Génétique Et Génomique Des Microorganismes Piézophiles Des

Génétique et génomique des microorganismes piézophiles des sources hydrothermales océaniques profondes : adaptation aux hautes pressions hydrostatiques chez l’archée piézo-hyperthermophile : Thermococcus barophilus, apport de la génétique et impact des hydrogénases Tiphaine Birien

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Tiphaine Birien. Génétique et génomique des microorganismes piézophiles des sources hydrothermales océaniques profondes : adaptation aux hautes pressions hydrostatiques chez l’archée piézo- hyperthermophile : Thermococcus barophilus, apport de la génétique et impact des hydrogénases. Microbiologie et Parasitologie. Université de Bretagne occidentale - Brest, 2018. Français. NNT : 2018BRES0018. tel-03166816

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THESE DE DOCTORAT DE

L'UNIVERSITE DE BRETAGNE OCCIDENTALE COMUE UNIVERSITE BRETAGNE LOIRE

ECOLE DOCTORALE N° 598 Sciences de la Mer et du littoral Spécialité : Microbiologie

Par Tiphaine BIRIEN Génétique et génomique des microorganismes piézophiles des sources hydrothermales océaniques profondes (Adaptation aux hautes pressio hdaie che lache piézophile : Thermococcus barophilus, apport de la génétique et impact des hydrogénases).

Thèse présentée et soutenue à lIUEM, Pla le 24 avril 2018 Unité de recherche : LM2E-UMR6197 UBO-CNRS-Ifremer

Rapporteurs avant soutenance : Composition du Jury :

Marie-Thérèse GIUDICI-ORTICONI Marie-Thérèse GIUDICI-ORTICONI Directrice de recherche, CNRS, Marseille Directrice de recherche, CNRS, Marseille

Philippe OGER Directeur de recherche, INSA Lyon Présidente du Jury Gwennola ERMEL Professeure, Université de Rennes 1

Jacques OBERTO Directeur de recherche, CNRS, Paris

Co-directeur de thèse Yann MOALIC Enseignant chercheur, Université de Bretagne Occidentale

Directeur de thèse Mohamed JEBBAR Professeur, Université de Bretagne Occidentale

Après avoir cherché sans trouver, il arrive quon trouve sans chercher

Jerome Klapka Jerome

“La mer est tout ! Elle couvre les sept dixièmes du globe terrestre… Cest limmense désert où lhomme nest jamais seul car il sent frémir la vie à ses côtés.

J. Verne (Vingt mille lieues sous les mers)

Les micro-organismes peuvent faire ce que vous voulez. Il suffit dimaginer comment

Koki Horikoshi, spécialiste japonnais des extrêmophiles

Henn Kim, Black Wave

Remerciements

Il est difficile de définir trois années de thèse, cest court et long à la fois entend-t- on souvent une chose est sûre en ce qui concerne le nombre de belles rencontres que lon a la chance de faire pendant ces trois années Entre simple rencontre ou collaboration, des personnes rentrent, passent dans notre vie et parfois y restent, mais dans tous les cas nous gardons tous une trace de ces passages et la plupart du temps de bons souvenirs des moments passés ensemble

Je tiens tout dabord à remercier Mohamed Jebbar, Didier Flament et Anne Godfroy, pour mavoir permis de réaliser ma thèse au sein du LM2E. Je remercie lensemble des personnes travaillant ou ayant travaillé au sein des deux UMR (composante UBO et IFREMER) durant mes années passées au sein du laboratoire.

Merci Mohamed pour mavoir confié ce projet de thèse, un projet certes de longue haleine, jalonné de hauts et de bas, mais qui reste une première expérience professionnelle tellement formatrice. Merci de mavoir fait confiance pour la campagne océanographique chinoise COMRA DY 34, cette expérience sur le Da Yang Yi Hao a été une véritable aventure autant sur le plan professionnel quhumain. Une aventure certes un peu redoutée mais tant attendue, et qui ma beaucoup appris. Je profite dévoquer cette expérience pour remercier le laboratoire « key laboratory of marine biogenetic ressources of third institute of oceanography » et lensemble des personnes qui étaient présentes sur ce mois et demi de navigation au sud-ouest de lOcéan Indien.

Je remercie tout particulièrement Yann Moalic, co-encadrant de mon stage de M2 et de ma thèse, pour son aide pour la compréhension des outils moléculaires, le travail à la paillasse; mais aussi pour son soutien moral, son franc parlé et ses innombrables phrases cultes notamment la réplique « pourquoi dès que je tente un truc de dingue ça foire » lors du concours de création de plasmide, ses nombreuses excuses pour ne pas faire de jogging le midi avec Steph et Alex, et le fameux « je me casse».

Je tiens également à citer Axel Thiel, investigateur du projet « génétique et adaptation à la pression » pendant son post doctorat au LM2E. Merci de mavoir

fait confiance pour le stage de M2, de mavoir formée sur le sujet, et davoir toujours trouvé les mots justes pour que je continue à avancer malgré les difficultés et la pression. Le sujet de stage a débouché sur un financement de thèse, tu nétais pas à nos côtés pour continuer les manips, mais tu es et resteras le maître de la transformation chez Thermococcus barophilus.

Je tiens à remercier Gishlaine Henneke, Christian Jeanthon et Jacques Oberto pour leur bienveillance et leurs conseils lors des comités de thèse.

Je remercie léquipe technique du LM2E, Nadège, Myriam et Stéphane, plus anciennement Morgane et Alex, pour leurs conseils, et leur travail de tous les jours afin dassurer la bonne gestion du laboratoire. Je remercie lensemble des chercheurs et enseignants chercheurs. Beaucoup ont contribué pendant leur cours à développer mon intérêt pour la microbiologie, et à me donner envie de continuer dans la recherche, même si ce nest pas chose aisée. Merci donc à Marc Leromancer, Gwenaelle Leblay, Frédérique Duthoit, Karine Alain (petit clin dil le j e Chie, e Afie d Sd Thehile, que nous avons eu la chance de partager et les petites pauses mots croisés du midi), Lois Maignien, et une spéciale dédicace à Claire Geslin, qui est vraiment une super enseignante.

Je remercie le côté Ifremer du LM2E, et plus particulièrement Erwan et son thésard Sébastien pour mavoir consacré de leur temps quand javais besoin de faire des mesures dhydrogène au micro-GC ; bon courage pour la fin de ta thèse Séb. Je remercie également Raphaël, Patricia et Christine. Un petit mot pour léquipe réplication : Didier, Gishlaine, Rémi, Audrey et Sébastien Laurent. Merci à tous pour votre bonne humeur.

Je remercie Stéphanie Renard, la fille de lîle dOuessant pour son investissement au sein du laboratoire, que ferait-on sans notre secrétaire mais au-delà du travail je te remercie pour ta présence, nos conversations, nos petites pauses goûters avec Mimi, nos discussions sur Yann Tiersen.

Myriam, mon autre confidente, je te remercie pour ta disponibilité, ton dynamisme, ton oreille toujours attentive. Jai adoré nos discussions sur tes nombreuses activités.

Nadège, impératrice des Mr/Mme, merci pour ta bonne humeur, ton rire si communicatif, pour tous les bons moments partagés lors de nos associations de nom de famille/prénom avec Sam et Alex, puis Sarah et Stéphanie. Merci également pour lidée des petits cadeaux pendant la campagne océanographique, une idée géniale qui fait du bien au moral!

Alex ou le Mac gyver du labo, cest un peu limage que jai de toi, capable de tout réparer avec brillo, mais également une personne gentille, simple et dotée dun humour et de jeux de mots comment dire, toujours là où on ne les attend pas!!! Ton départ nous a vraiment rendu triste, plein de belles choses pour la suite à Morlaix.

Sam aussi dit Sam le pompier, mon deuxième concurrent pour les Mr/Mme, merci pour les bons moments partagés, tes petites blagues/petits mensonges qui me faisaient bien rire.

Je tiens à remercier Sandy et Thierry, dune part pour leur savoir-faire en informatique (dépassant largement le mien), on se souvient des fameuses « infections » à deux reprises de mon ordi pro par Yann ; mais aussi et surtout pour leur bonne humeur.

Merci également à Sophie et Yannick, que serait mes passages matinaux devant laccueil de lIUEM sans votre bonne humeur quotidienne.

Kévin alias Batman, mon coéquipier/binôme durant le master, est devenu un ami par la suite, merci pour tes phrasés poétiques, ton humour. Je profite davoir évoqué mes années de Master pour remercier ma petite Sam pour son amitié, jai découvert une personne en or et Christian « lespagnol » également une personne que jai eu plaisir à connaitre. Je remercie les deux stagiaires de Loïs que jai eu la chance de rencontrer en M2, Clarisse pour nos repas partagés au RU et les recherches actives de mots fléchés avant de reprendre le travail, Flo alias poney indigo pour sa passion pour la science et linformatique, vous êtes vraiment deux personnes attachantes. Jordan, merci pour ta bonne humeur, ta connaissance du milieu marin, nest pas guide bilingue à Océanopolis qui veut. Bon courage pour la fin de vos thèses. Ellynn « liladaie de c » la stagiaire de Matty, merci pour ta simplicité, de nous avoir fait partagé ton don pour la cuisine à travers tes nombreux gâteaux, un délice

à chaque fois.

Je tiens à remercier lensemble des personnes qui ont travaillé à mes côtés pendant ma thèse. Jai eu le plaisir dencadrer Marion Gardette lors de ma deuxième année de thèse, on sest bien cassé les dents sur les manips pressions que lon a enchaînées de semaine en semaine. On se souviendra de la technique du hérisson encore longtemps, un concept peut être à breveter. Une personne formidable, travailleuse, avec toujours de bonnes idées, je te souhaite le meilleur pour la suite, jétais vraiment heureuse quand jai appris pour ta thèse, tu le mérites. Je remercie mes collègues et amis thésards/post-docs, avec qui jai partagé mon bureau, Coraline, merci pour nos petites séances potins avec notre fameuse expression « mammouth sous coquillage ». Merci Matthieu pour tes répliques cultes, pour ta voix cristalline toujours prête à chanter des morceaux qui rentrent dans la tête. Merci à Cess, davoir été présente et de mavoir soutenue dans les bons et mauvais moments. Un grand merci à Damien (merci pour ton soutien et pour ton aide quand jen avais besoin pour les manips et autre) et à Gwen (bon courage pour cette proche fin de thèse). Merci à Mélanie, Charlène, Vincent, Yang, Junwei, Sabrina, Sarah, Marc, Blandine, Caroline, David, Pierre et Marion. Bon courage à tous pour la continuation de vos recherches. Une petite pensée pour les thésards devenus grands, avec qui jai eu loccasion de passer de bons moments : Greg, Julien, Fred, Simon, Gaëlle et Sandrine. Bonne continuation pour les stagiaires actuels et peut être la relève à venir: Virginie, Paul et Amandine. Une pensée pour feu Extrême et Pression, les poissons rouges qui nous supportaient dans le bureau.

Je nai pas eu la chance denseigner durant ma thèse, cela na pas été facile à accepter; mais je voulais remercier Anouck de mavoir proposé lUE sciences et société pendant la deuxième année de thèse. Jai adoré minvestir dans ce projet et jai une pensée pour les M2 qui ont travaillé à mes côtés pendant 2 mois: Antoine Briand, Roxane Boullard, Sylvain Dutaut, Jérémy Fauchet, Gauthier Nourdin, Gaëtan Olivier, Nicolas Richet, Kévin Tallec (notre chef, créateur des pinatas), Clément Tanvet, Jordan Toullec et Emilie Vanpeene. On sest bien amusé. Certains sont en thèse à lheure actuelle, bon courage à vous. Une mention spéciale pour Gaëtan, je te souhaite pleins de réussites.

Merci aux personnes du LEMAR, que jai eu loccasion de croiser, voir avec qui

jai sympathisé. Gene, merci pour les discussions quand on se croisait dans les couloirs. Couloirs qui ont eu la chance dexposer tes jolies photos.

Je remercie également mes amies : Mélanie, Sandra et Sophie, pour mavoir permis de décompresser quand jen avais besoin, davoir toujours été compréhensives, et pour nos aprems girly du samedi en ville, nos pauses café à Izee, nos soirées, les nombreux petits restos pour votre présence dans ma vie tout simplement. «Je veux vivre le reste de ma vie à vivre de petites et grandes aventures avec les gens que jaime cette phrase nest pas de moi, mais voilà ce que minspire notre amitié, encore beaucoup de moments tout à la fois simples et passionnants à vivre avec vous trois. Un énorme merci à Nadège, Gwendoline et Guillaume (mon Guigui) pour votre sincère amitié.

Je remercie et encore le terme nest pas suffisant face à la reconnaissance et lamour que je leur porte, ma famille: mes parents pour leur implication dans tout ce que jai entrepris, leur intérêt pour mes projets que ce soit la thèse mais également tous les autres, leur soutien sans limite, les paroles réconfortantes, le partage des bons comme des mauvais moments. Je pense que sans vous je nen serai pas là. Un grand merci à mon frère, pour notre complicité, on le sait bien on pourra toujours compter lun sur lautre. La vie nous apprend quon a rarement besoin de grands discours quand les sentiments sont sincères. Merci à ma mamie pour son soutien, nos discussions, les petits mots laissés sur mon répondeur. Tu nauras pas vu la fin de ce travail, je pense à toi.

Enfin un énorme merci à Antoine, de partager ma vie et pour son soutien sans limite. La fin de la thèse nest pas une période facile, mais tu étais à mes côtés dans ce moment, encore merci. Je nous souhaite encore pleins de belles aventures, je taime.

Aant-propos Vire dans les grands fonds : une question dadaptation ?

La ie est largement rependue sur Terre, compris dans les niches cologiques o rgnent des paramtres phsico-chimiques les plus etraagants et etrmes : absence dogne, temprature, pH, osmolarit, teneur en eau, pression La qualification dun biotope detrme est dforme par notre propre perception, puisquil sagit premirement dune ision trs anthropocentre : des milieu hostiles lhomme et o toute ie humaine semble impossible . Cependant tout biotope dfini par une aleur faible ou forte dau minimum un paramtre majeur influenant les ccles itau peut tre agr de ce qualificatif (Gargaud et al., 2007). La dcouerte du microbiologiste amricain Thomas Brock en 1969, dun microorganisme The aaic, se deloppant dans les sources chaudes (50-90C) du parc de Yellostone au Etats Unis, jusqualors considres comme striles, ont bala les ides reues. Ds lors les milieu etrmes de la plante allaient faire lobjet de nombreuses inestigations Les sources hdrothermales ocaniques profondes, rgions ponctuelles de fortes actiits olcaniques, situes dans les grands fonds, font partie de ces endroits a ii hostiles ; du fait des conditions de temprature, de pression hdrostatique et de la composition du fluide anoique rduit qui mane de ces difices. En dpit de ces contraintes les chemines hdrothermales sont considres comme de ritables oasis de ie. Le terme detrmophile qualifie ces espces possdant la particularit de se delopper dans des conditions flirtant aec les limites de la ie. Ces dcouertes ont fait reculer les limites phsiques et chimiques connues de la Vie sur Terre, et ont aussi conduit riser les hpothses de la ie de tpe Terrestre sur dautres plantes du sstme solaire : leobiologie. Lintrt dtudier les enironnements profonds et les espces associes, est de rendre compte de la aste biodiersit quils abritent, des mcanismes mis en ure par ces organismes pour sadapter (oies mtaboliques et molcules originales) et aloriser terme les recherches fondamentales par des applications innoantes en biotechnologie. La biotechnologie des etrmophiles a pour objectif de rechercher et deploiter ces ressources naturelles de biomolcules, comme les enmes, les biopolmres, les mtabolites secondaires. Le projet de thse ise lucider les bases des signatures molculaires de ladaptation au fortes pressions hdrostatiques, che le modle archen Theccc bahi. Cette arche fait l'objet d'tude depuis une diaine dannes au LM2E et pour laquelle un outil gntique a t delopp au laboratoire (Thiel et al., 2014), qui serira de support biologique. Un olume important de la biosphre est soumis au hautes pressions hdrostatiques, et pourtant limpact de ce paramtre sur ladaptation et la phsiologie des organismes reste encore peu tudi.

Table des matie res

Table des illustrations Liste des abréviations

Introduction

I. La découverte de la biosphère profonde……………………………………………... I.a. Les abysses, un environnement aux conditions extrêmes…………………………………. I.b. La découverte des sources hydrothermales océaniques profondes………………...... I.c. La pression: le paramètre physique majeur des grands fonds………………………...... II. Les microorganismes adaptés à la vie sous pression………………………….. II.a. Les débuts de la microbiologie abyssale…………………………………………………………... II.b. Diversité des procaryotes psychro-piézophiles……………………………………………… II.c. Diversité des procaryotes des sources hydrothermales profondes………………... III. La pression hydrostatique et ses effets………………………………………………….. III.a. Les effets de la pression sur les cellules………………………………………………………... III.a.1. Influence de la pression sur les acides nucléiques…………………………………….. III.a.2. Influence de la pression sur la membrane cellulaire…………………………………. III.a.3. Influence de la pression sur les protéines………………………………………………….. III.a.4. Influence de la pression sur la traduction………………………………………………….. III.a.5. Influence de la pression sur le pH intracellulaire………………………………………. III.b. Les adaptations aux HPH chez les piézophiles……………………………………………… III.b.1. Gènes régulés par la pression…………………………………………………………………….. III.b.2 Adaptations structurales des biomolécules………………………………………………... III.b.3. Régulation du stress pression………………………………………………………………….....

IV. Métabolisme de l’hydrogène……………………………………………………………………

IV.a. Les hydrogénases….………………………………………………………………………………………… IV.a.1. (Ni-Fe)-hydrogénases…………………………………………………………………………………... IV.a.2. (Fe-Fe)-hydrogénases………………………………………………………………………………….. IV.a.3. Hydrogénases sans métaux………………………………………………………………………

IV.b. Le métabolisme de l’hydrogène chez les Themcccale……………………………… IV.b.1. Les hydrogénases des Themcccale……………………………………………………….. IV.b.2. Rôle des différentes hydrogénases …………………………………………………………….. IV.b.3. Influence du soufre dans le métabolisme…………………………………………………… IV.b.4. Le régulateur transcriptionnel SurR …………………………………………………………..

IV.c. Les hydrogénases chez Themccc bahil…………………………………………..

V. Etudes physiologiques par des approches de génétiques………………

V.a. La découverte du troisième domaine du vivant………………………………………………. V.b. Les intérets des archées…………………………………………………………………………………... V.c. Les transferts génétiques chez les archées……………………………………………………… V.c.1. La transformation………………………………………………………………………………………. V.c.2. La conjugaison……………………………………………………………………………………………. V.c.3. La transduction…………………………………………………………………………………………..... V.d. Les défis de la génétique des archées…………………………………………………………….. V.e. L’outil génétique développé chez Themccc bahil…………………………...

VI. Objectifs de la thèse……………………………………………………………………………..

Matériel et Méthodes

I. Outil génétique……………………………………………………………………………………..

I.a. Matériel biologique…………………………………………………………………………………………. I.b. Milieu de culture…………………………………………………………………………………………….... I.b.1. Milieu TRM………………………………………………………………………………………………...... I.b.2. Milieu LB…………………………………………………………………………………………………...... I.c. Construction des plasmides……………………………………………………………………………... I.c.1. pUPH…………………………………………………………………………………………………………...... I.c.2. Liste des plasmides construits………………………………………………………………………. I.d. Transformation dans Themccc bahil…………………………………………… .. I.d.1. Etape de transformation...... I.d.2. Sélection des mutants…………………………………………………………………………………… I.d.3. Extraction/purification de l’ADN génomique et vérification des mutants… I.d.4. Réalisation de stries sur TRM complémenté en Simvastatine et TRM………..... I.e. Tests de croissance en milieu liquide……………………………………………………………….

II. Caractérisation des mutants hydrogénases……………………………………..

II.a. Suivi de croissance des mutants hydrogènases sous pression...... II.a.1. Préparation des seringues…………………………………………………………………………… II.a.2. Mise en pression des incubateurs………………………………………………………………... II.a.3. Dénombrement cellulaire……………………………………………………………………………. II.a.4. Contraintes liées à la pression……………………………………………………………………... II.b. Mesures d’hydrogène……………………………………………………………………………………... II.b.1. Préparation des fioles …………………………………………………………………………………. II.b.2. Mesures au micro-GC……………………………………………………………………………………

Résultats

Chapitre I : Amélioration de l’outil génétique…………………………………………………. I.a. Contexte de l’étude…………………………………………………………………………………………… I.b. Tests de sensibilité de T bahil MP sauvage à la 6-MP……………………………... I.c. Construction de T bahil TERMP…………………………………………………. I.d. Résultats de la transformation de T bahil MP par le plasmide pUPH1….. I.e.Tests de sensibilité des souches mutées…………………………………………………………. I.f. Efficacité du nouveau marqueur de sélection………………………………………………… I.g. Conclusion de l’étude……………………………………………………………………………………...

Chapitre 2 : Obtention et caractérisation des mutants hydrogénases……….. II.a. Construction des mutants hydrogénases……………………………………………………… II.a.1. Contexte de l’étude…………………………………………………………………………………….. II.a.2. Obtention des mutants………………………………………………………………………………. II.a.2.a. Obtention du mutant mbh (mbh)………………………………………………………... II.a.2.b. Obtention des mutants hI (hI) et hII (hII)………………………………… II.a.2.c.Obtention du mutant mbhcdh (cmbh) et du double mutant mbhmbhcdh (mbhcmbh)……………………………………………………………………. II.a.2.d. Obtention du mutant mb (mb)………………………………………………………… II.a.3. Vérification de l’absence du plasmide……………………………………………………….. II.a.4. Conclusion de l’étude………………………………………………………………………………….

II.b. Caractérisation des mutants hydrogénases………………………………………………….. II.b.1. Contexte de l’étude…………………………………………………………………………………….. II.b.2. Résultats des croissances des mutants hydrogénases sous pression……….. II.b.2.a. Croissances à 0,1 MPa……………………………………………………………………………...115 II.b.2.b. Croissances à 40 MPa et 70 MPa……………………………………………………………... II.b.3. Résultats de la production d’hydrogène des mutants hydrogénases……….. II.b.4. Discussion et conclusion de l’étude………………………………………………………….. II.b.4.a. Croissance des mutants hydrogénases et production d’H2 à 0,1MPa……... II.b.4.b. Croissance des mutants hydrogénases sous pression……………………………..

Discussion générale et conclusion………………………………………………………………

Bibliographie…………………………………………………………………………………………………….

Valorisation des travaux de thèse……………………………………………………………….

Table des illustrations

Liste des figures : Fige 1: Ce aneale chmaie de la bihe fnde ...... 1 Fige 2: Lcaliain de ie hdhema ...... 4 Fige 3: Reenain chmaie d'ne ce hdhemale ...... 5 Fige 4: Phgahie d'n fme ni ...... 6 Fige 5: Elin de la deni celllaie de micganime en fncin de la ein ... 8 Fige 6: Le effe de la ein la cellle ...... 17 Fige 7: Adaain de liide achen a cndiin eninnemenale che M. jannachii ...... 19 Fige 8: Le effe de HPH le mablime de S. ceeiae e acidificain de la acle ...... 21 Fige 9: Reenain chmaie d me TR/S che P. fndm SS9 ...... 23 Fige 10: Fncinnemen d me eiaie de Sheanella benhica 0,1 e 60 MPa 25 Fige 11: Sce de ie caalie de hdgnae ...... 35 Fige 12: Mablime de hdgnae ...... 41 Fige 13: Le glae anciinnel SR ...... 44 Fige 14: Le i dmaine d ian ...... 51 Fige 15: Le anfe gnie che le ache ...... 56 Fige 16: Mhde de diin de gne ...... 63 Fige 17: Le challenge ae die le ache ...... 66 Fige 18: Schma d incie de l'il gnie che T. bahil ...... 70 Fige 19: Schma cailaif de l'ae d'benin de ece lamidie ...... 81 Fige 20: Pincie de la PCR de ificain de l'benin de man ...... 84 Fige 21: Schma cailaif de la anfmain che T. bahil ...... 86 Fige 22: Incbae hae ein/hae emae (T Indie) ...... 89 Fige 23: Schma cailaif de ae de ii de ciance ein ...... 90 Fige 24: Biace HP em ...... 92 Fige 25: Mee a mic-GC ...... 93 Fige 26: Te de enibili la 6-MP de che T. kdakaeni e T. bahil ...... 95 Fige 27: Cncin d lamide UPH ...... 98 Fige 28: Schma elicaif de l'il gnie amli ...... 99 Fige 29: Gel de ificain de la anfmain ...... 101 Fige 30: Te de enibili de man ben ...... 102 Fige 31: Le hdgnae cible dan cee de ...... 107 Fige 32: Gel de ificain de man mbh ...... 108 Fige 33: Gel de ificain de man hI e hII ...... 109 Fige 34: Gel de ificain d man c-mbh e d dble man mbh/c-mbh ...... 110 Fige 35: Gel de ificain de l'benin d man mb ...... 111 Fige 36: Ciance de man hdgnae 0,1 MPa aec e an fe ...... 115 Fige 37: Ciance de man hdgnae 40 MPa, aec e an fe ...... 117 Fige 38: Ciance de man hdgnae 70 MPa, aec e an fe ...... 117 Fige 39: Pcenage de dcin d'hdgne a le man e ii de le ciance ...... 120

Liste des tableaux : Tablea 1: Le ihile chhile il ...... 11 Tablea 2: Le ihile hemhile e hehemhile il ...... 15 Tablea 3: Le hdgnae che le Themcccale ...... 38 Tablea 4: Eein de gne cdan le hdgnae de T. bahil, en fncin de aiain de ein ...... 46 Tablea 5: Eemle de ece en che ceaine ache ...... 56 Tablea 6: Mhde de dliance de l'ADN che ceaine ache ...... 58 Tablea 7: Eemle de me de anfmain che le ae ge d'ache ...... 60 Tablea 8: Eemle de mcanime de cnjgain che le Slflbale ...... 65 Tablea 9: Eemle de mhde de lecin e cne-lecin efficace che le ache 68 Tablea 10: Tablea cailaif de che de l'de ...... 73 Tablea 11: Lie de amce ...... 79 Tablea 12: Sence de amce ilie la ificain de man ...... 84 Tablea 13: Cle hdgnae di dan cee de ...... 107 Tablea 14: Taille de amlicn aend ...... 108

Liste des abre viations

aa : acide amin ADN : Acide dsoribonuclique Ampi: Ampicilline ARN : Acide ribonuclique ARNt : ARN de transfert ADP : Adnosine diphosphate ATP : Adnosine-5-triphosphate C : cstine C : degr celsus Cell.mL-1 : Cellule par millitre CO : monode de carbone

CO2 : Diode de carbone CRISPRS: Clustered regularl interspaced short palindromic repeats dNTP: Dsoribonuclotide DHA: Acide docosaheanoque (C22:6 -3) e- : lectron EDTA: Acide Ethlne Diamine Tetraactique EPA: acide icaosapentanoque (C20:5 3) 5-FoA: 5-Fluoorotic Acid FP : Fau positif g: graitationnel g/L: gramme/litre h: heure His: Histidine HMG-Coa: 3-hdro-3-mthlglutarl-coenme A HPHs: Hautes Pressions Hdrostatiques

H2 : hdrogne

H2S : Sulfure dhdrogne IPTG: Isopropl -D-1-thiogalactopranoside j: jour KDa: Kilodalton Km: Kilomtre L: litre LB: Luria Bertani LUCA: Last Uniersal Common Ancestor m: mtre min: minute Mbh: Membrane bound hdrogenase Mbh Codh: Carbon monoide dehdrogenase Mb: Membrane bound odoreductase mM: millimolaire MPa: mgapascal MPa.Km-1 : mgapascal par kilomtre 6-MP: 6-mthlpurine NAD: Nicotinamide adnine dinuclotide NADPH: Nicotinamide adnine dinuclotide phosphate

Nsr: NAD(P)H linked sulfur reductase OmpH: Outer membrane protein H, gne associ L OmpL: Outer memebrane protein L, gne associ H ORF : Oepn Reading Frame pb: paire de base PC: Phosphatidlcholine PCR: Polmerase Chain Reaction pdo: protein disulfide odoreductase PE: Phosphatidlthanolamine PEG: Polthlne glcol PF: flagelles polaires PFA: Paraformaldhde PG: phosphatidlglcrol PL: Flagelles latrau pH : potentiel Hdrogne PUFAs: acides gras polinsaturs Pur: Purine PrF: Orotodine-5-monophosphate dcarbolase ROV: remotel operated ehicle RPM: Rotation par minute SDS: Dodclsulfate de sodium SHI: Sulfhdrogenase I SHII: Sulfhdrogenase II Sim: Simastatine SurR: Rgulateur transcriptonnel (Sulfur response) T: temps TAE: Tris Acetate EDTA Taq PFU: Taq polmrase TE: Tris EDTA ToR/ToS : protine membranaire qui actie les gnes de irulences de Vibi cheae TRM: Thermococcus Rich Medium T.b: T. bahi t: Theccc bahi ild tpe T.K: T. kdakaei: Theccc kdakaei s: seconde S: soufre M: micromolaire U: unit UV: ultra iolet V: Volt VTA: Voltae tranfert agent Xgal: 5-bromo-4-chloro-3-indoll-bta-D-galactopranoside + gne : mutant de dltion

Introduction

I. La découverte de la biosphère profonde

I.a. Les abysses, un environnement aux conditions extrêmes

Le abe, d gec ancien ab an fnd, dne fnde immene , dignen le fnd canie i enden de fnde imeinnane de l de 2000 me.

Ce cmaimen abal dne fnde menne de 3800 me, ece 80% de la

eficie de fnd main, ce i eene l de 65% de la face de ne lane blee (Fang and Balinki, 2008)(Jannach and Tal, 1984; Oge and Jebba, 2010)

(figure 1).

Fige 1: Cope aneale chmaie de la biophe pofonde (Michod, 2014; Oge and Jebba, 2010) Le ligne oge e blee epenen la empae e la peion limie po la ie.

A de elle fnde le aame hic-chimie n diffen de ce cnn en

face e aaaien cmme cnaignan. Le gand fnd n caaci a ne absence de lumière, achan e celle-ci ne ne e dan la cche iee de la

clnne dea, la hnhe e dnc limie ne cenaine de me de fnde

(Vaneel e al., 2010). A ing me de fnde, il n a l dagiain eficielle.

Le cle emen e e. A 200 m gne ence ne age cla cclaie.

Mai 300 m, ce la ni enelle- ae le mignage dne lnge bd dn

bmeible.

Le fnd canie n de milie oligotrophes (Jannach and Tal, 1984), el 1% d cabne de la dcin imaie hnhie de face e e fme

aiclaie (neige maine). En ce i cncene le températures, elle n faible mai

elaiemen cnane aec ne abiliain de 2C 3000 m, e ne cillain ene 0,5 e

1C de fnde de 5000 m, lecein de la mdianne (13C) e de la me

ge (22C).

Enfin ln de aame hie maje e la fe pression hydrostatique, dfinie cmme la fce eece a ne clnne liide ne face, e agmenan de 10 MPa

(mgaacal) le kilme (10 MPa.Km-1) dan la clnne dea e de 20-30 MPa.Km-1 a niea de che e dimen. La fe de Maianne, i dien acellemen le ecd de fnde la me, 11 km de fnde, e aini mie ne ein de 110 MPa

i 1 nne a cm2. P dnne n eemle de cmaain image cela ia ne

ie lngle dn ce .

Aini, d fai de ce cndiin ligne de bie de face, limage acie ce eninnemen fnd a endan lngem celle dn de, d de e fme de ie. En migne lhhe fmle en 1841 a le naalie anglai Fbe (Anden and Rice, 2006). Pendan ne camagne de dagage en me Ege, il alie de lemen

de fnde ciane, e emae ne diminin d nmbe danima en fncin de la fnde. La cbe hie i dcle de ce beain, li mne e e

ie diaaiai a-del de 550 m.

La ali e an ae, mai il fada aende le emie elain

cangahie dmne e la ie eie en in de la lane. D 1860, la

dcee de ca l de 1800 m de fnde a Alhne Milne Edad eme en

ein le dcee de Fbe. En 1864 le ae ngien Sa emne a niea dn

Fjd, 2 file. Le dcee enchainen de 1872 1876, le anglai bd d Challenge

acen e le me d glbe e en de la ie j 5500 m de fnde. Le naie dani Galahea, ae de n ediin de 1950 1952, 115 ece a-del de

6000 m ; nammen a niea de la fe de Maianne 10900 m de fnde, de anima ineb, de dimen e de bacie n emn bd. Aini endan de 100 an, de echeche n mene ai i la ie eiai e fnde ; e ence ajdhi le camagne cangahie cninen dele la ichee de gand fnd.

La bihe fnde e acellemen cnide cmme le l ae cme de la Tee

(Clell and DHnd, 2013; Kallmee e al., 2012). Ce cme immene, abie ne gande diei dece mai en faible ani, aec ne bimae de lde de ele milligamme de maie ganie a m2 (Cai, 2013).

Lhmgni ai afaie de gand fnd e de mme nance ; en effe de ne chade, anie e chage de maie ganie die : le ce hdhemale,

iennen nce ce eninnemen. Ce cme cmlee, cnid cmme ln de

l ecaclaie de la Tee, n de iable ai de ie, caaci a ne faible bidiei e a cnaie ne fe bimae de 10 100 kg a m2 (Cli e al., 1979; Pie and Maeinn, 1998).

I.b. La découverte des sources hydrothermales océaniques profondes

En 1977, de glge amicain emba bd d -main Alvin, dcen a lage de le Galag l de 2600 m de fnde ne fe acii lcanie, de difice hdhema a alle de chemine, d mane n flide chad. Cee elain mae la dcee de la emie ce hdhemale acie (Cli e al., 1979;

Lndale, 1977) (figure 2). De camagne liee n emi la dcee de nmbe

ie, die diffen endi d glbe aec de fnde allan de 700 m n e

l de 4000 m. La fe de Caman dcee en 2009, abie le ie Beebe, i 4960 m de fnde (Cnnell e al., 2012). Le chemine hdhemale e fmen a niea : de ne fe acii ecnie, de dale mdi-canie (Alanie, Pacifie

Oienal, Ocan Indien), de ne de bdcin, a niea de Bain aie-ac d

Pacifie ccidenal (figure 2). Ce n de gin ncelle de fe acii ecnie,

i fagilien la ce canie e cen de fie a leelle ne lea de me.

Celle-ci e chaffe imi de la chambe magmaie, leffe de la emae e de la ein, le flide acidifie e di de cnian de la che me (baale,

idie, gabb). Ce flide acide dne emae aiinan le 350C emne ja

lanche canie. Le difice e fmen al a cnac d flide aec lea de me dne

emae che de 2C, ce i enaine la ciiain de mina i accmlen a de ie de flide (Cann e al., 1999) (figure 3).

Fige 2: Localiaion de ie hdohema (Floe and Reenbach, 2011) Le ie hdohema on locali a niea de ide mdio-ocanie (Alanie, Pacifie Oienal, Ocan Indien). Le poin epenen le one eploe.

Fige 3: Repenaion chmaie d'ne oce hdohemale (Floe and Reenbach, 2011)

Ce habia mi labence ale de lmie, de ein lee, de f gadien de emae, e la ence dlmen ie (ma ld, mhane, lfe) (Gld,

1992) (figure 3 et 4), emblen emie e inada lmegence de la ie (Pie and

Maeinn, 1998). Un cme lian e an en a niea de ce chemine.

La ie de ce cme ee le flide hdhemal i e ne ce dnegie e de nimen, e la ence de micganime, i cnien la bae de la chane alimenaie dan ce eninnemen. Lnegie nceaie a delemen ne ien a de la hnhe, celle-ci nan a aliable d fai de labence de lmie, le ea

hie dend de la dcin imaie de bacie. A la lace de la lmie ce ne

acin chimie i fni lnegie imaie nceaie le mablime. En effe le flide n chag en ma ld (fe, inc, mangane, lmb, cie) e en lmen

di (H2S, CO2, H2) (Jannach and Tal, 1984; Main e al., 2008). Ce cm chimie di eenen de ce dnegie, de accee e dnne dlecn

le micganime. Ce hnmne e le nm de chiminhe (Gme-Sae e al.,

2017).

Fige 4: Phoogaphie d'n fme noi (Floe e al., 2012) De chemine on iible dan le fond, cee phoo a pie pa le ROV Jaon II a niea de l Eaen La Speading Cene (Wood Hole Oceanogaphic Iniion).

Edie ce eninnemen fnd e le ece acie, eme de ende cme de la

ae bidiei il abien, aini e le mcanime mi en e a ce ganime

adae.

La haute pression hydrostatique (HPH) cnie le incial aame hie i inflence lacii mablie e le ccle de ie de ganime main fnd. Cela n amne n inee ce aame hie maje e la ein hdaie ; i malg le fai e leeniel d lme de la bihe eee i mi de ein

lee, ee ln de aame le min di. N dcin dan la aie iane, ce

e la ein hdaie, la diei de micganime ihile (d gec ie :

ee ee ; hile : d gec hil ( ami, i aime )), le effe de la ein le

ganime i n mi aini e le agie dadaain mie en lace a ceain micganime faie face.

I.c. La pression: le paramètre physique majeur des grands fonds

La piézophysiologie digne lde de ladaain de ganime ian a hae

ein hdaie (Abe and Ka, 1999). Elle cnie en lde de ne

hilgie mie en lace a le cellle ce ein e la mie en idence de lmen ciie la iabili celllaie. La ein hdaie cnie ln de

incia aame hie i inflence llin, e la diibin de macganime e de micganime dan le milie canie fnd (Sme,

1990; Yaan, 1986). La dcee dganime ihile dan le eninnemen hae ein el e le aife fnd, le ei de le ence le ce hdhemale fnde, a le de inegain la caaci dadaain e la facl de ie de ce ece.

Le eme de ihile a ili la emie fi a Yaan en 1995 (Yaan, 1995).

Un ganime ihile e e dfini cmme n ganime dn limm de ciance

e e ne ein iee la ein amhie (0,1 MPa) (Bale, 1992), da la dfiniin de Zbell e Mia en 1957 (Zbell and Mia, 1957). En fncin de

ima de ein de ciance de micganime, n dfini le piézosensibles i

en ne agmenain de ein faible j 20 MPa, achan e le a de ciance dimine aec lagmenain de ein. Le piézotolérants i e delen j 40 MPa, aec ne ciance inchange il ien cee ein ein amhie. Enfin le piézophiles an e n bein de hae ein ce de manie imale. De piézophiles obligatoires ou stricts eien galemen, incaable de e dele ein amhie e faible ein (figure 5) (Daniel e al., 2006).

Fige 5: Eolion de la deni celllaie de micooganime en foncion de la peion (Zeng e al., 2009)

Dan le can, la ein hdaie agmene de 10 MPa le 10 me. La ein e dfinie cmme la fce eece ne face, la ein hdaie, cend dnc

la fce eece a lea n c immeg ; celle-ci eece eln le incie de Le

Chelie de 1884 (admin, 2013). Seln ce incie : le le mdificain eiee ae n me hic-chimie en ilibe en ne lin e n nel a dilibe, llin e a ebain i ln engende e en mde leffe. Le mdificain een e ne aiain de cncenain, emae

ein. Si le lme d me e agmen, la ein dimine eln le incie

la ein di ee cnane. Le me agi dnc en faian la acin i

di le l de mle de ga. Le effe de fe ein hdaie ne acin

hic-chimie lilibe n dnc gen a la aiain de lme d me leel la ein eece V.

II. Les microorganismes adaptés à la vie sous pression

Le bie de la bihe fnde lighe, e caaci a le hae ein hdaie, eeneaien 70% d nmbe al de cellle Tee. Mai elemen

ne cinanaine dece die ihile e ilane (adae a hae ein hdaie) n ile (33 bacie e 16 ache). P la maji dene elle, il

agi de bacie chhile hhe. Selemen e de che n

ihile ice ; le 15 che ihile bligaie ile, 14 n de bacie e

ne ele ache Pyrococcus yayanosii CH1 (Zeng e al., 2009). Ce nmbe limi de

ihile il j mainenan e elie a le fai e emne de chanilln

ei, le maineni, i le clie, e cmli e ce. Ai elemen

ele e de biace hae ein e hae emae indienable

le de, n del.

II.a. Les débuts de la microbiologie abyssale

Le echeche la micbilgie abale n cmmenc dan le anne 1884 aec le camagne cangahie d Taliman e d Taaille mene a le cheche fanai Regnad e Cee. Il meen lhhe de la ence de bacie l de 5000 m de fnde (Minic e al., 2006), e cllece de bacie j 8200 m. Ce galemen

n de emie faie de eimenain linflence de la ein de bacie

(Meeman and McMillan, 2014). Mai le dcee e n iablemen accene aec lanemen de nelle echnlgie (naie cangahie, bmeible ROV

(Remel Oeaed ndeae Vehicle)) e la mlilicain de camagne

cangahie, el e lediin Danih Galahea Rnd he ld en 1950-1952.

Aini dan la dcennie iane, le innie de la micbilgie maine : Clade ZBell,

Richad Mia, Hlge Jannach n dmn ne acii micbienne alenie e labence de bacie adae libe a cndiin abale. D 1949, ZBell e Mia ineen

lde de leffe de la ein le micganime, il ilen ai de 1957, de

micganime ein de chanilln enan de dimen fnd, e ce laide dincbae ein en ianim (Zbell and Mia, 1957). En di de le eff, il ilen n micganime ielan e nn ihile. ZBell emle le eme de bahilie, en bean la deni celllaie en fncin de aiain de ein, celle-ci nan a la mme ein amhie e de ein l lee. Malg ce dcee, le ceicime gne leience de micganime aiman la ein. Il fada aini aende 1979 e le dba i cl, aec lilemen d emie micganime ihile bligaie a Yaan e n ie (Yaan e al., 1979). Il

n le emie beni e maineni en cle e n ihile, i a idenificain

e lea e Psychromonas sp CNTP3. Pa la ie Yaan cninea le de la

ein aec nammen la dcee de la che ihile bligaie Codwellia sp MT41

(Yaan e al., 1981) ence le emie de linflence de hae ein hdaie le liide e le ine (DeLng and Yaan, 1985; Yaan, 1986).

Aini dan le anne 1970, de nmbe aa de Rbe Scha, Ria Clell, Jd

Deming, Aiide Yaan ence le ie janaie d fee Hikhi, n

emi de mie cmende la ie dan le fnd canie e de dmne leience de bacie ihile.

Ce emie micganime di aien de bacie chhile hhe, mai la dcee de ce hdhemale en 1977 allai cnie n iable nan le echeche la micbilgie abale.

D l, de micganime hehemhile (>90C) anabie ic n e il de ce cme aiclie. Nmbe dene e aaiennen a dmaine de ache,

l aicliemen lde de Thermococcales. Le eience mene ein celle-ci n emi de ende cme d caace ilan i ihile de che, en effe ce denie, la ciance e le i amlie a le hae ein.

II.b. Diversité des procaryotes psychro-piézophiles

La la de ch-ihile n il ene 2500 m e 11 000 m, a niea de lenemble de can fnd e de emie cche de dimen. I dn eninnemen fid e lighe, le emae imale ne dae a le 15C (Mia,

1975) e n dfini a ne gamme de ein lage (tableau 1)(La e al., 2007). La maji de ce ch-ihile aaien la clae de Gamma-proteobacteria, aec de eenan dan le cin gene e cmend ce ge : Shewanella, Photobacterium

(Ngi e al., 1998), Colwellia (Yaan e al., 1981), Moritella (X e al., 2003) e

Psychromonas (Ngi e al., 2002). Le Shewanella n le l nmbee ai ile, cin Moritella n ile e ae le Psychromonas e Colwellia. Le gene

Photobacterium cmend i che ihile mde, dn la che SS9 de P. profundum, mdle bacien de lde de la ihilie (mcanime de glain de la

ein, adaain de membane a HPH, de gnmie e caaciain

hlgnie)(Vannie, 2012).

De ecein n ne aec lilemen dne che ihile PRT1 aaenan la famille de Rhodobacterales (fe de Pe Ric, 8350 m de fnde), le de ae

n de bacie Gam iif aaenan a Fimice (Fe Alienne en Alaka,

2500 m de fnde).

(Dap Caio, 2013; Vannie, 2012) Tablea 1: Le piophile pchophile iol Nom Nature de Lieu de Profondeur Optimum de Références l’échantillon prélèvement pression Carnobacteriu Eau de mer Fosse Aleutian mètres MPa Lauro e al, m AT1 Piézophile Carnobacteriu Eau de mer Fosse Aleutian mètres Mpa Lauro e al, m AT Piézophile Colwellia Fosse du Japon mètres MPa à C Deming e hadaliensis - MPa à C al, BNL-1 Piézophile stricte Colwellia Sédiments Fosse du Japon mètres MPa à C Nogi e al, piezophila Piézophile stricte Colwellia sp. Amphipode Fosse Kermadec mètres Piézophile Lauro e al, KT Colwellia sp. Amphipode Fosse des mètres MPa Yayanos e al,

MT1 Mariannes Piézophile ; Delong stricte et al., Moritella Sédiments Sierra leone, mètres MPa C Xu e al, abyssi Océan MPa C Atlantique Piézophile tropical Est Moritella Sédiments Fosse du Japon mètres MPa Lauro e al, japonica DSK1 Piézophile Moritella PE Océan Pacifique MPa Yayanos e al, Piézophile Delong et al., Moritella Sédiments Sierra leone, mètres MPa C Xu e al, profunda Océan Piézophile Atlantique tropical Est Moritella Sédiments Fosse des mètres MPa Kato e al, yayanosii Mariannes Piézophile ; Nogi et DB1MT- stricte Kato, Photobacteriu Sédiments Fosse de Ryuku mètres MPa Nogi e al, m profundum Piézophile DSJ Photobacteriu Amphipode Fosse de Sulu mètres MPa Delong , m profundum Piézophile Delong e al, SS Psychromonas Sédiments Fosse du Japon mètres MPa Nogi e al, kaikoae Piézophile stricte Psychromonas Sédiments Océan mètres - MPa à Xu e al profunda Atlantique C MPa à C Piézophile Psychromonas Eau de mer Océan Pacifique mètres MPa Delong e al, sp CNPT Piézophile ; Yayanos e al Psychromonas Sédiments Côtes Hawaï mètres Delong et sp HS11 - Yayanos, Shewanella Eau de mer Fosse de Ryuku mètres MPa Kato e al benthica Piézophile DB101 Shewanella Eau de mer Baie de Suruga mètres MPa Kato e al benthica Piézophile DB01 Shewanella Eau de mer Fosse du Japon mètres MPa Kato e al benthica Piézophile DB0 Shewanella Eau de mer Fosse du Japon mètres MPa Kato e al benthica Piézophile DB0 Shewanella Eau de mer Fosse Izu-Bonin mètres - MPa Kato e al benthica Piézophile DB1F/R Shewanella Sédiments Fosse des mètres MPa Kato e al benthica Mariannes Piézophile DB1MT- stricte Shewanella Amphipode Fosse Kermadec mètres Lauro e al

benthica KT - Shewanella Amphipode Fosse Kermadec mètres MPa Lauro e al benthica KT Piézophile Shewanella Amphipode Fosse des mètres MPa Delong et benthica PT Philippines Piézophile Yayanos, Shewanella Amphipode Fosse des mètres MPa Delong et benthica PT Philippines Piézophile Yayanos, Shewanella Pacifique du MPa Delong et benthica PT - Nord - Piézophile Yayanos, Shewanella Sédiments Fosse de Ryuku mètres MPa Nogi e al benthica DSS1 Piézophile

II.c. Diversité des procaryotes des sources hydrothermales profondes

La dcee de ce hdhemale a linn le echeche acie la micbilgie abale. Le camagne cangahie ae e ence acelle

emeen lelain de nea ie lenemble de can, e de ende cme de la bidiei micbienne acie. Ce eninnemen i jalnnen le can n de

gin chade, aini de nmbe micganime hemhile (imm de ciance cmi ene 45C e 70C) i hehemhile (imm de ciance ie 80C)

n e il e cli en labaie (Hbe e al., 2002; Mihnichenk and Bnch-

Omlkaa, 2006; Reenbach e al., 2006; Wagne and Wiegel, 2008). La maji de

cae dce n de ache hehemhile a mablime ai

(mhangne lihhe, lfadcice, ganhe). Qele bacie n

galemen ile a niea de ce ce hdhemale (tableau 2). Aec la

emae, la ein e galemen n aame caaciie de ce chemine, n nmbe limi de i-(he)-hemhile a dce. P la maji, ce n de ache i n ile a niea de ie ; e ce ache i-(he)-hemhile aaiennen en gande aie lde de Thermococcales (aec i gene Thermococcus,

Pyrococcus, Palaeococcus) (Gdf e al., 1996; Gnle e al., 1995; Maeinn e al.,

1999a; Takai and Hikhi, 2000) (tableau 2) :

Thermoccocus barophilus e ne ache ile 3550 m de fnde la ide mdi-

Alanie. Vigg Maeinn e n ie n ile ce micganime anabie ic,

e delan ein amhie 85C. Sa cle ein hdaie e

adi a ne agmenain de la emae maimale de ciance aini e d a de ciance, n imm de ein e ie 40 MPa (Maeinn e al., 1997, 1999a). De

l de anale de mie, n emi de le l de cle ein amhie, leein dne ine de e, adian n caace ihile.

En 2002, ai dn chanilln hdhemal de la dale Pacifie Oienale 2600 m de

fnde, la bacie Marinitoga pieophila e ile (Alain e al., 2002). Cee che e

le ai n imm de ein 40 MPa al elle ien dne fnde la

ein e de 26 MPa. Cmme le ca cden la ein hdaie agmene la

iee de ciance ; e le la ein dimine la mhlgie e ale, aec la fmain de filamen bacien d fai e le cellle ne e diien l mai allngen.

Ce i aelle le beain faie Escherichia coli a Sahi Ihii e n ie, mai dan le en inee, lagmenain de ein enainai ne mdificain de la mhlgie de la bacie, i en cndiin de e delai ce lng filamen (Ihii e al., 2004).

En 2007, l dne camagne cangahie Fanc-e, le ROV victor d Pourquoi pas ? dce la dale mdi-Alanie l de 4100 m, le ie hdhemal Ahade. Jean

Li Biien e Zeng Xiang ilen ai dn fagmen de chemine Pyrococcus yayanosii,

emie ihile bligaie, celle-ci an incaable de e dele de ein infiee 20 MPa (Biien e al., 2011).

Pl cemmen de nelle ece ihile n ile ai de dimen main fnd hdhema de lOcan Pacifie : Palaeococcus pacificus (Zeng e al.,

2013) e Kosmotoga pacifica (LHaidn e al., 2014). Thermococcus pieophilus e ne ache ile a niea de la fe de Caman (glfe d Meie), le ie Beebe 4964 me de fnde. Cee che ihile, de la l lage gamme de ein de ciance. Aec de ima de emae e de ein, eeciemen de 75C e 50 MPa, elle a la caaci de e dele de la ein amhie ja min 120 MPa

(Dalma e al., 2016).

(D'ap Caio, 2013; Vannie, 2012) Tablea 2: Le piophile hemophile e hpehemophile iol Nom Nature de Lieu de Profondeur Optimum références l’échantillon prélèvement de pression Kosmotoga Sédiment Océan MPa à Thermophile L’Haridon pacifica SLHLJ1T hydrothermal Pacifique Est mètres C e al bactérie Marinitoga Cheminée Ride MPa à Thermophile Alain e pieophila hydrothermal Pacifique Est mètres C al bactérie e Piézophile Methanocaldoco Cheminée Ride MPa à Thermophile Jones e ccus jannaschii hydrothermal Pacifique Est mètres C al, ; archée e Miller e al, Methanococcus Fluide Site Kairei - MPa à Hyperthermo Takai e al kandleri fumeur noire mètres C phile archée Paleococcus Cheminée Arc MPa Thermophile Takai et al., ferrophilus, hydrothermal Ogasawara- mètres archée e Bonin Paleococcus Cheminée Océan MPa Hyperthermo Zeng e al pacificus hydrothermal Pacifique Est mètres phile DY01T, e archée Pieobacter Cheminée Site TAG MPa Thermophile Takai e al thermophilus hydrothermal MAR mètres , bactérie e Pyrococcus fluide Bassin Nord , MPa Hyperthermo Erauso e abyssi GE, Fidji mètres phile al archée Pyrococcus Cheminée Site Ashadze MPa Hyperthermo Zeng et al., yayanosii hydrothermal MAR mètres phile CH,archée e Thermococcus Cheminée Site Snakepit MPa Hyperthermo Marteinsso barophilus MP, hydrothermal MAR mètres phile n e al archée e Thioprofundum Cheminée Site TAG MPa Thermophile Takai e al lithotrophica, hydrothermal MAR mètres bactérie e Thermococcus Echantillons Fosse des MPa à Hyperthermo Dalmasso pieophilus hydrotherma Caïmans mètres C phile e al archée ux

En di de ce dcee, le ihile dci ce j, ee la maji de bacie chhile hhe. Le ihile i n accmmde e ceain faie de la ein n caace bligaie de delemen, n dnc d adae, mee en lace de mcanime de ie a hae ein, ce i n amne n inege ce aame hie de gand fnd : la ein hdaie e n imac le ganime ian. Da Yaan le bacie de fnde n aci

a de ce lif de caaciie diffene de micganime ian

ein amhie (Yaan e al., 1979).

III. La pression hydrostatique et ses effets

III.a. Les effets de la pression sur les cellules

La gamme de ein laelle n mi le ganime Tee end de 0 200 MPa.

La ein ne mdifie a le liain calene mai agi la cnfmain e le ce fme a le liain faible, ele le fncin celllaie e le mablime n dnc affec. D 1914, Pec William Bidgman, hicien amicain, dmne leffe de HPH

le ce bilgie, en dcian la caglain de lalbmen de lf a la ein

(Bidgman, 1914; Cai, 2013). Il bee ne caglain de ine d blanc df leffe de la ein dnnan celi-ci n aec df ci. Dei le g diemen e lin de la ein dan diffen dmaine n emi den aende daanage leffe de hae ein le caace cal e la dnamie de mlcle bilgie.

Le bacie nn ilane, e en en iain de e de ein imane, lin de le imm de ciance. Le effe de la ein hdaie

n lagemen di che le ece mhile mdle en micbilgie cmme la bacie Escherichia coli ence la lee Saccharomyces cerevisiae (Abe and Ka, 1999;

Bale, 2002). Smie la ein, la membane a eemle agi de fan emblable

n e a fid. Elle e igidifie, ce i imace de nmbee acin dendane de la flidi membanaie, e mdifie lhmaie de la cellle (diminin de la flidi membanaie, imemabili a in e ae mlcle, diminin de change nceaie a bn fncinnemen de la cellle) (MacDnald, 1984). La membane ne a la ele ce bilgie imace (fmain de ine nn dnae mai dlie, la fmain de mnme, de blme dan la adcin de ine, ence dan la mbili) (Oge and Jebba, 2010) (figure 6). Lenemble de mdificain engende

a la ein le cnian celllaie fai e mi de hae ein, le

ganime eden ceaine de le fncin, an mene la m de la cellle (We,

2000).

Fige 6: Le effe de la peion la cellle (Oge and Jebba, 2010)

III.a.1. Influence de la pression sur les acides nucléiques Le HPH abilien le n hdgne e figen le ineacin, en agmenan la ce dble bin i--i de la ce imle bin ne mme emae. La cnence de ce changemen, e ne abili de lADN agmene a lagmenain de ein, e la difficl de la aniin de la fme dble bin e la fme imle bin, nceaie ceaine fncin celllaie el e la licain, la anciin e la adcin

(Macgeg, 1998, 2002). La la de fncin e inhibe de hae ein hdaie, a eemle la ce de la dble hlice de lADN a ne ein inhibiice de 1000 MPa (Abe, 2007).

III.a.2. Influence de la pression sur la membrane cellulaire La membane celllaie cnie dne bicche liidie, abian ine e ce, e la ce bilgie la l enible la ein. Lhmaie de cee membane e indienable ae le fncin bichimie nmale e iale le ganime.

Dan le cndiin hilgie imale le membane n ganie e liide. Une agmenain de emae diminin de ein enaine ne agmenain de memen liidie cndian n dde membanaie. A cnaie ne diminin de la emae agmenain de la ein n ligine dne diminin de memen liidie, ce i enaine ne igidificain de la membane (aniin liide/gel) (Oge and Cai, 2013). Cee aniin ne a immdiae e il e ede dan la membane de mlange liide/gel. Le liide adaen la cmein en changean de cnfmain, lagmenain de la ein a dnc de ecin la membane, e e adi a ne ee de flidi membanaie. La membane deenan

aidemen imemable lea e a ae mlcle, le change aini e le ineacin liide/ine an nceaie a bn fncinnemen de la membane ne n l

ible (Wine and Jeek, 2009). La mbili, la diiin celllaie n inhibe de ein de 10 e 20 MPa (Abe, 2007).

Ceendan de changemen de la cmiin liidie dan le membane en ne n

e (emae, ein, H) n ible, e en le nm dadaain hmiee (Sinenk, 1974).

Che le bacie, ce hnmne a di, e a dmn ne mdificain d nmbe dinaain en ci an la chane liidie, ence ne agmenain diminin dan le in en acide ga, dan la lnge de le chane, e ne mdificain de la

in de diffene e laie. La che mdle SS9 dn lde de effe de la

ein, a emi de mee en idence ne accmlain d hhaidlchline (PC) e d

hhaidlglcl (PG) la lace de hhaidlhanlamine (PE), ce i cend

n aage de liide a ina (Yan e al., 1997). Ladaain hmiee eieai ai che le ache, e ceci a lincain dannea cclenane dan le

chaine iende a mdificain d a ene liide dihe e ahe

(figure 7) (Oge and Cai, 2013). Ce ne n diffene de celle de de ae dmaine d ian, le mdificain ineiennen incialemen la lnge e la

aain de chane liidie.

Fige 7: Adapaion de lipide achen a condiion enionnemenale che M. jannachii (Oge and Caio, 2013) A) Qand la empae e le pH agmenen e e la peion dimine, la cellle accmle de annea cclopenane dan le chaine iopenode. B) Dan le mme condiion, le appo lipide a/di he dimine.

III.a.3. Influence de la pression sur les protéines

Le ine, e l aicliemen le ine mlimie, cnien le macmlcle de la cellle le l enible la ein. De la mme manie e le liide, le ine adaen le lme ie la cmein, enainan aini de changemen de cnfmain, de blme dencmbemen e dhdaain. Le ine ne n a iablemen dnae a la ein, ceendan le mdificain n

ffiane affece la abili, laciain en mlime, e le bn fncinnemen de

ie caalie de enme. Le bn fncinnemen de ine e dnc al a la cmein (Baln e al., 2002; Nh, 2002). La la de ine die ne n

a dnae de ein hdaie ene 0 e 110 MPa, le micganime n caable de ce mai l de ein l fe de lde de 300 MPa (Pee and

Zh, 2002). Lacii de ceaine ine e mme e acie ceaine ein, ce a eemle le ca dne ae de la ihile Methanocaldococcus jannashii, i acci la iee de la acin elle caale 50 MPa e 125C (Michel and Clak, 1997).

Une eidae de Pyrococcus horikoshii ee able j 300 MPa ene 25 e 90C ; e

ne acii maimale 180 MPa ne emae de 50C (Renbam e al., 2012). O

P. horikoshii ne e dele e j 40 MPa (Zeng e al., 2009), ce i cnfime e le effe de HPH le ine e ien de ein imane e en a- del de cndiin hilgie de micganime.

III.a.4. Influence de la pression sur la traduction La adcin e le ce celllaie le l enible la ein. Nammen ie le

ibme e dicien in vitro hae ein (G e al., 1993). Le ibme aci de lARNm de lARN n able hae ein j 100 MPa, a cnaie le ibme nn chag cmmencen e dicie d 60 MPa. Laimilain de acide amin e galemen enible a hae ein. Mme i le ibme ne n a affec de faible ein, il e nceaie e laiinnemen en acide amin (aa)

i ffian, e la nhe ie ai lie. Cmme la membane lamie e lne de emie ce affece a la ein, le an de acide amin ne e fai a cecemen. Le hae ein n dnc endance limie le an e laimilain de acide amin.

III.a.5. Influence de la pression sur le pH intracellulaire Le H clamie aclaie di e gl e le acii enmaie fncinnen nmalemen. O le hae ein n endance abaie le H ; il a mn che la lee S. cerevisae, e de 40 60 MPa, le H dimine de 0,3 ni, ce i a

cnence la diminin de ceaine acii (Abe and Hikhi, 1998) (figure 8),

ce le ca de la hhfckinae, enme ineenan dan la glcle.

Fige 8: Le effe de HPH le mabolime de S. ceeiae e acidificaion de la acole (Abe and Hoikohi, 1998) Repenaion d modle popo po eplie le nemen celllaie o peion hdoaie. Lhdaaion e la diociaion d CO2 o hae peion condien laccmlaion de poon dan le coplame. Po maineni n pH coplamie, le acole de lee on ei po eeni le poon po de hae peion hdoaie.

III.b. Les adaptations aux HPH chez les piézophiles

Ceendan de micganime, le ihile dfini cdemmen, ne n a affec e a cnaie n caable de e dele ein. Le agie ade a le micganime, adae a aiain de ein ne n a ence cmlemen dfinie. Ceendan i mcanime n cncenan ladaain la ein : ajemen de gne eim cmene la ee de lacii bilgie (Camana e al., 2005), leein de gne cifie a HPH e ladaain cale de bimlcle faie face a HPH (Ka, 1999; Sme, 1992).

III.b.1. Gènes régulés par la pression Lde dn enemble de gne ihile a ende ible ie a aance dan la deciin de gnme de ihile die aie cmme Photobacterium profundum,

Pyrococcus yayanosii, ence Shewanella benthica. Bale e n ie n di le

mcanime dadaain la ein che Photobacterium profundum SS9 (Chi and Bale,

1993; Simna e al., 2006) ; bacie ihile mde digine abale (gamme de

ein ene 0,1 MPa e 90 MPa, aec n imm 28 MPa) (Bidle and Bale, 1999; Chi and Bale, 1993). De changemen de ein endan la cle enainen de changemen dan leein de gne ompH e ompL (Oe membane ein High/L

ee), i cden de ine membanaie. La ine OmH de la membane eene e l eime 28 MPa (ein imale de ciance de SS9), andi e OmL de la membane eene e feniellemen eime 0,1 MPa (Bidle and Bale, 1999;

Welch and Bale, 1998). Ce gne n gl a de ine an-membanaie

TR/TS (Welch and Bale, 1998) (figure 9). La glain a TR/TS e fai en fncin de aiain, i e manifeen dan leninnemen (emae, alini, H) che de ece d gene Photobacterium Vibrio (Mille e Mekalan, 1988). Dan le ca de P. profundum SS9, ce la ein i a ce le de dclenche eninnemenal, ie

TR e TS eaien imlie dan la ecein de la ein. En effe le niea deein de la ine TR che la bacie diminen ne ein lee e le man

TR ne di a dOmL mai mainien n niea dOmH le, ce i gge e TR e nceaie acie OmL e ime OmH.

Fige 9: Repenaion chmaie d me ToR/S che P. pofndm SS9 (Paon e Heal, 2002) A bae peion, le me ToR/S acif, acie le gne ompL e pime ompH, andi e o HPH, le complee ToR/S e o fome de monome ce i me la peion d gne ompH e nacie pl le gne ompL.

Tj che cee bacie SS9, n me flagellaie iginal a mi en idence, la mbili flagellaie e n ce celllaie enible la ein. Le gnme de la che cnien de ge de gne flagellaie : n ge de gne cdan de flagelle

laie (PF) e n ae ge de gne cdan de flagelle laa (PL). Le man de dlin le gne cdan le flagelle laie enen de blme de mbili en e cicnance, le man de dlin de gne cdan le flagelle laa

an e ne n dfecif e de cndiin de hae ein de hae ici.

Ce me flagellaie (laal) emeai dae la mbili de ein allan de

30 MPa 150 MPa (Ele e al., 2008). Ce me adaaif emble e cmmn lie gamma-bacie, e e e nammen che la che ilane Shewallena pieotolerans WP3 (Wang e al., 2008) mai le mcanime enable de cee adaain a hae ein ee ence e cnn.

Shewanella benthica DB6705 e Shewanella violacea DSS12 n de che ale a la

ein (Ka and Haahi, 1999; Tamegai e al., 1997). Ce de che cmme de nmbe micganime mdifien le me eiaie de fan nde a e eninnemena. Che le Shewanella, de me eiaie n en e fncinnen eln le hae e bae ein (Ka and Haahi, 1999). P die la

glain d me eiaie ein, le cchme de e c e ne inl

dae eminale n ifi che ne che de Shewanella benthica DB172F (Qehi e al., 1998). De cchme C n ifi (ne membanaie c-551 e ne clie c-552). Le de n mn e la inl dae e niemen indie l de ein

lee. Il a galemen be e la c-551 e eim 0,1 MPa e 60 MPa, mai la c-552 ne le 0,1 MPa. Ka a mn en 1998 (Ka e al., 1998), il eiai de e de

me eiaie, ln fncinnan 60 MPa cm de de cmlee la inl

dae e accee eminal dlecn e lae fncinnan 0,1 MPa le cchme

C dae e laccee eminal dlecn. Lhhe mie e 0,1 MPa, le me

eiaie fncinne 3 cmlee al 60 MPa la chane eiaie e l cmace, el de cman fncinnen (figure 10).

Fige 10: Foncionnemen d me epiaoie de Sheanella benhica 0,1 e 60 MPa (Michod, 2014) (Kao e al., 1998; Oge and Jebba, 2010)

Q- : inone, QH2 :inol, C-551 :cochome C-551, C-552 : cochome C-552

III.b.2 Adaptations structurales des biomolécules Le lipides membranaires n enible a effe de la ein i enden la membane min flide. Le micganime de gand fnd mainiennen la fncinnali de le membane, en mdlan la cmiin de le liide membanaie

eln le cndiin eninnemenale aelle il n cnain. Ce me e nmme ladaain hmiee (Oge and Cai, 2013; Sinenk, 1974). Un gand nmbe de

ihile ne dien a je n a le dacide ga mnina dan le liide cmme n ai le ene. Delng e Yaan n be ne clain iie ene le nmbe dacide ga mn e lina dan le membane (Allen e al., 1999).

Che la bacie P. profundum SS9, la in dacide ga mn e l ina agmene aec la ein hdaie (Allen e al., 1999; Bale, 2002). De de n

mn e la in dee hhaidlglcl (PG) agmene aec la ein hdaie ne che ile d dimen. Le PG emblen je n le dan la

cain de la membane en ne ne ciance ein (Mangeldf e al.,

2005).

La ence dan la membane de ceain acide ga lina : AG mga-3

lina (PUFA : l naaed fa acid) el e lEPA (Acide icaenane

C20 :5 -3) le DHA (Acide dcaheane C22 :6 -3) aaien n le dan le mainien de le mainien dne membane fncinnelle, nammen la flidi (DeLng and

Yaan, 1985; Ka and Haahi, 1999; Ngi e al., 2002; O. Wien e al., 1986). On emae

ne agmenain de PUFA en fncin de la fnde che le ece ihile

(DeLng and Yaan, 1985), mai le le ee ence inceain, e le ili e ence

emble aiable en fncin de che. Che Thermococcus barophilus, n nea mdle de membane a mi en idence; celi-ci eme dadae la flidi membanaie, a ne

glain d ai di/ahe, cmbine la mdlain d deg dinaain le lcne (Cai e al., 2013). Le lcne n de aene de la famille de cande. Le lcne n galemen e che ne ae Thermococcales de

ce hdhemale fnde Thermococcus hydrothermalis (Laai e al., 1998).

Ceain micganime ada de fe ene en el a hae emae, n la caaci de die de solutés compatibles (Yance, 2005). Ce mlcle de ba id mlclaie (ce, acide amin) accmlen dan le cellle maineni ne

ein mie able dan le b de maineni le lme celllaie ie a e (alin,

hemie d H)(Bn, 1976; Yance, 2005). Ceaine de ce mlcle emeaien ai de ge la cellle face a adica libe di acif de lgne (caaci adbane), ence de abilie le ce de ceaine macmlcle (le ine

a eemle). En ce i cncene le e engend a la ein, e dde e n

enche ladaain a de l cmaible. Ceendan il embleai e de

ile, dfinie cmme de mlcle ee che de ganime ian dan le

gand fnd, le emean de faie face a hae ein eien (Main e al., 2002).

Nammen ce-ci le emeaien de maineni n lme celllaie e ne ein de

gecence ffiane. Lde ean de fence e celle alie che SS9 ; i a mn

e la che accmle d glamae, de la glcine bane 0,1 MPa, e a cnaie de

ligme d hdbae 28 MPa (Main e al., 2002). Che Thermococcus barophilus, le mannlglcae eai accml hae emae e hae alini, cee agmenain e ineemen innelle lagmenain de la ein. O le mannlglcae ineiendai dan lilibe mie, le abliemen de la

gecence e cmme chaenne mlclaie aide le ine e elie (Cai,

2013). Le ile n e-e ne imance che le ece ian ein.

III.b.3. Régulation du stress pression

Le effe de la ein hdaie n lagemen di che le ece mhile cmme E. coli e S. cerevisiae, i leein de ine de e de agmenain de ein a mie en idence. Un hnmne imilaie e di che le

ihile, de gne de ne a e n eim de ein de 0,1 MPa.

Pa eemle che la che P. profundum SS9, ne ein de 0,1 MPa cnie n e, enainan la eein de 4 gne (hptG, dnaK, dnaJ et groEL), i cden de

ine chaenne de ne a e (Camana e al., 2005).

En di d fai e de micganime ihile aien dce, e dde

e n inee la iance de ce micganime a HPH. Qele de n ceendan cmmenc dnne de la an a mcanime dadaain de

ihile ; ce a eemle le ca Desulfovibrio hydrothermalis (Amani e al., 2014),

T. barophilus (Vannie e al., 2015) , Desulfovibrio hydrothermalis (Padel e al., 2013), P. yayanosii (Michd and Jebba, 2016) ence che Thermococcus pieophilus (Dalma,

2016). Le emie cnclin eaien il neie a denme de gne cifie del ie hae ein, mai celle-ci eaien l en fae dn changemen d mablime adae a aiain de ein.

Ce de n emi de mne e de aiain de ein che le ache ihile

n n imac la flidi membanaie, la cmiin/le inaain de liide de celle-ci (Cai e al., 2015; Oge and Cai, 2013). Elle, enainen de mdificain de ie mablie anabie (hdgnae/lfhdgnae), de changemen de

ane membanaie nammen a niea de acide amin, de inaciain de ceaine ie de nhe cee en negie en cndiin de e (hane) e de glain fine dan la dcin e la cnein dnegie (Maine e al., 2016), aini

e le le de l cmaible (im nhe) dan ladaain a fe ein

(Cai e al., 2015).

Che D. pieophilus C1TLV30 ile 1700 me en mdianne, le de n mn

e le an de acide amin e affec a la ein, aini e lacii lfa-

dcice i e dimine de fe ein (Padel e al., 2013). Che ne ae

lfa dcice D. hydrothermalis ile de la dale E Pacifie 2600 m de fnde,

ne anale d ancime (RNA-e) a alie (26-10-0,1 MPa). 65 gne n ne eein diffene ein, nammen ce i cden : le acide amin amaie, ce imli dan le mablime negie, ce de la adcin e le gne an fncin cnne. En ce i cncene le acide amin, ne accmlain de glamae e la binhe de ce acide amin n mie en idence ein. De

la imilaie n mn che la bacie ihile P. profundum SS9, aini e che S. violacea, le gne de la glamine nhae e iiemen gl ein.

Lde a galemen mi en idence e le gne imli dan le mablime negie

n imac a la ein ; cela a ai P. profondum e S. violacea, la cchme dae C eminal e la inl dae n ne eein diffene dendane de la ein (Ohke e al., 2013; Tamegai e al., 2012). Le niea dATP agmene aec la

ein, ce i gge e la che mdle n mablime negie en fncin de la

ein.

Che SS9 le de ancimie n mn e le aage de 28 MPa 0,1 MPa enaine la eein de nmbe gne, cdan la la de ane

enme d mablime (Camana e al., 2005).

Che Pyrococcus yayanosii, de de cmaaie n alie ene P. yayanosii aec

ne ienible P. furiosus. Cee che a chiie ca elle e hilgiemen che de P. yayanosii (emae imale, H, alini) mai le ima de ein n diffen. Cee de aai b de e de eniel mae de la ihilie.

Le la enden ae lhhe e P. yayanosii a femen ada n gnme a cndiin de ein aelle elle e mie ; nammen a niea de la binhe de acide amin, d mablime negie (hdgnae/fmae). Ti

inciale fncin n cncene: la mbili a linemdiaie de lachellm, la

adcin a niea de la ni 50S de ibme e de ane, e a niea de la cneain de lnegie.

P. yayanosii de de hdgnae : Mbh (Membane bnd hdgenae) (PYCH-

11230-360), Mb (Membane bnd dedcae) (PYCH-11410-530), SHI

(Slfhdgenae I) (PYCH-03370-4F00), SHII (Slfhdgenae II) (PYCH-0010-40), demin a hmlgie de ence aec celle de P. furiosus.

Mbh e -eime a la ein (80 MPa), Mb e an elle -eime a la

ein aini e N (NAD(P)H linked lf edcae) e d (ein dilfide

dedcae). SHI e SHII n -eime hae e faible ein (20 e 80 MPa).

Che lache T. barophilus, ne ine de e (P60) e indie a le bae ein

(Maeinn e al., 1999b, 1999a). De l de de n mene mne leffe de hae ein la abili d me de T. barophilus. Il a aini dmn e T. barophilus een le bae ein cmme n e. Elle accmle de mlcle de

e en cndiin de faible ein hdaie; ce i migne dne adaain d

me a HPH (Cai, 2013).

Ladaain de T. barophilus a HPH a galemen die a cmaain de

ancime aec le micganime ienible le l che ai T. kodakarensis.

La glain de gne a cmae ein amhie, cnide cmme ne bae ein; 40 MPa, i la ein imale de ciance de T. barophilus e hae

ein, 70 MPa. Le ein de 40 e 70 MPa emeen ddie la ne de gne face ne cndiin de e, la ein amhie an elle eme de i le gne

gl a ne agmenain de ein.

Lde a l la mdificain glbale de leein de 378 gne l de la aiain de la

ein alie. Pami ce 378 gne, 178 bien ne glain iie. Ce-ci n imli dan la dcin e la cnein dnegie, dan le an, e le mablime din inganie e glcide. 156 gne n gl de fan ngaie. Ce-l cden de

ine ineenan dan le an/le mablime de acide amin e de nclide.

De gne n aci im, le niea deein agmene dimine en fncin de lagmenain de la ein.

Le effe n incialemen be a niea de la binhe e d an de acide amin i n inhib HPH, de nmbe ane e ine membanaie

n an e -eim, de gne imli dan la mbili celllaie emblen e

eim che T. barophilus ein imale la che e de de miccie n mn n nmbe de flagelle l iman 40 MPa 0,1MPa e

70 MPa. La mbili de T. barophilus emble e fncin de la ein imale de la che

i 40 MPa. De l, 33 ine hhie, cifie de T. barophilus n gle

a le aiain de ein e dnc eniellemen imlie dan ladaain a HPH.

En ce i cncene n ceain nmbe dhdgnae e de inne, ce i n inee dan la ie de lde, elle n eime en cndiin de e ein (Vannie, 2012).

Le la che e clie en de a-de de la ein imale, il n a a de

glain de gne cdan de ine de e mai n changemen glbal d mablime, affecan la dcin dnegie e le mablime. Cncemen, face de hae ein, la cellle a bein de l dnegie. Elle di la dene dnegie en glan ngaiemen

de gne cdan de ie de binhe cee en negie, a eemle en faian le

ecclage de lhiidine en ilian la ie d GTP a lie de lhiidine la nhe de

e nclide. En aallle elle gle iiemen de gne cdan a eemle de hydrogénases e de sulfhydrogénases.

Le gne cdan le hdgnae membanaie Mbh, Mbh-Cdh n ne fe eein 0,1 MPa e 70 MPa, il en e de mme le hdgnae clie SHI

(TERMP_00067) e SHII (TERMP_00070), i n -eime a le e indi 0 ,1

MPa e 70 MPa.

Ce emie cnaain che T. barophilus n amne n inege le hdgnae e le le elle n dan n adaain la ein. Aini dan la chaine

aie n en, ce e ne hdgnae, el e le le e cmmen fncinne ce mablime de lhdgne che le Thermococcales.

IV. Métabolisme de l’hydrogène

IV.a. Les hydrogénases

Le hdgnae n de mallenme, i caalen la dcin e la cnmmain

+ - de la mlcle dhdgne eln la acin eible iane: 2H + 2e ↔ H2 (Adam, 1990;

Vignai and Clbea, 2004). D 1900 de ganime caable dde lhdgne n dce; cmme Bacillus pantotrophus il a Kaee en 1906. En 1930, lacii de hdgnae a dcee a Sehenen e Sickland (Sehenn and Sickland, 1931;

Thae e al., 2010; W and Mandand, 1993). Lenemble de ce enme n caable de caale la acin dan le de en in vitro, mai in vivo elle iilgien le l en

i la dcin, i ldain, de lhdgne ian le bein de lganime. Le

emie hdgnae n die che le cae abie e anabie, bacie e ache (Bien and Schlegel, 1981). Pa la ie de hdgnae de e (Fe-Fe) ecliemen n mie en idence che de ecae ; cnne le nm dhdgnme che le aie e de chllae che le alge ee (Gaffn and

Rbin, 1942).

Le hdgnae n n le cenal dan le mablime negie de la la de micganime dian de lhdgne. Le bacie ilien le hdgnae caale la dcin dhdgne la dcin de n a c dn ce femenaif cl ldain de ba cabn (Adam, 1990; Vignai and Billd,

2007; Vignai and Clbea, 2004).

La claificain de hdgnae a dabd cni idenifie le dnne e accee dlecn : NAD (hdgnae de la clae EC1.12.1.12), cchme (clae 1.12.2.1), cenme F420 (clae 1.12.99.1) feedine (clae 1.18.99.1). Pi Vd, en 1992, cmae le lmen de ence cne de gin de fiain d nickel de 16 hdgnae e cen aini de -ge. W e Mandand en 1993, fn ne claificain l fine i ee la ence en acide amin de 30 hdgnae bacienne (W and Mandand, 1993). Une cenaine dhdgnae n dmai caacie gniemen e/ bichimiemen. Une claificain en cmaan la nae de le ie caalie a emi de diffencie i clae hlgniemen diince. En effe le hdgnae een e aie en i clae (Vignai and

Clbea, 2004; Vignai e al., 2001), en e baan la nae mallie de le ie acif : le

(Ni-Fe)-hdgnae, (Fe-Fe)-hdgnae ence le hdgnae an ma

(figure 11).

IV.a.1. (Ni-Fe)-hydrogénases

Le (Ni-Fe)-hdgnae e (NiFeSe)-hdgnae n le l cnne e le majiaie,

ene che le ache e bacie. Elle den n ame de nickel e d fe dan le

ie acif. Ceaine dene elle, cniennen n ame de nickel chla a n ame de

lnim la fme de lncine (He e al., 1989). In vivo, elle fncinnen

incialemen dan le en de la cnmmain dhdgne. Elle n la la mlimie hdimie. Elle n cnie dne gande -ni alha e

ne eie -ni ba, diffene le lan immnlgie (Kac e al., 1989). Ce hdgnae n ee che le bacie, canbacie ache

mhangne e Thermococcales.

Elle n ee fme clamie, ilamie e/ membanaie. Il eie

ae ge : les hydrogénases (Ni-Fe) consommatrices d’hydrogène, ce enme

alien ldain de lhdgne, le lecn de lhdgne n anf a cchme li n cmlee membanaie de la chane eiaie effecan la

anlcain anmembanaie de n. Elle n ee che le bacie

dcice d fmaae ddan inganie, dan le bacie fiaice dae, che le micganime anabie lf-dce. Ce hdgnae nickel-fe

n galemen e che de ache mhangne fme membanaie (Vignai and Clbea, 2004; W and Mandand, 1993). Les hydrogénases (Ni-Fe)-senseurs d’hydrogène et utilisant l’hydrogène comme substrat, le hdgnae cnmmaice dhdgne n ee che ceaine bacie fiaice dae e che ceaine canbacie (Oelfel e al., 1998; Vignai e al., 2000). Les hydrogénases (Ni-Fe)-cytoplasmiques hétéromultimériques réversibles n de

+ + enme caable de lie de cface lble cmme le F420, NAD , NADP e fncinnen de fan eible (Vignai and Clbea, 2004). Elle n ee che le bacie hehemhile, che le ache anabie mhangne elle e Methanosarcina maei (Bame e al., 2000), Methanococcus voltae, Methanocaldococcus jannaschii e,

Thermococcales cmme Pyrococcus furiosus, Thermococcus litoralis e che ceaine canbacie (Schmi e al., 1995; Schneide and Schlegel, 1976). Enfin les hydrogénases

(Ni-Fe)-membranaires productrices d’hydrogène, elle acien ldain dn ge cabnle de cm ganie n cabne (CO, fmiae, acae) la dcin de n de lea, die de lhdgne. Ce enme n ee che ceaine ache cmme Methanosarcina barkeri (Mee e al., 1999, 2002), Methanobaxterium thermoautotrophicum (Teeegen and Heddeich, 1999) ence Pyrococcus furiosus

(Saa e al., 2000; Sila e al., 2000).

IV.a.2. (Fe-Fe)-hydrogénases

Le (Fe-Fe)-hdgnae, nn a de nickel dan le ie acif mai niemen n ame de fe. Elle n ee che le micganime femenaif anabie ic

dian de lhdgne. Cnaiemen a cdene in vivo, elle fncinnen

feniellemen dan le en de la dcin dhdgne. La feedine, fladine, cchme di n de dnne dlecn hilgie. Elle n mnmie, e fn 60 kDa, e enible lgne. Ce hdgnae n dcee che de bacie anabie e ecae mai acne che le ache. Elle n ifie che de bacie (Adam, 1990) e de ecae (Akhmana e al., 1998; Hne e al., 2000) : de bacie femenaie anabie ice (Clostridia, Megasphaera elsdenii) (Pee e al., 1998), che ceaine bacie hehemhile Thermotoga maritima, che de bacie dcice de lfae Desulfovibrio, che de ecae cmme de alge ee

(C. reinhardtii) e de aie (Trichomonas vaginalis) (Adam, 1990). Le hdgnae de bacie anabie e de alge ee (Hae and Nabe, 1993) n mnmie e

ie dan le clame, celle de bacie dcice d lfae n dimie e

ilamie.

IV.a.3. Hydrogénases sans métaux

Enfin le hdgnae an ma n dcee la emie fi a Thae e

n ie en 1990, che Methanothermobacter thermoautotrophium (Shima and Thae,

2007). Iniialemen aele hdgnae an ma, elle n deene le hdgnae

an cene fe-fe en 2004 ie la dcee de la ence dn ame de fe dan lenme (Zingibl e al., 1992) ; elle den n cface ganie cnenan n ame de fe ie caalie (Ln e al., 2004). Elle n hmdimie, de 38 kDa e miniaie.

Fige 11: Sce de ie caalie de hdognae (Shima and Thae, 2007)

Le bacie den majiaiemen le de emie clae dhdgnae, andi

e le (Ni-Fe) e le (Fe)-hdgnae e een daanage che le ache, acne hdgnae de e (Fe-Fe) na mie en idence che le ache (Thae e al., 2010).

Le ache anabie i ien dan le eninnemen eme den en

lie (Ni-Fe)-hdgnae. Dan ce eninnemen le mablime de lhdgne a n

le eeniel.

IV.b. Le métabolisme de l’hydrogène chez les Themcccale

IV.b.1. Les hydrogénases des Themcccale

Le Thermococcales n de Eache, egan le Thermococcus, Pyrococcus e

Palaeococcus. Ce n de hehemhile, aec ne ciance an e alie de

emae de 100C, hhe e anabie. Elle ilien de ba inie aec la dcin d fe lmenaie fman d lfe dhdgne (H2S). En abence de

fe ce ganime een ce en ence de ae e cabhdae. Dan le

mablime, lhdgne di, e le la diliain de n cmme accee dlecn e gge la ence dhdgnae dan ce ganime (Kanai e al., 2011).

Che le Thermococcales, la glcle e dle eln ne ein mdifie de la ie dEmbden-Meehf dan laelle le enme glclie claie n emlace a

ne enme lie la feedine. La feedine e laccee dlecn e le

ae daie de la ie glclie che ce micganime e le dnne dlecn

la dcin de l H2 (an de O e al., 1998).

La emie hdgnae dcee che le Thermococcales e ne (Ni-Fe)-hdgnae clie de Pyrococcus furiosus (Hyh-I; SHI) (Ban and Adam, 1989); ce ne enme

NADPH-dendane cme de ae ni (hame cd a 4 gne

(PF0891-PF0894)(Ma and Adam, 2001). Elle ineien dan la dcin d fe, d laellain lfhdgnae (Ma e al., 1993). SHI de lhdgne e di le NADP+

(gne le NADPH la dcin dH2 a Mbh), elle e ai die de n

fme de lhdgne en ilian NADPH cmme dnne dlecn (an Haae e al.,

2005; Ma e al., 1994).

Pl ad ne deime hdgnae a e dan le clame de Pyrococcus furiosus

(Ma e al., 2000). Hyh-II (SHII) (PF1329-PF1332) e ne enme hmlge de Hh-I

(Kanai e al., 2011; Ma and Adam, 2001; Ma e al., 2000). Le de Hh n imilaie, en ce i cncene le aec mlclaie e le acii enmaie, lecein e

Hh-II emble min acie e Hh-I. Pyrococcus furiosus ilie lhdgne cmme n mablie, ce de enme Hh- aaien le dlimine le ecden dce

fme dhdgne.

Dan le anne 2000, ne ae (Ni-Fe)-hdgnae a dcee, cee fi ci dan la membane lamie de Pyrococcus furiosus, e aele Mbh (McTenan e al., 2014; Sch e al., 2013a). De ine MbhL e Mbhk n idenifie, le gne cdan ce de

leide fmen n el n (ln mbh : mbhABCDEFGHIJKLMN). Le di de hi emie gne (mbhABCDEFGH) a ne fe imilai de ce aec le

ni mlimie de ane Na+/H+, e n emen n le dan le aage de in H+ e Na+ ae la membane. Le gne (mbhIJKLMN) cden an e de

ine i n ne fe imilai de ence aec de -ni de la membane de

Ech hdgnae de la che Methanosarcina barkeri (Knkel e al., 1998; Mee e al.,

1999) e lhdgnae CO-indie (C) de la che Rhodospirillum rubum (F e al., 1996).

Pa la ie de de la membane de P. furiosus n emi de mne de fncin de

Mbh; la enan cmme ne me in, gnan ne fce n-mice, dian le n e gnan aini de lhdgne, en ilian ne feedine de faible eniel. La fce n-mice gne e ilie la nhe dATP cndie a le cmlee ATP

nhae li la membane (Saa e al., 2003). Ce i eme de cncle le le de cneain dnegie de lhdgnae Mbh.

En l de ce i hdgnae, le gnme de Pyrococcus furiosus cnien n iime

e de (Ni-Fe)-hdgenae (Sila e al., 2000). Ln mbx (mbxABCDFGHHMJKLN) a

ne ce imilaie celi de ln mbh. Ceendan le fai e Mbx ai ne acii hdgnae e inceain. Sa fncin e analge celle de Mbh, en ilian la feedine cmme accee dlecn e cnee lnegie en fman n gadien din (Bidge e al., 2011; Sch e al., 2007; Sila e al., 2000).

Le i e dhdgnae (Ni-Fe) de P. furiosus (Hh, Mbh e Mb) e n mie en

idence dan dae gnme de Thermococcales, cmme che P. horikoshii (Kaaabaai e al., 1998), P. abyssi (Chen e al., 2003), Thermococcus kodakarensis (Fki e al., 2005),

Thermococcus onnurineus (Lee e al., 2008), Thermococcus sibiricus (Madan e al., 2009),

Thermococcus gammatolerans (Zianic e al., 2009). Mbh e Mb n ene che

e le ece de Thermococcales, le hdgnae Hh galemen af che T. gammatolerans (tableau 3). La ence de ce hdgnae ggen d caace fndamenal de le le dan le mablime de Thermococcales.

Dae e dhdgnae (Ni-Fe) aaenan a hdgnae-4 de E. coli n

e che P. abyssi, T. onnurineus e T. gammatolerans.

Tablea 3: Le hdognae che le Themococcale

IV.b.2. Rôle des différentes hydrogénases

De de n alie le hdgnae de Thermococcales ; dan le b de mie cmende le le de chae hdgnae ; de manilain gnie, aec la cain de man de dlin n nammen eneie.

Che T. , le i hdgnae n ee : (Hh) (TK2072 TK2069)

i cend a Hh-I de P. furiosus ; Mbh (TK2080 TK2093) e Mb (TK1226 TK1214).

Le emie e dan de milie de cle (MA-YT cmlmen aec d ae, maldeine fe) faian la dcin de H2 celle de H2S n emi de mne

a Ween Bl, e MbhL e HhL n l eime dan le cndiin la dcin d H2 e faie e linee MbL e eime and la dcin dH2S i e faie (Kanai e al., 2011).

De man de dlin n cni, dabd le man PHY1, man Hh. Le caaciain hilgie de ce man n emi de mne e le gne ne a eeniel la ciance, ne a enable de la dcin dhdgne cmme cela aai

aanc (Ma e al., 1993, 1994), e jeai n le dan la dcin dalanine, en l d

ecclage de lH2 la nhe de NADPH.

De ae man MHD1 (mbhJKL) e MXD1 (mbxJKL) n cni, afin de

cmende le le de ce de ae hdgnae. Lde hilgie d man MHD1 a mn ne diminin de ciance dan de cndiin de cle aec ae e aec maldeine, ce de ba faien la dcin dH2, e eme de cncle d le de cee hdgnae dan la dcin dhdgne. P le man MXD1, le de

hilgie emeen de cncle n fncinnemen en ence de fe e dan

n imlicain dan la gnain dH2S. Lde a emi de diinge le le de ce i

(NI-Fe)-hdgnae che T. kodakarensis (Kanai e al., 2011).

Ce anale gnie cben aec le de alie che P. furiosus (Licmb e al.,

2011) .

De man de dlin n galemen cni che P . T dabd de dlin de SHI e de SHII (man SHI e man SHII), cmme che T. kodakarensis, ce de hdgnae clamie ne n a indienable la ciance de cellle (Licmb e al., 2011).

Pa la ie de anale de ciance e bichimie n alie le man SHI,

SHII e le dble man SHI /SHII (Sch e al., 2012).

Lacii de hdgnae e iie a la dcin d mhlilgne, i en ence dH2 eme de ie a clain la cnmmain de lH2. Il n a a de diffence dacii che le man SHII, lacii e l faible le man SHI e a de decin

le dble man SHI/SHII. SHI e dnc enable de la maji de lacii dane de ce hdgnae clie e cnfime e la dcin dhdgne e acie a membane (Mbh) (Sch e al., 2012).

La dlin de lni mbhL de Mbh, el en cmbinan aec de dlin de SHI e /

SHII a mn, il n a a de ciance en abence de fe. Mai and la ence de

fe e ffiane, acn dfa de ciance ne be. Il n a a de dcin dH2 decable and mbhL e dle. Ce la cnfimen e Mbh e la ele enme

die de lhdgne e il neie a dalenaie en abence de fe. Un ba niea de SHI ne e a cmene labence de Mbh emee la ciance d man mbhL en abence de fe (Sch e al., 2012). shI e e dle che Pyrococcus furiosus; an

blme de ciance la che. SHI ne dnc a ne enme eenielle.

Si ln me le diffene infmain : Lenme enable de la dcin de lH2 e

n cmlee hdgnae li la membane, ael Mbh (McTenan e al., 2014). Mbh gne de lhdgne mlclaie e ilie lnegie de cee acin eegnie ce n gadien de n de a e dae de la membane. Enie le mage de in H+ e fai

e linie de la cellle a lATP nhae (Saa e al., 2003), emean aini la nhe dATP e dnc la dcin dnegie. Cee enme fncinne en abence de fe. Il ne

emble a eie dae ie mablie ie le man de dlin de Mbh enainen la m celllaie (Ch e al., 2007; Sakaba e al., 2004).

La feedine e le el accee dlecn ldain de glcide. Pa cnen,

n mcanime de dcin de NADPH e galemen nceaie die de

ialen dce la binhe. Aini, de lfhdgnae clie aele SHI e SHII n ee che le Thermococcales (Ban and Adam, 1989; Ma e al., 2000). Celle-ci emeen de fni d NADPH en ilian lhdgne cmme dnne dlecn.

Le gnme de Thermococcales cnien galemen n cmlee dddcae li la membane nmm Mb, i ene ne imilai de ence lee aec Mbh (hmlge de Mbh) (Sila e al., 2000). Mb di NADP aec la feedine cmme dnne dlecn e eme la cneain dnegie en man de in H+ Na+. Cee enme fncinne en ence de fe (Sch e al., 2007)(figure 12).

Fige 12: Mabolime de hdognae (Sanangelo e al., 2008)

Le anfe dlecon de lhdognae Mbh (en jane), gne de lH2. Lacii de Mbh podi ai n gadien de poon ili po la podcion dATP. Le hdognae coplamie (en ble clai) conmen lH2 e gnen d NADPH. Mb (en e) pend le elai de Mbh, and d ofe e pen. Le glae ancipionnel edo SR (en oge), o a fome die acie lopon Mbh.

IV.b.3. Influence du soufre dans le métabolisme

Le fe e n face iman dan la cmhenin d mablime de hdgnae (Schich e al., 1993); en effe che lie Thermococcales, le enme

n gle en fncin de la ence de labence de fe dan le milie de cle

(Adam e al., 2001). Aini de de gnie e hilgie che T. kodakarensis n mn e Mbh e eenielle la ciance en abence de fe, aini e che P. furiosus.

Le lfhdgnae SHI e SHII n galemen dmne cmme -eime en

ence de fe, mai eime lil n a a de fe dan le milie (Adam e al., 2001; Sch e al., 2007). A l, le cmlee Mb e imli dan la dcin d

fe, ie la dlin d cmlee imace ngaiemen la ciance de P. furiosus en

ence de fe (Bigde e al., 2011). Le mme beain n faie che T. onnurineus e cee ece de ai ne hdgnae Mbh-Cdh emean ldain d mnde de cabne (CO) la dcin dH2 (Lee e al., 2008). Il emble dnc e

die en ence de fe n hnmne de -glain de hdgnae (SHI,

SHII, Mbh) e a cnaie ne glain iie de gne imli dan la dcin d

fe. Le la illen e Mbh e Mb, n de cmlee analge dn la fncin e de de la feedine die di d mablime negie

eeciemen en abence e ence de fe. En ence de fe, n hif mablie

e di, il a iliain de fe lmenaie cmme accee dlecn, mai and le

fe ne l dinible, il a ne diminin de leein de 3 n de hdgnae Mbh, SHI, SHII, e ne agmenain de Mb e N (NADPH lf edcae).

IV.b.4. Le régulateur transcriptionnel SurR

Un glae anciinnel ed a caaci la emie fi che P. furiosus

(Licmb e al., 2009; Sch e al., 2012, 2013a). Ce glae e le nm de SurR (Slf

ene egla) (Licmb e al., 2017; Yang e al., 2010), ce ne ine cme de

232 acide amin (lc PF0095) ; ce n hmdime, chae mnme an cm de 3 dmaine diinc. SR e ne ine hlice//hlice, aec n mif CC, ce n cmmae ed cnlan n deg daffini lADN. Aini and SR e fme

die, il e caable de e lie lADN, a cnaie fme de ( a fme dilfide, ce--die la fmain d n dilfe ene 2 cine d mif CC), SR ne e

aache lADN (figure 13).

SR ineiendai dan la glain de hdgnae, che Pyrococcus furiosus, il aaai cmme cne che le Thermococcales, e il ne emble a eie de che hmlge che dae ece (Sch e al., 2013a).

Dan n a di, SR acie la anciin de gne i cden le hdgnae

lble Hh I e II, e Mbh, aini e de nmbe ae gne imli dan le mablime de lhdgne (Sch e al., 2007). A mme mmen SR ime leein

de gne imli dan la dcin d fe : N (NADPH lf edcae), Mb, d

(ein dilfide dedcae) (Bidge e al., 2011).

Ce changemen da d glae e la dendance d fe, en effe in vitro le fe inacieai SR ia ldain d mif CC. Cela eai iblemen d a fai e SR e i de n ca le fe e di e emche indiecemen SR de e die.

Ldain de id cine enaine n changemen de cnfmain dan le dmaine daachemen lADN (Yang e al., 2010).

A niea de gin mice; ceci enaine ne mdificain de la glain (aciain

eein) de gne cible d glae SR (Licmb e al., 2017).

Qand d fe e aj a milie de cle P. furiosus, n changemen aide e

di, e ne diminin de la dcin dH2 e bee, e a cnaie dan le mme

em, de lH2S e di. Ce changemen e bef, iil a lie en ne diaine de mine.

A niea anciinnel, la ne a fe, enaine ne diminin damaie de leein de i hdgnae (Sch e al., 2007). Tandi e lddcae Mb,

end la lace de Mbh, e e ligine de la dcin dH2S, iblemen en lien aec n ae cmlee N (Bidge e al., 2011).

Ce hnmne de ne a fe, ne a n ca nie de P. furiosus ; ie le mme

hnmne e be che T. kodakarensis, n milie ae e a aj de fe

(Jge e al., 2014).

Fige 13: Le glae ancipionnel SR (Lipcomb e al., 2009; Yang e al., 2010)

En abence de ofe, SR e dan n a di (SRed), il e lie alo lADN e dclenche la ancipion : aciaion de hdognae podcice dH2 pobablemen en ecan lappaeil de ancipion baal d pomoe, e pime le gne de la pone a ofe. Mai and d ofe e diponible, le cellle paen de la podcion dH2 lH2S, en aion de la daciaion de SR (SRo) d fai dne odaion d glae pa le ofe o de pollfe de la cellle.

De man de dlin n enei che T. kodakarensis (TKR, TK1086), la dlin de ce gne SR a enain ne diminin de la ciance de T. kodakarensis en abence de

fe al e la ciance en ence de fe, ee inchange (Sanangel e al., 2011).

Aec le delemen de la gnie che P. furiosus (Licmb e al., 2011), de man de surR n cni afin de cmende la glain de leein de gne n cnle.

La main de surR a n effe la dcin dhdgne. San fe n bee e le

che dle enen ne ciance mde e ne diminin de la dcin dH2,

emen de ne ee daciain de Mbh a SR.

IV.c. Les hydrogénases chez Themccc bahil

T. barophilus de de hlge de hdgnae e de ddcae membanaie, eeciemen ael Mbh (Membane-bnd hdgenae) e Mb

(Membane-bnd dedcae) (Vannie e al., 2011). Elle de 7 cmlee hdgnae diffen : Mb, Mbh, Hg 4-1, Hg 4-II, Hg 4-III, SlFI e SlFII.

Cmme T. onnurineus e T. gammatolerans ; T. barophilus de la ie de la cabdhie.

Le gne cdan e ni Mb n ene le gnme de la che MP dn ceaine n cde a lie gne (Vannie e al., 2011). Le gne cdan 9 ni mbh n ene le gnme de T. barophilus (Vannie e al., 2011).

Dae hdgnae n ee : ne ni H de lhdgnae IV (HDH) cde

a TERMP_01147, ne Ni-Fe hdgnae de e III (Hh 3) cde a la TERMP_01148 e

ne ni B de lhdgnae IV (HhDB). Ce Ni-Fe eiaien a ecclage de lhdgne e diai le NADPH (Ma and Adam, 2001; Sila e al., 2000).

De gne cdan de hmlge a ine de bacie n ee : HypA,

HypC, HypD, HypE et HypF, elle n imlie dan linein dn cene Ni-Fe hdgnae.

Le de ancimie che T. barophilus, n mn e ceain gne en a aec la dcin e la cnein dnegie n eim ie de aiain de

ein, cmme la che e ihile cela e elie a le fai de la ncei dn a acc dnegie e dele ein. P de ein i cnien

n e la che, i 0,1 MPa e 70 MPa, le gne de hdgnae e de inne

n eim. Le gne cdan le hdgnae membanaie Mbh e Mbh-Cdh

n eim, aini e ce cdan le hdgnae clie SHI e SHII cmme n n le i dan le ablea (da le la ben a Paline Vannie)

(tableau 4). Le gne cdan le glae SR an li, a ne eein inchange en fncin de la ein (tableau 4).

Tablea 4:Epeion de gne codan po le hdognae de T. baophil, en foncion de aiaion de peion

Nom du gène Fonction Moyene d’expression ,MPa MPa MPa sulfhydrogenase II subunit TERMP b sulfhydrogenase II subunit TERMP g sulfhydrogenase II subunit TERMP d sulfhydrogenase II subunit SHI TERMP a sulfhydrogenase II subunit TERMP a sulfhydrogenase II subunit TERMP d sulfhydrogenase II subunit TERMP g sulfhydrogenase II subunit SHII TERMP b NADH-ubiquinone oxidore- TERMP ductase subunit B hydrogenase- component TERMP H Mbh-Codh Ni-Fe-hydrogenase III large TERMP subunit TERMP hypothetical protein hydrogenase- component TERMP B NADH-quinone oxidore- TERMP ductase subunit I TERMP hypothetical protein NADH-ubiquinone oxidore- TERMP ductase subunit membrane bound hydrogenase beta NADH dehy- TERMP drogenase NADH-ubiquinone oxidore- TERMP ductase subunit B TERMP hypothetical protein Na H antiporter subu- TERMP nit D TERMP hypothetical protein Mbh Na/H antiporter MnhB TERMP subunit-like protein membrane bound hydro- TERMP genase MbhE-like subunit TERMP hypothetical protein membrane bound hydro- TERMP genase MbhC-like subunit multiple resistance and pH TERMP regulation protein membrane bound hydro- TERMP genase MbhA-like subunit Fe-hydrogenase subunit TERMP beta membrane bound hydro- TERMP genase MbhM-like subunit

membrane bound hydrogenase NiFe-hydrogenase TERMP large subunit energy-conserving NiFe-hydrogenase ferredoxin TERMP subunit beta membrane bound hydrogenase NiFe-hydrogenase TERMP small subunit membrane bound hydro- TERMP genase MbhI-like subunit membrane bound hydro- TERMP genase MbhH-like subunit membrane bound hydro- TERMP genase MbhG-like subunit membrane bound hydro- TERMP genase MbhF-like subunit membrane bound hydro- TERMP genase MbhE-like subunit TERMP hypothetical protein membrane bound hydro- TERMP genase MbhC-like subunit membrane bound hydro- TERMP genase MbhB-like subunit membrane bound hydro- TERMP genase MbhA-like subunit SurR TERMP heat shock regulator NADH-ubiquinone oxidore- TERMP ductase subunit I NADH-ubiquinone oxidore- TERMP ductase subunit D NADH-ubiquinone oxidore- TERMP ductase subunit C NADH-ubiquinone oxidore- TERMP ductase subunit B NADH-ubiquinone oxidore- TERMP ductase subunit H NADH-ubiquinone oxidore- TERMP ductase subunit M Mbx PH adaptation potassium TERMP efflux system protein TERMP hypothetical protein Na H antiporter subu- TERMP nit B TERMP hypothetical protein Na H antiporter subu- TERMP nit G Na H antiporter subu- TERMP nit F Na H antiporter subu- TERMP nit E

Afin de mie cmende ce mablime de lhdgne che T. barophilus, le le de ce hdgnae e le imlicain dan ladaain la ein, il a nceaie lina de aa ali che T. kodakarensis (Sanangel e al., 2011) ence che P. furiosus

(Bidge e al., 2011; Licmb e al., 2017) de eci la gnie. Un il de gnie inee (Thiel e al., 2014) e n daillen a la ie a emi lbenin de man de dlin de gne cdan ce hdgnae e la cmhenin de ce mablime che cee che ihile. Dan la chaine aie n abden le delemen e lin de la gnie de ache, e n eminen a ne enain de lil gnie ili a labaie.

V. Etudes physiologiques par des approches de génétiques

La bilgie mlclaie ege n enemble de echnie, ilie le anale bilgie de ganime ian e la cmhenin de mcanime de la cellle lchelle de mlcle ; idenifie la fncin e/ le le caace eeniel dn gne.

Le ache den de i nie, lie le caaci e dele dan de eninnemen eme (H, alini, emae, ein hdaie)(Jaell e al.,

2011). Ce i n bilgiemen e bichimiemen ineane, e fn de ache ne de l imane ece de alicain biechnlgie e indielle. Mai ce ece een ence difficile alie, e ce malg le de la gnmie, de la gnie e de la bilgie nhie. La blicain d gnme de

Methanocaldococcus jannaschii en 1996 (Bl e al., 1996), a ma le db de la gnmie de ache e a nammen emi deniage de nmbee eecie. Le gnme de ache n ann la maji a le cnnaiance de ce che le ecae e bacie (iin, anfe, analgie), ce i enaine n f a de gne i le fncin bichimie ne n a aigne (fncin nn cnne) ; le a de gne de fncin cnne necde a 60% che ceaine famille cmme le Thermococcales.

Lelain de la hilgie de ache ee limie a le fai d mane de cnnaiance

ce iime dmaine d ian. En aiclie che le ece die emhile dn le cndiin eme de ciance, emchen enden l difficile la mie en lace ence liliain dil gnie, ili de manie l inie che de ece mhile ; e end le mae de lecin cammen ili dan dae ca,

inefficace ici (Alle and Meaech, 2005). Si ln inee l cimen a cae

ihile hehemhile nammen de e ache, la cmhenin de mcanime imli dan ladaain, e acellemen limie a le mane dil gnie dinible.

Afin de mie cmende la gnie che le ache e lin de dele de il gnie che ce micganime, n edfinin l lin ce e ne ache, le in de mie le cnnae e le il gnie i n meg.

V.a. La découverte du troisième domaine du vivant

La bidiei eee a fai lbje dne ln cnane de claificain ; aidemen le beain maccie diingen le ece animale de ga. Le delemen de la miccie a 17me icle a enie emi de dfini le ganime ni e licelllaie, i de diinge le cellle enan n na (ecae) de celle i nen n a (cae). Mai en 1970 ne dcee a bleee le ide ee, en

enan le iime dmaine d ian : le ache.

Ce en cmaan le ence de lARN, mlcle eenielle la lece d cde gnie, e Cal Wee, a e cee hhe. Il bae e anale hlgnie

n caace nieel facilemen idenifiable : le acide nclie de la eie ni de ibme (Wee and F, 1977), en alian n dcage enmaie ci de ce ARN. Il dmne e de ece ecae enen de mif imilaie e

n dnc che hlgniemen, de mme de bacie cmae enemble.

La hie de la diincin ene cae e ecae a dan n emie em e

enfce en alian e le mif de bacie e ecae n diffen. Mai lde dne bacie cnne n mablime iginal : anabie ice, dcice de mhane ; a linne cee claificain. Il alie n de cee mhangne, e cmme de diffence n nable aec le ecae, mai cne e aene, de diffence n galemen bee aec le ae bacie. Cee che cnieai dnc

n ge a, il aellea dan n emie em : le achbacie (Wee e al.,

1978). Ce eme fai fence a caace a priori ancien de mhangne, d fai e le cndiin de ie, emblen che de celle i gnaien la Tee imiie. Pa la ie de nmbee che i emblaien e de bacie e n le e de achbaceia : halhile (Magm e al., 1978), hemhile (Wee e al., 1990) La nmenclae a l ie le eme baceia ai cnfin, le achbaceia n aini deene le achaea. En 1980 la cmmna cienifie a admi leience de ce

iime ge d ian (figure 14).

Le ache eemblen mhlgiemen a bacie, a le aille, le fme, le mde de diiin, la fmain de bifilm ; mai n l che a niea mlclaie e bichimie de ecae nammen a niea de mcanime infmainnel

(licain de lADN a eemle) ; ceendan de caace nie nn e a ein de de ae ge en fn n ge diinc (la ence dhe dacide ga e nn dee, liide de e i fmen ne mncche liidie) (Faka e al., 2013).

Le ache n mniene Tee. Elle n caable de e dele dan de endi inhabiel, aec de cndiin eme de ein, de alini, de emae, de

H la cmbinain de lie de ce aame (Faka e al., 2013). Mme i e le ache ne n a emhile, lina de ache mhile ian dan de maai, ea e, ence le l ceendan n gand nmbe de echeche n mene le ece lan dan de cndiin flian aec le limie de la ie. Lin e dble, mee en lmie le le de ache dan ce eninnemen, e lili de le enme

hemable le alicain indielle.

Fige 14: Le oi domaine d ian (Foee, 2015) Labe nieel d ian o appaaien le oi gand domaine : Ache, Bacie e Ecaoe.

V.b. Les intérets des archées

Lde de ache a lie in, dabd la ein de origines de la vie,

ie la dcee de ache a emi en cae le cnce e le bacie n le

innie e, n dnn naiance a ecae. La cmaain de 3 dmaine d ian

(Ekaa, Baceia, Achaea) eme dabli n ai-b de LUCA, i ne a la

emie cellle mai le denie ance cmmn nieel (La Unieal Cmmn Ance), aan dnn naiance lenemble de e ian acel. Mai ligine de chae gne

ai de LUCA ne a ence alemen dfinie. De cnaii n : le emie

i e e de ligne n meg de LUCA, lne a dnn le bacie e lae le ache e ecae (hhe de Wee) e dae ggen e le ecae n

meg de ache (hhe ece)(Da Cnha e al., 2017; Lake, 2015).

Un ae in, e le ressemblance moléculaire (réplication, transcription et traduction) avec les eucaryotes. Dan ce ca, le ache n de mdle bilgie

l ada e le bacie. Mme i le cnaie a admi endan lngem, aec la mie en idence de lnieali d cde gnie e de mcanime de bae de la

adcin, anciin e licain. E. coli a lganime mdle, emean ddie le mcanime mlclaie infmainnel e deale le la a ecae. Si ceaine cnclin e n ae eace, dan le anne 1970 de nmbee diffence

n mie en idence ene la bilgie mlclaie de ecae e de bacie. La bilgie mlclaie de ache e che de celle de ecae, nammen en ce i cncene la licain de lADN. Pa eemle lenme S11, aan fncin la fmain de cae de dble bin de lADN afin de dclenche la ecmbinain miie, a dabd dcee e caacie che le ache, e ai galemen

ene che le ecae. Cela a galemen le ca de nmbee ine de la

licain, ec (Faka e al., 2013; L and Waefallen, 2001) .

En l de le imi hlgnie aec le ecae, le ache den galemen de enzymes inédites, d fai nammen de la diei de le lie de ie. Pa eemle

la echnie de la PCR ; liliain de la f de P. furiosus (Kim e al., 2008). De nmbee ae enme iane die a de ache hehemhile e acidhile aien e elie lindie dan le biechnlgie. Ce enme nceian de fe emae e de H acide een e ilie dan de

cd indiel, le enme claie ne aien a fncinne. Ce a eemle le ca la anfmain de lamidn en ceS a le amlae. Le enme ie dache, n en leine megence e ineen le indiel, a eemle le eae lindie d aie, le liae ae le degen, dan lindie d eile i eaie de limie le aiemen chimie. Tj dan n ci de

eec de leninnemen, e lhee de negie enelable, ce di ineen le

ece de lnegie : la echeche de bi-caban, de ga nael cmme le bi-hdgne

(Faka e al., 2013).

Le ache n galemen de acteurs écologiques intéressants, imli dan le gand ccle bigchimie cmme le ce de niificain, le ccle de lae, le ccle

d cabne. De l elle ineagien aec dae ganime (mbie). Il e galemen

ne ce j, acne de ache dcie ne ahgne (Reee and Schlee, 2011).

Afin de cmende la bichimie, la hilgie , le mcanime de anciin/adcin

ence dadaain (Waege e al., 2010) e le eniel in biechnlgie, de ache gnie n cammen alie. Ceendan le me n min cnn che le ache e che le de ae dmaine d ian (ecae e bacie). Le delemen de la gnie che le ache di faie face de nmbe dfi en eme de cle en labaie, de delemen de agie gnie cifie e de mhde de ciblage (Faka e al., 2013).

V.c. Les transferts génétiques chez les archées

De mhde de gnie n eneie che le ae ge dache (Rhe and

Mecalf, 2005) : mhangne (Methanococcus e Methanosarcina) (Tmbla and Whiman,

1999), Halhile (Halobacterium salinarum e Haloferax volcanii) (Sa, 2006),

Thermococcales (T. kodakarensis, T. onnurineus e T. barophilus e che P. furiosus e P. abyssi) ence che le Sulfolobales (Sulfolobus solfataricus e Slflb acidocaldarius)

(Bekne and Li, 2008; Wagne e al., 2009) (L and Waefallen, 2001).

Le manilain e fn daanage che le Eache (Mhangne, Halache e

Thermococcales) e che le Cenache (Sulfolobales). P ceaine le mdificain gnie ne n a ible, e ce en di de infmain enielle en eme de

hilgie, dganiain d gnme e de limance eninnemenale. Ce le ca de cenache, nammen de ece Pyrobaculum e Thermoproteus, aini e le eache de gene Archaeoglobus e Thermoplasma; ce ae ece n gniemen inacceible (Faka e al., 2013).

Le manilain gnie n cammen ilie demine le le

hilgie de gne, dle a cnaie -eime n gne enaine ne ne diffene, n changemen de hne. Le echnie de gnie e n mie en lace

che de ache mdle die nammen la adcin, ence la licain e

aain de lADN, mai ai le diiin celllaie, le ce li lARN, ceain aec d mablime(Ami e al., 2012)

Le ache gnie alie a Eache n emi didenifie e de mie caacie le gne imli dan la mhangne (G e al., 2005) e dan la fiain d cabne inganie (Waege e al., 2010), dce le mcanime dadaain de

ine halhile a fe cncenain en aim dan le clame (Hchen e al., 2005). Che T. kodakarensis, la gnie a emi ddie ceain aec

hilgie cmme la anciin, la licain de lADN, le mablime en gnal. Le eience de gnie che le Mhangne e n daanage cncene le ie de la mhangne, mai ai de de de bilgie mlclaie e de hilgie de ache (anciin, mglain, de de ine de ce). Le cham delain n dendan de che die.

P le Cenache, de diiif gnie n del che le Sulfolobales (She e al., 2009). Le man de dlin n emi de i le le de gne cdv (fmain de

icle) dan la diiin celllaie (Samn e al., 2008), le ne a e daif

(Maa e al., 2009), le glae de la anciin (Peee e al., 2009; Schele e al.,

2006; Zheng e al., 2012), la fmain de ili (Fl e al., 2008; Sab e al., 2007).

Le anfe gnie ali che le ache n limi, e an le change gnie n fen che ce micganime (figure 15 et tableau 5). De nmbe

lamide, i, ence dinein, ann e ae lmen gnie ence le lmen CRISPR, n en che le ache. Le CRISPR, a eemle, n e

aiemen dan le gnme dache, cne 40% che le bacie. Le halhile e le sulfolobales n cnn ai ne abndance e ne diei imane de i e dlmen ea-chmmie. Che le Themhile a eemle, n e cie la

aicle iale SSV1 de sulfolobus shibatei. La dcin de cee aicle iale e indie

a le adiain UV (Main e al., 1984) e n gnme la aiclai de e -enle

iemen ai bien dan le cellle de Sulfolobus e dan le aicle iale elle- mme (Nadal e al., 1986). De lamide n e dan de che can e le banche gnie de ache (Bn e al., 1989). Che le ache halhile de nmbe lamide e bacihage n il. Le lamide PHH1 de Halobacterium halobium cnien linfmain gnie de la fmain de acle ga (Weidinge e al.,

1979) e le lamide L cnfe limmni cne linfecin a le hage H de cee mme

che (Schnabel, 1984). Le lamide HV2 (6 ,35 Kb) de H. volcanii (Chalebi e al., 1987), le lamide GRB-1 (1,7 Kb) de H. halobium ili ee leffe de dge agian a niea de la lgie de lADN (Fee e al., 1989) e le baceihage H de H. halobium

(G e al., 1989), n ami le mie caacie. Qele che de Mhangne hbegen de lamide dae e dlmen eachmmie. Le lamide

PME2001 (4,5 Kb) de Mb. thermoautotrophicum Marburg f le emie e mi en

idence (Meile e al., 1983). Dae lamide de eie aille n idenifi che de mhangne PURB500 (8,7 Kb) il ai dne che mhile maine d gene

Methanococcus (Wd e al., 1985) e le lamide C2A (5,1 Kb) il de Methanosarcina acetivorans (Se and Gnal, 1988).

Fige 15: Le anfe gnie che le ache (Wagne e al., 2017) Diffen mcanime de anfe d'ADN on dci che le ache. Ce-ci inclen l'abopion de l'ADN pa anfomaion che le membe de Eachaeoa (a), le anpo de icle membanaie conenan n plamide o n ADN ial che de membe de Themococcale (b), le anfe e l'incopoaion d'ADN pa andcion (c ), le anfe de plamide conjgaif ene le membe de Slfolobaceae (d), le anfe bidiecionnel e l'incopoaion d'ADN gnomie e plamidie pa fion celllaie ene le haloachaea (e), e l'change bidiecionnel d'ADN chomoomie che le cenacheoa. d me d'ADN (f).

(Poo, 1990) (Faka e al., 2013) Tablea 5: Eemple de ece pen che ceaine ache Souche Nom de référence l’élément Plasmides

Mehanococcs sp C PURB Wood e al Gardner e al, Mehanococcs PURB Zhao e al jannaschii Mehanococcs PURB Zhao e al, jannaschii Mehanococcs sp AG PURB Zhao e al, Mehanobacerim PURB Meile e al hermoaorophicm Marbrg Mehanolobs olcanii pMP Thomm e al Mehanosarcina pCA Sowers et Gunsalus, aceiorans sp A Metcalf e al Halofera olcanii pKV Lam e al pHK Holmes e al ; Holmes e al pHV/ oriC Norais e al oriC Norais e al Halobacerim pHH Blaseio e al salinarm pGRB Krebs e al pNRC Ng e al oriC et orc Berquist e al Slfolobs solfaarics SSV Cannio e al ; Jonuscheit e al ; Soopa e al pSSVx Aucelli e al oriC Contursi et al., Slfolobs pRN Berkner e al acidocaldarics Slfolobs islandics pRN Deng e al Thermococcs pTN Santangelo e al koadakarensis Prococcs frioss pGT Wage e al oriC Farkas e al Prococcs abssi pGT Lucas e al VLP (Virus Like Particle) Mehanococcs olae PURB/VLP Wood e al sp A Mehanococcs olae VTA Bertani, PS Phages Mehanobacer smihii PG Bertani et Baresi, Mehanobacerim M Meile e al hermoahorophicm Marbrg Mehanococcs sp No aucun Zillig e al b

Diffene echnie de gnie n ilie, mai lae inciale e cmmne ee la

dliance de lADN egne. La dcee d emie lamide achen cnie la

emie ae de delemen dil gnie che le ache (Faka e al., 2013).

Le de emie me gnie del che le ache n mi en lace che

ne halhile (Haloarcula hispanica) e ne mhangne (Methanosarcina acetivorans).

La dliance dADN che le ache a diffene mhde e bae llecain, la

anfmain chimie, la anfmain a hlae, lime cnjgain aec

E.coli. Ce mhde n cammen ilie (Alle and Meaech, 2005; Ddh e al.,

2010; Gchinkaa e al., 2016) (tableau 6).

(Faka e al., 2013) Tablea 6: Mhode de dliance de l'ADN che ceaine ache

V.c.1. La transformation

La transformation e la caaci de bacie aci n fagmen dADN digine eie, legene. Celi-ci e le l en digine lamidie chmmie ;

enan dae bacie dae ganime ian, i aaien de lADN dan le milie (tableau 7). On diinge de e de anfmain : la transformation artificielle, ln fai ene de lADN (ciclaie linaie) de fce dan la cellle.

Ceaine bacie den la caaci de ende de lADN d milie eie, ce la

compétence naturelle, mai e le bacie ne n a caable de le faie. Une

ianaine de bacie n naellemen cmene, acne cmence na mie en

idence che de bacie e delan de emae che de 90C (Han e al.,

2014). Ceendan cee caaci e ee che de ache hehemhile. Ceaine mhangne cmme M. voltae P5, Methanobacter thermoautotrophicum Marburg, ence de Thermococcales cmme T. kodakarensis ence P. furiosus COM1, n naellemen cmene, ce i facilie le manilain mai cela ee limi (Licmb e al., 2011). Le ache halhile n le emie e manile gniemen a la dcee de la echnie de anfmain (d fai de la facili de la manilain e de le bnne iee de ciance) (Chalebi e al., 1987; Cline and Dlile, 1987) e i le me gnie n le l hii (Leigh e al., 2011). Le mhangne n

ne cmiin aline che de clame bacien, ce i a end ible le delemen de le gnie en inian diecemen de echnie e mhde

eiane che le bacie.

Une anfmain a bene che Methanococcus voltae, Methanobacterium, Haloferax volcanii, a de lADN gnmie libe e che Halobacterium e H. volcanii a de lADN

lamidie. Dlile e n ie en 1987, n i mee a in ne mhde de

anfmain le ache halhile. La anfmain la anfecin de H. halobium e H. volcanii, fme de hlae (Chalebi e al., 1987; Cline and

Dlile, 1987; Cline e al., 1989). Cee maiie d anfe de maiel gnie che le halhile a emi de cnie e dindie che H. volcanii, n ece naee dn la

lecin de anfe e bae la iance la minline, n inhibie de la 3-hd-

3-mhlglaaeCA (HMG-CA), i e ne enme ineenan dan la ie d mealnae (Lam and Dlile, 1989). En 1987, Beani e n ie blie la emie fi lbenin dache ecmbinane mhangne ; a anfmain a de gand fagmen dADN gnmie. Cee anfmain de M. voltae, dmne a de man dahie Hi- (an Hiidine) e P- (an Pine), ne fai ael acn aiemen

alable de cellle, elle n imlemen mie en cnac aec de lADN de e aage,

en milie liide (Beani and Baei, 1987). En 1988, Well dmne ne ae che mhangne M. thermoautotrophicum, e ai e anfme (Well e al., 1988).

Cee anfmain a mie en idence en ilian de fagmen dADN de ha id mlclaie d man ian a 5-flacile. Le fence de anfmain de ce de ache mhangne n faible.

P agmene le nmbe dece mdle, i ne n a naellemen cmene, de mhde hie e chimie n ene. Plie me de anfmain

ean de lmen gnie nael n del ilian de ann,

lamide cie ence de i dlie lADN, ce le ca che ceaine

Sulfolobales. Che beac de mhangne e dhalhile, lindcin de lADN ee

ne anfmain mdie a n lime ; n hlae e gn e eme la

anfmain a de cle ilian de lhlne glcl (PEG) de lime.

Llecain e ne ae mhde en eie che le Sulfolobales abie ence che de Thermococcales anabie, n aiemen chimie e en nceaie

ae la anfmain.

(Leigh e al., 2011; Lo and Waefallen, 2001) Tablea 7: Eemple de me de anfomaion che le ae gope d'ache

Mécanisme : transformation Organisme ADN impliqué Marqueurs Méthode Référence Sulfolobales S solfaarics PRN et PRN Electroporation Zillig e al, Schelper e al, Prangishvili e al, S solfaarics pNOB, lacS Electroporation Elferink e al, PH dérivé de

PRN Zillig e al, S acidocalarics pGT et son CaCl et heat Aaggard e al, dérivé pCSV shock dérivé pGT ADH-alcohol Electroporation Aravalli et Gar- ret, deshydrogenase pCV et pAG -FOA Electroporation Aagaard e al, Aravilli et Ga- rett, pCmalLacS -FOA Electroporation Berkner e al,

S solfaarics Phage SSV Infection, Schleper e al, Electroporation S solfaarics Gθ pEXSs Hydromycin B Electroporation Cannio e al, o resistance S solfaarics Dérivé de Electroporation Stedman e al, PBL SSV pKSDM lacS Electroporation Stedman e al, pMSS lacS Electroporation Aucelli e al, pJlacS lacS Electroporation Berkner e al, pMJ lacS Electroporation Jonuscheit e al, S islandics PRN Uracil, -FOA Electroporation Deng e al S Méthanogènes M olae ADN Auxotrophie Transformation Bertani et Ba- génomique purine, naturelle ou resi,

histidine ou Electroporation Micheletti e al, Auxotrophie HSCom, histidine, purine, BES résistance, puromycine résistance Mip Puromycine Transformation Gernhardt e al, résistance naturelle ou

protoplaste ou Patel et al, électroporation M maripladis pKAS Puromycine Transformation Sandbeck et résistance naturelle ou Leigh, PEG-mediated Tumbula et al., transformation pDLT Puromycine PEG-mediated Tumbula e al, résitance transformation Mehanosarcina pWN Puromycine Liposome- Metcalf e al, sp résistance mediated transformation Thermococcales Thermococcs pLC Simvastine, - Transformation Santangelo e al, a, kodakarensis FOA, -MP b Prococcs pYS PEG mediated Lucas e al, abssi transformation Prococcs pYS Simvastatine Transformation Waege e al, frioss Thermococcs Simvastatine, - Transformation Thiel e al, barophils FOA Halophiles H salinarm pGRB Mevinolin, PEG-mediated Blaseio et Pfei- novobiocin, transformation fer,

uracil, -FOA Krebs e al., pHH Mevinolin, PEG-mediated Dassarma, novobiocin, transformation

uracil, -FOA Berquist e al., pNRC Mevinolin, PEG-mediated novobiocin, transformation uracil, -FOA H olcanii pHK Mevinolin, PEG-mediated Lam et Doolittle, novobiocin, transformation uracil, leucine, Holmes e al, thymidine, Allers e al, tryptophane, - FOA Allers et Meva- pHV Mevinolin, PEG-mediated rech, Norais e al, novobiocin, transformation uracil, leucine, thymidine, tryptophane, - FOA pHV/ Mevinolin, PEG-mediated novobiocin, transformation uracil, leucine, thymidine, tryptophane, - FOA

Cmme cdemmen de nmbee ache den de lmen eachmmie, e.g hage, i e lamide (tableau 5), aini beac de ece dache n di de lamide endgne.

Le ece cni ne n a caable de licain anme ; e la la de

il gnie ili, le ece lamidie en n de mae de lecin, en l de gin dhmlgie inge a lc di (figure 16). En ce i cncene le mae de lecin che le halhile, Sulfolobales e Thermococcales, il

n en ba lahie/la hie lacile e la enibili lacide 5- flie (Faka e al., 2013).

Fige 16: Mhode de dipion de gne (Faka e al., 2013) a) Un nemen de doble ecombinaion ene n plamide e n chomoome, aec n mae de lecion la place d gne cible. b) Une imple ecombinaion e poible, aec de lADN linaie, en pl de ie de ecombinaion (mae) peen e ili po la cone lecion (eciion d mae). c) Enemen de doble ecombinaion, o le mae e ing aini e la gion dhomologie d gne dle. La cone lecion peme de lecionne la peion an le mae. d) Un nemen de imple ecombinaion peme lingaion d plamide, ce i gne ne ne fome inemdiaie. La cone lecion peme dobeni n fome me aec eciion d mae e d gne cible o la fome aage. e)Toe ce agie poaien adape aec n pomoe ap o change alllie. La lecion gne ne fome inemdiaie aec le plamide ing dan le chomoome. La cone lecion peme de eae oi la fome aage o la fome gniemen modifie

V.c.2. La conjugaison

La cnjgain bacienne e n mcanime i nceie de bacie i n e mee en cnac diec, hie e emaie, abli n n ene elle anfe d maiel gnie. La cnjgain a mie en idence la emie fi a de

cienifie en 1946 Ledebeg e Tam (Ledebeg and Tam, 1946).

De anfe n ali a conjugaison che de Halhile ence che de

Sulfolobales (tableau 8). Che la che H. volcani, ne cnjgain naelle a bee

(Meaech and Wecbege, 1985). Elle e diffene de la cnjgain cnne che le bacie ca le de aen een e la fi dnne e ecee, e ce anfe gnie bidiecinnel e galemen diffen de la fin celllaie che le ecae ca il nimlie a la fin de cellle. De n clamie, a linemdiaie deel le maiel gnie aeai dne che lae aaien le ai be en miccie lecnie balaage (Renhine e al., 1989). Ce mme ae aien

galemen aen alie la fin de lae che H. volcanii. Elle e diffene de la cnjgain cnne che le Sulfolobus, de lamide cnjgaif n galemen il en aiclie le lamide PNOB8 (45 Kb) (Schlee e al., 1995; She e al., 1998; Zillig e al.,

1998) .

La cnjgain a eneie ene diffene che e galemen ene diffen dmaine : bacie-ache, ene la bacie E. coli e de Methanococci (Methanococcus maripuladis). Ce ce e en min efficace mai l aide. Lefficaci de cee cnjgain inedmaine e de 0,2 2 10-6 a cellle eee. Le ce eie le fncin iT e le gne tra e a le lamide d dnne (P, 1990).

Che Mb. thermoautotrophicum e Ms. barkei, de mhde ae le lae aaien dcie mai acne gnain de la ai de ce bacie na bene

(Kiene e al., 1987).

(Lo and Waefallen, 2001) Tablea 8: Eemple de mcanime de conjgaion che le Slfolobale Mécanisme : conjugaison Organisme ADN impliqué Marqueurs Méthode Référence Sulfolobales Slfolobs sp Plasmide Schleper e al, conjugatif Prangishvili e al, S Vecteur Aagaard e al, acidocaldarics d’intégration

basé sur de Aagaard e al, l’ADNr mobile ADN génomique Auxotrophie Grognan e al, Schmidt e al,

V.c.3. La transduction

La andcin e le denie mcanime emean la de dieificain gnie.

Ledebeg a dnn n nm ce mcanime en 1951, i fai ael n ae e dagen infecie, nammen le i. Il n anfe d maiel gnie dne bacie ne ae.

Che le gene Methanococcus, la transduction a dcie, che M. voltae nammen. G.

Beani a idenifi en 1989, n lmen filable che cee che (P, 1990). Cee

aicle imie de 40 nm de diame, ian la DNae, ael VTA (Vlae anfe agen) ee dn fagmen dADN de 4400 b ceible de andi che de clne de ce ganime.

V.d. Les défis de la génétique des archées

De nmbee baie echnlgie d fai de cndiin de ie aiclie de ache cnien n fein ce de e lmegence dil gnie (figure 17). Chae ge ene de aanage e de daanage, en l de la difficl cmmne de cle de ache en labaie.

Fige 17: Le challenge pae po die le ache (Faka e al., 2013) Abe phlognie de ache, aec le diffen aon e ne decipion de le pincipale caaciie.

Le Thermococcales e sulfolobale n hehemhile, il e dnc nceaie dabli de milie de lecin ada a hae emae, l de 70C. De l en ce i cncene le Sulfolobales, le echnie dien eni cme d faible H. P le Mhangne e le Thermococcales ce lgne i cnie n lmen ie, an dnn e ce n de che anabie (Faka e al., 2013).

Un ae challenge e de e de mae de lecin e de cne-lecin,

ifie le la de la manilain gnie. Le anibiie n cible le

ibme bacien la machineie ineenan dan la nhe de la membane celllaie

(Cammaan e al., 1985; P e al., 1988). Le blme e e le ache n la

la iane a anibiie ili en ine che le bacie. La hemabili e la laili de cm dien galemen e ie en cme (Ami e al., 2012; Nll

and Vaga, 1997).

Un de men de lecin cnie a delemen de mae dahie cendan de che ahie i en cmlmene a anfmain

(lecine, hane, Thmidine, agmaine) (Alle e al., 2004; Oenbeg e al., 2000;

Sanangel e al., 2010) ((tableau 9). Lacile e le 5-FA n ili cmme mae de

lecin/cne-lecin che de nmbee Halhile. Che le Mhangne, de mhde de lecin e cne-lecin n dele en ilian ahie/

hie de lHiidine, ilian le gne hisA cmme mae, en ilian le 6- aaacil e 8-aahanhine che la che M. maripaludis. Che Sulfolobus, labliemen de mhde de manilain gnie ilie j de mae de

lecin, la ciance lace a eemle S. solfataricus aec ne che dle d gne lacS ; cdan la -galacidae. La lecin e ai e faie a iance lhgmcine B, banl lalcl benl ia le gne de lalcl dhdgnae l cmmnmen a ahie lacl. Che le Thermococcales cmme T. kodakarensis,

ele mae hie n ili cmme laginine/cilline, le hane, lagmaine lacile (Ami e al., 2012).

Une ae lin e dilie de anibiie acif cne la cellle (tableau 9). P le

Mhangne, la lecin e fai ia diffen anibiie cmme la mcine e e di aec le gne (pac) de la bacie Streptomyces alboniger (Genhad e al., 1990), la nmcine lacide edmnie. Qele ache nhien de liide di iande, ilian la ie d malnae, e le aine (minline, Simaaine). La minline a dabd ilie che le halache (Lam and Dlile, 1989; Peck e al., 2000). Ajdhi ce cm n cammen ili le Thermococcales (T. kodakarensis, P. furiosus) (Mami e al., 2007; Waege e al., 2010), Sulfolobales. La

Minline e Simaaine inhiben la cenme A (HMG-CA) dcae (emie ae de la binhe de liide che le ache, elle inhibe ai la nhe de l che le ecae). La nbicine inhibe la DNA gae, ne dge ile la lecin de

halhile (Ami e al., 2012).

(Aomi e al., 2012) Tablea 9: Eemple de mhode de lecion e cone-lecion efficace che le ache

V.e. L’outil génétique développé chez Themcccc bahil

Le gne cnien ne ce dinfmain, il e dnc nceaie dai de il gnie le caacie e die le fncin celllaie e hilgie. Pami ce il, la gnie inee eme de mee le effe de la dlin dn lie gne la hilgie de lganime. Dle de gne a emi lie de : le de face de anciin, ine imlie dan liniiain de la licain, llngain de lADN, enme mablie, le hdgnae, e enme imlie dan la mhangne, le de le ine de hine e de la chmaine, ecmbinain e aain de lADN, aemblage e mbili de flagelle, mdificain de la face celllaie, mdificain de ARN(L and Waefallen, 2001)

Dei 2013, le LM2E die dn me gnie n ganime mdle T.

barophilus MP (Thiel e al., 2014).

Ce il eme de dle n lie gne cible a ecmbinain hmlge laide dn lamide ingaif (nn licaif) e e e ili lde de gne dadaain a HPH. T. barophilus e n bn ganime mdle de ache de gnie, d fai de ce nmbee i e aanage : a caaci e dele ein amhie, le fai elle i cliable a labaie, e e n gnme i eniemen

enc (Vannie e al., 2011).

La mie en lace de ce il a inie a le echeche en gnie mene che T. kodakarensis (Ami e al., 2004; Mikaa e al., 1994) (Hileman and Sanangel, 2012; Sa e al., 2003).

Le incie de lil gnie e celi de la dble ecmbinain hmlge : ne emie

ecmbinain eme lingain d lamide dan le gnme de T. barophilus, e la deime, leciin de celi-ci (figure 18) (Thiel e al., 2014).

Le lamide ingaif cmend le mae de lecin ian : le gne hmgpf cdan

la HMG-CA (Sanangel e al., 2008) aan la iance lanibiie

Simaaine i e ili cmme mae de lecin iif l de la emie

ecmbinain ; le gne pyrF (ie de lahie lacile) i e enable dne

enibili a 5-FOA (acide flie) e i e de mae de lecin ngaif le deime nemen de ecmbinain. Ce lamide e galemen ne gin ie de la fin de de gin dADN i encaden le gne cible e ln haie dle. A la fin de de cing e , de ibili de cnfigain n ible : (1) la fme ne

dan l le gne cible, e (2) la cnfigain aage. Te le de n Simaaine

enible e 5-FOA ian. Bien e lil ai emi la dlin de lie gne, le

blme maje ide dan la faible enibili de la che a 5-FOA a a le gne pyrF, i enaine ne abence de cne lecin ; e manifean a laaiin dne

iime cnfigain la fin de la ecnde ae de ecmbinain : de che dblemen iane, ielle den le lamide dan le gnme. Elle n aele fa iif , e le igine ee ce j nn lcide.

Fige 18: Schma d pincipe de l'oil gnie che T. baophil (Thiel e al., 2014)

Sim : Simaaine ian, Sim : Simaaine enible, 5-FoA : 5-FoA ian, 5-FoA : 5-Foa enible, RH : gion dhomologie, PF : gne de lecion a 5-FoA, hmgpf : gne de lecion la Simaaine, GC : gne cible, C.O : coing oe

VI. Objectifs de la thèse

A labaie, lache T. barophilus e n mdle di dei ne diaine danne, nammen afin de cmende ladaain de la che a hae ein hdaie.

De de ancimie n cemmen mn ne -eein de ceain gne cle de aiain de ein, nammen le hdgnae (Vannie e al., 2015). Ce

i e ne ible imlicain de ce hdgnae dan ladaain de T. barophilus a HPH.

Afin ddie ce hdgnae, de cmende le fncinnemen, e le le dan le mcanime adaaif de T. barophilus ein, de man de dlin n cni.

P cela n il gnie cdemmen dci, a del a labaie. Bien e lil ai ili de eience de dlin de gne, celi-ci ene n dfa de

enibili d mae de cne-lecin.

Le emie bjecif de la he a dnc de aaille lamliain de lil gnie, dan le b de dimine ce fa iif li a 5-FA.

Un nea me de cne-lecin a dnc en e del, en ilian n nea mae : la 6-mhline (6-MP). Le la de cee emie de n en dan le chaie 1.

T. barophilus, clie de ein infiee e iee (0,1 e 70 MPa) a ein

imale, -eime de cle de gne cdan le hdgnae membanaie e clamie, e ceci en ence de fe. Le face fe di e i en cme e a

n imance, iil ineien dan le mablime de hdgnae. Sn abence faie celle i dien de lH2, a ence celle imlie dan la dcin de lH2S.

Dan ce de ancimie, le fe an en dan le milie de cle, ne

emble a ai deffe leein de hdgnae, ie en cndiin de e

ein, mme le hdgnae i ne deaien a e acie en a ence, n - eime.

Aini ne fi lil amli, n an lilie afin de nde n blmaie : cmmen fncinne le mablime de lhdgne che T. barophilus ? Le fncinnemen e le le de hdgnae n-il idenie a hdgnae de ae Thermococcales ?

Qel e limance d fe dan ce mablime ? Le hdgnae n-elle n le dan ladaain de T. barophilus a HPH ?

N an dnc cni le man hdgnae. Le la de lbenin de man de dlin n en dan la emie aie d chaie 2.

Une fi le incia man ben, n an enei ne caaciain de ce-ci afin de ifie le fncinnemen de la che an ce gne. De ache n chiie:

dabd, de cle ein dan de incbae de hae ein e hae

emae (0,1, 40 e 70 MPa) la fi en ence e en abence de fe. Ce i n a

emi de i le effe de la dlin de gne la ciance de T. barophilus, e ddie le face fe, mai galemen le face ein, la cmbinain de ce de face, e le inflence le mablime de hdgnae che T. barophilus. Dan n deime

em j dan le b de caacie ce man, de cmende le le e le fncinnemen de gne, de dage de lhdgne n ali a chmagahie en

hae gaee. Le la de ce manilain n en dan la ecnde aie d chaie 2.

Mate riel et Me thodes

I. Outil génétique

I.a. Matériel biologique

T MP (T.b) e ne ache ile dn fagmen de chemine hdhemale d ie Snakei (39.827170 ; 75.454690), ne fnde de 3550 m, la ide mdi-Alanie l de la camagne MAR93 (Maeinn e al., 1999a). Ce n de ce de 0,8-2 m de diame mbile, aec imm de ciance ne

emae de 85C, ne ein de 40 MPa, n H de 7 e ne cncenain en el a alen de 20-30 g/L.

La che e de T. barophilus MP aage a emi laide de lil gnie (Thiel e al.,

2014) de cnie n ceain nmbe de man (tableau 10). La lie de ce man e

ene dan le ablea ci-de.

La che ilie a c de cee he e T. barophilus TERMP_00517 i die de la

che aage. Le gne TERMP_00517 e hmlge a gne TK0064 i cde lhanhine anfeae enable de la enibili a 6-MP che T. kodakarensis

(Sanangel e al., 2012). Cee denie cend la che T. barophilus anfme a dlin d gne TERMP_00517, i ene 80% danalgie aec le gne TK0064 (gne de

enibili la 6-MP). N dcin cee che e n iliain l de la aie lamliain de lil gnie.

Tablea 10: Tablea capilaif de oche de l'de Souche Souche parent Génotype Région(s) Chapitre de génomique(s) référence délétée(s)

Thermococcs Wild type Amélioration de barophils MP l’outil génétique UBOCC-M-

TbTERMP Thermococcs T.b muté Simple mutant Amélioration de UBOCC-M- barophils MP TK l’outil génétique TERMP

TbTERMP Thermococcs T.b muté Simple mutant Amélioration de pUPH barophils MP TK l’outil génétique UBOCC-M- TERMP

TbTERMP Thermococcs T.b muté Simple mutant Utilisation de Mbh barophils MP l’outil génétique

TERMP to TERMP

TbTERMP Thermococcs T.b muté Simple mutant Utilisation de Co-Mbh barophils MP l’outil génétique caractérisation des TERMP mutants to TERMP

TbTERMP Thermococcs T.b muté Simple mutant Utilisation de Mbx barophils MP l’outil génétique caractérisation des TERMP mutants to TERMP

TbTERMP Thermococcs T.b muté Simple mutant Utilisation de SHI barophils MP l’outil génétique caractérisation des TERMP mutants to TERMP

TbTERMP Thermococcs T.b muté Simple mutant Utilisation de SHII barophils MP l’outil génétique caractérisation des TERMP mutants to TERMP

TbTERMP Thermococcs T.b muté Simple mutant Utilisation de SurR barophils MP l’outil génétique

TERMP

TbTERMP TbTERMP T.b muté Double mutant Utilisation de Mbh/ Co-Mbh Mbh l’outil génétique

TERMP à Co-Mbh TERMP

TERMP à TERMP

T (T.k), e ne ache ile dchanilln i dn lfaae de face lle Kdaa a lage d Jan. Iniialemen dcie cmme aaenan a gene

Pyrococcus (Mikaa e al., 1994), de de alie en 2004 n emi ne e - claificain de la che dan le gene Thermococcus (Ami e al., 2004). Cee ache hehemhile a n imm de ciance 85C, n H de 6,5 e faible ein

hdaie. (UBOCC-3205).

La che d’E DH5α (Saagene) a ilie la cain de

lamide. Ce n de cellle cmene i n dnc la caaci dinge le lamide.

I.b. Milieu de culture

I.b.1. Milieu TRM

Le milie de cle incialemen ili l de cee de e le milieu TRM

(Thermococcales Rich Medim) (Zeng e al., 2009). Sa cmiin 1 L dea dminalie e de 23 g de NaCl, 5 g de MgCl2, 3,3 g de PIPES, 4 g de Tne, 1 g deai de lee, 0,7 g de KCl, 0,5 g de (NH4)2SO4, 0,05 g de NaB, 0,01 g de SCl2, 2 ge de

Raine 1% i e lindicae cl ifie labence dgne, le H e aj

6,6-6,7.

Le milie de cle e enie anf dan n flacn Sch de 1L, e acla 20 mn

121C. A efidiemen d milie, 1 ml de cm ian e aj ilemen :

K2HPO4 5%, KH2PO4 5%, CaCL2, 2H2O 2%, Na2WO4 (10 mM), FeCl3 .6H2O (25 mM).

Le milie e ai dan de file Pnicilline ile de 50 100 mL, le fe lmenaie

Tndalli e aj (2g/L). Le file n feme hemiemen (bchn ile) i de ide-ga n ali laide dne ame ga. L de cee ae lgne e emlac

a n ga inee, le diae N2. Enie la hae liide e die a le Na2S 5% (0,1% en cncenain finale) afin dlimine lgne en.

A anfmain, le anfman n al milie TRM lide. La lidificain d milie e fai a laj de Phagel (Sigma) ne cncenain de 10 g/L de milie.

L de la anfmain, le milie TRM e lmen a diffene bance : la

Simaaine 2,5 g/mL (Sigma) (milie lide e liide), i e n inhibie de lenme

HMG-CA caalan la emie ae de binhe de liide che le ache, de

lanibiie 6-MP 6-mhline (Sigma) i ea dci a la ie (ili de 0 250

M dan le milie de cle liide lide) le 5-FOA 8 mg/mL (Emede) (milie

lide niemen).

I.b.2. Milieu LB

De che dE. coli DH5, n ilie le manilain de lADN e ce cle n

alie milie LB (liide lide) 37C. La ence d lamide e ifie a laj de 100 g/mL dAmicilline e dIPTG dan le milie. La cmiin d milie LB

(Lia-Beani) (Beani, 1951) 1 L dea dminalie e de 5 g deai de lee, 10 g de ne, 10 g de NaCl. P n milie de LB gl de laga bacilgie e aj hae de 1%.

I.c. Construction des plasmides

I.c.1. pUPH

Ce lamide e cni a digein/ligain. Le lamide (lamide UFH (Thiel e al.,

2014) e line (TK0664) n dig a le enme de eicin XhI (ie de eicin :

C/TCGAG ; GAGCT/C ; 2H 37C) e SmaI (Sie de eicin : CCC/GGG ; GGG/CCC ;

25C la ni).

A chae ae de digein, ne ificain gel dagae 0,9% e ne ificain clnne afin dlimine le amn eecif de de enme n alie.

La ligain de di dig (lamide e ine) e effece emae ambiane la ni (T4, DNA ligae, mega). Le lamide ben e nmm UPH1.

Lae iane e la anfmain a chc hemie dE. coli (DH5 cmene cnee -80C) a UPH1 : ne incbain de 30 min 4C (glace), i ne indcin de 5 min 37C, e ne incbain de 10 min 4C. Pi 1 mL de LB liide e aj dan chae be, ii dne incbain de ce-ci 1 h 37C, ii dne cenifgain de 5 min

5000 g. Le cl celllaie ben e eend dan 100 L de LB i 50 L e d

de milie LB lide cmlmen en Amicilline e IPTG (100 g/mL). Le be n enie incbe 37C endan la ni.

Le lendemain, 10 clnie/be n ie milie LB aga cmlmen aec de lAmicilline (Ami) e de lIPTG (100 g/mL), i incb 37C endan la ni.

P le cin emie clnie lecinne, ne PCR e alie diecemen clnie :

chacne de ie, le bnne en bi ili e lng dan n be PCR cnenan 100

L dea ile. Enie, le be PCR n lac 95C endan 10 min (hemccle) afin de le le cellle. Le be n a eln le cle ian : 5 L de clnie,

33,5 L dea, 10 L de amn gTa 5X, 1 L de dNTP (10 mM), 0,5 L damce en

TK0664, 0,5 L damce anien TK0664 (TK0664 : AAA AAA CTC GAG CCC GTC CA

AGC TAC CAC TCC C (20 M); TK0664 d: AAA AAA CCC GGC TTC AAA ACC CAG CCA AAC

AAC ACC C (20M)) e 0,5 L de gTa (5 U/L). Le be n hmgni e ne PCR e alie (hemccle : 94C 5 min (30 ccle), 94C 40 ec, 52C 40 ec, 72C 2 min,

72C 5 min, 4C). Le di PCR n l gel dleche 0,9%, ifie

e line TK0664 e bien en dan le lamide cni. La migain e faie 90 V

endan 30 min.

A ificain de la ence labence d lamide dan n clnie a PCR, ne ie cnenan bien ne lamide din e ilie enemence 5 mL de LB + Amicilline

(100 g/mL). A incbain 37C agiain 250 RPM endan la ni, ne eacin lamidie e alie, e le be cnenan le cle dE. coli aec le lamide

eaie n cenifg 6 min 6000 g. Le cl celllaie e eend aec 250 L de

lin de eenin e anf dan n eendf. Enie en ilian le ki deacin

lamidie (ki, geneJET, ThemFiche), le lamide UPH1 e eai, en ilian le

cle ian : dan chae be 250 L de lin de le n aj, le be n mlang a inein de be 5 6 fi. 350 L de lin de nealiain n aj, le be n mlang a inein e d be 4-6 fi. Le be n enie cenifg 5 min 12000 g. Le nagean e anf dan ne clnne (ki, geneJET,

ThemFihe). Le clnne n cenifg 1 min 12000 g, i de laage aec 500 L de amn de laage n ali (cenifgain 1 min, 12000 g). Le clnne n enie cenifge ide enlee e ace dhanl (3 min, 12000 g). Pi la clnne e

lace dan n be e, 100 L dea ile n aj e a 2 min, ne cenifgain de 2 min 12000 g a alie. Le aain n ifie n gel dagae 0,9%.

Le be cnenan le lamide n cne -20C.

I.c.2 Liste des plasmides construits

La dlin de gne aec lil gnie cdemmen dci nceie liliain d

lamide UPH dan leel n ine le gin flanane d gne cible. P cela, dan

n emie em, de PCR n alie afin damlifie le gin flanane dan le gnme de T. barophilus. La cmiin d mi PCR, chae chanilln, e la iane :

41,5 L dea, 5 L de amn 10X, 1 L de dNTP (10 mM), 0,5 L damce en (20 mM), 0,5

L damce anien (20 mM), 0,5 L de Ta PFU (5 U/mL) e 1 L dADN maice. Le

gamme damlificain ili e 5 min 94C, i 30 ccle cmenan 1 min 94C,

1min 55C, 2 min 30 72C i 72C endan 7 min e 4C en emae finale (tableau

11).

Tablea 11: Lie de amoce Hydrogénases Séquence (’-’) Tm (°C) CoMbh Up AAAAAAGGTACCCAACTTCCGGGCTTTTTGCT GAGTAA CoMbh Do TTTGGGTGAACAGCAGAGCCAGTTTTTTCTTT TGATGAAATTTGTTATTC CoMbh Up AGAAAAAACTGGCTCTGCTGTTCACCCAAATT TTTCTTAATTTGTCTTG CoMbhDo AAAAAAAGATCTCACGAAATGAAAAGCTTGC GGAGGAAA MbhUp AAAAAAGGTACCATAAGAATCTTGCCATAAGG GC MbhDo CAAATCAAGAGATGAGGTGAGAAAACTTTCC GCTTTAAGTTTCTTTTTATAATAA MbhUp TTATTATAAAAAGAAACTTAAAGCGGAAAGTT TTCTCACCTCATCTCTTGATTTG MbhDo AAAAAAAGATCTTTTCTGCAAGCTCAATAGCT TC SHIUp AAAAAAGGTACCGGCCTCTCTGGAGTTGGAA CCCTCT SHIDo GAGAAATTTTGAATAGACGGGATCATCACCCG AAAGATTGCTTCTC SHIUp ATCTTTCGGGTGATGATCCCGTCTATTCAAAAT TTCTCTATCTATTTTTGTTAAATC SHIDo AAAAAAAGATCTTCCATTTTGTTCTCGAGCATT

AAAGCAACAA SHIIUp AAAAAAGGTACCCCCAATAAAATAAGCTCATTT ATGGCAGCG SHIIDo GGGGAGGGGATCTCTATTCTCTTTTCTAAATTT TATCTCTGGTGGTTTTATGA SHIIUp TTTAGAAAAGAGAATAGAGATCCCCTCCCCAT GAACATCAT SHIIDo AAAAAAAGATCTAAAGACATTTTCGAGCTCCT CATACCC MbxUpKpnI AAAAAAggtaccACGTCAACATTTATGAAGTAA AACGCTATCCT MbxDO CTTGGAGGGTTGGTATTATCTTTTTCTCTTTTCT TAGGCTTTTCTTACATGAGAAAAA MbxUp AAGAGAAAAAGATAATACCAACCCTCCAAGAG TTTAAACTTGAAAG MbxDoBamHI AAAAAAGGATCCGGGAAAGATTGAGCATTAC TTTGATGAATATCCT T.bTERMP Séquence ’-’ TmC MPbUp AAAAAACGTACCAAGAAAACCGGAGTTTTAG . TGAATACACC MPbDo TCTCATGGAAACATTTAAATGGTTGTGGTATCT . TGGACAAGAAGAAAA MPbUp TTGTCCAAGATACCACAACCATTTAAATGTTTC . CATGAGAAAAATGAAATGCAAAAA MPbDo AAAAAAAGATCTCTCGCTCTAAAGGAGCTTTC . AACA

A cee ae, 2 fagmen denin 1 kb n ben. Ce-ci n ili cmme maice ne ecnde PCR aec cmme amce a eemle Mb_1U_KnI e

Mb_2D_BamHI. Le mi PCR ai cm de 40,5L dea, 5 L de amn 10, 1 L de dNTP (10 mM), 0,5 L de chae amce (20 M), 0,5 L de Ta PFU (5 U/mL) e 1 L de de di PCR cden, aec n gamme PCR ialen a cden mai aec

ne lngain 72C endan 4 min 30. La aille d di PCR a ifie a migain

gel dagae 0,9%.

Le fagmen dADN cendan line a enie eai e ifi ai d gel dleche clnne aec le ki Gel eacin Them Scienific.

Le fagmen cendan la fin de gin flanane d gne dle a in dan le lamide UPH a digein/ligain. Le lamide e line n dig a le enme de eicin KnI e BamHI (3h 37C). Une ificain gel dagae e ne

ificain clnne, emean lliminain de amn eecif de de enme,

n alie a chae ae de digein. La ligain de di de digein

(lamide e ine) a alie endan 3h emae ambiane e emi lbenin d

lamide P(gne dle). Le lamide n anfm dan E. coli cmme

cdemmen i dan T. barophilus (figure 19).

Fige 19: Schma capilaif de l'ape d'obenion de ece plamidie

I.d. Transformation dans Themccc bahil

I.d.1. Etape de transformation

P la anfmain, le cellle n incle 1% en milie TRM aec fe endan

16h 85C e ein amhie; i le lendemain n ali de 0,6 mL de la cle de ni a anf dan 30 mL de TRM an fe e incb 6 h 85C ein amhie. Le cellle n enie cenifge (8000 g, 8 min) e cncene dan

600 L de TRM f i lace glace endan 30 min, en enceine anbie (enceine de e COY, Laba dc). Un ali de 25 L cnenan 4 5 g dADN lamidie

a aj 200 L d cncen de cellle, e le mlange a incb 1 h glace. Un chc

hemie a ali endan 10 min 85C, ii a ne incbain glace endan

10 min. 225 L de cellle anfme n incl dan 20 mL de TRM f ii dne incbain de 18 h 85C.

I.d.2. Sélection des mutants

A incbain, le cellle n cenifge 8000 g endan 8 min. En enceine anabie, le nagean a limin e le cl eend dan le nagean ean, i enin 100 L. Un ilemen a la mhde de cadan a ali aec cee enin

milie lide de TRM aec d fe clldal (0,5 g/L) cnenan de la Simaaine ne cncenain finale de 2,5 g/mL. La lidificain d milie a alie aec d Phagel

(Sigma) ne cncenain de 10 g/L i le be n incbe 5 j 85C, en jae anabie.

A incbain, 2 3 clnie n incle chacne dan 20 mL de TRM f addiinn de 2,5 g/mL de Simaaine (10 L). Le file n incbe endan 16 h

85C. Ce cle n enie ilie incle, 1%, 2 file de 20 mL de milie

TRM f + Simaaine, lne leacin dADN gnmie, e la ecnde la deime ae de lecin. Ce enemencemen n incb 16 h 85C.

P lae de lecin 6-MP, le cle de ni n cenifge i, en enceine anabie, le nagean a limin e le cl eend dan le ee d nagean

(enin 100 L). Cee enin a enie ilie alie n ilemen a la mhde de cadan milie TRM lide aec fe clldal (0,5 g/L) e 6-MP ne cncenain finale de 100 M. Cmme cdemmen, le milie a lidifi aec d

Phagel (Sigma) ne cncenain de 10 g/L, e le be n incbe 5 j 85C.

De nea, 2 3 clnie n eie chacne dan 20 mL de TRM f en enceine anabie e incbe 16h 85C. Pi ne file de 20 mL de TRM f a incle 1%

aec cee cle e incbe 16h 85C alie enie leacin dADN gnmie.

I.d.3. Extraction/purification de l’ADN génomique et vérification des mutants

Une eacin de lADN gnmie (Ki Geneje, ThemFihe) a alie le inemdiaie, ene le de ae de lecin ifie lingain d lamide; e le cellle bene lae finale ifie lbenin de man. P cela, le cellle

n incle 1% dan d TRM aec d fe e incbe 16h 85C. A incbain, le cellle n cenifge (8000 g, 8 min), e le cl a ei dan 300 L de TE (Ti

HCl 100 mM, H 8, 50 mM NaCl, 50 mM EDTA, H 8), 40 L de SDS 10% (ddcllfae de

dim), 40L de akl 10% e 20 L de inae K (20 mg/mL). Le be n incb

1h 55C. Pi 200 L de amn de le e 20 L de RNae (50 mg/mL) n aj e le

chanilln n lai emae ambiane endan 5 min. Le mlange a enie

e dan ne clnne de ificain e cenifg 1 min 6000g. 500 L d amn de laage I n aj ii dne cenifgain 1 min 8000 g. A liminain de llan,

500 L d amn de laage II n aj e le be n cenifg 1 min 12000g.

Llan a je e ne nelle cenifgain ide 3 min 12000 g a alie

limine le ace dhanl. La clnne a enie lace dan n be de 1,5 mL, 200 L dea ile n aj e le be cenifg 1 min 8000 g. Enfin, la clnne a limine e le chanilln n cne 4C, aan la aliain de PCR de ificain dbenin de man.

La PCR la fin de la emie lecin eme de ifie lingain d lamide, en

ilian le amce de ificain d gne Tk0064 (TK0664 : AAA AAA CTC GAG CCC

GTC CA AGC TAC CAC TCC C (20 M); TK0664 d: AAA AAA CCC GGC TTC AAA ACC CAG

CCA AAC AAC ACC C (20M)).

La PCR la fin de la deime anfmain eme de ifie e le man a bien

ben gce ne diffence de la aille de amlicn la fme aage e me, a liliain damce cifie de gin hmlge emean la dble

ecmbinain lamidie (figure 20) (tableau 12). La cmiin d mi PCR e la

iane, chae chanilln : 40,5 L dea, 5 L de amn (5X Geen GTa ReaciOn

Bffe, Pmega), 1 L de dNTP (10 mM), 0,5 L de chae amce en e anien (20 M),

0,5 L de Ta lmae (5 U/mL) (GTa DNA Plmeae, Pmega) e 2 L dADN maice.

Le gamme damlificain ili e le ian : 95C endan 5 min, 30 ccle cmenan 40 95C, 40 53C, 2min30 72C, i 7 min 72C e 4C la

emae finale. Le di damlificain n enie be a leche

gel dagae 0,9%, cnenan d bme dhidim ne cncenain finale de 0,5 mg/mL (amn de migain : Ti 40 mM, H 8, acae 40 mM, EDTA 1 mM, H 8, TAE

1X). La migain a alie 90 V endan 30 min, aec de mae de aille : 1-kb ladde e 100 b-ladde (Pmega).

Fige 20: Pincipe de la PCR de ificaion de l'obenion de man

Tablea 12: Sence de amoce ilie po la ificaion de man Nom Séquence ’-’ Tm C Hydrogénases CoMbhUp ATGTAAATGTCCAGCAGGTAAGCCCA Co-MbhDo CAAGGTTTATTTGAGACTTTCTGTTTGATAC TC MbhUp GAGGTGCATGTTCTGTGCCCTATGT MbhDo CATTTTAAAAAGTGCAATATACTGTGAAGA ACT SHIUp GATTAATCCCTGGAGCTAATTTTTCTTTACG

SHIDo CGGGAATTAATGATTCATATATTAACAGTAC AG SHIIUp CCGGGCTAAATTTTTCACTTAGAATG SHIIDo CAATGAACATCATTTGTCCTTCGCCAC MbxUp CTTCATATACCTGCACCTCAGCGT MbxDo GGCTGTAACTTCTGTGGCCAGA T.bTERMP MPbUp ACCTCAGACATCTCTGCTGCTTG MPbDo GCCCCGATAAGTGCTGAAAGATACA

Le man n galemen ifi a anage (mhde de Sange), le anage a

ali a la ci Beckman Cle Genmic (UK).

I.d.4. Réalisation de stries sur TRM complémenté en Simvastatine

A benin de clnie milie de lecin cnenan le 6-MP, de ie n alie

milie TRM, fe clldal (0,5 g/L), cmlmen en Simaaine (2,5 g/mL) e milie TRM an anibiie. Ceci dan le b de ifie e ln a bien e la dble

ecmbinain e e le lamide aan la iance la Simaaine a bien dia. Le be ie n lace dan de jae anabie e incbe 85C endan 5 j (figure

21).

A le 5 j dincbain le clnie i e n dele niemen TRM n

eie dan 30 mL de TRM cmlmen en fe, e lace 85C endan ne ni.

Enie de eacin dADN gnmie (Ki Geneje, ThemFihe) ii dne PCR aec le amce de gne dle (tableau 12) n alie afin de ifie i la dlin a bien e lie (mme mhde e cdemmen dan la aie I.d.3. Extraction/purification de l’ADN génomique et vérification des mutants

Fige 21: Schma capilaif de la anfomaion che T. baophil Encad e : ape alie dan lenceine anaobie, Encad ble : ape de biologie molclaie, encad oge : ape de ceening de man TRM e TRM + Sim (aec la mhode de cone-lecion aec le 6-MP, cee ape ne pl indipenable)

I.e. Tests de croissance en milieu liquide

De e de ciance en milie TRM liide n enei afin de ifie la enibili a

6-MP de che T. kodakarensis, T. barophilus, T. barophilus inemdiaie (UPH1 ing), T. barophilus m (TERMP_00517 dl) e T. barophilus m inemdiaie

(TERMP_00517 dl e UPH1 ing). Le cncenain ilie n chiie dan

n emie em en e fan a aa de la blicain de Sanangel (Sanangel e al.,

2010), eln leel la cncenain inhibiice de 6-MP en milie lide che T. kodakarensis e de 10 M.

A ai de -cle de che die incbe e la ni 85C en milie TRM, de file cnenan le milie TRM (10 mL) e le diffene cncenain de 6-MP ee

(0 g/L (min), 50 g/L, 100 g/L, 250 g/L) n enemence 0,1% (ilica). Le file incle n lace le 85C, le ii de ciance a e faie diffen em

(0h, 3h, 6h, 9h, 12h) en lean chae fi 450 L de milie i en aj a 50

L de di de fiain PFA 5% (Paafmaldhde). Lae de fiain cendan la de la ciance e indienable, le dnmbemen e faian a cmie de fl

(Cfl Sace aec). La cmie de fl e ne echnie i eme nammen de faie dfile de aicle gande iee dan le faicea dn lae, afin de le dnmbe. Le maage de cellle cee ache de cmage e fai a Sbegeen (inecalan de lADN aan la caaci de flece UV). De dilin n alie and cela e nceaie (dilin en cacade ja millime : 990 L dea al, 10 L de cellle fie,

1 L de Sbegeen).

II. Caractérisation des mutants hydrogénases

II.a. Suivi de croissance des mutants hydrogènases sous pression

II.a.1. Préparation des seringues

Le cbe de ciance n alie en ilica dchanilln. P alie le cinie

ein, le labaie die de 5 incbae hae ein e hae emae. De

cle de man e min n a, 20 mL de TRM incl a 0,2 mL de cle incbe 85C la ni. Le lendemain ne cle faiche e ae ai de

TRM incl 10% a la cle de la eille, le einge n ae ai de cee cle faiche i cend a em 0h. Palablemen le einge n lane dan de file feme hemiemen e flhe la ame ga, de fan enlee lgne.

Le einge n ae ilemen imi de la flamme en cndiin ile, e feme hemiemen a n bchn en lne. Le einge n lace dan de incbae ein de ein de 0,1, 40 70 MPa, e ne emae de 85C,

endan 12 h. Un ii e ali a fiain de cellle dan de be de aafmaldhde

2% (50 L de aafmaldhde 450 L de cle). Le be n anal a cme

de fl (dilin a diime dan ne lin de NaCl 20 g/L).

II.a.. Mise en pression des incubateurs

Le LM2E de cin incbae hae ein e hae emae (figure 22), il

n en acie indable e n en dne e hae emae (T Indie). Le

me de cnle de la emae e amai a n bie lecnie andi e le

me de cnle de la ein e manel gce ne ale de ie.

P le iliain, n jin ie e lac dan la gge de lincbae. Un me de fle e ili le einge de 2,5 mL cnenan le cle, de fan le ce

l facilemen.

De lea dinie e ilie emli le incbae ; en faian bien aenin e de lea ne cle a dan le f.

Le cecle de lincbae e iinn cecemen e i aec le 6 c laide dne cl dnammie e de la ige mallie de mainien.

Lincbae fem e decend dcemen dan le f en le mainenan a niea de la

anne de lincbae e a a niea d manme.

Le biie lecie e mi enin, e le glage de la emae de cnigne n

ali a niea d glae mae.

Le incbae n enie mi ein, cela ne me manelle e cnnece

la anne de lincbae (ifie le niea dea de la me). La me e acinne dcemen aec le leie (en enan ai le ei dea e nn le manme) de fan faie mne la ein en eillan le manme de lincbae.

Aec le chaffage la ein a agmene denin 1 MPa 1C, il e nceaie danicie cee agmenain.

Le bine anne de lincbae e enie feme. La me e dcnnece de lincbae.

Le bn chaffage d biie lecie e acinn. La mne en ein e eille, e

i nceaie de diminin de ein n alie en an la anne de lincbae.

Une fi le ii cinie emin, le incbae n dei geiemen e

e. Le chaffage e ein, lincbae e le a niea de la anne e d

ne cl lae. La anne de lincbae e ee dcemen cnle la decene de ein. Lincbae e e aec la cl dnammie e la ige de mainien en dian le 6 c. La aie iee de lincbae e ie e iinne en ilibe

n ian file. Le bie lecie e mi h enin. Le einge n eie en faian aenin lea chade. Enie lincbae e iinn le 6 ian file.

Fige 22: Incbae hae peion/hae empae (Top Indie)

II.a.. Dénombrement cellulaire

Le dnmbemen de cellle a ali a cmie de fl (Cfl Sace, Paec). Ce aaeil e n diiif emean nammen de alie de cmage celllaie a decin de cellle aec n lae. Le maage de cellle a ali aec n agen inecalan de lADN, i flece UV, le SYBR Geen (Pmega). P lanale le

me chanilln n dil a 1/10 dan ne lin de H20 + NaCl (20 g/L) e 1 L de SYBR

Geen a aj. Paalllemen, le cellle n dnmbe a cmage a micce

en cellle de THOMA, an dilin (figure 23).

Fige 23: Schma capilaif de ape de ii de coiance o peion

II.a.. Contraintes liées à la pression

La cle hae ein indi de nmbee cnaine echnie. En effe le incbae hae ein ili ne emeen a de alie le cle dan le mme cndiin e ne incbain en e ein amhie.

T dabd, le cle dien e alie en einge ie ce lacin d in de cee denie i eme llain de la ein dan le milie. Ce mde de cle ne ceendan a idal le micganime anabie bligaie cmme T. barophilus

ie de change de ga n lie ae la ai en laie de einge e a niea d in. Il a dnc de ie dgnain d milie endan lincbain. Ce e dchange e ceendan nceaie limine le ga ie, cmme l H2S di a le micganime endan la cle.

Enie il e imible de alie n lemen en c dincbain. En effe ne ae de deiain e nceaie ce le einge e effece n lemen.

Le cellle ne een a e nea mie ein e incbe a la ie, la

aliain dn ii de ciance a eemle, ie la deiain a n imac le cellle. P alie de cinie de ciance, il e dnc nceaie dilie n incbae diffen chae em de lemen, ce i imlie e le diffen

in de la cinie cenden de cellle i nn a incbe eacemen dan le mme cndiin ie lincbae ai diffen.

Enfin le nmbe de einge a incbae en mme em e limi cae de la ce d clinde dn diame de 5 cm e de 50 cm de fnde de la chambe dincbain. Aini

ele 6 einge de 1 mL de 2,5 mL 2 einge de 20 mL een e incbe dan

n mme ace. De l le labaie die niemen de 5 incbae. Cela limie dnc le nmbe deai e de lica aliable ne mme eience.

Un nel il hebae a del a LM2E, en cllabain aec lindiel HP

em (figure 24). Un biace dn lme de 350 mL, an ne ein maimale de 1200 ba e ne emae de 100C, e fncinne en anabie. Il e d dne chambe dbeain in situ chambe dincbain, e eme de faie de cle en cnin ein e de lee diecemen le cle. Le me e ence en hae dimiain. Une fi laaeil imi il emeai de allie a ele incnnien de incbae T indie e facilie le cle hae ein

alie a LM2E.

Fige 24: Bioace HP em

II.b. Mesures d’hydrogène

II.b.1. Préparation des fioles

De file de cle d min e de diffen man n ae aec an fe.

Le file cniennen 20 mL de TRM, n die a flh dae e la hae liide

a d Na2S 10% (1%). Le lendemain de ie de file n incle, n ilica eia a ii de ciance celllaie (85C endan 72 h, aec de lemen e le 3 h j

12 h i e le 24 h j 72 h), 450 L n le e fie dan 50 L de glaaldhde. Le cmage e fen a cmie de fl. Lae ilica n de file de 20 mL de TRM, aec an fe eln la cndiin ee, ae de la mme fan lecein de la ein dan la file, i di e cnle e la fi ffiane

e dece a mic-GC, e la fi a lee ne a lendmmage. La ein dan la file di e ie ene 1000 e 2000 MBAR.

II.b.. Mesures au micro-GC

Le labaie die dn micchmagahe en hae gaee (mic-GC, MTI M200,

Agilen) (figure 25). Ce ne echnie de chimie analie emean la decin e la

anificain de cm en dan n chanilln gae. Un chmagahe e e dci cmme cm de 3 ni fncinnelle de bae inecnnece a de caillaie aan le an d ga le lng d me. Le ni emeen linjection dne

ani dnne dchanilln, la séparation de ece chimie ene e la détection en aal d me. Le mic-GC e i de de ie e de de dece cndcii hemie TCD (SRA inmen, Macl Eile, Fance) cl n cae de

ein. Le ie A e B n cme de clnne chaffe 100C e 80C leelle le ga ece n lagn e lhlim. Le ga ece ili dan cee anale, e lagn. Celi-ci eme de e le cm en dan la hae gaee e le dece. Le em dinjecin e de 30 n em danale de 160 (Jean Piee

Dnal, REM/GM). Le lgiciel de ilage e daciiin e SOPRANE (SRA inmen).

Fige 25: Mee a mico-GC

Re sultats

Chapitre I : Amélioration de l’outil génétique

I.a. Contexte de l’étude

Bien e lil del a labaie ai emi lbenin de man (Thiel e al., 2014), laaiin la fin de la ecnde ae de ecmbinain dne iime fme, aele fa

iif , bablemen d n mane defficaci de lanibiie de cne- lecin,

e blme. Ce fa iif cenden ne dble iance (Sim e 5-FA), al

e la ee d lamide l d deime nemen de ecmbinain, fai e le che deaien e Sim e FA. Dan le b de dimine ce a de fa iif (60-90%) e de

abde de lae de ceening de ce fa iif, i e ne ae chnhage (5 j);

n nea me de cne-lecin a en en ilian n ae mae : la 6- mhline 6-MP. La 6-MP e n analge de ine, i emche la fmain dacide ganlie ai de lacide adnlie, ce i dimine lincain dadnine dan lacide

ibnclie, inhiban aini la nhe d ibme (Lallie, 1965; Mille and Kemne,

1963). Che T. kodakarensis, la 6-MP e cnne cmme inhibie de ciance efficace, li

la ence d gne TK0664 (Sanangel e al., 2010). Ce gne cde lhanhine ganine hhibl anfeae. D ne chi dan cee de de emlace le gne pyrF a le gne TK0664 dan le ece naee e de ee lefficaci de la 6-MP la ciance de lie che de T. barophilus. N n mme demande cmmen

agie la che face la 6-MP (enible nn) ? Si elle e enible, cmmen la ende nn enible ? Le nea men de cne-lecin e il l efficace ? Lil ea--il

iliable en ine ?

I.b. Tests de sensibilité de T bahil MP sauvage à la 6-MP

Dan n emie em, de cinie de ciance n alie diffene cncenain de 6-MP ; afin de ifie la enibili de ne mdle dde T. barophilus la 6-mhline. Le cinie n alie 12 h la che T. barophilus MP e

cmae celle de la che T. kodakarensis KOD1 (dan le gne TK0664) enible cee dge.

Fige 26: Te de enibili la 6-MP de oche T. kodakaeni e T. baophil Cobe de coiance: T. kodakaeni KOD1 (A); e de T. baophil MP (B). Le oche on clie 85 C e 0.1 MPa dan d TRM conenan diffene concenaion de 6-MP: 0 M (),

10 M (▲), 50 M (), 100 M () and 250 M()

Le e de ciance n ali dan d milie TRM cmlmen aec diffene cncenain de 6-MP allan de 0 250 M de 6-MP (figure 26-B). La ciance de T. barophilus e e imace 10 M. D 50 M de 6-MP, n effe inhibie e iible aec n a de la ciance de 3 h 12 h mai ne eie ai de 24 h (dnne nn mne). Le mme effe e be de cncenain de 6-MP l imane (100 e 250 M).

P T. kodakarensis KOD1, la ciance an 6-MP dan le milie e de min, e eme dacie lalle de la cbe de ciance de T. kodakarensis, aec e diffene hae

(laence, enenielle, ainnaie) (figure 26-A). P ne cncenain de 50 M de 6-

MP aje dan le milie, ne deni celllaie l faible e al bee en cmaain aec le min. Ceendan ai d em 10h la ciance eend. A de cncenain de 100 e 250 M de 6-MP, n a de ciance celllaie e be, la deni celllaie e inchange e faible le 6 emie hee ; mai cmme cdemmen ne eie de ciance e bee 10h. La mlcle agi e emble de dendan. En effe la ciance de T. kodakarensis e l faible l la cncenain en 6-MP aje dan le milie de cle e imane. La che T. kodakarensis e dnc bien enible la 6-MP, mai lanibiie i ble la ciance celllaie dan n emie em ne emble l agi ai dn ceain mmen.

N an e la enibili la 6-MP de la che T. kodakarensis e lie a gne TK0664

i cde lhanhine ganine hhiblanfeae.

T. barophilus ne a ai enible la 6-mhline, mme i le enage d gnme de la che a mi en idence le gne TERMP_00517 cdan cmme TK0664 lhanhine ganine hhlanfeae (Vannie e al., 2011). Le gne TK0664 de

214 aa al e TERMP_00517 en de 215 aa, il eie ene e 80,5% dideni e 90,2% de ence ie imilaie, il e dnc ible e ce gne TERMP_00517 dnne cee

elaie enibili T. barophilus. P e la cne-lecin fncinne de manie

imale, il fa ne che nn enible la 6-MP ; ce i la dlin d gne a

alie. Une emie ae de cncin d lamide an le gne TK0664 a ali

(UPH), i la anfmain de T. barophilus a ce lamide an en l le gin hmlgie d gne dle (gne TERMP_00517). Le T. barophilus m (TERMP_00517) e T. barophilus m inemdiaie (TERMP_00517 ::UPH-1) emen de cncle

an limac d gne TERMP_00517 le 6-MP.

I.c. Construction de T bahil TERMP

La cncin d lamide UPH1 (figure 27) a bene, celi-ci cnien bien le gne de enibili la 6-MP de T. kodakarensis : Tk0664 (cnle a PCR de ificain), le gne

HMG-CA e le gin dhmlgie de gin flanane d gne dle, ici TERMP-

00517. La anfmain de T. barophilus a celi-ci a dnc e eneie (figure

28).

Ce emie aail a cni beni le che T. barophilus m e T. barophilus m inemdiaie (cncin T. barophilus m TERMP_00517 anfm a UPH1). T. barophilus m (TERMP_00517) ben l de la deime ae de lecin ne de

l le lamide, la dlin d gne hmlge Tk0664 de T. barophilus : TERMP_00517 a e lie; ce i a emi de i i le fai denlee ce gne a de ecin la ciance en ence de 6-MP. Enfin la cncin Tb m (TERMP_00517) inemdiaie le

lamide UPH1 a ing dan le chmme, eme de i leffe de TK0664 el.

Fige 27: Concion d plamide pUPH C PH. L I-6MPK SI-6MPKD TK0664 T. KOD1. P, TK0664 FH SI (S) I () , , PH F TK0664. L BHI (B) KI (K) PH.

Fige 28: Schma eplicaif de l'oil gnie amlio Eemple de la dlion d gne TERMP_00517. Le plamide pUPH-1 a coni pa ligaion de gion flanane en amon e en aal d gne TERMP_00517 dan pUPHe ili po anfome T. baophil MP. Ap le pemie nemen de ecombinaion (pop-in), le cellle conenan le plamide ing on lecionn n milie aec de la Simaaine (in). La pemie paie damoce 1 a ilie po eifie lingaion d plamide cee ape. Enie le cellle inemdiaie on ale n milie complmen en 6-MP po pemee le deime nelmen de ecombinaion (pop- o), coepondan leciion d plamide. Enainan aini de fome poible la dlion d gne o le gnope WT, dpendan d ie de ecombinaion. Le amoce 2 e 3 on ilie po alide le man oben.

I.d. Résultats de la transformation de T bahil MP par le plasmide pUPH1

A la fin de la anfmain une première sélection iie a la Simaaine a lie, aini n alemen milie TRM cmlmen en Simaaine e ali. A cee ae i le che n ing le lamide ; elles doivent être Simvastatine résistantes et 6MP sensibles (figure 28). De clnie (enin ne enaine) n bene a le 5 j dincbain e n emi ne ni en cle liide. Le gel de ificain (figure 29-

A) effec la ie de eacin dADN gnmie e de la PCR aec le amce de

TK0664, ai de ce clnie n mn e le lamide aai bien ing dan le chmme de anfman; ne bande e bee 819 b, ce i cend bien la

aille d gne TK0664 (819 b). Le man T. barophilus inemdiaie n bien ben e n ili le de de cinie afin de i i le gne a T. barophilus cnfe ne enibili a 6-MP.

A la emie lecin, 50 L de cle liide n enemenc n milie TRM

lide cmlmen a 100 M de 6-MP. Le alemen 6-MP i cenden la deuxième étape de la sélection e i emlacen liliain d 5-FOA, n cnclan, aec n nmbe de clne ben iman (100 clnie). En effe le che i en

cee ae 6-MP n 6-MP résistante ce i ien de dmn e nmalemen

Simvastatine sensible ; ielle n nmalemen ed le lamide.

Afin de ifie e le lamide e bien aben e e le gne TERMP_00517 a bien dl, des stries n alie TRM e TRM/Sim. De clnie n bene TRM e

TRM/Sim, ce n dnc de fa iif (30%), elle n iane le Simaaine al

ne fi le lamide ed elle deai edeeni enible la Simaaine cmme elle ne

den l le gne HMG-CoA. On ne inee a clnie an dele

TRM e a Simaaine (70%). Mai a ificain, de ADN gnmie eneie

ifie i n bien la fme aage dan j le gne cible, a cnaie la fme dle aende, le PCR alie aec le amce d gne TK0664 nn a mn damlificain de celi-ci la che anfme bene (acne bande ne ialie

819 b) e a cne le la de la ificain aec le amce d gne TERMP_00517

n l ne bande 1000 b e an amlificain eeciemen le de aie damce ilie la ificain, (figure 29-B) la che anfme, ce i cend la aille de gin dhmlgie ilie dle le gne ; ce i indie

e le gne a bien dl. Sinn la aille d fagmen amlifi aai de 1693 b e de

250 b eeciemen le de aie damce; ce e n an beni aec le

min iif de T. barophilus i de le gne TERMP_0051 7 (figure 29-B).

La che T. barophilus anfme ne dan l le gne TERMP_00517 a bien

bene, le cinie de ciance n dnc e eneie cee che afin de

ifie a enibili la 6-MP. De l elle a e ilie le dlin de gne dadaain a hae ein hdaie an cainde ne inefence d gne

100

hmlge TK0664.

Fige 29: Gel de ificaion de la anfomaion M PCR . (A) A TK0664 I-6MPK SI-6MPKD (P 1, F 29-A) PH T. (, 819). (B) L TERM00517 -6MPB -6MPBD (1 3) 6MPBM 6MPBMD ( 2 4).

I.e.Tests de sensibilité des souches mutées Le mme cle e le emie e de enibili a 6-MP, a effec le de man ben : T. barophilus TERMP_00517 e TERMP_00517 ::UPH-1.

Une cle dan d TRM cmlmen aec de cncenain de 0 250 M de 6-MP.

T. barophilus me a bene ie a ecnd ceening a le 6-MP, ce che ne

den l le lamide, elle ne n dnc l enible la 6-MP, de l ie la

anfmain a le lamide UPH1, elle ne den l le gne hmlge

TK0664 :TERMP_00517 celi-ci aan dl. Ce i eme de i i ce gne a ne inflence la ciance en ence de 6-MP.

101

Fige 30: Te de enibili de man oben Cobe de coiance: T. baophil TERMP_00517 (A); and T. baophil TERMP_00517::pUPH- 1 (B). Le oche on clie 85 C e 0.1 MPa dan d TRM Conenan diffene concenaion de 6-MP: 0 M (),10 M (▲), 50 M (), 100 M () and 250 M().

102

La ciance ne a inflence a la 6-MP. Le la n diffen de ce ben aec la che T. barophilus (figure 30-A) i elle de le gne TERMP_00517, n

ei effe de ai be, la deni celllaie ai l faible en fncin de la cncenain de 6-MP aje a milie de cle. Aini le gne TERMP_00517 indiai ne lge enibili la 6-MP. Le aa eni de dlin de gne dadaain a hae

ein hdaie, en dnc ali aec cee che T. barophilus me ende inenible la 6-MP.

T. barophilus m inemdiaie e ben a anfmain de T. barophilus m a

UPH1. La che ne de l le gne TERMP_00517, mai la fin de la emie

ecmbinain, elle de le gne Tk0664 (ingain d lamide). T. barophilus me inemdiaie e dnc end enible la 6-MP. Acne ciance ne bee le fe cncenain de 6-MP aje dan le milie (50 M, 100 M e 250 M), 10 M de 6-MP le fil de ciance e diffen. Malg le fai e le gne TERMP_00517 ne i

l en la enibili emble l imane en ence de ce gne. Pan ce gne

i e n hmlge de Tk0664 aai mn da le la cden n ceain effe de enibili de la che la 6-MP (effe de l de la cinie de T. barophilus ) (figure

26-b).

I.f. Efficacité du nouveau marqueur de sélection

A la fin de de ae de ecmbinain, de ibili n eniage, la fme aage,

la main na a e lie, la che dle an le gne din. De PCR n

alie afin de ifie e le gne a bien dl. O aec la lecin a 5-FA, ne

iime fme aele fa iif e ible. Cee fme cnien j le lamide, e e dnc dblemen iane, il e dnc nceaie de ifie labence d lamide dan le gnme. Une denie ae ai dnc alie aec lancienne mhde, n ceening

TRM e TRM cmlmen a de la Simaaine. Le che i ne cniennen l le

lamide n enible la Simaaine, elle ne e delen e le TRM nn cmlmen. Sel le fa iif e delen le de milie.

103

N an dnc afin de alide nn, lefficaci de la nelle mhde, cma le a de FP ben: aec le 5-FA le 726 clne e, 625 n de fa iif. Le emie manilain dcie cdemmen (benin de T.bTERMP_00517) n dnn n a de fa if de 37%. Aec le cncin alie aec le nel il (TERMP_00517 e 6-MP) 326 clne e, acn FP ne n ben.

I.g. Conclusion de l’étude

Lbjecif de cee de ai de e ne alenaie a mae de cne lecin 5-FA

i enai de nmbe daanage le lan aie : fe cncenain dan le milie (0,8%), nn lbili dan le milie emae ambiane, diminin d H ne fi celi-ci di dan le milie, an blie ne incnnien maje dan la cne

lecin le f a de fa iif (Sim ian e 5-FA ian).

T dabd le anfmain T. barophilus a le lamide UPH-1, an le gne de

enibili la 6-MP : TK0664, n emi de ene enible la 6-MP la che, ie el

ne lge enibili aai mie en idence la che WT l de emie e de

enibili. Cee enibili a e mie en idence a le ii de ciance effece aec diffene cncenain de 6-MP.

Aini la ie de manilain T. barophilus, la 6-MP e e ilie cmme mae de cne-lecin.

Ce cinie e la cain d man T. barophilus TERMP_00517 n galemen emi de e limlicain d gne TERMP_00517 (hmlge de TK0664 che T. barophilus) dan la enibili de la che a 6-MP. Pie ne fi dl, T. barophilus deien cmlemen inenible la 6-MP e ce e ime la de danibiie ene dan le milie. Aini le de eni, la che de T. barophilus m (T. barophilus

TERMP_00517) ea ilie ie e inefence de ce gne l de la cne-

lecin.

104

Enfin en ce i cncene lefficaci de cee nelle mhde, la fin de nemen de

lecin a la Simaaine i a la 6-MP, le a de fa iif ne e de 37% cne

60-90% ben a le 5-FA. Lbjecif emie e dnc emli ie le a de fa iif e neemen dimin.

Lil e acellemen ili en ine a labaie. Celi-ci e ili dan dae

je, nammen lANR CASPAR, dn le b e de dce le le hilgie de de ibnclae majee de e -CASP, aCPSF1 e aRNaeJ cne che le ache, en aaillan de mdle P. abyssi e T. barophilus.

La dlin de gne dadaain a hae ein hdaie. Le dlin de cle de gne effece e n ae le la de ancimie de Paline

Vannie l de a he (Vannie, 2012) ceain gne aien / eim en fncin de aiain de ein.

105

Chapitre 2 : Obtention et caractérisation des mutants hydrogénases

II.a. Construction des mutants hydrogénases

II.a.1. Contexte de l’étude

Pa la ie, n an ili lil gnie dci dan le chaie 1, afin dafndi ne

hmaie lie la che ihile T. barophilus, ai le mcanime mi en e

a cee che adae la ein hdaie. Le aail e fcali le hdgnae, ie le de de ancimie liminaie n mn de aiain de leein de ce gne en fncin de la ein (Vannie, 2012). Un ceain nmbe de man n ben : i hdgnae membanaie : man de mbh (mbh), man de Mbh-Cdh (co-mbh) e man de Mb (mbx), e de clie : man de SHI

(shI) e man de SHII (shII), aini n dble man dl mbh e mbh-codh

(mbh/co-mbh). La cncin de man e i afin de cmende a mie le fncinnemen de ce hdgnae e le ible ineenin dan ladaain la

ein.

Le diffen e dhdgnae n cd a de cle de gne idenifi dan le gnme de T. barophilus ie n enage cmle (Vannie, 2012; Vannie e al., 2011).

Le hdgnae cible l de cee de n :

M-Mbh (Membane bnd hdgenae) cde a de cle TERMP_01498-85 e

TERMP_01484-71, M-Mb (Membane bnd idedcae) cde a TERMP_00965-

53, SHI (Slfhdgenae I) cde a TERMP_00539-36, SHII (Slfhdgenae II) cde

a TERMP_0067-70 e M-Mbh-Cdh (mnde de cabne hdgnae), caable dde le mnde de cabne, cde a TERMP_01154639 (tableau 13).

Liliain de lil gnie dci dan le emie chaie a emi la dlin de

lie cle e la cain de man (figure 31 et tableau 13).

106

Fige 31: Le hdognae cible dan cee de dap (Moon e al., 2015; Sch e al., 2012; Vannie, 2012) Le hdognae membanaie Mbh (en oange) e Mbh-Codh (en e) on cible, loidodcae Mb (en ble), e le de hdognae coolie SHI e SHII (en oge).

Tablea 13: Cle hdognae di dan cee de Hydrogénase Gènes codants Gènes délétés Mrp-Mbh TERMP TERMP TERMP SHI TERMP TERMP SHII TERMP TERMP Mrp-Mbh-Codh TERMP TERMP Mrp-Mbx TERMP TERMP

De PCR n alie afin de ifie, e le man ben n bien bi la dlin de gne cible e il ne cniennen a le lamide ili l de la anfmain. La aille de amlicn aende aec liliain de amce e ene dan le ablea (tableau

14).

107

Tablea 14: Taille de amplicon aend Mutants Taille WT pb Taille mutant pb Mutant mbh mbh Mutant mbhcodh combh Mutant shI shI Mutant shII shII Mutant mb mb

Le la aend a leche de di PCR n en ci-a.

II.a.2. Obtention des mutants

II.a.2.a. Obtention du mutant mbh (mbh)

Fige 32: Gel de ificaion de man mbh

Le gel dleche ben a migain de di PCR la ificain de man mbh (mbh) e en la fige (figure 32).

Afin de alide la PCR, lie min n ali. Un emie min ngaif, dan leel lADN a emlac a de lea, eme de ifie labence damlificain en abence dADN e dnc labence de cnaminan dan le di ili alie la

PCR. Le ecnd min ngaif cnien de lADN lamidie ili la dlin d cmlee ABC, imli dan le an d male. Ce min eme de alide labence

108

damlificain acifie, ce--die lamlificain de gne nn cibl a le amce

ilie.

Un min iif a galemen ali. Il cnien de lADN lamidie ili la cain de man. Il eme aini de ifie e le amce n cifie e emeen bien damlifie le gne cibl, ce--die la ence cendane la fin de gin flanane ie de a e dae d cle de gne dl.

Labence de bande, e aini labence de di damlificain le min ngaif, e n amlicn cendan la aille aende le min iif de chae man. Le

min n dnc alid e le la ben een e ine.

P chacn de man e, n cnae la ence dne bande cendan n amlicn dne aille glbalemen cmie ene 400 e 500 b, a cmaain aec le mae de aille. Cela cend bien a di damlificain aend la fme mane i e de 458 b, dnc le cellle bene n bien de man mbh.

II.a.2.b. Obtention des mutants hI (hI) et hII (hII)

Fige 33: Gel de ificaion de man hI e hII

La fige mne le la ben a migain la ificain de lbenin de

109

man shI e shII (figure 33). Le min n idenie ce ili le man mbh e il n alid de la mme fan. Le la n dnc eliable.

P chae man shI e shII, ne bande e bee, ie 400 b. De l, n i

e le bande shII n l bae le gel e cenden n fagmen l c, a

a shI. Cela cncide bien aec le aille de fagmen aend ie la aille de amlicn aende le man shII e de 367 b e de 466 b shI. Ce la cnfimen lbenin de man shI e shII.

II.a.2.c.Obtention du mutant mbhcdh (cmbh) et du double mutant

mbhmbhcdh (mbh/cmbh)

Fige 34: Gel de ificaion d man co-mbh e d doble man mbh/co-mbh

Le la de la PCR de ificain d man co-mbh e d dble man mbh/co- mbh n en la fige (figure 34).

Le min ngaif cee PCR n diffen de cden. Le min cnien de lADN de cellle alablemen ilie faie la main mai aan idenifie cmme nn mane, il a dnc bien abence damlificain. Cmme cdemmen, le

min iif e ali aec lADN lamidie ili la anfmain. Une

110

amlificain e bee, le min e dnc alide e le la ineable.

P le man co-mbh, ne bande e ene enin 400 b, ce i cend la aille aende de 480 b. Le cellle n dnc bien bi la main.

Un dble man a galemen c a liliain de cellle mane mbh anfme aec le lamide co-mbh. On bee lamlificain dn fagmen de mme aille e

co-mbh e le min iif, lbenin d dble man mbh/co-mbh e dnc cnfime.

II.a.2.d. Obtention du mutant mb (mb)

Fige 35: Gel de ificaion de l'obenion d man mb

Le la de la PCR de ificain d man mbx n en la fige (figure

35). Le min ngaif cee PCR n diffen de cden. Le min cnien de lADN de cellle alablemen ilie faie la main mai aan idenifie cmme nn mane, il a dnc bien abence damlificain. Ici, le min iif na a

ali aec lADN lamidie ili la anfmain. Une amlificain a bee

le i man e, aec ne aille de 1000 b, ce i cend bien la aille aende la che mane.

111

II.a.3. Vérification de l’absence du plasmide

Pa aille, labence d lamide linie de cellle a galemen ifie en alian

ne PCR aec de amce cifie d gne Tk0664 le man. Ce la ne

n a en ici mai labence damlificain a cnfim e le lamide nai a

en.

Lenemble de ce la cnfime e le man mbh, shI, shII, Co-Mbh e le dble man mbh/co-mbh n bien ben.

Lae iane a cni caacie ce man en alian de cinie de ciance e de dage dH2, afin ddie le le de gne dl.

II.a.4. Conclusion de l’étude

Lenemble de man cibl n ben, ifi a PCR dan n emie em cmme ln mn le la cden, i a enage (mhde de Sange, Beckman

Cle Genmic (UK)).

Le emie man ben ai mbh, co-mbh, shI, shII n caaci a de cle ein 0,1MPa, 40MPa e 70MPa, aini e a n dage dhdgne

ein amhie. Le emie la ben en en dan la deime

aie d chaie 2.

En ce i cncene le man ben ai mbx e le dble man mbh/co-mbh, le mme aa de caaciain en alie afin dai ne ne cmle d mablime de hdgnae 0,1 MPa e ein. Le b an de i cmae ce mablime aec dae Thermoccoccales de de emblable n mene, mai

galemen dan le ca de ne che ihile ddie le le ein e le

enel imlicain dan ladaain la ein.

Mai le aail de cncin de man dan cee aie : hdgnae e imlicain de celle-ci dan ladaain a hae ein hdaie ee cmle. En effe cncenan le man mbx, ce cle cnien de fi 14 gne, la ali a dle dan cee de mai il eai inean de dle amen le de aie afin de i le le

112

de chae cle indendemmen. P le ae man co-mbh, shI et shII le 16 gne e 4 gne eeciemen n dl.

Il ai galemen e inean de cnine cnie de dble man cmme il a fai le dble man mbh/co-mbh. Aini le dble man shI/shII,

shI/mbh, shI/co-bh, shII/mbh, shII/co-mbh n eniage cmlmene lde.

Enfin le glae anciinnel SR e galemen cibl. De enaie dbenin d man n alie, mai le mmen elle n ee infcee. Il e bable

e le blme i li lganiain d gnme a de lORF surR aec ne ne de cheachemen ene le gne. Un ae lamide a dnc cni ne dlin

aielle de SR.

Une fi le nea lamide ben, il ea ili anfme T. barophilus. Ean dnn limance d fe dan le mablime de hdgnae, e le fai e SR i ligine de cee glain, de ce baclemen ene le hdgnae dcice H2 e celle

dcice dH2S, lbenin de ce man eai inean i i le mablime de hdgnae fncinne imilaiemen a ae Thermococcales che ne che mdle.

Le ciance ein emeaien ddie le fncinnemen de ce glae

ein.

113

II.b. Caractérisation des mutants hydrogénases

II.b.1. Contexte de l’étude

Une fois les mutants obtenus, nous avons décidé de les caractériser physiologiquement par deux approches, dans le but de comprendre le fonctionnement des hydrogénases chez T. barophilus, mai galemen den aende daanage le ible imlicain dan ladaain a HPH.

T dabd des cultures sous pression ont été réalisées, avec les incubateurs de hautes pressions et hautes températures. Une période de mise au point des cultures a été nécessaire

(iliain dn dce ie lgne dan le milie, aille de eingues, méthode de comptage), afin dbeni des résultats les plus répétables possibles.

Pour une même température (85°C), différentes conditions de pressions ont été testées : 0,1

MPa, 40 MPa et 70 MPa, en se référant aux études transcriptomiques antérieures (Vannie,

2012; Vannie e al., 2015). 40 MPa correspond à la pression optimale de la souche, celle-ci ayant été découverte au niveau de la dorsale médio-Atlantique à 3550 m de profondeur. 0,1 et

70 MPa sont des pressions où la souche se développe, mais qui peuvent engendrer un stress, et possiblement une réponse métabolique différente, permettant la che de adae.

Le gne cibl n ce cdan le hdgnae, dn leein est modulée par les variations de pression, notamment sur-exprimés pour des conditions de pressions éloignées de son optimum (Vannie, 2012). Nous voulions voir si le fait dai dl ce gne, allait avoir une influence sur la croissance de la souche en fonction de la pression; et ainsi en déduire

ne ible imlicain dn lie cle de gne dan ladaain la ein.

Comme le soufre a une influence certaine sur le métabolisme des hydrogénases, les cultures ont été réalisées dans les deux conditions : avec ou sans soufre.

Dans un deuxième temps, des mesures de la production d’hydrogène ont été entreprises. Une période de mise au point de la méthode a également été nécessaire, où des cultures avec/sans soufre ont été réalisées.

II.b.2. Résultats des croissances des mutants hydrogénases sous pression

114

II.b.2.a. Croissances à 0,1 MPa

Dans un premier temps, nous voulions voir la croissance des mutants à pression atmosphé- rique (0,1 MPa) (figure 36).

Les souches T. barophilus sauvage et le mutant (T.bTERMP_00517), nous servent de témoin pour apprécier une croissance standard de T. barophilus, et constitue un élément de compa- raison avec les croissances obtenues pour les mutants (mbh, co-mbh, shI, shII).

Fige 36: Coiance de man hdognae 0,1 MPa aec e an ofe Le oche die pendan le ii de coiance : co-mbh (ble clai), mbh (oange), Tmoin TERMP_00517 (oge), hI (mae), hII (e), Tmoin T. baophil WT (ble fonc) * : ead de coiance e diminion de la deni celllaie po le man mbh

A 0,1 MPa et en présence de soufre, le ciance n emblable lenemble de man e de min, n bee ne ciance enenielle e n laea aein a alen de 12 h de cle aec ne cncenain celllaie finale che de 107 cell/mL. A

0,1 MPa aec fe, le ciance de man mbh e co-mbh n lgemen l faible, mai le a de ciance n de 2,3 e 2,1 h eeciemen ; e de 2,5 h la che

aage. On e dnc die e le ciance n imilaie le diffene che. Ce higamme e ein amhie e aec fe, le hdgnae dle nenainen a de diffence ignificaie e nenen a dan le delemen de T. barophilus.

Le cle ene dan lhigamme de die, sans soufre, n diffene, la

115

ciance e l lene. En effe le laea e aein elemen a b de 36 h, cne 12 h aec fe dan le milie. En eanche i le delemen e aleni, la cncenain celllaie finale e emblable celle bene cdemmen.

Ce che enen dnc n delemen celllaie iniial l len en abence de fe, e aeignen finalemen le mme a de ciance. Pa aille, la diffence e de

niemen a aame fe, e nn a a main, ie le man enen

ne ciance dalle imilaie a min.

Cee beain ne alie a a man mbh (mbh). Ce cellle enen n em de laence de 12 h, endan leel il n a a de delemen, i la ciance e enenielle mai l faible e la che aage e le ae man.

Il semble que les deux clusters délétés de Mbh soient impliqués dans la croissance de T. à 0,1 MPa, en absence de soufre.

II.b.2.b. Croissances à 40 MPa et 70 MPa

Nous avons testé la croissance sous pression des mêmes souches afin de comparer, mais sur des temps plus courts: un suivi de croissance de 12 h avec des points de cinétique réalisés tous les 3 h. Un el min e ali ici, il agi de la che TERMP_00517, placé dans chaque incubateur pour toutes les croissances entreprises. Dan le ca acne ciance ne b- tenue pour le témoin, la manilain ne a alable.

Rappelons que 40 MPa, correspond à la pression optimale de croissance de la souche T. barophilus, e e 70 MPa e ne ein a-imale. Le ciance bene 40 MPa,

eflen dnc nmalemen le fncinnemen imal d mablime de T. barophilus,

116

e 70 MPa lina de la ein de 0,1 MPa, ne cndiin de e.

Croissance à 40 MPa, avec soufre Croissance à 40 MPa, sans soufre 1,00E+08 1,00E+08 1) - 1) -

1,00E+07 1,00E+07

1,00E+06 1,00E+06 Densité Densité cellulaire (cell.mL Densité Densité cellulaire (cell.mL 1,00E+05 1,00E+05 0 3 6 9 12 0 3 6 9 12 Temps (Heure) Temps (Heure)

Fige 37: Coiance de man hdognae 40 MPa, aec e an ofe co-mbh (ble clai), mbh (oange), Tmoin TERMP_00517 (oge), hI (mae), hII (e)

Croissance à 70 MPa, avec soufre Croissance à 70 MPa, sans soufre 1,00E+08 1,00E+08 1) 1) - -

1,00E+07 1,00E+07

1,00E+06 1,00E+06 Densité Densité cellulaire (cell.mL Densité Densité cellulaire (cell.mL 1,00E+05 1,00E+05 0 3 6 9 12 0 3 6 9 12 Temps (Heure) Temps (Heure)

Fige 38: Coiance de man hdognae 70 MPa, aec e an ofe co-mbh (ble clai), mbh (oange), Tmoin TERMP_00517 (oge), hI (mae), hII (e)

A 40 MPa et 70 MPa en présence et en absence de soufre, on observe une croissance du mutant

TERMP_00517 (figure 37 et 38), présent dans toutes les manipulations sous pression que nous avons entreprises, il sert de témoin de croissance.

117

Pour les deux pressions testées, en présence de soufre (figure 37), on remarque une croissance proche de celle du témoin pour les mutants des hydrogénases cytosoliques (shI et

shII), et au contraire une croissance plus faible pour les hydrogénases membranaires (mbh et co-mbh). En absence de soufre pour les deux pressions testées (figure 38), les mêmes conclusions peuvent être faites, les mutants hydrogénases cytosoliques présentent une croissance, même si le mutant shII (qui correspond au shI de P. furiosus) a une croissance plus faible que le mutant shI (qui correspond au shII de P. furiosus), et les mutants hydrogénases membranaires mbh et co-mbh, ont une croissance très faible à 40 MPa et 70 MPa sans soufre.

L’ hydrogénase membranaire Mbh a possiblement un rôle pour la croissance de

T. barophilus, pour toutes les pressions testées, que ce soit l’optimum (40 MPa) ou les conditions sub et supra-optimales (0,1 et 70 MPa). La différence notable est que pour la pression de 0,1 MPa, en présence de soufre, le mutant mbh ne a imac, mai pour des plus fortes pressions de 40 et 70 MPa, le mutant a une croissance impactée avec et sans soufre. Il serait donc intéressant de voir le comportement du mutant de lhdgnae

Mbx pour les différentes pressions. Mbx fonctionne peut être seulement en présence de soufre, pour de faible pression.

Alors que le mutant co-mbh présente une croissance non impactée à 0,1 MPa, on remarque que pour des pressions plus élévées, la présence de lhdgnae Mbh-Codh semble plus importante pour la croissance de T. barophilus.

Pour lhdgnae SHII, son absence ne semble pas importante à 0,1 MPa, pourtant pour des pressions plus élévées, notamment à 40 et 70 MPa sans soufre, son absence semble entrainer un défaut de croissance.

Lhdgnae SHI ne semble pas quant à elle, avoir de rôle dans la croissance de la souche et ce pour toutes les conditions de pression et de soufre testées.

II.b.3. Résultats de la production d’hydrogène des mutants hydrogénases

De ii de la dcin dH2 a le man n ali a chmagahie en hae

118

gaee. En aallle n ii de ciance a effec. A chae em, n dnc ali:

ne mee de la dcin dH2 e n lemen de cellle i ea fie e cme. De cinie 12 h n dabd alie le min e le man; mai acne

dcin de ga nai dece, n an dnc agmen le em de cinie, aec la

aliain de in de cinie, ai d em 24 h. En ce i cncene laj de fe dan le milie, n an a alable ali de mee d min (TERMP_00517) aec

ne cncenain de 1 g/L de fe e an fe. Le la de dcin dH2 n dnn de meille la aec d fe dan le milie. Ce i e nnan ie la dcin dhdgne a le hdgnae, e fai nmalemen an fe. N an dnc ali

ne gamme de fe (0 1,5 g/L), afin dimie la ani de fe ilie. La ani de 0,5 g/L a chiie ielle dnnai le meille a de dcin e le meille

endemen celllaie. Mai il ea nceaie de alie, de mee de la dcin dH2 e

galemen dH2S le min e lenemble de man, aec de ani de fe de 0,

0,5, 1 e 2 g/L. Dan n emie em en ian le mme cle ein amhie e i ible a la ie ein (40 e 70 MPa).

P le mmen la cndiin ee e n ii de ciance e de dcin dH2 d min

TERMP_00517 e de man (mbh, co-mbh, shI, shII e mbx) 72h, aec fe

(0,5 g/L), ein amhie.

Gahie 0,1 MPa aec fe (figure 39)

Le la ben mnen n lge ead de ciance e de endemen celllaie le man mbx (figure 39). La ciance de min e de ae man e emblable, ce la e en accd aec la cdene ciance bene 0,1 MPa e aec d fe

(figure 36). Cela e elie a le fai e lhdgnae la l imane dan la ciance an fe e Mbh, ce i elie e le man mbh ene n dfa de ciance an fe mai a le ae man; e aec fe, ce Mb i e lhdgnae la l imane, ce i elie aec d fe, el le man mbx

ene n dfa de ciance. Ce hhe n en accd aec la glain d

119

mablime de lhdgne a le fe.

En ce i cncene la dcin dH2, celle-ci e ineiane le man mbh e mbx.

Une dcin dH2 (de 0h 72h) e mie en idence le min, shI, shII et co- mbh (dcin l faible) (figure 39); cela e elie a ne dcin baale dH2,

e-e die a lhdgnae Mbh. Mai dan ce ca le man mbx, deai galemen

die ne ani emblable dhdgne, ce i ne a le ca ici. De l nmalemen en ence de fe, ce ne dcin dH2S i e me en lace, a laciain de Mb.

Mai cmme n mme ici dan ne cndiin de ein b-imale e e e le mablime fncinne diffemen en ain de ce e.

Fige 39: Pocenage de podcion d'hdogne pa le man e ii de le coiance Tmoin TERMP_00517 (oge)co-mbh (ble clai), mbh (oange), , hI (mae), hII (e), mb (maon)

120

II.b.4. Discussion et conclusion de l’étude

II.b.4.a. Croissance des mutants hydrogénases et production d’H2 à 0,1MPa

En fonction des conditions de culture avec/sans soufre, chez de nombreuses Thermococcales, un shift a été mis en évidence. Sans soufre les hydrogénases Mbh, SHI et SHII permettent la

dcin dhdgne. Un hif aide, de ele mine, e produit quand du soufre est aj en fae de hdgnae imlie dan la fmain dH2S, notamment Mbx. La réponse serait contrôlée par le régulateur transcriptionnel SurR (Licmb e al., 2009).

Sans soufre

En absence de soufre, la croissance est ralentie et diminuée pour le mutant mbh. Mbh e lhdgnae membanaie inciale i eme la dcin dH2. Il semble que les deux clusters mbh délétés chez le mutant mbh soient impliqués dans la croissance de T. barophilus à 0,1 MPa en absence de soufre. De précédentes études n mn limance des Mbh chez les Thermococcales (P. furiosus (Saa e al., 2000, 2003), T. kodakarensis

(Kanai e al., 2005; Sanangel e al., 2011)) pour le développement en absence de soufre (pas de ciance e dcin dimine dhdgne). Par exemple le mutant TSS1103 (délété pour Mbh TK2080-2093) de T. kodakarensis (Sanangel e al., 2011) où Mbh est indienable la dcin dH2 et pour une croissance sans soufre. Chez P. furiosus, des mutants mbhL, SHI/SHII, SHI/SHII/mbhL ont été réalisés (Sch e al., 2012), en absence de soufre il a été monré que les mutants mbhL et SHI/SHII/mbhL ne présentaient pas de croissance, par contre le mutant SHI/SHII a une croissance similaire au témoin ; et en présence de soufre, une croissance semblable pour toutes les souches est obtenue. Ce qui confirme le rôle de Mbh dans la croissance en absence de soufre et le fait que la compensation par les hydrogénases cytosoliques en ce qui concerne la croissance cellulaire ne soit pas possible; linee e an ai.

Comme chez T. kodakarensis et P. furiosus, nos résultats suggèrent le rôle important de lhydrogénase Mbh e iblemen n le dan ladaain de T. barophilus quand la pression est sub-optimale. Aucune autre hydrogénase fonctionnant sans soufre ne semble prendre le relais et compenser la perte de mbh.

121

En ce i cncene la dcin dH2, le mutant TSS1103 de T. kodakarensis ne produit pas dH2 sans soufre (Sanangel e al., 2011), le même constat a été fait chez P. furious (Sch e al., 2012) où sans soufre dans le milieu, les mutants de délétion mbhL/SHI/SHII et mbhL ne

dien a dhdgne a cne le man SHI/SHII di ne ani dH2 compa- rable au témoin. Il eai inean de ee la dcin dH2 du mutant mbh de T. barophilus, les tests sont à refaire avec soufre mais surtout en condition sans soufre.

Chez T. barophilus, lde de Mbh n eme donc de conclure de son importance dans la culture sans soufre, puisque un retard de croissance est observé pour le mutant mbh. Cepen- dan limance che dae Thermococcales comme P. furiosus et T. kodakarensis semble plus marquée, iacne ciance ne bee quand Mbh est délété, et la production dH2 est inexistante chez ces souches mutées (Sanangel e al., 2011; Sch e al., 2012).

Lde dea e cmle a ne de de la dcin dH2 des souches mutées sans soufre et à pression atmosphérique, notamment de mbh, et si possible des mutants mbh/shI, mbh/shII, voir mbh/shI/shII afin de ifie i le mee de la dcin dH2 par Mbh con- firment son importance et sont similaires a de alie che dae Thermococcales.

Il est également important de noter que 0,1 MPa, ne a la ein optimale de la souche, n n dnc e e Mbh en l de n le dan le mablime de lH2 en absence de soufre, semble ai n le dan ladaain a bae ein.

Les mutants shI et shII ne présentent pas de retard de croissance, la croissance est

équivalente à celle du témoin à 0,1 MPa, sans soufre. Ce qui confirme les premières hypothèses quant à limance de lhdgnae membanaie Mbh et le rôle secondaire des hydrogénases cytosoliques. Chez P. furiosus aucune des de enme ne indienable pour la viabilité (Licmb e al., 2011). De man de hdgnae clie de P. furiosus : SHI e SHII, n ali (Licmb e al., 2011). Acne diffence de ciance na mne dan le cndiin ee (aec/an fe). Le man de dlin

SHI/SHII, mbhL/SHI/SHII e d man mbhL e n an dci cdemmen

122

mnen e la dcin dH2 ne a alie a ce de hdgnae clie che

P. furiosus (Sch e al., 2012).

De de cmlmenaie afin de ee lacii de hdgnae dan le clame n

alie (Sch e al., 2012), le man SHI, SHII e le dble man SHI/SHII.

Lacii ne a affece le man SHII, a cne le man SHI lacii e

l faible (10%) e le dble man a dacii dece. Ce i cnfime e la maji de lacii de hdgnae clamie e de SHI e e Mbh ineien

incialemen a niea de la membane (Saa e al., 2000; Sila e al., 2000). Dan ne

de SHI e SHII n eeciemen la SHII e la SHI de P. furiosus, e mme i le acii

eecie na a ee, ne SHII e beac l eime e SHI, eln le dnne

ancimie, e en accd aec ce i e ben che P. furiosus.

Chez T. kodakarensis un seul homologue sulfhydrogénase a été découvert (TK2069-72) (Fki e al., 2005). Le mutant construit croit au même taux que le témoin dans un milieu avec du soufre et sans soufre, mais la densité cellulaire finale est plus faible pour le mutant. En dépit de la plus faible deni celllaie, la dcin dH2 est plus importante pour le mutant que pour la souche sauvage. Une explication serait que le mutant SHI est incapable de consommer lH2 produit par Mbh (Sanangel e al., 2011).

Les résultats à 0,1 MPa sur les hydrogénases cytosoliques de T. barophilus, nous donnent des informations similaires aux autres Thermococcales. Elles ne sont pas indispensables à la crois-

ance ni la dcin dH2. Cependant si on se réfère aux études transcriptomiques chez T. barophilus et P. yayanosii, il a été montré que ces slfhdgnae aaien n niea de- pression qui variait pour de basses pressions. Chez T. barophilus, une sur-expression des gènes codant pour les hydrogénases cytosoliques à 0,1 et 70 MPa, et pour P. yayanosii une sous- expression de celles-ci, pour de faibles et hautes pressions. Or dans notre étude les sulfhydro- génases ne semblent pas impliquées dans la croissance pour de faibles pressions (0,1 MPa).

En ce qui concerne le mutant mbx, réaliser une croissance sans soufre de ce mutant est à envisager. Le résultat attendu de la délétion de cette hydrogénase, and il n a a de fe

123

serait une croissance non impactée. Ce qui confirmerait que son activité est naturellement in- hibée par le régulateur SurR quand le soufre est absent. Des mutants de délétions de lhd- génase Mbx (TS1105) ont été réalisés chez T. kodakarensis (Sanangel e al., 2011), la croissance du mutant sans soufre est identique à celle du témoin, et il en est de même pour la pro- dcin dhdrogène. Une étude de délétion de mbx a également était réalisée chez P. furiosus

(Bidge e al., 2011) qui ne montre pas de différence de croissance en absence de soufre, mais le la aen l inean en ence de fe ce e n alln e par la suite. Réaliser ces croissances sans soufre à 0,1 MPa chez T. barophilus permettrait un com-

lmen dinfmain, mai lde de ce man ee lus enrichissante en présence de soufre.

Les études transcriptomiques chez P. yayanosii, ont montré que mbx était sur-exprimée pour des stress de pression, mai ceci ne a ai che T. barophilus, il n a pas de changement de lexpression de mbx à 0,1 MPa et 70 MPa. Les résultats de transcriptomiques sont tout de même à nuancer, ielle n alie en ence de fe, e cee -expression des gènes mbx chez P. yayanosii peut également être liée à ce facteur soufre ; ainsi réaliser les

de de ancimie an fe emeai de ifie elle e la a de linflence du soufre dans ces résultats de transcriptomiques (Michd, 2014; Michd and Jebba,

2016). Pour le moment un retard de croissance et un rendement cellulaire légérement plus faible du mutant à 0,1 MPa et avec soufre, ont été observés, mais il serait intéressant de refaire un suivi de croissance de mbx aux différentes pressions, pour voir si loxidoréductase Mbx permet une croissance sous pression.

Avec soufre

En présence de soufre, une croissance est observée pour les mutants mbh, co-mbh, shI, shII. Ces hydrogénases pour cette pression et avec soufre, ne semblent pas nécessaires à la croissance de la souche. Lhhe ae ar la littérature serait que Mbx assure la croissance en présence de soufre dans le milieu. Mbx est un homologue de la sous unité du cmlee Mbh. Leein de ce n e aidemen e eniblemen agmene a la

124

présence de soufre. Le complexe Mbx remplace fonctionnellement le complexe Mbh quand du soufre est disponible (Ch e al., 2007; Sch e al., 2007). Il e ne ne faible mai decable ani dH2 e die a e le che cnenan ln mbh (af

mbx) and d fe e en, ce i e e cmme le niea deein baal de

Mbh (Sanangel e al., 2011).

Lde de la croissance du mutant mbx permettrait de voir le comportement du mutant en présence et en absence de soufre. En se référant à la littérature en présence de soufre, on pour-

ai aende ne ciance l faible i a de croissance pour ce mutant mbx, étant dnn e ce lhdgnae i fncinne aec du soufre (nos premiers résultats de suivi de croissance de mbx avec soufre, montrent un retard de croissance et un rendement cellulaire légérement plus faible).

Chez T. kodakarensis, un mutant de délétion mbx (TS1105) (TK1214-1226), a été construit.

Avec du soufre dans le milieu la souche pousse plus lentement et la densité cellulaire et 25% moins importante que celle du témoin (Sanangel e al., 2011). Dans un milieu sans soufre, la croissance du mutant mbx e la dcin dH2 est la même que pour la souche témoin (T. kodakarensis), ce i e e leein de Mbh est suffisante pour les réoxydations de cofacteur.

Des mutants de délétions ont également été obtenus chez P. furiosus (Bidge e al., 2011), la délétion de mbxL en présence de soufre, a entrainé un défaut de croissance mais la délétion de cette hydrogénase ne a lhale contrairement à n hmlge Mbh. Lhhe e en présence de sfe dae mcanime ineiennen.

En ce i cncene la dcin dH2S, les études de délétion de certaines hydrogénases ont permis de rendre compte que ni Mbh, ni SHI, ni SHII ne sont responsable de la production dH2S. Che P. furiosus (Sch e al., 2012) la dcin de ga a alie, le dble man SHI/SHII e SHI/SHII/mbhL aini e le man mbhL, diffene

ani de fe (an fe, 0,5 g/L e 2 g/L). En ce i cncene la dcin dH2S acne dcin ne bee, en cndiin an fe. Mai le ae cndiin

(0,5 g/L e 2 g/L) il a dcin dH2S e le che ee, le ale n ai

125

ialene.

Cependant le mutant de mbx, mbxL a montré une dcin dH2S en présence de soufre, ce

i gge e daes mécanismes soient impliqués dans la réduction du soufre (Bidge e al., 2011).

Lde d man mbx serait intéressante afin de comparer à la littérature, ce qui se passe chez T. barophilus and d fe e en en eme de ciance e de dcin dH2S de ce mutant mbx.

De l cmme n lavons évoqué un peu plus haut, Mbx est sur-exprimée chez P. yayanosii en condition de hautes et basses pressions, ce qui suggère peut être un rôle de cette oxydoré- dcae dan ladaain la ein, mai e le de de ancimie n ali- sées avec du soufre, le doute de son inflence dan cee de net pas à écarter, in le sait Mbx est activé en presence de soufre. Les cultures du muant mbx avec et sans soufre et pour les différentes conditions de pression, permettraien dae de éléments de réponses complémentaires. Si par exemple à 0,1 MPa et 70 MPa, en condition de soufre et sans soufre, on obtient un retard de croissance du mutant mbx, i ne a be 40 MPa, cela cn- firmerait les données de transcriptomique.

En ce i cncene le mee de la dcin dH2 l0,1 MPa, afin de cmle lde, il

eai inean de alie :

Un ii de ciance, dage dH2S e H2 en ence de fe:

Refaie cee ciance de man aec la mme ani de fe (0,5 g/L), mai

galemen en alian ne gamme fe (0,5 g/L, 1g/L e 2g/L i n de ani

de fe ee dan la liae).

Faie le dage dhdgne en aallle a chmagahie en hae gaee.

Mai ai ifie la dcin dH2S (la decin a le mic-GC ne eme a de

mee lH2S, ee aec n dage climie), ie en ence de fe, le

mablime en fae de la dcin dH2S e fai. Cela e li ne lee

dinhibiin d cmlee Mb d fai de la dglain d glae SR e a

126

cnaie ne ee daciain de hdgnae dcice dH2.

Enfin le fai de faie ne gamme de fe emeai de i i la ani de fe a

ne inflence la dcin dH2S. Le dcin dH2S n-elle fe

dendane ?

Un ii de ciance, dage dH2S e H2 en abence de fe:

Faie ne ciance de man en abence de fe dan le milie, deai n

ae l dinfmain la dcin dH2 en fncin de dlin

eneie. En e fan a ii de ciance ali cdemmen, le man

n ne ciance emblable a min, af le man mbh i an fe ene

n ead de ciance; ce i cnfime limance de cee hdgnae

membanaie. Dan le cnclin cdene Mbh emblai allie e emee la

ciance de ae man. Ce i cnfime le dnne de la liae. Dan le

ii de ciance cden le man Mb naai a ii, il eai inean

de i a ciance ici.

Faie en aallle n ii de la dcin dH2 i ai en abence de fe n

dnne l dinfmain, ie ce dan ce cndiin e le mablime e

enclench. On ai aende le man co-mbh, shI, shII et mbx ne

dcin dH2. P mbx la dcin deai e maimale a min ialene

celle de min. Le iin ne n a ai e le man shI,

shII et co-mbh, i aeln-le, n de hdgnae galemen acie en

abence de fe dan le milie, il e ible e le dlin affecen l

min la dcin dH2.

En aallle n dage de lH2S ai e inean, nmalemen an fe le

mablime de lH2S e inhib mai e- e ne dcin baale ea dece.

De diffence en abence d cmlee Mb en e e ne.

127

P cmle lde:

Lde dae man cni cmme le dble man mbh/co-mbh en

c de cncin cmme le glae surR ai galemen e inean. Il

ai e inean de i ce i e ae and le glae SR e aben

dan le diffene cndiin dej ee.

Si SR e aben en cndiin an fe, il aa--il ne ciance d man aec

e an fe ? La ee d glae SR aa--elle n imac la ani dH2

e H2S die dan le de cndiin aec an fe ?

Enfin, le mee de ga ein aien cmle le de de ciance

ein de man. T dabd la che min, n ai cmae

le dcin dH2 e dH2S, 40 MPa e la ein imale T. barophilus, e

ce e le dcin en change de aiain de ein. Pe e e

de e ein, le dcin de ga en dimine i la che e en

difficl, a cnaie agmene adae a mie ce changemen. Che

T. barophilus, le de ancimie n mn e le e ein engende

ne -eein de gne imli dan la dcin dnegie, le hdgnae

nammen ; a eemle mbh, mbh-codh, shII ence shI n eime 0,1

e 70 MPa. E ce e le fai e le gne ien -eim a faie e le acii

ea galemen l imane ?

Le emie cinie de ciance e dcin dH2, dn n enn de ale, n

alie ein amhie. Il e iman de aele e T. barophilus e ne ache ihile, ile 3550 m de fnde. Sn imm de ein e 40 MPa, ai le cndiin e n enn de i ein amhie, n iblemen ne cndiin de e T. barophilus. Il e dnc ible e lhdgnae Mbh i indienable la ciance dan cee cndiin de ein b-imale mai 40 MPa, le la diffen e-e. A 40 MPa, la che an n imm de ein, le mablime negie e imal, d fai dn nmbe de cellle iman e dnc dne

128

dcin dnegie ffiane. Ai ne cndiin de 70 MPa i cend ne

ein a-imale, le la en e-e emblable n e 0,1 MPa, a cnaie, ne ae fan de gle le mablime de lH2 e me en lace de fe

ein. Da le de de ancimie che T. barophilus, le gne de hdgnae n -eim en cndiin de e ein (0,1 e 70 MPa), le cle mbh, mbh-codh n -eime 0,1 e 70 MPa e le gne cdan le hdgnae clie shI e shII galemen. A cnaie le glae SR e Mb ne n a imac,

aeln e ce de n alie en ence de fe (Vannie, 2012). Le mablime de lhdgne emble dnc mdifi en cndiin de e ein la

che. Le anale de ciance n dnc galemen alie ein 40 MPa e 70 MPa, en ence e abence de fe.

Il fa dnc ende en cnidain e le mablime e a priori imac a le aiain de ein, en l d face fe i inflence le mablime.

II.b.4.b. Croissance des mutants hydrogénases sous pression

Avec soufre

En présence de soufre, n aend ce e le man i ne fncinnen a aec fe ne soient pas impactés, puisque selon la littérature ils ne sont pas activés par le régulateur dans cette condition; ne serait impacté à 40 MPa et 70 MPa, avec soufre que le mutant de Mbx.

Pie en ence de fe ce la seule hydrogénase étudiée potentiellement active, résul- tat que nous attendons également à pression atmosphérique (Bidge e al., 2011).

Nous ne pouvons que supposer le résultat que nous pourrions avoir, achan acne ae

étude de suivi de croissance de mutants hydrogénases de Thermococccales ein na

été réalisée. Nous pouvons cependant nous appuyer sur les études transcriptomiques réalisées chez T. barophilus.

Soit comme attendu en présence de soufre, un défaut de croissance du mutant mbx, ce qui irait dans la théorie de sa régulation positive en ence de fe d fai dne inhibiin d

129

régulateur SurR. Si au contraire une croissance est observée soit il y a un phénomène de compensation par un autre système qui fonctionne également à cette pression ou une dérégulation du régulateur SurR. En effe n ai imagine e la ein inflence la ed d

glae, aini a lie de dan n a d, il eai dan un état réduit (capable de se fixer au promoteur), ce qui inactiverait mbx et au contraire permettrait laciain de gènes codant les autres hydrogénases sous pression. Afin de valider cette hypothèse les cultures de cette souche mbx sous pression à 40 et 70 MPa, avec du soufre, seraient à réaliser.

Or ici deux profils se dessinent, un premier profil pour les mutants mbh et co-mbh qui con- firment cette hypothèse. A 40 et 70 MPa, avec du soufre, la délétion de mbh et également celle de co-mbh entrainent un défaut de croissance de la souche, ce qui suppose que dans cette condition leur présence a une importance alors que cela ne a be ein amh- rique (0,1 MPa, avec du soufre).

Chez les autres Thermococcales, l,1 MPa, Mbx fournit lnegie ffiane la

croissance. Les deux hydrogénases Mbh et Co-Mbh ne sont pas censées être fonction-

nelles en présence de soufre. Mbh et Co-Mbh ont-elle de limance dan la cle

sous hautes pressions avec du soufre ? La création e lde de dble man

mbx/mbh et mbx/co-mbh, permettrait également de mieux comprendre le phé-

nomène.

Mbx est-il inactivé sous pression ? La croissance du mutant mbx sous pression et en

condition de soufre permettrait de répondre à ces hypothèses, ce qui supposerait un

changement de fonctionnement du régulateur SurR.

SurR serait-il impacté par la pression ? Son état redox est-il impacté sous pression?

Lde d man surR sous pression en condition avec et sans soufre pourrait être

intéressante.

En ce qui concerne les mutants shI et shII, ils ont une croissance attendue, avec du soufre, il nineiennen e (SHII) a (SHI) dans la croissance. Ce qui est similaire à ce qui est

130

obtenu à 0,1 MPa mai a lencne des hypothèses précédentes notamment celles sur le régulateur SurR. Mbx jouerait ici son rôle. La construction de mutant mbx/shI et

mbx/shII seraient intéressants, pour voir si avec du soufre il y a croissance ou non, normalement non, et permettrait de cncle limance de Mbx ein. Sil n a a de croissance cela confirmerait le fonctionnement normal de SurR sous pression et le fonctionnement de Mbx. Au contraire il a cisance alors Mbh et Mbh-Codh ont possiblement une implication sous pression et avec fe, cela eai en fae dne dglain de SR a la pression. Ce qui pourrait expliquer les résultats de transcriptomiques et le fait que pour des stress pressions et avec soufre, il y ait une sur-expression des gènes normalement sur-expri- mées par le régulateur en condition sans soufre (mbh, mbh-codh, shI et shII) (Vannie e al.,

2015).

Sans soufre

En absence de soufre, Mbx nineien a nmalemen af i changemen da - duit/oxydé du régulateur sous pression ; mais normalement un mutant de délétion mbx devrait présenter une croissance standard (semblable au témoin), car les autres hydrogénases sont activées sans soufre par SurR.

Les trois autres hydrogénases devraient présenter un défaut de croissance, plus important pour

mbh et co-mbh, et légérement pour shI et shII. Ici la croissance des mutants mbh et

co-mbh est réduite, fortement impactée, à 40 MPa et 70 MPa, sans soufe, al 0,1 MPa seule mbh avait un retard, il y a donc ici un effet pression qui confime limance de Mbh et implique Mbh-Codh. Pour SHI et SHII la croissance est légérement plus faible, ces deux autres hydrogénases pour les mêmes conditions semblent moins impactées.

Dans ce cas-ci, il ne semble pas avoir de dérégulation du SurR par la pression, mais il pourrait

être intéressant de tester la croissance du mutant mbx dans cette condition (40 ou 70 MPa,

an fe) i la ne d man. Sil a ciance, cela e en fae dne ne normale du régulateur, mais si sans soufre et sous pression, la croissance du mutant mbx est

131

impactée, cela eai en fae dne dglain de SR a la ein. Mai cee h- thèse ne semble pas valide au vu de nos résultats de croissance sans soufre et sous pression.

Si l’on résume l’hydrogénase Mbh semble importante pour la croissance de la souche à 0,1 MPa en absence de soufre et sous pressions à 40 et 70 MPa, et ce peu importe la présence ou l’absence de soufre.

La carboxyhydrogénase Mbh-Codh n’a pas d’influence à 0,1 MPa que ce soit en absence ou présence de soufre, mais pour de fortes pressions, cette hydrogénase semble avoir un impact sur la croissance de T. barophilus, dans les deux conditions avec et sans soufre.

Les Sulhydrogénases SHII (SHI de P. furiosus) et SHI (SHII de P. furiosus) ne semblent pas influencer la croissance, pour de faibles pressions, mais il semble- rait que SHII soit quand même impliquée dans la croissance sous hautes pressions, avec et sans soufre.

Le soufre semble avoir un impact sur la croissance à 0,1 MPa, et réguler le méta- bolisme de manière semblable à ce qui est connu pour les autres Thermococcales.

Mais pour de hautes pressions sa présence ou absence, ne semble pas influencer le métabolisme de la même manière (du moins en présence de soufre).

132

Discussion ge ne rale et conclusion

En eme dadaain de nmbee de n alie la emae, la alini, laci- di, e en di d fai e leeniel d lme de la bihe eee e mi de pressions élevées, la pression reste ln de aame le min di.

Les hautes pressions hydrostatiques ont pourtant des effets sur les macromolécules et le mé- tabolisme cellulaire.

Les effets de la pression hydrostatique ont été majoritairement étudiés chez les espèces méso- philes, tel que E. coli ou encore S. cerevisiae.

Des travaux ont commencé sur les espèces piézophiles et ont montré des réponses similaires face au stress engendré par la pression. En ce qui concerne les acides aminés par exemple, un certain nombre dacide amin amaie ne een e nhi hae e- sions, leur synthèse étant trop coûteuse en énergie (histidine/tryptophane) (Cai e al., 2015).

Un changemen glbal dan leein gnie de diee ie mablie a été observé lorsque la pression change (Vannie e al., 2015). De nombreuses modifications (augmentation des insaturations, incorporation de lycopènes) au niveau de la membrane quand la pression augmente. Enfin la mise en évidence de la production de mlcle dadaain la ein hydrostatique (solutés compatibles) (Cai e al., 2016).

De aa n mi lhhe e de gne cdan le hdgnae, ont une expression modulée en fonction de la pression, et aien je n le dan ladaain la e- sion chez les Thermococcales, comme chez T. barophilus (Vannie e al., 2015), P. yayanosii

(Michd and Jebba, 2016) et plus récemment chez T. piezophilus (Dalma, 2016). Ce a-

a ali a labaie n cni n in de da dan ne de de cmhen-

in dadaain a hae ein hdaie che T. barophilus. N an dnc dcid de n inee ce hdgnae e le mablime.

Che le Thermococcales comme T. onnurineus, T. kodakarensis, P. furiosus, T. paralvinellae

(Henle e al., 2016; Kim e al., 2010; Licmb e al., 2011; Mn e al., 2015; Sanangel e al., 2011) , le hdgnae n imlie dan n me eiaie imle elle lien

133

ldain de la feedine la fmain dhdgne, e cken lnegie la fme dn gadien din anmembanaie (Sch e al., 2013b).

Lenme enable de la fmain de lH2 e n cmlee hdgnae li la membane, ael Mbh (McTenan e al., 2014). Mbh gne de lhdgne mlclaie e ilie lnegie de cee acin eegnie ce n gadien de n de a e dae de la membane. Enie le mage de in Na+ e fai e linie de la cellle a ne ATP

nhae (Saa e al., 2003), emean aini la nhe dATP e dnc la dcin dnegie. Cee enme fncinne en abence de fe. Il ne emble a eie dae ie mablie ie le man de dlin de mbh enainen la m celllaie (Ch e al., 2007; Sakaba e al., 2004).

La feedine e le el accee dlecn ldain de glcide. Pa cnen,

n mcanime de dcin de NADPH e galemen nceaie die de

ialen dce la binhe. Aini, de lfhdgnae clie n

ee che le Thermococcales (Ban and Adam, 1989; Ma e al., 2000). Celle-ci

emeen de fni d NADPH en ilian lhdgne cmme dnne dlecn.

Le gnme de Thermococcales cnien galemen ne iddcae lie la membane nmm Mb, i ene ne imilai de ence lee aec Mbh (hmlge de Mbh)

(Sila e al., 2000). Mb di le NADP aec la feedine cmme dnne dlecn e

eme la cneain dnegie en man de in H+ Na+. Cee enme fncinne en

ence de fe (Sch e al., 2007). Ce mablime e la dendance d fe e d glae anciinnel SR (Licmb e al., 2017; Yang e al., 2010). Dan n a

di, SR acie la anciin de gne i cden le hdgnae lble Hh I

(SHI) e II (SHII), e Mbh, aini e de nmbe ae gne imli dan le mablime de lhdgne (Sch e al., 2007). A mme mmen SR ime leein de gne imli dan la dcin d fe : N, Mb, d (Bidge e al., 2011).

134

Des études transcriptomiques chez deux modèles de Thermococcales ont permis de mettre en

idence ne mdlain de leein de gne en fncin de la ein. En effe chez P. yayanosii, il a été observé aux pressions inférieures et supérieures à la pression optimale de croissance, une sous-expression des hydrogénases membranaires (Mbh), aini une sous- expression des hydrogénases cytosoliques SHI et SHII, mais une sur-expression des oxidoré- ductases (Mbx) (Michd, 2014). Chez T. barophilus, la réponse des hydrogénases face aux variations de pression est différente, les hydrogènases membranaires sont sur-exprimées en condition de stress pression, il en est de même pour les hydrogénases cytosoliques qui sont sur-exprimées à 0,1 MPa et 70 MPa (Vannie e al., 2015). Chez T. piezophilus, de nombreux cle dhdgnae e de sulfhydrogénases ont été mis en évidence dans le génome, les analyses du transcriptome sont encore en cours, mais les grandes tendances déjà observées dans le transcriptomes des autres Thermococcales piézophiles semblent se confirmer, les mé- canismes de prdcin e cnein dnegie n affec a le aiain de ein

(Moalic et al., en préparation).

Afin ddie le gne dadaain la ein e nammen ce imli dan le mablime de hdgnae, de man de dlin n ali che T. barophilus.

Le b de lde de man hdgnae e dble, cmende le fncinnemen de ce mablime che T. barophilus, e i le cmae aec dae mdle, aini e ddie ce mablime ein e eae de faie n lien aec le de

ancimie.

P alie ce man de dlin, n il gnie a del a labaie. La mie en lace de ce il a inie a le echeche en gnie mene che T. kodakarensis (Ami e al., 2004; Mikaa e al., 1994) (Hileman and Sanangel, 2012; Sa e al., 2003).

Ce me ilie n lamide naee dle de gne a ecmbinain hmlge.

Lil en a db de ma he, eai lahie lacile e la iance la

Simaaine, n anibiie ; a la mhde die in/ . Lingain d

lamide naee dan la gin din e mainene a la ence d gne de iance

135

la Simaaine e la deime ecmbinain, cndian la ee d lamide aini e d gne cible, e alie en ilian le 5-FA cmme agen de lecin.

Bien e lil i fncinnel e ai emi la dlin de lie gne, le blme maje

ide dan la faible enibili de la che a 5-FOA a a le gne pyrF, i enaine

ne abence de cne-lecin dan ceain ca; e manifean a laaiin dne

iime cnfigain la fin de la ecnde ae de ecmbinain : de che dblemen iane aele fa iif , i den ence le lamide naee, e dn ligine ee ce j nn lcide.

La emie aie d aail de he a dnc cni amlie lil gnie, en delan ne nelle ie de cne-lecin. Un nea mae de lecin, la 6-m-

hline 6-MP, a chii cmme alenaie a 5-FA. Lde a emi dbeni n

il imi. Le cnclin de lde n e la 6-MP e e ilie cmme mae de cne-lecin che T. barophilus, e n iliain ae ceain aanage : il e l

aie manile, l efficace ie le nmbe de fa iif a femen dimin

(37% cne 80%) e a emi de die le em de manilain. Lil gnie amli e acellemen ili dan de nmbe je a labaie la mainenance gnmie e a emi la ie de ce aail de he: la cncin de man de dlin cmende ladaain de T. barophilus a HPH.

La ie d aail e fcalie le hdgnae, ie le de ancimie

liminaie n mn de aiain de leein de ce gne en fncin de la ein, cmme n an le i cdemmen. Un ceain nmbe de man n ben :

i le hdgnae membanaie : mbh (man mbh), co-mbh (man mbh-codh) e mbx (man mbx), e de le hdgnae clie : shI e shII (man shI e shII), aini n dble man mbh/co-mbh. Acellemen la cncin de man hdgnae e i afin de cmende a mie le fncinnemen de ce hdgnae e le ible ineenin dan ladaain la ein.

A ificain de lbenin de ce man (a PCR e enage), n db de

136

caaciain a enei, aec de cle de ciance ein amhie (0,1

MPa) e ein dan de incbae hae ein/hae emae (40 e 70

MPa). Il e iman de aele e T. barophilus e ne ache i-hehemhile, ile 3550 m de fnde (Maeinn e al., 1999a). Elle e caable de e dele

ne gamme de ein allan de 0,1 85 MPa, aec n imm de ein de 40 MPa

ne emae de 85C (Maeinn e al., 1999a). Aini le manilain 40 MPa

eenen la cndiin imale la che, andi e le manilain alie le ein b e a imale de 0,1 MPa e 70 MPa, n de cndiin de e celle-ci. Dan cee de e a la ie, il ea dnc inean de i cmae le diffence bee en eme de ciance e de dcin dhdgne ce diffene cndiin.

Un ae face a i en cnidain l de ce manilain, ce le fe. En effe celi-ci e n face inflenan le mablime de lhdgne, e il enaine de ne de hdgnae diffene, aini lenemble de cle n alie la fi en abence e ence de fe.

De dage dhdgne a chmagahie en hae gaee, n galemen ali

caacie la ne hilgie de man, e ce ein amhie e en

ence de fe.

T e dde n alie linflence de la ein le hdgnae, hmi celle e n an cie cdemmen ; ceendan le hdgnae de ceaine

Thermococcales n die, e ce mablime e n fncinnemen e mainenan bien cnn. De ache imilaie ne de, ai de dlin de ceaine hdgnae che T. kodakarensis ence che P. furiosus, n n dnn de lmen de cmaain lineain de n la (Bidge e al., 2011; Licmb e al.,

2017; Sanangel e al., 2011).

Le emie la de ciance ein amhie, emeen de cncle

137

limance de lhdgnae Mbh. La dlin de ce gne enaine n ead de ciance de la che an fe. Ce emie la e en accd aec le de alie Mbh, SHI

ence SHII che dae Thermococcales, Mbh aaai cmme nceaie la ciance e la dcin dH2 en abence de fe. Le lfhdgnae aaaien cmme ecndaie, ne an allie la ee de Mbh, la dlin de ce gne nimacan

a la ciance de la che ni la dcin dH2 (Sanangel e al., 2011; Sch e al., 2012).

Ceendan afin de cmle cee de le hdgnae fncinnan an fe, il

eai inean de alie de mee de la dcin dH2 an fe, de e aaien

enei a mic-GC mai le la an fe nn a cnclan.

Ai i le man surR e ben, il eai inean de i i a dlin a n effe. Che P. furiosus (Licmb e al., 2017) e T. kodakarensis (Sanangel e al., 2011), de man de surR n ben ; e an fe, la ciance d man e imace aini e la dc-

in dH2. Il ai e inean ddie le le e le fncinnemen de ce glae che T. barophilus.

Ce régulateur transcriptionnel décrit chez P. furiosus (Licmb e al., 2009; Yang e al., 2010), fonctionne de la manière suivante en absence de soufre, SurR est sous forme réduite et active la trancription de mbh, parallélement il réprime la transcription des gènes impliqués dans la

dcin dH2S. En présence de soufre, SurR est dans un état oxydé et est dérégulé, ainsi la

dcin dH2 e inhibe al e celle dH2S enclenchée. Chez T. kodakarensis, un homologue codé par TK1086 (Fki e al., 2005) a été décrit. Pour décrire son action un mutant de délétion a été construit celui-ci est incapable de synthétiser le complexe Mbh, le man ne gne a lH2 dans aucun milieu, et est incapable de se développer sans soufre dans aucun milieu. Par contre la croissance de ce mutant avec du soufre peu importe le milieu reste intacte.

Si ln inee a glae SR che P. furiosus (Licmb e al., 2017), le man surR ne eme a la ciance an fe, en ence de fe ne ciance d man e

bee. En ce i cncene la dcin dH2 celle-ci e l faible le man surR, mai and la ani dH2 e nmalie la ciance le ale dH2 n ialene

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ene le man e le min.

Le de ancimie de T. barophilus, nn a mn de aiain deein d gne surR ein (Vannie, 2012) e le mmen n enaie dbenin d man surR nn a abi. Lbenin de ce man e la caaciain de celi-ci

emeai de i i le faible hae ein enainen n changemen da de ce

glae, emblable ce e ln bien aec/an fe. E i ln bee ne dglain d mablime de hdgnae ein. Aec n hif emblable ce e ln bee

le fe mai engend ici a le face ein.

Si ne dglain e aimen engende a la ein, en e-il d face fe, celi- ci ineien-il nn, e i i de elle manie ? Rabli-il le fncinnemen nmal agmene--il la dglain d mablime ? Ce hif engend a le e ein

e il eie, e-il n mcanime dadaain n e bi a la cellle ? Mai ce ne n e de hhe i e dien de ifie. S a e de n emie

la an fe 0,1 MPa le man mbh e imac, e en ence de fe e 0,1

MPa ce la ciance d man mbx i e imace, ce i le n fncinnemen

nmal d min emblable ce i e cnn d mablime de lH2.

Un suivi de croissance du mutant mbx en absence et présence de soufre serait également à envisager. Notre mutant mbx semble se développer avec soufre, avec un léger retard et un rendement plus faible. Ce qui est en accord avec la littérature Mbx ne semble pas nécessaire à la viabilité de P. furiosus, contrairement à son homologue Mbh, mais la croissance du mutant mbx avec du soufre est légérement impactée (Bidge e al., 2011). Le dage de lH2S avec du soufre et sans soufre, serait intéressant pour ce mutant. Chez P. furiosus, la ee de Mb nen- traine pas de différence de dcin dH2S, en cndiin fe ce i gge e dae acteurs interviennent (Bidge e al., 2011).

En ce i cncene la dcin dH2, les études sont à compléter, avec et sans soufre pour lenembe de man, e n dage de la dcin dH2S, e eniage lenemble

139

de man e dan le de cndiin, afin dbeni ne ne glbale d fncinnemen d mablime de lH2 chez T. barophilus à pression atmosphérique.

Dae man n cni nt en cours de construction. La construction de mutants de mbh afin de séparer les deux unités du cluster, des mutants de Mbh-Codh, et le mutant du régulateur SurR fn acellemen ai d je dn age de Mae 2, le obtention permettrait de compléter cette étude. Ce manilain emen de

iablemen cncle le mablime de hdgnae ein amhie che

T. barophilus e de i i celi-ci fncinne de manie imilaie dae Thermococcales

i de diffence n bee.

Cee cndiin de ciance ein amhie cnie ne cndiin de e

T. barophilus, i infie a ein imale. Il e dnc ible e le beain faie cee ein ne ien a le mme ne ein de 40 MPa. Da cee

de il emble e lhdgnae membanaie Mbh ineienne dan ladaain de la

che a faible ein. Ce i e en accd aec le dnne de ancimie de T. barophilus ie de faible ein le gne mbh n -eim (Vannie e al.,

2015). Pa cne le hdgnae clie SHI e SHII ne emblen a ai de le ici, le de ancimie n mn e le gne le cdan n an -eim en cndiin de faible e fe ein. On aai dnc aende ce e la ciance de man shI e shII ien galemen imace 0,1 MPa. P Pyrococcus yayanosii, a cnaie ce ne aie d cle mbx cdan le iddcae, i e - eime de e ein, al e mbh e -eim; mai ce la che P. yayanosii n nance d fai e le anale n faie aec d fe dan le milie de cle, celi-ci inflence le mablime de lhdgne (Michd and Jebba, 2016).

Le anale mnen ceendan e le fncin celllaie affece n en

ialene e le cellle ien lace hae bae ein. Il e dnc ible

e le beain faie 0,1 MPa ien che de celle 70 MPa.

Da n la, le diffence ne n a mae ene la ein imale de 40

140

MPa, e le de ae ein de e ee. En effe n aai aende a mme

ne 0,1 e 70 MPa, ce--die en cndiin de e, e a cnaie n fil

alemen diffen 40 MPa. A cnaie n benn de fil de ciance de hdgnae che 40 e 70 MPa.

Da n la le hdgnae membanaie, Mbh e Mbh-Cdh emblen e imane ne ciance hae ein (40 e 70 MPa), a a a hdgnae clie, i emblen ai min dinflence la ciance

ein.

Ce i e nnan ce e le fe ne emble a ai le mme imac le mablime

hae ein 0,1 MPa, ie le ne 40 e 70 MPa, en cndiin aec

an fe n ae che cmme i celi-ci nineenai a dan la glain hae

ein; al ein amhie n an ne de diffence ene la cndiin fe e an fe (nammen Mbh e Mb).

Da le de ancimie che T. barophilus, 70 MPa, mbh, mbh-codh n - eime, aini e le hdgnae clie (Vannie, 2012). P le mmen ie ce aa de he, Mbh emble ai n le dan ladaain a faible e bae

ein. Mbh-Cdh emble galemen imlie mai niemen de hae

ein (40 e 70 MPa). Le le de lfhdgnae e an li min iible e ime la ein ee.

Mai aan de cncle limance de ceaine hdgnae la ciance de T. barophilus ein, de cle ein cmlmenaie n alie nammen le man hdgnae e n nan a ence e (cmme mbx); e i a en ilian le biace HP/HT de HP em, afin de faie n ii de ciance en cnin. Il eai galemen inean de faie n ii de la dcin dH2 e dH2S ein (40 e 70 MPa) afin de i cmae ce i ea ben ein amhie e alle l lin dan lanale de man ein. Ceendan la mie en lace d cle a nceie n aail de mie a in aan de cmlemen

ainnel.

141

Pour conclure sur ce travail de thèse, le premier objectif a été rempli en permettant d’obtenir un outil génétique plus efficace, cette étude a fait l’objet d’une publication (Birien et al., 2018). L’utilisation de l’outil a permis d’obtenir un certains nombre de mutants, ciblés suite aux études transcriptomiques réalisés sur T. . La caractérisation des mutants hydrogénases obtenus par culture à pression atmosphérique et sous pression, ainsi que les dosages d’H2 ne nous permettent pas encore de conclure quant à l’importance du rôle des hydrogénases ciblés dans l’adaptation aux hautes pressions hydrostatiques.

Cependant l’hydrogénase membranaire Mbh, semble avoir une importance certaine dans le métabolisme de T. pour l’ensemble des pressions testées. Des perspectives sont envisagées afin de continuer cette étude : continuer les cultures de croissance sous pression, les mesures de l’H2 et de l’H2S aux différentes pressions ainsi que les analyses de PCR quantitatives en temps réel sur les mutants (RT-PCR) après extraction de l’ARN afin de quantifier l’expression des gènes ciblés aux différentes conditions testées.

142

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Valorisation des travaux de the se

o Responsabilités extra-recherche :

Projet interdisciplinaire mené avec les M2 du Master Sciences de la Mer et du Littoral Institut Universitaire Européen de la Mer, IUEM, Plouzané dans le cadre de l’UE sciences et société (23/09/2015 au 17/11/2015) Formation des étudiants en stage (Co-encadrement de stages (3ème/L3/M1/M2), co- encadrement de travaux pratiques en génétique microbienne) Formation Initiale d’Animateurs Petits Débrouillards (24/10/2016 au 28/10/2016) Communication/vulgarisation scientifique (Portes ouvertes de l’IUEM en 2015, Inter- vention au Lycée Savina à Tréguier en , Responsable de l’organisation pour le LM2E de la Nuit Européenne des chercheur(e)s 30/09/2016, Fête de la science du 14 au 16/10/2016, Participation au projet des Jeunes reporters des Arts et des Sciences avec le collège Diwan Plijidi) Participation à la rédaction de la Newsletter mensuelle du LM2E

o Campagne océanographique :

Participation à la campagne océanographique chinoise (25/03/2015 au 29/04/2015) à bord du Da Yang Yi Hao, échantillonnage de sédiments et roches hydrothermales au niveau des dorsales océaniques de l’Océan Indien, à des fins de cultures et d’analyses biomoléculaires.

o Communications orales :

2015, Genetics adaptations of archaea to hydrostatic pressure. Tiphaine Birien, Y. Moalic, and M. Jebbar Réunion au Third institute of oceanography, Xiamen (China).

2016, Vivre dans les grands fonds, une question d’adaptation T. Birien Journées de l’EDSML, accueil des nouveaux doctorants, IUEM.

2017, Role of Hydrogenases in adaptation to high hydrostatic pressure in a piezo-hyperthermophilic archaeon Thermococcus barophilus T. Birien, M. Gardette, Y. Moalic, and M. Jebbar Thermophiles 2017 14th International meeting on thermophile biology, August 27-sep 1 2017, South Africa. (Bourse AFEM)

o Posters :

Genetic modifications of the hyperthermophilic piezophilic archaeon Thermococcus barophilus: Development of a stringent 6-methylpurine counterselection system. Tiphaine Birien, Yann Moalic, Axel Thiel and Mohamed Jebbar

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UBO (Université de Bretagne Occidentale), Ifremer, LM2E (Laboratoire de Microbiologie des Environnements Extrêmes), UMR 6197 (CNRS-Ifremer-UBO), IUEM (Institut Universitaire Européen de la Mer), Technopôle Brest- Iroise, 29280 PLOUZANE, France. 4th International workshop on Deep Sea Microbiology, September-15-17, 2014, Brest, France.

Studiying life adaptation to high hydrostatic pressure environments: implication of sulphur and hydrogen metabolism revealed through genetic manipulation in the piezo-hyperthermophilic archaeon: Thermococcus barophilus. Tiphaine Birien, Marion Gardette, Yann Moalic and Mohamed Jebbar Université de Bretagne Occidentale, Brest, France, CNRS, Brest, France, Ifremer, Brest, France Molecular biology of Archaea 2016, August 1-3, 2016, London, England.

Rôle des Hydrogénases dans l’adaptation aux hautes pressions hydrostatiques d’une ar- chée piézophile hyperthermophile Thermococcus barophilus. Tiphaine Birien, Marion Gardette, Yann Moalic and Mohamed Jebbar Université de Bretagne Occidentale, Brest, France, CNRS, Brest, France, Ifremer, Brest, France 8ème Colloque de l’Association Francophone d’Ecologie Microbienne, -20 oct 2017, Camaret-Sur- Mer, France.

162 G C A T T A C G G C A T genes

Article Development of an Effective 6-Methylpurine Counterselection Marker for Genetic Manipulation in Thermococcus barophilus

Tiphaine Birien 1,2,3, Axel Thiel 1,2,3, Ghislaine Henneke 1,2,3, Didier Flament 1,2,3, Yann Moalic 1,2,3 ID and Mohamed Jebbar 1,2,3,* ID 1 Université de Brest (UBO, UBL), Institut Universitaire Européen de la Mer (IUEM)–UMR 6197, Laboratoire de Microbiologie des Environnements Extrêmes (LM2E), Rue Dumont d’Urville, F-29280 Plouzané, France; [email protected] (T.B.); [email protected] (A.T.); [email protected] (G.H.); [email protected] (D.F.); [email protected] (Y.M.) 2 CNRS, IUEM–UMR 6197, Laboratoire de Microbiologie des Environnements Extrêmes (LM2E), Rue Dumont d’Urville, F-29280 Plouzané, France 3 Ifremer, UMR 6197, Laboratoire de Microbiologie des Environnements Extrêmes (LM2E), Technopôle Pointe du diable, F-29280 Plouzané, France * Correspondence: [email protected]; Tel.: +33-298-498-817; Fax: +33-298-498-705 Received: 8 January 2018; Accepted: 2 February 2018; Published: 7 February 2018

Abstract: A gene disruption system for Thermococcus barophilus was developed using simvastatin (HMG-CoA reductase encoding gene) for positive selection and 5-Fluoroorotic acid (5-FOA), a pyrF gene for negative selection. Multiple gene mutants were constructed with this system, which offers the possibility of complementation in trans, but produces many false positives (<80%). To signiﬁcantly reduce the rate of false positives, we used another counterselective marker, 6-methylpurine (6-MP), a toxic analog of adenine developed in Thermococcus kodakarensis, consistently correlated with the TK0664 gene (encoding a hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transferase). We thus replaced pyrF by TK0664 on our suicide vector and tested T. barophilus strain sensitivity to 6-MP before and after transformation. Wild-Type (WT) T. barophilus is less sensitive to 6-MP than WT T. kodakarensis, and an increase of cell resistance was achieved after deletion of the T. barophilus TERMP_00517 gene homologous to T. kodakarensis TK0664. Results conﬁrmed the natural resistance of T. barophilus to 6-MP and show that TK0664 can confer sensitivity. This new counterselection system vastly improves genetic manipulations in T. barophilus MP, with a strong decrease in false positives to <15%. Using this genetic tool, we have started to investigate the functions of several genes involved in genomic maintenance (e.g., polB and rnhB).

Keywords: archaea; piezophiles; hyperthermophiles; genetics; gene deletion; deep sea; hydrothermal vents

1. Introduction The Thermococcales are generally found in natural biotopes typical of thermophilic microorganisms. Originally discovered in terrestrial and submarine hot vents, they have since been found in deep subsurface environments [1,2]. The Thermococcales order is presently represented by three genera: Pyrococcus [3], Thermococcus [4] and Palaeococcus [5,6]. Thermococcales are getting increasing attention from academia and industry because they provide a unique source of stable biocatalysts and other products such as archaeal lipids and compatible solutes [7,8]. Several species are used as biological models or sources of thermostable molecules studied in structural and metabolic biochemistry, genetics, and microbial physiology [9].

Genes 2018, 9, 77; doi:10.3390/genes9020077 www.mdpi.com/journal/genes Genes 2018, 9, 77 2 of 13

Members of this order grow easily under anaerobic conditions in the laboratory, making them models of choice for many years in fundamental or applied research projects [10,11]. Notably, their metabolism is based on the degradation of peptide and carbohydrate substrates to produce organic acids, hydrogen gas (H2) and carbon dioxide (CO2). This is associated with the production of hydrogen sulfide through the reduction of elemental sulfur [12]. The production of H2 has been well characterized for different models of Thermococcales even when elemental sulfur (S) is not supplied in the growth medium [13–16]. Thermococcus barophilus is a hyperthermophilic, piezophilic and heterotrophic archaeon belonging to the Thermococcales order and Euryarchaeota phylum. T. barophilus was isolated from a deep-sea hydrothermal vent in 1993 and has the particularity of being the first true piezophile characterized. Indeed, it grows optimally at 85 C with a pressure of 40 MPa. However, T. barophilus can also grow in a range spanning from atmospheric pressure (0.1 MPa) up to 85 MPa [17]. These features make it a good model for studying piezophilic and stress responses, and adaptive mechanisms [18–20]. Although comparative genomic and transcriptomic experiments offer substantial information about overall adaptive responses to changes in physico-chemical environmental conditions, the fundamental biological processes of cellular systems require synergy between biochemical and genetic approaches. Thus, as for eukarya and bacteria, genetic techniques have been developed for archaea, but have been seriously held back by limitations of culture conditions, expertise and the availability of suitable genetic markers for screening methods [21–25]. Nevertheless, genetic experimentation is now expanding on four groups of Archaea: Methanogens, Halophiles, Thermococcales and Sulfolobales, with more genetic manipulations being performed in Euryarchaeota than Crenarcheota [23]. Since the first genetic system developed in Thermococcus kodakarensis [26], several studies have been published showing that genetic manipulation is possible in different species of Thermococcales (e.g., Pyrococcus furiosus, Pyrococcus yayanosii, Thermococcus kodakarensis and Thermococcus onnurineus)[27–30]. Among these, a gene deletion system has recently been developed for the T. barophilus MP DpyrF host, relying on simvastatin resistance and 5-fluoroorotic acid sensitivity [31]. In this system, a suicide vector carries the selection markers, HMG-CoA reductase and PyrF genes, and the flanking areas of a targeted gene that are used in a double-crossover recombination to: (i) integrate in the chromosome; and then (ii) disrupt the gene of interest. Indeed, two configurations are possible, either obtaining the mutant deleted in the targeted gene or a return to the wild-type state. However, as described previously when using the PyrF/5-FOA marker for counterselection [32], a third configuration is also obtained with a high rate of false positives (up to 80%), probably due to a lack of efficiency of the antibiotic, since no mutation was detected in PyrF alleles [31]. To avoid the stage of false-positive screening, which is particularly time-consuming for our model (at least five days of incubation), we improved our genetic tool by using another counterselective marker, 6-methylpurine (6-MP). This toxic compound is an adenine analog that depresses the growth of different organisms [33–35]. It inhibits the formation of guanylic acid from adenylic acid, decreases the incorporation of adenine into ribonucleic acid, and inhibits ribosome synthesis [36]. In T. kodakarensis, 6-MP is known as an effective growth inhibitor consistently correlated with TK0664, a gene encoding a hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transferase [37]. Thus, in this study, we replaced pyrF by TK0664 on our suicide vector and tested the inhibitory effect of 6-MP on growth of several strains of T. barophilus before and after transformation with a suicide vector bearing sensitivity to 6-MP. This new counterselection system strongly improves genetic manipulations in T. barophilus MP, with a strong decrease in the rate of false positives to 15%. Among the deletion mutants obtained, we confirmed that polB or rnhB could be deleted from T. barophilus without any effect of these individual deletions on cell growth under our growth conditions. This is similar to observations Genes 2018, 9, 77 3 of 13 in T. kodakarensis [38,39] and showed that PolD is sufficient for DNA replication in T. barophilus, as shown in T. kodakarensis [39].

2. Materials and Methods

2.1. Strains and Growth Media The strains used in this study are described in Table 1. All strains were grown under anaerobic conditions, at 85 C in Thermococcales Rich Medium (TRM). [40], which was made up as follows: 1 L of demineralized water was supplemented with 23 g NaCl, 5 g MgCl2, 3.3 g PIPES, 4 g Tryptone, 1 g yeast extract, 0.7 g KCl, 0.5 g (NH4)2SO4, 0.05 g NaBr, 0.01 g SrCl2, and 1 mL resazurin 1%. The pH was adjusted to 6.6–6.7 and the medium autoclaved for 20 min at 121 C. Once cooled, 1 mL of each of the following solutions was added sterilely: 5% k2HPO4, 5% KH2PO4, 2% CaCl2 2H2O, 10 mM Na2W04, 25 mM FeCl3 6H20. The liquid medium was dispensed in 50 or 100 mL vials, sulfur was added (2 g/L), and all vials were sealed with butyl-rubber stoppers, vacuum and N2 gas addition steps were required to remove O2 and to maintain the culture media under anaerobic conditions. The liquid phase was reduced by 0.1 mL of a Na2S, 9H20 solution. TRM was used in liquid or solid form and, for the latter case, 10 g/L of phytagel (Sigma-Aldrich Chimie, L’Isle D’Abeau Chesnes, St Quentin Falavier, France) were added to the TRM liquid medium. After cell transformation, the transformants were selected on TRM supplemented with 2.5 µg/mL of simvastatin (Sigma) or 100 µM of 6-MP (Sigma).

Table 1. Thermococcus barophilus strains used and constructed in this study.

Strain Genotype Parent Strain References UBOCC-M-3203 Wild Type T. kodakarensis KOD1 [22] UBOCC-M-3107 Wild Type T. barophilus MP [17] UBOCC-M-3300 TBDTERMP_00517 T. barophilus MP This study UBOCC-M-3301 TBDTERMP_00517::TK0664 T. barophilus MP This study UBOCC-M-3302 TBDTERMP_00517, DTERMP_01623 T. barophilus MP This study UBOCC-M-3303 TBDTERMP_00517, DTERMP_00671 T. barophilus MP This study

2.2. Microbial Growth

Pre-cultures were incubated overnight at 85 C for 16 h, an aliquot of 0.2 mL of each overnight culture was introduced into 20 mL of fresh TRM supplemented with different concentrations of 6-MP (0 µM, 10 µM, 50 µM, 100 µM and 250 µM). Cultures were incubated at 85 C and cell numbers were counted every 3 h. Growth was monitored by cell counting using a Thoma chamber and photonic microscopy at a magnification of 40 (Olympus) or using flow cytometry (CyFlowSpace, ⇥ Sysmex Partec, GmbH, Görlitz, Germany). Cells were fixed with 2.5% glutaraldehyde (Sigma) and counted by one of the two cell counting methods described above. All the experiments were carried out in triplicate.

2.3. Construction of Gene Deletion Vectors Plasmid pUFH served as a starting point to construct our new suicide vector [31]. This plasmid bears two selection markers: the HMG-CoA gene of Pyrococcus furiosus, encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, to reduce the inhibitory effects of simvastatin [41]; and the pyrF gene of T. barophilus, encoding the Orotidine-5’-monophosphate (OMP) decarboxylase, to confer sensitivity to 5-FOA [28,42]. In this study, pyrF was replaced by TK0664 amplified from T. kodakarensis KOD1 (primers XhoI-6MPK_Up and SmaI-6MPK_Do). To achieve this, the XhoI and SmaI sites were used and the resulting plasmid was named pUPH (Figure 1). According to Thiel et al. (2014), the flanking regions of the targeted gene were amplified sequentially with an overlap extension to form a fragment of 2 kb [31]. Then, this fragment Genes 2018, 9, 77 4 of 13 was inserted between the BamHI and KpnI sites of pUPH. The primers 6MPb_1Up, 6MPb_1Do, 6MPb_2Up and 6MPb_2Do (Table 2) were used to delete TERMP_00517 encoding xanthine-guanine phosphoribosyltransferase. All primers used in the present study are detailed in Table 2. The deletion pathway and pop-in/pop-out recombination steps are described in Figure 2. Genes 2018, 9, x FOR PEER REVIEW 4 of 13

Figure 1. Construction of the pUPH plasmid. Primers XhoI-6MPK_Up and SmaI-6MPK_Do were Figure 1. Constructionused ofto amplify the pUPH TK0664 from plasmid. the T. kodakarensis Primers KOD1 XhoI-6MPK_Upgenome. Then, TK0664 andand the vector SmaI-6MPK_Do pUFH were used were digested by SmaI (S) and XhoI (X) and ligated after a gel purification step, to form plasmid to amplify TK0664 frompUPH where the pyrFT.kodakarensis is replaced by TK0664KOD1. The restriction genome. sites BamHI Then, (B) and TK0664KpnI (K) wereand conserved the vector pUFH were digested by SmaI (S)to enable and cloning XhoI of (X)the homologous and ligated regions in after pUPH. a gel puriﬁcation step, to form plasmid pUPH where pyrF is replaced by TK0664. TheTable restriction 2. List of primers sites used in BamHIthis study. (B) and KpnI (K) were conserved to Primers Used for Tm enable cloning ofAmplification the homologous of Flanking regions in pUPH. Sequence (5-3) Genes 2018, 9, x FOR PEER REVIEW (°C) 5 of 13 Regions of Targeted Gene PolB_1Up AAAAAAGGTACCGCTTAACATTCCTGACTCCCAGAATCTT 59.4 PolB_1Do TCTATTTCATTAAATCACCTAATTTCACCCTTTTAAAAATACATGCCCAT 57.9 PolB_2Up ATTTTTAAAAGGGTGAAATTAGGTGATTTAATGAAATAGAATGAGCAGGA 57.9 PolB_2Do AAAAAAGGATCCCGGCTTCTGGGGAAACCTCG 60.6 6MPb_1Up AAAAAACGTACCAAGAAAACCGGAGTTTTAGTGAATACACC 58.4 6MPb_1Do TCTCATGGAAACATTTAAATGGTTGTGGTATCTTGGACAAGAAGAAAA 59.5 TTGTCCAAGATACCACAACCATTTAAATGTTTCCATGAGAAAAATGAAATG 6MPb_2Up 60.3 CAAAAA 6MPb_2Do AAAAAAAGATCTCTCGCTCTAAAGGAGCTTTCAACA 56.0 RHII_1Up AAAAAAGGTACCCGGTACCCTGATAAAGAAGGCATC 59.4 RHII_1Do TTAGTATTCAGGAAATGAGGACTCTTGAGGTTCTTTCTCTTCGGT 61.3 RHII_2_Up AGAGAAAGAACCTCAAGAGTCCTCATTTCCTGAATACTAACGTTCCG 63.0 RHII_2_Do AAAAAAAGATCTACGACTCATGATGTTAATCCTCTTACAGAG 57.4 Primers Used to Check Tm Sequence (5-3) Mutants (°C) PolB_Up GTCAGCTATGAGCTCGTGAAGAGTTAT 59 PolB_Do AGAAGAGCGTAAATGTAAGGCTGGA 59 6MPk_Up AAAAAACTCGAGCCCGTCCAAGCTACCACTCCC 69 6MPk_Do AAAAAACCCGGCTTCAAAACCCAGCCAAACAACACCC 71 6MPb_Up ACCTCAGACATCTCTGCTGCTTG 60 6MPb_Do GCCCCGATAAGTGCTGAAAGATACA 60 RHII_Up GAGGAATCGCTGAAGTTTTACTGGG 59 RHII_Do CTACAAAGAGCATGGCGAATTTCCG 60 Tm: Melting temperature.

Figure 2. Schematic deletion diagram of TERMP_00517. The plasmid pUPH-1 was constructed by Figure 2. Schematic deletion diagram of TERMP_00517. The plasmid pUPH-1 was constructed by ligation of homologous regions (HR) flanking TERMP_00517 inside pUPH and used to transform T. ligation of homologous regions (HR) ﬂanking 00517 inside pUPH and used to transform barophilus MP. After a first homologous recombinationTERMP_ (pop-in), cells containing the integrated T. barophilusplasmid MP. were After selected a ﬁrst with homologous simvastatin (int). recombination The pair of (pop-in),primers 1 cells was used containing to verify the plasmid integrated plasmidintegration were selected at this step.with Then,simvastatin intermediated (int). The cells pair were of spread primers on 1 6-MPwas used to get to the verify second plasmid integrationrecombination at this step. event Then, (pop-out), intermediated resulting in cells plasmid were ex spreadcision. onThis 6-MP could to lead get either the second to gene recombination deletion eventor (pop-out), to a WT genotype, resulting depending in plasmid on excision. the recombinat Thision could site lead(full line either or dashed to gene line deletion respectively). or to a WT genotype,Primer depending pairs 2 and on3 are the used recombination to validate successful site (full creation line or of dashed a mutant line strain. respectively). Primer pairs 2 and 3 are used to validate successful creation of a mutant strain. 2.4. Transformation of Thermococcus barophilus The transformation protocol used in this study was identical to that described by Thiel et al. (2014) [31]. No CaCl2 cell treatment was required for the transformation and sulfur was omitted from the TRM medium during the 6 h of cell pre-incubation at 85 °C. Then, the cells were harvested by centrifugation (8000× g, 6 min) concentrated in 200 µL of fresh TRM without sulfur; and kept on ice for 30 min. An aliquot of 4–5 µg of plasmid DNA was added to the cells, and the mixture was incubated for 1 hour on ice. The heatshock step was carried out at 85 °C for 10 min and was followed by an incubation of 10 min on ice. Finally, the transformants were used to inoculate 20 mL of fresh TRM medium supplemented with sulfur and incubated at 85 °C for 18 h. After transformation, the cells that had integrated the plasmid into their chromosome were selected on solid medium (Pop-in recombination, Figure 2). At 85 °C, phytagel maintains TRM plates in a solid state (Sigma, 10 g/L). Cells were harvested by centrifugation (8000× g, 6 min), resuspended in 100 µL of fresh TRM before spreading on plates containing simvastatin (final concentration 2.5 µg/mL). The plates were then incubated for five days at 85 °C. A second step was needed to excise the targeted gene (pop-out recombination, Figure 2). This counterselection was performed on plates containing TRM, supplemented with 6-MP (final concentration 100 µM). The strains growing on these plates were resistant to 6-MP and sensitive to simvastatin, since the plasmids had been excised. A PCR was performed, and the PCR products sequenced to examine the different mutants.

2.5. DNA Extraction and Purification First, overnight cultures were centrifuged at 8000× g for 8 min. Then, the pellet was suspended in 300 µL of TE (100 mM of Tris-HCl pH8, 50 mM of NaCl, 50 mM of EDTA pH 8). To ensure cell lysis, 40 µL of SDS (10%), 40 µL of Sarkosyl (10%) and 20 µL of proteinase K (20 mg/mL) were added.

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Table 2. List of primers used in this study.

Primers Used for Ampliﬁcation of Flanking Sequence (50-30) Tm (C) Regions of Targeted Gene PolB_1Up AAAAAAGGTACCGCTTAACATTCCTGACTCCCAGAATCTT 59.4 PolB_1Do TCTATTTCATTAAATCACCTAATTTCACCCTTTTAAAAATACATGCCCAT 57.9 PolB_2Up ATTTTTAAAAGGGTGAAATTAGGTGATTTAATGAAATAGAATGAGCAGGA 57.9 PolB_2Do AAAAAAGGATCCCGGCTTCTGGGGAAACCTCG 60.6 6MPb_1Up AAAAAACGTACCAAGAAAACCGGAGTTTTAGTGAATACACC 58.4 6MPb_1Do TCTCATGGAAACATTTAAATGGTTGTGGTATCTTGGACAAGAAGAAAA 59.5 6MPb_2Up TTGTCCAAGATACCACAACCATTTAAATGTTTCCATGAGAAAAATGAAATGCAAAAA 60.3 6MPb_2Do AAAAAAAGATCTCTCGCTCTAAAGGAGCTTTCAACA 56.0 RHII_1Up AAAAAAGGTACCCGGTACCCTGATAAAGAAGGCATC 59.4 RHII_1Do TTAGTATTCAGGAAATGAGGACTCTTGAGGTTCTTTCTCTTCGGT 61.3 RHII_2_Up AGAGAAAGAACCTCAAGAGTCCTCATTTCCTGAATACTAACGTTCCG 63.0 RHII_2_Do AAAAAAAGATCTACGACTCATGATGTTAATCCTCTTACAGAG 57.4 Primers Used to Check Sequence (5 -3 ) Tm ( C) Mutants 0 0 PolB_Up GTCAGCTATGAGCTCGTGAAGAGTTAT 59 PolB_Do AGAAGAGCGTAAATGTAAGGCTGGA 59 6MPk_Up AAAAAACTCGAGCCCGTCCAAGCTACCACTCCC 69 6MPk_Do AAAAAACCCGGCTTCAAAACCCAGCCAAACAACACCC 71 6MPb_Up ACCTCAGACATCTCTGCTGCTTG 60 6MPb_Do GCCCCGATAAGTGCTGAAAGATACA 60 RHII_Up GAGGAATCGCTGAAGTTTTACTGGG 59 RHII_Do CTACAAAGAGCATGGCGAATTTCCG 60 Tm: Melting temperature.

2.4. Transformation of Thermococcus barophilus The transformation protocol used in this study was identical to that described by Thiel et al. (2014) [31]. No CaCl2 cell treatment was required for the transformation and sulfur was omitted from the TRM medium during the 6 h of cell pre-incubation at 85 C. Then, the cells were harvested by centrifugation (8000 g, 6 min) concentrated in 200 µL of fresh TRM without sulfur; ⇥ and kept on ice for 30 min. An aliquot of 4–5 µg of plasmid DNA was added to the cells, and the mixture was incubated for 1 h on ice. The heatshock step was carried out at 85 C for 10 min and was followed by an incubation of 10 min on ice. Finally, the transformants were used to inoculate 20 mL of fresh TRM medium supplemented with sulfur and incubated at 85 C for 18 h. After transformation, the cells that had integrated the plasmid into their chromosome were selected on solid medium (Pop-in recombination, Figure 2). At 85 C, phytagel maintains TRM plates in a solid state (Sigma, 10 g/L). Cells were harvested by centrifugation (8000 g, 6 min), resuspended in ⇥ 100 µL of fresh TRM before spreading on plates containing simvastatin (final concentration 2.5 µg/mL). The plates were then incubated for five days at 85 C. A second step was needed to excise the targeted gene (pop-out recombination, Figure 2). This counterselection was performed on plates containing TRM, supplemented with 6-MP (final concentration 100 µM). The strains growing on these plates were resistant to 6-MP and sensitive to simvastatin, since the plasmids had been excised. A PCR was performed, and the PCR products sequenced to examine the different mutants.

2.5. DNA Extraction and Purification First, overnight cultures were centrifuged at 8000 g for 8 min. Then, the pellet was suspended ⇥ in 300 µL of TE (100 mM of Tris-HCl pH8, 50 mM of NaCl, 50 mM of EDTA pH 8). To ensure cell lysis, 40 µL of SDS (10%), 40 µL of Sarkosyl (10%) and 20 µL of proteinase K (20 mg/mL) were added. The cell suspension was incubated for 1 h at 55 C. Then, 20 µL of RNase A (50 mg/mL) and 200 µL of lysis buffer (GeneJet Genomic DNA purification kit, Thermofisher Illkirch, France) were added. The mix was put into a purification column and centrifuged at 6000 g for 1 min. Two successive cleaning steps ⇥ were carried out, with 500 µL of cleaning solution and 1 min of centrifugation at 12,000 g. To remove ⇥ any trace of ethanol, the suspension was centrifuged (12,000 g, 3 min). Then, the column was placed ⇥ in a clean tube and 200 µL of sterile water used for elution after centrifugation at 12,000 g for 1 min. ⇥ Genes 2018, 9, x FOR PEER REVIEW 6 of 13

The cell suspension was incubated for 1 h at 55 °C. Then, 20 µL of RNase A (50 mg/mL) and 200 µL of lysis buffer (GeneJet Genomic DNA purification kit, Thermofisher Illkirch, France) were added. The mix was put into a purification column and centrifuged at 6000× g for 1 min. Two successive cleaning steps were carried out, with 500 µL of cleaning solution and 1 min of centrifugation at 12,000× g. To remove any trace of ethanol, the suspension was centrifuged (12,000× g, 3 min). Then, the column was placed in a clean tube and 200 µL of sterile water used for elution after centrifugation at 12,000× g for 1 min.

Genes 2018, 9, 77 6 of 13 3. Results

3.1. Sensitivity3. Results of T. barophilus MP to the Purine Analog 6-MP To3.1. verify Sensitivity if wild of T. type barophilus (WT) MP T. tobarophilus the Purine Analogcells were 6-MP sensitive to 6-MP, growth experiments were conducted Toon verify liquid if wildTRM type media (WT) containingT. barophilus 6-MPcells were at concentrations sensitive to 6-MP, ranging growth experimentsfrom 0 to 250 were µM (Figure 3A). Growthconducted of the on liquidWT strain TRM mediawas slightly containing impact 6-MPed at concentrationsin the presence ranging of 10 from µM 0 6-MP, to 250 withµM a slight (Figure 3A). Growth of the WT strain was slightly impacted in the presence of 10 µM 6-MP, with a effect on the growth rate but not on the growth yield. As shown in Figure 3A, at a minimum slight effect on the growth rate but not on the growth yield. As shown in Figure 3A, at a minimum concentrationconcentration of 50 of µM 50 µ 6-MP,M 6-MP, an an inhibitory inhibitory effecteffect on on growth growth was was observed, observed, with a haltwith in a growth halt in growth betweenbetween 3 and 3 12 and h 12(Figure h (Figure 3A)3A) that that could could eveneven last last until until 24 h24 (data h (data not shown). not shown). The same The inhibitory same inhibitory effect waseffect observed was observed with with higher higher concen concentrationstrations of of 6-MP 6-MP (100 (100 and and 250 µ 250M). µM).

Figure Figure 3. Growth 3. Growth curves curves of: of:T. T.kodakarensis kodakarensis KOD1KOD1 (A ();A and); andT. barophilus T. barophilusMP (B ).MP The (B strains). The were strains were cultivated at 85 C and 0.1 MPa in TRM medium containing different concentrations of 6-MP: 0 µM cultivated at 85 °C and 0.1 MPa in TRM medium containing different concentrations of 6-MP: 0 µM (⌅), 10 µM(N), 50 µM( ), 100 µM(⌥) and 250 µM( ). (), 10 µM (), 50 µM (×),⇥ 100 µM () and 250 µM• (). To make a comparison with T. kodakarensis, in which 6-MP is used as a selection marker in genetic Tomanipulations, make a comparison we performed with theT. kodakarensis same growth, experimentsin which 6-MP in T. kodakarensisis used as aKOD1, selection with themarker same in genetic manipulations,range of concentrations we performed of 6-MP the (Figuresame growth3B). Regardless experiments of the concentration in T. kodakarensis used, growth KOD1, inhibition with the same range ofwas concentrations observed, but with of 6-MP a resumption (Figure of 3B). growth Rega beyondrdless 6 or of 9 the h of concentration incubation, which used, might growth possibly inhibition be due to the growth of resistant cells. was observed, but with a resumption of growth beyond 6 or 9 h of incubation, which might possibly As genetic manipulations are mainly carried out on solid culture media, we tested whether be dueT. to barophilus the growthis sensitive of resistant or not tocells. 6-MP compared with T. kodakarensis. Therefore, we did spot tests Asto genetic assess the manipulation growth of T. barophiluss are mainlyon TRM carried solid medium out on supplemented solid culture with media, 6-MP concentrationswe tested whether T. barophilusranging is sensitive from 0 to 250or µnotM, followedto 6-MP by compared the incubation with of theT. spottedkodakarensis plates for. Therefore, ﬁve days at we 85 Cdid under spot tests to assess anaerobicthe growth conditions. of T. barophilus When comparing on TRMT. barophilus solid mediumwith T. kodakarensis supplemented, the results with highlighted 6-MP aconcentrations clear difference at 100 µM, with no growth in (data not shown), whereas cells ranging from 0 to 250 µM, followed by T.the kodakarensis incubation of the spotted platesT. barophilusfor five days at 85 °C were able to grow, even at 250 µM, but not at 500 µM. According to the results obtained, the T. barophilus under WT anaerobic strain does conditions. not appear to Whenbe very sensitive comparing to 6-MP. T. barophilus with T. kodakarensis, the results highlightedIt a is clear known difference that the sensitivity at 100 µM, of T. kodakarensiswith no growthto 6-MP in is T. linked kodakarensis to the TK0664 (datagene not encoding shown), a whereas T. barophilushypoxanthine/guanine cells were able phosphoribosyltransferase to grow, even at 250 [37 µM,]. By but analyzing not at the 500 genome µM. of AccordingT. barophilus to[43 ],the results obtained,we identiﬁedthe T. barophilus the TERMP_00517 WT straingene does encoding not appear a hypoxanthine/guanine to be very sensitive phosphoribosyltransferase. to 6-MP. The TK0664 gene product is composed of 214 amino acids), while the gene product It is known that the sensitivity of T. kodakarensis to 6-MP is linkedTERMP_00517 to the TK0664 gene encoding is composed of 215 aa, these two proteins share 80.5% identity and 90.2% similarity in the peptide a hypoxanthine/guaninesequence. Given the phosphoribosyltransferase degree of similarity between the [37]. two By proteins, analyzing it was the questioned genome whether of T. barophilus [43], the we product identified of the TERMP_00517 the TERMP_00517gene is responsible gene to some encoding extent for the relativea hy sensitivitypoxanthine/guanine of phosphoribosyltransferase.T. barophilus to 6-MP. To test The this, TK0664TERMP_00517 gene producdeletiont experiments is composed were of performed. 214 amino acids), while the TERMP_00517 gene product is composed of 215 aa, these two proteins share 80.5% identity and 90.2% similarity in the peptide sequence. Given the degree of similarity between the two proteins, it was

Genes 2018, 9, x FOR PEER REVIEW 7 of 13

Genesquestioned2018, 9, whether 77 the product of the TERMP_00517 gene is responsible to some extent for the relative7 of 13 sensitivity of T. barophilus to 6-MP. To test this, TERMP_00517 deletion experiments were performed.

D 3.2. Construction of the TERMP_00517 After several unsuccessful attempts to delete with the pUFH suicide vector [31], After several unsuccessful attempts to delete TERMP_00517 with the pUFH suicide vector [31], the new construct pUPH (Figure 1) containing the marker cassette was used to clone the the new construct pUPH (Figure 1) containing the TK0664 marker cassette was used to clone the flanking area of this targeted gene. The resulting plasmid (pUPH-1) served in the transformation flanking area of this targeted gene. The resulting plasmid (pUPH-1) served in the transformation of of MP using simvastatin as a marker for the pop-in recombination step (Figure 2). T. barophilusT. barophilus MP using simvastatin as a marker for the pop-in recombination step (Figure 2). Several Several transformants were checked for plasmid integration by PCR after genomic DNA extraction. transformants were checked for plasmid integration by PCR after genomic DNA extraction. As As shown in Figure 4A, the gene was present in the transformants and absent from WT shown in Figure 4A, the gene TK0664TK0664 was present in the transformants and absent from WT T. . Then, selected clones were spread on solid TRM medium supplemented with 100 µM T.barophilus barophilus. Then, selected clones were spread on solid TRM medium supplemented with 100 µM 6- 6-MP.MP. After After five five days days of of incubation incubation at at 85 85 °C,C, among among the the hundreds hundreds of of clones clones obtained, obtained, more more than sixty µ were streaked onon solidsolid TRMTRM mediummedium withwith oror withoutwithout addedadded simvastatinsimvastatin (2.5(2.5 µg/mL).g/mL). This was done to validate the pop-out recombination step or the plasmid excision from the genome and to compare the efficiencyefficiency of 6-MP with 5-FOA [[31].31]. Thus, more than forty clones were sensitive to simvastatin, among which twenty-four were checked for targeted gene deletion. Finally, Finally, PCR controls made it possible to identify six clones as DTERMP_00517TERMP_00517 (Figure 4B).4B). One of these strain mutants was selected to be used as a host strain in further genetic experiments.experiments.

Figure 4. PCR gel migration of mutant strain constructions. (A) TK0664 gene amplification realized Figure 4. PCR gel migration of mutant strain constructions. (A) TK0664 gene ampliﬁcation realized with primers XhoI-6MPK_Up and SmaI-6MPK_Do (Primer pair 1, Figure 2) to verify the genotype of with primers XhoI-6MPK_Up and SmaI-6MPK_Do (Primer pair 1, Figure 2) to verify the genotype pUPH after integration into the T. barophilus genome (int, well 2, 819 bp). (B) TERM_00517 gene of pUPH after integration into the T. barophilus genome (int, well 2, 819 bp). (B) TERM_00517 gene amplification realized with primers Verif-6MPB_Up and Verif-6MPB_Do (wells 1 and 3, Primer ampliﬁcation realized with primers Verif-D6MPB_Up and Verif-D6MPB_Do (wells 1 and 3, Primer pair pair 2, Figure 2) and primers 6MPB_verif_YM_Up and 6MPB_verif_YM_Do (wells 2 and 4, Primer 2, Figure 2) and primers 6MPB_verif_YM_Up and 6MPB_verif_YM_Do (wells 2 and 4, Primer pair 3, pair 3, Figure 2). Figure 2).

3.3. TERMP_00517 Is Responsible for 6-MP Sensitivity in Thermococcus barophilus 3.3. TERMP_00517 Is Responsible for 6-MP Sensitivity in Thermococcus barophilus Growth monitoring was carried out with the TREMP-00517 T. barophilus mutant on liquid TRM Growth monitoring was carried out with the DTREMP-00517 T. barophilus mutant on liquid TRM medium with concentrations of 6-MP ranging from 0 to 250 µM. Results showed that the mutant was medium with concentrations of 6-MP ranging from 0 to 250 µM. Results showed that the mutant was resistant to 6-MP regardless of the concentration used, and demonstrated that the TREMP_00517 gene resistant to 6-MP regardless of the concentration used, and demonstrated that the TREMP_00517 gene was responsible for the relative sensitivity to 6-MP in T. barophilus (compared with T. kodakarensis) was responsible for the relative sensitivity to 6-MP in T. barophilus (compared with T. kodakarensis) and and that its deletion did not affect the viability of the strain under selected culture conditions (TRM that its deletion did not affect the viability of the strain under selected culture conditions (TRM medium, medium, 85 °C, anaerobic conditions) (Figure 5A). 85 C, anaerobic conditions) (Figure 5A). The mutant TREMP_00517 T. barophilus was transformed with the plasmid pUPH-1 bearing The mutant DTREMP_00517 T. barophilus was transformed with the plasmid pUPH-1 bearing the the flanking genes of the TERMP_00517 and TK0664 genes. The integration of this plasmid was made ﬂanking genes of the TERMP_00517 and TK0664 genes. The integration of this plasmid was made upstream or downstream of the TERMP_00517 deleted region, the epictopic complemented mutant upstream or downstream of the TERMP_00517 deleted region, the epictopic complemented mutant resistant to simvastatin was grown in liquid TRM medium supplemented with 6-MP up to 250 µM resistant to simvastatin was grown in liquid TRM medium supplemented with 6-MP up to 250 µM (Figure 5B). This strain was slightly sensitive to 10 µM 6-MP and its growth was completely inhibited (Figure 5B). This strain was slightly sensitive to 10 µM 6-MP and its growth was completely inhibited

Genes 2018, 9, 77 8 of 13

Genes 2018, 9, x FOR PEER REVIEW 8 of 13 at 50 µM 6-MP, showing that the Tk0664 gene confers sensitivity to 6-MP (Figure 5B) much more at 50 µM 6-MP, showing that the Tk0664 gene confers sensitivity to 6-MP (Figure 5B) much more effectivelyeffectively than the thanTERMP_00517 the TERMP_00517gene, gene, as as shown shown in WT WT T.T. barophilus barophilus (Figure(Figure 3A). 3A).

Figure 5. Growth curves of: T. barophilus TERMP_00517 (A); and T. barophilus TERMP_00517::pUPH- Figure 5.1 (B). TheGrowth strains werecurves cultivated of: at T. 85 °C barophilus and 0.1 MPaDTERMP_00517 in TRM medium containing(A); and differentT. barophilus DTERMP_00517concentrations::pUPH-1 of 6-MP: (B 0). µM The (), strains 10 µM ( were), 50 µM cultivated (×), 100 µM at ( 85) andC 250 and µM ( 0.1). MPa in TRM medium containing different concentrations of 6-MP: 0 µM( ), 10 µM( ), 50 µM( ), 100 µM( ) and ⌅ N ⇥ ⌥ 250 µM( Thus,). deletion of TREMP_00517, the gene encoding xanthine-guanine phosphoribosyltransferase,• confers resistance to 6-MP along with a higher sensitivity through complementation with the TK0664 gene. Thus, deletion of TREMP_00517, the gene encoding xanthine-guanine phosphoribosyltransferase, confers resistance3.4. Efficiency to of the 6-MP New Counterselecti along withon aMarker higher sensitivity through complementation with the TK0664 gene. To assess the efficiency of this new counterselection system, pop-in and pop-out recombinations were made for different target genes. Due to the randomization of the pop-out step that can either 3.4. Efﬁciencylead ofto the WT New strain Counterselection or to gene deletion, Marker several clones were screened by PCR to verify the veracity of the mutation. However, it was also necessary to check for the absence of the plasmid from the To assessstrain thegenome. efﬁciency For T. barophilus of this new, 5FOA counterselection has been previously system, used as pop-ina drug for and the pop-outcounterselection recombinations were madestep for [31] different but a high target rate of genes.false positive Due clones to the (still randomization containing the plasmid of the after pop-out growth step on 5FOA that can either plates) was recurrently observed. Consequently, colonies were re-streaked on TRM-simvastatin lead to theplates WT tostrain sort out or to the gene ones deletion,that had really several lost the clones plasmid. were This screened false-positive by PCR screening to verify is time- the veracity of the mutation. However, it was also necessary to check for the absence of the plasmid from the strain genome. For T. barophilus, 5FOA has been previously used as a drug for the counterselection step [31] but a high rate of false positive clones (still containing the plasmid after growth on 5FOA plates) was recurrently observed. Consequently, colonies were re-streaked on TRM-simvastatin plates to sort out the ones that had really lost the plasmid. This false-positive screening is time-consuming because it requires another 3–5 days of incubation at 85 C before screening for potential mutants is possible. The use of 6-MP could therefore strongly reduce the processing time of mutant constructions, in addition to expanding the utility of T. barophilus as a genetic tool. Genes 2018, 9, 77 9 of 13

Overall, with 5-FOA, 726 clones were screened and 625 were false positives (86%). With 6-MP, as described above, the first construction (DTERMP_00517) gave a rate of 37% false positives, which representsGenes a strong 2018, 9, x decrease. FOR PEER REVIEW For the next genetic deletions realized with the strain DTERMP_005179 of 13 , among the 326 clones screened, none were false positives (0%). This difference is highly significant consuming because it requires another 3–5 days of incubation at 85 °C before screening for potential 22 (t-test, p-valuemutants < 10 is possible.) and The clearly use of demonstrates6-MP could therefore the improvementstrongly reduce the of theprocessing pop-out time recombination of mutant step or the counterselectionconstructions, instep addition with to 6-MP.expanding the utility of T. barophilus as a genetic tool. Overall, with 5-FOA, 726 clones were screened and 625 were false positives (86%). With 6-MP, 3.5. Deletionas described of polB or above, rnhB the Is Notfirst construction Essential for ( ViabilityTERMP_00517 in Thermococcus) gave a rate of 37% barophilus false positives, which represents a strong decrease. For the next genetic deletions realized with the strain TERMP_00517, The constructionamong the 326 clones of effective screened, geneticnone were tools false posi in tivesT.barophilus (0%). This difference, a deep is seahighly hydrothermal significant vent Thermococcales,(t-test, p-value completes < 1022) and the clearly range demonstrates of approaches the improvem usedent in of our the laboratorypop-out recombination to study step the cellular or the counterselection step with 6-MP. processes of Thermococcales essential for adaptation and genomic maintenance under extreme temperature3.5. and/orDeletion of high polB or hydrostatic rnhB Is Not Essential pressure for Viabilit conditionsy in Thermococcus of deep seabarophilus hydrothermal vents. Among theThe different construction cellular of effective processes genetic tools being in studiedT. barophilus with, a deep this sea new hydrothermal genetic tool, vent a special emphasisThermococcales, is being put on completes genome the replication, range of approaches centering used inon our the laboratory functional to study characterization the cellular of the Thermococcalesprocesses (e.g., of ThermococcalesPyrococcus abyssiessentialand for T.adaptation barophilus and) replicationgenomic maintenance complex. under Here, extreme the PolB and PolD DNAtemperature polymerases and/orfound high hydrostatic in Thermococcales pressure conditionscarry of out deep DNA sea hydrothermal synthesis. vents. It has been shown in Among the different cellular processes being studied with this new genetic tool, a special a T. kodakarensisemphasisstrain is being deficient put on genome in PolB replication, that this cent doesering noton the affect functional growth characterization rate [36] and of the PolB does provide resistanceThermococcales to UV (e.g., irradiation. Pyrococcus In abyssi contrast, and T. all barophilus attempts) replication to generate complex. mutants Here, the deleted PolB and in polD have been unsuccessful.PolD DNA polymerases found in Thermococcales carry out DNA synthesis. It has been shown in a T. The polDkodakarensisand polBstrain genesdeficient were in PolB targeted that this does for not deletion affect growth in T. rate barophilus [36] and, PolB with does primers provide designed resistance to UV irradiation. In contrast, all attempts to generate mutants deleted in polD have been (Table 2) tounsuccessful. delete the genes TERMP_01623 (PolB) and TERMP_01872-TERMP_01873 (large and small subunits of PolD).The polD Plasmids and polB containinggenes were targeted upstream for deletion and downstream in T. barophilus, with homologous primers designed regions (Table of these two deletion targets2) to delete were the inserted genes TERMP_01623 in the pUPH (PolB) plasmid and TERMP_01872-TERMP_01873 (at KpnI/BamHI restrictions (large and sites). small For polB, the counterselectionsubunits of PolD). on 6-MP Plasmids made cont itaining possible upstream to isolate and downstream several clones homologous resistant regions to of 6-MP these thattwo had been deletion targets were inserted in the pUPH plasmid (at KpnI/BamHI restrictions sites). For polB, the effectivelycounterselection deleted in the onTERMP_01623 6-MP made it possible(PolB to) isolat gene.e several Conversely, clones resistant several to 6-MP attempts that had in been deleting polD have failed,effectively demonstrating deleted in the that TERMP_01623 as for T. kodakarensis (PolB) gene. Conversely,[39] that several PolB isattempts not essential in deleting for polD cell growth (Figure 6)have while failed, PolD demonstrating is and that that PolD as isfor sufficientT. kodakarensis for [39] replicating that PolB is DNA not essential under for the cell culture growth conditions used in this(Figure study. 6) while PolD is and that PolD is sufficient for replicating DNA under the culture conditions used in this study.

Figure 6. Growth curves of T. barophilus TERMP_00517, T. barophilus TERMP_00517, Figure 6. TERMP_01623Growth curves(polB) and of T. barophilusT. barophilus TERMP_00517DTERMP_00517, TERMP_00671, T. (rnhB barophilus). The strainsDTERMP_00517, were DTERMP_01623cultivated(polB at 85) and°C andT. 0.1 barophilus MPa in TRMDTERMP_00517 medium containing, DTERMP_00671 different concentration(rnhB of). The6-MP: strains T. were cultivated atbarophilus 85 C andTERMP_00517 0.1 MPa in, TRMrnhB medium(×), T. barophilus containing TERMP_00517 different, concentrationpolB ( ) and ofT. 6-MP: barophilusT. barophilus TERMP_00517 (parental strain) (). DTERMP_00517, DrnhB ( ), T. barophilus DTERMP_00517, DpolB (N) and T. barophilus DTERMP_00517 ⇥ (parental strain) (⌥).

DNA replication in all living organisms takes place concurrently on two separate strands. The lagging strand consists of multiple discontinuous segments called Okazaki fragments, whereas the Genes 2018, 9, 77 10 of 13 leading strand consists of one large continuous segment. The production of each individual lagging strand by DNA polymerase is primed by a short stretch of RNA. RNases H are enzymes that degrade the RNA portion of RNA/DNA or RNA-DNA/DNA duplexes and RNase HII is likely the key enzyme involved in RNA elimination in Thermococcales [44]. In the same way as for polB, primers were designed to delete the rnhB gene. Genomic regions upstream and downstream of the targeted gene were PCR-ampliﬁed and cloned in the pUPH plasmid. The DTERMP_00517 T. barophilus strain was transformed by this new construction and the deletion of the mutant in the rnhB gene has since been successfully obtained. Thus, this gene does not appear to be essential for the growth cycle as its growth is similar to that of the parental strain (Figure 6). This conﬁrms what has been recently demonstrated in T. kodakarensis, where RNase HII individual deletion is not essential for cell growth [38].

4. Discussion In this study, we have shown that the WT T. barophilus MP strain is relatively resistant to 6-MP, and the deletion of the TERMP_00517 gene homologous to the TK0664 gene makes the strain completely resistant to 6-MP. The epictopic expression of TK0664 in the T. barophilus strain deleted for the TERMP_00517 gene makes it completely sensitive to 6-MP. Based on the lethal incorporation of 6-methylpurine in the purine salvage pathway through TK0664 expression, the TK0664/6-MP system has allowed the deletion of multiple genes in different archaea [23,45]. In this study, we demonstrated the relevance of using this counterselection marker in T. barophilus. Despite the presence in its genome of the TERMP_00517 gene encoding xanthine-guanine phosphoribosyltransferase, homologous to TK0664, T. barophilus has previously been described as insensitive to 6-MP [31]. Here, the results of our study highlighted the influence of this gene on the sensitivity of the WT strain. Indeed, a dose-effect is observed with the WT T. barophilus strain but this had totally disappeared from the strain with an impaired TERMP_00517 gene (Figures 3A and 5A). Moreover, the sensitivity of T. barophilus to 6-MP conferred by TK0664 is much higher than that allowed by TERMP_00517 (Figure 5B). Although the two gene products share more than 80% identity and 90% similarity, it seems that the xanthine-guanine phosphoribosyltransferase enzyme encoded by TK0664 gene is more efficient than that encoded by TREMP_00517 gene in producing sufficient toxic product after 6-MP enzymatic conversion. It should be mentioned that the system with the pyrF/5FOA marker was very useful for initiating genetic manipulations in T. barophilus [31], but because the percentage of false positives is too high, the time needed to obtain a mutant is much longer, requiring more liquid culture steps, restreaking on solid media, and PCR checking, which together lengthen the procedure considerably. With the DTERMP_00517 T. barophilus strain, the new system gives few or no false positives (less than 15%) after screening on solid TRM supplemented with simvastatin, which substantially reduces the time required to obtain mutants in T. barophilus. However, it should be noted that this substantial improvement does not make it possible to skip the PCR verification step to truly verify plasmid excision. The new pUPH suicide vector bearing simvastatin (hmg-CoA) resistance and 6-MP (TK0664) sensitivity markers that was constructed and used in this study for T. barophilus has already allowed individual deletion of the genes TERMP_00517, polB and rnhB in T. barophilus. Here, the results obtained on genes encoding DNA polymerases corroborate the results obtained in T. kodakarensis [39]: PolD is likely the essential replicative enzyme and PolB could play a role in DNA repair and/or recombination and an alternative role in DNA replication [39]. As demonstrated in this study, loss of rnhB from T. barophilus had no effect on growth rate. This corroborates a recent study showing that RNase HII can be deleted in T. kodakarensis with no discernible effects on viability and growth [38]. However, it seems that RNase HII must collaborate with Fen1 (a flap endonuclease) to maintain viability in the absence of GAN (for GINS-associated nuclease) in T. kodakarensis [38]. Genes 2018, 9, 77 11 of 13

5. Conclusions This improvement enlarges the number of genetic selection markers for T. barophilus, which is particularly valuable at present to pursue investigations on piezophilic adaptation in this deep-sea hydrothermal vent archaeon [20]. As illustrated in this study, T. barophilus can also serve as a model for the genetic and physiological studies of other cellular processes such as the genomic maintenance under high temperature and high pressure, corresponding to the environmental conditions found in deep sea hydrothermal vents.

Acknowledgments: We thank Nadège Quintin for the deposition of the strains described in this work in the UBOculture collection (http://www.univ-brest.fr/souchotheque/CollectionLM2E). We are grateful to Helen McCombie for helpful improvements to the written English. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-1725 01-Living Deep). A.T. was supported by a postdoctoral fellowship from the Conseil Général 29 and from Ifremer. T.B. was supported by a Ph.D. fellowship from the Conseil Régional de Bretagne. Author Contributions: T.B., A.T., Y.M. and M.J. conceived and designed the experiments; T.B., A.T. and Y.M. performed the experiments; all the authors analyzed the data; and T.B., A.T., Y.M., G.H., D.F. and M.J. wrote, edited and approved the manuscript. Conﬂicts of Interest: The authors declare no conﬂict of interest.

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Tie : Adaai a hae ei hdaie: di de ce de ge de hdgae che e ache i-hehehie Theccc bahi

M c : D-a, , a, a, a, , Thermococcales R : Da , aaa a a a a a Ha Thermococcus barophilus. C a - a a a Sa 3550 , a a 40 MPa; a a a - a a a b a-a (0,1 70 MPa). I, a a a aaa a HPH a a aba a. C b ba a b a , a a Saa a 6- (6-MP) a . N a , a a 6-MP a -. C a a (SHI SHII), a baa (Mb, Mb-C Mb). La a 6- a a, a ab b a , a a 30% 80% b a 5-FOA, a a a. L a a a a a.

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Keod : D-a, , a , a, a , , Thermococcales Abac : T a a a a b, b a a a ab a a , a aaab. A Ha a a aa. I , a aaa HHP a a a T.barophilus. T aaa - a a a 3550 a a ; , a a - a b a a-a HHP (0,1 a 70 MPa). H, a a aaa HHP aaab aa. T ba a b ba a a, a aa a 6-MP a . I a a , 6- a . T a a a (SHI a SHII), a ba b a (Mb, Mb-C, Mb). U 6- a , a a - 80% ba 5-FOA 10%, a a a HHP a a a .