Estudio Del Modelo Aspiculuris Tetraptera
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UNIVERSITAT DE VALÈNCIA FACULTAT DE FARMÀCIA DOCTORADO EN PARASITOLOGÍA HUMANA Y ANIMAL Septiembre 2018 Estudio del modelo Aspiculuris tetraptera – ratón y su aplicación en el desarrollo de una formulación vacunal basada en la proteína recombinante PP2A Anabel Bolado Ortiz Directores: Dra. María Trelis Villanueva Dra. Mª Dolores Bernal Membrilla, Dr. Antonio Osuna Carrillo de Albornoz DEPARTAMENT DE FARMÀCIA I TECNOLOGIA FARMACÈUTICA I PARASITOLOGIA TESIS DOCTORAL Programa de Doctorado en Parasitología Humana y Animal Estudio del modelo A. tetraptera – ratón y su aplicación en el desarrollo de una formulación vacunal basada en la proteína recombinante PP2A por ANABEL BOLADO ORTIZ Directores Dra. María Trelis Villanueva Departament de Farmàcia i Tecnologia Farmacèutica i Parasitologia, Àrea de Parasitologia, Universitat de València Dra. Mª Dolores Bernal Membrilla Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Universitat de València Dr. Antonio Osuna Carrillo de Albornoz Instituto de Biotecnología, Grupo de Bioquímica y Parasitología Molecular, Departamento de Parasitología, Universidad de Granada Valencia, 2018 “Whatever happens, believe in you. Believe in life. Believe in tomorrow. Believe in everything you do.” ‐ Bill Kaulitz AGRADECIMIENTOS Me gustaría agradecer en primer lugar la oportunidad que en su día mi tutora y directora María Trelis, profesora del departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica y Parasitología de la Universitat de València, me brindó, su total confianza en mi trabajo y en persona, y sobretodo agradecerle que me impulsara a meterme en este gran proyecto que ha sido una parte muy importante de mi vida y que como bien me dijo antes de embarcarnos en esto, era una gran oportunidad y aprendería mucho profesionalmente, pero sobre todo aprendería en lo personal, y en eso no he podido tener mejor referencia, me ha enseñado a parte de técnicas, a superarme, a aprender de otros, a luchar por lo que uno quiere pase lo que pase. Estoy muy segura de que sin ti y sin tus ánimos no hubiese visto el final del túnel. De la misma forma quiero agradecer a mi directora Mª Dolores Bernal del departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universitat de València, su esfuerzo y mucha, mucha dedicación, además de enseñarme a ser autosuficiente y perfeccionista, su otra perspectiva de las cosas me ha abierto los ojos en miles de ocasiones y su forma de trabajar tan rigurosa, me ha enseñado con las cosas si quieres que salgan bien se hacen con dedicación, planificación y cariño. A mi director Antonio Osuna del Instituto de Biotecnología de la Universidad de Granada, haber compartido toda su sabiduría, todas las respuestas cuando no sabíamos por seguir y ser el que creía que cada resultado, aunque fuese negativo, abría un abanico de posibilidades. A otros profesores de la Universitat de València, Antonio Marcilla, Marius Fuente y Mª Teresa Puchades, de los que he aprendido una pasión por esta área que puede con todo y sobretodo, que todo se sobrepone con buen humor. También por su apoyo y la confianza de saber que podría contar con ellos ante cualquier problema. Gracias al Departamento de Farmacia, Tecnología Farmacéutica y Parasitología en el que se encuentra integrado el Doctorado de Parasitología humana y animal, por la oportunidad de realizar mi Tesis en él y abrirme un abanico de posibilidades. Asimismo, a la Universitat de València, en la que comencé mis estudios superiores y siempre me ha ofrecido diferentes opciones para el futuro. No podía olvidarme de Silvia Taroncher, empezamos el Máster juntas y en este largo recorrido hemos caminado a la par, nos hemos apoyado, hemos superado grandes retos juntas, todo lo que se venía se hacía más fácil sabiendo que lo podíamos hablar y entre las dos encontrar solución. También hay gente ajena a todo esto que me ha animado desde fuera, sería imposible nombrarlos a todos, pero me gustaría mencionar a Patri, Paula y Sara, han sabido no preguntar cuando no debían, han comprendido mis nervios y han escuchado todos los problemas, pero también se han alegrado de mis logros. En especial, a Melo, me has apoyado desde el segundo 0, tú también te has sacrificado para que yo pudiese terminar, y jamás podré agradecerte el apoyo que me has ofrecido, que ni tú creo has sido consciente, mi más sentido gracias. Quería dejar para el final a mi familia, porque ellos son el principio y el final, porque no podría acabar de escribir todo lo agradecida que estoy a mi madre y a mi hermano lo que han hecho por mí. A mi hermano, que siempre ha sido todo, siempre está detrás para que no me caiga y aquí me ha hecho seguir mi sueño, si yo he flaqueado me ha animado, si he dudado ha razonado conmigo, he caminado mucho detrás de su bolsillo, del bolsillo que siempre me ha protegido. A mi madre, aunque no haya comprendido tantas cosas nunca ha dudado de mí y de que podía conseguirlo, pero no lo hubiese conseguido si ella no hubiese creído en mí y sobre todo si ella no me hubiese dejado tomar mis decisiones, me haya dejado caer y me haya ayudado levantarme, soy lo que soy, y esto es lo que es por ella. No podía olvidarme de mi padre, que, aunque hace mucho que no está aquí, su duro trabajo y su lucha hasta el final me son de inspiración cada día, dio hasta el último aliento por mí y yo a cambio, le quiero brindar mis pequeños logros, para que allá donde esté sonría al ver donde he llegado. RESUMEN ANABEL BOLADO ORTIZ, 2018.‐ ESTUDIO DEL MODELO Aspiculuris tetraptera – RATÓN Y SU APLICACIÓN EN EL DESARROLLO DE UNA FORMULACIÓN VACUNAL BASADA EN LA PROTEÍNA RECOMBINANTE PP2A. TESIS DOCTORAL (DIRS. DRA. Mª TRELIS VILLANUEVA, DRA. Mª DOLORES BERNAL MEMBRILLA Y DR. ANTONIO OSUNA CARRILLO DE ALBORNOZ), FACULTAT DE FARMÀCIA, UNIVERSITAT DE VALÈNCIA, VALENCIA. Las helmintiasis afectan a más de 1.500 millones de personas en todo el mundo, causando una gran morbilidad y asociándose a importantes tasas de discapacidad. En ganadería, se estiman pérdidas de productividad de unos 1.200 millones de euros al año, a los que hay que sumar los gastos en tratamientos antiparasitarios que rondan los 1.000 millones de euros anuales. En los animales cursan con problemas gastrointestinales, causando pérdidas de peso, retraso en el crecimiento y baja reproductibilidad. En la presente Tesis Doctoral se ha establecido un modelo experimental para el estudio de las nematodosis técnicamente fácil y reproducible. Para ello, se han puesto a punto las condiciones óptimas de infección con el modelo experimental Aspiculuris tetraptera‐ratón (CD1), que han resultado en una dosis infectante de 2 hembras grávidas y un tiempo de infección inferior a 30 días para evitar infecciones secundarias consiguiendo infecciones controladas. En este modelo se ha caracterizado la respuesta inmunitaria, tanto a nivel local como sistémico, generada en el hospedador. Se han analizado los niveles de inmunoglobulinas, el recuento leucocitario, los cambios histológicos en la mucosa de colon y los perfiles de expresión de citoquinas en órganos y tejidos inmunoactivos (bazo, nódulo linfático mesentérico y placas de Peyer). La infección controlada del ratón se acompaña de elevadas IgM e IgG específicas en suero e IgA en mucosa. Todo ello acompañado por sobreproducción de quimioquinas atrayentes de neutrófilos y macrófagos en mucosa, y una respuesta inflamatoria Th17 inicial que facilita el establecimiento del parasitismo, y que deriva en una respuesta Th9 local promovida por la IL‐25 producida en respuesta a la infección. Como un primer abordaje en el estudio de la prevención de las nematodosis se ha empleado este modelo en ensayos de vacunación con la proteína recombinante PP2A, formulada con distintos adyuvantes (mucoadhesivos como carboximetilcelulosa o Plurónic, paredes bacterianas, polietilenimina y ácido oleico) y utilizando distintas vías de administración. La vacuna constituida por el péptido PP2Ar con carboximetilcelulosa y paredes bacterianas como coadyuvantes (FV‐CMC), administrada vía intranasal, proporcionó los mejores valores de eficacia (tasa de protección) y seguridad (efectos adversos), así como un mayor efecto inmunomodulador protector, por lo que es una buena candidata para ensayos de inmunización frente a nematodosis. PALABRAS CLAVE: Nematoda, Aspiculuris, ratón, proteína recombinante, vacunación, PP2Ar, Carboximetilcelulosa, Plurónic, Polietilenimina, Vinil‐Sulfona. LISTADO DE ABREVIATURAS, SIGLAS Y ACRÓNIMOS APC: Célula Presentadora de Antígenos BSA: albúmina de Suero Bovino CMC: Carboximetilcelulosa d.p.i.: días post‐inmunización d.p.inf.: días post infección d.p.r.: días post‐reto EDTA: ácido etilendiaminotetraacético FITC: isotiocianato de fluoresceína GAM: anticuerpo cabra anti‐ratón HE: tinción hematoxilina‐eosina IFN: interferón Ig: inmunoglobulina IL: interleuquina KO: knock‐out NK: “natural killer” o citocina natural NLM: nódulo linfático mesentérico OVA: ovoalbúmina PAS: Ácido Peryódico de Schiff PBS: tampón fosfato salino PBS‐T: tampón fosfato salino con Tween PCR: reacción en cadena de la polimerasa PEI: polietilenimina PLU: Plurónic PP: placas de Peyer PP2Ar: PP2A recombinante PSTP: proteína serin/treonin fosfastasa RT‐qPCR: reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real semicuantitativa TfH: células T auxiliares foliculares TGF: factor de crecimiento transformante Th: linfocitos T cooperadores Th1: linfocitos T cooperadores de tipo 1 Th17: linfocitos T cooperadores de tipo 17 Th2: linfocitos T cooperadores de tipo 2 Th22: linfocitos T cooperadores de tipo 22 ThGM: linfocitos T cooperadores