Phytochemische Untersuchungen von zwei Heilpflanzen Zentralamerikas sowie pharmakologisch‐biologische Untersuchungen von Naturstoffen mit AP‐1, MMPs und Humaner Neutrophiler Elastase als molekulare Targets

Inaugural‐Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der Albert‐Ludwigs‐Universität Freiburg im Breisgau

vorgelegt von

Andrea Hrenn aus Giengen (Brenz)

Juni 2008

Dekan: Prof. Dr. A. Bechthold Leiterin der Arbeit: Prof. Dr. I. Merfort Referentin: Prof. Dr. I. Merfort Korreferent: Prof. Dr. A. Bechthold Drittprüfer: Prof. Dr. R. Schubert

Tag der Verkündigung des Prüfungsergebnisses: 03.07.2008

Teile dieser Arbeit wurden in folgenden Publikationen und Posterpräsentationen veröffentlicht:

Publikationen

Hrenn A., Steinbrecher T., Labahn A., Schwager J., Schempp C.M. and Merfort I., Plant phenolics inhibit neutrophil elastase, Planta Medica 72 (12): 1127‐1131 (2006).

Lindenmeyer M.T., Hrenn A., Kern C., Castro V., Murillo R., Müller S., Laufer S., Schulte‐ Mönting J., Siedle B. and Merfort I., Sesquiterpene lactones as inhibitors of IL‐8 expression in HeLa cells, Bioorganic & Medicinal Chemistry 14 (8): 2487‐2497 (2006).

Siedle B., Hrenn A. and Merfort I., Natural compounds as inhibitors of human neutrophil elastase, Planta Medica 73 (5): 401‐420 (2007).

Steinbrecher T.*, Hrenn A.*, Dormann K.L., Merfort I. and Labahn A., Bornyl (3,4,5‐ trihydroxy)‐cinnamate ‐ an optimized human neutrophil elastase inhibitor designed by free energy calculations, Bioorganic & Medicinal Chemistry 16 (5): 2385‐2390 (2008). *These authors contributed equally to this work.

Jäger C., Hrenn A., Zwingmann J., Suter A. and Merfort I., Sesquiterpene lactones from Arnica montana inhibit the transcription factors AP‐1 (activator protein‐1) and NF‐κB (nuclear factor‐kappaB) and modulate the activity of MMP1 and MMP13 manuscript in preparation Kurzvorträge

Hrenn A., Altevogt D., Interdisziplinäre Zusammenarbeit zwischen Biologie und Chemie: NF‐kappaB und FRET Promovierendenseminar der Pharmazie, Juni 2007, Freiburg, Deutschland

Posterpräsentationen

Hrenn A., Labahn A., Steinbrecher T., Schwager J., Merfort I., Studies on natural phenolics as inhibitors of elastase Annual Congress of the Society for Medicinal Plant Research, Firenze, Italien, August 2005

Steinbrecher T.*, Hrenn A.*, Merfort I., Dormann K.L., Labahn A., A new human neutrophil elastase inhibitor designed by free energy calculations Bunsentagung, Graz, Österreich, Mai 2007 (*These authors contributed equally to this work.)

Steinbrecher T.*, Hrenn A.*, Dormann K.L., Labahn A., Merfort I., Bornyl (3,4,5‐trihydroxy)‐ cinnamate ‐ an optimized human neutrophil elastase inhibitor designed by free energy calculations Irseer Naturstofftage der DECHEMA e.V., Irsee (Allgäu), Deutschland, Februar 2008 (*These authors contributed equally to this work.)

Meinen Eltern

Probleme kann man niemals mit derselben Denkweise lösen, durch die sie entstanden sind. Albert Einstein

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

A. Einleitung ...... 1

1. Phytochemische Untersuchungen ...... 2 1.1. Hieronyma alchorneoides Fr. Allemão ...... 2 1.2. Siparuna thecaphora (Poepp. et Endl.) A. DC...... 5 2. Pharmakologisch‐biologische und molekularbiologische Untersuchungen ...... 10 2.1. Inhibition von Transkriptionsfaktoren (AP‐1, NF‐κB) ...... 10 2.2. Matrixmetalloproteinasen (MMPs)...... 12 2.3. Untersuchungen zur Elastase‐Hemmung ...... 13 3. Ziele dieser Arbeit ...... 15

B. Literaturteil ...... 17

1. Definition, Einteilung und Strukturen ...... 17 2. Anwendungsgebiete ...... 20 2.1. Wundheilung ...... 20 2.1.1. Studien am Menschen ...... 20 2.1.2. Studien im Tiermodell und möglicher Mechanismus ...... 21 2.1.3. Versorgung von Brandwunden ...... 23 2.2. Adstringierende Wirkung ...... 25 2.3. Antibakterielle, antivirale und antifungale Effekte ...... 25 2.3.1. Antibakterielle Aktivität ...... 26 2.3.2. Antivirale Aktivität ...... 27 2.3.3. Antifungale Aktivität ...... 28 2.3.4. Möglicher Mechanismus ...... 28 2.4. Wirkung bei Hautschädigung durch UV‐Strahlung...... 29 2.4.1. Studien am Menschen oder ex‐vivo ...... 30 2.4.2. Studien im Tiermodell ...... 31 2.4.3. Möglicher Mechanismus ...... 32 2.5. Hauttumore ...... 34 2.5.1. Studien ...... 34 2.5.2. Möglicher Mechanismus ...... 36

II Inhaltsverzeichnis

2.6. Weitere Anwendungsgebiete ...... 39 2.6.1. Atopische Dermatitis und Psoriasis ...... 39 2.6.2. Tannolact® (Firma Galderma) als Beispiel für ein etabliertes Fertigarzneimittel ...... 41 2.6.3. Therapie von Feigwarzen ...... 42 2.6.4. Sonstige Gebiete ...... 43 3. Bioverfügbarkeit, Metabolisierung ...... 44 4. Zusammenfassung ...... 46

C. Ergebnisse ...... 49

1. Phytochemische Untersuchungen traditioneller Arznei‐ pflanzen Costa Ricas ...... 49 1.1. Auswahl der Pflanzenextrakte im EMSA ...... 49 1.2. Hieronyma alchorneoides Fr. Allem...... 50 1.2.1. Extraktauftrennung durch Säulenchromatographie und Untersuchung der erhaltenen Fraktionen auf Hemmaktivität im NF‐κB‐EMSA ...... 50 1.2.2. Strukturaufklärung von 7, 4‘‘‐O‐Dimethylamentoflavon (H.1) ...... 50 1.2.3. Strukturaufklärung von 7‐O‐Monomethylamentoflavon (H.2) ...... 60 1.2.4. Strukturaufklärung von Amentoflavon (H.3) ...... 69 1.2.5. Untersuchung der biologischen Wirkungen der Biflavonoide ...... 79 1.2.5.1. NF‐κB‐EMSA 79 1.2.5.2. Luciferase‐Reportergen‐Assay 80 1.2.6. Isolierung und Strukturaufklärung von (+)‐Catechin (H.4) ...... 81 1.3. Siparuna thecaphora (Poepp. et Endl.) A. DC...... 89 1.3.1. Extraktauftrennung ...... 89 1.3.2. Untersuchung der Aktivität der erhaltenen Fraktionen im NF‐κB‐EMSA ...... 89 1.3.3. Weitere biologisch kontrollierte Auftrennung der Unterfraktion S.t.3 mittels Säulenchromatographie und MTT‐Test ...... 89 1.3.4. Detektion einer Dragendorff‐positiven Substanz ...... 90 1.3.5. Strukturaufklärung von 3, 7, 4‘‐Trimethylkämpferol (S.1) ...... 91 1.3.6. Isolierung und Strukturaufklärung von Aristolactam AIIIa (S.2) ...... 95 2. Pharmakologisch‐biologische Untersuchungen ...... 105 2.1. Inhibition des Transkriptionsfaktors AP‐1 ...... 105 2.1.1. Untersuchung der Hemmkonzentrationen von Sesquiterpenlactonen bei PMA‐Stimulierung in HeLa229‐Zellen sowie in Jurkat‐T‐Zellen ...... 105 Inhaltsverzeichnis III

2.1.2. Untersuchung der Hemmkonzentrationen von isolierten Sesquiterpen‐ lactonen aus A. montana in Jurkat‐T‐Zellen nach IL‐1β‐Stimulierung ...... 112 2.1.3. Untersuchung von Arnikazubereitungen aus Drogen verschiedener Herkunft ...... 113 2.2. Inhibition der Expression von MMP1 und MMP13 ...... 117 2.2.1. Testung von Arnikazubereitungen in bovinen Chondrocyten ...... 117 2.2.2. Testung von Arnikazubereitungen in humanen Chondrocyten ...... 119 2.3. Elastase aus Neutrophilen Granulocyten als Target zur Untersuchung auf antiphlogistische Aktivität ...... 121 2.3.1. Testung der Elastase aus Neutrophilen ...... 121 2.3.1.1. Untersuchung auf direkte Hemmung 122 2.3.1.2. Untersuchung auf Hemmung der Elastase‐Freisetzung 123 2.3.2. Dockingexperimente ...... 124 2.3.3. Naturstoffe als Leitstruktur ‐ Hemmung des isolierten Enzyms mit voraus‐ gesagter Substanz (Bornyl‐3,4,5‐trihydroxycinnamat) ...... 126

D. Zusammenfassung ...... 131

E. Diskussion ...... 135

1. Phytochemische Untersuchungen ...... 135 2. Pharmakologisch‐biologische Untersuchungen ...... 142

F. Experimenteller Teil ...... 153

1. Materialien ...... 153 1.1. Chemikalien ...... 153 1.2. Cytokine, Primer, Enzyme, Kits ...... 155 1.3. Computerprogramme ...... 155 1.4. Herkunft des untersuchten Pflanzenmaterials ...... 155 1.5. Verbrauchsmaterialien ...... 156 1.6. Geräte ...... 157 2. Methoden ...... 159 2.1. Chromatographische und spektroskopische Verfahren ...... 159 2.1.1. Säulenchromatographie (SC) ...... 159 2.1.2. Niederdruckflüssigkeitschromatographie (Lobar) ...... 160 2.1.3. Dünnschichtchromatographie (DC) ...... 161 IV Inhaltsverzeichnis

2.1.4. Massenspektrometrie ...... 162 2.1.5. NMR‐Spektroskopie ...... 163 2.1.6. UV‐Spektroskopie ...... 163 3. Extraktgewinnung und biologisch‐kontrollierte Fraktionierung des Extrakts von Hieronyma alchorneoides ...... 164 3.1. Extraktherstellung und Aufarbeitung ...... 164 3.2. Isolierung der Biflavonoide H.1 bis H.3 ...... 169 3.3. Isolierung von Catechin (H.4) ...... 169 3.4. Strukturaufklärung und Eigenschaften der isolierten Verbindungen H.1 bis H.4 ...... 170 4. Fraktionierung eines Extraktes von Siparuna thecaphora ...... 172 4.1. Extraktherstellung und biologisch‐kontrollierte Aufarbeitung ...... 172 4.1.1. Auftrennung der Fraktion S.t.3 ...... 174 4.2. Isolierung von Kämpferol‐3,7,4’‐trimethylether (S.1) ...... 183 4.3. Identifizierung von Kämpferol‐3,7,4’‐trimethylether (S.1) ...... 183 4.4. Isolierung von Aristolactam AIIIa (S.2) ...... 183 4.5. Identifizierung von Aristolactam AIIIa (S.2) ...... 184 5. Biologische Untersuchungsmethoden ...... 185 5.1. Zellkulturen ...... 185 5.1.1. Kultivierung von primären Zellen ...... 186 5.1.2. Kultivierung von Suspensionszellen ...... 187 5.1.3. Kultivierung von adhärenten Zellen (HeLa229, NLZ‐9) ...... 188 5.1.4. Auftauen und Einfrieren der Zellen ...... 189 5.2. Herstellung von Proteinextrakten ...... 189 5.2.1. Kernextraktprotokoll für Jurkat‐T‐Zellen ...... 190 5.2.2. Kernextraktprotokoll für HeLa229‐Zellen ...... 191 5.2.3. Herstellung von Gesamt‐Proteinextrakten aus Jurkat‐T‐Zellen ...... 191 5.2.4. Bestimmung der Proteinkonzentration ...... 192 5.3. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) ...... 192 5.3.1. Herstellung der DNA‐Sonden ...... 193 5.3.2. Radioaktive Markierung der DNA ...... 193 5.3.3. Elektrophorese ...... 194 5.3.4. Bindungsreaktion mit AP‐1 ...... 194 5.3.5. Bindungsreaktion mit NF‐κB ...... 196 Inhaltsverzeichnis V

5.3.6. Competition Assay ...... 196 5.4. Untersuchungen von Testsubstanzen im NF‐κB‐ und AP‐1‐EMSA sowie mittels quantitativer real‐time PCR ...... 196 5.5. Untersuchungen zur Cytotoxizität im MTT‐Test ...... 199 5.6. Herstellung von RNA‐Extrakten ...... 200 5.6.1. RNA‐Extraktion mit dem RNeasy Mini‐Kit von Qiagen ...... 200 5.6.2. Bestimmung der Nukleinsäure‐Konzentration ...... 202 5.6.3. Reinheitskontrolle mit dem Agilent Bioanalyzer ...... 203 5.7. Quantitative real‐time RT‐PCR (qRT‐PCR) ...... 205 5.7.1. cDNA‐Synthese ...... 205 5.7.2. LightCycler®‐Analyse ...... 206 5.8. Elastase‐Assay ...... 211 5.8.1. Isolierung der Neutrophilen Granulocyten ...... 211 5.8.2. Bestimmung der Elastase‐Hemmung mit isolierter Elastase (direkte Hemmung) ...... 212 5.8.3. Hemmung der Elastase‐Freisetzung ...... 214 5.8.4. Hemmung des isolierten Enzyms ...... 215 5.9. Luciferase‐Reportergen‐Assay ...... 217 5.9.1. Luciferase‐Reportergen‐Assay ...... 218 5.9.2. Hemmung reiner Luciferase ...... 219

G. Literatur ...... 221

H. Anhang ...... 239

Einleitung 1

A. Einleitung

Der tropische Regenwald liefert einen unvorstellbaren Reichtum an Arten, aus denen Substanzen verschiedenster Stoffklassen isoliert werden können. Die Suche nach neuen Verbindungen als arzneiliche Wirkstoffe oder neuen Heilpflanzen kann sich an traditionell medizinisch eingesetzten Pflanzen orientieren. Die pharmakologischen und phytochemischen Untersuchungen von diesen bekannten Pflanzen führen zu neuen Wirkstoffen oder Leitstrukturen. Schätzungen geben an, dass von den Wirkstoffen, die in den letzten 20 Jahren auf den Markt kamen, ca. 30 % Naturstoffe oder Naturstoffderivate waren, und die Anzahl derer, die sich an Naturstoffen orientiert haben, noch deutlich höher liegt (Dobson 2004; Newman et al. 2007). Bei der Suche nach neuen Wirkstoffen werden häufig große Datenbanken durchsucht; es hat sich jedoch gezeigt, dass Naturstoffdatenbanken im Vergleich zu Datenbanken, die nur synthetisch gewonnene Stoffe beinhalten, eine größere Anzahl Treffer gegenüber biologischen Targets erbringen. Die strukturelle Vielfalt, sei es an chiralen Zentren, an Ringsystemen oder anderen Strukturelementen, ist bei Naturstoffen deutlich größer (Dobson 2004; Newman et al. 2007). Leider ist der Aufwand für die chemische Totalsynthese solcher Naturstoffe immer noch sehr groß bzw. manche Strukturelemente sind synthetisch fast unzugänglich. Durch diese Strukturelemente sind die Interaktionsmöglichkeiten mit biologischen Systemen jedoch vielfältiger und die Wirkung ist möglicherweise effektiver, da die Substanzen besser zu ihren Zielstrukturen passen. Zusätzlich kann das Wechselwirkungspotential bei Substanzen, die sich in einem Organismus gebildet haben, geringer sein als bei Substanzen, die synthetisiert wurden und biologische Systeme nie als Umfeld hatten. Die große Vielfalt an Strukturvarianten innerhalb der einzelnen Substanzklassen der Naturstoffe erlaubt neben der direkten Wirkstoffsuche eine weitergehende Untersuchung von Struktur‐Wirkungs‐Beziehungen. Ein weiterer wichtiger Punkt, der für die Untersuchung von traditionell verwendeten Heilpflanzen spricht, ist der, dass durch die Klärung der Wirkstoff‐Frage und durch die Aufklärung des molekularen Wirkmechanismus deren Einsatz auf eine wissenschaftliche Basis gestellt und dadurch ihr Stellenwert gestärkt wird.

2 Einleitung

1. Phytochemische Untersuchungen

1.1. Hieronyma alchorneoides Fr. Allemão

Zu den Heilpflanzen, die in der traditionellen Medizin Zentralamerikas bekannt sind, gehört auch Hieronyma alchorneoides. Für den traditionellen Einsatz liegt eine Beschreibung der Anwendung eines Rindendekokts bei Husten vor (Tinto et al. 1991). Hieronyma alchorneoides Fr. Allemão gehört zur Familie der Euphorbiaceae (Wolfsmilchgewächse). Es existieren verschiedene Schreibweisen für den Genus dieser Pflanze, unter anderem auch Hyeronima, wobei sich A. Radcliffe‐Smith für die konservierte Schreibweise Hieronyma ausspricht (Radcliffe‐Smith 1994). Er begründet dies zum einen mit der Überschrift der ursprünglichen Bildtafel, zum anderen mit der griechischen Herkunft dieses Wortes („hieros“ und „onyma“). Professor Francisco Freire Allemão e Cysneiro hat diesen Namen 1848 zum ersten Mal veröffentlicht. Der Name wurde ausgewählt, um Jeronimo Serpa, einen brasilianischen Botaniker, zu ehren. „Jeronimo“ ist die iberische Form des lateinischen „Hieronymus“. Die gewählte Schreibweise existiert auch beispielsweise für Hieronymus Bock (Botaniker) oder Hieronymus Bosch (Maler) (Radcliffe‐Smith 1994). Manuel Solís Corrales und Róger Moya Roque verwenden ebenfalls diese Nomenklatur (Corrales et al. 2003). H. alchorneoides kommt in Brasilien entlang des an der Küste gelegenen Regenwaldes vor. Brasilianische Namen der Pflanze sind „margonçalo“ oder „lucurana“ (Kuroshima et al. 2005; Lorenzi 1998). Das Verbreitungsgebiet reicht von Mexiko über Zentralamerika bis nach Südamerika und erstreckt sich vom Meeresspiegel bis auf eine Höhe von ca. 900 m. In Costa Rica kommt dieser Baum in der Nördlichen und der Atlantischen Zone sowie im Süden vor. Die untersuchte Art gehört zur Unterfamilie Phyllanthoideae und darin zum Tribus Antidesmeae, Subtribus Antidesminae. Der Genus Hieronyma umfasst ca. 20 bis 30 Arten in Amerika (Buske et al. 2002).

H. alchorneoides ist ein Baum, dessen Holz aufgrund der Härte und der schönen rötlich‐ kastanienbraunen Färbung forstwirtschaftlich genutzt wird und der daher reichlich vorkommt bzw. auch wieder aufgeforstet wird. Er wächst auf feuchten, sauren, sandigen oder lehmigen Böden. Die jährliche Regenmenge sollte 3500 bis 5000 mm und die Temperatur 24 bis 30 °C betragen (Flores 2002). Als immergrüner Baum kann er eine Höhe von 24 bis 50 m erreichen. Der Durchmesser kann 120 bis 150 cm betragen (DBH (Durchmesser auf Brusthöhe)). Der Stamm ist gerade und im unteren Drittel wachsen häufig Einleitung 3 dicke Wurzeln zur Stabilisierung heraus. Die Baumkrone ist sehr ausladend, das Blattwerk ist meistens auf die äußeren Zweige beschränkt. Die Laubblätter sind ungeteilt und wechselständig bzw. spiralig an den Zweigspitzen angeordnet. Der Blattstiel ist gefurcht, 3 bis 6 cm lang, mit einer charakteristischen Krümmung vor der Blattspreite. Die Blätter erscheinen teilweise zweifarbig aufgrund eines bräunlichen Flaums auf der Oberfläche. Die Blattspreite ist elliptisch oder breit eiförmig mit einer markanten, fiedernervigen Blattaderung. Die sekundären Blattadern verlaufen parallel und etwa im gleichen Abstand zum Blattrand. Die Blattspitze ist rund, stumpf oder tropfenförmig auslaufend (siehe Abbildung A.1). Die Blattgröße variiert zwischen 13‐22 cm in der Länge und 6‐11 cm in der Breite. Alte Blätter verfärben sich rot, bevor sie abfallen.

Abbildung A.1: Zweig mit männlichen Blüten (links) und Früchte (rechts) von Hieronyma alchorneoides Fr. Allemão (Quellen: http://striweb.si.edu/ctfs/webatlas/plant.photos/, http://pick4.pick.uga.edu/mp/20 p?see=I_SP1728)

H. alchorneoides ist diözisch. Die männlichen und weiblichen Blüten sitzen auf verzweigten Rispen, die aus den Blattachseln entspringen und bis zu 7 cm lang werden können. Die Blüten sind im Durchmesser ca. 2 mm groß, grünlich bis gelblich und ohne Kronblätter. Die männlichen Blüten enthalten wenige kurze Staubblätter. Die weiblichen Blüten besitzen einen kurzen Stiel und 2 Fruchtblätter, außerdem gibt es verkümmerte Staubblatt‐ Anhängsel. Blütezeit ist zweimal im Jahr. Die männlichen Blüten sind dabei sehr lange zu 4 Einleitung sehen, meistens von August bis Ende November und von Februar bis April. Die weiblichen Bäume blühen nur im späten September bis Oktober und im späten Februar. Früchte entstehen direkt nach der weiblichen Blüte. Jede Blütenrispe trägt dann ein paar Dutzend kleine (3 bis 5 mm), kugelförmige Steinfrüchte, die sich beim Reifen von grün nach dunkel‐ weinrot verfärben (siehe Abbildung A.1). Jede Frucht enthält einen einzigen, weißen Samen. Für die Keimung ist eine ausreichende Verfügbarkeit von Licht wichtig. Die Blüten werden von Insekten wie Bienen, Wespen und anderen bestäubt. Die Früchte sind bei Vögeln und Affen sehr beliebt (Quellen: http://www.cds.ed.cr/teachers/harmon/ page51.html, (Flores 2002)).

Synonyme Bezeichnungen für H. alchorneoides sind Hyeronima caribaea Urban, H. chocoensis Cuatrec., H. ferruginea Tul., H. heterotrichia Pax & Hoffm., H. mattogrossensis Pax & Hoffm., H. mollis Muell. Arg. und H. ovatifolia Lu sowie die Trivialnamen pilón, muira‐ gonçalo, bully tree, suradan, zapatero und nancitón (http://www.worldagroforestry.org/sea /Products/AFDbases/wd/asps/DisplayDetail.asp?SpecID=1822).

Bisher gibt es nur wenige phytochemische Untersuchungen dieser Pflanze, die zur Isolierung von Alkaloiden wie Hyeronimon und Antidesmonderivaten, von Aquilegiolid (ein Butenolid) sowie von Lupeol, Stigmasterol und β‐Sitosterol geführt haben (Buske et al. 2002; Tinto et al. 1991). Die Strukturformeln sind in Abbildung A.2 gezeigt. Das Holz enthält Gerbstoffe, daher schmeckt es bitter. Für die Spezies Hieronyma oblonga wurden zudem weitere Alkaloide identifiziert (Alves et al. 1999). Im Rahmen einer pharmakologischen Studie wurde ein Extrakt aus Blättern von H. alchorneoides analysiert. Fraktionen des Extrakts sowie isolierte Inhaltsstoffe wurden auf ihre analgetische Wirkung in unterschiedlichen Tests an Mäusen untersucht. Als Wirkstoff mit antinocizeptiven Eigenschaften wurde das Triterpen Simiarenol identifiziert. Eine Analyse des weiteren Inhaltsstoffspektrums bestätigte das Vorkommen von β‐Sitosterol, außerdem wurde Amentoflavon (siehe Abbildung A.2) isoliert (Kuroshima et al. 2005). Bisher sind keine weiteren Untersuchungen auf antiinflammatorische Wirkungen oder weitere biologisch‐aktive Inhaltsstoffe dokumentiert worden. Einleitung 5

R H N O HO O O Aquilegiolid O (CH2)n H

Rn

17, 18‐bis‐nor‐Antidesmon O 4

18‐nor‐Antidesmon O 5 HO Antidesmon O 6 β‐Sitosterol 8‐Dihydroantidesmon α‐H, β‐OH 6 (Hyeronimon)

OH H H H

HO

OH Simiarenol O HO O O H HO OH OH O H Amentoflavon H HO H

Lupeol

Abbildung A.2: Strukturen der bisher aus Hieronyma alchorneoides isolierten Verbindungen.

1.2. Siparuna thecaphora (Poepp. et Endl.) A. DC.

Eine weitere Pflanze Zentralamerikas, die in der traditionellen Medizin beispielsweise bei fiebrigen Erkrankungen angewendet wird, ist Siparuna thecaphora. Die Gattung Siparuna wird in die Familie Siparunaceae eingeordnet (Renner et al. 2005). Man findet aber auch die ältere Einordnung in die Familie der Monimiaceae (Leitao et al. 1999). Die Familie der Monimiaceae gehört zur Ordnung der Laurales sensu Dahlgren und umfasst ca. 34 Gattungen, von denen 5 in Brasilien vorkommen, und ca. 440 Arten. Die Familie der Siparunaceae, die ebenfalls zu den Laurales gehört, umfasst 2 Gattungen, Glossocalyx (Vorkommen hauptsächlich in Westafrika) und Siparuna (Ciccio et al. 2002). Inzwischen umfasst die Gattung Siparuna 150 Arten, damit ist sie die größte Gattung ihrer 6 Einleitung

Familie. Es sind Arten, die ursprünglich in Zentral‐Amerika beheimatet waren, mittlerweile aber in der Südlichen Hemisphäre verteilt sind und vor allem in tropischen und subtropischen Gebieten vorkommen. Es handelt sich um kleine Sträucher, die 1 bis 12 m hoch werden können. Selten kommen bis zu 20 m hohe Bäume vor. Die Rinde ist pink bis dunkelrot gefärbt (Leitao et al. 1999).

Zum ersten Mal wurde S. thecaphora 1838 von Eduard Friedrich Poeppig und Stephan Ladislaus Endlicher beschrieben, allerdings als Citrosma thecaphora. Siparuna thecaphora (Poepp. et Endl.) A. DC. (nach Alphonse Louis Pierre Pyrame de Candolle) ist die heute gültige Bezeichnung (Ciccio et al. 2002). In den folgenden Jahrzehnten gab es immer wieder Verwirrungen wegen der Bezeichnung von Arten, die sich als identisch herausstellten. Dazu trägt auch eine große Variabilität in der Morphologie bei. S. gilgiana, S. andina und S. nicaraguensis sind Synonyme (Renner et al. 2005). Die Pflanze trägt den Trivialnamen „limoncillo“, außerdem, je nach der in der jeweiligen Region von den indigenen Völkern gesprochenen Sprache, die folgenden Namen: "puban cura", "bu wann cura" (Colorado, eine Sprache aus Ecuador); "hija de raposa", "guayusa" (Spanisch); "huaira panga", "malagri panga", "raposa panga", "asna panga" (Quichua oder Kichwa, gesprochen in Ecuador, Kolumbien, Peru); "nataquére" (Secoya); "cocotsena" (Cofán); "nonangonca", "nononcagui", "nemocago", "veñañabo" (Waorani) (http://www.umsl.edu/~renners/ siparuna/book.html). Das Verbreitungsgebiet reicht in Costa Rica von der Pazifischen bis zur Karibischen Küste und erstreckt sich vom Meeresspiegel bis auf eine Höhe von 2000 m. Allgemein kommt S. thecaphora vom südlichen Mexiko über Zentralamerika bis Brasilien oder Bolivien vor (Ciccio et al. 2002).

S. thecaphora ist ein immergrüner, diözischer Strauch oder kleiner Baum, der 3 bis 7 m hoch werden kann. Der Durchmesser auf Brusthöhe (DBH) beträgt bis zu 10 cm. Die langen, dünnen Zweige hängen teilweise über andere Pflanzen. Die jüngeren Zweige sind länglich‐ rund, mit einfachen Haaren. Die Blätter sind gegenständig oder in Dreiergruppen als Wirtel angeordnet und der Blattstiel ist 0,7 bis 3,5 (bis 5) cm lang. Das Blatt ist länglich, lanzettlich oder elliptisch, mit einer Größe von 8‐25 cm und einer Breite von 5‐8 cm. Die Spitze läuft scharf aus. Beide Oberflächen sind mit winzigen einfachen oder Sternhaaren besetzt. Ältere Einleitung 7

Blätter sind oben kahl und weisen 6‐12 Paare an sekundären Nerven auf, der Blattrand ist fein gezähnt (siehe Abbildung A.3).

Abbildung A.3: Zweig mit Früchten von Siparuna thecaphora (Poepp. et Endl) A. DC. (Quelle: mod. nach http://striweb.si.edu/ctfs/webatlas/plant.photos/).

Der Blütenstand ist 1 bis 5,5 cm lang, trägt 10 bis 20 Blüten und weist winzige, angepresste Sternhaare auf. Männliche Blüten haben zur Blütezeit einen Durchmesser von 1,5 bis 2,5 mm, die Tepalen bilden einen wellenförmigen Kranz, der kahl und gelb, cremefarben bis orange‐rot gefärbt ist. Sie enthalten 2 bis 5 Staubblätter. Die weibliche Blüte ist gleich groß, mit 8 bis 15 Griffeln. Die Frucht ist kahl und im frischen, reifen Zustand rot mit schwachen bräunlichen oder grünen Punkten. Wenn sie getrocknet ist, ragen die 6 bis 15 Steinfrüchtchen merklich heraus. Charakteristisch ist ein Duft nach Zitrone durch den Gehalt an ätherischem Öl. Dieser spiegelt sich auch in den Trivialnamen wieder (limoncillo ‐ kleine Zitrone) (Quelle der Beschreibung: http://www.umsl.edu/~renners/siparuna/).

Bei der phytochemischen Untersuchung einzelner Spezies der Gattung wurden verschiedene Alkaloide gefunden. Typisch sind Benzylisochinolinalkaloide, besonders Aporphin‐Derivate. Eine weitere bekannte Inhaltsstoffklasse sind Sesquiterpene. Tabelle A.1 gibt eine Übersicht der bisher in der Gattung Siparuna gefundenen Inhaltsstoffe, geordnet nach Spezies und Grundgerüst‐Typen wieder (Leitao et al. 1999). Die in S. thecaphora vorkommenden 8 Einleitung

Inhaltsstoffe sind dabei hervorgehoben. Die zugehörigen Strukturformeln der Verbindungen sind in Abbildung A.4 dargestellt.

Tabelle A.1: Bisher bekannte Inhaltsstoffe für verschiedene Siparuna‐Arten; die im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Art S. thecaphora ist fett hervorgehoben.

Inhaltsstoff Art Beschreibung

I. Alkaloide S. brasiliensis (Leitao et al. 1999) S. gilgiana* (Chiu et al. 1982) S. nicaraguensis* (Gerard et al. 1986) Liriodenin S. apiosyce, S. tonduziana, (Leitao et al. 1999; Renner et al. 2005) S. arianeae S. dressleriana (Gerard et al. 1986) S. guianensis (Braz et al. 1976) (Leitao et al. 1999; Montgomery et al. N‐Methyllaurotetanin Glossocalyx brevipes, S. arianeae 1985) Cassamedin S. guianensis (Braz et al. 1976) Oxonanatenin S. gilgiana* (Chiu et al. 1982) Flavinantenin S. dressleriana (Gerard et al. 1986) O‐Methylflavinantenine S. dressleriana (Gerard et al. 1986) Reticulin S. apiosyce, S. tonduziana (Leitao et al. 1999) II. Sesquiterpene Cadalen 1‐Hydroxycalamenen, 1,6‐ S. macrotepala (El Seedi et al. 1994) Dimethyltetrahydronaphtalen‐4‐on Sipaucin S. pauciflora (Jenett‐Siems et al. 2003) III. Sonstige ätherisches Öl: Curzerenon, (Ciccio et al. 2002; Manjarrez et al. Myristicin, Eugenolmethylether; S. guianensis, S. nicaraguensis* 1967; Renner et al. 2005) Germacren D, α/β‐Pinen Sipandinolid S. andina* (Jenett‐Siems et al. 2000) Kämpferolderivate S. brasiliensis (Syn. S. apiosyce) (Leitao et al. 1999) cis‐Trihydroxyflavanon S. andina* (Jenett‐Siems et al. 2000) β‐Sitosterol S. guianensis, S. apiosyce (Braz et al. 1976) Stigmasterol S. guianensis (Braz et al. 1976) * Synonym: S. thecaphora

Im Folgenden sind die Verwendung in der traditionellen Medizin und bisher bekannte phytochemische Untersuchungen aufgeführt. In Zentral‐ und Mittelamerika wird Siparuna zur Behandlung von Malaria und als Antipyretikum angewandt. Für diesen Einsatz wird ein Mazerat aus Blättern in Wasser Einleitung 9 gekocht und als Bad gegen Fieber, Erkältung und Rheuma angewendet (Renner et al. 2005). Ein anderer Teil der traditionellen Anwendungen durch Ureinwohner in Zentral‐ und Südamerika dürfte auf den hohen Gehalt an ätherischem Öl zurückzuführen sein. Dazu gehört zum Beispiel, mit der Inhalation der flüchtigen Bestandteile von zerriebenen Blättern oder Zweigen Fieber oder Kopfschmerzen zu vertreiben bzw. mit den Zweigen zu wedeln, um die „mal aire“, die schlechte Luft, zu vertreiben (Renner et al. 2005). Die Wirkung bei Malaria wurde näher untersucht. Die Aktivität gegen Plasmodien (P. falciparum) konnte in in‐vitro Untersuchungen belegt werden (Jenett‐Siems et al. 1999). Liriodenin wirkt als Sedativum im Zentralnervensystem, es könnte den Einsatz von Siparuna‐ Blättern als Tee gegen Husten erklären.

O H3CO N N O H3CO

O O

O O

Liriodenin Oxonantenin Pinen

OH

HO O

O OH O O OH O O O

cis‐3‐Acetoxy‐4`, 5, 7‐ Sipandinolid trihydroxyflavanon

Abbildung A.4: Strukturen der Verbindungen, die bisher aus S. thecaphora isoliert wurden.

Ein Einsatz bei Schlangenbissen und kleinen Wunden wird berichtet und eine anti‐ hämorrhagische Wirkung bei Tests an Mäusen bestätigt (Otero et al. 2000). Blätter von S. apiosyce (S. brasiliensis) waren im ersten Brasilianischen Arzneibuch (1926) monographiert, in der jetzt gültigen 4. Auflage ist Siparuna allerdings nicht mehr vertreten. Außerdem wurden bei Extrakten von S. lepidanthal (Syn. S. decipiens) und weiteren Arten cytotoxische (antitumorale) Effekte beobachtet (Renner et al. 2005). Über die cytotoxische Wirkung von S. thecaphora liegen noch keine Berichte vor. 10 Einleitung

2. Pharmakologisch‐biologische und molekularbiologische Untersuchungen

2.1. Inhibition von Transkriptionsfaktoren (AP‐1, NF‐κB)

Bei der Suche nach entzündungshemmenden Wirkstoffen sind Transkriptionsfaktoren wie AP‐1 (Activator protein‐1) und NF‐κB (Nuclear factor‐kappaB) bedeutende molekulare Targets. Der Transkriptionsfaktor NF‐κB ist ein dimeres Protein, dessen Monomere zur Rel/NF‐κB Proteinfamilie gehören. In Säugetieren sind bisher 5 NF‐κB‐Untereinheiten bekannt, nämlich p65 (RelA), cRel, RelB, p50 (p105) und p52 (p100). Am häufigsten ist das Dimer aus p50/p65 anzutreffen. In unstimulierten (ungestressten) Zellen wird das Dimer von seiner inhibitorischen Untereinheit IκB im Cytosol gehalten. Kommt es zur Stimulierung durch bspw. Cytokine (IL‐1β, TNF‐α, etc.) wird IκB über mehrere Schritte abgebaut. Eine Phosphorylierung durch den IκB‐Kinase‐Komplex und die nachfolgende Ubiquitinylierung induzieren die Degradierung durch das Proteasom 26S (Hayden et al. 2006). Nach der Freisetzung wird NF‐κB in den Kern transportiert und kann dort durch die Bindung an bestimmte DNA‐Elemente (κB‐Sequenzen) in Promotoren als Transkriptionsfaktor wirken. NF‐κB ist an der Transkription einer Vielzahl von Genen beteiligt, unter anderem von Genen, die für Cytokine, Adhäsionsmoleküle, Akute‐Phase‐Proteine, Regulatoren von Apoptose und für Enzyme codieren (Pahl 1999). Damit spielt NF‐κB eine große Rolle im menschlichen Immunsystem, bei Entzündungsreaktionen sowie bei Tumorentstehung und ‐wachstum.

Eine intensive Suche nach Inhibitoren hat bereits begonnen. Gilmore et al. zählen 2006 mittlerweile 785 Hemmstoffe auf verschiedenen Stufen der Aktivierungskaskade (Gilmore et al. 2006). Mit Bortezomib (Velcade®) ist ein Inhibitor des Proteasom 26S als Fertigarzneimittel gegen multiples Myelom auf dem Markt.

Ein prominentes Beispiel für bereits bekannte NF‐κB‐Hemmstoffe auf Naturstoffbasis sind Sesquiterpenlactone. Sesquiterpenlactone (SLs) sind eine Verbindungsklasse aus dem Sekundärstoffwechsel von Pflanzen, die charakteristisch für bestimmte Familien, wie die der Asteraceae ist. Sie haben nachgewiesenermaßen ein breites biologisches und pharmakologisches Wirkspektrum (Willuhn 1998). Vor allem die antiphlogistischen Effekte Einleitung 11 sind seit den 1970er‐Jahren Gegenstand vieler Studien (Hall et al. 1979). Ein Teil ihrer Wirksamkeit üben sie über die Hemmung von NF‐κB aus. Für Sesquiterpenlactone konnte gezeigt werden, dass sie das Cystein 38 der DNA‐bindenden Domäne der p65‐Untereinheit über eine Art Michael‐Reaktion alkylieren können (Garcia‐Pineres et al. 2001; Lyss et al. 1998; Lyss et al. 1997). In vorangegangenen Studien konnten weitere Angriffsorte aufgezeigt werden. So werden andere Transkriptionsfaktoren wie AP‐1 und NF‐AT durch Sesquiterpenlactone ebenfalls bereits in micromolaren Konzentrationen gehemmt (Klaas 2001). Sesquiterpenlactone aus Arnica montana wurden bisher noch nicht auf ihre Wirksamkeit gegenüber dem Transkriptionsfaktor AP‐1 untersucht.

Zubereitungen aus Arnika sind ausschließlich zur äußeren Applikation zugelassen. Es liegt eine positive Bewertung der Kommission E für Anwendungsgebiete wie Behandlung von rheumatischen Muskel‐ und Gelenkbeschwerden, Verletzungs‐ und Unfallfolgen (Hämatome, Quetschungen, Prellungen) vor. Die Herkunft der verwendeten Arnikablüten ist aufgrund der verschiedenen Chemotypen von Bedeutung. So weist der spanische Chemotyp ein Inhaltsstoffspektrum auf, das durch das Vorkommen von Dihydrohelenalinen charakterisiert ist. Dagegen dominieren bei Arnikablüten vom mitteleuropäischen Chemotyp Helenalinderivate (Willuhn et al. 1991). Der bedeutendste strukturelle Unterschied ist dabei das Vorkommen von einer (bei den Dihydroverbindungen) oder zwei α,β‐ungesättigten Carbonylfunktionen. Die Grundgerüste sind in Abbildung A.5 gezeigt. Eine Abhängigkeit der Hemmaktivität vom Vorhandensein dieses Strukturelements ist gezeigt worden (Wagner et al. 2006).

H H

O O

O O O O A OR B OR

Abbildung A.5: Grundgerüste der eingesetzten Verbindungen, A Dihydrohelenalin‐ und B Helenalintyp, R steht für die verschiedenen Säurereste. 12 Einleitung

Der Transkriptionsfaktor AP‐1 ist ein wichtiger Mediator, der eine bedeutende Rolle bei der Zellproliferation, dem Überleben und der Differenzierung von Zellen spielt (Shaulian et al. 2001). In Zellen von Säugetieren besteht der AP‐1‐Komplex aus Homo‐ oder Heterodimeren von Jun (c‐Jun, v‐Jun, JunB, JunD), Fos (c‐Fos, FosB, Fra‐1, Fra‐2), Jun Dimerisierungspartnern (JDP1 und JDP2) oder aktivierenden Transkriptionsfaktoren (ATF2, LRF1/ATF3 und B‐ATF). Die Proteinfamilie wird auch zu den bZIP (basic region leucine zipper) Proteinen gezählt. Der AP‐1‐Komplex bindet nach Aktivierung durch bestimmte Cytokine wie IL‐1β u.a. an die DNA und reguliert die Transkription von Genen, die bei der Zellproliferation, Apoptose, Metastasierung und im zellulären Metabolismus involviert sind (Karin et al. 1997). Außerdem ist der Transkriptionsfaktor im Entzündungsgeschehen wie beispielsweise bei Arthritis von Bedeutung. AP‐1 trägt in Osteoclasten zur Aktivierung von Signalwegen bei, die zur Zerstörung des Knochens führen können (Wagner et al. 2005). Die Untereinheiten c‐Jun und c‐Fos weisen in ihren DNA‐bindenden Domänen Cysteinreste auf (Glover et al. 1995; Klatt et al. 1999). Diese könnten analog zu NF‐κB als Angriffspunkte für potentielle Hemmstoffe dienen. Weitere Hinweise auf den Wirkmechanismus der AP‐1‐ Hemmung durch SLs wurden bisher noch nicht beschrieben.

2.2. Matrixmetalloproteinasen (MMPs)

Wichtige Enzyme, welche u.a. durch die beiden Transkriptionsfaktoren AP‐1 und NF‐κB in ihrer Aktivität reguliert werden, sind die Matrixmetalloproteinasen (MMPs). Diese Enzyme sind eine Familie von Zink‐haltigen Endopeptidasen mit einem vielfältigen Substratspektrum. Sie werden auch Matrixine genannt und mit anderen Proteinfamilien in die Metzincine eingeordnet. Für den Menschen wurden bisher 23 MMP‐Gene gefunden (Pardo et al. 2005). Diese Vielzahl an Enzymen kann nach strukturellen oder funktionellen Gesichtspunkten klassifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Untergruppe der Kollagenasen (v.a. MMP1 und 13) näher betrachtet (Pardo et al. 2005; Tardif et al. 2004). Sie haben als Substrat vorrangig Bestandteile der extrazellulären Matrix (ECM) wie verschiedene Kollagentypen und Aggrecan.

MMP1 hat eine große physiologische Bedeutung bei der embryonalen Entwicklung, Gewebebildung und Wundheilung (Pardo et al. 2005). Im normalen Gewebe von Erwachsenen ist der MMP1‐Level sehr niedrig. Die Expression ist durch Wachstumsfaktoren, Einleitung 13

Hormone und Cytokine reguliert. Die proteolytische Aktivität ist durch Aktivatoren aber auch Inhibitoren wie α‐Macroglobulin und TIMPs (tissue inhibitor of metalloproteinases) kontrolliert (Nagase et al. 1999; Pardo et al. 2005). MMPs spielen jedoch auch eine große Rolle bei chronisch‐entzündlichen Erkrankungen wie Rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis. Sie können von Chondrocyten sezerniert werden und liegen dann im Gelenkspalt vor. Als Kollagenasen sind sie in der Lage, Kollagentripel‐ helices zu spalten. Damit wird die extrazelluläre Matrix des Gelenkknorpels degradiert. Die Cytokine (wie IL‐1β), die zur Aktivierung der Transkriptionsfaktoren beitragen, sind auch für die Expression von Matrixmetalloproteinasen (MMPs) verantwortlich, weil Bindestellen für die Transkriptionsfaktoren in den Promotoren vorhanden sind (Yan et al. 2007). Die herkömmliche Therapie der Arthritis ist nicht kurativ, sondern soll den Entzündungsprozess stoppen und dem Patienten den Schmerz, der häufig zusätzlich zur Bewegungseinschränkung führt, nehmen. Je mehr man über den Mechanismus der Gelenkzerstörung weiß, desto besser kann man direkt dort eingreifen. Für eine Reihe von pflanzlichen Verbindungen bzw. isolierten Naturstoffen ist bereits ein positiver Effekt bei der Behandlung von Arthritis beschrieben worden (Khanna et al. 2007). Der Vorteil von diesen Verbindungen ist eine meist geringere Nebenwirkungsrate und niedrigere Therapiekosten als bei Synthetica. Eine Übersicht über Metalloproteasen als therapeutische Targets und mögliche Inhibitoren ist bei (Fingleton 2007; Rowan et al. 2008; Takaishi et al. 2008) gegeben. Obwohl für Arnikazubereitungen Erkrankungen des Bewegungsapparates als Anwendungsgebiete bekannt sind, ist ihr Einfluss auf die IL‐1β‐induzierte Expression von MMP1 und MMP13 auf Genebene bisher noch unbekannt.

2.3. Untersuchungen zur Elastase‐Hemmung

Eine Hemmung von Elastase oder ihrer Freisetzung aus den Granula der Neutrophilen kann eine weitere Therapieoption bei entzündlichen Erkrankungen, zusätzlich zu den oben genannten Targets wie Transkriptionsfaktoren oder MMPs, sein. Neutrophile Elastase (Humane Neutrophile Elastase, HNE) ist eine Serinprotease, die in den azurophilen Granula von Neutrophilen Granulocyten gespeichert ist. Unter den Oberbegriff Elastase fallen zudem Pankreaselastase, Fibroblastenelastase und MMP12 (Macrophagenelastase). HNE ist ein stark basisches Glycoprotein mit einem 14 Einleitung

Molekulargewicht von ca. 30 kDa. Sie besitzt ein aktives Zentrum, das die sogenannte katalytische Triade (His, Asp, Ser) beinhaltet. Für die Substratspezifität ist die sogenannte S1‐Tasche zuständig, welche die Seitenketten der Aminosäuren, die der Spaltstelle benachbart sind, aufnimmt. Elastase spaltet bevorzugt nach der Aminosäure Valin und hat durch das häufige Vorkommen von Valinresten ein sehr breites Substratspektrum. Das ist für ihre physiologische Rolle in der Abwehr von eingedrungenen Fremdorganismen wichtig. Als Substrat für Elastase gelten Proteine eingedrungener Bakterien, verschiedene Bestandteile der Extrazellulären Matrix (ECM) wie Elastin, Kollagen und Proteoglykane, und lösliche Proteine wie Cytokine, Blutgerinnungsfaktoren und Immunglobuline. Der Fähigkeit, vom Bindegewebsprotein Elastin kleine, lösliche Peptidfragmente abspalten zu können, verdankt Elastase einerseits ihren Namen. Man nimmt an, dass die Degradierung von ECM es den Neutrophilen Granulocyten andererseits ermöglicht, zu Orten des Entzündungsgeschehens zu wandern. Die Aktivierung von Neutrophilen führt zu einer Degranulierung und Freisetzung der Elastase in den extrazellulären Spalt. Zusammen mit Elastase werden noch weitere Enzyme wie Cathepsin G, Myeloperoxidase sowie reaktive Sauerstoffspezies sezerniert. Letzteres wird auch „oxidative burst“ genannt. Elastase kommt vor allem an Grenzen des menschlichen Körpers zur Außenwelt, wie Lunge und Darm vor ((Siedle et al. 2007) und darin zitierte Literatur).

Die Degradation von ECM in einem Übermaß, das nicht mehr durch die physiologischen Inhibitoren in Schach gehalten werden kann, führt zur Entgleisung der Proteasereaktion und damit zur Zerstörung von gesundem Gewebe. Im Menschen sind α1‐Antitrypsin (auch α1‐ Protease‐Inhibitor genannt), Elafin, SLPI (sekretorischer Leukoproteaseinhibitor), EIM (Enzyminhibitor der Monocyten) sowie α2‐Macroglobulin die Elastaseinhibitoren. Ein Zusammenhang mit der Elastaseüberaktivität wird beispielsweise bei entzündlichen Erkrankungen wie cystischer Fibrose, weiteren Lungenerkrankungen und Rheumatoider Arthritis beschrieben. Bei Rheumatoider Arthritis wird ein vermehrter Einstrom von Neutrophilen in das Synovialgewebe beobachtet. HNE wird mit dem Abbau von Knorpelgewebe und der Bildung von Pannusgewebe (durch unkontrollierte Vermehrung der Synovialzellen) in Verbindung gebracht (Siedle 2003). Zusätzlich wird ein Zusammenhang der Elastase mit Krebs (u.a. mit Metastasierung) postuliert (Sato et al. 2006; Thai et al. 2008). Einleitung 15

Durch die weite Verbreitung der Erkrankungen, bei denen Elastase eine Rolle spielt, ist die Suche nach Hemmstoffen von großer Bedeutung. Dabei gibt es verschiedene Ansätze. Zum einen existieren synthetische Inhibitoren des Enzyms, die sich wiederum in Peptidanaloga und andere unterteilen lassen. Eine Übersicht über Naturstoffe als Elastase‐Inhibitoren ist in (Siedle et al. 2007) dargestellt. Untersuchungen zu Struktur‐Wirkungsbeziehungen mit phenolischen Inhaltsstoffen haben bereits erste Erkenntnisse geliefert (Siedle et al. 2003).

3. Ziele dieser Arbeit

Um Kenntnisse über biologisch aktive Inhaltsstoffe der Euphorbiaceae Hieronyma alchorneoides und der Siparunaceae Siparuna thecaphora zu gewinnen und um das Wissen über die entzündungshemmenden Eigenschaften von Sesquiterpenlactonen, Arnikazubereitungen sowie phenolischen Naturstoffen zu erweitern, sind folgende Punkte Gegenstand dieser Arbeit:

1. Biologisch kontrollierte Isolierung und Strukturaufklärung von Inhaltsstoffen aus den Blättern von Hieronyma alchorneoides. Untersuchung der gewonnenen Substanzen auf NF‐κB‐hemmende Eigenschaften im EMSA und Luciferase‐Reportergenassay. 2. Untersuchung eines Extraktes aus den Blättern von Siparuna thecaphora auf cytotoxische Eigenschaften, sowie Isolierung und Strukturaufklärung der wirksamen Inhaltsstoffe. 3. Untersuchung der Aktivität von isolierten Sesquiterpenlactonen aus Blüten von Arnica montana sowie von verschiedenen Arnikazubereitungen in Bezug auf ihre Hemmung der DNA‐Bindefähigkeit des Transkriptionsfaktors AP‐1 in Jurkat‐T‐Zellen mittels EMSA. 4. Untersuchungen zum molekularen Wirkmechanismus der AP‐1‐Hemmung durch die Sesquiterpenlactone Parthenolid und Millerenolid. Überprüfung, ob der bei NF‐κB gefundene, direkte Angriff der SLs an der DNA‐bindenden Domäne auch auf AP‐1 übertragen werden kann. 5. Testung von Arnikazubereitungen auf die Hemmung der Expression von MMPs in bovinen und humanen Chondrocyten durch quantitative real‐time RT‐PCR‐Analyse. 16 Einleitung

6. Untersuchung von 10 strukturell verschiedenen Gerbstoffen und anderen phenolischen Naturstoffen auf direkte Hemmung des Enzyms Elastase sowie auf Beeinflussung der Freisetzung von Elastase aus Neutrophilen Granulocyten. 7. Untersuchung einer durch Docking‐Berechnungen entworfenen und synthetisierten Testsubstanz (in Kooperation). Überprüfung der vorausgesagten Aktivität in einem im Arbeitskreis neu etablierten Testsystem auf direkte Hemmung von Elastase. 8. Literaturübersicht über die Bedeutung von Gerbstoffen bei topischer Anwendung, ihre Einsatzmöglichkeiten und diskutierte Wirkmechanismen. Literaturteil 17

B. Literaturteil

Gerbstoffdrogen sind aufgrund ihrer reduzierenden und Protein‐fällenden Wirkung Bestandteile vieler traditionell eingesetzter Arzneimittel. In der Volksmedizin wird die adstringierende und antiresorptive Wirkung zur Behandlung von Durchfall und weiteren Erkrankungen seit Jahrhunderten ausgenutzt. Im vorliegenden Kapitel soll die topische Anwendung von Gerbstoffen näher beleuchtet werden. Zunächst wird ein kurzer Überblick über die Einteilung und die Strukturen der Gerbstoffe gegeben. In den darauffolgenden Abschnitten wird für verschiedene Anwendungsgebiete der Gerbstoffe die Datenlage zusammengefasst. Vorliegende in‐vivo‐Studien am Mensch oder Tier werden in diesem Rahmen aufgeführt und in‐vitro‐Untersuchungen zum möglichen Wirkmechanismus vorgestellt. Am Ende steht eine kritische Zusammenfassung der erhaltenen Daten.

1. Definition, Einteilung und Strukturen

Ursprünglich wurde der Begriff „Gerbstoff“ für Substanzen verwendet, die Tierhaut in Leder umwandeln können. 1962 wurden pflanzliche Gerbstoffe definiert als wasserlösliche Polyphenole mit einem mittleren Molekulargewicht zwischen 500 und 3000 Dalton (Da). Sie weisen eine große Zahl von Hydroxylgruppen oder anderen funktionellen Gruppen auf (1 bis 2 pro 100 Da) und besitzen die Fähigkeit, sich mit Proteinen oder anderen Makromolekülen (aber auch mit Alkaloiden) über Quervernetzungen zu verknüpfen (Chung et al. 1998). Sie sind in Pflanzen weit verbreitet. Gerbstoffe werden eingeteilt in hydrolysierbare und kondensierte (nicht‐hydrolysierbare) Verbindungen. Daneben gibt es Verbindungen, die Strukturelemente der hydrolysierbaren und der kondensierten Gerbstoffe enthalten. Diese werden als komplexe Gerbstoffe bezeichnet. Eine Sondergruppe sind die Labiatengerbstoffe, die hauptsächlich aus Kaffeesäure‐Estern mit Rosmarinsäure als Vertreter bestehen (Okuda 2005). Sie sind keine Gerbstoffe im engeren Sinne, weisen aber ähnliche Merkmale auf und werden deshalb so bezeichnet. Hydrolysierbare Gerbstoffe enthalten als zentrales Element einen Zucker (oder eine andere nichtaromatische Polyhydroxyverbindung), dessen Hydroxylgruppen alle oder nur zum Teil verestert sind. Hydrolysierbar bedeutet, dass sie durch verdünnte Säuren vollständig in 18 Literaturteil kleinere Moleküle gespalten werden. Nach der Säurekomponente des Esters kann die Klasse der hydrolysierbaren Gerbstoffe wiederum in Gallotannine (Ester der Gallussäure) und Ellagitannine (Ester der Hexahydroxydiphensäure) unterteilt werden. Bei der Hydrolyse durch Säuren, Basen oder bestimmte Enzyme werden Gallotannine in ihren Zucker (Glucose) und Gallussäuremoleküle gespalten. Ellagitannine sind weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass der Hexahydroxydiphenoylrest nach Abspaltung spontan zur Ellagsäure (Lacton) zyklisiert (Chung et al. 1998). Die charakteristischen Strukturelemente sind in Abbildung B.1 dargestellt. Beispiele für Gallotannine sind Hamamelistannin und chinesische Tannine (aus chinesischen Gallen). Ellagitannine kommen u.a. in den Gattungen Caesalpinia, Terminalia und Eucalyptus vor (Chung et al. 1998). Insgesamt ist die Verbreitung bis auf wenige Ausnahmen auf zweikeimblättrige Angiospermen beschränkt (Yoshida et al. 2005). Sie wurden erst in den 1970ern isoliert und identifiziert (Yoshida et al. 2000). Okuda unterteilt die Ellagitannine noch nach dem Grad der Oxidation und der Oligomerisierung bzw. nach der Art der Verknüpfung der Monomere (Okuda 2005). Agrimoniin (Struktur siehe Abbildung C.53 im Ergebnisteil) oder Pedunculagin (siehe Abbildung B.1) sind Beispiele für hydrolysierbare Gerbstoffe vom Typ der Ellagitannine. Sehr ausführliche Beschreibungen der Ellagitannine, ihrer Strukturen, ihres natürlichen Vorkommens sowie Daten zur Strukturaufklärung und biologischen Wirksamkeit sind bei Okuda und Yoshida et al. zusammengestellt (Okuda 2005; Yoshida et al. 2000; Yoshida et al. 2005).

OH

OH OH HO O HO HO O OH O HO O O CH2 HO COOH O HO O O O HO COOH O O OH O O O HO OH HO OH OH OH HO HO OH OH OH HO OH HO OH Gallussäure Hexahydroxydiphensäure Ellagsäure Pedunculagin

Abbildung B.1: Typische Strukturelemente von hydrolysierbaren Gerbstoffen sowie Pedunculagin als Beispiel für ein Ellagitannin.

Literaturteil 19

Kondensierte Gerbstoffe sind oligomere Flavanderivate. Sie enthalten meistens mehrere Flavan‐3‐ol‐ und/oder Flavan‐3,4‐diol‐Einheiten, die über (4,8)‐ oder (4,6)‐Bindungen verknüpft sind. Die Flavan‐3‐ole sind die sogenannten Catechinbausteine. Je nach Konfiguration der asymmetrischen C‐Atome an C‐2 und C‐3 unterscheidet man Catechine (2‐Phenyl und 3‐OH stehen trans) und Epicatechine. Diese Polymerisationsprodukte, die auch Proanthocyanidine genannt werden, sind in vielen Früchten und Gemüsesorten enthalten, bekannt sind Rotwein und Kakao. Kondensierte Gerbstoffe gehören zu den am weitesten verbreiteten Naturstoffen und kommen in Farnen, Gymnospermen und Angiospermen vor (Yoshida et al. 2005). Ihren Namen tragen sie, da beim Erhitzen in saurer Lösung Anthocyanidine sowie höhermolekulare Verbindungen (Phlobaphene) gebildet werden. Gallussäureester von Flavanen wie Epigallocatechin und Epigallocatechin‐3‐gallat (EGCG) werden teilweise auch zu diesen Gerbstoffen gezählt (Chung et al. 1998). Für eine weitere Klassifizierung der Proanthocyanidine und ihrer Bausteine siehe (Aron et al. 2008). Die Strukturen eines Procyanidins und von EGCG sind in Abbildung B.2 dargestellt.

OH OH OH HO O HO O OH OH OH OH O OH OH OH HO O O OH

OH OH OH OH

(‐)‐Epigallocatechin‐ Procyanidin B2 3‐gallat (EGCG)

Abbildung B.2: Strukturen des Teepolyphenols EGCG sowie von Procyanidin B2 als Beispiel für einen kondensierten Gerbstoff.

Die Aufgaben der Gerbstoffe in den Pflanzen sind vielfältig und reichen von der Farbgebung von Blättern, Blüten und Früchten bis zu antimikrobiellen oder antifungalen Effekten sowie Schutz vor UV‐Licht und freien Radikalen. Sie bieten einen Fraßschutz vor Insekten und höheren Tieren. Außerdem können toxische (Schwer‐)Metallionen komplexiert werden und die Pflanzen sind dadurch gegen diese Art der Umweltgifte unempfindlicher (Stevenson et al. 2007). 20 Literaturteil

2. Anwendungsgebiete

2.1. Wundheilung

Ein traditionelles Einsatzgebiet für Gerbstoffe ist die Wundheilung. Als Heilung bezeichnet man einen sehr komplexen Vorgang, der die Funktion und Unversehrtheit des verletzten Gewebes wiederherstellt. Wundheilung kann grob in drei Stufen gegliedert werden. Zuerst (in der sogenannten Entzündungsphase) wird die Wunde, also die zerstörte Hautschicht, durch einen Fibrinpfropf verschlossen. Über verschiedene Cytokine kommt es zu Rötung, Schwellung und Schmerz. Abwehrzellen (Neutrophile Granulocyten, Makrophagen, Monocyten) werden angelockt. In einer zweiten Stufe (Proliferation) erfolgt die Bildung von Granulationsgewebe. Mit der Re‐Epithelialisierung und beginnender Kollagensynthese gewinnt das Gewebe wieder an Festigkeit. In der dritten und letzten Stufe (Remodelling), die mehrere Monate andauern kann, bleibt die Kollagensynthese bestehen, es entsteht Narbengewebe, und das Gewebe wird wieder mechanisch belastbar. Während der Wundheilung müssen neue Blutgefäße gebildet werden, um die verletzten Gefäße zu ersetzen und die Sauerstoff‐ und Nährstoffversorgung zu übernehmen (Hunt et al. 2000; Sen et al. 2002). Traditionell werden Gerbstoffe eingesetzt, um beim Wundverschluss unterstützend sowie einer Entzündung entgegen zu wirken.

2.1.1. Studien am Menschen

Gerbstoffe wurden bei ulcerierenden Aphten auf der Mundschleimhaut in einer Pilotstudie mit 32 Patienten eingesetzt (de Armas et al. 2005). Angewendet wurde eine flüssige Formulierung (CIKRON‐H®), die einen wässrigen Extrakt der Rinde von Rhizophora mangle enthält. R. mangle, die Rote Mangrove, wird in der traditionellen Medizin in der Karibik eingesetzt. Der Extrakt enthält bis zu 54 Prozent an Polyphenolen, vor allem polymere und hydrolysierbare Gerbstoffe. Auf eine Konzentrationsangabe für die angewandte Formulierung wurde leider verzichtet. Die topische Anwendung einmal pro Tag zeigte einen antiseptischen und wundheilungsfördernden Effekt. In der Placebo‐kontrollierten Studie stellte sich heraus, dass die Zeit für die Abheilung verkürzt ist (7 gegenüber 12 Tagen) und es zu einer Reduktion von Erythem und Schmerz kommt. Bei 71 % der Verum‐Gruppe waren nach 7 Tagen alle Läsionen abgeheilt, was nur bei 7 % der Placebo‐Gruppe (1 Person von 15) Literaturteil 21 der Fall war. Nebenwirkungen traten während der Behandlungsdauer nicht auf (de Armas et al. 2005).

2.1.2. Studien im Tiermodell und möglicher Mechanismus

Drei Fraktionen eines wässrig‐alkoholischen Terminalia arjuna‐Rindenextrakts wurden in einem in‐vivo Modell zur Wundheilung an Ratten eingesetzt (Chaudhari et al. 2006). Der Baum Terminalia arjuna (Combretaceae) kommt in Indien vor. Vor allem der Rinde werden verschiedene pharmakologische Wirkungen zugeschrieben. Für den Gesamtextrakt gab es im Vorfeld von der gleichen Gruppe eine Studie im Tiermodell, die einen wundheilenden Effekt zeigt (Rane et al. 2003). Nun sollten drei Fraktionen näher auf ihre Wirkung untersucht werden. Nach der topischen Anwendung der Fraktionen (1 % in einer Grundlage auf Paraffinbasis, einmal pro Tag) bis zur Abheilung der Wunde wurde ein statistisch signifikanter Unterschied in der Zugfestigkeit und der prozentualen Epithel‐Bildung gemessen. Am aktivsten war Fraktion 1, die im Wesentlichen aus Gerbstoffen bestand (Fraktion 2: restliche Inhaltsstoffe nach Extraktion der Gerbstoffe, z.T. Zucker; Fraktion 3: Saponine). Als zusätzlicher Marker wurde der Hexosamin‐Gehalt (Bestandteil der extracellulären Matrix) im Granulationsgewebe der Wunde gemessen, auch hier war der Einfluss von Fraktion 1 am höchsten (Chaudhari et al. 2006).

Epicatechin‐3‐gallat (ECG) wurde ebenfalls in einem in‐vivo Modell zur Wundheilung bei Ratten eingesetzt (Kapoor et al. 2004). Beobachtet wurde in diesem Fall die Narbenbildung. Dabei verbesserte ECG die Reifung der Kollagenfasern (50 µL einer Lösung mit einer Konzentration von 0,8 mg/mL, intradermal appliziert am Tag vor dem Setzen der Wunde und sieben weitere Tage danach). Außerdem kamen die Kollagenfasern kompakter zur Anordnung, was zu einer besseren Gewebestruktur führte. Auf enzymatischer Ebene wurde in den Gewebeproben der Versuchstiere eine Erhöhung der Konzentration an iNOS und ihrer Aktivität detektiert, wodurch über eine Signalkaskade die Synthese von Kollagen induziert und die Ausbildung der mechanischen Belastbarkeit verbessert wird. Zusätzlich wurde die

Aktivität der COX‐2 erhöht, was wiederum über PGE2 (Prostaglandin E2) die Proliferation von Fibroblasten fördert. Eine Steigerung des VEGF‐Spiegels wurde gemessen Dies kann als Ursache für die im Vergleich zur Kontrollgruppe früher einsetzende Angiogenese (gemessen an der Zahl der Blutgefäße zum jeweiligen Zeitpunkt) angesehen werden. Eine Arginase‐ 22 Literaturteil

Hemmung durch ECG konnte ebenfalls festgestellt werden. Die Autoren postulieren einen Zusammenhang der Arginase‐Aktivität mit einer Keloid‐Bildung. Um die Narbenbildung auf ein Normalmaß zu bringen, ist es wichtig, die Arginase‐I‐Aktivität zu reduzieren. Die normale Wundheilung war durch diese Wirkung nicht beeinträchtigt. Zu diesem Einfluss fehlen weitere Untersuchungen. Insgesamt zeigt die Studie aber, dass die Qualität der Wundheilung und Narbenbildung durch den Naturstoff ECG verbessert werden kann (Kapoor et al. 2004).

Im Mausmodell wurde untersucht, ob ein Proanthocyanidin‐Extrakt aus Traubenkernen die Wundheilung beschleunigen kann (Khanna et al. 2002). Die topische Anwendung (25 µL einer Lösung mit einer Konzentration von 100 mg/mL) dieses Extrakts an fünf aufeinanderfolgenden Tagen führte zu einer schnelleren Kontraktion und einem schnelleren Wundverschluss. Die Zelldichte war höher, es wurde mehr Bindegewebe angelegt und die histologische Struktur war verbessert. Am Wundrand war ein erhöhter VEGF‐Spiegel messbar. Dieser wird u.a. induziert durch eine höhere Menge an Oxidantien wie H2O2 und ist für die Wundheilung förderlich (Khanna et al. 2002). In Übereinstimmung damit konnten in‐vitro Untersuchungen belegen, dass ein Traubenkernextrakt die VEGF‐Expression in Keratinocyten unterstützt. Diese ist wiederum wichtig für die Angiogenese in der Wunde (Sen et al. 2002). Dieser im Tiermodell bestätigte Effekt wurde durch in‐vitro‐Versuche in Keratinocyten, auf transkriptioneller Ebene in einem Luciferase‐Assay (VEGF‐Promotor) und durch Nachweis des Proteins im Zellkulturmedium mittels ELISA (Enzyme‐linked Immunosorbent Assay) belegt (Khanna et al. 2002; Khanna et al. 2001; Sen et al. 2002). Die Autoren Sen und Khanna sehen in der nachweislich wundheilungsfördernden Eigenschaft der auch stark antioxidativ wirkenden Verbindungen einen Widerspruch zur Anwendung der hyperbaren Sauerstofftherapie bei schlecht heilenden Wunden. Durch die Zerstörung von Blutgefäßen, die normalerweise Sauerstoff liefern, und durch den hohen Energieverbrauch bei den regenerativen Prozessen herrscht in der Wunde eher ein Sauerstoffmangel. Der Erfolg der hyperbaren Sauerstofftherapie wird darauf zurückgeführt, dass die Zufuhr von molekularem Sauerstoff die Kollagensynthese anregt und den Wundverschluss verbessert. Es wird postuliert, dass reaktive Sauerstoffspecies (ROS), wie sie auch von Granulocyten im sogenannten „oxidative burst“ freigesetzt werden, die Heilung unterstützen. Die Bildung von ROS, wie Wasserstoffperoxid, begünstigt daher die Bildung von VEGF in Keratinocyten. Literaturteil 23

Als mögliche Lösung für diesen Konflikt kann angesehen werden, dass die Naturstoffe vorrangig in Signalwege eingreifen, welche zur Wundheilung beitragen und dass ihr antioxidatives Potential hier nicht im Vordergrund steht. So wurde nachgewiesen, dass durch die Polyphenole die Produktion von Wasserstoffperoxid in Keratinocyten gesteigert werden kann. Zur Untermauerung dieser Hypothese sollten aber weitere Studien durchgeführt werden (Sen et al. 2002).

Als zusätzlich vorteilhaft für die Wundheilung wird die antiinflammatorische Wirkung der Gerbstoffe angesehen. Diese kann durch eine Modulation der Entzündungsreaktion, beispielsweise durch Herunterregulation von NF‐κB, ROS‐produzierenden Enzymen (bspw. aus Neutrophilen Granulocyten) oder Hemmung der Enzymaktivität verschiedener anderer Enzyme (COX, LOX, etc.) ausgeübt werden (Stevenson et al. 2007). Der Autor nennt allerdings Polyphenole (also möglicherweise auch Flavonoide etc.) als Wirkstoffe und keine genauen Angriffspunkte.

2.1.3. Versorgung von Brandwunden

Ein spezieller Aspekt der Wundheilung ist die Versorgung von Brandwunden. Hier gibt es sowohl positive als auch negative Berichte über den Einsatz von Gerbstoffen. Einem häufigen Gebrauch von Tanninen im frühen 20. Jahrhundert (1925) folgte eine Zeit, in der die Anwendung in nur geringem Ausmaß stattfand. Nach dem zweiten Weltkrieg wurde diese Therapie fast eingestellt. Es wurden Leberschäden beobachtet, die mittlerweile aber auf die Belastung des Stoffwechsels durch die Verbrennungen selbst oder auf Nebenprodukte, die in den Gerbstoffpräparaten enthalten waren, zurückgeführt werden (Chung et al. 1998; Halkes et al. 2001). Die verwendeten Gerbstoffpräparate waren nicht oder nicht ausreichend spezifiziert, von schlechter Qualität und wurden teilweise in sehr hohen Konzentrationen eingesetzt bzw. in den Studien getestet. Mittlerweile wird der Einsatz von Präparaten, die isolierte (aufgereinigte) und definierte Gerbstoffe enthalten, und für die eine Toxizität experimentell ausgeschlossen wurde, wieder positiv bewertet. Hupkens et al. stellen verschiedene tierexperimentelle sowie klinische Untersuchungen vor, die eine Schmerzreduktion, eine frühere Mobilisierung, gute kosmetische Ergebnisse sowie eine hämodynamische Stabilisierung belegen konnten (Hupkens et al. 1995). Neben den adstringierenden Effekten kann auch ein niedrigeres 24 Literaturteil

Infektionsrisiko zu den positiven Wirkungen der Gerbstofftherapie gezählt werden (siehe auch nächste Abschnitte). In der Fachinformation zu Tannolact® (siehe Abschnitt 2.6.2) findet sich der Hinweis, dass der durch die adstringierende Wirkung von Gerbstoffen gebildete, dünne Schutzfilm aus koaguliertem Eiweiß einen Flüssigkeitsverlust vermindert. Diesem Flüssigkeitsverlust wird bereits in einem Artikel von 1933 große Aufmerksamkeit gewidmet (Mitchiner et al. 1933). Gerade bei großflächigen Verbrennungen kann der Flüssigkeitsverlust zusammen mit Schock tödlich enden.

Im Mausmodell wurde ein Extrakt von Astilbe thunbergii Rhizom bzw. drei daraus isolierte Verbindungen auf ihre unterstützende Wirkung bei der Wundheilung von Verbrennungen hin untersucht (Kimura et al. 2007). Die Substanzen waren aktiv und konnten den Heilungsprozess beschleunigen, allerdings kann man sie nicht zu den Gerbstoffen im eigentlichen Sinne zählen, sondern nur zu den phenolischen Naturstoffen (Flavanonolglycosid, Chromon‐ und Isocumarinderivat). Der Extrakt (70 % Ethanol, 0,5 % oder 1 % in Salbengrundlage, Applikation von 100 mg Zubereitung täglich über 14 Tage) verbesserte die Wundheilung. Die Wundfläche war nach 6 bzw. 15 Tagen gegenüber den nur mit Salbengrundlage behandelten Wunden deutlich verkleinert.

Ein Extrakt einer weiteren Terminalia‐Art (T. chebula) (vgl. T. arjuna bei Wundheilung im Rattenmodell) sowie ein Extrakt von Acacia mollissima, die beide einen hohen Gehalt an Polyphenolen aufweisen, wurden auf ihr Potential zur Stabilisierung von Kollagen getestet (Krishnamoorthy et al. 2008). T. chebula weist einen hohen Gehalt an hydrolysierbaren Gerbstoffen auf, wohingegen A. mollissima vor allem Proanthocyanidine enthält. Es konnte gezeigt werden, dass eine Kollagenase‐Hemmung (durch Veränderung der Enzym‐ Sekundärstruktur) für die Wirkung der Extrakte verantwortlich ist. Dies kann sich bei Verbrennungen und auch bei Hauterkrankungen positiv auswirken, da es hier zum Teil zu einer sehr hohen Expression von Kollagenasen (MMPs) und daher zu einer schlechten Abheilung kommen kann. Zusätzlich wird die Anwendung von Biomaterialien wie künstlicher Haut gefährdet.

Literaturteil 25

2.2. Adstringierende Wirkung

Eine mögliche Grundlage für die Anwendung von Gerbstoffen auf oberflächlichen Wunden ist ihre adstringierende Wirkung. Dabei kommt es zur Quervernetzung von Strukturproteinen. Dieser Film, bei dessen Bildung vor allem Aminogruppen von basischen Aminosäuren mit Phenolgruppen reagieren, wirkt austrocknend. Fölster‐Holst sieht den Einsatz daher vor allem bei entzündeten, nässenden, oberflächlichen Hauterkrankungen sowie gegen Juckreiz, z.B. bei Windpocken. Zudem sei es von Vorteil, dass die komplexen Moleküle vom Körper nicht aufgenommen werden (Foelster‐Holst et al. 2007). Synthetisch gewonnene Tannine – so Fölster‐Holst – bieten vor allem bei der Anwendung in der Pädiatrie oder Schwangerschaft den Vorteil, zum einen weniger Nebensubstanzen zu enthalten und damit ein reduziertes mögliches allergenes Potential zu besitzen. Zum anderen sind sie von gleichbleibender Qualität und erlauben daher eine genauere Dosierung. Außerdem würden bei diesen Produkten (Handelsname Tamol® PP (BASF)) keine Verfärbungen auftreten. Zu den weiteren Wirkungen eines Präparates, welches diesen synthetischen Gerbstoff enthält (Tannolact®), siehe Abschnitt 2.6.2. In ihren Arbeiten zum Mechanismus der adstringierenden Wirkung stellen Chung et al. vier Typen von Protein‐Gerbstoff‐Bindungen heraus und zwar Wasserstoffbrücken (über phenolische OH‐Gruppen), hydrophobe Wechselwirkungen, elektrostatische Anziehung und kovalente Bindung über Oxidationsreaktionen. Für eine effektive Quervernetzung muss das Tannin klein genug sein, um die Proteinfaser zu penetrieren, aber groß genug, um die Proteinketten an mehr als einer Stelle zu berühren. Eine Mindestgröße von 350 Da wird dafür als optimal angenommen (Chung et al. 1998).

2.3. Antibakterielle, antivirale und antifungale Effekte

Ein weiterer Aspekt, der auch bei der im vorherigen Kapitel behandelten Wundheilung bezüglich der Sekundärinfektionen eine Rolle spielt, ist der antimikrobielle Effekt von hydrolysierbaren Gerbstoffen und Proanthocyanidinen. Es wurden einerseits direkte antimikrobielle Effekte gezeigt, andererseits gibt es Hinweise auf eine Senkung von Resistenzen gegenüber der herkömmlichen Antibiotikatherapie (Chaudhari et al. 2006; Hatano et al. 2005). 26 Literaturteil

2.3.1. Antibakterielle Aktivität

Terminalia arjuna‐Rindenextrakt zeigte eine antimikrobielle Wirkung gegen Streptococcus, Pseudomonas und E. coli (Chaudhari et al. 2006). In einem Übersichtsartikel aus Finnland wurden die antioxidativen und antimikrobiellen Eigenschaften verschiedener gerbstoffhaltiger Beeren betrachtet (Heinonen 2007). Ein Beerenextrakt aus Moltebeere (Rubus chamaemorus), der Ellagitannine enthält, zeigte in‐vitro Aktivität gegen humanpathogene Keime wie Salmonella, Staphylococcus, Helicobacter und Bacillus. Als weitere Keime, die gegen die phenolischen Inhaltsstoffe verschiedener Beeren empfindlich sind, werden Escherichia, Clostridium und Campylobacter genannt. Für Himbeere (enthält Phenole und Ellagitannine) konnte eine Wirkung gegen Klebsiella oxytoca und Proteus mirabilis gezeigt werden. Nicht empfindlich waren Lactobacillus und Listeria (Heinonen 2007).

Gerbstoffe verringern die Antibiotika‐Resistenz von Methicillin‐resistenten Staphylococcus aureus (MRSA)‐Stämmen (Hatano et al. 2005). Untersucht wurden unter anderem hydrolysierbare Gerbstoffe (Corilagin, Tellimagrandin I), Epicatechingallat (ECG), EGCG und Proanthocyanidine. Für EGCG wurden Abbauprodukte, die in Lösung entstehen, identifiziert und ebenfalls getestet. Ein Teil der EGCG‐Abbauprodukte war selbst noch aktiv. Die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika wurde durch ein EGCG‐Abbauprodukt sowie durch Proanthocyanidine erhöht. Bei letzteren konnte gezeigt werden, dass ein größeres Molekulargewicht zu einer höheren Aktivität führt. Die Resistenz wird bei den untersuchten Stämmen vor allem durch PBP2a (Penicillin binding protein 2a) vermittelt. Die Phenole könnten dabei durch einen direkten Angriff an PBP2a oder durch Angriff an bakteriellen Zellwandbausteinen bzw. der Membran wirken (Hatano et al. 2005; Yoshida et al. 2005). Außerdem konnte ein hemmender Effekt auf β‐Lactamase durch hydrolysierbare Gerbstoffe beobachtet werden. EGCG zeigt eine höhere Wirksamkeit gegenüber S. aureus als gegenüber gram‐negativen Stäbchen (Puupponen‐Pimiä et al. 2005). Eine dort zitierte Studie zeigte, dass EGCG und β‐Lactam‐Antibiotika an der gleichen Stelle (Peptidoglycan der Zellwand) angreifen.

Im Agardiffusionstest wurden verschiedene Pflanzenextrakte mit phenolischen Inhaltsstoffen auf ihre antibakterielle Aktivität untersucht (Smullen et al. 2007). Dabei wurde Literaturteil 27 vor allem die Hemmung von Streptococcus mutans und außerdem von weiteren Bakterien, die Karies auslösen können, betrachtet. Am aktivsten zeigten sich Extrakte von roten Traubenschalen und Traubenkernen (es finden sich beide Angaben für einen untersuchten Extrakt), Grüntee und Schlehenschalen. Die minimale Hemmkonzentration lag zwischen 0,5 und 2 mg/mL. Für einen Rindenextrakt aus der Strandkiefer (Pinus maritima, Pycnogenol®) wurde eine vergleichbare Aktivität gemessen. Die Extrakte waren vor allem gegenüber gram‐positiven Bakterien aktiv, nur Grüntee auch gegen gram‐negative. Für Kakao wurde gefunden, dass bei Fraktionen mit steigendem Polymerisationsgrad der Epicatechine die antibakterielle Aktivität ebenfalls stieg. Die Anheftung von S. mutans an Glas wurde durch verschiedene Extrakte verringert (Smullen et al. 2007).

Rotweinausfällungen, die reich an Polyphenolen sind, zeigten eine deutliche antibakterielle Aktivität. Sie könnten als Hauttonikum oder bei Infektionen angewendet werden (Shanbrom 2004). Neuere Untersuchungen demonstrierten eine Wirkung von Proanthocyanidinen im unteren nanomolaren Konzentrationsbereich gegen Protozoen. Im in‐vitro Zellkulturversuch an mit Leishmania donovani infizierten RAW‐Zellen waren die höhermolekularen Verbindungen ähnlich wirksam wie die Referenzsubstanz Natriumstibogluconat (Kolodziej et al. 2001).

2.3.2. Antivirale Aktivität

Es liegen mehrere Untersuchungen zu den antiviralen Eigenschaften der Gerbstoffe vor. Eine Untersuchung belegt, dass monomere und dimere hydrolysierbare Gerbstoffe gegen Herpes simplex wirksam sind (Okuda 2005). Oenothein B, ein oligomeres Ellagitannin, zeigte Aktivität im nanomolaren Bereich (Yoshida et al. 2000). Für andere Ellagitannine wird im gleichen Artikel berichtet, dass sie eine Wirkung gegen HIV aufweisen, möglicherweise über Beeinflussung der viralen Reversen Transkriptase. In Versuchen mit CYSTUS052, einem Zistrosenextrakt (Cistus incanus), der reich an polymeren Polyphenolen (Proanthocyanidinen, aber auch Flavonoiden) ist, konnte eine Wirkung gegen Influenza A Viren in‐vitro (Zellkultur) und im Mausmodell nachgewiesen werden (Droebner et al. 2007; Ehrhardt et al. 2007). Der Einsatz bei Windpocken ist dagegen eher symptom‐orientiert im Sinne einer Abmilderung des Juckreizes zu betrachten (Foelster‐Holst et al. 2007). 28 Literaturteil

2.3.3. Antifungale Aktivität

In einem Review werden Studien zitiert, welche die Wachstumshemmung von filamentösen Pilzen sowie Aktivität gegen weitere Pilzspecies belegten (Chung et al. 1998). Es wird u.a. eine Wirkung gegen Candida albicans durch einen Extrakt bzw. Inhaltsstoffe einer Terminalia‐Art angeführt. Für C. albicans sind die Literaturangaben insgesamt allerdings widersprüchlich, andere Studien (auch die oben angeführten von Smullen und Chaudhari) fanden keine Wirkung der untersuchten Extrakte gegenüber diesem pathogenen Pilz.

Eine tabellarische Übersicht verschiedener Pilze, Hefen, Viren und Bakterien, die gegenüber Gerbstoffen empfindlich sind, ist jeweils mit Angabe relevanter Literaturstellen bei Chung et al. aufgeführt (Chung et al. 1998).

2.3.4. Möglicher Mechanismus

Die schon zuvor angesprochene, adstringierende Wirkung leistet zum antimikrobiellen Effekt sicherlich einen Beitrag. Der durch die Quervernetzung von Strukturproteinen gebildete Film schützt als mechanische Barriere gegen das Eindringen von Bakterien. Die Anheftung an Epithelzellen ist aber eine Voraussetzung für die Infektion und Besiedlung mit Bakterien (Puupponen‐Pimiä et al. 2005). Zusätzlich ist eine trockene Wunde kein guter Nährboden für Bakterien und Pilze (Foelster‐Holst et al. 2007). Für die direkte antimikrobielle Wirkung sind mehrere Wege der Hemmung vorstellbar. Entweder kommt es zu einer Bindung an wichtige, mikrobielle Enzyme (direkte Hemmung, Nachweis in verschiedenen Studien) oder an ihre Substrate (4 Typen von Protein‐Gerbstoff‐ Bindungen (siehe Abschnitt 2.2)). Vorstellbar ist auch eine Bindung an die Membran bzw. eine Störung von Membranfunktionen, wie z.B. dem Elektronentransport. Des Weiteren wurde eine Komplexierung von Metallionen, die für wichtige zelluläre Prozesse von Bedeutung sind, nachgewiesen (Chung et al. 1998). Zusätzlich zu den schon genannten Mechanismen wird bei Heinonen auch eine Destabilisierung der Cytoplasmamembran, die bis hin zur Durchlässigkeit führen kann, bzw. ein Eingriff in den mikrobiellen Metabolismus aufgeführt (Heinonen 2007). Man kann sich vorstellen, dass das Vorkommen von Gerbstoffen in bestimmten Früchten ein natürlicher Abwehrmechanismus gegen bakterielle Infektionen ist. Literaturteil 29

Eine antibakterielle Aktivität durch die Hemmung der Glucosyltransferase (Glucansynthese) von Streptococcus mutans wird beschrieben (Okuda 2005).

2.4. Wirkung bei Hautschädigung durch UV‐Strahlung

Als UV‐Licht der Sonne kommen natürlicherweise vor allem die sogenannte UV‐B‐Strahlung mit einer Wellenlänge von 290 bis 320 nm sowie die UV‐A‐Strahlung (315‐380 nm) vor. Die negativen Folgen einer zu starken UV‐Einstrahlung werden immer deutlicher. Außer dem Risiko, an Hautkrebs zu erkranken (siehe nachfolgenden Abschnitt), gibt es auch kosmetische Effekte einer vorzeitigen Hautalterung. Diese ist geprägt durch eine Verringerung der Hautelastizität, eine Veränderung in der Pigmentierung und Faltenbildung. Außerdem können durch UV‐B‐Strahlung elastische Fasern der Haut beschädigt oder in ihrer 3D‐ Struktur verändert werden (Tsukahara et al. 2001). UV‐Strahlung führt zu Entzündungsreaktionen in der Haut, so dass sie zu metabolischer Hyperaktivität angeregt wird. Diese kann in epidermaler Hyperproliferation und beschleunigtem Zugrundegehen von Kollagenfasern enden. Die zusätzliche DNA‐Schädigung kann zur Entwicklung maligner Zellen führen (Kaur et al. 2007).

Im Allgemeinen sind am Alterungsprozess hochkomplizierte biochemische Prozesse beteiligt. Der Einfluss von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und freien Radikalen ist heute unumstritten. Durch UV‐Exposition wird die Bildung von ROS deutlich gesteigert (Kaur et al. 2007). Neben den intrinsischen Faktoren stellt die UV‐Strahlung den bedeutendsten extrinsischen Faktor, der zur Hautalterung beiträgt, dar (Baumann 2007). Eine vorbeugende Maßnahme bzw. ein Therapieansatz kann daher die Anwendung von Antioxidantien bzw. Radikalfängern sein. Die Haut ist mit einem Netzwerk an enzymatischen und nicht‐enzymatischen antioxidativen Systemen ausgestattet. Dazu zählen u.a. Katalase, Glutathion‐Peroxidase, Superoxid‐ Dismutase (SOD), Tocopherole und Ascorbate (Kaur et al. 2007). Außerdem dient die oberste Hornschicht der Lichtstreuung, es kommt zur Absorption durch Melanin und zur Reparatur durch spezielle Enzyme. Bei intensiver Exposition oder zusätzlichen Risikofaktoren ist dieser Schutz aber nicht ausreichend (Elmets et al. 2001). 30 Literaturteil

2.4.1. Studien am Menschen oder ex‐vivo

Grüntee wurde auch für dieses Anwendungsgebiet getestet. Eine doppelblinde, randomisierte Studie mit 40 Frauen wurde über 8 Wochen durchgeführt. Die Probandinnen litten unter schwachen bis mittleren Anzeichen von Hautalterung durch Licht. Unter topischer (10 % Creme) bzw. oraler Anwendung von Extrakten aus Grünem Tee ergab sich allerdings kein positives Ergebnis. Nach dem Studienzeitraum waren keine klinisch signifikanten, sichtbaren Veränderungen zu beobachten. Nur der Gehalt an elastischem Gewebe verbesserte sich (Chiu et al. 2005). Dem steht eine Studie zur präventiven Anwendung von Grüntee gegenüber. Dort wurde bei topischer Anwendung von EGCG und seinen Derivaten eine deutliche Reduktion der UV‐ Licht‐induzierten Symptome angegeben. Es wurden 5‐6 Personen pro Studienaspekt eingesetzt (Elmets et al. 2001). Freiwilligen Probanden wurden GTP (Grünteepolyphenole, 5 % in Ethanol‐Wasser) oder verschiedene isolierte Catechine auf eine Hautpartie aufgetragen, welche 30 Minuten danach einer Strahlendosis ausgesetzt wurde, die doppelt so hoch wie die Dosis war, die für eine Hautrötung nötig ist (im Vorfeld ermittelt). Das UV‐ behandelte Gewebe wurde nach 24, 48 und 72 Stunden untersucht. Die Rötung wurde durch GTP um 80 % reduziert; die Zahl der Zellen, die Zeichen eines Sonnenbrandes aufwiesen, war um 66 % verringert. Die Langerhanszellen zeigten ein verlängertes Überleben (58 % Reduktion der Schädigung) und die DNA‐Schädigung war um 55 % vermindert. Die Hemmung der UV‐Schädigung des Gewebes konnte konzentrationsabhängig gezeigt werden. Bei den isolierten Catechinen waren nur die Verbindungen, die einen Gallatrest an Position 3 tragen, wirksam (Elmets et al. 2001; Nagle et al. 2006).

Bei der topischen Anwendung von GTP auf menschlicher Haut konnte in einer weiteren Studie eine konzentrationsabhängige Hemmung der DNA‐Schädigung durch UV‐B‐Strahlung gezeigt werden. Als Marker wurde die Bildung von Cyclobutan‐Pyrimidin‐Dimeren (CPD, zwischen zwei Thymidin‐Resten) herangezogen, welche als Mediatoren einer UV‐induzierten Immunsuppression gelten und evtl. mit verantwortlich für die Entstehung von Hautkrebs sind. Die Dimerbildung setzt augenblicklich nach UV‐Exposition ein, während die Hautrötung (Erythem) erst verzögert eintritt. GTP konnten die Dimerbildung konzentrationsabhängig hemmen, die Erythembildung war vermindert. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Reparatur/Elimination der DNA‐Schädigung bei GTP‐behandelter Haut schneller als die Literaturteil 31

üblichen 3 bis 4 Tage erfolgte. Eine Hemmung der UV‐Licht‐Penetration in tiefere Hautschichten wurde von der gleichen Gruppe nachgewiesen (Katiyar et al. 2001). Eine klinische Studie mit oraler Gabe von 400 oder 800 mg EGCG zeigte dagegen keinen Schutz vor UV‐induziertem Erythem (Nagle et al. 2006).

2.4.2. Studien im Tiermodell

In einem in‐vivo Maus‐Modell wurden EGCG und GTP in einer hydrophilen Cremegrundlage auf Hemmung einer UV‐induzierten Hautschädigung untersucht (Vayalil et al. 2003). Untersuchungen belegen, dass die GTP in einer hydrophilen Cremegrundlage bei 4 °C sechs bis sieben Monate und bei 25 °C zumindest drei bis vier Monate stabil sind. Um den Mechanismus des Hautschutzes zu verstehen, wurden verschiedene Parameter näher betrachtet. Die Zubereitung (Dosis ca. 1 mg/cm2) wurde vor einer einmaligen oder mehrfachen (täglich für 10 Tage) UV‐B‐Exposition aufgetragen. Die UV‐induzierte Verringerung von antioxidativen Enzymen wurde zurückgedrängt. Dies wurde in Gewebeproben der behandelten Mäuse untersucht. Die Wiederherstellung des ursprünglichen Enzymlevels betrug bei Glutathion‐Peroxidase bis zu 100 %, bei Katalase bis zu 90 %. Der oxidative Stress (gemessen als Lipidperoxidation und Proteinoxidation) wurde durch die Wirkstoffe reduziert. Es wurden mehrere Signalwege untersucht, und durch Immunoblotting von Hautlysaten bestätigt, dass eine UV‐induzierte Phosphorylierung von ERK1/2, JNK, und p38‐Proteinen der MAPK‐Familie durch die Testsubstanzen unterbunden wird (Vayalil et al. 2003). Die orale Gabe von GTP (im Trinkwasser) führte auch zu einer deutlichen, aber im Vergleich zur topischen Anwendung schwächeren Hemmung der einzelnen Parameter.

EGCG und GTP, die vor der UV‐Licht‐Exposition aufgetragen wurden, schützten im Tierversuch vor lokaler und systemischer Immunsuppression (Katiyar et al. 2001). Bei Anwendung von EGCG auf Maushaut konnte eine Hemmung der Infiltration von CD11b+‐ Zellen gezeigt werden. CD11b ist ein Oberflächenmarker für Makrophagen und Neutrophile. Die demonstrierte Stimulation des Immunsystems wird als positiv angesehen, da dadurch einer Tumorentstehung vorgebeugt werden soll (Katiyar et al. 2001).

32 Literaturteil

Tsukahara et al. untersuchten einen Extrakt von Sanguisorba officinalis L. auf seine Wirkung bei UV‐B‐Einstrahlung auf Rattenhaut (Tsukahara et al. 2001). Hierzu wurden die Hinterläufe von drei Wochen alten Ratten dreimal pro Woche UV‐B‐Strahlung in einer Dosis, die noch kein Erythem (Hautrötung) hervorruft, ausgesetzt. Der Extrakt (0,2 % oder 1 % in 80 % EtOH) wurde direkt nach der Bestrahlung und ein Tag danach aufgetragen. Eine konzentrations‐ abhängige Hemmung der Faltenbildung und der Faserdegradierung wurde beobachtet. Die Hautelastizität blieb erhalten. Als Inhaltsstoffe des Extrakts aus Wurzeln und Rhizom werden verschiedene Gerbstofftypen angegeben. Für den Gesamtextrakt wird eine Hemmaktivität gegenüber Elastase genannt. Allerdings konnten die zum Vergleich eingesetzten Gerbstoffe aus Grüntee die Fibroblastenelastase nicht hemmen. Eine Hemmung der Elastase aus Fibroblasten führt zur Reduktion der Faltenbildung, erhält die Hautelastizität und verhindert Veränderungen in der dreidimensionalen Struktur der elastischen Fasern Die Autoren schließen daher nicht aus, dass die in Sanguisorba enthaltenen Gerbstoffe nicht allein die Wirkstoffe sind. Allerdings könnten Gerbstoffe aufgrund ihrer Fähigkeit zur multiplen Enzymhemmung trotzdem zu einer Wirkung in‐vivo beitragen (Tsukahara et al. 2001). Eine weitere Untersuchung der Wirkstoffe fand nicht statt.

2.4.3. Möglicher Mechanismus

Eine koreanische Arbeitsgruppe führte ebenfalls verschiedene Untersuchungen an einem Sanguisorba officinalis Extrakt durch (Kim et al. 2008). So wurde in‐vitro auf Hemmung von Elastase, MMP1‐Expression und antioxidative Eigenschaften geprüft und in menschlichen Fibroblasten auf eine Induktion der Typ I Kollagensynthese getestet. Der Extrakt ist ein potenter Radikalfänger und außerdem ein guter Hemmstoff für Elastase (IC50‐Wert 42,3 µg/mL). Dies bestätigt die Ergebnisse von Tsukahara, wobei nicht klar hervorgeht, auf welche Elastase sich Kim et. al. beziehen. Eine konzentrationsabhängige Hemmung von MMP1 konnte ebenfalls gezeigt werden. Der Extrakt ist in den untersuchten Konzentrationen nicht cytotoxisch. Diese Wirkungen sind aber nicht allein auf die Gerbstoffe zurückzuführen, da ein aus dem Extrakt isoliertes Triterpenglycosid ebenfalls in den verwendeten Testsystemen aktiv war, wenn auch teilweise schwächer (Kim et al. 2008).

Für EGCG und GTP werden bei Nagle et al. weitere in‐vitro‐Studien angeführt, die zeigen, dass EGCG DNA‐Schäden verringern kann und es dadurch zu einer Erhöhung des Literaturteil 33

Zellüberlebens kommt (Nagle et al. 2006). Allerdings sei EGCG nicht durch Absorption der UV‐Strahlung wirksam gegen Sonnenbrand/UV‐Hautschädigung. Der bei Elmets et al. eingesetzte GTP‐Extrakt zeigt eine UV‐Absorption bei 273 nm, aber nicht bei Wellenlängen im UV‐B‐Bereich (Elmets et al. 2001). Dafür spricht auch, dass im Tierversuch die orale Gabe von GTP photoprotektiv gewirkt hat, wenn auch schwächer als die topische Anwendung. Das wäre bei einer direkten Wirkung nicht möglich. Auf der Basis des negativen Ergebnisses bei schon bestehender Hautschädigung (Studie Chiu 2005) postulieren Nagle et al., dass es mehr ein Schutz‐ als ein Reparaturmechanismus sei.

Die in‐vivo‐Untersuchungen am Mausmodell identifizierten verschiedene Enzyme (Glutathion‐Peroxidase, Katalase,…) sowie Oxidationsreaktionen von Lipiden und Proteinen als biochemische Targets für GTP, die eine Wirksamkeit auf molekularer Ebene beweisen (Vayalil et al. 2003).

Ein Zeichen der Hautalterung ist eine veränderte Pigmentierung. Ein Schlüsselenzym der Melanin‐Biosynthese ist die Tyrosinase. Melanin wird durch verschiedene Oxidationsreaktionen gebildet. Trotz seiner wichtigen physiologischen Rolle (UV‐Absorption, Abfangen von ROS) ist eine unkontrollierte Hyperpigmentierung zumeist unerwünscht. Eine Übersicht über die wichtigsten Hemmstoffe ist bei Kim et al. dargestellt. Hier ist auch EGCG aufgeführt (Kim et al. 2005). An et al. bestätigen in ihren Untersuchungen die Hemmung verschiedener Enzyme. Es wurden Gerbstoffe und weitere Polyphenole aus Blättern von Diospyros kaki (Kakibaum, Sharonfrucht) isoliert und auf ihre Wirkung gegen Falten untersucht. Zwei verschiedene Fraktionen mit einem hohen Anteil an phenolischen Verbindungen wurden getestet und zeigten eine deutliche Hemmung von Xanthinoxidase, Tyrosinase, Kollagenasen und Elastase. Das Zusammenspiel dieser Effekte kann bei Hautproblemen und gegen Falten unterstützend wirken. Ein Einsatz als Hautaufheller ist denkbar. Daher könnten diese Extrakte in kosmetischen Produkten eingesetzt werden, wie dies in der traditionellen Medizin schon lange der Fall ist (An et al. 2005).

34 Literaturteil

2.5. Hauttumore

Der Prozess der Tumorentstehung lässt sich in drei Phasen unterteilen. Die erste ist die Initiation, die von genetischen Veränderungen herrührt. Die Tumorpromotion ist die zweite Stufe, diese ist noch reversibel und drückt sich in einem veränderten Expressionsmuster aus. Die Tumorprogression ist die dritte Stufe, diese ist letztendlich irreversibel. Sie kann spontan erfolgen und ist durch malignes Wachstum charakterisiert. Das Fortschreiten wird durch genetische Fehler, die aufgrund der gesteigerten zellulären Proliferation erfolgen, noch verstärkt (Chen et al. 2008; Pitot 1993). Krebserkrankungen haben in den Industriestaaten eine große Bedeutung. Daher wird mit enormem Einsatz nach Stoffen zur Chemoprävention oder Wachstumshemmung von Tumoren gesucht. Chemoprävention bedeutet, dass durch die Gabe von natürlichen oder synthetischen Verbindungen das Auftreten von Krebs verringert wird. Dabei möchte man die Entwicklung der Krankheit verlangsamen, blockieren oder umkehren. Ein zentrales Ziel ist es dabei, die fehlgesteuerten Signalwege positiv zu beeinflussen (Chen et al. 2008).

Ein wichtiger Risikofaktor bei der Entstehung von Hauttumoren ist die UV‐Strahlung. Es gibt Schätzungen, dass allein in den USA pro Jahr über 1 Million neuer Hautkrebs‐Diagnosen (ohne Melanom) gestellt werden (Katiyar et al. 2001). Zu den Hauttumoren allgemein zählen beispielsweise Basalzellenkrebs (Basaliom), Plattenepithelcarcinom (Spinaliom) und malignes Melanom. UV‐Strahlung kann das Immunsystem supprimieren und als Tumorinitiator, ‐promotor sowie als Co‐Carcinogen wirken. Eine Schädigung beispielsweise durch Sonnenbrand kann auch die DNA betreffen. Es können Dimere entstehen (Cyclobutan‐ Pyrimidin‐Dimere, CPD, mit Thymidin), die als Mediatoren für UV‐B‐induzierte Immunsuppression und Hautkrebsinduktion angesehen werden. Die Dimere können zu Mutationen führen und bei zu großer Schädigung cytotoxisch sein. Die Zellen werden in die Apoptose geleitet (Katiyar et al. 2001).

2.5.1. Studien

In einem Review von 2006 wurden die vorbeugenden Eigenschaften von Grünteepolyphenolen auf die Entstehung von Krebs in Haut, Lunge und Intestinum zusammengestellt (Sang et al. 2006). Im Tiermodell gibt es für Hautkrebs 16 positive Studien Literaturteil 35 und keine negative. Das ist die beste Datenlage (gesehen als Verhältnis von positiven zu negativen Studien) für diese Krebsart (Sang et al. 2006). Allerdings wurden die einzelnen Studien nicht als Literaturstelle angegeben und die untersuchten Krebsarten nicht genauer spezifiziert. Chen et al. berichten, dass aufgrund von Erfolgen im Tiermodell (Senkung der Tumorinzidenz) und bei epidemiologischen Studien nun Klinische Studien der Phase I und II am Menschen durchgeführt werden sollen, um den Effekt von Grünem Tee gegen Krebs zu überprüfen. Jedoch wird das Ziel der Untersuchungen und die Krebsart nicht genannt. In in‐vitro‐Studien konnte gezeigt werden, dass Teepolyphenole Apoptose selektiv in Tumorzellen induzieren können (Chen et al. 2008).

Teepolyphenole und andere Gerbstoffe werden als anticarcinogen angesehen (Chung et al. 1998). Es wird eine Studie vorgestellt, die gezeigt hat, dass im Mausmodell die TPA (Tetradecanoylphorbolacetat)‐induzierte Tumorpromotion durch die topische Applikation von Grünteepolyphenolen (GTP) gehemmt werden konnte. Weitere Studien bestätigten diese Ergebnisse (Perchellet et al. 1994). Die Tumor‐auslösende Wirkung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (u.a. Initiatoren) konnte durch die topische Anwendung von GTP (oder EGCG) im Mausmodell unterdrückt werden. Für Ellagsäure ist ebenfalls eine Hemmung der Tumorbildung in‐vitro und in‐vivo gezeigt worden. Es wurde postuliert, dass Ellagsäure als Anticarcinogen wirken kann, da sie den Metabolismus von Procarcinogenen hemmt, an DNA binden kann und damit eine Methylierung schwieriger macht, sowie als Radikalfänger fungiert (Chung et al. 1998). Mehrere Tabellen zeigen in dieser Arbeit Literaturübersichten über die anticarcinogene und antimutagene Aktivität von Gerbstoffen. Für die anticarcinogene Wirkung gegen Hautkrebs gibt es Berichte zur Aktivität von Ellagsäure, GTP und Gallotanninen. Chen et al. zeigen, dass im Mausmodell durch Grünteepolyphenole (topische Applikation) die Tumorhäufigkeit, das Tumorvolumen und die Anzahl der Tumorherde auf der Haut deutlich reduziert werden können. Sie gehen davon aus, dass GTP in allen drei Stufen der Tumorentstehung wirksam sind (Chen et al. 2008). Dieser positive Effekt konnte in einem zweistufigen Carcinogeneseexperiment auf Maushaut für EGCG allein bestätigt werden (Okuda 2005). Nach 25 Wochen war die Zahl der Mäuse, die durch DMBA (Dimethylbenzoanthracen, Tumorinitiator) und Teleocidin (Tumorpromotor) einen Tumor entwickelt haben, auf weniger als ein Viertel im Vergleich zur 36 Literaturteil

Kontrollgruppe gesunken. Die Zahl der Tumore pro Maus wurde auf 5 %, bezogen auf die Kontrollgruppe, reduziert. Im Mausmodell konnte durch die topische Anwendung von EGCG in einer hydrophilen Creme (Dosis ca. 1 mg/cm2 Hautfläche, ca. 25 min vor der Bestrahlung aufgetragen) ein hoher Schutz vor Tumorentstehung durch Strahlung erzielt werden (Tumorinzidenz 60 % Hemmung nach 24 Wochen, Tumoranzahl 86 % Hemmung, Tumorvolumen 95 % Hemmung). In der unbehandelten Kontrollgruppe hatten bereits nach 16 Wochen 100 % der Mäuse Tumore entwickelt. Die Anwendung einer speziellen Formulierung könnte die Bioverfügbarkeit erhöhen (Kaur et al. 2007; Mittal et al. 2003). Über einen Anwendungszeitraum von 30 Wochen waren keine Nebenwirkungen beobachtet worden.

2.5.2. Möglicher Mechanismus

Als möglicher Mechanismus kann eine Hemmung der Gelatinasen MMP2 und MMP9 durch EGCG postuliert werden (Garbisa et al. 2001). Diese Enzyme haben eine große Bedeutung bei der Tumorinvasion und Metastasierung. Zusätzlich werden weitere Proteasen gehemmt, beispielsweise Kollagenasen (direkt bzw. durch eine gesteigerte Expression ihres Inhibitors TIMP) oder das Proteasom, wobei letzteres sehr unspezifisch ist (Sang et al. 2006). Ein antimutagener Effekt von Geraniin, Pentagalloylglucose und EGCG wurde experimentell im Ames‐Test mit Salmonella typhimurium demonstriert (Okuda et al. 1984; Okuda 2005). Als Mutagene wurden Trp‐P‐2 und N‐OH‐Trp‐P‐2 eingesetzt. Ein mutagener Effekt der Gerbstoffe selbst wurde zuvor ausgeschlossen. Es konnte eine Hemmung der Ornithin‐Decarboxylase durch topische Anwendung von Gerbsäure gezeigt werden. Dieses Enzym wird mit der Tumorpromotion in der Maushaut in Verbindung gebracht (Chung et al. 1998).

EGCG werden starke krebspräventive Eigenschaften zugeschrieben. Bei verschiedenen Untersuchungen wurde eine Hemmung von Enzymen, die mit Krebs in Verbindung gebracht werden, wie NO‐Synthase, TNF‐α, Telomerase und Urokinase, bestätigt (Katiyar et al. 2001). Darüberhinaus existieren Daten, dass EGCG pro‐apoptotisch im frühen Krebsstadium ist. Telomerase beispielsweise ist in 85 bis 90 Prozent aller menschlichen Tumore exprimiert (Baumann 2007). Das zeigt die Bedeutung dieser festgestellten Hemmung. Literaturteil 37

Einen inhibitorischen Einfluss auf die Freisetzung von TNF‐α in‐vitro haben auch Inhaltsstoffe (Ellagitannine) einer Ahornart (Acer nikoense) in einem ähnlichen Konzentrationsbereich (30 µM bis 80 µM) wie EGCG (Yoshida et al. 2005).

Ein wichtiger Punkt ist in diesem Zusammenhang die Bioverfügbarkeit und die Biotransformation. Sang et al. kritisieren daher zu Recht, dass in‐vitro‐Studien durchgeführt werden, ohne die Bioverfügbarkeit zu beachten (Sang et al. 2006). Die Anwendung auf der Haut, wo durch direkte Applikation höhere Konzentrationen erreicht werden können, ist eine Möglichkeit, die schlechte orale Bioverfügbarkeit zu umgehen. Des Weiteren können auch Effekte durch Oxidationsprodukte nicht bei allen Versuchsprotokollen ausgeschlossen werden. Catechine sind unter Zellkulturbedingungen nicht immer stabil gegenüber Oxidation. Hierzu fehlen weitere Studien. Als Mechanismus gegen eine Tumorentstehung ist eine Hemmung von Transkriptionsfaktoren (AP‐1, NF‐κB), Signalwegen von Wachstumsfaktoren sowie MAP‐ Kinasen vorstellbar, die zur Senkung der Angiogenese, des Tumorzellwachstums oder zur Induktion von Apoptose führen kann (Sang et al. 2006). Abbildung B.3 zeigt ein Diagramm aus diesem Review, in dem eine Vielzahl von möglichen weiteren Angriffspunkten von EGCG (10 µM bis 100 µM) zusammengestellt wurde. Häufig werden jedoch die in‐vitro‐Versuche mit sehr hohen Konzentrationen durchgeführt, die in‐vivo nicht erreicht werden können. Außerdem fehlt der Beweis der Wirksamkeit im Tiermodell (Sang et al. 2006). Es gibt eine kleine Anzahl von Studien, die zeigen, dass EGCG bereits in submikromolaren Konzentrationen wichtige Targets wie DNA‐Methyltransferase, Squalenepoxidase, antiapoptotische Bcl‐2‐Proteine und Signalwege über VEGFR (vascular endothelial growth factor receptor) hemmen kann (Nagle et al. 2006). Dagegen sind andere Studien mit so hohen Dosen an GTP ausgeführt worden, dass die Übertragbarkeit von beispielsweise beobachteten cytotoxischen Effekten, die tumorspezifisch sein sollen, auf in‐vivo‐ Verhältnisse fraglich ist (Nagle et al. 2006).

Eine Hemmung eines Teils der bereits genannten Targets wurde auch in der im vorigen Kapitel vorgestellten Untersuchung von Vayalil et al. bestätigt (Vayalil et al. 2003). So konnte eine Hemmung der Reduktion von antioxidativen Enzymen (Glutathion‐Peroxidase, 38 Literaturteil

Katalase), eine Hemmung von Protein‐ und Lipidoxidation sowie eine Hemmung der Phosphorylierung von MAPK in‐vivo (in Lysaten der Maushaut) demonstriert werden.

DNA‐Methyltransferase MMPs Arachidonsäure‐ Proteasom Metabolismus

MAP‐Kinasen Telomerase

Laminin‐ AP‐1 Rezeptor EGCG EGFR NF‐κB Signalweg

oxidativer CDKs Stress

Topoisomerase Proliferation/ Transformation Angiogenese Apoptose ↑

Abbildung B.3: Aus in‐vitro Studien abgeleitete mögliche Mechanismen der tumorpräventiven Wirkung von EGCG in Konzentrationen von 10 – 100 µM. Mit Ausnahme der Apoptose handelt es sich um hemmende Effekte (mod. aus (Sang et al. 2006)).

Ein Teil der Wirkung wird den antioxidativen Eigenschaften zugeschrieben. Ein Zusammenhang von Hauttumoren und dem Vorliegen von freien Radikalen, die beispielsweise durch Sonneneinstrahlung entstehen können, wird vermutet. UV‐induzierter

Stress der Haut äußert sich u.a. in der Produktion von PGE2 und Aktivierung des EGFR (epidermal growth factor receptor). Es kann dadurch zu Entzündungsreaktionen und Hyperproliferation kommen (Elmets et al. 2001). Die meisten Gerbstoffe weisen eine hohe Aktivität als Radikalfänger auf. Für Ellagitannine ist in verschiedenen Testsystemen ein stärkerer antioxidativer Effekt als bei α‐Tocopherol gemessen worden (Yoshida et al. 2000). Eine Übersicht zu den Studien, welche die antioxidativen Eigenschaften von Proanthocyanidinen verschiedener Herkunft untersucht haben, ist bei Aron et al. dargestellt (Aron et al. 2008). Die phenolische Struktur der Flavan‐3‐ole ist dazu geeignet, freie Radikale abzufangen, die dabei entstehenden Produkte sind weniger gesundheitsschädlich. Literaturteil 39

Außerdem sind die Verbindungen in der Lage, mit Metallionen Chelate zu bilden und ihre Toxizität dadurch zu verringern.

Chung et al. stellen verschiedene Studien vor, die eine Verringerung der Hydroperoxid‐ Bildung durch verschiedene Gerbstoffe zeigen (Chung et al. 1998). Es gibt zudem Hinweise, dass auch eine „indirekte“ antioxidative Wirkung besteht. Diese kommt über eine Induktion endogener Enzyme, die an Schutzmechanismen beteiligt sind, zustande (Stevenson et al. 2007). Dabei werden beispielsweise Superoxiddismutase (SOD), Katalase und Glutathion‐Peroxidase hochreguliert. Diese können Hydroperoxide entgiften.

Es gibt in der Literatur immer wieder Berichte, dass Gerbstoffe selbst carcinogen sein können. Dies wird auf die Beobachtung zurückgeführt, dass bei bestimmten Personengruppen, die viel Gerbstoff‐reiche Lebensmittel konsumieren, bestimmte Krebsarten häufiger auftreten. Hierunter fällt z.B. Speiseröhrenkrebs, der verstärkt bei (übermäßigem) Genuss von Betelnuss und bestimmten Kräutertees auftritt. Allerdings ist dieser Effekt wohl eher auf Begleitstoffe und weitere Lebensumstände als auf die Gerbstoffe selbst zurückzuführen (Chung et al. 1998).

2.6. Weitere Anwendungsgebiete

2.6.1. Atopische Dermatitis und Psoriasis

Zu den chronisch‐entzündlichen Hauterkrankungen gehören auch die Atopische Dermatitis (Neurodermitis) und Psoriasis (Schuppenflechte). Beide Krankheitsverläufe sind noch nicht vollständig verstanden, eine Beteiligung des Immunsystems wird angenommen. Zur Therapie der Neurodermitis gehören die Behandlung der trockenen oder manchmal auch nässenden Hautstellen mit antientzündlichen Wirkstoffen (Immunsuppressiva und Kortikoide) und eine Basispflege der Haut. Bei Psoriasis, einer z.T. erblich bedingten Autoimmunerkrankung, entstehen sogenannte Plaques, die durch eine Hyperproliferation der Keratinocyten stark schuppen. Entzündungsmediatoren werden in diesen Plaques u.a. durch die eingewanderten 40 Literaturteil

Neutrophilen Granulocyten freigesetzt. Als Therapie werden meistens eine intensive Hautpflege, antientzündliche Substanzen oder Immunmodulatoren eingesetzt.

Das synthetische Tannin Tamol® PP wird beispielsweise bei juckenden Dermatosen eingesetzt. Experimentell wurde bestätigt, dass die Histamin‐Freisetzung aus Hautmastzellen reduziert wird. Zusätzlich wurde ein hemmender Effekt von Tamol® gegenüber Humaner Neutrophiler Elastase (HNE) (Mrowietz et al. 1991), Plasmin und Mastzellchymase gezeigt (Wiedow et al. 1997; Zuberbier et al. 1999). Tamol® ist in der Lage, in die Haut zu penetrieren. Es gelangt bei beschädigtem Stratum corneum bis in die Epidermis und Dermis, was für eine pharmakologische Wirksamkeit bei Ekzemen u.a. Erkrankungen wichtig ist (Wirtz et al. 1995). Diese pharmakologischen Effekte und nicht allein die nur in sehr hohen Dosen „gerbenden“ Eigenschaften (arzneilich nicht gebräuchlich) erklären die klinische Beobachtung. Das auf dem Markt befindliche Produkt Tannolact®, das für die Behandlung von Hauterkrankungen dieses Formenkreises indiziert ist, ist Gegenstand von Abschnitt 2.6.2.

Für Elastase (HNE) konnte gezeigt werden, dass sie Keratinocyten über den EGFR‐Signalweg zur Hyperproliferation anregt (Meyer‐Hoffert et al. 2004; Rogalski et al. 2002). Dies ist vor allem bei Psoriasis ein Grund für den Krankheitsverlauf. Für strukturell verschiedene Gerbstoffe konnte eine Elastase‐hemmende Wirkung bestätigt werden (Foelster‐Holst et al. 2007; Hrenn et al. 2006). Daher könnte die epidermale Hyperplasie durch den Einsatz dieser Naturstoffe reduziert werden. Allerdings stehen Studien zur Bioverfügbarkeit und der Nachweis, dass die Proliferation in‐vivo gehemmt wird, noch aus.

Ein weiterer wichtiger Mechanismus bei entzündlichen Hauterkrankungen ist die vermehrte Expression von ICAM‐1 (intercellular adhesion molecule‐1), was in der Folge zu einer Interaktion von Leukocyten und Keratinocyten führt. ICAM‐1 wird u.a. durch inflammatorische Cytokine wie Interferon‐γ (IFN‐γ) hochreguliert (Bito et al. 2000). In einem in‐vitro‐Versuch mit einer Keratinocyten‐Zell‐Linie wurde Pycnogenol® (Rindenextrakt der Strandkiefer) auf seine hemmenden Eigenschaften überprüft. Eine zeit‐ und konzentrationsabhängige Hemmung der induzierbaren ICAM‐1‐Expression sowie eine verringerte Interaktion mit cokultivierten T‐Zellen konnte ermittelt werden (Bito et al. 2000). Literaturteil 41

Verschiedene in‐vitro‐Untersuchungen zu den antiinflammatorischen und antioxidativen Eigenschaften von Pycnogenol®, das vor allem Proanthocyanidine und Phenolsäuren enthält, sind als Übersichtsartikel 2002 zusammengestellt worden (Rohdewald 2002). Eine weitere Zusammenstellung der in‐vitro‐Versuche ist bei (Sarikaki et al. 2004) aufgeführt. Auf der Grundlage dieser Untersuchungen kann das therapeutische Potential von Gerbstoffen bei Patienten mit entzündlichen Hauterkrankungen erklärt werden.

2.6.2. Tannolact® (Firma Galderma) als Beispiel für ein etabliertes Fertigarzneimittel

Der synthetische Gerbstoff (Phenol‐Methanal‐Harnstoff‐Polykondensat, sulfoniert, Natriumsalz), der in den Präparaten, die als Creme, Lotio, Puder, Badezusatz etc. auf dem Markt sind, enthalten ist, erlaubt die Anwendung bei oberflächlichen Hauterkrankungen, die mit Entzündungen, nässenden Ekzemen und Juckreiz verbunden sind. Dazu gehört auch die unterstützende Behandlung von Windeldermatitis, entzündlichen Hauterkrankungen wie Windpocken und von übermäßiger Schweißsekretion. Die lokale Anwendung ist auch in der Schwangerschaft und Stillzeit möglich. Von einer Resorption ist bei intakter Hornschicht der Haut nicht auszugehen, wie in Penetrationsuntersuchungen bewiesen wurde. Histochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass durch die Eiweiß‐Gerbstoff‐Komplexbildung der synthetische Gerbstoff in den oberen Hautschichten gebunden wird (Einlagerung in das Stratum corneum, aber nicht mehr in das Stratum basale). Bei geschädigter oder fehlender Hornschicht werden in der Epidermis Konzentrationen erreicht (1000 – 1800 μg/mL), bei denen in experimentellen Untersuchungen eine Hemmung der Aktivität der HLE und eine Verminderung der Anzahl der 12‐HETE‐Rezeptoren (12‐Hydroxyeicosatetraensäure, Arachidonsäuremetabolit) nach 24 stündiger Inkubation nachgewiesen wurden (Arenberger et al. 1992; Mrowietz et al. 1991). Als Wirkung wird ein eiweißfällender Effekt, der zu adstringierenden, gerbenden und schorfbildenden Effekten führt, in Betracht gezogen. Die adstringierende Eigenschaft führt zu einer Verdichtung des kolloidalen Gefüges und zu einer oberflächigen Abdichtung. Damit verbunden ist eine Entquellung (Fällung quellfähiger Eiweiße) und Austrocknung sowie eine Hornhautstabilisierung durch die Bildung eines schützenden Films. Durch die adstringierende Wirkung synthetischer Gerbstoffe ist die Unterdrückung einer erhöhten Schweißsekretion möglich. Untersuchungen belegen einen direkten Einfluss auf entzündungsvermittelnde 42 Literaturteil

Enzyme wie Elastase, Chymase und Plasmin (Wiedow et al. 1997). Der Gerbstoff ist in der Lage, in einer Konzentration von 1 µg/mL die Freisetzung von Histamin aus Mastzellen zu hemmen, und zwar stärker als Dexamethason in der gleichen Konzentration. Eine antipruriginöse Wirkung ist an Freiwilligen durch die Histamin‐Quaddelmethode belegt. Mit der Lippenreiz‐Methode wurde nach Applikation des synthetischen Gerbstoffs eine mit einem Lokalanästhetikum vergleichbare Unempfindlichkeit gezeigt, die, wie klinische Daten mit freiwilligen Probanden belegen, insbesondere zur Schmerzlinderung führt (Puschmann et al. 1985). Die adstringierende Eigenschaft des in Tannolact® enthaltenen Wirkstoffes bedingt durch den Entzug an mikrobiell verwertbarem Substrat eine indirekte antibakterielle und antimykotische Wirkung. Auch nässende und intertriginöse Dermatosen, die bakteriell und mit Fadenpilzen, insbesondere aber mit Hefepilzen wie Candida albicans, superinfiziert sind, können deshalb einer Therapie zugänglich sein. Dies stellt die Firma in der Fachinformation so dar; wie in Abschnitt 2.3.3 gezeigt, ist die Datenlage zur antifungalen Wirkung von Gerbstoffen allgemein widersprüchlich. Im Gegensatz zu pflanzlichen Gerbstoffen ist der synthetische Gerbstoff in Tannolact® gegenüber fermentativen (enzymatischen) Einflüssen stabil (Quelle: Fachinformationen zu den Produkten Tannolact® Lotio, Creme, Fettcreme, Puder, Badezusatz).

2.6.3. Therapie von Feigwarzen

Polyphenon E® Salbe (Veregen™) der Firma MediGene AG wurde 2007 von der FDA in den USA zur Behandlung von externen Genitalwarzen (Condylomata acuminata) bei Personen über 18 Jahren zugelassen. Enthalten sind 15 % „Kunecatechine“ oder auch „Sinecatechine“, ein nach einem speziellen Verfahren gewonnener, definierter Extrakt aus Blättern von Grünem Tee (Camellia sinensis). Die wirksamen Bestandteile sind Tee‐Polyphenole, vor allem EGCG und weitere Catechine. Die Wirksamkeit wurde in zwei randomisierten, doppelblinden Studien mit 397 Patienten überprüft. Nach 16 Wochen Behandlung (Applikation 3 Mal pro Tag) waren bei 53,6 % der Patienten alle Warzen verschwunden. Dies war bei 35,3 % der Patienten, die nur mit der Grundlage behandelt wurden, ebenso der Fall (FDA Drug Approvals, Formulary 2007; Pressemitteilungen MediGene). Lokale Hautreaktionen waren häufig, aber schwach bis mittel ausgeprägt (Scheinfeld 2008). Literaturteil 43

Die Wirksamkeit dieses Präparates gegenüber Placebo scheint nicht besonders ausgeprägt zu sein. Nach oder unter der Behandlung können außerdem neue Warzen auftreten, die Behandlungsdauer sollte jedoch 16 Wochen nicht überschreiten. Die Firma wirbt im Gegensatz dazu mit einer niedrigen Rezidivrate (ca. 6 % bei 12 Wochen Nachbeobachtungszeit). Allerdings dürfte angesichts der mit dieser Erkrankung für den Patienten verbundenen Unannehmlichkeiten und Schmerzen auch eine Wirksamkeit in nur jedem zweiten Fall den alternativen Therapieversuch rechtfertigen. Zumal für die Standardtherapie mit Imiquimod (Aldara®) die Rate der Ausheilung in einer Studie über 16 Wochen an 224 Patientinnen ca. 60 % (vs. 20 % bei Placebo) und an 318 männlichen Probanden lediglich 23 % (vs. 5 % bei Placebo) betrug. Imiquimod hat dabei ein wesentlich schwerwiegenderes Nebenwirkungspotential (Fachinformation Aldara®).

Für Polyphenon E® gibt es noch eine weitere positive Studie (90 Patientinnen, 8 bis 12 Wochen) zur topischen und/oder oralen Anwendung bei Zervixläsionen. Die Infektionen mit HPV (Humanem Papilloma Virus) verschwanden bei ca. 70 % der Patientinnen und es kam zu einer Abheilung der Läsionen (Ahn et al. 2003; Nagle et al. 2006).

2.6.4. Sonstige Gebiete

Oligomere Proanthocyanidine wurden im Mausmodell auf die Förderung der Proliferation von Epithelzellen und Haarfollikelwachstum untersucht (Takahashi 2001). Bei den Proliferationsversuchen mit Haarepithelzellen oder Keratinocyten waren die Procyanidine B2 und C1 im unteren micromolaren Konzentrationsbereich aktiv. Im in‐vivo‐Versuch wurde Mäusen eine 1 %ige Lösung der Procyanidine appliziert. Nach 19 Tagen konnte eine Haarwachstumsförderung belegt werden, indem die Fläche gemessen wurde, die mit Haaren bewachsen war (Fläche B2: 70 %, Fläche C1: 78 %, Fläche Kontrollgruppe: 42 %).

Als weiteres topisches Anwendungsgebiet kann die Behandlung von Schlangenbissen gelten. Hierzu gibt es vor allem in der traditionellen Medizin Berichte. Chung et al. legen dar, dass die Hemmung von beispielsweise Hyaluronidase durch Gerbsäuren den hämorrhagischen Effekt von Schlangengift neutralisieren kann (Chung et al. 1998). Eine weitergehende Hemmung von Enzymen aus dem Schlangengift durch Gerbstoffe ist denkbar. Damit können lokale Reaktionen, die durch Schlangengifte hervorgerufen werden, behandelt werden. 44 Literaturteil

3. Bioverfügbarkeit, Metabolisierung

Für eine Wirksamkeit ist die Aufnahme der Verbindungen in die Haut bzw. die Penetration durch die Haut unerlässlich. Um einen direkten Eingriff in die Signalkaskade von beispielsweise Tumorzellen zu erreichen, muss die Substanz von den Zellen aufgenommen werden. Das hohe Molekulargewicht der Polyphenole und ihre hohe Anzahl an hydrophilen Gruppen sind Gründe für die schlechte orale Bioverfügbarkeit (rule of 5, (Lipinski et al. 1997)). Je nach Literaturquelle soll sie zwischen 2 % und bis zu 10 % betragen ((Stevenson et al. 2007) und andere). Durch das Vorkommen von Metaboliten in Urin und Faeces nach oraler Verabreichung an freiwillige Probanden muss man annehmen, dass ein gewisser Anteil an Gerbstoffen, vor allem von Proanthocyanidinen, aufgenommen wird. Allerdings ist bereits eine Metabolisierung durch die intestinale Flora gegeben, die nach der Aufnahme noch verstärkt wird (Aron et al. 2008; Heilmann et al. 1998). Ein Schema zur möglichen Biotransformation ist bei Lambert et al. gezeigt (Lambert et al. 2007). Es gibt nur sehr wenige Studien, welche die biologische Aktivität der entstehenden Metabolite untersucht haben. Außerdem wurde gezeigt, dass ein Efflux aus den Zellen die Bioverfügbarkeit drastisch verringern kann. EGCG und weitere Catechine konnten als Substrat für MRPs (multidrug resistance‐associated proteins) identifiziert werden (Lambert et al. 2007; Sang et al. 2006). Die Bioverfügbarkeit spielt aber für die Versuchsergebnisse eine große Rolle. So konnte bspw. gezeigt werden, dass sie in Mäusen größer ist als in Ratten. Damit übereinstimmend gibt es Daten, dass die Tumorentstehung in Mäusen deutlich besser gehemmt wurde als in Ratten (Sang et al. 2006). Zwei große Übersichtsartikel zur oralen Bioverfügbarkeit von Polyphenolen beim Menschen mit Plasmaspiegeln, Halbwertszeiten, Eliminationswegen und ihrer in‐vivo‐Wirksamkeit bilden den zweiteiligen Review von Manach und Williamson (Manach et al. 2005; Williamson et al. 2005). Der Bioabbau von Gerbstoffen durch Hydrolyse und Oxidation unter Zuhilfenahme mikrobieller Enzyme ist als Schema in einer Arbeit aufgeführt (Mingshu et al. 2006). Dort wird der Einsatz von Tannase (Tannin‐Acyl‐Hydrolase, aus Pilzen, Bakterien und Hefen), Polyphenoloxidase und Decarboxylase beschrieben, um biologisch aktive, kleine Moleküle zu erhalten. Diese könnten dann als definierte Verbindungen für verschiedene Anwendungsgebiete eingesetzt werden. Die Aktivität muss allerdings noch getestet werden. Literaturteil 45

2006 wurde eine Übersicht angefertigt, welche die Bioverfügbarkeit in der Haut von verschiedenen Nahrungsergänzungsmitteln (Polyphenole, Vitamine, u.a.) nach oraler Applikation vergleicht (Richelle et al. 2006). Bei oraler Einnahme wird eine Wirkung über einen indirekten Weg, d.h. über Second Messenger vermutet. Die Substanzen stehen erst nach der Passage des GI‐Trakts (Intestinale Barriere), der Verteilung durch die Blutzirkulation und eventueller Metabolisierung in der Haut zur Verfügung. Im Gegensatz zu Lambert wird hier die Metabolisierung als Vorteil im Sinne einer Aktivierung angesehen. Die gesamte Fläche der Haut mit allen Kompartimenten kann von einer systemisch verfügbaren Substanz erreicht werden. Für eine topische Anwendung spricht dagegen der direkte Applikationsweg einer vermutlich höheren Menge. Als Voraussetzung muss eine gewisse Stabilität der Verbindung gegeben sein, das Vorliegen der aktiven Form ist erforderlich und die Substanz muss ein Penetrationsvermögen in die Hautschichten aufweisen (Richelle et al. 2006). Kaur et al. stellen verschiedene Untersuchungen vor, die zeigen, dass die topische Anwendung vor allem zwei Vorteile hat (Kaur et al. 2007). Zum einen werden deutlich höhere Konzentrationen in der Haut erzielt, als dies bei oraler Einnahme der Fall wäre. Die systemischen Konzentrationen bleiben bei topischer Applikation meistens sehr gering, was für das Nebenwirkungspotential wichtig ist. Zum anderen wird eine Art Depot in den Hautschichten aufgebaut, das nicht abgewaschen werden kann und einige Tage anhält. Außerdem kann direkt der Teil der Haut geschützt werden, der dies am nötigsten hat. Neue Systeme zur gezielten topischen Anwendung von Antioxidantien müssen entwickelt werden. Eine passende Formulierung, die eine effiziente Freisetzung erlaubt, ohne die chemischen Eigenschaften der Substanzen (auch durch Unstabilitäten) zu verändern, muss gefunden werden. Dabei spielt auch die Löslichkeit und die Permeationsfähigkeit der Verbindungen eine große Rolle (Kaur et al. 2007). Dvorakova et al. konnten zeigen, dass bei topischer Anwendung (Maushaut, menschliche Haut) einer Cremegrundlage mit EGCG (10 %) eine hohe Konzentration (1 bis 20 % der aufgetragenen Dosis) in der Haut erzielt werden konnte (Dvorakova et al. 1999). Dabei wurde nur eine geringe Permeation gemessen, es sind daher keine systemischen Effekte zu erwarten. Der Zusatz eines Antioxidans (beispielsweise butyliertes Hydroxytoluol, BHT) war zur Stabilisierung von EGCG in der Zubereitung nötig. Im Gegensatz dazu dürfte die Menge an EGCG, die nach oraler Verabreichung in die Haut gelangt, deutlich geringer sein, zumal die orale systemische Bioverfügbarkeit nur rund 2 % beträgt (Dvorakova et al. 1999). 46 Literaturteil

Eine Untersuchung von Fang et al. vergleicht die Aufnahme und die Penetration verschiedener Grünteepolyphenole nach topischer Applikation sowie bei Anwendung von Elektroporation und Iontophorese (Fang et al. 2006). Als Modell diente Schweinehaut. (+)‐Catechin scheint besser aufgenommen zu werden als (‐)‐Epicatechin. Ein Galloylrest wirkt sich positiv aus. Vor allem EGCG wird gut aufgenommen, es entsteht eine Art Depot in der Haut, allerdings permeieren nur sehr wenige Moleküle durch die Haut.

Die dermale Bioverfügbarkeit von Pycnogenol®, einem Extrakt aus der Rinde der Strandkiefer, wurde untersucht (Sarikaki et al. 2004). Eine Aufnahme innerhalb von 30 Minuten in die menschliche Haut konnte gezeigt werden. Teilweise stieg die Aufnahme mit der Zeit noch weiter an. Dabei wurden verschiedene Substanzen wie Gallussäure und Catechin (nmol bis pmol‐Bereich) durch eine HPLC‐MS‐Methode detektiert. Die im Extrakt vorhandenen Hydroxyzimtsäurederivate konnten allerdings nicht detektiert werden. Hinweise auf eine Metabolisierung ergaben sich daraus, dass eine Substanz gefunden wurde, die im reinen Extrakt nicht detektiert worden war.

4. Zusammenfassung

Für die topische Anwendung von Gerbstoffen bei Wunden konnte gezeigt werden, dass die Abheilung beschleunigt wird und Entzündungsreaktionen gemildert werden. Das Gewebe wird durch die Erhöhung der Expression von VEGF und einer damit beschleunigten Angiogenese früher durchblutet. Die Bildung von Narbengewebe kann durch die Hemmung von Arginase I auf ein normales Maß reduziert werden. Die mechanische Belastbarkeit setzt früher ein. Diese Effekte könnten u.a. auf eine verbesserte Kollagen‐Neusynthese zurückzuführen sein. Bei dem Spezialfall der Brandwunden gibt es ebenfalls positive Erfahrungen. Für die Übertragung vom Tiermodell auf den Menschen fehlen Berichte. Der Einsatz von definierten Extrakten oder Einzelsubstanzen wäre wünschenswert, um die in in‐vitro‐Versuchen beobachteten Effekte besser mit den in‐vivo‐Versuchen korrelieren zu können. Zusätzliche Studien am Menschen und eine detailliertere Aufklärung der Wirkmechanismen sind für ein umfassenderes Verständnis des wundheilungsfördernden Potentials erforderlich. Literaturteil 47

Verschiedene Studien belegen eine antibakterielle, antivirale oder antifungale Wirkung von Gerbstoffen. Gerade in Hinsicht auf topische Erkrankungen, die mit Entzündungen einhergehen, bzw. auf Sekundärinfektionen sind diese Wirkungen wichtig. Verschiedene Wirkmechanismen wurden im Abschnitt 2.3 vorgestellt und scheinen plausibel. Außerdem kann gegenüber der konventionellen Antibiotikatherapie in zunehmendem Maße eine Resistenzentwicklung festgestellt werden. Gerbstoffe könnten bei topischer, direkter Applikation, für die eine systemische Bioverfügbarkeit nicht notwendig ist, als adjuvante Therapie eingesetzt werden.

Die besten Strategien, eine UV‐Licht‐induzierte, vorzeitige Hautalterung zu umgehen, ist das Vermeiden von Sonne, die Anwendung von Sonnenschutz und die Applikation von Stoffen, welche die Kollagenasen hemmen sowie die Kollagen‐Synthese fördern können. Außerdem wird eine Zufuhr von Antioxidantien (wie z.B. von Polyphenolen), welche die freien Radikale abfangen, empfohlen (Baumann 2007). In der Prävention der UV‐bedingten Hautschädigungen gibt es besonders für Grünteepolyphenole solide Untersuchungen. Die in in‐vitro‐Untersuchungen festgestellten Mechanismen erklären die im Tiermodell gezeigten Hemmungen von Erythembildung und weiteren Entzündungsreaktionen. Für die Behandlung von schon bestehenden Hautveränderungen nach UV‐Exposition gibt es allerdings keine positiven Studien.

Für die Tumorprävention und ‐behandlung von Hautkrebs gibt es positive Untersuchungen mit Gerbstoffen, vor allem aber auf in‐vitro‐Ebene oder im Tiermodell. Die Datenlage müsste dahingehend ausgeweitet werden, die benötigten Konzentrationen für die erzielten Effekte im in‐vivo‐Modell bei topischer Anwendung nachzuprüfen. Die in einem eigenen Abschnitt angesprochene Bioverfügbarkeit spielt bei dieser Anwendung eine größere Rolle als bspw. bei der Wundheilung. Denn es soll hier nicht nur zu einer oberflächlichen Wirkung kommen, sondern auch ein Eingriff in Signalkaskaden erfolgen. Ein mögliches chemopräventives Potential könnte durchaus vorhanden sein, allerdings müssen mögliche negative Effekt der Langzeittherapie noch erforscht werden. Außerdem muss die richtige Dosierung gefunden werden (Vayalil et al. 2003). Den vor allem älteren Beschreibungen, dass Gerbstoffe procarcinogen, mutagen und hepatotoxisch sind, muss vor einer weit verbreiteten Anwendung nachgegangen werden (Aron et al. 2008). 48 Literaturteil

Als postulierte Mechanismen kommen der antioxidative Effekt, Schutz der DNA vor Schädigung und/oder Methylierung, Induktion von Apoptose in Tumorzellen, Regulation des Zellzyklus und Hemmung der Zellproliferation in Betracht (Aron et al. 2008; Chen et al. 2008). Weitere Untersuchungen zur Identifikation zusätzlicher molekularer Targets stehen noch aus.

Weitere Anwendungsgebiete, bei denen Gerbstoffe als adjuvante Therapie eingesetzt werden, sind Atopische Dermatitis, Psoriasis, nässende Ekzeme und übermäßige Schweißsekretion. Ein Präparat (Polyphenon E® Salbe) ist in den USA zur Behandlung von externen Feigwarzen zugelassen, die europäische Zulassung ist beantragt.

Erste Untersuchungen zur Bioverfügbarkeit liegen vor, müssen aber noch ausgeweitet werden. Zusammen mit Studien zum molekularen Wirkmechanismus bilden sie die Grundlage für eine rationale Therapie mit Gerbstoffen. Ergebnisse 49

C. Ergebnisse

1. Phytochemische Untersuchungen traditioneller Arznei‐ pflanzen Costa Ricas

1.1. Auswahl der Pflanzenextrakte im EMSA

Aus Costa Rica wurden verschiedene lipophile und hydrophile Pflanzenextrakte zur Verfügung gestellt. Durch die Testung im EMSA sollten zwei aktive Extrakte, welche die NF‐κB DNA‐Bindung hemmen, ausgewählt und deren Inhaltsstoffspektren aufgeklärt werden. Die Durchführung des EMSAs ist im Experimentellen Teil in Kapitel F.5.3 beschrieben. In Abbildung C.1 ist das Ergebnis der Testung von Extrakten aus Hieronyma alchorneoides und aus Siparuna thecaphora dargestellt. Untersucht wurden methanolische (MeOH) sowie mit tert‐Butylmethylether (tBME) angefertigte Extrakte.

Hieronyma Siparuna alchorneoides thecaphora MeOHtBME MeOH tBME [µg/mL] 50 100 50 100 50 100 10050 TNF‐α ‐ +++++++++

W

○

Y 12 345678910

Abbildung C.1: Testung der Ausgangsextrakte von Hieronyma alchorneoides und Siparuna thecaphora im NF‐κB‐EMSA: Jurkat‐T‐Zellen wurden eine Stunde mit den Extrakten in den angegebenen Konzentrationen inkubiert, dann für eine Stunde mit TNF‐α (1 ng/mL) stimuliert. Anschließend wurden die Gesamt‐Proteinextrakte im EMSA untersucht. Bahn 1 zeigt einen Extrakt unbehandelter Kontrollzellen, in Bahn 2 wurden die Zellen nur für 1 h stimuliert. MeOH steht für Methanol als Extraktionsmittel, tBME für tert‐Butylmethylether. Das gefüllte Dreieck bezeichnet die spezifische NF‐κB‐Oligonucleotid‐Bande, der leere Kreis die unspezifische Bande und das leere Dreieck zeigt die Bande, die durch freies Oligonucleotid verursacht wurde. 50 Ergebnisse

Der tBME‐Extrakt dieser Pflanzen wurde jeweils für die anschließende Fraktionierung ausgewählt und nun in größerer Menge hergestellt und bearbeitet.

1.2. Hieronyma alchorneoides Fr. Allem.

1.2.1. Extraktauftrennung durch Säulenchromatographie und Untersuchung der erhaltenen Fraktionen auf Hemmaktivität im NF‐κB‐EMSA

Der erhaltene Extrakt wurde, wie in Abschnitt F.3.1 (Experimenteller Teil) beschrieben, durch Säulenchromatographie an Sephadex® LH 20 mit Methanol als Elutionsmittel aufgetrennt. Die biologische Aktivität der erhaltenen Unterfraktionen wurde im NF‐κB‐EMSA (50 µg Fraktion pro mL Medium) getestet. Es sollten vor allem NF‐κB‐hemmende Substanzen isoliert werden. Das Ergebnis dieses Tests ist in Abbildung F.1 (Exp. Teil) dargestellt. Aus den aktivsten Fraktionen H.a.10 und 12 konnten zwei Substanzen (H.1 und H.3) durch Umkristallisation aus eiskaltem Methanol isoliert werden. Eine weitere Verbindung (H.2) trat in der dazwischen liegenden Fraktion H.a.11 auf. Neben der Überprüfung im EMSA wurden die aktiven Fraktionen noch im Luciferase‐ Reportergen‐Assay untersucht.

1.2.2. Strukturaufklärung von 7, 4‘‘‐O‐Dimethylamentoflavon (H.1)

Die Umkristallisation aus eiskaltem Methanol ergab 43 mg einer Reinsubstanz aus Fraktion H.a.10 (siehe Exp. Teil, Abschnitt F.3.2). Die Strukturformel von Verbindung H.1 ist in Abbildung C.2 gezeigt.

OCH3 5'' 4''

3'' 6'' 5' '' 6' 4' OH 1 2'' 1* O 2* 8 O1 1' 3' H3CO 7 9 8* 9* 3* 2 2' 4* 7* 6 3 10* 10 HO 5 4 5* O 6* OH O OH

Abbildung C.2: Strukturformel der Verbindung H.1

Die Struktur dieser Verbindung wurde mittels NMR‐ und MS‐Analysen aufgeklärt. Das ESI‐Massenspektrum (Abbildung C.3) zeigt im positiven Modus ein Quasimolekülion bei m/z = 567,2 [M+H]+, was auf ein Molekulargewicht von 566 g/mol und eine Summenformel von C32H22O10 schließen lässt. Ergebnisse 51

567.2 100 [M+H]+ 95

90 85

80

75

70 65 60

55

50 45

Relative Abundance Relative 40 568.2 35 30

25 20

15 10 629.8 5 349.2 417.1 551.2 724.7 297.1 435.0 760.0 860.4 899.9 927.4 996.6 1066.8 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 m/z

Abbildung C.3: ESI‐Massenspektrum (positiver Modus) der Verbindung H.1 (7, 4‘‘‐O‐Dimethylamentoflavon)

Im 1H‐Spektrum (Abbildung C.4) treten 16 Signale auf, die für insgesamt 20 Protonen stehen. Zusätzlich tritt bei ca. 10,5 ppm ein Signal auf, das für zwei H‐Atome an Heteroatomen (OH‐ Gruppen), die eine Wasserstoffbrückenbindung zu einer Carbonylgruppe aufweisen, steht. Fast alle Signale haben eine chemische Verschiebung, wie sie für Aromaten charakteristisch ist. Aufgrund der chemischen Verschiebung und der Kopplungskonstanten wurde das Vorliegen von zwei ähnlichen, miteinander verknüpften Flavonoideinheiten postuliert. Zudem sind bei 55,5 ppm und 56,0 ppm mit den korrespondierenden Protonensignalen bei 3,75 ppm und 3,81 ppm (jeweils Multiplizität von 3 H) zwei charakteristische Signale für 2 Methoxygruppen zu erkennen. Im 13C‐Spektrum (Abbildung C.5) sind 29 Signale zu sehen, von denen zwei (δ = 114,4 und 127,9) deutlich größer erscheinen und für mehr als ein C‐Atom stehen können. Zwei Signale liegen im Bereich von Carbonylkohlenstoffen (δ = 181,9 und 182,1, C4 und C4*). Nach dem HSQC‐Spektrum (Abbildung C.7) treten 11 Methin‐, aber keine Methylengruppen auf. Das genannte Signal bei δ = 127,9 korreliert mit Protonensignalen bei δ = 7,66 (d, Integral für 2 H) und δ = 8,03 (d, 2 H). Letzteres Protonensignal koppelt mit dem C‐Atom bei 131,3 ppm. Unter dem Signal von δ = 127,9 können sich also 3 Kohlenstoffatome 52 Ergebnisse verbergen. Das Signal bei δ = 114,4 koppelt mit einem Signal bei 6,92 ppm, also mit 2 Protonen. Insgesamt liegen demnach 32 C‐Atome vor.

Aus dem H‐H‐COSY (Abbildung C.6) konnte eine schwache Kopplung zwischen den Protonen bei 6,33 ppm und 6,74 ppm entnommen werden. Die Signale erscheinen als breite Singuletts, was insgesamt für eine meta‐Kopplung spricht. Die Kopplung der Signale bei 6,92 ppm und 7,66 ppm ist charakteristisch für ein AA’BB‘‐System an para‐substituierten Aromaten. Die Kopplungskonstante J beträgt hier 8,5 Hz. Der weitere Aromat ist trisubstituiert (ortho‐ und para‐Substitution). Die Signale bei 7,15 ppm und 8,03 ppm koppeln zwar miteinander, stehen aber nur für 3 H‐Atome.

Aufgrund der Analyse der 1D‐ und 2D‐Spektren (1H‐1H‐ und 1H‐13C‐Korrelationen) konnte ein 3‘‐8*‐Biapigenin‐Grundgerüst identifiziert werden. Die Protonensignale für Ring A der ersten Einheit treten bei 6,74 ppm (H‐8) und 6,33 ppm 13 (H‐6) auf (dazugehörige C‐Signale bei δC8 = 92,6 und δC6 = 98,0). Das dazwischen liegende C‐7 erscheint bei 165,1 ppm und weist im HMBC‐Spektrum (Abbildung C.8) eine

Fernkopplung mit der Methoxygruppe bei 56,0 ppm (δH‐7‐OCH3 = 3,81) auf. Die Signale von C‐5, C‐9 und C‐10 sind ebenfalls durch HMBC‐long‐range‐Kopplungen zu identifizieren. C‐9 und C‐10 (δC9 = 157,2 und δC10 = 104,7) koppeln mit H‐8. C‐10 zeigt außerdem eine

Korrelation mit H‐6 sowie mit H‐3 (Ring C, δH3 = 6,88, δC3 = 103,2). Die Kohlenstoffe an C‐4 und C‐2 liefern Signale bei δC4 = 181,9 und δC2 = 163,1. Beide koppeln mit H‐3 im HMBC‐ Spektrum. Eine Carbonylfunktion bzw. die direkte Nachbarschaft eines Sauerstoffs im Ring sind der Grund für die starke Entschirmung und bedingen die chemische Verschiebung bei höheren ppm‐Werten. Das Signal für C‐2 zeigt darüber hinaus long‐range‐Kopplungen zum B‐Ring. Das Signal bei

8,03 ppm (H‐2‘ und H‐6‘, zugehörige Signale für C‐Atome bei δC2‘ = 131,3 und δC6‘ = 127,9) koppelt mit C‐2. Durch die 1H‐1H‐Kopplung (para) im COSY kann H‐5‘ bei 7,15 ppm identifiziert werden (δC5‘ = 116,2). Das Dublett weist ebenfalls eine Korrelation zu C‐4‘ bei 159,7 ppm auf. Dieses C‐Atom trägt eine OH‐Gruppe und ist daher weiter entschirmt. C‐1‘ und C‐3‘ treten bei δC1‘ = 120,8 (Kopplung zu H‐5‘) und δC3‘ = 120,0 in Resonanz. Aufgrund der chemischen Verschiebung des Signals von C‐3‘ ist der Aromat hier ebenfalls substituiert, was für eine Verknüpfung zum 2. Apigenin‐Baustein über C‐8*(δC8* = 104,0) spricht. Dieses Ergebnisse 53 kann über die long‐range‐Kopplung zu H‐2‘ sowie durch die Tieffeldverschiebung von

C‐8*gegenüber von C‐8 (δC8 = 92,6) belegt werden.

Das C‐8*‐Signal zeigt eine weitere Korrelation zu H‐6* (δH6* = 6,41, δC6* = 98,7). Dieses Protonensignal korreliert außerdem mit C‐10* bei 103,6 ppm. Die weiteren Signale des A‐Ringes der 2. Einheit liegen mit der Arbeit von (Suarez et al. 2003)

übereinstimmend bei δC9* = 154,5 (keine Kopplungen, was auf quartäre Kohlenstoffatome in der Nachbarschaft bzw. über 2 bis 3 Bindungen schließen lässt), δC5* = 160,5 (Kopplung zu

H‐6*) und δC7* = 162,2. C‐7* und C‐5* tragen jeweils eine Hydroxygruppe. Das Signal bei 103,6 ppm (C‐10*) zeigt ebenfalls eine schwache long‐range‐Kopplung zu H‐3* bei 6,87 ppm (δC3* = 103,1), mit dem auch das Carbonyl‐C‐Atom (C‐4*) bei 182,1 ppm koppelt. C‐2* erscheint bei 164,0 ppm und kann durch die Fernkopplungen zu H‐3* und

H‐2“/H‐6“ (δH2“/6“ = 7,66, δC2“/6“ = 127,9) abgesichert werden. Letzteres Protonensignal zeigt eine COSY‐Kopplung zu H‐3‘‘/H‐5‘‘ bei 6,92 ppm (δC3“/5“ = 114,4). Dieser B‐Ring weist das genannte AA‘BB‘‐System auf. C‐1“ verursacht ein Signal bei 122,9 ppm. Für C‐4“ wird eine chemische Verschiebung von 162,0 ppm gemessen. Dieses C‐Atom trägt die

2. Methoxygruppe (δC = 55,5, δH = 3,75). Als Beleg für diese Position kann die long‐range‐ Kopplung von C‐4“ zu den Protonen der Methoxygruppe nicht verwendet werden, da C‐7* bei 162,2 ppm erscheint und diese Signale nicht zu unterscheiden sind. Allerdings tritt im Vergleich zu Amentoflavon (siehe Abschnitt 1.2.4 sowie Tabelle C.4) eine Verschiebung des Signals von H‐3“/H‐5“ um 0,2 ppm und von H‐2“/H‐6“ um 0,1 ppm zu höheren ppm‐Werten auf, während sich das Signal von H‐6* gegenüber dem unsubstituierten Amentoflavon nicht ändert (6,40 bzw. 6,41 ppm).

Die Substanz ist in verschiedenen Gattungen unter unterschiedlichen Namen beschrieben worden, z.B. als Podocarpusflavon B in Celaenodendron mexicanum (Camacho et al. 2000), Podocarpus macrophylla (Miura et al. 1969), sowie als Putraflavon in Putranjiva roxburghii (Garg et al. 1971). Suarez et al. isolierten die Substanz aus Podocalyx loranthoides (Suarez et al. 2003). Für die Gattung Hieronyma liegt bisher keine Beschreibung vor. Die vollständigen NMR‐Daten mit Fernkopplungen und 1H‐1H‐Kopplungen von 7, 4‘‘‐O‐Dimethylamentoflavon sind in Tabelle C.1 angegeben, ebenso die Literaturwerte von (Suarez et al. 2003). Die Position der Methoxygruppen wurde dort mit NOE‐Experimenten bestätigt.

54 Ergebnisse 3 3'' OCH 2'' 4'' 3* O 5'' 4* 2* 1'' 6'' 1* 10* OH O 5* 9* OH 8* 0.00.51.01.5 6* 3' 4' 7* 5' 2' HO 6' 1' 3 2 1 4 O O 9 10 5 8 OH 2.02.53.03.54.0 7 6 CO 3 H 7-OMe 4"-OMe 4.55.05.56.0 6.3 6 6* 6 6* 6.5 6.57.07.58.08.5 8 3", 5", 3, 3* 6.7 5' f1 (ppm) 8 2'', 6'' 3, 3* 6.9 2', 6' 3", 5" 7.1 5' 9.09.5 f1 (ppm) 7.3 10.0 7.5 10.5 11.0 2'', 6'' 7.7 11.5 12.0 7.9 12.5 2', 6' 5-OH 8.1 13.0 5* -OH 13.5 14.0

Abbildung C.4: 1H‐Spektrum der Verbindung H.1 (400 MHz, d6‐DMSO) Ergebnisse 55 3 3'' OCH 2'' 4'' 3* O 5'' 4* 2* 1'' 6'' 1* 10* OH O 5* 9* OH 8* 6* 3' 4' 7* 5' 2' HO 6' 1' 3 2 1 4 O O 9 10 5 8 OH 7 6 CO 3 H

Abbildung C.5: 13C‐NMR‐Spektrum der Verbindung H.1 (100 MHz, d6‐DMSO) 56 Ergebnisse

Abbildung C.6: 2D‐1H‐1H‐Shiftkorrelationsspektrum der Verbindung H.1 (d6‐DMSO) Ergebnisse 57

Abbildung C.7: HSQC‐Spektrum der Verbindung H.1 (d6‐DMSO) 58 Ergebnisse

Abbildung C.8: HMBC‐Spektrum der Verbindung H.1 (d6‐DMSO) Ergebnisse 59

Tabelle C.1: NMR‐Daten der Verbindung H.1 in d6‐DMSO, sowie Literaturwerte (Suarez et al. 2003) Position 13C 13C 1H 1H COSY HMBC δ/ppm Literatur δ/ppm mult; H; Literatur (1H‐1H) (13C‐1H) (δ/ppm) J[Hz] (δ/ppm mult H; J[Hz]) 2 163,1 (164,3) 3, 2’, 6’ 3 103,2+ (103,5) 6,88 s; 1 H (6,87 s) 4 181,9 (182,3) 3 5 161,1 (161,1) 12,94 s; 1 H (12,95 s) 6 6 98,0 (98,3) 6,33 s (breit); 1 H (6,35 d; 1,8) 8 8 7 165,1 (165,3) 6, 8, 7‐OCH3 8 92,6 (93,0) 6,74 s (breit); 1 H (6,75 d; 1,8) 6 6 9 157,2 (157,6) 8 10 104,7 (104,9) 3, 6, 8 7‐OCH3 56,0 (56,3) 3,81 s; 3 H (3,82 s; 3 H) 1‘ 120,8 (121,2) 3, 5’ 2‘ 131,3 (131,6) 8,02 d*; 2 H; 8,4 (7,96 bd) 6’ 3‘ 120,0 (120,2) 4‘ 159,7 (159,8) 2’, 6’ 5‘ 116,2 (116,4) 7,15 d; 1 H; 8,2 (7,18 d; 9,0) 6’ 6‘ 127,9 (128,2) 8,04 d*; 2 H; 8,4 (8,04 bdd) 5’ 2’ 2* 164,0 (163,4) 3*, 2’’, 6’’ 3* 103,1+ (103,5) 6,87 s; 1 H (6,89 s) 4* 182,1 (182,1) 3* 5* 160,5 (160,5) 13,05 s; 1 H (13,07 s) 6* 6* 98,7 (98,8) 6,41 s; 1 H (6,45 s) 8* 7* 162,2 (162,1) 6, 3 8* 104,0 (104,3) 6* 2’, 6* 9* 154,5 (154,8) 10* 103,6 (104,0) 3*, 6* 1‘‘ 122,8 (123,2) 3*, 3’’, 5’’ 2‘‘ 127,9 (128,2) 7,66 d; 2 H; 8,5 (7,66 b; 8,7) 6’’ 3‘‘ 114,4 (114,8) 6,92 d; 2 H; 8,8 (6,93 d; 2 H; 8,7) 5’’ 4‘‘ 162,0 (162,5) 2’’, 6’’ 5‘‘ 114,4 (114,8) 6,92 d; 2 H; 8,8 (6,93 d; 2 H; 8,7) 6’’ 3’’ 6‘‘ 127,9 (128,2) 7,66 d; 2 H; 8,5 (7,66 b; 8,7) 5’’ 2’’ 4‘‘‐OCH3 55,5 (55,8) 3,75 s; 3 H (3,76 s; 3 H)

+) Die chemischen Verschiebungen dieser Signale sind austauschbar. d*) Für 6’ würde ein dd (Dublett vom Dublett) erwartet werden, da eine ortho‐Kopplung zu H‐5’ und eine meta‐Kopplung zu H‐2’ vorliegen müsste. Durch Überlappung erscheint nur ein unregelmäßig geformtes Dublett.

60 Ergebnisse

1.2.3. Strukturaufklärung von 7‐O‐Monomethylamentoflavon (H.2)

Durch Umkristallisation aus eiskaltem Methanol wurden 3,6 mg einer Reinsubstanz aus Fraktion H.a.11 erhalten. Die Struktur ist in Abbildung C.9 dargestellt.

OH ' 5'' 4'

3'' 6'' 5' 1'' 2'' 6' 4' OH 1* 2* 8 1 O O 1' 3' 3* H3CO 7 9 8* 9* 2 2' 4* 7* 6 3 10* 10 HO O 5 4 5* 6* OH O OH

Abbildung C.9: Strukturformel der Verbindung H.2

Bei der MS‐Untersuchung (ESI‐Spektrum im positiven Modus, siehe Abbildung C.10) tritt ein charakteristisches Signal für ein Quasimolekülion bei m/z = 553,1 [M+H]+ auf. Daraus ergibt sich eine Summenformel von C31H20O10.

553.1 100

95 [M+H]+ 90 85 80

75 70 65 60

55 50 45

Relative Abundance Relative 40

35 30 554.1 25 20 234.9 15 583.1 1148.6 10 584.2 721.6 5 541.0 1113.0 1149.7 233.3 236.0 364.2 393.9 692.4 736.1 860.5955.0 991.3 0 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 m/z Abbildung C.10: ESI‐Massenspektrum (positiver Modus) von H.2

Ergebnisse 61

Die NMR‐Spektren sind denen der Verbindung H.1 sehr ähnlich. Da die Substanz bei der Dünnschichtchromatographie ebenfalls ein sehr ähnliches Verhalten zeigte, konnte zusammen mit der MS‐Analyse auf eine Verbindung, die sich nur in einer Methylgruppe von H.1 unterscheidet, geschlossen werden. Im 13C‐Spektrum (Abbildung C.12) sind 29 Signale zu sehen, von denen zwei (δ = 115,7 und 128,1) eine deutlich größere Intensität aufweisen, was für mehr als ein C‐Atom spricht.

2 Signale liegen im Bereich von Carbonylkohlenstoffen (δ = 181,9 und 182,1, C4 und C4*). Im HSQC‐Spektrum (Abbildung C.14) treten 11 Signale für CH‐Gruppen und kein Signal für eine CH2‐Gruppe auf. Das genannte Signal bei δ = 128,1 zeigt eine Fernkopplung mit einem Dublett bei 7,57 ppm (2 H, J = 8,8 Hz, siehe Abbildung C.15). Das Signal bei 115,7 ppm weist eine long‐range‐Kopplung mit einem Dublett bei 6,73 ppm (2 H, J = 8,8 Hz) auf, also ebenfalls mit 2 Protonen. Insgesamt liegen 31 C‐Atome vor. Die 13C‐NMR‐Daten stimmen weitgehend mit denen von Verbindung H.1 überein. Nur sehr geringe Unterschiede treten bei den Signalen der zweiten Flavonoid‐Untereinheit für C‐3‘‘, C‐4‘‘ und C‐5‘‘ auf, ein Zeichen, dass es in diesem Bereich zu Unterschieden im Vergleich zu Substanz H.1 kommt.

Etwas größere Unterschiede existieren zwischen H.1 und H.2 bei den chemischen Verschiebungen der Protonen für die zweite Flavonoid‐Untereinheit (siehe Abbildung C.11). 13 Eine Kopplung mit J = 2,2 Hz ist zwischen den Protonen bei δ = 6,79 (H‐8, C‐Signal bei δC8 =

92,6) und δ = 6,37 (H‐6, δC6 = 98,1) zu beobachten und zeigt eine meta‐Kopplung an. Die Kopplung der Signale bei δ = 6,73 (H‐3“/H‐5“) und δ = 7,57 (H‐2“/H‐6“) ist charakteristisch für das AA’BB‘‐System im Ring B der 2. Untereinheit. Die Kopplungskonstante J beträgt hier 8,8 Hz. Die chemische Verschiebung von H‐3‘‘/H‐5‘‘ ist gegenüber der Verbindung H.1 leicht verändert, was auf den Wegfall der Methoxygruppe zugunsten einer 4‘‘‐Hydroxygruppe hindeutet.

Die eine verbleibende Methoxygruppe tritt bei δ = 56,0 mit dem korrespondierenden

Protonensignal bei δH‐7‐OCH3 = 3,84 auf. Das Kohlenstoffatom an C‐7 bei δ = 165,1 koppelt im HMBC‐Spektrum mit der Methylgruppe bei δ = 56,0. Die benachbarten C‐Atome treten bei den gleichen ppm‐Werten wie bei Verbindung H.1 in Resonanz und bestätigen das Vorliegen einer Methoxygruppe an C‐7. 62 Ergebnisse

Die Zuordnung der Signale aller C‐Atome erfolgte mit Hilfe der 1H‐ und 13C‐NMR‐, HMBC‐, HSQC‐ sowie 1H‐1H‐COSY‐Spektren und ist in Tabelle C.2 zusammen mit den für diese Substanz existierenden Literaturdaten von (Markham et al. 1990) aufgeführt. 13C‐NMR‐ Werte sind im Rahmen der vorliegenden Arbeit erstmals beschrieben.

7‐O‐Methylamentoflavon ist eine bereits bekannte Verbindung, die aber bisher noch nicht aus Hieronyma‐Arten isoliert worden ist. Markham et al. beschreiben die Substanz für Libocedrus bidwillii, L. plumosa und weitere Libocedrus‐Arten sowie für Papuacedrus, Austrocedrus, Calocedrus und Neocallitropsis‐Arten (Markham et al. 1990). Krauze‐ Baranowska et al. fanden sie in Ginkgo biloba sowie Podocarpus dacrydioides (Krauze‐ Baranowska et al. 2004). Die Substanz wird auch Sequoiaflavon genannt (Lin et al. 1999a; Saponara et al. 1998). Lin et al. berichten das Vorkommen von Sequoiaflavon in Chamaecyparis und Saponara et al. für Ginkgo. Ergebnisse 63 3'' OH 2'' 4'' 3* O 5'' 4* 2* 1'' 6'' 1* 10* OH O 5* 9* OH 8* 6* 3' 4' 7* 5' 2' HO 6' 1' 3 2 1 4 O O 9 10 5 8 OH 7 6 CO 3 H

Abbildung C.11: 1H‐NMR‐Spektrum der Verbindung H.2 (400 MHz, d6‐DMSO) 64 Ergebnisse 3'' OH 2'' 4'' 3* O 5'' 4* 2* 1'' 6'' 1* 10* OH O 5* 9* OH 8* 6* 3' 4' 7* 5' 2' HO 6' 1' 3 2 1 4 O O 9 10 5 8 OH 7 6 CO 3 H

Abbildung C.12: 13C‐NMR‐Spektrum der Verbindung H.2 (100 MHz, d6‐DMSO) Ergebnisse 65

f1 (ppm) f1

6.46.66.87.07.2 7.4 7.67.8 8.0 8.28.4

Abbildung C.13: 2D‐1H‐1H‐Shiftkorrelationsspektrum der Verbindung H.2 (d6‐DMSO) 66 Ergebnisse

Abbildung C.14: HSQC‐Spektrum der Verbindung H.2 (d6‐DMSO) Ergebnisse 67

Abbildung C.15: HMBC‐Spektrum der Verbindung H.2 (d6‐DMSO) 68 Ergebnisse

Tabelle C.2: NMR‐Daten von H.2 in d6‐DMSO sowie Literaturwerte (Markham et al. 1990) Position 13C 1H 1H COSY HMBC δ/ppm δ/ppm mult; H; Literatur (1H‐1H) (13C‐1H) J[Hz] (δ/ppm mult; H; J[Hz]) 2 164,0 3, 2’, 6’ 3 103,1+ 6,92 s; 1 H (6,78 s) 4 181,9 3 5 161,9 12,97 s; 1 H (OH; 13,11 s) 5‐OH, 6 6 98,1 6,37 d; 1 H; 2,2 (6,35 d; 2,1) 8 8, 5‐OH 7 165,1 6, 8, 7‐OCH3 8 92,6 6,79 d; 1 H; 2,2 (6,73 d; 2,1) 6 9 157,3 8 10 104,7 3, 6, 8, 5‐OH 1‘ 120,8 3, 5’ 2‘ 131,4 8,05 d; 2 H; 9,2 (8,11 d; 2,0) 5’, 6’ 6’ 3‘ 120,0 5’ 4‘ 159,7 2’, 6’ 5‘ 116,1 7,16 d; 1 H; 8,4 (7,09 d; 8,6) 2’, 6’ 6‘ 127,9 8,05 dd; 2,3; 9,2 (8,01 dd; 2,0; 8,6) 2’, 5’ 2’ 7‐OCH3 56,0 3,81 s; 3 H (3,81) 2* 163,6 3*, 2’’, 6’’ 3* 102,6+ 6,81 s; 1 H (6,90 s) 4* 182,1 3 5* 160,5 13,1 s; 1 H (OH; 12,99 s) 6, 5‐OH 6* 98,6 6,41 s; 1 H (6,31 s) 7* 161,0 OH; 10,27 s; 1 H (10,28 s) 6* 8* 103,6 2’, 6* 9* 154,4 10* 103,9 3*, 5*‐OH, 6* 1‘‘ 121,3 3*, 3’’, 5’’ 2‘‘ 128,1 7,57 d; 2 H; 8,78 (7,59 d; 8,8) 3’’, 6’’ 6’’ 3‘‘ 115,7 6,73 d; 2 H; 8,78 (6,68 d; 8,8) 2’’, 5’’ 5’’ 4‘‘ 161,1 OH; 10,27 2’’, 3’’, 5’’, 6’’ 5‘‘ 115,7 6,73 d; 2 H; 8,8 (6,68 d; 8,8) 3’’, 6’’ 3’’, 4’’‐OH 6‘‘ 128,1 7,57 d; 2 H; 8,8 (7,59 d; 8,8) 2’’, 5’’ 2’’

+) Die chemischen Verschiebungen für diese Signale sind austauschbar.

Ergebnisse 69

1.2.4. Strukturaufklärung von Amentoflavon (H.3)

Durch Umkristallisation aus eiskaltem Methanol konnten 12,1 mg einer Reinsubstanz aus Fraktion H.a.12 isoliert werden. Die Strukturformel ist in Abbildung C.16 dargestellt.

OH 5'' 4''

6'' 3'' 5' 4' OH 6' 1'' 2'' 1* 2* 8 1 1' 3' O HO 7 9 O 8* 9* 3* 2 2' 7* 4* 6 3 HO 10* 10 5 4 5* O 6* OH O OH

Abbildung C.16: Verbindung H.3 (Amentoflavon)

Das EI‐Massenspektrum (Abbildung C.17) zeigt einen Molekülpeak bei m/z = 538,2. Entsprechend wurde im ESI‐MS im negativen Modus ein Signal bei m/z = 537,0 [M‐H]‐ detektiert. Zusammen ergibt sich daraus eine Summenformel von C30H18O10.

44.1 100

95 90

85 80

75

70 65 60

55

50 45

Relative Abundance Relative 40

35 30 25 55.1 20 15 69.0 [M]+ 10 71.1 97.0 538.2 111.0 304.2 135.0 5 227.1 273.2 521.2 539.2 305.2 376.1 644.1 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 m/z Abbildung C.17: EI‐Massenspektrum (Direkteinlass) der Verbindung H.3

70 Ergebnisse

Zur Strukturaufklärung wurden NMR‐Daten herangezogen. Da die Substanz auf der DC ein den zuletzt untersuchten Verbindungen sehr ähnliches Laufverhalten zeigt, konnte zusammen mit den MS‐Spektren auf eine Verbindung, die sich nur in einer Methylgruppe von H.2 bzw. in zwei Methylgruppen von H.1 unterscheidet, geschlossen werden.

Im 13C‐Spektrum (Abbildung C.19) sind 27 Signale zu sehen, von denen 2 (115,7 ppm und 128,2 ppm) deutlich intensiver erscheinen und für mehr als ein C‐Atom stehen können.

2 Signale liegen im Bereich von Carbonylkohlenstoffen (181,9 und 182,1 ppm, C4 und C4*). Es treten keine Signale im Bereich von Methoxygruppen auf.

Die 13C‐NMR‐Daten zeigen eine große Übereinstimmung mit denen von Verbindung H.2. Unterschiede ergeben sich in diesem Fall nur für die erste Flavonoiduntereinheit für die C‐Atome 7, 8 und 10. Entsprechend zeigen sich auch beim Vergleich der 1H‐NMR‐Daten (Abbildung C.18) nur Unterschiede für H‐6 und H‐8.

Die Protonensignale sind gegenüber denen der Verbindung H.2 um 0,3 ppm (H‐8) bzw. 0,17 ppm (H‐6) hochfeldverschoben, was durch das Fehlen der Methylgruppe an 7‐OH zu erklären ist. Die vollständigen Daten sind in Tabelle C.3 aufgeführt. Es zeigen sich gute Übereinstimmungen mit Literaturwerten ((Li et al. 2003), im gleichen Lösungsmittel gemessen). Als Übersicht wurden alle erhaltenen Werte für H.1, H.2 und H.3 in Tabelle C.4 zusammengefasst. Hier zeigen sich noch einmal die ähnlichen chemischen Verschiebungen und die geringen Änderungen durch Fehlen oder Vorhandensein einer Methoxygruppe an C‐4‘‘ oder C‐7.

Amentoflavon ist eine bereits bekannte Verbindung, die von Kuroshima et al. für Hieronyma beschrieben worden ist (Kuroshima et al. 2005). Der IUPAC‐Name von Amentoflavon lautet 8‐[5‐(5,7‐dihydroxy‐4‐oxo‐4H‐chromen‐2‐yl)‐2‐hydroxyphenyl]‐5,7‐dihydroxy‐2‐(4‐hydroxy‐ phenyl)chromen‐4‐on. Nach der Locksley‐Regel lautet der Name für Amentoflavon I‐4’,II‐4’,I‐5,II‐5,I‐7,II‐7‐ hexahydroxy[I‐3’,II‐8]‐biflavon (Rahman et al. 2007).

Ergebnisse 71

Markham et al. beschreiben die Substanz für die bei Verbindung H.2 genannten Koniferen‐ Gattungen wie Libocedrus, Papuacedrus, Austrocedrus, Calocedrus und Neocallitropsis (Markham et al. 1990). Außerdem stellte die Gruppe ein Vorkommen von Amentoflavon in Sequoiadendron giganteum fest (Markham et al. 1987). Li et al. fanden Amentoflavon in Torreya yunnanensis (Li et al. 2003). Ohmoto et al. haben Amentoflavon aus Pollenkörnern von Cryptomeria japonica isoliert (Ohmoto et al. 1983). Es ist eines der bekanntesten Biflavonoide für Ginkgo biloba (Dell'Agli et al. 2002; Joyeux et al. 1995; Krauze‐Baranowska et al. 2004).

72 Ergebnisse 3'' OH 2'' 4'' 3* O 5'' 4* 2* 1'' 6'' 1* 10* OH O 5* 9* OH 8* 6* 3' 4' 7* 5' 2' HO 6' 1' 3 2 4 1 O O 9 10 5 8 OH 7 6 HO

Abbildung C.18: 1H‐NMR‐Spektrum von Verbindung H.3 (Amentoflavon) (400 MHz, d6‐DMSO) Ergebnisse 73 3'' OH 2'' 4'' 3* O 5'' 4* 2* 1'' 6'' 1* 10* OH O 5* 9* OH 8* 6* 3' 4' 7* 5' 2' HO 6' 1' 3 2 1 4 O O 9 10 5 8 OH 7 6 HO

Abbildung C.19: 13C‐NMR‐Spektrum der Verbindung H.3 (Amentoflavon) (100 MHz, d6‐DMSO) 74 Ergebnisse

Abbildung C.20: 2D‐1H‐1H‐Shiftkorrelationsspektrum der Verbindung H.3 (d6‐DMSO) Ergebnisse 75

Abbildung C.21: HSQC‐Spektrum der Verbindung H.3 (d6‐DMSO) 76 Ergebnisse

3 3* 6* 2', 6' 2'', 6'' 3", 5" 6 8 5' 90 8 95 6* 6 100 3 3* 10 8* 105 10* 110 115 3", 5" 5' 3' 1" 120 1' 125 2' 2", 6" 130 6' 135 f1 (ppm) 140 145 150 9* 155 9 5* 4' 7* 160 4" 5 2 2* 7 165 170 175 180 4* 4 185

Abbildung C.22: HMBC‐Spektrum der Verbindung H.3 (Amentoflavon), (d6‐DMSO) Ergebnisse 77

Tabelle C.3: NMR‐Daten der Verbindung H.3 in d6‐DMSO sowie Literaturwerte (Li et al. 2003) Position 13C 13C 1H 1H COSY HMBC δ/ppm Literatur δ/ppm mult; H; Literatur (1H‐1H) (13C‐1H) (δ/ppm) J[Hz] (δ/ppm mult; H; J[Hz]) 2 163,6/ (163,8) 3 163,8 3 102,6 (103,0) 6,79 s; 1 H (6,75 s) 4 182,1 (181,9) 3 5 161,4 (161,4) OH; 12,97 s; 1 H (OH; 12,94 s) 6 6 98,8 (98,8) 6,20 d; 1 H; 2,0 (6,19 d; 2,8) 8 8 7 164,1 (163,7) (OH; 10,20 s) 8? 8 94,0 (94,0) 6,46 d; 1 H; 2,0 (6,46 d; 2,0) 6 9 157,3 (157,3) 8 10 103,5 (103,7) 3, 6, 8 1‘ 121,4 (120,0) 3, 5’? 2‘ 131,4 (131,4) 8,00 m; 2 H (8,00 d; 2,0) 6’ (2,3) 3‘ 120,1 (121,4) 5’ 4‘ 159,7 (159,4) 2’, 6’ 5‘ 116,3 (116,1) 7,15 d; 1 H; 9,3 (7,16 d; 9,2) 6‘ 127,7 (127,7) 8,00 m; 2 H (7,99 dd; 2,0; 2’ (2,3) 8,8) 2* 163,8 (164,1) 3*, 2’’, 6’’ 3* 102,9 (102,6) 6,83 s; 1 H (6,79 s) 4* 181,7 (182,1) 3* 5* 160,5 (160,5) OH; 13,1 s; 1 H (OH; 13,07 s) 6* 6* 98,7 (98,6) 6,40 s; 1 H (6,41 s) 7* 161,0 (161,7) (OH; 10,73 s) 8* 104,1 (103,9) 2’, 6* 9* 154,5 (154,5) 10* 103,7 (103,7) 3*, 6* 1‘‘ 120,8 (121,0) 3*, 3’’, 5’’ 2‘‘ 128,2 (128,1) 7,58 d; 2 H; 8,8 (7,56 d; 8,8) 3’’, 5’’, 6’’ 6’’ AA’BB’ 3‘‘ 115,7 (115,7) 6,72 d; 2 H; 8,8 (6,73 d; 8,4) 2’’, 5’’, 6’’ 5’’ AA’BB’ 4‘‘ 161,4 (161,0) 2’’, 3’’, 5’’, 6’’ 5‘‘ 115,7 (115,7) 6,72 d; 2 H; 8,8 (6,73 d; 8,4) 2’’, 3’’, 6’’ 3’’ 6‘‘ 128,2 (128,1) 7,58 d; 2 H; 8,8 (7,56 d; 8,8) 2’’, 3’’, 5’’ 2’’

78 Ergebnisse

Tabelle C.4: Zusammenstellung der 13C und 1H‐NMR‐Daten der Verbindungen H.1 bis H.3. Alle Werte sind als chemische Verschiebung δ in ppm angegeben, bei 1H zusätzlich die Aufspaltung und die Kopplungskonstante J [Hz]. Die Spektren wurden in d6‐DMSO gemessen. Position 13C 13C 13C 1H 1H 1H H.1 H.2 H.3 H.1 H.2 H.3 2 163,1 164,0 163,6 3 103,2 103,1 102,6 6,88 s 6,92 s 6,79 s 4 181,9 181,9 182,1 5 161,1 161,9 161,4 OH; 12,94 s OH; 12,97 s OH; 12,97 s 6 98,0 98,1 98,8 6,33 s 6,37 d; 2,2 6,20 d; 2,0 7 165,1 165,1 164,1 8 92,6 92,6 94,0 6,74 s 6,79 d; 2,2 6,46 d; 2,0 9 157,2 157,3 157,3 10 104,7 104,7 103,5 7‐OCH3 56,0 56,0 3,81 s 3,81 s 1‘ 120,8 120,8 121,4 2‘ 131,3 131,4 131,4 8,04 d; 8,4 8,05 d; 9,2 8,01 m 3‘ 120,0 120,0 120,1 4‘ 159,7 159,7 159,7 5‘ 116,2 116,1 116,3 7,15 d; 8,2 7,16 d; 8,4 7,15 d; 9,3 6‘ 127,9 127,9 127,7 8,02 d; 8,4 8,05 dd 8,01 m 2* 164,0 163,6 163,8 3* 103,1 102,6 102,9 6,87 s 6,81 s 6,83 s 4* 182,1 182,1 181,7 5* 160,5 160,5 160,5 OH; 13,05 s OH; 13,1 s OH; 13,10 6* 98,7 98,6 98,7 6,41 s 6,41 s 6,40 s 7* 162,2 161,0 161,0 OH; 10,27 8* 104,0 103,6 104,1 9* 154,5 154,4 154,5 10* 103,6 103,9 103,7 1‘‘ 122,8 121,3 120,8 2‘‘ 127,9 128,1 128,2 7,66 d; 8,5 7,57 d; 8,8 7,58 d; 8,8 3‘‘ 114,4 115,7 115,7 6,92 d; 8,8 6,73 d; 8,8 6,72 d; 8,8 4‘‘ 162,0 161,1 161,4 OH; 10,27 5‘‘ 114,4 115,7 115,7 6,92 d; 8,8 6,73 d; 8,8 6,72 d; 8,8 6‘‘ 127,9 128,1 128,2 7,66 d; 8,5 7,57 d; 8,8 7,58 d; 8,8 4‘‘‐OCH3 55,5 3,75 s

Ergebnisse 79

1.2.5. Untersuchung der biologischen Wirkungen der Biflavonoide

1.2.5.1. NF‐κB‐EMSA

Bei der Kontrolle der erhaltenen Fraktionen im EMSA zeigte sich, dass die Biflavonoide (Verbindungen H.1 bis H.3) nicht allein die aktiven Substanzen sind. Die Durchführung des EMSAs ist im Kapitel F.5.3 (Exp. Teil) beschrieben. Die Fraktion H.a.10 wurde einmal als Ganzes in Konzentrationen von 100 µg/mL und 200 µg/mL in Jurkat‐T‐Zellen getestet und im anderen Fall wurde die aufgereinigte Substanz H.1 (7, 4‘‘‐O‐Dimethylamentoflavon) in einer Konzentration von 100 µM [entspricht 56,6 µg/mL] und 200 µM [entspricht 113,2 µg/mL] eingesetzt. Als Kontrolle wurde Fraktion H.a.14 aufgetragen, die sicher kein solches Biflavonoid enthält. Auf der DC waren hier nur rote Flecken erkennbar. Es handelt sich dabei eventuell um Gerbstoffe (Proanthocyanidine) mit hohem Molekulargewicht, deren Struktur aber nicht aufgeklärt wurde. Die Biflavonoide waren gelb gefärbt. Das Ergebnis des EMSAs ist in Abbildung C.23 zu sehen. Das Biflavonoid H.1 zeigte eine konzentrationsabhängige Hemmung der NF‐κB DNA‐Bindefähigkeit.

Abbildung C.23: NF‐κB‐EMSA zur Aktivitätstestung des Biflavonoids H.1 aus H.a.10. Die Gesamtfraktion H.a.10 wurde mit H.a.14 verglichen, die keine Biflavonoide enthält. Das isolierte Biflavonoid wurde in einer Konzentration von 100 µM bzw. 200 µM (entsprechend 56,6 bzw. 113,2 µg/mL) getestet. Dazu wurden Jurkat‐T‐Zellen eine Stunde mit Testsubstanz vorinkubiert und anschließend eine Stunde mit TNF‐α stimuliert. Das gefüllte Dreieck bezeichnet die spezifische Bande des NF‐κB‐ Oligonucleotid‐Komplexes, der leere Kreis die Bande unspezifischer Protein‐DNA‐ Wechselwirkungen und das leere Dreieck zeigt ungebundenes Oligonucleotid an. 80 Ergebnisse

Es konnte aber auch eine deutliche Hemmaktivität der Biflavonoid‐freien Fraktion beobachtet werden. Diese Fraktion wurde nicht weiter verfolgt. Eine weitere Auftrennung der Fraktion H.a.10 führte nicht zur Isolierung von Reinsubstanzen, sodass die für die NF‐κB‐Hemmung im EMSA verantwortlichen, aktiven Substanzen nur teilweise gefunden werden konnten.

1.2.5.2. Luciferase‐Reportergen‐Assay

Diese Ergebnisse sind in Abbildung F.2 (Exp. Teil) dargestellt. Da die H.1‐H.3‐freien Fraktionen aber die Luciferase direkt hemmen, konnte dieser Test nicht als molekulares Target zur Wirkstoffsuche eingesetzt werden.

Untersuchungen zur Biologischen Aktivität in Literaturquellen In der Literatur wurden Amentoflavon und Dimethylamentoflavon in‐vitro auf Aktivität gegen Protozoen getestet. Beide zeigten eine geringe bis mittlere Aktivität (Camacho et al. 2000). Woo et al. wiesen für Amentoflavon aus Selaginella tamariscina eine anti‐ entzündliche und antifungale Wirkung nach. In in‐vitro Untersuchungen konnte eine Hemmung der Produktion von NO über eine Hemmung der NF‐κB‐Aktivierung nachgewiesen werden (Woo et al. 2005).

Ergebnisse 81

1.2.6. Isolierung und Strukturaufklärung von (+)‐Catechin (H.4)

Aus Fraktion H.a.6.2 wurde (+)‐Catechin mit der Summenformel C15H14O6 und dem relativen

Molekulargewicht Mr von 290,3 isoliert.

5' OH 6' 4'

8 1 1' 3' HO 7 9 O 2 2' OH 3 6 10 4 5 OH 4α OH 4βH H

Abbildung C.24: Strukturformel der Verbindung H.4

Die Strukturaufklärung von (+)‐Catechin erfolgte mittels NMR‐Untersuchungen. Im 13C‐Spektrum (Abbildung C.26) sind 14 Signale zu sehen, von denen das bei 144,9 ppm für zwei C‐Atome steht. Es gibt kein Signal im Bereich von Carbonylkohlenstoffen (> 170 ppm). Nach dem HSQC‐Spektrum (

Abbildung C.28) treten 7 CH‐Gruppen, 1 CH2‐Gruppe (δC4 = 27,0), aber keine Methylgruppe auf. Die im 1H‐Spektrum (Abbildung C.25) auftretenden Signale weisen auf das Vorliegen von zwei aromatischen Ringen hin. Im H‐H‐COSY (Abbildung C.27) tritt eine Kopplung zwischen den Protonen bei δH4β = 2,53 und δH4α = 2,88 (J = 16,2 Hz) auf. Die 2. Kopplung der beiden

Signale findet mit H‐3 (δH3 = 4,00) statt. Die gemessene Kopplungskonstante von J = 8,2 Hz des Dubletts vom Dublett bei δ = 2,53 ist charakteristisch für eine transoide Kopplung. Bei einer cisoiden Kopplung, wie z.B. bei (‐)‐Epicatechin wird dagegen eine Kopplungskonstante von J3, 4β = 3,3 Hz beobachtet (Hemingway et al. 1996). Das Signal von H‐3 koppelt mit H‐2

(δH2 = 4,59; 7,5 Hz). Die zugehörigen Kohlenstoffatome zeigen Signale bei δC2 = 81,4 und δC3 = 67,3. Beide haben ein Sauerstoffatom gebunden, C‐2 steht zusätzlich unter dem Einfluss eines Aromaten.

Die Signale des Ringes A sind denen der Biflavonoid‐Einheiten sehr ähnlich. Die Protonensignale treten bei 5,88 ppm (H‐8) und 5,95 ppm (H‐6) auf und zeigen eine Kopplungskonstante J von 2,3 Hz, die für meta‐Kopplungen charakteristisch ist (Hemingway 82 Ergebnisse

13 et al. 1996). Die dazugehörenden C‐Signale treten bei δC8 = 94,0 und δC6 = 95,0 in

Resonanz. Das dazwischen liegende C‐7 erscheint bei 156,1 ppm. Die Signale von C‐5 (δC5 = 95,0), C‐9 und C‐10 sind durch HMBC‐long‐range‐Kopplungen (Abbildung C.29) zuzuordnen.

C‐9 und C‐10 (δC9 = 155,4 und δC10 = 99,2) koppeln mit H‐8, C‐10 außerdem mit H‐6 sowie mit H‐4α/β. C‐2 zeigt long‐range‐Kopplungen zum B‐Ring und kann auch darüber zugeordnet werden. Im

B‐Ring tritt ein AB‐X‐System mit den Signalen von H‐2‘ (δH2‘ = 6,86), H‐6‘ (δH6‘ = 6,75) und

H‐5‘ (δH5‘ = 6,79) auf. Die entsprechenden C‐Atome (δC2‘ = 113,9, δC6‘ = 118,5 und δC5‘ = 114,9) konnten durch das HSQC‐Spektrum zugeordnet werden. Das bei δ = 144,9 auftretende Signal zeigt Fernkopplungen zu H‐2‘, H‐5‘ und H‐6‘ und ist C‐4‘ und C‐3‘ zuzuordnen. Die tiefere Lage erklärt sich durch die durch Hydroxylgruppen bedingte Abschirmung.

Insgesamt stimmen die gefundenen Werte (siehe Tabelle C.5) gut mit den Literaturdaten von Catechin überein (Hemingway et al. 1996). Die Abgrenzung zum (‐)‐Epicatechin kann zusätzlich über die Literaturwerte von (Shen et al. 1993) erfolgen.

(+)‐Catechin ist eine lang bekannte Substanz, die ubiquitär vorkommt. Freudenberg beschrieb Catechin 1921 für die Liane Uncaria gambir (Freudenberg et al. 1921). Aus Hieronyma wurde Catechin bisher nicht isoliert. Flavan‐3‐ole, wie das Catechin, sind als Antioxidantien getestet worden (Aron et al. 2008). Auf eine Überprüfung der biologischen Aktivität in den vorhandenen Testsystemen wurde verzichtet, da in der Literatur eine negative Testung gegenüber MMPs aufgeführt ist (Demeule et al. 2000). Zusätzlich zeigte sich die verwandte Substanz Epicatechin als wenig aktiv in den Elastase‐Tests (vgl. Kapitel 2.3.1).

Ergebnisse 83 OH OH 3' 4' 5' 2' OH 6' 1' α 2 3 4 H 1 4 H O β 4 9 10 5 8 OH β 4 7 6 HO β 4 α α 4 4

1 Abbildung C.25: H‐NMR‐Spektrum der Verbindung H.4 (400 MHz, CD3OD) 84 Ergebnisse OH OH 3' 4' 5' 2' OH 6' 1' α 2 3 4 H 1 4 H O β 4 9 10 5 8 OH 7 6 HO

13 Abbildung C.26: C‐NMR‐Spektrum der Verbindung H.4 (100 MHz, CD3OD) Ergebnisse 85

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 2.0 β 2.5 4 4 α 4 4 3.0 3.5 3 4.0 4.5 2 f2 (ppm) 5.0 5.5 8 6 6.0 6.5 6' 5' 2' 7.0 3 β α 4 4 4 4 6' 2 2' 8 6 5'

1 1 Abbildung C.27: 2D‐ H‐ H‐Shiftkorrelationsspektrum der Verbindung H.4 (CD3OD) 86 Ergebnisse

β 4 α 4

Abbildung C.28: HSQC‐Spektrum der Verbindung H.4 (CD3OD) Ergebnisse 87 β 4 α 4

Abbildung C.29: HMBC‐Spektrum der Verbindung H.4 (CD3OD) 88 Ergebnisse

Tabelle C.5: NMR‐Daten der Verbindung H.4 (Catechin), gemessen in CD3OD, sowie Literaturwerte (Hemingway et al. 1996) Position 13C 13C 1H 1H COSY HMBC δ/ppm Literatur δ/ppm mult; H; Literatur (1H‐1H) (13C‐1H) (δ/ppm) J[Hz] (δ/ppm mult; H; J[Hz]) 2 81,4 (82,8) 4,59 d; 7,5 (4,57 d; (7,4)) 3 (4α,) 4β, 2‘, 6‘ 3 67,4 (68,7) 4,00 ddd; 8,2, (3,98 m) 2, 4α, 4β 2, 4α, 4β 7,5, 5,5 4α 27,1 2,88 dd; 5,5, (2,85 dd; 5,4, 3, 4α 2 16,2 16,2) 4β 27,1 (28,4) 2,53 dd; 8,2, (2,51 dd; 8,0, 3, 4β 2 16,2 16,2) 5 156,2 (157,6) 4β, 6 6 95,0 (96,4) 5,95 d; 2,3 (5,94 d; ca. 2) 8 8 7 156,4 (157,8) 4β, 6 8 94,0 (95,6) 5,88 d; 2,3 (5,86 d) 6 6 9 155,5 (156,9) (4α,) 2, 4β, 8 10 99,4 (100,9) 4α, 4β, 6, 8 1‘ 130,8 (132,2) 2, 5‘ 2‘ 113,9 (115,3) 6,86 d; 1,9 (6,83 d; 2,0) 6‘ 2, 5’, 6‘ 3‘ 144,9 (146,2) 2‘, 5‘, 6’ 4‘ 144,9 (146,2) 2‘, 5‘, 6‘ 5‘ 114,6 (116,1) 6,79 d; 8,1 (6,77 d; 8) 6‘ (6‘) 2 6‘ 118,6 (120,1) 6,75 dd; 8,2, 1,9 (6,73 dd) 5‘, 2’ 2, 2‘

Ergebnisse 89

1.3. Siparuna thecaphora (Poepp. et Endl.) A. DC.

1.3.1. Extraktauftrennung

Die Vorfraktionierung des erhaltenen Extrakts (siehe Abbildung C.1) aus Blättern von S. thecaphora erfolgte, wie im Experimentellen Teil in Abschnitt F.4.1 genauer beschrieben, mittels offener Säulenchromatographie an Sephadex® LH 20 und Methanol als Elutions‐ mittel. Die Unterfraktionen von zwei Trennungen wurden dünnschichtchromatographisch untersucht (Fließmittelsystem 1) und schließlich zu 10 Fraktionen zusammengefasst. Nachfolgend wurden verschiedene Trennsysteme eingesetzt. Sie sind an der jeweiligen Stelle beschrieben. Um gezielt biologisch aktive Verbindungen aus S. thecaphora zu isolieren, wurden die erhaltenen Teilfraktionen in jedem Schritt mittels eines geeigneten Testsystems auf ihre Aktivität hin untersucht und nur die positiv getesteten Fraktionen weiter verwendet.

1.3.2. Untersuchung der Aktivität der erhaltenen Fraktionen im NF‐κB‐EMSA

Die Überprüfung der 10 Fraktionen der ersten Trennung auf Beeinflussung der NF‐κB DNA‐ Bindeaktivität im EMSA ergab 3 aktive Fraktionen (S.t.3, 5 und 7), die weiter untersucht wurden (siehe Abbildung F.5, Exp. Teil). Zudem gab es Anhaltspunkte für eine cytotoxische Wirkung des Extraktes, die im MTT‐Test experimentell belegt wurde (Tabelle F.8, Exp. Teil). Daher wurde auf eine weitere Testung im EMSA verzichtet, denn eine Hemmung der NF‐κB DNA‐Bindefähigkeit könnte vorgetäuscht werden, und bei der weiteren Fraktionierung der MTT‐Test eingesetzt. Die beiden Testsysteme sind im Exp. Teil genauer beschrieben.

1.3.3. Weitere biologisch kontrollierte Auftrennung der Unterfraktion S.t.3 mittels Säulenchromatographie und MTT‐Test

Die Unterfraktion S.t.3 wurde weiter säulenchromatographisch aufgetrennt und die erhaltenen Teilfraktionen jeweils im MTT‐Test untersucht. Die aktivsten Fraktionen wurden weiter aufgetrennt (siehe Abschnitt F.4.1.1). Insgesamt wurden Fraktionen erhalten, die teilweise eine hohe cytotoxische Aktivität aufwiesen. So erreichten die Unterfraktionen S.t.3.1.2 bis 4 nach drei Stunden Inkubation (100 µg/mL) eine ähnliche Toxizität wie die Referenzsubstanz Parthenolid in einer Konzentration von 100 µM. Leider wurde die Menge der erhaltenen Fraktionen immer geringer. Um ein ungefähres Bild des Substanzspektrums zu erhalten, wurden mit den aktiven Fraktionen GC‐MS‐Analysen 90 Ergebnisse durchgeführt. Es konnten Alkaloide, Fettsäuren und Terpene (vor allem Sesquiterpene) aus der Substanzdatenbank zugeordnet werden. Allerdings ergab sich kein Hinweis auf eine Substanz, die in allen Fraktionen vorkommt und das aktive Prinzip ausmachen könnte. Da die Ausgangsmengen der S.t.3.x.x‐Fraktionen zum Großteil deutlich unter 100 mg lagen, in den Chromatogrammen aber eine Vielzahl von Substanzen auftrat, wurde auf eine weitere Auftrennung verzichtet. Eine Auftrennung bis zu einer größeren Menge an Reinsubstanz wäre sehr schwierig und zeitaufwändig.

1.3.4. Detektion einer Dragendorff‐positiven Substanz

Mit den cytotoxisch aktiven Unterfraktionen S.t.3.5 und S.t.3.6 verhielt es sich ähnlich. Die beiden Fraktionen wurden vereinigt und einer säulenchromatographischen Auftrennung an Umkehrphase (RP‐18) mit einem Methanolgradienten unterzogen. Im Vergleich zu den Ausgangsfraktionen wurden cytotoxisch aktivere Fraktionen erhalten, die aber immer noch komplex zusammengesetzt waren. Das Ergebnis des MTT‐Tests ist in Abbildung F.9 (Exp. Teil) dargestellt. Auffällig war das Auftreten einer Dragendorff‐positiven Substanz in den Teilfraktionen 5 bis 13. Für diese Färbung kann ein Alkaloid verantwortlich sein, daher wurden nicht nur die cytotoxischen Fraktionen weiterverfolgt, sondern auch diejenigen, welche die Färbung hervorrufen. Nach Literaturrecherche (Kupchan et al. 1970; Lo et al. 2000) wurde eine Vorgehensweise zur Extraktion der Alkaloide vorgenommen, die per Dünnschichtchromatographie und GC‐ MS‐Analyse überprüft wurde (vgl. Experimenteller Teil). Aus den Teilfraktionen 5 und 6 konnte eine Substanz angereichert werden. Die erhaltene Ausbeute und Reinheit war aber zu gering, um ein aussagekräftiges NMR‐Spektrum zu erhalten bzw. die Verbindung weiter aufzureinigen. Aufgrund der charakteristischen Färbung nach Dragendorff‐Derivatisierung (Rf‐Wert 0,31) und dem in der GC‐MS‐Analyse erhaltenen Molekülpeak der Substanz bei 341 kann man nur spekulieren, dass es sich um ein Alkaloid handelt. Mit diesem Molekulargewicht ist beispielsweise N‐Methyllaurotetanin für die Gattung Siparuna (S. pauciflora) beschrieben worden (Leitao et al. 1999; Lopez et al. 1988; Lopez et al. 1990). Ergebnisse 91

1.3.5. Strukturaufklärung von 3, 7, 4‘‐Trimethylkämpferol (S.1)

Aus Fraktion S.t.5 wurde durch Umkristallisieren die Verbindung S.1 isoliert. Nach Anhaltspunkten aus den GC‐MS‐Untersuchungen wurde ein Molekulargewicht von 328 g/mol erwartet. Die Struktur der Verbindung ist in Abbildung C.30 dargestellt.

5' 6' 4' O

8 1 1' O 7 9 O 3' 2 2' 3 6 10 5 4 O OH O

Abbildung C.30: Verbindung S.1

Die Strukturaufklärung erfolgte mittels NMR‐Spektroskopie. Nach den Erfahrungen mit den Flavonoid‐Derivaten aus Hieronyma reichten die Messungen des 1H‐Spektrums und des H‐H‐ COSYs zur Strukturaufklärung aus. Sehr charakteristisch im 1H‐Spektrum (Abbildung C.31) ist ein Signal bei 3,90 ppm, das für 9 Protonen steht und in der Spreizung 3 Singuletts ergibt. Es muss sich also um eine trimethoxylierte Verbindung handeln. Die genaue Zuordnung zu den entsprechenden Signalen kann mit den vorhandenen Daten nicht erfolgen. Die Literaturdaten geben entweder nur einen Wert für eine chemische Verschiebung an (Rossi et al. 1997) oder zwei Werte, die nicht näher zugeordnet sind (Vidari et al. 1971). Die Vorhersage mit den Programmen ChemDraw Ultra sowie MestreNova liefert übereinstimmend den niedrigsten ppm‐Wert für die OCH3‐Gruppe an C‐3 von 3,50 ppm und denselben Wert von 3,73 ppm für die Protonen der beiden anderen Methoxygruppen. Die weiteren Signale können H‐6 (6,38 ppm) und H‐8 (6,47 ppm) zugeordnet werden, die im COSY (Abbildung C.32) eine meta‐ Kopplung mit einer charakteristischen, kleinen Kopplungskonstante J von 2,2 Hz zeigen. Der Ring B zeigt Signale für ein AA’BB‘‐System. Die Zuordnung für H‐2‘/6‘ ist bei 8,10 ppm und für H‐3‘/H‐5‘ bei 7,05 ppm. Außerdem kann die 5‐OH‐Gruppe einem Signal bei 12,65 ppm zugeordnet werden.

Die vollständigen NMR‐Daten mit den 2 genannten Literaturstellen sind in Tabelle C.6 aufgeführt. 92 Ergebnisse

Kämpferol‐3,7,4‘‐trimethylether ist bereits lange bekannt und zum ersten Mal von Erdtmann et al. beschrieben worden (Erdtman et al. 1966). Die Substanz ist für S. apiosyce von Leitao et al. beschrieben worden (Leitao et al. 2000).

Es wurden verschiedene Studien zur biologischen Wirksamkeit der Substanz durchgeführt, unter anderem Untersuchungen zur apoptotischen Aktivität von Kämpferol und seinen Derivaten. Niering et al. konnten einen zellprotektiven Einfluss von Kämpferol gegenüber dem Einfluss von H2O2 zeigen, jedoch auch eine DNA‐Schädigung und apoptotische Wirkung von Kämpferol selbst (Niering et al. 2005). Eine apoptotische Wirkung in Krebszellen zeigten in‐vitro und in‐vivo auch Flavone (Chen et al. 2004). Ergebnisse 93 O 3' 4' 5' 2' O 6' 1' 3 2 1 4 O O 9 10 5 8 OH 7 6 O

1 Abbildung C.31: H‐NMR‐Spektrum der Verbindung S.1 (400 MHz, CDCl3) 94 Ergebnisse

1 1 Abbildung C.32: 2D‐ H‐ H‐Shiftkorrelationsspektrum der Verbindung S.1 (CDCl3)

Ergebnisse 95

Tabelle C.6: Kämpferol‐3,7,4‘‐trimethylether in CDCl3 sowie Literaturwerte von (Rossi et al. 1997) und (Vidari et al. 1971) Position 1H 1H Literaturwerte 1H Literaturwerte COSY (Rossi) (Vidari) δ/ppm mult; J[Hz] (δ/ppm mult; J[Hz]) (δ/ppm mult; J[Hz]) (1H‐1H) 3 (O‐Me) 3,88 s* (3,84 s) 5 (OH) 12,65 s (12,6 s) (12,7) 6 6,38 d; 2,2 (6,33 d; 2,2) (6,35 d; 2,5) 8 7 (O‐Me) 3,90 s* (3,84 s) 8 6,47 d; 2,2 (6,43 d; 2,2) (6,45 d; 2,5) 6 2‘ 8,10 d; 9,1 (8,07 d; 9,0) (8,07 d; 9) 3‘, 5‘, 6‘ 3‘ 7,05 d; 9,1 (7,0 d; 9,0) (7,02 d; 9) 2‘, 5‘, 6‘ 4‘(O‐Me) 3,92 s* (3,84 s) 5‘ 7,05 d; 9,1 (7,0 d; 9,0) (7,02 d; 9) 2‘, 3‘, 6‘ 6‘ 8,10 d; 9,1 (8,07 d; 9,0) (8,07 d; 9) 2‘, 3‘, 5‘ ‐OCH3 (3,87 (6H), 3,89 (3H))

*) eindeutige Zuordnung der Signale nicht möglich

1.3.6. Isolierung und Strukturaufklärung von Aristolactam AIIIa (S.2)

Die im NF‐κB‐EMSA aktive Fraktion S.t.7 wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan:Methanol:Ethylacetat 8:1:1 (V:V) als Elutionsmittel weiter aufgetrennt. Es wurden 8 Teilfraktionen erhalten, von denen drei eine DC‐reine Verbindung enthielten. Allerdings war nur in Teilfraktion 3 eine für die NMR‐Messung ausreichende Menge von 1,6 mg vorhanden (s. Abschnitt F.4.4, Exp. Teil). Für eine biologische Testung war die isolierte Substanzmenge zu gering. Die Strukturformel ist in Abbildung C.33 dargestellt. Das Molekül ist ein 3,6‐Dihydroxy‐4‐ methoxyphenanthren‐Derivat. Die Summenformel lautet C16H11NO4. Eine weitere Bezeichnung ist 2,9‐Dihydroxy‐1‐methoxy‐dibenz[cd, f]indol‐4(5H)‐on. Aus dem gemessenen Massenspektrum (Abbildung C.34) kann eine Molmasse von 281 g/mol entnommen werden. Ein ungerades Molekulargewicht deutet auf eine stickstoffhaltige Verbindung hin. Allerdings färbten sich die Substanzflecke der Fraktion S.t.7 auf einer DC nach Derivatisierung mit Dragendorff‐Reagenz nicht an.

96 Ergebnisse

O 2 HO 3 1

4 10a NH 10 H3CO 4a 4b 9 5 8a 6 8 HO 7

Abbildung C.33: Struktur der Verbindung S.2

281.0 100 + 95 [M]

90

85

80

75

70

65 265.9

60

55

50

45 Relative Abundance Relative 40

35

30

25

20 282.0 237.9 15 182.0

10 44.1 90.8 140.5 118.8 295.0 77.1 155.0 5 209.0 310.0 63.1 180.0 239.0 326.0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

Abbildung C.34: EI‐Massenspektrum (Direkteinlass) der Verbindung Aristolactam AIIIa (S.2)

Zur Strukturaufklärung wurden NMR‐Messungen durchgeführt. Im 13C‐NMR‐Spektrum (Abbildung C.36) sind 14 C‐Atome deutlich zu sehen, 2 weitere liegen im Bereich von 118 bis 125 ppm. Aufgrund der geringen Substanzmenge ist das Grundrauschen ziemlich hoch. Ein Signal für einen Carbonyl‐Kohlenstoff tritt bei 168,6 ppm auf. Im HSQC‐Spektrum (Abbildung C.38) können einigen C‐Atomen direkt Protonen zugeordnet werden. Bei 5 Signalen handelt es sich um Methingruppen. Es treten keine CH2‐Signale auf. Ergebnisse 97

Das Signal bei 59,9 ppm korreliert mit dem Singulett bei 4,00 ppm (3 H) und steht somit für eine Methoxygruppe. Die Position der Methoxygruppe kann über die long‐range‐Kopplung (Abbildung C.39) zum Signal bei 149,3 ppm (C‐4) ermittelt werden. Die Zuordnung des Signals bei 149,3 ppm zu C‐4 wiederum kann durch Fernkopplungen mit der OH‐Gruppe an C‐3 und mit H‐2 festgelegt werden. Somit weist das Signal einen etwas niedrigeren ppm‐ Wert auf als das Signal für C‐3.

Im 1H‐Spektrum (Abbildung C.35) gibt es 9 Signale, die der Verbindung zugeordnet werden können und die für insgesamt 11 Protonen stehen. Damit sind alle Protonen der Verbindung sichtbar. Aus dem H‐H‐COSY (Abbildung C.37) können folgende Kopplungen zwischen den Protonen abgelesen werden: H‐7 (7,08 ppm, dd) koppelt mit H‐8 (7,77 ppm, d, J = 8,6 Hz) und H‐5 (8,55 ppm, d), wobei die H‐5/H‐7‐Kopplung schwächer ausgeprägt ist (Kopplungskonstante J = 2,4 Hz). Dies lässt auf eine meta‐Kopplung schließen. Alle weiteren Protonen koppeln nicht. Die Protonen‐tragenden Kohlenstoffe liegen bei δC2 = 113,6, δC5 = 112,1, δC7 = 117,3,

δC8 = 130,4 und δC9 = 104,6. Zusammen mit der Methylgruppe (siehe oben) können damit 8 Protonen zugeordnet werden. Die restlichen 3 H‐Signale erscheinen nicht bei den Nahkopplungen, sondern nur bei den Fernkopplungen. Zusammen mit den hohen ppm‐ Werten ist das ein Hinweis für die Bindung an Heteroatome. Das Singulett bei 9,72 ppm (H‐6‐OH) zeigt im HMBC‐Spektrum (Abbildung C.39) eine Korrelation mit den Kohlenstoffen C‐6 (155,6 ppm), C‐5 (112,1 ppm) und C‐7 (117,3 ppm), also jeweils über 2 bzw. 3 Bindungen. Ebenso liefert das Signal bei 10,19 ppm (H‐3‐OH) 3 Fernkopplungen, nämlich mit C‐3, C‐2 und C‐4. Die chemischen Verschiebungen der

Kohlenstoffe liegen bei δC3 = 152,1, δC2 = 113,6 und δC4 = 149,3. Damit ist diese OH‐Gruppe in Nachbarschaft zu dem Kohlenstoff, der die Methoxygruppe trägt. Das letzte Signal liegt bei 10,65 ppm (N‐H) und koppelt mit dem Carbonyl‐Kohlenstoff bei 168,6 ppm. Außerdem gibt es ein Signal für eine Kopplung mit C‐10 (δC10 = 132,9 ppm) und 2 schwache Signale für

Kopplungen mit C‐1 (δC1 = 122,2) bzw. C‐10a (δC10a = 124). Es liegt also ein 5‐Ring mit einer Lactam‐Struktur vor. In Nachbarschaft über 3 Bindungen liegt H‐2 (7,59 ppm), das eine Fernkopplung zu dem Carbonyl‐C‐Atom, zu C‐3, C‐4 sowie zu C‐1 und C‐10a zeigt. 98 Ergebnisse

In dem Ring, der im H‐H‐COSY das ABX‐System zeigt, koppelt H‐5 (8,55 ppm) im HMBC‐ Spektrum mit C‐4b (128,0 ppm), C‐8a (127,7 ppm), des Weiteren schwach mit C‐6 und C‐7. H‐7 tritt dagegen nur mit einem Signal bei 127,7 ppm (C‐8a) in Wechselwirkung. H‐8 weist eine Fernkopplung mit C‐9 (δC9 = 104,6), C‐8a, C‐4b und C‐6 auf.

Die Zuordnung wird unterstützt durch H‐9, das mit C‐10 (δC10 = 132,9), C‐8a, C‐4b, C‐8 sowie C‐10a korreliert. Die Zuordnung der quartären C‐Atome C‐1, C‐4a, C‐10a bleibt unsicher, sie wird durch die Literaturangaben aber unterstützt. Die Zuordnung von C‐4b und C‐8a ist austauschbar, denn die Signale liegen zu dicht beieinander. In Tabelle C.7 sind alle NMR‐Daten als Übersicht zusammengefasst.

Die Verbindung S.2 (Aristololactam AIIIa) wurde als erstes aus Aristolochia argentina (Aristolochiaceae) isoliert und von Priestap zum ersten Mal beschrieben (Priestap 1985). Ausführliche NMR‐Daten sind in (Priestap 1985; Priestap 1989) enthalten. Kumar et al. beschreiben in ihrem Review (1982‐2003) Fundstellen für Aristolactam AIIIa in verschiedenen Aristolochia‐Arten, für Fissistigma balansae (Annonaceae) und Goniothalamus cheliensis (Kumar et al. 2003). Die aus Fissistigma balansae sowie F. oldhamii isolierte Substanz wurde von Chia et al. auf ihre Hemmung der Blutplättchenaggregation getestet und zeigte eine mittlere Aktivität (Chia et al. 2000).

Die Klasse der Aristolactame umfasst eine Vielzahl von Substanzen, die außer für Aristolochiaceae unter anderem für Vertreter der Menispermaceae (Stephania), Annonaceae (Schefferomitra), Monimiaceae und Piperaceae beschrieben worden sind (Mix et al. 1982). Nach jetzigem Kenntnisstand ((Leitao et al. 1999) und neuerer Literatursuche (April 2008) über Beilstein) ist Aristolactam AIIIa bisher noch nicht aus der Gattung Siparuna isoliert worden.

Ergebnisse 99

NH 9 O 10 8a 8 10a 1 2 7 4a 4b 3 5 4 6 CO HO HO 3 H

Abbildung C.35: 1H‐NMR‐Spektrum der Verbindung S.2 (400 MHz, d6‐DMSO) 100 Ergebnisse NH 9 O 10 8a 8 10a 1 2 7 4a 4b 3 5 4 6 CO HO HO 3 H

Abbildung C.36: 13C‐NMR‐Spektrum der Verbindung S.2 (100 MHz, d6‐DMSO) Ergebnisse 101 2 9 8 5 7 6.7 6.8 6.97.0 9 7 7.1 7.27.3 7.4 7.57.6 2 7.7 8 f2 (ppm) 7.87.98.08.18.28.38.48.58.68.78.8 5

Abbildung C.37: 2D‐1H‐1H‐COSY der Verbindung S.2 (d6‐DMSO) 102 Ergebnisse

Abbildung C.38: HSQC‐Spektrum der Verbindung S.2 (d6‐DMSO) Ergebnisse 103

Abbildung C.39: HMBC‐Spektrum der Verbindung S.2 (d6‐DMSO) 104 Ergebnisse

Tabelle C.7: NMR‐Daten der Verbindung S.2 in d6‐DMSO sowie Literaturwerte (Priestap 1985; Priestap 1989) Position 13C 13C 1H 1H COSY HMBC δ/ppm Literatur δ/ppm mult; Literatur (1H‐1H) (13C‐1H) (δ/ppm) J[Hz] (δ/ppm) 1‐C=O 168,6 (168,3) NH, 2 1 122,2* (120,1) (2) 2 113,6 (113,3) 7,59 s (7,63) 3‐OH 3 152,1 (151,7) 3‐OH, 2 4 149,3 (149,0) 3‐OH, 2 4a 122* (121,9) 4b 128,0* (127,4) 5, 9 5 112,1 (111,8) 8,55 d; 2,5 (8,57) 14 6‐OH 6 155,6 (155,2) 5, 6‐OH, 8 7 117,3 (117,0) 7,07 dd; 8,6, 2,5 (7,09) 12, 15 5, 6‐OH 8 130,4 (130,0) 7,77 d; 8,6 (7,76) 14 9 8a 127,7 (127,7) 8, 9 9 104,6 (104,2) 6,99 s (7,03) 8 10 132,9 (132,6) NH, 9 10a 124* (122,7) (2, 9) OH‐3 10,19 s OH‐6 9,72 s NH 10,65 s (10,62) MeO‐4 59,9 (59,5) 3,98 s (4,02)

*) Signale sind nicht sicher zugeordnet

Eine weitergehende Untersuchung des Extrakts von S. thecaphora fand nicht statt. Ergebnisse 105

2. Pharmakologisch‐biologische Untersuchungen

2.1. Inhibition des Transkriptionsfaktors AP‐1

Der Transkriptionsfaktor AP‐1 (Activator protein‐1) stellt einen zentralen Mediator im Immunsystem sowie bei der Zelldifferenzierung und ‐proliferation dar. Er spielt außerdem eine große Rolle bei Entzündungsprozessen und Rheumatoider Arthritis. Über die AP‐1‐ Transkription wird auch die IL‐induzierte Produktion von Kollagenasen (MMPs) geregelt (Benderdour et al. 2002). AP‐1 ist involviert in Signalwege, die über Osteoclasten zu einer Knochenzerstörung führen können (Wagner et al. 2005). AP‐1 liegt wie NF‐κB als Dimer vor. Die AP‐1‐Untereinheiten aus den Proteinfamilien Jun und Fos können sich als Homo‐ oder Heterodimere zusammenlagern. Die Regulation bzw. Aktivierung erfolgt durch bakterielle oder virale Infektionen, Hormone, Wachstumsfaktoren oder Cytokine.

Getestet werden soll der Einfluss von Sesquiterpenlactonen sowie Zubereitungen aus Blüten von Arnica montana auf die DNA‐Bindeaktivität des Transkriptionsfaktors AP‐1. Für diese Tests wurden generell Kernextrakte im EMSA eingesetzt, die für jeden Assay auf die gleiche Proteinmenge eingestellt wurden (s. Abschnitt F.5.2 und F.5.3, Exp. Teil).

2.1.1. Untersuchung der Hemmkonzentrationen von Sesquiterpenlactonen bei PMA‐ Stimulierung in HeLa229‐Zellen sowie in Jurkat‐T‐Zellen

Um zu sehen, in welchem Ausmaß neben NF‐κB auch der Transkriptionsfaktor AP‐1 durch Sesquiterpenlactone beeinflusst wird, wurden exemplarisch zwei Verbindungen vom Germacranolidtyp im EMSA getestet. Die Strukturen der verwendeten Verbindungen sind in Abbildung C.40 dargestellt. 4β,15‐Epoxy‐miller‐9E‐enolid wird im Folgenden nur noch als Millerenolid bezeichnet. Erste Untersuchungen zur Abklärung des Mechanismus der AP‐1‐Hemmung wurden ebenfalls durchgeführt. Verwendet wurden Jurkat‐T‐Zellen und HeLa229‐Zellen. Ein Problem bei der Untersuchung der AP‐1 DNA‐Bindeaktivität stellt die Grundstimulierung der Zellen dar. Die Jurkat‐T‐Zellen wurden daher am Vortag ausplattiert. Das Niveau der Grundstimulierung zeigte sich dann niedriger und die Zellen waren besser stimulierbar. Keinen Einfluss hatte eine 24‐stündige Hungerperiode, in der FCS dem Medium entzogen 106 Ergebnisse wurde. Zusätzlich wurden die Zellen maximal über 2 bis 3 Wochen nach dem Auftauen verwendet. Parthenolid wurde in einer Konzentrationsreihe getestet und dann als Positivkontrolle verwendet.

O H O O

OH O O O O O ABO

Abbildung C.40: Strukturen der verwendeten Testsubstanzen: (A) 4ß,15‐Epoxy‐miller‐9E‐enolid (= Millerenolid, aus Milleria quinqueflora) und (B) Parthenolid (Sigma‐Aldrich).

Zu Beginn der Versuche war die Datenlage unklar, da Bork et al. einerseits für HeLa‐Zellen gezeigt haben, dass Parthenolid und Isohelenin (= Isoalantolacton) die DNA‐Bindung von AP‐1 nicht beeinflussen (Bork et al. 1997). Andererseits bewiesen Kang et al. für das Germacranolid Costunolid eine Hemmung der AP‐1 DNA‐Bindefähigkeit in RAW 264.7‐Zellen (Kang et al. 2004). Der strukturelle Unterschied von Parthenolid und Costunolid beschränkt sich auf den stabilen Epoxidring.

Ergebnisse 107

Der in Abbildung C.41 gezeigte EMSA stellt das Ergebnis eines Versuchs mit Jurkat‐T‐Zellen dar. Diese wurden eine Stunde mit den angegebenen Substanzkonzentrationen inkubiert und nachfolgend für eine weitere Stunde mit 100 ng/mL PMA stimuliert. Eine vollständige Hemmung der AP‐1 DNA‐Bindung tritt bei 10 µM für Millerenolid (SL A) bzw. bei 20 µM für Parthenolid (SL B) auf.

Millerenolid (SL A) Parthenolid (SL B) µM 1 2,5 5 10 5 10 20 50 PMA − +++++ ++++

W

○

Y 12 3 4 5 6 7 8 910

Abbildung C.41: Einfluss der Sesquiterpenlactone Millerenolid (A) und Parthenolid (B) auf die AP‐1 DNA‐ Bindung in Jurkat‐T‐Zellen. Die Zellen wurden für eine Stunde mit der jeweiligen Verbindung in der angegebenen Konzentration inkubiert und anschließend für eine weitere Stunde mit 100 ng/mL PMA stimuliert. Bahn 1 zeigt unstimulierte Zellen (Negativkontrolle), in Bahn 2 sind die Zellen nur stimuliert worden (Positivkontrolle). Kernextrakte wurden angefertigt und im EMSA untersucht. Das gefüllte Dreieck kennzeichnet die Position der AP‐1‐DNA‐Komplexe, der Kreis steht für unspezifische Protein‐DNA‐Wechselwirkungen. Das offene Dreieck zeigt ungebundenes Oligonucleotid.

Für den ersten Versuch mit HeLa229 ‐Zellen wurden diese ebenfalls für eine Stunde mit Millerenolid und Parthenolid vorinkubiert, dann eine weitere Stunde mit PMA stimuliert, Kernproteinextrakte nach dieser Zeit hergestellt und im EMSA auf AP‐1 DNA‐Bindefähigkeit überprüft. Die Konzentrationen mussten erhöht werden. Dieses Phänomen wird bei verschiedenen Zell‐Linien immer wieder beobachtet und liegt möglicherweise an 108 Ergebnisse unterschiedlichen Glutathion‐Spiegeln bzw. Rezeptordichten. Das Ergebnis ist in Abbildung C.42 dargestellt. Die beiden Substanzen hemmen die Aktivierung von AP‐1 in einer Konzentration von 30 µM (Millerenolid, SL A) und 50 µM (Parthenolid, SL B) fast vollständig, ohne cytotoxisch zu wirken. Damit wird den Ergebnissen von Bork et al. widersprochen und die Ergebnisse von

Kang et al. werden bestätigt.

Millerenolid (SL A) Parthenolid (SL B) µM 10 20 30 50 100 20 50 75 PMA − ++ +++ ++++

W

○

Y 1234 56 78 910

Abbildung C.42: Der Einfluss der Sesquiterpenlactone Millerenolid und Parthenolid auf die AP‐1 DNA‐Bindung in HeLa229‐Zellen. Die Zellen wurden für eine Stunde mit der jeweiligen Verbindung in der angegebenen Konzentration inkubiert und anschließend für eine Stunde mit 100 ng/mL PMA stimuliert. Bahn 1 zeigt unstimulierte Zellen (Negativkontrolle), in Bahn 2 sind die Zellen nur stimuliert worden (Positivkontrolle). Kernextrakte wurden angefertigt und im EMSA untersucht. Das gefüllte Dreieck kennzeichnet die Position der AP‐1‐DNA‐Komplexe, der Kreis steht für unspezifische Protein‐DNA‐Wechselwirkungen. Das offene Dreieck zeigt ungebundenes Oligonucleotid.

Um zu überprüfen, ob AP‐1 direkt von den SLs gehemmt wird, wie das für NF‐κB der Fall ist, wurde ein weiteres Experiment in HeLa229‐Zellen durchgeführt. SLs können an Nucleophile, z.B. Thiolgruppen von Proteinen, in einer Michael‐Reaktion binden. Ein direkter Angriff an AP‐1 ist für 15‐Deoxy‐Δ12,14‐prostaglandin J2, sowie für Gold(I) und Selenit von Perez‐Sala et al. bzw. Handel et al. gezeigt worden (Handel et al. 1995; Perez‐Sala et al. 2003).

Ergebnisse 109

Die HeLa229‐Zellen wurden zuerst stimuliert (1 h), dann wurden Millerenolid und Parthenolid in verschiedenen Konzentrationen für 2 h dazugegeben. Der EMSA zeigte, dass bereits aktiviertes AP‐1 von den Verbindungen gehemmt werden kann. Allerdings war die benötigte Konzentration für eine vollständige Hemmung mit 50 µM (Millerenolid) bzw. 75 µM (Parthenolid) etwas höher als vorher gezeigt. Man kann also annehmen, dass die beiden SLs direkt mit AP‐1 interagieren (Abbildung C.43).

Millerenolid Parthenolid SL A SL B µM 1 h 3 h 20 30 50 50 75 PMA − ++ +++ ++

W

○

Y 123 4 5 6 78

Abbildung C.43: Der Einfluss von Millerenolid (SL A) und Parthenolid (SL B) auf die AP‐1 DNA‐Bindung in HeLa229‐Zellen. Die Zellen wurden erst für eine Stunde mit 100 ng/mL PMA stimuliert und dann mit der jeweiligen Verbindung in der angegebenen Konzentration weitere 2 h inkubiert. Bahn 1 zeigt unstimulierte Zellen (Negativkontrolle), in Bahn 2 und 3 sind die Zellen nur für die ausgewiesene Zeit stimuliert worden (Positivkontrolle). Kernextrakte wurden angefertigt und im EMSA untersucht. Das gefüllte Dreieck kennzeichnet die Position der AP‐1‐DNA‐Komplexe, der Kreis steht für unspezifische Protein‐DNA‐Wechselwirkungen. Das offene Dreieck zeigt ungebundenes Oligonucleotid.

Um mehr Informationen über den Mechanismus der AP‐1 Hemmung durch SLs zu bekommen, wurde die Versuchsdurchführung nochmals modifiziert. Wenn die Hemmung auf einer irreversiblen Alkylierung von freien Sulfhydrylgruppen oder Cysteinresten beruht, sollte die Hemmaktivität der SLs durch einen Überschuss an Dithiothreitol (DTT) und dem damit verbundenen Überangebot an freien Sulfhydrylgruppen unterbunden werden. 110 Ergebnisse

Um dies zu zeigen, wurden die Zellen 1 h mit PMA stimuliert, dann wurde DTT 10 min vor der zweistündigen SL‐Inkubation auf die Zellen gegeben. Wie in Abbildung C.44 gezeigt, unterdrückte DTT die Hemmaktivität von Parthenolid (SL B) vollständig (Bahn 6, 8 und 10).

Parthenolid (SL B) µM 1 h 3 h3 h 50 50 75 75 100 100 PMA ‐ + + ++ ++ ++ + DTT ‐ ‐‐+ ‐‐++‐ +

◄

○

Y 12345678910

Abbildung C.44: Der Einfluss von Parthenolid (SL B) auf die AP‐1 DNA‐Bindefähigkeit in Gegenwart von DTT. Die HeLa229‐Zellen wurden 1 h mit 100 ng/mL PMA stimuliert. Zu den Zellen für die Extrakte von Bahn 4, 6, 8 und 10 wurde dann DTT (5 mM) gegeben und 10 min einwirken gelassen. Danach wurde für 2 h mit Parthenolid in den angegebenen Konzentrationen inkubiert. In Bahn 1 sind unbehandelte Kontrollzellen gezeigt, in Bahn 2 wurden die Zellen für 1 h stimuliert, in Bahn 3 für 3 h. Bahn 4 zeigt den Effekt von DTT allein. Die Bahnen 5, 7 und 9 zeigen Zellen ohne DTT‐ Vorbehandlung. Kernextrakte wurden angefertigt und im EMSA untersucht. Das gefüllte Dreieck kennzeichnet die Position der AP‐1‐DNA‐Komplexe, der Kreis steht für unspezifische Protein‐DNA‐Wechselwirkungen. Das offene Dreieck zeigt ungebundenes Oligonucleotid.

Ergebnisse 111

Die irreversible Bindung wurde durch das nächste Experiment bestätigt. Die Zugabe von DTT nach einer zweistündigen Inkubation mit 75 µM bzw. 100 µM Parthenolid (SL B) hatte keinen Einfluss mehr auf die Hemmung der AP‐1 DNA‐Bindung (Abbildung C.45, Bahn 8 und 10). Die Zellen waren wieder eine Stunde mit PMA vorstimuliert worden. Die SLs scheinen nach zwei Stunden weitgehend mit dem vorliegenden AP‐1 reagiert zu haben.

Parthenolid (SL B) µM 1 h 4 h4 h 50 50 75 75 100 100 PMA ‐ + + +++++++ DTT ‐ ‐‐+ ‐‐++‐ +

W

○

Y 1234 56 7 8910

Abbildung C.45: Der Einfluss einer Inkubation mit DTT auf die Hemmung der AP‐1 DNA‐Bindung durch Parthenolid (SL B) in HeLa229‐Zellen. Bahn 1 zeigt unbehandelte Kontrollzellen, in Bahn 2 wurden die Zellen nur mit 100 ng/mL PMA für eine Stunde stimuliert, in Bahn 3 für 4 h. In Bahn 4, 6, 8 und 10 wurden die Zellen für eine Stunde mit PMA stimuliert, dann für 2 h mit Parthenolid in den angegebenen Konzentrationen inkubiert. Bei den angegebenen Bahnen (6, 8 und 10) wurde anschließend für eine weitere Stunde DTT in einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben. Die Zellen in den Bahnen 5, 7, und 9 wurden nach der Stimulation 3 weitere Stunden mit Substanz inkubiert. Kernextrakte wurden angefertigt und im EMSA untersucht. Das gefüllte Dreieck kennzeichnet die Position der AP‐1‐DNA‐Komplexe, der Kreis steht für unspezifische Protein‐DNA‐Wechselwirkungen. Das offene Dreieck zeigt ungebundenes Oligonucleotid.

112 Ergebnisse

2.1.2. Untersuchung der Hemmkonzentrationen von isolierten Sesquiterpenlactonen aus A. montana in Jurkat‐T‐Zellen nach IL‐1β‐Stimulierung

Getestet werden sollte der Einfluss von Verbindungen aus Arnica montana auf die DNA‐ Bindeaktivität des Transkriptionsfaktors AP‐1. Wie in Kapitel 2.1.1 gezeigt, hemmen Sesquiterpenlactone die AP‐1 DNA‐Bindefähigkeit konzentrationsabhängig. Im folgenden Abschnitt soll die unterschiedliche Aktivität von Helenalin‐ und Dihydrohelenalinderivaten untersucht werden. Die Strukturen der drei exemplarisch verwendeten SLs sind in Abbildung C.46 dargestellt. A und B sind Dihydrohelenalinester, die typisch für den spanischen Chemotyp von A. montana sind. Verbindung C weist als Helenalinester zwei α, β‐ungesättigte Carbonylgruppen auf und steht stellvertretend für SLs des mitteleuropäischen Chemotyps.

H H H

O O O

O O O O O O O O O ABCO O O

Abbildung C.46: Strukturen der eingesetzten Sesquiterpenlactone. A kennzeichnet Dihydrohelenalin‐ isovalerianat, B Dihydrohelenalinmethacrylat und C Helenalinisobutyrat.

Für die Versuche wurden Konzentrationsreihen der Verbindungen A bis C getestet. Parthenolid wurde in einer Konzentration von 50 µM als Referenzsubstanz eingesetzt. Die Jurkat‐T‐Zellen wurden für 1 h mit den verschiedenen Konzentrationen inkubiert, anschließend für eine weitere Stunde mit 20 ng/mL humanem IL‐1β stimuliert. Gleiche Proteinmengen der angefertigten Kernextrakte wurden im EMSA auf die AP‐1 DNA‐ Bindefähigkeit untersucht (siehe Abschnitte F.5.2 und F.5.3, Exp. Teil). Das Ergebnis ist in Abbildung C.47 dargestellt. Die Spezifität des beobachteten Komplexes wurde durch einen Competition Assay abgesichert. Helenalinisobutyrat zeigt bereits bei einer Konzentration von 5 µM eine Hemmung, die unter das Niveau der Grundstimulierung geht (30 µM für eine komplette Hemmung). Die Dihydrohelenaline sind wie erwartet Ergebnisse 113 schwächer aktiv, für den Isovalerianat‐Ester sowie für den Methacrylat‐Ester ist eine Konzentration von um die 20 µM für eine Hemmung nötig. Eine vollständige Hemmung wird erst mit 100 µM erreicht.

P Helenalinisobutyrat Dihydrohelenalin- Dihydrohelenalin- isovalerianat methacrylat µM comp 50 1 5 10 20 30 5 1020 50 100 comp 5 10 20 50 100 IL-1β -++++++++++++ +- ++ ++++ +

W

○

Y 12 3456 78910111213 1415 16 17 18 19 20 21 22 10000 8000 6000 4000 2000 Integral [PSL] 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Abbildung C.47: Einfluss der isolierten SLs aus A. montana auf die AP‐1 DNA‐Bindeaktivität. Die Jurkat‐T‐Zellen (ca. 1,5 Millionen pro Platte, am Vortag ausplattiert) wurden 1 h mit den jeweiligen Substanzen in den angegebenen Konzentrationen inkubiert und eine weitere Stunde mit 20 ng/mL IL‐1ß stimuliert. Mit der Positivkontrolle wurde ein Competition Assay mit nicht gelabeltem Oligonucleotid durchgeführt (Bahn 3 und 17). Die Bahnen 1 und 15 zeigen unbehandelte Kontrollzellen, in Bahn 2 und 16 wurden die Zellen nur für 1 h stimuliert (Positivkontrolle). Parthenolid (P) wurde als Referenzsubstanz eingesetzt. Das ausgefüllte Dreieck markiert die spezifische Bande, der Kreis die nicht‐spezifische und das leere Dreieck freies Oligonucleotid.

2.1.3. Untersuchung von Arnikazubereitungen aus Drogen verschiedener Herkunft

Nachdem in Kapitel 2.1.2 die für den jeweiligen Chemotyp charakteristischen, isolierten SLs getestet wurden, sollte nun der Einfluss verschiedener Arnikazubereitungen auf die DNA‐ Bindeaktivität des Transkriptionsfaktors AP‐1 überprüft werden. Zum Einsatz kamen eine spanische Arnikatinktur, zwei mitteleuropäische Arnikatinkturen (aus frischen sowie getrockneten Arnikablüten) sowie ein Arnikagel, das eine Tinktur aus frischen Arnikablüten vom mitteleuropäischen Chemotyp enthält. Die Zellen wurden für eine Stunde mit den 114 Ergebnisse

Zubereitungen in den angegebenen Konzentrationen inkubiert, wobei die Ethanol‐ konzentration auf die in der jeweiligen Versuchsreihe höchste angepasst wurde. Nachfolgend wurde mit IL‐1β (human, 20 ng/mL) für 3 Stunden stimuliert. Parthenolid (50 µM) wurde als Referenzsubstanz eingesetzt. Das Ergebnis ist in Abbildung C.48 gezeigt.

Tinktur Tinktur F Tinktur SP P Gel µL/mL 0.5 125100.5125 10 2 5 10 20 50 5510 20 30 0 IL-1β - +++++++++++ - ++ ++ ++ - ++ ++++

W

○

Y 12 3456 789101112 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 20000 16000 12000 8000 4000 Integral [PSL] 0 12345678910111213 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Abbildung C.48: Einfluss von Arnikatinkturen oder Arnikagel (Gel) auf die AP‐1 DNA‐Bindung (Tinktur: Arnikablüten mitteleuropäischer Herkunft, Tinktur F: frische Arnikablüten mitteleuropäischer Herkunft, Tinktur SP: Tinktur aus Arnikablüten vom spanischen Chemotyp). Jurkat‐T‐Zellen wurden am Vortag ausplattiert, am Versuchstag lagen 1‐1,5 Millionen pro well vor. Die Negativkontrollen (Bahn 1, 13, 20) blieben unbehandelt, die jeweilige Positivkontrolle wurde mit 20 ng/mL humanem IL‐1ß stimuliert. Als Kontrollsubstanz kam Parthenolid (P) in einer Konzentration von 50 µM zum Einsatz. Die Zellen wurden eine Stunde mit der jeweiligen Zubereitung in der angegebenen Konzentration inkubiert und 3 h mit 20 ng/mL humanem IL‐1ß stimuliert. Es wurden Kernextrakte analysiert, die pro shift auf die gleiche Proteinmenge eingestellt wurden. Das ausgefüllte Dreieck markiert die spezifische Bande, der Kreis die nicht‐ spezifische und das leere Dreieck ungebundenes Oligonucleotid.

Die mitteleuropäische Arnikatinktur zeigte bereits bei der niedrigen Konzentration von 2 µL/mL eine Hemmung. Für die Tinktur aus frischen Arnikablüten sowie die spanische Arnikatinktur wurden 5 µL/mL benötigt, um eine Hemmung unter den Level der Grundstimulierung zu erhalten. Das Gel zeigte diesen Effekt bei 10 µL/mL. Die gegenüber den Einzelverbindungen längere Stimulationszeit wurde für die spanische Arnikatinktur exemplarisch verglichen. Dieses Ergebnis ist in Abbildung C.49 dargestellt. Ergebnisse 115

Erwartungsgemäß sind die hemmenden Effekte etwas größer bei längeren Inkubationszeiten.

P Tinktur SP 3 h Tinktur SP 1 h µL/mL 50 2 5 10 20 25 10 20 IL-1ß - ++ + + + ++ + ++ + +-

W

○

Y 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 25000

20000

15000

10000

5000

0 1234567891011121314

Abbildung C.49: EMSA mit der spanischen Arnikatinktur und zwei verschiedenen Stimulationszeiten. Beobachtet wird die Hemmung der AP‐1 DNA‐Bindung. Jurkat‐T‐Zellen wurden am Vortag ausplattiert, am Versuchstag lagen ca. 1 Million Zellen pro well vor. Die Negativkontrollen (Bahn 1 und 14) blieben unbehandelt, die jeweilige Positivkontrolle wurde mit 20 ng/mL humanem IL‐1ß stimuliert. Als Kontrollsubstanz kam Parthenolid (P) in einer Konzentration von 50 µM zum Einsatz. Die Zellen wurden eine Stunde mit der jeweiligen Zubereitung in der angegebenen Konzentration inkubiert und 1 h oder 3 h mit 20 ng/mL humanem IL‐1ß stimuliert. Es wurden Kernextrakte analysiert, die pro shift auf die gleiche Proteinmenge eingestellt wurden. Das ausgefüllte Dreieck markiert die spezifische Bande, der Kreis die nicht‐ spezifische und das leere Dreieck ungebundenes Oligonucleotid.

Für eine bessere Vergleichbarkeit wurde der Gehalt an Sesquiterpenlactonen (SLs) mittels GC‐Analyse bestimmt. In Tabelle C.8 sind die Zubereitungen mit ihrem jeweiligen SL‐Gehalt (angegeben als Gesamtgehalt sowie Gehalt an Helenalin‐ und Dihydrohelenalinderivaten) aufgeführt. Zusätzlich ist die aus den EMSAs entnommene Hemmkonzentration angegeben. Diese wurde mit dem ermittelten Gehalt unter Verwendung eines mittleren Molekulargewichts von 332,4 g/mol umgerechnet auf die molare Konzentration, welche für die Hemmung notwendig ist. Erwartungsgemäß waren die Arnikazubereitungen mit einem höheren Gehalt an Helenalinderivaten stärker wirksam als diejenigen, bei denen Dihydrohelenalinderivate dominieren (siehe Vergleich mitteleuropäische mit spanischer Arnikatinktur). 116 Ergebnisse

Insgesamt sind die Sesquiterpenlactone in den Arnikatinkturen aber etwas aktiver, als wenn sie isoliert in Lösung vorliegen.

Tabelle C.8: Übersicht über den Gehalt an Sesquiterpenlactonen (SLs) in den untersuchten Arnikazubereitungen, sowie über die ermittelten und die berechneten Hemmkonzentrationen

Gehalt an Sesquiterpenlactonen* Konzentrationen für die Hemmung

[g/100 mL] der AP‐1 DNA‐Bindung§

Gesamt‐ Helenalin‐ DH‐ aus EMSA entspricht entspricht

gehalt Derivate Derivate [Zubereitung] [SLs] [SLs]

Arnikatinktur 0,0644 0,0551 0,0093 2 µL/mL 1,29 µg/mL 3,88 µM mitteleurop.

Arnikatinktur F 0,0167 0,0130 0,0037 5 µL/mL 0,835 µg/mL 2,51 µM (ME, frisch)

Arnikatinktur SP 0,0837 0,0039 0,0798 5 µL/mL 4,19 µg/mL 12,6 µM (spanisch)

Arnika‐Gel 0,0063 0,0046 0,0017 10 µL/mL 0,63 µg/mL 1,90 µM

Helenalin‐ ca. 5 µM isobutyrat

Dihydrohelenalin‐ ca. 20 µM isovalerianat

Dihydrohelenalin‐ ca. 20 µM methacrylat

*) Die Quantifizierung der SLs erfolgte durch GC‐Analyse. §) Bei den Konzentrationen für die Hemmung der AP‐1 DNA‐Bindung unter das Niveau der Grundstimulierung ist zum einen die in einem EMSA mit Jurkat‐T‐Zellen ermittelte Konzentration an µL Zubereitung pro mL Medium angegeben. Mit dem ermittelten Gesamtgehalt wurde diese Konzentration umgerechnet auf die Massenkonzentration [µg SLs/mL]. Daraus folgte schließlich die Umrechnung auf eine molare Konzentration

an SLs (berechnet mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von Mrel = 332,4). DH steht für Dihydrohelenalin

Ergebnisse 117

2.2. Inhibition der Expression von MMP1 und MMP13

Matrixmetalloproteinasen (MMPs) spielen eine Rolle bei Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises. Sie werden verstärkt exprimiert bei entzündlichen Prozessen und können zur Degradierung der Knorpelmatrix beitragen (Pardo et al. 2005; Tardif et al. 2004). Zudem sind MMP1 und MMP13 Zielgene von NF‐κB und AP‐1. Um zu untersuchen, ob die Hemmung der oben genannten Transkriptionsfaktoren auf DNA‐ Ebene auch auf der RNA‐Ebene zum Tragen kommt, wurden Arnikazubereitungen auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der Expression von MMPs in bovinen und humanen Chondrocyten untersucht. Dazu wurde die Expression der Zielgene nach IL‐1β‐Stimulierung mittels qRT‐PCR im LightCycler® untersucht.

2.2.1. Testung von Arnikazubereitungen in bovinen Chondrocyten

Die für die Versuche verwendeten primären bovinen Chondrocyten wurden von Dr. Zwingmann aus den Knien von Rindern isoliert. Die Behandlung ist im experimentellen Teil (Abschnitt F.5.1.1 und F.5.6) beschrieben. Die exemplarisch auf RNA‐Integrität getesteten Proben wiesen alle einen RIN Wert von 10 auf (siehe Abschnitt F.5.6.3, Exp. Teil). Die Sequenzen der verwendeten Primer sowie der Sonde sind in Tabelle F.16 im Exp. Teil aufgeführt. Für die Auswertung wurde der fold‐increase gegenüber unbehandelten Zellen berechnet. Die Versuche wurden mehrmals reproduziert. Eine Hemmung ist bei allen Zubereitungen konzentrationsabhängig deutlich zu sehen (Abbildung C.50). Am stärksten aktiv ist die Tinktur aus mitteleuropäischen Arnikablüten. Als Referenzsubstanz wurde ein isoliertes SL (Helenalinisobutyrat, HIB, 2 µM) verwendet. Der hemmende Effekt der Zubereitungen in der jeweils höchsten getesteten Konzentration lag auf einem ähnlichen Niveau wie der dieser Einzelsubstanz. Cytotoxische Effekte traten bei den verwendeten Konzentrationen nicht auf. Damit konnte ein deutlicher Einfluss der Arnika‐Präparate nicht nur auf DNA‐Ebene, sondern auch auf RNA‐Ebene (verminderte Expression von Effektorenzymen) gezeigt werden. 118 Ergebnisse

Tinktur F Tinktur Tinktur SP Gel HIB

[µL/mL] 0,5120,20,512 5 1 2 52 µM IL‐1β ‐ +++++++++++++ 100 MMP1

80

60

increase

40 fold

20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Tinktur F Tinktur Tinktur SP Gel HIB

[µL/mL] 0,5120,20,51251252 µM IL‐1β ‐ +++++++++++++ 320 300 MMP13 280 260 240 220 200 180 160

increase 140

fold 120 100 80 60 40 20 0 1234567891011121314

Abbildung C.50: Einfluss von Arnikazubereitungen auf die Expression von MMP1 (oben) und MMP13 (unten). Bovine Chondro cyten (ca. 1 Mio./well, fas t konfluent) wurden für eine Stunde mit den angegebenen Substanzen (Tinktur F: mitteleuropäische, frische Blüten, Tinktur: mitteleuropäisch, Tinktur SP: spanisch, Gel: enthält mitteleuropäische Arnika‐Tinktur, HIB: Helenalinisobutyrat) in den verschiedenen Konzentrationen inkubiert, dann für vier Stunden mit IL‐1ß stimuliert (20 ng/mL). Gleiche Mengen der extrahierten Gesamt‐RNA wurden zur cDNA umgeschrieben und im LightCycler® (qRT‐PCR) auf die Genexpression der MMPs untersucht. Der Genexpressionslevel wurde für jede Probe auf die Negativkontrolle (unbehandelte Zellen, Bahn 1) bezogen und als fold‐increase berechnet. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert aus 3 unabhängigen Experimenten, die jeweils als Duplikate vermessen wurden, mit der dazugehörigen Standardabweichung.

Ergebnisse 119

2.2.2. Testung von Arnikazubereitungen in humanen Chondrocyten

Um zu überprüfen, ob die mit bovinen Chondrocyten erhaltenen Ergebnisse auch auf humane Zellen zutreffen, wurden die Versuche zudem mit humanen Chondrocyten durchgeführt.

Gel

[µL/mL] 125 IL‐1β ‐ ++++ 180 170 160 MMP1 150 140 130 120 110 100 90

increase 80

70 fold 60 50 40 30 20 10 0 12345

Gel

[µL/mL] 125 IL‐1β ‐ ++++ 60 MMP13 50

40

30

increase

fold 20

10

0 12345

Abbildung C.51: Effekt von Arnika‐Gel (enthält mitteleuropäische Tinktur aus frischen Arnikablüten) auf die Genexpression von MMP1 (oben) und MMP13 (unten) in humanen Chondrocyten nach IL‐1ß‐ Stimulierung. Die Zellen wurden für eine Stunde mit Gel in den angegebenen Konzentrationen inkubiert, dann für vier Stunden mit IL‐1ß stimuliert (20 ng/mL). Gleiche Mengen der extrahierten Gesamt‐RNA wurden zur cDNA umgeschrieben und im LightCycler® (qRT‐PCR) auf die Genexpression der MMPs untersucht. Der Genexpressionslevel wurde für jede Probe auf die Negativkontrolle (unbehandelte Zellen, Bahn 1) bezogen und als fold‐increase berechnet. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert aus 3 unabhängigen Experimenten, die jeweils als Duplikate vermessen wurden, mit der dazugehörigen Standardabweichung. 120 Ergebnisse

Da humane Chondrocyten sehr teuer sind und nur kurzfristig zur Verfügung standen, wurde exemplarisch nur das Arnikagel getestet. Das Ergebnis ist in Abbildung C.51 dargestellt. MMP13 wird von der kleinsten eingesetzten Konzentration stärker beeinflusst als MMP1. Insgesamt ist auch in humanen Zellen eine deutliche, konzentrationsabhängige Hemmung zu beobachten.

Ergebnisse 121

2.3. Elastase aus Neutrophilen Granulocyten als Target zur Untersuchung auf antiphlogistische Aktivität

Das Enzym Humane Neutrophile Elastase spielt eine wichtige Rolle im Entzündungsgeschehen, so beispielsweise bei Erkrankungen wie Rheumatoider Arthritis, cystischer Fibrose und weiteren schweren Lungenerkrankungen. Eine physiologische Funktion ist die Abwehr eingedrungener Fremdorganismen. Die Stimulation der Neutrophilen erfolgt beispielsweise über das körpereigene Phospholipid PAF (Plättchen‐ aktivierender Faktor) oder das bakterielle formylierte Tripeptid (fMLP). Da PAF allein ein sehr schwacher Aktivator der Neutrophilen ist, wird bei den Versuchen Cytochalasin B (Inhibitor der Mikrofilamentaktivität) zugegeben, um die Freisetzung von Elastase zu verstärken.

Da aus der Literatur auch phenolische Naturstoffe als Elastase‐Inhibitoren bekannt sind (Siedle et al. 2007), sollten Vertreter dieser Substanzklasse untersucht werden, um weitere Kenntnisse über Struktur‐Wirkungs‐Beziehungen zu gewinnen. Hierzu wurden 10 strukturell unterschiedliche Substanzen in den zwei beschriebenen Testsystemen auf direkte Hemmung der Elastase bzw. auf Hemmung ihrer Freisetzung unter Verwendung von menschlichen Granulocyten untersucht. Weiterhin wurde ein in‐vitro‐Assay auf Hemmung der isolierten Elastase etabliert und eine nach Bindungsstudien berechnete und synthetisierte Substanz in diesem Assay untersucht.

2.3.1. Testung der Elastase aus Neutrophilen

Der von Dr. Karin Schorr etablierte Assay (Schorr et al. 2005) wurde zur Testung verschiedener Gerbstoffe und weiterer phenolischer Verbindungen mit sehr unterschiedlichen Molekulargewichten eingesetzt. Dabei kann durch leichte Abänderung des Versuchsprotokolls sowohl auf direkte Hemmung der Elastase als auch auf Hemmung der Elastase‐Freisetzung getestet werden (s. Abschnitt F.5.8, Exp. Teil). Eine schematische Darstellung ist in Abbildung C.52 aufgeführt. Alle 10 Substanzen wurden sowohl auf direkte Hemmung der Elastase als auch auf Hemmung ihrer Freisetzung untersucht.

122 Ergebnisse

Vollblut Vollblut Plasma Plasma Neutrophile Granulocyten Neutrophile Granulocyten

Inkubation mit Cytochalasin B, Inkubation mit Testsubstanzen, Stimulation mit PAF Elastase ‐ Substrat (SAAVNA) und Cytochalasin B Elastase Stimulation mit PAF Inkubation mit Testsubstanzen, Elastase ‐ Substrat (SAAVNA) Beenden der Reaktion mit Zitronensäure 2 %

Beenden der Reaktion mit Zitronensäure 2 % UV‐Messung der Absorption bei 405 nm UV‐Messung der Absorption bei 405 nm

Abbildung C.52: Schematische Darstellung des Tests auf direkte Hemmung der isolierten Elastase (links) sowie Hemmung der Elastase‐Freisetzung (rechts).

2.3.1.1. Untersuchung auf direkte Hemmung

Die sehr großen Gerbstoffmoleküle (Agrimoniin und Pedunculagin) zeigten eine deutliche direkte Elastase‐Hemmung mit einem IC50‐Wert im unteren micromolaren Bereich. Die erzielten Hemmwerte sind in Tabelle C.9 dargestellt. Sie wurden mit GraphPad Prism berechnet und spiegeln den Mittelwert von mindestens zwei Experimenten, die jeweils in Triplicaten gemessen wurden, wieder. Die Substanzen sind allerdings zu groß, um in die Bindungstasche zu passen, was durch Docking‐Experimente (Dr. Thomas Steinbrecher, Physikalische Chemie, Programm FlexX) bestätigt wurde.

Tabelle C.9: Zusammenstellung der Endergebnisse der aktiven Substanzen bei den Untersuchungen auf Elastasehemmung

Test‐Substanz IC50‐Wert [µM] Art der Hemmung ± Standardfehler Agrimoniin 0,9 ± 0,05 Direkt Pedunculagin 2,8 ± 0,3 Direkt EGCG 25,3 ± 2,6 Direkt Resveratrol 12,0 ± 0,9 Freisetzung Genistein 0,5 ± 0,1 Freisetzung EGCG steht für Epigallocatechingallat

Ergebnisse 123

Ihre Hemmwirkung entfalten die Substanzen entweder durch Versperren des aktiven Zentrums bzw. der Selektivitätstasche oder durch unspezifische Denaturierung des Proteins. Beide Strukturen haben auch eine hohe Anzahl phenolischer Gruppen. Für

Epigallocatechingallat wurde ein IC50‐Wert von 25,3 µM ermittelt. Sartor et al. erzielten in ihrem Testsystem für Elastase einen deutlich niedrigeren Wert von 0,4 µM (Sartor et al. 2002). Die Strukturen der aktiven Verbindungen sind in Abbildung C.53 dargestellt.

OH OH OH HO O HO O O HO O OH O O HO O O OH CH HO O O HO 2 O O O O O O OH O O O O O O OH HO OH HO O OH HO OH HO OH OH HO OH HO HO OHHO OH

Agrimoniin

OH OH HO O OH O HO O HO O CH OH HO 2 O O O O O O OH O OH OH HO O HO OH HO OH OH HO OH HO OH Pedunculagin Epigallocatechingallat

Abbildung C.53: Strukturen der Substanzen, welche die Elastase direkt hemmen.

2.3.1.2. Untersuchung auf Hemmung der Elastase‐Freisetzung

Die Durchführung des Tests auf Hemmung der Elastase‐Freisetzung aus Neutrophilen Granulocyten wurde nach dem in Abbildung C.52 gezeigten Schema durchgeführt. Eine ausführliche Beschreibung ist in Abschnitt F.5.8.3 (Exp. Teil) zu finden. Die verwendeten Testsubstanzen sind in Abbildung C.54 dargestellt. Für die angegebenen Substanzen konnte experimentell eine direkte Hemmung ausgeschlossen werden. Es hat sich in den durchgeführten Versuchen gezeigt, dass eine Hemmung der Elastase‐Freisetzung eher bei den kleineren Molekülen auftrat. Resveratrol und Genistein waren die mit Abstand aktivsten Substanzen. In unserem Testsystem zeigte 124 Ergebnisse

Resveratrol einen IC50‐Wert von 12 µM, was im Gegensatz zu dem von Rotondo et al. gefundenen Wert von 31 µM steht (Rotondo et al. 1998). Der für Genistein ermittelte Wert von 0,5 µM ist ebenfalls deutlich niedriger als der in der Arbeit von Tou ermittelte Wert von

99 µM (Tou 2002). Die IC50‐Werte mit dem zugehörigen Standardfehler sind in Tabelle C.9 gezeigt.

OH

HO O OH OH OH HO O OH OH OH OH OH HO O HO HO OH OH OH OH OH OH

(+)‐Epicatechin ‐ (4α‐8) ‐ (+)‐epicatechin (+)‐Epicatechin Hydroxytyrosol (OHT) Tyrosol

O

OH O HO O HO O O

OH O OH OH O

O Resveratrol Triacetoxystilben (TAS) Genistein

Abbildung C.54: Strukturen der Hemmstoffe der Elastase‐Freisetzung.

Die weiteren untersuchten Substanzen waren deutlich schwächer aktiv. (+)‐Epicatechin und (+)‐Epicatechin‐(4α‐8)‐(+)‐epicatechin (EE) verringerten die Elastase‐Freisetzung auf 27 % bzw. 44 % bei einer Konzentration von 200 µM. Die anderen phenolischen Naturstoffe zeigten bereits bei einer Konzentration von 50 µM eine Hemmung von 26 % im Falle von Triacetoxystilben (TAS) bzw. 34 % für Tyrosol und 12 % für Hydroxytyrosol (OHT). Für alle Substanzen wurde keine Aktivität bei der direkten Hemmung gemessen.

2.3.2. Dockingexperimente

Kombiniert wurden die Untersuchungen mit Docking‐Experimenten, die Dr. Thomas Steinbrecher (Physikalische Chemie, Universität Freiburg) durchgeführt hat. Die verwendete Struktur des Enzyms ist in Abbildung C.55 dargestellt. Beobachtet wurde eine Vielzahl von Platzierungen (Placements) der jeweiligen Verbindung auf der Enzymoberfläche, die danach Ergebnisse 125 unterschieden wurden, ob sie in der Bindetasche liegen oder nicht. Angegeben wurde dann der prozentuale Anteil der Placements, die innerhalb der Bindetasche liegen (% BP). Die Ergebnisse sind in Tabelle C.10 aufgeführt.

Tabelle C.10: Docking Experimente mit ausgewählten Naturstoffen, Erklärung siehe Text Verbindung Placements Dockings in der Dockings nicht in der [%] BP Bindetasche Bindetasche

Bornylcaffeat 459 141 318 31 Hydroxytyrosol 300 43 257 14 Agrimoniin 83 0 83 0 Pedunculagin 77 2 75 3

Die Docking‐Experimente ließen leider keine Voraussage der Aktivität der Testsubstanzen unter den durchgeführten Bedingungen zu. Jedoch gilt, dass Moleküle, die nicht in die Bindungstasche passen, trotzdem aktiv sein können, indem sie die Bindungstasche versperren.

Abbildung C.55: Darstellung des gesamten Elastase‐Moleküls für die Docking‐Experimente: „A“ kennzeichnet das aktive Zentrum, „S“ die Selektivitätstasche, die durch eine der möglichen Platzierungen für Pedunculagin teilweise verdeckt wird.

126 Ergebnisse

Es wurden für manche Substanzen (beispielsweise Hydroxytyrosol) Wechselwirkungen mit dem aktiven Zentrum beobachtet, was sich experimentell nicht bestätigen ließ (kein Effekt bis 50 µM). Für Hydroxytyrosol war das Ergebnis überraschend, da die Struktur o‐Dihydroxygruppen aufweist und für Bornylcaffeat ein Teil der Wirksamkeit diesem Strukturelement zugeschrieben wird (Siedle et al. 2003). Wahrscheinlich ist darüber hinaus noch ein bestimmtes lipophiles Gerüst für eine hohe Hemmaktivität nötig.

2.3.3. Naturstoffe als Leitstruktur ‐ Hemmung des isolierten Enzyms mit voraus‐ gesagter Substanz (Bornyl‐3,4,5‐trihydroxycinnamat)

Vorherige Untersuchungen hatten gezeigt, dass Bornylcaffeat (BC, Struktur siehe Abbildung C.56) eine interessante Leitstruktur für Elastase‐Inhibitoren sein könnte (Siedle et al. 2003). Auf der Grundlage von weitergehenden Bindungsstudien wurde ein putatives Bindungsmodell für Bornylcaffeat entwickelt (Steinbrecher et al. 2006). Hierauf basierend wurden verschiedene Strukturen berechnet, um die Aktivität der Leitstruktur zu verbessern. Die beste Bindungsaffinität sollte laut Vorhersage demnach Bornyl‐3,4,5‐trihydroxycinnamat (BTC, Struktur siehe Abbildung C.56) haben. Die Substanz wurde von Dr. Korinna Dormann (Organische Chemie, Universität Freiburg) synthetisiert. Aufgabe war es nun, diese synthetisierte Substanz und Bornylcaffeat, das im Test mit isolierter Elastase einen IC50‐Wert von 1,6 µM ergeben hatte (Melzig et al. 2001), zu untersuchen.

O O HO HO O O

HO HO OH

Abbildung C.56: Strukturen von Bornylcaffeat (BC, links) und Bornyl‐3,4,5‐trihydroxy‐cinnamat (BTC, rechts).

Dieser Test mit isolierter Elastase stand nicht zur Verfügung und war in der Literatur nur ungenau beschrieben (Loeser et al. 2000). Daher musste er neu etabliert werden. Bei der Etablierung des Testsystems traten Probleme auf. So wurde eine Schwankung der Aktivität Ergebnisse 127 des Enzyms abhängig von der Art des Puffers bzw. der Elektrolytkonzentration und des eingesetzten Substrats beobachtet (siehe Abbildung C.57).

50 mM HEPES + SAAPVNA 50 mM Tris‐HCl + SAAPVNA 50 mM Tris‐HCl + SAAVNA 1,6 50 mM HEPES + SAAVNA

1,4

1,2

1,0

0,8

Absorption 0,6

0,4

0,2

0,0 ohne Elektrolyte 150 mM NaCl

Abbildung C.57: Darstellung des Einflusses der Art des Puffers, Elektrolytkonzentration und Substratsequenz auf die Enzymaktivität. 300 µM Substrat wurden mit 40 mU/mL Enzym für 1 h bei 37 °C unter den angegebenen Bedingungen inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion mit Trypsin‐Inhibitor wurde die Absorption bei 405 nm gemessen.

Es wurden 2 verschiedene Puffer mit 2 verschiedenen Enzymsubstraten inkubiert. Der eine Ansatz enthielt jeweils 150 mM NaCl, was einen großen Einfluss nur bei Tris‐HCl mit SAAVNA zeigt. Aus der Literatur sind diese Effekte bekannt (Steinmeyer et al. 1990). In einem weiteren Test wurde gezeigt, dass die Verwendung von Tris‐HCl 50 µM oder 50 mM keinen Einfluss auf die gemessene Absorption hatte. Daher wurde die in der Literatur beschriebene Konzentration von 50 µM verwendet. Abweichend von der Literatur musste eine weitaus höhere Enzymmenge als beschrieben (Loeser et al. 2000) eingesetzt werden, um überhaupt eine messbare Absorption der Substratumsetzung zu erreichen. Agrimoniin in einer Konzentration von 5 µM wurde als Vergleichssubstanz eingesetzt. Abhängig von der Enzymmenge wurde eine Hemmaktivität zwischen 20 % und 80 % erreicht. Ein großer Unterschied trat auch zwischen den Enzymstocklösungen, die mit dem Enzym der gleichen Firma, aber zu unterschiedlichen Zeiten hergestellt wurde, auf (Abbildung C.58). 128 Ergebnisse

100

80

60 [%]

40 Hemmung

20

0 0,2 0,1 0,04 0,1* 0,04* Enzymkonzentration [U/mL]

Abbildung C.58: Erzielte Hemmung der Elastase‐Aktivität durch Agrimoniin 5 µM bei verschiedenen Elastase‐ Konzentrationen (angegeben ist die Konzentration der Stocklösung in U/mL), wobei mit „*“ eine zweite Stocklösungen von zwei unterschiedlichen Bestellungen des Enzyms gekennzeichnet ist. Die Aktivität einer Enzymlösung ohne Zusatz von Agrimoniin wurde als 100 % festgelegt.

Die genaue Versuchsbeschreibung, die letztendlich verwendet wurde, liegt in Abschnitt F.5.8.4 im Exp. Teil vor. Nachdem die Versuchsvorschrift festgelegt worden war, wurden mehrere Versuchsreihen durchgeführt, um diese Ergebnisse zu reproduzieren und eine

IC50‐Wert‐Berechnung möglich zu machen. α1‐Antitrypsin wurde als Referenzsubstanz in die Testungen miteinbezogen. Diese Substanz ist ein physiologischer Inhibitor mit einem mittleren Molekulargewicht von 53 kDa, der auch in der Literatur beschrieben ist. Allerdings weichen die angegebenen Werte stark voneinander ab, je nachdem, welches Testsystem verwendet wurde (Hernandez et al. 2005; Sartor et al. 2002). Dieses Phänomen kann für alle Hemmwerte bei Elastase‐Tests beobachtet werden (Siedle et al. 2007).

Der IC50‐Wert wurde mit GraphPad Prism 4 berechnet. Für jede Konzentration liegen Werte aus mindestens 3 isolierten Bestimmungen der Berechnung zugrunde. Ergebnisse 129

In Abbildung C.59 sind die Hemmkurven der drei getesteten Substanzen dargestellt.

Bornylcaffeat 100 α1‐Antitrypsin Bornyl‐(3,4,5‐trihydroxy)‐cinnamat 80 [%]

60

40 Hemmung

20

0

0.001 0.01 0.1 1 10 Konzentration [µM]

Abbildung C.59: Hemmung der Humanen Neutrophilen Elastase durch die drei Testsubstanzen. Unbehandeltes Enzym wird als Positivkontrolle verwendet und die gemessene Absorption als 0 % Hemmung definiert.

Als aktivste Substanz stellte sich die Referenzsubstanz α1‐Antitrypsin mit einem ermittelten

IC50‐Wert von 0,12 µM (vgl. Tabelle C.11) heraus. Der ermittelte IC50‐Wert für Bornyltrihydroxycinnamat lag immerhin um den Faktor drei niedriger als bei Bornylcaffeat. Leider ließ sich eine größere Überlegenheit gegenüber der schon bekannten Substanz nicht nachweisen.

Tabelle C.11: Zusammenstellung der erhaltenen Werte für die halbmaximale Elastase‐ Hemmung und des zugehörigen Konfidenzintervalls der drei Testsubstanzen

Bornyl‐ Testsubstanz Bornylcaffeat α1‐Antitrypsin trihydroxycinnamat

IC50‐Wert [µM] 1,56 0,54 0,12

95 % Konfidenzintervall 1,05‐2,30 0,33‐0,89 0,051‐0,29

130 Ergebnisse

Interessanterweise zeigte Bornylcaffeat bei Testung im in Abschnitt 2.3.1 beschriebenen Elastase‐Assay (Elastase isoliert aus Vollblut) bis zu einer Konzentration von 20 µM keine direkte Hemmung, die analoge Verbindung BTC wies in der gleichen Konzentration nur eine geringe Aktivität von 21 % Hemmung auf. Beide Substanzen zeigten eine relativ starke Hemmung der Elastase‐Freisetzung aus den Neutrophilen Granulocyten von ca. 70 % bei 20 µM.

Zusammenfassung 131

D. Zusammenfassung

1. Die biologisch kontrollierte Fraktionierung eines Extraktes aus Blättern der in der traditionellen Medizin Zentralamerikas verwendeten Euphorbiaceae Hieronyma alchorneoides Fr. Allemão, führte zur Isolierung und Strukturaufklärung der drei Biflavonoide 7,4‘‘‐O‐Dimethylamentoflavon (H.1), 7‐O‐Methylamentoflavon (H.2) und Amentoflavon (H.3) sowie von (+)‐Catechin (H.4). Als biologisches Testsystem diente hauptsächlich der NF‐κB‐EMSA. Die Strukturen wurden mittels 1D‐ und 2D‐NMR‐ spektroskopischer und massenspektrometrischer Methoden aufgeklärt. Die Verbindungen H.1 und H.2 sowie H.4 sind im Rahmen dieser Arbeit erstmals für die Gattung Hieronyma beschrieben worden. Die Untersuchung im NF‐κB‐EMSA zeigte, dass diese Biflavonoide nur einen geringen Anteil an der NF‐κB‐inhibierenden Aktivität des Extrakts haben und noch unbekannte Begleitstoffe zur Hemmung beitragen.

2. Die phytochemische Untersuchung eines Extraktes aus den Blättern von Siparuna thecaphora (Poepp. et Endl.) A. DC. (Siparunaceae), der im MTT‐Test eine starke cytotoxische Aktivität aufwies, führte zur Isolierung des Flavonoids 3,7,4‘‐Trimethoxykämpferol (S.1) und des Alkaloids Aristolactam AIIIa (S.2). S.1 ist hier für die Art, S.2 für die Gattung erstmals beschrieben. Zur Strukturaufklärung wurden MS‐ und NMR‐Daten eingesetzt. Auf diese Substanzen allein konnte die starke cytotoxische Aktivität nicht zurückgeführt werden. Die Fraktionen mit sehr starker, im MTT‐Assay gezeigter Cytotoxizität, waren zu komplex zusammengesetzt und lagen in zu geringen Mengen vor, als dass einzelne Substanzen hieraus isoliert werden konnten.

3. Es konnte gezeigt werden, dass Sesquiterpenlactone aus den Blüten von Arnica montana sowie Arnikazubereitungen die DNA‐Bindung des Transkriptionsfaktors AP‐1 in Jurkat‐T‐Zellen hemmen. Helenalinisobutyrat führte in einer Konzentration von 5 µM zu einer Hemmung der IL‐1β‐induzierten Aktivierung von AP‐1. Für den gleichen Effekt wurde von Dihydrohelenalinisovalerianat und Dihydrohelenalin‐ methacrylat eine Konzentration von ca. 20 µM benötigt. Dies steht im Einklang mit 132 Zusammenfassung

vorhergehenden Analysen mit dem Transkriptionsfaktor NF‐κB, die ebenfalls eine stärkere Aktivität von Helenalinderivaten gezeigt haben. In Übereinstimmung damit zeigte eine Tinktur aus mitteleuropäischen (ME), getrockneten Arnikablüten eine deutliche Hemmung der AP‐1 DNA‐Bindung bei einer Konzentration von 2 µL/mL (µL Zubereitung/mL Medium). Von der Tinktur aus frischen Blüten (ME) und einer Tinktur aus spanischen Arnikablüten waren 5 µL/mL für eine vollständige Hemmung der nach Stimulierung mit IL‐1β induzierten Aktivierung von AP‐1 erforderlich. Das Gel, das eine Tinktur aus frischen Blüten (ME) enthält, zeigte diesen Effekt bei 10 µL/mL.

4. Um Hinweise auf den Wirkmechanismus der AP‐1‐Hemmung durch Sesquiterpenlactone zu finden, wurden mit Parthenolid und 4β‐15‐Epoxymiller‐9Z‐ enolid weitere Versuche durchgeführt. Nach der Bestimmung der Konzentration für eine vollständige Hemmung der AP‐1 DNA‐Bindung wurde gezeigt, dass Sesquiterpenlactone AP‐1 direkt angreifen. In HeLa229‐Zellen, in denen nach PMA‐ Stimulierung AP‐1 bereits vorlag, wurde die DNA‐Bindung verhindert. Um einen postulierten Angriff an Cysteinresten zu überprüfen, wurde im EMSA nachgewiesen, dass durch DTT im Überschuss die Hemmaktivität der SLs verloren geht. Die nachträgliche Zugabe dieses Sulfhydrylgruppen‐Donors konnte die Hemmung nicht mehr beeinflussen. Dies deutete darauf hin, dass die Hemmung überwiegend irreversibel geschieht.

5. Die verschiedenen Arnikazubereitungen wurden außerdem auf ihre Hemmaktivität gegenüber der IL‐1β‐induzierten Expression von MMP1 und MMP13 auf Genebene in Chondrocyten untersucht. Die Analysen der mRNA erfolgten mittels quantitativer real‐time RT‐PCR. Alle Zubereitungen zeigten eine konzentrationsabhängige, zu der Vergleichssubstanz Helenalinisobutyrat (2 µM) ähnlich starke Verringerung der Genexpression in einem Bereich von 0,2 µL bis 5 µL Zubereitung pro mL Zellkulturmedium in bovinen Chondrocyten nach IL‐1β‐Stimulierung. Für einen Nachweis der Übertragbarkeit auf den menschlichen Organismus wurden die Versuche exemplarisch mit dem Arnikagel in humanen Chondrocyten wiederholt. Die starke, konzentrationsabhängige Hemmung konnte wiederum gezeigt werden. Zusammenfassung 133

6. Die Gerbstoffe Agrimoniin, Pedunculagin und EGCG konnten als starke direkte Inhibitoren des Enzyms Humane Neutrophile Elastase (aus Vollblut) identifiziert

werden. Die IC50‐Werte lagen hierbei zwischen 0,9 µM und 25 µM. Alle 7 weiteren untersuchten phenolischen Verbindungen zeigten keine oder nur eine geringe Hemmaktivität. Bei den Untersuchungen, in wieweit die Substanzen die Elastasefreisetzung aus Neutrophilen Granulocyten hemmen können, wurden als aktivste Verbindungen

Genistein mit einem IC50‐Wert von 0,5 µM sowie Resveratrol mit einem IC50‐Wert von 12 µM ermittelt. Alle anderen Substanzen, wie Tyrosol, Hydroxytyrosol, Triacetoxystilben, (+)‐Epicatechin und (+)‐Epicatechin‐(4α‐8)‐(+)‐epicatechin, waren merklich schwächer aktiv, die Hemmung lag dort bei einer Konzentration von 50 µM teilweise deutlich unter 50 %.

7. Es wurde ein Elastase‐Assay unter Verwendung von kommerziell erhältlicher, isolierter Elastase im Arbeitskreis etabliert, um das in Kooperation mit anderen Arbeitskreisen nach Bindungsstudien und chemischer Synthese zur Verfügung stehende Bornyl‐3,4,5‐trihydroxycinnamat zu testen. Als Vergleichssubstanzen wurden das als Vorlage dienende Bornylcaffeat und der physiologische Inhibitor α1‐

Antitrypsin untersucht. Die Aktivität lag mit einem IC50‐Wert von 0,54 µM wie

erwartet über der der Vergleichssubstanz Bornylcaffeat (IC50‐Wert von 1,56 µM), allerdings nicht ganz so hoch wie in den Docking‐Studien berechnet. Für α1‐

Antitrypsin wurde mit 0,12 µM der niedrigste IC50‐Wert in dieser Versuchsreihe erzielt.

8. In einem Kapitel wurde eine Übersicht über die aktuelle Literatur zur Bedeutung von Gerbstoffen bei topischer Anwendung, ihren Einsatzgebieten und möglichen Wirkmechanismen zusammengestellt und diskutiert.

Diskussion 135

E. Diskussion

Bei der Entwicklung von Arzneistoffen darf die Rolle von biogenen Quellen nicht vernachlässigt werden. So dienen Substanzen, die durch direkte Isolation aus pflanzlichen, tierischen oder mikrobiellen Organismen gewonnen werden, zum einen direkt als Arzneistoffe oder ‐ weitaus wichtiger ‐ als Leitstruktur. Zwischen 2000 und 2006 wurden insgesamt 26 Arzneimittel auf den Markt gebracht bzw. zugelassen, die auf pflanzlichen Inhaltsstoffen basieren. Die neuen Arzneimittel werden vor allem in der Tumortherapie und als Antiinfektiva eingesetzt (Saklani et al. 2008). Gerade bei der Krebstherapie spielen Naturstoffe eine große Rolle. Zwischen 1940 und 2007 waren von den 155 neuen, niedermolekularen Verbindungen 73 % nicht‐synthetisch, 47 % davon waren Naturstoffe oder direkt von diesen abgeleitet (Newman et al. 2007). Eine Untersuchung von Feher et al. zeigt, dass Naturstoffe als Vorbilder für eine kombinatorische Synthese die Diversität dieser Substanzen und ihre biologische Relevanz erhöhen (Feher et al. 2003). Trotzdem ist die Pharmazeutische Industrie immer weniger bereit, an Naturstoffen zu forschen, da die Suche nach diesen neuen Arzneistoffen aufwändiger ist (Baker et al. 2007). Dennoch sind Baker et al. davon überzeugt, dass eine Fortsetzung der Untersuchungen von biologischem Material zu einem Fortschritt bei der Wirkstoffsuche gegen Bakterien oder Tumore führen wird. Die Naturstoff‐Forschung an Universitäten kann hier einen maßgeblichen Beitrag leisten.

1. Phytochemische Untersuchungen

In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Pflanzen, die traditionell in Zentralamerika als Heilpflanzen eingesetzt werden, auf antiinflammatorisch oder cytotoxisch wirkende Substanzen untersucht. Siparuna thecaphora und Hieronyma alchorneoides sind in Zentralamerika wachsende Sträucher bzw. Bäume.

Hieronyma alchorneoides Fr. Allemão (Euphorbiaceae), deren Rindendekokt in der traditionellen Anwendung bei Husten zum Einsatz kommt (Tinto et al. 1991), ist in der Vergangenheit bereits phytochemisch untersucht worden. Als Inhaltsstoffe waren ein Butenolid, Lupeol, Stigmasterol, β‐Sitosterol, Simiarenol, Antidesmonderivate und 136 Diskussion

Amentoflavon aus den Blättern sowie Hyeronimon (8‐Dihydroantidesmon) aus den Wurzeln isoliert worden (Buske et al. 2002; Kuroshima et al. 2005; Tinto et al. 1991). Die biologisch kontrollierte Fraktionierung eines tBME‐Extraktes aus Blättern von H. alchorneoides an offener Säulenchromatographie mit Überprüfung der Aktivität gegenüber NF‐κB als molekularem Target führte zur Isolierung und Identifizierung von 3 Biflavonoiden (Strukturformeln siehe Abbildung E.1). Es handelt sich dabei um 3‐8‘‐verknüpfte Biapigenine, die eine unterschiedliche Methylierung der Hydroxylgruppen aufweisen. Die Verbindung H.3 (Amentoflavon) ist bereits für H. alchorneoides bekannt (Kuroshima et al. 2005), die beiden anderen Verbindungen (H.1 und H.2) wurden hier zum ersten Mal aus H. alchorneoides isoliert. H.1 (7, 4‘‘‐O‐Dimethylamentoflavon, Synonym Podocarpusflavon B oder Putraflavon) wurde das erste Mal als Inhaltsstoff von Podocarpus macrophylla (Miura et al. 1969) sowie inzwischen für weitere Pflanzen beschrieben. H.2 (7‐O‐Methylamentoflavon, Synonym Sequoiaflavon) wurde unter anderem in Libocedrus‐ Arten nachgewiesen (Markham et al. 1990). Amentoflavon und 7‐O‐Methylamentoflavon kommen neben weiteren Biflavonoiden ebenso in Ginkgo biloba vor (Krauze‐Baranowska et al. 2004). Des Weiteren wurde (+)‐Catechin (H.4, Struktur siehe Abbildung E.1) aus H. alchorneoides isoliert.

OR2 4'' 5'' 3''

6'' 2'' 1'' 5' 2* 5' 4' OH 1* 4' OH 6' O 3* 6' 8 4* 8 1 1 1' 3' 9* 1' 3' R1O 7 9 O HO 7 9 O 2 2' 8* 10* O 2 2' OH 5* 3 6 3 6 10 7* 10 4 5 4 HO OH 5 OH 6* 4α OH O OH 4βH H

R1 R2

H.1 CH3 CH3 H.4

H.2 CH3 H H.3 H H

Abbildung E.1: Strukturen der aus H. alchorneoides isolierten Verbindungen H.1 bis H.4.

Diskussion 137

Das Spektrum der biologischen Aktivität von Biflavonoiden ist vor allem für Amentoflavon sehr breit untersucht. Shin et al. zeigen eine Neuroprotektion durch Amentoflavon (Shin et al. 2006). Der Zelltod bei Hypoxie wird reduziert, da die Caspase‐3‐Aktivierung verhindert wird, außerdem findet eine verringerte iNOS‐ und COX‐2‐Induktion (Nachweis auf Proteinebene) statt. Amentoflavon wirkt als hoch‐affiner Benzodiazepin‐Rezeptor‐Ligand mit einem gemischt competitiven/nicht‐competitiven Mechanismus, was von Nielsen et al. experimentell belegt werden konnte (Nielsen et al. 1988). Durch das Vorkommen in Ginkgo biloba und dessen Einsatz bei Gedächtnisleistungs‐ störungen ist bereits eine Vielzahl weiterer Untersuchungen verschiedener molekularer Wirkmechanismen erfolgt. Neben den antiinflammatorischen Wirkungen und einer Verstärkung der Mikrozirkulation konnte eine Hemmung der PDE‐5 (Phosphodiesterase‐5), die ein Beleg für die beobachtete Gefäßrelaxation sein könnte, demonstriert werden (Dell'Agli et al. 2006).

Ein analgetischer Effekt wurde durch selektive COX‐1‐Hemmung und damit Hemmung der Prostaglandin‐Synthese nachgewiesen (Bucar et al. 1998). Für Fraktionen von Extrakten aus Blättern von H. alchorneoides konnte der analgetische Effekt von Amentoflavon in Tests an Mäusen bestätigt werden (Kuroshima et al. 2005). Eine Beschreibung eines Antityrosinase‐Effekts, der durch eine Erniedrigung des Protein‐ und mRNA‐Levels von tyrosine‐related protein‐2 (TRP‐2) vermittelt wird, und damit zu einer Hemmung der Pigmentation (durch Melanin) führt, liegt für ein Amentoflavon‐Derivat und weitere Biflavonoide aus Podocarpus vor (Cheng et al. 2007). Außerdem wird eine antifungale Aktivität gegenüber Candida albicans berichtet (Jung et al. 2007), die von Woo et al. für Amentoflavon aus Selaginella tamariscina bestätigt wird (Woo et al. 2005). Zusätzlich weisen die Biflavonoide eine geringe bis mittlere Aktivität gegen Protozoen auf (Camacho et al. 2000). Die antivirale Aktivität gegen Influenza‐Viren u.a. wurde von Lin et al. untersucht. Für Amentoflavon wurde eine halbmaximale Hemmung im Konzentrationsbereich von 3 bis 4 µg/mL nachgewiesen (Lin et al. 1999b).

Die entzündungshemmende Wirkung der Inhaltsstoffe von H. alchorneoides wurde in dieser Arbeit zuerst durch einen NF‐κB‐EMSA getestet. Im EMSA werden unter Verwendung von Kernextrakten die Substanzen daraufhin untersucht, ob sie die Kerntranslokation von NF‐κB 138 Diskussion bzw. die NF‐κB DNA‐Bindung hemmen können. Der Transkriptionsfaktor NF‐κB ist an der Genexpression von proinflammatorischen Cytokinen (wie Interleukinen und TNF‐α),

Enzymen des Entzündungsgeschehens (COX, PLA2, iNOS), Zelladhäsionsmolekülen und Akute‐Phase‐Proteinen beteiligt (Pahl 1999). Eine wichtige Rolle spielt NF‐κB damit in der Pathogenese akuter und chronischer Entzündungen und ist daher das Ziel einer intensiven Suche nach spezifischen Inhibitoren. Gilmore et al. zeigen, dass von 785 bekannten Inhibitoren von NF‐κB 331 Naturstoffe sind, deren Hauptangriffspunkte die NF‐κB DNA‐ Bindung (90 Verbindungen) bzw. die Hemmung der IKK und IκB‐Phosphorylierung (90 Verbindungen) sind (Gilmore et al. 2006). Damit ist der EMSA ein wertvolles Tool zur Auffindung neuer Inhibitoren. Als Hemmstoff von NF‐κB zeigte das untersuchte Biflavonoid H.1 im EMSA nur eine schwache Aktivität, da eine Konzentration von 200 µM noch nicht zur vollständigen Hemmung ausreicht. Die beobachtete Hemmaktivität der Ausgangsfraktion ist daher wohl unter anderem auf Begleitstoffe zurückzuführen. Woo et al. zeigten für Amentoflavon (H.3) in einer Konzentration von 60 µM allerdings eine vollständige Hemmung der NF‐κB‐ Aktivierung in einem Reportergen‐Assay mit RAW‐Zellen (Woo et al. 2005). Der postulierte Mechanismus läuft über eine Hemmung der IκB‐Degradierung und damit Blockade der Kerntranslokation von p65. Möglicherweise ist der unterschiedliche Methylierungsgrad von Bedeutung, allerdings wurde auch ein anderer Zelltyp sowie ein anderes Testsystem verwendet.

Die Aktivierung von NF‐κB, welche aus der IκB‐Degradierung, der Translokation von NF‐κB in den Kern sowie der DNA‐Bindung besteht, muss nicht unbedingt zur Transaktivierung eines Promotors führen. Abhängig vom jeweiligen Stimulus kann NF‐κB selbst posttranslational modifiziert werden, wodurch die Transaktivierung mancher NF‐κB‐abhängiger Gene erst ermöglicht bzw. verstärkt wird (Chen et al. 2002). Es gibt verschiedene Methoden, um zu untersuchen, inwieweit Verbindungen die NF‐κB‐Aktivierung blockieren. Um den Effekt von Substanzen zu untersuchen, welche die Kerntranslokation und DNA‐Bindung von NF‐κB hemmen, bedient man sich des EMSAs, während zur Untersuchung der κB‐abhängigen Transkription sogenannte Reportergen‐Assays verwendet werden. Um das Spektrum der Aktivität zu testen, wurde der Luciferase‐Reportergen‐Assay durchgeführt. Als Reportergen kommt hier Luciferase aus dem Glühwürmchen (Photinus Diskussion 139 pylaris) zum Einsatz. Dieses Enzym katalysiert die Oxidation von Luciferin zu Oxyluciferin unter Freisetzung von Photonen. Das Ausmaß der Enzymaktivität ist ein Maß für die Expressionsrate der Luciferase und damit auch indirekt für die durch NF‐κB beeinflusste Promotoraktivität. Testsubstanzen, die nur hier eine Hemmung zeigen und nicht im EMSA, können NF‐κB beispielsweise durch die Hemmung von Kinasen oder Störung des Transkriptionsapparates beeinflussen. Allerdings trat eine direkte Hemmung der Luciferase durch die Begleitsubstanzen des Extraktes auf. Daher konnte dieser Test nicht zur Aktivitätsüberprüfung verwendet werden.

Catechin (H.4) ist ein weit verbreiteter Naturstoff, der bereits in den 1920er beschrieben wurde (Freudenberg et al. 1921). Als Baustein von Flavonoiden und Gerbstoffen hat er durch die polyphenolische Struktur mehrere biologische Wirkungen (siehe Kapitel B). Die Einzelsubstanz ist als Hemmstoff von MMPs getestet worden, allerdings bei MMP2 und 9 ohne Wirksamkeit, bei MMP12 wurde eine Hemmung beobachtet (70 % bei 100 µM) (Demeule et al. 2000). Die strukturell verwandte Substanz Epicatechin zeigte bei eigenen Untersuchungen mit Elastase keine Aktivität bei der direkten Hemmung und nur eine geringe Hemmung der Elastase‐Freisetzung.

Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass aus H. alchorneoides pharmakologisch interessante Verbindungen isoliert worden sind. Vor allem die Hemmung von NF‐κB durch den Extrakt sowie die nachgewiesene antivirale und analgetische Wirkung (Bucar et al. 1998; Kuroshima et al. 2005; Lin et al. 1999b) könnten Gründe für den traditionellen Einsatz bei Husten sein. Allerdings müssen einige der vorher zitierten, weiteren Untersuchungen eher kritisch gesehen werden, da sie mit Extrakten verschiedener Pflanzen durchgeführt wurden und die Vergleichbarkeit dann schwierig ist. Eigene Untersuchungen haben gezeigt, dass Begleitsubstanzen im Extrakt eine Wirkung hervorrufen oder vortäuschen können. Daher wäre zumindest bei erwiesener Aktivität eine Überprüfung der Reinsubstanzen wünschenswert. Eine bessere Vergleichbarkeit von sehr unterschiedlichen Molekülen ist durch eine Testung von molaren Mengen gegeben.

140 Diskussion

Wie oben bereits erwähnt, wurde als zweite Pflanze Siparuna thecaphora (Poepp. et Endl.) A. DC. (Siparunaceae) für eine phytochemische Aufarbeitung ausgewählt. Untersuchungen von Siparuna thecaphora wurden bereits in der Literatur beschrieben. Als Inhaltsstoffe sind ätherisches Öl und Alkaloide bekannt. Leitao et al. haben die aus der Gattung bzw. Familie isolierten Inhaltsstoffe als Übersicht dargestellt (Leitao et al. 1999). Die dort zitierten Quellen beschreiben die traditionelle Anwendung bei gastrointestinalen Beschwerden, Hauterkrankungen, bei Erkältungen, Kopfschmerzen, Fieber durch Malaria und andere Infektionen. Außerdem werden durch Ureinwohner im Amazonasgebiet Tees bei rheumatischen Beschwerden verwendet, zusätzlich wird eine Verwendung bei Husten angeführt. Die traditionelle Anwendung bei Schlangenbissen wurde weiter untersucht. Eine mittelmäßige Neutralisierung des haemorrhagischen Effekts von Schlangengift (Bothrops) konnte für S. thecaphora bei Tests an Mäusen gezeigt werden (Otero et al. 2000).

Der Ausgangsextrakt (tBME) zeigte eine hemmende Aktivität im NF‐κB‐EMSA, erwies sich aber auch als cytotoxisch im MTT‐Test. Deshalb ist es wahrscheinlich, dass die im NF‐κB‐ EMSA beobachtete Hemmung der DNA‐Bindung zumindest teilweise durch cytotoxische Effekte bedingt ist. Aus diesem Grund wurde die biologisch‐kontrollierte Fraktionierung mittels MTT‐Test durchgeführt. Leider konnten die stark cytotoxisch wirkenden Substanzen nicht isoliert werden, da sie letztlich in einer zu geringen Konzentration vorlagen. Auch von anderen Siparuna‐Arten wird berichtet, dass sie cytotoxisch sind (Renner et al. 2005). Es war allerdings möglich, aus dem Extrakt von S. thecaphora ein trimethoxyliertes Kämpferolderivat (S.1) sowie ein Alkaloid (Aristolactam AIIIa, S.2) zu isolieren. Die Strukturen sind in Abbildung E.2 dargestellt.

O 5' 2 HO 3 1 6' 4' O NH 8 1 1' 4 10a O 9 O 3' 7 H CO 4a 10 2 2' 3 4b 3 9 6 5 10 8a 5 4 O 6 OH O 8 HO 7

S.1 S.2

Abbildung E.2: Strukturen der aus Siparuna thecaphora im Rahmen dieser Arbeit isolierten Verbindungen S.1 und S.2.

Diskussion 141

Das Flavonoid S.1 (3,7,4‘‐Trimethoxykämpferol) ist bereits für die Gattung Siparuna beschrieben worden, genauer für S. apiosyce (Synonym S. brasiliensis (Leitao et al. 2000)). Kämpferolderivate wurden bereits in Apoptose‐Assays untersucht (Chen et al. 2004; Niering et al. 2005). Im MTT‐Test wird jedoch nicht zwischen Apoptose und Nekrose unterschieden, das Flavonoid S.1 zeigte hier eine Cytotoxizität von fast 70 %, allerdings in einer recht hohen Konzentration von 100 µg/mL (entspricht ca. 300 µM). Diese Verbindung könnte zur beobachteten cytotoxischen Aktivität der Fraktion S.t.5 beitragen.

Aristolactam AIIIa (S.2) ist das erste Mal von Priestap für Aristolochia argentina beschrieben worden, für S. thecaphora bzw. allgemein für die Gattung Siparuna liegen keine Fundstellen vor (Priestap 1985). Laut Beilstein‐Suche gibt es nur Berichte in Fissistigma‐ und Aristolochia‐ Arten (Stand April 2008). Kumar et al. beschreiben zusätzlich das Vorkommen in Goniothalamus cheliensis (Kumar et al. 2003). Die Verbindung wird zur Klasse der Aporphin‐ Alkaloide gezählt (Mix et al. 1982). Die Kenntnisse über das Inhaltsstoffspektrum von S. thecaphora wurden somit durch diese Arbeit um zwei Substanzen und für die Gattung um eine Substanz erweitert. Das Alkaloid wurde auf Hemmung der Blutplättchenaggregation überprüft. Eine Konzentration von 100 µg/mL reduzierte die Kollagen‐induzierte Aggregation auf ca. 40 %, die durch Arachidonsäure induzierte auf ca. 57 %. Letztere wird durch Aspirin in der gleichen Konzentration vollständig gehemmt, während es auf die Kollagen‐induzierte keinen Einfluss hat (Chia et al. 2000). Für eine eigene Testung wurde die Substanz in zu geringer Ausbeute erhalten. Auffällig war eine recht hohe Cytotoxizität der untersuchten Fraktion im MTT‐Test. 142 Diskussion

2. Pharmakologisch‐biologische Untersuchungen

Untersuchungen mit Sesquiterpenlactonen (Hemmung des Transkriptionsfaktors AP‐1)

Die Hemmung des Transkriptionsfaktors NF‐κB durch Naturstoffe wurde unter anderem für Sesquiterpenlactone (SLs) gezeigt. Sesquiterpenlactone sind Naturstoffe, die eine Vielzahl an Wirkungen aufweisen (Schmidt 1999). Hierbei sind vor allem antiphlogistische Wirkungen (Hall et al. 1979), aber auch antibakterielle, antitumorale, cytotoxische, kardiotoxische und migränehemmende Effekte zu nennen (Marles et al. 1995; Schmidt 1999). Ein Teil dieser Wirkungen lässt sich auf die Hemmung von NF‐κB zurückführen (Garcia‐Pineres et al. 2001; Lyss et al. 1998; Lyss et al. 1997). Neben NF‐κB sind als weitere wichtige molekulare Targets im Entzündungsgeschehen die Transkriptionsfaktoren AP‐1 und NF‐AT zu nennen. Eine Hemmung dieser Mediatoren durch unterschiedlich strukturierte SLs wurde im micromolaren Bereich bereits nachgewiesen (Klaas 2001).

AP‐1 ist ein dimeres Protein, das aus Proteinen der Jun‐ oder Fos‐Familie zusammengesetzt sein kann und sowohl zur basalen als auch zur induzierbaren Genexpression beiträgt. Diese Induktion kann beispielsweise durch UV‐Licht oder proinflammatorische Cytokine stattfinden und ist ein Beispiel für die Beteiligung von AP‐1 an Entzündungsreaktionen und an der Immunantwort. Eine weitere Bedeutung hat AP‐1 in der Regulation von Wachstum, Apoptose und Überleben (Proliferation und Differenzierung) der Zellen (Shaulian et al. 2001).

Eine der bekanntesten Arten, welche die Inhaltsstoffklasse der Sesquiterpenlactone führt und die zu den Arzneipflanzen der traditionellen Medizin Europas gehört, ist Arnica montana (Willuhn 1998). In der Arbeitsgruppe Merfort ist bereits viel über den Mechanismus der NF‐κB‐Hemmung sowie zu Struktur‐Wirkungsbeziehungen von SLs erforscht worden (Garcia‐ Pineres et al. 2001; Siedle 2003; Wagner et al. 2006). Zu den wichtigen Strukturelementen für eine pharmakologische Aktivität gehören reaktive Enon‐Gruppen wie α, β‐ungesättigte Carbonylgruppen, die mit Nucleophilen reagieren können. Um das Wissen über das Wirkspektrum der SLs aus Arnika zu erweitern, wurde ihre Hemmfähigkeit gegenüber AP‐1 Diskussion 143 untersucht. Als Reinsubstanzen wurden exemplarisch ein Helenalinderivat und zwei Dihydrohelenalinester im AP‐1‐EMSA überprüft.

Die Hemmung der DNA‐Bindefähigkeit von AP‐1 wurde in Jurkat‐T‐Zellen mit IL‐1β als Stimulus konzentrationsabhängig gezeigt. Helenalinisobutyrat führt, wie erwartet, in einem niedrigeren Konzentrationsbereich zu einer Inhibition. 5 µM reichen aus, um eine Hemmung unter das Niveau der Grundstimulierung zu erzielen. Dihydrohelenalinisovalerianat und Dihydrohelenalinmethacrylat zeigen diesen Effekt erst bei ca. 20 µM. Betrachtet man die vollständige Hemmung, liegt ungefähr ein Faktor 3 zwischen den erforderlichen Konzentrationen. Das Helenalinderivat hemmt bei 30 µM, wohingegen beide Dihydrohelenaline erst bei 100 µM eine vollständige Hemmung zeigen.

Da bei vielen Pflanzen der Extrakt als „Wirkstoff“ angesehen wird, wurden zusätzlich zu den isolierten SLs verschiedene Arnikazubereitungen überprüft. Die eingesetzten Tinkturen unterscheiden sich zum einen in der Drogenherkunft (spanischer und mitteleuropäischer Chemotyp), zum anderen wurde untersucht, ob es einen Unterschied zwischen einer Tinktur aus frischen Arnikablüten und einer Tinktur aus getrockneten Arnikablüten gibt. Die in der Apotheke häufig anzutreffende Formulierung des Arnikagels wurde ebenfalls überprüft. Für die Transkriptionsfaktoren NF‐κB und NF‐AT wurden Untersuchungen mit Arnikazubereitungen bereits von Christoph Klaas durchgeführt (Klaas 2001).

Betrachtet man im AP‐1‐EMSA die Volumenzugabe der jeweiligen Zubereitung, ist die mitteleuropäische Arnikatinktur aus getrockneten Arnikablüten am aktivsten. Eine Hemmung der IL‐1β‐induzierten AP‐1‐Aktivierung tritt bei 2 µL Zubereitung/mL Medium auf. Zwischen der mitteleuropäischen Tinktur aus frischen Blüten und der spanischen Tinktur konnte kein Unterschied beobachtet werden. Beide hemmen bei einer Konzentration von 5 µL/mL. Vom Gel, das eine mitteleuropäische Tinktur aus frischen Blüten enthält, waren 10 µL/mL erforderlich. Für eine exaktere Vergleichbarkeit wurde der SL‐Gehalt der einzelnen Zubereitungen mittels GC‐Analyse quantifiziert. Unter Berücksichtigung der so ermittelten molaren Konzentration an SLs stellt sich das Gel mit einer Hemmkonzentration von 1,9 µM als aktivste Zubereitung heraus. Bei den beiden mitteleuropäischen Tinkturen scheint diejenige aus frischen Blüten 144 Diskussion etwas aktiver zu sein als die aus getrockneten (2,51 µM gegenüber 3,88 µM). Die schwächste Hemmaktivität zeigt die spanische Tinktur, von der für eine Hemmung 12,6 µM SLs benötigt werden. Dass die spanische Tinktur mit einem deutlich höheren Anteil an Dihydrohelenalinderivaten eine schwächere Hemmung zeigt, wurde erwartet. Die Hemmkonzentration für isolierte Dihydrohelenaline liegt mit 20 µM etwas höher. Insgesamt konnte jeweils eine höhere Aktivität der in Tinkturen vorliegenden SLs gegenüber den isolierten SLs (in DMSO‐Lösung) beobachtet werden. Diese höhere Aktivität könnte auf synergistische Effekte der anderen im Extrakt enthaltenen Stoffe zurückgeführt werden. Zusätzlich konnte von Dr. Steffen Wagner im Arbeitskreis gezeigt werden, dass Einzelverbindungen stärker an Proteine binden als SLs aus Arnikazubereitungen (Wagner et al. 2004a) und dadurch letztere in den Zellen in höherer Konzentration für eine Hemmung zur Verfügung stehen.

Um den molekularen Mechanismus der AP‐1‐Hemmung durch SLs näher zu beleuchten, wurden weitere Experimente durchgeführt. Zuerst wurde die für eine vollständige Hemmung der AP‐1 DNA‐Bindung benötigte Konzentration ermittelt. Sie betrug in HeLa229‐Zellen für 4β‐15‐Epoxymiller‐9Z‐enolid (SL A) 30 µM und für Parthenolid (SL B) 50 µM. Untersuchungen mit PMA‐vorstimulierten Zellen sprachen dafür, dass AP‐1 direkt angegriffen wurde. Wurden die Zellen erst 1 Stunde stimuliert und dann für zwei weitere Stunden mit den Testsubstanzen inkubiert, erhöhten sich die benötigten Konzentrationen (auf 50 µM für SL A und 75 µM für SL B), aber eine vollständige Hemmung war möglich. Wenn die SLs in die Aktivierungskaskade von AP‐1 eingreifen würden, könnte eine Hemmung bei dieser Versuchsanordnung nicht mehr stattfinden. Die benötigten Konzentrationen sind höher als bei Jurkat‐T‐Zellen. Dieses Phänomen wurde bereits für die NF‐κB‐Hemmung durch SLs in unserem Arbeitskreis beobachtet (Garcia‐Pineres et al. 2004; Lindenmeyer 2004). Möglicherweise sind unterschiedliche Glutathion‐Level für die beobachteten Effekte verantwortlich. Godwin et al. konnten nachweisen, dass eine steigende Konzentration an Glutathion den hemmenden Effekt von cis‐Platin verringert und die Zellen somit eine Resistenz gegenüber Thiol‐reaktiven Verbindungen zeigen (Godwin et al. 1992).

Im Folgenden wurde dem Versuchsansatz nach der Stimulation ein Überschuss an DTT (Dithiothreitol), also ein Überangebot an freien Sulfhydrylgruppen, zugegeben. Es konnte Diskussion 145 gezeigt werden, dass durch diese Zugabe die Hemmaktivität von Parthenolid (SL B) vollständig unterdrückt wird. Wenn die Alkylierung mehr oder weniger irreversibel stattfindet, dürfte eine nachträgliche Zugabe von DTT die Hemmaktivität nicht beeinflussen. Auch dies konnte experimentell belegt werden. Nach einer 2‐stündigen Inkubation mit Parthenolid war die Hemmung durch DTT nicht mehr zu unterbinden.

Diese Versuche sprechen dafür, dass SLs AP‐1 über einen direkten Angriff hemmen. SLs können in einer Art Michael‐Addition mit Nucleophilen, besonders mit biologischen Thiolgruppen, reagieren. Sie können dadurch über L‐Cystein Proteine alkylieren. Für NF‐κB wurde der direkte Angriff an das Cystein‐38 der DNA‐bindenden Domäne der p65‐ Untereinheit gezeigt (Garcia‐Pineres et al. 2001). Bei AP‐1 besitzen sogar beide Untereinheiten Cysteinreste in der DNA‐Binderegion. Für die humanen Proteine c‐Fos (Position 154) und c‐Jun (Position 278) konnte dort je ein Cystein identifiziert werden (siehe Abbildung E.3) (Bohmann et al. 1987; Glover et al. 1995).

Abbildung E.3: Darstellung der Struktur des c‐Jun/c‐Fos‐Heterodimers, das an DNA gebunden hat. Hervorgehoben sind die beiden Cysteinreste (Cys‐154 bei c‐Fos, Cys‐278 bei c‐Jun, gelb) sowie Arginin‐ und Lysinreste (blau‐türkis) in der Nachbarschaft, die z.T. an der DNA‐Bindung beteiligt sind.

146 Diskussion

In der Nachbarschaft befinden sich Arginin‐ und Lysinreste, die eine Bindung von SLs erleichtern. Für Substanzen wie Gold (I)‐Salze und Selenit konnte ein direkter Angriff an Jun (Cys272) und Fos (Cys154) gezeigt werden (Handel et al. 1995). 15‐deoxy‐Δ12,14‐prostaglandin J2 kann über eine α, β‐ungesättigte Carbonylgruppe an Cystein 269 von c‐Jun binden (Perez‐ Sala et al. 2003). Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen sieht man, dass die gleichen Cysteinreste, wie oben bei Glover angegeben, gemeint sind.

Quantitative real‐time RT‐PCR Ergänzend zur Untersuchung der DNA‐Bindung der Transkriptionsfaktoren wurden Genexpressionsanalysen auf mRNA‐Ebene mit Arnikazubereitungen durchgeführt. Eine moderne Methode zur Quantifizierung der Genexpression, die hierfür verwendet wurde, ist die quantitative real‐time RT‐PCR. Matrixmetalloproteinasen (MMPs) sind unter anderem Zielgene der Transkriptionsfaktoren NF‐κB und AP‐1 und an Krankheiten mit chronischer Entzündung wie Rheumatoider Arthritis beteiligt (Benderdour et al. 2002; Yan et al. 2007). Sie werden sowohl von Chondrocyten als auch von Synovialzellen exprimiert und sezerniert. MMPs, vor allem Kollagenasen (siehe unten), können die Knorpelmatrix degradieren. Im Gelenk liegen hauptsächlich Aggrecan (Proteoglycan) und Kollagen Typ II als Bestandteile der Extrazellulären Matrix vor, sowie ein kleiner Anteil an Chondrocyten. Als Mechanismus der Gelenkzerstörung wird angenommen, dass zuerst Aggrecan durch MMPs oder weitere Enzyme wie Cathepsin oder auch Neutrophile Elastase lysiert wird und dann die Kollagenfasern nicht mehr gegen Proteolyse durch MMPs geschützt sind (Rowan et al. 2008; Takaishi et al. 2008). MMPs können fast alle Bestandteile der extracellulären Matrix im Knorpelgewebe abbauen. Die MMPs, die bei Arthritis eine bedeutende Rolle spielen, sind die sogenannten Kollagenasen, die Kollagentripelhelices hydrolysieren können. Dazu gehören MMP1 (Kollagenase 1), MMP8 (Kollagenase 2) und MMP13 (Kollagenase 3) sowie MMP2 und 14. Rowan et al. stellen eine Theorie vor, dass MMP13 das wirksamste Kollagen Typ II ‐ abbauende Enzym ist und vor allem in Osteoarthritis vorkommt, wohingegen MMP1 bei Rheumatoider Arthritis vorherrscht (Rowan et al. 2008). Allerdings tragen wohl eher beide Enzyme in bestimmten Stadien zu beiden Erkrankungen bei. Modellvorstellungen zur physiologischen Rolle sowie Ansätze für eine selektive Hemmung von MMP13 sind bei (Takaishi et al. 2008) gezeigt. Bisher ist noch kein MMP‐Inhibitor als Arzneimittel auf dem Markt. Diskussion 147

Aufgrund ihrer wichtigen physiologischen und pathophysiologischen Rolle wurden MMP1 und MMP13 als Zielgene ausgewählt. Die vier bei den AP‐1‐Versuchen eingesetzten Arnikazubereitungen wurden auf konzentrationsabhängige Hemmung der beiden Gene nach IL‐1β‐Stimulierung in primären bovinen Chondrocyten untersucht. Primäre Zellen aus einem Gelenk wurden für diese Versuche ausgewählt, um einen Zelltyp, der direkt von der Erkrankung betroffen ist, vorliegen zu haben. Die relative Quantifizierung erfolgte gegenüber dem Referenzgen 18S rRNA durch Auswertung von real‐time RT‐PCR‐Analysen. Alle Zubereitungen zeigten eine konzentrationsabhängige, im Vergleich zu Helenalinisobutyrat (2 µM) ähnlich starke Verringerung der Genexpression in einem Bereich von 0,2 bis 5 µL Zubereitung pro mL Zellkulturmedium. Bei der Tinktur aus mitteleuropäischen Arnikablüten genügte der untere Konzentrationsbereich (0,2 bis 0,5 µL/mL) für eine Hemmung. Die spanische Tinktur verhielt sich ähnlich wie das Arnikagel, die Hemmung wurde hier im Konzentrationsbereich von 2 bis 5 µL/mL beobachtet. Mit dem Arnikagel wurden die Versuche exemplarisch in humanen Chondrocyten wiederholt, um die Übertragbarkeit der Daten auf den Menschen zu überprüfen. Die starke, konzentrationsabhängige Hemmung wurde auch hier gezeigt.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Arnikapräparate und ihre wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffe, die Sesquiterpenlactone, Transkriptionsfaktoren, wie AP‐1, direkt inhibieren. Dies wirkt sich dann folgerichtig in Form einer Hemmung der Induktion von Zielgenen auf RNA‐Ebene aus. Erkenntnisse über den molekularen Wirkmechanismus tragen dazu bei, die entzündungshemmende Wirkung, in diesem Fall von Arnikazubereitungen, besser zu verstehen.

Bei der Suche nach Inhibitoren von Entzündungsreaktionen und pathologischen Krankheitsverläufen gibt es häufig Schwierigkeiten mit der Korrelation von in‐vitro‐ zu in‐vivo‐Daten. Dabei spielt sowohl die Spezifität als auch die Bioverfügbarkeit eine entscheidende Rolle. Für SLs aus Arnika konnte im Schweinehautmodell eine Hautpenetration und ‐permeation gezeigt werden (Wagner et al. 2007). Dabei scheint die Anwendung von Tinkturen vorteilhaft gegenüber Einzelsubstanzen (Wagner et al. 2004b). Durch eine lokale Applikation sind unerwünschte systemische Wirkungen stark verringert. Weitere Studien, welche die Bioverfügbarkeit im Gelenk zeigen, wären für alle topischen 148 Diskussion

Zubereitungen wünschenswert und würden den Einsatz von Arnikazubereitungen bei rheumatischen Gelenkerkrankungen wissenschaftlich noch mehr untermauern. Bisher existieren nur für wenige Substanzen Daten zur verfügbaren Konzentration im Plasma und vor allem im Gelenk (Janusz et al. 2006).

Es gibt eine Reihe von MMP‐Inhibitoren. Eine Übersicht über die Inhibitoren von MMPs in klinischen Studien findet sich in (Fingleton 2007). Bisher ist noch nicht geklärt, ob ein direkter Angriff an MMPs zum Erfolg führen kann oder ein Eingriff in die Signalkaskade neue Therapieoptionen bringt (Rowan et al. 2008). Festzuhalten bleibt außerdem, dass die alleinige Hemmung von MMPs das Fortschreiten der Erkrankung zwar aufzuhalten vermag, allerdings ist es fraglich, ob es zu einer Art „Reparatur“ kommen kann und bereits bestehende Symptome wie Schmerz und Bewegungseinschränkung gelindert werden.

Elastase‐Tests Ein weiteres wichtiges Target im Entzündungsgeschehen ist die Elastase. Es handelt sich um eine Serinprotease, die u.a. Elastin, einen Bestandteil des Bindegewebes, spaltet. Bei übermäßiger Aktivität führt diese Eigenschaft zur Zerstörung von körpereigenem, gesundem Gewebe. Pathologische Prozesse wie COPD, cystische Fibrose und Rheumatoide Arthritis sind unter anderem geprägt durch ein Übermaß an Elastaseaktivität ((Siedle et al. 2007) und darin zitierte Literatur). Eine Hemmung ist prinzipiell direkt durch Blockade der Enzymfunktion möglich, aber auch durch Eingriff in die Freisetzung. Entsprechende Hemmstoffe stoppen die gewebezerstörenden Prozesse und damit die Entzündungsreaktion in einer sehr frühen Phase.

SLs hemmen die Freisetzung von Elastase (Siedle 2003). In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Substanzen mit o‐Dihydroxygruppen, wie beispielsweise Hydroxyzimtsäurederivate, eine direkte Hemmung ausüben können. Um die Kenntnisse über Struktur‐Wirkungs‐Beziehungen zu erweitern, wurden in der vorliegenden Arbeit Gerbstoffe, die aufgrund ihrer phenolischen Struktur zahlreiche Hydroxygruppen besitzen, auf ihr Hemmpotential getestet, die erhaltenen Ergebnisse mit Literaturdaten verglichen und durch Docking‐Ergebnisse überprüft. Diskussion 149

Eine starke direkte Hemmung wurde durch die Ellagitannine Agrimoniin und Pedunculagin erzielt. Diese Substanzen mit einem sehr hohen Molekulargewicht sind vermutlich eher unspezifische Inhibitoren, die die Bindungstasche versperren (siehe Abbildung C.55, Ergebnisteil) bzw. das Enzym durch Wechselwirkungen stören. Als weitere aktive Substanz erwies sich EGCG (Epigallocatechingallat) mit einem IC50‐Wert von 25 µM. Sartor et al. fanden für diese Substanz einen deutlich niedrigeren Hemmwert von 0,4 µM (Sartor et al. 2002). Ein möglicher Grund dafür ist die längere Inkubationszeit von 2 h (in unserem Testsystem 30 min), außerdem wurde isoliertes Enzym verwendet. Bei Inkubation von Neutrophilen mit dieser Testsubstanz wurde innerhalb von 45 min nur eine knapp 30 %ige Hemmung der Substratumsetzung durch 9 µM EGCG beobachtet (Sartor et al. 2002). Hier würde der IC50‐Wert dann höher liegen. Diese Gruppe zeigte auch, dass eine mindestens 50fach höhere Konzentration an EGCG für eine Hemmung von MMP2 oder MMP9, Thrombin und Cathepsin G nötig ist. Pankreaselastase (vom Schwein) blieb sogar bis zu einer Konzentration von 1 mM EGCG unbeeinträchtigt. Damit konnte eine relative Spezifität gezeigt werden (Sartor et al. 2002). Allerdings ist eine Hemmung der MMPs durch EGCG, mit einem IC50‐Wert von 8 µM (MMP2) und 13 µM (MMP9), ebenfalls beschrieben (Garbisa et al. 2001). Demeule et al. haben verschiedene Grünteepolyphenole, inklusive EGCG hinsichtlich ihrer Wirkung auf MMP2, 9 und 12 (Macrophagen‐Elastase) untersucht (Demeule et al.

2000). EGCG stellte sich als stärkster Inhibitor der Enzyme heraus (IC50‐Wert für MMP2 6

µM, für MMP9 0,3 µM). Für MMP12 wurde bei Grünteepolyphenolen ein IC50‐Wert von 0,3 µg/mL erhalten (1 µM EGCG übte eine Hemmung von ca. 50 % aus). Die Substanzen hatten aber ebenfalls keinen Einfluss auf Pankreaselastase (Demeule et al. 2000).

Da bekannt war, dass Hydroxyzimtsäurederivate wie beispielsweise Bornylcaffeat gute direkte Inhibitoren darstellen (Siedle 2003), wurde Hydroxytyrosol (OHT) im Vergleich zu Tyrosol getestet. Die beiden Verbindungen waren allerdings inaktiv. Das spricht dafür, dass außer dem Strukturelement, das direkte Wechselwirkungen mit dem aktiven Zentrum eingehen kann, wahrscheinlich noch ein bestimmtes lipophiles Gerüst für eine hohe direkte Hemmaktivität notwendig ist. Bezüglich der Elastase‐Freisetzung zeigten sie in einer Konzentration von 50 µM jedoch eine Reduktion von 12 % (OHT) bzw. 34 %.

150 Diskussion

Verschiedene Substanzen wurden auch auf Hemmung der Elastase‐Freisetzung untersucht. Allerdings kann über Substanzen, die eine starke direkte Hemmung zeigen, mit diesem Testsystem keine Aussage gemacht werden. Deshalb wurden nur Substanzen, für die ein direkter Angriff am Enzym experimentell ausgeschlossen werden konnte, auf ihre Hemmfähigkeit untersucht. Die höchste Aktivität der untersuchten Substanzen zeigten

Genistein mit einem IC50‐Wert von 0,5 µM sowie Resveratrol mit einem IC50‐Wert von 12 µM. Werden die Hydroxygruppen von Resveratrol acetyliert, wie das bei Triacetoxystilben (TAS) der Fall ist, sinkt die Aktivität drastisch. Eine Konzentration von 50 µM zeigte dann nur noch eine Hemmung von 26 %. Für beide Substanzen gibt es Literaturdaten mit einem höheren IC50‐Wert (Genistein 99 µM (Tou 2002), Resveratrol 31 µM (Rotondo et al. 1998)).

Der molekulare Mechanismus, über den die Exocytose von abbauenden Enzymen wie der Elastase gehemmt wird, ist noch unklar. Substanzen, die hier eingreifen, haben den Vorteil, dass sie viele verschiedene Entzündungsmediatoren beeinflussen, so z.B. außer Elastase auch Kollagenasen, Cathepsin G, Myeloperoxidase (und die damit verbundene Bildung reaktiver Sauerstoffspezies). Bei der beobachteten Hemmung stehen eher membranstabilisierende Effekte oder ein Eingriff in die Signalübertragungsmechanismen, welche die Exocytose regulieren, im Vordergrund. Eine Hemmung der Elastase‐Synthese über Hemmung der Transkription und Translation wäre erst nach mehreren Stunden nachweisbar und nicht so rasch wie im verwendeten Assay.

Da Zimtsäurederivate die Aktivität dieses wichtigen Proteins beeinflussen, können sie als Leitstruktur bei der Entwicklung von neuen Elastase‐Inhibitoren eingesetzt werden. Die phytochemische und pharmakologische Untersuchung von traditionell eingesetzten Heilpflanzen ist ein mehr zielgerichteter Ansatz zur Leitstruktursuche als das reine Screening von Substanzdatenbanken (Feher et al. 2003). Daher sind Naturstoffe gute Vorlagen für Hemmstoffe.

Voraussetzung für den Einsatz einer Substanz als Leitstruktur ist, dass zuerst die Zusammenhänge zwischen chemischer Struktur und den pharmakologischen Effekten untersucht werden. Von der HNE als molekularem Target kennt man die genaue Struktur der Bindungstasche sowie den Mechanismus der ablaufenden Reaktionen. Außerdem ist eine Diskussion 151

Selektivitätstasche bekannt. Hilfreich ist ebenso, dass gute Inhibitoren bereits bekannt sind. In Kooperation mit der Physikalischen Chemie (Universität Freiburg), in der die Docking‐ Experimente durchgeführt wurden, und der Organischen Chemie (Uni Freiburg), wo die Synthese vorgenommen wurde, konnte schließlich als neuer Enzyminhibitor Bornyl‐3,4,5‐ trihydroxycinnamat getestet und mit Bornylcaffeat verglichen werden. Als Referenzsubstanz wurde der physiologische Inhibitor α1‐Antitrypsin eingesetzt. Die Aktivität (IC50‐Wert von

0,54 µM) lag wie erwartet über der der Vergleichssubstanz (IC50‐Wert von 1,56 µM), allerdings nicht ganz so hoch wie berechnet. Die niedrigste Konzentration von 0,12 µM für eine halbmaximale Hemmung wurde für die Referenzsubstanz α1‐Antitrypsin ermittelt.

Interessanterweise war dieser Wert nur mit kommerziell erhältlicher HNE zu erreichen, nicht mit der aus Granulocyten isolierten Elastase. Das zeigt, dass das eingesetzte Testsystem für die Betrachtung der Hemmwerte eine große Bedeutung hat. Auffällig ist, dass häufig verschiedene Werte für eine halbmaximale Hemmung bei der gleichen Testsubstanz erhalten werden (Siedle et al. 2007). Wie bei der Etablierung des Testsystems auf Elastase zu beobachten war, wird die Aktivität der Elastase von der Elektrolytkonzentration der verwendeten Puffer, vom Substrat und von der Inkubationsdauer beeinflusst (Stein 1983; Steinmeyer et al. 1990). Eine einheitliche Verwendung von Referenzsubstanzen wäre daher wünschenswert, damit abgeschätzt werden kann, wie aktiv die neuen Testsubstanzen im Verhältnis sind.

Für die Entwicklung einer neuen Leitstruktur müssen außerdem auch pharmakokinetische Parameter der Verbindungen wie Bioverfügbarkeit oder Plasma‐Eiweiß‐Bindung betrachtet werden. Zusätzlich sollten die Substanzen eine ausreichende Stabilität aufweisen, um eine Handhabbarkeit in den Tests aber auch in der weiteren Entwicklung zu ermöglichen. Letzteres ist bei der neu synthetisierten Substanz leider nicht der Fall. Insgesamt kann dieser Teil der vorliegenden Arbeit aber als „proof of concept“ betrachtet werden, der zeigt, dass die Methode der Voraussage zusammen mit der biologischen Überprüfung ein wertvolles Werkzeug zur Entwicklung neuer Inhibitoren sein kann.

Experimenteller Teil 153

F. Experimenteller Teil 1. Materialien

1.1. Chemikalien

Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Reagenzien und Chemikalien sind in nachfolgender Tabelle F.1 aufgelistet. Die Testsubstanzen für die Elastase‐Versuche bzw. für die zellbiologischen Untersuchungen sind im jeweiligen Kapitel aufgeführt.

Tabelle F.1: Verwendete Chemikalien Chemikalie Hersteller Chemikalie Hersteller Heparin‐Natrium Braun „Multi“ BBraun, Aceton p.a. Merck, Darmstadt 10.000 I.E./mL Melsungen Acrylamid‐Lsg, wässrig HEPES ([4‐(2‐Hydroxy‐ethyl)‐ Sigma, Roth, Karlsruhe (30 % AA, 0,8 % Bis) piperazino]‐ethano‐sulfonsäure) Deisenhofen Amersham, γ‐33P‐ATP Hepes Buffer 1 M Roche, Mannheim Freiburg Ameisensäure konz. Roth, Karlsruhe Kaliumchlorid (KCl) Merck, Darmstadt Kaliumdihydrogenphosphat p‐Anisaldehyd Sigma, USA Merck, Darmstadt (KH2PO4) Aprotinin (from Bovine Lung) Sigma, USA Kaliumjodid (KI) Roth, Karlsruhe Ammoniumperoxodisulfat Merck, Darmstadt Leupeptin Sigma, USA (APS) (NH4)2S2O8 Magnesiumchlorid Hexahydrat β‐Mercaptoethanol Sigma, USA Merck, Darmstadt (MgCl2*6 H2O) Bismutnitrat (Wismut‐III‐ Roth, Karlsruhe Methanol p.a. Fluka, Seelze Nitrat), basisch MTT 3‐[4,5‐Dimethylthiazol‐2‐yl]‐ Borsäure (H3BO3) Roth, Karlsruhe 2,5‐Diphenyl Tetrazolium Bromid Roth, Karlsruhe (Thiazolylblau C18H16BrN5S) Sigma, Bromphenolblau Natriumchlorid (NaCl) Merck, Darmstadt Deisenhofen BSA (Bovines Serum Albumin) Amersham, UK Natriumhydroxid (NaOH) Merck, Darmstadt Sigma, BSA Fraktion V (für Elastase) Roth, Karlsruhe Nonidet P‐40 (NP‐40) Deisenhofen Calciumchlorid Dihydrat PAF (Plättchen aktivierender Merck, Darmstadt Bachem, Schweiz (CaCl2 * 2 H2O) Faktor) Chloroform (Trichlormethan) Roth, Karlsruhe Penicillin‐Streptomycin 500x Roche, Mannheim Cytochalasin B (von Sigma, Schnelldorf Pepstatin A Sigma, USA Helminthosporium) Deuterierte Lösungsmittel Deutero, PMSF Sigma, (CD3OD/d6‐DMSO/CDCl3) Kastellaun (Phenylmethylsulfonylfluorid) Deisenhofen 154 Experimenteller Teil

Chemikalie Hersteller Chemikalie Hersteller Poly(d(i‐c)) Na 50 Ab Amersham, (Polydesoxy‐inosinyl‐ Dextran T 500 Roche, Mannheim Schweden desoxycytidylsäure, doppelsträngig) Rotiphorese® Gel 30, siehe Dichlormethan Merck, Darmstadt Roth, Karlsruhe Acrylamidlösung Dinatriumhydrogenphosphat Gibco BRL, Merck, Darmstadt RPMI 1640 Medium Dihydrat (Na2HPO4 * 2 H2O) Karlsruhe DMEM (Dulbecco‘s modified Gibco BRL Salzsäure 37 %, rauchend Merck, Darmstadt eagle medium) Karlsruhe Riedel de Haën, N,N‐Dimethylformamid (DMF) Merck, Darmstadt Schwefelsäure konz. (95‐97 %) Seelze Dimethylsulfoxid (DMSO) Fluka, Seelze SDS (Natriumdodecylsulfat) Roth, Karlsruhe Pharmacia (GE 1,4‐Dithiothreitol (DTT) Roche, Mannheim Sephadex® LH 20 Healthcare), Schweden EDTA (Ethylendiamin‐ Fluka, Buchs, tetraessigsäure), Roth, Karlsruhe Sojabohnen Trypsin‐Inhibitor Schweiz Dinatriumsalz, Dihydrat EGTA (Ethylenglykol‐bis‐(2‐ Roth, Karlsruhe Streptomycin (siehe Penicillin) Roche, Mannheim aminoethyl)‐tetraessigsäure) Substrat für Elastase MeO‐Suc‐ Essigsäure 99 % (Eisessig) Roth, Karlsruhe Sigma, Schnelldorf Ala‐Ala‐Pro‐Val‐pNA Substrat für Elastase N‐Succinyl‐ Ethanol p.a. Roth, Karlsruhe Bachem, Schweiz Ala‐Ala‐Val‐p‐NA Ethylacetat p.a. Merck, Darmstadt Sucrose (Saccharose) Roth, Karlsruhe Sigma, TEMED (N, N, N`, N`‐ Sigma, FBS (Fetal bovine serum) Taufkirchen Tetramethylethylendiamin) Deisenhofen Sigma, Tris Ultra Qualität (Tris‐ Ficoll Type 400 Roth, Karlsruhe Deisenhofen (hydroxymethyl)‐aminomethan) Amersham, Gibso BRL, Ficoll‐Paque™ Plus Trypsin‐EDTA Schweden Karlsruhe Cambrex Bio Gel Slick® Solution Science Rockland, Tween®‐20 Roth, Karlsruhe USA Biochrom AG, L‐Glutamin (200 mM) Xylencyanol Roth, Karlsruhe Berlin Sigma, Glycerin Zeocin Invitrogen, USA Deisenhofen Biochrom AG, HAM´s F 12 Medium Zitronensäure Sigma, Schnelldorf Berlin

Experimenteller Teil 155

1.2. Cytokine, Primer, Enzyme, Kits

Tabelle F.2: Verwendete Cytokine, Primer, Enzyme und Kits Cytokin, Primer, Enzym oder Kit Hersteller Bovine Serum Albumin (BSA) Standard Set Quick Start™ Bio‐Rad, USA Bradford Quick Start™ Dye Reagent 1x Bio‐Rad, USA Interleukin‐1β (IL‐1β) human, bovin Peprotech EC, England Luciferase Reporter Gen Assay System Roche, Mannheim (Lysis buffer, Reaction buffer, Substrat) Neutrophile Elastase (EC 3.4.21.37) Sigma, Schnelldorf Oligonucleotide für EMSA* (AP‐1 Consensus Oligonucleotid, Promega, Mannheim NF‐κB Consensus Oligonucleotid) PMA (Phorbol‐12‐myristat‐13‐acetat) Calbiochem, Bad Soden Primer und Sonden (Probes) für Echtzeit‐PCR# Sigma Genosys, USA QuantiLum® Recombinant Luciferase Promega, USA QuantiTect® Reverse Transcription Kit Qiagen, Hilden Æ Quantiscript® Reverse Transcriptase QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit Qiagen, Hilden RNA 6000 Pico Assay Kit Agilent Technologies, USA RNase‐Free DNase Set Qiagen, Hilden RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden T4‐Polynucleotidkinase (mit 10x Kinase‐Puffer) New England Biolabs, USA TNF‐α (Tumornekrosefaktor‐α) RnD Systems, Wiesbaden

* Die Sequenzen der Oligonucleotide sind in Kapitel 5.3.1 aufgeführt. # Konzentrationen und Sequenzen der eingesetzten Primer sind in Kapitel 5.7.2 aufgeführt.

1.3. Computerprogramme

Die folgenden Programme bzw. Datenbanken wurden im Rahmen dieser Arbeit verwendet: GraphPad Prism 4/5, Origin, WinCats (CAMAG), ChemDraw Ultra 8, BAS Reader 3.01, Aida, MestreNova, Scifinder Scholar, Beilstein Crossfire, Ovid, ISI web of knowledge

1.4. Herkunft des untersuchten Pflanzenmaterials

Die Blätter von Hieronyma alchorneoides wurden im Nationalpark Marino Ballena (Puntarenas) in Costa Rica am 9.04.2003 gesammelt. Ein Herbarexemplar (Nummer JVR 11686) ist im Museum Juvenal Valerio an der Universidad Nacional hinterlegt. Die Blätter von Siparuna thecaphora wurden am 5.03.2003 in Guayabo de Turrialba, Costa Rica, gesammelt. Die Nummer des Herbarbelegs hierfür lautet JVR 11426. 156 Experimenteller Teil

1.5. Verbrauchsmaterialien

Tabelle F.3: Verwendete Verbrauchsmaterialien Verbrauchsmaterial Hersteller 1,7 mL‐ und 2 mL‐Reaktionsgefäße Roth, Karlsruhe 15 mL‐ und 50 mL‐Tubes Falcon, USA 6‐ und 24‐well‐Platten Greiner bio‐one, Frickenhausen 60 mm‐Platten Falcon, USA 96‐well Platten (PS‐microplate, flat bottom, glasklar, Greiner bio‐one, Frickenhausen Cat. # 655101) Cryoröhrchen Greiner, Frickenhausen DC‐Alufolien Kieselgel 60 F 20x20 cm 254 Merck, Darmstadt (Art. Nr. 1.05554) Deckgläser für Hämacytometer Menzel GmbH, Braunschweig Einmalpipetten 10 mL und 25 mL Greiner, Frickenhausen Einmalhandschuhe rotiprotect Latex Roth, Karlsruhe Gewebe‐Kulturflaschen 75 cm2 und 175 cm2 Greiner, Frickenhausen GH Polypro Membranfilter Pall, USA Halbmikroküvetten Plastibrand® PMMA Roth, Karlsruhe Kieselgel 60 Merck, Darmstadt LightCycler® 480 Multiwell Plate 96 Roche, Mannheim LightCycler® 480 Sealing Foil Roche, Mannheim Micro‐Spin™ G‐25 Säulen Amersham, Freiburg MultiGuard Barrier Tips Sorensen, USA Omnifix®‐F 1mL Luer Spritzen BBraun, Melsungen Omnifix® 10 mL Luer Lock Spritzen BBraun, Melsungen (Roth) Pasteurpipetten (230 mm) Roth, Karlsruhe PCR‐Tubes (Mµlti®‐Ultra Tubes 0,2 mL) Roth, Karlsruhe PD‐Tips (Präzisions‐Dispenser Tips, Plastibrand) für Brand, Wertheim Handystepper (2,5 mL) Pipettenspitzen (versch. Größen) Roth, Karlsruhe Rotilabo® Blottingpapier 0,36 mm Roth, Karlsruhe Rundfilter Macherey Nagel, Düren Saran Folie Dow, USA Seesand Roth, Karlsruhe Sterican® Gr1 (20G) ‐ Kanülen BBraun, Melsungen Sterilindikatorband für Dampfsterilisation Roth, Karlsruhe Timer (Kurzzeitmesser 3‐zeilig) Roth, Karlsruhe Vials für DC/GC‐MS (2 mL Crimp vials) Chromacol LTD, England Watte (bel de Luxe) Hartmann, Heidenheim weiße F96‐well Lumitrac‐Platten Greiner, Frickenhausen Wing‐Flo™ Flügelkanüle zur Blutabnahme Intermedica GmbH, Klein‐Winternheim Zellschaber 24 cm Biochrom seromed, Berlin (TPP, Schweiz)

Experimenteller Teil 157

1.6. Geräte

Die Geräte, die in dieser Arbeit benutzt wurden, sind in Tabelle F.4 aufgeführt. Die GC‐MS‐ Anlage ist in Kapitel 2.1.4 beschrieben.

Tabelle F.4: Verwendete Geräte Gerät Hersteller Adhesive Seal Applicator ABgene, UK Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, USA

Arpege 110 AirLiquide, N2‐Behälter KGW Isotherm, Karlsruhe β + γ Monitor LB145 Berthold Technologies, Bad Wildbad Biofuge fresco Tischzentrifuge Heraeus, Stuttgart CAMAG DC‐Doppeltrogkammer CAMAG, Schweiz CAMAG Probenautomat ATS 4 CAMAG, Schweiz CAMAG Reprostar Photoeinheit CAMAG, Schweiz Chip Priming Station Agilent Technologies, USA Clean Air Sicherheitswerkbank CleanAir Techniek, Worden, Holland DC‐Zerstäuber Roth, Karlsruhe Electrophoresis Power Supply EPS 200 Amersham Pharmacia Biotech Inc., Freiburg Eppendorf Pipetten (versch. Größen) Eppendorf, Hamburg Eppendorf Tischzentrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg Föhn Siemens, Deutschland Fraktionssammler Retriever II Teledyne Isco, USA Gasprofi 1 Laborgasbrenner WLD Tec, Göttingen Gefriertrocknung Alpha 2‐4 LSC Christ, Osterode Gelkammer (EMSA‐Gele) mit Spacer Thoma, Freiburg Geltrockner Model 583 Bio Rad, München GeneQuant II Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Freiburg Handstückzähler (Zellzählung) Roth, Karlsruhe Handystep Multistep Pipette Brand, Wertheim Hera Cell Incubator Heraeus, Stuttgart LB 122 Handmonitor Berthold Technologies, Bad Wildbad LightCycler® 480 Roche, Mannheim Luminometer Bechthold, Wildbad Magnetrührer IKA‐COMBIMAG RET Jahnke & Kunkel, Staufen Membranpumpe KNF Laboport Schütt Labortechnik GmbH, Göttingen Metallkanüle (für Fortuna Optima® Glasspritze) Sigma Aldrich, Schnelldorf für Elastase Microplate Reader Model 550 Bio Rad, München 158 Experimenteller Teil

Gerät Hersteller Mikroskop Nikon TMS Nikon, Japan Millipore‐Wasser‐Anlage (MilliQ Plus PF) Millipore, USA Neubauer Zählkammer (Neubauer bright line) Marienfeld, Deutschland pH‐Meter CG 825 Schott, Hofheim/Ts pH‐Elektrode Inlab 4231, Durchmesser 3 mm Mettler Toledo, Schweiz PhosphoImager FLA‐3000 Fuji Photo Film Co. Ltd., Japan Pipetboy acu IBS Integra Biosciences, Schweiz Reax top (Mixer) Heidolph, Schwabach Rotationsverdampfer IKA Works, Staufen Rotina 35R Tischzentrifuge Hettich‐AG, Schweiz Scotsman Eismaschine BS, Freiburg Ständer für Falcon‐Tubes, Reaktionsgefäße Roth, Karlsruhe Thermoblock Grant Boekel BBA Grant Instruments, UK Thermocycler (Gene Amp PCR System 2400) Applied Biosystems, USA

ThermoForma Steri‐Cycle CO2 Incubator Thermo Life Sciences, Freiburg Thermomixer Comfort Eppendorf, Hamburg Thermoplate S (Laborheizplatte) Desaga / Sarstedt, Nümbrecht Transferpette Mehrkanalpipette Eppendorf, Hamburg Trockenschrank Heraeus, Stuttgart Ultraschallbad Sonorex Super RK510H Bandelin, Berlin UV‐Lampe BSGT, Heiligenberg UV/VIS‐Photometer Uvikon 933 Kontron Instruments, Neufahrn vacuubrand Pumpe Brand, Wertheim Vacuum‐Concentrator BA‐VC‐300H (speedvac) Saur, Reutlingen Vakuumpumpe Roth, Karlsruhe Vortex Mixer IKA MS2‐S8 IKA Works, Staufen Vortex‐Genie 2 Scientific Industries, USA Waagen Mettler‐Toledo, Zürich, Schweiz Wasserbad HB4 basic IKA Labortechnik, Staufen Wasserbad HB4 digital IKA Labortechnik, Staufen Wasserbad, schüttelnd GFL 1083 GFL, Burgwedel

Experimenteller Teil 159

2. Methoden

2.1. Chromatographische und spektroskopische Verfahren

2.1.1. Säulenchromatographie (SC)

Es wurden folgende Säulenmaterialien und Elutionsmittelsysteme verwendet:

Sephadex® LH 20 Das in Methanol gelagerte oder 12 h vorgequollene Sephadex® LH 20 (Pharmacia) wurde in entsprechender Menge möglichst blasenfrei als Säule gepackt. Die Säulendimensionen sind an der jeweiligen Stelle angegeben. Der Extrakt oder eine Fraktion davon wurde in möglichst wenig Elutionsmittel gelöst, konzentriert auf die Säule gegeben und einsinken gelassen. Dann wurde Methanol als Elutionsmittel vorsichtig dazugegeben. Damit wurde eine möglichst hohe Bandenschärfe erzielt. Das Eluat wurde mittels eines Fraktionssammlers aufgefangen, dünnschichtchromatographisch kontrolliert und ähnliche Fraktionen vereinigt. Für die DC wurden zwischen 25 und 40 µL als Bande aufgetragen. Das Säulenmaterial wurde durch Spülen mit Methanol (bei nachfolgender Untersuchung einer ähnlichen Fraktion) bzw. mit einer wässrigen Lösung von 2 % NaOH und 2 % NaEDTA gereinigt. Im letzteren Fall wurde mit gereinigtem Wasser bis zur Neutralität gespült und anschließend auf Methanol konditioniert. Das Sorbens wurde mehrfach verwendet.

Kieselgel 60 Korngröße 0,0630 ‐ 0,200 mm (70 ‐ 230 mesh ASTM), Fa. Merck Das Kieselgel wurde mit dem Elutionsmittel aufgeschlämmt und in die Säule gefüllt. Bis zum vollständigen Absinken des Säulenbetts wurde weiter mit Elutionsmittel gespült. Die zu trennende Fraktion wurde an trockenes Kieselgel adsorbiert, auf das benetzte Kieselgel gestreut und mit einer Schicht Seesand bedeckt. Eluiert wurde mit einem aus der DC abgeleiteten Fließmittelsystem der Zusammensetzung Dichlormethan:Methanol:Ethylacetat 8:1:1, V:V. Gespült wurde mit reinem Methanol. Das Säulenbett wurde nur einmal verwendet, danach wurde das Kieselgel verworfen.

160 Experimenteller Teil

2.1.2. Niederdruckflüssigkeitschromatographie (Lobar)

Die Trenneinheit bestand aus einer der unten angegebenen Säulen mit den Umkehrphasen RP‐8 bzw. RP‐18 und den folgenden Geräten: • programmierbare Pumpe Modell S 1990 (Latek) • UV‐Detektor mit variabler Wellenlänge (Labomatik) • Schreiber Modell SE 120 BBC (Goerz Metrawatt)

Die Probenaufgabe erfolgte mit Probenschleifen von 1 mL oder 2 mL Fassungsvolumen. Zu trennende Fraktionen wurden möglichst konzentriert in dem zu Beginn verwendeten Elutionsmittel gelöst. Als Elutionsmittel dienten Methanol‐Wasser‐Mischungen, deren Methanolanteil in 5 oder 10 %‐Schritten bis zum reinen Methanol erhöht wurde. Die Gradientenerhöhung erfolgte jeweils nach ca. 1 h bzw. nach Ende eines Substanzpeaks. Alle Lösungsmittel wurden mit Hilfe einer Millipore‐Filteranlage filtriert und im Ultraschallbad entgast. Die Fraktionen wurden in Reagenzgläschen mit Hilfe eines Probensammlers (Retriever II, Isco) aufgefangen. Die Detektion erfolgte durch Messung der Absorption (UV) bei der im jeweiligen Schritt angegebenen Wellenlänge mittels Durchfluss‐Detektor.

Verwendete Säulen: • Latek Glassäule LC‐1/2‐23, Innendurchmesser 12,7 mm, Länge 580 mm Trennphase Lichroprep RP‐8 (Korngröße 25 ‐ 40 µm), Merck Höhe des Säulenbetts ca. 53,5 cm • Kronlab (Sinsheim) Glassäule Classic CL 15/450 S, Länge 450 mm, Innendurchmesser 15 mm Trennphase Eurosil Bioselect 100‐30 C‐18 (100 Å, 20 ‐ 45 µm, irregulär) der Firma Knauer Eurochrom Höhe des Säulenbetts ca. 38 cm

Säulen mit einem Durchmesser von 12,7 mm wurden mit maximal 100 mg beladen, Säulen mit einem Durchmesser von 15 mm sind zur Trennung von Mengen von 230 bis zu 750 mg geeignet. Vor der Trennung wurde die Säule mindestens 2 h mit dem zuerst eingesetzten Elutionsmittel bei einer Flussrate von 1,6 – 2 mL/min äquilibriert, am Ende der Trennung wurde weiter mit reinem Methanol gespült. Nach der meistens eingesetzten DC‐Kontrolle Experimenteller Teil 161 wurden die Reagenzgläser zu Unterfraktionen vereinigt. Das organische Lösungsmittel (Methanol) wurde abrotiert, das verbliebene Wasser durch Gefriertrocknung entfernt.

2.1.3. Dünnschichtchromatographie (DC)

Die zu untersuchenden Fraktionen oder Substanzen wurden in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, in 1,5 mL Probenvials gefüllt und mit dem CAMAG Auftrageautomat (Autosampler) ATS 4 bandenförmig (0,4 bis 0,7 cm) auf Kieselgelplatten aufgesprüht. Es wurden DC‐Alufolien der Größe 20 x 10 cm, die mit Kieselgel 60 F254 (Fa. Merck) beschichtet waren, verwendet. Nachdem die Banden getrocknet waren, wurde mit einem der angegebenen Fließmittelsysteme (1) bis (3) über eine Strecke von 8,5 cm entwickelt. Die Platten wurden mit dem Föhn getrocknet und bei kurz‐ (254 nm) und langwelligem (366 nm) UV‐Licht sowie Tageslicht betrachtet. Dabei wurden bei 254 nm die fluoreszenzlöschenden und bei 366 nm die fluoreszierenden Zonen detektiert. Nach Bedarf wurde mit Anisaldehyd‐ Schwefelsäure‐ oder Dragendorff‐Reagenz derivatisiert und die Platten mithilfe des Dokumentationsgerätes Reprostar 3 abphotographiert oder eingescannt.

Fließmittelsysteme (V:V):

(1) CH2Cl2:MeOH:EtOAc 8:1:1

(2) CH2Cl2:MeOH:EtOAc:CHOOH 6:2:2:1

(3) CH2Cl2:Aceton:EtOAc:CHOOH 2:5:3:1

Anisaldehyd‐Schwefelsäure‐Reagenz Eine Mischung aus 85 mL Methanol, 10 mL Eisessig und 5 mL Schwefelsäure konz. wird vorsichtig hergestellt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden 0,5 mL Anisaldehyd hinzugefügt. Das Reagenz wird im Kühlschrank aufbewahrt. Entwickelte, trockene DC‐Platten werden ganzflächig besprüht und bei 110‐120 °C auf einer Heizplatte bis zur vollständigen Farbentwicklung erhitzt.

162 Experimenteller Teil

Dragendorffs‐Reagenz nach Munier und Macheboeuf (Merck 1970) Für die Vorratslösung werden gleiche Teile einer Lösung aus 0,85 g basischem Bismutnitrat in 10 mL Eisessig und 40 mL Wasser mit einer Lösung aus 8 g Kaliumjodid in 20 mL Wasser gemischt. Vor Gebrauch werden 1 mL Vorratslösung mit 2 mL Eisessig und 10 mL Wasser gemischt. Diese Lösung wird auf die Platten gesprüht und nach Bedarf die Platte erhitzt oder mit dem Föhn getrocknet.

Die Rf‐Werte der isolierten Verbindungen und die jeweilige Färbung sind bei den Substanzeigenschaften angegeben.

2.1.4. Massenspektrometrie

Die Fraktionen von Siparuna thecaphora wurden mittels GC‐MS untersucht. Dabei wurde folgende Gerätekombination verwendet: • GC System HP 6890 series • Kapillarsäule Rtx‐1 MS (Fa. Restek; 25 m; 0,25 mm Innendurchmesser; 0,25 µm Filmdicke von Dimethylsiloxan) • Agilent 5973 Network Mass Selective Detector • Injector 7683 Series Als Trägergas kam Helium 5.0 zum Einsatz. Die Bedingungen wurden wie folgt gewählt: Säulendurchfluss: 1,0 mL/min; lineare Gasgeschwindigkeit: 38 cm/sec; Temperatur: 120 °C ‐ 270 °C, 10 °C/min, dann 20 min konstant, Injektortemperatur: 250 °C, splitless.

EI‐Massenspektren (Elektronenstoß‐Ionisation) Die EI‐Massenspektren wurden mit Direkteinlass auf einem TSQ 700 von Thermoelectron aufgenommen. Die Ionisierungsenergie betrug 70 eV, die Ionenanalyse fand mit einem Tripel‐Quadrupol statt.

ESI‐Massenspektren (Elektrospray‐Ionisation) Die ESI‐Massenspektren wurden auf einem LCQ‐Advantage von Thermoelectron gemessen. Die Ionenanalyse fand mittels Iontrap statt.

Experimenteller Teil 163

2.1.5. NMR‐Spektroskopie

Die NMR‐Spektren wurden mit dem folgenden Gerät aufgenommen: Gerät Bruker DRX 400 MHz Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer Messfrequenzen 1H: 400,13 MHz, 13C: 100,63 MHz NMR‐Röhrchen Norell 507‐HP (5 mm, 7 inch)

Lösungsmittel deuteriertes Methanol (CD3OD) deuteriertes DMSO (d6‐DMSO)

deuteriertes Chloroform (CDCl3) Die chemischen Verschiebungen δ sind in ppm angegeben und auf Trimethylsilan (TMS) bezogen. Die Kopplungskonstante J ist in Hz angegeben. Die Proben wurden gefriergetrocknet und in deuteriertem Lösungsmittel gelöst.

2.1.6. UV‐Spektroskopie

Die Messung der Absorption erfolgte mit einem Uvikon 933 UV/VIS‐Zweistrahl‐Spektrometer (Kontron Instruments). Die Küvetten hatten eine Schichtdicke von d = 1 cm und ein Fassungsvermögen von 1,5 mL. Alle Messungen erfolgten bei Raumtemperatur in dem jeweiligen Lösungsmittel.

164 Experimenteller Teil

3. Extraktgewinnung und biologisch‐kontrollierte Fraktionierung des Extrakts von Hieronyma alchorneoides

3.1. Extraktherstellung und Aufarbeitung

Aus 1 kg getrockneten Blättern von Hieronyma alchorneoides Fr. Allem., Familie Euphorbiaceae, wurde mit tBM‐Ether:Methanol 7:3 ein Extrakt hergestellt. Dieser Extrakt wurde noch in Costa Rica entfettet (24 h bei ‐ 20 °C in Methanol) und nach Freiburg versandt. Erhalten wurden 80,39 g Rohextrakt, also etwa 8 % des ursprünglichen Drogengewichtes.

Die Auftrennung des Rohextrakts erfolgte mittels offener Säulenchromatographie über Sephadex® LH 20, Säulenbett ca. 56 cm hoch, Durchmesser ca. 6,5 cm. Der Extrakt wurde aufgrund der großen Menge in 2 Portionen à 30 g (Trennung A: 30,00 g, Trennung B: 30,03 g, jeweils in ca. 50 mL Methanol gelöst und durch Watte filtriert) aufgetrennt. Als Eluent diente 100 % Methanol. Das erhaltene Eluat wurde in großen Reagenzgläsern (RG) aufgefangen und nach seinem Verhalten auf der DC in größere Fraktionen zusammengefasst. Es wurden je 30 µL als 4 mm breite Banden mithilfe des CAMAG Auftrageautomaten ATS 4 auf DC‐ Alufolien gesprüht, maximal 25 Banden pro Platte. Fließmittelsysteme für die Eluate waren

(1) CH2Cl2:MeOH:EtOAc 8:1:1 (V:V) bis RG 75 (A) / 80 (B), danach

(2) CH2Cl2:MeOH:EtOAc:CHOOH 6:2:2:1 (V:V) bis RG 208 (A) / 168 (B) und bis zum Ende

(3) CH2Cl2:Aceton:EtOAc:CHOOH 2:5:3:1 (V:V). Detektiert wurde unter kurz‐ und langwelligem UV‐Licht sowie durch Besprühen mit Anisaldehyd‐Schwefelsäure‐Reagenz. Von der ersten Trennung (A) wurden 784 Reagenzgläser schließlich in 20 Fraktionen aufgeteilt und die Fraktionen auf ihre NF‐κB‐inhibierende Aktivität hin im EMSA getestet. Die Ergebnisse dienten als Grundlage für die weitere biologisch kontrollierte Isolierung (die Durchführung der EMSAs ist in Kapitel 5.3 beschrieben).

Es wurden Stocklösungen in einer Konzentration von 10 mg/mL in DMSO hergestellt. Da es sich bei den Fraktionen um ein Vielstoffgemisch mit unbekannten Molekülmassen handelt, konnten keine molaren Konzentrationen getestet werden. Es ergab sich der in Abbildung F.1 gezeigte EMSA.

Experimenteller Teil 165

H.a. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 RE 13 14 15 16 17 18 19 TNF‐α ‐ + + + + + + + + + + + + + + + ‐ + + + + + + + +

W

○

Y 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Abbildung F.1: NF‐κB‐EMSA mit den Fraktionen von H. alchorneoides. H.a.0 bis 19 und der Rohextrakt (RE, Bahn 16), wurden jeweils in einer Konzentration von 50 µg/mL in Jurkat‐T‐Zellen getestet. Bahn 1 zeigt unbehandelte Kontrollzellen, in Bahn 2 wurden die Zellen nur mit 0,5 ng/mL TNF‐α stimuliert. Die übrigen Bahnen zeigen Zellen, die eine Stunde mit Extrakt inkubiert und eine weitere Stunde mit TNF‐α stimuliert wurden. Das gefüllte Dreieck bezeichnet die spezifische Bande, der leere Kreis die unspezifische Bande und das leere Dreieck zeigt die Bande, die durch freies Oligonucleotid verursacht wird.

Jurkat‐T‐Zellen (ca. 1,2 Mio./well) wurden hierzu eine Stunde mit 50 µg Fraktion pro mL Medium inkubiert und anschließend mit TNF‐α (0,5 ng/mL) stimuliert. Anschließend wurden Gesamt‐Proteinextrakte (siehe Abschnitt 5.2.3) angefertigt. Als Kontrolle wurden einerseits unbehandelte Zellen (‐) und Zellen, die nur mit TNF‐α stimuliert wurden (+), verwendet, andererseits der Rohextrakt (RE) in der gleichen Konzentration getestet. Wie aus der Abbildung ersichtlich ist, wurden bei dieser Konzentration zwei aktive Teilextrakte erhalten, nämlich Fraktion H.a.10 und H.a.12.

Die Überprüfung der Fraktionen auf Einfluss der NF‐κB‐abhängigen Genexpression wurde des Weiteren mittels Luciferase‐Reportergen‐Assay durchgeführt (siehe Kapitel 5.9). Die Fraktionen H.a.10 bis 12 sowie H.a.14 und der Rohextrakt (RE) wurden als Stocklösungen in einer Konzentration von 10 mg/mL in DMSO eingesetzt. Das in Abbildung F.2 gezeigte Ergebnis resultiert aus den Mittelwerten einer Dreifachbestimmung (bei H.a.10 bis H.a.12 von 2 unabhängigen Experimenten). Die getesteten Fraktionen zeigen eine konzentrationsabhängige Hemmung, allerdings tritt auch bei H.a.14 eine deutliche Hemmung in der getesteten Konzentration von 100 µg/mL auf. Da der Gesamtextrakt eine sehr starke Hemmung zeigt, wurde auf direkte Hemmung 166 Experimenteller Teil der Luciferase getestet. Es stellte sich heraus, dass das Enzym direkt gehemmt, eine Aktivität also vorgetäuscht wurde und damit dieser Assay bei den Fraktionen nicht angewendet werden konnte.

100 H.a.10 H.a.11

80 H.a.12 H.a.14 RE

60 [%]

40 Hemmung

20

0 20 50 100 Konzentration [µg/mL]

Abbildung F.2: Untersuchung zur Hemmung der NF‐κB‐abhängigen Genexpression mithilfe des Luciferase‐ Reportergen‐Assays. NLZ9‐Zellen wurden 1 Stunde mit den Testfraktionen inkubiert (RE = Rohextrakt) und anschließend 3 Stunden mit 5 ng/mL TNF‐α stimuliert. Die Proteinextrakte wurden auf ihre Luciferase‐Aktivität getestet. Als Positivkontrolle dienten nur mit TNF‐α stimulierte Zellen, ihre Luciferase‐Hemmung wurde gleich Null gesetzt. Die Luciferase‐Aktivität wurde gegen die Gesamtproteinkonzentration normalisiert.

Die Cytotoxizität unter diesen Bedingungen, welche durch einen MTT‐Test überprüft wurde, lag im Rahmen der Positivkontrolle und damit unter 10 % (Durchführung siehe Kapitel 5.5).

Die zweite Trennung, die analog der ersten an Sephadex durchgeführt wurde, ergab wiederum 15 Unterfraktionen. Nun wurden die Unterfraktionen der beiden Trennungen nach DC‐Ähnlichkeiten schließlich zu 18 Fraktionen zusammengefasst, wie in Abbildung F.3 zu sehen ist. Dort ist gleichzeitig angegeben, aus welchen Fraktionen die Reinsubstanzen H.1 bis H.4 isoliert wurden. Experimenteller Teil 167

Extrakt aus Hieronyma alchorneoides, entfettet

30 g, Sephadex‐ 30 g, Sephadex‐ Chromatographie A Chromatographie B

20 Fraktionen 15 Fraktionen DC‐Überprüfung

H. H. H. a. a. H. a. H. 0 1 a. H. 2 a. H. H. 3 a. a. H. 4 a. H. 5 6 a. H. 7 a. H. H. 8 a. a. H. 9 a. H. H. 10 11 a. H. 12 a. a. H. H.4 13 a. 14 15 a. 16 H.1 17 H.2 H.3

Abbildung F.3: Fraktionierung von 2 mal 30 g Rohextrakt aus Hieronyma alchorneoides über Sephadex‐ Chromatographie mit Methanol als Elutionsmittel. Angegeben sind die erhaltenen Fraktionen H.a.0 bis H.a.17 sowie die isolierten Reinsubstanzen H.1 bis H.4.

Die Massen der erhaltenen Fraktionen H.a.0 bis 17 sind in Tabelle F.5 dargestellt.

Tabelle F.5: Fraktionsgewichte nach Vereinigung der Trennungen A und B (je 30 g) des Extraktes von H. alchorneoides an Sephadex® LH 20 Fraktion H.a. Auswaage [g] 0 0,0308 1 1,1518 2 4,6258 3 1,3100 4 1,0623 5 0,5280 6 0,6749 7 2,1883 8 1,8039 9 0,8345 10 3,6186 11 1,2164 12 1,6098 13 1,5712 14 1,0693 15 1,3919 16 0,0713 17 0,1433

168 Experimenteller Teil

Bei gleichem DC‐Fleckmuster wurde von einem ähnlichen Verhalten im NF‐κB‐EMSA ausgegangen und die Gesamtfraktionen nicht erneut geprüft. Die Fraktionen H.a.10 und 12 wurden weiterverfolgt, da sie Aktivität im EMSA zeigten.

Bei genauerer Betrachtung der Fraktionen H.a.10 bis H.a.12 der beiden Trennungen

(Fließmittelsystem (2), CH2Cl2:MeOH:EtOAc:HCOOH 6:2:2:1 (V:V)) fiel auf, dass bei Fraktion H.a.11 ein ähnlicher gelber Fleck nach Derivatisierung mit Anisaldehyd‐ Schwefelsäurereagenz auf der DC zu sehen war (siehe Abbildung F.4). Deshalb wurde diese Fraktion ebenfalls miteinbezogen.

Fraktion H.a. 10 11 12 Trennung ABABAB Front ‐

Start ‐

Abbildung F.4: DC‐Vergleich der Fraktionen H.a. 10 bis 12 nach den Trennungen A und B, Fließmittelsystem (2), Derivatisierung mit Anisaldehyd‐Schwefelsäure. Die gelben Flecke sind durch zusätzliche Linien sichtbar gemacht.

Experimenteller Teil 169

3.2. Isolierung der Biflavonoide H.1 bis H.3

Bereits bei der Vereinigung der beiden Fraktionen 10 der Trennungen A und B fiel eine Substanz aus und konnte dadurch abgetrennt werden. Die Substanz (H.1) wurde durch Umkristallisieren in kaltem Methanol weiter aufgereinigt, bis sie DC‐rein vorlag und zu NMR‐ und MS‐Untersuchungen gegeben werden konnte. Sie lieferte den gelben Fleck der Fraktion auf der DC‐Platte nach Derivatisierung mit Anisaldehyd/Schwefelsäure‐Reagenz. H.1 wurde in einer Ausbeute von 43 mg erhalten.

Die beiden anderen Fraktionen (H.a.11 und H.a.12) wurden daraufhin mit wenig Methanol in Spitzkölbchen überführt und im Kühlschrank stehen gelassen, bis auch hier Substanzen auskristallisierten. Durch Waschen mit kaltem Methanol wurden die Substanzen weiter aufgereinigt (H.2 (3,6 mg) und H.3 (12,1 mg)) und Analysen zur Strukturaufklärung unterzogen.

3.3. Isolierung von Catechin (H.4)

Als weitere vielversprechende Fraktion wurde H.a.6 ausgewählt. Sie zeigte im DC einen recht klar abgetrennten Fleck bei einem Rf‐Wert von 0,56 (Fließmittelsystem 2). Im GC‐MS‐ Spektrum (Methode: Standard) war kein signifikanter Peak der Fraktion sichtbar. Diese Analysenmethode konnte daher nicht für eine Überprüfung der Aufreinigung eingesetzt werden. Die Fraktion wurde auf einer Lobar RP‐8‐Säule (siehe 2.1.2) mit einem Methanol‐Gradienten aufgetrennt. Trennphase war Lichroprep RP‐8. Begonnen wurde mit 30 % Methanol, einer Flussrate von 0,6 mL/min und Detektion bei 250 nm. 51,7 mg der Fraktion H.a.6 wurden gelöst und auf die Säule gegeben. Von 30 % bis 60 % Methanol wurde in 5 %‐Schritten erhöht, danach in 10 %‐Schritten bis 100 % Methanol. Gewechselt wurde nach ca. 1 Stunde oder nach Ende eines Peaks. Das Eluat wurde dünnschichtchromatographisch untersucht

(Fließmittel (2), CH2Cl2:MeOH:EtOAc:HCOOH 6:2:2:1 (V:V)) und zu Unterfraktionen zusammengefasst. Bei der Kontrolle stellte sich heraus, dass die gewünschte Substanz in den ersten Reagenzgläschen (H.a.6.1 und 6.2) enthalten war, die daraufhin einzeln im DC untersucht wurden. In H.a.6.2 war H.4 DC‐rein in einer Ausbeute von 3,8 mg enthalten. 170 Experimenteller Teil

3.4. Strukturaufklärung und Eigenschaften der isolierten Verbindungen H.1 bis H.4

7, 4’’‐O‐Dimethylamentoflavon (H.1)

Die Untersuchungen zur Strukturaufklärung ergaben ein Molekül mit Biflavonoid‐Struktur (3‘‐8‐verknüpfte Apigenin‐Einheiten).

Summenformel C32H22O10 Molekülmasse Mr = 566,5 Rf‐Wert DC 0,90 (Fließmittelsystem 2) DC‐Färbung: löscht bei 254 nm, keine Fluoreszenz bei 366 nm, nach Derivatisierung mit Anisaldehyd‐Schwefelsäure‐Reagenz gelb

EI‐Massenspektrum mit Direkteinlass, angegeben ist das m/z‐Verhältnis (relative Intensität): 566 (74), 358 (23), 243 (24), 239 (9), 197 (30), 167 (12), 165 (20), 55 (17)

Außerdem wurde ein ESI im positiven Modus aufgenommen (siehe Abbildung C.3). Dort wurde die höchste Intensität bei m/z = 567,2 [M+H]+ gemessen. Die MS‐Daten stimmen mit der Literatur überein (Garg et al. 1971).

NMR‐Daten: siehe Abschnitt C.1.2.2 (Ergebnisteil), gemessen in d6‐DMSO

7‐O‐Methylamentoflavon (H.2)

Summenformel C31H20O10 Molekülmasse Mr = 552,5 Rf‐Wert DC 0,87 (Fließmittelsystem 2) DC‐Färbung: löscht bei 254 nm, keine Fluoreszenz bei 366 nm, nach Derivatisierung mit Anisaldehyd‐Schwefelsäure‐Reagenz gelb

ESI‐Massenspektrum (negativer Modus): m/z (rel. Int.): 550,9 (100), 551,9 (32,5), 538,9 (2,1)

ESI‐Massenspektrum (positiver Modus): m/z (rel. Int.): 553,1 (100), 554,1 (29,3), 552,5 (3,5), 234,9 (14,6)

CI‐Massenspektrum (Direkteinlass, NH3): m/z (rel. Int.): 552,2 (100), 534,2 (50,3), 520,2 (3,3), 418,2 (27,8), 390,1 (31,6)

NMR‐Daten: siehe Abschnitt C.1.2.3 (Ergebnisteil)

Experimenteller Teil 171

Amentoflavon (H.3)

Summenformel C30H18O10 Molekülmasse Mr = 538,5 Rf‐Wert DC 0,85 (Fließmittelsystem 2) DC‐Färbung: löscht bei 254 nm, keine Fluoreszenz bei 366 nm, nach Derivatisierung mit Anisaldehyd‐Schwefelsäure‐Reagenz gelb.

EI‐Massenspektrum (Direkteinlass, negativer Modus): m/z (rel. Int.): 539 (29,7), 538,2 (100)

ESI‐Massenspektrum (negativer Modus): m/z = 537,0 Die Werte stimmen mit den MS‐Daten von (Li et al. 2003) überein.

NMR‐Daten: siehe Abschnitt C.1.2.4 (Ergebnisteil), gemessen in d6‐DMSO

(+)‐Catechin (H.4)

Summenformel C15H14O6 Molekülmasse Mr = 290,3 Rf‐Wert DC 0,56 (Fließmittelsystem 2) DC‐Färbung: löscht bei 254 nm, keine Fluoreszenz bei 366 nm, bei Tageslicht kaum sichtbar; nach Derivatisierung mit Anisaldehyd‐ Schwefelsäure‐Reagenz und Erhitzen orange‐rot, nach längerem Erhitzen bräunlich‐rot

Tabelle F.6: EI‐Massenspektrum mit Direkteinlass von (+)‐Catechin, angegeben ist das m/z‐ Verhältnis, die relativen Intensitäten sowie Literaturdaten m/z rel. Intensität (Pussa et al. 2006) 290,2 31,32 152,1 42,15 139,1 100,0 76 124,1 18,70 123,1 37,35 100 44,0 15,85

Bei weiteren MS‐Messungen wurden m/z‐Signale bei 291,1 [M+H]+ und 139,0 (ESI, positiver Modus) sowie bei 288,9 [M‐H]‐ (ESI, negativer Modus) detektiert.

NMR‐Daten: siehe Abschnitt C.1.2.6 (Ergebnisteil), gemessen in CD3OD 172 Experimenteller Teil

4. Fraktionierung eines Extraktes von Siparuna thecaphora

4.1. Extraktherstellung und biologisch‐kontrollierte Aufarbeitung

Blätter von Siparuna thecaphora (Poepp. et Endl.) A. DC., Familie Siparunaceae (früher Monimiaceae) wurden in Costa Rica gesammelt. 28,72 g des fertigen, entfetteten Extrakts (tBME) wurden aus Costa Rica erhalten. Die Ausgangsaktivität im NF‐κB‐EMSA ist aus der Abbildung C.1 (Ergebnisteil) ersichtlich.

Die Extraktauftrennung erfolgte mittels offener Säulenchromatographie an Sephadex® LH 20 in 2 Portionen. Für Trennung A wurden 12,0 g eingesetzt; für Trennung B 10,0 g. Die abgewogene Menge Extrakt wurde in wenig Methanol gelöst (Ultraschallbad) und möglichst konzentriert auf eine Sephadex‐Säule gegeben. Das Säulenbett war ca. 58 cm hoch und die Säule hatte einen Durchmesser von ca. 6,5 cm. Als Eluent diente reines Methanol, die Chromatographie lief über mehrere Tage. Die in Reagenzgläsern aufgefangenen Unterfraktionen wurden per DC überprüft (Fließmittelsystem (1)) und bei Trennung A zu 8 Fraktionen, bei Trennung B zu 7 Fraktionen vereinigt. Für Trennung B wurde das mit Methanol gespülte Sephadex‐Bett erneut verwendet. Die Vereinigung der Teilfraktionen der beiden Trennungen erfolgte nach ihrer Ähnlichkeit in der DC‐Analyse. Die erhaltenen 10 Fraktionen mit den zugehörigen Massen sind in Tabelle F.7 aufgeführt.

Tabelle F.7: Fraktionsgewichte nach Vereinigung der Trennungen A und B des Extraktes von S. thecaphora (insgesamt 22 g an Sephadex® LH 20) Fraktion S.t. Auswaage [g] 1 1,1513 2 3,9740 3 13,3342 4 1,2656 5 1,1927 6 1,0338 7 0,0856 8 0,0062 9 0,4311 10 0,4982

Experimenteller Teil 173

Biologische Kontrolle Zur biologischen Kontrolle der Fraktionen wurde mit den Fraktionen der Trennung A ein NF‐κB‐EMSA durchgeführt, das Ergebnis ist in Abbildung F.5 dargestellt.

S.t. 1 2 3 4 5 6 7 8 TNF‐α ‐ + + + + + + + + +

◄ ○

Y 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Abbildung F.5: NF‐κB‐EMSA zur Aktivitätstestung der Fraktionen der ersten Sephadex‐Trennung (A) von Siparuna thecaphora. Die Fraktionen S.t.1 bis 7 wurden in einer Konzentration von 100 µg/mL, S.t.8 mit 80 µg/mL getestet. Dazu wurden Jurkat‐T‐Zellen eine Stunde mit Testsubstanz vorinkubiert und anschließend eine Stunde mit TNF‐α (0,5 ng/mL) stimuliert. Als Referenz wurde in Bahn 1 ein Extrakt von unbehandelten Zellen verwendet, in Bahn 2 wurden die Zellen nur eine Stunde stimuliert (Positivkontrolle). Das gefüllte Dreieck bezeichnet die spezifische Bande des NF‐κB‐Oligonucleotid‐Komplexes, der leere Kreis die Bande unspezifischer Protein‐ DNA‐Wechselwirkungen und das leere Dreieck zeigt ungebundenes Oligonucleotid an.

Die Fraktionen S.t.3, 5 und 7 sollten weiterverfolgt und die aktiven Substanzen isoliert werden. Da nicht ausgeschlossen werden konnte, dass die Hemmung von NF‐κB durch cytotoxische Effekte (zumindest teilweise) vorgetäuscht worden ist, wurden weitere Tests durchgeführt. Die Verminderung der unspezifischen Bande kann hierfür ein Zeichen sein.

Mit den 3 aktiven Fraktionen wurde ein MTT‐Assay durchgeführt, dieser ist in Kapitel 5.5 beschrieben. Die Zellen (HCT 8, 2000 Zellen/well) wurden für 2 Tage mit 100 µg/mL Substanz inkubiert. Das Ergebnis ist in Tabelle F.8 dargestellt.

174 Experimenteller Teil

Tabelle F.8: Ergebnis des MTT‐Tests mit den Fraktionen von S. thecaphora Fraktion Absorptionswert Hemmung in % 3 0,368 43,64 5 0,228 65,08 7 0,220 66,31 Kontrolle 0,653 0

Alle drei untersuchten Fraktionen zeigten eine Cytotoxizität und wurden weiter untersucht.

4.1.1. Auftrennung der Fraktion S.t.3

In einer ersten GC‐MS‐Analyse wurden zahlreiche Signale detektiert. Durch Vergleich mit einer MS‐Substanz‐Bibliothek wurden darunter Sesquiterpene sowie N‐haltige Verbindungen vermutet.

Die in dieser Fraktion enthaltene Menge von über 13 g wurde in 2 Portionen durch Säulenchromatographie an Kieselgel aufgetrennt. Für die erste Trennung wurden ca. 200 g Kieselgel als Säule gepackt (Säulendimensionen: Betthöhe ca. 29 cm + ca. 3 cm Substanzverreibung, Außendurchmesser der Säule 4,9 cm) und 6,57 g der Fraktion S.t.3 aufgetrennt. Fließmittel war Dichlormethan:Methanol: Ethylacetat 8:1:1 (V:V). Es wurden 14 Fraktionen (S.t.3.1.1‐14) erhalten, die nach ihrem DC‐ Muster zusammengefasst wurden.

Auf einer 2. Säule wurden unter den gleichen Bedingungen 6,43 g der Fraktion S.t.3 aufgetrennt und 10 Unterfraktionen erhalten (S.t.3.2.1‐10). Nach dünnschichtchromatographischer Überprüfung wurden die Fraktionen aus den beiden Trennungen vereinigt. Die erhaltenen Fraktionen mit ihren Auswaagen sind in Tabelle F.9 aufgeführt.

Experimenteller Teil 175

Tabelle F.9: Fraktionsgewichte nach Vereinigung der Trennungen 1 und 2 der Fraktion S.t.3 von S. thecaphora (insgesamt 13 g) an Kieselgel Fraktion S.t. Auswaage [mg] 3.0 nicht möglich 3.1 681,6 3.2 170,8 3.3 1005,3 3.4 476,4 3.5 235,4 3.6 251,4 3.7 228,3 3.8 4982,1

Kontrolle der biologischen Aktivität Ein MTT‐Assay (Durchführung siehe Kapitel 5.5) wurde mit den aus der ersten Trennung erhaltenen Fraktionen durchgeführt. Jurkat‐T‐Zellen (1 Mio./4 mL) wurden 3 h mit 100 µg/mL Fraktion inkubiert. Unbehandelte Zellen dienten als Negativkontrolle, mit 100 µM Parthenolid behandelte Zellen als Positivkontrolle. Die Zellen wurden weitere 2 h mit MTT‐ Lösung (entsprechend 7,5 mg pro Schale) behandelt. Das Ergebnis ist in Abbildung F.6 dargestellt. Die größte Toxizität zeigten die Fraktionen S.t.3.1.2‐4.

100

80

60 [%]

40 Cytotoxizität

20

0 P 3h P 1h234567891010_2111213

Abbildung F.6: MTT‐Test mit den Unterfraktionen von S.t.3.1. Parthenolid (P) wurde in einer Konzentration von 100 µM als Positivkontrolle (Inkubation 1 h und 3 h) eingesetzt. Die Inkubationszeit der Unterfraktionen S.t.3.1.2 bis 13 (100 µg/mL) betrug 3 h mit Jurkat‐T‐Zellen (1 Mio./well) und weitere 2 h mit MTT (7,5 mg/well). Unterfraktion 10_2 steht für ausgefallene Kristalle der Fraktion 10. Angegeben ist die Cytotoxizität in [%] bezogen auf unbehandelte Kontrollzellen, denen 100 % Viabilität unterstellt wird.

176 Experimenteller Teil

Auftrennung der Fraktion S.t.3.3 Die Auftrennung der cytotoxischen Fraktion S.t.3.3 erfolgte an einer Kronlab‐Säule mit Eurosil RP‐18 Umkehrphase (siehe 2.1.2) unter Verwendung eines Methanol‐Gradienten. Die Fraktion wurde in 2 Portionen (Trennung A und B) aufgetrennt. Trennung A: 236,3 mg wurden in Methanol‐Wasser aufgenommen und mittels einer 2 mL‐ Schlaufe auf die Säule gegeben. Die Flussrate betrug 1,6 mL/min. Nach je 2,4 min wurde das Auffanggläschen gewechselt. Die Detektion erfolgte bei 210 nm. Die Säule war auf 35 % Methanol äquilibriert. Nach ca. 1 h wurde auf MeOH 40 % gewechselt, dann wurde der Gradient in 10 %‐Schritten erhöht. Die Gradientenerhöhung erfolgte jeweils nach 1 bis 2 h. Zur Kontrolle wurden Proben abgefüllt und auf DC‐Platten aufgetragen. Nach erhaltenem

DC‐Muster im Fließmittelsystem (1) CH2Cl2:MeOH:EtOAc 8:1:1 (V:V) wurden Unterfraktionen zusammengefasst und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bzw. das restliche Wasser durch Gefriertrocknung entfernt. Erhalten wurden die Unterfraktionen S.t.3.3.1A bis 17A.

Trennung B: Die restlichen 743,8 mg der Fraktion wurden auf dieselbe RP‐18 Säule gegeben. Begonnen wurde mit 30 % Methanol, dann wurde der Gradient in 5 und 10 %‐Schritten auf 100 % Methanol erhöht. Flussrate war 1,4 mL/min, detektiert wurde wiederum bei 210 nm. Da eine so große Menge aufgetragen wurde, kam anfangs ein niedrigerer Methanolanteil zum Einsatz und die Flussrate wurde niedriger gewählt. Für diese Säulentrennung erfolgte die Vereinigung wiederum nach dem erhaltenen DC‐Muster. Als Fließmittel wurde das oben angegebene Gemisch (System (1)) verwendet. Das Eluat wurde zu den Unterfraktionen S.t.3.3.1B bis 14B zusammengefasst und nach Entfernung des Methanols gefriergetrocknet.

Mit allen Unterfraktionen der Trennungen A und B wurde erneut eine

Dünnschichtchromatographie mit dem Fließmittelsystem (1) CH2Cl2:MeOH:EtOAc 8:1:1 (V:V) durchgeführt. Nach dem Substanzmuster in der Gesamt‐DC für jede Trennung wurde weiter vereinigt. Die Zusammensetzung und Auswaagen der erhaltenen Fraktionen S.t.3.3.1 bis 16 sind in Tabelle F.10 dargestellt.

Experimenteller Teil 177

Tabelle F.10: Fraktionsgewichte nach Vereinigung der Trennungen A und B der Fraktion S.t.3.3 (insgesamt 980,1 mg) Fraktion S.t.3.3. Auswaage [mg] 1 233,0 2 21,1 3 11,8 4 85,4 5 14,3 6 6,8 7 9,1 8 49,8 9 96,3 10 23,3 11 63,4 12 38,4 13 36,1 14 29,8 15 78,0 16 12,6

Die letztendlich erhaltenen Fraktionen wurden auf 2 Platten aufgesprüht, gleich entwickelt

(Fließmittelsystem (1), CH2Cl2:MeOH:EtOAc 8:1:1 (V:V)), einmal mit Anisaldehyd‐Schwefel‐ säure‐ und das andere Mal mit Dragendorff‐Reagenz derivatisiert.

Kontrolle der biologischen Aktivität Es wurde ein MTT‐Assay mit Jurkat‐T‐Zellen durchgeführt. Die Zellen (1 Mio./well) wurden für 3 Stunden mit den Fraktionen S.t.3.3.1‐5 sowie 7 bis 16 in einer Konzentration von 100 µg/mL inkubiert. Bei S.t.3.3.6 lag eine zu niedrige Ausbeute vor. Als Negativkontrolle dienten zwei Proben, die nur mit DMSO in der entsprechenden Konzentration behandelt wurden. Bei der Positivkontrolle wurde mit 100 µM Parthenolid (P) inkubiert. Dann wurde MTT‐Lösung zugegeben (entsprechend 7,5 mg MTT/well) und weitere 2 h inkubiert. Das weitere Vorgehen war analog der Beschreibung (Abschnitt 5.5). Das Ergebnis ist in Abbildung F.7 dargestellt. Vor allem die Fraktionen S.t.3.3.8 bis 12 sowie 15 wiesen eine hohe Cytotoxizität auf.

178 Experimenteller Teil

100

80

60 [%]

40 Cytotoxizität

20

0 P 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 3.1.3

Abbildung F.7: MTT‐Test mit den Unterfraktionen von S.t.3.3. Parthenolid (P) wurde in einer Konzentration von 100 µM als Positivkontrolle eingesetzt. Die Inkubationszeit der Unterfraktionen S.t.3.3.1 bis 16 (100 µg/mL) betrug 3 h mit Jurkat‐T‐Zellen (1 Mio./well) und weitere 2 h mit MTT (7,5 mg/well). Unterfraktion 3.1.3 steht für die Ausgangsfraktion. Angegeben ist die Cytotoxizität in [%] bezogen auf unbehandelte Kontrollzellen, denen 100 % Viabilität unterstellt wird.

Um einen Anhaltspunkt für die Substanzklasse, die für diese Cytotoxizität verantwortlich ist, zu bekommen, wurden GC‐MS‐Analysen und ein Abgleich mit der MS‐Substanzbibliothek durchgeführt. In den Fraktionen 7‐11 ist eine größere Anzahl an Sesquiterpenen erkennbar. In den Fraktionen 8‐12 können Alkaloide vermutet werden. In den Fraktionen 11‐13 sowie 15 sind Fettsäuren unterschiedlicher Länge enthalten.

Auftrennung der Fraktion S.t.3.3.8 Die erste der Fraktionen, die im MTT‐Test eine hohe Cytotoxizität zeigten, wurde weiter aufgetrennt, um die aktive(n) Substanz(en) zu finden. Nach den bisherigen Anhaltspunkten könnte es sich um ein Alkaloid oder Sesquiterpen handeln. Ein Vergleich der MS‐Spektren der gefundenen Sesquiterpene mit der vorliegenden Substanzdatenbank bzw. mit Sesquiterpenen vom Cadinan‐Typ, die im Genus Siparuna vorkommen, ergab kein eindeutiges Ergebnis (El Seedi et al. 1994; Leitao et al. 1999).

Experimenteller Teil 179

Die Fraktion wurde mittels Säulenchromatographie an einer Kieselgel 60 Phase aufgetrennt. Dazu wurden ca. 18 g Kieselgel als Säule gepackt. Das Säulenbett hatte eine Höhe von 24 cm, der Durchmesser war 16 mm. Als Fließmittel wurde Dichlormethan:Methanol:Ethylacetat 8:1:1 (V:V) ausgewählt. 49,8 mg Fraktion S.t.3.3.8 ergaben nach DC‐Überprüfung des aufgefangenen Eluats schließlich 6 Unterfraktionen. Die Auswaagen sind in Tabelle F.11 dargestellt.

Tabelle F.11: Fraktionsgewichte der erhaltenen Teilfraktionen nach Säulenchromatographie von 49,8 mg der Fraktion S.t.3.3.8 an Kieselgel Fraktion S.t.3.3.8. Auswaage [mg] 1 28,2 2 0,6 3 6,8 4 1,6 5 3,3 6 14,0

Als biologische Kontrolle der erhaltenen Unterfraktionen S.t.3.3.8.1 bis 6 wurde ein MTT‐ Assay mit Jurkat‐T‐Zellen durchgeführt. Die Vorgehensweise war analog zu der Testung bei S.t.3.3. Bei den Teilfraktionen 1 und 2 liegt die Cytotoxizität bei fast 90 %, bei 3 bis 5 über 50 %. S.t.3.3.8.6 zeigt nahezu keine Beeinflussung der Zellviabilität (Abbildung F.8).

100

80

[%] 60

40 Cytotoxizität

20

0 P1234563.3.8

Abbildung F.8: MTT‐Test mit den Unterfraktionen von S.t.3.3.8. Parthenolid (P) wurde in einer Konzentration von 100 µM als Positivkontrolle eingesetzt. Die Inkubationszeit der Unterfraktionen S.t.3.3.8.1 bis 6 (100 µg/mL) betrug 3 h mit Jurkat‐T‐Zellen (1 Mio./well) und weitere 2 h mit MTT (7,5 mg/well). Unterfraktion 3.3.8 steht für die Ausgangsfraktion. Angegeben ist die Cytotoxizität in [%] bezogen auf unbehandelte Kontrollzellen, denen 100 % Viabilität unterstellt wird. 180 Experimenteller Teil

Leider war die Menge der aktiven Fraktionen gering und die darin enthaltenen Substanzen zu zahlreich. Deshalb wurde die Aufreinigung nicht weitergeführt. Auch die biologisch kontrollierte Auftrennung der Fraktion S.t.3.3.15 war leider erfolglos und führte nicht zur Isolierung einzelner Verbindungen.

Gemeinsame Auftrennung der Fraktion S.t.3.5 und S.t.3.6 Diese Fraktionen wurden ebenfalls aufgrund ihrer cytotoxischen Aktivität ausgewählt und über Säulenchromatographie (siehe Kapitel 2.1.2) an Umkehrphase weiter aufgetrennt. Für die Trennung wurden die beiden Fraktionen zusammen in Methanol gelöst, die Vereinigung der Teilfraktionen nach SC erfolgte aufgrund eines ähnlichen DC‐Verhaltens. 443,2 mg wurden auf die Säule mit Umkehrphase (RP‐18) gegeben und durch einen Methanol‐Gradienten getrennt. Zu Beginn wurde mit Methanol 30 % eluiert, danach wurde der Methanolanteil kontinuierlich auf 100 % gesteigert. Flussrate war 1,6 mL/min. Nach DC‐Überprüfung wurden die Unterfraktionen S.t.3.5+6.1 bis S.t.3.5+6.16 erhalten, deren Auswaagen in Tabelle F.12 aufgeführt sind.

Tabelle F.12: Fraktionsgewichte nach der gemeinsamen Auftrennung der Fraktionen S.t.3.5 und 3.6 (insgesamt 443,2 mg) an RP‐18 Fraktion S.t. 3.5+6. Auswaage [mg] 1 40,1 2 14,3 3 25,5 4 19,2 5 18,6 6 30,4 7 17,8 8 39,8 9 17,1 10 21,5 11 27,7 12 19,3 13 25,5 14 11,2 15 21,9 16 28,3

Experimenteller Teil 181

Diese Fraktionen wurden auf 2 DC‐Platten aufgetragen, mit dem gleichen Fließmittel (System (1)) entwickelt und mit Anisaldehyd‐Schwefelsäure‐Reagenz bzw. Dragendorff‐ Reagenz derivatisiert. Bei der Anisaldehyd‐Färbung zeigt sich für alle Fraktionen noch ein heterogenes Gemisch. Bei der Dragendorff‐Färbung tritt eine typische, orange‐rote Färbung bei einem Rf‐Wert von ca. 0,2 auf. Allerdings in allen Fraktionen von S.t.3.5+6.5 bis 13.

Kontrolle der biologischen Aktivität Bei den 16 Fraktionen wurde die Zytotoxizität mittels MTT‐Assay ermittelt. Die Durchführung des Tests ist in Kapitel 5.5 beschrieben. Es waren vor allem die späteren Fraktionen (S.t.3.5+6.12‐16) aktiv (Abbildung F.9).

100

80

60 [%]

40 Cytotoxizität

20

0 P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 3.5 3.6

Abbildung F.9: MTT‐Test mit den Unterfraktionen von S.t.3.5+6. Parthenolid (P) wurde in einer Konzentration von 100 µM als Positivkontrolle eingesetzt. Die Inkubationszeit der Unterfraktionen S.t.3.5+6.1 bis 16 (100 µg/mL) betrug 3 h mit Jurkat‐T‐Zellen (1 Mio./well) und weitere 2 h mit MTT (7,5 mg/well). 3.5 und 3.6 stehen jeweils für die Ausgangsfraktion. Angegeben ist die Cytotoxizität in [%] bezogen auf unbehandelte Kontrollzellen, denen 100 % Viabilität unterstellt wird.

182 Experimenteller Teil

Anreicherung von Alkaloiden Die Substanzen, die sich mit Dragendorff‐Reagenz färben lassen, sollten isoliert und ihre Struktur aufgeklärt werden. Nach Angaben aus der Literatur (Kupchan et al. 1970; Lo et al. 2000) wurde folgendermaßen vorgegangen: Die Fraktion S.t.3.5+6.5 (21,9 mg) wurde in insgesamt 10 mL 5 %iger HCl gelöst, mit 2 * 10 mL Chloroform ausgeschüttelt und nach Alkalisieren mit NaOH (pH 10‐11) noch 3 Mal mit 10 mL Chloroform ausgeschüttelt. Es wurden Substanzen in einer Ausbeute von 2,5 mg nach Trocknung dieser Phase (2. Ausschütteln, Alkaloidphase) erhalten. Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen, da er in Methanol schlecht löslich war. Die restlichen Phasen wurden durch Abrotieren des organischen Lösungsmittels bzw. Gefriertrocknung getrocknet und der Rückstand in Methanol aufgenommen. Mit den Proben aller Phasen wurden DC‐ sowie GC‐MS‐Analysen durchgeführt. Bei der DC‐Analyse wurden die einzelnen Proben auf 2 Platten aufgetragen, mit dem gleichen Fließmittel (System (1)) entwickelt, aber unterschiedlich derivatisiert. Eine Platte wurde mit Anisaldehyd‐Schwefelsäure‐Reagenz besprüht, um möglichst viele Substanzen zu erfassen und eine Aussage über die Reinheit der Substanz treffen zu können. Die 2. Platte wurde mit Dragendorff‐Reagenz besprüht, um zu detektieren, in welcher Phase sich die gesuchte Substanz befindet. Die typische Färbung trat bei einem Substanzfleck mit einem

Rf‐Wert von 0,32 in der nach der 2. Ausschüttelung mit Chloroform erhaltenen Phase auf. Es konnte gezeigt werden, dass eine Aufkonzentrierung möglich ist, allerdings wurden auch andere Substanzen aus der alkalischen Phase mitextrahiert. Dieses Ergebnis wurde durch die durchgeführte GC‐MS‐Analyse bestätigt.

Anschließend wurde mit der Fraktion S.t.3.5+6.6 genauso verfahren. 23,5 mg wurden den verschiedenen Schritten unterzogen, die Alkaloidphase ergab eine Ausbeute von 1,0 mg. Die

DC‐Analyse zeigte nach Dragendorff‐Färbung einen orangen Substanzfleck bei einem Rf‐Wert von 0,31. Der GC‐MS‐Vergleich der Alkaloidphase von 5 und 6 ergab, dass es sich um dasselbe Alkaloid handeln könnte. Die Retentionszeit und die MS‐Signale stimmten gut überein. Die

Alkaloidteilfraktionen wurden vereinigt und zur NMR‐Messung (in CDCl3) gegeben. Die theoretische Ausbeute der neuen Fraktion betrug 3,5 mg (vgl. Ergebnisteil, C.1.3.4). Experimenteller Teil 183

4.2. Isolierung von Kämpferol‐3,7,4’‐trimethylether (S.1)

In der GC‐MS‐Analyse der Fraktion S.t.5 wurde unter anderem ein Signal detektiert, das durch Vergleich mit der MS‐Substanzdatenbank einem Flavonoid(derivat) zugeordnet werden konnte. Zu dessen Isolierung wurde ein Teil der Fraktion S.t.5 in wenig Methanol gelöst und in den Kühlschrank gestellt. Ein Rückstand setzte sich ab. Der Überstand wurde abgenommen und in einem anderen Kolben gesammelt, der Rückstand wurde wiederum mit wenig kaltem Methanol gewaschen. Mit dem gereinigten Rückstand (insgesamt 34,8 mg) wurde eine GC‐MS‐Analyse durchgeführt, um die Reinheit zu überprüfen.

4.3. Identifizierung von Kämpferol‐3,7,4’‐trimethylether (S.1)

Summenformel C18H16O6 Molekülmasse 328,3 Rf‐Wert DC 0,88 (Fließmittelsystem 1) DC‐Färbung: löscht bei 254 nm, keine Fluoreszenz bei 366 nm, nach Derivatisierung mit Anisaldehyd‐Schwefelsäure‐Reagenz gelb, Fleck erscheint dann bei 366 nm strahlend

MS der GC‐MS (Retentionszeit 18,94 min): m/z: 328, 309, 285, 150, 135

NMR‐Daten in CDCl3: siehe Abschnitt C.1.3.5, Ergebnisteil

4.4. Isolierung von Aristolactam AIIIa (S.2)

Die Trennung von 20,7 mg der Fraktion S.t.7 erfolgte durch Säulenchromatographie an Kieselgel (13 g) mit einem aus der DC abgeleiteten Fließmittel der Zusammensetzung Dichlormethan:Methanol:Ethylacetat 8:1:1 (V:V). Es wurden 8 Fraktionen (S.t.7.1.1 – 8) aufgefangen. Nach Überprüfung per DC wurden 3 Fraktionen, die jeweils nur einen Substanzfleck lieferten, erhalten. Nur Fraktion S.t.7.1.3 enthielt eine ausreichende Menge (1,6 mg) an Substanz, die für eine Strukturaufklärung durch NMR‐Analysen genügte.

184 Experimenteller Teil

4.5. Identifizierung von Aristolactam AIIIa (S.2) gelbliches Pulver, nicht in CDCl3 löslich

Summenformel C16H11NO4 Molekülmasse Mr = 281,3 Rf‐Wert DC 0,39 (Fließmittelsystem 1) DC‐Färbung: löscht nicht bei 254 nm, hellblaue (leicht türkise) Fluoreszenz bei 366 nm, nach Derivatisierung mit Anisaldehyd‐Schwefelsäure‐ Reagenz bleibt Fluoreszenz erhalten, keine Färbung bei Tageslicht

Tabelle F.13: EI‐Massenspektrum der Substanz S.2 mit Direkteinlass, angegeben ist das m/z‐ Verhältnis, die relativen Intensitäten sowie Literaturdaten m/z rel. Intensität rel. Intensität (Priestap 1985) 281,0 100 100 267,0 10,5 14,5 265,9 62,9 88,6 237,9 15,2 41,3 182,0 13,8 40,8

In einer weiteren MS‐Untersuchung wurde im ESI (positiver Modus) der 100 %‐Peak bei m/z = 282,1 [M+H]+ gemessen.

NMR‐Daten: siehe Abschnitt C.1.3.6 (Ergebnisteil), gemessen in d6‐DMSO

Experimenteller Teil 185

5. Biologische Untersuchungsmethoden

5.1. Zellkulturen

Prinzipiell wurden im Umgang mit den Zellkulturen nur sterile Plastikartikel wie Einmalpipetten oder Kulturflaschen verwendet oder die Pipettenspitzen, Wasserflaschen und weiteres Zubehör durch Autoklavieren im heißen, gespannten Wasserdampf (2 bar, 121 °C, mind. 15 Minuten) sterilisiert. Zudem wurde alles vor dem Einbringen in die Sicherheitswerkbank mit 70 %igem Ethanol abgesprüht. Die Zellen wurden nur unter Laminar‐Flow‐Bedingungen behandelt.

Allgemeine Lösungen:

10x PBS‐Puffer: 80 g NaCl, 2 g KCl, 7,65 g Na2HPO4 * 2 H2O, 2 g KH2PO4 auf 1000 mL mit

Millipore‐H2O auffüllen (30 min autoklavieren bei 121 °C, 2 bar) Diese Stocklösung wurde vor Gebrauch mit Millipore‐Wasser 1:10 verdünnt, um 1x PBS‐ Puffer zu erhalten und gegebenenfalls erneut autoklaviert.

Penicillin‐Streptomycin‐Stocklösung: Penicillin‐Streptomycin 500x wurde unter der Laminar‐ Flow‐Bank in 20 mL sterilem Millipore‐Wasser gelöst (Penicillin 50000 U/mL, Streptomycin 50 mg/mL), zu 1 mL in Reaktionsgefäße aliquotiert und bis zur Zugabe zum Zellkulturmedium (1 mL auf 500 mL Medium) bei ‐ 20 °C gelagert.

L‐Glutamin‐Lösung 200 mM: Die fertig gekaufte, sterile Lösung wurde unter Laminar‐Flow‐ Bedingungen zu 5 mL aliquotiert und bei ‐ 20 °C bis zum Gebrauch gelagert. 5 mL wurden zu 500 mL Zellkulturmedium gegeben, die Endkonzentration im Medium betrug also 2 mM L‐Glutamin.

Bestimmung der Zellzahl: Für die Versuche wurde die Zellkonzentration mit Hilfe einer Neubauer‐Zählkammer bestimmt. Ca. 10 µL Zellsuspension wurden unter das Deckgläschen des Hämacytometers gegeben und die Felder ausgezählt. Ein Feld besteht aus 16 kleinen Quadraten und ist in der Abbildung F.10 jeweils mit „L“ gekennzeichnet. Es wird ein Mittelwert aus 4 Feldern berechnet. Da das Volumen bzw. die Fläche definiert ist, kann die Zahl mit 104 multipliziert 186 Experimenteller Teil werden und ergibt dann die Anzahl der Zellen pro mL. Die jeweils verwendete Zellzahl ist bei den Versuchen angegeben.

Abbildung F.10: Zählfeld der Neubauer‐Zählkammer zur Bestimmung der Zellzahl

5.1.1. Kultivierung von primären Zellen

Primäre Zellen werden im Gegensatz zu immortalisierten Zelllinien direkt aus dem lebenden Organismus entnommen und kultiviert. Eine Schwierigkeit stellt bei dieser Vorgehensweise die Simulation von in‐vivo‐gleichen oder zumindest ‐ähnlichen Bedingungen für die Zellen dar. Sie verhalten sich nur teilweise proliferativ. Dadurch können Aktivierungen verschiedener Signalwege verändert sein. Zusätzlich ist eine Entdifferenzierung der Zellen in Kultur möglich, weshalb eine längere Kultivierung problematisch sein kann und vermieden wurde.

Kultivierung von bovinen Chondrocyten Knorpelgewebe von Knien adulter Rinder wurde von einem lokalen Metzger (Schlachter) bezogen. Das Gelenk wurde nach Vorschrift aufgearbeitet und die isolierten, aufgereinigten Chondrocyten in Aliquots zu je 3 Millionen Zellen in flüssigem Stickstoff aufbewahrt (Schmal et al. 2005). Die Zellen wurden schnell aufgetaut, in ca. 20 mL vorgewärmtes Ham’s F‐12 Medium mit

10 % FCS gegeben und horizontal in Kulturflaschen kultiviert (37 °C, 5 % CO2). Dem Medium wurde zusätzlich 1 % Penicillin/Streptomycin zugegeben. Die Zellen adhärierten und wurden bis zur Konfluenz alle 2 Tage mit frischem, warmem Medium versorgt. Konfluente Zellen wurden trypsiniert, d.h. durch Zugabe von Trypsin abgelöst, und für die Versuche in 6‐well Platten (Konzentration von 1 ‐ 1,2 * 106 Zellen/well) Experimenteller Teil 187 ausgesät. Als Medium wurde sogenanntes Hungermedium (Ham’s F‐12 Medium mit nur 2,5 % FCS) verwendet. Die Zellen wurden nach 24 h für den Versuch verwendet, eine längere Kultivierung fand nicht statt. Die weitere Behandlung erfolgte wie beim jeweiligen Versuch angegeben.

Kultivierung von humanen Knorpelzellen Humane Gelenkchondrocyten wurden von Lonza, Belgien, erhalten und in Chondrocyte Growth Media (Lonza, Belgien) mit 5 % FCS und Wachstumsfaktoren kultiviert. Für die Versuche wurden nur Zellen bis zur Passage 7 verwendet. Die Zellen wachsen ebenfalls adhärent und wurden bis zur Konfluenz kultiviert und durch Trypsinieren passagiert. Sie wurden analog zu den bovinen Chondrocyten in 6‐well Platten ausgesät.

5.1.2. Kultivierung von Suspensionszellen

Jurkat‐T‐Zellen [humane T‐Zell Leukämiezellen; DSMZ‐Nr.: ACC 282; runde Suspensionszellen, „human T cell leukemia established from the peripheral blood of a 14‐ year‐old boy with acute lymphoblastic leukemia (ALL) at first relapse in 1976“] (Schneider et al. 1977). Jurkat‐T‐Zellen wurden in 175 cm2‐Zellkulturflaschen, gefüllt mit ungefähr 30 mL RPMI 1640

Medium, in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 und Wasserdampf bei 37 °C horizontal im Brutschrank kultiviert. Dem gekauften Medium wurden 10 % FCS (Fötales Kälberserum, als Quelle für Proteine, Spurenelemente, Proteaseinhibitoren, Wachstumsfaktoren, etc.) (V:V), 5 mL Glutamin (entspr. 2 mM; wachstumslimitierende Aminosäure), und 1 mL Antibiotikastocklösung (s.o., entsprechend 100 IU/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin) zugesetzt. Um die Zell‐Linie zu erhalten, wurde ein Teil der durch leichtes Schütteln homogenisierten Zellsuspension mit einer sterilen Pipette in eine neue Kulturflasche gegeben und auf das gewünschte Endvolumen mit erwärmtem, frischem Medium gebracht. Bei normalem Zellwachstum war eine Verdünnung im Verhältnis 1:4 bis 1:8 alle 2 ‐ 4 Tage notwendig. Die Farbe des Mediums konnte in dieser Zeit von rot‐pink nach gelb umschlagen. Dies lag an der

Stoffwechselaktivität der Zellen und dem CO2‐Anteil. Man konnte nach 24 h mit einer Verdopplung der Zellzahl rechnen. 188 Experimenteller Teil

5.1.3. Kultivierung von adhärenten Zellen (HeLa229, NLZ‐9)

HeLa229‐Zellen [humane epitheliale Cervixcarcinom‐Zellen; ATCC‐Nr.: CCL2.1; (Scherer et al. 1953)] wurden wie Jurkat‐Zellen horizontal bei denselben Bedingungen im Brutschrank kultiviert, allerdings in 75 cm2‐Kulturflaschen. Diese Zellen heften sich an, wachsen also adhärent. Die Zelldichte sollte unter Konfluenz gehalten werden, wobei eine 80 %ige Konfluenz ideal ist. Wenn die Zellen zu dicht wuchsen, wurden sie durch Trypsinieren abgelöst und in geringerer Zahl mit frischem RPMI‐Medium in die Kulturflasche gegeben. Dazu wurden ca. 2 mL Trypsin‐EDTA in die Flasche gegeben, nachdem das Medium durch Absaugen entfernt und die Zellschicht mit ca. 3 mL sterilem PBS gewaschen worden war. Die Zellen wurden für ca. 5 Minuten inkubiert, das Einhalten dieser Zeit ist wichtig, da sonst zu viele Proteine verdaut werden und die Zellmembran geschädigt werden kann. Der Verdau der Auswüchse („Füßchen“) wurde durch Zugabe von 8 mL frischem Medium gestoppt. Die Zellen wurden vollständig abgespült und in ein Falcon‐Tube überführt. Die Zellsuspension wurde für 5 min bei 1600 rpm und 4 °C abzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen mit frischem, erwärmtem Medium versetzt.

NLZ9‐Zellen: NLZ9‐Zellen wurden durch stabile Cotransfektion von pNF‐κB‐Luc und pZeoV in 293‐Zellen (Humane, embryonale epitheliale Nierenzellen [adhärente Zellen, ATCC‐Nr.: CRL‐1573]) erhalten. Die Zellen wurden in DMEM‐Medium unter Begasung mit 5 % CO2 bei 37 °C im Brutschrank kultiviert. Dem Medium wurde 10 % FBS, 100 IU/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin sowie 100 µg/mL Zeocin zugesetzt. Die Zell‐Linie wurde von Maja Lindenmeyer im Arbeitskreis eingeführt (Lindenmeyer 2004). NLZ9‐Zellen wurden durch das sog. „Shake‐off“‐Verfahren (Abklopfen der Zellen) passagiert. Dazu wurde das Medium vorsichtig abgesaugt und 10 mL frisches, erwärmtes Kulturmedium hinzugefügt. Durch kräftiges Klopfen gegen die Unterseite der 175 cm2‐Zellkulturflasche wurden die Zellen von der Wand gelöst. Geeignete Mengen an Zellsuspension wurden in neue Kulturflaschen überführt und mit 30 mL frischem, warmem Medium verdünnt. Auch hier erfolgte das Passagieren der Zellen alle 2‐3 Tage in einem Verhältnis von 1:3 bis 1:6.

Experimenteller Teil 189

5.1.4. Auftauen und Einfrieren der Zellen

Die Zellen wurden alle getreu dem Motto „schnell auftauen, langsam einfrieren“ behandelt. Für Jurkat‐T‐Zellen wurde folgendermaßen vorgegangen: Die Zellen wurden kultiviert, bis sie sehr dicht waren, dann wurde die Zellsuspension in ein großes Falcon‐Tube überführt. Die Zellen wurden bei 1600 rpm und 4 °C für 5 min zentrifugiert, anschließend wurde der Überstand verworfen und das Zellpellet in 5 mL einer sterilen FBS:DMSO (90:10)‐Mischung resuspendiert. Je 1 mL wurde in spezielle Reaktionsgefäße (Cryo‐Tubes) überführt, beschriftet und in einer Styroporbox bei – 86 °C für mehrere Stunden eingefroren. Die längerdauernde Lagerung fand in flüssigem Stickstoff (‐ 169 °C) statt. Andere Zelltypen wurden erst im Kühlschrank abgekühlt, dann bei – 20 °C und danach erst bei – 86 °C eingefroren. Zum Auftauen wurde eine Kulturflasche mit erwärmtem Medium vorbereitet, das Zellaliquot aus dem Stickstoff geholt, kurz bei Raumtemperatur erwärmt und mit ca. 1 mL warmem Medium verflüssigt. Die Zellsuspension wurde in die Kulturflasche gegeben, mit dem Medium vorsichtig vermischt, und die Flasche sofort in den Inkubator gelegt. Ein Mediumwechsel nach 12 bis 24 h diente zur vollständigen Entfernung von DMSO, das durch das Einfriermedium eingebracht wurde.

5.2. Herstellung von Proteinextrakten

In den folgenden Abschnitten sind die Protokolle für die Anfertigung von Proteinextrakten aus den verschiedenen Zelltypen sowie für die Bestimmung der Proteinkonzentration beschrieben. Die Herstellung von Gesamtproteinextrakten beruht auf der Lyse der Membranen durch hypertone Puffer und Detergentien. Bei der Isolierung von Kernproteinen werden Zell‐ und Kernmembran nacheinander lysiert. Die Zellmembran wird durch Einwirkung eines hypotonen Puffers und/oder Detergentien lysiert, für die Kernmembran wird im darauffolgenden Schritt ein hypertoner Puffer verwendet.

190 Experimenteller Teil

5.2.1. Kernextraktprotokoll für Jurkat‐T‐Zellen

Am Vortag (ca. 24 h vor dem Versuch) wurden 750.000 Zellen pro 6 cm‐Platte in je 5 mL RPMI‐Medium mit Zusätzen ausplattiert, so dass am Versuchstag eine Konzentration von ca. 1,5 Millionen Zellen pro Platte vorlag. Die Zellen wurden nach Vorschrift inkubiert, stimuliert und während dieser Zeit bei 37 °C und 5 % CO2 im Inkubator belassen. Am Ende wurde die Zellsuspension in Falcon‐Tubes überführt und für 5 min bei 4 °C und 1600 rpm zentrifugiert. Alle weiteren Schritte wurden nicht mehr unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Der Überstand wurde entfernt, das Zellpellet mit 1 mL eiskaltem 1x PBS‐Puffer gewaschen, wobei die Zellsuspension in ein Eppendorf‐Reaktionsgefäß überführt und kurz abzentrifugiert wurde. Der Puffer wurde wiederum entfernt, das Zellpellet in 400 µL Puffer A (ohne Proteasehemmercocktail) resuspendiert und 10 min auf Eis quellen gelassen. Anschließend wurde kurz zentrifugiert (4500 rpm, 4 °C, 5 min) und der Puffer A abgesaugt. Im nächsten Schritt wurden 200 µL Igepal (Puffer A + NP‐40 + Proteasehemmercocktail) zugegeben, das Pellet resuspendiert und für 5 ‐ 10 min auf Eis stehen gelassen. Der beim Zentrifugieren (4500 rpm (2000 g), 4 °C, 5 min) erhaltene Überstand ist der cytosolische Extrakt. Dieser Überstand wurde entfernt (verworfen oder zur EMSA‐Kontrolle bei – 86 °C eingefroren) und das Pellet mit 48 µL eiskaltem Puffer C (mit Proteasehemmercocktail) versetzt. Da sich das Pellet nur schwer resuspendieren ließ, wurde es ca. 10 min mit dem Vortexer behandelt und 10 weitere Minuten auf Eis inkubiert. Die eigentliche Lyse der Kernmembran wurde durch Zugabe von 4 µL 5 M NaCl‐Lösung eingeleitet. Die Suspension wurde 30 min bei 4 °C und 550 rpm geschüttelt und ein letztes Mal zentrifugiert (13000 rpm, 4 °C, 10 min). Der Überstand ist der Kernextrakt und wurde in ein Save‐Lock‐Reaktionsgefäß überführt und bis zur weiteren Verwendung bei – 86 °C eingefroren.

Puffer A: 10 mM Hepes (pH 7,6), 15 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA (pH 8,0) Igepal: Puffer A + 0,2 % NP‐40 (1 mL 10 %ige Lösung auf 50 mL Puffer A) Puffer C: 25 mM Hepes (pH 7,6), 50 mM KCl, 0,1 mM EDTA (pH 8,0), 10 % Glycerol Die 5 M‐NaCl‐Lösung wird immer zu 1/12 des Volumens zugegeben. Proteasehemmercocktail: 1 % Aprotinin‐Lösung (Originallösung), 0,5 % PMSF‐Lösung (0,1 % (m/V) in EtOH), 0,1 % DTT‐Lösung (0,1 M) Experimenteller Teil 191

5.2.2. Kernextraktprotokoll für HeLa229‐Zellen

Am Vortag (ca. 24 h vor dem Versuch) wurden die Zellen in einer Konzentration von 750000/5 mL Medium in 6 cm‐Platten ausplattiert, so dass am Versuchstag eine Konzentration von ca. 1,5 Millionen Zellen pro Platte vorlag und die Zellen sich anheften konnten. Nach der vorgegebenen Inkubations‐ und Stimulationszeit wurde das Medium entfernt. Die Zellen wurden jeweils mit 2 mL eiskaltem 1x PBS‐Puffer gewaschen, anschließend wurden je 2 mL Puffer A (ohne Proteasehemmercocktail) in die wells gegeben und die Zellen für 10 min auf Eis quellen gelassen. Der Puffer A wurde abgesaugt. Im nächsten Schritt wurde 1 mL Igepal (Puffer A + NP‐40 + Proteasehemmercocktail) zugegeben und die Zellen für 5 min auf Eis stehen gelassen. Danach wurde die Suspension in Reaktionsgefäße überführt. Der beim Zentrifugieren (4500 rpm (2000 g), 4 °C, 10 min) erhaltene Überstand ist der cytosolische Extrakt. Dieser Überstand wurde entfernt (verworfen oder zur EMSA‐Kontrolle bei – 86 °C eingefroren) und die Gefäße auf Eis gestellt. Die auf der Platte verbleibenden Kerne wurden mit 100 µL Puffer C für 10 min inkubiert. 8,5 µL 5 M NaCl‐Lösung wurden dann zu der Flüssigkeit auf der Platte gegeben, die Zelltrümmer mit Plastikschabern abgelöst und mit dieser Lösung das Pellet in den Reaktionsgefäßen resuspendiert. Die Suspension wurde 30 min bei 4 °C und 550 rpm geschüttelt und anschließend zentrifugiert (13000 rpm, 4 °C, 10 min). Der Überstand ist der Kernextrakt und wurde in ein Save‐Lock‐Reaktionsgefäß überführt und bis zur weiteren Verwendung bei – 86 °C eingefroren.

Pufferzusammensetzung siehe vorigen Abschnitt.

5.2.3. Herstellung von Gesamt‐Proteinextrakten aus Jurkat‐T‐Zellen

Die Zellen wurden analog der Beschreibung in 5.2.1 ausplattiert und behandelt. Am Ende der Stimulationszeit wurde die Zellsuspension mit Hilfe von 5 mL‐Spitzen in 15 mL‐Tubes überführt. Die Tubes wurden auf Eis gestellt und die Zellen bei 4 °C für 5 min bei 1600 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt, das Pellet mit 1,0 mL kaltem 1x PBS‐Puffer resuspendiert und die Suspension in 1,7 mL Reaktionsgefäße überführt. Die Zellen wurden für 30 sec bei Maximalgeschwindigkeit (13000 rpm) abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt, das verbleibende Pellet vorsichtig in 50 µL Totex‐Lyse‐Puffer aufgeschlämmt und 192 Experimenteller Teil

30 min auf Eis inkubiert. Die Lösung wurde für 10 min bei 4 °C und 13000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand ist der gewünschte Proteinextrakt und wurde in neue Save‐ Lock‐Reaktionsgefäße überführt. Die Lagerung erfolgte bei – 86 °C.

Zusammensetzung des Totex‐Puffers:

20 mM Hepes, 0,35 M NaCl, 20 % Glycerol, 1,0 % NP‐40, 1,0 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 0,1 mM EGTA in Millipore‐Wasser Diesem Puffer wird vor Gebrauch ein Proteasehemmercocktail zugesetzt. Es werden n+1 Ansätze vorbereitet und pro mL Totex‐Puffer 5 µL DTT (100 mM), 5 µL PMSF (0,1 %) sowie 10 µL Aprotinin zugegeben.

5.2.4. Bestimmung der Proteinkonzentration

Die quantitative Bestimmung des Proteingehaltes erfolgte bei allen Extrakten mittels des Bio‐Rad Protein Assays nach Bradford (Bio‐Rad Quick Start™ Bradford Dye Reagent 1x). Dieser Assay beruht auf der Bildung von stabilen Farbstoff‐Protein‐Komplexen aus Coomassie Brillant Blue G‐250 Farbstoff und löslichen Proteinen. Eine Kalibriergerade wurde durch die Verwendung der mitgelieferten Albuminstandards angefertigt. Die Messung von 5 µL Probe (Proteinextrakt oder Standard), die ca. 20 min mit 250 µL Reagenz inkubiert wurden, erfolgte bei 595 nm auf einer unbeschichteten 96‐well Platte im Microplate‐Reader. Die Proteinextrakte mussten i.d.R. 1:1 bis 1:5 verdünnt werden. Das Reagenz wurde mittels einer Mehrkanalpipette (Transferpette®) zugegeben, entstehende Luftblasen wurden vor der Messung entfernt. Absorptionen im Bereich von 0,2 bis 0,9 wurden in die Auswertung mit einbezogen.

5.3. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

Im EMSA wird die sequenzspezifische Bindung von Transkriptionsfaktoren (oder allgemein von Proteinen) an doppelsträngige DNA‐Oligonucleotide untersucht. Die Ausbildung eines entstandenen Protein‐DNA‐Komplexes wird durch eine Gelelektrophorese untersucht. Dabei wandern die DNA‐Moleküle, die Protein gebunden haben, aufgrund ihrer Größe langsamer („mobility shift“) durch ein natives Polyacrylamidgel und werden dadurch abgetrennt. Am Experimenteller Teil 193 unteren Rand tritt eine Bande auf, die durch den Überschuss an ungebundenem Oligonucleotid hervorgerufen wird. Weiter oben im Gel erscheinen eine oder mehrere Banden, die an die Sequenz gebundenes Protein oder Proteinkomplexe beinhalten. Die Methode wird daher auch Gelshift‐Assay oder Bandshift‐Assay genannt. Das entsprechende Oligonucleotid wird radioaktiv markiert und das Ergebnis durch Autoradiographie des getrockneten Gels sichtbar gemacht.

5.3.1. Herstellung der DNA‐Sonden

Zur Detektion der Transkriptionsfaktoren im Radioaktiv‐EMSA wurden folgende Oligonucleotid‐Sequenzen verwendet:

AP‐1 (Activator Protein‐1) Es wird eine Oligonucleotid‐Sequenz aus dem Kollagenase‐Promotor verwendet. sense 5’‐ CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA ‐3’ antisense 5’‐ TTC CGG CTG ACT CAT CAA GCG ‐3’

NF‐κB (Nuclear factor‐kappa B) Es wird nachstehende Sequenz eingesetzt, die als NF‐κB Consensus‐Sequenz bezeichnet wird. sense 5’‐ AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C ‐3’ antisense 5’‐ G CCT GGG AAA GTC CCC TCA ACT ‐ 3’

Beide Sequenzen wurden als Doppelstränge bei der Firma Promega bestellt und direkt für die radioaktive Markierung verwendet.

5.3.2. Radioaktive Markierung der DNA

Für die radioaktive Markierung der Oligonucleotide war ein Enzym nötig, das den Transfer der terminalen, radioaktiven Phosphatgruppe von [γ‐33P]‐ATP auf die 5’‐OH‐Enden des Doppelstranges übernehmen kann. Hierzu wurde die Polynucleotidkinase aus dem Bakteriophagen T4 (T4‐PNK) eingesetzt. Über kleine Säulen mit Sephadex™ G‐25 DNA Grade F Füllung wurde die markierte DNA aufgereinigt. 194 Experimenteller Teil

Die genaue Vorschrift lautete wie folgt: 37 µL Millipore‐Wasser wurden mit 5 µL Kinase‐Puffer 10x, 1 µL Oligonucleotid (1,75 pmol/µL) und 5 µL [γ‐33P]‐ATP (3000 Ci/mmol) versetzt. Zuletzt wurden 2 µL T4‐PNK (10 U/µL) zugegeben. Ein Ansatz beinhaltete also 50 µL. Mehr sollte nicht auf eine Säule gegeben werden. Die Lösungen wurden nach unten zentrifugiert und bei 37 °C für 60 – 70 min inkubiert. Microspin G25‐Säulen wurden nach Vorschrift der Firma Amersham vorbehandelt und der vorhandene Puffer abzentrifugiert. Die Inkubationslösung wurde für 2 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Die erhaltene Lösung an aufgereinigter, radioaktiv markierter DNA (Konzentration 0,035 pmol/µL) wurde direkt verwendet bzw. bei ‐ 20 °C gelagert. Aufgrund der Halbwertszeit des 33P ist die Lösung ca. 4 Wochen verwendbar.

5.3.3. Elektrophorese

Das native, also nicht denaturierende, 4 %ige Polyacrylamidgel wurde für die EMSAs aller Transkriptionsfaktoren in gleicher Weise hergestellt. Für ein Gel wurden 56,5 mL Millipore‐ Wasser, 7,0 mL 5x TBE‐Puffer und 10 mL wässrige Acrylamidlösung (30 % AA, 0,8 % Bis) in ein Becherglas gegeben und auf dem Magnetrührer gerührt. Als eigentliche Reaktionsstarter wurden 400 µL APS (10 % in Millipore‐Wasser) und 40 µL TEMED zugegeben. Nach ca. 5 min wurde das Gel in die vorbereitete Gelkammer gegossen und zur Polymerisation für mindestens 3 h (meistens aber über Nacht) waagerecht gelagert.

5x TBE‐Puffer: 108 g Tris, 55 g Borsäure, 40 mL 0,5 M EDTA (pH 8,0), mit Millipore‐H2O auf 2000 mL auffüllen

5.3.4. Bindungsreaktion mit AP‐1

Es wurden die in Kapitel 5.2 beschriebenen Kernextrakte verwendet. Gleiche Mengen an Kernproteinen (2 – 5 µg) wurden abpipettiert, auf ein Volumen von 7 µL aufgefüllt, zu einem Bindemix gegeben und 25 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Bindemix (15 µL Gesamtvolumen) war wie folgt zusammengesetzt:

Experimenteller Teil 195

Tabelle F.14: Zusammensetzung des AP‐1 Bindemix für den EMSA Volumen [µL] Bestandteil Stocklösung Entspricht 2 BSA 10 µg/µL 20 µg 2 Poly(dIdC) 1 µg/µL 2 µg 2 Puffer D+ 4 Puffer F 3 Millipore‐Wasser

1 MgCl2 100 mM 4,5 mM in 22 µL 1 Markiertes Oligo 0,035 pmol/µL 1,59 fmol/µL in 22 µL

BSA: wird in Wasser gelöst und als Kompetitor für Proteine eingesetzt Poly(d(i‐c)): Poly(desoxy‐Inositol‐desoxy‐Cytidyl), kurz Poly(dIdC), ein synthetischer, repetitiver Strang, diente dazu, unspezifische Bindungen abzufangen. Die

vorliegenden 50 A260 Einheiten wurden in 2,5 mL sterilem Millipore‐Wasser gelöst, in Aliquots zu 60 µL abpipettiert und bei ‐ 20 °C eingefroren. 1 OD entspricht 50 µg/mL, die Stocklösung hatte somit eine Konzentration von 1 µg/µL. Puffer D+: 20 mM HEPES (pH 7,9), 20 % Glycerol, 100 mM KCl, 0,5 mM EDTA, 0,25 % NP‐40, 2 mM DTT, 0,1 % PMSF (in 1 mL Ethanol gelöst) Puffer F: 20 % Ficoll 400, 100 mM HEPES (pH 7,9), 300 mM KCl, 10 mM DTT, 0,1 % PMSF Als Vorbereitung wurden n+1 Ansätze pipettiert. Magnesium: erhöht die Bindefähigkeit von b‐Zip‐Proteinen.

Während der Inkubationszeit wurde das Gel in eine vertikale Gelelektrophorese‐Apparatur eingespannt und die Gelenden in 0,5x TBE‐Puffer als Elektrodenpuffer getaucht. Zusätzlich wurden Luftblasen vom unteren Gelrand entfernt und die Taschen gespült. Als Marker wurden 3 µL Farbstoffgemisch (Bromphenolblau und Xylencyanol) in eine Tasche gefüllt. Zur Kontrolle wurde das Gel 5 bis 10 min unter den unten angegebenen Bedingungen vorlaufen gelassen. Nach Beendigung der Inkubation wurden die Proben in die Taschen des Gels überführt. Die Gelelektrophorese erfolgte dann über ca. 90 min (Laufstrecke des Farbstoffes Brom‐ phenolblau ca. 10 cm) bei 200 V (22 bis 14 mA). Anschließend wurde das Gel vorsichtig von der Glasplatte auf ein Filterpapier (17 * 22 cm) überführt, mit Klarsichtfolie abgedeckt und 196 Experimenteller Teil im Vakuum‐Geltrockner bei 80 °C für 50 – 60 min getrocknet. Das trockene Gel wurde über Nacht (16 – 22 h) unter einen PhosphoImager BAS‐Film gelegt. Die Auflegezeit hing vom Alter und damit von der verbliebenen Menge an Radioisotop 33P ab. Ausgewertet wurde im PhosphoImager (Fuji).

5.3.5. Bindungsreaktion mit NF‐κB

Für die Analyse der Bindung von NF‐κB an das Oligonucleotid wurde eine analoge Vorschrift verwendet. Im Bindemix war kein Magnesiumchlorid nötig, dieses Volumen wurde durch Wasser ersetzt. Da nur aktiviertes NF‐κB binden kann, reichen in diesem Fall Gesamtproteinextrakte aus.

5.3.6. Competition Assay

Zur Absicherung, dass im EMSA eine spezifische Bande betrachtet wurde, können Competition Assays durchgeführt werden. Dem EMSA‐Bindemix wurde dafür ein Überschuss (100‐fach, in diesem Fall 1 µL ungelabeltes Oligonucleotid pro Reaktionsansatz) an nicht markiertem Oligonucleotid hinzugefügt. Folglich wird das Protein von diesem Überschuss abgefangen und die Bande verschwindet, da das markierte Oligo keinen Bindungspartner mehr vorfindet. In allen Versuchen wurde das entsprechende Oligonucleotid mit der spezifischen Sequenz eingesetzt, das auch für die radioaktive Markierung Verwendung fand.

5.4. Untersuchungen von Testsubstanzen im NF‐κB‐ und AP‐1‐EMSA sowie mittels quantitativer real‐time PCR

Von den Testsubstanzen wurden Stocklösungen in DMSO angefertigt. Falls nichts anderes angegeben ist, wurden die Substanzen eingewogen, DMSO bis zu einer Endkonzentration von 10 mM hinzugefügt und falls nötig im Ultraschallbad bis zur vollständigen Auflösung behandelt. Die Stocklösungen wurden bei – 20 °C aufbewahrt. Da bei den Pflanzenextrakten das Molekulargewicht noch nicht bekannt ist, wurden die Stocklösungen in einer Konzentration von 10 mg/mL hergestellt. Experimenteller Teil 197

Mit diesen Testlösungen wurden die Zellen für 1 h vorinkubiert und dann für 1 bis 3 h mit den unten angeführten Cytokinen stimuliert, ohne das Medium zu wechseln. Die jeweiligen Zeiten sind bei den einzelnen Versuchen spezifiziert. Nach Ablauf dieser Zeiten wurde ein Proteinextrakt (Kern‐ oder Gesamtextrakt, siehe Kapitel 5.2) hergestellt und dieser, wie oben beschrieben, im EMSA untersucht. Die RNA‐Extraktion ist in Kapitel 5.6.1 beschrieben.

Referenzsubstanz Parthenolid: Sesquiterpenlacton aus Tanacetum parthenium, Sigma, eingesetzt als 10 mM Stocklösung in DMSO

Untersuchungen im EMSA Zubereitungen aus Arnica montana • Arnikatinktur (mitteleuropäischer Chemotyp), getrocknete Arnikablüten vom Typ Arbo, alkoholische Tinktur 1:10 nach Ph.Eur. 4 hergestellt (Perkolation), vom 23.9.05 CJ • Arnikatinktur F (mitteleuropäischer Chemotyp), aus frischen Arnikablüten hergestellt, Bioforce, Arnica mont flos rec T. 1:20 kg, Art. Nr. 02601100, Ch.Nr. 017766, Gebinde Nr. E76, 17.8.05 (PS) • Arnikatinktur SP (spanischer Chemotyp), Kneipp, Ch. B. 6511, ID 6713, 100 mL, 18.7.05, Würzburg Alle Tinkturen wurden direkt zu den Zellen ins Medium gegeben. Um den Einfluss von Ethanol, der in den Tinkturen enthalten ist, auszuschließen, wurde jeweils die höchste Konzentration, die durch das Maximum an Tinktur eingebracht wurde, berechnet und für alle Proben angepasst.

• Arnikagel, A. Vogel Arnica Gel, Bioforce, „Arnica montana extract“, Ch. B. 018602, Exp 11/2008, enthält Tinktur aus frischen, mitteleuropäischen Arnikablüten Das Gel wurde direkt vor dem Versuch 1:3 mit Zellkulturmedium verdünnt und leicht erwärmt. Alle Zubereitungen wurden qualitativ und quantitativ auf ihren SL‐Gehalt mittels GC‐MS untersucht (siehe Tabelle C.8, Ergebnisteil). 198 Experimenteller Teil

Sesquiterpenlactone (SLs) • 4β, 15‐Epoxy‐miller‐9E‐enolid (aus Milleria quinqueflora, (Castro et al. 2000))

• Dihydrohelenalinisovalerianat • Dihydrohelenalinmethacrylat • Helenalinisobutyrat (HIB) Aus den Einzelsubstanzen, die aus Blüten von Arnica montana isoliert wurden, wurde eine 10 mM Stocklösung in DMSO hergestellt. Die Reinheit wurde mittels GC‐MS überprüft.

Testung mittels quantitativer RT‐PCR Chondrocyten wurden mit verschiedenen Arnikazubereitungen für eine Stunde vorinkubiert und dann für vier weitere Stunden mit IL‐1β (20 ng/mL) stimuliert. Nach dieser Zeit wurde die mRNA‐Isolierung nach einem Protokoll von Qiagen durchgeführt. Helenalinisobutyrat wurde als Referenzsubstanz eingesetzt.

Verwendete Stimulantien • PMA‐Stocklösung: eine Konzentration von 1 mg/mL wurde eingesetzt, 0,5 µL pro Schale (5 mL) ergeben somit eine Endkonzentration von 100 ng/mL • IL‐1β (bovin/human): Stocklösung 50 µg/mL (Die vorhandenen 10 µg werden in 100 µL sterilem Millipore Wasser gelöst und mit 100 µL einer Mischung aus 90 % PBS und 10 % FBS auf eine Endkonzentration von 50 µg/mL verdünnt. Die Lösung wird in Aliquots à 10 µL bei ‐ 20 °C eingefroren.) Stimuliert wird in einer Konzentration von 20 ng/mL für 1 h bzw. 3 h. • TNF‐α (rekombinant, murin): 0,5 µL einer Stocklösung wurden zu einer Endkonzentration von 1 ng/mL (400 U/mL) ins Medium gegeben

Experimenteller Teil 199

5.5. Untersuchungen zur Cytotoxizität im MTT‐Test

Dieser Test beruht auf der Umsetzung des gelben, löslichen Tetrazoliumsalzes 3‐[4,5‐ Dimethylthiazol‐2‐yl]‐2,5‐Diphenyl‐Tetrazoliumbromid (MTT) in den Mitochondrien zu einem blauvioletten Formazansalz. Dieser Vorgang kann nur in lebenden, stoffwechselaktiven Zellen durch die mitochondriale Dehydrogenase unter NADH‐Verbrauch stattfinden. Die Reaktion ist in Abbildung F.11 dargestellt. Die jeweiligen Zellen wurden wie im Experiment beschrieben behandelt, d.h. inkubiert und/oder stimuliert und nach dieser Zeit mit einer 1:1 Mischung aus warmem Medium und MTT‐Lösung versetzt. Jurkat‐T‐Zellen wurden weitere 2 h inkubiert. Danach wurde die Suspension in kleine Falcon‐Tubes überführt, damit das entstandene, unlösliche Formazan für 10 min bei 5000 rpm und 4 °C abzentrifugiert werden konnte. Der Überstand wurde verworfen und 1 mL einer Lösung aus 20 % SDS und DMF 1:1 dazugegeben, um den Farbstoff über Nacht in Lösung zu bringen. Falls das nicht ausreichte, wurden die Tubes im Ultraschallbad behandelt. 100 µL der so entstandenen Farblösung wurden auf 96‐well‐Platten bei 595 nm im Microplate‐Reader vermessen. Die Viabilität unbehandelter Zellen wurde als Negativkontrolle stets mitbestimmt.

+ NADH N N N NH + N N ‐ NAD+ N N N S N S

Abbildung F.11: Umsetzung von MTT zu einem Formazan

Die prozentuale Cytotoxizität wurde nach folgender Formel berechnet:

⎛ AFr ⎞ Cytotoxizi [] ⎜1%100%tät −⋅= ⎟ Formel 1 ⎝ AK ⎠ wobei die Cytotoxizität für die Kontrolle als 0 % definiert wird (100 % Viabilität unterstellt) und AFr die Absorption der jeweiligen Fraktion bzw. behandelten Zellen und AK die Absorption der Kontrolle bedeutet.

200 Experimenteller Teil

MTT‐Lösung: 5 mg MTT/mL PBS 1x (steril), diese Lösung wird am Versuchstag frisch hergestellt, falls nötig, im Ultraschallbad gelöst und direkt vor der Verwendung mit dem jeweiligen Medium versetzt und auf 37 °C vorgewärmt. SDS/DMF‐Lösung (extraction buffer): SDS (Natriumdodecylsulfat) wurde in einer Konzentration von 20 % (m/V) in Millipore‐Wasser vollständig gelöst und danach zu gleichen Volumenteilen mit Dimethylformamid (DMF) versetzt. Die Stocklösungen für die Untersuchung der Fraktionen von Siparuna thecaphora wurden in einer Konzentration von 10 mg/mL in DMSO hergestellt.

5.6. Herstellung von RNA‐Extrakten

Zur Untersuchung der Expressionshemmung bestimmter Zielgene durch verschiedene Testsubstanzen/Zubereitungen wurden RNA‐Extrakte angefertigt. Da RNasen (Ribonucleasen) ubiquitäre Enzyme sind, muss bei der Herstellung dieser Extrakte und der Handhabung der RNA darauf geachtet werden, dass Handschuhe getragen und nur RNase‐ freie Materialien verwendet werden. RNasen sind sehr stabile Enzyme, die keine Kofaktoren benötigen und sehr schwierig zu inaktivieren sind. Kleinste Mengen reichen aus, um RNA abzubauen. Daher soll auch möglichst staubarm gearbeitet werden. Zum Pipettieren werden sogenannte Filter‐Tips (gestopfte Spitzen) verwendet. Gearbeitet wurde bei allen Schritten bei Raumtemperatur, also zwischen 20 und 25 °C.

5.6.1. RNA‐Extraktion mit dem RNeasy Mini‐Kit von Qiagen

Gesamt‐RNA‐Extrakte wurden mittels des RNeasy Mini‐Kits von Qiagen angefertigt. Die Lösungen wurden nach der Vorschrift des Herstellers vorbereitet und eingesetzt. Das Prinzip der Aufreinigung beruht auf der Lyse der Zellen, Bindung der RNA an eine Säulenmembran, Auswaschen von Verunreinigungen und anschließender Elution der RNA mit Wasser. Zusätzlich wird ein DNA‐Verdau mit dem RNase‐Free DNase Set durchgeführt. Die Zellen wurden nach Vorschrift behandelt (inkubiert/stimuliert) und am Ende der Inkubationszeit wurde das Medium abgesaugt, die Zellen mit jeweils 1 mL kaltem 1x PBS‐ Puffer gewaschen und 350 µL/well des ersten Puffers (RLT) sofort auf die Zellen gegeben. Dieser denaturierende RLT‐Puffer enthält GTC (Guanidinisothiocyanat), das RNasen Experimenteller Teil 201 inaktivieren und damit die zu isolierende RNA vor Abbau schützen soll. Die Zellen wurden abgeschabt und die Suspension in RNase‐freie 1,7 mL‐Reaktionsgefäße überführt. Diese Suspension wurde durch fünfmaliges Scheren durch 20 G‐Kanülen (1 mL‐Spritzen) homogenisiert. Anschließend wurden 350 µL Ethanol 70 % in jeden Ansatz gegeben und die Lösungen durch Pipettieren (5 Mal auf‐ und abpipettieren) gemischt. Die Zugabe von Ethanol stellt geeignete Bedingungen für die RNA‐Bindung an die Säulenmembran her. Die erhaltenen 700 µL wurden auf eine RNeasy Mini‐Spin Säule gegeben. Als Auffanggefäße wurden mitgelieferte 2 mL Collection‐Tubes verwendet, in welche die Säulchen gestellt wurden. Diese Säulchen enthalten eine Silicium‐Gel‐Membran und haben ein maximales Fassungsvolumen von 700 µL. Die Bindefähigkeit für RNA liegt bei ca. 100 µg (> 200 Basen), es wurden ca. 1 Million Zellen pro Ansatz verwendet.

Die Lösung wurde durch Zentrifugation bei 13000 rpm (> 8000 g) für 15 sec durch die Säulchen gepresst, dabei wurde die RNA gebunden. Das Filtrat wurde verworfen (Sondermüll). Nun wurden 350 µL des zweiten Puffers (RW1) auf die Säule gegeben und in gleicher Weise zentrifugiert. Dieses Filtrat wurde ebenfalls verworfen. Im nächsten Schritt wurde evtl. mitisolierte DNA auf der Säule einem Verdau durch eine DNase unterworfen. Je Ansatz wurden 10 µL DNase I stock und 70 µL des zugehörigen RDD Puffers sehr vorsichtig durchmischt und für 15 min auf die Säule gegeben. Dann wurde erneut mit 350 µL RW1‐Puffer gewaschen, zentrifugiert und das Filtrat verworfen. In einem weiteren Waschschritt wurde zweimal mit je 500 µL des dritten Puffers (RPE) gewaschen. Die Lösung wurde beim ersten Mal durch Zentrifugation für 15 sec, beim zweiten Mal für 2 Minuten entfernt. Der 2. Zentrifugationsschritt soll die Membran trocknen. Nachdem die Säulchen in ein neues, RNase‐freies Reaktionsgefäß gestellt wurden, wurde die RNA mit Wasser eluiert. Es wurden zweimal 30 µL RNase‐freies Wasser auf die Säule gegeben und nach jeder Aufgabe für 1 Minute bei 13000 rpm zentrifugiert. Wenn die RNA zu verdünnt vorliegt, kann das Elutionsvolumen auf 20 µL pro Schritt verringert werden.

Für die OD‐Messung zur Bestimmung der Konzentration wurden 4 µL abgenommen, die restliche RNA wurde bis zur Verwendung bei – 80 °C gelagert. RNA‐Proben für die 202 Experimenteller Teil

Reinheitskontrolle mit dem Agilent Bioanalyzer wurden bei Bedarf ebenfalls abpipettiert, um sie weiter zu verdünnen. Liegt die RNA zu verdünnt vor (1000 ng in mehr als 12 µL), wird sie durch teilweise Lösungsmittelentfernung in der Speedvac aufkonzentriert und die Konzentration über Messung der Absorption erneut bestimmt.

Verwendete Puffer: Zum ersten Puffer RLT werden 10 µL 2‐Mercaptoethanol (β‐Mercaptoethanol) pro mL Puffer gegeben (1 %). Diese Mischung wird direkt vor jedem Versuch für n+1 Proben hergestellt. Vor der Verwendung des Puffers muss geprüft werden, ob ein Niederschlag vorhanden ist, der ggf. durch Erwärmen wieder in Lösung gebracht wird. Absoluter Ethanol wird mit RNase‐freiem Wasser auf 70 % (V:V) verdünnt. Der Puffer RW1 wird direkt verwendet. Der Puffer RPE liegt als Konzentrat vor, 4 Volumenteile Ethanol abs. müssen vor dem ersten Gebrauch zugegeben werden. Das DNase Kit (RNase‐Free DNase Set) beinhaltet DNase I, die in RNase‐freiem Wasser rekonstituiert werden muss und dann in Aliquots bei – 20 °C eingefroren wird, außerdem den Puffer RDD. Alle Schritte, bei denen DNase verwendet wird, werden mechanisch sehr vorsichtig ausgeführt.

5.6.2. Bestimmung der Nukleinsäure‐Konzentration

Die Konzentrations‐ und Reinheitsbestimmung erfolgte über eine Messung der Absorption bei 260 und 280 nm mit Hilfe des GeneQuant II. Als Referenz wurde Tris‐HCl‐Puffer (10 mM, pH 7,5) verwendet. 4 µL RNA wurden mit 96 µL Tris‐HCl‐Puffer verdünnt und in einer Küvette vermessen. (Bei einem Absorptionswert von 1 bei 260 nm gilt für RNA in Wasser eine Konzentration von 40 µg/µL laut Herstellerangaben.) Die Konzentration für eine Lösung in Tris‐HCl bei 260 nm errechnet sich nach folgender Formel:

Konzentrat [ µL/ngion ]= Absorption ⋅44⋅Verdünnungsfaktor Formel 2

Für die cDNA‐Synthese wurde ein Volumen eingesetzt, das 1000 ng RNA entspricht.

Experimenteller Teil 203

Eine Aussage über die Reinheit der RNA‐Lösung bzw. eine evtl. vorliegende

Proteinkontamination ergab sich aus dem Quotienten A260 nm / A280 nm. Diese Messung sollte in pH‐gepufferter Lösung stattfinden und wurde ebenfalls in Tris‐HCl pH 7,5 durchgeführt. Bei einer reinen DNA‐ bzw. RNA‐Lösung gilt:

A260 nm / A280 nm = 2 Ein Wert über 1,7 wurde für die cDNA‐Synthese akzeptiert.

5.6.3. Reinheitskontrolle mit dem Agilent Bioanalyzer

Eine Qualitäts‐ und Reinheitskontrolle der isolierten RNA wurde mit Hilfe des RNA 6000 Pico Assays auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer durchgeführt. Die Lab‐on‐a‐Chip‐Technologie von Agilent Technologies basiert auf dem Prinzip der Mikrofluidik, der Steuerung winziger Flüssigkeitsmengen in miniaturisierten Systemen. Das Innere eines Lab‐on‐a‐Chip besteht aus Systemen winziger geschlossener Kanäle und wells, die in einen Glas‐ oder Kunststoff‐Mikrochip geätzt sind. Durch Druck strömen die Proben kontrolliert durch die vorgegebenen Kanäle. Das Verfahren basiert auf der Gelelektrophorese als Instrument der Größenseparation und trennt die Probenbestandteile, in diesem Fall die RNA, für eine nachfolgende Detektion. Der Bioanalyzer wird mit Hilfe der Software „2100 expert“ bedient und die Daten über dieses Programm ausgewertet. Neben einer Gehaltsbestimmung der Proben erfolgt das Erstellen eines Elektropherogramms, anhand dessen man erkennen kann, ob die RNA degradiert ist. Außerdem wird der Faktor RIN (RNA Integrity Number) berechnet, der mittlerweile als Standard für die Intaktheit von RNA weit verbreitet ist. In die RIN‐Berechnung fließen, anders als bei Agarose‐Gel Analysen, nicht nur Informationen über die ribosomale RNA, sondern auch über den Zustand der restlichen Gesamt‐RNA durch die Ablaufverfolgung der Elektrophorese ein. Die RIN liegt im Bereich von 2 bis 10, wobei 2 degradiert und 10 vollkommen intakt bedeutet (Schroeder et al. 2006).

Die Vorbereitung der Proben für den Agilent Bioanalyzer geschah mit Hilfe des RNA 6000 Pico LabChip® Kits. Es wurde nach Vorschrift des Herstellers vorgegangen. Vor und nach jeder Analyse wurden die Elektroden des Bioanalyzers mit 350 μL RNase freiem Wasser gereinigt. Man bereitete den Gel‐Dye Mix vor, indem man 65 μL Gel und 1 μL Dye Konzentrat 204 Experimenteller Teil

(Farbstoff) miteinander mischte, vortexte und zentrifugierte (14.000 rpm (13.000 g), 10 min). Nacheinander wurden nun je 9,0 µL Gel‐Dye Mix, 9,0 µL der Conditioning Solution und je 5 µL des Markers in die dafür vom Hersteller vorgesehenen Vertiefungen auf dem RNA Pico Chip pipettiert und mit einer extra dafür vorgesehenen Vorrichtung, der Chip Priming Station, in das Innere des Chips gepresst. Die extrahierte RNA (Kontrollen von 5 Versuchen mit bovinen Chondrocyten) wurde aufgrund der mittels OD‐Messung bestimmten Konzentration mit RNase‐freiem Wasser auf eine Konzentration von 5 ng/μL verdünnt. Auf den Chip pipettierte man 1 μL der zu testenden RNA und 1 μL der verdünnten RNA 6000 Ladder. Daraufhin wurde der Chip 1 min auf dem Vortex Mixer (IKA Works) bewegt. Der fertig pipettierte Chip wurde in den Bioanalyzer eingesetzt und der Lauf sofort gestartet.

Abbildung F.12: Beispiel für ein Elektropherogramm einer RNA‐Probe. Mit dem Pfeil ist der Marker gekennzeichnet, die Probe weist 2 deutliche Peaks auf.

Zur Auswertung wurden die Elektropherogramme und die RIN herangezogen. Das Elektropherogramm von eukaryotischer Gesamt‐RNA sollte einen Marker‐Peak und 2 ribosomale Peaks (18S, 28S) aufweisen. Ein Beispiel ist in Abbildung F.12 gezeigt.

Experimenteller Teil 205

5.7. Quantitative real‐time RT‐PCR (qRT‐PCR)

Mit dieser Methode, die auch Echtzeit‐RT‐PCR genannt wird, ist es möglich, den Level der Genexpression über die Quantifizierung spezifischer mRNA zu bestimmen. Im ersten Schritt wird dafür cDNA hergestellt, die dann amplifiziert werden kann.

5.7.1. cDNA‐Synthese

Für die Herstellung von cDNA aus den gewonnenen RNA‐Extrakten wurde das QuantiTect Reverse Transcription Kit von Qiagen verwendet und nach folgender Vorschrift vorgegangen. Die RNA‐Proben wurden auf Eis aufgetaut, die Kit‐Komponenten bei Raumtemperatur. Alle Lösungen wurden vorsichtig durchmischt, gegebenenfalls abzentrifugiert und auf Eis gestellt. Durch die Kühlung soll eine RNA‐Degradierung unterdrückt werden. Daher wird sie bei allen weiteren Schritten aufrechterhalten. Im ersten Schritt ist eine Elimination von genomischer DNA vorgesehen. Dazu wurde 1 µg RNA in maximal 12 µL Lösung mit 2 µL gDNA Wipeout‐buffer (7x) aus dem Kit versetzt. Lag die RNA als konzentriertere Lösung vor, wurde mit RNase‐freiem Wasser auf ein Endvolumen von 14 µL/Probe aufgefüllt. Das Kit ist für eine Gesamt‐RNA‐Menge von 10 pg bis 1 µg ausgelegt. Die Proben wurden im Thermocycler bei 42 °C für 2 min inkubiert und dann sofort wieder auf Eis gestellt. Im zweiten Schritt fand die eigentliche Reverse Transkription statt. Hierfür wurden pro Ansatz 1 µL Quantiscript Reverse Transcriptase und 5 µL Quantiscript RT‐Puffer mit RT Primer Mix (4:1) vorgemischt. Es wurden n+1 Ansätze vorbereitet. Zu den 14 µL Lösung aus dem ersten Schritt kamen nun 6 µL dieser Mischung hinzu. Der Ansatz wurde bei 42 °C für 15 min inkubiert, anschließend erfolgte eine Inaktivierung bei 95 °C für 3 Minuten. Die erhaltene cDNA wurde noch mit jeweils 80 µL RNase‐freiem Wasser verdünnt und bei – 20 °C gelagert oder gleich für die RT‐PCR weiterverwandt.

Zu den Kit‐Komponenten: Die Quantiscript Reverse Transcriptase von Qiagen ist eine Mischung von Omniscript®‐ und Sensiscript®‐Enzymen, das sind heterodimere Enzyme, die rekombinant in E. coli exprimiert werden. Das Enzym besitzt 2 Funktionen: Erstens ist es eine RNA‐abhängige DNA‐Polymerase, welche die Fähigkeit besitzt, mRNA in cDNA umzuschreiben. 206 Experimenteller Teil

Als zweites besitzt das Enzym die Fähigkeit, als RNase H (hybrid‐abhängige Exoribonuclease) zu wirken. Die RNA, die als Doppelstrang mit DNA vorliegt, wird abgebaut und es entsteht einzelsträngige DNA. Dadurch wird die PCR‐Empfindlichkeit erhöht. In der Enzymlösung ist außerdem noch ein RNase‐Inhibitor enthalten. Im QRT‐Puffer sind Magnesium und dNTPs enthalten. Der Primer‐Mix enthält eine zufällige Primer‐Auswahl (sogenannte Random‐Hexamere), die eine hohe Ausbeute garantieren soll.

5.7.2. LightCycler®‐Analyse

Die erhaltene cDNA wird direkt für die quantitative RT‐PCR eingesetzt. In der Analyse kann der Expressionslevel von 2 Genen parallel betrachtet werden (Duplex‐Messung). Bei dieser Methode wird ein fluoreszierender Farbstoff in eine Hybridisierungssonde (TaqMan®‐Sonde) mit spezifischer Sequenz eingebaut. Die Fluoreszenz steigt proportional mit der Produktmenge an. Diese Methode stellt eine Alternative zu interkalierenden Farbstoffen dar.

Dazu werden Primer für ein Referenzgen sowie für ein Zielgen zusammen mit der jeweiligen Fluoreszenzsonde mit den Proben inkubiert. Diese Sequenzen werden genspezifisch designt und mit Fluoreszenzfarbstoff gelabelt bei Sigma Genosys bestellt. Beim Zielgen ist die Sonde am 5’‐Ende mit FAM (6‐Carboxyfluorescein, Reporter‐Farbstoff) markiert, das 3’‐Ende trägt TAMRA (6‐Carboxy‐Tetramethyl‐Rhodamin) als Quencher. Als Referenzgen wird das für 18S rRNA codierende Gen verwendet, die Sonde ist in diesem Fall VIC‐TAMRA‐gelabelt. Durch den Quencher in räumlicher Nähe wird die Fluoreszenz des Reporter‐Farbstoffs absorbiert (FRET‐System). Während 50 Zyklen läuft eine Verlängerung der Primer bei gleichzeitiger Spaltung der Sonde ab. Diese Reaktionen werden durch ein Enzym katalysiert, die HotStar Taq DNA‐Polymerase. Dieses Enzym ist im verwendeten Quantitect Multiplex PCR NoROX Master Mix 2x von Qiagen enthalten. Es stellt eine modifizierte Form einer Taq DNA‐ Polymerase dar, die erstmals aus Thermus aquaticus isoliert wurde. Das Enzym ist bei Raumtemperatur inaktiv, dies verhindert die Bildung von unerwünschten Artefakten. Die Aktivierung findet durch Inkubation für 15 Minuten bei 95 °C zu Beginn der PCR statt. Der weitere Ablauf ist schematisch in Abbildung F.13 dargestellt. Experimenteller Teil 207

Im ersten Schritt erfolgt die Anlagerung der Primer und der Sonde. In der folgenden Phase werden die Primer verlängert und damit die Sonde nach und nach verdrängt. Die Sonde bindet an die Sequenz, kann aber nicht verlängert werden, da das 3’‐Ende durch ein Phosphat blockiert ist. Die verdrängte Sonde wird durch die zusätzliche 5’‐3’‐Exonuclease‐ Aktivität der Polymerase gespalten. Dadurch entsteht ein räumlicher Abstand zwischen Quencher und Reporterfarbstoff, dessen Fluoreszenzsignal dann detektiert werden kann. Dieses Signal wird in jedem Zyklus gemessen und kann zur Quantifizierung verwendet werden. Freie, nicht‐hybridisierte Sonde wird hingegen nicht hydrolysiert.

Abbildung F.13: Schematischer Ablauf der PCR und Entstehung des Fluoreszenz‐Signals

Die Quantifizierung der PCR basiert bei allen Systemen auf der Berechnung des

Fluoreszenzschwellenwertes, des sog. Threshold Cycle oder CT‐Wertes (auch Crossing Point

CP). Dabei wird der Fluoreszenzschwellenwert so eingestellt, dass er innerhalb der exponentiellen Phase der PCR liegt. Der CT‐Wert ist jener PCR‐Zyklus, bei dem die Reporterfluoreszenz die Hintergrundfluoreszenz signifikant übersteigt. Am Anfang der PCR‐ Reaktion wird nur diese Hintergrundfluoreszenz gemessen, da aufgrund der geringen Template‐Menge das Fluoreszenzsignal der Proben noch nicht detektierbar ist. Innerhalb der real‐time PCR gibt es verschiedene Quantifizierungsstrategien. Zum einen die absolute Quantifizierung, bei der anhand einer externen Kalibrierkurve die Expressionsrate 208 Experimenteller Teil des Zielgens quantifiziert wird. Zum anderen die relative Quantifizierung, bei der die Expression des Zielgens mit der eines Referenzgens (Housekeeping Gen) verglichen wird. Diese Referenz sollte immer gleich exprimiert und beispielsweise durch den verwendeten Stimulus nicht reguliert werden (Pfaffl 2004). Die relative Quantifizierung kann entweder über Verwendung einer Standardkurve

(Verdünnungsreihe) oder über die ΔΔCT‐Methode (Verzicht auf Standardreihe) erfolgen. Im vorliegenden Fall wurde die ΔΔCT‐Methode verwendet. Dabei wird zunächst der ΔCT‐Wert als Differenz der CT‐Werte des Zielgens und des Housekeeping‐Gens (interner Standard) berechnet, d.h. es findet eine Normalisierung auf den Standard statt. Als Housekeeping‐Gen wurde in dieser Arbeit die 18S rRNA verwendet.

=Δ − CCC )rRNAS18(T)obe(PrTT Formel 3

Da pro Analyse Doppelbestimmungen des zu untersuchenden Gens durchgeführt wurden, handelte es sich bei den CT‐Werten um Mittelwerte technischer Replikate. Zur Untersuchung der Wirkung eines Stimulus auf die Genexpression der einzelnen Gene wurden ΔΔCT‐Werte berechnet, die sich aus der Differenz der ΔCT‐Werte der mit dem Stimulus behandelten

Zellen minus der ΔCT‐Werte der Kontrolle (unbehandelte Zellen) ergaben:

Δ=ΔΔ CC − ΔC )Kontrolle(T)Stimulus(TT Formel 4

Abschließend wurde der fold increase (relativer Expressionsunterschied, auch ratio genannt) errechnet, um ein direktes Maß für die Steigerung oder Hemmung der Genexpression zu erhalten.

fold = 2increase ΔΔ− CT Formel 5

Der ΔΔCT‐Wert der Kontrolle wird gleich 0 und der fold increase gemäß Formel 5 gleich 1 gesetzt. Dies führt dazu, dass die Genexpression der behandelten Zellen als Vielfaches der Kontrolle darstellbar ist. Dieses Berechnungsschema setzt eine Verdopplung der DNA‐Menge in jedem Zyklus voraus. Man geht dann von einer optimalen real‐time PCR‐Effizienz in allen Proben aus. Als Kalibrator wird eine Probe definiert, die bei allen Versuchen vermessen wird, um die ablaufende Reaktion zu überprüfen. Es sollten bei allen Analysen ähnliche CT‐Werte erhalten werden.

Experimenteller Teil 209

Für die Analyse wurde nach folgender Vorschrift vorgegangen: Die Belegung der 96‐well‐Platte wurde geplant. Die Proben für jedes Zielgen, ein Kalibrator und ein Blindwert wurden als Duplikate vermessen. Primer, Sonden, cDNA‐Proben, der Mastermix (MM2x) und Wasser wurden aufgetaut, leicht gevortext und kurz abzentrifugiert. Es wurde auf Eis gearbeitet, die Sonden und der Mastermix wurden zusätzlich vor Licht geschützt. Unter Laminar‐Flow Bedingungen wurde der sogenannte Reaktionsmix (Mastermix) für jedes Zielgen angesetzt (Zusammensetzung siehe Tabelle F.15). In die speziellen Platten wurden 23 µL/well Mastermix pipettiert, jeweils 2 µL/well der entsprechenden cDNA (entsprechend 20 ng Gesamt‐RNA‐Input) zugegeben und die Platte mit LightCycler® 480 Sealing Foil versiegelt. Dazu wurde der Adhesive Seal Applicator verwendet. Die Platte wurde für 2 min bei 4 °C und 1200 rpm abzentrifugiert, um eine sichere Vermischung der cDNA mit dem Mastermix zu gewährleisten. Die Platte wurde unverzüglich in den LightCycler® gestellt oder für kurze Zeit kühl und dunkel gelagert. Die Bedienung des Geräts und die nachfolgende Berechnung der CT‐Werte erfolgten mit der LightCycler®‐Software. Als Temperaturprofil wurde eine vom Hersteller empfohlene Sequenz für eine 2‐stufige PCR erstellt. Begonnen wurde mit einer einmaligen Inkubation bei 95 °C für 15 min zur Aktivierung des Enzyms. In den folgenden 50 Zyklen wurde jeweils für 1 min bei 94 °C (DNA Denaturierung), dann 1 min bei 60 °C (Primer‐Annealing und Polymerisation) und 1 sec bei 72 °C (Fluoreszenz‐Messung) inkubiert. Alle Experimente wurden mindestens dreimal (mit 2 Wiederholungen) durchgeführt und die cDNA in Duplikaten vermessen. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind in Tabelle F.16 und Tabelle F.17 dargestellt. Zur besseren Auswertung wurde eine Farb‐Kompensation gemessen und diese in die Analysen einbezogen.

Kit‐Komponenten: HotStar Taq® DNA polymerase: EC 2.7.7.7

QuantiTect Multiplex PCR‐Puffer enthält 11 mM MgCl2, KCl, (NH4)2SO4, verschiedene Salze und Zusätze für eine spezifische Primer‐Bindung dNTP Mix dNTP‐Mischung (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP)

210 Experimenteller Teil

Tabelle F.15: Mastermix‐Bestandteile pro Reaktionsansatz (Endvolumen 23 µL, Ansatz für n+2 Proben) Komponente Volumen [µL] Endkonzentration in 25 µL DEPC‐Wasser 7,750 μL Quantitect Multiplex PCR Master Mix 2x 12,500 μL 18S rRNA primer fwd (10 μM) 0,125 μL 50 nM 18S rRNA primer rev (10μM) 0,125 μL 50 nM 18S rRNA Sonde (5 μM) 0,500 μL 100 nM Zielgen primer fwd (10 μM) 0,750 μL 300 nM Zielgen primer rev (10μM) 0,750 μL 300 nM Zielgen Sonde (5 μM) 0,500 μL 100 nM (fwd: forward bzw. sense; rev: reverse bzw. antisense) Alle Sequenzen wurden zu einer 100 µM Lösung rekonstituiert und auf die angegebene Konzentration mit RNase‐freiem Wasser verdünnt.

Tabelle F.16: Sequenzen der Primer für die bovinen Zellen

Gen Sequenz Farbstoffe Konzentration [µM] 18S rRNA Sonde TTGCGCGCCTGCTGCCT VIC, TAMRA 5 18S rRNA sense CGGCTACCACATCCAAGG 10 18S rRNA antisense CGGGTCGGGAGTGGGT 10 MMP1 Sonde ATGAGCGTCTCCTCCGATACCTGC FAM, TAMRA 5 MMP1 sense CTTCACCAAGGTCTCTGAGG 10 MMP1 antisense GGTCCACCATTCATCATCATC 10 MMP13 Sonde CCTCTGGTCTGTTGGCTCACGCTT FAM, TAMRA 5 MMP13 sense TTGGAACTAAAGAGCATGGTGAC 10 MMP13 antisense CAGTGTAGGTGTAGATGGGAAAC 10

Tabelle F.17: Sequenzen der Primer für die humanen Zellen

Gen Sequenz Farbstoffe Konzentration [µM] 18S rRNA s. oben MMP1 Sonde ACGGATACCCCAAGGACATCTACAGCTCC FAM, TAMRA 5 MMP1 sense CTGTTCAGGGACAGAATGTGCT 10 MMP1 antisense TCGATATGCTTCACAGTTCTAGGG 10 MMP13 Sonde TCCTCAGACAAATCATCTTCATCACCACCAC FAM, TAMRA 5 MMP13 sense TCCTCTTCTTGAGCTGGACTCATT 10 MMP13 antisense CGCTCTGCAAACTGGAGGTC 10

Die 18S rRNA wurde für humane und bovine Zellen eingesetzt. Die 18S rRNA kam von DSM, Basel, Design bei Sigma Genosys. Experimenteller Teil 211

5.8. Elastase‐Assay

5.8.1. Isolierung der Neutrophilen Granulocyten

Für die Versuche des Abschnitts C.2.3.1 wurde das Blut von freiwilligen, gesunden Spendern (m/w) des Instituts für Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Freiburg, verwendet. Pro Versuch wurden die Zellen von 2 Blutproben am Ende der Isolierung gemischt. Ca. 25 mL Blut (mit 100 µL Heparin‐Na 10.000 IE/mL, entsprechend 40 IE/mL Blut versetzt) wurden mit 3 mL einer Dextranlösung vorsichtig gemischt und ca. 40 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Erythrocyten aggregieren, sedimentieren und werden dadurch abgetrennt. Der farblose Überstand (ca. 10 – 15 mL) wurde sehr vorsichtig mit einer Pipette abgenommen, mit 1x PBS‐Puffer auf 40 mL verdünnt und anschließend mit Hilfe einer langen Metallkanüle mit 10 mL Ficoll‐Paque™ Plus unterschichtet. Bei der nachfolgenden Zentrifugation für 30 min, bei 20 °C und 500 g (1500 rpm) werden unvollständig abgetrennte Erythrocyten durch das Polymer verklumpt und sedimentieren. Die Granulocyten wandern ebenfalls durch die gesamte Schicht hindurch. Andere Zellen wie Lymphocyten und Blutplättchen verbleiben an der Grenzschicht zwischen verdünntem Serum und Ficoll‐Paque. Die restlichen Erythrocyten im Pellet wurden durch osmotische Hydrolyse mit Millipore‐ Wasser lysiert. Dazu wurde der Überstand abgesaugt, 5,5 mL reines, eiskaltes Wasser zum Pellet gegeben und nach genau 21 sec die Hämolyse durch Zugabe von 44 mL kaltem Hepes‐ Sucrose‐Puffer beendet. Als zelluläre Bestandteile sind nun nur noch Granulocyten vorhanden, die zum größten Teil aus Neutrophilen bestehen. Diese wurden durch Zentrifugation bei 500 g, 4 °C für 10 min als Pellet gewonnen und in 5,5 mL PBS mit Ca2+/Mg2+ resuspendiert und bei 37 °C im Wasserbad gehalten. Die Zellsuspension hat eine Konzentration von ca. 10 – 30 * 106 Zellen pro mL.

0,9 % NaCl: 0,9 g NaCl in 100 mL Wasser (Millipore) Dextranlösung: 10 % (m/m) Dextran T 500 in 0,9 % NaCl‐Lösung PBS 10x: siehe Abschnitt 5.1 2+ 2+ PBS mit Ca /Mg : 0,9 mM CaCl2 (66,25 mg/500 mL) und

0,49 mM MgCl2 (49,75 mg/500 mL) in 1x PBS 212 Experimenteller Teil

Hepes‐Sucrose‐Puffer: 10,954 g Sucrose, 250 µL Hepes 1 M (Endkonzentration 2,5 mM), pH‐Wert auf 7,4 einstellen, Millipore‐Wasser ad 100 mL, auf 4 °C kühlen

5.8.2. Bestimmung der Elastase‐Hemmung mit isolierter Elastase (direkte Hemmung)

Die untersuchten Substanzen sind in Tabelle F.18 beschrieben. Es wurden millimolare Stocklösungen in DMSO hergestellt. Der DMSO‐Gehalt in der Endlösung wurde auf 0,2 % limitiert. Damit diese Konzentration nicht überschritten wurde, wurde das Volumen der DMSO‐Stocklösung auf 1 µL in ca. 500 µL Ansatzgesamtvolumen begrenzt. Die passenden Stocklösungen für die gewünschten Testkonzentrationen sind in Tabelle F.19 aufgeführt.

Tabelle F.18: Bei der Durchführung der Versuche zur Elastasehemmung verwendete Testsubstanzen Substanz Vorkommen, Herkunft Quelle Epicatechin Byrsonima crassifolia (Geiss et al. 1995) Epicatechin‐(4α‐8)‐ Byrsonima crassifolia F. Geiß epicatechin Resveratrol DSM Genistein DSM Tyrosol DSM Hydroxytyrosol DSM Triacetoxystilben (TAS) DSM Agrimoniin Alchemilla xanthochlora (Geiger et al. 1990) (Rothmaler) Pedunculagin Alchemilla xanthochlora C. Geiger (Rothmaler) Epigallocatechingallat Camellia sinensis DSM (EGCG)

Die Substanzen aus früheren Dissertationen wurden per DC auf Reinheit überprüft.

Tabelle F.19: Volumen und Konzentration der Stocklösungen für die Elastase‐Testung gewünschte 0,1 0,5 1 5 10 20 25 50 75 100 125 150 Konzentration [µM] benötigtes 0,5 0,25 0,5 0,25 0,5 1,0 0,25 0,5 0,75 1,0 0,625 0,75 Volumen [µL]

Stocklösung [mM] 0,1 1 1 10 10 10 50 50 50 50 100 100 Experimenteller Teil 213

Bei der Untersuchung des direkten Einflusses der Testsubstanzen auf die Elastase‐Aktivität wurde nach folgender Vorschrift vorgegangen (Schorr et al. 2005): Die Zellsuspension mit den isolierten Neutrophilen in PBS mit Ca2+/Mg2+ (50 µL/Probe) wurde mit Cytochalasin B‐Lösung (2,5 µL/Probe, Endkonzentration 5 µg/mL) versetzt und die Mischung 5 min bei 37 °C im schüttelnden Wasserbad inkubiert. Cytochalasin B ist ein Inhibitor der Mikrofilamentaktivität und erleichtert die Exocytose. Für weitere 20 min bei 37 °C wurde PAF (50 µL/Probe, Endkonzentration 0,1 µM) dazu gegeben, um die Exocytose der Elastase‐haltigen Granula auszulösen. PAF (Plättchen‐ aktivierender Faktor, 1‐O‐Hexadecyl‐2‐O‐acetyl‐sn‐glycero‐3‐phosphocholin) ist ein Phospholipid, das von Immunzellen gebildet wird. Nach dieser Zeit wurde durch 10 minütige Zentrifugation bei 500 g (1500 rpm) und 20 °C der Elastase‐haltige Überstand von den Zellen abgetrennt. Der Überstand wurde weiter für die Versuche verwendet, das Pellet wurde verworfen. 102,5 µL Überstand wurden zu jeder Probe in 1,7 mL Reaktionsgefäßen gegeben. Darin enthalten waren bereits 1 µL Testlösung oder DMSO und 375 µL Substratlösung (Endkonzentration 0,8 mM). Die Mischung wurde für 30 min bei 37 °C im schüttelnden Wasserbad inkubiert. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 125 µL Zitronensäurelösung beendet. Nach einem Zentrifugationsschritt bei 2000 rpm und 20 °C für 5 min wurde die Absorption von 100 µL der gelb gefärbten Lösung bei 405 nm in 96‐well‐ Platten vermessen.

Für die Negativkontrolle wurde noch vor Zugabe des Substrats die Zitronensäurelösung in die Ansätze pipettiert. Als Hintergrundwert dienten leere wells, diese Absorption wurde von der gemessenen Absorption jeder Probe abgezogen. Die Absorption eines Ansatzes ohne Inhibitor (Testsubstanz‐frei) wurde als 100 % gesetzt.

Alle Ansätze wurden als Dreifachbestimmung durchgeführt und für die Berechnung der IC50‐ Werte mehrere Bestimmungen gemittelt.

Die Berechnung erfolgte nach der angegebenen Formel:

⎛ A obePr ⎞ Hemmung [] ⎜1%100% −⋅= ⎟ Formel 6 ⎝ AK ⎠

214 Experimenteller Teil

Die eingesetzten Lösungen waren wie folgt zusammengesetzt: Albuminpuffer: 1 mg/mL BSA in PBS mit Ca2+/Mg2+ SAAVNA N‐Succinyl‐L‐alanyl‐L‐alanyl‐L‐valin‐p‐nitroanilid, die Tripeptidstruktur dient als Substrat, von dem p‐Nitroanilin (gelb gefärbt) durch Elastase abgespalten wird und photometrisch vermessen werden kann. SAAVNA‐Stocklösung: 300 mM in DMSO (50 mg SAAVNA in 347 µL DMSO), wird in Aliquots eingefroren SAAVNA‐Arbeitslösung: 45 mL Albuminpuffer + 154 µL SAAVNA‐Stocklösung (1,02 mM) Cytochalasin B‐Lösung: 0,965 mg in 200 µL DMSO und 800 µL Wasser (0,965 mg/mL in 20 % DMSO) PAF‐Stocklösung: 10‐2 M in EtOH (5,24 mg/1 mL Ethanol), aliquotieren PAF‐Arbeitslösung 1: 25 µL Stocklösung + 2475 µL Albuminpuffer (1:100) PAF‐Arbeitslösung 2: 50 µL PAF Arbeitslösung 1 + 4950 µL Albuminpuffer (1:100), Konzentration dieser Lösung 1 µM (10‐6 M) Zitronensäure‐Lösung: 2 % (m/V) in Millipore‐Wasser

5.8.3. Hemmung der Elastase‐Freisetzung

Neutrophile Granulocyten setzen nach Stimulation durch verschiedene Entzündungsmediatoren Enzyme und antimikrobielle Substanzen aus ihren Granula frei. Der Grad der Degranulierung sollte untersucht und über die Elastase‐Aktivität nach (Schorr et al. 2005) quantifiziert werden. Die isolierten Granulocyten liegen nach der oben beschriebenen Isolierung (5.8.1) als Zellsuspension vor und wurden 30 min bei 37 °C belassen. In Eppendorff‐Reaktionsgefäßen wurden pro Ansatz 1 µL Untersuchungslösung oder DMSO, 375 µL Substratlösung (SAAVNA) und 2,5 µL Cytochalasin B‐Lösung vorgemischt. 50 µL Zellsuspension wurden dazupipettiert und der Ansatz für 5 min bei 37 °C im schüttelnden Wasserbad vorinkubiert. Durch Zugabe von 50 µL PAF‐Lösung 2 als Stimulus wurde die Freisetzungsreaktion initiiert. Alle Testsubstanzen wurden parallel getestet, um einen direkten Vergleich zu haben. Die Enzymreaktion wurde nach 20 min bei 37 °C durch Zugabe von 125 µL Zitronensäurelösung beendet. Experimenteller Teil 215

Die Proben wurden bei 500 g (2000 rpm), 20 °C für 5 min zentrifugiert und die Absorption von 100 µL Probe auf einer 96‐well‐Platte bei 405 nm im Microplate‐Reader gemessen. Alle Tests wurden als Dreifachbestimmung angesetzt. Für die Bestimmung der Grundstimulierung (Negativkontrolle) wurde die Absorption der Ansätze ohne Induktor (Albumin‐Lösung statt PAF) gemessen. Die Hemmung wurde als prozentualer Wert angegeben, die Absorption der Lösung ohne Inhibitor (Testsubstanz) wurde gleich 100 % Aktivität (0 % Hemmung) gesetzt, die Berechnung erfolgte nach Formel 6.

Untersuchungslösung: Testsubstanz als 10 mM Lösung in DMSO, auf die Endkonzentration mit Tris‐HCl‐Puffer verdünnt, DMSO auf 0,2 % begrenzt. Alle weiteren Lösungen waren gleich zusammengesetzt wie bei der direkten Hemmung (siehe 5.8.2).

5.8.4. Hemmung des isolierten Enzyms

Die Durchführung der Untersuchung auf Hemmung der isolierten Elastase erfolgte nach den Methoden von Stein bzw. Löser (Loeser et al. 2000; Stein 1985), die in unserem Labor modifiziert und optimiert wurden. Hierbei wurde der Einfluss der Salz‐ und Enzymkonzentration auf die Aktivität bzw. die Hemmung der Elastase getestet (siehe Abschnitt C.2.3.3, Ergebnisteil). Die Testsubstanzen wurden als millimolare Stocklösungen in DMSO hergestellt und mit Tris‐ HCl‐Puffer 50 µM, pH 7,5, auf 100 µL verdünnt (Testlösung). Die DMSO‐Konzentration im Reaktionsansatz wurde auf 1 % begrenzt. 100 µL Testlösung wurden mit 250 µL Substratlösung (Endkonzentration 291,7 µM) gemischt und auf 37 °C gebracht. Nach der Zugabe von 250 µL Enzymlösung (Endkonzentration 41,7 mU/mL) wurde die Mischung 1 h bei 37 °C im schüttelnden Wasserbad inkubiert. Durch Zugabe von 500 µL Sojabohnen‐Trypsin‐Inhibitor‐Lösung und sofortiges Kühlen im Eisbad wurde die Reaktion gestoppt. Die Lösung wurde gemischt, abzentrifugiert und die Absorption bei 405 nm in Küvetten gegen Tris‐HCl‐Puffer gemessen. 216 Experimenteller Teil

Eine Lösung ohne Testsubstanz (Inhibitor) wurde als Positivkontrolle verwendet. In diesem Fall besteht die Testlösung aus reinem Tris‐HCl‐Puffer.

Die Hemmung wurde auf die Positivkontrolle (Wert der Kontrolle AK wurde als 100 % Aktivität, d.h. 0 % Hemmung definiert) bezogen und nach Formel 6 in Prozent angegeben.

Für die Berechnung eines Hemmwertes wurden Mehrfachbestimmungen durchgeführt, mindestens aber Ergebnisse von 3 getrennten Versuchen gemittelt. Die IC50‐Werte wurden aus Dosis‐Wirkungs‐Kurven berechnet und sind mit 95 %‐Vertrauensintervall angegeben (GraphPadPrism‐Software).

Testsubstanzen: Bornylcaffeat (aus Verbesina turbacensis Kunth, V.t.3.4.2, DC‐ Überprüfung der Reinheit) (Lobitz et al. 1998) Bornyl‐(3,4,5‐trihydroxy)‐cinnamat (Synthese Dr. K. Dormann) (Steinbrecher et al. 2008) Agrimoniin (Geiger et al. 1990) α1‐Antitrypsin (Referenzsubstanz, Sigma) Tris‐HCl‐Puffer: 50 µM, pH‐Einstellung mit HCl auf pH 7,5 Enzymlösung: Das gekaufte Enzym (EC 3.4.21.37, Sigma) wird unter Berücksichtigung der Deklaration (> 50 U/mL) in Tris‐HCl 50 µM, pH 7,5 gelöst. Die Konzentration der Stocklösung beträgt 0,1 U/mL, 250 µL entsprechen 25 mU/Ansatz Substratlösung: 700 µM N‐Methoxysuccinyl‐L‐Ala‐L‐Ala‐L‐Pro‐L‐Val‐pNA in 50 µM Tris‐ HCl‐Puffer, pH 7,5 (SAAPVNA) gemessen wird die Absorption des freien p‐Nitroanilins Inhibitorlösung: Trypsin‐Inhibitor aus Sojabohnen, Stocklösung 0,2 mg/mL in Tris‐HCl, 50 µM, pH 7,5

Experimenteller Teil 217

5.9. Luciferase‐Reportergen‐Assay

Eine Spezialform der Genexpressionsstudien stellt der Reportergen‐Assay dar. Mit Hilfe dieser Assays lassen sich z.B. Fragestellungen bezüglich der NF‐κB‐abhängigen Genexpression beantworten (siehe Abbildung F.14). Man kann mit ihnen die spezifische Aktivität von Promotoren und Enhancern, die z.B. im Falle von NF‐κB‐abhängigen Genexpressionstudien κB‐bindende Elemente enthalten müssen, im Hinblick auf ihre Regulation durch Transkriptionsfaktoren analysieren. Reportergene kodieren für Proteine, die leicht nachweisbar und quantifizierbar sind und sich gut von endogenen Proteinen unterscheiden. Am häufigsten verwendet man Reporterenzyme bei Promotorstudien, d.h. man kloniert den zu untersuchenden Promotor vor ein Protein, das sich leicht nachweisen lässt und nach Möglichkeit geringen oder gar keinen schädlichen Einfluss auf die Zelle hat, in der man das Konstrukt später exprimieren möchte. Die erhaltene Menge an Protein bzw. Proteinaktivität zeigt somit an, wie aktiv der Promotor ist. Häufig verwendete Reportergene sind das Luciferase‐Gen, das Chloramphenicol‐Acyltransferase‐Gen (CAT) und das β‐Galactosidase‐Gen.

Signal

Promotor Transkription Translation

Reportergen mRNA Reporterprotein

TNF-α

Abbildung F.14: Funktionsweise der Reportergen‐Assay‐Systeme. TNF‐α induziert die Expression des Reportergens. Nach der Transkription und Translation kann das Reporterprotein durch seine Aktivität leicht detektiert werden.

218 Experimenteller Teil

5.9.1. Luciferase‐Reportergen‐Assay

Luciferase, das Enzym des Glühwürmchens Photinus pyralis, wird durch das Gen luc kodiert. Die sauerstoffabhängige Biolumineszenzreaktion beruht auf dem Energietransfer von ATP zum Substrat Luciferin unter Bildung von Oxyluciferin, AMP, CO2 und Licht der Wellenlänge 560 nm. Die Quantenausbeute von 0,88 ist die höchste unter den bekannten Biolumineszenzreaktionen. Der quantitative Nachweis der Aktivität erfolgt über die Messung von Lichtemissionsreaktionen in RLUs („relative light units“) in einem Luminometer. Nach der automatischen Injektion des Substrats durch das Luminometer startet die lichtemittierende Reaktion in < 1 sec und ist bei einer Zugabe des Substrats im Überschuss über einen bestimmten Zeitraum proportional zur Luciferaseaktivität der Probe. Der Luciferase‐Assay ist extrem sensitiv (Messbereich zwischen 10 fg – 10 ng), schnell und kommt im Vergleich zum CAT‐Test ohne Radioaktivität aus. Die Kinetik der Reaktion kann durch Zugabe von Coenzym A, Pyrophosphat oder Nukleotide verlangsamt werden (Ford et al. 1995). Coenzym A scheint die Lichtproduktion zu erhöhen, indem es die Dissoziation von oxidiertem Luciferin begünstigt. Dadurch kann die Transkription des Reportergens indirekt bestimmt werden. Alle Messungen der Luciferase‐Aktivität erfolgten mit Hilfe des Luciferase Reporter Gene Assay Systems der Fa. Roche Diagnostics.

Bei der Testung in den stabil transfizierten NLZ9‐Zellen wurden 1,25 * 105 Zellen/well (24‐well‐Platte) in 1 mL Medium ohne Zeocin‐Zusatz ausplattiert. Es erfolgte eine Dreifach‐ Bestimmung, d.h. immer 3 wells wurden gleich behandelt. 2 Tage danach wurden die Zellen 1 h mit der entsprechenden Testsubstanz (maximal 10 µL DMSO/mL Medium) inkubiert und anschließend 3 h mit 800 U (2 ng/mL) TNF‐α bei 37 °C und 5 % CO2 stimuliert. Die Zellen wurden vom Boden abgespült, in Reaktionsgefäße überführt, 5 min bei 3000 rpm und 4 °C abzentrifugiert und das Pellet mit 1 mL eiskaltem PBS gewaschen. Das Pellet wurde schließlich in 125 µL Luciferase Reporter Gene Assay‐Lysepuffer resuspendiert und 15 min bei RT inkubiert. Danach wird für 3 min bei 4 ° C und 13000 rpm abzentrifugiert. Die Luciferase‐Aktivität wurde wiederum in einer weißen 96‐well‐Lumitrac‐Platte im Luminometer vermessen. Dabei wurden 50 µL Reaktionsansatz (Überstand) mit 100 µL Substrat (automatische Injektion) versetzt und nach einer Verzögerung von 0,5 sec wurde für 3 sec die Lichtemission [Lucif RLU] gemessen. Parallel erfolgte mit 5 µL Proteinextrakt eine Experimenteller Teil 219

Bestimmung der Proteinkonzentration, gegen die die Luciferase‐Aktivität normalisiert wurde. Zellen, die nur mit Stimulus behandelt wurden, dienten als Positivkontrolle. Deren Luciferase‐Aktivität wurde nach Normalisierung gleich 100 % gesetzt. Die Normalisierung gegen die Proteinkonzentration [µg/µL] erfolgte nach folgender Formel:

⋅100RLULucif WertNorm = Formel 7 []⋅CµLVol oteinPr

Die Aktivität einer Probe berechnet sich dann

⎛ Wert ⎞ ⋅= ⎜ Norm ⎟ Formel 8 [] %100%Aktivität ⎜ ⎟ ⎝ Wert Kontrolle_Norm ⎠

Die Hemmung ist schließlich

Hemmung []= %100% − [%Aktivität ] Formel 9

5.9.2. Hemmung reiner Luciferase

Um einen direkten Einfluss auf die Luciferase zu testen, der eine NF‐κB‐Hemmung vortäuschen würde, wurde das isolierte Enzym mit den zu testenden Substanzen inkubiert und ebenfalls vermessen. Rekombinante Luciferase aus Photinus pylaris (Promega) wurde dazu in Luciferase Reporter Gen Assay‐Lysepuffer (mit 1 mg/mL BSA‐Zusatz) suspendiert, wobei eine Endkonzentration von 1 µg Luciferase/15 µL Puffer hergestellt wurde. Die Luciferase‐Lösung wurde dann mit den entsprechenden Substanzen für 1 h bei RT inkubiert und anschließend in einer weißen 96‐well‐Lumitrac‐Platte im Luminometer vermessen. Dabei wurden 15 µL Reaktionsansatz mit 50 µL Substrat (automatische Injektion) versetzt und nach einer Verzögerung von 0,5 sec für 3 sec die Lichtemission gemessen.

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Anhang 239

H. Anhang

Abkürzungsverzeichnis

AP‐1 Activator Protein‐1 ATP Adenosintriphosphat ATCC American Type Culture Collection BSA bovines Serumalbumin cDNA copyDNA COPD chronisch obstruktive Lungenerkrankung (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) COSY Correlated Spectroscopy COX‐1/2 Cyclooxygenase 1/2 δ chemische Verschiebung [ppm] d Dublett; Schichtdicke Da Dalton DC Dünnschichtchromatographie DMEM Dulbecco`s Modified Eagle`s (minimal essential) Medium, benannt wurde es nach Renato Dulbecco und Harry Eagle DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxy ribonucleic acid) DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig DTT Dithiothreitol ECM extrazelluläre Matrix EGCG Epigallocatechin‐3‐gallat EI, ESI Electron Impact (Elektronenstoß‐Ionisation), Electrospray Ionization EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay FBS/FCS fetal bovine serum / fetal calf serum FM Fließmittel fMLP formyliertes bakterielles Tripeptid (formyl‐Methionyl‐Leucyl‐phenylalanin) g Erdbeschleunigung; Gramm GC‐MS Kopplung von Gaschromatographie und Massenspektrometrie h Stunde HAM’s F‐12 Medium, von Ham entwickelt, F‐12 eine Modifizierung des F‐10 Mediums und reich an Aminosäuren, Vitaminen und Spurenelementen. Außerdem ist der Gehalt an Zinksulfat erhöht, und es wurden Putrescin und Linolsäure hinzugefügt (Ham 1965). HMBC heteronuclear multiple quantum correlation HNE Humane Neutrophile Elastase HSQC heteronuclear single quantum correlation Hz Hertz

IC50‐Wert Wert, der die halbmaximale Hemmkonzentration angibt IκB Inhibitorisches kappaB IKK IκB‐Kinase Komplex IL Interleukin iNOS induzierbare NO‐Synthase IU International Units J Kopplungskonstante 240 Anhang

L Liter m Meter; Masse; milli µM, mM micromolar, millimolar µg Microgramm min Minute MMP Matrixmetalloproteinase mRNA messenger Ribonukleinsäure MTT 3‐[4,5‐Dimethylthiazol‐2‐yl]‐2,5‐Diphenyl Tetrazolium Bromid, Einsatz im Assay zur Bestimmung der Cytotoxizität n nano NF‐AT Nuclear Factor of activated T‐cells NF‐κB Nuclear Factor kappaB NMR Nuclear Magnetic Resonance o ortho p para p.a. pro analysi PAF Plättchen aktivierender Faktor PBS Phosphat buffered saline, Pufferzusammensetzung s. Exp. Teil

PLA2 Phospholipase 2 PMA Phorbol‐1‐myristat‐13‐acetat qRT‐PCR quantitative real‐time RT‐PCR (qRT‐RT‐PCR)

Rf Retentionsfaktor RG Reagenzglas RNA Ribonukleinsäure RP Reversed Phase, Umkehrphase rRNA ribosomale RNA rpm rounds per minute, Umdrehungszahl RPMI Medium, Mitte der 1960er Jahre am Roswell Park Memorial Institute von G. E. Moore entwickelt. Enthält ein Hydrogencarbonat‐Puffersystem, außerdem Glucose, Salze, Aminosäuren und Vitamine und zusätzlich noch Phenolrot als pH‐ Indikator. RT Raumtemperatur; Reverse Transkription RT‐PCR Reversed Phase‐Polymerase Kettenreaktion (chain reaction) SC Säulenchromatographie SL(s) Sesquiterpenlacton(e) SOD Superoxiddismutase TIMP tissue inhibitor of metalloproteinases TNF‐α Tumor Necrosis Factor‐α UV Ultraviolett V Volumen (V:V bedeutet Mischung von Volumenteilen) x fach (1x einfach) Konzentrationsangabe bei Puffern etc.

Weitere Abkürzungen von Chemikalien sind im Exp. Teil zu finden. Anhang 241

Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde auf Anregung und unter Leitung von Frau Prof. Dr. I. Merfort am Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie (Institut für Pharmazeutische Wissenschaften) angefertigt. Mein besonderer Dank gilt meiner Doktormutter für die Möglichkeit, diese Arbeit unter ihrer Betreuung anzufertigen. Ich danke ihr für ihre wertvollen Ratschläge, ihre stete Bereitschaft zu wissenschaftlichen Diskussionen sowie ihre Förderung und Unterstützung in allen Bereichen meiner Arbeit.

Herrn Prof. Dr. A. Bechthold (Institut für Pharmazeutische Wissenschaften, Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie) danke ich herzlich für die Übernahme des Korreferates. Bei Herrn Prof. Dr. R. Schubert (Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie) bedanke ich mich für die Übernahme des Amtes als Drittprüfer.

Für die Blutspende zu den Elastase‐Versuchen sei allen Freiwilligen aus der Pharmazeutischen Biologie und Pharmazeutischen Technologie gedankt. Birgit Erhard und Dr. Marcel Geyer danke ich fürs Blutabnehmen. Herrn Dr. Thomas Steinbrecher und Herrn PD Dr. A. Labahn (Institut für Physikalische Chemie) danke ich für die gute Kooperation bei den Docking‐Berechnungen der Elastase‐ Hemmstoffe. Herrn Dr. Zwingmann (Universitätsklinikum Freiburg) danke ich für die Isolierung der bovinen Chondrocyten. Der Firma Bioforce (Roggwil, Schweiz) danke ich für die finanzielle Unterstützung der Arbeiten mit AP‐1 und Arnika durch Sachmittel. Ich danke Herrn Dr. J. Wörth und Herrn C. Warth (Institut für Organische Chemie und Biochemie) für die Durchführung der MS‐Spektren mit Direkteinlass. Herrn V. Brecht (Lehrstuhl für Pharmazeutische Chemie) danke ich für die Messung der NMR‐Spektren, die Bereitstellung alter Daten sowie für die guten Tipps zur Auswertbarkeit.

Dominik Altevogt (AG Prof. Bannwarth, Institut für Organische Chemie und Biochemie) danke ich für die gute Zusammenarbeit zu jeder Zeit bei der Durchführung der FRET‐ Messungen. 242 Anhang

Mein besonderer Dank gilt allen jetzigen und ehemaligen Kolleginnen und Kollegen des Lehrstuhls für Pharmazeutische Biologie, die mich bei der Entstehung dieser Arbeit unterstützt haben. Vielen Dank an die AG Merfort: Maja Lindenmeyer, Stefan Müller, Bettina Siedle, Karin Schorr, Barbara Schuler, Olha Kos, Claudia Kern, Cordula Markmann, Simona Lang, Suzana Schnitzar, Beate Ritzenthaler, Christoph Jäger, Christian Lass, Titus Sparna, Steffen Wagner, Agnès Millet, Katrin Naumann, Kathrin Schmich, Cleber Schmidt, Marcio Fronza sowie Torsten Lingott für die angenehme Arbeitsatmosphäre und die schöne gemeinsame Zeit. Dazu auch allen früheren und jetzigen Mitarbeitern und ‐innen der AG Bechthold ein Dankeschön. Bei allen Kolleginnen und Kollegen möchte ich mich für die gute Zusammenarbeit während der Praktika (und dem Klausurkorrigieren) bedanken. Ein herzliches Dankeschön geht an Frau Dr. Gabriele Weitnauer für das Erledigen vieler organisatorischer Dinge. Außerdem danke ich allen Gästen unserer Arbeitsgruppe: Raúl Arce Córdoba, José Miguel Escandell Planells, Franklin Binns Quirós, Renato Murillo, Catarina Ekenäs, Eun‐Myoung Shin und Ivan Pavlovic für das bunte Leben in unserem Labor. Ein besonderer Dank geht dabei an Herrn Prof. Dr. Renato Murillo (Escuela de Quimica, Ciprona, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica) für die unerlässliche Hilfe bei der Diskussion der NMR‐Spektren.

Bei Karin Schorr möchte ich mich für das Einlernen in die Elastase‐Versuche bedanken, die ich jetzt ja wieder einem Brasilianer (Marcio) weitergeben durfte. Bei allen, die bei der Extraktaufarbeitung mitgewirkt haben und dabei die große Zahl an Fraktionen wieder überschaubar gemacht haben, möchte ich mich bedanken: Anna Dähnhardt, Claudia Haas, Sandra Ebeling, Ivan Pavlovic, Martin Helmstädter. Steffen Wagner möchte ich für viele gemeinsame Praktika, seine kreativen Vorschläge und die gute Zusammenarbeit danken. An Barbara Schuler geht ein großes Dankeschön für das Einlernen in die Zellkultur und EMSA‐Technik, für ihre großzügige Hilfe bei den Extrakten, allen anderen Labortätigkeiten und darüber hinaus. Anhang 243

Agnès Millet und Kathrin Schmich danke ich für die Durchsicht von Teilen des Manuskriptes und für die gemeinsamen Mittagspausen in Zeiten der „Mensa‐Depression“. Daniela Bertarelli danke ich für die gemeinsame Zeit in unserem Labor mit den durchlittenen EMSAs und für die wunderbare Freundschaft, die daraus entstand.

Schließlich möchte ich all meinen Freunden für ihre Unterstützung in allen Lebenslagen danken.

Vor allem möchte ich meiner ganzen Familie sehr herzlich danken, die diese Arbeit erst ermöglicht hat. Sie war mir zu jedem Zeitpunkt eine große Stütze, hat immer an mich geglaubt und mich mit Tipps versorgt. Bedanken möchte ich mich auch bei meiner „Schwiegerfamilie“ und meiner Schwägerin mit Familie für ihre aufbauende Unterstützung.

Mein größtes Dankeschön geht an Martin für sein Verständnis und Vertrauen, seine unermüdliche Energie und dafür, mich durch alle Hochs und Tiefs zu begleiten. 244 Anhang

Lebenslauf

NAME Andrea Hrenn

GEBURTSDATUM 29. Dezember 1978 GEBURTSORT Giengen an der Brenz STAATSANGEHÖRIGKEIT deutsch FAMILIENSTAND ledig

SCHULBILDUNG 1985 – 1989 Grundschule Giengen

1989 – 1998 Margarete‐Steiff‐Gymnasium Giengen

18.06.1998 Abitur

BERUFSAUSBILDUNG 10/1998 – 03/2003 Studium der Pharmazie an der Albert‐Ludwigs‐Universität Freiburg

August 2000 Ablegen des ersten Staatsexamens März 2003 Ablegen des zweiten Staatsexamens

05/2003 – 04/2004 Praktisches Jahr Apotheke der Kliniken des Landkreises Heidenheim Schönberg‐Apotheke Freiburg

Mai 2004 Ablegen des dritten Staatsexamens

01.06.2004 Approbation als Apothekerin

seit 07/2004 Promotion am Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie der Universität Freiburg (AK Prof. Dr. Irmgard Merfort)