UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS MICHELLY CRISTIANE PALUDO Brazilian jabuticabas: Phenolic characterization, capacity of deactivation of reactive species of oxygen and nitrogen and antiproliferative potential in prostate and breast tumor cells Jabuticabas brasileiras: Caracterização fenólica, capacidade de desativação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e potencial antiproliferativo sob células tumorais de próstata e mama CAMPINAS 2018 MICHELLY CRISTIANE PALUDO Brazilian jabuticabas: Phenolic characterization, capacity of deactivation of reactive species of oxygen and nitrogen and antiproliferative potential in prostate and breast tumor cells Jabuticabas brasileiras: Caracterização fenólica, capacidade de desativação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e potencial antiproliferativo sob células tumorais de próstata e mama Thesis presented to the Faculty of Food Engineeri ng of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Ph.D., in the area of Food Science. Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de doutora em Ciência de Alimentos. Orientadora: Profa. Dra. Helena Teixeira Godoy Coorientador: Prof. Dr. Cristiano Augusto Ballus Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pela aluna Michelly Cristiane Paludo e orientada pela Profa. Dra. Helena Teixeira Godoy e coorientada pelo Prof. Dr. Cristiano Augusto Ballus. Campinas 2018 BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Helena Teixeira Godoy - Orientadora DCA/ FEA/ UNICAMP - Campinas/ SP Dra. Silvia Borges Pimentel de Oliveira - Membro Titular BC/ IB/ UNICAMP - Campinas/ SP Profa. Dra. Suzana Lucy Nixdorf - Membro Titular Instituto de química/ UEL - Londrina/ PR Prof. Dr. Marcelo Alexandre Prado - Membro Titular DCA/ FEA/ UNICAMP - Campinas/ SP Prof. Dr. Severino Matias de Alencar - Membro Titular IAN/ ESALQ/ USP - Piracicaba/ SP A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno. Agradecimentos Á minha Orientadora Prof. Dra. Helena Teixeira Godoy, um amor de pessoa, sempre disposta a me ouvir e colaborar. Ao meu Coorientador Prof. Dr. Cristiano Augusto Ballus, amigo desde o meu mestrado, se tornou meu Coorientador para somar incalculavelmente ao meu trabalho. Sempre presente, disposto a ajudar e, respondendo prontamente, sempre preocupado com minha formação e meu aprendizado, um exemplo de profissional. Ao seu Dirceu, técnico do laboratório presente desde o meu mestrado, sempre disposto a ajudar em tudo, desde descascar quilos de jabuticabas, até lavar toda a vidraria que eu utilizava que não era pouca. Todos os que fazem experimentos sabem o valor que pessoas assim têm, são fundamentais para o andamento do laboratório. Aos técnicos Eduardo e Marcela sempre dispostos a ajudar. Á todos do laboratório que colaboraram com o andamento da minha pesquisa. Ao CNPq - Coordenação Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (processo 145652/2014-9) pelo auxilio financeiro, com a concessão da bolsa de doutorado. Á CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pelo auxílio financeiro fornecido ao laboratório de pesquisa e pela bolsa de doutorado sanduiche PDSE (Processo: 88881.135420/2016-01). Ao Professor Dr. Isidro Hermosín-Gutiérrez, que me faltam palavras para agradecer tudo que o fez por mim. Abriu as portas do seu laboratório na Universidad Castilla-La Mancha (UCLM). Sempre esteve disposto a ajudar, me explicando os métodos, quantas vezes fossem necessárias, tudo sempre com muito bom humor. Á equipe maravilhosa e incomparável do IRICA onde passei os 6 meses do meu doutorado sanduiche na Espanha. Ao José sempre disposto a me ensinar e explicar tudo sobre cromatografia. Á Carmen por quem houve simpatia mútua, desde o momento que entrei no laboratório, sempre disposta a ensinar e a resolver tudo. Á Maria também sempre disposta á me ajudar. Á Victoria, um encanto de pessoa, sempre preocupada em ajudar á todos do laboratório. E á todos da equipe: Sergio, Ronan e Gusmão. Nunca vou me esquecer do auxílio que recebi, não só em relação aos experimentos, mas à tudo, sempre preocupados em saber se estava tudo certo. O mundo certamente seria muito melhor, se todos fossem como vocês, por isso, aceitem os meus mais sinceros agradecimentos. Á Equipe da Biologia Celular. Ao Professor Dr. Hernandes Faustino de Carvalho, por abrir as portas do seu laboratório, para que eu trabalhasse, como se fosse sua aluna. Á Silvia uma das pessoas mais encantadora, bondosa e disposta que conheci. Ao James que foi de imensa ajuda, preparando os meios de cultura, lavando e esterilizando todo o material que eu utilizava. Ao Andrés pela paciência e calma de esperar eu liberar o fluxo, mesmo já tendo passado muito do meu horário. Ao Professor Dr. Edson, por emprestar seu laboratório para eu ler minhas placas, sempre simpático e, á todos dessa Equipe maravilhosa: Isabela, Mariana, Ariane, Guilherme e Francisco, sempre dispostos a ajudar no que fosse possível. Aos funcionários da secretaria de Pós-graduação da FEA por toda a ajuda no processo de defesa da tese. Aos membros da banca examinadora pelos conselhos e pelas correções, que auxiliaram no aprimoramento deste trabalho. Á todos que de uma forma contribuíram com este trabalho. Gostaria de agradecer imensamente aos meus pais, Izolda Lucia Paludo e Italino Paludo, que sempre estiveram ao meu lado, me apoiando e me incentivando, independentemente da situação em que estivessem. Tenho a absoluta certeza, que se hoje sou Doutora, foi devido á todo apoio e incentivo, que sempre recebi dos meus amados pais, pai e mãe são as maiores riquezas que uma pessoa pode ter. Aos meus irmãos Mari, Fabio e Kika, que sempre me ouviu, dando bons conselhos, sem se preocupar em me agradar e sim em me recomendar o que era o certo a ser feito. Ao meu namorado Marcus por suportar a distância por 6 meses durante o doutorado sanduíche. Obrigada por fiscalizar meus prazos, mais do que ninguém, para que eu nunca atrasasse o cronograma do doutorado. Ele sempre me falava: “Não estou aqui para passar a mão na sua cabeça. Eu me importo com você, por isso quero que veja as coisas, como elas realmente são”. Essas palavras, muitas vezes, fizeram com que eu corresse atrás de muitas coisas. Ás minhas amigas companheiras de República. Á Luciana sempre disposta a ajudar com os tratamentos estatísticos, envolvendo PCA. Á Lidiane, sempre disposta a ajudar com todos os seus conhecimentos. Á Rafinha companheira de República, durante o mestrado e o doutorado, sempre disposta a me ajudar com os seus conhecimentos sobre os ensaios biológicos. Meninas, obrigada por serem fantásticas e estarem sempre presentes, nos bons e maus momentos. Aprendi muito com vocês, amigas para toda a vida. Resumo A jabuticaba é uma fruta nativa do Brasil, rica em compostos fenólicos, dentre os quais estão as antocianinas. Estes compostos apresentam alta capacidade antioxidante e estão relacionados à prevenção de muitas doenças crônico degenerativas. Desta forma, este trabalho teve como objetivo realizar a otimização da extração dos compostos fenólicos totais (TPC) da semente e das antocianinas monoméricas totais (TMA) da casca, e efetuar a caracterização dos mesmos. Além disso, foi avaliada a capacidade de desativação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS), bem como a determinação do potencial antiproliferativo em células tumorais de próstata e mama, dos extratos das cascas e das sementes de cinco variedades de jabuticaba. Assim, este estudo realizou com sucesso a otimização da extração dos TPC da semente e das TMA da casca. Foram obtidas as seguintes condições ótimas para TPC da semente solvente etanol:água (60:40 v/v) e para TMA da casca solvente metanol:água:ácido acético (80:20:0,5 v/v/v), sendo o tempo de extração de 30 minutos para ambas as extrações. Também foi efetuada a avaliação da capacidade dos extratos das cascas e das sementes das jabuticabas em desativar ROS e RNS. Ambos os extratos mostraram ser uma excelente fonte de antioxidantes exógenos: casca Sabará (SPF) -1 • desativou o HOCl com IC50 9,24 µg mL , semente Paulista (PF) desativou o O2 ˉ -1 - com IC50 16,15 µg mL , semente Coroada (CFP) desativou o ONOO na ausência de -1 - NaHCO3 com IC50 3,84 µg mL , casca CFP desativou o ONOO na presença de -1 • NaHCO3 com IC50 5,88 µg mL , casca SFP desativou o ROO (ORAC) em 918,16 -1 μmol TE g e a semente Sabará desativou o H2O2 em 49,11% inibição na concentração de 125,00 µg extrato mL-1. Para complementar este trabalho foi realizado o teste de atividade mitocondrial (MTT) sobre células tumorais de mama (MDA-MB-231) e de próstata (DU-145), o qual demostrou que os extratos da casca e da semente diminuem a proliferação das células tumorais. O extrato da casca PFP -1 inibiu o crescimento celular da MDA-MB-231 com IC50 25,86 µg mL de extrato. Para finalizar os experimentos foi realizada a quantificação e identificação dos compostos fenólicos antociânicos e não antociânicos por meio de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas. Os resultados demostraram que as antocianinas majoritárias foram a cianidina-3-glicosídeo e a delfinidina-3-glicosídeo. Foram detectados 3 derivados de miricitina, 14 derivados de quercetina incluindo a quercetina livre, 13 derivados de ácido elágico, incluindo o ácido elágico livre, e 4 derivados de ácido metilelágico. Dessa forma, foi possível caracterizar o perfil dos compostos fenólicos de variedades de jabuticabas, até então não estudadas. O método de extração otimizado mostrou-se rápido, simples, com um adequado rendimento. Os extratos analisados comprovaram um elevado potencial antioxidante, capaz de combater eficientemente a proliferação das células DU-145 e MDA-MB-231, demostrando que a jabuticaba possui efeitos benéficos à saúde humana. Palavras-chave: Myrciaria ssp., câncer de próstata e mama, antocianinas, antioxidantes, estresse oxidativo. ABSTRACT Jabuticaba is a Brazilian fruit, rich in phenolic compounds, specially anthocyanins.