Fabienne Le Cann

ANNÉE 2017

THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1 sous le sceau de l’Université Bretagne Loire

En Cotutelle Internationale avec l’Université de Gand, Belgique

pour le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1 Mention : Biologie

Ecole doctorale Vie Agro Santé

présentée par Fabienne Le Cann

Préparée à l’unité de recherche UMR Inserm U1085 IRSET Institut de Recherche en Santé Environnement et Travail UFR Sciences de la Vie et de l’Environnement

Thèse soutenue à Rennes Caractérisation de le 2 juin 2017 nouveaux inhibiteurs devant le jury composé de : Mojgan DJAVAHERI-MERGNY de la kinase RIPK1 et CR INSERM, Université de Bordeaux / rapporteur Alicia TORRIGLIA de la nécroptose DR INSERM, Université de Paris Descartes, UPMC / rapporteur Sandy ADJEMIAN-CATANI Junior Scientist, Université de Gand / rapporteur Sandrine RUCHAUD CR CNRS, Sorbonne Universités, UPMC Paris VI / examinateur Tom VANDEN BERGHE Senior Scientist, Université de Gand / examinateur Georges BAFFET DR INSERM, Université de Rennes 1 / examinateur, Président de jury Peter VANDENABEELE Pr, Dr, Université de Gand / co-directeur de thèse Marie-Thérèse DIMANCHE-BOITREL DR INSERM, Université de Rennes 1 / co-directrice de thèse ANNÉE 2017

Fabienne Le Cann

Thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of

DOCTOR IN BIOLOGY from Rennes 1 University & DOCTOR OF SCIENCES: Biochemistry and Biotechnology from Ghent University

Academic year 2016-2017

Rennes 1 University – Faculty of Sciences in Health and Environment under seal of University Bretagne Loire

Ghent University – Faculty of Sciences

Prepared at the research unit of UMR Inserm U1085 IRSET Institute for Research in Health, Environment and Work UFR Sciences in Health and Environment, Rennes, France and at the VIB research unit for Molecular Signaling and Cell Death, Department of Biomedical Molecular Biology VIB-UGent Center for Inflammation Research, Ghent, Belgium

Joint PhD fellowship presented in Rennes Characterization of new on the 2nd june 2017 necroptosis inhibitors Examination Board : targeting RIPK1 Mojgan DJAVAHERI-MERGNY CR INSERM, University of Bordeaux / thesis referee Alicia TORRIGLIA DR INSERM, University of Paris Descartes, UPMC / thesis referee Sandy ADJEMIAN-CATANI Junior Scientist, University of Ghent / thesis referee Sandrine RUCHAUD CR CNRS, Sorbonne Universities, UPMC Paris VI / examiner Tom VANDEN BERGHE Senior Scientist, University of Ghent / examiner Georges BAFFET DR INSERM, University of Rennes 1 / examiner, jury president Peter VANDENABEELE Pr, Dr, University of Ghent / co-promotor Marie-Thérèse DIMANCHE-BOITREL DR INSERM, University of Rennes 1 / co-promotor

www.irset.org

INSTITUT DE RECHERCHE SANTE, ENVIRONNEMENT & TRAVAIL Inserm Unité 1085 ó Université de Rennes 1 ó Campus de Villejean ó 35043 RENNES Cedex ó France

Marie-Thérèse DIMANCHE-BOITREL, Senior scientist, DR INSERM Tél : +33 (0)2 23 23 48 99 Secrétariat : +33 (0)2 23 23 47 21 Fax : +33 (0)2 23 23 47 94 Email : [email protected]

TO WHOM IT MAY CONCERN

Subject: Confidentiality of Fabienne Le Cann’s manuscript thesis

Fabienne Le Cann defended her joint thesis between the University of Rennes1 and the

University of Ghent on the June 02th 2017 at the Faculty of Pharmacy in Rennes. The

conditions of this oral defense were confidential. The thesis title was “Characterization of

new inhibitors of RIPK1 and necroptosis”. The results of this thesis work having led to the

filing of three European patents, the thesis manuscript must be kept confidential for 2 years

after the date of this thesis defense.

I thank you for respecting these privacy rules in the name of intellectual property.

Kind regards

Dr Marie-Thérèse Dimanche-Boitrel (co-promotor)

Rennes, June 16, 2016

Je dédie cette thèse à mon papa parti trop tôt, ma maman et ma sœur,

À mes très chers amis,

Et à mes deux amours.

Vous me comblez tous de bonheur, merci infiniment.

Abréviations

AIF Apoptosis Inducing Factor AIM2 Absent in melanoma 2, interferon-inducible protein ALAT Alanine Amino Transférase ANT Adénine nucléotide translocase AP-1 Activator Protein 1 Apaf1 Apoptotic Peptidase Activating Factor 1 ASAT Aspartate Amino Transférase ASK1 Apoptosis signaling kinase-1

Bcl2 B-cell lymphoma-2

BclXL B-cell lymphoma-extra large

CAMK Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase CARD Caspase Activation Recruitment Domain CD95 Récepteur Fas cFLIP cellular FLICE-Like Inhibitory Protein (cellular Fas-associated death-domain-like IL1-β-converting enzyme inhibitory protein) CHX cycloheximide cIAPs cellular Inhibitors of Apoptosis Proteins / E3 ubiquitin ligases cIAPs CMV Cytomegalovirus CsA Cyclosporine A CYLD Cylindromatosis CypA Cyclophiline A CypD Cyclophiline D

DAI/ZBP-1 DNA-dependent activator of IFN regulatory factors / Z-DNA binding protein 1 DAMPs Damage-Associated Molecular Patterns Daxx Death Domain-associated protein DD Death Domain DISC Death-Inducing Signaling Complex DR Death Receptor

ERK Extracellular signal-Regulated Kinase (ou MAPK)

FADD Fas Associated Death Domain FAK Focal Adhesion Kinase FasL Ligand Fas

γGT gamma Glutamyl-Transpeptidase, ou gamma Glutamyl-Transférase GPX4 Glutathione Peroxidase 4 GSH Glutathion

HHV8 Herpès Virus Humain de type 8

HMGB1 High Mobility Group Box 1 hTERT human Telomerase Reverse Transcriptase

IDO Indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase IFN Interféron IKK Inhibitor of Kappa B Kinase α/β (IκB kinase α/β) IĸBα Inhibitor of ĸB-alpha IL Interleukine IRFs Interferon-Regulatory Factor proteins IRI Ischemia-Reperfusion Injury

JNK c-Jun N-terminal kinase

KD Kinase Dead KO knockout

LPS Lipopolysaccharide LT Oncoprotéine Large T du virus SV40 LUBAC Linear Ubiquitin Chain Assembly Complex

MAPK Mitogen Activated Protein Kinase MAVS Mitochondrial AntiViral-Signaling protein MCMV Murine Cytomegalovirus MEK MAPK kinase / ERK kinase MEKK MAPK kinase kinase MLKL Mixed Lineage Kinase Domain Like MNNG 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine MOMP Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization MPTP Mitochondrial Membrane Permeability Transition Pore

NAD Nicotinamide Adénine Dinucléotide NADPH forme réduite du Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate Nec-1 Nécrostatine-1 NETs Neutrophil Extracellular Traps NF-ĸB Nuclear Factor-ĸB NK Natural Killer NKT Natural Killer T NLRs NODD Like Receptors NOX NADPH oxidase NSA Nécrosulfonamide

PAMPs Pathogen-Associated Molecular Patterns PAR Poly (ADP-ribose) PARP-1 Poly (ADP-ribose) polymerase 1 PIPs Phosphatidyl Inositol Phosphates PKR Protein kinase RNA-activated

Poly (I:C) Acide polyinosinique-polycytidylique PPIase Peptidyl-Prolyl cis-trans isomérase PRR Pattern Recognition Receptor

RAF Rapidly Accelerated Fibrosarcoma, MAP3K RAIDD RIP-associated ICH-1/CED-3 homologous protein with a death domain Ras rat Sarcoma, a GTPase RHIM RIP Homotypic Interaction Motif RIPK Receptor Interacting Protein Kinase RIG-I Retinoic Acid-Inducible Gene I ROS Reactive Oxygen Species RSL3/5 Ras Selective Lethal 3 or 5

SfA Sangliféhrine A SIRS Syndrome de Réponse Inflammatoire Systémique Smac Second Mitochondrial activator of Caspases ST oncoprotéine Small T du virus SV40

TAK1 TGF-β Activated Kinase 1 TICAM1 Toll Like Receptor-adaptor molecule 1 TLR Toll Like Receptor TNF Tumor Necrosis Factor TNF-α TNF-alpha TNFR TNF Receptor TRADD TNFR1-Associated Death Domain TRAF TNFR Associated Factor TRAIL TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand TRAIL-R TRAIL-Receptor TRAMP Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 (or DR3) TRIF TIR-domain-containing adapter inducing IFN-β

VDAC Voltage-Dependent Anion Channels vIRA viral Inhibitor of RIP Activation

WT Wild Type XIAP X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein ZBP-1 Z-DNA binding protein 1

Sommaire Avant-propos ...... 1 Introduction générale ...... 3 I. Morts cellulaires ...... 3 A. Mort cellulaire non régulée ou accidentelle, la nécrose ...... 4 B. Morts cellulaires programmées ...... 4 1) Apoptose ...... 4 2) Nécroses régulées ...... 7 II. La famille des Receptor Interacting Protein Kinases ...... 16 A. Les différents membres ...... 17 1) RIPK1 ...... 17 2) RIPK3 ...... 20 3) RIPK2 ...... 23 4) RIPK4 ...... 24 5) RIPK5, RIPK6, RIPK7 ...... 25 B. Le rôle des RIPK1/3 dans la survie, la mort cellulaire et l’inflammation ...... 26 1) Le rôle des RIPK1/3 dans la signalisation des ligands des récepteurs de mort ...... 26 2) Le rôle des RIPK1/3 dans la nécrose indépendante des récepteurs de mort ...... 36 C. La détection de la nécrose régulée : les marqueurs actuels ...... 39 D. Rôle des RIPK1 et RIPK3 dans le développement embryonnaire murin ...... 41 III. Les pathologies liées à la nécrose régulée ...... 46 A. Les pathologies ischémiques : ...... 50 1) L’ischémie cérébrale : modèle d’AVC ...... 50 2) L’ischémie cardiaque ...... 50 3) L’ischémie rénale ...... 51 B. Le choc septique : ...... 52 1) Le modèle du syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS) ...... 52 2) Le modèle de ligature du cæcum suivi d’une perforation intestinale ...... 52 C. Les lésions cutanées ...... 52 1) Modèles génétiques de pathologies cutanées ...... 53 2) L’érythrodermie bulleuse avec épidermolyse ...... 53 3) Le psoriasis ...... 54 D. Les maladies inflammatoires de l’intestin ...... 54 IV. Le rôle de la nécroptose dans les pathologies du foie ...... 55 A. L’hépatite aigüe ...... 55 1) Modèle d’hépatite immuno-induite ...... 55

2) Modèle d’hépatite induite par l’acétaminophène ...... 57 B. Les maladies chroniques du foie ...... 58 1) La stéatose hépatique non-alcoolique (NASH) ...... 58 2) La stéatose du foie alcoolique ...... 59 3) Les hépatites virales à VHC/VHB ...... 60 V. Les inhibiteurs chimiques de la nécroptose ...... 60 A. Les inhibiteurs de RIPK1 ...... 63 1) Les Nécrostatines ...... 63 2) Pazopanib ...... 69 3) Le pan-inhibiteur de RIPK1 et RIPK3, ponatinib ...... 69 4) La molécule hybride PN10 (Ponatinib-Nec1) ...... 70 5) Le Cpd27 ...... 71 6) Le GSK’963 ...... 73 7) Les GSK’481 et GSK2982772 ...... 73 8) Le Compound 56 (RIPA-56) ...... 75 B. Les inhibiteurs de RIPK3 ...... 77 1) GSK’840, GSK’843 et GSK’872 ...... 77 2) GW’39 ...... 78 3) Dabrafenib ...... 78 C. Les inhibiteurs de MLKL ...... 78 1) Nécrosulfonamide (NSA) ...... 79 2) Compound-1 ...... 79 D. Les inhibiteurs d’autres cibles ...... 79 1) La Nec-7 ...... 79 2) Le Vorinostat ...... 79 E. Leurs intérêts thérapeutiques ...... 80 Contexte et objectifs du travail ...... 85 Résultats ...... 89 Article 1 : Sibiriline, un nouvel inhibiteur de la RIPK1 (Receptor-Interacting Protein Kinase 1) protège de l’hépatite immuno-induite ...... 89 Article 2 : Découverte du 6-E11, un nouvel inhibiteur bioinspiré spécifique de RIPK1 (Receptor- Interacting Protein Kinase 1) et qui protège de l’ischémie froide-réoxygénation ...... 166 Discussion générale et perspectives ...... 203 Références bibliographiques ...... 217

Table des figures

Figure 1 - Les modes de mort cellulaire divergent en fonction de l’engagement des caspases et de la séquestration ou du relargage des DAMPs Page 3

Figure 2 - Classification des différents modes de mort cellulaire Page 5

Figure 3 - Voies extrinsèque et intrinsèque de l’apoptose Page 6

Figure 4 - Stimuli et voies de signalisation responsables de la nécroptose Page 8

Figure 5 - Représentation schématique de la structure des RIPK1 et RIPK3 humaines Page 9

Figure 6 - Historique des découvertes majeures de la nécroptose Page 11

Figure 7 - Structure des membres de la famille des RIP kinases Page 16

Figure 8 – Les RIPK1-4, senseurs essentiels du stress extra- et intracellulaire Page 17

Figure 9 - Domaines protéiques et modifications post-traductionnelles de la kinase RIPK1 humaine Page 17

Figure 10 - Représentation simplifiée du rôle pléiotropique de la kinase RIPK1 Page 19

Figure 11 - Domaines protéiques de la kinase RIPK3 humaine Page 20

Figure 12 - Vue générale des voies de signalisation responsables de la nécroptose Page 23

Figure 13 - Signalisations engagées par le récepteur TNFR1 suite à la fixation du TNF-α Page 27

Figure 14 - Complexes moléculaires formés lors de la fixation de TRAIL sur les récepteurs TRAIL-R1/R2 Page 32

Figure 15 - Voies de signalisation de l’apoptose et de la nécroptose induites par FasL Page 35

Figure 16 - Schéma général des différents nécrosomes responsables d’une nécrose régulée Page 39

Figure 17 - Implication de RIPK1, RIPK3 et MLKL dans différents modèles précliniques de pathologies inflammatoires Page 46

Figure 18 - Modèle d’hépatolyse induite par la concanavaline A Page 57

Figure 19 - Voie de signalisation responsable de l’activation de la nécroptose lors de la stimulation du TNFR1 Page 61

Figure 20 - Rôle clef des activités kinases de RIPK1 et RIPK3 dans l’activation de la pseudokinase MLKL lors de la nécroptose Page 63

Figure 21 - Structure chimique des nécrostatines Page 64

Figure 22 - Modélisation structurale de l’inhibition de la RIPK1 par les nécrostatines Page 65

Figure 23 - Classification des petites molécules inhibitrices des protéines kinases, basée sur la structure des complexes « composé chimique-enzyme » Page 67

Table des tableaux

Tableau 1 – Mise en évidence de certains marqueurs de la nécrose régulée dans les pathologies humaines Page 41

Tableau 2 – Caractéristiques majeures des souris déficientes ou génétiquement modifiées pour un (ou plusieurs) acteur(s) ou régulateur(s) de la nécroptose Pages 44-45

Tableau 3 – Pathologies associées à une nécroptose Pages 48-49

Tableau 4 – Les Nécrostatines, inhibiteurs chimiques de l’activité kinase de la RIPK1 : mode d’action, efficacité et sélectivité Page 68 Tableau 5 – Inhibiteurs chimiques de l’activité kinase de la RIPK1, autres que les Nécrostatines : mode d’action, efficacité et sélectivité Pages 72 (partie 1), pages 76-77 (partie 2)

Tableau 6 - Inhibiteurs chimiques de la nécroptose : cible(s) et mode d’action Page 81

Tableau 7. Comparaison des caractéristiques biologiques de nos inhibiteurs de la kinase RIPK1 : Sibiriline et 6E11 avec la molécule de référence de notre étude, la Nec-1s. Page 210

I. INTRODUCTION

Avant-propos

La nécroptose est une nécrose régulée dépendante de l’activité des kinases RIPK1 et RIPK3 et d’une pseudokinase MLKL. Le rôle positif ou négatif des différents acteurs de la nécroptose (RIPK1, RIPK3, MLKL, FADD ou caspase 8) a été montré au cours de certaines pathologies humaines. Ces pathologies ischémiques, inflammatoires et dégénératives sont caractérisées par une mort cellulaire massive accompagnée d’une inflammation aigüe ou chronique. Or la nécrose est responsable du relargage de molécules immunogènes, les DAMPS, suggérant un rôle primordial de la nécroptose lors de l’inflammation observée.

Bien que les anti-TNF-α soient utilisés dans le traitement de plusieurs pathologies inflammatoires chroniques invalidantes ou auto-immunes sévères comme la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis sévère, la rectocolite hémorragique et la maladie de Crohn, leur utilisation au cours des hépatites a montré d’importants effets indésirables mais peu d’effets bénéfiques. Cette approche thérapeutique peut, par exemple, conduire à la réactivation des virus de l’hépatite B ou C, augmenter les dommages tissulaires voire dans certains cas provoquer la mort des patients (Boetticher et al. 2008; Coffin et al. 2011; Wree et al. 2016). Dans le cas des pathologies ischémiques, la reperfusion ou la réoxygénation de l’organe richement vascularisé conduit à l’apparition de nouveaux dommages tissulaires (Yellon and Hausenloy 2007; Degterev and Linkermann 2016). Il est donc primordial de prévenir ou de limiter l’apparition de ces dommages cérébraux, cardiaques ou rénaux secondaires à l’ischémie chez le patient.

Ainsi, la mise en évidence de voies de mort régulées dans de nombreux contextes pathologiques permet d’envisager le développement d’inhibiteurs de la mort cellulaire pour de nouvelles approches thérapeutiques. La nécroptose est, dans ce contexte, une cible intéressante puisqu’elle fait intervenir les RIPK1 et RIPK3 qui jouent un rôle pro-inflammatoire dans de nombreux tissus (Vanden Berghe et al. 2016; Degterev and Linkermann 2016).

Ces travaux de thèse ont consisté à caractériser de nouveaux inhibiteurs de la kinase RIPK1 (i) in vitro dans différents modèles de nécroptose induite par les ligands des récepteurs de mort de la superfamille du TNFR1 ou dans un modèle humain d’ischémie et (ii) in vivo dans un modèle murin d’hépatite aigüe. La structure de ces nouvelles molécules pourra être optimisée à des fins thérapeutiques.

Introduction générale

I. Morts cellulaires La mort cellulaire résulte de différents types d’agression (biologique, physiques, chimiques). Historiquement, celle-ci fut longtemps différenciée en deux formes : l’apoptose, largement considérée comme seule mort programmée non-immunogène versus la nécrose, non programmée et inflammatoire. Aujourd’hui, les progrès de la recherche ont permis de mieux caractériser les mécanismes moléculaires de mort cellulaire, parmi lesquelles de nouvelles nécroses régulées ont été décrites chez l’Homme (Figure 1). Cependant, dans le cas de ces nécroses régulées, il reste à déterminer si elles sont à l’origine de l’inflammation tissulaire observée ou si elles résultent du contexte inflammatoire installé au sein du tissu au cours de pathologies inflammatoires nécrotiques. Le comité de mort cellulaire (NCCD, Nomenclature Committee on Cell Death) réactualise régulièrement la nomenclature des morts cellulaires (Kroemer et al. 2005; Kroemer et al. 2009; Galluzzi et al. 2012; Galluzzi et al. 2015).

Figure 1. Les modes de mort cellulaire divergent en fonction de l’engagement des caspases et de la séquestration ou du relargage des DAMPs (issue de Kearney and Martin 2017). Abréviations: DAMPs, Damage Associated Molecular Patterns.

A. Mort cellulaire non régulée ou accidentelle, la nécrose La nécrose est causée par un événement physique, chimique ou mécanique extérieur à la cellule dit « accidentel ». Cette mort est indépendante de toute machinerie moléculaire et quasi- immédiate ; elle ne peut être influencée ni par une intervention génétique ni par une molécule pharmacologique du fait de l’absence de régulation intracellulaire (Galluzzi et al. 2015). La nécrose est inflammatoire du fait du relargage du contenu cellulaire au sein du tissu. L’agent responsable de l’inflammation peut être une molécule exogène associée à un pathogène (PAMP, « a pathogen-associated molecular pattern ») ou une molécule endogène inappropriée (DAMP, « a damage-associated molecular pattern ») relarguée dans le milieu extracellulaire. La détection des DAMPs et PAMPs se fait respectivement grâce aux récepteurs intracellulaires de type NLRs (Nodd Like Receptors), MAVS, RIG-I et AIM2 ou aux récepteurs membranaires extracellulaires de type TLRs (Toll Like Receptors). Ces récepteurs activés mobilisent des facteurs de transcription tels que NF-ĸB, Fos-Jun et IRFs, tous impliqués dans la production de cytokines inflammatoires et de chimiokines. La cellule en processus de nécrose présente la morphologie suivante : gonflement cellulaire, perte de l’intégrité membranaire suite à une perméabilisation précoce, éclaircissement du cytoplasme, gonflement des organites cellulaires, dysfonctionnement mitochondrial, perméabilisation de la membrane lysosomale, légère condensation de la chromatine, noyau intact et libération du contenu cytoplasmique dans l’espace extracellulaire.

B. Morts cellulaires programmées Les morts cellulaires dépendantes d’une machinerie cellulaire sont dites programmées ou régulées (Figure 2). Elles peuvent être modulées par une intervention moléculaire ou un traitement pharmacologique. Il est vital pour l’organisme de maîtriser la mort cellulaire afin d’éviter une réponse inflammation incontrôlée délétère au bon fonctionnement d’un tissu ou d’un (ou plusieurs) organe(s) ou du système immunitaire.

1) Apoptose L’apoptose est définie par différentes caractéristiques morphologiques décrites en 1972 par John Kerr, Andrew Wyllie et Alastair Currie : un bourgeonnement de la membrane plasmique, une condensation cytoplasmique et chromatinienne ainsi qu’une fragmentation nucléaire (Kerr et al. 1972). La fragmentation de la cellule en « corps apoptotiques » définis par une membrane contenant des micronoyaux (fragments nucléaires) est une marque de l’apoptose. D’après les observations de Kerr et al., l’apoptose est fréquente au cours du développement embryonnaire et du renouvellement des tissus sains ainsi que lors de certaines situations pathologiques telles que l’ischémie tissulaire et la régression tumorale (Kerr et al. 1972). Cette mort intervient en réponse à de nombreux stimuli soit externes par l’activation des récepteurs de mort (DRs) ou des récepteurs des PAMPs (PRRs, Pattern Recognition Receptors), soit internes via des facteurs de stress, une perte d’intégrité de l’ADN suite à des dommages ou une modification majeure de l’homéostasie cellulaire (Ziegler and Groscurth, 2004).

Figure 2. Classification des différents modes de mort cellulaire (adaptée de Galluzzi et al. 2012). Abréviations: DRs, Death Receptors from TNF-R1 superfamily; ROCK1, Rho-associated coiled-coil containing protein Kinase 1; RIPK, Receptor Interacting Protein Kinase; MLKL, Mixed Lineage Kinase domain Like; DAI, DNA-dependent activator of IFN regulatory factors; TRIF, TIR-domain-containing adapter inducing IFN-β; GPX4, Glutathione Peroxidase 4; MEK, MAPK kinase; Src, tyrosine kinase Src; ROS, Reactive Oxygen Species; CypD, cyclophilin D; MPTP, mitochondrial membrane permeability transition pore; PARP-1, poly(ADP)ribose polymerase-1; AIF, Apoptosis Inducing Factor; NET, neutrophil extracellular traps; NOX, NADPH oxidase ; Raf, Rapidly Accelerated Fibrosarcoma, MAP3K; ERK; Extracellular signal- Regulated Kinase or MAPK.

Ces événements vont conduire à l’activation d’enzymes intracellulaires, les caspases (« cysteine dependent aspartate specific protease »). Celles-ci vont engendrer le clivage des protéines essentielles à l’intégrité structurale de la cellule, dites « vitales » et donc indispensables au maintien, à l’organisation et à l’attachement du cytosquelette ainsi les protéines nécessaires à l’intégrité structurale du noyau par le maintien de l’appareil mitotique (Ziegler and Groscurth, 2004). Cette mort fut longtemps considérée comme la seule voie de mort programmée en opposition avec la nécrose considérée elle comme accidentelle. Il existe deux voies distinctes de régulation de l’apoptose : les voies extrinsèque et intrinsèque (Figure 3).

La voie extrinsèque est principalement activée par la fixation des ligands des récepteurs de la superfamille du TNF (« Tumor Necrosis Factor ») : le TNF-α, le FasL et le TRAIL (« TNF- Related Apoptosis Inducing Ligand »), permettant la formation du complexe IIa dans le cas du TNF-α ou du complexe moléculaire appelé « Death Inducing Signaling Complex » (DISC) dans le cas de FasL ou de TRAIL nécessaire à l’activation de la caspase 8 initiatrice qui joue un rôle central pour l’activation des caspases effectrices -3, -6 et -7. L’apoptose extrinsèque est couramment activée par les cellules de l’immunité telles que les cellules NK (« Natural Killer ») et les cellules T cytotoxiques suite à l’activation des DRs et des PRRs afin d’éliminer les cellules infectées, endommagées ou précancéreuses ainsi que par les cellules hôtes pour empêcher la réplication virale dans les cellules hôtes et la dissémination des virus dans l’organisme. Les cellules apoptotiques sont ensuite éliminées par les macrophages (Silke et al. 2015). La voie intrinsèque est quant à elle déclenchée en réponse à un dommage intracellulaire majeur ou un signal de stress et régulée par les protéines pro-apoptotiques et anti-apoptotiques de la famille Bcl2. Elle est caractérisée par la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale (MOMP) et la libération du cytochrome-c dans le cytosol ainsi que d’autres molécules pro-apoptotiques (Smac, Endo G, AIF). Sept molécules Apaf1 interagissent alors avec le cytochrome-c et recrutent par leur domaine CARD (pour « Caspase Activation Recruitment Domain ») la procaspase 9 pour former l’apoptosome, responsable de l’activation de la caspase 9 puis de la caspase 3 (Bratton et al. 2001).

Figure 3. Voies extrinsèque (a) et intrinsèque (b) de l’apoptose (issu de Mariño et al. 2014).

Ces deux voies peuvent être engagées de manière successive via le clivage de Bid en tBid (truncated Bid) par la caspase 8 permettant une amplification du signal pro-apoptotique,

6 responsable de l’activation de la caspase 3 à l’origine d’un démantèlement cellulaire irréversible entraînant la mort cellulaire par apoptose. L’apoptose assure la mort cellulaire liée au développement de l’organisme et à l’homéostasie tissulaire chez l’adulte. Cette mort a longtemps été décrite comme non-inflammatoire en opposition à la nécrose puisque elle empêche la fuite de tout matériel intracellulaire par la formation de corps apoptotiques. De plus, l’apoptose génère des signaux chimio-attractifs et de reconnaissance afin d’assurer une élimination rapide de la cellule par phagocytose, appelés « find me » et « eat me » (Cullen et al. 2013) telle que l’externalisation de la phosphatidylsérine qui va permettre leur reconnaissance et leur élimination. Cependant lorsque la destruction des corps apoptotiques est incomplète, il peut y avoir dégradation de leur membrane plasmique et libération de leur contenu au sein du tissu à l’origine d’une nécrose dite secondaire (Honda et al. 2000) conduisant à une auto-immunité ou une réponse inflammatoire non contrôlée (Mukae et al. 2002; Kawane et al. 2010). Ainsi l’apoptose peut être source d’inflammation et contribuer au développement de pathologies comme cela a été décrit dans le foie où la mort des hépatocytes peut être suivie d’une inflammation due à la phagocytose des corps apoptotiques par les cellules de Kupffer ou par les cellules étoilées du foie, productrices de TNF-α, de FasL et de TRAIL (Malhi et al. 2010). 2) Nécroses régulées La nécrose a longtemps été considérée comme une mort purement accidentelle. Aujourd’hui, il a largement été démontré qu’elle peut également avoir lieu en réponse à différentes voies de signalisation finement régulées. Ces morts inflammatoires et immunogènes sont bénéfiques pour lutter contre les bactéries pathogènes, ainsi que les infections virales et parasitaires dans un contexte de danger pour l’organisme (Matzinger 1998); de plus, elles favorisent la cicatrisation. Elles peuvent devenir délétères lorsqu’elles sont dérégulées dans le cas d’une maladie autoimmune, inflammatoire ischémique ou dégénérative. Le terme de nécrose régulée n’est pas un synonyme de nécroptose comme cela a pu être largement utilisé dans la littérature entre 2005 et 2008 (Figure 2). La nécrose régulée regroupe différents types de mort qui présentent toutes une morphologie nécrotique : la nécroptose, la ferroptose, la nécrose régulée dépendante de la perméabilité mitochondriale, la parthanatos, la pyroptose, la NETose et l’ETose (Vanden Berghe et al. 2014). Elles sont contrôlées par différentes voies de signalisation mais elles partagent les mêmes caractéristiques telles que la perte de l’intégrité membranaire, la production excessive d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ou la déplétion en ATP (Vandenabeele et al. 2010b; Galluzzi et al. 2011).

a) Nécroptose : La nécrose programmée/nécroptose désigne une mort cellulaire programmée non-apoptotique, déclenchée par l’engagement des récepteurs de mort (DRs) de la superfamille du TNF (TNFR1, Fas, TRAIL-R1 et TRAIL-R2) ou par la stimulation des récepteurs de l’immunité innée (PRRs tels que TLR3, TLR4, TRIF ou DAI) en l’absence d’activité intracellulaire de la caspase 8 (Vercammen et al. 1998; Holler et al. 2000; Kalai et al. 2002; Kaiser et al. 2013b; Upton et al. 2010; Upton et al. 2012) (Figure 4). Elle se manifeste par les mêmes caractéristiques morphologiques que la nécrose : une perte de l’intégrité membranaire suite à une perméabilisation précoce, un gonflement des organites

7 cellulaires, un dysfonctionnement mitochondrial et un gonflement cellulaire jusqu’à la libération des DAMPs dans l’espace extracellulaire. Les DAMPs agissent alors comme un signal de danger et conduisent au déclenchement d’une réponse inflammatoire nécessaire au recrutement des cellules de l’immunité innée sur le site infectieux ou de la lésion (Kaczmarek et al. 2013).

Figure 4. Stimuli et voies de signalisation responsables de la nécroptose (modifiée de Silke et al. 2015).

Cette nécrose régulée fut d’abord mise en évidence in vitro lors de la stimulation de lignées cellulaires par les ligands de la superfamille du TNF : FasL, TRAIL et TNF-α dans le cadre de l’inhibition pharmacologique ou de l’extinction de la caspase 8 (Vercammen et al. 1998; Holler et al. 2000; Degterev et al. 2005). Lors de l’engagement des DRs, la nécrose dépend de l’activité des kinases RIPK1 (Holler et al. 2000; Degterev et al. 2008) et RIPK3 (Cho et al. 2009; He et al. 2009; Zhang et al. 2009). Degterev et al. ont découvert le premier inhibiteur de la nécroptose, baptisé nécrostatine (ou Nec-1), qui bloque l’activité de la RIPK1 en bloquant son autophosphorylation sur les résidus Ser14/15 (conservés chez la souris) (Degterev et al. 2005; Degterev et al. 2008). D’autres inhibiteurs de la RIPK1 bloquent également son autophosphorylation : GSK’963 (Berger et al. 2015), ponatinib (Fauster et al. 2015) et pazopanib (Fauster et al. 2015). La nécroptose peut aussi être bloquée grâce à l’utilisation d’inhibiteurs de l’activité de la RIPK3 qui empêchent ainsi l’activation de la pseudokinase effectrice de la nécroptose, MLKL (Mixed-

8 lineage kinase domain-like protein) : le GSK’872 (Kaiser et al. 2013 b), le GSK’843 (Kaiser et al. 2013 b), le dabrafenib (Li et al. 2014) et le ponatinib (Fauster et al. 2015; Najjar et al. 2015). L’activation de la nécroptose induit une série d’autophosphorylations notamment sur les Ser14/15 et Ser161 de la RIPK1 humaine (hRIPK1) et sur la Ser199/Ser227 de la RIPK3 humaine (hRIPK3) et de trans-phosphorylations entre RIPK1 et RIPK3 conduit à leur activation et leur interaction par leur domaine RHIM respectif (Figure 5) en l’absence d’activité caspase 8 (Vercammen et al. 1998; Degterev et al. 2008; Cho et al. 2009; He et al. 2009; Sun et al. 2012; Chen et al. 2013). En effet, la caspase 8 inactive par clivage la RIPK1 et la RIPK3 (Vercammen et al. 1998; Lin et al. 1999; Holler et al. 2000; Feng et al. 2007).

Figure 5. Représentation schématique de la structure des RIPK1 et RIPK3 humaines (issu de Vandenabeele et al. 2010 a). Abréviations: RIP, Receptor Interacting Protein Kinase; RHIM, a RIP homotypic interaction motif; DD, death domain; KD, kinase domain; P-Ser161: autophosphorylation site of RIP1; P-Ser199: autophosphorylation site of RIP3.

L’interaction de RIPK1 et RIPK3 activées, via leur domaine RHIM, conduit à la formation d’un complexe multiprotéique appelé nécrosome (Cho et al. 2009; Zhang et al. 2009; Vandenabeele et al. 2010b). L’activité de l’E3 ubiquitine ligase cIAP1 et de la kinase TAK1 bloquent l’activation de la RIPK1 et donc la production de ROS dépendante de l’activation du nécrosome (Vanlangenakker et al. 2011b). Enfin, la pseudokinase MLKL a été identifiée comme étant un substrat naturel de la kinase RIPK3 (Sun et al. 2012). RIPK3 phosphorylée (Ser227 RIPK3 humaine ou Thr231/Ser232 RIPK3 murine) est nécessaire au recrutement et à la phosphorylation de MLKL au niveau de la boucle d’activation sur les résidus suivants : Thr357/Ser358 MLKL humaine ou Ser345/Ser347/Ser352/ Thr349 MLKL murine (Sun et al. 2012; Chen et al. 2013; McQuade et al. 2013; Xie et al. 2013b). Une étude a montré que RIPK1, RIPK3 et MLKL phosphorylées transloquent simultanément au noyau avant de déclencher la nécroptose (Yoon et al. 2016) ; puis MLKL activée forme des oligomères avant d’être adressée au cytosol vers la membrane plasmique et les membranes intracellulaires (Murphy et al. 2013; Hildebrand et al. 2014). MLKL possède une forte affinité pour les phospholipides membranaires de type PIPs (pour « phosphatidyl inositol phosphates ») (Wang et al. 2014a; Dondelinger et al. 2014) et les cardiolipines de la membrane interne

9 mitochondriale (Wang et al. 2014a). MLKL va alors directement perméabiliser la membrane plasmique. Certaines études impliquent un influx d’ions calcium ou sodium (Cai et al. 2014; Chen et al. 2014); d’autres montrent que MLKL va directement former des pores qui vont perméabiliser la membrane plasmique et conduire à la nécrose cellulaire (Dondelinger et al. 2014; Wang et al. 2014a).

Il existe également des nécroptoses indépendantes de la RIPK1 activées suite à la détection de PAMPs tels que le lipopolysaccharide (LPS) et les acides nucléiques viraux. Il s’agit de la nécroptose dépendante de DAI/ZBP1 (Z-DNA binding protein, ou DNA-dependent activator of IFN regulatory factors) ou de TRIF/TICAM1 (TLR-adaptator molecule 1, ou TIR-domain- containing adaptater inducing IFN-β) en aval des TLR3/4 (Holler et al. 2000; Rebsamen et al. 2009; Upton et al. 2010; Upton et al. 2012; Kaiser et al. 2013b). Les protéines senseurs DAI et TRIF sont connues pour contenir un domaine RHIM dans leur séquence. Elles sont donc capables suite à l’engagement des PRRs d’activer la RIPK3 et de former un nécrosome « non canonique » contenant RIPK3 et MLKL, des acteurs majeurs de la nécroptose (Kaiser et al. 2008; Upton et al. 2010; He et al. 2011; Upton et al. 2012; Kaiser et al. 2013b). MLKL est aujourd’hui reconnue comme étant la pseudokinase qui exécute la nécroptose en aval des différents stimuli nécroptotiques (Zhang et al. 2016c). L’activation de la MLKL peut être bloquée par l’utilisation du nécrosulfonamide (ou NSA) pour la MLKL humaine (Sun et al. 2012) ou du composé-1 pour la MLKL murine (Hildebrand et al. 2014).

La définition de la nécroptose a ainsi beaucoup évolué depuis les travaux de Holler et al. en 2000 qui montraient un rôle de RIPK1, avec la découverte de nouveaux acteurs : RIPK3 et MLKL et la découverte de voies de signalisation nécrotiques indépendantes de RIPK1. Il existe à l’heure actuelle des inhibiteurs chimiques dirigés contre chaque acteur et utilisables in vitro (Figure 6). Les différents groupes cherchent actuellement à comprendre les mécanismes d’activation des kinases RIPK1 et RIPK3 et de la pseudokinase MLKL. Ils s’attachent également à améliorer l’efficacité et la sélectivité des inhibiteurs de la RIPK1 mais aussi à développer de nouveaux inhibiteurs de la RIPK3 et de MLKL utilisables in vivo dans les modèles précliniques de pathologies inflammatoires pour étudier leurs applications potentielles chez l’Homme. Cette mort cellulaire joue un rôle primordial dans le développement embryonnaire (Dillon et al. 2016) et elle est nécessaire à l’inflammation qui permet à l’hôte de lutter contre les infections bactériennes ou virales ou de réparer les dommages tissulaires (Cho et al. 2009; Upton et al. 2010; Upton et al. 2012; Polykratis et al. 2014; Humphries et al. 2015; Silke et al. 2015). Certains virus tel que le virus de la vaccine (virus à ADN double brin) activent la nécroptose grâce à la production de protéines inhibitrices de l’activation des caspases (Dobbelstein and Shenk 1996; Wasilenko et al. 2003; Gerlic et al. 2013). D’autres sont capables d’inhiber la nécroptose induite par le TNF tels que les virus humains du molluscum contagiosum, du sarcome de Kaposi, du CMV et le virus humain de la variole (Chan et al. 2003; Challa et al. 2010; Omoto et al. 2015). Lorsque la nécroptose est excessive, elle peut être délétère pour l’organisme et contribuer à de nombreuses pathologies telles que les ischémies cérébrales, cardiaques et rénales, les chocs septiques, la dégénérescence maculaire, les pathologies neurodégénératives, l’athérosclérose, les 10 pancréatites, les dommages hépatiques, les pathologies inflammatoires de l’intestin et les lésions inflammatoires cutanées (Kaczmarek et al. 2013; Jouan-Lanhouet et al. 2014; Vanden Berghe et al. 2016; Galluzzi et al. 2017; Wegner et al. 2017).

Figure 6. Historique des découvertes majeures de la nécroptose (inspiré de Vandenabeele et al. 2010 b). Abréviations: TNF: Tumor Necrosis Factor; TNFR1: TNF-Receptor1; Fas: Fas Receptor; TRAILR2: TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand-Receptor2; RIPK: Receptor Interacting Protein Kinase; CYLD: cylindromatosis; NF-ĸB: Nuclear Factor Kappa-B; Nec-1: necrostatin-1; MLKL: Mixed Lineage Kinase Domain Like; NSA: necrosulfonamide; LPS: lipopolysaccharide; IFNs: interferons.

D’une part, le développement d’inhibiteurs de la nécroptose grâce aux différents criblages de chimiothèques offre de nouveaux outils pour la compréhension des voies de signalisation dépendantes des DRs et des PRRs responsables d’une nécroptose. D’autre part, ces criblages pourront aussi mener à la découverte de nouveaux acteurs de cette nécrose régulée afin de pouvoir proposer des inhibiteurs sélectifs et efficaces chez l’Homme.

b) Ferroptose : La ferroptose a été mise en évidence dans des lignées cellulaires humaines transformées par différents oncogènes (hTERT, Ras ou les oncoprotéines LT et ST de SV40) traitées par l’érastine (eradicator of ras and ST cells) (Dolma et al. 2003). L’érastine engage les cellules tumorigènes dans une nécrose régulée dépendante de la voie de signalisation RAS-RAF-MEK (Yagoda et al. 2007). Cet inducteur se lie aux porines mitochondriales VDAC (voltage- dependent anion channels) et altère la membrane externe des mitochondries (Yagoda et al. 2007). De plus, il inhibe le transporteur Xc-, un antiporteur cystéine/glutamate (Cys/Glu), responsable de l’accumulation de cystéines oxydées (Dixon et al. 2012). L’inhibition de ce transporteur diminue la biosynthèse du glutathion (GSH) responsable d’une perte de fonction de la GPX4 (Glutathione (GSH) peroxidase 4) et d’une peroxidation lipidique dépendante des ROS (Yang et al. 2014; Dixon et al. 2012). Différents groupes s’accordent pour dire que la production accrue de ROS est responsable la ferroptose. Cette mort indépendante des caspases n’induit ni la libération du cytochrome-c, ni le clivage de PARP-1 (Poly(ADP-ribose)polymérase-1), ni la déplétion en ATP (Dolma et al. 2003; Yagoda et al. 2007; Dixon et al. 2012). Elle est caractérisée par l’accumulation de concentrations létales de lipides peroxydés peut être inhibée par des antioxydants (Yagoda et al. 2007). Cette mort fut baptisée ferroptose par Dixon et al. puisqu’elle dépend uniquement du métabolisme du fer intracellulaire (Yang and Stockwell 2008; Dixon et al. 2012). Il existe différents inducteurs de cette mort : l’érastine et les RSL3 et RSL5 (Ras Selective Lethal 3 or 5) qui ont des mécanismes d’action similaires et le BSO (buthionine sulfoxamine), inhibiteur irréversible de la biosynthèse du GSH (Yagoda et al. 2007; Dixon et al. 2012). Le premier inhibiteur chimique décrit fut nommé ferrostatine-1 (Fer-1) (Dixon et al. 2012). C’est un chélateur des lipides peroxydés in vitro ; celui-ci est instable in vivo. La molécule 16- 86, dérivée de la Fer-1, a depuis été mise au point car elle offre une meilleure stabilité plasmatique et métabolique et une meilleure efficacité in vivo dans un modèle de lésion d’ischémie-reperfusion rénale (Linkermann et al. 2014). Le groupe de Peter Vandenabeele a récemment mis au point une nouvelle série d’analogues de la Fer-1 qui offre une meilleure stabilité et une meilleure efficacité anti-ferroptotique (de l’ordre du nM) utilisable chez la souris (Hofmans et al. 2016). La liproxstatine-1 prévient également la mort cellulaire induite par les inducteurs de la ferroptose (érastine, RSL3 et BSO). Cette molécule plus liposoluble que la ferrostatine est capable de passer la barrière hémato-encéphalique. Elle protège contre les lésions d’ischémie- reperfusion hépatique chez la souris ou de l’insuffisance rénale aigüe chez la souris avec un KO inductible de GPX4 (Friedmann Angeli et al. 2014). Une autre molécule possède également une activité anti-ferroptotique, le zileuton, utilisé par voie orale dans le traitement de l’asthme. Cet inhibiteur est spécifique de la 5-lipoxygénase, une enzyme responsable de la peroxydation lipidique. Il empêche la mort induite par l’érastine et le glutamate en inhibant la production de ROS (Liu et al. 2015). D’autres molécules sont capables de contrer cette mort : les antioxydants lipophiles, les chélateurs de fer ou des inhibiteurs de kinases (U0126 : inhibiteur de MEK ; SU6656 : inhibiteur de Src).

D’un point de vue pathophysiologique, cette nécrose régulée semble être impliquée dans la neurodégénérescence lors de la maladie de Parkinson (Seiler et al. 2008; Do Van et al. 2016), la maladie de Huntington (Skouta et al. 2014), le cancer (Lachaier et al. 2014), l’ischémie- reperfusion rénale ou hépatique (Linkermann et al. 2012; Linkermann et al. 2014; Friedmann Angeli et al. 2014) et l’hépatite induite par la surconsommation d’acétaminophène (Lőrincz et al. 2015).

c) Nécrose régulée provoquée par une perméabilisation mitochondriale brutale : L’élévation brutale de la perméabilité de la membrane interne mitochondriale aux petits solutés a lieu en réponse à une surproduction de ROS ainsi qu’une augmentation massive du taux de Ca2+ cytosolique (Brenner and Grimm 2006; Kroemer et al. 2007). Cette perméabilisation peut être à l’origine d’une nécrose contrôlée par la cyclophiline D matricielle mitochondriale (CypD) (Baines et al. 2005; Basso et al. 2005; Schinzel et al. 2005). CypD est responsable de l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale (MPTP) inséré dans la membrane interne qui conduit à la translocation du NAD+ de la matrice mitochondriale vers le cytosol. L’activité pronécrotique de CypD est régulée par la protéine p53, suppresseur de tumeur (Vaseva et al. 2012). Le premier inhibiteur de cette mort fut la cyclosporine A (CsA) qui lie la CypD (Handschumacher et al. 1984) et bloque son activité peptidyl-prolylcis-trans isomérase (PPIase) (Halestrap and Davidson 1990; Griffiths and Halestrap 1991). La CsA module l’homéostasie calcique mitochondriale et empêche la perméabilisation de la membrane interne mitochondriale induite par l’influx massif de calcium (Fournier et al. 1987; Broekemeier and Pfeiffer 1989; Broekemeier et al. 1989). Le traitement par la CsA ou la perte de CypD prévient cette mort in vitro et in vivo dans de nombreux modèles pathophysiologiques tels que l’ischémie-reperfusion cardiaque (Clarke et al. 2002; Baines et al. 2005; Nakagawa et al. 2005; Kung et al. 2011), cérébrale (Schinzel et al. 2005; Vaseva et al. 2012) ou rénale (Devalaraja-Narashimha et al. 2009; Linkermann et al. 2013 b). La Sangliféhrine A (SfA) est un second inhibiteur de cette mort en bloquant l’activité PPIase de la CypD qui empêche de façon prolongée l’ouverture du pore mitochondrial. Contrairement à la CsA, la SfA ne bloque pas l’interaction de la CypD avec l’adénine nucléotide translocase (ANT) (Clarke et al. 2002). Cette molécule a été démontrée comme protectrice de l’ischémie reperfusion cardiaque ou rénale (Clarke et al. 2002; Linkermann et al. 2013 b).

d) Parthanatos : Une hyperactivation de la PARP-1 (Poly(ADP-ribose)polymérase-1) provoque une nécrose régulée appelée parthanatos (Andrabi et al. 2008). PARP-1 fait partie de la famille des protéines PARPs qui transfèrent des groupements ADP-ribose (PAR) sur des protéines cibles ; les PARPs régulent ainsi de nombreux processus cellulaires (Gibson and Kraus, 2012). Ces modifications protéiques sont à l’origine d’une déplétion en NAD+ intracellulaire suivie d’une déplétion en ATP, caractéristique de la nécrose (Leist et al. 1997; Chiarugi 2005). La PARP-1 participe à la protection du génome ; elle peut être activée en aval de cassures simple ou double brins de l’ADN induites par les UVs, les ROS ou les agents alkylants tel que le MNNG, un agent carcinogène et mutagène (Lonskaya et al. 2005; Rouleau et al. 2010; Sosna et al. 2014). La

13 persistance de dommages à l’ADN peut être à l’origine d’une hyperactivation de la PARP-1 responsable d’une mort cellulaire. En effet, l’hyperactivation de la PARP-1 est nécessaire au relargage mitochondrial de la protéine mitochondriale AIF (apoptosis-inducing factor) et à sa translocation vers le noyau (Yu et al. 2006). AIF nucléaire entrainerait une condensation et une fragmentation chromatinienne (Hangen et al. 2010). De plus, la liaison des PAR à AIF serait requise pour la translocation d’AIF et l’exécution de la nécrose dépendante de PARP-1 (Yu et al. 2002; Wang et al. 2011; Michels et al. 2013). Les inhibiteurs de PARP-1 tels que DPQ, 3-AB et PJ-34 protègent certains modèles de pathologies neurologiques et neurodégénératives liées à la parthanatos (revu dans Fatokun et al. 2014). Cette mort indépendante des caspases semble être une cible privilégiée dans le traitement de pathologies neuronales telles que les maladies d’Alzheimer, de Parkinson, de Huntington ou l’ischémie-reperfusion cérébrale (Galluzzi et al. 2014; Narne et al. 2016).

e) Pyroptose : Cette forme de nécrose régulée ferait suite à une infection ou un stress cellulaire (Lamkanfi and Dixit 2010). Elle est caractérisée par l’activation d’un senseur intracellulaire, l’inflammasome, complexe multi-protéique responsable de l’activation de la caspase 1 nécessaire à la maturation et à la sécrétion des interleukines IL1-β et IL-18, deux cytokines inflammatoires (Fernandes-Alnemri et al. 2007; Gross et al. 2011; Zitvogel et al. 2012; Croker et al. 2014). Elle conduit à la production de ROS, une perte de fonction de la mitochondrie, un gonflement cellulaire, une perméabilisation de la membrane plasmique et un relargage de DAMPs mais aussi une condensation nucléaire et une fragmentation de l’ADN (Lamkanfi and Dixit 2010). Elle interviendrait dans la mort des cellules immunitaires spécialisées. Elle a aussi été observée lors de la mort des macrophages infectés et des lymphocytes T de patients séropositifs HIV (Doitsh et al. 2014; Monroe et al. 2014). Ce mécanisme de défense anti-infectieuse hautement inflammatoire pourrait être à l’origine d’une cytopénie ou immunosuppression prolongée allant jusqu’à la septicémie (Croker et al. 2014). La pyroptose est également décrite dans des pathologies inflammatoires chroniques telles que la maladie héréditaire de CAPS (pour Cryopyrin-associated periodic syndrome) (Lachmann et al. 2009; Vande Walle and Lamkanfi 2016) ainsi que d’autres maladies multifactorielles comme le diabète, l’athérosclérose, l’asthme (Conforti-Andreoni et al. 2011) et la maladie d’Alzheimer (Heneka, 2017).

f) NETosis/ETosis : La NETose est la mort des neutrophiles par nécrose régulée qui conduit à la libération contrôlée de « pièges » extracellulaires (NETs pour « neutrophil extracellular traps »). Formés suite à la rupture de la membrane nucléaire, ils sont composés uniquement de chromatine décondensée et d’histones. Ils permettent l’immobilisation et la mort des bactéries (Brinkmann et al. 2004; Fuchs et al. 2007; Remijsen et al. 2011 a; Metzler et al. 2014). La libération des NETs nécessite l’activation des NOX (NADPH oxidases) via la voie Raf-MEK-ERK, la production de ROS et la synthèse de protéines anti-apoptotiques suite à une infection bactérienne, virale ou parasitaire (Fuchs et al. 2007; Hakkim et al. 2011; Remijsen et al. 2011b). Par exemple, les infections de la peau dues à des bactéries Gram positives provoquent la formation de NETs (Yipp et al. 2012). Chez l’Homme, le défaut en NOX provoque une maladie héréditaire, la 14 granulomatose septique chronique, caractérisée par une réponse immunitaire inappropriée et par des infections sévères répétées par certaines bactéries ou champignons (van den Berg et al. 2009). La formation de NETs était initialement considérée comme étant un témoin de la mort des neutrophiles ou NETose. Cependant, elle peut avoir lieu sans être suivie de la mort des neutrophiles, on parle de « NETose vitale » (Yipp et al. 2012; Zhao et al. 2015). La « NETose vitale » est une particularité des neutrophiles. Elle intervient dans les premières minutes de l’infection bactérienne en l’absence de perméabilisation de la membrane plasmique sans conduire à la mort des neutrophiles (Pilsczek et al. 2010; Yipp et al. 2012; Zhao et al. 2015; Amini et al. 2016). De plus, la formation des NETs pourrait également avoir lieu lors de nécroptose des neutrophiles lors de rhumatismes inflammatoires (Mulay et al. 2016; Desai et al. 2015). La cytotoxicité des cristaux d’urate de sodium (MSU) accumulés lors de la crise de goutte ou l’utilisation d’un activateur de la protéine kinase C, le PMA (phorbol-12-myristate-13- acétate), sont responsables d’un fort stress oxydatif in vitro après 2 heures de traitement de neutrophiles humains. Ces composés conduisent à la production de ROS et à l’activation du complexe RIPK3-MLKL responsable de la rupture de la membrane plasmique et de la formation de NETs (Mulay et al. 2016; Desai et al. 2015). Le mécanisme moléculaire à l’origine de la formation des NETs dépend donc de la durée de stimulation des neutrophiles, du type de stimuli ainsi que du contexte pathologique (revu dans Desai et al. 2016). La NETose dépendante des NOX est très différente des autres nécroses régulées ; il s’agit de la seule catégorie de mort cellulaire considérée comme spécifique d’un type cellulaire. L’ETose correspond au même mécanisme de mort (Wartha and Henriques-Normark 2008) appliqué aux éosinophiles et aux mastocytes dans la lutte contre les parasites et les agents infectieux (Remijsen et al. 2011 a).

En seulement une décennie, ces divers mécanismes moléculaires de nécrose régulée ont été mis en évidence. Contrairement à l’apoptose, la nécrose regroupe la mort accidentelle et les morts régulées qui partagent les mêmes caractéristiques morphologiques, cela complexifie donc leur classification. Les voies de signalisation impliquées dans les différents types de mort sont identifiées grâce à l’utilisation d’inhibiteurs chimiques spécifiques ou de modèles biologiques génétiquement modifiés pour l’expression de leurs acteurs clefs (Galluzzi et al. 2012). La classification actuelle des nécroses régulées est ainsi basée sur les voies de signalisation moléculaires impliquées (Galluzzi et al. 2014). La définition du terme nécroptose (Degterev et al. 2005; Degterev et al. 2008), alors considérée comme la seule forme de nécrose régulée initiée par l’activation de la kinase RIPK1, a également évolué. La nécroptose désigne désormais la nécrose régulée qui peut, dans certains cas, être déclenchée directement par l’activation de la kinase RIPK3 (Galluzzi et al. 2012) puisqu’il existe des nécroptoses indépendantes de l’activité kinase de la RIPK1 (Kaiser et al. 2008; Upton et al. 2010; He et al. 2011; Upton et al. 2012; Kaiser et al. 2013b).

II. La famille des Receptor Interacting Protein Kinases Le kinome humain est composé de plus de 500 kinases classées en famille selon la similarité de séquence de leur domaine kinase. Les RIP (Receptor Interacting Protein) kinases font partie des serine/thréonine kinases (Manning et al. 2002). Les sept membres de la famille des RIPKs partagent une homologie de séquence du domaine kinase, leur signature protéique ; cependant ces sept kinases possèdent de nombreux domaines fonctionnels différents voire spécifiques (Figure 7).

Figure 7. Structure des membres de la famille des RIP kinases (issu de Humphries et al. 2015). Les domaines protéiques fonctionnels sont indiqués pour chaque membre. Abréviations: Roc, Ras of complex proteins; COR, C-terminal of Roc; WD, WD40 repeats; and ARM, Armadillo.

Les RIPKs sont impliquées dans l’immunité innée et adaptative (revu dans Zhang et al. 2010; Humphries et al. 2015). Elles sont décrites comme senseurs du stress extracellulaire suite aux infections par des pathogènes, à une stimulation par des cytokines ou à une inflammation et comme senseurs du stress intracellulaire en aval d’une différenciation cellulaire ou de dommages à l’ADN. Ces différents stimuli de stress vont initier les mêmes types de réponses cellulaires via les RIPKs : d’une part, des signaux de survie grâce à l’activation des MAPKs (p38, JNK et ERK) et de la voie NF-B ou des signaux inflammatoires ainsi que des réponses immunitaires via l’activation de facteurs de transcription tels que NF-ĸB et AP-1 (Figure 8) et, d’autre part une mort cellulaire programmée de type apoptotique ou nécroptotique (Figure 8). Les fonctions biologiques des différentes RIPKs ne sont pas redondantes du fait de l’existence de domaines spécifiques. Les RIPK1-5 n’existent que chez les vertébrés ; RIPK6 et RIPK7 sont les seules de la famille à posséder des orthologues chez la drosophile et le C. elegans. De nombreuses études cherchent actuellement à déterminer le rôle de leur fonction kinase ainsi que les mécanismes et les protéines régulant celle-ci. La composition des différents complexes protéiques contenant les RIPKs formés en fonction du signal de stress est mal connue. Un objectif majeur reste également l’identification de leur(s) substrat(s) respectif(s).

Figure 8. Les RIPK1-4, senseurs essentiels du stress extra- et intra-cellulaire (issu de Zhang et al. 2010).

A. Les différents membres

1) RIPK1 Le premier membre de cette famille a été identifié en 1995 par Stanger et al. via un criblage double hybride dans la levure, basé sur l’interaction avec le domaine de mort intracellulaire du récepteur Fas/APO-1 (CD95). Deux protéines ont été identifiées : le récepteur Fas, lui-même, et une nouvelle kinase contenant un domaine de mort C-terminal, homologue à celui des récepteurs de mort : Fas et TNFR1 ; cette kinase de 74 kDa fut nommée RIP pour « receptor interacting protein ». Suite à la découverte de nouveaux membres de la famille, elle fut ensuite nommée RIPK1 et reste la protéine la plus largement étudiée de par son implication majeure dans l’inflammation et son rôle dual entre mort et survie cellulaire (Festjens et al. 2007). RIPK1 est constituée de trois domaines : un domaine kinase N-terminal, un domaine intermédiaire contenant un motif d’interaction protéine-protéine, baptisé RHIM (a RIP homotypic interaction motif) et un domaine de mort (DD) C-terminal (Figure 9).

Figure 9. Domaines protéiques et modifications post-traductionnelles de la kinase RIPK1 humaine (issu d’Ofengeim and Yuan, 2013).

L’expression basale de RIPK1 est forte dans le poumon chez l’Homme et la souris (Honarpisheh et al. 2016). Elle est détectée en forte quantité dans les biopsies humaines d’hépatites autoimmunes (Günther et al. 2016) ou cérébrales de patients atteints de sclérose en plaque (Ofengeim et al. 2015). RIPK1 peut être recrutée via son domaine de mort (DD) par différents DRs tels que TNFR1, Fas/CD95, TRAIL-R1/R2 et TRAMP/DR3 (Stanger et al. 1995; Chaudhary et al. 1997; Wen et al. 2003) ainsi que par les PRRs de type TLR-3/4 (Meylan et al. 2004; Youn et al. 2005). A son tour, RIPK1 recrute alors par son domaine de mort des protéines adaptatrices telles que TRADD, FADD, RAIDD, TRAF1, TRAF2, TRAF3 et NEMO ou les kinases FAK et MEKK3 (Figure 9) (Hsu et al. 1996; Varfolomeev et al. 1996; Ahmad et al. 1997; Duan and Dixit 1997; Inoue et al. 2000; Zhang et al. 2000; Devin et al. 2001; Bradley and Pober 2001; Meylan et al. 2004; Wertz et al. 2004; Kurenova et al. 2004; Yang et al. 2001). Son domaine intermédiaire (ID) permet l’interaction avec les déubiquitinases A20 et CYLD (Zhang et al. 2000; Wright et al. 2007) ou encore la kinase MEKK1 (Kim et al. 2001) (Figure 9). Le domaine RHIM de la RIPK1 permet son interaction avec RIPK3, TRIF ou DAI ainsi que la protéine M45 codée par le virus murin du cytomégalovirus (MCMV) (Sun et al. 2002; Kaiser and Offermann 2005; Rebsamen et al. 2009; Upton et al. 2008) (Figure 9). La RIPK1 joue ainsi un rôle clef au carrefour de plusieurs voies de signalisation responsables de la survie, de l’inflammation ou de la mort cellulaire dans un contexte de stress extra- ou intracellulaire. Ainsi la signalisation induite par la RIPK1 contrôle le destin cellulaire et est finement régulée pour assurer le maintien de l’homéostasie tissulaire. La RIPK1 possède des fonctions opposées assurées par son domaine intermédiaire (ID) ou son domaine kinase (KD). Le domaine intermédiaire de la RIPK1 est responsable de l’activation de la signalisation du NF-ĸB et des MAPKs par sa fonction d’échafaudage en réponse à la stimulation des récepteurs de mort de la famille du TNF : le TNFR1, le TRAILR1 et Fas (Ting et al. 1996; Kelliher et al. 1998; Lin et al. 2000; Kreuz et al. 2004) à l’origine de l’inflammation ou de la survie cellulaire. Tandis que sa fonction kinase est à l’origine de la mort de la cellule par l’induction de l’apoptose ou de la nécroptose lors de l’engagement des DRs et des PRRs (Silke et al. 2015) ou de l’apoptose lors de la formation du ripoptosome (Wang et al. 2008; Tenev et al. 2011). Le ripoptosome est un complexe cytosolique, responsable d’une apoptose ou d’une nécroptose et formé par la RIPK1, FADD et la caspase 8 auxquelles peuvent s’ajouter cFLIP ou la RIPK3 en fonction du type cellulaire et du stimulus (Tenev et al. 2011; Feoktistova et al. 2011; Feoktistova et al. 2016). A ce jour, le rôle de la RIPK1 a été plus largement étudié au cours de l’inflammation et de la mort cellulaire induites par le signal TNF (Figure 10). Il existe différentes séries d’inhibiteurs de l’activité kinase de RIPK1 : les Nécrostatines, le pazopanib, le ponatinib, le PN-10, le Cpd27, les GSKs et le RIPA-56 (Chapitre V. partie A).

Figure 10. Représentation simplifiée du rôle pléiotropique de la kinase RIPK1 (issu de Dara et al. 2016b).

L’activation de la nécroptose induit l’auto-phosphorylation de la RIPK1, caractéristique de son activation, sur les résidus suivants : Ser14/15, Ser20, Ser161 et Ser166 pour la RIPK1 humaine (Degterev et al. 2008) (Figure 9) versus Ser14/15, Ser161 et Ser166 pour la RIPK1 murine (Ofengeim et al. 2015) in vitro. L’autophosphorylation et la trans-phosphorylation des kinases RIPK1 et RIPK3 conduisent à leur activation et leur interaction par leur domaine RHIM respectif en l’absence d’activité caspase 8 (Vercammen et al. 1998; Cho et al. 2009; He et al. 2009; Chen et al. 2013) qui peut cliver RIPK1 (Asp324) et RIPK3 (Asp328) (Vercammen et al. 1998; Lin et al. 1999; Holler et al. 2000; Feng et al. 2007). L’activité de l’E3 ubiquitine ligase cIAP1 et de la kinase TAK1 peuvent également empêcher l’activation de la RIPK1 et donc la production de ROS dépendante de l’activation du nécrosome (Vanlangenakker et al. 2011b). RIPK1 est constitutivement exprimée dans de nombreux tissus ; tandis que dans les cellules T activées, son expression est inductible par un stimulus FasL (Stanger et al. 1995). Le rôle de RIPK1 a pu être étudié par la génération des souris RIPK1-/- (Kelliher et al. 1998). Ces souris déficientes meurent 1 à 3 jours après la naissance d’une mortalité massive des tissus lymphoïdes et adipeux due à une sensibilisation à l’apoptose induite par le TNF-α accompagnée par une perte de l’activation de la voie de survie NF-ĸB (Kelliher et al. 1998). La fonction kinase de la RIPK1 ne joue pas un rôle vital pour le développement ou la survie de l’organisme puisque les souris qui expriment une RIPK1 inactive (RIPK1D138N ou RIPK1K45A) sont viables et fertiles (Newton et al. 2014; Berger et al. 2014; Kaiser et al. 2014). La fonction kinase de la RIPK1 joue un rôle régulateur clef au cours de l’inflammation puisque l’hyperactivation de la RIPK1 est responsable d’une apoptose ou d’une nécroptose conduisant à l’apparition de pathologies inflammatoires sévères (Jouan-Lanhouet et al. 2014). Le rôle anti-inflammatoire et anti-apoptotique de la fonction d’échafaudage de la RIPK1 a alors été démontré par l’invalidation ciblée de la RIPK1 responsable d’une inflammation spontanée et d’une apoptose massive au sein de certains tissus comme l’intestin et la peau alors que la perte de son activité kinase n’affecte pas l’intégrité de ces tissus (Takahashi et al. 2014; Dannappel et al. 2014). Dans ces travaux, la perte de la RIPK3 ou de MLKL bloque l’inflammation médiée par la perte de la RIPK1 dans les cellules de l’épiderme alors que la perte

19 simultanée de RIPK3 et FADD restaure l’intégrité du tissu intestinal chez les souris RIPK1IEC KO (Takahashi et al. 2014; Dannappel et al. 2014). La RIPK1 indépendamment de son activité kinase est donc indispensable au maintien de l’intégrité de certains tissus comme la peau et l’intestin en limitant l’activation de la RIPK3. Tandis que l’extinction de la RIPK1 dans le foie montre qu’elle n’est pas indispensable à l’homéostasie hépatique (Filliol et al. 2016). Cependant dans un contexte hépatique inflammatoire, elle empêche l’apoptose des hépatocytes médiée par le TNF-α indépendamment de sa fonction kinase (Filliol et al. 2016, 2017). De plus, au cours du développement embryonnaire, la RIPK1 joue un rôle anti-inflammatoire critique en empêchant l’induction de la nécroptose (Dillon et al. 2014; Kaiser et al. 2014; Newton et al. 2016b; Lin et al. 2016). Les fonctions de survie, d’inflammation ou de mort médiées par la RIPK1 dépendantes donc de son activité, des voies de signalisation activées, de l’environnement cellulaire (stress ou inflammation) et du tissu.

2) RIPK3 La RIPK3 est une protéine qui engage vers la mort cellulaire (Moriwaki and Chan 2013; Newton 2015) ; elle est exprimée dans de nombreux tissus. Elle est constituée d’un domaine kinase (KD) N-terminal et d’un domaine C-terminal contenant le motif d’interaction protéine- protéine nommé RHIM (a RIP homotypic interaction motif) (Figure 11).

Figure 11. Domaines protéiques de la kinase RIPK3 humaine (issu de Moriwaki and Chan 2013). K50 (lysine 50), résidu crucial au sein du site de fixation de l’ATP ; P-S199 et P-S227, sites d’auto-phosphorylation ; D328, site de clivage par la caspase 8. Abréviation : RHIM, a RIP homotypic interaction motif.

RIPK3 peut être adressée à différents compartiments cellulaires : au noyau lors de la nécroptose (par sa séquence NLS, nuclear localization signal), dans le cytoplasme (par ses deux séquences NES, nuclear export signal) ou à la mitochondrie lors de l’apoptose (Kasof et al. 2000; Yang et al. 2004; Yoon et al. 2016). RIPK3 est faiblement exprimée dans de nombreux tissus (rate, cerveau, thymus, poumon, cœur, foie, rein, intestin grêle, côlon, testicules et muscle) ; de plus, elle est différentiellement exprimée entre l’Homme ou la souris (Honarpisheh et al. 2016). Elle est détectée chez la souris à l’aide d’un anticorps monoclonal par immunohistochimie dans les cellules de Kupffer ou macrophages résidents du foie (Dara et al. 2015; Günther et al. 2016), les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques (Dara et al. 2015) et les cellules épithéliales intestinales (Newton et al. 2016a). Chez l’Homme, elle est détectée au cours de l’inflammation en immunohistochimie à l’aide d’un anticorps polyclonal dans les biopsies du foie de patients atteints d’hépatites diverses

(Gautheron et al. 2014; Afonso et al. 2015), dans les lymphocytes T CD8+ de patients atteints du VIH (Gaiha et al. 2014), dans les cellules épithéliales du poumon lors de bronchites pulmonaires chroniques obstructives (Mizumura et al. 2014), dans les biopsies cérébrales de patients atteints sclérose en plaque (Ofengeim et al. 2015), au cours des maladies inflammatoires du côlon (Pierdomenico et al. 2014) et dans les kératinocytes lors de l’érythrodermie bulleuse avec épidermolyse (Kim et al. 2015). RIPK3 est un substrat de la caspase 8 lors de l’apoptose induite par le TNF-α ; elle peut être clivée au niveau de l’aspartate 328 (Asp328) (Feng et al. 2007) (Figure 11). La surexpression de la kinase RIPK3 conduit à l’activation de la caspase 8 (Sun et al. 1999; Yu et al. 1999; Pazdernik et al. 1999; Kasof et al. 2000) lors de l’absence ou de l’inactivation des cIAP1/2 E3 ubiquitines ligases (Vince et al. 2012). La RIPK3 assure la bascule de l’apoptose vers la nécroptose (Zhang et al. 2009). L’activité kinase de la RIPK3 joue un rôle clef dans la nécroptose lors de l’engagement des récepteurs de mort de la superfamille du TNF tels que TNFR1, TRAIL-R4/R5, Fas/CD95 (Cho et al. 2009; Zhang et al. 2009; He et al. 2009), du DAI (Upton et al. 2012), des TLR-3 ou TLR-4 (He et al. 2011; Kaiser et al. 2013 a) ou encore des interférons (Thapa et al. 2013; Dillon et al. 2014; Kaiser et al. 2014) (Figure 12). La kinase RIPK3 est activée suite à son autophosphorylation sur le résidu Ser199 nécessaire à la phosphorylation de la kinase RIPK1 (Cho et al. 2009) (Figure 11). Il existe cinq inhibiteurs de son activité kinase et de la nécroptose dépendante de RIPK3 : trois composés GSKs (le GSK’840 spécifique de la RIPK3 humaine, le GSK’843 et le GSK’872), le GW’39 et le dabrafenib (Chapitre V. partie B). La séquence RHIM de la RIPK3 (Figure 11) permet son interaction et son recrutement par la RIPK1 (Sun et al. 1999; Yu et al. 1999) favorisant la phosphorylation de cette dernière lors de l’activation de la RIPK3 (Sun et al. 2002) et formant ainsi un complexe protéique indispensable à l’activation de la nécroptose (He et al. 2009). La phosphorylation du résidu Ser227 de la RIPK3 humaine (Thr231/Ser232 de la RIPK3 murine) est indispensable au recrutement de son substrat, la pseudokinase MLKL, formant ainsi le complexe « nécrosome » inducteur de la nécroptose (Sun et al. 2012; Chen et al. 2013; Cai et al. 2013). Lors de la nécroptose, le RHIM conduit au changement de la conformation de la RIPK3 responsable de la formation de filaments amyloïdes (Li et al. 2012). Différents travaux ont montré que l’intégrité du domaine RHIM est indispensable à la nécroptose (He et al. 2009), à la formation du ripoptosome (Li et al. 2012) et à l’activation de l’inflammasome NLRP3 (Moriwaki and Chan 2016) dépendantes de RIPK3. Les mutants RIPK3 K51A, RIPK3 D143N ou RIPK3 D161G dépourvus d’activité kinase in vitro n’induisent pas l’apoptose. Cependant l’ajout d’inhibiteurs de la famille GSK sur des lignées cellulaires RIPK3 K51A, RIPK3 D143N ou RIPK3 D161G ou RIPK3 wild type conduit à une apoptose par un mécanisme dépendant du domaine RHIM, permettant le recrutement du complexe RIPK1/FADD/cFLIPL/caspase 8 (Mandal et al. 2014). La kinase inactive RIPK3 D161N provoque une apoptose spontanée in vitro et la mort in utero des souris RIPK3D161N d’une apoptose massive dirigée par la caspase 8 et la RIPK1 (Newton et al. 2014) ; tandis que les souris RIPK3K51A (kinase inactive) sont viables et fertiles (Mandal et al. 2014). La mutation D161N altèrerait la conformation de RIPK3 ; le domaine RHIM pourrait alors être accessible pour RIPK1 afin d’initier une apoptose (Zhang and Chan 2014a). Le domaine kinase et le domaine RHIM de RIPK3 collaboreraient donc afin de réguler l’apoptose et la nécroptose.

RIPK3 joue également un rôle proinflammatoire indépendant de son activité kinase. En effet, l’expression de la RIPK3 est nécessaire pour la régulation de l’activité de la caspase 8 lors de la maturation et la sécrétion de l’IL1-β dans les BMDCs (Bone Marrow-derived Dendritic Cells) stimulés par le LPS (Moriwaki et al. 2015; He et al. 2013). La maturation de la pro-IL1-β médiée par la RIPK3 nécessite la formation et l’activation de l’inflammasome et du ripoptosome (Feoktistova et al. 2011; Tenev et al. 2011; Maelfait et al. 2008). Lorsque la caspase 8 est inactivée par zVAD, le ripoptosome recrute la MLKL au sein du complexe grâce à l’activité kinase de la RIPK3 afin d’assurer la sécrétion de l’IL-1β lors de la stimulation des TLR3/4 (Lawlor et al. 2015). De même, lors de l’inactivation de la caspase 8, la RIPK3 ainsi que RIPK1 et MLKL sont essentielles pour l’assemblage de l’inflammasome NLRP3 induit par la stimulation du TLR3. Tandis que celui- ci peut être activé indépendamment de RIPK3 par RIPK1, FADD et caspase 8 lors de la stimulation du TLR3 par le Poly(I :C) (Kang et al. 2015a). Les fonctions du nécrosome, du ripoptosome et de l’inflammasome NLRP3 sont interconnectées mais non-interchangeables. RIPK3 ne joue pas un rôle vital au cours du développement car les souris déficientes en RIPK3 (RIPK3KO) sont viables et fertiles (Newton et al. 2004; Mandal et al. 2014). Son rôle dans l’activation de NF-ĸB a été exclu puisque les souris déficientes en RIPK3 ne présentent aucune altération du niveau d’activation de NF-ĸB en aval du signal TNF (Newton et al. 2014). Cependant il a été démontré que RIPK3 joue un rôle crucial dans l’expression de cytokines dépendante de l’activation NF-ĸB par le LPS indépendamment du rôle de RIPK1; en effet, la translocation nucléaire de certaines sous-unités (hétérodimères RelB-p50) de NF-ĸB est dépendante de l’expression de RIPK3 dans les BMDCs murins stimulés par le LPS (Moriwaki et al. 2014). De plus, la fonction kinase de RIPK3 ne joue pas non plus un rôle vital puisque les souris exprimant la kinase inactive RIPK3K51A, RIPK3D161G ou RIPK3D143N sont viables (Mandal et al. 2014). Pourtant les souris exprimant la kinase inactive RIPK3D161N meurent in utero d’une apoptose massive prévenue par la perte simultanée de la RIPK1 et de la caspase 8 (Newton et al. 2014). D’où l’hypothèse selon laquelle la mutation D161N de la RIPK3 pourrait favoriser l’accès du RHIM à la kinase RIPK1 pour initier l’apoptose (Zhang and Chan 2014). En effet, le blocage de la nécroptose dû à la perte de RIPK3 ou de son substrat MLKL bascule la mort cellulaire vers une apoptose (Remijsen et al. 2014). Selon une étude récente, l’activation de MLKL pourrait être, dans certains cas, indépendante de l’activité de la RIPK3 (Günther et al. 2016) (Figure 12). La surexpression de la RIPK3 est aujourd’hui proposée comme outil dans la détection de la nécroptose dans les biopsies de patients atteints de pathologies inflammatoires (revu dans Vanden Berghe et al. 2016). RIPK3 semble être une cible de choix dans le traitement de certaines pathologies inflammatoires nécrotiques telles que le syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS) induit par le TNF responsable de lésions intestinales (Duprez et al. 2011; Newton et al. 2016a), les lésions ischémiques du rein (Linkermann et al. 2012; Linkermann et al. 2013b; Newton et al. 2016a) et l’infarctus du myocarde (Luedde et al. 2014; Newton et al. 2016a).

Figure 12. Vue générale des voies de signalisation responsables de la nécroptose (adapté de Jouan-Lanhouet et al. 2014).

3) RIPK2 La RIPK2, également appelée RICK (RIP-like-interacting caspase-like apoptosis-regulatory protein (CLARP) kinase) ou encore CARDIAK (caspase-recruitment domain (CARD)- containing IL-1β converting enzyme (ICE)-associated kinase) est exprimée dans de nombreux tissus. RIPK2 est composée d’un domaine kinase N-terminal, un domaine intermédiaire (ID) et un domaine CARD C-terminal (Figure 7). Elle interagit avec différents membres de la famille TRAF : les TRAF1, TRAF2, TRAF5 et TRAF6 (McCarthy et al. 1998; Thome et al. 1998) nécessaires à la production de cytokines. Lorsqu’elle est surexprimée, RIPK2 interagit également avec les protéines anti-apoptotiques cFLIP et cIAP1 ou XIAP (Inohara et al. 1998; McCarthy et al. 1998; Thome et al. 1998; Bertrand et al. 2009; Damgaard et al. 2012; Krieg et al. 2009) ainsi que la caspase 1 pro- inflammatoire via leurs domaines CARD respectifs (Martinon and Tschopp 2004). L’interaction RIPK2-caspase 1 promeut la maturation de l’IL-1β et augmente l’activité de la caspase 8 responsable de la mort programmée dépendante des récepteurs de mort (Martinon and Tschopp 2004). Elle a été montrée comme fortement impliquée dans l’activation de NF-ĸB et de l’apoptose induite par la caspase 8 suite à l’engagement des récepteurs de mort, TNFR1 et Fas (Inohara et al. 1998; McCarthy et al. 1998; Thome et al. 1998). RIPK2 joue ainsi un rôle protecteur crucial

23 au cours de l’inflammation et l’immunité innée et adaptative dépendante de la voie du NF-ĸB, du TNF-α et de la voie des NOD1 et NOD2 indépendamment des TLRs (Park et al. 2007). Les NODs sont des récepteurs cytosoliques des dérivés bactériens de type peptidoglycanes, fortement exprimés dans les épithéliums muqueux. La caspase 12 clive RIPK2 afin d’empêcher la stimulation de NOD2 (LeBlanc et al. 2008) ce qui conduit à une réponse anti-microbienne défectueuse. Les macrophages déficients en RIPK2 montrent une altération dans la production de cytokines induite par les interleukines IL-1 et IL-18 et aux ligands respectifs des TLR-4, -2 et -3 suivants: LPS, acides lipotéichoiques et Poly(I:C) (Kobayashi et al. 2002). Les souris RIPK2 déficientes sont viables mais présentent une immunité défectueuse ; elles souffrent d’infections bactériennes respiratoires (Balamayooran et al. 2011; Shimada et al. 2009). De plus, une signalisation NOD défectueuse est associée à la maladie de Crohn (Hugot et al. 2001; Ogura et al. 2001; Hampe et al. 2001). A l’opposé, de forts taux de RIPK2 sont délétères et responsables d’une inflammation non contrôlée. Les souris RIPK2 déficientes résistent ainsi au choc septique induit par le LPS (Chin et al. 2002; Kobayashi et al. 2002). L’hyperexpression de RIPK2 lors de la production d’IFNs de type I, par exemple, conduit à la surexpression des NOD1 et NOD2 conduisant à une réponse inflammatoire exagérée (Kim et al. 2011). Cette inflammation est alors due à l’engagement de la voie NOD responsable de l’activation des voies NF-ĸB et MAPKs : JNK et ERK2 suite à l’ubiquitination de RIPK2 permettant le recrutement de la TAK1 et du complexe IKK, de façon similaire à la RIPK1 lors du signal TNF (Figure 8) (Windheim et al. 2007; Abbott et al. 2007; Yang et al. 2007; Hasegawa et al. 2008). L’expression de RIPK2 est fortement augmentée chez les patients atteints de sclérose en plaque (Satoh et al. 2005). Les NOD1, NOD2 et RIPK2 joue un rôle critique dans le développement de cette pathologie chez la souris (Shaw et al. 2011). De plus, la perte de RIPK2 semble atténuer l’inflammation dans un modèle d’allergie respiratoire (Goh et al. 2013). Son activité kinase n’est pas nécessaire à l’activation de NF-ĸB ni de JNK (Thome et al. 1998) mais nécessaire à l’activation de ERK2 (Navas et al. 1999) et à sa propre stabilité (Nembrini et al. 2009; Windheim et al. 2007). Une étude dans un modèle d’ischémie cardiaque a montré que RIPK2 participe à l’activation de la MAPK p38, aggravant ainsi la pathologie (Jacquet et al. 2008).

4) RIPK4 La RIPK4 humaine fut d’abord identifiée dans un système double hybride et nommée DIK (pour « PKC-delta-interacting protein kinase ») (Bhr et al. 2000). Son orthologue murin nommé PKK interagit avec la PKC-β (Chen et al. 2001). Son domaine kinase N-terminal, homologue à celui des autres membres de la famille RIP, est lié par une région intermédiaire à une région C- terminale formée de 11 régions ankyrines (Figure 7) (Holland et al. 2002; Meylan et al. 2002; Muto et al. 2002). RIPK4 est largement décrite comme nécessaire à la différenciation des kératinocytes lors de la formation d’une couche cornée (Holland et al. 2002). Les souris RIPK4 déficientes meurent rapidement après la naissance à cause de la fermeture de leurs orifices externes ; elles sont dépourvues de couche cornée et présentent des membres postérieurs et une queue raccourcie

(Holland et al. 2002). RIPK4 interagit avec la PKC afin de réguler la voie de signalisation de la PKC modulant ainsi la différenciation et l’inflammation cutanée (Rountree et al. 2010). RIPK4 est phosphorylée par les kinases MEKK-2 et MEKK-3 (Moran et al. 2003). L’étude de souris transgéniques surexprimant une forme inactive de RIPK4 dans les cellules lymphoïdes montre que son activité kinase est nécessaire à la génération des progéniteurs des lymphocytes B et à la prolifération des lymphocytes B dépendante du BCR (B-Cell receptor) (Cariappa et al. 2003). RIPK4 est responsable de l’activation de la voie NF-ĸB via IKKα/β (Inhibitor of Kappa B kinase α/β) et de la voie JNK-AP1 (Meylan et al. 2002; Muto et al. 2002) (Figure 8). Lors de l’apoptose, le clivage de RIPK4 par des caspases au niveau des résidus Asp340 et Asp378 génère des fragments C-terminaux. Ceux-ci agissent comme des dominants négatifs de la protéine et bloquent l’activité pro-NF-ĸB de RIPK4 (Meylan et al. 2002). De plus, le phénotype des souris déficientes en RIPK4 est similaire à celui des souris déficientes en IKKα (Hu et al. 1999; Li et al. 1999; Takeda et al. 1999), suggérant une cascade de signalisation commune.

5) RIPK5, RIPK6, RIPK7 Trois autres protéines ont rejoint la famille des RIPKs (Meylan and Tschopp, 2005). La kinase SgK288 (Sugen kinase 288) baptisée RIPK5 partage 35% d’homologie avec RIPK4 à travers son domaine kinase N-terminal et des régions ankyrines en C-terminal (Figure 7). La surexpression de RIPK5 provoque une apoptose (Zha et al. 2004). A l’heure actuelle, la fonction physiologique de RIPK5 reste inconnue. Les kinases LRRK1 et LRRK2 furent nommées respectivement RIPK6 et RIPK7. Ces deux RIPKs sont riches en régions leucines suivies d’un domaine Roc/COR (Ras of complex proteins/C-terminal of Roc) et du domaine kinase. RIPK6 contient également des régions ankyrines en N-terminal ; elle est activée par la liaison du GTP au domaine Roc (Figure 7). RIPK6 participe au trafic intracellulaire du récepteur à l’EGF (Hanafusa et al. 2011). RIPK6 a été récemment impliquée dans la régulation de l’orientation du fuseau mitotique, essentielle pour le développement tissulaire et l’homéostasie (Hanafusa and Matsumoto 2015). RIPK7 contient quant à elle un domaine WD40 en C-terminal. Leur ressemblance structurelle suggère des fonctions communes. En effet, RIPK6 et RIPK7 sont impliquées dans la maladie de Parkinson (Zimprich et al. 2004; Paisán-Ruíz et al. 2004; Greggio and Singleton 2007; Haugarvoll et al. 2007; Gandhi et al. 2009; Seol 2010). RIPK7 est fortement exprimée dans le tissu cérébral où elle joue un rôle important dans la libération des neurotransmetteurs ainsi que la maintenance et la croissance des neurones. La neurotoxicité de RIPK7 mutée dans le domaine COR (Y1699C) provient de l’exacerbation de son activité kinase, l’altération de sa fonction GTPase et la séquestration des vésicules synaptiques par son domaine WD40 (Greggio et al. 2006; Smith et al. 2006; Haugarvoll et al. 2007; Lewis et al. 2007; Jorgensen et al. 2009; Piccoli et al. 2014). RIPK7 mutée phosphoryle les MEKK3, -4, -6, -7 en amont des p38 et JNK (Gloeckner et al. 2009), impliquées dans le stress oxydatif, la neurotoxicité et l’apoptose. RIPK7 joue également un rôle dans le système immunitaire et dans certaines pathologies telles que les maladies inflammatoires de l’intestin (Liu et al. 2011; Liu and Lenardo 2012; Vora and

McGovern 2012), certains cancers comme le mélanome (Agalliu et al. 2015; Bandmann and Cookson 2012; Hassin-Baer et al. 2009) ou encore la lèpre (Marcinek et al. 2013). Les derniers travaux concernant la RIPK7 proposent la détection dans les tissus ou les fluides biologiques (urines, sang, ou liquide céphalo-rachidien) de fort taux de RIPK7 ou la détection de la protéine déphosphorylée comme outil de diagnostic ou comme biomarqueur du cancer (Nichols et al. 2010; Fraser et al. 2016; Wang et al. 2017).

B. Le rôle des RIPK1/3 dans la survie, la mort cellulaire et l’inflammation Au cours de la dernière décennie, la contribution des RIPK1/3 dans le devenir cellulaire a été étudiée au cours de l’inflammation et dans différents modèles de mort. La complexité de leur rôle respectif a été mise en évidence dans des lignées cellulaires et des souris génétiquement déficientes.

1) Le rôle des RIPK1/3 dans la signalisation des ligands des récepteurs de mort Les ligands de la superfamille du TNF comptent 19 membres dont le TNF-α, le TRAIL et le FasL, les plus décrits dans la littérature. Ces derniers conduisent à différents types de morts cellulaires dans un contexte inflammatoire tel que les infections virales ou bactériennes, les lésions tissulaires, les maladies inflammatoires ou auto-immunes ainsi que les pathologies dégénératives ou cancéreuses.

a) La signalisation du TNF-α/TNFR1 La découverte du TNF par William Coley et al. en 1893 a indirectement mis en évidence le potentiel thérapeutique anti-tumoral de cette cytokine grâce à l’utilisation d’un mélange d’extraits bactériens pour le traitement de tumeurs (Coley 1991; revu dans Balkwill 2009). Le TNF ne fut isolé qu’en 1975 par Carswell et al. qui identifièrent sa capacité à provoquer la nécrose hémorragique dans les tumeurs malignes murines (Carswell et al. 1975). Les travaux d’Aggarwal et al. dans les années 1980 ont permis d’isoler le TNF humain et de déterminer sa séquence protéique (Aggarwal et al. 1985). Ces dernières données ont rapidement permis à la société Genentech et à l’équipe de Fiers et al. de cloner le gène du TNF humain et murin (Pennica et al. 1985; Marmenout et al. 1985; Fransen et al. 1985). Il n’a cependant pas pu être utilisé pour ses propriétés anti-tumorales du fait de ses propriétés pro-inflammatoires observées lors d’un choc septique induit par l’administration du TNF-α recombinant. Par la suite, plusieurs groupes ont choisi de neutraliser le TNF-α afin de maîtriser l’inflammation dans de nombreuses pathologies pro-inflammatoires (Madhusudan et al. 2004; Feldmann 2008). Cette cytokine joue un rôle pléiotropique clef au cours d’une inflammation chronique ou aigüe. Suite à la stimulation du TNFR1, elle provoque différentes réponses cellulaires en fonction du type de cellules : la survie, la prolifération, la différenciation, l’élimination du pathogène ou la mort cellulaire.

Figure 13. Signalisations engagées par le récepteur TNFR1 suite à la fixation du TNF-α (issu de Dondelinger et al. 2016) Abréviations : IĸBα-SR: dominant négatif d’IĸBα; CHX: cycloheximide, inhibiteur de la traduction; Act.D: actinomycine D, inhibiteur de la transcription.

Différents complexes cytosoliques sont à l’origine du devenir cellulaire en aval de l’engagement du TNFR1 : le complexe I pro-survie, les complexes pro-apoptotiques IIa et IIb et le complexe nécrosome (qui est également nommé le complexe IIc) (Figure 13). L’activité de la caspase 8 ainsi que la phosphorylation et l’ubiquitination de la RIPK1 jouent un rôle déterminant dans l’issue de la signalisation du TNFR1.

Le complexe I La fixation du TNF-α sur son récepteur TNFR1 permet le recrutement intracellulaire de la protéine adaptatrice TRADD et de la RIPK1 via les interactions homotypiques de leurs domaines de mort respectifs (Olivier Micheau and Tschopp 2003). Ce complexe I contenant TRADD permet le recrutement de TRAF2 et/ou TRAF5. TRAF2 via son domaine CIM (cIAP interaction motif) interagit avec les E3 ubiquitines ligases, cIAP1 et cIAP2 (Inhibitor of Apoptosis Protein) (Vince et al. 2009; Haas et al. 2009) qui vont ubiquitinyler les composants du complexe I tels que RIPK1 et cIAP1 (Park et al. 2004; Bertrand et al. 2008; Mahoney et al. 2008; Varfolomeev et al. 2008; Dynek et al. 2010; Gerlach et al. 2011). Les chaînes d’ubiquitines générées par cIAP1/2 permettent l’interaction du complexe LUBAC composé de HOIP, HOIL-1 et SHARPIN. Ce complexe possède également

27 une activité de type E3 ubiquitine-ligase (Haas et al. 2009; Gerlach et al. 2011; Ikeda et al. 2011; Tokunaga et al. 2011) (Figure 13). Une fois activé, le complexe LUBAC ajoute de nouvelles chaines d’ubiquitines sur RIPK1, NEMO, TRADD et TNFR1 (Haas et al. 2009; Gerlach et al. 2011; Tokunaga et al. 2009; Smit et al. 2012; Draber et al. 2015). Ces protéines ubiquitinées servent de plateforme pour le recrutement des complexes TAB2/3/TAB1/TAK1 et NEMO/IKKα/IKKβ (complexe IKK, Inhibitor of Kappa B Kinase). Leur interaction est respectivement assurée par les protéines TAB2/3 et NEMO qui possèdent des domaines d’interaction avec les ubiquitines (Wang et al. 2001; Kanayama et al. 2004; Ea et al. 2006; Wu et al. 2006). L’activité de la kinase TAK1 permet la phosphorylation et l’activation des MAPKs (JNK, p38 et ERK) et de la kinase IKKβ activant ainsi le complexe IKK (Figure 13). IKKβ phosphoryle à son tour IĸBα ce qui conduit à la polyubiquitination puis à la dégradation de IĸBα par le protéasome (Brown et al. 1995; Lin et al. 1995; Spencer et al. 1999; Winston et al. 1999). IĸBα séquestre et inactive le facteur de transcription NF-ĸB dans le cytosol. Sa dégradation est alors responsable de l’activation et la translocation nucléaire de NF- ĸB. La formation du complexe I permet ainsi l’activation rapide de NF-ĸB par le TNF afin de permettre l’expression de gènes cibles dont plusieurs protéines anti-apoptotiques tels que cFLIP, TRAF1, TRAF2, cIAP1 et cIAP2 (Wang et al. 1998; Micheau et al. 2001). Elle permet aussi d’induire l’expression et l’activation de déubiquitinases (DUBs) telles que A20 et Cezanne afin d’empêcher l’hyperactivation de la voie NF-ĸB (Enesa et al. 2008; Wertz et al. 2004). L’activité de l’E3 ubiquitine ligase, Pellino3, cible la RIPK1 et bloque la formation du complexe II (Yang et al. 2013). De plus, IKKα/IKKβ empêchent le recrutement de la RIPK1 dans le complexe IIb en phosphorylant RIPK1 au sein du complexe I entraînant l’inhibition des morts dépendantes de RIPK1, apoptose et nécroptose (Dondelinger et al. 2015). Ce rôle inhibiteur de la RIPK1 phosphorylée est indépendant de l’activation de NF-ĸB (Dondelinger et al. 2015).

Les complexes IIa, IIb et nécrosome/complexe IIc

En général, la fixation du TNF-α sur le TNFR1 est insuffisante pour conduire à la mort cellulaire. Elle permet la formation du complexe I membranaire, l’ubiquitination de la RIPK1 et l’activation des voies NF-ĸB et MAPKs (Figure 13). La RIPK1 au sein de ce complexe est essentielle au signal NF-ĸB, pro-survie ou pro-inflammatoire ; elle intervient par sa fonction d’échafaudage via son domaine intermédiaire indépendamment de son domaine d’activité kinase (Hsu et al. 1996; Ting et al. 1996; Kelliher et al. 1998). Les protéines anti-apoptotiques exprimées en quantité suffisante empêchent l’activation des complexes cytosoliques IIa et IIb, responsables de l’apoptose. En effet, la formation transitoire des complexes II ne conduit pas à la mort cellulaire si la transcription des gènes pro-survie induite par le complexe I permet l’expression suffisante de protéines anti-apoptotiques notamment la protéine cFLIP, une protéine homologue de la caspase 8, ou la protéine TRAF2 (Wang et al. 1998; Micheau et al. 2001). Le signal NF-ĸB peut être inhibé in vitro par l’inhibition de NF-ĸB, l’expression d’un dominant négatif d’IĸBα (IĸBα-SR) ou l’utilisation d’inhibiteurs de la transcription

(actinomycine D) ou de la traduction (cycloheximide, CHX) au profit d’un signal de mort cellulaire lors de l’activation du TNFR1 par le TNF-α (Van Antwerp et al. 1996; Rubin et al. 1988). Dans ces conditions, les complexes cytoplasmiques secondaires s’assemblent quand TRADD se dissocie du complexe I et s’associe à FADD dans le cytosol (Micheau and Tschopp 2003). La protéine FADD recrute alors la caspase 8 pour permettre son activation initiant l’apoptose (Figure 13) (Wang et al. 2008; Wilson et al. 2009; Salvesen and Walsh 2014). De plus, l’activité de la caspase 8 bloque le signal NF-ĸB en clivant la RIPK1 (Micheau and Tschopp 2003). Une autre manière d’induire l’apoptose par le TNF est l’inhibition des E3 ubiquitine ligases cIAP1/2 (par des petites molécules smac-mimétiques) ou la perte d’activité du complexe LUBAC conduisant à la formation accrue de complexes II (Bertrand et al. 2008; Wang et al. 2008). En effet, le défaut d’ubiquitination de la RIPK1 au sein du complexe I favorise la formation des complexes II (Wilson et al. 2009; Ea et al. 2006; O’Donnell et al. 2007).

Le complexe IIa ou traddosome est un complexe pro-apoptotique formé en absence d’activité NF-ĸB, indépendamment de l’activité kinase de RIPK1. Ce complexe est composé des protéines TRADD, FADD et caspase 8 (Figure 13). Le complexe pro-apoptotique IIb est lui formé par les protéines RIPK1, FADD et caspase 8 en l’absence de cIAP1/2 ou de LUBAC. Sa formation et son activité dépendent de l’activité kinase de la RIPK1 (Wang et al. 2008; Gentle et al. 2011; Dondelinger et al. 2013) (Figure 13). Les complexes IIa et IIb nécessitent le recrutement de FADD et l’activation de la caspase 8 pour initier l’apoptose (Vercammen et al. 1998; Oberst et al. 2011 a, 2011 b; O’Donnell et al. 2011; Dillon et al. 2012).

Le complexe pro-nécrotique IIc ou nécrosome est composé de la RIPK1, de la RIPK3 et de MLKL phosphorylées (Sun et al. 2012). Si la caspase 8 est inactive ou inhibée, la nécroptose assure la mort cellulaire via le complexe IIc (Figure 13). L’apoptose prévient donc de la nécroptose induite par le TNF-α (Feng et al. 2007; Lin et al. 1999; O’Donnell et al. 2011; Kaiser et al. 2011; Oberst et al. 2011). Ces morts sont mutuellement exclusives. L’activation de la déubiquitinase CYLD (cylindromatosis) favorise l’apoptose et la nécroptose dépendantes de l’activité kinase de la RIPK1 (Draber et al. 2015). De plus, CYLD a été montrée in vitro et in vivo comme nécessaire à la déubiquitination de la protéine TRAF2 qui va se dissocier de MLKL afin de permettre l’activation de la nécroptose induite par le TNF-α (Petersen et al. 2015). L’induction de la nécroptose est inhibée par l’activation de la caspase 8 qui peut cliver CYLD, RIPK1 et RIPK3 (O’Donnell et al. 2011; Vercammen et al. 1998; Lin et al. 1999; Holler et al. 2000; Feng et al. 2007). Tandis que la déubiquitinase A20 inhibe à la fois la signalisation NF-ĸB et l’induction de l’apoptose ou de la nécroptose par le TNF (Vanlangenakker et al. 2011b; Opipari et al. 1992; Vereecke et al. 2010). In vitro, les conditions qui empêchent l’activation des kinases IKKα/IKKβ par l’inhibition de la kinase TAK1 ou des kinases IKKα/IKKβ sensibilisent les cellules à l’apoptose et à la nécroptose dépendantes de l’activité kinase de la RIPK1 (Figure 13) (Dondelinger et al. 2013, 2015; Legarda-Addison et al. 2009; O’Donnell et al. 2012; Arslan and Scheidereit 2011; Morioka et al. 2014). La nécroptose, voie de mort cellulaire de secours

La nécroptose induite par les récepteurs de la superfamille du TNF est initiée seulement lors de la formation cytosolique du nécrosome. Ce dernier est formé lorsque la capacité d’homodimérisation et d’autoclivage de la caspase 8 est compromise sinon l’activité de la caspase 8 conduit à une apoptose extrinsèque par défaut. C’est pourquoi la nécroptose a longtemps été décrite comme initiée par le recrutement de la RIPK3 au complexe inactif RIPK1/FADD/caspase 8 suggérant que le nécrosome était alors formé à partir d’un complexe IIb inactif. Actuellement, il est admis que le complexe RIPK1/RIPK3/MLKL est formé en parallèle du complexe IIb (Sun et al. 2012). Ce modèle nécessite cependant d’être clarifié quant au lien entre le complexe IIb et le nécrosome. RIPK1-autophosphorylée (Ser14/15, Ser166 hRIPK1 ou Ser14/15 mRIPK1) et RIPK3 phosphorylée (Ser227 hRIPK3 ou Ser231/Ser232 mRIPK3) s’associent via leur domaine RHIM pour former des oligomères qui favorisent des événements de trans-phosphorylation directe ou indirecte entre RIPK1 et RIPK3 à l’origine de la nécroptose (Cho et al. 2009; He et al. 2009; Zhang et al. 2009). Cependant, à l’heure actuelle, il n’a pas encore été démontré que RIPK1 est un substrat de RIPK3. La nécroptose est cependant caractérisée par l’activation de la kinase RIPK3 (Kaiser et al. 2013 b; Moriwaki and Chan 2013), indispensable au recrutement de la pseudokinase MLKL (mixed lineage kinase-domain like) responsable de la perméabilisation de la membrane plasmique (Sun et al. 2012) et du relargage de composants intracellulaires pro- inflammatoires (Kaczmarek et al. 2013). RIPK3-phosphorylée interagit transitoirement avec MLKL (Chen et al. 2013; McQuade et al. 2013; Xie et al. 2013 b); cette dernière n’a pas d’activité kinase mais elle lie l’ATP (Sun et al. 2012; Murphy et al. 2013). RIPK3 phosphoryle MLKL sur les résidus Thr357 et Ser358 chez l’Homme (Sun et al. 2012) ou les résidus Ser345, Ser347, Thr349 et Ser352 chez la souris (Xie et al. 2013 b) conduisant à la formation d’homotrimères de la pseudokinase qui transloquent à la membrane indispensable au bon déroulement de la nécroptose par la perméabilisation de la membrane plasmique. De plus, l’interaction RIPK3-MLKL conduit à l’exposition de la queue N-terminale de MLKL chargée positivement qui peut interagir avec les phospholipides membranaires (Murphy et al. 2013; Cai et al. 2013; Chen et al. 2014). Certaines études montrent que MLKL pourrait déclencher un influx cytoplasmique de Ca2+ ou de Na+ et rompre ainsi l’homéostasie osmotique (Cai et al. 2013; Chen et al. 2014). D’autres équipes émettent l’hypothèse de l’implication des oligomères de MLKL dans l’activation massive d’enzymes telle que la NADPH oxidase 1 (NOX1), responsable de l’oxydation de la membrane plasmique lors de la nécroptose (Kim et al. 2007). Les kinases RIPK3 et RIPK1 semblent ubiquitinées à des niveaux différents au sein du nécrosome (Moquin et al. 2013; Onizawa et al. 2015; de Almagro et al. 2015). Cependant il existe encore un débat concernant les E3 ubiquitine ligases impliquées au cours de la nécroptose. cIAP1/2 ne seraient pas impliquées tandis que HOIP y participerait en partie (de Almagro et al. 2015). De plus, MLKL peut se lier à TRAF2 ce qui pourrait réguler la fonction pro-nécrotique de MLKL indépendamment de la fonction ubiquitine ligase de TRAF2 (Hornbeck et al. 2012; Petersen et al. 2015). La perte de CYLD protège de la nécroptose et corrèle avec un niveau élevé d’ubiquitination de la RIPK1 au sein du complexe I (Draber et al. 2015; O’Donnell et al. 2011; Vanlangenakker et al. 2011a; Moquin et al. 2013). La perte d’A20 quant à elle favorise la polyubiquitination de RIPK3 au sein du nécrosome et sensibilise ainsi à la nécroptose (Onizawa et al. 2015). L’ubiquitination de la RIPK1 activée sur la Lys115 permet l’assemblage du

30 nécrosome. De plus, l’ubiquitination de la RIPK1 au sein du nécrosome est indépendante de la RIPK3 et de MLKL et est importante pour maintenir son activité kinase pour l’induction de la nécroptose (de Almagro et al. 2017).

b) La signalisation du TRAIL-R1/R2 (DR4/DR5) TRAIL est une cytokine de la superfamille du TNF (Wiley et al. 1995; Pitti et al. 1996). Son expression est ubiquitaire ; cependant elle est majoritairement exprimée à la surface des cellules activées de l’immunité innée et adaptative telles que les monocytes, les macrophages, les cellules NK, les NKT, les cellules dendritiques et les cellules de Kupffer (Manzo et al. 2009). Elle peut aussi être exprimée à la membrane de la plupart des cellules dans un contexte pro-inflammatoire (Saitou et al. 2005). TRAIL est largement connue pour sa capacité à induire sélectivement la mort des cellules tumorales ou transformées dans un contexte physiologique. Ce ligand se lie à cinq récepteurs différents : deux récepteurs de mort contenant un domaine de mort fonctionnel (DD pour « Death Domain ») TRAIL-R1/DR4 et TRAIL-R2/DR5 capables d’induire la mort de la cellule ainsi que deux récepteurs leurres TRAIL-R3/DcR1 et TRAIL-R4/DcR2 et un récepteur soluble, l’ostéoprotégérine (OPG) (LeBlanc and Ashkenazi 2003). DR4 et DR5 sont tous deux exprimés chez l’Homme tandis que seul DR5 est exprimé chez la souris (Wu 2009).

Le complexe I ou DISC Le DISC ou complexe I est associé à la membrane plasmique suite à la fixation de TRAIL sur les récepteurs agonistes, TRAIL-R1 et TRAIL-R2. Il est composé de TRAIL, TRAIL-R1, TRAIL-R2, FADD et des procaspases 8 ou 10 (Figure 13). La dimérisation des procaspases conduit à leur auto-activation par clivage au sein du DISC. Les homodimères de caspases 8 matures sont alors libérés du DISC et remplacées par de nouvelles molécules de procaspases 8. Seule la caspase 8 activée libérée dans le cytosol peut à son tour activer les caspases effectrices - 3, -6 et -7 et induire une apoptose extrinsèque (Sprick et al. 2002; Wang and El-Deiry 2003; Thorburn 2004; Manzo et al. 2009) responsable d’un bourgeonnement membranaire et de la fragmentation de l’ADN, les signes caractéristiques de l’apoptose.

Cependant, en présente d’inhibiteurs de l’apoptose tel que XIAP, l’apoptose est assurée par l’activation de la voie intrinsèque dépendante de la caspase 8 activée et d’acteurs mitochondriaux (Figure 14) (Gillissen et al. 2013; Ndozangue-Touriguine et al. 2008; Vogler et al. 2008; Wilson et al. 2009). Les récepteurs leurres TRAIL-R3 et TRAIL-R4 peuvent également bloquer l’induction du signal apoptotique. En effet, la formation du DISC est bloquée par l’interaction TRAIL/TRAIL-R3 ; alors que le recrutement de TRAIL-R4 avec TRAIL-R2 au sein du DISC empêche le recrutement de TRAIL-R1 et l’activation des caspases 8 et 10 (Mérino et al. 2006).

Figure 14. Complexes moléculaires formés lors de la fixation de TRAIL sur les récepteurs TRAIL-R1/R2 (issu de Shirley et al. 2011).

Les voies non-apoptotiques associées au complexe II L’inhibition de la formation du DISC ou de l’activation de la caspase 8 orienterait le signal TRAIL vers les voies non-apoptotiques de prolifération et de survie dépendante de NF-ĸB et des MAP kinases p38, ERK1/2 et JNK (Varfolomeev et al. 2005) (Figure 14). Un complexe II se forme alors à partir du complexe I (DISC) et devient cytosolique afin d’activer les voies de survie responsables de la sécrétion de cytokines notamment l’IL-8 et l’expression de la protéine anti-apoptotique FLIP. Le complexe II est composé de FADD, la procaspase 8, RIPK1, TRAF2, NEMO, IKK et TRADD (Varfolomeev et al. 2005; Jin and El-Deiry 2006). La protéine FLIP exprimée en quantité suffisante peut alors être recrutée dans le DISC et former des hétérodimères avec la procaspase 8 empêchant ainsi sa maturation et l’induction de l’apoptose (Tsuchiya et al. 2015) (Figure 14). La protéine TRAF2 a également été démontrée comme inhibitrice de l’apoptose induite par TRAIL dans les lignées cellulaires HaCaT et HeLa et dans des kératinocytes humains en culture primaire (Karl et al. 2014).

Il est important de noter que la voie du TNF-α reste la voie majeure d’activation de NF-ĸB ; cependant l’activation de NF-ĸB par TRAIL pourrait favoriser la migration et l’invasion tumorale (Ishimura et al. 2006; Fingas et al. 2010). Des fonctions de différenciation cellulaire associées à l’activation des MAPKs ont été attribuée à TRAIL notamment dans les cellules intestinales (Rimondi et al. 2006), les myoblastes du muscle squelettique (O’Flaherty et al. 2006; Freer-Prokop et al. 2009), les ostéoclastes (Yen et al. 2008), les cellules T helper (Zhang et al. 2003) et les cellules dendritiques (Cho et al. 2010).

La voie intrinsèque ou mitochondriale Selon le type cellulaire, l’induction de l’apoptose par TRAIL nécessite l’activation de la voie intrinsèque mitochondriale (Ozören and El-Deiry 2002) (Figure 14). La caspase 8 active clive alors la protéine Bid en une forme tronquée appelée tBid ; cette dernière est transloquée à la membrane mitochondriale. tBid/Bax/Bak entraînent la dépolarisation mitochondriale et le relargage de molécules pro-apoptotiques comme le cytochrome-c (Cyt-c), SMAC et HtrA2/Omi (Jin and El-Deiry 2005). Le Cyt-c favorise l’apoptose grâce à la formation de l’apoptosome responsable de l’activation de la caspase 3 (Bratton et al. 2001) (Figure 14). Tandis que SMAC et HtrA2/Omi bloquent l’action des IAPs. On parle de cellules de type II pour les lignées cellulaires qui nécessitent l’activation de la voie intrinsèque pour l’induction de l’apoptose dépendante des récepteurs de mort (Scaffidi et al. 1998; Schmitz et al. 1999). Dans ce cas, la quantité faible de caspase 8 activée ne permettant pas la formation efficace du DISC, l’activation de la caspase 3 nécessite alors l’intervention de la mitochondrie afin d’amplifier le signal apoptotique. La surexpression de Bcl-2 et de Bcl-xL ou la perte de Bax/Bak dans ce type de cellules peut empêcher l’induction de l’apoptose par la voie extrinsèque par opposition aux cellules de type I. Dans les cellules de type I, la voie extrinsèque suffit à l’induction de l’apoptose.

La nécroptose induite par TRAIL L’inhibition des caspases par l’inhibiteur pan-caspases (zVAD) au cours d’un signal TRAIL oriente vers la nécrose indépendante des caspases et dépendante de la RIPK1 dans la lignée humaine Jurkat (Holler et al. 2000) et la lignée humaine U937 (Dunai et al. 2012). FADD, RIPK1, RIPK3 et MLKL sont également nécessaires pour l’induction de cette nécrose régulée (Holler et al. 2000; He et al. 2009; Dunai et al. 2012). He et al. ont mis en évidence que l’activité kinase de RIPK3 est indispensable à l’induction de la nécroptose dans la lignée humaine d’adénocarcinome du côlon HT29 traitée par TRAIL/zVAD/Smac-mimétiques (He et al. 2009). Dunai et al. ont démontré le rôle de l’activité de la kinase RIPK1 et de la pseudokinase MLKL grâce à l’utilisation de leurs inhibiteurs respectifs, Nec-1 et NSA dans la lignée humaine U937 traitée par le zVAD (Dunai et al. 2012). Plusieurs groupes ont mis en évidence que la protéine TRAF2 inhibe la nécroptose induite par TRAIL in vitro dans les lignées cellulaires HaCaT et HeLa et dans des kératinocytes humains en culture primaire (Karl et al. 2014) et in vivo chez la souris (Petersen et al. 2015). Une autre étude a montré l’existence d’une nécrose régulée par

TRAIL dépendante de l’activation des caspases dans la lignée murine d’adénocarcinome de la prostate TRAMP-C2 (Kemp et al. 2003). D’autres travaux ont montré que le pH extracellulaire acide, caractéristique de certaines pathologies inflammatoires ou le cancer, peut être responsable de la transition de l’apoptose vers la nécrose induite par TRAIL et dépendante de la RIPK1 dans des lignées humaines d’adénocarcinome du côlon HT29 ou d’hépatocarcinome HepG2 (Meurette 2005; Meurette et al. 2007) ou la lignée murine MEF (Jouan-Lanhouet et al. 2012). Cette nécroptose induite par TRAIL à pHe acide est responsable d’une déplétion en ATP intracellulaire médiée par les kinases RIPK1 et RIPK3 responsables de l’activation de la PARP-1 in vitro et in vivo (Jouan- Lanhouet et al. 2012).

c) La signalisation du Fas (CD95)

L’interaction FasL/Fas (CD95L/CD95) entraîne l’activation puis l’agrégation du récepteur Fas (CD95) à la membrane plasmique ainsi que la formation du complexe DISC (Kischkel et al. 1995). Le DISC ou complexe I est composé du couple ligand/récepteur, de FADD, de la procaspase 8 et de la procaspase 10 (Muppidi et al. 2006) (Figure 15). La dimérisation des procaspases permet leur activation, leur clivage puis leur libération dans le cytoplasme où elles pourront activer la caspase 3 (Figure 15). La protéine anti-apoptotique c-FLIP pourrait également être recrutée au sein du DISC par FADD avec la procaspase 8 (Krueger et al. 2001) afin de réguler l’activation des caspases et l’induction de la mort (Irmler et al. 1997; Scaffidi et al. 1999). Ceci expliquerait l’échappement de certaines tumeurs aux traitements qui ciblent la voie extrinsèque (Shirley et al. 2011). Le récepteur Fas peut également conduire à l’activation de la voie intrinsèque dite mitochondriale en présence de la protéine anti-apoptotique XIAP grâce à la surexpression des protéines pro-apoptotiques Bcl2 et BclXL (Muppidi et al. 2006; Jost et al. 2009) (Figure 15). Fas peut aussi induire l’apoptose en interagissant avec les protéines adaptatrices Daxx et RIPK1, indépendamment de sa liaison avec FADD (Stanger et al. 1995). Daxx recrute ASK1 qui active JNK (Chang et al. 1998) et RIPK1 lie RAIDD (Duan and Dixit, 1997). Cependant la perte de RIPK1 n’affecte pas l’apoptose induite par son ligand, FasL (Holler et al., 2000). RIPK1 via le recrutement de TRADD, TRAF2 et des cIAP1/2 au niveau du DISC participe à la survie cellulaire par l’activation de la voie NF-ĸB (Varfolomeev et al. 1996; Cullen et al. 2013). Lors d’un signal FasL, RIPK1 associée au DISC permet aussi l’activation des MAPKs p38 et ERKs (Kreuz et al. 2004; Siegmund et al. 2007) (Figure 15). La forme clivée du FasL (cl-FasL) ou le FasL soluble peuvent également conduire à la formation d’un complexe de motilité (MISC) responsable de la migration cellulaire des cellules tumorales dans les cancers du sein triple-négatifs (Malleter et al. 2013). Ce complexe est responsable de l’activation de la voie PI3K/Akt dépendante de l’activation du canal calcique ORAI-1 lors d’un signal FasL (Khadra et al. 2011; Malleter et al. 2013). Lors d’un signal Fas/FasL, FADD est indispensable au déclenchement de la nécroptose (Holler et al. 2000) (Figure 15). En effet, l’activation de la nécroptose en l’absence d’activité caspase est médiée par le recrutement de la RIPK1 au sein du DISC dans la lignée humaine Jurkat traitée par FasL/zVAD±CHX (Holler et al. 2000; Degterev et al. 2005). He et al. ont démontré que l’activité de la kinase RIPK3 est indispensable au déclenchement de la 34 nécroptose dans la lignée humaine HT29 traitée par FasL/zVAD/Smac-mimétiques (He et al. 2009) (Figure 15). Des travaux ont mis en évidence que l’isoforme FLIPs sensibilise à la nécroptose induite par le FasL tandis que l’isoforme cFLIPL bloque cette voie de mort. En effet, les hétérodimères de caspase 8-FLIPL s’associent au DISC ou avec les complexes RIPK1-RIPK3 cytosoliques afin de cliver ou d’inactiver RIPK1 et RIPK3 (Tsuchiya et al. 2015; Geserick et al. 2009; Oberst et al. 2011) et, par la suite, l’activation de MLKL, substrat de la RIPK3, nécessaire à l’exécution de la nécroptose (Sun et al. 2012) (Figure 15). Tandis que d’autres travaux ont démontré le rôle inhibiteur de TRAF2 lors de l’apoptose et de la nécroptose induites par FasL dans des kératinocytes humains en culture primaire (Karl et al. 2014) et in vivo chez la souris (Petersen et al. 2015).

Figure 15. Voies de signalisation de l’apoptose et de la nécroptose induites par FasL (modifié de O’ Reilly et al. 2016).

Très peu d’études ont élucidé la voie de signalisation impliquée dans la nécroptose provoquée par les récepteurs TRAIL-R1, TRAIL-R2 et Fas. Pourtant, il est communément admis que le déclenchement de la nécroptose médié par TNF-α, TRAIL et FasL (Holler et al. 2000) est contrôlé par la formation et l’activation d’un complexe commun RIPK1-RIPK3-MLKL, appelé nécrosome. En effet, la nécroptose est déclenchée par un complexe multi-protéique issu de l’interaction de différents acteurs via leur domaine RHIM (RIP Homotypic Interaction Motif) et indispensable au recrutement et à l’activation de la pseudokinase MLKL (revu dans Zhang et al. 2016). De nombreux travaux ont récemment mis en évidence l’existence d’un nécrosome indépendant de la RIPK1 (Rebsamen et al. 2009; Upton et al. 2012; Kaiser et al. 2013b; Dillon et al. 2014). Dans ce cas, le nécrosome est formé suite au recrutement de RIPK3 par un partenaire possédant un domaine RHIM (TRIF ou DAI) permettant ainsi l’activation de MLKL par la RIPK3. La

35 nécroptose peut aussi être induite par la simple dimérisation de RIPK1 et/ou de la dimérisation ou de l’oligomérisation de RIPK3 responsable de l’oligomérisation de MLKL (Cook et al. 2014; Orozco et al. 2014; Wu et al. 2014) ou par l’activation de MLKL indépendamment de RIPK3 (Günther et al. 2016). Il ne semble donc pas exister de voie canonique de la nécroptose. Les mécanismes de mort nécrotique programmée semblent résulter de la biodisponibilité et du niveau d’expression des différents acteurs de mort.

2) Le rôle des RIPK1/3 dans la nécrose indépendante des récepteurs de mort La tumorigenèse et la surveillance immunitaire sont influencées par le mode de mort cellulaire. Certaines molécules naturelles ou dérivées telles que l’étoposide et la shikonine sont capables de provoquer une mort programmée de certaines cellules cancéreuses résistantes à l’apoptose. Elles offrent ainsi de nouvelles perspectives pour la thérapie anti-cancéreuse grâce à la mise en évidence de certains mécanismes de mort dépendants des RIPKs. Dans un contexte immunitaire, la mort cellulaire et l’inflammation jouent aussi des rôles primordiaux dans la destruction des niches de pathogènes infectieux lors de la défense de l’hôte. Des travaux récents ont montré l’importance de la nécroptose dépendante des RIPKs suite à l’engagement des PRRs au cours de l’immunité anti-virale ou anti-bactérienne (Kaiser et al. 2013b; Mocarski et al. 2014; Mocarski et al. 2015). Ainsi lors des nécroses régulées, le relargage de signaux de danger (DAMPs) suite à la rupture de la membrane plasmique joue le même rôle que les PAMPs extracellulaires dans l’amplification de la réponse inflammatoire et de l’immunité (Mocarski et al. 2014).

a) Nécrose régulée et anti-cancéreux L’étoposide, une molécule anti-cancéreuse inhibitrice de l’ADN-topoisomérase II, stimule la formation du ripoptosome. Cette molécule est responsable de l’accumulation de dommages à l’ADN qui génère un stress génotoxique. Le ripoptosome provoque alors l’apoptose ou la nécroptose des cellules cancéreuses, même en présence de fort taux de la protéine anti- apoptotique Bcl-2 (Tenev et al. 2011). Ce complexe multiprotéique cytosolique est composé de la RIPK1, de FADD et de la caspase 8 auxquelles peuvent s’ajouter cFLIP ou RIPK3 en fonction du type cellulaire et du stimulus (Tenev et al. 2011; Feoktistova et al. 2011; Feoktistova et al. 2016). Le ripoptosome est similaire au complexe II formé lors de la signalisation du TNF (Micheau and Tschopp 2003; Wang et al. 2008; Bertrand and Vandenabeele 2011). Cependant, il se forme spontanément indépendamment de l’activation de la voie intrinsèque mitochondriale ou de la voie des récepteurs de mort (TNF- α, TRAIL ou FasL) lorsque les E3 ubiquitine ligases cIAP1/2 sont absentes et en présence de fort taux de RIPK1 (Tenev et al. 2011; Feoktistova et al. 2011). En effet, un stress génotoxique va conduire à de faibles taux intracellulaires de XIAP et cIAP1/2 favorables à l’assemblage de ce complexe. In vitro, ce complexe se forme suite à un traitement par les smac-mimétiques sans production autocrine de TNF ou grâce à la surexpression de la RIPK1 (Tenev et al. 2011; Schilling et al. 2014). L’activité kinase de la RIPK1 est indispensable pour la formation de ce complexe (Tenev et al. 2011). Ainsi cFLIP et les IAPs sont des régulateurs négatifs de la mort induite par ce complexe puisqu’ils provoquent l’ubiquitylation et la dégradation de ses différents composants notamment la RIPK1 (Feoktistova et al. 2011).

La shikonine (naphtoquinone), extraite des herbes médicinales chinoises, est une molécule naturelle anti-cancéreuse prometteuse pour lutter contre certains cancers primaires résistants aux chimiothérapies actuelles tels que les ostéosarcomes, les gliomes, les myélomes multiples et les cancers du sein (Fu et al. 2013; Huang et al. 2013; Wada et al. 2015; Shahsavari et al. 2016). Cette molécule naturelle pourrait induire la mort des cellules cancéreuses par nécroptose (Hu et al. 2007; Han et al. 2007) en favorisant la synthèse des kinases RIPK1 et RIPK3 (Fu et al. 2013). De plus, cette mort nécrotique dépendante de la concentration de shikonine peut être inhibée par un inhibiteur de la RIPK1, la Nec-1 (Fu et al. 2013) ou par un inhibiteur de la RIPK3, le GSK’872 (Zhou et al. 2017). La shikonine est responsable de l’activation de la RIPK1 et de la RIPK3 qui participent à la dégradation de la chromatine et aux cassures doubles brins de l’ADN via l’augmentation de la production de ROS intracellulaires (Zhou et al. 2017).

b) Nécroptoses et infections virales La détection d’acides nucléiques viraux est cruciale pour l’immunité antivirale. L’effet cytopathique d’une cellule hôte infectée par un virus à ARN double brin est fréquemment dû à l’apoptose (Galluzzi et al. 2008). Cependant la nécroptose permet aussi de lutter contre l’évasion de certains virus à l’apoptose et à la pyroptose. Ainsi, la possibilité d’induire une nécroptose serait une adaptation de l’hôte à l’évolution (Humphries et al. 2015; Silke et al. 2015). Au cours de l’infection par un pathogène, les membres de la famille des TLRs sont sensibles à des PAMPs différents (Gay et al. 2014). Les récepteurs TLR3 et TLR4 lient respectivement les ARN doubles brins intracellulaires ou le LPS extracellulaire. Il est important de noter que l’engagement des TLR3, localisés dans les endosomes, nécessite la formation d’autophagosomes pour permettre le transfert des ARN double brins cytosoliques vers les endosomes intracellulaires des cellules infectées. TLR3/4 activent alors directement l’apoptose ou, lors d’un défaut d’activité caspase, la nécroptose en guise de secours (Kalai et al. 2002; Zhang et al. 2009; He et al. 2011; Kaiser et al. 2011) (Figure 16). En l’absence d’activité caspase 8, les TLR3/4 activent la nécroptose en recrutant la protéine adaptatrice TRIF qui via son domaine RHIM est indispensable à l’activation de la RIPK3 (He et al. 2011; Kaiser et al. 2013b) indépendamment de la RIPK1 (Guo et al. 2015; Mocarski et al. 2015). La RIPK3 ainsi activée conduit au recrutement de MLKL pour former le nécrosome, complexe cytosolique responsable de l’activation de MLKL (Chan et al. 2015) (Figure 16). De plus, les TLRs peuvent également provoquer la nécroptose des cellules infectées de façon indirecte (via le TNFR1) puisque le TNF-α est produit suite à l’engagement du TLR3 et de RIG-I (Retinoic acid-Inducible Gene I), un second senseur viral intracellulaire (Rajput et al. 2011; Kaiser et al. 2013a). C’est le cas du virus de l’herpès murin MHV68 qui conduit à la nécroptose dépendante du TNF via l’activation de la protéine du réticulum endoplasmique STING (stimulator of interferon genes) (Schock et al. 2017). Certains travaux ont mimé une infection virale à ARN double brin dans des macrophages de types BMDMs en traitant des souris par des interférons (IFNs) en combinaison avec du Poly(I:C) (He et al. 2011). Ces macrophages meurent d’une nécroptose impliquant les protéines TRIF et RIPK3 sans intervention de la RIPK1 (Cavassani et al. 2008; He et al. 2011). De plus, les souris RIPK3KO ne parviennent pas à contrôler la réplication du virus de la vaccine (Cho et al. 2009). Ces données montrent que la nécroptose initiée par la détection des particules virales via TRIF est indispensable à la lutte anti-virale.

Lors de l’infection virale, les ADN viraux peuvent également provoquer une nécroptose via l’activation de la protéine senseur DAI/ZBP1 dont l’expression est induite par la production d’IFNs de type I (α/β) (Upton et al. 2012). L’activation de cette voie va ainsi bloquer la réplication virale (Upton and Chan 2014). Suite à la détection d’ADN viraux cytoplasmiques, DAI peut interagir avec la RIPK3 par leurs domaines RHIM respectifs et permettre la formation d’un nécrosome constitué par DAI, RIPK3 et MLKL qui va déclencher la nécroptose grâce à l’activation de la RIPK3 (Upton et al. 2012) (Figure 16). En effet, la nécroptose permet aux cellules infectées de lutter contre la réplication de certains virus à ADN double brin. Par exemple, le MCMV (murine cytomegalovirus) est capable de synthétiser des inhibiteurs de la caspase 8 (Kaiser et al. 2011). Chez l’Homme, certains virus tel que le virus de la vaccine, le virus de la variole, le virus de l’herpès humain 8 également appelé virus du sarcome de Kaposi (HHV8 ou KSHV) et le virus MCV (Molluscum Contagiosum Virus) activent la nécroptose grâce à la production de protéines inhibitrices de l’activation des caspases (Dobbelstein and Shenk 1996; Wasilenko et al. 2003; Gerlic et al. 2013). Les interférons ont un fort pouvoir antiviral et cytotoxique au cours de l’infection. Les IFN de type I (α/β) et de type II () sont, par exemple, capables d’induire la nécroptose dépendante de l’activation de la kinase PKR (RNA-responsive protein kinase) (Figure 16). Lorsque FADD est phosphorylée (Ser191) ou son expression réprimée ou encore lorsque la caspase 8 est inactivée, le signal IFN active la transcription de PKR qui ensuite interagit avec RIPK1 pour initier la formation du nécrosome RIPK1-RIPK3 et déclencher la nécroptose (Thapa et al. 2013). De plus, l’assemblage de ce complexe est indépendant de l’activité de la kinase RIPK1 et nécessite la transcription des protéines Jak1/STAT1 (Thapa et al. 2013).

Certains virus échappent naturellement à la nécroptose, ce mécanisme de secours dans l’élimination des virus. Le cytomégalovirus murin (MCMV) produit un inhibiteur viral de l’activation des RIPKs, le vIRA ou M45, compétitif du domaine RHIM ainsi qu’un inhibiteur de la caspase 8, le M36, bloquant ainsi respectivement la nécroptose et l’apoptose afin de bloquer l’inflammation et d’assurer sa réplication chez l’hôte (Upton et al. 2008; Upton et al. 2012; Daley-Bauer et al. 2017). Certains virus de l’herpès produiraient également des inhibiteurs viraux compétiteurs du RHIM qui ciblent les RIPKs afin d’échapper à cette stratégie cellulaire anti-virale (Kaiser et al. 2008; Mocarski et al. 2015).

Figure 16. Schéma général des différents nécrosomes responsables d’une nécrose régulée (issu de Zhang et al. 2016c).

C. La détection de la nécrose régulée : les marqueurs actuels In vitro dans diverses lignées cellulaires et in vivo dans plusieurs modèles précliniques, des biomarqueurs de l’exécution de la nécroptose peuvent être mis en évidence : l’activation de RIPK1 et/ou de la RIPK3 suite à leur phosphorylation sur des sites spécifiques, l’interaction RIPK3-MLKL, la formation d’un nécrosome RIPK1-RIPK3-MLKL ou TRIF-RIPK3-MLKL ou encore DAI-RIPK3-MLKL ainsi que la phosphorylation, l’oligomérisation et la translocation membranaire de MLKL. Pour se faire, on dispose d’anticorps fonctionnels pour la détection des protéines analysées par westerns blots ou pour leurs immunoprécipitations. Certains anticorps reconnaissent des sites de phosphorylation caractéristiques de l’activation de la RIPK1 : l’anti-phospho-Ser14/15 hRIPK1/mRIPK1 et l’anti-phospho-Ser166 hRIPK1 (Ofengeim et al. 2015; Berger et al. 2015), de la RIPK3 : l’anti-phospho-Ser227 hRIPK3 et l’anti-phospho-Ser232 mRIPK3 (Li et al. 2015; Meng et al. 2015) et de la MLKL : l’anti-phospho-Thr357/Ser358 hMLKL et l’anti-phospho- Ser358 mMLKL (Wang et al. 2014b; Meng et al. 2015) (Tableau 1). On dispose également de sondes biosenseurs pour détecter l’interaction entre RIPK1 et RIPK3 basée sur un transfert d’énergie entre sondes fluorescentes (FRET) utilisables en microscopie en temps réel ou en microscopie électronique dans des cellules vivantes (Sipieter et al. 2014). Pour l’analyse de biopsies issues de modèles murins ou de patients atteints de pathologies nécrotiques, on dispose de deux anticorps qui reflètent l’activation de la kinase RIPK3. Ceux-ci sont utilisables en immunohistochimie sur des coupes de tissus murins (l’anti-phospho-Ser232 mRIPK3) ou de tissus humains (l’anti-phospho-Thr357/Ser358 hMLKL).

L’anticorps anti-phospho-Ser232 de la RIPK3 murine a permis de montrer dans un modèle d’athérosclérose une élévation de la nécroptose dans les plaques d’athérome (Meng et al. 2015). Pour le diagnostic chez l’Homme, la nécroptose ou la prédisposition à celle-ci est détectée par une augmentation de la transcription et/ou de la traduction de RIPK1, RIPK3 et MLKL dans les tissus (Tableau 1). Seul un anticorps qui cible la forme phosphorylée de la pseudokinase MLKL humaine, l’anticorps monoclonal anti-phospho-Thr357/Ser358 MLKL, est disponible actuellement pour l’immunohistochimie. Il a été testé dans des tissus humains issus de patients atteints de pathologies nécrotiques aigües ou chroniques. Un fort marquage de la forme phosphorylée de MLKL (pMLKL) a été mis en évidence par Wang et al. en 2014 dans des biopsies provenant du foie de patients atteints d’hépatite aigüe induite par la consommation excessive de paracétamol (acétaminophène). Günther et al. ont, quant à eux, montré un fort marquage de pMLKL dans des biopsies de foie de patients atteints d’hépatite autoimmune (Günther et al. 2016). De même, l’activation de la nécroptose a également été montrée par cet anticorps dans des biopsies cérébrales de patients atteints de sclérose en plaques, maladie dégénérative du système nerveux central (Ofengeim et al. 2015). Une autre étude a corrélé le taux d’expression de RIPK3 avec la sévérité de l’hépatite chronique induite par la surconsommation de glucides et de lipides, ou d’alcool, ou induite par une infection par le virus de l’hépatite B ou C (Afonso et al. 2015). Ces outils permettent d’identifier les pathologies inflammatoires chroniques ou aigües qui résistent à la nécroptose ou qui activent cette voie de mort au cours de l’initiation ou de l’aggravation de l’inflammation.

Modèles de pathologies Résistance à la nécroptose Références Cancer ovarien Faible taux de MLKL associé à un mauvais He et al. 2013 pronostic Cancer du sein Très faible expression de RIPK3 due à la Koo et al. 2015 méthylation de son promoteur Mélanome Perte de la RIPK3 Geserick et al. 2015 Leucémie Faible expression de la RIPK3 Nugues et al. 2014 Modèles/Biopsies humaines Marqueur de la nécroptose Références Stéatose hépatique non Niveaux élevés de hRIPK3 Gautheron et al. 2014 alcoolique (NASH) et de phospho Thr357/Ser358 hMLKL Afonso et al. 2015 Stéatose du foie alcoolique Souris RIPK3 KO protégées de la pathologie. Roychowdhury et al. 2013 (ASH) Niveaux élevés de hRIPK3 corrélés à la sévérité Afonso et al. 2015 de la fibrose Hépatite aigüe induite par Protection par Nec-1 chez la souris. Takemoto et al. 2014 l’acétaminophène siRNA mRIPK3 ou RIPK3 KO protecteurs. Ramachandran et al. 2013 Inhibition de mRIPK3 protectrice. Li et al. 2014 MLKL KO non protecteur. Günther et al. 2016 Marquage phospho Thr357/Ser358 hMLKL Wang et al. 2014a Hépatite autoimmune Forts taux de hRIPK1, hMLKL et de phospho Günther et al. 2016 Thr357/Ser358 hMLKL Hépatites B et C Fort taux de hRIPK3 Afonso et al. 2015 Virus de l’immunodéficience Les lymphocytes T CD8+ non prolifératifs issus Gaiha et al. 2014 humaine (VIH) de patients expriment hRIPK3 et meurent par nécrose lors de leur stimulation antigénique Bronchite pulmonaire Niveaux élevés de hRIPK3 dans les cellules Mizumura et al. 2014 chronique obstructive épithéliales pulmonaires Sclérose en plaque Niveaux élevés de hRIPK1 et hRIPK3. Ofengeim et al. 2015 Formation du nécrosome au niveau des lésions Maladies inflammatoires du Forts taux de hRIPK3 et hMLKL Pierdomenico et al. 2014 côlon Erythrodermie bulleuse avec Fort taux de hRIPK3 et de phospho-hMLKL Kim et al. 2015 épidermolyse dans les kératinocytes et les sections de peau des patients Psoriasis Diminution de l’inflammation par un inhibiteur Harris et al. 2017 de la RIPK1 dans des explants de peau Tableau 1 – Mise en évidence de certains marqueurs de la nécrose régulée dans les pathologies humaines

D. Rôle des RIPK1 et RIPK3 dans le développement embryonnaire murin Les travaux réalisés à l’aide de modèles murins génétiquement modifiés ont permis de réaliser de grandes avancées dans la compréhension de la signalisation moléculaire à l’origine de la nécroptose (Tableau 2). Cette voie de mort joue un rôle primordial dans le développement embryonnaire, l’homéostasie tissulaire, l’immunité et l’inflammation puisque l’extinction des régulateurs négatifs de la nécroptose (caspase 8 et FADD) conduit à un phénotype létal ou à des troubles inflammatoires. Les premières observations faites lors de la perte de la caspase 8, de FADD ou de FLIP, acteurs de l’apoptose extrinsèque, conduisant au même phénotype létal, ont permis de suggérer leur rôle respectif dans l’inhibition d’une mort non apoptotique. Les souris déficientes en caspase

8 (Casp8-/-), en FADD (Fadd-/-) ou en FLIP (Cflar-/-) meurent à 10,5 jours in utero de problèmes cardiaques (Varfolomeev et al. 1998; Yeh et al. 1998; Yeh et al. 2000). Le croisement des souris Ripk3-/- avec les souris Casp8-/- ou Fadd-/- permet leur survie (Kaiser et al. 2011; Oberst et al. 2011; Zhang et al. 2011; Dillon et al. 2012), ce qui suggère que l’activation de la caspase 8 dépendante de FADD clive la kinase RIPK3 et empêche son activation à ce stade de développement embryonnaire. Ceci met en avant l’implication de la RIPK3 dans cette mort cellulaire et la pertinence de cette mort non apoptotique in vivo. Les souris déficientes en RIPK1 (Ripk1-/-) meurent 3 jours après la naissance d’une apoptose des thymocytes et des adipocytes et présentent un œdème dû à une inflammation systémique (Kelliher et al. 1998; Rickard et al. 2014). Ces observations démontrent que la perte de RIPK1 est délétère pour l’organisme. Leur croisement avec les souris Fadd-/- ou Casp8-/- empêche la létalité embryonnaire de la perte de caspase 8 ou FADD. Cependant, les souris Ripk1-/- Fadd-/- et Ripk1-/- Casp8-/- meurent dans les heures qui suivent la naissance (Zhang et al. 2011; Dillon et al. 2014; Rickard et al. 2014; Kaiser et al. 2014). Des travaux ont montré que la mortalité au stade embryonnaire 10,5 (E10,5) des souris Casp8-/-est due à la signalisation du TNFR1 puisque la délétion des gènes Tnfr1 dans ces souris permet le développement fœtal seulement jusqu’au stade embryonnaire E16,5 (Dillon et al. 2014). La nécroptose serait activée par l’engagement du TNFR1 à ce stade de développement. Les souris qui expriment une forme inactive de la RIPK1 (RIPK1D138N ou RIPK1K45A) sont viables (Kaiser et al. 2014; Newton et al. 2014). Les lignées cellulaires issues de ces souris sont résistantes aux signaux nécroptotiques et/ou apoptotiques. De plus, elles ne présentent pas de défaut d’activation de la voie NF-ĸB et produisent les mêmes taux de cytokines en réponse au TNF que les cellules wild-type (Kaiser et al. 2014; Newton et al. 2014). Ces résultats mettent en évidence que la fonction kinase de la RIPK1 n’est pas indispensable à la vie de l’organisme. La mort post-natale des souris Ripk1-/- pourraient être due à une apoptose excessive ou une nécroptose. Cependant, trois équipes ont montré que la perte de la caspase 8 n’empêche pas la mort périnatale des souris Ripk1-/- (Dillon et al. 2014; Rickard et al. 2014; Kaiser et al. 2014) tandis que les souris Casp8-/- Ripk3-/- sont viables (Oberst et al. 2011; Kaiser et al. 2011). De plus, les souris Ripk3-/- (Newton et al. 2004) et les souris Mlkl-/- (Wu et al. 2013; Murphy et al. 2013) sont également viables suggérant l’implication exclusive de la nécroptose dans la mort périnatale des souris Ripk1-/-. Les souris Ripk3-/- et Ripk3-/- Fadd-/- sont également viables alors que les souris Ripk1-/-, Ripk1-/- Fadd-/- et Ripk1-/- Casp8-/- meurent après la naissance (Kelliher et al. 1998; Newton et al. 2004; Dillon et al. 2014; Rickard et al. 2014; Kaiser et al. 2014). RIPK1 possède donc un rôle de survie contrairement à RIPK3. Ce rôle protecteur de la RIPK1 est renforcé par l’observation de la viabilité des souris exprimant une kinase RIPK1 inactive (RIPK1D138N ou RIPK1K45A). De plus, la délétion de la RIPK1 dans certains tissus tels que l’intestin (Ripk1IEC-KO), l’épiderme (Ripk1E-KO) ou le foie (Ripk1LPC-KO) montre que la RIPK1 joue un rôle crucial dans l’homéostasie de certains tissus grâce à sa fonction pro-survie. En effet, la RIPK1, indépendamment de sa fonction kinase, bloque l’apoptose dépendante de FADD et de la caspase 8 dans les cellules épithéliales intestinales ainsi que la nécroptose dépendante de la RIPK3 dans les kératinocytes (Dannappel et al. 2014; Takahashi et al. 2014). La délétion de la RIPK1 dans les cellules parenchymateuses hépatiques (RIPK1LPC-KO) sensibilise les hépatocytes à une

42 apoptose massive induite par le TNF-α et amplifie la production de cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IFN- et IL-6) dans un contexte d’hépatite immuno-induite par la ConA (Filliol et al. 2016). Les souris RIPK1K45A ou les souris traitées par la Nec-1s sont, quant à elles, protégées de cette hépatite (Filliol et al. 2016; Günther et al. 2016). Ces travaux mettent en évidence le rôle anti-inflammatoire et anti-apoptotique de la RIPK1 dans la survie des hépatocytes lors de l’hépatite ainsi que l’implication de son activité kinase dans la nécroptose des hépatocytes. Les souris Ripk1-/- Ripk3-/- ainsi que les souris Ripk1-/- Mlkl-/- survivent plus longtemps que les souris Ripk1-/- mais meurent à quelques jours de vie d’une inflammation intestinale due à l’apoptose excessive des cellules épithéliales intestinales (Dillon et al. 2014; Rickard et al. 2014). De plus, la perte de TNFR1 retarde la mort des souris Ripk1-/- Ripk3-/- suggérant que le TNF-α participe au signal apoptotique (Dillon et al. 2014). Par contre, les souris Ripk1-/- Ripk3-/- Casp8-/- et Ripk1-/- Ripk3-/- Fadd-/- survivent mais présentent des troubles lymphoprolifératifs après plusieurs mois (Dillon et al. 2014; Kaiser et al. 2014; Rickard et al. 2014). Il faut noter que les souris déficientes en RIPK3 ou mutées Ripk3K51A, Ripk3D161G ou Ripk3D143N sont viables à l’exception des souris RIPK3D161N qui meurent au stade E10.5. Cette mutation permettrait l’accessibilité à la RIPK1 du domaine RHIM de la RIPK3 mutée entraînant une mort par apoptose (Zhang and Chan, 2014). La RIPK1 semble jouer un rôle vital rapidement après la naissance grâce à sa fonction anti-apoptotique, indépendante de sa fonction kinase, afin de maintenir l’intégrité du tissu intestinal (Dillon et al. 2014; Kaiser et al. 2014). Les souris Ripk1-/- Tnfr1-/- meurent après la naissance or cette mort est retardée par la perte de TRIF ou de IFNAR (Dillon et al. 2014). Ces observations suggèrent que TNF et TRIF sont partiellement responsables de la mort des souris déficientes en RIPK1. De plus, la viabilité des souris Ripk1-/- Ripk3-/- Tnfr1-/- met en évidence le rôle de la RIPK3 dans le décès des souris Ripk1-/- Tnfr1-/- (Dillon et al. 2014). Cette mort dépendante de RIPK3 mais indépendante de RIPK1 induite par TRIF ou les IFNs joue un rôle dans la mort des souris Ripk1-/-. Il s’agirait d’une nécroptose puisque la mort des souris Ripk1-/- est retardée par la délétion de la RIPK3 ou de MLKL (Dillon et al. 2014; Rickard et al. 2014). Les données in vitro valident cette hypothèse car les cellules RIPK1-/- sont sensibles à la nécroptose en réponse au Poly(I :C) ou aux IFNs (Dillon et al. 2014). Des travaux récents confirment ces observations grâce aux souris Ripk1RHIM/RHIM qui permettent de mettre en évidence que RIPK1 via son domaine RHIM empêche l’interaction ZBP1-RIPK3 de provoquer la nécroptose dans le thymus et la peau responsable de la mort des souris après la naissance. En effet, les souris Ripk1RHIM/RHIM meurent d’une inflammation dans le thymus, d’une hyperplasie et d’œdèmes cutanés ainsi que d’une inflammation abdominale et d’anomalies hépatiques (Newton et al. 2016b ; Lin et al. 2016). Ainsi la perte du domaine RHIM de la RIPK3 ou de son activité kinase (RIPK3 D161N) prévient la mort de ces souris ainsi que la perte de la RIPK3 ou de son substrat MLKL ou encore de son interactant ZBP1 (Newton et al. 2016b). RIPK1 joue donc un rôle anti-nécroptotique critique lors du développement en empêchant la formation du complexe ZBP1/RIPK3/MLKL.

Génotype Viable Observations Références Tnfr1-/- Oui Troubles immunitaires Pfeffer et al. 1993 Tnf-/- Oui Aucune anomalie Pasparakis et al. 1996 Casp8-/- Non Mort à E10.5 in utero Varfolomeev et al. 1998 Casp8-/- Ripk3-/- Oui Accumulation massive de lymphocytes Oberst et al. 2011 Kaiser et al. 2011 Weng et al. 2014 Casp8-/- Tnfr1-/- Non Mort à E16.5 in utero Dillon et al. 2014 Fadd-/- Non Mort à E10.5 in utero Zhang et al. 1998 Yeh et al. 1998 Fadd-/- Ripk3-/- Oui Troubles lymphoprolifératifs sévères Dillon et al. 2012 Fadd-/- Tnfr1-/- Non Mort à E16.5 in utero Dillon et al. 2014 Cflar-/- Non Mort à E10.5 in utero Yeh et al. 2000 Cflar-/- Tnfr1-/- Non Mort à E16.5 in utero Dillon et al. 2014 Ripk1-/- Non Mort à 3 jours de vie d’une défaillance Kelliher et al. 1998 multi-organes du fait de l’activation Rickard et al. 2014 systémique de la caspase-3 Ripk1D138N Oui Fertiles - aucune anomalies Newton et al. 2014 Ripk1K45A Oui Fertiles - aucune anomalies Kaiser et al. 2014 Ripk1K45A Sharpin-/- Oui Aucune anomalie Berger et al. 2014 Ripk1RHIM/RHIM Non Mort à la naissance. Anomalies cutanées Newton et al. 2016b sévères. Nécroptose : thymus et peau Lin et al. 2016 Ripk1-/- Casp8-/- Zbp1-/- Trif- Oui Viables Newton et al. 2016b /- Ripk1-/- Fadd-/- Non Mort après la naissance Zhang et al. 2011 Ripk1-/- Casp8-/- Non Mort quelques heures après la naissance Dillon et al. 2014 Ripk1-/- Ripk3-/- Non Mort entre 0 et 20 jours de vie d’une Dillon et al. 2014 inflammation systémique Ripk1-/- Mlkl-/- Non Mort avant 4 jours de vie d’une Rickard et al. 2014 inflammation systémique Ripk1-/- Tnfr1-/- Non Mort après la naissance Rickard et al. 2014 Ripk1-/- Tnfr1-/- Trif -/- Non Mort avant 25 jours de vie Dillon et al. 2014 Ripk1-/- Tnfr1-/- Ifnar1 -/- Non Mort avant 25 jours de vie Dillon et al. 2014 Ripk3-/- Oui Fertiles - aucune anomalies Newton et al. 2004 Ripk3-/- CypD-/- Oui Fertiles - aucune anomalies Linkermann et al. 2013a Ripk3D161N Non Mort à E10.5 in utero Newton et al. 2014 Ripk3D161N Casp8-/- Oui Troubles lymphoprolifératifs Newton et al. 2014 Ripk3K51A Oui Fertiles mais peu caractérisées Mandal et al. 2014 Ripk3D161G Ripk3D143N Ripk3K51A Casp8-/- Oui Peu caractérisées Mandal et al. 2014 Mlkl-/- Oui Fertiles – aucune anomalies Wu et al. 2013 Cflar-/- Ripk3-/- Tnfr1-/- Non Mort à E16.5 in utero Dillon et al. 2014 Ripk1-/- Ripk3-/- Tnfr1-/- Oui Cependant +90% meurent avant 150 Dillon et al. 2014 jours de vie d’un sepsis dû à une rupture de la barrière intestinale Ripk1-/- Ripk3-/- Casp8-/- Oui Troubles lymphoprolifératifs après Dillon et al. 2014 plusieurs mois Kaiser et al. 2014 Rickard et al. 2014 Ripk1-/- Ripk3+/- Casp8-/- Oui Faible poids Kaiser et al. 2014 Ripk1-/- Ripk3-/- Fadd-/- Oui Troubles lymphoprolifératifs après Dillon et al. 2014 plusieurs mois Tableau 2 – Caractéristiques majeures des souris déficientes ou génétiquement modifiées pour un (ou plusieurs) acteur(s) ou régulateur(s) de la nécroptose 44

Délétion tissu spécifique Viable Observations Références Ripk1 IEC KO Oui Apoptose et inflammation de Dannappel et al. 2014 l’épithélium intestinal Ripk1E-KO Oui Apoptose, nécroptose et Dannappel et al. 2014 inflammation de la peau Takahashi et al. 2014 Ripk1LPC-KO Oui Sensibilisation à l’hépatite immuno- Filliol et al. 2016 induite IEC : intestinal epithelial cells ; E : epidermis ; LPC : liver parenchymal cells Tableau 2 (suite) – Caractéristiques majeures des souris déficientes ou génétiquement modifiées pour un (ou plusieurs) acteur(s) ou régulateur(s) de la nécroptose

Pour conclure, les différents travaux menés chez la souris montrent que la RIPK1 joue un rôle de survie puisque les souris Ripk1-/- meurent in utero. RIPK1 possède des propriétés anti- inflammatoire et anti-apoptotique nécessaires à l’homéostasie de certains tissus comme l’intestin et la peau. Pour le foie, RIPK1 a un rôle protecteur en cas de dommages immuno-induits. De plus, la RIPK1 inhiberait l’activité nécroptotique de la kinase RIPK3 induite par le TNFR1 rapidement après la naissance. Les souris Ripk1-/- Tnfr1-/- sont sensibilisées aux autres signaux nécroptotiques responsables de l’activation du complexe RIPK3-MLKL tels que TRIF ou les IFNs ce qui conduit à leur mort après la naissance. En effet, ZBP1/DAI, protéine senseur de l’infection virale induite par les IFNs de type I, joue également un rôle primordial dans l’induction de la nécroptose au cours de cette période périnatale qui peut être bloquée par RIPK1 (Tableau 2). D’autres travaux seraient nécessaires pour comprendre ce mécanisme. Les souris Sharpin-/- sont dépourvues d’activité NF-ĸB mais sensibles à l’apoptose et à la nécroptose suite à l’engagement du TNFR1 ; elles souffrent d’inflammation dans de nombreux organes. Le croisement Sharpin-/- Ripk1K45A/K45A empêche l’apparition de toute inflammation permettant la survie des souris (Berger et al. 2014). L’ubiquitination de la RIPK1 par le complexe LUBAC permettant l’activation de la voie NF-ĸB ainsi que l’activité kinase de la RIPK1 jouent un rôle primordial dans la régulation de l’inflammation (Tokunaga and Iwai 2012). De ce fait, l’utilisation d’inhibiteurs de la kinase RIPK1 a montré qu’il s’agissait d’une cible privilégiée dans le traitement de nombreuses pathologies nécro-inflammatoires (Tableau 3, ci-dessous). Le blocage de l’activité kinase de la RIPK1 a réduit les dommages tissulaires dans de nombreux modèles pathologiques (Degterev and Linkermann 2016).

III. Les pathologies liées à la nécrose régulée La mort cellulaire nécrotique est impliquée dans l’élimination des pathogènes et contribue à l’inflammation suite au relargage de DAMPs ou PAMPs (Wallach et al. 2014). La nécroptose a été associée à différentes situations physio-pathologiques grâce à l’utilisation de modèles murins (Tableau 3). L’équipe de Degterev a été la première à mettre en évidence le rôle majeur de la nécroptose au cours d’une ischémie cérébrale. Ils ont montré un effet protecteur de la Nec-1 suggérant un rôle de la nécroptose dans les accidents vasculaires cérébraux (Degterev et al. 2005). Par la suite, la Nec-1 a été largement utilisée entre 2005 et 2012 dans plusieurs modèles murins de pathologies afin de déterminer l’implication éventuelle de la nécroptose (Figure 17).

Figure 17. Implication de RIPK1, RIPK3 et MLKL dans différents modèles précliniques de pathologies inflammatoires (issue de Silke et al. 2015).

Jusqu’alors la nécroptose était définie par l’activation de la RIPK1 à l’origine de la formation du nécrosome RIPK1-RIPK3 en aval des récepteurs de mort (DRs) et en l’absence d’activités caspases ; cette interaction est abolie par la Nec-1, l’inhibiteur de RIPK1 (Cho et al. 2009; He et al. 2009). Or des données structurales et biochimiques ont révélées que la Nec-1 est non- sélective de la kinase RIPK1 ; elle est notamment capable de bloquer l’activité de l’enzyme indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO) régulatrice de l’immunité (Takahashi et al. 2012; Vandenabeele et al. 2013). De nombreuses études bousculent la conception de la nécroptose puisqu’elles révèlent l’existence de nécroptoses indépendantes de l’activité kinase de RIPK1 (Rebsamen et al. 2009; Upton et al. 2012; Kaiser et al. 2013b; Dillon et al. 2014) ou de l’activité kinase de RIPK3 suite à la dimérisation de RIPK1 ou de RIPK3 (Cook et al. 2014; Orozco et al. 2014; Wu et al. 2014). Une étude récente a mis en évidence l’existence d’une nécroptose indépendante de RIPK3 dépendante de l’activité kinase de RIPK1 dans l’hépatite murine induite à la ConA et dans l’hépatite auto-immune humaine induite par le TNF-α et l’IFN- (Günther et al. 2016). Cette étude met en évidence que l’activation de MLKL peut avoir lieu indépendamment de l’activité RIPK3. L’existence des complexes pro-nécroptotiques différents tel que RIPK1-MLKL et RIPK3-MLKL au cours de la nécroptose induite par le TNF-α, dans certaines conditions, complexifie davantage la compréhension de ce mode de mort cellulaire. L’enjeu actuel est donc de confirmer la contribution de la nécroptose dans les différents modèles de pathologies précédemment publiés par différents groupes grâce à l’utilisation de nouveaux outils. L’utilisation de la Nec-1s, du PN-10, inhibiteurs de classe II plus sélectifs de la RIPK1 et fonctionnels chez la souris, sera privilégiée dans le cas de la nécroptose en aval des DRs ou de l’IFNAR1 car l’inhibiteur de MLKL (NSA) disponible pour la communauté est spécifique de l’espèce humaine (Sun et al. 2012). Dans le cas des nécroptoses indépendantes de RIPK1, l’utilisation des souris RIPK3 KO est un très bon outil (Newton et al. 2004). Cependant, Newton et al. ont montré dans différents modèles murins que les fonctions non nécroptotiques de RIPK1 et RIPK3 (décrites par Berger et al. 2015; Weng et al. 2014; Wang et al. 2014b) peuvent déclencher certaines pathologies nécroinflammatoires (Newton et al. 2016b). Ces pathologies, comme les lésions liées à l’ischémie-reperfusion rénale ou le sepsis provoqué par la perte de la déubiquitinase A20, étaient jusqu’alors attribuées à la nécroptose dans ces modèles murins de pathologies humaines (Newton et al. 2016b). Les meilleurs outils restent l’utilisation des souris MLKL KO ou son inhibition (la pseudokinase MLKL étant la protéine effectrice de la nécroptose) (Wu et al. 2013; Murphy et al. 2013; Hildebrand et al. 2014) pour étudier le rôle de la nécroptose dans l’initiation ou l’aggravation de la pathologie. Cependant l’activité kinase de la RIPK1 joue un rôle important dans l’induction de l’apoptose, de la nécroptose ou de la production de cytokines pro-inflammatoires ou de chimiokines (Newton and Manning 2016). L’utilisation d’inhibiteurs de la RIPK1 permet à l’heure actuelle d’étudier la contribution de son activité kinase dans l’initiation ou l’aggravation des modèles murins de pathologies nécrotiques inflammatoires. De plus, une étude récente démontre que l’inhibition de l’activité kinase de la RIPK1 pourrait permettre l’amélioration de différentes pathologies inflammatoires chroniques humaines. Elle a abouti à la synthèse du premier inhibiteur de la RIPK1 actuellement en essai clinique pour le traitement du psoriasis, de l’arthrite rhumatoïde et de la colite ulcérative (Harris et al. 2017) (Tableau 3).

Modèle Modèles patho- Inhibiteur Organes Pathologies génétique Références physiologiques protecteur murin testé Ischémie-reperfusion Cerveau AVC Nec-1 ND Degterev et al. 2005 cérébrale transitoire RIPK3 KO He et al. 2009

Pancréatite Pancréatite induite par la protégé Zhang et al. 2009 Pancréas aigüe céruléine MLKL KO Nec-1 Wu et al. 2013 protégé Ischémie-reperfusion suite RIPK3 KO Nec-1 Luedde et al. 2014 Infarctus du à une ligation artérielle protégé Cœur myocarde Ischémie-reperfusion dans Nec-1 ND Oerlemans et al. 2012 un cœur isolé perfusé RIPK3 KO Nec-1 Duprez et al. 2011 protégé Nec-1s Takahashi et al. 2012 Modéré induit RIPK1D138N Newton et al. 2014

par le TNF protégé Polykratis et al. 2014 Cpd27 Harris et al. 2013 Ponatinib Najjar et al. 2015 Choc septique/ PN-10 Berger et al. 2015 septicémie Aigu induit par la GSK’963 Berger et al. 2015

combinaison TNF+zVAD GSK2982772 Harris et al. 2017 RIPK3 KO Nec-1 Duprez et al. 2011 Ligature caecale protégé suivie d’une perforation RIPK3 KO et intestinale MLKL KO Wu et al. 2013 Corps non-protégés entier RIPK3 KO Virus de la variole Cho et al. 2009 sensibilisé

HSV-1 Nec-1 ND Peri et al. 2011 Infections virales RIPK3 KO Cho et al. 2009 non protégé Virus de la vaccine RIPK1D138N Nec-1 Polykratis et al. 2014 non protégé Infections Toxoplasma gondii Nec-1 ND Osborn et al. 2010 parasitaires RIPK3 KO S. enterica Nec-1 Robinson et al. 2012 Infections protégé bactériennes Nec-1 RIPK3 KO S. aureus Kitur et al. 2015 Nec-1s protégé érythrodermie bulleuse Dabrafenib Kim et al. 2015 Maladies avec épidermolyse Peau inflammatoires Nec-1, NSA ND Zhang et al. 2016b cutanées psoriasis GSK2982772 ND Harris et al. 2017 Tableau 3 (Partie 1) – Pathologies associées à une nécroptose (adapté de Jouan-Lanhouet et al. 2014). ND, non déterminé ; rayé : non protecteur. DMLA, dégénérescence maculaire liée à l’âge.

Inhibiteur Modèle génétique Organes Pathologies Modèles Références protecteur murin testé Tamura et al. 2014 DMLA Nec-1 ND Hanus et al. 2013 Pathologies Yeux détachement de la rétiniennes rétine suite à la Nec-1 RIPK3 KO protégé Trichonas et al. 2010 mort des photorécepteurs Jouan-Lanhouet et al.

Nec-1 2012 Zhou et al. 2013 Filliol et al. 2016 Nec-1s RIPK1K45A protégé Immuno-induite Dara et al. 2016a par la ConA RIPK3 KO NSA Weinlich et al. 2013 non protégé RIPK3 KO non protégé Günther et al. 2016 MLKL KO protégé Roychowdhury et al. 2013 Hépatites Nec-1 RIPK3 KO Li et al. 2014 aigües partiellement Zhang et al. 2014b Dabrafenib protégé Yang et al. 2015 Deutsch et al. 2015 Foie RIPK3 KO Induite par Dara et al. 2015 et MLKL KO* l’acétaminophène *Günther et al. 2016 non protégés RIPK3 KO : Ramachandran et al. protégé à 6h 2013 non protégé à 24h RIPK1 LPC-KO Schneider et al. 2016 non protégé Casp8LPC-KO, RIPK3-KO et Gautheron et al. 2014

Casp8LPC/ RIPK3-KO non-alcooliques protégés Hépatites chroniques Nec1 RIPK3 KO protégé Afonso et al. 2015 Roychowdhury et al. alcooliques Nec-1 RIPK3 KO 2013 Wang et al. 2016 Devalaraja-Narashimha et al. 2009 Lésion rénale Ischémie- RIPK3KO/CypDKO Rein Nec-1 Linkerman et al. 2012 aigüe reperfusion protégé Linkerman et al. 2013b Newton et al. 2016a Günther et al. 2011 entérocolite induite Nec-1 ND Pierdomenico et al. Maladies par le DSS Intestin inflammatoires 2014 intestinales Nec-1 colite ulcérative ND Harris et al. 2017 GSK2982772 Tableau 3 (Partie 2) – Pathologies associées à une nécroptose (adapté de Jouan-Lanhouet et al. 2014). ND, non déterminé ; rayé : non protecteur. DSS : dextran sulfate sodium.

A. Les pathologies ischémiques : L’ischémie peut être transitoire ou prolongée au sein du tissu. L’apport en oxygène et en nutriments est compromis par l’obstruction du flux sanguin en amont du tissu ; cela peut conduire à l’altération du métabolisme énergétique et à la mort cellulaire. Lorsque le flux sanguin est restauré, on parle de reperfusion tissulaire puisque l’apport d’oxygène est rétabli. La reperfusion du tissu engendre cependant une production excessive de ROS responsable d’une mort cellulaire massive accompagnée d’une inflammation.

1) L’ischémie cérébrale : modèle d’AVC L’accident vasculaire cérébral (AVC) résulte d’une ischémie transitoire ou d’une hémorragie intracrânienne ou intracérébrale du fait d’une occlusion des vaisseaux sanguins suite à une thrombose ou une embolie. Ce traumatisme implique différents événements cellulaires : l’apoptose, le stress oxydatif (Lo et al. 2003) et la nécroptose (Degterev et al. 2005). Le groupe d’Alexei Degterev fut le premier à mettre en évidence l’implication de la nécrose programmée dans une pathologie humaine grâce à l’utilisation de la Nec-1 ou de la Nec-1s dans un modèle murin d’ischémie-reperfusion cérébrale (Degterev et al. 2005; Xu et al. 2010) (Tableau 3). De plus, Xu et al. ont montré le bénéfice thérapeutique de l’utilisation simultanée d’inhibiteurs de l’apoptose et de la nécroptose dans ce même modèle. Au cours d’une hémorragie intracérébrale provoquée par l’administration de collagénase, les souris RIPK3 déficientes sont partiellement protégées de la nécrose résultante (Zhu et al. 2012). Ces différentes études suggèrent la nécroptose comme cible thérapeutique privilégiée afin de prévenir ou limiter les dommages tissulaires.

2) L’ischémie cardiaque L’infarctus du myocarde conduit à la perte massive et irréversible de cardiomyocytes (Lloyd- Jones et al. 2010). L’apoptose et la nécrose sont responsables des dommages observés au cours des heures qui suivent l’ischémie. Le traitement le plus efficace actuellement est la restauration rapide du flux sanguin. Cependant la reperfusion du cœur conduit à l’apparition de nouveaux dommages au sein du myocarde (Yellon and Hausenloy 2007). Le défi actuel est donc de contrer cette mort cellulaire puisque le pronostic dépend de l’étendue des dommages. La mort des cardiomyocytes est due à un fort stress oxydatif (Kung et al. 2011; Di Lisa et al. 2011) et suivie d’une forte inflammation au sein du tissu (Cleutjens et al. 1999; Frangogiannis 2006; Frantz et al. 2009). Des études récentes dans des modèles d’ischémie-reperfusion ont montré l’implication de la nécroptose (Degterev et al. 2005; Degterev et al. 2008) et de la nécrose régulée provoquée par une perméabilisation mitochondriale (Baines et al. 2005; Nakagawa et al. 2005). Il serait alors intéressant de cibler ces processus de mort dans un contexte pathologique afin de protéger le tissu cardiaque (Diwan et al. 2003; Frangogiannis 2008) et empêcher l’amplification de l’inflammation. Certaines équipes ont montré l’implication de l’apoptose grâce à des approches génétiques (Lee and Gustafsson 2009; Eefting et al. 2004) ; cependant seule une minorité d’études controversées ont utilisé des inhibiteurs de caspases dans des modèles animaux

50 précliniques appropriés (revu par Oerlemans et al. 2013). D'autres ont bloqué l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondrial (MPT) responsable de la déplétion en ATP et la mort des cardiomyocytes (Di Lisa and Bernardi 2006; Ovize et al. 2010; Di Lisa et al. 2011). La découverte d’inhibiteurs pharmacologiques de la nécroptose a permis d’étudier l’implication de cette mort au cours de l’infarctus du myocarde (Degterev et al. 2005; Kung et al. 2011; Smith and Yellon 2011). Smith et al. ont été les premiers à avoir montré que la Nec-1 réduit la taille de la zone lésée du myocarde (Smith et al. 2007) impliquant la cyclophiline D (Lim et al. 2007). Oerlemans et al. ont montré le rôle cardioprotecteur de la Nec-1 dans des cellules humaines pour lutter contre un stress oxydatif suggérant une application de la Nec-1 lors des transplantations de greffons (Oerlemans et al. 2012) (Tableau 3). Cependant d’autres études in vivo seraient nécessaires en utilisant des inhibiteurs spécifiques de RIPK1 pour confirmer le rôle de cette kinase dans ces dommages. Un autre groupe a montré dans un modèle murin d’ischémie du cœur un rôle majeur de la kinase RIPK3 dans la réponse inflammatoire et la production de ROS observées lors des dommages ultérieurs à l’ischémie (Luedde et al. 2014) (Tableau 3). Une autre étude montre que la RIPK3 est responsable de la nécrose des cardiomyocytes via l’activation de son substrat, la CaMKII (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase 2) responsable de l’ouverture du pore mitochondrial (mPTP) indépendamment de la RIPK1 et de MLKL dans un contexte d’ischémie ou de stress oxydatif (Zhang et al. 2016a). Ces études suggèrent que la kinase RIPK1 et/ou la kinase RIPK3 sont des cibles intéressantes pour limiter les dommages cardiaques observés suite à une ischémie ou à un stress oxydatif.

3) L’ischémie rénale Des signes d’engagement de la nécroptose ont été observés au cours de lésions rénales aigües causées par une ischémie-reperfusion chez la souris. En effet, l’utilisation de la Nec-1, la perte d’activité de la RIPK1 et la déficience en RIPK3 protègent de ces lésions in vivo (Linkermann et al. 2012; Linkermann et al. 2013b; Newton et al. 2016a) (Tableau 3). De plus, une étude a montré que la perte de la caspase 8 favorise la nécroptose des cellules épithéliales tubulaires et l’altération du rein ou du greffon au cours de l’ischémie; tandis que la perte de RIPK3 protège le greffon du donneur de la nécroptose induite par le TNF-α réduisant ainsi l’inflammation et prolongeant sa fonctionnalité à long terme dans un modèle murin d’allogreffe (Lau et al. 2013). La nécroptose participerait donc également aux lésions observées lors de transplantations rénales. Cependant, des données récentes in vivo montrent que les inhibiteurs sélectifs de la kinase RIPK1 tels que la Nec-1s et le ponatinib ne protègeraient pas de l’apparition des lésions dans ce modèle contrairement à l’utilisation de la Nec-1 ou des ferrostatines (Fer-1, 16-86 et liproxstatine) (Degterev and Linkermann 2016). Ainsi, la Nec-1 préviendrait de cette nécrose tissulaire via l’inhibition d’une autre cible que la kinase RIPK1. La Nec-1 ou les inhibiteurs de la ferroptose (la Sangliféhrine A ou la molécule 16-86) seules ou en combinaison sont bénéfiques pour le traitement des lésions ischémiques rénales chez la souris (Linkermann et al. 2013 a; Linkermann et al. 2013 b). Il est intéressant de noter que la perte de cyclophiline D ou son inhibition par la cyclosporine A préviennent in vivo de lésions rénales provoquées suite à une ischémie-reperfusion et in vitro d’une nécrose provoquée par une perméabilisation mitochondriale brutale (Devalaraja-Narashimha et al. 2009) (Tableau 3). Différentes formes de 51 nécroses régulées notamment la nécroptose, la nécrose provoquée par une perméabilisation mitochondriale et la ferroptose semblent donc participer au développement de la pathologie.

B. Le choc septique : Le choc septique est caractérisé par une réponse immunitaire systémique aigüe, souvent en réponse à une agression bactérienne, qui conduit à une inflammation aigüe et à la défaillance de nombreux organes vitaux (Hotchkiss et al. 2016). Cette défaillance multi-viscérale est liée à une mort cellulaire incontrôlée (Bantel and Schulze-Osthoff 2009). De plus, le sepsis est associé à une forte production de ROS et de cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF.

1) Le modèle du syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS) Le modèle murin du SIRS mime la phase hyper-inflammatoire de la pathologie grâce à une injection intraveineuse de TNF-α; il est létal en quelques heures suite à une forte hypothermie. Il implique une nécroptose dépendante de l’activité de RIPK1 et RIPK3 en aval du TNFR1 dans de nombreux tissus (Duprez et al. 2011; Takahashi et al. 2012). En effet, dans ces travaux, le prétraitement par Nec-1 ou Nec-1s réduit de façon majeure la production de cytokines pro- inflammatoires, associée à une diminution de la mortalité comme la déficience en RIPK3 (Duprez et al. 2011; Linkermann et al. 2012; Newton et al. 2014; Polykratis et al. 2014) (Tableau 3). Il est important de noter que l’efficacité de la Nec-1 dépend de la dose administrée et de sa pharmacocinétique (Takahashi et al. 2012; Vandenabeele et al. 2013). D’autre part, les souris exprimant une forme inactive de la RIPK1 (RIPK1 D138N) sont protégées du SIRS induit par le TNF (Polykratis et al. 2014; Newton et al. 2014) (Tableau 3).

2) Le modèle de ligature du cæcum suivi d’une perforation intestinale L’utilisation de souris déficientes en RIPK3 ou en MLKL dans le modèle murin de ligature du cæcum suivi d’une perforation intestinale (CLP) ne montre pas de protection contre le choc septique observé suite à la libération de la flore bactérienne hors du côlon (Wu et al. 2013) (Tableau 3). Il existe cependant une controverse concernant l’éventuelle implication de la nécroptose dans ce modèle puisque Duprez et al. avaient précédemment montré que les souris RIPK3 déficientes étaient protégées contre ce choc septique polybactérien (Duprez et al. 2011) (Tableau 3). La différence majeure observée entre les deux groupes pourrait provenir de la composition de la flore bactérienne de ces souris.

C. Les lésions cutanées Les kératinocytes de l’épiderme sont exposés aux agressions extérieures subies par la peau telles que les lésions de la couche cornée ou la présence de microorganismes pathogènes. Ces agressions vont engendrer des signaux qui favorisent la cicatrisation ou le déclenchement d’une réponse immunitaire locale. La perte de contrôle de ces événements engendre des maladies inflammatoires de la peau.

1) Modèles génétiques de pathologies cutanées Une étude menée chez la souris a mis en exergue le rôle protecteur de FADD vis-à-vis de la nécroptose dans les kératinocytes de l’épiderme ainsi que son rôle anti-inflammatoire lors des lésions de la couche cornée (Bonnet et al. 2011). Dans ce modèle de souris déficientes en FADD dans les kératinocytes de l’épiderme, le TNF participe à l’initiation de la nécroptose. De plus, l’extinction sélective de RIPK3 protège les kératinocytes de la nécroptose et de l’apparition de lésions inflammatoires cutanées. Ces données montrent donc que la nécroptose serait à l’origine de cette inflammation sévère de la peau. Un autre groupe a montré que la caspase 8 intervient également dans cette pathologie grâce à l’utilisation de souris sélectivement déficientes en caspase 8 dans les kératinocytes (Kovalenko et al. 2009). L’homéostasie et la protection de la couche cornée vis-à-vis des lésions et de l’inflammation est maintenue grâce aux protéines FADD et caspase 8. Récemment, le groupe de Martin Leverkus a montré que la perte de RIPK3 ou l’inhibition de son activation par le drabrafenib favorise la résistance du mélanome à la nécroptose induite par la combinaison CD95L/zVAD/Smac-mimétiques (Geserick et al. 2015). Cibler la nécroptose pourrait donc présenter un intérêt thérapeutique pour les pathologies inflammatoires de la peau. A l’inverse, il serait intéressant de sensibiliser les mélanomes résistants aux thérapies actuelles à la nécroptose.

2) L’érythrodermie bulleuse avec épidermolyse L’érythrodermie bulleuse avec épidermolyse (ou syndrome de Lyell, ou encore syndrome de Stevens-Johnson) est une pathologie cutanée sévère et létale caractérisée par un détachement de la peau et une forte mortalité des kératinocytes. Cette nécrose aigüe intervient souvent en réponse à un médicament (allopurinol, sulfonamides et carbamazepine) (Kinoshita and Saeki 2017). Cette pathologie grave touche le visage, le tronc et les zones d’appui jusqu’à l’ensemble de l’épiderme ; son mécanisme reste mal connu. Elle est due à une forte réaction immune du fait de l’hypersensibilité des lymphocytes T cytotoxiques (CD8+) aux antigènes, des monocytes, des macrophages et des cellules NK (Tohyama and Hashimoto 2012). Les kératinocytes se détachent du fait d’une apoptose et d’une nécrose massives ; la nécrose prédomine pendant quelques jours. La nécrose totale de l’épiderme entraine sa séparation du derme (Downey et al. 2012; Hoetzenecker et al. 2016). Les métabolites médicamenteux altèrent les mitochondries et conduisent à la production de ROS responsable de la production de TNF-α et d’une apoptose intrinsèque des kératinocytes (Paquet and Pierard 2007; Tohyama and Hashimoto 2012; Chung et al. 2016; Hoetzenecker et al. 2016). La perte de la RIPK3 ou l’utilisation de la Nec-1, inhibiteur de la RIPK1, ou de NSA, inhibiteur de MLKL, bloque la mort des kératinocytes déclenchée par les PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells) issus de patients atteints par la pathologie (Saito et al. 2014). Une autre étude montre que la Nec-1, le dabrafenib ou le NSA empêche la mort des kératinocytes in vitro dans un modèle humain de la pathologie suggérant un rôle majeur de la nécroptose dans l’aggravation de l’atteinte cutanée (Kim et al. 2015) (Tableau 3). De plus, dans les explants de peau de patients atteints de la pathologie, les auteurs montrent une élévation du taux de l’expression de RIPK3 corrélée à un fort taux de MLKL phosphorylée témoignant d’une nécroptose des kératinocytes (Kim et al. 2015) (Tableau 1).

3) Le psoriasis Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique cutanée qui peut être associée à des rhumatismes. L’hyperprolifération, la différenciation incomplète et le défaut d’apoptose des kératinocytes sont associés à un infiltrat lymphocytaire et à une inflammation chronique (Pariser 2003; Tse et al. 2006; Li et al. 2008; Zhou et al. 2012). Elle évolue par poussée et est caractérisée par l’apparition d’épaisses plaques de peau qui desquament sur les coudes, les genoux et le cuir chevelu et laisse des zones de peau rouge. Les causes et les mécanismes de cette maladie sont peu connus. On sait cependant que certaines cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF, l’IFN- et les interleukines IL-17a, IL-23 et IL-24 sont surexprimées et jouent un rôle majeur au cours de la pathologie (Di Cesare et al. 2009; Gottlieb et al. 2011; Kumari et al. 2013; Sun et al. 2015). Zhang et al. ont montré in vitro dans un modèle murin de psoriasis l’implication de la nécroptose via l’utilisation de la Nec-1 et de NSA (deux inhibiteurs connus de la nécroptose) (Zhang et al. 2016b) (Tableau 3). Il n’existe pas à l’heure actuelle de traitement préventif ou curatif. Une molécule est actuellement en phase IIa d’essais cliniques dans le cadre du traitement du psoriasis (Harris et al. 2017) (Tableau 3). Cet inhibiteur de la RIPK1 (le GSK2982772) est une molécule anti-inflammatoire prometteuse qui aurait des applications thérapeutiques dans le cadre du psoriasis (Harris et al. 2017) (Tableau 1).

D. Les maladies inflammatoires de l’intestin

L’intégrité structurale de l’intestin est assurée uniquement si la balance entre prolifération et mort cellulaire des cellules épithéliales est finement régulée. Une forte mortalité de celles-ci a été associée à la maladie de Crohn et aux colites ulcératives, deux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (Han et al. 2011; Günther et al. 2013). Le renouvellement du tissu intestinal et le maintien de son homéostasie sont assurés par l’apoptose, la nécrose et la nécroptose (Teng et al. 2005; Tait and Green 2008; Christofferson and Yuan 2010). L’altération de l’expression des acteurs moléculaires inhibiteurs de la nécroptose tels que la caspase 8 et FADD déclenche une inflammation intestinale (Günther et al. 2011; Welz et al. 2011) (Tableau 3). RIPK3 et MLKL sont surexprimées tandis que le taux d’expression de la caspase 8 est réduit dans l’iléum et le côlon d’enfants atteints de la maladie de Crohn ou de colites ulcératives (Pierdomenico et al. 2014) (Tableaux 1 et 3). De plus, Newton et al. ont démontré que l’expression de la RIPK3 dans les cellules épithéliales intestinales est responsable de l’inflammation et de la toxicité médiée par le TNF-α (Newton et al. 2016b) suggérant un rôle inflammatoire majeur de la RIPK3 dans l’intestin. Une nouvelle molécule inhibitrice sélective de la RIPK1 (GSK2982772), actuellement en essai clinique, permet de réduire efficacement la production de cytokines pro-inflammatoires IL-1β et IL-6 dans des explants humains de colite ulcérative (Harris et al. 2017) (Tableau 3). Ces résultats prometteurs mettent en évidence que le blocage de l’activité kinase de la RIPK1 permettrait de réduire l’inflammation intestinale. Les acteurs de la nécroptose sont donc des protéines cibles qui présentent un intérêt thérapeutique à explorer dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin.

IV. Le rôle de la nécroptose dans les pathologies du foie Les maladies du foie ont une forte prévalence chez l’Homme. Les infections virales (virus de l’hépatite B et C) et le mode de vie : une consommation chronique et abusive d’alcool, une alimentation riche en sucres et en graisses ainsi que les pathologies liées à l’âge comme diabète de type II, ou encore une utilisation excessive de médicaments tel que le paracétamol peuvent être à l’origine d’une atteinte aigüe ou chronique du foie. Le traitement de ces pathologies suscite un fort intérêt. Les modèles murins d’hépatites permettent une meilleure compréhension des mécanismes de mort cellulaire à l’origine de l’hépatolyse excessive observée au cours de ces maladies hépatiques.

A. L’hépatite aigüe

1) Modèle d’hépatite immuno-induite La concanavaline A (ConA), glycoprotéine de la famille des lectines extraite du haricot Canavalia ensiformis, lie spécifiquement les résidus D-mannose et D-glucose des glycoprotéines et glycolipides. Elle est connue pour ses propriétés mitogènes chez la souris puisque son injection conduit à l’activation des lymphocytes T, des cellules de Kupffer et des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques provoquant la libération massive de cytokines pro- inflammatoires en quelques heures. L’inflammation résultante conduit au recrutement des cellules de l’immunité au niveau du foie et à mort massive des hépatocytes. Cette hépatite aigüe est caractérisée par un pic des transaminases ASAT et ALAT sériques entre 10 et 12 heures post- injection (Trautwein et al. 1998). Ce modèle d’inflammation hépatique mime les hépatites autoimmunes et les hépatites virales humaines dont l’hépatolyse est médiée par les lymphocytes cytotoxiques NKT et les ligands de mort tels que le TNF-α, le FasL, le TRAIL en association avec l’IFN- (Figure 18). Ce modèle d’hépatite murine a permis de mieux appréhender les événements immunitaires, inflammatoires et de mort cellulaire à l’origine des hépatites immuno-induites (Tiegs et al. 1992). Les cellules NKT sont à l’origine de la mort des hépatocytes dans le cas de l’hépatite induite par la ConA (Tiegs et al. 1992; Kaneko et al. 2000; Takeda et al. 2000). L’activation des cellules NKT serait médiée par l’IFN-. La libération du TNF-α et de l’IFN- est indispensable à l’hépatolyse (Gantner et al. 1995; Küsters et al. 1997; Mizuhara et al. 1994; Tagawa et al. 1997; Watanabe et al. 1996; Wolf et al. 2001). Plusieurs mécanismes de mort ont été mis en cause : le système perforine/granzyme B (Watanabe et al. 1996; Arshad et al. 2012) ainsi que la mort dépendante des récepteurs de mort induite par la fixation de leurs ligands à la surface des hépatocytes, FasL/Fas (Tiegs et al. 1992; Leist et al. 1996; Seino et al. 1997; Tagawa et al. 1997; Takeda et al. 2000) et TRAIL/DR5 (Zheng et al. 2004; Beraza et al. 2009; Arshad et al. 2012). Cependant l’orchestration des signalisations de mort impliquées dans la destruction des hépatocytes est encore mal comprise. L’apoptose ou l’implication de caspases semble exclue dans cette hépatolyse (Günther et al. 2016; Jouan-Lanhouet et al. 2012; Künstle et al. 1999) ; or seule l’apoptose et la nécroptose ont une signalisation dépendante des récepteurs de mort (Galluzzi et al. 2012). 55

La RIPK1 joue un rôle clef dans l’hépatite induite par la ConA puisque l’utilisation d’un inhibiteur de l’activité kinase de RIPK1, la Nec-1, a montré une protection de l’hépatolyse (Jouan-Lanhouet et al. 2012; Zhou et al. 2013) suggérant l’implication de la nécroptose, mort indépendante des caspases (Tableau 3). Une autre étude a montré in vivo que l’absence de clivage de la RIPK1 par la caspase 8 favorise la formation du nécrosome et la lyse des hépatocytes déficients en caspase 8 par nécrose dans ce modèle (Liedtke et al. 2011). Une équipe a décrit une protection partielle vis-à-vis de l’hépatolyse induite par la ConA dans les souris RIPK3 KO suggérant une contribution de la RIPK3 dans l’activation des lymphocytes NKT (Kang et al. 2015 b) en contradiction avec trois autres études (Weinlich et al. 2013; Deutsch et al. 2015; Günther et al. 2016). Lors de cette hépatite murine, l’activation de la nécroptose permet l’activation de la pseudokinase MLKL indépendamment de l’activité kinase de RIPK3 (Günther et al. 2016) (Tableau 3). Dans cette même étude, les auteurs montrent que l’expression de MLKL est fortement induite par l’administration de la ConA et dépendante de l’activation du facteur de transcription STAT-1 induite par les IFN-. Grâce à l’utilisation de souris Tnfr1-/-, ils mettent aussi en évidence que le TNF-α n’est pas nécessaire à la synthèse de la RIPK1 et de MLKL dans les hépatocytes mais qu’il collabore avec les IFNs pour activer la RIPK1 et permettre la translocation de MLKL à la membrane (Günther et al. 2016) (Figure 18). Des travaux récents ont cependant confirmé la fonction pro-nécroptotique de RIPK1 dans l’hépatolyse et l’inflammation induites par la ConA via son activité kinase grâce à l’utilisation de la Nec-1s (inhibiteur sélectif de la RIPK1) (Filliol et al. 2016; Günther et al. 2016) et de souris exprimant la kinase RIPK1 inactive (RIPK1K45A) (Filliol et al. 2016) (Tableau 3). L’utilisation de souris conditionnellement déficientes en RIPK1 dans les cellules parenchymateuses hépatiques, RIPK1LPC-KO a, de plus, montré le rôle protecteur de la RIPK1 vis-à-vis de l’apoptose induite par le TNF-α dans ce modèle d’hépatite (Filliol et al. 2016). Günther et al. ont corrélé les observations de ce modèle murin avec la détection de forts taux de RIPK1 et MLKL et l’immuno-marquage de la phospho Thr357/Ser258-MLKL dans des biopsies de patients atteints d’hépatite auto-immune (Günther et al. 2016) (Tableau 1).

Figure 18. Modèle d’hépatolyse induite par la concanavaline A (modifiée de Dara et al. 2016a).

2) Modèle d’hépatite induite par l’acétaminophène En cas de surdose, le paracétamol ou acétaminophène (acétyl-para-aminophénol, APAP) conduit à une insuffisance hépatique aigüe qui peut entraîner la mort chez l’Homme et la souris (Dargan and Jones 2002). La souris est le modèle de choix pour l’étude d’une surdose d’APAP car il reproduit la physiopathologie humaine. L’APAP est métabolisé par les hépatocytes en une forme non toxique majoritaire ; cependant une fraction minoritaire est transformée en N-acétyl- p-benzoquinone imine (NAPQI) par le cytochrome P450 (Dahlin et al. 1984; Mitchell et al. 1973). Ce métabolite est détoxifié par la forme réduite du glutathion hépatique (GSH). Une forte consommation d’APAP (au-delà de 3g par jour chez l’humain) conduit à une forte accumulation de NAPQI responsable d’une faible biodisponibilité du GSH. Les hépatocytes sont alors sensibles au stress oxydatif (Malhi et al. 2010). En l’absence de GSH, le NAPQI interagit avec des protéines mitochondriales à l’origine d’une déplétion en ATP et d’un stress oxydatif à l’origine d’une hépatolyse (Kaplowitz et al. 2015). Ces événements moléculaires signent l’implication d’une nécrose cellulaire massive induite par l’APAP.

Le rôle de la nécroptose est actuellement débattu dans cette pathologie puisque de récentes études ont montré la phosphorylation de MLKL dans le foie de patients atteints d’hépatite induite par les médicaments (DILI pour « Drug Induced Liver Injury ») (Wang et al. 2014a). Quelques arguments suggèrent le rôle de la nécroptose dans cette pathologie puisque l’inhibition chimique de l’activité kinase de RIPK1 par la Nec-1 (Dara et al. 2015; Deutsch et al. 2015; Takemoto et al. 2014; Zhang et al. 2014b) ainsi que l’utilisation de siRNA pour diminuer le taux d’expression de RIPK3 (Ramachandran et al. 2013) ou de RIPK1 (Dara et al. 2015) chez la souris réduisent l’hépatolyse induite par l’APAP (Tableau 3). D’après Ramachandran et al., les souris Ripk3-/- sont protégées de cette hépatite lors d’une courte fenêtre de 6 heures puisque après 24 heures cette protection est perdue du fait d’un fort stress oxydatif d’origine mitochondriale (Ramachandran et al. 2013). Cependant l’utilisation de souris déficientes en RIPK3 a levé une controverse car elle conduit à des observations opposées dans différents groupes. Deutsch et al. observent une protection partielle de l’hépatolyse (Deutsch et al. 2015). Dara et al. quant à eux n’observent pas de protection lors de la délétion de RIPK3 ou de MLKL (Dara et al. 2015) ; ils en concluent donc que la nécroptose ne contribue pas à cette pathologie contrairement à leurs premières observations. Günther et al. grâce à l’utilisation des souris Mlkl-/- démontrent également que MLKL ne joue pas un rôle crucial lors de cette hépatite (Günther et al. 2016). Cependant Dara et al. ont observé une réduction de l’hépatite grâce à l’inhibition ou l’extinction transitoire de RIPK1 via un mécanisme en amont de la kinase JNK, indépendamment de RIPK3 et MLKL (Dara et al. 2015) en corrélation avec l’étude de Zhang et al. qui décrivent une nécroptose dépendante de RIPK1 et AIF responsables de l’activation de la kinase JNK et de la translocation mitochondriale de Bax (Zhang et al. 2014b). Une autre étude exclue l’implication de la RIPK1 dans l’hépatolyse ; elle démontre que l’extinction de RIPK1 dans les cellules parenchymateuses du foie n’est pas suffisante pour protéger les souris de cette hépatite (Schneider et al. 2016). Enfin, un autre groupe montre que cette hépatolyse est due à la production excessive de ROS et de lipides oxydés provoquée par une nécroptose et une ferroptose simultanées dans des hépatocytes primaires murins. En effet, cette mort induite par l’APAP peut être prévenue par l’utilisation combinée d’antioxydants lipophile (α-tocophérol, ou vitamine E) ou hydrophile (acide déshydroascorbique, ou vitamine C) ou encore par l’utilisation de la ferrostatine-1 ou de la nécrostatine-1 (Lőrincz et al. 2015). Ces études démontrent donc la coexistence de différentes nécroses régulées dans cette pathologie hépatique provoquée par une surdose d’APAP.

B. Les maladies chroniques du foie

1) La stéatose hépatique non-alcoolique (NASH) La maladie non-alcoolique du foie gras (NAFLD) représente la maladie du foie la plus fréquemment observée dans les pays occidentaux (Vernon et al. 2011). Elle est souvent associée à l’obésité, au diabète de type 2 et aux pathologies cardiovasculaires (Schattenberg and Schuppan 2011). Elle peut évoluer en stéato-hépatite dite non-alcoolique (ou NASH) puis en fibrose hépatique voire en cancer hépatique (CHC) dans les cas les plus sévères (Schuppan and Afdhal 2008; Bhala et al. 2011; Poelstra and Schuppan 2011). Les mécanismes moléculaires

58 responsables de la stéatose sont encore mal compris. De nombreuses équipes tentent d’identifier les voies de signalisation impliquées dans l’évolution vers la fibrose. La stéatohépatite sévère se différencie de la stéatose bénigne par une hépatolyse massive, attribuée à l’apoptose (Wree et al. 2013). Des études immuno-histochimiques ont caractérisé la NASH par la présence de nombreux hépatocytes apoptotiques accompagnés de différents degrés de fibrose et d’une accumulation de lipides au sein du tissu (Schattenberg and Schuppan 2011). La plupart des études ont alors focalisé sur les mécanismes de l’apoptose dans cette hépatolyse (Witek et al. 2009; Anstee et al. 2010; Ratziu et al. 2012; Hatting et al. 2013). Cependant, la nécrose et l’inflammation sont également caractéristiques de cette pathologie (Malhi and Gores 2008; Schattenberg and Schuppan 2011) suggérant l’existence d’autres voies de mort au cours de cette hépatite. Chez la souris, un régime alimentaire dépourvu de méthionine et de choline mime la NASH ; en effet, on observe une élévation des taux d’aminotransférases ainsi qu’une stéatose due à une nécrose des hépatocytes, un dysfonctionnement mitochondrial, la production de ROS, une inflammation et une fibrose tissulaire (Rinella et al. 2008). Les souris déficientes en RIPK3 soumises à ce régime alimentaire sont protégées de cette hépatite (Gautheron et al. 2014) (Tableau 3). Cette étude démontre que l’activation des voies RIPK3/JNK en l’absence d’activation de la caspase 8 dans les cellules parenchymateuses est à l’origine de cette hépatite. De plus, le groupe met en évidence l’augmentation de l’expression de la RIPK3 dans les foies de patients atteints de NASH (Gautheron et al. 2014) suggérant la contribution de la nécroptose dans l’hépatolyse du parenchyme (Tableau 2). Afonso et al. montrent l’activation de la nécroptose dans le modèle murin de la pathologie ainsi que la protection des souris déficientes en RIPK3 (Afonso et al. 2015) (Tableau 3). Grâce à l’utilisation de biopsies hépatiques de patients atteints de NASH, cette équipe confirme également le rôle de la nécroptose dans l’aggravation de la stéatose hépatique non-alcoolique chez l’Homme en corrélant les taux de marqueurs de l’hépatite (ASAT, ALAT, GT), de la nécrose (HMGB1 et CypA) et de TNF-α sériques aux marquages immuno-histologiques de la RIPK3 et de la forme phosphorylée de MLKL (Afonso et al. 2015) (Tableau 1).

2) La stéatose du foie alcoolique L’éthanol est métabolisé en acétaldéhyde, une substance très toxique pour l’organisme, par différentes enzymes hépatiques : l’alcool déshydrogénase (ADH), les cytochromes (CYP2E1 notamment) et les catalases. L’ADH mitochondriale va métaboliser l’acétaldéhyde en acétate ou acide acétique, une molécule inactive et inoffensive. La formation de métabolites réactifs conduit à la formation de ROS, à une déplétion en GSH mitochondrial et à une modification de l’homéostasie redox responsables de la mort des hépatocytes (Beier and McClain 2010). L’hépatolyse induite par l’alcool a tout d’abord été attribuée à l’apoptose (McVicker et al. 2007; Roychowdhury et al. 2012). Au cours de la pathologie, on observe l’induction du TNF-α et de FasL (McVicker et al. 2007), ligands de mort acteurs de cette hépatolyse puisque des souris déficientes en TNFR1 ou en Fas (CD95/APO-1) sont protégées (Minagawa et al. 2004; Yin et al. 1999). Aujourd’hui, de récentes études suggèrent la contribution de la nécroptose grâce à l’utilisation de souris déficientes en RIPK3 ; celles-ci présentent une protection partielle de l’hépatite induite par l’alcool (Roychowdhury et al. 2013; Wang et al. 2016) (Tableau 3). Une

équipe a également montré un fort marquage de la RIPK3 en immunohistochimie dans des biopsies hépatiques de patients atteints de stéatose du foie alcoolique suggérant l’implication de la nécroptose au cours de l’hépatolyse (Afonso et al. 2015) (Tableau 1).

3) Les hépatites virales à VHC/VHB Le foie est souvent la cible de virus hépatotropes qui peuvent être responsable d’hépatites aigües ou chroniques. Les infections par les virus de l’hépatite C (VHC) et de l’hépatite B (VHB) conduisent fréquemment à une hépatite chronique (Everhart and Ruhl, 2009). L’hépatite chronique à VHB touche 80 à 90% des jeunes enfants contre 5% des adultes infectés. Ils représentent un problème de santé publique majeur. Le VHC est un virus à ARN tandis que le VHB est un virus à ADN ; ils sont transmissibles par voie sanguine. Le VHB peut se propager par contact avec des sécrétions corporelles infectées. L’hépatite chronique au VHC ou VHB évolue souvent en défaillance hépatique, en cirrhose (stade le plus sévère de la fibrose) ou en cancer du foie. Les patients ont alors recours à une greffe du foie ; en France, cette population représente 10% des transplantations hépatiques par an. La forme aigüe de l’hépatite à VHC est très souvent asymptomatique et résolue spontanément dans les mois qui suivent l’infection. A l’heure actuelle, il n’existe pas de vaccin contre le VHC mais un traitement est désormais disponible afin d’éliminer le génotype 1 du virus. Tandis qu’il n’existe pas de traitement contre la forme aigüe de l’hépatite B ; cette dernière peut être mortelle en cas d’insuffisance hépatique aigüe. Une étude menée sur des biopsies de patients infectés par le VHB ou VHC a montré que l’infection des hépatocytes active une apoptose, une autophagie et une réponse UPR (« unfolded protein response ») simultanées (Yeganeh et al. 2015). Par ailleurs, Afonso et al. ont montré l’augmentation de l’expression de la RIPK3 dans des biopsies de foie de patients atteints de l’hépatite B ou C (Afonso et al. 2015) suggérant un rôle fonctionnel de la RIPK3 dans les lésions du foie (Tableau 1). La nécroptose, l’apoptose et l’autophagie participeraient donc à l’hépatolyse lors des infections à VHB ou VHC.

V. Les inhibiteurs chimiques de la nécroptose La nécroptose est une nécrose régulée qui intervient en réponse à un stress. En excès, elle est à l’origine d’une réponse immunogène et inflammatoire au sein du tissu qui peut conduire au disfonctionnement de différents organes ; comme cela a été montré dans les pathologies ischémiques, les infections virales, bactériennes ou parasitaires, l’athérosclérose, les pancréatites nécrosantes, les hépatites et les pathologies inflammatoires de l’intestin et de la peau (Tableau 3). L’utilisation d’inhibiteurs de la nécroptose pourrait donc prévenir la mort cellulaire au sein du tissu mais également réduire la réaction inflammatoire au sein de l’organe ou du corps. Au cours de la dernière décennie, de nombreuses études ont permis la découverte d’inhibiteurs de cette nécrose régulée. Certaines de ces molécules sont sélectives d’une protéine clef dans la signalisation telle que RIPK1, RIPK3 ou MLKL (Figure 19).

Figure 19. Voie de signalisation responsable de l’activation de la nécroptose lors de la stimulation du TNFR1 (adaptée de Conrad et al. 2016).

L’équipe d’Alexei Degterev a montré que l’activation de la kinase RIPK1 est bloquée par l’utilisation de la nécrostatine-1 (Nec-1) ou de la Nec-1s, un dérivé stable et sélectif de la RIPK1 (Degterev et al. 2005; Degterev and Yuan 2008). Ces deux molécules stabilisent la RIPK1 dans une conformation inactive permettant ainsi de bloquer la mort et l’installation d’une inflammation, suite à l’engagement des récepteurs de mort, dans différents modèles murins pathologiques (Xie et al. 2013a). Cependant, Nec-1 n’est pas sélective de la RIPK1 ce qui est un frein majeur à son utilisation en thérapeutique puisqu’elle cible notamment l’indoléamine 2,3-

61 dioxygénase (IDO), enzyme régulatrice de l’immunité. De plus, Nec-1 présente des défauts pharmacologiques liés à son métabolisme et sa demi-vie ; elle peut, par exemple, être toxique à faible dose dans un modèle de choc septique induite par le TNF-α (Takahashi et al. 2012). Il est important de noter que la Nec-1 a permis de mettre en évidence l’importance de la nécroptose dans de nombreux modèles murins de pathologies inflammatoires. L’utilisation de la Nec-1s in vivo ainsi que la découverte d’autres molécules sélectives de RIPK1 telles que PN10 et Cpd27 permettent d’exclure les effets non-sélectifs de la Nec-1 dans ces différents modèles d’études. De nombreux arguments soutiennent actuellement l’utilisation thérapeutique d’inhibiteurs de la kinase RIPK1 (Figure 20). Notamment l’établissement d’une lignée murine déficiente en activité kinase pour la RIPK1 a permis de montrer une susceptibilité moindre aux pathologies inflammatoires liées au TNF (Berger et al. 2014) ; de plus, la reconstitution d’une lignée murine déficiente en RIPK1 par la kinase inactive empêche la mortalité périnatale des souris Ripk1-/- (Berger et al. 2014; Newton et al. 2014). Récemment, un nouvel inhibiteur de la kinase RIPK1 (GSK2982772) est entré en essai clinique de phase IIa pour le traitement du psoriasis, de la polyarthrite rhumatoïde et de la colite ulcérative (Harris et al. 2017). La RIPK3, partenaire de la RIPK1 par son domaine RHIM, joue également un rôle crucial par son activité kinase lors de la nécroptose (Sun et al. 2002; Cho et al. 2009; He et al. 2009; Zhang et al. 2009). L’inhibition de la trans-phosphorylation de RIPK1 et de RIPK3 responsable de la formation du nécrosome bloque l’activation de la nécroptose (Cho et al. 2009) (Figure 20). De même, chez la souris la perte de la RIPK3 n’est pas létale et protège des lésions nécrotiques comme l’utilisation de la Nec-1 (Tableau 3) ou la perte d’activité de la RIPK3 (RIPK3 K51A, D161G, D161N ou D143N) (Figure 20). De plus, la signalisation moléculaire conduisant à la formation du nécrosome diffère selon le stimulus et le type cellulaire. Par exemple, lors d’un signal IFN sa formation est indépendante de l’activité kinase de RIPK1 (Thapa et al. 2013). La nécroptose peut également être engagés par d’autres protéines telles que TRIF ou ZBP1/DAI qui contiennent un domaine RHIM permettant le recrutement de la RIPK3 (Upton et al. 2012; Dillon et al. 2014). L’autophosphorylation et l’oligomérisation de la RIPK3 sont nécessaires à l’activation de la nécroptose (Wu et al. 2014). Ces résultats obtenus in vitro et in vivo ont poussé les équipes à développer des inhibiteurs de l’activité kinase de RIPK3. Deux groupes ont identifiés des inhibiteurs sélectifs de la RIPK3 : les GSK’843 et GSK’872 cytotoxiques, le GSK’840 inactif chez la souris (Kaiser et al. 2013b; Mandal et al. 2014) et le GW’39B (Rodriguez et al. 2016) (Figure 20). Un autre inhibiteur non sélectif de la RIPK3, le dabrafenib, est un anticancéreux qui cible le mutant B-RafV600E et protège les souris de l’hépatite induite par l’acétaminophène (Li et al. 2014). MLKL a été identifiée comme substrat de la RIPK3 et comme la pseudokinase effectrice de la nécroptose (Sun et al. 2012). La phosphorylation de la sérine 345 (Ser345) au niveau de la boucle d’activation de MLKL par la RIPK3 est une étape clef pour l’exécution de la nécroptose en aval de l’activation des RIPK1/3 (Sun et al. 2012; Rodriguez et al. 2016). La phosphorylation de MLKL par RIPK3 permettrait de bloquer son auto-inhibition et rendrait accessible son domaine N-terminal (4HB) formé de quatre hélices alpha (Hildebrand et al. 2014). Le domaine 4HB est nécessaire à l’oligomérisation membranaire de MLKL. La translocation et l’insertion membranaire de tétramères de MLKL permettent la perméabilisation de la membrane plasmique et l’exécution de la nécroptose (Chen et al. 2014; Dondelinger et al. 2014). Les souris déficientes 62 en MLKL sont viables et ne présentent pas de phénotype particulier, comme les souris RIPK3-/- ; les fibroblastes et les macrophages de ces souris sont résistants à la nécroptose induite par différents signaux (Wu et al. 2013). Ces souris représentent un outil intéressant pour l’étude des pathologies nécrotiques. Deux inhibiteurs de la pseudokinase sont actuellement décrits : l’un stabilise la conformation inactive de la MLKL murine (coumpound-1) (Hildebrand et al. 2014) tandis que l’autre lie de façon covalente la MLKL humaine (nécrosulfonamide, NSA) (Sun et al. 2012) (Figure 20).

Figure 20. Rôle clef des activités kinases de RIPK1 et RIPK3 dans l’activation de la pseudokinase MLKL lors de la nécroptose (issue de Silke et al. 2015).

A. Les inhibiteurs de RIPK1

1) Les Nécrostatines Cette famille de petites molécules chimiques, composée de la nécrostatine-1 (Nec-1) et de ses dérivés (Figure 21), a été développée et publiée par Degterev et al. en 2005. L’équipe américaine a réalisé le crible d’une banque de 15 000 composés chimiques pour sélectionner des inhibiteurs de la mort nécrotique induite par les récepteurs de mort indépendamment des caspases. Le modèle utilisé était la lignée cellulaire humaine monocytaire U937 traitée par TNF-α et zVAD. Cette mort non-apoptotique était alors peu décrite et peu caractérisée (Holler et al. 2000). La protection sélective de Nec-1 vis-à-vis de la nécrose induite par l’engagement des récepteurs de mort les a conduits à baptiser cette mort « nécroptose » afin de désigner cette nécrose dite programmée par analogie avec l’apoptose. 63

Des études chimiques permettant de relier la structure à l’activité biologique ont abouti à la caractérisation de nouveaux inhibiteurs dérivés de la Nec-1. Deux des 93 modifications chimiques réalisées sur la structure de Nec-1 (EC50 = 494 ± 125nM) ont permis de préserver l’activité anti-nécroptotique dans le modèle des cellules Jurkat déficientes en FADD traitées par le TNF-α. L’ajout d’un élément chlore sur le noyau phénol améliore l’activité de la molécule de 2,7 fois (EC50 = 182 ± 24nM). Le changement de l’élément souffre, potentielle cible du métabolisme, dans la molécule 7-Cl-Nec-1 (EC50 = 180nM) par un oxygène rend la molécule beaucoup plus efficace (7-Cl-O-Nec-1 ou Nec-1s, EC50 = 3,1nM) (Figure 21 ; Tableau 4). La perte du groupement méthyle sur l’azote du noyau benzyle est responsable de la perte d’activité de la molécule (Nec-1i). La structure permettant un effet anti-nécroptotique est donc peu flexible (Degterev et al. 2005; Degterev et al. 2008; Christofferson et al. 2012).

Nécrostatine-1 7-Cl-Nec-1 7-Cl-O-Nec-1 Nec-1 inactive (Nec-1) (Nec-1s) (Nec-1i)

Figure 21. Structure chimique des nécrostatines.

L’effet anti-nécroptotique de la Nec-1 a été démontré par Degterev et al. dans différents types cellulaires traités par différents stimuli nécroptotiques connus in vitro. Cette activité protectrice sélective a permis de mettre en évidence la divergence des voies de signalisation apoptotiques et nécroptotiques (Degterev et al. 2005). Holler et al. en 2000 avait précédemment démontré le rôle crucial de l’activité kinase de la RIPK1 lors de la prise de décision entre la nécroptose et les autres morts régulées par les récepteurs de mort Fas, TRAIL et TNFR1. Puis, l’effet protecteur de la Nec-1 a été testé lors de la nécroptose induite par la dimérisation de la kinase RIPK1 ou de son domaine kinase sans stimulation des récepteurs de mort. Ces travaux ont permis de démontrer que la Nec-1 cible un élément de la signalisation nécroptotique en aval des récepteurs de mort mais en amont des événements intracellulaires (Degterev et al. 2005). La même équipe a confirmé les observations précédentes de Holler et al. démontrant que la RIPK1 est une kinase clef dans l’activation de la nécroptose puisque l’effet anti-nécroptotique précoce de la Nec-1 est dû à l’inhibition allostérique de la kinase RIPK1 in vitro (Degterev et al. 2008). La structure de la molécule Nec-1 est caractéristique des inhibiteurs de kinases. Cependant elle est non sélective vis-à-vis de la RIPK1 car elle cible deux autres kinases : PKAC-α et PAK1 (Biton and Ashkenazi 2011). Degterev et al. ont montré in vitro que la Nec-1 inhibe l’autophosphorylation de la kinase humaine RIPK1 purifiée sans affecter l’activité de RIPK2 et RIPK3. La kinase inactive RIPK1 K45M perd également sa capacité d’autophosphoylation ce qui suggère que la Nec-1 inactiverait l’activité kinase de la RIPK1. En effet, les données obtenues lors de l’inhibition de l’activité kinase de la RIPK1 in vitro corrèlent avec l’activité anti-nécroptotique de la Nec-1 et ses dérivés. La même équipe a identifié par spectrométrie de

64 masse les résidus auto-phosphorylés de RIPK1 dépendants de son activité kinase in vitro : Ser14/15, Ser20, Ser161 et Ser166 en N-terminal de la protéine (Degterev et al. 2008). L’étude de la spécificité de la molécule Nec-1s (7-Cl-O-Nec-1) contre 485 kinases a montré que la RIPK1 est la seule kinase dont l’activité est inhibée à plus de 60% (Christofferson et al. 2012). L’analyse de la structure cristallographique du domaine kinase de la RIPK1 par rayons X a été réalisée par Xie et al. et publiée en 2013 (Figure 22). Ils ont réalisé une co-cristallisation de la RIPK1 avec la Nec-1s (indole-hydantoïne), molécule très hydrophobe. Degterev et al. ont démontré en 2008 que la Nec-1 est un inhibiteur compétitif de l’ATP in vitro et d’après cette étude son efficacité est liée au maintien de l’intégrité de la boucle-T (ou domaine d’activation) de la protéine dans sa conformation inactive. Dans ce cas, on parle d’inhibiteur de kinase de type II (Liu and Gray 2006). Trois types d’inhibiteurs de kinase ont été décrits selon leur positionnement dans le domaine kinase (Figure 23).

Figure 22. Modélisation structurale de l’inhibition de la RIPK1 par les nécrostatines (issu de Xie et al. 2013 b).

La kinase RIPK1 présente une structure canonique (Figure 22A) : un lobe N-terminal (5 feuillets beta anti-parallèles et une hélice alpha-C dite d’activation), un lobe C-terminal (six hélices alpha et une paire de feuillets beta), un site de fixation de l’ATP (acides aminés clefs conservés) et boucle d’activation (ou boucle T). Le motif DFG caractéristique de la boucle d’activation des protéines Ser/Thr kinases et responsable de la fixation du Mg2+ est remplacé par un motif DLG (Asp156-Leu157-Gly158) pour la kinase RIPK1 (Degterev et al. 2008) au sein duquel les résidus Asp156 et Ser161 forment deux liaisons hydrogènes avec la molécule Nec-1s (Xie et al. 2013b) (Figure 22B). La Nec-1s se fixe exclusivement avec la conformation inactive de la RIPK1 dite « αC-Glu out-DLG-out » dans une poche hydrophobe définie par les résidus suivants : Ile43, Lys45, Leu90, Met92 (Najjar et al. 2015). Cette poche se situe entre les deux lobes (N- et C- terminaux) du domaine kinase à proximité du site d’activation (hélice αC), en dehors du site de fixation de l’ATP. Le noyau indole de la Nec-1s interagit avec six résidus : Met67, Leu70, Val75, Leu129, Val134 et His136. Le noyau benzyle de la molécule est entouré, quant à lui, de résidus hydrophobes, cruciaux pour la stabilité de l’interaction: Val76, Leu78, Leu90, Met92, Leu157, Leu 159 et Phe162 (Xie et al. 2013b) (Figure 22B). Le résidu Met92 de la RIPK1 jouerait un rôle crucial en terme d’accessibilité pour les molécules hydrophobes (« the gatekeeper ») telle que la molécule Nec-1s ou les molécules dérivées du Ponatinib (Najjar et al. 2015). Des liaisons hydrogènes contribuent également à l’orientation de la Nec-1s dans la poche hydrophobe, telles que les liaisons entre l’azote du noyau indole et la Ser161 de la boucle T ainsi que celle du noyau benzyle avec la Val76 et l’Asp156. Ainsi la mutation RIPK1 S161A, responsable d’une diminution de l’activité de RIPK1, rompt la liaison hydrogène avec la glycine 188 et diminue l’efficacité de la Nec-1s (Xie et al. 2013b). Par son mode d’interaction, la Nec-1s empêche l’autophosphorylation de la RIPK1 sur les résidus Ser14/15 et Ser166 bloquant ainsi son activité kinase (Ofengeim et al. 2015). La liaison de la Nec-1s à la kinase RIPK1 conduit à un changement de conformation de la kinase (« αC-Glu-in » vers « αC-Glu-out »); on parle d’inhibiteur allostérique. La kinase RIPK1 suite à la fixation de la Nec-1s est alors bloquée et stabilisée en conformation inactive (αC-Glu- out/DLG-out), caractérisée par un large mouvement de l’hélice αC (Xie et al. 2013b). Nec-1s interagit uniquement avec la conformation « DLG-out » de la RIPK1 à l’arrière de la poche ATP sans contact avec les résidus les plus conservés du site ATP ; ce qui expliquerait sa forte sélectivité pour la RIPK1.

Figure 23. Classification des petites molécules inhibitrices des protéines kinases, basée sur la structure des complexes « composé chimique-enzyme » (illustrée d’après Roskoski 2016).

Cette famille composée de Nec-1, Nec-1s, Nec-3 et Nec-5 comporte cependant des faiblesses. Les études chimiques permettant de relier la structure à l’activité biologique ont montré que même de légères modifications de la structure de ces molécules conduisent à leur perte d’activité ou ne permettent pas d’obtenir de puissantes affinités pour la RIPK1 (IC50 de Nec-1s=210nM) (Choi et al. 2012; Jagtap et al. 2007; Teng et al. 2005, 2007, 2008). De plus, l’interaction Glu63/Lys45 est trop faible au sein de la conformation « Glu-out/DLG-out » pour être stable d’un point de vue énergétique (Najjar et al. 2015). Ces données montrent donc que l’optimisation de cette famille de molécules est limitée.

Structure chimique Mode d’action Efficacité et sélectivité

Cristallographie : non Criblage : Résidus de contact : cf Nec1s lignée U937 +TNF zVAD (signal nécroptotique)

Efficacité cellulaire : 860nM Occupe : une poche hydrophobe à proximité de l’hélice αC, en dehors Cibles : RIPK1 et IDO du site de fixation de l’ATP sans + deux kinases PKAC-α et PAK1 contact avec le site ATP dans un panel de 485 kinases (KinomeScan, DiscoveRx Corp)

Efficacité In vivo : Inhibiteur de kinase de type II :

bloque et stabilise la RIPK1 en - AVC Nec-1 conformation inactive « αC-Glu out / - Infarctus DLG-out » - Chocs septiques (SIRS et CLP) - Infections virales, parasitaires ou IC = 760nM 50 bactériennes Il inhibe l’autophosphorylation sur - Psoriasis Ser14/15 et Ser166 et empêche la - Pathologies rétiniennes formation du nécrosome - Hépatites non alcoolique et autoimmune - Ischémie rénale - Maladies inflammatoires intestinales

Résidus de contact déterminés par Version améliorée de la Nec-1 par cristallographie : une étude de relation structure/activité

Noyau indole : Met67, Leu 70, Val75, Leu129, Val134, His136 Sélectivité : forte vis à vis de RIPK1 Asp156, Ser161 situés dans la boucle Efficacité cellulaire : 238nM T de la RIPK1 forment des liaisons

H avec le noyau indole de Nec-1s Efficacité in vivo : (d’où une forte sélectivité) - SIRS induit par le TNF- Noyau benzyle : liaisons α - Hépatite à ConA hydrophobes avec Val76, Leu78, - infection pulmonaire à Leu90, Met92, Leu157, Leu159, S. aureus Phe162 - encéphalite auto-immune Occupe : une poche hydrophobe à proximité de l’hélice αC, en arrière Nec-1s du site de fixation de l’ATP Cristallographie : Xie et al. 2013b Inhibiteur de kinase de type II : bloque et stabilise la RIPK1 en conformation inactive « αC-Glu out / DLG-out » uniquement Il inhibe l’autophosphorylation sur Ser14/15 et Ser166 et empêche la formation du nécrosome

Tableau 4. Les Nécrostatines, inhibiteurs chimiques de l’activité kinase de la RIPK1 : mode d’action, efficacité et sélectivité.

La Nec-1 protège les modèles rongeurs de pathologies neurodégénératives, de dégénérescence rétiniennes et de maladies inflammatoires telles que le sepsis, les hépatites du foie alcoolique ou non-alcoolique, l’hépatite induite par la ConA, les pancréatites et les maladies inflammatoires de l’intestin (Tableaux 3 et 5) (Degterev et al. 2005; Degterev et al. 2008; Jouan-Lanhouet et al. 2014). Cependant la Nec-1 n’est pas utilisable en thérapeutique du fait de son homologie de structure avec le méthylthio-hydantoïne-tryptophane, l’inhibiteur de l’indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO), enzyme qui joue un rôle primordial dans l’immunité. De plus, Nec-1 possède une courte demi-vie et peut être toxique à faible dose (Takahashi et al. 2012; Vandenabeele et al. 2013; Degterev et al. 2013). La Nec-1s, sélective de la RIPK1, est donc privilégiée pour l’étude de la nécroptose in vivo. La Nec-1s prévient, entre autres, l’infection pulmonaire à S. aureus, le SIRS induit par le TNF et l’hépatite induite par la ConA (Kitur et al. 2015; Takahashi et al. 2012; Filliol et al. 2016).

2) Pazopanib Pazopanib est une molécule anti-cancéreuse qui cible différentes tyrosine kinases : préférentiellement le VEGFR-1, -2, -3, le PDGFRβ et c-Kit (Harris et al. 2008) ainsi que la RIPK1 (IC50 6,6µM) (Fauster et al. 2015). Elle est actuellement utilisée par voie orale dans le traitement du carcinome rénal et du sarcome avancé des tissus mous (Ward and Stadler 2010; van der Graaf and Gelderblom 2012; Ray-Coquard et al. 2017; van der Graaf et al. 2017). Elle est issue d’un crible de molécules utilisées en thérapeutique afin d’envisager son application rapide et de combler le manque dans le cadre de pathologies nécrotiques. Les propriétés anti- nécroptotiques de cette molécule seraient indépendantes de sa cible principale, le VEGFR, puisqu’un autre inhibiteur de VEGFR, le vandetanib, ne protège pas de la nécroptose induite par le TNF (Fauster et al. 2015).

3) Le pan-inhibiteur de RIPK1 et RIPK3, ponatinib La famille des nécrostatines ne permettant pas le développement de molécules utilisables en thérapeutique, plusieurs équipes dont l’équipe de Degterev ont cherché à mettre au point un inhibiteur aussi sélectif que la Nec-1s vis-à-vis de la kinase RIPK1 mais de forte affinité. Le ponatinib, pan-inhibiteur de RIPK1 et RIPK3, a été identifié dans deux criblages distincts. Dans le premier, il a été mis en évidence à partir d’un panel d’inhibiteurs de tyrosine kinases de classe II (Najjar et al. 2015). En effet, les auteurs se sont basés sur la similarité de structure entre RIPK1 (Xie et al. 2013 b) et Abl (Zhou et al. 2011). Ainsi le ponatinib est non sélectif et inhibe l’activité de la tyrosine kinase BCR-ABL et des Ser/Thr kinases RIPK1, RIPK3 ainsi que la kinase RIPK2. Les études de modélisation réalisées par le groupe d’Alexei Degterev a permis de mettre en évidence que le groupement amide de la molécule ponatinib forme des liaisons hydrogènes avec le résidu Asp156 de la triade DLG (spécifique de la RIPK1) au sein de l’hélice αC dans la conformation « Glu-in/DFG-out » de la kinase. Cette observation montre une analogie avec le mode d’interaction de la Nec-1s qui lie le même résidu Asp156 de la RIPK1 par son groupement urée (Najjar et al. 2015). Ainsi la modélisation de la molécule ponatinib avec la RIPK1 montre très peu de contacts avec la kinase RIPK1. Grâce à leurs travaux, cette équipe montre que la poche hydrophobe de la RIPK1 (définie par les résidus Ile43, Lys45, Leu90 et Met92) est plus étroite que celle des kinases Abl, RIPK2 et RIPK3 qui contient un résidu

69 hydrophobe plus petit (ou « gatekeeper ») mais un motif DFG plus volumineux en terme de contrainte stérique (Najjar et al. 2015) (Tableau 5). Cette molécule bloque l’apoptose (TNF-α/TAK1i) ou la nécroptose (LPS/z-VAD) dépendante de RIPK1 avec une meilleure efficacité que celle de la Nec-1 ou de son analogue, la Nec-1s (Najjar et al. 2015). De plus, elle est également plus efficace (facteur 10) que le GSK’872 (Kaiser et al. 2013 b) sur la nécroptose indépendante de RIPK1 (Poly(I:C)/z-VAD) (Najjar et al. 2015). Cette molécule empêche la phosphorylation de la pseudokinase MLKL lors de la nécroptose en bloquant l’activation des RIPKs (Fauster et al. 2015). Son efficacité d’inhibition des morts exclusivement dépendantes de RIPK1 ou de RIPK3 grâce à ses propriétés pan- inhibitrices en font une molécule prometteuse. Dans le second criblage, les auteurs ont testé une chimiothèque de composés utilisés en thérapeutique dans le modèle cellulaire des Jurkat déficientes en FADD traitées par le TNF-α (Fauster et al. 2015). Ils montrent que le ponatinib cible les kinases RIPK1, RIPK3 et TAK1 (Fauster et al. 2015). Cette étude met en évidence que même si cette molécule possède une activité anti-nécroptotique à des doses couramment utilisées pour la thérapie anti-cancéreuse dans la lutte contre diverses formes de leucémies, elle présente des effets cytotoxiques qui limitent son utilisation en clinique. L’enjeu fut donc d’améliorer la spécificité de cette structure pour permettre son utilisation dans le cas des pathologies nécrotiques inflammatoires. L’équipe de Degterev a en effet montré que la double inhibition RIPK1/RIPK3 est capable de prévenir du choc septique dépendant des RIPK1 et RIPK3 induit par le TNF-α (Duprez et al. 2011) à de faibles doses non toxiques chez la souris (Najjar et al. 2015) (Tableau 5).

4) La molécule hybride PN10 (Ponatinib-Nec1) Suite aux études de modélisation menées sur la molécule ponatinib, l’équipe a cherché à améliorer cette molécule puisqu’elle est non spécifique et cible plusieurs kinases Abl, RIPK1, RIPK2 et RIPK3 (Najjar et al. 2015; Fauster et al. 2015). En effet, cette molécule anti- cancéreuse a peu de chances d’être acceptée en tant qu’agent cytoprotecteur en clinique. L’équipe a alors mis au point une molécule chimère Ponatinib-Nec-1, baptisée PN-10. Ils ont cherché à conserver la sélectivité de la Nec-1s vis-à-vis de la RIPK1 et l’efficacité anti-nécroptotique du ponatinib démontrée in vitro dans un modèle de nécroptose induite par le TNF-α dans la lignée Jurkat déficiente en FADD. La Nec-1s possède une forte sélectivité en ciblant la conformation « Glu-out/DLG-out » de la kinase RIPK1 tandis que le ponatinib et le PN-10 sont efficaces dans les modèles cellulaires grâce à leur forte affinité pour la conformation « Glu-in/DLG-out » de la kinase RIPK1 (Najjar et al. 2015). La molécule PN-10 pourrait être améliorée en trouvant la structure chimique optimale du noyau fluoré qui lui permettrait d’adopter au mieux la conformation de poche hydrophobe « DLG-out » où le résidu Met92, représente une gêne stérique clef pour l’accessibilité des molécules hydrophobes, en arrière de l’hélice αC (Christofferson et al. 2012) (Tableau 5). PN-10 présente une meilleure efficacité vis-à-vis de la RIPK1 comparée à la Nec-1s dans un test d’activité kinase ainsi qu’une activité meilleure anti-nécroptotique in vitro que la Nec-1s (d’un facteur 20) ou le ponatinib (d’un facteur 3) (Najjar et al. 2015). Cette molécule est sélective de la RIPK1 dans un panel de 90 kinases (ScanEDGE panel, DiscoveRx Corp). De plus, les auteurs ont montré que la molécule PN-10 possède la capacité de bloquer la formation

70 du nécrosome comme la Nec-1 (Cho et al. 2009), à une dose plus faible que la Nec-1s dans un modèle de nécroptose : la lignée cellulaire MEFs stimulées par la combinaison TNF-α/CHX/z- VAD (Najjar et al. 2015; Thapa et al. 2013) (Tableau 5). Le ponatinib (pan-RIPK1/3) est peu efficace quant à lui dans ce test tandis que les inhibiteurs de la RIPK3 GSK’843 et GSK’872 sont eux incapables de bloquer la formation du nécrosome dans ce modèle (Najjar et al. 2015). Ces données démontrent que la molécule PN-10 a perdu la capacité du ponatinib à inhiber l’activité kinase de la RIPK3. PN-10 comme la Nec-1s ou le Ponatinib bloquent également la fonction pro-inflammatoire de la RIPK1 (indépendante de sa fonction de mort) responsable de la transcription du TNF-α (Najjar et al. 2015). Ces données suggèrent des propriétés anti-inflammatoires intéressantes de la molécule. L’amélioration de la sélectivité du PN-10 diminue la cytotoxicité reprochée au ponatinib et offre une meilleure efficacité de la molécule versus Nec-1 et ponatinib (tous trois testés à 1mg/kg et à 0,4mg/kg) in vivo dans le modèle de SIRS induit par le TNF-α (Najjar et al. 2015) (Tableau 5). Cette molécule pourrait donc être privilégiée à la Nec-1s in vivo pour l’étude de modèles murins de pathologies humaines dépendantes de l’activité de la kinase RIPK1. 5) Le Cpd27 La molécule Cpd27 est une molécule de la famille des furo[2,3-d]pyrimidines (Harris et al. 2013). Elle est issue du criblage de la chimiothèque des inhibiteurs de kinases de la société GSK (GlaxoSmithKline) (Kufareva and Abagyan 2008). Ce criblage a permis de mettre en évidence trois séries d’inhibiteurs de la RIPK1 : les 1-aminoisoquinolines, les 5-phénylpyrrolo[2,3- b]pyridines et les furo[2,3-b]pyrimidines. Ces molécules ciblent la conformation inactive « DLG- out » de la kinase RIPK1, il s’agit donc d’inhibiteurs de kinases de classe II (Liu and Gray 2006). Pour rappel, cette séquence de résidus Asp-Phe-Gly (DFG) de la kinase (ou Asp-Leu-Gly (DLG) dans le cas de la RIPK1) en amont de la boucle d’activation (hélice αC) adopte une conformation différente appelée « DFG-in » (« DLG-in » pour RIPK1) lorsque la kinase est activée. Le résidu phénylalanine (ou leucine) pivote vers l’intérieur et obstrue partiellement le site ATP. Ce réarrangement crée une nouvelle poche hydrophobe à proximité du site de liaison de l’ATP disponible pour la partie hydrophobe de la structure des inhibiteurs de classe II (Figure 23). Ainsi le reste de la structure chimique de l’inhibiteur forme des liaisons hydrogènes avec des résidus de contact à proximité de la poche afin de stabiliser l’interaction. Une étude cristallographique de la structure chimique du Cpd27 complexée à la RIPK1 a montré qu’elle cible la conformation « DLG-out » de la kinase RIPK1 et occupe la poche ATP de la kinase (Tableau 5). L’équipe de Gough et al. a abandonné l’amélioration de ce composé car les molécules dérivées du Cpd27 sont peu sélectives de la kinase RIPK1. Cette molécule utilisée à 1µM inhibe l’activité de 26 kinases dans un test de phosphorylation dirigé contre 300 kinases (Reaction Biology Corporation ©) incluant la RIPK1. De plus, les dérivés du Cdp27 ont de hauts poids moléculaires, de fortes propriétés lipophiles les rendant peu solubles (13µM) dans des solvants aqueux et une forte affinité pour les protéines (0,04% de fraction libre) (Tableau 5). L’ensemble de ces obstacles les rend peu intéressants pour un développement pharmacologique malgré leur bonne absorption par voie orale chez le rongeur et leur pouvoir protecteur dépendant de la quantité administrée dans le modèle du SIRS induit par le TNF-α grâce à un prétraitement en une dose (20mg/kg).

Structure chimique Mode d’action Efficacité et sélectivité

Cristallographie : non Criblage : Modélisation des résidus de contact : - panel d’inhibiteurs de Tyrosine kinases un seul contact : Asp156 au sein de la - FDA approved drugs triade DLG de l’hélice C α Inhibiteur de kinase de type II : Sélectivité : mauvaise bloque et stabilise la RIPK1 en Cibles : Bcr-Abl, RIPK-1,-2,-3 conformation inactive « αC-Glu in / Efficacité cellulaire : 30 nM Ponatinib DLG-out » (d’où son efficacité mais cytotoxique à >1µM cellulaire) Efficacité in vivo : Il inhibe l’autophosphorylation sur Ser14/15 et Ser166 et empêche la Plus efficace que la Nec-1 dans le formation du nécrosome comme les SIRS induit par le TNF-α Nécrostatines.

Cristallographie : non Criblage : Modélisation des résidus de - panel d’inhibiteurs de Tyrosine contact : kinases - FDA approved drugs un seul contact : Asp156 au sein de la triade DLG de l’hélice αC Sélectivité : cible uniquement la RIPK1 à 1µM dans un panel de 90 Inhibiteur de kinase de type II : kinases (ScanEDGE panel, bloque et stabilise la RIPK1 en DiscoveRx Corp) conformation inactive « αC-Glu in / DLG-out » Efficacité cellulaire : 10 nM, peu cytotoxique PN-10 Il inhibe l’autophosphorylation sur Ser14/15 et Ser166 et empêche la Efficacité in vivo : formation du nécrosome comme les Plus efficace que la Nec-1 dans le Nécrostatines. SIRS induit par le TNF-α

Cristallographie : oui Criblage : panel d’inhibiteurs de la société GSK Inhibiteur allostérique. Sélectivité : Occupe la poche ATP de la RIPK1 - peu sélective de RIPK1, - cible 25 kinases dans un panel de Inhibiteur de kinase de type II : 300 kinases à 10µM (Reaction bloque et stabilise la RIPK1 en Biology Corporation ©) excluant la conformation inactive « DLG-out » RIPK1

Il inhibe l’autophosphorylation sur Efficacité cellulaire : 250 nM Ser14/15 et Ser166 et empêche la Haut PM, lipophile, peu soluble en

formation du nécrosome comme les solvants aqueux Cpd27 Nécrostatines. Efficacité in vivo : Absorbable par voie orale. Mal distribué car fraction libre quasi nulle. Protège du SIRS induit par le TNF-α (20mk/kg) Tableau 5 (Partie 1). Inhibiteurs chimiques de l’activité kinase de la RIPK1, autres que les Nécrostatines : mode d’action, efficacité et sélectivité.

6) Le GSK’963 Cette molécule a également été mise en évidence par l’équipe de Gough à l’issu du criblage de la chiomiothèque de la société GSK dans un test d’activité enzymatique ADP-Glo grâce à l’utilisation du domaine kinase de la RIPK1 recombinante. La molécule 1-pivaloyl-5-phényl 4,5- dihydropyrazole ou GSK’963 est une petite molécule chirale inhibitrice de la kinase RIPK1, hautement efficace et sélective (Berger et al. 2015). Le mode d’action de cette substance chimique n’a pas été décrit dans ces travaux. Elle est sélective de la RIPK1 dans un test dirigé contre 340 kinases (Reaction Biology Corporation ©) et plus efficace que la Nec-1 (facteur 200) dans des tests biochimiques et cellulaires sans inhiber l’IDO. Elle possède un énantiomère inactif, le GSK’962, utilisable in vitro et in vivo. De plus, elle montre une forte activité anti-nécroptotique de l’ordre du nanomolaire (1-4nM) dans de nombreux modèles cellulaires humains. Elle possède une demi-vie plus longue que la Nec-1 in vivo et elle protège complètement du sepsis aigu provoqué par la combinaison TNF+z-VAD chez la souris à 2mg/kg en injection intrapéritonéale, dose à laquelle la Nec-1 ne montre aucune protection dans ce modèle (Berger et al. 2015). Malgré son utilité in vitro et in vivo, la faible absorption de la molécule par voie orale chez le rongeur est un obstacle à son développement pharmaceutique (Berger et al. 2015).

7) Les GSK’481 et GSK2982772 Le groupe de Peter Gough a identifié un troisième inhibiteur sélectif de la kinase RIPK1, il s’agit d’une benzoxazepinone nommée GSK’481 (Harris et al. 2016). Cette série diffère des précédentes car les inhibiteurs ainsi identifiés sont hautement sélectifs et efficaces vis-à-vis de la kinase RIPK1 (profil monokinase) et absorbés par voie orale chez le rongeur. Cet inhibiteur est issu du criblage de la chimiothèque « DNA-encoded librairies » de la société GSK (Clark et al. 2009). La molécule GSK’481 n’a aucune cible parmi 318 kinases dans le test au P33 radiomarqué de la société Reaction Biology Corp et cible uniquement la RIPK1 dans le test de compétitivité KinomeScan de la société DiscoveRx Corp qui contient 456 kinases (Harris et al. 2016). GSK’841 est une molécule hautement lipophile, peu soluble (30µg/ml) et peu absorbable chez le rat avec une courte demi-vie (Harris et al. 2016). Elle présente une forte sélectivité d’espèce pour la RIPK1 primate ce qui a poussé l’équipe à identifier les divergences entre la séquence protéique de la RIPK1 humaine et simienne avec les RIPK1 du lapin, du mini-porc, de la souris et du rat. La co-cristallisation de sa structure chimique avec la RIPK1 a permis d’identifier deux résidus de contact : Met95 et Glu93 dans la poche ATP ; ce composé forme également une liaison H avec l’Asp156 du site d’activation de la RIPK1 (Harris et al. 2016). D’après les auteurs, cet inhibiteur occupe la même poche hydrophobe que la Nec-1s. L’optimisation de la molécule GSK’481 a permis de synthétiser la première molécule inhibitrice de la RIPK1 en essai clinique (Harris et al. 2017). L’équipe américaine propose l’utilisation du GSK2982772 (ou (S)-5-benzyl-N-(5-methyl-4-oxo-2,3,4,5-tetrahydrobenzo[b] [1,4]oxazepin-3-yl)-1H-1,2,4-triazole-3-carboxamide) dans le traitement de pathologies inflammatoires nécrotiques telles que le psoriasis, l’arthrite rhumatoïde et la colite ulcérative.

Le co-cristal de GSK2982772 avec la RIPK1 montre que l’inhibiteur ne cible pas le site actif de la kinase. Il occupe une petite poche hydrophobe enfouie à l’arrière du site ATP ce qui restreint les modifications possibles sur la structure chimique ; il s’agit de la même poche hydrophobe que la Nec-4 (Harris et al. 2017; Xie et al. 2013 b) suggérant le mode d’action de inhibiteurs de kinase de classe III (Müller et al. 2015). Le groupe benzyle de la molécule est logé dans la poche hydrophobe derrière le site ATP de la kinase et occupe l’espace du phosphate soit un endroit différent du résidu adénine de l’ATP. Son mode d’inhibition n’est donc pas strictement allostérique. Cette poche est formée par deux feuillets β définis par les résidus Leu90-Val91-Met92 et Ile43-Met44-Lys45. Cette poche étroite favorise l’accès à de petits groupements lipophiles non polaires. L’hétérocycle à l’opposé de la structure, exposé au solvant, forme des liaisons hydrogènes avec les résidus de contact. Celui-ci accepte peu de changements, il doit être peu encombrant, non-chiral et comporter un cycle à sept membres pour stabiliser l’inhibiteur dans la poche hydrophobe. Ce composé réalise trois liaisons hydrogènes avec les résidus de contacts suivants : Asp156, Met67 et Val76 (Tableau 5). La molécule GSK2982772 est la molécule optimale obtenue dans cette étude en termes de structure-activité dans les tests biochimiques d’activité kinase et d’efficacité cellulaire (de l’ordre de 1nM) dans les U937 ou les PBMCs stimulés par un signal nécroptotique TNF/zVAD/Smac- mimétiques (Harris et al. 2017). Ce composé lie efficacement la kinase RIPK1 et est compétitif de l’ATP. Il possède une très forte spécificité puisqu’il ne cible aucune kinase parmi les 339 kinases dans le test de phosphorylation de la société Reaction Biology Corp et cible uniquement la kinase RIPK1 dans le test de compétitivité KinomeScan (456 kinases) de la société DiscoveRx Corp à la concentration de 10µM. Cette molécule n’a pas d’action sur les cytochromes P450 (Harris et al. 2017) (Tableau 5).

Son efficacité in vivo a été démontrée à l’aide du modèle murin de sepsis modéré ou aigu provoqué par le TNF ou la combinaison TNF+z-VAD à une dose respective de 10 ou 50 mg/kg. Cet inhibiteur est capable de réduire la production de cytokines proinflammatoires (IL-1β et IL- 6) dans des explants de patients atteints de colite ulcérative. Ses propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques comprises entre 2 et 1000 mg/kg ainsi que son fort potentiel inhibiteur permettent d’envisager l’administration de faibles doses chez l’Homme ; sa demi-vie est prédite autour de 12 heures. Ce composé présente les propriétés idéales en termes de lipophilie, solubilité, perméabilité cellulaire et absorption orale dans des modèles précliniques. Il est distribué dans de nombreux tissus tels que le côlon, le foie, le rein et le cœur à des concentrations similaires aux concentrations plasmatiques mais il est activement éliminer du tissu cérébral. Ce composé comme GSK’481 est très efficace vis-à-vis de la RIPK1 chez l’Homme ou le singe par comparaison aux autres espèces pré-cliniques (facteur >50) (Harris et al. 2016, 2017) (Tableau 5). Selon les auteurs, cette sélectivité d’espèce est réservée aux inhibiteurs de kinases de type III (Figure 22). Ils présenteraient une moins bonne efficacité vis-à-vis de la RIPK1 murine car ils ciblent la boucle d’activation qui présente peu de flexibilité chez la souris du fait de sa séquence en acides aminés. Cette conformation serait donc moins sensible aux inhibiteurs de kinases de type III.

Cette molécule a été validée en phase I de développement clinique en 2015. La tolérance et l'absence d'effets secondaires chez des volontaires sains ainsi que la cinétique et le métabolisme de la substance ont été étudiées. A l’heure actuelle, la molécule est en phase IIa d’essai clinique. Il s’agit d’évaluer l’efficacité du médicament et de déterminer ses éventuels effets secondaires sur un nombre limité (de 100 à 200) de patients. Si la molécule présente un intérêt thérapeutique, elle est suivie de la phase IIb d’évaluation de la dose thérapeutique à grande échelle.

8) Le Compound 56 (RIPA-56) Ren et al., ont également découvert un inhibiteur de classe III de la RIPK1, le N-benzyl-N N- hydroxy-2,2-dimethylbutanamide ou RIPA-56 (Ren et al. 2017). Ce composé cible la RIPK1 dans un panel de plus de 300 kinases de la société Reaction Biology Corporation, les résultats du criblage n’ont pas été publiés par ce groupe. Ce composé montre des propriétés anti- nécroptotiques dans un modèle humain (HT29+TNF/zVAD/Smac-mimétiques, EC50=28nM) et un modèle murin (L929 +TNF/zVAD, EC50=27nM). Il est plus efficace que le GSK’481, efficace sur une RIPK1 humaine ou de primate (d’un facteur 100). Cette molécule est métaboliquement stable dans des microsomes hépatiques humains (demi-vie : 128min) (Ren et al. 2017). De plus, elle bloque la phosphorylation de la RIPK1 ainsi que l’activité kinase de la RIPK1 in vitro (IC50=13nM). De plus, elle empêche l’autophosphorylation de la RIPK3 (Ser227) (Ren et al. 2017) ; or l’autophosphorylation de ce résidu est nécessaire au recrutement de MLKL (Sun et al. 2012 ; Chen et al. 2013). Cependant, elle n’a pas d’effet sur l’activité de la kinase RIPK3 à 10µM dans le test enzymatique ADP-Glo (Ren et al. 2017). Son mode d’interaction avec la RIPK1 est différent de celui de la Nec-1 ; cet inhibiteur se fixe dans la poche hydrophobe en arrière du site de fixation de l’ATP impliquant la formation de liaisons hydrogènes entre le groupement carbonyle de l’inhibiteur et le résidu Asp156 et entre le groupement hydroxyle et le résidu Val76 (Tableau 5). Les auteurs concluent à un mode d’interaction de type III responsable de la stabilisation de la RIPK1 dans une conformation inactive (Figure 23). Ils ont de plus montré que ce composé n’a pas d’effet sur l’activité enzymatique de l’IDO à 200µM, contrairement à la Nec-1. Cette molécule absorbable par voie orale chez la souris (demi-vie de 3h) protège de l’inflammation et des dommages multi-organes lors du SIRS induit par le TNF-α grâce à une dose de 3mg/kg administrée par voie intrapéritonéale (offrant la meilleure distribution) de façon plus efficace que la Nec-1 (Ren et al. 2017). Il n’est pas toxique chez la souris lors de l’administration de fortes doses répétées. Ce composé possède des propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques intéressantes pour un développement thérapeutique. Il traverse les parois endothéliales lui permettant une bonne distribution systémique. De plus, il traverse la barrière hémato-encéphalique chez la souris (Ren et al. 2017) (Tableau 5). L’ensemble de ces données confère à cet inhibiteur de la RIPK1 un atout pour d’éventuelles applications dans le traitement des maladies nécrotiques inflammatoires et des maladies neurodégénératives ainsi que le traitement des accidents vasculaires cérébraux ou des ischémies cérébrales. Cependant, d’autres tests seraient nécessaires notamment par voie orale dans des modèles précliniques ainsi que des tests sur des explants humains avant d’envisager son application chez l’Homme.

Structure chimique Mode d’action Efficacité et sélectivité

Mode d’action non publié Criblage : test enzymatique ADP-Glo en présence de la RIPK1 recombinante

Ce composé inhibe l’auto- Sélectivité : phosphorylation sur - sélective de la RIPK1 Ser14/15 et Ser166 et - pas d’effet sur IDO empêche la formation du - ne cible aucune kinase dans un panel de 300 nécrosome comme les kinases à 10µM (Reaction Biology Corporation) Nécrostatines. Efficacité : 1-4 nM, molécule hautement efficace (facteur 200 par rapport à Nec-1) GSK’963 In vivo : protège du sepsis aigu induit par la combinaison TNF zVAD Faible absorption par voie orale et demi-vie plus courte que la Nec-1 Cristallographie : oui Criblage : à partir d’une chimiothèque de type « DNA encoded librairies » de la société GSK Liaison H avec l’Asp156 Sélectivité : forte Modélisation des résidus de contact : seulement deux - cible la RIPK1 dans un panel de 456 kinases à résidus de contact Met95 et 10µM (KinomeScan, DiscoveRx Corp) Glu93 dans la poche - ne cible aucune kinase dans un panel de 318 hydrophobe kinases à 10µM (Reaction Biology Corporation) GSK’481 Inhibiteur allostérique. Efficacité : forte Cet inhibiteur occupe la Très lipophile, peu soluble en solvant aqueux. poche ATP de la RIPK1 Sélectif de l’espèce primate. In vivo : peu absorbé par voie orale, courte demi-vie Cristallographie : oui Version améliorée du GSK’481 : par une étude de relation structure/activité Résidus de contact : Sélectivité : très forte pour la RIPK1 - hétérocycle : 3 liaisons H - cible la RIPK1 à 10µM dans un panel de 456 avec Asp156, Met67, kinases (KinomeScan, DiscoveRx Corp) Val76 - ne cible aucune kinase dans un panel de 318 - poche hydrophobe, en kinases à 10µM (Reaction Biology Corporation) arrière du site ATP, - sélectif de l’espèce primate (facteur 50) formée par deux feuillets Efficacité : très forte (1nM) β : In vivo : Non toxique, absorbable par voie orale. Leu 90-Val91-Met92 Etude complète dans de nombreuses espèces pré- GSK2982772 et Ile43-Met44-Lys45 cliniques. Inhibiteur de kinase de Lipophile mais soluble dans les solvants aqueux, type III : diffuse dans les cellules. Stable métaboliquement. Demi-vie de 12h chez Occupe une très petite poche l’Homme, dose efficace entre 2 et 1000mg/kg. hydrophe enfouie à l’arrière Anti-inflammatoire dans des explants de peau du site ATP, à l’extérieur du humaine de patients atteints de psoriasis site actif de la RIPK1. Compétitif de l’ATP. Bonne distribution systémique excepté au niveau cérébral

Cristallographie : non Criblage : HT29 + TNF/zVAD/Smac-mimétiques Modélisation des résidus Sélectivité : forte dans un panel de plus de 300 de contact : kinases (Reaction Biology Corporation) - noyau phényl : interactions Efficacité : forte (13nM) contre h/mRIPK1 hydrophobes In vivo : Non toxique, absorbable par voie orale. Protège du SIRS induit par le TNF-α - liaisons H avec les résidus Stable métaboliquement RIPA-56 Asp156 et Val76 Bonne distribution systémique. Traverse la Inhibiteur de kinase de barrière hémato-encéphalique. type III. Demi-vie de 2h environ chez l’Homme.

Tableau 5 (Partie 2). Inhibiteurs chimiques de l’activité kinase de la RIPK1, autres que les Nécrostatines : mode d’action, efficacité et sélectivité.

B. Les inhibiteurs de RIPK3 L’importance de l’activité de la RIPK3 pour l’activation de la nécroptose a poussé les équipes à rechercher des inhibiteurs de cette kinase (Kaiser et al. 2013 b; Mandal et al. 2014). De plus, l’utilisation de modèles d’infection virale a permis de démontrer l’existence de nécroptoses indépendantes de l’activité kinase de la RIPK1 (Upton et al. 2012; Kaiser et al. 2013 b). L’utilisation des souris RIPK3 KO montrent que la RIPK3 ne joue pas un rôle vital et que la perte de la RIPK3 protège de certaines pathologies nécrotiques (Newton et al. 2004; Kaczmarek et al. 2013; Jouan-Lanhouet et al. 2014) ; cela suggère que l’inhibition de activité kinase pourrait être bénéfique dans le traitement de certaines pathologies nécrotiques.

1) GSK’840, GSK’843 et GSK’872 Kaiser et al. ont développé trois inhibiteurs de la kinase RIPK3 provenant de la chimiothèque de la société GSKs : GSK’840, GSK’843 et GSK’872 (Kaiser et al. 2013 b; Mandal et al. 2014). Ils ont criblé la chimiothèque à l’aide d’un test de compétition de l’ATP. Ces molécules présentent différentes affinités vis-à-vis du domaine kinase in vitro (de l’ordre de 1nM) et une bonne sélectivité dans un test de phosphorylation de la société Reaction Biology Corp contre plus de 300 kinases à 1µM. Les résultats de ce test de spécificité ainsi que le mode d’action de ces molécules n’ont pas été publiés par les auteurs. Cependant le mode de criblage suggère que ces molécules sont compétitives de l’ATP. La molécule GSK’840 montre la meilleure affinité et la meilleure sélectivité dans ce criblage mais elle est inefficace vis-à-vis de la RIPK3 murine. Les molécules GSK’843 et GSK’872 ciblent à la fois les RIPK3 humaine et murine ; cependant elles favorisent l’apoptose dépendante de la RIPK1 et l’activation de la caspase 8 (Mandal et al. 2014). Ces molécules bloquent la mort cellulaire dans différents modèles de nécroptoses, l’un dépendant de RIPK1 et RIPK3 (TNF+z- VAD dans la lignée 3T3-sA) et l’autre dépendant de RIPK3 uniquement (Poly(I :C)+z-VAD ou LPS+z-VAD dans la même lignée) (Kaiser et al. 2013 b; Mandal et al. 2014). Ces composés notamment le GSK’872 bloquent la nécroptose mais induisent une apoptose ; ce qui les rend hautement cytotoxiques à forte dose (Harris et al. 2013).

2) GW’39 Rodriguez et al. ont décrit un autre inhibiteur de la RIPK3 issu d’un criblage basé sur un modèle de nécroptose induite par la dimérisation de la RIPK3 (Rodriguez et al. 2016). Cette molécule présente des similarités de structure avec le GSK’872 mais une activité comparable à la molécule GSK’840. Cet inhibiteur montre une activité anti-nécroptotique due à l’inhibition de l’activité kinase de la RIPK3 bloquant ainsi la phosphorylation de MLKL (Ser345) par la kinase RIPK3 dans différents modèles cellulaires humains et dans un modèle cellulaire murin. Ce composé empêche efficacement la translocation de MLKL à la membrane plasmique qui nécessite la phosphorylation de la sérine 345 au niveau de la boucle d’activation de la pseudokinase (Rodriguez et al. 2016).

3) Dabrafenib Il s’agit à ce jour du seul inhibiteur de la RIPK3 testé in vivo. Les auteurs ont cherché des inhibiteurs de la nécroptose parmi les inhibiteurs de kinases disponibles en clinique. Ils ont découvert la molécule dabrafenib, un inhibiteur de B-Raf (V600E) compétitif de l’ATP, utilisée dans le traitement du mélanome qui présente une affinité modérée pour la RIPK3. Pourtant cette molécule a montré un effet protecteur dans l’hépatite induite par l’acétaminophène chez la souris. De plus, elle offre une protection des hépatocytes humains lors de la nécrose dépendante de la RIPK3 induite par l’acétaminophène dans la même étude (Li et al. 2014). L’effet protecteur du dabrafenib in vivo semblerait être médié par l’inhibition de la RIPK3 puisqu’un autre inhibiteur de B-Raf, le vemurafenib, n’empêche pas l’apparition de lésions hépatiques dans ce modèle murin (Li et al. 2014).

C. Les inhibiteurs de MLKL MLKL étant la pseudokinase effectrice de la nécroptose, elle représente une cible intéressante en thérapeutique pour bloquer spécifiquement la mort par nécroptose (Vanden Berghe et al. 2016) puisque RIPK1 et RIPK3 possèdent également des fonctions non-nécroptotiques (Moriwaki and Chan 2017). De plus, la mortalité des souris RIPK3D161N (kinase inactive) démontre que le changement de conformation du domaine kinase de la RIPK3 pourrait permettre l’accès de son domaine RHIM à la kinase RIPK1 pour initier l’apoptose (Newton et al. 2014; Zhang and Chan 2014). MLKL est composée d’un domaine N-terminal constitué par quatre hélices (4HB) connectées au domaine C-terminal (Murphy et al. 2013). Le domaine C-terminal possède l’activité auto- inhibitrice de la protéine tandis que le domaine 4HB est pro-nécroptotique. L’activation de la nécroptose est médiée par l’activation de MLKL responsable d’un changement de conformation de la pseudokinase qui va perdre sa fonction auto-inhibitrice (Hildebrand et al. 2014). La phosphorylation de MLKL au niveau de la boucle d’activation par la RIPK3 conduit à l’activation de la pseudokinase (Rodriguez et al. 2016; Murphy et al. 2013).

1) Nécrosulfonamide (NSA) Sun et al. ont découvert un inhibiteur covalent de la pseudokinase MLKL, sélectif de l’espèce humaine, appelé nécrosulfonamide ou NSA (Sun et al. 2012). Cette petite molécule agit en aval de la formation du nécrosome RIPK1/RIPK3. Elle a ainsi permis d’isoler et d’identifier MLKL, comme l’effecteur de la nécroptose (Sun et al. 2012). Cet inhibiteur lie de façon covalente le résidu Cys86 du domaine 4HB N-terminal ; la MLKL murine est dépourvue du résidu Cys correspondant (Sun et al. 2012). A ce jour, cet inhibiteur n’a pas été utilisé in vivo.

2) Compound-1 Un criblage basé sur un test de dénaturation thermique (« thermal shift assay ») a permis d’identifier le « Compound-1 » (Hildebrand et al. 2014). Cette molécule est inhibitrice de VEGFR2 et ressemble aux inhibiteurs de classe II. Ce composé est inactif vis-à-vis de la kinase RIPK3 mais bloque efficacement la nécroptose dès 1µM et conduit à l’augmentation de la phosphorylation de MLKL murine au niveau de la boucle d’activation par RIPK3 mais à l’inhibition de sa localisation membranaire. Cet inhibiteur stabiliserait donc MLKL dans sa conformation inactive en empêchant l’exposition du domaine 4HB malgré la phosphorylation de la boucle d’activation (Hildebrand et al. 2014). Il serait intéressant d’utilisé ce composé dans des modèles humains ex vivo afin de déterminer ses effets dans des tissus humains.

D. Les inhibiteurs d’autres cibles

1) La Nec-7 La nécrostatine-7 présente une structure différente des autres membres de la famille des nécrostatines. Elle ne présente pas d’activité inhibitrice vis-à-vis de la RIPK1. Elle bloque cependant la nécroptose induite par le TNF-α dans le modèle de Jurkat déficientes en FADD (Zheng et al. 2008). La Nec-7 ciblerait donc un autre acteur de la nécroptose.

2) Le Vorinostat Les inhibiteurs des HDACs (histone déacétylases) sont des agents anti-cancéreux qui possèdent une activité anti-inflammatoire et neuroprotectrice. Le Vorinostat (suberoylanilide hydroxamic acid) fut le premier inhibiteur des HDACs approuvé en clinique. Il fut prescrit dans le traitement des rechutes des lymphomes T cutanés. Son application anti-nécroptotique fut décrite pour la première fois par Wang et al. en 2013 dans la lignée murine L929. Cette équipe a montré qu’un prétraitement par le vorinostat bloque la nécroptose induite par le TNF-α en activant la voie NF-ĸB et la voie MAPK p38, en bloquant l’activation des kinases JNK et Akt et en augmentant l’expression du régulateur négatif de la nécroptose cFLIP (Wang et al. 2013). Ces données montrent que le vorinostat exerce une activité anti-inflammatoire et cytoprotectrice en bloquant la nécroptose.

E. Leurs intérêts thérapeutiques L’utilisation d’inhibiteurs de l’activité kinase de la RIPK1 en thérapeutique semble être une stratégie intéressante pour l’amélioration ou la prévention de nombreuses pathologies inflammatoires humaines (Galluzzi et al. 2017). La RIPK1 joue un rôle clef dans la régulation de l’inflammation à la fois par ses propriétés d’échafaudage et par son activité kinase au cours de la réponse immunitaire innée (Berger et al. 2014). Son activité kinase est à l’origine de l’engagement de la signalisation nécroptotique dépendante des DRs (TNFR1, Fas et TRAIL- R1/R2), des TLR3/4 et de l’IFNAR1 (Holler et al. 2000; Degterev and Yuan 2008; Jouan- Lanhouet et al. 2012; Najjar et al. 2015), de la production de cytokines pro-inflammatoires (Christofferson et al. 2012), de la formation de l’inflammasome (Duong et al. 2015) ainsi que de certaines formes d’apoptose (Wang et al. 2008; Gentle et al. 2011; Dondelinger et al. 2013). Des travaux ont montré que l’inhibition de la nécroptose dépendante de l’activité kinase de RIPK1 par les protéines pro-apoptotiques caspase 8 et FADD joue un rôle crucial dans la prévention de l’inflammation au sein du tissu cutané et intestinal chez l’Homme ou la souris (Günther et al. 2011; Bonnet et al. 2011; Welz et al. 2011). La RIPK1 possède également des fonctions anti- inflammatoire et anti-apoptotique indépendantes de son activité kinase permettant le maintien de l’intégrité tissulaire dans un contexte inflammatoire (Dannappel et al. 2014; Takahashi et al. 2014; Filliol et al. 2016). L’utilisation d’inhibiteurs de la RIPK1 (Nec-1, Nec-1s et PN-10) permet à l’heure actuelle d’étudier la contribution de son activité kinase dans l’initiation ou l’aggravation des modèles murins de pathologies inflammatoires à des fins thérapeutiques. L’équipe de Gough est la première a proposé un inhibiteur de la RIPK1 en essai thérapeutique grâce à des propriétés physicochimiques et pharmacologiques compatibles avec des applications cliniques. La molécule GSK2982772 validée en phase I permettrait de réduire l’inflammation dans le psoriasis, les colites ulcératives et les arthrites rhumatoïdes ; ces trois études de phase II sont en cours (Harris et al. 2017). Degterev et al. ont montré en 2005 que la nécroptose serait impliquée dans les pathologies neurodégénératives ; or cette molécule est éliminée du tissu cérébral par une glycoprotéine transporteur d’efflux (Degterev et al. 2005; Harris et al. 2017).

La nécroptose est une voie de mort complexe puisque en fonction du stimulus de mort ou du stimulus infectieux elle nécessite des acteurs protéiques différents (Vanden Berghe et al. 2016) (Tableau 6). La molécule Ponatinib, pan RIPK1/RIPK3, offre des perspectives intéressantes puisqu’elle bloque à la fois la nécroptose dépendante de la formation du complexe RIPK1/RIPK3 et la nécroptose dépendante du complexe RIPK3-MLKL indépendante de l’activité de la RIPK1. Cependant malgré ses propriétés inhibitrices de la nécroptose, cette molécule est cytotoxique ce qui empêche son application cytoprotectrice dans le cadre de pathologies inflammatoires. D’autres études montrent que l’inhibition de l’activité de la RIPK3 bloque également la nécroptose (Kaiser et al. 2013 b; Mandal et al. 2014; Rodriguez et al. 2016; Li et al. 2014). Cependant seule le Dabrafenib, inhibiteur de B-RAFV600E et de la RIPK3, a été testé in vivo ; il protège un modèle murin d’hépatite induite par l’acétaminophène (Li et al. 2014). Newton et al. ont montré que la RIPK3 joue un rôle crucial dans la décision entre apoptose et nécroptose (Newton et al. 2014). De plus, l’utilisation d’inhibiteur de la RIPK3

80 sensibilise à l’apoptose (Mandal et al. 2014). L’inhibition de la phosphorylation de MLKL par la kinase RIPK3 semble être une meilleure stratégie pour bloquer la nécroptose (Sun et al. 2012; Hildebrand et al. 2014). La NSA est spécifique de l’espèce humaine et ne permet donc pas son utilisation dans les modèles murins pré-cliniques de nécroptose (Sun et al. 2012). Il serait cependant intéressant de tester cette molécule dans des explants humains de pathologies nécrotiques. Le Compound-1 n’a à ce jour pas été testé dans un modèle murin (Hildebrand et al. 2014).

Nom Cible (s) Description Références Inhibiteurs de la kinase RIPK1 (cf. Tableaux 5 et 6) Nécrostatines, Ponatinib, PN-10 Cpd27, 1-aminisoquinolines, pyrrolo[2,3]pyrimidines, GSK’963 GSK’481, GSK2982772 et RIPA-56 Inhibiteurs de la kinase RIPK3 GSK’843 h/m RIPK3 Compétitifs de l’ATP. Kaiser et al. 2013b GSK’872 h/m RIPK3 Sélectifs de la RIPK3. Anti- Mandal et al. 2014 GSK’840 hRIPK3 nécroptotiques dans des modèles dépendant ou indépendant de la RIPK1. Pro-apoptotiques. GW’39 h/m RIPK3 Anti-nécroptotique Rodriguez et al. 2016 Ponatinib Bcr-Abl Inhibiteur de classe II, situé au Fauster et al. 2015 (AP24534) RIPK1, RIPK3 contact de l’hélice α. Najjar et al. 2015 et RIPK2 Non sélectif de la RIPK3. Anti-nécroptotique mais cytotoxique à faible dose. Dabrafenib h/m RIPK3 Compétitif de l’ATP. Affinité Li et al. 2014 B-Raf (V600E) modérée pour la RIPK3 Inhibiteurs de la pseudokinase MLKL Necrosulfonamide hMLKL Inhibiteur covalent. Sun et al. 2012 (NSA) Spécifique de l’espèce humaine Compound 1 mMLKL Stabilise MLKL dans sa Hildebrand et al. VEGFR2 conformation inactive 2014 Inhibiteurs d’autres cibles Nec-7 Cible non identifiée, Anti-nécroptotique. Zheng et al. 2008 différente de la RIPK1 Vorinostat HDACs Anti-nécroptotique Wang et al. 2013 Active la voie NF-ĸB et la MAPK p38, inhibe les kinases JNK et Akt et augmente l’expression de CYLD, déubiquitinase de RIPK1 Tableau 6. Inhibiteurs chimiques de la nécroptose : cible(s) et mode d’action.

Il est donc important de développer de nouveaux inhibiteurs de la nécroptose qui ciblent la RIPK1, la RIPK3, la MLKL ou d’autres cibles encore méconnues car ces composés pourront trouver des applications thérapeutiques différentes en fonction du tissu, du contexte inflammatoire, du type de mort(s) cellulaire(s) ou des acteurs moléculaires impliqués. La difficulté dans le développement de ces molécules réside dans la spécificité d’espèce de la conformation des sites actifs des différents acteurs décrits ici (RIPK1, RIPK3 et MLKL) due à des différences dans leur séquence protéique. La protéine recombinante RIPK1 est, de plus, difficile à produire ce qui freine l’avancée des études cristallographiques des inhibiteurs disponibles. La modélisation des interactions protéine-inhibiteur permet de s’affranchir de cette contrainte. De plus, la stratégie de criblage de chimiothèque de type « DNA-encoded librairies » récemment proposée par Harris et al. semble également permettre de s’affranchir de ces difficultés.

II. CONTEXTE ET OBJECTIFS

Contexte et objectifs du travail

Ces travaux de thèse avaient pour objectif d’étudier le mode d’action de deux inhibiteurs de la nécroptose issus d’un criblage cellulaire : la Sibiriline et le 6E11. La Sibiriline est issue de la chimiothèque non commerciale de petits composés, la ReCC (Roscoff essential Chemical Collection). Tandis que le 6E11 provient de la collection de 2800 composés chimiques de l’Université de Claude Bernard Lyon 1. Ce criblage fut réalisé dans un modèle humain de nécroptose induite par le TNF-α dans la lignée cellulaire Jurkat déficiente en FADD en collaboration avec la plate-forme de criblage moléculaire KISSf, dirigée par Stéphane Bach (station biologique de Roscoff, Unité de recherche USR3151 du CNRS). La nécroptose est considérée comme une mort hautement inflammatoire délétère au cours de l’initiation ou de l’aggravation de pathologies inflammatoires ou dégénératives. Dans un contexte de danger pour l’organisme, la nécrose cellulaire conduit à une réponse inflammatoire rapide suite à libération du contenu intracellulaire (DAMPs) provoquée par la perméabilisation de la membrane plasmique afin d’assurer la cicatrisation tissulaire et/ou l’élimination du pathogène. Lorsque la nécrose régulée est incontrôlée, elle est responsable d’une inflammation aigüe ou chronique qui va amplifier les dommages tissulaires. Lorsque l’apoptose est bloquée, la nécroptose peut assurer la mort cellulaire des cellules lésées ou infectées. Différents stimuli sont capables de déclencher la nécroptose. Il s’agit des ligands des récepteurs de mort tels que TNF-α, TRAIL et FasL sécrétés par les cellules immunitaires ainsi que les cellules épithéliales lors de l’inflammation ou encore des IFNs qui ont un fort pouvoir cytolytique lors de l’infection virale. Les cellules infectées par des pathogènes pourront aussi être éliminées par cette voie de mort grâce à la détection de PAMPs tels que le LPS et les ADN/ARN viraux. L’activation des kinases RIPK1 et/ou RIPK3 et de la pseudokinase MLKL joue un rôle crucial pour la formation du nécrosome et le bon déroulement de la nécroptose dans ces différents modèles de mort induite par les ligands de mort ou les PAMPs. Dans le modèle de signalisation du TNFR1, la RIPK1 possède des fonctions contradictoires puisqu’elle contrôle le choix entre la survie cellulaire, l’induction de l’inflammation ou la mort cellulaire par apoptose ou nécroptose. Ces fonctions opposées de la RIPK1 de vie ou de mort cellulaire dépendantes respectivement de son ubiquitination ou de son activation (phosphorylation). L’étude de l’action de ces deux nouveaux inhibiteurs de la RIPK1 a été menée en collaboration avec l’équipe du Pr Peter Vandenabeele (Institut VIB/Université de Gand, Belgique), reconnue internationalement pour ses travaux sur la nécroptose induite par le TNF. Dans un modèle murin d’hépatite immuno-induite aigüe, l’injection intraveineuse de Concanavaline A (ConA) provoque une inflammation et une hépatolyse provoquée par les cellules de Kupffer et les lymphocytes NKT. Cette hépatolyse est démontrée pour être dépendante de l’engagement des récepteurs de mort suite à la libération de TNF-α, de TRAIL, du FasL et de l’IFN- au sein du tissu. Lors de cette hépatite, la mort des hépatocytes est dépendante de l’activité de la kinase RIPK1 puisque l’utilisation d’inhibiteurs chimiques de la RIPK1 : la Necrostatine-1 (Nec-1) ou son dérivé sélectif de RIPK1, la Nec-1s, protège les souris.

Mon travail de thèse s’est appuyé sur l’utilisation de différents modèles de nécroptose induite in vitro par les ligands de mort : TNF-α, TRAIL ou FasL et l’utilisation du modèle murin d’hépatite induite par l’administration de ConA.

Caractérisation de la sibiriline, un nouvel inhibiteur de la kinase RIPK1 qui protège de l’hépatite immuno-induite

La fonction kinase de la RIPK1 joue un rôle clef dans l’induction de la mort cellulaire. Les objectifs de cette étude étaient : i) de vérifier in vitro l’efficacité biologique de la Sibiriline dans différents modèles de nécroptose induite par les ligands de mort TRAIL, FasL ou TNF-α, ii) de tester son innocuité sur la survie et la prolifération cellulaire, iii) d’identifier sa cible moléculaire et déterminer son mode d’action par des études de modélisation ainsi que son efficacité biochimique sur l’activité enzymatique de la kinase RIPK1, et iv) d’évaluer son efficacité in vivo dans le modèle murin d’hépatite induite par la ConA. Ces travaux font actuellement l’objet d’un article, soumis à The FEBS Journal.

Caractérisation de la molécule 6-E11, un nouvel inhibiteur bioinspiré spécifique de RIPK1 et qui protège de l’ischémie froide-réoxygénation

L’activité kinase de la RIPK1 est responsable de l’activation de la nécroptose. Lorsque la nécroptose devient excessive, elle conduit à l’aggravation de pathologies inflammatoires humaines comme les ischémies-reperfusion.

Les objectifs de cette étude étaient : i) de déterminer l’efficacité biologique de 6E11 in vitro dans des modèles de nécroptose dépendants des ligands de mort TNF-α ou TRAIL, ii) d’identifier sa cible moléculaire, déterminer son mode d’action par des études de modélisation et son efficacité biochimique sur l’activité enzymatique de la kinase RIPK1, et iii) d’évaluer son efficacité sur la viabilité des cellules aortiques endothéliales humaines soumises à une hypoxie froide-réoxygénation.

Ces travaux font l’objet d’un article soumis à Scientific Reports.

III. RÉSULTATS

Résultats

Article 1 : Sibiriline, un nouvel inhibiteur de la RIPK1 (Receptor- Interacting Protein Kinase 1) protège de l’hépatite immuno-induite

Fabienne Le Cann†,1,2, Claire Delehouzé†,3, Sabrina Penna-Leverrier†,1,2, Aveline Filliol1,2, Arnaud Comte4, Olivier Delalande5, Nathalie Desban3, Blandine Baratte3, Isabelle Gallais1,2, Claire Piquet-Pellorce1,2, Florence Faurez1,2, Marion Bonnet1,2, Yvette Mettey6, Peter Goekjian7, Michel Samson1,2, Peter Vandenabeele8,9, Stéphane Bach,*,3 and Marie-Thérèse Dimanche-Boitrel,*,1,2

†These authors contributed equally to this work These authors share senior authorship

Article soumis à The FEBS Journal.

Introduction de l’article

La nécroptose est une nécrose régulée bénéfique pour l’homéostasie et la cicatrisation tissulaire. Lorsqu’elle est excessive, elle est accompagnée d’une inflammation massive et délétère au sein du tissu. Cette mort cellulaire est contrôlée par l’activité des kinases RIPK1 et RIPK3 et d’une pseudokinase effectrice MLKL. De nombreux travaux suggèrent que les taux d’expression de ces différents acteurs de la nécroptose sont corrélés à la sévérité des dommages et de l’inflammation dans de nombreuses pathologies humaines dont les hépatites. Lors d’une hépatite, la mort des hépatocytes initie l’inflammation qui lorsqu’elle est chronique peut conduire à une fibrose, une cirrhose voire un carcinome hépatocellulaire. La recherche d’inhibiteurs de l’hépatolyse est donc actuellement une nouvelle stratégie thérapeutique. L’hépatite induite par la Concanavaline A est un modèle d’inflammation immuno-induite qui mime les hépatites autoimmunes et les hépatites virales humaines où l’hépatolyse est médiée par les lymphocytes cytotoxiques NKT et les ligands de mort tels que le TNF-α, le FasL, le TRAIL en association avec l’IFN-. Les travaux antérieurs de l’équipe ont montré que l’inhibition de l’activité de la kinase RIPK1 par l’utilisation de la Nec-1 ou de son analogue sélectif, la Nec-1s, permet une réduction de l’hépatolyse induite par la ConA. Dans ce contexte, nous développons de nouveaux inhibiteurs de la nécroptose et de la RIPK1.

Dans ce travail, nous avons caractérisé par des approches in vitro, in silico et in vivo les effets biologiques de la Sibiriline issue du criblage d’une chimiothèque non commerciale de petits composés (ReCC, Roscoff essential Chemical Collection, Roscoff, France) dans un modèle de nécroptose induite par le TNF-α dans les cellules Jurkat déficientes en FADD.

Dans cette étude, nous avons démontré que : i) ce composé chimique bloque la nécroptose induite par le TNF-α, FasL ou TRAIL dans différents modèles cellulaires murins ou humains, ii) cette molécule cible la kinase RIPK1 sans affecter la kinase RIPK3 grâce à des tests d’interaction moléculaire et d’activité enzymatique, iii) la Sibiriline serait un inhibiteur de kinase similaire aux inhibiteurs de type II grâce à la modélisation moléculaire de son mode d’action et de son interaction avec la RIPK1, iv) la Sibiriline protège les souris de l’hépatite autoimmune induite par la Concanavaline A. Ces résultats suggèrent que la Sibiriline pourrait être un inhibiteur prometteur à des fins thérapeutiques dans l’objectif de réduire l’hépatolyse au cours des pathologies du foie. Sa structure chimique reste cependant à optimiser avant de pouvoir envisager son utilisation thérapeutique.

Article 1 : Sibiriline, a new small chemical inhibitor of Receptor-Interacting Protein Kinase 1, prevents immune-dependent hepatitis

For Review Only Sibiriline, a new small chemical inhibitor of Receptor-Interacting Protein Kinase 1, prevents immune-dependent hepatitis

1 INSERM UMR 1085, Institut de Recherche sur la Santé, l’Environnement et le Travail, F- 35043 Rennes, France. 2 Biosit UMS 3080, Université de Rennes 1, F-35043 Rennes, France. 3 Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06, CNRS USR3151, Protein Phosphorylation and Human Disease Laboratory, Station Biologique, F-29688 Roscoff, France. 4 CNRS UMR 5246, Chimiothèque, ICBMS, Université Claude Bernard Lyon 1, F-69622 Villeurbanne, France. 5 CNRS UMR 6290, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Université de Rennes 1, F-35043 Rennes, France. 6 Laboratoire Chimie Organique, Faculté de Médecine-Pharmacie, Laboratoire Signalisation et Transports Ioniques Membranaires, Université de Poitiers, CNRS, 86073 Poitiers Cedex 9, France. 7 CNRS UMR 5246, Laboratoire Chimie Organique 2-Glycosciences, Université de Lyon, ICBMS, Université Claude Bernard Lyon 1, F-69622 Villeurbanne, France. 8 Molecular Signaling and Cell Death Unit, VIB Inflammation Research Center, Ghent, Belgium. 9 Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, Ghent, Belgium.

†These authors contributed equally to this work These authors share senior authorship

Corresponding authors: S. Bach, Protein Phosphorylation and Human Disease Laboratory, Station Biologique, Place Georges Teissier, F-29688 Roscoff, France Tel: +33 2 98 29 23 91 Fax: +33 2 98 29 25 26 Email: [email protected] M-T. Dimanche-Boitrel, INSERM UMR 1085, Institut de Recherche sur la Santé, 2 avenue du Pr Léon Bernard, F-35043 Rennes, France Tel: +33 2 23 23 48 99 Fax: +33 2 23 23 47 94 Email: [email protected]

Running title: Sibiriline, a RIPK1 inhibitor preventing hepatitis

Abbreviations: ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase; ATP, adenosine triphosphate; AU, arbitrary unit; Con A, concanavalin A; DR, death receptor; MD, molecular docking; MEFs, mouse embryonic fibroblasts; Nec-1, necrostatin-1; RT; room temperature; Sib, Sibiriline; Sib-i, inactive Sibiriline; TNF, tumor necrosis factor; FasL, Fas ligand; TRAIL, TNF-related apoptosis-inducing ligand.

Keywords: necroptosis, RIPK1 inhibitor, molecular docking, Con A-induced hepatitis, kinase Inhibitor

The FEBS Journal Page 2 of 59 For Review Only

Abstract

Necroptosis is a regulated form of cell death involved in several disease models including in particular liver diseases. Receptor-Interacting Protein Kinases, RIPK1 and RIPK3, are the main serine/threonine kinases driving this cell death pathway. We screened a non-commercial kinase focused chemical library allowed us to identify Sibiriline as new inhibitor of necroptosis induced by TNF in Fas-Associated protein with Death Domain (FADD)-deficient Jurkat cells. Moreover, Sib inhibits necroptotic cell death induced by various death ligands in human or mouse cells while not protecting from caspase-dependent apoptosis. By using competition binding assay and recombinant kinase assays, we demonstrated that Sib is a rather specific competitive RIPK1 inhibitor. Molecular docking analysis shows that Sib is trapped closed to human RIPK1 ATP-binding site in a relatively hydrophobic pocket locking RIPK1 in an inactive conformation. In agreement with its RIPK1 inhibitory property, Sib inhibits both TNF induced RIPK1-dependent necroptosis and RIPK1-dependent apoptosis. Finally, Sib protects mice from Concanavalin A-induced hepatitis. These results reveal the small molecule Sib as a new RIPK1 inhibitor potentially of interest for the treatment of immune-dependent hepatitis.

Page 3 of 59 The FEBS Journal For Review Only

Introduction

Excessive hepatocyte cell death has been identified as a central pathophysiological mechanism in both acute and chronic liver injuries, involving mostly cell death by apoptosis and necrosis (oncosis) [1]. More recently, necroptosis, a specific form of regulated necrosis, has also been implicated in liver disease models [2,3]. Necroptosis is a caspase-independent nonapoptotic backup cell death mechanism initiated upon blockade of apoptosis [4]. This cell death pathway is dependent on serine-threonine Receptor-Interacting Protein Kinases, RIPK1 and RIPK3, and a pseudokinase MLKL (Mixed-Lineage Kinase domain-Like) (see for review [5]). Moreover, it is inhibited by necrostatin-1 (Nec-1), the first small tryptophan-based molecule inhibitor of RIPK1 kinase activity [4,6]. Necroptosis may occur in response to various stimuli [5]. The TNF-induced necroptosis pathway has been the most intensively studied. Upon TNF stimulation when caspase-8 is inhibited or absent [7,8], RIPK1 in complex II recruits RIPK3, resulting in autophosphorylation and activation of the latter. Caspase-8 and FLIPL in complex II negatively regulates RIPK1 and RIPK3 by proteolysis [9]. Then, these kinases interact with each other via their RIP homotypic interaction motifs (RHIM) domains promoting necrosome formation [10], recruitment and phosphorylation of MLKL [11, 12] which in turn oligomerizes and is recruited to negatively charged phosphoinositolphosphates, causing loss of plasma membrane integrity [13]. Necroptosis contributes to the pathogenesis of several inflammatory diseases including ischemic reperfusion injury, acute pancreatitis, sepsis, neurodegeneration and viral infection [14]. More recently, some studies reported that necroptosis is also involved in inflammatory- 94 driven liver diseases. On the one hand, RIPK3-deficient mice are protected from ethanol-, acetaminophen (APAP)-induced hepatocyte injury or non-alcoholic steatohepatitis (NASH) [15-17]. On the other hand, RIPK3 expression is increased in liver biopsies of chronic ethanol-fed mice,

The FEBS Journal Page 4 of 59 For Review Only

alcoholic liver disease patients, NASH patients or patients with other chronic liver diseases (hepatitis B and C) [15,17,18]. Furthermore, Nec-1 or Nec-1s protect against APAP- or Concanavalin A (Con A)-induced hepatoxicity [19-22]. To date, the only possible candidate to be used in the clinic would be the anticancer drug B-RafV600E Dabrafenib which besides mutant Raf targeting also inhibits RIPK3 and alleviates APAP-induced liver injury [23]. Altogether these data suggest that targeting necroptosis could be a novel cellular process to be therapeutic targeted in liver diseases. Nec-1 (5-((1H-indol-3-yl)methyl)-3-methyl-2-thioxoimidazolidin-4-one) was identified in a phenotype screen for small molecule inhibiting TNF-induced necroptosis in human monocytic U937 cells [4, 24] and further, was shown to be an allosteric inhibitor of RIPK1 kinase [6]. However, Nec-1 is not specific for RIPK1 because its chemical scaffold is similar to methyl- thiohydantoin-trytophan (MTH-Trp), an inhibitor of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), an immune regulator [25]. Structure-activity relationship (SAR) study revealed that small substituent Cl at the 7-position of the indole ring leads to the compound necrostatin-1s (Nec- 1s) [24] having an increased selective RIPK1 inhibitory activity [26] and lacking IDO inhibitory activity [25]. However, necrostatins have poor pharmacokinetic properties. More recently, other classes of compounds were described such as the 1-aminoisoquinolines, 5- phenylpyrrolo[2,3-b]pyridines, 5-arylpyrrolo[2,3-b]pyridines, furo[2,3-d]pyrimidines, analogs of Bcr-Abl inhibitor ponatinib, PN10 (fusion of the scaffold of ponatinib and Nec-1s), the benzo[b][1,4]oxazepin-4-ones, the compound GSK’963 and the N-benzyl-N-hydroxy-2,2-

95 dimethylbutanamide [27-33]. The previously described biological activities validate kinase RIPK1 as a promising therapeutic target for discovering new compounds to treat various human disorders [34]. The quest for an optimized clinical candidate is still in progress with the synthesis of the first-in-class RIP1 kinase specific inhibitor (GSK2982772) [35] and will benefit from the description of new potent RIPK1 inhibitors.

Page 5 of 59 The FEBS Journal

For Review Only

In order to find new inhibitors of RIPK1, we screened an in-house kinase-focused library of small chemical compounds (the ReCC, Roscoff essential Chemical Collection, Roscoff, France) using a phenotypic screen based on the inhibition of TNF-induced necroptosis in human FADD-deficient Jurkat T cells (in vitro model described in [36]). Among 1015 tested compounds, 4-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2-yl)phenol (Sibiriline, Sib) was selected as the best hit. Interestingly, we describe here the biochemical properties and both in vitro and in vivo effects of this new pyrrolo[2,3-b]pyridine-based derivative as a potent RIPK1 inhibitor/ necroptosis inhibitor. Our results indicate that the kinase activity of RIPK1 is dose- dependently affected by Sib. In silico molecular modeling and docking studies reveal that Sib interacts with RIPK1 kinase domain in a hydrophobic “back” pocket [29], between the gatekeeper and the DFG (DLG in RIPK1) motif, adjacent to the ATP-binding site, thus locking RIPK1 in an inactive DLG out conformation. Finally, to assess the therapeutic efficacy of Sib in liver diseases, we studied its effects in Con A-induced hepatitis in C57Bl/6 mice. This acute hepatitis is a mouse model of immune-mediated liver injury [37]. A single intraperitoneal injection of Sib protects mice from liver injury induced by Con A, and therefore, reveals Sib as a promising new chemical scaffold of RIPK1 inhibitor, with a straightforward, high-yielding synthesis, which is effective in the treatment of the preclinical model of immune-dependent hepatitis.

The FEBS Journal Page 6 of 59

For Review Only

Results

Sibiriline is a new necroptosis inhibitor To identify novel necroptosis inhibitors, we screened a non-commercial kinase-focused chemical library of 1015 compounds for their ability to block TNF-induced necroptosis in FADD-deficient human Jurkat cells (Fig. 1A). These compounds were tested at the concentration of 10 μM and compared to the well-characterized RIPK1 inhibitor necrostatin-1 (Nec-1). Among the tested drugs, Sibiriline (Sib) stood out as the most potent molecule at rescuing cells from necroptotic cell death whereas Sib-i came out as its inactive analog (Fig.

1B). Similarly to Nec-1 (EC50=0.3μM), Sib efficiently blocked necroptotic death in FADD- deficient Jurkat cells in a concentrationdependent manner with an EC50 value of 1.2 μM (Fig. 1C). The inactive derivative Sib-i was unable to block necroptosis in FADD-deficient Jurkat cells even at the high concentration of 50 μM (Fig. 1C). Importantly, Sib has a very low cytotoxic effect against human peripheral blood leukocytes (PBL) (Fig. 2A) or human retinal pigment epithelial cells (RPE-1 hTERT) (Fig. 2B).

Sib blocks necroptotic but not apoptotic cell death To further analyze Sib inhibitory effect, we compared the ability of Sib and Nec-1 to block necroptosis in murine and human cell lines in vitro. Necroptosis was induced by a wide range of well-described necroptotic stimuli such as TRAIL+zVAD-fmk, TNF+zVAD-fmk or FasL+zVAD-fmk in human U937 or mouse L929sAhFas cells. In all of these models, Sib efficiently blocked necroptosis in a dose-dependent manner, and with an efficacy almost similar to Nec-1 (Fig. 3A). This efficient protection from necroptosis by Sib was evidenced by measurements of both plasma membrane permeabilization (% of propidium iodide positive cells) and intracellular ATP levels (Fig. 3A). This latter assay highlighted the fact that Sib inhibitory effect appeared at 2.5 μM and was almost complete at 5 μM. Notably and like Nec- 1, Sib did

Page 7 of 59 The FEBS Journal

For Review Only

not rescue from apoptosis induced by TRAIL, FasL or staurosporine in Jurkat cells (Fig. 3B,C), showing that Sib is a selective inhibitor of necroptosis but not of apoptosis. It is to be noted that in a different human cell line resistant to extrinsic apoptosis, the FADD-deficient Jurkat cells, TNF-induced necroptosis can also be prevented by Sib. Conversely, Fas-induced apoptosis in the L929AsFas mouse model is not sensitive to Sib (data not shown). Overall, these data evidenced that Sib specificity towards inhibiting necroptosis, but not apoptosis, does not depend upon the stimuli, the cell type, or even the species.

Sib rescues cells from necroptosis even after cell death initiation and allows cell survival and proliferation In the hypothetical perspective of using Sibiriline as a necroptosis inhibitor in medecine, we tested its activity when administered after, rather than before, necroptosis initiation. In the following experimental set up, Sib or Nec-1 was added at the non-toxic concentration of 10 μM between 1 h to 4 h after TNF-dependent necroptosis induction in FADD-deficient Jurkat cells. When added in the first couple of hours following necroptosis induction, Sib promotes an almost complete recovery by decreasing cell death to approximately 10%. When added 3 or 4 h after necroptosis induction, both Sib or Nec-1 treatment rescued necroptotic FADD- deficient Jurkat cells, reducing by a minimum of 50 % the number of propidium iodide (PI) positive cells (Fig. 4A). To further refine Sib’s potential at preventing cells from a necroptotic wave, a clonogenic assay was performed 24 h after necroptosis induction by TNF+zVAD-fmk in L929 cells in presence or not of Sib, Sib-i, Nec-1 or Nec-1s. Eight days later, culture plates were stained with crystal violet and showed that treatment with Sib, Nec-1 or Nec-1s but not

100 with Sib-i allowed the formation of colonies (Fig. 4B), suggesting that Sib as other well- known necroptosis inhibitors (Nec-1 or Nec-1s), not only protected cells from cell death but allowed them to survive and proliferate.

The FEBS Journal Page 8 of 59

For Review Only

Sib is a potent inhibitor of RIPK1 In order to investigate the mechanism of action of Sib and its target, the selectivity of Sib and Sib-i was tested at 10 μM against a panel of 456 kinases including eight lipid kinases in an in vitro competition binding assay (KINOMEscan, DiscoverX, San Diego, CA, USA). RIPK1 was shown to be among the top kinases targeted by Sib as only 0.2% of the initial amount of the kinase was still on the affinity matrix after competition with Sib (Table S1 and blue circle on Fig. 5A). Sib-i is not a potent interactor of the tested kinases (Fig.5A). Death-Associated Protein Kinase-3 (DAPK3) is only poorly affected by Sib-i (32% of the initial amount of kinase is still on the affinity matrix after competition with 10 μM Sib-i, Fig. 5A). Using this competition binding assay, the dissociation constant (Kd) of Sib for RIPK1 was calculated with a standard dose-response curve and showed the high affinity of Sib for RIPK1 with a Kd in nM range and equal to 218 nM (Fig. 5B, left panel). High affinity of Nec-1 or Nec-1s for RIPK1 was also confirmed with Kd equal to 31 nM or 8 nM, respectively (Fig. 5B, right panel).

To further confirm the inhibition of RIPK1 enzymatic activity by Sib, an in vitro autophosphorylation assay using recombinant full-length RIPK1 (GST-tagged) was performed. This assay showed an inhibition of RIPK1 auto-phosphorylation by Sib in a dose- dependent manner, Sib-i having no effect (Fig. 6A). The catalytic activity of RIPK1 was also quantified by monitoring the phosphorylation of Myelin-Basic Protein (MBP) a known substrate of RIPK1. Consistently, Sib efficiently inhibits the phosphorylation of MBP in a dose-dependent manner with an IC50 equal to 1.03 μM (Fig. 6B).

Finally, to characterize the mechanism of RIPK1 inhibition by Sib, we analyzed the effect of increasing the concentrations of ATP (up to 1mM of cold ATP) on the inhibition of 101 autophosphorylation by 10μM of Sib. Results obtained show that in presence of 1 mM cold ATP,

Page 9 of 59 The FEBS Journal

For Review Only

the inhibition of the RIPK1 auto-phosphorylation by Sib was decreased. It suggests an ATP- competitive mechanism of RIPK1 inhibition by Sib (Fig. 6C). This result was previously described for Nec-1 [6]. Very interestingly, Sib had a very low inhibitory effect on RIPK3 kinase activity with an IC50 equal to 101.9 μM (Fig. 6D). Altogether, these data demonstrated that Sib is a specific inhibitor of RIPK1 kinase activity. In agreement with this biochemical activity, Sib was able, with a similar efficacy to Nec-1, to inhibit RIPK1-dependent necroptosis induced by the combination TNF+TAK1i+zVAD-fmk by reducing the percentage of Syber Green (% SG) positive cells measured in function of time (Fig. 7A, upper left panel). This necroptotic pathway was characterized by the lack of caspase-3 activity (very low DEVD-AMC fluorescence) (Fig. 7A, lower left panel). Moreover, Sib like Nec-1 inhibited RIPK1-dependent apoptosis induced by the combination of TNF+TAK1i [38,39] by decreasing both the % SG positive cells and caspase-3 activity measured as a function of time (Fig. 7B, upper and lower right panels).

Molecular modeling of the RIPK1-Sib complex To further understand the mechanism of inhibition by the small chemical compound, we studied in silico the RIPK1-Sib complex to establish a possible model of RIPK1 inhibition by Sib. Molecular docking simulations of Sib to RIPK1 kinase and molecular dynamics trajectory computed for the best complex indicated a preferential binding mode similar to the one described for Nec-1s on a site next to the ATP-binding site (Fig. 8 and Fig.9). Contact residues determined included notably the seven key amino acids (Leu70, Val76, Leu78, Leu90, Asp156, Ser161, Phe162) (Fig. 8A) involved in the interaction with necrostatins (see [40] for details on RIPK1-Necrostatins complexes). An exhaustive list of surrounding residues (3.5Å cut-off) also included the amino acids Met67, Lys77, Lys79, Met92, Val134

102 and Ile154 (Fig. 9). Note here that Met92 is the gatekeeper residue of RIPK1 [6] and the catalytic triad residues are Lys45, Glu63 and Asp156 as reported [40]. Sib thus binds in the “back” pocket of RIPK1 between the

The FEBS Journal Page 10 of 59 For Review Only

DLG motif and the gatekeeper. Despite the presence of a canonical H-bond donor / H bond acceptor motif, Sib, like Nec-1s, does not appear to bind to the hinge region, at least in this conformation of the protein (Fig. 8B,C). In contrast, the inactive compound Sib-i did not contact the C-lobe region of RIPK1 (Fig. 9). Comparison between the contact residues predicted for active compounds (Sib and Nec-1s) and inactive compound (Sib-i) did indicate the position of a good inhibitor that should promote hydrophobic interactions with the long helix defined by residues from Pro111 to Lys132, thus locking the conformation of the enzyme by reducing the mobility of the two main subdomains of the kinase towards each other (Fig. 9).

Sib protects mice from Concanavalin A-induced hepatitis The identification of Sib as a specific necroptosis and RIPK1 inhibitor as Nec-1 prompted us to test this compound in a murine model of immune-dependent hepatitis induced by Concanavalin A (Con A) treatment. In this model, we have previously demonstrated a protective effect of an intravenous (i.v.) injection of Nec-1 or Nec-1s against Con A-induced hepatitis [19, 22]. Here, we studied the protective effect of an intraperitoneal (i.p.) injection of 3 mg/kg Sib or 6.25 mg/kg Nec-1s 1 h before an i.v. injection of 12 mg/kg Con A.

Pre-treatment with either Sib or Nec-1s protected mice from Con A-induced hepatotoxicity by significantly decreasing serum AST/ALT levels measured 24 h after treatment (Fig. 10A). Moreover, Sib or Nec-1s significantly decreased liver damage by reducing the size of

103 perivascular and parenchymal zones of necrosis stained with Hematoxylin and Eosin (Fig. 10B, see arrows). In accord with the protection afforded by Sib or Nec-1s, the loss of mouse body weight induced by ConA treatment was significantly reduced by Sib or Nec-1s pretreatment (Fig. 11). Altogether these data suggest that 3 mg/kg Sib had an almost comparable efficacy to 6.25 mg/kg Nec-1s in protecting mice against Con A-induced hepatitis.

Page 11 of 59 The FEBS Journal For Review Only

Discussion By using a cellular screen and a unique non-commercial kinase-focused chemical library of 1015 small molecular compounds, we identified a new inhibitor of TNF-induced necroptosis in Jurkat Fadd-deficient cells with a micromolar EC50 concentration. Sibiriline (Sib) , 4-(1H- pyrrolo[2,3-b]pyridin-2-yl)phenol is a new pyrrolo[2,3-b]pyridine-based derivative compound. Our present data enlarge the number of small chemical compounds having a potent necroptosis inhibitory activity [41]. Sib was also able to inhibit TRAIL- or FasL- induced necroptosis but not apoptosis regardless of the human or murine cell line origin. Protection from necroptotic cell death was obtained at 1-5 μM concentration of Sib in our diverse cellular systems, suggesting a large therapeutic window for potential clinical application. Moreover, protection from necroptosis has been afforded by Sib up to 4 hours after the induction of death, which could allow a therapeutic potential in the case of cardiac infarction or stroke. Regarding the mode of action underlying necroptosis inhibition by Sib, a KINOMEscan competition binding assay at DiscoverX (456 kinases and activated mutant kinases) was performed and showed that RIPK1 was the top kinase inhibited by Sib. In contrast to Nec-1 which did not bind to RIPK2 and RIPK4 [42], Sib bound to RIPK4 to a certain extent (Table S1). We showed in this study that the kinase activity of RIPK3 is only poorly affected by Sib (approximately 100 times less potently inhibited compared to RIPK1).

The Kinome scan revealed also that JAK2, PDGFR, KIT and KIT (V559D) are other major kinases targeted by Sib. Chemical synthesis of Sibiriline analogues, notably driven by the

104 molecular docking reported in this study, would be necessary to improve the selectivity of this compound. As expected, no kinase was efficiently targeted by the inactive counterpart, Sib-i. We have also determined a Kd binding constant of Sib for RIPK1 of 218 nM whereas the Kd of Sib-i was greater than 30000 nM. The in vitro competitive assay used for both Kd study and kinase profiling is based on an active-site/ligand binding technology developed by

The FEBS Journal Page 12 of 59

105

For Review Only

DiscoverX (Fremont, CA, United States): it can detect the effect of compounds that bind the kinase active site and directly (sterically) or indirectly (allosterically) prevent kinase binding to one immobilized ligand. The majority of kinase inhibitors developed to date target the ATP binding site. Based on the selectivity reported for Sib, we hypothesized that Sib also targets the ATP binding site of RIPK1. We showed here that ATP competes with Sib for the inhibition of RIPK1 autophosphorylation (Fig. 6C). Such result was already described for Nec-1 [6], suggesting some similarities in the mode of action between Sib and Nec-1. In silico molecular modeling and docking studies highlighted these similarities. To understand the interaction mode of Sib with RIPK1, molecular docking was performed based on the co-crystal structure of RIPK1 with Nec-1s (PDB: code 4ITH). The predictive binding mode was shown on Figure 8. As was the case for Nec-1s, Sib was located in the hydrophobic “back” [29] pocket between the N-lobe and C-lobe of the RIPK1 kinase domain, interacting with both the DLG motif and the gatekeeper. This pocket is formed by a number of residues including Leu70, Val76, Leu78, Leu90, Asp156, Ser161 and Phe162 (see [40] for details on RIPK1- Necrostatins complexes). In analogy with the inhibition of RIPK1 by Nec-1s, we hypothesized that Sib locks RIPK1 in an inactive conformation (“DLG (Asp-Leu-Gly)-out” state of kinase) notably by interaction with Asp156 of the DLG motif and neighboring Ser161. Interactions with the C-lobe also appear to be an important element for successful inhibition. Our results suggest that Sibiriline shares characteristics of the type II kinase inhibitor class, which target the inactive enzymatic conformation, with the caveat that it does not interact with the hinge region, despite its H-bond donor – H-bond acceptor motif. Since the description of the druggability of necroptosis [4], numerous chemobiological studies have led to the discovery of molecules that can bind to the catalytic site of RIPK1 [34]. As examples, compounds characterized by a GlaxoSmithKline group include notably pyrrolo[2,3 b]pyridine-based derivatives [27]. Interestingly, and similarly to the putative mechanism of Sibiriline described here, these small chemical compounds share

106

Page 13 of 59 The FEBS Journal

107

For Review Only

also all characteristic of the type II kinase inhibitor class. This class of compounds is believed to perturb the Phe side chains of the catalytic site inwards to obstruct the ATP-binding cleft. Since Nec-1 or Nec-1s have already been shown to protect mice from Concanavalin A (Con A)-induced hepatitis [19,21,22], we tested the effect of Sib in this model of murine hepatitis. Pretreatment of mice with 3 mg/kg Sib has almost the same protective effect against Con A induced hepatitis than pretreatment of mice with 6.25 mg/kg Nec-1s, by decreasing serum AST/ALT levels and liver injury. Sib seems to have no toxic adverse effect since this compound allowed mice to recover some weight after Con A treatment. Altogether these data demonstrated efficacy of Sib in vivo which make Sib to be a highly promising template for lead optimization.

108

The FEBS Journal Page 14 of 59

109

For Review Only

Materials and methods

Cell lines and culture conditions SV40 large T-immortalized MEFs and L929sAhFas were kind gifts of the University of Ghent (Belgium). These cell lines were cultured in DMEM high glucose (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, St Aubin, FR) supplemented with 10 % FCS and 2 mM L-glutamine (Invitrogen). HT29, Jurkat wild-type A3, FADD-deficient Jurkat I 2.1, L929, U937, RPE-1 hTERT human cell lines were obtained from ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). HT29 cells were cultured in EMEM (Eurobio, Les Ulis, FR) supplemented with 10 % FCS and 2 mM L-glutamine. Jurkat, FADD-deficient Jurkat and U937 cells were cultured in RPMI containing Glutamax (Invitrogen) supplemented with 15 % FCS. RPE-1 hTERT cells were cultured in DMEM-F12 containing Glutamax (Invitrogen) supplemented with 10 % FCS.

All cells were cultured under a 5 % CO2 atmosphere at 37 °C.

Chemicals and biological compounds Recombinant human Flag-tagged TRAIL (TRAIL-Flag) and z-VAD-fmk were obtained from Enzo Life Sciences (Villeurbanne, FR). Necrostatin-1 (Nec-1) and necrostatin-1s (Nec-1s) were from Calbiochem (VWR International, Fontenay-sous-Bois, FR). The TAK1 kinase inhibitor, NP-009245, was from AnalytiCon Discovery GmbH (Postdam, DE). Anti-Flag M2 IgG1 antibody, cycloheximide (CHX), propidium iodide, were obtained from Sigma-Aldrich (St Quentin-Fallavier, FR). TNFα were obtained from Invitrogen. This TNF was used in the screen of new necroptosis inhibitors. Recombinant human TNFα, was also produced and purified to at least 99% homogeneity at VIB Protein service facility (Ghent, BE). It has a specific biological activity of 6.8x107 IU/mg and was used at 2000 IU/ml (67 ng/ml) in FADD-deficient Jurkat or

110

Page 15 of 59 The FEBS Journal

111

For Review Only

at 600 IU/ml (20 ng/ml) in MEFs. The multi-aggregated Ig-CD95L (or Ig-FasL) was a kind gift of Dr P. Legembre (CLCC Eugene Marquis, Rennes, FR) and was used at 200 ng/ml. Synthesis of 4-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2-yl)phenol (Sib) : following literature procedure [43], a solution of 3-picoline (200 mg, 2.2 mmol, 1 eq) in anhydrous THF (10 ml) was added dropwise to a solution of LDA (freshly prepared by adding nBuLi (1.5 ml, 2.5 M solution in hexanes, 3.9 mmol) to diisopropylamine (0.54 ml, 3.9 mmol) in anhydrous THF (10 ml)) at 0°C under argon. The orange mixture was stirred for 20 min before dropwise addition of a solution of 4-methoxybenzonitrile (316 mg, 2.2 mmol, 1 eq) in anhydrous THF (10 ml). After 1 h at 0°C, more LDA solution in THF (10 ml, 3.9 mmol, prepared as above) was added dropwise and the reaction was slowly warmed to RT over 1 h before being heated to reflux in a water bath for 2 h. After cooling, the yellow solution was quenched carefully with saturated

NH4Cl (10 ml) and water (40 ml) was added. The precipitate was filtered, washed with diethyl ether and water, dried under vacuum to afford 2-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrrolo[2,3- b]pyridine as a light yellow solid (327 mg, 68%). Analytical data are in accordance with the literature. 2-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine (100 mg, 0.44 mmol) was suspended in anhydrous dichloromethane (5 ml) and cooled to -78°C. Boron tribromide (1.3 ml of 1M solution on dichloromethane, 1.3 mmol, 3 eq) was added dropwise and the dark red mixture was stirred for 16 h while warming to RT. The reaction was carefully quenched with water, dichloromethane (10 ml) was added and the solid was dissolved by addition of 1M sodium hydroxide (15 ml). After stirring for 10 min, the aqueous phase was washed with dichloromethane (2x10 ml) and the pH was adjusted to 5 with 1M hydrochloric acid. The resulting precipitate was filtered, washed with water and dried under vacuum to obtain a tan solid (68 mg, 74%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 11.93 (bs, 1H), 9.71 (bs, 1H), 8.14 (dd, J = 4.7, 1.3 Hz, 1H), 7.85 (dd, J = 7.8, 1.3 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.02 (dd, J = 7.8, 4.7 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 8.7 Hz,

112

The FEBS Journal Page 16 of 59 For Review Only

2H), 6.70 (d, J = 2.0 Hz, 1H). 13C NMR (75 MHz, DSMO-d6) : 157.7, 149.6, 141.9, 139.0,

127.1, 126.9, 122.7, 121.3, 115.9, 115.8, 95.1. MS (ESI): m/z 211 [M+H]+. Synthesis of the inactive derivative Sib-i has been described previously [44].

Cell-based screening assay for characterization of necroptosis inhibitors The details of the cell-based assay used to screen a library of small chemical compounds have been described in Miao and Degterev, 2009 [36]. The Jurkat FADD-deficient I 2.1 cell line was maintained in RPMI 1640 medium (Gibco) containing Glutamax and 15% fetal calf serum (Eurobio). Necroptosis was induced by addition of 10 ng/ml of human recombinant TNF-α (Invitrogen). Necrostatin-1 (Nec-1, Calbiochem) was used as model necroptosis inhibitor. Cells were maintained in 75 cm2 flask and passed every 2 or 3 days. Chemical collections analyzed were formatted in 96-well plates with 80 molecules per plate at 10 mM in 100% DMSO. For each collection plate, two cell plates were seeded (one treated with TNF-α and the other one without TNF-α). Cells were seeded at 20 000 cells/well, in 40 μl of medium, in a 96-well clear, flat bottom plate (CytoOne, Starlab) before treatment. Then, 40 μl of medium with or without TNF-α at 25 ng/ml were added to all wells in the corresponding plate. Immediately after TNF- α addition, 20 μl of diluted compound at 50 μM were added to the plates. Final concentration of each chemical compound was 10 μM at 0,1 % DMSO. Eight positive (Nec-1 at 10 μM final) and eight negative (DMSO) controls were used in each plate to validate the assay. Cells were incubated at 37°C, 5% CO2 for 24 h before performing MTS viability assay, described hereafter. Compounds were diluted before treating cells. Liquid handling was performed using the Nimbus Microlab liquid handler (Hamilton Robotics, Bonaduz, Switzerland) under microbiological safety workbench. The stock solutions of compounds at 10 mM were diluted directly in culture medium to obtain a solution at 50 μM before treating cells.

113

Page 17 of 59 The FEBS Journal

114

For Review Only

Cell death assays Cell viability was measured by a water soluble tetrazolium compound MTS (3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-5-[3-carboxymethoxy-phenyl]-2-[4-sulfophenyl]-2H-tetrazolium, inner salt) (CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Fitchburg, WI, USA), according to the manufacturer's instructions. This method is based on the reduction of MTS tetrazolium compound by viable cells to generate a colored formazan product. Human peripheral blood lymphocytes (PBL) and human RPE-1 hTERT cells were seeded in 96-well plates at 2.5x105 or 8x103 cells per well, respectively. After 24 h of treatment, 20 μl of assay solution was added. After 3 h incubation at 37°C, the absorbance at 490 nm and 630 nm was measured by a microplate reader (SPECTROstar Nano, BMG Labtech). The results were corrected by subtracting the background reading (after 2 h incubation with blank medium) and viability was calculated with % viability = mean (OD490 - OD630) sample/mean (OD490 -

OD630) control x 100. Detection of necrotic cells was done by using propidium iodide staining (500 ng/ml) and flow cytometry analysis. U937, Jurkat or L929 sAhFas cell lines were seeded at 2.5x105 cells/well in 24-well plate. Concerning necroptotic models: U937 cells were pretreated with z-VAD-fmk (30 μM) for 30 min and then treated for 20 h with TRAIL-Flag (200 ng/ml) and 2 μg /ml M2 anti-Flag antibody. L929 sAhFas cell line were pretreated with z-VAD-fmk (20 μM) for 30 min and then with TNF (10 ng/ml) or Ig-FasL (200 ng/ml) for 16 h. FADD-deficient Jurkat cells were treated with 10 ng/ml TNF. As for apoptotic models, wild-type Jurkat cells were treated either with TRAIL-Flag (20 ng/ml) and 2 μg/ml M2 anti-Flag antibody, Ig-FasL (200 ng/ml) or staurosporine (100 nM) for 18 h. After treatment, percentage of propidium iodide positive cells was determined by flow cytometry analysis of fluorescence (FL-2) (FACScalibur, Becton Dickinson, Le Pont de Claix, FR) and expressed as %/NT.

115

The FEBS Journal Page 18 of 59 For Review Only

Clonogenic Assay After treatment with TNF/zVAD-fmk in presence or absence of inhibitory compounds (Sib, Sibi, Nec-1 or Nec-1s) as described above, L929 cells were seeded out in an appropriate dilution, here 1,000 cells per well (in 6-well plates), and allow for 8 days to form colonies. The subsequent colonies were fixed with ice cold methanol and stained with crystal violet (50% ethanol).

RIPK1 and RIPK3 kinase assays Human RIPK1 full length GST-tagged was expressed by baculovirus in Sf9 insect cells (SignalChem, product #R07-10G, Richmond, CA, USA). The protocol used to detect the enzymatic activity is adapted from Degterev et al., 2008 [6]. For detection of RIPK1 autophosphorylation, kinase reaction was initiated mixing 5 µl of RIPK1, 5 µl of 3X kinase reaction buffer (5 mM MOPS pH 7.2, 2.5 mM -glycerophosphate, 4 mM MgCl2, 2.5 mM

MnCl2, 1 mM EGTA, 0.4 mM EDTA, 50 μg/ml BSA, 0.05 mM DTT), 2 µl H2O and 3 µl of the tested molecule. The mixture was kept on ice for 10 minutes. During the incubation, the

ATP solution was prepared by mixing 5 µl of 3X kinase reaction buffer, 4 µl H2O, 6 µl cold

ATP at 150 µM and 2 µCi of [-32P] ATP. This ATP solution was then mixed with RIPK1 and the tested compound and incubate for 30 minutes at 30 °C. Reactions were stopped by boiling in 5 µl of loading buffer for 3 minutes at 95 °C. 25 µl of each reaction were loaded per well in pre-cast NuPage 12% Bis-Tris gel (Thermo Fisher Scientific) and analyzed by SDS-PAGE. Autophosphorylated RIPK1 band was visualized by analysis in a Typhoon Phosphorimager (GE Healthcare Life Sciences, Velizy-Villacoublay, FR). Alternatively, the kinase activity of RIPK1 can be detected using the “gold standard” P81 phosphocellulose assay. Note here that the P81 ion exchange chromatography paper (GE Healthcare) used in this study is no longer provided by the manufacturer. For a final volume of 30 μl, 2 μl of kinase was assayed in

116 buffer described above with 0.1 μg/μl of myelin basic protein (MBP, Sigma, #M1891) as substrate

Page 19 of 59 The FEBS Journal

117

For Review Only

and in the presence of 15μM [-33P] ATP (3,000 Ci/mmol; 10 mCi/ml). Controls (maximal kinase activity) were performed with appropriate dilutions of dimethylsulfoxide. After extensive washes with a solution of phosphoric acid at 1% in water using a FilterMate Harvester (PerkinElmer, Waltham, MA), the wet filters were counted in the presence of 20μl ACS (GE Healthcare) scintillation fluid using a TopCount® Scintillation and Luminescence Counter (PerkinElmer, Waltham, MA). The kinase activity of RIPK3 (human, recombinant, expressed by baculovirus in Sf9 insect cells) was detected in RIPK1 buffer with 0.1 μg/μl of MBP as substrate following the P81 phosphocellulose assay described here before.

Kinase binding assays Binding assays were performed by DiscoverX (Freemont, CA, USA). These assays are based on a competition binding assay that quantitatively measures the ability of a compound to compete with an immobilized, active-site directed ligand. See Fabian et al., 2005 for details on this assay technology [45]. In brief, streptavidin-coated magnetic beads were mixed with biotinylated small-molecule ligands to generate affinity resins for the assay. After blocking, binding reactions were assembled by combining DNA tagged kinases, inhibitors and liganded affinity beads. The ability of the tested compound to compete with the immobilized ligand is measured via quantitative PCR of the DNA tag. The percent inhibition was calculated by measuring the amount of kinase captured on the solid support as a function of the test compound concentration. In this study, binding assays were used for (i) the analysis of selectivity against a large panel of kinases (service « KINOMEscan ») and for (ii) the determination of binding constant (Kd) of small chemical compound for RIPK1 (service « KdELECT »). Dissociation constants (Kds) are calculated by measuring the amount of kinase captured on the solid support as a function of the test compound concentration with top concentration = 30,000 nM.

118

The FEBS Journal Page 20 of 59 For Review Only

Analysis of cell death and caspase-3 activation MEFs were seeded at 7,500 cells per well in 96-well plate. The next day, cells were pretreated with the indicated compounds for 30 min and then stimulated with human TNF (600 IU/ml) in combination with 1 μM TAK1i with or without 20 μM z-VAD-fmk in the presence of 5 μM SytoxGreen (Invitrogen) and 20 μM DEVD-MCA (PeptaNova GmbH, Sandhausen, DE). SytoxGreen intensity and caspase-3 activation were measured at intervals of 1 hour using a Fluostar Omega fluorescence plate reader (BMG Labtech GmbH, Ortenberg, DE), with excitation/emission filters of 485/520 nm for SytoxGreen and 360/460 nm for DEVD-MCA, gains set at 1,100, 20 flashes per well, and orbital averaging with a diameter of 3 mm. Percentage of cell death was calculated as (induced fluorescence – background fluorescence)/(maximal fluorescence – background fluorescence) x 100. The maximal fluorescence is obtained by full permeabilization of the cells using Triton X-100 at a final concentration of 0.1 %. The caspase-3 activity was calculated as (induced DEVD-AMC fluorescence – background fluorescence) x 100/ (SytoxGreen fluorescence obtained from the Triton X-100 permeabilized cells).

ATP concentration measurement

U937 and L929 sAhFas were seeded at 2.104 cells/well in white 96-well plate for 24 h. U937 cells were pretreated with z-VAD-fmk (30 μM) for 30 min and then treated for 20 h with TRAIL-Flag (200 ng/ml) and 2 μg/ml M2 anti-Flag antibody. L929 sAhFas cell line were pretreated with z-VAD-fmk (20 μM) for 30 min and then treated with mouse TNF (10 ng/ml) or Ig-FasL (200 ng/ml) for 16 h. Concentration of cellular ATP was measured using CellTiter- Glo® Luminescent Cell viability assay (Promega) according to the manufacturer’s instruction and as previously described [19]. ATP concentration was expressed as %/NT ± SD.

119

Page 21 of 59 The FEBS Journal

120

For Review Only

Molecular docking In order to complete the RIPK1 structure available from PDB structures, we performed homology modeling of full RIPK1 protein, notably for the completion of the missing residues.

The selected template was ITHJ_B as only loop 177REVDGTAKKNGG188 is missing in this structure. Homology modeling did not seem reliable because it did not propose any structuration of this loop despite PSSPred results predicting that a majority of residues should be involved in alpha-helix secondary structure. PEPFold ab-initio method allowed us to model the loop efficiently and finally enabled us the completion of the RIPK1 model for molecular docking computations. Next, a Normal Mode Analysis (NMA) was achieved with ElNemo program to modulate the RIPK1 conformations available from the initial model, improving the variety of protein structures that will be used during docking by the addition of two more models for RIPK1after modes selection (following ElNemo standard validation of essential modes). The final three models of RIPK1 were used as biological target (receptor) for the exploration of possible association modes with compounds Nec-1s, Sib and Sib-i. Docking calculations were performed by using the standard protocol proposed in the VINA implementation of YASARA suite (global docking, 1000 runs per target / per compound). Results have been clusterized thanks to the g cluster command of the Gromacs program (Jarvis-Patrick method). After ranking of the poses, the best positioning of the ligand towards the receptor (energy criteria) was submitted to a short molecular dynamics simulation in water for 10 nanoseconds in order to improve the model of compound-RIPK1 complex. Final models were obtained after energy minimization after checking that the ligand was stable during the MD trajectory. Ligand-contacting residues were detected using a 3.5Å cut-off distance and pharmacophores were derived from a standard analysis by using Ligand Scout program.

121

The FEBS Journal Page 22 of 59

122

For Review Only

Concanavalin A-induced hepatitis Seven to nine-week-old female C57Bl/6 WT were purchased from Janvier (Le Genest St Isle, FR). Con A was provided by Sigma Aldrich and diluted at 12 mg/kg in PBS/5% DMSO (vehicle). C57Bl/6 WT mice were pretreated for 1 hour with i.p. administration of 3 mg/kg Sib or 6,25 mg/kg Nec-1s diluted in vehicle before retro-orbital administration of 12 mg/kg Con A for 24 hours. At the end of treatment, mice were sacrified (vehicle, n=5; Sib, n=4; Nec-1s, n=4; vehicle+Con A, n=10; Sib+Con A, n=13; Nec-1s+Con A, n=10). All animals received human care and all study protocols comply with the institution’s guidelines. At the end of the experiment, mice body weights were measured and fragments of mouse livers were fixed in 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin for Hematoxylin/Eosin staining. Serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) were measured in mouse serum according to the IFCC primary reference procedures and using the Olympus AU2700 Autoanalyser (Olympus France, Rungis, FR).

Statistical analyses Data presented were acquired from a minimum of three independent experiments. They are expressed as means ± SD or ± SEM. Statistical analyses for in vitro studies were performed with unpaired t tests. For in vivo studies, Mann-Whitney U test was used for comparison of control group parameters with treatment group. All statistical analyses were performed with GraphPad Prism6 software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Acknowledgements Dr. Sandrine Ruchaud is warmly acknowledged for her continuing support and critical reading of the manuscript. We would like to thank Béatrice Foll-Josselin for cell culture and Mathieu Bertrand and Kathrin Weber for helpful scientific advices. The authors also thank the

Page 23 of 59 The FEBS Journal 123

For Review Only

Cancéropôle Grand-Ouest (axis: Nature sea products in cancer treatment), GIS IBiSA (Infrastructures en Biologie Santé et Agronomie, France) and Biogenouest (Western France life science and environment core facilty network) for supporting KISSf screening facility (Roscoff, France). We also thank the animal house facilities and the immunohistology platform (Biosit, Rennes). Michel Samson, Stéphane Bach and Marie-Thérèse Dimanche- Boitrel were supported by PLBIOINCa (“NECROTRAIL” Program). MT Dimanche-Boitrel’s group was also supported by grants from Conseil Régional de Bretagne (ID2 Santé), and the Ligue Contre le Cancer (committees Ille et Vilaine and Maine et Loire). F Faurez was supported by INCa (postdoctoral fellow). M Bonnet was supported by the European University of Brittany (Chaire d’excellence). Research in the group of Prof. P. Vandenabeele is supported by grants from the Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB), from Ghent University (MRP, GROUP-ID consortium), grants from the 'Foundation against Cancer' (2012-188 and FAF-F/2016/865), grants from the Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) (FWO G.0875.11, FWO G.0A45.12N, FWO G.0787.13N, FWO G.0C37.14N, , FWO G.0E04.16N), grants from the Flemish Government (Methusalem BOF09/01M00709 and BOF16/MET_V/007), a grant from the Belgian science policy office (BELSPO)(IAP 7/32). This work is part of shared PhD ship between universities of Rennes and Ghent.

Author contributions FLC designed, performed an analyzed in vitro and in vivo data. CD designed, performed and analyzed in vitro data and protein kinase production and phosphorylation. SPL designed, performed and analyzed in vitro data. AF designed, performed and analyzed in vivo data. AC synthetized the compounds and characterized them by RMN and mass spectrometry. OD conducted in silico molecular modeling and docking analyses. ND was in charge of cell culture, MTS viability assay and autophosphorylation assay. BB was in charge of protein kinase

124

The FEBS Journal Page 24 of 59

125

For Review Only

purification and phosphorylation assays. IG was in charge of cell culture and MTS assay. CPP designed, performed and analyzed in vivo data. FF designed and performed in vitro data. MB designed and performed in vivo data. YM was the chemist who synthetized the compound sibiriline for the first time. PG analyzed results of chemical synthesis and revised the manuscript. MS designed, performed and analyzed in vivo data. PV revised the manuscript. SB and MTDB participated in the study, design and coordination. All the authors read and approved the final manuscrit submitted for publication.

Conflict of Interest The authors declare no conflict of interest.

126

Page 25 of 59 The FEBS Journal

127

For Review Only

References

1. Malhi H, Guicciardi ME & Gores GJ (2010) Hepatocyte death: a clear and present danger. Physiol Rev 90, 1165-1194. 2. Saeed WK & Jun DW (2014) Necroptosis: an emerging type of cell death in liver diseases. World J Gastroenterol 20, 12526-12532. 3. Zhao H, Jaffer T, Eguchi S, Wang Z, Linkermann A & Ma D (2015) Role of necroptosis in the pathogenesis of solid organ injury. Cell Death Dis 6, e1975. 4. Degterev A, Huang Z, Boyce M, Li Y, Jagtap P, Mizushima N, Cuny GD, Mitchison TJ, Moskowitz MA & Yuan J (2005) Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nat Chem Biol 1, 112-119. 5. Vanden Berghe T, Linkermann A, Jouan-Lanhouet S, Walczak H & Vandenabeele P (2014) Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol 15, 135-147. 6. Degterev A, Hitomi J, Germscheid M, Ch'en IL, Korkina O, Teng X, Abbott D, Cuny GD, Yuan C, Wagner G et al. (2008) Identification of RIP1 kinase as a specific cellular target of necrostatins. Nat Chem Biol 4, 313-321. 7. Vercammen D, Brouckaert G, Denecker G, Van de Craen M, Declercq W, Fiers W & Vandenabeele P (1998) Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med 188, 919-930. 8. Duprez L, Takahashi N, Van Hauwermeiren F, Vandendriessche B, Goossens V, Vanden Berghe T, Declercq W, Libert C, Cauwels A & Vandenabeele P (2011) RIP kinase dependent necrosis drives lethal systemic inflammatory response syndrome. Immunity 35, 908-918.

The FEBS Journal Page 26 of 59 128

For Review Only

9. Oberst A, Dillon CP, Weinlich R, McCormick LL, Fitzgerald P, Pop C, Hakem R, Salvesen GS & Green DR (2011) Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3- dependent necrosis. Nature 471, 363-367. 10. Li J, McQuade T, Siemer AB, Napetschnig J, Moriwaki K, Hsiao YS, Damko E, Moquin D, Walz T, McDermott A et al. (2012) The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell 150, 339-350. 11. Sun L, Wang H, Wang Z, He S, Chen S, Liao D, Wang L, Yan J, Liu W, Lei X & Wang X (2012) Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell 148, 213-227. 12. Cai Z, Jitkaew S, Zhao J, Chiang HC, Choksi S, Liu J, Ward Y, Wu LG & Liu ZG (2014) Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol 16, 55-65. 13. Wang H, Sun L, Su L, Rizo J, Liu L, Wang LF, Wang FS & Wang X (2014) Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Mol Cell 54, 133-146. 14. Zhou W & Yuan J (2014) Necroptosis in health and diseases. Semin Cell Dev Biol 35, 14- 23. 15. Roychowdhury S, McMullen MR, Pisano SG, Liu X & Nagy LE (2013) Absence of receptor interacting protein kinase 3 prevents ethanol-induced liver injury. Hepatology 57, 1773-1783. 16. Ramachandran A, McGill MR, Xie Y, Ni HM, Ding WX & Jaeschke H (2013) Receptor interacting protein kinase 3 is a critical early mediator of acetaminophen-induced hepatocyte necrosis in mice. Hepatology 58, 2099-2210. 17. Gautheron J, Vucur M, Reisinger F, Cardenas DV, Roderburg C, Koppe C, Kreggenwinkel K, Schneider AT, Bartneck M, Neumann UP et al. (2014) A positive feedback loop between RIP3 and JNK controls non-alcoholic steatohepatitis. EMBO Mol Med 6, 1062-1074.

Page 27 of 59 The FEBS Journal

129

For Review Only

18. Afonso MB, Rodrigues PM, Carvalho T, Caridade M, Borralho P, Cortez-Pinto H, Castro RE, Rodrigues CM (2015) Necroptosis is a key pathogenic event in human and experimental murine models of non-alcoholic steatohepatitis. Clin Sci (Lond) 129, 721-739. 19. 19 Jouan-Lanhouet S, Arshad MI, Piquet-Pellorce C, Martin-Chouly C, Le Moigne-Muller G, Van Herreweghe F, Takahashi N, Sergent O, Lagadic-Gossmann D, Vandenabeele P et al. (2012) TRAIL induces necroptosis involving RIPK1/RIPK3-dependent PARP-1 activation. Cell Death Differ 19, 2003-2014. 20. Takemoto K, Hatano E, Iwaisako K, Takeiri M, Noma N, Ohmae S, Toriguchi K, Tanabe K, Tanaka H, Seo S et al. (2014) Necrostatin-1 protects against reactive oxygen species (ROS)- induced hepatotoxicity in acetaminophen-induced acute liver failure. FEBS Open Bio 4, 777- 787. 21. Günther C, He GW, Kremer AE, Murphy JM, Petrie EJ, Amann K, Vandenabeele P, Linkermann A, Poremba C, Schleicher U et al. (2016) The pseudokinase MLKL mediates programmed hepatocellular necrosis independently of RIPK3 during hepatitis. J Clin Invest 126, 4346-4360. 22. Filliol A, Piquet-Pellorce C, Le Seyec J, Farooq M, Genet V, Lucas-Clerc C, Bertin J, Gough PJ, Dimanche-Boitrel MT, Vandenabeele P et al. (2016) RIPK1 protects from TNF-α- mediated liver damage during hepatitis. Cell Death Dis 7, e2462. 23. Li JX, Feng JM, Wang Y, Li XH, Chen XX, Su Y, Shen YY, Chen Y, Xiong B, Yang CH et al. (2014) The B-Raf(V600E) inhibitor dabrafenib selectively inhibits RIP3 and alleviates acetaminophen-induced liver injury. Cell Death Dis 5, e1278.

130

The FEBS Journal Page 28 of 59

131

For Review Only

24. Teng X, Degterev A, Jagtap P, Xing X, Choi S, Denu R, Yuan J & Cuny GD (2005) Structure- activity relationship study of novel necroptosis inhibitors. Bioorg Med Chem Lett 15, 5039- 5044. 25. Takahashi N, Duprez L, Grootjans S, Cauwels A, Nerinckx W, DuHadaway JB, Goossens V, Roelandt R, Van Hauwermeiren F, Libert C et al. (2012) Necrostatin-1 analogues: critical issues on the specificity, activity and in vivo use in experimental disease models. Cell Death Dis 3, e437. 26. Christofferson DE, Li Y, Hitomi J, Zhou W, Upperman C, Zhu H, Gerber SA, Gygi S & Yuan J (2012) A novel role for RIP1 kinase in mediating TNFα production. Cell Death Dis 3, e320. 27. Harris PA, Bandyopadhyay D, Berger SB, Campobasso N, Capriotti CA, Cox JA, Dare L, Finger JN, Hoffman SJ, Kahler KM et al. (2013) Discovery of Small Molecule RIP1 Kinase Inhibitors for the Treatment of Pathologies Associated with Necroptosis. ACS Med Chem Lett 4, 1238-1243. 28. Fauster A, Rebsamen M, Huber KV, Bigenzahn JW, Stukalov A, Lardeau CH, Scorzoni S, Bruckner M, Gridling M, Parapatics K et al. (2015) A cellular screen identifies ponatinib and pazopanib as inhibitors of necroptosis. Cell Death Dis 6, e1767. 29. Najjar M, Suebsuwong C, Ray SS, Thapa RJ, Maki JL, Nogusa S, Shah S, Saleh D, Gough PJ, Bertin J et al. (2015) Structure guided design of potent and selective ponatinib-based hybrid inhibitors for RIPK1. Cell Rep 10, 1850-1860. 30. Berger SB, Harris P, Nagilla R, Kasparcova V, Hoffman S, Swift B, Dare L, Schaeffer M, Capriotti C, Ouellette M et al. (2015) Characterization of GSK'963: a structurally distinct, potent and selective inhibitor of RIP1 kinase. Cell Death Discov 1, 15009. 31. Harris PA, King BW, Bandyopadhyay D, Berger SB, Campobasso N, Capriotti CA, Cox JA, Dare L, Dong X, Finger JN et al. (2016) DNA-Encoded Library Screening Identifies Benzo[b][1,4]oxazepin-4-ones as Highly Potent and Monoselective Receptor Interacting Protein 1 Kinase Inhibitors. J Med Chem 59, 2163-2178.

Page 29 of 59 The FEBS Journal

132

For Review Only

32. Degterev A & Linkermann A (2016) Generation of small molecules to interfere with regulated necrosis. Cell Mol Life Sci 73, 2251-2267. 33. Ren Y, Su Y, Sun L, He S, Meng L, Liao D, Liu X, Ma Y, Liu C, Li S et al. (2017) Discovery of a Highly Potent, Selective, and Metabolically Stable Inhibitor of Receptor-Interacting Protein 1 (RIP1) for the Treatment of Systemic Inflammatory Response Syndrome. J Med Chem 60, 972-986. 34. Conrad M, Angeli JP, Vandenabeele P & Stockwell BR (2016) Regulated necrosis: disease relevance and therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov 15, 348-366. 35. Harris PA, Berger SB, Jeong JU, Nagilla R, Bandyopadhyay D, Campobasso N, Capriotti CA, Cox JA, Dare L, Dong X et al. (2017) Discovery of a First-in-Class Receptor Interacting Protein 1 (RIP1) Kinase Specific Clinical Candidate (GSK2982772) for the Treatment of Inflammatory Diseases. J Med Chem 60, 1247-1261. 36. Miao B & Degterev A (2009) Methods to analyze cellular necroptosis. Methods Mol Biol 559, 79-93. 37. Tiegs G & Gantner F (1996) Immunotoxicology of T cell-dependent experimental liver injury. Exp Toxicol Pathol 48, 471-476. 38. Wang L, Du F & Wang X (2008) TNF-alpha induces two distinct caspase-8 activation pathways. Cell 133, 693-703. 39. Dondelinger Y, Aguileta MA, Goossens V, Dubuisson C, Grootjans S, Dejardin E, Vandenabeele P & Bertrand MJ (2013) RIPK3 contributes to TNFR1-mediated RIPK1 kinase- dependent apoptosis in conditions of cIAP1/2 depletion or TAK1 kinase inhibition. Cell Death Differ 20, 1381-1392.

The FEBS Journal Page 30 of 59

133

For Review Only

40. Xie T, Peng W, Liu Y, Yan C, Maki J, Degterev A, Yuan J & Shi Y (2013) Structural basis of RIP1 inhibition by necrostatins. Structure 21, 493-499. 41. Kopalli SR, Kang TB & Koppula S (2016) Necroptosis inhibitors as therapeutic targets in inflammation mediated disorders – a review of the current literature and patents. Expert Opin Ther Pat 26, 1239-1256. 42. Biton S & Ashkenazi A (2011) NEMO and RIP1 control cell fate in response to extensive DNA damage via TNF-α feedforward signaling. Cell 145, 92-103. 43. Selig R, Schollmeyer D, Albrecht W & Laufer S (2011) The application of Stille crosscoupling reactions with multiple nitrogen containing heterocycles. Tetrahedron 67, 9204- 9213. 44. Bali A, Sen U & Peshin T (2014) Synthesis, docking and pharmacological evaluation of novel indole based potential atypical antipsychotics. Eur J Med Chem 74, 477-490. 45. Fabian MA, Biggs WH 3rd, Treiber DK, Atteridge CE, Azimioara MD, Benedetti MG, Carter TA, Ciceri P, Edeen PT, Floyd M et al. (2005) A small molecule-kinase interaction map for clinical kinase inhibitors. Nat Biotechnol 23, 329-336.

Supporting information Additional Supporting Information may be found online in the supporting information tab for this article.

134

Page 31 of 59 The FEBS Journal For Review Only

Figure legends

Fig. 1. Identification of Sibiriline as potent necroptosis inhibitor by cell-based screening of chemical library. (A) Workflow of the cell-based selection of new necroptosis inhibitors. Among 1015 compounds, 4-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2-yl)phenol (Sibiriline, Sib) was selected as an inhibitor of TNFα-induced necroptosis in human FADD-deficient Jurkat cells. The different steps of the selection are reported in the inverted triangle. Inactive Sibiriline (Sib-i) was not detected during the screening campaign and is thus considered as the negative control of Sibiriline. (B) Results of the automated cell-based screening assay highlighting putative necroptosis inhibitor candidates shown in scatter plot. 96 compounds were screened per plate (including eight positive and eight negative controls) for their anti-necroptotic activity on Jurkat

FADD-deficient cell line treated with TNF-α. Cell viability was evaluated by 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) reduction assay, 24 h after addition of tested compounds on cells and is expressed in % of survival in cells treated with DMSO. The primary screening is performed in monoplicate. (C) Dose-dependent inhibition of TNF-α induced necroptosis by increasing concentrations of Sibiriline. After a 24-hour incubation, the effect of the tested compound on the cell viability was evaluated by MTS reduction assay and is expressed in % of survival in cells treated with DMSO (n=3, mean±SD).

Fig. 2. At inhibitory concentration, Sibiriline is not toxic towards human primary leukocytes or retina cells. 24 h after Sibiriline treatment cell viability was measured with an MTS assay to determine the toxicity of the compound towards either. (A) human primary blood leukocytes

135

The FEBS Journal Page 32 of 59 For Review Only

(hPBLs, n=6 individuals, mean±SD). (B) human retina pigmented epithelium cells (RPE-1 hTERT, n=3, mean±SD).

Fig. 3. Sibiriline inhibits death receptor-induced necroptosis but not apoptosis. (A) Necroptosis was induced in U937 cells by a pretreatment with zVAD-fmk (20 μM) followed by a 24 h treatment with TRAIL-Flag (10 ng/ml). In L929 sAhFas cell line, the same zVAD- fmk pretreatment was followed either with a TNF (10 ng/ml) or an Ig-FasL (200 ng/ml) 16 h treatment. The percentage of cell death was determined by propidium iodide staining using flow cytometry (upper panels) (n=3, mean±SEM, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 and ****P<0.0001). Intracellular ATP levels (lower panels) were measured with the CellTiter- Glo® Luminescent Cell Viability Assay (n=3, mean±SEM, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 and ****P<0.0001). Apoptosis was induced in Jurkat wild-type cells with either (B) a TRAIL-Flag (10 ng/ml) or FasL (200 ng/ml) or (C) staurosporine (100 nM) 18 h treatment. The percentage of cell death was quantified by flow cytometry using propidium iodide staining (n=3, mean±SD). Results shown are representative of at least three independent experiments.

Fig. 4. Sibiriline remains effective at preventing necroptosis when applied post cell death initiation and allows cell survival and proliferation. (A) Viability was assessed by flow cytometry with Propidium Iodide (PI) staining on Fadd-def Jurkat cells treated with TNF (10 ng/ml) followed by 10 μM Sibiriline (Sib) or necrostatin-1 (Nec-1) addition 1 to 4 h post necroptosis initiation (n=4, mean±SEM, ***P<0.001 and ****P<0.0001). (B) Clonogenic assay was performed in L929 cells. 24 h after TNF+zVAD-fmk treatment in absence or presence of 10 μM necroptosis inhibitors (Nec-1, Nec-1s or Sib) or 10 μM Sib-i, 1,000 cells per well were plated and stained with crystal violet 8 days later. One representative of three experiments is shown.

136

Page 33 of 59 The FEBS Journal

137

For Review Only

Fig. 5. Study of the binding of Sibiriline to RIPK1 and to a large panel of kinases. (A)

Biochemical kinase profiling assay (KINOMEscanSM) which measures drug binding with a panel of 456 purified kinases (mostly human). This TREEspot™ Kinase dendrogram (DiscoverX) is an artistic representation of the human kinome phylogenetic tree. The codes reported on this figure indicate the subclasses of protein kinases: CMGC for CDKs, MAP kinases, GSK and CDK-like kinases; AGC for Protein kinase A, G, and C families (PKA, PKC, PKG); CAMK for Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases; CK1, Cell Kinases 1 (originally known as Casein Kinase 1); STE, STE Kinases (Homologs of yeast STErile kinases); TKL, Tyrosine Kinases- Like; TK, Tyrosine Kinases. Each kinase tested in the assay panel is marked with a circle. The hit kinases reported, including are marked with a red circle, except RIPK1 who is marked with a blue circle. 0 % represents the higher affinity, whereas small green dots indicate that at the tested concentration of molecule (here 10 μM), Sib or Sib-i cannot bind significantly to the kinase (as over 35 % of the tested kinase are still on the affinity matrix after competition with the tested compound). For RIPK1, only 0.2 % of the initial amount of kinase is still on the affinity matrix after competition with 10 μM Sibiriline (the full list of results for Sibiriline is reported in Table S1). Selectivity Score (reported on the figure as S-Score) is a value related to compound selectivity. It is calculated by dividing the number of kinases that compounds bind to by the total number of distinct kinases tested, excluding mutant variants. S Score(35) = (number of nonmutant kinases with %Ctrl <35)/(number of non-mutant kinases tested). Images were generated using TREEspot™ Software Tool and reprinted with permission from KINOMEscan®, a division of DiscoverX Corporation. (B) Measure of the binding constant for RIPK1/Sibiriline interaction. An 11- point 3-fold serial dilution of Sib, Sib-i, Nec-1 or Nec-1s were prepared in 100 % DMSO in order to determine the binding constant (Kd). Kds are calculated by measuring the amount of kinase captured on the solid support as a function of the test compound concentration (n=2, mean±SEM).

138

The FEBS Journal Page 34 of 59 For Review Only

Fig. 6. Effect of Sibiriline on the catalytic activity of RIPK1. (A) RIPK1 was treated with 5, 10 or 50 μM of the mentioned chemical compound to analyze the effect on the kinase autophosphorylation. Radioactive autophosphorylation assays were processed with ATP-32P at 30 μM final concentration. Necrostatin-1, a well-described inhibitor of RIPK1, was used as an internal control. Coomassie staining was performed in order to estimate the total amount of protein loaded on polyacrylamide gel. Autophosphorylated RIPK1 band was visualized on radiographic film. Assays were performed at least two times, and similar results were obtained each time. The representative images are shown: (B) Sibiriline inhibits the catalytic activity of RIPK1. GST-RIPK1 full length produced by baculovirus in Sf9 insect cells was assayed in the presence of increasing concentrations of Sibiriline with myelin basic protein, MBP, as a substrate. Kinase activities are expressed in % of maximal activity, i.e. measured in the absence of inhibitor. The value marked with a circle corresponds to 10 μM Nec-1s (n=3, mean±SD), (C) High concentration of ATP has an effect on the inhibition of RIPK1 autophosphorylation by Sibiriline. 0.25 or 1 mM of cold ATP were used to study the competition with Sibiriline. These assays are similar to those described in (A). Necrostatin-1, a known ATP competitive inhibitor of RIPK1, was used as an internal control. % of RIPK1 activity inhibition are calculated through a ratio with DMSO (-), as a 0 percent reference. The normalization between samples was performed using the quantification of proteins. (D) No effect of Sibiriline on the catalytic activity of RIPK3. GST-RIPK3 full length produced by baculovirus in Sf9 insect cells was assayed in the presence of increasing concentrations of Sibiriline with myelin basic protein, MBP, as a substrate. Kinase activities are expressed in % of maximal activity, i.e. measured in the absence of inhibitor. The value marked with a circle corresponds to 10 μM of GSK’872, a reference RIPK3 inhibitor (n=3, mean±SD).

139

Page 35 of 59 The FEBS Journal For Review Only

Fig. 7. Sibiriline prevents RIPK1-dependent cell death upon TNF stimulation. The percentage of cell death (SytoxGreen fluorescence intensity) and caspase-3 activity, arbitrary units (DEVDAMC fluorescence intensity) were measured in function of the time by using a Fluostar Omega fluorescence plate reader as described in Materials and Methods. MEF cells were pretreated or not (DMSO) with the indicated compounds (Nec-1, Sib, Sib-i) at 10 μM and TAK1i at 1 μM ± z-VAD-fmk at 20 μM for 1 h and then treated with hTNF (600 IU/ml). (A) Effect of Sibiriline on RIPK1-dependent necroptosis induced by TNF+TAK1i+z-VAD in immortalized MEFs (% cell death, n=3, mean±SD; caspase-3 activity AU, n=3, mean±SD). Results shown are representative of at least three independent experiments. (B) Effect of Sibiriline on RIPK1- dependent apoptosis induced by TNF+TAK1i in immortalized MEFs. (% cell death, n=3, mean ±SD; caspase-3 activity AU, n=3, mean±SD). Results shown are representative of at least three independent experiments.

Fig. 8. Sibiriline interacts closed to the RIPK1 ATP-binding pocket. (A) Close-up view of the interaction between Sib and surrounding residues in RIPK1 reporting the contact residues determined after MD optimization of the best position of Sib obtained upon docking: (i) Bold residues are the seven key amino acids involved in the interaction with necrostatins (as reported in Xie et al., 2013) [40]; (ii) italic residues are defining the pharmacophore derived from LigandScout analysis. (B) View of the overall structure of Sib-bound RIPK1 highlighting the bridging contact performed by Sib between both protein subdomains. Activation loop defined by residues Asp156 to Glu196 is shown in red. (C) Superimposition of the model to the X-ray structure 4ITH obtained for the complex formed by Nec-1s (orange sticks) with RIPK1.

Fig. 9. Contact residues (3.5Å cut-off distance) predicted for the interaction of active and inactive inhibitors with human RIPK1, in comparison with those of the experimental Nec-1s- RIPK1

140

The FEBS Journal Page 36 of 59 For Review Only

structure. Comparison between active compounds (Sib, top row and Nec-1s, bottom row) and the inactive compound (Sib-i, middle row) indicates that the inactive compound shares many of the interactions with one or both active inhibitors, with the notable exception of the contacts with the residues between 129 and 136, which are present in both active inhibitors. The position of a good inhibitor should therefore promote hydrophobic interactions with the end of the long C domain helix defined by residues 111Pro to 132Lys, thereby reducing the mobility of the two main subdomains of the kinase towards each other.

Fig. 10. Sibiriline prevents concanavalin A-induced hepatitis in vivo. C57Bl/6 WT mice were pretreated for 1 h with i.p. administration of 3 mg/kg Sib or 6,25 mg/kg Nec-1s diluted in vehicle before i.v administration of 12 mg/kg Con A. At the end of treatment, mice were sacrificed (vehicle, n=5; Sib, n=4; Nec-1s, n=4; vehicle+Con A, n=10; Sib+Con A, n=13; Nec-1s+Con A, n=10). (A) Serum levels of AST and ALT were determined at 24 h post-Con A injection as described in Materials and Methods. Mean±SEM *P<0.05 and **P<0.01. (B) Hematoxylin- and Eosin-stained liver sections were shown. Scale bars represent 500 μm. (one picture representative for each group of mice).

Fig. 11. Sibiriline reduces the loss of mouse body weight induced by Concanavalin A treatment. C57Bl/6 WT mouse body weights were determined 24 h post-treatment in each group (vehicle, n=5; Sib, n=4; Nec-1s, n=4; vehicle+Con A, n=10; Sib+Con A, n=13; Nec-1s+Con A, n=10). Mean±SEM *P<0.05.

Supplementary material Table S1. Matrix of screen for the selectivity profiling of Sibiriline (Sib) (related to Fig. 5A).

141

Page 37 of 59 The FEBS Journal

142

For Review Only

The table reports the full list of the 458 kinases used in the selectivity profiling of Sib. Sib was screened at 10 μM and results are reported as “% Ctrl”, where lower numbers indicate stronger hits in the panel of kinases tested. %Ctrl calculation: (test compound signal - positive control signal)/(negative control signal - positive control signal) x 100. Test compound = Sib; negative control = DMSO (100%Ctrl); positive control = control compound (0%Ctrl).

The FEBS Journal Page 38 of 59

143

Figure 1

144

A 125 DMSO 100 Nec‐1

75 Sib

Cell Viability Cell Viability (%) 25

0 0 1020304050[Inhib]

B 100 Nec-1 DMSO

50 Sib

25 Cell Viability Cell Viability (%)

0 0 1020304050[Inhib]

Figure 2

145

A DR-induced necroptosis

U937 L929 sAhFas L929 sAhFas 0µM 0µM 0µM Sib Nec-1 Sib Nec-1 Sib Nec-1 80 10µM 1µM 1µM 20µM 100 5µM 100 5µM 10µM 10µM 60 80 80

60 40 60 ** ** *** *** * ** 40 **** ** 40 * 20 **** 20 **** 20 0 % Cell Death% (PI+ cells)

0 Cell Death% (PI+ cells) 0 % Cell Death% (PI+ cells) ‐ + ‐‐ ++ ‐‐ ++ Trail zVAD ‐ + ‐ ‐‐ + ++ ‐ ‐‐ + ++ TNF zVAD ‐ + ‐ ‐‐ + + + ‐ ‐‐ + ++ Ig-FasL zVAD

U937 *** *** 100 **

80 ** 60 ** Sib 40 * Sib +TRAIL zVAD 20 Nec-1 Nec-1 +TRAIL zVAD

0 (%) level ATP Relative 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 inhibitor [µM]

B DR-induced apoptosis

Jurkat wt Jurkat wt

100 0 µM 100 0 µM 1 µM 80 5 µM 1 0µM 80 5 µM 60 20 µM 10µM 60

40 40

20 20

0 0 % Cell Death% (PI+ cells) Cell Death% (PI+ cells)

C DR-independent induced apoptosis Jurkat wt

100 0 µM 5 µM 80 10 µM 60 40 20

0 % Cell Death% (PI+ cells)

Figure 3

146

A 60 TN TNF 50

30 *** **** 20 **** **** **** **** 10 **** *** % Cell Death (PI+ % 0 4h 3h 2h 1h 1h 2h 3h 4h Ctl Ctl ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ S4h S3h S2h S1h TNF TNF N4h N3h N2h N1h ‐ ‐ ‐ 1 ‐ 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 hours post treatment ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ S10 S10 S10 S10 Ctl Ctl Ctl Ctl N10 N10 N10 N10 Ctl Ctl Ctl Ctl ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Sib Sib Nec-1 ‐ Nec-1 TNF TNF TNF TNF TNF TNF TNF TNF

B Inhibitors _ Nec-1 Nec-1s Sib Sib-i

DMSO

TNF/zVAD

Figure 4

147

A Sib (456 Assays Tested) Sib-i (456 Assays Tested) 104 Interactions Mapped 1 Interaction Mapped S-Score(35)=0.197 S-Score(35)=0.003

B Sib (Kd=218nM) Nec-1 (Kd=31nM) -8 6×10 Sib-i (Kd>30000nM) Nec-1s (Kd=8nM) 6×10-8 (qPCR signal) (qPCR (qPCR signal) (qPCR 4×10-8 4×10-8

-8 2×10 2×10-8 Amount of RIPK1 RIPK1 of Amount Amount ofRIPK1 0 0 10-12 10-10 10-8 10-6 10-4 10-12 10-10 10-8 10-6 10-4 Compound concentration (M) Compound concentration (M) Figure 5

148

Figure 6

149

A B

Figure 7

150

B C

Figure 8

151

Sib

Sib-i

Nec-1s

Figure 9

152

B Vehicle ConA

Sib Sib + ConA

Nec-1s Nec-1s + ConA

Figure 10

153

105 * * 100

80 Vehicle Sib Nec-1s Vehicle Sib Nec-1s

+ ConA

Figure 11

154

Table S1

KINOMESCAN (456 kinases) on sibiriline (sib) DiscoveRx Gene Symbol Entrez Gene Symbol Percent Control AAK1 AAK1 29 ABL1(E255K)-phosphorylated ABL1 9,4 ABL1(F317I)-nonphosphorylated ABL1 73 ABL1(F317I)-phosphorylated ABL1 18 ABL1(F317L)-nonphosphorylated ABL1 34 ABL1(F317L)-phosphorylated ABL1 25 ABL1(H396P)-nonphosphorylated ABL1 1 ABL1(H396P)-phosphorylated ABL1 8,4 ABL1(M351T)-phosphorylated ABL1 8,6 ABL1(Q252H)-nonphosphorylated ABL1 6,2 ABL1(Q252H)-phosphorylated ABL1 6 ABL1(T315I)-nonphosphorylated ABL1 10 ABL1(T315I)-phosphorylated ABL1 12 ABL1(Y253F)-phosphorylated ABL1 12 ABL1-nonphosphorylated ABL1 11 ABL1-phosphorylated ABL1 10 ABL2 ABL2 53 ACVR1 ACVR1 27 ACVR1B ACVR1B 94 ACVR2A ACVR2A 13 ACVR2B ACVR2B 9,3 ACVRL1 ACVRL1 69 ADCK3 CABC1 85 ADCK4 ADCK4 68 AKT1 AKT1 100 AKT2 AKT2 85 AKT3 AKT3 100 ALK ALK 52 ALK(C1156Y) ALK 32 ALK(L1196M) ALK 57 AMPK-alpha1 PRKAA1 84 AMPK-alpha2 PRKAA2 84 ANKK1 ANKK1 10 ARK5 NUAK1 73 ASK1 MAP3K5 100 ASK2 MAP3K6 70 AURKA AURKA 3 AURKB AURKB 3,8 AURKC AURKC 0,7

155

AXL AXL 44 BIKE BMP2K 65 BLK BLK 60 BMPR1A BMPR1A 59 BMPR1B BMPR1B 8,6 BMPR2 BMPR2 70 BMX BMX 76 BRAF BRAF 83 BRAF(V600E) BRAF 80 BRK PTK6 54 BRSK1 BRSK1 74 BRSK2 BRSK2 77 BTK BTK 62 BUB1 BUB1 65 CAMK1 CAMK1 31 CAMK1D CAMK1D 81 CAMK1G CAMK1G 48 CAMK2A CAMK2A 72 CAMK2B CAMK2B 81 CAMK2D CAMK2D 99 CAMK2G CAMK2G 100 CAMK4 CAMK4 100 CAMKK1 CAMKK1 36 CAMKK2 CAMKK2 28 CASK CASK 77 CDC2L1 CDK11B 43 CDC2L2 CDC2L2 47 CDC2L5 CDK13 94 CDK11 CDK19 83 CDK2 CDK2 95 CDK3 CDK3 100 CDK4-cyclinD1 CDK4 70 CDK4-cyclinD3 CDK4 56 CDK5 CDK5 98 CDK7 CDK7 38 CDK8 CDK8 74 CDK9 CDK9 51 CDKL1 CDKL1 79 CDKL2 CDKL2 43 CDKL3 CDKL3 56 CDKL5 CDKL5 100 CHEK1 CHEK1 90 CHEK2 CHEK2 4 156

CIT CIT 38 CLK1 CLK1 59 CLK2 CLK2 29 CLK3 CLK3 78 CLK4 CLK4 29 CSF1R CSF1R 9,4 CSF1R-autoinhibited CSF1R 26 CSK CSK 56 CSNK1A1 CSNK1A1 88 CSNK1A1L CSNK1A1L 72 CSNK1D CSNK1D 56 CSNK1E CSNK1E 52 CSNK1G1 CSNK1G1 47 CSNK1G2 CSNK1G2 19 CSNK1G3 CSNK1G3 56 CSNK2A1 CSNK2A1 20 CSNK2A2 CSNK2A2 29 CTK MATK 68 DAPK1 DAPK1 24 DAPK2 DAPK2 20 DAPK3 DAPK3 12 DCAMKL1 DCLK1 78 DCAMKL2 DCLK2 94 DCAMKL3 DCLK3 100 DDR1 DDR1 41 DDR2 DDR2 45 DLK MAP3K12 76 DMPK DMPK 100 DMPK2 CDC42BPG 23 DRAK1 STK17A 2,1 DRAK2 STK17B 0,75 DYRK1A DYRK1A 33 DYRK1B DYRK1B 28 DYRK2 DYRK2 22 EGFR EGFR 76 EGFR(E746-A750del) EGFR 81 EGFR(G719C) EGFR 48 EGFR(G719S) EGFR 89 EGFR(L747-E749del, A750P) EGFR 69 EGFR(L747-S752del, P753S) EGFR 89 EGFR(L747-T751del,Sins) EGFR 94 EGFR(L858R) EGFR 70 EGFR(L858R,T790M) EGFR 62 157

EGFR(L861Q) EGFR 82 EGFR(S752-I759del) EGFR 86 EGFR(T790M) EGFR 50 EIF2AK1 EIF2AK1 100 EPHA1 EPHA1 77 EPHA2 EPHA2 80 EPHA3 EPHA3 28 EPHA4 EPHA4 100 EPHA5 EPHA5 100 EPHA6 EPHA6 86 EPHA7 EPHA7 100 EPHA8 EPHA8 100 EPHB1 EPHB1 100 EPHB2 EPHB2 100 EPHB3 EPHB3 95 EPHB4 EPHB4 96 EPHB6 EPHB6 0,65 ERBB2 ERBB2 84 ERBB3 ERBB3 93 ERBB4 ERBB4 97 ERK1 MAPK3 98 ERK2 MAPK1 100 ERK3 MAPK6 80 ERK4 MAPK4 92 ERK5 MAPK7 97 ERK8 MAPK15 86 ERN1 ERN1 69 FAK PTK2 100 FER FER 98 FES FES 93 FGFR1 FGFR1 58 FGFR2 FGFR2 43 FGFR3 FGFR3 47 FGFR3(G697C) FGFR3 52 FGFR4 FGFR4 95 FGR FGR 58 FLT1 FLT1 6,8 FLT3 FLT3 2,8 FLT3(D835H) FLT3 12 FLT3(D835Y) FLT3 17 FLT3(ITD) FLT3 8,8 FLT3(K663Q) FLT3 4,7 FLT3(N841I) FLT3 7,5 158

FLT3(R834Q) FLT3 66 FLT3-autoinhibited FLT3 59 FLT4 FLT4 73 FRK FRK 46 FYN FYN 60 GAK GAK 38 GCN2(Kin.Dom.2,S808G) EIF2AK4 83 GRK1 GRK1 100 GRK4 GRK4 55 GRK7 GRK7 49 GSK3A GSK3A 94 GSK3B GSK3B 78 HASPIN GSG2 28 HCK HCK 67 HIPK1 HIPK1 23 HIPK2 HIPK2 16 HIPK3 HIPK3 23 HIPK4 HIPK4 95 HPK1 MAP4K1 46 HUNK HUNK 64 ICK ICK 62 IGF1R IGF1R 86 IKK-alpha CHUK 11 IKK-beta IKBKB 16 IKK-epsilon IKBKE 64 INSR INSR 29 INSRR INSRR 54 IRAK1 IRAK1 5 IRAK3 IRAK3 29 IRAK4 IRAK4 44 ITK ITK 83 JAK1(JH1domain-catalytic) JAK1 42 JAK1(JH2domain-pseudokinase) JAK1 14 JAK2(JH1domain-catalytic) JAK2 0,2 JAK3(JH1domain-catalytic) JAK3 6,6 JNK1 MAPK8 5,9 JNK2 MAPK9 39 JNK3 MAPK10 8,8 KIT KIT 0,8 KIT(A829P) KIT 58 KIT(D816H) KIT 86 KIT(D816V) KIT 37 KIT(L576P) KIT 1,2 159

KIT(V559D) KIT 0,4 KIT(V559D,T670I) KIT 5,8 KIT(V559D,V654A) KIT 19 KIT-autoinhibited KIT 30 LATS1 LATS1 86 LATS2 LATS2 84 LCK LCK 61 LIMK1 LIMK1 66 LIMK2 LIMK2 82 LKB1 STK11 100 LOK STK10 86 LRRK2 LRRK2 89 LRRK2(G2019S) LRRK2 70 LTK LTK 46 LYN LYN 86 LZK MAP3K13 87 MAK MAK 100 MAP3K1 MAP3K1 100 MAP3K15 MAP3K15 72 MAP3K2 MAP3K2 72 MAP3K3 MAP3K3 47 MAP3K4 MAP3K4 85 MAP4K2 MAP4K2 4,6 MAP4K3 MAP4K3 85 MAP4K4 MAP4K4 27 MAP4K5 MAP4K5 64 MAPKAPK2 MAPKAPK2 93 MAPKAPK5 MAPKAPK5 98 MARK1 MARK1 49 MARK2 MARK2 28 MARK3 MARK3 42 MARK4 MARK4 33 MAST1 MAST1 56 MEK1 MAP2K1 66 MEK2 MAP2K2 69 MEK3 MAP2K3 42 MEK4 MAP2K4 46 MEK5 MAP2K5 13 MEK6 MAP2K6 61 MELK MELK 81 MERTK MERTK 44 MET MET 56 MET(M1250T) MET 59 160

MET(Y1235D) MET 26 MINK MINK1 12 MKK7 MAP2K7 100 MKNK1 MKNK1 83 MKNK2 MKNK2 43 MLCK MYLK3 15 MLK1 MAP3K9 32 MLK2 MAP3K10 83 MLK3 MAP3K11 37 MRCKA CDC42BPA 90 MRCKB CDC42BPB 80 MST1 STK4 90 MST1R MST1R 92 MST2 STK3 53 MST3 STK24 71 MST4 MST4 56 MTOR MTOR 100 MUSK MUSK 22 MYLK MYLK 78 MYLK2 MYLK2 46 MYLK4 MYLK4 61 MYO3A MYO3A 68 MYO3B MYO3B 80 NDR1 STK38 54 NDR2 STK38L 63 NEK1 NEK1 96 NEK10 NEK10 54 NEK11 NEK11 90 NEK2 NEK2 92 NEK3 NEK3 77 NEK4 NEK4 60 NEK5 NEK5 67 NEK6 NEK6 100 NEK7 NEK7 55 NEK9 NEK9 78 NIK MAP3K14 85 NIM1 MGC42105 96 NLK NLK 100 OSR1 OXSR1 75 p38-alpha MAPK14 96 p38-beta MAPK11 92 p38-delta MAPK13 91 p38-gamma MAPK12 73 161

PAK1 PAK1 76 PAK2 PAK2 47 PAK3 PAK3 100 PAK4 PAK4 48 PAK6 PAK6 83 PAK7 PAK7 45 PCTK1 CDK16 92 PCTK2 CDK17 90 PCTK3 CDK18 92 PDGFRA PDGFRA 17 PDGFRB PDGFRB 0,75 PDPK1 PDPK1 63 PfCDPK1 (P. falciparum) CDPK1 50 PfPK5 (P. falciparum) MAL13P1.279 96 PFTAIRE2 CDK15 79 PFTK1 CDK14 100 PHKG1 PHKG1 83 PHKG2 PHKG2 35 PIK3C2B PIK3C2B 88 PIK3C2G PIK3C2G 69 PIK3CA PIK3CA 95 PIK3CA(C420R) PIK3CA 77 PIK3CA(E542K) PIK3CA 88 PIK3CA(E545A) PIK3CA 53 PIK3CA(E545K) PIK3CA 78 PIK3CA(H1047L) PIK3CA 72 PIK3CA(H1047Y) PIK3CA 58 PIK3CA(I800L) PIK3CA 70 PIK3CA(M1043I) PIK3CA 54 PIK3CA(Q546K) PIK3CA 93 PIK3CB PIK3CB 97 PIK3CD PIK3CD 83 PIK3CG PIK3CG 97 PIK4CB PI4KB 2 PIM1 PIM1 35 PIM2 PIM2 18 PIM3 PIM3 39 PIP5K1A PIP5K1A 57 PIP5K1C PIP5K1C 48 PIP5K2B PIP4K2B 76 PIP5K2C PIP4K2C 61 PKAC-alpha PRKACA 72 PKAC-beta PRKACB 92 162

PKMYT1 PKMYT1 100 PKN1 PKN1 100 PKN2 PKN2 36 PKNB (M. tuberculosis) pknB 48 PLK1 PLK1 83 PLK2 PLK2 74 PLK3 PLK3 71 PLK4 PLK4 21 PRKCD PRKCD 100 PRKCE PRKCE 100 PRKCH PRKCH 81 PRKCI PRKCI 98 PRKCQ PRKCQ 87 PRKD1 PRKD1 88 PRKD2 PRKD2 96 PRKD3 PRKD3 84 PRKG1 PRKG1 98 PRKG2 PRKG2 78 PRKR EIF2AK2 63 PRKX PRKX 91 PRP4 PRPF4B 100 PYK2 PTK2B 77 QSK KIAA0999 86 RAF1 RAF1 100 RET RET 63 RET(M918T) RET 50 RET(V804L) RET 65 RET(V804M) RET 91 RIOK1 RIOK1 64 RIOK2 RIOK2 5 RIOK3 RIOK3 57 RIPK1 RIPK1 0,2 RIPK2 RIPK2 53 RIPK4 RIPK4 5 RIPK5 DSTYK 61 ROCK1 ROCK1 70 ROCK2 ROCK2 98 ROS1 ROS1 26 RPS6KA4(Kin.Dom.1-N-terminal) RPS6KA4 86 RPS6KA4(Kin.Dom.2-C-terminal) RPS6KA4 42 RPS6KA5(Kin.Dom.1-N-terminal) RPS6KA5 100 RPS6KA5(Kin.Dom.2-C-terminal) RPS6KA5 82 RSK1(Kin.Dom.1-N-terminal) RPS6KA1 80 163

RSK1(Kin.Dom.2-C-terminal) RPS6KA1 95 RSK2(Kin.Dom.1-N-terminal) RPS6KA3 77 RSK2(Kin.Dom.2-C-terminal) RPS6KA3 100 RSK3(Kin.Dom.1-N-terminal) RPS6KA2 91 RSK3(Kin.Dom.2-C-terminal) RPS6KA2 81 RSK4(Kin.Dom.1-N-terminal) RPS6KA6 76 RSK4(Kin.Dom.2-C-terminal) RPS6KA6 64 S6K1 RPS6KB1 73 SBK1 SBK1 83 SGK SGK1 30 SgK110 SgK110 46 SGK2 SGK2 66 SGK3 SGK3 54 SIK SIK1 68 SIK2 SIK2 82 SLK SLK 87 SNARK NUAK2 52 SNRK SNRK 98 SRC SRC 20 SRMS SRMS 64 SRPK1 SRPK1 56 SRPK2 SRPK2 100 SRPK3 SRPK3 74 STK16 STK16 6,1 STK33 STK33 40 STK35 STK35 67 STK36 STK36 87 STK39 STK39 60 SYK SYK 13 TAK1 MAP3K7 40 TAOK1 TAOK1 38 TAOK2 TAOK2 69 TAOK3 TAOK3 81 TBK1 TBK1 45 TEC TEC 69 TESK1 TESK1 100 TGFBR1 TGFBR1 99 TGFBR2 TGFBR2 20 TIE1 TIE1 49 TIE2 TEK 100 TLK1 TLK1 90 TLK2 TLK2 92 TNIK TNIK 8,8 164

TNK1 TNK1 30 TNK2 TNK2 57 TNNI3K TNNI3K 99 TRKA NTRK1 50 TRKB NTRK2 22 TRKC NTRK3 36 TRPM6 TRPM6 79 TSSK1B TSSK1B 69 TTK TTK 53 TXK TXK 66 TYK2(JH1domain-catalytic) TYK2 5,7 TYK2(JH2domain-pseudokinase) TYK2 22 TYRO3 TYRO3 81 ULK1 ULK1 51 ULK2 ULK2 71 ULK3 ULK3 19 VEGFR2 KDR 17 VRK2 VRK2 98 WEE1 WEE1 100 WEE2 WEE2 97 WNK1 WNK1 100 WNK3 WNK3 67 YANK1 STK32A 68 YANK2 STK32B 88 YANK3 STK32C 71 YES YES1 60 YSK1 STK25 89 YSK4 YSK4 2,3 ZAK ZAK 37 ZAP70 ZAP70 47

165

Article 2 : Découverte du 6-E11, un nouvel inhibiteur bioinspiré spécifique de RIPK1 (Receptor-Interacting Protein Kinase 1) et qui protège de l’ischémie froide-réoxygénation

C Delehouzé†,1, F Le Cann†,2, S Penna-Leverrier†,2, A Comte3, M Jacquard4,5,6,7,8, O Delalande9, N Desban1, B Baratte1, I Gallais2, F Faurez,2, M Bonnet2, PG Goekjian10, R Thuillier4,5,6,7,8, F Favreau4,5,6,7,8, P Vandenabeele11,12, T Hauet4,5,6,7,8, MT Dimanche- Boitrel,*,2 and S Bach,*,1

†These authors contributed equally to this work These authors share senior authorship

Article en cours de préparation.

Introduction de l’article

La mort cellulaire programmée est un processus naturel qui permet l’élimination des cellules endommagées au sein du tissu. Ce processus peut être utilisé par les cellules de la tumeur primaire pour provoquer la mort des cellules endothéliales et ainsi permettre l’extravasation des cellules tumorales. La nécroptose est contrôlée par une voie de signalisation impliquant une cascade de kinases dont RIPK1, RIPK3 et une pseudokinase effectrice MLKL. Cette nécrose régulée peut être bloquée par l’utilisation de petites molécules inhibitrices de l’activité kinase de la RIPK1 comme les nécrostatines (Nec-1 et Nec-1s) ou d’autres structures chimiques récemment décrites. La nécroptose peut être provoquée in vitro via la stimulation des récepteurs de mort par le TNF-α, FasL ou TRAIL. Dans le cas de la reperfusion post-ischémie cardiaque, hépatique ou rénale, la nécroptose est accompagnée d’une inflammation aigüe responsable de dommages tissulaires irréversibles allant dans certains cas jusqu’à la perte de fonction de l’organe. Nos travaux s’inscrivent dans l’enjeu actuel des travaux de recherche liés à la nécrose régulée qui est de développer des inhibiteurs sélectifs de la kinase RIPK1 afin de contrôler la nécroinflammation tissulaire lors de la transplantation d’organes.

L’objectif de ce travail était de caractériser par des approches in vitro et in silico les effets biologiques de la molécule 6E11 issue du criblage d’une chimiothèque de l’Université de Claude Bernard Lyon 1 dans un modèle de nécroptose induite par le TNF-α dans les cellules Jurkat déficientes en FADD.

166

Nos travaux ont mis en évidence que : i) 6E11 bloque la nécroptose induite par le TNF-α ou TRAIL dans des modèles cellulaires humains, ii) cette molécule cible la kinase RIPK1 de façon très sélective et sans affecter l’activité de la kinase RIPK3 grâce à des tests d’interaction moléculaire et d’activité enzymatique, iii) 6E11, dont la structure est très proche de celle des composés d’origine naturelle, serait un inhibiteur de kinase similaire aux inhibiteurs de type III d’après les études de modélisation moléculaire de son interaction avec la RIPK1, iv) 6E11 protège les cellules endothéliales aortiques humaines de la mort provoquée par une hypoxie froide/réoxygénation, avec une meilleure efficacité que les nécrostatines, Nec-1 et Nec-1s. Ces données démontrent in vitro des propriétés intéressantes pour 6E11 dans un modèle cellulaire d’ischémie froide/réoxygénation et permettent d’envisager une application thérapeutique prometteuse de la molécule 6E11 dans un contexte nécroinflammatoire qui pourrait être responsable de la perte de fonction de l’organe comme le cœur, le foie ou le rein lors de la greffe. Sa structure chimique devra être optimisée et testée dans un modèle préclinique de transplantation d’organe avant d’être proposée comme additif dans les solutions de préservation d’organes.

167

Article 2: Discovery of 6E11, the first highly selective bioinspired inhibitor of Receptor-Interacting Protein Kinase 1 (RIPK1)- dependent necroptosis

Running title: 6E11, the first bioinspired non-ATP competitive RIPK1 inhibitor.

C Delehouzé†,1, S Leverrier-Penna†,2,3, F Le Cann†,2,3,4, A Comte5, M Jacquard-Fevai 6,7,8,9,10, O Delalande11, N Desban1, B Baratte1, I Gallais2,3, F Faurez,2,3, MC Bonnet2,3,12,, M Hauteville13, PG Goekjian14, R Thuillier6,7,8,9,10, F Favreau6,7,8,9,10, P Vandenabeele4,15, T Hauet6,7,8,9,10, MT Dimanche-Boitrel,*,2,3 and S Bach,*,1

1 Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06, CNRS USR3151, Protein Phosphorylation and Human Disease Laboratory, Station Biologique, F-29688 Roscoff, France. 2 INSERM UMR 1085, Institut de Recherche sur la Santé, l’Environnement et le Travail, F- 35043 Rennes, France. 3 Biosit UMS 3080, Université de Rennes 1, F-35043 Rennes, France. 4 Molecular Signaling and Cell Death Unit, VIB Inflammation Research Center, Ghent, Belgium. 5 Université de Lyon, CNRS UMR 5246, ICBMS, Chimiothèque, Université Claude Bernard Lyon 1, F-69622 Villeurbanne, France. 6 Inserm U1082, Poitiers, France. 7 CHU de Poitiers, Service de Biochimie, Poitiers, France. 8 Université de Poitiers, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Poitiers, France. 9 Fédération Hospitalo-Universitaire SUPORT, Poitiers, France. 10 IBiSA Plateforme 'MOPICT', Institut national de la recherche agronomique, Unité expérimentale Génétique, expérimentations et systèmes innovants, Domaine Expérimental du Magneraud, Surgères, France. 11 CNRS UMR 6290, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Université de Rennes 1, F-35043 Rennes, France. 12 Division of Infection & Immunity, College of Biomedical and Life Sciences, Cardiff University, Cardiff, United Kingdom. 13 Laboratoire de Biochimie Analytique et Synthèse Bioorganique, Université de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, F-69622 Villeurbanne, France. 14 Université de Lyon, CNRS UMR 5246, ICBMS, Laboratoire Chimie Organique 2- Glycosciences, Université Claude Bernard Lyon 1, F-69622 Villeurbanne, France. 15 Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, Ghent, Belgium.

†These authors contributed equally to this work

 These authors share senior authorship

*Corresponding authors: Marie-Thérèse Dimanche-Boitrel, INSERM UMR 1085, IRSET, 2 avenue du Pr Léon Bernard, F-35043 Rennes, France. Tel: +33 2 23 23 48 99; Fax: +33 2 23 23 47 94; Email: [email protected] and Stéphane Bach, USR3151 CNRS/UPMC, Protein Phosphorylation and Human Disease Laboratory, Station Biologique, Place Georges Teissier, F-29688 Roscoff, France. Tel: +33 2 98 29 23 91;

168

Fax: +33 2 98 29 25 26; Email: [email protected] Abstract

Necroptosis is a programmed cell-death pathway that has been shown to be of central pathophysiological relevance in multiple disorders (hepatitis, brain and cardiac ischemia, pancreatitis, viral infection and inflammatory diseases). Necroptosis is driven by two serine threonine kinases, RIPK1 (Receptor Interacting Protein Kinase 1) and RIPK3, and a pseudo-kinase MLKL (Mixed Lineage Kinase domain-Like) associated in a multi-protein complex called necrosome. In order to find new inhibitors for use in human therapy, a chemical library containing highly diverse chemical structures was screened using a cell-based assay. The compound 6E11, a bioinspired compound synthesized in 1981, was characterized as a positive hit. Interestingly, this flavanone compound: inhibits necroptosis induced by death receptors ligands TNF-α (Tumor Necrosis Factor) or TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand); is an extremely selective inhibitor, among kinases, of human RIPK1 enzymatic activity with a nM Kd; has a non-ATP competitive mode of action and a novel putative binding site; is weakly cytotoxic towards human primary blood leukocytes or retinal pigment epithelial cells at effective concentrations; protects human aortic endothelial cells (HAEC) from cold hypoxia/reoxygenation injury more effectively than Nec-1 and Nec-1s. Altogether, these data demonstrate that 6E11 is the first bioinspired selective inhibitor of RIPK1-driven necroptosis.

Keywords: necroptosis/ RIPK1 inhibitor/ molecular docking/ cold hypoxia- reoxygenation/kinase inhibitor

Abbreviations: ATP, adenosine triphosphate; AU, arbitrary unit; DR, death receptor; MD, molecular docking; Nec-1, necrostatin-1; TNF, tumor necrosis factor; TRAIL, TNF-related apoptosis-inducing ligand.

169

INTRODUCTION

Programmed cell death (PCD) is a natural process for removing unwanted cells in both pathological and non-pathological contexts. Cell death has long been dominated by apoptosis, but include now a growing list of regulated necrosis pathways, including necroptosis, ferroptosis, parthanatos or cyclophilin D (CypD)-dependent necrosis (see (1), for review). Necroptosis is so far the best-studied form of non-apoptotic cell death. This peculiar PCD does not involve key apoptosis regulators, such as caspases, Bcl-2 family members or cytochrome c release from mitochondria. A two-step chemobiological approach has led to the characterization of Ser/Thr RIPK1 (Receptor- Interacting Protein Kinase 1) kinase as key regulator of necroptosis (2,3), when small chemicals, termed necrostatins, were shown to be able to suppress this non-apoptotic form of cell death in human monocytic U937 cells.

Necroptosis is activated upon stimulation of death receptors by the cytokines TNF-α (Tumor Necrosis Factor α), FasL (Fas Ligand) and TRAIL (Tumor-necrosis-factor Related Apoptosis-Inducing Ligand) when caspase-8 is inhibited or absent. The TNFR1 (Tumor Necrosis Factor Receptor 1)-mediated necroptosis is known as the prototype of regulated necrosis. The binding of TNF to its receptor TNFR1 leads to the formation of a sequence of signaling complexes finely tuned by ubiquitylation and deubiquitylation events. The receptor-associated “complex I” induces prosurvival signals through activation of NF-κB (Nuclear Factor – kappa B) and MAPKs (Mitogen Activated Protein Kinases), while other cytosolic complexes drive two different programmed cell deaths: (i) apoptosis, via formation of complex including FADD (Fas-Associated Death Domain) that recruits caspase-8 to activate a caspase- dependent cascade; or (ii) necroptosis, via activation of RIPK1 and two other key players, Ser/Thr RIPK3 kinases and the pseudokinase MLKL (Mixed Lineage Kinase Domain-Like) in a complex called the “necrosome” (4). In accordance with this activation cascade, TNF-α was shown to induce necroptosis in human Jurkat T cells when FADD is deleted (5).

The ground-breaking finding that necroptosis is a genetically controlled process led to the hypothesis that this programmed cell-death is ´druggable´, an emerging breakthrough that carries the potential for significant advances in everyday clinical

170 medicine (2). Indeed molecular targets, including RIPK1, RIPK3 and MLKL, have been shown to be involved in multiple disease models where necroptosis is of central pathophysiological relevance, such as: in ischemia-reperfusion injury (including stroke, myocardial infarction, resuscitation, solid organ transplantation or heart surgery) in brain, heart and kidney disease, and in inflammatory diseases, including moderate to severe Rheumatoid Arthritis (RA), psoriasis, retinal disorders, neurodegenerative diseases and infectious disorders (sepsis, viral infections, parasites, bacterial infections) (6,7) (Fig. 1). More recently, it has been shown that human and murine tumor cells induce necroptosis of endothelial cells, which promotes tumor cell extravasation and metastasis (8). Necroptosis can thus also be targeted in the treatment of human metastasis, the leading cause of cancer-related death in humans.

Following the molecular description of necroptosis and the characterization of necrostatins (2,3,9), various screening initiatives using cell-based assays or high- throughput in vitro RIPK1 binding assays have shed light on new chemical scaffolds including the 1-aminoisoquinolines (10), 5-phenylpyrrolo[2,3-b]pyridines (10), 5- arylpyrrolo[2,3-b]pyridines (10), furo[2,3-d]pyrimidines (10), analogs of Bcr-Abl inhibitor ponatinib (11,12), PN10 (hybrid of ponatinib and Nec-1s) (11), the benzo[b][1,4]oxazepin-4-ones (13), the compound GSK’963 (14) and the RIPA-56 (15). The quest for an optimized clinical candidate is still in progress with the synthesis of the first-in-class RIPK1 specific inhibitor (GSK2982772) (16).

We now reported here the characterization of the first highly selective bioinspired inhibitor of RIPK1, 2-(4-(benzyloxy)phenyl)-2,5-dihydroxy-7-methoxychroman-4-one (compound called 6E11), using a phenotypic cell screen which detects the ability of small chemicals to block TNF-driven necrotic death. Moreover, we show that this new inhibitor protects cells from cold hypoxia/reoxygenation injury. This work sheds light on the interest to study natural products or derivatives in the quest of drugs targeting necroptosis-related disorders.

RESULTS

Discovery of a novel potent small molecular inhibitor of necroptosis. To identify

171 new necroptosis inhibitors, a robust TNF-induced FADD-deficient human Jurkat necroptosis assay was used to screen a chemical library of 2800 compounds belonging to the chemical library of University Claude Bernard (Lyon, France) (Fig. 2a). The screening process was assessed using a viability test based on cell proliferation measurement (MTS). Compound 6E11 was found to block necrotic cell death with an EC50 of 4.6 μM. Although less potent than Nec-1s (EC50 of 0.1 μM), 6E11 is a novel core for structural optimization (Fig. 2b). Its inactive analogue 8A03 did not show any inhibition towards necrotic cell death. The chemical structures of these compounds are depicted on Fig. 2a. 6E11 is bioinspired as it’s a synthetic derivative of the naturally occuring 2,5-dihydroxy-2-phenylchroman-4-ones isolated from Populus nigra buds (17). The bioactivity of 6E11 was studied in the work reported here.

6E11 is selective towards death receptor-induced necroptosis. 6E11’s ability to inhibit necroptosis inhibitory efficacy was compared to Nec-1 activity in human cell lines in vitro. Necroptosis was induced by necroptotic triggers such as TNF-α in human FADD-deficient Jurkat cells resistant to extrinsic apoptosis or TRAIL+zVAD- fmk+CHX in human Jurkat T cells. In both models, 6E11 blocked necroptosis in a dose-dependent manner (Fig. 3a and 3b). This antinecroptotic activity of 6E11 was demonstrated by measurements of plasma membrane permeabilization (% of propidium iodide positive cells), intracellular ATP levels and mitochondrial transmembrane potential in living cells (DIOC6(3) measurement) (Figures 3a and 3b). However, our results suggested that 6E11’s anti-necroptotic efficacy was species- specific, as it did not protect murine cell lines (L929 or MEFs) from necroptotic stimulus (data not shown). Moreover, as Nec-1, 6E11 did not rescue Jurkat cells from apoptosis induced by TRAIL (Figure 3c). Altogether this data showed that 6E11 protects cells from necroptosis in a selective manner.

6E11 is not cytotoxic at inhibitory concentration and rescues cells from necroptosis even after necrotic stimulus induction. 6E11 has a little or no cytotoxic effect in the range of 1 to 25µM against human peripheral blood leukocytes (PBL) or human retinal pigment epithelial cells (RPE-1 hTERT) (Fig. 4a), concentrations at which it significantly suppresses necroptosis. In order to investigate 6E11 activity as a necroptosis inhibitor in a potentially relevant clinical scenario, we

172 investigated its efficacy after, rather than before, necroptosis induction. 6E11 was added at a concentration of 10 µM from 1 h to 4 h after TNF treatment in FADD- deficient Jurkat cells. When added from one to four hours following necroptosis induction, 6E11 rescues FADD-deficient Jurkat cells from 60% cell death to approximately 20% (Figure 4b).

6E11 is a highly selective inhibitor of human RIPK1 among protein kinases. To elucidate the binding mode of 6E11 and to identify its target, the selectivity of 6E11 was assessed at 10 µM against a panel of 456 kinases (mainly human) in an in vitro competition binding assay (KINOMEscan®, DiscoverX, San Diego, CA, USA). 6E11 showed an almost absolute kinase selectivity towards human RIPK1. Only Mek5 was shown to be poorly affected by 6E11 (see supplementary Table S2 for details). In these results, 6E11 competes with 99.85% of RIPK1-ligand complexes leading to prevention of kinase binding to the immobilized ligand (Supplementary Table S2 and blue circle on Fig. 5a). The dissociation constant (Kd) of 6E11 for RIPK1 was calculated with a standard dose-response curve using this competition-binding assay. 6E11 shows a high affinity for RIPK1 with a Kd of 130 nM (Fig. 5b, left and right panels). High affinity Nec-1s for RIPK1 was also confirmed with Kd equal to 26 nM (at room temperature). Similarly to Nec-1s, the binding affinity of 6E11 to RIPK1 is not drastically affected by modifying the incubation temperature from 4°C to 37°C (Fig. 5b, right panel). To monitor RIPK1 enzymatic activity in presence of 6E11, we performed an in vitro auto-phosphorylation assay using recombinant full-length RIPK1 (GST-tagged). This assay showed an inhibition of RIPK1 auto-phosphorylation by 6E11 in a dose- dependent manner (Fig. 6a). Furthermore, the catalytic activity of RIPK1 was quantified by monitoring the phosphorylation of Myelin-Basic Protein (MBP), a known substrate of RIPK1. Accordingly, 6E11 efficiently inhibited the phosphorylation of MBP in a dose-dependent manner with an IC50 equal to 1.2 µM with 20µM ATP (Fig. 6b). To further characterize the mechanism of RIPK1 inhibition by 6E11, we monitored RIPK1 activity in the presence of 6E11, with increasing concentrations of cold ATP (up to 1mM). Results obtained show that, in the presence of increasing concentrations of ATP, the inhibitory activity of 6E11 on RIPK1 auto-phosphorylation was maintained. 6E11 is thus a non-ATP competitor (Fig. 6b). Nec-1 was described as an ATP competitive compound (3). Very interestingly, 6E11 had no significant effect at 10µM

173 on RIPK3 kinase activity (Fig. 6c). Taken altogether, these data demonstrated that 6E11 is a specific inhibitor of RIPK1 kinase activity acting through a different inhibition mechanism than Nec-1.

6E11 has a putative binding site out of the ATP binding cleft of RIPK1. The predictive orientation for the bioinspired compound described here was studied by in silico analysis of the theoretical RIPK1-6E11 complex. Molecular dynamic (MD) simulation of RIPK1-6E11 model allowed us to improve the preferential binding mode identified by docking calculations which is different from Nec-1s (binding site #1 marked with a orange circle on Fig.7b). From analysis of the most frequent contacts of the compound to the kinase, we are able to propose that 6E11 should bind RIPK1 kinase through tight hydrophobic interactions and a non-specific hydrogen bond (HB), as well as other transient HB interactions observed during the simulation (site #2 marked with a blue circle on Fig.7b). Stable contact residues defining a pharmacophore and determined on the most representative structural model included six key amino acids Lys30, Val47, Leu60, Leu78, Tyr88 and Leu90 (Fig. 7a). Surrounding residues (4.0Å cut-off distance) describing the 6E11 binding pocket observed over the MD simulation trajectory also comprised of Phe28, Val31, Lys45, Thr46, Ala59, Glu63, Val81, Ile83, Ser89 and Asp156. We should note that among these amino acids, three of them (Leu78, Leu90 and Asp156) have been already described to be involved in the interaction with necrostatins (see (18) for details on RIPK1-Necrostatins complexes). Our simulations suggest that 6E11 fits tightly in an alternative and putative cleft surrounded notably by the RIPK1 catalytic triad residues: Lys45, Glu63 and Asp156. This cleft of RIPK1 is mainly hydrophobic but richer in hydrogen bond acceptors than the kinase hinge within the ATP-binding site. Interestingly, this model shows that 6E11 does not make any interaction with the kinase hinge in this conformation of RIPK1 regardless of hydrogen bonds. Moreover, this proposed binding mode for 6E11 occupying a lipophilic pocket in a cleft near the substrate binding site of RIPK1 indicates that this compound is likely a type III kinase inhibitor. This binding mode is in line with the high selectivity of 6E11 detected by the KINOMEscanSM Assay (Fig. 5a) and also with the non-ATP competitive mode of inhibition (reported on Fig. 6b).

6E11 protects human aortic endothelial cells from cold hypoxia-reoxygenation. 174

Hypoxic cold storage condition mimics the situation occurring during ex vivo graft preservation and the cold hypoxia/reoxygenation sequence mimics organ transplantation process, two situations in which necrotic cell death occurs. In order to assess the potential protective activity of 6E11 in these processes, we used human aortic endothelial cells model (HAEC) treated with the University of Wisconsin (UW) preservation solution, in the presence of increasing concentrations of 6E11, Nec-1, Nec-1s, or 8A03. The compounds were added at various steps of the hypoxia reoxygenation sequence (see supplementary Fig. S1 for a detailed view of the experiment). The treatment with compound 6E11 during cold hypoxia or during cold hypoxia and reoxygenation brought measurable benefits on cell survival. Compared to the control inhibitors of necroptosis (Nec-1 and Nec-1s), the effect of compound 6E11 was significantly better (Fig. 8a and b). No protective effect was observed when 6E11 was added only at the reoxygenation step (Fig. 8c). The structurally related compound 8A03 was shown to be inactive.

DISCUSSION

Nearly 50% of all new approved drugs are of natural origin (19), actually being either natural products or “bioinspired” (directly derived therefrom). This percentage highlights the crucial impact of studies of natural products on the discovery of new drugs. In line with this observation, the present study reports the characterization of the first highly selective bioinspired inhibitor of RIPK1. By using a cell-based screening assay to analyze a French academic chemical collection of 2800 small molecular compounds, we identified 6E11 as a new inhibitor of programmed necrosis with a M

EC50 concentration. 6E11, 2-(4-(benzyloxy)phenyl)-2,5-dihydroxy-7-methoxychroman- 4-one, is a bioinspired compound derived from the 2,5-dihydroxy-2-phenylchroman-4- ones isolated from Populus nigra buds (17). This study enlarges the chemical families of potent necroptosis inhibitors. 6E11 was shown to inhibit TNF-α or TRAIL-induced necroptosis in human Jurkat cells but not TRAIL-induced apoptosis. In both models, 6E11 inhibited hallmarks of necroptosis in a dose-dependent manner, notably the plasma membrane permeabilization and the decrease of intracellular ATP levels. In order to study the mechanism of action of 6E11, a KINOMEscan® was performed and showed that RIPK1 was specifically affected by the selected chemical compound with

175 a low nM Kd (130nM at room temperature). Mek5 was the only other kinase weakly affected among the large set tested (456 kinases, wild type and mutants). In line with this result, we showed that RIPK3 kinase activity is not inhibited by 6E11 and that the inhibition of RIPK1 is not affected by high concentrations of ATP (up to 1mM). Based on its high selectivity, on the non-ATP competitive mechanism of inhibition, we hypothesized that 6E11 targets a pocket outside the ATP-binding cleft. The high sequence similarity in the ATP-binding site among members of the kinase families, a pocket targeted by the vast majority of kinase inhibitors discovered to date, often results in low selectivity and additional toxicities, and suffer from competition with high intracellular ATP concentrations. In order to predict a putative binding mode of 6E11 to the RIPK1 kinase domain we performed molecular simulations. The result obtained is shown of Fig. 7. In this model, 6E11 occupies a lipophilic pocket in the “back” cleft of RIPK1 and thus can be classified as type III kinase inhibitor (referred to as allosteric inhibitors) in a distinct site from Nec-1s. It interacts with the three catalytic amino acids, L45, Glu 63 and Asp 156, in proximity to the triphosphate and substrate binding site. In contrast to Nec-1s, 6E11 does not compete with intracellular ATP (typically in the low-millimolar range) to negatively modulate RIPK1 activity. Interestingly, Degterev and Linkermann (20) report in vivo studies showing that selective inhibition of RIPK1 should not be considered as the sole parameter in tackling deleterious effects of renal ischemia–reperfusion injury: Nec-1 is active whereas the more RIPK1-selective Nec- 1s is not. In this study, we show that 6E11 has a stronger protective effect against cell death induced by cold hypoxia/ reoxygenation in human aortic endothelial (HAEC) cells than both Nec-1 and Nec-1s (Fig. 8). Ren et al. (15) used a cell-based screen on a collection of 200,000 compounds in order to identify another chemical scaffold of type III inhibitors, RIPA-56 (N-benzyl-N-hydroxy-2,2-dimethylbutanamide), exhibiting an absolute selectivity for RIPK1. Harris et al. (13) have characterized Benzo[b][1,4]- oxazepin-4-ones as type III mono-kinase selective RIPK1 inhibitors from a GSK’s property collection of DNA-encoded small-molecule libraries. It will be very informative to test other type III inhibitors in the cold hypoxia/ reoxygenation assay described here (Fig. S1). The concept of necroinflammation has recently emerged in IRI. Necroinflammation can be initiated by a few necrotic cells that activate the innate immune system, which subsequently leads to necrosis of more cells triggering more inflammation in a process leading to organ failure. In this context, pharmacologic inhibition of regulated necrosis, if directly associated with inflammation, might

176 functionally be considered as an anti-inflammatory drug.

There are great clinical and basic research needs to characterize selective, high- affinity, small-chemical inhibitors of programmed necrosis-related kinases, including RIPK1. 6E11 is one of such compounds useful for pathway elucidation and target validation in addition to drug discovery. This new scaffold of RIPK1 inhibitor has now to be chemically improved in order to study its potential use in clinic for improving the solid organ preservation and transplantation in conditions of static or dynamic cold ischemia. As mentioned on Fig. 1, necroptosis is implicated in a large spectrum of human disorders. Thus the bioactivity of such drug-like compound could also be investigated in other clinical use, such as psoriasis and ulcerative colitis. Our main objective is to increase the use of organs previously considered as marginal (e.g. from expanded criteria donors) in the context of the current organ shortage crisis.

METHODS

Cell cultures. Jurkat wild-type A3, FADD-deficient Jurkat I 2.1 and RPE-1 hTERT human cell lines were obtained from ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). Jurkat wild type, FADD-deficient Jurkat cells were cultured in RPMI containing Glutamax (Invitrogen) supplemented with 15 % FCS. RPE-1 hTERT cells were cultured in DMEM-F12 containing Glutamax (Invitrogen) supplemented with 10 % FCS. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by Ficoll gradient centrifugation from blood buffy coats of healthy donors, provided by the Etablissement Français du Sang (EFS). The research protocol was conducted under French legal guidelines. After separation of monocytes by 1 h adhesion step, non- adherent PBMCs (PBLs) were harvested. PBLs were cultured in RPMI 1640 medium (Gibco, Life technologies, Carlsbad, CA, USA) supplemented with 10% decomplemented fetal calf serum (Life technologies), penicillin (100 IU/ml), and streptomycin (100 µg/ml). All cells were cultured under a 5 % CO2 atmosphere at 37 °C.

Reagents. Recombinant human Flag-tagged TRAIL (TRAIL-Flag) and z-VAD-fmk were obtained from Enzo Life Sciences (Villeurbanne, FR). Necrostatin-1 (Nec-1) and necrostatin-1s (Nec-1s) were from Calbiochem (VWR International, Fontenay-

177 sous-Bois, FR). Anti-Flag M2 IgG1 antibody, cycloheximide (CHX), propidium iodide, were obtained from Sigma-Aldrich (St Quentin-Fallavier, FR). TNFα were obtained from Invitrogen. This TNF was used in the screen of new necroptosis inhibitors. The chemical synthesis of 6E11 compound is described in Hauteville et al. (21).

Cell-based screening assay for characterization of necroptosis inhibitors. The cell-based assay used in this study has been previously described by Miao and Degterev (5). Briefly, necroptosis was induced in Jurkat FADD-deficient I 2.1 cell line by addition of 10 ng/ml of human recombinant TNF-α (Invitrogen). Necrostatin-1s (Nec-1s, 7-Cl-O-Nec-1, Calbiochem) was used as positive necroptosis inhibitor. Chemical compounds collection plates were formatted at 10 mM in 100% DMSO in 96-well plates. For each collection plate, two 96-well clear, flat bottom plates (CytoOne, Starlab) were seeded (at 20 000 cells/well) before treatment. One plate was treated with the tested compounds and TNF-α and the other plate was only treated with the tested compounds. Final concentration of each chemical compound was 10 μM at 0,1% DMSO. Cells were incubated at 37°C, 5% CO2 for 24 h before performing MTS viability assay according to the manufacturer's instructions (CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega, Fitchburg, WI, USA). Compounds dilution and distribution in the plates were performed using the Nimbus Microlab liquid handler (Hamilton Robotics, Bonaduz, Switzerland) under microbiological safety workbench.

Cell death assays. Cell viability was assessed by MTS assay, described here before. Cells were seeded at a density of 2.5x105 per well for human peripheral blood lymphocytes (PBL) or 8x103 cells per well for human RPE-1 hTERT cells in 96-well plates and then treated for 24 h. After the treatment, 20 μl of assay solution was added per well for 3 h incubation at 37°C. The absorbance was determined by a microplate reader (SPECTROstar Nano, BMG Labtech) at 490 nm and 630 nm. The percentage of viability were determined by subtracting the background reading (after 2 h incubation with blank medium) from the absorbance. Results were expressed through the following formula: % viability = mean (OD490 - OD630) sample/mean

(OD490 - OD630) control x 100. Flow cytometry analyses were performed to detect necrotic cells using propidium iodide staining (500 ng/ml) from treated cell lines

178 seeded at a density of 2.5x105 cells/well in 24-well plate.

Cell treatments. Necroptosis was induced by TNF or TRAIL treatment in different cellular models. FADD-deficient cells were stimulated with 10ng/ml human TNF. z- VAD-fmk (30 µM) and cycloheximide (1µg/ml) pretreatment was performed for 30 min with Jurkat cells before a 18h treatment with TRAIL-Flag (200 ng/ml) and 2 µg /ml M2 anti-Flag antibody. Apoptosis was induced in wild-type Jurkat cells by TRAIL-Flag (20 ng/ml) and 2 µg/ml M2 anti-Flag antibody for 18 h. Then the percentage of propidium iodide positive cells was measured by flow cytometry analysis of fluorescence (FL-2) (FACScalibur, Becton Dickinson, Le Pont de Claix, FR) and expressed as %/NT.

Cellular ATP concentration measurement. FADD-deficient Jurkat cells were seeded for 24 h at a density of 2.104 cells/well in white 96-well plate and then treated with human TNF (10 ng/ml). ATP concentration was measured using CellTiter-Glo® Luminescent Cell viability assay kit (Promega) according to the manufacturer’s instruction. ATP concentration was expressed as %/NT ± SD.

RIPK1 and RIPK3 kinase assays. Human RIPK1 full length GST-tagged was purchased from SignalChem (Richmond, CA, USA). The protocol used to detect the enzymatic activity was adapted from Degterev et al. (3). RIPK1 autophosphorylation was assessed by mixing 5 l of RIPK1, 5 l of 3X kinase reaction buffer (5 mM MOPS pH 7.2, 2.5 mM -glycerophosphate, 4 mM MgCl2, 2.5 mM MnCl2, 1 mM EGTA, 0.4 mM EDTA, 50 μg/ml BSA, 0.05 mM DTT), 2 l H2O and 3 l of the tested molecule. This “RIPK1 reaction mix” was incubated on ice for 10 minutes. During this time, the

ATP solution was prepared by mixing 5 l of 3X kinase reaction buffer, 4 l H2O, 6 l cold ATP at 150 M and 2 Ci of -32P ATP. This ATP solution and the RIPK1 reaction mix were then mixed and incubate for 30 minutes at 30 °C. 25 l of each reaction were loaded in pre-cast NuPage 12% Bis-Tris gel (Thermo Fisher Scientific) and analyzed by SDS-PAGE. Autophosphorylated RIPK1 band was visualized by analysis in a Typhoon Phosphorimager (GE Healthcare Life Sciences, Velizy- Villacoublay, France). Alternatively, the kinase activity of RIPK1 can be detected using the “gold standard” P81 phosphocellulose assay. Briefly, 2 µl of kinase was assayed in buffer described above with 0.1 µg/µl of myelin basic protein (MBP, Sigma,

179

#M1891) as substrate and in the presence of 15µM [-33P] ATP (3,000 Ci/mmol; 10 mCi/ml). Maximal kinase activity was assessed with appropriate dilutions of DMSO. After extensive washes with a 1% solution of phosphoric acid using a FilterMate Harvester (PerkinElmer, Waltham, MA, USA), the wet filters were counted in the presence of 20µl ACS (GE Healthcare) scintillation fluid using a TopCount® Scintillation and Luminescence Counter (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). The kinase activity of RIPK3 (human, recombinant, expressed by baculovirus in Sf9 insect cells) was detected with 0.1 µg/µl of MBP as substrate following the assay described above.

Kinase binding assays. Competition binding assays were performed by DiscoverX (Freemont, CA, USA). Details about these assays can be found in Fabian et al. (22) and Karaman et al. (23) and on the Discoverx website [http://www.discoverx.com/services/drug-discovery-development-services/kinase- profiling/kinomescan]. In this study, binding assays were used for (i) the analysis of selectivity against a large panel of kinases (service “KINOMEscan®”) and for (ii) the determination of binding constant (Kd) of small chemical compound for RIPK1 (service “KdELECT”).

Mitochondrial transmembrane potential (MTP) assay. Mitochondrial transmembrane potential (MTP) was measured using 3,3’-dihexyloxacarbocyanine iodide, DiOC6(3), and flow cytometry analysis. Human FADD-deficient Jurkat cells were incubated with 6E11 at various concentrations and TNF (10ng/ml) for 18 h. Then treated cells were incubated with DiOC6(3) at 50 nM (the final concentration) for 20 min and investigated for the reduction of MTP by using flow cytometry.

Molecular docking. According to our previous work relative to RIPK1 ligands [Le Cann et al., in revision], we used a RIP1 kinase homology model including its activation loop to perform docking simulations in the aim to explore the association modes of 6E11 compound to RIPK1. Docking calculations were performed by using VINA standard protocol (YASARA, global docking, 1000 runs theoretical complexes computed). Clustering was achieved through Jarvis-Patrick method as implemented in the Gromacs suite. The best pose of the ligand towards the receptor (energy 180 criteria) was submitted to a 60ns molecular dynamics (MD) simulation in water to improve the model of 6E11-RIPK1 complex. As the ligand was stable during the MD trajectory, the final model was selected as the energy minimized most representative structure of the simulation (molecular frame at t=37.570ns). 6E11-contacting residues were defined as surrounding amino acids given a 3.0Å cut-off distance and pharmacophores were derived from a standard analysis by using the Ligand Scout program.

In vitro “cold hypoxia/reoxygenation” assays. Human aortic endothelial cells (HAEC; Gibco, Waltham, MA, USA) were grown to 80% confluence, and then synchronized using FBS depleted media for 16h. For hypothermia/hypoxia, cells were washed twice with PBS then incubated in University of Wisconsin (UW) solution in 95%N2 / 5%CO2 atmosphere at 4°C for 24 hours. Increased concentrations of 6E11, 8A03, Nec-1 and Nec-1s were added in cell medium at various steps: hypoxia; hypoxia and reoxygenation; and only during reoxygenation. Controls are cells not subjected to this protocol and are continuously oxygenated for the same time in PBS supplemented with 2% of FBS. Cell viability was evaluated by XTT test (Sigma- Aldrich, St Quentin-Fallavier, FR).

Statistical analyses. Data from a minimum of three independent experiments were expressed as means ± SD or ± SEM. Statistical analyses were done by ANOVA, Tukey's Multiple Comparison Test and Student’s t-test for two groups of data, and significance levels used are *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001 by using GraphPad Prism6 software (GraphPad Software, San Diego, CA).

ACKNOWLEDGMENTS Dr. Sandrine Ruchaud is warmly acknowledged for her continuing support and critical reading of the manuscript. We would like to thank Béatrice Foll-Josselin for cell culture. The authors also thank the Cancéropôle Grand-Ouest (axis: Nature sea products in cancer treatment), GIS IBiSA (Infrastructures en Biologie Santé et Agronomie, France) and Biogenouest (Western France life science and environment core facilty network) for supporting KISSf screening facility (Roscoff, France). Stéphane Bach and Marie-Thérèse Dimanche-Boitrel were supported by INCa (“NECROTRAIL” Program). MT Dimanche-Boitrel’s group was also supported by

181 grants from Conseil Régional de Bretagne (ID2 Santé), and the Ligue Contre le Cancer (committees Ille et Vilaine and Maine et Loire). F Faurez was supported by INCa (post-doctoral fellow). MC Bonnet was supported by the European University of Brittany (Excellence Research Chair). Research in the group of Prof. P. Vandenabeele is supported by grants from the Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB), from Ghent University (MRP, GROUP-ID consortium), grants from the 'Foundation against Cancer' (2012-188 and FAF-F/2016/865), grants from the Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) (FWO G.0875.11, FWO G.0A45.12N, FWO G.0787.13N, FWO G.0C37.14N, FWO G.0E04.16N), grants from the Flemish Government (Methusalem BOF09/01M00709 and BOF16/MET_V/007), a grant from the Belgian science policy office (BELSPO)(IAP 7/32). This work is part of shared PhD ship between the Universities of Rennes 1 and Ghent (Belgium). AUTHOR CONTRIBUTIONS CD designed, performed the cell-based screening of the chemical library, analyzed in vitro data and set-up protein kinase production and phosphorylation. FLC designed, performed and analyzed in vitro data. SPL designed, performed and analyzed in vitro data. AC and MH synthesized the compounds and characterized them by RMN and mass spectrometry. MJF performed in vitro “cold hypoxia/reoxygenation” assays. OD conducted in silico molecular modeling and docking analyses. ND was in charge of cell culture and autophosphorylation assay. BB was in charge of protein kinase purification and phosphorylation assays. IG performed and analyzed in vitro data. FF performed and analyzed in vitro data. MCB performed and analyzed in vitro data. PG analyzed results of chemical synthesis and revised the manuscript. RT designed and analyzed results of in vitro “cold hypoxia/reoxygenation” assays. FF designed and performed in vitro “cold hypoxia/reoxygenation” assays, analyzed results and revised the manuscript. PV revised the manuscript. TH analyzed results of in vitro “cold hypoxia/reoxygenation” assays and revised the manuscript. MTDB and SB participated in the study, design and coordination. All the authors read and approved the final manuscript submitted for publication.

COMPETING FINANCIAL INTERESTS STATEMENT The authors declare no conflict of interest.

182

REFERENCES

1. Conrad, M. , Angeli, J. P. F., Vandenabeele, P. & Stockwell B. R. Regulated necrosis: disease relevance and therapeutic opportunities. Nat. Rev. Drug Discov. 15, 348–366 (2016).

2. Degterev, A. et al. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nat. Chem. Biol. 1, 112-119 (2005).

3. Degterev, A. et al. Identification of RIP1 kinase as a specific cellular target of necrostatins. Nat. Chem. Biol. 4, 313–321 (2008).

4. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H. & Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15-, 135–147 (2014).

5. Miao, B. & Degterev, A. Methods to analyze cellular necroptosis. Methods Mol. Biol. 559, 79–93 (2009).

6. Jouan-Lanhouet, S. et al. Necroptosis, in vivo detection in experimental disease models. Semin. Cell Dev. Biol. 35, 2–13 (2014).

7. Vanden Berghe, T., Hassannia, B. & Vandenabeele, P. An outline of necrosome triggers. Cell. Mol. Life Sci. 73, 2137–2152 (2016).

8. Strilic, B. et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536, 215–218 (2016).

9. Teng, X. et al. Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15, 5039–5044 (2005).

10. Harris, P. A. et al. Discovery of Small Molecule RIP1 Kinase Inhibitors for the Treatment of Pathologies Associated with Necroptosis. ACS Med. Chem. Lett. 4, 1238–1243 (2013).

11. Najjar, M.et al. Structure Guided Design of Potent and Selective Ponatinib-Based Hybrid Inhibitors for RIPK1. Cell Rep. 10, 1850–1860 (2015).

12. Fauster, A. et al. A cellular screen identifies ponatinib and pazopanib as inhibitors of necroptosis. Cell Death Dis. 6, e1767; 10.1038/cddis.2015.130 (2015).

13. Harris, P. A.et al. DNA-Encoded Library Screening Identifies Benzo[b][1,4]oxazepin-4- ones as Highly Potent and Monoselective Receptor Interacting Protein 1 Kinase Inhibitors. J. Med. Chem. 59, 2163–2178 (2016).

14. Berger, S. B.et al. Characterization of GSK′963: a structurally distinct, potent and selective inhibitor of RIP1 kinase. Cell Death Discov. 1, 15009; 10.1038/cddiscovery.2015.9 (2015).

15. Ren, Y.et al. Discovery of a Highly Potent, Selective, and Metabolically Stable Inhibitor of Receptor-Interacting Protein 1 (RIP1) for the Treatment of Systemic Inflammatory Response Syndrome. J. Med. Chem. 60, 972–986 (2017).

16. Harris, P. A. et al. Discovery of a First-in-Class Receptor Interacting Protein 1 (RIP1) Kinase Specific Clinical Candidate (GSK2982772) for the Treatment of Inflammatory

183

Diseases. J. Med. Chem. 60, 1247-1261 (2017).

17. Chadenson, M., Hauteville, M. & Chopin, J. Synthesis of 2,5-dihydroxy-7- methoxyflavanone, cyclic structure of the benzoyl-(2,6-dihydroxy-4-methoxybenzoyl)- methane from Populus nigra buds. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 107b–108 (1972).

18. Xie, T. et al. Structural Basis of RIP1 Inhibition by Necrostatins. Structure. 21, 493–499 (2013).

19. Newman, D. J. & Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. J. Nat. Prod. 79, 629–661 (2016).

20. Degterev, A. & Linkermann, A. Generation of small molecules to interfere with regulated necrosis. Cell. Mol. Life Sci. 73, 2251–2267 (2016).

21. Hauteville, M., Chopin, J., Geiger, H. & Schuler, L. Protogenkwanin, a new flavonoid from equisetum arvense L. Tetrahedron. 37, 377-381 (1981).

22. Fabian, M. A. et al. A small molecule-kinase interaction map for clinical kinase inhibitors. Nat. Biotechnol. 23, 329–336 (2005).

23. Karaman, M. W. et al. A quantitative analysis of kinase inhibitor selectivity. Nat. Biotechnol. 26, 127–132 (2008).

184

FIGURE LEGENDS

Figure 1. Impact of RIPK1-dependent necroptosis in human diseases. See Table S1 for the comprehensive list of the references.

Figure 2. Characterization of hit compound 6E11 as new necroptosis inhibitor. (a) Cell-based high-throughput screening of ICBMS chemical library. The chemical structures of the best hit (6E11) and its negative control (8A03) are depicted above the workflow. (b) Protection of 6E11 against TNF-α-induced Jurkat FADD deficient cell necroptosis. Among 2800 compounds, a new compound, 6E11, was selected as an inhibitor of TNF-induced necroptosis in human FADD-deficient Jurkat T cells.

Figure 3. 6E11 inhibits death receptor-induced necroptosis, but not apoptosis. (a) Human FADD-deficient Jurkat T cells were treated or not with TNF (10 ng/ml) in presence or not of increased concentrations of 6E11 (0, 1, 5, 10 µM) or Nec-1 (0, 1, 5, 10 µM) for 18 hours. Intracellular ATP levels (upper left panel) were measured with the CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (n=3, mean±SEM, *P<0.05)

(EC50 ~6µM). The percentage of cell death was determined by propidium iodide staining using flow cytometry (upper right panel) (n=3, mean±SEM, **P<0.01 and ***P<0.001). Human FADD-deficient Jurkat T cells were treated or not with TNF (10 ng/ml) in presence or not of increased concentrations of 6E11 (0, 5, 10, 20 µM) for 18 hours. The mitochondrial transmembrane potential (MTP) was measured using the fluorescent dye DiOC6(3) and flow cytometry analysis (lower panel). (b) 6E11 inhibits TRAIL-induced necroptosis. Wild-type Jurkat T cells were treated or not with TRAIL (10ng/ml), Z-VAD (30µM) and CHX (1µg/ml) for 18 hours in presence or not of increased concentrations of 6E11 (0, 5, 10, 20 µM) or 10 µM Nec-1. The percentage of cell death was determined by propidium iodide staining using flow cytometry (left panel) (n=3, mean±SEM, **P<0.01); 6E11 does not inhibit TRAIL-induced apoptosis. Wild-type Jurkat T cells were treated or not with TRAIL (20ng/ml) for 18 hours in presence or not of increased concentrations of 6E11 (0, 5, 10, 20 µM) or Nec-1 (0, 5, 10, 20 µM). The percentage of cell death was determined by propidium iodide staining using flow cytometry (right panel) (n=3, mean±SEM).

185

Figure 4. 6E11 is not cytotoxic at inhibitory concentration and protects from necroptosis even after cell death initiation. (a) 24 hours after treatment with increased concentrations of 6E11, cell viability was measured with a MTS assay to determine the toxicity of the compound towards either human primary blood leukocytes (hPBLs) (upper panel) (n=6 individuals, mean±SEM) or human retina pigmented epithelium cells (RPE-1 hTERT) (lower panel) (n=3, mean±SEM). (b) Viability was measured with a MTS assay in FADD-def Jurkat cells treated with TNF- (10 ng/ml) followed by 10 µM 6E11 addition 1 to 4 h post necroptosis initiation (n=4, mean±SEM, *P<0,05 ; ** P<0,01).

Figure 5. 6E11 is a highly selective inhibitor of human kinase RIPK1. (a) Selectivity of 6E11 was assessed biochemically against a panel of 456 purified kinases (KINOMEscanSM Assay) at 10 µM and the compound was found to be highly selective for RIPK1. Only 0.15 % of the initial amount of RIPK1 is still on the affinity matrix after competition with 6E11 (the full list of results is reported in Supplementary Table S1). S-Score (35) = (number of non-mutant kinases with %Ctrl <35)/(number of non-mutant kinases tested). (b) Measure of the binding constant for RIPK1/6E11 and RIPK1/Nec-1s interactions. An 11-point 3-fold serial dilution of 6E11 and Nec-1s were prepared in 100 % DMSO in order to determine the binding constant (Kd). Kds are calculated at three various temperatures by measuring the amount of kinase captured on the solid support as a function of the test compound concentration (n=2, mean±SEM).

Figure 6. 6E11 inhibits the enzymatic activity of RIPK1 with a non-ATP competitive mode of action. (a) RIPK1 was treated with 5, 10 or 50 µM of 6E11 to analyze the effect on the kinase autophosphorylation. Radioactive autophosphorylation assays were processed with ATP-32P at 30 µM final concentration. Necrostatin-1 (Nec-1) was used as an internal control. Coomassie staining was performed in order to estimate the total amount of protein loaded on polyacrylamide gel. Autophosphorylated RIPK1 band was visualized on radiographic film. % of RIPK1 activity inhibition are calculated through a ratio with DMSO, as a 0 percent reference. (b) ATP competition assay shows that inhibition of RIP1-kinase activity by 6E11 is not affected by ATP concentration. On the left panel, 0.25 or 1 mM of cold ATP were used to study the competition with 6E11. These assays are similar 186 to those described in (a). % of RIPK1 activity inhibition are calculated through a ratio with DMSO (-), as a 0 percent reference. The RIPK1 catalytic activity can also be tested using myelin basic protein, MBP, as a substrate (right panel). GST-RIPK1 full length produced by baculovirus in Sf9 insect cells was assayed in the presence of increasing concentrations of 6E11 with Kinase activities are expressed in % of maximal activity, i.e. measured in the absence of inhibitor. The IC50 values obtained at various ATP concentration are reported in the table (n=3, mean±SD). (c) 6E11 is inactive on RIPK3 activity. GST-RIPK3 full length produced by baculovirus in Sf9 insect cells was assayed in the presence of 10µM of inhibitor with with ATP 33-P and myelin basic protein, MBP, as a substrate. Kinase activities are expressed in % of maximal activity, i.e. measured in the presence of DMSO (as a 100 % reference).

Figure 7: Molecular model of the RIPK1-6E11 complex. (a) Close-up view of the putative interaction between 6E11 and surrounding residues in RIPK1 extracted from the best pose of docking simulation improved by 60ns molecular dynamic trajectory (key-residues are shown in italic and bold). (b) Overall structure of RIPK1 showing the putative binding site of 6E11 highlighted in blue dashed circle (site #2). The binding site (site #1) of Nec-1s (determined from the X-ray structure 4ITH) is marked with a orange dashed circle on the same panel and the relative positions and orientations of each 6E11 and Nec-1s compounds are shown in a close-up view on the panel (c). On panel (a) residues common to sites #1 and #2 are in red.

Figure 8: 6E11 protects human aortic endothelial cells (HAEC) from cold hypoxia reoxygenation injury when treatment occurs during cold hypoxia step (a), during both cold hypoxia and reoxygenation steps (b), but not when treatment occurs during the reoxygenation step (c). Increased concentrations (1, 3.33, 10, 33.3 µM) of 6E11, Nec-1, Nec-1s or 8A03 were added to the UW preservation solution during hypoxia or/and in PBS – 2% FBS during reoxygenation. UW corresponds to cells treated with UW preservation solution. Controls are cells not subjected to this protocol and continuously oxygenated. DMSO are cells treated with drug vehicle. The ratio of cell viability evaluated by XTT test, is calculated in comparison to the untreated control (100% of cell viability). Data shown are mean ± SD, n=3; ANOVA and Tukey's Multiple Comparison Test; * p<0.05 vs UW. See supplementary files (Figure S1) for a schematic representation of the protocol.

187

188

SUPPLEMENTARY MATERIAL

Table S1: List of selected articles reporting a link between necroptosis and human diseases (referred to Fig. 1).

Figure S1: Schematic views of the protocols performed to detect the impact of RIPK1 inhibitors on the protection of human aortic endothelial cells (HAEC) subjected to hypoxia reoxygenation injury, when treatment is performed during cold hypoxia step (a), during cold hypoxia and reoxygenation steps (b) and during the reoxygenation step (c).

Table S2. Matrix of screen for the selectivity profiling of 6E11 (related to Fig. 5a). The table reports the full list of the 456 kinases used in the selectivity profiling of 6E11. 6E11 was assayed at 10 μM and results are reported as “% Ctrl”, where lower numbers indicate stronger hits in the panel of kinases tested. %Ctrl calculation: (test compound signal - positive control signal)/(negative control signal - positive control signal) x 100. Test compound = 6E11; negative control = DMSO (100%Ctrl); positive control = control compound (0%Ctrl).

189

Figure 1

190

Screening of non-commercial chemical library ICBMS (2,800 molecules)

Primary screening TNF--induced Selection of hits JURKAT FADD-def cell necroptosis (molecule that inhibits the TNF- induced cell- (compounds tested at 10µM) death: >80% of cell viability)

Study of the mechanism of action Validation of hits Effect on necroptosis-related target (dose-dependent effect) (here RIPK1)

Study of the toxicity Study of the in vitro effect on a disease- on normal cells related phenotype (here hypoxia-induced cell-death)

6E11 (hit) 8A03 (negative control)

b 6E11, EC50= 4,6 µM Nec-1s, EC50= 0.1 µM

6E11 + TNF-α 8A03 + TNF- 120 120 α 120 Nec-1s + TNF-α 6E11 w/o TNF-α 8A03 w/o TNF-α Nec-1s w/o TNF-α 100 100 100

80 80 80

60 60 60

40 40 40 % Cell Viability % Cell Viability % Cell Viability 20 20 20

0 0 0 0.001 0.01 0.1 1 10 100 0.001 0.01 0.1 1 10 100 0.001 0.01 0.1 1 10 100 6E11 [µM] 8A03 [µM] Nec-1s [µM]

Figure 2

191

192

hPBLs a

100

50 % Cell viability

0 110100 6E11 [µM]

RPE-1 hTERT

100

50 % Cell Viability

0 0.01 0.1 1 10 100 6E11 [µM]

b Jurkat FADD -/- TNF- 140 120 100 * * * * 80 60 * * 40 % Cellviability 20 0 - 1234 - 1234 hour s post treatment 6E11 6E11

Figure 4

193 a 6E11 (456 Assays Tested) / 2 Interactions Mapped S-Score(35)=0.01

Kd for 6E11 at RT 1×10-7 (qPCR signal) (qPCR

5×10-8

Amount of RIPK1 RIPK1 of Amount 0 0.0001 0.01 1 100 10000 1.0×106 6E11 [µM]

Figure 5

194

6E11 a

Phosphorylated RIPK1

Inhibition (%) 57 83 96 54

97 kDa GST-RIPK1 Coomassie staining b

160 µM ATP 125 ATP mM 0.03 0.25 1 80 µM ATP 100 40 µM ATP 10µM 6E11 - + - + - + (%) 20 µM ATP Phosphorylated 75 10 µM ATP 5 µM ATP RIPK1 50

Inhibition 25 (%) 60 80 78 RIPK1 activity 97 kDa 0 GST-RIPK1 0.01 0.1 1 10 100 Coomassie staining 6E11 [µM]

Figure 6

195

Figure 7

196

6E11 Nec-1 Nec-1s 1,2 * 1,2

1,0 Control * 1,0 8A03 0,8 0,8 * Cell viability (ratio) (ratio) Cell viability Cell viability (ratio) Cell viability 0,6 0,6

0,4 DMSO

0,4 UW 0,2

0,2 0,0 DMSO Contrôle UW 8A0333.3 (33,3) 8A03 10 (10) 8A03 3.33 (3,33) 8A03 (1)1 (µM) 0,0 ) ) ) ) ) ) ) ) W 3 3 1 .3 3 (1) 3 3 1 U 3, (10) ,3 3 .3 3. .3 trôle 3 3 1 ( 3 3 3 (10) 3 n ( ( 1 ( ( ( DMSO 1 1 1 ec1 s 1s s Co 1 6E c c1 ( N 1 c 1 E 6E11 Nec1 (10) c Nec1s ( 6 6E1 Ne

Ne Ne Nec Ne b

6E11 Nec-1 Nec-1s

1,2 1,2 1,0 1,0 Control * 8A03 0,8 0,8 Cell viability (ratio) Cell viability Cell viability (ratio) (ratio) Cell viability 0,6 * 0,6

* 0,4 DMSO 0,4 UW * 0,2 * * * 0,2 0,0 DMSO Contrôle UW 33.38A03 8A03 10 (10) 3.338A03 8A03 1 (1 ) (33,3) (3,33) (µM) 0,0 ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) O le W ,3 0 3 (1 .3 0 3 (1 .3 0 3 (1 S ô U 3 1 ,3 3 1 .3 3 1 .3 M tr 3 ( 3 1 3 ( 3 1 3 ( 3 s n ( 1 ( 1 ( 1 ( c ( s ( 1 D o 1 1 1 E 1 c 1 e s 1 s c 1 E 1 6 c e c N 1 c 1 e C E 6 E e N e c e c N 6 6 N N e N e N N

c 6E11 Nec-1 Nec-1s

1,2 1,2 1,0 1,0 Control 8A03 0,8 0,8 Cell viability (ratio) (ratio) Cell viability 0,6 (ratio) Cell viability 0,6

0,4 DMSO

0,4 UW

0,2 * * * * 0,2 * 0,0 * * DMSO Contrôle UW 8A0333.3 (33,3) 8A0310 (10) 8A033.33 (3,33) 8A03 1 (1) S 0,0 (µM)

e ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) O l W ,3 0 3 (1 .3 0 3 (1 .3 0 3 (1 S ô U 3 (1 ,3 3 (1 .3 3 (1 .3 M tr 3 3 1 3 3 1 3 3 s n ( 1 ( 1 ( 1 ( c ( s ( 1 D o 1 1 1 E 1 c 1 e s 1 s c C 1 E 1 6 c e c N 1 c 1 e E 6 E e N e c e c N 6 6 N N e N e N N

Figure 8

197

Table S1 198

a Treatment with the tested compound

Serum deprivation Storage for 24h at 4°C PBS with 2% of FBS during M200 2% FBS under hypoxia in UW 6 h at 37°C 16h at 37 °C Hypoxia/ O reoxygenation O2 2

Serum deprivation PBS with 2 % of FBS PBS with 2% of FBS during M200 2% FBS during 24h at 37°c 6 h at 37°C 16h at 37 °C

Control O2 O2

b Treatment with the tested compound Serum deprivation PBS with 2% of FBS during M200 2% FBS Storage for 24h at 4°C 6 h at 37°C 16h at 37 °C under hypoxia in UW Hypoxia/ O reoxygenation O2 2

Serum deprivation PBS with 2 % of FBS PBS with 2% of FBS during M200 2% FBS during 24h at 37°c 6 h at 37°C 16h at 37 °C

Control O2 O2

c Treatment with the tested compound Serum deprivation Storage for 24h at 4°C PBS with 2% of FBS during M200 2% FBS under hypoxia in UW 6 h at 37°C 16h at 37 °C Hypoxia/ O reoxygenation O2 2

Serum deprivation PBS with 2 % of FBS PBS with 2% of FBS during M200 2% FBS during 24h at 37°c 6 h at 37°C 16h at 37 °C

Control O2 O2

Figure S1

199

200

IV. DISCUSSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES

201

202

Discussion générale et perspectives

Les études récentes montrent que la mort cellulaire dans un contexte inflammatoire n’est pas seulement la manifestation d’un dommage tissulaire, elle est nécessaire pour l’élimination des pathogènes et la régulation de l’inflammation (Wallach et al. 2014). Le maintien de l’homéostasie tissulaire et la régénération des tissus altérés est un enjeu crucial dans le cas de pathologies inflammatoires ou dégénératives. La découverte de la nécroptose comme voie de mort contrôlée par des voies de signalisation bien définies, tout comme l’apoptose, a suscité un engouement pour ce type de mort cellulaire dans un contexte développemental, de maintien de l’homéostasie tissulaire ou inflammatoire. L’objectif actuel est de mieux comprendre sa régulation dans la préservation de l’homéostasie d’un organisme et sa contribution à de nombreuses pathologies inflammatoires ou dégénératives récemment identifiées afin de développer des thérapies efficaces. L’utilisation de modèles murins expérimentaux et de molécules pharmacologiques ciblant la nécroptose a montré l’importance de RIPK1, RIPK3 et MLKL dans l’établissement ou l’aggravation des pathologies ciblées telles que l’ischémie-reperfusion rénale, l’infarctus du myocarde, le SIRS induit par une forte dose de TNF (Newton et al., 2016a) ou les hépatites sévères (Wang et al. 2014a ; Gautheron et al. 2014 ; Afonso et al. 2015 ; Günther et al. 2016). Ces données mettent en évidence l’intérêt thérapeutique de ces cibles moléculaires. D’où l’exploration croissante de l’expression ou de l’activation de RIPK1, RIPK3 et MLKL dans les biopsies de patients atteints de pathologies dues à une mort cellulaire ou inflammation massive. La mise à disposition de nouveaux anticorps phospho-spécifiques, d’inhibiteurs pharmacologiques ou naturels et de modèles génétiques devrait permettre une avancée dans la compréhension de la contribution de la nécroptose à la liste grandissante de pathologies dégénératives, inflammatoires ou infectieuses (Jouan-Lanhouet et al. 2014; Vanden Berghe et al. 2016; Conrad et al. 2016). Dans ce contexte, nous nous sommes attachés à l’identification de nouveaux inhibiteurs de la nécroptose. Dans ce but, nous avons réalisé le criblage de deux chimiothèques non commerciales de petits composés : la ReCC (Roscoff essential Chemical Collection) et la chimiothèque de l’Université de Claude Bernard Lyon 1) dans un modèle de nécroptose induite par le TNF- dans la lignée cellulaire Jurkat déficiente en FADD. A l’issue de ce criblage, nous avons caractérisé les effets biologiques de deux nouvelles molécules inhibitrices de cette mort nécroptotique dans des tests in vitro et in vivo. Nous avons montré que deux petites molécules : Sibiriline (issue du criblage de la ReCC) et 6E11 (issue du criblage de la chimiothèque de l’Université de Lyon 1) bloquent la nécroptose induite par le TNF-α, FasL ou TRAIL dans différents modèles cellulaires murins ou humains tout comme la Nec-1 ou la Nec-1s (inhibiteurs référents de la nécroptose). Nous avons aussi mis en évidence que la Sibiriline cible la kinase RIPK1 ainsi que d’autres kinases : JAK2, PDGFRβ, KIT et KIT(V559D) tandis que 6E11 cible spécifiquement la kinase RIPK1 par un mécanisme distinct d’après l’étude de modélisation moléculaire de leur interaction avec la RIPK1 in silico. De plus, nos données montrent que ces composés ciblent la kinase RIPK1 sans affecter la kinase RIPK3 grâce à des tests d’interaction moléculaire et d’activité enzymatique. La Sibiriline serait

203 un inhibiteur de kinase similaire aux inhibiteurs de type II tels que la Nec-1 et la Nec-1s alors que 6E11 serait un inhibiteur de type III tels que les composés GSK2982772 et RIPA-56, récemment caractérisés par d’autres équipes (Harris et al. 2017 ; Ren et al. 2016). Par ailleurs, nos travaux ont démontré que la Sibiriline protège les souris d’une hépatite autoimmune induite par la Concanavaline A suggérant l’utilisation potentielle de cette molécule dans les pathologies du foie. 6E11, quant à lui, protège les cellules endothéliales humaines des dommages induits par l’ischémie froide/réoxygénation ce qui suggère des propriétés intéressantes pour la transplantation d’organes.

L’équipe a choisi de tester deux chimiothèques non commerciales dans le modèle de nécroptose induite par le TNF-α dans des cellules de leucémie T aigüe, les Jurkat déficientes en FADD. L’ensemble des composés chimiques ont été testés à la dose de 10µM afin d’inhiber cette mort nécrotique mesurée par un test de viabilité cellulaire (test colorimétrique, rapide et fiable, de réduction des sels de tétrazolium ou MTS). L’effet anti-nécroptotique potentiel des molécules sélectionnées au cours de ce criblage (« hit compounds ») a ensuite été confirmé par un effet dose dans ce même modèle de nécroptose puis dans d’autres modèles de nécroptose induite par TRAIL ou FasL en utilisant d’autres méthodes d’évaluation de la mort cellulaire (marquage au iodure de propidium analysé par cytométrie en flux, mesure du taux intracellulaire d’ATP, marquage au DiOC6(3) analysé par cytométrie en flux). Enfin, les protéines kinases, cibles de ces molécules inhibitrices de la nécroptose, ont été identifiées à l’aide d’un test d’interaction moléculaire (DiscoverX, KINOMEscan®). Il existe d’autres types de criblage dirigés contre une cible privilégiée tels que le criblage à l’aide d’un test enzymatique (test ADP- Glo) en présence de la protéine kinase cible recombinante (ici la RIPK1 humaine) ou encore le criblage de grandes chimiothèques vis-à-vis de la cible thérapeutique d’intérêt marquée par un fragment d’ADN (« DNA-encoded librairies »). Ces deux approches permettent d’accélérer la découverte de composés dirigés contre une protéine cible difficilement accessible aux molécules pharmacologiques et d’éviter la phase d’identification de la protéine ciblée par le composé sélectionné à l’issue du criblage. Cependant le choix de l’équipe a été d’utiliser la mort nécrotique induite par le TNF-α dans les cellules Jurkat déficientes en FADD pour trouver de nouvelles molécules inhibitrices de la nécroptose. Mon projet de thèse était d’étudier les effets biologiques des nouveaux inhibiteurs identifiés lors de ces criblages. Deux nouvelles molécules ont été et identifiées et ciblent la kinase RIPK1, ce qui conforte le rôle majeur de l’activité kinase de la RIPK1 dans la nécroptose induite par le TNF-α. Nous avons utilisé différents tests afin de mesurer la mortalité cellulaire tels que les marquages à l’iodure de propidium ou au Sytox Green ainsi que la mesure du potentiel transmembranaire mitochondrial à l’aide de la sonde lipophile fluorescente DIOC6(3). Nous avons utilisé le marquage à l’iodure de propidium pour quantifier par cytométrie en flux les cellules mortes dans une population cellulaire après traitement. Dans ces études, la mesure de l’intensité de fluorescence du marquage au Sytox Green a été utilisée pour quantifier les cellules mortes par spectrofluorimétrie au cours de traitement réalisé en cinétique. Cette sonde émet de la fluorescence dans le vert, offre peu de bruit de fond et une grande stabilité du signal et fixe avec une forte affinité l’ADN double brin. Elle permet donc d’évaluer en temps réel la mortalité par nécrose des cellules en combinaison avec la sonde DEVD-AMC qui, elle, permet d’évaluer

204 l’activité caspase-3 de la population cellulaire (mort par apoptose). La mitochondrie constitue une source énergétique cellulaire primordiale pour sa survie ; ainsi la chute du potentiel transmembranaire de la mitochondrie au sein des cellules vivantes signe une dépolarisation des organites et la mort cellulaire, mesurées à l’aide du DIOC6(3) par cytométrie en flux.

I. Rôles physiologique et pathologique de la RIPK1 La RIPK1 est à l’heure actuelle la cible privilégiée des pathologies inflammatoires nécrotiques puisqu’elle joue un rôle clef soit par sa fonction d’échafaudage, soit par sa fonction kinase au carrefour de la décision entre vie, mort cellulaire et inflammation. Les souris RIPK1-/- meurent rapidement après la naissance d’une apoptose massive des tissus lymphoïdes et adipeux induite par le TNF-α accompagnée par une perte de l’activation de la voie de survie NF-ĸB (Kelliher et al. 1998). Ces données ont alors vivement suscité l’intérêt de la communauté scientifique. Holler et al. ont montré en 2000 que la RIPK1 joue un rôle crucial dans la mort indépendante des caspases induite par le TNFR1, Fas et TRAIL-R2 (Holler et al. 2000). Puis Degterev et al. ont démontré que cette voie de mort peut être bloquée par l’utilisation d’un inhibiteur chimique, la nécrostatine-1 (Nec-1) ciblant l’activité de cette kinase (Degterev et al. 2005; Degterev et al. 2008). Il faudra attendre jusqu’en 2014 pour générer les souris RIPK1 kinase inactive (RIPK1 K45A ou D138N) qui permettent d’étudier la fonction kinase de la RIPK1 dans différents modèles pathologiques sans avoir recours aux inhibiteurs de RIPK1, qui pour certains d’entre eux sont peu sélectifs, cytotoxiques, instables ou peu absorbables (Newton et al. 2014; Kaiser et al. 2014). La recherche d’inhibiteurs de RIPK1 sélectifs, efficaces, stables et utilisables en clinique est à présent un objectif majeur. La molécule GSK2982772 actuellement en essai clinique est utilisable à faible dose par voie orale mais elle ne passe pas la barrière hématoencéphalique (Harris et al. 2017); elle n’est donc pas adaptée pour le traitement des AVC. La molécule RIPA-56 est moins stable que la molécule précédente. RIPA-56 est mieux distribuée par voie intrapéritonéale et capable de traverser tous les tissus et toutes les parois endothéliales chez la souris (Ren et al. 2016). Cette dernière molécule pourrait être prometteuse pour une application thérapeutique si les effets anti-nécroptotiques observés chez la souris sont confirmés chez l’Homme.

1) Fonctions tissulaires de la RIPK1 a) indépendantes de son activité kinase Il est primordial de préserver la fonction d’échafaudage de la RIPK1 au sein du tissu puisqu’elle est responsable de son action anti-inflammatoire et anti-apoptotique. En effet, l’invalidation ciblée de la RIPK1 chez la souris provoque une inflammation spontanée et une apoptose massive dans l’intestin ou la peau (Takahashi et al. 2014; Dannappel et al. 2014). Ces données obtenues à partir de modèles génétiques murins démontrent que la RIPK1 est indispensable au maintien de l’intégrité de certains tissus comme la peau et l’intestin tandis qu’elle n’est pas nécessaire à l’homéostasie d’autres tissus comme le foie (Filliol et al. 2016). Pourtant notre équipe a mis en évidence dans un contexte hépatique inflammatoire que la RIPK1 empêche l’apoptose des hépatocytes médiée par le TNF-α indépendamment de sa fonction kinase

205

(Filliol et al. 2016, 2017). Nos travaux in vivo dans le modèle d’hépatite induite par la ConA pourraient être complétés par un immunomarquage de la forme activée de NF-ĸB et de la forme clivée de la caspase-3 après traitement par la Sibiriline afin de s’assurer du maintien de la fonction anti-inflammatoire et anti-apoptotique de la RIPK1. Au cours du développement embryonnaire, la RIPK1 joue un rôle anti-inflammatoire critique en empêchant l’induction de la nécroptose (Dillon et al. 2014; Kaiser et al. 2014; Newton et al. 2016b; Lin et al. 2016). Les données récentes de la littérature montrent que les fonctions de survie, d’inflammation ou de mort médiées par la RIPK1 dépendent de son activité, des voies de signalisation activées, de l’environnement cellulaire (stress ou inflammation) ou du tissu.

b) dépendantes de son activité kinase Les travaux de l’équipe ont montré que l’activité kinase de la RIPK1 joue un rôle primordial dans l’établissement de l’hépatite immuno-induite par la Concanavaline A (Jouan-Lanhouet et al. 2012; Filliol et al. 2016). Nous avons donc testé un nouvel inhibiteur de la kinase RIPK1, la Sibiriline, dans ce modèle d’hépatite aigüe puisque cette molécule cible l’activité de la kinase RIPK1 par compétition à l’ATP, mais de façon non sélective. Sa sélectivité pourrait être améliorée grâce à une étude reliant activité et structure de la molécule. Son mode d’action est similaire à celui des inhibiteurs de type II puisqu’elle interagit avec le résidu Met92 (« gatekeeper ») dans la poche allostérique de la kinase RIPK1 en conformation inactive, en arrière du site de fixation de l’ATP. Son efficacité pourrait être améliorée en optimisant l’interaction clef de sa structure avec le résidu Met95 situé dans la région charnière (« hinge ») entre les lobes N- et C- terminaux du domaine kinase de la RIPK1 ce qui permettrait de verrouiller la kinase en conformation inactive. L’activité de la kinase RIPK1 joue également un rôle crucial dans les pathologies ischémiques telle que l’ischémie cérébrale (Degterev et al. 2005; Xu et al. 2010), l’ischémie cardiaque (Oerlemans et al. 2012) et l’ischémie rénale (Linkermann et al. 2012; Linkermann et al. 2013b; Newton et al. 2016a). Nos travaux montrent que l’utilisation de la molécule 6E11, un nouvel inhibiteur de nécroptose, issu de la chimiothèque de l’Université Claude Bernard de Lyon1, protège les cellules endothéliales humaines de l’aorte de l’hypoxie froide/réoxygénation. Cette molécule présente une grande sélectivité vis-à-vis de la RIPK1 humaine. Elle pourra également être améliorée en termes d’efficacité en stabilisant la molécule à proximité de la poche de fixation de l’ATP grâce à l’ajout de liaisons hydrogènes entre l’hétérocycle de sa structure et la kinase RIPK1. Sa sélectivité d’espèce suggère un mode d’action de type III ; de plus, elle est non-compétitive de l’ATP et se lie à la RIPK1 en dehors du site de fixation de l’ATP. D’après la littérature, la sélectivité d’espèce des inhibiteurs de type III vis-à-vis de la RIPK1 dite « primate » peut s’expliquer par la séquence protéique des RIPK1 dites « non-primates ». En effet, la séquence de la boucle d’activation de ces RIPK1 ne leur permet pas d’adopter la conformation nécessaire à l’interaction avec les inhibiteurs de type III (Harris et al. 2016). Cette molécule reste à tester dans un modèle nécroptotique d’explants humains ou dans des modèles pathologiques de souris humanisées.

206

2) Rôles pro-inflammatoires de la RIPK1, indépendants de la nécroptose L’activité kinase de RIPK1 n’est pas limitée à l’induction de la nécroptose par l’engagement des DRs et des PRRs; elle est également responsable d’une apoptose provoquée par un signal TNF (Silke et al. 2015) ou par la formation du ripoptosome (Wang et al. 2008; Tenev et al. 2011). Or la nécroptose et l’apoptose, mutuellement exclusives, peuvent être toutes deux pro- inflammatoires par le relargage de DAMPs ou de corps apoptotiques (Davidovich et al. 2014) ; et, lorsqu’elles persistent, conduire à des pathologies sévères voire létales chez l’Homme. Ces données corroborent les travaux de Polly Matzinger qui en 1994 suggéraient l’existence de signaux endogènes de danger nécessaires à l’activation du système immunitaire inné (Matzinger 1994; Matzinger 1998). Deux décennies plus tard, l’immunogénicité des DAMPs reste mal comprise mais avérée (Kaczmarek et al. 2013; Aaes et al. 2016). L’activité kinase des RIPK1 et RIPK3 peut aussi directement induire l’expression de gènes pro-inflammatoires suite à la fixation du LPS sur les récepteurs TLR4, indépendamment de la pseudokinase MLKL et de l’induction de la nécroptose (Najjar et al. 2016). Leurs activités pro- inflammatoires nécessitent alors l’activation de Erk1/2, cFos et NF-ĸB (Najjar et al. 2016). Face à cette complexité, l’enjeu actuel est d’identifier des biomarqueurs de la nécroptose (Vanden Berghe et al. 2016; Galluzzi et al. 2017). La phosphorylation de RIPK1 est difficile à interpréter car il existe de multiples sites de phosphorylation de RIPK1 qui reflètent soit son activation soit son inhibition (Dondelinger et al. 2015; McQuade et al. 2013; Degterev et al. 2008). A l’heure actuelle, le marquage de la forme phosphorylée de MLKL (phospho-Thr357/Ser358 MLKL) est un bon outil et est privilégié pour la mise en évidence de la nécroptose dans des tissus humains. Par ailleurs, différentes études ont montré un fort marquage immunohistochimique de p-MLKL dans les tissus de patients atteints de pathologies nécrotiques aigües ou chroniques (Wang et al. 2014 ; Ofengeim et al. 2015 ; Afonso et al. 2015 ; Günther et al. 2016).

3) Le modèle d’hypoxie froide/réoxygénation des cellules endothéliales aortiques humaines in vitro Ce modèle de dommages nécrotiques induits par l’hypoxie froide/réoxygénation in vitro nous a permis de montrer que la molécule 6E11 possède des propriétés cytoprotectrices vis-à-vis de cellules humaines endothéliales aortiques. En effet, nous avons montré que l’activité cytoprotectrice de 6E11 est optimale lorsque la molécule est ajoutée au cours de l’hypoxie froide tandis que les molécules Nec-1 et Nec-1s apportent très peu de protection lors de cette mort nécrotique. Il est à noter que le traitement par 6E11 lors de la phase d’hypoxie froide et de la phase de réoxygénation n’offre pas de bénéfice supplémentaire en terme de viabilité dans nos conditions in vitro. Cette phase d’hypoxie à froid mime les conditions de conservation des organes destinés à la greffe. L’hypoxie froide/réoxygénation mime quant à elle mime les conditions de préservation et de transplantation du greffon. Nos travaux montrent que 6E11, un inhibiteur de type III hautement sélectif de la kinase RIPK1 présente des propriétés intéressantes potentielles dans le cadre de la préservation des tissus pour la transplantation d’organes. Il serait intéressant de comparer cette molécule 6E11 dans le modèle d’hypoxie froide/réoxygénation aux autres inhibiteurs de type III de la RIPK1 récemment publiés : RIPA-56 et GSK’2982772 (Ren et al. 2016 ; Harris et al. 2017) ou à un

207 autre inhibiteur de type II de la RIPK1, très sélectif : GSK’963 (Harris et al. 2016). Ces travaux pourraient en effet lever les doutes de certains groupes quant à l’intérêt de l’utilisation thérapeutique d’inhibiteurs sélectifs de la RIPK1 dans la lutte contre les dommages ischémiques du rein notamment. Ces équipes ont obtenus des résultats contradictoires avec des inhibiteurs de type II de la RIPK1: Nec-1 (non sélectif), Nec-1s (hautement sélectif) et Ponatinib (plus efficace que Nec-1) ; elles concluent que l’inefficacité de la Nec-1s exclue toute implication de l’activité kinase de la RIPK1 dans les dommages ischémiques du rein (Degterev and Linkermann, 2016). De nouvelles synthèses chimiques basées sur les études de modélisation seront nécessaires afin d’améliorer l’efficacité de la molécule 6E11 à des doses de l’ordre du nano-molaire comme c’est le cas pour les molécules RIPA-56, GSK’963 et GSK’2982772 (Ren et al. 2016 ; Harris et al. 2016 ; Harris et al. 2017).

4) Importance des résultats pour le domaine de la nécroptose Nos données montrent que la Sib possède une sélectivité faible et une affinité modérée (Kd=218nM) pour la kinase RIPK1. Ces résultats s’expliquent du fait du mode d’action de cet inhibiteur. Cette molécule cible le site de fixation de l’ATP de la kinase RIPK1 ; la Sib entre donc en compétition avec l’ATP afin de prévenir l’autophosphorylation de la RIPK1, comme la Nec-1. Or le site de fixation de l’ATP possède des similarités de séquence et donc de conformation entre les différentes kinases. La Sib interagit ainsi avec les kinases RIPK1, RIPK4, JAK2, PDGFRβ, KIT et KIT(V559D) qui possèdent des similarités de structure. Par comparaison avec les inhibiteurs de la RIPK1 développés par GSK et qui sont efficaces à très faibles doses (1-4nM), la Sib présente plus faible efficacité in vitro (1-5µM). Par contre, son efficacité in vivo (1,43mM soit 3mg/kg) semble être similaire à celle de la Nec-1s (2,25mM soit 6,25mk/kg) dans le modèle d’hépatite immunoinduite par l’administration de ConA. La Sib (« hit compound ») est moins sélective dans le domaine des inhibiteurs de la RIPK1 que d’autres molécules hautement efficaces vis-à-vis de la nécroptose in vivo (GSK’963, GSK2982772 et RIPA-56) (Ren et al. 2016 ; Harris et al. 2016 ; Harris et al. 2017). Cependant, les fortes similarités de la Sib avec la Nec-1 (profil de sélectivité, mode d’action et efficacité) en font une molécule intéressante qui pourrait être optimisée dans le cadre d’une étude structure/activité en synthétisant des analogues. La molécule 6E11 est plus originale car elle dérive d’une structure naturelle et présente un profil de sélectivité quasi absolu vis-à-vis de la RIPK1 dans le panel de 456 kinases testées. Cette molécule est non compétitive de l’ATP puisqu’elle interagirait avec la RIPK1 dans une poche hydrophobe différente du site de fixation de l’ATP. 6E11 inhibe la nécroptose induite par TNF ou TRAIL uniquement dans des cellules humaines, suggérant une spécificité d’espèce. Les tests d’autophosphorylation montrent que 6E11 bloque l’autophosphorylation de la RIPK1 humaine, sans altérer l’activité kinase de RIPK3. De plus, 6E11 testée en dose-réponse n’est pas toxique à des concentrations inférieures à 20µM dans les cellules humaines (human PBLs, RPE-1, HAECs). Par ailleurs, nous avons montré que cette molécule protège de façon plus efficace que la Nec-1s les cellules humaines endothéliales de l’aorte de la mort cellulaire induite par l’hypoxie froide/réoxygénation. Cependant, malgré sa très forte sélectivité vis-à-vis de la RIPK1, la synthèse de molécules analogues plus affines serait nécessaire pour améliorer l’efficacité de cette molécule « précurseur » ainsi que sa solubilité.

208

Nos travaux ont permis de confirmer que les molécules Sib et 6E11sont deux nouvelles structures chimiques inhibitrices de la nécroptose en ciblant l’activité de la RIPK1. Une étude cristallographique de l’interaction Sib-RIPK1 (ou 6E11-RIPK1) associée à une étude pharmacologique apporterait des informations précieuses sur le site d’interaction potentiel afin d’améliorer l’affinité, l’efficacité (6E11 et Sib) et/ou la sélectivité (Sib). De plus, dans le domaine des inhibiteurs de la RIPK1, seule la conformation inactive de la kinase a été décrite en interaction avec les inhibiteurs actuellement disponibles. Nous pourrions envisager d’étudier la conformation active du complexe Sib-RIPK1 afin d’apporter de nouvelles informations structurales à la communauté scientifique. Cependant la difficulté réside dans la production du domaine kinase de la RIPK1 en quantité suffisante pour la réalisation de ce type d’études. Dans le même temps, il reste à étudier leurs mécanismes d’action cellulaire. Par exemple, ces molécules, une fois optimisées, devront être testées dans différents modèles cellulaires vis-à-vis des signalisations MAPK et NFkB activées par l’engagement des récepteurs de mort de la superfamille du TNFR1. Ces données permettront de vérifier que l’activité anti-nécroptotique de ces composés chimiques n’altère pas les fonctions biologiques de RIPK1 liées à ses propriétés d’échafaudage.

II. Méthodes d’étude de la nécroptose in vivo Certaines formes de nécroptose sont indépendantes de l’activité de la RIPK1 lors de l’engagement des PRRs (Zhang et al. 2016c). De nombreuses études se sont alors basées sur l’activation de la RIPK3 et de son substrat p-MLKL pour détecter la nécroptose. La communauté scientifique a convenu de l’intérêt du marquage tissulaire de la phosphorylation des résidus Thr357 et Ser358 de MLKL (Sun et al. 2012) comme biomarqueur de la nécroptose dans les pathologies humaines (comme l’hépatite induite par l’acétaminophène (Wang et al., 2014a), l’hépatite auto-immune (Günther et al., 2016), la sclérose en plaque (Ofengeim et al., 2015)) et comme outil pronostic de celles-ci (les hépatites chroniques induites par la surconsommation de glucides et de lipides, ou d’alcool, ou par une infection par le virus de l’hépatite B ou C (Afonso et al. 2015), par exemple). Le groupe de Xiaodong Wang et al. a depuis développé un anticorps anti-phospho-MLKL-humaine utilisé pour le diagnostic dans les biopsies hépatiques (Wang et al. 2014a). Cependant, il existe également d’autres formes de nécroptose indépendantes de RIPK3 lors de l’engagement du IFNR (Dara et al. 2016a) ou encore indépendantes de RIPK3 et de MLKL lors de l’engagement de la mitochondrie (Delavallée et al. 2011). La nécroptose dépendante des DRs et des kinases RIPK1 et RIPK3 est contrôlée par différents acteurs tels que FADD, la caspase 8, FLIP, A20, TAK1 et les cIAPs (régulateurs négatifs) et par CYLD, RIPK3 et p-MLKL (régulateurs positifs). Tandis que la nécroptose dépendante des PRRs est indépendante de la RIPK1 et contrôlée par les protéines senseurs TRIF et DAI et par la kinase RIPK3. Ces données démontrent qu’il pourrait être intéressant de développer des molécules compétitrices du domaine RHIM à des fins thérapeutiques puisque ce domaine joue un rôle central dans le recrutement de la RIPK3 et donc dans le contrôle de la mort cellulaire et de l’inflammation. Dans le cas de la nécroptose indépendante de RIPK3 et MLKL, elle est contrôlée par AIF, PARP-1, les calpaïnes, Bax, Bcl-2, l’histone H2AX et la cyclophine A. Ces études montrent que la nécroptose regroupe différents mécanismes moléculaires dépendants des RIPKs ou d’AIF

209 mitochondriale. Cependant la majorité des pathologies inflammatoires impliquant la nécroptose sont sensibles à la Nec-1 (Tableau 3) ce qui rend le développement des inhibiteurs de la kinase RIPK1 attrayant pour un développement en clinique.

1) L’utilisation d’inhibiteurs de la nécroptose L’implication des acteurs de la nécroptose : RIPK1, RIPK3 et MLKL a été démontrée dans le développement de la pathologie inflammatoire nécrotique grâce à l’utilisation d’inhibiteurs de la RIPK1 ou de modèles murins génétiquement modifiés pour l’un de ces acteurs clefs. Avant de conclure à l’implication de la nécroptose dans certaines pathologies, il faut cependant prendre soin d’écarter une implication de l’enzyme indoléamine 2,3-dioxygénase ou d’une autre enzyme ciblée lors de l’utilisation de la Nec-1. Dans le cadre de notre étude, nous avons écarté l’effet de nos inhibiteurs sur l’enzyme indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO) car les molécules Sib et 6E11 ne possèdent pas de noyau indole dans leur structure chimique. La solution semble donc résider dans l’utilisation des souris Mlkl-/- ou l’utilisation d’un inhibiteur plus sélectif de la RIPK1 tel que la Nec-1s ou une autre molécule récemment décrite : PN-10, GSK’963, GSK’481 ou GSK2982772. D’autant que les inhibiteurs actuels de la RIPK3 ont montré des effets cytotoxiques et que les inhibiteurs de la MLKL n’ont à l’heure actuelle pas été utilisés dans des modèles in vivo. De plus, on ne peut écarter des rôles de MLKL indépendants de la nécroptose ainsi que l’implication d’autres régulateurs de celle-ci.

Sibiriline 6E11 Nec-1s Sélectivité Modérée Quasi absolue : Forte : - 99,8% RIPK1 (Kd - 99,85% RIPK1 (Kd -100% RIPK1 (Kd 3nM) 218nM) 130nM) -72% PDGFRβ (Kd>30µM) - 99,8% JAK2 - 65% MEK5 -51% KIT(V559D, V654A) - 99,6% KIT(V559D) -35% KIT(V559D, T670I) - 99,25% PDGFRβ -34% KIT - 99,2% KIT - 95% RIPK4 Efficacité EC50 = 1,2µM EC50 = 4,6µM EC50 = 0,1µM Modèle Jurkat FADD-/- in vivo L’injection i.p. de Sib Non testé L’injection i.p. de la Nec-1s (3mg/kg) protège de (6,25mg/kg) protège de l’hépatite induite par la l’hépatite induite par la ConA (12mg/kg), de façon ConA (12mg/kg) semblable à la Nec-1s (6,25mg/kg) Avantages Efficacité similaire à Nec- Sélectivité quasi-absolue Forte sélectivité pour RIPK1 1/Nec-1s in vitro et in vivo. pour hRIPK1. Efficace dans de nombreux Aussi efficace que Nec-1 Non compétitive de l’ATP modèles de nécroptose in en post-induction de la vivo Plus efficace que Nec-1/Nec- nécroptose par le TNF- 1s dans le modèle d’hypoxie froide/ réoxygénation Inconvénients Moins sélective que Nec-1s Moins efficace que Nec- Courte demi-vie 1/Nec-1s in vitro Toxicité à faible dose Tableau 7. Comparaison des caractéristiques biologiques de nos inhibiteurs de la kinase RIPK1 : Sibiriline et 6E11 avec la molécule de référence de notre étude, la Nec-1s.

210

Le profil de sélectivité de la Sib montre l’existence d’autres cibles que la kinase RIPK1 parmi les 456 kinases testées. En effet, la Sib module également l’activité des kinases RIPK4 et JAK2 ou des récepteurs à activité tyrosine-kinase : PDGFRβ, KIT et KIT(V559D). Ces protéines kinases jouent un rôle majeur dans le devenir cellulaire en termes de prolifération, de croissance, de survie ou de réponse inflammatoire ou immunitaire. L’impact de l’effet inhibiteur multi-cible de la Sib reste à évaluer lors de la signalisation nécroptotique in vitro mais également dans le modèle d’hépatite induite par la ConA in vivo. On pourrait supposer que la forte inhibition de la kinase JAK2 qui peut aussi réguler la réponse immune agisse en synergie avec l’inhibition de la kinase RIPK1 dans la protection contre l’hépatite induite par la ConA. Nos inhibiteurs de RIPK1 sont à améliorer mais nos travaux montrent que ces deux composés possèdent des propriétés anti-nécroptotiques intéressantes qui pourront être optimisées par la synthèse d’analogues et d’études reliant la structure à la fonction. Il serait important de mener une étude pharmacologique de nos molécules à l’aide de microsomes hépatiques humains, par exemple, afin de déterminer leur métabolisation et leur stabilité dans des cellules humaines in vitro ainsi qu’une étude de biodisponibilité de celles-ci in vivo.

2) La détection tissulaire des acteurs de la nécrose régulée Les lésions tissulaires sont étroitement liées à la sévérité de l’inflammation au cours de la pathologie. C’est la raison pour laquelle certaines études ont cherché à quantifier le taux de transcrits de différents acteurs de la nécrose régulée (tels que TNR1, RIPK1, RIPK3, MLKL, Caspase-8, FADD, cIAP1/2, GPX4, CYPD, CASP1, NLRP3, PARP1) dans les différents organes humains en comparaison aux organes murins sains ou pathologiques (Honarpisheh et al. 2016). Ces données permettent de mieux comprendre les résultats obtenus chez la souris et de souligner la susceptibilité accrue de certains tissus à la nécroptose, à la ferroptose ou à la pyroptose chez l’Homme. En effet, l’inflammation observée dans les pathologies ischémiques et les hépatites chroniques ainsi que le SIRS semble dépendante de l’induction de l’apoptose et de différentes voies de nécroses régulées (Newton et al. 2016a; Honarpisheh et al. 2016). Ces voies pourraient être activées selon une cinétique et une intensité différente au cours de l’initiation ou de l’aggravation de la pathologie. L’activation des voies de morts régulées dépendrait donc de la biodisponibilité des différents acteurs moléculaires permettant d’orchestrer ces différentes voies de mort au cours de la pathologie.

3) Le modèle d’hépatite immunoinduite par l’injection de ConA Le modèle d’hépatite immunoinduite par l’administration de la concanavaline A permet de mettre en évidence l’existence d’une nécroptose non canonique. En effet, dans ce modèle la nécroptose des hépatocytes est due à l’activité de RIPK1 et de MLKL indépendamment de RIPK3 (Günther et al. 2016). Ces résultats corrèlent avec les observations de différents groupes qui montrent que la RIPK3 n’est pas exprimée dans les hépatocytes au niveau basal chez l’homme et la souris (Dara et al. 2015; Günther et al. 2016; Honarpisheh et al. 2016) et que les souris RIPK3 KO ne sont pas protégées (Weinlich et al. 2013; Günther et al. 2016).

211

Certains groupes montrent cependant une augmentation de l’expression de la RIPK3 au niveau tissulaire lors de diverses hépatites (Gautheron et al. 2014; Afonso et al. 2015) ; ce qui n’est pas suffisant pour impliquer la nécroptose. Certains auteurs critiquent l’utilisation de l’anticorps polyclonal anti-RIPK3 responsable d’un marquage non spécifique en immunohistochimie (Dara et al. 2016b). Ces forts taux de RIPK3 détectés au cours de l’inflammation peuvent également traduire l’implication de la fonction pro-inflammatoire de RIPK3. L’expression de RIPK3 ne serait pas induite lors de l’hépatite et donc non détectable dans les hépatocytes ; elle est cependant détectée dans les cellules non parenchymateuses du foie telles que les cellules de Kupffer (ou macrophages résidents) et les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques, nécessaires à la régénération du foie (Dara et al. 2015; Günther et al. 2016). De plus, RIPK1 ne pouvant activer MLKL directement ; ces travaux suggèrent l’implication d’une autre kinase non-identifiée pour l’activation de MLKL. Les cellules non- parenchymateuses pourraient également participer à l’inflammation tissulaire par l’induction d’une nécroptose et/ou d’une inflammation dépendante de la RIPK3 au sein des cellules de Kupffer ou des cellules endothéliales sinusoïdales. Sib est un inhibiteur de la RIPK1 mais il inhibe également l’activité d’autres kinases, notamment JAK2, KIT(V559D), PDGFRβ, KIT et RIPK4. Celles-ci sont connues pour jouer un rôle dans la régulation de prolifération et de la survie cellulaire ou de la réponse inflammatoire ou immune. Cette inhibition « multiple » pourrait donc améliorer l’effet anti-nécroptotique et anti-inflammatoire de l’inhibition de la RIPK1 lors cours du traitement de la pathologie. Cependant nos résultats ainsi que les travaux de notre équipe montrent que la perte d’activité de la RIPK1 via l’utilisation de la Nec-1s ou de souris RIPKK45A (kinase-dead) suffit pour protéger le foie de l’hépatolyse induite par l’administration de ConA. Ces kinases pourraient alors jouer un rôle secondaire lors de cette hépatite. L’étude de leur implication dans cette hépatolyse pourrait permettre l’identification de nouveaux acteurs de cette hépatite immuno-induite.

4) Enjeux de l’inhibition de la nécroptose dans ces modèles in vivo Newton et al. ont récemment démontré que l’extinction de la RIPK3 ne protège pas l’ensemble des pathologies attribuées à la nécroptose suite à l’utilisation de la Nec-1, dont l’AVC par exemple (Newton et al. 2016a). Cependant, la perte d’activité de la RIPK1 ou la perte de la RIPK3 améliore les pathologies telles que l’ischémie-reperfusion rénale, l’infarctus du myocarde ou le SIRS induit par une forte dose de TNF (Newton et al. 2016a). Il existe un débat concernant la part de la nécroptose dans l’initiation ou l’aggravation de ces pathologies puisque RIPK1 et RIPK3 jouent également un rôle pro-inflammatoire au-delà de leur fonction pronécroptotique. Le SIRS est protégé par la perte simultanée de la RIPK3 (ou MLKL) et de la caspase-8 (Newton et al. 2016a), ce qui signe la coexistence d’une apoptose et d’une nécroptose au cours de cette inflammation systémique. De plus, la RIPK3 joue un rôle primordial dans la toxicité médiée par le TNF au niveau intestinal chez la souris (Newton et al. 2016a). Tandis que la perte de MLKL dans un modèle d’ischémie-reperfusion rénale est moins efficace que la perte d’activité de la RIPK1 ou la perte de la RIPK3 (Newton et al. 2016a) soulevant l’interrogation sur le rôle de la nécroptose dans les dommages liés à l’ischémie/reperfusion dans le rein. Par ailleurs, il a été montré qu’une faible quantité de cellules nécrotiques pouvait cependant activer le système immunitaire et initier une nécro-inflammation

212 au cours de ces dommages. En effet, cette nécrose mineure déclenche la nécrose d’autres types cellulaires du tissu rénal amplifiant ainsi l’inflammation jusqu’à la perte de fonction du rein (Mulay et al. 2016). L’inhibition de cette nécrose immunogène reste donc un enjeu crucial au cours de cette pathologie.

III. Intérêt thérapeutique des inhibiteurs de la RIPK1 A l’heure actuelle, les inhibiteurs de l’activité kinase de RIPK1 sont de très bons outils pour l’étude de la nécroptose in vitro et in vivo puisque son rôle pro-inflammatoire est distinct de son activité kinase. Cependant très peu d’inhibiteurs de RIPK1 sont à la fois sélectif et efficace puisqu’il s’agit d’inhibiteurs de kinase de type II (tels que Nec-1, Nec-1s, Ponatinib, PN-10 et Cpd27) qui lient partiellement le site de fixation de l’ATP et qui se fixent uniquement à la conformation inactive de la kinase RIPK1 dans une poche hydrophobe instable (Degterev et al., 2008; Christofferson et al. 2012; Xie et al., 2013b; Najjar et al., 2015; Fauster et al., 2015; Harris et al., 2013; Berger et al., 2015). Nos études de modélisation moléculaire du complexe Sib- RIPK1 mettent en évidence des caractéristiques communes avec les inhibiteurs de kinase de type II. Deux groupes viennent de décrire deux inhibiteurs de type III : le GSK2982772 et le RIPA-56 qui lient la kinase RIPK1 bloquée en conformation inactive avec une forte affinité et une forte sélectivité, en dehors du site ATP, dans une poche hydrophobe stabilisée par des liaisons hydrogènes formées avec deux résidus (Asp156 et Val76) du site actif (Harris et al. 2017; Ren et al. 2017). De plus, ces deux composés sont non toxiques et absorbables par voie orale dans des modèles précliniques. Nos travaux sur la molécule 6E11 suggèrent que cette molécule dérivée d’un composé naturel ferait également partie des inhibiteurs type III ciblant de manière hautement sélective la RIPK1 humaine. Il est intéressant de noter que le composé GSK2982772 a été testé dans des explants de patients atteints de colite ulcérative où il est capable de réduire la production de cytokines pro- inflammatoires (IL-1β et IL-6) (Harris et al. 2017). La molécule GSK2982772 a été validée en phase I de développement clinique en 2015 ; elle est donc bien tolérée et ne présente pas d'effets secondaires chez des volontaires sains. Cette phase d’étude permet également d'étudier la cinétique et le métabolisme de cette molécule chez l'Homme. A l’heure actuelle, la molécule est en phase IIa d’essai clinique afin d’évaluer son efficacité et de déterminer ses éventuels effets secondaires chez un nombre limité de patients atteints de psoriasis, de colites ulcératives ou d’arthrites rhumatoïdes (Harris et al. 2017). Si la molécule présente un intérêt thérapeutique, elle sera présentée en phase IIb afin d’évaluer sa dose thérapeutique à grande échelle. Ces données récentes offrent des arguments concrets pour le développement d’inhibiteurs de la kinase RIPK1 en thérapeutique. La Sibiriline présente des applications thérapeutiques potentielles en traitement curatif de certaines pathologies du foie. On pourrait également envisager son utilisation en traitement curatif d’autres pathologies telles que l’infarctus du myocarde ou l’AVC. En effet, nous avons montré que cette molécule possède une activité anti-nécroptotique jusqu’à 4 heures après l’induction de cette mort cellulaire. La molécule 6E11 pourrait, quant à elle, être plus appropriée en prévention des dommages cellulaires de certaines pathologies ischémiques ou pour optimiser la préservation et la transplantation d’organes chez l’Homme.

213

IV. Conclusions générales et perspectives Ces travaux de thèse ont donc permis d’identifier deux nouvelles structures chimiques : Sibiriline et 6E11 capables de cibler la RIPK1 et dont l’efficacité, la sélectivité et le mode d'action diffèrent. Nos données permettent d’enrichir nos connaissances concernant les possibilités d’inhibition de la kinase RIPK1 par des composés chimiques et d’envisager l’optimisation de ces molécules pour une utilisation thérapeutique dans le cadre des maladies du foie ou des lésions liées à l’ischémie-reperfusion. Sibiriline et 6E11 appartiennent à deux classes d’inhibiteurs différentes d’après nos données in silico ce qui explique leurs différences en terme d’efficacité biologique in vitro et in vivo (Tableau 7). La molécule 6E11 protège les cellules humaines endothéliales de l’aorte des dommages induits par l’hypoxie froide/réoxygénation. Il serait intéressant de tester les autres inhibiteurs de type III soient les molécules GSK2982772 et RIPA-56 sur la mort nécrotique induite par l’hypoxie froide/réoxygénation dans les cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs) in vitro. Nous pourrons également envisager l’utilisation des explants de peau humaine pour tester l’efficacité de la molécule 6E11 et/ou d’analogues de cette structure chimique dans un modèle de psoriasis puisque ce composé possède une activité inhibitrice de RIPK1 spécifique de l’espèce humaine. Les travaux de la molécule Sibiriline (ou de ses dérivés) pourront eux être complétés par l’étude de son mode d’action cellulaire notamment dans l’activation des voies MAPKs et NF-ĸB activées par l’engagement des récepteurs de mort de la superfamille du TNFR1. De plus, l’étude de l’implication des kinases : JAK2, KIT(V559D), PDGFRβ, KIT et RIPK4 également inhibées par l’activité de la Sibiriline permettrait une meilleure compréhension du mode d’action de cet inhibiteur « multi-kinase » dans l’hépatite induite par la ConA. Cet inhibiteur pourrait alors permettre l’identification du rôle éventuel d’autres acteurs moléculaires de cette hépatite immuno-induite. L’étude de sa distribution systémique et de sa toxicité à long terme in vivo seront également envisagées en association avec une étude de ses propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques. Ces informations pourront permettre d’améliorer la structure de cette molécule « hit » issue du criblage de la chimiothèque de Roscoff et d’envisager une utilisation thérapeutique d’une version améliorée de cette molécule. La Nec-1 n’est pas utilisable en thérapeutique du fait de son homologie de structure avec le méthylthio-hydantoïne-tryptophane, l’inhibiteur de l’IDO, enzyme qui joue un rôle primordial dans l’immunité. De plus, la Nec-1 possède une courte demi-vie et peut être toxique à faible dose (Takahashi et al. 2012; Vandenabeele et al. 2013; Degterev et al. 2013). Sibiriline et 6E11 ne bloqueraient pas l’activité de l’IDO du fait de leur structure chimique. Elles pourront être testées sur des explants humains de peau dans un modèle de psoriasis. 6E11 sera, quant à elle, testée dans un modèle d’auto-transplantation rénale porcine afin d’établir une preuve de concept de son activité anti-nécroptotique ex vivo. L’enjeu majeur de notre équipe à l’issue de ces travaux est maintenant de parvenir à produire des molécules analogues de Sib et 6E11 à la fois hyper-sélectives de la RIPK1 et hautement efficaces (de l’ordre du nM in vitro) mais aussi absorbables à faible dose par voie orale. Ces molécules améliorées seraient à tester dans des modèles précliniques pour faire la preuve de concept de leur intérêt dans les pathologies nécrotiques inflammatoires, ischémiques ou dégénératives et peut-être aboutir à un nouvel inhibiteur utilisable en clinique.

214

V. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

215

216

Références bibliographiques

Aaes, Tania Løve, Agnieszka Kaczmarek, Tinneke Delvaeye, Bram De Craene, Stefaan De Koker, Liesbeth Heyndrickx, Iris Delrue, et al. 2016. “Vaccination with Necroptotic Cancer Cells Induces Efficient Anti-Tumor Immunity.” Cell Reports 15 (2): 274–87. doi:10.1016/j.celrep.2016.03.037. Abbott, Derek W., Yibin Yang, Jessica E. Hutti, Swetha Madhavarapu, Michelle A. Kelliher, and Lewis C. Cantley. 2007. “Coordinated Regulation of Toll-like Receptor and NOD2 Signaling by K63-Linked Polyubiquitin Chains.” Molecular and Cellular Biology 27 (17): 6012–25. doi:10.1128/MCB.00270-07. Afonso, Marta B., Pedro M. Rodrigues, Tânia Carvalho, Marta Caridade, Paula Borralho, Helena Cortez-Pinto, Rui E. Castro, and Cecília M.P. Rodrigues. 2015. “Necroptosis Is a Key Pathogenic Event in Human and Experimental Murine Models of Non- Alcoholic Steatohepatitis.” Clinical Science 129 (8): 721–39. doi:10.1042/CS20140732. Agalliu, Ilir, Marta San Luciano, Anat Mirelman, Nir Giladi, Bjorg Waro, Jan Aasly, Rivka Inzelberg, et al. 2015. “Higher Frequency of Certain Cancers in LRRK2 G2019S Mutation Carriers with Parkinson Disease: A Pooled Analysis.” JAMA Neurology 72 (1): 58–65. doi:10.1001/jamaneurol.2014.1973. Aggarwal, B. B., W. J. Kohr, P. E. Hass, B. Moffat, S. A. Spencer, W. J. Henzel, T. S. Bringman, G. E. Nedwin, D. V. Goeddel, and R. N. Harkins. 1985. “Human Tumor Necrosis Factor. Production, Purification, and Characterization.” The Journal of Biological Chemistry 260 (4): 2345–54. Ahmad, Manzoor, Srinivasa M. Srinivasula, Lijuan Wang, Robert V. Talanian, Gerald Litwack, Teresa Fernandes-Alnemri, and Emad S. Alnemri. 1997. “CRADD, a Novel Human Apoptotic Adaptor Molecule for Caspase-2, and FasL/Tumor Necrosis Factor Receptor-Interacting Protein RIP.” Cancer Research 57 (4): 615–619. Almagro, M C de, T Goncharov, K Newton, and D Vucic. 2015. “Cellular IAP Proteins and LUBAC Differentially Regulate Necrosome-Associated RIP1 Ubiquitination.” Cell Death and Disease 6 (6): e1800. doi:10.1038/cddis.2015.158. Almagro, M. Cristina de, Tatiana Goncharov, Anita Izrael-Tomasevic, Stefanie Duttler, Matthias Kist, Eugene Varfolomeev, Xiumin Wu, et al. 2017. “Coordinated Ubiquitination and Phosphorylation of RIP1 Regulates Necroptotic Cell Death.” Cell Death and Differentiation 24 (1): 26–37. doi:10.1038/cdd.2016.78. Amini, Poorya, Darko Stojkov, Xiaoliang Wang, Simone Wicki, Thomas Kaufmann, Wendy Wei-Lynn Wong, Hans-Uwe Simon, and Shida Yousefi. 2016. “NET Formation Can Occur Independently of RIPK3 and MLKL Signaling.” European Journal of Immunology 46 (1): 178–84. doi:10.1002/eji.201545615. Andrabi, Shaida A., Ted M. Dawson, and Valina L. Dawson. 2008. “Mitochondrial and Nuclear Cross Talk in Cell Death: Parthanatos.” Annals of the New York Academy of Sciences 1147 (1): 233–41. doi:10.1196/annals.1427.014. Anstee, Quentin M., Danilo Concas, Hiromi Kudo, Adam Levene, John Pollard, Peter Charlton, Howard C. Thomas, Mark R. Thursz, and Robert D. Goldin. 2010. “Impact of Pan-Caspase Inhibition in Animal Models of Established Steatosis and Non- Alcoholic Steatohepatitis.” Journal of Hepatology 53 (3): 542–50. doi:10.1016/j.jhep.2010.03. 016. Arshad, Muhammad Imran, Claire Piquet-Pellorce, Annie L’Helgoualc’h, Michel Rauch, Solène Patrat-Delon, Frédéric Ezan, Catherine Lucas-Clerc, et al. 2012. “TRAIL but Not FasL and TNFα, Regulates IL-33 Expression in Murine Hepatocytes during Acute Hepatitis.” Hepatology 56 (6): 2353–62. doi:10.1002/hep.25893. 217

Arslan, Seda Çöl, and Claus Scheidereit. 2011. “The Prevalence of TNFα-Induced Necrosis over Apoptosis Is Determined by TAK1-RIP1 Interplay.” PloS One 6 (10): e26069. doi:10.1371/journal.pone.0026069. Baines, Christopher P., Robert A. Kaiser, Nicole H. Purcell, N. Scott Blair, Hanna Osinska, Michael A. Hambleton, Eric W. Brunskill, et al. 2005. “Loss of Cyclophilin D Reveals a Critical Role for Mitochondrial Permeability Transition in Cell Death.” Nature 434 (7033): 658–62. doi:10.1038/nature03434. Balamayooran, Theivanthiran, Sanjay Batra, Gayathriy Balamayooran, Shanshan Cai, Koichi S. Kobayashi, Richard A. Flavell, and Samithamby Jeyaseelan. 2011. “Receptor- Interacting Protein 2 Controls Pulmonary Host Defense to Escherichia Coli Infection via the Regulation of Interleukin-17A.” Infection and Immunity 79 (11): 4588–99. doi:10.1128/IAI.05641-11. Balkwill, Frances. 2009. “Tumour Necrosis Factor and Cancer.” Nature Reviews Cancer 9 (5): 361–371. Bandmann, Oliver, and Mark R. Cookson. 2012. “Parkinson Disease, Cancer, and LRRK2: Causation or Association?” Neurology 78 (11): 772–73. doi:10.1212/WNL.0b013 e318249f744. Bantel, Heike, and Klaus Schulze-Osthoff. 2009. “Cell Death in Sepsis: A Matter of How, When, and Where.” Critical Care (London, England) 13 (4): 173. doi:10.1186/cc7966. Basso, Emy, Lisa Fante, Jonathan Fowlkes, Valeria Petronilli, Michael A. Forte, and Paolo Bernardi. 2005. “Properties of the Permeability Transition Pore in Mitochondria Devoid of Cyclophilin D.” The Journal of Biological Chemistry 280 (19): 18558–61. doi:10.1074/jbc.C500089200. Beier, Juliane I., and Craig J. McClain. 2010. “Mechanisms and Cell Signaling in Alcoholic Liver Disease.” Biological Chemistry 391 (11): 1249–64. doi:10.1515/BC.2010.137. Beraza, Naiara, Yann Malato, Leif E. Sander, Malika Al-Masaoudi, Julia Freimuth, Dieter Riethmacher, Gregory J. Gores, Tania Roskams, Christian Liedtke, and Christian Trautwein. 2009. “Hepatocyte-Specific NEMO Deletion Promotes NK/NKT Cell– and TRAIL-Dependent Liver Damage.” The Journal of Experimental Medicine 206 (8): 1727–37. doi:10.1084/jem.20082152. Berg, J. Merlijn van den, Elsbeth van Koppen, Anders Åhlin, Bernd H. Belohradsky, Ewa Bernatowska, Lucien Corbeel, Teresa Español, et al. 2009. “Chronic Granulomatous Disease: The European Experience.” Edited by Andy Alspaugh. PLoS ONE 4 (4): e5234. doi:10.1371/journal.pone.0005234. Berger, Sb, P Harris, R Nagilla, V Kasparcova, S Hoffman, B Swift, L Dare, et al. 2015. “Characterization of GSK′963: A Structurally Distinct, Potent and Selective Inhibitor of RIP1 Kinase.” Cell Death Discovery 1 (July): 15009. doi:10.1038/cddiscovery. 2015.9. Berger, Scott B., Viera Kasparcova, Sandy Hoffman, Barb Swift, Lauren Dare, Michelle Schaeffer, Carol Capriotti, et al. 2014. “Cutting Edge: RIP1 Kinase Activity Is Dispensable for Normal Development but Is a Key Regulator of Inflammation in SHARPIN-Deficient Mice.” Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950) 192 (12): 5476–80. doi:10.4049/jimmunol.1400499. Bertrand, Mathieu J. M., Karine Doiron, Katherine Labbé, Robert G. Korneluk, Philip A. Barker, and Maya Saleh. 2009. “Cellular Inhibitors of Apoptosis cIAP1 and cIAP2 Are Required for Innate Immunity Signaling by the Pattern Recognition Receptors NOD1 and NOD2.” Immunity 30 (6): 789–801. doi:10.1016/j.immuni.2009.04.011. Bertrand, Mathieu J. M., Snezana Milutinovic, Kathleen M. Dickson, Wai Chi Ho, Alain Boudreault, Jon Durkin, John W. Gillard, James B. Jaquith, Stephen J. Morris, and

218

Philip A. Barker. 2008. “cIAP1 and cIAP2 Facilitate Cancer Cell Survival by Functioning as E3 Ligases That Promote RIP1 Ubiquitination.” Molecular Cell 30 (6): 689–700. doi:10.1016/j.molcel.2008.05.014. Bertrand, Mathieu J.M., and Peter Vandenabeele. 2011. “The Ripoptosome: Death Decision in the Cytosol.” Molecular Cell 43 (3): 323–25. doi:10.1016/j.molcel.2011.07.007. Bhala, Neeraj, Paul Angulo, David van der Poorten, Eric Lee, Jason M. Hui, Giorgio Saracco, Leon A. Adams, et al. 2011. “The Natural History of Nonalcoholic Fatty Liver Disease with Advanced Fibrosis or Cirrhosis: An International Collaborative Study.” Hepatology (Baltimore, Md.) 54 (4): 1208–16. doi:10.1002/hep.24491. Bhr, C., A. Rohwer, L. Stempka, G. Rincke, F. Marks, and M. Gschwendt. 2000. “DIK, a Novel Protein Kinase That Interacts with Protein Kinase Cdelta. Cloning, Characterization, and Gene Analysis.” The Journal of Biological Chemistry 275 (46): 36350–57. doi:10.1074/jbc.M004771200. Biton, Sharon, and Avi Ashkenazi. 2011. “NEMO and RIP1 Control Cell Fate in Response to Extensive DNA Damage via TNF-α Feedforward Signaling.” Cell 145 (1): 92–103. doi:10.1016/j.cell.2011.02.023. Boetticher, Nicholas C., Craig J. Peine, Paul Kwo, Gary A. Abrams, Tushar Patel, Bashar Aqel, Lisa Boardman, et al. 2008. “A Randomized, Double-Blinded, Placebo- Controlled Multicenter Trial of Etanercept in the Treatment of Alcoholic Hepatitis.” Gastroenterology 135 (6): 1953–60. doi:10.1053/j.gastro.2008.08.057. Bonnet, Marion C., Daniela Preukschat, Patrick-Simon Welz, Geert van Loo, Maria A. Ermolaeva, Wilhelm Bloch, Ingo Haase, and Manolis Pasparakis. 2011. “The Adaptor Protein FADD Protects Epidermal Keratinocytes from Necroptosis In Vivo and Prevents Skin Inflammation.” Immunity 35 (4): 572–82. doi:10.1016/j.immuni.2011.08.014. Bradley, John R., and Jordan S. Pober. 2001. “Tumor Necrosis Factor Receptor-Associated Factors (TRAFs).” Oncogene 20 (44): 6482. Bratton, S. B., G. Walker, S. M. Srinivasula, X. M. Sun, M. Butterworth, E. S. Alnemri, and G. M. Cohen. 2001. “Recruitment, Activation and Retention of Caspases-9 and -3 by Apaf-1 Apoptosome and Associated XIAP Complexes.” The EMBO Journal 20 (5): 998–1009. doi:10.1093/emboj/20.5.998. Brenner, C., and S. Grimm. 2006. “The Permeability Transition Pore Complex in Cancer Cell Death.” Oncogene 25 (34): 4744–56. doi:10.1038/sj.onc.1209609. Brinkmann, Volker, Ulrike Reichard, Christian Goosmann, Beatrix Fauler, Yvonne Uhlemann, David S. Weiss, Yvette Weinrauch, and Arturo Zychlinsky. 2004. “Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.” Science 303 (5663): 1532–1535. Broekemeier, K. M., M. E. Dempsey, and D. R. Pfeiffer. 1989. “Cyclosporin A Is a Potent Inhibitor of the Inner Membrane Permeability Transition in Liver Mitochondria.” The Journal of Biological Chemistry 264 (14): 7826–30. Broekemeier, K. M., and D. R. Pfeiffer. 1989. “Cyclosporin A-Sensitive and Insensitive Mechanisms Produce the Permeability Transition in Mitochondria.” Biochemical and Biophysical Research Communications 163 (1): 561–66. Brown, K., S. Gerstberger, L. Carlson, G. Franzoso, and U. Siebenlist. 1995. “Control of I Kappa B-Alpha Proteolysis by Site-Specific, Signal-Induced Phosphorylation.” Science (New York, N.Y.) 267 (5203): 1485–88. Cai, Zhenyu, Siriporn Jitkaew, Jie Zhao, Hsueh-Cheng Chiang, Swati Choksi, Jie Liu, Yvona Ward, Ling-gang Wu, and Zheng-Gang Liu. 2013. “Plasma Membrane Translocation of Trimerized MLKL Protein Is Required for TNF-Induced Necroptosis.” Nature Cell Biology 16 (1): 55–65. doi:10.1038/ncb2883.

219

Cariappa, Annaiah, Luojing Chen, Khaleda Haider, Mei Tang, Eugene Nebelitskiy, Stewart T. Moran, and Shiv Pillai. 2003. “A Catalytically Inactive Form of Protein Kinase C- Associated Kinase/Receptor Interacting Protein 4, a Protein Kinase C Beta-Associated Kinase That Mediates NF-Kappa B Activation, Interferes with Early B Cell Development.” Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950) 171 (4): 1875–80. Carswell, E. A., L. Jâ Old, R. L. Kassel, S. Green, N. Fiore, and B. Williamson. 1975. “An Endotoxin-Induced Serum Factor That Causes Necrosis of Tumors.” Proceedings of the National Academy of Sciences 72 (9): 3666–3670. Cavassani, Karen A., Makoto Ishii, Haitao Wen, Matthew A. Schaller, Pamela M. Lincoln, Nicholas W. Lukacs, Cory M. Hogaboam, and Steven L. Kunkel. 2008. “TLR3 Is an Endogenous Sensor of Tissue Necrosis during Acute Inflammatory Events.” The Journal of Experimental Medicine 205 (11): 2609–21. doi:10.1084/jem.20081370. Challa, Sreerupa, Melissa Woelfel, Melissa Guildford, David Moquin, and Francis Ka-Ming Chan. 2010. “Viral Cell Death Inhibitor MC159 Enhances Innate Immunity against Vaccinia Virus Infection.” Journal of Virology 84 (20): 10467–76. doi:10.1128/JVI. 00983-10. Chan, F. K.-M., J. Shisler, J. G. Bixby, M. Felices, L. Zheng, M. Appel, J. Orenstein, B. Moss, and M. J. Lenardo. 2003. “A Role for Tumor Necrosis Factor Receptor-2 and Receptor-Interacting Protein in Programmed Necrosis and Antiviral Responses.” Journal of Biological Chemistry 278 (51): 51613–21. doi:10.1074/jbc.M305633200. Chan, Francis Ka-Ming, Nivea Farias Luz, and Kenta Moriwaki. 2015. “Programmed Necrosis in the Cross Talk of Cell Death and Inflammation.” Annual Review of Immunology 33: 79–106. doi:10.1146/annurev-immunol-032414-112248. Chang, H. Y., H. Nishitoh, X. Yang, H. Ichijo, and D. Baltimore. 1998. “Activation of Apoptosis Signal-Regulating Kinase 1 (ASK1) by the Adapter Protein Daxx.” Science (New York, N.Y.) 281 (5384): 1860–63. Chaudhary, Preet M., Michael Eby, Alan Jasmin, Angela Bookwalter, Jessica Murray, and Leroy Hood. 1997. “Death Receptor 5, a New Member of the TNFR Family, and DR4 Induce FADD-Dependent Apoptosis and Activate the NF-κB Pathway.” Immunity 7 (6): 821–830. Chen, L., K. Haider, M. Ponda, A. Cariappa, D. Rowitch, and S. Pillai. 2001. “Protein Kinase C-Associated Kinase (PKK), a Novel Membrane-Associated, Ankyrin Repeat- Containing Protein Kinase.” The Journal of Biological Chemistry 276 (24): 21737–44. doi:10.1074/jbc.M008069200. Chen, Wanze, Zhenru Zhou, Lisheng Li, Chuan-Qi Zhong, Xinru Zheng, Xiurong Wu, Yingying Zhang, et al. 2013. “Diverse Sequence Determinants Control Human and Mouse Receptor Interacting Protein 3 (RIP3) and Mixed Lineage Kinase Domain-like (MLKL) Interaction in Necroptotic Signaling.” The Journal of Biological Chemistry 288 (23): 16247–61. doi:10.1074/jbc.M112.435545. Chen, Xin, Wenjuan Li, Junming Ren, Deli Huang, Wan-Ting He, Yunlong Song, Chao Yang, et al. 2014. “Translocation of Mixed Lineage Kinase Domain-like Protein to Plasma Membrane Leads to Necrotic Cell Death.” Cell Research 24 (1): 105–21. doi:10.1038/cr.2013.171. Chiarugi, Alberto. 2005. “Intrinsic Mechanisms of poly(ADP-Ribose) Neurotoxicity: Three Hypotheses.” Neurotoxicology 26 (5): 847–55. doi:10.1016/j.neuro.2005.01.012. Chin, Arnold I., Paul W. Dempsey, Kevin Bruhn, Jeff F. Miller, Yang Xu, and Genhong Cheng. 2002. “Involvement of Receptor-Interacting Protein 2 in Innate and Adaptive Immune Responses.” Nature 416 (6877): 190–94. doi:10.1038/416190a. Cho, Young S., Sreerupa Challa, Lauren Clancy, and Francis K.-M. Chan. 2010. “Lipopolysaccharide-Induced Expression of TRAIL Promotes Dendritic Cell

220

Differentiation.” Immunology 130 (4): 504–15. doi:10.1111/j.1365- 2567.2010.03266.x. Cho, YoungSik, Sreerupa Challa, David Moquin, Ryan Genga, Tathagat Dutta Ray, Melissa Guildford, and Francis Ka-Ming Chan. 2009. “Phosphorylation-Driven Assembly of the RIP1-RIP3 Complex Regulates Programmed Necrosis and Virus-Induced Inflammation.” Cell 137 (6): 1112–23. doi:10.1016/j.cell.2009.05.037. Choi, Sungwoon, Heather Keys, Richard J. Staples, Junying Yuan, Alexei Degterev, and Gregory D. Cuny. 2012. “Optimization of Tricyclic Nec-3 Necroptosis Inhibitors for in Vitro Liver Microsomal Stability.” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 22 (17): 5685–88. doi:10.1016/j.bmcl.2012.06.098. Christofferson, D. E., Y. Li, J. Hitomi, W. Zhou, C. Upperman, H. Zhu, S. A. Gerber, S. Gygi, and J. Yuan. 2012. “A Novel Role for RIP1 Kinase in Mediating TNFα Production.” Cell Death & Disease 3 (6): e320. doi:10.1038/cddis.2012.64. Christofferson, Dana E, and Junying Yuan. 2010. “Necroptosis as an Alternative Form of Programmed Cell Death.” Current Opinion in Cell Biology 22 (2): 263–68. doi:10.1016/j.ceb.2009.12.003. Chung, Wen-Hung, Chuang-Wei Wang, and Ro-Lan Dao. 2016. “Severe Cutaneous Adverse Drug Reactions.” The Journal of Dermatology 43 (7): 758–66. doi:10.1111/1346- 8138.13430. Clark, Matthew A, Raksha A Acharya, Christopher C Arico-Muendel, Svetlana L Belyanskaya, Dennis R Benjamin, Neil R Carlson, Paolo A Centrella, et al. 2009. “Design, Synthesis and Selection of DNA-Encoded Small-Molecule Libraries.” Nature Chemical Biology 5 (9): 647–54. doi:10.1038/nchembio.211. Clarke, Samantha J., Gavin P. McStay, and Andrew P. Halestrap. 2002. “Sanglifehrin A Acts as a Potent Inhibitor of the Mitochondrial Permeability Transition and Reperfusion Injury of the Heart by Binding to Cyclophilin-D at a Different Site from Cyclosporin A.” The Journal of Biological Chemistry 277 (38): 34793–99. doi:10.1074/jbc.M202191200. Cleutjens, J. P., W. M. Blankesteijn, M. J. Daemen, and J. F. Smits. 1999. “The Infarcted Myocardium: Simply Dead Tissue, or a Lively Target for Therapeutic Interventions.” Cardiovascular Research 44 (2): 232–41. Coffin, Carla S., Hughie F. Fraser, Remo Panaccione, and Subrata Ghosh. 2011. “Liver Diseases Associated with Anti-Tumor Necrosis Factor-Alpha (TNF-α) Use for Inflammatory Bowel Disease.” Inflammatory Bowel Diseases 17 (1): 479–84. doi:10.1002/ibd.21336. Coley, W. B. 1991. “The Treatment of Malignant Tumors by Repeated Inoculations of Erysipelas. With a Report of Ten Original Cases. 1893.” Clinical Orthopaedics and Related Research, no. 262 (January): 3–11. Conforti-Andreoni, Cristina, Paola Ricciardi-Castagnoli, and Alessandra Mortellaro. 2011. “The Inflammasomes in Health and Disease: From Genetics to Molecular Mechanisms of Autoinflammation and beyond.” Cellular & Molecular Immunology 8 (2): 135–45. doi:10.1038/cmi.2010.81. Conrad, Marcus, José Pedro Friedmann Angeli, Peter Vandenabeele, and Brent R. Stockwell. 2016. “Regulated Necrosis: Disease Relevance and Therapeutic Opportunities.” Nature Reviews Drug Discovery 15 (5): 348–66. doi:10.1038/nrd.2015.6. Cook, W. D., D. M. Moujalled, T. J. Ralph, P. Lock, S. N. Young, J. M. Murphy, and D. L. Vaux. 2014. “RIPK1-and RIPK3-Induced Cell Death Mode Is Determined by Target Availability.” Cell Death & Differentiation 21 (10): 1600–1612.

221

Croker, Ben A, Joanne A O’Donnell, and Motti Gerlic. 2014. “Pyroptotic Death Storms and Cytopenia.” Current Opinion in Immunology 26 (February): 128–37. doi:10.1016/j.coi.2013.12.002. Cullen, Sean P., Conor M. Henry, Conor J. Kearney, Susan E. Logue, Maria Feoktistova, Graham A. Tynan, Ed C. Lavelle, Martin Leverkus, and Seamus J. Martin. 2013. “Fas/CD95-Induced Chemokines Can Serve as ‘Find-Me’ Signals for Apoptotic Cells.” Molecular Cell 49 (6): 1034–48. doi:10.1016/j.molcel.2013.01.025. Dahlin, D. C., G. T. Miwa, A. Y. Lu, and S. D. Nelson. 1984. “N-Acetyl-P-Benzoquinone Imine: A Cytochrome P-450-Mediated Oxidation Product of Acetaminophen.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 81 (5): 1327–31. Daley-Bauer, Lisa P., Linda Roback, Lynsey N. Crosby, A. Louise McCormick, Yanjun Feng, William J. Kaiser, and Edward S. Mocarski. 2017. “Mouse Cytomegalovirus M36 and M45 Death Suppressors Cooperate to Prevent Inflammation Resulting from Antiviral Programmed Cell Death Pathways.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, March. doi:10.1073/pnas.1616829114. Damgaard, Rune Busk, Ueli Nachbur, Monica Yabal, Wendy Wei-Lynn Wong, Berthe Katrine Fiil, Mischa Kastirr, Eva Rieser, et al. 2012. “The Ubiquitin Ligase XIAP Recruits LUBAC for NOD2 Signaling in Inflammation and Innate Immunity.” Molecular Cell 46 (6): 746–58. doi:10.1016/j.molcel.2012.04.014. Dannappel, Marius, Katerina Vlantis, Snehlata Kumari, Apostolos Polykratis, Chun Kim, Laurens Wachsmuth, Christina Eftychi, et al. 2014. “RIPK1 Maintains Epithelial Homeostasis by Inhibiting Apoptosis and Necroptosis.” Nature 513 (7516): 90–94. doi:10.1038/nature13608. Dara, Lily, Heather Johnson, Jo Suda, Sanda Win, William Gaarde, Derick Han, and Neil Kaplowitz. 2015. “Receptor Interacting Protein Kinase 1 Mediates Murine Acetaminophen Toxicity Independent of the Necrosome and Not through Necroptosis.” Hepatology 62 (6): 1847–57. doi:10.1002/hep.27939. Dara, Lily, Zhang-Xu Liu, and Neil Kaplowitz. 2016a. “A Murder Mystery in the Liver: Who Done It and How?” Journal of Clinical Investigation 126 (11): 4068–71. doi:10.1172/JCI90830. Dara, Lily, Zhang-Xu Liu, and Neil Kaplowitz. 2016b. “Questions and Controversies: The Role of Necroptosis in Liver Disease.” Cell Death Discovery 2 (December): 16089. doi:10.1038/cddiscovery.2016.89. Dargan, Paul I., and Alison L. Jones. 2002. “Acetaminophen Poisoning: An Update for the Intensivist.” Critical Care (London, England) 6 (2): 108–10. Davidovich, Pavel, Conor J. Kearney, and Seamus J. Martin. 2014. “Inflammatory Outcomes of Apoptosis, Necrosis and Necroptosis.” Biological Chemistry 395 (10): 1163–71. doi:10.1515/hsz-2014-0164. Degterev, A., J. L. Maki, and J. Yuan. 2013. “Activity and Specificity of Necrostatin-1, Small-Molecule Inhibitor of RIP1 Kinase.” Cell Death and Differentiation 20 (2): 366. doi:10.1038/cdd.2012.133. Degterev, Alexei, Junichi Hitomi, Megan Germscheid, Irene L Ch’en, Olga Korkina, Xin Teng, Derek Abbott, et al. 2008. “Identification of RIP1 Kinase as a Specific Cellular Target of Necrostatins.” Nature Chemical Biology 4 (5): 313–21. doi:10.1038/nchembio.83. Degterev, Alexei, Z. Huang, M. Boyce, Y. Li, P. Jaqtap, N. Mizushima, GD Cuny, TJ Mitchison, MA Moskowitz, and J. Yuan. 2005. “Degterev 2005 - Nature Chemical Biology - Chemical Inhibitor of Nonapoptotic Cell Death with Therapeutic Potential for Ischemic Brain Injury.pdf.” Nat Chem Biol.

222

Degterev, Alexei, and Andreas Linkermann. 2016. “Generation of Small Molecules to Interfere with Regulated Necrosis.” Cellular and Molecular Life Sciences 73 (11–12): 2251–67. doi:10.1007/s00018-016-2198-x. Degterev, Alexei, and Junying Yuan. 2008. “Expansion and Evolution of Cell Death Programmes.” Nature Reviews Molecular Cell Biology 9 (5): 378–90. doi:10.1038/nrm2393. Delavallée, Laure, Lauriane Cabon, Patricia Galán-Malo, Hans K. Lorenzo, and Santos A. Susin. 2011. “AIF-Mediated Caspase-Independent Necroptosis: A New Chance for Targeted Therapeutics.” IUBMB Life 63 (4): 221–32. doi:10.1002/iub.432. Desai, Jyaysi, Santhosh V. Kumar, Shrikant R. Mulay, Lukas Konrad, Simone Romoli, Christine Schauer, Martin Herrmann, et al. 2015. “PMA and Crystal-Induced Neutrophil Extracellular Trap Formation Involves RIPK1-RIPK3-MLKL Signaling.” European Journal of Immunology 46 (1): 223–29. doi:10.1002/eji.201545605. Desai, Jyaysi, Shrikant R. Mulay, Daigo Nakazawa, and Hans-Joachim Anders. 2016. “Matters of Life and Death. How Neutrophils Die or Survive along NET Release and is ‘NETosis’ = Necroptosis?” Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS 73 (11– 12): 2211–19. doi:10.1007/s00018-016-2195-0. Deutsch, M, C S Graffeo, R Rokosh, M Pansari, A Ochi, E M Levie, E Van Heerden, et al. 2015. “Divergent Effects of RIP1 or RIP3 Blockade in Murine Models of Acute Liver Injury.” Cell Death and Disease 6 (5): e1759. doi:10.1038/cddis.2015.126. Devalaraja-Narashimha, Kishor, Alicia M. Diener, and Babu J. Padanilam. 2009. “Cyclophilin D Gene Ablation Protects Mice from Ischemic Renal Injury.” American Journal of Physiology. Renal Physiology 297 (3): F749-759. doi:10.1152/ajprenal.00239.2009. Devin, A., Y. Lin, S. Yamaoka, Z. Li, M. Karin, and null Liu Zg. 2001. “The Alpha and Beta Subunits of IkappaB Kinase (IKK) Mediate TRAF2-Dependent IKK Recruitment to Tumor Necrosis Factor (TNF) Receptor 1 in Response to TNF.” Molecular and Cellular Biology 21 (12): 3986–94. doi:10.1128/MCB.21.12.3986-3994.2001. Di Cesare, Antonella, Paola Di Meglio, and Frank O. Nestle. 2009. “The IL-23/Th17 Axis in the Immunopathogenesis of Psoriasis.” The Journal of Investigative Dermatology 129 (6): 1339–50. doi:10.1038/jid.2009.59. Di Lisa, Fabio, and Paolo Bernardi. 2006. “Mitochondria and Ischemia-Reperfusion Injury of the Heart: Fixing a Hole.” Cardiovascular Research 70 (2): 191–99. doi:10.1016/j.cardiores.2006.01.016. Di Lisa, Fabio, Andrea Carpi, Valentina Giorgio, and Paolo Bernardi. 2011. “The Mitochondrial Permeability Transition Pore and Cyclophilin D in Cardioprotection.” Biochimica Et Biophysica Acta 1813 (7): 1316–22. doi:10.1016/j.bbamcr.2011.01.031. Dillon, Christopher P., Bart Tummers, Katherine Baran, and Douglas R. Green. 2016. “Developmental Checkpoints Guarded by Regulated Necrosis.” Cellular and Molecular Life Sciences 73 (11–12): 2125–36. doi:10.1007/s00018-016-2188-z. Dillon, Christopher P., Andrew Oberst, Ricardo Weinlich, Laura J. Janke, Tae-Bong Kang, Tehila Ben-Moshe, Tak W. Mak, David Wallach, and Douglas R. Green. 2012. “Survival Function of the FADD-CASPASE-8-cFLIPL Complex.” Cell Reports 1 (5): 401–7. doi:10.1016/j.celrep.2012.03.010. Dillon, Christopher P., Ricardo Weinlich, Diego A. Rodriguez, James G. Cripps, Giovanni Quarato, Prajwal Gurung, Katherine C. Verbist, et al. 2014. “RIPK1 Blocks Early Postnatal Lethality Mediated by Caspase-8 and RIPK3.” Cell 157 (5): 1189–1202. doi:10.1016/j.cell.2014.04.018.

223

Diwan, Abhinav, Tony Tran, Arunima Misra, and Douglas L. Mann. 2003. “Inflammatory Mediators and the Failing Heart: A Translational Approach.” Current Molecular Medicine 3 (2): 161–82. Dixon, Scott J., Kathryn M. Lemberg, Michael R. Lamprecht, Rachid Skouta, Eleina M. Zaitsev, Caroline E. Gleason, Darpan N. Patel, et al. 2012. “Ferroptosis: An Iron- Dependent Form of Nonapoptotic Cell Death.” Cell 149 (5): 1060–72. doi:10.1016/j.cell.2012.03.042. Do Van, Bruce, Flore Gouel, Aurélie Jonneaux, Kelly Timmerman, Patrick Gelé, Maud Pétrault, Michèle Bastide, et al. 2016. “Ferroptosis, a Newly Characterized Form of Cell Death in Parkinson’s Disease That Is Regulated by PKC.” Neurobiology of Disease 94 (October): 169–78. doi:10.1016/j.nbd.2016.05.011. Dobbelstein, Matthias, and Thomas Shenk. 1996. “Protection against Apoptosis by the Vaccinia Virus SPI-2 (B13R) Gene Product.” Journal of Virology 70 (9): 6479–6485. Doitsh, Gilad, Nicole L. K. Galloway, Xin Geng, Zhiyuan Yang, Kathryn M. Monroe, Orlando Zepeda, Peter W. Hunt, et al. 2014. “Cell Death by Pyroptosis Drives CD4 T- Cell Depletion in HIV-1 Infection.” Nature 505 (7484): 509–14. doi:10.1038/nature12940. Dolma, Sonam, Stephen L. Lessnick, William C. Hahn, and Brent R. Stockwell. 2003. “Identification of Genotype-Selective Antitumor Agents Using Synthetic Lethal Chemical Screening in Engineered Human Tumor Cells.” Cancer Cell 3 (3): 285–96. Dondelinger, Yves, M. A. Aguileta, Vera Goossens, Christel Dubuisson, Sasker Grootjans, Emmanuel Dejardin, Peter Vandenabeele, and M. J. M. Bertrand. 2013. “RIPK3 Contributes to TNFR1-Mediated RIPK1 Kinase-Dependent Apoptosis in Conditions of cIAP1/2 Depletion or TAK1 Kinase Inhibition.” Cell Death & Differentiation 20 (10): 1381–1392. Dondelinger, Yves, Maurice Darding, Mathieu J. M. Bertrand, and Henning Walczak. 2016. “Poly-Ubiquitination in TNFR1-Mediated Necroptosis.” Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS 73 (11–12): 2165–76. doi:10.1007/s00018-016-2191-4. Dondelinger, Yves, Wim Declercq, Sylvie Montessuit, Ria Roelandt, Amanda Goncalves, Inge Bruggeman, Paco Hulpiau, et al. 2014. “MLKL Compromises Plasma Membrane Integrity by Binding to Phosphatidylinositol Phosphates.” Cell Reports 7 (4): 971–81. doi:10.1016/j.celrep.2014.04.026. Dondelinger, Yves, Sandrine Jouan-Lanhouet, Tatyana Divert, Emilie Theatre, John Bertin, Peter J. Gough, Piero Giansanti, et al. 2015. “NF-κB-Independent Role of IKKα/IKKβ in Preventing RIPK1 Kinase-Dependent Apoptotic and Necroptotic Cell Death during TNF Signaling.” Molecular Cell 60 (1): 63–76. doi:10.1016/j.molcel.2015.07.032. Downey, Andrew, Chris Jackson, Nadia Harun, and Alan Cooper. 2012. “Toxic Epidermal Necrolysis: Review of Pathogenesis and Management.” Journal of the American Academy of Dermatology 66 (6): 995–1003. doi:10.1016/j.jaad.2011.09.029. Draber, Peter, Sebastian Kupka, Matthias Reichert, Helena Draberova, Elodie Lafont, Diego de Miguel, Lisanne Spilgies, et al. 2015. “LUBAC-Recruited CYLD and A20 Regulate Gene Activation and Cell Death by Exerting Opposing Effects on Linear Ubiquitin in Signaling Complexes.” Cell Reports 13 (10): 2258–72. doi:10.1016/j.celrep.2015. 11.009. Duan, Hangjun, and Vishva M. Dixit. 1997. “RAIDD Is a New ‘Death’ Adaptator Molecule.” Nature 385 (January). https://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/handle/2027.42/62739/ 385086a0.pdf?sequence=1&isAllowed=y. Dunai, Zsuzsanna A., Gergely Imre, Gabor Barna, Tamas Korcsmaros, Istvan Petak, Pal I. Bauer, and Rudolf Mihalik. 2012. “Staurosporine Induces Necroptotic Cell Death

224

under Caspase-Compromised Conditions in U937 Cells.” PloS One 7 (7): e41945. doi:10.1371/journal.pone.0041945. Duong, Bao H., Michio Onizawa, Juan A. Oses-Prieto, Rommel Advincula, Alma Burlingame, Barbara A. Malynn, and Averil Ma. 2015. “A20 Restricts Ubiquitination of pro-Interleukin-1β Protein Complexes and Suppresses NLRP3 Inflammasome Activity.” Immunity 42 (1): 55–67. doi:10.1016/j.immuni.2014.12.031. Duprez, Linde, Nozomi Takahashi, Filip Van Hauwermeiren, Benjamin Vandendriessche, Vera Goossens, Tom Vanden Berghe, Wim Declercq, Claude Libert, Anje Cauwels, and Peter Vandenabeele. 2011. “RIP Kinase-Dependent Necrosis Drives Lethal Systemic Inflammatory Response Syndrome.” Immunity 35 (6): 908–18. doi:10.1016/j.immuni. 2011.09.020. Dynek, Jasmin N., Tatiana Goncharov, Erin C. Dueber, Anna V. Fedorova, Anita Izrael- Tomasevic, Lilian Phu, Elizabeth Helgason, et al. 2010. “C-IAP1 and UbcH5 Promote K11-Linked Polyubiquitination of RIP1 in TNF Signalling.” The EMBO Journal 29 (24): 4198–4209. doi:10.1038/emboj.2010.300. Ea, Chee-Kwee, Li Deng, Zong-Ping Xia, Gabriel Pineda, and Zhijian J. Chen. 2006. “Activation of IKK by TNFalpha Requires Site-Specific Ubiquitination of RIP1 and Polyubiquitin Binding by NEMO.” Molecular Cell 22 (2): 245–57. doi:10.1016/j.molcel.2006.03.026. Eefting, Frank, Benno Rensing, Jochem Wigman, Willem Jan Pannekoek, Wai Ming Liu, Maarten Jan Cramer, Daniel J. Lips, and Pieter A. Doevendans. 2004. “Role of Apoptosis in Reperfusion Injury.” Cardiovascular Research 61 (3): 414–26. doi:10.1016/j.cardiores.2003.12.023. Enesa, Karine, Mustafa Zakkar, Hera Chaudhury, Le A. Luong, Lesley Rawlinson, Justin C. Mason, Dorian O. Haskard, Jonathan L. E. Dean, and Paul C. Evans. 2008. “NF- kappaB Suppression by the Deubiquitinating Enzyme Cezanne: A Novel Negative Feedback Loop in pro-Inflammatory Signaling.” The Journal of Biological Chemistry 283 (11): 7036–45. doi:10.1074/jbc.M708690200. Fatokun, Amos A, Valina L Dawson, and Ted M Dawson. 2014. “Parthanatos: Mitochondrial- Linked Mechanisms and Therapeutic Opportunities.” British Journal of Pharmacology 171 (8): 2000–2016. doi:10.1111/bph.12416. Fauster, A, M Rebsamen, K V M Huber, J W Bigenzahn, A Stukalov, C-H Lardeau, S Scorzoni, et al. 2015. “A Cellular Screen Identifies Ponatinib and Pazopanib as Inhibitors of Necroptosis.” Cell Death and Disease 6 (5): e1767. doi:10.1038/cddis.2015.130. Feldmann, Marc. 2008. “Many Cytokines Are Very Useful Therapeutic Targets in Disease.” Journal of Clinical Investigation 118 (11): 3533–36. doi:10.1172/JCI37346. Feng, Shanshan, Yonghui Yang, Yide Mei, Li Ma, De-e Zhu, Naseruddin Hoti, Mark Castanares, and Mian Wu. 2007. “Cleavage of RIP3 Inactivates Its Caspase- Independent Apoptosis Pathway by Removal of Kinase Domain.” Cellular Signalling 19 (10): 2056–67. doi:10.1016/j.cellsig.2007.05.016. Feoktistova, Maria, Peter Geserick, Beate Kellert, Diana Panayotova Dimitrova, Claudia Langlais, Mike Hupe, Kelvin Cain, Marion MacFarlane, Georg Häcker, and Martin Leverkus. 2011. “cIAPs Block Ripoptosome Formation, a RIP1/Caspase-8 Containing Intracellular Cell Death Complex Differentially Regulated by cFLIP Isoforms.” Molecular Cell 43 (3): 449–63. doi:10.1016/j.molcel.2011.06.011. Feoktistova, Maria, Peter Geserick, and Martin Leverkus. 2016. “Ripoptosome Analysis by Caspase-8 Coimmunoprecipitation.” Cold Spring Harbor Protocols 2016 (3): pdb.prot087403. doi:10.1101/pdb.prot087403.

225

Fernandes-Alnemri, T., J. Wu, J.-W. Yu, P. Datta, B. Miller, W. Jankowski, S. Rosenberg, J. Zhang, and E. S. Alnemri. 2007. “The Pyroptosome: A Supramolecular Assembly of ASC Dimers Mediating Inflammatory Cell Death via Caspase-1 Activation.” Cell Death and Differentiation 14 (9): 1590–1604. doi:10.1038/sj.cdd.4402194. Festjens, N, T Vanden Berghe, S Cornelis, and P Vandenabeele. 2007. “RIP1, a Kinase on the Crossroads of a Cell’s Decision to Live or Die.” Cell Death and Differentiation 14 (3): 400–410. doi:10.1038/sj.cdd.4402085. Filliol, Aveline, Claire Piquet-Pellorce, Jacques Le Seyec, Muhammad Farooq, Valentine Genet, Catherine Lucas-Clerc, John Bertin, et al. 2016. “RIPK1 Protects from TNF-α- Mediated Liver Damage during Hepatitis.” Cell Death & Disease 7 (11): e2462. doi:10.1038/cddis.2016.362. Filliol, Aveline, Claire Piquet-Pellorce, Céline Raguénès-Nicol, Sarah Dion, Muhammad Farooq, Catherine Lucas-Clerc, Peter Vandenabeele, Mathieu J. M. Bertrand, Jacques Le Seyec, and Michel Samson. 2017. “RIPK1 Protects Hepatocytes from Kupffer Cells-Mediated TNF-Induced Apoptosis in Mouse Models of PAMP-Induced Hepatitis.” Journal of Hepatology, January. doi:10.1016/j.jhep.2017.01.005. Fingas, Christian D., Boris R. A. Blechacz, Rory L. Smoot, Maria E. Guicciardi, Justin Mott, Steve F. Bronk, Nathan W. Werneburg, Alphonse E. Sirica, and Gregory J. Gores. 2010. “A Smac Mimetic Reduces TNF Related Apoptosis Inducing Ligand (TRAIL)- Induced Invasion and Metastasis of Cholangiocarcinoma Cells.” Hepatology (Baltimore, Md.) 52 (2): 550–61. doi:10.1002/hep.23729. Fournier, N., G. Ducet, and A. Crevat. 1987. “Action of Cyclosporine on Mitochondrial Calcium Fluxes.” Journal of Bioenergetics and Biomembranes 19 (3): 297–303. Frangogiannis, Nikolaos G. 2006. “The Mechanistic Basis of Infarct Healing.” Antioxidants & Redox Signaling 8 (11–12): 1907–39. doi:10.1089/ars.2006.8.1907. Frangogiannis, Nikolaos G. 2008. “The Immune System and Cardiac Repair.” Pharmacological Research 58 (2): 88–111. doi:10.1016/j.phrs.2008.06.007. Fransen, Lucie, Rita Mūller, Anne Marmenout, Jan Tavernier, José Van der Heyden, Eric Kawashima, André Chollet, et al. 1985. “Molecular Cloning of Mouse Tumour Necrosis Factor cDNA and Its Eukaryotic Expression.” Nucleic Acids Research 13 (12): 4417–4429. Frantz, Stefan, Johann Bauersachs, and Georg Ertl. 2009. “Post-Infarct Remodelling: Contribution of Wound Healing and Inflammation.” Cardiovascular Research 81 (3): 474–81. doi:10.1093/cvr/cvn292. Fraser, Kyle B., Mark S. Moehle, Roy N. Alcalay, Andrew B. West, and LRRK2 Cohort Consortium. 2016. “Urinary LRRK2 Phosphorylation Predicts Parkinsonian Phenotypes in G2019S LRRK2 Carriers.” Neurology 86 (11): 994–99. doi:10.1212/WNL.0000000000002436. Freer-Prokop, Margot, John O’Flaherty, Jason A. Ross, and Crystal M. Weyman. 2009. “Non- Canonical Role for the TRAIL Receptor DR5/FADD/Caspase Pathway in the Regulation of MyoD Expression and Skeletal Myoblast Differentiation.” Differentiation; Research in Biological Diversity 78 (4): 205–12. doi:10.1016/j.diff. 2009.05.002. Friedmann Angeli, Jose Pedro, Manuela Schneider, Bettina Proneth, Yulia Y. Tyurina, Vladimir A. Tyurin, Victoria J. Hammond, Nadja Herbach, et al. 2014. “Inactivation of the Ferroptosis Regulator Gpx4 Triggers Acute Renal Failure in Mice.” Nature Cell Biology 16 (12): 1180–91. doi:10.1038/ncb3064. Fu, Zeze, Biyong Deng, Yuxin Liao, Liancheng Shan, Fei Yin, Zhuoying Wang, Hui Zeng, Dongqing Zuo, Yingqi Hua, and Zhengdong Cai. 2013. “The Anti-Tumor Effect of

226

Shikonin on Osteosarcoma by Inducing RIP1 and RIP3 Dependent Necroptosis.” BMC Cancer 13 (December): 580. doi:10.1186/1471-2407-13-580. Fuchs, Tobias A., Ulrike Abed, Christian Goosmann, Robert Hurwitz, Ilka Schulze, Volker Wahn, Yvette Weinrauch, Volker Brinkmann, and Arturo Zychlinsky. 2007. “Novel Cell Death Program Leads to Neutrophil Extracellular Traps.” The Journal of Cell Biology 176 (2): 231–41. doi:10.1083/jcb.200606027. Gaiha, Gaurav D., Kevin J. McKim, Matthew Woods, Thomas Pertel, Janine Rohrbach, Natasha Barteneva, Christopher R. Chin, et al. 2014. “Dysfunctional HIV-Specific CD8+ T Cell Proliferation Is Associated with Increased Caspase-8 Activity and Mediated by Necroptosis.” Immunity 41 (6): 1001–12. doi:10.1016/j.immuni.2014. 12.011. Galluzzi, L., J. M. Bravo-San Pedro, I. Vitale, S. A. Aaronson, J. M. Abrams, D. Adam, E. S. Alnemri, et al. 2015. “Essential versus Accessory Aspects of Cell Death: Recommendations of the NCCD 2015.” Cell Death and Differentiation 22 (1): 58. doi:10.1038/cdd.2014.137. Galluzzi, L., I. Vitale, J. M. Abrams, E. S. Alnemri, E. H. Baehrecke, M. V. Blagosklonny, Ted M. Dawson, et al. 2012. “Molecular Definitions of Cell Death Subroutines: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012.” Cell Death & Differentiation 19 (1): 107–120. Galluzzi, Lorenzo, Catherine Brenner, Eugenia Morselli, Zahia Touat, and Guido Kroemer. 2008. “Viral Control of Mitochondrial Apoptosis.” PLoS Pathog 4 (5): e1000018. Galluzzi, Lorenzo, Oliver Kepp, Francis Ka-Ming Chan, and Guido Kroemer. 2017. “Necroptosis: Mechanisms and Relevance to Disease.” Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease 12 (1): 103–30. doi:10.1146/annurev-pathol-052016-100247. Galluzzi, Lorenzo, Oliver Kepp, Stefan Krautwald, Guido Kroemer, and Andreas Linkermann. 2014. “Molecular Mechanisms of Regulated Necrosis.” Seminars in Cell & Developmental Biology 35 (November): 24–32. doi:10.1016/j.semcdb.2014.02.006. Galluzzi, Lorenzo, Tom Vanden Berghe, Nele Vanlangenakker, Sabrina Buettner, Tobias Eisenberg, Peter Vandenabeele, Frank Madeo, and Guido Kroemer. 2011. “Programmed Necrosis : From Molecules to Health and Diseases.” In International Review of Cell and Molecular Biology, 289:1–35. Elsevier. http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/B9780123860392000018. Gandhi, Payal N., Shu G. Chen, and Amy L. Wilson-Delfosse. 2009. “Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2): A Key Player in the Pathogenesis of Parkinson’s Disease.” Journal of Neuroscience Research 87 (6): 1283–95. doi:10.1002/jnr.21949. Gantner, Florian, Marcel Leist, Ansgar Wilhelm Lohse, Paul Georg Germann, and Gisa Tiegs. 1995. “Concanavalin A—induced T-Cell—mediated Hepatic Injury in Mice: The Role of Tumor Necrosis Factor.” Hepatology 21 (1): 190–98. doi:10.1002/hep.1840210131. Gautheron, J., M. Vucur, F. Reisinger, D. V. Cardenas, C. Roderburg, C. Koppe, K. Kreggenwinkel, et al. 2014. “A Positive Feedback Loop between RIP3 and JNK Controls Non-Alcoholic Steatohepatitis.” EMBO Molecular Medicine 6 (8): 1062–74. doi:10.15252/emmm.201403856. Gay, Nicholas J., Martyn F. Symmons, Monique Gangloff, and Clare E. Bryant. 2014. “Assembly and Localization of Toll-like Receptor Signalling Complexes.” Nature Reviews. Immunology 14 (8): 546–58. doi:10.1038/nri3713. Gentle, I. E., W. W.-L. Wong, J. M. Evans, A. Bankovacki, W. D. Cook, N. R. Khan, U. Nachbur, et al. 2011. “In TNF-Stimulated Cells, RIPK1 Promotes Cell Survival by Stabilizing TRAF2 and cIAP1, Which Limits Induction of Non-Canonical NF- B and Activation of Caspase-8.” Journal of Biological Chemistry 286 (15): 13282–91. doi:10.1074/jbc.M110.216226.

227

Gerlach, Björn, Stefanie M. Cordier, Anna C. Schmukle, Christoph H. Emmerich, Eva Rieser, Tobias L. Haas, Andrew I. Webb, et al. 2011. “Linear Ubiquitination Prevents Inflammation and Regulates Immune Signalling.” Nature 471 (7340): 591–96. doi:10.1038/nature09816. Gerlic, M., B. Faustin, A. Postigo, E. C.-W. Yu, M. Proell, N. Gombosuren, M. Krajewska, et al. 2013. “Vaccinia Virus F1L Protein Promotes Virulence by Inhibiting Inflammasome Activation.” Proceedings of the National Academy of Sciences 110 (19): 7808–13. doi:10.1073/pnas.1215995110. Geserick, P., J. Wang, R. Schilling, S. Horn, P. A. Harris, J. Bertin, P. J. Gough, M. Feoktistova, and M. Leverkus. 2015. “Absence of RIPK3 Predicts Necroptosis Resistance in Malignant Melanoma.” Cell Death & Disease 6 (September): e1884. doi:10.1038/cddis.2015.240. Geserick, Peter, Mike Hupe, Maryline Moulin, W. Wei-Lynn Wong, Maria Feoktistova, Beate Kellert, Harald Gollnick, John Silke, and Martin Leverkus. 2009. “Cellular IAPs Inhibit a Cryptic CD95-Induced Cell Death by Limiting RIP1 Kinase Recruitment.” The Journal of Cell Biology 187 (7): 1037–54. doi:10.1083/jcb.200904158. Gibson, Bryan A., and W. Lee Kraus. 2012. “New Insights into the Molecular and Cellular Functions of poly(ADP-Ribose) and PARPs.” Nature Reviews Molecular Cell Biology 13 (7): 411–24. doi:10.1038/nrm3376. Gillissen, B., A. Richter, A. Richter, T. Overkamp, F. Essmann, P. G. Hemmati, R. Preissner, C. Belka, and P. T. Daniel. 2013. “Targeted Therapy of the XIAP/Proteasome Pathway Overcomes TRAIL-Resistance in Carcinoma by Switching Apoptosis Signaling to a Bax/Bak-Independent ‘Type I’ Mode.” Cell Death & Disease 4 (May): e643. doi:10.1038/cddis.2013.67. Gloeckner, Christian Johannes, Annette Schumacher, Karsten Boldt, and Marius Ueffing. 2009. “The Parkinson Disease-Associated Protein Kinase LRRK2 Exhibits MAPKKK Activity and Phosphorylates MKK3/6 and MKK4/7, in Vitro.” Journal of Neurochemistry 109 (4): 959–68. doi:10.1111/j.1471-4159.2009.06024.x. Goh, Fera Y., Katrina L. T. P. Cook, Nadine Upton, Lin Tao, Lin Chin Lah, Bernard P. Leung, and W. S. Fred Wong. 2013. “Receptor-Interacting Protein 2 Gene Silencing Attenuates Allergic Airway Inflammation.” Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950) 191 (5): 2691–99. doi:10.4049/jimmunol.1202416. Gottlieb, A. B., C. Leonardi, F. Kerdel, S. Mehlis, M. Olds, and D. A. Williams. 2011. “Efficacy and Safety of Briakinumab vs. Etanercept and Placebo in Patients with Moderate to Severe Chronic Plaque Psoriasis.” The British Journal of Dermatology 165 (3): 652–60. doi:10.1111/j.1365-2133.2011.10418.x. Graaf, Winette T. A. van der, and Hans Gelderblom. 2012. “New Systemic Therapy Options for Advanced Sarcomas.” Current Treatment Options in Oncology 13 (3): 306–17. doi:10.1007/s11864-012-0196-2. Graaf, Winette T. A. van der, Daniel Orbach, Ian R. Judson, and Andrea Ferrari. 2017. “Soft Tissue Sarcomas in Adolescents and Young Adults: A Comparison with Their Paediatric and Adult Counterparts.” The Lancet. Oncology 18 (3): e166–75. doi:10.1016/S1470-2045(17)30099-2. Greggio, Elisa, Shushant Jain, Ann Kingsbury, Rina Bandopadhyay, Patrick Lewis, Alice Kaganovich, Marcel P. van der Brug, et al. 2006. “Kinase Activity Is Required for the Toxic Effects of Mutant LRRK2/Dardarin.” Neurobiology of Disease 23 (2): 329–41. doi:10.1016/j.nbd.2006.04.001. Greggio, Elisa, and Andrew Singleton. 2007. “Kinase Signaling Pathways as Potential Targets in the Treatment of Parkinson’s Disease.” Expert Review of Proteomics 4 (6): 783–92. doi:10.1586/14789450.4.6.783.

228

Griffiths, E. J., and A. P. Halestrap. 1991. “Further Evidence That Cyclosporin A Protects Mitochondria from Calcium Overload by Inhibiting a Matrix Peptidyl-Prolyl Cis- Trans Isomerase. Implications for the Immunosuppressive and Toxic Effects of Cyclosporin.” The Biochemical Journal 274 ( Pt 2) (March): 611–14. Gross, Olaf, Christina J. Thomas, Greta Guarda, and Jurg Tschopp. 2011. “The Inflammasome: An Integrated View.” Immunological Reviews 243 (1): 136–51. doi:10.1111/j.1600-065X.2011.01046.x. Günther, Claudia, Gui-Wei He, Andreas E. Kremer, James M. Murphy, Emma J. Petrie, Kerstin Amann, Peter Vandenabeele, et al. 2016. “The Pseudokinase MLKL Mediates Programmed Hepatocellular Necrosis Independently of RIPK3 during Hepatitis.” The Journal of Clinical Investigation 126 (11): 4346–60. doi:10.1172/JCI87545. Günther, Claudia, Eva Martini, Nadine Wittkopf, Kerstin Amann, Benno Weigmann, Helmut Neumann, Maximilian J. Waldner, et al. 2011. “Caspase-8 Regulates TNF-α-Induced Epithelial Necroptosis and Terminal Ileitis.” Nature 477 (7364): 335–39. doi:10.1038/nature10400. Günther, Claudia, Helmut Neumann, Markus F Neurath, and Christoph Becker. 2013. “Apoptosis, Necrosis and Necroptosis: Cell Death Regulation in the Intestinal Epithelium.” Gut 62 (7): 1062–71. doi:10.1136/gutjnl-2011-301364. Guo, Hongyan, William J. Kaiser, and Edward S. Mocarski. 2015. “Manipulation of Apoptosis and Necroptosis Signaling by Herpesviruses.” Medical Microbiology and Immunology 204 (3): 439–48. doi:10.1007/s00430-015-0410-5. Haas, Tobias L., Christoph H. Emmerich, Björn Gerlach, Anna C. Schmukle, Stefanie M. Cordier, Eva Rieser, Rebecca Feltham, et al. 2009. “Recruitment of the Linear Ubiquitin Chain Assembly Complex Stabilizes the TNF-R1 Signaling Complex and Is Required for TNF-Mediated Gene Induction.” Molecular Cell 36 (5): 831–44. doi:10.1016/j.molcel.2009.10.013. Hakkim, Abdul, Tobias A. Fuchs, Nancy E. Martinez, Simone Hess, Heino Prinz, Arturo Zychlinsky, and Herbert Waldmann. 2011. “Activation of the Raf-MEK-ERK Pathway Is Required for Neutrophil Extracellular Trap Formation.” Nature Chemical Biology 7 (2): 75–77. doi:10.1038/nchembio.496. Halestrap, A. P., and A. M. Davidson. 1990. “Inhibition of Ca2(+)-Induced Large-Amplitude Swelling of Liver and Heart Mitochondria by Cyclosporin Is Probably Caused by the Inhibitor Binding to Mitochondrial-Matrix Peptidyl-Prolyl Cis-Trans Isomerase and Preventing It Interacting with the Adenine Nucleotide Translocase.” The Biochemical Journal 268 (1): 153–60. Hampe, J., A. Cuthbert, P. J. Croucher, M. M. Mirza, S. Mascheretti, S. Fisher, H. Frenzel, et al. 2001. “Association between Insertion Mutation in NOD2 Gene and Crohn’s Disease in German and British Populations.” Lancet (London, England) 357 (9272): 1925–28. doi:10.1016/S0140-6736(00)05063-7. Han, Jiahuai, Chuan-Qi Zhong, and Duan-Wu Zhang. 2011. “Programmed Necrosis: Backup to and Competitor with Apoptosis in the Immune System.” Nature Immunology 12 (12): 1143–49. doi:10.1038/ni.2159. Han, Weidong, Ling Li, Shuang Qiu, Qinghua Lu, Qiangrong Pan, Ying Gu, Jianhong Luo, and Xun Hu. 2007. “Shikonin Circumvents Cancer Drug Resistance by Induction of a Necroptotic Death.” Molecular Cancer Therapeutics 6 (5): 1641–49. doi:10.1158/1535-7163.MCT-06-0511. Hanafusa, Hiroshi, Kouki Ishikawa, Shin Kedashiro, Tsukasa Saigo, Shun-Ichiro Iemura, Tohru Natsume, Masayuki Komada, Hiroshi Shibuya, Atsuki Nara, and Kunihiro Matsumoto. 2011. “Leucine-Rich Repeat Kinase LRRK1 Regulates Endosomal

229

Trafficking of the EGF Receptor.” Nature Communications 2 (January): 158. doi:10.1038/ncomms1161. Hanafusa, Hiroshi, and Kunihiro Matsumoto. 2015. “LRRK1 Regulates Spindle Orientation by Phosphorylating CDK5RAP2.” Cell Cycle (Georgetown, Tex.) 14 (21): 3349–50. doi:10.1080/15384101.2015.1093446. Handschumacher, R. E., M. W. Harding, J. Rice, R. J. Drugge, and D. W. Speicher. 1984. “Cyclophilin: A Specific Cytosolic Binding Protein for Cyclosporin A.” Science (New York, N.Y.) 226 (4674): 544–47. Hangen, Emilie, Klas Blomgren, Paule Bénit, Guido Kroemer, and Nazanine Modjtahedi. 2010. “Life with or without AIF.” Trends in Biochemical Sciences 35 (5): 278–87. doi:10.1016/j.tibs.2009.12.008. Harris, Philip A., Deepak Bandyopadhyay, Scott B. Berger, Nino Campobasso, Carol A. Capriotti, Julie A. Cox, Lauren Dare, et al. 2013. “Discovery of Small Molecule RIP1 Kinase Inhibitors for the Treatment of Pathologies Associated with Necroptosis.” ACS Medicinal Chemistry Letters 4 (12): 1238–43. doi:10.1021/ml400382p. Harris, Philip A., Scott B. Berger, Jae U Jeong, Rakesh Nagilla, Deepak Bandyopadhyay, Nino Campobasso, Carol A. Capriotti, et al. 2017. “Discovery of a First-in-Class Receptor Interacting Protein 1 (RIP1) Kinase Specific Clinical Candidate (GSK2982772) for the Treatment of Inflammatory Diseases.” Journal of Medicinal Chemistry, February. doi:10.1021/acs.jmedchem.6b01751. Harris, Philip A., Amogh Boloor, Mui Cheung, Rakesh Kumar, Renae M. Crosby, Ronda G. Davis-Ward, Andrea H. Epperly, et al. 2008. “Discovery of 5-[[4-[(2,3-Dimethyl-2H- Indazol-6-Yl)methylamino]-2-Pyrimidinyl]amino]-2-Methyl-Benzenesulfonamide (Pazopanib), a Novel and Potent Vascular Endothelial Growth Factor Receptor Inhibitor.” Journal of Medicinal Chemistry 51 (15): 4632–40. doi:10.1021/jm800566m. Harris, Philip A., Bryan W. King, Deepak Bandyopadhyay, Scott B. Berger, Nino Campobasso, Carol A. Capriotti, Julie A. Cox, et al. 2016. “DNA-Encoded Library Screening Identifies Benzo[b][1,4]oxazepin-4-Ones as Highly Potent and Monoselective Receptor Interacting Protein 1 Kinase Inhibitors.” Journal of Medicinal Chemistry 59 (5): 2163–78. doi:10.1021/acs.jmedchem.5b01898. Hasegawa, Mizuho, Yukari Fujimoto, Peter C. Lucas, Hiroyasu Nakano, Koichi Fukase, Gabriel Núñez, and Naohiro Inohara. 2008. “A Critical Role of RICK/RIP2 Polyubiquitination in Nod-Induced NF-kappaB Activation.” The EMBO Journal 27 (2): 373–83. doi:10.1038/sj.emboj.7601962. Hassin-Baer, Sharon, Yael Laitman, Esther Azizi, Irena Molchadski, Gilli Galore-Haskel, Frida Barak, Oren S. Cohen, and Eitan Friedman. 2009. “The Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) G2019S Substitution Mutation. Association with Parkinson Disease, Malignant Melanoma and Prevalence in Ethnic Groups in Israel.” Journal of Neurology 256 (3): 483–87. doi:10.1007/s00415-009-0117-x. Hatting, Maximilian, Gang Zhao, Fabienne Schumacher, Gernot Sellge, Malika Al Masaoudi, Nikolaus Gaβler, Mark Boekschoten, et al. 2013. “Hepatocyte Caspase-8 Is an Essential Modulator of Steatohepatitis in Rodents.” Hepatology (Baltimore, Md.) 57 (6): 2189–2201. doi:10.1002/hep.26271. Haugarvoll, Kristoffer, Mathias Toft, Owen A. Ross, Linda R. White, Jan O. Aasly, and Matthew J. Farrer. 2007. “Variants in the LRRK1 Gene and Susceptibility to Parkinson’s Disease in Norway.” Neuroscience Letters 416 (3): 299–301. doi:10.1016/j.neulet.2007.02.020. He, S., Y. Liang, F. Shao, and X. Wang. 2011. “Toll-like Receptors Activate Programmed Necrosis in Macrophages through a Receptor-Interacting Kinase-3-Mediated

230

Pathway.” Proceedings of the National Academy of Sciences 108 (50): 20054–59. doi:10.1073/pnas.1116302108. He, Sudan, Lai Wang, Lin Miao, Tao Wang, Fenghe Du, Liping Zhao, and Xiaodong Wang. 2009. “Receptor Interacting Protein Kinase-3 Determines Cellular Necrotic Response to TNF-α.” Cell 137 (6): 1100–1111. doi:10.1016/j.cell.2009.05.021. He, Yuan, Luigi Franchi, and Gabriel Núñez. 2013. “TLR Agonists Stimulate Nlrp3- Dependent IL-1β Production Independently of the Purinergic P2X7 Receptor in Dendritic Cells and in Vivo.” Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950) 190 (1): 334–39. doi:10.4049/jimmunol.1202737. Heneka, Michael T. 2017. “Inflammasome Activation and Innate Immunity in Alzheimer’s Disease.” Brain Pathology (Zurich, Switzerland) 27 (2): 220–22. doi:10.1111/bpa.12483. Hildebrand, Joanne M., Maria C. Tanzer, Isabelle S. Lucet, Samuel N. Young, Sukhdeep K. Spall, Pooja Sharma, Catia Pierotti, et al. 2014. “Activation of the Pseudokinase MLKL Unleashes the Four-Helix Bundle Domain to Induce Membrane Localization and Necroptotic Cell Death.” Proceedings of the National Academy of Sciences 111 (42): 15072–77. doi:10.1073/pnas.1408987111. Hoetzenecker, Wolfram, Tarun Mehra, Ieva Saulite, Martin Glatz, Peter Schmid- Grendelmeier, Emmanuella Guenova, Antonio Cozzio, and Lars E. French. 2016. “Toxic Epidermal Necrolysis.” F1000Research 5. doi:10.12688/f1000research.7574.1. Hofmans, Sam, Tom Vanden Berghe, Lars Devisscher, Behrouz Hassannia, Sophie Lyssens, Jurgen Joossens, Pieter Van Der Veken, Peter Vandenabeele, and Koen Augustyns. 2016. “Novel Ferroptosis Inhibitors with Improved Potency and ADME Properties.” Journal of Medicinal Chemistry 59 (5): 2041–53. doi:10.1021/acs.jmedchem.5b01641. Holland, Pamela, Cynthia Willis, Suzanne Kanaly, Moira Glaccum, Annjanette Warren, Keith Charrier, J. Murison, et al. 2002. “RIP4 Is an Ankyrin Repeat-Containing Kinase Essential for Keratinocyte Differentiation.” Current Biology: CB 12 (16): 1424–28. Holler, Nils, Rossana Zaru, Olivier Micheau, Margot Thome, Antoine Attinger, Salvatore Valitutti, Jean-Luc Bodmer, Pascal Schneider, Brian Seed, and Jürg Tschopp. 2000. “Fas Triggers an Alternative, Caspase-8–independent Cell Death Pathway Using the Kinase RIP as Effector Molecule.” Nature Immunology 1 (6): 489–495. Honarpisheh, Mohsen, Jyaysi Desai, Julian A. Marschner, Marc Weidenbusch, Maciej Lech, Volker Vielhauer, Hans-Joachim Anders, and Shrikant R. Mulay. 2016. “Regulated Necrosis-Related Molecule mRNA Expression in Humans and Mice and in Murine Acute Tissue Injury and Systemic Autoimmunity Leading to Progressive Organ Damage, and Progressive Fibrosis.” Bioscience Reports 36 (6). doi:10.1042/BSR20160336. Honda, O., M. Kuroda, I. Joja, J. Asaumi, Y. Takeda, S. Akaki, I. Togami, S. Kanazawa, S. Kawasaki, and Y. Hiraki. 2000. “Assessment of Secondary Necrosis of Jurkat Cells Using a New Microscopic System and Double Staining Method with Annexin V and Propidium Iodide.” International Journal of Oncology 16 (2): 283–88. Hornbeck, Peter V., Jon M. Kornhauser, Sasha Tkachev, Bin Zhang, Elzbieta Skrzypek, Beth Murray, Vaughan Latham, and Michael Sullivan. 2012. “PhosphoSitePlus: A Comprehensive Resource for Investigating the Structure and Function of Experimentally Determined Post-Translational Modifications in Man and Mouse.” Nucleic Acids Research 40 (Database issue): D261-270. doi:10.1093/nar/gkr1122. Hotchkiss, Richard S., Lyle L. Moldawer, Steven M. Opal, Konrad Reinhart, Isaiah R. Turnbull, and Jean-Louis Vincent. 2016. “Sepsis and Septic Shock.” Nature Reviews Disease Primers 2 (June): 16045. doi:10.1038/nrdp.2016.45.

231

Hsu, Hailing, Jianing Huang, Hong-Bing Shu, Vijay Baichwal, and David V Goeddel. 1996. “TNF-Dependent Recruitment of the Protein Kinase RIP to the TNF Receptor-1 Signaling Complex.” Immunity 4 (4): 387–96. doi:10.1016/S1074-7613(00)80252-6. Hu, Xun, Weidong Han, and Ling Li. 2007. “Targeting the Weak Point of Cancer by Induction of Necroptosis.” Autophagy 3 (5): 490–92. Hu, Y., V. Baud, M. Delhase, P. Zhang, T. Deerinck, M. Ellisman, R. Johnson, and M. Karin. 1999. “Abnormal Morphogenesis but Intact IKK Activation in Mice Lacking the IKKalpha Subunit of IkappaB Kinase.” Science (New York, N.Y.) 284 (5412): 316–20. Huang, Chuanjiang, Yinan Luo, Jingwei Zhao, Fuwei Yang, Hongwei Zhao, Wenhai Fan, and Pengfei Ge. 2013. “Shikonin Kills Glioma Cells through Necroptosis Mediated by RIP-1.” Edited by Robert W. Sobol. PLoS ONE 8 (6): e66326. doi:10.1371/journal.pone. 0066326. Hugot, J. P., M. Chamaillard, H. Zouali, S. Lesage, J. P. Cézard, J. Belaiche, S. Almer, et al. 2001. “Association of NOD2 Leucine-Rich Repeat Variants with Susceptibility to Crohn’s Disease.” Nature 411 (6837): 599–603. doi:10.1038/35079107. Humphries, F., S. Yang, B. Wang, and P. N. Moynagh. 2015. “RIP Kinases: Key Decision Makers in Cell Death and Innate Immunity.” Cell Death and Differentiation 22 (2): 225. doi:10.1038/cdd.2014.126. Ikeda, Fumiyo, Yonathan Lissanu Deribe, Sigrid S. Skånland, Benjamin Stieglitz, Caroline Grabbe, Mirita Franz-Wachtel, Sjoerd J. L. van Wijk, et al. 2011. “SHARPIN Forms a Linear Ubiquitin Ligase Complex Regulating NF-κB Activity and Apoptosis.” Nature 471 (7340): 637–41. doi:10.1038/nature09814. Inohara, N., L. del Peso, T. Koseki, S. Chen, and G. Núñez. 1998. “RICK, a Novel Protein Kinase Containing a Caspase Recruitment Domain, Interacts with CLARP and Regulates CD95-Mediated Apoptosis.” The Journal of Biological Chemistry 273 (20): 12296–300. Inoue, Jun-ichiro, Takaomi Ishida, Nobuo Tsukamoto, Norihiko Kobayashi, Asuka Naito, Sakura Azuma, and Tadashi Yamamoto. 2000. “Tumor Necrosis Factor Receptor- Associated Factor (TRAF) Family: Adapter Proteins That Mediate Cytokine Signaling.” Experimental Cell Research 254 (1): 14–24. doi:10.1006/excr.1999.4733. Irmler, M., M. Thome, M. Hahne, P. Schneider, K. Hofmann, V. Steiner, J. L. Bodmer, et al. 1997. “Inhibition of Death Receptor Signals by Cellular FLIP.” Nature 388 (6638): 190–95. doi:10.1038/40657. Ishimura, Norihisa, Hajime Isomoto, Steven F. Bronk, and Gregory J. Gores. 2006. “Trail Induces Cell Migration and Invasion in Apoptosis-Resistant Cholangiocarcinoma Cells.” American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology 290 (1): G129-136. doi:10.1152/ajpgi.00242.2005. Jacquet, Sebastien, Yasuhiro Nishino, Sarawut Kumphune, Pierre Sicard, James E. Clark, Koichi S. Kobayashi, Richard A. Flavell, Jan Eickhoff, Matt Cotten, and Michael S. Marber. 2008. “The Role of RIP2 in p38 MAPK Activation in the Stressed Heart.” The Journal of Biological Chemistry 283 (18): 11964–71. doi:10.1074/jbc.M707750200. Jagtap, Prakash G., Alexei Degterev, Sungwoon Choi, Heather Keys, Junying Yuan, and Gregory D. Cuny. 2007. “Structure-Activity Relationship Study of Tricyclic Necroptosis Inhibitors.” Journal of Medicinal Chemistry 50 (8): 1886–95. doi:10.1021/jm061016o. Jin, Zhaoyu, and Wafik S. El-Deiry. 2005. “Overview of Cell Death Signaling Pathways.” Cancer Biology & Therapy 4 (2): 139–63.

232

Jin, Zhaoyu, and Wafik S. El-Deiry. 2006. “Distinct Signaling Pathways in TRAIL- versus Tumor Necrosis Factor-Induced Apoptosis.” Molecular and Cellular Biology 26 (21): 8136–48. doi:10.1128/MCB.00257-06. Jorgensen, Nathan D., Yong Peng, Cherry C.-Y. Ho, Hardy J. Rideout, Donald Petrey, Peng Liu, and William T. Dauer. 2009. “The WD40 Domain Is Required for LRRK2 Neurotoxicity.” PloS One 4 (12): e8463. doi:10.1371/journal.pone.0008463. Jost, Philipp J., Stephanie Grabow, Daniel Gray, Mark D. McKenzie, Ueli Nachbur, David C. S. Huang, Philippe Bouillet, et al. 2009. “XIAP Discriminates between Type I and Type II FAS-Induced Apoptosis.” Nature 460 (7258): 1035–39. doi:10.1038/nature08229. Jouan-Lanhouet, S., M. I. Arshad, Claire Piquet-Pellorce, Corinne Martin-Chouly, Gwenaelle Le Moigne-Muller, Franky Van Herreweghe, Nozomi Takahashi, et al. 2012. “TRAIL Induces Necroptosis Involving RIPK1/RIPK3-Dependent PARP-1 Activation.” Cell Death & Differentiation 19 (12): 2003–2014. Jouan-Lanhouet, Sandrine, Franck Riquet, Linde Duprez, Tom Vanden Berghe, Nozomi Takahashi, and Peter Vandenabeele. 2014. “Necroptosis, in Vivo Detection in Experimental Disease Models.” Seminars in Cell & Developmental Biology, Regulated Necrosis & Modeling developmental signaling pathways & Development of connective maps in the brain, 35 (November): 2–13. doi:10.1016/j.semcdb.2014.08.010. Kaczmarek, Agnieszka, Peter Vandenabeele, and Dmitri V. Krysko. 2013. “Necroptosis: The Release of Damage-Associated Molecular Patterns and Its Physiological Relevance.” Immunity 38 (2): 209–23. doi:10.1016/j.immuni.2013.02.003. Kaiser, W. J., L. P. Daley-Bauer, R. J. Thapa, P. Mandal, S. B. Berger, C. Huang, A. Sundararajan, et al. 2014. “RIP1 Suppresses Innate Immune Necrotic as Well as Apoptotic Cell Death during Mammalian Parturition.” Proceedings of the National Academy of Sciences 111 (21): 7753–58. doi:10.1073/pnas.1401857111. Kaiser, W. J., H. Sridharan, C. Huang, P. Mandal, J. W. Upton, P. J. Gough, C. A. Sehon, R. W. Marquis, J. Bertin, and E. S. Mocarski. 2013. “Toll-like Receptor 3-Mediated Necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL.” Journal of Biological Chemistry 288 (43): 31268–79. doi:10.1074/jbc.M113.462341. Kaiser, W. J., J. W. Upton, and E. S. Mocarski. 2008. “Receptor-Interacting Protein Homotypic Interaction Motif-Dependent Control of NF- B Activation via the DNA- Dependent Activator of IFN Regulatory Factors.” The Journal of Immunology 181 (9): 6427–34. doi:10.4049/jimmunol.181.9.6427. Kaiser, William J., and Margaret K. Offermann. 2005. “Apoptosis Induced by the Toll-like Receptor Adaptor TRIF Is Dependent on Its Receptor Interacting Protein Homotypic Interaction Motif.” Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950) 174 (8): 4942–52. Kaiser, William J., Jason W. Upton, Alyssa B. Long, Devon Livingston-Rosanoff, Lisa P. Daley-Bauer, Razqallah Hakem, Tamara Caspary, and Edward S. Mocarski. 2011. “RIP3 Mediates the Embryonic Lethality of Caspase-8-Deficient Mice.” Nature 471 (7338): 368–72. doi:10.1038/nature09857. Kaiser, William J, Jason W Upton, and Edward S Mocarski. 2013. “Viral Modulation of Programmed Necrosis.” Current Opinion in Virology 3 (3): 296–306. doi:10.1016/j.coviro.2013.05.019. Kalai, Michaël, Geert Van Loo, T. Vanden Berghe, Ann Meeus, Wilhelmina Burm, Xavier Saelens, and Peter Vandenabeele. 2002. “Tipping the Balance between Necrosis and Apoptosis in Human and Murine Cells Treated with Interferon and dsRNA.” Cell Death and Differentiation 9 (9): 981.

233

Kanayama, Atsuhiro, Rashu B. Seth, Lijun Sun, Chee-Kwee Ea, Mei Hong, Abdullah Shaito, Yu-Hsin Chiu, Li Deng, and Zhijian J. Chen. 2004. “TAB2 and TAB3 Activate the NF-kappaB Pathway through Binding to Polyubiquitin Chains.” Molecular Cell 15 (4): 535–48. doi:10.1016/j.molcel.2004.08.008. Kaneko, Y., M. Harada, T. Kawano, M. Yamashita, Y. Shibata, F. Gejyo, T. Nakayama, and M. Taniguchi. 2000. “Augmentation of V a14 NKT Cell–mediated Cytotoxicity by Interleukin 4 in an Autocrine Mechanism Resulting in the Development of Concanavalin A–induced Hepatitis.” J. Exp. Med. 191 (1): 105–14. Kang, Seokwon, Teresa Fernandes-Alnemri, Corey Rogers, Lindsey Mayes, Ying Wang, Christopher Dillon, Linda Roback, et al. 2015a. “Caspase-8 Scaffolding Function and MLKL Regulate NLRP3 Inflammasome Activation Downstream of TLR3.” Nature Communications 6 (June): 7515. doi:10.1038/ncomms8515. Kang, Young Jun, Bo-Ram Bang, Kyung Ho Han, Lixin Hong, Eun-Jin Shim, Jianhui Ma, Richard A. Lerner, and Motoyuki Otsuka. 2015b. “Regulation of NKT Cell-Mediated Immune Responses to Tumours and Liver Inflammation by Mitochondrial PGAM5- Drp1 Signalling.” Nature Communications 6 (September): 8371. doi:10.1038/ncomms 9371. Kaplowitz, Neil, Sanda Win, Tin Aung Than, Zhang-Xu Liu, and Lily Dara. 2015. “Targeting Signal Transduction Pathways Which Regulate Necrosis in Acetaminophen Hepatotoxicity.” Journal of Hepatology 63 (1): 5–7. doi:10.1016/j.jhep.2015.02.050. Karl, I., M. Jossberger-Werner, N. Schmidt, S. Horn, M. Goebeler, M. Leverkus, H. Wajant, and T. Giner. 2014. “TRAF2 Inhibits TRAIL- and CD95L-Induced Apoptosis and Necroptosis.” Cell Death & Disease 5 (October): e1444. doi:10.1038/cddis.2014.404. Kasof, Gary M, Judith C Prosser, Derong Liu, Matthew V Lorenzi, and Bruce C Gomes. 2000. “The RIP-like Kinase, RIP3, Induces Apoptosis and NF-κB Nuclear Translocation and Localizes to Mitochondria.” FEBS Letters 473 (3): 285–91. doi:10.1016/S0014-5793(00)01473-3. Kawane, K., H. Tanaka, Y. Kitahara, S. Shimaoka, and S. Nagata. 2010. “Cytokine- Dependent but Acquired Immunity-Independent Arthritis Caused by DNA Escaped from Degradation.” Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (45): 19432–37. doi:10.1073/pnas.1010603107. Kearney, Conor J., and Seamus J. Martin. 2017. “An Inflammatory Perspective on Necroptosis.” Molecular Cell 65 (6): 965–73. doi:10.1016/j.molcel.2017.02.024. Kelliher, Michelle A., Stefan Grimm, Yasumasa Ishida, Frank Kuo, Ben Z. Stanger, and Philip Leder. 1998. “The Death Domain Kinase RIP Mediates the TNF-Induced NF- κB Signal.” Immunity 8 (3): 297–303. Kemp, T. J., J.-S. Kim, S. A. Crist, and T. S. Griffith. 2003. “Induction of Necrotic Tumor Cell Death by TRAIL/Apo-2L.” Apoptosis 8 (6): 587–599. Kerr, John FR, Andrew H. Wyllie, and Alastair R. Currie. 1972. “Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-Ranging Implications in Tissue Kinetics.” British Journal of Cancer 26 (4): 239. Khadra, Nadine, Laurence Bresson-Bepoldin, Aubin Penna, Benjamin Chaigne-Delalande, Bruno Ségui, Thierry Levade, Anne-Marie Vacher, et al. 2011. “CD95 Triggers Orai1- Mediated Localized Ca2+ Entry, Regulates Recruitment of Protein Kinase C (PKC) β2, and Prevents Death-Inducing Signaling Complex Formation.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 (47): 19072–77. doi:10.1073/pnas.1116946108. Kim, J. W., C. O. Joe, and E. J. Choi. 2001. “Role of Receptor-Interacting Protein in Tumor Necrosis Factor-Alpha -Dependent MEKK1 Activation.” The Journal of Biological Chemistry 276 (29): 27064–70. doi:10.1074/jbc.M009364200.

234

Kim, Sue Kyung, Woo-Jung Kim, Jung-Ho Yoon, Jae-Hoon Ji, Michael J. Morgan, Hyeseong Cho, You Chan Kim, and You-Sun Kim. 2015. “Upregulated RIP3 Expression Potentiates MLKL Phosphorylation-Mediated Programmed Necrosis in Toxic Epidermal Necrolysis.” The Journal of Investigative Dermatology 135 (8): 2021–30. doi:10.1038/jid.2015.90. Kim, You-Sun, Michael J. Morgan, Swati Choksi, and Zheng-Gang Liu. 2007. “TNF-Induced Activation of the Nox1 NADPH Oxidase and Its Role in the Induction of Necrotic Cell Death.” Molecular Cell 26 (5): 675–87. doi:10.1016/j.molcel.2007.04.021. Kim, Yun-Gi, Jong-Hwan Park, Thornik Reimer, Darren P. Baker, Taro Kawai, Himanshu Kumar, Shizuo Akira, Christiane Wobus, and Gabriel Núñez. 2011. “Viral Infection Augments Nod1/2 Signaling to Potentiate Lethality Associated with Secondary Bacterial Infections.” Cell Host & Microbe 9 (6): 496–507. doi:10.1016/j.chom. 2011.05.006. Kinoshita, Yuri, and Hidehisa Saeki. 2017. “A Review of Toxic Epidermal Necrolysis Management in Japan.” Allergology International: Official Journal of the Japanese Society of Allergology 66 (1): 36–41. doi:10.1016/j.alit.2016.06.001. Kischkel, F. C., S. Hellbardt, I. Behrmann, M. Germer, M. Pawlita, P. H. Krammer, and M. E. Peter. 1995. “Cytotoxicity-Dependent APO-1 (Fas/CD95)-Associated Proteins Form a Death-Inducing Signaling Complex (DISC) with the Receptor.” The EMBO Journal 14 (22): 5579–88. Kitur, Kipyegon, Dane Parker, Pamela Nieto, Danielle S. Ahn, Taylor S. Cohen, Samuel Chung, Sarah Wachtel, Susan Bueno, and Alice Prince. 2015. “Toxin-Induced Necroptosis Is a Major Mechanism of Staphylococcus Aureus Lung Damage.” PLoS Pathogens 11 (4): e1004820. doi:10.1371/journal.ppat.1004820. Kobayashi, Koichi, Naohiro Inohara, Lorraine D. Hernandez, Jorge E. Galán, Gabriel Núñez, Charles A. Janeway, Ruslan Medzhitov, and Richard A. Flavell. 2002. “RICK/Rip2/CARDIAK Mediates Signalling for Receptors of the Innate and Adaptive Immune Systems.” Nature 416 (6877): 194–99. doi:10.1038/416194a. Koo, Gi-Bang, Michael J. Morgan, Da-Gyum Lee, Woo-Jung Kim, Jung-Ho Yoon, Ja Seung Koo, Seung Il Kim, et al. 2015. “Methylation-Dependent Loss of RIP3 Expression in Cancer Represses Programmed Necrosis in Response to Chemotherapeutics.” Cell Research 25 (6): 707–25. doi:10.1038/cr.2015.56. Kovalenko, Andrew, Jin-Chul Kim, Tae-Bong Kang, Akhil Rajput, Konstantin Bogdanov, Oliver Dittrich-Breiholz, Michael Kracht, Ori Brenner, and David Wallach. 2009. “Caspase-8 Deficiency in Epidermal Keratinocytes Triggers an Inflammatory Skin Disease.” The Journal of Experimental Medicine 206 (10): 2161–77. doi:10.1084/jem.20090616. Kreuz, Sebastian, Daniela Siegmund, Jost-Julian Rumpf, Dierk Samel, Martin Leverkus, Ottmar Janssen, Georg Häcker, et al. 2004. “NFkappaB Activation by Fas Is Mediated through FADD, Caspase-8, and RIP and Is Inhibited by FLIP.” The Journal of Cell Biology 166 (3): 369–80. doi:10.1083/jcb.200401036. Krieg, Andreas, Ricardo G. Correa, Jason B. Garrison, Gaëlle Le Negrate, Kate Welsh, Ziwei Huang, Wolfram T. Knoefel, and John C. Reed. 2009. “XIAP Mediates NOD Signaling via Interaction with RIP2.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106 (34): 14524–29. doi:10.1073/pnas.0907131106. Kroemer, G, W S El-Deiry, P Golstein, M E Peter, D Vaux, P Vandenabeele, B Zhivotovsky, et al. 2005. “Classification of Cell Death: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death.” Cell Death and Differentiation 12 (November): 1463–67. doi:10.1038/sj.cdd.4401724.

235

Kroemer, G., L. Galluzzi, and C. Brenner. 2007. “Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death.” Physiological Reviews 87 (1): 99–163. doi:10.1152/physrev.00013. 2006. Kroemer, G, L Galluzzi, P Vandenabeele, J Abrams, E S Alnemri, E H Baehrecke, M V Blagosklonny, et al. 2009. “Classification of Cell Death: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009.” Cell Death and Differentiation 16 (1): 3–11. doi:10.1038/cdd.2008.150. Krueger, A., I. Schmitz, S. Baumann, P. H. Krammer, and S. Kirchhoff. 2001. “Cellular FLICE-Inhibitory Protein Splice Variants Inhibit Different Steps of Caspase-8 Activation at the CD95 Death-Inducing Signaling Complex.” The Journal of Biological Chemistry 276 (23): 20633–40. doi:10.1074/jbc.M101780200. Kufareva, Irina, and Ruben Abagyan. 2008. “Type-II Kinase Inhibitor Docking, Screening, and Profiling Using Modified Structures of Active Kinase States.” Journal of Medicinal Chemistry 51 (24): 7921–32. doi:10.1021/jm8010299. Kumari, Snehlata, Marion C. Bonnet, Maria H. Ulvmar, Kerstin Wolk, Niki Karagianni, Ellen Witte, Claudia Uthoff-Hachenberg, et al. 2013. “Tumor Necrosis Factor Receptor Signaling in Keratinocytes Triggers Interleukin-24-Dependent Psoriasis-like Skin Inflammation in Mice.” Immunity 39 (5): 899–911. doi:10.1016/j.immuni.2013.10.009. Kung, Gloria, Klitos Konstantinidis, and Richard N. Kitsis. 2011. “Programmed Necrosis, Not Apoptosis, in the Heart.” Circulation Research 108 (8): 1017–36. doi:10.1161/CIRCRESAHA.110.225730. Künstle, Gerald, Hannes Hentze, Paul-Georg Germann, Gisa Tiegs, Thomas Meergans, and Albrecht Wendel. 1999. “Concanavalin A Hepatotoxicity in Mice: Tumor Necrosis Factor–mediated Organ Failure Independent of Caspase-3–like Protease Activation.” Hepatology 30 (5): 1241–51. doi:10.1002/hep.510300517. Kurenova, Elena, Li-Hui Xu, Xihui Yang, Albert S. Baldwin, Rolf J. Craven, Steven K. Hanks, Zheng-Gang Liu, and William G. Cance. 2004. “Focal Adhesion Kinase Suppresses Apoptosis by Binding to the Death Domain of Receptor-Interacting Protein.” Molecular and Cellular Biology 24 (10): 4361–71. Küsters, Sabine, Gisa Tiegs, Lena Alexopoulou, Manolis Pasparakis, Eleni Douni, Gerald Künstle, Horst Bluethmann, et al. 1997. “In Vivo Evidence for a Functional Role of Both Tumor Necrosis Factor (TNF) Receptors and Transmembrane TNF in Experimental Hepatitis.” European Journal of Immunology 27 (11): 2870–75. doi:10.1002/eji.1830271119. Lachaier, Emma, Christophe Louandre, Zakaria Ezzoukhry, Corinne Godin, Jean-Claude Mazière, Bruno Chauffert, and Antoine Galmiche. 2014. “[Ferroptosis, a new form of cell death relevant to the medical treatment of cancer].” Medecine Sciences: M/S 30 (8–9): 779–83. doi:10.1051/medsci/20143008016. Lachmann, Helen J., Philip Lowe, Sandra Daniela Felix, Christiane Rordorf, Kieron Leslie, Sheril Madhoo, Helmut Wittkowski, et al. 2009. “In Vivo Regulation of Interleukin 1beta in Patients with Cryopyrin-Associated Periodic Syndromes.” The Journal of Experimental Medicine 206 (5): 1029–36. doi:10.1084/jem.20082481. Lamkanfi, Mohamed, and Vishva M. Dixit. 2010. “Manipulation of Host Cell Death Pathways during Microbial Infections.” Cell Host & Microbe 8 (1): 44–54. doi:10.1016/j.chom.2010.06.007. Lau, A., S. Wang, J. Jiang, A. Haig, A. Pavlosky, A. Linkermann, Z.-X. Zhang, and A. M. Jevnikar. 2013. “RIPK3-Mediated Necroptosis Promotes Donor Kidney Inflammatory Injury and Reduces Allograft Survival: RIPK3-Mediated Necroptosis and Renal

236

Allograft Injury.” American Journal of Transplantation 13 (11): 2805–18. doi:10.1111/ajt.12447. Lawlor, Kate E., Nufail Khan, Alison Mildenhall, Motti Gerlic, Ben A. Croker, Akshay A. D’Cruz, Cathrine Hall, et al. 2015. “RIPK3 Promotes Cell Death and NLRP3 Inflammasome Activation in the Absence of MLKL.” Nature Communications 6 (February): 6282. doi:10.1038/ncomms7282. LeBlanc, H. N., and A. Ashkenazi. 2003. “Apo2L/TRAIL and Its Death and Decoy Receptors.” Cell Death and Differentiation 10 (1): 66–75. doi:10.1038/sj.cdd.4401187. LeBlanc, Philippe M., Garabet Yeretssian, Nancy Rutherford, Karine Doiron, Amal Nadiri, Lei Zhu, Douglas R. Green, Samantha Gruenheid, and Maya Saleh. 2008. “Caspase-12 Modulates NOD Signaling and Regulates Antimicrobial Peptide Production and Mucosal Immunity.” Cell Host & Microbe 3 (3): 146–57. doi:10.1016/j.chom. 2008.02.004. Lee, Youngil, and Asa B. Gustafsson. 2009. “Role of Apoptosis in Cardiovascular Disease.” Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death 14 (4): 536–48. doi:10.1007/s10495-008-0302-x. Legarda-Addison, D., H. Hase, M. A. O’Donnell, and A. T. Ting. 2009. “NEMO/IKKgamma Regulates an Early NF-kappaB-Independent Cell-Death Checkpoint during TNF Signaling.” Cell Death and Differentiation 16 (9): 1279–88. doi:10.1038/cdd.2009.41. Leist, M., B. Single, A. F. Castoldi, S. Kühnle, and P. Nicotera. 1997. “Intracellular Adenosine Triphosphate (ATP) Concentration: A Switch in the Decision between Apoptosis and Necrosis.” The Journal of Experimental Medicine 185 (8): 1481–86. Leist, Marcel, Florian Gantner, G. KÃ$1/4$nstle, Ines Bohlinger, Gisa Tiegs, Horst Bluethmann, and Albrecht Wendel. 1996. “The 55-kD Tumor Necrosis Factor Receptor and CD95 Independently Signal Murine Hepatocyte Apoptosis and Subsequent Liver Failure.” Molecular Medicine 2 (1): 109. Lewis, Patrick A., Elisa Greggio, Alexandra Beilina, Shushant Jain, Acacia Baker, and Mark R. Cookson. 2007. “The R1441C Mutation of LRRK2 Disrupts GTP Hydrolysis.” Biochemical and Biophysical Research Communications 357 (3): 668–71. doi:10.1016/j.bbrc.2007.04.006. Li, Dianrong, Tao Xu, Yang Cao, Huayi Wang, Lin Li, She Chen, Xiaodong Wang, and Zhirong Shen. 2015. “A Cytosolic Heat Shock Protein 90 and Cochaperone CDC37 Complex Is Required for RIP3 Activation during Necroptosis.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112 (16): 5017–22. doi:10.1073/pnas.1505244112. Li, Jixi, Thomas McQuade, Ansgar B. Siemer, Johanna Napetschnig, Kenta Moriwaki, Yu- Shan Hsiao, Ermelinda Damko, et al. 2012. “The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis.” Cell 150 (2): 339–50. doi:10.1016/j.cell.2012.06.019. Li, J-X, J-M Feng, Y Wang, X-H Li, X-X Chen, Y Su, Y-Y Shen, et al. 2014. “The B- RafV600E Inhibitor Dabrafenib Selectively Inhibits RIP3 and Alleviates Acetaminophen-Induced Liver Injury.” Cell Death and Disease 5 (6): e1278. doi:10.1038/cddis.2014.241. Li, Q., Q. Lu, J. Y. Hwang, D. Büscher, K. F. Lee, J. C. Izpisua-Belmonte, and I. M. Verma. 1999. “IKK1-Deficient Mice Exhibit Abnormal Development of Skin and Skeleton.” Genes & Development 13 (10): 1322–28. Li, Yi-Yang Yvonne, Thomas M. Zollner, and Michael P. Schön. 2008. “Targeting Leukocyte Recruitment in the Treatment of Psoriasis.” Clinics in Dermatology 26 (5): 527–38. doi:10.1016/j.clindermatol.2007.11.002.

237

Liedtke, Christian, Jörg–Martin Bangen, Julia Freimuth, Naiara Beraza, Daniela Lambertz, Francisco J. Cubero, Maximilian Hatting, et al. 2011. “Loss of Caspase-8 Protects Mice Against Inflammation-Related Hepatocarcinogenesis but Induces Non-Apoptotic Liver Injury.” Gastroenterology 141 (6): 2176–87. doi:10.1053/j.gastro.2011.08.037. Lim, S. Y., S. M. Davidson, M. M. Mocanu, D. M. Yellon, and C. C. T. Smith. 2007. “The Cardioprotective Effect of Necrostatin Requires the Cyclophilin-D Component of the Mitochondrial Permeability Transition Pore.” Cardiovascular Drugs and Therapy 21 (6): 467–69. doi:10.1007/s10557-007-6067-6. Lin, Juan, Snehlata Kumari, Chun Kim, Trieu-My Van, Laurens Wachsmuth, Apostolos Polykratis, and Manolis Pasparakis. 2016. “RIPK1 Counteracts ZBP1-Mediated Necroptosis to Inhibit Inflammation.” Nature 540 (7631): 124–28. doi:10.1038/nature20558. Lin, Y. C., K. Brown, and U. Siebenlist. 1995. “Activation of NF-Kappa B Requires Proteolysis of the Inhibitor I Kappa B-Alpha: Signal-Induced Phosphorylation of I Kappa B-Alpha Alone Does Not Release Active NF-Kappa B.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92 (2): 552–56. Lin, Y., A. Devin, A. Cook, M. M. Keane, M. Kelliher, S. Lipkowitz, and Z. G. Liu. 2000. “The Death Domain Kinase RIP Is Essential for TRAIL (Apo2L)-Induced Activation of IkappaB Kinase and c-Jun N-Terminal Kinase.” Molecular and Cellular Biology 20 (18): 6638–45. Lin, Y., A. Devin, Y. Rodriguez, and Z. G. Liu. 1999. “Cleavage of the Death Domain Kinase RIP by Caspase-8 Prompts TNF-Induced Apoptosis.” Genes & Development 13 (19): 2514–26. Linkermann, A., J. H. Brasen, M. Darding, M. K. Jin, A. B. Sanz, J.-O. Heller, F. De Zen, et al. 2013a. “Two Independent Pathways of Regulated Necrosis Mediate Ischemia- Reperfusion Injury.” Proceedings of the National Academy of Sciences 110 (29): 12024–29. doi:10.1073/pnas.1305538110. Linkermann, A., J.-O. Heller, A. Prokai, J. M. Weinberg, F. De Zen, N. Himmerkus, A. J. Szabo, J. H. Brasen, U. Kunzendorf, and S. Krautwald. 2013b. “The RIP1-Kinase Inhibitor Necrostatin-1 Prevents Osmotic Nephrosis and Contrast-Induced AKI in Mice.” Journal of the American Society of Nephrology 24 (10): 1545–57. doi:10.1681/ASN.2012121169. Linkermann, Andreas, Jan H. Bräsen, Nina Himmerkus, Shuya Liu, Tobias B. Huber, Ulrich Kunzendorf, and Stefan Krautwald. 2012. “Rip1 (Receptor-Interacting Protein Kinase 1) Mediates Necroptosis and Contributes to Renal Ischemia/Reperfusion Injury.” Kidney International 81 (8): 751–761. Linkermann, Andreas, Rachid Skouta, Nina Himmerkus, Shrikant R. Mulay, Christin Dewitz, Federica De Zen, Agnes Prokai, et al. 2014. “Synchronized Renal Tubular Cell Death Involves Ferroptosis.” Proceedings of the National Academy of Sciences 111 (47): 16836–41. doi:10.1073/pnas.1415518111. Liu, Yang, Wei Wang, Yuyao Li, Yunqi Xiao, Jian Cheng, and Jia Jia. 2015. “The 5- Lipoxygenase Inhibitor Zileuton Confers Neuroprotection against Glutamate Oxidative Damage by Inhibiting Ferroptosis.” Biological & Pharmaceutical Bulletin 38 (8): 1234–39. doi:10.1248/bpb.b15-00048. Liu, Yi, and Nathanael S. Gray. 2006. “Rational Design of Inhibitors That Bind to Inactive Kinase Conformations.” Nature Chemical Biology 2 (7): 358–64. doi:10.1038/nchembio799. Liu, Zhihua, Jinwoo Lee, Scott Krummey, Wei Lu, Huaibin Cai, and Michael J. Lenardo. 2011. “The Kinase LRRK2 Is a Regulator of the Transcription Factor NFAT That

238

Modulates the Severity of Inflammatory Bowel Disease.” Nature Immunology 12 (11): 1063–70. doi:10.1038/ni.2113. Liu, Zhihua, and Michael J. Lenardo. 2012. “The Role of LRRK2 in Inflammatory Bowel Disease.” Cell Research 22 (7): 1092–94. doi:10.1038/cr.2012.42. Lloyd-Jones, Donald, Robert J. Adams, Todd M. Brown, Mercedes Carnethon, Shifan Dai, Giovanni De Simone, T. Bruce Ferguson, et al. 2010. “Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2010 Update: A Report from the American Heart Association.” Circulation 121 (7): 948–54. doi:10.1161/CIRCULATIONAHA. 109.192666. Lo, Eng H., Turgay Dalkara, and Michael A. Moskowitz. 2003. “Neurological Diseases: Mechanisms, Challenges and Opportunities in Stroke.” Nature Reviews Neuroscience 4 (5): 399–414. doi:10.1038/nrn1106. Lonskaya, I., V. N. Potaman, L. S. Shlyakhtenko, E. A. Oussatcheva, Y. L. Lyubchenko, and V. A. Soldatenkov. 2005. “Regulation of Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1 by DNA Structure-Specific Binding.” Journal of Biological Chemistry 280 (17): 17076–83. doi:10.1074/jbc.M413483200. Lőrincz, Tamás, Katalin Jemnitz, Tamás Kardon, József Mandl, and András Szarka. 2015. “Ferroptosis Is Involved in Acetaminophen Induced Cell Death.” Pathology Oncology Research: POR 21 (4): 1115–21. doi:10.1007/s12253-015-9946-3. Luedde, Mark, Matthias Lutz, Natalie Carter, Justyna Sosna, Christoph Jacoby, Mihael Vucur, Jérémie Gautheron, et al. 2014. “RIP3, a Kinase Promoting Necroptotic Cell Death, Mediates Adverse Remodelling after Myocardial Infarction.” Cardiovascular Research 103 (2): 206–16. doi:10.1093/cvr/cvu146. Madhusudan, Srinivasan, Martin Foster, Sethupathi R. Muthuramalingam, Jeremy P. Braybrooke, Susan Wilner, Kulwinder Kaur, Cheng Han, et al. 2004. “A Phase II Study of Etanercept (Enbrel), a Tumor Necrosis Factor Alpha Inhibitor in Patients with Metastatic Breast Cancer.” Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research 10 (19): 6528–34. doi:10.1158/1078- 0432.CCR-04-0730. Maelfait, Jonathan, Elisabeth Vercammen, Sophie Janssens, Peter Schotte, Mira Haegman, Stefan Magez, and Rudi Beyaert. 2008. “Stimulation of Toll-like Receptor 3 and 4 Induces Interleukin-1beta Maturation by Caspase-8.” The Journal of Experimental Medicine 205 (9): 1967–73. doi:10.1084/jem.20071632. Mahoney, D. J., H. H. Cheung, R. Lejmi Mrad, S. Plenchette, C. Simard, E. Enwere, V. Arora, et al. 2008. “Both cIAP1 and cIAP2 Regulate TNFalpha-Mediated NF-kappaB Activation.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105 (33): 11778–83. doi:10.1073/pnas.0711122105. Malhi, H., M. E. Guicciardi, and G. J. Gores. 2010. “Hepatocyte Death: A Clear and Present Danger.” Physiological Reviews 90 (3): 1165–94. doi:10.1152/physrev.00061.2009. Malhi, Harmeet, and Gregory J. Gores. 2008. “Molecular Mechanisms of Lipotoxicity in Nonalcoholic Fatty Liver Disease.” Seminars in Liver Disease 28 (4): 360–69. doi:10.1055/s-0028-1091980. Malleter, Marine, Sébastien Tauzin, Alban Bessede, Rémy Castellano, Armelle Goubard, Florence Godey, Jean Levêque, et al. 2013. “CD95L Cell Surface Cleavage Triggers a Prometastatic Signaling Pathway in Triple-Negative Breast Cancer.” Cancer Research 73 (22): 6711–21. doi:10.1158/0008-5472.CAN-13-1794. Mandal, Pratyusha, Scott B. Berger, Sirika Pillay, Kenta Moriwaki, Chunzi Huang, Hongyan Guo, John D. Lich, et al. 2014. “RIP3 Induces Apoptosis Independent of Pronecrotic Kinase Activity.” Molecular Cell 56 (4): 481–95. doi:10.1016/j.molcel.2014.10.021.

239

Manning, G., D. B. Whyte, R. Martinez, T. Hunter, and S. Sudarsanam. 2002. “The Protein Kinase Complement of the Human Genome.” Science 298 (5600): 1912–34. Manzo, Fabio, Angela Nebbioso, Marco Miceli, Mariarosaria Conte, Floriana De Bellis, Vincenzo Carafa, Gianluigi Franci, Francesco P. Tambaro, and Lucia Altucci. 2009. “TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand: Signalling of a ‘Smart’ Molecule.” The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 41 (3): 460–66. doi:10.1016/j.biocel.2007.12.012. Marcinek, Patrick, Aditya Nath Jha, Vidyagouri Shinde, Arun Sundaramoorthy, Raja Rajkumar, Naveen Chandra Suryadevara, Sanjeev Kumar Neela, et al. 2013. “LRRK2 and RIPK2 Variants in the NOD 2-Mediated Signaling Pathway Are Associated with Susceptibility to Mycobacterium Leprae in Indian Populations.” PloS One 8 (8): e73103. doi:10.1371/journal.pone.0073103. Mariño, Guillermo, Mireia Niso-Santano, Eric H. Baehrecke, and Guido Kroemer. 2014. “Self-Consumption: The Interplay of Autophagy and Apoptosis.” Nature Reviews Molecular Cell Biology 15 (2): 81–94. doi:10.1038/nrm3735. Marmenout, Anne, Lucie Fransen, Jan Tavernier, José Van Der Heyden, Richard Tizard, Eric Kawashima, Alan Shaw, et al. 1985. “Molecular Cloning and Expression of Human Tumor Necrosis Factor and Comparison with Mouse Tumor Necrosis Factor.” European Journal of Biochemistry 152 (3): 515–22. doi:10.1111/j.1432- 1033.1985.tb09226.x. Martinon, Fabio, and Jürg Tschopp. 2004. “Inflammatory Caspases: Linking an Intracellular Innate Immune System to Autoinflammatory Diseases.” Cell 117 (5): 561–74. doi:10.1016/j.cell.2004.05.004. Matzinger, P. 1994. “Tolerance, Danger, and the Extended Family.” Annual Review of Immunology 12 (1): 991–1045. doi:10.1146/annurev.iy.12.040194.005015. Matzinger, Polly. 1998. “An Innate Sense of Danger.” In Seminars in Immunology, 10:399– 415. Elsevier. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1044532398901439. McCarthy, J. V., J. Ni, and V. M. Dixit. 1998. “RIP2 Is a Novel NF-kappaB-Activating and Cell Death-Inducing Kinase.” The Journal of Biological Chemistry 273 (27): 16968– 75. McQuade, Thomas, YoungSik Cho, and Francis Ka-Ming Chan. 2013. “Positive and Negative Phosphorylation Regulates RIP1 and RIP3-Induced Programmed Necrosis.” The Biochemical Journal 456 (3): 409–15. doi:10.1042/BJ20130860. McVicker, Benita L., Dean J. Tuma, Kusum K. Kharbanda, Jacy L. Kubik, and Carol A. Casey. 2007. “Effect of Chronic Ethanol Administration on the in Vitro Production of Proinflammatory Cytokines by Rat Kupffer Cells in the Presence of Apoptotic Cells.” Alcoholism, Clinical and Experimental Research 31 (1): 122–29. doi:10.1111/j.1530- 0277.2006.00270.x. Meng, Lingjun, Wei Jin, and Xiaodong Wang. 2015. “RIP3-Mediated Necrotic Cell Death Accelerates Systematic Inflammation and Mortality.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112 (35): 11007–12. doi:10.1073/pnas.1514730112. Mérino, Delphine, Najoua Lalaoui, Alexandre Morizot, Pascal Schneider, Eric Solary, and Olivier Micheau. 2006. “Differential Inhibition of TRAIL-Mediated DR5-DISC Formation by Decoy Receptors 1 and 2.” Molecular and Cellular Biology 26 (19): 7046–55. doi:10.1128/MCB.00520-06. Metzler, Kathleen D., Christian Goosmann, Aleksandra Lubojemska, Arturo Zychlinsky, and Venizelos Papayannopoulos. 2014. “A Myeloperoxidase-Containing Complex Regulates Neutrophil Elastase Release and Actin Dynamics during NETosis.” Cell Reports 8 (3): 883–96. doi:10.1016/j.celrep.2014.06.044.

240

Meurette, O. 2005. “TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) Induces Necrosis- Like Cell Death in Tumor Cells at Acidic Extracellular pH.” Annals of the New York Academy of Sciences 1056 (1): 379–87. doi:10.1196/annals.1352.018. Meurette, Olivier, Amélie Rebillard, Laurence Huc, Gwenaëlle Le Moigne, Delphine Merino, Olivier Micheau, Dominique Lagadic-Gossmann, and Marie-Thérèse Dimanche- Boitrel. 2007. “TRAIL Induces Receptor-Interacting Protein 1–Dependent and Caspase-Dependent Necrosis-Like Cell Death under Acidic Extracellular Conditions.” Cancer Research 67 (1): 218–226. Meylan, Etienne, Kim Burns, Kay Hofmann, Vincent Blancheteau, Fabio Martinon, Michelle Kelliher, and Jürg Tschopp. 2004. “RIP1 Is an Essential Mediator of Toll-like Receptor 3–induced NF-κB Activation.” Nature Immunology 5 (5): 503–7. doi:10.1038/ni1061. Meylan, Etienne, Fabio Martinon, Margot Thome, Michael Gschwendt, and Jürg Tschopp. 2002. “RIP4 (DIK/PKK), a Novel Member of the RIP Kinase Family, Activates NF- Kappa B and Is Processed during Apoptosis.” EMBO Reports 3 (12): 1201–8. doi:10.1093/embo-reports/kvf236. Meylan, Etienne, and Jürg Tschopp. 2005. “The RIP Kinases: Crucial Integrators of Cellular Stress.” Trends in Biochemical Sciences 30 (3): 151–59. doi:10.1016/j.tibs.2005.01.003. Micheau, O., S. Lens, O. Gaide, K. Alevizopoulos, and J. Tschopp. 2001. “NF-kappaB Signals Induce the Expression of c-FLIP.” Molecular and Cellular Biology 21 (16): 5299–5305. doi:10.1128/MCB.21.16.5299-5305.2001. Micheau, Olivier, and Jürg Tschopp. 2003. “Induction of TNF Receptor I-Mediated Apoptosis via Two Sequential Signaling Complexes.” Cell 114 (2): 181–90. Michels, Judith, Ilio Vitale, Lorenzo Galluzzi, Julien Adam, Ken André Olaussen, Oliver Kepp, Laura Senovilla, et al. 2013. “Cisplatin Resistance Associated with PARP Hyperactivation.” Cancer Research 73 (7): 2271–80. doi:10.1158/0008-5472.CAN- 12-3000. Minagawa, Masahiro, Qinggao Deng, Zhang-Xu Liu, Hidekazu Tsukamoto, and Gunther Dennert. 2004. “Activated Natural Killer T Cells Induce Liver Injury by Fas and Tumor Necrosis Factor-Alpha during Alcohol Consumption.” Gastroenterology 126 (5): 1387–99. Mitchell, J. R., D. J. Jollow, W. Z. Potter, D. C. Davis, J. R. Gillette, and B. B. Brodie. 1973. “Acetaminophen-Induced Hepatic Necrosis. I. Role of Drug Metabolism.” The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 187 (1): 185–94. Mizuhara, Hidekazu, Elaine O’Neill, Nobuo Seki, Toshikazu Ogawa, Chihiro Kusunoki, Kazuyuki Otsuka, Susumu Satoh, Mineo Niwa, Hachiro Senoh, and Hiromi Fujiwara. 1994. “T Cell Activation-Associated Hepatic Injury: Mediation by Tumor Necrosis Factors and Protection by Interleukin 6.” Journal of Experimental Medicine 179 (5): 1529–1538. Mizumura, Kenji, Suzanne M. Cloonan, Kiichi Nakahira, Abhiram R. Bhashyam, Morgan Cervo, Tohru Kitada, Kimberly Glass, et al. 2014. “Mitophagy-Dependent Necroptosis Contributes to the Pathogenesis of COPD.” The Journal of Clinical Investigation 124 (9): 3987–4003. doi:10.1172/JCI74985. Mocarski, E. S., W. J. Kaiser, D. Livingston-Rosanoff, J. W. Upton, and L. P. Daley-Bauer. 2014. “True Grit: Programmed Necrosis in Antiviral Host Defense, Inflammation, and Immunogenicity.” The Journal of Immunology 192 (5): 2019–26. doi:10.4049/jimmunol.1302426.

241

Mocarski, Edward S., Hongyan Guo, and William J. Kaiser. 2015. “Necroptosis: The Trojan Horse in Cell Autonomous Antiviral Host Defense.” Virology 479–480 (May): 160– 66. doi:10.1016/j.virol.2015.03.016. Monroe, Kathryn M., Zhiyuan Yang, Jeffrey R. Johnson, Xin Geng, Gilad Doitsh, Nevan J. Krogan, and Warner C. Greene. 2014. “IFI16 DNA Sensor Is Required for Death of Lymphoid CD4 T Cells Abortively Infected with HIV.” Science (New York, N.Y.) 343 (6169): 428–32. doi:10.1126/science.1243640. Moquin, David M., Thomas McQuade, and Francis Ka-Ming Chan. 2013. “CYLD Deubiquitinates RIP1 in the TNFα-Induced Necrosome to Facilitate Kinase Activation and Programmed Necrosis.” PloS One 8 (10): e76841. doi:10.1371/journal.pone. 0076841. Moran, Stewart T., Khaleda Haider, Yongkai Ow, Peter Milton, Luojing Chen, and Shiv Pillai. 2003. “Protein Kinase C-Associated Kinase Can Activate NFkappaB in Both a Kinase-Dependent and a Kinase-Independent Manner.” The Journal of Biological Chemistry 278 (24): 21526–33. doi:10.1074/jbc.M301575200. Morioka, Sho, Peter Broglie, Emily Omori, Yuka Ikeda, Giichi Takaesu, Kunihiro Matsumoto, and Jun Ninomiya-Tsuji. 2014. “TAK1 Kinase Switches Cell Fate from Apoptosis to Necrosis Following TNF Stimulation.” The Journal of Cell Biology 204 (4): 607–23. doi:10.1083/jcb.201305070. Moriwaki, K., and F. K.-M. Chan. 2013. “RIP3: A Molecular Switch for Necrosis and Inflammation.” Genes & Development 27 (15): 1640–49. doi:10.1101/gad.223321.113. Moriwaki, K., and F. K.-M. Chan. 2017. “The Inflammatory Signal Adaptor RIPK3: Functions Beyond Necroptosis.” International Review of Cell and Molecular Biology 328: 253–75. doi:10.1016/bs.ircmb.2016.08.007. Moriwaki, Kenta, Sakthi Balaji, Thomas McQuade, Nidhi Malhotra, Joonsoo Kang, and Francis Ka-Ming Chan. 2014. “The Necroptosis Adaptor RIPK3 Promotes Injury- Induced Cytokine Expression and Tissue Repair.” Immunity 41 (4): 567–78. doi:10.1016/j.immuni.2014.09.016. Moriwaki, Kenta, John Bertin, Peter J. Gough, and Francis Ka-Ming Chan. 2015. “A RIPK3- Caspase 8 Complex Mediates Atypical pro-IL-1β Processing.” Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950) 194 (4): 1938–44. doi:10.4049/jimmunol.1402167. Moriwaki, Kenta, and Francis Ka-Ming Chan. 2016. “Necroptosis-Independent Signaling by the RIP Kinases in Inflammation.” Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS 73 (11–12): 2325–34. doi:10.1007/s00018-016-2203-4. Mukae, Naomi, Hideki Yokoyama, Takakazu Yokokura, Yasuhiko Sakoyama, and Shigekazu Nagata. 2002. “Activation of the Innate Immunity in Drosophila by Endogenous Chromosomal DNA That Escaped Apoptotic Degradation.” Genes & Development 16 (20): 2662–71. doi:10.1101/gad.1022802. Mulay, Shrikant R., Jyaysi Desai, Santhosh V. Kumar, Jonathan N. Eberhard, Dana Thomasova, Simone Romoli, Melissa Grigorescu, et al. 2016. “Cytotoxicity of Crystals Involves RIPK3-MLKL-Mediated Necroptosis.” Nature Communications 7 (January): 10274. doi:10.1038/ncomms10274. Müller, Susanne, Apirat Chaikuad, Nathanael S. Gray, and Stefan Knapp. 2015. “The Ins and Outs of Selective Kinase Inhibitor Development.” Nature Chemical Biology 11 (11): 818–21. doi:10.1038/nchembio.1938. Muppidi, J. R., A. A. Lobito, M. Ramaswamy, J. K. Yang, L. Wang, H. Wu, and R. M. Siegel. 2006. “Homotypic FADD Interactions through a Conserved RXDLL Motif Are Required for Death Receptor-Induced Apoptosis.” Cell Death and Differentiation 13 (10): 1641–50. doi:10.1038/sj.cdd.4401855.

242

Murphy, James M., Peter E. Czabotar, Joanne M. Hildebrand, Isabelle S. Lucet, Jian-Guo Zhang, Silvia Alvarez-Diaz, Rowena Lewis, et al. 2013. “The Pseudokinase MLKL Mediates Necroptosis via a Molecular Switch Mechanism.” Immunity 39 (3): 443–53. doi:10.1016/j.immuni.2013.06.018. Muto, Akihiro, Jürgen Ruland, Linda M. McAllister-Lucas, Peter C. Lucas, Shoji Yamaoka, Felicia F. Chen, Amy Lin, Tak W. Mak, Gabriel Núñez, and Naohiro Inohara. 2002. “Protein Kinase C-Associated Kinase (PKK) Mediates Bcl10-Independent NF-Kappa B Activation Induced by Phorbol Ester.” The Journal of Biological Chemistry 277 (35): 31871–76. doi:10.1074/jbc.M202222200. Najjar, Malek, Danish Saleh, Matija Zelic, Shoko Nogusa, Saumil Shah, Albert Tai, Joshua N. Finger, et al. 2016. “RIPK1 and RIPK3 Kinases Promote Cell-Death-Independent Inflammation by Toll-like Receptor 4.” Immunity 45 (1): 46–59. doi:10.1016/j.immuni. 2016.06.007. Najjar, Malek, Chalada Suebsuwong, Soumya S. Ray, Roshan J. Thapa, Jenny L. Maki, Shoko Nogusa, Saumil Shah, et al. 2015. “Structure Guided Design of Potent and Selective Ponatinib-Based Hybrid Inhibitors for RIPK1.” Cell Reports 10 (11): 1850– 60. doi:10.1016/j.celrep.2015.02.052. Nakagawa, Takashi, Shigeomi Shimizu, Tetsuya Watanabe, Osamu Yamaguchi, Kinya Otsu, Hirotaka Yamagata, Hidenori Inohara, Takeshi Kubo, and Yoshihide Tsujimoto. 2005. “Cyclophilin D-Dependent Mitochondrial Permeability Transition Regulates Some Necrotic but Not Apoptotic Cell Death.” Nature 434 (7033): 652–58. doi:10.1038/nature03317. Narne, Parimala, Vimal Pandey, Praveen Kumar Simhadri, and Prakash Babu Phanithi. 2016. “Poly(ADP-Ribose)polymerase-1 Hyperactivation in Neurodegenerative Diseases: The Death Knell Tolls for Neurons.” Seminars in Cell & Developmental Biology, November. doi:10.1016/j.semcdb.2016.11.007. Navas, T. A., D. T. Baldwin, and T. A. Stewart. 1999. “RIP2 Is a Raf1-Activated Mitogen- Activated Protein Kinase Kinase.” The Journal of Biological Chemistry 274 (47): 33684–90. Ndozangue-Touriguine, O., M. Sebbagh, D. Mérino, O. Micheau, J. Bertoglio, and J. Bréard. 2008. “A Mitochondrial Block and Expression of XIAP Lead to Resistance to TRAIL- Induced Apoptosis during Progression to Metastasis of a Colon Carcinoma.” Oncogene 27 (46): 6012–22. doi:10.1038/onc.2008.197. Nembrini, Chiara, Jan Kisielow, Abdijapar T. Shamshiev, Luigi Tortola, Anthony J. Coyle, Manfred Kopf, and Benjamin J. Marsland. 2009. “The Kinase Activity of Rip2 Determines Its Stability and Consequently Nod1- and Nod2-Mediated Immune Responses.” The Journal of Biological Chemistry 284 (29): 19183–88. doi:10.1074/jbc.M109.006353. Newton, K., D. L. Dugger, A. Maltzman, J. M. Greve, M. Hedehus, B. Martin-McNulty, R. a. D. Carano, et al. 2016a. “RIPK3 Deficiency or Catalytically Inactive RIPK1 Provides Greater Benefit than MLKL Deficiency in Mouse Models of Inflammation and Tissue Injury.” Cell Death and Differentiation 23 (9): 1565–76. doi:10.1038/cdd.2016.46. Newton, K., D. L. Dugger, K. E. Wickliffe, N. Kapoor, M. C. de Almagro, D. Vucic, L. Komuves, et al. 2014. “Activity of Protein Kinase RIPK3 Determines Whether Cells Die by Necroptosis or Apoptosis.” Science 343 (6177): 1357–60. doi:10.1126/science.1249361. Newton, K., X. Sun, and V. M. Dixit. 2004. “Kinase RIP3 Is Dispensable for Normal NF- Bs, Signaling by the B-Cell and T-Cell Receptors, Tumor Necrosis Factor Receptor 1, and Toll-Like Receptors 2 and 4.” Molecular and Cellular Biology 24 (4): 1464–69. doi:10.1128/MCB.24.4.1464-1469.2004.

243

Newton, Kim. 2015. “RIPK1 and RIPK3: Critical Regulators of Inflammation and Cell Death.” Trends in Cell Biology 25 (6): 347–53. doi:10.1016/j.tcb.2015.01.001. Newton, Kim, and Gerard Manning. 2016. “Necroptosis and Inflammation.” Annual Review of Biochemistry 85 (June): 743–63. doi:10.1146/annurev-biochem-060815-014830. Newton, Kim, Katherine E. Wickliffe, Allie Maltzman, Debra L. Dugger, Andreas Strasser, Victoria C. Pham, Jennie R. Lill, et al. 2016b. “RIPK1 Inhibits ZBP1-Driven Necroptosis during Development.” Nature 540 (7631): 129–33. doi:10.1038/nature20559. Nichols, R. Jeremy, Nicolas Dzamko, Nicholas A. Morrice, David G. Campbell, Maria Deak, Alban Ordureau, Thomas Macartney, et al. 2010. “14-3-3 Binding to LRRK2 Is Disrupted by Multiple Parkinson’s Disease-Associated Mutations and Regulates Cytoplasmic Localization.” The Biochemical Journal 430 (3): 393–404. doi:10.1042/BJ20100483. Nugues, A.-L., H. El Bouazzati, D. Hétuin, C. Berthon, A. Loyens, E. Bertrand, N. Jouy, T. Idziorek, and B. Quesnel. 2014. “RIP3 Is Downregulated in Human Myeloid Leukemia Cells and Modulates Apoptosis and Caspase-Mediated p65/RelA Cleavage.” Cell Death & Disease 5 (August): e1384. doi:10.1038/cddis.2014.347. O’ Reilly, Eimear, Andrea Tirincsi, Susan E. Logue, and Eva Szegezdi. 2016. “The Janus Face of Death Receptor Signaling during Tumor Immunoediting.” Frontiers in Immunology 7 (October). doi:10.3389/fimmu.2016.00446. Oberst, Andrew, Christopher P. Dillon, Ricardo Weinlich, Laura L. McCormick, Patrick Fitzgerald, Cristina Pop, Razq Hakem, Guy S. Salvesen, and Douglas R. Green. 2011. “Catalytic Activity of the Caspase-8–FLIPL Complex Inhibits RIPK3-Dependent Necrosis.” Nature 471 (7338): 363–67. doi:10.1038/nature09852. O’Donnell, Marie Anne, Hidenori Hase, Diana Legarda, and Adrian T. Ting. 2012. “NEMO Inhibits Programmed Necrosis in an NFκB-Independent Manner by Restraining RIP1.” PloS One 7 (7): e41238. doi:10.1371/journal.pone.0041238. O’Donnell, Marie Anne, Diana Legarda-Addison, Penelopi Skountzos, Wen Chen Yeh, and Adrian T. Ting. 2007. “Ubiquitination of RIP1 Regulates an NF-kappaB-Independent Cell-Death Switch in TNF Signaling.” Current Biology: CB 17 (5): 418–24. doi:10.1016/j.cub.2007.01.027. O’Donnell, Marie Anne, Eva Perez-Jimenez, Andrew Oberst, Aylwin Ng, Ramin Massoumi, Ramnik Xavier, Douglas R. Green, and Adrian T. Ting. 2011. “Caspase 8 Inhibits Programmed Necrosis by Processing CYLD.” Nature Cell Biology 13 (12): 1437–42. doi:10.1038/ncb2362. Oerlemans, Martinus I. F. J., Jia Liu, Fatih Arslan, Krista Ouden, Ben J. Middelaar, Pieter A. Doevendans, and Joost P. G. Sluijter. 2012. “Inhibition of RIP1-Dependent Necrosis Prevents Adverse Cardiac Remodeling after Myocardial Ischemia–reperfusion in Vivo.” Basic Research in Cardiology 107 (4). doi:10.1007/s00395-012-0270-8. Oerlemans, Martinus I.F.J., Stefan Koudstaal, Steven A. Chamuleau, Dominique P. de Kleijn, Pieter A. Doevendans, and Joost P.G. Sluijter. 2013. “Targeting Cell Death in the Reperfused Heart: Pharmacological Approaches for Cardioprotection.” International Journal of Cardiology 165 (3): 410–22. doi:10.1016/j.ijcard.2012.03.055. Ofengeim, Dimitry, Yasushi Ito, Ayaz Najafov, Yaoyang Zhang, Bing Shan, Judy Park DeWitt, Juanying Ye, et al. 2015. “Activation of Necroptosis in Multiple Sclerosis.” Cell Reports 10 (11): 1836–49. doi:10.1016/j.celrep.2015.02.051. Ofengeim, Dimitry, and Junying Yuan. 2013. “Regulation of RIP1 Kinase Signalling at the Crossroads of Inflammation and Cell Death.” Nature Reviews. Molecular Cell Biology 14 (11): 727–36. doi:10.1038/nrm3683.

244

O’Flaherty, J., Y. Mei, M. Freer, and C. M. Weyman. 2006. “Signaling through the TRAIL Receptor DR5/FADD Pathway Plays a Role in the Apoptosis Associated with Skeletal Myoblast Differentiation.” Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death 11 (12): 2103–13. doi:10.1007/s10495-006-0196-4. Ogura, Y., D. K. Bonen, N. Inohara, D. L. Nicolae, F. F. Chen, R. Ramos, H. Britton, et al. 2001. “A Frameshift Mutation in NOD2 Associated with Susceptibility to Crohn’s Disease.” Nature 411 (6837): 603–6. doi:10.1038/35079114. Omoto, Shinya, Hongyan Guo, Ganesh R. Talekar, Linda Roback, William J. Kaiser, and Edward S. Mocarski. 2015. “Suppression of RIP3-Dependent Necroptosis by Human Cytomegalovirus.” Journal of Biological Chemistry 290 (18): 11635–48. doi:10.1074/jbc.M115.646042. Onizawa, Michio, Shigeru Oshima, Ulf Schulze-Topphoff, Juan A. Oses-Prieto, Timothy Lu, Rita Tavares, Thomas Prodhomme, et al. 2015. “The Ubiquitin-Modifying Enzyme A20 Restricts Ubiquitination of the Kinase RIPK3 and Protects Cells from Necroptosis.” Nature Immunology 16 (6): 618–27. doi:10.1038/ni.3172. Opipari, A. W., H. M. Hu, R. Yabkowitz, and V. M. Dixit. 1992. “The A20 Zinc Finger Protein Protects Cells from Tumor Necrosis Factor Cytotoxicity.” The Journal of Biological Chemistry 267 (18): 12424–27. Orozco, S, N Yatim, M R Werner, H Tran, S Y Gunja, S WG Tait, M L Albert, D R Green, and A Oberst. 2014. “RIPK1 Both Positively and Negatively Regulates RIPK3 Oligomerization and Necroptosis.” Cell Death and Differentiation 21 (10): 1511–21. doi:10.1038/cdd.2014.76. Ovize, Michel, Gary F. Baxter, Fabio Di Lisa, Péter Ferdinandy, David Garcia-Dorado, Derek J. Hausenloy, Gerd Heusch, et al. 2010. “Postconditioning and Protection from Reperfusion Injury: Where Do We Stand? Position Paper from the Working Group of Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.” Cardiovascular Research 87 (3): 406–23. doi:10.1093/cvr/cvq129. Ozören, Nesrin, and Wafik S. El-Deiry. 2002. “Defining Characteristics of Types I and II Apoptotic Cells in Response to TRAIL.” Neoplasia (New York, N.Y.) 4 (6): 551–57. doi:10.1038/sj.neo.7900270. Paisán-Ruíz, Coro, Shushant Jain, E. Whitney Evans, William P. Gilks, Javier Simón, Marcel van der Brug, Adolfo López de Munain, et al. 2004. “Cloning of the Gene Containing Mutations That Cause PARK8-Linked Parkinson’s Disease.” Neuron 44 (4): 595–600. doi:10.1016/j.neuron.2004.10.023. Paquet, Philippe, and Gerald E. Pierard. 2007. “Toxic Epidermal Necrolysis: Revisiting the Tentative Link between Early Apoptosis and Late Necrosis (Review).” International Journal of Molecular Medicine 19 (1): 3–10. Pariser, David M. 2003. “Management of Moderate to Severe Plaque Psoriasis with Biologic Therapy.” Managed Care (Langhorne, Pa.) 12 (4): 36–44. Park, Jong-Hwan, Yun-Gi Kim, Christine McDonald, Thirumala-Devi Kanneganti, Mizuho Hasegawa, Mathilde Body-Malapel, Naohiro Inohara, and Gabriel Núñez. 2007. “RICK/RIP2 Mediates Innate Immune Responses Induced through Nod1 and Nod2 but Not TLRs.” Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950) 178 (4): 2380–86. Park, Sun-Mi, Jong-Bok Yoon, and Tae H. Lee. 2004. “Receptor Interacting Protein Is Ubiquitinated by Cellular Inhibitor of Apoptosis Proteins (c-IAP1 and c-IAP2) in Vitro.” FEBS Letters 566 (1–3): 151–56. doi:10.1016/j.febslet.2004.04.021. Pasparakis, M., L. Alexopoulou, V. Episkopou, and G. Kollias. 1996. “Immune and Inflammatory Responses in TNF Alpha-Deficient Mice: A Critical Requirement for TNF Alpha in the Formation of Primary B Cell Follicles, Follicular Dendritic Cell

245

Networks and Germinal Centers, and in the Maturation of the Humoral Immune Response.” The Journal of Experimental Medicine 184 (4): 1397–1411. Pazdernik, Nanette J., David B. Donner, Mark G. Goebl, and Maureen A. Harrington. 1999. “Mouse Receptor Interacting Protein 3 Does Not Contain a Caspase-Recruiting or a Death Domain but Induces Apoptosis and Activates NF-κB.” Molecular and Cellular Biology 19 (10): 6500. Pennica, Diane, Joel S. Hayflick, Timothy S. Bringman, Michael A. Palladino, and David V. Goeddel. 1985. “Cloning and Expression in Escherichia Coli of the cDNA for Murine Tumor Necrosis Factor.” Proceedings of the National Academy of Sciences 82 (18): 6060–6064. Petersen, S. L., T. T. Chen, D. A. Lawrence, S. A. Marsters, F. Gonzalvez, and A. Ashkenazi. 2015. “TRAF2 Is a Biologically Important Necroptosis Suppressor.” Cell Death and Differentiation 22 (11): 1846–57. doi:10.1038/cdd.2015.35. Pfeffer, K., T. Matsuyama, T. M. Kündig, A. Wakeham, K. Kishihara, A. Shahinian, K. Wiegmann, P. S. Ohashi, M. Krönke, and T. W. Mak. 1993. “Mice Deficient for the 55 Kd Tumor Necrosis Factor Receptor Are Resistant to Endotoxic Shock, yet Succumb to L. Monocytogenes Infection.” Cell 73 (3): 457–67. Piccoli, Giovanni, Franco Onofri, Maria Daniela Cirnaru, Christoph J. O. Kaiser, Pravinkumar Jagtap, Andreas Kastenmüller, Francesca Pischedda, et al. 2014. “Leucine-Rich Repeat Kinase 2 Binds to Neuronal Vesicles through Protein Interactions Mediated by Its C-Terminal WD40 Domain.” Molecular and Cellular Biology 34 (12): 2147–61. doi:10.1128/MCB.00914-13. Pierdomenico, Maria, Anna Negroni, Laura Stronati, Roberta Vitali, Enrica Prete, John Bertin, Peter J. Gough, Marina Aloi, and Salvatore Cucchiara. 2014. “Necroptosis Is Active in Children with Inflammatory Bowel Disease and Contributes to Heighten Intestinal Inflammation.” The American Journal of Gastroenterology 109 (2): 279– 287. Pilsczek, Florian H., Davide Salina, Karen K. H. Poon, Candace Fahey, Bryan G. Yipp, Christopher D. Sibley, Stephen M. Robbins, et al. 2010. “A Novel Mechanism of Rapid Nuclear Neutrophil Extracellular Trap Formation in Response to Staphylococcus Aureus.” Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950) 185 (12): 7413–25. doi:10.4049/jimmunol.1000675. Pitti, R. M., S. A. Marsters, S. Ruppert, C. J. Donahue, A. Moore, and A. Ashkenazi. 1996. “Induction of Apoptosis by Apo-2 Ligand, a New Member of the Tumor Necrosis Factor Cytokine Family.” The Journal of Biological Chemistry 271 (22): 12687–90. Poelstra, Klaas, and Detlef Schuppan. 2011. “Targeted Therapy of Liver Fibrosis/Cirrhosis and Its Complications.” Journal of Hepatology 55 (3): 726–28. doi:10.1016/j.jhep.2011.04.008. Polykratis, Apostolos, Nicole Hermance, Matija Zelic, Justine Roderick, Chun Kim, Trieu- My Van, Thomas H. Lee, Francis K. M. Chan, Manolis Pasparakis, and Michelle A. Kelliher. 2014. “Cutting Edge: RIPK1 Kinase Inactive Mice Are Viable and Protected from TNF-Induced Necroptosis In Vivo.” The Journal of Immunology 193 (4): 1539– 43. doi:10.4049/jimmunol.1400590. Rajput, Akhil, Andrew Kovalenko, Konstantin Bogdanov, Seung-Hoon Yang, Tae-Bong Kang, Jin-Chul Kim, Jianfang Du, and David Wallach. 2011. “RIG-I RNA Helicase Activation of IRF3 Transcription Factor Is Negatively Regulated by Caspase-8- Mediated Cleavage of the RIP1 Protein.” Immunity 34 (3): 340–51. doi:10.1016/j.immuni.2010.12.018. Ramachandran, Anup, Mitchell R. McGill, Yuchao Xie, Hong-Min Ni, Wen-Xing Ding, and Hartmut Jaeschke. 2013. “Receptor Interacting Protein Kinase 3 Is a Critical Early

246

Mediator of Acetaminophen-Induced Hepatocyte Necrosis in Mice: Hepatology.” Hepatology 58 (6): 2099–2108. doi:10.1002/hep.26547. Ratziu, Vlad, Muhammad Y. Sheikh, Arun J. Sanyal, Joseph K. Lim, Hari Conjeevaram, Naga Chalasani, Manal Abdelmalek, et al. 2012. “A Phase 2, Randomized, Double- Blind, Placebo-Controlled Study of GS-9450 in Subjects with Nonalcoholic Steatohepatitis.” Hepatology (Baltimore, Md.) 55 (2): 419–28. doi:10.1002/hep.24747. Ray-Coquard, Isabelle, Olivier Collard, Françoise Ducimetiere, Mathieu Laramas, Florence Mercier, Nadine Ladarre, Stephanie Manson, et al. 2017. “Treatment Patterns and Survival in an Exhaustive French Cohort of Pazopanib-Eligible Patients with Metastatic Soft Tissue Sarcoma (STS).”BMC Cancer 17(1): 111.doi:10.1186/s12885- 017-3057-3. Rebsamen, Manuele, Leonhard X Heinz, Etienne Meylan, Marie-Cécile Michallet, Kate Schroder, Kay Hofmann, Jessica Vazquez, Chris A Benedict, and Jürg Tschopp. 2009. “DAI/ZBP1 Recruits RIP1 and RIP3 through RIP Homotypic Interaction Motifs to Activate NF-κB.” EMBO Reports 10 (8): 916–22. doi:10.1038/embor.2009.109. Remijsen, Q, V Goossens, S Grootjans, C Van den Haute, N Vanlangenakker, Y Dondelinger, R Roelandt, et al. 2014. “Depletion of RIPK3 or MLKL Blocks TNF-Driven Necroptosis and Switches towards a Delayed RIPK1 Kinase-Dependent Apoptosis.” Cell Death and Disease 5 (1): e1004. doi:10.1038/cddis.2013.531. Remijsen, Q, T W Kuijpers, E Wirawan, S Lippens, P Vandenabeele, and T Vanden Berghe. 2011b. “Dying for a Cause: NETosis, Mechanisms behind an Antimicrobial Cell Death Modality.” Cell Death and Differentiation 18 (4): 581–88. doi:10.1038/cdd.2011.1. Remijsen, Quinten, Tom Vanden Berghe, Ellen Wirawan, Bob Asselbergh, Eef Parthoens, Riet De Rycke, Sam Noppen, Michel Delforge, Jean Willems, and Peter Vandenabeele. 2011a. “Neutrophil Extracellular Trap Cell Death Requires Both Autophagy and Superoxide Generation.” Cell Research 21 (2): 290–304. doi:10.1038/cr.2010.150. Ren, Yan, Yaning Su, Liming Sun, Sudan He, Lingjun Meng, Daohong Liao, Xiao Liu, et al. 2017. “Discovery of a Highly Potent, Selective, and Metabolically Stable Inhibitor of Receptor-Interacting Protein 1 (RIP1) for the Treatment of Systemic Inflammatory Response Syndrome.” Journal of Medicinal Chemistry 60 (3): 972–86. doi:10.1021/acs.jmedchem.6b01196. Rickard, James A., Joanne A. O’Donnell, Joseph M. Evans, Najoua Lalaoui, Ashleigh R. Poh, TeWhiti Rogers, James E. Vince, et al. 2014. “RIPK1 Regulates RIPK3-MLKL- Driven Systemic Inflammation and Emergency Hematopoiesis.” Cell 157 (5): 1175– 88. doi:10.1016/j.cell.2014.04.019. Rimondi, Erika, Paola Secchiero, Andrea Quaroni, Carlotta Zerbinati, Silvano Capitani, and Giorgio Zauli. 2006. “Involvement of TRAIL/TRAIL-Receptors in Human Intestinal Cell Differentiation.” Journal of Cellular Physiology 206 (3): 647–54. doi:10.1002/jcp. 20512. Rinella, Mary E., Marc S. Elias, Robin R. Smolak, Tao Fu, Jayme Borensztajn, and Richard M. Green. 2008. “Mechanisms of Hepatic Steatosis in Mice Fed a Lipogenic Methionine Choline-Deficient Diet.” Journal of Lipid Research 49 (5): 1068–76. doi:10.1194/jlr. M800042-JLR200. Rodriguez, D A, R Weinlich, S Brown, C Guy, P Fitzgerald, C P Dillon, A Oberst, et al. 2016. “Characterization of RIPK3-Mediated Phosphorylation of the Activation Loop of MLKL during Necroptosis.” Cell Death and Differentiation 23 (1): 76–88. doi:10.1038/cdd.2015.70.

247

Roskoski, Robert. 2016. “Classification of Small Molecule Protein Kinase Inhibitors Based upon the Structures of Their Drug-Enzyme Complexes.” Pharmacological Research 103 (January): 26–48. doi:10.1016/j.phrs.2015.10.021. Rouleau, Michèle, Anand Patel, Michael J. Hendzel, Scott H. Kaufmann, and Guy G. Poirier. 2010. “PARP Inhibition: PARP1 and beyond.” Nature Reviews. Cancer 10 (4): 293– 301. doi:10.1038/nrc2812. Rountree, Ryan B., Cynthia R. Willis, Huyen Dinh, Hal Blumberg, Keith Bailey, Charles Dean, Jacques J. Peschon, and Pamela M. Holland. 2010. “RIP4 Regulates Epidermal Differentiation and Cutaneous Inflammation.” The Journal of Investigative Dermatology 130 (1): 102–12. doi:10.1038/jid.2009.223. Roychowdhury, Sanjoy, Dian J. Chiang, Palash Mandal, Megan R. McMullen, Xiuli Liu, Jessica I. Cohen, John Pollard, Ariel E. Feldstein, and Laura E. Nagy. 2012. “Inhibition of Apoptosis Protects Mice from Ethanol-Mediated Acceleration of Early Markers of CCl4 -Induced Fibrosis but Not Steatosis or Inflammation.” Alcoholism, Clinical and Experimental Research 36 (7): 1139–47. doi:10.1111/j.1530- 0277.2011.01720.x. Roychowdhury, Sanjoy, Megan R. McMullen, Sorana G. Pisano, Xiuli Liu, and Laura E. Nagy. 2013. “Absence of Receptor Interacting Protein Kinase 3 Prevents Ethanol- Induced Liver Injury.” Hepatology 57 (5): 1773–1783. Rubin, B. Y., L. J. Smith, G. R. Hellermann, R. M. Lunn, N. K. Richardson, and S. L. Anderson. 1988. “Correlation between the Anticellular and DNA Fragmenting Activities of Tumor Necrosis Factor.” Cancer Research 48 (21): 6006–10. Saito, Nao, Hongjiang Qiao, Teruki Yanagi, Satoru Shinkuma, Keiko Nishimura, Asuka Suto, Yasuyuki Fujita, et al. 2014. “An Annexin A1-FPR1 Interaction Contributes to Necroptosis of Keratinocytes in Severe Cutaneous Adverse Drug Reactions.” Science Translational Medicine 6 (245): 245ra95. doi:10.1126/scitranslmed.3008227. Saitou, Yukiko, Katsuya Shiraki, Hiroyuki Fuke, Tomoko Inoue, Kazumi Miyashita, Yutaka Yamanaka, Yumi Yamaguchi, et al. 2005. “Involvement of Tumor Necrosis Factor- Related Apoptosis-Inducing Ligand and Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis- Inducing Ligand Receptors in Viral Hepatic Diseases.” Human Pathology 36 (10): 1066–73. doi:10.1016/j.humpath.2005.07.019. Salvesen, Guy S., and Craig M. Walsh. 2014. “Functions of Caspase 8: The Identified and the Mysterious.” Seminars in Immunology 26 (3): 246–52. doi:10.1016/j.smim. 2014.03.005. Satoh, Jun-ichi, Megumi Nakanishi, Fumiko Koike, Sachiko Miyake, Toshiyuki Yamamoto, Mitsuru Kawai, Seiji Kikuchi, et al. 2005. “Microarray Analysis Identifies an Aberrant Expression of Apoptosis and DNA Damage-Regulatory Genes in Multiple Sclerosis.” Neurobiology of Disease 18 (3): 537–50. doi:10.1016/j.nbd.2004.10.007. Scaffidi, C., S. Fulda, A. Srinivasan, C. Friesen, F. Li, K. J. Tomaselli, K. M. Debatin, P. H. Krammer, and M. E. Peter. 1998. “Two CD95 (APO-1/Fas) Signaling Pathways.” The EMBO Journal 17 (6): 1675–87. doi:10.1093/emboj/17.6.1675. Scaffidi, C., I. Schmitz, P. H. Krammer, and M. E. Peter. 1999. “The Role of c-FLIP in Modulation of CD95-Induced Apoptosis.” The Journal of Biological Chemistry 274 (3): 1541–48. Schattenberg, Jörn M., and Detlef Schuppan. 2011. “Nonalcoholic Steatohepatitis: The Therapeutic Challenge of a Global Epidemic.” Current Opinion in Lipidology 22 (6): 479–88. doi:10.1097/MOL.0b013e32834c7cfc. Schilling, Ramon, Peter Geserick, and Martin Leverkus. 2014. “Characterization of the Ripoptosome and Its Components: Implications for Anti-Inflammatory and Cancer

248

Therapy.” Methods in Enzymology 545: 83–102. doi:10.1016/B978-0-12-801430- 1.00004-4. Schinzel, Anna C., Osamu Takeuchi, Zhihong Huang, Jill K. Fisher, Zhipeng Zhou, Jeffery Rubens, Claudio Hetz, Nika N. Danial, Michael A. Moskowitz, and Stanley J. Korsmeyer. 2005. “Cyclophilin D Is a Component of Mitochondrial Permeability Transition and Mediates Neuronal Cell Death after Focal Cerebral Ischemia.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102 (34): 12005–10. doi:10.1073/pnas.0505294102. Schmitz, I., H. Walczak, P. H. Krammer, and M. E. Peter. 1999. “Differences between CD95 Type I and II Cells Detected with the CD95 Ligand.” Cell Death and Differentiation 6 (9): 821–22. doi:10.1038/sj.cdd.4400569. Schneider, Anne T., Jérémie Gautheron, Frank Tacke, Mihael Vucur, and Tom Luedde. 2016. “Receptor Interacting Protein Kinase 1 (RIPK1) in Hepatocytes Does Not Mediate Murine Acetaminophen Toxicity.” Hepatology 64 (1): 306–8. doi:10.1002/hep.28225. Schock, Suruchi N, Neha V Chandra, Yuefang Sun, Takashi Irie, Yoshinori Kitagawa, Bin Gotoh, Laurent Coscoy, and Astar Winoto. 2017. “Induction of Necroptotic Cell Death by Viral Activation of the RIG-I or STING Pathway.” Cell Death and Differentiation, January. doi:10.1038/cdd.2016.153. Schuppan, Detlef, and Nezam H. Afdhal. 2008. “Liver Cirrhosis.” Lancet (London, England) 371 (9615): 838–51. doi:10.1016/S0140-6736(08)60383-9. Seiler, Alexander, Manuela Schneider, Heidi Förster, Stephan Roth, Eva K. Wirth, Carsten Culmsee, Nikolaus Plesnila, et al. 2008. “Glutathione Peroxidase 4 Senses and Translates Oxidative Stress into 12/15-Lipoxygenase Dependent- and AIF-Mediated Cell Death.” Cell Metabolism 8 (3): 237–48. doi:10.1016/j.cmet.2008.07.005. Seino, K., NOBUHIKO Kayagaki, KAZUYOSHI Takeda, KATASHI Fukao, K. Okumura, and HIDEO Yagita. 1997. “Contribution of Fas Ligand to T Cell-Mediated Hepatic Injury in Mice.” Gastroenterology 113 (4): 1315–1322. Seol, Wongi. 2010. “Biochemical and Molecular Features of LRRK2 and Its Pathophysiological Roles in Parkinson’s Disease.” BMB Reports 43 (4): 233–44. Shahsavari, Zahra, Fatemeh Karami-Tehrani, Siamak Salami, and Mehran Ghasemzadeh. 2016. “RIP1K and RIP3K Provoked by Shikonin Induce Cell Cycle Arrest in the Triple Negative Breast Cancer Cell Line, MDA-MB-468: Necroptosis as a Desperate Programmed Suicide Pathway.” Tumour Biology: The Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine 37 (4): 4479–91. doi:10.1007/s13277-015-4258-5. Shaw, Patrick J., Maggie J. Barr, John R. Lukens, Maureen A. McGargill, Hongbo Chi, Tak W. Mak, and Thirumala-Devi Kanneganti. 2011. “Signaling via the RIP2 Adaptor Protein in Central Nervous System-Infiltrating Dendritic Cells Promotes Inflammation and Autoimmunity.” Immunity 34 (1): 75–84. doi:10.1016/j.immuni.2010.12.015. Shimada, Kenichi, Shuang Chen, Paul W. Dempsey, Rosalinda Sorrentino, Randa Alsabeh, Anatoly V. Slepenkin, Ellena Peterson, et al. 2009. “The NOD/RIP2 Pathway Is Essential for Host Defenses against Chlamydophila Pneumoniae Lung Infection.” PLoS Pathogens 5 (4): e1000379. doi:10.1371/journal.ppat.1000379. Shirley, Sarah, Alexandre Morizot, and Olivier Micheau. 2011. “Regulating TRAIL Receptor- Induced Cell Death at the Membrane: A Deadly Discussion.” Recent Patents on Anti- Cancer Drug Discovery 6 (3): 311. doi:10.2174/157489211796957757. Siegmund, Daniela, Stefanie Klose, Donghui Zhou, Bernd Baumann, Christian Röder, Holger Kalthoff, Harald Wajant, and Anna Trauzold. 2007. “Role of Caspases in CD95L- and TRAIL-Induced Non-Apoptotic Signalling in Pancreatic Tumour Cells.” Cellular Signalling 19 (6): 1172–84. doi:10.1016/j.cellsig.2006.12.008.

249

Silke, John, James A Rickard, and Motti Gerlic. 2015. “The Diverse Role of RIP Kinases in Necroptosis and Inflammation.” Nature Immunology 16 (7): 689–97. doi:10.1038/ni.3206. Sipieter, François, Maria Ladik, Peter Vandenabeele, and Franck Riquet. 2014. “Shining Light on Cell Death Processes - a Novel Biosensor for Necroptosis, a Newly Described Cell Death Program.” Biotechnology Journal 9 (2): 224–40. doi:10.1002/biot.201300200. Skouta, Rachid, Scott J. Dixon, Jianlin Wang, Denise E. Dunn, Marina Orman, Kenichi Shimada, Paul A. Rosenberg, et al. 2014. “Ferrostatins Inhibit Oxidative Lipid Damage and Cell Death in Diverse Disease Models.” Journal of the American Chemical Society 136 (12): 4551–56. doi:10.1021/ja411006a. Smit, Judith J., Davide Monteferrario, Sylvie M. Noordermeer, Willem J. van Dijk, Bert A. van der Reijden, and Titia K. Sixma. 2012. “The E3 Ligase HOIP Specifies Linear Ubiquitin Chain Assembly through Its RING-IBR-RING Domain and the Unique LDD Extension.” The EMBO Journal 31 (19): 3833–44. doi:10.1038/emboj.2012.217. Smith, Christopher C. T., Sean M. Davidson, Shiang Y. Lim, James C. Simpkin, John S. Hothersall, and Derek M. Yellon. 2007. “Necrostatin: A Potentially Novel Cardioprotective Agent?” Cardiovascular Drugs and Therapy 21 (4): 227–33. doi:10.1007/s10557-007-6035-1. Smith, Christopher C.T., and Derek M. Yellon. 2011. “Necroptosis, Necrostatins and Tissue Injury.” Journal of Cellular and Molecular Medicine 15 (9): 1797–1806. doi:10.1111/j.1582-4934.2011.01341.x. Smith, Wanli W., Zhong Pei, Haibing Jiang, Valina L. Dawson, Ted M. Dawson, and Christopher A. Ross. 2006. “Kinase Activity of Mutant LRRK2 Mediates Neuronal Toxicity.” Nature Neuroscience 9 (10): 1231–33. doi:10.1038/nn1776. Sosna, Justyna, Susann Voigt, Sabine Mathieu, Arne Lange, Lutz Thon, Parvin Davarnia, Thomas Herdegen, et al. 2014. “TNF-Induced Necroptosis and PARP-1-Mediated Necrosis Represent Distinct Routes to Programmed Necrotic Cell Death.” Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS 71 (2): 331–48. doi:10.1007/s00018-013-1381-6. Spencer, E., J. Jiang, and Z. J. Chen. 1999. “Signal-Induced Ubiquitination of IkappaBalpha by the F-Box Protein Slimb/Beta-TrCP.” Genes & Development 13 (3): 284–94. Sprick, Martin R., Eva Rieser, Heiko Stahl, Anne Grosse-Wilde, Markus A. Weigand, and Henning Walczak. 2002. “Caspase-10 Is Recruited to and Activated at the Native TRAIL and CD95 Death-Inducing Signalling Complexes in a FADD-Dependent Manner but Can Not Functionally Substitute Caspase-8.” The EMBO Journal 21 (17): 4520–30. Stanger, Ben Z., Philip Leder, Tae-Ho Lee, Emily Kim, and Brian Seed. 1995. “RIP: A Novel Protein Containing a Death Domain That Interacts with Fas/APO-1 (CD95) in Yeast and Causes Cell Death.” Cell 81 (4): 513–523. Sun, Liming, Huayi Wang, Zhigao Wang, Sudan He, She Chen, Daohong Liao, Lai Wang, et al. 2012. “Mixed Lineage Kinase Domain-like Protein Mediates Necrosis Signaling Downstream of RIP3 Kinase.” Cell 148 (1–2): 213–27. doi:10.1016/j.cell.2011.11.031. Sun, X., J. Lee, T. Navas, D.T. Baldwin, T.A. Stewart, and V. M. Dixit. 1999. “Sun X et Al. 1999 - JBC - RIP3, a Novel Apoptosis-Inducing Kinase.pdf.” The Journal of Biological Chemistry. Sun, X., J. Yin, M. A. Starovasnik, W. J. Fairbrother, and V. M. Dixit. 2002. “Identification of a Novel Homotypic Interaction Motif Required for the Phosphorylation of Receptor-Interacting Protein (RIP) by RIP3.” Journal of Biological Chemistry 277 (11): 9505–11. doi:10.1074/jbc.M109488200.

250

Sun, Yue, Jie Zhang, Rongfen Huo, Tianhang Zhai, Huidan Li, Pinru Wu, Xianjin Zhu, Zhou Zhou, Baihua Shen, and Ningli Li. 2015. “Paeoniflorin Inhibits Skin Lesions in Imiquimod-Induced Psoriasis-like Mice by Downregulating Inflammation.” International Immunopharmacology 24 (2): 392–99. doi:10.1016/j.intimp.2014.12.032. Tagawa, Y.-i, K. Sekikawa, and Y. Iwakura. 1997. “Suppression of Concanavalin A-Induced Hepatitis in IFN-Gamma (-/-) Mice, but Not in TNF-Alpha (-/-) Mice: Role for IFN- Gamma in Activating Apoptosis of Hepatocytes.” The Journal of Immunology 159 (3): 1418–1428. Tait, S W G, and D R Green. 2008. “Caspase-Independent Cell Death: Leaving the Set without the Final Cut.” Oncogene 27 (50): 6452–61. doi:10.1038/onc.2008.311. Takahashi, N., L. Duprez, S. Grootjans, A. Cauwels, W. Nerinckx, J. B. DuHadaway, V. Goossens, et al. 2012. “Necrostatin-1 Analogues: Critical Issues on the Specificity, Activity and in Vivo Use in Experimental Disease Models.” Cell Death & Disease 3: e437. doi:10.1038/cddis.2012.176. Takahashi, Nozomi, Lars Vereecke, Mathieu J. M. Bertrand, Linde Duprez, Scott B. Berger, Tatyana Divert, Amanda Gonçalves, et al. 2014. “RIPK1 Ensures Intestinal Homeostasis by Protecting the Epithelium against Apoptosis.” Nature 513 (7516): 95– 99. doi:10.1038/nature13706. Takeda, K., O. Takeuchi, T. Tsujimura, S. Itami, O. Adachi, T. Kawai, H. Sanjo, K. Yoshikawa, N. Terada, and S. Akira. 1999. “Limb and Skin Abnormalities in Mice Lacking IKKalpha.” Science (New York, N.Y.) 284 (5412): 313–16. Takeda, Kazuyoshi, Yoshihiro Hayakawa, Luc Van Kaer, Hironori Matsuda, Hideo Yagita, and Ko Okumura. 2000. “Critical Contribution of Liver Natural Killer T Cells to a Murine Model of Hepatitis.” Proceedings of the National Academy of Sciences 97 (10): 5498–5503. Takemoto, Kenji, Etsuro Hatano, Keiko Iwaisako, Masatoshi Takeiri, Naruto Noma, Saori Ohmae, Kan Toriguchi, et al. 2014. “Necrostatin-1 Protects against Reactive Oxygen Species (ROS)-Induced Hepatotoxicity in Acetaminophen-Induced Acute Liver Failure.” FEBS Open Bio 4: 777. doi:10.1016/j.fob.2014.08.007. Tenev, Tencho, Katiuscia Bianchi, Maurice Darding, Meike Broemer, Claudia Langlais, Fredrik Wallberg, Anna Zachariou, et al. 2011. “The Ripoptosome, a Signaling Platform That Assembles in Response to Genotoxic Stress and Loss of IAPs.” Molecular Cell 43 (3): 432–48. doi:10.1016/j.molcel.2011.06.006. Teng, Xin, Alexei Degterev, Prakash Jagtap, Xuechao Xing, Sungwoon Choi, Régine Denu, Junying Yuan, and Gregory D. Cuny. 2005. “Structure-Activity Relationship Study of Novel Necroptosis Inhibitors.” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 (22): 5039–44. doi:10.1016/j.bmcl.2005.07.077. Teng, Xin, Heather Keys, Arumugasamy Jeevanandam, John A. Porco, Alexei Degterev, Junying Yuan, and Gregory D. Cuny. 2007. “Structure-Activity Relationship Study of [1,2,3]thiadiazole Necroptosis Inhibitors.” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 17 (24): 6836–40. doi:10.1016/j.bmcl.2007.10.024. Teng, Xin, Heather Keys, Junying Yuan, Alexei Degterev, and Gregory D. Cuny. 2008. “Structure-Activity Relationship and Liver Microsome Stability Studies of Pyrrole Necroptosis Inhibitors.” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 18 (11): 3219–23. doi:10.1016/j.bmcl.2008.04.048. Thapa, R. J., S. Nogusa, P. Chen, J. L. Maki, A. Lerro, M. Andrake, G. F. Rall, A. Degterev, and S. Balachandran. 2013. “Interferon-Induced RIP1/RIP3-Mediated Necrosis Requires PKR and Is Licensed by FADD and Caspases.” Proceedings of the National Academy of Sciences 110 (33): E3109–18. doi:10.1073/pnas.1301218110.

251

Thome, M., K. Hofmann, K. Burns, F. Martinon, J. L. Bodmer, C. Mattmann, and J. Tschopp. 1998. “Identification of CARDIAK, a RIP-like Kinase That Associates with Caspase- 1.” Current Biology: CB 8 (15): 885–88. Thorburn, Andrew. 2004. “Death Receptor-Induced Cell Killing.” Cellular Signalling 16 (2): 139–44. doi:10.1016/j.cellsig.2003.08.007. Tiegs, Gisa, J. Hentschel, and A. Wendel. 1992. “A T Cell-Dependent Experimental Liver Injury in Mice Inducible by Concanavalin A.” J. Clin. Invest. 90 (July): 192–203. Ting, A. T., F. X. Pimentel-Muiños, and B. Seed. 1996. “RIP Mediates Tumor Necrosis Factor Receptor 1 Activation of NF-kappaB but Not Fas/APO-1-Initiated Apoptosis.” The EMBO Journal 15 (22): 6189–96. Tohyama, Mikiko, and Koji Hashimoto. 2012. “Immunological Mechanisms of Epidermal Damage in Toxic Epidermal Necrolysis.” Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 12 (4): 376–82. doi:10.1097/ACI.0b013e328355b865. Tokunaga, Fuminori, and Kazuhiro Iwai. 2012. “Linear Ubiquitination: A Novel NF-κB Regulatory Mechanism for Inflammatory and Immune Responses by the LUBAC Ubiquitin Ligase Complex.” Endocrine Journal 59 (8): 641–52. Tokunaga, Fuminori, Tomoko Nakagawa, Masaki Nakahara, Yasushi Saeki, Masami Taniguchi, Shin-ichi Sakata, Keiji Tanaka, Hiroyasu Nakano, and Kazuhiro Iwai. 2011. “SHARPIN Is a Component of the NF-κB-Activating Linear Ubiquitin Chain Assembly Complex.” Nature 471 (7340): 633–36. doi:10.1038/nature09815. Tokunaga, Fuminori, Shin-ichi Sakata, Yasushi Saeki, Yoshinori Satomi, Takayoshi Kirisako, Kiyoko Kamei, Tomoko Nakagawa, et al. 2009. “Involvement of Linear Polyubiquitylation of NEMO in NF-kappaB Activation.” Nature Cell Biology 11 (2): 123–32. doi:10.1038/ncb1821. Trautwein, Christian, Tim Rakemann, Nisar Peter Malek, Jörg Plümpe, Gisa Tiegs, and Michael Peter Manns. 1998. “Concanavalin A-Induced Liver Injury Triggers Hepatocyte Proliferation.” Journal of Clinical Investigation 101 (9): 1960. Tse, Wai-Pui, Chun-Tao Che, Ken Liu, and Zhi-Xiu Lin. 2006. “Evaluation of the Anti- Proliferative Properties of Selected Psoriasis-Treating Chinese Medicines on Cultured HaCaT Cells.” Journal of Ethnopharmacology 108 (1): 133–41. doi:10.1016/j.jep. 2006.04.023. Tsuchiya, Yuichi, Osamu Nakabayashi, and Hiroyasu Nakano. 2015. “FLIP the Switch: Regulation of Apoptosis and Necroptosis by cFLIP.” International Journal of Molecular Sciences 16 (12): 30321–41. doi:10.3390/ijms161226232. Upton, Jason W., and Francis Ka-Ming Chan. 2014. “Staying Alive: Cell Death in Antiviral Immunity.” Molecular Cell 54 (2): 273–80. doi:10.1016/j.molcel.2014.01.027. Upton, Jason W., William J. Kaiser, and Edward S. Mocarski. 2008. “Cytomegalovirus M45 Cell Death Suppression Requires Receptor-Interacting Protein (RIP) Homotypic Interaction Motif (RHIM)-Dependent Interaction with RIP1.” The Journal of Biological Chemistry 283 (25): 16966–70. doi:10.1074/jbc.C800051200. Upton, Jason W., William J. Kaiser, and Edward S. Mocarski. 2010. “Virus Inhibition of RIP3-Dependent Necrosis.” Cell Host & Microbe 7 (4): 302–13. doi:10.1016/j.chom.2010.03.006. Upton, Jason W., William J. Kaiser, and Edward S. Mocarski. 2012. “DAI/ZBP1/DLM-1 Complexes with RIP3 to Mediate Virus-Induced Programmed Necrosis That Is Targeted by Murine Cytomegalovirus vIRA.” Cell Host & Microbe 11 (3): 290–97. doi:10.1016/j.chom.2012.01.016. Van Antwerp, D. J., S. J. Martin, T. Kafri, D. R. Green, and I. M. Verma. 1996. “Suppression of TNF-Alpha-Induced Apoptosis by NF-kappaB.” Science (New York, N.Y.) 274 (5288): 787–89.

252

Vande Walle, Lieselotte, and Mohamed Lamkanfi. 2016. “Pyroptosis.” Current Biology: CB 26 (13): R568-572. doi:10.1016/j.cub.2016.02.019. Vanden Berghe, Tom, Behrouz Hassannia, and Peter Vandenabeele. 2016. “An Outline of Necrosome Triggers.” Cellular and Molecular Life Sciences 73 (11–12): 2137–52. doi:10.1007/s00018-016-2189-y. Vanden Berghe, Tom, Andreas Linkermann, Sandrine Jouan-Lanhouet, Henning Walczak, and Peter Vandenabeele. 2014. “Regulated Necrosis: The Expanding Network of Non- Apoptotic Cell Death Pathways.” Nature Reviews. Molecular Cell Biology 15 (2): 135–47. doi:10.1038/nrm3737. Vandenabeele, P., S. Grootjans, N. Callewaert, and N. Takahashi. 2013. “Necrostatin-1 Blocks Both RIPK1 and IDO: Consequences for the Study of Cell Death in Experimental Disease Models.” Cell Death and Differentiation 20 (2): 185–87. doi:10.1038/cdd.2012.151. Vandenabeele, Peter, Wim Declercq, Franky Van Herreweghe, and Tom Vanden Berghe. 2010a. “The Role of the Kinases RIP1 and RIP3 in TNF-Induced Necrosis.” Sci Signal 3 (115): re4. Vandenabeele, Peter, Lorenzo Galluzzi, Tom Vanden Berghe, and Guido Kroemer. 2010b. “Molecular Mechanisms of Necroptosis: An Ordered Cellular Explosion.” Nature Reviews Molecular Cell Biology 11 (10): 700–714. doi:10.1038/nrm2970. Vanlangenakker, N, M J M Bertrand, P Bogaert, P Vandenabeele, and T Vanden Berghe. 2011b. “TNF-Induced Necroptosis in L929 Cells Is Tightly Regulated by Multiple TNFR1 Complex I and II Members.” Cell Death and Disease 2 (11): e230. doi:10.1038/cddis.2011.111. Vanlangenakker, N., T. Vanden Berghe, P. Bogaert, B. Laukens, K. Zobel, K. Deshayes, D. Vucic, S. Fulda, P. Vandenabeele, and M. J. M. Bertrand. 2011a. “cIAP1 and TAK1 Protect Cells from TNF-Induced Necrosis by Preventing RIP1/RIP3-Dependent Reactive Oxygen Species Production.” Cell Death and Differentiation 18 (4): 656–65. doi:10.1038/cdd.2010.138. Varfolomeev, E. E., M. Schuchmann, V. Luria, N. Chiannilkulchai, J. S. Beckmann, I. L. Mett, D. Rebrikov, et al. 1998. “Targeted Disruption of the Mouse Caspase 8 Gene Ablates Cell Death Induction by the TNF Receptors, Fas/Apo1, and DR3 and Is Lethal Prenatally.” Immunity 9 (2): 267–76. Varfolomeev, Eugene E., Mark P. Boldin, Tanya M; Goncharov, and David Wallach. 1996. “A Potential Mechanism of‘Cross-Talk’ between the p55 Tumor Necrosis Factor Receptor and Fas/APOI: Proteins Binding to the Death Domains of the Two Receptors Also Bind to Each Other.” The Journal of Experimental Medicine 183 (3): 1271–75. Varfolomeev, Eugene, Tatiana Goncharov, Anna V. Fedorova, Jasmin N. Dynek, Kerry Zobel, Kurt Deshayes, Wayne J. Fairbrother, and Domagoj Vucic. 2008. “C-IAP1 and c-IAP2 Are Critical Mediators of Tumor Necrosis Factor Alpha (TNFalpha)-Induced NF-kappaB Activation.” The Journal of Biological Chemistry 283 (36): 24295–99. doi:10.1074/jbc.C800128200. Varfolomeev, Eugene, Heather Maecker, Darcie Sharp, David Lawrence, Mark Renz, Domagoj Vucic, and Avi Ashkenazi. 2005. “Molecular Determinants of Kinase Pathway Activation by Apo2 Ligand/Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis- Inducing Ligand.” Journal of Biological Chemistry 280 (49): 40599–608. doi:10.1074/jbc.M509560200. Vaseva, Angelina V., Natalie D. Marchenko, Kyungmin Ji, Stella E. Tsirka, Sonja Holzmann, and Ute M. Moll. 2012. “p53 Opens the Mitochondrial Permeability Transition Pore to Trigger Necrosis.” Cell 149 (7): 1536–48. doi:10.1016/j.cell.2012.05.014.

253

Vercammen, Dominique, Greet Brouckaert, Geertrui Denecker, Marc Van de Craen, Wim Declercq, Walter Fiers, and Peter Vandenabeele. 1998. “Dual Signaling of the Fas Receptor: Initiation of Both Apoptotic and Necrotic Cell Death Pathways.” Journal of Experimental Medicine 188 (5): 919–930. Vereecke, Lars, Mozes Sze, Conor Mc Guire, Brecht Rogiers, Yuanyuan Chu, Marc Schmidt- Supprian, Manolis Pasparakis, Rudi Beyaert, and Geert van Loo. 2010. “Enterocyte- Specific A20 Deficiency Sensitizes to Tumor Necrosis Factor-Induced Toxicity and Experimental Colitis.” The Journal of Experimental Medicine 207 (7): 1513–23. doi:10.1084/jem.20092474. Vernon, G., A. Baranova, and Z. M. Younossi. 2011. “Systematic Review: The Epidemiology and Natural History of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease and Non-Alcoholic Steatohepatitis in Adults.” Alimentary Pharmacology & Therapeutics 34 (3): 274–85. doi:10.1111/j.1365-2036.2011.04724.x. Vince, James E., Delara Pantaki, Rebecca Feltham, Peter D. Mace, Stephanie M. Cordier, Anna C. Schmukle, Angelina J. Davidson, et al. 2009. “TRAF2 Must Bind to Cellular Inhibitors of Apoptosis for Tumor Necrosis Factor (Tnf) to Efficiently Activate Nf- {kappa}b and to Prevent Tnf-Induced Apoptosis.” The Journal of Biological Chemistry 284 (51): 35906–15. doi:10.1074/jbc.M109.072256. Vince, James E., W. Wei-Lynn Wong, Ian Gentle, Kate E. Lawlor, Ramanjaneyulu Allam, Lorraine O’Reilly, Kylie Mason, et al. 2012. “Inhibitor of Apoptosis Proteins Limit RIP3 Kinase-Dependent Interleukin-1 Activation.” Immunity 36 (2): 215–27. doi:10.1016/j.immuni.2012.01.012. Vogler, Meike, Henning Walczak, Dominic Stadel, Tobias L. Haas, Felicitas Genze, Marjana Jovanovic, Jürgen E. Gschwend, Thomas Simmet, Klaus-Michael Debatin, and Simone Fulda. 2008. “Targeting XIAP Bypasses Bcl-2-Mediated Resistance to TRAIL and Cooperates with TRAIL to Suppress Pancreatic Cancer Growth in Vitro and in Vivo.” Cancer Research 68 (19): 7956–65. doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-1296. Vora, Puja, and Dermot P. B. McGovern. 2012. “LRRK2 as a Negative Regulator of NFAT: Implications for the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Disease.” Expert Review of Clinical Immunology 8 (3): 227–29. doi:10.1586/eci.12.11. Wada, Naoko, Yawara Kawano, Shiho Fujiwara, Yoshitaka Kikukawa, Yutaka Okuno, Masayoshi Tasaki, Mitsuharu Ueda, et al. 2015. “Shikonin, Dually Functions as a Proteasome Inhibitor and a Necroptosis Inducer in Multiple Myeloma Cells.” International Journal of Oncology 46 (3): 963–72. doi:10.3892/ijo.2014.2804. Wallach, David, Tae-Bong Kang, and Andrew Kovalenko. 2014. “Concepts of Tissue Injury and Cell Death in Inflammation: A Historical Perspective.” Nature Reviews Immunology 14 (1): 51–59. Wang, C., L. Deng, M. Hong, G. R. Akkaraju, J. Inoue, and Z. J. Chen. 2001. “TAK1 Is a Ubiquitin-Dependent Kinase of MKK and IKK.” Nature 412 (6844): 346–51. doi:10.1038/35085597. Wang, C. Y., M. W. Mayo, R. G. Korneluk, D. V. Goeddel, and A. S. Baldwin. 1998. “NF- kappaB Antiapoptosis: Induction of TRAF1 and TRAF2 and c-IAP1 and c-IAP2 to Suppress Caspase-8 Activation.” Science (New York, N.Y.) 281 (5383): 1680–83. Wang, Di, Ming Zhao, Guozhu Chen, Xiang Cheng, Xiaoxi Han, Song Lin, Xuhui Zhang, and Xiaodan Yu. 2013. “The Histone Deacetylase Inhibitor Vorinostat Prevents TNFα- Induced Necroptosis by Regulating Multiple Signaling Pathways.” Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death 18 (11): 1348–62. doi:10.1007/s10495-013-0866-y. Wang, Huayi, Liming Sun, Lijing Su, Josep Rizo, Lei Liu, Li-Feng Wang, Fu-Sheng Wang, and Xiaodong Wang. 2014a. “Mixed Lineage Kinase Domain-like Protein MLKL

254

Causes Necrotic Membrane Disruption upon Phosphorylation by RIP3.” Molecular Cell 54 (1): 133–46. doi:10.1016/j.molcel.2014.03.003. Wang, Lai, Fenghe Du, and Xiaodong Wang. 2008. “TNF-α Induces Two Distinct Caspase-8 Activation Pathways.” Cell 133 (4): 693–703. doi:10.1016/j.cell.2008.03.036. Wang, Min, Mingzhang Gao, Zhidong Xu, and Qi-Huang Zheng. 2017. “Synthesis of [(11)C]HG-10-102-01 as a New Potential PET Agent for Imaging of LRRK2 Enzyme in Parkinson’s Disease.” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 27 (6): 1351–55. doi:10.1016/j.bmcl.2017.02.019. Wang, Shaogui, Hong-Min Ni, Kenneth Dorko, Sean C. Kumer, Timothy M. Schmitt, Atta Nawabi, Masaaki Komatsu, et al. 2016. “Increased Hepatic Receptor Interacting Protein Kinase 3 Expression due to Impaired Proteasomal Functions Contributes to Alcohol-Induced Steatosis and Liver Injury.” Oncotarget 7 (14): 17681–98. doi:10.18632/ oncotarget.6893. Wang, Shulin, and Wafik S El-Deiry. 2003. “TRAIL and Apoptosis Induction by TNF-Family Death Receptors.” Oncogene 22 (53): 8628–33. doi:10.1038/sj.onc.1207232. Wang, Xiaqiong, Wei Jiang, Yiqing Yan, Tao Gong, Jiahuai Han, Zhigang Tian, and Rongbin Zhou. 2014b. “RNA Viruses Promote Activation of the NLRP3 Inflammasome through a RIP1-RIP3-DRP1 Signaling Pathway.” Nature Immunology 15 (12): 1126– 33. doi:10.1038/ni.3015. Wang, Yingfei, No Soo Kim, Jean-Francois Haince, Ho Chul Kang, Karen K. David, Shaida A. Andrabi, Guy G. Poirier, Valina L. Dawson, and Ted M. Dawson. 2011. “Poly(ADP-Ribose) (PAR) Binding to Apoptosis-Inducing Factor Is Critical for PAR Polymerase-1-Dependent Cell Death (Parthanatos).” Science Signaling 4 (167): ra20. doi:10.1126/scisignal.2000902. Ward, James E., and Walter M. Stadler. 2010. “Pazopanib in Renal Cell Carcinoma.” Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research 16 (24): 5923–27. doi:10.1158/1078-0432.CCR-10-0728. Wartha, Florian, and Birgitta Henriques-Normark. 2008. “ETosis: A Novel Cell Death Pathway.” Sci. Signal. 1 (21): pe25–pe25. Wasilenko, Shawn T., Tara L. Stewart, Adrienne FA Meyers, and Michele Barry. 2003. “Vaccinia Virus Encodes a Previously Uncharacterized Mitochondrial-Associated Inhibitor of Apoptosis.” Proceedings of the National Academy of Sciences 100 (24): 14345–14350. Watanabe, Yoshifumi, Masahiko Morita, and Toshihiro Akaike. 1996. “Concanavalin A Induces Perforin-Mediated but Not Fas-Mediated Hepatic Injury.” Hepatology 24 (3): 702–710. Wegner, Kelby W., Danish Saleh, and Alexei Degterev. 2017. “Complex Pathologic Roles of RIPK1 and RIPK3: Moving Beyond Necroptosis.” Trends in Pharmacological Sciences, January. doi:10.1016/j.tips.2016.12.005. Weinlich, Ricardo, Andrew Oberst, Christopher P. Dillon, Laura J. Janke, Sandra Milasta, John R. Lukens, Diego A. Rodriguez, et al. 2013. “Protective Roles for Caspase-8 and cFLIP in Adult Homeostasis.” Cell Reports 5 (2): 340–48. doi:10.1016/j.celrep. 2013.08.045. Welz, Patrick-Simon, Andy Wullaert, Katerina Vlantis, Vangelis Kondylis, Vanesa Fernández-Majada, Maria Ermolaeva, Petra Kirsch, Anja Sterner-Kock, Geert van Loo, and Manolis Pasparakis. 2011. “FADD Prevents RIP3-Mediated Epithelial Cell Necrosis and Chronic Intestinal Inflammation.” Nature 477 (7364): 330–34. doi:10.1038/nature10273.

255

Wen, Leng, Li Zhuang, Xia Luo, and Ping Wei. 2003. “TL1A-Induced NF-κB Activation and c-IAP2 Production Prevent DR3-Mediated Apoptosis in TF-1 Cells.” Journal of Biological Chemistry 278 (40): 39251–58. doi:10.1074/jbc.M305833200. Weng, Dan, Robyn Marty-Roix, Sandhya Ganesan, Megan K. Proulx, Gregory I. Vladimer, William J. Kaiser, Edward S. Mocarski, et al. 2014. “Caspase-8 and RIP Kinases Regulate Bacteria-Induced Innate Immune Responses and Cell Death.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111 (20): 7391–96. doi:10.1073/pnas.1403477111. Wertz, Ingrid E., Karen M. O’Rourke, Honglin Zhou, Michael Eby, L. Aravind, Somasekar Seshagiri, Ping Wu, et al. 2004. “De-Ubiquitination and Ubiquitin Ligase Domains of A20 Downregulate NF-kappaB Signalling.” Nature 430 (7000): 694–99. doi:10.1038/nature02794. Wiley, S. R., K. Schooley, P. J. Smolak, W. S. Din, C. P. Huang, J. K. Nicholl, G. R. Sutherland, T. D. Smith, C. Rauch, and C. A. Smith. 1995. “Identification and Characterization of a New Member of the TNF Family That Induces Apoptosis.” Immunity 3 (6): 673–82. Wilson, Nicholas S., Vishva Dixit, and Avi Ashkenazi. 2009. “Death Receptor Signal Transducers: Nodes of Coordination in Immune Signaling Networks.” Nature Immunology 10 (4): 348–55. doi:10.1038/ni.1714. Windheim, Mark, Christine Lang, Mark Peggie, Lorna A. Plater, and Philip Cohen. 2007. “Molecular Mechanisms Involved in the Regulation of Cytokine Production by Muramyl Dipeptide.” The Biochemical Journal 404 (2): 179–90. doi:10.1042/BJ20061704. Winston, J. T., P. Strack, P. Beer-Romero, C. Y. Chu, S. J. Elledge, and J. W. Harper. 1999. “The SCFbeta-TRCP-Ubiquitin Ligase Complex Associates Specifically with Phosphorylated Destruction Motifs in IkappaBalpha and Beta-Catenin and Stimulates IkappaBalpha Ubiquitination in Vitro.” Genes & Development 13 (3): 270–83. Witek, Rafal P., W. Carl Stone, F. Gamze Karaca, Wing-Kin Syn, Thiago A. Pereira, Kolade M. Agboola, Alessia Omenetti, et al. 2009. “Pan-Caspase Inhibitor VX-166 Reduces Fibrosis in an Animal Model of Nonalcoholic Steatohepatitis.” Hepatology (Baltimore, Md.) 50 (5): 1421–30. doi:10.1002/hep.23167. Wolf, D., R. Hallmann, G. Sass, M. Sixt, S. Kusters, B. Fregien, C. Trautwein, and G. Tiegs. 2001. “TNF- -Induced Expression of Adhesion Molecules in the Liver Is Under the Control of TNFR1--Relevance for Concanavalin A-Induced Hepatitis.” The Journal of Immunology 166 (2): 1300–1307. doi:10.4049/jimmunol.166.2.1300. Wree, Alexander, Lori Broderick, Ali Canbay, Hal M. Hoffman, and Ariel E. Feldstein. 2013. “From NAFLD to NASH to Cirrhosis-New Insights into Disease Mechanisms.” Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology 10 (11): 627–36. doi:10.1038/nrgastro.2013.149. Wree, Alexander, Wajahat Z. Mehal, and Ariel E. Feldstein. 2016. “Targeting Cell Death and Sterile Inflammation Loop for the Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis.” Seminars in Liver Disease 36 (1): 27–36. doi:10.1055/s-0035-1571272. Wright, Ato, William W. Reiley, Mikyoung Chang, Wei Jin, Andrew Joon Lee, Minying Zhang, and Shao-Cong Sun. 2007. “Regulation of Early Wave of Germ Cell Apoptosis and Spermatogenesis by Deubiquitinating Enzyme CYLD.” Developmental Cell 13 (5): 705–16. doi:10.1016/j.devcel.2007.09.007. Wu, Chuan-Jin, Dietrich B. Conze, Tao Li, Srinivasa M. Srinivasula, and Jonathan D. Ashwell. 2006. “Sensing of Lys 63-Linked Polyubiquitination by NEMO Is a Key Event in NF-kappaB Activation [Corrected].” Nature Cell Biology 8 (4): 398–406. doi:10.1038/ncb1384.

256

Wu, Gen Sheng. 2009. “TRAIL as a Target in Anti-Cancer Therapy.” Cancer Letters 285 (1): 1–5. doi:10.1016/j.canlet.2009.02.029. Wu, Jianfeng, Zhe Huang, Junming Ren, Zhirong Zhang, Peng He, Yangxin Li, Jianhui Ma, et al. 2013. “Mlkl Knockout Mice Demonstrate the Indispensable Role of Mlkl in Necroptosis.” Cell Research 23 (8): 994–1006. doi:10.1038/cr.2013.91. Wu, X. N., Z. H. Yang, X. K. Wang, Y. Zhang, H. Wan, Y. Song, X. Chen, J. Shao, and J. Han. 2014. “Distinct Roles of RIP1–RIP3 Hetero-and RIP3–RIP3 Homo-Interaction in Mediating Necroptosis.” Cell Death & Differentiation 21 (11): 1709–1720. Xie, Tian, Wei Peng, Yexing Liu, Chuangye Yan, Jenny Maki, Alexei Degterev, Junying Yuan, and Yigong Shi. 2013a. “Structural Basis of RIP1 Inhibition by Necrostatins.” Structure 21 (3): 493–99. doi:10.1016/j.str.2013.01.016. Xie, Tian, Wei Peng, Chuangye Yan, Jianping Wu, Xinqi Gong, and Yigong Shi. 2013b. “Structural Insights into RIP3-Mediated Necroptotic Signaling.” Cell Reports 5 (1): 70–78. doi:10.1016/j.celrep.2013.08.044. Xu, Xingshun, Kao-Wei Chua, Chu C. Chua, Chun-Feng Liu, Ronald C. Hamdy, and Balvin H.L. Chua. 2010. “Synergistic Protective Effects of Humanin and Necrostatin-1 on Hypoxia and Ischemia/Reperfusion Injury.” Brain Research 1355 (October): 189–94. doi:10.1016/j.brainres.2010.07.080. Yagoda, Nicholas, Moritz von Rechenberg, Elma Zaganjor, Andras J. Bauer, Wan Seok Yang, Daniel J. Fridman, Adam J. Wolpaw, et al. 2007. “RAS–RAF–MEK-Dependent Oxidative Cell Death Involving Voltage-Dependent Anion Channels.” Nature 447 (7146): 865–69. doi:10.1038/nature05859. Yang, J., Y. Lin, Z. Guo, J. Cheng, J. Huang, L. Deng, W. Liao, Z. Chen, Z. Liu, and B. Su. 2001. “The Essential Role of MEKK3 in TNF-Induced NF-kappaB Activation.” Nature Immunology 2 (7): 620–24. doi:10.1038/89769. Yang, Shuo, Bingwei Wang, Lisa S. Tang, Jakub Siednienko, John J. Callanan, and Paul N. Moynagh. 2013. “Pellino3 Targets RIP1 and Regulates the pro-Apoptotic Effects of TNF-α.” Nature Communications 4 (October). doi:10.1038/ncomms3583. Yang, Wan Seok, and Brent R. Stockwell. 2008. “Synthetic Lethal Screening Identifies Compounds Activating Iron-Dependent, Nonapoptotic Cell Death in Oncogenic-RAS- Harboring Cancer Cells.” Chemistry & Biology 15 (3): 234–45. doi:10.1016/j.chembiol.2008.02.010. Yang, Wan Seok, Rohitha SriRamaratnam, Matthew E. Welsch, Kenichi Shimada, Rachid Skouta, Vasanthi S. Viswanathan, Jaime H. Cheah, et al. 2014. “Regulation of Ferroptotic Cancer Cell Death by GPX4.” Cell 156 (1–2): 317–31. doi:10.1016/j.cell.2013.12.010. Yang, Y., J. Ma, Y. Chen, and M. Wu. 2004. “Nucleocytoplasmic Shuttling of Receptor- Interacting Protein 3 (RIP3): IDENTIFICATION OF NOVEL NUCLEAR EXPORT AND IMPORT SIGNALS IN RIP3.” Journal of Biological Chemistry 279 (37): 38820–29. doi:10.1074/jbc.M401663200. Yang, Yibin, Catherine Yin, Amit Pandey, Derek Abbott, Christopher Sassetti, and Michelle A. Kelliher. 2007. “NOD2 Pathway Activation by MDP or Mycobacterium Tuberculosis Infection Involves the Stable Polyubiquitination of Rip2.” The Journal of Biological Chemistry 282 (50): 36223–29. doi:10.1074/jbc.M703079200. Yeganeh, Behzad, Moghadam A Rezaei, J Alizadeh, E Wiechec, SM Alavian, M Hashemi, B Geramizadeh, et al. 2015. “Hepatitis B and C Virus-Induced Hepatitis: Apoptosis, Autophagy, and Unfolded Protein Response.” World Journal of Gastroenterology 21 (47): 13225. doi:10.3748/wjg.v21.i47.13225.

257

Yeh, W. C., J. L. de la Pompa, M. E. McCurrach, H. B. Shu, A. J. Elia, A. Shahinian, M. Ng, et al. 1998. “FADD: Essential for Embryo Development and Signaling from Some, but Not All, Inducers of Apoptosis.” Science (New York, N.Y.) 279 (5358): 1954–58. Yeh, Wen-Chen, Annick Itie, Andrew J. Elia, Michelle Ng, Hong-Bing Shu, Andrew Wakeham, Christine Mirtsos, et al. 2000. “Requirement for Casper (c-FLIP) in Regulation of Death Receptor–induced Apoptosis and Embryonic Development.” Immunity 12 (6): 633–642. Yellon, Derek M., and Derek J. Hausenloy. 2007. “Myocardial Reperfusion Injury.” The New England Journal of Medicine 357 (11): 1121–35. doi:10.1056/NEJMra071667. Yen, Men-Luh, Hwei-Fang Tsai, Yi-Ying Wu, Hsiao-Lin Hwa, Be-Hang Lee, and Ping-Ning Hsu. 2008. “TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL) Induces Osteoclast Differentiation from Monocyte/Macrophage Lineage Precursor Cells.” Molecular Immunology 45 (8): 2205–13. doi:10.1016/j.molimm.2007.12.003. Yin, M., M. D. Wheeler, H. Kono, B. U. Bradford, R. M. Gallucci, M. I. Luster, and R. G. Thurman. 1999. “Essential Role of Tumor Necrosis Factor Alpha in Alcohol-Induced Liver Injury in Mice.” Gastroenterology 117 (4): 942–52. Yipp, Bryan G, Björn Petri, Davide Salina, Craig N Jenne, Brittney N V Scott, Lori D Zbytnuik, Keir Pittman, et al. 2012. “Infection-Induced NETosis Is a Dynamic Process Involving Neutrophil Multitasking in Vivo.” Nature Medicine 18 (9): 1386–93. doi:10.1038/ nm.2847. Yoon, S, K Bogdanov, A Kovalenko, and D Wallach. 2016. “Necroptosis Is Preceded by Nuclear Translocation of the Signaling Proteins That Induce It.” Cell Death and Differentiation 23 (2): 253–60. doi:10.1038/cdd.2015.92. Youn, Hyung S., Joo Y. Lee, Katherine A. Fitzgerald, Howard A. Young, Shizuo Akira, and Daniel H. Hwang. 2005. “Specific Inhibition of MyD88-Independent Signaling Pathways of TLR3 and TLR4 by Resveratrol: Molecular Targets Are TBK1 and RIP1 in TRIF Complex.” Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950) 175 (5): 3339–46. Yu, Pei Wen, Betty CB Huang, Mary Shen, Jeff Quast, Eva Chan, Xiang Xu, Garry P. Nolan, Donald G. Payan, and Ying Luo. 1999. “Identification of RIP3, a RIP-like Kinase That Activates Apoptosis and NFκB.” Current Biology 9 (10): 539–S3. Yu, Seong-Woon, Shaida A. Andrabi, Hongmin Wang, No Soo Kim, Guy G. Poirier, Ted M. Dawson, and Valina L. Dawson. 2006. “Apoptosis-Inducing Factor Mediates poly(ADP-Ribose) (PAR) Polymer-Induced Cell Death.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103 (48): 18314–19. doi:10.1073/pnas.0606528103. Yu, Seong-Woon, Hongmin Wang, Marc F. Poitras, Carmen Coombs, William J. Bowers, Howard J. Federoff, Guy G. Poirier, Ted M. Dawson, and Valina L. Dawson. 2002. “Mediation of poly(ADP-Ribose) Polymerase-1-Dependent Cell Death by Apoptosis- Inducing Factor.” Science (New York, N.Y.) 297 (5579): 259–63. doi:10.1126/science. 1072221. Zha, Jikun, Qianhe Zhou, Liang-Guo Xu, Danying Chen, Lixia Li, Zhonghe Zhai, and Hong- Bing Shu. 2004. “RIP5 Is a RIP-Homologous Inducer of Cell Death.” Biochemical and Biophysical Research Communications 319 (2): 298–303. doi:10.1016/j.bbrc.2004.04.194. Zhang, Duanwu, Juan Lin, and Jiahuai Han. 2010. “Receptor-Interacting Protein (RIP) Kinase Family.” Cellular and Molecular Immunology 7 (4): 243–49. doi:10.1038/cmi.2010.10. Zhang, D.-W., J. Shao, J. Lin, N. Zhang, B.-J. Lu, S.-C. Lin, M.-Q. Dong, and J. Han. 2009. “RIP3, an Energy Metabolism Regulator That Switches TNF-Induced Cell Death from Apoptosis to Necrosis.” Science 325 (5938): 332–36. doi:10.1126/science.1172308.

258

Zhang, Haibing, Xiaohui Zhou, Thomas McQuade, Jinghe Li, Francis Ka-Ming Chan, and Jianke Zhang. 2011. “Functional Complementation between FADD and RIP1 in Embryos and Lymphocytes.” Nature 471 (7338): 373–76. doi:10.1038/nature09878. Zhang, J., D. Cado, A. Chen, N. H. Kabra, and A. Winoto. 1998. “Fas-Mediated Apoptosis and Activation-Induced T-Cell Proliferation Are Defective in Mice Lacking FADD/Mort1.” Nature 392 (6673): 296–300. doi:10.1038/32681. Zhang, Jianke, and Francis K. M. Chan. 2014a. “RIPK3 Takes Another Deadly Turn.” Science 343 ((6177)): 1322–23. doi:doi: 10.1126/science.1252526. Zhang, Jing, Yu Yang, Wenyan He, and Liming Sun. 2016. “Necrosome Core Machinery: MLKL.” Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS 73 (11–12): 2153–63. doi:10.1007/s00018-016-2190-5. Zhang, S. Q., A. Kovalenko, G. Cantarella, and D. Wallach. 2000. “Recruitment of the IKK Signalosome to the p55 TNF Receptor: RIP and A20 Bind to NEMO (IKKgamma) upon Receptor Stimulation.” Immunity 12 (3): 301–11. Zhang, Ting, Yan Zhang, Mingyao Cui, Li Jin, Yimei Wang, Fengxiang Lv, Yuli Liu, et al. 2016a. “CaMKII Is a RIP3 Substrate Mediating Ischemia- and Oxidative Stress- Induced Myocardial Necroptosis.” Nature Medicine 22 (2): 175–82. doi:10.1038/nm.4017. Zhang, Wen-Jing, Zhen-Bo Song, Yong-Li Bao, Wen-liang Li, Xiao-Guang Yang, Qi Wang, Chun-Lei Yu, Lu-Guo Sun, Yan-Xin Huang, and Yu-Xin Li. 2016b. “Periplogenin Induces Necroptotic Cell Death through Oxidative Stress in HaCaT Cells and Ameliorates Skin Lesions in the TPA- and IMQ-Induced Psoriasis-like Mouse Models.” Biochemical Pharmacology 105 (April): 66–79. doi:10.1016/j.bcp.2016.02.001. Zhang, X. R., L. Y. Zhang, S. Devadas, L. Li, A. D. Keegan, and Y. F. Shi. 2003. “Reciprocal Expression of TRAIL and CD95L in Th1 and Th2 Cells: Role of Apoptosis in T Helper Subset Differentiation.” Cell Death and Differentiation 10 (2): 203–10. doi:10.1038/sj.cdd.4401138. Zhang, Ye-Fa, Wei He, Cheng Zhang, Xiao-Jing Liu, Yan Lu, Hua Wang, Zhi-Hui Zhang, Xi Chen, and De-Xiang Xu. 2014b. “Role of Receptor Interacting Protein (RIP)1 on Apoptosis-Inducing Factor-Mediated Necroptosis during Acetaminophen-Evoked Acute Liver Failure in Mice.” Toxicology Letters 225 (3): 445–53. doi:10.1016/j.toxlet.2014.01.005. Zhao, Wenpu, Darin K. Fogg, and Mariana J. Kaplan. 2015. “A Novel Image-Based Quantitative Method for the Characterization of NETosis.” Journal of Immunological Methods 423 (August): 104–10. doi:10.1016/j.jim.2015.04.027. Zheng, Shi-Jun, Pu Wang, Galit Tsabary, and Youhai H. Chen. 2004. “Critical Roles of TRAIL in Hepatic Cell Death and Hepatic Inflammation.” Journal of Clinical Investigation 113 (1): 58–64. doi:10.1172/JCI200419255. Zheng, Weihong, Alexei Degterev, Emily Hsu, Junying Yuan, and Chengye Yuan. 2008. “Structure-Activity Relationship Study of a Novel Necroptosis Inhibitor, Necrostatin- 7.” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 18 (18): 4932–35. doi:10.1016/j.bmcl.2008.08.058. Zhou, Lin-Li, Zhi-Xiu Lin, Kwok-Pui Fung, Chun-Tao Che, Ming Zhao, Christopher H. K. Cheng, and Zhong Zuo. 2012. “Ethyl Acetate Fraction of Radix Rubiae Inhibits Cell Growth and Promotes Terminal Differentiation in Cultured Human Keratinocytes.” Journal of Ethnopharmacology 142 (1): 241–47. doi:10.1016/j.jep.2012.04.051. Zhou, Tianjun, Lois Commodore, Wei-Sheng Huang, Yihan Wang, Mathew Thomas, Jeff Keats, Qihong Xu, et al. 2011. “Structural Mechanism of the Pan-BCR-ABL Inhibitor Ponatinib (AP24534): Lessons for Overcoming Kinase Inhibitor Resistance.”

259

Chemical Biology & Drug Design 77 (1): 1–11. doi:10.1111/j.1747- 0285.2010.01054.x. Zhou, Yingqun, Weiqi Dai, Chunlei Lin, Fan Wang, Lei He, Miao Shen, Ping Chen, et al. 2013. “Protective Effects of Necrostatin-1 against Concanavalin A-Induced Acute Hepatic Injury in Mice.” Mediators of Inflammation 2013: 1–15. doi:10.1155/2013/706156. Zhou, Zijian, Bin Lu, Chen Wang, Zongqi Wang, Tianfei Luo, Meihua Piao, Fankai Meng, Guangfan Chi, Yinan Luo, and Pengfei Ge. 2017. “RIP1 and RIP3 Contribute to Shikonin-Induced DNA Double-Strand Breaks in Glioma Cells via Increase of Intracellular Reactive Oxygen Species.” Cancer Letters 390 (April): 77–90. doi:10.1016/j.canlet.2017.01.004. Zhu, Xiaoxia, Luyang Tao, Emiri Tejima-Mandeville, Jianhua Qiu, Juyeon Park, Kent Garber, Maria Ericsson, Eng H. Lo, and Michael J. Whalen. 2012. “Plasmalemma Permeability and Necrotic Cell Death Phenotypes after Intracerebral Hemorrhage in Mice.” Stroke; a Journal of Cerebral Circulation 43 (2): 524–31. doi:10.1161/STROKEAHA. 111.635672. Ziegler, U., and P. Groscurth. 2004. “Morphological Features of Cell Death.” News in Physiological Sciences 19 (3): 124–28. doi:10.1152/nips.01519.2004. Zimprich, Alexander, Saskia Biskup, Petra Leitner, Peter Lichtner, Matthew Farrer, Sarah Lincoln, Jennifer Kachergus, et al. 2004. “Mutations in LRRK2 Cause Autosomal- Dominant Parkinsonism with Pleomorphic Pathology.” Neuron 44 (4): 601–7. doi:10.1016/j.neuron.2004.11.005. Zitvogel, Laurence, Oliver Kepp, Lorenzo Galluzzi, and Guido Kroemer. 2012. “Inflammasomes in Carcinogenesis and Anticancer Immune Responses.” Nature Immunology 13 (4): 343–51. doi:10.1038/ni.2224.

260

Tout d’abord, je tiens à remercier chacun des membres de mon jury de thèse. Les Dr Mojgan Djavahery‐Mercgny, Dr Alicia Torriglia et Dr Sandy Adjemian‐Catani d’avoir accepté dans un court délai d’être rapporteurs de cette thèse et de m’avoir accordé leur temps pour l’évaluation de celle‐ci ainsi que pour leurs précieux conseils pour l’amélioration de la discussion générale. Je remercie également les Dr Sandrine Ruchaud, Dr Tom Vanden Berghe et Dr Georges Baffet pour leur participation à mon jury de thèse et le temps qu’ils m’ont consacré pour l’évaluation de ce travail.

Je remercie Marie‐Thérèse Dimanche‐Boitrel pour m’avoir accueillie au sein de son équipe de recherche en octobre 2013, pour son encadrement au cours de ces années de thèse et enfin sa disponibilité au cours de ces derniers mois de rédaction.

Je remercie Peter Vandenabeele de m’avoir accueillie à Gand au sein de son unité de recherche au cours de l’année 2015. Cette année au sein dans son laboratoire a été très enrichissante scientifiquement et humainement. Merci pour vos « unit meetings » dans des lieux improbables ! Je remercie Véronique Vandevoorde pour toute l’aide qu’elle m’a apporté au cours de cette cotutelle.

Je remercie Dominique Lagadic‐Gossmann de m’avoir accueillie au sein de l’Irset, mais aussi et surtout pour l’attention qu’elle m’a accordée au cours de ces années. Je vous en suis reconnaissante.

Je remercie les membres de mes comités de thèse : Anne Corlu, David Gilot, Nathalie Dejucq‐ Rainsford et Stéphane Bach pour leur enthousiasme autour de ce projet, le temps qu’ils m’ont consacré ainsi que pour leurs conseils avisés. Je remercie particulièrement Anne, ma tutrice de thèse. Merci de tout cœur pour vos encouragements.

Je remercie tous les collaborateurs scientifiques de ce projet. Je remercie particulièrement Stéphane Bach qui a toujours su prendre le temps de m’éclairer sur le « monde barbare » des kinases et aussi pour son enthousiasme débordant à toute épreuve. Je remercie Sabrina Leverrier‐Penna pour son amitié et le grand travail que tu as fourni dans ce projet ; j’espère que tu obtiendras un poste pérenne. Je remercie Claire Delehouzé qui forme un beau duo avec Stéphane, j’espère que tu pourras obtenir toi aussi un poste et rester au sein de la station avec ton sibirilois. Je remercie Isabelle Gallais pour son aide précieuse dans les manips. Merci à Michel Samson, Claire Piquet‐ Pellorce et Aveline Filliol pour leur bonne humeur et leur expertise lors de nos manips « souris » tardives. Merci à Arnaud Comte pour sa pédagogie, il a su me faire comprendre simplement sa chimie. Merci aussi à Peter Goekjian pour son investissement. Merci à l’équipe du Pr. Thierry Hauet pour leur contribution à ce projet.

Merci à tous titulaires : Fred, Domi B, Georges, Sophie, François, Aubin, Jacques, Valentine, Martine, Normand, Odile, Eric, Corinne, Claudie, Marc, Lydie, Laurent, Valérie, Gwen, les stagiaires, les docs : Mika (mon mentor de M2, tu n’as pas toujours été facile mais j’ai aimé travaillé avec toi), Amélie, Adéo, Fidaa, Mélinda, Marie, Kévin, Doriane, les futurs docs : Arnaud, Victorien, Marie et Lisa et les post‐docs : Kenji, Abdullah, Sophie LT … des labos rennais. Merci à tous pour les moments conviviaux passés à la cafet’ ou lors de nos heures de culture ou dans les labos.

Un remerciement particulier à Jérémy, Manuella, Medjda et Sophie. Merci d’avoir partagé les hauts et les bas chaque jour. Vous êtes mes collègues de bureau mais pas que ! Merci pour votre amitié ! Bon courage à toi, Sophie : la fin approche !

Merci à Nathalie Théret, j’ai passé un bon moment dans ton équipe. Merci pour ton soutien. Merci à Badia Massassi pour nos agréables échanges.

Merci à Brigitte pour ton sourire et ton travail dévoué !

Merci à mes nombreux collègues belges pour leur accueil, en particulier : « my co‐desk worker » Dario (the best Xmas organizer ever !), Kathi (the best post‐doc I have ever met !), Benji, François, Sasker, Eun Woo, Mathieu, Ria, Yann, Miguel, Yves, Sofie, Kirsten, Behrouz, Men, Tom, Wim. Merci beaucoup car vous avez toujours été de bons conseils et disponibles pour répondre à mes questions. Et à tous mes autres collègues qui ont été à mes côtés et qui prennent de mes nouvelles depuis mon retour : Sandrien from the plant « side », Corinne, Liesbeth, Stephanie, Natascha, Sandy, Michael, Tania, Tinneke, Giel, Morgane, Andy, Nozomi, Bartosz, Tatyana, Barbara, Inge, Eleen, Sandrine, Franck, Maria, Jolien, Alexandra, Vera). Merci à tous pour leur accueil et leurs conseils au cours de mon séjour. Et aussi pour tous ces moments conviviaux lors des « drinks » et des « unit meetings ».

Merci à Ben’ mon mentor de M1, ta passion m’a donné envie d’atteindre mes objectifs ! Merci à Guillaume et Patricia, mes très chers amis, vos conseils et vos expériences m’ont été profitables.

A tous mes très chers amis de longue date, ces derniers qui me demandent toujours mon sujet de thèse … Merci pour votre soutien ! Désolée de vous avoir délaissé ces dernières semaines.

Merci infiniment à ma maman et ma sœur. A mon beauf Ju et mon neveu qui a égayé 2014 ;) Je m’excuse de ne pas avoir été très disponible ces derniers temps.

Et pour finir, je remercie mon mari pour sa patience, son soutien indéfectible et son amour. Sans toi, rien n’aurait été possible. Milles merci. A toi mon petit garçon, si un jour tu lis ma thèse sache que j’ai fait tout mon possible pour être disponible mais j’aurai voulu l’être encore plus. Tu apportes à chaque jour son lot de joie et d’émerveillements, sois en sûr. Tu as changé ma vie. Je serai là pour te voir grandir ou profiter de la vie. Fabienne LE CANN 17, rue Joseph TURMEL 35 000 RENNES (FRANCE) + 33 6 99 47 87 67 [email protected]

Date of birth : 06/11/1988 (28 years) – French native speaker

Thesis submitted for the degree of Doctor of Biology and Sciences

SCIENTIFIC PUBLICATIONS Discovery of 6E11, a new bioinspired necroptosis inhibitor highly selective for Receptor-Interacting th Protein Kinase 1 (RIPK1) - submitted to Scientific Reports on the 24 may 2017 C Delehouzé, F Le Cann, S Leverrier-Penna, A Comte, M Jacquard, O Delalande, N Desban, B Baratte, I Gallais, F Faurez, M Bonnet, PG Goekjian, R Thuillier, F Favreau, P Vandenabeele, T Hauet, MT Dimanche- Boitrel and S Bach

Sibiriline, a new small chemical inhibitor of Receptor-Interacting Protein Kinase 1, prevents immune-dependent hepatitis – in revision in The FEBS Journal Claire Delehouzé, Sabrina Leverrier-Penna, Fabienne Le Cann, Aveline Filliol, Arnaud Comte, Olivier Delalande, Nathalie Desban, Blandine Baratte, Isabelle Gallais, Claire Piquet-Pellorce, Florence Faurez, Marion Bonnet, Yvette Mettey, Peter Goekjian, Michel Samson, Peter Vandenabeele, Stéphane Bach and Marie-Thérèse Dimanche-Boitrel

The Disintegrin and Metalloprotease ADAM12 Is Associated with TGF-β-Induced Epithelial to Mesenchymal Transition - PLoS One. 2015; 10(9): e0139179. Michaël Ruff, Anthony Leyme, Fabienne Le Cann, Dominique Bonnier, Jacques Le Seyec, Franck Chesnel, Laurent Fattet, Ruth Rimokh, Georges Baffet, and Nathalie Théret

EDUCATION . 2013-2017 Joint PhD in Biology and Health Sciences – Faculty of Sciences in Health and Environment, Rennes 1 University (France) and in Biochemistry and Biotechnology, Ghent University, Faculty of Sciences (Belgium) – ministerial scholarship « Characterization of new necroptosis inhibitors targeting RIPK1 » Supervisors: Dr. Marie-Thérèse DIMANCHE-BOITREL, INSERM UMR 1085, IRSET, Rennes, And Prof. Dr. Peter VANDENABEELE, VIB-UGent Center for Inflammation Research, Gent, Belgium

. 2011-2013 Master of Biology specializing in cellular and molecular sciences of living University of Rennes 1 (France) – with high honors (Magna Cum Laude, ranking 5/43)

. 2011 Undergraduate degree specializing in cellular biology, genetics, microbiology and physiology – University of Rennes 1 (France) – with honors (ranking 10/94)

. 2008-2010 Two year diploma taken at an Institute of technology in bioengineering - with honors, Quimper (France)

. 2006-2008 Two year preparatory training for the University of Pharmacy, Rennes (France)

. 2006 High School Diploma specializing in physics and chemistry – with honors, Quimper (France)

PROFESSIONAL SKILLS  Molecular and cellular biology :  Construction of mutants DNA, synthesis of RNA in vitro translate in chimeric proteins-GFP,  Microinjection of RNA in oocytes, RNA-interference tissu-inductible in drosophila model,  Transient transfection, stable transfection by lentiviral approach.

 Biochemistry : western blot, immunoprecipitation, protein assays, cell viability measurements.

 Flow cytometry. Immunohistochemistry. Epifluorescence and confocal microscopy.

 Cell culture: cell lines or murine oocytes in primary culture.

 Animal experimentation diploma (level 1), Veterinary School (ENV) of Nantes, France – October 2014.

CONGRESS . 6th day of Research on Medicine industry and health – Rennes, France, 20th January 2016 Poster « Sibiriline, a new inhibitor of RIPK1-mediated cell deaths » . 15th International TNF Conference – Ghent, Belgium, 20-23 May 2015 Poster « 6E11, a new necroptosis inhibitor » . Annual VIB seminar – Blankenberge, Belgium, 30th March-1st April 2015 . VIB Predoc Symposium – Ghent, Belgium, 19th March 2015 . 3rd day of IRSET Young Researchers’ meeting – Rennes, France, December 2014 . 1st day of the scientific theme « Signalization and CANcer » (SCAN) – Rennes, France, 20th November 2014 1st poster prize « A new necroptosis inhibitor, specific of RIPK1 » . International Symposium on Mechanisms of Innate Immunity, Cell Death and Inflammation – Ghent, Belgium, 23-26 September 2014 . International congress on Cell Death in Cancer, 2nd edition – La Baule, France, 14-17 May 2014 . Meeting in Health, INSERM Grand Ouest – Nantes, France, 3rd December 2013 . Functional and Molecular Screening meeting, Biogenouest – Rennes, France, 15th November 2013

INTERNSHIPS . 2015 A full year internship in the VIB research unit for Molecular Signaling and Cell Death in Ghent (Belgium) Characterization of new necroptosis inhibitors targeting RIPK1. PhD supervisor: Prof. Dr. Peter VANDENABEELE, Center Director: Bart LAMBRECHT, Department of Biomedical Molecular Biology, VIB-UGent Center for Inflammation Research, Belgium

. 2013 Five-month internship in a research laboratory in Rennes Implication of proteins ADAM12 in epithelial-to-mesenchymal transition. Internship supervisor: Mrs. Nathalie THÉRET, Unit director: Mrs. Dominique LAGADIC- GOSSMANN, INSERM unit number 1085-IRSET, Rennes.

. 2012 Four-month internship in a research laboratory in Rennes Localization of proteins ECT2 during asymmetric division in second meiosis in mouse oocytes. Internship supervisor: Mr. Guillaume HALET, Unit director: Mr. Claude PRIGENT, CNRS unit number 6290-IGDR, Rennes.

. 2011 Six-week voluntary internship in a research laboratory in Rennes Influence of MKL1 on the acetylation and the trimethylation of the lysine 9 of the histones H3 of human breast cancer cells MCF-7. Internship supervisor: Mr. Gilles FLOURIOT, Unit director: Mr. Gilles SALBERT, CNRS unit number 6026, Rennes.

. 2010 Three months internship in a research laboratory in Quebec (Canada) Role of proteins CRUMBS in the repression of PI3K/Akt pathway into drosophila model. Internship supervisor: Mr. Patrick LAPRISE, Research center in cancerology, Hôtel-Dieu, Quebec.

. 2009 Four-week internship in a biomedical analysis laboratory in Châteaulin Technician in medical bacteriology. Scientific project: Identification of Salmonella serotypes. Internship supervisor: Mr. SEGERAL.

CERTIFICATES  Animal experimentation diploma - level 1 - 2014  CLES of English (Certificate of skills in Language of Graduate Education) - level 2 - 2011  Certificate of first aid and emergency care - level 2 - 2011  C2i (Certificate of Computing and Internet Use) - level 1 – 2011  Informatics tools : ImageJ, MultiGauge, Pubmed, Zotero (daily use) Characterization of new necroptosis inhibitors targeting RIPK1

Necroptosis, a regulated necrosis, is a beneficial cell death for homeostasis and tissue repair. However, excessive necrotic cell death leads to deleterious tissue inflammation. This regulated necroptotic process is controlled by RIPK1, RIPK3 and MLKL activities. This cell death pathway was described in numerous organs upon pathological conditions such as inflammatory, ischemic and degenerative diseases. During hepatitis, hepatocyte cell death initiates inflammation. Chronic inflammation can trigger fibrosis, cirrhosis that can lead to hepatocellular carcinoma. During cerebral, cardiac or renal post-ischemic reperfusion, necroptosis occurs in a context of acute inflammation triggering irreversible damage that may lead up to the loss of organ function. Necroptosis is a new promising target for clinical approaches. Cell death stimuli can originate from death receptors engagement (TNF receptors superfamily: TNFR1, Fas/CD95 and TRAIL-R1/R2) by immune cells. Several studies suggest that necroptosis actor’s expression levels (RIPK1, RIPK3 and phospho-MLKL) are correlated with damage and inflammation severities in numerous human pathologies. Moreover, RIPK1 kinase activity would be an initiating event or a worsening element of inflammatory or ischemic diseases. In this context, new necroptosis and RIPK1 inhibitors were developed. We characterized biological effects of two compounds (Sibiriline and 6E11) in vitro and/or in vivo. These molecules were selected from a screening of an in-house kinase-focused library of small chemical compounds (the ReCC, Roscoff essential Chemical Collection, Roscoff, France) or a chemical library of the University of Claude Bernard Lyon 1 using a phenotypic screen based on the inhibition of TNF-induced necroptosis in human FADD-deficient Jurkat T cells. We demonstrated that these two chemical compounds prevent necroptosis induced by TNF- α, FasL or TRAIL in different murine and human cells. Therefore, we have shown that these molecules target the kinase RIPK1 without affecting RIPK3 kinase activity using molecular binding and enzymatic activity assays. Their modes of action were refined by molecular modeling studies of their complex with RIPK1. Sibiriline would be a type II-like kinase inhibitor whereas 6E11 would be a type III kinase inhibitor. Furthermore, we illustrated Sibiriline inhibitory potency in liver diseases thank to a murine model of autoimmune hepatitis induced by concanavalin A injection. We also showed that 6E11 alleviates endothelial cell death in an in vitro human model of ischemia-reoxygenation showing interesting properties for the treatment of ischemia pathologies. In conclusion, this work leads to the characterization of two new chemical compounds which prevent necroptosis by targeting RIPK1 kinase activity. They differ by their mode of interaction, their selectivity and their efficacy. Their structure have yet to be optimized for the purpose of therapeutical use.

Caractérisation de nouveaux inhibiteurs de la kinase RIPK1 et de la nécroptose

La nécroptose est une mort cellulaire bénéfique pour l’homéostasie et la cicatrisation tissulaire. Lorsqu’elle est massive au sein du tissu, elle est accompagnée d’une inflammation et devient alors délétère. Cette nécrose régulée dépend de l’activité des kinases RIPK1 et RIPK3 et d’une pseudokinase MLKL. Elle a été décrite dans de nombreux organes au cours de pathologies inflammatoires, ischémiques et dégénératives. Lors d’une hépatite, la mort des hépatocytes initie l’inflammation qui lorsqu’elle est chronique peut conduire à une fibrose, une cirrhose voire un carcinome hépatocellulaire. Dans le cas de la reperfusion post-ischémie cérébrale, cardiaque, ou rénale, la nécroptose est accompagnée d’une inflammation aigüe responsable de dommages irréversibles allant jusqu’à la perte de fonction de l’organe. La nécroptose est donc une nouvelle cible intéressante en thérapeutique. Les stimuli de mort peuvent provenir de l’engagement des récepteurs de mort appartenant à la superfamille du récepteur au TNF dont TNFR1, Fas/CD95 et TRAIL-R1/R2 par les cellules de l’immunité. De nombreux travaux suggèrent que les taux d’expression des acteurs de la nécroptose : RIPK1, RIPK3 et phospho-MLKL sont corrélés à la sévérité des dommages et de l’inflammation dans de nombreuses pathologies humaines. De plus, l’activité de la kinase RIPK1 serait à l’origine de l’initiation ou de l’aggravation des pathologies inflammatoires ou ischémiques. Dans ce contexte, nous développons de nouveaux inhibiteurs de la nécroptose et de RIPK1.

Nous avons caractérisé in vitro et in vivo les effets biologiques de deux molécules (Sibiriline et 6E11) issues du criblage d’une chimiothèque non commerciale de petits composés (Roscoff) ou d’une chimiothèque de l’Université Claude Bernard Lyon 1 dans un modèle de nécroptose induite par le TNF-α dans les cellules Jurkat déficientes en FADD.

Nous avons montré que ces composés chimiques bloquent la nécroptose induite par le TNF- α, FasL ou TRAIL dans différents modèles cellulaires murins ou humains. De plus, nous avons démontré que ces composés ciblent la kinase RIPK1 sans affecter la kinase RIPK3 grâce à des tests d’interaction moléculaire et d’activité enzymatique. Leur mode d’action a été précisé par la modélisation moléculaire de leur interaction avec la RIPK1. La Sibiriline serait un inhibiteur de kinase similaire aux inhibiteurs de type II alors que 6E11 serait un inhibiteur de type III. Par ailleurs, nous avons montré que la Sibiriline protège les souris d’une hépatite autoimmune induite par la Concanavaline A suggérant l’utilisation potentielle de cette molécule dans les pathologies du foie. 6E11, quant à lui, protège les cellules endothéliales humaines des dommages induits par l’ischémie/réoxygénation ce qui démontre des propriétés intéressantes pour le traitement des pathologies ischémiques.

Pour conclure, ces travaux ont permis la découverte de deux nouveaux inhibiteurs de la nécroptose ciblant l’activité kinase de la RIPK1 qui diffèrent par leur mode d’interaction, leur sélectivité et leur efficacité. Leurs structures restent encore à optimiser dans l’objectif d’une utilisation thérapeutique.