Populationsgenetik Und Phylogeographie Des Archäophyten Und Kulturreliktzeigers Vinca Minor L
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Populationsgenetik und Phylogeographie des Archäophyten und Kulturreliktzeigers Vinca minor L. (Apocynaceae) Dissertation Sina Möller Populationsgenetik und Phylogeographie des Archäophyten und Kulturreliktzeigers Vinca minor L. (Apocynaceae) Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat) im Fachbereich 10 Mathematik und Naturwissenschaften der Universität Kassel vorgelegt von Diplom-Biologin Sina Möller aus Kassel Kassel, im Januar 2015 Betreuer: Prof. Dr. Kurt Weising Prüfungskommision: Prof. Dr. Kurt Weising (1. Gutachter) Prof. Dr. Elvira Hörandl (2. Gutachter) Prof. Dr. Rüdiger Wagner (Beisitzer) Dr. Christine Nowack (Beisitzer) Tag der Disputation: 27.03.2015 Für meine Eltern Glaube dem Erfahrenen: Du findest Größeres im Wald als in den Büchern. Das Holz und die Steine werden Dir Dinge vermitteln, die Du von keinem Lehrer hören kannst. Bernardus Claraevallensis Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 1.1. Anthropogener Einfluss auf die europäische Vegetation 1 1.1.1. Natürliche und anthropogen bedingte Vegetationsentwicklung Mitteleuropas 1.1.2. nachNeobiota der letzten und biologische Eiszeit Invasionen - Definitionen 21 1.1.3. Kulturreliktzeiger und Stinsenpflanzen 3 1.2. Asexuelle Reproduktion 4 1.3. Vinca minor L. 5 1.3.1. Systematische Stellung 5 1.3.2. Morphologie, Blütenbiologie und Reproduktion 8 1.3.3. Verbreitung und biogeographischer Status von Vinca minor 11 1.3.4. Mythologische und pharmakologische Bedeutung 13 1.3.5. Gartenformen 14 1.4. Zielsetzung der Arbeit 16 2. Material und Methoden 18 2.1. Pflanzenmaterial 18 2.1.1. Pflanzenmaterial für die 454-Sequenzierung und die Etablierung von Mikro- satellitenmarkern 18 2.1.2. Pflanzenmaterial für populationsgenetische Untersuchungen 19 2.1.3. Pflanzenmaterial für phylogeographische Untersuchungen 20 2.2. DNA-Isolation 23 2.2.1. Standard-CTAB-Methode 23 2.2.2. Sorbitol-Variante der CTAB-Methode 23 2.3. Mikrosatelliten 24 2.3.1. Nukleäre Mikrosatelliten 24 2.3.1.1. Evolution und Mutation 25 2.3.1.2. Mikrosatelliten als molekulare Marker 26 2.3.1.3. Mikrosatellitenmarker für Apocynaceae 27 2.3.2. Plastidäre Mikrosatelliten 28 2.3.3. Etablierung von Mikrosatellitenmarkern über 'next generation sequencing' 29 (NGS) 2.3.4. Bioinformatische Verarbeitung von NGS-Daten zur Etablierung artspezifischer Mikrosatellitenmarker für Vinca minor 31 2.3.4.1. Rohsequenzen 31 2.3.4.2. Assemblierung der Rohsequenzen 32 2.3.4.3. Suche nach Mikrosatelliten 32 2.3.4.4. Rekonstruktion des Plastoms von Vinca minor 32 2.3.4.5. Primerdesign 33 2.3.5. Verwendung universeller Primer für Mikrosatellitenloci aus dem Plastom (ccmps) 33 2.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 34 2.5. Gelelektrophorese 37 2.5.1. Agarose-Gelelektrophorese 37 2.5.2. Polyacralamid-Gelelektrophorese 38 2.6. Primertests 39 2.7. Fragmentlängenanalyse 39 2.8. Populationsgenetische Auswertung der nukleären Mikrosatelliten 40 2.8.1. Charakterisierung der genotypischen und genetischen Diversität 40 2.8.2. Abschätzung der Klonalität 41 2.8.3. Neighbour Joining-Analyse 42 2.8.4. Bayes'sche Analyse 44 2.8.5. AMOVA 45 2.8.6. F-Statistik 45 2.8.7. Mantel-Test 47 2.9. Phylogeographische Auswertung der plastidären Mikrosatellitenmarkern 47 3. Ergebnisse 49 3.1. DNA-Isolation 49 3.2. Bioinformatische Verarbeitung von NGS-Daten zur Etablierung von 50 Mikrosatellitenmarkern 3.2.1. Assemblierung der Rohsequenzen 50 3.2.2. Identifizierung und Charakterisierung von Mikrosatelliten 51 3.2.3. Primerdesign 52 3.2.4. Rekonstruktion des Plastoms und Suche nach plastidären Mikrosatelliten 52 3.3. Primertests 55 3.3.1. Primertests für Mikrosatellitenloci aus NGS-Daten 55 3.3.1.1. Mikrosatellitenloci aus dem Kerngenom 55 3.3.1.2. Zwischenartliche Übertragbarkeit 56 3.3.2. Mikrosatellitenloci aus dem Plastom 57 3.3.3. Universelle Primer für plastidäre Mikrosatelliten (ccmps) 58 3.4. Populationsgenetische Auswertung von Vinca minor 59 3.4.1. Allelische Diversität 60 3.4.2. Nullallele 64 3.4.3. Genotypische und genetische Diversität 64 3.4.3.1. Populationen südlich und westlich der Alpen 65 3.4.3.2. Populationen in Mitteleuropa inkl. der Alpen und in Nordamerika 68 3.4.4. Genetische Struktur 71 3.4.4.1. Multilocus-Genotypen (MLG) und Multilocus-Linien (MLL) 71 3.4.4.2. Neighbour-Joining-Analyse auf Basis der genetischen Distanzen zwischen den individuellen Multilocus-Genotypen 76 3.4.4.3. Neighbour-Joining-Analyse auf Basis der genetischen Distanzen 82 zwischen Populationen 3.4.4.4. Bayes'sche Analyse 86 3.4.5. Genetische Differenzierung und Struktur westlich und südlich der Alpen 87 3.4.5.1. Fixationsindizes 87 3.4.5.2. Paarweise FST-Werte 90 3.4.5.3. Analyse molekularer Varianz (AMOVA) 93 3.4.5.4. Mantel-Test ('isolation by distance') 93 3.5. Phylogeographie (plastidäre Mikrosatelliten) 95 4. Diskussion 100 4.1. Mikrosatellitenmarker aus der 454-Sequenzierung 100 4.1.1. De novo Assemblierung 101 4.1.2. Abundanz der Mikrosatellitenmotive in V. minor und Primerdesign 102 4.1.3. Funktionalität und Übertragbarkeit der nukleären Mikrosatellitenmarker 104 4.1.4. Rekonstruktion des Plastoms 107 4.1.5. Funktionalität und Übertragbarkeit der plastidären Mikrosatellitenmarker 108 4.1.6. Mikrosatelliten-Marker für Vinca minor: Fazit und Ausblick 109 4.2. Populationsgenetik und Phylogeographie von Vinca minor 111 4.2.1. Methodische Diskussion 111 4.2.1.1. Nukleäre Mikrosatellitenmarker 111 4.2.1.1.1. Polymorphie und Abschätzung von Klonalität 111 4.2.1.1.2. Nullallele 111 4.2.1.1.3. NJ-Dendrogramme, Neighbour Net-Netzwerke und 112 Bayes'sche Analyse 4.2.1.2. Plastidäre Mikrosatellitenmarker 113 4.2.2. Inhaltliche Diskussion 114 4.2.2.1. Italien: hohe genetische Diversität und geringe genetische 114 Differenzierung 4.2.2.2. Klonalität als Indikator für anthropogen entstandene V. minor- 118 Vorkommen 4.2.2.3. Seltene Ereignisse sexueller Reproduktion in Mitteleuropa 120 4.2.2.3.1. Geitonogamie 120 4.2.2.3.2. Interklonale Reproduktion 123 4.2.2.4. Somatische Mutationen 124 4.2.2.5. Der Ursprung mitteleuropäischer Vinca minor-Vorkommen und die 125 Verbreitungsmuster der klonalen Linien in Mitteleuropa 4.2.2.6. Nordamerika 129 4.2.2.7. Cultivare 130 4.2.3. Ausblick 133 5. Zusammenfassung 136 6. Literaturverzeichnis 140 7. Abbildungsverzeichnis 155 8. Tabellenverzeichnis 156 9. Abkürzungsverzeichnis 157 10. Anhang 158 11. Referenzen 212 12. Erklärung 214 Danksagung 215 1. Einleitung 1. Einleitung 1.1. Anthropogener Einfluss auf die europäische Vegetation 1.1.1. Natürliche und anthropogen bedingte Vegetationsentwicklung Mitteleuropas nach der letzten Eiszeit Infolge der allmählichen Klimaerwärmung nach der letzten Eiszeit im Holozän kam es zur Remigration zahlreicher Tier- und Pflanzenarten aus den glazialen Refugien nach Mittel- und Nordeuropa, wo sich sukzessive eine ausgedehnte natürliche Waldvegetation etablierte. Deren heutige Struktur und Artenzusammensetzung ist jedoch nicht nur auf natürliche Prozesse zurückzuführen, sondern stark von anthropogenen Einflüssen geprägt. So begann bereits während des Neolithikums die sukzessive Zerstörung der natürlichen potentiellen Vegetation infolge der Sesshaftwerdung des Menschen und seiner zunehmenden Populationsdichte (Behre 1988, Kaplan et al. 2009). Im Neolithikum wurden auch erste, in Mitteleuropa nicht beheimatete Nutzpflanzen aus dem Vorderen Orient eingeführt. So weisen Makrofossilien auf die Nutzung von Getreidearten wie Triticum dicoccum, T. monococcum, Hordeum vulgare sowie der Leinpflanze (Linum usitatissimum) und des Mohns (Papaver setigerum) während der Bandkeramik-Kultur hin. Mit der finalen neolithischen Expansion manifestierten sich auch in Pollendiagrammen erste anthropogene Indikatoren (Poaceae, Calluna, Plantago lanceolata; Behre 1988, Lang 1994). Während der Römerzeit wurden zahlreiche kultivierte Pflanzen aus der mediterranen Region in die Römischen Kolonien eingeführt, soweit deren Anpassungsfähigkeit an das lokale Klima gegeben war (Kowarik 2003). Ein bekanntes Beispiel ist der Pfirsich (Prunus persica, Willerding 1984 in Kowarik 2003). Im Mittelalter wurde die Flora fortwährend durch die Einführung von Nutz- und Symbolpflanzen aus dem Mittelmeergebiet und Vorderasien erweitert, wie z. B. Lilium candidum (Krausch 1990 in Kowarik 2003). Mit der Kolonialisierung Nordamerikas erfolgte schließlich auch ein floristischer Austausch zwischen der Alten und der Neuen Welt, der jedoch in zunehmendem Maße auch unbeabsichtigte Einschleppungen mit sich brachte (Kowarik 2003). Seit dem Mesolithikum wurden infolge der zunehmenden Mobilität des Menschen bis heute insgesamt über 6.000 Landpflanzenarten aus allen Teilen der Welt nach Europa eingeführt, davon zirka 860 Arten nach Deutschland (DAISIE 2014). Heute sind etwa 370 dieser eingeführten Taxa in der mitteleuropäischen Flora etabliert (Kunick 1991, Russow 2002). 1 1. Einleitung Neben Makrofossilien und Pollenfunden bei Pflanzen geben auch moderne molekulare Marker interessante Einblicke in die Migrationsgeschichte von Tier- und Pflanzenarten. Daraus entstand die Disziplin der Phylogeographie, die sich für die innerartlichen Evolutionsprozesse in Zeit und Raum interessiert (Avise 2000). Sie beschäftigt sich sowohl mit der Rekonstruktion postglazialer Migrationsrouten (z. B. Taberlet et al. 1998), als auch mit den anthropogen beeinflussten Ausbreitungswegen eingeführter Arten (z. B. LeRoux et al. 2011). Die Populationsgenetik hat dagegen das Ziel, mittels molekularer Marker Informationen über die rezente genetische Diversität und Struktur von Arten sowie ihrer Populationen zu gewinnen und darüber z. B.