بررسی فیلوژنتیکی گونه Peronia Peronii )نرمتنان:شکم پایان
Total Page:16
File Type:pdf, Size:1020Kb
مجله تازه هاي بیوتکنولوژی سلولي- مولکولي دوره چهارم، شماره پانزدهم، تابستان 1393 بررسی فیلوژنتیکی گونه Peronia peronii )نرمتنان:شکم پایان، sea slug ( در سواحل بین جزر و مدی چابهار بر اساس توالی ژنی SrDNA 18 گیﻻن عطاران فریمان* 1 ، یاسمن موسوی پور2 ، آرش شکوری1 1 هیئت علمی دانشگاه علوم دریایی و دریانوردی چابهار ،گروه زیست شناسی ،دانشکده علوم دریایی ،دانشگاه علوم دریایی و دریانوردری چابهار ، چابهار ، ایران 2کارشناسی ارشد ،گروه زیست شناسی ، دانشکده علوم دریایی ، دانشگاه علوم دریایی و دریانوردری چابهار ، چابهار ، ایران چکیده سابقه و هدف : بررسی های فیلوژنتیکی و شناساسیی مورفولوژی و مولکولی بر روی گونه های هر منطقه میتواند پایه ی مطالعات بعدی را بنیان گزاری کند . مطالعات فیلوژنتیکی زیادی بر اساس ژنوم میتوکندریایی در دیگر نقاط ساحلی دنیا بر روی این گروه از شکم پایان تابحال انجام گرفته ، اما اطﻻعات کمی از ژنوم هسته ای این گروه ثبت شده است. بیشتر مطالعات انجام شده در ایران بر اساس بررسی های ریخت شناسی موجود انجام شده ولی گزارشی از بررسی های مولکولی گونه های ایرانی از سواحل جنوبی ثبت نشده است . در این پژوهش برای اولین بار گونه ای از sea slug های سواحل چابهار مورد بررسی فیلوژنتیکی قرار گرفت . مواد و روش ها : نمونه برداری از سواحل صخره ای تیس در چابهار انجام شد و به آزمابشگاه انتقال داده شدند و پس از بررسی های ریخت شناسی گونه ، نمونه ها در فریزر 80- درجه نگه داری شدند ، استخراج DNA با استفاده از روش CTAB صورت گرفت ، سپس واکنش زنجیره ای پلیمراز و توالی یابی و ترسیم درخت فیلوژنی انجام شدند. یافته ها : توالی نوکلئوتیدهای بدست آمده در منطقه ژنی S rDNA 18مورد آنالیزهای مولکولی قرار گرفتند . با آنالیزهای انجام شده و ترسیم درخت فیلوژنی مشخص شد که گونه ی ایرانی در کﻻد Panpulmonata قرار گرفته است ، گونه ایرانی و دیگر گونه های این کﻻد بیشترین واگرایی را نسبت به گونه های دوکﻻد دیگر دارند . نتایج : آنالیز فیلوژنتیکی MLنشان داد که گونه ی چابهار 100 درصد شبیه با Peronia cf. peronii و در یک گروه خواهری قرار گرفته اند ، بررسی خصوصیات مورفولوژیکی هم این نتایج را تایید کرد . کلمات کلیدی : 18S rDNA ، Peronia peronii ، فیلوژنی ، سواحل چابهار ، شکم پایان مقدمه Pulmonata Cu� نرم تنان یکی از بزرگترین و متنوع ترین گروههای جانوری 1931 انجام گرفت شکم پایان در سه گروه Opisthobranchia Milne Edwards vier هستند و بعد از بندپایان بزرگترین گروه را در میان بی مهرگان 1814 , ، 1848 , - و ProsobranchiaArchive Miln _ Edwards,1848 of SID تقسیم بندی شدند ، به خود اختصاص داده اند . نرم تنان در همه جای زمین در محیط های دریایی از سواحل جزر و مدی تا عمیق ترین قسمت شکم پایان یکی از گروههای تخصص یافته ی متازوآ میباشد و های اقیانوس ،آب های شیرین و در خشکی دیده میشوند .رده مطالعات زیادی روی آنها صورت گرفته است اما مطالعه فیلوژنی Opistho� Euthyneura ی شکم پایان بزرگترین و متنوع ترین گروه از نرم تنان هستند آنها از سال 1988 انجام شد )9( . ) pulmonates branchs ، بر اساس طبقه بندی که توسط Thiele Johannes در سال چندین خصوصیت مشترک با ششداران دارند که هردوی آنها در یک گروه بنام Euthyneura قرار گرفته آدرس نویسنده مسئول : گروه زیست شناسی ،دانشکده علوم دریایی ،دانشگاه علوم دریایی و دریانوردری چابهار ، چابهار ، ایران اند( که شامل بیشترگونه های sea slug ها ، land snail ها ، Email :[email protected] land slug تاریخ دریافت مقاله: 29/2/92 و برخی خانواده های شکم پایان دریازی که صدف تاریخ پذیرش: 20/4/93 دارند میباشند، تاکسون راسی شکم پایان محسوب میشود)9(. www.SID.ir تازه های بیو تکنولوژی سلولی - مولکولی دوره چهارم، شماره پانزدهم، تابستان 1393، بررسی... Pulmonata گروهی از شکم پایان دریازی هستند که با توانایی تعداد 5_4 نمونه این نرم تن زگیل دار از منطقه بین جزر و تنفس در معرض هوا شناخته شده اند ، بجای آبشش یک ریه مدی تیس واقع در غرب چابهار ) شکل شماره 1 ( با موقعیت تنفسی دارند ، این گروه خانواده های زیادی از شکم پایان جغرافیایی º 60 و ´ 37 شرقی و º 25 درجه و ´ 22 شمالی خشکی زی ، آب شیرین و دریازی را به خود اختصاص داده جمع اوری گردید . نمونه ها بصورت دستی گرفته شدند و اند )11(. نظریه ای وجود دارد بر این مبنا که �Opisthobran جهت عملیات آزمایشگاهی به آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشگاه chia پارافایلتیک هستند که شاید بدلیل وجود Pulmonata دریانوردی و علوم دریایی چابهار انتقال داده شدند ، و بﻻفاصله باشد ،البته این نظریه هنوز به اثبات نرسیده است. �Pulmon پاهای شکمی جداسازی شدند و در دمای 80- درجه سانتیگراد ata ممکن است یک گروه منوفایلتیک با Opisthobranchia نگه داری شدند )23(. باشد، از طرفیOpisthobranchia یک گروه منوفایلتیک نیست استخراج DNA ، واکنش زنجیره ای پلیمراز و توالی یابی و نمیتواند بعنوان یک تاکسون معتبر پذیرفته شود.آنها در حال در این پژوهش به منظور استخراج DNA از تکه های کوچک حاضر در زیر رده ی Orthogastropoda قرار گرفته اند )24(. جداشده از پاهای شکمی موجود و توسط بافر CTAB 2% قطعات ژنی مورد استفاده در این پژوهش قطعه ژنی CTAB( ,1.4M NaCl , 0.1% β_mercaptooethanol ,20mM 18S rRNA )18S ribosomal RNA( میباشد . 18S rRNA قسمتی از EDTA and 100mM TRIS-HCl pH8 ( به همراه پروتئیناز ژن RNA ریبوزومی است و جز ساختاری RNA ریبوزوم های mercapthonal β_ , K در یک میکروتیوب با هم ترکیب شدند یوکاریوتی سیتوپﻻسمی است و بهمین ترتیب یکی از اجزای ، پس از انکوباسیون و سانتریفیوژ، کلروفرم _ ایزوآمیل الکل اساسی در تمام سلول های یوکاریوتی بشمار میرود. این قطعه )به نسبت 24:1 ( اضافه شد ، بسته به مقدار رسوب DNA ، ژنی هومولوگ 16S rRNA در پروکاریوت ها و میتوکندری آب دیونیزه اضافه شد و DNA استخراجی برای مطالعات بعدی است. توالی ژنی 18S rRNA بطور گسترده ای در تجزیه و در فریزر20_ نگه داری شد )23( . کیفیت DNA استخراج تحلیل های مولکولی مورد استفاده قرار میگیرد. زیرواحد کوچک شده روی ژل آگارز 1% با دستگاه الکتروفورز و کمیت آن هم SSU( 18S rRNA( از ژنهایی است که اغلب در مطالعات با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر مدل RS232C مورد فیلوژنتیکی مورد استفاده قرار میگیرد و همچنین یک مارکر سنجش قرار گرفت . بررسی باند ها ی DNAبا استفاده از مهم در واکنش زنجیره ای پلی مراز( )PCR میباشد)16( .تا دستگاه ژل داک مدلE_BOX_VX2/2M بررسی گردید بحال مطالعات زیادی بر روی توالی های ژنی این گروه از شکم ..در واکنش زنجیره ای پلیمراز بسط و توسعه قسمتی از ژن پایان انجام شده است ، ولی مطالعاتی که بر روی این قطعه ژنی هسته ای 18S rDNA که چیزی با استفاده از آغازگرهای های صورت گرفته است نسبت به قطعه ژنوم میتوکندریایی کمتر Sa)5’_AACCTGGTTGATCCTGCCAGT_3’( 18و 18 است که از ان جمله میتوان Göbbeler و klussmann-kolb در GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC_3_’5( Sb’( بود سال2009 )6(و Shields در سال 20SID( 2009( اشاره کرد. of جنس )15( . هر واکنش زنجیره ای Archiveپلیمراز با استفاده از دستگاه Peronii در اغلب سواحل صخره ای جنوب شرقی ایران پراکنش ترموسایکلر ependorf مدل 5331 انجام شد . در هر واکنش دارد . در این تحقیق گونه ای از این جنس برای اولین بار در 15 نانوگرم DNA استخراج شده در حجمی 50 میکرولیتری ایران مورد آنالیز های مولکولی قرار گرفت و توالی آن با گونه بعنوان نمونه الگو استفاده گردید . در واکنش زنجیره ای پلیمراز Mgcl PCR Buffer x S rRNA های مشابه موجود در بانک ژنی در منطقه ژنی 18 5 میکرولیتر 10 , 6 میکرولیتر 2 مورد مقایسه قرار گرفت . ، 2.5 میکرولیتر dNTP ، و Taq DNA polymerase مورد مواد و روش ها استفاده قرار گرفتند . در سیکل حرارتی داده شده به دستگاه نمونه برداری PCR ، در ابتدا به مدت 4 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی پس از بررسی منطقه و تعیین ایستگاهها در بهمن ماه 1390 گراد قرار گرفت و بدنبال آن در یک سیکل 38 تایی که شامل 31 30 www.SID.ir تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی دوره چهارم، شماره پانردهم، گیﻻن عطاران فریمان و همکاران واسرشتگی در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه میباشد که صحت کار را باﻻ برده و مقایسه را راحت تر میکند . ، اتصال اغازگرها در دمای 5 .56 درجه سانتی گراد به مدت در حقیقت بکار بردن یک یا دو گونه به عنوان out group در 1 دقیقه ،بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت ترسیم درخت، rooting را در درخت انجام می دهد . 2 دقیقه ، و در اخر با دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت جدول شماره 1: گونه های استفاده شده در مطالعه حاضر و 10 دقیقه سیکل حرارتی پایان داده میشود . پس از اطمینان شماره ثبت آنها در بانک ژنی که در آنالیز مولکولی این پژوهش از صحت محصول PCR و تکثیر باندهای مورد نظر، به کمک استفاده شده است. الکتروفورز روی ژل آگارز 1% ، نمونه ها برای تعیین توالی ژن ها شــماره بانــک نام گونه ژنــی به کشور کانادا ارسال گردید و نتایج بدست امده از تعیین توالی Peronia peronii مطالعه حاضر محصوﻻت با استفاده از بسته های نرم افزاری مورد آنالیزهای Peronia peronii HQ659975 فیلوژنتیکی قرار گرفت Peronia cf. peronii HQ659976 Onchidium cf. tumidum HQ659973 Onchidium verrucosum AY427522 Phyllocaulis tuberculosus HQ659987 Onchidella celtica X70211 Marinula filholi HQ659944 Aplysia parvula DQ237959 Aplysia californica AY039804 Sarasinula linguaeformis HQ659989 Smeagol phillipensis FJ917210 Phyllocaulis variegates HQ659988 Vaginulus taunaisii HQ659990 تصویر شماره 1: منطقه نمونه برداری، منطقه نموبرداری در این مطالعه در Parahedyle cryptophthalma AY427518 شکل مشخص شده است . Stylocheilus longicauda DQ237963 )Acteon tornatilis)out group GQ845183 آنالیزهای فیلوژنتیک در ابتدا کروماتوگرام هاي حاصل از تعیین توالي نمونه ها ، با نتایج با بررسی مورفولوژی گونه مورد نظر مشخص گردید که دارای استفاده از نرم افزار BioEdit )7( ویرایش شده سپس توالي هاي بدنی نرم میباشد در حدود 100 میلیمتر طول متوسط دارد و مورد اشاره با استفاده از نرم افزار ClustalX7.0 )11( هم ردیف به رنگ سبز تیره مایل به قهوهای دیده میشوند، سطح پشتی گردیدند. ماتریس داده هاي هم ردیف سازي شده براي هر دو بدن با زگیل هایی )tubercles ( گرد و درشت سبز_خاکستری قطعه مورد نظر DNA مورد نظر به کمک نرم افزارMEGA 5 ) رنگ پوشیده شده است )شکل 3_الف ( ، گونه از نظر ریخت 14(به صورت جداگانه تجزیه و تحلیل SIDمیگردد .