Encyclia Angustiloba)

UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

GERMINACIÓN Y CONSERVACIÓN IN VITRO DE SEMILLAS DE ORQUIDEA (Encyclia angustiloba)

TRABAJO EXPERIMENTAL

Trabajo de titulación presentado como requisito para la obtención del título de

INGENIERA AGRÓNOMA

AUTORA OTERO RUIZ KARISSA LISSETH

TUTORA PhD. VEGAS GARCÍA ARIADNE

GUAYAQUIL – ECUADOR

2020

UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERIA AGRONÓMICA

APROBACION DEL TUTOR

Yo, ARIADNE VEGAS, docente de la Universidad Agraria del Ecuador, en mi calidad de Tutor, certifico que el presente trabajo de titulación: “GERMINACIÓN Y CONSERVACIÓN IN VITRO DE SEMILLAS DE ORQUIDEA (encyclia angustiloba)”, realizado por la estudiante OTERO RUIZ KARISSA LISSETH; con cedula de identidad N° 0706693298 de la carrera de INGENIERIA AGRONÓMICA, Unidad Académica Guayaquil, ha sido orientado y revisado durante su ejecución; y cumple con los requisitos técnicos exigidos por la Universidad Agraria del Ecuador; por lo tanto se aprueba la presentación del mismo.

Atentamente,

……………………………….. PhD. ARIADNE VEGAS

Guayaquil, 7 de Febrero del 2020

UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERIA AGRONÓMICA

APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN

Los abajo firmantes, docentes designados por el H. Consejo Directivo como miembros del Tribunal de Sustentación, aprobamos la defensa del trabajo de titulación: “GERMINACIÓN Y CONSERVACIÓN IN VITRO DE SEMILLAS DE ORQUIDEA (Encyclia angustiloba)”, realizado por la estudiante OTERO RUIZ KARISSA LISSETH, el mismo que cumple con los requisitos exigidos por la Universidad Agraria del Ecuador.

Atentamente,

Ing. Danilo Valdez Rivera PRESIDENTE

Ing. Wilmer Baque Bustamante Ing. Kleber Calle Romero EXAMINADOR PRINCIPAL EXAMINADOR PRINCIPAL

Blga. Flor Dorregaray Llerena EXAMINADOR SUPLENTE

Guayaquil, 10 de febrero 2020

Dedicatoria

Esta tesis se la dedico exclusivamente a mis padres

Diana Ruiz y Bolívar Otero, por ser las personas más importantes en mi vida y que me han apoyado incondicionalmente en todas las decisiones que he tomado, También quiero dedicar este trabajo a mis hermanos Kathia y Kevin por estar en todo momento conmigo y nunca dejarme sola. A mi mejor amiga

Bianca, por su absoluta ayuda en los momentos difíciles.

Agradecimiento

Agradezco a la Universidad Agraria del Ecuador, por permitirme realizar mi proyecto de tesis, en el laboratorio de Biotecnología. A mi tutora de Tesis la

Dra. Ariadne Vegas García, por sus enseñanzas y su colaboración incondicional para lograr este proyecto.

A mis profesores que con sus enseñanzas han sabido guiarme día a día, Al biólogo. James Pérez por su ayuda fundamental en la obtención de las cápsulas de la orquídea Encyclia angustiloba

Autorización de Autoría Intelectual

Yo OTERO RUIZ KARISSA LISSETH en calidad de autor(a) del proyecto realizado, sobre “GERMINACIÓN Y CONSERVACIÓN IN VITRO DE SEMILLAS DE

ORQUIDEA (Encyclia angustiloba)” para optar el título de INGENIERA

AGRÓNOMA por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD AGRARIA DEL

ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autor(a) me correspondan, con excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su

Reglamento.

Guayaquil, 04 de Agosto del 2020

OTERO RUIZ KARISSA LISSETH 0706693298

Índice general

PORTADA……………………………………………………………………………...1

APROBACION DEL TUTOR ………………………………………………………..2

APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN………………………….3

Dedicatoria……………………………………………………………………………4

Agradecimiento……………………………………………………………………....5

Autorización de Autoría Intelectual……………………………………………….6

Índice general …………………………………………………………………………7

Índice de tablas……………………………………………………………………...11

Índice de figuras…………………………………………………………………….12

1. Introducción………………………………………………………………………16

1.1 Antecedente del problema…………………………………………………….16

1.2 Planteamiento y formulación del problema………………………………..16

1.2.1 Planteamiento del problema………………………………………………16

1.2.2 Formulación del problema………………………………………………...17

1.3 Justificación de la investigación...... 17

1.4 Delimitación de la investigación ……………………………………………20

1.5 Objetivo general ...... 20

1.6 Objetivos específicos ...... 20

1.7 Hipótesis ...... 20

2. Marco teórico……………………………………………………………………..19

2.1 Estado del arte ...... 19

2.2 Bases teóricas ...... 23

2.2.1 Generalidades de Encyclia angustiloba ...... 23

2.2.2 Taxonomía de la orquídea Encyclia angustiloba ...... 23 8

2.2.3 Morfología de la orquídea Encyclia angustiloba ...... 24

2.2.4 Micropropagación de orquídeas ...... 24

2.2.5 Propagación de orquídeas por semillas ...... 25

2.2.6 Etapas de la Micropropagación ...... 25

2.2.6.1. Selección del explante ...... 25

2.2.6.2. Establecimiento de medios de cultivo ...... 26

2.2.6.3. Multiplicación ...... 26

2.2.6.4. Desarrollo y enraizamiento…………………………………….…...…26

2.2.6.5. Adaptación a medio externo…………………………………………..26

2.2.7 Factores que afectan la propagación, la germinación y crecimiento

de las orquídeas ...... 27

2.2.7.1. Luz ...... 27

2.2.7.2. Temperatura ...... 30

2.2.7.3. pH ...... 30

2.2.7.4. Humedad relativa (HR) ...... 30

2.2.8 Medios de cultivos en orquídeas ...... 31

2.2.9 Medios de cultivo con suplementos orgánicos ...... 29

2.2.9.1. Agua de coco...... 29

2.2.9.2. Medio PDA (Agar Dextrosa-Papa) ...... 29

2.2.10 Medios de cultivo con reguladores de crecimiento ...... 30

2.2.10.1 Citocininas (BAP) 6-benzilaminopurina...... 30

2.2.11 Fitohormonas ...... 30

2.3 Marco legal ...... 30

3. Materiales y métodos……………………………………………………………33

3.1 Enfoque de la investigación………………………………………………….33 9

3.1.1 Tipo de investigación...... 33

3.2 Metodología ...... 33

3.2.1 Variables ...... 33

3.2.1.1. Variable independiente para la germinación in vitro de semillas 33

3.2.1.2. Variables independientes para la conservación in vitro de

semillas…………………………………………………………………..33

3.2.1.3. Variable dependiente para la germinación in vitro de semillas…34

3.2.1.4. Variable dependiente para la conservación in vitro de semillas..34

3.2.2 Tratamientos………………………………………………………………...34

3.2.3 Diseño experimental……………………………………………………….35

3.2.4 Recolección de datos ...... 36

3.2.4.2. Métodos y técnicas ...... 36

3.2.5 Análisis estadístico ...... 37

3.2.5.1. Análisis funcional...... 37

3.2.5.3. Hipótesis estadística ...... 37

3.2.5.3.1. Hipótesis estadística para la germinación de las semillas...... 37

3.2.5.5 Manejo del ensayo………………………………………………………..38

3.2.5.6 Variables a evaluarse………………………………………...... 39

3.3. Aspectos administrativos ...... 41

3.3.1 Recursos bibliográficos ...... 41

3.3.2 Materiales y equipos ...... 41

3.3.3 Recursos humanos ...... 42

3.3.4 Recursos económicos ...... 42

4.Resultados…………………………………………………………………………43 10

4.1 Determinar el porcentaje de germinación de las semillas de Encyclia

angustiloba en medios de cultivos artificiales……………………………43

4.1.1 Primera Siembra …………………………………………………………….43

4.1.2 Conservación de semillas de Encyclia angustiloba ...... 44

4.2 Identificar el medio de cultivo más apropiado para la germinación de

Encyclia angustiloba…………………………………………………………..45

4.3 Establecer métodos de conservación de semillas in vitro de Encyclia

angustiloba...... 46

5. Discusión………………………………………………………………………….47

6. Conclusiones……………………………………………………………………..50

7. Recomendaciones…………………………………………………………….....51

8. Bibliografía………………………………………………………………………..52

9. Anexos…………………………………………………………………………….58

Índice de tablas

Tabla 1. Tratamientos para evaluar para la germinación in vitro de las semillas de

Encyclia angustiloba...... 35

Tabla 2.Tratamientos para evaluar para la conservación in vivo de las semillas de

Encyclia angustiloba...... 35

Tabla 3. Características del experimento ...... 40

Tabla 4. Valoración económica del proyecto ...... 42

Tabla 5. Porcentajes de germinación y contaminación de las semillas sembradas

en los tres medios iniciales (PDA, MS Agua de coco y MS BAP) ...... 43

Tabla 6. Anava Prueba de Kruskal Wallis en la germinación in vitro de semillas de

E. angustiloba ...... 44

Tabla 7. Anava Prueba de Kruskal Wallis en la conservación de semillas de Encyclia

angustiloba ...... 45

Tabla 8. Anava Prueba de Kruskal Wallis para la comparación de los medios de

cultivo apropiados para la germinación de semillas de Encyclia

angustiloba ...... 46

Tabla 9. Composición básica fundamental medios de cultivo...... 59

Tabla 10. Componentes del medio Murishage y Skoog (MS) ...... 60

Tabla 11. Anava Prueba de Kruskal Wallis en germinación in vitro de las semillas

de Encyclia angustiloba (medios de cultivos sin germinación) ...... 61

Tabla 12. Anava Prueba de Kruskal Wallis en la Conservación de la semilla Encyclia

angustiloba (medios de cultivos sin germinación) ...... 61

Tabla 13. Anava Prueba de Kruskal Wallis en la Germinación de Encyclia

angustiloba (medios de cultivos con germinacion) ...... 61

Índice de figuras

Figura 1. Criterios para establecer germinación y estadios de crecimiento de

Encyclia angustiloba (Batigyna et al. 2003)...... 40

Figura 2. Plántulas de Encyclia angustiloba en medio PDA a los 120 dds (400X) 44

Figura 3. Ubicación geográfica del Laboratorio de Biotecnología de la Universidad

Agraria del Ecuador, sede Guayaquil. (Tomado de Google Maps)...... 58

Figura 4. Cápsulas maduras de la orquídea Encyclia angustiloba donadas por el jardín botánico de Guayaquil ...... 62

Figura 5. Pesado y desinfección de las semillas de Encyclia angustiloba en la cámara de flujo laminar. A) Pesado de la semilla en la balanza analítica; y B)

Proceso de desinfección de las semillas...... 62

Figura 6. Preparación de los medios de cultivos para la germinación de las semillas de Encyclia angustiloba A) Fase de elaboración y B) Medios de cultivos antes de la esterilización en autocable...... 63

Figura 7. Proceso de siembra de los medios de cultivo A) Siembra de las semillas de Encyclia angustiloba; y B) Colocación de los medios de cultivo en condiciones de luz...... 63

Figura 8. Evaluación y contaje de las semillas de la orquídea Encyclia angustiloba en los medios de cultivo. A) Contaje de las semillas B) Evaluación de la germinación de las semillas mediante el uso de microscopio (400x)...... 64 13

Figura 9. Evaluación de la contaminación externa por hongos y bacterias en los medios de cultivo. A) Contaminación en el medio de cultivo PDA. B) Contaminación en el cultivo MS AC...... 64

Figura 10. (A) Semillas de orquídea, bajo microscopio a 30 días después de la siembra (400x), (B) Plántula bajo microscopio a los 3 meses. (C) Plántula a los 8 meses de siembra en condiciones de luz. (D) Plántula en medio de cultivo MS complementado con BAP y ANA ...... 65

Figura 11. Evaluación y contaje de las semillas de la orquídea en los medios de cultivo mediante el uso del microscopio con mi tutora Dra. Ariadne Vegas...... 66

Resumen

La orquídea Encyclia es una especie endémica de la provincia del Guayas, la única en su clase y fue designada como la flor emblemática de Guayaquil. El objetivo de la presente investigación fue determinar la germinación y conservación in vitro de semillas de Encyclia angustiloba. Esta investigación fue realizada en el laboratorio de biotecnología de la Universidad Agraria del Ecuador. Se utilizaron tres medios de cultivo para la determinación del porcentaje de germinación: MS adicionado con

20% agua de coco (AC), MS suplementado con BAP (3 mg L-1) y PDA, utilizando

10 repeticiones, con un total de 30 unidades experimentales. Para la conservación, se utilizaron cuatro tratamientos: refrigeración a 4°C y temperatura ambiente

(aprox 20 ± 2°C), ambos en condiciones de oscuridad, durante 90 días, y sembrados posteriormente en dos medios de cultivo, con 10 repeticiones para un total de 40 unidades experimentales. Se utilizó la fórmula de análisis de varianza no paramétrico Kruskal Wallis para determinar las mejores condiciones de germinación y conservación. Entre los 90 y 120 días después de la siembra, se presentó el 0,1096% y 0,0509% de germinación en los medios de cultivos PDA y

MS AC, respectivamente, y no hubo germinación en el MS BAP. Las condiciones de conservación a las que fueron sometidas las semillas de la orquídea, no favorecieron su germinación.

Palabras clave: Dextrosa, Epidendrum, medios de cultivo, Orchidaceae,

propagación in vitro,

Abstract

The Encyclia orchid is an endemic species of Guayas province, the only one of its kind and was designated as the Guayaquil emblematic flower. The objective of the present research was to determine the in vitro germination and conservation of

Encyclia angustiloba seeds. This research was carried out in the biotechnology laboratory of the Agrarian University of Ecuador. Three culture media were used to determine the germination percentage: MS with 20% coconut water (AC), MS supplemented with BAP (3 mg L-1) and PDA, using 10 repetitions, with a total of 30 experimental units. For conservation, four treatments were used: refrigeration 4°C and room temperature (approximately 20 ± 2°C), both in dark conditions for 90 days, and later placed in two culture media, with 10 repetitions for a total of 40 experimental units. For statistical analysis, the Kruskal Wallis non-parametric variance formula was used to determine the best germination and conservation conditions. Among 90 to 120 days after culture, 0.1096% and 0.0509% of germination occurred in the PDA and MS AC culture medium, respectively, and there was no germination in the MS BAP. The conservation conditions where the seeds were placed, did not favor the germination percentage and it was null.

Keywords: Culture media, dextrose Epidendrum, Orchidaceae propagation in

vitro

1. Introducción

1.1 Antecedente del problema

Las orquídeas se caracterizan por presentar una muy variada gama de formas, colores, tamaños y fragancias, especialmente sus flores, hecho que suma a estas plantas un agregado en su valor comercial (Jørgensen y León, 1999).

Ecuador posee una gran diversidad de plantas pues en su territorio han sido contabilizadas hasta ahora, 4032 especies, de las cuales 1714 son endémicas. En términos absolutos, es el país que más especies de orquídeas tiene en todo el planeta. Ecuador alberga cuatro de las cinco familias de orquídeas (Barrientos,

2010).

La orquídea Encyclia angustiloba es una especie endémica de la provincia del

Guayas, la única en su clase entre los tipos de orquídeas que crecen en los diferentes ecosistemas y fue designada como la flor emblemática de Guayaquil

(EcuRed, 2016).

1.2 Planteamiento y formulación del problema

1.2.1 Planteamiento del problema

Debido a su belleza y rareza, las orquídeas se encuentran entre las plantas más buscadas por horticultores, y por vándalos a nivel mundial (Mosquera et al., 2010).

De hecho, algunas especies se encuentran amenazadas o en peligro de extinción en nuestro país, debido al saqueo indiscriminado, destrucción de espacios, contaminación ambiental y deforestación, asociado a los problemas de lento crecimiento y baja tasa de germinación en condiciones naturales (León et al., 2011).

Parte de la fragilidad de las orquídeas, es atribuida a lo complejo de su biología reproductiva, en especial por las características de sus semillas, las cuales son muy pequeñas y carecen de endospermo, lo que hace que la viabilidad en su entorno natural sea muy precaria (Flores, Legaria y Colinas 2013, p. 7 - 12).

Considerando lo antes mencionado, y en búsqueda de propagar y conservar

la especie Encyclia angustiloba se plantea desarrollar metodologías en cultivo

in vitro.

1.2.2 Formulación del problema

¿Se podrá elaborar un protocolo para la germinación y conservación in vitro

de semillas de orquídea Encyclia angustiloba?

1.3 Justificación de la investigación

Debido a la dificultad que presentan las semillas de las orquídeas para germinar en forma natural, se han desarrollado metodologías de germinación asimbiótica bajo condiciones in vitro (Arditti y Ernst, 1993).

Para la comercialización de estas plantas, se requiere un largo periodo de tiempo para la propagación; establecimiento, desarrollo y floración; sin embargo, es posible disminuir este tiempo e incrementar las poblaciones a través de técnicas biotecnológicas de cultivo, suministrando las condiciones óptimas y los nutrimentos necesarios para su crecimiento y desarrollo (Nava, 2013).

De acuerdo con lo mencionado por (Flores, Robledo y Jimares 2017) el cultivo in vitro es una técnica que permite la germinación y propagación de prácticamente cualquier orquídea, esto debido a que se lleva a cabo en condiciones de asepsia, con una fuente de nutrimentos y condiciones físicas controladas, lo que facilita su capacidad de reproducción y crecimiento. Sin embargo, cada especie de orquídea tiene diferentes necesidades de nutrientes para germinar, por lo que hay que evaluar cuál es el medio de germinación adecuado para cada una de ellas.

En este sentido, el objetivo es evaluar la eficacia de diferentes medios de cultivo como son Murashige y Skoog (MS) más un ingrediente adicional, a saber: Agua coco, BAP (Bencil Amino Purina) y medio Papa Dextrosa Agar (PDA) para la 18 micropropagación de semillas de Encyclia angustiloba, con el fin de propagar y conservar esta emblemática orquídea ecuatoriana y ofrecer a la comunidad científica y a los productores y conservacionistas un medio para el cultivo de esta orquídea.

1.4 Delimitación de la investigación

 Espacio: Laboratorio de Biotecnología de la Universidad Agraria del

Ecuador, sede Guayaquil.

 Tiempo: El periodo de esta investigación fue de 10 meses

aproximadamente, desde octubre de 2018 hasta agosto 2019.

1.5 Objetivo general

Establecer un protocolo para la germinación y conservación in vitro de semillas de orquídea Encyclia angustiloba.

1.6 Objetivos específicos

 Identificar el medio de cultivo más apropiado para la germinación de Encyclia

angustiloba.

 Determinar el porcentaje de germinación de las semillas de Encyclia

angustiloba en medios de cultivos artificiales.

 Establecer métodos de conservación de semillas in vitro de Encyclia

angustiloba.

1.7 Hipótesis

Al menos uno de los tratamientos ayudará a la germinación y conservación de las semillas de Encyclia angustiloba. 19

2. Marco teórico 2.1 Estado del arte

Las orquídeas son conocidas en todo el mundo, principalmente debido a la exuberante belleza de sus flores. Por su rareza y dificultad de propagación, es una planta que se cotiza muy bien en el mercado de la floricultura, bien sea como flor cortada o como planta ornamental. Ecuador es reconocido como un país megadiverso en la diversidad de estas plantas, de hecho, el 24% de su flora nativa está constituida por las Orquídeas (Cerna, Cárdenas, Cruz y Jácome 2014).

Estas plantas poseen adicionalmente un incalculable valor en el equilibrio de la biodiversidad, ellas poseen diferentes roles dentro de los ecosistemas, entre ellos el de proveedoras de néctar y aceites esenciales para colibríes, murciélagos, mariposas, palomillas, abejas, abejorros y otros polinizadores; se pude mencionar también como sus hojas y pseudobulbos proveen alimento para insectos y ciertos mamíferos, las orquídeas por ser mayoritariamente epifitas agregan estructura a los troncos de árboles y sustratos en donde crecen y por lo tanto, son importante fuente de refugios para insectos, arañas y aves. Por estas razones, existen actualmente grandes esfuerzos por preservar la diversidad de especies, tanto en su estado natural como en viveros. Ejemplos de este trabajo los podemos apreciar en los Jardines Botánicos de Quito y el Jardín Botánico de las Orquídeas en Puyo

(IARNA, 2017).

La germinación y desarrollo de plántulas de híbridos de Encyclia, en general, presentó la mejor germinación en el medio de cultivo MS+AC (Salazar, Amaya y

Barrientos 2013).

Al inicio de la fase de germinación de la semilla de orquídea, la cual inicia al finalizar la semana cuatro, donde el desarrollo se da de en forma muy equilibrada, alcanzando el mayor porcentaje de germinación en el medio MS+AC con un 67.53% (Barrientos, 2010, p. 34).

“La Encyclia debe desarrollarse a temperaturas algo frescas o cálidas; preferiblemente entre los 20°C - 28°C. No soporta las heladas” (Tropical, 2016, p.

56).

Debido a lo complejo de sus ciclos reproductivos y su indudable valor económico, las orquídeas son objeto de diversos estudios dentro del campo de la biotecnología. En este sentido, la aplicación del cultivo in vitro en estas hermosas plantas tiene como principal uso la conservación de germoplasma, además, los especímenes producidos de esta manera son de gran interés para los programas de reintroducción de especies nativas en áreas de preservación del medio ambiente (Araujo, 2014).

Las orquídeas presentan problemas serios para su propagación en forma natural debido a que la mayor parte de las semillas están escasamente diferenciadas por lo que no se les distinguen los cotiledones ni las radículas ya que carecen de endospermo (Duarte, 2014).

La primera propagación exitosa de orquídeas en condiciones in vitro a partir de la germinación de semillas fue lograda por Knudson (1922) con especies de

Cattleya, posterior a este trabajo ha habido muchos otros, entre ellos, Lo et al.

(2004) con Dendrobium tosaense y Damon, 2004 con Cattleya aurantiaca, Encyclia angustiloba y Brassavola nodosa.

El medio cultivo es una mezcla de sustancias que proveen a la planta las condiciones nutritivas necesarias para su desarrollo (Robles, 2015). Como indica

Cedrés, Sherry y adema (2015) se han modernizado las técnicas para la siembra in vitro de orquídeas mediante semillas, Este método asimbiótico suma ya varios protocolos, el primero considera tener cápsulas cerradas ó verdes, realizar la desinfección antes de la siembra, ya que las semillas se mantienen estériles en el 21 interior del fruto. En el segundo caso, con las cápsulas abiertas es necesario desinfectar las semillas. Posterior a estos pasos de esterilización, viene la siembra de las semillas, las cuales se ha venido haciendo con éxito en medio MS; sin embargo, Torrente et al. (2013) han determinado que en el medio BM1 (Terrestrial

Orchid Medium Phyto Technology Laboratories) se desarrolla más rápido el protormo de las especies de orquídeas como: Orchis papilionacea, Orchis coriophora, Ophrys speculum, y Ophrys Fusca.

Actualmente se conocen dos principales alternativas de conservación de especies: conservación in situ y ex situ ambas deben ser complementarias y deben trabajarse en conjunto para poder establecer una estrategia de conservación integral. Cuando se trata de conservar la mayor diversidad genética durante la micropropagación, las semillas constituyen normalmente el material de propagación elegido, ya que se induce de manera sencilla, la brotación múltiple en un estado precoz de su desarrollo, con una tasa de multiplicación muy alta debido a su bajo grado de diferenciación celular en un tejido con alto grado de estabilidad genética (Robles, 2015).

La conservación ex situ de germoplasma de especies raras y amenazadas se basa principalmente en utilización de bancos de germoplasma, estos son centros orientados en el almacenamiento de propágulos de una parte representativa de la variabilidad genética que corresponde a una determinada especie (Iriondo, 2001).

Para determinar los medios de cultivo y condiciones óptimas para esta conservación, se cultivaron plántulas en medio MS modificado, variando la concentración de sus componentes de MS + 170 ml L-1 agua de coco, MS + 1 mg

L-1 BAP y PDA (15 g papa L-1 - 10 g L-1 Dextrosa- 10 g L-1 agar) bajo refrigeración a 5°C (Avila, 2006). 22

La germinación de orquídeas sucede en cinco estadios secuenciales; la primera etapa comienza con la imbibición de las semillas a través de a testa lo cual produce un aumento en el volumen del embrión; en la segunda etapa existe una división celular; en la tercera etapa el protocormo empieza a desarrollarse; en la cuarta etapa el protocormo sigue creciendo y se desarrolla una yema apical y la quinta etapa aparecen las primeras hojas fotosintéticas y raíces (Barbery y Morales, 2011).

La preservación de especies con semillas ortodoxas como lo son la mayoría de las orquídeas es viable y puede garantizar su almacenamiento. Y las semillas para su conservación se mantienen bajo humedad y temperatura (refrigeración o ambiente) (Ortega, 2012).

Se recolectaron semillas de 12 especies de orquídeas que se extrajeron y se desecaron, estas fueron almacenadas en tubos vacutainers, a través de dos métodos:

• En refrigeración a 4◦C, más oscuridad

• a temperatura ambiente 20±2 ◦C, más luz

Se evaluaron cinco tratamientos: Murashige & Skoog M&S (T1), M&S+ vitaminas (T2), M&S + auxinas (T3), M&S + carbón activado 1% (T4) y Knudson C

(T5), se determinó que los medios óptimos de germinación in vitro para todas las especies en estudio fueron: (T4), seguido de (T1). Las orquídeas, indistintamente del tratamiento, que presentaron mayor viabilidad fueron: Sobralia rosea (90%),

Sievekingia marsupialis (90%), Maxillaria rufescens y Epidendrum sp. (75%).

(Cerna et al., 2014). 23

2.2 Bases teóricas

2.2.1 Generalidades de Encyclia angustiloba

Encyclia es un género de 242 especies de orquídeas epífitas que se han

reclasificado procedentes del género Epidendrum, son diferentes a los bulbos

parecidos a las Cattleya y en la estructura de las flores. Se encuentra en

Centroamérica, y Caribe, donde por las noches llena el aire con las fragancias

de su perfume parecido a los cítricos (Asociación ecuatoriana de Orquideología,

2018). En el período 2005 – 2010, la familia Orchidaceae es la que mayor

número de adiciones, nuevos registros y cambios taxonómicos ha presentado

para el país: se han añadido 340 nuevas especies, 25 nuevos registros, 275

cambios taxonómicos y se han identificado dos nuevos géneros de orquídea para

el país (Orquidea, 2013).

Entre sus usos se destaca el ornamental, medicinal como agua para bañar a

las parturientas, y según estudios etnobotánicas esta planta aporta vitaminas

(Villavicencio y Pérez 2005).

2.2.2 Taxonomía de la orquídea Encyclia angustiloba

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase: Liliopsida

Orden: Asparagales

Familia: Orchidaceae

Género: Encyclia

Especie: angustiloba 24

2.2.3 Morfología de la orquídea Encyclia angustiloba

Según (Stevens y Ulloa, 2011), Encyclia angustiloba presenta las siguientes características morfológicas:

Hojas: Las hojas son angostas y crecen hasta 25 cm de longitud. Las plantas que están expuestas al sol brillante adquieren una coloración rojiza.

Cada pseudobulbo tiene una o dos hojas.

Inflorescencia: Una por pseudobulbo, originada en la base del pseudobulbo maduro, paniculada, de 60 a 150 cm de largo, pedúnculo de 20 a 50 cm de largo, provisto de brácteas triangulares de 1,7 a 3,5 cm de largo, de 1 a 1,4 cm de ancho, brácteas florales triangulares, de 4 a 8 mm de largo, de 4 a 5 mm de ancho, ovario ligeramente surcado, de 20 a 32 mm de largo.

Flores: La panícula atractiva está erguida, ramificada y tiene las flores agrupadas en la punta. Los pétalos y sépalos son de color marrón rojizo y el labio es blanco, lo que contrasta muy bien con los pétalos.

Fruto: Cápsula elipsoide o fusiforme, 4 cm de largo, 1 cm de diámetro

2.2.4 Micropropagación de orquídeas

En el caso de las orquídeas, las semillas representan el material de propagación de primera opción, ya que induce de manera sencilla la brotación múltiple en un estado precoz de su desarrollo, con una tasa de multiplicación muy alta, debido a su bajo grado de diferenciación celular en un tejido con alto grado de estabilidad genética (Salazar, 2013). En este caso en particular, la técnica de cultivo in vitro puede contribuir a mejorar los porcentajes de germinación (Iriondo, 2011; Raya., 2013). 25

2.2.5 Propagación de orquídeas por semillas

Según (Mosquera, Cáceres y De la Cruz, 2010), la germinación in vitro de semillas de orquídeas puede ser efectuada por dos vías: a) Co-cultivo de las semillas con diversos hongos micorrízicos para establecer una relación simbiótica. Para lo cual es necesario el aislamiento y cultivo del hongo en un medio de cultivo específico. b) Inoculación de las semillas en un medio de cultivo, que, en ausencia de hongos simbióticos, proporciona los nutrientes requeridos para el desarrollo de la semilla.

2.2.6 Etapas de la micropropagación

2.2.6.1. Selección del explante

En esta etapa se escoge el material vivo (planta) que genera las cápsulas

(semillas) a trabajar, con preferencia que estas aun estén verdes, es decir que

no hayan abierto. Cuando se trabaja con cápsula verde, debe estimarse el

tiempo requerido para su maduración (este es diferente para cada especie), de

saltar este paso es posible que la cápsula se encuentre en un estadio inicial de

maduración, lo que afectaría negativamente el proceso de germinación (Otero

y Bayman, 2014).

Algunos de los indicadores para determinar si una cápsula presenta semillas

maduras, son el cambio de coloración (generalmente inicia la presencia de

tonalidades amarillas), la base de la cápsula en el lugar del relicto floral se

encuentra seco y cuando se presiona no se deforma debido a que se encuentra

llena de semillas (Seaton y Ramsay, 2005; Tirado, Naranjo y Atehortúa, 2013).

Una vez seleccionado el explante debe seguirle la etapa de desinfección, ya

que el éxito de la micropropagación de plantas depende en gran medida del

control y prevención de la contaminación microbiana. Los contaminantes más 26 frecuentes en el cultivo in vitro son los hongos filamentosos, las bacterias y las levaduras (Mosquera, 2010).

2.2.6.2. Establecimiento de medios de cultivo

Un medio de cultivo es el soporte artificial sobre el cual germinarán y se desarrollarán las plántulas seleccionadas, por tal razón este sustrato debe de poseer una serie de características, según se muestra en la Tabla 9 de anexos.

2.2.6.3. Multiplicación

El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicación sucesivos y poder destinar parte de ellos a la siguiente etapa de producción: enraizamiento, bulbificación, etc. (Cedrés et al, 2015).

En el caso de las orquídeas para asegurar una óptima multiplicación, se recomienda cultivar a una temperatura de 27°C ± 2°C, con iluminación difusa, y se debe eliminar aquellos cultivos contaminados o que presenten problemas de fenolización (Mosquera, 2010).

2.2.6.4. Desarrollo y enraizamiento

Esta etapa consiste en la aparición de raíces y desarrollo de las plántulas.

El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro.

En el primer caso pueden emplearse varios tipos de sustratos y reguladores de crecimiento (auxinas) para promover la rizogénesis. Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas.

2.2.6.5. Adaptación a medio externo

Representa la etapa final de la micropropagación, es la adaptación paulatina de las plantas al medio ex vitro. Para ello, se recomienda seguir una 27

serie de pasos para obtener la mayor efectividad posible en este proceso.

Según Cedrés, (2015) estos pasos básicos son:

. Verificar la presencia de raíces, hojas y tallos

. Lavar con abundante agua el medio de cultivo de las plantas a trasplantar

 Tratar las plantas con fungicidas

. Preparar un sustrato adecuadamente, adicionando musgos, perlita, carbón

vegetal, poliestireno, arcilla, etc.

. Acondicionar domo o maceta cerrada con tapa plástica para el trasplante,

para evitar la desecación.

2.2.7 Factores que afectan la propagación, la germinación y crecimiento de las orquídeas

Existe un gran número de factores que afectan a la propagación, germinación y crecimiento de las orquídeas, que depende en gran medida de las especies con las que se desee trabajar. Según (López, Sosa y Mejía, 1995) esto dependerá en gran medida de las especies de orquídea que se trabaje, no obstante, los factores básicos que influyen el desarrollo de estas plantas son las siguientes:

2.2.7.1. Luz

Las plantas como organismos autótrofos requieren indispensablemente de

luz solar. Dependiendo de la especie podemos observar que un cambio de

intensidad lumínica puede causar organogénesis y cambios morfogenéticos

específicos debido a la longitud de onda de la luz (González, 2003).

En el caso de Encyclia angustiloba se ha reportado que requiere alta

intensidad lumínica 1000 - 3000 µmdm2s-1 (Avila, 2006). 28

2.2.7.2. Temperatura

Es uno de los factores más importantes en el desarrollo de orquídeas, y

que inciden en la mayoría de los procesos fisiológicos; por lo que debe ser

considerado como un factor fundamental a controlar durante el proceso (Arditti

y Ernest, 1993). Generalmente cada especie tiene un intervalo de temperatura

en el que se produce el crecimiento óptimo, que oscila entre los 20°C - 25ºC

(Pierik, 1990; citado por González, 2003).

2.2.7.3. pH

Según Mosquera et al. (2010), el pH en el rango 5,0 a 6,5 es apto para el

crecimiento, con un máximo alrededor de 6,0. Un pH bajo (menor de 4,5), o alto

(mayor que 7), generalmente frena el crecimiento y desarrollo in vitro.

Por su parte, Robles (2015), señala que, si el pH es demasiado bajo, pueden

presentarse las siguientes complicaciones: la auxina, Acido Indol Acético (AIA)

y el ácido giberélico (AG3) se hacen menos estables, el agar pierde su rigidez,

precipitación de sales (fosfato o hierro) y finalmente, la vitamina B1 y el ácido

pantoténico se hacen menos estables.

2.2.7.4. Humedad relativa (HR)

Representa al igual que los otros factores un aspecto limitante, no obstante,

en orquídeas es un factor clave en su óptimo crecimiento, ya que de esta

depende la formación de raíces y la calidad de los brotes, En Encyclia

angustiloba se ha determinado que el óptimo es 45% a 60 % HR (López-

Villalobos et al. 1995).

2.2.8 Medios de cultivos en orquídeas

Dentro del campo de la propagación in vitro de las orquídeas existen actualmente varios medios de cultivo, como lo son: Murishage y Skoog (MS) 29 completo, MS, MS con reguladores de crecimiento, Knudson, Coco-tiamina.

Independientemente del medio elegido, el procedimiento general para preparar un medio de cultivo es hacer una solución stock por separado. En el caso del MS se recomienda hacer una solución de macronutrientes; una solución de calcio, otra de hierro, una de micronutrientes y otra de vitaminas (IARNA, 2017). A continuación, en la tabla 10 de anexos se detallarán las proporciones en la preparación del medio MS.

2.2.9 Medios de cultivo con suplementos orgánicos

Según Salazar, Amaya y Barrientos (2013), con el fin de minimizar los costos de la micropropagación de orquídeas, entre otros cultivos, se ha incursionado en el uso de suplementos para los medios de cultivos con componentes orgánicos.

Tal es el caso del uso de alternativas como:

2.2.9.1. Agua de coco

El agua de coco es un suplemento de los medios de cultivo debido al alto contenido de azúcares, aminoácidos, antioxidantes, minerales, ácidos orgánicos y agentes promotores del crecimiento. Adicionalmente, se observado con la adición de compuestos orgánicos como el agua de coco, un incremento porcentual de la sobrevivencia ex vitro de las plántulas (Moreno y Mencha, 2007).

2.2.9.2. Medio PDA (Agar Dextrosa-Papa)

Este medio es ampliamente utilizado para aislamiento, purificación y mantenimiento de hongos. Tiene la infusión de papa como fuente de almidones y la dextrosa que son la base para el crecimiento de hongos. Este medio debe presentar un pH de 5,6, el cual evita el crecimiento de las bacterias y es óptimo para el desarrollo de los hongos (Narrea, 2006).

2.2.10 Medios de cultivo con reguladores de crecimiento

2.2.10.1. Citocininas (BAP) 6-benzilaminopurina

El BAP es un tipo de citocinina sintética que aporta al medio de cultivo la

mencionada fitohormona, esta se utiliza para estimular la división celular

(Cedrés, 2015). Adicionalmente, (González y Delgado, 2005) indica que esta

hormona puede retardar el envejecimiento celular e influye en el transporte de

auxinas.

2.2.11 Fitohormonas

También llamadas hormonas vegetales, intervienen en la regulación celular

de los procesos de crecimiento y desarrollo de plantas; así una misma hormona

es capaz de intervenir en varios procesos y esto depende de la concentración de

la misma y su respuesta ocurre en un tiempo determinado. De acuerdo a la

especie que se utilice como objetivo de estudio se aplicará un tipo y

concentración determinada de estos reguladores de crecimiento (Espinoza,

2018).

2.3 Marco legal

Régimen del Buen Vivir

Capitulo Segundo (Biodiversidad y Recursos Naturales)

Según la Constitución de la Republica de Ecuador (2008), indica lo siguiente:

Articulo 73.- EI Estado aplicará medidas de precaución y restricción para las actividades que puedan conducir a la extinción de especies, la destrucción de ecosistemas o la alteración permanente de los ciclos naturales. Se prohíbe la introducción de organismos y material orgánico e inorgánico que puedan alterar de manera definitiva el patrimonio genético nacional.

Articulo 400.- El Estado ejercerá la soberanía sobre la biodiversidad, cuya administración y gestión se realizará con responsabilidad intergeneracional. Se declara de interés público la conservación de la biodiversidad y todos sus 31 componentes, en particular la biodiversidad agrícola y silvestre y el patrimonio genético del país.

Articulo 405.- EI sistema nacional de áreas protegidas garantizará la conservación de la biodiversidad y el mantenimiento de las funciones ecológicas. El sistema se integrará por los subsistemas estatal, autónomo descentralizado, comunitario y privado, y su rectoría y regulación será ejercida por el Estado. El Estado asignará los recursos económicos necesarios para la sostenibilidad financiera del sistema, y fomentará la participación de las comunidades, pueblos y nacionalidades que han habitado ancestralmente las áreas protegidas en su administración y gestión.

Artículo 406.- El Estado regulará la conservación, manejo y uso sustentable, recuperación, y limitaciones de dominio de los ecosistemas frágiles y amenazados; entre otros, los páramos, humedales, bosques nublados, bosques tropicales secos y húmedos y manglares, ecosistemas marinos y marinos-costeros.

En cumplimiento Ley orgánica de Agrobiodiversidad, semillas y fomento de la agricultura sustentable, en la cual se expresa lo siguiente:

Artículo 7.- De los beneficios e incentivos. A fin de estimular la conservación y uso de la agrobiodiversidad, la semilla nativa y tradicional así como la producción de semilla certificada de forma sostenible, orientada a garantizar la soberanía alimentaria, el Estado en sus diferentes niveles de gobierno, realizará las siguientes acciones: a) Establecer programas de transferencia e innovación tecnológica participativa para la conservación de las zonas de alta de agrobiodiversidad, Fitomejoramiento de semilla, producción y se comercialización con énfasis en el desarrollo de proyectos para los pequeños y medianos productores de semillas; b) Promover la generación de productos financieros, líneas de crédito y tasas de interés preferencial, para estimular la producción y comercialización de semilla; y, c) Impulsar la formación de organizaciones de productores de semillas y de empresas semilleristas públicas, privadas y comunitarias; generar programas de provisión de capital de riesgo, servicios financieros de apoyo, infraestructura, equipamiento, tecnificación, seguro agrícola y garantía crediticia. Artículo 22.- De la investigación e innovación de los recursos fitogenéticos. La Autoridad Agraria Nacional en coordinación con la institución rectora de la educación superior, ciencia, tecnología e innovación, centros de educación superior y entidades privadas establecerá planes, programas y proyectos para fomentar la investigación, el desarrollo y la innovación tecnológica en materia de los recursos fitogenéticos y semillas. Además, fortalecerá y se promoverá la generación de capacidades del talento humano. Artículo 28.- Semilla nativa. Para efectos de esta ley, la semilla nativa es todo material reproductivo sexual y asexual vegetal que mantiene su capacidad de reproducción, originario o autóctono, que ha sido domesticado, conser-vado, criado, cuidado, utilizado e intercambiado por productores, comunas, comunidades, pueblos y nacionalidades de acuerdo a sus 32 diversos saberes y culturas, cuyo uso, conservación, calificación, intercambio, promoción y protección corresponde a las personas, y colectividades con el apoyo del Estado. La semilla nativa patrimonio de pueblos y nacionalidades, es parte de los recursos genéticos para la alimentación y la agricultura, cuyo competente genético no es susceptible apropiación. PROTECCIÓN DE LA AGROBIODIVERSIDAD Artículo 7. Protección de la agrobiodiversidad.- El Estado así como las personas y las colectividades protegerán, conservarán los ecosistemas y promoverán la recuperación, uso, conservación y desarrollo de la agrobiodiversidad y de los saberes ancestrales vinculados a ella. Las leyes que regulen el desarrollo agropecuario y la agrobiodiversidad crearán las medidas legales e institucionales necesarias para asegurar la agrobiodiversidad, mediante la asociatividad de cultivos, la investigación y sostenimiento de especies, la creación de bancos de semillas y plantas y otras medidas similares así como el apoyo mediante incentivos financieros a quienes promuevan y protejan la agrobiodiversidad. Artículo 8. Semillas.- El Estado así como las personas y las colectividades promoverán y protegerán el uso, conservación, calificación e intercambio libre de toda semilla nativa. Las actividades de producción, certificación, procesamiento y comercialización de semillas para el fomento de la agrobiodiversidad se regularán en la ley correspondiente. El germoplasma, las semillas, plantas nativas y los conocimientos ancestrales asociados a éstas constituyen patrimonio del pueblo ecuatoriano, consecuentemente no serán objeto de apropiación bajo la forma de patentes u otras modalidades de propiedad intelectual, de conformidad con el Art. 402 de la Constitución de la República.

3. Materiales y métodos

3.1 Enfoque de la investigación

Se detalla el tipo, nivel de conocimiento y diseño de investigación.

3.1.1 Tipo de investigación

La presente investigación fue de carácter inductivo con las diferentes variables

o tratamientos que se realizaron en forma experimental, para acceder a la toma

de datos y así comprobar la hipótesis estadística.

3.1.2 Diseño de investigación

Investigación experimental: esta investigación permitió relacionar los

resultados de las variables a medir para ver el efecto que causan en las

dependientes.

Investigación descriptiva: se recolectaron los datos que fueron basados en el

planteamiento de cada una de las variables, y así poder establecer

características y propiedades sobre el objeto de estudio.

Investigación explicativa: se relacionaron los datos obtenidos y los resultados

que se obtuvieron en la investigación.

3.2 Metodología

3.2.1 Variables

3.2.1.1. Variable independiente para la germinación in vitro de semillas

Los tres medios de cultivos usados en esta investigación, todos basados en

la formulación de Murashige and Skoog (MS) más un ingrediente adicional, a

saber: Agua de coco, Bencilaminopurina (BAP) y (Papa Dextrosa Agar) (PDA).

3.2.1.2. Variables independientes para la conservación in vitro de semillas

Las semillas cosechadas y puestas en cajas Petri, colocadas en sobres de

papel filtro dentro fundas plásticas herméticas, conteniendo silicagel y se 34

conservaron en dos condiciones: Temperatura ambiente 25°C ± 2 ºC y bajo

refrigeración a 4°C, en condiciones de oscuridad, por un período de tres meses.

3.2.1.3. Variable dependiente para la germinación in vitro de semillas

Se evaluó porcentaje de germinación de las semillas.

3.2.1.4. Variable dependiente para la conservación in vitro de semillas

Se evaluó el porcentaje de germinación, después de transcurridos tres

meses de los tratamientos de conservación, de manera de elegir las mejores

condiciones.

3.2.2 Tratamientos

Los tratamientos y dosificaciones utilizados para la germinación y

conservación in vitro de semillas de Encyclia angustiloba, fueron obtenidos del

trabajo experimental de Espinoza (2018) en la orquídea Encyclia aspera, ya

que no existe investigaciones en E. angustiloba. por lo tanto, en dicha

investigación se representa en mg/L y ml/L, cuyas dosis fueron:

 MS + 170 ml/L-1 agua de coco,

 MS + 1 mg/L-1 BAP

 PDA (15 g L-1 papa – 10 g L-1 dextrosa, 10 g L-1 agar).

En la Tabla 1, se describen los tratamientos utilizados en la germinación in

vitro de las semillas de orquídea de Encyclia angustiloba, y en la Tabla 2 se

observan los tratamientos evaluar para la conservación in vivo de las semillas.

Tabla 1. Tratamientos para evaluar para la germinación in vitro de las semillas de Encyclia angustiloba. No. Descripción Tratamiento

1 MS + 200 ml L -1 agua de coco

2 MS + 3 mg L-1 BAP

PDA (30 g papa L-1 - 20 g L-1 3 Dextrosa- 18 g L-1 agar)

Otero, 2020

Tabla 2.Tratamientos para evaluar para la conservación in vivo de las semillas de Encyclia angustiloba.

No. Tratamiento Descripción

1 Bajo refrigeración a 4°C y oscuridad.

Temperatura del laboratorio (aprox 20 ± 2°C) y luz 2 ambiental

Otero, 2020

3.2.3 Diseño experimental

Para llevar a cabo esta investigación se utilizó un Diseño Completamente al

azar (DCA), compuesto de tres tratamientos con 10 repeticiones cada uno, que

dan un total de 30 unidades experimentales a evaluar el mejor medio de cultivo

para la germinación de las semillas. En el tratamiento MS PDA hubo un total de

1823 semillas sembradas; en MS BAP, 1618 y en el MS AC, 1963.

Para determinar la mejor condición de almacenamiento se aplicó el método

de análisis de varianza no paramétrico de Kruskal Wallis, compuesto de cuatro

tratamientos con 10 repeticiones cada uno, que dan un total de 40 unidades 36 experimentales. En el tratamiento AC - 4°R hubo un total de 570 semillas sembradas; en AC – TA, 370; en PDA – 4°R, 1378 y en PDA –TA,1343.

3.2.4 Recolección de datos

3.2.4.1. Recursos

Materiales y equipos: Para llevar a cabo la realización del proyecto se

emplearon semillas de Encyclia angustiloba donadas por el Biólogo James

Pérez, recolectadas en el 08 mes de enero del 2019. Así mismo, se emplearon

medios de cultivo, agua destilada, cajas Petri, bisturí, pinzas, papel aluminio,

vaso de precipitación, silicagel, balanza analítica, autoclave, cámara de flujo

laminar, microscopio estereoscópico, computadora portátil.

Recursos bibliográficos: la información que se presentó en este estudio fue

basada en artículos científicos, boletines, libros y sitios web encontrados en la

biblioteca virtual del centro de información agraria.

Recurso humano: este recurso fue representado por la tutora y por la autora

de este proyecto.

Recurso financiero: la inversión de este proyecto fue financiado por la autora.

La Universidad Agraria del Ecuador facilitó el uso de los materiales, equipos y

medios de cultivo de su laboratorio de Biotecnología.

3.2.4.2. Métodos y técnicas

 Método inductivo: Este método permitió observar los resultados obtenidos

con la finalidad de cumplir los objetivos e hipótesis planteada.

 Método deductivo: Permitió observar casos particulares de la investigación

a través de principios, teorías y leyes. 37

 Método sintético: Permitió establecer y relacionar los resultados para

construir la discusión, conclusiones relacionadas bajo la perspectiva de

totalidad de la investigación.

3.2.5 Análisis estadístico

3.2.5.1. Análisis funcional

Con los resultados obtenidos en cada unidad experimental en función de las

variables a medir se realizó un análisis de varianza no paramétrico Kruskal

Wallis con el 5% de probabilidad (ANOVA) para la germinación y conservación

de las semillas y para la determinación de las diferencias entre dos muestras

independientes, comparando dos poblaciones, mediante la aplicación del

software estadístico INFOSTAT.

3.2.5.3. Hipótesis estadística

3.2.5.3.1. Hipótesis estadística para la germinación de las semillas.

Ho: Ningún tratamiento contribuyó a la germinación de semillas de Encyclia

angustiloba.

Ha: Al menos uno de los tratamientos contribuyó a la germinación de semillas

de Encyclia angustiloba.

3.2.5.3.2. Hipótesis estadística para la conservación de las semillas.

Ho: Ningún tratamiento contribuyó a la conservación de semillas de Encyclia

angustiloba

Ha: Al menos uno de los tratamientos contribuyó a la conservación de semillas

de Encyclia angustiloba.

3.2.5.4. Delimitación experimental

Las características del experimento se observan en la Tabla 3:

Tabla 3. Características del experimento Variable Descripción

Germinación de las semillas

Tipo de siembra In vitro

Número de tratamientos 3

Número de repeticiones 10

Número de unidades experimentales 30

Conservación de las semillas

Tipo de siembra In vitro

Número de tratamientos 4

Número de repeticiones 10

Número de unidades experimentales 40

Otero, 2020

3.2.5.5 Manejo del ensayo

Preparación: se realizó en forma manual con uso de medios de cultivo y

condiciones de conservación.

Material genético: semillas de Encyclia angustiloba proveniente del Jardín

Botánico de Guayaquil.

Proceso de desinfección y siembra de las semillas in vitro: se colocó

aproximadamente 0.025 mg de semillas de Encyclia angustiloba y con ayuda

de la micropipeta se colocó 3000 microlitros de agua destilada estéril. Al 39

momento de la siembra con una agitadora o varilla de vidrio se mezcló las

semillas y el agua destilada, luego por cada caja Petri se colocó 100 microlitros

de la mezcla y se lo esparció por todo el medio de cultivo. Las semillas se

desinfectaron en una solución de etanol al 70% durante 5 minutos, para

después transferirlas a una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% por 10

minutos y por último se enjuagaron con agua destilada estéril. El proceso de

siembra se llevó a cabo en la cámara de flujo laminar, previamente

desinfectada, al igual que todas las superficies de contacto utilizando

isopropanol al 70%, y todo el material utilizado para la siembra.

Dosificación: Se realizaron tres diferentes tratamientos de medios de cultivo

para poder demostrar cuál de estos es el mejor para la germinación y dos

condiciones diferentes para determinar la mejor conservación de semillas.

Toma de muestra: Las muestras se tomaron al azar.

3.2.5.6. Variables a evaluarse

Porcentaje de contaminación externa: En cada uno de los tratamientos se

realizó aplicando la formula; del total de medios de cultivos sin contaminación,

para el total de medios cultivos sembrados por 100.

Porcentaje de germinación: El porcentaje de germinación en cada uno de los

tratamientos se realizó aplicando la fórmula, del total de semillas germinadas,

dividido por el total de semillas sembradas por 100.

El criterio que se siguió para establecer el inicio de la germinación fue a partir

del estadio 2 o semilla hinchada y verde (Figura 1). Durante 3 meses se registró

semanalmente el porcentaje de semillas germinadas para cada réplica y

tratamiento. La suma de los porcentajes de cada réplica fue el total o 100% de

los individuos evaluados. 40

Figura 1. Criterios para establecer germinación y estadios de crecimiento de Encyclia angustiloba (Batigyna et al. 2003). Conservación de las semillas de E. angustiloba: Las semillas de Encyclia

angustiloba extraídas de las cápsulas desinfectadas se dividieron en dos lotes,

una para las pruebas mencionadas anteriormente y el otro lote para evaluar su

capacidad de conservación o almacenamiento. La cápsula de Encyclia midió

de largo aproximadamente 3 cm y de diámetro 4 cm. La desinfección se realizó

lavando varias veces las semillas, colocando alcohol al 70% aproximadamente

por cinco minutos, cloro al 2% por 10 minutos y se puso a remojar en agua

destilada estéril las tres semillas cada uno por cinco minutos. Previamente al

almacenamiento, las semillas recién extraídas de las cápsulas se introdujeron

en papel filtro y se aseguraron los sobres con un clic metálico. Posteriormente,

se colocaron en fundas herméticas transparentes que contenían silicagel, esto

ayudó a extraer la humedad de las semillas, luego se mantuvo cada funda en

dos condiciones de almacenamiento distinto:

a) Bajo refrigeración a 4°C y oscuridad. 41

b) A temperatura del laboratorio (aprox 20°C ± 2°C) y luz ambiental.

Luego de transcurridos tres meses se colocaron 0,025 mg de semillas de cada

condición de almacenamiento en cápsulas de Petri con el medio de cultivo que

arrojó los mayores porcentajes de germinación de las 10 repeticiones.

Posteriormente, se registró el número de semillas germinadas y se reportó

como porcentaje de germinación de cada réplica. En este caso, igualmente se

empleó un análisis de varianza no paramétrico de Kruskal Wallis.

3.3. Aspectos administrativos

3.3.1 Recursos bibliográficos

Los recursos de consulta que se utilizaron son:

 Biblioteca de la Universidad Agraria del Ecuador.

 Tesis de grados de varias universidades

 Informes técnicos

 Revistas agrícolas

 Boletines de instituciones de investigación

 Páginas Web.

 Diarios.

3.3.2 Materiales y equipos

Los materiales que se utilizaron para recopilar la información de carácter

experimental son:

 Hojas

 Bolígrafos

 Instrumentos de laboratorio

 Cámara fotográfica

 CPU, impresora 42

 Mapa de Ubicación

3.3.3 Recursos humanos

Los recursos más importantes para levantar esta investigación fue el talento

humano, tales como:

 Estudiante tesista

 Catedrático de la Universidad Agraria del Ecuador

3.3.4 Recursos económicos

Tabla 4. Valoración económica del proyecto

Materiales $

Cajas Petri 200 Agua de coco 2,00 Bencilaminopurina (BAP) 60,00 Papa- Dextrosa-Agar (PDA) 60,00 Papel aluminio 2,00 Alcohol 18,00 Tubos de ensayo 30,00 Algodón 3,50 Transporte 150 Materiales varios 200 Marcadores 5,00 Total $ 730,5

Otero, 2020

4. Resultados

4.1 Determinación del porcentaje de germinación de las semillas de Encyclia angustiloba en medios de cultivos artificiales

4.1.1 Primera Siembra

A partir del séptimo día de la siembra de semillas de Encyclia angustiloba en

los medios de cultivo MS suplementados con BAP y agua de coco y PDA se

registraron los siguientes porcentajes de contaminación externa debida a la

presencia de hongos y bacterias: BAP (70%), PDA (50%) y Agua de coco (80%).

En el medio PDA, las semillas germinaron entre los 90 y 120 días después de

la siembra, en un porcentaje de 0.1096% (dos en 1823 semillas sembradas); en

MS suplementado con agua de coco se logró la germinación a los 120 días, en

un porcentaje de 0.0509% (uno en 1963 semillas sembradas). En ambos casos

no hubo formación de protocormos iniciales sino de plántulas directamente; en

el medio de cultivo MS BAP no se logró la germinación de las semillas (0 en

1618), en los tres tratamientos se contabilizaron un total de 5404 semillas

sembradas (Tabla 5, Figura 2).

Tabla 5. Porcentajes de germinación y contaminación de las semillas sembradas en los tres medios iniciales (PDA, MS Agua de coco y MS BAP)

Medios de cultivo Porcentaje de Porcentaje de Organismos germinación contaminación contaminantes externos

Medio de cultivo PDA 0,1096 50 Hongos

MS Agua de coco

0,0509 80 Hongos y bacterias

Medio de cultivo BAP Hongos y bacterias

0 70

Otero, 2020 44

Figura 2. Plántulas de Encyclia angustiloba en medio PDA a los 120 dds (400X)

Según el análisis no paramétrico de Kruskal Wallis con p-valor de >0,9999 no

hubo significancia estadística con un H = 1,50 y P = >0,9999 en los resultados

obtenidos en la germinación de semillas de Encyclia angustiloba (Tabla 6).

Tabla 6. Anava Prueba de Kruskal Wallis en la germinación in vitro de semillas de E. angustiloba Variable Tratamiento N Medias D.E Medianas H P

Germinación MS BAP 1 3,00 0,00 3,00 1,50 >0,9999

Germinación PDA 1 2,00 0,00 3,00

Germinación MS Agua de 1 3,00 0,00 2,00 coco

Otero, 2020

4.1.2 Conservación de semillas de Encyclia angustiloba

En este ensayo en las placas Petri sembradas con las semillas de Encyclia

angustiloba conservadas a 4ºC y temperatura ambiente, a los 30 días después

de la siembra se observó el 65% de cajas Petri con contaminación externa

debida a la presencia de hongos y 12.5% por bacterias. 45

En las placas Petri sembradas en PDA y MS agua de coco que se mantuvieron

sin contaminación durante un período de 120 días, no se observó la germinación

de las semillas en esos medios de cultivo.

Según el análisis no paramétrico de Kruskal Wallis con p-valor de >0,9999 no

hubo significancia estadística con un H = 2,70 y P = >0,9999 en los resultados

obtenidos en la conservación de semillas de Encyclia angustiloba (Tabla 7).

Tabla 7. Anava Prueba de Kruskal Wallis en la conservación de semillas de Encyclia angustiloba Variable Trat. Cons. N Media D.E Mediana H P

Germinación Agua 4ºR 1 1,00 0,0 1,00 2,70 >0,999 de 0 9 coco

Germinación Agua TA 1 1,00 0,0 1,00 de 0 coco

Germinación PDA 4ºR 1 4,00 0,0 4,00 0

Germinación PDA TA 1 3,00 0,0 3,00 0

Otero, 2020

4.2 Identificación el medio de cultivo más apropiado para la germinación de

Encyclia angustiloba

Según el análisis de varianza (Tabla 8), se pudo observar que no hubo diferencias significancia entre los tratamientos, con un H = 2 y P = >0,9999.

Tabla 8. Anava Prueba de Kruskal Wallis para la comparación de los medios de cultivo apropiados para la germinación de semillas de Encyclia angustiloba Variable Trat. N Medias D.E Medianas H P

Germinación Medio de 1 1,00 0,00 1,00 2 >0,9999 cultivo MS Agua de coco

Germinación Medio de 1 0,00 0,00 0,00 cultivo MS BAP

Germinación Medio de 1 2,00 0,00 2,00 cultivo PDA

Otero, 2020

4.3 Establecimiento de métodos de conservación de semillas in vitro de

Encyclia angustiloba.

Al conservar las semillas de Encyclia angustiloba en refrigeración a 4°C y a temperatura ambiente, por un período de tres meses se pudo observar que no hubo germinación en los medios de cultivo PDA y MS Agua de coco. Esto quiere decir que las semillas de esta orquídea en esas condiciones de conservación no fueron favorables para la germinación de la semilla, aun cuando se contabilizaron un total de 3361 semillas sembradas.

5. Discusión

Considerando los resultados sobre la germinación y conservación in vitro de semillas de la orquídea Encyclia angustiloba se aprueba la hipótesis planteada de que al menos uno de los tratamientos ayudará a la germinación y conservación de las semillas de Encyclia angustiloba.

En la fase de germinación in vitro de las semillas de orquídea Encyclia angustiloba, los porcentajes de germinación fueron bajos en comparación con otras especies de orquídeas, incluyendo las del género Encyclia, además los tiempos de germinación fueron más largos, aun cuando se utilizaron cápsulas maduras cerradas.

En el medio de cultivo PDA se logró un 0,1096% de germinación, a los primeros

90 días, seguido por el medio de cultivo MS suplementado 20% de AC donde se obtuvo un porcentaje menor del 0,0509 %, en un tiempo más prolongado de 120 días, y no hubo germinación con el medio basal MS BAP. En la literatura no existen señalamientos sobre los porcentajes de germinación de semillas de esta especie.

Barrientos (2010) indica que el inicio de la fase de germinación de semillas de

Phalaenopsis fueron breves, en unos 30 días, alcanzando un alto porcentaje de germinación en el medio de cultivo MS AC (67.53%). Para la especie E. aspera,

Espinoza (2018) reportó un porcentaje de germinación de 52% de los medios de cultivo MS solo y en combinación con ANA y BAP. Durante la evaluación de la germinación de esta orquidea se evidenciaron los cinco estadios secuenciales, tal como los describe Barbery y Morales (2011), los cuales son: inhibición de las semillas a través de la testa, que produce un aumento en el volumen del embrión; división celular y desarrollo inicial; desarrollo de la yema apical y aparición de hojas fotosintéticas. 48

Existen varios factores complejos que influyen en la germinación y el crecimiento de las orquídeas, entre ellos están la madurez de la cápsula, la composición de los medios de cultivo, la temperatura, el fotoperiodo y la humedad. Considerando que en el protocolo de germinación se proporcionaron las condiciones idóneas citadas en la literatura para las orquídeas relacionadas con esta especie, se podría decir que el genotipo podría influir en la germinación de la especie, pero no existe información al respecto.

Con respecto a la constitución de los medios de cultivo utilizados para la germinación de semillas de orquídeas, la información es extensa y se han descrito innumerables medios de cultivo. Muchos autores mencionan al medio de cultivo MS básico o en combinación con agua de coco y otros reguladores de crecimiento. Sin embargo, no existen precedentes en la especie Encyclia angustiloba y en la utilización del medio de cultivo PDA. Existen algunos trabajos relacionados con el género Encyclia y la especie relacionada como el Phalaenopsis, como indica

Barrientos (2010) que utilizaron MS; MS suplementado con jugo de piña, agua de coco, AIA, GA3) (200 mL/L, 200mL/L, 0.5 mg/L, 0.5 mg/L, respectivamente, alcanzando el mayor porcentaje de germinación (63.53%) y formación de plántulas en el hibrido Phalaenopsis en el medio MS AC. En la especie E. aspera, Espinoza

(2018) usó los medios de cultivo MS; MS suplementado con ANA y BAP, (2-0.5, 1-

0.5, 0.5-0.5 mg/L), respectivamente obteniendo que el tratamiento más efectivo fue el (MS ANA+ BAP), con un porcentaje de germinación del 52%.

En este trabajo se utilizaron medios de cultivos similares a estas especies, no obstante, se obtuvieron porcentajes bajos en la germinación de semillas de orquídea E. angustiloba. 49

En la conservacion de las semillas de E. angustiloba, como hubo una germinacion baja al inicio del experimento, no resultó una buena estrategia conservar estas semillas en refrigeración a 4°C y en temperatura ambiente durante

90 dias, esto está en contraposicion a lo que dice Espinoza (2018) sobre la conservacion de las semillas de la orquidea Encyclia aspera, porque obtuvo un alto porcentaje de germinacion, aun cuando estas fueron conservadas bajo refrigeracion a 4°C en un periodo largo de 6 años, desmostrando asi la capacidad de viabilidad de esta especie. En general, Ortega (2012) indica que la preservación de especies con semillas ortodoxas como lo son la mayoría de las orquídeas es viable y puede garantizar su almacenamiento, y para ello, las semillas se mantienen bajo humedad y temperatura (refrigeración o ambiente). No obstante, en el caso de

E. angustiloba se podria utilizar la conservacion in vitro de plántulas en medios de cultivo básicos debido a que esta orquidea es de crecimiento lento, como se evidenció en esta investigación.

6. Conclusiones

En este trabajo se pudo determinar que el porcentaje de germinación fue muy bajo, obteniéndose en el medio de cultivo PDA un 0,1096%, seguido por el medio cultivo MS+AC (0,0509 %) y además fue un proceso lento que ocurrió entre los 90 y 120 días; y en el medio de cultivo MS+ BAP no hubo germinación.

En los medios de cultivo PDA y MS AC se logró obtener la germinación y formación de plántulas de la orquídea Encyclia angustiloba, en comparación con el medio de cultivo MS BAP, demostrando que posiblemente la adición de compuestos orgánicos en los medios de cultivo in vitro fue importante para respuesta de esta especie.

Las condiciones de conservación a las que fueron sometidas las semillas de la orquídea no fueron favorables y el porcentaje de germinación fue nulo, posiblemente debido a que la germinación inicial fue baja.

7. Recomendaciones

Realizar ensayos de iniciación in vitro a partir de las cápsulas verdes o inmaduras de Encyclia angustiloba, ya que representa una alternativa aceptable para la germinación de sus semillas.

En posteriores experimentos con la orquídea Encyclia angustiloba, es necesario probar diferentes tratamientos y concentraciones, ya que no existen investigaciones para este tipo de orquídea. La utilización de otros tratamientos que induzcan la germinación del embrión, tales como adición de la hormona de crecimiento Ga

(Giberelinas) y el carbón activado en los medios de cultivo.

Debido a que el crecimiento de esta especie es muy lento, se podría conservar y multiplicar in vitro en forma de plántulas sobre todo si la germinación inicial es muy baja, como la que se consiguió en este trabajo, en vez de realizarlo a partir de semillas.

Además, se recomienda evaluar la viabilidad de las semillas antes de iniciar el estudio in vitro.

8. Bibliografía

Araújo, A. G. (2014) Crescimento in vitro e aclimatização de plântulas de orquídea.

2004. Dissertação de mestrado. Lavras, Universidade Federal de Lavras, 73

Arditti J, y Ernest R. 1993. Micropropagation of Orchis. John Wiley, y Sons. New

York. 640 pp.

Asociación ecuatoriana de Orquideología (2018, 23 julio). Descripción de Plantas

emblemáticas. https://www.orquideasecuador.org/index.php/acerca-de-las-

orquideas/orquideas-emblematicas-ecuador/oriente.

Avila, I. (2006). Propagación y mantenimiento in vitro de orquídeas mexicanas, para

colaborar en su conservación. 7.

Barbery, R., y Morales, I. (2011). Manual para el cultivo in vitro de la orquidea

Cattleya nobilior "Flor simbolo de Concepcion". Bolivia: Centro para la

participacion y el desarrollo humano sosteninble CEPAD.

Barrientos, F. (2010). Evaluación de diferentes medios de cultivo in vitro en el

desarrollo de híbridos de Orquideas. 74.

Batygina, T. B., Bragna, M, y Vasilyeva V. E. (2003). The reproductive system and

germination in orchids. Acta Biológica Cracoviensia. Series Botánica 45

(2):2134.

Cavalcante, M. P., Willadino, L, Dias A.G, y Tenório S.D, (2001). Propagacao de

orquidea Góngora quinquenervis por semeadura in vitro. Pesq. Agropec.

Bras. 36: 1319-1324

Cedrés, M., Sharry, S., Adema, M, y Abedini, W. (2015). Plantas de probeta: manual

para la propagación de plantas por cultivo de tejidos in vitro -1a ed. adaptada. 53

- La Plata: Universidad Nacional de La Plata. Libro digital, PDF.

http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/46738/Documento_complet

o__.pdf-PDFA.pdf?sequence=1

Cerna, M., Cárdenas, S., Cruz, A. y Jácome, I. (2014). Colección de germoplasma

de especies de la familia Orchidaceae del cantón Santiago de Méndez -

Morona Santiago, Ecuador. La Granja: Revista de Ciencias de la Vida, ISSN-

e 1390-8596, ISSN 1390-3799, Vol. 20, Nº. 2. págs. 5-19.

Constitución de la República del Ecuador (2008). Ciudad Alfaro: Asamblea

Constituyente.

Damon A, Aguilar E, Rivera L, Nikolaeva V (2004) Germinación in vitro de semillas

inmaduras de tres especies de orquídeas de la región del Soconusco,

Chiapas, México. Revista Chapingo Serie Horticultura. 10 (2): 195-203.

Duarte, I. (2014). Germinacion in vitro de Barkeria uniflora Lex. Dressler y

Halbinger, una orquídea endémica de México. Mexico: Universidad Nacional

Autónoma De México.

Espinoza, L. (2018). Germinacion in vitro de semillas Encyclia aspera

(Orchidaceae) una especie amenazada en Ecuador. Loja: Universidad

Tecnica Particular de Loja.

EcuRed. (2016). Encyclia angustiloba. https://www.ecured.cu/Encyclia_angustiloba

Flores, G., Legaria, J.P., Gil, I. y Colinas, M.T. (2013). Propagación in vitro de

Oncidium stramineum una orquídea endémica y amenazada de México.

Revista Chapingo Serie Horticultura 14 (3): 347-353.

Flores, L., Robledo, A., Jimares, M.J (2017). Medio de cultivo y sustitutos de agar

en el crecimiento in vitro de Orquídeas. Revista Mexicana de Ciencias

Agrícolas 8 (6): 1315-1328. 54

González, L. K. (2003). Respuesta de tres explantes de Vainilla (Vanilla planifolia)

a diferentes frecuencias de inmersión temporal. Tesis de Pregrado en

Ingeniería en Biotecnología. Instituto Tecnológico de Costa Rica. Cartago.

Costa Rica. 56 pp.

González, R., Delgado, A., Zavaleta, H., Herrera, B., (2009). La citocinina BAP

promueve la acumulación de hexosas e incrementa la actividad de

fosfoenolpiruvato carboxilasa y fosfoenlopiruvato carboxicinasa durante el

retraso de la senescencia foliar de trigo. Agrociencia, 43(4), 379-

391.,http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1405-

31952009000400005&lng=es&tlng=es

GoogleMaps (2018). Laboratorio de Biotecnología de la Universidad Agraria del

Ecuador (13 agosto, 2018).

IARNA (2017). Protocolos para el cultivo in vitro de Orquídeas con distribución en

Guatemala. Instituto de Agricultura, Recursos Naturales y Ambiente,

Universidad Rafael Ladívar. Guatemala. Recuperado de

file:///D:/USUARIO/Downloads/protocolos-para-cultivo-in-vitro-de orquideas-

de-guatemala.pdf

Iriondo, J. (2011). Conservación de germoplasma de especies raras y amenazadas.

(Revisión). Invest. Agro. Prod. Veg (ES), 16(1), 5-24.

Jørgensen, P.M. y S. León (eds.). (1999). Catalogue of the vascular plants of

Ecuador. Monogr. Syst. Bot. Missouri Bot. Gard. 75: i–viii, 1–1182.

Knudson, C. (1922) Nonsymbiotic germination of orchid seeds. Botanical Gazette

73: 1- 25.

León, S., Valencia R., Pitman, N, Endara, L, Ulloa Ulloa C, y Navarrete H. (eds.).

(2011). Libro rojo de las plantas endémicas del Ecuador, 2ª edición. 55

Publicaciones del Herbario QCA, Pontificia Universidad Católica del

Ecuador, Quito.

Lo S.F., Nalawade S.M., Kuo C.L., Chen C.L., Tsay, H.S. (2004) Asymbiotic

germination of immature seeds, plantlet development and ex vitro

establishment of plants of Dendrobium Tosaense Makino - A medicinal

important orchid: Vitro Cell. Dev. Biol.- Plant 40: 528-535.

López, A., Sosa, C., Mejia, J.M. (1995). Plantas del Suroeste de México con

potencial ornamental: Orquídeas. Revista Chapingo (Horticultura) 3: 45-56.

Recuperado de file:///D:/USUARIO/Downloads/rchshI2033.pdf

McKendrick, S. (2000). Manual para la germinación in vitro de orquídeas. Copyright,

Ceiba Foundation for Tropical Conservation.

Ministerio de Turismo (2018). Ecuador primer país de Orquídeas del mundo.

Consultado de https://www.turismo.gob.ec/ecuador-el-primer-pais-de-las-

orquideas-del-mundo/

Moreno, D. y Mencha, R. A. (2007). Efecto de los compuestos orgánicos en la

propagación in vitro de Stanhopea tigrina Bateman (Orchidaceae) Foresta

Veracruzana, vol. 9, núm. 2, 2007, pp. 27- 32

Mosquera, A.M., Cázares, J. G., de la Cruz Lázaro C. E., Flores A. (2010).

Germinación in vitro de semillas y desarrollo de plántulas de orquídeas

silvestres de Tabasco, Villahermosa, Tabasco: Universidad Juárez

Autónoma de Tabasco.

Narrea, M. (2006). Agar dextrosa papa. Consultado julio 16, 2018, desde

http://sisbib.unmsm.edu.pe/BVRevistas/entomologia/v45/pdf/a25v45.pdf

Nava, F. (2013). Propagación in vitro y establecimiento en invernadero de las

orquídeas Trichocentrum. carthagenense y Laelia eyermaniana para su 56

conservación y potencial aprovechamiento sustentable. Tesis de Postgrado.

Instituto politécnico Nacional. México.

Orquídea. (2013). Orquídeas en el Ecuador. Ecuador pais de las orquídeas, 3.

Otero, J. y Bayman, P. (2014). Germinación simbiótica y asimbiótica en semillas de

orquídeas epifitas. Revista UNAL.

Ortega, M. (2012). Conservación y propagación de orquídeas. 57.

Pedroza, M.J., Fernández L. Ch, y Suarez S.A. (2005). Evaluation of the effect of

three growth regulators in the germination of Comparettia falcate seeds under

in vitro conditions. En: Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 41: 38-843

Raya, Y., Carrillo, G., P. M., Corona, T., Carrillo, J. y Alcantar, G. (2013).

Propagación in vitro de Laelia halbingeriana. Revista Mexicana de Ciencias

Agrícolas.

Robles, D. (2015). Efecto de la interacción de citocinina y sacarosa en el cultivo in

vitro de Oncidium sphacelatum (Lindl.) (Orchidaceae). Tesis de pregrado.

Universidad de las Artes y Ciencias de Chiapas. Recuperado de

https://repositorio.unicach.mx/bitstream/20.500.12114/714/1/BIO%20584.15

%20R63%202015.pdf.

Ruiz, B. (2008). Germinacion in vitro de semillas Encyclia adenocaula (La Llave &

Lex.) Schltr (Orchidaceae). Revista Internacional de BOTANICA, 7.

Salazar, A. (2013). Evaluación de diferentes medios de cultivo in vitro en el

desarrollo de híbridos de Phalaenopsis (Orchidaceae). 103.

Salazar, S., Amaya, A. y Barrientos, F. (2013). Evaluación de diferentes medios de

cultivo in vitro en el desarrollo de híbridos de Phalaenopsis (Orchidaceae).

Revista colombiana de Biotecnología XV (2): 97-103. Recuperado de

http://www.scielo.org.co/pdf/biote/v15n2/v15n2a12.pdf 57

Salazar, V. M. (2003). Micropropagación de Mormodes tuxtlensis Salazar,

Cuitlauzina pendula La Llave, Lex y Lycaste skinneri (Batem. ex Lindl.) Lindl.

(Orchidaceae) a partir de protocormos. Tesis de Licenciatura. Universidad

Autónoma de Puebla. México. 106 pp.

Seaton, P. y Ramsay, M. (2005) Growing orchids from seed. Royal Botanic

Gardens, Kew. U.K. 83 pp.

Serna, A.L. (1999). Propagación in vitro de orquídeas a partir de semilla sexual.

Fitotecnia No. 034 genética. Diciembre, Universidad de Caldas, A.A. 275.

Manizales, Colombia.

Stevens, W. D., Ulloa Ulloa, C, Pool, A., y Montiel, O. M. (2011). Flora de

Nicaragua. Monogr. Syst. Bot. Missouri Bot. Gard. 85: i–xlii.

Tirado, J., Naranjo, E. y Atehortúa, L. (2013). Propagación in vitro de Phalaenopsis

(Orchidaceae) a partir de protocormos, mediante el sistema de inmersión

temporal "RITA". Revista Colombiana de Biotecnología, ISSN-e 1909-8758,

ISSN 0123-3475, Vol. 7, Nº. 1.

Torrente, R. J., Jiménez, J., Cánovas, J., Toderici, M., Castro, H., Sanchéz-Goméz,

P. (2013). Avances en el cultivo in vitro de diversas Orchidaceae del

Suroeste Ibérico. 6to Congreso de Biología de la Conservación de las

Plantas, Murcia-España.

Tropicos.org (2018). Missouri Botanical Garden. Consultado 25 julio 2018

˂http://www.tropicos.org˃

Tropical, N. (2016). La espectacular orquídea Encyclia cordigera. Obtenido de

https://naturalezatropical.com/encyclia-cordigera/

Villavicencio, N. M. y Pérez, E. B. (2005). Guía de la flora útil de la Huasteca y la

zona Otomi-Tepehua Hidalgo. UAEH. Pp 171. 58

9. Anexos

Figura 3. Ubicación geográfica del Laboratorio de Biotecnología de la Universidad Agraria del Ecuador, sede Guayaquil. (Tomado de Google Maps).

Tabla 9. Composición básica fundamental medios de los cultivos Compuestos Medios de cultivo

Agua Destilada

Compuestos orgánicos Suplementos macroorgánicos: Carbohidratos

Suplementos microorgánicos:

Vitaminas,

Aminoácidos

Reguladores de crecimiento (auxinas,

citocininas, giberilinas, brasinoesteroides,

etileno, ancymidol)

Antibióticos

Compuestos inorgánicos Macronutrientes

Micronutrientes

Compuestos indefinidos Agua de coco

Infusión de papa

Extractos de levadura

Caseína hidrolizada

Agentes solidificantes

Carbón activo

Cedrés et al., 2015

Tabla 10. Componentes del medio Murashige & Skoog (MS) Solución (g/Lt) Compuesto MS (mg.L-1)

Macronutrientes NH4NO3 1650

KNO3 1900

MgSO4. 7 H2O 370

KH2PO4 170

Calcio CaCl. 2H2O 440

Micronutrientes H3BO3 6.2

MnSO4.4H2O 22.3

Zn.SO4.7H2O 8.6

KI 0.83

NaMoO4.2H2O 0.25

CuSO4.5H2O 0.025

CoCl2.6H2O 0.025

Hierro Na2EDTA 37.3

FeSO4.7H2O 27.8

Vitaminas Myo-inositol 100

Glicina 2.0

Acido Nicotínico 0.5

Piridoxina-HCL 0.5

Tiamina-HCL 0.1

IARNA, 2017.

Tabla 11. Anava Prueba de Kruskal Wallis en la germinación in vitro de las semillas de Encyclia angustiloba (medios de cultivos sin germinación)

Otero, 2020

Tabla 12. Anava Prueba de Kruskal Wallis en la Conservación de las semillas de Encyclia angustiloba (medios de cultivos sin germinación)

Otero, 2020

Tabla 13. Anava Prueba de Kruskal Wallis en la Germinación de Encyclia angustiloba (medios de cultivos con germinación)

Otero, 2020

Figura 4. Cápsulas maduras de la orquídea Encyclia angustiloba donadas por el jardín botánico de Guayaquil Otero, 2020

A B

Figura 5. Pesado y desinfección de las semillas de Encyclia angustiloba en la cámara de flujo laminar. A) Pesado de la semilla en la balanza analítica; y B) Proceso de desinfección de las semillas. Otero, 2020 63

A B

Figura 7. Proceso de siembra de los medios de cultivo A) Siembra de las semillas de Encyclia angustiloba; y B) Colocación de los medios de cultivo en condiciones de luz. Otero, 2020

A B

Figura 9. Evaluación de la contaminación externa por hongos y bacterias en los medios de cultivo. A) Contaminación en el medio de cultivo PDA. B) Contaminación en el cultivo MS AC. Otero, 2020

B A

C D

Figura 11. Evaluación y contaje de las semillas de la orquídea en los medios de cultivo mediante el uso del microscopio con mi tutora Dra. Ariadne Vegas. Otero, 2020