ETUDES CHIMIQUE ET TOXICOLOGIQUE DES EXTRAITS DE FRUITS D’Aframomum Angustifolium (ZINGIBERACEAE)

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DOMAINE SCIENCES ET TECHNOLOGIE ************************

MENTION BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

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Mémoire pour l’obtention du Diplôme de Master II Parcours : Biochimie, Biodiversité et Santé

ETUDES CHIMIQUE ET TOXICOLOGIQUE DES EXTRAITS DE FRUITS D’Aframomum angustifolium (ZINGIBERACEAE)

présenté par : RAKOTONIRINA Fandresena Nacya le 19 avril 2019 devant le jury composé de :

- Président : Professeur RASAMIRAVAKA Tsiry - Rapporteur : Professeur RAKOTO Danielle A. Doll - Examinateurs : Docteur RAZAFIARIMANGA Zara Docteur RANDRIAMAMPIANINA Lovarintsoa Judicaël

TABLE DES MATIERES REMERCIEMENTS ...... i GLOSSAIRE ...... ii LISTE DES ABREVIATIONS ...... iii LISTE DES FIGURES ...... iv LISTE DES TABLEAUX ...... v INTRODUCTION GENERALE ...... 1 SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ...... 4 1. GENERALITES SUR LE GENRE Aframomum ...... 4 2. UTILISATIONS DES Aframomum ...... 4 2.1 UTILISATIONS DANS LE MONDE ...... 4 2.2 UTILISATIONS D’Aframomum angustifolium A MADAGASCAR ...... 5 2.3 REPARTITION GEOGRAPHIQUE ...... 7 3. DONNEES PHARMACOLOGIQUES ...... 7 4. PRINCIPAUX METABOLITES SECONDAIRES RENCONTRES...... 8 PREMIERE PARTIE : ETUDE CHIMIQUE

I. INTRODUCTION ...... 9 II. MATERIELS ET METHODES ...... 9 II.1 MATERIELS ...... 9 II.1.1 Matériel végétal ...... 9 II.1.1.1 Taxonomie ...... 9 II.1.1.2 Description botanique de l’espèce angustifolium ...... 9 II.1.1.3 Date et lieu de récolte ...... 10 II.1.1.4 Préparation du matériel d’étude...... 10 II.1.2 Les produits chimiques et les autres matériels...... 10 II.2 METHODES ...... 10 II.2.1 Méthodes d’extraction des principes actifs ...... 10 II.2.1.1 Extraction à froid ...... 10 II.2.1.2 Extraction à chaud ...... 11 II.2.2 Méthodes de purification ...... 11 II.2.2.1 Traitement par la chaleur ...... 11 II.2.2.1.1 Principe ...... 11 II.2.2.1.2 Mode opératoire ...... 11

II.2.2.2 Fractionnement par le n-butanol ...... 11 II.2.2.2.1 Principe ...... 11 II.2.2.2.2 Mode opératoire ...... 12 II.2.3 Méthodes analytiques ...... 12 II.2.3.1 Chromatographie sur couche mince ...... 12 II.2.3.1.1 Principe ...... 12 II.2.3.1.2 Mode opératoire ...... 12 II.2.3.2 Méthodes de criblage phytochimique ...... 13 II.2.3.2.1 Principe ...... 13 II.2.3.2.2 Test sur l’extrait acide ...... 13 II.2.3.2.3 Tests sur l’extrait hydroéthanolique ...... 14 a) Détection des flavonoïdes ...... 14 b) Détection des leucoanthocyanes ...... 14 II.2.3.2.4 Tests sur l’extrait chloroformique ...... 14 a) Détection des stéroïdes et triterpènes ...... 14 b) Détection des stérols insaturés ...... 14 II.2.3.2.5 Tests sur l’extrait aqueux ...... 14 a) Détection des anthraquinones ...... 15 b) Détection des iridoïdes ...... 15 c) Détection des saponines ...... 15 d) Détection des tanins et autres polyphénols ...... 15 e) Détection des désoxyoses ...... 15 II.2.4 Méthode de concentration ...... 16 II.2.5 Calcul de rendement ...... 16 III. RESULTATS ...... 16 III.1 EXTRAITS OBTENUS ...... 16 III.2 PURIFICATION ...... 17 III.2.1 Traitement par lachaleur ...... 17 III.2.2 Fractionnement par le n-butanol ...... 17 III.3 DEGRE D’HOMOGENEITE DES DIFFERENTS PRODUITS ...... 18 III.4 CARACTERISATION CHIMIQUE ...... 19 III.4.1 Propriétés physico-chimiques ...... 19 III.4.2 Nature chimique ...... 19

III.5 RENDEMENTS ...... 20 IV. DISCUSSION ET CONCLUSIONS ...... 21 DEUXIEME PARTIE : ETUDE TOXICOLOGIQUE

I. INTRODUCTION ...... 22 II. MATERIELS ET METHODES ...... 22 II.1 MATERIELS ...... 22 II.1.1 Les animaux d’expérimentation ...... 22 II.1.1.1 Animaux à sang chaud : les souris ...... 22 II.1.1.2 Animaux à sang froid : les larves de moustique ...... 22 II.1.2 Les végétaux d’expérimentation ...... 22 II.1.3 Matériels de microbiologie ...... 23 II.1.3.1 Les germes utilisés ...... 23 II.1.3.2 Le milieu de culture ...... 23 II.1.3.3 Les disques pour antibiogramme ...... 23 II.2 METHODES ...... 24 II.2.1 Méthodes d’étude des effets sur les animaux ...... 24 II.2.1.1 Tests sur animaux à sang chaud ...... 24 II.2.1.1.1 Estimation de la toxicité ...... 24 II.2.1.1.2 Détermination de la DL50 (24h) ...... 24 II.2.1.2 Test sur les animaux à sang froid ...... 25 II.2.1.2.1 Principe ...... 25 II.2.1.2.2 Mode opératoire ...... 25 II.2.2 Méthodes d’étude des effets sur les végétaux ...... 25 II.2.2.1 Etude des effets sur le pouvoir germinatif des graines ...... 25 II.2.2.1.1 Principe ...... 25 II.2.2.1.2 Mode opératoire ...... 26 II.2.2.2 Etude des effets sur la croissance des jeunes plantules ...... 26 II.2.2.2.1 Principe ...... 26 II.2.2.2.2 Mode opératoire ...... 26 II.2.2.3 Analyse statistique ...... 26 II.2.3 Méthodes d’étude des effets sur les microorganismes ...... 27 II.2.3.1 Méthode de stérilisation ...... 27 II.2.3.2 Spectre d’activité antimicrobienne ...... 27

II.2.3.2.1 Principe ...... 27 II.2.3.2.2 Mode opératoire ...... 27 III. RESULTATS ...... 28 III.1 EFFETS SUR LES ANIMAUX ...... 28 III.1.1 Effets sur la souris ...... 28 III.1.1.1 Description des symptômes ...... 28 III.1.1.1.1 Symptômes développés après injection intrapéritonéale ...... 28 III.1.1.1.2 Symptômes développés après administration orale ...... 28 III.1.1.2 Détermination de la DL50 (24 h) ...... 29 III.1.1.2.1 Méthode de REED et MUENCH (1938) ...... 29 III.1.1.2.2 Méthode de BOYD ...... 30 III.1.2 Effets sur les larves de moustique ...... 31 III.2 EFFETS SUR LES VEGETAUX ...... 31 III.2.1 Effets sur le pouvoir germinatif des graines ...... 31 III.2.2 Effets sur la croissance des jeunes plantules ...... 32 III.3 EFFETS SUR LES MICROORGANISMES ...... 34 IV. DISCUSSIONS ET CONCLUSION ...... 36 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ...... 38 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 39 REFERENCES WEBOGRAPHIQUES ...... 46 ANNEXES ...... 47 RESUME ...... 48

REMERCIEMENTS

Je voudrais exprimer toute ma gratitude à l’égard de tous ceux qui m’ont soutenue pour arriver au terme de ce mémoire, spécialement :

A mon Seigneur et mon unique Sauveur Jésus-Christ de m’avoir donné le temps, la force, le courage et la santé durant toute la réalisation de ce travail.

Je souhaite exprimer spécialement ma reconnaissance :

A Madame le Professeur RAKOTO-RANOROMALALA Danielle. A. Doll, rapporteur de ce mémoire, pour son encadrement et son aide précieuse à l’élaboration de ce manuscrit. « Je vous remercie très sincèrement pour votre aide précieuse. »

A Monsieur le Professeur RANDRIANARIVO H. Ranjàna, Responsable du parcours Biochimie, Biodiversité et Santé, pour son appui et ses conseils durant le stage au laboratoire. « Veuillez agréer mon profond respect. »

A Monsieur le Professeur RASAMIRAVAKA Tsiry, qui nous fait un grand honneur en acceptant la présidence de ce mémoire. « Veuillez recevoir mes remerciements les plus respectueux et ma vive reconnaissance. »

A Madame le Docteur RAZAFIARIMANGA Zara et Monsieur le Docteur RANDRIAMAMPIANINA Lovarintsoa, qui nous font l’honneur de siéger dans le Jury de ce mémoire en tant qu’examinateurs. « Veuillez agréer mon profond respect. »

A mes parents : RAKOTONIRINA Samuel et LANTOMALALA Veloarisoa Razanamaro, qui ont fait des sacrifices pendant tout une vingtaine d’années pour que je réussisse.

A mon frère : RAKOTONIRINA Ny Ony Dulin.

A mon bien-aimé, RAKOTOMANANDRIANA Radoniaina qui a été toujours là pour moi et qui m’a toujours soutenue. « Toute ma gratitude et tout mon amour ! »

A toute ma famille, pour son soutien tant moral que financier ;

A tous mes amis et à toute l’équipe de Toxicologie du laboratoire de Biochimie appliquée aux Sciences médicales pour m’avoir soutenue et aidée durant la réalisation du travail. « Mes sincères remerciements ; soyez bénis. »

Aux étudiants de la promotion en Master II 2017 et 2018, pour leur aide dans l’élaboration de ce mémoire. « En souvenir de ce que nous avons fait et vécu ensemble. »

GLOSSAIRE

Athérogène : lié à la production d’athéromes ou athérosclérose, des plaques de lipides, de glucides de sang et de dépôt calcaire qui se fixent dans les artères.

Contorsion abdominale : étirement de l’animal avec des torsions du corps.

Epicotyle : partie de la jeune plantule en germination située au- dessus de l’insertion du ou des cotylédons.

Exophtalmie : sortie du globe oculaire hors de son orbite.

Hypocotyle : partie de la tige située à la base de la plantule et qui émerge la première de la graine lors de la germination.

Liliopsida ou Monocotylédones : plantes dont les semences ont un seul lobe ou cotylédon.

Magnoliopsida ou Dicotylédones : plantes dont les semences ont deux cotylédons.

LISTE DES ABREVIATIONS

ATCC : American Type Culture Collection

BAE : n-Butanol/Acide acétique/Eau distillée

CCM : Chromatographie sur Couche Mince

MBFA : Mention Biochimie Fondamentale et Appliquée

DL0 : Dose létale 0%

DL100 : Dose létale 100%

DL50 : Dose létale 50%

EAC : Extrait aqueux à chaud

EAF : Extrait aqueux à froid

EB : Extrait Brut

E1 : Extrait purifié

ED : Eau Distillée

EHE : Extrait Hydroéthanolique

HDL : High Density Lipopotrein ip : Intrapéritonéale

IPM : Institut Pasteur de Madagascar

LABASM : Laboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales

LDL : Low Density Lipoprotein

MH : Mueller-Hinton p/p/p : Poids/poids/poids p/v : Poids/volume

UV : Ultra-violet

iii

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : « Koba » emballés avec des feuilles de « longoza » ...... 5 Figure 2 : Vieille feuille de « longoza » ...... 6 Figure 3 : Tige de« longoza » ...... 6 Figure 4 : Fruits de « longoza » ...... 7 Figure 5 : Répartition géographique d’Aframomum angustifolium (iNatCarte) ...... 7 Figure 6 : Schéma récapitulatif de l’extraction et de purification des principes toxiques d’A. angustifolium ...... …17 Figure 7: Chromatogramme des différents extraits obtenus au cours de l’extraction et de la purification, observé sous lumière UV à 254 nm (éluant : système B/A/E 60/20/20, p/p/p) ...... 18 Figure 8: Chromatogramme des différents extraits obtenus au cours de l’extraction et de la purification, observé sous lumière UV à 356 nm (éluant : système B/A/E 60/20/20, p/p/p) ...... 18 Figure 9: Chromatogramme des différents extraits obtenus au cours de l’extraction et de la purification Eluant : système B/A/E 60/20/20, p/p/p ; révélation au réactif à la vanilline sulfurique...... 19 Figure 10: Détermination graphique de la DL50 (24 h) par la méthode de REED et MUENCH (1938) ...... 30 Figure 11: Schéma récapitulatif des différentes étapes de l’étude des effets de l’EHE à différentes concentrations sur la croissance des jeunes plantules ...... 32 Figure 12: Effets de différentes concentrations de l’EHE sur la croissance de l’épicotyle de petit pois ...... 33 Figure 13: Effets de différentes concentrations de l’EHE sur la croissance de l’hypocotyle de petit pois...... 33 Figure 14: Effets de différentes concentrations de l’EHE sur la croissance de l’épicotyle de haricot ...... 34 Figure 15: Effets de différentes concentrations de l’EHE sur la croissance de l’hypocotyle de haricot ...... 34

LISTE DES TABLEAUX

Tableau1 : Familles chimiques présentes dans les espèces du genre Aframomum ...... 8 Tableau2 : Caractéristiques des extraits bruts ...... 16 Tableau3 : Résultats du criblage phytochimique ...... 20 Tableau4 : Rendement de purification et rendement en toxines des extraits de fruits d’Aframomum angustifolium...... 20 Tableau5 : Liste des plantes potagères utilisées ...... 23 Tableau6 : Germes utilisés et leurs caractéristiques ...... 23 Tableau7 : Normes utilisées pour les tests de sensibilité des microorganismes ...... 28 Tableau8 : Résultats expérimentaux de la détermination de la DL50 (24 h) de l’EHE sur la souris ...... 29 Tableau9 : Valeurs utilisées pour l’estimation de la DL50 (24h) chez la souris par la méthode graphique des totaux cumulatifs ...... 30 Tableau10 : Valeurs utilisées pour l’estimation de la DL50 (24 h) par la méthode de régression linéaire ...... 30 Tableau11 : Effets de l’EHE à 1 mg/ml sur la germination de diverses graines de plantes potagères ...... 31 Tableau12 : Résultats des tests en milieu solide des différents extraits ...... 35

INTRODUCTION GENERALE

La toxicologie est connue comme étant la science des poisons. Elle se focalise surtout sur les effets nocifs des substances chimiques sur les organismes vivants. Elle fait aujourd’hui appel à des disciplines scientifiques comme la biologie, la chimie, la physiologie et s’intéresse à plusieurs secteurs de l’activité humaine : l’agriculture, l’alimentation, l’industrie pharmaceutique, l’environnement, les milieux de travail, etc (FRANCK, 2010).

Une substance est dite toxique lorsqu’elle provoque, après pénétration dans l’organisme, des effets délétères sur l’organisme, pouvant aller du trouble d’une ou de plusieurs fonctions vitales de façon passagère ou durable, dans l’immédiat, à court ou à long terme, quelle que soit la dose et la voie d’administration, jusqu’à la suppression complète de ces fonctions et amener à la mort. (www.csst.qs.ca)

Certaines plantes, même à usage courant, se retrouvant parfois dans les champs cultivés, contiennent ou accumulent diverses substances chimiques toxiques appelées toxines, qui provoquent chez certains sujets des réactions physiologiques dommageables. A titre d’exemple, plus de 700 espèces de plantes sont dénombrées au Canada et aux Etats-Unis comme ayant causé des problèmes d’intoxication chez les animaux ou les humains (ALAIN FOURNIER, 2002).

Actuellement, grâce à l’évolution de la science et de diverses disciplines médico- pharmacologiques, ces toxines sont utilisées à des fins thérapeutiques ou comme outils biologiques. A titre d’exemples :

- la neurotoxine produite par Clostridium botulinum d’origine alimentaire, utilisée dans les pays occidentaux pour le traitement des affections paralysantes musculaires d’origine rachidienne (GRAVEL et BOUDREAULT, 2000) ;

- la toxine tétanique ou tétanospasmine d’origine bactérienne, protéine toxique isolée de Clostridium tetani, qui a contribué à l’élucidation du fonctionnement du système nerveux central (BIZZINI, 1977).

A Madagascar, bien qu’elle soit riche en plantes toxiques et aussi médicinales, une grande partie de la flore n’est pas encore exploitée. C’est pourquoi l’unité de recherche de Toxicologie du LABASM (Laboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales, Mention Biochimie Fondamentale et Appliquée), au sein de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo, s’est intéressée à l’étude de ces plantes sur les plans chimique, biologique et toxicologique dont notamment :

- Acridocarpus excelsus, une Malpighiacée malgache (AMDJAD, 2009) ; - Albizia boivinii, une Fabacée endémique de Madagascar (RATSIMIEBO, 2016) ; - Deinbollia boinensis, de la famille des Sapindacées (RAKOTOBE, 2003) ; - Dialium unifoliatum, une Fabacée endémique de Madagascar (RAMBELOHARINTSOA, 2013) ; - Dombeya macrantha, une Malvacée endémique de Madagascar (TOIHIRI, 2016) ; - Mimusops commersonii, de la famille des Sapotacées (RAKOTOARIVELO, 2004) ; - Ocotea madagascariensis, de la famille des Lauracées (RANDRIAMAHAVALISOA, 2003) ; - Pittosporum senacia, de la famille des Pittosporacées (RAZAFINTSALAMA, 2006) ; - Rhodocodon madagascariensis, de la famille des Liliacées (TOILIBOU, 2006) ; - Schefflera longipedicellata, de la famille des Araliacées (RASOLOHARIJAONA, 2008) ; - Uapaca thouarsii,de la famille des Euphorbiacées (RANDRIANANDRASANA, 2004) ;

La présente étude a consisté à approfondir les investigations sur une plante bien connue des Malgaches sous le nom de longoza, scientifiquement nommée Aframomum angustifolium. Le but principal de l’étude est d’extraire les principes actifs de la plante et de les étudier sur les plans chimique et toxicologique.

La plante a été choisie pour cette étude, vue sa popularité auprès des Malgaches. Elle est largement disponible dans le pays, principalement au Sud-est de l’île, et très utilisée dans la vie quotidienne des Malgaches (voir p. 5). Nous avons travaillé sur les fruits, sur lesquels aucune étude approfondie, notamment de toxicité n’a été entreprise.

Après l’introduction générale et la synthèse bibliographique, ce mémoire comporte deux parties : la première traite l’étude chimique qui est consacrée à l’extraction et la purification ainsi que la caractérisation des composés actifs et la deuxième rapporte l’étude toxicologique avec la détermination des effets des extraits de la plante sur des animaux, des végétaux et des microorganismes. Une conclusion générale et des perspectives terminent le document.

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1. GENERALITES SUR LE GENRE Aframomum Avec environ 70 espèces endémiques de l’Afrique sub-saharienne et de Madagascar, Aframomum est l’un des genres les plus importants de la famille des Zingibéracées. Il appartient à l’embranchement des Angiospermes, classe des Liliopsida (ex- Monocotylédones), sous-classe des Zingiberidea, ordre des Zingiberales ou Scitaminales. Dans la nouvelle classification de KRESS et al. (2002), le genre Aframomum se place dans la sous-famille des Alpinioidées, tribu des Alpinieae. Les Aframomum sont des herbes pérennes de grande taille, rhizomateuses et aromatiques. Les plantes de ce genre sont utilisées en cuisine comme colorants et en pharmaceutique et médecine traditionnelle en tant que remèdes (VICTOR et al., 2014). Des études sur des huiles essentielles de certaines espèces d’Aframomum ont déjà été effectuées (VICTOR et al., 2014). Afin de mieux cadrer le sujet, cette partie du mémoire sera consacré aux données sur : - les utilisations des plantes du genre Aframomum ; - leurs propriétés pharmacologiques connues ; - les métabolites secondaires rencontrés chez ce genre. La classification ainsi que la description botanique de la plante, matériel d’étude sont données dans l’étude chimique (§II.1.1, p. 9).

2. UTILISATIONS DES Aframomum

2.1 UTILISATIONS DANS LE MONDE Les espèces du genre Aframomum connaissent de multiples usages dans la vie quotidienne. Quelques exemples sont cités ci-dessous.

 A. arundinaceum est utilisé dans la lutte contre les cancers dus à la drogue et résistants aux médicaments (VICTOR et al., 2014).  Au Cameroun, les feuilles, les fruits et les rhizomes des Aframomum sont largement utilisés dans l'alimentation et en médecine traditionnelle (ABONDO et AMVAM, 1995).  En Ethiopie et en Erythrée, les graines d’A. corrorima sont utilisées pour donner du goût à toutes sortes de sauces et sont généralement mélangées à d’autres épices. Elles sont également utilisées en médecine comme tonique, carminatif et stimulant digestif (JANSEN, 1981).

 Les extraits hydroéthanoliques d’A. aulacocorpus, A. citratum et A. daniellii améliorent le poids corporel, le profil lipidique, le statut antioxydant et peuvent être utilisés dans le traitement des maladies chroniques (NGUELE et al., 2016).  En Europe, les graines d’A. melegueta ou « graines de paradis » servent à aromatiser la nourriture et les boissons, en particulier le vin et la bière (STEPHEN et al., 2016).  A. alboviolaceum est une plante à plusieurs usages allant de l’alimentation à la thérapie. Ainsi par exemple, ses feuilles sont utilisées comme épice et ses graines comme stomachique et vermifuge (SCHUM, 1904).  Au Cameroun, les feuilles d’A. daniellii sont utilisées comme aromates d’aliments. Les fruits sont comestibles et peuvent avoir des propriétés laxatives. Les graines servent d’une part d’épices et d’autre part d’appâts pour pêcher (ABDOU, 2009 ; EMMANUEL et al., 2017).

2.2 UTILISATIONS D’Aframomum angustifolium A MADAGASCAR

(RATOVONDRAMAMY, 2008) Les feuilles, les racines, les tiges et les fruits d’A. angustifolium ont de nombreux usages dans la vie quotidienne à Madagascar.

 Les feuilles

Les jeunes feuilles, de couleur verdâtre (Figure 1) sont fréquemment utilisées dans le service culinaire comme cuillères. Cette méthode est pratiquée surtout chez les Betsimisaraka de la côte Est de Madagascar. Elles sont aussi employées pour emballer les « mofo ravina » ou les « koba», sortes de pudding, qui ont des saveurs très spéciales.

Figure 1: « Koba » emballés avec des feuilles de « longoza »

Les vieilles feuilles, de couleur jaunâtre (Figure 2) sont utilisées comme remède efficace contre les maux d’estomac.

Figure 2: Vieille feuille de « longoza »

 Les tiges

Les tiges rigides, mesurant environ 2 m de hauteur (Figure 3) sont exploitées pour faire des clôtures des jardins potagers (destinés à la culture de légumes).

Figure 3: Tige de « longoza »

 Les racines

Les racines, macérées dans l’eau, sont très utiles pour le soin de la lombalgie (douleur située au niveau des vertèbres lombaires, muscle en arrière de l’abdomen).

 Les fruits

Les jeunes fruits, de couleur verdâtre (Figure 4, p. 7) servent à traiter la coqueluche (maladie qui atteint principalement les enfants, caractérisée par une toux quinteuse), tandis que les fruits murs de couleur rougeâtre sont très bons à manger, surtout pour les enfants et peuvent aussi être conservés en confiture.

Figure 4 : Fruits de « longoza »

2.3REPARTITION GEOGRAPHIQUE A. angustifolium est une plante tropicale qui pousse en Côte d’Ivoire, au Cameroun, au Gabon, à Madagascar et se retrouve surtout dans les sous-bois et les forêts humides (www.inaturalist.org).

A Madagascar, elle est très répandue sur les bords des routes et dans les zones humides de la forêt de Mandraka et de Ranomafana (Figure 5) (RABARIJAONA, 2017).

Figure 5 : Répartition géographique d’Aframomum angustifolium (iNat Carte)

3. DONNEES PHARMACOLOGIQUES Plusieurs propriétés pharmacologiques de certaines Aframomum ont été identifiées d’après des études antérieures. Quelques exemples sont cités ci-dessous.

- Les extraits éthanolique et aqueux d’A. melegueta ont une activité antimicrobienne. L’extrait éthanolique a une forte activité par rapport à l’extrait aqueux vis-à-vis de souches bactériennes telles que Klebsiella sp, Salmonella sp, Escherichia coli et Shigella sp, avec des zones d’inhibition respectives de 3 mm, 15 mm, 20 mm et 15 mm) (STEPHAN et al., 2016). Ses graines possèdent des propriétés anti-cholestérol, anti-constipation, antidiabétique et anticancéreux (VICTORIN et al., 2018).

- L’administration orale chez la souris des extraits hydroéthanoliques d’A. aulacocorpus, A. citratum et A. daniellii diminue le gain de poids exponentiel entrainé par la diète athérogène. Ceci s’est accompagné d’une réduction significative du cholestérol total et du cholestérol LDL avec une augmentation significative du cholestérol HDL (NGUELE et al., 2016).

- L’extrait éthanolique des feuilles et des fruits d’A. spectrum a montré, in vitro, une activité antiplasmodiale. L’évaluation des activités biologiques de l’huile essentielle des mêmes organes a montré une activité contre les bactéries à Gram + et à Gram- (ZAKARIA, 2012).

4. PRINCIPAUX METABOLITES SECONDAIRES RENCONTRES Plusieurs familles chimiques ont déjà été rencontrées chez les espèces du genre Aframomum. Quelques exemples sont présentés dans le tableau 1.

Tableau 1 : Familles chimiques présentes dans les espèces du genre Aframomum

Parties Familles chimiques Espèces Références concernées identifiées alcaloïdes, tanins, saponines, plante STEPHAN et al. A. melegueta stéroïdes, flavonoïdes, entière (2016) terpénoïdes, phénols A. danielli fruit tanins, phénols, flavonoïdes ABDOU (2009) terpénoïdes, stéroïdes, A. stipulatum et graine saponosides, tanins NGAKEGNI (2012) A. giganteum fruit flavonoides, quinones terpènes, flavonoïdes, graine, fruit, A. spectrum hétérosides, tanins, alcaloïdes, ZAKARIA (2012) feuille saponosides A. alboviolaceum rhizome diterpènes, sesquiterpènes ABREU (1997)

Première partie ETUDE CHIMIQUE

I. INTRODUCTION

D’après notre étude bibliographique, aucune étude chimique n’a été réalisée sur A. angustifolium. Dans la présente partie, nous avons :  extrait les principes actifs des fruits d’A. angustifolium en testant plusieurs méthodes ;  mis au point un protocole de purification pour obtenir des extraits clarifiés à partir de l’extrait brut ;  caractérisé ces extraits par diverses méthodes d’analyse et déterminer les familles chimiques qu’ils contiennent.

II. MATERIELS ET METHODES II.1 MATERIELS II.1.1Matériel végétal

II.1.1.1 Taxonomie

(www.tela-botanica.org)

La plante est classée comme suit : Domaine : BIOTA Règne : PLANTAE Classe : LILIOPSIDA Sous-classe : LILIIDAE Ordre : ZINGIBERALES Famille : ZINGIBERACEAE Genre : Aframomum Espèce : angustifolium Noms vernaculaires : longoza, sintogno, longozakely (Malgache, Antakarana), cardamone de Madagascar, cardamone du Cameroun, graines de paradis, malaguette, maniguette, poivre de Guinée (Français), Cameroon cardamon, grains of paradise, great cardamon, Madagascar cardamon (Anglais).

II.1.1.2 Description botanique de l’espèce angustifolium

(www.lubcor.fr)

A. angustifolium a déjà été décrite par Pierre Sonnerat mais reclassée dans l’actuelle classification par Karl Moritz Schumann en 1904.

La plante se présente comme une grande plante herbacée vivace, de 1,5 à 4 m de haut, issue de rhizomes étendus. Elle possède des grandes feuilles simples, alternes et caduques, de couleur verte et des fleurs en forme de trompette, de couleur jaune ou rosée qui s’organisent en épis. Groupées en inflorescences de 4 à 10 fleurs apparaissant à la base des pousses feuillées, les fleurs ont des pétales rouges, un labelle jaune ou orange pâle. Les fruits sont ovoïdes à subglobuleux, de 7 à 9,5 cm de long, y compris le calice persistant, rouge à maturité (HUMBERT, 1946). La tige est très rigide surtout quand sa hauteur atteint 1,50 m à 2 m. La plante a une odeur fruitée, avec des notes d'abricot, épicée et sucrée, légèrement poivrée. Les graines ressemblent à celles du poivre et de la cardamone par leur goût épicé, piquant avec un arrière-goût légèrement âcre.

II.1.1.3 Date et lieu de récolte

Les fruits utilisés ont été récoltés à Ranomafana Ifanadiana (à 391 km d’Antananarivo, RN 7 et RN 25) au mois de Mai 2016.

II.1.1.4 Préparation du matériel d’étude

Les fruits frais sont broyés à l’aide d’un Robot mix de marque Blender (Robot coupe GT 550). Le broyat obtenu constitue le matériel végétal de départ, conservé dans des bocaux au congélateur à + 4°C.

II.1.2 Les produits chimiques et les autres matériels

Durant les expériences, des produits chimiques et des solvants de marque «Prolabo » ou « Merck » et de qualité pure ou « pour analyse » ont été utilisés.

Le support utilisé pour la chromatographie sur couche mince (CCM) est le gel de silice

Merck 60F254, étalé sur une plaque en plastique de dimensions 20 x 20 cm. L’épaisseur de la couche est de 0,2 mm.

II.2 METHODES II.2.1 Méthodes d’extraction des principes actifs

(RAHARISOA, 1999 ; PENCHEV, 2010)

II.2.1.1 Extraction à froid

Le broyat est délayé dans le solvant d’extraction [eau distillée (ED) ou mélange hydroéthanolique 75% (75% d’éthanol et 25% d’ED)] dans le rapport 1/20 (p/v), c’est-à-dire 1 g de matériel végétal dans 20 ml de solvant.

Le mélange est soumis à une forte agitation magnétique pendant 3 h avant de le laisser macérer pendant au moins 12 h à +4°C. Après la macération, une nouvelle agitation de 30 min est nécessaire pour mieux extraire les principes actifs avant de filtrer le mélange sur 4 épaisseurs de gaze. Le filtrat obtenu est centrifugé à 10 000 trs/min pendant 15 min à l’aide d’une centrifugeuse Bremse (T52). Le surnageant issu de cette centrifugation est évaporé en utilisant un évaporateur rotatif de marque Büchi (Rotavapor R110), jusqu’à atteindre le rapport 1/1 (p/v), c’est-à-dire 1 ml d’extrait final pour 1 g de poudre de départ.

II.2.1.2 Extraction à chaud

Le broyat est délayé dans l’ED suivant le rapport 1/20 (p/v), c’est-à-dire 1 g de broyat dans 20 ml d’ED. Le mélange ainsi obtenu est chauffé à reflux sous agitation magnétique (décoction) pendant 3 h. La suite de la manipulation est similaire à celle de l’extraction à froid.

II.2.2 Méthodes de purification

II.2.2.1 Traitement par la chaleur

(RANDRIAMAHAVALISOA, 2003)

II.2.2.1.1 Principe

La méthode est basée sur la propriété de certaines molécules comme les protéines à coaguler sous l’effet de la chaleur.

II.2.2.1.2 Mode opératoire

L’extrait à traiter est chauffé au bain-marie bouillant à 96°C pendant 15 min. Après refroidissement, le précipité formé est éliminé par centrifugation à 3000 trs/min durant 15min.

II.2.2.2 Fractionnement par le n-butanol

(KAMOUN, 1987)

II.2.2.2.1 Principe

Il s’agit d’une extraction liquide-liquide qui permet de partager les molécules selon leurs propriétés physico-chimiques entre 2 phases liquides non miscibles (l’eau et le n- butanol).

II.2.2.2.2 Mode opératoire

Dans une ampoule à décanter, l’extrait à tester est additionné volume à volume de n- butanol. Le mélange est ensuite agité énergiquement et laissé reposer jusqu’à la décantation totale. Deux phases sont observées, une phase inférieure aqueuse et une phase supérieure organique (butanolique). Cette dernière est recueillie tandis que la phase aqueuse subit à nouveau deux fractionnements successifs. A la fin, les 3 phases organiques sont rassemblées puis débarrassées du solvant par évaporation. La phase aqueuse est aussi évaporée.

II.2.3 Méthodes analytiques

II.2.3.1 Chromatographie sur couche mince

(PETIT, 1966 ; AUDIGIER et al., 1989 ; MAHUZIER et HAMON, 1990 ; MARCEL, 2009 ; SUTOUR, 2010)

II.2.3.1.1 Principe La CCM est une technique réservée surtout à la séparation des composés en vue de l’analyse d’un mélange. Elle permet la séparation des composés en fonction de leur interaction avec deux phases distinctes, l’une aqueuse stationnaire et l’autre organique mobile. Les composés sont entraînés à des vitesses différentes sur un support solide selon leur affinité relative pour la phase stationnaire et la phase mobile.

II.2.3.1.2 Mode opératoire  Dépôt des échantillons

Les extraits à analyser sont déposés sur la plaque de gel de silice (voir § II.1.2, p. 10) à l’aide d’un capillaire qui donnera des dépôts de 3-4 mm, espacés de 6 mm et situés à 1,5 cm du bord inférieur de la plaque. Chaque extrait est déposé en 3 fois et chaque dépôt est immédiatement séché à l’aide d’un séchoir à main.

 Développement du chromatogramme

Le développement consiste à faire migrer l’éluant qui est le système de solvants Butanol/Acide acétique/Eau (B/A/E, 20/20/20, p/p/p) sur la plaque préparée précédemment. La plaque est placée en position verticale dans une cuve à chromatographie et l’éluant dont le niveau est ajusté à 0,75-1 cm du fond de la cuve, monte par capillarité. Pendant le développement, la cuve doit demeurer hermétiquement fermée et ne pas être déplacée.

Lorsque le front du solvant arrive à environ 0,5 cm de son bord supérieur, la plaque est retirée de la cuve. Le niveau atteint par le solvant est marqué au crayon par un trait fin, puis la plaque est séchée à l’aide d’un séchoir à main.

 Révélation

Le chromatogramme est révélé selon deux techniques : - il est examiné sous lumière ultra-violette (UV) aux longueurs d’ondes 254 nm et 360nm. - il est révélé par pulvérisation du réactif à la vanilline sulfurique (voir composition en Annexe 1).

II.2.3.2 Méthodes de criblage phytochimique

(ARISOA, 2001 ; BEKRO et al., 2007 ; EDEOGA et al., 2005 ; BRUNETON, 2009 ; GUESSAN et al., 2009 ; SALEM, 2009 ; MAHMOUDI et al., 2013 ; FATIMA, 2014 ; GUESSOUM et LECHEHEB, 2015)

II.2.3.2.1 Principe

Le criblage ou screening phytochimique est un ensemble de techniques permettant de détecter dans une plante, la présence de familles chimiques de composés potentiellement actifs. Il est réalisé sur des extraits acide, hydroéthanolique, chloroformique et aqueux préparés à partir du matériel végétal de départ ou du résidu d’évaporation à sec de l’extrait à étudier.

II.2.3.2.2 Test sur l’extrait acide

Détection des alcaloïdes :

Pour détecter les alcaloïdes, le broyat ou le résidu d’évaporation à sec est additionné de 2 ml d’acide chlorhydrique (HCl) 2 N. Après une macération d’au moins 12 h à +4°C, le mélange est filtré. Le filtrat obtenu constitue l’extrait acide utilisé pour le test. Dans trois tubes à essais contenant chacun 0,5 ml d’extrait acide, sont additionnées respectivement 5 gouttes de réactifs de MAYER, de WAGNER et de DRAGENDORF. La réaction positive se manifeste par la formation d’un précipité. La présence d’alcaloïdes est confirmée par la dissolution de celui-ci en milieu hydroéthanolique 80%.

II.2.3.2.3 Tests sur l’extrait hydroéthanolique a) Détection des flavonoïdes Le broyat ou le résidu sec est repris dans 10 ml de mélange hydroéthanolique 75%. La suspension est filtrée après une macération d’au moins 12 h à +4°C. Le filtrat constitue l’extrait hydroéthanolique. Deux tubes à essais contenant chacun 0,5 ml d’extrait hydroéthanolique sont utilisés pour le test. Quatre gouttes d’HCl 2 N et 2 tournures de magnésium sont ajoutées dans le premier tube alors que le deuxième tube sert de témoin. Le changement de coloration en rouge de la phase supérieure dans le premier tube traduit la présence de flavonoïdes. b) Détection des leucoanthocyanes Un mélange de 0,5 ml d’extrait hydroéthanolique et 0,5 ml d’HCl 2 N est porté à l’ébullition pendant 30 min. Un changement de coloration en rouge après refroidissement révèle la présence de leucoanthocyanes. II.2.3.2.4 Tests sur l’extrait chloroformique a) Détection des stéroïdes et triterpènes (Test de LIEBERMANN- BURCHARD) Le matériel à analyser est mis en suspension dans 3 ml de chloroforme. Le mélange obtenu est filtré après une macération d’au moins 12 h à +4°C. Le filtrat constitue l’extrait chloroformique. Dans un tube à essais contenant 0,5 ml d’extrait chloroformique sont ajoutées 5 gouttes d’anhydride acétique. Trois gouttes de H2SO4 36 N sont ensuite ajoutées après une légère agitation. La présence d’un anneau rouge violacé à l’interface des deux liquides indique la présence de triterpènes, tandis que la coloration verte de la phase aqueuse inférieure révèle la présence des stéroïdes. b) Détection des stérols insaturés (Test de SALKOWSKI)

L’extrait chloroformique est mélangé avec 1 ml de H2SO4 36 N, versé le long de la paroi interne du tube. Le mélange est agité légèrement. L’apparition d’un anneau rouge violacé ou mauve au niveau de l’interface des deux liquides indique la présence de stérols insaturés. II.2.3.2.5 Tests sur l’extrait aqueux Pour tous les tests sur l’extrait aqueux, le matériel végétal ou le résidu sec est délayé dans 10 ml d’ED et le tout est porté à l’ébullition pendant 30 min puis laissé macérer à +4°C pendant au moins 12 h.

a) Détection des anthraquinones (Test de BORNTRAGER)

L’extrait aqueux (0,5 ml) est mélangé à 0,5 ml de benzène. Le mélange est agité énergiquement puis laissé reposer jusqu’à l’obtention de deux phases bien nettes (phase benzénique supérieure et phase alcaline inférieure). De l’ammoniaque (NH4OH 25%) de volume 0,5 ml est ensuite ajouté. Après agitation, le changement de coloration en rouge de la phase inférieure indique la présence d’anthraquinones.

b) Détection des iridoïdes

Le mélange de 0,5 ml d’extrait aqueux et de5 gouttes de HCl 2 N est chauffé au bain- marie bouillant pendant 30 min. L’apparition d’un précipité bleu foncé ou vert foncé traduit la présence d’iridoïdes.

c) Détection des saponines

Un millilitre d’extrait aqueux est agité énergétiquement pendant 30 s. La présence de saponines se traduit par la formation d’une mousse de 3 cm de hauteur persistant pendant au moins 30 min.

d) Détection des tanins et autres polyphénols  Test à la gélatine

L’extrait aqueux (0,5 ml) reçoit 5 gouttes de gélatine 1%. L’apparition d’un précipité montre la présence de polyphénols.

 Test à la gélatine salée

La présence d’un précipité après l’ajout de 5 gouttes de gélatine salée 10% indique que l’extrait aqueux contient des tanins.

 Test au chlorure ferrique (FeCl3)

Cinq gouttes de FeCl3 10% en solution méthanolique sont ajoutées dans 0,5 ml d’extrait. Le changement de coloration en bleu noirâtre indique la présence de tanins pyrogalliques alors que la couleur vert noirâtre montre celle de tanins catéchiques.

e) Détection des désoxyoses (Test de KELLER-KILIANI)

Dans un tube à essai, 0,5 ml d’extrait est mélangé à 0,5 ml de solution aqueuse de

FeCl3 10% et 0,5 ml d’acide acétique glacial. Une légère agitation est nécessaire avant l’addition de 0,5 ml d’acide sulfurique (H2SO4) 36 N dans le tube incliné. L’apparition d’un anneau pourpre à l’interface indique que l’extrait contient des désoxyoses.

II.2.4 Méthode de concentration Les opérations d’évaporation et de réduction de volume des extraits sont effectuées à l’aide d’un évaporateur rotatif Büchi (R110) à 45°C sous pression réduite.

II.2.5 Calcul de rendement Le rendement pour chaque extrait est calculé selon la formule suivante :

(푃푣 − 푝퐶) R = × 100 푄 avec : - R : rendement (en%) ; - Pc : poids du ballon avec le résidu d’évaporation à sec (en g) ; - Pv : poids du ballon vide (en g) ; - Q : poids du matériel végétal de départ (en g).

III.RESULTATS

III.1 EXTRAITS OBTENUS Deux types d’extraction des principes actifs ont été réalisés : - une extraction à froid utilisant l’ED ou le mélange hydroéthanolique 75% comme solvants (voir §II.2.1.1, p. 10) ; - une extraction aqueuse à chaud (voir § II.2.1.2, p.11).

Trois extraits bruts (EB) ont ainsi été obtenus (un extrait aqueux à froid EAF, un extrait aqueux à chaud EAC et un extrait hydroéthanolique à froid EHE). Les trois EB ont tous été testés sur souris par voie intrapéritonéale (ip) (voir méthode au § II.2.1.1.1, p. 24). Les résultats sont résumés dans le tableau 2.

Tableau 2: Caractéristiques des extraits bruts

Temps de Extrait Rendement Consistance Couleur Goût pH survie des brut (%) souris testées Amer EAF Limpide Marron 5 à 6 20 h 6,76 piquant Amer EAC Limpide Marron 4 à 5 20 h 6,08 piquant Marron Amer EHE Limpide 5 18 h 6,83 noirâtre piquant EAF = Extrait aqueux à froid EAC = Extrait aqueux à chaud EHE = Extrait hydroéthanolique

Ces résultats montrent que les trois EB sont tous toxiques pour la souris. Mais l’EHE est le plus toxique si nous nous référons au temps de survie des souris et il présente aussi le meilleur rendement (6,83%). Compte tenu de ces résultats, l’EHE a été choisi pour la suite des manipulations.

III.2 PURIFICATION L’extrait brut obtenu a été purifié en deux étapes : - un traitement par la chaleur ; - un fractionnement par le n-butanol.

Ces méthodes de purification ont été bioguidées par des tests de toxicité sur souris.

III.2.1 Traitement par la chaleur

L’EHE a été traité par la chaleur selon la méthode décrite au § II.2.2.1 (p. 11). L’extrait issu de ce traitement était toxique pour la souris. Il a été utilisé pour la suite de travaux et il a été dénommé E1.

III.2.2 Fractionnement par le n-butanol

Cent milligrammes du résidu obtenu après l’évaporation à sec de l’extrait E1 ont été repris dans 10 ml d’ED puis la solution a été fractionnée par le n-butanol selon la méthode décrite au §II.2.2.2, (p. 11). Deux phases bien séparées ont été obtenues. Aucun des extraits issus des deux phases n’a été toxique pour la souris.

20 g de poudre de fruits

Extrait aqueux à froid

Extrait aqueux à chaud Extrait hydroéthanolique

Extrait hydroéthanolique EHE 1,366 g

Traitement par chaleur

Extrait purifié E1 137 mg

Figure 6 : Schéma récapitulatif de l’extraction et de purification des principes toxiques d’A. angustifolium

III.3 DEGRE D’HOMOGENEITE DES DIFFERENTS PRODUITS

L’évolution de l’homogénéité des différents extraits obtenus est montrée sur le chromatogramme des figures 7 à 9 (p. 18 et 19). L’éluant utilisé était le système B/A/E (60/20/20, p/p/p) selon la technique donnée au § II.2.3.1.2 (p. 12). Le chromatogramme a été observé sous UV à 254 nm et 366 nm puis révélé avec le réactif à la vanilline sulfurique.

Figure 7 : Chromatogramme des différents extraits obtenus au cours de l’extraction et de la purification, observé sous lumière UV à 254 nm (éluant : système B/A/E 60/20/20, p/p/p)

Figure 8 : Chromatogramme des différents extraits obtenus au cours de l’extraction et de la purification, observé sous lumière UV à 366 nm (éluant : système B/A/E 60/20/20, p/p/p)

Figure 9 : Chromatogramme des différents extraits obtenus au cours de l’extraction et de la purification (éluant : système B/A/E 60/20/20, p/p/p) ; révélation au réactif à la vanilline sulfurique

D’après ces figures, l’EHE et l’extrait E1 présentent tous deux bandes majeures sous lumière UV (254 nm et 366 nm). Après révélation avec le réactif à la vanilline sulfurique, l’EHE et E1 présentent les mêmes bandes.

III.4 CARACTERISATION CHIMIQUE III.4.1 Propriétés physico-chimiques

D’après leur comportement au cours des étapes d’extraction et de purification, les principes actifs des fruits d’A. angustifolium : - sont thermostables car ils résistent aux opérations de congélation et de décongélation répétées et au chauffage à reflux à 96°C-100°C ; - sont solubles dans les solvants polaires comme l’eau, l’éthanol et probablement dans les solvants organiques comme le n-butanol ; - ont un goût amer piquant ; - ont une odeur piquante.

III.4.2 Nature chimique

La nature chimique des composés actifs a été déterminée par un criblage phytochimique réalisé sur le broyat des fruits, les extraits EHE et E1. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 3, p. 20.

Tableau 3: Résultats du criblage phytochimique

FAMILLES EXTRAIT TESTS BROYAT EHE E1 CHIMIQUES Mayer ⁻ ⁻ ⁻ Extrait acide Alcaloïdes Wagner ⁻ ⁻ ⁻ Dragendorff ⁻ ⁻ ⁻ Extrait Flavonoïdes Willstatter ⁺ ⁻ ⁻ hydroéthanolique Leucoanthocyanes Bate-Smith ⁺ ⁺ ⁺ Stéroides Liebermann- ⁻ ⁻ ⁻ Extrait Triterpènes Burchard ⁺ ⁻ ⁻ chloroformique Stérols insaturés Salkowski ⁺ ⁻ ⁻ Anthraquinones Borntrager ⁺ ⁺ ⁺ Iridoïdes ⁻ ⁻ ⁻ Test de Saponosides ⁻ ⁻ ⁻ mousse Gélatine 1% ⁻ ⁻ ⁻ Gélatine Extrait aqueux ⁻ ⁻ ⁻ Polyphénols dont salée 10% les tanins FeCl3 10% dans le ⁻ ⁻ ⁻ méthanol Keller- Désoxyoses ⁺ ⁻ ⁻ Kiliani + : Test positif - : Test négatif

D’après ce tableau, les fruits d’A. angustifolium contiendraient des flavonoïdes, des leucoanthocyanes, des triterpènes, des stérols insaturés, des anthraquinones et des désoxyoses. Tandis que l’EHE et E1 ne contiennent que des leucoanthocyanes et anthraquinones.

III.5 RENDEMENTS

En appliquant la formule présentée au §II.2.4 (p. 15), les rendements pendant les étapes de purification ont été déterminés. Le tableau 4 résume le résultat.

Tableau 4 : Rendement de purification et rendement en toxines des extraits de fruits d’A. angustifolium

Poids du résidu Rendement de purification Rendement en toxines (par d’évaporation à sec (par rapport à l’EB rapport au matériel de de E1 2 000 mg) départ 20 000 mg) 137 mg 6,85% 0,685%

IV. DISCUSSION ET CONCLUSIONS

L’étude chimique a permis de mettre en évidence la présence de principes toxiques dans les fruits d’A. angustifolium. Différentes méthodes d’extraction et de purification ont été réalisées sur les fruits aboutissant à l’obtention de 3 types d’extrais (EAF, EAC et EHE). L’EHE s’est avéré le plus toxique (temps de survie des souris testées le plus court) avec le meilleur rendement, 6,83 %. Ce rendement est plus élevé par rapport à celui de l’extrait hydroéthanolique de 20 espèces d’Aframomum du Cameroun qui variait entre 0,05% et 3,7% pour les graines et entre 0,07% et 2,6% pour les feuilles (ABOND0, 1995. L’EHE a été traité par la chaleur et l’extrait obtenu après cette étape a été toxique pour la souris. Ce dernier a été fractionné par le n-butanol mais les deux extraits issus des deux phases, aqueuse et butanolique, n’ont pas été toxiques pour la souris. Ceci pourrait être dû à la partition des principes dans les deux phases, donnant des concentrations non toxiques dans chacune des deux phases. L’utilisation d’autres solvants organiques tels que l’acétate d’éthyle, pourrait donner de meilleurs résultats et plus d’information sur ces extraits de fruits. Du point de vue physico-chimique, les principes toxiques des fruits d’A. angustifolium sont solubles dans les solvants organiques comme l’eau, l’éthanol et probablement dans certains solvants apolaires comme le n-butanol. Ils sont thermostables car les opérations de congélation et de décongélation répétées ainsi que le chauffage n’affectent pas leur toxicité. Ils ont un goût amer et aussi une odeur piquante. Le criblage phytochimique réalisé sur les fruits d’A. angustifolium montre qu’ils contiennent essentiellement des flavonoïdes, des leucoanthocyanes, des triterpènes, des stérols insaturés, des anthraquinones et des désoxyoses. Par contre l’EHE et l’extrait E1 ne contiennent que des leucoanthocyanes et des anthraquinones. Ces composés pourraient donc être à l’origine de la toxicité de ces extraits.

Pour conclure, les fruits d’A. angustifolium contiendraient des principes toxiques qui pourraient appartenir à deux groupes chimiques, à savoir les leucoanthocyanes et les anthraquinones.

Deuxième partie

ETUDE TOXICOLOGIQUE

I. INTRODUCTION

L’étude chimique a permis de mettre en évidence la présence des principes actifs dans les fruits d’A. angustifolium. Dans cette partie, nous avons :  Evalué la toxicité des extraits de fruits en observant les symptômes d’intoxication qu’ils provoquent et en étudiant leur effet-dose sur souris ;  Evalué leur toxicité sur les larves de moustique ;  Etudié leurs effets sur les divers microorganismes ;  Etudié leurs effets sur la germination des graines et sur la croissance des jeunes plantules des plantes Monocotylédones et Dicotylédones. L’EHE disponible en quantité suffisante est utilisé pour tous les tests sauf pour l’étude des effets sur les microorganismes où les extraits bruts sont testés.

II. MATERIELS ET METHODES

II.1 MATERIELS II.1.1 Les animaux d’expérimentation

II.1.1.1 Animaux à sang chaud : les souris

Les animaux utilisés dans les expériences sur les animaux à sang chaud sont des souris mâles (Mus musculus) de race OF1 fournies par l’Institut Pasteur de Madagascar (IPM). Leur poids est compris entre 25 et 30 g.

II.1.1.2 Animaux à sang froid : les larves de moustique

Des larves du moustique Culex quinquefasciatus capturées dans les eaux stagnantes situées aux alentours de l’Université d’Antananarivo sont utilisées.

II.1.2 Les végétaux d’expérimentation

Des graines de plantes potagères Dicotylédones et Monocotylédones sont utilisées pour les tests sur les végétaux. Le Tableau 5 (p. 23) montre la liste de ces graines.

Tableau 5 : Liste des plantes potagères utilisées

NOM NOM CLASSE FAMILLE VULGAIRE SCIENTIFIQUE Petit pois Pisum sativum FABACEE Haricot blanc Phaseolus vulgaris DICOTYLEDONES APIACEE Carotte Daucus carotta BRASSICACEE Tissam white Brassica sp Riz Oryza sativa MONOCOTYLEDONES POACEE Maïs Zea mays

II.1.3 Matériels de microbiologie

II.1.3.1 Les germes utilisés

(AFSSA, 2006 ; ANSSA, 2011 ; ROBERT, 2007)

Des souches bactériennes disponibles au LABASM sont utilisées. Elles sont présentées dans le Tableau 6.

Tableau 6 : Germes utilisés et leurs caractéristiques

Type Nom des germes Morphologie Référence Clostridium perfringens Bacille ATCC 13124 Gram + Listeria monocytogenes Bacille ATCC 19114TM Staphylococcus aureus Coque ATCC 29213 Enterobacter aerogenes Bacille ATCC 13048 Gram - Shigella flexneri Bacille ATCC 1202 Vibrio fischeri Bacille - ATCC : American Type Culture Collection

II.1.3.2 Le milieu de culture

Le milieu de Mueller-Hinton (MH) est le milieu solide non sélectif utilisé pour étudier la sensibilité des souches bactériennes vis-à-vis des agents antimicrobiens. Sa composition est donnée en Annexe III.

II.1.3.3 Les disques pour antibiogramme

Des disques stériles de 6 mm de diamètre découpés dans du papier Buvard ont été utilisés pendant les tests d’antibiogramme.

II.2 METHODES II.2.1 Méthodes d’étude des effets sur les animaux

II.2.1.1 Tests sur animaux à sang chaud (souris)

II.2.1.1.1 Estimation de la toxicité (BEPPE et al., 2014) La toxicité des extraits à étudier est estimée sur des souris mâles selon deux voies d’administration :  la voie orale (gavage) ;  la voie ip. L’extrait est administré à raison de 0,25 ml pour 25 g de souris par voie orale et par voie ip à raison de 0,3 ml pour 25 g de souris. Pour chaque voie d’administration, un lot de 3 souris est utilisé et le comportement et/ou changement physique des souris sont observés dans les 24 h suivant l’administration. Pour la voie orale, l’extrait à tester est injecté au fond de l’estomac de la souris à l’aide d’une seringue dotée d’une aiguille courbée à bout arrondi. Pour la voie ip, l’extrait est injecté directement dans l’abdomen de la souris.

II.2.1.1.2 Détermination de la DL50 (24 h)

(RISPIN et al, 2002)

La dose létale 50% (24 h) (DL50 24 h) est la dose qui provoque la mort de la moitié de souris testées en 24 h (AMIARD, 2011). Différentes doses en progression géométrique de raison r de l’extrait à étudier sont injectées à des lots homogènes de 5 souris pesant 25 ± 2 g. Deux méthodes sont employées pour déterminer la DL50 (24 h) : - la méthode de REED et MUENCH (1938) ; - la méthode de régression linéaire de BOYD (1966).

Pour la première méthode, la détermination de DL50 (24 h) se fait de 2 façons :  soit par calcul selon la formule suivante :

(0,5-N) log DL50 = log B + × log r (M-N) avec : - B : dose immédiatement inférieure à la DL50 ; - N : mortalité provoquée par la dose B ;

- M : mortalité provoquée par la dose immédiatement supérieure à la DL50 (24 h) ; - R : raison de la progression géométrique.  soit par une méthode graphique qui consiste à projeter le point d’intersection de la courbe des totaux cumulatifs des survivants et celle des morts en fonction des doses injectées.

Pour la méthode BOYD (1966), la DL50 (24 h) est obtenue par la relation :

% mortalité = f (log dose)

L’équation de la droite de régression est : Y = A + BX avec : - Y : pourcentage de mortalité ; - A : constante ; - B : coefficient de régression ; - X : logarithme décimal de la dose (log dose).

II.2.1.2 Test sur les animaux à sang froid : les larves de moustique

II.2.1.2.1 Principe

Le test consiste à tester la résistance des animaux aquatiques (larves de moustique) vis-à-vis de l’intoxication de leur milieu par l’extrait à tester.

II.2.1.2.2 Mode opératoire

Des larves de Culex quinquefasciatus au troisième stade de leur développement sont sélectionnées. Elles sont réparties en lots de cinq et déposées dans 200 ml d’extrait à tester à 2mg/ml. Après 24 h, la mortalité larvaire se traduit soit par une immobilité totale des larves, soit par leur incapacité à plonger ou d’atteindre la surface de l’eau. Dans ce dernier cas, elles sont dites moribondes.

II.2.2 Méthodes d’étude des effets sur les végétaux

Les effets de l’extrait à étudier sont évalués par 2 expériences : la première sur la germination des graines et la deuxième sur la croissance des jeunes plantules.

II.2.2.1 Etude des effets sur le pouvoir germinatif des graines

II.2.2.1.1 Principe

Ce test consiste à déterminer les effets de l’extrait à étudier sur la capacité de germination des graines.

II.2.2.1.2 Mode opératoire

Les graines de plantes potagères (voir Tableau 5, p. 24) sont d’abord trempées dans de l’eau de javel 10% puis rincées abondamment à l’eau de robinet pour les désinfecter. Elles sont ensuite trempées dans l’extrait (pour les graines-tests) ou dans de l’eau de robinet (pour les graines servant de témoins) pendant 48 h à la température ambiante et à l’obscurité. Après leur trempage, les graines sont placées sur des assiettes en plastique dont le fond est recouvert de coton imbibé d’extrait à tester pour les graines-tests et d’eau de robinet pour les témoins. Le nombre de graines ayant germé est compté après 72 h.

II.2.2.2 Etude des effets sur la croissance des jeunes plantules

II.2.2.2.1 Principe

L’étude des effets des extraits toxiques sur la croissance des jeunes plantules consiste à mesurer la longueur de leurs épicotyles et hypocotyles.

II.2.2.2.2 Mode opératoire

L’expérience se déroule en deux étapes : le trempage des graines et la croissance des jeunes plantules. Un représentant des Monocotylédones et un représentant des Dicotylédones sont utilisés.

 Trempage

Des lots de 10 graines sont utilisés. Tous les lots sont trempés dans l’eau de robinet et l’ensemble est placé à l’obscurité et à la température ambiante pendant 48 h.

 Croissance des jeunes plantules

Après trempage, les graines pré-germées sont transférées sur une assiette en plastique préalablement recouverte de coton hydrophile imbibé : - d’eau de robinet (lot témoin négatif); - d’extrait à étudier de concentrations croissantes ; - de glyphosate de concentration 7,2 mg/ml (lot témoin positif). Tous les deux jours, pendant deux semaines, les jeunes plantules sont arrosées avec de l’eau de robinet et la longueur de leurs hypocotyles et épicotyles est mesurée.

II.2.2.3 Analyse statistique

Les résultats obtenus sont analysés à l’aide du logiciel StatitCf (Version 5).

II.2.3 Méthodes d’étude des effets sur les microorganismes (RAZAFINTSALAMA, 2006 ; RASOLOFOMANANA, 2015 ; VELOMALALA, 2013)

II.2.3.1 Méthode de stérilisation

La stérilisation des milieux de culture, des disques pour antibiogramme, des cônes des micropipettes est réalisée à l’aide d’un autoclave à 120°C sous une pression de 2 bars pendant 1 h. La verrerie et les pinces sont stérilisées à l’étuve à 180°C pendant 15 min. Toutes les manipulations sont réalisées autour de la flamme d’un bec Bunsen.

II.2.3.2 Spectre d’activité antimicrobienne

II.2.3.2.1 Principe

En milieu solide, la sensibilité des souches microbiennes à un antibiotique se traduit par la formation d’une zone d’inhibition de leur développement, appelée halo d’inhibition, autour d’un disque d’antibiogramme sur lequel le composé actif a été déposé.

II.2.3.2.2 Mode opératoire  Première étape :

Les souches pures à tester sont prélevées à partir d’une culture sur gélose-pente puis repiquées par la méthode des quadrants sur du milieu de Mueller-Hinton (MH) coulée dans des boites de Petri, puis incubées à 37°C pendant 24 h : c’est le relancement de la culture.

 Deuxième étape :

Une colonie de germe prélevée à l’aide d’une œse sur la culture précédente est mise en suspension dans du sérum physiologique de manière à avoir une concentration bactérienne égale à 106 cellules/ml. Cette préparation constitue l’inoculum. 1 ml de ce dernier est ensemencé uniformément dans une boite de Petri contenant du milieu MH solide selon la technique d’inondation.

La boite est laissée à la température ambiante pendant 1 min pour que les germes puissent bien adhérer à la surface de la gélose. L’excès de suspension bactérienne est éliminé par aspiration, puis la boite est séchée à l’étuve à 37°C pendant 15 min. Les disques stériles pour antibiogramme sont imprégnés de 20 μl d’extrait à tester. Ils sont ensuite déposés à la surface du milieu ensemencé à l’aide d’une pince fine stérile. La préparation est incubée à 37°C pendant 24 h. Chaque test est réalisé en double.

 Troisième étape :

Après incubation, le diamètre des halos d’inhibition est mesuré. Les résultats sont exprimés suivant les normes données dans le Tableau 7.

Tableau 7 : Normes utilisées pour les tests de sensibilité des microorganismes (LEIPZIG, 1996)

Diamètre de la zone Degré de sensibilité des Résultats d’inhibition (X) germes

X < 8 mm Insensible - 9 mm ≤ X ≤ 14 mm Sensible + 15 mm ≤ X ≤ 19 mm Très sensible ++ X > 20 mm Extrêmement sensible +++

III. RESULTATS III.1 EFFETS SUR LES ANIMAUX III.1.1 Effets sur la souris III.1.1.1 Description des symptômes

Deux voies d’administration ont été utilisées pour l’évaluation de la toxicité de l’EHE des fruits d’A. angustifolium sur les souris : la voie intrapéritonéale (ip) et voie orale.

III.1.1.1.1 Symptômes développés après injection intrapéritonéale

Différents symptômes apparaissaient chez la souris après injection par voie ip de l’EHE à la dose létale de 840 mg/kg. - Une contorsion abdominale suivie d’une diminution de l’activité motrice et une érection de la queue ont été simultanément observées 15 min après l’injection. - Trente minutes après l’injection, ces symptômes étaient accompagnés d’un trainement des pattes postérieures et d’un frisson. - Les mêmes symptômes additionnés d’une exophtalmie ont été observés 1 h après l’injection. - La mort de l’animal est survenue 18 h après l’injection.

III.1.1.1.2 Symptômes développés après administration orale

Une diminution de l’activité motrice a été observée après l’administration orale de la dose létale par voie ip 840 mg/kg. Cependant, aucune souris n’est morte 24 h après le test.

III.1.1.2 Détermination de la DL50 (24 h)

La DL50 (24 h) de l’EHE par voie ip a été estimée selon deux méthodes : celles de REED et MUENCH (1938) et de BOYD (1966) (voir § II.2.1.1.2, p. 24).

III.1.1.2.1 Méthode de REED et MUENCH (1938)

Sept doses en progression géométrique de raison r égale à 1,38, allant de 90,48 mg/kg (dose la plus élevée provoquant 0% de mortalité en 24 h) à 840 mg/kg (dose létale la plus faible tuant 100% des souris testées) ont été utilisées sur 7 lots de cinq souris mâles. Les résultats obtenus après 24 h sont résumés dans le Tableau 8.

Tableau 8 : Résultats expérimentaux de la détermination de la DL50 (24 h) de l’EHE sur la souris Dose en Nombre de souris mortes après Nombre de souris Taux de mg/kg 9 h 12 h 15 h 18 h 21 h 24 h mortes survivantes mortalité souris 90,48 0 0 0 0 0 0 0 5 0% 135,72 0 0 0 0 1 0 1 4 20% 180,96 0 0 0 1 1 0 2 3 40% 361,92 0 0 0 1 1 1 3 2 60% 600 0 0 0 2 1 0 3 2 60% 723,84 0 0 0 2 1 1 4 1 80% 840 0 0 0 2 2 1 5 0 100%

 D’après la formule de REED et MUENCH donnée au §II.2.1.1.2 (p. 24), B = 180,96 mg/kg ; N = 40% soit 0,4 ; M = 60% soit 0,6 et r = 1,38. La valeur de la DL50 (24 h) estimée par cette méthode est donc égale à 212,57 mg/kg.

 D’après la méthode graphique de ces mêmes auteurs, la valeur de la DL50 (24 h) déterminée à partir de la projection de l’intersection de la courbe des totaux cumulatifs des mortes et celle des totaux cumulatifs des survivantes en fonction des doses injectées est de 330,1 mg/kg (voir tableau 9 et figure 10, p. 30).

Tableau 9 : Valeurs utilisées pour l’estimation de la DL50 (24 h) chez la souris par la méthode graphique des totaux cumulatifs

Nombre Nombre Nombre de Dose en Totaux cumulatifs des de souris de souris souris mg/kg testées mortes survivantes mortes survivantes

90,48 5 0 5 0 17 135,72 5 1 4 1 12 180,96 5 2 3 3 8

361,92 5 3 2 6 5 600 5 3 2 9 3 723,84 5 4 1 13 1 840 5 5 0 18 0

20 18 16 14 12 10 MORTES 8

6 SURVIVANTES 4 Totaux cumulatifs cumulatifs Totaux 2 0

DL50 = 330,1 mg/kg Dose en mg/kg

Figure 10: Détermination graphique de la DL50 par la méthode de REED et MUENCH (1938) III.1.1.2.2 Méthode de BOYD

Les valeurs utilisées pour l’estimation de la DL50 (24 h) d’après la méthode de BOYD (1966) décrite au §II.2.1.1.2 (p. 24), sont présentées dans le Tableau 10.

Tableau 10 : Valeurs utilisées pour l’estimation de la DL50 (24 h) par la méthode de régression linéaire Nombre de Taux de Dose en mg/kg log dose souris mortes mortalité 90,48 1,95 0 0% 135,72 2,13 1 20% 180,96 2,25 2 40% 361,92 2,55 3 60% 600 2,77 3 60% 723,84 2,85 4 80% 840 2,92 5 100%

L’équation de la droite de régression linéaire est :

Y = - 164,40 + 86,73X

La DL50 (24 h) est donc estimée à 296,51 mg/kg.

Ainsi, la DL50 (24 h) par voie ip de l’EHE se situe entre 212,57 mg/kg et 330,1mg/kg.

III.1.2 Effets sur les larves de moustique

D’après la méthode décrite au §II.2.1.2.2 (p. 25), l’EHE à 2 mg/ml n’a provoqué aucune mortalité en 24 h.

III.2 EFFETS SUR LES VEGETAUX III.2.1 Effets sur le pouvoir germinatif des graines

L’objectif était de déterminer les effets de l’EHE à 1 mg/ml sur la germination de différentes graines de plantes potagères. La méthode décrite au §II.2.2.1.2 (p. 26) a été utilisée. Le Tableau 11 montre les résultats obtenus.

Tableau 11 : Effets de l’EHE à 1 mg/ml sur la germination de diverses graines de plantes potagères

Taux de Taux Classe Famille Nom usuel Nom scientifique germination d’inhibition

- Petit pois Pisum sativum 100% 0% FABACEAE Haricot blanc Phaseolus vulgaris 100% 0% APIACEAE Carotte Daucus carotta 46,66% 53,34%

DONES

DICOTYLE BRASSICACEAE Tissam white Brassica sp 93,33% 6,67%

- Riz Oryza sativa 66,66% 33,34% POACEAE

LEDONES Maïs Zea mays 53,33% 46,67%

MONOCOTY

D’après ces résultats, l’EHE a un effet variable selon le type de graine. En effet, il n’a montré aucun effet sur les graines de petit pois et de haricot blanc (100% de germination). Une inhibition de la germination à des taux variant de 6,67% à 53,34% a été observée chez les quatre autres graines.

III.2.2 Effets sur la croissance des jeunes plantules

Les effets de l’EHE ont été testés sur la croissance des jeunes plantules de Dicotylédones : le petit pois (Pisum sativum) et le haricot (Phaseolus vulgaris). Cinq concentrations différentes de l’EHE, allant de 0,45 mg/ml à 7,2 mg/ml, ont été utilisées sur cinq lots de 10 graines de chaque plante-test. Deux autres lots, l’un arrosé avec de l’eau de robinet et l’autre avec une solution de glyphosate de concentration 7,2 mg/ml, ont respectivement servi de témoins négatif et positif (voir §II.2.2.2.2, p. 26). Les étapes du test sont résumées sur la figure 11.

7 lots de 10 graines de chaque plante- test

Trempage dans l’eau de robinet à l’obscurité et à la température ambiante pendant 48 h

Un lot mis à germer Un lot mis à germer et 5 lots mis à germer et et arrosé avec de arrosé avec du arrosés avec 5 l’eau de robinet glyphosate à 7,2 concentrations (témoin négatif) mg/ml (témoin positif) différentes de l’EHE

0,45 mg/ml 0,9 mg/ml 1,8 mg/ml 3,6 mg/ml 7,2 mg/ml

Figure 11 : Schéma récapitulatif des différentes étapes de l’étude des effets de l’EHE à différentes concentrations sur la croissance des jeunes plantules

Les résultats obtenus sont présentés sur les figures 12 à 15 (p. 33 et 34).

Croissance des épicotyles de petit pois

200 p>0,05 150

100

0 3 5 7 9 11 13 15 -50 Nombre de jours

0,45 mg/ml 0,9 mg/ml 1,8 mg/ml 3,6 mg/ml Longueur des épicotyles (en mm) épicotyles Longueur des 7,2 mg/ml 7,2 mg/ml GLY 0 mg/ml

Figure 12 : Effets de différentes concentrations de l’EHE sur la croissance de l’épicotyle de petit pois

Croissance de l'hypocotyle de petit pois 35 p<0,05 30 25 20 15 10 5 0 3 5 7 9 11 13 15 Nombre de jours

0,45 mg/ml 0,9 mg/ml 1,8 mg/ml 3,6 mg/ml

(en mm)l'hypocotyle Longueur de 7,2 mg/ml 7,2 mg/ml GLY 0 mg/ml

Figure 13 : Effets de différentes concentrations de l’EHE sur la croissance de l’hypocotyle de petit pois

D’après les Figures 11 et 12, l’EHE inhibe la croissance de l’épicotyle de petit pois à toutes les concentrations. Le même résultat a été obtenu pour la croissance de l’hypocotyle de cette plante. Un effet-dose est noté pour l’épicotyle et l’hypocotyle.

Croissance de l'épicotyle de haricot

25 p>0,05 20 15 10 5 0

-5 3 5 7 9 11 13 15 Nombre de jours

(en mm) épicotyles Longueur des 0,45 mg/ml 0,9 mg/ml 1,8 mg/ml 3,6 mg/ml 7,2 mg/ml 7,2 mg/ml GLY 0 mg/ml Figure 14 : Effets de différentes concentrations de l’EHE sur la croissance de l’épicotyle de haricot

Croissance de l'hypocotyle de haricot

30,00 p<0,05 25,00 20,00 15,00 10,00 mm) 5,00 0,00 3 5 7 9 11 13 15

Nombre de jours (en l'hypocotyle Longueur de 0,45 mg/ml 0,9 mg/ml 1,8 mg/ml 3,6 mg/ml

7,2 mg/ml 7,2 mg/ml GLY 0 mg/ml

Figure 15 : Effets de différentes concentrations de l’EHE sur la croissance de l’hypocotyle de haricot D’après les résultats ci-dessus, l’EHE exerce un effet stimulateur sur la croissance de l’épicotyle de haricot à toutes les concentrations à partir du 9ème jour. Aucun effet notable n’a été obtenu sur l’hypocotyle.

III.3 EFFETS SUR LES MICROORGANISMES

La sensibilité de six souches microbiennes aux EB (EHE, EAF et EAC) a été testée en milieu solide selon la méthode détaillée au § II.2.3.2.2 (p. 27).

Les résultats sont montrés dans le tableau 12.

Tableau 12 : Résultats des tests en milieu solide des différents extraits

Diamètre du halo en mm Type Souche Résultat EHE EAF EAC Clostridium perfringens 6 7 7 - Gram+ Listeria monocytogènes 8 7 7 - Staphylococcus aureus 6 6 6 - Enterobacteraerogenes 6 7 6 - Gram- Shigella flexneri 7 6 7 - Vibrio fisheri 7 6 6 - -: insensible D’après ce tableau, les diamètres du halo d’inhibition des six souches testées sont tous inférieurs ou égaux à 8 mm. Ainsi, selon les normes présentées dans le tableau 7 (p. 28), les souches testées sont résistantes vis-à-vis des extraits bruts des fruits d’A. angustifolium.

IV. DISCUSSION ET CONCLUSIONS

Les propriétés toxiques des extraits des fruits d’Aframomum angustifolium ont été évaluées sur des animaux à sang chaud (souris), des animaux à sang froid (larves de moustique), des végétaux et des microorganismes. Chez la souris, l’EHE a provoqué des symptômes à savoir une diminution de l’activité motrice, des frissons et une exophtalmie indiquant une action sur le système nerveux central et l’appareil locomoteur. Par contre, aucune mortalité n’a été observée après un gavage intragastrique à une dose létale par voie ip (840 mg/kg) à part une diminution de l’activité motrice. Cela veut dire que l’EHE n’est pas létal quand il est administré par voie orale. Ceci pourrait être dû à la digestion des principes toxiques dans le tube digestif ou à leur non absorption (RATSIMIEBO, 2016) La DL50 (24 h) de l’EHE est comprise entre 212,57 mg/kg et 330,1 mg/kg. Par rapport aux toxines déjà étudiées au LABASM, par exemple l’extrait brut d’Albizia boivinii dont la DL50 (24 h) se situe entre 0,971 g/kg et 1,03 g/kg (RATSIMIEBO, 2016), l’EHE est modérément toxique. Par contre, il est beaucoup moins toxique que l’extrait des feuilles de Pittosporum senacia dont la DL50 (24 h) se situe entre 26,05 mg/kg et 27,41 mg/kg (RAZAFINTSALAMA, 2006). Aucune étude n’a été faite sur le genre Aframomum d’après la littérature mais MARCIA et al. (2018) ont étudié la toxicité du rhizome de Curcuma zerumbet (ZINGIBERACEAE) et ont trouvé une DL50 (24h) égale à 1,85g/kg, largement supérieure à celle de l’EHE. Ce dernier est donc plus toxique que l’extrait de rhizome de Curcuma zerumbet. Des études plus approfondies sont nécessaires pour obtenir plus de précisions à ce sujet. Chez les larves du moustique Culex quinquefasciatus, l’EHE n’a provoqué aucune mortalité avec une concentration de 2 mg/ml qui était déjà assez élevée. Chez les végétaux, la germination des graines a été inhibée par l’EHE à 1 mg/ml à un taux variant de 6,67% à 53,34% Les graines de la carotte (Daucus carotta) étaient les plus sensibles avec un taux d’inhibition de 46,66% tandis que celles du petit pois et du haricot blanc (FABACEAE) sont insensibles à l’extrait et ont germé à 100%. L’inhibition de la germination peut être due à l’inactivation des enzymes responsables de la germination (effet indirect) ou à la destruction des embryons (effet direct) (RAZAFINTSALAMA, 2006). Chez les jeunes plantules de petit pois, une activité inhibitrice a été observée sur le développement de l’épicotyle et de l’hypocotyle du petit pois. Cette activité est comparable à

36 celle de l’extrait de feuilles d’Albizia androyensis (RASOLOFOMANANA, 2015). Ceci laisse à penser que l’extrait agit en bouleversant le phénomène d’enracinement et d’absorption, ce qui conduit à un manque de nutriments nécessaires au développement de la plantule, d’où l’inhibition de la croissance (KEFELI et KALEVITCH, 2003). Par contre, l’EHE stimule légèrement la croissance de l’épicotyle des jeunes plantules de haricot, ce qui est encore comparable à l’action de l’extrait des feuilles d’Albizia boivinii (RATSIMIEBO, 2016). L’EHE pourrait donc stimuler l’action des phytohormones qui facilitent le développement des tiges (KEFELI et KALEVITCH, 2003). Cependant, il n’a pas d’effet sur l’hypocotyle de haricot. Cette résistance serait probablement due à l’absence de récepteurs des substances actives. Sur les microorganismes, les différents extraits bruts des fruits d’A. angustifolium n’ont montré aucune activité antimicrobienne. Les germes testés étaient résistants vis-à-vis de ces extraits. En résumé, l’étude de l’activité toxicologique des extraits de fruits d’A. angustifoliuma permis de montrer que l’EHE est toxique sur la souris. Il n’a montré aucune activité larvicide vis-à-vis de Culex quinquefasciatus. Chez les végétaux, il peut avoir une activité inhibitrice sur la germination de graines de Monocotylédones et de Dicotylédones. Il agit sur la croissance de l’épicotyle et de l’hypocotyle de jeunes plantules soit en l’inhibant soit en la stimulant, selon l’espèce testée. Les extraits bruts étaient inactifs sur les microorganismes testés.

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

Il a été signalé précédemment qu’aucune étude sur les principes toxiques de fruits d’Aframomum angustifolium n’a encore été effectuée. Les résultats obtenus dans ce mémoire ont abouti à l’acquisition des premières données chimiques et toxicologiques sur cette plante. Les études faites sur A. angustifolium ont permis de :  mettre en évidence l’activité toxique dans les fruits ;  étudier quelques propriétés physico-chimiques et toxicologiques des principes actifs ;  déterminer leur nature chimique.

Les résultats de cette étude, bien qu’intéressants, sont encore préliminaires, mais dans l’avenir, nous envisageons de :  améliorer les différentes méthodes d’extraction et de purification afin d’obtenir les principes toxiques en plus grande quantité et à l’état pur;  élucider la structure des principes toxiques et étudier leurs mécanismes d’action ;  rechercher d’autres propriétés biologiques comme l’activité antioxydante.

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REFERENCES WEBOGRAPHIQUES

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2. http://www.lubcor.fr

3. http://www.tela-botanica.org

4. http://www.csst.qs.ca

ANNEXES

Annexe I : Composition du réactif à la vanilline sulfurique

Vanilline ...... 0,5 g

Acide sulfurique (H2SO4) ...... 100 ml

Annexe II : Composition des réactifs utilisés pour la détection des alcaloïdes

Réactif de MAYER

Chlorure de mercure (HgCl2) ...... 1,36 g Iodure de potassium (KI) ...... 5 g Eau distillée qsp ...... 100 ml

Réactif de WAGNER Iodure de potassium (KI) ...... 2 g Iode ...... 1,27 g Eau distillée qsp ...... 100 ml

Réactif de DRAGENDORFF : mélange volume à volume de 2 solutions A et B Solution A :

Nitrate de bismuth (Bi(NO3)3) ...... 1,7 g Acide tartrique concentré ...... 20 g Eau distillée qsp ...... 30 ml

Solution B : Iodure de potassium (KI) ...... 1 g Eau distillée qsp ...... 40 ml

Annexe III : Composition du milieu de MUELLER-HINTON

Extrait de viande ...... 2 g Peptone ...... 17,5 g Amidon ...... 1,5 g Agar ...... 15 g

Nom : RAKOTONIRINA Prénoms : Fandresena Nacya Titre du mémoire : Etudes chimique et toxicologique des extraits de fruits d’Afromomum angustifolium (ZINGIBERACEAE) RESUME Une activité toxique a été mise en évidence dans les fruits d’Afromomum angustifolium (ZINGIBERACEAE). Parmi les trois extraits obtenus après extraction, l’extrait brut hydroéthanolique (EHE) a été retenu car il est le plus actif sur la souris et présente le meilleur rendement. Cet extrait a été purifié à l’aide de deux techniques successives : traitement par la chaleur et fractionnement par le n-butanol. Le rendement en toxines est de 0,685%. Les principes toxiques sont thermostables, solubles dans les solvants polaires comme l’eau, l’éthanol et dans les solvants organiques apolaires comme le n-butanol. Ils ont un goût amer piquant et une odeur piquante. D’après le criblage phytochimique des leucoanthocyanes et des anthraquinones sont présents dans l’extrait purifié E1. L’EHE administré par voie intrapéritonéale (ip) et par gavage a provoqué plusieurs symptômes d’intoxication chez la souris, mais il n’a été létal que par voie ip. La DL50 (24 h) par voie ip est estimée entre 212,57 mg/ml et 330,1 mg/ml. L’EHE à 2 mg/ml n’a provoqué aucune activité sur les larves du moustique Culex quinquefasciatus. L’EHE a exercé une faible activité inhibitrice sur la germination des graines de quelques plantes potagères. Par contre, il agit sur la croissance de l’épicotyle et de l’hypocotyle de jeunes plantules soit en l’inhibant soit en la stimulant selon la plante- test. Aucune activité n’a été trouvée sur les microorganismes testés. Mots clés : Afromomum angustifolium, Zingiberaceae, fruits, toxique, DL50, inhibition, stimulation. Encadreur : Professeur RAKOTO-RANOROMALALA Danielle. A. Doll

Family name: RAKOTONIRINA

First name: Fandresena Nacya Title: Chemical and toxicological studies of Aframomum angustifolium fruit extract (ZINGIBERACEAE). ABSTRACT Toxic activity has been highlighted in pod extracts of Afromomum angustifolium (ZINGIBERACEAE). Among of the three extracts obtained by extraction, the hydroethanolic extract (EHE) was selected during the experience because it was the most active on the test with mouse and gave the best yield. This extract was purified by using two methods consecutively : heat treatment and treatment with n-butanol. The toxin yield was 0.685%. The toxic principles were thermostable, soluble in polar solvents such as water, ethanol and in nonpolar solvents such as n-butanol. They had a bitter and spicy taste. They also showed a spicy smell. Phytochemical screening revealed the presence of leucoanthocyanes and anthraquinones in the purified extract E1. EHE administered by intraperitoneal injection and intragastric gavage caused several symptoms of intoxication on mouse but the intraperitoneal route was the only one lethal. The LD50 (24 h) obtained by intraperitoneal route was estimated between 212.57 mg/ml and 330.1 mg/ml. The EHE extract at 2 mg/ml did not caused any larvicidal activity on the mosquito Culex quinquefasciatus larvae. On the one hand, EHE had a low inhibition activity during the germination of some vegetables. On the other hand, sometimes, it exerted stimulation, sometimes an inhibition of the young seedlings growth depending on the type of the seeds. No antimicrobial activity was found on the microorganisms strains tested. Key words: Afromomum angustifolium, Zingiberaceae, fruits, toxic, LD50, inhibition, stimulation. Advisor: Professeur RAKOTO-RANOROMALALA Danielle. A. Doll