Paludo Michellycristiane D.Pdf

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

MICHELLY CRISTIANE PALUDO

Brazilian jabuticabas: Phenolic characterization, capacity of deactivation of reactive species of oxygen and nitrogen and antiproliferative potential in prostate and breast tumor cells

Jabuticabas brasileiras: Caracterização fenólica, capacidade de desativação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e potencial antiproliferativo sob células tumorais de próstata e mama

CAMPINAS 2018 MICHELLY CRISTIANE PALUDO

Brazilian jabuticabas: Phenolic characterization, capacity of deactivation of reactive species of oxygen and nitrogen and antiproliferative potential in prostate and breast tumor cells

Thesis presented to the Faculty of Food Engineeri ng of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Ph.D., in the area of Food Science.

Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de doutora em Ciência de Alimentos.

Orientadora: Profa. Dra. Helena Teixeira Godoy Coorientador: Prof. Dr. Cristiano Augusto Ballus

Este exemplar corresponde à versão final da tese

defendida pela aluna Michelly Cristiane Paludo e

orientada pela Profa. Dra. Helena Teixeira Godoy

e coorientada pelo Prof. Dr. Cristiano Augusto

Ballus.

Campinas 2018

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Helena Teixeira Godoy - Orientadora DCA/ FEA/ UNICAMP - Campinas/ SP

Dra. Silvia Borges Pimentel de Oliveira - Membro Titular BC/ IB/ UNICAMP - Campinas/ SP

Profa. Dra. Suzana Lucy Nixdorf - Membro Titular Instituto de química/ UEL - Londrina/ PR

Prof. Dr. Marcelo Alexandre Prado - Membro Titular DCA/ FEA/ UNICAMP - Campinas/ SP

Prof. Dr. Severino Matias de Alencar - Membro Titular IAN/ ESALQ/ USP - Piracicaba/ SP

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Agradecimentos

Á minha Orientadora Prof. Dra. Helena Teixeira Godoy, um amor de pessoa, sempre disposta a me ouvir e colaborar. Ao meu Coorientador Prof. Dr. Cristiano Augusto Ballus, amigo desde o meu mestrado, se tornou meu Coorientador para somar incalculavelmente ao meu trabalho. Sempre presente, disposto a ajudar e, respondendo prontamente, sempre preocupado com minha formação e meu aprendizado, um exemplo de profissional. Ao seu Dirceu, técnico do laboratório presente desde o meu mestrado, sempre disposto a ajudar em tudo, desde descascar quilos de jabuticabas, até lavar toda a vidraria que eu utilizava que não era pouca. Todos os que fazem experimentos sabem o valor que pessoas assim têm, são fundamentais para o andamento do laboratório. Aos técnicos Eduardo e Marcela sempre dispostos a ajudar. Á todos do laboratório que colaboraram com o andamento da minha pesquisa. Ao CNPq - Coordenação Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (processo 145652/2014-9) pelo auxilio financeiro, com a concessão da bolsa de doutorado. Á CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pelo auxílio financeiro fornecido ao laboratório de pesquisa e pela bolsa de doutorado sanduiche PDSE (Processo: 88881.135420/2016-01). Ao Professor Dr. Isidro Hermosín-Gutiérrez, que me faltam palavras para agradecer tudo que o fez por mim. Abriu as portas do seu laboratório na Universidad Castilla-La Mancha (UCLM). Sempre esteve disposto a ajudar, me explicando os métodos, quantas vezes fossem necessárias, tudo sempre com muito bom humor. Á equipe maravilhosa e incomparável do IRICA onde passei os 6 meses do meu doutorado sanduiche na Espanha. Ao José sempre disposto a me ensinar e explicar tudo sobre cromatografia. Á Carmen por quem houve simpatia mútua, desde o momento que entrei no laboratório, sempre disposta a ensinar e a resolver tudo. Á Maria também sempre disposta á me ajudar. Á Victoria, um encanto de pessoa, sempre preocupada em ajudar á todos do laboratório. E á todos da equipe: Sergio, Ronan e Gusmão. Nunca vou me esquecer do auxílio que recebi, não só em relação aos experimentos, mas à tudo, sempre preocupados em saber se estava tudo certo. O mundo certamente seria muito melhor, se todos fossem como vocês, por isso, aceitem os meus mais sinceros agradecimentos. Á Equipe da Biologia Celular. Ao Professor Dr. Hernandes Faustino de Carvalho, por abrir as portas do seu laboratório, para que eu trabalhasse, como se fosse sua aluna. Á Silvia uma das pessoas mais encantadora, bondosa e disposta que conheci. Ao James que foi de imensa ajuda, preparando os meios de cultura, lavando e esterilizando todo o material que eu utilizava. Ao Andrés pela paciência e calma de esperar eu liberar o fluxo, mesmo já tendo passado muito do meu horário. Ao Professor Dr. Edson, por emprestar seu laboratório para eu ler minhas placas, sempre simpático e, á todos dessa Equipe maravilhosa: Isabela, Mariana, Ariane, Guilherme e Francisco, sempre dispostos a ajudar no que fosse possível. Aos funcionários da secretaria de Pós-graduação da FEA por toda a ajuda no processo de defesa da tese. Aos membros da banca examinadora pelos conselhos e pelas correções, que auxiliaram no aprimoramento deste trabalho. Á todos que de uma forma contribuíram com este trabalho. Gostaria de agradecer imensamente aos meus pais, Izolda Lucia Paludo e Italino Paludo, que sempre estiveram ao meu lado, me apoiando e me incentivando, independentemente da situação em que estivessem. Tenho a absoluta certeza, que se hoje sou Doutora, foi devido á todo apoio e incentivo, que sempre recebi dos meus amados pais, pai e mãe são as maiores riquezas que uma pessoa pode ter. Aos meus irmãos Mari, Fabio e Kika, que sempre me ouviu, dando bons conselhos, sem se preocupar em me agradar e sim em me recomendar o que era o certo a ser feito. Ao meu namorado Marcus por suportar a distância por 6 meses durante o doutorado sanduíche. Obrigada por fiscalizar meus prazos, mais do que ninguém, para que eu nunca atrasasse o cronograma do doutorado. Ele sempre me falava: “Não estou aqui para passar a mão na sua cabeça. Eu me importo com você, por isso quero que veja as coisas, como elas realmente são”. Essas palavras, muitas vezes, fizeram com que eu corresse atrás de muitas coisas. Ás minhas amigas companheiras de República. Á Luciana sempre disposta a ajudar com os tratamentos estatísticos, envolvendo PCA. Á Lidiane, sempre disposta a ajudar com todos os seus conhecimentos. Á Rafinha companheira de República, durante o mestrado e o doutorado, sempre disposta a me ajudar com os seus conhecimentos sobre os ensaios biológicos. Meninas, obrigada por serem fantásticas e estarem sempre presentes, nos bons e maus momentos. Aprendi muito com vocês, amigas para toda a vida.

Resumo

A jabuticaba é uma fruta nativa do Brasil, rica em compostos fenólicos, dentre os quais estão as antocianinas. Estes compostos apresentam alta capacidade antioxidante e estão relacionados à prevenção de muitas doenças crônico degenerativas. Desta forma, este trabalho teve como objetivo realizar a otimização da extração dos compostos fenólicos totais (TPC) da semente e das antocianinas monoméricas totais (TMA) da casca, e efetuar a caracterização dos mesmos. Além disso, foi avaliada a capacidade de desativação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS), bem como a determinação do potencial antiproliferativo em células tumorais de próstata e mama, dos extratos das cascas e das sementes de cinco variedades de jabuticaba. Assim, este estudo realizou com sucesso a otimização da extração dos TPC da semente e das TMA da casca. Foram obtidas as seguintes condições ótimas para TPC da semente solvente etanol:água (60:40 v/v) e para TMA da casca solvente metanol:água:ácido acético (80:20:0,5 v/v/v), sendo o tempo de extração de 30 minutos para ambas as extrações. Também foi efetuada a avaliação da capacidade dos extratos das cascas e das sementes das jabuticabas em desativar ROS e RNS. Ambos os extratos mostraram ser uma excelente fonte de antioxidantes exógenos: casca Sabará (SPF) -1 • desativou o HOCl com IC50 9,24 µg mL , semente Paulista (PF) desativou o O2 ˉ -1 - com IC50 16,15 µg mL , semente Coroada (CFP) desativou o ONOO na ausência de -1 - NaHCO3 com IC50 3,84 µg mL , casca CFP desativou o ONOO na presença de -1 • NaHCO3 com IC50 5,88 µg mL , casca SFP desativou o ROO (ORAC) em 918,16 -1 μmol TE g e a semente Sabará desativou o H2O2 em 49,11% inibição na concentração de 125,00 µg extrato mL-1. Para complementar este trabalho foi realizado o teste de atividade mitocondrial (MTT) sobre células tumorais de mama (MDA-MB-231) e de próstata (DU-145), o qual demostrou que os extratos da casca e da semente diminuem a proliferação das células tumorais. O extrato da casca PFP -1 inibiu o crescimento celular da MDA-MB-231 com IC50 25,86 µg mL de extrato. Para finalizar os experimentos foi realizada a quantificação e identificação dos compostos fenólicos antociânicos e não antociânicos por meio de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas. Os resultados demostraram que as antocianinas majoritárias foram a cianidina-3-glicosídeo e a delfinidina-3-glicosídeo. Foram detectados 3 derivados de miricitina, 14 derivados de quercetina incluindo a quercetina livre, 13 derivados de ácido elágico, incluindo o ácido elágico livre, e 4 derivados de ácido metilelágico. Dessa forma, foi possível caracterizar o perfil dos compostos fenólicos de variedades de jabuticabas, até então não estudadas. O método de extração otimizado mostrou-se rápido, simples, com um adequado rendimento. Os extratos analisados comprovaram um elevado potencial antioxidante, capaz de combater eficientemente a proliferação das células DU-145 e MDA-MB-231, demostrando que a jabuticaba possui efeitos benéficos à saúde humana.

Palavras-chave: Myrciaria ssp., câncer de próstata e mama, antocianinas, antioxidantes, estresse oxidativo.

ABSTRACT

Jabuticaba is a Brazilian fruit, rich in phenolic compounds, specially anthocyanins. These compounds present higher antioxidant capacity and are related to the prevention of many chronic degenerative diseases. Thus, the present study aimed optimizing the extraction process of total phenolic compounds (TPC) in jabuticaba seeds, as well as total monomeric anthocyanins (TMA) in jabuticaba skins, and its characterization. It was also evaluated the potential of jabuticaba seeds and skins extracts, from five jabuticaba varieties, in the deactivation capacity of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS), as well as the determination of the antiproliferative potential in prostate and breast tumor cells. The optimization of the extraction of TPC from seeds and TMA from skins was successfully performed and the best conditions were ethanol:water (60:40 v/v) for TPC from seeds and methanol:water:acetic acid (80:20:0,5 v/v/v) for TMA from skins; for both compounds classes the total extraction time was 30 min. The capacity of seeds and skins extracts on deactivation capacity of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) was also evaluated. Both extracts can be considered significant sources of exogenous antioxidants: Sabará skins (SPF) deactivated the HOCl with -1 • -1 IC50 9.24 µg mL ; Paulista seeds (PF) deactivated the O2 ˉ with IC50 16.15 µg mL ; - Coroada seeds (CFP) deactivated the ONOO in the absence of NaHCO3 with IC50 -1 - 3.84 µg mL ; CFP skins deactivated the ONOO in the presence of NaHCO3 with IC50 5.88 µg mL-1; SFP skins deactivated the ROO• (ORAC) in 918.16 μmol TE g-1 and the

Sabará seeds deactivated the H2O2 with 49.11% of inhibition in the concentration of 125,00 µg of extract mL-1. To complement this study, it was performed the mitochondrial activity assay (MTT) in breast tumor cells (MDA-MB-231) and in prostate tumor cells (DU-145); the trial results allowed to conclude that the skin extracts present an excellent action against these tumor cells. PFP skins extract -1 inhibited the MDA-MB-231 cellular growth with IC50 25.86 µg mL of extract. The identification and quantification of anthocyanic and non-anthocyanic phenolic compounds were performed by high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry. The main anthocyanins identified in the samples were cyanidin- 3-glycoside and delphynidin-3-glycoside. It was also found three myricetin derivatives; 14 quercetin derivatives, including free-quercetin; 13 elagic acid derivatives, including free-elagic acid; and, 4 methyl elagic acid derivatives. Thus, it was possible to characterize the phenolic compounds profile of the jabuticaba varieties that were not been studied yet. With the above information it is clear that the extraction method optimized here was extremely fast, simple, inexpensive and with adequate extraction performance. The analyzed extracts presented high antioxidant potential and efficiently reduced the proliferation of DU-145 and MDA-MB-231 cells, demonstrating that jabuticaba is extremely beneficial to human health.

Keywords: Myrciaria ssp., prostate and breast cancer, anthocyanins, antioxidants, oxidative stress.

SUMÁRIO

Introdução Geral e Objetivos...... 18 Introdução Geral...... 19 Objetivos...... 24 Objetivo geral...... 24 Objetivos específicos...... 25 Referências ...... 25 Capitulo 1 Revisão Bibliográfica...... 32 Revisão bibliográfica...... 33 Jabuticaba: aspectos gerais...... 33 Compostos antioxidantes...... 37 Compostos fenólicos...... 40 Antocianinas...... 43 Espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio...... 47 Métodos de extração para compostos fenólicos e antocianinas...... 51 Compostos Fenólicos...... 51 Antocianinas...... 54 Purificação, Identificação e Quantificação dos compostos fenólicos e antocianinas ...... 56 Câncer...... 61 Referências………………………………………………………………………………....65 CHAPTER 2…………………………………………………………………………………89 ARTICLE: Optimizing the extraction of anthocyanins and phenolic compounds from skins and seeds of jabuticaba fruits (Myrciaria jabuticaba (Vell.) O. Berg) with ternary mixture experimental designs……………………………………………………………..91 Abstract………………………………………………………………………………………91 Key words……………………………………………………………………………………92 Introduction………………………………………………………………………………….92 Material and Methods………………………………………………………………………93 Samples……………………………………………………………………………………..93 Initial extraction procedure………………………………………………………………...94 Extraction optimization of TMA from skins and TPC from seeds in ‘Sabará’ jabuticaba……………………………………………………………………………………94 Evaluation of solvent effects by simplex lattice design (SLD)…………………………94 Solvent validation…………………………………………………………………………...97 Univariate optimization of extraction time………………………………………………..97 Comparison of the optimized extraction method in this work with other described methods……………………………………………………………………………………...97 Skin TMA of five jabuticaba varieties……………………………………………………..97 Seed TPC of five jabuticaba varieties…………………………………………………….98 Principal component analysis (PCA)………………………………………..……………98 Statistical analysis…………………………………………………………………………..98 Results and Discussion…………………………………………………………………….99 Solvent effects………………………………………………………………………………99 Solvent mixture validation………………………………………………………………..102 Univariate optimization of the extraction time………………………………...... 102 Comparison of the optimized extraction method with other methods reported in the literature…………………………………………………………………………………....104 TPC and TMA evaluated in five jabuticaba varieties………………………………….106 Conclusions………………………………………………………………………………..111 Acknowledgements………………………………………………………………………..111 Conflict of interest…………………………………………………………………………111 Ethical approval……………………………………………………………………………111 Informed consent………………………………………………………………………….111 References…………………………………………………………………………………111 CHAPTER 3……………………………………………………………………...... 116 ARTICLE Extracts of peels and seeds of five varieties of Brazilian jabuticaba present high capacity to deactivate reactive species of oxygen and nitrogen…………………………………………………………………………...... 118 Abstract…………………………………………………………………………...... 118 Keywords…………………………………………………………………………………..119 Introduction………………………………………………………………………………...119 Materials and Methods……………………………………………………………………120 Samples…………………………………………………………………………………....120 Extraction procedure for total monomeric anthocyanins (TMA) of the peel and total phenolic compounds (TPC) of the seeds of jabuticaba varieties…………………….121 ROS and RNS scavenging assays……………………………………………………...121 General……………………………………………………………………………………..121 Hypochlorous acid-scavenging assay…………………………………………………..122 Peroxynitrite-scavenging assay………………………………………………………….122 Superoxide radical-scavenging assay…………………………………………………..122 Hydrogen peroxide-scavenging assay………………………………………...... 123 Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) assay……………………...... 123 Principal Component Analysis (PCA)…………………………………………………...124 Results and discussion…………………………………………………………………...124 Hypochlorous acid………………………………………………………………………...130 Superoxide………………………………………………………………………………...131 Peroxynitrite………………………………………………………………………………..132 Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC)……………………………...... 134 Hydrogen Peroxide………………………………………………………………………..135 Principal Components Analysis (PCA)………………………………………………….136 Conclusions………………………………………………………………………………..138 Acknowledgements……………………………………………………………………….138 References…………………………………………………………………………………138 CHAPTER 4……………………………………………………………………...... 142 ARTICLE: Anthocyanin and non-anthocyanin phenolic composition from five jabuticaba varieties skins using HPLC-DAD-ESI-MS/MS and antiproliferative action under tumor cells of breast (MDA-MB-231) and prostate cancers (DU-145) ………144 Abstract…………………………………………………………………………………….145 Key words………………………………………………………………………………….145 Introduction………………………………………………………………………………...145 Material and Methods…………………………………………………………...... 147 Chemicals………………………………………………………………………...... 147 Samples……………………………………………………………………………………147 Extracts preparation and chromatographic analysis…………………………………..148 Tannins condensed by precipitation with methylcellulose…………………………....149 HPLC–DAD–ESI-MSn identification and quantification of phenolic compounds from five jabuticaba varieties…………………………………………………………………..149 Anthocyanins analysis……………………………………………………………………149 Non-anthocyanins analysis………………………………………………………………149 Identification and quantification of monomer content of flavan-3-ol, total content and structural characteristics of oligomers (proanthocyanidins) using multiple reaction monitoring (MRM) in HPLC-DAD-ESI-MS / MS………………………………………..150 Statistical analysis to chromatographic trials………………………………...... 150 Tumor cell assays using skin extracts from five jabuticaba varieties………………..150 Extracts preparation………………………………………………………………………150 Cellular lineages…………………………………………………………………………..150 Experimental groups and treatments performed with five jabuticaba varieties skin extracts……………………………………………………………………………………..151 Mitochondrial activity assay (MTT)……………………………………………………...151 Statistical analysis to cellular trials………………………………………………………151 Results and Discussion…………………………………………………………………..152 Non-anthocyanin phenolic compounds from five jabuticaba varieties skins………………………………………………………………………………………...152 Anthocyanin phenolic compounds from five jabuticaba varieties skins……………..162 Principal component analysis (PCA) to anthocyanin and non-anthocyanin phenolic compounds from five jabuticaba varieties skins…………………...... 163 Antiproliferative effect of extracts from five jabuticaba varieties skins under prostate and breast tumor cells………………………………………………...... 167 Conclusions...... 169 Acknowledgments...... 170 References...... 176 CHAPTER 5...... 176 ARTICLE: Content of flavan-3-ol and ellagitannins in extracts made from jabuticaba seeds and their effect in decreasing tumor cells proliferation of breast and prostate cancer...... 177 Abstract...... 178 Key words...... 178 Introduction...... 178 Material and methods...... 180 Chemical...... 180 Samples...... 181 Extracts preparation and chromatographic analysis...... 181 Tannins condensed by precipitation with methylcellulose...... 181 Identification and quantification of phenolic compounds from five jabuticaba varieties...... 182 Identification and quantification of monomer content of flavan-3-ol, total content and structural characteristics of oligomers (proanthocyanidins) using multiple reaction monitoring (MRM) in HPLC-DAD-ESI-MS / MS...... 182 Ellagitannin analysis using HPLC-DAD-ESI-MS / MS...... 182 Statistical analysis to chromatographic trials...... 183 Tumor cell assays using seed extracts from five jabuticaba varieties...... 183 Extracts preparation...... 183 Cellular lineages...... 183 Experimental groups and treatments performed with five jabuticaba varieties seed extracts...... 183 Mitochondrial activity assay (MTT)...... 184 Statistical analysis to cellular trials...... 184 Results and Discussion...... 184 Phenolic compounds from five jabuticaba varieties seeds...... 184 Principal components analysis (PCA) for the results of the non-anthocyanin phenolic compounds from the seeds of the five jabuticaba varieties...... 192 Antiproliferative effect of the seeds extracts from five jabuticaba varieties under tumor cells of prostate and breast cancers...... 194 Conclusion...... 197 Acknowledgments...... 197 References...... 198 Discussão Geral...... 203 Otimização da extração dos compostos fenólicos totais (TPC) e antocianinas monoméricas totais (TMA) e quantificação dos TPC e TMA...... 204 Terminação da capacidade dos extratos das cascas e das sementes das cinco variedades de jabuticaba aqui estudas em desativar as especies reativas de oxigênio (ROS) e as espécies reativas de nitrogênio (RNS)...... 208 Compostos fenólicos não-antociânicos e antocianicos das cascas das cinco variedades de jabuticabas e ação antiproliferativa sob células tumorais de câncer de mama e próstata...... 212 Teor de flavan-3-óis e elagitaninos em estratatos de sementes de jabuticaba e seu efeito na diminuição da proliferação de células tumorais de câncer de mama e próstata...... 218 Conclusão geral...... 224 Referências gerais...... 225

INTRODUÇÃO GERAL

OBJETIVOS

Introdução Geral

A jabuticabeira tem origem subtropical (Mata Atlântica), porém cresce em diversos tipos de solos, além de possuir extraordinária capacidade de adaptação a diversos climas (SILVA, 2001). Esta planta tem despertado grande interesse dos produtores rurais, devido à sua alta produtividade, rusticidade, elevado valor agregado na forma, in natura e a possibilidade de aproveitamento dos frutos nas mais variadas formas como geleias, sucos entre outros produtos (VIEITES et al., 2011; ABE et al., 2012). A jabuticaba é nativa do Brasil e, apresenta um período curto de maturação, identificado pela mudança de coloração do verde para o roxo escuro, o que reduz os riscos de colheita com graus de maturação inadequados (PALUDO et al., 2011). Esta fruta possui bagas subglobosas. Quando madura apresenta uma coloração roxa quase negra de aparência lisa, contendo de uma a quatro sementes. A casca é fina e frágil, porém é uma boa fonte de compostos fenólicos e antocianinas, sendo considerada fonte de pigmentos naturais (LIMA, 2008; SILVA, 2010, LEITE- LEGATTI, et al., 2012). Já, a polpa é doce com leve acidez, de sabor característico e de coloração variando de branca a translúcida (CORRÊA et al., 2007). O fruto da jabuticabeira está inserido no grupo das frutas vermelhas, o qual abrange frutos pequenos, com formato arredondado e, alto teor de antocianinas (BARBIERI; VIZZOTO, 2012). A aparência atraente e, a presença de compostos fenólicos, principalmente as antocianinas, com comprovada ação antioxidante e possíveis efeitos relacionados à promoção da saúde (SEERAM, 2008; XIE et al., 2012) estímulam o seu consumo. Os antioxidantes são definidos como uma família heterogênea de moléculas naturais, presentes em pequena quantidade quando comparados às biomoléculas que eles supostamente protegeriam, assim previnem (reduzem) a extensão do dano oxidativo (HALLIWEL; GUTTERIDGE, 2007). Eles estabilizam os radicais livres doando hidrogênio e/ou elétrons, porém permanecem estáveis mesmo com a ausência desses átomos, através do mecanismo de ressonância. Dividem-se em duas categorias básicas: sintéticos e naturais. Atuam nos organismos vivos através de diferentes mecanismos, como complexação de íons metálicos, captura de

radicais livres, decomposição de peróxidos, inibição de enzimas responsáveis pela geração de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e na modulação de vias sinalizadoras celulares (VASCONCELOS et al., 2006). É importante mencionar que os antioxidantes ingeridos na dieta são relevantes na manutenção do equilíbrio das espécies reativas de oxigênio (Reactive oxygen species (ROS)) e espécies reativas de nitrogênio (Reactive nitrogen species (RNS)), principalmente quando o sistema de defesa antioxidante endógeno não é capaz de desativar de forma eficaz as espécies reativas, formadas durante o estresse oxidativo e nitrosativo (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). As ROS e RNS exibem propriedades químicas distintas entre si, especialmente em relação a sua reatividade, variando desde o peróxido de hidrogênio, que é pouco reativo, até o radical hidroxila, que é muito reativo (WINTERBOURN, 2008). Sabe-se que o estresse oxidativo e nitrosativo são resultantes do desequilíbrio entre a capacidade de defesa antioxidante das células e a formação de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio. No decorrer destes eventos, alguns componentes celulares relevantes, como lipídios, proteínas e DNA, podem ter sua estrutura química modificada. Vários trabalhos demonstraram que o estresse oxidativo e nitrosativo estão relacionados á algumas doenças humanas, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes, câncer, doenças neurodegenerativas, patologias hepáticas e ao processo de envelhecimento (VALKO et al., 2007; ALMEIDA et al., 2009). O progressivo interesse no estudo da ação dos compostos fenólicos e das antocianinas, presentes nos extratos das frutas vermelhas, deve-se à inversa relação entre o consumo de frutas e a incidência de problemas cardiovasculares (XIE et al., 2012) e outras doenças crônicas como por exemplo cardiopatias e câncer (SZAJDEK; BOROWSKA, 2008). Além disso, também é crescente o número de trabalhos de pesquisa com experimentos in vivo e in vitro que comprovam não só a capacidade antioxidante, mas o efeito contra diversos tipos de câncer (ROYCELYNN et al., 2012) e sobre o sistema imunológico (WANG et al., 2010; MARZOCCHELLA et al., 2011). Sabe-se que câncer é o nome dado a um grupo de mais de cem diferentes tipos de doenças que têm em comum o crescimento desordenado de células anormais

com potencial invasivo. Além do mais, sua origem se dá por condições multifatoriais. Esses fatores causais podem agir em conjunto ou em sequência para iniciar ou promover o câncer (carcinogênese) (INCA, 2014), sendo que a carcinogênese é dividida em três estágios: iniciação, promoção e progressão (TSAO et al., 2004; INCA, 2011). O câncer de próstata está entre os tumores de maior ocorrência mundial. Sendo considerado uma doença da terceira idade (INCA, 2014). Acredita-se que, a exemplo de outros tipos de tumor, fatores genéticos, hereditários, hormonais, fatores de crescimento, exposição ambiental, ocupacional, alterações em genes somáticos e comportamento dietético estejam relacionados ao desenvolvimento deste tipo de câncer (PAIVA et al., 2010 ). O longo tempo de latência do câncer de próstata oferece uma "ampla janela" de oportunidade para intervenção quimiopreventiva por agentes dietéticos como, por exemplo, alimentos que contenham compostos antioxidantes (GUNDALA et al., 2014). Outro câncer de grande ocorrência mundial é o de mama. Este é responsável pela maior causa de morte por câncer nas mulheres em todo o mundo. É a segunda causa de morte por câncer nos países desenvolvidos, atrás somente do câncer de pulmão, e a maior causa de morte por câncer nos países em desenvolvimento (INCA, 2014). A prevenção primária dessa neoplasia é um campo de pesquisa e de intervenções bastante promissor. Cerca de 30% dos casos desta doença podem ser evitados por medidas como uma alimentação saudável, prática de atividade física regular e manutenção do peso ideal (INCA, 2014). Um mecanismo anticâncer muito pesquisado é a indução seletiva da apoptose, levando apenas células malignas à morte (SUBHASHINI et al., 2005). A apoptose tem um papel fundamental na determinação do crescimento tumoral e sua agressividade. Neste sentido, é considerada um mecanismo celular intrínseco e regulado, por meio do qual há um controle entre a produção de novas células e a capacidade individual das mesmas em se autodestruírem (DUARTE, 2010). O controle e o tratamento do câncer têm apontado para a busca de novas diretrizes, voltadas para o aprimoramento e a melhoria de terapias não convencionais. A descoberta de novos fármacos derivados de plantas medicinais possui um papel relevante no tratamento do câncer, sendo que, de todos os

fármacos antitumorais disponíveis entre 1940 e 2002, 40% foram originados de produtos naturais ou semissintéticos (BUTLER, 2004). Neste sentido, o trabalho de Wang et al. (2014) mostrou que os extratos aquosos da semente da jabuticaba (jabuticaba plantada e colhida em Taiwan) possuem atividade apoptótica sobre células de câncer oral. Desse modo fica claro que a jabuticaba, por possuir compostos fenólicos e antocianinas em sua composição, pode oferecer vários benefícios a saúde. Neste sentido há um vasto interesse na pesquisa das suas propriedades funcionais e seus benefícios associados (DAÍ; MUMPER, 2010). As antocianinas estão entre os pigmentos naturais mais conhecidos e reconhecidos como compostos funcionais que agregam valor aos alimentos (PRATA et al., 2010). As novas possibilidades de utilização das antocianinas, principalmente na indústria de alimentos, deixam clara a importância de estudos analíticos sobre estes pigmentos (LOPES, 2002). A capacidade antioxidante dos compostos fenólicos antociânicos e não antociânicos é de grande importância, existindo vários métodos para avaliá-las, podendo ser in vitro e in vivo (PINELO et al., 2004). Atualmente está crescendo a utilização da determinação da capacidade de desativação das ROS e RNS de importância biológica. Sabe-se que estas espécies reativas exibem propriedades químicas diferentes entre si, principalmente em relação à sua reatividade, variando desde o peróxido de hidrogênio, que é pouco reativo, até o radical hidroxila que é fortemente reativo (WINTERBOURN, 2008). Levando-se em conta que cada espécie reativa apresenta propriedades químicas específicas, a capacidade de uma matriz desativar determinada ROS ou RNS não indica necessariamente que ela terá capacidade de desativar outra espécie reativa, o que sugere que a capacidade antioxidante de uma matriz deve ser medida frente a diferentes ROS e RNS para que se conheça o perfil completo da capacidade antioxidante. Dessa forma, o conhecimento do perfil completo da capacidade antioxidante, pode ser mais efetivo na interpretação de pesquisas, que buscam correlacionar as propriedades antioxidantes in vitro com a redução do risco de doenças crônico-degenerativas, relacionadas ao estresse oxidativo (RODRIGUES et al., 2014). Como comentado anteriormente os compostos fenólicos e as antocianinas fazem parte da composição de vários alimentos. Assim, para que estes compostos possam

ser analisados, há a necessidade de extraí-los dos alimentos. A etapa de extração dos compostos da matriz é uma das fases mais importantes no processo de análise de alimentos, pois procura-se sempre extrair, da forma mais seletiva possível, os compostos de interesse. A diversidade estrutural, as interações com outros componentes da amostra, assim como as características físicas da amostra são alguns dos elementos responsáveis pela dificuldade na extração e análise de compostos fenólicos antociânicos e não antociânicos, de forma que não existe um método universal de análise (DAÍ; MUMPER, 2010). Diversos métodos de extração para esses compostos são encontrados na literatura (MERTZ et al., 2007; ZHANG et al., 2008), bem como trabalhos de otimização da extração para uma amostra específica (BARNES et al., 2009; ZOU et al., 2011). Existem vários métodos de extração para as antocianinas, os quais empregam diferentes solventes, podendo estes serem acidificados ou não, assim como a possibilidade de utilização de vários equipamentos para auxiliar neste processo (SANTOS et al., 2010; WU et al., 2012; ALEZANDRO et al., 2013). Para os compostos fenólicos, também existem vários métodos de extração, com grande variedade de solventes e equipamentos que contribuem para está etapa (WU et al., 2012; MORELLI; PRADO, 2012; ALEZANDRO et al., 2013). A análise de alimentos é composta por várias etapas, sendo que a identificação e quantificação dos compostos fenólicos e antocianinas são de grande importância. Para realizar, com sensibilidade e eficiência essas etapas, faz-se necessário o uso de técnicas modernas, como cromatografia líquida de alta eficiência (High- performance liquid chromatography (HPLC)) com detecção de arranjo de diodos (Diode array detector (DAD)) acoplada à espectrometria de massas (mass spectrometry (MS)). Na maioria das vezes, para a correta identificação de uma classe de compostos, é preciso efetuar a purificação dos extratos e isolamento de frações, utilizando técnicas de extração em fase sólida (Solid Phase Extraction (SPE)) (LIMA et al., 2011) sendo o cartucho com fase estacionaria C-18 o mais empregado (DAÍ; MUMPER, 2010). O conhecimento das propriedades antioxidantes e da ação antiproliferativa e apoptótica in vitro a partir de novas variedades de frutas é de fundamental importância. Dessa forma, o estudo das variedades de jabuticaba é de grande valia,

pois esta fruta é uma fonte natural de composto fenólicos antociânicos e não antociânicos e, consequentemente, fonte de compostos antioxidantes, com possíveis efeitos na prevenção de doenças e promoção da saúde. Existem várias espécies de jabuticaba, como a Coroada (Myrciaria coronata Mattos), Híbrida (Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg), Pintada (Plinia ssp.), porém somente as variedades Sabará (Myrciaria jabuticaba (Vell.) O. Berg) e a Paulista (Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg.), são comercializadas e possuem alguns poucos estudos sobre suas propriedades. Tanto a M. jabuticaba (Sabará) quanto a M. cauliflora (Paulista) são encontradas em abundância no território brasileiro, o que proporciona o acesso de toda a população a esta fruta e aos benefícios de sua composição química. Com base nisso, é de essencial importância à caracterização (identificação e quantificação) dos compostos fenólicos e das antocianinas, a avaliação das propriedades antioxidantes, assim como a realização de vários testes para avaliar o poder antiproliferativo e apoptótico em células a partir dos extratos das diferentes variedades de jabuticaba. Este estudo visou enriquecer a literatura, pois são escassos os trabalhos que utilizem técnicas modernas e caracterização completa nas variedades em questão. Além disso, os resultados desta tese geraram conhecimentos úteis para a população que busca respaldo científico sobre as jabuticabas, assim como para os produtores que procuram agregar valor aos seus produtos, pela disponibilidade de maiores informações sobre os compostos fenólicos nas diferentes partes da fruta. Outra contribuição importante deste trabalho consiste na produção de uma importante base de dados para as indústrias alimentícias, cosméticas e farmacêuticas para o desenvolvimento de produtos contra os danos oxidativos.

Objetivos

Objetivo geral

Este trabalho teve como objetivo; otimizar a extração dos compostos fenólicos totais da semente e das antocianinas monoméricas totais da casca; caracterizar e

quantificar os compostos fenólicos antociânicos e não antociânicos por HPLC-DAD- MSn; avaliar a capacidade antioxidante in vitro utilizando ensaios com ROS e RNS e, verificar a ação antiproliferativa sob células tumorais dos extratos das cascas e das sementes das variedades de jabuticabas: Sabará (Myrciaria jabuticaba (Vell.) O. Berg), Paulista (Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg), Coroada (Myrciaria coronata Mattos), Híbrida (Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg) e Pintada (Plinia ssp.).

Objetivos específicos a) Otimizar a extração dos compostos fenólicos totais da semente e das antocianinas monoméricas totais da casca da jabuticaba Sabará através de planejamento experimental; b) Identificar e quantificar por HPLC-DAD-MSn os compostos fenólicos antociânicos e não-antociânicos das cascas da jabuticaba Sabará, Paulista, Híbrida, Coroada e Pintada; c) Identificar e quantificar por HPLC-DAD-MSn os compostos fenólicos das sementes das cinco variedades de jabuticaba; e) Determinar a capacidade dos extratos das cascas e das sementes das cinco variedades de jabuticaba em desativar as principais ROS e RNS de importância biológica; f) Verificar a ação antiproliferativa dos extratos das cascas e das sementes das cinco variedades de jabuticaba sob células tumorais de próstata (DU-145) e mama (MDA MB-231).

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CAPITULO 1

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Revisão bibliográfica

Jabuticaba: aspectos gerais

A jabuticabeira (Myrciaria spp.) é conhecida há quase cinco séculos, e pode ser encontrada desde o Pará até o Rio Grande do Sul. Pertence à família Mirtaceae, a mesma do camu-camu, jambo e goiaba (SOUZA-MOREIRA et al., 2008). É uma planta de clima tropical e subtropical úmido, que não suporta estiagens prolongadas e geadas intensas. Prefere os solos profundos ricos em matéria orgânica (CHIARELLI et al., 2005). A espécie predominante de jabuticaba é a Myrciaria jabuticaba (Vell.) O. Berg, conhecida como Sabará, de ocorrência no Brasil, Paraguai e Argentina. No Brasil sua ocorrência principal é nos estados do Rio de Janeiro, Minas Gerais e São Paulo. Além dessa, outra espécie de jabuticaba muito conhecida em todo o país é a Paulista, Assu ou Ponhema, Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg (MANICA et al., 2000; GEÖCZE, 2007). Outras variedades de menor ocorrência estão listadas na Tabela 1.

Tabela 1 – Espécies existentes de jabuticabas, seus nomes comuns e locais de ocorrência Espécies Nomes comuns Ocorrência Myrciaria coronata Mattos Coroada de coroa São Paulo Myrciaria jaboticaba (Vell.) O. Sabará Brasil, Paraguai e Berg Argentina Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg Paulista, Assu ou Brasil Ponhema Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg Jabuticaba Híbrida Brasil Plinia ssp. Jabuticaba Pintada Brasil M. phitrantha Costada São Paulo M. peruviana Jabuticaba de cabinho Minas Gerais e Rio Grande do Sul M. aureana Branca São Paulo M. olongata Azeda São Paulo

M. grandufolia Jabuticaba graúda Minas Gerais Fonte: MATOS, 1983; SOUSA et al. 1995; LORENZI, 2006; GEÖCZE, 2007.

No estado de São Paulo, o município de Casa Branca, destaca-se na produção de jabuticaba, pois em seu distrito, Lagoa Branca, encontra-se um dos maiores jabuticabais do Brasil (FILHO, 2014). A espécie Sabará ocupa uma das maiores áreas cultivadas no Brasil, apresentando crescimento médio e alta produtividade (LIMA, 2008). A produção ocorre praticamente o ano inteiro, porém o auge da colheita é entre os meses de agosto a outubro (FILHO, 2014). O período de comercialização pós-colheita é curto. Estudos indicam que, em apenas dois dias após a colheita, há uma rápida alteração da aparência e do sabor causado pela intensa perda de água e fermentação da polpa (BARROS et al., 1996). É importante mencionar, que mesmo assim o potencial econômico e de comercialização desse fruto é de grande interesse, devido suas características organolépticas (MOTA et al., 2002). Neste sentido, entre as várias frutas nativas brasileiras, estudadas recentemente, a mais popular é a jabuticaba, devido a sua produção e comercialização terem aumentado, impulsionadas pela sua crescente aceitação por parte da população brasileira (ABE et al., 2012). As jabuticabas são bem conhecidas, por serem muito saborosas e nutritivas. Segundo a tabela brasileira de composição de alimentos, 100 g da parte comestível da jabuticaba crua possui 83,6% de umidade, 58 kcal, 0,6 g de proteína, 0,1 g de lipídios, 15,3 g de carboidratos, 2,3 g de fibra alimentar, 0,4 g de cinzas e 8 mg de cálcio (NEPA-UNICAMP, 2006). Um estudo realizado recentemente revelou a composição química e mineral das variedades Sabará e Paulista (ALEZANDRO et al., 2013). Estas estão descritas na Tabela 2.

Tabela 2. Composição química e mineral da jabuticaba Paulista e da jabuticaba Sabará maduras Composição (mg/100 g de peso seco) Paulista Sabará Proteínas 1,02 0,94 Lipídios 0,55 0,40 Cinzas 2,30 2,90

Fibras totais 17,9 19,3 Fibras solúveis 1,80 2,30 Fibras insolúveis 16,1 17,0 Carboidratos 78,2 76,5 Composição Mineral (mg/100 g de peso Paulista Sabará seco) Nitrogênio (N) 800 660 Fósforo (P) 110 100 Potássio (K) 1320 1000 Cálcio (Ca) 20 20 Magnésio (Mg) 120 100 Enxofre (S) 80 70 Boro (B) 0,7 0,8 Zinco (Zn) 2 2,9 Ferro (Fe) 2,9 2,7 Manganês (Mn) 1,8 2,7 Cobre (Cu) 1 1 Sódio (Na) 0,76 1,03 Fonte: (ALEZANDRO et al., 2013).

O trabalho realizado por Lima (2008) demonstrou que os frutos da Sabará pesam ao redor de 8,267 g, a casca pesa 3,255 g, a polpa 2,705 g e a semente 1,644 g. O principal componente da polpa da jabuticaba é a água (86,72% da massa total). Alezandro et al. (2013) demonstraram em seu trabalho que em uma porção 100 g de jabuticaba (cerca de 15 unidades), proporciona entre 10 e 15% da ingestão diária recomendada (IDR) de cobre, manganês e potássio. Assim, sob orientações da FDA (Food and Drug Administration), a jabuticaba pode ser considerada uma "boa fonte" destes minerais. Ela também é uma das fontes mais ricas de proantocianidinas, especialmente no Brasil, onde o acesso ao blueberry e cranberry é limitado (ALEZANDRO et al., 2013). As cascas das jabuticabas geralmente não são consumidas, porém apresentam características que estimulam sua utilização pelas indústrias alimentícia, cosmética e

farmacêutica. É importante mencionar, que nelas está a maior concentração dos constituintes de interesse do fruto em relação à saúde, como: antocianinas (cianidina 3-glicosídeo e delfinidina 3-glicosídeo), quercetina, elagitaninos, ácido elágico, fibras solúveis, insolúveis e polifenóis totais (ABE et al., 2012; LEITE-LEGATTI et al., 2012). Estudos têm demonstrado que produtos feitos a partir da casca da M. jabuticaba, quando incorporada na dieta de ratos saudáveis e obesos, beneficia o estado redox, ou seja, o equilíbrio entre o estado de oxidação e redução celular das células do plasma, melhora a inflamação no fígado e tecido adiposo, diminui a resistência à insulina, e ajuda a diminuir o colesterol total, diminuindo o LDL colesterol e aumentando o HDL colesterol (DRAGANO, 2011; LENQUISTE et al., 2012). Quando a jabuticaba encontra-se madura, os carboidratos em maior concentração na polpa são os açúcares solúveis, o que demonstra sua potencialidade no aproveitamento industrial (MAGALHÃES et al., 1991). O estudo realizado por Lima (2008) mostra que a polpa da Sabará possui 14,130 Brix (HOBSON et al., 1993). É importante ressaltar que as concentrações destes sólidos constituem uma das variáveis mais relevantes para mensurar a qualidade dos frutos (LIMA, 2008). De acordo com Barros et al. (1996), uma rápida deterioração e fermentação do fruto está associada ao excesso de açúcares no mesmo, o que reduz sua vida útil. Porém frutas mais doces têm melhor aceitação no consumo in natura e quando industrializadas apresentam maior rendimento. Quando se utiliza a jabuticaba na fabricação de suco, bebidas alcoólicas ou outras preparações, geralmente gera-se bagaço, com alto teor de fibras. Esse subproduto pode ser reaproveitado como ingrediente em alimentos ricos em carboidratos, com influencia positiva em vários aspectos da digestão, absorção e metabolismo. Ele também pode ser aproveitado na elaboração de farinhas pré- gelatinizadas obtidas por extrusão, destinadas ao preparo de pudins, purê pré- pronto, bolo, bolacha, macarrão e até mesmo bebidas isotônicas, entre outros (ASCHERI et al., 2006). Na pesquisa realizada por Reynertson et al. (2008) foi demonstrado o conteúdo total de compostos fenólicos da jabuticaba sendo o valor de 31,6 mg de ácido gálico/g de fruta seca. Na espécie Sabará fresca o teor de polifenóis encontrado

para o fruto íntegro foi 1,75 g/100 g, polpa 0,07 g/100 g, casca 1,89 g/100 g (LIMA, 2008). Silva (2010), obteve para o extrato de jabuticaba valor de compostos fenólicos de 636,23 mg de ácido gálico/100 g, e 723 μmol L-1 de Trolox/g, esse resultado mostra que ela possui considerável quantidade de compostos fenólicos. Alezandro et al. (2013) mostra em seu trabalho que a jabuticaba é uma excelente fonte de polifenóis na dieta e que as espécies mais relevantes comercialmente (Sabará e Paulista) também são ótimas fontes de compostos fenólicos. Duas antocianinas, cianidina 3-glicosídeo (433 mg/100 g) e delfinidina 3- glicosídeo (81 mg/100 g) foram encontrados na casca da jabuticaba (LEITE et al., 2011). Outros trabalhos também encontraram estas duas antocianinas na casca desta fruta (SANTOS et al., 2010; LIMA et al., 2011). Com o fruto maduro, a casca, tem seus níveis de antocianinas aumentados e os teores de taninos e ácido elágico total diminuídos (ABE et al., 2012). O teor de antocianinas na jabuticaba madura é maior do que em outras frutas da família Myrtaceae, como camu-camu e pitanga (ABE et al., 2012).

Compostos Antioxidantes

Os antioxidantes geralmente são definidos como uma família heterogênea de moléculas naturais, sendo estas “qualquer molécula que atrase, previna ou remova um dano oxidativo de uma molécula alvo”. A expressão molécula alvo engloba praticamente todas as moléculas encontradas em alimentos e em tecidos vivos (excluindo a água) e inclui, por exemplo, proteínas, lipídios, carboidratos e DNA. Os antioxidantes podem atuar de várias formas na proteção das biomoléculas: removendo espécies reativas por ação enzimática; reduzindo a formação dessas; suprimindo fisicamente as mesmas e desativando-as pelos nomeados “agentes de sacrifício”, os quais são moléculas preferencialmente oxidadas pelas espécies reativas para preservar biomoléculas de maior relevância biológica (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). Os mecanismos pelos quais os antioxidantes em alimentos exercem sua ação podem ser divididos em duas possíveis vias: reações de transferência de um átomo

de hidrogênio (HAT) (Equação 1) ou transferência de um elétron (SET) (Equação 2 a 5) (PRIOR et al., 2005).

R● + AH → RH + A● Eq. 1

Em que: R● é o radical livre e AH é o antioxidante. Nesta reação, o novo radical formado é mais estável que o inicial.

R● + AH → R- + AH●+ Eq. 2 ●+ ● + AH + H2O → A + H3O Eq. 3 - + R + H3O → RH + H2O Eq. 4 M(III) + AH → AH+ + M(II) Eq. 5

Na qual: R● é o radical livre, AH é o antioxidante e M(III) é um metal com estado de oxidação + 3. Ao contrário da Equação 1, na Equação 2 a 5 o antioxidante transfere um elétron para reduzir o composto, incluindo metais, carbonilas e radicais. Os compostos antioxidantes podem ser classificados como sintéticos ou naturais. Os antioxidantes sintéticos são normalmente utilizados na indústria de alimentos para aumentar a vida útil dos alimentos. Alguns exemplos de antioxidantes sintéticos são butilhidroxitolueno (BHT), o butilhidroxianisol (BHA), o propilgalato (PG) e o terciobutilhidroxinona (TBHQ) (BARREIROS et al., 2006). Sabe se que o consumo dessas substâncias tem sido relacionado à malefícios a saúde (SVILAAS et al., 2004). Isso tem levado a indústria de alimentos a restringir seu uso, além de buscar outras alternativas, ainda que parciais, por antioxidantes naturais. Existem fórmulas, já comercializadas, para adição em alimentos, formuladas a partir de substratos com alto potencial antioxidante, como os extratos de alecrim e orégano (TRINDADE, 2007). Com isso há um crescente interesse na utilização de antioxidantes naturais na busca da conservação dos alimentos e na proteção contra doenças que envolvem danos causados por radicais livres. A realização de vários estudos sugerem que os compostos antioxidantes possuem efeitos benéficos como agentes profiláticos e, que há uma diminuição no risco de doenças cardiovasculares e alguns

tipos de cânceres associados ao consumo de frutas e vegetais (HIDALGO et al., 2010; XIA et al., 2010). Os compostos fenólicos e as antocianinas podem agir como antioxidantes primários, reagindo diretamente com os radicais livres, dando lugar a um novo radical menos reativo, que o radical livre inicial, ou podem atuar como antioxidantes secundários, recuperando ou intensificando outros sistemas antioxidantes, como certas enzimas (GORINSTEIN et al., 2000). Os compostos fenólicos contribuem significativamente com a capacidade antioxidante total de muitas frutas e vegetais (LUO et al., 2002). A classe das antocianinas também possui ação antioxidante. Esta ação foi observada em tubos de ensaio, facilitando a compreensão do fato da incidência de tumores e problemas cardíacos serem menores entre consumidores de alimentos ricos em antioxidantes (SILVA, 2010). Quanto ao modo de ação dos compostos fenólicos, de forma geral, estes compostos em particular os flavonóides, possuem estrutura ideal para a desativação dos radicais livres (BARREIROS et al., 2006). A atividade antioxidante dos flavonóides depende da sua estrutura, e pode ser definida por cinco fatores: reatividade como agente doador de Hidrogênio (H) e de elétrons; estabilidade do radical flavanoil formado; reatividade frente a outros antioxidantes; capacidade de quelar metais de transição; solubilidade e interação com as membranas. Biologicamente, os compostos fenólicos de frutas e vegetais exercem efeito antioxidante através de diferentes mecanismos de ação que englobam o sequestro de radicais livres, inibição do surgimento de espécies reativas, por interação com enzimas e sequestro de metais. Dentre estes, o principal ocorre pela doação de H e formação de radicais fenólicos intermediários estabilizados por ressonância de elétrons não pareados na estrutura aromática, ou seja, pela ação de sequestro dos radicais livres. Além disto, os radicais fenólicos podem complexar outros radicais livres e colaborar na terminação de reações de oxidação em cadeia (NIJVELDT et al., 2001; DAÍ, 2010). A eficácia dos antioxidantes de origem vegetal depende da sua estrutura e da sua concentração no alimento. A quantidade destes compostos no vegetal é influenciada

por fatores genéticos, condições ambientais, grau de maturação e variedade da planta (MOURE et al., 2001).

Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são relevantes para a reprodução e crescimento, promovendo a proteção da planta contra patógenos, predadores e em especial, contra alterações no conteúdo de água, níveis de luz, exposição à radiação UV e carência de nutrientes e minerais. Além de tudo, contribuem para a cor e sabor de frutas e vegetais sendo característicos do vegetal no qual são produzidos (CUSHNIE; LAMB, 2005; NACZK; SHAHIDI, 2006). É importante mencionar os compostos fenólicos estruturalmente são formados por no mínimo um anel aromático com um ou mais grupamentos hidroxilas substituintes, variando de moléculas fenólicas simples (ácidos fenólicos, flavonóides) a compostos altamente polimerizados (ligninas e taninos). A maior parte dos compostos fenólicos é encontrada na natureza na forma conjugada com mono ou polissacarídeos, ligados a um ou mais grupos de compostos fenólicos, podendo também ocorrer na forma de derivados funcionais, ou seja, ésteres e metil ésteres. Existem cerca de oito mil compostos fenólicos, classificados de acordo com suas características estruturais (DAÍ; MUMPER, 2010; DEL RIO et al., 2012; MORELLI; PRADO, 2012). Os flavonois, representados principalmente pela quercetina, kaempferol e miricetina, são definidos estruturalmente pela presença de hidroxila em C3 e grupamento cetonico em C4 (TERRIER et al., 2009). Podem estar conectados a açúcares, majoritariamente glicose, galactose e ácido glucurônico, e dependendo do grau de hidroxilação apresentam alterações na cor, atividade antioxidante e estabilidade. Exercem papel de proteção contra radiações UV nas plantas, sendo encontrados principalmente nas cascas das frutas (HE et al., 2012). Os flavonois de maior ocorrência entre os compostos predominantes nas frutas vermelhas são a quercetina e miricetina glicosiladas, sendo estes determinados pela hidroxila em C3, podem ser encontrados na forma monomérica, polimérica e oligomérica (ARON; KENNEDY, 2007).

Os taninos condensados e proantocianinas são as denominações utilizadas para estruturas oligoméricas e poliméricas de flavan-3-ois. Existem dois tipos de proantocianinas as do tipo B, com ligações C4-C6 e C4-C8, e as do tipo A, com ligações C2-O-C5 e C2-O-C7 adicionais (TERRIER et al., 2009). A principal função desses compostos nas plantas é a de conferir adstringência, característica resultante da capacidade de precipitação de proteínas e muito importante na defesa da planta contra predadores. Para qualidade dos alimentos exercem papel notável na qualidade de vinhos e contribuem para a estabilidade microbiológica e oxidativa (ARON; KENNEDY, 2007). Numerosas pesquisas discutem as variações na concentração e no perfil de compostos fenólicos observadas em diferentes variedades de uma mesma espécie de fruta vermelha (MERTZ et al., 2007; HASSIMOTTO et al., 2008; AABY et al., 2012). Além de que, mudanças relevantes na concentração de fenólicos podem ocorrer devido a diferenças de altitude, temperatura, radiação solar e disponibilidade de água no decorrer do cultivo de uma espécie (fatores edafoclimáticos) (INTRIGLIOLO; CASTEL 2010), ou mesmo, devido a condições de armazenamento pós-colheita. Os compostos fenólicos são encontrados nas frutas, vegetais, sementes, flores e cascas, sendo alvo de constantes estudos devido suas propriedades, pois foram identificados como compostos que trazem benefícios à saúde, variando desde prevenção da cárie até ao câncer. Eles exercem estes benefícios pelo seu poder antioxidante (WOLLGAST; ANKLAN, 2000). Estudos epidemiológicos mostram uma relação entre o aumento no consumo de antioxidantes como compostos fenólicos e a diminuição no risco de doenças cardiovasculares e certos tipos de câncer (BRAVO, 1998). Os extratos vegetais que possuem compostos fenólicos são capazes de afetar o crescimento e metabolismo dos micro-organismos (DIOXON; STEELE, 1999). Isso ocorre devido ao fato desses compostos inibirem a síntese dos ácidos nucleicos, função das membranas citoplasmáticas e a energia do metabolismo dos micro- organismos (CUSHNIE; LAMB, 2005). Entre os compostos fotoquímicos, os compostos fenólicos compõem um dos grupos mais numerosos e largamente distribuídos no reino vegetal (BRAVO, 1998).

Eles são em parte responsáveis pela qualidade sensorial e nutricional dos alimentos vegetais. A adstringência dos alimentos e bebidas são dependentes da concentração dos compostos fenólicos. Portanto a oxidação desses compostos no período do processamento e do armazenamento pode ocasionar características indesejáveis aos alimentos (SHANHIDI; NACZK, 1995). Estudos revelam que os compostos fenólicos são importantes constituintes dietéticos, devido a sua alta capacidade antioxidante, relacionada à sua habilidade em complexar íons metálicos e prevenir a conversão de hidroperóxido em oxirradicais reativos (DIMITRIOS et al., 2006), confirmando a importância para a saúde do ser humano, sendo que o seu consumo regular pode colaborar na prevenção de doenças. Além disso, os mesmos também são agentes redutores que em conjunto com outros agentes redutores da dieta, como vitamina C, vitamina E e os carotenoides, conseguem proteger os tecidos corporais contra o estresse oxidativo (SCALBERT; WILLIAMSON, 2000). Com isso, o potencial antioxidante destes compostos exercem funções redutoras do oxigênio singlete, nas reações de oxidação lipídica e na quelação de metais (ROCKENBACH et al., 2008). Há relatos em vários estudos da associação entre o consumo de frutas e vegetais e a diminuição do risco do desenvolvimento de diversas desordens crônico- degenerativas, como câncer, inflamações, doenças cardiovasculares, catarata, degeneração macular entre outras, sendo os compostos fenólicos alguns dos grupos de compostos bioativos, aos quais são atribuídos tais efeitos (STANNER et al., 2004; HUANG et al., 2005). Um dos mecanismos responsável pela diminuição do risco dessas doenças envolve a redução ou inibição de reações de oxidação, por meio da desativação das ROS e RNS. Os compostos fenólicos, incluindo os flavonóides, são reconhecidos por inibir a peroxidação lipídica e as lipoxigenases in vitro, por meio da capacidade de sequestrar radicais livres, como o hidroxílico, superóxido e os peroxílicos, os quais reconhecidamente promovem o estresse oxidativo celular (TACHAKITTIRUNGROD et al., 2007; LEONTOWICZ et al., 2007). Vários trabalhos demonstram que os compostos fenólicos, presentes nos alimentos, estão relacionados com ações anti- carcinogênicas (inibição do câncer de cólon, esôfago, pulmão, fígado, mama e pele), anti- inflamatórias, anti-hepatotóxica, antiviral, antialérgica e antitrombótica (MAZZA;

GIRARD, 1998). Além disso, previnem a oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), reduzindo os riscos da aterosclerose, agindo na prevenção de doenças cardiovasculares e na absorção de produtos tóxicos oriundos da peroxidação lipídica (CHIANG et al., 2004; GORELIK et al., 2008).

Antocianinas

Entre os flavonoides de maior ocorrência em frutas vermelhas, as antocianinas, são responsáveis pela forte coloração vermelha à roxa de várias frutas e vegetais. Além da possibilidade de serem empregadas como substitutos de corantes sintéticos em alimentos (WROLSTAD; CULVER, 2012; BUCHWEITZ et al., 2013), a relação entre sua capacidade antioxidante e possíveis efeitos benéficos à saúde são alvos constantes de estudos (HAFEEZ et al., 2008). Elas são estruturalmente divididas em duas ou três partes: uma base aglicona (antocianidina), açúcares e alguns casos, grupamentos acil. Existem cerca de 25 agliconas, sendo somente 6 as de maior incidência em frutas vermelhas. Formadas de um esqueleto carbônico com 3 anéis principais, C6-C3-C6 (Figura 1), com possibilidade de glicosilação nos carbonos 3 e 5 à açúcares que podem ou não estar acilados a ácidos fenólicos. Conforme demonstrado por He; Giusti, (2010), as 6 principais antocianidinas formam a estrutura central de cerca de 635 diferentes antocianinas já identificadas (HE; GIUSTI, 2010). Lembrando que as antocianinas contém ligações duplas conjugadas responsáveis pela absorção de luz em torno de 500 nm, caracterizando a cor típica destes pigmentos (REIN, 2005).

Figura 1. Estrutura química do cátion flavílium

Fonte: (REIN, 2005).

É importante mencionar que as estruturas glicosiladas da cianidina, seguida da delfinidina e malvidina, são as antocianidinas de maior ocorrência nas frutas vermelhas, sendo glicose e rutinose, o mono e o dissacarídeo de maior ocorrência. Essas observações estão de acordo com o relato de Andersen; Jordhein (2006) que, considerando publicações de 1992 até 2006 em diversas fontes de antocianinas, indicam como de ocorrência majoritária as agliconas, cianidina (30%), delfinidina (22%) e a presença de glicose em 90% das estruturas identificadas. Quando as antocianinas são extraídas, apresentam-se na forma do cátion flavílium, geralmente glicosiladas, sendo as mais comuns a β-D-glicose, β-D- galactose e α-D-ramnose (RAMOS et al., 2000). Possuem polaridade relativamente alta por conterem grupos (hidroxilas, carboxilas e metoxilas) e açúcares ligados aos seus anéis aromáticos. Devido a isso, elas são mais solúveis em solventes de polaridade alta (água, metanol e etanol) do que em solventes de polaridade baixa (hexano, diclorometano, éter de petróleo e etílico). São derivadas das antocianidinas, que não possuem grupos glicosídeos, sendo que a maioria é hidroxilada nas posições 3, 5 e 7. Já nas antocianinas, uma ou mais destas hidroxilas são substituías por açúcares. Por elas estarem ligadas a açúcares, possuem maior solubilidade e estabilidade, quando são comparadas com as antocianidinas (HARBONE, 1994). Segundo Bridle; Timberlake (1997), as antocianinas fazem parte do maior grupo de pigmentos hidrossolúveis do reino vegetal, assim são alguns dos pigmentos vegetais mais atraentes (GOULD; LEE, 2002). Sua cor é fortemente influenciada pelos grupos metoxi e glicólicos. Quanto mais grupos metoxila, mais vermelha, quanto mais hidroxilas e grupos glicólicos mais forte é a cor azul (HARBORNE, 1958). Observa-se um crescente interesse na utilização das antocianinas em vários segmentos industriais, nos quais se destacam as indústrias farmacêuticas, cosmética e alimentícia (TERCI, 2004). Neste sentido elas podem ser utilizadas para caracterização e determinação da origem dos produtos o que auxilia na identificação de possíveis adulterações (FLAMINI et al., 2003). As antocianinas possuem uma grande vantagem quando utilizadas pela indústria alimentícia, pois não há limite máximo na sua aplicação nos alimentos, estando seu

uso vinculado à quantidade necessária para se atingir o efeito desejado (ANVISA, 2010). Sabe-se que as antocianinas atuam como fortes antioxidantes, sendo que essas propriedades bioativas já foram demonstradas com estudos in vitro e in vivo (GALVANO et al., 2004). Elas também são potentes antioxidantes quando comparadas com o butilato hidroxi anisol (BHA), butilato hidroxi tolueno (BHT) e o α- tocoferol (vitamina E), os quais são considerados antioxidantes clássicos (NARAYAN et al., 1999). Uma boa alternativa para se obter coloração vermelha nos alimentos através de fontes vegetais são as antocianinas, por serem solúveis em água, facilitam sua inclusão em sistemas aquosos. Segundo Ozela (2004), possuem potencial para substituir corantes artificiais como o vermelho 40, ponceau 4R, eritrosina e bordeaux S, desta forma atuam como agentes coloríficos em produtos alimentícios, cosméticos, fármacos entre outros. Os corantes podem ser definidos pela sua origem como corantes naturais e sintéticos. Corantes naturais são aqueles obtidos a partir do metabolismo de organismos vivos sejam eles de origem vegetal, animal, fungos ou micro-organismos. Corantes sintéticos são sintetizados por reações químicas (CAVALCANTI, 2013). As possibilidades da utilização das antocianinas, principalmente na indústria de alimentos, deixam clara a importância de estudos sobre estes pigmentos, levando-se em conta a fragilidade destes compostos frente a vários fatores como pH, oxigênio, luz, presença de metais entre outros (LOPES, 2002). Neste contexto, embora as antocianinas apresentem um alto potencial de aplicação industrial, seu uso tem sido restrito (BOBBIO; MERCADANTE, 2008). Estudos demonstram que elas são mais estáveis em meio ácido, mesmo assim, pode ocorrer degradação por vários fatores, resultando em diminuição da cor, surgimento de cor amarelada e a formação de produtos insolúveis (LOPES et al., 2007). O meio ácido exerce poder de conservação sobre as antocianinas, pois os ácidos orgânicos protegem o cátion flavilium da água, ou seja, eles impedem que ocorra a hidratação. Com isso a cor varia de vermelho a azul sem passar pela fase incolor. Outro fator muito importante é a temperatura, pois as mesmas não suportam temperaturas elevadas, mesmo sobre a proteção do meio ácido ou estando

complexadas com ácido em temperaturas elevadas ocorre a degradação (STRINGHETA, 1991). O oxigênio é um importante fator na degradação das antocianinas. Esta degradação ocorre através de um mecanismo de oxidação direta ou indireta dos constituintes do meio que reagem com as antocianinas (JACKMAN; SMITH, 1992). Porém quando se utiliza atmosferas modificadas com gases inertes, como o nitrogênio, consegue-se aumentar a estabilidade das mesmas (DARAVINGAS; CAIN, 1968). Já foi comprovada que a degradação destas, interfere diretamente nas medidas de compostos fenólicos, e na atividade antioxidante (MALACRIDA; MOTA, 2006). Além da sua potencial aplicação como corantes naturais, as antocianinas constituem pigmentos com uma grande gama de atividades biológicas, as quais englobam: atividade antioxidante (TSUDA et al., 2003), anti-inflamatória (YOUDIM et al., 2002), anticâncer (HOU, 2003), antimutagênica (PETERSON; DWYER, 1998), quimiopreventiva (ZHAO et al., 2004), inibição da enzima o-glucosidase (MATSUI et al., 2001), antivirais (KAPADIA et al., 1997), entre outras. Além disto, podem reduzir o risco de doenças coronárias através da modulação da proteção arterial (COLANTUONI et al., 1991), inibição da agregação de plaquetas (MORAZZONI; MAGISTRETTI, 1990) ou proteção endotelial (YOUDIM et al., 2002). Em uma revisão de artigos, realizada por Santos; Meireles (2009) mostram que o consumo das antocianinas pode promover vários benefícios à saúde como, redução do risco de doença cardiovascular, diabetes, câncer, efeito protetor contra danos gástricos e hepáticos, degradação do colágeno e aumento do desempenho cognitivo, entre outros. De acordo com Duthie (2007), resultados de diversas pesquisas in vivo e in vitro demonstram claramente que as antocianinas e extratos brutos de frutas vermelhas apresentam ação protetora contra o câncer, modulando marcadores de dano do DNA e mutagênese. Porém, o mecanismo preciso em que esses efeitos ocorrem permanecem pouco claro e muitas pesquisas se baseiam em doses, não alcançadas nutricionalmente.

Espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio

A oxidação é parte fundamental na vida aeróbica e do metabolismo celular. Dessa forma, as espécies pró-oxidantes são geradas naturalmente e desempenham funções biológicas fundamentais. As espécies reativas de oxigênio (ROS), são derivadas do oxigênio molecular com atividade redox e maior reatividade, já as espécies reativas de nitrogênio (RNS) são derivadas do óxido nítrico (NO●) (GOMES et al., 2006). As ROS e de RNS são produtos do metabolismo celular normal e exibem papel duplo, pois podem ser benéficas ou prejudiciais aos seres vivos. Os efeitos benéficos dessas espécies reativas, acontecem em concentrações baixas ou moderadas e, são fundamentais para a sinalização e regulação celular, detoxificação e função imunológica, sendo, portanto, continuamente geradas pelo organismo humano (VALKO et al., 2007; WINTERBOURN, 2008). Os efeitos prejudiciais das ROS e RNS ocorrem durante o estresse oxidativo e o estresse nitrosativo. Isto ocorre em sistemas biológicos, quando de um lado há uma grande produção de ROS/RNS e, de outro lado, uma carência de antioxidantes endógenos enzimáticos ou não enzimáticos. Sabe-se, que as ROS são fortemente reativas e altamente tóxicas, dessa forma, seu excesso pode reagir com muitos componentes celulares como lipídios, proteínas estruturais, enzimas, DNA e nucleotídeos, causando geralmente alterações prejudiciais às funções celulares (QUINN et al., 2004; KOVACIC et al., 2005; VALKO et al., 2007). Já as alterações causadas pelas RNS conduzem à formação de macromoléculas nitradas através da adição de um grupo nitro. Os alvos biológicos alterados pela nitração englobam: resíduos de tirosina e triptofano em proteínas, ácidos graxos poli-insaturados, bases do DNA e açúcares (MAZZULLI et al., 2006; VALKO et al., 2007). Devido a estes efeitos, o estresses oxidativo e nitrosativo podem gerar doenças cardiovasculares, degenerativas, diabetes, câncer, praticamente todas as patologias hepáticas, e também participar do processo de envelhecimento (ALMEIDA et al., 2009). As ROS e RNS são substâncias oriundas de diferentes fontes como a NADPH oxidase, a cadeia transportadora de elétrons mitocondrial (MURRANT; REID, 2001),

ciclo-oxigenase, aminoácidos oxidases e óxido nítrico sintase desacoplada (NOS) (GÖRLACH, 2005; KÄLVEGREN et al., 2005). Elas são geradas no interior das células pela exposição a agentes internos ou externos. As fontes endógenas podem ser várias: a cadeia respiratória; as células fagocitárias (monócitos, neutrófilos, e macrófagos) que utilizam o sistema de NADPH oxidase; a autoxidação de compostos de carbono reduzidos (aminoácidos, proteínas, lipídios, glicídios e ácidos nucléicos) e a ativação catalítica de varias enzimas do metabolismo intermediário como a xantina oxidase, aldeído oxidase, monoamino oxidase, ciclooxigenase ou lipoxigenase (HALLIWELL; GUTERIDGE 1999; BABIOR, 2004). Em geral, nos organismos vivos, o mais comum é o surgimento de espécies reativas, a partir da transferência de elétrons, por meio de reações redox. Como exemplo, a reação de 2+ ● - 3+ Fenton, onde o Fe (estado ferroso) reduz o H2O2 formando o HO , HO e Fe (estado férrico) (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). As fontes exógenas das ROS e RNS incluem a exposição a radiações (eletromagnéticas, luz solar, ozônio), a componentes dos cigarros, entre outros (CHOE; MIN, 2006). O excesso destas espécies no organismo é combatido por antioxidantes gerados pelo corpo ou ingeridos através dieta. A formação das ROS e RNS vem sendo amplamente estudada na deterioração oxidativa de produtos alimentícios, assim como na patogênese de diversas doenças humanas, como aterosclerose, diabetes, inflamações crônicas, doenças neurodegenerativas e certos tipos de câncer (FRANKEL; GERMAN, 2006; VALKO et al., 2007). A ocorrência de ROS em alimentos é inevitável por causa da natureza biológica das matrizes alimentícias, podendo levar a redução no valor nutricional, além de alterações físicas e químicas na qualidade dos alimentos durante o armazenamento ou comercialização (CHOE; MIN, 2006). As ROS são as principais responsáveis pelo inicio das reações de oxidação nos alimentos, pois podem reagir com lipídios, proteínas, açúcares e vitaminas, gerando compostos voláteis indesejáveis, degradando ácidos graxos essenciais, aminoácidos, vitaminas e produzindo compostos carcinogênicos (CHOE; MIN, 2006). Isto pode tornar o alimento menos aceitável, ou ainda, inaceitável pelos consumidores (MIN; CHOE, 2002; LEE et al., 2003).

●- Entre as ROS mais comuns podemos citar o radical ânion superóxido (O2 ), radical hidroxila (HO●), e também o radical hidroperoxila (HOO●), radical peroxila ● ● ●- (ROO ), radical alcoxila (RO ), radical ânion carbonato (CO3 ), radical ânion dióxido ●- de carbono (CO2 ), não esquecendo dos derivados de oxigênio não radicalares, 1 denominados como peróxido de hidrogênio (H2O2), oxigênio singlete ( O2), ácido hipocloroso (HOCl) e o ozônio (O3) (KOVACIC et al., 2005; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). As RNS são derivadas do radical óxido nítrico (NO●) e de ● seus metabólitos, incluindo tanto o dióxido de nitrogênio (NO2 ) (MAZZULLI et al., 2006) quanto as espécies não radicalares como ânion peroxinitrito (ONOO-) e o - ânion nitrosoperoxicarbonato (ONOOCO2 ) (HALLIWELL, 2001). ●- O O2 é formado quimicamente ou enzimaticamente através da transferência de ●- um elétron ao oxigênio triplete. Contudo sabe se que o O2 é comumente gerado na mitocôndria, de onde 1-3% de todos os elétrons “escapam” da cadeia de transporte de elétrons para formá-lo ao invés de contribuir para a redução do oxigênio para a formação de água (MILLER et al., 2005). Ele também é gerado pela enzima NADPH oxidase (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007; WINTERBOURN, 2008), várias outras ●- enzimas reduzem oxigênio a O2 , sendo a xantina oxidase uma das mais pesquisadas (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). ●- Logo, após a produção de O2 (em pH fisiológico) este é rapidamente convertido em H2O2 pela enzima superóxido dismutase (SOD), sendo que esta reação também ●- pode ocorrer, pela via não enzimática, em condições ácidas. Contudo, o O2 reage com o NO● para formar o ONOO-, um poderoso agente oxidante e nitrosativo ●- (ALMEIDA et al., 2009). Assim, mesmo o O2 sendo relativamente pouco reativo, seus metabólitos, HOO●, HO● e ONOO-, são altamente reativos e podem causar danos aos tecidos. Além disto, esse radical pode agir como redutor, doando um elétron para metais, que são catalisadores da oxidação lipídica e da reação de Fenton (VALKO et al., 2007).

O H2O2 é produzido em alta quantidade nos peroxissomas pela ação de diversas enzimas oxidases envolvidas no catabolismo de aminoácidos e na oxidação de ácidos graxos, e é degradado pela catalase e glutationa peroxidase (CHOE; MIN, 2006). Este é uma ROS que pode atuar como agente oxidante ou como agente redutor. Mesmo que sua reatividade seja baixa, este pode ser citotóxico em grandes

concentrações, ele está envolvido na produção do radical hidroxila. O H2O2 apresenta facilidade de difusão dentro e entre células e pode ser transformado em produtos altamente deletérios e reativos, como o HOCl (HALLIWELL;

GUTTERIDGE, 2007). O H2O2 é hidrossolúvel, e com isso, atravessa a membrana através de canais de água. Esta característica proporciona que ele alcance o núcleo e gere o HO● in situ, em razão dos metais de transição ligados ao DNA, levando a uma lesão da biomolécula (VALKO et al., 2006). A capacidade de desativar o H2O2 pode ser medida pelo monitoramento da oxidação da lucigenina induzida pelo H2O2 (RODRIGUES et al., 2012). Em geral, os ROO● e RO● são poderosos agentes oxidantes. Estes radicais possuem a capacidade de remover hidrogênio de outras moléculas, constituindo uma reação relevante na peroxidação lipídica (LAGUERRE et al., 2007). O ROO● é 1 gerado pela reação direta entre o O2 com o radical alquila na oxidação de ácidos graxos insaturados. Os ROO● produzem hidroperóxidos pela abstração de hidrogênio de outra molécula de ácido graxo. A maior parte dos hidroperóxidos é estável a temperatura ambiente, porém, aquecimento, luz UV ou metais de transição, aceleram a decomposição heterolítica de hidroperóxidos e, geram radicais peroxila. Além disto, o hidroperóxido pode sofrer decomposição homolítica, gerando novas espécies radicalares, como o RO● e o HO● que vão contribuir para que comecem novos processos de peroxidação (CHOE; MIN, 2006). A capacidade de desativar o ROO● pode ser medida pelo monitoramento do decaimento da fluorescência, devido à oxidação da fluoresceína induzida pelo ROO● (OU, HAMPSCH-WOODILL; PRIOR, 2001).

O HOCl é produzido enzimaticamente pela mieloperoxidase que utiliza o H2O2, gerado durante a explosão respiratória (burst respiratório), para catalisar a oxidação de dois elétrons do cloreto. O HOCl e sua base conjugada (-OCl) são fortes oxidantes que agem como agentes antimicrobianos. O HOCl é um componente chave da resposta inflamatória além de ser bactericida, porém, tem sido associado com diversas doenças humanas (PATTISON et al., 2009; PENNATHUR et al., 2010). O HOCl é permeável a membrana celular e capaz de gerar a oxidação e cloração de proteínas, lipídios e ácidos nucleicos nos tecidos do hospedeiro. Esta ROS oxida os grupos sulfidrila, ascorbato, NADPH e promove a cloração das bases do DNA. A

passagem do HOCl pelas membranas celulares causa danos nas proteínas e nos lipídios e se atingir o citoplasma, também reagirá com os constituintes celulares (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007; PENNATHUR, 2010). A capacidade de desativar o HOCl pode ser medida pelo monitoramento da oxidação da di- hidrorodamina 123 (DHR) para a rodamina 123 induzida pelo HOCl (RODRIGUES et al., 2012). Em várias condições patológicas (inflamações, septicemia e isquemia), as células ● ● do sistema imunológico geram ambos radicais O2 - e NO por meio do processo oxidativo, nomeado explosão respiratória (burst respiratório), desencadeado durante ● ● o processo inflamatório. Sob estas condições, o O2 - e o NO podem reagir rapidamente para produzir quantidades significativas de uma molécula muito mais reativa, o ONOO-. Este é um forte agente oxidante que pode levar a oxidação e nitração de lipídios, fragmentação do DNA, nitração de resíduos de aminoácidos de proteínas, assim como a oxidação de cisteína, metionina e outros resíduos. Dessa forma, a toxicidade do NO● está majoritariamente ligada a sua capacidade de reagir ● com o O2 - (VALKO et al., 2007; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). A surpreendente estabilidade do ONOO- colabora para sua toxicidade, pois possibilita sua difusão para longe do seu sítio de formação, permitindo que reaja seletivamente com diferentes componentes celulares (BECKMAN et al., 1994). A capacidade de desativar o ONOO- pode ser medida pelo monitoramento da oxidação da DHR para a rodamina 123 induzida pelo ONOO- (RODRIGUES et al., 2012).

Métodos de extração para compostos fenólicos e antocianinas

Compostos Fenólicos

Sabe-se que a vasta variedade estrutural, alta reatividade, capacidade de formar complexos insolúveis com proteínas e carboidratos, susceptibilidade a ação de enzimas são alguns dos fatores que devem ser considerados durante a extração, separação, identificação e quantificação de compostos fenólicos em alimentos. Além do mais, interferentes como ceras, lipídios, terpenos e outros pigmentos como clorofilas e carotenoides complicam sua extração e purificação. Devido a esses

motivos, vários métodos são apresentados para a extração de todos ou de uma classe específica de compostos fenólicos presentes nos alimentos (NACZK; SHAHIDI, 2006). O preparo da amostra é um fator de alto impacto sobre a eficácia da extração. A estabilização através do congelamento e da liofilização são recursos abrangentemente utilizados para a preservação da amostra no período que antecede à análise, principalmente no caso de frutas vermelhas (LAGO-VANZELA et al., 2011; HE et al., 2012). A trituração, ou seja, diminuição do tamanho das partículas da amostra é uma medida que aumenta a superfície de contato entre amostra e solvente facilitando a extração e a reprodução do método. Todos os métodos de extração e seus respectivos solventes tentam obter um extrato com alta concentração de compostos fenólicos, para aquisição de um produto destinado a alimentação humana e com grande valor agregado. Eles são geralmente extraídos por solventes como água, metanol, etanol e acetona ou uma mistura desses, uma vez que as moléculas glicosiladas são mais solúveis em água e as agliconas que são pouco polares, mais solúveis em solventes de baixa polaridade. A combinação de vários solventes é útil para obter a vantagem da especificidade de cada um e, com isto, aumentar o rendimento da extração (ESCRIBANO-BAILÓN; SANTOS-BUELGA, 2003). Simões et al. (1999) sugerem a extração dividida em etapas, a qual explora a troca de solventes em cada extração, de acordo com a polaridade de cada solvente. A sequência de solventes propostas se baseia em uma polaridade crescente dos mesmos. São bem conhecidas a extração líquido-líquido (LLE), extração sólido- líquido (SLE), para matrizes sólidas, e a extração em fase sólida (SPE). O método de SPE normalmente é realizado após a LLE ou SLE (DOPICO-GARCÍA et al., 2007; LEE et al., 2007). Existem outros métodos de extração para os compostos fenólicos como, extração por mesa de agitação, realizada a 30 0C (SANTOS et al., 2010) e a extração por soxhlet (SANTOS et al., 2010). Há também outros métodos de extração como o descrito por Scherer; Godoy (2009), na qual as amostras são diluídas em metanol 100% e submetidas à agitação por 180 min., em seguida, são filtradas e concentradas em rota-evaporador (38 0C) até secagem total.

O método de extração de compostos fenólicos através do ultrassom tem grande potencial de extração, pois facilita a liberação dos compostos extraíveis, aumenta o transporte contínuo dos solventes para os compostos alvos das células vegetais, principalmente nos primeiros minutos, aumentando o rendimento da extração (ZHANG et al., 2009; MORELLI; PRADO, 2012). Além de ser uma alternativa simples, eficiente e economicamente vantajosa, ele promove grande liberação dos compostos fenólicos ou pelo menos, uma vez que estes estão inseridos em estruturas celulares de difícil acesso, a frequência do ultrassom pode romper a membrana da célula ou da matriz, facilitando assim a extração (CORRALES et al., 2009; MORELLI; PRADO, 2012). Contudo, o solvente preferencialmente utilizado para o método de extração por ultrassom é o etanol por ser menos tóxico (SANTOS et al., 2010). É importante mencionar que para fins alimentícios é preferível etanol como solvente, pelo fato de ser considerado GRAS (geralmente reconhecido como seguro) entre outros benefícios. Neste caso é evitada a utilização de acetona e de metanol por serem tóxicos (SANTOS et al., 2010). Neste sentido algumas técnicas adotam o etanol no lugar do metanol, isso é fortemente recomendado especialmente quando a extração possui finalidade alimentícia. Além disso, ele melhora a eficiência da extração, segundo alguns autores que substituíram o metanol por etanol na análise de fenólicos (WANG, 2008; VIROT et al., 2009). Na literatura são encontrados alguns métodos de extração para os compostos fenólicos da jabuticaba. No trabalho de Wu et al. (2012), o método utilizado foi, o de homogeneizar com solvente (70% (v/v) metanol) o pó da jabuticaba liofilizada em liquidificador. Após este processo o extrato obtido foi colocado em ultrassom por 30 min, filtrado e reextraido o bagaço, mais duas vezes. O mesmo trabalho realizou outro método de extração, sendo que neste a jabuticaba foi macerada em metanol 100% e deixada macerando por uma semana no escuro, sendo que após este período, o extrato foi filtrado. Alezandro et al. (2013), obteve o extrato da jabuticaba da seguinte forma, extraiu três vezes o pó da jabuticaba liofilizada, utilizando como solvente metanol e água (70:30, v/v) e a solução foi homogeneizada e filtrada.

Antocianinas

As antocianinas são hidrossolúveis e estáveis em condições ácidas. Nos vegetais e frutas in natura, encontram-se no interior dos vacúolos celulares com valores de pH de 3 à 5 e misturadas a íons inorgânicos e outros compostos fenólicos (BROUILLARD et al., 2010). A possibilidade de ligação desses compostos com açúcares e outros ácidos fenólicos tem efeito direto na solubilidade em água, com aumento nos casos de glicosilação e redução devido à acilações (GIUSTI; JING, 2008). Devido a isto existem vários métodos de extração para as antocianinas, vários solventes com alto poder de extração, metanol (BORGES et al., 2009; LAGO- VANZELA et al., 2011; ZHENG et al., 2012), etanol (KRAFT et al., 2008; PERESTRELO et al., 2012; VAGIRI et al., 2012), acetona, água e suas combinações (LÄTTI et al., 2008; AABY et al., 2012; GAVRILOVA et al., 2011) são os mais utilizados em vários metodos de extração. Na maioria das vezes é realizada a extração em meio ácido, para manter o cátion flavilium (LEE; HONG, 1992). Porém dependendo da finalidade da extração são preferíveis alguns solventes. Para fins alimentícios é preferível, o etanol, pelo fato de ser considerado GRAS, entre outros benefícios e, neste caso é evitada a utilização da acetona e do metanol por serem tóxicos (SANTOS et al., 2010). Para se obter uma extração eficiente, deve-se otimizar a extração das antocianinas, resultando em mínima degradação das mesmas, gerando um extrato com alta atividade antioxidante, utilizando tecnologia limpa e matéria-prima de baixo custo (SANTOS et al., 2010). Recentemente, foi demonstrada a redução na concentração final de antocianinas extraídas de morango e o desaparecimento de estruturas aciladas quando extraídas utilizando metanol com 5% de ácido fórmico. Porém, rendimentos maiores foram obtidos nas extrações com solventes (metanol ou acetona) e pequenas quantidades de ácido (0,5 e 2%) (KAJDZANOSKA et al., 2011). Neste sentido, a utilização de solventes neutros ou com concentrações reduzidas de ácidos orgânicos são alternativas sugeridas para evitar esses problemas (DOWNEY et al., 2007; KAJDZANOSKA et al., 2011).

A acidificação do meio a valores de pH iguais ou menores que 2 é uma das medidas adotadas para facilitar a remoção e estabilidade das antocianinas. Durante a extração, o solvente acidificado, normalmente metanol, destrói as membranas celulares dissolvendo os compostos a serem extraídos. Em meio ácido, a formação do cátion flavilium é favorecida, colaborando para estabilização dos pigmentos, uma mudança no valor de pH igual ou inferior a 2, resulta em aumento da concentração das antocianinas totais (VADULGA et al., 2008). Porém, nessas condições podem ocorrer mudanças na forma nativa dos compostos com liberação de açúcares, grupos acil ou destruição de co-pigmentos (NACZK; SHAHIDI, 2006; GIUSTI; JING, 2008). O preparo de amostras utilizando nitrogênio durante pulverização, extração exaustiva com acetona acidificada e, partição em clorofórmio, é a metodologia de preparo de amostras e de extração proposta pelo trabalho de Rodriguez-Saona; Wrolstad (2001). Esse método possibilita a obtenção de um extrato final parcialmente purificado e concentrado. Contudo, o tempo total para a realização do método é longo e grandes quantidades de solventes orgânicos são utilizados (DUAN et al., 2011; LIMA et al., 2011). Com o enfoque de melhorar cada vez mais a extração de compostos como, as antocianinas, surgiram vários métodos de extração, como a extração com soxhlet (SANTOS et al., 2010). Um dos métodos utilizados atualmente é a extração em fase sólida (SPE) que utilizam cartuchos C18 e Sephadex e extração assistida por ultrassom, sendo que o melhor método de extração para as antocianinas da jabuticaba testado por Santos et al. (2010) foi a extração por mesa de agitação realizada a 30 0C, utilizando etanol como solvente, com tempo de extração de 2 horas (RIJKE et al., 2006; SANTOS et al., 2010). No trabalho de Wu et al. (2012) o método utilizado para extração das antocianinas da jabuticaba foi, homogeneizar com solvente (70% (v/v) metanol) o pó da jabuticaba liofilizada em liquidificador, após este processo colocar o extrato obtido em ultrassom por 30 min, filtrar e reextrair o bagaço mais duas vezes. O mesmo trabalho realizou outro método de extração, sendo que neste a jabuticaba foi macerada em metanol 100% e deixada macerando por uma semana no escuro, após este período o extrato foi filtrado. Alezandro et al. (2013), obteve o extrato da

jabuticaba da seguinte forma, extraiu três vezes o pó da jabuticaba liofilizada, utilizado como solvente metanol/água/ácido acético (70:30:0,5 v/v), a solução foi homogeneizada e filtrada. Muitos estudos foram realizados para a otimização do processo de extração com solventes (POMPEU et al., 2009; MONRAD et al., 2012) e com a utilização de alternativas mais recentes, como o uso do ultrassom e mesa de agitação (CHEN et al., 2007; GHAFOOR et al., 2009). Estas pesquisas utilizaram planejamento experimental fatorial, como o delineamento experimental composto central (DCC), o qual possibilita o estudo das variáveis de extração simultaneamente. Desta forma, além da avaliação de cada variável individualmente, é possível também a determinação de possíveis efeitos sinérgicos e antagônicos resultantes de interações entre as variáveis estudadas (FERREIRA et al., 2007).

Purificação, Identificação e Quantificação dos compostos fenólicos e antocianinas

Após o procedimento de extração, processos como o de purificação e fracionamento podem ser empregados para a remoção de interferentes ou para a obtenção de frações com características estruturais e químicas comuns. Em alguns casos o fracionamento com solventes é utilizado almejando à purificação ou a separação de uma ou mais classes de compostos como etapa necessária no processo de identificação. Mertz et al. (2007) realizou em seu trabalho extração dos compostos fenólicos para posterior análise em HPLC-MS, utilizando como solvente acetona 70% acidificada com 2% de ácido fórmico. Após isto, realizou o fracionamento com acetato de etila, buscando à separação de compostos minoritários. Com isso, nos extratos iniciais de amora-preta foram separados e identificados cinco compostos majoritários, sendo dois elagitaninos e três antocianinas, e cerca de 40 diferentes compostos fenólicos na fração de acetato de etila. A separação (purificação) dos extratos pode ser feita pela LLE, também pode ser efetuada utilizando cromatografia em coluna aberta, SPE ou utilizando métodos mais

modernos com o emprego de equipamentos de HPLC com coletor de frações (GIUSTI; JING, 2008). A purificação dos extratos através da SPE é um método versátil, por causa da variedade de resinas disponíveis, o que permite a remoção de interferentes com separação de frações de diferentes composições (GIUSTI; JING, 2008). Buscando a obtenção de frações de antocianinas de alta pureza, He; Giusti (2010) desenvolveram um método de purificação utilizando cartucho de modo misto com troca iônica e C-18. O método demonstrou maior pureza quando comparado com outras resinas largamente utilizadas como os cartuchos de C-18 para 11 das 12 fontes de antocianinas pesquisadas. Os valores de pureza encontrados variaram de 85,6 a 99,9% para a metodologia realizada com a resina de modo misto e de 47 a 99,2% com C-18 somente. As metodologias espectrofotométricas disponíveis para a determinação de compostos fenólicos em alimentos, podem ser definidas como análises de quantificação do teor total de compostos fenólicos como um único grupo. Podem ainda ser métodos voltados para uma classe específica, como o teste de determinação do teor de antocianinas (GIUSTI; WROLSTAD, 2001) e o teste da Vanilina, para determinação de taninos condensados (GOLDESTEIN; SWAIN,1963). É de suma importância a quantificação das antocianinas. Para extratos contendo mistura das mesmas, as medidas de absorbância realizadas em um único valor de pH são equivalentes ao total das antocianinas. Porém, esses métodos sofrem interferências, portanto não podem ser usados na presença de produtos escuros, originados da degradação de açúcares ou da própria antocianina (JACKMAN; SMITH, 1996). Por isso, os métodos indiretos subtrativos ou diferenciais são uma boa opção para a determinação da concentração deste composto (WROLSTAD, 1976). Os métodos espectrofotométricos utilizados para quantificação das antocianinas em frutas apresentam bom desempenho, rapidez, baixo custo, além de não necessitarem do uso de padrões (WROLSTAD et al., 1995). O método do pH diferencial é amplamente utilizado na determinação espectrofotométrica do teor total de antocianinas e foi introduzido por Fuleki; Francis (1968) e melhorado por Sondheirmer; Kertsz (1948). Essa metodologia se baseia nas mudanças estruturais do cromóforo em função do pH, comportamento

característico das antocianinas e amplamente descrito na literatura (GIUSTI; JING, 2008; BROUILLARD et al., 2010). Segundo Wrolstad et al. (1995) este método permite exatidão e rapidez nas medidas de antocianinas monomericas totais (WROLSTAD et al., 1995; JACKMAN; SMITH, 1996). Este método realiza a media da solução em dois pH diferentes, ou seja, em condição ácida (pH 1,0) ocorre predomínio de formas estruturais intactas de intensa coloração (cátion flavílium) e em condição alcalina (pH 4,5) a formações de estruturas incolores (hemicetais). A quantificação é feita medindo os extratos nas duas condições em 520 nm, comprimento de onda de máxima absorbância e em 700 nm, para a eliminação da influência de interferentes nas leituras (GIUSTI; WROLSTAD, 2001). A cianidina-3- glicosídeo é utilizada como forma de expressão dos resultados para o método do pH diferencial, devido à presença desta em praticamente todas as frutas vermelhas (BROUILLARD, 1982). Os métodos substrativos consistem na mudança de absorbância da amostra, no comprimento de onda de máxima absorbância, após branqueamento com sulfito de sódio (FRANCIS, 1982; JACKMAN; SMITH, 1996). No trabalho realizado por Teixeira et al. (2008) o extrato da jabuticaba apresentou diferença (p<0,05) entre o método do pH único e pH diferencial. Os resultados mostram que o método do pH único estimou teor inferior ao estimado pelo método de pH diferencial, o que sugere que o método do pH diferencial é melhor para a quantificação das antocianinas monoméricas totais da jabuticaba. Os compostos fenólicos podem ser quantificados através de vários métodos, colorimétricos ou enzimáticos (BEER et al., 2003). Eles podem ter sua concentração e perfil avaliados através das técnicas de HPLC e eletroforese capilar (CE) (STALIKAS, 2007). Entre os métodos colorimétricos estão o teste de Folin-Denis onde a redução do reagente pelos compostos fenólicos das amostras com intensa cor azul é lida espectrofotometricamente em comprimento de onda de 760 nm, usando ácido tânico como padrão (DESHPANDE et al., 1986), Folin-Ciocalteu (é o mais empregado) sendo o resultado expresso em equivalente de ácido gálico (BRAVO et al., 2006; VAQUEIRO et al., 2007; PAIXÃO et al., 2007). Esta técnica consiste em uma mistura dos ácidos fosfomolibídico e fosfotungstico, na qual o molibdênio se encontra no

estado de oxidação possuindo cor amarela, porém, em presença de certos agentes redutores, como os compostos fenólicos, formam-se os chamados complexos molibdênio-tungstênio azuis, nos quais o número de oxidação dos metais está entre cinco e seis, e cuja coloração, permite a determinação da concentração das substâncias redutoras (SINGLETON et al., 1999; HUANG et al., 2005). As metodologias descritas acima são exemplos dos métodos mais empregados para a determinação de fenólicos totais. Apesar de pouco específicas, são muito empregadas (ABDILE et al., 2005; FU et al., 2011;), porque fornecem informações iniciais importantes na caracterização das amostras e na determinação de sua atividade antioxidante. A cromatografia é utilizada tanto no preparo de amostras, buscando o isolamento de um grupo em específico, como na análise dos compostos fenólicos. A técnica mais empregada é a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD). A definição das estruturas tem sido efetuada por meio da combinação com a (MS) e outras técnicas hifenadas relevantes como espectrometria de ressonância magnética nuclear (NMR) (VALLS et al., 2009; DAÍ; MUMPER, 2010). Os compostos fenólicos e as antocianinas apresentam identificação complexa, devida principalmente à variedade estrutural, e os poucos padrões disponíveis, para a maioria dos compostos. Porém, atualmente, o HPLC-MS se tornou o método padrão, mais eficiente na identificação desses compostos. Várias tecnologias de ionização já foram desenvolvidas incluindo a espectrometria com ionização por elétrons (EI), por eletrospray (ESI), ionização química à pressão atmosférica (APCI) e ionização a laser (MALDI) (WU; PRIOR, 2005; NACZK; SHAHIDI, 2006). Sendo que, a ionização por eletrospray é o método mais utilizado, em modo positivo para análise de antocianinas, e em modo negativo, para outros compostos fenólicos (VALLS et al., 2009). O emprego das colunas de fase reversa e sistema de fase móvel composta por solvente aquoso acidificado e solventes orgânico, normalmente metanol ou acetonitrila, são condições largamente utilizadas para análise de antocianinas e compostos fenólicos por HPLC-DAD-MS. Os ácidos mais usuais são o ácido fórmico e acético em concentrações que variam de 0,01 à 5%, sendo recomendado o uso de

concentrações de até 1% para análise em espectrometria de massas. Contudo, valores maiores geralmente são empregados para a separação de antocianinas devido a melhor resolução de picos e ionização (VALLS et al., 2009). Taninos hidrolisáveis também requerem acidificação da fase móvel, em menores concentrações do que as utilizadas em análise de antocianinas, sendo o ácido acético o mais apropriado devido à alta volatilidade e menor supressão iônica (ARAPITSAS, 2012). A identificação de compostos fenólicos é efetuada, normalmente, pela combinação de informações obtidas durante a separação cromatográfica e detecção. Dessa forma, a ordem de eluição, o espectro de DAD, o padrão de fragmentação obtido por espectrometria de massas e quando possível, a comparação com padrões, e com dados da literatura, devem formar um conjunto de dados lógicos que indicam uma provável identificação. Mesmo assim, em caso de isômeros estruturais a confirmação de estruturas inéditas o uso de RMN se faz necessário (WU; PRIOR, 2005; VALLS et al., 2009). A classificação dos compostos baseados em suas características espectrais na região do UV-visível foi apresentado por Mӓӓttӓ et al. (2003) como medida inicial na identificação de compostos fenólicos. As antocianinas possuem absorbância máxima ao redor de 520 nm com deslocamentos desse valor dependendo do grau de hidroxilação e metilação da estrutura central, o cátium flavílium. Além do mais, padrões de glicosilação e acilação normalmente geram características marcantes no espectro de DAD que auxiliam na identificação e confirmação estrutural em conjunto com as informações obtidas pelo espectro de massas e ordem de eluição. Sendo assim, em colunas de fase reversa (C-18) a retenção de antocianinas é determinada pelo número de hidroxilas e metoxilas da parte aglicona da estrutura (delfinidina < cianidina < petunidina < pelargonidina < peonidina < malvidina) e do padrão de glicosilação e acilação (diglicosídeos < monoglicosídeos < acetilglicosídeos < caffeoil-glicosídeos < coumaroil glicosídeos) (GIUSTI; JING, 2008; VALLS et al., 2009).

Câncer

Câncer é o nome dado a um grupo de mais de cem diferentes tipos de doenças, que têm em comum, o crescimento desordenado de células anormais com potencial invasivo. Além do mais, sua origem se dá por condições multifatoriais. Esses fatores causais podem agir em conjunto ou em sequência para iniciar ou promover o câncer (carcinogênese) (INCA, 2014). A carcinogênese é dividida em três estágios: iniciação, promoção e progressão. A iniciação envolve ligação e dano direto ao DNA por meio dos agentes carcinogênicos, sendo rápida e irreversível, ou seja, os genes sofrem ação dos agentes cancerígenos. A promoção compreende mecanismos epigenéticos e leva à pré-malignidade, sendo também um processo irreversível, de maneira simplificada os agentes oncopromotores atuam na célula já alterada. A progressão ocorre devido a mecanismos genéticos e é o período entre pré-malignidade e o câncer, também sendo geralmente irreversível, ou seja, caracterizado pela multiplicação descontrolada e irreversível da célula (TSAO et al., 2004; INCA, 2011). Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS), anualmente surgem mais de dez milhões de novos casos de câncer com cerca de oito milhões de mortes, resultando na segunda causa de morte, em países desenvolvidos, sendo superada apenas pelas doenças cardiovasculares (JEMAL et al., 2009; RUZZA; QUINTIERI, 2009). Para o ano 2030, estima-se que a carga global de novos casos de câncer será de 21,4 milhões, e com 13,2 milhões de mortes por esta doença. Isso ocorrerá em consequência do crescimento da população, bem como da redução na mortalidade infantil, e nas mortes por doenças infecciosas em países em desenvolvimento, também em decorrência do aumento da expectativa de vida da população, pois o aparecimento dessa patologia é favorecido pelo envelhecimento do organismo (FERLAY et al., 2007; INCA, 2014). São conhecidas mais de cem tipos de neoplasias, determinadas pela etiologia, processo de evolução e forma de tratamento. Entre os vários tipos, os com maior índice de mortalidade continuam sendo as neoplasias malignas de pulmão, brônquio, próstata, mama, cólon e reto (JEMAL et al., 2009).

O câncer de próstata (depois dos tumores de pele não melanoma) é o mais incidente entre os homens em todas as regiões do país, com 91,24/ 100 mil no Sul, 88,06/ 100 mil no Sudeste, 62,55/ 100 mil no Centro-Oeste, 47,46/ 100 mil no Nordeste e 30,16/ 100 mil no Norte (INCA, 2014). Uma das últimas estimativas mundiais mostrou que cerca de 1,1 milhão de novos casos de câncer de próstata no ano de 2012. Aproximadamente 70% dos casos diagnosticados no mundo ocorrem em países desenvolvidos. As maiores taxas de incidência foram observadas na Austrália/ Nova Zelândia, Europa Ocidental e América do Norte. Esse aumento pode ser reflexo, em grande parte, da maior facilidade para diagnosticar esta doença atualmente (INCA, 2014). O único fator de risco bem estabelecido para o desenvolvimento do câncer de próstata é a idade. Aproximadamente 62% dos casos diagnosticados no mundo ocorrem em homens com 65 anos ou mais. Com o aumento da expectativa de vida mundial, foi observado que o número de novos casos de carcinoma de próstata aumentaram aproximadamente 60% até o momento. Além do mais, a etnia e o histórico familiar da doença também são consideradas fatores de risco. O câncer de próstata é em torno de duas vezes mais frequente em homens negros se comparados aos brancos. Os estadunidenses, jamaicanos e caribenhos com ascendência africana apresentam as mais altas taxas de incidência do câncer de próstata do mundo, o que pode ser atribuído, em parte, à hereditariedade (cerca de 5% a 10%) (INCA, 2014). Considera-se o câncer de próstata uma doença da terceira idade, uma vez que cerca de três quartos dos casos em todo o mundo ocorrem a partir dos 65 anos de idade (INCA, 2014). Menos de 1% dos casos acometem indivíduos com menos de 40 anos de idade (JEMAL et al., 2003; PAIVA et al., 2010). Acredita-se que, a exemplo de outros tipos de tumor, fatores genéticos, hereditários, hormonais, fatores de crescimento, exposição ambiental, ocupacional, alterações em genes somáticos e comportamento dietético estejam relacionados ao desenvolvimento deste tipo de câncer (METTLIN et al., 1997; PAIVA et al., 2010 ). O longo tempo de latência do câncer de próstata oferece uma "ampla janela" de oportunidade para intervenção quimiopreventiva por agentes dietéticos como, por exemplo, alimentos que contenham compostos antioxidantes (GUNDALA et al., 2014).

O câncer de mama também será abordado, pois este é o de maior ocorrência em mulheres de todo o mundo, tanto em países em desenvolvimento, quanto em países desenvolvidos. Aproximadamente 1,67 milhões de novos casos dessa neoplasia ocorreram no ano de 2012, em todo o mundo, o que representa 25% de todos os tipos de câncer diagnosticados nas mulheres. Suas taxas de incidência variam entre as diferentes regiões do mundo, com as taxas mais elevadas em 2012 na Europa Ocidental (96/ 100 mil) e as menores taxas na África Central e na Ásia Oriental (27/ 100 mil) (INCA, 2014). No Brasil o câncer de mama (depois dos tumores de pele não melanoma) é o mais frequente nas mulheres das regiões Sudeste (71,18/ 100 mil), Sul (70,98/ 100 mil), Centro-Oeste (51,30/ 100 mil) e Nordeste (36,74/ 100 mil). Na região Norte, é o segundo tumor mais incidente (21,29/ 100 mil) (INCA, 2014). Nos últimos 40 anos, a sobrevida vem aumentando nos países desenvolvidos. Atualmente, é de 85%, enquanto, nos países em desenvolvimento, permanece com valores entre 50% e 60%. Este tipo de neoplasia é a maior causa de morte por câncer nas mulheres em todo o mundo, com cerca de 520 mil mortes estimadas no ano de 2012. É a segunda causa de morte por câncer nos países desenvolvidos, atrás somente do câncer de pulmão, e a maior causa de morte por câncer nos países em desenvolvimento (INCA, 2014). A prevenção primária dessa neoplasia é um campo de pesquisa e de intervenções bastante promissor. Cerca de 30% dos casos desta doença podem ser evitados por medidas como uma alimentação saudável, prática de atividade física regular e manutenção do peso ideal (INCA, 2014).

Tabela 1. Foram estimados no ano de 2014 as taxas brutas e de incidência por 100 habitantes e do número de casos novos de câncer, segundo sexo e localização primária. Localização Estimativa de casos novos primaria da Homens Mulheres neoplasia Estados Capitais Estados Capitais maligna Casos Taxa Casos Taxa Casos Taxa Casos Taxa bruta bruta bruta bruta Próstata 68.80 70,42 17.54 82,93 - - - - Mama feminina - - - - 57.12 56,12 19.17 80,67 Fonte: (INCA, 2014).

Células neoplásicas caracterizam-se por ignorar os sinais externos e internos que regulam a proliferação celular, perdem o controle dos processos de apoptose e diferenciação, são geralmente instáveis, deficientes no reparo de danos no DNA e, na correção de erros de replicação, tendendo a acumular mutações. São invasivas, sobrevivendo e proliferando em novos ambientes, produzindo metástases e angiogênese sustentada (capacidade de formação de novos vasos sanguíneos para suprimento próprio e permanente) (ALBERTS et al., 2008; LUO, 2009; INCA, 2014). Já, as células normais são perfeitamente sintonizadas com o ambiente em que elas se encontram, respondem aos sinais dos reguladores externos, que podem estimular ou inibir a proliferação celular (FADEEL; ORRENIUS, 2005; ALBERTS et al., 2008; INCA, 2014 ). Um mecanismo anticâncer muito pesquisado é a indução seletiva da apoptose, levando apenas células malignas à morte (SUBHASHINI et al., 2005). A apoptose tem um papel fundamental na determinação do crescimento tumoral e sua agressividade. Neste sentido, é considerada um mecanismo celular intrínseco e regulado, por meio do qual há um controle entre a produção de novas células e a capacidade individual das mesmas, em se autodestruírem (TERZIAN et al., 2007; DUARTE, 2010). O controle e o tratamento do câncer, têm apontado para a busca de novas diretrizes, voltadas para o aprimoramento e, a melhoria de terapias não

convencionais. As descobertas de novas drogas anticâncer de origem vegetal, impulsionam os estudos nesta área, sendo que de todos os fármacos antitumorais disponíveis entre 1940 e 2002, 40% foram originados de produtos naturais ou semissintéticos (BUTLER, 2004). A Organização Mundial de Saúde define planta medicinal como sendo “todo e qualquer vegetal que possui, em um ou mais órgãos, substâncias que possam ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos semissintéticos” (WHO, 1998; OMS, 2002). Aproximadamente 60% dos quimioterápicos são produtos naturais ou derivados desses (CRAGG; NEWMAN, 2009). A busca contínua por novos compostos anticancerígenos em plantas medicinais e alimentos tradicionais é uma estratégia realista e promissora (HU et al., 2009).

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CHAPTER 2

ARTICLE

Optimizing the extraction of anthocyanins and phenolic compounds from skins and seeds of jabuticaba fruits (Myrciaria jabuticaba (Vell.) O. Berg) with ternary mixture experimental designs

Chapter 2

Optimizing the extraction of anthocyanins and phenolic compounds from skins and seeds of jabuticaba fruits (Myrciaria jabuticaba (Vell.) O. Berg) with ternary mixture experimental designs

Michelly Cristiane Paludo1 • Ronan Carlos Colombo2 • Isidro Hermosín-Gutiérrez3 • Cristiano Augusto Ballus4 • Helena Teixeira Godoy1

1Department of Food Science, Faculty of Food Engineering, University of Campinas (UNICAMP), Rua Monteiro Lobato 80, 13083-862, Campinas, SP, Brazil 2Agricultural Research Center, Londrina State University, Celso Garcia Cid Road, km 380, P.O. Box 10.011, 86057-970, Londrina, Paraná, Brazil 3Instituto Regional de Investigación Científica Aplicada, Universidad de Castilla-La Mancha, Campus Universitario s/n, 13071 Ciudad Real, Spain 4Department of Food Science and Technology, Center for Agrarian Sciences, Federal University of Santa Maria, Avenida Roraima 1000, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil

* Corresponding author. Phone: +55 19 3521 4024 E-mail address: [email protected]

*This manuscript was submitted to the journal “Food Analytical Methods”.

Abstract Jabuticaba is a Brazilian fruit that is rich in phenolic compounds, mainly anthocyanins. Thus, the extraction of the total phenolic compounds (TPC) of the seed and the total monomeric anthocyanins (TMA) of the skins in ‘Sabará’ jabuticaba was optimized with a simplex lattice design for solvent mixing, and the extraction time was optimized by univariate design. The optimum conditions for the extraction method were ethanol:water (60:40 v/v) solvent for TPC and methanol:water:acetic acid (80:20:0.5 v/v/v) solvent for TMA. For both compound groups, the optimum extraction time was 30 min. The TMA yield for the bark of the Sabará

variety was 1172.16 mg cyanidin-3-glycoside equivalents from a 100 g-1 freeze-dried sample, and for TPC of seed, it was 86.50 mg gallic acid equivalents per 1 g lyophilized sample. The optimized extraction method proved to be extremely fast, simple, and inexpensive and to have excellent extraction performance. Thus, this method was also applied to study the TMA and TPC contents in five other varieties of jabuticaba.

Key words: Myrciaria ssp.; total monomeric anthocyanins; phenolic compounds; experimental design; optimization.

Introduction Jabuticaba is commonly found in Mata Atlântica, a Brazilian biome, but it can grow in a large variety of soils and environmental conditions (Silva, 2001). Due to the high yields, rusticity, high commercial value of fresh fruits and use in prepared juices, jellies, and other products, jabuticaba has aroused the interest of farmers (Abe et al., 2012). Jabuticaba fruit consists of a subgloboid-berry covered by a smooth and light dark-purple or black skin with one to four seeds in the flesh (Leite-Legatti et al., 2012; Silva, 2010). In addition, the fruit is rich in phenolic compounds that are found mainly in the skin (Lima et al., 2008). A progressive interest in studying the phenolic compound activity, especially the anthocyanins, in small fruits extracts has increased due to the positive correlation between consuming these fruits and decreases in cardiovascular problems (Xie et al., 2012) and other chronic diseases (Szajdek & Borowska, 2008). These compounds can act like primary antioxidants, reacting directly with free radicals and giving way to a less reactive radicals than the initial free radical, or they can act as secondary antioxidants, restoring or enhancing other antioxidant systems (Gorinstein et al., 2000). The anthocyanins are among the most well-known natural pigments and are functional compounds that add value to food (Prata et al., 2010). Additionally, they can be used as substitutes for synthetic food colouring in the food industry (Buchweitz et al., 2013). Anthocyanins exhibit numerous biological activities, including anti-inflammatory (Youdim et al., 2002), anti-cancer (Hou, 2003), anti-mutagenic (Peterson & Dwyer, 1998), chemopreventive (Zhao et al., 2004), and antiviral activity (Kapadia et al., 1997), among others.

Several methods of extraction for phenolic compounds, including anthocyanins, are found in the literature (Zhang et al., 2008), along with optimization of their extraction (Zou et al., 2011). However, few studies have focused specifically on optimizing the extraction of total phenolic compounds (TPC) of the jabuticaba seed and total monomeric anthocyanins (TMA) of the jabuticaba skin. Moreover, the great majority of the studies are based on the skin, and we only found one study that optimized the TPC extraction of the jabuticaba seed (Hacke et al., 2016). The available protocols for these purposes, even those that approached the optimization of the extraction method, require very long extraction times and processes not accessible to all laboratories. It is known that the extraction stage of matrix compounds is one of the most important phases in the food analysis process because it is always preferable to extract the compounds of interest as selectively and exhaustively as possible (Daí & Mumper, 2010). Thus, the use of experimental planning makes it possible to study extraction variables simultaneously. In addition, besides evaluating each individual variable, it is also possible to determine some synergistic and antagonistic effects resulting from the interactions among the studied variables (Ferreira et al., 2007). Keeping in mind that jabuticaba has high levels of phenolic compounds, especially anthocyanins, and that these compounds have beneficial effects, it is very important to develop a fast, simple, cheap and efficient method to extract these compounds. Thus, this study aimed to optimize the extraction method for TPC from seeds and TMA from the skin of the ‘Sabará’ jabuticaba by multivariate experimental design with easily accessible solvents and simple methods. The optimized methods were applied to five more jabuticaba varieties.

Material and Methods

Samples ‘Sabará’ (Myrciaria jaboticaba (Vell.) O. Berg) (SF) and ‘Paulista’ (Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg) (PF) jabuticaba samples were provided by Faggan Farmers Group, located in Lagoa Branca, São Paulo (21°46'26" S, 47°05'11" W and 684 m of elevation) in October 2014 and 2015. Other samples of ‘Sabará’ (Myrciaria jaboticaba (Vell.) O. Berg) (SFP), ‘Coroada’ (Myrciaria coronata Mattos) (CFP), ‘Híbrida’ (Myrciaria cauliflora (DC.)

O. Berg) (HFP) and ‘Pintada’ (Plinia ssp.) (PFP) jabuticabas, were provided by F.P. Frutas e Plantas, located in Araçoiaba da Serra, São Paulo, (23°30'19" S, 47°36'51" W and 625 m of elevation) in October 2014 and 2015. Fruits samples were hand-processed to separate seeds and skins, which were frozen at -22 °C, freeze-dried, vacuum-packed and stored at -22 °C. The freeze-dried samples were ground to a fine and homogeneous powder to be used to prepare the extracts.

Initial extraction procedure The extraction was made according to Alezandro et al. (2013), with some modifications. Fifty mL of extraction solvent ethanol:water (70:30, v/v) was added to 0.5 g of freeze-dried skin and seed samples. The mixture was shaken for two hours in a shaking water bath at 30 °C, filtered in Whatman paper n°. 1, and re-extracted two times more under the same conditions using 25 + 25 mL of extraction solvent ethanol:water (70:30, v/v). Skin samples that contain anthocyanins were submitted to the same procedures described above, but the extraction solvent was methanol:water:acetic acid (70:30:0,5, v/v/v). The extracts obtained in the three extractions were combined, taken to a volume of 100 mL in a volumetric flask, and analysed for total phenolic compounds (TPC) and total monomeric anthocyanins (TPC) using the methods described in sections Skin TMA of five jabuticaba varieties and Seed TPC of five jabuticaba varieties. Three independent replicates were performed, which were analysed in triplicate.

Extraction optimization of TMA from skins and TPC from seeds in ‘Sabará’ jabuticaba

Evaluation of solvent effects by simplex lattice design (SLD) The efficiency of the extraction with different proportions of solvents was studied aiming to determine the combination that produced more efficient extraction. It was chosen to work with methanol, ethanol and water solvent mixtures to extract TPC from the jabuticaba seed and TMA from the jabuticaba skin because these solvents have been show to produce efficient extraction, as demonstrated by Aaby et al. (2012); Escribano-Bailón & Santos- Buelga (2003); Vagiri et al. (2012); Zheng et al. (2012), and are accessible to all research laboratories.

The multivariate statistical technique for optimization of mixtures, simplex centroid design with axial points, allows analysis of all proportions of solvents (0 - 100%) using a reduced number of experiments. In addition, it allows examination of possible interactions between the variables (Bochi et al., 2014). All conditions tested are shown in (Table 1). The different conditions studied in this trial form a triangle, with pure components at the vertex representing 100% of one of each solvent. Middle points in each side represent a binary mixture (1:1), the centre point represents a ternary mixture (1:1:1), and axial points representing 2/3 of one of the solvents and 1/6 of the others. Thus, this kind of design allows the evaluation of linear and quadratic models of response (Bochi et al., 2014). The total content of monomeric anthocyanins and the content of total phenolic compounds were the two evaluated responses, and the procedures are described in sections Skin TMA of five jabuticaba varieties and Seed TPC of five jabuticaba varieties. The solvent ratio that resulted in the optimal TMA response of the jabuticaba skin and TPC of the jabuticaba seed was fixed for further univariate optimization of the extraction time.

Table 1. Solvent optimization experiments: simplex lattice design and observed responses.

Run number Independent variables Responsesa

Ethanol (X1) Methanol (X2) Water (X3) TPC seed TMA peel

Coded value Real value (%) Coded value Real value (%) Coded value Real value (%)

1 1 100 0 0 0 0 73.34 509.31

10 0 0 1 100 0 0 91.22 1111.86

11 0 0 0 0 1 100 61.89 301.97

9 1/2 50 1/2 50 0 0 62.07 920.17

12 1/2 50 0 0 1/2 50 110.13 1020.02

5 0 0 1/2 50 1/2 50 106.02 1149.44

4 1/3 33.3 1/3 33.3 1/3 33.3 120.81 1213.45

2 1/3 33.3 1/3 33.3 1/3 33.3 115.1 1141.09

7 1/3 33.3 1/3 33.3 1/3 33.3 122.86 1185.62

6 2/3 66.6 1/6 16.6 1/6 16.6 109.77 1156.39

8 1/6 16.6 2/3 66.6 1/6 16.6 112.07 1235.71

3 1/6 16.6 1/6 16.6 2/3 66.6 84.67 947.66 aResults were expressed as mg of cyanidin-3-glucoside equivalent 100 g-1 of freeze-dried sample (skin) for total monomeric anthocyanins (TMA) and mg of gallic acid equivalent g-1 of freeze-dried sample (seed) for total phenolic compounds (TPC).

Solvent validation The extraction solvent was validated using seven replicates (n = 7) under the same conditions as those used in section Initial extraction procedure, but instead, the optimum solvent mixture was used to extract TPC and TMA from the jabuticaba seed and skin, respectively.

Univariate optimization of extraction time The time was the last variable to be optimized using a univariate optimization procedure. At this stage, the optimum solvent mixture conditions for skin and seed were evaluated with the goal of reducing the extraction time. The following times were tested: (1) 2 hours of extraction and 2 hours of re-extraction, (2) 2 hours of extraction and 1.5 hours of re- extraction, (3) 2 hours of extraction and 1 hour of re-extraction, (4) 2 hours of extraction and 30 minutes of re-extraction, (5) 1.5 hour of extraction and 30 min of re-extraction, (6) 1 hour of extraction and 30 min of re-extraction, (7) 30 min of extraction and 30 min of re-extraction, and (8) 15 min of extraction and 15 min of re-extraction.

Comparison of the optimized extraction method in this work with other described methods. The optimal conditions were compared with the initial reference method described in Alezandro et al. (2013) and section (Initial extraction procedure) as well as with another method reported in the literature (Santos et al., 2010). Freeze-dried samples, skin or seed powder, were conditioned in a 125 mL Erlenmeyer flask and ethanol, 99.5% purity was used as solvent (skin or seed powder / solvent - 1:10, w/v). These Erlenmeyer flasks were sonicated for 10 min at room temperature and, after this step, they were placed in a shaking water bath for two hours at 150 rpm and 30 °C. The residue was separated from the solvent by simple filtration with Whatman paper n° 1.

Skin TMA of five jabuticaba varieties Total monomeric anthocyanin (TMA) content was determined by the pH-differential method described by Giusti & Wrosltad (2001). The method consists of two dilutions of the sample in two buffer systems: potassium chloride, pH 1.0 (0.025 mol L-1) and sodium acetate, pH 4.5 (0.4 mol L-1).

The dilution factor for the samples was determined using potassium chloride buffer, pH 1.0, until the absorbance of the sample at the maximum wavelength (520 nm) did not exceed 1.2. Two dilutions of the sample were prepared, one with potassium chloride buffer, pH 1.0, and one with sodium acetate buffer, pH 4.5; both had the same dilution factor. Samples were left to stabilize for 15 min, and the readings were taken at 520 nm and 700 nm wavelengths. Sample absorbance and TMA concentration were calculated according to Giusti & Wrosltad. (2001). TMA samples were expressed in mg equivalent of cyanidin-3-glycoside per 100 g-1 of freeze-dried sample (mg c-3-g. 100 g-1 d.w.).

Seed TPC of five jabuticaba varieties Seed and skin TPC were determined according to the Folin-Ciocalteu method adapted by Singleton et al. (1999). An aliquot of 25 μL of sample was added to 125 μL of Folin- Ciocalteu reagent, diluted 1:10 (v/v) in distilled water, and added to the wells of the microplate. After a 5-min wait, 100 μL of 7.5% sodium carbonate solution (m/v) was added. After two hours at room temperature, the sample absorbance was measured at a 760 nm wavelength. Gallic acid was used as the standard, and the results were expressed in mg equivalents of gallic acid per gram of freeze-dried sample (mg GAE g-1 d.w.).

Principal component analysis (PCA) Principal component analysis (PCA) was used to better exploit the results obtained from the seed TPC and skin TMA analyses. The pre-processing used was autoscaling, and the selected components number was two. The analysis was performed with Matlab (version R2014a, MathWorks, Natick – MA, USA) and PLS_Toolbox (version 7.3.1 – Eigenvector, WA, USA) software.

Statistical analysis All data were subjected to ANOVA, and the means were compared by Tukey and Student t-tests (p < 0.05) using the Statistica 7.0 software.

Results and Discussion

Solvent effects In this study, we used two experimental designs using mixtures of methanol, ethanol and water solvents, to optimize the extraction of the jabuticaba seed TPC content (design 1) and the extraction of the jabuticaba skin TMA content (design 2; in this trial, the solvent mixtures were acidified with acetic acid 0.5%). The table 1 provides the full results for optimization of the solvent mixture. The lowest seed TPC extraction efficiency was recorded for trial 11 (100% water), followed by trials 9 (50% ethanol, 50% methanol), 1 (100% ethanol) and 10 (100% methanol). In contrast, trials 7 (33.3% ethanol, 33.3% methanol and 33.3% water), 8 (ethanol 16.6%, methanol 66.6% and water 16.6%) and 6 (ethanol 66.6%, methanol 16.6% and water 16.6%) had the highest extraction efficiencies. However, the best solvent mixture for extracting seed TPC was 60% ethanol + 40% water, as seen in the quadratic response model presented in Figure 1 and in the predicted value (Table 2). Morelli and Prado (2012) verified that the best solvent mixture to extract TPC from grapes was 60% ethanol and 40% water in an ultrasonic bath. The use of ethanol as a solvent to extract TPC was also reported in other studies (Santos et al., 2010; Ribeiro et al., 2015; Berto et al., 2015). Regarding the extraction of skin TMA, trial 11 (100% water + 0.5% acetic acid) showed the poorest results, followed by trials 1 (100% ethanol + 0.5% acetic acid) and 9 (50% ethanol + 50% methanol + 0.5% acetic acid). The best results were obtained in trials 8 (16.6% ethanol, 66.6% methanol, 16.6% water + 0.5% de acetic acid) and 4 (33.3% ethanol, 33.3% methanol, 33.3% water + 0.5% acetic acid). However, to extract skin TMA, the best response was obtained using 80% methanol + 20% water acidified with 0.5% of acetic acid (Figure 1 and Table 2). The methanol:water solvent mixture to extract jabuticaba anthocyanins was also reported by Wu et al. (2012), Alezandro et al. (2013), and Batista et al. (2014). However, in these studies, the solvent mixture optimization was performed by multivariate design, and consequently the solvent proportions differ from those used in our study, which reports the best solvent mixture for extracting jabuticaba skin TMA.

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Figura 1. Gráfico de resposta estimada resultante do modelo quadrático

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Table 2. Summary of ANOVA, significant coefficients and validation of prediction for the models calculated in the optimisation step.

Summary of ANOVA and significant coefficients of the models Significant coefficients ± standard error Regression Model Indicated Responses Significance Fit Model (p >

A (Ethanol) B (Methanol) C (Water) AB AC BC (p < 0.05) 0.05)

Total Phenolic Compounds Quadratic 74355.2 ± 13328.5 91603.4 ± 13328.5 53099.4 ± 13328.5 - 212839.9 ± 59617.9 159410.9 ± 59617.9 0.0497 0.055

Total Monomeric Anthocyanins Quadratic 549.76 ± 74.10 1107.41 ± 74.10 283.50 ± 74.10 - 2574.83 ± 331.45 1797.58 ± 331.45 0.000334 0.143

Validation of the model prediction for the two quadratic models obtained from SLD* in solvent optimization experiments

Ethanol Methanol Water TPCa (mg g-1 freeze-dried sample (seed))

Predicted Values Interval of confidence Experimental Values

X1 X2 X3 -95% 95%

0.6 0 0.4 116.93 89.25 144.61 105.35 ± 4.60

Ethanol Methanol Water TMAb (mg 100 g-1 freeze-dried sample (peel))

Predicted Values Interval of confidence Experimental Values

X1 X2 X3 -95% 95%

0 0.8 0.2 1230.23 1094.85 1365.61 1487.64 ± 24.42

*Simplex lattice design. a Total phenolic compounds expressed as gallic acid equivalent mg g-1. b Total monomeric anthocyanins expressed as cyanidin-3-glucoside equivalent mg 100 g-1.

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Solvent mixture validation To validate the optimized solvent mixture for extracting TPC and TMA of jabuticaba seeds and skins, respectively, we performed 10 extractions (n = 10), using 60% ethanol + 40% water for seeds and 80% methanol + 20% water, acidified with 0.5% of acetic acid, for skins. All of the obtained results in these extractions were in agreement with the predicted model values and the other parameters as verified by ANOVA (Table 2).

Univariate optimization of the extraction time For the optimization of the extraction time trials in jabuticaba seed TPC and jabuticaba skin TMA, the solvent mixture optimized in section solvent effects was used. For both extractions, were analysed 8 options, starting with a total of 4 hours (extraction + re- extraction) and decreasing to a total of 30 minutes (extraction + re-extraction). All experimental conditions were fixed except the time. The results for optimization of the extraction time are presented in Table 3. The extraction of jabuticaba seed TPC and skin TMA was not statistically significantly different by Tukey's test; the extraction process that was performed for 4 hours had the same efficiency as that performed for 30 minutes. With these results, it was possible to reduce the extraction time to 3.5 hours, which is excellent and saves the analyst's time and decreases both the electric energy expenditures and equipment wear. It should be noted that the method optimized in this research study is an excellent alternative for researchers that are working with anthocyanins and phenolic compounds because most of the methods found in the literature are usually very long.

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Table 3. Univariate optimization of extraction time.

Extraction time Reextraction time * Extraction yield

TPC a (mg g-1 freeze-dried sample (seed)) TMA b (mg.100 g-1 freeze-dried sample (peel))

2 hours 2 hours 113.05 ± 4.55 a 1267.26 ± 43.23 a

2 hours 1.5 hours 116.17 ± 7.10 a 1244.07 ± 58.49 a

2 hours 1 hour 113.53 ± 6.31 a 1275.15 ± 34.37 a

2 hours 30 minutes 109.55 ± 0.69 a 1285.81 ± 83.63 a

1,5 hours 30 minutes 101.31 ± 3.81 a 1065.48 ± 36.32 a

1 hour 30 minutes 96.26 ± 5.02 a 1063.16 ± 26.44 a

30 minutes 30 minutes 102.20 ± 2.07 a 1103.05 ± 16.60 a

15 minutes 15 minutes 89.15 ± 3.34 a 1113.26 ± 33.13 a

Results are mean values (n = 3) plus standard deviations. Same lower case letter in the column means no significant differences at 95% of confidence (p≤0.05) by Tukey test. * Reextraction procedure is performed once. a Total phenolic compounds expressed as gallic acid equivalent mg g-1. b Total monomeric anthocyanins expressed as cyanidin-3-glucoside equivalent mg 100 g-1.

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Thus, the extraction procedure and optimized time were as follows: 0.5 g of freeze- dried sample (seeds or skins) was weighed, and 50 mL of ethanol/water extractive solution (60:40, v/v, for phenolic compounds) was added. This extract was shaken for 15 min in a shaker at 150 rpm at 30 °C. The residue was re-extracted once more in 50 mL of extractive solution for 15 min. The skin anthocyanin content extraction followed the same procedure described above using methanol/water/acetic acid (80:20:0.5, v/v/v) as the extractive solution. The extracts were centrifuged at 3000 rpm for 10 min and filtered on Whatman paper n° 1, and the filtrates were combined and calibrated to a volume of 100 mL in a volumetric flask.

Comparison of the optimized extraction method with other methods reported in the literature In this study, the ‘Sabara’ jabuticaba seed TPC and skin TMA were extracted using three extraction methods: the optimized method, the method described by Alezandro et al. (2013) and the method described by Santos et al. (2010). All results for these analyses are shown in Table 4. The optimized extraction method in this study was not significantly different (89.15 mg GAE/g d.w. TCP, 1113.26 mg c-3-g. 100 g-1 d.w. TMA) compared to that proposed by Alezandro et al. (2013) (89.53 mg GAE/g d.w. TCP, 1359.10 mg c-3-g. 100 g-1 d.w. TMA). However, the optimized method is more advantageous because it is extremely fast, taking only 30 minutes to perform the extraction instead of six hours. Another great advantage is that for extraction of TPC from seeds, researchers can use ethanol:water (60:40, v/v) as the extractive solvent, while Alezandro et al. (2013) used methanol:water (70:30 v/v) because ethanol is less toxic than methanol and is thus less risky to the analyst and the environment.

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Table 4. Comparison of the three extraction methods.

Optimized Extraction Extraction time Reextraction time Solvent extractor Conditions of the extraction process Yield

15 minutes 15 minutes ethanol/water (60:40 v/v) Shaking at 150 rpms a 30 0C 89.15 ± 3.34 a TCP a

15 minutes 15 minutes Methanol/water/acetic acid (80/20/0.5 v/v/v) Shaking at 150 rpms a 30 0C 1113.26 ± 33.13 A TMA A

Extraction according to Alezandro et al. (2013) Extraction time Reextraction time Solvent extractor Conditions of the extraction process Yield

2 hours 2 hours 2x Methanol/water (70:30 v/v) Shaking at 150 rpms a 30 0C 89.53 ± 1.49 a TCP a

Methanol/water/acetic acid solution 2 hours 2 hours 2x (70:30:0.5 v/v/v) Shaking at 150 rpms a 30 0C 1359.10 ± 50.25 A TMA A

Extraction according to Santos et al. (2010) Extraction time Reextraction time Solvent extractor Conditions of the extraction process Yield

Sonicated for 10 min. After incubation in 2 hours _ Pure ethanol 17.16 ± 2.36 b TCP b a shaking bath at 150 rpm a 30 0C

Sonicated for 10 min. After incubation in 2 hours _ Pure ethanol 77.34 ± 8.67 B TMA B a shaking bath at 150 rpm a 30 0C

Results are mean values (n = 3) plus standard deviations. Same lower case letters represent no significant differences between the total phenolic compounds contents, the same capital letters represent no significant differences between total anthocyanins monomeric contents. At 95% of confidence (p≤0.05) by Tukey test. TCP a Total phenolic compounds contents expressed as gallic acid equivalent mg g-1. TMA b Total monomeric anthocyanins contents expressed as cyanidin-3-glucoside equivalent mg 100 g-1.

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The extraction method proposed by Santos et al. (2010) was significantly different (17.16 mg GAE/g d.w. TCP, 77.34 mg c-3-g. 100 g-1 d.w. TMA) compared to the optimized method in this study and the method recommended by Alezandro et al. (2013). The last two methods had efficiency higher than 80% for extracting phenolic compounds and 93% efficiency in extracting anthocyanins; the optimized method reduces the extraction time to 1.5 hour. Keeping these results in mind, the optimized extraction methods proved to be an excellent method for extracting the seed TPC and skin TMA from jabuticaba fruit; the methods had high efficiency for extracting the compounds of interest, is extremely fast, practical and simple, and uses solvents and equipment found in most of the research laboratories.

TPC and TMA evaluated in five jabuticaba varieties The optimized extraction method developed in this study was applied in five more jabuticaba varieties (SFP, PF, CFP, HFP and PFP) harvested in two crop seasons (2014 and 2015) totalling 24 samples. We also determined, in all samples, the seed and skin TPC (according to the method described in section seed TPC of five jabuticaba varieties) and skin TMA (according to the method described in section skin TMA of five jabuticaba varieties). The obtained results for these variables are presented in Table 5 and Figure 2.

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Table 5. Content of total monomeric anthocyanins and total phenolic compounds in skin and seed of varieties jabuticaba (mean ± standard deviations, n = 3).

Total monomeric anthocyanins (TMA) Total phenolic compounds (TPC) Varieties Skin Skin Seed 2014 2015 2014 2015 2014 2015

Sabará Fagan (SF) 1172.16 ± 25.52 B d 2510.39 ± 18.19 A b 82.13 ± 1.34 B b 103.23 ± 3.28 A c 86.50 ± 2.51 B b c 95.77 ± 3.57 A c

Paulista Fagan (PF) 273.67 ± 18.99 B e 481.02 ± 23.71 A e 75.91 ± 2.74 B b c 94.10 ± 1.51 A c 72.05 ± 2.52 B d 119.18 ± 0.80 A a b

Sabará F.P (SFP) 1603.09 ± 110.20 B c 2892.15 ± 58.35 A a 122.78 ± 4.15 B a 141.63 ± 5.59 A a 95.39 ± 4.74 B b 112.13 ± 7.29 A b

Hibrida F.P (HFP) 1098.49 ± 22.41 B d 1498.72 ± 13.70 A c 71.232 ± 0.93 B c 120.45 ± 4.85 A b 72.24 ± 1.61 B d 109.74 ± 8.19 A b c

Pintada F.P (PFP) 1801.90 ± 1.76 B b 947.19 ± 48.69 A d 55.27 ± 2.58 B d 147.88 ± 0.37 A a 78.17 ± 4.56 B c d 117.08 ± 4.21 A a b

Coroada F.P (CFP) 2059.57 ± 3.42B a 1398.06 ± 44.49 A c 127.81 ± 6.33A a 127.03 ± 4.33 A b 125.96 ± 4.17 A a 131.62 ± 4.13 A a Same capital letters represent equal means in the lines (comparison between harvesting years, p˂0,05), and same lowercase letters represent equal averages in columns (between different varieties for each harvest year, p˂0,05). Results were expressed as mg of cyanidin-3-glucoside equivalent mg 100 g-1 of freeze-dried sample (skin) for total monomeric anthocyanins (TMA) and mg of gallic acid equivalent g-1 of freeze-dried sample (seed and skin) for total phenolic compounds (TPC). Tukey p≤0,05, n=3.

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Figura. 2. (a) Score graphic for jabuticaba varieties: SF0 Sabará Fagan, PF Paulista, SFP Sabará F.P, PFP Pintada, HFP Hibrida and CFP Coroada, ● crop 1 samples (2014) and * crop 2 samples (2015). (b) Loadings graphic for principal components analysis.

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The data presented in Table 5 were used for principal component analysis (PCA). The data were arranged in a 36x3 dimension matrix with the samples in the 36 rows and the variables in the 3 columns. The 36 rows correspond to the triplicates for the measured variables in the varieties in both crops (2014 and 2015). The varieties are described by abbreviation in the PCA scores graphic, and the symbols describe the two crops. The variables used for exploratory analysis were the total monomeric anthocyanins of the skins and total phenolic compounds of the seeds and skins. Although the number of variables in this stage of the study was not high, the use of Principal Component Analysis allowed a better visualization of the data in a two-dimensional graphic (PC1xPC2), thus justifying its use. The loading graphics showed how each variable influenced the position of the samples in the score graphic. All samples remained in the model since outlier samples were not found. Analysing the graphic of scores using in the 2014 and 2015 crop seasons [Figure 2 (a)] together, the loading graphics [Figure 2 (b)] and the data in table 5 verify that the skin and seed TPC are the variables that were most highly positively correlated with PC-1, but the loadings were not very high (approximately 0.6-0.7). Regarding PC-2, the most correlated variable was skin TMA, with a considerably high loading (greater than 0.9). Comparing the two crop seasons, practically all the samples had a higher content of skin and seed TPC in the 2015 crop, indicating that the levels of TPC and skin TMA in jabuticabas are strongly influenced by the crop season due to several environmental factors, such as rainfall, drought, temperature, soil conditions and others. The results obtained in the varieties of the CFP and PFP seeds, both of the 2015 harvest, and the PFP and SFP peel also belonging to the 2015 harvest were those with the highest concentration of total phenolic compounds when compared to the other varieties studied here. SF and SFP jabuticabas harvested in 2015 were the samples with the highest anthocyanin content. The HFP jabuticaba harvested in 2015 had more phenolic compounds in its skins than in its seeds, whereas the CFP jabuticaba harvested in 2015 had considerably higher values of phenolic compounds in skins and seeds. In contrast, the PFP jabuticaba harvested in 2015 was verified to have the lowest anthocyanin content. However, a higher concentration of phenolic compounds was found in skins and seeds. PFP jabuticaba harvested in 2014, compared to the SF and SFP jabuticabas harvested in 2015, had considerably lower anthocyanin content, and similar results were verified for the HFP jabuticaba harvested in 2014. In the SF jabuticaba harvested in 2014 had a lower

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concentration of phenolic compounds in its skins and seeds and lower concentration of anthocyanins in comparison to the SFP and CFP jabuticaba fruits harvested in 2014. Regarding the resulted founded for PF jabuticaba, in both crop seasons (2014 and 2015), this variety had the lowest content of phenolic compounds and anthocyanins in comparison to the other varieties analysed in this study. In addition, there are studies on only Sabará and Paulista jabuticabas varieties. The Pintada, Híbrida and Coroada jabuticabas varieties had not been studied to date, and this first work to investigate these varieties. Hacke et al. (2016) reported 8.65 g GAE/100 g d.w. in ‘Paulista’ jabuticaba seeds, a result that is in agreement with this study for ‘Paulista’ jabuticaba harvested in the 2014 and 2015 crops season (7.20 and 11.91 g of GAE/100 g d.w., respectively). In contrast, for the ‘Sabara’ and ‘Paulista’ jabuticabas, it was reported that the skin TMA contents were 350 and 450 mg c-3-g 100 g-1 d.w., respectively (Alezandro et al., 2013). However, these results are lower than those found in the present study for the same variety: 1172.16 and 2510.39 mg c-3-g. 100 g-1 d.w., in 2014 and 2015 crop seasons, respectively, and, for 373.67 mg c-3-g. 100 g-1 d.w. (2014 crop), and 481.02 mg c-3-g. 100 g-1 d.w. (2015 crop), respectively. Santos et al. (2010) reported TPC and anthocyanin contents of 33.97 mg GAE/g d.w. and 533 mg c-3-g. 100 g-1 d.w., respectively, in jabuticaba skins. For ‘Sabara’ jabuticaba, Batista et al. (2014) found a TPC value of 113.80 mg GAE/g d.w. and a TMA value of 1737.12 mg c-3-g. 100 g-1 d.w., corroborating the results obtained in this study in the 2014 crop season. However, in the 2015 crop season, the results were higher than those recorded in 2014. It is probable that results were influenced by the changes in growing and environmental conditions in both crop seasons. In ‘Sabara’ jabutica skins, Silva et al. (2014) reported total anthocyanin content of 21.60 (mg c-3-g. 100 g-1 d.w.), which was lower than that found in this study, which again confirms the efficiency of the extraction method used here. All analysed varieties in this study had considerably higher concentrations of TPC and TMA, and these results are very important since phenolic compounds are extremely beneficial to health.

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Conclusions The extraction method optimization for total phenolic compounds and total monomeric anthocyanins of ‘Sabara’ jabuticaba seeds and skins can be used with success. This method reduces the extraction time, and thus reduces expenses such as electricity, wear on the equipment, and analyst time. The optimized method has high efficiency for extracting phenolic compounds from seeds and skins in five jabuticaba varieties.

Acknowledgements The authors are thankful to Coordenação Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (process no. 145652/2014-9) for their financial support for this study, to Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES Foundation, Brazil) for the financial assistance provided to the research laboratory and to Luciana Fontes de Oliveira for collaborating for the principal component analysis (PCA).

Conflict of interest Authors have no conflict of interest.

Ethical Approval This article does not contain any studies with human or animal subjects.

Informed Consent Informed consent was obtained from all individual participants included in the study.

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CHAPTER 3

ARTICLE

Extracts of peels and seeds of five varieties of Brazilian jabuticaba present high capacity to deactivate reactive species of oxygen and nitrogen

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Chapter 3

Extracts of peels and seeds of five varieties of Brazilian jabuticaba present high capacity to deactivate reactive species of oxygen and nitrogen

Running title: Extracts of peels and seeds of jabuticaba deactivated ROS and RNS

Michelly Cristiane Paludoa, Luciana Fontes de Oliveirab, Isidro Hermosín-Gutiérrezc, Cristiano Augusto Ballusd, Silvia Borges Pimentel de Oliveirae, Helena Teixeira Godoya aDepartment of Food Science, Faculty of Food Engineering, University of Campinas (UNICAMP), Rua Monteiro Lobato 80, 13083-862, Campinas, SP, Brazil bLaboratório de Química Analítica "Henrique Bergamin Filho", Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA), Universidade de São Paulo, Av. Centenário, 303 - São Dimas, 13416-000 – Piracicaba, SP, Brazil cInstituto Regional de Investigación Científica Aplicada, Universidad de Castilla-La Mancha, Campus Universitario s/n, 13071 Ciudad Real, Spain dDepartment of Food Science and Technology, Center for Agrarian Sciences, Federal University of Santa Maria, Avenida Roraima 1000, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil eDepartment of Structural and Functional Biology, State University of Campinas, Av. Bertrand Russel, CP 6109, 13083-865 Campinas, SP, Brazil

* Corresponding author. Phone: +55 19 3521 4024 E-mail address: [email protected]

*This manuscript was submitted to the journal “Food Research International”.

Abstract Jabuticaba has a high concentration of phenolic compounds, which have a significant antioxidant capacity. Methodologies have been developed to evaluate the ability of • • plant extracts to fight free radicals such as H2O2, O2 ˉ, HOCl, ONOOˉ and ROO . Thus, the capacity of deactivation of reactive oxygen species (ROS) and reactive

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nitrogen species (RNS) in peel and seed extracts of five varieties of jabuticaba was -1 evaluated. Sabará peel (SFP) deactivated HOCl with IC50 9.24 µg mL , Paulista • -1 seed (PF) deactivated O2 ˉ with IC50 16.15 µg mL , Coroada seed (CFP) deactivated -1 ONOOˉ with IC50 3.84 µg mL , the peel of CFP deactivated ONOOˉ with IC50 5.88 µg mL-1, the peel of SFP deactivated the ROO• at 918.16 µmol TE g-1, and Sabará seed -1 deactivated H2O2 with 49.11% inhibition at a concentration of 125 µg mL of extract. This demonstrates the high antioxidant potential of this fruit, proving that it is extremely beneficial to human health.

Keywords Myrciaria coronata Mattos; Plinia ssp.; reactive oxygen species; reactive nitrogen species; hypochlorous acid; superoxide anion.

1. Introduction The Brazilian fruit jabuticaba has a reduced maturation period, presents the shape of grooved berries and when ripe is dark purple, almost black, with a smooth appearance and contains one to four seeds. The peel is an excellent source of phenolic compounds and natural pigments (Silva, 2010, Leite –Legatti, Dragano, Marques, Malta & Riccio, 2012). The attractive appearance and the presence of phenolic compounds, mainly anthocyanins, with proven antioxidant action and possible effects related to health promotion are some of the elements that stimulate the consumption of this fruit (Xie, Zhao & Shen, 2012). It should be noted that this fruit is easily found throughout Brazilian territory, and thus, the general population has easy access to jabuticaba and can benefit from its intake. It is important to mention that the antioxidants ingested in the diet are relevant in maintaining the balance of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS), especially when the endogenous antioxidant defence system is not able to effectively deactivate the reactions formed during oxidative and nitrosative stress (Halliwell & Gutteridge, 2007). Several studies have demonstrated that these stresses are related to some human diseases, including cardiovascular diseases, diabetes, cancer, neurodegenerative diseases, hepatic diseases and the ageing process (Almeida, Fernandes, Lima, Costa & Bahia, 2009).

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It is known that ROS and RNS exhibit different chemical properties, mainly in relation to their reactivity; for example, hydrogen peroxide has low reactivity (Winterbourn, 2008). Reactive species are products of normal cell metabolism and exhibit dual roles, as they may be beneficial or detrimental to living organisms (Halliwell & Gutteridge, 2007). Excess of these species in the body is counteracted by antioxidants generated by the body or ingested through diet. •- Among the most common ROS are the superoxide anion radical (O2 ), peroxyl radical (ROO•), and alkoxyl radical (RO•), and non-radical oxygen derivatives include hydrogen peroxide (H2O2) and hypochlorous acid (HOCl) (Halliwell & Gutteridge, 2007). RNS are derived from the nitric oxide radical (NO•) and its metabolites, • including both nitrogen dioxide (NO2 ) (Mazzulli et. al., 2006) and non-radical species such as peroxynitrite anion (ONOO-) (Halliwell, 2001). Considering that each reactive species presents specific chemical properties, the ability of a matrix to deactivate certain ROS or RNS does not necessarily indicate that it will be able to deactivate another reactive species. Thus, the antioxidant capacity of a matrix must be measured against different ROS and RNS to provide a more detailed profile of its antioxidant capacity (Rodrigues, Benassib & Bragagnolo, 2014). The knowledge of in vitro antioxidant properties of new fruit varieties is of fundamental importance. Thus, the study of jabuticaba varieties is of great value because it is a source of antioxidants, with possible effects on disease prevention and health promotion. Therefore, this work focused on the evaluation of deactivation •- • - capacity of ROS (O2 , ROO , H2O2, and HOCl) and RNS (ONOO ) from extracts of five varieties of jabuticaba. To date, there have been no studies on the deactivation of ROS and RNS by jabuticaba extracts; this the first study to apply these analyses in different varieties of this fruit.

2. Materials and Methods

2.1. Samples The Sabará (Myrciaria jaboticaba (Vell.) O. Berg) (SF) and Paulista (Myrciaria cauliflora (DC) O. Berg (PF) varieties were donated by Faggan’s team of farmers, located in the interior of the state of São Paulo, in the district of Lagoa Branca, which

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is located at latitude 21⁰46’26” south and longitude 47⁰05’11” west and at an altitude of 684 metres (in October 2014 and October 2015). Species of Sabará (Myrciaria jaboticaba (Vell) O. Berg.) (SFP), Coroada (Myrciaria coronata Mattos) (CFP), Hybrid (Myrciaria cauliflora (DC) O. Berg) (HFP) and Pintada (Plinia ssp) (PFP) were donated in October 2014 and October 2015 by the company F.P. Fruits and Plants, located in the interior of the state of São Paulo, in Araçoiaba da Serra municipality, which is located at latitude 23⁰30’19” south and at longitude 47⁰36’51” west and at an altitude of 625 metres. Samples were depulped manually and divided into portions of peels and seed, which were then frozen at -22⁰C and lyophilized. The lyophilized samples were crushed to a fine homogeneous powder, packed in a vacuum and again frozen at -22⁰C until analysis.

2.2 Extraction procedure for total monomeric anthocyanins (TMA) of the peel and total phenolic compounds (TPC) of the seeds of jabuticaba varieties. The TPC extractions of the seeds and the TMA extractions of the peels were performed according to the methods optimized by Paludo et al. (2017). Briefly, 0.5 g of lyophilized sample (peel or seed) was weighed, and 50 mL of ethanol: water extractor solution (60:40, v/v, extracted from seed TPC) was added. This extract was stirred for 15 min in a shaking bath at 150 rpm and 30 ⁰C. The fruit residue was again extracted with 50 mL of the extractor solution. The same procedure was used to extract TMA from the peel, but the extraction solvent was replaced with a methanol: water: acetic acid (80:20:0.5, v/v/v) solution. The extracts were centrifuged at 3000 rpm for 10 min and were filtered through filter paper (Whatman Nº 1). The filtrate extracts were combined, measured to a volume of 100 mL in a graduated flask, and analysed via deactivation tests of reactive oxygen and nitrogen species as described below.

2.3. ROS and RNS scavenging assays

2.3.1. General All assays of deactivation of the reactive oxygen and nitrogen species were performed using a BMG LABTECH microplate reader equipped with fluorescence

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and UV/Vis lamps, as well as a chemiluminescence detector. The thermostat was set at 37 ⁰C. The peels and seed extracts of the varieties of jabuticaba were diluted in the proper buffer for each analysis. The standard used was gallic acid, which was also diluted in the proper buffer for each analysis. The IC50 value (in vitro inhibitory concentration to decrease by 50% the amount of reactive species in the tested media) corresponded to four experiments using five concentrations in duplicate and was calculated from the curves of percent inhibition against antioxidant concentration using Graph Pad Prism 5. Graph comparison was performed using Origin Pro 8 software. Gallic acid was used as a positive control in the deactivation tests of the •‐ ‐ ROS O2 , H2O2, and HOCl and of the RNS ONOO ; trolox was used as a positive control in those of the ROS ROO•. For statistical analyses, ANOVA, Tukey’s test and Student’s t test were performed with 95% confidence using Statistica 7.0 software.

2.3.2.1. Hypochlorous acid-scavenging assay The capacity of each extract to scavenge HOCl was defined according to Gomes et al. (2007) and Ribeiro, Berto, Chisté, Freitas, Visentainer & Fernandes (2015). The assay investigated the effect of the extracts and standards on the HOCl-induced oxidation of DHR (diidrorodamina) to rhodamine 123. The results are expressed as percentage inhibition of HOCl-induced oxidation of DHR.

2.3.3. Peroxynitrite-scavenging assay The ONOOˉ scavenging ability of each jabuticaba extract and standard was verified by monitoring the ONOOˉ induced oxidation of non-fluorescent DHR to the fluorescent rhodamine 123 as described by Chisté, Mercadante, Gomes, Fernandes, Lima & Bragagnolo (2011) and Ribeiro et al. (2015). In a parallel set of experiments, -1 the assays were performed in the presence of 25 mol L NaHCO3 in order to simulate the physiological CO2 concentrations. The results were expressed as percentage inhibition of ONOOˉ-induced oxidation of DHR.

2.3.4. Superoxide radical-scavenging assay The superoxide radical was produced by a non-enzymatic system NADH/ phenatime methosulfato (PMS)/O2, and this radical reduces nitrotetrazolium blue

123

(NBT) into a purple-coloured formazan; this method was performed according to Gomes et al. (2007) and Ribeiro et al. (2015). Therefore, the effect of the extracts • and standards on the O2 ˉ induced reduction of NBT at 560 nm was determined spectrophotometrically. The effects were expressed as the percentage inhibition of the NBT reduction to formazan.

2.3.5. Hydrogen peroxide-scavenging assay The hydrogen peroxide scavenging activity was measured using a chemiluminescence methodology by monitoring the scavenging ability of each jabuticaba extract and standard on the H2O2 induced oxidation of lucigenin. This method followed the procedure presented by Chisté et al. (2011) and Ribeiro et al.

(2015). The results were expressed as the percentage inhibition of the H2O2 induced oxidation of lucigenin.

2.3.6. Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) assay The antioxidant ability performed by the ORAC assay was adapted from Dávalos, Gómez-Cordovés, & Bartolomé (2004). AAPH reagent (1.08 g) was completely dissolved in 10 mL of 75 mmol L-1 phosphate buffer (pH 7.4), generating a final concentration of 400 mmol L-1. Fluorescein stock solution (10 mmol L-1) was prepared in 75 mmol L-1 phosphate buffer (pH 7.4). Fluorescein working solutions (0.1 mmol L-1) were prepared daily by diluting the stock solution with 75 mmol L-1 phosphate buffer (pH 7.4). The reaction consisted of rapidly mixing 20 μL of each jabuticaba extract, 120 μL of fluorescein working solution and 60 μL of AAPH in a 96- well polypropylene plate using a multichannel pipet. The microplate was immediately placed in the reader, and the fluorescence was recorded every minute for 80 min.

Fluorescence readings were obtained at λEx = 485 nm and λEm = 520 nm. Quantification was performed using a Trolox analytical curve. To construct the curves, it was necessary to plot the Trolox concentrations (X) against the net area under the fluorescence decay curve, net AUC (Y). The AUC was calculated as

124

where ᶂ0 is the initial fluorescence reading at 0 min, and ᶂi is the fluorescence reading at time i (time final). The net AUC corresponding to a standard or a sample was calculated by subtracting the AUC corresponding to the blank (AUC sample – AUC blank). The results were expressed as μmol of trolox equivalents per g of each jabuticaba sample (μmol TE g-1).

2.3.7. Principal Component Analysis (PCA) For a better visualization of the results obtained in analyses of ROS and RNS of both peels and seed extracts, an exploratory analysis was performed using principal component analysis (PCA). The results obtained for all analyses were organized in a data matrix where each sample of the different varieties analysed in the two crops was organized in lines and the variables in columns, obtaining a 36x12 matrix (samples x variables). All analyses were performed in Matlab version R2014a (MathWorks, Natick – MA, USA) and PLS toolbox (version 7.3.1 – Eigenvector – WA, USA).

2.3.8. Results and discussion All the results obtained with the ROS and RNS deactivation analyses, both for the peel extracts and for the seed extracts, are shown in tables 1 and 2, in the PCA image (figure 1) and in the supplementary material (graphs 2 and 3)

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•ˉ Table 1. Superoxide radical (O 2), hydrogen peroxide (H2O2), hypochlorous acid (HOCl), peroxynitrite (ONOOˉ), and peroxyl radical (ROO•) activities of extracts from the seed of jabuticaba and gallic acid standard.

ORAC ROO• (µmol Trolox -1 -1 Varieties IC50 (µg mL ) equivalents. mg extract) H2O2 (% Maximum inhibition with ·ˉ -1 HOCl O 2 ONOOˉ 125 ug extract. mL )

Absence of NaHCO3 Presence of 25 mM NaHCO3

2014 2015 2014 2015 2014 2015 2014 2015 2014 2015 2014 2015

Sabará Fagan (SF) 45.18 ± 0.39 A b 42.37 ± 0.35 A b 31.32 ± 0.30 A d 18.87 ± 0.12 B d 58.94 ± 0.27 A b 30.35 ± 0.09 B b 69.02 ± 0.38 A a 36.37 ± 0.24 B c 457.77 ± 59.98 A b 574.62 ± 56.04 A a b 26.84%± 0.59 B a 49.11% ± 0.28 A a

Paulista Fagan (PF) 50.32 ± 0.21 A a 35.04 ± 0.47 B c d 46.91 ± 0.47 A b 16.15 ± 0.25 B d 63.81 ± 0.24 A a 32.97 ± 0.17 B a 65.53 ± 0.08 A a 41.94 ± 0.31 B b 381.40 ± 61.85 B b 694.43 ± 42.85 A a 18.75%± 0.68 B c 33.38% ± 0.29 A c

Sabará F.P (SFP) 42.61 ± 0.38 A b 40.57 ± 0.33 A b 35.30 ± 0.17 A c 25.09 ± 0.39 B b 46.50 ± 0.27 A d 32.18 ± 0.19 B a 53.01 ± 0.45 A b 32.60 ± 0.22 B d 375.20 ± 14.56 B b 560.24 ± 33.26 A a b 12.72% ± 1.81 B e 27.50% ± 0.37 A d

Hibrida F.P (HFP) 43.84 ± 0.34 A b 33.09 ± 0.27 B d 21.75 ± 0.08 A e 22.06 ± 0.20 A c 55.57 ± 0.31 A c 24.87 ± 0.13 B c 67.46 ± 0.23 A a 30.36 ±0.14 B d e 344.52 ± 39.67 A b 447.72 ± 10.79 A b 23.22% ± 0.80 B b 41.50% ± 1.75 A b

Pintada F.P (PFP) 31.29 ± 0.27 A d 46.78 ± 0.30 A a 62.03 ± 0.37 A a 26.15 ± 0.20 B b 46.75 ± 0.34 A d 30.38 ± 0.26 B b 47.72 ± 0.18 A c 46.17 ± 0.37 A a 348.08 ± 18.49 B b 507.71 ± 95.81 A b NA 18.28% ± 0.89 e

Coroada F.P (CFP) 35.24 ± 0.15 B c 38.98 ± 0.31 A b c 17.22 ± 0.07 B f 29.17 ± 0.28 A a 31.88 ± 0.26 A e 24.91± 0.13 B c 34.18 ± 0.22 A d 27.89 ± 0.22 B e 640.33 ± 34.96 A a 585.44 ± 56.05 A a b 16.893± 0.81 B d 27.68% ± 0.67 A d

Gallic acid 1.82 ± 0.10 1.82 ± 0.10 4.74 ± 0.12 4.74 ± 0.12 0.19 ± 0.02 0.19 ± 0.02 0.75 ± 0.02 0.75 ± 0.02 100% (1 mg)* ± 0.06 100% (1 mg)* ± 0.06

IC50 = in vitro inhibitory concentration to decrease by 50% the amount of reactive species in the tested media (mean ± standard error). ORAC = oxygen radical -1 absorbance capacity (mean ± standard error). H2O2 % maximum inhibition with 125 µg extract mL . NA = no activity was found within the assayed concentration range (20-70 µg mL-1).* The standard gallic acid got 100% inhibition of the reactive species tested at a concentration of 1 mg mL-1. Equal capital letters represent equal means in the lines (comparison between harvesting years, p˂0,05), and equal lowercase letters represent equal averages in columns (comparison between harvesting years, p˂0,05).

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•ˉ Table 2. Superoxide radical (O 2), hydrogen peroxide (H2O2), hypochlorous acid (HOCl), peroxynitrite (ONOOˉ), and peroxyl radical (ROO•) activities of extracts from the peel of jabuticaba and gallic acid standard.

ORAC ROO• (µmol Trolox -1 -1 Varieties IC50 (µg mL ) equivalents. g sample) H2O2 (% Maximum inhibition with ·ˉ -1 HOCl O 2 ONOOˉ 70 µg extract. mL ) Presence of 25 mM Absence of NaHCO3 NaHCO3

2014 2015 2014 2015 2014 2015 2014 2015 2014 2015 2014 2015

Sabará Fagan (SF) 17.04 ± 0.26 A b 11.65 ± 0.25 B d 46.90 ± 0.19 A e 44.47 ± 0.28 B a 8.20 ± 0.16 A b 6.12 ± 0.09 B a 12.49 ± 0.16 A d 10.81 ±0.11 B b 537.31 ± 62.98 B c 839.72 ± 78.93 A a b 17.61% ± 0.37 B b 25.09% ± 1.22 A a

Paulista Fagan (PF) 26.48 ± 0.30 A a 12.07 ± 0.25 B c d 53.78 ± 0.15 A b 44.90 ± 0.26 B a 10.41 ± 0.30 A a 6.19 ± 0.08 B a 17.60 ± 0.18 A b 13.5 ± 0.04 B a 276.81 ± 24.33 B d 386.96 ± 22.85 A d 2.644% ± 0.22 B c 10.65% ± 0.27 A b

Sabará F.P (SFP) 17.19 ± 0.21 A b 9.24 ± 0.19 B e 38.96 ± 0.13 B f 40.38 ± 0.16 A b 5.35 ± 0.05 A c 3.89 ± 0.11 B b c 11.75 ± 0.12 A d 8.85 ± 0.09 B c 688.00 ± 21.08 B b 918.16 ± 32.88 A a NA 9.01% ± 0.98 b c

Hibrida F.P (HFP) 17.72 ± 0.25 A b 13.50 ± 0.11 B b c 50.63 ± 0.06 A c 36.83 ± 0.21 B c 7.06 ± 0.09 A b 4.09 ± 0.08 B b c 14.29 ± 0.18 A c 7.54 ± 0.17 B d 514.77 ± 79.93 A c 640.90 ± 57.27 A c 23.230% ± 1.20 A a 23.37% ± 0.11 A a

Pintada F.P (PFP) 12.60 ± 0.25 B c 15.81 ± 0.21 A a 71.50 ± 0.24 A a 33.59 ± 0.25 B d 10.13 ± 0.22 A a 4.18 ± 0.06 B b 20.45± 0.21 A a 8.82 ± 0.10 B c 513.86 ± 30.00 A c 620.42 ± 84.85 A c NA 3.78% ± 0.13 d

Coroada F.P (CFP) 12.52 ± 0.18 B c 14.44 ± 0.21 A a b 48.08 ± 0.18 A d 44.57 ± 0.17 B a 4.52 ± 0.07 A c 3.84 ± 0.12 B c 6.56 ± 0.15 A e 5.88 ± 0.11 B e 916.08± 30.24 A a 707.41 ± 49.19 B b c 2.850% ± 0.09 B c 7.38% ± 0.22 A c

Gallic acid 1.82 ± 0.10 1.82 ± 0.10 4.74 ± 0.12 4.74 ± 0.12 0.19 ± 0.02 0.19 ± 0.02 0.75 ± 0.02 0.75 ± 0.02 100% (1 mg)* ± 0.06 100% (1 mg)* ± 0.06

IC50 = in vitro inhibitory concentration to decrease by 50% the amount of reactive species in the tested media (mean ± standard error). ORAC = oxygen radical -1 absorbance capacity (mean ± standard error). H2O2 % maximum inhibition with 70 µg extract mL . NA = no activity was found within the assayed concentration range (20–70 µg mL-1).* The standard gallic acid got 100% inhibition of the reactive species tested at a concentration of 1 mg mL-1. Equal capital letters represent equal means in the lines (comparison between harvesting years, p˂0,05), and equal lowercase letters represent equal averages in columns (comparison between harvesting years, p˂0,05).

127

Figure 1. Principal Components Analysis (PCA).

Samples/Scores Plot 2 0.5 b) 0.4 1 c) d) a) 0.3 i) 0 0.2 j) 0.1 -1

0 h) -2 -0.1 f) g) e)

PrincipalComponent 2(18.79%) -0.2 -3 Harvest1 -0.3 l) Harvest2 PrincipalComponent 2(18.79%) k) -4 -0.4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Principal Component 1 (52.97%) Principal Component 1 (52.97%)

(i) (ii)

0.5 2 d) SF0 SF0 HFP HFP 0.4 b) 1 c) 0.3 PF0 CFP i) SFP PF0 0 CFP SFP 0.2 a) j) 0.1 -1 f)

0 e) -2 -0.1

-3 h) -0.2

-4 PFP PFP g) PrincipalComponent 2(34.65%)

PrincipalComponent 2(34.65%) -0.3 PFP k) l) -5 -0.4 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Principal Component 1 (48.46%) Principal Component 1 (48.46%)

(ii) (iv)

0.6 4 0.5 i) PFP 3 PFP 0.4 PFP j) 0.3 b) 2 g) PF0 PF0 0.2 PF0 1 a) 0.1 h)

0 SFP 0 SFP l) SFP f) SF0 -0.1 CFP -1 SF0 CFP CFP -0.2 k) HFP e)

-2 HFP PrincipalComponent 2(25.23%) PrincipalComponent 2(25.23%) HFP -0.3 c) d) -3 -0.4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 Principal Component 1 (39.65%) Principal Component 1 (39.65%)

(v) (vi)

● The twelve analysed variables are a) HOCl peel; b) HOCl seed c) H2O2 peel; d) H2O2 seed; e) ROO ● - - - peel; f) ROO seed; g) ONOO with Na2CO3 peel; h) ONOO without Na2CO3 peel; i) ONOO with - ●- ●- Na2CO3 seed; j) ONOO without Na2CO3 seed; k) O2 peel; and l) O2 seed. Figure (i) scores PC1xPC2 for the model that included all samples of both crops; (ii) loadings PC1xPC2 for all variables of both crops; (iii) scores PC1xPC2 for the model with samples referring to the 2014 crop (1 crop); (iv) loadings PC1xPC2 for the model with variables referring to the 2014 crop (1 crop); (v) scores for the

128

model with samples referring to the 2015 crop (2 crops) and (vi) loadings PC1xPC2 for the model with variables referring to the 2015 crop (2 crops).

Figure 2. Percent inhibition curves versus antioxidant concentration for the peel extracts (support material)

129

Scavenging capacity of each jabuticaba peel extract and standard (positive control, gallic acid), (a, b) hypochlorous acid (HOCl), peroxynitrite (ONOOˉ) in the presence (c, d) and absence (e, f) of NaHCO3 • and (g, h) superoxide radical (O2 ˉ). SF Sabará Fagan, PF Paulista, SFP Sabará F.P, PFP Pintada, HFP Hibrida and CFP Coroada. Each point shows the standard error bars and represents the values obtained from four experiments, in five concentrations, performed in triplicate.

Figure 3. Percent inhibition curves versus antioxidant concentration for the seed extracts (support material)

130

Scavenging capacity of each jabuticaba seed extract and standard (positive control, gallic acid), (I, j) hypochlorous acid (HOCl), peroxynitrite (ONOOˉ) in the presence (k, l) and absence (m, n) of NaHCO3 and (o, p) superoxide radical (O2˙ˉ). SF Sabará Fagan, PF Paulista, SFP Sabará F.P, PFP Pintada, HFP Hibrida and CFP Coroada. Each point shows the standard error bars and represents the values obtained from four experiments, in five concentrations, performed in triplicate.

3.1. Hypochlorous acid HOCl is produced enzymatically by myeloperoxidase. This reactive species and its conjugate base (-OCl) are strong oxidants that act as antimicrobial agents. HOCl is a key component of the inflammatory response, in addition to being bactericidal. However, it has also been associated with several human diseases. It is known that the cell membrane is permeable to it, which makes it capable of generating oxidation and chlorination of proteins, lipids and nucleic acids in tissues (Pennathur et al. 2010). In view of the great importance of studies on exogenous sources of antioxidants that collaborate in the deactivation of reactive hypochlorous acid species, tests were

131

carried out to verify the capacity of the peel and seed extracts of five varieties of jabuticaba to deactivate this reactive species. Thus, according to tables 1 and 2, the most effective extract for the deactivation of this reactive species was the SFP peel -1 -1 (IC50 9.24 µg mL ), followed by the SF peel extract (IC50 11.65 µg mL ), both from the 2015 crop. The extract with the least action on the deactivation of HOCl was that -1 of SF seed (IC50 50.32 µg mL ) from the 2014 crop. All the extracts tested here showed a good capacity to deactivate these reactive species, and the peel extracts from both the 2014 crop and the 2015 crop were more powerful in deactivating HOCl than were the seed extracts. Comparing the results obtained with the jabuticaba peel extracts analysed here with the work of Ribeiro, Chisté, Freitas, Da Silva, Visentainer & Fernandes (2014) who studied the fruit Psidium cattleianum, which belongs to the same family as the jabuticaba, we observed that the extracts of the jabuticaba peels had greater action on the deactivation of the HOCl than did the peels of Psidium cattleianum (IC50 32 µg mL-1). -1 Boeing et al. (2017) reported the deactivation of peel (IC50 2.10 µg mL ) and -1 seed (IC50 7.1 µg mL ) extracts of Bactris setosa fruit. These extracts showed greater efficiency in the deactivation of HOCl compared to the extracts of the peels and seeds of jabuticaba. The fruit Couepia bracteosa studied by Berto, Ribeiro, De Souza, Fernandes & Chisté (2015) showed deactivation of the hypochlorous acid -1 reactive species with the peel extract (IC50 25.3 µg mL ). This result suggests that this extract is less powerful in the deactivation of HOCl than the peel extracts of the jabuticaba studied here.

3.2. Superoxide •‐ O2 is formed chemically or enzymatically by transfer of an electron to the triplet oxygen (Miller, Pastor-Barriuso, Dalal, Riemersma, Appel & Guallaar, 2005).

Soon after its production, it is converted to H2O2 by the enzyme superoxide •‐ • - dismutase (SOD) at physiological pH. The O2 also reacts with NO to form ONOO , a powerful oxidizing and nitrosative agent (Almeida, Fernandes, Lima, Costa & Bahia •‐ • • 2009). Thus, even though O2 has low reactivity, its metabolites HOO , HO and

132

ONOO- are highly reactive and can cause damage to tissues (Valko, Leibfritiz, Moncol, Cronin, Mazur & Telser, 2007). Therefore, research on compounds that have the ability to deactivate this •‐ reactive species is extremely relevant. In this context, we performed a test of O2 deactivation; results from tables 1 and 2 show that the extracts produced from the seeds of the varieties SF and PF from the 2015 crop and the extract of the CFP from •- -1 the 2014 crop were the most powerful in deactivating O2 (IC50 18.87 µg mL , 16.15 µg mL-1 and 17.22 µg mL-1 respectively), followed by the extract from the PFP peel -1 from the 2015 crop (IC50 33.59 µg mL ). The extracts that showed the lowest activity •- in the deactivation of O2 was that of the PFP peel from the 2014 crop, followed by -1 - the extract of the PFP seed from the 2014 crop (IC50 71.50 µg mL and 62.03 µg mL 1, respectively). These results show that the extracts obtained from both the peel and seed of jabuticaba have excellent ability to deactivate this reactive species because even the •‐ result with lowest power in the deactivation of O2 (PFP peel 2014 crop IC50 71.50 µg mL-1) is more powerful than the result obtained from the peel extracts of Psidium -1 cattleianum (IC50 84 µg mL ) (Ribeiro et al., 2014). Boeing et al. (2017) evaluated the power of deactivation of extracts of Bactris •‐ setosa fruit under O2 . The values obtained for the peel and seed extract were IC50 65 µg mL-1 and 570 µg mL-1, respectively. Thus, this fruit is also less effective in the deactivation of this reactive species when compared to the extracts of the peel and seeds of the jabuticaba studied here. Berto et al. (2015) analysed the deactivation action of extracts of the Amazonian •‐ -1 fruit Quararibea cordata under O2 , obtaining a result of IC50 385 µg mL for the peel extract. The seed extract did not present any deactivation action for the superoxide radical. Again, the extracts of the peel and seed of the varieties of jabuticaba studied here showed a greater power of deactivation of this reactive species.

3.3. Peroxynitrite ONOO- is a strong oxidizing agent that can lead to oxidation and nitration of lipids, DNA fragmentation, nitration of amino acid residues of proteins, and oxidation of cysteine, methionine and other residues (Valko et al. 2007; Halliwell & Guteridge,

133

2007). The surprising stability of ONOO- contributes to its toxicity, as it allows diffusion away from its formation site, allowing it to react selectively with different cellular components (Beckman, Chen, Ischiropoulos & Crow,1994). In view of the poor effects of ONOO-, we performed tests to verify the efficiency of the peel and seed extracts of some varieties of jabuticaba to deactivate this reactive species in the presence and absence of bicarbonate (NaHCO3). In this way, the data in tables 1 and 2 show that the peel extracts are significantly more powerful than the seed extracts in ONOO- deactivation both in the presence and absence of NaHCO3. The peel extracts of CFP, HFP and SFP from the 2015 crops showed the greatest deactivation power of this reactive species in the absence -1 -1 -1 of NAHCO3 (IC50 3.84 µg mL , 4.09 µg mL and 3.89 µg mL , respectively).

Following the same line of the tests performed in the presence of NAHCO3, seed -1 extracts of CFP and HFP produced the best results (IC50 5.88 µg mL and 7.54 µg mL-1) from the 2015 crop. The seed extracts of PF and SF from the 2014 crop showed the smallest action - -1 in ONOO deactivation in the absence of NaHCO3 (IC50 63.81 µg mL and 58.94 µg -1 mL ). In the experiments performed in the presence of NaHCO3, the extracts with the least deactivation activity of the reactive species were those of the seeds of SF, HFP -1 -1 -1 and PF (IC50 69.02 µg mL , 67.46 µg mL , and 65.53 µg mL respectively) from the 2014 crop. Ribeiro et al. (2014) analysed the ability of Psidium cattleianum seed extract to - -1 deactivate ONOO in both the presence (IC50 55,00 µg mL ) and absence (IC50 12.1 -1 µg mL ) of NaHCO3. Comparing the values of the results of Ribeiro et al. (2014) with our results obtained for jabuticaba peel extracts, the strong ONOO- deactivation both in the presence and in the absence of NaHCO3 exerted by extracts of jabuticaba peels is evident. The extracts of the 2015 crop of the jabuticaba seeds also showed - greater power in ONOO deactivation in both the presence and absence of NaHCO3 when compared to the results reported by Ribeiro et al. (2014). However, the Bactris setosa fruit extracts of peels and seeds, analysed by Boeing et al. (2017), showed greater action in ONOO- deactivation in the presence -1 -1 -1 (IC50 8.1 µg mL and 1.49 µg mL , respectively) and absence (IC50 9.2 µg mL and

134

-1 1.01 µg mL ) of NaHCO3 when compared with the peel and seed extracts of jabuticaba investigated in the present work. The research of Berto et al. (2015) showed the deactivation effect of the peel and - seed extracts of the Quararibea cordata fruit on ONOO in both the presence (IC50 -1 -1 -1 49.4 µg mL and 37.6 µg mL , respectively) and absence (IC50 97.00 µg mL and -1 22.7 µg mL ) of NaHCO3. These results, when compared with those of the present study, make it clear that extracts from the peels of jabuticaba have greater action on - the deactivation of ONOO in both the presence and absence of NaHCO3. However, the extracts of the seeds of jabuticaba have the lowest action on ONOO- deactivation in both the presence and absence of NaHCO3.

3.4. Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) In general, ROO• and RO• are powerful oxidizing agents. These radicals have the ability to remove hydrogen from other molecules (Laguerre, Lecomte & Villeneuve, 2007). The ROO•s produced hydroperoxides by the abstraction of hydrogen from another fatty acid molecule. Most hydroperoxides are stable at room temperature, but heating, UV light or transition metals accelerate the heterolytic decomposition of hydroperoxides and result in peroxyl radical (Choe & Min, 2006). To understand the importance of research on exogenous sources of ROS deactivation, we performed experiments to verify the deactivation of extracts of the peels and seeds of some varieties of jabuticaba on ROO•. According to the data in tables 1 and 2, the extracts with most potent in combating this reactive species were the CFP peel (916.00 µmol TE g-1) from the 2014 crop, followed by extracts the peels of SFP (918.16 µmol TE g-1) and SF (839.72 µmol TE g-1), both from the 2015 crop. The extract with the least action against ROO- was the PF extracts (276.81 µmol TE g-1) from the 2014 crop. The extracts of the seeds of the jabuticaba varieties analysed here were also efficient in combating this reactive species. We can verify these results by comparing them with the results of Inata et al. (2015), who analysed the action of jabuticaba (Myrciaria jaboticaba), popularly known as Jabuticaba Sabara, in combating the ROO•. In this study, the following data were found: 827.00 µmol TE g-1 for the peel extract and 654.00 µmol TE g-1 for the seed extract. Comparing these results with those obtained in the present work, we can

135

verify that the extracts of CFP peels from the 2014 crop and those of SFP and SF both from the 2015 crop have greater action against ROO•. The seed extracts were very similar between the two works.

3.5. Hydrogen Peroxide

H2O2 can act as an oxidizing agent or as a reducing agent. Even if its reactivity is low, it can be cytotoxic at high concentrations, in addition to being involved in the production of the hydroxyl radical. It also exhibits easy diffusion within and between cells and can be transformed into reactive and highly harmful products, such as HOCl (Halliwell & Gutteridge, 2007) Considering the relevance of research on substances that have the capacity to deactivate H2O2, we performed tests to verify the capacity of deactivation of peels and seeds extracts of some varieties of jabuticaba under this reactive species.

Therefore, based on the data in tables 1 and 2, the most potent extract in H2O2 deactivation was SF seed (49.11% inhibition in the concentration of 125 µg extract mL-1), followed by the HFP seed (41.50% inhibition in the concentration of 125 µg extract mL-1), both from the 2015 crop.

For the deactivation of H2O2, the extracts of the seeds of the jabuticaba were significantly more powerful than the extracts of the peels, and those that were the least powerful were the peels of PF (2.64% inhibition in the concentration of 70 µg extract mL-1) and CFP (2.85% inhibition in the concentration 70 µg extract mL-1), both from the 2014 crop. However, all the extracts tested showed good action in the deactivation of hydrogen peroxide, considering that the concentration of 125 µg of SF seed extract per mL was able to deactivate 49.11% of this species and that the concentration of only 70 µg of extract from the peel SF per mL was able to deactivate 25.09% of

H2O2. This is supported by comparing the results obtained here with those of Berto et al. (2015), who tested the peel extracts (35% inhibition at the concentration of 1000 µg extract mL-1) and seed extracts (25.2% inhibition at the concentration of 1000 µg extract mL-1) of the Quararibea cordata fruit. This is also confirmed when compared with the research by Boeing et al. (2017), who analysed the deactivation action of the

136

seed extract (24% inhibition in the concentration of 1000 µg extract mL-1) of Bactris setosa fruit.

3.6. Principal Components Analysis (PCA) In the analysis of main components were analysed 12 variables that were subtitled for a better understanding of the results and visualization of the loadings • graphs: a) HOCl peel; b) HOCl seed; c) H2O2 peel; d) H2O2 seed; e) ROO peel; f) • - - - ROO seed; g) ONOO with Na2CO3 peel; h) ONOO without Na2CO3 peel; i) ONOO - •‐ •‐ with Na2CO3 seed; j) ONOO without Na2CO3 seed; k) O2 peel; and l) O2 seed. A first PCA was performed with all data for both crops, with the crops being used as a class on the score graphic to see if there was a difference between the two crops and to determine the variables responsible for this difference. The processing used was self-calling, and the number of main components used was four, which explained 89% of the variation of the data. Figures 1 (i) and (ii) show the scores and loadings graphs for principal components 1 and 2, which explained 53 and 19% of the data variation, respectively. It can be seen from the graph of scores in figure 1 (i) that the samples referring to the distinct crops were separated into two groups in main component 1, except for the sample CFP from the 2014 crop, which remained in the same group as the 2015 crop. Samples for the 2014 crop tended to get high scores in this component. If we look at the loadings graph in figure 1 (ii) for this PCA, we can verify that the variables that are responsible for this trendy are those that also have positive values for PC1: - - a) HOCl peel; b) HOCl seed; g) ONOO with Na2CO3 peel; h) ONOO without Na2CO3 - - •‐ peel; i) ONOO with Na2CO3 seed; j) ONOO without Na2CO3 seed; k) O2 peel; and l) •‐ O2 seed. Therefore, the samples of the 2014 crop in general showed higher values of these variables. On the other hand, the samples referring to 2015 crop present higher values in relation to the following variables c) H2O2 peel; d) H2O2 seed; e) ROO• peel; and f) ROO• seed. Two additional PCA models were then made for each crop separately (only samples from 2014 crop and only samples 2015 crop) to determine how the different varieties behaved in both crops. In this case, the matrices had the dimensions of 18 x

137

12 (samples x variables), and the variables and the legends were the same for all PCA models, as well as the pre-processing used (self-scaling). Figure 2 (iii) and (iv) show the scores and loadings graphs (PC1xPC2 explaining 48 and 35% of the data variation, respectively) for the samples from the 2014 crop, and figures 1 (v) and 1(vi) show the score and loading graphs (PC1xPC2 explaining 40 and 25% of the data variation, respectively) for the samples from the 2015 crop. Interesting considerations can be observed in both PCAs, for example, that the PFP variety is different from the others in both crops (as seen in the scores graphs of - Figure 1 (iii) and (v)). For the 2014 crop, the variables g) ONOO with Na2CO3 peel; - •‐ •‐ h) ONOO without Na2CO3 peel; k) O2 peel; and l) O2 seed are the main variables responsible for this differentiation, and for the 2015 crop, the main variables are a) •‐ HOCl peel; b) HOCl seed and l) O2 seed. It is also interesting to note that both samples that belong to the same variety (Sabará) but that were yielded by different producers, samples SFO (Casa Branca city) and SFP (Araçoiaba da Serra city) showed relatively different behaviours in both crops, demonstrating that the cultivation environment has great influence on the compounds produced by these fruits; climate change differences (edaphoclimatic factors), which directly affect the biosynthesis of the secondary compounds; and phenolic compounds. In general, the experiments in the principal component analyses were very important because they provided a general idea of how the different varieties behave in a single crop and the ability to visualize the differences in crops. Some low loadings (<0.4-0.5) indicated a low correlation of the variables with the samples. The results presented here are consistent because the extracts used for the analyses are total extracts, that is, without purification, and they thus contain different phenolic compounds in different proportions, being that in the peels, the major compounds are the anthocyanins, and within each phenolic compound is diversity. This implies that the responses to the different tests for ROS and RNS depend on the phenolic composition of each extract. The different responses obtained between the 2014 and 2015 crops are in agreement with the exposed idea. However, this does not diminish the importance of the results obtained here because comparing them with other

138

results of other fruits obtained extremely interesting values and show the promising capacity of deactivation of several ROS and RNS.

4. Conclusions Through the data obtained in this study, it was possible to verify the excellent action of both the extracts of the peels and the extracts of the seeds of the varieties of jabuticaba studied here in the deactivation of the reactive oxygen species HOCl, •- • - O2 , ROO and H2O2 and of the reactive nitrogen species ONOO . This demonstrates that jabuticaba is a great source of exogenous antioxidants and thus assists in preventing harm to the health of those who consume it. In this way, it shows a great potential for application in the enrichment of products already commercialized by the pharmaceutical, cosmetic and alimentary industries, as well as for the development of new products. The results presented here also suggest the important effect that the crop and the location have on the biosynthesis of the phenolic compounds of jabuticaba, which have a reflex in their deactivation action of ROS and RNS. Emphasizing that this work has enriched the literature with previously unpublished data.

Acknowledgements The authors are thankful to CNPq - Coordenação Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (process no. 145652/2014-9) for their financial support for this study and CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES Foundation, Brazil) for the financial assistance provided to the research laboratory. We are very grateful to Alessandra Braga Ribeiro for the training provided to our research team regarding ROS and RNS methodologies.

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CHAPTER 4

ARTICLE

Anthocyanin and non-anthocyanin phenolic composition from five jabuticaba variety skins using HPLC-DAD-ESI-MS/MS and their antiproliferative action on tumour cells of breast (MDA-MB-231) and prostate cancers (DU-145)

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Chapter 4

Abbreviated running title: Anthocyanin and non-anthocyanin phenolics from jabuticaba skins

Michelly Cristiane Paludoa e, Silvia Borges Pimentel de Oliveirab, Luciana Fontes de Oliveirac, Ronan Carlos Colombod, Sergio Gómez-Alonsoe, Isidro Hermosín-Gutiérreze, Cristiano Augusto Ballusf, Helena Teixeira Godoya,*. aDepartment of Food Science, Faculty of Food Engineering, University of Campinas (UNICAMP), Rua Monteiro Lobato 80, 13083-862, Campinas, SP, Brazil bDepartment of Structural and Functional Biology, State University of Campinas, Av. Bertrand Russel, CP 6109, 13083-865 Campinas, SP, Brazil. cLaboratório de Química Analítica "Henrique Bergamin Filho", Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA), Universidade de São Paulo, Av. Centenário, 303 - São Dimas, 13416- 000 – Piracicaba, SP, Brazil. dDepartament of Agronomy, Londrina Satate University, Celso Garcia Cid Road, km 380, P.O. Box 10.011, 86057-970, Londrina, Paraná, Brazil. eUniversidad de Castilla-La Mancha, Instituto Regional de Investigación Científica Aplicada, Avda. Camilo José Cela s/n, 13071 Ciudad Real, Spain. fDepartment of Food Science and Technology, Centre for Agrarian Sciences, Federal University of Santa Maria, Av. Roraima 1000, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil.

* Corresponding author. Phone: +55 19 3521 4024 E-mail address: [email protected]

*This manuscript was submitted to the journal “Food Research International”.

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Abstract Jabuticaba has been studied extensively, mainly regarding its phenolic composition. Although there are several varieties, research has been concentrated in Sabará and Paulista due to their greater dispersion. This study aimed to characterize five jabuticaba varieties in terms of their anthocyanin and non-anthocyanin phenolic compositions and their antiproliferative action on tumour cells of breast and prostate cancer. The most abundant of anthocyanins were cyanidin- 3-glycoside and delphinidin-3-glycoside. Three myricitin derivatives, 14 quercetin derivatives (including free quercetin), 13 ellagic acid derivatives (including free ellagic acid) and 4 methylellagic acid derivatives were detected. The variety that showed the best antiproliferative action was Pintada (PFP), which was harvested in the 2015 crop. This study characterized the anthocyanin and non-anthocyanin phenolic compounds profile of jabuticaba varieties not previously studied.

Key words Anthocyanins; jabuticaba; breast cancer; prostate cancer; apoptosis.

1. Introduction Jabuticaba fruit belongs to the small fruit group, which is composed of berry fruits. It is high in anthocyanins, the main phenolic compound responsible for its intense red to purple colour (Barbieri & Vizzoto, 2012). The attractive fruits and presence of phenolic compounds, mainly anthocyanins, with proven antioxidant action and possible effects related to health promotion (Xie et al., 2012), are among the factors that promote this fruit’s consumption. Antioxidant compounds act in living organisms through different mechanisms, such as metallic ion complexation, free-radical capture, peroxide decomposition, inhibition of enzymes responsible for the generation of reactive oxygen and nitrogen species, and modulation of cellular signals pathways (Vasconcelos et al., 2006). The growing interest in studying the actions of phenolic compounds and anthocyanins found in small fruit extracts is due to the inverse relationship between these fruits’ consumption and the incidence of cardiovascular disease (Rissanen et al., 2002; Xie et al., 2012) as well as other chronic diseases (Szajdek and Borowska, 2008). There is increasing evidence not only of their antioxidant capacity but also of the effects of these compounds on different types of cancer

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(Stoner et al., 2008; Roycelynn et al., 2012) and the immune system (Wang et al., 2010; Marzocchella et al., 2011). Cancer is the name given to a group of more than one hundred different types of diseases that have in common the disordered growth of abnormal cells with invasive potential (Tsao et al., 2004; INCA, 2014). Prostate cancer is among the most common tumours in the world, being considered a disease of the elderly (INCA, 2014). The long latency time of prostate cancer offers a wide window of opportunity for chemopreventive intervention by dietary agents such as foods containing antioxidant compounds (Gundala et al., 2014). Another cancer of great worldwide occurrence is breast cancer. It is the greatest cause of cancer death in women worldwide. The primary prevention of this neoplasm is a very promising area of research and interventions (INCA, 2014). Liu et al. (2013) showed that the anthocyanin cianidin-3-glycoside can inhibit proliferation of breast cancer cells. Similar results are described by Fang et al. (2014). A breast cancer cell lineage used in many studies is MDA-MB-231. According to Fung et al. (2013), this cell lineage is more susceptible to dietary interventions than other lines. A possible synergistic effect between anthocyanin and ellagitannin metabolites in reducing MDA-MB-231 cell proliferation was reported by Teixeira et al. (2017). The control and treatment of cancer have directed researchers to seek new control strategies, aimed at the improvement of non-conventional therapies. New drugs derived from medicinal plants have relevant roles in the treatment of cancer, and 40% of all antitumour drugs available between 1940 and 2002 originated from natural or semi-synthetic products (Butler, 2004). Considering all the possible health benefits of anthocyanin and non- anthocyanin phenolic compounds, the identification and quantification of these compounds in foods is extremely important. To carry out these studies with sensitivity and efficiency, it is necessary to use modern techniques, such as high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled to mass spectrometry (MS) (Lima et al., 2011; Daí & Mumper, 2010). It is possible carry out precise studies in jabuticaba fruits, since this fruit is a natural source of phenolic compounds, especially anthocyanins, and flavonols, gallotannins and ellagitannins. Consequently, jabuticaba is a source of antioxidant compounds that have possible effects in disease prevention and health promotion (Leite-Legatti et al., 2012; Wu et al., 2013). At this moment 32 phenolic compounds have been described in jabuticaba fruits, such as cyanidin-3-

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glycoside, delphinidin-3-glycoside, ellagic acid, and gallic acid (Alezandro et al., 2013). However, the studies are restricted to the Sabará and Paulista jabuticaba varieties. The present study aimed to characterize the phenolic profile of skins from five jabuticaba varieties (in two crop seasons): Sabará (Myrciaria jaboticaba (Vell.) O. Berg), Paulista (Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg), Coroada (Myrciaria coronata Mattos), Híbrida (Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg) and Pintada (Plinia spp.). We also assessed the skin extracts’ ability to decrease the proliferation of breast and prostate cancer cells.

2. Material and Methods

2.1. Chemicals All solvents were of HPLC-MS quality, all chemicals were of analytical grade (> 99%), and water was ultrapure (Mili-Q Direct 3 system (Millipore, Billerica, MA, USA)). To identify phenolic compounds, we used commercial standards from Phytolab (Vestenbergsgreuth, Germany): malvidin-3-glycoside and (-)-gallocatechin; Extrasynthese (Genay, France): cyanidin-3-glycoside, quercetin, myricetin and quercetin-3-glycoside; and Sigma-Aldrich (Tres Cantos, Madrid, Spain): (+)-catechin and (-)-gallocatechin 3-gallate. Some other, non-commercial flavonol standards (myricetin 3-glucoside and quercetin 3- glucuronide) were previously isolated from ‘Petit Verdot’ grape skins (Castillo-Muñoz et al., 2009). Quantification (milligrams per kilograms of dried skin) was performed as equivalents of the most representative compounds for each family of phenolic compounds: cyanidin-3- glycoside was used for anthocyanins; ellagic acid for ellagic acid and methylellagic acid derivatives; quercetin-3-rhamnoside for flavonols, flavonol 3-glycoside and its free- aglycones; (+)-catechin for flavan-3-ols (total proanthocyanidins); corresponding standards for flavan-3-ol monomers and dimers; and the total using the sum of (+)-catechin equivalents.

2.2 Samples Sabará (Myrciaria jaboticaba (Vell.) O. Berg) (SF) and Paulista (Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg) (PF) jabuticaba samples were provided by Faggan Farmers Group, located in Lagoa Branca, São Paulo (21°46'26" S, 47°05'11" W and 684 m of elevation) in October 2014 and 2015. Other samples of Sabará (Myrciaria jaboticaba (Vell.) O. Berg) (SFP), Coroada

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(Myrciaria coronata Mattos) (CFP), Híbrida (Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg) (HFP) and Pintada (Plinia spp.) (PFP) were provided by F.P. Frutas e Plantas, located in Araçoiaba da Serra, São Paulo, (23°30'19" S, 47°36'51" W and 625 m of elevation) in October 2014 and 2015. Jabuticaba samples were peeled off to separate flesh and skins, which were frozen at - 22 °C, freeze-dried, vacuum-packed and stored at -22 °C. The freeze-dried samples were ground to a fine and homogeneous powder to be used to prepare the extracts.

2.3 Extracts preparation and chromatographic analysis The extracts of the five jabuticaba varieties were prepared according to Paludo et al. (2017). The extracts were dried in a speed vac (Eppendorf Vacufuge Plus Vacuum Concentrator, Eppendorf) and resuspended in a specific solvent mixture for each chromatographic trial. For anthocyanin compounds analysis, the skin extracts were resuspended in HCl 0.1 N (1:10, v/v), filtered through a polyester membrane (0.20 μm, Chromafil PET 20/25, Macherey-Nagel, Düren, Germany), and directly injected onto HPLC equipment. To reduce the interference of anthocyanin compounds in flavonol analysis, the extracts from five jabuticaba varieties were previously purified by solid-phase extraction (SPE) according to Castillo-Munõz et al. (2007) with some adaptation. The extracts were passed through cartridges (6 mL, 500 mg, Bond Elute Plexa PCX, Agilent®); the anthocyanin-free fractions were eluted in ethanol. This eluate was dried in a rotary evaporator (35 °C), re- dissolved in 1.5 mL of 20% methanol, and directly injected onto the HPLC equipment. For flavan-3-ol isolation, the monomers, B-type dimers, and polymeric proanthocyanidins were isolated from the five jabuticaba varieties’ skins using SPE C18 (Sep- Pak Plus C18, Waters Corp., Milford, MA; 820 mg). A mixture of 2 mL of skin extract and 12 mL of ultrapure water was passed through a C18 cartridge previously conditioned with 5 mL of methanol and 5 mL of water. After the cartridge was dried under reduced pressure, methanol (15 mL) and ethyl acetate (5 mL) were added to recover adsorbed phenolics. Later, the solvent was evaporated in a rotary evaporator (35 °C), and the residue was dissolved in methanol (2 mL) and stored at -18 °C until needed.

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2.4 Tannins condensed by precipitation with methylcellulose The tannins were quantified according to the method of condensing tannins by precipitation with methylcellulose (Sarneckis et al., 2006).

2.5 HPLC–DAD–ESI-MSn identification and quantification of phenolic compounds from five jabuticaba varieties 2.5.1 Anthocyanins analysis The HPLC separation, identification and quantification of the anthocyanins were performed in an Agilent 1100 Series liquid chromatograph equipped with ion trap mass spectrometer. First, 10 µL of extract was injected on a C18 reverse-phase column (Zorbax Eclipse, 2.1 × 150 mm; 3.5 µm particle size, Agilent) at a controlled temperature of 40 °C (Rebello et al., 2013). The used solvents were a mixture of water:acetonitrile: formic acid (88.5:3:8.5, v/v/v, solvent A; 41.5:50:8.5, v/v/v, solvent B) and a flow rate of 0.19 mL min-1. The linear solvents' gradient for anthocyanin analysis was 0 min, 6%; 10 min, 30%; 30 min, 50%; 34 min, 100%; 36 min, 100%; 42 min, 6%. The ESI-MS/MS parameters were as -1 follows: positive ionization mode; dry gas, N2, 11 L min ; drying temperature, 350 °C; nebulizer, 65 psi; capillary, -2500 V; capillary out, 70 V; skimmer 1, 20 V; skimmer 2, 6 V; and scan range, 50–1200 m/z. For quantification we used the extracted chromatograms obtained at 520 nm, and the total anthocyanin concentration is expressed as cyaniding-3- glycoside equivalent (mg kg-1 of dry skin).

2.5.2 Non-anthocyanin analysis To analyse non-anthocyanin compounds, the same equipment described for anthocyanin analysis was used. First, 20 µL of SPE extract was injected on a C18 reverse- phase column (Zorbax Eclipse, 2.1 × 150 mm; 3.5 µm particle size, Agilent) at a controlled temperature of 40 °C (Rebello et al., 2013). The used solvents were Solvent A (acetonitrile:water:formic acid, 3:88.5:8.5, v/v/v), solvent B (acetonitrile:water:formic acid, 50:41.5:8.5, v/v/v), and solvent C (methanol:water:formic acid, 90:1.5:8.5, v/v/v). The flow rate was 0.19 mL min-1, and the linear solvents' gradient was 0 min, 98% A and 2% B; 8 min, 96% A and 4% B; 37 min, 70% A, 17% B, and 13% C; 51 min, 50% A, 30% B, and 20% C; 51.5 min, 30% A, 40% B, and 30% C; 56 min, 50% B and 50% C; 57 min, 50% B and 50% C; 64 min, 98% A and 2% B. For quantification we used the extracted chromatograms

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obtained at 360 nm, and the total concentrations of flavonols and ellagic derivatives are expressed as quercetin-3-rahmnoside (mg kg-1 of dry skin) and ellagic acid (mg kg-1 of dry skin) equivalents, respectively.

2.5.3 Identification and quantification of monomer content of flavan-3-ol and of total content and structural characteristics of oligomers (proanthocyanidins) using (SRM) selected reaction monitoring in HPLC-DAD-ESI-MS / MS The individual contents of flavan-3-ol monomers were analysed directly in the extracts. Structural information and estimation of the total proanthocyanidin (PA) content was obtained following the acid catalyzed depolymerization method and was assisted by pyrogallol (Lago-Vanzela et al., 2011a, 2011b; Rebello et al., 2013).

2.6 Statistical analysis of chromatographic trials All analyses were performed in triplicate, and the results are expressed as averages and standard deviations. Data were submitted to ANOVA, and the averages were compared by the Student-Newman-Keuls (SKN) test at α=0.05. Phenolic compound groups were also submitted to principal component analysis (PCA) using the statistical software SAS 9.0 and SPSS Statistics.

2.7. Tumour cell assays using skin extracts from five jabuticaba varieties

2.7.1. Extract preparation The extracts of the five jabuticaba varieties were prepared according to Paludo et al. (2017). The extracts were dried in a speed vac (Eppendorf Vacufuge Plus Vacuum Concentrator, Eppendorf) and resuspended in ultrapure water/dimethylsulphoxide (DMSO).

2.7.2. Cellular lineages We used cellular lineages established from prostate (DU-145) and breast cancers (MDA-MB-231). Cells were maintained in RPMI culture medium with 1 g/L glucose containing 10% foetal bovine serum (FBS) 10% and supplemented with 1% penicillin- streptomycin. Cell lineages were kept in a humidified oven at 35 °C and 5% CO2. Cell lineages were obtained from American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) as a

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donation from Prof Dr Hernandes Faustino de Carvalho, Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, SP, Brazil.

2.7.3. Experimental groups and treatments performed with five jabuticaba varieties’ skin extracts. Cell lineages of prostate (DU-145) and breast cancers (MDA-MB-231) were plated at a concentration of 9x104 cells per well (well trays = 96), filled with 100 L of culture medium (with FBS). After 24 hours, the culture medium was changed, and the cells were submitted to the treatments with the five jabuticaba varieties’ extracts at concentrations of 2.5, 25, 50 and 250 µg mL-1. Cells were submitted to a treatment with doxorubicin for 24, 48 (Leite-Legatti et al., 2012; Wang et al., 2014) or 72 hours. The extracts from the five jabuticaba skin varieties were diluted in culture medium without FBS, and the final concentration of DMSO was at most 0.2% to avoid harming cellular viability. Control groups consisted of cells cultivated in culture medium with DMSO and without FBS.

2.7.4. Mitochondrial activity assay (MTT) After each incubation period, the cell viability was assessed through the colorimetric thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), which is based on the cleavage of tetrazolium salt. This cleavage produces formazan, which is insoluble in water and presents a blue colour. The formazan is then solubilized in isopropanol and measured by absorbance in a spectrophotometer. The formazan produced in this reaction is directly proportional to the number of viable cells presents in the culture medium at the moment of the MTT was added (Tada et al., 1986). To the culture medium was added 10 L of solution prepared from 5 mg mL-1 of MTT. After that, the plate was kept in a humidified oven (95%) at 37 °C and 5% of

CO2 for three hours, and then 100 L of acidified isopropanol (isopropyl alcohol and hydrochloric acid) was added. Readings were performed after 10 minutes at 540 and 570 nm in a microplate reader (Denizot & Lang, 1986).

2.7.5. Statistical analysis of cellular trials The inhibitory concentration that decreased 50% the amount of reactive species in the tested medium by 50% (IC50) was determined using the software Graph Pad Prism 5. Data

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were submitted to ANOVA, and the averages were compared by Tukey’s test and the Student- Newman-Keuls test at α=0.05 using the statistical software Statistica 7.0.

3. Results and Discussion

3.1. Non-anthocyanin phenolic compounds from five jabuticaba varieties’ skins Using HPLC procedures on non-anthocyanins phenolic compounds identified several flavonoids, ellagic acid, and methylellagic acid. Among the identified flavonoids, the quercetin and myricetin derivatives were the most numerous. As shown in Tables 1 and 2, the identified and quantified compounds were three flavonol derivatives from myricetin (M): M- hex-1 (myricetin-hexose), M-hex-2 and M-rhm (myricetin-rhamnoside); 14 flavonol derivatives from quercetin (Q): Q-hex-1 (quercetin-hexose), Q-hex-2, Q-glcu (quercetin- glucuronide), Q-pent-1, Q-pent-2 and Q-pent-3 (quercetin-pentose isomers), Q-rhm (quercetin- rhamnoside), Q-galloyl-pent-1 and Q-galloyl-pent-2 (quercetin-galloyl-pentose isomers), Q-cm-hex-1 and Q-cm-hex-2 (quercetin-coumaroyl-hexose isomers), Q-fer-hex-1 and Q-fer-hex-2 (quercetin-feruloyl-hexose isomers), and Free-Q (free-quercetin); 13 derivatives from ellagic acid (EA): EA-hex (ellagic acid-hexose), EA-pent-1 and EA-pent-2 (ellagic acid-pentose isomers), EA-rhm-1 and EA-rhm-2 (ellagic acid-rhamnoside isomers), EA-ac-rhm-1 and EA-ac-rhm-2, (ellagic acid-acetyl-rhamnoside isomers), EA-valeryl-rhm-1, EA-valeryl-rhm-4, EA-valeryl-rhm-2 and EA-valeryl-rhm-3 (ellagic acid-valeryl-rhamnoside isomers), EA-caprilyl-rhm (ellagic acid-caprilyl- rhamnoside), and Free-EA (free-ellagic acid); and four derivatives from methylellagic acid (Me-EA): Me-EA-valeryl-rhm (methylellagic acid-valeryl-rhamnoside), Me-EA-caprilyl-rhm (methylellagic acid-caprilyl- rhamnoside), Me-EA-rhm (methylellagic acid-rhamnoside), and Me-EA-ac-rhm (methylellagic acid-acetyl-rhamnoside). The flavan-3-ol monomers that were identified and quantified were the phenolic compounds catechin, gallocatechin, epicatechin 3-gallate, gallocatechin 3-gallate and epigallocatechin 3-gallate. Three proanthocyanidins were estimated: mDP, galloylation (%) and prodelphinidin (%).

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Table 1. Anthocyanin and non-anthocyanin phenolic compounds identified by HPLC-DAD- ESI-MS/MS in the skin of five jabuticaba varieties.

MS Peak Assignation a Rt (min) UV-vis (nm) MS2 (m/z) (m/z) Flavonols

4 M-hex-1 (M-3-gal) 20.5 255; 265 sh; 305 sh; 352 479.2 316.9; 315.8

2 M-hex-2 (M-3-glu) 19.0 352,0 479.4 316.8; 315.8

5 M-rhm 24.6 255 sh; 261; 305 sh; 348 463.4 316.7; 316.0

9 Q-hex-1 (Q-3-gal) 27.5 256 sh; 262; 305 sh; 352 463.4 300.8; 300.1

11 Q-hex-2 (Q-3-glu) 29.6 353,0 463.4 300.8; 300.0

17 Q-glcu (Q-3-glucur) 39.6 352,0 463.4 300.8; 300.0

12 Q-pent-1 30.6 351,0 433.2 300.8

13 Q-pent-2 32.3 354,0 433.3 300.8

14 Q-pent-3 33.2 256; 262 sh; 310 sh; 350 433.4 300.8

15 Q-rhm (Q-3-rhm) 35.0 255; 260 sh; 305 sh; 348 447.4 300.8

16 Q-galloyl-pent-1 37.9 357,0 585.2 (433.4); 300.9

18 Q-galloyl-pent-2 40.7 357,0 585.2 (433.4); 300.9

23 Q-cm-hex-1 47.6 255 sh; 265; 295 sh; 314; 352 sh 609.3 463.0; 301.0

24 Q-cm-hex-2 47.7 265 sh; 295 sh; 314; 352 sh 609.3 462.9; 300.9

22 Q-fer-hex-1 47.0 255; 265 sh; 300 sh; 325; 352 sh 639.2 476.9; 462.9; 314.9; 300.8

25 Q-fer-hex-2 49.3 255; 265 sh; 295 sh; 328; 352 sh 639.2 477.0; 462.9; 315.1; 300.9

19 Free-Q 44.7 255; 265 sh; 300 sh; 371 301.0 299.8; 270.8; 254.7; 228.8; 178.7; 150.7

Ellagic derivatives

1 EA-Hex 15.6 254; 292 sh; 345 sh; 360 463.2 300.8

3 EA-pent-1 19.4 253; 292 sh; 345 sh; 358 433.3 300.8; 299.8

7 EA-pent-2 26.3 254; 295 sh; 348 sh; 359 433.4 300.7

8 EA-rhm-1 27.2 254; 261 sh; 303 sh; 348 sh; 359 447.5 300.8

10 EA-rhm-2 28.5 254; 260 sh; 290 sh; 348 sh; 362 447.4 300.6; 299.9 252; 262 sh; 308 sh; 345 sh; 361 sh; 20 EA-ac-rhm-1 45.8 489.3 299.8; 300.8 376 254; 260 sh; 295 sh; 336 sh; 345 sh; 26 EA-ac-rhm-2 50.0 489.3 299.8; 300.8 358 27 EA-valeryl-rhm-1 52.9 254; 260 sh; 300 sh; 348 sh; 361 531.4 488.9; 470.8; 300.8; 299.8

28 EA-valeryl-rhm-4 55.2 254; 260 sh; 300 sh; 348 sh; 361 531.2 488.9; 470.8; 300.8; 299.8

30 EA-valeryl-rhm-2 57.8 254; 260 sh; 305 sh; 355 sh; 373 531.3 470.9; 300.8; 299.7

31 EA-valeryl-rhm-3 57.9 254; 260 sh; 300 sh; 348 sh; 361 531.3 488.9; 471.0; 300.8; 299.8

33 EA-caprilyl-rhm 60.3 256; 265 sh; 297 sh; 345 sh; 360 573.3 531.5; 513.0; 300.7; 299.8

6 Free-EA 25.5 253; 292 sh; 355 sh; 367 301.3 300.8; 256.8; 228.7; 184.7

32 Me-EA-valeryl-rhm 59.4 253; 265 sh; 290 sh; 348 sh; 365 545.5 503.3; 485.0; 470.0; 442.3; 314.9; 299.9

34 Me-EA-caprilyl-rhm 61.6 255; 265 sh; 297 sh; 344 sh; 357 587.6 544.9; 527.0; 467.1; 315.2; 314.0; 300.1

21 Me-EA-rhm 46.8 253; 262 sh; 290 sh; 352 sh; 365 461.4 314.9; 300.3

29 Me-EA-ac-rhm 57.0 253; 260 sh; 290 sh; 351 sh; 365 503.2 460.7; 442.9; 428.2; 314.8; 299.9

Anthocyanins

a dp-3-glc 6.207 287; 523 465 303

b cy-3-glc 9.284 280; 516 449 287

c pt-3-glc 11.124 284; 506 433 271

d pg-3-glc 11.224 283; 520 479 317

e pn-3-glc 12.925 283; 518 463 301

f dp-3-acglc 14.393 280; 524 507 303

g cy-3-acglc 16.127 281; 519 491 287

h dp-3-cmglc 18.185 299; 528 611 303

i cy-3-cmglc 20.313 284; 314 sh, 440 sh; 520 595 287

154

j cy-3-ferglc 20.86 270; 331, 440 sh; 520 625 287 a M: myricetin derivatives, Q: quercetin derivatives, EA: ellagic acid, Me-EA: methylellagic acid, hex: hexose, pent: pentose, rhm: rhamnosis, gal: galactose, glu: glucose, ac: acetic acid, cm: p-coumaric acid, fer: ferulic acid, dp: delphinidin, cy: cyanidin, pg: pelargonidin, pn: peonidin, pt: petunidine, glc: glycoside, cmglc: coumaryl- glicoside, acglc: acetylglicoside, ferglc: feruloylglycoside.

155

Table 2. Anthocyanin and non-anthocyanin phenolic compounds contents obtained by HPLC-DAD-ESI-MS/MS for the skin of five jabuticaba varieties (mean ± standard deviation, n = 3).

Non-anthocyanin phenolic compounds

SF molar% PF molar% SFP molar% PFP molar% HFP molar% CFP molar%

Peak Assignation 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop

4 M-hex-1 ND 0.96 ± 0.05 b ND ND 1.10 ± 0.04 b 0.35 ±0.03 d ND 1.55 ± 0.33 a 0.58 ± 0.02 c ND 1.32 ± 0.24 a 0.88 ± 0.15 b

2 M-hex-2 ND ND ND ND ND ND 5.54 ± 1.69 b 14.28 ± 1.06 a ND ND ND ND

5 M-rhm 26.18 ± 2.22 c d 24.36 ± 2.20 d 38.93 ± 0.67 a 27.14 ±1.12 c d 32.12 ± 1.36 b 29.26 ± 0.69 b c 8.14 ± 1.41 g 14.70 ± 2.35 f 21.04 ± 0.47 e 16.64 ± 0.51 f 37.43 ± 3.30 a 29.44 ± 2.86 bc

9 Q-hex-1 2.15 ± 0.27 d 2.37 ± 0.33 d ND ND 2.29 ± 0.08 d 6.74 ± 0.42 c 9.21 ± 0.49 b 1.40 ± 0.18 e 13.22 ± 0.52 a ND ND ND

11 Q-hex-2 11.30 ± 0.68 d 13.49 ± 0.86 c 6.97 ± 1.06 e 10.12 ± 1.51 d 11.30 ± 0.13 d 10.09 ± 0.61 d 13.63 ± 0.46 c 15.36 ± 1.79 b 4.87 ± 0.04 f 6.29 ± 0.11 e 18.10 ± 0.67 a 18.22 ± 0.52 a

17 Q-glcu ND ND ND ND 0.40 ± 0.01 e ND ND ND 1.90 ± 0.03 b 5.69 ± 0.05 c ND ND

12 Q-pent-1 1.65 ± 0.07 f g 1.54 ± 0.13 f g 6.52 ± 0.45 b 7.83 ± 0.27 a 1.63 ± 0.09 f g 2.07 ± 0.61 e f 4.12 ± 0.42 d 2.72 ± 0.81 e 4.70 ± 0.18 c d 4.97 ± 0.20 c 0.76 ± 0.11 g 1.56 ± 0.50 f g

13 Q-pent-2 2.07 ± 0.26 d e 1.88 ± 0.23 d e 6.94 ± 1.62 b c 9.22 ± 2.35 a 2.10 ± 0.16 d e 3.65 ± 0.21 d 5.78 ± 0.51 c 8.30 ± 0.85 a b 5.78 ± 0.39 c 9.07 ± 0.40 a 0.75 ± 0.10 e 2.11 ± 0.11 d e

14 Q-pent-3 6.71 ± 0.86 d e 9.60 ± 2.72 d 15.02 ± 1.32 c 21.97 ± 5.05 a b 8.38 ± 0.93 d e 6.71 ± 0.45 d e 25.19 ± 2.18 a 21.20 ± 1.76 b 4.21 ± 0.33 e 6.04 ± 0.38 d e ND ND

15 Q-rhm 27.19 ± 2.08 b 22.16 ± 1.98 c d 19.64 ± 4.76 d 20.75 ±1.22 d 21.67 ± 0.92 c d 20.08 ± 0.64 d 8.48 ± 1.54 e 3.88 ± 0.86 f 23.84 ± 0.51 b c d 26.31 ± 0.86 b c 26.46 ± 2.74 b c 38.43 ± 2.33 a

16 Q-galloyl-pent-1 1.00 ± 0.09 b c ND 3.59 ± 1.28 a ND 0.86 ± 0.01 b c 0.25 ± 0.03 c 0.69 ± 0.21 b c 1.37 ± 0.19 b 0.43 ± 0.15 c 0.37 ± 0.10 c ND ND

18 Q-galloyl-pent-2 1.56 ± 0.05 b 1.58 ± 0.33 b ND ND 1.77 ± 0.08 b 0.78 ± 0.12 c ND ND 0.22 ± 0.02 d 0.43 ± 0.04 d 9.76 ± 0.07 b 6.98 ± 4.81 a

23 Q-cm-hex-1 0.77 ± 0.04 c d 1.52 ± 0.03 b ND 2.93 ± 0.69 a 1.54 ± 0.03 b 1.58 ± 0.05 b 1.30 ± 0.67 b c 1.32 ± 0.06 b c 1.02 ± 0.05 b c d 0.59 ± 0.01 d 1.76 ± 0.16 b 1.78 ± 0.24 b

24 Q-cm-hex-2 ND 0.52 ± 0.04 c ND ND 0.66 ± 0.07 b 0.95 ± 0.03 a ND ND 0.95 ± 0.01 a 0.41 ± 0.01 d ND ND

22 Q-fer-hex-1 ND ND 2.35 ± 0.20 a ND ND ND 2.19 ± 0.57 a ND ND ND ND 0.57 ± 0.03 b

25 Q-fer-hex-2 ND ND ND ND ND ND 0.87 ± 0.11 a ND ND ND ND ND

19 Free Q 19.37 ± 3.64 a 19.25 ± 2.93 a ND ND 14.10 ± 2.45 a b 17.08 ± 1.10 a 10.11 ± 4.32 b c ND 6.15 ± 1.61 c 7.31 ± 2.82 c 8.96 ± 3.06 c ND

Total flavonols (mg kg-1 DW skin, eq Q-rhm) 349.59 ± 13.33 e 679.57 ± 37.11 c 121.67 ± 6.87 g 140.84 ± 8.91 g 648.81 ± 13.87 c 1147.87 ± 27.04 b 449.06 ± 146.24 d 241.56 ± 42.82 f 1195.21 ± 60.42 b 1521.29 ± 58.10 a 522.67 ± 69.61 d 469.98 ± 28.63 d

1 EA-hex 6.99 ± 0.37 b 6.43 ± 0.17 b 1.41 ± 0.10 e 4.04 ± 1.22 c 6.24 ± 0.11 b ND 2.45 ± 0.01 d ND 12.44 ± 0.25 a ND 5.70 ± 1.47 b ND

3 EA-pent-1 1.95 ± 0.11 b 2.04 ± 0.21 b ND ND 2.50 ± 0.09 a ND ND ND ND ND 1.57 ± 1.09 d 1.58 ± 0.02 c

7 EA-pent-2 18.21 ± 0.79 e 19.94 ± 0.66 e 13.60 ± 1.18 f 20.31 ± 3.78 e 17.85 ± 0.35 e 36.59 ± 1.74 c ND 44.84 ± 1.96 b 36.42 ± 0.59 c 50.33 ± 1.11 a 24.58 ± 3.96 d 49.91 ± 3.32 a

8 EA-rhm-1 0.28 ± 0.01 e 0.54 ±0.09 e 2.05 ± 0.18 d 3.97 ± 0.98 b 0.21 ± 0.01 e ND 0.67 ± 0.37 e ND 6.04 ± 0.10 a ND 3.21 ± 0.68 c ND

10 EA-rhm-2 3.21 ± 0.05 b c d 3.23 ± 0.16 b c d 6.13 ± 0.12 b 4.19 ± 1.03 b c 3.78 ± 0.23 b 2.19 ± 0.39 b c d 16.89 ± 3.68 a 1.34 ± 0.44 c d 2.51 ± 0.05 b c d ND 0.65 ± 0.28 d ND

20 EA-ac-rhm-1 0.38 ± 0.04 b c 0.41 ± 0.01 b c 1.67 ± 0.08 a 1.32 ± 0.44 a 0.46 ± 0.02 b c 0.78 ± 0.05 b 1.31 ± 0.66 a 0.60 ± 0.05 b c ND ND 0.41 ± 0.17 c 0.30 ± 0.02 b c

156

Table 2. Continuation.

Non-anthocyanin phenolic compounds

SF molar% PF molar% SFP molar% PFP molar% HFP molar% CFP molar%

Peak Assignation a 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop

26 EA-ac-rhm-2 0.92 ± 0.05 e 1.09 ± 0.05 d 3.00 ± 0.02 a 2.09 ± 0.06 b 0.89 ± 0.01 e 0.82 ± 0.02 e ND 1.29 ± 0.0 c 0.26 ± 0.12 f ND ND 0.19 ± 0.0 f

27 EA-valeryl-rhm-1 0.27 ± 0.00 b 0.21 ± 0.01 b 0.55 ± 0.01 a 0.16 ± 0.01 b 0.20 ± 0.01 b 0.23 ± 0.01 b 0.63 ± 0.38 a 0.20 ± 0.01b 0.26 ± 0.14 b ND ND 0.21 ± 0.01 b

28 EA-valeryl-rhm-4 0.37 ± 0.02 c d 0.38 ± 0.01 b c 0.56 ± 0.01 a 0.16 ± 0.0 f 0.20 ± 0.00 e 0.36 ± 0.01 d ND 0.40 ± 0.01 b ND ND ND ND

30 EA-valeryl-rhm-2 0.27 ± 0.00 d e 0.30 ± 0.02 c d 0.86 ± 0.07 a 0.43 ± 0.02 b 0.34 ± 0.06 c 0.25 ± 0.01 d e ND 0.22 ± 0.01 e ND ND ND ND

31 EA-valeryl-rhm-3 ND ND 0.55 ± 0.01 a 0.32 ± 0.02 b 0.27 ± 0.03 c ND ND ND ND ND ND ND

33 EA-caprilyl-rhm 0.81 ± 0.03 d 0.96 ± 0.04 c 1.80 ± 0.07 a 1.03 ±0.0 b 0.83 ± 0.02 d 1.05 ± 0.06 b ND 0.68 ± 0.03 e ND ND ND ND

6 Free EA 66.29 ± 1.38 a b c 64.41 ± 1.33 a b c 69.71 ± 3.22 a b 60.51 ± 4.38 b c 66.15 ± 0.74 a b c 57.74 ± 1.66 c d 73.60 ± 11.07 a 49.40 ± 4.03 d e 42.56 ± 0.75 e 49.66 ± 1.11 d e 63.31 ± 5.71 a b c 48.00 ± 3.00 e

Total EA derivatives (mg kg-1 DW skin, eq. EA) 960.30 ± 37.50 d 1265.60 ± 22.60 b c 472.16 ± 7.15 f 1659.65 ± 61.32 a 1314.49 ± 25.83 b c 1123.68 ± 60.95 c d 376.57 ± 120.05 f 1210.01 ± 19.94 c 462.41 ± 23.98 f 683.33 ± 10.22 e 1497.69 ± 337.12 a b 1372.42 ± 15.80 b c

32 Me-EA-valeryl-rhm ND 47.27 ± 0.43 a ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

34 Me-EA-caprilyl-rhm 43.25 ± 1.52 f 52.72 ± 0.43 d 49.19 ± 1.19 e 60.87 ± 5.25 c 100.00 ± 0.00 a 100.00 ± 0.00 a ND 72.97 ± 1.94 b ND ND ND ND

21 Me-EA-rhm 56.74 ± 1.52 a ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

29 Me-EA-ac-rhm ND ND 50.80 ± 1.19 b 39.12 ± 5.25 c ND ND ND 27.02 ± 1.94 d 100.00 ± 0.00 a ND ND ND

Total Me-EA derivatives (mg kg-1 DW skin, eq. EA) 6.19 ± 0.15 c 5.39 ± 0.17 d 5.17 ± 0.14 d 8.26 ± 0.52 b 2.79 ± 0.04 e 2.58 ± 0.03 e ND 9.58 ± 0.78 a 0.04 ± 0.00 f ND ND ND

Flavan-3-ols monomers

(+)-catechin 53.15 ± 5.65 b c d 61.76 ± 3.50 a b 45.79 ± 5.11 d e 69.05 ± 7.48 a 59.54 ± 3.84 a b c 62.73 ± 3.55 a b 49.73 ± 2.47 b c d e 39.30 ± 2.54 e 48.48 ± 6.53 c d e 52.76 ± 3.53 b c d 62.13 ± 1.58 a b 60.79 ± 7.86 a b c

(−)-gallocatechin 36.61 ± 3.42 a b 27.85 ± 6.48 a b 40.35 ± 8.24 a ND 28.95 ± 2.03 a b 26.99 ± 4.11 a b 29.18 ± 7.62 a b 22.26 ± 3.76 b 41.37 ± 7.43 a 33.66 ± 6.29 a b 25.74 ± 2.21 a b 25.30 ± 9.56 a b

Epicatechin 3-gallate 4.59 ± 0.68 f 6.74 ± 1.65 d e f 10.45 ± 0.83 c d 24.14 ± 3.94 b 5.64 ± 0.21 e f 8.70 ± 1.04 c d e 6.31 ± 1.43 e f 24.68 ± 1.70 b 9.04 ± 0.58 c d e 10.78 ± 1.69 c 12.57 ± 1.07 c 28.88 ± 1.87 a

Gallocatechin 3-gallate 1.51 ± 0.23 d 1.90 ± 0.13 c d ND 10.15 ± 1.30 b 2.33 ± 0.53 c d 3.22 ± 0.25 c ND 12.67 ± 2.35 a 1.69 ± 0.18 c d 3.80 ± 1.66 c ND 10.12 ± 1.22 b

Epigallocatechin 3-gallate 6.08 ± 1.04 a ND 6.31 ± 2.21 a ND 2.87 ± 0.77 b ND ND ND ND ND ND ND

Total monomers (mg kg-1 DW skin, eq. Catechin) 0.21 ± 0.03 a 0.14 ± 0.03 b c 0.08 ± 0.02 d e 0.03 ± 0.01 f 0.15 ± 0.01 b 0.12 ± 0.02 b c d 0.06 ± 0.01 e f 0.04 ± 0.01 f 0.19 ± 0.03 a 0.11 ± 0.02 c d 0.10 ± 0.01 d 0.03 ± 0.01 f

Proanthocyanidins

mDP 11.37 ± 1.14 a 1.92 ± 0.04 c 2.35 ± 0.54 c 1.82 ± 0.10 c 4.66 ± 0.58 b 2.84 ± 0.30 c 2.54 ± 0.41 c 2.18 ± 0.07 c 2.84 ± 0.17 c 3.04 ± 0.83 c 2.75 ± 0.86 c 1.76 ± 0.27 c

Galloylation % 2.45 ± 0.39 c 5.95 ± 0.79 a b 8.80 ± 2.28 a 8.03 ± 1.70 a 4.51 ± 0.47 b c 5.80 ± 1.44 a b 3.95 ± 0.91 b c 8.21 ± 0.97 a 8.67 ± 0.13 a 8.81 ± 1.74 a 4.67 ± 1.42 b c 5.71 ± 0.34 a b

Prodelphinidin % 26.23 ± 0.60 a b 21.02 ± 0.19 a b 22.53 ± 3.72 a b 19.59 ± 3.57 b 27.49 ± 0.62 a 24.26 ± 2.37 a b 20.48 ± 2.72 a b 26.60 ± 2.42 a b 25.88 ± 0.40 a b 20.51 ± 1.20 a b 22.27 ± 3.77 a b 22.24 ± 4.43 a b

Total Proanthocyanidins (mg kg-1 DW skin, eq. 6.15 ± 0.61 a 1.10 ± 0.11 c d 0.59 ± 0.01 d 0.51 ± 0.10 d 2.56 ± 0.56 b 1.73 ± 0.62 b c 0.57 ± 0.07 d 0.52 ± 0.03 d 2.07 ± 0.42 b 2.27 ± 0.37 b 1.61 ± 0.84 b c d 0.56 ± 0.03 b c Catechin)

157

Table 2. Continuation.

Anthocyanin phenolic compounds

SF molar% PF molar% SFP molar% PFP molar% HFP molar% CFP molar%

Peak Assignation 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop

a dp-3-glc 16.46 ± 0.43 c 12.62 ± 0.07 h 27.15 ± 0.22 a 15.40 ± 0.33 e d 14.53 ± 0.19 f 13.97 ± 0.05 g 15.16 ± 0.35 e 23.13 ± 0.09 b 15.67 ± 0.20 d 13.99 ± 0.27 g 13.87 ± 0.23 g 12.21 ± 0.06 i

b cy-3-glc 82.52 ± 0.37 f 86.31 ± 0.11 b 72.13 ± 0.27 h 83.76 ± 0.36 d 84.63 ± 0.21 c 84.83 ± 0.06 c 84.15 ± 0.35 d 76.21 ± 0.09 g 83.26 ± 0.15 e 84.91 ± 0.26 c 85.09 ± 0.20 c 86.80 ± 0.04 a

c pt-3-glc 0.23 ± 0.02 c d 0.24 ± 0.001 c d ND 0.17 ± 0.01 d 0.05 ± 0.001 e 0.36 ± 0.01 b 0.21 ± 0.009 c d 0.36 ± 0.09 b 0.27 ± 0.006 c 0.36 ± 0.03 b 0.29 ± 0.008 b c 0.46 ± 0.04 a

d pg-3-glc 0.21 ± 0.01 a 0.13 ± 0.007 b ND ND 0.14 ± 0.009 b 0.07 ± 0.007 c ND ND ND ND ND ND

e pn-3-glc 0.35 ± 0.01 b 0.40 ± 0.005 a ND 0.26 ± 0.00 f 0.33 ± 0.002 c 0.33 ± 0.004 c d 0.16 ± 0.002 h 0.20 ± 0.003 g 0.31 ± 0.00 d 0.22 ± 0.01 g 0.27 ± 0.003 e 0.21 ± 0.01 g

f dp-3-acglc ND ND ND ND ND 0.06 ± 0.001 b ND ND ND 0.10 ± 0.007 a ND ND

g cy-3-acglc 0.09 ± 0.01 b 0.12 ± 0.03 b 0.11 ± 0.02 b ND 0.16 ± 0.06 b 0.15 ± 0.02 b 0.16 ± 0.03 b ND 0.39 ± 0.07 a 0.34 ± 0.04 a 0.11 ± 0.01 b 0.11 ± 0.003 b

h dp-3-cmglc ND ND 0.21 ± 0.02 a ND ND 0.03 ± 0.003 c ND ND ND ND 0.05 ± 0.00 b ND

i cy-3-cmglc 0.10 ± 0.01 c 0.11 ± 0.002 c 0.28 ± 0.02 a 0.30 ± 0.02 a 0.12 ± 0.001 c 0.12 ± 0.004 c 0.13 ± 0.01 c ND 0.07 ± 0.006 d ND 0.18 ± 0.003 b 0.11 ± 0.003 c

j cy-3-ferglc ND ND 0.10 ± 0.004 a ND ND 0.03 ± 0.006 c ND ND ND ND 0.04 ± 0.006 b ND

Total mg kg-1 DW skin, Eq. Cy-3-glc 4295.63 ± 593.16 e 10546.4 ± 289.98 b 1496.53 ± 68.86 g 1663.47 ± 25.91 g 7659.33 ± 1210.97 c 12174.33 ±480.39 a 6341.68 ± 685.69 d 3237.88 ± 355.60 f 4553.73 ± 304.71 e 5880.23 ± 113.85 d 7198.46 ± 211.69 c 4613.01 ± 307.74 e a M: myricetin derivatives, Q: quercetin derivatives, EA: ellagic acid, Me-EA: methylellagic acid, hex: hexose, pent: pentose, rhm: rhamnosis, gal: galactose, glu: glucose, ac: acetic acid, cm: p-coumaric acid, fer: ferulic acid, dp: delphinidin, cy: cyanidin, pg: pelargonidin, pn: peonidin, pt: petunidine, glc: glycoside, cmglc: coumaryl-glicoside, acglc: acetylglicoside, ferglc: feruloylglycoside. Means followed by the different letters in the same row differ by t test’s p>0.05. ND: non-detected.

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The major compound derivative from myricetin was M-rhm (peak 5), which presented an m/z ratio of 463 and an MS/MS fragmentation of 316. These results are in agreement with Neves et al. (2016). The jabuticaba varieties that presented the highest concentration of this compound in the skin were PF and CFP, both harvested in the 2014 crop season, whereas the lowest concentrations were recorded in PFP in both crop seasons and HFP in the 2015 crop season. Silva et al. (2017) found in Sabara jabuticaba skins 0.06 µg mL-1 of myricetin; on the other hand, Inata et al. (2015) reported 4.3 mg myricetin per 100 g of dried skin in Sabara jabuticaba. Peak 14, which presented an m/z ratio of 433 and an MS/MS fragmentation of 301, was a quercetin derivative (Q-pent-3). Peak 15 (m/z 447/301) also was a quercetin derivative (Q-rhm). These results are in agreement with Neves et al. (2016). Q-pent-3 and Q-rhm were the most representative quercetin derivatives in the five studied jabuticaba varieties. PFP in both crop seasons and PF harvested in 2015 presented the highest Q-pent-3 concentrations. On the other hand, this compound was not detected in the CFP jabuticaba variety. However, CFP presented the highest Q-rhm concentration, whereas the SFP and PF varieties in both crop seasons presented the lowest concentrations of this compound. Paulista and Sabara jabuticaba fruits presented, in molar percentage, 11.6 and 12.6% of Q-pent-3 and 26.5 and 26.9% of Q-rhm, respectively (Neves et al., 2016), similar to the molar percentage values reported in the present study for the same jabuticaba varieties. In Sabara jabuticaba skin extracts, Silva et al. (2017) reported that the quercetin content was 0.09 µg mL-1, whereas Inata et al. (2015) reported 3.5 mg of quercetin per 100 g of skin in the same jabuticaba variety, and Wu et al. (2012) detected in Sabara jabuticaba 11.57 mg of quercetin per 10 g of jabuticaba fruit extracts. The total flavonols (myricetin and quercetin derivatives) were expressed in mg per kg of dried skins as equivalents of Q-rhm. The highest total flavonol content was recorded in HFP jabuticabas harvested in 2015. In contrast, the PF jabuticaba variety in both crop seasons presented the lowest concentration of total flavonols. However, in all jabuticaba varieties studied there were considerable concentrations of myricetin and quercetin derivatives, as well as total flavonols. Due to the wide variety of standards used to express the concentrations of these compound classes, as well as the numerous techniques used to perform the chromatographic analyses, the comparison of results reported in other studies would not be satisfactory.

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Of ellagic acid (EA) derivatives, the principal compound recorded in all studied jabuticaba varieties was free ellagic acid (m/z 301/257). These m/z and fragmentation values were also described by Neves et al. (2016). PFP and PF jabuticaba varieties, both harvested in the 2014 crop season, presented the highest free EA concentrations. On the other hand, HFP jabuticaba in both crop seasons and the PFP and CFP jabuticaba harvested in 2015 showed the lowest free EA concentrations. The molar percentage of free EA reported in Paulista and Sabara jabuticaba fruit extracts were 64.7 and 72.4%, respectively (Neves et al., 2016). Similar results were described in our study for skin extracts from Paulista and Sabara jabuticaba. Alezandro et al. (2013) reported that Sabara jabuticaba had 40 mg of EA per 100 g of dried sample. Greater concentrations were reported by Plaza et al. (2016) and Inada et al. (2015) in the same variety: 142.8 and 178 mg of EA per 100 g of dried samples. The total of ellagic acid derivatives (milligrams per kilogram of dried skin, eq. EA) was measured in all studied varieties but was highest in PF jabuticaba harvested in 2015 and in CFP jabuticaba harvested in 2014. The PF, PFP and HFP jabuticaba varieties harvested in 2014 presented the lowest concentrations of total ellagic acid. In Paulista and Sabara jabuticaba fruits, Neves et al. (2016) reported a total concentration of ellagic acid equivalents of 152.7 and 294.3 mg kg-1. The concentrations reported by Neves et al. (2016) are lower than that recorded in this study, possibly due to the plants’ environmental conditions and cultural practices. Methylellagic acid derivatives (Me-EA) were also detected, with substituents similar to those found for ellagic acid derivatives. Quantitatively, all jabuticaba varieties presented higher concentrations of ellagic acid derivatives than methylellagic acid derivatives. In PFP (2014 crop season), HFP (2015 crop season) and CFP (2014 and 2015 crop seasons), Me-EA derivatives were not detected. The highest concentration of total Me-EA was recorded in PFP jabuticaba harvested in 2015. Me-EA (EA equivalent) total concentrations of 2.85 and 1.96 mg kg-1 of jabuticaba fruits were reported for Paulista and Sabara jabuticaba (Neves et al., 2016). The results presented by Neves et al. (2016) were considerably lower than the results found for the same varieties in the present study. A few condensed tannins (flavan-3-ols) were detected. Catechin was the main monomeric flavan-3-ol detected in all jabuticaba varieties, and the varieties that presented the highest concentrations of this compound were PF (harvested in 2015), SFP and CFP (both harvested in 2014 and 2015). On the other hand, PF (harvested in 2014) and PFP (harvested in

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2014 and 2015) jabuticaba varieties presented the lowest concentration of catechin. In Sabara jabuticaba, Silva et al. (2017) reported a catechin concentration of 0.13 µg mL-1 of skin aqueous extract. The total monomeric flavan-3-ols were expressed in catechin equivalents in milligrams per kilogram of dried skin. The varieties that presented the highest concentration were SF and HFP, both of the 2014 harvest. The 2015 PF and CFP and both PFP crops presented the lowest concentrations of this compound. The reaction with pyrogallol induces the depolymerization of condensed tannin molecules. After this reaction, the catechin concentration increased, suggesting that these compounds can be found polymerized in larger molecules. Polymerization is related to loss of astringency (Fulcrand et al., 1996), which is favourable to improve the fruits’ flavour. It is especially interesting that this was observed in Sabara jabuticaba, which is widely used in technological procedures to manufacture food products. The main proanthocyanidinin isolated was prodelphinidin. No two studied jabuticaba varieties differed statistically in their concentrations of these compounds. The total proanthocyanidinins (catechin equivalents) were expressed in milligrams per kilogram of dried skin. SF jabuticaba harvested in 2014 had the highest concentration of total proanthocyanidinins. PF and PFP jabuticabas (in both crop seasons) presented the lowest concentration of proanthocyanidinins. In Sabara jabuticaba a proanthocyanidinin A2 concentration of 0.12 µg mL-1 of skin aqueous extract has been reported (Silva et al., 2017). The total condensed tannin content (Table 3) was also measured, and the varieties that presented the highest concentration were SFP and PFP, both from the 2015 harvest, while PFP (2014 crop season) showed the lowest content of this compound.

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Table 3. Total condensed tannins contents in the skin of five jabuticaba varieties (mean ± standard deviation, n = 3) a.

2014 Crop 2015 Crop Sabará Fagan (SF) 123.72 ± 9.44 A d 134.35 ± 18.28 A c d Paulista Fagan (PF) 137.42 ± 20.07 A c d 183.70 ± 5.08 B b Sabará F.P (SFP) 180.20 ± 8.33 A b 194.30 ± 28.47 A a b Pintada F.P (PFP) 57.18 ± 4.48 A e 217.37 ± 4.84 B a Hibrida F.P (HFP) 109.32 ± 5.94 A d 155.32 ± 13.96 B c Coroada F.P (CFP) 115.61 ± 7.89 A d 113.80 ± 13.92 A d aMean values expressed in mg g-1 of d.w skin, eq. Epicatechin. Columns followed by the same capital letters did not differ statistically (comparison between crop seasons, p˂0.05), and rows followed by the same lower case letters did not differ statistically (comparison among varieites, p˂0.05).

Analyses of total flavan-3-ols (total proanthocyanidins) and total condensed tannins were performed because although these denominations are theoretically equivalent, the structural complexity of the polymerized flavan-3-ols is enormous, and these denominations try to describe a complex group of substances with chemical properties that differentiate them. Thus, proanthocyanidins are polymers of the flavan-3-ols, which under strong oxidative conditions (6 N HCl medium and temperature at 100 °C for 2 hours) are depolymerized. This behaviour shows the proanthocyanidins in which the flavan-3-ol units are bound by "B-type" bonds (interflavan bonds between positions C-4 and C-8, especially the different flavan-3-ol molecules). This type of binding breaks down in the depolymerization assay with pyrogallol. There are also other types of interflavan bonds, such as those of type "A", which do not break under the conditions of the pyrogallol assay. The condensed tannins, however, are polymers of flavan-3-ols, which have the property of precipitating proteins and other polymers, such as methylcellulose. For this reason, we performed the precipitation assay with methylcellulose, that is, to estimate the total content of condensed tannins. Oligomers (polymers with few structural units) only cause precipitation of the methylcellulose. For all non-anthocyanin phenolic compounds, differences were observed between the years of harvests in most of the samples studied. This happened due to the edaphoclimatic factors that strongly influenced the synthesis of these compounds in the plants; in the year 2014 a severe drought occurred throughout Brazil. Thus, the fruits collected in the 2014

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harvest suffered a much greater stress than the fruits collected in the harvest of 2015, which was a relatively normal year in terms of rainfall.

3.2. Anthocyanin phenolic compounds from five jabuticaba varieties’ skins The identified anthocyanins were delphinidin-3-glycoside (dp-glc), cyanidin-3- glycoside (cy-glc), petunidine-3-glycoside (pt-3-glc), pelargonidin-3-glycoside (pg-3-glc), peonidin-3-glycoside (pn-3-glc), delphinidin-3-acetylglycoside (dp-3-acglc), cyanidin-3- acetylglycoside (cy-3-acglc), delphinidin-3-coumaroylglycoside (dp-3-cmglc), cyanidin-3- coumaroylglycoside (cy-3-cmglc) and cyanidin-3-feruloylglycoside (cy-3-ferglc). The presence of anthocyanins derived from the anthocyanidins delphinidin (Dp), cyanidin (Cy), petunidin (Pt), pelargonidin (Pg) and peonidin (Pn) was detected by molecule fragmentation, resulting in ions with m/z of 303, 287, 271, 317 and 301, respectively. The identification of the monoglycosylated structures occurred from the fragmentation patterns observed in the MS/MS spectra, in which only one type of fragment was observed, characterizing the loss of a neutral fragment corresponding to one glucose (162 Da). In the case of cy-3-coumaroylglycoside, the loss of a neutral fragment corresponding to a cumaroylglycosis (308 Da) was observed. The identification of cy-3-coumaroylglycoside was confirmed by the corresponding UV-Vis spectrum, in which a typical peak of coumaryl residue appeared at the 314 nm wavelength. All results of the identification of anthocyanin phenolic compounds can be found in Table 1. The chromatogram of said compounds is available in supplementary Figure S1.

Figure S1. Anthocyanins profile (DAD, 520 nm) recorded in SFP jabuticaba skins from 2015 crop (all anthocyanins).

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The most commonly detected anthocyanin was cy-3-glc, followed by dp-3-glc. These results corroborate Inada et al. (2015), Leite-Legatti et al. (2012) and Plaza et al. (2016). The same result was reported in jabuticaba fruits the pn-3-glc (Trevisan et al., 1972). CFP jabuticaba harvested in 2015 presented the highest concentration of cy-3-glc, and PF jabuticaba harvested in 2014 showed the lowest concentration of this compound. For dp-3- glc, the highest concentration was recorded in PF jabuticaba harvested in 2014, whereas the lowest concentration of this compound was observed in CFP jabuticaba harvested in 2015 (Table 2). Neves et al. (2016) reported cy-3-glc and dp-3-glc molar percentages in jabuticaba skins of, respectively, 75.1 and 23.7% in Paulista jabuticaba and 80.5 and 18.4% in Sabara jabuticaba. These results corroborate those recorded in the present study. Alezandro et al. (2013) reported in Sabara jabuticaba 123 mg of cy-3-glc per 100 g of dried sample and 23.5 mg of dp-3-glc per 100 g of dried sample. Silva et al. (2017) found in Sabara jabuticaba skins 8.96 µg mL-1 (cy-3-glc) and 0.465 µg mL-1 (dp-3-glc). Inada et al. (2015) reported values of 1261 mg of cy-3-glc per 100 g of dried skin and 269 mg of dp-3-glc per 100 g; and Wu et al. (2012) reported 29.80 mg of cy-3-glc per 10 g of jabuticaba fruits and for dp-3-glc 7.36 mg per 10 g. Anthocyanin phenolic compounds were expressed in cy-3-glc equivalents (milligrams per kilogram of dried skin). SFP jabuticaba harvested in 2015 presented the highest concentration of total anthocyanins; whereas the lowest concentration of this compound was recorded in PF jabuticaba from both crop seasons. In Paulista jabuticaba, Neves et al. (2016) reported 331.7 mg of cy-3-glc eq. per kg of fruits and 1057.7 mg of cy-3-glc eq. per kg of fruits. These results are lowest than those found in the present study. For the anthocyanin phenolic compounds, the same phenomena mentioned above for non-anthocyanin phenolic compounds was observed. That is, differences were observed between the years of harvests in most of the samples studied. This was due to edaphoclimatic factors which strongly influence the synthesis of these compounds in plants.

3.3. Principal component analysis (PCA) of anthocyanin and non-anthocyanin phenolic compounds from five jabuticaba varieties’ skins Principal components analysis was used in this work to compare the samples in relation to the analysed compounds. As the number of samples (36) and the number of

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variables were relatively large, the use of only the tables without the use of PCA would become laborious and in some cases very difficult. The results obtained for the analysis of anthocyanins were organized in a data matrix where each the samples of the different varieties analysed in the two harvests were listed in the rows and the 10 anthocyanins found were listed in the columns, creating a 36x10 matrix (samples x variables). The data matrix was used in PCA, and the different varieties were used as a class in the score graphic (Figure 1 (a)) to see if there was a difference and what variables were responsible for this difference based on the loading plot analysis (Figure 1 (b)). The pre- processing used was self-scaling, and the number of main components used was 4, which explained 86.5% of the variation of the data.

Gráfico de loadings Gráfico de Scores 0.6 4 HFP dp-3-acglc SF/SFP 0.4 cy-3-acglc s2 s2 3 PF pg-3-glc s2 PFP 0.2 CFP cy-3-ferglc 2 dp-3-glc 0 s1 cy-3-glc dp-3-cmglc 1 s1 s1 s2 s2 s1 -0.2 cy-3-cmglc s1 s2 s1 s1 s2 s1 s1 0 s2 PC2(17.78%) pn-3-glc PC2 (17.78%) s2 -0.4

s2s2 pt-3-glc -1 s2 -0.6 s2 s1 s2 s1 s1 -2 -0.8 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 PC 1 (45.36%) PC 1 (45.36%) (a) (b) Gráfico de Scores Gráfico de Loadings s2 s2 s2 CFP s2 Antocianinas s1 s2 s2 HFP s2 s1 PFP Flavonóis s1 s1 s1 s1 PF Derivados de ácido elágico s1 SF/SFP 2 s1 0.4 s1 s2 1 s1 Taninos s1 0.2 condensados 0 s2 Monômeros -1 s2 s1 2 0 -2 s1 1 -0.2 Proantocianidinas PC3 (19.33%) -3 0 0.4 PC3(19.33%) Derivados de 0.2 2 -1 PC 1 (37.24%) -0.4 1 ácido metil elágico 0 PC 1 (37.24%) -0.2 0 -2 0.4 -1 0.2 -0.4 0 -0.2 PC 2 (23.40%) -2 -3 PC 2 (23.40%)

(c) (d) Figure 1. (a) Scores (PC1xPC2) to anthocyanin phenolic compounds from five jabuticaba varieties, 2014 crop (S1) and 2015 crop (S2). (b) Loadings graphic (PC1xPC2) to anthocyanin phenolic compounds from five jabuticaba varieties, 2014 crop (S1) and 2015 crop (S2). (c) Scores (PC1xPC2) to total anthocyanin and non- anthocyanin phenolic compounds from five jabuticaba varieties, 2014 crop (S1) and 2015 crop (S2). (d)

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Loadings graphic (PC1xPC2) to total anthocyanin and non-anthocyanin phenolic compounds from five jabuticaba varieties, 2014 crop (S1) and 2015 crop (S2).

The first principal component (PC1) represented 45.3% of the total variation. PC1 divided all jabuticaba varieties as a function of the different crop seasons; this effect was more evident in the PF jabuticaba samples. However, PC1 could be used to explain the PF sample replicates from 2014 crop. The 2014 crop was predominantly on the right of the graphic, except PFP jabuticaba, which showed the highest proportions of cy-3-cmglc, dp-3-cmglc, cy- 3-ferglc and dp-3-glc. The second principal component explained HFP jabuticaba from the 2015 crop. In relation to anthocyanin groups, these samples (PF jabuticaba from 2014 crop and HFP jabuticaba from 2015 crop) differed from the other analysed samples. The PF sample from 2014 crop contained high values of the anthocyanins cy-3-cmglc, dp-3-cmglc, cy-3-ferglc and dp-3-glc, as can be verified in the loadings graphic (Figure 1 (b)). However, in the 2015 crop this did not hold true for this same variety. The HFP sample presented high dp-3-acglc, cy-3-acglc and pg-3-glc concentrations when harvested in 2015, which was not true for the first harvest (2014 crop). Principal component analysis was also used for a better visualization of non- anthocyanin phenolic compounds. In this case the data matrix used was of 36x42 dimensions: 36 samples and 42 variables (non-anthocyanic phenolic compounds). The data were self- scaled prior to analysis, and the number of principal components used was 5, which explained 71% of the data variation. The scores and loading graphics are available in Figure 2 (a) and (b), respectively.

Gráfico de Scores 6 s1 CFP 5 s1 HFP s1 PFP 4 PF SF/SFP s1 3 s1 s2 2 s2 s1 s1 s1 1 s2 s2 s1 s2 s1 s1 0

s1 PC2(16.30%) s1 -1 s2 s1 s2 s1 -2 s1 s2 s2 -3 s2 s2 s2 s2 s2 -4 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 PC1 (21.90%) (a)

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Gráfico de Loadings 0.3 Free-Q EA-pent-1 mDP galato de epigalocatequina Me-EA-rhm free EA 0.2 M-rhm galocatequina EA-valeryl-rhm-4 EA-hex Me-EA-caprilyl-rhm EA-caprilyl-rhm 0.1 Q-rhm prodelfinidinas EA-valeryl-rhm-2 catequina EA-valeryl-rhm-1 Q-galloyl-pent-1 Q-cm-hex-2 Q-galloyl-pent-2 EA-rhm-2 EA-valeryl-rhm-3 EA-ac-rhm-2 0 M-hex-1 Q-hex-1 Q-fer-hex-1 Q-fer-hex-2 EA-ac-rhm-1 -0.1 Q-cm-hex-1 EA-rhm-1 Q-pent-3 PC2(16.30%) Q-glcu Me-EA-ac-rhm-1 M-hex-2 EA-pent-2 -0.2 galato de galocatequina Q-pent-1

galato de epicatequina galoilação Q-pent-2 -0.3

-0.4 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 PC 1 (21.90%)

(b) Figure 2. (a) Scores (PC1xPC2) to non-anthocyanin phenolic compounds from five jabuticaba varieties, 2014 crop (S1) and 2015 crop (S2). (b) Loadings graphic (PC1xPC2) to non-anthocyanin phenolic compounds from five jabuticaba varieties, 2014 crop (S1) and 2015 crop (S2).

By analysing the score graphic (Figure 2 (a)), a trend of separation between the different varieties of jabuticaba analysed in relation to non-anthocyanin phenolic compounds was observed. The PF jabuticaba (2014 crop) showed the greatest difference in relation to the other analysed varieties. In addition, the CFP jabuticaba (for both crops) showed a subtle difference from the other samples. Another relevant piece of information that can be obtained from the graphic of scores (Figure 2 (a)) is the difference in PC1 between the different harvests. All samples from 2014 are shifted to the right of the graphic. In regard to the compounds that were responsible for this differentiation (loading graphic analysis - Figure 2 (b)), it can be seen that the weights for most of the compounds were close, and it was not possible to identify a single compound that was responsible for the differentiation among samples. A third PCA was performed using the total compounds: anthocyanin phenolic compounds and non-anthocyanin phenolic compounds (flavonols, ellagic acid derivatives, methylellagic acid derivatives, monomers of flavan-3-ols, proanthocyanidins and condensed tannins) from different jabuticaba varieties (2014 and 2015 crops). The data matrix used in this analysis comprised 36 lines (samples) and 7 variables (36x7). The pre-processing used was self-scaling, and the number of components used was 4, which explained 90% of the data total variation. Figure 1 (c) and 1 (d) show the scores and loading graphics for PCA

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(PC1xPC2xPC3). The percentage of variation explained was 37%, 23% and 19% for PC1, PC2 and PC3, respectively. By analysing the score graphic (Figure 1 (c)), it can be seen that the SF and SFP samples (both crops) were well grouped, and the loading graphic shows that the variables responsible for this grouping were anthocyanins, flavonols, ellagic acid derivatives and condensed tannins. In addition, the PFP and PF jabuticaba varieties from the 2015 crop showed a relative difference from the others due to the proanthocyanidins and methylellagic acid derivatives. All the other samples presented contrary behaviour to the SF and SPF jabuticaba varieties, that is, they had a smaller influence in relation to the total compounds considered in the analysis. Regarding the both crop seasons, the crops showed a great differentiation in certain varieties, e.g., PFP jabuticaba variety, and for other jabuticaba varieties this differentiation was more subtle, e.g., HFP jabuticaba variety. However, it must be noted that it was possible to observe this distinction between the different crops in all varieties.

3.4. Antiproliferative effect of extracts from five jabuticaba varieties’ skins on prostate and breast tumour cells Results from mitochondrial activity assays (MTT) in prostate (DU-145) and breast tumour cells (MDA-MB-231) submitted to jabuticaba skin extracts are available in Table 4.

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-1 Table 4. Results of treatments carried (MTT) out with skin extracts from five jabuticaba varieties and reference drug expressed in IC50 (µg mL of extract)a.

Variety DU-145 MDA-MB-231

24 hours 48 hours 72 hours 24 hours 48 hours 72 hours

2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop 2014 Crop 2015 Crop

Sabará Fagan (SF) 87.63 ± 6.13 b A 58.62 ± 3.45 b B 77.49 ± 1.78 d A 71.63 ± 2.61 a B 74.52 ± 14.54 d e A 52.42 ± 3.58 a A 76.37 ± 2.45 c A 62.91 ± 4.31 b c B 70.21 ± 2.24 c A 78.29 ± 1.42 a B 52.70 ± 6.82 c A 51.28 ± 3.74 b A

Paulista Fagan (PF) 44.00b% ± 5.80 c d A 81.02 ± 4.19 a B 97.54 ± 4.70 c d A 60.00 ± 7.47 b B 93.64 ± 1.22 b c A 52.17 ± 0.28 a B 109.46 ± 3.35 b A 59.48 ± 6.80 b c B 65.79 ± 1.65 c A 58.29 ± 4.99 b A 59.24 ± 6.74 b c A 50.23 ± 0.94 b c A

Sabará F.P (SFP) 41.88b% ± 1.00 c d A 47.86 ± 2.68 b c B 119.93 ± 3.09 b A 32.72 ± 1.43 d B 84.6 ± 4.60 c d A 32.24 ± 0.72 c B 55.07 ± 2.59 c d A 50.62 ± 4.99 c A 47.97 ± 3.76 d A 38.00 ± 2.67 c B 48.22 ± 5.01 c A 57.63 ± 5.28 b A

Pintada F.P (PFP) 22.66b% ± 2.12 e A 47.88 ± 8.66 b c B 197.23 ± 17.70 a A 13.71 ± 0.71 e B 232.20 ± 2.30 a A 29.73 ± 0.70 c B 150.76 ± 14.83 a A 25.86 ± 5.88 d B 108.56 ± 7.10 a A 39.84 ± 2.04 c B 79.72 ± 9.04 a A 38.89 ± 1.91 c B

Hibrida F.P (HFP) 48.23b% ± 2.45 c A 58.85 ± 9.61 b B 112.3 ± 5.30 b c A 44.50 ± 2.03 c B 104.15 ± 7.62 b A 44.54 ± 0.86 b B 138.76 ± 12.53 a A 107.54 ± 9.57 a B 91.08 ± 4.56 b A 56.87 ± 3.55 b B 72.70 ± 5.68 a b A 75.39 ± 8.76 a A

Coroada F.P (CFP) 104.51 ± 6.14 a A 36.35 ± 2.16 c B 54.84 ± 6.06 e A 30.18 ± 2.47 d B 59.37 ± 0.82 e A 29.74 ± 1.3 c B 45.43 ± 3.02 d A 70.59 ± 6.91 b B 39.75 ± 2.77 d A 40.76 ± 3.94 c A 52.66 ± 1.75 c A 52.22 ± 0.47 b A

Doxorubicin 38.97c% ± 1.35 d A 0.31 ± 0.10 d B 0.29 ± 0.03 f A 0.17 ± 0.14 f A 0.47 ± 0.03 f A 0.44 ± 0.13 d A 23.61c% ± 2.17 e A 15.98c% ± 4.50 e A 30.93c% ± 1.67 e A 47.66c% ± 1.36 d B 16.96 ± 0.14 d A 0.13 ± 0.11 d B

Solvent / vehicle 0b% ± 0 e A 32.36b% ± 4.04 e B 9.91b% ± 2.67 g A 18.97b% ± 1.01 e B 17.72b% ± 2.77 g A 21.29b% ± 2.43 e A 0b% ± 0 f A 7.51b% ± 2.19 f B 0b% ± 0 f A 13.23b% ± 4.02 e B 0b% ± 0 e A 4.97b% ± 1.31 e B

Columns followed by the same capital letters did not differ statistically (comparison between crop seasons, p˂0.05), and rows followed by the same lower case letters did not differ statistically (comparison among varieites, p˂0.05).

IC50 average ± standard deviation n=3.

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The jabuticaba skin extracts from 2015 showed a greater decrease in cellular proliferation in DU-145 and MDA-MB-231 tumour cells in the three treatment times tested (24, 48 and 72 hours). For DU-145, the best treatment times were 48 and 72 hours. PFP jabuticaba from 2015 presented the highest efficiency in all studied times for controlling DU- 145 and MDA-MB-231 tumour cell proliferation, whereas unsatisfactory results were recorded for this same jabuticaba variety harvested in 2014. In MDA-MB-231 tumour cells under 24 and 48 hours of treatment, the extracts from all jabuticaba varieties analysed in both crop seasons were more efficient in controlling the cellular proliferation than the drug doxorubicin. The antiproliferative effect of the Sabara jabuticaba polar extract under the breast cancer cell linages (MCF7) and prostate cancer (PC-3) can be achieved with 181.2 GI50 -1 -1 μg mL of extract and > 250 GI50 μg mL of extract, respectively (Leite-Legatti et al., 2012). Thus, the results obtained for the two cell linages analysed are very promising, since all the varieties analysed in both crops showed an effect in decreasing cellular proliferation. This encourages new studies to elaborate a drug from this fruit that is so well known and abundant in Brazil. Few studies have reporting the antiproliferative effects of jabuticaba varieties under tumour cells, and the rare existing studies were carried out with Sabara jabuticaba.

4. Conclusions The different jabuticaba varieties’ phenolic compositions included a great variety of compounds, mainly flavonols and anthocyanins. The results obtained on tumour cell proliferation (DU-145 and MDA-MB-231 linages) are extremely promising, since all the studied varieties from both crop seasons presented relevant results in decreasing the cellular proliferation. The difference recorded between the years (2014 and 2015 crops) shows the influence of the edaphoclimatic factors on the biosynthesis of the anthocyanin and non- anthocyanin phenolic compounds and consequently on the antiproliferative effects of the jabuticaba skin extracts. These data can be used in future studies, mainly in the pharmaceutical area, for the development of drugs based on this fruit, and also in the food industry, such as in studies on formulations with jabuticaba skins. Until now, jabuticaba skins were only a byproduct. Therefore, this work has demonstrated the high potential of this byproduct that, with further research, can be used as raw material for the production of various drugs and foods. Finally,

170

this study also characterized the profile of phenolic compounds, both anthocyanins and non- anthocyanins, of some jabuticaba varieties that have not been studied until now.

Acknowledgments Authors thankful to CNPq - National Coordination of Scientific and Technological Development (process number: 145652/2014-9), for the financial support of this study, and CAPES - Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES Foundation, Brazil) to provide the research laboratory and the PDSE scholarship (process number: 88881.135420/2016-01). We also thank Professor Hernandes Faustino de Carvalho for opening the doors of his laboratory and provide all the necessary material for the biological tests.

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CHAPTER 5

ARTICLE

Content of flavan-3-ol and ellagitannins in extracts made from jabuticaba seeds and their effect in decreasing tumor cells proliferation of breast and prostate cancer

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CHAPTER 5

Content of flavan-3-ol and ellagitannins in extracts made from jabuticaba seeds and their effect in decreasing tumor cells proliferation of breast and prostate cancer

Michelly Cristiane Paludoa,b, Silvia Borges Pimentel de Oliveirac, Luciana Fontes de Oliveirad, Ronan Carlos Colomboe, Sergio Gómez-Alonsoeb, Isidro Hermosín-Gutiérrezb, Cristiano Augusto Ballusf, Helena Teixeira Godoya,*. aDepartment of Food Science, Faculty of Food Engineering, University of Campinas (UNICAMP), Rua Monteiro Lobato 80, 13083-862, Campinas, SP, Brazil bUniversidad de Castilla-La Mancha, Instituto Regional de Investigación Científica Aplicada, Avda. Camilo José Cela s/n, 13071 Ciudad Real, Spain. cDepartment of Structural and Functional Biology, State University of Campinas, Av. Bertrand Russel, CP 6109, 13083-865 Campinas, SP, Brazil. dLaboratório de Química Analítica "Henrique Bergamin Filho", Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA), Universidade de São Paulo, Av. Centenário, 303 - São Dimas, 13416- 000 – Piracicaba, SP, Brazil. eDepartament of Agronomy, Londrina Satate University, Celso Garcia Cid Road, km 380, P.O. Box 10.011, 86057-970, Londrina, Paraná, Brazil. fDepartment of Food Science and Technology, Centre for Agrarian Sciences, Federal University of Santa Maria, Av. Roraima 1000, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil.

* Corresponding author. Phone: +55 19 3521 4024 E-mail address: [email protected]

*This manuscript was submitted to the journal “Food Research International”.

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Abstract This study aimed to evaluate the phenolic profile from seeds in five jabuticaba varieties, in two crops season, as well as the phenolic compounds against breast and prostate tumor cells proliferation. The ellagitannins characterization was performed by HPLC-DAD-ESI-MS/MS techniques, being vescalagin the main ellagitannin, followed by castalagin. Analysis of monomeric flavan-3-ols and proanthocyanidins was performed by multiple reaction monitoring using HPLC-DAD-ESI-MS/MS, revealing a large proportion of prodelphynidins. The results obtained with the cell viability analysis showed that all the jabuticaba seed extracts studied showed a significant effect in decresing cell proliferation under the breast cancer (MDA-MB-231) and prostate cancer (DU-145) lineages. In this study it was possible to characterize the profile of the phenolic compounds from jabuticaba seeds not previously studied and to show that the extract obtained from these samples reduces considerably the proliferation of the MDA-MB-231 and DU-145 tumor cells. Key words Phenolic compounds, ellagitannins, proanthocyanidins, seed, MDA-MB-231, DU-145, apoptosis.

1. Introduction Jabuticaba tree (Myrciaria sp.) is a fruit plant which belongs to Myrtaceae family, and occurs in some Brazilian zones (Ascheri et al., 2006). This species has been extensively studied due to its phenolic composition and antioxidant capacity. Although there are several species, the research carried out so far has focused on the Sabará and Paulista varieties, due to their greater occurrence. The food industry usually generates a large amount of waste during the manufacturing process, remembering that the fruit skins and seeds represent a great part of that residue (Martins & Farias, 2002). Studies has shown that residues such as skins and seeds have a considerable amount of vitamins, minerals, fibers, proteins and compounds with antioxidant properties, such as phenolic compounds (Sousa et al., 2011). Regarding jabuticaba fruits, skins and seeds representing 50% of the fruit weight (Lima et al., 2008). Alezandro et al. (2013) reported that the jabuticaba seeds presentes relevant concentration of phenolic compounds, ellagitannins and proanthocyanidins. The progressive interest in studying the action of phenolic compounds in fruit extracts is due to the inverse relationship between fruit

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consumption and the incidence of chronic diseases (Xie et al., 2012). In addition, there are also a growing number of in vivo and in vitro assays that prove not only the antioxidant capacity, but the effect against different types of cancer (Stoner et al., 2008; Roycelynn et al., 2012). Among the various types of cancer, those with the highest mortality rate remain the lung, prostate, breast, colon and rectum (Jemal et al., 2009). Neoplastic cells are characterized by ignoring the external and internal signals that regulate cell proliferation, losing the control of the processes of apoptosis and differentiation, are generally unstable, deficient in the repair of ADN damage and in the correction of replication errors, tending to accumulate mutations. They are invasive, surviving and proliferating in new environments, producing metastases and sustained angiogenesis (Alberts et al., 2008; Luo, 2009; INCA, 2011). Breast cancer is the second in numbers of occurrences worldwide and the most common among women. However, if diagnosed and treated early, the prognosis is good (INCA, 2011). A breast cancer cell lineage used in several surveys is the MDA-MB-231. According to Fung et al. (2013), this lineage is highly susceptible to interventions through diet. Teixeira et al. (2017) reported that the possible effect of the of ellagitannins metabolites on decrease of the proliferation of this cell lineage. Prostate cancer, more than any other type, is considered a neoplasm of the elderly (INCA, 2011). The long latency time of this neoplasm offers a "wide window" of opportunity for chemopreventive intervention by dietary agents such as foods containing antioxidant compounds such as phenolic compounds (Gundala et al., 2014). The control and treatment of cancer have pointed to the search for improvement of non-conventional therapies. The discovery of new drugs derived from plants has a relevant role in the treatment of this disease, and of all the antitumor drugs available between 1940 and 2002, 40% were originated from natural products (Butler, 2004). In this context, Wang et al. (2014) in your study reported that the aqueous extracts from jabuticaba seed have apoptotic activity on oral cancer cells, because they have survivin deletion power. The search for new anticancer compounds in plants and foods is a realistic and promising strategy (Hu et al., 2009). We cannot forget that the food analysis is composed of several stages, and the identification and quantification of the phenolic compounds are of great importance. These analyzes are complex mainly due to the structural variety of these compounds. Thus, to

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perform these steps with sensitivity and efficiency, it is necessary to use modern techniques, such as high performance liquid chromatography (HPLC) coupled with mass spectrometry (MS). In most cases, for the correct identification of a class of compounds, it is necessary to purify the extracts and isolate fractions using solid phase extraction techniques (SPE) (Lima et al., 2011). The identification and quantification of phenolic compounds and the knowledge of the antiproliferative action under tumor cells from new fruit varieties is of fundamental importance. Thus, the study of the seeds of jabuticaba varieties is of great value, since this fruit is a natural source of phenolic compounds, consequently, a source of antioxidant compounds, with possible effects on disease prevention and health promotion (Leite-Legatti et al., 2012; Wu et al., 2013). There are some jabuticaba species, such as Coroada (Myrciaria coronata Mattos), Híbrida (Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg), Pintada (Plinia ssp.), however, only Sabará (Myrciaria jabuticaba (Vell.) O. Berg) and Paulista (Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg.) species, are widely marketed and have studies on properties contained in the fruit as a whole and in its skins. On the other hand, studies on seed properties are extremely scarce. Based on this, the objective of this work was the characterization of the phenolic profile of the seeds from five jabuticaba varieties (in two crops season), and also the verification of the action of the extracts of these samples in decreasing cellular proliferation under tumor cells of breast and prostate.

2. Material and Methods

2.1. Chemicals All solvents were of HPLC-MS quality, all chemicals were of analytical grade (> 99%), using ultrapure water (Milli-Q). For phenolic compounds identification were used the commercial standards: (-)-gallocatechin (Phytolab (Vestenbergsgreuth, Germany); quercetin, myricetin and quercetin-3-glycoside (Extrasynthese, Genay, France); (+)-catechin and (-)- gallocatechin 3-gallate (Sigma Aldrich, Tres Cantos, Madrid, Spain); and castalagin and vescalagin (ADERA, Pessac, France). Quantification (mg per kg of dried seed) was done as equivalents of the most representative compounds for each Family of phenolic compounds: quercetin-3-rhamnoside to flavonols, flavonol 3-glycoside and its free-aglycones; (+)-catechin to flavan-3-ols (total

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proanthocyanidins); flavan-3-ols monomers and dimers by corresponding standards, and its total using (+)-catechin equivalents sum; and vescalagin to ellagitannins.

2.2. Samples ‘Sabará’ (Myrciaria jaboticaba (Vell.) O. Berg) (SF) and ‘Paulista’ (Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg) (PF) jabuticaba samples were provided by Faggan Farmers Group, located in Lagoa Branca, São Paulo (21°46'26" S, 47°05'11" W and 684 m of elevation) in October 2014 and 2015. Other samples of ‘Sabará’ (Myrciaria jaboticaba (Vell.) O. Berg) (SFP), ‘Coroada’ (Myrciaria coronata Mattos) (CFP), ‘Híbrida’ (Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg) (HFP) and ‘Pintada’ (Plinia ssp.) (PFP) jabuticabas, were provided by F.P. Frutas e Plantas, located in Araçoiaba da Serra, São Paulo, (23°30'19" S, 47°36'51" W and 625 m of elevation) in October 2014 and 2015. Jabuticabas samples were peeled off to separate flesh and seed, which were frozen at - 22 °C, freeze-dried, vacuum-packed and stored at -22 °C. The freeze-dried samples were ground to a fine and homogeneous powder to be used to prepare the extracts.

2.3. Extracts preparation and chromatographic analysis The five jabuticaba varieties extracts were prepared according to Paludo et al. (2017). The extracts were dried in speed vac (Eppendorf Vacufuge Plus Vacuum Concentrator, Eppendorf) and resuspended in a specific solvent mixture for each chromatographic trial. To flavan-3-ols trials, the monomers, B-type dimers, and polymeric proanthocyanidins, were isolated from five jabuticaba varieties seed, using SPE C18 (Sep-Pak Plus C18, Waters Corp., Mildford, MA; 820 mg). A mixture between 2 mL of seed extract and 12 mL of ultrapure water was passed by C18 cartridge, previously conditioned with 5 mL of methanol and 5 mL of water. After the cartridge was dried under reduced pressure, methanol (15 mL) and ethyl acetate (5 mL) were added in order to recover adsorbed phenolics; later on the solvent was evaporated in a rotary evaporator (35 °C), the residue was dissolved in methanol (2 mL) and stored at -18 °C until needed.

2.4. Tannins condensed by precipitation with methylcellulose The tannins quantification was performed according to the tannins condensed by precipitation with methylcellulose methodology (Sarneckis et al., 2006).

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2.5. Identification and quantification of phenolic compounds from five jabuticaba varieties

2.5.1. Identification and quantification of monomer content of flavan-3-ol, total content and structural characteristics of oligomers (proanthocyanidins) using multiple reaction monitoring (MRM) in HPLC-DAD-ESI-MS / MS The individual content of flavan-3-ols monomers was analyzed directly in the extracts. Structural information and estimation of the total proanthocyanidins (PA) content was obtained following the acid catalyzed depolymerization method and assisted by pyrogallol (Lago-Vanzela et al., 2011a, 2011b; Rebello et al., 2013). The analysis was performed using an Agilent 1200 series system equipped with DAD (Agilent, Germany), and coupled to an AB Sciex 3200 Q TRAP (Applied Biosystems) electrospray ionization mass spectrometry system (ESI-MS/MS). The chromatographic system was managed by the Agilent ChemStation (version B.01.03) data-processing station. The mass spectra data was processed with the Analyst MSD software (Applied Biosystems, version 1.5). The samples (before and after acid-catalyzed depolymerization reaction) were injected (10 μL) on a reversed-phase column Agilent Eclipse XDB-C18 (2.1 × 150 mm; 3.5 μm particle; Agilent, Germany), thermostated at 16 °C. The chromatographic column, solvents and elution gradient were the same described by Rebello et al. (2013).

2.5.2. Ellagitannin analysis using HPLC-DAD-ESI-MS / MS The separation, identification and quantification of ellagitannins were carried out following the methodology described by Navarro et al. (2017), using HPLC system Agilent 1100 Series (Agilent, Waldbronn, Germany) equipped with ion trap mass spectrometer. Identification of ellagitannins was based on the combination of their chromatographic and UV / Vis retention times and MS spectral data with the spectra and retention times obtained for the pattern set. The conditions for ESI ionization and MS / MS fragmentation were optimized by direct injection of a solution of 30 mg L-1 castalagine in solvent A: scan range 100-2100 m/z; negative ionization mode; capillary, 4500 V; nebulizer, 60.0 psi; dry gas, -1 N2, 11.0 L min ; drying temperature, 350 °C; Skimmer 1, 42.3 V; skimmer 2, 6.0 V; capillary out, 76.7 V; octopole, 3.04; octopole radio frequency, 250 Vpp; octopole ∆ 2.40 V; lens 1, 5.0 V; lens 2, 60.0 V; MS/MS automatic with fragmentation amplitude of 1.50 V. The

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quantification was performed by the external standardization method (castalagine) using the chromatograms obtained by DAD at 250 nm.

2.5.3. Statistical analysis to chromatographic trials All analysis were performed in triplicate and the results were expressed by averages and standard deviation. Data were submitted to ANOVA and the averages were compared by Student-Neuman-Keuls (SKN) test at 0.05 of significant. Flavan-3-ols, ellagitannins and condensed tannins concentrations were submitted to principal component analysis (PCA), using the statistical software’s SAS 9.0 and SPSS Statistics.

2.6. Tumor cell assays using seed extracts from five jabuticaba varieties

2.6.1. Extracts preparation The five jabuticaba varieties extracts were prepared according to Paludo et al. (2017). The extracts were dried in speed vac (Eppendorf Vacufuge Plus Vacuum Concentrator, Eppendorf) and resuspended in ultrapure water/dimethylsulfoxide (DMSO).

2.6.2. Cellular lineages Were used cellular lineages established from prostate (DU-145) and breast (MDA- MB-231) cancer. Cells maintenance was realized in culture medium RPMI 1 g (glucose), added to FBS (fetal bovine serum) 10% and supplemented with penicillin-streptomycin 1%.

Cell lineages were kept in humidified stove at 37 ºC and 5% of CO2. Cell lineages were obtained from American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) – donation from Prof. Dr. Hernandes Faustino de Carvalho, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, SP, Brazil.

2.6.3. Experimental groups and treatments performed with five jabuticaba varieties seed extracts. Cell lineages of prostate (DU-145) and breast (MDA-MB-231) cancers were plated at concentration of 9x104 cells per well (well trays = 96), filled with 100 L of culture medium (with FBS). After 24 hours, the culture medium was changed and the cells were submitted to the treatments with the five jabuticaba varieties extracts at concentrations of 2.5, 25, 50 and

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250 µg mL-1. Cells were submitted to a treatment with doxorubicin for 24 and 48 hours (Leite-Legatti et al., 2012; Wang et al., 2014), and for 72 hours. The extracts from the five jabuticaba seed varieties were diluted in culture medium without FBS, considering to the final concentration of DMSO was at maximum 0.2%, avoiding to cellular viability. Control groups consisted in cells cultivated on culture medium with DMSO and without FBS.

2.6.4. Mitochondrial activity assay (MTT) After each incubation period, the cell viability was verified through the colorimetric assay MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide), which is based on the cleavage of tetrazolium salt, this cleavage produces the formazan, which is insoluble in water and presents a blue color. The formazan is then solubilized in isopropanol and measured by absorbance in a spectrophotometer. The formazan produced in this reaction is directly proportional to the number of viable cells presents in the culture medium at the moment of the MTT was added (Tada et al., 1986). In the culture medium was added 10 L of solution prepared from 5 mg mL-1 of

MTT. After that, the plate was kept in humidified stove (95%) at 37 ºC and 5% of CO2, during three hours and then was added 100 L of acidified isopropanol (isopropyl alcohol and hydrochloric acid). Readings were performed after 10 minutes at 540 and 570 nm in microplate reader (Denizot & Lang, 1986).

2.6.5. Statistical analysis to cellular trials

IC50 (inhibitory concentration, in vitro, to decrease in 50% the amount of reactive species in the tested media) was determined using the software Graph Pad Prism 5. Data were submitted to ANOVA and the averages were compared by Tukey’s and Student-Neuman- Keuls tests at 0.05 of significant, using the statistical software Statistica 7.0.

3. Results and Discussion

3.1. Phenolic compounds from five jabuticaba varieties seeds The chromatographic analysis performed to phenolic compounds, allowed to identify and quantify the ellagitannins and flavan-3-ols in seeds from five jabuticaba varieties (Tables 1 and 2). The identified ellagitannins were vescalagin, castalagin, casuarinin and casuarictin,

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besides two possible artifacts that were probably formed in the process of extraction and resuspension of the extracts (Puech et al., 1999). The obtained chromatographic profile and spectra from DAD are presented in the Figures 1a and 1b. The flavan-3-ol monomers identified were catechin, gallocatechin, epicatechin 3-gallate, gallocatechin 3-gallate and epigallocatechin 3-gallate. Whereas, to proanthocyanidins were estimated mDP, galloylation (%) and prodelphinidin (%).

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Table 1. Compounds identified in the determination of ellagitannins by HPLC-DAD-ESI-MS/MS in seed extracts made from five jabuticaba varieties.

Peak Compound Formula Rt (min) UV-Vis (nm) MS (m/z) MS2 (m/z) m/z(t) m/z (exp) ∆ (ppm)

1 Vescalagin C41H26O26 20.44 233; 278 sh 933.2 915; 914; 896; 870; 631; 613 933.06395 933.0601 - 4.56

2 Castaligin C41H26O26 24.23 233; 278 sh 933.2 914; 896; 888; 870; 630; 612; 568 933.06395 933.0602 - 4.36

3 Vescalagin methyl derivative C42H28O27 32.59 232; 250 sh; 278 sh 963.2 944; 783; 660; 642 963.07452 963.0704 - 4.28

4 Vescalagin ethyl derivative C43H30O27 37.88 232; 250 sh; 278 sh 977.1 958; 674; 656 977.09017 977.0854 - 4.88

5 Casuarinin C41H28O26 39.02 232; 270 935.1 926; 917; 916; 872; 855; 632 935.0796 935.0751 - 4.81

6 Casuarictin C41H28O26 39.35 232; 270 935.1 916; 782; 765; 658; 632; 614; 328 935.0796 935.0756 - 4.58

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Table 2. Ellagitannins and flavan-3-ols concentration recorded in extracts from seeds of five jabuticaba varieties using HPLC-DAD-ESI- MS/MS.a

SF molar% PF molar% SFP molar% PFP molar% HFP molar% CFP molar%

Peak Compound 2014 crop 2015 crop 2014 crop 2015 crop 2014 crop 2015 crop 2014 crop 2015 crop 2014 crop 2015 crop 2014 crop 2015 crop

Ellagitannins

1+3+4 Vescalagin total 50.70 ± 1.33 b 52.63 ± 1.02 b 39.65 ± 1.74 d 52.72 ± 3.09 b 52.52 ± 1.51 b 49.93 ± 1.32 b 57.43 ± 0.48 a 55.96 ± 1.22 a 50.23 ± 0.34 b 51.63 ± 2.05 b 43.64 ± 0.61 c 43,92 ± 0,94 c

2 Castaligin 47.67 ± 1.14 b c 45.39 ± 0.88 c d e 60.35 ± 1.74 a 46.32 ± 2.71 c 44.92 ± 1.41 c d e 44.15 ± 1.13 c d e 40.10 ± 0.60 f 42.57 ± 1.39 d e f 49.77 ± 0.34 b 46.02 ± 2.02 c d 42.22 ± 0.84 e f 40.19 ± 1.49 f

5 Casuarinin 0.96 ± 0.10 d e 1.27 ± 0.02 d e ND 0.70 ± 0.54 e 1.60 ± 0.01 d 3.47 ± 0.16 c 1.36 ± 0.31 d e 0.98 ± 0.04 d e ND 1.41 ± 0.15 d e 6.89 ± 0.27 b 7,75 ± 0,74 a

6 Casuarictin 0.67 ± 0.11 d e 0.71 ± 0.18 d e ND 0.25 ± 0.12 f g 0.97 ± 0.11 d e 2.46 ± 0.38 c 1.11 ± 0.15 d 0.50 ± 0.15 e f ND 0.94 ± 0.18 d e 7.24 ± 0.20 b 8,15 ± 0,38 a

Total g/kg of dried seeds, vescalagin eq. 45,08 ± 2,20 a 43.17 ± 1.85 a b 22.56 ± 0.95 e 37.11 ± 3.65 c 43.49 ± 2.68 a b 38.13 ± 1.92 b c 23.93 ± 1.96 e 40.10 ± 3.88 a b c 21.99 ± 3.06 e 31.49 ± 2.03 d 45.58 ± 2.18 a 45.67 ± 2.70 a

Flavan-3-ols monomers

(+)-catechin 25.61 ± 0.69 e 37.77 ± 4.16 a b c 26.69 ± 2.00 d e 43.71 ± 3.48 a 34.78 ± 3.69 b c 35.33 ± 3.04 b c 42.92 ± 4.22 a 33.40 ± 1.49 b c d 38.92 ± 3.48 a b 30.74 ± 3.76 c d e 30.61 ± 1.77 c d e 38.67 ± 0.94 a b

(−)-gallocatechin 61.13 ± 3.37 a b 59.37 ± 4.70 a b 69.86 ± 1.28 a 50.59 ± 3.51 b 59.47 ± 7.87 a b 61.43 ± 6.06 a b 49.28 ± 3.58 b 55.98 ± 3.33 b 58.24 ± 2.22 a b 53.59 ± 8.28 b 62.90 ± 2.98 a b 53.43 ± 5.29 b

Epicatechin-3-gallate 10.19 ± 2.74 a 2.13 ± 0.45 b 3.66 ± 0.60 b 2.55 ± 0.83 b 3.24 ± 0.67 b 1.72 ± 0.80 b 3.92 ± 0.17 b 1.58 ± 0.60 b 3.45 ± 0.63 b 1.69 ± 1.09 b 3.65 ± 0.65 b 2,80 ± 1,02 b

Gallocatechin-3-gallate 2.75 ± 0.85 b 0.51 ± 0.17 c d 0.40 ± 0.40 c d ND 0.29 ± 0.29 d ND 1.53 ± 0.52 c 6.23 ± 0.91 a 0.40 ± 0.17 c d 5.49 ± 0.72 a ND 0,67 ± 0,25 c d

Epigallocatechin-3-gallate ND ND ND ND ND ND ND 5.21 ± 0.71 a ND 2.66 ± 0.29 b 2.51 ± 0.90 b ND

Total g/kg of dried seeds, catechin eq. 0.32 ± 0.07 c 0.74 ± 0.03 c 0.36 ± 0.08 c 0.78 ± 0.07 c 0.76 ± 0.05 c 1.81 ± 0.38 b 0.67 ± 0.06 c 2.31 ± 0.25 b 0.98 ± 0.09 c 5.06 ± 0.96 a 0.34 ± 0.02 c 0,76 ± 0,05 c

Proanthocyanidins

mDP 2.16 ± 0.16 b 2.38 ± 0.05 b 1.80 ± 0.10 b 4.07 ± 1.52 a b 2.45 ± 0.12 b 3.11 ± 0.64 a 2.34 ± 0.19 b 2.92 ± 0.32 a b 1.87 ± 0.09 b 2.21 ± 0.21 b 3.28 ± 0.27 a b 3,03 ± 0,36 a b

Galloilation % 30.37 ± 0.93 c d 31.27 ± 1.31 b c d 23.57 ± 1.82 f 32.50 ± 2.71 a b c d 35.25 ± 2.16 a b 25.53 ± 1.41 e f 32.41 ± 1.86 a b c d 28.16 ± 1.65 d e 36.83 ± 2.69 a 35.82 ± 2.19 a b 32.58 ± 1.16 a b c d 34.08 ± 1.08 a b c

Prodelphinidin % 33.18 ± 2.51 c d 37.15 ± 4.08 b c d 48.59 ± 7.19 b 29.27 ± 2.01 d 37.50 ± 6.20 b c d 40.68 ± 5.84 b c d 39.08 ± 3.05 b c d 47.01 ± 4.38 b c 34.68 ± 6.08 c d 57.74 ± 7.56 a 31.09 ± 2.58 d 36.15 ± 5.88 b c d

Total g/kg of dried seeds, catechin eq. 4,13 ± 0,97 b c 4.44 ± 1.19 b c 2.50 ± 0.68 c 5.38 ± 0.10 b 5.51 ± 0.86 b 10.33 ± 1.11 a 3.13 ± 0.66 b c 5.55 ± 1.10 b 2.85 ± 0.78 c 10.39 ± 1.01 a 4.53 ± 0.61 b c 5.51 ± 1.17 b a In a same line, different letters mean statistical differences by the t test p>0,05, (average ± standard deviation), n=3, ND not detected.

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Figure 1 (a): Ellagitannins chromatographic profile (detection 250 nm) founded in jabuticaba seeds (CFP, 2014 crop). (b): Ellagitannins UV-vis spectrum founded in jabuticaba seeds (CFP, 2014 crop).

The vescalagin isomer was the majority compound identified in all jabuticaba varieties studied, followed by castalagin. These compounds were identified by molecular weight (m/z 933.2) and confirmed by spectral characteristics and comparison with authentic standards. In this study two artifacts formed during the extraction and resuspension process of the extracts were identified. During the extraction process, using ethanol and water as the extracting solvent, it was probable that the vescalagin underwent a transformation incorporating an ethanol molecule, and thus forming a vescalagin complex plus ethanol (vescalagin-ethyl derivative) with m/z 963.2 (peak 4). And during the resuspension process of this extract with methanol and water as solvent, vescalagin underwent another transformation with the incorporation of a methanol molecule, forming a complex with methanol plus vescalagin (vescalagin-methyl derivative) with m/z 977.1 ( peak 3). The formation of these complexes (artifacts) has already been described in detail by Puech et al. (1999).

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The peaks 3 and 4 belongs to peak 1, however, due to the incorporation of one- methanol and one-ethanol molecule, respectively, occurred the formation of the two identified compounds. Thus, to quantify these compounds was sum the peaks 1, 3 and 4 and the result was expressed as vescalagin molar %. PFP jabuticaba variety presented the highest concentration of vescalagin in both crop seasons, whereas the lowest one was recorded in PF jabuticaba variety, harvested in 2014. Hacke et al. (2016) also reported the presence of vescalagin and castalagin in Sabará jabuticaba seed extracts. In Sabará and Paulista jabuticaba seeds, the vescalagin content were 74.22 and 157.39 mg per 100 g of fruits, respectively (Neves et al., 2016). Vescalagin and castalagin are isomers, and presents similar m/z and UV spectrum, though its MS2 spectra differs markedly (Navarro et al., 2017). Thus, these compounds were identified by its retention time using specific standards. Studies have shown that vescalagin has a greater effect on polarity, solution oxidation and thermodegrability than castalagin (Vivas et al., 2004), besides being more hydrophilic. These properties confer to vescalagin more polarity than castalagin, which explains its lower retention time in a reverse phase column, such as the one employed in this analysis. Taking into account the above, the seeds of jabuticaba are potential sources of castalagin and vescalagin. It should be noted that these two compounds are the majority of the ellagitannins in this sample, which would facilitate the purification process. The other identified ellagitannins, casuarinin and casuarictin, also are isomers and are described for jabuticaba fruit extract (Wu et al., 2013) and jabuticaba skins extract (Plaza et al., 2016). These two ellagitannins are complex, since they also contain gallic acid which can be released by hydrolysis. Therefore, they are also galotannins. It is noteworthy that in the two studies mentioned above neither vescalagin nor castalagin were detected, probably because the analyzes were not performed on the seeds, as in the present work. The total ellagitannins in this study was expressed as g of vescalagin equivalent per kg of dried seeds. The highest concentration of ellagitannins was recorded in SF and CFP jabuticaba varieties, in both crop seasons. on the other hand, the lowest concentrations were verified in PF, PFP and HFP jabuticaba varieties, harvested in 2014. However, all jabuticaba varieties analyzed in this trial presented a considerable ellagitannins content. Taking into account the high diversity of standards used to express the chromatographic results as well as the numerous techniques of analysis and expression units, it is extremely difficult to compare

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the results between the investigations and to become unsatisfactory. It is noteworthy that, to date, studies on jabuticaba have been concentrated on the fruit as a whole or on the skin, with extremely rare work on the seeds, and the scarce studies used only the Sabará variety. Regarding the flavan-3-ol monomers (Table 2), the most important was the gallocatechin in all jabuticaba varieties, in both crop seasons. A highest concentration of this compound was recorded in PF jabuticaba variety (2014 crop season), whereas the lowest ones were verified in PF and HFP jabuticaba varieties (2015 crop season) and PFP (both crop seasons). Neves et al. (2016) reported that the gallocatechin content in Paulista jabuticaba seeds was 1.0 mg per 100 g of fruits and 0.83 mg per 100 g of fruits in Sabara jabuticaba seeds. The total flavan-3-ols monomers was expressed as g kg-1 of dried seeds (catechin equivalents). HFP jabuticaba harvested in 2015 presented the highest concentration of this compound. On the other hand, in the jabuticaba varieties SF, PF and CFP from 2014 crop season, were recorded the lowest concentrations of catechin. The reaction with pyrogalol induces the depolymerization of condensed tannin molecules. After this reaction, the catechin concentration increased, suggesting that these compounds can be found polymerized in larger molecules. Polymerization is related to loss of astringency (Fulcrand et al, 1996), which is favorable to improve the fruits flavor. It is interesting, specially, to ‘Sabara’ jabuticaba, which is widely used in technological procedures to manufacturing of food products. To proanthocyanidinins, the compounds that highlights to all jabuticaba varieties studied were the prodelphinidin, in both crops season. HFP jabuticaba variety (harvested in 2015) presented the highest concentration of this compound. On the other hand, the varieties PF (2015) and CFP (2014), presented the lowest content of prodelphinidin. For the total content of proanthocyanidins, the highest concentrations were recorded in SFP and HFP jabuticaba varieties, both from the 2015 harvest. On the other hand, the ones with the lowest content were PF and HFP, both from the 2014 harvest. To complete the analysis of the phenolic compounds, the total condensed tannins were estimated, revealing that the variety that contains the highest concentration of this compound is the SFP, crop 2015, and the one that contains the lowest content is the HFP, crop 2014. All results for this analysis are available in Table 3.

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Table 3. Total condensed tannins concentration from five jabuticaba varieties seed (average ± standard deviation, n = 3). a

Seeds Jabuticaba variety 2014 crop 2015 crop Sabará Fagan (SF) 67.52 ± 5.24 A c d e f 64.59 ± 7.45 A d e f Paulista Fagan (PF) 48.79 ± 7.15 A e f 78.01 ± 5.45 B b c d Sabará F.P (SFP) 88.91 ± 17.17 A a b c 102.33 ± 1.26 A a

Pintada F.P (PFP) 49.21 ± 10.95 A e f 69.2 ± 2.22 A c d e 45.99 ± 7.87 A f ± Hibrida F.P (HFP) 67.24 3.62 A c d e f Coroada F.P (CFP) 97.02 ± 15.52 A a b 86.95 ± 6.11 A a b c a Mean values expressed in mg g-1 of dried seeds, Epicatechin eq. Columns followed by the same capital letters did not differ statistically (comparison between crop seasons, p˂0.05), and rows followed by the same lower case letters did not differ statistically (comparison among varieties, p˂0.05).

The results obtained for the analysis of proanthocyanidins and total condensed tannins could not be compared with any other results, because up to now no other studies have been found that carried out these analyzes on the seeds of jabuticaba. The analyzes of total flavan-3-ol (total proanthocyanidins) and total condensed tannins were performed in this study, because although these nomenclatures are theoretically corresponding, the structural complexity of the polymerized flavan-3-ols is vast, and these denominations attempt to describe a group complex of substances with chemical properties that differentiate them. Thus proanthocyanidins are polymers of the flavan-3-ols which under strong oxidative conditions (6 N HCl medium and temperature at 100 ° C for 2 hours) are depolymerized. This behavior shows the proanthocyanidins in which the flavan-3-ol units are bound by "B-type" bonds (interflavan bonds between positions C-4 and C-8, especially the different flavan-3-ol molecules). This type of binding breaks down in the depolymerization assay with pyrogallol. There are also other types of interflavan bonds, such as those of type "A", which do not break under the conditions of the pyrogallol assay. The condensed tannins, however, are polymers of flavan-3-ols which have the property of precipitating proteins and other polymers, such as methylcellulose. For this reason, we performed the precipitation assay with methylcellulose, that is, to estimate the total content of condensed tannins. Oligomers (polymers with few structural units) only cause precipitation of the methylcellulose.

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All samples studied here presented considerable levels of ellagitannins, monomeric flavan-3-ols, proanthocyanidins and total condensed tannins. Thus, the seeds of the varieties of jabuticaba analyzed here are sources of these compounds, which bring several benefits to human health, revealing that this byproduct has great potential for its incorporation in the food, pharmaceutical and cosmetic industry.

3.2. Principal components analysis (PCA) for the results of the non-anthocyanin phenolic compounds from the seeds of the five jabuticaba varieties As the number of samples (36) and the number of variables were relatively large, the use of only the tables without the use of PCA would become more laborious and in some cases very difficult. The principal components analysis was used in this work in order to verify the differences and similarities between the samples in relation to the analyzed compounds (phenolic compounds). The results obtained for the analysis of phenolic compounds were organized in a data matrix, obtaining a matrix 36x12 (samples x variables). The pre-processing used was self- scaling and the number of princiapl components used was 5 which explained 78% of the variation of the data. The different jabuticaba varieties were used as a class in the score graphic PC1 x PC2 (Figure 2 (a)) to verify if there was a difference and what the variables were responsible for this difference based on the loadings plot analysis (Figure 2 (b)). The variation percentage explained to de first and second components were 27 and 22%, respectively.

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4 0.6 CFP HFP 0.5 Vescalagina (total) s2 3 PFP Galato de galocatequina s2 PF 0.4 s2 SF/SFP 2 s2 s1 0.3 Galato de epigalocatequina s1 Catequina 0.2 Prodelfinidinas 1 s2 s2 Galoilação s2 0.1 s1 s1 s2 s1 0 s1 s2 s2 0

s1 mDP PC 2 (22.95%) PC2

PC2(22.95%) -0.1 -1 s1 s2 s2 s2 s2 -0.2 Galato de epicatequina s2 Castalagina -2 s1 Casuarinin s1 s1 s1 -0.3 Galocatequina Casuarictin s1 s1 -3 -0.4 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 PC 1 (27.30%) PC 1 (27.30%) (a) (b)

4 Monômeros (flavo3oles) CFP s2 HFP 0.6 3 PFP PF s2 s2 SF/SFP 0.4 Proantocianidinas 2

0.2

1 s1 s1 s1 s1 0 s2 s2 s1 s1 s1 s2 s1 s2 s2

s2 PC2(36.23%) PC2 (36.23%) 0 -0.2 s2 s2 s2 s2 s2 -1 s1 s2 s2 s1 s2 -0.4 Taninos s1 s1 s1 s1 s1 s1 Elagitaninos -2 -3 -2 -1 0 1 2 3 -0.5 0 0.5 1 PC 1 (52.55%) PC 1 (52.55%) (c) (d) Figura 2. (a) Scores graphic (PC1xPC2) to non-anthocyanin phenolic compounds from different jabuticaba varieties (2014 and 2015 crops). (b) Loadings graphic (PC1xPC2) to non-anthocyanin phenolic compounds from different jabuticaba varieties (2014 and 2015 crops). (c) Scores graphic (PC1xPC2) to non-anthocyanin total phenolic compounds from different jabuticaba varieties (2014 and 2015 crops). (d) Loadings graphic (PC1xPC2) to non-anthocyanin total phenolic compounds from different jabuticaba varieties (2014 and 2015 crops).

It is possible to observe a distinct separation between the crops season (Figure 2) for some studied variables; which can be explained by the environmental conditions that occurred during the different crops season. One phenolic compound can be founded in both crops, or only in one crop season, or in both crops with significant variation in its concentration. Although this, the PF jabuticaba samples from the 2014 crop, were grouped in the principal component 1(Figura 2(a)), and the compounds responsible to this aggrupation are gallocatechin and castalagin (Figura 2(b)). The CFP jabuticaba samples (from both crops season) were grouped and separated to the other ones due to the presence of casuarinin and casuarictin compounds. The gallocatechin

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3-gallate also influenced the differences recorded between PFP and HFP (both from 2015 crop) in the principal component 2. A PCA also was performed using the total compounds concentration, such as ellagitannins, flavan-3-ol (monomers), proanthocyanidins, and condensed tannins. The matrix employed was 36 x 4 (samples x variables), using the pre-processing self-scaling. Two principal components were used in order to explain 89% of total data variation; being 52% explained by PC1 and 36% explained by PC2. The figures 2 (c) and (d) presented the scores and loadings graphic. It is possible to verify that the HFP jabuticaba variety (2015 crop) showed a very different behavior in the principal component 2 (Figure 2 (c)), which can be explained by the monomer content (flavan-3-ols) and proanthocyanidins (Figure 2 (d)). In addition, the HFP, PFP and PF jabuticaba varieties, all of the 2014 crop season, presented similar behavior in the principal component 1 and this fact can be explained by lower values of all the variables used. It was also possible to verify that the samples of the CFP jabuticaba variety harvested in 2014 presented a tendency to present higher values for tannins and ellagitannins.

3.3. Antiproliferative effect of the seeds extracts from five jabuticaba varieties under tumor cells of prostate and breast cancers In addition to all the chromatographic analyzes, the biological assay for mitochondrial activity (MTT), under tumor cells of prostate cancer (DU-145) and breast cancer (MDA-MB- 231) was also carried out with the purpose of to verify the antiproliferative action of the seed extracts from five jabuticaba varieties researched here. All results obtained with the biological assay are shown in Table 4.

195

Table 4. Results of treatments carried out in DU-145 and MDA-MB-231 cell lineages with seed extracts from five jabuticaba varieties and -1 a reference drug expressed in IC50 (µg mL of extract) .

Seed

Jabuticaba variety DU-145 MDA-MB-231

24 hours 48 hours 72 hours 24 hours 48 hours 72 hours

2014 2015 2014 2015 2014 2015 2014 2015 2014 2015 2014 2015

Sabará Fagan (SF) 59.76 ± 2.78 a b A 49.68 ± 4.78 a B 36.46 ± 4.43 d A 8.12 ± 2.10 c B 36.09 ± 3.06 b A 38.20 ± 6.78 c A 53.50 ± 6.49 c A 54.67 ± 0.95 a A 49.28 ± 0.27 d A 48.46 ± 5.22 b c A 26.44 ± 8.08 b A 25.39 ± 2.23 c A

Paulista Fagan (PF) 71.92 ± 2.40 a b A 47.84 ± 6.10 a B 52.09 ± 3.36 c A 16.9 ± 4.07 b B 59.43 ± 2.02 a A 39.81 ± 3.26 c B 74.83 ± 6.46 a b A 37.70 ± 7.87 b c B 90.49 ± 7.08 b A 41.71 ± 1.96 d B 24.97 ± 2.22 b A 23.57 ± 0.47 c A

Sabará F.P (SFP) 61.67 ± 3.23 b A 41.01 ± 3.98 a B 60.02 ± 9.71 b c A 30.51 ± 0.44 a B 43.28 ± 2.21 b A 41.66 ± 3.73 b c A 48.39 ± 3.26 c A 27.47 ± 1.31 c B 45.32 ± 5.18 d A 43.01 ± 0.95 c d A 69.91 ± 5.03 a A 24.33 ± 8.54 c B

Pintada F.P (PFP) 75.37 ± 3.65 a A 39.92 ± 1.81 a B 75.91 ± 1.67 a A 24.92 ± 3.63 a B 54.80 ± 3.26 a A 52.46 ± 4.68 a A 78.02 ± 5.03 a A 51.12 ± 5.55 a b B 116.10 ± 1.64 a A 52.55 ± 0.94 a b B 30.24 ± 4.60 b A 41.23 ± 4.53 b B

Hibrida F.P (HFP) 73.32 ± 2.38 a b A 40.13 ± 4.36 a B 65.33 ± 4.28 a b A 28.91 ± 1.42 a B 57.84 ± 5.80 a A 50.65 ± 0.44 a b A 89.64 ± 8.31 a A 59.97 ± 6.58 a B 107.83 ± 6.56 a A 57.26 ± 1.06 a B 74.60 ± 4.91 a A 62.31 ± 6.82 a A

Coroada F.P (CFP) 57.41 ± 11.77 b A 26.72 ± 0.64 b B 36.75 ± 0.39 d A 24.24 ± 0.76 a B 43.96 ± 3.88 b A 50.42 ± 0.64 a b B 54.31 ± 12.42 b c A 25.99 ± 5.76 c B 69.81 ± 3.40 c A 46.49 ± 1.87 b c d B 64.45 ± 3.21 a A 64.50 ± 2.37 a A

Doxorubicin 0.48 ± 0.05 c A 0.45 ± 0.03 c A 0.26 ± 0.07 e A 0.41 ± 0.05 d B 0.10 ± 0.02 c A 0.43 ± 0.21 d A 6.98**% ± 1.52 d A 23.99**% ± 0.36 d B 13.45**% ± 3.25 d A 0.48 ± 0.10 e B 0.52 ± 0.12 c A 0.28 ± 0.05 d B

Solvent / vehicle 15.85 ± 1.80 d A 22.05*% ± 2.87 d B 0.15*% ± 2.26 f A 20.47*% ± 1.23 e B 17.72*% ± 2.77 d A 13.12*% ± 1.20 e A 0*% ± 0 e A 0*% ± 0 e A 0*% ± 0 e A 12.51*% ± 1.60 f B 0*% ± 0 d A 8.12*% ± 1.49 e B

a Columns followed by the same capital letters did not differ statistically (comparison between crop seasons, p˂0.05), and rows followed by the same lower case letters did not differ statistically (comparison among varieties, p˂0.05).

IC50 average ± standard deviation n=3 * Maximum percentage of growing inhibition in the concentration of 250 ug mL-1 of extract. ** Maximum percentage of growing inhibition in the concentration of 0.6 ug mL-1 of Doxorubicin.

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Three treatment times (24, 48 and 72 hours) were evaluated for both cell lineages. For the DU-145 lineage, in relation to the extracts from 2014 crop, the most significant effect in the reduction of the cellular proliferation was recorded at 72 hours, followed by 48 hours. However, for extracts from 2015 crop, the most significant effect on the reduction of cell proliferation was at 48 hours followed by 24 hours. The extracts from 2015 crop showed a more significant effect on the decrease of the cellular proliferation in the three times here tested when compared with the extracts from 2014 crop. This fact can be explained due to the differences in the amount of rainfall, temperature, that is, different environmental factors between the seasons of 2014 and 2015. These factors exert a strong influence on the biosynthesis of phenolic compounds. It is known that phenolic compounds have an effect on the action in the decrease of cell proliferation, so the occurrence of different results between different crops. The most significant result obtained for the reduction of the cellular proliferation of DU-145 was with the extract from SF jabuticaba variety, crop 2015, in the time 48 hours. In contrast, the extract from PFP jabuticaba variety, harvested in 2014, in the time 24 and 48 hours, showed the worst result to decrease the proliferation of DU-145. For the MDA-MB-231 lineage, the extracts from 2015 crop were also more efficient in reducing cell proliferation when compared to the extracts from 2014 crop. In the tests carried out with the MDA-MB-231, both the extracts from 2014 and 2015 crop seasons showed a more effective action in the reduction of the cellular proliferation at treatment time 72 hours, followed by the time 24 hours. The extract from PF jabuticaba variety, 2015 crop season, at treatment time 72 hours, was the most efficient against the proliferation of MDA-MB-231. On the other hand, the extract made from PFP jabuticaba variety, 2014 crop season, at treatment time 48 hours, was shown to be the least efficient to against MDA-MB-231 cell proliferation. The results obtained for both cell lineages analyzed here are very promising, since the seed extracts made from all jabuticaba varieties analyzed in both crops showed to have an effect in against cell proliferation. This stimulates the realization of new researches for elaboration of drugs from the seeds of the jabuticaba varieties studied here, emphasizing that the seed is a by-product practically unexplored to the moment. It was not possible to compare the antiproliferative effect of the extracts of the seeds studied here under the DU-145 and MDA-MB-231 lines with other studies, because until the moment there are no other published

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studies with seed extracts made from all jabuticaba varieties studied here under the cell lines used herein. The study closest to the one performed here was by Leite-Legatti et al. (2012), which showed the antiproliferative effect of Sabará jabuticaba (fruit) polar extract under breast -1 cancer cell lines (MCF7), resulting in 181.2 GI50 μg mL of extract and prostate cancer (PC- -1 3), with a result of> 250 GI50 μg mL of extract.

4. Conclusion From this study the characterization of the phenolic profile of the seeds of 5 varieties of jabuticaba was carried out, some of which had not been studied so far. The seeds of this fruit contain considerable amounts of ellagitannins, monomeric flavan-3-ols, proanthocyanidins and total condensed tannins. All analyzed jabuticaba varieties showed an effect on the decrease of the cellular proliferation under the breast and prostate cancer lineages studied here. The difference between the crop seasons showed the influence of environmental factors on the biosynthesis of the phenolic compounds and, consequently, their effects on the action in decreasing the cellular proliferation using jabuticaba seed extracts. These results impel new studies, especially in the pharmaceutical industry, for the development of drugs based on this by-product and also in the food industry, with research for the industries to add the jabuticaba seeds in several formulations. Thus, this work demonstrated the very high potential of this byproduct that, with further studies, can serve as a raw material for the production of various drugs and foods.

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DISCUSSÃO GERAL

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Discussão Geral

Otimização da extração dos compostos fenólicos totais (TPC) e antocianinas monoméricas totais (TMA) e quantificação dos TPC e TMA

Foram realizados dois planejamentos experimentais com a mistura de metanol, etanol e água, tanto para a otimização da extração do conteúdo de TPC para a semente (planejamento 1) como para a otimização da extração TMA para a casca (planejamento 2; neste planejamento a mistura de solventes foi acidificada com 0,5% de ácido acético glacial). O menor rendimento na extração dos TPC para a semente foi no experimento de número 11, (água 100%), seguido dos ensaios 12 (etanol 100%) e 10 (metanol 100%). O ensaio 7 (33,3% etanol, 33,3% metanol e 33,3% água), e o teste 6 (66,6% etanol, 16,6% metanol e 16,6% água), obtiveram os rendimentos mais elevados. No entanto, a mistura de solventes calculada como sendo a melhor para extração dos TPC da semente foi 60% etanol e 40% água, utilizando o gráfico de resposta estimada resultante do modelo quadrático (Figura 1 do Capitulo 2), e o valor predito (Tabela 1 do Capitulo 2). Para a extração do conteúdo de TMA da casca, o ensaio de número 11 (água 100%) obteve o menor rendimento, seguido dos testes 12 (etanol 100%) e 10 (metanol 100%). Os melhores rendimentos foram obtidos com as misturas dos solvestes nos experimentos de número 8 (16,6% etanol, 66,6% metanol e 16,6% água) e no número 4 (33,3% etanol, 33,3% metanol e 33,3% água). No entanto, o solvente escolhido para extração das TMA da casca foi 80% metanol e 20% água, acidificado a 0,5% com ácido acético glacial. Esta condição foi definida utilizando o gráfico de resposta estimada resultante do modelo quadrático, e o valor predito. Vários trabalhos encontrados na literatura utilizam a mistura metanol/água acidificada para extração das antocianinas da jabuticaba como os realizados por Wu et al. (2012), Alezandro et al. (2013), Batista et al. (2014), entre outros. Porém, neses trabalhos não houve a otimização da mistura de solventes através do planejamento multivariado, consequentemente as proporções de cada solvente foram diferentes das utilizadas no presente estudo, o qual efetivamente demostra a

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melhor mistura de solventes para extração das TMA da casca da jabuticaba, através do planejamento experimental. Com o objetivo de validar as misturas de solventes otimizadas para extração dos TPC da semente e das TMA da casca, foram realizadas 10 extrações (n= 10) aplicando as misturas de solventes otimizadas para cada extração (60% etanol, 40% água e 80% metanol, 20% água acidificados a 0,5% com ácido acético glacial, respectivamente). Todos os resultados obtidos nas extrações do TPC da semente e TMA da casca da jabuticaba estão de acordo com o valor predito (previsão do modelo), e com os valores significância de regressão e da falta de ajuste gerados pelo modelo de ANOVA. Os resultados da validação, os valores preditos, assim como, os dados dos valores de significância de regressão e da falta de ajuste gerados pelo modelo de ANOVA encontram-se na Tabela 1 do Capitulo 2. Para os ensaios da otimização do tempo de extração, tanto para os TPC da semente como para as TMA da casca da jabuticaba, foi utilizada a mistura de solventes otimizada. Para ambas as extrações foram testados 8 tempos, começando com um total de 4 horas (extração + reextração) e diminuindo até um total de 30 minutos (extração + reextração). Todas as condições experimentais foram mantidas fixas, exceto o tempo, que estava sendo avaliado. Os resultados para otimização do tempo de extração estão na Tabela 2 do Capitulo 2. Os resultados tanto para o conteúdo de TPC da semente como para as TMA da casca da jabuticaba não apresentaram diferença estatística significativa pelo teste de Tukey, ou seja, o processo de extração mais longo, de 4 horas, apresentou o mesmo rendimento que o processo mais rápido, de 30 minutos. Com estes resultados foi possível diminuir em três horas e meia o processo de extração, o que é excelente, pois além de economizar o tempo do analista, diminui os gastos de energia elétrica e o desgaste do equipamento. Deve-se ressaltar que o método otimizado nesta pesquisa é uma alternativa para os pesquisadores que trabalham com antocianinas e compostos fenólicos, pois a maioria dos métodos de extração encontrados na literatura geralmente são muito longos. Neste estudo foi realizada a extração dos TPC da semente e das TMA da casca da SF, de acordo com três métodos de extração: o método aqui otimizado, o método

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descrito por Alezandro et al. (2013) e o descrito por Santos et al. (2010). Todos os resultados para essas análises estão expostos na Tabela 3 do Capitulo 2. O método de extração otimizado nesta pesquisa não apresentou diferença significativa (rendimento 89,15 mg/GAE g A.L. TCP, 1113,26 mg c-3-g. 100 g-1 A.L. TMA), quando comparado a extração segundo Alezandro et al. (2013) (rendimento 89,53 mg GAE/g A.L. TCP, 1359,10 mg c-3-g. 100 g-1 A.L. TMA). Contudo, o método otimizado se mostra mais vantajoso, pelo fato de ser extremamente mais rápido, levando apenas meia hora para realizar a extração ao invés de seis horas. Outra grande vantagem é que para a extração dos TPC da semente foi fixado como solvente etanol:água (60:40, v/v), enquanto Alezandro et al. (2013) utilizaram metanol:água (70:30. v/v), pois sabe-se que o etanol é menos tóxico que o metanol e, dessa forma, oferece menos riscos ao analista e ao meio ambiente. O método de extração realizado segundo Santos et al. (2010), mostrou diferença (rendimento 17,16 mg GAE/g A.L. TCP, 77,34 mg c-3-g. 100 g-1 A.L. TMA) significativa tanto quando comparado com o método aqui otimizado quanto quando comparado com o método de Alezandro et al. (2013). Esses métodos obtiveram rendimento extremamente mais elevados tanto para compostos fenólicos (80% superior), quanto para antocianinas (93% superior), além do método otimizado diminuir o tempo de extração em uma hora e meia. Dessa forma, os métodos de extração otimizados neste estudo provaram ser um excelente método para a extração do conteúdo de TPC da semente e de TMA da casca da jabuticaba, pois apresentam alto rendimento dos compostos extraídos, além de serem rápidos, práticos e simples, utilizando solventes e equipamentos encontrados na grande maioria dos laboratórios de pesquisa. A extração aqui otimizada, foi aplicada para mais 5 variedades de jabuticabas (SFP, PF, CFP, HFP e PFP) em duas safras (safra 2014 e 2015) totalizando 24 amostras. Também foi realizada a quantificação dos TPC nos extratos da semente e da casca, e a quantificação das TMA no extrato da casca de todas as amostras. Todos os resultados obtidos encontram-se descritos na Tabela 4 do Capitulo 2. As variedades da semente CFP e PFP ambas da safra 2015 e as variedades da casca PFP e SFP também pertencentes à safra de 2015 são as que possuem a maior concentração de compostos fenólicos totais, quando comparadas com as

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demais variedades aqui estudadas. A SF safra 2015 e SFP safra 2015 são as amostras com maior teor de antocianinas aqui analisadas. A HFP safra 2015 possui mais compostos fenólicos na sua casca que na sua semente, a CFP safra 2015 obteve valores consideráveis de compostos fenólicos tanto na casca quanto na semente. A PFP safra 2015 obteve o menor teor de antocianinas, porém maior concentração de compostos fenólicos, tanto na casca quanto na semente. A amostra PFP safra 2014, quando comparada com as matrizes SF safra 2015 e SFP safra 2015 possui consideravelmente menos antocianinas, este comportamento se repete para HFP safra 2014. A SF safra 2014 possui menor concentração de compostos fenólicos na sua casca e na sua semente e menor concentração de antocianinas quando comparada com as amostras SFP safra 2014 e CFP safra 2014. A PF safra 2014 e 2015 foi à variedade que apresentou o menor teor de compostos fenólicos e antocianinas quando comparada com as demais variedades aqui pesquisadas. Praticamente todas as amostras da safra de 2015 apresentaram valores mais elevados, tanto para o conteúdo total de compostos fenólicos, como para antocianinas monoméricas. Isso pode ser explicado por fatores como chuvas, seca, temperatura, ou seja, fatores edafoclimáticos. Atualmente são encontrados na literatura apenas trabalhos com as variedades Sabará e Paulista. As demais variedades (Pintada, Híbrida e Coroada) não haviam sido estudadas até o presente momento, sendo este o primeiro trabalho a investigar estas variedades. O trabalho de Hacke et al. (2016) encontrou para semente da variedade Paulista teores de fenólicos de 8,65 g GAE/100 g A.L, o que esta de acordo com o presente trabalho que encontrou para Paulista safra 2014 7,20g GAE/100 g de A.L. Alezandro et al. (2013) encontraram teores de TMA para casca liofilizada das jabuticabas Sabará e Paulista na ordem de 350 (mg c-3-g. 100 g-1 A.L) e 450 (mg c- 3-g. 100 g-1 A.L) respectivamente. Já neste estudo foram obtidos os valores para SF safra 2014 1172,16 (mg c-3-g. 100 g-1 A.L), safra 2015 2510,39 (mg c-3-g. 100 g-1 A.L), para SFP safra 2014 1603,09 (mg c-3-g. 100 g-1 A.L), safra 2015 2892,15 (mg c-3-g. 100 g-1 A.L) e para Paulista safra 2014 373,67 (mg c-3-g. 100 g-1 A.L), safra 2015 481,02 (mg c-3-g. 100 g-1 A.L). Os resultados obtidos para a variedade Paulista estão de acordo com obtidos neste trabalho. Porém, os resultados para a variedade

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Sabará são extremamente inferiores aos aqui encontrados, mostrando que o método de extração aqui otimizado é realmente eficiente para extração destes compostos. Todas as variedades analisadas nesta pesquisa possuem concentrações consideráveis tanto para o conteúdo TPC como para TMA, o que é de grande valia, pois sabe-se que estes compostos são extremamente benéficos a saúde humana.

Determinação da capacidade dos extratos das cascas e das sementes das cinco variedades de jabuticaba aqui estudas em desativar as especies reativas de oxigênio (ROS) e as espécies reativas de nitrogênio (RNS)

Todos os resultados obtidos com as análises de desativação das ROS e RNS, tanto para os extratos da casca como para os extratos da semente, estão expostos nas Tabelas 1 e 2 do Capitulo 3. Em vista da grande importância de estudos sobre fontes exógenas de antioxidantes que colaborem na desativação de espécies reativas como o ácido hipocloroso, foram realizados ensaios para verificar a capacidade dos extratos das cascas e das sementes de cinco variedades de jabuticabas em desativar esta espécie reativa. Dessa forma o extrato que se mostrou mais efetivo na desativação -1 desta espécie reativa foi o da casca SFP (IC50 9,24 µg mL ), seguido pelo extrato da -1 casca SF (IC50 11,65 µg mL ) ambos da safra 2015. O extrato com menor ação na -1 desativação do HOCl foi o da semente SF (IC50 50,32 µg mL ) safra 2014. Todos os extratos aqui testados mostram boa capacidade de desativação desta espécie reativa, sendo que os extratos das cascas tanto da safra de 2014, quanto da safra 2015, se mostraram mais poderosos na desativação do HOCl, do que os extratos das sementes. Comparando os resultados obtidos com os extratos das cascas de jabuticaba aqui analisados com o trabalho de Ribeiro et al. (2014) que estudou a fruta Psidium cattleianum, a qual pertence a mesma família que a jabuticaba, observamos que os extratos das cascas de jabuticaba tem maior ação na desativação do HOCl que os -1 da casca da Psidium cattleianum (IC50 32 µg mL ). •ˉ Outra espécie reativa é O2 , e pesquisas sobre compostos que tenham a capacidade de desativar está espécie reativa são de grande relevância. Neste

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•ˉ contexto, realizamos o ensaio de desativação do O2 , no qual podemos observar que os extratos produzidos a partir das sementes das variedades SF, PF safra 2015 •ˉ e o extrato da CFP safra 2014 foram os mais poderosos na desativação do O2 (IC50 18,87 µg mL-1, 16,15 µg mL-1 e 17,22 µg mL-1 respectivamente), seguido do extrato -1 da casca PFP safra 2015 (IC50 33,59 µg mL ). Os extratos que mostraram menor •ˉ atividade na desativação do O2 foram os da casca PFP safra 2014, seguido do -1 -1 extrato da semente PFP também da safra 2014 (IC50 71,50 µg mL e 62,03 µg mL respectivamente). Estes resultados mostram que os extratos obtidos tanto da casca quanto da semente da jabuticaba possuem excelente ação na desativação desta espécie reativa, pois quando comparados à fruta Psidium cattleianum, mesmo o resultado •ˉ -1 com menor poder na desativação do O2 (casca PFP safra 2014 IC50 71,50 µg mL ), mostra-se mais poderoso que o resultado obtido do extrato da casca da Psidium -1 cattleianum (IC50 84 µg mL ) (RIBEIRO et al., 2014). O ONOO- assim como as espécies reativas ciatadas acima também possuem efeitos maléficos ao organismo humano, por esta razão realizamos ensaios para verificar a capacidade dos extratos das cascas e das sementes de algumas variedades de jabuticabas em desativar esta espécie reativa na presença e na ausência de bicarbonato (NaHCO3). Desta maneira, observando os resultados obtidos os extratos das cascas se mostraram significativamente mais poderosos que os extratos das sementes na - desativação do ONOO , tanto na presença quanto na ausência do NaHCO3. Os extratos das cascas CFP, HFP e SFP safra 2015 foram os que apresentaram maior poder de desativação desta espécie reativa na ausência de NaHCO3 (IC50 3,84 µg mL-1, 4,09 µg mL-1, 3,89 µg mL-1, respectivamente). Seguindo a mesma linha, nos ensaios realizados na presença de NaHCO3, os extratos das cascas CFP e HFP -1 safra 2015 foram os que apresentaram melhor resultado (IC50 5,88 µg mL e 7,54 µg mL-1). Os extratos das sementes PF e SF safra 2014 apresentaram a menor ação na - -1 - desativação do ONOO na ausência de NaHCO3 (IC50 63,81 µg mL e 58,94 µg mL 1 ). Nos ensaios realizados na presença de NaHCO3, os extratos com menor

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atividade na desativação desta espécie reativa foram os das sementes SF, HFP e -1 -1 -1 PF safra 2014 (IC50 69,02 µg mL , 67,46 µg mL e 65,53 µg mL respectivamente). Ribeiro et al. (2014) analisaram a capacidade do extrato da casca da Psidium - -1 cattleianum em desativar o ONOO tanto na presença (IC50 55 µg mL ) quanto na -1 ausência (IC50 12,1 µg mL ) do NaHCO3. Comparando os valores do trabalho de Ribeiro et al. (2014) com os resultados obtidos para os extratos das cascas das jabuticabas, fica evidente a forte ação na desativação do ONOO- tanto na presença quanto na ausência do NaHCO3 exercida pelos extratos das cascas da jabuticaba. Os extratos da safra 2015 das sementes das jabuticabas também mostraram maior poder na desativação do ONOO-, tanto na presença, quanto na ausência do

NaHCO3, quando comparados aos resultados mostrados por Ribeiro et al. (2014). Por entender a importância de pesquisas voltadas a fontes exógenas de desativação de ROS, realizamos neste trabalho experimentos para verificar a ação de desativação dos extratos das cascas e das sementes de algumas variedades de jabuticaba sobre o ROO•. Dessa forma, analisando as respostas dos experimentos, o extrato com maior poder no combate desta espécie reativa foi o da casca CFP (916,08 μmol TE g-1) safra 2014, seguido pelos extratos da casca SFP (918,16 μmol TE g-1) e SF (839,72 μmol TE g-1) ambos da safra de 2015. O extrato que obteve a menor ação contra o ROO• foi o da casca PF (276,81 μmol TE g-1) safra 2014. Os extratos das sementes das variedades de jabuticabas aqui analisados também se mostraram eficientes no combate a esta espécie reativa. Podemos comprovar estes resultados comparando-os com os resultados de Inata et al. (2015), que analisaram a ação da jabuticaba (Myrciaria jaboticaba) conhecida popularmente como Jabuticaba Sabará em combater o ROO•. Neste estudo, foram encontrados os seguintes dados: 827 μmol TE g-1 para o extrato da casca e 654 μmol TE g-1 para o extrato da semente. Comparando esses resultados com os obtidos no presente trabalho, podemos verificar que os extratos das cascas CFP safra 2014 e os SFP e SF ambos da safra 2015 possuem maior ação contra ROO•. Já os extratos das sementes se mostraram muito semelhantes entre os dois trabalhos. Tendo em vista a relevância de pesquisas sobre substâncias que possuam a capacidade de desativar o H2O2, realizamos ensaios para verificar a capacidade de

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desativação dos extratos das cascas e das sementes das variedades de jabuticabas sob esta espécie reativa. Assim, o extrato mais poderoso na desativação do H2O2, foi o da semente SF (49,11% de inibição na concentração de 125 µg extrato mL-1) seguido pelo da semente HFP (41,50% de inibição na concentração de 125 µg extrato mL-1), ambos da safra de 2015.

Para a desativação do H2O2, os extratos das sementes das jabuticabas mostraram ser significativamente mais poderosos que os extratos das cascas, sendo que os extratos com menor poder na desativação foram os das cascas PF (2,64% de inibição na concentração de 70 µg extrato mL-1) e CFP (2,85% de inibição na concentração de 70 µg extrato mL-1), ambos da safra de 2014. Contudo todos os extratos aqui testados apresentaram uma boa ação na desativação do peróxido de hidrogênio, levando em conta que a concentração de 125 µg de extrato da semente SF por mL conseguiu desativar 49,11% desta espécie e que a concentração de apenas 70 µg de extrato da casca SF por mL conseguiu desativar 25,09% do H2O2. Isso é reforçado quando comparamos os resultados aqui obtidos com os de Berto et al. (2015), que testou os extratos da casca (35% de inibição na concentração de 1000 µg extrato mL-1) e da semente (25,2% de inibição na concentração de 1000 µg extrato mL-1) da fruta Quararibea cordata. Isto também se confirma quando comparamos com a pesquisa de Boeing et al. (2017), que analisou a ação de desativação do extrato da semente (24% de inibição na concentração de 1000 µg extrato mL-1) da fruta Bactrissetosa.

Compostos fenólicos não-antociânicos e antocianicos das cascas das cinco variedades de jabuticabas e ação antiproliferativa sob células tumorais de câncer de mama e próstata

Com as análises cromatográficas voltadas para os compostos fenólicos não- antociânicos, foi possível detectar diversos flavonoides e grandes quantidades de derivados de ácido elágico e ácido metilelágico. Dentre os flavonoides identificados, nota-se a presença de derivados de quercetina e miricetina. Os compostos identificados e quantificados foram (Tabela 1 do Capitulo 4) 3 flavonóis derivados da miricetina (M): M-hex-1 (miricetina-hexose), M-hex-2 e M-rhm

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(miricetina-rahmnosídeo). E 14 flavonóis derivados da quercetina (Q): Q-hex-1 (quercetina-hexose), Q-hex-2, Q-glcu (quercetina-glucuronide), Q-pent-1, Q-pent-2 e Q-pent-3 (isômeros de quercetina-pentose), Q-rhm (quercetina-rahmnosídeo), Q- galloyl-pent-1 e Q-galloyl-pent-2 (isômeros de quercetina-galloyl-pentose), Q-cm- hex-1 e Q-cm-hex-2 (isômeros de quercetina-coumaroil-hexose), Q-fer-hex-1 e Q- fer-hex-2 (isômeros de quercetina-feruloil-hexose), Free Q (quercetina livre). E 13 derivados do ácido elágico (EA): EA-hex (ácido elágico-hexose), EA-pent-1 e EA- pent-2 (isômeros de ácido elágico-pentose), EA-rhm-1 e EA-rhm-2 (isômeros de ácido elágico-rahmnosídeo), EA-ac-rhm-1 e EA-ac-rhm-2, (isômeros de ácido elágico-acetil-rahmnosídeo), EA-valeryl-rhm-1, EA-valeryl-rhm-4, EA-valeryl-rhm-2 e EA-valeryl-rhm-3 (isômeros de ácido elágico-valeryl-rahmnosídeo), EA-caprilyl-rhm (ácido elágico-caprilyl- rahmnosídeo), Free EA (ácido elágico livre). E 4 derivados do ácido metilelágico (Me-EA) sendo estes: Me-EA-valeryl-rhm (ácido metilelágico- valeryl-rahmnosídeo), Me-EA-caprilyl-rhm (ácido metilelágico-caprilyl- rahmnosídeo), Me-EA-rhm (ácido metilelágico-rahmnosídeo), Me-EA-ac-rhm (ácido metilelágico- acetil-rahmnosídeo). Para os flavan-3-oles monômeros foram identificados e quantificados, os compostos fenólicos catequina, galocatequina, galato de epicatequina, galato de galocatequina, galato de epigalocatequina, já para as proantocianidinas foram estimados mDP, %galoilação, %prodelfinidinas. Todos os resultados de identificação para os compostos fenólicos não-antociânicos estão expostos na Tabela 1 do Capitulo 4 e os resultados de quantificação desses compostos, estão na Tabela 2 do Capitulo 4. O composto majoritário derivado da miricetina foi o M-rhm, sendo este o pico 5 com m/z de 463 e fragmento MS/MS de 316, os valores de m/z e MS/MS aqui encontrados concordam com o trabalho de Neves te al., (2016). A variedade que apresentou a maior concentração deste composto na casca foi a PF e a CFP ambas da safra 2014, já as variedades que apresentaram o menor teor foram PFP ambas as safras e HFP safra 2015. O pico 14 com m/z 433 e fragmento MS/MS 301 é um composto derivado da quercetina (Q-pent-3), o pico 15 com m/z 447 e fragmentação 301 também é derivado da quercetina (Q-rhm), estes dados estão de acordo com o estudo

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realizado por Neves te al., (2016). Os compostos Q-pent-3 e Q-rhm foram os compostos majoritários na classe dos derivados da quercetina nas variedades aqui estudas. As variedades PFP ambas as safras e PF safra 2015 apresentaram as maiores concentrações de Q-pent-3, em contra partida na CFP este composto não foi detectado. Porém, a CFP foi à variedade com o maior teor de Q-rhm, já as SFP e PF ambas as safras, mostraram a menor concentração deste composto. Neves et al. (2016) encontraram em seu trabalho valor em %molar para o composto Q-pent-3 na variedade Paulista (fruta) de 11,6% e para Sabará (fruta) 12,6%, valores similares aos encontrados na casca dessas mesmas variedades no presente trabalho, Neves et al., (2016) também quantificaram o composto Q-rhm sendo que para Paulista (fruta) o valor foi 26,5% e para Sabará (fruta) de 26,9%, estes valores também são similares aos encontrados nas cascas dessas mesmas variedades neste estudo. O total de flavonóis (derivados de miricitina + derivados de quercetina) foram expressos em mg por kg casca seca equivalente em Q-rhm dessa forma a variedade HFP safra 2015 foi a que obteve o maior teor do composto em questão, por outro lado as variedades PF ambas as safras, revelaram a menor concentração dos flavonóis totais. Todas as variedades aqui analisadas mostraram quantidades consideráveis dos derivados da miricitina e quercetina, assim como, o teor total de flavonóis. A grande diversidade de padrões utilizados para expressar os resultados cromatográficos, assim como as inúmeras técnicas de análises e unidades de expressão tornam a comparação dos resultados entre os trabalhos de investigações bem complicada. Além do mais, com exceção da jabuticaba Sabará, as demais variedades praticamente não possuem estudos publicados até o momento. Para os derivados do ácido elágico (EA) o composto majoritário encontrado em todas as variedades de jabuticaba aqui estudadas foi o ácido elágico livre com m/z 301 e fragmentação 257, esses valores de m/z e de fragmentação já foram comprovados no trabalho de Neves te al., (2016). A PFP e a PF ambas da safra 2014, foram às variedades com a maior concentração de Free EA, por outro lado às variedades HFP ambas as safras e as PFP e CFP, ambas da safra 2015, mostraram o menor teor do referido composto. O estudo realizado por Neves te al., (2016)

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mostrou o valor em %molar do Free EA da variedade Paulista (fruta) foi de 64,7% e para Sabará (fruta) foi 72,4%, valores são semelhantes aos encontrados para a casca dessas mesmas variedades no presente trabalho. O total dos derivados do ácido elágico (mg/kg de casca seca eq. EA) foi expressivo para todas as variedades estudadas, sendo mais pronunciado na variedade PF safra 2015 e na CFP safra 2014, porem as variedades PF, PFP e HFP pertencentes a safra 2014 obtiverem os resultados mais baixos para o total EA. Neves te al., (2016) encontraram em seu trabalho teor total de EA para variedade Paulista (fruta) de 152,7 mg/kg eq. EA e para Sabará (fruta) 294,3 mg/kg eq. EA, estes valores são muito inferiores aos encontrados para casca dessas mesmas variedades no presente estudo. Foram identificados também derivados de ácido metilelágico (Me-EA) com substituintes semelhantes aos encontrados para os derivados de ácido elágico. Quantitativamente, todas as jabuticabas apresentaram maiores teores dos compostos derivados de ácido elágico, do que dos compostos derivados do Me-EA, sendo que nas variedades PFP safra 2014, HFP safra 2015 e CFP ambas as safras não foi detectado nenhum composto derivado do Me-EA. A variedade que apresentou a maior concentração do total Me-EA (mg/kg de casca seca eq. EA) foi a PFP safra 2015. Neves et al., (2016) encontraram em seu trabalho valores para o conteúdo total do Me-EA para variedade Paulista (fruta) de 2,85 mg/kg eq. EA e para Sabará (fruta) 1,96 mg/kg eq. EA, esses valores quando comparados com os encontrados para as cascas dessas mesmas variedades na presente pesquisa são consideravelmente menores. Foi encontrada uma pequena quantidade de taninos condensados (flavan-3-oles). A catequina foi o principal entre os flavan-3-oles monoméricos encontrados, sendo que as variedades com maior concentração deste composto foram PF safra 2015, SFP e CFP ambas as safras, já as variedades PF safra 2014 e a PFP ambas as safras mostraram o menor teor do composto em questão. Silva te al., (2017), mostraram em seu trabalho teor de catequina de 0,13 µg/ml de extrato aquoso da casca da jabuticaba Sabará.

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O total de flavan-3-oles monoméricos foi expresso em mg/kg casca seca eq. catequina, sendo que as variedades que apresentaram a maior concentração foram SF e HFP ambas da safra 2014, já as variedades PF, CFP ambas da safra 2015 e a PFP ambas as safras apresentaram o menor teor deste composto. Para as proantocianididas os compostos que se destacaram foram as prodelfinifidinas, sendo que as variedades aqui analisadas não apresentaram diferença significativa em relação a este tipo de compostos. O total das proantocianidinas foi expresso em mg/kg casca seca eq. catequina, e a variedade que obtive maior destaque foi SF safra 2014, por outro lado as variedades PF e PFP ambas as safras foram as que mostram menor teor do composto em questão. O teor de taninos condensados totais (Tabela 3 do Capitulo 4) também foi realizado neste trabalho, sendo que as variedades que obtiveram a maior concentração foram SFP e PFP ambas da safra 2015, enquanto a PFP safra 2014 mostrou o menor teor do referido composto. Para todos os compostos fenólicos não-antociânicos foram observadas diferenças entre os anos de colheitas, na maior parte das amostras estudadas, isto correu devido aos fatores edafoclimáticos os quais influenciam fortemente a síntese desses compostos nas plantas, destacando que no ano de 2014 ocorreu uma forte seca em todo o Brasil, assim os frutos coletados na safra de 2014 sofreram um estresse muito maior que os frutos coletados na safra de 2015 que foi um ano relativamente normal, em relação à quantidade de chuvas. As antocianinas identificadas foram delfinidina-3-glicosídeo (dp-glc), cianidina-3- glicosídeo (cy-glc), petonidina-3-glicosideo (pt-3-glc), pelargonidina-3-glicosídeo (pg- 3-glc), peonidina-3-glicosídeo (pn-3-glc), delfinidina-3-acetilglicosideo (dp-3-acglc), cianidina-3-acetilglicosideo (cy-3-acglc), delfinidina-3-cumarilglicosideo (dp-3-cmglc), cianidina-3-cumarilglicosídeo (cy-3-cmglc) e cianidina-3- ferroilglicosideo (cy-3- ferglc). A presença de antocianinas derivadas das antocianidinas delfinidina (Dp), cianidina (Cy), petonidina (Pt), pelargonidina (Pg) e peonidina (Pn) foi detectada com base na fragmentação das moléculas, originando íons com valores de m/z de 303, 287, 271, 317 e 301, respectivamente. A identificação das estruturas monoglicosadas ocorreu a partir dos padrões de fragmentação observados nos

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espectros MS/MS, nos quais eram observados apenas um tipo de fragmento, caracterizando a perda de um fragmento neutro que corresponde a uma glicose (162 Da). No caso da cy-3-cumarilglicosídeo, observou-se a perda de um fragmento neutro que corresponde a uma cumaroilglicose (308 Da). A identificação de cy-3- cumarilglicosídeo foi confirmada pelo correspondente espectro de UV-Vis, nos quais aparece um pico típico do resíduo cumaril no comprimento de onda de 314 nm. Todos os resultados da identificação dos compostos fenólicos antociânicos podem ser consultados na Tabela 1 do Capitulo 4. A antocianina predominante claramente foi cy-3-glc, seguida da dp-3-glc, CFP safra 2015 foi à variedade com a maior concentração de cy-3-glc e a PF safra 2014 foi a que obteve o menor teor deste composto, para a dp-3-glc a variedade com o teor mais elevado foi PF safra 2014 enquanto a CFP safra 2015 se mostrou com a menor concentração deste composto quando comparada com as demais variedades aqui estudadas. Todos os resultados quantitativos referentes aos compostos fenólicos antociânicos podem ser encontrados na Tabela 2 do Capitulo 4. Vários trabalhos também obtiveram resultados onde a cy-3-glc foi a predominante seguida pela dp-3-glc na jabuticaba (INADA et al., 2015; LEITE-LEGATTI et al., 2012; PLAZA et al., 2016). Trevisan et al. (1972) também identificaram a pn-3-glc em frutos de jabuticaba. Neves et al., (2016), encontraram em seu estudo valores do composto cy-3-glc na casca da jabuticaba Paulista de 75,1% molar e para a casca da Sabará 80,5% molar, estes valores estão de acordo com os encontrados neste trabalho, Neves et al., (2016) também encontraram valores do composto dp-3-glc nas cascas da jabuticaba Paulista de 23,7% molar e para a Sabará de 18,4% molar, estes valores também estão de acordo com os encontrados no presente estudo. Os compostos fenólicos antociânicos totais foram expressos em mg/kg de casca seca eq. cy-3-glc, sendo que a SFP safra 2015 foi a variedade que obteve o teor mais pronunciado deste composto, por outro lado a PF ambas as safras foi a variedade com a menor concentração de compostos antociânicos totais. Neves et al. (2016) encontraram em sua pesquisa teor total de antocianinas na casca da jabuticaba Paulista de 331,7 mg/kg fruta eq. cy-3-glc e para a Sabará 1057,7 mg/kg fruta eq. cy-3-glc, estes valores são consideravelmente inferiores aos encontrados na presente pesquisa.

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Para os compostos fenólicos antociânicos foi possível observar o mesmo fenômeno comentado acima, para os compostos fenólicos não-antociânicos, ou seja, foram observadas diferenças entre os anos de colheitas na maior parte das amostras estudadas, isto correu devido aos fatores edafoclimáticos os quais influenciam fortemente a síntese desses compostos nas plantas. Além de todos os ensaios cromatográficos também foi realizado ensaio biológico denominado teste de atividade mitocondrial (MTT-Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide), sob células tumorais de câncer de próstata (DU-145) e de mama (MDA- MB-231), com objetivo de verificar a ação antiproliferativa dos extratos das cascas de jabuticabas, aqui estudados. Todos os resultados obtidos com o ensaio biológico estão disponíveis na Tabela 4 do Capitulo 4. Foram testados 3 tempos de tratamento 24 horas, 48 horas e 72 horas para ambos os tipos celulares. A safra 2015 foi a que revelou maior eficiência na diminuição da proliferação celular, tanto para DU-145 quanto para MDA-MB-231, nos três tempos de tratamento testados. Para DU-145 os melhores tempos de tratamento foram de 48 horas e de 72 horas, e o que se mostrou menos eficiente foi o tempo de 24 horas. A variedade PFP safra 2015 foi a que se mostrou mais eficiente nos três tempos de tratamento utilizados, encontra partida a safra 2014 da variedade PFP foi a que obteve, o pior efeito, em todos os tempos de tratamentos testados. Para a linhagem celular MDA-MB-231 o resultado obtido para a variedade PFP se repetiu, ou seja, a PFP safra 2015 foi a mais eficiente na diminuição da proliferação celular, enquanto a PFP safra 2014 foi a menos eficiente nos três tempos de tratamento testados. Um resultado muito interessante observado para MDA-MB-231, foi que tanto no tempo de 24 horas como no de 48 horas os extratos de todas as variedades analisadas tanto da safra 2014, como da safra 2015, se mostraram fortemente mais eficientes na diminuição da proliferação celular que a droga de referência doxorubicin também analisada. Os resultados obtidos para as duas linhagens celulares analisadas, se mostram promissores pois todas as variedades analisadas em ambas as safras mostraram efeito na diminuição da proliferação celular, isto impulsiona a realização de novos estudos para elaboração de um fármaco a partir desta fruta tão abundante no Brasil.

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Até o momento são extremamente escassos estudos do efeito antiproliferativo das variedades de jabuticabas sob células tumorais, e os raros estudos existentes foram realizados com a variedade Sabará. Leite e Legatti et al. (2012), mostraram em seu trabalho o efeito antiproliferativo do extrato polar da jabuticaba Sabará sob as linhagens celulares de câncer de mama (MCF7) resultado 181,2 GI50 µg/ml de extrato e de câncer de próstata (PC-3) resultado >250 GI50 µg/ml de extrato.

Teor de flavan-3-óis e elagitaninos em extratos de sementes de jabuticaba e seu efeito na diminuição da proliferação de células tumorais de câncer de mama e próstata

As análises cromatográficas voltadas para os compostos fenólicos, possibilitaram a identificação e quantificação dos elagitaninos e dos flavan-3-óis contidos nas sementes das cinco variedades de jabuticaba aqui estudadas (Tabela 1 e 2 do Capitolo 5). Os elagitaninos identificados foram vescalagina, castalagina, casuarinin, casuarictin, além de dois possíveis artefatos que provavelmente foram formados no processo de extração e de resuspensão dos extratos (Puech et al., 1999). O perfil cromatográfico e os espectros obtidos no DAD podem ser visualizados nas Figuras 1a e 1b do Capitulo 5. Os monômeros de flavan-3-óis identificados foram catequina, galocatequina, 3-galato de epicatequina, 3-galato de galocatequina e 3-galato de epigalocatequina. Já para as proantocianidinas, foram estimados mDP (grau médio de polimerização), %galoilação e %prodelfinidinas. O isômero vescalagina foi o composto majoritário em todas as variedades aqui estudadas, seguido de castalagina. Estes foram identificados pelas massas moleculares (m/z 933,2) e confirmados pelas características espectrais e comparação com padrões autênticos. Neste trabalho foram identificados dois artefatos formados durante o processo de extração e ressuspensão dos extratos. O que possivelmente ocorreu foi que, durante o processo de extração utilizando etanol e água como solvente extrator, a vescalagina sofreu uma transformação incorporando uma molécula de etanol formando assim um complexo de vescalagina mais etanol (etil derivado da

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vescalagina) com m/z 963,2 (pico 4). E, durante a etapa de ressuspensão deste extrato com metanol e água como solvente, a vescalagina sofreu outra transformação com a incorporação de uma molécula de metanol formando um complexo com metanol mais vescalagina (metil derivado de vescalagina) com m/z 977,1 (pico 3). A formação desses complexos (artefatos) já foi anteriormente descrita por Puech et al. (1999). Considerando o exposto acima, os picos 3 e 4 na verdade fazem parte do pico 1, mas como incorporaram uma molécula de metanol e etanol respectivamente, formaram os dois compostos aqui identificados. Dessa forma, na etapa de quantificação dos compostos aqui identificados os picos 1, 3 e 4 foram somados, dando origem ao total de vescalagina expressa em %molar. A variedade com a maior concentração de vescalagina foi PFP ambas as safras, em contra partida a que demostrou menor teor do referido composto foi a PF safra 2014. Hacke et al. (2016) também identificaram a vescalagina e a castalagina nos extratos da semente da jabuticaba Sabará. O trabalho de Neves et al. (2016) demostrou teor de vescalagina para o extrato da semente da jabuticaba Sabará de 74,22 mg/100 g de fruto e para o extrato da semente da jabuticaba Paulista 157,39 mg/100 g de fruto. A vescalagina e a castalagina são isômeros e, portanto, apresentam características de m/z e espectro UV semelhantes, ainda que seus espectros MS2 difiram notavelmente (NAVARRO et al., 2017). Dessa forma, estes compostos foram diferenciados através do tempo de retenção, fato confirmado pela utilização de padrões. Estudos demonstraram que a vescalagina apresenta maior efeito sobre a polaridade, oxidabilidade em solução e termodegrabilidade que a castalagina (VIVAS et al., 2004), além de ser mais hidrofílica. Essas propriedades fazem com que a vescalagina apresente comportamento mais polar que a castalagina, o que explica seu menor tempo de retenção em uma coluna de fase reversa, como a empregada nesta análise. Levando em consideração o exposto acima, as sementes da jabuticaba são potenciais fontes de castalagina e vescalagina. Ressaltando que esses dois compostos são majoritários entre os elagitaninos desta amostra, o que facilitaria o processo de purificação.

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Os demais elagitaninos identificados, casuarinin e casuarictin, também são isômeros, e já haviam sido descritos tanto em extratos de jabuticaba obtidos da fruta inteira (Wu, Dastmalchi, Long, & Kennelly, 2013) como nos extratos obtidos das cascas (Plaza et al., 2016). Estes dois elagitaninos são complexos, já que também contem ácido gálico que pode ser liberado por hidrólise. Portanto, são também galotaninos. É notável que nos dois artigos mencionados anteriormente não se detectaram nem vescalagina nem castalagina, provavelmente pelo fato das análises não terem sido realizadas nas sementes, como no presente trabalho. O total de elagitaninos foi expresso neste trabalho como g de equivalentes de vescalagina por kg semente seca, sendo que as variedades que apresentaram a maior concentração de elagitaninos totais foram SF e CFP para ambas as safras. Por outro lado, as que menos se destacaram foram PF, PFP e a HFP todas da safra 2014. Todas as variedades de jabuticaba aqui estudadas apresentaram teor considerável de elagitaninos. Levando em consideração a alta diversidade de padrões empregados para expressar os resultados cromatográficos, assim como, as inúmeras técnicas de análises e unidades de expressão, torna-se extremamente complicada a comparação dos resultados entre os trabalhos de investigações, além de se tornarem pouco satisfatórias. Destaca-se que, até o momento, os estudos sobre a jabuticaba estiveram concentrados no fruto como um todo ou na casca e os escassos estudos encontrados com a semente utilizaram somente a variedade Sabará. Como comentado acima, no presente trabalho foram identificados e quantificados cinco monômeros de flavan-3-óis (Tabela 2 do Capitulo 5), sendo o mais pronunciado a galocatequina para todas as variedades aqui pesquisadas, nos dois anos de colheita. A variedade que apresentou o teor mais elevado de galocatequina foi a PF safra 2014, e as que menos se destacaram em relação a este composto foram PF e HFP, ambas da safra 2015 e a PFP de ambas as safras. O trabalho de Neves et al. (2016) demostrou teor de galocatequina para semente da jabuticaba Paulista de 1,0 mg/100 g de fruta e para semente da jabuticaba Sabará de 0,83 mg/100 g de fruto. O total de flavan-3-óis monômeros foi expresso neste estudo como g/kg semente seca eq. catequina, sendo que a HFP safra 2015 foi a variedade com a maior

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concentração do composto em questão. Já as SF, PF e CFP, todas da safra 2014, foram as variedades que apresentaram o menor teor de flavan-3-óis monoméricos totais. A reação com o pyrogalol estabiliza as unidades de extensão a despolimerização das moléculas de taninos condensados, permitindo sua análise cromatográfica. Após esta reação, as concentrações de catequina e galocatequina aumentaram, sinalizando que esses compostos podem ser encontrados polimerizados em moléculas maiores. A polimerização está relacionada com o decréscimo da adstringência (Fulcrand et al., 1996), o que contribui para o sabor da fruta. Essa característica é interessante principalmente para a variedade Sabará, que é a mais empregada em processos tecnológicos para a obtenção de produtos alimentícios. Para a classe das proantocianididas, os compostos com maior notoriedade foram as prodelfinifidinas para todas as variedades de jabuticabas aqui estudadas, em ambos anos de colheita. A variedade HFP, safra 2015, foi a variedade com a concentração mais elevada deste composto. Por outro lado, as variedades PF safra 2015 e a CFP safra 2014 foram as variedades com o menor teor de prodelfinidinas. Para o conteúdo total de proantocianidinas as variedades com a maior concentração foram SFP e HFP, ambas da safra 2015. Em contrapartida, as que mostraram o menor teor foram as PF e HFP, ambas da safra 2014. Para completar as análises dos compostos fenólicos, foi realizada a estimação de taninos condensados totais, revelando que a variedade que contém a maior concentração deste composto é a SFP safra 2015, e a que contém o menor teor é a HFP safra 2014. Todos os resultados referentes a esta análise estão disponíveis na Tabela 3 do Capitulo 5. Os resultados aqui obtidos para as análises de proantocianidinas e taninos condensados totais não puderam ser comparados com nenhum outro resultado, pois até o momento não foram encontrados outros trabalhos que tenham realizado estas análises nas sementes da jabuticaba. As análises de flavan-3-óis (proantocianidinas totais) e taninos condensados totais foram realizadas neste estudo, por que apesar dessas nomenclaturas teoricamente serem correspondentes, a complexidade estrutural dos flavan-3-óis

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polimerizados é vasta, e essas denominações tentam descrever um grupo complexo de substâncias com propriedades químicas que as diferenciam. Dessa forma, as proantocianidinas são polímeros dos flavan-3-óis que, em condições oxidativas fortes (meio HCl 6 mol L-1 e temperatura a 100 0C durante 2 horas), se despolimerizam e sofrem oxidação, originando antocianidinas de cor vermelha. Este comportamento é exibido pelas proantocianidinas nas quais as unidades de flavan-3-óis estão unidas por ligações “tipo B” (ligações interflavan entre as posições C-4 e C-8, principalmente, as distintas moléculas de flavan-3-óis). Este tipo de ligação se rompe no ensaio de despolimerização com o pirogalol. Há também outras formas de ligações interflavan, como as do tipo “A”, que não se rompem nas condições do ensaio com pirogalol. Já os taninos condensados são polímeros dos flavan-3-óis, que podem ser uma mistura de polímeros com enlaces tipo A e/ou tipo B, incluindo no mesmo polímero, os quais possuem a propriedade de precipitar as proteínas e outros polímeros, como a metílcelulose. Por este motivo, empregamos o ensaio de precipitação com metílcelulose para estimar o conteúdo total dos taninos condensados. Todas as amostras aqui estudadas apresentaram teores consideráveis de elagitaninos, flavan-3-óis monoméricos, proantocianidinas e taninos condensados totais. Dessa forma, as sementes das variedades de jabuticaba aqui analisadas são fontes dos referidos compostos, os quais trazem vários benefícios à saúde humana, revelando que este subproduto tem grande potencial para sua incorporação na indústria alimentícia, farmacêutica e cosmética. Além de todas as análises cromatográficas também foi realizado o ensaio biológico referente ao teste de atividade mitocondrial (MTT), sob células tumorais de câncer de próstata (DU-145) e câncer de mama (MDA-MB-231), com o propósito de verificar a ação antiproliferativa dos extratos das sementes das variedades de jabuticaba aqui pesquisadas. Todos os resultados obtidos com o ensaio biológico estão apresentados na Tabela 4 do Capitulo 5. Foram avaliados 3 tempos de tratamento (24 horas, 48 horas e 72 horas) para ambas as linhagens celulares. Para a linhagem DU-145, em relação aos extratos da safra 2014, o efeito mais significativo na redução da proliferação celular foi de 72 horas, seguido pelo de 48 horas. Porém, para os extratos da safra 2015 o efeito mais

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significativo na redução da proliferação celular foi de, 48 horas, seguido pelo de 24 horas. Os extratos da safra 2015 mostraram efeito mais significativo na diminuição da proliferação celular nos 3 tempos aqui testados quando comparados com os extratos da safra 2014. Este fato pode ser explicado devido às diferenças em relação a quantidade de chuvas, temperatura, ou seja, fatores edafoclimáticos diferentes entre as safras 2014 e 2015. Tais fatores exercem forte influência sobre a biossíntese dos compostos fenólicos. Sabe-se que os compostos fenólicos possuem efeito sobre a ação na diminuição da proliferação celular, por isso a ocorrência de resultados diferentes entre safras distintas. O resultado mais significativo obtido para redução da proliferação celular da DU-145 foi com o extrato da variedade SF, safra 2015, no tempo de 48 horas. Em contrapartida, o extrato da variedade PFP, safra 2014, no tempo de 24 e 48 horas, mostrou o pior resultado para diminuição da proliferação da DU-145. Para a linhagem MDA-MB-231, os extratos da safra 2015 também se mostraram mais eficientes na redução da proliferação celular quando comparados com os extratos das safras 2014. Nos testes realizados com a MDA-MB-231, tanto os extratos da safra 2014 quanto os extratos da safra 2015 mostraram ação mais efetiva na redução da proliferação celular no tempo de tratamento de 72 horas, seguidos pelo tempo de tratamento de 24 horas. O extrato da variedade PF, safra 2015, no tempo de tratamento de 72 horas, foi o que se mostrou mais eficiente contra a proliferação da MDA-MB-231. Por outro lado, o extrato da variedade PFP, safra 2014, no tempo de tratamento de 48 horas, revelou ser o menos eficiente contra a proliferação celular da MDA-MB-231. Os resultados obtidos para ambas as linhagens celulares aqui analisadas se mostram muito promissores, pois os extratos das sementes de todas as variedades analisadas em ambas as safras revelaram possuir efeito contra a proliferação celular. Isto estimula a realização de novas pesquisas para elaboração de fármacos a partir das sementes das variedades de jabuticaba aqui estudas, ressaltando que a semente é um subproduto praticamente inexplorado até o momento. Não foi possível comparar o efeito antiproliferativo dos extratos das sementes aqui estudados sob as linhagens DU-145 e MDA-MB-231 com outros estudos, porque até o momento não

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há outros trabalhos publicados com extratos das sementes das variedades aqui estudas sob as linhagens celulares aqui utilizadas. O trabalho mais próximo ao aqui realizado foi o de Leite e Legatti et al. (2012) que mostrou o efeito antiproliferativo do extrato polar da jabuticaba Sabará (fruta) sob as linhagens celulares de câncer de mama (MCF7), com resultado de 181,2 GI50 -1 -1 µg mL de extrato e de câncer de próstata (PC-3), com resultado >250 GI50 µg mL de extrato.

Conclusão geral

O trabalho aqui realizado constatou que o método de extração para TPC da semente da variedade SF, assim como o método de extração para TMA da casca da variedade SF, foram otimizados com sucesso, diminuindo drasticamente o tempo de extração, e dessa forma reduzindo o custo e otimizando o tempo do analista, ressaltando que os mesmos obtiveram alto rendimento na extração dos compostos. Os métodos de extração aqui otimizados também se mostraram eficientes para as cinco variedades estudadas, tanto para o conteúdo TPC como para as TMA. Este trabalho também revelou a ação tanto dos extratos das cascas, como dos extratos das sementes, das variedades de jabuticabas aqui estudadas, na desativação das espécies reativas de oxigênio HOCl, O2•ˉ, ROO• e H2O2, e da espécie reativa de nitrogênio ONOO-. Também foi realizada a caracterização das diferentes espécies de jabuticaba quanto à composição fenólica antociânica e não-antociânica que revelou grande quantidade de compostos, sobretudo flavonois, além de antocianinas. Os resultados para diminuição da proliferação celular das linhagens celulares DU-145 e MDA-MB-231, se mostraram extremamente promissores, pois todas as variedades testadas em ambas as safras obtiveram resultados relevantes na diminuição da proliferação celular. Estes resultados comprovam que a jabuticaba é uma ótima fonte de antioxidantes exógenos, e assim pode auxiliar na prevenção de danos à saúde, de quem a consome. Os resultados aqui expostos também sugerem o efeito importante que a safra e a localização possuem sobre a biossíntese dos compostos fenólicos da jabuticaba, os quais possuem reflexo em sua ação, frente à desativação das ROS e RNS e na diminuição da proliferação

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celular das linhagens DU-145 e MDA-MB-231. Esses dados servem de base para futuros estudos, principalmente na área farmacêutica para o desenvolvimento de fármacos a base desta fruta tão conhecida e abundante no Brasil. E também na área alimentícia com estudos para as indústrias acrescentarem a casca ou a semente da jabuticaba em várias formulações, ressaltando que até o momento a casca e a semente da jabuticaba são subprodutos. Assim sendo, este trabalho demostrou alto potencial desses subprodutos que com pesquisas mais aprofundadas podem servir de matéria-prima para produção de vários medicamentos e alimentos. Ressaltando que este trabalho enriqueceu a literatura com dados inéditos até o momento.

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