The role of GBA2 in controlling locomotor activity Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn vorgelegt von Marina Amelie Woeste aus Borken (i. Westf.) Bonn 2018 Angefertigt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn 1. Gutachter: Prof. Dr. Dagmar Wachten 2. Gutachter: Prof. Dr. Christoph Thiele 3. Gutachter: Prof. Dr. Frank Bradke 4. Gutachter: Prof. Dr. Anton Bovier Tag der Promotion: 11. Oktober 2018 Erscheinungsjahr: 2018 Abstract Glycosphingolipids are major constituents of cellular membranes, fulfilling both structural and functional roles. Modifications of the basic glycosphingolipid glucosylceramide (GlcCer) result in numerous complex glycosylated and sialylated glycosphingolipids, which are highly abundant in the central nervous system (CNS). Glycosphingolipid homeostasis is tightly regulated and the non-lysosomal glucosylceramidase GBA2 plays a central role as it hydrolyzes GlcCer to glucose and ceramide. Recently, mutations in GBA2 have been identified in human patients suffering from autosomal-recessive cerebellar ataxia (ARCA), hereditary spastic paraplegia (HSP), or Marinesco-Sjögren-like Syndrome (MSLS). How these mutations impair enzyme function and might cause locomotor dysfunction is not known. I could show that all these mutations – beside one – cause a complete loss of GBA2 activity, indicating that also the human patients potentially lack GBA2 activity. Detailed analysis of the structure-function properties of GBA2 revealed that its activity is encoded in the protein’s tertiary structure, including the N-terminal domain, linker region, and C-terminal domain. GBA2 proteins interact and form oligomers, a characteristic that might also be crucial for enzyme function. However, in vivo experiments did not reveal severe locomotor dysfunction or morphological defects in the cerebellum in GBA2-knockout mice, pointing towards species-dependent differences in GBA2-regulated metabolism of GlcCer and GlcCer metabolites in the CNS. However, acute pharmacological inhibition of GBA2 in murine cerebellar neurons in vitro impairs neurite outgrowth, suggesting a potential mechanism how loss of GBA2 activity results in ataxia and spasticity in ARCA, HSP, and MSLS patients carrying mutations in GBA2. In vivo in the mouse, compensatory mechanisms might occur, preventing severe neurological manifestation after genetic loss of GBA2. Zusammenfassung Glycosphingolipide sind Hauptbestandteile zellulärer Membranen und erfüllen sowohl strukturelle als auch funktionelle Aufgaben. Modifizierungen des einfachen Glycosphingolipids Glucosylceramid (GlcCer) bringen zahlreiche komplexe glycosylierte und sialylierte Glycosphingolipide hervor, die besonders im zentralen Nervensystem (ZNS) vorkommen. Die Glycosphingolipid-Homöostase unterliegt einer starken Regulation, wobei die nicht- lysosomale Glucosylceramidase GBA2 eine zentrale Rolle spielt, da sie GlcCer zu Glucose und Ceramid hydrolysiert. Kürzlich wurden Mutationen im GBA2-Gen in Patienten identifiziert, die an autosomal-rezessiver cerebellärer Ataxie (ARCA), hereditärer spastischer Paraplegie (HSP) oder dem Marinesco-Sjögren-ähnlichen Syndrom (MSLS) leiden. Ob und wie diese Mutationen die Funktion des Enzyms beeinträchtigen und möglicherweise die lokomotorische Dysfunktion in ARCA, HSP und MSLS verursachen, ist nicht bekannt. Ich konnte zeigen, dass, bis auf eine, all diese Mutationen zu einem kompletten Funktionsverlust von GBA2 führen, was darauf hinweist, dass auch in den Patienten ein Verlust der GBA2-Aktivität zu verzeichnen ist. Eine detaillierte Analyse der strukturellen und funktionellen Eigenschaften von GBA2 zeigte, dass die Aktivität in der tertiären Proteinstruktur, einschließlich der N-terminalen Domäne, der Linker-Region und der C-terminalen Domäne, kodiert ist. GBA2-Proteine interagieren miteinander und bilden oligomere Komplexe, eine charakteristische Eigenschaft, die auch für die Funktion des Enzyms wichtig sein könnte. In vivo Experimente, zeigten jedoch keinen eindeutigen Defekt in der lokomotorischen Funktion oder morphologische Veränderungen des Cerebellums in GBA2-knockout Mäusen, was womöglich auf spezies-spezifische Unterschiede im GBA2-regulierten Metabolismus von GlcCer und GlcCer-Metaboliten im ZNS zurückzuführen ist. Ein akuter pharmakologischer Block der GBA2-Aktivität in murinen cerebellären Neuronen in vitro inhibierte jedoch das Neuritenwachstum, was darauf hindeutet, dass ein solcher Effekt auch die Grundlage für die Entwicklung von Ataxie und Spastik in ARCA, HSP und MSLS-Patienten sein könnte. In vivo in der Maus scheinen hingegen kompensatorische Mechanismen zu greifen, die eine schwere neurologische Manifestation durch den Verlust von GBA2 verhindern. Table of contents Table of contents List of figures..................................................................................................................... VII List of tables ........................................................................................................................ X Abbreviations .................................................................................................................... XII 1 Introduction .................................................................................................................. 1 1.1 Glycosphingolipids .................................................................................................. 1 1.2 Glucosylceramide: key lipid in glycosphingolipid metabolism .................................. 2 1.2.1 Degradation of glycosphingolipids .................................................................... 5 1.2.1.1 The lysosomal glucosylceramidase GBA1 ................................................. 6 1.2.1.2 The non-lysosomal glucosylceramidase GBA2.......................................... 6 1.3 Glycosphingolipid-associated disorders ................................................................... 8 1.3.1 Lysosomal storage disorders ............................................................................ 8 1.3.2 GBA2-associated disorders .............................................................................. 9 1.3.2.1 Male subfertility in GBA2-knockout mice ................................................... 9 1.3.2.2 Mutations in GBA2 in neurological disorders ............................................10 1.4 Aim of this thesis ....................................................................................................13 2 Material and methods..................................................................................................14 2.1 Chemicals ..............................................................................................................14 2.2 Cell culture material ................................................................................................14 2.3 Antibodies ..............................................................................................................14 2.3.1 Primary antibodies ..........................................................................................14 2.3.2 Secondary antibodies ......................................................................................16 2.3.3 Dyes ................................................................................................................17 2.4 Molecular biology ...................................................................................................17 2.4.1 Cloning of wild-type and mutant mGBA2 proteins ...........................................17 2.4.1.1 Vectors .....................................................................................................17 2.4.1.2 Primers ....................................................................................................17 2.4.1.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) ..........................................................21 2.4.1.4 Agarose gel electrophoresis for detection of nucleic acids .......................22 2.4.1.5 DNA purification using Sure Clean ...........................................................23 I Table of contents 2.4.1.6 Restriction digest of plasmid DNA ............................................................23 2.4.1.7 Extraction of DNA from agarose gels .......................................................24 2.4.1.8 Ligation of DNA fragments with vector .....................................................24 2.4.1.9 Determining nucleic acid concentrations by spectrophotometry ...............24 2.5 Escherichia coli culture ...........................................................................................24 2.5.1 Bacterial strains ...............................................................................................24 2.5.2 Culture medium ...............................................................................................25 2.5.3 Generation of competent E.coli .......................................................................25 2.5.4 DNA amplification in E.coli ..............................................................................25 2.5.4.1 Transformation of competent bacteria ......................................................25 2.5.4.2 Small-scale (Mini) plasmid preparation via alkaline lysis ..........................26 2.5.4.3 Sequencing of amplified plasmid DNA .....................................................26