Spécialité Sciences De La Production Végétale

REPUBLIQUE TUNISIENNE MINISTERE DE L’AGRICULTURE, MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT DES RESSOURCES HYDRAULIQUES ET SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE DE LA PECHE SCIENTIFIQUE

INSTITUT NATIONAL AGRONOMIQUE DE TUNISIE

Ecole Doctorale Sciences et Techniques de L’Agronomie et de l’Environnement

THESE DE DOCTORAT EN SCIENCES AGRONOMIQUES

Spécialité Sciences de la Production Végétale

Identification d’une association Lathyrus sativus-bactéries pour la dépollution biologique des sols contaminés par le plomb

Soutenue publiquement par

Souhir ABDELKRIM 27 décembre 2018 à INAT

Devant le jury composé de

M. Fayçal BEN JEDDI, Professeur, INAT Président M. Moez JEBARA, Professeur, CBBC Directeur de thèse M. Mustapha SANAA, Professeur, INAT Rapporteur M. Bouaziz SIFI, Professeur, INRAT Rapporteur M. Gouider TIBAOUI, Professeur, ESA Mateur Examinateur Mme. Salwa HARZALLI JEBARA, M. Conférences, CBBC Membre invité

REPUBLIQUE TUNISIENNE MINISTERE DE L’AGRICULTURE, MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT DES RESSOURCES HYDRAULIQUES ET SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE DE LA PECHE SCIENTIFIQUE

INSTITUT NATIONAL AGRONOMIQUE DE TUNISIE

Ecole Doctorale Sciences et Techniques de L’Agronomie et de l’Environnement

THESE DE DOCTORAT EN SCIENCES AGRONOMIQUES

Spécialité Sciences de la Production Végétale

Identification d’une association Lathyrus sativus-bactéries pour la dépollution biologique des sols contaminés par le plomb

Soutenue publiquement par

Souhir ABDELKRIM 27 décembre 2018 à INAT

Devant le jury composé de

DEDICACES

Je dédie cette thèse avec grand amour & fierté :

À mes chers parents MOHAMED et AWATEF ABDELKRIM

À mon cher époux EMIR AYED

À mon frère & ma sœur SAMI et YOSR ABDELKRIM

Sources de tendresse, de noblesse et d’affection

À tous les membres de ma famille

À tous mes amis

Et à tous ceux qui ont aidé à l’élaboration de ce travail

SOUHIR REMERCIEMENTS

Mes chaleureux remerciements s’adressent à mon directeur de thèse, Prof. Moez Jebara, Professeur au laboratoire des légumineuses au centre de biotechnologie de Borj Cedria (C.B.B.C), pour l’honneur qu’il m’a fait en me permettant d’intégrer l’unité de recherche du laboratoire des légumineuses au C.B.B.C et d’avoir accepté la direction de cette thèse. Ses encouragements continus, son encadrement rigoureux tout au long de ces années, sa grande expérience qu’il m’a fait largement profiter, sa confiance, ses précieuses connaissances, ses conseils judicieux et ses commentaires rigoureux m’ont aidé considérablement dans ce travail. Qu’il trouve ici, l’expression des mes sincères gratitudes et mes profonds respects.

Mes vifs remerciements s’adressent à mon co-directeur de thèse Dr. Salwa Harzalli Jebara, Maitre de Conférences au laboratoire des légumineuses au C.B.B.C, qui a suivi de près la progression de ce travail et m’a fait bénéficier de ses conseils, sa grande expérience, ses précieuses connaissances, et de son encadrement durant toutes ces années. Qu’elle trouve ici, l’expression des mes sincères gratitudes et mes profonds respects.

Mes profonds remerciements s’adressent au Prof. Mustapha Sanaa, Professeur de l’Enseignement Supérieur Agricole à l’I.N.A.T, pour l’honneur qu’il me fait en acceptant de faire partie du comité d'évaluation de ce travail de thèse. Qu’il trouve ici l’expression de mes gratitudes et mes profonds respects.

Mes profonds remerciements s’adressent au Prof. Bouaziz Sifi, Professeur de l’Enseignement Supérieur Agricole à l’I.N.R.A.T d’avoir accepté d'évaluer ce travail. Qu’il trouve ici l’expression de mes sincères estimes et mes profonds respects.

Mes vifs remerciements s’adressent au Prof. Fayçal Ben Jeddi, Professeur de l’Enseignement Supérieur Agricole à l’I.N.A.T, pour l’honneur qu’il me fait d’avoir accepté de présider le jury de soutenance. Qu’il trouve ici l’expression de mes gratitudes et mes profonds respects.

Mes profonds remerciements s’adressent au Prof. Gouider Tibaoui, Professeur de l’Enseignement Supérieur Agricole à E.S.A Mateur, pour l’honneur qu’il me fait en acceptant d'examiner ce travail. Qu’il trouve ici l’expression de mes sincères estimes et mes profonds respects. Mes sincères reconnaissances s’adressent à Dr. Ghassen Abid, Maitre de Conférences au laboratoire des légumineuses au C.B.B.C pour sa disponibilité et sa collaboration dans la réalisation de la partie moléculaire.

Je remercie également les ingénieurs du laboratoire des légumineuses Mme Fatma Souissi et Mr Manai Khedhiri pour leurs aides et leurs conseils. Mes sincères reconnaissances s’adressent aussi à ma très chère amie Faten Louati, pour son aide précieuse et son assistance technique. Qu’ils trouvent ici l’expression de ma profonde gratitude.

Mes plus vifs remerciements s’adressent au Prof. Ridha Mhamdi et au Prof. Haythem Mhadhbi Professeurs au laboratoire des légumineuses au C.B.B.C pour leurs conseils judicieux qui m’ont aidé considérablement dans ce travail.

Je tiens aussi à exprimer ma gratitude aux chercheurs du laboratoire des légumineuses Dr. Issam Nouairi, Dr. Samir Ben Romdhane, Dr. Bacem Mnasri, Dr. Moncef Mrabet, Dr. Kais Zribi, Dr. Darine Trabelsi, Dr. Thouraya Ben Hammouda, Dr. Wissal Msehli et Dr. Imen Rajhi pour leurs conseils précieux, leurs encouragement, leurs commentaires judicieux et rigoureux. Qu’ils trouvent dans ce travail mes meilleurs remerciements et l’expression de ma grande reconnaissance.

Mes sincères reconnaissances s’adressent à tout le personnel du laboratoire des légumineuses Mr Fathi Barhoumi, Mr Saber Rezgui, Mr Saber Rahmeni, Mr Fathi Dallagi, Mme Jamila Hammemi, Mme Monia Soubgui, Mlle Faten Louati, Mme Sameh Chalbout, Mme Basma Gharsallah pour leur accueil chaleureux et les conditions agréables de travail qu’ils m’ont fournis ainsi que leur assistance technique. Qu’ils trouvent ici l’expression de mes profonds remerciements. Merci également à mes collègues Omar Saadani, Cherni Ala, Saif Chihaoui, Wael Toukabri, Manel Chiboub, Marwa Aouida, Ibtissem Aroua, Imtiez Baccouchi, Oumaima Chaieb, Senda Salem, Rakia Mhamdi, Imen Haddoudi, Ameni Ben Zineb, Nadia Kallala, Yosra Sendi, Sabrine Jeder, Fadwa Melki, Sabrine Ben Moussa, Karima Jalleli, Amal Bouallegue, Takwa Gritli, Marwa Batnini et Nouha Ferchichi pour leurs encouragement, leurs sympathie et leurs précieux conseils je leur souhaite la réussite.

Merci également à toute l'équipe de séquençage à la Faculté des Sciences, Campus Manar, Tunis, Tunisie.

Abdelkrim Souhir RESUME

Le but de ce travail est d’étudier le potentiel de la gesse commune (Lathyrus sativus) à accumuler les métaux lourds, d'identifier et de caractériser les souches isolées des nodules racinaires de cette plante afin de former un inoculum efficace pour augmenter la croissance et l'absorption du plomb (Pb) par la gesse ainsi que l’amélioration de la qualité et la fertilité des sols contaminés. Les plantes de gesse ont été cultivées sur quatre sols provenant de sites contaminés par les métaux lourds. Quarante six bactéries ont été isolées des nodules racinaires des plantes de L. sativus cultivées sur des sols contaminés et ont été identifiées et criblées in vitro pour leur activité PGP, ainsi que leur capacité à tolérer et à accumuler le Pb. L'association L. sativus- PGPR a été étudiée dans des expériences en pot et en plein champ pour confirmer son potentiel de phytoremédiation. La réponse au plomb de l'association L. sativus- PGPR a également été analysée à l’échelle biochimique et moléculaire. Les résultats ont montré que L. sativus est capable d'accumuler des concentrations élevées du Pb et du Cd dans toutes les parties de la plante ce qui fait de cette plante un candidat potentiel pour la phytoremediation. La tolérance aux métaux lourds a démontré que la concentration maximale du Cd et du Pb tolérée par les 46 isolats est de 0,8 et 2,5 mM, respectivement. Le séquençage de l'ADNr 16S a également été obtenu et évalué pour l'identification de chaque isolat. Un test d’efficience a été réalisé en utilisant 22 bactéries et a montré que seule Rhizobium leguminosarum nodule la gesse, alors que certaines bactéries ont amélioré les paramètres de croissance des plantes. Dans le but de rechercher des rhizobactéries promotrices de la croissance des plantes (PGPR) ayant des activités multiples, 12 bactéries appartenant à l’espèce R. leguminosarum, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas sp, P. fluorescens, Luteibacter sp, Variovorax sp, Bacillus simplex et B. megaterium ont été sélectionnées sur la base de leur efficience et leur tolérance au Pb. Lors du criblage, la majorité des souches testées ont été capables de synthétiser l'acide indoleacétique, les sidérophores et le cyanure d’hydrogène avec des capacités variables de solubilisation du phosphate tricalcique. Une culture en pot en présence de 0,5 mM de Pb a été réalisée avec dix consortia formé chacun de quatre PGPR efficients et résistants au Pb. Les résultats ont montré que l'inoculation améliore la croissance des plantes ainsi que l'absorption du Pb surtout chez les plantes inoculées avec I1, I5, I7 et I9. On a également constaté que l'inoculation avec des PGPR aide à minimiser les dommages oxydatifs et à améliorer la réponse antioxydante des plantes, la biosynthèse des composés phénoliques ainsi que leur teneur en caroténoïdes, en proline et en sucres solubles. L'importance de nos résultats est validée par l’expérience réalisée dans un vignoble dans la région de Mornag en utilisant 6 inocula, qui vient de confirmer le rôle positif des PGPR en association avec L. sativus dans la phytoremediation. En effet la co-inoculation avec l’inoculum I5 a contribué dans la réduction des effets nocifs du plomb, signalés par une amélioration des paramètres de croissance et une accumulation élevée de métaux. De plus, la rhizosphère des plantes inoculées avec I5 a montré une réduction de la fraction extractible et totale du Pb, une stimulation de l’activité des enzymes du sol et une augmentation de la teneur en azote total et en phosphore assimilable du sol. Ainsi on vient de confirmer les travaux réalisés dans les conditions contrôlées et de valoriser le potentiel de l’association L. sativus- inoculum I5 (R. leguminosarum+ P. fluorescens+ Luteibacter sp+ Variovorax sp) dans la phytoremédiation du Pb et dans l'amélioration de la qualité et fertilité des sols contaminés. L’étude de l’expression de quelques gènes impliqués dans le transport et la détoxification du plomb affirme que LsABC, LsPCS, LsGR, LsGST et LsCNGC sont activés suite à l’application du traitement métallique et que l’inoculation avec l’inoculum I5 stimule d’avantage l’expression de tous ces gènes étudiés.

Mots clés: Co-inoculation, L. sativus, PGPR, phytoremédiation, plomb. ABSTRACT

In this study, grass pea (Lathyrus sativus) plants were grown in four soils that were collected from sites differently contaminated by heavy metals. Results showed that L. sativus was able to accumulate high concentrations of Pb and Cd in all plant parts and therefore can be classified as a strong metal accumulator. Forty-six strains were isolated from root nodules of L. sativus grown in contaminated soils. Heavy metal tolerance of the isolates was evaluated and demonstrated that the maximum concentration of Cd and Pb tolerated by strains were 0.8 and 2.5 mM, respectively. Twenty-two of the bacterial isolates were tested for their effects on plant biomass production and nodule formation and showed that only Rhizobium leguminosarum nodulated L. sativus, while some bacteria improved the shoots and roots dry biomass. Sequences of their 16S rDNA gene fragments were also obtained and evaluated for tentative identification of the isolates. In search of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) with multiple activities, twelve bacteria belonging to R. leguminosarum, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas sp, P. fluorescens, Luteibacter sp, Variovorax sp, Bacillus simplex and B. megaterium were selected among the collection based on their efficiency and tolerance to Pb. Upon screening, all test strains were able to synthesize indoleacetic acid; more than 90% were siderophore producers and 75% showed varying levels of phosphate solubilizing ability. The gaseous metabolite biosynthesis showed that 42% of strains were cyanogenic. The Pb bioaccumulation differs with incubation times between cell wall and cytoplasm; indeed, the most part was adsorbed to cell surface. A pot experiment demonstrated that the inoculation with combined bacteria enhanced plant growth parameters over the uninoculated plants. Therefore, ten consortia formed by mixing four efficient and Pb-resistant PGPR were selected and assessed for their beneficial effect in improving Pb (0.5 mM) uptake and in inducing host-defensive system of L. sativus under hydroponic conditions based on various physiological and biochemical parameters. Results showed that inoculation improved shoots and roots dry weight as well as plants Pb uptake with highest increases registered in plants inoculated with I1, I5, I7 and I9. We also found that PGPR inoculation helps in reduction of oxidative damage and enhanced the antioxidant enzymes activities, phenolic compound biosynthesis, carotenoids, soluble sugars and proline contents. In this study we assessed the potential of L. sativus inoculated, in situ, with 6 inocula, for Pb phytoremediation. The experiment was performed in a vineyard in the region of Mornag. Results confirm the positive role of PGPR in reducing the harmful effects of Pb, which are signaled by increased plant growth parameters and high metals accumulation mainly in plants inoculated with I5. The rhizosphere of I5 inoculated plants showed reduction in metal availability, activation in soil enzymes activities which were related with increases in soil nitrogen content and phosphorous availability. The importance of our research is provided by the confirmation of experiments obtained under controlled conditions. Our study established the positive effect of co-inoculation of L. sativus with I5 inoculum (R. leguminosarum+ P. fluorescens+ Luteibacter sp+ Variovorax sp) for the phytoremediation of mine tailings, as well as the improvement of soil quality and fertility. The expression patterns of LsABC, LsPCS, LsGR, LsGST and LsCNGC in shoots and roots of Lathyrus sativus indicated that these genes are differentially expressed under Pb treatments, suggesting their possible role in Pb stress tolerance mechanism. In this study, results also revealed that I5 inoculum stimulated the expression of all studied genes.

Keywords: Co-inoculation, lead, L. sativus, phytoremediation, PGPR. ملــــــــــــخــّ ــــص

أثبتت هذه الدراسة أن نبتة الهرطمان )Lathyrus sativus( تمتلك قدرة عالية على امتصاص المعادن الثقيلة وخاصة منها الرصاص Pb والكادميوم Cd وذلك على إثر زرعها في عينات من التربة الملوثة متأتية من أربعة مناطق في شمال البالد التونسية. كما بينت أن استعمال هذه النبتة يمثل حال بيولوجيا للتخلّص من التلوث الذي يمثل عائقا بالنسبة للفالحين بما أنه يحد من مردو دية االنتاج ويهدد سالمة كل الكائنات الحية. كما تم عزل 64 عينة بكتيرية من العقد الجذيرية للنبتة ودراسة مدى تحملها للعناصر المعدنية الثقيلة وقدرتها على تكوين العقد الجذيرية وتحسين نمو النباتات الملقحة، وأثبتت النتائج أن الريزوبيا Rhizobium leguminosarum هي البكتيريا الوحيدة القادرة على تكوين عقد جذيرية التي تساعد على تثبيت األزوت الجوي. وإضافة إلى هذه البكتيريا توجد أنواع أخرى قادرة على تحسين نمو وإنتاج النبتة إضافة إلى قدرتها على تحمل وتركيز الرصاص والكادميوم. وبناء على هذه المعطيات تم انتقاء اثنان وعشرون عزلة (22) إلثبات التسلسل الجيني وتقييم قدرتها على إفراز مواد تمكن من تحسين معايير نمو النباتات. أثبتت النتائج أن 12 من هذه البكتيريا األكثر فاعلية ومقاومة للرصاص تنتمي إلى R. leguminosarum، Variovorax sp ،Luteibacter sp ،P. fluorescens ،Pseudomonas sp ،Sinorhizobium meliloti Bacillus simplex و B. megaterium وقادرة على إنتاج حمض األندول _3_ اساتيك (AIA) وإنتاج سيداروفور و حمض السييانيدريك (HCN) وإذابة الفسفاط. وعند اختبار الجمع بين أربعة أنواع من البكتيريا المحفزة لنمو النباتات عبر تلقيح نبتة الهرطمان بعشرة مجموعات بكتيرية وزرعها في البيوت المكيفة في وسط مائي مع إضافة mM 0,5 من الرصاص، أظهرت النتائج أنها حسنت من نمو النباتات مع زيادة كبيرة في إنتاج مضادات األكسدة وزيادة نسبة امتصاص الرصاص من قبل النبتة خاصة عند تلقيحها بالملقح I1 وI5 وI7 وI9 مقارنة مع الشواهد الغير ملقحة. ولتأكيد أهمية نتائج البحث تم تلقيح نبتة الهرطمان بستة ملقحات بكتيرية مختلفة وذلك في حقل زراعي بمنطقة المرناق بين صفوف أشجار العنب وأكدت النتائج الدور اإليجابي للملقح R. leguminosarum+ P. fluorescens+ I5) (Luteibacter sp+ Variovorax sp في الحد من اآلثار الضارة للرصاص مع تحسين مردودية إنتاج النبتة وامتصاص وتركيز المعادن الثقيلة داخل خالياها وباإلضافة إلى ذلك تم تخفيض نسبة الرصاص والكادميوم في التربة مع تحسين نشاط األنزيمات ومحتواها من األزوت والفوسفور المتاح. وبالتالي يمكن استعمال الملقح I5 في تطهير وتحسين جودة وخصوبة التربة الملوثة. وقد تم تقييم نظام مقاومة نبتة الهرطمان من خالل تفعيل التعبير الجيني وذلك باستخدام تقنية RT.PCR quantitative على النباتات الملقحة بـI5 والغير ملقحة، وكشفت النتائج عن تعبير قوي للجينات LsGST ، LsGR، LsPCS ، LsABC و LsCNGC على مستوى أوراق النباتات الملقحة مقارنة مع الشواهد الغير ملقحة.

المفاتيحّ:ّالبكتيريا المحفزة لنمو النباتات، الرصاص، النبات المعالج للملوثات، الهرطمان، ملقحة. Table des matières

INTRODUCTION GENERALE……………………………………………………………………..1

Premier chapitre: Revue de littérature

I. Lathyrus sativus…………………………………………………………………………………5 1. Description…………………………………………………...... 5 1.1. Classification botanique et origine………………………………………………....5 1.2. Morphologie…………...………………………………………………………….6 1.3. Valeur nutritive de Lathyrus sativus……………………………………..…….....6 1.4. Teneur en facteurs antinutritionnels…………………………………………...….7 2. Fixation biologique de l’azote………………………………………….………………....7 2.1. Fixation de l'azote par Lathyrus sativus- Rhizobium….………………...….……...7 2.2. Importance de la fixation biologique d’azote…………………………………...... 8 2.3. La fixation symbiotique………………………………...………………………….9 2.4. Les bactéries qui vivent en symbiose avec Lathyrus sativus………………...…...11 3. Lathyrus sativus et la résistance aux contraintes biotiques et abiotiques………..……….11 II. Les métaux lourds ...... 12 1. Généralités ...... 12 2. Le plomb ...... 13 3. Le cadmium ...... 14 4. La biodisponibilité des métaux lourds ...... 14 III. Effets des métaux lourds sur les plantes ...... 15 1. Effet phytotoxique des métaux lourds ...... 15 2. La réponse des plantes au stress métallique ...... 16 2.1. Définition d’un stress oxydatif ...... 16 2.2. Effets néfastes des espèces réactives de l’oxygène (ERO) ...... 17 IV. La dépollution des sols pollués par les métaux lourds………………………………………18 1. Les techniques physico-chimiques……………………………………………………….18 2. La bioremediation ...... 20 2.1. La bioremédiation par les microorganismes ...... 20 2.2. La phytoremediation………………………………………………………………21 2.2.1. La phytoextraction……………………………………………………………..22 2.2.2. La phytostabilisation…………………………………………………………...23 2.2.3. La phytovolatilisation………………………………………………………….24 2.2.4. La phytodégradation, rhizodégradation et phytostimulation…………..…...…..24 2.3. Interaction plante-microorganismes…………………………………..……...... 25 2.3.1. Mécanismes directs……………………………………..………………...... 26 2.3.1.1. Fixation de l'azote………………………………..…………...……....…26 2.3.1.2. Solubilisation des phosphates………………………………..……...…..26 2.3.1.2. Production de phytohormones……………………………..……...….....28 2.3.2. Mécanismes indirects…………………………………..……………….…...... 29 2.3.2.1. Production de sidérophores…………………………...……………...….29 2.3.2.2. Production de métabolites antifongiques……………………...……...... 29 3. Les mécanismes de tolérance, d’absorption et d’accumulation des métaux adoptés par les plantes…………………………...……………….…………………………..…...……….…31 3.1. Réponse antioxydante des plantes….……………………………………………...31 3.2. Les mécanismes d’absorption, de transport, et d’accumulation des métaux…...….33 3.2.1. Les chélateurs externes……………………………...……………………….....33 3.2.2. Les chélateurs internes…………………………………………………….....…33 a. Les méthallothionéines…………………………………………...……..…33 b. Les phytochélatines…………………………………………...... ………...34 c. Le glutathion…………………………………………………....………….34 d. Les acides organiques……………………………………………..…….....35 e. Les acides aminés………...……………………………………….…….....35 3.2.3. Les transporteurs transmembranaires……………...………………….……...... 35

Deuxième chapitre: Etude des potentialités de Lathyrus sativus à accumuler les métaux lourds et isolement, identification et caractérisation des bactéries tolérantes à la contamination métallique

Introduction………………………………………………………………….…………………….37 1. Matériel et méthodes...... 37 1.1. Matériel végétal...... 37 1.2. Etude du potentiel de la gesse commune à accumuler les métaux lourds……….…37 1.2.1. Échantillonnage et caractérisation physicochimique des sols prospectés……...37 1.2.1.1. Dosage des métaux lourds totaux……………………………………...... 38 1.2.1.2. Dosage de l’azote total………………………………………………..…38 1.2.1.3. Dosage du phosphore assimilable…………………………………….…38 1.2.1.4. Mesure du pH et de la matière organique ………………………………38 1.2.1.5. Dosage du potassium……………..……………………………………..38 1.2.1.6. Détermination de la texture des sol ...... ………………………39 1.2.2. Culture des plantes et accumulation des métaux lourd ...... 39 1.2.2.1. La culture des plantes ...... 39 1.2.2.2. Dosage des métaux lourds...... 39 1.3. Isolement et caractérisation des bactéries ...... 40 1.3.1. Test de dépistage des bactéries tolérantes aux métaux lourds ...... 40 1.3.2. Identification moléculaire par séquençage du gène de l’ADNr 16S ...... 40 1.3.2.1. Lyse cellulaire par la protéinase K...... 40 1.3.2.2. Amplification de l’ADNr 16S ...... 41 1.3.2.3. Séquençage ...... 41 1.3.3. Effet des souches bactériennes sur la croissance et la nodulation des plantes ...42 1.3.4. Identification de gènes impliqués dans la résistance aux métaux lourds ...... 42 1.3.5. Bioaccumulation du plomb par les bactéries ...... 43 1.3.6. Production de l’acide indole 3-acétique (AIA) ...... 43 1.3.7. Solubilisation du phosphate tricalcique ...... 44 1.3.8. Production de siderophores ...... 44 1.3.9. Production de cyanure d'hydrogène (HCN) ...... 44 1.3.10. Sélection des inocula efficients...... 45 1.4. Analyse statistique ...... 46 2. Résultats……………………………………...... 46 2.1. . Caractéristiques physico-chimiques et teneur en métaux lourds des échantillons de sol ...... 46 2.2. Effet des métaux lourds sur la croissance des plantes ...... 47 2.3. Accumulation des métaux lourds par les populations de Lathyrus sativus ...... 48 2.3.1. Le cadmium ...... 49 2.3.2. Le plomb...... 50 2.3.3. Le cuivre ...... 51 2.3.4. Le zinc ...... 52 2.4. Caractérisation et identification des bactéries isolées des nodosités racinaires de Lathyrus sativus cultivées sur les échantillons de sol ...... 53 2.4.1. Tolérance aux métaux lourds des bactéries isolées ...... 53 2.4.2. Caractérisation moléculaire des isolats...... 54 2.4.2.1. Amplification par PCR de l’ADNr 16S ...... 54 2.4.2.2. Le séquençage…………………………………………………………..55 2.4.3. Détection des gènes de résistance au Pb et au Cd chez les souches bactériennes ...... 55 2.4.4. Etude des performances de la gesse inoculée avec des bactéries isolées des nodules racinaire...... 56 2.5. Criblage in vitro de souches bactériennes pour leur effet promoteur de la croissance des plantes (PGP) ...... 58 2.5.1. Production de l’acide 3-indole acétique ...... ……………………………………58 2.5.2. Production de sidérophores ...... 58 2.5.3. Solubilisation du phosphate tricalcique ...... 59 2.5.4. Production de cyanure d'hydrogène (HCN) ...... 60 2.5.5. Bioaccumulation du plomb par les bactéries ...... 61 2.6. Amélioration des paramètres de croissance par co-inoculation avec des PGPR et choix des inocula…………………………………………………………………………62 2.6.1. Effet de la co-inoculation sur la biomasse végétale ...... 62 2.6.2. Effet de la co-inoculation sur la teneur en azote ...... 63 2.6.3. Effet de la co-inoculation sur la nodulation...... 64 2.7. Etude de l’interaction entre les bactéries . …………………………………………67 3. Discussion .. ………………………………………………………………………………67

Troisième chapitre: Etude des potentialités des PGPR dans l’amélioration de l'absorption du Pb par Lathyrus sativus et la stimulation de son système de défense

Introduction ...... 74 1. Matériel et méthodes ...... 74 1.1. Mise en place de la culture hydroponique ...... 74 1.2. Dosage du plomb ...... 76 1.3. La teneur en chlorophylle et caroténoïdes ...... 76 1.4. Dosage des phénols totaux ...... 76 1.5. Détermination des caractéristiques de la membrane ...... 77 1.5.1. Peroxydation des lipides: dosage du malondialdehyde (MDA) ...... 77 1.5.2. Mesure de la perméabilité membranaire ...... 77 1.5.3. Indice de stabilité membranaire ...... 78 1.6. Dosage de la proline ...... 78 1.7. Détermination de la teneur en sucres solubles ...... 78 1.8. Accumulation du Cu, Zn et Ca sous le traitement avec le Pb ...... 78 1.9. Dosage des enzymes antioxydants ...... 79 1.9.1. Extraction des protéines et des enzymes ...... 79 1.9.2. Dosage des protéines solubles ...... 79 1.9.3. Dosage des activités enzymatiques ...... 79 1.9.3.1. Activité gaïacol peroxydase GPOX (EC 1.11.1.7) ...... 79 1.9.3.2. Activité superoxyde dismutase SOD (EC 1.15.1.1) ...... 80 1.9.3.3. Activité Catalase CAT (EC 1.11.1.6) ...... 80 1.9.3.4. Activité ascorbate peroxidase APX (EC 1.11.1.11) ...... 80 1.10. Analyse statistique ...... 80 2. Résultats ...... 81 2.1. Effet de l'inoculation avec des PGPR sur les paramètres de croissance de Lathyrus sativus en présence de Pb ...... 81 2.1.1. La biomasse végétale ...... 81 2.1.2. La teneur en azote total...... 81 2.1.3. La nodulation ...... 81 2.2. Accumulation du plomb par les plantes ...... 83 2.3. Teneur en nutriments essentiels ...... 84 2.4. Teneur en chlorophylle et en caroténoïdes ...... 84 2.5. Estimation des phénols totaux...... 84 2.6. Peroxydation des lipides et fuite des électrolytes (EL%) ...... 86 2.7. Teneur en proline et en sucres solubles ...... 86 2.8. Réponse des enzymes antioxydants au traitement métallique ...... 89 3. Discussion ...... 91

Quatrième chapitre: Confirmation de l’efficacité de l’association Lathyrus sativus- PGPR dans l’amélioration de la fertilité et de la qualité des sols et dans la réhabilitation des sites contaminés par le plomb

Introduction ...... 98 1. Matériel et méthodes ...... 98 1.1. Localisation du champ et caractéristiques du sol ...... 98 1.2. Protocole expérimental ...... 99 1.3. Processus de l'inoculation ...... 99 1.4. Récolte des plantes et dosage des métaux lourds ...... 100 1.5. Teneur en azote et en phosphore des plantes ...... 101 1.6. La teneur en chlorophylle et caroténoïdes ...... 101 1.7. Dosage de la proline...... 101 1.8. Analyse des échantillons de sol ...... 101 1.8.1. Dosage de la matière organique et détermination du pH et de la conductivité électrique du sol ...... 102 1.8.2. Détermination des métaux lourds totaux et extractibles ...... 102 1.8.3. Dosage de l’azote total et du phosphore assimilable au niveau du sol ...... 102 1.8.4. Dosages des enzymes du sol ...... 102 1.8.4.1. Activité de la phosphatse alcaline ...... 102 1.8.4.2. Activité de la β-glucosidase (E.C. 3.2.1.21) ...... 103 1.8.4.3. Activité de l’uréase (E.C. 3.5.1.5) ...... 103 1.9. Analyse statistique ...... 104 2. Résultats ...... 104 2.1. Effet de l'inoculation avec des PGPR sur les paramètres agronomiques des plantes de Lathyrus sativus ...... 104 2.2. Effet de l'inoculation avec des PGPR sur la teneur en proline, chlorophylle et en caroténoïdes ...... 106 2.3. Effet de l'inoculation avec des PGPR sur l’accumulation du plomb et du cadmium par les plantes ...... 107 2.4. Facteur de bioconcentration (BCF), facteur de translocation (TF) et accumulation totale des métaux au niveau de la partie aérienne et racinaire des plantes de Lathyrus sativus ...... 109 2.5. Effet de l’inoculation sur les paramètres chimiques du sol……………………...111 2.5.1. La concentration des métaux lourds dans le sol ...... 111 2.5.2. Effets de l'inoculation avec des PGPR sur les paramètres de fertilité du sol…112 2.5.3. Effet de l'inoculation avec des PGPR sur l’activité des enzymes du sol ...... 112 3. Discussion ...... 112

Cinquième chapitre: Etude des mécanismes impliqués dans la tolérance et l'absorption du Pb, et la stratégie de détoxication adoptée par L. sativus et stimulée par l’inoculation bactérienne

Introduction ...... 117 1. Matériel et méthodes ...... 117 1.1. Mise en place de la culture hydroponique . ………………………………………117 1.2. Dosage du plomb……………………………………………………………… .. 118 1.3. Etude des paramètres physiologiques et biochimiques ...………………………..118 1.4. Etude de l’expression des gènes par PCR en temps réel………………………..119 1.4.1. Extraction des ARN totaux………………………………………...…………119 1.4.2. Analyse qualitative et quantitative des ARNs totaux ………………………...119 1.4.3. Suivie de la migration et révélation…………………………………………...120 1.4.4. Transcription inverse des ARNm et synthèse des ADNc…………….….…....120 1.4.5. Recherche et mise au point des amorces……………………………………...121 1.4.6. La PCR en temps réel…………………………………………………………122 1.5. Analyse statistique ……….………………………………………………………123 A. Etude des mécanismes de réponse de L. sativus suite à l'application de 1 mM de Pb pendant 24, 48 et 72 h, à l’échelle physiologique et biochimique………………………………..123 A.1. Résultats……………………………………………………………………………….123 1.1. Absorption du plomb par L. sativus………………………………….…………..124 1.2. Teneur en chlorophylle et en caroténoïdes de L. sativus…..………………….….124 1.3. Peroxydation des lipides, fuite des électrolytes (EL%) et stabilité membranaire de L. sativus……………………………………………………………………...………...……125 1.4. Teneur en proline et en sucres solubles de L. sativus……………………...………..126 1.5. Activités des enzymes antioxydants ……………..………………………...……….127 A.2. Discussion………………………………………………………………………...……..130

B. Etude des mécanismes de réponse de L. sativus après 3, 6, 9 et 14 jours de traitement par 1 mM de Pb, à l’échelle moléculaire………………………………………………………..136 B.1.Résultats…………………………………………………………………………..….….136 1.1. Accumulation du Pb dans les feuilles et les racines de Lathyrus sativus…..…….136 1.2. Effet du plomb sur le niveau d’expression de LsPCS, LsABC, LsCNGC, LsGR et LsGST………………………………………………………………………………...…...137 B.2.Discussion…………………………….……………………………………………....….143

CONCLUSION GENERALE………………………………………………………………………...146 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES…………………………………………………….…...….151 ANNEXES PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES PARTICIPATION A DES TRAVAUX ET A DES MANIFESTATIONS SCIENTIFIQUES

Liste des tableaux

Tableau 1: Caractéristiques physico-chimiques et teneur en métaux lourds des échantillons de sol; S0 (Borj Cedria), S1 (Menzel Bourguiba), S2 (Jebel Ressas) and S3 (Ghezala). FN: normes Françaises pour les sols agricoles………………………………………………………………………………………………………….47

Tableau 2: Croissance et nodulation des populations de Lathyrus sativus cultivées sur les sols de Borj Cedria (S0), Menzel Bourguiba (S1), Jebel Ressas (S2) et Ghezala (S3) et récoltées au stade floraison (60 jours après la germination)………………………………………………...... 48

Tableau 3: Tolérance aux métaux lourds des 46 bactéries isolées………………………………………………54

Tableau 4: Test de l’efficience et séquençage de l'ADNr 16S des 22 bactéries sélectionnées, isolées des nodules racinaires de Lathyrus sativus. Les plantes ont été récoltées au stade floraison (60 jours après la germination). MTC: la concentration maximale de tolérance au plomb et au cadmium………………………………………..57

Tableau 5: Caractéristiques des souches bactériennes isolées des nodosités racinaires des plantes de Lathyrus sativus cultivées sur les sols prospectés. MTC: la concentration maximale de tolérance au plomb; Gène PbrA: gène résistant au Pb……………………………………………………………………...……………………….58

Tableau 6: Caractéristiques des souches bactériennes efficientes et résistantes aux métaux lourds. AIA: Production de l’acide 3-indole acétique. HCN: Production de cyanure d'hydrogène, absente, -; faible, +; modérée, ++; forte, +++. nd: activités non détectées………………………………………………...... 61

Tableau 7: Bioaccumulation du plomb par les souches sélectionnées, dans la paroi cellulaire ainsi que dans le milieu intracellulaire ……………………………...…………………………………………………………..…62

Tableau 8: Caractéristiques des souches bactériennes utilisées dans ce chapitre, isolées des nodules racinaires des plantes de Lathyrus sativus cultivées dans des sols contaminés. Test de nodulation; MTC: la concentration maximale de tolérance au plomb; l'existence ou l'absence du gène de résistance au plomb (PbrA); AIA: production d'acide indole acétique…………………………………………………...…………………………..74

Tableau 9: Teneur en Pb, Ca, Zn et Cu des feuilles, des racines et des nodules chez les plantes de Lathyrus sativus inoculées avec des PGPR, traitées avec 0,5 mM de Pb et récoltées au stade floraison…….……………83

Tableau 10: Caractéristiques des souches bactériennes utilisées pour l'inoculation de Lathyrus sativus en plein champ. Test de nodulation; MTC: concentration maximale de tolérance au plomb et au cadmium; Gène PbrA: gène de résistance au Pb; Gène CadA: gène de résistance au Cd; AIA: production d'acide indoleacétique; la production de sidérophores; capacité de solubilisation du phosphate tricalcique; HCN: production de cyanure d'hydrogène.……………………………………………...……………………………………………………..100

Tableau 11: Effet de l'inoculation avec les consortia I1, I5, I7, I8, I9 et I10 en plein champ sur les paramètres agronomiques de Lathyrus sativus. PA: partie aérienne; PR: partie racinaire; PN: partie nodulaire; MF: matière fraiche; MS: matière sèche………………………………………………………………………………..…….106 Tableau 12: Effet de l'inoculation en plein champ de la gesse avec les consortia I1, I5, I7, I8, I9 et I10 sur le facteur de translocation (TF), le facteur de bioconcentration (BCF) et la concentration totale (CT) du plomb et de cadmium (μg plante-1) au niveau des feuilles et des racines des plantes de Lathyrus sativus…….…………110

Tableau 13: Impact de l'inoculation en plein champ de la gesse avec les consortia I1, I5, I7, I8, I9 et I10 sur les propriétés chimiques du sol…………………………………………………………………………………...... 111

Tableau 14: Caractéristiques des souches bactériennes isolées des nodules racinaires des plantes de Lathyrus sativus cultivées dans des sols contaminés. Test de nodulation; MTC: la concentration maximale de tolérance au plomb; l'existence ou l'absence de gène de résistance au plomb (PbrA); AIA: production d'acide indoleacétique…………………………………………………………………………………………………...118

Tableau 15: Différents couples d'amorces utilisés pour l'amplification spécifique par PCR en temps réel……………………………………………………………………………………………………………...122

Tableau 16: Effets du plomb (1 mM) sur la chlorophylle totale (mg g-1 MF), la teneur en caroténoïdes (mg g-1 MF), la fuite des électrolytes (%) et l'indice de stabilité membranaire (%) au niveau des feuilles des plantes contrôles (non inoculées) et au niveau des plantes inoculées (I1 et I5) avant l'application du plomb (0) et 24, 48 et 72 heures après l’application du traitement métallique (HAT) de Lathyrus sativus…………………………125

Tableau 17: Effets du plomb (1 mM) sur la teneur en malondialdéhyde (MDA) (nmol g-1 MF), proline (μmol g- 1 MS) et en sucres solubles (mg g-1 MS) des feuilles et des racines des plantes contrôles (C: non inoculées) et au niveau des plantes inoculées (I1 et I5) avant l'application du plomb (0) et 24, 48 et 72 heures après l’application du traitement métallique (HAT) de Lathyrus sativus…………………………………………………………...127

Tableau 18: Effets de l'inoculation avec l’inoculum I5 sur l'accumulation du Pb (mg g-1 MS) dans les feuilles et les racines des plantes de Lathyrus sativus traitées avec 1 mM Pb. Les données ont été enregistrées au stade floraison, 3; 6, 9 et 14 jours après l'application du traitement métallique (JAT)……………………………….137

Liste des figures

Figure 1: Plante de Lathyrus sativus, population locale «Tunisie»…………………………………….5

Figure 2: Plante de Lathyrus sativus……………………………………………………………………6

Figure 3: Flux et transformation de l’azote sur une culture de légumineuses (ammoniac [NH3], + – ammonium [NH4 ], protoxyde d’azote [N2O], nitrate [NO3 ], azote gazeux inerte [N2])……….…...…9

Figure 4: Schéma synthétique du processus de nodulation et de la fixation biologique de l'azote …..10

Figure 5: Activités anthropiques conduisant à la contamination des sols par des métaux lourds…….13

Figure 6: Impact des métaux lourds sur les plantes………………………………………………..….16

Figure 7: Schématisation de la balance entre les ERO et les antioxydants…………………………...16

Figure 8: Production des espèces réactives de l’oxygène (ERO) par les protéines RBOH, les peroxysomes (Per), les mitochondries (Mit), les chloroplastes (Chl) et les peroxydases liées aux parois cellulaires (PER). La présence de Fe2+ peut faire basculer l'équilibre cellulaire et provoquer un stress oxydatif via la formation de radicaux hydroxyles à travers la réaction de Fenton………………….…17

Figure 9: Interactions métal-bactérie ayant un impact sur la bioremédiation………...………….……21

Figure 10: Comparaison de différentes méthodes de nettoyage des sols. Les méthodes d'assainissement du sol peuvent être divisées en trois catégories: physique, chimique et biologique. Remédiation physique, les méthodes comprennent (1) le remplacement du sol, (2) l'isolation du sol, (3) la vitrification, et (4) électrocinétique; Les méthodes biologiques comprennent généralement (5) la phytostabilisation, (6) la phytovolatilisation et (7) la phytoextraction, et les méthodes chimiques contiennent (8) l'immobilisation et (9) le lavage du sol………………………………………………..22

Figure 11: Illustration schématique des mécanismes importants connus pour l’amélioration de la croissance des plantes avec les PGPR……………………………………………………………….....26

Figure 12: Diverses substances organiques/inorganiques produites par les bactéries solubilisatrices des phosphates responsables de la solubilisation des phosphates dans les sols …………………….…28

Figure 13: Mécanismes des interactions plantes-bactéries-métaux lourds en phytoremédiation. M2+, ion métallique divalent…………………………………………………………………………………31

Figure 14: Effet du plomb sur la production des espèces réactives de l’oxygène et sur l’activité des enzymes antioxydants……………………………………………………………………………….....32

Figure 15: Schéma récapitulatif des transporteurs de métaux lourds dans une cellule végétale……...36

Figure 16: Analyse en composantes principales des paramètres physico-chimiques du sol et des paramètres liés à la croissance des plantes. SDW: Poids sec de la partie aérienne; RDW: poids sec de la partie racinaire; NN: nombre de nodules; OM: matière organique; N: azote; P2O5: phosphore assimilable; K2O: potassium; Cu: cuivre; Zn: zinc; Pb: plomb; Cd: cadmium et pH..……..…….……48 Figure 17: Répartition du cadmium entre les organes des populations de Lathyrus sativus cultivées dans l’échantillon de sol de Menzel Bourguiba (S1), Jebel Ressas (S2) et Ghezala (S3). M: Mahdia; K: Kerkena. Les résultats sont des moyennes (± SD) de trois mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05……..……………...49

Figure 18: Répartition du plomb entre les organes des populations de Lathyrus sativus cultivées dans l’échantillon de sol de Menzel Bourguiba (S1), Jebel Ressas (S2) et Ghezala (S3). M: Mahdia; K: Kerkena. Les résultats sont des moyennes (± SD) de trois mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05..…………………...50

Figure 19: Répartition du cuivre entre les organes des populations de Lathyrus sativus cultivées dans l’échantillon de sol de Menzel Bourguiba (S1), Jebel Ressas (S2) et Ghezala (S3). M: Mahdia; K: Kerkena. Les résultats sont des moyennes (± SD) de trois mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05.….………………...51

Figure 20: Répartition du zinc entre les organes des populations de Lathyrus sativus cultivées dans l’échantillon de sol de Menzel Bourguiba (S1), Jebel Ressas (S2) et Ghezala (S3). M: Mahdia; K: Kerkena. Les résultats sont des moyennes (± SD) de trois mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05.…………………...52

Figure 21: Electrophorèse des produits d’amplification par PCR du gène de l’ADNr 16S. M6, M11, M3, K2, K6 et M12: isolats bactériens. M: marqueur…………………………………………………54

Figure 22: Amplification des gènes résistants au plomb (A) et au cadmium (B) par PCR; Marqueur moléculaire M. 1- B. megaterium (K5); 2- Luteibacter sp (K20); 3- B. simplex (K14); 4- R. leguminosarum (M6); 5- B. megaterium; (K11); 6- R. leguminosarum (M12)………………………..56

Figure 23: Production de sidérophores par quelques souches étudiées, sur le milieu Chrome Azurol S (CAS)…………………………………………………………………………………………………..59

Figure 24: Solubilisation du phosphate tricalcique par quelques souches étudiées, sur le milieu NBRIP…………………………………………………………………………………………...……..60

Figure 25: Production de cyanure d’hydrogène (HCN). Les bactéries ont été striées sur le milieu LB. Le papier Feigl-Anger a été placé en haut de la boite de pétrie…………………………………….....60

Figure 26: Exemple de l’effet de la co-inoculation avec des PGPR sur la croissance des plantes. T: témoin non inoculé.…………………………………………………………………………………….63

Figure 27: Différence entre les plantes inoculées avec les consortia 3 et 4 et entre le témoin (T) non inoculé……………………………………………………………………………………..……..…….64

Figure 28: Effet de la co-inoculation avec des PGPR sur la nodulation des plantes de Lathyrus sativus cultivées sur du sable stérile. La récolte a été réalisée au stade floraison (60 jours après la germination)…………………………………………………………………………………………....65

Figure 29: Effet de la co-inoculation avec des rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (PGPR) sur les paramètres de croissance des plantes de Lathyrus sativus cultivées dans des conditions contrôlées. A / Matière sèche des parties aériennes; B / Matière sèche des parties racinaires; C / Nombre de nodules; D / Teneur en azote. Les résultats sont des moyennes (± SD) de cinq mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05…………………………………………………………….……………………………………..66

Figure 30: Effets des PGPR sur les paramètres de croissance de Lathyrus sativus en présence de plomb. Le traitement métallique (0,5 mM Pb) a été initié lorsque les plantes ont été âgées de 33 jours et la récolte a été faite au stade de la floraison (après 30 jours de l’application du métal). a: La matière sèche des parties aériennes; b: La matière sèche des parties racinaires; c: Le nombre de nodules; d: La teneur en azote total. Les résultats sont des moyennes (± SD) de cinq mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05……….…….82

Figure 31: Changements de la teneur des feuilles en chlorophylle totale (a) et en caroténoïdes (b); et accumulation des phénols totaux dans les feuilles (c) et les racines (d) des plantes de Lathyrus sativus inoculées avec des PGPR et traitées avec 0,5 mM Pb. Les résultats sont des moyennes (± SD) de cinq mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05………….………………………………………………………………………85

Figure 32: Teneur en malondialdéhyde (MDA) des feuilles (a) et des racines (b), fuite des électrolytes foliaire% (c) et indice de stabilité membranaire% (d) des plantes de Lathyrus sativus inoculées avec des PGPR après 30 jours de traitement avec le plomb (0,5 mM). Les résultats sont des moyennes (± SD) de cinq mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05.……………………………………………………………………87

Figure 33: Effets du traitement métallique sur la teneur en proline des feuilles (a), des racines (b) et des nodules (c) et sur la teneur en sucres solubles des feuilles (d) et des racines (e) de Lathyrus sativus inoculées avec des PGPR. Les résultats sont des moyennes (± SD) de cinq mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05…………………………………………………………………………………………………...88

Figure 34: Effets de l'inoculation avec des PGPR sur l’activité de la peroxydase (GPOX, μmol H2O2 -1 -1 -1 -1 min mg protéine), catalase (CAT, μmol H2O2 min mg protéine), superoxyde dismutase (SOD, USOD mg-1 protéine) et ascorbate peroxydase (APX, nmol ascorbate min-1 mg-1 protéine) de Lathyrus sativus en présence de 0,5 mM Pb. a: Feuilles; b: Racines; c: Nodules. Les résultats sont des moyennes (± SD) de cinq mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05………………………………………………………...90

Figure 35: Les principaux effets de l'inoculation avec des PGPR sur les changements physiologiques et biochimiques de Lathyrus sativus en présence de Pb (0,5 mM)…………………………………….97

Figure 36: Effet de l'inoculation avec les inocula I1 et I5 sur la croissance des plantes de L. sativus………………………………………………………………………………………………...105

Figure 37: Effet de l'inoculation avec les inocula I1 et I5 sur la nodulation des plantes de L. sativus………………………………………………………………………………………………...105

Figure 38: Effet de l'inoculation en plein champ sur l'accumulation des métaux chez Lathyrus sativus. A / accumulation du plomb; B / accumulation du cadmium. Chaque valeur est la moyenne de trois mesures effectuées sur les trois parcelles durant la saison agricole janvier 2016- mai 2016. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05…………………………………………………………….……………………………………108

Figure 39: Effet de l'inoculation au champ sur l'absorption du Pb et du Cd par la vigne. Chaque valeur est la moyenne de trois mesures effectuées sur les trois parcelles durant la saison agricole janvier 2016- mai 2016. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05………………………………………………………..…………………...109

Figure 40: Effets de l'inoculation avec des PGPR sur l'accumulation du Pb (mg g-1 MS) dans les feuilles (A) et les racines (B) des plantes de Lathyrus sativus traitées avec 1 mM Pb. Les données ont été enregistrées au stade floraison, 24; 48 et 72 h après l'application du traitement métallique. Les résultats sont des moyennes (± SD) de trois mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05.……………………...……………124

Figure 41: Effets de l'inoculation avec des PGPR sur l’activité de la superoxyde dismutase (SOD, -1 -1 -1 USOD mg protéine), peroxydase (GPOX, μmol H2O2 min mg protéine), catalase (CAT, μmol -1 -1 -1 -1 H2O2 min mg protéine) et ascorbate peroxydase (APX, nmol ascorbate min mg protéine) de Lathyrus sativus en présence de 1 mM Pb. A: Feuilles; B: Racines. Les données ont été enregistrées au stade floraison, 24; 48 et 72 h après l'application du traitement métallique. Les résultats sont des moyennes (± SD) de cinq mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05……………………………………………………….129

Figure 42: Illustration de la défense antioxydante et des mécanismes de tolérance au Pb induits par l’inoculation avec des PGPR chez Lathyrus sativus dans des conditions de stress métallique de court terme (1 mM Pb, pendant 24, 48 et 72h)……………………………………………………………..135

Figure 43: Analyse de l’expression du gène LsABC dans les feuilles (a) et les racines (b) de Lathyrus sativus traitées avec 1 mM Pb et inoculées avec I5. Les résultats sont des moyennes (± SD) de trois mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05.…………………………………………………………………………..……138

Figure 44: Analyse de l’expression du gène LsPCS dans les feuilles (a) et les racines (b) de Lathyrus sativus traitées avec 1 mM Pb et inoculées avec I5. Les résultats sont des moyennes (± SD) de trois mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05.…………………………………………………………………………..……139

Figure 45: Analyse de l’expression du gène LsGR dans les feuilles (a) et les racines (b) de Lathyrus sativus traitées avec 1 mM Pb et inoculées avec I5. Les résultats sont des moyennes (± SD) de trois mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05.………………………………………...……...………………………………140

Figure 46: Analyse de l’expression du gène LsGST dans les feuilles (a) et les racines (b) de Lathyrus sativus traitées avec 1 mM Pb et inoculées avec I5. Les résultats sont des moyennes (± SD) de trois mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05…………………………………...……………………………………………141

Figure 47: Analyse de l’expression du gène LsCNGC dans les feuilles (a) et les racines (b) de Lathyrus sativus traitées avec 1 mM Pb et inoculées avec I5. Les résultats sont des moyennes (± SD) de trois mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05.…………………………………………………………………………...142

LISTE DES ABREVIATIONS

ADN Acide désoxyribonucléique

ADNr Acide désoxyribonucléique ribosomique Ag L'argent AIA Acide indole 3-acétique Am L’américium APX Ascorbate peroxydase As Arsenic Au L'or BSA Bovine Sérum Albumine C Carbone CAT Catalase Cd Cadmium LiCl Chlorure de lithium CMT Concentration maximale de tolérance Co Cobalt Cr Chrome CTAB Bromure d'hexadécyltriméthylammonium Cu Cuivre °C Degré Celsius DEPC Pyrocarbonate d'éthyle DHA Déhydroascorbate DHAR DHA réductase dNTP Désoxyribonucléosides triphosphate EDTA Ethylène diamine tétra-acétate ERO Espèces réactives de l’oxygène g Gramme G Glutathion GPOX Gaïacol peroxydase GSH Glutathion réduit GR Glutathion réductase h Heure HEPES Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1- pipérazine éthane sulfonique Hg Mercure j Jour kg Kilogramme MF Masse fraiche ml Millilitre mm Millimètre MO Matière organique MS Masse sèche Ni Nickel

Na2CO3 Carbonate de sodium PA Parties aériennes pb Paire de base Pb Plomb PCR Réaction de polymérisation en chaîne Pd Palladium PMSF Fluorure de phénylméthylsulfonyle PR Parties racinaires PGPR Rhizobactérie promotrice de la croissance des plantes POX Peroxydases Pt Platine PVP Polyvinylpyrrolidone Ra Radium Ru Ruthénium Sn Étain SOD Superoxyde dismutase Th Thorium TY Tryptone Yeast Extract U L'uranium V/V Volume par volume YEMA Yeast Extract Mannitol Agar Zn Zinc

INTRODUCTION GENERALE

Thèse en Sciences Agronomiques Spécialité Sciences de la Production Végétale Introduction générale

INTRODUCTION GENERALE

Les déchets dangereux générés par les activités humaines, agricoles et industrielles telles que les opérations minières et le rejet de déchets industriels sont responsables de la contamination des sols et des eaux souterraines par des polluants toxiques (Etesami, 2018). La pollution accrue des sols a de graves conséquences sur l'écosystème en affectant les activités des microorganismes du sol, entraînant une détérioration de la fertilité des sols et une réduction de la production végétale (Saadani et al., 2016). En outre, les métaux lourds peuvent être transmis à la chaîne alimentaire avec un potentiel important d'altération à la santé animale et humaine, en raison de leur forte toxicité et de leur persistance car ils ne peuvent pas être dégradés ou transformés en formes moins dangereuses (Etesami, 2018; Järup, 2003). Certains métaux lourds tels que le cuivre et le zinc sont essentiels aux réactions métaboliques et sont requis comme oligo-éléments par les organismes vivants. D'autres, comme le plomb (Pb) et le cadmium (Cd), n'ont aucun rôle biologique et sont nocifs pour les êtres vivants, même à de très faibles concentrations (Kochare et Tamir, 2015). Le plomb est l'un des polluants les plus dangereux dans l'environnement (Lamhamdi et al., 2013), il a une faible solubilité et une forte capacité de liaison avec les colloïdes du sol (Matter, 2016). Le plomb est le principal métal lourd toxique causant de graves problèmes de santé publique car il est considéré comme un élément cancérigène (Yuan et al., 2016). Les principales sources de pollution par le plomb sont les effluents industriels, les engrais, les pesticides et les boues d'épuration municipales (Ansari et al., 2016). Bien que le plomb ne soit pas inclus dans les éléments essentiels pour les plantes et n'a aucune fonction biologique, il est absorbé rapidement par les racines et s'accumule dans différents organes de la plante (Lamhamdi et al., 2013). L'absorption du plomb par les plantes dépend principalement de sa concentration, du type de sol, des propriétés du sol et de l’espèce végétale (Fahr et al., 2013). À des concentrations élevées, le plomb affecte négativement la croissance des plantes et provoque une vaste gamme de dysfonctionnements physiologiques et biochimiques par perturbation cellulaire, chlorose des feuilles, altération de la photosynthèse inhibition de la croissance et perturbation de la nutrition minérale et de l'homéostasie (Chibuike et Obiora, 2014; Lamhamdi et al., 2013). L'exposition au plomb peut induire un stress oxydatif dû à la surproduction des espèces réactives de l'oxygène (ERO) extrêmement nocives pour les cellules végétales (Patra et al., 2011), puisqu'elles s’attaquent facilement aux structures

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biologiques et aux biomolécules et entraînent une peroxydation lipidique, une perte de l'intégrité de la membrane, un déséquilibre du redox cellulaire et l'inactivation des enzymes (Sewelam et al., 2016). Ainsi, les plantes ont développé des mécanismes de défense internes qui permettent le piégeage des ERO et la protection des cellules végétales contre les dommages oxydatifs; ceux-ci comprennent plusieurs mécanismes enzymatiques et non enzymatiques (Fahr et al., 2013). Les mécanismes enzymatiques comprennent les enzymes antioxydants, comme la superoxyde dismutase (SOD), la catalase (CAT), la peroxydase (POX), l'ascorbate peroxydase (APX) et la glutathion réductase (GR) (Sharma et al., 2012). L'ascorbate (AsA), le glutathion (GSH), la proline, les caroténoïdes, les composés phénoliques, les flavonoïdes et les tocophérols servent d'antioxydants puissants non enzymatiques pour l'élimination des ERO dans la cellule (Sharma et al., 2012; Kasote et al., 2015). La pollution des sols est une préoccupation prioritaire des agronomes et des écologistes, pour cette raison, plusieurs mesures réglementaires sont adoptées pour limiter la présence des métaux lourds dans l'environnement (Kaur et al., 2012). Comparée à l'approche physico-chimique conventionnelle, coûteuse, inadaptée dans le cas de surfaces étendues et altérant les propriétés du sol, la phytoremédiation est une technologie d'assainissement rentable, efficace et respectueuse de l'environnement (Dary et al., 2010; Ullah et al., 2015). Cette approche biologique représente une alternative prometteuse pour éliminer, détruire ou séquestrer des substances dangereuses de l'environnement et pour nettoyer les sols contaminés par des métaux lourds (Ullah et al., 2015). La phytoremédiation présente plusieurs approches la phytoextraction, la phytostabilisation, la phytodégradation, la phytotransformation, la phytovolatilisation, la phytofiltration et la rhizodégradation (Saadani et al., 2016). Cependant, une biomasse végétale élevée, avec une meilleure couverture végétale et des niveaux élevés d'absorption et d'accumulation de métaux lourds dans une partie cultivable, est également importante pour une phytoremédiation réussie (Hao et al., 2014; Ullah et al., 2015). Néanmoins, des quantités limitées de biomasse végétale réduisent l'application des plantes hyperaccumulatrices, en particulier dans les sols contaminés, où l'azote et le phosphore sont gravement déficients (Dary et al., 2010). Dans ce cas, il existe une autre façon de maximiser les chances de succès de la phytoremédiation en utilisant des rhizobactéries promotrices de la croissance des plantes (PGPR) (Thijs et al., 2016). En effet, l'interaction entre les plantes et les bactéries bénéfiques de la rhizosphère joue un rôle crucial dans l'adaptation aux environnements métallifères et peut être explorée pour améliorer la

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phytoremédiation assistée par des bactéries, une approche prometteuse pour nettoyer les sols contaminés par les métaux (Ma et al., 2016). De nombreuses études ont été menées pour évaluer l'impact du partenariat entre légumineuses et PGPR sur l'efficacité de la phytoremédiation (Chiboub et al., 2017; Gómez- Sagasti et Marino, 2015; Saadani et al., 2016). Les PGPR peuvent fixer l'azote atmosphérique et le fournir aux plantes, produire des phytohormones, y compris les auxines (AIA) et des cytokinines qui améliorent la croissance des plantes, solubilisent les phosphates rendant le phosphore facilement disponible aux plantes et synthétisent les sidérophores qui peuvent solubiliser et séquestrer le fer du sol et le fournir aux plantes (Etesami, 2018). Ces bactéries sont aussi capables d'améliorer les mécanismes de défense contre les agents pathogènes et la toxicité, d'améliorer la fertilité du sol et d'extraire ou de stabiliser les métaux simultanément (Mishra et al., 2017). De plus, l'inoculation avec les PGPR peut atténuer la toxicité des métaux lourds et augmenter de manière significative leur absorption par les plantes (Chen et al., 2010). En effet, de nombreuses bactéries du sol tolèrent les métaux lourds et jouent un rôle important dans la disponibilité des métaux en modifiant le pH du sol (Ma et al., 2011; Ma et al., 2016). De plus, les PGPR induisent des changements physico-chimique menant à une meilleure tolérance des plantes au stress abiotique (Anjana et al., 2016). Ainsi, la symbiose légumineuses-PGPR est bénéfique à la fois pour l'assainissement du métal dans les environnements contaminés et pour la promotion de la croissance des plantes. En effet, le rôle important des bactéries du sol pour améliorer la capacité d'élimination des métaux des légumineuses associées a été largement étudié (Jebara et al., 2017). La gesse commune (Lathyrus sativus) est une légumineuse annuelle qui possède une incroyable capacité à tolérer des conditions de croissance difficiles, le stress abiotique et même biotique (Vaz Patto et al., 2006; Talukdar, 2011; Nagati et al., 2015). Sa capacité de phytoextraction du plomb, du cadmium, du cuivre et du zinc a été étudiée (Beladi et al., 2011; Brunet et al., 2008). De plus, cette plante présente des potentiels d'accumulation du plomb similaires à celles des plantes accumulatrices efficaces (Brunet et al., 2008). Mais à ce jour, il n'y a aucune information sur l'effet des PGPR sur la capacité de phytoremédiation de L. sativus et le rôle de cette plante dans l’amélioration de la fertilité et de la qualité des sols. La pollution par les métaux lourds est devenue l'un des problèmes environnementaux les plus graves à l'heure actuelle (Ogbomida et al., 2018). En effet, en Tunisie l’activité industrielle est diversifiée et s’est régulièrement accrue au cours des vingt dernières années. Les industries, dispersées et de ce fait difficiles à contrôler, sont à l’origine de fortes charges

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polluantes et présentent, par conséquent, une menace sérieuse à l’agriculture en touchant plusieurs sols (Ghannem et al., 2016; Othmani et al., 2015; Wali et al., 2013). En outre, certains sols proches des sites miniers en exploitation et/ou abandonnés sont devenus contaminés par les métaux lourds, avec des teneurs supérieures aux normes autorisées pour un sol agricole (Fatnassi et al., 2014). Afin de faire face à ce problème, les scientifiques se sont intéressés à la recherche de nouvelles plantes tolérantes et accumulatrices de métaux lourds ainsi que la recherche de bactéries rhizosphériques résistantes à la contamination métallique. C’est dans ce cadre que s’inscrit le sujet de cette thèse qui fait partie du projet « Amélioration de la tolérance des légumineuses aux contraintes biotiques et abiotiques » du laboratoire des légumineuses au Centre de Biotechnologie de Borj Cedria (CBBC). L’objectif global de la présente thèse est d’identifier une association Lathyrus sativus- PGPR pour la phytoremédiation des sites contaminés par les métaux lourds et l’amélioration de la fertilité et de la qualité de ces sols. Pour cela ce travail a été conduit comme suit:

 Etude des potentialités de Lathyrus sativus à accumuler des métaux lourds et isolement, identification et caractérisation des bactéries tolérantes à la contamination métallique.  Etude des potentialités des PGPR dans l’amélioration de l'absorption du Pb par la gesse et la stimulation de son système de défense.  Confirmation de l’efficacité de l’association Lathyrus sativus- PGPR dans l’amélioration biologique de la fertilité et de la qualité des sols et dans la réhabilitation des sites contaminés par le plomb en plein champ.  Etude des mécanismes impliqués dans l'absorption du Pb, la tolérance et la stratégie de détoxication adoptée par la plante et stimulée par l’inoculation bactérienne.

Premier chapitre

Revue de littérature

Premier chapitre Revue de littérature

I. Lathyrus sativus 1. Description 1.1. Classification botanique et origine

Le Lathyrus sativus appartient au sous-règne des plantes vasculaires, à l’embranchement des Phanérogames, au sous embranchement des Angiospermes, à la classe des dicotylédones, à la sous classe des Dialypétales, à l’ordre des Fabales, à la famille des Fabaceae (légumineuses), à la sous famille des Papilionoideae, à la tribu des Fabaeae, au genre Lathyrus L. et à l’espèce: sativus (Campbell, 1997). Le genre Lathyrus comprend environ 150 espèces (Brink et Belay, 2006). Parmi les 150 espèces on peut citer: Lathyrus sativus, Lathyrus cicera, Lathyrus axillaris, Lathyrus niger, Lathyrus palustris, Lathyrus odoratus, Lathyrus ochrus, Lathyrus angulatus. Plusieurs auteurs ont souligné que l’origine de Lathyrus sativus est inconnue (Figure 1). Cependant, il semblerait que l’espèce Lathyrus sativus est probablement dérivée de l’espèce sauvage Lathyrus cicera qui est présente à l’état sauvage en Europe méridionale, en Afrique du Nord et à l’ouest de l’Asie (Brink et Belay, 2006). En Tunisie, le genre Lathyrus est représenté par une quinzaine d’espèces réparties essentiellement dans le nord du pays. Ces espèces présentent un intérêt agronomique considérable en tant que fourrage (L. ochrus et L. articulatus) et comme alimentation humaine (L. cicera et L. sativus) (Ben Brahim et al., 2001).

Figure 1: Plante de Lathyrus sativus, population locale «Tunisie».

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1.2. Morphologie

Lathyrus sativus est une plante herbacée annuelle, fortement ramifiée, rampante ou grimpante ayant une tige ailée peu rigide (Figure 2). Ses feuilles sont opposées, formées par une ou deux folioles linéaires et lancéolées terminées par une vrille rameuse qui permet l’appui sur d’autres plantes (Brink et Belay, 2006). Ses fleurs sont typiques des Fabaceae, à cinq pétales. Elles mesurent 1,5 cm de diamètre. Les fleurs sont bleues, roses ou blanches selon les variétés. Le fruit est une gousse ovale de 1,5 cm de largeur pour 3 cm de longueur. Elle comporte deux ailes foliacées et contient de trois à cinq graines, d’un diamètre compris entre 4 et 7 mm (Campbell, 1997). La classification infraspécifique repose essentiellement sur la couleur des fleurs, les marques sur les gousses et la taille et la couleur des graines. En général, les graines blanches sont les plus utilisées pour la consommation humaine (Brink et Belay, 2006).

Figure 2: Plante de Lathyrus sativus (Brink et Belay, 2006).

1.3. Valeur nutritive de Lathyrus sativus

La gesse commune (Lathyrus sativus L.) est une culture d'une immense importance économique, en particulier dans les pays en développement, y compris l’Inde, Bangladesh, Pakistan, Népal et l’Ethiopie. Elle est également cultivée en Chine et en Europe, au Moyen- Orient et en Afrique du Nord (Dixit et al., 2016). Lathyrus sativus sert à plusieurs fins, y compris l'alimentation humaine, le fourrage et comme engrais vert dû en partie à ses qualités nutritives (Chowdhury et al., 2005; Joshi, 1998; Mahler-Slasky et Kislev, 2010). En effet, les graines contiennent des niveaux élevés de protéines (25,6 g/100 g) et d'acides aminés

Premier chapitre Revue de littérature essentiels (7,92 g/100 g) avec une teneur totale en lipides et en phénols de 1,67 g/100 g et 174,91 mg/ 100 g, respectivement. L’acide ascorbique (13,50 mg/100 g), le glutathion (15,90 mg /100 g) ainsi que l’acide folique (206,70 μg/100 g) sont également présents (Tamburino et al., 2012). De plus, la teneur des graines en cuivre, zinc, manganèse et phosphore, est assez importante (Sidorovaa et al., 2013).

1.4. Teneur en facteurs antinutritionnels

Bien que les graines de Lathyrus sativus soient riches en protéines, la surconsommation peut provoquer une maladie des neurones. En effet, le Lathyrus sativus accumule dans ses graines une substance neurotoxique l’oxaloacétate L-acide-2,3-diaminopropionique (ODAP) dont la consommation excessive et prolongée conduit au lathyrisme chez l'homme et les animaux (Abd El-Moneim et al., 2001). Cette maladie neurologique est caractérisée par des troubles de la marche accompagnés d’une hypertonie musculaire, jusqu’à une paralysie des membres inférieurs et parfois la mort du patient (Haimanot et al., 2005). La maladie est plus prononcée lorsque la gesse constitue la composante dominante du régime alimentaire (pour plus de 25% de l'apport calorique) pendant une période entre trois et quatre mois (Dixit et al., 2016; Kumar, 1998). Le niveau d'ODAP dans les graines sèches varie considérablement, en fonction des facteurs génétiques, du stade de croissance des plantes, des nutriments, et des conditions environnementales (sécheresse, salinité, eau et métal) entre 0,22 et 16,2 g/ kg (Castell et al., 1994; Dixit et al., 2016; Tamburino et al., 2012).

2. Fixation biologique de l’azote 2.1. Fixation de l’azote par Lathyrus sativus- Rhizobium

La gesse est une légumineuse donc elle est capable de fixer l’azote atmosphérique via l’association avec les bactéries du genre Rhizobium. Sur ce, la gesse commune joue un rôle important en tant que culture de légumineuse dans les rotations culturales, ajoutant environ 25- 67 kg ha-1 d'azote au sol en une seule saison et conférant un certain surplus du rendement et une richesse en protéines à la culture suivante non légumineuse (Brink et Belay, 2006; Mahadavi et al., 2007). Ainsi elle a été utilisée comme source d’azote, pour les cultures vivrières essentielles, elle est par exemple cultivée avant la culture du riz ou en co-culture, ou en rotation après la culture de l’orge (Brink et Belay, 2006; Campbell, 1997; Hanbury et al., 2000).

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2.2. Importance de la fixation biologique d’azote

L'azote (N) est un nutriment essentiel pour la croissance et la productivité des plantes. Il constitue le facteur clé de la production agricole car la concentration des formes d’azote assimilables dans le sol (ammonium, nitrate..) est souvent limitante pour la croissance des plantes (Roger et al., 1996). Bien qu’il ne représente que 1 à 3% de la matière sèche végétale, l’azote entre dans la fabrication des acides nucléiques, des acides aminés, des protéines, chlorophylles ainsi que d’autres molécules indispensables à la croissance et au développement des plantes (Morot-Gaudry, 1997).

Bien qu'il y ait environ 78% de N2 dans l'atmosphère, il n'est pas disponible pour les plantes (Ahemad et Kibret, 2014). Toutefois, les organismes capables de fixer l'azote sont généralement classés en deux groupes:

 Bactéries fixatrices de N2 symbiotiques, y compris les membres de la famille des rhizobiacées qui forment une symbiose avec les légumineuses de la famille des Fabacées (par exemple les rhizobiums) et les bactéries du genre Frankia (actinobactérien fixateur d'azote) lors de leur interaction symbiotique avec les plantes actinorhiziennes (Benson et Silvester, 1993; Zahran, 2001).  Bactéries non symbiotiques (libres, associatives et endophytes) fixatrices d'azote comme les cyanobactéries (Anabaena, Nostoc), Azospirillum, Azotobacter, Gluconoacetobacter diazotrophicus et Azocarus (Bhattacharyya et Jha, 2012). Cependant, les bactéries fixatrices d'azote non symbiotiques ne fournissent qu'une petite quantité de l'azote fixé nécessaire à la plante hôte (Glick, 2012). La nutrition azotée des plantes de la famille des légumineuses est assurée par deux voies complémentaires: absorption de l’azote minéral du sol par les racines, comme chez tous les végétaux supérieurs, et fixation de l'azote atmosphérique (Figure 3), grâce à la symbiose avec les bactéries du sol (Voisin et al., 2015).

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2.3. La fixation symbiotique

L'établissement de la symbiose implique une interaction complexe entre l'hôte et le symbiote entraînant la formation d’excroissances racinaires spécifiques, appelées «nodosités», qui hébergent les bactéries symbiotiques (Voisin et al., 2015). L’azote atmosphérique est converti en formes utilisables par les plantes par fixation biologique de N2 (FBN), réalisée par une enzyme complexe, la nitrogénase (Kim et Rees, 1994). La FBN résultant de la symbiose rhizobia-légumineuses peut profiter non seulement à la culture hôte, mais elle peut également avoir des effets positifs pour les cultures suivantes (Lupwayi et al., 2004). La symbiose est à bénéfices réciproques: la bactérie fournit à la plante le N fixé; En échange les bactéries profitent des substrats carbonés issus de la photosynthèse ainsi la plante apporte l’énergie nécessaire à la synthèse des nodosités et à leur fonctionnement (Laranjo et al., 2014; Voisin et al., 2015). Dans les premiers stades de la symbiose, un dialogue moléculaire complexe prend place, il s'agit d'un processus impliquant des facteurs Nod synthétisés par la bactérie et des flavonoïdes libérés par les racines des légumineuses, de sorte que les deux partenaires symbiotiques se reconnaissent mutuellement et initient la nodulation (Laranjo et al., 2014; Oldroyd, 2013). En effet les exsudats racinaires de la plante contiennent plusieurs substances, principalement des flavonoïdes qui sont capables d’attirer les rhizobiums par chimiotactisme à travers l'activation

Premier chapitre Revue de littérature de la transcription des gènes Nod qui permettent à leur tour la production de facteurs Nod (Figure 4) (Patriarca et al., 2004). Les facteurs Nod sont des molécules de signalisation de nature lipo-chito-oligosaccharides reconnues à leur tour par la plante et les types de facteurs Nod produits ainsi que leur quantité permettent une reconnaissance spécifique de chaque souche par son partenaire végétal (Oldroyd, 2013). Quand les facteurs Nod sont produits, ils induisent chez la plante des modifications morphologiques, physiologiques et moléculaires complexes provoquant la déformation des poils absorbants et une éventuelle pénétration des bactéries au sein de la plante hôte via une structure tubulaire appelée cordon d’infection (Oldroyd et al., 2011). Lorsque le cordon d’infection atteint la base des cellules épidermiques, il fusionne avec leur paroi et les bactéries se propagent dans l’espace intercellulaire entre la cellule épidermique et la couche de cellules sous-jacente (Gage et Morgolin, 2000). En même temps, la paroi de la cellule corticale sous- jacente s’invagine, permettant au cordon d’infection de continuer sa progression vers le cortex interne de la racine (Figure 4). Les cellules du cortex interne se différencient et leur cycle cellulaire est réactivé, ce qui donne la formation d’un primordium nodulaire (Gharzouli, 2013). Le nodule se prolonge et le raccordement vasculaire avec la stèle de la racine est mis en place. Les bactéries qui sont acheminées dans les cellules du nodule se différencient en bactéroїdes fixant l’azote atmosphérique et l’ensemble nodule et bactéroїde forment le symbiosome (Chataigné, 2007).

Poils absorbants

Flavonoïdes gènes nod

Cordon d’infection

Initiation à la formation de nodule Facteurs Nod

gènes nif Nodule

Fixation biologique de l’azote

Figure 4: Schéma synthétique du processus de nodulation et de la fixation biologique de l'azote (Laranjo et al., 2014).

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D’autre part, la fixation biologique de l'azote atmosphérique dans les nodosités est assurée par un système enzymatique: la nitogénase formée de deux métalloprotéines, la protéine à fer Fe (ou dinitrogénase réductase, codée par le gène nifH) et la protéine de molybdène-fer MoFe, (dinitrogénase, codée par les gènes nifD et nifK) (Kim et Rees, 1994). Ensemble, ces protéines induisent la réduction du diazote en ammoniac (Figure 4). En effet, la protéine Fe est réduite par un donneur primaire d’électrons, habituellement la ferrédoxine. Lors de la seconde étape, la protéine Fe réduite transfère les électrons à la protéine MoFe, qui catalyse à la fois la réduction du diazote gazeux et la production d’hydrogène (Hopkins, 2003). Les gènes de la nitrogénase (nif) comprennent les gènes structuraux, les gènes impliqués dans l'activation de la protéine Fe, la biosynthèse du cofacteur de molybdène de fer, le don d'électrons et les gènes régulateurs nécessaires à la synthèse et à la fonction de l'enzyme (Glick, 2012).

2.4. Les bactéries qui vivent en symbiose avec Lathyrus sativus

Les plantes de gesse, comme les autres espèces de légumineuses, sont capables d'entrer dans une relation symbiotique avec les bactéries du sol du genre Rhizobium et fixer l'azote atmosphérique. Plusieurs études ont montré que la nodulation de cette plante est assurée par l’espèce Rhizobium leguminosarum (Barrientos et al., 2003 ; Brink et Belay, 2006, Mahdavi et al., 2007; Sidorova et al., 2013). De même, les bactéries isolées des plantes de gesse cultivées dans différents sites dans les régions arides de la Tunisie ont été restreintes à l'espèce Rhizobium leguminosarum (Guefrachi et al., 2013). De plus, R. leguminosarum favorise l’amélioration de la production de la matière sèche de sa plante hôte (Brink et Belay, 2006).

3. Lathyrus sativus et la résistance aux contraintes biotiques et abiotiques

La gesse est une légumineuse annuelle qui possède une capacité étonnante à tolérer des conditions de croissance difficiles, et est considérée comme l'une des sources les plus prometteuses de gènes d'intérêt (Vaz Patto et al., 2006). Cette plante est faiblement affectée par les stress abiotiques et biotiques tels que l'engorgement des sols, une forte salinité ainsi que la sécheresse, elle est aussi reconnue comme une source potentielle de résistance à plusieurs maladies importantes chez les légumineuses (Almeida et al., 2015; Campbell, 1997; Nagati et al., 2015; Talukdar, 2011; Vaz Patto et al., 2006; Vaz Patto et Rubiales, 2014). De même, cette plante présente des potentiels d'accumulation du plomb équivalentes à celles des

Premier chapitre Revue de littérature plantes accumulatrices efficaces comme Brassicae juncea et Thlaspi rotundifolium (Brunet et al., 2008). D'autres études ont démontré que Lathyrus sativus a la capacité maximale d'accumuler du plomb et du cuivre comparativement à d'autres légumineuses comme Medicago sativa et Onobrychis viciifolia (Beladi et al., 2011) de plus que son potentiel à accumuler le cadmium (Nagati et al., 2015; Talukdar, 2014). Les mêmes auteurs ont révélé que cette plante peut former un outil intéressant pour la phytoremédiation. En raison de ses faibles besoins en nutriments, la gesse commune peut prospérer dans les sols pauvres, ainsi que dans les milieux arides (Hillocks et Maruthi, 2012). Aussi, la gesse est principalement cultivée sur les terres marginales et submarginales qui sont généralement caractérisées par une mauvaise qualité et une faible fertilité du sol (Dixit et al., 2016). Même si le mécanisme exact de cette tolérance n'est toujours pas connu, des études ont indiqué qu'il est lié à la capacité d'ajustement du potentiel osmotique des plantes (Jiang et al., 2013; Piwowarczyk et al., 2014), à leurs activité enzymatique antioxydante élevée (Jiang et al., 2013; Talukdar, 2013), de plus de l’accumulation accrue des composés phénoliques (Piwowarczyk et al., 2016; Piwowarczyk et al., 2017).

II. Les métaux lourds

1. Généralités

Bien que les métaux lourds soient des composés naturels, les activités anthropiques les introduisent en quantités excessives dans différentes matrices environnementales (Figure 5), ce qui cause de graves menaces pour la santé de l'homme et de l'écosystème (RoyChowdhury et al., 2018). Certains métaux lourds sont des oligo-éléments essentiels, cependant, la plupart d'entre eux peuvent être toxiques pour tous les êtres vivants à des concentrations élevées, cependant, les métaux lourds comprennent également les métalloïdes, tels que l'arsenic, qui sont capables d'induire une toxicité à un faible niveau d'exposition (Tchounwou et al., 2012). Métal lourd est un terme collectif général qui s'applique au groupe des métaux et des métalloïdes dont la densité est supérieure à 4 ± 1 g cm-³, de plus il est largement reconnu et généralement appliqué aux contaminants répandus dans les écosystèmes aquatiques et terrestres (Mohammed et al., 2011). Les métaux lourds, sont généralement classés en trois catégories: métaux toxiques (Hg, Cr, Pb, Zn, Cu, Ni, Cd, As, Co, Sn, etc.), métaux précieux (Pd, Pt, Ag, Au, Ru, etc.) et radionucléides (U, Th, Ra, Am, etc.) (Ahemad, 2014). La pollution par les métaux lourds est devenue l'un des problèmes environnementaux les plus graves à l'heure actuelle (Ogbomida et al., 2018). En effet, une fois introduits dans

Premier chapitre Revue de littérature l'environnement, les métaux lourds persistent indéfiniment en raison de leur stabilité et de leurs propriétés non dégradables causant des dommages à l'eau, l'air et au sol et peuvent même s’accumuler dans les organismes vivants et donc contaminer toute la chaîne alimentaire (Mohammed et al., 2011). De plus, l’accumulation de fortes doses de métaux lourds dans le corps des animaux a pour conséquence des problèmes de reproduction, un affaiblissent du système immunitaire, une mauvaise condition physique des animaux et l’apparition des maladies cancéreuses (Tunegova et al., 2016). La toxicité des métaux dépend de plusieurs facteurs, y compris la dose, la voie d'exposition ainsi que la génétique des individus exposés. En raison de leur degré élevé de toxicité, As, Pb, Cd et Hg figurent parmi les métaux d'importance prioritaire pour la santé publique et sont inclus dans les 20 substances les plus dangereuses selon l’agence pour les substances toxiques et le registre des maladies (ATSDR) et l’agence de protection de l’environnement des États-Unis (US EPA) (Khalid et al., 2017).

Exploitation minière (As, Cd, Pb, Hg)

Industrie Dépôts atmosphériques (As, Cd, Cr, Co, Cu, Hg, Ni, Zn) (As, Cd, Cr, Cu, Pb, Hg, U)

Sources anthropiques de la contamination métallique

Agriculture Traitement des déchets (As, Cd, Cu, Pb, Se, U, Zn) (As, Cd, Cr, Cu, Pb, Hg, Zn)

Figure 5: Activités anthropiques conduisant à la contamination des sols par des métaux lourds (Ahemad, 2012).

2. Le plomb

Parmi les métaux lourds, le plomb est un contaminant environnemental majeur et un métal hautement toxique dont l'utilisation répandue a causé de graves problèmes de santé publique (Jaishankar et al., 2014). Le plomb a une persistance prolongée dans le sol en raison de sa nature non biodégradable, sa faible solubilité et de sa forte capacité de liaison avec les colloïdes du sol (Matter, 2016). Les principales sources de pollution par le plomb sont les

Premier chapitre Revue de littérature effluents industriels, les engrais, les pesticides, les émissions gazeuses des véhicules et les boues d'épuration municipales (Ansari et al., 2016). Le plomb en suspension dans l'air peut être déposé au niveau du sol et l'eau, atteignant ainsi les hommes et les animaux via la chaîne alimentaire (Järup, 2003). Le Pb présente des effets nocifs à de faibles concentrations et est considéré comme un élément cancérigène (Yuan et al., 2016). L'exposition prolongée au plomb produit divers effets délétères sur le système hématopoïétique, rénal, reproducteur et nerveux central, principalement par l'augmentation du stress oxydatif, et ces altérations jouent un rôle important dans les manifestations de troubles graves et des maladies (Flora et al., 2012).

3. Le cadmium

Le cadmium est l'un des métaux lourds toxiques, qui est largement distribué dans la croûte terrestre à une concentration moyenne d'environ 0,1 mg kg-1 (Tchounwou et al., 2012). Les processus naturels et anthropiques contribuent à augmenter les concentrations du cadmium dans le sol, aggravant ainsi ses effets délétères sur la croissance des cultures (Abd_Allah et al., 2015). L’extraction par fusion, l'exploitation minière, la fertilisation excessive par les engrais phosphatés, les boues d'épuration et l'utilisation d'eau polluée par le cadmium pour l'irrigation sont les principales sources de pollution par le cadmium (Zoffoli et al., 2013). Le cadmium est un agent cancérigène humain connu, de plus c’est un irritant pulmonaire et gastro-intestinal sévère qui peut être mortel s'il est inhalé ou ingéré (Tchounwou et al., 2012). Le cadmium est très persistant dans l'environnement et s’accumule dans les mollusques, les crustacés et les plantes au fil du temps, mais une fois entré dans le corps humain, il est très difficile à retirer (RoyChowdhury et al., 2018). Certains métaux lourds sont rapidement absorbés par les plantes et transportés jusqu'aux parties supérieures (Hart et al., 1998), ainsi les plantes contaminées deviennent impropres à la consommation si les teneurs dépassent les concentrations maximales recommandées (Mench et Baize, 2004).

4. La biodisponibilité des métaux lourds

La « biodisponibilité » est définie comme la fraction de la concentration totale qui peut interagir avec une cible biologique (Baize et Tercé, 2002). Elle dépend:

 Des caractéristiques physiques et chimiques de la matrice  De la forme chimique du métal dans le sol

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 De l’organisme vivant

La mobilité des métaux lourds dans l'écosystème dépend de leur biodisponibilité dans le sol, en outre, ils sont sensibles au pH et fortement lessivés dans les sols acides (Gandois et al., 2010). De plus, Les métaux lourds sont associés aux constituants du sol qui contrôlent leur mobilité (Baize, 1997), ils peuvent être:  Adsorbés sur les phases hydroxyde du fer, de l’aluminium et du manganèse  Inclus dans les réseaux cristallins des minéraux primaires et des constituants secondaires  Adsorbés par la matière organique

Les variations des conditions physico-chimiques (pH, température, force ionique etc.) peuvent influencer directement la mobilité des éléments en faisant passer les métaux présents dans un sol d’une forme à une autre. La biodisponibilité est un outil d’évaluation de la toxicité et le risque de pollution (Qasim et al., 2014). En effet, Le changement de la biodisponibilité d’un polluant correspond à un changement de toxicité.

III. Effets des métaux lourds sur les plantes 1. Effet phytotoxique des métaux lourds

La contamination des sols agricoles par des métaux lourds est devenue une préoccupation environnementale critique en raison de leurs effets écologiques négatifs et de leurs effets toxiques aigus et chroniques sur les plantes cultivées sur ces sols (Yadav, 2010). La pollution des sols par les métaux lourds favorise leur absorption par les plantes, entraînant leur accumulation dans les tissus végétaux et des éventuels effets phytotoxiques visibles (Figure 6) reflétés en termes de chlorose, nécrose, flétrissement, inhibition de la croissance et brunissement des extrémités des feuilles (Ghnaya et al., 2016). Les métaux provoquent aussi des altérations de la fonctionnalité des membranes en induisant la peroxydation des lipides, la détérioration de la perméabilité de la membrane plasmique conduisant ainsi à la fuite des ions, provoquent des perturbations du métabolisme chloroplastique en inhibant la biosynthèse de la chlorophylle et en réduisant l‘activité des enzymes impliquées dans la fixation du CO2 (Bouazizi et al., 2010; Lamhamdi et al., 2013). En effet, l'absorption des métaux par les plantes dépend principalement de leur concentration, du type de sol, des propriétés du sol et des espèces végétales (Fahr et al., 2013). De plus, les métaux peuvent remplacer des éléments essentiels ou des enzymes perturbant ainsi leur fonction et provoquant des effets toxiques indirects (Asati et al., 2016). Dans ce cas,

Premier chapitre Revue de littérature la contamination par les métaux lourds rend le sol impropre à la croissance des plantes et détruit la biodiversité, ce qui entraîne des baisses significatives des rendements (Etesami, 2018; Kukreja et Goutam, 2012).

Nécrose foliaire Chlorose s

Enroulement foliaire Brûlure

Stress oxydatif Troubles métaboliques Déséquilibre ionique

Figure 6: Impact des métaux lourds sur les plantes (Liu et al., 2015).

2. La réponse des plantes au stress métallique

Une concentration élevée en métaux lourds induit également un stress oxydatif en augmentant la production des espèces réactives de l’oxygène (ERO) au sein des plantes.

2.1. Définition d’un stress oxydatif

Un déséquilibre entre les oxydants et les antioxydants en faveur des oxydants, pouvant conduire à des dommages, est appelé «stress oxydatif» (Sies, 1997) (Figure 7).

Figure 7: Schématisation de la balance entre les ERO et les antioxydants (Bertrand, 2008).

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La toxicité des ions métalliques se traduit par l’activation des formes réduites de l’oxygène aboutissant à la formation accrue des espèces réactives de l’oxygène (Piqueras et al., 1999). En effet, les mitochondries, les chloroplastes et les peroxysomes sont les principales sources génératrices des ERO (Hernandez et al., 1999). Par ailleurs, les chaînes de transfert d'électrons au niveau de l'appareil photosynthétique sont également capables de produire les ERO (Parent et al., 2008). La réduction partielle de l’oxygène donne naissance à l’anion •‾ superoxyde (O2 ). Ce dernier se trouve rapidement transformé en peroxyde d’hydrogène

(H2O2) par la superoxyde dismutase qui, de ce fait, joue un rôle important dans la lutte contre •‾ le stress oxydatif dans la mesure où H2O2 est moins réactif que (O2 ) (Halliwell et Gutteridge, 1986). Le peroxyde d’hydrogène généré peut se transformer en radical hydroxyle (OH•) à travers la réaction de Fenton (Figure 8) (Romero-Puertas et al., 2004).

Dommage oxydatif

Peroxydation des lipides Destruction de l'ADN Oxydation des protéines Réticulation chimique et/ ou

Protéine Protéine

Figure 8: Production des espèces réactives de l’oxygène (ERO) par les protéines RBOH, les peroxysomes (Per), les mitochondries (Mit), les chloroplastes (Chl) et les peroxydases liés aux parois cellulaires (PER). La présence de Fe2+ peut faire basculer l'équilibre cellulaire et provoquer un stress oxydatif via la formation de radicaux hydroxyles à travers la réaction de Fenton (Mittler, 2017).

2.2. Effets néfastes des espèces réactives de l’oxygène (ERO)

La réponse primaire des plantes est la génération des ERO lors de l'exposition à des niveaux élevés de métaux lourds. Divers métaux génèrent des ERO directement à travers les réactions de Haber-Weiss ou la surproduction des ERO et l'apparition de stress oxydatif chez les plantes pourraient être les conséquences indirectes de la toxicité des métaux lourds (Mithofer et al., 2004; Wojtaszek, 1997). L'un des effets les plus néfastes induits par l'exposition aux métaux des plantes est la peroxydation lipidique, qui peut directement provoquer une détérioration de la biomembrane.

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En effet, le malondialdéhyde (MDA), un des produits de décomposition des acides gras polyinsaturés de la membrane est considéré comme un indicateur fiable du stress oxydatif (Demiral et Türkan, 2005). De plus, les ERO s’attaquent aux structures biologiques et aux biomolécules et entraînent une perte de l’intégrité de la membrane, un déséquilibre du redox cellulaire, une inactivation des enzymes, l'oxydation et la destruction des lipides, des protéines et de l'ADN dans les cellules stressées, causant ainsi des dysfonctionnements morphologiques, physiologiques et biochimiques au niveau des plantes (Sewelam et al., 2016).

IV. La dépollution des sols pollués par les métaux lourds 1. Les techniques physico-chimiques

De nombreuses techniques physico-chimiques ont été proposées pour éliminer les métaux du sol. Parmi ces techniques:  Le remplacement du sol: implique l'élimination partielle ou complète des sols contaminés par des métaux et remplacement subséquent avec un sol propre (RoyChowdhury et al., 2018). La méthode de remplacement des sols peut isoler efficacement le sol et l'écosystème contaminés, minimisant ainsi son effet sur l'environnement. Cependant, cette technique est coûteuse et est appropriée pour les sols fortement contaminés avec une petite superficie (Khalid et al., 2017). Aussi, cette méthode ne fait que déplacer le milieu contaminé à un endroit différent, transférant le contaminant d'une zone à risque plus élevé à une zone à risque moins élevé (RoyChowdhury et al., 2018).  La vitrification: consiste à chauffer le sol à haute température pour réduire la mobilité des métaux lourds (Mallampati et al., 2015; Navarro et al., 2013). Le refroidissement du sol fondu produit des matériaux vitreux, qui sont même plus résistants que le béton. Pour les processus de vitrification in situ, les électrodes sont insérées verticalement dans la zone contaminée pour chauffer le sol qui doit être un peu humide pour assurer la conductance nécessaire (RoyChowdhury et al., 2018). Par conséquent, les propriétés du sol jouent un rôle important dans le processus de vitrification. Cette technique peut être appliquée pour la réhabilitation à petite échelle des sites pollués par les métaux lourds, néanmoins, à grande échelle cette technique peut être très coûteuse (Khalid et al., 2017).  La remédiation électrocinétique: fonctionne sur le principe de l’application d’un gradient de champ électrique d'intensité appropriée dans un sol contaminé à travers deux électrodes. Les métaux lourds présents dans le sol sont séparés par électrophorèse ou électro migration, ce qui diminue la contamination (Yao et al., 2012). Après migration vers les

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électrodes, les contaminants peuvent être éliminés par différents procédés physico-chimiques (précipitation, complexation, pompage) (Zhang et al., 2010).  Techniques d’immobilisation: le processus d'immobilisation réduit la solubilité des métaux et donc leur mobilité dans le sol (Fin zgar et al., 2006). Plusieurs agents d'immobilisation organiques et inorganiques sont utilisés pour réduire la toxicité des métaux par précipitation, sorption et complexation (RoyChowdhury et al., 2018). Ces processus entraînent une redistribution des métaux lourds de la solution du sol aux particules solides, limitant ainsi leur transport et leur biodisponibilité dans le sol (Khalid et al., 2017). Les agents immobilisant couramment utilisés comprennent l'argile, les composts organiques, le ciment, les minéraux, les phosphates et les zéolites (Sun et al., 2016).  L’encapsulation: implique le mélange des sols contaminés avec d'autres produits, tels que le béton et la chaux. Le sol contaminé devient immobile et empêche ainsi la contamination du milieu environnant (Pandey et al., 2012). Un certain nombre de matériaux de liaison sont utilisés dans la formation de blocs solides, mais le ciment est préféré en raison de sa disponibilité, de sa polyvalence et de son rapport coût/ efficacité (Khalid et al., 2017). Bien que cette technique soit efficace, elle empêche également l'utilisation du sol traité pour tout type de culture.  Lavage de sol: se rapporte à l’extraction des métaux lourds du sol à l'aide de divers réactifs et agents d'extraction (Guo et al., 2016; Park et Son, 2016). Par la précipitation, l'échange d'ions, la chélation ou l'adsorption, les métaux lourds sont transférés du sol à la phase liquide, puis séparés du lixiviat (Ferraro et al., 2015). Les agents de lixiviation peuvent être des acides organiques, des surfactants, des solvants, des agents chélatants et des agents réducteurs (Liao et al., 2015; Shahid et al., 2014). Le choix de l’agent de lixiviation est basé sur la nature des contaminants et la nature du lien entre les contaminants et le sol (Liao et al., 2015). Parmi les agents de lavage disponibles, les agents chélatants organiques tel que l'EDTA (Éthylènediaminetétraacétique) représentent une solution bien consolidée, capable de retirer efficacement les métaux provenant de sols contaminés en raison de formation de complexes métalliques stables et solubles (Ferraro et al., 2015; Lestan et al., 2008; Lim et al., 2005; Nowack, 2002). La plupart des techniques physico-chimiques sont onéreuses et altèrent significativement la qualité agronomique des sols contrairement aux méthodes biologiques (Alkorta et Garbisu, 2001; Lear et al., 2007; Reed et al., 1996).

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2. La bioremédiation

La bioremédiation est une alternative efficace et prometteuse grâce à son approche écologique et rentable pour nettoyer ou stabiliser les contaminants de l'environnement (Ayangbenro et Babalola, 2017).

2.1. La bioremédiation par les microorganismes

Bien que l'accumulation des métaux lourds dans les sols, constitue une menace pour l'écosystème naturel, en réduisant la communauté microbienne du sol, sa diversité et sa fonctionnalité, la présence de ces polluants améliore la tolérance/ et ou la résistance microbienne à ces éléments en raison de leur adaptation rapide aux changements environnementaux (Haroun et al., 2007; Luo et al., 2011). En effet, les bactéries isolées des environnements pollués sont capables de tolérer une forte concentration de métaux que celles isolées des zones non polluées (Ma et al., 2009). Une telle adaptation peut être obtenue en développant divers mécanismes de résistance, qui peuvent contribuer au processus de bioremédiation efficace des sites contaminés par les métaux lourds (Chauhan et Solanki, 2015; Zhang et al., 2014). En effet, les bactéries peuvent acquérir une résistance métallique en stimulant le transfert de plasmides de résistance des métaux à large spectre aux bactéries dans la zone contaminée et / ou en favorisant la transformation et l'incorporation efficace des gènes clés pour l'adaptation (Martinez et al., 2006). Ces gènes de résistance comme PbrA et CadA codaient certaines enzymes du mécanisme de tolérance chez les bactéries et sont impliqués dans la détoxification des métaux lourds par l'efflux actif et la séquestration (Chiboub et al., 2016; Hynninen et al., 2009; Maynaud et al., 2014). En outre, sous contrainte métallique, les PGPR ont développé de nombreuses stratégies grâce auxquelles ils peuvent immobiliser, mobiliser ou transformer les métaux, réduisant ainsi leur toxicité pour tolérer l'absorption des ions métalliques (Ahemad, 2014). Ces mécanismes comprennent la biosorption, la biotransformation, la complexation, l’oxydation-réduction et les capacités de précipitation ou de bioaccumulation à l'intérieur et à l'extérieur de la cellule microbienne (Figure 9) (Ahemad, 2012). En effet, la liaison des métaux lourds à des matériaux extracellulaires peut immobiliser le métal, de ce fait, de nombreux métaux se lient aux groupes fonctionnels anioniques (par exemple les groupes sulfhydryle, carboxyle, hydroxyle, sulfonate, amine et amide) présents sur les surfaces cellulaires. De plus les macromolécules produites par voie microbienne avec des propriétés de liaison métallique comprennent les cyclodextrines, les exopolysaccharides et des molécules amphipathiques

Premier chapitre Revue de littérature appelé «biosurfactants». Grâce à des combinaisons de groupes carboxyle, phosphoryle et hydroxyle, ces molécules complexes les cations divalents, augmentent leur solubilité pour améliorer l'efficacité de nettoyage des sols (Tabak et al., 2005). En raison de ces capacités, les bactéries ont été utilisées pour l'élimination des métaux lourds des environnements contaminés (Ayangbenro et Babalola, 2017).

Interactions Métal- bactérie

(ex)

Biolixiviation Cellule Chimisorption des métaux (e.g. hydrogène phosphate d'uranyle) bactérienne Insoluble + Acide métal organique

Métal soluble-chélate

(Oxydé, soluble)

(Réduit, insoluble)

des agents chélateurs

Figure 9: Interactions métal-bactérie ayant un impact sur la bioremédiation (Tabak et al., 2005).

2.2. La phytoremédiation

Étant non dégradables, les métaux lourds doivent être éliminés des sols contaminés. De nos jours, ce problème a été résolu en utilisant une «technologie verte» impliquant des plantes tolérantes aux métaux, pour nettoyer les sols pollués (Ullah et al., 2015). Il s’agit d’une technologie d'assainissement rentable, efficace et respectueuse de l'environnement (Dary et al., 2010). La phytoremédiation est une approche utilisée pour enlever, détruire ou séquestrer les polluants des sols et de l'eau, elle est généralement considérée comme une option de gestion écologique pour les sols pollués (Rajkumar et al., 2010). À son tour, la phytoremédiation inclus plusieurs approches (Figure 10) qui sont la rhizodégradation, la phytovolatilisation, la phytoextraction, la phytostimulation et la phytostabilisation (Ullah et al., 2015).

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Méthodes chimiques Méthodes biologiques Méthodes physiques

Remédiation Remplacement Sources des métaux lourds électrocinétique Naturelle et anthropique du sol (Agriculture, industries, Phytovolatilisation exploitation minière)

Phytoextraction Lavage du sol

Approches de la la de Approches phytoremédiation Phytostabilisation Immobilisation (Amendements organiques) Zone contaminée Phytostabilisation Immobilisation Mobilisation Immobilisation Mobilisation Lavage du sol Chélate et microbiologie assistée Vitrification Lixiviation Isolation du sol Lixiviation

Rapide et efficace mais dépend du Économique, respectueuse de Laborieux et coûteux, mais peut être type du sol, de la chimie et du métal l'environnement, mais prend du temps et se appliqué aux sites hautement limite aux sites modérément contaminés contaminés

2.2.1. La phytoextraction

La phytoextraction désigne l'utilisation de plantes pour le prélèvement ou la réduction de la contamination métallique dans sites contaminés par des métaux. Ceci est assuré par, l’absorption, le transport des métaux lourds et leur accumulation dans la biomasse végétale aérienne, facile à récolter, puis les plantes sont récoltées et incinérées pour recycler les métaux (Zu et al., 2004). La phytoextraction est apparue comme une technique prometteuse pour l'assainissement du sol qui peut facilement absorber les métaux lourds et purifier le sol de ces contaminants (Yang et al., 2014). Par conséquent, la phytoextraction peut être une technique parfaite pour la purification du sol. Les plantes ont un mécanisme naturel pour absorber et stocker les nutriments en fonction de leur biodisponibilité dans le sol et des besoins de la plante. Parmi les plantes ayant un potentiel pour la phytoextraction, les hyperaccumulateurs ont tendance à absorber même les éléments non essentiels de 100 fois plus que les non-accumulateurs (Ghori et al., 2016). En

Premier chapitre Revue de littérature raison de leur plus grande biomasse, ils peuvent recueillir des métaux lourds en utilisant des canaux ioniques et des protéines de transport des métaux à travers les racines et les stocker dans les organes hors sol où ils sont stockés dans les vacuoles et les parois cellulaires ou sont détoxifiés (Dary et al., 2010; Ghori et al., 2016). Jusqu'à présent, la plupart des recherches effectuées se sont concentrées sur les espèces hyperaccumulatrices, qui comprennent plus de 400 plantes (Hao et al., 2014). D'après Baker et Brooks (1989), les hyperaccumulateurs sont définis comme des plantes qui accumulent plus de 100 mg kg-1 de Cd; de 1000 mg kg-1 de Cu, Co, Cr, Ni ou Pb, et plus de 10000 mg kg-1 de Mn ou Zn. Le facteur de bioconcentration (BCF) et le facteur de translocation (TF) (ratio de la concentration des métaux dans les racines par rapport au sol et dans la partie aérienne par rapport aux racines, respectivement) peuvent être utilisés pour estimer le potentiel d'une plante à des fins de phytoremédiation. Les valeurs BCF et TF> 1 pour les métaux indiquent un meilleur potentiel de phytoextraction d'une plante, alors que les plantes avec des valeurs BCF> 1 et des facteurs de translocation faibles (TF <1) ont un potentiel de phytostabilisation (Yoon et al., 2006). Une décontamination par la phytoextraction nécessite une répétition de cycles de culture avec récolte de la biomasse à la fin de chaque cycle. Ces cycles se succèdent jusqu'à ce que la concentration de métal dans le sol atteigne une valeur acceptable, ce qui conduit à l’accumulation de biomasse végétale potentiellement dangereuse (Brunet, 2008). Celle-ci doit être stockée de manière à ne présenter aucun risque de contamination pour l’environnement (Blaylock et Huang, 2000; Brunet, 2008). La biomasse peut être traitée par compaction, par combustion, par gazéification ou par pyrolyse (Kumar et al., 1995; Raskin et al., 1997; Bridgwater et al., 1999; Blaylock et Huang, 2000; Garbisu et Alkorta, 2001). Les processus de combustion et de gazéification impliquent d’importantes sources d’énergie thermique et électrique (Ghosh et Spingh, 2005).

2.2.2. La phytostabilisation

La phytostabilisation implique l'établissement d'un couvert végétal dans le but de réduire la mobilité et la biodisponibilité des métaux dans la rhizosphère des plantes, réduisant ainsi la contamination des sites (Bolan et al., 2011). Les racines aident à prévenir l'érosion et le lessivage du sol, immobilisent les lourd métaux par adsorption ou accumulation et fournir une rhizosphère dans laquelle les métaux se stabilisent (Radziemska et al., 2017). Par conséquent, la phytostabilisation a une grande signification pratique dans la restauration écologique et la remédiation de sols pollués par des métaux lourds.

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Lors de la sélection des plantes pour la phytostabilisation, certains points doivent être pris en considération. Premièrement, les plantes devraient être tolérantes à des niveaux élevés de métaux dans le sol et aux conditions édaphiques défavorables telles que la sécheresse, l’excès de salinité et la faible teneur en nutriments. Deuxièmement, les plantes devraient également être de mauvais transporteurs de métal aux tissus aériens qui pourraient être consommés par les humains ou les animaux. Troisièmement, les plantes doivent se développer rapidement pour établir une couverture végétale, avoir un enracinement dense et une grande biomasse (Chibuike et Obiora, 2014). En outre, les plantes choisies pour une utilisation en phytostabilisation devraient idéalement être des espèces indigènes qui peuvent établir, grandir et coloniser les sites contaminés par des métaux. Cette approche vise ainsi à limiter les risques de transfert de la pollution en dehors du sol contaminé.

2.2.3. la phytovolatilisation

Dans cette forme de phytoremédiation, les plantes sont utilisées pour absorber les polluants du sol; ces polluants sont transformés en produits volatiles et sont ensuite libérés dans l'atmosphère par le biais du processus de transpiration (Khalid et al., 2017). La phytovolatilisation est principalement utilisée pour l'assainissement des sols pollués par le mercure, cependant, elle peut également être utilisée pour l'assainissement des sols pollués par le sélénium (Marques et al., 2009).

2.2.4. La phytodégradation, rhizodégradation et phytostimulation

La rhizodégradation fait référence à la décomposition des polluants organiques (hydrocarbures, pesticides, etc...) dans le sol par les micro-organismes de la rhizosphère (Mukhopadhyay et Maiti, 2010). La phytodégradation est la dégradation des polluants organiques par les plantes à l'aide des enzymes telles que la déshalogénase et l'oxygénase (Vishnoi et Srivastava, 2008). Les plantes peuvent stimuler l'activité microbienne de 10 à 100 fois dans la rhizosphère par la sécrétion d'exsudats contenant des hydrates de carbone, des acides aminés, des flavonoïdes fournissant ainsi une source de carbone et d'azote pour les microbes du sol et créant un environnement riche en nutriments dans lequel l'activité microbienne est stimulée (Ali et al., 2013).

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2.3. Interaction plante-microorganismes

L'établissement optimal de la légumineuse en particulier dans les sols contaminés où l'azote et le phosphore sont gravement déficients; nécessite la présence de bactéries associées nécessaires à la fixation de l'azote atmosphérique et à la solubilisation des phosphates (Dary et al., 2010). Dans ce contexte, malgré le grand intérêt pour les plantes métallifères, l'attention des microbiologistes envers les bactéries devient de plus en plus importante (Hao et al., 2014). Récemment, on s'est intéressé à l'utilisation de plantes associées à des microorganismes comme outil de phytoremédiation des sols contaminés par des métaux lourds (Jebara et al., 2017; Mishra et al., 2017). À ces fins, de nombreuses études ont été menées pour évaluer l'impact de diverses bactéries rhizosphériques sur l'efficacité de phytoremédiation de leur plante hôte, ce qui semblait avantageux (Chiboub et al., 2018, Kamran et al., 2016, Karimi et al., 2017). En outre, Ndeddy Aka et Babalola (2016) et Saadani et al. (2016) ont confirmé l'effet bénéfique de Brassica juncea, de Vicia faba, de Lens culinaris et de Sulla coronaria lorsqu'ils sont associés à leurs bactéries spécifiques lors de l'assainissement des sites pollués par des métaux lourds. Le rôle important des bactéries du sol pour améliorer la capacité d'élimination des métaux des légumineuses associées a été largement étudié (Jebara et al., 2017). Ces bactéries connues sous le nom de rhizobactéries promotrices de la croissance des plantes (PGPR) ont une capacité exceptionnelle à favoriser la croissance de leur plante hôte par plusieurs mécanismes. En général, les PGPR favorisent directement la croissance des plantes en facilitant l'acquisition des ressources (azote, phosphore et minéraux essentiels) ou en modulant les niveaux d'hormones végétales, ou indirectement en diminuant les effets inhibiteurs de divers agents pathogènes sur la croissance et le développement des plantes (Figure 11) pour le développement d'une agriculture écologiquement durable (Ahemad et Kibret, 2014; Nadeem et al., 2014).

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Production de sidérophores Solubilisation Fixation de N2 des phosphates

Bio-fertilisation

Bio-contrôle

Induction de Antibiose Sécrétion la résistance d'enzymes systémique Amélioration de la lytiques croissance de la plante

Figure 11: Illustration schématique des mécanismes importants connus pour l’amélioration de la croissance des plantes avec les PGPR (Kumar et al., 2011).

2.3.1. Mécanismes directs 2.3.1.1. Fixation de l'azote

Conformément à la description faite sur l’importance de la fixation biologique de l’azote et de l’établissement de la symbiose entre les légumineuses et les bactéries du sol du genre Rhizobium (pages 8, 9, 10 et 11), les PGPR favorisent directement la croissance de leur plante hôte en fixant l'azote atmosphérique (Nadeem et al., 2014).

2.3.1.2. Solubilisation des phosphates

Le phosphore (P), deuxième élément nutritif important pour la croissance des plantes après l'azote, est abondamment disponible dans les sols sous une forme organique et inorganique (Figure 12) (Ahemad et Kibret, 2014). En effet, le phosphore joue un rôle clé dans la photosynthèse, la respiration, le développement des racines, le transfert d'énergie, la biosynthèse des macromoléculaire (Çakmakçı et al., 2017). Malgré les différentes sources de phosphore, les formes disponibles pour les plantes sont généralement faibles et cette faible disponibilité est due au fait que la majorité du P dans le sol se trouve sous des formes insolubles, alors que les plantes ne l'absorbent que sous deux - 2- formes solubles, le monobasique (H2PO4 ) et les ions dibasiques (HPO4 ) (Bhattacharyya et Jha, 2012). Pour surmonter la carence en P dans les sols, il existe des applications fréquentes d'engrais phosphatés dans les champs agricoles, néanmoins l'application régulière des engrais

Premier chapitre Revue de littérature phosphatés est non seulement coûteuse mais également dangereuse pour l'environnement. Cela a conduit à la recherche d'une option écologiquement sûre et économiquement raisonnable pour améliorer la production agricole dans les sols pauvres en phosphore (Ahemad et Kibret, 2014). Dans ce contexte, les organismes couplés à une activité de solubilisation du phosphate, souvent appelés microorganismes solubilisant les phosphates (PSM), peuvent fournir les formes de P disponibles aux plantes et donc un substitut viable aux engrais chimiques phosphatés (Khan et al., 2006) . Parmi les différents PSM qui colonisent la rhizosphère, les bactéries solubilisatrices des phosphates (PSB) sont considérées comme des biofertilisants prometteurs puisqu'elles peuvent fournir le P aux plantes à partir de sources inaccessibles par divers mécanismes (Figure 12) (Zaidi et al., 2009). Typiquement, la solubilisation du phosphate inorganique résulte de l'action des acides organiques de poids moléculaire bas, tel que l’acide citrique et l’acide gluconique, qui sont synthétisés par diverses bactéries du sol (Zaidi et al., 2009). Inversement, la minéralisation du phosphore organique se produit par la synthèse de différentes phosphatases, catalysant l'hydrolyse des esters phosphoriques (Glick, 2012). Fait important, la solubilisation et la minéralisation du phosphate peuvent coexister dans la même souche bactérienne (Tao et al., 2008). Bien que, les PSB sont généralement répondues dans la plupart des sols; leurs établissement et leurs performances sont gravement affectés par des facteurs environnementaux, en particulier dans des conditions de stress (Ahemad et Khan, 2012a; Ahemad et Khan, 2010a). Cependant, les effets bénéfiques de l'inoculation avec des PSB seules (Ahemad et Khan, 2012b, Ahemad et Khan, 2011, Ahemad et Khan, 2010b) ou en combinaison avec d'autres microbes rhizosphériques ont été signalés (Vikram et Hamzehzarghani, 2008; Zaidi et Khan, 2005). En plus de fournir le P assimilable aux plantes, les bactéries solubilisatrices de phosphate augmentent également la croissance des plantes en augmentant la disponibilité d'autres oligo-éléments (Zaidi et al., 2009).

Premier chapitre Revue de littérature

Les EPS produites par le PSB forment du phosphore libre à partir du Dissolution indirecte des composés Ca-P (composés P organiques) phosphate insoluble dans le milieu.

Assimilation de P Exo-polysaccharides

Acides inorganiques Phytases

+ Minéralisation du P organique Excrétion de H accompagnant la par des enzymes bactériennes diminution du pH

+ + + Phosphatases Acides H , (H +NH4 ), + (NH4 - N), (H2CO3, H2S

Acides organiques

Excrétion des acide organiques qui chélate des ions minéraux ou baisse le pH pour amener P en solution

2.3.1.3. Production de phytohormones

L’auxine (acide indole-3-acétique/ AIA) est une phytohormone sécrétée par les rhizobactéries qui interfère avec de nombreux processus de développement des plantes, et par conséquent, joue un rôle très important dans les interactions rhizobactéries-plantes (Spaepen et al., 2007; Spaepen et Vanderleyden, 2011). En effet, l'AIA affecte la division, l'extension et la différenciation des cellules végétales; stimule la germination des graines et des tubercules; augmente le taux de développement du xylème et des racines; contrôle les processus de croissance végétative; initie la formation des racines latérales et adventices; intervient dans les réponses à la lumière, à la gravité et à la fluorescence; affecte la photosynthèse, la formation de pigments, la biosynthèse de divers métabolites et la résistance à des conditions stressantes (Ahemad et Kibret, 2014). De plus, l'AIA bactérienne augmente la surface et la longueur des racines, et fournit ainsi à la plante un meilleur accès aux nutriments du sol (Ahmad et al., 2008). Une molécule importante qui modifie le niveau de synthèse de l'AIA est l'acide aminé tryptophane, identifié comme le précurseur principal de l'AIA et joue donc un rôle dans la modulation du niveau de biosynthèse de l'AIA (Zaidi et al., 2009).

Premier chapitre Revue de littérature

La plupart des espèces de Rhizobium produisent de l'AIA (Ahemad et Khan, 2012c; Chiboub et al., 2016; Fatnassi et al., 2013). Comme l'AIA est impliqué dans de multiples processus, y compris la division cellulaire, la différenciation et la formation de faisceaux vasculaires, ces trois processus sont également essentiels pour la formation de nodules. Par conséquent, il semble probable que les niveaux d'auxine au niveau des légumineuses hôtes sont nécessaires à la formation de nodules (Glick, 2012 ; Spaepen et al., 2007).

2.3.2. Mécanismes indirects 2.3.2.1. Production de sidérophores

Le fer est un nutriment vital pour tous les êtres vivants. Dans l'environnement aérobie, le fer se présente principalement sous forme de Fe3+ et est susceptible de former des hydroxydes et des oxyhydroxydes insolubles, le rendant ainsi généralement inaccessible aux plantes et aux micro-organismes (Rajkumar et al., 2010). Les sidérophores sont de petits chélateurs de haute affinité qui sont produits par de nombreux micro-organismes pour séquestrer le fer (Sharma et al., 2013). Chez les rhizobactéries à Gram négatif et à Gram positif, le fer (Fe3+) dans le complexe de Fe3+-sidérophore sur la membrane bactérienne est réduit en Fe2+ qui est ensuite libéré (Ahemad et Kibret, 2014). Ainsi, les sidérophores agissent comme agents de solubilisation de fer à partir de minéraux ou de composés organiques dans des conditions limitantes de fer , et accélèrent la mobilité de Fe3+ dans la rhizosphère en le rendant disponible aux plantes, entraînant ainsi une augmentation indirecte de la croissance des plantes (Indiragandhi et al., 2008; Ma et al., 2009). En plus de favoriser la croissance des plantes, la production de ces chélateurs du fer peut également exercer un rôle de biocontrôle, de biocapteur et de bioremédiation en formant des complexes stables avec les métaux lourds (Ahemad et Kibret, 2014; Ahmed et Holmström, 2014).

2.3.2.2. Production de métabolites antifongiques

L'application de micro-organismes pour lutter contre les maladies, qui est une forme de contrôle biologique, est une approche respectueuse de l'environnement (Lugtenberg et Kamilova, 2009). Le principal mécanisme indirect de promotion de la croissance des plantes par les rhizobactéries consiste à agir comme agents de lutte biologique (Glick, 2012). En général, la compétition pour les nutriments, la résistance systémique induite et la production de métabolites antifongiques sont les principaux modes d'activité de lutte biologique chez les

Premier chapitre Revue de littérature

PGPR (Lugtenberg et Kamilova, 2009). De nombreuses rhizobactéries sont capables de produire des métabolites antifongiques comme le cyanure d’hydrogène (HCN), les phénazines, la pyrrolnitrine, le 2,4-diacétylphloroglucinol, la pyolutéorine, le viscosinamide et la tensine (Bhattacharyya et Jha, 2012). L'interaction de certaines rhizobactéries avec les racines des plantes peut entraîner une résistance des plantes contre certaines bactéries, champignons et virus pathogènes. Ce phénomène est appelé résistance systémique induite (ISR) (Lugtenberg et Kamilova, 2009). De plus, les ISR impliquent des signaux de jasmonate et d'éthylène dans la plante et ces hormones stimulent les réponses de défense de la plante hôte contre une variété de pathogènes végétaux (Glick, 2012). Ces bactéries sont aussi capables d'extraire ou de stabiliser les métaux simultanément (Mishra et al., 2017). De plus, l'utilisation des inocula de bactéries efficientes et résistantes aux métaux lourds pourrait améliorer la nodulation, la production de biomasse et la tolérance des plantes hôtes aux métaux lourds dans les sols les plus pollués (Ghnaya et al., 2016). Ainsi, l'amélioration des interactions entre les plantes et les microorganismes bénéfiques de la rhizosphère est considérée comme une composante importante des technologies de phytoremédiation (Hao et al., 2014). L'inoculation avec des PGPR réduit aussi l'effet nocif des métaux toxiques et augmente leur absorption et leur accumulation dans les organes des plantes pour améliorer l'efficacité de phytoremédiation de leur hôte (Kamran et al., 2016; Ma et al., 2011). En effet, les interactions cohésives entre les plantes et les PGPR résistantes aux métaux lourds jouent un rôle essentiel dans l'amélioration des mécanismes de tolérance des plantes et l'adaptation aux sols pollués, et peuvent être explorées pour améliorer les stratégies de phytoremédiation (Jebara et al., 2017; Mishra et al., 2017). Cependant, il est essentiel de considérer la combinaison appropriée de plantes et de bactéries afin d'assurer une efficacité élevée et une meilleure performance des technologies à base de bactéries existantes (Ma et al., 2016). De plus, des recherches récentes ont montré que la relation symbiotique entre les légumineuses et les PGPR peut être appliquée pour améliorer la remédiation, la qualité et la fertilité des sols contaminés par les métaux, ainsi que la tolérance des plantes (Checcucci et al., 2017; Jebara et al., 2017; Saadani et al., 2016). Par conséquent, il est nécessaire de développer des souches efficaces combinant des activités PGPR, la résistance et une bonne adaptation aux sites pollués.

Premier chapitre Revue de littérature

Surface cellulaire

Cellule bactérienne Vacuole M2+ Métal actif Séquestration du métal Transporteurs d'efflux

Transporteur d'efflux Réactions redox Lixiviation

Substances Résistance métallique / détoxification Enzymes microbiennes polymériques Ligands extracellulaires Phytochélatines inorganiques Acides organiques Siderophores Biosurfactants

Transformation du métal Alcalinisation pH réduit

Immobilisation du métal Mobilisation du métal Volatilisation du métal

Réduit la translocation du métal Augmente le transport du métal Augmente la transpiration

Phytostabilisation Phytovolatilisation Associations plante-bactérie Technologie «verte» in situ pour la restauration écologique des sols pollués par les métaux

Figure 13: Mécanismes des interactions plantes-bactéries-métaux lourds en phytoremédiation. M2+, ion métallique divalent (Ma et al., 2016).

3. Les mécanismes de tolérance, d’absorption et d’accumulation des métaux adoptés par les plantes

Pour tolérer la toxicité des métaux lourds, les plantes ont mis au point de nombreuses techniques pour atténuer ses effets délétères.

3.1. Réponse antioxydante des plantes

La protection cellulaire contre le stress causé par les métaux lourds comprend à la fois des mécanismes de défense, de réparation et de protection pour minimiser l'apparition de dommages oxydatifs et l'élimination des ERO afin de rétablir les conditions d’homéostasies (Jebara et al., 2017). Ces mécanismes sont formés par des systèmes antioxydants enzymatiques comprenant la superoxyde dismutase (SOD), la glutathion réductase (GR), la peroxydase (POX), la catalase (CAT), et l'ascorbate peroxydase (APX) (Figure 14). Les POX nécessitent la présence de substrat particulier pour réaliser leurs activités: l’acide ascorbique (Asc) et le glutathion (GSH) (Noctor et Foyer, 1998 ; Foyer et Noctor, 2000). La première étape est catalysée par l’ascorbate peroxydase (APX) et consiste en une réduction du peroxyde d’hydrogène en H2O2, couplée à une oxydation de l’ascorbate en

Premier chapitre Revue de littérature monodéhydroascorbate (MDHA). Pour permettre la poursuite de cette réaction, l’ascorbate oxydé doit être à nouveau réduit pour générer l’ascorbate par la réduction directe du MDHA par la MDHAR (monodéhydroascorbate réductase) via l’oxydation d’une molécule de NAD(P)H ou bien par la réduction du DHA par la déhydroascorbate réductase (DHAR), couplée à une oxydation du GSH (Remon, 2006). Enfin, le glutathion oxydé GSSG, produit au cours de cette dernière réaction, est régénéré en GSH grâce à la glutathion réductase (GR). Les mécanismes antioxydants non enzymatiques impliqués dans la défense et la protection cellulaire comprennent essentiellement le glutathion (GSH), la proline, l'ascorbate (AsA) et les caroténoïdes (Etesami, 2018). De plus, dans plusieurs études, l’activité des enzymes antioxydants et la teneur en antioxydants contribuent à une plus grande tolérance et à l'accumulation de métaux dans les plantes soumises au stress métallique (Seth, 2012, Wu et al., 2015). Un autre mécanisme défensif commun activé chez les plantes exposées à des conditions stressantes est la production, l'accumulation et l'ajustement des osmolytes (Fraire- Velázquez et Balderas-Hernández, 2013).

Transport d'électrons liés à la membrane

Mécanisme de Haber-Weiss

Réaction de Fenton

Figure 14: Effet du plomb sur la production des espèces réactives de l’oxygène et sur l’activité des enzymes antioxydants (Sharma et Dubey, 2005).

Aussi, l'un des mécanismes de détoxification des métaux est la synthèse et / ou l'exsudation d'agents chélatant les métaux (Sima et al., 2012). Les agents chélatants, excrétés par les apex des racines dans la rhizosphère, chélatent avec le métal et détoxifient les métaux à l'intérieur (Sima et al., 2012). Les acides organiques et les composés phénoliques sont inclus parmi ces ligands (Michalak, 2006). L'induction de la biosynthèse du composé phénolique a été

Premier chapitre Revue de littérature observée chez le blé en réaction à la toxicité du nickel, chez le maïs en réponse à l'aluminium, et chez Phaseolus vulgaris exposé à Cd2+ (Diaz et al., 2001; Michalak, 2006). L'action antioxydante des composés phénoliques est due à leur forte tendance à chélater les métaux (Sima et al., 2012). Les composés phénoliques possèdent des groupes hydroxyle et carboxyle, capables de se lier aux métaux lourds particulièrement au fer et au cuivre (Kovacik, 2010 ; Michalak, 2006). En effet, ils peuvent inactiver les ions de fer par chélation et en plus suppression de la réaction de Fenton, qui est considérée comme la source la plus importante des ERO (Arora, 1998; Rice- Evans, 1997). De même, les mécanismes biochimiques tels que l'adsorption, le transport, l'accumulation et la translocation des métaux lourds sont adoptés par les plantes, qui sont d'une importance capitale dans l'amélioration et le succès de phytoremédiation (Revathi et Venugopal, 2013).

3.2. Les mécanismes d’absorption, de transport, et d’accumulation des métaux

La mobilité des éléments minéraux est un facteur limitant si bien que les bactéries et les plantes exsudent des chélateurs externes afin de mobiliser ces éléments et les rendre disponibles. Dans le cas où l’ion métallique entre, libre, dans la plante, il est pris en charge par des molécules qui s’apparentent à des chélateurs internes. En effet, la complexation des ions métalliques par des ligands de haute affinité spécifiques réduit la concentration des ions métalliques libres dans les cellules, réduisant ainsi leur phytotoxicité.

3.2.1. Les chélateurs externes

Certains chélateurs sont naturellement synthétisés par la plante en réponse aux déficiences en nutriments tel que les phytosidérophores, les acides organiques, les acides phénoliques, l’acide caféique (Hopkins, 2003).

3.2.2. Les chélateurs internes a. Les méthallothionéines

Les métallothionéines (MTs) sont des protéines de faible poids moléculaire riches en cystéines et sont regroupées en trois groupes basés sur l’arrangement des cystéines (Freisinger, 2011). Plusieurs espèces végétales incluant Arabidopsis contiennent des gènes qui codent pour les quatre types de MTs (Benatti et al., 2014). De plus, des études récentes, qui ont analysé les effets de la surexpression des MTs chez Arabidopsis thaliana et le tabac ont montré que les plantes transformées ont présenté une tolérance accrue à la contrainte due au

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Cd, qui s'est accompagnée d'une plus faible accumulation de H2O2 chez A. thaliana et d'une plus forte activité de piégeage des radicaux libres chez le tabac (Gu et al., 2014, Zhou et al., 2014). De même, l'introduction d'un gène de la métallothionéine dans le tabac a amélioré la tolérance de la plante au Cd, au Zn et au Ni (Dorlhac de Borne et al., 1998; Pavlikova et al., 2004). En effet, chez les plantes, les MTs répondent à différents types de stress tels que les ions métalliques, les chocs thermiques, les infections virales, la forte salinité, la sécheresse et les radiations UV (Gallego et al., 2012). Ainsi, certains auteurs ont suggéré que ces protéines seraient plutôt impliquées dans le contrôle général de l’homéostasie cellulaire.

b. Les phytochélatines

Les phytochélatines (PCs) sont des peptides de faible poids moléculaire qui présentent une forte affinité pour les métaux lourds, leur structure générale est (γ-Glu-Cys) n-Gly (n= 2-11). La phytochélatine séquestre les métaux solubles dans le cytoplasme avant de les transporter dans les vacuoles et les chloroplastes, réduisant ainsi l'effet délétère des ions métalliques sur les cellules (Estrella-Gomez et al., 2009; Anjum et al., 2014). Les phytochélatines sont synthétisées par une enzyme la phytochélatine synthase, à partir d’un tripeptide précurseur, le glutathion (Glu-Cys-Gly). Néanmoins, Zhu et al. (1999) ont montré, à partir de clones transformés de Brassica junceae, que la surexpression des gènes intervenant dans la synthèse du glutathion conduit à une augmentation de la tolérance au cadmium via une augmentation du pool de phytochélatines. La production des PCs est immédiatement induite par l’exposition aux métaux lourds et positivement corrélée avec l’accumulation des métaux dans les tissus (Pal et Rai, 2010). En effet, Estrella-Gomez et al. (2009) ont montré que l'accumulation des PCs par Salvinia minima est une réponse directe à l'accumulation de Pb2+. Les phytochélatines, en tant que voie d'homéostasie et de désintoxication des métaux, ont été identifiées dans une grande variété d'organismes vivants (Emamverdian et al., 2015). Il a été suggéré que le transport au vacuole est médiatisé par des protéines transporteurs de types ATPases telles que Nramp et Zip (Clemens, 2001; Singh et al., 2010).

c. Le glutathion

Le glutathion (GSH ; γ-glutamyl-cysteinyl-glycine) est un tri-peptide synthétisé, dans le cytosol et les chloroplastes, à partir de molécules de cystéine et de glutamate par deux

Premier chapitre Revue de littérature enzymes: l’γ-glutamylcystéine synthétase (γ-ECS) et la glutathion synthétase (GSHS) (Brunet, 2008). Le GSH peut former des complexes avec les ions métalliques comme le Pb ou le Cd (Reddy, 2005). Cette réaction de conjugaison se fait grâce à une enzyme la glutathion- S-transférase (GST) (Chasseaud, 1979; Peuke et Rennenberg, 2005). En raison de son pouvoir réducteur, le GSH joue un rôle important dans divers processus biologiques, notamment la croissance/ division cellulaire, la régulation enzymatique, la synthèse des protéines, le piégeage des ERO, la synthèse les phytochélatines pour la chélation des métaux, la détoxication (Sharma et al., 2012).

d. Les acides organiques

Les acides organiques représentent un autre groupe de chélateurs naturels, tels que des acides dicarboxyliques (acides fumarique, malique, oxalique) ou des acides tricarboxyliques (comme l’acide citrique). Une stimulation de leur synthèse en présence de métaux lourds a été enregistrée, ce qui laisse penser qu’elles assurent le transport xylémien des ions métalliques depuis les racines vers les parties aériennes de la plante (Remon, 2006). De plus, d’autres études ont montré que, dans certains cas, des acides organiques pourraient être directement impliqués dans les mécanismes de tolérance.

e. Les acides aminés

Les acides aminés libres, comme la proline, l’histidine et la cystéine, s’accumulent lors d’un stress métallique et pourraient être eux aussi impliqués dans la chélation de divers métaux lourds (Emamverdian et al., 2015).

3.2.3. Les transporteurs transmembranaires

Nombreux transporteurs peuvent intervenir dans le déplacement des éléments métalliques au sein des cellules végétales (Figure 15). Certains permettent aux ions métalliques de traverser la membrane plasmique, tels que les CNGC «cyclic nucleotide-gated non selective cation channels», ZIP «ZRT, IRT-like Protein», et les pompes ATPases de type P. Une fois entrés dans la cellule, ces éléments peuvent être chélatés ou non à des molécules comme le GSH ou les PCs et sont pris en charge dans le symplasme ou stockés dans des vacuoles grâce à d’autres transporteurs, tels que des CDF «Cation Diffusion Facilitator» et des transporteurs ABC «ATP-binding cassette». Certains éléments métalliques pourront ressortir des vacuoles grâce aux transporteurs NRAMP (Natural Resistance Associated Macrophage Protein) et ainsi

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être remis en circulation dans le symplasme ou bien être exportés à l’extérieur de la cellule via certains transporteurs ABC et CDF (Brunet, 2008).

Figure 15: Schéma récapitulatif des transporteurs de métaux lourds dans une cellule végétale (Brunet, 2008).

Deuxième chapitre

Etude des potentialités de Lathyrus sativus à accumuler les métaux lourds et isolement, identification et caractérisation des bactéries tolérantes à la contamination métallique

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

Introduction

Afin d’exploiter les potentialités de Lathyrus sativus vis-à-vis des métaux lourds et d’identifier des bactéries tolérantes à la contamination métallique du sol, avec des multiples activités promotrices de la croissance des plantes, on a visé de: (i) étudier la capacité de deux populations de gesse à croître dans des sols contaminés et de déterminer leur potentiel d'accumulation de quatre métaux lourds: le plomb, le zinc, le cuivre et le cadmium; (ii) isoler et identifier les bactéries associées aux nodules racinaires de Lathyrus sativus; (iii) étudier la tolérance des bactéries isolées vis-à-vis des métaux lourds et leurs effets sur la croissance des plantes et la nodulation, (iv) évaluer le potentiel des bactéries efficientes et résistantes au Pb sélectionnées, pour leurs multiples activités promotrices de la croissance des plantes et leur capacité pour la bioaccumulation du plomb; (v) étudier l'effet de 22 inocula formé chacun de quatre PGPR sur la croissance de Lathyrus sativus dans des conditions contrôlées afin de sélectionner les combinaisons bactériennes qui favorisent une meilleure croissance de la plante pour un éventuel programme de phytoremédiation.

1. Matériel et méthodes

1.1. Matériel végétal

La gesse a été choisie dans ce travail en raison de sa résistance à de nombreuses contraintes abiotiques et abiotiques. Les graines de Lathyrus sativus utilisées dans cette étude ont été obtenues après une prospection dans la région de Mahdia (35 ° 30'0 "N, 11 ° 3'36" E, altitude 13 m) et dans la région de Kerkena (34 ° 39'29 "N 11 ° 04'07" E, altitude 0 m). Il s’agit de deux populations cultivées.

1.2. Etude du potentiel de la gesse commune à accumuler les métaux lourds

1.2.1. Échantillonnage et caractérisation physicochimique des sols prospectés

Des échantillons de sol ont été collectés (jusqu’à 15 cm de profondeur) à partir de quatre zones prospectées au nord de la Tunisie: (S0) Borj Cedria (36°42'40.86''N 10°25'45.7392''E, altitude 2 m) sélectionnée comme zone de contrôle sans contamination, (S1) Menzel Bourguiba (37°8'7.083''N 9°48'31.0788''E, altitude 12 m) située près d'une mine de fer, (S2) Jebel Ressas (36°36'46.2054''N 10°19'24.9528''E, altitude 86 m) située à proximité d'une ancienne mine de plomb et de zinc et actuellement utilisée comme zone agricole et (S3) Ghezala (37°4'34.9068''N 9°32'17.955''E, altitude 56 m) située à proximité d'une mine Pb/Zn.

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1.2.1.1. Dosage des métaux lourds totaux

Les échantillons de sol collectés ont été séchés à 40 °C pendant 16 h. La concentration des métaux totaux a été déterminée par minéralisation à chaud (à 100 °C) de 0,5 g de sol par un mélange d’acides concentrés HCl/HNO3 (3/1: v/v). Après évaporation totale du solvant,

HNO3 (0,6%) a été ajouté et le mélange a été filtré avec du papier Whatman (Peña-Icart et al., 2011). La concentration totale de chaque métal (Cd, Cu, Pb et Zn) a été déterminée par spectrophotométrie d’absorption atomique (AAS).

1.2.1.2. Dosage de l’azote total

La teneur en azote des sols a été mesurée par la méthode de Kjeldahl (1883). L'échantillon de sol (2 g) a été digéré avec de l'acide sulfurique (96%) et un mélange de catalyseur + + (CuSO4 /K2SO4 Se) à des températures comprises entre 100 et 350 ºC jusqu'à digestion complète. La solution obtenue a été distillée après addition de NaOH et l'ammoniac formé a

été piégé dans une solution de H3BO3. La quantité d'ammoniac présente dans chaque échantillon a été déterminée par titrage avec de l'acide sulfurique (N/100).

1.2.1.3. Dosage du phosphore assimilable

Le phosphore assimilable (P2O5) a été mesuré en utilisant la méthode d’Olsen (Olsen et al., 1954) avec les modifications suggérées par Dabin (1967), en ajoutant du bicarbonate de sodium et du fluorure d'ammonium (pH = 8,5). La teneur en phosphore a été déterminée par spectrophotométrie à 660 nm (Watanabe et Olsen, 1965).

1.2.1.4. Mesure du pH et de la matière organique

Le pH a été mesuré à l’aide d’un pH mètre et le pourcentage de la matière organique a été mesuré par analyse thermogravimétrique après calcination (Kalra et Maynard, 1991).

1.2.1.5. Dosage du potassium

La teneur en potassium (échangeable) des sols a été déterminée après extraction avec l'acétate d'ammonium comme décrit par Mountier et al. (1966).

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1.2.1.6. Détermination de la texture des sols

L’analyse granulométrique des sols a été déterminée par la méthode à la pipette de Robinson, après destruction de la matière organique et dispersion des particules à l'examétaphosphate de sodium (Aubert, 1978).

1.2.2. Culture des plantes et accumulation des métaux lourds

1.2.2.1. La culture des plantes

Les graines des deux populations cultivées de Lathyrus sativus (provenance de Mahdia et de Kerkena) ont été désinfectées et stérilisées avec de l'éthanol (70%) pendant 1 min, rincées plusieurs fois avec de l'eau stérilisée et laissées à l'obscurité à 4 °C durant une nuit, puis germées sur de l’agar 9 ‰ (Annexe 1) à 28 °C pendant 3 jours. Après la germination, les plantules ont été transférées dans des pots en plastique contenant 1 kg de sol (S0, S1, S2 et S3). L'expérience a été réalisée dans une chambre de culture en conditions contrôlées à la station expérimentale du Centre de Biotechnologie de Borj Cedria (35 km au sud-est de Tunis), à des températures comprises entre 25 °C et 19 °C (jour /nuit), une humidité relative de 60% et une photopériode de 16 h de lumière/8 h d'obscurité. Les plantes ont été irriguées avec de l’eau distillée. L’expérience a été conduite selon un dispositif complètement randomisé. La récolte des plantes a été réalisée en deux étapes: au stade floraison (60 jours après la germination), toutes les parties de la plante ont été récoltées, alors qu'au stade formation de gousses (120 jours après la germination) seules les graines ont été récoltées. Les racines et les nodules ont été lavés plusieurs fois avec de l'eau distillée. Les parties aériennes, les racines et les nodules ont été séparés et le nombre de nodules a été enregistré. Tous les organes de la plante (même les graines du stade formation de gousses) ont été séchés à 70 °C pendant 72 h, puis le poids sec de la partie aérienne et des racines a été déterminé avant leur broyage et stockage dans de petits flacons.

1.2.2.2. Dosage des métaux lourds

Afin de déterminer la concentration des métaux (Pb, Cu, Zn et Cd) qui ont été absorbés par les plantes et accumulés dans leurs différentes parties, les échantillons (0,1 g de chaque matière végétale séchée) ont été minéralisés à chaud (100 °C) à l’aide d’un mélange d'acides concentrés (HNO3/HClO4 = 4/1 (v/v)). Après évaporation totale du solvant, HNO3 (0,6%) a

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

été ajouté et le mélange a été filtré avec du papier Whatman (Zaier et al., 2010). La concentration de chaque métal (Cd, Cu, Pb et Zn) a été déterminée par spectrophotométrie d’absorption atomique (AAS).

1.3. Isolement et caractérisation des bactéries

Un total de 46 bactéries ont été isolées des nodules racinaires des deux populations de Lathyrus sativus cultivées sur des sols Tunisiens différemment contaminés par les métaux lourds (S0, S1, S2 et S3), et récoltées au stade floraison. Les nodules collectés ont été lavés avec de l'eau stérilisée; leurs surfaces ont été désinfectées avec de l'éthanol 70% et du HgCl2 0,2%, après plusieurs lavages avec de l’eau distillée stérilisée, ils ont été utilisés pour l’isolement des bactéries (Somasegaran et Hoben, 1985). Après, les nodules ont été écrasés et la suspension résultante a été striée sur le milieu YEMA (Vincent, 1970) (Annexe 2). Les boites ont été incubées dans l’étuve à 28 °C, température optimale pour la croissance des bactéries, pendant 48 h. Les colonies individualisées ont été purifiées par des repiquages répétés (chaque 48 h d’intervalle) sur le milieu YEMA à 28 °C. Après purification, les isolats ont été conservés dans du glycerol 20% à - 80 °C.

1.3.1. Test de dépistage des bactéries tolérantes aux métaux lourds

Pour la détermination de la concentration maximale de tolérance (MTC) aux métaux lourds, 46 bactéries (20 µl de chaque suspension bactérienne 109 CFU) ont été ensemencées sur le milieu YEMA additionné de concentrations croissantes des métaux: PbCl2, 0, 1, 1,5, 2, 2,5,

2,6 mM; CdCl2 H2O, 0, 0,05, 0,1, 0,5, 0,8, 1 mM; ZnSO4 7H2O, 0, 0,2, 0,25, 0,5, 1 mM;

CuSO4 5H2O, 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3 mM. Des témoins positifs et négatifs ont été utilisés. Un témoin positif consiste en un milieu sans métal et inoculé avec des souches bactériennes; tandis qu'un témoin négatif consiste en un milieu additionné de métal mais sans aucune inoculation bactérienne. Les cultures ont été incubées à 28 °C pendant 3 à 5 jours. La concentration au-dessus de laquelle la croissance bactérienne a échoué a été considérée comme seuil de tolérance aux métaux.

1.3.2. Identification moléculaire par séquençage de l’ADNr 16S

1.3.2.1. Lyse cellulaire par la protéinase K

L'ADN a été extrait de chaque isolat en utilisant la méthode décrite par Terefework et al. (1998). A partir d’une boîte de pétri, contenant des colonies pures, chaque colonie est

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries repiquée sur milieu TY gélosé incliné (Annexe 3) et incubé à 28 °C pendant 48 heures. Les bactéries sont ensuite mises en suspension par ajout de 8 ml d’eau milliQ stérile. Une centrifugation de 7 min est effectuée et le culot est resuspendu dans 50 µl d’eau milliQ et soumis à une deuxième centrifugation de 3 min. Au culot est ajouté 100 µl de tampon tris HCl 10 mM pH 8,3; 100 µl d’eau distillée stérilisée et 17 µl de PK: (Protéinase K1 mg ml-1). Le mélange est ensuite incubé durant une nuit à 55 °C. La réaction est arrêtée par ébullition pendant 10 min puis le produit obtenu est stocké à -20 °C.

1.3.2.2. Amplification de l’ADNr 16S

La caractérisation moléculaire des souches est basée sur l’amplification d’un gène chromosomique: ADNr 16S par une paire d’amorces spécifiques fD1 (5'- GGAGAGTTAGATCTTGGCTC-3 ') et rDl (5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'). Les réactions PCR ont été réalisées dans un volume final de 25 μl contenant: 2,5 μl de tampon de réaction 10X, 1 μM des amorces utilisées, MgCl2 1,5 mM, dNTP 200 μM, 1,5 U de polymérase Taq (Appligène 5U μl-1) et 1,5 μl (10 ng) de l’ADN bactérien. L’amplification est réalisée dans un thermocycleur (Biometra TRIO-Thermoblock) selon le programme approprié. Les produits PCR (amplifiât) ont été révélés par électrophorèse horizontale sur un gel d’agarose 1% (Sigma medium EEO type II) à 100 V pendant 30 min dans un tampon TAE 10× (Tris Acétate EDTA) (Annexe 4). Le gel est coloré au bromure d’éthidium (BET) (150 10-5 g/l d’eau distillée) et visualisé sous UV (312 nm) au Biodoc (Biodoc 2 NT / Biometra). Le Felix 500 pb Ladder est utilisé comme marqueur de poids moléculaire.

1.3.2.3. Séquençage

Le séquençage permet de déterminer l’ordre de succession des nucléotides des fragments d’ADN obtenus par PCR. La technique utilisée dans ce travail est celle de Sanger. En se basant sur les résultats de la tolérance des isolats aux métaux lourds et de la caractérisation moléculaire préliminaire par PCR / RFLP, 22 bactéries ont donc été identifiées par séquençage. Le gène de l'ADNr 16S des souches sélectionnées a été amplifié avec les mêmes amorces et séquencé. L'homologie de la séquence d'ADNr 16S d'un isolat donné a été réalisée en utilisant le programme BLAST de la base de données GenBank (http: www.ncbi.nlm.gov/BLAST/).

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

1.3.3. Effet des souches bactériennes sur la croissance et la nodulation des plantes

Ce test a été réalisé dans des pots en plastique contenant du sol (provenant de Borj Cedria (S0)) qui a été stérilisé à l'autoclave. Les vingt-deux souches bactériennes qui ont été identifiées par séquençage ont été utilisées pour l'inoculation des deux populations de gesse (de provenance de Mahdia et de Kerkena). Chaque souche (109 CFU ml-1) a été appliquée séparément sur les racines des plantes 7 jours et 15 jours après la germination. En effet, chaque souche a été cultivée dans un erlenmeyer contenant un milieu YEM (Vincent, 1970) (Annexe 5) et a été mise sous agitation continue à 150 rpm pendant 48 h à 28 °C pour obtenir une concentration finale de 109 CFU ml-1. Des plantes non inoculées ont été utilisées comme témoin (T). Les plantes ont été cultivées sous les mêmes conditions contrôlées précédemment décrites. Les plantes ont été irriguées avec la solution nutritive de Vadez et al. (1996) dépourvue d’azote (Annexe 6). L’expérience a été conduite selon un dispositif complètement randomisé. Les paramètres de croissance: le poids sec de la partie aérienne et des racines ainsi que le nombre de nodules ont été déterminés au stade floraison (60 jours après la germination).

1.3.4. Identification de gènes impliqués dans la résistance aux métaux lourds

L’ADN de chaque isolat, déjà récupéré par la méthode de la lyse cellulaire (décrite ci- dessus), a été amplifié en utilisant des amorces spécifiques:  Pour l'amplification du gène de résistance au plomb (pbrA), les amorces utilisées sont pbrA1 (5'-ATGAGCGAATGTGGCTCGAAG-3') et pbrA2 (5'-TCATCGACGC AACAGCCTCAA-3') (Borremans et al., 2001).  Pour l'amplification du gène de résistance au cadmium (CadA) une paire d'amorces a été utilisée: P1: CadA1 (5'-GAAAGAAGATAAAGTGCCGTTTT-3'), CadA1 (5'- ATGCACAAGGACAACCAACA-3'), P2: CadA3 (5'- TGAAAAATCTGCTCGCCAAG-3'), CadA3 (5'-ATGCACAAGGACAACCAACA- 3') (Chiboub et al., 2016). Le programme de la PCR utilisé pour l’amplification du gène de résistance au plomb est le suivant: dénaturation à 95 °C pendant 3 min, puis 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 1 min, hybridation à 60 °C pendant 1 min, extension à 72 °C pendant 2 min et une extension finale à 72 °C pendant 10 min. Les conditions d'amplification par PCR ont été décrites par Wei et al. (2009). Le programme de la PCR utilisé pour l’amplification du gène de résistance

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries au Cd est le suivant: dénaturation à 95 °C pendant 3 min, puis 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 1 min, hybridation pendant 1 min à 50 °C (P2) et 52 °C (P1), extension à 72 °C pendant 2 min et une extension finale à 72 °C pendant 10 min (Chiboub et al., 2016). Par la suite, les amplifiats obtenus par PCR ont été destinés au séquençage. Par la suite 12 bactéries sélectionnées sur la base de leur efficience et leur résistance au plomb ont été utilisées dans le reste du travail pour des essais ultérieurs.

1.3.5. Bioaccumulation du plomb par les bactéries

Nous nous sommes intéressés à l'étude de la capacité d'accumulation du Pb par les souches bactériennes sélectionnées. Pour cela, des cellules bactériennes (0,1 g de poids sec) ont été inoculées dans 100 ml de milieu TY liquide contenant différentes concentrations du plomb (à une concentration égale aux valeurs MTC de chaque bactérie: 1,5; 2; 2,5 mM Pb) puis incubées à 28 °C avec une agitation continue à 150 rpm. Les cellules bactériennes ont été récoltées 24 et 48 h après l'inoculation par une centrifugation à 6000 g pendant 25 min. Après trois lavages avec de l’eau ultra pure stérilisée, les culots de cellules obtenus ont été mélangés avec de l'EDTA stérilisée à 10 mM puis incubés à 28 °C et 150 rpm pendant 10 min dans le but d’enlever les ions Pb adsorbés à la surface cellulaire. Après une centrifugation de 25 min à 14000 g, les cellules bactériennes ont

été mélangées avec 5 ml de HNO3 0,1 M et la solution a été centrifugée 30 min à 14000 g et le surnageant a été destiné pour la détermination du Pb2+ extracellulaire (lié à la paroi cellulaire) (Carrasco et al., 2005). Par la suite, la masse du culot cellulaire a été notée et ce dernier a subit une digestion à chaud durant 3 h à 110 °C avec un mélange d’acide sulfurique et d’acide perchlorique H2SO4/HClO4 (3:1 V/V) pour être enfin dilué avec ddH2O et destiné pour la détermination du Pb2+ intracellulaire accumulé (Fan et al., 2011). Les concentrations du plomb ont été déterminées par spectrophotométrie d’absorption atomique.

1.3.6. Production de l’acide indole 3-acétique (AIA)

L'analyse quantitative de l’AIA a été effectuée selon la méthode décrite par Sheng et al. -1 (2008). Pour cela, 10 ml d’un milieu SMS (g : saccharose, 10, (NH4)2SO4, 1, K2HPO4, 2,

MgSO4 7H2O, 0,5, extrait de levure, 0,5, CaCO3, 0,5, NaCl, 0,1; pH 7,2) additionné de 0,5 mg ml-1 de tryptophane a été inoculé avec 200 µl de chaque suspension bactérienne, préparée sur un milieu YEM liquide. Le mélange est incubé à l’obscurité sous agitation continue à 150 rpm et à 28 °C pendant 5 jours. Les cellules bactériennes ont été éliminées par centrifugation à 8000 g pendant 5 min. Un millilitre de chaque surnageant a été mélangé avec 100 µl d'acide

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries orthophosphorique (10 mM) et 2 ml du réactif de Salkowsky (Gordon et Weber, 1951) et les mélanges obtenus ont été incubés à l'obscurité à 25 °C pendant 30 min. La densité optique (DO) a été mesurée à 530 nm. La concentration d’AIA a été déterminée en se basant sur une courbe standard, établie à partir d’une série de dilution d’une solution d’AIA.

1.3.7. Solubilisation du phosphate tricalcique

La solubilisation du phosphate tricalcique a été évaluée selon la méthode décrite par Nautiyal (1999) en utilisant le milieu de culture NBRIP (National Botanical Research -1 Institute’s Phosphate growth medium) (g1 : glucose, 10; Ca3(PO4)2, 5; MgCl2 6H2O, 5;

MgSO4 7H2O, 0,25; KCl, 0,2, (NH4)2SO4, 0,1, agar, 15, pH, 7). Le milieu NBRIP a été inoculé avec les cultures bactériennes et incubé à 28 °C pendant 7 jours. La capacité des bactéries à solubiliser le phosphate insoluble est indiquée par la formation d'un halo transparent autour de chaque colonie.

1.3.8. Production de siderophores

La sécrétion de sidérophores par les souches a été analysée selon la méthode décrite par Schwyn et Neilands (1987). Pour cela, le milieu Chrome Azurol S (CAS, Annexe 7) a été inoculé avec les cultures bactériennes et incubé à 28 °C pendant 5 jours. L'apparition de halos orange autour des colonies indique la production de sidérophores.

1.3.9. Production de cyanure d'hydrogène (HCN)

La production de cyanure d'hydrogène a été mesurée qualitativement en adaptant la méthode de Feigl et Anger (1966). Les bactéries ont été striées sur un milieu Luria Bertani (LB) (Annexe 8). Le papier Feigl-Anger a été préparé en trempant le papier filtre dans une solution de chloroforme avec de l'éthylacétoacétate de cuivre et du tétra base (4, 4 'tertraméthyl diaminodiphénylméthane) et séché à l'air libre. Le papier a été placé en haut de la boite de pétrie. Les boites ont été scellées et incubées à 28 °C pendant 4 jours. Un changement de couleur du papier Feigl-Anger indique une production de HCN. Le papier réagit avec le gaz HCN et le produit d'oxydation du tétra base donne une couleur bleue enregistrée comme une réaction faible (+), modérée (++) ou forte (+++), respectivement. Un milieu non inoculé a été utilisé comme témoin négatif.

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

1.3.10. Sélection des inocula efficients

Les graines de gesse de la population de provenance de Mahdia ont été désinfectées et stérilisées avec de l'éthanol (70%) pendant 1 min ensuite avec de l'hypochlorite de sodium (2%), rincées plusieurs fois avec de l'eau stérilisée et laissées à l'obscurité à 4 °C durant une nuit, puis germées sur de l’agar 9 ‰ à 28 °C pendant 3 jours. Après la germination, les graines ont été transférées dans des pots en plastique contenant du sable stérilisé, puis 21 consortia ont été utilisés pour l'inoculation des plantes. Chaque consortium a été formé en mélangeant quatre bactéries: deux PGPR, une souche efficiente et une souche résistante au Pb (109 UFC ml-1 de chaque culture bactérienne); des plantes non inoculées ont été utilisées comme témoin (T). Les plantes ont été cultivées sous les mêmes conditions contrôlées et une solution nutritive dépourvue d’azote a été utilisée pour l’irrigation (Vadez et al., 1996). L’expérience a été conduite selon un dispositif complètement randomisé. La matière sèche de la partie aérienne et de la partie racinaire ainsi que le nombre de nodules et la teneur en azote ont été déterminés au stade floraison. Les détails de la co-inoculation par les bactéries du genre Rhizobium, Sinorhizobium, Bacillus, Pseudomonas, Luteibacter et Variovorax sont les suivants:

T. plantes non inoculées 1. Rhizobium leguminosarum (M12)+ Bacillus simplex+ Luteibacter sp+ Variovorax sp 2. R. leguminosarum (M6)+ B. simplex+ Luteibacter sp+ Variovorax sp 3. R. leguminosarum (M4)+ B. simplex+ Luteibacter sp+ Variovorax sp 4. R. leguminosarum (M5)+ B. simplex+ Luteibacter sp+ Variovorax sp 5. R. leguminosarum (M12)+ Pseudomonas sp+ Luteibacter sp+ Variovorax sp 6. R. leguminosarum (M12)+ Pseudomonas fluorescens (M11)+ Luteibacter sp+ Variovorax sp 7. R. leguminosarum (M12)+ P. fluorescens (M11)+ P. fluorescens (K23)+ Pseudomonas sp 8. R. leguminosarum (M12)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Variovorax sp 9. R. leguminosarum (M6)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Variovorax sp 10. R. leguminosarum (M5)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Variovorax sp 11. R. leguminosarum (M4)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Variovorax sp 12. R. leguminosarum (M12)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Bacillus megaterium 13. R. leguminosarum (M6)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ B. megaterium 14. R. leguminosarum (M4)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ B. megaterium 15. R. leguminosarum (M5)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ B. megaterium 16. R.leguminosarum (M12)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Sinorhizobium meliloti 17. R. leguminosarum (M12)+ P. fluorescens (K23)+ Variovorax sp+ S. meliloti

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

18. R. leguminosarum (M12)+ P. fluorescens (K23)+ B. megaterium+ S. meliloti 19. R. leguminosarum (M12)+ P. fluorescens (K23)+ B. simplex+ S. meliloti 20. R. leguminosarum (M5)+ Variovorax sp+ Luteibacter sp+ S. meliloti 21. R. leguminosarum (M5)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ S. meliloti

1.4. Analyse statistique

Le traitement des données a été réalisé à l’aide du logiciel Microsoft Excel 2007. L’analyse statistique de variance de l’ensemble des données a été accomplie en utilisant le logiciel SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) version 18. Les moyennes ont été séparées en utilisant le test Tukey HSD à p < 0,05.

2. Résultats

2.1. Caractéristiques physico-chimiques et teneur en métaux lourds des échantillons de sol

La détermination de la texture du sol a révélé que le sol de Borj Cedria (S0) est un sol limon sableux (19% d'argile, 10% de limon, 71% de sable), le sol de Menzel Bourguiba (S1) est un sol limon argilo-sableux (21% argile, 27% limon, 52% sable) tandis que les sols de Jebel Ressas et de Ghezala (S2 et S3) sont des sols argileux (49% d'argile, 33% de limon, 18% de sable; 46% d'argile, 37% de limon, 17% de sable; respectivement). L'analyse chimique du sol a montré que S0, S1 et S2 sont riches en matière organique, azote et phosphore comparativement à S3, qui est pauvre en MO (1,11%) et présente la plus faible teneur en NPK (Tableau 1). Les concentrations les plus élevées de cadmium et de plomb ont été retrouvées à Ghezala (S3), où elles ont été 8 et 30 fois, respectivement, plus élevées que les teneurs autorisées pour les sols agricoles selon les normes françaises (Baize et Sterckeman, 2001). Dans le sol S0, toutes les concentrations de métaux lourds n'ont pas dépassé les limites de la réglementation française (Tableau 1). Cependant, la concentration du plomb a dépassé dans les sols S1 et S2 les limites autorisées pour les sols agricoles de 8 fois et 7 fois, respectivement. Des concentrations modérées de cuivre et de zinc ont été enregistrées dans les sols prospectés, qui n'ont pas dépassé les normes françaises. Les résultats ont révélé que les concentrations du plomb et du cadmium ont été relativement importantes et qu'elles ont été considérées comme des polluants majeurs.

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

Tableau 1: Caractéristiques physico-chimiques et teneur en métaux lourds des échantillons de sol; S0 (Borj

Cedria), S1 (Menzel Bourguiba), S2 (Jebel Ressas) et S3 (Ghezala). P2O5: phosphore assimilable; K2O: potassium échangeable. FN: normes Françaises pour les sols agricoles.

Sols pH Matière Azote P₂O₅ K₂O Cuivre Zinc Plomb Cadmium organique (%) (‰) (mg kg-1) (mg kg-1) (mg kg-1) (mg kg-1) (mg kg-1) (mg kg-1) S0 7.6c 6,23a 1,29b 58b 133,2c 5,1c 26c 11c < 0,27c S1 8,05bc 5,61a 2,08a 44,4c 625,2b 23b 88b 761b 3,8b

S2 8,23b 3,73b 2,04a 82,1a 834a 42a 225a 816b 5b

S3 9,04a 1,11c 0,45c 6,5d 114c 30b 250a 3044a 17a NF - - - - - 35-100 150-300 60-100 0,7-2

Pour chaque colonne, les valeurs suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes selon le test Tukey HSD test, p < 0,05.

2.2. Effet des métaux lourds sur la croissance des plantes

La réponse de Lathyrus sativus à la contamination métallique a montré une diminution de la biomasse végétale et du nombre de nodules, comparativement à celle cultivée sur le sol témoin non contaminé (Tableau 2). Cette diminution a été corrélée négativement avec l’augmentation de la concentration totale des métaux lourds dans le sol ainsi que du pH (Figure 16; Annexe 9). Cependant, les plantes cultivées sur le sol de Ghezala semblent être les plus affectées par les niveaux élevés de Pb et de Cd, comparativement à celles cultivées sur le sol de Borj Cedria non contaminé. Cet effet indésirable a été observé avec une différence significative entre les deux populations. En effet, la population de gesse de provenance de Mahdia est apparue comme la plus résistante à la contamination métallique avec la meilleure matière sèche des parties aériennes et racinaires et le nombre de nodules le plus élevé (437; 94; 8, respectivement), comparée à la population de gesse de provenance de Kerkena. La comparaison entre les plantes cultivées sur les sols contaminés a montré que la meilleure biomasse végétale a été enregistrée chez les plantes cultivées sur le sol de Menzel Bourguiba avec une différence significative entre les plantes, la plus haute matière sèche et nombre de nodules ont été observés chez la population de provenance de Mahdia (Tableau 2). De plus, une différence significative entre le poids sec de la partie aérienne et le nombre de nodules a été notée chez les plantes cultivées sur le sol de Jebel Ressas avec les valeurs les plus élevées chez la population de gesse de provenance de Mahdia. Cependant, aucune différence significative n'a été notée au niveau de la matière sèche de la partie racinaire des deux populations de L. sativus cultivées sur le sol de Jebel Ressas.

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

Sols Population Matière sèche (mg plante-1) Nombre de nodules de gesse Partie aérienne Partie racinaire (plante-1) S0 Mahdia 1749a ± 69 385a ± 23 54a ± 4,11 Kerkena 1305c ± 52 209b ± 19 33c ± 1,47 S1 Mahdia 1545b ± 46 211b ± 16 42b ± 3,14 Kerkena 1182d ± 35 152c ± 15 23d ± 2,36 S2 Mahdia 985e ± 36 127cd ± 9 31c ± 2,29 Kerkena 557f ± 44 105de ± 12 13e ± 1,87 S3 Mahdia 437g ± 25 94e ± 12 8f ± 0,96 Kerkena 152h ± 12 58f ± 13 4g ± 0,75

Les valeurs représentent la moyenne de 3 répétitions (± SD). Pour chaque colonne, les valeurs suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes selon le test Tukey HSD test à p < 0,05.

2.3. Accumulation des métaux lourds par les populations de Lathyrus sativus

La capacité de la gesse commune à absorber les métaux lourds varie considérablement selon l'échantillon de sol, la population de plantes et l'organe de la plante.

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

2.3.1. Le cadmium

L'accumulation du Cd dans les tissus des plantes a été importante avec la concentration la plus élevée enregistrée au niveau des graines de la population de gesse de provenance de Mahdia cultivées sur le sol de Ghezala (Figure 17). Les résultats ont montré une différence significative entre les deux populations de gesse, également dans chaque partie de la plante. En effet, une teneur élevée en Cd dans la partie aérienne de la population de provenance de Mahdia a été notée (83 mg kg-1) chez les plantes cultivées sur le sol de Ghezala (S3), tandis que celle notée chez la population de provenance de Kerkena a été plus faible. Au niveau des racines, la concentration du Cd varie entre 39 et 45 mg kg-1 au niveau des plantes cultivées sur le sol de Menzel Bourguiba (S1), de 69 à 80 mg kg-1 au niveau des plantes cultivées sur le sol de Jebel Ressas (S2) et de 79 à 98 mg kg-1 au niveau des plantes cultivées sur le sol de Ghezala (S3), respectivement chez les populations de provenance de Kerkena et Mahdia. En Outre, l'accumulation du Cd a été importante dans les nodules de la population de provenance de Mahdia cultivée sur les sols de Menzel Bourguiba et de Jebel Ressas (Figure 17). Le sol de Ghezala a été hautement contaminé par le Cd, ainsi une accumulation importante de cadmium dans les graines de la population de provenance de Mahdia a été observée (318 mg kg-1).

Partie aérienne Partie racinaire

100 150

)

) )

1 - - b b a b 100 b b b 50 c c c

50 c

Cd (mg Cd kg

Accumulationdu Accumulationdu 0 0 M K M K

Graines Nodules

400 100 a

a )

1 a

)

- 1 - 300 b 200 50

b b b Cd (mg Cd kg

100

Cd (mgkg Cd Accumulationdu Accumulationdu 0 0 M K M K

Figure 17: Répartition du cadmium entre les organes des populations de Lathyrus sativus cultivées dans l’échantillon de sol de Menzel Bourguiba (S1), Jebel Ressas (S2) et Ghezala (S3). M: Mahdia; K: Kerkena. Les résultats sont des moyennes (± SD) de trois mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05.

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

2.3.2. Le plomb

L'absorption du plomb par les plantes varie significativement selon les échantillons de sol et les populations (Figure 18). L'accumulation maximale du Pb a été enregistrée au niveau des racines des populations de gesse de provenance de Mahdia et Kerkena cultivées sur le sol de Menzel Bourguiba (2050 et 1927 mg kg-1, respectivement). En effet, une différence significative entre les deux populations de gesse a été particulièrement notée chez les plantes cultivées sur le sol de Menzel Bourguiba. De plus, l’accumulation du plomb au niveau des racines de la population de provenance de Kerkena cultivée sur le sol de Jebel Ressas a été significativement plus élevée que celle enregistrée chez la population de provenance de Mahdia (Figure 18). Les résultats n'ont pas montré de différence significative entre l’accumulation du Pb dans la partie aérienne et racinaire des deux populations de gesse cultivées sur le sol de Ghezala. Tandis que, des quantités importantes de ce métal ont été accumulées au niveau des graines et des nodules des populations de provenance de Mahdia et Kerkena cultivées sur le sol de Menzel Bourguiba.

Partie aérienne Partie racinaire

2000 3000

a )

) ab ab 1

1 a - - 1500 bc b a c 2000 b b b 1000 c 1000

500 (mgkg Pb

Pb(mg kg

Accumulationdu Accumulationdu 0 0 M K M K

Graines Nodules

400 a 600

) a

)

- 1 - 300 b b c 400 c 200

d 200

Pb(mg kg Pb (mgkg Pb

100 Accumulationdu Accumulationdu 0 0 M K M K

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

2.3.3. Le cuivre

L'accumulation du cuivre varie d’un échantillon de sol à un autre et au sein des populations de gesse (Figure 19). Le niveau maximal a été enregistré au niveau des racines de la population de provenance de Mahdia cultivée sur le sol de Jebel Ressas (1451 mg kg-1). Les résultats ont aussi révélé une différence significative entre la partie aérienne, racinaire, les graines et les nodules des deux populations de gesse cultivées sur le sol de Menzel Bourguiba. Une différence significative a également été enregistrée au niveau de la partie aérienne et racinaire des deux populations de gesse cultivées sur le sol de Jebel Ressas (Figure 19). Une teneur élevée en Cu dans la partie aérienne de la population de provenance de Mahdia a été notée (753 mg kg-1) chez les plantes cultivées sur le sol de Ghezala, comparativement à celle notée chez la population de provenance de Kerkena. Aucune différence significative n'a été notée entre l’accumulation du cuivre dans les racines des deux populations de gesse cultivées sur le sol de Ghezala.

Partie aérienne Partie racinaire

1000 2000

a )

) ) a 1

800 1 - b - 1500 b 600 c c cd 1000 400 d e Cu (mgkg Cu d

Cu (mg Cukg d d

500

Accumulationdu 200 Accumulation du Accumulation 0 0 M K M K

Graines

Nodules

1500 1000

)

) )

1 - a - a 1000 b b 500 b

500 c

Cu (mgkg Cu Cu (mg (mg Cu kg

Accumulationdu Accumulationdu 0 0 M K M K

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

2.3.4. Le zinc

L'absorption du zinc par les plantes varie significativement entre les populations et les échantillons de sol (Figure 20). Ainsi, l'accumulation maximale du Zn a été enregistrée au niveau des racines des deux populations de gesse cultivées sur les sols de Menzel Bourguiba et de Jebel Ressas (343, 375 mg kg-1, respectivement). En ce qui concerne les plantes cultivées sur le sol de Menzel Bourguiba, aucune différence significative n'a été détectée du point de vue accumulation du zinc au niveau de la partie aérienne, des graines et des nodules des deux populations de gesse (Figure 20). De plus, l'accumulation du métal au niveau de la partie aérienne et racinaire de la population de gesse de provenance de Mahdia a été supérieure à celle enregistrée chez la population de gesse de provenance de Kerkena pour les plantes cultivées sur le sol de Jebel Ressas. Cependant, l'accumulation du Zn dans la partie aérienne des deux populations de gesse cultivées sur le sol de Ghezala a été importante mais sans aucune différence significative.

Partie aérienne Partie racinaire

600

400 a

)

) 1

1 ab -

- b ab b a 300 400 a c b b b

200 c Zn (mgkg Zn Zn (mgkg Zn 200

100

Accumulationdu Accumulationdu 0 0 M K M K

Graines

Nodules

300 600

) a

1 -

a ) 1 - a 200 b 400 a b

100 200

Zn (mgZn kg

Zn (mgkg Zn Accumulation du Accumulation 0 Accumulationdu 0 M K M K

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

2.4. Caractérisation et identification des bactéries isolées des nodosités racinaires de Lathyrus sativus cultivées dans les échantillons de sol

La culture des deux populations de Lathyrus sativus (provenance de Mahdia et de Kerkena) dans les sols prospectés nous a permis d’isoler un total de 46 bactéries à partir des nodules racinaire. Ces 46 bactéries ont fait l’objet d’une étude de tolérance vis-à-vis du Pb, Cu, Zn et Cd et une caractérisation moléculaire préliminaire par PCR / RFLP ; et en se basant sur les résultats de ces deux dernières études, 22 bactéries ont été identifiées par séquençage. On a essayé par la suite de chercher des gènes de résistance au plomb et au cadmium chez ces 22 souches bactériennes.

2.4.1. Tolérance aux métaux lourds des bactéries isolées

En se basant sur les résultats du Tableau 3, nous avons remarqué que le pourcentage de bactéries survivant diminue avec l'augmentation de la concentration des métaux dans le milieu de culture. Le test de tolérance aux métaux lourds a montré que les concentrations maximales de tolérance MTC de 4%; 7 %; 7% et 20% des isolats ont atteint 0,2 mM pour le Cu; 0,5 mM pour le Zn; 0,8 mM pour le Cd et 2,5 mM pour le Pb, respectivement. Les résultats ont aussi montré que 100% des bactéries tolèrent 1 mM de Pb mais seulement 20% d'entre elles ont pu croître avec 2,5 mM de Pb. Pour le cadmium et le cuivre, 13% et 30% des isolats tolèrent 0,5 mM de Cd et 0,15 mM de Cu, respectivement. Le zinc a été hautement toxique pour la majorité des bactéries et a été létale à faibles concentrations, ainsi seulement 7% des isolats ont été capables de croître dans un milieu contenant des taux de 0,5 mM de Zn. Il convient de mentionner que certaines bactéries ont été particulièrement tolérantes à plusieurs métaux lourds en même temps. Cependant, les isolats qui ont démontré leur capacité à tolérer des concentrations élevées de métaux lourds ont été isolés des nodules racinaires de la population de gesse de provenance de Kerkena.

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

Tableau 3: Tolérance aux métaux lourds des 46 bactéries isolées

Métaux Concentration (mM) Survie des isolats (%) 1 100 Pb 1,5 86,95 2 39,13 2,5 19,56 0,1 65,21 Zn 0,2 50 0,25 39,13 0,5 6,57 0,05 60,86 Cu 0,1 39,13 0,15 30,43 0,2 4,34 0,05 52,17 Cd 0,1 26,08 0,5 13,04 0,8 6,57

2.4.2. Caractérisation moléculaire des isolats

2.4.2.1. Amplification par PCR de l’ADNr 16S

L’extraction de l’ADN génomique et l’amplification par PCR du gène de l’ADNr 16S ont été réalisées pour les 46 isolats bactériens sélectionnés. L’électrophorèse sur gel d’agarose 1% des produits de PCR a montré des bandes de taille 1,5 kb en utilisant un marqueur de taille de 500 pb (Figure 21).

M M6 M11 M3 K2 K6 M12

1500 pb

Figure 21: Electrophorèse des produits d’amplification par PCR du gène de l’ADNr 16S. M6, M11, M3, K2, K6 et M12: isolats bactériens. M: marqueur.

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

2.4.2.2. Le séquençage

Les résultats du séquençage des fragments de l’ADNr 16s amplifiés ont été obtenus sous forme d’électrophorégrammes et analysés par le logiciel Chromas pro. Ensuite, l’alignement est effectué, les séquences écrites en ligne sont envoyées sur internet et comparées à des séquences déposées dans des banques de données. On peut ainsi obtenir des BLAST, c’est- à- dire des comparaisons avec les séquences les plus proches et l’identification qui correspond, rendue avec un pourcentage de similarité de la souche à identifier avec les espèces les plus proches (Tableau 4). Le séquençage de l'ADNr 16S a révélé diverses espèces représentées par Rhizobium sp, Bacillus sp, R. leguminosarum, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas sp, P. fluorescens, Luteibacter sp, Variovorax sp, Bacillus simplex et B. megaterium (Tableau 4). Les résultats ont montré que parmi les bactéries sélectionnées, les rhizobiums ont été les plus sensibles au stress métallique. En outre, la tolérance aux métaux lourds a été observée chez Luteibacter sp, P. fluorescens et B. megaterium, qui ont démontré leur capacité à croître avec 2,5 mM Pb, aussi Bacillus simplex et Variovorax sp ont pu tolérer 0.8 mM Cd (Tableau 4).

2.4.3. Détection des gènes de résistance au Pb et au Cd chez les souches bactériennes

L’amplification par PCR, avec les amorces spécifiques, du gène de résistance au plomb et du gène de résistance au cadmium a révélé par électrophorèse des bandes de poids moléculaires variables: d’environ 450 pb pour le plomb (Figure 22A) et entre 600 et 1100 pb pour le cadmium (Figure 22B). Les résultats ont montré que R. leguminosarum (M6, M12), Luteibacter sp (K20), P. fluorescens (K23), B. simplex (K14), Bacillus sp (M9) et B. megaterium (K5, K11) possèdent le gène de résistance au Pb ou au Cd ou les deux. La comparaison des séquences de nos fragments de PCR a montré une forte homologie avec les gènes de résistance au Pb et au Cd chez d'autres bactéries. Selon l'analyse des séquences nucléotidiques avec le programme BLAST, le gène PbrA chez les souches M6, M9, M12, K5, K11 et K14 a été similaire à 70%-75% avec celui de Rhodanobacter sp, alors que celui de K20 a été similaire à 81% à celui de Rhodanobacter denitrificans. De même, la comparaison de la séquence du gène CadA chez les souches K14 et K5 a montré une similitude de 88 et 97% avec Bacillus sp. Chez M12 le gène de résistance au Cd a montré 78% de similitude avec Paenibacillus sp. Concernant M6 et K23, la comparaison de la séquence du gène CadA a

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries révélé une homologie avec R. leguminosarum bv. trifolii 83% et Pseudomonas sp 85%, respectivement. L'analyse de la séquence du gène de résistance au cadmium chez la souche M9 a montré qu’il a été identique à 94% au gène cadA de Bacillus firmus.

450 pb

1 2 3 M 4 5 6 M

600 pb

1 2 3 M 4 5 6

Figure 22: Amplification des gènes de résistance au plomb (A) et au cadmium (B) par PCR; M: Marqueur moléculaire. 1- B. megaterium (K5); 2- Luteibacter sp (K20); 3- B. simplex (K14); 4- R. leguminosarum (M6); 5- B. megaterium; (K11); 6- R. leguminosarum (M12).

2.4.4. Etude des performances de la gesse inoculée avec les bactéries isolées

des nodules racinaires

Le test de nodulation a montré que seulement 6 des 22 bactéries nodulaient Lathyrus sativus et que la taille et le nombre de nodules ont été variables (Tableau 4). Des augmentations significatives ont été observées dans les biomasses végétales de 40 à 149% au niveau de la partie racinaire et de 29 à 106% au niveau de la partie aérienne. En effet, l'inoculation par R. leguminosarum (M1) et B. megaterium (K5) a amélioré la matière sèche de la partie aérienne de 97% et 106%, respectivement chez les populations de gesse de provenance de Mahdia et de Kerkena. De plus, l'inoculation avec B. simplex (K14) et R. leguminosarum (M4) a amélioré la matière sèche de la partie racinaire de 88% et de 149% respectivement chez les populations de gesse de provenance de Kerkena et de Mahdia. Des augmentations significatives ont été observées au niveau de la matière sèche des parties

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries aériennes et racinaires de la population de gesse de provenance de Kerkena inoculée avec P. fluorescens (K23), Variovorax sp (K17) et Luteibacter sp (K20). Les résultats ont également montré que les souches bactériennes qui nodulent la population de gesse de provenance de Mahdia ont été les plus efficientes (Tableau 4).

Souches Matière sèche (mg plante-1) Nodules MTC (mM) Séquençage de l’ADNr 16S Mahdia Partie Partie (plante-1) Pb Cd aérienne racinaire TM 576e ± 89 463g ± 37 - - - - M1 1136a ± 101 603efg ± 55 38 1,5 0,1 Rhizobium leguminosarum 97% M3 580e ± 26 891cd ± 90 0 1,5 0,05 Rhizobium sp 97% M4 841bcd ± 42 1155a ± 49 82 1,5 0,05 Rhizobium leguminosarum 97% M5 741cde ± 40 753de ± 32 90 1,5 0,05 Rhizobium leguminosarum 98% M6 848bcd ± 44 523fg ± 49 60 1,5 0,05 Rhizobium leguminosarum 99% M7 993ab ± 65 676ef ± 55 0 1,5 0,05 Sinorhizobium meliloti 97% M9 863bc ± 49 706e ± 60 0 2 0,05 Bacillus sp 96% M10 731cde ± 43 666ef ± 70 0 2 0,1 Bacillus sp 97% M11 990ab ± 96 983bc ± 41 0 1,5 0,1 Pseudomonas fluorescens 97% M12 1026ab ± 89 1116ab ± 35 80 1,5 0,05 Rhizobium leguminosarum 97% M20 670de ± 26 491g ± 51 16 1,5 0,5 Rhizobium leguminosarum 98% Kerkena TK 421d ± 21 355ef ± 34 - - - - K2 623bc ± 45 448de ± 45 0 2,5 0,05 Bacillus megaterium 97% K4 591c ± 52 461cd ± 41 0 2,5 0,1 Bacillus sp 97% K5 866a ± 35 413def ± 15 0 2,5 0,05 Bacillus megaterium 97% K6 702b ± 24 441de ± 25 0 2,5 0,1 Pseudomonas fluorescens 96% K11 643bc ± 21 340f ± 40 0 2,5 0,05 Bacillus megaterium 97% K14 648bc ± 42 666a ± 45 0 1,5 0,8 Bacillus simplex 98% K17 683bc ± 49 551bc ± 37 0 2 0,8 Variovorax sp 90% K19 621bc ± 11 553bc ± 47 0 2 0,1 Pseudomonas sp 96% K20 713b ± 21 551bc ± 24 0 2,5 0,05 Luteibacter sp 97% K22 623bc ± 25 476bcd ± 31 0 2 0,5 Variovorax sp 96% K23 663bc ± 55 572b ± 20 0 2,5 0,1 Pseudomonas fluorescens 96%

Les valeurs représentent la moyenne de 5 répétitions (± SD). Pour chaque colonne, les valeurs suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes, pour chaque population séparément, selon le test Tukey HSD test à p < 0,05.

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

2.5. Criblage in vitro des souches bactériennes pour leur effet promoteur de la croissance des plantes (PGP)

Dans cette partie du travail, 12 souches bactériennes ont été sélectionnées sur la base de leur efficience et de leur résistance au plomb (Tableau 5).

Souches bactérienne Test de MTC (mM) Gène PbrA nodulation R. leguminosarum (M5) + 1,5 - R. leguminosarum (M6) + 1,5 + R. leguminosarum (M12) + 1,5 + R. leguminosarum (M4) + 1,5 - S. meliloti (M7) - 1,5 - B. megaterium (K5) - 2,5 + B. simplex (K14) - 1,5 + Variovorax sp (K17) - 2,0 - Luteibacter sp (K20) - 2,5 + P. fluorescens (K23) - 2,5 - Pseudomonas sp (K19) - 2,0 - P. fluorescens (M11) - 1,5 -

2.5.1. Production de l’acide 3-indole acétique

Les 12 souches bactériennes sélectionnées se sont montrées capables de produire l’acide indole acétique (AIA) impliqué dans la stimulation de la croissance des plants (Tableau 6). Ce pouvoir de production d’AIA varie de 0,89 à 63,55 μg ml-1. La production significative la plus importante a été enregistrée chez S. meliloti (63,55 ± 3,05 μg ml-1) suivie de Luteibacter sp (47,22 ± 0,84 μg ml-1). Parmi les souches de R. leguminosarum, M5, M6 et M12 ont produit la quantité d'AIA la plus élevée, suivies de M4. Cependant, la quantité d’AIA synthétisée par B. megaterium a été significativement plus haute que celle synthétisée par B. simplex. Les souches Pseudomonas et Variovorax sp ont présenté une faible capacité de production d’AIA avec des valeurs comprises entre 0,89 et 2,01 μg ml-1 (Tableau 6).

2.5.2. Production de sidérophores

La production de sidérophores par les différentes souches étudiées a été déterminée après 5 jours d’incubation à 28 °C dans le milieu Chrome Azurol S (CAS). Les souches ont montré une variabilité de production par rapport à une souche de référence. L’analyse a été basée sur l’observation de la variation de la coloration bleue du milieu CAS qui vire vers l’orange clair tout en formant un halo autour de chaque colonie, ce changement

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries de couleur est un indicateur de production de siderophores (Figure 23). Après, l’intensité de production est étudiée en mesurant le diamètre du halo de production de sidérophores pour chaque bactérie. Parmi les souches testées, 92% se sont montrés capables de produire et de sécréter des composés chélateurs du fer. Les données du Tableau 6 montrent que la production significative la plus importante de sidérophores a été enregistrée chez Variovorax sp (9,06 ± 0,86 mm) suivie de R. leguminosarum, Luteibacter sp et P. fluorescens (M4, K20 et M11 respectivement).

Figure 23: Production de sidérophores par quelques souches étudiées, sur le milieu Chrome Azurol S (CAS).

2.5.3. Solubilisation du phosphate tricalcique

Les bactéries sélectionnées ont été testées pour leurs capacités à solubiliser le phosphate

(Ca3(PO4)2) sous sa forme assimilable par la plante. Ce pouvoir a été indiqué par la formation d’une zone claire autour des colonies bactériennes sur le milieu NBRIP (Figure 24). Les résultats ont montré qu'un peu plus de 90% des souches ont formé des halos visibles et ont présenté une capacité de solubilisation du phosphate dans le milieu NBRIP (Tableau 6). Le pouvoir de solubilisation le plus élevé a été enregistré chez P. fluorescens K23 (15,16 ± 1,05 mm) suivie de Variovorax sp K17 (10,86 ± 0,81 mm), B. megaterium K5 (10,05 ± 0,92 mm), R. leguminosarum M5 (9,66 ± 1,15 mm) et P. fluorescens M11 (9,33 ± 0,57 mm). Parmi les souches de R. leguminosarum; trois (M5, M6 et M12) ont montré une capacité de solubilisation du phosphate significativement plus élevée que M4 (Tableau 6).

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Figure 24: Solubilisation du phosphate tricalcique par quelques souches étudiées, sur le milieu NBRIP.

2.5.4. Production de cyanure d'hydrogène (HCN)

La production de HCN a été mesurée qualitativement comme le montre le Tableau 6. Parmi les 12 souches bactériennes examinées, 42% ont démontré la capacité de synthétiser le HCN et cette synthèse varie selon les souches. P. fluorescens (K23; M11) et Pseudomonas sp ont montré une forte capacité de production de HCN alors que S. meliloti et Variovorax sp ont présenté un potentiel beaucoup moins important (Figure 25). La capacité de production de cyanure était absente chez les espèces Bacillus, R. leguminosarum et Luteibacter sp (Tableau 6).

P. fluorescens (K23) Variovorax sp (K17) Luteibacter sp (K20)

Figure 25: Production de cyanure d’hydrogène (HCN). Les bactéries ont été striées sur le milieu LB. Le papier Feigl-Anger a été placé en haut de la boite de pétrie.

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Tableau 6: Caractéristiques des souches bactériennes efficientes et résistantes aux métaux lourds. AIA: Production de ’acide 3-indole acétique. HCN: Production de cyanure d'hydrogène, absente, -; faible, +; modérée, ++; forte, +++. nd: activités non détectées.

Souches bactériennes AIA (µg ml-1) Siderophores (mm) Solubilisation du HCN phosphate (mm) R. leguminosarum (M5) 30,76c±2,46 5,43bc±0,75 9,66bc±1,15 - R. leguminosarum (M6) 26,17cd±2,37 5,13bc±1,21 7,83cd±0,76 - R. leguminosarum(M12) 28,33c±1,45 5,76bc±0,68 7,53cd±0,45 - R. leguminosarum (M4) 23,47d±1,07 6,86b±0,71 4,13e±0,23 - S. meliloti (M7) 63,55a±3,05 4,43cd±0,51 6,26de±0,64 + B. megaterium (K5) 21,85d±1,85 nd 10,05bc±0,92 - B. simplex (K14) 8,89e±1,21 2,66d±0,57 7,31cd ±0,67 - Variovorax sp (K17) 0,89f±0,08 9,06a±0,86 10,86b±0,81 + Luteibacter sp (K20) 47,22b±0,84 6,73b±0,64 nd - P. fluorescens (K23) 2,01f±0,83 6,46bc±0,51 15,16a±1,05 +++ Pseudomonas sp (K19) 1,16f±0,17 4,33cd±0,57 8,16cd±0,76 +++ P. fluorescens (M11) 1,32f±0,21 6,83b±0,76 9,33bc±0,57 +++

2.5.5. Bioaccumulation du plomb par les bactéries

La bioaccumulation du plomb par les souches résistantes varie entre la paroi cellulaire et le cytoplasme et avec le temps d'incubation (Tableau 7). La concentration la plus importante du Pb a été adsorbée à la surface cellulaire de toutes les bactéries avec la valeur la plus élevée enregistrée après 24 h d’incubation chez P. fluorescens K23 (12,90 ± 0,85 mg Pb g-1 matière sèche (MS)) en présence de 2,5 mM de Pb. Cependant, à la même période d'incubation et avec 2 mM de Pb, Pseudomonas sp K19 a adsorbé une concentration importante du Pb à la paroi cellulaire (3,42 ± 0,34 mg Pb g-1 MS). Avec une concentration de plomb plus faible (1,5 mM de Pb) et de nouveau à 24 h, les rhizobiums, B. simplex et P. fluorescens (M11) ont adsorbé le Pb à la surface cellulaire dans un intervalle de 0,81 à 7,31 mg g-1 MS. De plus, on a observé que la biosorption du métal à la paroi cellulaire a diminué lorsqu’on a augmenté le temps d'incubation de 24 à 48 h. Inversement, l'accumulation intracellulaire du Pb a augmenté avec le temps d'incubation, ainsi, le maximum a été obtenu à 48 h chez Luteibacter sp K20 (2,34 ± 0,33 mg Pb g-1 MS) en présence de 2,5 mM de Pb (Tableau 7).

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Tableau 7: Bioaccumulation du plomb par les souches sélectionnées, dans la paroi cellulaire ainsi que dans le milieu intracellulaire.

Souches bactériennes Concentration bioaccumulation du Pb (mg g-1 matière sèche) de Pb (mM) Pb intracellulaire Pb membranaire 24 h 48 h 24 h 48 h R. leguminosarum (M5) 1,5 0,17±0,05 0,24±0,10 1,82±0,11 0,53±0,05 R. leguminosarum (M6) 1,5 0,22±0,04 0,39±0,10 0,93±0,06 0,47±0,01 R. leguminosarum(M12) 1,5 0,16±0,02 0,20±0,01 1,04±0,08 0,51±0,07 R. leguminosarum (M4) 1,5 0,10±0,02 0,14±0,02 0,83±0,08 0,39±0,02 S. meliloti (M7) 1,5 0,12±0,05 0,30±0,05 0,81±0,08 0,48±0,03 B. megaterium (K5) 2,5 0,36±0,04 0,90±0,07 10,73±0,34 8,18±0,45 B. simplex (K14) 1,5 0,33±0,01 0,64±0,08 0,97±0,12 0,88±0,06 Variovorax sp (K17) 2,0 0,20±0,01 0,25±0,01 0,57±0,03 0,87±0,02 Luteibacter sp (K20) 2,5 0,27±0,04 2,34±0,33 2,19±0,12 1,59±0,07 P. fluorescens (K23) 2,5 0,33±0,02 0,75±0,05 12,90±0,85 1,81±0,07 Pseudomonas sp (K19) 2,0 0,26±0,02 0,48±0,01 3,42±0,34 1,04±0,08 P. fluorescens (M11) 1,5 0,66±0,04 0,88±0,01 7,31±0,24 0,52±0,08

Les valeurs représentent la moyenne de 3 répétitions (± SD).

2.6. Amélioration des paramètres de croissance par co-inoculation avec des PGPR et choix des inocula

Cette étude menée sur du sable stérile en utilisant 21 combinaisons bactériennes formée chacune de 4 souches a pour objectif de sélectionner les combinaisons efficientes qui favorisent une bonne croissance et une meilleure nodulation et fixation symbiotique de l’azote.

2.6.1. Effet de la co-inoculation sur la biomasse végétale

L'inoculation de Lathyrus sativus avec des PGPR a affecté les paramètres de croissance des plantes (Figure 26). L’analyse de variance a révélé une variation significative (à P < 0,05) de tous les paramètres étudiés selon les traitements bactériens testés. Les résultats ont montré que l'inoculation a augmenté significativement la biomasse végétale de 7 à 172% au niveau de la partie aérienne et de 10 à 85% au niveau de la partie racinaire. Les valeurs les plus élevées de la matière sèche de la partie aérienne (MSA) ont été enregistrées chez les plantes inoculées avec les consortia 3; 4; 12 et 20, avec une différence significative par rapport à toutes les plantes inoculées et par rapport au témoin non inoculé.

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

T I21 I19 I20 I17 I18 I22

Figure 26: Exemple de l’effet de la co-inoculation avec des PGPR sur la croissance des plantes. T: témoin non inoculé.

L'inoculum I4 formé de R. leguminosarum (M5)+ B. simplex+ Luteibacter sp+ Variovorax sp a stimulé significativement le développement de sa plante hôte et a donné la MSA la plus élevée (0,86 g de plante-1). Les valeurs les plus importantes de la matière sèche de la partie racinaire (MSR) ont été enregistrées avec six inocula (I1, I2, I3, I4, I9 et I20) avec une différence significative par rapport à toutes les autres plantes inoculées et par rapport au témoin non inoculé. On a aussi noté que l’inoculum I3 formé de R. leguminosarum (M4)+ B. simplex+ Luteibacter sp+ Variovorax sp et l’inoculum I4 ont augmenté significativement la MSR. Cette amélioration des paramètres de croissance chez la gesse par la co-inoculation montre bien les effets positifs des rhizobiums combinés avec des PGPR essentiellement lorsque cette plante est inoculée avec les inocula I3 et I4.

2.6.2. Effet de la co-inoculation sur la teneur en azote

L’analyse statistique de la variance (à p < 0,05) a montré une variabilité de la teneur en azote au sein des plantes et cette différence est significative par rapport au témoin non inoculé (Figure 29). Les résultats ont révélé que l'inoculation a amélioré la teneur en azote des feuilles avec une augmentation significative qui varie de 63 à 148% (Figure 27). Les teneurs en azote les plus élevées ont été enregistrées chez les plantes inoculées avec les inocula 4; 5; 8; 10; 12; 13; 15; 17 et 20 avec une différence significative par rapport à toutes les plantes inoculées et par rapport au témoin non inoculé. D’après les résultats, la teneur en N total la plus

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries importante a été enregistrée chez les plantes inoculées avec I20 (3,5%) formé de R. leguminosarum (M5)+ Variovorax sp+ Luteibacter sp+ S. meliloti, comparé à tous les autres consortia.

T I3 T I4

T I4

Figure 27: Différence entre les plantes inoculées avec les consortia 3 et 4 et entre le témoin (T) non inoculé.

2.6.3. Effet de la co-inoculation sur la nodulation

Comme prévu, les plantes non inoculées n'ont développé aucun nodule. Alors que, chez les plantes inoculées, les résultats ont montré que le nombre et la taille des nodules varient d’une plante à une autre et cette variation dépend de l’inoculum utilisé (Figure 28).

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

Le nombre moyen de nodules varie de 16 à 89, donc les plantes inoculées avec les inocula 1; 3; 4; 5; 7 et 16 ont montré les nombres de nodules les plus importants. De plus, la nodulation la plus élevée a été induite par l'inoculum I4 (89 nodules plante-1), suivie des inocula I1 et I3 (Figure 19).

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

1 A/ a

b b ) b

1 0,8 - c c c c c c c d d d 0,6 de de d de de e f

(g plante 0,4 f

partiesaériennes Matièresèche des 0,2

0 T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 1 B/ a ab a b ab b

0,8

) c c c

B/ 1 - de de d de 0,6 f ef g gh g gh gh

0,4 gh h (g plante (g

0,2

parties racinairesparties Matièresèchedes 0 T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

C/ 100 a 80

b b

) c c c 1

- cd cd cd 60 de de e e ef efg fgh gh gh 40 h h

(plante i 20 j Nombre de nodulesNombrede 0 T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

D/ 4 a bc b 3,5 d bc d d cd d ef e ef e ef e 3 fg g g g h h 2,5 2 (%) i 1,5 1

Teneur enTeneurazote 0,5 0 T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

consortium bactérien Figure 29: Effet de la co-inoculation avec des rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (PGPR) sur les paramètres de croissance des plantes de Lathyrus sativus cultivées dans des conditions contrôlées. A / Matière sèche des parties aériennes; B / Matière sèche des parties racinaires; C / Nombre de nodules; D / Teneur en azote. Les résultats sont des moyennes (± SD) de cinq mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05.

Cette étude de l’efficience menée sur du sable stérile nous a permis de sélectionner les combinaisons bactériennes les plus efficientes et qui ont amélioré significativement la matière

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries sèche des parties aériennes et racinaires ainsi que le nombre de nodules, ces combinaisons sont: I3, I4, I5, I8, I9, I10, I12, I15, I18 et I20.

2.7. Etude de l’interaction entre les bactéries

Cette étude de la compétitivité bactérienne, réalisée sur un milieu YEMA, nous a permis de s’assurer que les souches sélectionnées sont capables de vivre en synergie.

3. Discussion

Des recherches antérieures ont montré que le sol de Ghezala était pauvre en matière organique et avait une faible teneur en NPK (Chiboub et al., 2016). De plus, le même sol était principalement contaminé par le Pb et le Cd, ce résultat concorde avec les résultats obtenus par Zribi et al. (2012) et Jebara et al. (2015a). Cependant, des concentrations modérées du Cu et du Zn ont été enregistrées dans les sols de Jebel Ressas et de Menzel Bourguiba, bien qu'une forte contamination par le Pb et le Cd a été observée (Chiboub et al., 2016). Dans notre étude, la réponse de la gesse commune à la contamination métallique a montré que l'augmentation des concentrations des métaux lourds dans les sols a diminué proportionnellement la biomasse végétale et le nombre de nodules. En effet, des symptômes de toxicité sévère ont été observés chez des plantes cultivées sur des sols déjà contaminés par des métaux lourds (Gill, 2014; Silva et al., 2014). Les effets nuisibles de Cd et de Pb ont été démontrés par plusieurs études: réduction de la croissance (Ghnaya et al., 2016; Talat et Rudra, 2013), chlorose (Wali et al., 2014), brunissement des racines (Brunet et al., 2008) et réduction du nombre de nodules (Górska-Czekaj et Borucki, 2013). Ces effets toxiques pourraient être dus à l'inactivation des protéines et des enzymes par la génération des espèces réactives de l'oxygène (Wani et al., 2008). Dans cette étude, la diminution du nombre de nodules avec les fortes concentrations de métaux dans les sols pourrait être due à l'effet direct des métaux lourds sur les bactéries nodulantes dans le sol et au processus de nodulation. Aussi, ceci peut être expliqué par les dommages occasionnés par les métaux sur le système racinaire ce qui affecte la réponse des légumineuses aux facteurs Nod et affecte ainsi la symbiose en retardant la nodulation et en réduisant la fixation biologique de l'azote (Hao et al., 2014). Les deux populations de gesse testées ont été capables d'accumuler le Pb, le Cu, le Zn et le Cd dans toutes les parties de la plante avec des concentrations importantes. Certaines espèces végétales ont la capacité d'accumuler des quantités élevées de métaux toxiques, et elles deviennent ainsi les meilleurs candidats pour la phytoremédiation des sols contaminés par les

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries métaux lourds (Wang et al., 2016). En effet, le concept de phytoremédiation implique l'utilisation de plantes pour nettoyer et éliminer les polluants des sols (Nematian et Kazemeini, 2013). Un travail similaire qui a étudié l'accumulation du Cu et du Cd chez la gesse a montré que cette plante a absorbé le Cu et le Cd en quantités intéressantes et les a accumulés au niveau de sa partie aérienne et au niveau de ses racines (Nagati et al., 2015). Les mêmes auteurs ont révélé que Lathyrus sativus a la capacité de résister aux métaux lourds et pourrait présenter un meilleur outil de phytoremédiation comme d’autres Fabacées. De plus, des résultats similaires ont été rapportés par Talukdar (2014), qui a trouvé que Lathyrus sativus possède un grand potentiel d'accumulation du Cd. D'un autre côté, nos résultats sont en accord avec les résultats de Brunet et al. (2008), qui ont démontré que cette plante à le pouvoir d’accumuler des concentrations élevées de Pb dans ses tissus, équivalentes à celles des plantes hyperaccumulatrices comme Brassicae juncea et Thlaspi rotundifolium, ce qui fait d’elle une plante prometteuse pour la phytoremédiation. De plus, d'autres études ont démontré que la gesse commune a la capacité maximale d'accumuler du plomb et du cuivre comparativement à d'autres légumineuses comme Medicago sativa et Onobrychis vicifolia (Beladi et al., 2011). La présente étude suggère que Lathyrus sativus est un bon candidat pour la bioaccumulation du Pb, Cu, Zn et Cd, par conséquent, cette plante peut être classée comme une forte accumulatrice avec un potentiel approprié pour la phytoremédiation des sites pollués par des métaux lourds. Dans la présente étude, les isolats ont montré une réponse adaptative contre divers métaux lourds. En effet, les bactéries isolées des zones polluées ont pu tolérer des niveaux élevés de métaux toxiques que celles isolées des zones non polluées (Luo et al., 2011). Les niveaux de résistance au Cd et au Pb de ces bactéries sont comparables à ceux trouvés par Zribi et al. (2012). Il a été montré que les bactéries exposées à des niveaux élevés de polluants toxiques dans leur environnement étaient adaptées à ce stress en développant divers mécanismes de résistance, et pouvaient ainsi contribuer au processus de biorémédiation efficace des sites contaminés par les métaux lourds (Chauhan et Solanki, 2015; Zhang et al., 2014). La caractérisation moléculaire par séquençage de l'ADNr 16S a montré diverses espèces représentées par Rhizobium sp, R. leguminosarum, S. meliloti et des bactéries endophytes telles que Pseudomonas sp, P. fluorescens, Luteibacter sp, Variovorax sp, B. simplex et B. megaterium. Certains rapports ont indiqué que la diversité existe dans la rhizosphère mais ici nous avons observé que la diversité existe même parmi les organismes associés aux nodules (Rajendran et al., 2012). Cette étude a suggéré une grande diversité au sein des communautés bactériennes qui interagissent en association avec la gesse. Une telle diversité offre la

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries possibilité de sélectionner différentes souches présentant des caractéristiques d'efficience et de tolérance à différents métaux lourds, qui pourraient être utilisées en combinaison pour l'inoculation (Sbabou et al., 2016). Alors que les bactéries isolées de Lathyrus sativus cultivées dans différents sites dans la régions aride de la Tunisie ont été restreintes à l'espèce Rhizobium leguminosarum (Guefrachi et al., 2013). Cependant, peu d'études ont été faites sur la diversité des bactéries qui vivent au sein des nodules de la gesse. D'un autre côté, Sbabou et al. (2016) ont montré une importante diversité génétique au sein des bactéries isolées de Hedysarum spinosissimum L. cultivée dans des sites miniers. De plus, diverses espèces ont été isolées des plantes de Lens culinaris cultivées sur des sols contaminés par les métaux lourds (Jebara et al., 2015b). La présence de Bacillus et de Pseudomonas dans les nodules des légumineuses cultivées sur des sols pollués a également été décrite précédemment par Chiboub et al. (2016) et Sbabou et al. (2016). D’autre part, Hao et al. (2014) ont montré que les dommages causés aux racines par les métaux lourds ont affecté la réponse des légumineuses aux facteurs Nod en réduisant la zone infectieuse, considérée comme la raison principale de la réduction du nombre de nodules et non la réduction de la communauté bactérienne. Les plantes hyperaccumulatrices sont capables d'accumuler des concentrations élevées de métaux lourds et ont besoin de Rhizobium et d'autres bactéries associées aux plantes qui peuvent survivre dans ce milieu et améliorer la résistance de leur hôte (Idriss et al., 2004). En outre, Osorio-Vega (2007) a démontré le potentiel de la synergie entre divers genres bactériens dans la rhizosphère et leurs effets bénéfiques sur les plantes. L'amplification par PCR et l'électrophorèse ont montré que 8 des 22 bactéries sélectionnées possèdent le gène de résistance au Pb ou au Cd ou les deux. Parmi ces bactéries on trouve R. leguminosarum (M6, M12), Luteibacter sp (K20), P. fluorescens (K23), B. simplex (K14), Bacillus sp (M9) et B. megaterium (K5, K11). Il est possible que les amorces utilisées pour amplifier les gènes de résistance au Pb et au Cd chez les autres bactéries étudiées soient inappropriées (Wei et al., 2009). La forte similitude entre la séquence du gène de résistance au Pb et les gènes PbrA chez différentes espèces et genres de Rhodanobacter suggère qu'il y a eu un transfert possible du gène de résistance au Pb d’une seule source (Zhang et al., 2008). En effet, il a été rapporté que les espèces de Rhodanobacter étaient très abondantes dans de nombreux environnements contaminés par les métaux lourds et restaient rares dans les zones non contaminées (Hemme et al., 2016). Il semble que les bactéries ont amélioré leurs mécanismes de résistance aux métaux lourds avec le transfert latéral de gènes (LGT) par le

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries biais du processus évolutif afin de s'adapter rapidement aux agressions environnementales brutales (Barcellos et al., 2007). Le test de nodulation a montré que seulement 6 des 22 bactéries ont nodulé la gesse, ces bactéries appartiennent à l’espèce R. leguminosarum, comme il a été rapporté dans des études antérieures (Barrientos et al., 2003 ; Brink et Belay, 2006). De plus, cette bactérie a amélioré la production de la matière sèche de son hôte et a produit la biomasse végétale la plus élevée (Brink et Belay, 2006). L'amélioration de la croissance des plantes par les rhizobiums pourrait être directement liée à la fixation de l'azote ou à la production de sidérophores, d'hormones de croissance ou à la solubilisation des phosphates (Wani et al., 2008). Un grand nombre d'études ont démontré que les bactéries associées aux nodules se sont avérées capables d'améliorer la croissance des plantes, comme les rhizobiums (Jebara et al., 2015b; Egamberdieva et al., 2017). De plus, les résultats ont révélé que les bactéries R. leguminosarum (M1), B. megaterium (K5), B. simplex (K14) et R. leguminosarum (M4) ont augmenté significativement la matière sèche de la partie aérienne et de la partie racinaire dans un milieu dépourvu d'azote. Par conséquent, les genres Bacillus et Rhizobium représentent un moyen prometteur pour améliorer la croissance des plantes et surmonter les contraintes environnementales et les facteurs limitant la croissance (Korir et al., 2017; Meena et al., 2017). Notre étude confirme les effets positifs de B. megaterium, B. simplex et P. fluorescens sur la performance de croissance de Lathyrus sativus comme décrit précédemment pour d'autres légumineuses (Chiboub et al., 2016; Ortíz-Castro et al., 2008; Schwartz et al., 2013) . Il a été rapporté que les associations bactériennes avec les plantes ont un effet bénéfique sur différentes espèces végétales, certaines d'entre elles étant spécifiques à leur hôte (Hardoim et al., 2015). D'autres études ont montré que la plupart de ces microorganismes peuvent avoir des fonctions de biofertilisants et de biocontrôle en améliorant la nutrition minérale, la production de facteurs favorisant la croissance des plantes comme mentionné précédemment et l'amélioration de la santé des plantes en induisant une résistance systémique (Aydi Ben Abdallah et al., 2016). Dans la présente étude, les résultats ont aussi montré que les 12 bactéries sélectionnées R. leguminosarum, S. meliloti, Pseudomonas sp, P. fluorescens, Luteibacter sp, Variovorax sp, B. simplex et B. megaterium possèdent de multiples activités favorisant la croissance des plantes. L'estimation du niveau d'AIA produit par les souches a révélé que toutes les bactéries sélectionnées sont capables de produire cette phytohormone lorsque le milieu est additionné de L-tryptophane, comme observé par d'autres chercheurs (Fatnassi et al., 2013; Rajendran et

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries al., 2012). En effet, la production d'AIA a été rapportée pour nombreuses bactéries (Marasco et al., 2013; Mohite, 2013). Cependant, Khalid et al. (2004) ont suggéré que 80% des bactéries isolées de la rhizosphère sont capables de synthétiser l’acide indole 3-acétique, ce qui améliore la croissance des plantes et favorise une augmentation de la surface racinaire, facilitant ainsi l'absorption des nutriments du sol par les végétaux (Ahmad et al., 2008). Dans cette étude, la production d’AIA par les souches testées a varié de 0,89 à 63,55 μg ml-1. Ces résultats sont similaires à ceux obtenus par Rajendran et al. (2012), qui ont trouvé des valeurs entre 13,56 et 62,64 μg ml-1 chez des bactéries isolées des nodules racinaires du fenugrec. Les bactéries résistantes sélectionnées ont montré la capacité de produire des sidérophores à l'exception de B. megaterium. De plus, une production importante de sidérophores a été enregistrée chez Variovorax sp comme observé par Thijs et al. (2014). Les sidérophores sont des composés chélatants qui ont une forte affinité pour le fer et qui sont produits par des microorganismes dans des conditions limitantes du fer (Sharma et al., 2013). Ainsi les sidérophores produits par des bactéries promotrices de la croissance des plantes se lient à la forme indisponible du Fe3+ et accélèrent sa mobilité dans la rhizosphère en le rendant disponible aux plantes, entraînant ainsi une augmentation indirecte de la croissance des plantes (Ma et al., 2009). En plus de favoriser la croissance des plantes, la production de ces chélateurs du fer peut également exercer un rôle de biocontrôle, de biocapteur et de bioremediation (Ahmed et Holmström, 2014). Les sols déficitaires en phosphore pourraient être compensés par la capacité de solubilisation des phosphates inorganiques des PGPR, à travers la production des acides organiques, de phosphatases ou de phytases qui augmentent la biodisponibilité du phosphore dans la rhizosphère (Baldan et al., 2015).

Nos résultats ont révélé que parmi les bactéries testées pour la solubilisation du Ca3(PO4)2, 92% ont été capables de solubiliser le phosphate tricalcique dans le milieu NBRIP. Les microorganismes solubilisateurs des phosphates forment un halo transparent autour des colonies, comme décrit par Kang et al. (2002). Il a été noté que P. fluorescens (K23) produisait les plus grands halos, d'environ 15 mm après 7 jours d'incubation, confirmant que P. fluorescens était un bon solubilisateur des phosphates selon plusieurs études (De Freitas et al., 1997; Henri et al., 2008; Oteino et al., 2015). En outre, parmi les communautés bactériennes du sol, les Bacillus, les Pseudomonas et les rhizobiums ont été décrits comme des solubilisateurs efficaces des phosphates (Igual et al., 2001). Le HCN est un composé volatil, qui joue un rôle majeur dans le contrôle biologique par la suppression de divers agents pathogènes et l’inhibition par conséquent du développement des

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries maladies des plantes (Siddiqui et al., 2006). Cependant, ce composé volatil agit comme un inducteur de la résistance des plantes (Kumar et al., 2012). Les résultats du test qualitatif de la production de HCN ont montré que 42% des bactéries isolées ont été capables de produire du HCN. Une forte capacité de production du HCN a été enregistrée chez le genre Pseudomonas comme observé par Fouzia et al. (2015). Certains isolats testés ci-dessus pourraient présenter plus de deux ou trois caractères PGP, ce qui pourrait favoriser la croissance des plantes directement ou indirectement ou en synergie (Gupta et al., 2000). De plus, il est intéressant de noter que les isolats présentant des activités PGP maximales étaient des endophytes. Les résultats de la bioaccumulation du plomb par les bactéries sélectionnées ont montré que le potentiel d'augmentation de la rétention du Pb2+ n'était pas seulement dû à la liaison à la surface cellulaire, mais aussi à l'accumulation intracellulaire, également observée par Jebara et al. (2015a). La plus grande partie de Pb2+ a été adsorbée à la surface cellulaire de toutes les bactéries (Carrasco et al., 2005). Cette liaison métallique peut être due aux différents composés contenus dans les parois cellulaires tel que les lipopolysaccharides et les phospholipides, chez les bactéries à Gram-négatif et dans les peptidoglycanes, glycoprotéines, acides téichoïques et teichuroniques des parois cellulaires chez les bactéries à Gram-positif (Jarosławiecka et Piotrowska-Seget, 2014). L'accumulation du Pb intracellulaire a augmenté avec l'augmentation du temps d'incubation, ce qui a démontré que l'accumulation du Pb a été liée à la croissance cellulaire et à l'amélioration de la biomasse cellulaire (Fan et al., 2011). Ainsi, le maximum a été obtenu à 48 h et les valeurs les plus élevées ont été enregistrées chez les genres Luteibacter, Bacillus et Pseudomonas. En effet, une étude antérieure a démontré que ces bactéries ont présenté également une capacité importante d'accumulation du Cd2+ dans leurs biomasses (Hrynkiewicz et al., 2015). Cette excellente capacité de sorption des métaux pourrait être due à leurs rapports surface-volume élevés et à la présence de sites de chimiosorption potentiellement actifs (Ayangbenro et Babalola, 2017). Dans la présente étude, différentes combinaisons bactériennes formées de quatre souches efficientes et résistantes aux métaux lourds ont été testées dans des conditions contrôlées afin de sélectionner les combinaisons bactériennes qui favorisent une meilleure croissance de la gesse. Les résultats ont révélé une variabilité de réponse des plantes à la co-inoculation avec des augmentations significatives observées dans les biomasses végétales par rapport aux plantes non inoculées. D'autres études ont confirmé le rôle efficace de la co-inoculations avec des PGPR dans la stimulation de la croissance, de la productivité et du rendement du pois chiche dans le cadre des essais en pot et en plein champ (Dasgupta et al., 2015; Rokhzadi et

Deuxième chapitre Isolement et caractérisation des bactéries

Toashih, 2011). De plus, un grand nombre de bactéries rhizosphériques, y compris les espèces à Bacillus et Pseudomonas, se sont montrées bénéfiques pour les cultures des légumineuses et non légumineuses (Parmar et Dufresne, 2011). Des effets synergiques des rhizobactéries promotrices de la croissance des plantes et de Rhizobium sur la nodulation et la fixation de l'azote par le pois cajan (Cajanus cajan) ont également été observés par Tilak et al. (2006). L'amélioration de la croissance des plantes observée dans notre étude suite à l’inoculation avec des PGPR pourrait être due à la capacité de fixation de l'azote de R. leguminosarum ou à la modulation des niveaux d'hormones végétales par les endophytes qui produisent des substances stimulant la croissance végétale telles que l'AIA et d'autres PGP (Ahemad et Kibret, 2014). La matière sèche des parties aériennes et racinaires et le nombre de nodules les plus élevés ont été enregistrés chez les plantes inoculées avec le consortium 4 formé de R. leguminosarum (M5), B. simplex, Luteibacter sp et Variovorax sp. En effet, Schwartz et al. (2013) a confirmé le rôle effectif de B. simplex sur l'architecture des racines des légumineuses et la morphologie des nodules lorsqu'elles sont co-inoculées avec R. leguminosarum bv viciae (le nombre de racines latérales a augmenté et les nodules sont plus gros et plus larges). De plus, des études antérieures ont montré les effets positifs de Luteibacter sp et Variovorax sp en tant que PGPR sur la croissance de différentes plantes (Guglielmetti et al., 2013; Jiang et al., 2012).

Troisième chapitre

Etude des potentialités des PGPR dans l’amélioration de l'absorption du Pb par Lathyrus sativus et la stimulation de son système de défense

Troisième chapitre Etude des potentialités de L. sativus en présence de plomb

Introduction

Sur la base de la caractérisation moléculaire et des performances symbiotiques des souches bactériennes étudiées (Tableau 8), nous avons sélectionné 10 combinaisons formées de souches efficientes et résistantes au plomb avec un potentiel agronomique intéressant : I4, I3, I5, I8, I10, I12, I15, I18, I20 et I9 et qui ont été nommées par la suite I1, I2, I3, I4, I5, I6, I7, I8, I9 et I10, respectivement. Le but de cette étude est de déterminer la contribution des PGPR dans l'amélioration de la tolérance de Lathyrus sativus au plomb (0,5 mM) ainsi que de déterminer l’effet de l’inoculation sur le potentiel d'accumulation du Pb par cette plante en conditions hydroponiques par l'étude de divers paramètres physiologiques et biochimiques. Ce traitement de 30 jours avec le plomb avait pour objectif de sélectionner les combinaisons bactériennes les plus efficientes qui ont minimisé les effets néfastes du plomb, stimulé le système de défense de leur plante hôte et qui ont amélioré le potentiel de la gesse à absorber et accumuler le plomb.

Souches bactériennes Test de Pb MTC (mM) Gène de AIA (µg ml-1) (Séquençage de l’ADNr 16S) nodulation résistance au Pb (PbrA)

R. leguminosarum (M5) + 1,5 - 30,76±2,46 R. leguminosarum (M6) + 1,5 + 26,17±2,37 R. leguminosarum (M12) + 1,5 + 28,33±1,45 R. leguminosarum (M4) + 1,5 - 23,47±1,07 S. meliloti (M7) - 1,5 - 63,55±3,05 B. megaterium (K5) - 2,5 + 21,85±1,85 B. simplex (K14) - 1,5 + 8,89±1,21 Variovorax sp (K17) - 2,0 - 0,89±0,08 Luteibacter sp (K20) - 2,5 + 47,22±0,84 P. fluorescens (K23) - 2,5 - 2,01±0,83 Pseudomonas sp (K19) - 2,0 - 1,16±0,17

1. Matériel et méthodes

1.1. Mise en place de la culture hydroponique

Les graines de Lathyrus sativus (la population de provenance de Mahdia) ont été désinfectées, stérilisées puis sont mises à germer comme précédemment décrit dans le deuxième chapitre (paragraphe 1.3.10, page 45). Les graines germées ont été transférées sur

Troisième chapitre Etude des potentialités de L. sativus en présence de plomb

11 cristallisoirs contenant de la perlite stérilisée à l’autoclave et imbibée avec de l’eau distillée stérilisée, puis laissées durant une nuit à l’obscurité à 28 °C. Le lendemain, les consortia bactériens sélectionnés (voir les détails de la co-inoculation en bas) ont été utilisés pour l'inoculation de la gesse, après les plantes ont été mises à l’obscurité durant une nuit. Chaque consortium a été préparé en mélangeant quatre souches bactériennes. En effet, les souches ont été préparées sur un milieu YEM (Vincent, 1970) puis sont mises sous agitation continue à 150 rpm pendant 48 h à 28 °C pour obtenir une concentration finale de 109 CFU ml-1. Pour la co-inoculation, les cultures bactériennes des souches cultivées individuellement ont été mélangées et utilisées pour l’inoculation des graines sur la perlite. Une semaine plus tard, les plantules ont été transférées dans des pots en plastique de 5 litres contenant une solution nutritive (Vadez et al., 1996) et les plantules ont ensuite été ré-inoculées (109 UFC -1 ml ). Un traitement métallique de 0,5 mM Pb apporté sous forme de PbCl2 a été appliqué lorsque les plantules ont été âgées de 33 jours. La récolté a été faite au stade floraison (traitement de 30 jours) et les 10 inocula sélectionnés à la fin du premier chapitre ont été utilisés, séparément, pour l'inoculation de la gesse. Des plantes non inoculées ont été utilisées comme témoins (T). L'expérience a été conduite dans des conditions contrôlées à 25 °C/19 °C (jour / nuit), une humidité relative de 60%, une photopériode de 16 h de lumière/8 h d'obscurité et la solution nutritive a été continuellement aérée pour une oxygénation satisfaisante des racines. La solution nutritive a été renouvelée tous les 14 jours. L’expérience a été conduite selon un dispositif complètement randomisé. Les détails de la co-inoculation sont les suivants: T. plantes non inoculées I1: R. leguminosarum (M5)+ B. simplex+ Luteibacter sp+ Variovorax sp I2: R. leguminosarum (M4)+ B. simplex+ Luteibacter sp+ Variovorax sp I3: R. leguminosarum (M12)+ Pseudomonas sp+ Luteibacter sp+ Variovorax sp I4: R. leguminosarum (M12)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Variovorax sp I5: R. leguminosarum (M5)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Variovorax sp I6: R. leguminosarum (M12)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ B. megaterium I7: R. leguminosarum (M5)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ B. megaterium I8: R. leguminosarum (M12)+ P. fluorescens (K23)+ B. megaterium+ S. meliloti I9: R. leguminosarum (M5)+ Variovorax sp+ Luteibacter sp+ S. meliloti I10: R. leguminosarum (M6)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Variovorax sp

La partie aérienne et la partie racinaire ont été séparées, rincées abondamment avec de l'eau déionisée et ensuite divisées en deux parties: la première a été destinée aux dosages

Troisième chapitre Etude des potentialités de L. sativus en présence de plomb biochimiques, la deuxième partie a été séchée à 70 °C pendant 72 h, puis broyée et stockée dans de petits flacons.

1.2. Dosage du plomb

Le dosage du Pb a été fait comme précédemment décrit dans le deuxième chapitre (paragraphe 1.2.2.2, page 39).

1.3. La teneur en chlorophylle et caroténoïdes

La teneur en chlorophylle a (Chl a), chlorophylle b (Chl b), chlorophylle totale (Total Chl) et caroténoïdes (C) a été déterminée par spectrophotométrie selon Lichtenthaler et Wellburn (1983) et exprimée en mg g-1 de matière fraiche (MF). Les pigments photosynthétiques au niveau des feuilles (0,1 g) ont été extraits avec de l'acétone 80%. L'absorbance a été mesurée à trois longueurs d'onde 470, 646 et 663 nm et la teneur en pigments photosynthétiques est calculée grâce aux formules suivantes: -1 Chl a (µg ml )= 12.21A663- 2.81A646 -1 Chl b (µg ml )= 20.13A646- 5.03A663 Chl totale (µg ml-1)= Chl a+ Chl b C (µg ml-1)= (1000A470- 3.27Chl a- 104Chl b)/229

1.4. Dosage des phénols totaux

Les composés phénoliques ont été quantifiés en utilisant la méthode de Folin-Ciocalteu modifiée et décrite par Dewanto et al. (2002). Le réactif de Folin Ciocalteu est un acide de couleur jaune constitué par un mélange d'acide phosphotungstique (H3PW12O40) et d'acide phosphomolybdique (H3PMo12O40). Il est réduit, lors de l'oxydation des phénols, en un mélange d'oxydes bleus de tungstène et de molybdène (Ribereau-Gayon, 1968). La coloration produite, dont l’absorbance maximale à 760 nm, est proportionnelle à la quantité de polyphénols présents dans les extraits végétaux. Les racines et les feuilles de Lathyrus sativus ont été séchées à température ambiante puis broyées en poudre fine. Un échantillon de 2,5 g a été homogénéisé avec 80% d'acétone et les homogénats ont été filtrés avec du papier Whatman. Le filtrat a été récupéré et l'acétone a été évaporé avec l'évaporateur rotatif. L'échantillon dilué (125 μl) a été mélangé avec 0,5 ml d'eau distillée et 125 μl du réactif Folin-Ciocalteu, agité vigoureusement, puis maintenu 5 min à température ambiante. Ensuite, 1,25 ml d'une solution aqueuse de carbonate de sodium

Troisième chapitre Etude des potentialités de L. sativus en présence de plomb

(Na2CO3) à 7% a été additionnée et le mélange est ajusté à 3 ml avec de l'eau distillée. La solution obtenue a été incubée pendant 90 min à l’obscurité et à température ambiante avant d'être mesurée avec un spectrophotomètre à 760 nm. La teneur en composés phénoliques dans les extraits a été exprimée en équivalent d'acide gallique (mg de GAE g-1 MS), qui est utilisé comme composé de référence.

1.5. Détermination des caractéristiques de la membrane

La peroxydation lipidique (LP), la fuite des électrolytes (EL) et l'indice de stabilité des membres (MSI) ont été déterminés:

1.5.1. Peroxydation des lipides: dosage du malondialdehyde (MDA)

La décomposition membranaire a été mesurée avec la méthode décrite par Heath et Packer (1968). Pour étudier la peroxydation des lipides tous les processus sont faits à 4 °C. Un échantillon de 0,5 g a été homogénéisé avec 5 ml d'acide trichloroacétique à 0,1% (TCA), l'homogénat a été centrifugé à 15 000 g pendant 15 min. A une aliquote de 1 ml du surnageant, on a ajouté 4 ml d'acide thiobarbiturique à 0,5% (TBA) dans du TCA à 20%. Le mélange a été chauffé à 95 °C pendant 30 min puis rapidement refroidi avec de la glace. Après centrifugation à 10 000 g pendant 10 min, l'absorbance du surnageant a été mesurée à 532 nm et 600 nm. La densité optique est ensuite corrigée par la soustraction de l’absorbance non spécifique à 600 nm. La concentration du malondialdéhyde (MDA) a été calculée en utilisant son coefficient d’extinction 155 mM-1cm-1, selon la formule suivante: MDA (nmol ml-1) = [(A532-A600) /155000] 106. La teneur en MDA a été exprimée par la suite en nmol g-1 MF.

1.5.2. Mesure de la perméabilité membranaire

La fuite des électrolytes (EL), marqueur de fragilité membranaire, a été déterminée selon Dionisio-Sese et Tobita (1998), en utilisant un conductimètre électrique. Des échantillons de 100 mg de feuilles fraîches ont été coupés en disques de 5 mm de diamètre. Les disques foliaires sont par la suite mis dans des tubes à essai contenant 10 ml d'eau déionisée et l’ensemble est placé dans un bain marie à 32 °C pendant 2 h, la conductivité initiale est enregistrée (EC1). Les mêmes échantillons ont été autoclavés à 121 °C pendant 20 min et puis refroidis à 25 °C, la conductivité est mesurée une seconde fois (EC2). La fuite des électrolytes (EL) a été calculée en utilisant la formule suivante: EL (%)= (EC1 / EC2) × 100

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1.5.3. Indice de stabilité membranaire

L’indice de la stabilité membranaire (MSI) a été déterminé selon la méthode décrite par Sairam et al. (2002). Des échantillons de feuilles (0,1 g) ont été coupés en disques de taille homogène puis placés dans 10 ml d’eau déionisée et l’ensemble est mis à 40 °C pendant 30 min, la conductivité a été mesurée (C1). Après, les mêmes échantillons ont été placés dans un bain d’eau bouillante (100 °C) pendant 10 min et la conductivité a été enregistrée une deuxième fois (C2). L’indice de la stabilité membranaire (MSI) a été calculé comme suit: MSI = [1– (C1/C2)] × 100

1.6. Dosage de la proline

La teneur en proline a été déterminée selon la méthode décrite par Bates et al. (1973). Les échantillons (0,5 g) ont été extraits avec de l'acide sulfosalicylique à 3%. Les extraits végétaux récupérés (2 ml) ont été maintenus pendant 1 h dans de l'eau bouillante en ajoutant une quantité égale d'acide acétique glacial et du réactif à la ninhydrine. Après refroidissement du mélange réactionnel, 2 ml de toluène a été ajouté. Le chromophore a été aspiré à partir de la phase aqueuse, et l'absorbance a été mesurée à 520 nm et calculée en µmol g-1 MS à partir d'une gamme étalon de proline pure.

1.7. Détermination de la teneur en sucres solubles

La teneur en sucres solubles a été déterminée selon la méthode décrite par Shields et Burnett (1960). Les feuilles et les racines (0,25 g) ont été homogénéisées dans de l'éthanol à 80%. L'extrait a été vortexé et incubé à 70 °C pendant 30 min, puis centrifugé à 3000 rpm pendant 30 min. Le surnageant a été recueilli et 5 ml d'une solution d'anthrone à 0,2% (dans de l'acide sulfurique à 96%) ont été ajoutés à l'extrait, puis incubés à 100 °C pendant 10 min. Les échantillons ont ensuite été refroidis à la glace pendant 10 min. L'absorbance a été lue à 640 nm à laide d’un spectrophotomètre et la teneur en sucres a été estimée à partir d'une courbe standard préparée avec une concentration connue de glucose et exprimée en mg g-1 MS.

1.8. Accumulation du Cu, Zn et Ca suite à l’application du traitement métallique

La concentration des nutriments essentiels (Cu, Zn et Ca) dans les différentes parties de la plante a été déterminée comme précédemment décrit dans le deuxième chapitre (paragraphe 1.2.2.2, page 39).

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1.9. Dosage des enzymes antioxydants

1.9.1. Extraction des protéines et des enzymes

Toutes les étapes ont été réalisées à 4 °C pour maintenir les activités enzymatiques. Les feuilles, les racines et les nodules ont été d’abord broyés en présence de l’azote liquide, puis 50 mg de polyvinylpyrrolidone (PVP) et 1 ml d’un tampon d’extraction (50 mM tampon phosphate (pH=7,8), 10 mM de dithio-DL-thréitol DTT, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 0,1 mM EDTA) ont été ajoutés (Gogorcena et al., 1997). L’homogénat obtenu a été centrifugé à 14000 g pendant 20 min et le surnageant a été utilisé pour le dosage des activités enzymatiques. Pour l’extraction de l’ascorbate peroxydase, 5 mM d’ascorbate sont additionnés au tampon d’extraction afin de préserver l’activité de cette enzyme. 1.9.2. Dosage des protéines solubles

La concentration des protéines a été estimée selon la méthode de Bradford (1976), basée sur l'adsorption d'un colorant, le bleu de Coomassie G250 aux protéines. Ce dernier vire de la couleur rouge à la couleur bleue, avec une intensité proportionnelle à la quantité de protéines, et mesurable par spectrophotomètrie à 595 nm. La teneur en protéines est déterminée en utilisant l’albumine de sérum bovin (BSA) comme standard.

1.9.3. Dosage des activités enzymatiques

Les activités enzymatiques ont été évaluées par spectrophotométrie, en suivant l’évolution de l’absorbance du milieu réactionnel due à l’oxydation de leur co-substrat (ascorbate pour l’APX, gaïacol pour le gaïacol peroxydase; POX) ou la réduction du substrat (H2O2 pour la CAT). L’évaluation de l’activité SOD est différente.

1.9.3.1. Activité gaïacol peroxydase GPOX (EC 1.11.1.7)

L’activité GPOX est mesurée selon la technique décrite par Anderson et al. (1995). Le milieu réactionnel contient 50 mM du tampon phosphate pH 7, 9 mM de gaïacol et 19 mM de

H2O2. La réaction est initiée par addition de H2O2. La cinétique de la formation du tétraguaïacol à partir du gaïacol à 470 nm a été mesurée pendant 1 min et le coefficient d'extinction (ε = 26,6 mM-1 cm-1) a été utilisé pour le calcul de l’activité GPOX.

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1.9.3.2. Activité superoxyde dismutase SOD (EC 1.15.1.1)

La détermination spectrophotométrique de l'activité superoxyde dismutase a été dosée en suivant l'inhibition de la réduction photochimique du nitro bleu tétrazolium (NBT) par l’anion •‾ superoxyde O2 , en condition d’aérobie, formé à partir de l’oxydation de la riboflavine présente dans le milieu réactionnel selon le protocole de Yu et Rengel (1999). Le milieu réactionnel contient l’extrait enzymatique; 50 mM HEPES pH 7; 0,1 mM EDTA, 50 mM

Na2CO3; 13 mM méthionine; 0,025 w/v Triton X100, 75 µM NBT et 2 µM riboflavine. La riboflavine cède un électron au dioxygène O2 sous l’effet d’une intense source lumineuse. La réaction commence par l’exposition du milieu réactionnel à une source lumineuse et se termine par la mesure de l’absorbance à 560 nm.

1.9.3.3. Activité catalase CAT (EC 1.11.1.6)

L’activité catalase est déterminée par spectrophotométrie en suivant le déclin de H2O2 à 240 nm en fonction du temps selon la méthode Aebi (1984) dans un milieu réactionnel formé de l’extrait enzymatique, 50 mM tampon phosphate (pH=7) et 15 mM H2O2. La détermination de l’activité de cette enzyme est calculée à partir du coefficient d’extinction ε=0,036 mM-1 cm-1 et exprimée en mM de H2O2 décomposé par minute et par µg de protéines.

1.9.3.4. Activité ascorbate peroxidase APX (EC 1.11.1.11)

L'activité ascorbate peroxydase a été mesurée en suivant la diminution de l’absorbance à

290 nm en fonction du temps, causée par l’oxydation de l’ascorbate en présence de H2O2 (Amako et al., 1994). Le milieu réactionnel contient l’extrait enzymatique, 50 mM de tampon phosphate (pH 7), 0,5 mM ascorbate et 0,2 mM H2O2. L’activité de cette enzyme est calculée en utilisant le coefficient d’extinction ε=2,8 mM-1 cm-1.

1.10. Analyse statistique

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2. Résultats

2.1. Effet de l'inoculation sur la croissance de Lathyrus sativus en présence de Pb

2.1.1. La biomasse végétale

L’analyse statistique de la variance (à p < 0,05) a montré que la différence est significative entre la croissance des différentes plantes inoculées et traitées par rapport au témoin non inoculé et traité (Figure 30). L’inoculation avec des PGPR a significativement amélioré le développement de la partie aérienne et de la partie racinaire de Lathyrus sativus par rapport au témoin non inoculé (Figure 30). En effet, les inocula sélectionnés ont amélioré la biomasse végétale de 15 à 109% au niveau de la partie aérienne et de 19 à 56% au niveau de la partie racinaire (Figure 30). Les valeurs les plus élevées de la matière sèche des parties aériennes ont été obtenues avec les inocula I5; I6; I7 et I9. En outre, l'inoculation avec I9 et I5 a amélioré la matière sèche des parties racinaires et aériennes respectivement, de 1,5 fois et 2 fois par rapport au témoin non inoculé (Figure 30). Le traitement avec la concentration modérée de Pb (0,5 mM) n'a montré aucun symptôme de toxicité visible malgré la diminution significative de la MSA de toutes les plantes à l'exception de celles inoculées avec I1, I3, I5, I7 et I10. Parmi les différents inocula testés, I5 (R. leguminosarum (M5) + P. fluorescens + Luteibacter sp + Variovorax sp) a fourni la MSA la plus élevée en présence de 0,5 mM Pb (1,03 g de plante-1). De plus, l'inoculation avec I9 formé de R. leguminosarum (M5) + Variovorax sp + Luteibacter sp + S. meliloti a donné en présence de plomb la MSR la plus importante (0,24 g de plante-1) 2 fois plus élevée que le témoin non inoculé (Figure 30).

2.1.2. La teneur en azote total

Tous les inocula testés, à l'exception du consortium I6, ont augmenté significativement la teneur en azote des feuilles de leur plante hôte par rapport au témoin non inoculé (Figure 30). Les valeurs les plus élevées ont été enregistrées avec les inocula I1 et I9, qui ont amélioré significativement le N total de 99 et 120%, respectivement. L'addition du métal n'a pas affecté la teneur en azote chez toutes les plantes.

2.1.3. La nodulation

On a observé que le nombre de nodules le plus élevé a été obtenu avec les inocula I1 et I2 (99 et 106 nodules plante-1, respectivement), alors que les plantes inoculées avec I4 ont

Troisième chapitre Etude des potentialités de L. sativus en présence de plomb présenté le nombre de nodules le plus faible (37 nodules plante-1). Comme prévu, les plantes non inoculées n'ont montré aucune formation de nodules. Cependant, le traitement avec le plomb n'a pas réduit le nombre de nodules chez toutes les plantes inoculées (Figure 30).

1,2 a a ab ab bc cd 1 cde

fg def ef ef

) fgh fg 1 0,8 ghi - hi hi ij i ij 0,6 ji kl kl

(g PL (g l

0,4 parties aériennesparties Matièresèchedes 0,2 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10

0,3 b a ab ab a a 0,25 ab cd bc ) cd cd

1 cd cd

- cde 0,2 ef de deef de fg gh gh

(g PL (g 0,15

0,1 parties racinaireparties Matièresèchedes 0,05 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10

c 140 a ab 120 abc ab bc bcd bc bc cdef

100 bc cde bc defg bcd cdef

) efg 1 fg - 80 g

(PL 60 h h 40 20 i i Nombre de nodulesNombrede 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10

7 a abc ab d cd bcd 6 bcd cde cde de gh ef 5 ghij fg ghi

hij ghij 4 ijk jkl ij jk kl l (%) 3 2

1 Teneuren azote 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 consortium bactérien

- Pb + 0,5 mM Pb Figure 30: Effets des PGPR sur les paramètres de croissance de Lathyrus sativus en présence de plomb. Le traitement métallique (0,5 mM Pb) a été initié lorsque les plantes ont été âgées de 33 jours et la récolte a été faite au stade de la floraison (après 30 jours de l’application du métal). a: La matière sèche des parties aériennes; b: La matière sèche des parties racinaires; c: Le nombre de nodules; d: La teneur en azote total. Les résultats sont des moyennes (± SD) de cinq mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05.

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2.2. Accumulation du plomb par les plantes

Chez les plantes traitées avec le plomb, les résultats ont montré que les racines et les nodules contenaient des concentrations du plomb supérieures à celles des feuilles. Mais une quantité importante de ce métal a été également mesurée au niveau de la partie aérienne chez toutes les plantes avec les plus fortes améliorations dans le potentiel d’absorption du plomb enregistrées avec les inocula I5 et I7 (52% et 56%, respectivement), par rapport au témoin non inoculé (Tableau 9). En effet, la présence de PGPR efficients et résistants au plomb a augmenté significativement l'accumulation du plomb dans les feuilles, les racines et les nodules. L'accumulation maximale du Pb a été enregistrée au niveau des racines (104,7 mg g-1 MS) et des nodules (96,5 mg g-1 MS) des plantes inoculées avec l’inoculum I1.

Feuilles (mg g-1 MS) Racines (mg g-1 MS) Nodules (mg g-1 MS)

Pb Ca Zn Cu Pb Ca Zn Cu Pb Ca Zn Cu

T 41,2±1,3f 140,1±13,1a 4,2±0,2c 4,8±0,2b 71,2±5,4d 128,4±12,5b 3,8±0,3e 4,5±0,3b _ _ _ _

I1 57,7±1,6c 130±11,5ab 4,3±0,2c 6,5±0,3a 104,7±4,3a 119,1±8,6b 5,5±0,3cd 6,8±0,5a 96,5±3,4a 122,6±6,6b 10,8±1,1a 18,5±0,8a

I2 55,5±1,4cd 124,8±6,7ab 4,8±0,4c 5,9±0,5a 95,1±4,5ab 118,5±11,4b 4,2±0,2e 5,8±0,5a 87,8±1,2ab 58,8±11,9c 12,6±1,2a 17,2±1,1a

I3 46,9±2,5e 108,3±10,8b 4,4±0,3c 3,1±0,2c 94,4±4,7ab 120,6±9,9b 4,4±0,4de 3,8±0,2bc 56,1±2,2de 74,5±8,1c 6,8±0,6bc 10,3±1,1bc

I4 46,8±1,5e 77,4±11c 4,6±0,3c 4,6±0,2b 84,5±3,2bc 109,2±7,3b 4,3±0,3e 3,5±0,5bc 68,5±1,9c 74,2±7,5c 5,4±0,3c 10,9±0,8bc

I5 62,8±2,7ab 51,1±5,8cd 5,2±0,4bc 4,1±0,4b 74,6±5,2cd 76,1±6,1cd 7,6±0,5a 4,3±0,4b 81,1±6,3b 183,2±16,7a 6,8±0,4bc 8,6±0,3c

I6 55,1±1,3cd 39,7±4,1d 4,9±0,1c 3,9±0,2bc 95,6±4,3ab 58,5±4,8d 5,6±0,2c 2,7±0,1cd 56,7±3,1de 68,7±5,1c 6,3±0,6bc 11,2±1,2b

I7 64,2±0,3a 129±12,3ab 6,1±0,4b 3,1±0,3c 66,5±5,1d 153,7±4,4a 6,4±0,3bc 4,2±0,2b 51,1±6,1e 125,1±10,9b 7,6±0,7b 9,3±0,6bc

I8 57,2±2,4cd 109,4±9,3b 4,8±0,3c 2,1±0,1d 99,2±1,6a 84,7±4,1c 7,1±0,5ab 2,3±0,1d 64,2±2,1cd 20,4±2,3d 7,3±0,6bc 11,7±1,1b

I9 52,7±1,8d 106,1±8,5b 7,1±0,6a 4,2±0,2b 99,3±6,6a 71,6±6,5cd 7,9±0,3a 3,9±0,3b 57,2±3,1de 101,9±5,5b 6,7±0,3bc 10,8±0,7bc

I10 58,5±0,3bc 39,5±3,1d 6,1±0,2b 2,0±0,1d 101,2±1,1a 65,4±3,6cd 6,4±0,2bc 3,7±0,5bc 50,4±4,1e 73,9±7,3c 6,5±0,5bc 10,3±0,5bc

Les valeurs représentent la moyenne de 5 répétitions (± SD). Pour chaque colonne, les valeurs suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes, selon le test Tukey HSD test à p < 0,05.

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2.3. Teneur en nutriments essentiels

L'analyse minérale a révélé que l'accumulation du Cu la plus élevée a été enregistrée au niveau des feuilles, des racines et des nodules des plantes inoculées avec I1 (Tableau 9). De plus, la plus forte accumulation du Zn a été notée au niveau des feuilles et des racines des plantes inoculées avec I9 (7,1 et 7,9 mg g-1 MS, respectivement), tandis que la teneur en Zn dans les nodules a été assez élevée chez les plantes inoculées avec les inocula I1 et I2 (Tableau 9). Les données ont également montré que l'accumulation du Ca la plus élevée a été enregistrée au niveau des feuilles et des racines des plantes de Lathyrus sativus inoculées avec I7 (64,2 et 153,7 mg g-1 MS, respectivement). En outre, la concentration de cet élément a été très importante dans les nodules des plantes inoculées avec l’inoculum I5 (183,2 mg g-1 MS).

2.4. Teneur en chlorophylle et en caroténoïdes

Les résultats ont montré que les plantes inoculées avec des PGPR ont donné des taux de chlorophylle totale significativement plus élevées que celles retrouvées chez le témoin non inoculé, principalement dans l'ensemble des plantes inoculées avec I5 qui ont présenté une augmentation de 222% (Figure 31). Cependant, la teneur en chlorophylle des feuilles de gesse a diminué avec le traitement métallique, à l'exception des plantes inoculées avec I1, I5 et I10, où aucune différence significative n'a été observée par rapport à leurs contrôles respectifs. En outre, la plus forte teneur en chlorophylle en présence de plomb a été enregistrée chez les plantes inoculées avec I5 (2,43 mg g-1 MF). De même, les plantes inoculées ont présenté des teneurs en caroténoïdes significativement plus élevées que celles du témoin non inoculé (sauf les plantes inoculées avec I3 et I6), la plus forte augmentation significative (63%) a été enregistrée chez les plantes inoculées avec I7. Nos résultats ont indiqué que 0,5 mM Pb a augmenté la teneur en caroténoïdes d'un facteur de 2,5 chez les plantes inoculées avec I7 par rapport à celles non inoculées (Figure 31).

2.5. Estimation des phénols totaux

Le traitement avec 0,5 mM Pb a augmenté significativement la teneur en phénols des feuilles, quelque soit le processus d'inoculation (Figure 31). En revanche, en présence du plomb la teneur en polyphénols des racines des plantes inoculées a été améliorée de 2 à 99% par rapport à celles non inoculées. L'accumulation la plus élevée des composés phénoliques a

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été observée dans les racines des plantes inoculées avec I1, où elle a été multipliée par deux par rapport aux plantes non inoculées.

3 a a a bc b b cd de d 2 de de de ef de f f f ef

MF) f g

1 g - 1 h

i (mg g (mg

chlorophylle totalechlorophylle 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 b 0,3 a

0,2 c c c c MF) de cd de 1 e e - f f fg f gh hi fg ij j j

(mg g (mg 0,1

k Teneur enTeneurcarotenoides 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10

c 8 a

a a a a a a a a a a MS)

6 1 - b b b b b b b b b b b 4

des feuilles feuilles des 2 Phénols totaux Phénols (mg de GAE deGAE (mg g 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10

d a

MS)

- 6

b b b 4 bcd bc bc b cd cd de ef fg efg des racinesdes fg fg

2 fg g fg g fg fg

Phénols totaux Phénols

(mg de GAE (mgGAE de g

0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 Inoculum bactérien

- Pb + 0,5 mM Pb

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2.6. Peroxydation des lipides et fuite des électrolytes (EL%)

Le traitement avec le Pb (0,5 mM) a augmenté significativement le niveau de peroxydation lipidique chez les plantes de Lathyrus sativus, mesuré en taux de production de malondialdéhyde au niveau des feuilles et des racines (Figure 32). De plus, en présence du métal les résultats ont montré une augmentation remarquable du niveau de fuite ionique et une diminution de la stabilité membranaire, au niveau des feuilles des plantes inoculées par rapport aux plantes témoins, avec le pourcentage le plus élevé de EL enregistré chez les plantes non inoculées (30%). Cependant, l'inoculation avec des PGPR a réduit significativement le niveau de MDA dans les feuilles (17 à 24%) et les racines (25 à 45%) en présence de Pb par rapport aux plantes non inoculées. De plus, l'inoculation a amélioré significativement la stabilité de la membrane et a réduit la fuite des électrolytes surtout chez les plantes inoculées avec I1, I5 et I9.

2.7. Teneur en proline et en sucres solubles

L’accumulation de la proline est une des stratégies adaptatives déclenchées par la plante face aux contraintes de l’environnement. Cet acide aminé, marqueur de la résistance aux contraintes abiotiques, a été étudié dans les feuilles, les racines et les nodules des plantes de Lathyrus sativus. L’analyse statistique de la variance (à p < 0,05) a montré que le plomb a influencé significativement la teneur en proline et en sucres solubles (Figure 33). Une augmentation des quantités de proline chez toutes les plantes inoculées et non inoculées a été enregistrée. En effet, la plus forte stimulation dans la synthèse de la proline a été observée au niveau des feuilles des plantes inoculées avec I9 de 285% et au niveau des racines des plantes inoculées avec I1 de 317% (Figure 33). Aussi, une accumulation importante de proline a été enregistrée au niveau des nodules des plantes inoculées avec I1 et I5 (31 et 33 μmol g-1 MS, respectivement). De plus, l'inoculation des plantes avec des PGPR a amélioré significativement la teneur en sucres solubles (Figure 33). Cette augmentation étant plus prononcée dans les feuilles et les racines des plantes inoculées avec I5 de 134% et 67%, respectivement, par rapport aux plantes non inoculées. Les résultats obtenus ont également montré que le traitement avec le Pb a affecté le métabolisme des glucides chez Lathyrus sativus. En effet, 0,5 mM de Pb a significativement diminué le niveau des sucres solubles dans les feuilles et les racines (Figure 33). De plus, en présence de plomb, la teneur en sucres solubles a été plus élevée chez les plantes inoculées avec I1, I5 et I7 que chez les autres plantes.

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a 30 a

b b b b b b b MF)

b b b 1 - 20

cd c c cde cde cde cde cde cde

10 e de MDA (nmol g MDA 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10

b a

MF)

1 - b 10 b bcd bc b b b b b cde e e cde e de cde de e e e e

5 MDA (nmolg 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 c 40 a 30 bc b bc bc bc cd cd d d d 20

(%) e e ef e ef ef ef fg g 10 g g

Fuite deselectrolytes Fuite 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 d 120 a a ab abc a ab ab ab bcd cde def def 80 fg fg f fg ef gh gh h gh h

40 membranes(%)

Indice de stabilité stabilité deIndicedes 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 consortium bactérien

- Pb + 0,5 mM Pb

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a 50

MS) 1

- 40 b 30 b bc bc c bc bc bc d d 20 d d d d d de de de de ef f

10 Proline (µmolProlineg 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 b 25

MS) a 1

- 20

10 b bc cd cd de cd de de de cd de ef de 5 fg

g g g g g g g Proline (µmolProlineg 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10

c 40 ab a MS) c cd bc 1 1 30 cd cde efg def fgh def efg efgh i i i i hi ghi 20 i

10 Proline (µmolgProline 0 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10

80 a

b bc 60 cd cd

MS) d d d

1 - e e 40 ef ef ef fg gh

h h gh gh h gh gh (mgg

20 Sucres solublesSucres

0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10

e 80

a a a 60 b

MS) bc c

1 c c - d 40 d de d de ef ef

gh fg (mgg

20 h h h h h Sucres solublesSucres

0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 Inoculum bactérien

- Pb + 0,5 mM Pb Figure 33: Effets du traitement métallique sur la teneur en proline des feuilles (a), des racines (b) et des nodules (c) et sur la teneur en sucres solubles des feuilles (d) et des racines (e) de Lathyrus sativus inoculées avec des PGPR. Les résultats sont des moyennes (± SD) de cinq mesures. Les moyennes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05.

Troisième chapitre Etude des potentialités de L. sativus en présence de plomb

2.8. Réponse des enzymes antioxydants au traitement métallique

Les plantes de Lathyrus sativus traitées avec 0,5 mM Pb ont montré une induction importante de l’activité des enzymes antioxydants clés (la superoxyde dismutase SOD, la catalase CAT, l’ascorbate peroxydase APX et de la peroxydase GPOX) qui ont varié en fonction du tissu végétal (feuilles, racines et nodules) comme indiqué dans la Figure 34. De plus, le traitement avec le plomb a stimulé significativement l’activité des enzymes antioxydants chez les plantes inoculées et non inoculées, mais en général, toutes les plantes inoculées avec des PGPR ont présenté une augmentation plus élevée des enzymes piégeant les ERO, par rapport au témoin non inoculé (Figure 34). Les résultats suggèrent que le Pb a induit toutes les activités des enzymes antioxydants au niveau des racines et a stimulé l’activité de SOD, GPOX et CAT au niveau des feuilles; cependant, seules SOD, GPOX et APX ont été activées au niveau des nodules. • ‾ SOD est une enzyme clé qui convertit l'O2 en un élément moins toxique (H2O2). On a enregistré que l’inoculation des plantes avec des PGPR a amélioré l’activité SOD en présence de plomb, de 5% à 35% au niveau des feuilles et de 3% à 150% au niveau des racines. Parmi les différents inocula, l’inoculation avec I1, I5 et I9 a donné l'activité SOD la plus élevée dans les feuilles (35, 28 et 24%, respectivement). Dans les racines, l'inoculum I9 a stimulé significativement l'activité SOD, sous 0,5 mM Pb, d'environ 2,5 fois. Cependant, l'inoculation avec I10 a fourni l'activité SOD la plus élevée dans les nodules (Figure 34).

GPOX, CAT et APX sont des enzymes très importantes qui récupèrent l'excès de H2O2 et génèrent H2O et O2. Le traitement avec le Pb a stimulé l'activité de GPOX dans les feuilles et les racines, mais l’a diminué dans les nodules. Par rapport aux plantes non inoculées, l'activité GPOX a été significativement induite dans les feuilles et les racines des plantes inoculées avec I1 de 156 et 544%, respectivement. De plus, l'inoculation avec I1 a donné l'activité GPOX la plus élevée dans les nodules (Figure 34). La présence de plomb a stimulé l'activité CAT dans les feuilles et les racines mais l’a diminué dans les nodules des plantes inoculées. En particulier l'activité CAT a augmenté significativement dans les feuilles et les racines des plantes inoculées avec I9 de 206 et 243%, respectivement, par rapport aux plantes non inoculées. Cependant, en présence de 0,5 mM Pb, l'activité APX a diminué dans les feuilles et a augmenté dans les racines et les nodules. Cette augmentation étant 3,5 fois plus importante dans les racines des plantes inoculées avec I5 que celle notée dans les racines des plantes non inoculées. En outre, l'inoculation avec I5 et I10 a donné l'activité APX la plus élevée au niveau des nodules (Figure 34).

Troisième chapitre Etude des potentialités de L. sativus en présence de plomb a 10 300 a a ab b b b b c 8 c d d 200 d d d 6 de ef e gh fg e hi ij ghi i ij 4 ij f fg f fg fg l ijk jkl ijk kl kl 100 gh gh gh gh gh gh h

2 CAT Activité Activité GPOX Activité 0 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10

30 200

a a b b bcd ab abc bc de bcd cde 150 d cd d fg ef e e 20 g g fg ef fg gh hi gh ghi 100 j ij j h h h h j j 10 hij hi

k ijk jk ijk ijk 50 k

Activité APX Activité Activité SOD Activité 0 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 b 30 80 a

a b 60 c

20 b b d d

e cd d c cd 40 f e g g i gh gh 10 fg gh e ij ijk hi i hi ij j gh fgh f 20 l i hi i jk jk ij jkl kl

k jk CAT Activité Activité GPOX Activité 0 0

T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10

60 300 a a 40 200 b

b b b c c

c c d d de de e d de ef ef 20 f 100 fgh efg e fgh fg gh ghi hi ijk i hi i i i hi i hi jkl hi ij l kl

Activité SOD Activité jkl l Activité APX APX Activité 0 0 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 T I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10

2 200 c a b b a b 1,5 d c cd cd 150 cd e d c f g ef e 1 g g 100 f ef f f f g ef h gh ghi g h h hi i ij hi gh

0,5 50 ij j ij

Activité CAT Activité Activité Activité GPOX 0 0 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10

a 30 a ab cd bc 12 b d de f f f ef f cd c c 20 f d g g g g 8 e ef ef f fg h h h h gh hi h gh 10

4 j ij hij hi hij

Activité SOD Activité Activité APX 0 0 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 Inoculum bactérien Inoculum bactérien

-Pb + 0,5 mM Pb

Troisième chapitre Etude des potentialités de L. sativus en présence de plomb

3. Discussion

La présence de plomb provoque de nombreux symptômes de stress chez les plantes, y compris l'inhibition de la croissance qui est considérée comme l'un des plus importants indices de tolérance aux métaux lourds (Nareshkumar et al., 2015). Dans la présente étude, le traitement avec le plomb a réduit la croissance des plantes et la production de biomasse. Une réponse similaire à un traitement avec le plomb a déjà été observée chez différentes espèces végétales (Batista et al., 2017). De même, le plomb peut affecter directement l'élongation cellulaire en inhibant les enzymes de la paroi cellulaire et en atténuant la translocation des électrons dans le processus photosynthétique et la respiration, ce qui réduit la croissance des plantes (Zaefarian et al., 2012). Il est intéressant de noter que les racines ont été plus influencées par le stress causé par le plomb que les parties aériennes des plantes, ce qui pourrait être attribué à l'accumulation plus élevée du plomb dans les racines de L. sativus (Brunet et al., 2008). Ceci est en accord avec les résultats de Kaur et al. (2012) qui ont décrit des observations similaires avec les plantes de Triticum aestivum soumises à un stress causé par la présence de Pb. En effet, les racines sont le premier site d'exposition au métal et par conséquent, la biomasse racinaire a été plus affectée que la biomasse arienne, entraînant une réduction dans la production de la matière sèche (Puertas-Mejía et al., 2010). De plus, nos résultats ont démontré que l'inoculation des plantes avec des PGPR efficients et résistants au plomb, particulièrement avec I1, I5 et I9, a affecté remarquablement les paramètres agronomiques des plantes en présence du métal, probablement en atténuant la toxicité causée par le Pb (Zaefarian et al., 2012) et en améliorant la croissance des plantes par rapport aux plantes non inoculées et traitées avec le métal. L'amélioration des paramètres de croissance observée chez les plantes inoculées avec I1, I5 et I9 peut être due à la capacité de fixation de l'azote de R. leguminosarum (M5) et à la production importante d'AIA par Luteibacter sp et au potentiel de ces PGPR à produire les substances promotrices de la croissance des plantes. D'autres études ont confirmé le rôle efficace des inoculations combinées de PGPR dans la stimulation de la croissance et de la productivité de différentes légumineuses soumises à un stress métallique (Dasgupta et al., 2015; Fatnassi et al., 2015). Les résultats ont également révélé que L. sativus a été capable d'accumuler le Pb au niveau de ses différentes parties à des concentrations élevées. L'aptitude de la gesse dans l'accumulation et la tolérance aux ions Pb indique que cette plante peut avoir un mécanisme d'accumulation efficace pour l'élimination du plomb des sites contaminés. En effet, le potentiel de L. sativus à accumuler des métaux lourds a également été décrit par Brunet et al.

Troisième chapitre Etude des potentialités de L. sativus en présence de plomb

(2008) et Talukdar (2014). De plus, la gesse a présenté la capacité maximale d'absorber et d'accumuler du Pb comparativement à d'autres légumineuses (Beladi et al., 2011). Dans la présente étude, l'accumulation du Pb dans les feuilles, les racines et les nodules a été significativement améliorée par l'inoculation, avec l’accumulation la plus élevée enregistrée au niveau des feuilles des plantes inoculées avec I5 et I7, au niveau des racines et des nodules des plantes inoculées avec I1. Nos résultats sont en accord avec des études antérieures démontrant que l'inoculation avec des PGPR résistants aux métaux augmente significativement l'absorption des métaux lourds par les plantes comparativement au témoin non inoculé (Chen et al., 2010; Ma et al., 2011). Dans ce travail, l'augmentation de l'accumulation du Pb observée au niveau des feuilles des plantes inoculées avec I5 (R. leguminosarum (M5)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Variovorax sp) et I7 (R. leguminosarum (M5)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ B. megaterium) peut être liée à l'effet combiné de la résistance au Pb de P. fluorescens (K23) et de Luteibacter sp. En outre, le rôle effectif de B. simplex co-inoculée avec R. leguminosarum sur l'architecture racinaire et la morphologie nodulaire (Schwartz et al., 2013) peut expliquer l'augmentation de l'absorption du Pb par les racines et les nodules des plantes inoculées avec I1 (R. leguminosarum (M5)+ B. simplex+ Luteibacter sp+ Variovorax sp). De plus, l'inoculation avec des PGPR peut stimuler la production de différentes enzymes dégradantes, acides organiques, chélateurs de fer et sidérophores, qui pourraient inhiber l'effet phyto-toxique des polluants et augmenter l'absorption des métaux et leur accumulation dans différentes parties de la plante (Kamran et al., 2015; Yousaf et al., 2010). Étant un élément non essentiel, le Pb n'a pas de fonction biologique, mais il est facilement absorbé et accumulé dans les différentes parties de la plante et a été signalé de causer des dommages oxydatifs liés à la production des ERO qui entrainent une perturbation de l'équilibre métabolique et qui causent des dysfonctionnements morphologiques, physiologiques et biochimiques menant à l'oxydation et la destruction des lipides, des protéines et de l'ADN au niveau des cellules stressées (Sewelam et al., 2016). Avec l'accumulation du Pb dans les tissus végétaux, on a observé des effets sur les pigments photosynthétiques avec des niveaux réduits de chlorophylle et une augmentation du taux de caroténoïdes particulièrement accentuée par l'inoculation avec les PGPR. De même, des réductions de la teneur en chlorophylle, après exposition aux métaux lourds, y compris le plomb, ont été observées chez différentes espèces végétales (Kamran et al., 2016; Marzban et al., 2017). La diminution de la synthèse de la chlorophylle peut être due à l'inhibition de l'activité enzymatique telle que la protochlorophyllide réductase et l'acide aminolévulinique

Troisième chapitre Etude des potentialités de L. sativus en présence de plomb entraînant une baisse du processus photosynthétique (Singh, 2005). Néanmoins, les inoculations avec des PGPR ont augmenté significativement la teneur en chlorophylle totale des plantes de gesse, avec le maximum atteint avec l’inoculum I5. Une synthèse élevée de chlorophylle au niveau des plantes améliore l'activité photosynthétique et la production d'amidon, ce qui pourrait favoriser l'amélioration de la croissance des plantes dans des conditions de stress (Mahmood et al., 2016). De plus, l'inoculation avec des PGPR a augmenté la teneur en caroténoïdes en présence de Pb, en particulier chez les plantes inoculées avec I7. Ceci est en accord avec les travaux de Srivastava et al. (2013) qui ont signalé une nette amélioration de la teneur en caroténoïdes chez Brassica juncea sous toxicité à l'arsenic lorsque les plantes ont été inoculées avec des PGPR. En effet, la teneur en caroténoïdes augmente pour protéger la cellule contre la toxicité des métaux et sert d'antioxydant pour éliminer les radicaux libres, réduisant ainsi les dommages liés à la membrane cellulaire sous la contrainte métallique (Havaux, 2014; Hou et al., 2007). La production des espèces réactives de l’oxygène chez les plantes est également connue pour son effet nocif d’endommager les lipides dans la membrane cellulaire. Dans la présente étude, le stress métallique a augmenté la teneur en MDA, ceci est en corroboration avec les résultats de Hashem et al. (2016) et Chiboub et al. (2018). De plus, l'augmentation de la production des espèces réactives de l’oxygène (ERO) en réponse à la toxicité causée par le Pb a augmenté la perméabilité de la membrane et a réduit sa stabilité chez les plantes. Małkowski et al. (2002) ont également démontré que l'exposition au plomb induisait la fuite des ions essentiels. Dans la présente étude, les plantes inoculées avec des PGPR ont montré une teneur en MDA et une EL significativement plus faibles que les plantes non inoculées. Cette réduction du taux de MDA dans les feuilles et les racines des plantes inoculées peut renvoyer l'effet positif de l'inoculation avec des PGPR qui offre des mécanismes protecteurs aux cellules végétales contre les ERO, réduisant ainsi les dommages membranaires dans des conditions de stress et favorisant la croissance des plantes (Janmohammadi et al., 2013; Mahmood et al., 2016). De même, Fatnassi et al. (2015) et Chiboub et al. (2018) ont signalé une diminution de la peroxydation lipidique en présence de métaux lourds chez les plantes inoculées avec des PGPR. En outre, nos résultats ont révélé qu’avec 0,5 mM de Pb, la fuite des électrolytes a été moins importante chez les plantes inoculées, ce qui a probablement entraîné moins de dommages à la membrane. De plus, les plantes inoculées ont montré une meilleure stabilité membranaire que les plantes non inoculées, ce qui indique que l'inoculation avec des PGPR offre une meilleure tolérance des plantes au stress métallique.

Troisième chapitre Etude des potentialités de L. sativus en présence de plomb

Dans ce travail, l'absence de dommages visuels sur les plantes exposées au Pb, comme la nécrose et la chlorose, suggère que Lathyrus sativus possède la capacité de survivre dans de telles conditions via l'activation de mécanismes de défense aboutissant à la tolérance aux contraintes abiotiques. Il convient de mentionner que la capacité de la plante à piéger les ERO dépend de tout un système de défense antioxydant (Liang et al., 2003). Les polyphénols comprennent un large groupe de métabolites secondaires jouant un rôle important dans la protection des plantes contre divers stress (Abd_Allah et al., 2015; Alqarawi et al., 2014). Nos résultats ont révélé que la teneur en composés phénoliques a été significativement améliorée avec le traitement par le Pb dans les feuilles et les racines des plantes. Les résultats ont également indiqué une accumulation phénolique élevée dans les racines des plantes inoculées avec I1. De même, Pazoki (2015) a rapporté que l'inoculation avec des PGPR peut augmenter la teneur en polyphénols du blé soumis à un stress avec le Pb. De plus, Sima et al. (2012) ont décrit une augmentation de la teneur en polyphénols par stress métallique chez Medicago sativa. En effet, les phénols atténuent le stress oxydatif et augmentent la stabilité membranaire en diminuant sa fluidité et contribuent à une augmentation de la rigidité cellulaire et à la création de barrières physiques protégeant les cellules des effets néfastes des métaux lourds (Díaz et al., 2001; Kattab, 2007). Il a été démontré que, sous stress métallique, les propriétés antioxydantes des composés phénoliques peuvent être attribuées à leur capacité à chélater les ions métalliques, l'inhibition de la réaction de Fenton, ce qui entraîne un piégeage efficace des radicaux toxiques et une meilleure croissance des plantes (Wada et al., 2014). De même, d'autres osmolytes comme les sucres libres et les composés aminés peuvent contribuer au maintien de la croissance des plantes lorsqu'elles sont exposées à des conditions stressantes (Hashem et al., 2016). L'accumulation de ces composés peut construire une réponse adaptative menant à la préservation des molécules et membranes biologiques (Li et Jiang, 2017). Nos résultats ont montré que l'exposition au plomb a provoqué une accumulation de proline dans les feuilles, les racines et les nodules de L. sativus, ce qui peut être dû à la puissante capacité d'ajustement osmotique de Lathyrus sativus (Jiang et al., 2013). Des augmentations similaires de la teneur en proline ont été observées chez Phaseolus vulgaris (Karthik et al., 2016) et Cassia italic (Hashem et al., 2016), lorsqu'elles ont été exposées à des métaux lourds. Dans la présente étude, une augmentation supplémentaire de la teneur en proline a été enregistrée chez les plantes inoculées avec des PGPR et cultivées en présence de plomb. Les teneurs les plus élevées en proline ont été observées au niveau des feuilles des plantes

Troisième chapitre Etude des potentialités de L. sativus en présence de plomb inoculées avec I9, les racines des plantes inoculées avec I1 et au niveau des nodules des plantes inoculées avec I1 et I5. Les rapports de Janmohammadi et al. (2013) et Kamran et al. (2015) ont confirmé que les PGPR induisait une accumulation de proline et une atténuation subséquente du stress due aux métaux lourds chez les plantes de Triticum aestivum et Eruca sativa. Une accumulation de proline dans les plantes exposées à des conditions de stress a été suggérée comme un mécanisme défensif important ayant une grande contribution à la tolérance au stress (Hayat et al., 2012). De plus, l'inoculation avec des PGPR a augmenté significativement la teneur en sucres solubles chez Lathyrus sativus, par rapport aux plantes non inoculées, avec la teneur maximale enregistrée au niveau des feuilles et des racines des plantes inoculées avec I5. Une telle amélioration des sucres solubles par inoculation avec des PGPR a également été rapportée dans certaines études antérieures (Sandhya et al., 2010; Singh et Jha, 2016). Il a été suggéré que les sucres solubles peuvent servir de signaux non seulement pour détecter et contrôler l'activité photosynthétique, mais également pour détecter et contrôler la balance des ERO (Couée et al., 2006). Dans notre étude, la concentration de 0,5 mM de Pb a significativement diminué les niveaux de sucre soluble totaux dans les feuilles et les racines. Une telle inhibition sous contrainte métallique a été rapportée pour de nombreuses autres espèces végétales (John et al., 2008; Marzban et al., 2017). La réduction des sucres solubles peut être attribuée à la réduction des teneurs en chlorophylle, à la diminution des protéines et

à la diminution de la fixation du CO2 (Kalingan et al., 2016). D'autre part, nous avons constaté que l'inoculation avec des PGPR a induit l'accumulation du Cu, Zn et Ca chez les plantes exposées au Pb (0,5 mM). En effet, les PGPR sont capables de modifier le fonctionnement des racines et peuvent aussi modifier l'absorption des ions toxiques et des nutriments par les racines en améliorant l'état nutritionnel des éléments essentiels (Paul et Lade, 2014). Cependant, Vacheron et al. (2013) ont suggéré que l'absorption des éléments nutritifs augmente en raison de l'augmentation de la surface des racines stimulée par les PGPR. Il est connu que les cellules végétales sont équipées d'un système de protection comprenant des enzymes antioxydants comme la superoxyde dismutase, la catalase, l'ascorbate peroxydase et la peroxydase qui peuvent piéger les radicaux libres (Andrade et al., 2009). Une fonction coordonnée de ces enzymes en plus de certains métabolites joue un rôle important dans le piégeage des ERO et le maintien du statut redox de la cellule végétale (Sharma et Dubey, 2005). Dans la présente étude, le traitement métallique a stimulé les activités SOD, GPOX, CAT dans les feuilles et les activités SOD, GPOX, CAT et APX dans les racines.

Troisième chapitre Etude des potentialités de L. sativus en présence de plomb

Cependant, il est important de noter que les plantes inoculées ont présenté une activité élevée de toutes les enzymes antioxydants étudiées, par rapport aux plantes non inoculées. Par conséquent, cela peut indiquer un piégeage plus efficace des radicaux superoxydes dans les plantes associées à des PGPR efficients et résistants au plomb. Un tel effet bénéfique de la co- inoculation dans l'amélioration des activités enzymatiques antioxydantes en réponse au stress métallique a été largement étudiée chez différentes légumineuses (Chiboub et al., 2018; Saadani et al., 2016). Dans ce cas, les performances de l’inoculation sont plutôt liées à une •‾ élimination rapide de O2 et H2O2 assurée par SOD, CAT, APX et GPOX, stimulant ainsi le système de défense et conférant une protection plus assurée des plantes, cette augmentation étant plus marquée chez les plantes inoculées avec I1, I5 et I9. D’autre part, le fait qu'une forte biomasse végétale a été associée à des activités élevées des enzymes antioxydants, en particulier chez les plantes inoculées avec I1, I5 et I9, suggère leur rôle dans le maintien de la croissance des plantes (Souri et al., 2017). Les résultats obtenus sont cohérents avec d'autres indiquant que la co-inoculation avec des Rhizobium et des PGPR peut minimiser les effets néfastes du stress causé par le cuivre sur la croissance de Vicia faba (Fatnassi et al., 2015). Dans notre travail, l'inoculation avec des PGPR a amélioré les activités SOD, GPOX et APX dans les nodules. En effet, les nodules ont servi de zones tampons métalliques, offrant une protection supplémentaire à la plante contre les ions métalliques envahisseurs et d'autres contaminants solubles (Lebedev et al., 2011). L'amélioration des activités des enzymes antioxydants a fourni une idée claire sur l'interaction positive entre la plante et les bactéries en présence de Pb. Dans cette partie du travail, l’ensemble des résultats ont mis en évidence l’effet positif de l'inoculation bactérienne sur la croissance des plantes et la capacité d'absorption du plomb par Lathyrus sativus. En effet, l'inoculation avec I1, I5, I7 et I9 a nettement réduit les effets toxiques du Pb, qui ont été signalés par une amélioration des paramètres liés à la croissance des plantes et l'accumulation élevée de Pb (Figure 35).

Troisième chapitre Etude des potentialités de L. sativus en présence de plomb

Figure 35: Les principaux effets de l'inoculation avec des PGPR sur les changements physiologiques et biochimiques de Lathyrus sativus en présence de Pb (0,5 mM).

Quatrième chapitre

Confirmation de l’efficacité de l’association Lathyrus sativus- PGPR dans l’amélioration de la fertilité et de la qualité des sols et dans la réhabilitation des sites contaminés par le plomb

Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ

Introduction

Les inocula utilisés dans cette partie du travail (I1, I5, I7, I8, I9 et I10) ont été sélectionnés sur la base de divers paramètres physiologiques et biochimiques liés à la tolérance et l’accumulation du plomb. Ainsi on a sélectionné les combinaisons bactériennes les plus performantes, qui ont minimisé les effets toxiques du plomb et stimulé le système de défense de leur plante hôte et amélioré le potentiel de la gesse à absorber et accumuler le plomb, pour confirmer leur potentiel en plein champ. Le but de cette étude est:  Evaluer le potentiel des plantes de L. sativus inoculées, in situ, avec 6 inocula formé chacun par quatre PGPR efficients et résistants au Pb pour la phytoremédiation du plomb et du cadmium.  Étudier les impacts de ces associations sur les paramètres agronomiques des plantes, la fertilité et la qualité du sol.  Sélectionner une association Lathyrus sativus- PGPR qui pourra être utilisée dans un programme de phytoremédiation des sols contaminés par le plomb et améliorer la qualité et la fertilité de ces sols.

1. Matériel et méthodes

1.1. Localisation du champ et caractéristiques du sol

L’expérience a été réalisée dans un champ agricole (un vignoble) dans la région de Mornag appartenant au gouvernorat de Ben Arous, en Tunisie (36 ° 35'57.82 "N10 ° 18'59.65" E, altitude 735 m). Ce site est situé près d'une ancienne mine (Pb-Zn) et contient de fortes proportions de Pb, Zn et Cd, et a été rapporté d’être l'origine de la contamination du sol tout autour de cette zone (Saadani et al., 2016). Le sol étudié est un sol argileux (40,2% d’argile, 22,6% de limon, 30,2% de sable) et se caractérise par un pH alcalin (8,8), une conductivité de 0,5 ms cm-1, une teneur en phosphore assimilable et en azote total de 86,4 ppm et 0,24%, respectivement, et des teneurs relativement élevées en matière organique (6,7%) et en carbone organique total (2,79%). Cependant, les concentrations en Pb (895 mg kg-1 MS) et en Cd (2,2 mg kg-1 MS) sont supérieures à la teneur maximale en métaux lourds autorisée pour les sols agricoles selon les normes françaises (100 et 2 mg kg-1, respectivement).

Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ

1.2. Protocole expérimental

L’essai en plein champ a été réalisé durant la saison agricole janvier 2016- mai 2016. La préparation du lit de semence et le désherbage ont été suivis par le semis des graines de Lathyrus sativus avec un intra-ligne de 2 cm pour 13 cm en interligne, comme décrit par Berger et al. (2015). En effet, les plantes ont été cultivées dans les inter-rangs de vigne, disposées préalablement en 21 parcelles, trois d'entre elles ont été non inoculées et considérées comme témoins, et les autres ont été inoculées comme suit:

T. plantes non inoculées I1: R. leguminosarum (M5)+ B. simplex+ Luteibacter sp+ Variovorax sp I5: R. leguminosarum (M5)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Variovorax sp I7: R. leguminosarum (M5)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ B. megaterium I8: R. leguminosarum (M12)+ P. fluorescens (K23)+ B. megaterium+ S. meliloti I9: R. leguminosarum (M5)+ Variovorax sp+ Luteibacter sp+ S. meliloti I10: R. leguminosarum (M6)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Variovorax sp

Chaque parcelle cultivée a une surface de 15m2 et distante de 10 m au moins des autres parcelles afin de réduire les risques de contamination. Chaque mois, les mauvaises herbes ont été enlevées manuellement. L'essai avait été conçu suivant un dispositif en blocs randomisés. Les consortia bactériens utilisés pour l'inoculation des plantes de gesse en plein champ sélectionnés dans le troisième chapitre en fonction de leur performance à stimuler le système de défense et le potentiel d’accumulation du plomb de leur plante hôte.

1.3. Processus de l'inoculation

Les souches bactériennes utilisées dans cette partie du travail ont été isolées, caractérisées et sélectionnées dans le deuxième chapitre (Tableau 10) sur la base de leur efficience et de leur résistance au plomb et au cadmium. L'inoculation des plantes a été réalisée comme décrit par Saadani et al. (2016). Chaque souche bactérienne a été cultivée dans un erlenmeyer contenant un milieu YEM (Vincent, 1970) puis a été mise sous agitation continue à 150 rpm pendant 48 h à 28 °C, pour obtenir une concentration finale de 109 CFU ml-1. Pour la co-inoculation, des quantités égales des souches bactériennes ont été mélangées au champ, diluées 10 fois avec de l'eau et finalement utilisées pour inoculer les plantes, le contrôle non inoculé a reçu un volume égal d'eau.

Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ

Dans cette étude, l’inoculation a été réalisée en deux étapes: la première le jour du semis et la deuxième deux semaines plus tard (stade 2 feuilles).

Souches bactériennes MTC Test de Gènes de résistance AIA Siderophores solubilisation HCN (Séquençage de (mM) nodulation (µg ml-1) diamètre du de phosphate l’ADNr 16S) Pb Cd PbrA CadA halo(mm) diamètre du halo (mm) R. leguminosarum (M5) 1,5 0,05 + - - 30,76±2,46 5,43±0,75 9,66±1,15 - B. simplex (K14) 1,5 0,8 - + + 8,89±1,21 2,66±0,57 7,31±0,67 - Variovorax sp (K17) 2,0 0,8 - - - 0,89±0,08 9,06±0,86 10,86±0,81 + Luteibacter sp (K20) 2,5 0,05 - + - 47,22±0,84 6,73±0,64 - - P. fluorescens (K23) 2,5 0,1 - - + 2,01±0,83 6,46±0,51 15,16±1,05 +++ B. megaterium (K5) 2,5 0,05 - + + 21,85±1,85 - 10,05±0,92 - R. leguminosarum (M12) 1,5 0,05 + + + 28,33±1,45 5,76±0,68 7,53±0,45 - S. meliloti (M7) 1,5 0,05 - - - 63,55±3,05 4,43±0,51 6,26±0,64 + R. leguminosarum (M6) 1,5 0,05 + + + 26,17±2,37 5,13±1,21 7,83±0,76 -

1.4. Récolte des plantes et dosage des métaux lourds

La récolte des plantes a été réalisée en deux étapes: au stade floraison (trois mois après le semis), toutes les parties des plantes ont été récoltées, alors qu'au stade formation de gousses (quatre mois et demi après le semis) seules les gousses ont été récoltées. Pour ce faire, 30 plantes, 10 de chaque parcelle, ont été soigneusement et aléatoirement récoltées dans la partie centrale de chaque parcelle. Les plantes ont été ramenées au laboratoire et les racines et les parties aériennes ont été séparées, rincées abondamment avec de l'eau désionisée et le nombre de nodules a été enregistré. Tous les organes de la plante ont été pesés directement en tant que matière fraîche, puis séchés à 70 °C pendant 72 h. Les poids de la matière sèche ont été déterminés avant broyage en poudre fine et stockage dans de petits flacons. À la récolte finale, les gousses ont été recueillies de chaque parcelle et utilisées pour la détermination du rendement en grains. Le dosage du Pb et du Cd a été fait comme précédemment décrit dans le deuxième chapitre (paragraphe 1.2.2.2, page 39). La concentration des métaux lourds (Pb et Cd) a été déterminée par spectroscopie d'absorption atomique (AAS).

100

Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ

Le facteur de bioconcentration (BCF), le facteur de translocation (TF) et la concentration totale du métal au niveau des feuilles et des racines des plantes ont été calculés selon Nahar et al. (2016) et Chen et al. (2017) afin de déterminer l'efficacité de la phytoextraction du plomb et du cadmium des plantes inoculées et non inoculées comme suit: BCF indique le taux de concentration du métal dans les racines par rapport au milieu de culture :

BCF = [Métal] racine / [Métal] sol TF indique le taux de concentration du métal dans la partie aérienne par rapport aux racines :

TF = [Métal] partie aérienne / [Métal] racine La concentration totale du métal au niveau des feuilles et des racines des plantes :

Métal total dans les plantes = [Métal] partie aérienne × matière sèche aérienne + [Métal] racine × matière sèche racinaire

1.5. Teneur en azote et en phosphore des plantes

La teneur en azote total au niveau des plantes a été mesurée par la méthode de Kjeldahl (1883) comme précédemment décrit dans le deuxième chapitre (paragraphe 1.2.1.2, page 38). Le phosphore total a été mesuré par colorimétrie en utilisant la méthode du molybdate / acide ascorbique (Watanabe et Olsen, 1965) après la procédure d'oxydation au persulfate (Bowman et Moir, 1993).

1.6. La teneur en chlorophylle et caroténoïdes

La teneur en chlorophylle et en caroténoïdes a été mesurée comme précédemment décrit dans le troisième chapitre (paragraphe 1.3, page 76) selon la méthode de Lichtenthaler et Wellburn (1983).

1.7. Dosage de la proline

La teneur en proline a été mesurée comme précédemment décrit dans le troisième chapitre (paragraphe 1.6, page 78) selon la méthode de Bates et al. (1973).

1.8. Analyse des échantillons de sol

Le sol de la rhizosphère de Lathyrus sativus a été recueilli en secouant doucement le sol adhérant aux racines (Trabelsi et al., 2015). Les échantillons de sol tamisé ont été divisés en deux parties: la première a été conservée à -20 °C pour l'analyse de l'activité enzymatique qui

101

Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ peut être utilisée comme indicateur de la qualité du sol (Trabelsi et al., 2017); la seconde partie a été séchée à 40 °C pendant 16 h, puis broyée et stockée dans de petits flacons pour l'analyse des propriétés chimiques du sol.

1.8.1. Dosage de la matière organique et détermination du pH et de la conductivité électrique du sol

Le pH a été mesuré à l’aide d’un pH mètre, la conductivité électrique (EC) à l'aide d'un conductimètre, et le pourcentage de matière organique a été mesuré par analyse thermogravimétrique après calcination (Kalra and Maynard, 1991).

1.8.2. Détermination des métaux lourds totaux et extractibles

Des échantillons de sol (2 g) ont été traités avec de l'acétate d'ammonium 1 M (C2H7NO2) et de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 0,2 M pour extraire le Pb et le Cd extractibles (Saadani et al., 2016). Le mélange ainsi obtenu a été mis sous agitation continue et par la suite filtré avec du papier Wattman. La concentration des métaux lourds (Pb et Cd) a été déterminée par spectroscopie d'absorption atomique (AAS). La fraction totale des métaux lourds au niveau du sol a été déterminée comme précédemment décrit dans le deuxième chapitre (paragraphe 1.2.1.1, page 38).

1.8.3. Dosage de l’azote total et du phosphore assimilable au niveau du sol

Le dosage de l’azote total et du phosphore assimilable au niveau du sol a été réalisé comme précédemment décrit dans le deuxième chapitre (paragraphe 1.2.1.2 et 1.2.1.3, page 38).

1.8.4. Dosages des enzymes du sol

1.8.4.1. Activité de la phosphatase alcaline (EC 3.1.3.1) Les principales enzymes responsables de la minéralisation du phosphore organique du sol sont les phosphatases alcalines et phosphatases acides, qui sont responsables de la réaction finale conduisant à la séparation l'ion ortho-phosphate d'une molécule organique. Les phosphatases sont souvent classées en fonction du pH optimal pour leur activité, bien que les micro-organismes soient capables de produire à la fois des phosphatases acides et alcalines, les plantes ne produisent que des phosphatases acides (Plassard et al., 2015). L'activité de la phosphatase alcaline a été dosée selon la méthode décrite par Eivazi et Tabatabai (1977). L’activité enzymatique a été mesurée en mélangeant 0,5 g de sol et 1,5 ml

102

Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ d’un tampon borate (pH 11) et auquel on a ajouté 200 µl du substrat utilisé qui est le paranitrophenyl phosphate (pNPP). La réaction enzymatique a été faite à 37 °C durant 1 h, après, 1,5 ml d’une solution de NaOH 0,5 M a été additionné. Le sol a été séparé du produit formé par une centrifugation de 5 min à 4000 rpm avant la mesure de la concentration du produit résultant (paranitrophenol PNP) dans chaque échantillon. La mesure a été faite à 405 nm à l’aide d’un spectrophotomètre par rapport à une gamme étalon de PNP.

1.8.4.2. Activité de la β-glucosidase (E.C. 3.2.1.21)

L'activité de la ß-glucosidase a été déterminée en mesurant l'hydrolyse du p-nitrophényl ß- D-glucopyranoside (pNPG) comme décrit précédemment par Cai et al. (1999). Le rôle de la β-glucosidase dans les sols est essentiel puisque cette enzyme participe à la biodégradation de divers β-glucosides présents dans les débris végétaux, de plus, la β-glucosidase agit dans la dernière phase du processus de dégradation de la cellulose (Gil-Sotres et al., 2005; Martinez et Tabatabai, 1997). Ces réactions produisent du glucose, une source de carbone importante pour la croissance et l'activité des microorganismes du sol (Merino et al., 2016). Un rapport C:N faible favorise la fonction de β-glucosidase, ce qui entraîne une décomposition rapide de la matière organique et une libération des nutriments (Adetunji et al., 2017). L’activité de cette enzyme a été déterminée par l’incubation de l’échantillon de sol (0,5 g) pendant 90 min à 37 °C, en présence de 1,25 ml de tampon phosphate (0,1 M, pH=6) et 0,5 ml de 4-nitrofenyl-β-D-glucopyranoside (25 mM). Après, une centrifugation à 4000 rpm pendant 5 min, le surnagent a été mélangé avec 0,5 M de NaOH (v/v). La lecture spectrophotométrique des échantillons est faite à 405 nm par rapport à une gamme étalon de PNP.

1.8.4.3. Activité de l’uréase (E.C. 3.5.1.5)

L’activité uréase permet de transformer l’urée en NH3 et en CO2 et en milieu aqueux + l'ammoniac produit par cette réaction se transforme très rapidement en ammonium NH4 . (Byrnes et Amberger, 1989). Cette activité est mesurée selon la méthode modifiée de Kandeler et Gerber (1988). L’activité de cette enzyme est déterminée par incubation de 1 g de sol à 37 °C pendant 2 h, en présence de 4 ml d’un tampon borate (pH=10) et 0,5 ml d’urée (0,48%). Pour l’arrêt de la réaction enzymatique, on ajoute 20 ml d’un mixte composé de 1 M de KCl et 10 mM de HCl, avec une incubation de 30 min à 25 °C. Après filtration des échantillons, 3 ml de filtrat sont additionnés à 5 ml de salicylate de sodium (17 %) et 2 ml de dichloroisocyanurate (0,1%). La

103

Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ lecture des échantillons est effectuée par spectrophotométrie à 690 nm et les valeurs sont reportées à une gamme étalon de NH4Cl.

1.9. Analyse statistique

2. Résultats

2.1. Effet de l'inoculation avec des PGPR sur les paramètres agronomiques des plantes de Lathyrus sativus

L’analyse statistique de la variance (à p < 0,05) a montré que la différence est significative entre la croissance des plantes inoculées et celles du témoin non inoculé. L'inoculation « in situ » de la gesse a remarquablement affecté les paramètres agronomiques des plantes. Comme montre le Tableau 11, les PGPR interagissent différemment avec l'hôte végétal, les résultats ont aussi révélé des variations significatives dans les paramètres liés à la croissance, la teneur en azote total des feuilles et des graines ainsi que la nodulation des plantes de gesse. Ainsi, d’une façon générale, les meilleures performances agronomiques ont été enregistrées chez les plantes inoculées avec I1 et I5 (Figure 36). En effet, l’inoculum I1 a amélioré significativement, la longueur de la tige, la matière fraiche de la partie aérienne (MFA), la matière fraiche de la partie racinaire (MFR), la matière fraiche nodulaire (MFN) ainsi que la matière sèche des parties aériennes (MSA) de 40%, 61%, 35%, 62% et 47%, par rapport au témoin non inoculé, respectivement (Tableau 11). Tandis que l’inoculum I5 a stimulé le développement de la partie racinaire, avec une longueur des racines et une matière sèche de la partie racinaire (MSR) supérieure à celle notée chez le témoin de 31% et de 29%, respectivement (Tableau 11).

104

Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ

T I1 I5

Figure 36: Effet de l'inoculation avec les inocula I1 et I5 sur la croissance des plantes de L. sativus. T : témoin non inoculé.

Aussi, nous avons constaté une augmentation du poids sec nodulaire de 40% et 48% ainsi que du nombre de nodules de 40% et 31% pour les plantes inoculées avec les consortia I1 et I5, respectivement, par rapport à celles non inoculées (Figure 37).

T I1 I5

Figure 37: Effet de l'inoculation avec les inocula I1 et I5 sur la nodulation des plantes de L. sativus.

Des tendances similaires ont également été enregistrées au niveau des graines et des feuilles des plantes inoculées avec les PGPR, point de vue teneur en azote total, qui a été d’environ 1,3 fois plus élevée que le témoin chez les plantes inoculées avec I1 et I5 (Tableau 11). De

105

Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ

plus, l'inoculation bactérienne a entraîné une amélioration significative du rendement en grains chez toute les plantes inoculées par rapport au témoin. Cependant, aucun changement significatif n'a été observé dans la teneur en phosphore des feuilles avant et après l'inoculation. Mais une augmentation importante de la teneur en phosphore a été notée au niveau des graines des plantes inoculées avec I6 qui a atteint 143%, par rapport au témoin non inoculé. Les résultats obtenus indiquent clairement que l'inoculation avec des PGPR favorise la croissance des plantes de L. sativus dans les sols contaminés par des métaux lourds.

Paramè ters de Témoin I1 I5 I7 I8 I9 I10 croissance Longueur PA 49,33±6,70c 68,90±6,84a 60,19±6,77b 69,80±6,24a 59,13±5,31b 68,54±6,79a 58,04±5,19b (cm) PR 14,54±1,88b 15,61±1,91b 19,11±1,46a 15,51±1,84b 15,81±1,70b 17,93±1,71a 15,07±1,33b MF PA 27,03±2.24d 43,45±4,38a 32,8±3,85bc 29,9±2,65cd 33,07±2,86b 32,3±3,38bc 27,91±2,73d -1 (g PL ) PR 0,93±0,08d 1,26±0,11a 1,05±0,10bc 0,69±0,06e 1,08±0,08b 0,98±0,11cd 0,73±0,06e PN 0,21±0,02c 0,34±0,03a 0,28±0,02b 0,17±0,02d 0,23±0,03c 0,19±0,02d 0,07±0,01e MS PA 4,42±0,37d 6,49±0,51a 5,39±0,46c 5,413±0,56c 5,91±0,4b 5,87±0,48b 4,62±0,41d (g PL-1) PR 0,14±0,01c 0,17±0,01a 0,18±0,02a 0,14±0,01c 0,17±0,01ab 0,16±0,01b 0,15±0,02c PN 0,05±0,01c 0,07±0,01a 0,07±0,02a 0,05±0,04d 0,07±0,06a 0,061±0,05b 0,04±0,02e Nombre de nodules (PL-1) 23,01±2,06e 33,95±1,96a 30,04±3,57b 28,1±1,91bc 26,1±2,39cd 29,45±1,74b 24,2±1,92de Rendement en grains 6,84±0,48b 9,61±0,81a 9,08±0,83a 8,82±0,98a 8,92±1,02a 8,41±0,73ab 9,19±1,07a (g PL-1) Teneur en PA 4,57±0,21b 5,70±0,16a 5,65±0,27a 5,53±0,18ab 5,31±0,23ab 5,16±0,29b 5,16±0,21b azote (%) Graines 3,19±0,34b 4,31±0,23a 4,29±0,13a 4,28±0,26a 3,23±0,26b 4,35±0,21a 4,94±0,19a Teneur en PA 0,21±0,02a 0,21±0,01a 0,22±0,01a 0,19±0,01a 0,22±0,01a 0,23±0,01a 0,21±0,02a phosphore (%) Graines 0,21±0,01b 0,20±0,01b 0,20±0,01b 0,18±0,02b 0,19±0,01b 0,19±0,01b 0,51±0,07a Proline PA 2,98±0,23c 3,29±0,16bc 3,48±0,37bc 3,57±0,04bc 4,06±0,2ab 4,61±0,47a 4,09±0,43ab -1 (µmol g MS) PR 0,56±0,02c 1,86±0,18a 1,49±0,16b 1,41±0,14b 1,47±0,02b 0,73±0,02c 1,37±0,15b Teneur en Chl a 1,51±0,02a 1,54±0,02a 1,53±0,02a 1,49±0,03a 1,49±0,04a 1,51±0,03a 1,39±0,06b chlorophylle Chl b 1,08±0,06c 1,46±0,14a 1,32±0,14ab 1,23±0,03bc 1,19±0,13bc 1,32±0,09ab 1,09±0,04c (mg g-1 MF) Chl T 2,59±0,08cd 3,01±0,16a 2,86±0,16ab 2,72±0,05bc 2,68±0,17bc 2,83±0,11ab 2,49±0,09d C 0,31±0,02a 0,23±0,04b 0,29±0,04ab 0,29±0,02a 0,32±0,02a 0,29±0,03a 0,32±0,01a

Les valeurs représentent la moyenne de 30 répétitions, 10 plantes de chaque parcelle. Pour chaque ligne, les valeurs suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes, selon le test Tukey HSD test à p < 0,05.

2.2. Effet de l'inoculation avec des PGPR sur la teneur en proline, chlorophylle et en caroténoïdes

Nous avons également étudié la teneur en chlorophylle des plantes de gesse, qui a varié entre les plantes inoculées et non inoculées. Les résultats ont montré que l'inoculation avec les

106

Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ consortia I1, I5 et I9 a amélioré significativement la teneur en chlorophylle b de 35%, 23% et 22%, respectivement, par rapport aux plantes non inoculées (Tableau 11). En outre, des augmentations significatives de la teneur en proline ont été enregistrées au niveau des feuilles des plantes inoculées avec I9 et au niveau des racines des plantes inoculées avec I1 avec des valeurs atteignant 55% et 232%. Cependant aucun changement significatif n'a été observé dans la teneur en caroténoïdes des plantes inoculées et celles non inoculées à l’exception des plantes inoculées avec I1 (Tableau 11).

2.3. Effet de l'inoculation avec des PGPR sur l’accumulation du plomb et du cadmium par les plantes

Les concentrations du plomb et du cadmium chez les plantes de L. sativus ont montré des distributions différentes pour chaque métal (Figure 38). Les effets positifs de l'inoculation avec les PGPR efficients et résistants au Pb sur la capacité de phytoremédiation des plantes de gesse peuvent être attribués à l'effet de l'inoculation microbienne sur l'augmentation de l'absorption des métaux lourds par les plantes. En ce qui concerne l'analyse du plomb, les résultats ont montré que la partie aérienne et les racines contenaient des concentrations du plomb beaucoup plus élevées que celles des graines et des nodules. Tandis que les quantités du cadmium accumulées au niveau des différentes parties des plantes ont été semblables. Les résultats ont révélé que les concentrations des métaux ont augmenté lors de l'inoculation. En effet, l'accumulation maximale du Pb dans la partie aérienne des plantes (1180,85 mg kg-1 MS) a été enregistrée en appliquant l'inoculation combinée de R. leguminosarum (M5) + P. fluorescens (K23) + Luteibacter sp + Variovorax sp (Figure 38A). De plus, cet inoculum I5 a amélioré significativement l'accumulation du Pb dans les nodules et les graines de 98% et de 65%, respectivement, par rapport aux plantes non inoculées. Néanmoins, l'accumulation du plomb (Figure 38A) et du cadmium (Figure 38B) a été beaucoup plus élevée au niveau des racines des plantes inoculées avec I1, soit 58% et 45% plus que le témoin non inoculé, respectivement. Les résultats ont aussi montré que l’inoculation avec les consortia I1 et I5 a augmenté significativement l’accumulation du Cd dans les nodules de 39% et 30% et dans les graines de 29 et 25%, respectivement, par rapport aux plantes témoins.

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Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ

A Partie aérienne Partie racinaire

1500

2000 a

a 1500 b

MS) 1000 b MS)

1 1 -

bc - bc bc bc 1000 c c c c

500

(mg kg (mg (mg kg (mg

500

AccumulationPb du AccumulationPb du 0 0 T I1 I5 I7 I8 I9 I10 T I1 I5 I7 I8 I9 I10 Graines Nodules

400 900

a ab a

300 ab ab ab ab

MS) 600

MS)

- b 1 - 200 c c c

300 c (mg kg (mg

(mgkg 100

AccumulationPb du AccumulationPb du 0 0 T I1 I5 I7 I8 I9 I10 T I1 I5 I7 I8 I9 I10 B Partie aérienne Partie racinaire

120 a

a 160 a

b b b b b 120 b

80 b b MS)

MS) b

b b

1 1 1 - - 80

(mg kg (mg (mgkg

40 AccumulationCd du AccumulationCd du 0 0 T I1 I5 I7 I8 I9 I10 T I1 I5 I7 I8 I9 I10

Graines Nodules

120

a 150 ab ab

a a ab ab

ab b ab b b b b 80

MS) 100

MS)

- -

50 40

(mg kg (mg

AccumulationCd du AccumulationCd du 0 0 T I1 I5 I7 I8 I9 I10 T I1 I5 I7 I8 I9 I10

Inoculum bactérien Inoculum bactérien

108

Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ

Dans la présente étude, l'inoculation avec des PGPR efficients et résistants au plomb a significativement réduit l’absorption du Pb par la vigne. Ainsi, on a noté une diminution de jusqu’à 44% et 57% de l’accumulation du plomb dans les feuilles de vigne au niveau des parcelles inoculées avec I5 et I7, respectivement, par rapport à celles non inoculées (Figure 39). Néanmoins, aucun effet n’a été observé concernant le cadmium.

300 100

a a

a a a a a

80 a

b 200 b b b

MS) MS)

1 1

1 - - c 40

100 (mg kg (mg

(mg kg (mg 20

AccumulationPbdu AccumulationCddu 0 0 T I1 I5 I7 I8 I9 I10 T I1 I5 I7 I8 I9 I10

Inoculum bactérien Inoculum bactérien

2.4. Facteur de bioconcentration (BCF), facteur de translocation (TF) et accumulation totale des métaux au niveau de la partie aérienne et racinaire des plantes de Lathyrus sativus

Le facteur de bioconcentration et le facteur de translocation (ratio de la concentration des métaux dans les racines par rapport au sol et dans la partie aérienne par rapport aux racines, respectivement) peuvent être utilisés pour estimer le potentiel d'une plante à des fins de phytoremédiation. Les valeurs BCF et TF> 1 pour les métaux indiquent un meilleur potentiel de phytoextraction d'une plante, alors que les plantes avec des valeurs BCF> 1 et des facteurs de translocation faibles (TF <1) ont un potentiel de phytostabilisation (Yoon et al., 2006). Dans la présente étude, les facteurs de translocation du Cd des racines à la partie aérienne (TF) étaient <1 et n’ont pas été significativement affectés par l'inoculation, cependant, les valeurs du BCF liées à ce métal ont été > 1 (Tableau 12) indiquant le potentiel intéressant de phytostabilisation de la gesse pour ce métal. En effet, l’inoculum I1 a amélioré la valeur de BCF de 48% par rapport aux plantes non inoculées. En outre, l'inoculation avec I1 a augmenté

109

Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ significativement le Cd total chez les plantes de 91% par rapport aux plantes témoin. Cependant, seul l’inoculum I9 a augmenté significativement le facteur de translocation du cadmium par rapport aux autres inocula et par rapport au contrôle. Les résultats ont également révélé que le facteur de translocation du Pb a été <1 chez toute les plantes a l’exception de celles inoculées avec l’inoculum I5 qui a amélioré significativement la valeur TF de sa plante hôte, où il a été 1 et 2 fois plus élevé que les plantes non inoculées. En outre, les valeurs de BCF du Pb a été > 1 chez toutes les plantes étudiées à l’exception de celles inoculées avec I8 et I9. En effet, ce facteur a été 1,5 fois et 1,37 fois plus élevé chez les plantes inoculées avec I1 et I7, respectivement par rapport aux plantes témoins. En outre, les inocula I1 et I5 ont amélioré significativement la teneur totale en Pb des plantes de 72% et 94% par rapport aux plantes non inoculées, ainsi la valeur maximale a été enregistrée au niveau des plantes inoculées avec I5, où elle a augmenté d'environ 2 fois (Tableau 12). Les résultats suggèrent que l'inoculum I5 pourrait être utilisé pour la phytoextraction du Pb et pour la phytostabilisation du Cd, cependant, l’inoculum I1 pourrait être utilisé pour la phytostabilisation des sols contaminés par le Pb et le Cd.

Tableau 12: Effet de l'inoculation en plein champ de la gesse avec les consortia I1, I5, I7, I8, I9 et I10 sur le facteur de translocation (TF), le facteur de bioconcentration (BCF) et la concentration totale (CT) du plomb et du cadmium (μg plante-1) au niveau des feuilles et des racines des plantes de Lathyrus sativus.

BCF TF CT Pb Cd Pb Cd Pb Cd Témoin 1,20±0,09b 40,56±1,38b 0,67±0,025b 0,93±0,02b 3380,22±141,14b 383,16±23,26e I1 1,89±0,06a 59,86±3,72a 0,50±0,01bc 0,83±0,04b 5814,69±288,84a 733,79±10,85a I5 1,09±0,08bc 43,41±1,61b 1,21±0,15a 0,88±0,06b 6550,67±316,54a 471,71±14,63d I7 1,64±0,1a 46,70±5,30b 0,29±0,05c 0,78±0,1b 2522,18±311,85b 449,33±4,51d I8 0,82±0,1c 45,25±4,21b 0,79±0,11b 0,87±0,09b 3163,02±298,67b 527,71±3,86c I9 0,78±0,06c 38,02±1,54b 0,68±0,01b 1,24±0,04a 2934,52±306,58b 595,85±5,86b I10 1,30±0,03b 39,75±3,18b 0,54±0,07bc 0,84±0,05b 3098,97±321,36b 353,12±7,56e

Différentes lettres indiquent la moyenne de trois mesures effectuées sur les trois parcelles. Pour chaque colonne, les valeurs suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes, selon le test Tukey HSD test à p < 0,05.

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Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ

2.5. Effet de l’inoculation sur les paramètres chimiques du sol

2.5.1. La concentration des métaux lourds dans le sol

En se basant sur les résultats du Tableau 13, nous pouvons remarquer que l'accumulation du plomb et du cadmium dans le sol a été significativement affectée par l'inoculation avec les PGPR. En effet, la contribution de l'association L. sativus- PGPR dans la réduction de la concentration des métaux lourds dans la rhizosphère a été principalement réalisée par la réduction de la fraction extractible et de la fraction totale des métaux lourds dans les parcelles inoculées. En effet, on a noté que l'inoculation a réduit significativement de 8% et 63%, respectivement, le Pb et le Cd extractibles dans les échantillons de sol des parcelles inoculées avec I1, contre 7% et 69% pour ceux des parcelles inoculées avec I5, par rapport aux parcelles non inoculées. Au même temps, nous avons noté une réduction du Pb et du Cd totaux dans la rhizosphère des parcelles inoculées, principalement chez celles inoculées avec I5 atteignant 46% et 61%, respectivement, par rapport aux parcelles non inoculées.

Tableau 13: Impact de l'inoculation en plein champ de la gesse avec les consortia I1, I5, I7, I8, I9 et I10 sur les propriétés chimiques du sol.

Caractéristiques du sol Témoin I1 I5 I7 I8 I9 I10

Azote total (%) 0,17d 0,20bc 0,23a 0,19cd 0,19cd 0,19cd 0,22ab Phosphore assimilable (ppm) 43,66d 77,10b 88,87a 52,02cd 60,69c 60,65c 94,45a Beta-glucosidase 25,84b 30,12a 28,98a 28,83a 29,64a 30,04a 29,74a Enzymes du sol (µg PNP g-1 sol h-1) Urease 40,01c 48. 53b 53.87a 40.08c 43,62c 31,11d 50,21ab + -1 -1 (µg NH4 g sol h ) Phosphatase alkaline 13,59c 15,21ab 15,77a 14,55bc 15,67ab 15,61ab 16,19a (µg PNP g-1 sol h-1) Matière organique (%) 4,57a 4,67a 4,29a 4,64a 4,58a 4,81a 4,61a pH 9,13a 8,54cd 8,81bc 8,96ab 8,61cd 8,44d 8,83bc Conductivité (ms cm1) 307,83d 318,66cd 320,33c 340,66b 369,82a 321,21c 320,11c Concentration du Pb Total 845,44a 653,36bc 459,83d 529,78cd 557,99cd 803,46ab 844,27a métal (mg kg-1 MS) Extractable 333,09a 305,36bc 309,54bc 325,99ab 305,48bc 311,33bc 298,54c Cd Total 1,96a 1,06bc 0,77c 0,84bc 0,68c 0,93bc 1,47ab Extractable 1,69a 0,63c 0,53c 0,46c 0,47c 0,81bc 1,22b

Différentes lettres indiquent la moyenne de trois mesures effectuées sur les trois parcelles. Pour chaque ligne, les valeurs suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes, selon le test Tukey HSD test à p < 0,05.

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Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ

2.5.2. Effets de l'inoculation avec des PGPR sur les paramètres de fertilité du sol

Nous avons essayé d'évaluer les effets de l'inoculation avec des PGPR sur la teneur en azote et en phosphore, la teneur en matière organique ainsi que le pH et la conductivité électrique du sol (Tableau 13). Les résultats ont révélé que les échantillons de sol provenant des parcelles cultivées avec les plantes de L. sativus et inoculées avec I5 ont présenté les meilleurs paramètres de fertilité comparés à ceux des autres parcelles. En effet, l'inoculation avec I5 a augmenté significativement la teneur en azote total du sol ainsi que sa teneur en phosphore assimilable jusqu'à 35% et 103%, respectivement, par rapport aux parcelles non inoculées (Tableau 13). Nous avons également enregistré que le pH du sol a diminué suite à l'inoculation avec les PGPR. De plus, la conductivité électrique du sol semble être légèrement affectée par l'inoculation. Néanmoins, aucun effet significatif n'a été observé sur la teneur en matière organique au niveau de la rhizosphère des parcelles inoculées et non inoculées.

2.5.3. Effet de l'inoculation avec des PGPR sur l’activité des enzymes du sol

Les enzymes du sol ont été dosées au niveau de la rhizosphère des parcelles cultivées avec les plantes de gesse. L’activité de la bêta-glucosidase, de l'uréase et de la phosphatase alcaline a été significativement et positivement influencée par l'inoculation avec les PGPR (Tableau 13). En effet, l'activité maximale de l’uréase a été enregistrée dans les sols qui proviennent des parcelles inoculées avec I5, où elle a été stimulée de 32% par rapport à celles provenant des parcelles non inoculées. De plus, l’activité de la phosphatase alcaline et de la bêta- glucosidase ont significativement augmenté avec des valeurs atteignant 12% et 16% dans la rhizosphère des parcelles inoculées avec I5 et de 16% et 19% dans celles des parcelles inoculées I10, respectivement, par rapport aux sols provenant des parcelles non inoculées (Tableau 13).

3. Discussion

Nos résultats ont prouvé que l'inoculation des plantes de gesse en plein champ a amélioré significativement tous les paramètres agronomiques des plantes par rapport à celles non inoculées. Cette étude confirme nos travaux antérieurs (Abdelkrim et al., 2018a; Abdelkrim et al., 2018b; Abdelkrim et al., 2018c) réalisés dans les conditions contrôlées. L'effet positif de la co-inoculation sur la biomasse des plantes, le rendement en grains, la nodulation et la

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Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ fixation d'azote a déjà été décrit chez d'autres légumineuses en conditions normaux et sous stress métallique (Dary et al., 2010; Igiehon et Babalola, 2018; Saadani et al., 2016, Trabelsi et al., 2011). En outre, de nombreux chercheurs ont souligné la capacité des inocula bactériens pour promouvoir la croissance des plantes, la réponse à des facteurs environnementaux externes et la tolérance à différents types de stress, et la protection des plantes contre les agents pathogènes des plantes (Aydi-Ben Abdallah et al., 2016; Jebara et al., 2017; Timmusk et al., 2017). L'explication possible de cette éventuelle croissance accrue des plantes dans le sol contaminé par les métaux lourds, suite à l’inoculation avec des PGPR, peut être attribuée à la capacité des PGPR à produire des sidérophores, à solubiliser le phosphate dans le sol, à la capacité de fixation de l’azote de R. leguminosarum, ainsi qu’au potentiel important de Luteibacter sp à produire l'acide indole-3-acétique, ce qui réduit le stress métallique et conduit à une meilleure croissance et développement des plantes (Abdelkrim et al., 2018a). En effet, dans notre étude, toutes les souches bactériennes sont capables de produire l’AIA et les sidérophores à l’exception de B. megaterium (Abdelkrim et al., 2018b). Il est bien connu que l'ammonium produit par les bactéries agit comme source d'azote pour la plante hôte et augmente par conséquent la biomasse végétale, de plus, la production d'AIA par les bactéries associées à la plante dans la rhizosphère contribue à l’amélioration de la croissance des plantes dans les sols pollués en stimulant l'élongation des racines qui en résulte une absorption accrue des minéraux et des nutriments (Karthik et al., 2016). De plus, les inoculations bactériennes ont significativement augmenté la teneur en proline et en chlorophylle des plantes de L. sativus, par rapport aux plantes non inoculées. Ces résultats sont en accord avec d'autres études, qui ont également révélé que les rhizobactéries influencent positivement la teneur en chlorophylle et en proline des plantes sous contrainte métallique (Abdelkrim et al., 2018a, Hahm et al., 2017, Kamran et al., 2016). La présence de PGPR accélère aussi l'absorption du fer par la plante, ce qui pourrait augmenter les teneurs en chlorophylle dans les plantes inoculées (Kamran et al., 2015). De même, l'accumulation de proline est une réponse adaptative des plantes au stress environnemental, puisqu'elle intervient dans l'ajustement osmotique à l’échelle cellulaire, et sert également d'agent d'élimination des radicaux hydroxyles (Hayat et al., 2012). Les plantes inoculées avec I1 (R. leguminosarum (M5)+ B. simplex+ Luteibacter sp +Variovorax sp) ont présenté les plus fortes augmentations de la matière sèche des parties aériennes et racinaires et du nombre de nodules comme observé précédemment en conditions contrôlées (Abdelkrim et al., 2018b). Les résultats obtenus ont clairement indiqué que

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Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ l'inoculation avec des PGPR protège la gesse non seulement des concentrations élevées du Pb et du Cd dans le sol, mais favorise également la croissance des plantes. En effet, l'importance des bactéries du sol dans la résistance aux métaux lourds et leur capacité à favoriser la croissance de leur plantes hôtes dans un environnement contaminé par les métaux fait de ces association un choix privilégié pour les études de phytoremédiation (Tirry et al., 2018). Les associations légumineuses-PGPR ont récemment été considérées comme des systèmes biologiques prometteurs pour améliorer la tolérance et la capacité d'élimination des métaux des plantes hôtes (Gómez-Sagasti et Marino, 2015). La plante de gesse est considérée comme une excellente accumulatrice du Cd et du Pb (Brunet et al., 2008; Nagati et al., 2015; Talukdar, 2014), elle a également été recommandée comme matériel prometteur pour la phytoremédiation des métaux (Abdelkrim et al., 2018a, Abdelkrim et al., 2018b, Brunet et al., 2008). Dans cette étude, des concentrations considérablement élevées du Cd et du Pb ont été enregistrées au niveau des plantes de L. sativus inoculées avec des PGPR. L'augmentation des concentrations des métaux dans les tissus végétaux après l'inoculation avec des PGPR est en accord avec d'autres études (Ahmed Asad et al., 2018, Dabrowska et al., 2017, Tirry et al., 2018). Dans notre travail, nous avons aussi remarqué une réduction de la fraction extractible et de la fraction totale des métaux lourds dans la rhizosphère des parcelles inoculées, comparativement à celles des parcelles non inoculées. Nous avons suggéré que l'inoculation avec des PGPR résistants aux métaux convertit le Cd et le Pb en une forme disponible dans la rhizosphère et augmente ainsi leur absorption par les plantes et une diminution de la fraction totale des métaux dans le sol. En effet, des études antérieures ont montré que les PGPR libèrent dans la rhizosphère des enzymes dégradant, des acides organiques et des substances chélatrices des métaux tel que les sidérophores, ce qui pourrait améliorer l'absorption et l'accumulation des métaux dans différentes parties des plantes (Ahmed et Holmström, 2014; Kamran et al., 2015). Par ailleurs, les PGPR résistants peuvent affecter la mobilité et la disponibilité des métaux par chélation, acidification, oxydation-réduction dans la rhizosphère, ce qui contribue à l'absorption des métaux et contribue ainsi directement aux processus de phytoremédiation (Ma et al., 2011). Par exemple, Braud et al. (2009) ont trouvé que les sidérophores produits par Pseudomonas aeruginosa, ont été capables de solubiliser de grandes quantités du Pb dans la solution du sol. Nos résultats ont révélé que l'accumulation maximale du Pb dans la partie aérienne des plantes a été enregistrée en appliquant l'inoculum I5, ce qui devrait être dû à la présence de P. fluorescens. Remarquablement, cette souche a provoqué une accumulation plus élevée de

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Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ certains métaux lourds dans la partie aérienne de différentes plantes (Fuloria et al., 2009; Petriccione et al., 2013, Sheng et al., 2008). Il est important de noter que l'inoculation avec des PGPR influence le transport et la distribution du métal au sein de leurs plantes hôtes, ce qui entraîne une modification des valeurs de BCF et de TF, ce qui est avantageux pour augmenter l'efficacité de la phytoremédiation. Dans la présente étude, l'inoculum I5 a augmenté significativement la valeur TF du Pb qui a atteint 1,2 contre un TF du Cd <1, et a augmenté le Pb et le Cd totaux chez les plantes ayant un BCF> 1. Cependant, l'inoculum I1 a inhibé le transport du Pb et du Cd vers la partie aérienne avec un TF <1 mais a augmenté significativement le BCF ainsi que la teneur totale des plantes en Pb et en Cd. Cependant, le processus de phytoextraction nécessite généralement le transport des métaux lourds vers les parties de la plante faciles à récolter, c'est-à-dire facilement extractibles du site, alors que l'absorption des métaux dans les racines à faible facteur de translocation présente un potentiel important de phytostabilisation (Yoon et al., 2006). Ainsi, en comparant les valeurs BCF et TF, nous pouvons suggérer que l’association L. sativus- inoculum I5 pourrait être utilisée pour la phytoextraction du Pb du sol et la phytostabilisation du Cd, alors que l'association L. sativus- inoculum I1 pourrait être utilisée pour la phytostabilisation des sols contaminés par le plomb et le cadmium. Nos résultats sont similaires à ceux d’Ahsan et al. (2017) et Ghnaya et al. (2015) qui ont révélé que les interactions plantes-bactéries améliorent l'efficacité de la phytoremédiation. Dans la présente étude, l'inoculation avec des PGPR efficients et résistants au plomb a significativement réduit l’absorption du Pb par la vigne surtout au niveau des parcelles inoculées avec I5 et I7, par rapport à celles non inoculées, ce qui réduit considérablement le passage des contaminants toxiques dans la chaîne alimentaire pour une agriculture saine et durable. Nos résultats ont aussi révélé que les échantillons de sol provenant des parcelles inoculées ont présenté les meilleurs paramètres de fertilité et de qualité, par rapport à ceux provenant des parcelles non inoculées. En effet, le taux le plus élevé de phosphore assimilable et de l’azote total dans le sol a été enregistré dans la rhizosphère des plantes inoculées avec I5. De plus, le même sol rhizosphérique a présenté une activité importante de l'uréase, de la bêta- glucosidase et de la phosphatase alcaline, par rapport aux parcelles non inoculées. Il a été rapporté que le phosphate insoluble dans la rhizosphère des sols pollués par les métaux est susceptible d'être biodisponible par les bactéries associées aux plantes à travers leur capacité de production des acide organique et la sécrétion de phosphatase (Behera et al., 2017; Li et al., 2016; Ma et al., 2013). En effet, les microorganismes du sol sont efficaces pour libérer le phosphore des complexes inorganiques par solubilisation et des réserves organiques du sol par

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Quatrième chapitre Potentialités de l’association L. sativus- PGPR en plein champ minéralisation (Nisha et al., 2014). Parmi les communautés bactériennes du sol, les souches du genre Bacillus, Pseudomonas et Rhizobium sont parmi les plus puissants pour la solubilisation du phosphate tricalcique et sont donc très efficaces pour augmenter le phosphore assimilable dans le sol (Khan et al., 2009). Dans notre étude, l'amélioration de la disponibilité du phosphore et de l'azote total dans la rhizosphère des plantes inoculées avec I5 peut être liée à la capacité de solubilisation du phosphate tricalcique élevée de P. fluoresencs et à la capacité de fixation de l'azote de R. leguminosarum (Abdelkrim et al., 2018b). De plus, l'augmentation de l'activité de l'uréase et de la bêta-glucosidase dans la rhizosphère est un bon indicateur de l'amélioration de la qualité du sol (Adetunji et al., 2017). Des résultats similaires ont été rapportés par Nosheen et Bano (2014) et Madhaiyan et al. (2010), qui ont observé que l’activité de l'uréase et de la phosphatase a été améliorée dans la rhizosphère suite à l’inoculation bactérienne. Cette étude confirme que l'inoculum I5 peut être utilisé pour la phytoextraction du plomb et pour la phytostabilisation du cadmium. De plus, cet inoculum stimule l’activité de l’uréase, de la phosphatase alcaline et la beta-glucosidase dans la rhizosphere des plantes inoculées ce qui peut être lié à l'augmentation de la teneur en azote total et du phosphore assimilable au niveau du sol. Par conséquent, l’association L. sativus- l’inoculum I5 (R. leguminosarum (M5)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Variovorax sp) est une symbiose prometteuse pour la dépollution biologique des sites contaminés par le plomb et le cadmium et pour l’amélioration de la qualité et de la fertilité de ces sols.

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Cinquième chapitre

Etude des mécanismes impliqués dans la tolérance et l'absorption du Pb, et la stratégie de détoxication adoptée par L. sativus et stimulée par l’inoculation bactérienne

Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

Introduction

Après la confirmation du potentiel de phytoremédiation, en plein champ, de la gesse commune en association avec des PGPR efficients et résistants aux métaux, on a visé l’exploration des mécanismes de réponse de cette plante suite à l'application de 1 mM Pb, à l’échelle biochimique et moléculaire. Il s’agit d’une étape cruciale dans la compréhension des mécanismes impliqués dans l'absorption du plomb, la tolérance et la stratégie de détoxication adoptée par la plante et stimulée par l’inoculation bactérienne.

1. Matériel et méthodes

1.1. Mise en place de la culture hydroponique

Les graines de gesse (population de provenance de Mahdia) ont été désinfectées, stérilisées puis sont mises à germer comme précédemment décrit dans le deuxième chapitre (paragraphe 1.3.10, page 45). Les graines germées ont été transférées sur 3 cristallisoirs contenant de la perlite stérilisée à l’autoclave et imbibée avec de l’eau distillée stérilisée, puis laissées durant une nuit à l’obscurité à 28 °C. Le lendemain, les inocula I1 (R. leguminosarum (M5)+ B. simplex+ Luteibacter sp+ Variovorax sp) et I5 (R. leguminosarum (M5)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Variovorax sp) ont été utilisés pour l'inoculation de la gesse, après les plantes ont été mises à l’obscurité durant une nuit (Tableau 14). La préparation des inocula ainsi que le processus de l’inoculation ont été réalisés comme précédemment décrit dans le troisième chapitre (paragraphe 1.1, page 74). Une semaine plus tard, les plantules ont été transférées dans des pots en plastique stérilisés contenant une solution nutritive (Vadez et al., 1996) et les plantules ont ensuite été ré-inoculées (109 UFC ml-1). Des plantes non inoculées ont été utilisées comme témoins (T).

Un traitement métallique de 1 mM Pb (PbCl2) a été appliqué au stade floraison qui coïncide avec le fonctionnement optimal de l’activité nodulaire (Faghire et al., 2013) et deux récoltes ont été réalisées:  La première récolte a été faite 24, 48 et 72 h après l’application de 1mM Pb. L’étude a visé l’analyse du mécanisme de réponse immédiate des plantes inoculées et non inoculées à l’échelle physiologique et biochimique. Aussi que l’effet de la composition de chaque inoculum sur les pigments photosynthétiques, les teneurs en proline et en sucres solubles, les dommages oxydatifs et l’activité des enzymes antioxydants.  La deuxième récolte a été faite après 3, 6, 9 et 14 jours d'exposition à 1 mM Pb.

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

Cette étape a visé l’étude du mécanisme de réponse à l’échelle moléculaire. En effet, dans cette partie on a étudié l’effet de l’inoculum I5 uniquement puisque cet inoculum a donné les meilleurs résultats de phytoextraction du plomb en plein champ. L'expérience a été conduite dans des conditions contrôlées à 25 °C/19 °C (jour / nuit), une humidité relative de 60%, une photopériode de 16 h de lumière/8 h d'obscurité et la solution nutritive a été continuellement aérée pour une oxygénation satisfaisante des racines. La solution nutritive a été renouvelée tous les 14 jours. L’expérience a été conduite selon un dispositif complètement randomisé.

Souches bactériennes Test de Pb MTC (mM) Gène de AIA (µg ml-1) (Séquençage de l’ADNr nodulation résistance au Pb 16S) (PbrA) R. leguminosarum (M5) + 1,5 - 30,76±2,46 B. simplex (K14) - 1,5 + 8,89±1,21 Variovorax sp (K17) - 2,0 - 0,89±0,08 Luteibacter sp (K20) - 2,5 + 47,22±0,84 P. fluorescens (K23) - 2,5 - 2,01±0,83

1.2. Dosage du plomb

Le dosage du Pb a été fait comme précédemment décrit dans le deuxième chapitre (paragraphe 1.2.2.2, page 39).

1.3. Etude des paramètres physiologiques et biochimiques

La teneur en chlorophylle et en caroténoïdes (paragraphe 1.3, page 76), les caractéristiques de la membrane (paragraphe 1.5, page 77), le dosage de la proline et des sucres solubles (paragraphes 1.6 et 1.7, page 78) ainsi que le dosage des enzymes antioxydants (paragraphe 1.9, page 79) ont été déterminés comme précédemment décrit dans le troisième chapitre.

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

1.4. Etude de l’expression des gènes par PCR en temps réel

L’objectif de cette partie est d’étudier l’expression de gènes candidats impliqués dans la tolérance et l’accumulation du plomb chez la gesse commune.

1.4.1. Extraction des ARN totaux

L’extraction des ARNs totaux a été réalisée par la méthode de Chang et al. (1993) avec quelques modifications. En effet, Les échantillons (feuilles et racines) ont été finement broyés dans un mortier refroidi à l'azote liquide, jusqu'à obtention d'une poudre fine. Ensuite, 750 µl de tampon d’extraction (2% CTAB, 2% PVP, Tris-HCl 100 mM pH 8, 25 mM EDTA, 2 M NaCl, 0,5g/l spermidine) et 15 µl de β mercaptoéthanol préalablement chauffé à 65 °C ont été ajoutés au 200 mg du broyat. Par la suite, l’ensemble est incubé à 65 °C pendant 30 min et mélanger par vortex tout les 2 à 3 min. A ce mélange, 750 µl de chloroforme-isoamyl-alcool (24 :1) ont été ajoutés puis le mélange est centrifugé à 10000 rpm pendant 20 min. Par la suite le surnageant a été récupéré et les ARNs sont précipités par l'addition de 200 µl de LiCl 10M toute la nuit à 4 °C. Après le mélange a été centrifugé pendant 30 min à 13800 rpm, le culot d'ARNs est repris dans 200 µl d'eau traitée au DEPC. Une seconde précipitation des acides nucléiques a été réalisée en ajoutant 100 µl de NaAc 3M pH 5,2 et 500 µl d'éthanol absolu. Les tubes sont placés 1 h à – 80 °C puis centrifugés pendant 15 min à 13800 rpm. Le culot est lavé deux fois à l'éthanol 70%, séché et repris dans 50 µl d'eau traitée au DEPC. Les ARNs sont traités avec 1 µl de l'enzyme DNAse I (5U/µl) pour éliminer l'ADN génomique.

1.4.2. Analyse qualitative et quantitative des ARNs totaux

La concentration en ARNs totaux de chaque extrait a été déterminée à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop (Luminescence Spectrometer LS55- Perkin Elmer). Généralement, les protéines absorbent majoritairement à 280 nm, les composés phénoliques à 230 nm, et les acides nucléiques à 260 nm. Les rapports A260/A280 et A260/A230 permettent d’évaluer la pureté des acides nucléiques présents dans chaque échantillon. En effet, pour considérer un échantillon pur en ARN, le rapport A260/A280 doit être supérieur à 2,0 (pour l’ADN pur, le rapport doit être compris entre 1,8 et 2,0). Si ce rapport est inférieur à 1,8, la contamination en protéines est considérée comme importante. Le rapport A260/A230 doit être proche de 2,0 afin de pouvoir considérer l’échantillon exempt de contaminants. D’après les résultats trouvés du contrôle au spectrophotomètre, le degré de pureté de l’ARN des

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

échantillons est bon. On considère dans les calculs qu’une mole de nucléotides polycondensés représente 309 grammes. -1 -1 Dans ces conditions le coefficient d’extinction de l’ARN est de 7700 A260.M .cm , c’est à -1 dire qu’une unité d’absorbance à 260 nm (A260) représente 40 μg ml . Avant de procéder à la transcription inverse, il est nécessaire de doser et de contrôler l’intégrité de la qualité des ARN totaux extraits par électrophorèse sur gel d’agarose pour vérifier que ceux-ci ne sont pas dégradés. Cependant, l’intégrité des ARN totaux est visualisée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,2%. Le principe de l’électrophorèse sur gel d‘agarose repose sur la migration des molécules d’acides nucléiques et de leurs séparation selon leur taille. A pH basique, l’ARN est chargé négativement de part les charges négatives portées par les groupements phosphates. Dans du tampon Tris, Acétate, EDTA (TAE) 1X (pH 8) et sous l’impulsion d’un champ électrique, l’ADN va migrer vers l’anode en fonction de sa taille. La migration s’est effectuée dans le tampon TAE 1X sous un champ électrique de 80 volts durant 20 min.

1.4.3. Suivie de la migration et révélation

Avant d'être déposés dans les puits, les échantillons d'ARN sont mélangés avec un tampon de charge qui contient: - un alourdisseur (glycérol) pour entraîner l'ARN au fond des puits - des marqueurs de mobilité (bleu de bromophénol et xylène cyanol) Les deux marqueurs migrent à des vitesses différentes: le bleu de bromophénol (violet) migre avec les fragments de petite taille, le xylène cyanol (bleu turquoise) avec les fragments de grande taille. Ensuite, les ARNs sont révélés par l'intermédiaire du bromure d'éthidium (BET). Le BET est un colorant fluorescent très utilisé en biologie moléculaire pour le marquage et la détection des acides nucléiques. Du fait de sa structure, cette molécule possède la propriété de s'intercaler entre les paires de base des acides nucléiques, où sa fluorescence dans le visible est exaltée. Les ARNs sont révélés par excitation sous illumination par UV courts (300-320 nm).

1.4.4. Transcription inverse des ARNm et synthèse des ADNc

Le principe de la transcription inverse est de synthétiser un ADNc (ADN complémentaire) à partir d’une matrice d’ARNm. Ceci est effectué grâce à une enzyme appelée la transcriptase inverse (RT). Cette technique permet de rétrotranscrire les ARNm en ADNc pour être amplifiés par la suite par PCR.

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

La synthèse des ADNc a été réalisée grâce au kit Turbo-I First Strand cDNA Synthesis KIT (Biomatik) qui contient tous les composants nécessaires à la synthèse du premier brin d'ADNc, avec le choix d'utiliser soit l’Oligo (dT) et/ou des amorces aléatoires (hexamer primer). Dans un premier temps, 5 µg d’ARNt ont été dénaturés (5 min à 65 °C) puis incubés à 25 °C pendant 5 min avec des amorces aléatoires (hexamer primers). La synthèse d’ADNc a été effectuée à 42 °C pendant 60 min par l’enzyme Reverse Transcriptase (200 U/μl) en présence de 2 μl de nucléotides dNTP (10 mM), et 1 µl de RNase Inhibitor (40 U/μl). Après la transcription inverse, l’enzyme a été désactivée par traitement thermique 15 min à 70 °C. Les ADNc ainsi obtenus ont ensuite été utilisés comme matrice pour la PCR quantitative en temps réel.

1.4.5. Recherche et mise au point des amorces

Des séquences nucléotidiques spécifiques correspondantes aux gènes d’intérêt (LsABC, LsPCS, LsGR, LsGST, LsCNGC) et de référence (β-tubuline) sont identifiées chez L. sativus (Tableau 15). Les amorces sont ensuite déterminées via le programme Primer3 dans la région codante (CDS : « Coding DNA Sequence ») de la séquence d’intérêt selon plusieurs critères permettant une meilleure spécificité des amorces. - température de fusion (Tm) : 55 °C à 60 °C - taux en G et C : 40 à 70% - longueur des amorces : 18 à 20 nucléotides On veille également à ce que la taille des amplicons soit inférieure à 150 pb pour une efficacité optimale de l’amplification et supérieure à 80 pb afin de pouvoir les distinguer des éventuels dimères d’amorces. Le logiciel «Net Primer» (http://premierbiosoft.com/netprimer) est ensuite utilisé afin de minimiser le risque de formation de dimères d’amorces. L’outil «Basic Local Alignment Search Tool» (BLAST; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) permet de contrôler que les séquences des amorces ne s’hybrident pas sur d’autres régions du génome de Lathyrus sativus.

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

Tableau 15: Différents couples d'amorces utilisés pour l'amplification spécifique par PCR en temps réel.

Gènes Séquences des amorces

Phytochelatine synthase (LsPCS) 5’- CCTAATGGATGATGTGCCTT-3’ 5’- CTTCTTTGACAGCGAGCCTT-3’ Glutathion reductase (LsGR) 5’- GCCTGCTCCTCACTTAGACC-3’ 5’- ATGGGCTGTGGGTGATGTAA-3’ Glutathion S-transferase (LsGST) 5’- TAGATTCTGGGCTGATTTTGT-3’ 5’- CTTGTCTCCCAACTCTTGCT-3’ Transporteur CNGC (LsCNGC) 5’- AAAGGAGGGATGCAGAACAAT-3’ 5’- GCACCCTCATCAGCAAATCTA -3’ Protéine soluble (LsABC) 5’- CGAGTCACGAGCAGCATCTAT -3’ 5’- CGATTCAAGCCATAAGACAGC -3’ β-tubuline 5’-TGCCTAGGATCAGCAGCACA-3’ 5’-TCAGTGTCCCTGAGCTCACT-3’

1.4.6. La PCR en temps réel

La technologie de PCR en temps réel est basée sur la détection et la quantification d’un «reporter» fluorescent dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons générés pendant la réaction de PCR. En observant la quantité de fluorescence émise à chaque cycle, il devient possible de suivre la réaction PCR durant sa phase exponentielle où la première augmentation significative dans la quantité d’amplicons est en corrélation directe avec la quantité initiale de la matrice originale cible. L’amplification des gènes étudiés par PCR en temps réel a été effectuée dans le thermocycleur, Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System. Sur cet appareil, l’excitation UV est assurée par une lampe tungstène- halogène, et la détection par une caméra CDD. L’appareil possède cinq filtres d’excitation, et cinq filtres de détection; FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/TAMRA/Cy3, ROX/Texas Red et Cy5. Le contrôle de la température est assuré par la technologie Peltier, et permet une précision de température de +/- 0,25 °C et une uniformité de +/- 0,5 °C entre échantillons. Dans notre travail, Un Kit Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix a été utilisé. L’amplification des gènes d’intérêt est réalisée dans les plaques multipuits (96 puits) en présence des ADNc (100 ng) et du mélange réactionnel contenant les amorces sens et antisens du gène à amplifier et du tampon en présence de SYBR Green. Le SYBR Green émet une

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb fluorescence à 521 nm lorsqu’il s’intercale à l’ADN. Le programme utilisé consiste en un premier palier à 95 °C pendant 2 min, suivi de 35 cycles de 30 s à 95 °C et 30 s à 60 °C. La quantité d’ADN issue de l’amplification est alors enregistrée en temps réel par un enregistreur de fluorescence. Les transcrits codant les gènes d’intérêt sont quantifiés. Une courbe de fusion a également été réalisée en fin de réaction pour s’assurer de la spécificité de l’amplification, notamment l’absence de dimères d’amorces. La quantité relative des transcrits (QR) est calculée à partir des Ct (threshold cycle) obtenus. Le Ct ou cycle seuil est le nombre de cycle à partir duquel le produit PCR est détectable. Il est directement lié à la quantité d’ADN cible présent initialement dans l’échantillon. Le QR est calculé selon la formule (Livak et Schmittgen, 2001):

QR = 2-ΔCt = 2-(Ctgène intérêt - Ctgène de référence)

1.5. Analyse statistique

A. Etude du mécanisme de réponse de L. sativus suite à l'application de 1 mM de Pb pendant 24, 48 et 72 h, à l’échelle physiologique et biochimique

A.1. Résultats

Dans cette partie du travail, on a visé l’étude de l'absorption du plomb, la tolérance et la stratégie de détoxication adoptée par la gesse. Aussi on a visé d’évaluer l'effet de deux inocula I1 et I5 et leur composition sur certains paramètres physiologiques et biochimiques, étudiés en conditions hydroponiques après 24, 48 et 72 h d'exposition au Pb (1 mM).

1.1. Absorption du plomb par L. sativus

Nos résultats ont révélé qu’après 72 heures d'exposition à 1 mM de Pb, les plantes traitées n’ont présenté aucun symptôme de toxicité visible, malgré le fait que des concentrations élevées du plomb ont été enregistrées au niveau des plantes (Figure 40). L'absorption du métal a augmenté progressivement 24, 48 et 72 h après l'application du traitement avec une différence significative entre les contrôles non inoculés et les plantes inoculées. En effet, à 24

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

h, les feuilles des plantes témoins ont accumulé la plus forte concentration du plomb, ce qui explique le potentiel de L. sativus pour l'absorption du Pb mais à 48 et 72 h, les plantes inoculées avec I5 ont amélioré significativement ce potentiel de 32% et 35%, respectivement (Figure 40). De plus, les racines des plantes traitées avec le métal ont accumulé plus du Pb que les feuilles, avec les valeurs les plus élevées enregistrées dans les racines des plantes inoculées avec I1 et I5 à 72 h (20,99 et 19,28 mg g-1 MS, respectivement) ce qui laisse suggérer que les plantes inoculées ont développé un mécanisme spécifique pour améliorer l'absorption du plomb et son accumulation dans les tissus des plantes.

A 2 B 25 a a

a a

20 1,5 b b b

b b b b MS)

MS) 15 c 1 1

c 1 -

- d 1 c d d 10

e (mg g

(mg g

0,5 5 AccumulationduPb AccumulationPb du 0 0 Contrôle I1 I5 Contrôle I1 I5

1.2. Teneur en chlorophylle et en caroténoïdes de L. sativus

Les plantes inoculées avec des PGPR efficients et résistants au plomb ont significativement plus de contenu en chlorophylle total et en caroténoïdes que celles du témoin non inoculé (Tableau 16). Les plantes contrôles ont montré une réduction de 17%, 21% et 29% du niveau de la chlorophylle après 24, 48 et 72 h d'exposition au Pb, respectivement. Cependant, l'inoculation avec les PGPR a inversé cette perte de chlorophylle, avec la plus grande amélioration enregistrée chez les plantes inoculées avec I5 produisant 145%, 150% et 152% plus de Chl totale que les plantes contrôles à 24, 48 et 72 h, respectivement (Tableau 16). L'inoculation avec I1 et I5 a également amélioré significativement le taux de caroténoïdes des plantes non traitées de 87% et 75%, respectivement. De même, l'application de Pb a augmenté

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb la teneur en caroténoïdes à 24, 48 et 72 h chez les plantes inoculées avec I1 et I5 avec les plus fortes augmentations enregistrées à 72 h de 78% et 188%, respectivement, par rapport aux plantes non inoculées (Tableau 16).

Paramètres HAT Contrôle I1 I5 0 0,93 ± 0,03f 2,06 ± 0,07a 2,18 ± 0,09a Chlorophylle totale 24 0,77 ± 0,02fg 1,62 ± 0,07cd 1,89 ± 0,02b 48 0,73 ± 0,04g 1,50 ± 0,02d 1,83 ± 0,02b 72 0,66 ± 0,08g 1,30 ± 0,01e 1,66 ± 0,07c 0 0,08 ± 0,01d 0,15 ± 0,01c 0,14 ± 0,01c Caroténoïdes 24 0,07 ± 0,01d 0,13 ± 0,01c 0,14 ± 0,02c 48 0,07 ± 0,01d 0,15 ± 0,01c 0,20 ± 0,01b 72 0,09 ± 0,01d 0,16 ± 0,01c 0,26 ± 0,02a 0 10,88 ± 0,93cd 11,07 ± 0,59cd 12,36 ± 0,86c Fuite des électrolytes 24 11,34 ± 1,91cd 11,52 ± 0,47cd 13,55 ± 0,49bc 48 15,34 ± 1,20b 16,15 ± 0,96b 20,25 ± 1,08a 72 7,98 ± 0,49e 6,93 ± 0,84e 9,01 ± 0,92de 0 92,32 ± 0,71ab 94,05 ± 1,73ab 98,79 ± 1,20a Indice de stabilité 24 86,01 ± 0,91cd 92,86 ± 2,60ab 93,89 ± 2,10ab membranaire 48 64,46 ± 1,14f 79,84 ± 2,01de 87,56 ± 3,60bc 72 55,80 ± 2,97g 59,46 ± 3,50fg 75,18 ± 2,87e

Les valeurs représentent la moyenne de 5 répétitions (± SD). Pour chaque ligne, les valeurs suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes, selon le test Tukey HSD test à p < 0,05.

1.3. Peroxydation des lipides, fuite des électrolytes (EL%) et stabilité membranaire de L. sativus

Les résultats obtenus ont montré une augmentation remarquable du niveau de fuite des électrolytes et une diminution de la stabilité de la membrane (Tableau 16). En effet, EL a augmenté significativement à 48 h, avec les plus fortes hausses enregistrées dans les feuilles des plantes inoculées avec I5 (64%), ce qui peut être dû aux quantités élevées de plomb accumulées par ces plantes, cependant, ce paramètre a diminué significativement à 72 h. En outre, l'inoculation avec I1 et I5 a significativement amélioré l'intégrité de la membrane cellulaire par des augmentations de 8% et 9% de l'indice de stabilité membranaire à 24 h, 24% et 36% à 48 h, 7% et 35% à 72 h, respectivement par rapport aux plantes contrôles (Tableau

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

17). La teneur en malondialdéhyde (MDA), en tant qu'indicateur de la peroxydation lipidique, a été modifiée en réponse au plomb en fonction du temps et de l'inoculation (Tableau 17). Au niveau des feuilles du contrôle et les plantes inoculées avec I1, la teneur en MDA a augmenté significativement à 24 h et a persisté au même niveau après 48 et 72 h d'exposition au Pb. Cependant, au niveau des feuilles des plantes inoculées avec I5, la teneur en MDA a augmenté à 24 h suivi d'un ajustement pour maintenir un même niveau d'expression que le contrôle. De plus, au niveau des racines, elle a augmenté significativement jusqu'à 48 h et a chuté jusqu’au niveau initial à 72 h, démontrant ainsi que la réponse de la plante est liée à la spécificité de la composition de l'inoculum et au rôle protecteur de l'inoculum I5 contre les effets délétères du plomb par la modulation de la production de MDA (Tableau 17).

1.4. Teneur en proline et en sucres solubles de L. sativus

La synthèse de la proline est un indicateur de l'osmorégulation et a été mesurée au cours de l'expérience. L’analyse statistique de la variance (à p < 0,05) a montré que les teneurs en proline ont présenté des niveaux significativement différents au sein des plantes contrôles et celles inoculées avec des PGPR (Tableau 7). En réponse à 1 mM Pb, la biosynthèse de proline a immédiatement augmenté, et l'effet stimulant a été plus prononcé au niveau des feuilles des plantes inoculées avec I1 et I5 à 72 h par 40% et 66%, respectivement, par rapport au contrôle. De plus, la teneur en proline a augmenté graduellement et significativement dans les racines de toutes les plantes étudiées à 24, 48 et 72 h avec les plus fortes augmentations enregistrées après 72 h d'application du plomb chez les plantes inoculées avec I1 et I5 de 28% et 14%, respectivement, par rapport au contrôle. La concentration des sucres solubles a augmenté significativement à 48 h dans les feuilles des plantes soumises au Pb (Tableau 17). Cependant, le niveau de ces métabolites était plus prononcé lorsque les plantes ont été inoculées avec I5 de 52%, 21% et 23% après 24, 48 et 72 h, respectivement, par rapport au contrôle. Dans les racines des plantes témoins, la teneur en sucres solubles a diminué significativement de 9% et de 48% respectivement à 24 et 48 h, cependant une réduction de 34% a été enregistrée à 72 h. En revanche, les plantes inoculées avec I5 n'ont montré aucun changement significatif à 24 et 48 h, mais la concentration totale des sucres solubles dans ces plantes était 3,3 fois supérieure au contrôle, 72 h après l'exposition au Pb (Tableau 17). Les racines des plantes inoculées avec I1 ont conservé le même taux de sucres solubles en présence et en absence de plomb.

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

Tableau 17: Effets du plomb (1 mM) sur la teneur en malondialdéhyde (MDA) (nmol g-1 MF), proline (μmol g-1 MS) et en sucres solubles (mg g-1 MS) des feuilles et des racines des plantes contrôles (C: non inoculées) et au niveau des plantes inoculées (I1 et I5) avant l'application du plomb (0) et 24, 48 et 72 heures après l’application du traitement métallique (HAT) de Lathyrus sativus.

Plante HAT MDA Proline Sucres solubles C I1 I5 C I1 I5 C I1 I5 0 7,12d 7,94d 8,78d 8,09f 15,58d 15,72d 30,18f 49,01e 70,66d 24 14,19c 13,01c 23,66a 11,92e 17,50c 18,11c 51,22e 55,06e 77,77cd Feuilles 48 13,49c 13,33c 13,18c 12,52e 18,84c 21,78b 80,01bc 87,74b 97,01a 72 15,22c 14,62c 18,86b 15,27d 21,33b 25,35a 83,57bc 97,45a 102,90a 0 5,88c 4,09d 6,09c 0,46f 2,115f 3,92e 35,08de 56,58bc 58,64b Racines 24 9,18b 8,37b 8,25b 9,82d 12,05cd 11,20cd 32,04e 50,69c 56,20bc 48 6,48c 6,47c 13,36a 13,13c 16,63b 16,41b 18,31f 40,84d 52,23bc 72 6,74c 6,34c 6,40c 16,23b 20,77a 18,49ab 23,21f 57,94bc 77,16a

Les valeurs représentent la moyenne de 5 répétitions. Pour chaque ligne, les valeurs suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes, selon le test Tukey HSD test à p < 0,05.

1.5. Activité des enzymes antioxydants

Le plomb a significativement modifié les activités des enzymes antioxydants (SOD, GPOX, CAT et APX) au niveau des feuilles et des racines des plantes de gesse de manière dépendante du temps et de l'inoculation (Figure 41). L'exposition à 1 mM Pb a induit une stimulation immédiate de l'activité SOD dans les feuilles et les racines de L. sativus (Figure 41). Cette stimulation a été plus rapide et significativement plus élevée dans les feuilles des plantes inoculées avec I1 et I5, atteignant 4,5 et 5,5 fois à 24 h, respectivement, alors que le contrôle n’a pas dépassé trois fois. De plus, l'activité SOD a augmenté transitoirement à 48 et 72 h, principalement dans l'ensemble des plantes inoculées avec I1 et I5 qui ont atteint, respectivement, 42% et 73%, à 72 h, par rapport aux plantes non inoculées (Figure 41). Dans les racines, on a observé une augmentation significative de l'activité SOD au niveau du contrôle de 93% à 24 h qui a diminué rapidement jusqu'à 48% à 72 h. Cependant, chez les plantes inoculées avec I1, l'activité enzymatique a été significativement plus élevée que celle notée au niveau des plantes contrôles, de 29%, 59% et 139% à 24, 48 et 72 h, respectivement. Néanmoins, les racines des plantes inoculées avec I5 ont maintenu le même niveau de l’activité SOD avant et après l'application du traitement métallique (Figure 41). L'activité GPOX a augmenté significativement dans les feuilles de L. sativus après 72 h d'exposition au Pb; les plantes inoculées et les contrôles ont également exprimé une activité

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb de GPOX similaire sans aucune différence significative (Figure 41). En revanche, les racines des plantes inoculées avec I5 ont montré que l'activité GPOX a augmenté significativement de 45% à 24 h suivie d'une diminution graduelle après 48 et 72 h (32% et 41%, respectivement); et une tendance similaire de changements a été enregistrée chez les contrôles. Cependant, les plantes inoculées avec I1 ont tenté d'ajuster l'expression de l'activité GPOX en maintenant un niveau plus stable. Avant l'application de Pb, on a noté que les inocula I1 et I5 ont stimulé fortement l'activité CAT de 182% et 174% dans les feuilles et de 143% et de 437% dans les racines, respectivement, comparativement aux plantes contrôles (Figure 41). L'application de Pb a augmenté significativement l'activité CAT dans les feuilles et les racines du contrôle après 24 h d'exposition qui a été maintenue au même niveau à 48 h, avant une chute remarquable à 72 h (Figure 41). Cependant, dans les feuilles des plantes inoculées avec des PGPR, l'activité CAT a diminué significativement à 24 h, jusqu'à un niveau égal à celui du contrôle, suivi d'une nouvelle diminution à 72 h, où elle a été maintenue 8 fois plus élevée dans les plantes inoculées avec I5, par rapport au contrôle. Les résultats ont également montré que les racines des plantes inoculées avec I1 ont essayé de maintenir un niveau stable d'expression de l'activité CAT. Concernant les racines des plantes inoculées avec I5, l'activité CAT a diminué à 24 et 48 h, de 19% et 54%, respectivement, puis a repris son activité à 72 h ce qui correspond au temps d'adaptation, ou elle a été six fois plus importante que le contrôle. Au niveau des feuilles, l'activité APX a diminué à 24 et 48 h et a augmenté à 72 h chez les plantes inoculées avec I1 et celles des contrôles (Figure 41). Cependant, chez les plantes inoculées avec I5, l'activité APX a été maintenue au même niveau à 24 et 48 h, ce qui correspond au temps d'adaptation, suivi d'une stimulation significative à 72 h de 83%. De plus, l'activité APX au niveau des feuilles de ces même plantes a été 2, 3 et 3,5 fois supérieure à celle des plantes contrôles après 24, 48 et 72 h d'exposition au Pb, respectivement. Dans les racines, l'inoculum I5 a montré la capacité de stimuler l'activité APX jusqu'à 48 h, plus que I1, tandis qu'à 72 h l'activité enzymatique a été totalement inhibée chez toutes les plantes testées. En effet, les plantes contrôles n'ont montré aucun changement significatif de l'activité APX à 24 et 48 h, mais une réduction de 75% a été observée à 72 h. Cependant, l'activité APX a augmenté immédiatement à 24 h de 141% chez les plantes inoculées avec I1 suivie d'une inhibition irréversible de l'activité de l'APX, mais où elle a été 2 et 3,5 fois supérieure au contrôle, respectivement. Alors que chez les plantes inoculées avec I5, l'activité APX a augmenté significativement à 24 et 48 h de 62% et 133%, respectivement, et a baissé jusqu'à 72% à 72 h (Figure 41).

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

A 60 12

a a a 40 a 8 a a b b b b b c 20 4 cd cd d cd Activité SOD Activité d c GPOX Activité c d d d c 0 c 0 T0 24h 48h 72h T0 24h 48h 72h

240 400

a 300

a 160 a

b 200 bc b b 80 cd cd b

cd cd b Activité APX Activité Activité CAT Activité d d 100 cd c c cd cd de e e 0 e 0 T0 24h 48h 72h B T0 24h 48h 72h

20 8

15 a 6 aba b ab bc bc 10 4 cd bcd cd de de de cd d d de d d ef f

Activité SOD SOD Activité 5 2 f Activité GPOX Activité f e

0 0 T0 24h 48h 72h T0 24h 48h 72h 40 160

a 30 120 a a b 20 bc 80 b cd cd bc d d e de cd

Activité CAT Activité d d 10 e APX Activité 40 de def f f ef f f 0 0 T0 24h 48h 72h T0 24h 48h 72h

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

A.2. Discussion

L’étude du mécanisme de réponse de la gesse à 1 mM de plomb après 24, 48 et 72 h de l’application du métal a révélé que l'exposition au plomb induit son absorption immédiate par les plantes à des fortes concentrations et que ses feuilles et ses racines n’ont présenté aucun symptôme de toxicité, ce qui explique la haute tolérance de la gesse vis-à-vis de ce métal. L. sativus a prouvé son potentiel à absorber le plomb et à l'accumuler en quantités importantes dans ses racines, démontrant ainsi des capacités d'accumulation du plomb similaires à celles des accumulateurs potentiels comme Brassicae juncea, Thlaspi rotundifolium et Solarium melongena (Brunet et al., 2008; Yilmaz et al., 2009). En effet, certaines espèces végétales ont développé des mécanismes et des stratégies physiologiques et biochimiques pour tolérer des niveaux toxiques de métaux et tolérer une accumulation métallique élevée sans provoquer des altérations métaboliques au sein de la plante (Revathi et Venugopal, 2013). Dans notre étude, les résultats ont clairement démontré que le potentiel d'absorption du Pb par les plantes de L. sativus a augmenté suite à l'inoculation avec des PGPR. En effet, la tolérance/résistance aux métaux lourds chez les plantes et les bactéries est une condition préalable essentielle à l'accumulation des métaux par les plantes et à la phytoremédiation assistée par les bactéries (Ma et al., 2016). De plus, les résultats ont indiqué l'impact positif des PGPR sur l'absorption du Pb chez L. sativus après 48 h d'exposition au métal, en particulier au niveau des feuilles des plantes inoculées avec I5, dû à la présence de P. fluorescens, démontrant ainsi que la bio-disponibilité du Pb nécessite un temps d'adaptation. De même, Karimi et al. (2017) ont étudié le rôle des PGPR dans l'amélioration de l'absorption du plomb par les racines des plantes d’Onopordum acanthium et son transport vers la partie aérienne des plantes. En effet, plusieurs études ont démontré que la bactérie résistante aux métaux, P. fluorescens, a favorisé une accumulation significativement plus élevée des métaux lourds au niveau de la partie aérienne, comparativement aux plantes contrôles (Chiboub et al., 2018; Fuloria et al., 2009; Sheng et al., 2008). Nos résultats suggèrent que les plantes inoculées ont développé un mécanisme spécifique pour améliorer l'absorption du plomb, son accumulation et son transport vers la partie aérienne qui a nécessité une durée spécifique. En effet, la distribution des métaux dans les organes et les tissus des plantes est un indicateur indirect des mécanismes de détoxification et de tolérance employés par les plantes (Cosio, 2004). Dans notre étude, on a enregistré une diminution progressive de l'accumulation des pigments photosynthétiques en association avec le traitement métallique. Une telle inhibition

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb peut être la conséquence de la destruction de la membrane chloroplastique par une peroxydation lipidique due à l'augmentation du niveau des espèces réactives de l’oxygène (ERO), au blocage du transport photosynthétique des électrons, à une augmentation de l'activité chlorophyllase ou à une perturbation de l'absorption des éléments photosynthétiques essentiels comme le magnésium (Sharma et Dubey, 2005). Cependant, on a noté que l'inoculation avec des PGPR a inversé la perte en chlorophylle, en stimulant le mécanisme de défense dû à la production de différentes hormones de stress qui confèrent plus de teneur en chlorophylle au niveau des plantes inoculées avec des PGPR (Kamran et al., 2016). Nos résultats sont similaires à ceux de Pal et Sengupta (2016) qui ont également observé que l'inoculation avec des PGPR a entraîné une augmentation de la teneur en chlorophylle chez Oryza sativa. De plus, différentes études ont montré que les plantes inoculées avec des PGPR ont présenté plus de teneurs en chlorophylle que celles traitées et non inoculées (Kamran et al., 2015, Chiboub et al., 2018). Les données obtenues ont indiqué que l'inoculation avec des PGPR a augmenté progressivement la teneur en caroténoïdes, améliorant ainsi potentiellement la tolérance de L. sativus au stress métallique. Nadeem et al. (2006) et Shahabivand et Aliloo (2016) ont également rapporté que l'inoculation a amélioré la teneur en caroténoïdes du maïs et du blé sous stress abiotique. Il convient de noter que les caroténoïdes sont des composants importants des systèmes antioxydants, qui aident à atténuer le stress des plantes et à maintenir l'intégrité membranaire des cellules, à piéger les radicaux libres et à protéger les photosystèmes contre la destruction photo-oxydante (Emamverdian et al., 2015). L'accumulation du plomb par les plantes de L. sativus a été accompagnée d'une augmentation progressive de la fuite des électrolytes et de la teneur en MDA suivie de leur ajustement. Le MDA est un produit cytotoxique de peroxydation des acides gras insaturés, et son augmentation indique la lésion des membranes biologiques induite par les ERO (Kaur et al., 2012). Néanmoins, nos résultats ont démontré que l'inoculation avec des PGPR a réduit les dommages prononcés sur la membrane cellulaire et a amélioré la stabilité membranaire, en particulier chez les plantes inoculées avec I5, démontrant ainsi le rôle protecteur de P. fluorescens contre les effets nocifs du plomb, en modulant la formation de MDA. La réduction de la teneur en MDA et de la fuite des électrolytes en présence de plomb chez les plantes inoculées avec des PGPR est en accord avec des observations antérieures corrélées à de meilleurs mécanismes de tolérance au stress. De même, les résultats obtenus sont en accord avec d'autres indiquant que l'inoculation avec des PGPR peut réduire les dommages liés à la

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb membrane cellulaire dans des conditions de stress (Ilangumaran et Smith, 2017; Mahmood et al., 2016). Le traitement avec le plomb a induit une augmentation rapide et progressive des teneurs en proline et en sucres solubles (24 h après l'exposition au Pb, respectivement) et l'inoculation a amélioré d’avantage leur biosynthèse. Les résultats suggèrent que l’accumulation de ces composés est directement impliquée dans le mécanisme principal de tolérance des plantes au stress causé par le Pb, ainsi que l'accumulation de ce métal, qui ont été renforcées avec l'inoculation. Il a été démontré que les PGPR améliorent la résistance de leurs plantes hôtes au stress métallique par l'induction des ajustements métaboliques adéquats qui sont cruciaux pour la survie des plantes pendant les périodes de stress (Dimkpa et al., 2009; Mourato et al., 2012; Nahar et al., 2016). En général, la proline joue un rôle important dans l'ajustement osmotique, la protection des enzymes de la dénaturation, la désintoxication des espèces réactives de l'oxygène, la prévention des dommages membranaires et l'augmentation de la défense antioxydante (Alqarawi et al., 2014; Hoque et al., 2008; Kibria et al., 2017). En plus d'agir comme un chélateur des métaux et comme un stabilisateur de protéines, la proline minimise les effets toxiques des métaux (Sharma et Dubey, 2005). D’autre part, l'augmentation de la teneur en sucres solubles est une autre stratégie de défense importante pour les plantes qui optimise leur tolérance aux stress abiotiques (Çakmakçı et al., 2017; Hahm et al., 2017; Rosa et al., 2009). En effet, ils augmentent pour protéger et stabiliser les cellules membranaires en empêchant l'oxydation des membranes et des protéines, grâce à leur capacité de piéger les ERO et leur rôle comme molécules régulatrices du signal pour la régulation métabolique (Bano et al., 2013; Rosa et al., 2009). En ce qui concerne notre étude, Pramanik et al. (2017) ont également montré une observation expérimentale similaire chez le riz lorsqu'il est inoculé avec des PGPR en présence du cadmium. Une caractéristique commune des réactions des plantes face au stress causé par les métaux lourds est la production accrue des enzymes antioxydants piégeuses des ERO, et la modulation de leurs niveaux constitue une réponse adaptative importante (Jebara et al., 2017). Dans ce travail, l'activation des réponses de défense chez les plantes de L. sativus soumises à une application de 1 mM Pb a été appariée avec l'amélioration de l’activité de la superoxyde dismutase et de la peroxydase (SOD et GPOX) au niveau des feuilles et de l’activité SOD, GPOX ainsi que celle de la catalase (CAT) au niveau des racines. Des résultats similaires ont été obtenus chez Eichhornia crassipes et Lens culinaris en présence de Pb (Malar et al., 2014,

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

Jebara et al., 2015a). D’une façon générale, les activités des enzymes antioxydants divergent entre les concentrations de métaux lourds et les espèces végétales (Jebara et al., 2017). Les résultats ont révélé que l'exposition à 1 mM de plomb a induit une augmentation rapide de l'activité SOD dans les feuilles et les racines. Une augmentation parallèle de l'activité GPOX a été enregistrée, de même chez d’autres plantes comme chez Eichhornia crassipes (Malar et al., 2014) et Arachis hypogaea (Nareshkumar et al., 2015). Cette enzyme semble

être un antioxydant essentiel, impliqué non seulement dans le piégeage de H2O2, mais aussi dans plusieurs processus physiologiques et biochimiques tels que la croissance, le développement, la différenciation cellulaire et le catabolisme de l’auxine (Cui et Wang, 2006; Rastgoo et Alemzadeh, 2011). De plus, Gajewska et al. (2006) ont suggéré que l'augmentation de l'activité de GPOX peut être corrélée avec des lignifications plus élevées pour une bonne acclimatation au stress. Nos résultats ont également démontré que l'activité de la catalase a diminué dans les feuilles des plantes traitées avec le métal, puisque les catalases sont des métalloenzymes, ce qui peut être dû à une interaction directe avec le Pb (Gupta et al., 2013). Alors que les plantes inoculées avec I1 ont maintenu un niveau stable d'expression de l'activité CAT. Dans la présente étude, les activités des enzymes antioxydants ont augmenté d’avantage chez les plantes inoculées avec des PGPR, après l'application du traitement métallique; avec des différences existant entre les plantes inoculées avec I1 et I5. Ainsi, les résultats suggèrent que P. fluorescens stimule l’activité de la superoxyde dismutase (SOD) et l’ascorbate peroxyase (APX) dans les feuilles, CAT et APX dans les racines; tandis que B. simplex améliore les activités SOD, GPOX, CAT et APX dans les racines. Les résultats confirment celles retrouvées dans des études antérieures signalant des augmentations plus importantes de la production d'antioxydants enzymatiques chez les légumineuses traitées avec des métaux lourds et inoculées avec les PGPR, par rapport à des plantes non-inoculées (Chiboub et al., 2018; Jebara et al., 2015b). La modulation des niveaux d'antioxydants constitue une réponse adaptative importante à la contamination par les métaux lourds dans les tissus végétaux (Jebara et al., 2017). En outre, Siddiqui (2013) a suggéré qu'une combinaison de deux ou plusieurs activités d'enzymes antioxydants présente un effet synergique sur la tolérance au stress et est nécessaire pour assurer une détoxification complète des espèces réactives de l’oxygène dans diverses conditions de stress. De même, l'élimination rapide des ERO excessives est essentielle au bon fonctionnement des cellules et à la survie des organismes (Trachootham et al., 2008).

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

La stimulation de l’activité de l’ascorbate peroxydase (APX) observée dans la présente étude suggère également un rôle direct des PGPR qui ont déclenché des voies de défense abiotiques liées au stress par la modulation du piégeage des espèces réactives de l’oxygène (ERO), qui à son tour aide les plantes inoculées à améliorer leur tolérance au Pb. Les résultats sont en accord avec des études antérieures indiquant que l'inoculation avec des PGPR a amélioré l'activité de l'APX en présence des métaux lourds chez Vicia faba, Sulla coronaria (Saadani et al., 2016) et Lens culinaris (Jebara et al., 2015b). Enfin, il convient de noter que la capacité de L. sativus à lutter contre les ERO ne dépend pas seulement de certaines activités enzymatiques, mais de tout un système de défense antioxydant renforcé par l'inoculation avec des PGPR (Figure 42). En effet, l'exposition au plomb induit son absorption immédiate par les plantes qui s'accompagne d'une baisse progressive des teneurs en chlorophylle et d'une augmentation immédiate des teneurs en MDA et en proline ainsi que des activités SOD et CAT au niveau des feuilles et des racines, tandis que l’activité GPOX a été améliorée uniquement au niveau des racines. Cependant, au même temps, les plantes inoculées avec des PGPR ont présenté une activité SOD, des teneurs en proline et en chlorophylle significativement plus élevées et ont montré une augmentation significative de l'activité APX dans les racines (Figure 42). Ensuite, on a observé une diminution de la stabilité membranaire suivie d'une augmentation de la fuite des électrolytes et des sucres solubles, tandis que les plantes inoculées ont tenté d'augmenter la teneur en caroténoïdes et l'intégrité de la membrane cellulaire en augmentant l'indice de stabilité membranaire par rapport aux plantes témoins non inoculées. De plus, après un temps d'adaptation, l'inoculation avec des PGPR a stimulé l'activité des enzymes GPOX et APX dans les feuilles et a augmenté la teneur en sucres solubles dans les racines (Figure 42).

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

B. Etude du mécanisme de réponse de L. sativus après 3, 6, 9 et 14 jours de traitement par 1 mM de Pb, à l’échelle moléculaire

B.1. Résultats

L'objectif principal de cette partie du travail est d'étudier le mécanisme moléculaire impliqué dans l’absorption, du transport et de l’accumulation du plomb chez la gesse. Le profil d'expression de LsPCS, LsABC, LsCNGC, LsGR et LsGST a été étudié par PCR en temps réel à T0 et 3, 6, 9 et 14 j après le traitement métallique (1 mM Pb) chez les plantes contrôles non inoculées et chez les plantes inoculées avec des PGPRs.

1.1. Accumulation du Pb dans les feuilles et les racines de Lathyrus sativus

Nos résultats ont révélé que, après 14 jours d'exposition à 1 mM de Pb, les plantes traitées ont accumulé des concentrations élevées du Pb (Tableau 18). L'absorption du métal a augmenté progressivement après 3, 6, 9 et 14 jours de l'application du traitement métallique avec une différence significative entre le contrôle non inoculé et les plantes inoculées avec le consortium bactérien I5. En effet, l’accumulation la plus élevée du Pb a été enregistrée au niveau des racines (40,99±3,73 mg Pb g-1 MS) et des feuilles (98,48±3,56 mg Pb g-1 MS) des plantes inoculées par I5, particuliérement14 jours après traitement. Ainsi, l’inoculation avec des PGPR efficients et résistants au Pb a amélioré le potentiel d’absorption du Pb par les plantes de Lathyrus sativus. Dans ce travail, le contenu en Pb dans les plantes traitées a été important dans les racines et il a été transporté vers la partie aérienne où il a dépassé la concentration enregistrée au niveau des racines, après 9 et 14 j de l’application du traitement métallique, surtout au niveau des plantes inoculées.

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

Tableau 18: Effet de l'inoculation avec l’inoculum I5 sur l'accumulation du Pb (mg g-1 MS) dans les feuilles et les racines des plantes de Lathyrus sativus traitées avec 1 mM de Pb. Les données ont été enregistrées au stade floraison 3, 6, 9 et 14 jours après l'application du traitement métallique (JAT).

Plante JAT Contrôle I5 (mg Pb g-1 MS) (mg Pb g-1 MS) T0 _ _ 3 1,13±0,14e 1,65±0,18e Feuilles 6 19,65±0,91d 20,55±2,19d 9 77,65±3,29c 87,07±2,72b Accumulation du Pb 14 83,47±2,83bc 98,48±3,56a (mg g-1 MS) 0 _ _ 3 16,56±0,39c 18,52±0,96c Racines 6 18,42±2,80c 21,67±1,92c 9 21,34±0,92c 32,08±0,77b 14 31,45±3,33b 40,99±3,73a

Les valeurs représentent la moyenne de trois mesures (± SD). Les lignes avec des lettres différentes sont significativement différentes selon le test Tukey HSD à p <0,05.

1.2. Effet du plomb sur le niveau d’expression de LsPCS, LsABC, LsCNGC, LsGR et LsGST

Les résultats ont révélé que l'inoculation et le traitement métallique avec 1 mM Pb ont influencé l'expression des gènes étudiés (LsPCS, LsABC, LsCNGC, LsGR et LsGST). En effet, l'inoculation avec le consortium bactérien I5 a considérablement induit l’expression des gènes étudiés par rapport au contrôle non inoculé. Les résultats obtenus ont montré une expression différentielle de LsPCS, LsABC, LsCNGC, LsGR et LsGST dans les feuilles et les racines de Lathyrus sativus sous différent traitements. Au niveau des feuilles, où des quantités importantes de Pb ont été accumulées, une augmentation significative de l’expression des gènes étudiés a été notée. Cette induction étant beaucoup plus importante au niveau des feuilles des plantes inoculées, 6 jours après traitement métalliques (Figures 43, 44, 45, 46 et 47). Cependant, au niveau des racines, une accumulation moins importante des transcrits LsPCS, LsABC, LsCNGC, LsGR et LsGST, par rapport aux tissus foliaires, a été révélée. Particulièrement, une réduction significative de la transcription de LsABC et LsCNGC au niveau de la racine a été enregistrée malgré l’accumulation importante de Pb au niveau de cet organe. Néanmoins, l’expression de LsGST et LsGR au niveau du tissu racinaire des plantes contrôles a été améliorée, pour une régulation

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

suivie d’une stimulation de l’expression de LsGR pour les plantes inoculées. Le niveau de transcription de LsPCS dans le tissu racinaire des plantes contrôles est resté inchangé, contre une baisse enregistrée chez les plantes inoculées (Figure 44). Le Pb a induit l’accumulation des transcrits LsABC, principalement chez les plantes inoculées par I5 et traitées 6 jours par 1mM Pb (Figure 43a). Dans les tissus racinaires, la forte accumulation des transcrits LsABC a été révélée chez les plantes inoculées par I5 et traitées 9 jours par 1mM de Pb (Figure 43b).

ab a c a a b e b b b b d b (a) LsABC 50 a 40

30 b 20 c bc 10 d d d d d Expressionrelative d 0 T0 3 j 6 j 9 j 14 j

(b) LsABC

10 ab a 8

6 bc bc c c c 4

2 d Expressionrelative

d d 0 T0 3 j 6 j 9 j 14 j

Contrôle I5

Les résultats de la Figure 44 ont montré que le plomb a induit l’expression du gène LsPCS 6 et 9 j après traitement dans les tissus foliaires. Le niveau le plus élevé a été révélé après 6 j de traitement avec Pb chez les plantes inoculées par rapport aux plantes témoins. Cependant, le stress métallique n’a pas affecté l’expression de ce gène dans les racines. En effet, en

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb absence de stress métallique I5 a induit l’expression de LsPCS (18 fois que celle des témoins). De même, on a enregistré que chez les plantes inoculées le niveau d’expression de LsPCS a été 9 fois et 13 fois plus haut que le contrôle, 9 j et 14 j après l’application du traitement métallique, respectivement (Figure 44).

(a) LsPCS

60 a

20 b bc b bcd bcd d c d d Expressionrelative 0 T0 3 j 6 j 9 j 14 j

(b) LsPCS

a 45

15 b bc bc Expressionrelative bc c bc c c c 0 T0 3 j 6 j 9 j 14 j

Contrôle I5

Les résultats de la Figure 45 ont montré que le stress métallique n’a pas affecté l’expression du gène LsGR chez les plantes non inoculées par I5. Cependant, I5 a induit l’expression de LsGR après 6, 9 et 14 j après application du traitement métallique (8, 7 et 3 fois que celle des témoins, respectivement). Au niveau des racines, les plantes traitées avec 1 mM de Pb et non inoculées par I5 ont enregistré une augmentation significative dans l’expression du gène LsGR après 6, 9 et 14 j

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

après traitement (Figure 45). Chez les plantes témoins, I5 a augmenté significativement l’expression de LsGR par rapport aux plantes non inoculées au niveau des racines. Cependant, chez ces plantes inoculées, le traitement métallique a diminué significativement l’expression de LsGR après 3, 9 et 14 j par rapport à T0 au niveau des racines.

(a) LsGR

50 40 a 30 b 20 bc cd 10 d d d d d d Expressionrelative 0 T0 3 j 6 j 9 j 14 j

(b) LsGR 8 a a 7 6 b 5 bc bc bc 4 bcd bcd 3 cd 2 d 1 Expressionrelative 0 T0 3 j 6 j 9 j 14 j

Contrôle I5

Au niveau des feuilles, l’inoculation avec l’inoculum I5 a augmenté significativement l’expression du gène LsGST 3 j après le traitement métallique par rapport aux plantes non inoculées (Figure 46a). Cependant, I5 n’a pas affecté l’expression du gène LsGST après 6, 9 et 14 j du traitement, comparé aux plantes non inoculées. Au niveau des racines des plantes témoins, l’inoculum I5 a augmenté significativement l’expression de LsGST par rapport aux plantes non inoculées. Cependant le traitement avec 1 mM Pb a diminué significativement l’expression de LsGST chez les plantes inoculées après 3,

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

6, 9 et 14 j après traitement (Figure 46b). Chez les plantes non inoculées, une augmentation significative dans l’expression de LsGST a été révélée après 3 j, alors qu’une diminution significative a été révélée après 14 j par rapport aux plantes témoins. Chez les plantes non inoculées le stress métallique n’a pas affecté le niveau des transcrits LsGST après 6 et 9 j par rapport aux plantes témoins.

(a) LsGST

80 a ab 60 b 40 c 20 c c c

c c c Expressionrelative 0 T0 3 j 6 j 9 j 14 j

(b) LsGST 80 a 70 60 50 40 30 b 20 c cde cd

Expressionrelative 10 def ef f f f 0 T0 3 j 6 j 9 j 14 j

Contrôle I5

L’inoculation avec I5 n’a pas affecté le niveau de l’expression du gène LsCNGC dans les feuilles des plantes témoins (Figure 47a). Le stress métallique n’a pas modifié l'expression de LsCNGC après 3 et 9 j de traitement. Cependant, chez les plantes inoculées le niveau d’expression le plus élevé a été révélé après 6 j, alors que le niveau le plus faible a été révélé

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

après 14 j. Chez les plantes non inoculées, le niveau des transcrits LsCNGC le plus élevé a été révélé après 3 et 6 j, alors que niveau le plus faible a été enregistré après 9 et 14 j. L’inoculum I5 a augmenté significativement le niveau d'expression de LsCNGC dans les a c a d racines des plantes témoins par rapport aux plantes non inoculées (Figure 47b). Cependant, le c b c cd e e c c traitement avec 1 mM Pb a diminué significativement l’expression de LsCNGC chez toutes les plantes testées.

a c a d (a) c b c cd e e c c LsCNGC

140 a 120 100 80 b 60 b 40 c cd cd cd Expressionrelative 20 cd cd d 0 T0 3 j 6 j 9 j 14 j

(b) LsCNGC

70 a 60 50 b 40 30 20 c Expressionrelative 10 c c c c c c c 0 T0 3 j 6 j 9 j 14 j

Contrôle I5

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

B.2. Discussion

L'absorption et l'accumulation de métaux lourds par les plantes utilisant la technologie de phytoremédiation semble être un moyen efficace pour dépolluer l'environnement contaminé par des métaux lourds (Imam, 2017). Il est bien connu que l'accumulation de métaux lourds dans les légumes est influencée par de nombreux facteurs tels que le climat, le stade de développement des plantes, la concentration de métaux lourds, et la nature du sol (Broadly et al., 2007). Dans ce travail, les quantités de Pb mesurées au niveau des feuilles et des racines des plantes de gesse cultivées en hydroponie et traitées avec 1 mM Pb ont été similaires à celles retrouvées chez les plantes hyperaccumulatrices connues tel que Brassica juncea et Viola baoshanensis (Brunet et al., 2008; Weerakoon et Somaratne, 2009; Wu et al., 2010). La présente étude a aussi montré que l'inoculation avec des PGPR (I5) a amélioré significativement la capacité de la gesse à accumuler le Pb. Ces résultats sont en concordance avec les résultats déjà obtenus dans les autres parties de ce travail. En effet, certaines études ont révélé que les bactéries résistantes tel que Pseudomonas fluorescens peuvent améliorer le potentiel d’absorption des métaux lourds par les plantes (Chiboub et al., 2018; Yancheshmeh et al., 2011). Dans ce travail, le contenu en Pb dans les plantes traitées par 1 mM Pb était important dans les racines, après ce métal a été transporté vers la partie aérienne où il a dépassé la concentration enregistrée au niveau des racines, après 9 et 14 j de traitement. Ce transport était plus important au niveau des plantes inoculées par I5. Ceci permet de suggérer que le consortium I5 améliore le potentiel de phytoextraction de Lathyrus. sativus comme précédemment démontré. Afin d’évaluer l'impact du stress métallique induit par 1 mM de Pb et la contribution des PGPR dans l’amélioration du potentiel de phytorémédiation de Lathyrus sativus à l’échelle moléculaire, on a étudié l'expression de LsPCS, LsABC, LsCNGC, LsGR et LsGST au niveau des tissus foliaires et racinaires. Le CNGC (cyclic nucleotide-gated non selective cation channels) est le premier canal membranaire impliqué dans le transport du Pb à travers la membrane plasmique d’après Arazi et al. (1999). Une forte accumulation des transcrits LsCNGC a été révélée dans les feuilles des plantes inoculées par le consortium I5, 6 j après le traitement avec 1 mM Pb. Ceci permet de suggérer que chez Lathyrus sativus, les canaux CNGC ont facilité l’entrée du Pb dans les cellules et ont permis son transport par la voie symplastique (Brunet, 2009). En réponse à la présence de Pb dans les feuilles, une augmentation de la transcription de LsGST a été observée, ceci indiquerait la possibilité d’une augmentation de la formation de

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb complexes entre les molécules de glutathion (GSH) et les ions Pb (Brunet et al., 2009). Une augmentation de l’activité de l’enzyme GST a été motionnée comme directement liée à la quantité de Pb accumulée chez deux légumineuses Macrotyloma uniflorum et Cicer arietinum (Reddy et al., 2005). Selon Adamis et al. (2004), la GST peut catalyser la complexation du Cd avec le GSH, ce qui permet d'atténuer les effets toxiques du Cd. Il est bien connu que les glutathion S-transférases (GSTs), codent pour une grande famille de protéines multifonctionnelles, jouent un rôle central dans les processus de détoxification et la tolérance au stress oxydatif. Dans la présente étude, le traitement avec 1 mM Pb a induit l’expression de LsGST, particulièrement dans les feuilles des plantes inoculées. La présence d’un stress métallique génère la production des espèces réactives de l’oxygène chez les plantes (Malecka et al., 2001). Dans les racines de Lathyrus sativus exposées au Pb, l’augmentation de l’expression du gène LsGR, impliqué dans le cycle ascorbate-glutathion, semble être liée à l’amélioration de la capacité de tolérance au Pb chez les plantes, en complexant le Pb avec le glutathion et/ou en prenant en charge les ERO (Brunet et al., 2009). Une augmentation de l’expression du gène GR a été déjà révélée chez Medicago sativa en réponse au stress métallique induit par Cd et Hg (Ortega-Villasante et al., 2007). Dans ce travail, I5 a stimulé significativement l’expression de LsGR au niveau des feuilles par rapport aux plantes témoins, ce qui permet de suggérer le potentiel de I5 dans la réduction des effets délétère du Pb. L’induction de l’expression de LsGR dans les racines et les feuilles des plantes inoculées et traitées par 1 mM Pb suggère une mobilisation importante de GSH dans le cycle ascorbate glutathion et par conséquence une augmentation de la prise en charge des ERO (Reddy et al., 2005; Mishra et al., 2006). L’expression de LsABC (ATP-binding cassette) de type GCN (general control non- represible) a augmentée significativement suite au traitement avec 1 mM Pb au niveau des feuilles des plantes inoculées et non inoculées. On suggère que ces protéines interviennent dans la régulation des protéines qui seraient induites non pas par la présence de Pb directement mais par un signal systémique qu’il induit chez les plantes de Lathyrus sativus (Brunet, 2008). Récemment, il a été montré que l'activation de l’expression des protéines codant pour la famille GCN protège les cellules au cours de stress (Baker et al., 2012). Aussi, une réponse cellulaire commune au stress est l'induction de programmes spécifiques de traduction / transcription des gènes GCN pour maintenir leur homéostasie intracellulaire dans diverses conditions de stress (Rousakis et al., 2013). Les phytochelatines sont des chélateurs des métaux lourds essentiellement le Cd, sont synthétisées par voie enzymatique par la phytochélatine synthase (PCS) (Cobbett, 2000).

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Cinquième chapitre Mécanismes impliqués dans l’absorption et la détoxification du Pb

Plusieurs études ont suggéré qu'une augmentation de la production de phytochélatines pourrait contribuer à améliorer la tolérance des plantes à l'accumulation de métaux lourds (Zhu et al., 1999). L’expression différentielle du gène LsPCS dans les feuilles des plantes traitées avec 1 mM Pb pourrait suggérer qu’il s’agit d’une stratégie de séquestration et de désintoxication des métaux choisie par les plantes de Lathyrus sativus.

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CONCLUSION GENERALE

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CONCLUSION GENERALE

Cette étude a été réalisée dans le but d’identifier une symbiose Lathyrus sativus-bactéries bénéfiques de la rhizosphère pour la phytorémediations des sites contaminés par le plomb et pour l’amélioration de la fertilité et de la qualité de ces sols. En effet, la gesse commune (Lathyrus sativus) est une légumineuse qui a été choisie dans notre étude en raison de ses capacités à tolérer des conditions de croissance difficiles, le stress abiotique et même biotique ainsi que son potentiel d'accumulation du plomb équivalent aux plantes accumulatrices puissantes. On a entamé le travail par l’étude de la capacité des plantes de gesse à croitre dans des sols pollués et de déterminer leur potentiel à accumuler les métaux lourds. La population de provenance de Mahdia s’est avérée capable d'accumuler des concentrations élevées du Pb, Cu, Zn et du Cd dans toutes les parties de la plante et peut donc être classée comme un accumulateur puissant avec un potentiel approprié pour la phytoremédiation des sites pollués avec le Pb et le Cd. Notre recherche a rapporté que les bactéries qui vivent en association avec la gesse et qui ont été isolées des nodules racinaires des plantes cultivées sur des échantillons de sols contaminés par les polluants toxiques (46 isolat) sont à la fois efficientes et tolérantes aux métaux lourds. En effet, le test de nodulation a montré que Lathyrus sativus est nodulée uniquement par l’espèce Rhizobium leguminosarum, néanmoins certains endophytes sont capables d’améliorer la croissance des plantes. La concentration maximale de tolérance aux métaux lourds des isolats a atteint 0,2 mM pour le Cu; 0,5 mM pour le Zn; 0,8 mM pour le Cd et 2,5 mM pour le Pb. Le séquençage de l'ADNr 16S, des 22 bactéries les plus efficientes et les plus tolérantes aux métaux, a révélé diverses espèces qui vivent en association avec la gesse représentées par Rhizobium sp, Bacillus sp, R. leguminosarum, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas sp, Pseudomonas fluorescens, Luteibacter sp, Variovorax sp, Bacillus simplex et Bacillus megaterium. L’amplification par PCR, avec des amorces spécifiques, du gène de résistance au plomb et du gène de résistance au cadmium a montré que R. leguminosarum, Luteibacter sp, P. fluorescens, B. simplex, Bacillus sp et B. megaterium possèdent le gène de résistance au Pb et/ ou au Cd. La comparaison des séquences de nos fragments de PCR a montré une forte homologie avec les gènes de résistance au Pb et au Cd chez d’autres bactéries.

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Douze souches bactériennes ont été sélectionnées pour leur aptitude à produire des substances stimulant la croissance des plantes ayant un potentiel significatif pour la

solubilisation du Ca3 (PO4)2 et la production de l’AIA, de sidérophores et de HCN. Les souches résistantes au Pb ont également montré un grand potentiel de bioaccumulation du plomb, ce qui fait de ces bactéries un outil approprié pour améliorer l'efficacité de la bioremédiation des sols contaminés par le plomb. Cette étude a aussi révélé que l'inoculation des plantes de Lathyrus sativus avec des PGPR a amélioré significativement les paramètres de croissance des plantes, en conditions contrôlées, par rapport aux plantes non inoculées. Par ailleurs, cette culture nous a permis de sélectionner les 10 associations bactériennes les plus stimulantes de la croissance des plantes et les plus fixatrices d'azote qui sont I4, I3, I5, I8, I10, I12, I15, I18, I20 et I9 et qui ont été nommés par la suite I1, I2, I3, I4, I5, I6, I7, I8, I9 et I10, respectivement. Nos résultats ont indiqué que l'inoculation avec I5 et I9 a augmenté significativement la biomasse végétale en présence de plomb. De plus, l'inoculum I5 a augmenté considérablement la teneur en chlorophylle et en sucres solubles. En outre, une augmentation de la teneur en proline et en caroténoïdes a également été observée, en plus des augmentations des activités des enzymes antioxydants et du niveau des composés phénoliques totaux chez les plantes traitées avec le Pb. Cependant, l'inoculation avec des PGPR a amélioré d’avantage ces activités, renforçant ainsi le système de défense de la plante et fournissant une protection et une tolérance efficaces contre le stress causé par le Pb. Les résultats ont également montré que l'inoculation avec les PGPR en particulier avec I1, I5 et I9 a réduit la peroxydation lipidique et a stimulé l’activité des enzymes antioxydants aboutissant à l'atténuation de l'effet nocifs du Pb. De même, les plantes inoculées avec I1, I5 et I9 ont présenté moins de dommages oxydatifs et un mécanisme de défense plus efficace que les autres plantes inoculées et non inoculées. De plus, l'inoculation a amélioré l'absorption du plomb et son accumulation dans les organes de la plante essentiellement chez les plantes inoculées avec I1, I5 et I7. Par la suite, on a confirmé l’efficacité de l’association Lathyrus sativus- PGPR dans l’amélioration biologique de la fertilité et de la qualité des sols et dans la réhabilitation des sites contaminés par le plomb. Pour cela, 6 inocula formé chacun par quatre PGPR efficients et résistants au Pb (I1, I5, I7, I8, I9 et I10) ont été évalués en plein champ, pour leur capacité à améliorer le potentiel de phytoremédiation de la gesse. Ainsi on a étudié les impacts de ces associations sur les paramètres agronomiques des plantes, la fertilité et la qualité du sol, afin de sélectionner une association Lathyrus sativus- PGPR qui pourra être utilisée dans un

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programme de phytoremédiation des sols contaminés par le plomb et améliorer la qualité et la fertilité de ces sols. L’expérience réalisée dans un vignoble dans la région de Jebel Ressas a montré que l'inoculation « en plein champ » de la gesse a remarquablement et positivement affecté les paramètres agronomiques des plantes ainsi que le potentiel d’absorption du plomb et du cadmium principalement enregistrés chez les plantes inoculées avec I1 et I5. Cette étude a permis donc de confirmer le rôle positif des PGPR efficients et résistants au Pb dans la réduction des effets nocifs du plomb, qui sont signalés par une amélioration des paramètres liés à la croissance des plantes et l'accumulation élevée du Pb. De plus, la rhizosphère des plantes inoculées, surtout celles inoculées avec I5, a révélé une réduction dans la fraction extractible et la fraction totale du Pb, une stimulation dans l’activité des enzymes du sol (l’uréase, la phosphatase alcaline et la beta-glucosidase) qui a été liée à l'augmentation de la teneur en azote total et du phosphore assimilable au niveau du sol. Dans la présente étude, les résultats ont aussi montré que l'inoculation avec des PGPR efficients et résistants au plomb a significativement réduit l’absorption du Pb par la vigne. Ainsi, on a noté une diminution importante de l’accumulation du plomb dans les feuilles de vigne au niveau des parcelles inoculées avec I5 et I7, par rapport aux autres parcelles inoculées et non inoculées. L’application de 1 mM Pb à court terme (pendant 24, 48 et 72 h) a révélé que les plantes de L. sativus ont développé des systèmes de défense antioxydant non enzymatique et enzymatique pour lutter contre les espèces réactives de l’oxygènes générées par le stress métallique. L’étude a montré que l'inoculation avec des PGPR a amélioré la tolérance de la gesse à l'application de Pb. En effet, l'inoculation a inversé la perte de chlorophylle et a amélioré la biosynthèse des pigments photosynthétiques. La fuite des électrolytes a augmenté progressivement après l’application de Pb et l'inoculation a minimisé les dommages provoqués sur la membrane cellulaire et a amélioré la stabilité membranaire, en particulier chez les plantes inoculées avec I5 démontrant le rôle protecteur de P. fluorescens contre les effets délétères du plomb. En outre, l'inoculation a augmenté l'accumulation de produits métaboliques tels que la proline et les sucres solubles. Ceci peut être attribué à l'amélioration de l'ajustement osmotique et à l'amélioration du système de défense qui a entraîné une reprogrammation substantielle des cellules végétales. Par conséquent, les réponses métaboliques sont complexes et dynamiques et impliquent la modification de plus d'un métabolite. En outre, l'inoculation de la gesse a induit des modifications de l’activité des enzymes antioxydants (la superoxyde dismutase SOD, la catalase CAT, l’ascorbate peroxydase APX et de la peroxydase GPOX) principalement chez les plantes inoculées avec

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I5, où P. fluorescens a stimulé l’activité des enzymes SOD et APX dans les feuilles, CAT et APX dans les racines. Les résultats suggèrent que les enzymes antioxydants, les caroténoïdes, les sucres solubles et la proline sont susceptibles de fonctionner en combinaison et sont impliqués dans le mécanisme principal de défense antioxydante et de tolérance au stress oxydatif chez L. sativus, ainsi que dans l'accumulation du plomb. Après, l’étude de l’expression de quelques gènes impliqués dans le transport et la détoxification du plomb affirme que LsABC, LsPCS, LsGR, LsGST, LsCNGC sont activés suite à l’application du traitement métallique. La stimulation de l’expression des gènes LsGST, LsGR correspondrait à la formation de complexes Pb-glutathion et à une activation du cycle ascorbate-glutathion pour la détoxification des espèces réactives de l’oxygène chez L. sativus. De même la variation dans l’expression du gène de la phytochélatine synthétase (PCS) dans les feuilles des plantes exposées au Pb pourrait signifier que la formation de complexes PC-Pb est une stratégie de séquestration développée par Lathyrus sativus. L’expression du gène LsCNGC au niveau des feuilles des plantes est activée, suggérant une participation de ce transporteur à l’entrée du Pb dans le symplasme. Il faut noter que dans notre étude, l’inoculation avec l’inoculum I5 a stimulé d’avantage l’expression de tous les gènes étudiés. Ces résultats suggèrent que l’inoculation induit la surexpression des gènes liés au transport, la détoxification et à l’accumulation du Pb, contribuant fortement à la tolérance de Lathyrus sativus au plomb (1 mM). Collectivement, cette étude souligne le potentiel des PGPR à atténuer les effets néfastes du stress métallique et à améliorer l'absorption du Pb par les plantes de L. sativus. Ce travail a mis en évidence l'efficacité de l’inoculum I5 (R. leguminosarum (M5)+ P. fluorescens (K23)+ Luteibacter sp+ Variovorax sp) en association avec L. sativus pour assurer un nettoyage plus efficace des sols pollués par le plomb en accélérant le processus de phytoextraction et pour régénérer ces sols et améliorer leur qualité et leur fertilité. L'importance de notre recherche est validée à travers l’expérience réalisée en plein champ, et aussi par la confirmation de celles précédemment obtenues dans des conditions contrôlées. Ces faits ouvrent la voie à l'utilisation des légumineuses dans les projets de phytoremédiation dans le but de réhabiliter, par voie biologique, les sites pollués pour éviter la contamination de la nappe phréatique et minimiser le passage des contaminants toxiques à la chaine alimentaire pour une agriculture saine et durable.

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Perspectives Une évaluation de l’effet de l'inoculation en plein champ sur l’évolution de la diversité de la communauté bactérienne du sol sera envisagée. Une étude moléculaire en utilisant les gènes de ménages est primordiale dans l’identification de l’espèce pour certaines bactéries (Luteibacter sp, Variovorax sp). Aussi, le caractère endophyte des souches non rhizobiennes devrait être aussi confirmé pour Luteibacter sp, Variovorax sp et P. fluorescens moyennant une technique de marquage moléculaire en utilisant des gènes rapporteurs comme le gène de la β- glucuronidase (Gus) ou la protéine fluorescente verte (gfp). Continuer le travail avec la population de gesse de provenance de Mahdia et passer à la production de semences et à la production de l’inoculum I5 d’une manière industrielle. Déterminer le seuil de tolérance de la gesse au plomb pour qu’elle puisse être utilisée par les agriculteurs pour la dépollution des sols fortement contaminés par le Pb.

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Zhang, P., Jin, C., Zhao, Z. and Tian, G. 2010. 2D crossed electric field for electrokinetic remediation of chromium contaminated soil. Journal of Hazardous Materials 177: 1126-1133. Zhang, Q., Achal, V., Xiang, W.N. and Wang, D. 2014. Identification of heavy metal resistant bacteria isolated from yangtze River, China. International Journal of Agriculture and Biology 1: 619-623. Zhou, B., Yao, W., Wang, S., Wang, X. and Jiang, T. 2014. The metallothionein gene, TaMT3, fromTamarix androssowii confers Cd2+ tolerance in tobacco. International Journal of Molecular Sciences 15. Zhu, Y.L., Pilon-Smits, E.A.H., Tarun, A.S., Weber, S.U., Jouanin, L. and Terry, N. 1999. Cadmium tolerance and accumulation in Indian mustard is enhanced by overexpressing γglutamylcysteine synthetase. Plant Physiology 121: 1169-1177. Zoffoli, H.J., Amaral-Sobrinho, N.M. , Zonta, E., Luisi, M.V. Marcon G. and Tolon-Becerra A. 2013. Inputs of heavy metals due to agrochemical use in tobacco fields in Brazil’s Southern Region. Environmental Monitoring and Assessment 185: 2423-2437. Zribi, K., Djebali, N., Mrabet, M. and Khayat, N. 2012. Physiological responses to cadmium, copper, lead and zinc of Sinorhizobium sp strains modulating Medicago sativa in Tunisian mining soils. Annals of Microbiology 62:1181-1188. Zu, Y.Q., Li, Y., Christian, S., Laurent, L., Liu, F. 2004. Accumulation of Pb, Cd, Cu and Zn in plants and hyperaccumulator choice in Lanping lead-zinc mine area, China. Environment International 30: 567–576.

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ANNEXES

Annexe 1. Composition du milieu agar 9 ‰

- 9 g Agar - 1000 ml Eau distillée

Annexe 2. Composition du milieu YEMA (Vincent, 1970)

K2HPO4 0,5 g/l Mg SO4, 7H2O 0,2 g/l NaCl 0,1 g/1 Mannitol 10 g/l Extrait de levure 0,6 g/l Agar 15 g/l HCl (1/10, pH 7) 10 ml Rouge Congo 2,5 g/l

Annexe 3. Composition du milieu TY (Yeast Extract-Tryptone)

Tryptone 5 g/l Extrait de levure 3 g/l CaCl2, 2H2O 0, 88 g/1

Annexe 4. Tampon TAE pour électrophorèse

Tris 40 mM Acétate de sodium 4 mM Na2 EDTA 1 mM pH 7,9

Annexe 5. Composition du milieu YEM: Yeast Extract Mannitol

K2HPO4 0,5 g/l Mg SO4, 7H2O 0,2 g/l NaCl 0,1 g/1 Mannitol 10 g/l Extrait de levure 0,6 g/l HCl (1/10, pH 7) 10 ml

Annexe 6. Milieu Nutritif pour les plantes (Vadez et al., 1996)

Macroéléments Concentration finale (mM)

KH2PO4 0,36 K2SO4 0,7 MgSO4, 7H2O 1 CaCl2 1,65

Oligo-éléments Concentration finale (µM)

H3BO3 4 MnSO4, H2O 6,6 ZnSO4, 7H2O 1,55 CuSO4, 5H2O 1,56 Na2MoO4, 7H2O 0,12 CoSO4, 7H2O 0,12

Fer (séquestrène) 1,26 mg/l

Annexe 7. Composition du milieu CAS: Chrome Azurol S

Milieu MM9 Na2HPO4 60 g/l KH2PO4 30 g/l NaCl 5 g/l NH4Cl 10 g/l MgSO4 (1M) 2 ml CaCl2 (1M) 100 µl Glucose (20%) 20 ml pH 6,8

Solution de fer: 1/ 60,5 mg CAS 50 ml eau mQ

10 ml d’une solution de fer III (1 mM FeCl3, 6H2O mélangé avec 10 mM HCl) 2/ 72,9 mg HDTMA mélangé avec 40 ml eau milliQ

Annexe 8. Composition du milieu LB: Luria Bertani

Tryptone 10 g/l Extrait de levure 5 g/l NaCl 10 g/l Agar 15 g/l

Annexe 9. Coefficient de corrélation entre les facteurs physico-chimiques du sol et les paramètres de croissance des plantes en utilisant le coefficient de corrélation de Pearson (r) et la correction de Bonferroni. SDW: Poids sec de la partie aérienne; RDW: poids sec de la partie racinaire; NN: nombre de nodules; OM: matière organique; N: azote; P2O5: phosphore assimilable; K2O: potassium; Cu: cuivre; Zn: zinc; Pb: plomb; Cd: cadmium et pH.

Paramètres Coefficient de corrélation de Pearson de croissance Paramètres physico-chimiques du sol (r)

des plantes

pH OM N P2O5 K2O Cu Zn Pb Cd

r -,803 ,877 ,318 ,333 ,242 -,691 -,861 -,864 -,881 SDW p ,000 ,000 ,076 ,063 ,182 ,000 ,000 ,000 ,000 r -,824 ,898 ,281 ,340 ,216 -,729 -,867 -,880 -,908 RDW p ,000 ,000 ,120 ,057 ,236 ,000 ,000 ,000 ,000 r -,763 ,810 ,357 ,419 ,307 -,563 -,804 -,828 -,823 NN p ,000 ,000 ,045 ,017 ,087 ,001 ,000 ,000 ,000

Le niveau significatif a été fixé à p <0,05/66 après correction de Bonferroni, les valeurs p sont en gras.

PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES

1. Souhir Abdelkrim, Salwa Harzalli Jebara, Omar Saadani, Manel Chiboub, Ghassen Abid, Khediri Mannai, Moez Jebara (2018). Heavy metal accumulation in Lathyrus sativus growing in contaminated soils and identification of symbiotic resistant bacteria. Archives of Microbiology.

2. Souhir Abdelkrim, Salwa Harzalli Jebara, Omar Saadani, Manel Chiboub, Ghassen Abid, Moez Jebara (2018). Effect of Pb-resistant plant growth-promoting rhizobacteria inoculation on growth and lead uptake by Lathyrus sativus. Journal of Basic Microbiology 58: 579–589.

3. Souhir Abdelkrim, Salwa Harzalli Jebara, Omar Saadani, Moez Jebara (2018). Potential of efficient and resistant plant growth-promoting rhizobacteria in lead uptake and plant defence stimulation in Lathyrus sativus under lead stress. Plant Biology 20: 857-869.

4. Souhir Abdelkrim, Salwa Harzalli Jebara, Moez Jebara (2018). Antioxidant systems responses and the compatible solutes as contributing factors to lead accumulation and tolerance in Lathyrus sativus inoculated by plant growth promoting rhizobacteria. Ecotoxicology and Environmental Safety 166: 427–436.

PARTICIPATION A DES TRAVAUX ET A DES MANIFESTATIONS SCIENTIFIQUES Travaux scientifiques publiés

1. Manel Chiboub, Salwa Harzalli Jebara, Omar Saadani, Imen Challougui Fatnassi, Souhir Abdelkrim, Moez Jebara (2018). Physiological responses and antioxidant enzyme changes in Sulla coronaria inoculated by cadmium resistant bacteria. Journal of Plant Research.

2. Salwa Harzalli Jebara, Imen Challougui Fatnassi, Souhir Abdelkrim, Omar Saadani, Manel Chiboub, Ghassen Abid, Khediri Mannai, Moez Jebara (2017). Potentialities and limit of legume-plant growth promoting bacteria symbioses use in phytoremediation of heavy metal contaminated soils. International Journal of Plant Biology & Research 5: 1077.

3. Ghassen Abid, Dominique Mingeot, Yordan Muhovski, Guy Mergeai, Marwa Aouida, Souhir Abdelkrim, Ibtissem Aroua, Mohamed El Ayed, Mahmoud M’hamdi, Khaled Sassi, Moez Jebara (2017). Analysis of DNA methylation patterns associated with drought stress response in faba bean (Vicia faba L.) using methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP). Environmental and Experimental Botany.

4. Feten Rebaa, Ghassen Abid, Marwa Aouida, Souhir Abdelkrim, Ibtissem Aroua, Yordan Muhovski, Jean-Pierre Baudoin, Mahmoud M’hamdi, Khaled Sassi, Moez Jebara (2017). Genetic variability in Tunisian populations of faba bean (Vicia faba L. var. major) assessed by morphological and SSR markers. Physiology and Molecular Biology of Plants.

5. Omar Saadani , Imen Challougui Fatnassi, Manel Chiboub, Souhir Abdelkrim, Fathi Barhoumi, Moez Jebara, Salwa Harzalli Jebara (2016). In situ phytostabilisation capacity of three legumes and their associated Plant Growth Promoting Bacteria (PGPBs) in mine tailings of northern Tunisia. Ecotoxicology and Environmental Safety 130: 263–269.

6. Manel Chiboub, Omar Saadani, Imen Challougui Fatnassi, Souhir Abdelkrim, Moez Jebara, Salwa Harzalli Jebara (2016). Characterization of plant growth promoting rhizobacteria efficient and resistant to cadmium isolated from Sulla coronaria. Comptes Rendus Biologies 339: 391–398.

7. Imen Challougui Fatnassi, Manel Chiboub, Omar Saadani, Souhir Abdelkrim, Khedhiri Mannai, Jebara Moez, Salwa Harzalli Jebara (2016). Inoculation of Lens culinaris, Vicia faba and Sulla coronaria with Heavy Metal-Resistant PGPB Shows Potential for Phytostabilization; In book: Contaminated Soils: Sources, Properties and Impacts, Chapter: Chapter 7, pp. 163-188. Publisher: Nova Science Publishers, (Ed): Michaela Dunn, pp.7x10 - (NBC-R).

8. Salwa Harzalli Jebara, Omar Saadani, Imen Challougui Fatnassi, Manel Chiboub, Souhir Abdelkrim, Moez Jebara (2015). Inoculation of Lens culinaris with Pb- resistant bacteria shows potential for phytostabilization. Environmental Science and Pollution Research 22: 2537-2545.

9. Salwa Harzalli Jebara, Souhir Abdelkrim, Imen Challougui Fatnassi, Manel Chiboub, Omar Saadani, Moez Jebara (2015). Identification of effective Pb resistant bacteria isolated from Lens culinaris growing in lead contaminated soils. Journal of Basic Microbiology 55: 346-353.

Participation à des manifestations scientifiques

 Présentation orale intitulée «PGPRs And Nitrogen-Fixing Lathyrus sativus: A Perfect Team For Efficient Pb Phytoremediation?». Symposium Scientifique International, INAT, Tunis, Tunisie, Octobre 17-19, 2018

 Présentation par affiche intitulée «Pb-resistant PGPR effect on antioxidant status and genes expression pattern associated with lead tolerance and accumulation in Lathyrus sativus». 2nd Mediterranean Forum for PhD Students and Young researchers, CIHEAM Bari, Italie, Septembre 18-20, 2018

 Présentation orale intitulée «Lathyrus sativus- PGPR: une symbiose prometteuse pour l’amélioration biologique de la fertilité des sols et pour la réhabilitation des sites contaminés par le plomb». 18th Congress of the African Association of Biological Nitrogen Fixation (AABNF-AFRINOM), Oran, Algérie, Avril 22-24, 2018

 Présentation par affiche intitulée « In situ phytoremediation capacity of Lathyrus sativus and their associated Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPRs) in mine tailings contaminated soils». Maghrebian- Finnish Biotechnology symposium, Juva City, Finlande, Mars 19-23, 2018

 Présentation par affiche intitulée « PGPR promotes growth, Pb uptake and metal tolerance of Lathyrus sativus for remediation of contaminated areas». The Third International conference on Microbial Ecology (ATEMiii), Tunisie, Mars 17-19, 2018

 Présentation par affiche intitulée « Lathyrus sativus-PGPR responses to lead application proved great potential for Pb accumulation and potential useful for soil phytostabilisation». Journées Internationales de Biotechnologie de I'A.T.Biotech Yasmine Hammamet, Tunisie, Décembre 18-22, 2017

 Présentation orale intitulée «Lead-induced physiological response and biochemical changes in Lathyrus sativus inoculated with efficient and Pb resistant plant growth promoting bacteria». Congrès lnternational de Biotechnologie et valorisation des Bio-Ressources de I'AT-BVBR Tabarka, Tunisie, Mars 22-25, 2017

 Présentation par affiche intitulée «Characterization of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) efficient and Pb resistant isolated from Lathyrus sativus». Journées Internationales de Biotechnologie de I'A.T.Biotech Sousse, Tunisie, Décembre 18-22, 2016

 Présentation par affiche intitulée «Identification d’association Lathyrus sativus-bactéries pour la dépollution des sols contaminés par le plomb». Journées Internationales de Biotechnologie de I'A.T.Biotech Djerba, Tunisie, Décembre 20-24, 2015

 Présentation orale intitulée «Identification de symbioses Lathyrus sativus-Rhizobium efficientes et à intérêt de phytoremediation». Journées lnternationales de Biotechnologie de I'A.T.Biotech Mahdia, Tunisie, Décembre 19-22, 2012