Populationsgenetik und Phylogeographie des Archäophyten und Kulturreliktzeigers Vinca minor L. (Apocynaceae)

Dissertation Sina Möller Populationsgenetik und Phylogeographie des Archäophyten und Kulturreliktzeigers Vinca minor L. (Apocynaceae)

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat)

im Fachbereich 10 Mathematik und Naturwissenschaften der Universität Kassel

vorgelegt von Diplom-Biologin

Sina Möller

aus Kassel

Kassel, im Januar 2015 Betreuer: Prof. Dr. Kurt Weising

Prüfungskommision: Prof. Dr. Kurt Weising (1. Gutachter) Prof. Dr. Elvira Hörandl (2. Gutachter) Prof. Dr. Rüdiger Wagner (Beisitzer) Dr. Christine Nowack (Beisitzer)

Tag der Disputation: 27.03.2015 Für meine Eltern Glaube dem Erfahrenen: Du findest Größeres im Wald als in den Büchern. Das Holz und die Steine werden Dir Dinge vermitteln, die Du von keinem Lehrer hören kannst.

Bernardus Claraevallensis Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1 1.1. Anthropogener Einfluss auf die europäische Vegetation 1 1.1.1. Natürliche und anthropogen bedingte Vegetationsentwicklung Mitteleuropas 1.1.2. nachNeobiota der letzten und biologische Eiszeit Invasionen - Definitionen 21 1.1.3. Kulturreliktzeiger und Stinsenpflanzen 3 1.2. Asexuelle Reproduktion 4 1.3. Vinca minor L. 5 1.3.1. Systematische Stellung 5 1.3.2. Morphologie, Blütenbiologie und Reproduktion 8 1.3.3. Verbreitung und biogeographischer Status von Vinca minor 11 1.3.4. Mythologische und pharmakologische Bedeutung 13 1.3.5. Gartenformen 14 1.4. Zielsetzung der Arbeit 16

2. Material und Methoden 18 2.1. Pflanzenmaterial 18 2.1.1. Pflanzenmaterial für die 454-Sequenzierung und die Etablierung von Mikro- satellitenmarkern 18 2.1.2. Pflanzenmaterial für populationsgenetische Untersuchungen 19 2.1.3. Pflanzenmaterial für phylogeographische Untersuchungen 20 2.2. DNA-Isolation 23 2.2.1. Standard-CTAB-Methode 23 2.2.2. Sorbitol-Variante der CTAB-Methode 23 2.3. Mikrosatelliten 24 2.3.1. Nukleäre Mikrosatelliten 24 2.3.1.1. Evolution und Mutation 25 2.3.1.2. Mikrosatelliten als molekulare Marker 26 2.3.1.3. Mikrosatellitenmarker für Apocynaceae 27 2.3.2. Plastidäre Mikrosatelliten 28 2.3.3. Etablierung von Mikrosatellitenmarkern über 'next generation sequencing' 29 (NGS) 2.3.4. Bioinformatische Verarbeitung von NGS-Daten zur Etablierung artspezifischer Mikrosatellitenmarker für Vinca minor 31 2.3.4.1. Rohsequenzen 31 2.3.4.2. Assemblierung der Rohsequenzen 32 2.3.4.3. Suche nach Mikrosatelliten 32 2.3.4.4. Rekonstruktion des Plastoms von Vinca minor 32 2.3.4.5. Primerdesign 33 2.3.5. Verwendung universeller Primer für Mikrosatellitenloci aus dem Plastom (ccmps) 33 2.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 34 2.5. Gelelektrophorese 37 2.5.1. Agarose-Gelelektrophorese 37 2.5.2. Polyacralamid-Gelelektrophorese 38 2.6. Primertests 39 2.7. Fragmentlängenanalyse 39 2.8. Populationsgenetische Auswertung der nukleären Mikrosatelliten 40 2.8.1. Charakterisierung der genotypischen und genetischen Diversität 40 2.8.2. Abschätzung der Klonalität 41 2.8.3. Neighbour Joining-Analyse 42 2.8.4. Bayes'sche Analyse 44 2.8.5. AMOVA 45 2.8.6. F-Statistik 45 2.8.7. Mantel-Test 47 2.9. Phylogeographische Auswertung der plastidären Mikrosatellitenmarkern 47

3. Ergebnisse 49 3.1. DNA-Isolation 49 3.2. Bioinformatische Verarbeitung von NGS-Daten zur Etablierung von 50 Mikrosatellitenmarkern 3.2.1. Assemblierung der Rohsequenzen 50 3.2.2. Identifizierung und Charakterisierung von Mikrosatelliten 51 3.2.3. Primerdesign 52 3.2.4. Rekonstruktion des Plastoms und Suche nach plastidären Mikrosatelliten 52 3.3. Primertests 55 3.3.1. Primertests für Mikrosatellitenloci aus NGS-Daten 55 3.3.1.1. Mikrosatellitenloci aus dem Kerngenom 55 3.3.1.2. Zwischenartliche Übertragbarkeit 56 3.3.2. Mikrosatellitenloci aus dem Plastom 57 3.3.3. Universelle Primer für plastidäre Mikrosatelliten (ccmps) 58 3.4. Populationsgenetische Auswertung von Vinca minor 59 3.4.1. Allelische Diversität 60 3.4.2. Nullallele 64 3.4.3. Genotypische und genetische Diversität 64 3.4.3.1. Populationen südlich und westlich der Alpen 65 3.4.3.2. Populationen in Mitteleuropa inkl. der Alpen und in Nordamerika 68 3.4.4. Genetische Struktur 71 3.4.4.1. Multilocus-Genotypen (MLG) und Multilocus-Linien (MLL) 71 3.4.4.2. Neighbour-Joining-Analyse auf Basis der genetischen Distanzen zwischen den individuellen Multilocus-Genotypen 76 3.4.4.3. Neighbour-Joining-Analyse auf Basis der genetischen Distanzen 82 zwischen Populationen 3.4.4.4. Bayes'sche Analyse 86 3.4.5. Genetische Differenzierung und Struktur westlich und südlich der Alpen 87 3.4.5.1. Fixationsindizes 87

3.4.5.2. Paarweise FST-Werte 90 3.4.5.3. Analyse molekularer Varianz (AMOVA) 93 3.4.5.4. Mantel-Test ('isolation by distance') 93 3.5. Phylogeographie (plastidäre Mikrosatelliten) 95

4. Diskussion 100 4.1. Mikrosatellitenmarker aus der 454-Sequenzierung 100 4.1.1. De novo Assemblierung 101 4.1.2. Abundanz der Mikrosatellitenmotive in V. minor und Primerdesign 102 4.1.3. Funktionalität und Übertragbarkeit der nukleären Mikrosatellitenmarker 104 4.1.4. Rekonstruktion des Plastoms 107 4.1.5. Funktionalität und Übertragbarkeit der plastidären Mikrosatellitenmarker 108 4.1.6. Mikrosatelliten-Marker für Vinca minor: Fazit und Ausblick 109 4.2. Populationsgenetik und Phylogeographie von Vinca minor 111 4.2.1. Methodische Diskussion 111 4.2.1.1. Nukleäre Mikrosatellitenmarker 111 4.2.1.1.1. Polymorphie und Abschätzung von Klonalität 111 4.2.1.1.2. Nullallele 111 4.2.1.1.3. NJ-Dendrogramme, Neighbour Net-Netzwerke und 112 Bayes'sche Analyse 4.2.1.2. Plastidäre Mikrosatellitenmarker 113 4.2.2. Inhaltliche Diskussion 114 4.2.2.1. Italien: hohe genetische Diversität und geringe genetische 114 Differenzierung 4.2.2.2. Klonalität als Indikator für anthropogen entstandene V. minor- 118 Vorkommen 4.2.2.3. Seltene Ereignisse sexueller Reproduktion in Mitteleuropa 120 4.2.2.3.1. Geitonogamie 120 4.2.2.3.2. Interklonale Reproduktion 123 4.2.2.4. Somatische Mutationen 124 4.2.2.5. Der Ursprung mitteleuropäischer Vinca minor-Vorkommen und die 125 Verbreitungsmuster der klonalen Linien in Mitteleuropa 4.2.2.6. Nordamerika 129 4.2.2.7. Cultivare 130 4.2.3. Ausblick 133

5. Zusammenfassung 136

6. Literaturverzeichnis 140

7. Abbildungsverzeichnis 155

8. Tabellenverzeichnis 156

9. Abkürzungsverzeichnis 157

10. Anhang 158

11. Referenzen 212

12. Erklärung 214

Danksagung 215 1. Einleitung

1. Einleitung

1.1. Anthropogener Einfluss auf die europäische Vegetation

1.1.1. Natürliche und anthropogen bedingte Vegetationsentwicklung Mitteleuropas nach der letzten Eiszeit

Infolge der allmählichen Klimaerwärmung nach der letzten Eiszeit im Holozän kam es zur Remigration zahlreicher Tier- und Pflanzenarten aus den glazialen Refugien nach Mittel- und Nordeuropa, wo sich sukzessive eine ausgedehnte natürliche Waldvegetation etablierte. Deren heutige Struktur und Artenzusammensetzung ist jedoch nicht nur auf natürliche Prozesse zurückzuführen, sondern stark von anthropogenen Einflüssen geprägt. So begann bereits während des Neolithikums die sukzessive Zerstörung der natürlichen potentiellen Vegetation infolge der Sesshaftwerdung des Menschen und seiner zunehmenden Populationsdichte (Behre 1988, Kaplan et al. 2009).

Im Neolithikum wurden auch erste, in Mitteleuropa nicht beheimatete Nutzpflanzen aus dem Vorderen Orient eingeführt. So weisen Makrofossilien auf die Nutzung von Getreidearten wie Triticum dicoccum, T. monococcum, Hordeum vulgare sowie der Leinpflanze (Linum usitatissimum) und des Mohns (Papaver setigerum) während der Bandkeramik-Kultur hin. Mit der finalen neolithischen Expansion manifestierten sich auch in Pollendiagrammen erste anthropogene Indikatoren (Poaceae, Calluna, Plantago lanceolata; Behre 1988, Lang 1994). Während der Römerzeit wurden zahlreiche kultivierte Pflanzen aus der mediterranen Region in die Römischen Kolonien eingeführt, soweit deren Anpassungsfähigkeit an das lokale Klima gegeben war (Kowarik 2003). Ein bekanntes Beispiel ist der Pfirsich (Prunus persica, Willerding 1984 in Kowarik 2003). Im Mittelalter wurde die Flora fortwährend durch die Einführung von Nutz- und Symbolpflanzen aus dem Mittelmeergebiet und Vorderasien erweitert, wie z. B. Lilium candidum (Krausch 1990 in Kowarik 2003). Mit der Kolonialisierung Nordamerikas erfolgte schließlich auch ein floristischer Austausch zwischen der Alten und der Neuen Welt, der jedoch in zunehmendem Maße auch unbeabsichtigte Einschleppungen mit sich brachte (Kowarik 2003). Seit dem Mesolithikum wurden infolge der zunehmenden Mobilität des Menschen bis heute insgesamt über 6.000 Landpflanzenarten aus allen Teilen der Welt nach Europa eingeführt, davon zirka 860 Arten nach Deutschland (DAISIE 2014). Heute sind etwa 370 dieser eingeführten Taxa in der mitteleuropäischen Flora etabliert (Kunick 1991, Russow 2002).

1 1. Einleitung

Neben Makrofossilien und Pollenfunden bei Pflanzen geben auch moderne molekulare Marker interessante Einblicke in die Migrationsgeschichte von Tier- und Pflanzenarten. Daraus entstand die Disziplin der Phylogeographie, die sich für die innerartlichen Evolutionsprozesse in Zeit und Raum interessiert (Avise 2000). Sie beschäftigt sich sowohl mit der Rekonstruktion postglazialer Migrationsrouten (z. B. Taberlet et al. 1998), als auch mit den anthropogen beeinflussten Ausbreitungswegen eingeführter Arten (z. B. LeRoux et al. 2011). Die Populationsgenetik hat dagegen das Ziel, mittels molekularer Marker Informationen über die rezente genetische Diversität und Struktur von Arten sowie ihrer Populationen zu gewinnen und darüber z. B. Aussagen über Genfluss und Inzuchteffekte zu treffen (Hamilton 2009).

1.1.2. Neobiota und biologische Invasionen - Definitionen

Die Terminologie bezüglich eingeführter Arten ist in der Fachliteratur recht uneinheitlich, weshalb die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Begriffe kurz erläutert werden sollen.

Von den indigenen Taxa, die ein Gebiet durch natürliche postglaziale Migration kolonisieren, werden die Neobiota abgegrenzt, die erst durch anthropogene Translokation in ein Gebiet gelangten. Der Begriff der biologischen Invasion wird in der Fachliteratur aus zwei Perspektiven betrachtet. Bei der naturwissenschaftlich-invasionsbiologisch geprägten Ansicht handelt es sich um die vom Menschen absichtlich oder unbeabsichtigt vermittelte Ausbreitung von Organismen in Gebiete, die sie auf natürlichem Weg aufgrund räumlicher Ausbreitungsbarrieren nicht hätten erreichen können. Der zweite Ansatz schließt anthropozentrische Bewertungen mit ein und definiert invasive Arten als gebietsfremde, sich ausbreitende Problemarten. Obwohl von gängigen Wertvorstellungen abhängig (Daehler 2001), ist die letztgenannte Definition im internationalen Naturschutz etabliert (Kowarik 2003). Im Rahmen dieser Arbeit wird der Begriff 'invasiv' in dieser Perspektive verwendet. Zur Charakterisierung von Neobiota in der Adventivfloristik im Allgemeinen wird hingegen die vereinfachte Nomenklatur nach Schroeder (1969, 1974, 2000) verwendet, der eine Gruppierung nach Einbürgerungszeit (Archäophyten vs. Neophyten), Einwanderungsgrad (etabliert vs. unbeständig) und Einführungsweise (unbeabsichtigt, beabsichtigt und selbstständige Einwanderung nach anthropogenen Veränderungen) vorschlägt.

2 1. Einleitung

1.1.3. Kulturreliktzeiger und Stinsenpflanzen

Neben invasiven Arten enthält die mitteleuropäische Flora auch adventive Pflanzenarten, die sich zwar dauerhaft etablieren, aber nur geringe Tendenzen zur Verwilderung in natürlicher Vegetation zeigen. Diese Epökophyten sind häufig auch Jahre nach ihrer Einführung an durch Menschen geschaffene Habitate gebunden (Schroeder 2000). Sie finden sich z. B. in der Umgebung von mittelalterlichen Burgruinen und verlassenen Siedlungen. Hier kam es aufgrund der jahrhundertelangen Nutzung zu einer Stickstoffakkumulation im Boden (Dupouey et al. 2002). In der direkten Umgebung von ehemaligen Höhenburgen sind aufgrund des steilen Geländes forstwirtschaftliche Maßnahmen, die häufig durch schwere Technik zu einer Verdichtung des Bodens führen, selten (Hejcman et al. 2013). Diese Standorte bieten somit durch die Nährstoffverfügbarkeit und minimale rezente Strukturstörungen für bestimmte Taxa optimale Wachstumsbedingungen. Epökophyten werden hier als Kulturreliktzeiger (Prange 1996) oder in internationaler Fachterminologie als 'relics of cultivation' bezeichnet (Celka & Drapikowska 2008, Celka 2011). Floristische Untersuchungen zur Umgebung von Burgruinen existieren seit dem 19. Jh. u. a. für das Elsaßgebiet und Teile Frankreichs (Chatin 1861, Kirschleger 1862). In jüngerer Zeit wurden auch Mauerstandorte an norddeutschen Burgruinen (Dehnen-Schmutz 1999), sowie polnische (Celka 2011) und niederösterreichische Burgen (Hübl & Scharfetter 2008) hinsichtlich des Vorkommens von Kulturreliktzeigern untersucht. Epökophyten finden sich auch als Charakterarten alter Gartenkultur (sog. 'Stinzenplanten', Bakker & Boeve 1985, dt. Stinsenpflanzen) in verlassenen Gärten und Parks sowie in der Umgebung der Wasserschlösser Nordwesteuropas (Sukopp & Kowarik 2007).

Obwohl Kulturreliktzeiger und Stinsenpflanzen einen wichtigen Bestandteil des mitteleuropäischen Kulturerbes darstellen und sich aufgrund ihrer isolierten Vorkommen zur Betrachtung populationsbiologischer und -genetischer Fragestellungen eignen (z. B. Einfluss von Inzuchteffekten, Ausmaß des Genflusses), wurden hierzu bisher kaum Untersuchungen durchgeführt. Vergleichsweise gut untersucht ist lediglich ein regional im slawischen Kulturraum bedeutsamer Kulturreliktzeiger, die Rosenmalve Malva alcea, mit deren Populationsbiologie und -genetik sich drei Studien befassen (Celka & Drapiskowa 2008, Celka et al. 2008, Celka et al. 2010). Auch auf globaler Ebene existieren nur wenige Studien. So wurden lediglich epökophytische Vorkommen aus der präeuropäischen Periode von Agave- Arten in Mittelamerika (Parker et al. 2007, Parker et al. 2010, Parker et al. 2014) und von

3 1. Einleitung

Cordyline fruticosa in Polynesien (Hinkle 2007) bezüglich ihrer Populationsgenetik und ihrer Ausbreitungswege untersucht.

1.2. Asexuelle Reproduktion

Die Entstehung der Fähigkeit zu sexueller Reproduktion stellt eine der wichtigsten evolutiven Prozesse in der Geschichte des Lebens dar (Szathmáry & Maynard-Smith 1995). Einige Organismenlinien reproduzieren sich rein sexuell durch die Rekombination der Genome zweier Gameten, wie z. B. die Säugetiere (Mammalia). Die Evolution anderer Organismen erfolgte hingegen ausschließlich asexuell über mitotische Teilungen und anschließende Fragmentierung ('asexual scandal' bei den bdelloiden Rotatoria; Welch & Meselson 2000, Birky 2004). Unter den Angiospermen sind etwa 70 bis 80 % aller Taxa zu beiden Formen der Reproduktion befähigt (Klimeš et al. 1997).

Bei Angiospermen unterscheidet man prinzipiell zwei Mechanismen der asexuellen Reproduktion. Bei der Apomixis (syn. Agamospermie) erfolgt die Produktion von Samen ohne vorhergehende Fertilisation (Nogler 1984). Hingegen versteht man unter vegetativer Reproduktion die Ausbildung vegetativer Organe (z. B. Bulbillen, Ausläufer) und ihre Abtrennung von der Mutterpflanze unter Ausbildung erbgleicher Abkömmlinge (Klonierung; Frey & Lösch 2010, Vallejo-Marín et al. 2010). Alle so von einer Mutterpflanze erzeugten sog. Rameten sind dann genetisch identisch und bilden in ihrer Gesamtheit ein Genet bzw. einen Klon (Harper 1977, Cook 1983). Ohne Fragmentierung kommt es lediglich zur räumlichen Vergrößerung eines Individuums über klonales Wachstum (Vallejo-Marín et al. 2010). Die lokale Vergrößerung eines Genets über klonales Wachstum kann zur Ausbildung räumlich separierter Herden führen (engl. 'patch'; Charpentier 2002).

Die Fähigkeit zu klonaler Reproduktion bietet u. a. folgende Vorteile (Honnay & Bossuyt 2005):

1. Bei der Kolonisierung neuer Gebiete oder Habitate genügt eine einzige Pflanze für die erfolgreiche Etablierung der Art. Dies ist sowohl bei natürlichen Migrationsprozessen (z. B. bei Populus nigra, Barsoum et al. 2004) als auch bei der Etablierung gebietsfremder Arten von Vorteil (z. B. bei Fallopia japonica, Hollingsworth & Bailey 2000).

2. Bei sexueller Sterilität oder Reproduktionsbarrieren kann klonale Reproduktion das

4 1. Einleitung

Überleben von Populationen oder gar Arten sichern. Insbesondere bei polyploiden Arten hybridogenen Ursprungs kann die Aufrechterhaltung der Spezies rein vegetativ erfolgen, wie bei Gagea spathacea (Pfeiffer et al. 2012).

3. Populationen können sich unabhängig von der Verfügbarkeit von Bestäubern erhalten.

4. Es besteht die Fähigkeit zu rascher Massenausbreitung, z. B. bei Geophyten.

1.3. Vinca minor L.

1.3.1. Systematische Stellung

Das Kleine Immergrün, Vinca minor L., gehört zur Pflanzenfamilie der Apocynaceae (Hundsgiftgewächse), die mit den Rubiaceae, Gentianaceae, Gelsemaniaceae und Loganiaceae die Ordnung Gentianales (Backlund et al. 2000) innerhalb der Superasterideae (Soltis et al. 2011) bildet. Die Familie der Apocynaceae umfasst ca. 5.100 Spezies in 366 anerkannten Genera, die wiederum systematisch in 49 Subtriben, 25 Triben und fünf Unterfamilien zusammengefasst werden (Endress et al. 2014). Die fünf Unterfamilien Rauvolfioideae, Apocynoideae, Periplocoideae, Secamonoideae und Asclepiadioideae gliedern sich nach einer Revision von Endress & Bruyns (2000) nach Merkmalen des Narbenkopfes und der Antheren. Rauvolfioideae und Apocynoideae haben sich jedoch mit molekularen Methoden als paraphyletische Gruppen erwiesen (Livshultz et al. 2007, Simões et al. 2007).

Ihren Verbreitungsschwerpunkt haben die Apocynaceae in den Tropen und Subtropen, einige Arten sind jedoch bis in temperate Regionen verbreitet (Nazar et al. 2013). In Europa sind die Gattungen Apocynum, Nerium, Vincetoxicum, Asclepias und Vinca vertreten (Hegi 1966).

Innerhalb der Gattung Vinca (Unterfamilie Rauvolfioideae, Tribus Vinceae) sind sechs Spezies beschrieben (Govaerts & Leeuwenberg 2014, Tab. 1), bei denen es sich um Chamaephyten oder Hemikryptophyten handelt (Danert et al. 1994). Vier Arten, V. minor, V. major, V. difformis und V. erecta, weisen immergrüne Blätter auf. Bei Vinca herbacea und V. soneri hingegen sterben die oberirdischen Organe nach der Vegetationsperiode vollständig ab, der Wurzelstock bleibt aber erhalten (Koyuncu 2012). Hinsichtlich anderer morphologischer Merkmale sind sich die Arten recht ähnlich (Koyuncu 2012). In Europa verbreitet sind V. major und V. difformis (makaronesisch-lusitanischer Raum, Euxinische Provinz), V. herbacea (balkanisch-pontisch) und V. minor (Meusel et al. 1978a, Abb. 1). Vinca herbacea kommt in

5 1. Einleitung

Mitteleuropa nur in Niederösterreich an den südlichen und östlichen Hängen des Bisamberges vor, dessen Vegetation durch das pannonische Klima beeinflusst wird (Hegi 1966). Neben V. minor werden auch V. major und seltener V. difformis seit langem in Mitteleuropa kultiviert (Labhart 2005), verwildern zuweilen aus Anpflanzungen (Seybold 2006) und sind daher in dieser Region als altetabliert zu betrachten (Meusel et al. 1978b).

Tabelle 1: Übersicht über Verbreitung und Ploidie der Spezies des Genus Vinca. Die Angabe der beschriebenen Spezies erfolgt nach Govaerts & Leeuwenberg (2014). Die geographische Verbreitung der Arten und Unterarten folgt dem TWDG-System ('world geographical scheme for recording plant distributions', Brummitt 2001). Große Buchstaben kennzeichnen Staaten, in denen eine Art als einheimisch oder altetabliert gilt, kleine Buchstaben kennzeichnen Staaten, in denen eine Art als Neophyt gilt. Zweifacher Chromosomensatz nach Obermayer & Greilhuber (2006), n. b.: nicht bestimmt.

Spezies/Subspezies Verbreitung Chromosomenzahl (2n) Europa bis zum Kaukasus Vinca minor L. (10) den grb ire nor swe 11 AUT BGM CZE GER HUN NET POL SWI 12 46 COR FRA por SPA 13 BUL GRC? ITA ROM SIC tue YUG 14 BLR KRY ruc UKR (28) asc 33 TCS (34) tur (36) chs (51) nzn nzs (78) ala vrg Vinca erecta Regel & Schmalh. Zentralasien bis Nordost-Afghanistan n. b. 32 KGZ TZK UZB 34 AFG Mittel-, Südosteuropa bis Westasien Vinca herbacea Waldst. & Kit. 11 AUT CZE GER HUN 13 BUL ROM TUE YUG 14 KRY RUC RUS UKR 33 46 NCS TCS 34 EAI IRN IRQ LBS PAL TUR Vinca soneri Koyuncu Türkei n. b. 34 TUR Vinca difformis Pourr. Azoren, West- und Zentralmediterraner Raum 46 12 BAL COR FRA POR SAR SPA 13 ITA 20 ALG MOR 21 AZO Azoren, West- und Zentralmediterraner Raum Vinca difformis subsp. difformis. Pourr. n. b. 12 BAL COR FRA POR SPA 13 ITA 20 ALG MOR 21 AZO Vinca difformis subsp. sardoa Stearn Sardinien n. b. 12 SAR Südeuropa bis Ostmediterraner Raum (10) grb ire (11) aut ger swi (12) cor FRA por SAR spa 13 ALB bul ITA Vinca major L. KRI SIC tue YUG (14) kry ukr (20) alg mor (21) cny mdr (28) sth 33 TCS 90 34 EAI LBS TUR (36) chc chs (38) tai (50) nfk (51) ctm nzn nzs (76) cal (78) ala (79) mxc mxt (80) cos gua (82) ven (83) clm (85) clc jnf uru Vinca major subsp. balcanica (Pénzes) Nördliche Balkan-Halbinsel n. b. Kozuharov & Petrova 13 ALB BUL? YUG Südeuropa bis Ostmediterraner Raum (10) grb ire (11) aut ger swi (12) cor FRA por SAR spa (13) bul ITA KRI Vinca major subsp. major. L. SIC tue YUG (14) kry ukr (20) alg mor (21) cny mdr (28) sth 34 EAI LBS n. b. tur (36) chc chs (38) tai (50) nfk (51) ctm nzn nzs (76) cal (78) ala (79) mxc mxt (80) cos gua (82) ven (83) clm (85) clc jnf uru

6 1. Einleitung

7 1. Einleitung

1.3.2. Morphologie, Blütenbiologie und Reproduktion

Vinca minor bildet als Chamaephyt ausdauernde, niederliegende, basal verholzte Sprossachsen mit kurz gestielten, länglich-elliptischen, lederartigen Blättern. Am Terminalknoten entspringen vier, an den übrigen Nodien zwei Blätter. Die blauvioletten Blüten des Wildtyps (Abb. 2) erscheinen in Mitteleuropa zwischen März und Juni sowie seltener erneut im Herbst (Hegi 1966). Als Bestäuber kommen langrüsselige Insekten in Betracht (Hegi 1966, Schick 1982, Christ 2004). In einer von mir betreuten Qualifikationsarbeit konnten in Vinca minor-Beständen in der Umgebung Kassels in Nordhessen vor allem Insekten der Ordnungen Diptera (Bombylius major, Abb. 2D) und Hymenoptera (z. B. Bombus pratorum, B. pascuorum) sowie seltener Lepidoptera (Abb. 2E) als Blütenbesucher beobachtet werden (Schynawa 2013).

Die Corolla besteht aus fünf ausgebreiteten Petalen, die sich zu einer etwa einen Zentimeter langen Röhre verjüngen. Das darin befindliche Gynoeceum besteht aus zwei miteinander verwachsenen Karpellen (Baum 1948). Der schlanke Stylus ist am Ende zu einer konkaven Platte erweitert und trägt darauf einen gestielten Haarschopf. Dieser besondere Pistill-Kopf gehört dem Vinca-Thevetia-Typus an (Schick 1982). Die fünf S-förmig gekrümmten Antheren des Androeceums sind basal mit der Kronröhre verwachsen. Die oberseits behaarten Stamina sind so positioniert, dass der entlassene Pollen auf den Haarschopf an der Spitze des Pistills fällt. Das Epithelgewebe des schüsselförmigen Kragens unterhalb des Haarschopfes produziert ein klebriges Sekret, darunter befindet sich der rezeptive Bereich des Gynoezeums. Da die sich zusammenneigenden Antheren die Kronröhre über dem Haarschopf von oben verschließen (Abb. 2D), können Insekten mit ihrem Rüssel nur im schmalen Bereich zwischen den Antheren eindringen, um an die am Grund der Blüte befindlichen Nektardrüsen zu gelangen (Abb. 2C). Durch den veränderten Winkel des Rüssels beim Herausziehen aus der Kronröhre wird der von einer anderen Blüte am Insektenrüssel mitgeschleppte Pollen am rezeptiven Bereich des Gynoeceums abgestreift. Anschließend kommt der Rüssel mit dem Narbenschleim in Kontakt, dem beim Passieren der Stamina nun der blüteneigene Pollen anhaften kann (Ludwig 1881, Schick 1982). Dieser eigentümliche Bau der Blüte soll der Prävention von Autogamie dienen. Darwin konnte bei V. major indirekt durch artifizielle Bestäubung nachweisen, dass der Blütenbau zwar Autogamie verhindert, die Blüten aber selbstkompatibel sind (Darwin 1861).

8 1. Einleitung

Abbildung 2: Blütenmorphologie von Vinca minor. A: Blüten vom blauvioletten Wildtyp sowie einer rotviolettblühenden Varietät. B: Aufsicht auf eine Blüte des Wildtyps, auffällig ist die durch die zusammengeneigten Antheren und die Behaarung optisch verschlossene Kronröhre. C: Querschnitt durch eine Blüte, A: Antheren, H: Haarschopf, R: Rezeptiver Bereich des Gynoezeums, E: Epithelgewebe mit klebrigem Sekret, S: Stylus, N: Nektardrüsen. D: Bombylius major. E: Pieris napi beim Blütenbesuch. C bis E mit freundlicher Genehmigung von Laura Schynawa.

9 1. Einleitung

Abbildung 3: Habitus, Frucht- und Samenmorphologie von Vinca minor. A: Herbarbeleg eines vegetativen Sprosses, auffällig sind der basal abzweigende Stolo und die gegenständige Blattstellung. B: Sekundäre Bewurzelung eines vegetativen Sprosses. C: Sprossende mit Doppelbalgfrucht, D: Doppelbalgfrucht aus zwei Bälgen (links) und mit einem intakten sowie einem degenerierten Balg (rechts). E: Doppelbalg nach der Samenreife. F: Längliche Samen mit körniger Oberfläche und zentraler Raphe, in der sich ein Elaiosom befindet, das am ausgetrockneten Samen nicht sichtbar ist.

10 1. Einleitung

Nach erfolgreicher Bestäubung entwickeln sich Doppelbalgfrüchte (Abb. 3C bis E). Die paarig angeordneten, etwa 22 mm langen Bälge reifen zwischen Juni und August und enthalten jeweils bis zu drei anhängsellose Samen mit körniger Oberfläche (Hegi 1966, Abb. 3F). In einer von mir betreuten Qualifikationsarbeit konnte erstmals mikroskopisch die Existenz eines am V. minor-Samen befindlichen Elaiosoms nachgewiesen werden, das der myrmekochoren Ausbreitung dient (Will 2014).

Neben generativer Reproduktion über sexuell gebildete Samen vermag V. minor sich auch vegetativ mit Hilfe von Stolonen zu vermehren, die zur eigenständigen Bewurzelung fähig sind (Abb. 3AB). Da reife Früchte in Mitteleuropa eher selten beobachtet werden (Oltmann 1927, Hueck 1934, Hegi 1966), geht man von überwiegend vegetativer Reproduktion über Stolonen aus (Prange 1996).

1.3.3. Verbreitung und biogeographischer Status von Vinca minor

Vinca minor ist von Nordspanien bis zum Balkan und von Süditalien bis Südschweden verbreitet, gilt aber in weiten Teilen Europas als alteingebürgerter Archäophyt (Abb. 1). Die natürliche Verbreitungsgrenze der Spezies ist aufgrund der möglicherweise mehrfach unabhängig erfolgten Einbürgerungen schwer bestimmbar, zumal sich auch im submediterranen Verbreitungsschwerpunkt kein klares Verbreitungszentrum ergibt (Meusel et al. 1978). In Italien kommt V. minor in Laubwäldern bis in Höhen von 1.300 m vor, häufig vergesellschaftet mit Quercus pubescens und Q. petraea (Pignatti 1982). In den kontinental geprägten Regionen Italiens tritt V. minor auch als thermophiles Element zusammen mit Castanea sativa und Ostrya carpinifolia auf (Alpen, Südrand der Alpen, Friuli- und Po-Ebene, Nord-Apennin; Gumiero et al. 2009). Zudem gilt V. minor hier als Differentialart zur Abgrenzung collin-submontaner Alnus incana-reicher Auwälder von ihren montanen Ausprägungen (Sburlino et al. 2012). Außerdem ist V. minor Bestandteil der ursprünglichen Vegetation Norditaliens (Querco-Carpinetum boreoitalicum; Pignatti 1953, syn. Galio- Carpinetum Oberd. 1957), der Reliktflora der Poebene (Lorenzoni & Zanaboni 1988, Pignatti & Pignatti 2014). In Nordspanien tritt V. minor hauptsächlich in Auwäldern und an Bachläufen auf (Ortiz & Arista 2010). In Mitteleuropa soll V. minor laut Juraj Paule (pers. Mitteilung) in den pannonischen Eichen-Hainbuchenwäldern (Carpinion betuli) der Slowakei ihre nördliche natürliche Verbreitungsgrenze haben.

11 1. Einleitung

Die Problematik des ungewissen biogeographischen Status von V. minor wurde vor allem für Mitteleuropa in den vergangenen Jahren eingehend diskutiert. Bis auf Ellenberg (1996), der die Art als eine Charakterart der mitteleuropäischen Eichen-Hainbuchenwälder (Carpinion betuli) bezeichnet, sind sich die meisten Autoren über den eingebürgerten Status von V. minor in Mitteleuropa einig (Meusel et al. 1978, Haeupler & Schönfelder 1988, Nitsche et al. 1990, Benkert et al. 1996, Kowarik 2003).

Prange (1996) vermutet, dass die Art in Südwestdeutschland in der Zeit des Römischen Kaiserreichs eingeführt wurde. Er prägte für V. minor den Begriff 'Kulturrelikt', da die Spezies in dieser Region vorwiegend nahe des Limes und an Siedlungsplätzen aus Römischer Zeit auftritt. Mittelalterliche Gemälde (z. B. 'Paradiesgärtlein', datiert um 1410, Maler unbekannt, Krausch 2012) und die ersten historischen Kräuterbücher (z. B. Fuchs 1543, Bock 1560) belegen, dass V. minor spätestens im ausgehenden Mittelalter bzw. in der Renaissance auch jenseits der Grenzen des Römischen Reichs bekannt war. Auch heute noch ist die Art als Siedlungszeiger an mittelalterlichen Burgruinen zu finden (Hohla 2009). Auch für längst untergegangene Siedlungen (sog. Wüstungen; Sippel & Stiehl 2005, Kowarik 2003) und ehemalige Gärten und Parks (Lohmeyer & Sukopp 1992, Höchtl 2014) ist V. minor zuweilen der letzte Indikator.

Im 17. Jh. wurde Vinca minor nach Nord-Amerika (Wells 2000 in Stone 2009) und Australien eingeführt und diente dort insbesondere als Zierpflanze zur Bepflanzung von Gräbern und im Landschaftsbau, aber auch zur Erosionskontrolle (Darcy & Burkart 2002, Swearingen et al. 2010). In Australien gilt V. minor in sechs südlichen Territorien als lokal etabliert (WWF Australia 2006). In Nord-Amerika ist die Spezies heute in allen östlichen Staaten, einem Teil der westlichen Staaten und in fünf kanadischen Provinzen verbreitet (USDA NRCS 2002), wo sie in naturnahen Laubwäldern etabliert ist. In 25 Staaten der östlichen und südöstlichen USA gilt V. minor gar als moderat invasive Spezies (Kategorie 2; USDA Forest Service 2006). Beschreibungen über das Ausmaß der Invasivität variieren jedoch zwischen den einzelnen Staaten und Autoren. In Norwegen ist V. minor Bestandteil der Schwarzen Liste der Neobiota (Kategorie 'severe impact'; Gederaas et al. 2012).

12 1. Einleitung

1.3.4. Mythologische und pharmakologische Bedeutung

Die ethnobotanische Bedeutung von Vinca minor ist seit der Antike belegt. Bereits der römische Gelehrte Plinius der Ältere erwähnt die Art 77 n. Chr. in seiner Enzyklopädie 'Naturae historarium' unter dem Namen 'Vincapervinca' als Gartenpflanze. Der griechische Arzt Dioskurides führt V. minor in seiner Enzyklopädie 'De materia medica' aus dem 1. Jh. n. Chr. unter dem Namen 'Clematis daphnoides' als Heilmittel, z. B. gegen Durchfallerkrankungen und als Antidot gegen Schlangenbisse. Da Dioskurides die Wuchsform als über den Boden kriechend beschreibt, handelt sich vermutlich nicht um die Waldrebe Clematis vitalba, die im Gegensatz zu V. minor eine kletternde Wuchsform aufweist.

Hegi (1966) gibt einen Überblick über die volkstümliche Etymologie von V. minor. Vernakularnamen wie Immergrün, Singrün ('sin' für dauernd, immer) oder Totenkraut geben Hinweise auf seine volksbrauchtümliche Bedeutung. Andere Bezeichnungen wie Berwinkel (niederdeutsch), periwinkle (angelsächsisch) oder pervenche (französisch) sind direkte Anlehnungen an die Namensgebung durch Plinius.

Im mitteleuropäischen Raum fand V. minor im Liebes- und Unsterblichkeitsbrauchtum Anwendung (Perger 1861, Unger 1867), bei den Angelsachsen im Exorzismusglauben (Rohde 1922) und als Zauberpflanze (Seligmann 1910). Eine lokale Bedeutung als florales Element auf keramischen Wandfliesen hat Vinca minor an Jugendstilgebäuden in Jena (Gesang et al. 2007). Auch die Filmindustrie bedient sich der mythologischen Bedeutung von V. minor. So tritt die Art im ersten Teil der dystopischen Filmreihe 'Tribute von Panem' (USA, 2012) als Unsterblichkeitssymbol auf.

Bis heute wird V. minor in Teilen Südosteuropas ethnopharmakologisch verwendet, u. a. als blutreinigendes Mittel (Redžić 2007) oder bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Gedächtnisproblemen (Khanavi et al. 2010). Seit Mitte des 20. Jh. wurden aus der Pflanze 50 Reinalkaloide isoliert, die aus den oberirdischen Organen extrahierten Gesamtalkaloide sind aber in vitro cytotoxisch (Khanavi et al. 2010). Das Hauptalkaloid, Vincamin, gehört zur Gruppe der Indolalkaloide (Schlittler & Furlenmeier 1953). Ein synthetisches Derivat des Vincamins, Vinpocetin, wurde aufgrund seiner neuroprotektiven Eigenschaften (Valikovics 2007, Nyakas et al. 2009) für cerebrovaskulare und neuropsychiatrische Indikationen angewendet, z. B. bei Demenz (Patyar et al. 2011). Die Zulassung vincamin- und vinpocetinhaltiger Arzneimittel (z. B. Cavinton®) ist in Deutschland seit 2005 abgelaufen.

13 1. Einleitung

1.3.5. Gartenformen

Aufgrund ihrer Popularität als Gartenpflanze existieren von Vinca minor neben der blaublühenden Wildform mit grünen Blättern zahlreiche Cultivare. Gemäß des Internationalen Codes der Nomenklatur der Kulturpflanzen (ICNCP) werden Sorten im Rahmen dieser Arbeit als Cultivare bezeichnet (Kofferwort aus 'cultivated' und 'variety') und anstatt mit der ebenfalls gängigen Schreibweise cv. mit oberen, einfachen Anführungszeichen gekennzeichnet.

Labhart (2005) verzeichnet 19 Cultivare von V. minor, deren Ursprung größtenteils unbekannt ist. Bereits die ältesten Gartenenzyklopädien weisen jedoch auf Cultivare mit weißen, gefüllten blauen und roten Blüten oder variegaten Blättern hin, die durch Wiederbewurzelung von Stolonen vegetativ vermehrt wurden (Riedel 1769, Mawe & Abercrombie 1778). Als gefüllt- oder doppeltblühende Varietäten werden bei V. minor solche mit mehr als fünf Petalen bezeichnet, also mit einer doppelten Corolla (Cullen et al. 2011, Wang et al. 2011). Variegation bezeichnet das Phänomen verschiedenfarbiger Zonen auf den Laubblättern (Tilney-Bassett 1991). Solche phänotypischen Änderungen beruhen bei Pflanzen häufig auf natürlichen Mutationen in Knospen, die sich dann in auswachsenden Trieben manifestieren. Über solche Triebe selektierte Sorten werden als 'Sport' bezeichnet. Die induzierte und zufällige Erzeugung von Sports stellten zusammen mit Kreuzungen über artifiziellen Pollentransfer bis in die 1930er Jahre eine wichtige Methode zur Sortenetablierung für die Züchtung dar (Gaul 1964, Schum & Preil 1998). Da der Samenansatz bei V. minor gering und die Keimfähigkeit der Samen eingeschränkt ist (Hegi 1966), dürften die meisten Cultivare von V. minor solche Sports darstellen.

Varietäten unbekannten Ursprungs wie 'Rubra', 'Atropurpurea', 'Multiplex' und 'Argenteovariegata' gehen möglicherweise auf die in den alten Enzyklopädien genannten Varietäten zurück. Als im 20. Jh. selektierte Sorten gelten 'Bowles Variety' aus Frankreich (syn. 'La Grave', um 1920; van der Beeck 2011) und 'Gertrude Jekyll', die in Norditalien aufgesammelt und anschließend in England kultiviert wurde (Jekyll 1900). Selektionen jüngeren Datum sind 'Sabinka' aus dem Tessin (Scholz 1982) und die geschützte 'Hawaii' ® aus der Schweiz (Schlüssel 2004). Aus Neuzüchtungen mit 'Gertrude Jekyll' als Mutterpflanze hervorgegangene, geschützte Sorten sind 'Marie'®, 'Josefine'®, 'Anna'® und 'Elisa'® (Bundessortenamt 2014). Detaillierte Sortenbeschreibungen und Empfehlungen für deren Verwendung gibt Labhart (2005), ein Identifikationsschlüssel findet sich bei Cullen et al.

14 1. Einleitung

(2011). Tab. 2 gibt einen Überblick über die für Europa verzeichneten Sorten. Rot- oder gefülltblühende Bestände von V. minor sind auch in freier Natur zuweilen zu finden (Hegi 1966, Wang et al. 2011).

Tabelle 2: Übersicht über die häufigsten Vinca minor-Cultivare in Europa. Angaben nach Scholz (1982), Schlüssel (2004), Labhart (2005), Cullen et al. (2011), van der Beeck (2011); in Klammern sind die fünfstelligen Baumschulkatalog-Stammnummern (nach Erhardt et al. 2008), soweit verfügbar, verzeichnet; n. b.: nicht bekannt.

Sorte (Synonym) Habitus Blattmorphologie Blütenmorphologie Herkunft Häufige Sorten 'Alba' (52981) mittelstark, breit groß, oval, 3 x 2 cm, grün reichlich, weiß, groß n. b. 'Alba Plena' ('Alboplena') n. b. grün weiß, gefüllt n. b. 'Alba Variegata' ('Variegato alba') stark, flach schmal, reichlich, weiß, n. b. schmaler weißer Rand mittelgroß 'Argenteovariegata' (13253) n. b. weiß-panaschiert n. b. n. b. 'Aureovariegata' ('Variegata') schwach, niedrig oval, mittelgroß, reichlich, mittelgroß n. b. breiter gelber Rand 'Atropurpurea' stark, aufstrebend, oval-länglich, groß, rötlich n. b. ('Rubra', 'Purpurea', 'Burgundy') überhängend dunkelgrün (36109) 'Bowles Variety' stark, buschig, aufrecht, rundlich-oval, groß, blau, Petalen 1-1,5 cm Bowles, ('Le Grave', 'Bowles') (52982) überhängend dunkelgrün breit Frankreich 'Bowles White' wie 'Bowles Variety' wie 'Bowles Variety' weiß n. b. 'Bunter Teppich' schwach, sehr dicht, gross, rundlich, keine Blüte Menke, kurze Internodien breiter gelber Rand Deutschland 'Grüner Teppich' mittelstark, dichtbuschig grün seltene Blüte, blau , n. b. (52983) ∅ 3,5-4 cm 'Gertrude Jekyll' schwach, ganz flach klein, schmal, helles grün reichlich, klein, weiß Jekyll, England 'Multiplex' wie 'Atropurpurea', struppig wie 'Atropurpurea' spärlich, rötlich, rosé, n. b. ('Purpurea Plena', 'Roseoplena') gefüllt (67019) 'Oland Blue' n. b. grün blau, Petalen 5-9 mm n. b. breit 'Plena' wie Wildform, struppig groß, oval spärlich, blau, gefüllt n. b. ('Azurea Plena', 'Azurea Flore Plena') 'Sabinka' schwach, aufrecht, dicht sehr klein, schmal spärlich, hellblau, Schweiz, 3 x 1 cm sehr klein Tessin 'White Power' n. b. n. b. weiß n. b. Geschützte Sorten 'Anna'® schwach, niedrig, dicht, rundlich, klein, reichlich, blau, groß Menke, kurze Internodien dunkelgrün, glänzend Deutschland 'Elisa'® mittelstark, flach, zierlich klein, schmal, dunkelgrün reichlich, weiß, Menke, mittelgroß Deutschland 'Josefine'® sehr stark, flach, vieltriebig klein, schmal, hellgrün reichlich, hellblau, Menke, klein, Deutschland 'Marie'® mittelstark, niedrig, dicht oval bis spitz, klein, reichlich, blau, Menke, dunkelgrün mittelgroß Deutschland 'Hawaii'® kompakt, gut verzweigt länglich, klein, hellgrün blau, mittelgroß Green Pflanzenhandel, Hauenstein, Rombach, Nebelung, Schweiz

15 1. Einleitung

1.4. Zielsetzung der Arbeit

Vinca minor ist ursprünglich in Südeuropa beheimatet, aber in Mitteleuropa weit verbreitet. Die Art bildet in Mitteleuropa vor allem in der Umgebung von Burgruinen, Wüstungen und anderen historischen Stätten mehr oder weniger große, zusammenhängende Herden. Von den meisten Autoren wird die Art in Mitteleuropa als ursprünglich von den Römern eingeführte Kulturrelikt- bzw. Stinsenpflanze angesehen. In Nordamerika gilt V. minor als invasive Art.

Über die vorherrschende Reproduktionsbiologie von V. minor ist wenig bekannt. Hinweise auf vorwiegend vegetative Vermehrung wurden bislang noch nicht mit molekulargenetischen Methoden verifiziert. Dies gilt sowohl für ihre mediterrane Heimat als auch für Mitteleuropa und Nordamerika. Zudem ist unbekannt, ob die mitteleuropäischen Bestände auf eine oder multiple Einführungen zurückgehen und aus welchen Regionen die Ursprungspopulationen stammen. Schließlich ist auch unklar, ob innerhalb Mitteleuropas eine rein anthropogene oder auch eine natürliche Weiterverbreitung der Art erfolgte und welche Rolle verwilderte Gartenpflanzen für die Etablierung von neuen Populationen im Freiland spielen.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit soll daher erstmals die Populationsgenetik, Phylogeographie und vorwiegende Reproduktionsweise von V. minor in Mitteleuropa und Nordamerika im Vergleich zu ursprünglichen Verbreitungsgebieten im Süden Frankreichs, Italien und Slowenien mit Hilfe hochempfindlicher molekularer Marker untersucht werden. Dafür bieten sich nukleäre und plastidäre Mikrosatellitenmarker (Powell et al. 1996, Provan et al. 2001) an, die hier für V. minor erstmals unter Verwendung der 454-Pyrosequenzierung (Margulies et al. 2005), einer modernen 'next generation sequencing'-Methode, etabliert werden sollen.

Mit Hilfe dieser Marker sollen Freilandpopulationen und Cultivare von V. minor auf folgende Fragen hin untersucht werden:

16 1. Einleitung

Wie hoch ist die genetische Diversität von V. minor im submediterranen Ursprungsgebiet im Vergleich zu Mitteleuropa und Nordamerika und wie ist sie in den Großregionen jeweils strukturiert?

Korreliert die anthropogen bedingte Einführung mit einer genetischen Verarmung in Mitteleuropa?

Gibt es in mitteleuropäischen und nordamerikanischen Populationen Hinweise auf sexuelle Reproduktion, oder erfolgt eine rein vegetative Vermehrung?

Gibt es genetische Hinweise für Auswilderungen aus Gärten?

Lassen sich die historischen Ausbreitungswege der Art von Süd- nach Mitteleuropa, innerhalb Mitteleuropas sowie nach Nordamerika rekonstruieren?

17 2. Material und Methoden

2. Material und Methoden

2.1. Pflanzenmaterial

2.1.1. Pflanzenmaterial für die 454-Sequenzierung und die Etablierung von Mikrosatellitenmarkern

Das für die 454-Sequenzierung genomischer DNA von Vinca minor verwendete Pflanzenmaterial stammt aus einer Anpflanzung in der näheren Umgebung des Standorts Heinrich-Plett-Straße der Universität Kassel (geographische Koordinaten in Dezimalgrad: 51.2828 09.4492). Ein Herbarbeleg ist im Herbarium der Universität Kassel hinterlegt (Akzessionsnummer KS_VM454_01).

Im Rahmen der Voruntersuchungen zur Etablierung von Mikrosatellitenmarkern wurden insgesamt vier unterschiedliche Sets von Pflanzenproben verwendet (Tab. 3):

Probenset 1 wurde für die Primertests auf Basis der cDNA-Sequenzierung eingesetzt (vgl. 2.3.4.1). Es beinhaltete V. minor-Pflanzen aus eigenen Freilandaufsammlungen (Möller 2011) sowie Blattproben von V. major, V. difformis und V. herbacea, und einer weiteren Art aus dem Vinceae-Clade der Apocynaceae, Catharanthus roseus. Da die dem Primerdesign zugrundeliegenden cDNA-Sequenzen nicht selbst generiert wurden, sondern über eine Datenbank erhältlich waren, stand hierfür keine Positivkontrolle zur Verfügung.

Probenset 2 wurde für Primertests an nukleären Mikrosatellitenmarkern auf Basis der 454-Sequenzierung des V. minor-Genoms verwendet (vgl. 2.3.4.1). Es enthielt alle Akzessionen aus Probenset 1 (bis auf C. roseus) sowie die der 454-Sequenzierung unterzogenene V. minor-Akzession als Positivkontrolle. Als Negativkontrollen dienten je eine Akzession von Macaranga gigantea sowie M. pearsonii (Euphorbiaceae). Diese beiden Pflanzen waren im gleichen Multiplex-Ansatz zusammen mit V. minor sequenziert worden.

Probenset 3 wurde für die Etablierung plastidärer Mikrosatelliten auf Basis der 454-Sequenzdaten des Genoms eingesetzt (vgl. 2.3.4.5).

Probenset 4 wurde für die Überprüfung der Nutzbarkeit von universellen Primerpaaren zur Amplifikation plastidärer Loci verwendet (ccmp-Primer, Weising & Gardner 1999; vgl. 2.3.5).

18 2. Material und Methoden

Tabelle 3: Im Rahmen von molekularen Voruntersuchungen verwendetes Pflanzenmaterial. Zur näheren Erläuterung siehe Text. DE: Deutschland, IT: Italien.

Identifikationsnummer Spezies Herkunft 454-Seq. Set 1 Set 2 Set 3 Set4 ID_01 Vinca minor Lagoni de Mercurago, Piemont, (IT) - + + + +

ID_126 Vinca minor Weidelsburg, Hessen (DE) - + + + +

BONN-6026 Vinca major Botanischer Garten Bonn - + + + +

STUT (KullM3914) Vinca difformis Naturkundemuseum Stuttgart - + + - -

GIESS-0-U-3893 Vinca herbacea Botanischer Garten Gießen - + + - -

BONN-24402 Catharanthus roseus Botanischer Garten Bonn - + - - -

KS_VM454_01 Vinca minor Universität Kassel + - + + +

7424 Macaranga gigantea Botanischer Garten Universität Würzburg + - + + -

7425 Macaranga pearsonii Botanischer Garten Universität Kassel + - + + -

2.1.2. Pflanzenmaterial für populationsgenetische Untersuchungen

Als Population wurde eine lokale Ansammlung ('Herde') von Vinca minor-Sprossen in einem Waldstück definiert. Traten mehrere separate Flächen im gleichen Waldstück mit einer Maximaldistanz von 500 m zueinander auf, so wurden diese zu einer Population zusammengefasst. In Mitteleuropa inkl. der Alpen wurden durchschnittlich zehn Sprosse pro Population beprobt, südlich und westlich der Alpen in Abhängigkeit von der Größe der besammelten Fläche zwischen 15 und 48. Von sehr kleinen Populationen (kleiner als 5 m im Durchmesser) wurden maximal zehn Sprosse besammelt. Generell wurden die Stichproben so gewählt, dass sie innerhalb der jeweiligen Population möglichst weit voneinander entfernt lagen.

Das für die populationsgenetischen Untersuchungen mit nukleären Mikrosatellitenmarkern verwendete Pflanzenmaterial ist in Anhang A1 zusammengestellt, Abb. 4 gibt eine Übersicht über die geographische Lage der Populationen. 47 Freilandpopulationen wurden im Rahmen von vier Sammelreisen (Norddeutschland & Belgien 2012, Italien 2013, Süddeutschland 2013, Südfrankreich, Italien, Slowenien, Kroatien 2014) selbst beprobt. Material aus 13 weiteren Populationen lag bereits in Form isolierter DNA aus einer vorangegangenen Diplomarbeit vor (Möller 2011) vor. Zehn Populationen wurden durch Kollegen aus der Universität Kassel oder von externen Forschungsinstituten im Freiland besammelt und nach Kassel zur Analyse verschickt.

19 2. Material und Methoden

Insgesamt standen 949 individuelle Proben von 70 Populationen (N=4 bis N=48) aus zehn Ländern für die Bearbeitung mit Kern-Mikrosatelliten zur Verfügung, davon 36 Populationen aus Mitteleuropa inkl. der Alpen, sechs aus der Region westlich der Alpen, 26 aus Regionen südlich der Alpen bzw. den Südalpen, und drei Populationen aus Kanada. Zusätzlich wurden 18 Cultivare in die Studie integriert, die kommerziell oder über andere Institute bezogen wurden (vgl. Anhang A1).

2.1.3. Pflanzenmaterial für phylogeographische Untersuchungen

Das für die phylogeographischen Untersuchungen mit plastidären Mikrosatelliten verwendete Pflanzenmaterial ist in Anhang A2 aufgelistet, Abb. 5 gibt eine Übersicht über die geographische Herkunft der Akzessionen. Bei der Zusammenstellung der Proben wurde besonderer Wert auf eine möglichst breite Abdeckung des geographischen Verbreitungsgebietes von V. minor gelegt; von den einzelnen Fundorten wurden hingegen nur eine oder wenige Pflanzen analysiert. In die Untersuchung einbezogen wurden danach (1) 112 repräsentative Vertreter der auch mit nukleären Mikrosatelliten untersuchten Populationen, (2) alle 18 Cultivare sowie (3) 167 zusätzliche Proben, die entweder selbst gesammelt oder von Herbarien zur Verfügung gestellt wurden. Insgesamt wurden 297 individuelle Pflanzenproben aus 18 Ländern mittels plastidärer Mikrosatellitenmarker untersucht (vgl. Anhang A2).

20

2. Material und Methoden

2.2. DNA-Isolation

2.2.1. Standard-CTAB-Methode

Das in Freilandaufsammlungen beschaffte Probenmaterial wurde in Silicagel getrocknet und anschließend mit Hilfe einer Kugelmühle mechanisch aufgeschlossen. Die DNA wurde mit einem modifizierten Protokoll der von Weising et al. (2005) vorgeschlagenen Variante der letztlich auf Murray & Thompson (1980) zurückgehenden CTAB-Methode isoliert. Dabei wird die DNA aus den mechanisch aufgeschlossenen Proben durch Einsatz von Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) zu einem Komplex gebunden, der durch Ausschüttelung mit Chloroform-Isoamylalkohol und anschließende Zentrifugation von Zellresten, Proteinen und Lipiden getrennt wird. Die DNA wird anschließend mit Hilfe von Isopropanol gefällt, RNA wird durch RNAse-Behandlung entfernt und die DNA wird nach mehreren Waschschritten in Tris-EDTA (TE)-Puffer gelöst. Im Unterschied zum Originalprotokoll wurde auf die Entfernung von Polysacchariden sowie einen zweiten Fällungs- und Wasch-Schritt verzichtet, da der Polysaccharidanteil in Blättern von Vinca minor vergleichsweise gering ist. Das so etablierte, zeit- und kostensparende Protokoll findet sich im Anhang A3.

2.2.2. Sorbitol-Variante der CTAB-Methode

Zur Isolation der DNA für die 454-Sequenzierung sowie aus (z. T. bis zu 100 Jahre alten) Herbarbelegen wurde die von Krapp (2009) modifizierte Sorbitol-Methode (Tel-Zur et al. 1999) eingesetzt. Diese Variante der CTAB-Methode wurde ursprünglich für stark polysaccharidhaltige sukkulente Pflanzen entwickelt, erzielt aber auch bei anderen problematischen Proben, wie z. B. Herbarmaterial, hohe Ausbeuten an qualitativ guter DNA (Drábková et al. 2002). Bei dieser Methode wird das pulverisierte Gewebe zunächst in einem isotonischen, sorbitolhaltigen Puffer suspendiert, der die zellulären Membranen intakt lässt. In mehreren Waschschritten werden die DNA-haltigen Organellen von störendem Cytoplasma und dem Vakuoleninhalt befreit, bevor sie im CTAB-Extrationspuffer suspendiert und lysiert werden. Die übrigen Schritte sind analog zum Standard-CTAB-Protokoll. Da beim Mörsern mit flüssigem Stickstoff viel Material verloren geht und häufig nur geringe Mengen an Blattmaterial aus Herbarien zur Verfügung stand, wurde das Blattmaterial anstatt mit Pistill und Mörser auch hier mit einer Kugelmühle pulverisiert. Mörser, Pistill und flüssiger

23 2. Material und Methoden

Stickstoff wurden nur für die Probe verwendet, die für die 454-Sequenzierung vorgesehen war, da von ihr ausreichend Frischmaterial zur Verfügung stand. Das genaue Isolationsprotokoll findet sich im Anhang A4.

2.3. Mikrosatelliten

2.3.1. Nukleäre Mikrosatelliten

Bei der Auswahl von molekularen Markern für eine populationsgenetische Studie an Vinca minor muss berücksichtigt werden, dass sich die Art sowohl sexuell als auch vegetativ fortpflanzen kann und somit zur Ausbildung von Klonen fähig ist. Die relative Bedeutung von Klonalität innerhalb von Arten und Populationen lässt sich prinzipiell mit allen molekularen Markern abschätzen, so z. B. Allozymen (Harris 1966), RAPDs ('random amplified polymorphic DNA', Williams et al. 1990), ISSRs ('inter simple sequence repeat-PCR', Zietkiewicz et al. 1994), AFLPs ('amplified fragment length polymorphism', Voss et al. 1995) und Mikrosatellitenmarkern (Litt & Luty 1989). Die Effizienz der Detektion von Klonen hängt maßgeblich von der Wahl der Methode ab (Loxdale & Lushai 2003, Paun & Hörandl 2006). So betonen Honnay & Bossuyt (2005), dass dominante Multilocus-Marker wie AFLPs, ISSRs oder RAPDs zu einer Überschätzung der genetischen Diversität klonaler Pflanzen führen können. Dies ist darauf zurückzuführen, dass klonale Pflanzen mit zunehmendem Klonalter somatische Mutationen akkumulieren, die sich in zusätzlichen Banden manifestieren können. Daher bieten sich zur Abschätzung der genetischen Diversität klonaler Pflanzenarten vor allem locus-spezifische, codominante Marker an. Aufgrund ihrer deutlich höheren Sensibilität sind dabei Mikrosatelliten- den Allozym-Markern vorzuziehen.

Mikrosatelliten (Litt & Luty 1989) (syn. 'simple sequence repeats'=SSRs, Jacob et al. 1991; 'short tandem repeats'=STRs, Edwards et al. 1991; 'simple sequences', Tautz 1989) sind aus eins bis sechs Basenpaaren (bp) langen, tandemartig wiederholten Sequenzmotiven der DNA aufgebaut. Nach ihrer Entdeckung in einer Krabbenart (Skinner et al. 1974) wurden Mikrosatelliten in hoher Kopienzahl im Genom von Pro- (Van Belkum et al. 1998) und vor allem Eukaryoten (Tautz & Renz 1984) nachgewiesen und seitdem in großem Maßstab als molekulare Marker verwendet (Morgante & Olivieri 1993, Gupta et al. 1996, Powell et al. 1996, Weising et al. 2005).

24 2. Material und Methoden

2.3.1.1. Evolution und Mutation

Mikrosatelliten entstehen spontan de novo (Messier et al. 1996) oder durch die Übernahme von Mikrosatelliten über ins Genom eingebrachte mobile Elemente (Wilder & Hollocher 2001). Sie gehören zu den variabelsten Sequenztypen des Genoms (Weber 1990) und Plastoms (Provan et al. 2001). Die Polymorphismen leiten sich jedoch nicht aus Basensubstitutionen ab, sondern beruhen auf Längenänderungen dieser spezifischen DNA- Abschnitte infolge erhöhter Insertions-Deletions-Mutabilität. Bei der Replikation kann es in Bereichen mit mindestens drei bis vier Wiederholungseinheiten (Protomikrosatelliten; Rose & Falush 1998, Hancock 1999) nach der vorübergehenden Dissoziierung des replizierenden DNA-Stranges zu einer fehlerhaften Reassoziierung der komplementären Stränge, dem 'slipped strand mispairing', kommen (SSM; Levinson & Gutman 1987). Werden solche Mutationen nicht durch die DNA-Mismatch-Reparatur korrigiert, manifestieren sie sich als Längenpolymorphismen (Strand et al. 1993). Jede Längenvariante eines Mikrosatelliten entspricht einem 'Allel', das durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) nachweisbar ist (s. u.; 2.3.1.2). Nach einer Expansionsphase kann es wieder zur Verkürzung, Degeneration und schließlich dem 'Tod' des Mikrosatelliten kommen (z. B. Buschiazzo & Gemmell 2006).

Eine einheitliche Mutationsrate für Mikrosatelliten existiert nicht (Ellegren 2004). Umfassende Studien hierzu fehlen bislang, in Pflanzengenomen gelten aber Mutationsraten zwischen 10-2 und 10-5 Ereignissen pro Mikrosatellitenlocus und pro Generation als Richtwerte. Sie übertreffen somit die Rate von Punktmutationen in Genen um ein Vielfaches (Vigouroux et al. 2002, Thuillet et al. 2002, Raquin et al. 2008). Eine Übersicht zur Mutabilität und Evolution von Mikrosatelliten geben z. B. Ellegren (2004) sowie Buschiazzo & Gemmell (2006).

In der Populationsgenetik haben sich verschiedene Mutationsmodelle zur Evolution von Mikrosatelliten etabliert (Jarne & Lagoda 1996). Sie werden benötigt, wenn genetische Distanzen zwischen zwei Gruppen von Individuen aus deren Allelfrequenzen abgeleitet werden sollen (Bhargava & Fuentes 2010). Das 'infinite alleles' Modell (IAM; Kimura & Crow 1964) beruht auf der Annahme, dass jede Mutation mit gleicher Wahrscheinlichkeit ein beliebiges Allel hervorbringt, das vorher noch nicht existiert hat. Das 'stepwise mutation' Modell (SMM; Kimura & Ohta 1978) hingegen basiert auf der Annahme, dass jeder Mutation der Zugewinn oder Verlust einer Wiederholungseinheit zugrunde liegt. Allele, die durch eine oder wenige Wiederholungen getrennt sind, sind nach dem SMM - im Gegensatz zum IAM -

25 2. Material und Methoden näher miteinander verwandt als Allele, die sich durch zahlreiche Wiederholungseinheiten unterscheiden. Für Mutationen von Mikrosatelliten wird meist das SMM präferiert, da sich die Anzahl an Wiederholungseinheiten pro Mutation häufig nur um eine Einheit ändert (Levinson & Gutman 1987). Da jedoch weder das IAM noch das SMM die komplexen Vorgänge bei der Evolution von Mikrosatelliten korrekt widerspiegelt (Buschiazzo & Gemmell 2006), werden in populationsgenetischen Studien häufig mehrere Modelle berücksichtigt.

2.3.1.2. Mikrosatelliten als molekulare Marker

Mikrosatelliten sind für populationsgenetische Fragestellungen derzeit das Markersystem der Wahl (z B. Cosendai et al. 2013, Guicking et al. 2013) und eignen sich auch für die Charakterisierung von Klonen (vgl. 2.3.1, z. B. James et al. 2014) und Cultivaren (z. B. Becher et al. 2000, Farjado et al. 2013).

Neben der bereits genannten hohen Abundanz in eukaryotischen Genomen, dem ubiquitärem Vorkommen in allen Organismenreichen und dem hohen Grad an Polymorphie bieten Mikrosatelliten weitere Vorteile, die sie zu wertvollen genetischen Markern machen (Übersicht bei Powell et al. 1996, Weising et al. 2005). Von Mikrosatelliten in nicht- codierenden Genomabschnitten wird angenommen, dass sie neutral gegenüber Selektion sind. Zudem lassen sich einzelne Loci einfach und robust über eine PCR nachweisen. Primer, die komplementär zu den flankierenden Sequenzen sind, erlauben die locus-spezifische Amplifikation und automatisierte Längenbestimmung über Gel- oder Kapillarelektrophorese. Der codominante Vererbungsmodus von nukleären Mikrosatelliten erlaubt die exakte Bestimmung des Genotyps an dem betreffenden Locus und damit eine Abschätzung der Heterozygoten- und Inzuchtrate.

Viele der in früheren Publikationen genannten Nachteile von Mikrosatellitenmarkern sind heute aufgrund von technischen Fortschritten kaum noch von Bedeutung. So erschweren die sog. Stotterbanden, die durch ein Verrutschen der DNA-Polymerase während der PCR entstehen, zwar die absolute Größenbestimmung, weisen aber im Vergleich zum eigentlichen Allel meist eine geringere Intensität auf. Nullallele, die infolge von Mutationen in der Primer- Binderegion in flankierenden Sequenzen auftreten, führen zu fehlerhaften Abschätzungen der Homozygotierate in Populationen, können aber durch geeignete Computerprogramme detektiert werden (z. B. Van Oosterhout et al. 2004). Durch die schnelle und vergleichsweise

26 2. Material und Methoden kostengünstige Verfügbarkeit von großen Mengen an DNA-Sequenzen über moderne Verfahren des 'next generation sequencing' (NGS) ist auch der Aufwand für die Neu- Etablierung von Mikrosatellitenmarkern deutlich geringer geworden (Zalapa et al. 2012). Als wesentlicher verbliebener Nachteil bleibt das Homoplasierisiko zu nennen, das auf die hohe Mutationsrate von Mikrosatelliten zurückzuführen ist. Auch das Auftreten von Mutationen innerhalb des amplifizierten PCR-Produkts, die nicht auf dem SSM beruhen (z. B. in der den Mikrosatelliten direkt flankierenden Sequenz), lässt sich kaum vermeiden.

2.3.1.3. Mikrosatellitenmarker für Apocynaceae

Prinzipiell besteht die Möglichkeit der Übertragung von Mikrosatellitenmarker zwischen nah verwandten Arten innerhalb der gleichen Gattung (z. B. innerhalb von Prunus; Cipriani et al. 1999), manchmal auch innerhalb einer Familie (z. B. innerhalb der Bromeliaceae; Wöhrmann & Weising 2011). Ein denkbarer Weg zur Etablierung von Mikrosatellitenmarkern für Vinca minor wäre daher die Anwendung von Primerpaaren aus anderen Arten der Apocynaceae. Bisher wurden Mikrosatellitenmarker für zehn Arten dieser Familie aus den Unterfamilien Rauvolfioideae und Asclepiadioideae publiziert (Stand Oktober 2014, Tab. 4). Der Schwerpunkt liegt dabei auf bedrohten oder medizinisch-ökonomisch bedeutsamen Taxa. Der Übertragbarkeit von Mikrosatellitenmarkern innerhalb der Apocynaceae wurden bisher allerdings nur wenige Studien gewidmet, mit wenig ermutigenden Ergebnissen. So konnten z. B. nur drei von 24 für Catharanthus roseus etablierten Mikrosatelliten-Marker auf je eine Akzession der Arten Vinca minor, Thevetia peruviana und Nerium indicum übetragen werden. Eine Sequenzierung der Loci zeigte, dass das Mikrosatellitenmotiv in V. minor nicht vorhanden war (Shokeen et al. 2006). In einer vorangegangenen Diplomarbeit lag die Übertragbarkeit von sog. 'expressed sequence tag' (EST)-Mikrosatelliten aus C. roseus auf V. minor bei nur 1 %, obwohl beide Gattungen zur gleichen Tribus (Vinceae) gehören. Die Marker erwiesen sich zudem als monomorph (Möller 2011). Weitere Bemühungen in dieser Richtung erscheinen daher wenig sinnvoll.

27 2. Material und Methoden

Tabelle 4: Übersicht über die Studien, in denen Mikrosatellitenmarker für Arten der Apocynaceae etabliert wurden. Es sind bis bis Oktober 2014 veröffentlichte Studien aufgeführt. +: volle Übertragbarkeit, +/-: eingeschränkte Übertragbarkeit, *: Marker aus Xu et al. (2004), **: Auftrennung der Fragmente lediglich auf Agarosegelen mit niedriger Auflösung, n. d.: nicht bestimmt.

Übertragbarkeit Unterfamilie Tribus Art Autor Innerhalb der Zwischen Gattung Gattungen O'Quinn & Fishbein 2009 + n.d. Asclepias syriaca Kabat et al. 2010 n.d. n.d. Straub et al. 2011 n.d. n.d. Asclepiadeae Aspidosperma polyneuron Ferreira-Ramos et al. 2011 n.d. n.d. Asclepiadioideae Vincetoxicum atratum Tada et al. 2009 +/- n.d. Vincetoxicum pycnostelma Nakahama et al. 2012 n.d. n.d. Ceropegieae Ceropegia fantastica Sumangala et al. 2009 + n.d. Marsdenieae Hoya mindorensis Widiarsih et al. 2014 n.d. +*/** incertae sedis Amsonia kearneyana Topinka et al. 2004 +/- n.d. Cerbera magnas Xu et al. 2014 n.d. n.d. Plumerieae Himatanthus drasticus Baldauf et al. 2011 n.d. n.d. Rauvolfioideae Shokeen et al. 2006 +/- +- Vinceae Catharanthus roseus Mishra et al. 2011 n.d. +** Kumar et al. 2014 + n. d.

2.3.2. Plastidäre Mikrosatelliten

Die Verwendung von Plastiden-DNA (cpDNA) hat für die Untersuchung von Verwandtschaftsbeziehungen zwischen Pflanzentaxa eine Reihe von Vorteilen: Im Gegensatz zum Genom wird das Plastom meist uniparental-maternal vererbt, es ist nicht rekombinant und weist eine vergleichweise geringe Evolutionsrate in Struktur und DNA-Sequenz auf (Olmstead & Palmer 1994). In Vinca minor wurde die maternale Vererbung der Plastiden bereits über cytologische Verfahren nachgewiesen (Corriveau & Coleman 1988).

Sequenzvariation im Plastom wird nicht nur für phylogenetische Untersuchungen auf zwischenartlicher Ebene und höheren taxonomischen Stufen eingesetzt, sondern auch für phylogeographische Untersuchungen auf innerartlicher Ebene. Die Wissenschaft der Phylogeographie bildet die Nahtstelle zwischen Phylogenie und Biogeographie (Avise 2000). Ihr Ziel ist es, historische Ausbreitungsprozesse nachzuvollziehen, die zur gegenwärtigen Verbreitung evolutiver Linien geführt haben. Typischerweise werden bei phylogeo-

28 2. Material und Methoden graphischen Studien uniparental vererbte Organellen-Marker eingesetzt, bei Tieren aus der mitochondrialen DNA (z. B. Taberlet et al. 1994), bei Pflanzen aus der plastidären DNA (z. B. Kadereit et al. 2005). Aufgrund der fehlenden Rekombination sind die Sequenzvarianten an verschiedenen Positionen des Plastoms physikalisch miteinander verbunden und können zu sog. Haplotypen kombiniert werden. Die Haplotypen können nach ihrer genetischen Verwandtschaft zu phylogenetischen Bäumen oder Netzwerken kombiniert werden. Durch den Vergleich solcher Netzwerke mit der geographischen Verteilung der Haplotypen können z. B. postglaziale Remigrationsrouten aus Refugialräumen (z. B. Rendell & Ennos 2003) oder die Einführungsgeschichte invasiver Arten (z. B. Williams et al. 2005) rekonstruiert werden.

Die geringe Sequenzvariation der plastidären DNA hat zur Folge, dass Polymorphismen in phylogeographischen Studien auf innerartlicher Ebene häufig schwer nachweisbar sind. In solchen Fällen können plastidäre Mikrosatelliten verwendet werden, die im ansonsten konservierten Plastidengenom die höchsten Mutationsraten aufweisen (Übersichten bei Provan et al. 2001, Wheeler et al. 2014).

Mikrosatelliten kommen in Plastomen vorwiegend in nicht-codierenden Bereichen vor (Powell et al. 1995a,b; Provan et al. 2001, Shaw et al. 2007) und bestehen in der Regel aus

Mononukleotid-Wiederholungen vom Typ An/Tn (99 % der Loci, Provan et al. 1999). Plastidäre Mikrosatellitenmarker können wie alle Polymorphismen der plastidären DNA zu Haplotypen zusammengesetzt werden und eignen sich daher gut zur phylogeographischen Analyse (Marshall et al. 2002, Gugger et al. 2011, Thomson et al. 2014). Mit der Variabilität steigt allerdings auch das Homoplasierisiko: Identische Fragmentlängen, die auf unabhängige Mutationsereignisse zurückgehen, können zu einer Überschätzung der Verwandtschaft führen (Doyle et al. 1998; Übersicht bei Wheeler et al. 2014).

2.3.3. Etablierung von Mikrosatellitenmarkern über 'next generation sequencing' (NGS)

Lässt man die Möglichkeit der Übertragbarkeit bereits etablierter Mikrosatellitenmarker aus nah verwandten Arten außer Betracht, so standen für die Etablierung neuer Marker bis Mitte der 2000er Jahre zwei Verfahren zur Verfügung: (1) Die Suche nach Mikrosatelliten in existierenden Sequenz-Datenbanken, z. B. aus ESTs ('expressed sequence tags') (z. B. Wöhrmann & Weising 2011) und (2) traditionelle Klonierungsverfahren mit oder ohne

29 2. Material und Methoden vorherige Anreicherung (Übersichten bei Zane et al. 2002, Weising et al. 2005). Diese Verfahren bergen mindestens einen von vier Nachteilen: (a) eingeschränkte Verfügbarkeit für die Zielart (Datenbanken), (b) hohe Kosten, (c) hoher Zeitaufwand und (d) geringe Ausbeute (Klonierungsverfahren). Größere Sequenzierprojekte für Arten ohne Modellcharakter waren aufgrund der mit der Sanger-Sequenzierung (Sanger et al. 1977) verbundenen Kosten und deren technischen Limitierungen kaum möglich (Zalapa et al. 2012).

Mit dem Aufkommen der Sequenzier-Technologien der 'nächsten Generation' ('next generation sequencing', NGS) Mitte der 2000er Jahre wurden diese Einschränkungen bei der Mikrosatellitensuche weitestgehend aufgehoben. Diese Verfahren ermöglichen die zeitgleiche, zufällige ('shotgun') Generierung zehntausender Sequenzen aus dem Zielgenom ohne aufwändige Klonierungs- und Anreicherungsschritte (Metzker 2010). Zudem liegen die Kosten im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung pro Megabase bei weniger als 1 % (Zalapa et al. 2012). Das auf dem Prinzip der Pyrosequenzierung basierende GS FLX System (Margulies et al. 2005) wurde als erstes kommerzialisiert (454 Diagnostics, Roche Diagnostics) und vielfach zur Generierung von genomischen und transkriptomischen Sequenzdaten genutzt, die u. a. auch der Detektierung von Mikrosatelliten dienen sollten (s. u.; Übersicht bei Zalapa et al. 2012). Die 454-Methode liefert im Vergleich zu anderen NGS-Technologien relativ große Leseweiten und dadurch höhere Ausbeuten an Mikrosatellitenmarkern; in den letzten Jahren wurde jedoch auch vermehrt die Illumina-Sequenzierung eingesetzt (Zalapa et al. 2012).

Seit der ersten Studie zur Etablierung von Mikrosatelliten-Markern über 454-Sequenzierung über ein 'shotgun'-Verfahren in einer neuseeländischen Entenart (Abdelkrim et al. 2009) wurde die Technologie intensiv zur Etablierung von Mikrosatellitenmarkern auch in Nicht- Modellorganismen über alle Organismenreiche hinweg genutzt (z. B. Csencsics et al. 2010, Perry & Rowe 2011, Molinier et al. 2013). Selbst ohne vorherige Anreicherung erzielen 'shotgun'-Sequenzierungen kleineren Umfangs hohe Mengen an Sequenzinformation, in der eine Vielzahl an Mikrosatelliten enthalten ist (z. B. Castoe et al. 2010, Takayama et al. 2011). Neben nukleären Sequenzen enthält ein NGS-Datensatz auch immer plastidäre und mitochondriale Anteile, sodass mit einem gängigen 'shotgun'-Versuchsansatz neben kernspezifischen Mikrosatelliten auch solche für die Organellengenome etabliert werden können (z. B. Villareal et al. 2012; vgl. 2.3.4.4 sowie 2.3.4.5).

30 2. Material und Methoden

2.3.4. Bioinformatische Verarbeitung von NGS-Daten zur Etablierung artspezifischer Mikrosatellitenmarker für Vinca minor

2.3.4.1. Rohsequenzen

Die Etablierung artspezifischer Mikrosatellitenmarker für Vinca minor erfolgte über Nukleinsäure-Sequenzen, die mittels 454-Pyrosequenzierung gewonnen wurden. Bei dieser Methode werden Nukleinsäuren nach der Generierung einer DNA- oder cDNA-Bibliothek über eine Emulsions-PCR vervielfältigt und der Einbau neuer Nukleotide im Rahmen einer 'sequencing by synthesis'-Prozedur in Echtzeit lasergestützt detektiert (Margulies et al. 2005). Nach der bioinformatischen Verarbeitung stehen die Sequenzen für vielfältige Anwendungsmöglichkeiten zur Verfügung. Die Generierung der beiden im Rahmen dieser Arbeit genutzten Datensätze erfolgte über eine 454 GS FLX Titanium-Plattform (Roche Diagnostics, Branford). Der grundlegende Unterschied bestand in der Natur der sequenzierten Nukleinsäuren, der damit verbundenen Erstellung der Bibliothek sowie des Gesamtdatenumfanges.

Der erste Datensatz beruhte auf RNA- bzw. cDNA-Sequenzen. Im Zuge der weitläufigen Nutzung der verschiedenen NGS-Technologien wurde bei NCBI ein sog. SRA-Archiv ('sequence read archive'; Leinonen et al. 2010) zur Speicherung von über NGS-Technologien gewonnenen Rohsequenzen eingerichtet. In diesem Archiv liegen die Rohaten für eine 454-Sequenzierung der Gesamt-cDNA (Transkriptom) eines Blattes von Vinca minor unter der Akzessionsnummer SRX039641 öffentlich zugänglich vor. Der Datensatz wurde an der Universität von Calgary (Sun Center of Excellence for Visual Genomics) im Rahmen einer Studie hergestellt, die die Rekonstruktion der Synthesewege wichtiger Pflanzen-Metabolite und ihre gentechnische Herstellung in Hefen zum Ziel hat. Die Bibliothek wurde unter Anwendung der 'random priming method' (vgl. z. B. Wall et al. 2009) erstellt.

Der zweite Datensatz beruht auf genomischen DNA-Sequenzen aus einem Vinca minor- Individuum mit der Akzessionsnummer KS_VM454_01 (vgl. 2.1.1). Bis auf die Isolierung der Templat-DNA wurden alle Arbeitsschritte von unserem Kooperationspartner Bruno Huettel im Max-Planck-Institut fur Pflanzenzüchtungsforschung in Köln durchgeführt. Die Bibliothek wurde nach Maßgabe des 'rapid library preparation'-Protokolls (Roche Diagnostics 2011) generiert. Neben V. minor wurde auch je eine Akzession von Macaranga gigantea und M. pearsonii (Euphorbiaceae) in einem Multiplexverfahren der Sequenzierung unterzogen; zur Unterscheidung der einzelnen Proben wurden Barcodes eingesetzt.

31 2. Material und Methoden

2.3.4.2. Assemblierung der Rohsequenzen

Ziel einer Assemblierung ist es, Sequenzhomologien unter den Rohsequenzen zu detektieren, übereinander zu legen, diese zu Contigs zusammenzufassen, die Redundanz des Datensatzes zu reduzieren und einzigartige Unigenes zu definieren. Die Assemblierung der beiden o. g. Datensätze erfolgte jeweils getrennt mit mittlerer Sensitivität über die 'assembly'-Funktion des Programms Geneious v. 5.4 (Drummond et al. 2011). Der Datensatz aus der cDNA- Sequenzierung musste aufgrund seiner Größe in mehreren Teilschritten assembliert werden.

2.3.4.3. Suche nach Mikrosatelliten

Die assemblierten Datensätze wurden mithilfe des Programms SciRoKo v. 3.4 (Kofler et al. 2007) auf das Vorhandensein von Mikrosatelliten und die Frequenz der einzelnen Motive hin untersucht. Unter Verwendung der 'perfect MISA' Funktion wurde ausschließlich nach perfekten Mikrosatelliten gesucht (das Motiv wird hierbei nicht von anderen Basen unterbrochen). Mono-, Di-, Tri- und Tetranukleotidwiederholungen mit mindestens 15, sieben, sechs und fünf sowie Penta- und Hexanukleotidwiederholungen mit jeweils mindestens vier Wiederholungseinheiten wurden auf diese Weise detektiert. Mittels 'SciRoKo's little helper' wurden die betreffenden Sequenzen anschließend aus dem Gesamtdatensatz extrahiert.

2.3.4.4. Rekonstruktion des Plastoms von Vinca minor

Analog zu dem von Krapp et al. (2012) beschriebenen Vorgehen wurden die plastidären Sequenzen innerhalb des DNA-Gesamtdatensatz identifiziert und auf das Vorhandensein von plastidenspezifischen Mikrosatelliten untersucht. Dazu wurden die Sequenzen des DNA- Datensatzes innerhalb des Programms Geneious v. 5.4 (Drummond et al. 2011) als Datenbank definiert und eine BLAST ('basic local alignment search tool')-Analyse (Altschul et al. 1990) des Plastoms von Coffea arabica (Samson et al. 2007) gegen diese Datenbank durchgeführt. Coffea arabica stellte zum Zeitpunkt der Analyse die zu V. minor am nächsten verwandte Pflanzenart dar, deren Gesamt-Plastom bereits vollständig sequenziert vorlag. Zum C. arabica- Plastom ähnliche Sequenzen wurden aus dem Datensatz extrahiert und als dem V. minor- Plastom zugehörig definiert.

32 2. Material und Methoden

2.3.4.5. Primerdesign

Die flankierenden Sequenzen aller Mikrosatellitenloci mit Di- bis Hexanukleotid- Wiederholungen aus den beiden assemblierten Datensätzen wurden mittels der webbasierten Applikation BatchPrimer3 (You et al. 2008) nach möglichen Primer- Bindestellen durchsucht. Die Parameter für das Primerdesign wurden wie folgt definiert: Primerlänge zwischen 18 und 23 bp (Optimum: 20 bp), Länge des PCR-Produkts zwischen 100 bp und 300 bp (Optimum: 150 bp), Anlagerungs-Temperatur zwischen 50 °C und 70 °C (Optimum: 55 °C) sowie GC-Gehalt zwischen 30 % und 70 % (Optimum: 50 %). Für die übrigen Parameter wurden die Standard-Einstellungen beibehalten. Die auf diese Weise entwickelten nukleären Mikrosatellitenmarker aus dem cDNA (Transkriptom)-Datensatz wurden mit dem Kürzel Vimi ('Vinca minor') und einer durchlaufenden Nummer bezeichnet. Die aus dem genomischen Datensatz entwickelten nukleären Marker erhielten das Kürzel ngVm ('next generation Vinca minor') und ebenfalls eine fortlaufende Nummer.

Die Suche nach (A)n bzw. (T)n-Wiederholungsmotiven von mindestens 10 bp Länge in den dem Plastom zugewiesenen Contigs wurde manuell durchgeführt. Die Primer wurden manuell entworfen und mit dem webbasierten Programm Primer3 (Rozen & Skaletsky 2000) auf ihre Eigenschaften hin überprüft. Die Primer wurden dabei so gewählt, dass die erwarteten Produktgrößen in unterschiedlichen Größenklassen (<100 bp, ca. 200 bp, ca. 250 bp) lagen. So konnten später bis zu drei Loci parallel auf dem gleichen Kanal des LI-COR®-Sequenzierers elektrophoretisch aufgetrennt werden (vgl. 2.5.2), was den zeitlichen und finanziellen Aufwand minimierte. Die auf diese Weise entwickelten plastidären Mikrosatellitenmarker wurden mit dem Kürzel cpVm ('chloroplast Vinca minor') und einer fortlaufenden Nummer bezeichnet.

2.3.5. Verwendung universeller Primer für Mikrosatellitenloci aus dem Plastom (ccmps)

Da das Plastom ein hohes Maß an Konservierung aufweist, wurde eine Vielzahl universeller Primer publiziert (z. B. Shaw et al. 2005, 2007) und für Verwandtschaftsanalysen in verschiedenen Pflanzentaxa angewendet (z. B. Peterson et al. 2010, Givnish et al. 2011). Neben Primern für phylogenetische Fragestellungen stehen auch universelle Primerpaare zur Verfügung, die plastidäre Mikrosatelliten flankieren. Die von Weising & Gardner (1999)

33 2. Material und Methoden entwickelten zehn 'chloroplast consensus microsatellite primer' (ccmp)-Paare wurden in diesem Zusammenhang auf ihre Funktionalität in Vinca minor überprüft.

2.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die Polymerase-Kettenreaktion ('polymerase chain reaction', PCR) bezeichnet ein temperaturabhängiges, zyklisches Verfahren zur Vervielfältigung bestimmter DNA-Abschnitte mittels einer thermostabilen DNA-Polymerase (Saiki et al. 1988). Der DNA-Doppelstrang wird hierbei zunächst durch hohe Temperaturen in zwei Einzelstränge getrennt (Denaturierung). Im folgenden Schritt wird die Temperatur abgesenkt, so dass Primer binden können, die den zu vervielfältigenden DNA-Abschnitt flankieren und komplementär zur Zielsequenz sind (Annealing). Durch erneute Erhöhung der Temperatur auf einen für die eingesetzte DNA- Polymerase optimalen Wert (z. B. 72 °C bei der Taq-Polymerase, die ursprünglich aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus gewonnen wurde) wird von den Primern ausgehend ein neuer DNA-Strang synthetisiert (Elongation). Durch Wiederholung der Zyklen unter Zuhilfenahme einer thermostabilen Polymerase, die auch unter Einwirkung der hohen Temperaturen bei der Denaturierung ihre Aktivität beibehält, erfolgt eine exponentielle Vervielfältigung des von den beiden Primern flankierten DNA-Abschnitts.

Verwendete Geräte, Materialien & Reagenzien

Reaktionsgefäße Mikrotiterplatte (96-well PCR plate, Biozym)

Sealmat (Biozym)

Thermocycler T-Gradient Cycler oder T1 Cycler (Biometra, Göttingen)

Life Touch Thermal Cycler (Bioer Technologies, Hangzhou)

Mastercycler Nexus Gradient (Eppendorf, Hamburg)

Reagenzien 5x Mango-Taq gefärbter Reaktionspuffer (Bioline, Taunton)

100 mM TrisHCl

250 mM KCl

50 mM MgCl2 (Bioline, Taunton)

Mango-Taq DNA-Polymerase, 5U/μl (Bioline, Taunton)

Bovine Serum Albumin, 20 mg/ml (BSA; Thermo Scientific, Waltham)

2,5 mM dNTP-Lösung (je 2,5 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP; Roth, Karlsruhe])

10 μM Primer; aus 100 μM Stammlösung (Metabion, Martinsried)

Aqua bidest

DNA-Templat Stammlösungen standardisiert auf ca. 10 ng/μl in 1x TE-Puffer

34 2. Material und Methoden

Vorgehensweise In der vorliegenden Arbeit wurden zwei unterschiedliche PCR-Ansätze verwendet. Die Zusammensetzung unterscheidet sich maßgeblich dadurch, dass bei PCR-Ansatz A (Tab. 5) zusätzlich zu den beiden PCR-Primern ein universeller, fluoreszenzmarkierter M13-Primer zu dem PCR-Ansatz gegeben wurde. Einer der beiden PCR-Primer wird bei diesem Protokoll am 5'-Ende mit einer universellen Sequenz aus dem Phagen M13 versehen, an die der universelle fluoreszenzmarkierte Primer dann im Laufe der PCR binden kann. Diese erstmals von Schuelke (2000) vorgeschlagene Vorgehensweise ist v. a. im Rahmen einer Neuetablierung von genetischen Markern sehr ökonomisch, da sich in der Regel nicht alle getesteten Loci für die weitergehenden Analysen eignen und daher eine Vielzahl an fluoreszenzmarkierten Primern verworfen werden müssten. Bei Ansatz B (Tab. 5) hingegen, der zur Amplifikation der universellen ccmp-Plastidenmarker (Weising & Gardner 1999) diente, war einer der beiden PCR-Primer direkt fluoreszenzmarkiert. Bei der Amplifikation plastidärer Loci wurde generell weniger DNA eingesetzt (0,5 μl; PCR-Ansätze A2 und B) als bei nukleären Loci (2 μl, PCR-Ansatz A1), da das Plastom im Gegensatz zum Kerngenom in vielfacher Kopie pro Zelle vorliegt und daraus eine höhere Amplifikatsausbeute resultiert.

Tabelle 5: Zusammensetzung der PCR-Ansätze zur Amplifikation nukleärer und plastidärer Mikrosatellitenloci. Ansatz A1: nukleäre Loci, Ansatz A2: plastidäre cpVm-Loci, Ansatz B: plastidäre ccmp-Loci.

Volumina pro Reaktionsansatz (μl) Komponente Stammlösung Endkonzentration Ansatz A1 Ansatz A2 Ansatz B

H2O bidest - - 4,19 5,69 5,26 100 mM Tris HCl 20 mM Tris HCl 5x PCR-Puffer 2 2 2 250 mM KCl 50 mM KCl

MgCl2 50 mM 1,5 mM 0,3 0,3 0,5 dNTPs 2,5 mM 0,2 mM 0,8 0,8 0,8 Primer fw 10 μM 0,04 μM 0,04 0,04 0,4 Primer rev 10 μM 0,16 μM 0,25 0,25 0,4 M13-Primer univ. 10 μM 0,16 μM 0,25 0,25 - BSA 20 μg /μl 0,5 μg /μl 0,25 0,25 0,1 Taq-Polymerase 5 U/μl 0,05 U/μl 0,1 0,1 0,04 Templat-DNA ca. 10 ng/μl 2ng/μl oder 0,5 ng/μl 2 0,5 0,5 Summe 10 10 10

35 2. Material und Methoden

Zur Amplifikation der PCR-Ansätze, die einen universellen fluoreszenzmarkierten M13-Primer enthielten (PCR-Ansätze A1 und A2), wurde in der Regel ein nach Shaw et al. (2005) modifiziertes Protokoll 1 (Tab. 6) verwendet. Dieses Programm erwies sich für die Amplifikation einer Vielzahl von Loci als zuverlässig. Da es jedoch mit einer Gesamtdauer von zweieinhalb Stunden einen nur geringen Durchsatz ermöglicht, wurde zur Zeitökonomisierung ein zweites, zügigeres Protokoll 2 nach den bei Sullivan et al. (2006) zur PCR-Optimierung vorgeschlagenen Richtlinien entwickelt und bei einigen der untersuchten Kernloci eingesetzt. Zur Amplifikation der mit Reaktionsansatz B durchgeführten Reaktionen wurde ein drittes, leicht nach Weising et al. (2005) modifiziertes Protokoll 3 verwendet, das in unserem Labor standardmäßig zur Amplifikation von Mikrosatellitenloci eingesetzt wird (Tab. 6).

Tabelle 6: PCR-Protokolle zur Amplifikation nukleärer und plastidärer Mikrosatellitenloci. Protokoll 1 (nach Shaw et al. 2005) diente zur Amplifikation der nukleären Loci Vimi25, 27, 53 sowie aller cpVm- Loci nach, Protokoll 2 (nach Sullivan et al. 2006) diente zur Amplifikation der nukleären Loci Vimi34 und 43 sowie ngVm 24 und 26. Protokoll 3 (verändert nach Weising et al. 2005) diente zur Amplifikation der ccmp-Loci.

Protokoll Zyklenzahl Teilschritt Temperatur in °C Dauer 1x Initiale Denaturierung 80°C 5 min Denaturierung 95°C 1 min 30x Annealing 50°C 1min 1 Elongation 65°C 2 min 1x Finale Elongation 65°C 5 min 1x Aufbewahrung 10°C ∞ 1x Initiale Denaturierung 98°C 30 sec Denaturierung 92°C 1 sec 8x Annealing 63 bis 55°C 45 sec Elongation 72°C 15 sec 2 Denaturierung 92°C 1 sec 27x Annealing 55°C 45 sec Elongation 72°C 15 sec 1x Finale Elongation 72°C 60 sec 1x Aufbewahrung 10°C ∞ 1x Initiale Denaturierung 94°C 5 min Denaturierung 94°C 30 sec

3 30x Annealing 50°C 45 sec Elongation 72°C 1 min 1x Finale Elongation 72°C 7 min 1x Aufbewahrung 10°C ∞

36 2. Material und Methoden

2.5. Gelelektrophorese

Elektrisch geladene Makromoleküle lassen sich entsprechend ihrer Ladung unter Anlegung einer elektrischen Spannung in einem geeigneten Medium auftrennen. Nukleinsäuren werden dabei aufgrund der negativen Ladung ihrer Phosphatgruppen zur Anode hin bewegt. Für die Auftrennung großer DNA-Moleküle eignen sich Agarosegele, zur Auftrennung kleinerer Moleküle engmaschige Polyacrylamidgele, die die Auftrennung von DNA-Molekülen erlauben, die sich in der Länge nur in einem Nukleotid unterscheiden. Beide Medien bilden beim Aushärten ein Molekularsieb, das kleinere Moleküle schneller passieren lässt als größere, und erlauben so eine Auftrennung nach Molekülgröße. Um einen Einfluss der DNA-Konformation auf die Mobilität der Fragmente auszuschließen, wird die Polyacrylamidgelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt.

2.5.1. Agarose-Gelelektrophorese

Mittels der Agarose-Gelelektrophorese wurde die Menge und Qualität von DNA-Isolaten abgeschätzt sowie der Amplifikationserfolg bei PCR-Produkten im Rahmen von Vortests unter Standardbedingungen überprüft (vgl. Weising et al. 2005).

Verwendete Reagenzien

Laufpuffer (0,5x TBE) 45,5 mM Tris, 45,5 mM Borsäure, 1 mM EDTA (pH 8,3)

Agarose 0,8 % oder 1,5 % w/v in 0,5x TBE NEEO Ultra Quailty (Roth, Karlsruhe)

Auftragspuffer, 6x 40 % v/v Glycerin, 0,1 % w/v Bromphenolblau, 0,1 % w/v Xylencyanol in 0,5x TBE

Färbelösung 1μg/ml Ethidiumbromid in 0,5x TBE-Puffer

DNA-Quantifizierung λ-DNA in den Konzentrationen 5, 10, 20, 50 und 100 ng/μl in 1x TE-Puffer (Fermentas, Burlington)

Molekulargewichtsmarker 100 bp Längenstandard (Invitrogen, Carlsbad)

Vorgehensweise zur Quantifizierung von DNA-Isolaten

Je 2 μl DNA-Lösung wurden mit 0,5 μl eines beschwerenden, gefärbten Auftragspuffers vermischt und in einem 0,8%igen Agarose-Gel in 0,5x TBE-Puffer in einem elektrischen Feld bei 4 V/cm aufgetrennt. Kommerziell hergestellte DNA aus dem Phagen λ diente in

37 2. Material und Methoden variierenden, definierten Konzentrationen in parallelen Bahnen als Referenz zur Quantifizierung.

Vorgehensweise zur Überprüfung von PCR-Produkten

Da der bei der PCR verwendete Mango-Taq-Puffer bereits die Eigenschaften eines Auftragspuffers hatte (d. h. angefärbt und von hoher Dichte), wurden je 2 μl PCR-Produkt direkt in die Taschen eines 1,5%igen Agarose-Gels gefüllt und in 0,5x TBE-Puffer bei 6 V/cm aufgetrennt. Zur Fragmentlängenbestimmung wurden in einer Parallelbahn 1,5 μl eines 100 bp Längenstandards aufgetragen. Nach erfolgter Elektrophorese wurden die Gele etwa 10 min in Ethidiumbromid-Färbelösung gefärbt, unter UV-Licht visualisiert und fotografisch dokumentiert (BioDocAnalyze, Biometra, Göttingen).

2.5.2. Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Mittels der Polyacarylamid (PAA)-Gelelektrophorese wurden die PCR-Produkte für die Fragmentlängenanalyse unter denaturierenden Bedingungen hochauflösend aufgetrennt.

Verwendete Reagenzien

Gelpuffer ULTRA PURE SequaGel® Complete Buffer Reagent

Gellösung ULTRA PURE SequaGel® XR (beides National Diagnostics, Atlanta)

Ammoniumpersulfatlsg. (APS), 20 % 300 mg gelöst in 1,5 ml Aqua bidest (Sigma, St. Louis, Missouri, USA)

Laufpuffer (1x TBE) 90 mM Tris, 90 mM Borsäure, 2 mM EDTA (pH 8,3)

Ladepuffer 98 % v/v Formamid, 0,025 % v/v basisches Fuchsin, 10 mM EDTA

Vorgehensweise

Die PCR-Produkte wurden im Verhältnis 1:10 (nukleäre Marker) bzw. 1:50 (plastidäre Marker) mit Formamid-Ladepuffer verdünnt, bei 85 °C für 5 min denaturiert und je 0,2 bis

® 0,8 μl in einem automatischen Plattensequenzierer (LI-COR IR2 DNA Sequenzierer Long Readir 4200 oder 4300, LI-COR® Biosciences, Lincoln) aufgetrennt und visualisiert. Die Geleigenschaften (Puffer, Gellösung und APS im Verhältnis 100:25:1; Gellänge: 41 cm, Geldicke: 0,2 mm, 48 Taschen, Haifischzahnkamm) und die Elektrophoresebedingungen (Spannung 2.000 V, Stromstärke 25 mA, Leistung 50 W, Temperatur 45 °C, Vorlauf 30 min,

38 2. Material und Methoden moderate Scan-Geschwindigkeit) wurden nach Herstellerangaben gewählt.

2.6. Primertests

Aus der Vielzahl möglicher Kandidaten für die Etablierung von nukleären Mikrosatellitenloci wurden 60 (Vimi-) Loci aus dem cDNA-Datensatz und 35 (ngVm-) Loci aus dem genomischen Datensatz ausgewählt (siehe Anhang A7 und A8). Die flankierenden Primerpaare wurden kommerziell synthetisiert (Metabion, Martinsried). Bei der Auswahl wurde der Fokus auf möglichst lange Mikrosatellitenmotive gelegt, da längere Mikrosatelliten typischerweise variabler sind als kürzere (Weising et al. 2005). Anschließend wurden die zugrunde liegenden Sequenzen einer Qualitätskontrolle unterzogen (u. a.: Primer sollten nicht am Übergang zweier Sequenzen in einem Contig liegen) und gegebenenfalls verworfen. Die so selektierten Primerpaare wurden zur PCR-Amplifikation an einem reduzierten Probenset eingesetzt (siehe Tab. 3 in 2.1.1); die PCR-Produkte wurden zunächst auf Agarose- und anschließend auf PAA-Gelen analysiert. Für die plastidären Loci aus dem genomischen Datensatz sowie die universellen ccmp-Loci (Weising & Gardner 1999) wurden alle identifizierten Kandidaten auf ihre Funktionalität überprüft. Auf Basis der bei den Primertests erhaltenen Ergebnisse erfolgte die Selektion der für die populationsgenetischen und phylogeographischen Studien eingesetzten Mikrosatelliten-Loci. Hauptkriterium für die Auswahl war die Erzeugung von einer oder zwei distinkten Banden sowie (nur auf PAA-Gelen) deutliche Fragmentlängenunterschiede (Polymorphismen) zwischen den untersuchten V. minor- Akzessionen.

2.7. Fragmentlängenanalyse

Alle Fragmentlängenanalysen von Mikrosatellitenmarkern wurden wie unter 2.5.2 beschrieben auf dem LI-COR®-Sequenzierer durchgeführt. Parallel zu den PCR-Produkten wurde ein externer Längenstandard aufgetrennt. Dessen Herstellung erfolgte über die 'single nucleotide sequence analysis' (SNSA)-Methode (Guicking et al. 2008) aus der plastidären AT- reichen psbL-trnS Region aus Macaranga indistincta (Genbank-Nummer DQ358512; ccmp2-Locus, Weising & Gardner 1999). Da die Kettenabbruchsreaktion hierbei im Unterschied zur typischen Sanger-Sequenzierung nur für ein Abbruchsnukleotid (in diesem Fall ddTTP) durchgeführt wird, ist diese Methode im Vergleich zum Kauf kommerzieller

39 2. Material und Methoden

Längenstandards besonders kosteneffektiv. Die Gesamtsequenz des gewählten Fragments von ca. 280 bp Länge ist bekannt (Baenfer et al. 2006), so dass die Längen komigrierender PCR- Produkte im PAA-Gel abgeleitet werden konnten. Die Verwendung externer Längenstandards ist für Mikrosatelliten-Analysen auf Plattensequenzierern gängige Praxis (z. B. Guicking et al. 2008, Wöhrmann & Weising 2011). Als zusätzliche Referenzen zum visuellen Abgleich dienten bei der Hauptanalyse jeweils vier Positivkontrollen pro Gel (PCR-Produkte von Akzessionen mit bekannter Fragmentlänge).

2.8. Populationsgenetische Auswertung der nukleären Mikrosatelliten

Für jede Population und jeden Locus wurden die Allelzahlen und -frequenzen mittels des Programms GenAlEx v. 6.5 berechnet (Peakall & Smouse 2006, 2012).

Das Auftreten von Nullallelen wurde pro Population und Locus mittels des Programms Micro- Checker überprüft (Van Oosterhout et al. 2004, 2006). Bei diesem Verfahren werden aus den im Datensatz ermittelten Allelen Genotypen simuliert und mit den tatsächlich beobachteten Genotypen verglichen. Ist der Homozygotenüberschuss gleichmäßig über alle Allelgrößen (Homozygotengrößenklassen) verteilt und nicht nur z. B. bei kurzen Fragmenten präsent ('large allele dropout'), so deutet dies auf die Präsenz von Nullallelen hin (Van Oosterhout et al. 2004).

2.8.1. Charakterisierung der genotypischen und genetischen Diversität

Die genotypische Diversität wurde mittels der Parameter R ('genotypic richness', Dorken & Eckert 2001) und D* (Simpsons Diversität, korrigiert für geringe Stichprobengröße, Pielou 1969) abgeschätzt, die mit Hilfe des Programms GenClone v. 2.0 (Arnaud-Haond & Belkhir 2007) wie folgt errechnet wurden:

G−1 R= N−1

N (N −1) D *=1− Σ j j N (N−1)

Hierin bedeuten G: Anzahl der Genotypen, N: Anzahl an Stichproben, Nj: Anzahl an Individuen mit dem jten Genotypen

40 2. Material und Methoden

Die Abschätzung der genetischen Diversität der Populationen erfolgte über die Verwendung verschiedener Standard-Diversitätsindizes, die mittels der Programme FSTAT v. 2.9.3.2 (Goudet 1995) und GenAlEx v. 6.5 (Peakall & Smouse 2006, 2012) unter Einbezug aller Alleldaten für jeweils alle Stichproben berechnet wurden, darunter die Allelzahlen und

Allelfrequenzen, die beobachtete Heterozygotie HO und die erwartete Heterozygotie HE sowie die 'allelic richness'. Mittels dieser Programme wurden auch die Anteile von privaten Allelen pro Population ermittelt, die so als Maß für die genetische Differenzierung von Populationen dienen können.

Die beobachtete Heterozygotie HO ist ein Maß für den tatsächlich ermittelten Anteil an

Heterozygoten in einer Population, während die erwartete Heterozygotie HE der Wahrscheinlichkeit entspricht, dass zwei zufällig aus der Population gewählte Allele identisch sind. Sie basiert auf den Allelfrequenzen und errechnet sich wie folgt:

i =K 2 H E =1−∑ pi i=1

Hierin bedeutet pi: Frequenz des i-ten Allels von insgesamt K Allelen

2.8.2. Abschätzung der Klonalität

Zur Abschätzung des Ausmaßes der Klonalität wurden wie von Halkett et al. (2005) und De Meeûs et al. (2006) vorgeschlagen mehrere populationsgenetische Parameter ermittelt. Vegetative Vermehrung bedingt eine ähnliche genetische Signatur wie physikalische Kopplung ('physical linkage') zwischen den einzelnen Markern. Koeffizienten zur Messung des resultierenden Kopplungsungleichgewichts ('linkage disequilibrium', LD) können daher Hinweise auf das Ausmaß von Klonalität in einer Population geben (Halkett et al. 2005,

De Meeûs et al. 2006). Der standardisierte Korrelationskoeffizient rD (Agapow & Burt 2001) wurde in diesem Zusammenhang mittels des Programms Multilocus v. 1.3 (Agapow & Burt 2001) berechnet.

Der FIS-Wert, der die Abweichung von der Panmixis beschreibt, gilt als der informativste Schätzwert der F-Statistik (Wright 1951, 1965) im Kontext klonaler Organismen (Halkett et al. 2005) und wurde für jede Population sowie für jeden Locus und als Mittelwert über alle Loci hinweg mittels des Programms GenAlEx v. 6.5 (Peakall & Smouse 2006, 2012) bestimmt. Es wurden jeweils alle Alleldaten aller Stichproben pro Population in die Analysen

41 2. Material und Methoden einbezogen.

Grundlage zur Charakterisierung von Klonalität stellt die Identifikation von Multilocus- Genotypen (MLGs) dar. Dabei handelt es sich um die kombinierten allelischen Daten der verschiedenen Loci für eine bestimmte Probe. Mittels des Programms MLGSim v. 2.0 (Stenberg et al. 2003) wurden die MLGs ermittelt und zudem abgeschätzt, ob wiederkehrende MLGs das Resultat asexueller Reproduktion sind. Der errechnete kritische pSex-Wert ist definitionsgemäß die Wahrscheinlichkeit, mindestens so viele identische MLGs im Datensatz zu finden, wie es in einer panmiktischen Population der Fall wäre. Zur

Abschätzung der Signifikanz der pSex-Werte wird basierend auf den im realen Datensatz gegebenen Allelfrequenzen eine vordefinierte Anzahl an zufälligen MLGs (hier: 1.000.000) simuliert. Psex-Werte, die für das gegebene Signifikanzlevel (hier: 0,05) niedriger als die aus der Simulation resultierenden kritischen Werte sind, deuten auf MLGs asexuellen Ursprungs hin.

Zur Detektion somatischer Mutationen, die innerhalb von Klonen zu genetischer Variabilität führen können, wurde das Programm GenClone v. 2.0 (Arnaud-Haond & Belkhir 2007) verwendet. Der in diesem Programm implementierte Ansatz beruht auf der Verteilung genetischer Distanzen (Anzahl unterschiedlicher Allele) zwischen den einzelnen MLGs. Sind diese Distanzen ungewöhnlich niedrig und beruhen nur auf Längenvariabilität an einem Locus oder wenigen Loci, so deutet dies auf somatische Mutationen hin. Durch Vergleich mit den übrigen Distanzen kann ein Schwellenwert bestimmt werden, unterhalb dessen Multilocus-Genotypen zu Multilocus-Linien (MLLs) zusammengefasst werden (Arnaud-Haond et al. 2005, Arnaud-Haond & Belkhir 2007, Rozenfeld et al. 2007).

2.8.3. Neighbour Joining-Analyse

Mittels des Neighbour Joining-Algorithmus (NJ, Saitou & Nei 1987) lassen sich Phylogenien auf Basis genetischer Distanzen rekonstruieren. Aufgrund der Einfachheit der schrittweisen Rekonstruktion von Dendrogrammen über das 'nearest neighbour' Prinzip eignet sich dieses Verfahren zur schnellen Bearbeitung großer Datensätze. Die Neighbour Joining-Analyse wurde sowohl basierend auf genetischen Distanzen zwischen den einzelnen detektierten Multilocus-Genotypen als auch auf genetischen Distanzen zwischen Populationen durchgeführt.

42 2. Material und Methoden

Zur Rekonstruktion von NJ-Dendrogrammen auf Basis individueller Proben eignet sich u. a. das Distanzmaß nach Nei & Li (1979):

2n S= ab na+nb

Hierin bedeuten na und nb: Anzahl der Merkmale (Allele) in den Individuen a und b, nab: Anzahl der Merkmale (Allele), die in identischer Weise in beiden Individuen auftreten

Zur Berechnung der paarweisen genetischen Distanzen mussten die Alleldaten zunächst mittels des Programms Genetix v. 4.0.5 (Belkhir et al. 2004) in eine 0/1-Matrix (0: Allel nicht vorhanden, 1: Allel vorhanden) überführt werden, aus der dann mittels des Programms PAUP* v. 4.0 Beta 10 (Swofford 2003) Nei & Li's (1979) Distanzen berechnet wurden. Die NJ- Analyse wurde mittels des Programms SplitsTree v. 4.13.1 (Huson & Bryant 2006) durchgeführt und das Dendrogramm mit FigTree v. 1.4.2 (Rambaut 2006) visualisiert.

Takezaki & Nei (1996) betonen, dass zur Rekonstruktion populationsbasierter

Dendrogramme aus Mikrosatelliten-Daten u. a. das genetische Distanzmaß DA (Nei et al. 1983) geeignet ist:

m 1 r j D A=1− ∑ ∑ √ xi j yi j r j i

Hierin bedeuten r: Anzahl der Loci, mj: Allelzahl an Locus j, xij :Frequenz des iten Allels am Locus J, X/Y: Populationen bzw. Genotypen, deren paarweise genetische Distanz berechnet werden soll

Dieses Distanzmaß beruht zwar nicht auf einem Mutationsmodell (vgl. 2.3.1.1), ist aber robust gegenüber Stichprobenfehlern und daher in der Wiedergabe der korrekten Baumtopologie effizienter als auf Mutationsmodellen beruhende Distanzparameter (Nei et al.

1983). Die paarweisen genetischen Distanzen DA wurden über das Programm TreeFit (Kalinowski 2009) ermittelt, die NJ-Dendrogramme als Nexus-Datei ausgegeben und in FigTree v. 1.4.2 (Rambaut 2006) bearbeitet.

Zweigabelige Bäume werden zwar häufig genutzt, um genetische Beziehungen zwischen Populationen darzustellen, eignen sich für nicht hierarchisch evolvierende Populationen aber nur bedingt. Um das Ausmaß der Verfälschung der genetischen Beziehungen zwischen Populationen im Dendrogramm zu quantifizieren, wurde der Parameter R2 eingeführt:

̂ ̂ 2 2 ∑ Dij−dij R =1− ̂ ̄̂ 2 ∑ Dij−D

43 2. Material und Methoden

̂ ̂ Hierin bedeuten Dij : genetische Distanz in der Distanzmatrix zwischen den Populationen bzw. Genotypen i und j, d ij: Astlänge im Kladogramm zwischen den Populationen bzw. Genotypen i und j, D̄̂ : durchschnittliche Distanz

Dieser Parameter stellt somit ein Maß für den Anteil an Variation in der Datenmatrix dar, der durch den phylogenetischen Baum wiedergegeben wird. Ist R2 für den Baum kleiner als 0,9, sollte er nur bedingt zur Beschreibung der Populationsstruktur herangezogen werden (Kalinowski 2009). R2 wurde mittels des Programms TreeFit (Kalinowski 2009) kalkuliert. Darüber hinaus wurde für das populationsbasierte NJ-Dendrogramm ein Bootstrap-Test (Efron 1979, Felsenstein 1985) mit 1.000 Wiederholungen durchgeführt.

Inkompatible Baumtopologien lassen sich aber auch in Form von Netzwerken darstellen. Bei der Methode der Split-Dekomposition werden nur ideale Datensätze in Form eines Baums wiedergegeben, während widersprüchliche Äste in Splits zerlegt und in Form eines Netzwerks mit eingeschlossenen Parallelogrammen visualisiert werden (Huson 1998). Für diese Art der Darstellung wurden die genetischen Distanzen nach Nei & Li (1979) wie oben beschrieben ermittelt, die genetischen Distanzen nach Nei et al. (1983) mussten zunächst separat über das Programm Populations v. 1.2.31 (Langella 1999) ermittelt werden. Daraus wurde manuell eine Nexus-Datei erstellt und diese mittels des Programms SplitsTree v. 4.13.1 (Huson & Bryant 2006) zu einem Neighbour-Net verarbeitet.

2.8.4. Bayes'sche Analyse

Eine Analyse der genetischen Struktur auf Ebene der einzelnen ermittelten Multilocus- Genotypen wurde mittels eines im Programm Structure v. 2.3 (Pritchard et al. 2000) implementierten modellbasierten Cluster-Verfahrens durchgeführt, das auf einem Bayes'schen Algorithmus beruht. Ziel der Analyse ist es, alle individuellen Proben des gesamten Datensatzes aufgrund der individuellen Genotypdaten unabhängigen Clustern zuzuordnen. Dabei werden Simulationen für verschiedene Anzahlen an Clustern (K) durchgeführt und der wahrscheinlichste Wert für K ermittelt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Methode nach Evanno et al. (2005) angewendet, die auf der Ermittlung des höchsten ΔK-Wertes beruht. Die prozentuale Wahrscheinlichkeit q für die Zugehörigkeit eines MLGs zu einer oder mehreren verschiedenen Gruppen wird anschließend in einem Balkendiagramm farblich dargestellt.

Für jedes K von zwei bis 15 wurde die Analyse zehnfach wiederholt, basierend auf 50.000

44 2. Material und Methoden

Wiederholungen im 'burn-in' und 500.000 Schritten im eigentlichen Markov-Chain-Monte- Carlo-Verfahren. Mit diesen Einstellungen wurden separate Analysen mit unterschiedlichen Modellen bezüglich der Abstammung ('non-admixture': kein Genfluss zwischen den Clustern möglich, 'admixture': Genfluss möglich) und der Allelfrequenz ('correlated' und 'independent') durchgeführt. Alle übrigen Parameter entsprachen den Voreinstellungen. Die Ermittlung des optimalen Werts für K wurde mittels der webbasierten Anwendung STRUCTURE HARVESTER (Earl & von Holdt 2012) durchgeführt.

2.8.5. AMOVA

Eine Analyse molekularer Varianz (AMOVA, Excoffier et al. 1992) untersucht die Verteilung der gesamten Varianz in einem Datensatz innerhalb und zwischen vorher definierten Gruppen von Individuen. Dieses Verfahren basiert auf der Berechnung einer genetischen Distanzmatrix, in der quadrierte Differenzen innerhalb und zwischen Populationen ermittelt werden. Über die mittlere quadrierte Differenz lassen sich schließlich die Covarianzkomponenten ableiten (Bird et al. 2011), die einen Überblick über die prozentualen Anteile der Varianz auf verschiedenen hierarchischen Ebenen des Datensatzes erlauben (Excoffier et al. 1992). Die AMOVA wurde mit dem Programm Arlequin v. 3.5.1.3 (Excoffier et al. 2005, Excoffier & Lischer 2010) durchgeführt.

2.8.6. F-Statistik

Mittels der F-Statistik (Wright 1951, 1965) kann die genetische Differenzierung von Individuen bzw. Populationen auf verschiedenen hierarchischen Ebenen abgeschätzt werden (Holsinger & Weir 2009). Basierend auf hierarchischen Parametern über die Heterozygotie werden die Fixationsindizes für Individuen (I) innerhalb der Metapopulation (T), für Subpopulationen relativ zur Metapopulation (T) und für die Individuen (I) innerhalb der Supopulation (S) berechnet:

H H H F =1− I F =1− S F =1− I IT , ST H , IS H T T H S

Hierbei bedeuten HI: durchschnittliche beobachtete Heterozygotie innerhalb der Subpopulationen, HS: durchschnittliche erwartete Heterozygotie innerhalb jeder Subpopulation, HT: erwartete Heterozygotie der Individuen innerhalb der Gesamtpopulation

45 2. Material und Methoden

FIT ist somit ein Maß für das durchschnittliche Heterozygotendefizit der Individuen in Bezug zur Gesamtpopulation. FST repräsentiert das Ausmaß der genetischen Differenzierung zwischen den Subpopulationen und kann Werte zwischen 0 (keine Differenzierung) bis 1

(totale Differenzierung, Allele sind für die Subpopulationen fixiert) einnehmen. FIS hingegen quantifiziert das Ausmaß an Inzucht in jeder Subpopulation und kann Werte zwischen -1 (alle Individuen heterozygot) bis 1 (alle Individuen homozygot) annehmen.

Bei einer AMOVA können Analoga zu den Fixationsindizes auf Basis der Covarianzkomponenten berechnet werden, wobei:

σ2 σ2+σ2 σ2 F = a F = a b F = b CT 2 , ST 2 , SC 2 2 σT σT σ b+σ c

2 2 2 2 Hierbei stehen σa , σb , σc , σT : für die Covarianzkomponenten der Gruppe (a), Population (b) innerhalb der Populationen (c) und des Gesamtdatensatzes (T)

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die F-Statistik über die AMOVA mittels des Programms Arlequin v. 3.5.1.3 (Excoffier & Lischer 2010) abgleitet und die Signifikanz der Fixationsindizes mit einem nicht-parametrischen Permutationsverfahren basierend auf 1.000 Wiederholungen (Excoffier et al. 1992) überprüft.

Zur Abschätzung der paarweisen genetischen Differenzierung wurden zudem paarweise

FST-Werte zwischen Populationen mittels des Programms FSTAT v. 2.9.3.2 (Goudet 1995) kalkuliert. Zur Abschätzung der globalen genetischen Differenzierung über alle Populationen hinweg wurde neben Wright's FST, der ursprünglich für biallelische Loci entwickelt wurde,

Nei's GST für multiallelische Loci eingesetzt (Nei 1973). Beide Parameter setzen aber das IAM (’infinite alleles model’, Kimura & Crow 1964) voraus, das ursprünglich für Allozyme entwickelt wurde und daher die Mutationsprozesse von Mikrosatellitenmarkern nur bedingt wiedergeben kann (vgl. 2.3.1.1). Daher wurde als zusätzlicher Parameter Slatkins (1995) Rst berechnet, der explizit auf dem SMM (’stepwise mutation model’, Kimura & Ohta 1978) beruht:

S−S R = W ST S

Hierbei bedeuten S: durchschnittliche quadrierte Differenz der Allelgrößen zwischen allen Allelpaaren und Sw: durchschnittliche Summe der quadrierten Differenzen der Allelgrößen innerhalb einer Population.

46 2. Material und Methoden

Alle Parameter wurden pro Locus und über alle Loci hinweg mittels FSTAT v. 2.9.3.2 (Goudet 1995) berechnet. Ein Vergleich der Werte erlaubt einen umfassenden Einblick in die genetische Differenzierung der Populationen einer Art.

2.8.7. Mantel-Test

Ein Mantel-Test (Mantel 1967) ermöglicht lineare Vergleiche zwischen den Elementen zweier Distanz-Matrizen (Mantel & Valand 1970) und wird seit seiner erstmaligen Verwendung für eine systematische Fragestellung (Sokal 1979) in der Populationsgenetik genutzt, um Korrelationen zwischen genetischer und geographischer Distanz abzuleiten. Im Rahmen dieser Statistik wird ein Kreuzprodukt zwischen den standardisierten Distanzen gebildet und durch die Anzahl der Distanzen in der oberen triangularen Matrix minus eins geteilt. Der resultierende Korrelationskoeffizient r kann Werte zwischen -1 und +1 einnehmen (Legendre & Fortin 2010). Über einen solchen Test lässt sich abschätzen, ob der untersuchte Datensatz einem 'isolation by distance'-Muster (IBD, Wright 1938, 1940) unterliegt, also der Abnahme genetischer Ähnlichkeit mit zunehmender räumlicher Distanz (Jensen et al. 2005). Für diese Analyse wurden geographische Distanzen aus den GPS-Koordinaten der Fundorte mit dem Programm GeographicDistanceMatrixGenerator v. 1.2.3 (Ersts 2014) ermittelt und mit den genetischen Distanzen DA (Nei et al. 1983) in der webbasierten Applikation IBDWS v. 3.2.3 (Jensen et al. 2005) einem Mantel-Test auf Basis nicht logarithmierter Daten unterzogen.

2.9. Phylogeographische Auswertung der plastidären Mikrosatellitenmarker

Netzwerke bieten im Gegensatz zu Stammbäumen die Möglichkeit, Haplotypen nicht nur an den Astenden, sondern auch in internen Positionen an Knoten darzustellen (Posada & Crandall 2001). Zudem ermöglichen Haplotypen-Netzwerke eine direkte Visualisierung der Anzahl an Mutationen zwischen zwei Taxa. Die tatsächlich im Datensatz auftretende Haplotypen werden üblicherweise durch große Kreise symbolisiert, jeder Mutationsschritt zwischen zwei Haplotypen als Linie. Ist ein interner Knoten nicht durch einen Haplotypen besetzt, wird dieser durch einen kleinen schwarzen Kreis dargestellt. Widersprüche im Datensatz, die auf Homoplasie hinweisen können, werden als alternative Verbindungen oder Schleifen dargestellt. Im ersten Schritt der phylogeographischen Auswertung wurden die

47 2. Material und Methoden

Fragmentlängen der plastidären Mikrosatelliten als Sequenzen codiert. So wurden z. B. am Locus cpVm08 die Allele 182, 184 und 185 jeweils als A---, AAA- und AAAA codiert, wobei '-' als fehlende Position gewertet wird. Diese Pseudosequenzen wurden anschließend mittels des Programms TCS v. 1.2.1 (Clement et al. 2000) in ein Netzwerk nach dem Parsimonie- Prinzip umgesetzt.

48 3. Ergebnisse

3. Ergebnisse

3.1. DNA-Isolation

In Abb. 6 sind beispielhaft einige DNA-Proben dargestellt. die über verschiedene Isolationsprotokolle gewonnen wurden. Die höchste Qualität und Quantität zeigte das aus Frischmaterial mittels der Sorbitol-Variante der CTAB-Methode gewonnene, für die 454-Sequenzierung bestimmte DNA-Isolat (Abb. 6B). Die mittels der Standard-CTAB-Methode erhaltenen DNA-Isolate aus in Silicagel getrocknetem Frischmaterial wiesen ebenfalls durchweg eine hohe Qualität mit wenig niedermolekularen Bruchstücken sowie einen hohen DNA-Gehalt zwischen 10 und 200 ng/μl auf (Abb. 6A). Die DNA der über die Sorbitol-Methode aus Herbarproben erhaltenen DNA-Isolate enthielt hingegen auch niedermolekulare Bruchstücke (Abb. 6C). In einigen Fällen war die Ausbeute sehr gering und optisch nicht quantifizierbar, dennoch genügte sie zur Amplifikation plastidärer Mikrosatelliten (vgl. 3.5).

A: Standard-CTAB-Methode; DNA-Isolation aus getrocknetem Blattmaterial. B: Sorbitol-Variante der CTAB- Methode; DNA-Isolation aus frischem Blattmaterial. C: Sorbitol-Variante der CTAB-Methode; DNA-Isolation aus Herbarmaterial, λ: kommerziell erhältliche Referenz-DNA aus dem Phagen Lambda mit definierten Konzentrationen von 5 bis 100 ng/μl

49 3. Ergebnisse

3.2. Bioinformatische Verarbeitung von NGS-Daten zur Etablierung von Mikrosatellitenmarkern

3.2.1. Assemblierung der Rohsequenzen

Aus der Assemblierung der Vinca minor-cDNA-Sequenzen aus der Datenbank ergab sich eine Reduzierung von ursprünglich 723.230 Sequenzen mit einem Gesamtumfang von 387 Mbp auf 267.199 Unigenes mit einem Gesamtumfang von 267 Mbp. Die Unigenes unterteilten sich in 139.695 Contigs (hinterlegt im digitalen Anhang D1) und 127.524 nicht assemblierte Singletons (digitaler Anhang D2). Die Sequenzlängen der Unigenes variierten zwischen 50 und 3.918 bp (Tab. 7).

Der genomische Rohdatensatz der am MPI in Köln sequenzierten V. minor-Akzession umfasste 43.565 Sequenzen mit einem Gesamtumfang von 18 Mbp. Er reduzierte sich durch die Assemblierung auf 24.886 Unigenes mit einem Gesamtumfang von 13,7 Mbp. Die Unigenes unterteilten sich in 6.195 Contigs (digitaler Anhang D3) und 18.691 nicht assemblierte Singletons (digitaler Anhang D4). Die Sequenzlängen der Unigenes lagen zwischen 29 und 44.095 bp (Tab. 7).

Tabelle 7: Ergebnisse der Assemblierung der aus 454-Sequenzierungen von Vinca minor hervorgegangenen Sequenzen. Aufgeführt ist die Anzahl nicht assemblierter Sequenzen (Singletons), die Anzahl der aus homologen Sequenzen assemblierten Contigs und der Contigs mit >1.000 bp Länge, ihre minimale, durchschnittliche und maximale Sequenzlänge sowie die Gesamtsequenzlänge aller Singletons und Contigs.

cDNA (Transkriptom) Genom Art der Sequenz Singletons Contigs Contigs >1000 bp Singletons Contigs Contigs >1000 bp Anzahl 127.524 139.695 59.847 18.691 6.195 1.696 Minimallänge (bp) 50 59 1.000 29 32 1.000 Ø Länge (bp) 523 1.018 1.374 431 905 1.582 Maximallänge (bp) 1.200 3.918 3.918 802 44.095 44.095 Gesamtlänge (Mbp) 85 182 101 8,1 5,6 2,6

50 3. Ergebnisse

3.2.2. Identifizierung und Charakterisierung von Mikrosatelliten

Insgesamt wurden im assemblierten cDNA- bzw. Transkriptom-Datensatz 25.253 Mikro- satelliten mit den in 2.3.4.3 definierten Sucheinstellungen detektiert (140,42/Mb), im genomischen Datensatz waren es 1.371 (99,9/Mb) (Tab. 8).

Tabelle 8: Häufigkeit (absolut und prozentual) sowie Frequenz (pro Mbp) der über 454-Sequenzierung detektierten Mikrosatelliten, aufgeteilt nach der Länge der Wiederholungseinheiten.

Art der Wiederholungseinheit cDNA (Transkriptom) Genom (Mindestzahl an Wiederholungen) Anzahl % Frequenz/Mb Anzahl % Frequenz/Mb Mononukleotide (14) 13.632 54 75,74 554 40,4 40,02 Dinukleotide (7) 2.418 9,6 13,33 464 33,8 38,89 Trinukleotide (6) 4.101 16,2 22,77 204 14,9 14,93 Tetranukleotide (5) 2.512 9,9 13,83 29 2,1 2,12 Pentanukleotide (4) 1.725 6,8 9,95 72 5,3 5,34 Hexanukleotide (4) 865 3,4 4,8 48 3,5 3,44 Gesamt 25.253 100 140,42 1.371 100 99,9

Mononukleotidmotive stellten in beiden Datensätzen die häufigste Wiederholungseinheit dar (54 % bzw. 40,4 %), gefolgt von Trinukleotidmotiven (16,2 %) im Transkriptomdatensatz und Dinukleotidmotiven (33,8 %) im genomischen Datensatz.

Insgesamt wurden von den 501 nichtredundanten Kombinationsmöglichkeiten für Mono- bis Hexanukleotid-Mikrosatellitenmotive (Jurka & Pethiyagoda 1995) 210 unterschiedliche Motive im cDNA-Datensatz und 89 unterschiedliche Motive im genomischen Datensatz detektiert (Anhänge A5 und A6). In beiden Datensätzen stellte (A)n das häufigste individuelle Mikrosatellitenmotiv dar. Unter den Di- bis Hexanukleotid-Wiederholungseinheiten war im cDNA-Datensatz das Motiv (ACGT)n mit 1642 Loci das mit Abstand häufigste Motiv, gefolgt von (ACT)n, (AT)n und (AG)n mit 1283, 1152 und 1003 Loci (Anhang A5). Im genomischen

Datensatz waren die Motive (AT)n und (AG)n mit 207 bzw. 176 Loci am häufigsten vertreten, gefolgt von (AC)n und (AAT)n mit jeweils etwa 90 Loci (Anhang A6). Beide Datensätze enthielten insgesamt erheblich mehr AT- als GC-reiche Motive.

51 3. Ergebnisse

3.2.3. Primerdesign

Mikrosatelliten, die auf Mononukleotidwiederholungen basieren, werden aufgrund ihrer schwierigen Auswertbarkeit (vgl. u. a. Sun et al. 2006) selten für die Genotypisierung verwendet (Guichoux et al. 2011) und wurden auch in der vorliegenden Arbeit vom computerbasierten Primerdesign ausgeschlossen. Eine Ausnahme bilden nur plastidäre

Mikrosatelliten, wo das Motiv (A)n bzw. (T)n häufig den einzigen Wiederholungstyp darstellt.

Flankierende Sequenzen von zur Primersynthese ausreichender Länge waren innerhalb des cDNA (Transkriptom)-Datensatzes an 55 %, innerhalb des genomischen Datensatzes an 79 % der Mikrosatelliten-Loci mit zwei bis sechs Wiederholungseinheiten vorhanden. Die Effizienz des Primerdesigns in Bezug auf die einzelnen Typen von Mikrosatelliten- Wiederholungseinheiten ist in Tab. 9 zusammengefasst. Eine Auflistung aller generierten Primerpaare ist im digitalen Anhang D5 bis D10 zu finden. Aus den assemblierten cDNA-Daten wurden 60 Mikrosatellitenloci für nachfolgende Primertests (vgl. 3.3) ausgewählt, aus den Genom-Daten 35 Mikrosatellitenloci. Die Sequenzen der Primerpaare und ihre Charakteristika sind im Anhang A7 und A8 aufgelistet.

Tabelle 9: Absolute Zahlen und prozentualer Anteil der in den assemblierten Datensätzen detektierten Mikrosatellitenloci, für die Primer entworfen werden konnten. Der prozentuale Anteil bezieht sich jeweils auf die Gesamtzahl der Di- bis Hexanukleotid-Wiederholungseinheiten.

Art der Wiederholungseinheit cDNA (Transkriptom) Genom Mononukleotid n.d. n.d. Dinukleotid 1.404 (58 %) 346 (74 %) Trinukleotid 2.803 (68 %) 182 (89,2 %) Tetranukleotid 827 (33,9 %) 24 (82,8 %) Pentanukleotid 811 (32,3 %) 67 (93,1 %) Hexanukleotid 590 (68,2 %) 25 (53,1 %) Gesamt 6.435 (55 %) 644 (78,8 %)

3.2.4. Rekonstruktion des Plastoms und Suche nach plastidären Mikrosatelliten

Der Abgleich mit dem vollständig sequenzierten Coffea arabica-Plastom ergab, dass 1.740 Sequenzen (4 %) aus dem genomischen 454-Datensatz von V. minor plastidären Ursprungs sind. Diese konnten zu 64 Contigs und zehn Singeltons zusammengefasst werden (digitaler Anhang D10). Mit 114.370 bp Gesamtlänge deckten diese 73,7 % des C. arabica-

Plastoms ab (Abb. 7). Die Sequenzen plastidären Ursprungs aus V. minor enthielten 17 (A/T)n-

52 3. Ergebnisse

Mikrosatelliten mit einer Mindestlänge von zehn Basenpaaren. Für 14 dieser Loci konnten flankierende Primer entworfen werden (cpVm-Loci, Abb. 7, Anhang A13).

53 3. Ergebnisse 3. Ergebnisse

3.3. Primertests

3.3.1. Primertests für Mikrosatellitenloci aus NGS-Daten

3.3.1.1. Mikrosatellitenloci aus dem Kerngenom

60 bzw. 35 Mikrosatellitenloci wurden aus den assemblierten cDNA (Transkriptom)- und Genom-Daten ausgewählt (vgl. Anhang A7 und A8) und auf ihre Funktionalität in V. minor in Agarose- und hochauflösenden Polyacrylamid-Gelen überprüft. Für die aus den cDNA-Daten generierten Primerpaare stand keine Positivkontrolle zur Verfügung (Pflanzenset 1, siehe 2.1.1). Für die Loci aus dem genomischen Daten wurde die DNA der V. minor-Akzession KS_VM454_01 als Positivkontrolle eingesetzt (Pflanzenset 2, siehe 2.1.1).

Die Ergebnisse der Tests für alle 95 Primerpaare sind im Anhang A9 bis A12 dargestellt. Für 31 Primerpaare aus dem cDNA-Datensatz (52 %) sowie für sieben Primerpaare aus dem genomischen Datensatz (20 %) konnte mit keiner der Testpflanzen ein Amplifikat nachgewiesen werden. 17 Primerpaare aus dem cDNA-Datensatz (28 %) und elf Primerpaare aus dem genomischen Datensatz (31 %) wiesen unspezifische Bandenmuster auf Agarose- oder PAA-Gelen auf. 12 Primerpaare aus dem cDNA-Datensatz (20 %) und 17 Primerpaare aus dem genomischen Datensatz (49 %) generierten sowohl in Agarose- als auch in PAA- Gelen distinkte Einzelbanden für die getesteten V. minor-Individuen in den Probensets. Alle ngVm-Loci, die mit der Positivkontrolle ein Amplifikat erzeugten, amplifizierten auch die übrigen V. minor-Akzessionen. An jeweils neun (15 % bzw. 26 %) der getesteten Loci aus beiden Datensätzen traten auf Polyacrylamidgelen Fragmentlängenunterschiede zwischen den beiden V. minor-Proben im Probenset auf. Die Ergebnisse der Primertests sind in Tab. 10 zusammengefasst.

Da Macaranga gigantea und M. pearsonii (Euphorbiaceae) gemeinsam mit der V. minor- Akzession der Multiplex-454-Sequenzierung unterzogen wurden, wurden die DNA-Isolate dieser beiden Akzessionen in den Primertests der ngVm-Loci als Negativkontrollen eingesetzt. Keiner der ngVm-Primerpaare ergab ein Amplifikat in den Negativkontrollen.

Die 18 potentiellen Kandidaten wurden in einem größeren Testset auf ihre Eignung für populationsgenetische Fragestellungen hin getestet und sieben aufgrund des hohen Polymorphiegrades für die Hauptuntersuchung ausgewählt.

55 3. Ergebnisse

Tabelle 10: Ergebnisse der Primertests für nukleäre Mikrosatellitenloci auf Agarose- und PAA-Gelen. Vimi: Loci aus dem cDNA-Datensatz, ngVm: Loci aus dem genomischen Datensatz; Bedeutung der Symbole: -- keine Amplifikation, + distinkte Bande, (+) monomorph, (-) unspezifische Banden/Fragment zu lang/nicht auswertbar, (D) Doppelbande, ++ variabel innerhalb von V. minor.

Locus Summe Agarose-Gel (0,8%ig) PAA-Gel (6%ig) Vimi 1 bis 3, 6 bis 18, 21 bis 24, 28, 30, 37, 38, 45, 50 bis 52, 56, 59, 60 31 -- n.d. ngVm 1, 2, 10, 19, 20, 27, 35 7 Vimi 4, 5, 31, 32, 40, 42, 46, 48, 49, 54, 55, 57, 58 13 (-) n.d. ngVm 3, 6, 9 3

Vimi 19, 20 2 (D) (-) ngVm 12,13 2 Vimi 29, 41 2 + -- ngVm 4, 8, 14, 17, 30, 29 6 + (-) Vimi 35, 36, 44 3 + (+) ngVm 16, 18, 22, 23, 25, 28, 31, 32 8 Vimi 25, 26, 27, 33, 34, 39, 43, 47, 53 9 + ++ ngVm 5, 7, 11, 15, 21, 24, 26, 33, 34 9

3.3.1.2. Zwischenartliche Übertragbarkeit

Alle Mikrosatellitenloci, die in V. minor ein distinktes Amplifikat lieferten, wurden auch auf ihre Übertragbarkeit auf Akzessionen weiterer Vinca-Arten getestet, die Mikrosatellitenmarker aus dem cDNA-Datensatz zudem in Catharanthus roseus (vgl. Tab. 3 in Abschnitt 2.1.1). Die Ergebnisse sind in Tab. 11 zusammengefasst; die zugehörigen Gelbilder finden sich im Anhang A9 bis A12 und A25. Sieben der Loci aus dem cDNA-Datensatz und fünf Loci aus den genomischen Sequenzen zeigten ein Amplifikat auf Agarose- und PAA-Gelen in V. major, sieben bzw. drei Loci in V. herbacea, sechs bzw. vier Primerpaare in V. difformis. Sechs der getesteten Vimi-Loci zeigten auf Agarosegelen ein Amplifikat in Catharanthus roseus.

56 3. Ergebnisse

Tabelle 11: Interspezifische Übertragbarkeit der nukleären Mikrosatelliten-Loci aus Vinca minor auf drei weitere Arten der Gattung Vinca sowie auf Catharanthus roseus aus dem Vinceae-Clade. Catharanthus roseus wurde nur auf Agarosegelen getestet; +: distinkte Bande, -: kein Amplifikat; nb: nicht bestimmt.

Locus V. major V. herbacea V. difformis C. roseus Vimi25 + + + - Vimi33 + + - + Vimi34 + + + + Vimi35 + + + + Vimi36 + + + - Vimi39 + + + - Vimi41 - - - + Vimi43 + + + + Vimi47 - - - + ngVm04 + - - nb ngVm05 + - + nb ngVm17 + + + nb ngVm21 - + - nb ngVm29 + - + nb ngVm32 + + + nb

3.3.2. Mikrosatellitenloci aus dem Plastom

Die Ergebnisse der Primertests für die plastidären Primerpaare aus der 454-Sequenzierung sind in Tabelle 12 zusammengestellt; die Gelbilder finden sich im Anhang unter A14 und A15. Zwölf der vierzehn getesteten Primerpaare generierten sowohl in den drei getesteten V. minor-Akzessionen, als auch in einer V. major-Akzession aus Pflanzenset 3 (siehe 2.1.1) Amplifikate. Vier Loci (cpVm05, 07, 09, 11) generierten zudem in Macaranga gigantea und M. pearsonii distinkte Banden. Vier der Loci (cpVm01, 04, 07, 08) wiesen auf Polyacrylamidgelen Fragmentlängenunterschiede zwischen den einzelnen V. minor-Akzes- sionen auf und wurden daher im Rahmen der weiteren Analysen eingesetzt.

57 3. Ergebnisse

Tabelle 12: Funktionalität der plastidären Mikrosatellitenloci in drei Akzessionen von Vinca minor und Übertragbarkeit auf V. major, Macaranga gigantea und M. pearsonii. Die +: distinkte Bande, (+): unspezifisches Bandenmuster, -: kein Amplifikat. Macaranga gigantea und M. pearsonii wurden nur auf Agarosegelen getestet.

Locus V. minor V. major M. gigantea M. pearsonii cpVm01 + + - - cpVm02 + + (+) (+) cpVm03 + + (+) (+) cpVm04 + + (+) (+) cpVm05 + + + + cpVm06 + + (+) - cpVm07 + + + + cpVm08 + + - - cpVm09 + + + + cpVm10 - - - - cpVm11 + + + + cpVm12 + + - - cpVm13 - - - - cpVm14 + + - -

3.3.3. Universelle Primer für plastidäre Mikrosatelliten (ccmps)

Von den zehn verfügbaren universellen Primerpaaren für plastidäre Mikrosatelliten (ccmp1 bis ccmp10; Weising & Gardner 1999) erzeugten sieben in allen getesteten Akzessionen von V. minor und in V. major aus Set 4 (siehe 2.1.1) Amplifikate. Zwei der Loci (ccmp2 und 3) wiesen auf Polyacrylamidgelen Fragmentlängenunterschiede zwischen den V. minor- Akzessionen auf und wurden daher für die weiteren Untersuchungen eingesetzt. Die Gelbilder finden sich im Anhang A16 und A17.

58 3. Ergebnisse

3.4. Populationsgenetische Auswertung von Vinca minor

Ein zentraler Aspekt der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der genetischen Diversität, der genetischen Struktur und der Klonalität von Vinca minor in Mitteleuropa im Vergleich zu den natürlichen Verbreitungsgebieten südlich der Alpen und südwestlich der Alpen. Als Vergleichsproben wurden ferner drei Populationen aus Nordamerika mit in die Studie aufgenommen. Für die Untersuchungen standen damit insgesamt 949 Pflanzenproben aus 70 Freilandpopulationen zur Verfügung. Zusätzlich wurden 18 Cultivare in die Untersuchung mit einbezogen (zu Fundortangaben der Freilandproben vgl. Abb. 4 in Abschnitt 2.1.2 und Anhang A1). Von 95 getesteten nukleären Mikrosatellitenmarkern erwiesen sich 18 als robust und innerhalb von V. minor als polymorph (vgl. Abschnitt 3.3). Nach Maßgabe ihrer Variabilität wurden daraus sieben Marker ausgewählt und zur Genotypisierung des gesamten Pflanzenmaterials eingesetzt. Fünf dieser Marker stammen aus dem cDNA-Datensatz (Vimi25, 27, 34, 43 und 53) und zwei aus dem genomischen Datensatz (ngVm24 und ngVm26). Ihre Charakteristika sind in Tab. 13 zusammengefasst.

Tabelle 13: Eigenschaften der sieben für die populationsgenetischen Analyse von V. minor selektierten nukleären Mikrosatellitenloci aus dem cDNA- (Vimi) und dem genomischen Datensatz (ngVm).

Angegeben sind die Primersequenzen in 5'-3'-Richtung, die spezifische Schmelztemperatur TM, die aus den cDNA- bzw. genomischen Sequenzdaten erwarteten Fragmentlängen der amplifizierten Mikrosatelliten in Basenpaaren (bp) sowie das flankierte Mikrosatelliten-Motiv. fw: Vorwärts-Primer, rev: Rückwarts-Primer. Die mit * bzw. ** markierten Primer wurden am 5'-Ende mit einer universellen M13-Sequenz versehen (Schuelke 2000); *: GTTGTAAAACGACGGCCAGT, **: CAGGAAACAGCTATGACC.

Erwartete Fragmentlänge Locus Primersequenz (5'-3') T (°C) Mikrosatelliten-Motiv M (bp) fw: * CCGTTTTCCTATTCATTTTCT 55 Vimi25 (TGT)14 133 rev: CCTGAACCTGGAATTAGAACT 55 fw: ACGTAGTATGGCTACTCGACA 55 Vimi27 (GTT)16 162 rev: ** AGCAGTGTCCTCCTCAGAT 55 fw: * TCTCATTTACTCCCAACCTTC 55 Vimi34 (TAT)14 163 rev: TTTGTGTCTGTAGCTTCTCG 56 fw: * GCTGCTTAGACTTCTGATTTC 54 Vimi43 (ATT)13 144 rev: GAGTCCCTGTTTCTGTTGAT 54 fw: ACACCTGAGAATAGAGGTTCC 55 Vimi53 (TC)19 162 rev: ** CCAAACCATTTCCATCTAAG 55 fw: * TTCAAGCCCTTCTATTCC 53 ngVm24 (CT)11 160 rev: TATATTCTGGACGGTGGAG 53 fw: ACGGCTATGCTACAGACAATA 55 ngVm26 (GA)11 130 rev: ** GAAGATAGAAATGGAGTGAGGT 54

59 3. Ergebnisse

3.4.1. Allelische Diversität

Die sieben nukleären Mikrosatellitenloci wiesen in den 70 untersuchten Populationen und den 18 Cultivaren (N=967) insgesamt 145 individuelle Allele mit unterschiedlichen Fragmentlängen auf (11 bis 28 Allele pro Locus, ø 20,4; Tab. 14). Für 140 dieser Allele lassen sich die Fragmentlängen als Folge von SSM ('slipped strand mispairing')-Mutationen des Mikrosatellitenmotivs interpretieren (vgl. 2.3.1.1). In fünf Fällen war der Längenunterschied zum nächsten Allel geringer als aufgrund des Wiederholungstyps des betreffenden Mikrosatelliten zu erwarten war, z. B. im Falle der Allele 157 und 158 am Dinukleotid-Repeat- Locus Vimi53 (Tab. 14). Solche Mutationen gehen auf Insertionen bzw. Deletionen einzelner Basen zurück.

Die Allelzahlen pro Population und Locus in vier Großregionen und den Cultivaren sind in den Tabellen 15 und 16 zusammengestellt, die Frequenzen der einzelnen Allele in den gleichen Regionen in Anhang A18. Sowohl hinsichtlich der Allelzahlen als auch ihrer Frequenzen ergaben sich für die verschiedenen geographischen Großräume deutliche Unterschiede. So lagen die gemittelten Allelzahlen über alle Loci hinweg für die 36 Populationen in Mitteleuropa inkl. der Alpen bei 12,9 (ø 1,84 pro Locus), für sechs Populationen westlich der Alpen bei 20,5 (ø 2,9 pro Locus), für die 25 Populationen südlich der Alpen bei 36,6 (ø 5,2 pro Locus). In den drei kanadischen Populationen traten hingegen insgesamt nur 12 Allele auf (ø 1,71 pro Locus). Die 18 Cultivare wiesen zusammen 49 Allele auf (ø 7 pro Locus). Die hohe allelische Diversität in den Proben aus der Großregion südlich der Alpen kommt auch darin zum Ausdruck, dass mehr als die Hälfte der detektierten Allele (51,7 %) exklusiv in dieser Region auftraten (in Tab. 14 in Fettdruck bzw. hellgrau unterlegt wiedergegeben). Ein privates Allel wurde in Proben der Population 40 (Vuache) westlich der Alpen festgestellt (in Tab. 14 unterstrichen bzw. mittelgrau unterlegt).

60 3. Ergebnisse

Tabelle 14: Zusammenstellung der Allele (Fragmentlängen der PCR-Produkte) an sieben nukleären Mikrosatellitenloci auf der Basis von 967 Vinca minor-Akzessionen. Fett bzw. hellgrau hervorgehoben: Allele, die nur in Populationen südlich der Alpen vorkommen. Unterstrichen bzw. mittelgrau: privates Allel, das nur in Population 40 (Vuache) westlich der Alpen vorkommt. Kursiv bzw. dunkelgrau: Allele, deren Größenunterschiede sich nicht auf SSM ('slipped strand mispairing')-Mutationen des Mikrosatellitenmotivs zurückführen lassen. Σ: Gesamtzahl der detektierten Allele pro Locus.

Vimi25 Vimi27 Vimi34 Vimi43 Vimi53 ngVm24 ngVm26 133 157 183 156 150 168 136 136 160 186 159 157 172 138 139 163 189 162 158 174 140 142 166 192 165 160 176 142 145 169 195 168 162 178 144 148 172 198 171 164 180 145 151 175 201 174 166 182 146 154 178 204 177 168 184 147 157 181 207 180 170 186 148 158 184 210 183 172 188 149 160 187 213 186 174 190 150 163 190 216 189 176 152 164 193 219 192 178 154 166 196 222 195 180 156 169 199 225 198 182 158 172 202 228 201 184 160 175 205 231 204 186 162 181 208 234 207 188 164 184 211 237 210 190 166 217 240 213 192 168 220 216 194 170 223 219 196 172 222 198 200 202 204 206 208

Σ 19 Σ 22 Σ 20 Σ 23 Σ 28 Σ 11 Σ 22

61 3. Ergebnisse

Tabelle 15: Allelzahlen pro Population und Locus in Populationen der Großregionen westlich (37 bis 42) und südlich der Alpen (43 bis 67).

Pop Vimi25 Vimi27 Vimi34 Vimi43 Vimi53 ngVm24 ngVm26 Alle Loci 37 2 2 2 2 2 1 1 12 38 2 2 2 2 2 1 1 12 39 2 2 2 3 2 1 2 14 40 5 6 6 7 5 4 7 40 41 2 4 3 6 4 2 3 24 42 4 2 3 5 2 2 3 21 ø 2,8 2,7 3 4,2 2,8 1,8 2,8 20,5 43 3 6 8 10 7 6 6 46 44 4 4 10 10 5 5 5 43 45 2 8 10 9 6 5 6 46 46 3 5 7 8 5 3 6 37 47 8 9 10 10 19 5 9 70 48 2 7 7 12 10 6 5 49 49 3 6 10 11 12 7 8 57 50 6 10 19 16 14 8 15 88 51 4 4 5 3 4 1 3 24 52 4 8 9 12 13 8 10 64 53 6 5 7 6 4 2 2 32 54 4 4 7 3 2 2 2 24 55 3 2 3 3 5 2 2 20 56 3 6 6 8 8 3 3 37 57 4 3 7 7 9 2 3 35 58 4 7 8 7 6 2 4 38 59 6 8 12 12 12 4 9 63 60 5 7 8 10 9 3 5 47 61 2 2 1 3 4 4 3 19 62 2 2 2 2 1 2 1 12 63 1 1 2 1 2 2 2 11 64 2 2 2 2 1 1 1 11 65 2 2 2 2 1 1 2 12 66 4 3 3 2 2 2 1 17 67 1 2 2 2 2 2 2 13 ø 3,5 4,9 6,7 6,8 6,5 3,5 4,6 36,6

62 3. Ergebnisse

Tabelle 16: Allelzahlen pro Population und Locus in der Großregion Mitteleuropa inkl. der Alpen (1 bis 36), in Nordamerika (68 bis 70) und in den 18 untersuchten Cultivaren.

Pop Vimi25 Vimi27 Vimi34 Vimi43 Vimi53 ngVm24 ngVm26 Alle Loci 1 2 2 2 2 2 1 1 12 2 2 2 2 2 2 2 2 14 3 2 2 2 2 2 2 2 14 4 2 2 2 2 2 2 2 14 5 2 2 2 2 2 2 2 14 6 2 2 2 2 2 2 2 14 7 1 1 1 1 1 1 1 7 8 1 1 1 1 1 1 1 7 9 2 1 2 2 2 1 1 11 10 2 2 2 2 2 2 2 14 11 1 1 1 1 1 1 1 7 12 2 2 2 2 2 2 2 14 13 2 2 2 2 2 2 2 14 14 2 2 2 2 2 2 2 14 15 1 1 1 1 1 1 1 7 16 1 1 1 1 1 1 1 7 17 2 1 2 2 2 2 1 12 18 2 1 2 2 2 2 1 12 19 2 1 2 2 2 2 1 12 20 2 1 2 2 2 2 1 12 21 2 1 2 2 2 2 1 12 22 2 2 2 2 2 1 1 12 23 2 2 2 2 2 1 1 12 24 2 1 2 2 2 2 1 12 25 2 1 2 2 2 2 1 12 26 2 2 2 2 1 1 2 12 27 2 2 2 2 2 2 2 14 28 2 2 2 2 2 2 2 14 29 2 2 2 2 2 2 1 13 30 2 2 2 2 1 1 2 12 31 2 2 2 2 2 1 1 12 32 2 2 2 2 2 1 1 12 33 2 1 2 2 2 2 1 12 34 3 5 4 4 4 2 2 24 35 4 3 3 4 4 3 2 23 36 4 4 4 3 3 2 3 23 ø 2 1,8 2 2 1,9 1,6 1,5 12,9 68 2 1 2 2 2 2 1 12 69 2 1 2 2 2 2 1 12 70 2 1 2 2 2 2 1 12 ø 2 1 2 2 2 2 1 12 Cultivare 6 7 7 10 7 4 8 49 (ø 7)

63 3. Ergebnisse

3.4.2. Nullallele

In 15 der 31 Populationen südlich oder westlich der Alpen ergaben sich an fünf Loci Hinweise auf das Auftreten von Nullallelen, in den meisten Fällen für den Locus ngVm26 (Tab. 17). In den 36 Populationen aus Mitteleuropa inkl. der Alpen sowie den drei Populationen aus Kanada ergaben sich keine solchen Hinweise. Die Loci Vimi43 und Vimi53 lieferten in keiner der Populationen Hinweise auf Nullallele und sind daher in Tab. 17 nicht aufgeführt.

Tabelle 17: Übersicht über das Auftreten von Nullallelen für die Loci Vimi25, 27 und 43 sowie ngVm24 und 26 in Vinca minor-Populationen westlich (40 und 42) und südlich der Alpen (44 bis 60).

Population Vimi25 Vimi27 Vimi34 ngVm24 ngVm26 40 x 42 x 43 x x 44 x 45 x x 46 x x 47 48 x x 49 x x x 50 x x 51 x 57 x 58 x 59 x 60 x

3.4.3. Genotypische und genetische Diversität

Die meisten Parameter zur Quantifizierung der genotypischen und genetischen Diversität der untersuchten V. minor-Populationen zeigten deutliche Unterschiede zwischen den natürlichen Verbreitungsgebieten südlich und westlich der Alpen auf der einen Seite und den anthropogen bedingten Arealen in Mitteleuropa inkl. der Alpen und Nordamerika auf der anderen Seite. Die beiden Großregionen werden daher in separaten Abschnitten behandelt. Traten mehrere Stichproben mit identischen Genotypen innerhalb der Populationen auf, wurden diese Dopplungen in die Analyse mit einbezogen.

64 3. Ergebnisse

3.4.3.1. Populationen südlich und westlich der Alpen

Die Parameter zur Charakterisierung der genotypischen und genetischen Diversität für die Populationen im natürlichen Verbreitungsgebiet von V. minor westlich (Populationen 37 bis 42) und südlich der Alpen (Populationen 43 bis 67) sind in Tab. 18 zusammengestellt.

Zur Bestimmung der genotypischen Diversität wurden über alle Loci hinweg die Anzahl an Multilocus-Genotypen G, die 'genotypic richness' R und Simpson's Diversität D* berechnet, zur Bestimmung der genetischen Diversität die durchschnittliche Allelzahl A, die 'allelic richness' RS, die Zahl der privaten Allele PA sowie die beobachtete Heterozygotie HO, die erwartete Heterozygotie HE und der Inzuchtkoeffizient FIS (vgl. 2.8.1 und 2.8.2). Die Werte für

HO, HE, FIS und 'allelic richness' für jeden einzelnen Locus finden sich im Anhang A19 bis A22. Zur Abschätzung der Klonalität in Populationen mit mindestens zwei Genotypen wurde darüber hinaus der standardisierte Korrelationskoeffizient rD zur Messung des Kopplungsungleichgewichtes berechnet (vgl. 2.8.2). Es wurden jeweils die Alleldaten aller Stichproben pro Population in die Analyse einbezogen.

Die Anzahl der Multilocus-Genotypen (MLG) in den Populationen westlich der Alpen reichte bei einer Stichprobenzahl von zehn bis 48 Akzessionen von eins bis 16; die Parameter für R und D* nahmen westlich der Alpen Werte von null bis 0,79 bzw. von null bis 0,97 ein (ø 0,39 bzw. 0,43). Von den 25 Populationen südlich der Alpen wiesen fünf einen einzigen MLG auf. In drei Populationen traten zwei MLGs auf, in einer Population drei MLGs, in allen anderen Populationen mindestens fünf MLGs, bis hin zu 18 MLGs in 18 Proben für Population 60 (Bovec) und 29 MLGs in 30 Proben für Population 50 (Gervasio). Die Werte für R und D* variierten entsprechend zwischen null und eins (ø 0,5 bzw. 0,7).

Die Werte für die durchschnittliche Allelzahl A und die 'allelic richness' RS reichten westlich der Alpen von 1,71 bis 5,71 bzw. von 1,71 bis 3,87 (ø 2,93 bzw. 2,38), südlich der Alpen von 1,57 bis 12,57 bzw. von 1,57 bis 4,92 (ø 5,2 bzw. 3,21). Es trat ein privates Allel westlich der Alpen in Pop 40 (Vuache) auf, südlich der Alpen wurden in 13 von 25 Populationen zwischen einem und vier privaten Allelen detektiert (eine Auflistung der privaten Allele findet sich im

Anhang A23). Beobachtete (HO) und erwartete Heterozygotie (HE) variierten westlich der Alpen von 0,47 bis 0,86 bzw. von 0,35 bis 0,72 (ø 0,72 bzw. 0,47), südlich der Alpen zwischen 0,54 und 0,86 bzw. von 0,29 und 0,79 (ø 0,67 bzw. 0,58). Der Wert für den

Inzuchtkoeffizienten FIS reichte westlich der Alpen von -1 bis +0,02 (ø -0,61) und südlich der

65 3. Ergebnisse

Alpen von -1 bis +0,16 (ø -0,24).

Von den 31 Populationen südlich und westlich der Alpen erwiesen sich mithin 21 als genetisch mehr oder weniger divers (G>5; R>0,11; D*>0,55; A>2). In den zehn verbleibenden Populationen traten in den Stichproben nur maximal drei Multilocus-Genotypen pro Population auf (G≤3; R≤0,11; D*≤0,55; A≤2), was für ein hohes Maß an Klonalität spricht. Der deutliche Heterozygotenüberschuss (FIS=-1) in den sieben Populationen (37, 38, 62 bis 65, 67), die nur einen einzigen Genotypen aufweisen (G=1, R=0, D*=0), unterstreicht die Signatur rein monoklonaler Bestände. Die Populationen 61 und 66 zeigen zwar keinen deutlichen

Heterozygotenüberschuss, die Anwesenheit von nur zwei Genotypen und ein hoher rD-Wert von 1 weisen aber auch hier auf ein hohes Maß an Klonalität hin. Umgekehrt belegen in den

Populationen 47, 49, 50, 59 und 60 alle Parameter (R >0,9, FIS>0, rD<0,1) eine weitgehend generative Reproduktion. In den übrigen, genetisch mäßig diversen Populationen weisen die Parameter auf eine Kombination von generativer und klonaler Reproduktion hin. So indizieren auch hier erhöhte Werte für den standardisierten Korrelationskoeffizienten rD und negative FIS-Werte ein hohes Ausmaß an Klonalität. Für neun Populationen (39, 42, 45, 49, 51, 52, 54, 57, 59) ergaben sich Hinweise auf somatische Mutationen. Hier unterschieden sich einzelne Genotypen innerhalb der Populationen nur durch einen Mutationsschritt eines Allels an einem der sieben Mikrosatellitenloci (vgl. 2.2 und Anhang A24).

66 3. Ergebnisse

Tabelle 18: Genotypische und genetische Diversität von Vinca minor-Populationen westlich (37 bis 42) sowie südlich der Alpen (43 bis 67). N: Stichprobenzahl, G: Anzahl an Multilocus-Genotypen, R: 'genotypic richness', D*: Simpson's Diversität, A: mittlere Allelzahl, PA: Zahl privater Allele, RS: 'allelic richness', HO: beobachtete Heterozygotie, HE: erwartete

Heterozygotie, FIS: Inzuchtkoeffizient, rD: standardisierter Korrelationskoeffizient, *: Hinweise auf somatische Mutationen; Minimalwerte sind hellgrau, Maximalwerte dunkelgrau unterlegt.

Nr. Population N G R D* A PA RS HO HE FIS rD 37 Noire 1 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

38 Maures 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

39 Noire 2* 10 3 0,1 0,57 2 - 1,95 0,86 0,44 -0,94 1

40 Vuache 20 16 0,79 0,97 5,71 1 3,87 0,72 0,72 0,02 0,13

41 Pomier* 10 8 0,77 0,93 3,43 - 2,88 0,83 0,57 -0,42 0,46

42 Le Petit Bois* 10 7 0,67 0,87 3 - 2,16 0,47 0,35 -0,29 0,24

ø Westlich der Alpen 11,7 5,83 0,39 0,43 2,93 - 2,38 0,72 0,47 -0,61 -

43 Mercurago 35 11 0,3 0,9 6,57 1 3,65 0,54 0,63 0,16 0,35

44 Ticino 13 7 0,5 0,9 6,14 - 4,24 0,77 0,75 0,02 0,49

45 Ginestre* 25 12 0,46 0,86 6,57 1 3,84 0,7 0,72 0,04 0,57

46 Carrega 10 7 0,66 0,93 5,29 2 3,76 0,67 0,67 0,05 0,19

47 Fontana 24 23 0,96 0,99 10 4 4,62 0,67 0,78 0,16 0,02

48 Milanese 48 11 0,21 0,77 7 1 3,68 0,73 0,71 -0,03 0,7

49 Croara* 30 28 0,93 0,99 8,14 2 4 0,62 0,69 0,11 0,05

50 Gervasio 30 29 0,97 0,99 12,57 3 4,92 0,71 0,79 0,11 0,01

51 Arvonchi* 26 6 0,2 0,56 3,43 1 2,48 0,58 0,45 -0,28 0,62

52 Vallone* 28 21 0,74 0,96 9 3 4,27 0,74 0,7 -0,04 0,4

53 N Porton 10 6 0,56 0,78 4,57 - 3,05 0,67 0,56 -0,14 0,53

54 S Porton* 10 8 0,78 0,96 3,43 - 2,57 0,7 0,47 -0,44 0,33

55 Nova Gorica 10 5 0,44 0,67 2,86 - 2,48 0,74 0,51 -0,4 0,31

56 Zagomila 1 9 7 0,75 0,92 5,3 - 3,81 0,65 0,65 0,05 0,35

57 Zagomila 2* 9 8 0,86 0,97 5 - 3,66 0,68 0,67 0,04 0,26

58 Rocinj 10 9 0,88 0,98 5,4 - 3,69 0,64 0,64 0,05 0,15

59 Kozlov* 25 24 0,96 0,99 9 2 4,14 0,64 0,7 0,11 0,03

60 Bovec 18 18 1 1 6,71 4 4,02 0,65 0,72 0,12 0,06

61 Brabbia 12 2 0,09 0,5 2,71 1 2,55 0,76 0,51 -0,47 1

62 Agognate 13 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

63 Sta. Franca 5 1 0 0 1,57 - 1,57 0,57 0,29 -1 -

64 Carfalo 10 1 0 0 1,57 - 1,57 0,57 0,29 -1 -

65 Castelfidardo 39 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

66 Boymont 10 2 0,11 0,55 2,43 - 2,35 0,57 0,45 -0,23 1

67 Montalfina 28 1 0 0 1,86 1 1,86 0,86 0,43 -1 -

ø Südlich der Alpen 19,48 9,96 0,5 0,7 5,2 - 3,21 0,67 0,58 -0,24 -

67 3. Ergebnisse

3.4.3.2. Populationen in Mitteleuropa inkl. der Alpen und in Nordamerika

Die Parameter zur Charakterisierung der genotypischen und genetischen Diversität für die Populationen im anthropogen bedingten Verbreitungsgebiet von V. minor in Mitteleuropa inkl. der Alpen (Populationen 1 bis 36) und in Nordamerika (Populationen 68 bis 70) sind in Tab. 19 dargestellt. Exemplarische Mikrosatellitenprofile, die die allelische Diversität in den verschiedenen Großräumen illustrieren, finden sich in Abb. 8.

In Mitteleuropa inkl. der Alpen lagen alle Diversitätsparameter insgesamt deutlich niedriger als im natürlichen Verbreitungsgebiet und variierten auch zwischen den verschiedenen Populationen nur wenig. So wurden in vier bis 29 Stichproben von 36 Populationen nur maximal drei verschiedene MLGs pro Population ermittelt (G von 1 bis 3; ø 1,19). Die Werte für R reichten entsprechend von null bis 0,11 (ø 0,01), für D* von null bis 0,57 (ø 0,06), für A von 1,57 bis 3,29 (ø 1,83), für RS von 1,57 bis 3,12 (ø 1,8), für HO von 0,57 bis 1 (ø 0,71), für HE von 0,28 bis 0,68 (ø 0,38), und für FIS von -1 bis -0,18 (ø -0,93). In Nordamerika ergab sich über alle Diversitätsparameter hinweg gar keine Variation. Zudem wurden in keiner der mitteleuropäischen und nordamerikanischen Populationen private Allele detektiert.

Für 30 der 36 in Mitteleuropa inkl. der Alpen gesammelten Populationen wurde in allen Proben nur ein einziger Genotyp detektiert, fünf Populationen (31 bis 34, 36) enthielten zwei und nur eine Population (35, Sutschketal) drei Genotypen. Die aus nur einem Genotyp (G=1, R=0, D*=0) bestehenden Populationen wiesen außerdem einen deutlichen Heterozygo- tenüberschuss auf (FIS=-1), was auf Monoklonalität hinweist. Das gleiche, rein klonale Muster zeigen auch die drei kanadischen Populationen. In drei mitteleuropäischen Populationen (31 bis 33) wurde in einzelnen Proben ein Heterozygotiedefizit detektiert (siehe auch Abb. 8). Zusätzlich deuten die geringe klonale Diversität (G=2, R=0,11, D*=0,2), signifikante Hinweise auf ein Kopplungsungleichgewicht (rD=1) sowie ein negativer Inzuchtkoeffizient (FIS=-0,91) auf eine - allerdings extrem seltene - Etablierung genetisch differenzierter Individuen durch intraklonale Inzucht hin.

68 3. Ergebnisse

Tabelle 19: Genotypische und genetische Diversität von Vinca minor-Populationen in Mitteleuropa inkl. der Alpen (1 bis 36) sowie in Nordamerika (68 bis 70). N: Stichprobenzahl, G: Anzahl an Genotypen, R: 'genotypic richness', D*: Simpson's Diversität, A: Mittlere Allelzahl,

PA: Zahl privater Allele, RS: 'allelic richness', HO: beobachtete Heterozygotie, HE: erwartete Heterozygotie,

FIS: Inzuchtkoeffizient, rD: standardisierter Korrelationskoeffizient. Minimalwerte sind hellgrau, Maximalwerte dunkelgrau unterlegt.

Nr. Population N G R D* A PA RS HO HE FIS rD 1 Röm. Tempel Koblenz 7 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

2 Wüstung Bad Emstal 5 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

3 Hünenburg 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

4 Schlachtfelder 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

5 Grab Bad Emstal 5 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

6 Cochem 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

7 Neandertal 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

8 Wüstung Elten 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

9 Römerkastell Saalburg 10 1 0 0 1,57 - 1,57 0,57 0,28 -1 -

10 Boyneburg 8 1 0 0 1,57 - 1,57 0,57 0,28 -1 -

11 Burgruine Falkenstein 4 1 0 0 1,57 - 1,57 0,57 0,28 -1 -

12 Malsburg 8 1 0 0 1,57 - 1,57 0,57 0,28 -1 -

13 Ebersburg 10 1 0 0 1,57 - 1,57 0,57 0,28 -1 -

14 Wüstung Schleesen 10 1 0 0 1,57 - 1,57 0,57 0,28 -1 -

15 Wüstung Schlierbach 29 1 0 0 1,57 - 1,57 0,57 0,28 -1 -

16 Röm. Tempel Bremm 10 1 0 0 1,57 - 1,57 0,57 0,28 -1 -

17 Emserberg 11 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

18 Müllerthal 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

19 Kollund 5 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

20 Humbeek 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

21 Ortholz 8 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

22 Vaduz 5 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

23 Burgruine Schenkenberg 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

24 Schorndorf 5 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

25 Château de la Soie 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

26 Burgruine Montfort 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

27 Kassel Radweg 6 1 0 0 2 - 1,71 1 0,5 -1 -

28 Ename 10 1 0 0 2 - 1,71 1 0,5 -1 -

29 Ötztal 10 1 0 0 1,86 - 1,86 0,86 0,43 -1 -

30 Burgruine Zelking 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

31 Weidelsburg 10 2 0,11 0,2 1,71 - 1,71 0,66 0,35 -0,84 1

32 Igelsburg 10 2 0,11 0,36 1,71 - 1,71 0,63 0,34 -0,78 1

33 Château de Hohenstein 10 2 0,08 0,15 1,71 - 1,71 0,68 0,36 -0,91 1

34 Rautal 12 2 0,09 0,55 3,29 - 3,12 0,79 0,64 -0,18 1

35 Sutschketal 21 3 0,1 0,57 3,29 - 3,09 0,8 0,68 -0,18 0,98

36 Hasbruch 24 2 0,04 0,5 3,29 - 3,07 0,94 0,66 -0,41 1

ø Mitteleuropa inkl. Alpen 10,1 1,19 0,01 0,06 1,83 - 1,8 0,71 0,38 -0,93 -

68 Sault Ste. Marie 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

69 Riverwood Conservancy 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

70 Rattray Marsh 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

ø Nordamerika 10 1 0 0 1,71 - 1,71 0,71 0,36 -1 -

69

übrigen Proben der Population an diesem Locus homozygot.

Die Population 35 (Sutschketal) stellt in mehrerer Hinsicht eine Besonderheit dar. Zum einen handelt es sich um die einzige mitteleuropäische Population mit drei Multilocus-Genotypen. Zum anderen traten hier zwei Morphotypen mit unterschiedlichen Blütenfarben auf, die sich in der genetischen Analyse in unterschiedlichen Multilocus-Genotypen manifestierten. Der dritte Genotyp weist eine Allelverteilung auf, die einen hybridogenen Ursprung durch sexuelle Rekombination der beiden anderen Genotypen vom gleichen Standort nahelegt (Abb. 9). Da die Pflanze zur Zeit der Probennahme keine Blüte aufwies, ist nicht bekannt, ob ihr Phänotyp intermediär oder mit einer der Elternpflanze identisch ist. Diese Population trägt somit die Merkmale klonaler Populationen mit sehr geringen Raten sexueller

Reproduktion (G=3, R=0,2, D*=0,64, rD=1, FIS=-0,17). In den Populationen 34 and 36 hingegen fehlten solche Hybriden, obwohl auch hier zwei Blüten-Varietäten (blauer Wildtyp und rötlichtviolette oder rötlichtviolett-gefüllte Varietät) mit unterschiedlichen MLGs auftraten.

70 3. Ergebnisse

entstandenen hybriden Pflanze dargestellt, eine Negativkontrolle und eine nicht belegte Spur. S: Längenstandard. Die dunklen Banden stellen jeweils die Hauptbanden und somit die eigentlichen Allele dar. Zusätzliche graue Banden stellen Stotterbanden dar, die bei der PCR von Mikrosatelliten typischerweise auftreten. Die 'Tochterpflanze' trägt immer je ein Allel der 'Elternpflanzen'.

3.4.4. Genetische Struktur

In Abschnitt 3.4.2 wurde für jede Population lediglich die Anzahl der Multilocus-Genotypen (MLGs) ermittelt, die sich aus der Kombination der spezifischen Alleldaten an sieben nukleären Mikrosatellitenloci ergaben (vgl. Spalte G in Tab. 18 und 19). Für die weiteren Analysen wurden die MLGs individuell definiert und ihre Verteilung auf die einzelnen Populationen und die Cultivare bestimmt. Die so erhaltenen Daten wurden verschiedenen Analysen (u. a. Neighbour-Joining und Bayes'sche Analyse) zur Ermittlung der genetischen Struktur von V. minor in den untersuchten Großräumen unterzogen.

3.4.4.1. Multilocus-Genotypen (MLG) und Multilocus-Linien (MLL)

Insgesamt wurden in den 967 untersuchten Akzessionen 310 verschiedene Multilocus- Genotypen (MLGs) detektiert. Davon kamen 233 MLGs jeweils nur in einer einzigen Pflanze vor, während die übrigen 77 als 'klonale' Genotypen in mehreren Akzessionen auftraten. Eine Übersicht über die quantitative Verteilung der MLGs über die geographischen Großregionen und die Cultivare ist in Tab. 20 dargestellt. Alle 310 ermittelten MLGs inkl. ihrer spezifischen Alleldaten sind im Anhang A24 aufgelistet. In den 362 Pflanzen aus 36 Populationen in Mitteleuropa inkl. der Alpen wurden insgesamt nur 18 MLGs ermittelt, in den 70 Pflanzen aus sechs Populationen westlich der Alpen 35 und in den 487 Pflanzen aus 25 Populationen

71 3. Ergebnisse südlich der Alpen 248. Alle 30 untersuchten Pflanzen aus drei Populationen in Kanada wiesen den gleichen MLG auf; in den 18 Cultivaren wurden insgesamt 13 verschiedene MLGs gefunden.

Tabelle 20: Übersicht über die Zahl der innerhalb der vier Großregionen und den Cultivaren auf Basis der Alleldaten an sieben nukleären Mikrosatellitenloci ermittelten Multilocus-Genotypen (MLGs). Neben der Stichprobenzahl N ist die Anzahl einzigartiger und in mehreren Proben detektierter MLGs angegeben.

N Anzahl detektierter MLGs MLGs in nur einer Probe MLGs in mehr als einer Probe Gesamt 967 310 232 77 Mitteleuropa 362 18 3 15 Westlich der Alpen 70 35 26 9 Südlich der Alpen 487 248 198 50 Kanada 30 1 1 1 Cultivare 18 13 8 5

Mittels des Programms MLGSim v. 2.0 (Stenberg et al. 2003) wurde in einer Simulation abgeschätzt, ob wiederkehrende MLGs das Resultat asexueller Reproduktion sind (vgl. 2.8.2).

-11 Aus der Simulation ergab sich der kritische Wert pSex ≤ 5,38 e unter dem Signifikanzlevel von 0,05. Nur die wiederholten MLG15 (spezifisch für Population 32; Burgruine Igelsburg,

Hessen) und 21 (spezfisch für die Cultivare 'White Power' und 'Alba' ) liegen mit p Sex-Werten von 1,52 e-12 bzw. 8,98 e-11 über dem kritischen Wert. Nur für diese beiden MLGs besteht damit eine gewisse Wahrscheinlichkeit, dass ihr wiederholtes Auftreten in unterschiedlichen

Stichproben unabhängig voneinander zufällig entstanden sind. Alle übrigen pSex-Werte liegen unter dem kritischen Wert und sind somit signifikant (Anhang A24). Das wiederholte Auftreten des gleichen MLG in mehreren Akzessionen und Populationen ist somit nicht auf mangelndes Auflösungsvermögen der verwendeten Marker zurückzuführen, sondern beruht auf asexueller, klonaler Repoduktion.

In allen Populationen südlich und westlich der Alpen war jeder Genotyp exklusiv einer einzelnen Population zugehörig. Nördlich und innerhalb der Alpen sowie in Kanada hingegen traten sieben Genotypen wiederholt an zwei bis neun Fundorten auf, die jeweils geographisch deutlich voneinander separiert waren (Tab. 21, Abb. 10). Als besonders weit verbreitet erwies sich MLG3, der sowohl in fünf mitteleuropäischen Populationen (17 bis 21) als auch in den drei nordamerikanischen Populationen (68 bis 70) vorkommt und dort der jeweils einzige Genotyp war.

MLG1 und 9 bzw. MLG2 und 10 unterschieden sich jeweils nur durch eine Längenänderung

72 3. Ergebnisse eines Allels an je einem Locus (Vimi53: 157→158 bzw. Vimi34: 210→213) und können daher nach Arnaud-Haond & Belkhir (2007) zu zwei klonalen Linien (MLL) zusammengefasst werden, die möglicherweise aufgrund somatischer Mutationen entstanden sind (vgl. 2.8.2). Eine Übersicht über die geographische Verteilung der MLGs und MLLs in Mitteleuropa gibt Abb. 10.

Fünf MLGs (MLG2, 4, 5, 7 und 8) traten sowohl in Akzessionen von Freilandpopulationen als auch in ein oder zwei Cultivaren auf. Außerdem wiesen dreimal jeweils zwei Cultivare trotz teilw. unterschiedlichem Habitus identische Genotypen auf: 'Azurea' und 'Acorea' (MLG19; blaue, gefüllte Blüten); 'Gertrude Jekyll' (weiße Blüten) und 'Marie'® (MLG20) sowie 'White Power' und 'Alba' (MLG21; weiße Blüten; vgl. Tab. 21).

73 3. Ergebnisse

Tabelle 21: Übersicht über die 26 in den Großregionen Mitteleuropa inkl. der Alpen (Population 1 bis 36) und Nordamerika (Population 68 bis 70) sowie in den Cultivaren auf Basis der Alleldaten an sieben nukleären Mikrosatellitenmarkern ermittelten Multilocus-Genotypen (MLG) und Multilocus-Linien (MLL). *: homozygote MLGs, R: rötlichviolette Blüten, G: gefüllte Blüten, W: weiße Blüten, H: Hybrid Population 35.

MLG Pop Cultivar N 1 (MLL1) 1 bis 7, 31, 32, 34 - 83 2 (MLL2) 9 bis 15 'Grüner Teppich' 74 3 17 bis 21, 68-70 - 74 4 24, 25, 33 'Hawaii'® 28 5 28,36 'Bowles Variety', 'Aureovariegata' 26 6 22, 23, 35 - 24 7 34 (R/G), 36 (R) Multiplex' (R/G), 'Atropurpurea' (R) 18 8 35 (R) 'Rubra' (R) 11 9 (MLL1) 8 - 10 10 (MLL2) 16 - 10 11 26 - 10 12 27 (W) - 6 13 29 - 10 14 30 - 10 15 32 (*) - 2 16 31 (*) - 1 17 33 (*) - 1 18 35 (H) - 1 19 - 'Azurea', 'Acorea' (G) 2 20 - 'Gertrude Jekyll' (W), 'Marie'® 2 21 - 'White Power', 'Alba' (W) 2 22 - 'Anna'® 1 23 - Sabinka' 1 24 - Argenteovariegata' 1 25 - Elisa'® (W) 1 26 - Josefine'® 1

74

3.Ergebnisse

3. Ergebnisse

3.4.4.2. Neighbour-Joining-Analyse auf Basis der genetischen Distanzen zwischen den individuellen Multilocus-Genotypen

Neighbour-Joining (NJ)-Analysen wurden sowohl auf der Basis von individuellen Multilocus- Genotypen (3.4.3.2) als auch populationsbasiert durchgeführt (3.4.3.3).

In Abb. 11 bzw. 12 ist das Dendrogramm aus einer klassischen NJ-Analyse unter Berücksichtigung aller 310 Multilocus-Genotypen wiedergegeben, in Abb. 13 ein auf dem gleichen Datensatz beruhendes Netzwerk (Neighbor-Net). In beiden Fällen basierten die Berechnungen auf Nei & Li's genetischen Distanzen (Nei & Li 1979), die über das Programm PAUP* v. 4.10 Beta (Swofford 2003) ermittelt wurden (zur Methodik vgl. 2.8.3). Für die Erstellung sowohl des NJ-Baums als auch des Neighbor-Net wurde das Programm SplitsTree v. 4.1.3.1 (Huson & Bryant 2006) verwendet, für den traditionellen NJ-Baum zusätzlich FigTree v. 1.4.2 (Rambaut 2006). Es wurden keine Bootstrap-Werte ermittelt.

Das NJ-Dendrogramm in Abb. 11 lässt sich in sieben Gruppen (A bis G) unterteilen.

Die Gruppen B, C und D enthalten ausschließlich MLGs, die Populationen südlich der Alpen zugehörig sind und weisen gemäß der hohen genetischen Diversität dieser Pflanzen ein komplexes Verzweigungsmuster auf. Auch in den Gruppen A, E und G dominieren die MLGs aus den Populationen südlich der Alpen (in Abb. 11 und folgenden Abbildungen rot markiert), während sie in Gruppe F nur vereinzelt auftreten. Der Großteil der MLGs aus Mitteleuropa inkl. der Alpen (grün markiert), der Cultivare (lila) sowie die MLGs aus der Region westlich der Alpen (blau) finden sich in Gruppe F wieder. Aus Mitteleuropa inkl. der Alpen treten nur MLG13 aus Population 29 (Ötztal) und MLG14 aus Population 30 (Burgruine Zelking) aus der Alpenregion in den Gruppen E bzw. G auf, von den Cultivaren MLG23 ('Sabinka') in Gruppe A. Die MLGs aus den Regionen südlich und westlich der Alpen gruppieren nur teilweise nach ihrer Populationszugehörigkeit.

Ein vergrößerter Ausschnitt der Gruppe F aus der MLG-basierten NJ-Analyse aus Abb. 11 ist in Abb. 12 dargestellt. Es ist keine klare Gruppierung der MLGs nach ihrer geographischen Herkunft erkennbar (vgl. auch Abb. 10). Die wiederholt an verschiedenen Populationen und Cultivaren ermittelten MLG1 bis 8 und MLG19 bis 21 sowie die in einzelnen Populationen und Cultivaren detektierten MLGs sind zusammen mit den MLGs aus der Region westlich der Alpen (blau markiert) sowie einzelnen MLGs aus den Populationen 46 (Carrega), 47 (Fontana), 52 (Rio Vallone) aus der Region südlich der Alpen (rot markiert) über die ganze

76 3. Ergebnisse

Gruppe F hinweg verteilt. Die MLG15, 16 und 17, die sich von den MLG1 und 4 durch ein Heterozygotiedefizit unterscheiden (vgl. 3.4.3.1), stehen in direkter Schwesterposition zu den MLGs, von denen sie sich ableiten. In den Populationen 34 bis 36 traten jeweils ein blaublühender und ein rötlichviolett- oder gefülltblühender Morphotyp auf, die sich auch genetisch unterschieden. Die MLG7 und 8 sowie 19 bilden eine gemeinsame Untergruppe. Sie sind den rötlichvioletten oder gefüllten Pflanzen aus den Populationen 34 bis 36 sowie diversen rötlichvioletten oder gefüllten Cultivaren zugeordnet. Die den blaublühenden Pflanzen aus den Populationen 34 bis 36 zugeordneten MLG1, 6 und 5 sowie der einer potentiellen Hybridpflanze in Population 35 (vgl. 3.4.3.1) zugeordnete MLG17 stehen von diesen separiert und bilden keine gemeinsame Untergruppe. Die Cultivare mit weißen Blüten (MLG20, 21, 25) sind in einer eigenen Untergruppe positioniert, der am Fundort 27 mit weißen Blüten (Alte Mühle bei Kassel) detektierte MLG12 steht aber von diesen getrennt.

Das Neighbour-Net in Abb. 13 wurde ebenfalls mit dem Programm SplitsTree v. 4.13.1 (Huson & Bryant 2006) auf der Basis der gleichen genetischen Distanzen (Nei & Li 1979) zwischen den einzelnen MLGs berechnet. Die zu den MLGs führenden terminalen Äste sind meist recht lang, während das zentrale Grundgerüst durch zahlreiche Parallelogramme charakterisiert ist. Die relative Position vieler individueller MLGs ist im Vergleich zum Dendrogramm in Abb. 11 verändert, die grundlegende Anordnung bleibt aber erhalten. Die MLGs aus der Region südlich der Alpen auf der einen Seite sind auch hier von den MLGs aus Mitteleuropa inkl. der Alpen, westlich der Alpen und den Cultivaren auf der anderen Seite deutlich getrennt (siehe auch die Ausschnittsvergrößerung in Abb. 14).

77 3. Ergebnisse

Abbildung 11: Neighbour Joining-Dendrogramm aller 310 im Datensatz detektierten Multilocus- Genotypen. Die NJ-Analyse basiert auf Nei & Li's genetischen Distanzen (Nei & Li 1979). Sie wurde mit dem Programm SplitsTree v. 4.13.1 (Huson & Bryant 2006) durchgeführt und das Dendrogramm mit FigTree v. 1.4.2 (Rambaut 2006) visualisiert. Am Ende jeden Astes stehen für jede Probe jeweils die Populationszugehörigkeit oder der Cultivarname und der Multilocus-Genotyp (Pop_MLG bzw. 'Cultivar'_MLG). Es ergeben sich sieben Gruppen A bis G. Populationen oder Cultivare mit identischen Multilocus-Genotypen sind als MLG1 bis 8 und 19 bis 21 zusammengefasst. *: homozygote MLGs, R: rötlichviolette Blüten, G: gefüllte Blüten, W: weiße Blüten, H: Hybrid Population 35. Farbcodierung: rot - südlich der Alpen, blau - westlich der Alpen, grün - Mitteleuropa inkl. der Alpen, gelb - Nordamerika, lila - Cultivare. Die Länge des Maßstabs entspricht einer genetischen Distanz von 0,07.

78 3. Ergebnisse

Abbildung 12: Ausschnitt der Gruppe F aus dem Neighbour Joining-Dendrogramm aus Abbildung 11. Die NJ-Analyse basiert auf Nei & Li's genetischen Distanzen (Nei & Li 1979). Sie wurde mit dem Programm SplitsTree v. 4.13.1 (Huson & Bryant 2006) durchgeführt und das Dendrogramm mit FigTree v. 1.4.2 (Rambaut 2006) visualisiert. Am Ende jeden Astes stehen für jede Probe jeweils die Populationszugehörigkeit oder der Cultivarname und der Multilocus-Genotyp (Pop_MLG bzw. 'Cultivar'_MLG). Populationen oder Cultivare mit identischen Multilocus-Genotypen sind als MLG1 bis 8 und 19 bis 21 zusammengefasst. *: homozygote MLGs, R: rötlichviolette Blüten, G: gefüllte Blüten, W: weiße Blüten, H: Hybrid Population 35. Farbcodierung: rot - südlich der Alpen, blau - westlich der Alpen, grün - Mitteleuropa inkl. der Alpen, gelb - Nordamerika, lila - Cultivare. Die Länge des Maßstabs entspricht einer genetischen Distanz von 0,07.

79 3. Ergebnisse

Abbildung 13: Neighbour-Net aller 310 im Datensatz detektierten Multilocus-Genotypen. Die NJ-Analyse basiert auf Nei & Li's genetischen Distanzen (Nei & Li 1979). Sie wurde mit dem Programm SplitsTree v. 4.13.1 (Huson & Bryant 2006) durchgeführt. Am Ende jeden Astes stehen für jede Probe jeweils die Populationszugehörigkeit oder der Cultivarname und der Multilocus-Genotyp (Pop_MLG bzw. 'Cultivar'_MLG). Populationen oder Cultivare mit identischen Multilocus-Genotypen sind als MLG1 bis 8 und 19 bis 21 zusammengefasst (Legende siehe Box in Abb. 14). *: homozygote MLGs, R: rötlichviolette Blüten, G: gefüllte Blüten, W: weiße Blüten, H: Hybrid Population 35. Farbcodierung: rot - südlich der Alpen, blau - westlich der Alpen, grün - Mitteleuropa inkl. der Alpen, gelb - Nordamerika, lila - Cultivare. Die Länge des Maßstabs entspricht einer genetischen Distanz von 0,1.

80 3. Ergebnisse

Abbildung 14: Ausschnitt aus dem Neighbour Joining-Dendrogramm aus Abbildung 13. Die NJ-Analyse basiert auf Nei & Li's genetischen Distanzen (Nei & Li 1979). Sie wurde mit dem Programm SplitsTree v. 4.13.1 (Huson & Bryant 2006) durchgeführt. Am Ende jeden Astes stehen für jede Probe jeweils die Populationszugehörigkeit oder der Cultivarname und der Multilocus-Genotyp (Pop_MLG bzw. 'Cultivar'_MLG). Am Ende jeden Astes steht jeweils die Populationszugehörigkeit, der Cultivarname oder die MLG-Nummer nach Tab. 21. Populationen oder Cultivare mit identischen Multilocus-Genotypen sind als MLG1 bis 8, 19, 20 und 21 zusammengefasst und in der Box in der rechten oberen Hälfte der Abbildung näher aufgeschlüsselt. *: homozygote MLGs, R: rötlichviolette Blüten, G: gefüllte Blüten, W: weiße Blüten, H: Hybrid Population 35. Farbcodierung: rot - südlich der Alpen, blau - westlich der Alpen, grün - Mitteleuropa inkl. der Alpen, gelb - Nordamerika, lila - Cultivare. Die Länge des Maßstabs entspricht einer genetischen Distanz von 0,1.

81 3. Ergebnisse

3.4.4.3. Neighbour Joining-Analyse auf Basis genetischer Distanzen zwischen Populationen

Mikrosatellitenmarker bergen ein Homoplasierisiko, d. h., sich ähnelnde Genotypen können durch parallele, voneinander unabhängige Mutationen entstanden sein. Deshalb wurde die Neighbour Joining-Analyse nicht nur für die einzelnen Genotypen, sondern auch basierend auf genetischen Distanzen zwischen den pro Fundort bzw. Population detektierten MLGs errechnet. Das führt in der Regel zu homogeneren und übersichtlicheren Topologien. Lediglich bei den Populationen 34 bis 35 (Rautal, Sutschketal, Hasbruch) wurden die Distanzen für jeden der zwei bzw. drei MLGs separat berechnet, da die verschiedenen MLGs mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht auf natürlicher Populationsdynamik beruhen. Da zwischen den MLGs, die jeweils Pflanzen mit unterschiedlichen Blütenfarben zugeordnet sind, eine erhebliche genetische Distanz liegt (vgl. 3.4.3.2), gehen diese Populationen vermutlich stattdessen auf Anpflanzung von Pflanzen aus unterschiedlichen Ursprungspopulationen zurück.

Die Ergebnisse der auf den genetischen Distanzen DA (Nei et al. 1983) zwischen den Populationen basierenden, mit dem Programm TreeFit (Kalinowski 2009) durchgeführten Standard-NJ-Analyse sind in Abb. 15 dargestellt, das über eine Kombination aus den Programmen Populations v. 1.2.31 (Langella 1999) und SplitsTree v. 4.13.1 (Huson & Bryant 2006) berechnete Neighbour-Net in Abb. 16.

Das Dendrogramm lässt sich grob in sechs jeweils monophyletische Gruppen unterteilen, die in Abb. 15 mit römischen Ziffern I bis VI bezeichnet werden. Der Großteil der Populationen südlich der Alpen findet sich in den Gruppen I bis III wieder, die auch insgesamt nah zusammen gruppieren.

Die Gruppe I enthält die biklonale Population 61 aus Norditalien (Palude Brabbia) sowie die monoklonale Population 63 (Santa Franca) und die genetisch diverse Population 46 (Carrega), beide vom Nordrand des Appenin, sowie den Cultivar 'Sabinka', der sich bereits in der MLG-basierten NJ-Analyse inmitten der italienischen Proben anordnete.

Gruppe II fasst die ausschließlich italienischen, genetisch diversen Populationen 43 bis 45, 47 bis 50 und 52 zusammen.

Gruppe III besteht aus den kroatischen und slowenischen Populationen 53 bis 60, einer ost- italienischen Population (62, Arvonchi) sowie einer Population aus der Umgebung einer

82 3. Ergebnisse

Burgruine östlich von Wien (30, Burgruine Zelking), die auch schon in der MLG-basierten NJ- Analyse in Abb. 11 inmitten der Proben aus der Region südlich der Alpen gruppierte.

Gruppe IV umfasst elf Populationen aus Mitteleuropa und den Alpen, je zwei Populationen aus Italien und der Region westlich der Alpen sowie sechs Cultivare. Die Gruppe enthält mit MLG19 (Cultivare 'Azurea' und 'Acorea'), MLG7 (gefüllt- bzw. rötlichviolettblühende Pflanzen aus Population 34, Rautal, und Population 36, Hasbruch; Cultivare 'Multiplex' und 'Atropurpurea') und MLG 8 (rötlichviolettblühende Pflanzen aus Population 35, Sutschketal; Cultivar 'Rubra') alle Populationen und Cultivare mit rot- und gefülltblühenden Blüten. MLG8 befindet sich aber im Unterschied zum MLG-basierten NJ-Dendrogramm in Abb. 11 von MLG7 und 19 isoliert. Innerhalb von Gruppe IV befinden sich auch die biklonale Population 66 (Boymont) und die monoklonale Population 67 (Montalfina), die beide aus der direkten Umgebung italienischer Burgruinen stammen.

Gruppe V enthält neben dem Cultivar 'Gertrude Jekyll' ausschließlich Cultivare aus dem Zuchtprogramm von Herbert Menke ('Marie'®, 'Anna'®, 'Josefine'® und 'Elisa'®).

Gruppe VI ist die größte Gruppierung. Sie umfasst neben 28 Populationen aus Mitteleuropa inkl. der Alpen drei Populationen aus Nordamerika, vier aus der Region westlich der Alpen, zwei Populationen aus Mittelitalien und sechs Cultivare. Wie in Gruppe IV sind auch in Gruppe VI einige mitteleuropäische Populationen, die drei nordamerikanischen Populationen und fünf Cultivare aufgrund identischer Multilocus-Genotypen zusammengefasst (MLG1 bis 3, 5, 21). Hier sind u. a. die Populationen 31 (Weidelsburg) und 32 (Igelsburg), die neben Pflanzen mit MLG1 auch Pflanzen mit von diesem abgeleiteten, an mehreren Mikrosatellitenloci homozygoten MLG enthielten, und Population 8 (Röm. Höhentempel Bremm, MLL1, vgl. 3.4.3.1) positioniert. Auch die monoklonalen Populationen 64 (Carfalo) und 65 (Castelfidardo) aus Mittelitalien sind in dieser Gruppe vertreten.

Der R2-Wert von 0,78 erreicht nicht den Grenzwert 0,9, ab dem ein Baum als wirklich robust angesehen werden kann (vgl. 2.8.3). Nur elf interne Äste sind mit einem Bootstrap-Wert von über 50 gestützt. Auch das in Abb. 16 dargestellte populationsbasierte Neighbour-Net deutet auf Widersprüche im Datensatz hin (Parallelogramme im zentralen Bereich), repräsentiert das NJ-Dendrogramm aus Abb. 15 aber insgesamt recht gut. Im Neighbour-Net deutet sich eine Trennung in zwei Hauptgruppen an. Der Großteil der Populationen südlich der Alpen wird dabei von den übrigen Populationen getrennt.

83 3. Ergebnisse

Abbildung 15: Neighbour Joining-Dendrogramm aller 70 untersuchten Populationen und der 18 Cultivare.

Die NJ-Analyse basiert auf DA genetischen Distanzen (Nei et al. 1983) und wurde mit dem Programm TreeFit (Kalinowski 2009) durchgeführt. Am Ende jeden Astes steht jeweils die Populationszugehörigkeit oder der Cultivarname. Populationen oder Cultivare mit identischen Multilocus-Genotypen sind als MLG1 bis 8, 19, 20 und 21 zusammengefasst. Die römischen Ziffern I bis VI stehen für monophyletische Gruppen, die im Text näher besprochen werden. Farbcodierung: rot - südlich der Alpen, blau - westlich der Alpen, grün - Mitteleuropa inkl. der Alpen, gelb - Kanada, lila - Cultivare. *: homozygote MLGs, R: rötlichviolette Blüten, G: gefüllte Blüten, W: weiße Blüten, H: Hybrid Population 35. Bootstrap-Werte von über 50 sind angegeben, R2=0,78. Die Länge des Maßstabs entspricht einer genetischen Distanz von 0,06.

84

Abbildung 16: Neighbour-Net aller 70 untersuchten Populationen und der 18 Cultivare.

Die NJ-Analyse basiert auf DA genetischen Distanzen (Nei et al. 1983) und wurde mit dem Programm SplitsTree v. 4.13.1 (Huson & Bryant 2006) durchgeführt. Am Ende 3.Ergebnisse jeden Astes steht jeweils die Populationszugehörigkeit, der Cultivarname oder die MLG-Nummer nach Tab. 21. Populationen oder Cultivare mit identischen Multilocus- Genotypen sind als MLG1 bis 8, 19, 20 und 21 zusammengefasst und in der Box im rechten Teil der Abbildung näher aufgeschlüsselt. Farbcodierung: rot - südlich der Alpen, blau - westlich der Alpen, grün - Mitteleuropa inkl. der Alpen, gelb - Kanada, lila - Cultivare. *: homozygote MLGs, R: rötlichviolette Blüten, G: gefüllte Blüten, W:

85 weiße Blüten, H: Hybrid Population 35. Die Länge des Maßstabs entspricht einer genetischen Distanz von 0,1. 3. Ergebnisse

3.4.4.4. Bayes'sche Analyse

Da der im Programm Structure v. 2.3 (Pritchard et al. 2000) implementierte Bayes'sche Algorithmus annimmt, dass die Genotypen an unterschiedlichen Loci des Genoms unabhängig voneinander sind, eignet er sich nur bedingt zur Analyse klonaler Organismen, da sich Klonalität ähnlich wie ein Kopplungsungleichgewicht auswirkt (vgl. 3.4.3.1). Deshalb wurden wiederholt auftretende MLGs in die hier durchgeführte Bayes'sche Analyse jeweils nur einmal einbezogen. Aus der Bayes'schen Analyse der 310 individuellen Multilocus-Genotypen (MLG) geht K=3 als unter allen getesteten Modellen (vgl. 2.8.4) wahrscheinlichste Anzahl an Clustern hervor. In Abb. 17 sind die Ergebnisse aus der Analyse unter den Modellen 'admixture' und 'alleles correlated' dargestellt. Die Zuordnung der MLGs aus den vier Großregionen und den Cultivaren zu den drei Clustern ist in Form von Balkendiagrammen illustriert. Es ergibt sich eine generelle Trennung der MLGs des mittel- und westeuropäischen Raumes (dunkelgrau) von der italienischen Halbinsel (hellgrau) und dem ostitalienisch-slowenisch-kroatischen Raum (mittelgrau). Die im Alpenraum lokalisierten MLG13 (Population 29, Ötztal) und 14 (Population 30, Ruine Zelking) nehmen auch hier, wie in der NJ-Analyse, eine Sonderstellung ein - sie weisen einen moderaten Anteil q für alle Cluster K auf. Während die Cultivar- Genotypen MLG19 ('Acorea' und 'Azurea'), 21 ('White Power' und 'Alba') sowie 24 ('Argenteovariegata') eindeutig dem mitteleuropäischen Cluster zuzuordnen sind, ergibt sich für die Cultivar-Genotypen 20 ('Gertrude Jekyll', 'Marie'®), 22 ('Anna'®), 23 ('Sabinka'), 25 ('Elisa'®) und 26 ('Josefine'®) keine eindeutige Zugehörigkeit zu einem der drei Cluster. Auch südlich der Alpen zeigt sich bei einzelnen Multilocus-Genotypen ein Einfluss der zwei jeweils anderen Cluster. Die MLG306 (Population 64, Carfalo), 307 (Population 65, Castelfidardo), 309 (Population 66, Boymont) und 310 (Population 67, Montalfina) von mittelitalienischen Fundorten bzw. aus der Umgebung italienischer Burgruinen weisen einen moderaten bis hohen Anteil q für den dunkelgrauen, mitteleuropäischen Cluster auf, was sich ebenfalls mit ihrer Gruppierung in der NJ-Analyse deckt.

Die 151 bzw. 90 MLGs aus den Populationen 43 bis 50 und 52 (Nordwestitalien) sowie 51 und 53 bis 60 (Ostitalien, Slowenien, Kroatien) wurden in der initialen Bayes'schen Analyse vorwiegend dem hell- und mittelgrauen Cluster zugeordnet. Zur Detektion verdeckter Substrukturen wurden sie jeweils einer erneuten, gesonderten Analyse unterzogen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Abb. 18 dargestellt. Für beide Gruppen ergibt sich K=2 als wahrscheinlichste Zahl an Clustern. In Gruppe eins ist keine geographische Struktur

86 3. Ergebnisse offensichtlich, in Gruppe zwei hingegen bilden die kroatischen MLGs einen von den slowenischen und ostitalienischen MLGs separierten Cluster.

3.4.5. Genetische Differenzierung und Struktur westlich und südlich der Alpen

Die Parameter FST, GST (beruhend auf dem IAM) und RST (beruhend auf dem SMM) wurden zunächst für alle Populationen westlich und südlich der Alpen unter Einbezug aller Alleldaten für alle Stichproben berechnet (31 Populationen, N=557). Holsinger & Weir (2009) betonen aber, dass FST direkt mit der Varianz der Allelfrequenzen zwischen Populationen korreliert ist. Signifikante Unterschiede in den Allelfrequenzen zweier Populationen führen deshalb zu einer Erhöhung des Parameters. Aus der Existenz von Klonalität im Datensatz ergeben sich daher automatisch hohe FST-Werte, was zu einer inadäquaten Überschätzung der genetischen

Differenzierung führt. Daher wurden FST, GST und RST-Werte zusätzlich auf Basis eines reduzierten Datensatzes berechnet. Dieser enthielt nur die in den 21 genetisch diversen Populationen aus den Regionen westlich (Pop 40 bis 42) und südlich der Alpen (Pop 43 bis 60) ermittelten MLGs. Wenn eine Population mehrere Akzessionen mit identischen MLGs enthielt, wurde wie in der Bayes'schen Analyse (vgl. 3.4.3.4) der jeweilige MLG nur einmal in die Analyse einbezogen. Rein monoklonale Populationen wurden zudem aus der Analyse ausgeschlossen (21 Populationen, N=269).

3.4.5.1. Fixationsindizes

Neben dem Parameter FST weisen auch GST (beide beruhend auf dem IAM) und RST (beruhend auf dem SMM) unter Einbeziehung wiederholt auftretender Multilocus-Genotypen ('Klone') erhöhte Werte auf (31 Populationen, N=557; FST=0,29, GST=0,3, RST=0,35; vgl. jeweils Spalte A in Tab. 22). In einem korrigierten Datensatz ohne wiederholte MLGs und mono- bzw. biklonale Populationen sind die Werte weitaus niedriger (21 Populationen, N=269; FST=0,14,

GST=0,17, RST=0,19; vgl. jeweils Spalte B in Tab. 22) und weisen auf eine deutlich geringere, insgesamt moderate genetische Differenzierung hin.

87 3. Ergebnisse

Abbildung 17: Ergebnis der Bayes'schen Analyse für alle 310 im Datensatz detektierten Multilocus- Genotypen auf Basis der Alleldaten an sieben Mikrosatellitenloci für K=3. Die Analyse wurde mit Structure v. 2.3 (Pritchard et al. 2000) unter den Modellen 'admixture' und 'alleles correlated' durchgeführt. Für jeden Multilocus-Genotypen (MLG) 1 bis 310 ist die relative Zugehörigkeit q (0 bis 1) zu einem der drei Cluster K (hellgrau, mittelgrau, dunkelgrau) in Form eines Balkens dargestellt. Die Zugehörigkeit der MLGs zu den Populationen (Pop) 1 bis 70 und den Cultivaren ist entweder direkt unterhalb der MLG-Nummer oder in der Box unten rechts angegeben. Die Zugehörigkeit der MLGs zu den geographischen Großregionen und den Kultivaren ist farbig hinterlegt. Grün: Mitteleuropa inkl. der Alpen, blau: westlich der Alpen, gelb: Kanada, rot: südlich der Alpen, lila: Cultivare. *: homozygote MLGs, R: rötlichviolette Blüten, G: gefüllte Blüten, W: weiße Blüten, H: Hybrid Population 35.

88 3. Ergebnisse

Abbildung 18: Ergebnisse der Bayes'schen Analysen für 151 Multilocus-Genotypen in neun genetisch diversen Populationen in Italien und für 91 Multilocus-Genotypen in neun genetisch diversen Populationen in Ostitalien, Kroatien und Slowenien auf Basis der Alleldaten an sieben Mikrosatellitenloci für jeweils K=2. Die Analyse wurde mit Structure v. 2.3 (Pritchard et al. 2000) unter den Modellen 'admixture' und 'alleles correlated' durchgeführt. Es wurden zwei separate Analysen für 151 Multilocus-Genotypen in genetisch diversen Populationen in Italien (43 bis 50, 52) und für 91 Multilocus-Genotypen in genetisch diversen Populationen in Ostitalien, Kroatien und Slowenien (51, 53 bis 60) durchgeführt. Für jeden Multilocus-Genotypen (MLG) 63 bis 301 ist die relative Zugehörigkeit q (0 bis 1) zu einem der zwei Cluster K (petrol und türkis bzw. rosa und pink) in Form eines Balkens dargestellt.

89 3. Ergebnisse

Tabelle 22: Genetische Differenzierung über sieben nukleäre Mikrosatellitenloci für Vinca minor- Populationen westlich und südlich der Alpen.

Die Parameter FST, GST und RST wurden zum einen unter Einbeziehung wiederholter Multilocus-Genotypen für alle 31 Populationen (N=557, A) und zum anderen ohne wiederholte MLGs und mono- bzw. biklonale Populationen für 21 Populationen (N=269, B) berechnet.

FST GST RST Locus A B A B A B Vimi25 0,36 0,19 0,34 0,21 0,39 0,14 Vimi27 0,3 0,15 0,32 0,2 0,42 0,2 Vimi34 0,24 0,13 0,27 0,17 0,26 0,17 Vimi43 0,23 0,1 0,27 0,12 0,28 0,18 Vimi53 0,25 0,1 0,27 0,14 0,36 0,2 ngVm24 0,31 0,17 0,32 0,2 0,31 0,16 ngVm26 0,34 0,14 0,38 0,17 0,4 0,27 Gesamt 0,29 0,14 0,3 0,17 0,35 0,19

3.4.5.2. Paarweise FST-Werte

Die paarweisen FST-Werte zwischen den genetisch diversen Vinca minor-Populationen aus den Regionen westlich und südlich der Alpen werden mit zunehmender geographischer Entfernung tendenziell höher (Tab. 23, Abb. 19). So ergibt sich zwischen den nah beieinander liegenden slowenischen Beständen (53 bis 60) insgesamt eine eher geringe Differenzierung

(FST zwischen 0,01 und 0,15). Auch die Populationen 43 bis 50 und 52 im Nordwesten Italiens sind insgesamt nur gering voneinander differenziert (FST zwischen 0,03 und 0,15). Population

54 (Ponte Porton in Kroatien) ist insgesamt in die höchsten paarweisen F ST-Werte (0,17 bis

0,44) involviert. Die höchsten paarweisen FST-Werte (0,44; starke Differenzierung) wurden zwischen den geographisch am weitesten entfernten Populationen 54 und 42 (Petit Bois in den Ausläufern des französischen Jura) detektiert. Population 54 bildete auch in der Bayes'schen Analyse (vgl. Abb. 18 unten) einen eigenen Cluster. Die Population ist somit am stärksten von den übrigen Populationen differenziert.

Auch für die Populationen 41 (Pomier) und 42 (Petit Bois) aus der Region westlich der Alpen ergibt sich eine hohe Differenzierung zu den Populationen aus den übrigen Regionen

(FST zwischen 0,14 und 0,44). Die Population 40 (Vuache), die ebenfalls aus der Region westlich der Alpen stammt, zeigt im Vergleich mit den nordostitalienischen Populationen

(43 bis 50, 52) deutlich geringere FST-Werte (0,08 bis 0,12).

90

Tabelle 23: Paarweise FST-Werte der Populationen westlich (40 bis 42) der Alpen, in Nordwest-Italien (43 bis 50, 52) und in Ostitalien (51), Kroatien (53 und 54) und Slowenien (55 bis 60) ohne Berücksichtigung monoklonaler Populationen und wiederholter Multilocus-Genotypen.

Die untere triangulare Matrix enthält die paarweisen FST-Werte, die obere die geographischen Distanzen, * - signifikante Werte. Ausmaß der Differenzierung: dunkelgrau - stark, mittelgrau - moderat, hellgrau - gering, weiß - schwach.

40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 40 0 13 40 203 211 245 363 384 232 308 280 555 274 607 609 595 592 591 594 599 583 41 0,08* 0 49 193 200 236 355 375 222 300 270 544 264 596 599 583 581 579 583 588 572 42 0,23* 0,36* 0 242 250 285 403 424 271 348 319 593 313 645 648 632 629 627 631 636 619 43 0,12* 0,24* 0,38* 0 9,7 55 173 183 31 121 77 355 71 405 407 397 395 394 398 404 390 44 0,11* 0,23* 0,27 0,10 0 55 169 176 27 119 70 347 64 397 399 388 386 384 389 395 381 45 0,11* 0,22 0,30* 0,09* 0,04 0 121 142 30 67 55 329 48 373 375 374 372 371 376 383 372

46 0,10* 0,20* 0,25 0,14 0,08 0,11* 0 68 143 55 113 257 114 285 286 304 303 302 310 319 314 3.Ergebnisse 47 0,08* 0,16* 0,25* 0,12* 0,08* 0,09* 0,06* 0 153 96 107 196 112 233 235 242 241 240 248 256 249 48 0,08* 0,22* 0,31 0,05 0,03 0,05 0,08 0,07* 0 92 50 330 43 378 380 373 371 370 375 381 368 49 0,12* 0,19* 0,29* 0,09* 0,13* 0,10* 0,08* 0,09* 0,08* 0 76 292 74 328 330 338 337 336 343 351 343 50 0,09* 0,14 0,25* 0,06* 0,07* 0,08* 0,05* 0,07* 0,05* 0,06* 0 281 7 328 331 324 322 320 325 332 319 51 0,19* 0,29* 0,37 0,27* 0,21 0,19* 0,16 0,17* 0,20 0,14* 0,16* 0 288 66 68 47 46 46 55 65 67 52 0,09* 0,15 0,27* 0,09* 0,09* 0,11* 0,07* 0,09* 0,08 0,08 0,04* 0,20* 0 335 337 331 329 327 333 339 327 53 0,20* 0,31* 0,36 0,26* 0,11 0,17 0,16 0,19* 0,17 0,21* 0,15* 0,20* 0,16* 0 3 69 71 73 82 91 108 54 0,28* 0,42* 0,44 0,35* 0,25 0,28* 0,30 0,28* 0,27 0,31 0,25* 0,40* 0,27 0,17* 0 70 73 75 84 93 110 55 0,22* 0,35 0,43 0,25 0,22 0,22* 0,24 0,21* 0,22 0,17 0,19* 0,21* 0,21 0,25* 0,40 0 3 6 14 24 40 56 0,12* 0,21 0,25 0,17* 0,09 0,10 0,09 0,10* 0,11 0,10* 0,09* 0,07* 0,12 0,11* 0,26 0,12 0 3 12 22 37 57 0,15* 0,24* 0,29 0,20* 0,10* 0,14* 0,10* 0,13* 0,12 0,11* 0,09* 0,12* 0,12 0,11* 0,26* 0,12 0,02 0 10 21 34 58 0,16* 0,27* 0,33* 0,21* 0,16* 0,14* 0,17* 0,16* 0,16 0,12* 0,14* 0,10* 0,19* 0,16* 0,28 0,09 0,01 0,07 0 10 26 59 0,14* 0,21* 0,23* 0,19* 0,12* 0,14* 0,10* 0,13* 0,12 0,10* 0,10* 0,09* 0,12 0,13* 0,27* 0,15 0,03 0,03 0,06* 0 22 60 0,12* 0,22* 0,26* 0,15* 0,10* 0,12* 0,09* 0,12* 0,10 0,07* 0,09* 0,11* 0,11* 0,12* 0,23* 0,07 0,01 0,03 0,01 0,03 0 91 3. Ergebnisse

Abbildung 19: Übersicht über die paarweisen FST-Werte zwischen den 21 genetisch diversen Vinca minor- Populationen westlich und südlich der Alpen im geographischen Kontext.

92 3. Ergebnisse

3.4.5.3. Analyse molekularer Varianz (AMOVA)

Da sich bei der AMOVA wie bei der Berechnung von paarweisen FST-Werten eine starke Beeinflussung durch Klonalität zeigte, wurden in die AMOVA nur die 21 genetisch diversen Populationen aus den Regionen westlich und südlich der Alpen einbezogen. Wiederholte Multilocus-Genotypen wurden nur einmal berücksichtigt. Die AMOVA wurde für zwei hierarchische Systeme durchgeführt; zum einen nach den beiden geographischen Großgruppen, zum anderen nach der Zugehörigkeit zu den aus der Bayes'schen Analyse (vgl. Abb. 17) über alle Multilocus-Genotypen hervorgegangenen drei Clustern (Tab. 24). Innerhalb beider hierarchischer Systeme ergibt sich nur ein geringer Teil der Gesamtvariation als Variation zwischen den Clustern bzw. den geographischen Gruppen (6,4 % bzw. 4,77 %). Der größte Teil der Gesamtvariation ergibt sich jeweils aus der Variation innerhalb der Populationen (84,13 % bzw. 83,04 %).

Tabelle 24: Ergebnisse der AMOVA für 21 genetisch diverse Populationen südlich und westlich der Alpen. N=276. Angegeben sind die Freiheitsgrade (d.f.), die Quadratsumme (Σ 2), die Varianz-Komponenten, der prozentuale Anteil der Variation sowie die F-Statistik und deren Signifikanz.

Quelle der Variation d.f. Σ 2 Varianzkomponente Variation (%) Statistik Signifikanz Gruppen aus der Bayes'schen Analyse (K=3)

Zwischen den Gruppen 2 82 0,19 Va 6,4 FST = 0,16 <0,001

Zwischen den Populationen in den Gruppen 18 175 0,28 Vb 9,47 FSC = 0,1 <0,001

Innerhalb der Populationen 527 1.335 2,53 Vc 84,13 FCT = 0,06 <0,01 Summe 547 1.591 3,00 100 - - Geographische Gruppen (2)

Zwischen den Gruppen 1 28 0,15 Va 4,77 FST = 0,17 <0,001

Zwischen den Populationen in den Gruppen 19 229 0,37 Vb 12,19 FSC = 0,12 <0,001

Innerhalb der Populationen 527 1.336 2,53 Vc 83,04 FCT = 0,05 <0,05 Summe 547 1.591 3,05 100 - -

3.4.5.4. Mantel-Test ('isolation by distance')

Der Mantel-Test wurde auf Basis paarweiser genetischer Distanzen DA (Nei et al. 1983) und paarweiser geographischer Distanzen zwischen den Populationen mit dem Programm IBDWS v. 3.2.3 (Jensen et al. 2005) durchgeführt. Wiederholte Multilocus-Genotypen wurden jeweils nur einmal berücksichtigt. Es wurden drei verschiedene Ansätze gewählt. Zunächst wurde ein Mantel-Test für alle 21 genetisch diversen Populationen westlich und südlich der Alpen durchgeführt (N=269). Zwei weitere Tests wurden jeweils nur für die Populationen südlich der Alpen nach ihrer Zugehörigkeit zu den beiden aus der Bayes'schen Analyse

93 3. Ergebnisse hervorgehenden Clustern durchgeführt (vgl. Abb. 17 in 3.4.3.4). Eine Analyse umfasste dabei die Populationen 43 bis 50 und 52 (N=151), in die andere Analyse wurden die Populationen 51 und 53 bis 60 (N=90) einbezogen. Die Ergebnisse sind in Abb. 19 in Form eines Koordinatensystems mit den paarweisen geographischen Distanzen auf der x-Achse, den paarweisen genetischen Distanzen DA auf der y-Achse und der Geraden für den Korrelationskoeffizienten r wiedergegeben. Aus allen drei Analysen gehen signifikant hohe Korrelationskoeffizienten (r=0,59; 0,66; 0,75) hervor, die eine Zunahme genetischer

Abbildung 20: Ergebnisse der Mantel-Tests zum Nachweis von 'isolation by distance' (IBD).

Die Tests wurden auf Basis der genetischen Distanzen DA (Nei et al. 1983) und der paarweisen geographischen Distanzen mit dem Programm IBDWS v. 3.2.3 (Jensen et al. 2005) durchgeführt. A: Mantel-Test zwischen 21 genetisch diversen Populationen westlich und südlich der Alpen, B: Mantel-Test für zehn Populationen südlich der Alpen (Italien, hellgrauer Cluster aus der Bayes'schen Analyse), C: Mantel-Test für neun Populationen südlich der Alpen (mittelgrauer Cluster aus der Bayes'schen Analyse). Die Gerade stellt die Korrelationsgerade dar. Diagramm in A ist anders skaliert als in B und C.

94 3. Ergebnisse

3.5. Phylogeographie (plastidäre Mikrosatelliten)

Ein zentraler Aspekt der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der Ausbreitungswege von Vinca minor in Europa mit Hilfe von plastidären Mikrosatellitenmarkern. Vergleichsweise wurden auch Proben aus Nordamerika in die Analyse einbezogen. Für diese Untersuchungen wurden insgesamt 297 Pflanzenproben eingesetzt (vgl. 2.1.2, Abb. 5 und Anhang A2). Neben repräsentativen Proben von allen in der populationsgenetischen Analyse einbezogenen Fundorten wurden zusätzliche Proben (größtenteils Herbarmaterial) aus den vier Großregionen westlich der Alpen, Mitteleuropa inkl. der Alpen und Nordamerika sowie aus Großbritannien, Schweden, Rumänien, Bulgarien und Australien in die Untersuchung einbezogen. Pro Fundort wurden jeweils eine bis sieben Akzessionen untersucht.

Von 24 getesteten plastidären Mikrosatellitenmarkern erwiesen sich sechs als robust und innerhalb von V. minor als polymorph (vgl. Abschnitt 3.3). Vier der Marker (cpVm01, 04, 07, 08) stammten aus der 454-Sequenzierung, zwei wurden aus den von Weising & Gardner (1999) vorgeschlagenen 'chloroplast consensus microsatellite primer'-Loci abgeleitet (ccmp2, 3). Die Charakteristika dieser sechs Mikrosatellitenmarker sind in Tab. 25 zusammengefasst.

An den sechs plastidären Mikrosatellitenloci wurden in 297 Proben 15 Allele detektiert, die in der Kombination sieben verschiedene Haplotypen ergaben (Tab. 26).

Insgesamt wies Haplotyp H1 unter allen Haplotypen mit 82 % die höchste Frequenz auf, gefolgt von Haplotyp H2 (13 %), Haplotyp H3 trat deutlich seltener auf (0,27 %). Die Haplotypen H4, H5, H6 und H7 traten jeweils nur an einer einzelnen Lokalität als private Haplotypen auf (Abb. 20). Eine detaillierte Übersicht über die Verteilung der Haplotypen auf die einzelnen Stichproben findet sich im Anhang (A2).

Die Fragmentlängen der Haplotypen wurden als Sequenzen codiert (Tab. 26; zur Methodik vgl. 2.9) und in ein Haplotypennetzwerk umgesetzt (Abb. 20). Das 'Netzwerk' ist linear aufgebaut und damit eigentlich ein unbewurzelter Baum. Die Haplotypen bilden zwei kohärente Gruppen, die durch sieben Mutationsschritte deutlich voneinander getrennt sind. Die eine Gruppe enthält den häufigsten Haplotypen H1 sowie den durch einen Mutationsschritt von H1 unterschiedenen Haplotypen H3. Die zweite Gruppe enthält den zweithäufigsten Haplotypen H2, der von den übrigen Haplotypen H4 bis H7 in einem Abstand von einem oder zwei Mutationsschritten flankiert wird (Abb. 20G).

95 3. Ergebnisse

Tabelle 25: Eigenschaften der sechs für die phylogeographische Analyse selektierten plastidären Mikrosatellitenloci aus dem 454-Datensatz (cpVm) und aus Weising & Gardner (1999; ccmp).

Angegeben sind die Primersequenzen in 5'-3'-Richtung, die spezifische Schmelztemperatur TM, die aus den genomischen Sequenzdaten erwarteten Fragmentlängen der amplifizierten Mikrosatelliten in Basenpaaren (bp) sowie das flankierte Mikrosatelliten-Motiv (für ccmp-Loci Angaben für Nicotiana tabacum aus Weising & Gardner 1999). fw: Vorwärts-Primer, rev: Rückwarts-Primer. Die mit * bzw. ** markierten Primer wurden am 5'-Ende mit einer universellen M13-Sequenz versehen (Schuelke 2000); fluor.: Primer wurde direkt fluoreszenzmarkiert verwendet; *: GTTGTAAAACGACGGCCAGT, **: CAGGAAACAGCTATGACC.

Erwartete Locus Primersequenz (5'-3') T (°C) Mikrosatelliten-Motiv Herkunft M Fragmentlänge (bp) cpVm01 fw: * TCATACGGCAAGAGTCATTGG 61 T11 246 Vinca minor rev: AGAAGTTCTGTTTCGAACCC 56 cpVm04 fw: * GCACATATAGGACAAACACCCC 61 T10 209 Vinca minor rev: AATGAAGTATCCAGGCTCCG 59 cpVm07 fw: CACATCAATTCTCGAGCCCC 63 A10 177 Vinca minor rev: ** AGAGAAATGAGTTTTGGGTGTGC 62 cpVm08 fw: * TGGAAAGATAAAATGTGTAACC 54 A11 153 Vinca minor rev: TCAGCAATAGGTTCATTCGC 59 ccmp2 fw: fluor. GATCCCGGACGTAATCCTG 60 T11 112 Nicotiana tabacum rev: ATCGTACCGAGGGTTCGAAT 60 ccmp3 fw: CAGACCAAAAGCTGACATAG 58 T13 126 Nicotiana tabacum rev: fluor. GTTTCATTCGGCTCCTTTAT 60

Tabelle 26: Fragmentlängen und Sequenzcodierung der in 297 Vinca minor-Proben detektierten Haplotypen H1 bis H7, basierend auf der Fragmentlängenvariation an sechs plastidären Mikrosatellitenloci . Für Jeden Locus sind die tatsächlichen Fragmentlängen und deren Umcodierung in AT-Sequenzen angegeben (vgl. 2.9).

Haplotyp ccmp2 cpVm08 cpVm04 cpVm01 ccmp3 cpVm07 H1 145 158 214 252 59 182 ATT AATT AA AT AT ATTTT H2 147 160 213 253 60 185 AAA AAAA AT AA AA AAAAT H3 145 157 214 252 59 182 ATT ATTT AA AT AT ATTTT H4 147 160 213 253 60 186 AAA AAAA AT AA AA AAAAA H5 147 160 213 252 60 185 AAA AAAA AT AT AA AAAAT H6 147 160 214 253 60 185 AAA AAAA AA AA AA AAAAT H7 147 160 213 253 60 184 AAA AAAA AT AT AA AAATT

96 3. Ergebnisse

Eine Übersicht über die Verteilung der Haplotypen von allen 297 untersuchten Proben auf die geographischen Großräume und die Cultivare gibt Tab. 27. In Abb. 20A bis F werden die in den geographischen Großräumen gefundenen Haplotypen geographisch kartiert. Südeuropa weist eine deutlich größere Haplotypen-Diversität auf als alle anderen Regionen. Bis auf Haplotyp H6 sind hier alle Haplotypen vertreten, einschließlich der jeweils für eine Population privaten Haplotypen H4 und H5. Allerdings ist kein klares geographisches Muster der Haplotypenverteilung erkennbar und an einigen Lokalitäten treten mehrere Haplotypen in der gleichen Population auf (Anhang A2, Abb. 20). Es ist keine Korrelation zwischen genetischer Diversität auf nukleärer Ebene und der Zugehörigkeit zu einem bestimmten Haplotypen in der plastidären Analyse vorhanden. An den Fundorten westlich der Alpen sowie innerhalb der 18 Cultivare finden sich ausschließlich die beiden dominanten Haplotypen H1 und H2, in Mitteleuropa treten darüber hinaus auch H3 und H6 auf. Unter den Cultivaren und in Mitteleuropa ist der Haplotyp H2 fast ausschließlich auf rötlichviolett- oder rötlichgefüllt blühende Varietäten beschränkt. Der private Haplotyp H6 von einem französischen Fundort ist ebenfalls einer rötlichgefüllt blühenden Pflanze zugehörig. In Großbritannien, Schweden, Nordamerika, Australien und Rumänien tritt ausschließlich der häufigste Haplotyp H1 auf.

97 3. Ergebnisse

Tabelle 27: Verteilung der in 297 Vinca minor-Proben an sechs plastidären Mikrosatellitenloci detektierten sieben Haplotypen über sieben geographische Großräume und 18 untersuchte Cultivare.

Region H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7

Mitteleuropa inkl. der Alpen 109 6 3 - - 1 -

Westlich der Alpen 10 4 - - - - -

Südlich der Alpen 40 25 5 3 2 - 1

Nordamerika & Australien 45 ------

Großbritannien & Schweden 21 ------

Rumänien & Bulgarien 4 ------

Cultivare 14 4 - - - - -

Σ 243 39 8 3 2 1 1

98

4. Diskussion

4. Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals nukleäre und plastidäre Mikrosatellitenmarker für Vinca minor etabliert und im Rahmen populationsgenetischer und phylogeographischer Analysen eingesetzt. Der erste Teil der Diskussion befasst sich mit der Etablierung der molekularen Marker auf der Basis von DNA-Sequenzdaten, die mit Hilfe der 454-Sequenzierung erhalten wurden. Im zweiten Teil stehen die Populationsgenetik und Phylogeographie von V. minor im Fokus.

4.1. Mikrosatellitenmarker aus der 454-Sequenzierung

In dieser Arbeit konnten jeweils neun funktionelle, nukleäre Mikrosatellitenmarker aus Sequenzen etabliert werden, die über 454-Sequenzierung der cDNA (des Transkriptoms) bzw. des Genoms gewonnen wurden. Aus dem genomischen Datensatz konnte darüber hinaus ein Großteil des Plastoms von Vinca minor rekonstruiert werden, woraus sich vier funktionelle, polymorphe plastidäre Mikrosatellitenmarker ableiten ließen.

Die 454-Technologie und andere Verfahren des 'next generation sequencing' (NGS) wurde bereits in zahlreichen Studien zur Etablierung von Mikrosatellitenmarkern eingesetzt (Zalapa et al. 2012). Meist wurden Mikrosatelliten aus genomischen Sequenzen isoliert (z. B. Shirk et al. 2013, Bossu et al. 2014, Yang et al. 2014), aber auch das Transkriptom (cDNA) erwies sich als grundsätzlich geeignet (z. B. Giordano et al. 2014, Postolache et al. 2014). Prinzipiell stellt eine 'shotgun'-Sequenzierung des Genoms ohne vorherige Anreicherungsschritte die einfachste und effektivste Methode für die Etablierung von Mikrosatelliten dar (Zalapa et al. 2012), und bereits kleine Datensätze enthalten genug Sequenzinformationen für die Etablierung zahlreicher polymorpher Mikrosatellitenmarker (z. B. Buehler et al. 2011). Die über die 454 GS FLX Titanium-Plattform erhaltenen Rohsequenzen ('reads') weisen eine Länge von durchschnittlich 400 bp auf (Glenn 2011) und enthalten daher in der Regel ausreichende Sequenzinformation für das Design von Mikrosatelliten flankierenden Primerpaaren (Zalapa et al. 2012). Im Sinne einer Reduzierung der Redundanz werden Mikrosatellitenloci aber auch häufig erst nach einer Assemblierung der Rohdaten etabliert (z. B. Shirk et al. 2013). Dies gilt insbesondere für Sequenzen, die nach der Illumina-Methode generiert wurden, sowie für cDNA-Sequenzen (Zalapa et al. 2012).

100 4. Diskussion

Zu Beginn dieser Arbeit standen lediglich Sequenzinformationen über das Transkriptom für Vinca minor aus einer Datenbank (vgl. 2.3.4.1) zur Verfügung. Transkriptomdaten sind vor allem für unerfahrene Benutzer schwieriger zu handhaben als genomische. So ist vor der Sequenzierung üblicherweise ein Normalisierungsschritt nötig, um die hohe Abundanz bestimmter Transkripte auszugleichen und so eine homogenere Repräsentation des Gesamttranskriptoms im Datensatz zu garantieren (Ekblom & Galindo 2011). Die Assemblierung der Rohsequenzen erlaubt eine weitere Reduktion von Redundanz (Schliesky et al. 2012), erfordert jedoch je nach Größe des Datensatzes entsprechende bioinformatische Ressourcen und Kenntnisse (Zalapa et al. 2012).

4.1.1. De novo Assemblierung

Zur Gewährleistung eines möglichst hohen Maßes an Redundanzfreiheit wurden sowohl die cDNA-Sequenzen als auch die genomischen, über 454-Sequenzierung gewonnenen Sequenzen assembliert, bevor sie auf das Vorhandensein von Mikrosatellitenloci untersucht wurden (vgl. 2.3.4.2 und 3.2.1).

Die Assemblierung des cDNA-Datensatzes lieferte eine Reduzierung der Gesamtsequenzlänge um etwa die Hälfte und der Gesamtzahl der Sequenzen um 63 %. Andere Transkriptom- Studien an Blattmaterial berichten von einer Reduktion um etwa 80 % (Garzón-Martínez et al. 2012, Torales et al. 2012). Nach Schliesky et al. (2012) werden etwa die Hälfte der 20.000 bis 40.000 in Pflanzengenomen präsenten Gene in den Blättern exprimiert. Bei einer Transkriptomstudie des Blattes wären daher etwa 15.000 Unigenes zu erwarten. Ohne Referenzgenom ist eine optimale Rekonstruktion des Transkriptoms jedoch schwierig (z. B. Amin et al. 2014). Den limitierenden Faktor in diesem Zusammenhang stellen die bislang zur Verfügung stehenden Assemblierungsprogramme und ihre zugrunde liegenden Algorithmen dar (Schliesky et al. 2012). So existieren zwar Studien über den Vergleich der unterschiedlichen Programme (z. B. Zhang et al. 2011, Amin et al. 2014) und abhängig von der NGS-Technologie existieren Empfehlungen zur Wahl einer geeigneten Software (z. B. Miller et al. 2010) – ein 'perfekter' Assemblierer ist aber noch nicht verfügbar und vor allem de novo Assemblierungen von 454-Daten ohne Referenzgenom sind derzeit noch nicht ausreichend optimiert (Quail et al. 2012).

Die Assemblierung der beiden hier untersuchten 454-Datensätze mit dem Programm

101 4. Diskussion

Geneious v. 5.4 (Drummond et al. 2011) beruht auf dem sogenannten 'greedy'-Algorithmus, der dem des multiplen Sequenz-Alignments ähnlich ist (Zhang et al. 2000, Pop 2009). Hierbei werden Sequenzen aufgrund von Basenabfolgen, die optimal zueinander passen, aneinander gelagert. Dieses Verfahren birgt die Gefahr der Fehl-Assemblierung über am 3'- oder 5'-Ende befindliche Mikrosatellitenmotive zu einem artifiziellen Contig (Pop 2009). Dieses Phänomen trat auch in der vorliegenden Studie auf (Abb. 22). Dieser Problematik könnte man zukünftig durch eine Änderung der Assemblierungsparameter begegnen (z. B. durch eine Erhöhung der Länge der Mindestzahl an überlappenden Basen), oder das routinemäßige Ausfiltern von Sequenzen mit endständigen Mikrosatellitenmotiven.

Die Qualität der Assemblierung stellt ein generelles und grundlegendes Problem bei der Analyse von NGS-Daten dar, ist jedoch für die Etablierung von Mikrosatellitenmarkern von vergleichsweise geringer Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wurde z. B. im Rahmen einer Qualitätskontrolle jedes Contig, aus dem ein Mikrosatellitenlocus für Primertests ausgewählt werden sollte, auf mögliche Fehl-Assemblierungen hin überprüft und im Zweifelsfall verworfen.

Abbildung 22: Typische Fehl-Assemblierung von drei Sequenzen aus dem genomischen 454-Datensatz von Vinca minor. Ausschnitt der Geneious v. 5.4-Oberfläche (Drummond et al. 2011). Der im Programm Geneious implementierte

'greedy'-Algorithmus assembliert hier drei nicht zusammengehörige Rohsequenzen über ein (AT)n- Wiederholungsmotiv zum artifiziellen Contig 2340.

4.1.2. Abundanz der Mikrosatellitenmotive in V. minor und Primerdesign

Die Abundanz und Frequenz von individuellen Mikrosatellitenmotiven kann sowohl zwischen verschiedenen Arten als auch in unterschiedlichen genomischen Bereichen enorm variieren (Toth et al. 2000, Morgante et al. 2002, Kumpatla & Mukhopadhyay 2005). Gleichwohl sind AT-reiche Mikrosatelliten für gewöhnlich sehr viel häufiger als GC-reiche Mikrosatelliten, und intergenische, nichtkodierende Bereiche und Introns enthalten meist mehr Mikrosatelliten als Exons. Auch in 'expressed sequence tags' (ESTs) finden sich viele Mikrosatelliten, so dass ein 'database mining' in EST- und cDNA-Datenbanken häufig lohnend ist (z. B. Wöhrmann &

102 4. Diskussion

Weising 2011). Auch in der vorliegenden Arbeit wurde eine insgesamt sehr hohe Frequenz von Mikrosatelliten in den cDNA-Daten gefunden, was aber vermutlich z. T. durch die ungenügende Assemblierung bedingt war. Die Überrepräsentation von Trinukleotid- Wiederholungsmotiven in den cDNA-Daten von V. minor spiegelt die Ergebnisse früherer Studien wieder (Morgante et al. 2002, Varshney et al. 2002). Da Trinukleotidmotive in codierenden Bereichen das Leseraster nicht verschieben, sind sie in cDNA-Daten erwartungsgemäß häufiger als in genomischen Sequenzen (Scaglione et al. 2009). Ein hoher Gesamtanteil an Di- oder Tetranukleotid- Wiederholungsmotiven in ESTs und cDNAs würde hingegen auf einen übermäßig hohen Anteil an nicht translatierten Regionen im Vergleich zu offenen Leserastern hindeuten (Kumpatla & Mukhopadhyay 2005).

Die im genomischen Datensatz von V. minor am häufigsten auftretenden Motive (A)n, (AT)n,

(AG)n, (AC)n und (AAT)n (siehe 3.2.2) entsprechen den Erwartungen aus anderen Pflanzengenomen (Wang et al. 1994, Toth et al. 2000). Die im cDNA-Datensatz häufigsten

Mikrosatellitenmotive (ACGT)n und (ACT)n waren hingegen im genomischen V. minor- Datensatz sehr selten. Auch in den Genomen und der cDNA anderer dikotyler Pflanzen spielen diese Motive quantitativ meist keine große Rolle (Toth et al. 2000, Kumpatla & Mukhopadhyay 2005, Subirana & Messeguer 2008). Ausnahmen betreffen Berichte über eine

Häufung von (ACGT)n-Motiven in ESTs von Triticum aestivum (Varshney et al. 2002) und von

(ACT)n-Motiven in ESTs aus Coffea (Aggarwal et al. 2007).

Die mit 1.642 Sequenzen enorm hohe Abundanz des Motivs (ACGT)n im cDNA-Datensatz von V. minor und seine gleichzeitige Abwesenheit im genomischen Datensatz legen ein technisches Artefakt im cDNA-Datensatz nahe, zumal es sich dabei um ein (in einer cDNA eher unerwartetes) Tetranukleotid-Wiederholungsmotiv handelt. Die Vorbereitung von RNA zur 454-Sequenzierung beinhaltet neben deren Extraktion, Fragmentierung und polyA- Anreicherung über Oligo-(dT)-Kügelchen die reverse Transkription in doppelsträngige cDNA über 'random hexamer'-Primer (vgl. z. B. Wall et al. 2009). Möglicherweise stellen die

(ACGT)n-Wiederholungen Konkatemere dieser zufälligen Primer dar (Huettel, pers. Mitteilung). Dafür spricht auch, dass sich diese Motive häufig am Ende der Sequenzen befanden. Zu dem in NCBI hinterlegten cDNA-Datensatz aus V. minor (Akzessionsnummer SRX039641) sind keine Informationen zur Qualitätskontrolle angegeben, und die Daten wurden bisher nicht in einer wissenschaftlichen Zeitschrift veröffentlicht. Die Verlässlichkeit der Sequenzen ist daher etwas fraglich, und auf die Verwendung von (ACGT) n-

103 4. Diskussion

Wiederholungen wurde beim Primerdesign verzichtet. Gleichwohl konnten aus den cDNA- Sequenzen zahlreiche funktionelle und polymorphe Mikrosatellitenmarker etabliert werden.

Insgesamt konnten für 55 % der in den cDNA-Sequenzen detektierten Mikrosatellitenloci flankierende Primer entworfen werden, für die genomischen Daten sogar für 78,8 %. Die geringere Effizienz des Primerdesigns in den cDNA-Daten hängt maßgeblich damit zusammen, dass das Programm SciRoKo v. 3.4 (Kofler et al. 2007) zwar Einzelmotive aus zusammengesetzten ('compound') Mikrosatelliten in der Statistik als perfekte Motive aufführt, für diese Einzelmotive später aber keine Primer abgeleitet werden konnten. Häufig lagen Mikrosatellitenmotive auch direkt am 5'- oder 3'-Ende der Unigenes. Eine hohe Frequenz v. a. von Dinukleotid-Motiven in 5'- und 3'-UTRs ('untranslated regions') von ESTs bzw. Genen ist zwar bekannt (z. B. Fraser et al. 2004), aufgrund der Datengröße und der unzureichenden Assemblierung konnte für die betroffenenen Sequenzabschnitte aber nicht überprüft werden, ob sie tatsächlich in 5'- und 3'-UTRs liegen.

Im Literaturvergleich liegt die Effizienz des Primerdesigns in der vorliegenden Studie aber im oberen Bereich. So konnten z. B. Edwards et al. 2011 und Dutta et al. 2011 in Transkriptom- Datensätzen für 35,8 % bzw. 75,3 % aller detektierten SSR-Loci flankierende Primer entwerfen. Bei assemblierten genomischen 454-Daten lagen die Erfolgsraten zwischen 38 % (Shirk et al. 2013) und 65,1 % (Takayama et al. 2011), beim Verzicht auf eine vorherige Assemblierung nur zwischen 22,9 % (Bickler et al. 2013) und 26 % (Flores et al. 2014).

4.1.3. Funktionalität und Übertragbarkeit der nukleären Mikrosatellitenmarker

Trotz der optimalen Einstellung der Primereigenschaften generierten 50 % der aus cDNA- Daten sowie 7 % der aus genomischen Daten gewonnenen Primerpaare kein Amplifikat, und auch eine Veränderung der Reaktionsbedingungen bei der PCR brachte keine Verbesserung. Aufgrund der manuellen Qualitätskontrolle der assemblierten Contigs (vgl. 4.1.1) sind diese Ausfälle nicht auf Fehl-Assemblierungen zurückzuführen, sondern beruhen vermutlich auf Fehlern bei der 454-Sequenzierung. In einer Studie von Gilles et al. 2011 wurde für das 454 GS-FLX Titanium System eine durchschnittliche Fehlerrate von 1,07 % ermittelt, die jedoch nicht zufällig auf die Sequenzen eines Sequenzierlaufs verteilt war. So traten Insertionen, Deletionen und fehlerhafte Basen häufig im Zusammenhang mit Homopolymeren, am Ende einer Sequenz (Abb. 23) oder an bestimmten Positionen in der Pikotiterplatte auf.

104 4. Diskussion

Gilles et al. (2011) empfehlen, die der Auswahl von Primern unterliegenden Sequenzen aus Bereichen mit hoher Abdeckung zu entnehmen, da fehlerhafte Basen dann einfacher detektiert werden können (Abb. 23). Diese Strategie konnte in der vorliegenden Studie jedoch kaum genutzt werden, da die längsten und damit vielversprechendsten Mikrosatellitenmotive häufig in Bereichen mit lediglich einfacher bis zweifacher Abdeckung lagen. Basiert ein Primer auf einer Sequenz mit unentdeckten Fehlern, kann das eine Nichtamplifikation infolge fehlender Primerbindung zur Folge haben. Der vergleichsweise geringe Amplifikationserfolg bei den cDNA-Daten könnte zudem durch die Position der Primerbindestellen relativ zu Exons begründet sein. Liegen diese in zwei benachbarten Exons, die ein großes Intron flankieren, so ist die Distanz zwischen den Primern möglicherweise zu groß für eine erfolgreiche Amplifikation (Varshney et al. 2005).

Abbildung 23: Typische, nach der Assemblierung sichtbare Sequenzierfehler aus dem cDNA- und dem genomischen 454-Datensatz von Vinca minor. Ausschnitt der Geneious v. 5.4-Oberfläche (Drummond et al. 2011). Graue Bereiche repräsentieren hundertprozentige Basenübereinstimmung unter den assemblierten Bereichen bei hoher Abdeckung ('coverage'). Die obere Hälfte der Abbildung zeigt ein 'assembly' mit vierzehnfacher Abdeckung aus dem cDNA- Datensatz. Sie illustriert die zunehmenden Fehlerraten am 3'-Ende längerer 'reads'. Die untere Hälfte der Abbildung zeigt die ersten 130 bp eines 'assembly' mit neunfacher Abdeckung aus dem genomischen Datensatz. Insertionen sowie Fehlbasen sind farbig dargestellt (A: rot, G: gelb, C: lila, T: grün).

Einige der getesteten Primerpaare generierten in der PCR multiple Banden anstelle der für locus-spezifische Marker erwarteten, ein bis zwei distinkten Banden. Das Auftreten multipler Banden bei der Etablierung von Mikrosatellitenmarkern ist ein oft beobachtetes Phänomen

105 4. Diskussion

(z. B. Bell et al. 2013, Nevill et al. 2013). Zusätzliche Banden können durch interne Selbstanlagerung der Primer ('self-annealing') oder durch mehrfache Kopien des Ziel-Locus im Genom hervorgerufen werden. Computerprogramme für das Primerdesign berechnen in der Regel Parameter, die die Wahrscheinlichkeit der Bereitschaft der einzelnen Primerkandidaten zur internen Selbstanlagerung angeben, sodass aus einer vorhandenen Auswahl möglichst optimale Primerpaare selektiert werden können. Dieses Verfahren wurde auch in der vorliegenden Arbeit angewendet. Die an einigen Mikrosatellitenloci beobachteten multiplen Banden beruhen deshalb vermutlich auf mehrfachen Kopien eines Mikrosatellitenlocus im Genom (Fisher et al. 1998), die z. B. durch transposable Elemente oder Duplikationen entstehen können (Zhang 2004). Fernandez-Silva et al. (2013) empfehlen daher, vor der Mikrosatellitenetablierung die Sequenzen auf solche Elemente hin zu untersuchen.

Die Konversionsrate vom entworfenen Primerpaar zum polymorphen Locus lag in der vorliegenden Untersuchung bei 15 % für die aus den cDNA-Sequenzen abgeleiteten Vimi-Loci und bei 28,6 % für die ngVm-Loci aus dem genomischen Datensatz. Das entspricht den in der Literatur angegeben Konversionsraten. Für cDNA-Sequenzen reichen sie von 13 % (Dutta et al. 2011) bis 33 % (Giordano et al. 2013), für genomische Sequenzen von 13,5 % (Ahrens & James 2014) bis 34,4 % (Nevill et al. 2013). Eine elegante Strategie zur Erhöhung dieser Rate bietet die parallele Sequenzierung mehrerer Individuen der gleichen Spezies. Wenn anschließend nur solche Mikrosatellitenloci für das Primerdesign ausgewählt werden, die nach der Assemblierung in allen Individuen abgedeckt sind und bereits im Assembly Längenpolymorphismen aufweisen, kann die Konversionsrate bei genomischen 454-Daten auf 50 % (Chatwin et al. 2014) und bei Illumina-Daten auf 75 % erhöht werden (Vukosavljev et al. 2014).

64 % der Primerpaare, die aus dem cDNA-Datensatz abgeleitet wurden und in V. minor distinkte Banden lieferten, generierten auch in Vinca major, V. difformis und/oder V. herbacea und z. T. in Catharanthus roseus Amplifikate. Von den aus genomischen Sequenzen abgeleiteten Primerpaaren, die in V. minor Banden generierten, lieferten 35 % auch in Vinca major, V. difformis und/oder V. herbacea Amplifikate (vgl. Tab. 11, 3.3.1.2). Zwei Studien zur Etablierung von Mikrosatellitenmarkern in C. roseus berichteten von ähnlichen Übertragbarkeitsraten. Kumar et al. (2014) identifizierten zahlreiche Mikrosatellitenloci in Illumina-cDNA-Sequenzen von C. roseus, 77 % der daraus entwickelten Marker waren auf

106 4. Diskussion andere Arten der Gattung übertragbar. Shokeen et al. (2007) erzeugten über ein klassisches Klonierungsverfahren genomische Mikrosatellitenloci für C. roseus, deren Übertragbarkeits- rate innerhalb der Gattung nur bei 33 % lag. Loci aus EST- oder cDNA-Sequenzen zeigen im Vergleich zu solchen aus genomischen Daten häufig eine höhere Übertragbarkeitsrate, da sie mit Genen assoziiert sind und ihre Zielsequenzen daher einen höheren Konservierungsgrad aufweisen (Varshney et al. 2005, Zalapa et al. 2012). Ein Abgleich der den Vimi-Loci zugrunde liegenden Sequenzen mit der auf NCBI hinterlegten Protein-Datenbank der Angiospermen über den BLAST-Algorithmus (Altschul et al. 1997) ergab nur für den Locus Vimi36 eine signifikante Homologie zu einem bekannten Protein (DEAD-Box ATP-abhängige RNA-Helicase aus Morus notabilis). Die übrigen Loci sind demnach nicht mit bereits bekannten Genen assoziiert.

Die erhöhte Konservierung der DNA-Abschnitte in Genen bringt zwar in der Regel eine höhere Übertragbarkeit Gen-assoziierter Mikrosatellitenloci mit sich, aber häufig auch ein verringertes Maß an Polymorphie im Vergleich zu genomischen Mikrosatellitenloci (Varshney et al. 2005, Zalapa et al. 2012). Die Evaluierung zwischenartlich übertragener Mikrosatellitenloci als funktionelle Marker in der Zielart kann aber letztendlich nur auf Basis von Polymorphismen in Populationsproben erfolgen, die jedoch für V. major, V. herbacea und V. difformis sowie C. roseus im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht verfügbar waren.

4.1.4. Rekonstruktion des Plastoms

Zahlreiche Studien belegen, dass eine 'shotgun'-Sequenzierung ohne vorherige Anreicherung für Mikrosatelliten auch eine (Teil-)Rekonstruktion vom Plastiden- und Mitochondriengenom erlaubt (z. B. Takayama et al. 2011, Krapp et al. 2012). Diese Organellengenome können wie die nukleären Sequenzen auf das Vorhandensein von Mikrosatellitenmotiven untersucht werden.

In der vorliegenden Studie konnten 73,7 % des Plastoms von V. minor rekonstruiert werden. Darin waren 17 Mononukleotidmotiv-Mikrosatelliten mit mehr als zehn Wiederholungs- einheiten enthalten. Aus der Hochrechnung der Zahl der Mikrosatellitenloci auf das Gesamtplastom von V. minor ergeben sich etwa 23 Mikrosatellitenloci. Diese Werte sind vergleichbar mit den bei anderen Untersuchungen erhaltenen Daten. So deckten die 454-Sequenzdaten in den sechs von Takayama et al. (2011) auf einem Achtel einer

107 4. Diskussion

Pikotiterplatte sequenzierten Angiospermen-DNAs zwischen 13,1 % und 89,6 % des Plastoms ab, in den so generierten Teilplastomen wurden bis zu 29 Mononukleotid- Wiederholungsmotive gefunden. Bei den bisher komplett rekonstruierten Plastomen der Apocynaceae von Catharanthus roseus und Asclepias syriaca liegt die Zahl der Mononukleotid- Mikrosatelliten mit mehr als zehn Wiederholungseinheiten mit 33 bzw. 59 höher, die Autoren deuten aber auch eine hohe Plastomvariabilität innerhalb der Apocynaceae an (Ku et al. 2013).

4.1.5. Funktionalität und Übertragbarkeit der plastidären Mikrosatellitenmarker

Innerhalb der getesteten Vinca minor-Akzessionen waren 33,3 % der funktionalen plastidären Mikrosatellitenloci variabel, die übrigen Loci zeigten keine Variation. Die Abwesenheit von innerartlicher Variation an einigen Mikrosatellitenloci des Plastoms wurde bereits häufiger beobachtet (Provan et al. 1999, Rendell & Ennos 2003). Auch zwei der zehn von Weising & Gardner (1999) vorgeschlagenen universellen plastidären Mikrosatellitenloci (ccmps) erwiesen sich in V. minor als variabel, was sich mit den Ergebnissen aus anderen Studien deckt (z. B. ein polymorpher ccmp-Locus in Grivet & Petit 2002, zwei in Bruschi et al. 2000, zwei in Palmé et al. 2003, drei in Grivet & Petit 2003).

Zwölf der 14 getesteten plastidären Primerpaare generierten sowohl in Vinca minor als auch in V. major Amplifikate. Die hohe zwischenartliche Übertragbarkeit übertrifft somit die der nukleären Mikrosatellitenmarker. Angesichts der höheren Konservierung des Plastoms im Vergleich zum nukleären Genom (Taberlet et al. 1991) überrascht dieser Umstand nicht. Auch in anderen Gattungen konnte eine hohe Übertragbarkeitsrate plastidärer Mikrosatellitenloci nachgewiesen werden, z. B. in Macaranga (Euphorbiaceae; Guicking et al. 2006) oder Dyckia (Bromeliaceae; Krapp et al. 2012). Wie die nukleären Loci müssen aber auch die hier vorgestellten plastidären Loci in weiteren Akzessionen von V. major getestet werden, um sie letztendlich als polymorphe Marker innerhalb dieser Art charakterisieren zu können.

108 4. Diskussion

4.1.6. Mikrosatelliten-Marker für Vinca minor: Fazit und Ausblick

Nukleäre Mikrosatellitemarker

Sowohl die öffentlich verfügbare cDNA-Datenbank als auch die 'shotgun'-Sequenzierung des Genoms in kleinem Maßstab über 454-Technologie erwiesen sich als ergiebige Ressourcen für die erstmalige Isolierung von Mikrosatellitenloci für Vinca minor, für die bisher keine molekularen Marker verfügbar waren. Die hier etablierten 18 polymorphen Loci bergen bereits genügend Information für die populationsgenetische Analyse (Guichoux et al. 2011), wobei noch 11.561 bzw. 782 nicht getesteter Loci als potentielle Kandidaten zur Verfügung stehen. Vor allem die cDNA-Sequenzen bieten darüber hinaus die Möglichkeit zur Etablierung gen- oder phänotyp-assoziierter Marker (Wheat 2010).

Zu Beginn der vorliegenden Dissertation stellten die 'shotgun'-Sequenzierung über das 454 GS FLX System sowie Illumina HiSeq die gängigen Plattformen zur erfolgreichen Etablierung von Mikrosatellitenmarkern über NGS dar und wurden in zahlreichen Studien erfolgreich angewendet (Zalapa et al. 2012). Kritische Faktoren auf dem Weg vom Locus zum Amplifikat sind jedoch die Grundqualität der Sequenzen sowie die Anwendung geeigneter Strategien zur Qualitätskontrolle nach der Sequenzierung (Wei et al. 2014). Bei 454- Sequenzierungen im kleinen Maßstab ergibt sich häufig das Problem, dass die Verlässlichkeit der 'reads' nicht überprüft werden kann (geringe Deckung, häufig nur ein 'read' pro Locus; Grohme et al. 2013), bei Illumina-Daten wiederum erfordern die kurzen Sequenzen umfassende bioinformatische Ressourcen und sehr gute Kenntnisse des Anwenders (Zalapa et al. 2012). In jüngster Zeit wird daher zunehmend die von Eid et al. (2009) etablierte, auf Einzelmolekülsequenzierung beruhende PacBio-Technologie zur Etablierung von Mikro- satelliten verwendet (Grohme et al. 2013, Wainwright et al. 2013, Wei & Dick 2014). Diese Technologie liefert bei mehrfacher Sequenzierung des gleichen DNA-Abschnitts sehr lange Sequenzen mit hoher Genauigkeit und liegt im Preissegment zwischen 454 und Illumina (Carniero et al. 2012, Grohme et al. 2013). Die PacBio-Methode wird daher vor allem dann als die zukunftsweisende Methode der Wahl gehandelt, wenn Sequenzinformationen schnell und in kleinerem Umfang benötigt werden, während die neueste MiSeq Technologie des Marktführers Illumina die kosteneffektivste Lösung für mehrere Arten umfassende Großprojekte bleiben wird (Wei et al. 2014). In Kombination mit dem bisherigen Wissen über zeiteffiziente Arbeitsprozesse (z. B. Chatwin et al. 2014) und der Weiterentwicklung geeigneter Assemblierungsmethoden werden diese Methoden zukünftig die Etablierung von

109 4. Diskussion

Mikrosatellitenmarkern weiter vereinfachen. Um das Potential dieser Methoden wirklich ausnutzen zu können, sind jedoch letztendlich auch standardisierte Multiplex-Protokolle für die Hochdurchsatz-Genotypisierung großer Probenzahlen mit hohen Markerzahlen notwendig (Guichoux et al. 2011), die mit klassischen Plattensequenzierern nicht mehr umsetzbar sind.

Plastidäre Mikrosatellitenmarker

Genomische NGS-Daten bieten als Nebenprodukt zur Generierung nukleärer Sequenzen auch die Möglichkeit zur Rekonstruktion des Plastoms. Obwohl etwa drei Viertel des Vinca minor- Plastoms mit Hilfe des Coffea arabica-Referenzplastoms abgedeckt waren, konnten aus den plastidären Sequenzen nur vier polymorphe Mikrosatellitenloci isoliert werden. Ku et al. 2013) weisen zwar auf die hohe Plastomvariabilität zwischen verschiedenen Gattungen innerhalb der Apocynaceae hin, möglicherweise ist aber gerade das V. minor-Plastom innerartlich insgesamt wenig variabel. Alternativ könnten auch komplexe Mikrosatelliten analysiert werden, wenn eine im Vergleich zur Fragmentlängenanalyse präzisere Einzelnukleotid-Sequenzierung (SNS; Guicking et al. 2008) angewendet wird. Eine zeitgemäßere und vielversprechendere Methodik zur Detektion variabler plastidärer Loci wäre aber die gezielte Rekonstruktion des Plastoms mehrerer V. minor-Individuen (vgl. Melodelima & Lobréaux 2013, Alexander & Woeste 2013).

110 4. Diskussion

4.2. Populationsgenetik und Phylogeographie von Vinca minor

4.2.1. Methodische Diskussion

4.2.1.1. Nukleäre Mikrosatellitenmarker

4.2.1.1.1. Polymorphie und Abschätzung von Klonalität

Auf Basis der individuellen Kombinationen von 145 Allelen an sieben nukleären Mikrosatellitenloci wurden in 967 Akzessionen von Vinca minor 310 Multilocus-Genotypen ermittelt, von denen 77 in mehr als einer Akzession wiederholt auftraten. Aus einer Analyse mit dem Programm MLGSim v. 2.0 (Stenberg et al. 2003) geht hervor, dass diese wiederholten Multilocus-Genotypen nicht auf mangelndem Auflösungsvermögen der verwendeten Marker, sondern auf asexueller Reproduktion beruhen. Asexuelle Reproduktion kann prinzipiell über zwei Wege erfolgen: Apomixis und vegetative Vermehrung (siehe 1.2). Da es innerhalb der Apocynaceae nur wenige Nachweise für apomiktisch gebildete Samen (z. B. bei Amsonia, Carman 1997) gibt und V. minor Stolonen bildet, die nach Bewurzelung von der Mutterpflanze fragmentiert als Ramet eigenständig existieren können, geht das hier beobachtete genetische Muster mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit auf vegetatives, klonales Wachstum zurück. Die sieben verwendeten Mikrosatellitenmarker erlauben somit die präzise Charakterisierung des Ausmaßes an Klonalität in V. minor-Populationen.

4.2.1.1.2. Nullallele

Nullallele traten an insgesamt fünf Mikrosatellitenloci in 15 von 31 Populationen südlich und westlich der Alpen auf. An den Mikrosatellitenloci Vimi25, 27, 34 und ngVm24 waren jeweils nur eine bis drei Populationen betroffen, am Locus ngVm26 13 Populationen. Nullallele resultieren aus Mutationen in Mikrosatelliten-flankierenden Primerbindestellen. Ist ein diploides Individuum für ein Nullallel homozygot, tauchen bei der Gelelektrophorese gar keine Banden auf; ist das Individuum für ein Nullallel hingegen heterozygot, wird nur ein Allel via PCR korrekt amplifiziert und durch Gelelektrophorese abgebildet; dadurch wird Homozygotie vorgetäuscht. Eine Unterscheidung zu echten Homozygoten ist nur über Sequenzierung des Locus inkl. der flankierenden Regionen möglich, technisch jedoch aufwändig (Wagner et al. 2006). Ein häufiges Vorkommen von Nullallelen führt so zu Diskrepanzen zwischen dem beobachteten und dem tatsächlichen Genotypen (Dakin & Avise

111 4. Diskussion

2004), was vor allem bei Paternitätsanalysen problematisch ist (Blouin 2003). Bei populationsgenetischen Analysen führt das Vorhandensein von Nullallelen zu einer leichten

Überschätzung genetischer Distanzmaße und der FST-Werte. Auch die korrekte Cluster- Zuordnung von Individuen in der Structure-Analyse wird leicht beeinflusst (Chapuis & Estoup 2007, Carlsson 2008).

Prinzipiell stehen drei Verfahren zum Umgang mit Nullallelen zur Verfügung: (1) der Ausschluss der betreffenden Loci aus der Analyse, (2) die Software-gestützte Korrektur der

Alleldaten (z. B. für FST: Chapuis & Estoup 2007) oder (3) die Einbeziehung der Loci in die Analyse (Dakin & Avise 2004). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgte die Detektion möglicher Nullallele erst zu einem fortgeschrittenen Zeitpunkt, da zu Beginn der Analysen hauptsächlich monoklonale Populationen aus Mitteleuropa zur Verfügung standen. In diesen ist eine Detektion von Nullallelen nicht möglich. Vor allem der Locus ngVm26 war von der Existenz von Nullallelen betroffen. Da das o. g. Verfahren (1) die Markerzahl weiter reduziert hätte und Variante (2) nur für bestimmte Analysen anwendbar ist, wurde Verfahren (3) gewählt, d. h. der Mikrosatellitenmarker ngVm26 wurde in die Analysen einbezogen. Bei der Interpretation der Daten sollte daher die o. g. Beeinflussung der Parameter bedacht werden.

4.2.1.1.3. NJ-Dendrogramme, Neighbour Net-Netzwerke und Bayes'sche Analyse

Zur Charakterisierung der genetischen Beziehungen zwischen den 310 Multilocus-Genotypen bzw. 70 Populationen und 18 Cultivaren von Vinca minor wurden auf Basis der Alleldaten an sieben Mikrosatellitenmarkern und der daraus errechneten genetischen Distanzen nach

Nei & Li (Nei & Li 1979) bzw. DA (Nei et al. 1983) NJ-Dendrogramme erstellt. Die dabei erhaltenen Äste zeigten meist eine nur geringe statistische Stützung. Es ist bekannt, dass mit zunehmender Zahl der Mikrosatellitenmarker die Standardabweichung der genetischen Distanzmaße sinkt und sich somit die Stabilität und die mittlere Bootstrap-Unterstützung von NJ-Dendrogrammen erhöht (Koskinen et al. 2004). Takezaki & Nei (2008) konnten jedoch zeigen, dass die Wahrscheinlichkeit für das korrekte Verzweigungsmuster von populationsbasierten NJ-Phänogrammen unter Verwendung der genetischen Distanz DA auch mit wenigen Markern relativ hoch ist. Nach Evanno et al. (2005) reichen zur Ermittlung des optimalen K im Rahmen einer Bayes'schen Analyse bereits fünf Mikrosatellitenmarker aus; eine Erhöhung der Markerzahl auf zehn Loci erhöht lediglich die Signalintensität zur

112 4. Diskussion

Ermittlung des optimalen K. Da sich die Ergebnisse aus der populationsbasierten NJ-Analyse zudem weitestgehend mit den Ergebnissen aus der Bayes'schen Analyse decken, können sie trotz geringem R2-Wert und geringer Bootstrap-Unterstützung der Äste insgesamt als relativ robust angesehen werden. Eine Erhöhung der Markerzahl auf alle im Rahmen der Vortests polymorphen Loci würde sich vor allem auf die statistische Stützung der einzelnen Äste auswirken.

Die Topologie des populationsbasierten Neighbour-Nets ist nicht baumförmig und durch zahlreiche Parallelogramme im Zentrum charakterisiert. In einem Neighbour-Net repräsentieren baumähnliche Bereiche konfliktfreie Teile der Phylogenie, Multifurkationen bilden dagegen Teile der Phylogenie mit mangelnder Auflösung ab und netzartige Strukturen zeigen Konflikte im Datensatz an (Morrison 2005). Das populationsbasierte Neighbour-Net weist somit ein hohes Maß an widersprüchlichen Signalen auf, was andeutet, dass ein Baum die V. minor-Daten nicht adäquat wiedergibt.

Die Ergebnisse aller drei Verfahren sind zwar statistisch wenig gestützt, alle trennen aber den Großteil der Populationen südlich der Alpen von allen übrigen Populationen und den meisten Cultivaren ab. Trotz der geringen Markerzahl können die Ergebnisse daher als robust angesehen werden. Es sollte zudem bedacht werden, dass die sieben verwendeten nukleären Marker nach dem Ausmaß der Polymorphie innerhalb der Populationen ausgewählt wurden. Die Verwendung weiterer, weniger polymorpher Marker würde vermutlich zu einer Verstärkung des phylogenetischen Signals führen und somit die Abschätzung der verwandtschaftlichen Beziehungen der Populationen vereinfachen.

4.2.1.2. Plastidäre Mikrosatellitenmarker

Die sechs plastidären Mikrosatellitenmarker zeigten mit insgesamt 15 Allelen nur ein geringes Maß an Variabilität und generierten in 297 Akzessionen insgesamt sieben Haplotypen. Das aus den Datensätzen berechnete Haplotypen-Netzwerk ist linear und in zwei köharente Gruppen unterteilt. Die beiden häufigsten Haplotypen H1 und H2 liegen intern und sind durch sieben Mutationsschritte voneinander getrennt, werden von den übrigen Haplotypen aber jeweils im Abstand von ein oder zwei Mutationsschritten flankiert.

Die Koaleszenz-Theorie nimmt an, dass in einem Netzwerk peripher gelegene Haplotypen meist jünger als die inneren Haplotypen sind. Ältere Allele und Haplotypen sollten zudem

113 4. Diskussion häufiger auftreten, und durch eine größere Zahl abzweigender Linien und eine weitere geographische Verbreitung gekennzeichnet sein als jüngere Allele (Castelloe & Templeton 1994). Die Gültigkeit dieser Annahmen ist aber stark von der Sammelstrategie und der historischen Biogeographie der Art abhängig (Jakob et al. 2007). Es muss an dieser Stelle betont werden, dass nicht das gesamte natürliche Verbreitungsgebiet von Vinca minor in der plastidären Untersuchung abgedeckt werden konnte. Die Ergebnisse sind somit sicherlich auch in gewissem Maße von der Sammelstrategie beeinflusst. Zudem ist das Homoplasierisiko bei plastidären Mikrosatellitenmarkern vor allem auf höheren taxonomischen Ebenen und bei der Untersuchung voneinander separierter Populationen hoch (Provan et al. 2001). Die Abwesenheit von Schleifen im Haplotypen-Netzwerk von V. minor spricht zwar gegen Homoplasie, letztendlich ließe sich diese aber nur durch Sequenzierung der Loci ausschließen (Doyle et al. 1998, Ebert & Peakall 2009).

4.2.2. Inhaltliche Diskussion

4.2.2.1. Italien: hohe genetische Diversität und geringe genetische Differenzierung

Von den 31 Populationen südlich und westlich der Alpen erwiesen sich 21 in der populationsgenetischen Analyse als genetisch divers, zehn wiesen hingegen nur einen oder zwei Genotypen auf. Da hohe genotypische und genetische Diversität auf sexuelle Rekombination hinweisen (Halkett et al. 2005), tritt Reproduktion über Samen im natürlichen Verbreitungsgebiet von Vinca minor somit vermutlich recht häufig auf.

Vergleichende Übersichtsstudien (Ellstrand & Roose 1987, Widen et al. 1994) haben gezeigt, dass auch Pflanzenarten, die zur klonalen Reproduktion befähigt sind, häufig ein hohes Maß genetischer Diversität aufweisen. Dies ist in den italienischen Populationen von V. minor offensichtlich der Fall. Genetische Variation in Populationen klonal reproduzierender Pflanzenarten kann prinzipiell aus zwei verschiedenen Mechanismen der Sämlingsetablierung hervorgehen. Nach dem einen Mechanismus kommt es zur fortwährenden Etablierung von Sämlingen ('repeated seedling recruitment'; RSR), alternativ findet die Sämlingsetablierung nur in juvenilen, nicht aber in adulten Populationen statt ('initial seedling recruitment', ISR; Eriksson 1993). Auch empirische Studien haben gezeigt, dass innerhalb von Populationen keine kontinuierliche Etablierung von Sämlingen zur Aufrechterhaltung hoher Raten genetischer Diversität nötig ist. So sind Bestände von Populus

114 4. Diskussion tremuloides, in denen die Etablierung von Sämlingen vermutlich seit dem letzten Glazial ausblieb, genetisch erstaunlich divers (Jelinski & Cheliak 1992). Die Messung rezenter genetischer Muster erlaubt allerdings weder eine Abschätzung über die Art der Sämlingsetablierung, noch über die langfristige Überlebensrate von Sämlingen und der Dynamik der Geneten (Eriksson 1993). In der hier vorliegenden Studie konnte somit anhand molekularer Marker indirekt nachgewiesen werden, dass im natürlichen Verbreitungsgebiet sexuelle Rekombination und Sämlingsetablierung auftritt, deren Dynamik kann aber nur durch Langzeit-Feldstudien eruiert werden. Dabei bieten sich z. B. Paternitätsanalysen in einzelnen Populationen, wie bei Convallaria majalis (Vandepitte et al. 2013) über einen Zeitraum von mehreren Jahren an.

Insgesamt war in den Regionen westlich und südlich der Alpen eine zunehmende genetische Isolation mit zunehmender geographischer Distanz zu verzeichnen ('isolation by distance', r=0,59). Außerdem waren die genetisch diversen Populationen westlich und südlich der

Alpen genetisch moderat voneinander differenziert (FST=0,14, GST=0,17, RST=0,19). Die AMOVA ergab, dass über 80 % der genetischen Variation ihren Ursprung innerhalb der Populationen hat. Aus der Bayes'schen Analyse ergaben sich im natürlichen Verbreitungsgebiet von V. minor drei genetische Cluster, von denen einer westlich der Alpen, einer im Nordwesten Italiens und einer im Nordosten Italien bis nach Kroatien und Slowenien angesiedelt war. Innerhalb dieser Cluster erwiesen sich einige Populationen als genetisch nur sehr gering voneinander differenziert (paarweise FST-Werte <0,05; Abb. 19), mit zunehmender geographischer Entfernung ergab sich aber eine zunehmende genetische Differenzierung (r=0,66 für den hellgrauen Cluster und r=0,75 für den mittelgrauen Cluster). Da sich die nah beeinander liegenden Populationen am Südrand der slowenischen Alpen in einem zusammenhängenden Waldstück befinden, stellt in dieser Region ein stufenweiser Genfluss über Samen (Myrmekochorie) und Pollinatoren (Insekten) einen möglichen Erklärungsansatz für die geringe genetische Differenzierung dar.

Auch in der Umgebung von Mailand sind einige Populationen untereinander und von Population 46 (Carrega) am Nordrand des Apennin nur sehr gering differenziert. In diesem Gebiet liegt jedoch keine zusammenhängende Waldvegetation mehr vor. Die vor etwa 5.000 Jahren hier ursprüngliche Vegetation Norditaliens (Querco-Carpinetum boreoitalicum) ist heute nur noch in einzelnen Relikten vorhanden (Paoletti & Lorenzoni 1989), da es seit der Römerzeit zu einer systematischen Umwandlung der fertilen Tallandschaften der Poebene in

115 4. Diskussion

Weiden und Äcker kam (Lang 1994). Die Po-Ebene Norditaliens repräsentiert somit eine über Jahrhunderte fragmentierte und urbanisierte Kulturlandschaft (Lorenzoni & Zanaboni 1988, Pignatti & Pignatti 2014). Angesichts der eingeschränkten Reichweite der Pollen- und Samenvektoren erscheint rezenter Genfluss von V. minor über weite Strecken eher unwahrscheinlich. Möglicherweise spiegelt die geringe genetische Differenzierung zwischen den o. g. Populationen noch den historischen Genfluss innerhalb der vor der Römerzeit noch zusammenhängenden Waldvegetation wieder. Wie bereits oben angemerkt, wären in diesem Zusammenhang Kenntnisse über die kleinräumige Dynamik von V. minor-Beständen hilfreich. Auch zur Bewertung der großräumigen populationsgenetischen Parameter von V. minor wären grundlegende Kenntnisse über den Einfluss von Pollen und Samen auf den Genfluss wünschenswert.

In der phylogeographischen Analyse erwies sich die plastidäre Haplotypen-Diversität südlich der Alpen als am höchsten, sechs der insgesamt sieben gefundenen Haplotypen sind in dieser Region vertreten, darunter die dominanten Haplotypen H1 und H2 sowie die privaten Haplotypen H4, H5 und H7. Die Haplotypen H1 und H2 sind wie in Mitteleuropa stark überrepräsentiert und traten an einigen Sammelpunkten gemeinsam auf. Die geographische Verteilung der Haplotypen folgte keinem erkennbaren Muster.

In der Phylogeographie manifestiert sich die Überdauerung von Populationen in glazialen Refugien und ihre anschließende Remigration häufig in regionenspezifischen Haplotypen (siehe z. B. Ferris et al. 1998, Vettori et al. 2004, Cheddadi et al. 2006). Eine wichtige Voraussetzung für die Identifikation glazialer Refugien und die korrekte Interpretation molekularer Daten sind Makrofossilien oder Pollennachweise, die jedoch für Vinca minor nicht verfügbar sind. Die Überrepräsentation der beiden genetisch weit voneinander entfernten Haplotypen H1 und H2 in Norditalien und ihr gemeinsames Vorkommen an manchen Lokalitäten spricht für das Auftreten einer Kontaktzone, in der rekolonisierende Populationen durch maternalen Genfluss über Samen aufeinander treffen (Petit et al. 2003, Ronikier et al. 2008). Auch die Introgression eines der beiden Haplotypen durch 'chloroplast capture' (Rieseberg & Soltis 1991) aus einer nah verwandten Art der Gattung Vinca ist prinzipiell denkbar. 'Chloroplast capture' kann z. B. auftreten, wenn zwei ansonsten durch unterschiedliche Habitate räumlich separierte Arten in einer Kontaktzone aufeinander treffen und hybridisieren. Bei Rückkreuzung der Hybride mit dem paternalen Elternteil kann in der paternalen Art eine Linie entstehen, die den Chloroplasten der anderen Art trägt. Solche

116 4. Diskussion

Kontakte könnten einerseits in jüngerer Zeit durch anthropogene Beeinflussung entstanden sein. Die Haplotypenverteilung von Silene dioica in Europa deutet z. B. die Remigration der Art aus mehreren Ursprungsregionen gemeinsam mit der Expansion der sommergrünen Laubwälder nach Mittel- und Nordeuropa nach dem letzten Glazial an (Prentice et al. 2008). Einige der in S. dioica beobachteten Haplotypen sind auch in S. latifolia präsent. Die Autoren führen diese Beobachtung auf rezentes 'chloroplast capture' in anthropogen bedingten Kontaktzonen zurück, da S. latifolia erst durch den Ackerbau in anthropogen entstandene Habitate einwandern konnte. Zum anderen kann 'chloroplast capture' auch in Kontaktzonen aufgetreten sein, die bereits während oder nach dem letzten Glazial bestanden haben. Die in temperaten Wäldern Japans beheimatete Unterart Veratrum album subsp. oxysepalum (Melanthiaceae) weist auf der Hauptinsel Honshu einen Haplotypen auf, der von den Haplotypen auf den übrigen japanischen Inseln deutlich separiert ist. Dieser Haplotyp ist auch in V. stamineum präsent, einer Art, die in alpinen Wiesen der Honshu-Insel auftritt. Da die beiden Veratrum-Arten heute unterschiedliche Habitate besiedeln, führen die Autoren das beobachtete Muster auf Introgression innerhalb glazialer Refugien zurück (Kikuchi et al. 2010).

Um zu überprüfen, ob bei V. minor ein 'chloroplast capture' stattgefunden hat, wurden die Haplotypen der verfügbaren Akzessionen von V. major, V. difformis und V. herbacea mittels der sechs plastidären Mikrosatellitenmarker ermittelt (Tab. 28) und in das ursprüngliche Haplotypen-Netzwerk einbezogen (Abb. 24). Dabei zeigte sich, dass die Haplotypen der übrigen Vinca-Arten hier eine eigene kohärente Gruppe bilden, die deutlich von allen V. minor-Haplotypen getrennt ist. Eine Introgression von Plastiden-DNA aus rezenten Vinca- Arten scheint also eher keine Rolle bei der Etablierung der plastidären Diversität von V. minor gespielt zu haben. Um diese Hypothese zu erhärten, müsste der Stichprobenumfang für die übrigen Vinca-Arten aber deutlich erhöht werden.

Tabelle 28: Fragmentlängenvariation an sechs plastidären Mikrosatellitenloci in je einer Akzession von Vinca major, V. difformis und V. herbacea. Für Jeden Locus sind die tatsächlichen Fragmentlängen angegeben, die Umcodierung erfolgte nach 2.9.

Akzession ccmp2 cpVm08 cpVm04 cpVm01 ccmp3 cpVm07

V. major (BONN-6026) 145 149 213 252 61 181

V. herbacea (GIESS-0-U-3893) 147 151 215 253 59 181

V. difformis (STUT Kull M3914) 145 151 215 253 61 181

117 4. Diskussion

Abbildung 24: Plastidäres Haplotypen-Netzwerk unter Einbezug von Vinca minor, V. major, V. difformis und V. herbacea. Das Netzwerk wurde mit dem Programm TCS v. 1.2.1 (Clement et al. 2000) auf Basis der in Abschnitt 3.5 dargestellten sieben Haplotypen aus 297 Vinca minor-Akzessionen erstellt. Im Vergleich zum Netzwerk in Abb. 21 wurden hier zusätzlich die Haplotypendaten der drei in 2.1 verzeichneten Akzessionen von V. major, V. difformis und V. herbacea in die Analyse einbezogen. Diese drei Arten bilden eine separate, kohärente Gruppe.

Auch die in drei im oder in der Umgebung des südlichen französischen Jura gelegenen Populationen 40 bis 42 erwiesen sich als genetisch hoch divers. Vor allem Population 40 in den zwischen Jura und Alpen gelegenen Montagne de Vuache war von den nordwestitalienischen Populationen nur vergleichsweise gering genetisch differenziert, gruppierte aber dennoch in den aus der Bayes'schen Analyse hervorgegangenen mitteleuropäischen Cluster. Dieses Muster kann zum einen durch Homoplasie hervorgerufen worden sein, aber auch auf Genfluss am Südrand der Alpen hinweisen.

4.2.2.2. Klonalität als Indikator für anthropogen entstandene V. minor-Vorkommen

30 der 36 in Mitteuropa besammelten Populationen sowie alle drei Vinca minor-Vorkommen aus Nordamerika bestanden jeweils aus einem einzigen Multilocus-Genotyp, zeigten ein hohes Maß an Heterozygotie und erwiesen sich somit als monoklonal (vgl. Halkett et al. 2005, De Meeûs et al. 2006). Als weitere Gemeinsamkeit zeigten die mitteleuropäischen und die nordamerikanischen Populationen eine auffällig teppichartige Wuchsform (Abb. 25 und Antunes, Dickinson, mündl. Mitteilung). Auch südlich der Alpen wurde eine solche teppichartige Wuchsform an fünf der sieben mono- bzw. biklonalen Vorkommen (Population 63 bis 67) detektiert, die Populationen 61 und 62 und die genetisch diversen Populationen hingegen zeigten eine eher zerstreute Wuchsform (Abb. 25).

118 4. Diskussion

Parker et al. (2014) verglichen morphologische und genetische Eigenschaften von natürlichen und anthropogenen Vorkommen von Agave parryi var. huachucensis in Südost-Arizona. Sie konnten dabei zeigen, dass die Kultivierung dieser Art in präkolumbianischer Zeit mit morphologischer Uniformität, fixierter beobachteter Heterozygotie und reduzierter Zahl an Multilocus-Genotypen im Vergleich zu natürlichen Populationen einhergeht. Diese morphologische und genetische Signatur stellt nach Auffassung der Autoren eine Art von 'Barcode' für anthropogen entstandene Populationen der Agave-Art dar.

Auch bei V. minor stellt die teppichartige Wuchsform in Kombination mit geringer genetischer Diversität möglicherweise eine Signatur für anthropogen bedingte Bestände dar. Für Mitteleuropa wird angenommen, dass V. minor vom Menschen eingeführt wurde und hier rein anthropogen bedingt vorkommt (vgl. 1.3.3). Die in dieser Arbeit in Mitteleuropa inkl. der Alpen untersuchten Populationen wiesen z. B. häufig eine Assoziation zu ehemaligen Siedlungen oder Burgruinen auf. Genfluss wurde zwischen diesen Vorkommen nicht detektiert. Die molekularen Daten unterstützen somit die Hypothese, dass V. minor in Mitteleuropa nur anthropogen verbreitet wird.

Neben der teppichartigen Wuchsform deuten auch die jeweiligen Fundorte der V. minor- Populationen 63 bis 67 in der Region südlich der Alpen an, dass sie auf Anpflanzung bzw. Auswilderung zurückgehen. So befinden sich die Populationen 66 (Boymont) und 67 (Montalfina) in der unmittelbaren Umgebung mittelalterlicher Burgruinen, während die Populationen 63 bis 65 in unmittelbarer Nähe einer alten Hütte (Sta. Franca), einer Wegkreuzung (Carfalo) und einer Böschung (Castelfidardo) gesammelt wurden. Möglicherweise stellen diese Standorte Sekundärhabitate im natürlichen Verbreitungsgebiet dar, die auf Verwilderungen aus Anpflanzungen oder Gartenabfall zurückgehen. Ein ähnliches Muster fanden Sochor et al. (2013) für die Weidenart Salix daphnoides in den Karpaten: in anthropogen bedingten Sekundärhabitaten, in denen die Art als Bienenweide angepflanzt wurde, zeigten die Populationen eine stark reduzierte genetische Variation.

Es sollte allerdings betont werden, dass eine Reduktion der genetischen Diversität auch duch natürliche Gründereffekte bedingt sein kann. Dies könnte z. B. auf die bi- bzw. monoklonalen V. minor-Populationen 61 (Palude Brabbia) und 62 (Agognate) zutreffen, die jeweils nur wenige Meter von periodisch überfluteten Gewässern entfernt lagen. Hier ist es denkbar, dass Stolonen durch Überschwemmungen von der Mutterpflanze fragmentiert wurden und im Anschwemmungsgebiet neu austreiben. Eine hydrochore Ausbreitung von V. minor-Samen ist

119 4. Diskussion aber auszuschließen, da die Samen nicht schwimmfähig sind (persönl. Beobachtung).

4.2.2.3. Seltene Ereignisse sexueller Reproduktion in Mitteleuropa

4.2.2.3.1. Geitonogamie

In drei der 36 mitteleuropäischen V. minor-Bestände (Populationen 31 bis 33) traten einzelne Proben auf, die im Vergleich zu den übrigen Proben des Standortes an bis zu fünf nukleären Mikrosatellitenloci homozygot waren. Klonale Reproduktion diploider Organismen führt mit zunehmender Zeit zu einer Zunahme der Heterozygotie (bei sehr alten klonalen Linien bekannt als 'Meselson-Effekt', Welch & Meselson 2000), während selbst einzelne Inzuchtereignisse neue, homozygote Genotypen hervorbringen (Masel & Lyttle 2011).

Da der herkogame Aufbau der V. minor-Blüten Autogamie vorbeugt (Schick 1982), Vinca aber generell selbstkompatibel ist (Darwin 1861), wurde der Verlust der Heterozygotie hier vermutlich durch Geitonogamie hervorgerufen, der Selbstbestäubung zwischen mehreren Blüten des gleichen genetischen Individuums (Eckert 2000, Charpentier 2002). Zwei dieser Inzuchtereignisse wurden in den Populationen 31 und 32 (Weidelsburg und Igelsburg) in der Umgebung von Kassel detektiert (beide ansonsten dem MLG2 zugeordnet), das dritte in Population 33 (Château de Hohenstein) in den Vogesen, in der ansonsten MLG4 auftrat. East (1940) berichtet von Selbststerilität in einzelnen V. minor Linien. Möglicherweise ist das die Ursache für die Seltenheit solcher Inzuchtereignisse und ihr Ausbleiben in den übrigen V. minor-Populationen in Mitteleuropa.

Statistisch belastbare Bestäubungsexperimente waren im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich, da die im Gewächshaus kultivierten Pflanzen mehrfach von starkem Parasitenbefall mit Blattläusen (Aphididae), und Pilzen (Puccinia spec. und Phoma exigua var. Exigua) betroffen waren. Die mechanische und chemische Schädlingsbekämpfung führte bedauerlicherweise zu einem Ausbleiben der Blüte. In ihrer von mir betreuten Bachelor- Arbeit konnte Schynawa (2013) jedoch in genetisch monoklonalen Beständen von V. minor in der Umgebung Kassels Insekten beim Blütenbesuch beobachten. Die gleichen Blüten wiesen nach wenigen Wochen Fruchtansatz auf, jedoch konnten die resultierenden Samen trotz zahlreicher Versuchsansätze unter unterschiedlichen Bedingungen nicht zur Keimung gebracht werden (Will 2014). Die mitteleuropäischen V. minor-Bestände scheinen somit zwar prinzipiell zu sexueller Reproduktion fähig zu sein, sie tritt aber nur sehr selten auf.

120 4. Diskussion

Weiterhin kann die nur selten beobachtete intraklonale Inzucht auf das hohe Alter der betreffenden Klone zurückzuführen sein. Falls diese Bestände wirklich auf Anpflanzungen während der Römerzeit bzw. des Mittelalters zurückgehen, dürften die Klone ein physiologisches Alter von mehreren hundert Jahren haben. Die 'Theorie der somatischen Mutationen durch Klonalität' (Klekowski 1997, 2003) besagt, dass der reproduktive Erfolg einer Pflanze mit zunehmendem Alter abnimmt, weil schädliche somatische Mutationen akkumulieren. Seneszenz führt z. B. in Populus tremuloides mit zunehmendem Klonalter zu reduzierter reproduktiver männlicher Fitness. Das äußert sich z. B. in einer verringerten Anzahl funktionsfähiger Pollenkörner mit zunehmendem Alter der Individuen (Ally et al. 2010). In einer Tectona grandis-Samenplantage (Teakholz, Lamiaceae) ergab sich mit zunehmendem Alter des Mutterbaumes eine verringerte Samenkeimungungsrate bis zu weniger als 2 % bei über hundertjährigen Bäumen. Dies wurde im Zusammenhang mit dem physiologischen Alter der Klone und der damit verbundenen genetischen Last diskutiert (Mathew & Vasudeva 2003). Ein solche negative Korrelation zwischen Klonalter und Keimfähigkeit der Samen könnte auch die geringe Inzuchtrate bei den mitteleuropäischen V. minor-Beständen erklären. Klimatische Faktoren scheinen eine eher untergeordnete Rolle zu spielen, da auch im natürlichen Verbreitungsgebiet von V. minor monoklonale Vorkommen ohne Hinweise auf Inzucht auftraten.

Aus Inzucht hervorgegangene Individuen können zudem über eine reduzierte genetische Fitness verfügen, da schädliche Mutationen meist rezessiv sind und die durch Inzucht induzierte Homozygotie daher die Expression der genetischen Last erhöht. Dies kann zur Inzuchtdepression führen, die mit einer Reduktion der reproduktiven Fitness einhergeht (Keller & Waller 2002). In diesem Zusammenhang konnte z. B. bei Gentiana pneumonanthe nachgewiesen werden, dass das Ausmaß an Heterozygotie an Allozymloci direkt mit der relativen Fitness der Pflanzen korreliert (Oostermeijer et al. 1995).

Die Keimfähigkeit der Samen kann auch durch Pathogene eigeschränkt sein. Systemische Pathogene werden zwar über Samen meist nicht ausgebreitet (McKey et al. 2010), die V. minor-Samen neigen aber unter hoher Luftfeuchtigkeit zu raschem Schimmelbefall (Will 2014).

121 4. Diskussion

Abbildung 25: Gegenüberstellung der unterschiedlichen Wuchsformen von Vinca minor in Mitteleuropa und Italien. Oben: Teppichartige Wuchsform von Vinca minor in einem Hochwald aus Fagus sylvatica an der Weidelsburg in Nordhessen (Population 31). Die Populationsgröße beträgt hier mehrere Hektar. Unten: Lockere Wuchsform am Foresta Fontana (Population 47) in Italien. Vinca minor wächst hier am Wegesrand mit Ruscus aculeatus, Anemone nemorosa und A. ranunculoides sowie Allium ursinum.

122 4. Diskussion

Die Kultivierung der V. minor-Lebendpflanzen in den Gewächshausanlagen der Universität Kassel wurde mittlerweile optimiert. So konnte das Absterben der Triebe infolge des Befalls durch Phoma exigua var. exigua durch Aufstellen der Pflanzgefäße auf Vliesmatten und der damit verbundenen Vermeidung von Staunässe in den Töpfen reduziert werden. Zukünftige, umfassende in situ-Bestäubungsstudien wären daher zur eingehenden Interpretation der molekularen Daten möglich.

4.2.2.3.2. Interklonale Reproduktion

Population 35 (Sutschketal) stellt unter den hier besammelten mitteleuropäischen V. minor- Vorkommen eine Besonderheit dar. Hier traten zwei Morphotypen mit unterschiedlichen Blütenfarben auf, die sich in der genetischen Analyse in unterschiedlichen Multilocus- Genotypen manifestierten. Darüber hinaus konnte ein dritter Multilocus-Genotyp detektiert werden, dessen Allelmuster einen hybridogenen Ursprung durch sexuelle Rekombination der beiden Elterngenotypen nahe legt (siehe 3.4.2.2, Abb. 7). In den Populationen 34 and 36 hingegen fehlten solche Hybriden, obwohl auch hier zwei Blüten-Varietäten (blauer Wildtyp und rötliche oder gefüllte Varietät) auftraten. Auch dieses Beispiel illustriert, dass eine sexuelle Reproduktion von V. minor in Mitteleuropa zwar möglich ist, aber offenbar nur sehr selten auftritt.

In den Populationen 35 (Sutschketal) und 36 (Hasbruch), wo jeweils zwei deutlich differenzierte Genotypen mit unterschiedlichen Blütenfarben auftraten, kann neben dem bereits erwähnten Klonalter auch das Verhalten potentieller Bestäuber für die geringen Raten sexueller Rekombination ursächlich sein. Schynawa (2013) identifizierte in Nordhessen den Wollschweber Bombylius major (Diptera) sowie die Hummelarten Bombus pascuorum und B. pratorum (Hymenoptera) als Hauptbestäuber von V. minor. Nach Literaturangaben zeigen sowohl Bombylius als auch Bombus eine generelle Präferenz für blaue oder violette gegenüber rötlichen Blüten (Knoll 1921 in Woodcock et al. 2014, Forrest & Thomson 2009). Studien des Bestäuberverhaltens in Beständen klonaler Pflanzen zeigen zudem, dass die meisten Pollenbewegungen zwischen benachbarten Blüten erfolgen (Übersicht in Charpentier 2002, Vallejo-Marín et al. 2010). Eine weitgehend auf kurze Distanzen begrenzte Pollenausbreitung führt daher vor allem bei klonalen Pflanzen mit räumlich deutlich voneinander abgegrenzten Geneten (Phalanx-Wuchsform) zu eingeschränkter interklonaler Reproduktion (McLellan et

123 4. Diskussion al. 1997, Albert et al. 2008). Da die rötlich und blau blühenden Sprosse in Population 35 aggregiert vorlagen, ist eine solche Beeinflussung des reproduktiven Erfolges durch das Pollinatorenverhalten am Fundort Sutschketal wahrscheinlich.

Der am Fundort Sutschketal über die nukleäre Mikrosatellitenanalyse detektierte interklonale Hybrid wies in der plastidären Analyse den Haplotypen H1 auf, der auch für den blaublühenden Klon detektiert wurde. Der rotblühende Klon hingegen gehörte dem Haplotypen H2 an. Da Plastiden in V. minor maternal vererbt werden (Corriveau & Coleman 1988), stellt der rötlichtblühende Klon den paternalen Vorfahren und der blaublühende Klon den maternalen Vorfahren dar. Der Hybrid blühte zum Zeitpunkt der Probennahme jedoch nicht, weshalb der aus dieser Kreuzung hervorgehende Phänotyp nicht bekannt ist.

Am Fundort Rautal (Population 34) traten neben dem blaublühenden Wildtyp Sprosse mit gefüllten Blüten auf. Dabei sind die Stamina teilweise oder vollständig in Petalen transformiert, es handelt sich also um eine homöotische Transition (Wang et al. 2011). Solche Phänomene basieren häufig auf Funktionsverlust oder Deregulation der Expression des AGAMOUS-Gens, einem der C-Klasse zugehörigen Gen des ABC(E)-Modells der Blütenentwicklung (z. B. Bowman et al. 1989, Roeder & Yanofsky 2001), oder dessen Analoga (Dubois et al. 2010). Durch die Transformation der Stamina kommt es zu einer eingeschränkten Reproduktivität, die das Fehlen von Hybriden an diesem Fundort erklären mag.

4.2.2.4. Somatische Mutationen

Innerhalb der Populationen 39, 42, 45, 49, 51, 54, 57 und 59 westlich und südlich der Alpen wurden Genotypen detektiert, die sich durch die Längenmutation nur eines Allels an einem einzigen Mikrosatellitenlocus unterscheiden. Ein solches Muster ist vermutlich durch somatische Mutationen bedingt (Douhovnikoff & Dodd 2003, Meirmans & Van Tienderen 2004). Werden somatische Mutationen im Genom von Meristemzellen durch antiklinale Teilungen aufrecht erhalten, so manifestieren sie sich im Genotyp des entstehenden Organs (Klekowski 2003). Arnaud-Haond & Belkhir (2007) haben vorgeschlagen, solche Multilocus- Genotypen (MLG) als klonale Linien (MLL) zusammenzufassen (vgl. 2.8.2).

Das Auftreten von somatischen Mutationen kann die Abschätzung genetischer Diversität innerhalb von Populationen stark beeinflussen. So konnten in einer Studie der gefährdeten, in

124 4. Diskussion

Florida endemischen Art Ziziphus celata (Rhamnaceae) 41 MLGs zu 30 MLLs zusammengefasst werden (Gitzendanner et al. 2012), auch in Studien an Grevillea rhizomatosa (Proteaceae, Gross et al. 2011) und G. renwickiana (James & McDougall 2014) konnte in sterilen Populationen ein beträchtlicher Anteil genetischer Variation somatischen Mutationen zugeschrieben werden. Die Bestimmung eines geeigneten Schwellenwertes (Anzahl divergenter Allele), unterhalb dessen MLGs zu MLLs zusammengefasst werden können, ist aber keineswegs trivial. Douhovnikoff & Dodd (2003) schlagen dazu für Salix exigua eine vergleichende Untersuchung von Sämlingen mit adulten Sprossen vor. Ein solches Verfahren wäre auch bei künftigen Experimenten an V. minor anwendbar.

Innerhalb Mitteleuropas unterschieden sich MLG1 und 9 bzw. 2 und 10 jeweils nur durch einen Mutationschritt eines Allels an einem einzigen Mikrosatellitenlocus. Interessanterweise waren MLG1 und 2 die am weitesten verbreiteten Klone, die an besonders vielen Lokalitäten (zehn bzw. sieben) auftraten. Die mutmaßlichen Abkömmlinge dieser beiden Klone, MLG9 und 10, wurden jedoch nicht am gleichen Fundort wie MLG1 und 2 detektiert, sondern von diesen geographisch isoliert aufgesammelt. Es ist folglich denkbar, dass diese Abkömmlinge durch anthropogene Aktivitäten (Selektion einzelner Sprosse und deren Translokation an andere Orte) entstanden sind.

In den hier untersuchten Proben wurden über die o. g. Fälle hinaus keine Hinweise auf somatische Mutationen gefunden, die demzufolge in Mitteleuropa nur selten aufzutreten scheinen. Dies kann ein Resultat diplontischer Selektion sein. Dieser Mechanismus bezeichnet die Konkurrenz genetisch unterschiedlicher Zellen während der Gewebedifferenzierung. Dabei kann einer der Zelltypen eliminiert werden und das Gewebe so wieder von schädlichen Mutationen befreit werden (Orive 2001). McKey et al. (2010) merken jedoch an, dass die Mechanismen, die der diplontischen Selektion zugrundeliegen, bisher nur in Ansätzen verstanden sind.

4.2.2.5. Der Ursprung mitteleuropäischer Vinca minor-Vorkommen und die Verbreitungsmuster der klonalen Linien in Mitteleuropa

Plastidäre Mikrosatelliten sind aufgrund ihrer geringeren Mutationsrate und der fehlenden Rekombination des Plastoms generell besser geeignet als nukleäre Mikrosatelliten, um Migrationswege von Pflanzenarten nachzuverfolgen (vgl. 2.3.2). In Mitteleuropa,

125 4. Diskussion

Großbritannien und Schweden dominierte in der plastidären Analyse Haplotyp H1. In Südbayern und Tschechien trat zudem Haplotyp H3 auf, der von H1 nur einen Mutationschritt entfernt ist und vermutlich aus H1 hervorgegangen ist. In den mitteleuropäischen Freilandvorkommen mit rötlichblühenden Pflanzen war zusätzlich auch Haplotyp H2 vertreten und in Frankreich der private Haplotyp H6, der nur einen Mutationschritt von H2 entfernt ist. Da sich im natürlichen Verbreitungsgebiet von V. minor südlich und westlich der Alpen keine klare geographische Verteilung der Haplotypen zeigte, ist eine präzise Rekonstruktion der Ursprungsregion der mitteleuropäischen Bestände mit den verfügbaren plastidären Daten nicht möglich. Interessanterweise tritt Haplotyp H1 auch in Rumänien und Bulgarien auf. Möglicherweise stammt Haplotyp H1 ursprünglich aus osteuropäischen glazialen Refugien im Balkan und den Karpaten und gelangte erst nach der letzten Eiszeit nach Italien. Um dies näher zu untersuchen, sollte das Sammelgebiet in diese östlichen Regionen ausgedehnt werden. Insgesamt deutet die Präsenz von mehreren Haplotypen in Mitteleuropa an, dass mehrere, unabhängige Einführungen stattfanden.

Innerhalb der nukleären Analyse legen sowohl die Neighbour-Joining Analyse als auch die Bayes'sche Analyse nahe, dass ein Großteil der mitteleuropäischen V. minor-Populationen sowie die Populationen westlich der Alpen insbesondere mit drei der mittelitalienischen Vorkommen (Populationen 64, 65, 67; Carfalo, Castelfidardo und Montalfina) in einer engeren genetischen Beziehung stehen. Folglich stellen die drei Populationen aus Mittelitalien mögliche Ursprungspopulationen für die mitteleuropäischen V. minor-Vorkommen dar. Da die Populationen in Mittelitalien jedoch möglicherweise durch anthropogene Einflüsse erst in jüngerer Zeit entstanden sind (vgl. 4.2.2.2), kann ein Ursprung in dieser Region nicht eindeutig belegt werden. Zudem ist bekannt, dass die römische Gartenkultur durch andere Kulturen, z. B. die Griechen, stark beeinflusst wurde (Lawson 1950). Es ist daher denkbar, dass einige der V. minor-Vorkommen in Italien allochthone Provenienzen darstellen, die ihren Ursprung im Einzugsgebiet der Griechen haben. Ein Einbezug von Proben aus Südosteuropa wäre daher lohnend.

Estoup & Guillemaud (2010) betonen den Nutzen genetischer Marker zur Rekonstruktion von Invasionsrouten, deuten aber auch an, dass Dendrogramme und Cluster-Methoden dabei einige Probleme bergen. So führen vor allem die mit kurzen Divergenzzeiten verbundenen geringen genetischen Distanzen zwischen den Populationen zu inkorrekten Abschätzungen der Baumtopologie, während genetische Flaschenhalseffekte die Wahrscheinlichkeit einer

126 4. Diskussion korrekten Baumtopologie erhöhen. Da die anthropogene Ausbreitung von V. minor mit einer starken Reduktion genetischer Diversität einherging, ist hier ein solcher Flaschenhalseffekt gegeben. Birky et al. (1996) heben jedoch hervor, dass klonale Reproduktion langfristig zur Akkumulation von Mutationen führt, weshalb sich der genetische Ursprung solcher Klone schwer bestimmen lässt. Die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit weisen stattdessen auf eine genetische Stabilität der V. minor-Vorkommen seit ihrer Einführung hin, da mehrere, mutmaßlich hunderte Jahre alte Bestände genetisch identisch sind. Die limitierenden Faktoren stellen hier eher die genetische Veränderung der Ursprungspopulationen und die Identifikation und Besammlung potentieller Ursprungspopulationen dar (Ward & Jasieniuk 2009). Aufgrund des Einflusses des Menschen auf die Waldvegetation des mediterranen und submediterranen Raumes existieren diese Ursprungspopulationen möglicherweise gar nicht mehr. Die direkte Umgebung Roms sollte aber unbedingt intensiver beprobt werden.

Die in den Alpen bzw. am nordöstlichen Alpenrand gelegenen Populationen 29 (Ötztal, MLG13) und 30 (Burgruine Zelking, MLG14) stehen mit den Vorkommen südlich der Alpen in engerer genetischer Beziehung als mit den mitteleuropäischen und mittelitalienischen Vorkommen, andere Populationen der Alpen wiederum stehen mit den mitteleuropäischen Vorkommen in engerer Beziehung. Diese Ergebnisse deuten eine mehrfache unabhängige Kolonisierung des Alpenraumes an.

Innerhalb Mitteleuropas ergibt sich kein nachvollziehbares Muster bezüglich der geographischen Verteilung der gefundenen klonalen Linien. Stattdessen liegen zwischen einzelnen Rameten des gleichen Genets bis zu 850 km. Keine der in Mitteleuropa beheimateten Arten der Krautschicht von Wäldern zeigt ein solches Muster (vgl. z. B. Anemone nemorosa in Stehlik & Holderegger 2000; Viola riviniana in Auge et al. 2001; Convallaria majalis in Vandepitte et al. 2010). Es gibt zwar einzelne Fälle genetischer Homogenität in Pflanzenarten in ihrem natürlichen Verbreitungsgebiet, diese stehen jedoch meist im Zusammenhang mit Polyploidie, z. B. bei Gagea spathacea. Die Selbst- und Fernausbreitung dieser Gelbstern-Art erfolgte offenbar ausschließlich über Bulbillen, vermutlich über Bodenbewegungen und Flüsse (Pfeiffer et al. 2012). Auch arktisch-alpine Relikte wie Carex rufina (Westergaard et al. 2011) können über das gesamte Verbreitungsgebiet hinweg aus natürlichen Ursachen heraus genetisch homogen sein. Weitaus häufiger jedoch sind solche uniformen genetischen Muster durch die Translokation von Klonen durch den Menschen bedingt. Ein prominentes Beispiel stellt hierbei die

127 4. Diskussion

Englische Ulme Ulmus minor var. vulgaris (syn. Ulmus procera) dar. Gil et al. (2004) konnten zeigen, dass eine in Mittelitalien vorkommende klonale Linie auch in Spanien und England vetreten ist und schließen daraus, dass diese mittlerweile durch das Ulmensterben gefährdete Art ein 2.000 Jahre alter, usprünglich von den Römern ausgebreiteter Klon sei. Daher stellt neben dem hohen Ausmaß an Klonalität die weitläufige geographische Verteilung der MLGs und MLLs von Vinca minor einen weiteren Beleg für die rein anthropogene Ausbreitung der Art in Mitteleuropa dar.

Prange (1996) datiert den Zeitpunkt der Einführung von Vinca minor nach Westdeutschland auf die Römerzeit (siehe auch 1.3.3). Der an den bei Prange (1996) genannten Fundorten detektierte MLG1 stellt somit vermutlich einen der ersten nach Mitteleuropa eingeführten V. minor-Klone dar. Da V. minor bereits in den ersten Kräuterbüchern des ausgehenden Mittelalters erwähnt wird, nehmen einige Autoren an, dass die Art bereits zu dieser Zeit in Mitteleuropa relativ weit verbreitet war (vgl. 1.3.3). Dabei ist allerdings zu beachten, dass die mittelalterlichen Kräuterbücher von Bock, Brunfels und Fuchs in weiten Teilen eine Rezeption der antiken Werke von Dioskurides und Plinius darstellen und die Texte sich auch untereinander stark ähneln. Eigene Beobachtungen der Autoren sind zudem meist regional geprägt, z. B. bei Bock durch die Regionen Graubünden und Rheinland-Pfalz, wo er in einem Kloster lebte (Arber 1912). In Vitus Auslassers Herbarium von 1479, in dem er 198 einheimische Pflanzen verzeichnet, vermutlich aus der Umgebung Münchens, fehlt V. minor (Kostenzer 1971). Zudem kam es im 19. Jh. während der Epoche der Romantik und des Historismus zu einem gesteigerten Interesse des Menschen an Burgruinen und historischen Plätzen (Tschirner 1998). In der sog. Landesverschönerungszeit des 19. Jh. wurden zudem exotische, ästhetisch ansprechende Pflanzen an beliebten Landschaftselementen (wie z. B. Burgruinen, tiefen Tälern) ausgepflanzt. Hempel (2009) geht für Sachsen davon aus, dass auch V. minor-Bestände auf Auswilderungen aus dieser Zeit zurückgehen. Auch die Tatsache, dass die mitteleuropäischen V. minor-Klone mit Vorkommen in der Umgebung mittelalterlicher italienischer Burgruinen in näherer genetischer Beziehung stehen, spricht eher dafür, dass die mitteleuropäischen Klone womöglich erst im oder nach dem Mittelalter eingeführt wurden.

Der von Prange (1996) angenommene Status von V. minor als Kulturrelikt aus römischer Zeit bedarf daher in Hinblick auf die o. g. Argumente einer erneuten Bearbeitung unter Einbezug historischer Quellen in einem überregionalen Zusammenhang. Zudem wäre eine

128 4. Diskussion

Altersbestimmung der mitteleuropäischen Klone wünschenswert. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte, überregionale Identifikation von Klonen mit molekularen Markern bildet dafür eine wesentliche und notwendige Grundlage. Der nächste Schritt könnte in einer Ermittlung jährlicher Zuwachsraten un deren Korrelation mit der Populationsgröße darstellen. Da Zuwachsraten aber u. a. von Faktoren wie der Nährstoffverfügbarkeit oder jahresspezifischen klimatischen Faktoren abhängen, gibt diese Methodik nur einen groben Richtwert über das Klonalter (Übersicht bei DeWitte & Stöcklin 2010).

4.2.2.6. Nordamerika

Alle Stichproben in den drei mittels nukleärer Mikrosatellitenmarker untersuchten invasiven V. minor-Populationen in Kanada konnten dem gleichen Multilocus-Genotyp MLG3 zugeordnet werden. Zudem gehörten alle 45 mittels plastidärer Mikrosatelliten in Nordamerika und Australien untersuchten Proben ausnahmslos Haplotyp H1 an. Invasionsereignisse basieren häufig auf multiplen Einführungen (Dlugosch & Parker 2008, Wilson et al. 2009). Dadurch kommt es in invasiven Populationen oftg zu einer genetischen Durchmischung des Genpools aus mehreren Ursprungspopulationen, z. B. bei Ambrosia artemisiifolia in Frankreich (Genton et al. 2005) oder im Rahmen der globalen Invasion von Cytisus scoparius, dem Besenginster (Kang et al. 2007).

Bei Pflanzenarten, die zu asexueller Reproduktion fähig sind, ist hingegen genetische Uniformität innerhalb und auch zwischen weit entfernten invasiven Populationen häufig zu beobachten, insbesondere wenn die Einführung nur ein oder wenige Male erfolgte. So gehören die invasiven Populationen der für gartenbauliche Zwecke nach Maui, Neuseeland und Kalifornien eingeführten, apomiktischen Grasart Cortaderia jubata alle dem gleichen Klon an (Okada et al. 2009). Auch die Invasion des sich klonal reproduzierenden Schilfgrases Arundo donax in Nordamerika erfolgte rein asexuell (Ahmad et al. 2008). Ein solches Szenario ist auch für V. minor denkbar. Die molekularen Daten unterstützen die Hypothese, dass sich V. minor-Bestände in Nordamerika asexuell über Stolonen ausbreiten (Stone 2009), obwohl auch in Einzelfällen Samenproduktion beobachtet wurde (Miller 2003).

Vinca minor hat einen beträchtlichen Einfluss auf die einheimische Flora und Fauna in nordamerikanischen Wäldern. Aufgrund der Ausbildung dichter, monotypischer, immergrüner Matten hemmen V. minor-Populationen das Keimungsverhalten einheimischer

129 4. Diskussion

Baumarten (z. B. Acer saccharum; Darcy & Burkart 2002). Bultman & DeWitt (2008) beobachteten in einem Waldgebiet in Michigan den Rückgang der Abundanz an Arachniden der Familie Lycosidae sowie eine insgesamt veränderte Artenzusammensetzung der Arachnidenfauna in von V. minor dominierten Flächen. In einem lokalen Kontext beobachtete Lichthardt (1995), dass V. minor das Blühverhalten und den Reproduktionserfolg der Orchideenart Cypripedium fasciculatum im Clearwater National Park (Idaho) inhibierte. Der in Kanada auftretende MLG3 ist auch in Mitteleuropa vetreten, z. B. in der Umgebung Kassels (Pop17), wo er eine besonders starke Wüchsigkeit aufwies (pers. Beobachtung). Die mittels molekularen Marker erhaltenen Ergebnisse können die Grundlage zur Entwicklung naturschutzfachlicher Empfehlungen zur Bekämpfung der invasiven V. minor-Bestände darstellen.

4.2.2.7. Cultivare

Mit 13 verschiedenen nukleären Multilocus.Genotypen war die genetische Diversität unter den 18 untersuchten Cultivaren sehr hoch. Auf der plastidären Seite konnten die rötlich blühenden Cultivare alle dem Haplotyp H2 zugeordnet werden, die blau- und weißblühenden Cultivare dem Haplotyp H1.

Mehrere Cultivare wiesen identische Multilocus-Genotypen auf. So erwiesen sich 'White Power' und 'Alba', 'Atropurpurea' und 'Multiplex', 'Bowles Variety' und 'Aureovariegata', 'Azurea' und 'Acorea' sowie 'Marie'® und 'Gertrude Jekyll' als jeweils genetisch identisch. Bei diesen Cultivaren handelt es sich somit um Sport-Mutanten. Da Sport-Mutanten durch Selektion vegetativer Triebe entstehen, zeigen sie meist unter Verwendung gängiger molekularer Fingerprint-Methoden keine oder nur sehr geringe genetische Unterschiede zu den Cultivaren, von denen sie abstammen, unterscheiden sich aber aufgrund von spezifischen Mutationen im Phänotyp (z. B. Nybom 1990, Ye et al. 1998, Debener et al. 2000).

'Atropurpurea' und 'Multiplex' (MLG7) unterscheiden sich phänotypisch durch die Transformation von Stamina in Petalen (gefüllte Blüte, vgl. 4.2.2.3.2) und eine veränderte Blütenfarbe (rötlich vs. rosa). 'Rubra' hat ebenfalls eine rötliche Blüte, weist aber einen anderen Multilocus-Genotypen auf (MLG8). Die drei Cultivare gruppieren in der NJ-Analyse aber zusammen und lassen sich zudem alle dem Haplotyp H2 zuordnen. Sie gehen daher vermutlich auf eine gemeinsame Mutterpflanze zurück. Auch die Cultivare 'Acorea' und

130 4. Diskussion

'Azurea' (MLG19) gruppieren in der NJ-Joining-Analyse mit MLG7 und 8 zusammen. Es wäre denkbar, dass 'Atropurpurea' und 'Multiplex' aus einer Kreuzung von 'Rubra' mit 'Acorea' bzw. 'Azurea' entstanden sind. Die Allelverteilung auf die verschiedenen Cultivare erlaubt aber keinen direkten Verwandschaftsnachweis wie in Population 35 (Sutschketal) (vgl. Abb. 9 in 3.4.2.2).

'Bowles Variety' und 'Aureovariegata' (MLG4) unterscheiden sich morphologisch durch die Blattvariegation. Ein weiterer variegater Cultivar, 'Argenteovariegata', unterscheidet sich hingegen genetisch von 'Aureovariegata'. Variegation kann durch zwei Mechanismen entstehen. Der erste beruht auf der Nichtexpression bestimmter Gene für die Pigmentsynthese in einem Teil der Zellen eines Organs (Tilney-Bassett 1991). Dieser Typ ist der häufigste. Bei genetischen Mosaiken existieren hingegen zwei Zellinien mit unterschiedlichen Genotypen. Bei sogenannten Chimeren sind die genetisch unterschiedlichen Zellen bereits im Apikalmeristem präsent und garantieren so die Stabilität der Variegation. Viele Sports können so unter Beibehaltung der Variegation vegetativ vermehrt werden (Marcotrigiano 1997). Ursächlich für die Nichtexpression können transposable Elemente (Doodeman et al. 1984) und spontane oder induzierte Mutationen des Kern- oder Plastidengenoms sein (Tilney-Bassett 1991). Da sowohl die grünen als auch die weißen Zell-Linien gemischt untersucht wurden, lässt sich anhand der Ergebnisse hier nicht feststellen, ob es sich bei den betreffenden Cultivaren um Chimären handelt. Die Stabilität der Variegation weist jedoch auf Chimären hin. Andere, hier nicht untersuchte variegate Cultivare wie 'Silver Service' schlagen hingegen häufig in die grüne Wildform zurück (Schomberg, pers. Mitteilung). Auch in wildwachsenden V. minor-Beständen konnte Variegation an einzelnen Sprossen häufig beobachtet werden (pers. Beobachtung).

'Gertrude Jekyll' hat weiße, 'Marie'® blaue Blüten. 'Marie'® stammt aus dem Zuchtprogramm von Herbert Menke (von der Beeck 2011) und stellt somit einen Sport von 'Gretrude Jekyll' dar. Die übrigen Cultivare aus diesem Zuchtprogramm, 'Josefine'®, 'Elisa'® und 'Anna'®, unterschieden sich genetisch von 'Gertrude Jekyll', gruppieren aber mit dieser in der NJ- Analyse zusammen. Sie stellen somit das Resultat artifizieller Kreuzungen mit unbekannten Vaterpflanzen dar. Sowohl die 'Gertrude Jekyll'-Gruppe als auch 'Sabinka' gruppieren in einem Teil der Analysen separat bzw. unter den italienischen Vorkommen, was sich mit ihrer Historie deckt (Ursprung in Norditalien bzw. in der Schweiz im Tessin; Jekyll 1900, Scholz 1982). Auch die von 'Gertrude Jekyll' abgleiteten Cultivare zeigen diese Beziehung, in der

131 4. Diskussion

Structure-Analyse wiesen sie aber auch einen Anteil q für den mitteleuropäischen Cluster auf. Das deutet an, dass neben 'Gertrude Jekyll' als Mutterpflanze eine in Mitteleuropa auftretende Wildform oder ein Cultivar mitteleuropäischen Ursprungs als Vaterpflanze eingesetzt wurde. Die übrigen Cultivare gruppieren in der NJ-Analyse mit den mitteleuropäischen Vorkommen und sind auch in der Bayes'schen Analyse dem mitteleuropäischen Cluster zugehörig.

Mehrere Cultivare stehen mit Freilandvorkommen von Vinca minor in einer direkten genetischen Beziehung. So weisen die Populationen 10 bis 15 den gleichen MLG auf wie der Cultivar 'Grüner Teppich'. Zur Geschichte dieses Cultivars ist nichts bekannt. Zum einen könnten die Wildvorkommen durch Verwilderungen von 'Grüner Teppich' herrühren, zum anderen ist es möglich, dass 'Grüner Teppich' aus Wildvorkommen selektiert wurde. Das zweite erschent wahrscheinlicher, da die wilden Vorkommen z. T. vermutlich sehr alt sind (Vorkommen an mittelalterlichen Burgruinen, siehe aber auch 4.2.2.6) und 'Grüner Teppich' sich von den Wildvorkommen phänotypisch durch das Fehlen der Blüte unterscheidet.

Die Populationen 24 (Schorndorf, Deutschland), 25 (Château de la Soie, Schweiz) und 33 (Château de Hohenstein, Frankreich) wiesen den gleichen MLG auf wie der Cultivar 'Hawaii' ®. Da dieser Cultivar erst Anfang der 2000er Jahre selektiert wurde (Schlüssel 2004), die Population am Château de Hohenstein aber wahrscheinlich aus dem Mittelalter oder der Romantik stammt, wurde der Cultivar vermutlich durch Selektion von Freilandvorkommen ausgelesen.

Die Pflanzen von Population 28 (Ename, Belgien) und die blaublühenden Stichproben an Fundort 36 (Hasbruch, Deutschland) wiesen einen zu 'Bowles Variety' und 'Aureovariegata' identischen Genotypen auf. Der Hasbruch bei Oldenburg repräsentiert einen Altwald, der als Hutewald und Forst jahrhundertelang intensiv genutzt wurde, seit der Wende zum 20 Jh. erfolgten jedoch im zentralen Teil Renaturierungsmaßnahmen (Plue et al. 2010). Da V. minor sehr empfindlich gegen Bodenverdichtung in Folge von forstwirtschaftlichen Maßnahmen ist (Gaertig & Green 2008), gehen die Vorkommen im Hasbruch vermutlich auf die Zeit nach der Aufgabe der intensiven Forstwirtschaft zurück. Der Wald von Ename etablierte sich seit der Wende zum 19. Jahrhundert infolge der Aufgabe der Landwirtschaft auf der betreffenden Fläche (Honnay et al. 1999), die Vinca minor Bestände müssen sich somit seit dieser Zeit etabliert haben. Pott (1994) merkt an, dass eingebürgerte Zierpflanzen wie V. minor oder auch Aquilegia vulgaris sehr häufig in solchen Altwäldern vorkommen und daher als Indikatoren für historisch alte Wälder gelten, obwohl sie in diesen nicht heimisch sind. Da

132 4. Diskussion

'Bowles Variety' erst um 1920 selektiert wurde (von der Beeck 2011), gehen die blaublühenden V. minor-Vorkommen im Hasbruch und Ename möglicherweise auf frühe Auswilderungen des Cultivars zurück.

Alle untersuchten rot- bzw. gefülltblühenden Wildformen in den Populationen 34 (im Rautal bei Jena), 35 (im Sutschketal bei Berlin) und 36 (im Hasbruch bei Oldenburg) sind genetisch identisch zu einem der Cultivare 'Rubra' oder 'Atropurpurea' bzw. 'Multiplex', unterscheiden sich aber signifikant von den am gleichen Fundort vertretenen blaublühenden Pflanzen. Rötlich- und gefülltblühende Cultivare von V. minor sind seit dem 18. Jh. bekannt (Riedel 1769, Mawe & Abercrombie 1778). Angesichts der Historie der Habitate sind diese Vorkommen vermutlich als Stinsenpflanzen, also als Zeiger alter Gartenkultur oder Ansalbungen aus der Romantik zu werten. Im Rautal bei Jena befindet sich z. B. einer der größten Bestände des ursprünglich aus Südeuropa stammenden Geophyten Eranthis hyemalis nördlich der Alpen. Dieses Hahnenfußgewächs wurde im 18. Jh. in Mitteleuropa im Zuge des Aufkommens der Landschaftsparke weitläufig angepflanzt (Krausch 2012).

4.2.3. Ausblick

Klonale Pflanzen werden seit Mitte der 1980er Jahre genetisch untersucht. Das Studium klonaler Pflanzenarten ist ein hochaktuelles Forschungsthema und wird es auch künftig bleiben. So beschäftigten sich in einer kürzlich erschienenen Ausgabe der Zeitschrift Annals of Botany sechs Artikel mit den ökologischen Auswirkungen von Klonalität bei Pflanzen (Übersicht bei Dong et al. 2014). Weitere Untersuchungen zur Klonalität bei Vinca minor sind somit vor allem in ökologischen Zusammenhängen erstrebenswert.

In Norditalien tritt V. minor nur fragmentiert in einigen Waldstücken auf. In der Emilia- Romagna hat V. minor gar den Status einer geschützten Art. Rossi & Mondoni (2009) führen aus, dass eine ex situ Erhaltung der für die Wälder der Poebene typischen Pflanzen der Krautschicht, wie z. B. Anemone nemorosa, A. ranunculoides, Erythronium dens-canis, Scilla bifolia, Vinca minor u. a. über Samenbanken gesichert werden sollte. Die hier etablierten Mikrosatellitenmarker können daher für den Umweltschutz relevant sein, da mit ihrer Hilfe natürliche Vinca minor-Vorkommen von anthropogenen Populationen abgegrenzt werden können. Zudem kann durch die Kenntnis des genetischen Fingerabdruck der Mutterpflanze eine möglichst vielfältige ex situ-Erhaltung garantiert werden.

133 4. Diskussion

Unter der Annahme, dass Monoklonalität als Indikator für anthropogen bedingte Vinca minor Vorkommen zu werten ist, lassen sich die Grenzen des natürlichen Verbreitungsgebietes über die hier präsentierten Mikrosatelliten-Marker rekonstruieren und das von Meusel et al. (1978a,b) vorgestellte Verbreitungsgebiet (Abb. 1 in 1.3.1) spezifizieren. Sollte V. minor außerhalb des submediterranen Raumes tatsächlich ausschließlich anthropogen vorkommen, würde dies die Bedeutung der oben genannten ex situ-Erhaltungsmaßnahmen unterstreichen. Auch für die anderen Vinca-Arten lässt sich dieses Vorgehen womöglich anwenden.

Basierend auf molekularen Daten und Stammbäumen auf Art- und Gattungsebene könnten Untersuchungen zur Biogeographie und Merkmalsevolution in der Gattung Vinca folgen. So ist z. B. nicht bekannt, welches Taxon bzw. welche Merkmale (immergrüne Blätter, Polyploidie) ursprünglich und welche abgeleitet sind. Der Ursprung der Arten könnte darüber hinaus mit neueren Methoden wie 'ancient area reconstruction' und GBS ('genotyping by sequencing') abgeleitet werden. Insbesondere die disjunkten Verbreitungsgebiete von V. herbacea, V. difformis und V. major sind hierbei von Interesse.

Die Invasivität von V. minor in Nordamerika bedarf weiterer Forschung. Hierbei sollte zunächst abgeklärt werden, ob invasive Bestände in Zusammenhang mit den aktuell in Nordamerika verfügbaren Cultivaren stehen. Dafür sollten weitere, hauptsächlich in Nordamerika vermarktete und patentierte Sorten wie z. B. 'Illumination', 'Summer Snow', 'Giant Steps', '24 Carat', 'Sunny Skies', 'Parvin', 'Ralph Shugert', untersucht werden. Sollte sich bestätigen, dass die Freilandpopulationen in Nordamerika im wesentlichen auf die Auswilderung aus Gärten oder Gartenabfall zurückgehen, könnte die Selektion von Sorten mit weniger starkem Wuchsverhalten zur Eindämmung der Invasivität beitragen.

Vinca minor kann möglicherweise auch als Modell für die anthropogene Ausbreitung anderer Kulturrelikzeiger und Stinsenpflanzen, wie z. B. Helleborus viridis oder Eranthis hyemalis, in Mitteleuropa dienen. Vergleichende Untersuchungen zum Reproduktionsverhalten und zur Ökologie (Bestäuberverhalten, Samenvektoren, Keimungsverhalten) sowie der Populationsgenetik könnten interessante Einblicke in die Populationsbiologie und -entwicklung lange isolierter Pflanzenpopulationen geben. Wie bereits dargelegt müssen dafür aber unbedingt historische Quellen zu Rate gezogen werden.

Schließlich soll nicht unerwähnt bleiben, dass die hier entwickelten Mikrosatellitenmarker als informative Werkzeuge für die Sortenidentifikation, für den Schutz von Züchterrechten

134 4. Diskussion

('breeder´s rights') und für die molekulare Charakterisierung von Züchtungsprodukten bei V. minor eingesetzt werden können. Die hier präsentierten Mikrosatelliten-Marker stellen somit mögliche erste Kandidaten für das 'SMART (selection with markers and advanced reproductive technologies) breeding' bei V. minor dar. Bisher ist es nur Herbert Menke gelungen, durch gezielte Züchtung neue Cultivare zu entwickeln. Die hier präsentierten Mikrosatelliten-Marker könnten zukünftig zur Selektion geeigneter Elternpflanzen eingesetzt werden. Darüber hinaus enthält v. a. der cDNA-Datensatz mit hoher Wahrscheinlichkeit eine Vielzahl züchtungsrelevanter, phänotyp-assoziierter Marker, die für die Züchtung neuer V. minor-Cultivare routinemäßig eingesetzt werden könnten.

135 5. Zusammenfassung

5. Zusammenfassung

Das Kleine Immergrün (Vinca minor L.) aus der Familie der Apocynaceae ist in der Krautschicht sommergrüner Wälder Südeuropas heimisch, während es in weiten Teilen Mitteleuropas als wahrscheinlich von den Römern eingeführter, altetablierter Archäophyt gilt. Noch heute ist die Art als Kulturreliktzeiger häufig in der Umgebung ehemaliger römischer Tempel und mittelalterlicher Burgruinen zu finden. Zudem wird V. minor in zahlreichen Gartenformen kultiviert. In Teilen Nordamerikas wird der Chamaephyt hingegen als eingeführte, invasive Art eingestuft, die die einheimische Flora und Fauna bedroht. Da V. minor Stolonen bilden kann und in Mitteleuropa selten reife Samen beobachtet werden, wurde bislang vermutet, dass V. minor Bestände in Mitteleuropa sich rein asexuell erhalten. Diese Hypothese wurde aber bisher nie mit molekularen Methoden überprüft. Auch zur Populationsgenetik der Art ist bisher nichts bekannt.

Aus diesen Gegebenheiten resultieren folgende Fragen:

Wie hoch ist die genetische Diversität von V. minor im submediterranen Ursprungsgebiet im Vergleich zu Mitteleuropa und Nordamerika und wie ist sie in den Großregionen jeweils strukturiert?

Korreliert die anthropogen bedingte Einführung mit einer genetischen Verarmung in Mitteleuropa?

Gibt es in mitteleuropäischen und nordamerikanischen Populationen Hinweise auf sexuelle Reproduktion, oder erfolgt eine rein vegetative Vermehrung?

Gibt es genetische Hinweise für Auswilderungen aus Gärten?

Lassen sich die historischen Ausbreitungswege der Art von Süd- nach Mitteleuropa, innerhalb Mitteleuropas sowie nach Nordamerika rekonstruieren?

Mikrosatellitenmarker stellen für populationsgenetische Analysen heute die weitaus gängigste Technik dar. Als codominante, locusspezifische Marker erlauben sie die präzise Erfassung populationsgenetischer Parameter zur Quantifizierung der genetischen Diversität und Struktur, die Abschätzung von Genfluss, und die Detektion von Klonen. Mikrosatelliten sind mit Hilfe neuer DNA-Sequenziertechniken (NGS) unproblematisch und kosteneffektiv isolierbar. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurden daher zunächst nukleäre und plastidäre Mikrosatellitenmarker über NGS-454-Sequenzierung entwickelt.

136 5. Zusammenfassung

Etablierung von nukleären und plastidären Mikrosatellitenmarkern

Zur Etablierung artspezifischer nukleärer Mikrosatellitenmarker wurden zwei Verfahren angewendet. Zum einen wurde in einer öffentlich zugänglichen, über 454-Sequenzierung der cDNA von V. minor gewonnene und im 'sequence read archive' von NCBI hinterlegte Datenbank (Akzessionsnummer SRX039641) nach Mikrosatelliten gesucht. Zum anderen wurde die 454-Technologie eingesetzt, um in Kooperation mit Dr. Bruno Huettel vom Max- Planck-Institut für Pflanzenzüchtung in Köln genomische Sequenzdaten anhand einer V. minor-Akzession zu generieren und aus diesen Mikrosatelliten zu etablieren. Eine Assemblierung der 723.230 cDNA-Sequenzen mit insgesamt 387 Mbp erzielte eine Reduzierung auf 267.199 Unigenes (267 Mbp), die der genomischen Sequenzen eine Reduzierung von 43.565 (18 Mbp) auf 24.886 Sequenzen (13,7 Mbp). Die assemblierten Datensätze enthielten 25.253 bzw. 1.371 Mikrosatellitenloci aus Mono- bis Hexa- Nukleotidmotiven. Die Effizienz der Assemblierung war somit v. a. bei den cDNA-Sequenzen gering. Da die Etablierung von Mikrosatellitenloci aber auch auf Basis redundanter Sequenzen möglich ist, sofern ein manueller Abgleich der selektierten Sequenzen erfolgt, wurde auf eine weitere Optimierung der Assemblierung verzichtet. Aus den so identifizierten Loci wurden 60 (cDNA) bzw. 35 (genomische DNA) Di-, Tri- und Tetranukleotidmotive selektiert, flankierende Primer synthetisiert und in umfangreichen Pilotstudien getestet. Jeweils neun der Loci erwiesen sich als robuste, polymorphe Marker. Die sieben vielversprechendsten Marker wurden schließlich für die populationsgenetische Untersuchung ausgewählt.

Auch die Etablierung plastidärer Mikrosatellitenmarker erfolgte über zwei Ansätze. Zum einen wurde das Plastom von V. minor aus dem genomischen 454-Sequenzdatensatz rekonstruiert und auf das Vorhandensein von (A)n/(T)n-Wiederholungseinheiten hin untersucht. Für 14 der 17 dabei detektierten Loci konnten Primer entworfen werden. In einer Pilotstudie erwiesen sich vier der Loci als funktionelle, polymorphe Marker. Zusätzlich wurden die zehn universellen (ccmp) Primerpaare zur Amplifikation plastidärer Mikrosatellitenloci aus Weising & Gardner (1999) getestet, von denen zwei als funktionelle, polymorphe Marker für die Hauptstudie geeignet waren.

137 5. Zusammenfassung

Populationsgenetische und phylogeographische Analyse

Ein Probenset aus insgesamt 967 Pflanzenproben aus 70 Populationen aus Mitteleuropa inkl. der Alpen, den Regionen südlich und westlich der Alpen sowie aus Kanada und 18 Cultivaren wurde mittels der sieben neu etablierten, artspezifischen nukleären Mikrosatellitenmarker populationsgenetisch untersucht. Dabei erwiesen sich 21 der 31 untersuchten Populationen südlich und westlich der Alpen als genetisch hoch divers, die übrigen 10 zeigten vor allem klonales Wachstum und wiesen jeweils ein bis drei Multilocus-Genotypen (MLGs) auf. In 30 der 36 mitteleuropäischen Vorkommen (inkl. der Alpen) sowie den kanadischen Beständen war jeweils nur ein einziger MLG präsent. Drei der Vorkommen zeigten mit einem Heterozygotendefizit einzelner Stichproben Hinweise auf Geitonogamie, an drei weiteren Vorkommen traten jeweils zwei sowohl hinsichtlich der Blütenfarbe und -architektur als auch des MLG unterschiedliche Linien auf. An einem dieser Vorkommen wurde ein Hybrid-Genotyp detektiert, bisher der einzige molekulare Hinweis auf sexuelle Reproduktion im engeren Sinn in Mitteleuropa.

Die 967 Stichproben konnten insgesamt 310 individuellen Multilocus-Genotypen (MLGs) zugeordnet werden. Davon traten 233 MLGs nur in jeweils einer einzigen Probe auf, die 77 verbleibenden wurden in mehreren Akzessionen detektiert. Aus einer Simulation ging hervor, dass diese wiederholten MLGs auf rein asexuelle Reproduktion zurückzuführen sind. In Mitteleuropa waren lediglich 18 MLGs vertreten, von denen sieben an bis zu zehn, mehrere hundert Kilometer entfernten Fundorten auftraten. In Nordamerika gehören gar alle drei untersuchten Populationen dem gleichen Klon an. In Mitteleuropa traten in zwei Fällen somatische Mutationen zwischen zwei MLGs auf, sodass diese zu klonalen Linien (Multilocus- Linien; MLL) zusammengefasst werden konnten. Sieben der 18 Cultivare weisen einen zu diversen Freilandvorkommen identischen Genotypen auf.

Die Ergebnisse reflektieren den durch die anthropogene Selektion bedingten genetischen Flaschenhalseffekt, in dessen Folge der Genpool von Vinca minor in Mitteleuropa gegenüber der südeuropäischen Heimat der Art stark reduziert wurde. Sexuelle Reproduktion in Mitteleuropa zwischen zwei genetisch unterschiedlichen Individuen ist nur an wenigen Standorten überhaupt möglich und da meist nur ein Klon am gleichen Fundort auftritt, sehr selten. Die Ausbreitung erfolgt zudem rein anthropogen und über erhebliche Strecken, wie die identischen MLGs an unterschiedlichen, weit auseinander liegenden Fundorten belegen. Südlich und westlich der Alpen hingegen ist sexuelle Reproduktion über Samen häufig.

138 5. Zusammenfassung

Aus den kalkulierten Neighbour-Joining Phenogrammen, Neighbour-Nets und der Bayes'schen Analyse ergibt sich prinzipiell eine Abtrennung der in Norditalien und Slowenien gelegenen Vorkommen von den übrigen Regionen, wohingegen mehrere mittelitalienische Populationen mit denen westlich der Alpen und den mitteleuropäischen Vorkommen in einer engeren genetischen Beziehung stehen. Da die mittelitalienischen Vorkommen jedoch Anzeichen anthropogenen Ursprungs aufweisen (Monoklonalität, Lage an Wegrändern oder Burgen), lassen sich diese Populationen nur bedingt als potentielle Ursprungspopulationen ableiten. Die genetisch diversen norditalienischen und slowenischen Populationen sind trotz der Fragmentierung der norditalienischen Waldvegetation insgesamt nur moderat voneinander differenziert (FST=0,14, GST=0,17, RST=0,19). Die AMOVA ergab, dass über 80 % der genetischen Variation auf Variation innerhalb der Populationen zurückzuführen ist. Dennoch ergab sich aus einem Mantel-Test eine zunehmende genetische Differenzierung mit zunehmender geographischer Distanz (r=0,59).

Die phylogeographische Analyse wurde mit Hilfe von vier plastidären Mikrosatellitenmarkern aus der 454-Sequenzierung und zwei universellen plastidären ccmp-Mikrosatellitenloci durchgeführt. Untersucht wurden jeweils eine bis sechs Stichproben aus den o. g. 70 Populationen, die 18 Cultivare sowie zusätzliche Einzelproben aus mehreren Ländern, deren DNA aus Herbarbelegen isoliert wurde. Insgesamt wurden 297 Proben untersucht. Unter diesen wurden in der phylogeographischen Analyse sieben plastidäre Haplotypen detektiert. In der Region südlich der Alpen traten sechs Haplotypen auf (H1 bis H5, H7), in Mitteleuropa vier Haplotypen (H1 bis H3, H6), in Nordamerika, Großbritannien, Schweden und Nordamerika trat hingegen nur ein einziger Haplotyp H1 auf. Die beiden häufigsten Haplotypen nahmen im berechneten Haplotypen-Netzwerk periphere Positionen ein und waren durch sieben Mutationschritte voneinander getrennt. Südlich der Alpen ergab sich jedoch keine klare geographische Verteilung der Haplotypen. Auch die plastidären Daten indizieren somit eine geringere genetische Diversität in den Gebieten, wo V. minor eingeführt wurde. Der geographische Ursprung der mitteleuropäischen Vorkommen in Südeuropa konnte nicht abschließend geklärt werden, jedoch lässt das Vorkommen von zwei weit entfernten Haplotypen den Schluss zu, dass Vinca minor mindestens zweimal (und vermutlich mehrfach) unabhängig in Mitteleuropa eingeführt wurde.

139 6. Literaturverzeichnis

6. Literaturverzeichnis

Abdelkrim, J., Robertson, B. C., Stanton, J. A. L., & Gemmell, N. J. (2009). Fast, cost-effective development of species-specific microsatellite markers by genomic sequencing. Biotechniques, 46, 185-191.

Agapow, P. M., & Burt, A. (2001). Indices of multilocus linkage disequilibrium. Molecular Ecology Notes, 1, 101-102.

Aggarwal, R. K., Hendre, P. S., Varshney, R. K., Bhat, P. R., Krishnakumar, V., & Singh, L. (2007). Identification, characterization and utilization of EST- derived genic microsatellite markers for genome analyses of coffee and related species. Theoretical and Applied Genetics, 114, 359-372.

Ahmad, R., Liow, P. S., Spencer, D. F., & Jasieniuk, M. (2008). Molecular evidence for a single genetic clone of invasive Arundo donax in the United States. Aquatic Botany, 88, 113-120.

Ahrens, C. W., & James, E. A. (2014). Characterization of 13 microsatellite markers for Diuris basaltica (Orchidaceae) and related species. Applications in Plant Sciences, 2, published online, doi:10.3732/apps.1300069.

Albert, T., Raspé, O., & Jacquemart, A. L. (2008). Influence of clonal growth on selfing rate in Vaccinium myrtillus L. Plant Biology, 10, 643-649.

Alexander, L. W., & Woeste, K. E. (2013). Pyrosequencing of the northern red oak (Quercus rubra L.) chloroplast genome reveals high quality polymorphisms for population management. Tree Genetics & Genomes, 10, 803-812.

Ally, D., Ritland, K., & Otto, S. P. (2010). Aging in a long-lived clonal tree. PLoS Biology, 8, published online, doi: 10.1371/journal.pbio.1000454.

Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., & Lipman, D. J. (1990). Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology, 215, 403-410.

Altschul, S. F., Madden, T. L., Schäffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., & Lipman, D. J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, 25, 3389-3402.

Amin, S., Prentis, P. J., Gilding, E. K., & Pavasovic, A. (2014). Assembly and annotation of a non-model gastropod (Nerita melanotragus) transcriptome: a comparison of de novo assemblers. BMC Research Notes, 7, published online, doi:10.1186/1756-0500-7-488.

Arber, A. (1912). Herbals. Their origin and evolution. London: Cambridge University Press.

Arnaud-Haond, S., & Belkhir, K. (2007). GENCLONE: a computer program to analyse genotypic data, test for clonality and describe spatial clonal organization. Molecular Ecology Notes, 7, 15-17.

Auge, H., Neuffer, B., Erlinghagen, F., Grupe, R., & Brandl, R. (2001). Demographic and random amplified polymorphic DNA analyses reveal high levels of genetic diversity in a clonal violet. Molecular Ecology, 10, 1811-1819.

Avise, J. C. (2000). Phylogeography: the history and formation of species. Cambridge: Harvard University Press.

Backlund, M., Oxelman, B., & Bremer, B. (2000). Phylogenetic relationships within the Gentianales based on ndhF and rbcL sequences, with particular reference to the Loganiaceae. American Journal of Botany, 87, 1029-1043.

Baenfer, G., Moog, U., Fiala, B., Mohamed, M., Weising, K., & Blattner, F. R. (2006). A chloroplast genealogy of myrmecophytic Macaranga species (Euphorbiaceae) in Southeast Asia reveals hybridization, vicariance and long‐distance dispersals. Molecular Ecology, 15, 4409-4424.

Bakker, P. & Boeve, E. (1985). Stinzenplanten. 's Graveland: Vereniging tot behoud van Natuurmonumenten in Nederland.

Baldauf, C., Ciampi, M. B., Vigna, B. B., Mori, G. M., Guedes, J. P., De Souza, A. P., & dos Santos, F. A. (2011). Characterization of microsatellite loci in Himatanthus drasticus (Apocynaceae), a medicinal plant from the Brazilian savanna. American Journal of Botany, 98, published online, doi:10.3732/ajb.1100135.

Barsoum, N., Muller, E., & Skot, L. (2004). Variations in levels of clonality among Populus nigra L. stands of different ages. Evolutionary Ecology, 18, 601-624.

Baum, H. (1948). Über die postgenitale Verwachsung in Karpellen. Oesterreichische Botanische Zeitschrift, 95, 86-94.

Becher, S. A., Steinmetz, K., Weising, K., Boury, S., Peltier, D., Renou, J. P., Kahl, G., & Wolff, K. (2000). Microsatellites for cultivar identification in Pelargonium. Theoretical and Applied Genetics, 101, 643-651.

Behre, K. E. (1988). The role of man in European vegetation history. Dordrecht: Springer Netherlands.

Belkhir K., Borsa, P., Chikhi, L., Raufaste, N., & Bonhomme, F. (2004) GENETIX 4.05, logiciel sous Windows TM pour la génétique des populations. Laboratoire Génome, Populations, Interactions, CNRS UMR 5171, Université de Montpellier II, Montpellier (France). Distributed by the author, URL: http://kimura.univ-montp2.fr/genetix/

Bell, K. L., Murphy, D. J., & Gardner, M. G. (2013). Isolation, via 454 Sequencing, and characterization of microsatellites for Vachellia farnesiana (Fabaceae: Mimosoideae). Applications in Plant Sciences, 1, published online, doi:10.3732/apps.1300035.

Benkert, D., Fukarek, F., & Korsch, H. (1996). Verbreitungsatlas der Farn- und Blütenpflanzen Ostdeutschlands. Jena: Gustav Fischer.

Bhargava, A., & Fuentes, F. F. (2010). Mutational dynamics of microsatellites. Molecular Biotechnology, 44, 250-266.

140 6. Literaturverzeichnis

Bickler, C., A’Hara, S., Cottrell, J., Rogers, L., & Bridle, J. (2013). Characterisation of thirteen polymorphic microsatellite markers for cowslip (Primula veris L.) developed using a 454 sequencing approach. Conservation Genetics Resources, 5, 1185-1187.

Bird, C. E., Karl, S. A., Smouse, P. E., & Toonen, R. J. (2011). Detecting and measuring genetic differentiation. Phylogeography and population genetics in Crustacea, 19, 31-55.

Birky, C. W. (1996). Heterozygosity, heteromorphy, and phylogenetic trees in asexual eukaryotes. Genetics, 144, 427-437.

Birky, C. W. (2004). Bdelloid rotifers revisited. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101, 2651-2652.

Blouin, M. S. (2003). DNA-based methods for pedigree reconstruction and kinship analysis in natural populations. Trends in Ecology & Evolution, 18(10), 503-511.

Bock, H. (1560). Kreuterbuch. Digitalisiert von der Universitäts- und Landesbibliothek Düsseldorf, URL: http://digital.ub.uni- duesseldorf.de/vester/content/structure/5277713. [accessed 6th December 2014]

Bossu, A., Bertaudière-Montès, V., Dubut, V., & Manel, S. (2014). Microsatellite primers in Parietaria judaica (Urticaceae) to assess genetic diversity and structure in urban landscapes. Applications in Plant Sciences, 2, published online, doi:10.3732/apps.1400036.

Bowman, J. L., Smyth, D. R., & Meyerowitz, E. M. (1989). Genes directing flower development in Arabidopsis. The Plant Cell Online, 1, 37-52.

Brummitt, R. K., Pando, F., Hollis, S., & Brummitt, N. A. (2001). World geographical scheme for recording plant distributions. 2nd ed. Pittsburgh: Hunt Institute for Botanical Documentation Carnegie Mellon University. Available online, URL: http://www.nhm.ac.uk/hosted_sites/tdwg/TDWG_geo2.pdf. [accessed 2nd December 2014]

Bruschi, P., Vendramin, G. G., Bussotti, F., & Grossoni, P. (2000). Morphological and molecular differentiation between Quercus petraea (Matt.) Liebl. and Quercus pubescens Willd. (Fagaceae) in Northern and Central Italy. Annals of Botany, 85, 325-333.

Buehler, D., Graf, R., Holderegger, R., & Gugerli, F. (2011). Using the 454 pyrosequencing-based technique in the development of nuclear microsatellite loci in the alpine plant Arabis alpina (Brassicaceae). American Journal of Botany, published online, doi: 0.3732/ajb.1000488.

Bultman, T. L., & DeWitt, D. J. (2008). Effect of an invasive ground cover plant on the abundance and diversity of a forest floor spider assemblage. Biological Invasions, 10, 749-756.

Bundessortenamt (2014). Blatt für Sortenwesen. Amtsblatt des Bundessortenamts. Sonderheft Sortenregister. Available online, URL: http://www.bundessortenamt.de/internet30/fileadmin/Files/PDF/akt_Heft_BlfS.pdf [accessed 3rd December 2014]

Buschiazzo, E., & Gemmell, N. J. (2006). The rise, fall and renaissance of microsatellites in eukaryotic genomes. Bioessays, 28, 1040-1050.

Carlsson, J. (2008). Effects of microsatellite null alleles on assignment testing. Journal of Heredity, 99, 616-623.

Carman, J. G. (1997). Asynchronous expression of duplicate genes in angiosperms may cause apomixis, bispory, tetraspory, and polyembryony. Biological Journal of the Linnean Society, 61, 51-94.

Carneiro, M. O., Russ, C., Ross, M. G., Gabriel, S. B., Nusbaum, C., & DePristo, M. A. (2012). Pacific biosciences sequencing technology for genotyping and variation discovery in human data. BMC Genomics, 13, published online, doi:10.1186/1471-2164-13-375.

Castelloe, J., & Templeton, A. R. (1994). Root probabilities for intraspecific gene trees under neutral coalescent theory. Molecular Phylogenetics and Evolution, 3, 102-113.

Castoe, T. A., Poole, A. W., Gu, W., Jason de Koning, A. P., Daza, J. M., Smith, E. N., & Pollock, D. D. (2010). Rapid identification of thousands of copperhead snake (Agkistrodon contortrix) microsatellite loci from modest amounts of 454 shotgun genome sequence. Molecular Ecology Resources, 10, 341-347.

Celka, Z. (2011). Relics of cultivation in the vascular flora of medieval West Slavic settlements and castles. Biodiversity: Research and Conservation, 22, 1-110.

Celka, Z., & Drapikowska, M. (2008). Relics of cultivation in Central Europe: Malva alcea L. as an example. Vegetation History and Archaeobotany, 17, 251-255.

Celka, Z., Buczkowska, K., Baczkiewicz, A., & Drapikowska, M. (2010). Genetic differentiation among geographically close populations of Malva alcea. Acta Biologica Cracoviensia, Series Botanica, 52, 32-41.

Celka, Z., Drapikowska, M., Lembicz, M., Kubiak, L., & Szkudlarz, P. (2008). The population of Malva alcea at the medieval settlement: from distribution to the reproduction of individuals. Scripta Facultatis Rerum Naturalium Universitatis Ostraviensis, 186, 224-230.

Chapuis, M. P., & Estoup, A. (2007). Microsatellite null alleles and estimation of population differentiation. Molecular biology and evolution, 24, 621- 631.

Charpentier, A. (2002). Consequences of clonal growth for plant mating. Evolutionary Ecology, 15, 521-530.

Chatin, M. A. (1861). Sur les plantes des vieux chateaux. Bulletin de la Société Botanique de France, 8, 359-365.

Chatwin, W. B., Carpenter, K. K., Jimenez, F. R., Elzinga, D. B., Johnson, L. A., & Maughan, P. J. (2014). Microsatellite primer development for post oak, Quercus stellata (Fagaceae). Applications in Plant Sciences, 2, published online, doi:10.3732/apps.1400070.

141 6. Literaturverzeichnis

Cheddadi, R., Vendramin, G. G., Litt, T., François, L., Kageyama, M., Lorentz, S., ... & Lunt, D. (2006). Imprints of glacial refugia in the modern genetic diversity of Pinus sylvestris. Global Ecology and Biogeography, 15, 271-282.

Christ, K. D. (2004). Die Blütenökologie der Krautschicht naturnaher Wälder in der Umgebung von Ulm, Süddeutschland. Dissertation, Universität Ulm, Deutschland.

Cipriani, G., Lot, G., Huang, W. G., Marrazzo, M. T., Peterlunger, E., & Testolin, R. (1999). AC/GT and AG/CT microsatellite repeats in peach [Prunus persica (L.) Batsch]: isolation, characterisation and cross-species amplification in Prunus. Theoretical and Applied Genetics, 99, 65-72.

Clement, M., Posada, D. C. K. A., & Crandall, K. A. (2000). TCS: a computer program to estimate gene genealogies. Molecular Ecology, 9, 1657-1659.

Cook, R. E. (1983). Clonal plant populations: a knowledge of clonal structure can affect the interpretation of data in a broad range of ecological and evolutionary studies. American Scientist, 71, 244-253.

Corriveau, J. L., & Coleman, A. W. (1988). Rapid screening method to detect potential biparental inheritance of plastid DNA and results for over 200 angiosperm species. American Journal of Botany, 75, 1443-1458.

Cosendai, A. C., Wagner, J., Ladinig, U., Rosche, C., & Hörandl, E. (2013). Geographical parthenogenesis and population genetic structure in the alpine species Ranunculus kuepferi (Ranunculaceae). Heredity, 110, 560-569.

Csencsics, D., Brodbeck, S., & Holderegger, R. (2010). Cost-effective, species-specific microsatellite development for the endangered dwarf bulrush (Typha minima) using next-generation sequencing technology. Journal of Heredity, published online, doi:10.1093/jhered/esq069.

Cullen, J., Knees, S. G., & Cubey, H. Z. (2011). The European garden flora of flowering plants: a manual for the identification of plants cultivated in Europe, both out-of-doors and under glass. Cambridge: Cambridge University Press.

Daehler, C. C. (2001). Darwin's naturalization hypothesis revisited. The American Naturalist, 158, 324-330.

DAISIE European Invasive Alien Species Gateway (2008). European summary: aliens by groups. Available online, URL: http://www.europe- aliens.org/europeSummary.do [accessed 1st October 2014].

Dakin, E. E., & Avise, J. C. (2004). Microsatellite null alleles in parentage analysis. Heredity, 93, 504-509.

Danert, S., Hanelt, P., Helm, J., Kruse, J., Lehmann, C. O., Schultze-Motel, J. (1994). Urania Pflanzenreich. Band 2 Blütenpflanzen. Freiburg: Urania.

Darcy, A. J., & Burkart, M. C. (2002). Allelopathic potential of Vinca minor, an invasive exotic plant in west Michigan forests. Bios, 73, 127-132.

Darwin, C. R. (1861). Fertilisation of Vincas. Gardeners' Chronicle and Agricultural Gazette, 24, 552.

De Meeûs, T., Lehmann, L., & Balloux, F. (2006). Molecular epidemiology of clonal diploids: a quick overview and a short DIY (do it yourself) notice. Infection, Genetics and Evolution, 6, 163-170.

De Witte, L. C., & Stöcklin, J. (2010). Longevity of clonal plants: why it matters and how to measure it. Annals of Botany, 106, 859-870.

Debener, T., Janakiram, T., & Mattiesch, L. (2000). Sports and seedlings of rose varieties analysed with molecular markers. Plant Breeding, 119, 71- 74.

Dehnen-Schmutz, K. (1999). Nichteinheimische Pflanzen in der Flora mittelalterlicher Burgen. Dissertation, Technische Universität Berlin, Deutschland.

Dlugosch, K. M., & Parker, I. M. (2008). Founding events in species invasions: genetic variation, adaptive evolution, and the role of multiple introductions. Molecular Ecology, 17, 431-449.

Dong, M., Yu, F. H., & Alpert, P. (2014). Ecological consequences of plant clonality. Annals of Botany, 114, 367-367.

Doodeman, M., Gerats, A. G., Schram, A. W., De Vlaming, P., & Bianchi, F. (1984). Genetic analysis of instability in Petunia hybrida: 2. Unstable mutations at different loci as the result of transpositions of the genetic element inserted at the An1 locus. Theoretical and Applied Genetics, 67, 357- 366.

Dorken, M. E., & Eckert, C. G. (2001). Severely reduced sexual reproduction in northern populations of a clonal plant, Decodon verticillatus (Lythraceae). Journal of Ecology, 89, 339-350.

Douhovnikoff, V., & Dodd, R. S. (2003). Intra-clonal variation and a similarity threshold for identification of clones: application to Salix exigua using AFLP molecular markers. Theoretical and Applied Genetics, 106, 1307-1315.

Doyle, J. J., Morgante, M., Tingey, S. V., & Powell, W. (1998). Size homoplasy in chloroplast microsatellites of wild perennial relatives of soybean (Glycine subgenus Glycine). Molecular Biology and Evolution, 15, 215-218.

Drábková, L., Kirschner, J., & Vlĉek, Ĉ. (2002). Comparison of seven DNA extraction and amplification protocols in historical herbarium specimens of Juncaceae. Plant Molecular Biology Reporter, 20, 161-175.

Drummond, A. J., Ashton, B., Buxton, S., Cheung, M., Cooper, A., Duran, C., & Wilson, A. (2011). Geneious, version 5.4. Geneious, Auckland, New Zealand. Available online, URL: http://www.geneious.com. [accessed 20th January 2011]

Dubois, A., Raymond, O., Maene, M., Baudino, S., Langlade, N. B., Boltz, V., ... & Bendahmane, M. (2010). Tinkering with the C-function: a molecular frame for the selection of double flowers in cultivated roses. PLoS One, 5, published online, doi: 10.1371/journal.pone.0009288.

142 6. Literaturverzeichnis

Dupouey, J. L., Dambrine, E., Laffite, J. D., & Moares, C. (2002). Irreversible impact of past land use on forest soils and biodiversity. Ecology, 83, 2978- 2984.

Dutta, S., Kumawat, G., Singh, B. P., Gupta, D. K., Singh, S., Dogra, V., ... & Singh, N. K. (2011). Development of genic SSR markers by deep transcriptome sequencing in pigeonpea [Cajanus cajan (L.) Millspaugh]. BMC Plant Biology, 11, published online, doi:10.1186/1471-2229-11-17.

Earl, D. A. & vonHoldt, B. M. (2012). STRUCTURE HARVESTER: a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method. Conservation Genetics Resources, 4, 359-361.

East, E. M. (1940). The distribution of self-sterility in the flowering plants. Proceedings of the American Philosophical Society, 82, 449-518.

Ebert, D., & Peakall, R. (2009). Chloroplast simple sequence repeats (cpSSRs): technical resources and recommendations for expanding cpSSR discovery and applications to a wide array of plant species. Molecular Ecology Resources, 9, 673-690.

Eckert, C. G. (2000). Contributions of autogamy and geitonogamy to self-fertilization in a mass-flowering, clonal plant. Ecology, 81, 532-542.

EDDMapS. (2014). Early Detection & Distribution Mapping System. The University of Georgia - Center for Invasive Species and Ecosystem Health. Available online, URL: http://www.eddmaps.org/. [accessed 27th December 2014].

Edwards, A. L., Civitello, A., Hammond, H. A., & Caskey, C. T. (1991). DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. American Journal of Human Genetics, 49, 746-756.

Edwards, C. E., Parchman, T. L., & Weekley, C. W. (2011). Assembly, gene annotation and marker development using 454 floral transcriptome sequences in Ziziphus celata (Rhamnaceae), a highly endangered, Florida endemic plant. DNA Research, 1, 1-9.

Efron, B. (1979). Bootstrap methods: another look at the jackknife. The Annals of Statistics, 7, 1-26.

Eid, J., Fehr, A., Gray, J., Luong, K., Lyle, J., Otto, G., ... & Zhao, P. (2009). Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science, 323, 133-138.

Ekblom, R., & Galindo, J. (2010). Applications of next generation sequencing in molecular ecology of non-model organisms. Heredity, 107, 1-15.

Ellegren, H. (2004). Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nature Reviews Genetics, 5, 435-445.

Ellenberg, H. (1996). Vegetation Mitteleuropas mit den Alpen. Stuttgart: Ulmer.

Ellstrand, N. C., & Roose, M. L. (1987). Patterns of genotypic diversity in clonal plant species. American Journal of Botany, 74, 123-131.

Endress, M. E., & Bruyns, P. V. (2000). A revised classification of the Apocynaceae s. l. The Botanical Review, 66, 1-56.

Endress, M. E., Liede-Schumann, S., & Meve, U. (2014). An updated classification for Apocynaceae. Phytotaxa, 159, 175-194.

Erhardt, W., Götz, E., Bödeker, N., & Seybold, S. (2008) Der große Zander. Enzyklopädie der Pflanzennamen. Band 2 Arten und Sorten. Stuttgart: Ulmer.

Eriksson, O. (1993). Dynamics of genets in clonal plants. Trends in Ecology & Evolution, 8, 313-316.

Ersts, P. J. (2014). Geographic Distance Matrix Generator (version 1.2.3). American Museum of Natural History, Center for Biodiversity and Conservation. Available online, URL: http://biodiversityinformatics.amnh.org/open_source/gdmg. [accessed 28th December 2014].

Estoup, A., & Guillemaud, T. (2010). Reconstructing routes of invasion using genetic data: why, how and so what? Molecular Ecology, 19, 4113-4130.

Evanno, G., Regnaut, S., & Goudet, J. (2005). Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology, 14, 2611-2620.

Excoffier, L., Smouse, P. E., & Quattro, J. M. (1992). Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics, 131, 479-491.

Excoffier, L., Laval, G., & Schneider, S. (2005). Arlequin (version 3.0): an integrated software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online, 1, 47-50.

Excoffier, L., & Lischer, H. E. (2010). Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources, 10, 564-567.

Fajardo, D., Morales, J., Zhu, H., Steffan, S., Harbut, R., Bassil, N., ... & Zalapa, J. (2013). Discrimination of American cranberry cultivars and assessment of clonal heterogeneity using microsatellite markers. Plant Molecular Biology Reporter, 31, 264-271.

Felsenstein, J. (1985). Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution, 39, 783-791.

Fernandez-Silva, I., Whitney, J., Wainwright, B., Andrews, K. R., Ylitalo-Ward, H., Bowen, B. W., Toonen, R. J., Goetze, E., & Karl, S. A. (2013). Microsatellites for next-generation ecologists: a post-sequencing bioinformatics pipeline. PLoS One, 8, published online, doi: 10.1371/journal.pone.0055990.

Ferreira-Ramos, R., Monteiro, M., Zucchi, M. I., Pinheiro, J. B., Martinez, C. A., Mestriner, M. A., & Alzate-Marin, A. L. (2011). Microsatellite markers for Aspidosperma polyneuron (Apocynaceae), an endangered tropical tree species. American Journal of Botany, published online, doi: 10.3732/ajb.1100222.

143 6. Literaturverzeichnis

Ferris, C., King, R. A., Väinölä, R., & Hewitt, G. M. (1998). Chloroplast DNA recognizes three refugial sources of European oaks and suggests independent eastern and western immigrations to Finland. Heredity, 80, 584-593.

Fisher, P. J., Richardson, T. E., & Gardner, R. C. (1998). Characteristics of single-and multi-copy microsatellites from Pinus radiata. Theoretical and Applied Genetics, 96, 969-979.

Flores, C. G., Garza, L. A. L., Luz, J. W. L. D. L., & León, F. H. G. (2014). Development and Characterization of 10 Microsatellite Loci in the Giant Cardon Cactus, Pachycereus pringlei (Cactaceae). Applications in Plant Sciences, 2, published online, doi:10.3732/apps.1300066.

Forrest, J., & Thomson, J. D. (2009). Background complexity affects colour preference in bumblebees. Naturwissenschaften, 96, 921-925.

Fraser, L. G., Harvey, C. F., Crowhurst, R. N., & De Silva, H. N. (2004). EST-derived microsatellites from Actinidia species and their potential for mapping. Theoretical and Applied Genetics, 108, 1010-1016.

Frey, W., & Lösch, R. (2010). Geobotanik. Pflanze und Vegetation in Raum und Zeit. Heidelberg: Springer.

Fuchs, L. (1543). New Kreuterbuch. Digitalisiert von der Stadtbibliothek Ulm, URL: http://www.ulm.de/buecher/lfnkb1543/. [accessed 8th December 2014].

Gaertig, T. & Green, K. (2008). Die Waldbodenvegetation als Weiser für Bodenstrukturstörungen. AFZ-DerWald, 6, 300-301.

Garzón-Martínez, G. A., Zhu, Z. I., Landsman, D., Barrero, L. S., & Mariño-Ramírez, L. (2012). The Physalis peruviana leaf transcriptome: assembly, annotation and gene model prediction. BMC Genomics, 13, 151.

Gaul, H. (1964). Mutations in plant breeding. Radiation Botany, 4, 155-232.

Gederaas, L., Moen, T. L., Skjelseth, S., & Larsen, L.-K. (2012). Alien species in Norway – with the Norwegian Black List 2012. The Norwegian Biodiversity Centre. Available online, URL: http://www.artsdatabanken.no/File/689/Alien%20species. [accessed 9th December 2014].

Genton, B. J., Shykoff, J. A., & Giraud, T. (2005). High genetic diversity in French invasive populations of common ragweed, Ambrosia artemisiifolia, as a result of multiple sources of introduction. Molecular Ecology, 14, 4275-4285.

Gesang, K., Hoßfeld, U., & Wissemann, V. (2007). Zur Verwendung von Vinca minor L. als Ornament auf keramischen Wandfliesen des Jugendstils. Mitteilungen der Deutschen Dendrologischen Gesellschaft, 92, 94-96.

Gil, L., Fuentes-Utrilla, P., Soto, Á., Cervera, M. T., & Collada, C. (2004). Phylogeography: English elm is a 2,000-year-old Roman clone. Nature, 431, 1053.

Gilles, A., Meglécz, E., Pech, N., Ferreira, S., Malausa, T., & Martin, J. F. (2011). Accuracy and quality assessment of 454 GS-FLX Titanium pyrosequencing. BMC Genomics, 12, published online, doi:10.1186/1471-2164-12-245.

Giordano, A., Cogan, N. O., Kaur, S., Drayton, M., Mouradov, A., Panter, S., ... & Spangenberg, G. C. (2014). Gene discovery and molecular marker mevelopment, mased on high-throughput transcript sequencing of Paspalum dilatatum Poir. PloS One, 9, published online, doi: 10.1371/journal.pone.0085050.

Gitzendanner, M. A., Weekley, C. W., Germain-Aubrey, C. C., Soltis, D. E., & Soltis, P. S. (2012). Microsatellite evidence for high clonality and limited genetic diversity in Ziziphus celata (Rhamnaceae), an endangered, self-incompatible shrub endemic to the Lake Wales Ridge, Florida, USA. Conservation Genetics, 13, 223-234.

Givnish, T. J., Barfuss, M. H., Van Ee, B., Riina, R., Schulte, K., Horres, R., ... & Sytsma, K. J. (2011). Phylogeny, adaptive radiation, and historical biogeography in Bromeliaceae: insights from an eight-locus plastid phylogeny. American Journal of Botany, 98, 872-895.

Glenn, T. C. (2011). Field guide to next‐generation DNA sequencers. Molecular Ecology Resources, 11, 759-769.

Goudet, J. (1995). FSTAT (version 1.2): a computer program to calculate F-statistics. Journal of Heredity, 86, 485-486.

Govaerts, R., & Leeuwenberg, A. (2014). World Checklist of Apocynaceae. Facilitated by the Royal Botanic Gardens, Kew. Published online, URL: http://apps.kew.org/wcsp/ [accessed 7th October 2014].

Grivet, D., & Petit, R. J. (2002). Phylogeography of the common ivy (Hedera sp.) in Europe: genetic differentiation through space and time. Molecular Ecology, 11, 1351-1362.

Grivet, D., & Petit, R. J. (2003). Chloroplast DNA phylogeography of the hornbeam in Europe: evidence for a bottleneck at the outset of postglacial colonization. Conservation Genetics, 4, 47-56.

Grohme, M. A., Soler, R. F., Wink, M., & Frohme, M. (2013). Microsatellite marker discovery using single molecule real-time circular consensus sequencing on the Pacific Biosciences RS. BioTechniques, 55, 253-256.

Gross, C. L., Nelson, P. A., Haddadchi, A., & Fatemi, M. (2011). Somatic mutations contribute to genotypic diversity in sterile and fertile populations of the threatened shrub, Grevillea rhizomatosa (Proteaceae). Annals of Botany, published online, doi: 10.1093/aob/mcr283.

Gugger, P. F., González‐Rodríguez, A., Rodríguez‐Correa, H., Sugita, S., & Cavender‐Bares, J. (2011). Southward Pleistocene migration of Douglas‐fir into Mexico: phylogeography, ecological niche modeling, and conservation of ‘rear edge’populations. New Phytologist, 189, 1185-1199.

Guichoux, E., Lagache, L., Wagner, S., Chaumeil, P., Léger, P., Lepais, O., ... & Petit, R. J. (2011). Current trends in microsatellite genotyping. Molecular Ecology Resources, 11, 591-611.

144 6. Literaturverzeichnis

Guicking, D., Fiala, B., Kröger‐Kilian, T., Mohamed, M., & Weising, K. (2013). High gene flow in two thrips‐pollinated South‐East Asian pioneer trees: genetic diversity and population structure of Macaranga hypoleuca and M. beccariana (Euphorbiaceae). Botanical Journal of the Linnean Society, 173, 606-621.

Guicking, D., Köger-Kilian, T, Weising, K., & Blattner, F. R. (2008). Single nucleotide sequence analysis: a cost‐and time‐effective protocol for the analysis of microsatellite‐and indel‐rich chloroplast DNA regions. Molecular Ecology Resources, 8, 62-65.

Guicking, D., Rana, T. S., Blattner, F. R., & Weising, K. (2006). Microsatellite markers for the palaeotropic pioneer tree genus Macaranga (Euphorbiaceae) and their cross‐species transferability. Molecular Ecology Notes, 6, 245-248.

Guido Paoletti, M., & Giorgio Lorenzoni, G. (1989). Agroecology patterns in northeastern Italy. Agriculture, Ecosystems & Environment, 27, 139-154.

Gumiero, B., Maiolini, B., Surian, N., Rinaldi, M., Boz, B., Moroni, F. (2009) The Italian Rivers. In: Tockner, K., Robinson, C. T. & Uehlinger, U. (eds.), Rivers of Europe. London: Academic Press.

Gupta, P. K., Balyan, H. S., Sharma, P. C., & Ramesh, B. (1996). Microsatellites in plants: a new class of molecular markers. Current Science, 45, 45-54.

Haeupler, H., & Schönfelder, P. (1988). Atlas der Farn-und Blütenpflanzen der Bundesrepublik Deutschland. Stuttgart: Ulmer.

Halkett, F., Simon, J. C., & Balloux, F. (2005). Tackling the population genetics of clonal and partially clonal organisms. Trends in Ecology & Evolution, 20, 194-201.

Hamilton, M. B. (2009). Population genetics. Oxford: Wiley-Blackwell.

Hancock, J. M. (1999). Microsatellites and other simple sequences: genomic context and mutational mechanisms. Microsatellites: Evolution and Applications, 1, 3-9.

Harper, J. L. (1977). Population biology of plants. London: Academic Press.

Harris, H. (1966). Enzyme polymorphisms in man. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, 164, 298-310.

Hegi, G. (1966). Illustrierte Flora von Mitteleuropa. Band 5. Teil 3. Berlin: Parey.

Hejcman, M., Karlík, P., Ondráček, J., & Klír, T. (2013). Short-term medieval settlement activities irreversibly changed forest soils and vegetation in Central Europe. Ecosystems, 16, 652-663.

Hempel, W. (2009). Die Pflanzenwelt Sachsens von der Spätseizeit bis zur Gegenwart. Jena: Weißdorn-Verlag. Hinkle, A. E. (2007). Population structure of Pacific Cordyline fruticosa (Laxmanniaceae) with implications for human settlement of Polynesia. American Journal of Botany, 94, 828-839.

Höchtl, F. (2014). Pflanzen als Geschichtszeugen in historischen Gärten und Parks. Denkmalpflege in Baden-Württemberg, Nachrichtenblatt der Landesdenkmalpflege, 36(2), 82-89.

Hohla, M. (2009). Lebendige Spuren aus der Vergangenheit – Pflanzen unserer Burgen, Schlösser und Klöster. ÖKO-L, 31, 13-24.

Hollingsworth, M. L., & Bailey, J. P. (2000). Evidence for massive clonal growth in the invasive weed Fallopia japonica (Japanese Knotweed). Botanical Journal of the Linnean Society, 133, 463-472.

Holsinger, K. E., & Weir, B. S. (2009). Genetics in geographically structured populations: defining, estimating and interpreting FST. Nature Reviews Genetics, 10, 639-650.

Honnay, O., Hermy, M., & Coppin, P. (1999). Impact of habitat quality on forest plant species colonization. Forest Ecology and Management, 115, 157- 170.

Honnay, O., & Bossuyt, B. (2005). Prolonged clonal growth: escape route or route to extinction? Oikos, 108, 427-432.

Hübl, E., & Scharfetter, E. (2008). Zur Gefäßpflanzenflora von Burgruinen in Niederösterreich. Braunschweiger Geobotanische Arbeiten, 9, 249-310.

Hueck, K. (1934). Die Pflanzenwelt der deutschen Heimat und der angrenzenden Gebiete. Band 1: Der Wald. Berlin: Bermühler.

Huson, D. H. (1998). SplitsTree: analyzing and visualizing evolutionary data. Bioinformatics, 14, 68-73.

Huson, D. H., & Bryant, D. (2006). Application of phylogenetic networks in evolutionary studies. Molecular Biology and Evolution, 23, 254-267.

Jacob, H. J., Lindpaintner, K., Lincoln, S. E., Kusumi, K., Bunker, R. K., Mao, Y. P., Ganten, D., Dzau, V. J., & Lander, E. S. (1991). Genetic mapping of a gene causing hypertension in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat. Cell, 67, 213-224.

Jakob, S. S., Ihlow, A., & Blattner, F. R. (2007). Combined ecological niche modelling and molecular phylogeography revealed the evolutionary history of Hordeum marinum (Poaceae) - niche differentiation, loss of genetic diversity, and speciation in Mediterranean Quaternary refugia. Molecular Ecology, 16, 1713-1727.

James, E. A., & McDougall, K. L. (2014). Spatial genetic structure reflects extensive clonality, low genotypic diversity and habitat fragmentation in Grevillea renwickiana (Proteaceae), a rare, sterile shrub from south-eastern Australia. Annals of Botany, 114, 413-423.

Jarne, P., & Lagoda, P. J. (1996). Microsatellites, from molecules to populations and back. Trends in Ecology & Evolution, 11, 424-429.

145 6. Literaturverzeichnis

Jekyll, G. (1900). Home and garden. Notes and thoughts, practical and critical, of a worker in both. Reprint 2011. Cambridge: Cambridge University Press.

Jelinski, D. E., & Cheliak, W. M. (1992). Genetic diversity and spatial subdivision of Populus tremuloides (Salicaceae) in a heterogeneous landscape. American Journal of Botany, 79, 728-736.

Jensen, J. L., Bohonak, A. J., & Kelley, S. T. (2005). Isolation by distance, web service. BMC Genetics, 6, published online, doi:10.1186/1471-2156-6-13.

Jurka, J., & Pethiyagoda, C. (1995). Simple repetitive DNA sequences from primates: compilation and analysis. Journal of Molecular Evolution, 40, 120-126.

Kabat, S. M., Dick, C. W., & Hunter, M. D. (2010). Isolation and characterization of microsatellite loci in the common milkweed, Asclepias syriaca (Apocynaceae). American journal of botany, 97, published online, doi:10.3732/ajb.1000064.

Kadereit, J. W., Arafeh, R., Somogyi, G., & Westberg, E. (2005). Terrestrial growth and marine dispersal? Comparative phylogeography of five coastal plant species at a European scale. Taxon, 54, 861-876.

Kalinowski, S. T. (2009). How well do evolutionary trees describe genetic relationships among populations? Heredity, 102, 506-513.

Kang, M., Buckley, Y. M., & Lowe, A. J. (2007). Testing the role of genetic factors across multiple independent invasions of the shrub Scotch broom (Cytisus scoparius). Molecular Ecology, 16, 4662-4673.

Kaplan, J. O., Krumhardt, K. M., & Zimmermann, N. (2009). The prehistoric and preindustrial deforestation of Europe. Quaternary Science Reviews, 28, 3016-3034.

Keller, L. F., & Waller, D. M. (2002). Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology & Evolution, 17, 230-241.

Khanavi, M., Pourmoslemi, S., Farahanikia, B., Hadjiakhoondi, A., & Ostad, S. N. (2010). Cytotoxicity of Vinca minor. Pharmaceutical biology, 48, 96- 100.

Kikuchi, R., Jae‐Hong, P., Takahashi, H., & Maki, M. (2010). Disjunct distribution of chloroplast DNA haplotypes in the understory perennial Veratrum album ssp. oxysepalum (Melanthiaceae) in Japan as a result of ancient introgression. New Phytologist, 188, 879-891.

Kimura, M., & Crow, J. F. (1964). The number of alleles that can be maintained in a finite population. Genetics, 49, 725-783.

Kimura, M., & Ohta, T. (1978). Stepwise mutation model and distribution of allelic frequencies in a finite population. Proceedings of the National Academy of Sciences, 75, 2868-2872.

Kirschleger, M. F. (1862). Sur les plantes des vieux chateaux, dans la région Alsato-Vosgienne. Bulletin de la Société Botanique de France, 9, 15-18.

Klekowski, E. J. (1997). Somatic mutation theory of clonality. In: De Kroon, H. and Van Groenendael, J. (eds.), The ecology and evolution of clonal plants. Leiden: Backhuys.

Klekowski, E. J. (2003). Plant clonality, mutation, diplontic selection and mutational meltdown. Biological Journal of the Linnean Society, 79, 61-67.

Klimeš, L., Klimešova, J., Hendriks R. J. J., & Van Groenendael, J. M. (1997). Clonal plant architecture: a comparative analysis of form and function. In: de Kroon, H. & Groenendael, J. M. (eds.), The ecology and evolution of clonal plants. Leiden: Backhuys.

Knoll, F. (1921). Bombylius fuliginosus und die Farbe der Blumen (Insekten und Blumen I). Abhandlungen der Zoologisch-Botanischen Gesellschaft in Wien, 12, 17-119.

Kofler, R., Schlötterer, C., & Lelley, T. (2007). SciRoKo: a new tool for whole genome microsatellite search and investigation. Bioinformatics, 23, 1683- 1685.

Koskinen, M. T., Hirvonen, H., Landry, P. A., & Primmer, C. R. (2004). The benefits of increasing the number of microsatellites utilized in genetic population studies: an empirical perspective. Hereditas, 141, 61-67.

Kostenzer, O. (1971). Notizen zu Vitus Auslasser und sein Herbar von 1479. Veröffentlichungen des Tiroler Landesmuseum Ferdinandeum, 51, 87-97.

Kowarik, I. (2003). Biologische Invasionen. Neophyten und Neozoen in Mitteleuropa. Stuttgart: Ulmer.

Koyuncu, M. (2012). A new species of Vinca (Apocynaceae) from eastern Anatolia, Turkey. Turkish Journal of Botany, 36, 247-251.

Krapp, F. (2009). Molekulare Verwandtschaftsanalysen in der Gattung Dyckia (Bromeliaceae). Diplomarbeit, Universität Kassel, Deutschland.

Krapp, F., Wöhrmann, T., de Barros Pinangé, D. S., Benko-Iseppon, A. M., Huettel, B., & Weising, K. (2012). A set of plastid microsatellite loci for the genus Dyckia (Bromeliaceae) derived from 454 pyrosequencing. American Journal of Botany, 99, e470-e473.

Krausch, H. D. (1990). Die Einführung der Zierpflanzen nach Mitteleuropa. In: Kulturbund e. V. Gesellschaft für Denkmalpflege (Hrsg.): Denkmalpflege. Beiträge zur Gartendenkmalpflege. Blumenverwendung in historischen Gärten.

Krausch, H.-D. (2012). Kaiserkron und Päonien rot... Entdeckung und Einführung unserer Gartenblumen. 2. Auflage. München: Dölling und Garlitz.

Ku, C., Chung, W. C., Chen, L. L., & Kuo, C. H. (2013). The complete plastid genome sequence of Madagascar periwinkle Catharanthus roseus (L.) G. Don: plastid genome evolution, molecular marker identification, and phylogenetic implications in asterids. PloS One, 8, published online, doi: 10.1371/journal.pone.0068518.

146 6. Literaturverzeichnis

Kumar, S., Shah, N., Garg, V., & Bhatia, S. (2014). Large scale in-silico identification and characterization of simple sequence repeats (SSRs) from de novo assembled transcriptome of Catharanthus roseus (L.) G. Don. Plant Cell Reports, 33, 905-918.

Kumpatla, S. P., & Mukhopadhyay, S. (2005). Mining and survey of simple sequence repeats in expressed sequence tags of dicotyledonous species. Genome, 48, 985-998.

Kunick, W. (1991). Ausmaß und Bedeutung der Verwilderung von Gartenpflanzen. Berichte der Akademie für Naturschutz, 4, 6-13.

Labhart, G. (2005). Neues von Vinca, dem Bodendecker. g'plus Die Gärtner-Fachzeitschrift, 21, 26-29.

Lang, G. (1994). Quartäre Vegetationsgeschichte Europas: Methoden und Ergebnisse. Heidelberg: Spektrum.

Langella, O. (1999). Populations 1.2.31. Distributed by the author, available online, URL: http://bioinformatics.org/~tryphon/populations/. [accessed 15th September 2014].

Lawson, J. (1950). The Roman Garden. Greece and Rome, 19, 97-105.

Le Roux, J. J., Brown, G. K., Byrne, M., Ndlovu, J., Richardson, D. M., Thompson, G. D., & Wilson, J. R. (2011). Phylogeographic consequences of different introduction histories of invasive Australian Acacia species and Paraserianthes lophantha (Fabaceae) in South Africa. Diversity and Distributions, 17, 861-871.

Legendre, P., & Fortin, M. J. (2010). Comparison of the Mantel test and alternative approaches for detecting complex multivariate relationships in the spatial analysis of genetic data. Molecular Ecology Resources, 10, 831-844.

Leinonen, R., Sugawara, H., & Shumway, M. (2010). The sequence read archive. Nucleic Acids Research, published online, doi:10.1093/nar/gkq1019.

Levinson, G., & Gutman, G. A. (1987). Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution. Molecular Biology and Evolution, 4, 203-221.

Lichthardt, J. (1995). Monitoring of clustered Lady's Slipper orchid (Cypripedium fasciculatum Kell. Ex Wats.) at Apgar Campground, Clearwater National Forest. Idaho Department of Fish and Game. Published online, URL https://www.fishandgame.idaho.gov/ifwis/idnhp/cdc_pdf/cyfa95.pdf. [accessed 9th October 2014].

Litt, M., & Luty, J. A. (1989). A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. American Journal of Human Genetics, 44, 397-401.

Livshultz, T., Middleton, D. J., Endress, M. E., & Williams, J. K. (2007). Phylogeny of Apocynoideae and the APSA clade (Apocynaceae s. l.). Annals of the Missouri Botanical Garden, 94, 324-359.

Lohmeyer, W. & Sukopp, H. (1992). Agriophyten in der Vegetation Mitteleuropas. Schriftenreihe für Vegetationskunde, 25, 1-185.

Lorenzoni, G. G., & Zanaboni, A. (1988). L'importanza delle vegetazioni relitte e delle siepi nell 'agroecosistema della Pianura Padana e nella ricostruzione dinamica della vegetazione. Thalassia Salentina, 18, 447-455.

Loxdale, H. D., & Lushai, G. (2003). Rapid changes in clonal lines: the death of a ‘sacred cow’. Biological Journal of the Linnean Society, 79, 3-16.

Ludwig, F. (1881). Zur Biologie der Apocyneen. Botanisches Centralblatt, 8, 187-188.

Mantel, N. (1967). The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Research, 27, 209-220.

Mantel, N., & Valand, R. S. (1970). A technique of nonparametric multivariate analysis. Biometrics, 26, 547-558.

Marcotrigiano, M. (1997). Chimeras and variegation: patterns of deceit. HortScience, 32, 773-784.

Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E., Attiya, S., Bader, J. S., Bemben, L. A., ... & Volkmer, G. A. (2005). Genome sequencing in microfabricated high- density picolitre reactors. Nature, 437, 376-380.

Marshall, H. D., Newton, C., & Ritland, K. (2002). Chloroplast phylogeography and evolution of highly polymorphic microsatellites in lodgepole pine (Pinus contorta). Theoretical and Applied Genetics, 104, 367-378.

Masel, J., & Lyttle, D. N. (2011). The consequences of rare sexual reproduction by means of selfing in an otherwise clonally reproducing species. Theoretical Population Biology, 80, 317-322.

Mathew, J., & Vasudeva, R. (2003). Clonal variation for seed germination in teak (Tectona grandis Linn. f.). Current Science, 84, 1133-1136.

Mawe, T., & Abercrombie, J. (1778). The universal gardener and botanist: or, a general dictionary of gardening and botany. London: Robinson.

McKey, D., Elias, M., Pujol, B., & Duputié, A. (2010). The evolutionary ecology of clonally propagated domesticated plants. New Phytologist, 186, 318- 332.

McLellan, A. J., Prati, D., Kaltz, O., Schmid, B. (1997). Structure and analysis of phenotypic and genetic variation in clonal plants. In: De Kroon, H. and Van Groenendael, J. (eds.), The ecology and evolution of clonal plants. Leiden: Backhuys.

Meirmans, P. G., & Van Tienderen, P. H. (2004). GENOTYPE and GENODIVE: two programs for the analysis of genetic diversity of asexual organisms. Molecular Ecology Notes, 4, 792-794.

Melodelima, C., & Lobréaux, S. (2013). Complete Arabis alpina chloroplast genome sequence and insight into its polymorphism. Meta Gene, 1, 65-75.

147 6. Literaturverzeichnis

Messier, W., Li, S. H., & Stewart, C. B. (1996). The birth of microsatellites. Nature, 381, 483-487.

Metzker, M. L. (2010). Sequencing technologies - the next generation. Nature Reviews Genetics, 11, 31-46.

Meusel, H. , Jäger, E., Rauschert, S. & Weinert, E. (1978a). Vergleichende Chorologie der zentraleuropäischen Flora. Band 2 Textband. Jena: Fischer.

Meusel, H., Jäger, E., Rauschert, S., & Weinert, E. (1978b). Vergleichende Chorologie der zentraleuropäischen Flora. Band 1. Atlas. Jena: Fischer.

Miller, J. H. (2003). Nonnative invasive plants of southern forests. A field guide for identification and control. USDA Forest Service. Available online, URL: http://www.srs.fs.usda.gov/fia/data_acquisition/field_guide/Nonnative_Invasive_Plants_of_Southern_Forests.pdf. [accessed 10th October 2014].

Miller, J. R., Koren, S., & Sutton, G. (2010). Assembly algorithms for next-generation sequencing data. Genomics, 95, 315-327.

Mishra, R. K., Gangadhar, B. H., Yu, J. W., Kim, D. H., & Park, S. W. (2011). Development and characterization of EST based SSR markers in Madagascar periwinkle ('Catharanthus roseus') and their transferability in tther tedicinal plants. Plant Omics, 4, 154.

Molinier, V., Murat, C., Morin, E., Gollotte, A., Wipf, D., & Martin, F. (2013). First identification of polymorphic microsatellite markers in the Burgundy truffle, Tuber aestivum (Tuberaceae). Applications in Plant Sciences, 1, published online, doi: 10.3732/apps.1200220.

Möller, S. (2011). Populationsgenetische Untersuchungen am Kleinen Immergrün (Vinca minor L., Apocynaceae). Diplomarbeit, Universität Kassel, Deutschland.

Morgante, M., & Olivieri, A. M. (1993). PCR‐amplified microsatellites as markers in plant genetics. The Plant Journal, 3, 175-182.

Morgante, M., Hanafey, M., & Powell, W. (2002). Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes. Nature Genetics, 30, 194-200.

Morrison, D. A. (2005). Networks in phylogenetic analysis: new tools for population biology. International Journal for Parasitology, 35, 567-582.

Murray, M. G., & Thompson, W. F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research, 8, 4321-4326.

Nakahama, N., Kaneko, S., Hayano, A., Isagi, Y., Inoue-Murayama, M., & Tominaga, T. (2012). Development of microsatellite markers for the endangered grassland species Vincetoxicum pycnostelma (Apocynaceae) by using next-generation sequencing technology. Conservation Genetics Resources, 4, 669-671.

Nazar, N., Goyder, D. J., Clarkson, J. J., Mahmood, T., & Chase, M. W. (2013). The taxonomy and systematics of Apocynaceae: where we stand in 2012. Botanical Journal of the Linnean Society, 171, 482-490.

Nei, M. (1973). Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences, 70, 3321-3323.

Nei, M., & Li, W. H. (1979). Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences, 76, 5269-5273.

Nei, M., Tajima, F., & Tateno, Y. (1983). Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data. Journal of Molecular Evolution, 19, 153-170.

Nevill, P. G., Williams, A., Krauss, S., Bradbury, D., Samaraweera, S., & Gardner, M. G. (2013). Development of microsatellite loci for the riparian tree species Melaleuca argentea (Myrtaceae) using 454 sequencing. Applications in Plant Sciences, 1, published online, doi:10.3732/apps.1200401.

Nitsche, L., Nitsche, S. & Lucan, V. (1990). Flora des Kasseler Raumes. Teil II: Atlas. Naturschutzring Nordhessen e. V. (Hersg.): Naturschutz in Hessen, Sonderheft 5.

Nogler, G. A. (1984). Gametophytic apomixis. In: Johri, B. M. (ed.), Embryology of Angiosperms. Berlin: Springer.

Nyakas, C., Felszeghy, K., Szabó, R., Keijser, J. N., Luiten, P. G., Szombathelyi, Z., & Tihanyi, K. (2009). Neuroprotective effects of vinpocetine and its major metabolite cis‐apovincaminic acid on NMDA‐induced neurotoxicity in a rat entorhinal cortex lesion model. CNS Neuroscience & Therapeutics, 15, 89-99.

Nybom, H. (1990). DNA fingerprints in sports of Red Delicious' apples. HortScience, 25, 1641-1642.

Obermayer, R., & Greilhuber, J. (2006). Cryptopolyploidy revisited: the case of Vinca (Apocynaceae). Plant Systematics and Evolution, 256, 201-208.

Okada, M., Lyle, M., & Jasieniuk, M. (2009). Inferring the introduction history of the invasive apomictic grass Cortaderia jubata using microsatellite markers. Diversity and Distributions, 15, 148-157.

Olmstead, R. G., & Palmer, J. D. (1994). Chloroplast DNA systematics: a review of methods and data analysis. American Journal of Botany, 81, 1205- 1224.

Oltmann, F. (1927). Das Pflanzenleben des Schwarzwaldes. 3. Auflage. Freiburg: Badischer Schwarzwaldverein.

Oostermeijer, J. G. B., Van Eijck, M. W., Van Leeuwen, N. C., & Den Nijs, J. C. M. (1995). Analysis of the relationship between allozyme heterozygosity and fitness in the rare Gentiana pneumonanthe L. Journal of Evolutionary Biology, 8, 739-759.

O’Quinn, R. L., & Fishbein, M. (2009). Isolation, characterization and cross-species amplification of polymorphic microsatellite loci in Asclepias (Apocynaceae). Conservation Genetics, 10, 1437-1440.

148 6. Literaturverzeichnis

Orive, M. E. (2001). Somatic mutations in organisms with complex life histories. Theoretical Population Biology, 59, 235-249.

Ortiz, P. L. & Arista, M. (2010). Vinca L. In: S. Talavera, C. Andrés, M. Arista, M.P. Fernández Piedra, M.J. Gallego, P.L. Ortiz, C. Romero Zarco, F.J. Salgueiro, S. Silvestre & A. Quintanar (eds.), Flora Iberica, Volume XI, Gentianaceae-Boraginaceae. Available online, URL: http://www.floraiberica.es/floraiberica/texto/pdfs/11_131_02_Vinca.pdf.

Palmé, A. E., Semerikov, V., & Lascoux, M. (2003). Absence of geographical structure of chloroplast DNA variation in sallow, Salix caprea L. Heredity, 91, 465-474.

Paoletti, G. M., & Lorenzoni, G. G. (1989). Agroecology patterns in northeastern Italy. Agriculture, Ecosystems & Environment, 27, 139-154.

Parker, K. C., Hamrick, J. L., Hodgson, W. C., Trapnell, D. W., Parker, A. J., & Kuzoff, R. K. (2007). Genetic consequences of pre-Columbian cultivation for Agave murpheyi and A. delamateri (Agavaceae). American Journal of Botany, 94, 1479-1490.

Parker, K. C., Trapnell, D. W., Hamrick, J. L., Hodgson, W. C., & Parker, A. J. (2010). Inferring ancient Agave cultivation practices from contemporary genetic patterns. Molecular Ecology, 19, 1622-1637.

Parker, K. C., Trapnell, D. W., Hamrick, J. L., & Hodgson, W. C. (2014). Genetic and morphological contrasts between wild and anthropogenic populations of Agave parryi var. huachucensis in south-eastern Arizona. Annals of Botany, 113, 939-952.

Patyar, S., Prakash, A., Modi, M., & Medhi, B. (2011). Role of vinpocetine in cerebrovascular diseases. Pharmacological Reports, 63, 618-628.

Paun, O., & Hörandl, E. (2006). Evolution of hypervariable microsatellites in apomictic polyploid lineages of Ranunculus carpaticola: directional bias at dinucleotide loci. Genetics, 174, 387-398.

Peakall, R., & Smouse, P. E. (2006). GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes, 6, 288-295.

Peakall, R., & Smouse, P. E. (2012). GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research - an update. Bioinformatics, 28, 2537-2539.

Perger, A. R.v. (1861). Ueber den Gebrauch unserer heimischen Pflanzen bei kirchlichen und weltlichen Festen. Verhandlungen der Zoologisch- Botanischen Gesellschaft in Wien, früher Verh. des Zoologisch-Botanischen Vereins in Wien, 11, 279-284.

Perry, J. C., & Rowe, L. (2011). Rapid microsatellite development for water striders by next-generation sequencing. Journal of Heredity, 102, 125-129.

Peterson, P. M., Romaschenko, K., & Johnson, G. (2010). A classification of the Chloridoideae (Poaceae) based on multi-gene phylogenetic trees. Molecular Phylogenetics and Evolution, 55, 580-598.

Petit, R. J., Aguinagalde, I., de Beaulieu, J. L., Bittkau, C., Brewer, S., Cheddadi, R., ... & Vendramin, G. G. (2003). Glacial refugia: hotspots but not melting pots of genetic diversity. Science, 300, 1563-1565.

Pfeiffer, T., Klahr, A., Peterson, A., Levichev, I. G., & Schnittler, M. (2012). No sex at all? Extremely low genetic diversity in Gagea spathacea (Liliaceae) across Europe. Flora, 207, 372-378.

Pielou, E. C. (1969). An introduction to mathematical ecology. New York: Wiley Interscience.

Pignatti, E., & Pignatti, S. (2014). Plant Life of the Dolomites. Berlin: Springer.

Pignatti, S. (1982). Flora d'Italia. Vol. 3. Bologna: Edagricole.

Plue, J., Van Gils, B., Peppler-Lisbach, C., De Schrijver, A., Verheyen, K., & Hermy, M. (2010). Seed-bank convergence under different tree species during forest development. Perspectives in Plant Ecology, Evolution and Systematics, 12, 211-218.

Pop, M. (2009). Genome assembly reborn: recent computational challenges. Briefings in Bioinformatics, 10, 354-366.

Posada, D., & Crandall, K. A. (2001). Selecting the best-fit model of nucleotide substitution. Systematic Biology, 50, 580-601.

Postolache, D., Leonarduzzi, C., Piotti, A., Spanu, I., Roig, A., Fady, B., Roschanski, A., Liepelt, S., & Vendramin, G. G. (2014). Transcriptome versus genomic microsatellite markers: highly informative multiplexes for genotyping Abies alba Mill. and congeneric species. Plant Molecular Biology Reporter, 32, 750-760.

Pott, R. (1994). Naturnahe Altwälder und deren Schutzwürdigkeit. NNA-Berichte, 3, 115-133.

Powell, W., Machray, G. C., & Provan, J. (1996). Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends in Plant Science, 1, 215-222.

Powell, W., Morgante, M., Andre, C., McNicol, J. W., Machray, G. C., Doyle, J. J., Tingey, S. V., & Rafalski, J. A. (1995). Hypervariable microsatellites provide a general source of polymorphic DNA markers for the chloroplast genome. Current Biology, 5, 1023-1029.

Powell, W., Morgante, M., McDevitt, R., Vendramin, G. G., & Rafalski, J. A. (1995). Polymorphic simple sequence repeat regions in chloroplast genomes: applications to the population genetics of pines. Proceedings of the National Academy of Sciences, 92, 7759-7763.

Prange, W. (1996). Das Kleine Immergrün (Vinca minor L.) in Westdeutschland – eine Kulturreliktpflanze aus römischer Zeit. Schriften des Naturwissenschaftlichen Vereins Schleswig-Holstein, 66, 71-96.

Prentice, H. C., Malm, J. U., & Hathaway, L. (2008). Chloroplast DNA variation in the European herb Silene dioica (red campion): postglacial migration and interspecific introgression. Plant Systematics and Evolution, 272, 23-37.

149 6. Literaturverzeichnis

Pritchard, J. K., Stephens, M., & Donnelly, P. (2000). Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics, 155, 945-959.

Provan, J., Powell, W., & Hollingsworth, P. M. (2001). Chloroplast microsatellites: new tools for studies in plant ecology and evolution. Trends in Ecology & Evolution, 16, 142-147.

Provan, J., Soranzo, N., Wilson, N. J., Goldstein, D. B., & Powell, W. (1999). A low mutation rate for chloroplast microsatellites. Genetics, 153, 943-947.

Quail, M. A., Smith, M., Coupland, P., Otto, T. D., Harris, S. R., Connor, T. R., Bertoni, A., Swerdlow, H. P. & Gu, Y. (2012). A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics, 13, doi:10.1186/1471-2164- 13-341.

Rambaut, A. (2006). FigTree 1.4.2. Distributed by the author, available online, URL: http://beast.bio.ed.ac.uk/FigTree. [accessed 11th November 2014].

Raquin, A. L., Depaulis, F., Lambert, A., Galic, N., Brabant, P., & Goldringer, I. (2008). Experimental estimation of mutation rates in a wheat population with a gene genealogy approach. Genetics, 179, 2195-2211.

Redžić, S. S. (2007). The ecological aspect of ethnobotany and ethnopharmacology of population in Bosnia and Herzegovina. Collegium Antropologicum, 31, 869-890.

Rendell, S., & Ennos, R. A. (2003). Chloroplast DNA diversity of the dioecious European tree Ilex aquifolium L.(English holly). Molecular Ecology, 12, 2681-2688.

Riedel, J. C. (1769). Johann Christoph Riedels verbessertes und vermehrtes Garten Lexicon benebst einem nützlichen Garten Kalender. Nordhausen: Greß.

Rieseberg, L. H., & Soltis, D. E. (1991). Phylogenetic consequences of cytoplasmic gene flow in plants. Evolutionary Trends in Plants, 5, 65-84.

Roche Diagnostics (2011). Rapid library preparation method manual. GS FLX+ Series. Published by 454 Life Sciences, a Roche company, available online, URL: http://454.com/downloads/my454/documentation/gs-flx-plus/Rapid-Library-Preparation-Method-Manual_XLPlus_May2011.pdf. [accessed 14th December 2014].

Roeder, A. H., & Yanofsky, M. F. (2001). Unraveling the mystery of double flowers. Developmental Cell, 1, 4-6.

Rohde, S. E. (1922). The folk-lore of herbals. Folklore, 33, 243-264.

Ronikier, M., Costa, A., Aguilar, J. F., Feliner, G. N., Küpfer, P., & Mirek, Z. (2008). Phylogeography of Pulsatilla vernalis (L.) Mill.(Ranunculaceae): chloroplast DNA reveals two evolutionary lineages across central Europe and Scandinavia. Journal of Biogeography, 35, 1650-1664.

Rose, O., & Falush, D. (1998). A threshold size for microsatellite expansion. Molecular Biology and Evolution, 15(5), 613-615.

Rossi, G., & Mondoni, A. (2009). Le specie erbacee nemorali: strategie di conservazione nei boschi esistenti ed evoluzione nelle. Veneto Agricoltura, Centro Vivaistico per le Attività Fuori Foresta Convegno sul tema:'Boschi di pianura e biodiversità'. Legnaro (Padova), Corte Benedettina. Available online, URL: http://www-3.unipv.it/labecove/ricerche/downloads/rossi_mondoni_020409.pdf. [accessed 7th January 2014]

Rozen, S., & Skaletsky, H. (2000). Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Misener, S., & Krawetz, S. A. (eds.), Methods in Molecular Biology. Totowa: Humana Press.

Rozenfeld, A. F., Arnaud-Haond, S., Hernández-García, E., Eguíluz, V. M., Matías, M. A., Serrao, E., & Duarte, C. M. (2007). Spectrum of genetic diversity and networks of clonal organisms. Journal of the Royal Society Interface, 4, 1093-1102.

Russow, B. (2002). Pflanzen auf ur- und frühgeschichtlichen Siedlungsplätzen – Ein Diskussionsbeitrag zur Problematik der Kulturreliktpflanzen. Pulsatilla, 5, 37-49.

Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B., & Erlich, H. A. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239, 487-491.

Saitou, N., & Nei, M. (1987). The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, 4, 406-425.

Samson, N., Bausher, M. G., Lee, S. B., Jansen, R. K., & Daniell, H. (2007). The complete nucleotide sequence of the coffee (Coffea arabica L.) chloroplast genome: organization and implications for biotechnology and phylogenetic relationships amongst angiosperms. Plant Biotechnology Journal, 5, 339-353.

Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences, 74, 5463-5467.

Sburlino, G., Poldini, L., Andreis, C., Giovagnoli, L., & Tasinazzo, S. (2012). Phytosociological overview of the Italian Alnus incana-rich riparian woods. Plant Sociology, 49, 39-53.

Scaglione, D., Acquadro, A., Portis, E., Taylor, C. A., Lanteri, S., & Knapp, S. J. (2009). Ontology and diversity of transcript-associated microsatellites mined from a globe artichoke EST database. BMC Genomics, 10, published online, doi:10.1186/1471-2164-10-454.

Schick, B. (1982). Untersuchungen über die Biotechnik der Apocynaceenblüte: 2. Bau und Funktion des Bestäubungsapparates. Flora , 172, 347- 371.

150 6. Literaturverzeichnis

Schliesky, S., Gowik, U., Weber, A. P., & Bräutigam, A. (2012). RNA-seq assembly–are we there yet? Frontiers in Plant Science, 3, published online, doi: 10.3389/fpls.2012.00220.

Schlittler, E., & Furlenmeier, A. (1953). Vincamin, ein Alkaloid aus Vinca minor L.(Apocynaceae). Helvetica Chimica Acta, 36(7), 2017-2020.

Schlüssel, P. (2004) Neues aus dem Staudengarten. g'plus Die Gärtner-Fachzeitschrift, 23, 34-35.

Scholz, H. (1982). Eine neue Vinca minor (Apocynaceae) aus der Schweiz. Willdenowia, 12, 291– 292.

Schroeder, F. G. (1969). Zur Klassifizierung der Anthropochoren. Vegetatio, 16, 225-238.

Schroeder, F. G. (1974). Zu den Statusangaben bei der floristischen Kartierung Mitteleuropas. Göttinger Floristische Rundbriefe, 8, 71-79.

Schroeder, F. G. (2000). Lehrbuch der Pflanzengeographie. Wiesbaden: Quelle & Meyer.

Schuelke, M. (2000). An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments. Nature Biotechnology, 18, 233-234.

Schum, A., & Preil, W. (1998). Induced Mutations in ornamental plants. In: Jain, S. M., Brar, D. S., Ahloowalia, B. S. (eds.), Somaclonal variation and induced mutations in crop improvement. Dordrecht: Kluwer Academic.

Schynawa, L. (2013). Untersuchungen zur Populationsstruktur, Reproduktionsbiologie und der genetischen Diversität des Kleinen Immergrüns (Vinca minor L., Apocynaceae). Bachelorarbeit, Universität Kassel, Deutschland.

Seligmann, S.(1910). Der Böse Blick und Verwandtes: Ein Beitrag zur Geschichte des Aberglaubens aller Zeiten und Völker. Reprint 2013. London: Forgotten Books.

Seybold, S. (ed.), Schmeil, O., & Fitschen, J. (2006). Flora von Deutschland und angrenzender Länder. 93. Auflage. Wiebelsheim: Quelle & Meyer.

Shaw, J., Lickey, E. B., Beck, J. T., Farmer, S. B., Liu, W., Miller, J., Siripun, K. C., Winder, C. T., Schilling, E. E., & Small, R. L. (2005). The tortoise and the hare II: relative utility of 21 noncoding chloroplast DNA sequences for phylogenetic analysis. American Journal of Botany, 92, 142-166.

Shaw, J., Lickey, E. B., Schilling, E. E., & Small, R. L. (2007). Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise and the hare III. American Journal of Botany, 94, 275-288.

Shirk, R. Y., Glenn, T. C., Chang, S. M., & Hamrick, J. L. (2013). Development and characterization of microsatellite primers in Geranium carolinianum (Geraniaceae) with 454 sequencing. Applications in Plant Sciences, 1, published online, doi:10.3732/apps.1300006.

Shokeen, B., Sethy, N. K., Kumar, S., & Bhatia, S. (2007). Isolation and characterization of microsatellite markers for analysis of molecular variation in the medicinal plant Madagascar periwinkle Catharanthus roseus ((L.) G. Don). Plant Science, 172, 441-451.

Simões, A. O., Livshultz, T., Conti, E., & Endress, M. E. (2007). Phylogeny and systematics of the Rauvolfioideae (Apocynaceae) based on molecular and morphological evidence 1. Annals of the Missouri Botanical Garden, 94, 268-297.

Sippel, K., & Stiehl, U. (2005). Archäologie im Wald. Erkennen und Schützen von Bodendenkmälern. Kassel: Landesbetrieb HESSEN-Forst.

Skinner, D. M., Beattie, W. G., Blattner, F. R., Stark, B. P., & Dahlberg, J. E. (1974). Repeat sequence of a hermit crab satellite deoxyribonucleic acid is

(TAGG)n(ATCC)n. Biochemistry, 13, 3930-3937.

Slatkin, M. (1995). A measure of population subdivision based on microsatellite allele frequencies. Genetics, 139, 457-462.

Sochor, M., Vašut, R. J., Bártová, E., Majeský, Ľ., & Mráček, J. (2013). Can gene flow among populations counteract the habitat loss of extremely fragile biotopes? An example from the population genetic structure in Salix daphnoides. Tree Genetics & Genomes, 9, 1193-1205.

Sokal, R. R. (1979). Testing statistical significance of geographic variation patterns. Systematic Zoology, 28, 227-232.

Soltis, D. E., Smith, S. A., Cellinese, N., Wurdack, K. J., Tank, D. C., Brockington, S. F., ... & Soltis, P. S. (2011). Angiosperm phylogeny: 17 genes, 640 taxa. American Journal of Botany, 98, 704-730.

Stehlik, I., & Holderegger, R. (2000). Spatial genetic structure and clonal diversity of Anemone nemorosa in late successional deciduous woodlands of Central Europe. Journal of Ecology, 88, 424-435.

Stenberg, P., Lundmark, M., & Saura, A. (2003). MLGsim: a program for detecting clones using a simulation approach. Molecular Ecology Notes, 3, 329-331.

Stone, Katharine R. (2009). Vinca major, V. minor. In: Fire Effects Information System. U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Rocky Mountain Research Station, Fire Sciences Laboratory (Producer). Available online, URL: http://www.fs.fed.us/database/feis/. [accessed 24 December 2014].

Strand, M., Prolla, T. A., Liskay, R. M., & Petes, T. D. (1993). Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair. Nature, 365, 274-276.

Straub, S. C., Fishbein, M., Livshultz, T., Foster, Z., Parks, M., Weitemier, K., ... & Liston, A. (2011). Building a model: developing genomic resources for common milkweed (Asclepias syriaca) with low coverage genome sequencing. BMC Genomics, 12, 211.

Subirana, J. A., & Messeguer, X. (2008). Structural families of genomic microsatellites. Gene, 408, 124-132.

Sumangala, R. C., Kumar, L. N., Ramesha, B. T., Shaanker, R. U., Ganeshaiah, K. N., & Ravikanth, G. (2009). Development of microsatellite markers for a critically endangered species, Ceropegia fantastica from the Western Ghats, India. Conservation Genetics, 10, 1825-1827.

151 6. Literaturverzeichnis

Sukopp, H. & Kowarik, I. (2007). Stinsenpflanzen in Mitteleuropa und deren agriophytische Vorkommen. Berichte des Instituts für Landschafts- und Pflanzenökologie der Universität Hohenheim, 17, 81-90

Sullivan, S., Fahey, B., & Titus, D. (2006). Fast PCR: General considerations for minimizing run times and maximizing throughput. Technical note 5362, Bio-Rad Laboratories Inc., Waltham, USA. Available online, URL: http://www.bio- rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5362.pdf [accessed 8th January 2015].

Sun, X., Liu, Y., Lutterbaugh, J., Chen, W. D., Markowitz, S. D., & Guo, B. (2006). Detection of mononucleotide repeat sequence alterations in a large background of normal DNA for screening high-frequency microsatellite instability cancers. Clinical Cancer Research, 12, 454-459.

Swearingen, J., Slattery, B., Reshetiloff, K., & Zwicker, S. (2010). Plant invaders of mid-Atlantic natural areas. 4th ed. Washington, DC: National Park Service and U. S. Fish and Wildlife Service. Available online, URL: http://www.nps.gov/plants/ALIEn/pubs/midatlantic/index.htm. [accessed 7th October 2014].

Swofford, DL. (2003). PAUP*. Phylogenetic analysis using parsimony (*and other methods). Version 4.0 Beta 10. Sinauer Associations, Sunderland, Massachusetts, distributed by the author.

Szathmáry, E., & Maynard-Smith, J. (1995). The major evolutionary transitions. Nature, 374, 227-232.

Taberlet, P., & Bouvet, J. (1994). Mitochondrial DNA polymorphism, phylogeography, and conservation genetics of the brown bear Ursus arctos in Europe. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences, 255, 195-200.

Taberlet, P., Fumagalli, L., Wust‐Saucy, A. G., & Cosson, J. F. (1998). Comparative phylogeography and postglacial colonization routes in Europe. Molecular Ecology, 7, 453-464.

Taberlet, P., Gielly, L., Pautou, G., & Bouvet, J. (1991). Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109.

Tada, F., Yamashiro, T., & Maki, M. (2009). Development of microsatellite markers for the endangered grassland perennial herb Vincetoxicum atratum (Apocynaceae - Asclepiadoideae). Conservation Genetics, 10, 1057-1059.

Takayama, K., López, P. S., König, C., Kohl, G., Novak, J., & Stuessy, T. F. (2011). A simple and cost-effective approach for microsatellite isolation in non- model plant species using small-scale 454 pyrosequencing. Taxon, 60, 1442-1449.

Takezaki, N., & Nei, M. (1996). Genetic distances and reconstruction of phylogenetic trees from microsatellite DNA. Genetics, 144, 389-399.

Takezaki, N., & Nei, M. (2008). Empirical tests of the reliability of phylogenetic trees constructed with microsatellite DNA. Genetics, 178, 385-392.

Tautz, D. (1989). Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research, 17, 6463-6471.

Tautz, D., & Renz, M. (1984). Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes. Nucleic Acids Research, 12, 4127-4138.

Tel-Zur, N., Abbo, S., Myslabodski, D., & Mizrahi, Y. (1999). Modified CTAB procedure for DNA isolation from epiphytic cacti of the genera Hylocereus and Selenicereus (Cactaceae). Plant Molecular Biology Reporter, 17, 249 254.

Thomson, A. M., Dick, C. W., & Dayanandan, S. (2014). A similar phylogeographical structure among sympatric North American birches (Betula) is better explained by introgression than by shared biogeographical history. Journal of Biogeography, published online, doi:10.1111/jbi.12394.

Thuillet, A. C., Bru, D., David, J., Roumet, P., Santoni, S., Sourdille, P., & Bataillon, T. (2002). Direct estimation of mutation rate for 10 microsatellite loci in durum wheat, Triticum turgidum (L.) Thell. ssp durum desf. Molecular Biology and Evolution, 19, 122-125.

Tilney-Bassett, R. A. E. (1991) Genetics of variegation and maternal inheritance in ornamentals. In: Harding, J., Singh, F., & Mol, J. N. M. (Eds). Genetics and breeding of ornamental species. Dordrecht: Kluwer Academic.

Topinka, J., Donovan, A. J., & May, B. (2004). Characterization of microsatellite loci in Kearney's bluestar (Amsonia kearneyana) and cross‐ amplification in other Amsonia species. Molecular Ecology Notes, 4, 710-712.

Torales, S. L., Rivarola, M., Pomponio, M. F., Fernández, P., Acuña, C. V., Marchelli, P., ... & Poltri, S. N. (2012). Transcriptome survey of Patagonian southern beech Nothofagus nervosa (= N. Alpina): assembly, annotation and molecular marker discovery. BMC Genomics, 13, 291.

Tóth, G., Gáspári, Z., & Jurka, J. (2000). Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Research, 10, 967-981.

Tschirner, S. (1998). Elsass: Fachwerkdörfer und historische Städte, Burgen und Kirchen im Weinland zwischen Rhein und Vogesen. Köln: DuMont.

Unger, F. (1867). Die Pflanze als Todtenschmuck und Grabeszier. Wien: Braumüller.

USDA Forest Service (2006). Weed of the week. Common periwinkle. United States Department of Agriculture, Forest Service. Published online, URL: http://www.na.fs.fed.us/fhp/invasive_plants/weeds/common-periwinkle.pdf. [accessed 8th October 2014].

USDA NRCS (2002). Plant fact sheet Vinca minor L. United States Department of Agriculture, Natural Resources Conservation Service. Published online, URL: http://plants.usda.gov/factsheet/pdf/fs_vimi2.pdf. [accessed 7th October 2014].

Valikovics, A. (2007). Investigation of the effect of vinpocetine on cerebral blood flow and cognitive functions. Ideggyogyaszati szemle, 60, 301-310.

Vallejo-Marín, M., Dorken, M. E., & Barrett, S. C. H. (2010). The ecological and evolutionary consequences of clonality for plant mating. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics, 41, 193-213.

152 6. Literaturverzeichnis

Van Belkum, A., Scherer, S., van Alphen, L., & Verbrugh, H. (1998). Short-sequence DNA repeats in prokaryotic genomes. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62, 275-293.

Van Oosterhout, C., Hutchinson, W. F., Wills, D. P., & Shipley, P. (2004). MICRO‐CHECKER: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology Notes, 4, 535-538.

Van Oosterhout, C., Weetman, D., & Hutchinson, W. F. (2006). Estimation and adjustment of microsatellite null alleles in nonequilibrium populations. Molecular Ecology Notes, 6, 255-256.

Vandepitte, K., De Meyer, T., Jacquemyn, H., Roldán-Ruiz, I., & Honnay, O. (2013). The impact of extensive clonal growth on fine-scale mating patterns: a full paternity analysis of a lily-of-the-valley population (Convallaria majalis). Annals of Botany, 111, 623-628.

Varshney, R. K., Graner, A., & Sorrells, M. E. (2005). Genic microsatellite markers in plants: features and applications. TRENDS in Biotechnology, 23, 48-55.

Varshney, R. K., Thiel, T., Stein, N., Langridge, P., & Graner, A. (2002). In silico analysis on frequency and distribution of microsatellites in ESTs of some cereal species. Cellular and Molecular Biology Letters, 7, 537-546.

Vettori, C., Vendramin, G. G., Anzidei, M., Pastorelli, R., Paffetti, D., & Giannini, R. (2004). Geographic distribution of chloroplast variation in Italian populations of beech (Fagus sylvatica L.). Theoretical and Applied Genetics, 109, 1-9.

Vigouroux, Y., Jaqueth, J. S., Matsuoka, Y., Smith, O. S., Beavis, W. D., Smith, J. S. C., & Doebley, J. (2002). Rate and pattern of mutation at microsatellite loci in maize. Molecular Biology and Evolution, 19, 1251-1260.

Villarreal, J. C., Forrest, L. L., McFarland, K., & Goffinet, B. (2012). Chloroplast, mitochondrial, and nuclear microsatellites from the southern Appalachian hornwort, Nothoceros aenigmaticus (Dendrocerotaceae). American Journal of Botany, 99, published online, doi:10.3732/ajb.1100392. von der Beeck, A. (2011). Zu Gast bei Herbert Menke. Ein Blick in die Züchter-Werkstatt. Taspo Magazin Spezial, 1, 30-31.

Voss, P., Hogers, R., Bleeter, M., Reijans, M., Van de Lee, T., Hornes, M., ... & Zabeau, M. (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23, 4407-4414.

Vukosavljev, M., Esselink, G. D., Westende, W. P. C., Cox, P., Visser, R. G. F., Arens, P., & Smulders, M. J. M. (2014). Efficient development of highly polymorphic microsatellite markers based on polymorphic repeats in transcriptome sequences of multiple individuals. Molecular Ecology Resources, 15, 17-27.

Widiarsih, S., Siar, S. V., & Lalusin, A. G. (2014). Molecular characterization of Hoya mindorensis Schlechter by microsatellite markers. Philippine Journal of Crop Science, 39, 58-64.

Wagner, A. P., Creel, S., & Kalinowski, S. T. (2006). Estimating relatedness and relationships using microsatellite loci with null alleles. Heredity, 97, 336-345.

Wainwright, B. J., Arlyza, I. S., & Karl, S. A. (2013). Isolation and characterization of twenty-one polymorphic microsatellite loci for Polycarpa aurata using third generation sequencing. Conservation Genetics Resources, 5, 671-673.

Wall, P. K., Leebens-Mack, J., Chanderbali, A. S., Barakat, A., Wolcott, E., Liang, H., ... & Altman, N. (2009). Comparison of next generation sequencing technologies for transcriptome characterization. BMC Genomics, 10, 347.

Wang, Y. Q., Melzer, R., & Theißen, G. (2011). A double-flowered variety of lesser periwinkle (Vinca minor fl. pl.) that has persisted in the wild for more than 160 years. Annals of Botany, 107, 1445-1452.

Wang, Z., Weber, J. L., Zhong, G., & Tanksley, S. D. (1994). Survey of plant short tandem DNA repeats. Theoretical and Applied genetics, 88, 1-6.

Ward, S. M., & Jasieniuk, M. (2009). Review: sampling weedy and invasive plant populations for genetic diversity analysis. Weed Science, 57, 593- 602.

Weber, J. L. (1990). Informativeness of human (dC-dA)n·(dG-dT)n polymorphisms. Genomics, 7, 524-530.

Wei, N., & Dick, C. W. (2014). Characterization of twenty-six microsatellite markers for the tropical pioneer tree species Cecropia insignis Liebm (Urticaceae). Conservation Genetics Resources, 6, 987-989.

Wei, N., Bemmels, J. B., & Dick, C. W. (2014). The effects of read length, quality and quantity on microsatellite discovery and primer development: from Illumina to PacBio. Molecular Ecology Resources, 14, 953-965.

Weising, K., & Gardner, R. C. (1999). A set of conserved PCR primers for the analysis of simple sequence repeat polymorphisms in chloroplast genomes of dicotyledonous angiosperms. Genome, 42, 9-19.

Weising, K., Nybom, H., Wolff, K., & Kahl, G. (2005). DNA fingerprinting in plants: principles, methods, and applications. 2nd ed. Boca Raton: CRC press.

Welch, D. B. M., & Meselson, M. (2000). Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science, 288, 1211-1215.

Wells, E. F., & Brown, R. L. (2000). An annotated checklist of the vascular plants in the forest at historic Mount Vernon, Virginia: a legacy from the past. Castanea, 65, 242-257.

Westergaard, K. B., Alsos, I. G., Engelskjøn, T., Flatberg, K. I., & Brochmann, C. (2011). Trans-Atlantic genetic uniformity in the rare snowbed sedge Carex rufina. Conservation Genetics, 12, 1367-1371.

153 6. Literaturverzeichnis

Wheat, C. W. (2010). Rapidly developing functional genomics in ecological model systems via 454 transcriptome sequencing. Genetica, 138, 433- 451.

Wheeler, G. L., Dorman, H. E., Buchanan, A., Challagundla, L., & Wallace, L. E. (2014). A review of the prevalence, utility, and caveats of using chloroplast simple sequence repeats for studies of plant biology. Applications in Plant Sciences, 2, published online, doi:10.3732/apps.1400059.

Widén, B., Cronberg, N., & Widén, M. (1994). Genotypic diversity, molecular markers and spatial distribution of genets in clonal plants, a literature survey. Folia Geobotanica, 29, 245-263.

Wilder, J., & Hollocher, H. (2001). Mobile elements and the genesis of microsatellites in dipterans. Molecular Biology and Evolution, 18, 384-392.

Will, M. (2014). Untersuchung der Myrmekochorie beim Kleinen Immergrün (Vinca minor L., Apocynaceae). Bachelorarbeit, Universität Kassel, Deutschland.

Willerding, U. (1984). Ur- und Frühgeschichte des Gartenbaus. In: Franz, G. (Hrsg.), Deutsche Agrargeschichte, Geschichte des Deutschen Gartenbaues, Band 6.

Williams, D. A., Overholt, W. A., Cuda, J. P., & Hughes, C. R. (2005). Chloroplast and microsatellite DNA diversities reveal the introduction history of Brazilian peppertree (Schinus terebinthifolius) in Florida. Molecular Ecology, 14, 3643-3656.

Williams, J. G., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A., & Tingey, S. V. (1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 18, 6531-6535.

Wilson, J. R., Dormontt, E. E., Prentis, P. J., Lowe, A. J., & Richardson, D. M. (2009). Something in the way you move: dispersal pathways affect invasion success. Trends in Ecology & Evolution, 24, 136-144.

Wöhrmann, T., & Weising, K. (2011). In silico mining for simple sequence repeat loci in a pineapple expressed sequence tag database and cross- species amplification of EST-SSR markers across Bromeliaceae. Theoretical and Applied Genetics, 123, 635-647.

Woodcock, T. S., Larson, B. M., Kevan, P. G., Inouye, D. W., & Lunau, K. (2014). Flies and flowers II: floral attractants and rewards. Journal of Pollination Ecology, 12, 63-94.

Wright, S. (1938). Size of population and breeding structure in relation to evolution. Science, 87, 430-431.

Wright, S. (1940). Breeding structure of populations in relation to speciation. American Naturalist, 74, 232-248.

Wright, S. (1951). The genetical structure of populations. Annals of Eugenics, 15, 323-354.

Wright, S. (1965). The interpretation of population structure by F-statistics with special regard to systems of mating. Evolution, 19, 395-420.

WWF Australia (2010). National list of naturalised invasive and potentially invasive garden plants. World Wildlife Fund Australia. Available online, URL: http://awsassets.wwf.org.au/downloads/sp092_list_invasive_garden_plant_4apr06.pdf. [accessed 7th October 2014].

Xu, L., Zeng, L., Liao, B., & Zhong, Y. (2014). Microsatellite markers for a mangrove species, Cerbera manghas, from South China. Conservation Genetics Resources, 6, 45-48.

Yang, T., Jiang, J., Burlyaeva, M., Hu, J., Coyne, C. J., Kumar, S., ... & Zong, X. (2014). Large-scale microsatellite development in grasspea (Lathyrus sativus L.), an orphan legume of the arid areas. BMC Plant Biology, 14, published online, doi:10.1186/1471-2229-14-65.

Ye, G. N., Söylemezoglu, G., Weeden, N. F., Lamboy, W. F., Pool, R. M., & Reisch, B. I. (1998). Analysis of the relationship between grapevine cultivars, sports and clones via DNA fingerprinting. Vitis, 37, 33-38.

You, F. M., Huo, N., Gu, Y. Q., Luo, M. C., Ma, Y., Hane, D., ... & Anderson, O. D. (2008). BatchPrimer3: a high throughput web application for PCR and sequencing primer design. BMC Bioinformatics, 9, published online, doi:10.1186/1471-2105-9-253.

Zalapa, J. E., Cuevas, H., Zhu, H., Steffan, S., Senalik, D., Zeldin, E., ... & Simon, P. (2012). Using next-generation sequencing approaches to isolate simple sequence repeat (SSR) loci in the plant sciences. American Journal of Botany, 99, 193-208.

Zane, L., Bargelloni, L., & Patarnello, T. (2002). Strategies for microsatellite isolation: a review. Molecular Ecology, 11, 1-16.

Zhang, D. X. (2004). Lepidopteran microsatellite DNA: redundant but promising. Trends in Ecology & Evolution, 19, 507-509.

Zhang, W., Chen, J., Yang, Y., Tang, Y., Shang, J., & Shen, B. (2011). A practical comparison of de novo genome assembly software tools for next- generation sequencing technologies. PloS One, 6, published online, doi:10.1371/journal.pone.0017915.

Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., & Miller, W. (2000). A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational biology, 7, 203-214.

Zietkiewicz, E., Rafalski, A., & Labuda, D. (1994). Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, 20, 176-183.

154 7. Abbildungsverzeichnis

7. Abbildungsverzeichnis

Nummer Abbildung Seite

Abb. 1 Verbreitungsgebiete von Vinca minor, V. herbacea, V. major und V. difformis. 7

Abb. 2 Blütenmorphologie von Vinca minor. 9

Abb. 3 Habitus, Frucht- und Samenmorphologie von Vinca minor. 10

Abb. 4 Fundorte der populationsgenetisch untersuchten Vinca minor-Bestände. 21

Abb. 5 Fundorte der phylogeographisch untersuchten Vinca minor-Akzessionen. 22

Abb. 6 Genomische DNA nach gelektrophoretischer Auftrennung auf Agarosegelen. 49

Abb. 7 Rekonstruktion des Teilplastoms von Vinca minor. 54

Abb. 8 Exemplarische Darstellung der Allele am nukleären Mikrosatellitenlocus Vimi43. 70

Genetischer Fingerabdruck der Pflanzen am Fundort Sutschketal (Population 35) und Nachweis des hybridogenen Ursprungs eines neuen Abb. 9 71 Genotyps.

Geographische Verteilung der in 67 Populationen von Vinca minor in Mitteleuropa inkl. der Alpen, westlich der Alpen und südlich der Alpen auf Abb. 10 75 Basis der Alleldaten an sieben nukleären Mikrosatellitenloci ermittelten Multilocus-Genotypen (MLGs) und Multilocus-Linien (MLLs).

Abb. 11 Neighbour Joining-Dendrogramm aller 310 im Datensatz detektierten Multilocus-Genotypen. 78

Abb. 12 Ausschnitt der Gruppe F aus dem Neighbour Joining-Dendrogramm aus Abb. 11. 79

Abb. 13 Neighbour-Net aller 310 im Datensatz detektierten Multilocus-Genotypen. 80

Abb. 14 Ausschnitt aus dem Neighbour Joining-Dendrogramm aus Abb. 13. 81

Abb. 15 Neighbour Joining-Dendrogramm aller 70 untersuchten Populationen und der 18 Cultivare. 84

Abb. 16 Neighbour-Net aller 70 untersuchten Populationen und der 18 Cultivare. 85

Ergebnis der Bayes'schen Analyse für alle 310 im Datensatz detektierten Multilocus-Genotypen auf Basis der Alleldaten an sieben Abb. 17 88 Mikrosatellitenloci für K=3.

Ergebnisse der Bayes'schen Analysen für 151 Multilocus-Genotypen in neun genetisch diversen Populationen in Italien und für 91 Multilocus- Abb. 18 Genotypen in neun genetisch diversen Populationen in Ostitalien, Kroatien und Slowenien auf Basis der Alleldaten an sieben Mikrosatellitenloci 89 für jeweils K=2.

Übersicht über die paarweisen FST-Werte zwischen den 21 genetisch diversen Vinca minor-Populationen westlich und südlich der Alpen im Abb. 19 92 geographischen Kontext.

Abb. 20 Ergebnisse der Mantel-Tests zum Nachweis von 'isolation by distance' (IBD). 94

Geographische Verteilung und Haplotypen-Netzwerk der sieben detektierten plastidären Haplotypen H1 bis H7 in 229 Vinca minor-Proben in Abb. 21 99 Europa, Nordamerika und Australien.

Abb. 22 Typische Fehl-Assemblierung von drei Sequenzen aus dem genomischen 454-Datensatz von Vinca minor. 102

Abb. 23 Typische, nach der Assemblierung sichtbare Sequenzierfehler aus dem cDNA- und dem genomischen 454-Datensatz von Vinca minor. 105

Abb. 24 Plastidäres Haplotypen-Netzwerk unter Einbezug von Vinca minor, V. major, V. difformis und V. herbacea. 118

Abb. 25 Gegenüberstellung der unterschiedlichen Wuchsformen von Vinca minor in Mitteleuropa. 122

155 8. Tabellenverzeichnis

8. Tabellenverzeichnis

Nummer Tabelle Seite

Tab. 1 Übersicht über Verbreitung und Ploidie der Spezies des Genus Vinca. 6

Tab. 2 Übersicht über die häufigsten Vinca minor-Cultivare in Europa. 15

Tab. 3 Im Rahmen von molekularen Voruntersuchungen verwendetes Pflanzenmaterial. 19

Tab. 4 Übersicht über die Studien, in denen Mikrosatellitenmarker für Arten der Apocynaceae etabliert wurden. 28

Tab. 5 Zusammensetzung der PCR-Ansätze zur Amplifikation nukleärer und plastidärer Mikrosatellitenloci. 35

Tab. 6 PCR-Protokolle zur Amplifikation nukleärer und plastidärer Mikrosatellitenloci. 36

Tab. 7 Ergebnisse der Assemblierung der aus 454-Sequenzierungen von V. minor hervorgegangenen Sequenzen. 50

Häufigkeit (absolut und prozentual) sowie Frequenz (pro Mbp) der über 454-Sequenzierung detektierten Mikrosatelliten, aufgeteilt nach der Tab. 8 51 Länge der Wiederholungseinheiten.

Absolute Zahlen und prozentualer Anteil der in den assemblierten Datensätzen detektierten Mikrosatellitenloci, für die Primer entworfen Tab. 9 52 werden konnten.

Tab. 10 Ergebnisse der Primertests für nukleäre Mikrosatellitenloci auf Agarose- und PAA-Gelen. 56

Interspezifische Übertragbarkeit der nukleären Mikrosatelliten-Loci aus Vinca minor auf drei weitere Arten der Gattung Vinca sowie auf Tab. 11 57 Catharanthus roseus aus dem Vinceae-Clade.

Funktionalität der plastidären Mikrosatellitenloci in drei Akzessionen von Vinca minor und Übertragbarkeit auf V. major, Macaranga gigantea Tab. 12 58 und M. pearsonii.

Eigenschaften der sieben für die populationsgenetischen Analyse von Vinca minor selektierten nukleären Mikrosatellitenloci aus dem cDNA- Tab. 13 59 (Vimi) und dem genomischen Datensatz (ngVm).

Zusammenstellung der Allele (Fragmentlängen der PCR-Produkte) an sieben nukleären Mikrosatellitenloci auf der Basis von 967 Vinca minor- Tab. 14 61 Akzessionen.

Tab. 15 Allelzahlen pro Population und Locus in Populationen der Großregionen westlich (37 bis 42) und südlich der Alpen (43 bis 67). 62

Allelzahlen pro Population und Locus in der Großregion Mitteleuropa inkl. der Alpen (1 bis 36), in Nordamerika (68 bis 70) und in den 18 Tab. 16 63 untersuchten Cultivaren.

Übersicht über das Auftreten von Nullallelen für die Loci Vimi25, 27 und 43 sowie ngVm24 und 26 in Vinca minor-Populationen westlich Tab. 17 64 (40 und 42) und südlich der Alpen (44 bis 60).

Tab. 18 Genotypische und genetische Diversität von Vinca minor-Populationen westlich (37 bis 42) sowie südlich der Alpen (43 bis 67). 67

Genotypische und genetische Diversität von Vinca minor-Populationen in Mitteleuropa inkl. der Alpen (1 bis 36) sowie in Nordamerika (68 bis Tab. 19 69 70).

Übersicht über die Zahl der innerhalb der vier Großregionen und den Cultivaren auf Basis der Alleldaten an sieben nukleären Tab. 20 72 Mikrosatellitenloci ermittelten Multilocus-Genotypen (MLGs).

Übersicht über die 26 in den Großregionen Mitteleuropa inkl. der Alpen (Pop 1 bis 36) und Nordamerika (Pop 68 bis 70) sowie in den Tab. 21 Cultivaren auf Basis der Alleldaten an sieben nukleären Mikrosatellitenmarkern ermittelten Multilocus-Genotypen (MLG) und Multilocus-Linien 74 (MLL).

Tab. 22 Genetische Differenzierung über sieben nukleäre Mikrosatellitenloci für Vinca minor-Populationen westlich und südlich der Alpen. 90

Paarweise FST-Werte der Populationen westlich (40 bis 42) der Alpen, in Nordwest-Italien (43 bis 50, 52) und in Ostitalien (51), Kroatien (53 Tab. 23 91 und 54) und Slowenien (55 bis 60) ohne Berücksichtigung mononklonaler Populationen und wiederholter Multilocus-Genotypen.

Tab. 24 Ergebnisse der AMOVA für 21 genetisch diverse Populationen südlich und westlich der Alpen. 93

Eigenschaften der sechs für die phylogeographische Analyse selektierten plastidären Mikrosatellitenloci aus dem 454-Datensatz (cpVm) und Tab. 25 96 aus Weising & Gardner (1999; ccmp).

Fragmentlängen und Sequenzcodierung der in 297 Vinca minor-Proben detektierten Haplotypen H1 bis H7, basierend auf der Tab. 26 96 Fragmentlängenvariation an sechs plastidären Mikrosatellitenloci .

Verteilung der in 297 Vinca minor-Proben an sechs plastidären Mikrosatellitenloci detektierten sieben Haplotypen über sieben geographische Tab. 27 98 Großräume und 18 untersuchte Cultivare.

Tab. 28 Fragmentlängenvariation an sechs plastidären Mikrosatellitenloci in je einer Akzession von Vinca major, V. difformis und V. herbacea. 117

156 9. Abkürzungsverzeichnis

9. Abkürzungsverzeichnis

Einheiten °C Grad Celsius mm Millimeter bp Basenpaare mM Millimolar cm Zentimeter ng Nanogramm kb Kilobase U Unit km Kilometer V Volt M Molar Vol. Volumen mA Milliampere W Watt Mb Megabase μg Mikrogramm mg Milligramm μl Mikroliter min Minute(n) μM Mikromolar ml Milliliter Sonstiges λ-DNA Lambda-DNA KCl Kaliumchlorid A je nach Kontext: Adenin oder Allelzahl L. Linné

A. bidest zweifach destilliertes Wasser LD 'linkage disequilibrium' Abb. Abbildung LI Liechtenstein AFLPs 'amplified fragment length polymorphism' ln natürlicher Logarithmus

AMOVA 'analysis of molecular variance' MgCl2 Magnesiumchlorid APS Ammoniumpersulfat MLG Multilocus-Genotyp BLAST 'basal local alignment search tool' MLL Multilocus-Linie BP 'before present' MPI Max-Planck-Institut BSA Rinderserumalbumin mRNA 'messenger RNA' bzw. beziehungsweise N Stichprobengröße C Cytosin NaCl Natriumchlorid ccmp 'consensus chloroplast microsatellite primer' n. b. je nach Kontext: nicht bekannt oder nicht bestimmt cDNA 'complementary DNA' NCBI National Center for Biotechnology Information CH Schweiz n. Chr. nach Christus cp plastidär NGS 'next generation sequencing' cpVm 'plastid Vinca minor' ngVm 'next generation Vinca minor' CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid p Signifikanz D* Simpson's Diversität PAA Polyacrylamid dATP Desoxy-Adenosintriphosphat PCR Polymerase-Kettenreaktion dNTP Desoxy-Nukleotidtriphosphat pers. persönlich ddATP Didesoxy-Adenosintriphosphat pH Wasserstoffionen-Konzentration ddNTP Didesoxy-Nukleotidtriphosphat Pop Population DE Deutschland PVP Polyvinylpyrrolidion d. h. das heißt r Korrelationskieffizient DNA Desoxyribonukleinsäure R 'genotypic richness' EDTA Ethylendiamintetraessigsäure RAPDs 'random amplified polymorphic DNA'

engl. Englisch rD standardisierter Korrelationskoeffizient EST 'expressed sequence tags' rev 'reverse' et al. und andere rRNA ribosomale RNA

FIS, FIT, FST Fixationsindizes RNA Ribonukleinsäure fw 'forward' RNaseA Ribonuklease A

G Guanin RS 'allelic richnes' ggf. gegebenenfalls SNSA 'single nucleotide sequence analysis' GPS 'global positioning system' s. o. siehe oben

GST 'coefficient of genic differentiation' sog. sogenannte

H2O Wasser SRA 'sequence read archive' HCl Salzsäure SMM 'stepwise mutation model'

HO, HE beobachtete und erwartete Heterozygotie SSM 'slipped strand mispairing' IAM 'infinite alleles model' SSR 'simple sequence repeat' IBD 'isolation by distance' s. u. siehe unten ICNCP 'international code of nomenclature for cultivated plants' subsp. Subspezies ID Identifikationsnummer syn. Synonym inkl. inklusive T Thymin IRDye Infrared Dye Tab. Tabelle ISSRs 'inter simple sequence repeats' Taq Thermus aquaticus IT Italien TBE Tris-Borat-EDTA Jh. Jahrhundert

157 10. Anhang

10. Anhang

7.1 Elektronischer Anhang

Im elektronischen Anhang (hinterlegt auf digitalem Datenträger) finden sich folgende Dateien:

Nummer Datei

D1 Contigs aus der Assemblierung der 454-Sequenzen (cDNA; txt-Format)

D2 Nicht assemblierte 454-Sequenzen (cDNA; txt-Format)

D3 Contigs aus der Assemblierung der 454-Sequenzen (Genom; txt-Format)

D4 Nicht assemblierte 454-Sequenzen (Genom; txt-Format)

D5 Primer Dinukleotid-Mikrosatelliten (cDNA; xls-Format)

D6 Primer Trinukleotid-Mikrosatelliten (cDNA; xls-Format)

D7 Primer Tetranukleotid-Mikrosatelliten (cDNA; xls-Format)

D8 Primer Pentanukleotid-Mikrosatelliten (cDNA; xls-Format)

D9 Primer Hexanukleotid-Mikrosatelliten (cDNA; xls-Format)

D10 Primer Alle Mikrosatellitenmotive (Genom; xls-Format)

D11 Ursprungssequenzen der für Primertests selektierten Mikrosatellitenloci (cDNA; txt-Format)

D12 Ursprungssequenzen der für Primertests selektierten Mikrosatellitenloci (Genom; txt-Format)

D13 Plastidäre Sequenzen (aus dem genomischen 454-Datensatz extrahiert; txt-Format)

D14 Ursprungssequenzen der für Primertests selektierten Mikrosatellitenloci (Plastom; txt-Format)

D15 Übersicht über die 310 mittels nukleärer Mikrosatelliten ermittelten Multilocus-Genotypen (MLGs; xls-Format)

158 10. Anhang

7.2 Übrige Anhänge

Der gedruckte Anhang enthält folgende Daten:

Nummer Anhang Seite

A1 Übersicht über die mittels nukleärer Mikrosatellitenmarker populationsgenetisch untersuchten Pflanzenproben von Vinca minor. 160

A2 Übersicht über die 297 mittels plastidärer Mikrosatellitenmarker phylogeographisch untersuchten Pflanzenproben von Vinca minor. 165

A3 Protokoll zur DNA-Isolierung aus getrocknetem Blattmaterial nach der Standard-CTAB-Methode. 175

A4 Protokoll zur DNA-Isolierung aus getrocknetem Blattmaterial nach der Sorbitol-Variante der CTAB-Methode. 176

Übersicht über die 210 im assemblierten cDNA (Transkriptom)-454-Datensatz ermittelten Mikrosatellitenmotive, aufgeschlüsselt nach Anzahl A5 177 an Wiederholungseinheiten.

Übersicht über die 89 im assemblierten genomischen 454-Datensatz ermittelten Mikrosatellitenmotive, aufgeschlüsselt nach Anzahl an A6 181 Wiederholungseinheiten.

Eigenschaften der 60 für Primertests selektierten Primperpaare zur Amplifikation nukleärer Mikrosatellitenloci aus dem cDNA A7 183 (Transkriptom)-454-Datensatz.

Eigenschaften der 35 für Primertests selektierten Primperpaare zur Amplifikation nukleärer Mikrosatellitenloci aus dem genomischen A8 186 Datensatz.

Ergebnisse der Primertests für die 60 nukleären Mikrosatellitenloci aus dem cDNA (Transkriptom)-454-Datensatz (Vimi-Loci) nach A9 188 Auftrennung der PCR-Produkte auf 1,5%igen Agarosegelen.

Ergebnisse der Primertests für die 35 nukleären Mikrosatellitenloci aus dem genomischen 454-Datensatz (ngVm-Loci) nach Auftrennung der A10 189 PCR-Produkte auf 1,5%igen Agarosegelen.

Ergebnisse der Primertests für ausgewählte nukleäre Vimi- und ngVm-Loci nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 6%igen A11 190 Polyacrylamidgelen, 700er Kanal des LI-COR® Sequenzierers.

Ergebnisse der Primertests für ausgewählte nukleäre Vimi- und ngVm-Loci nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 6%igen A12 191 Polyacrylamidgelen, 800er Kanal des LI-COR® Sequenzierers.

Eigenschaften der 14 für Primertests selektierten Primperpaare zur Amplifikation plastidärer Mikrosatelliten (plastidäre Sequenzen abgeleitet A13 192 aus dem genomischen 454-Datensatz).

Ergebnisse der Primertests für die 14 plastidären Mikrosatellitenloci aus dem genomischen 454-Datensatz (cpVm-Loci) nach Auftrennung der A14 193 PCR-Produkte auf 1,5%igen Agarosegelen.

Ergebnisse der Primertests für ausgewählte plastidäre cpVm-Loci nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 6%igen Polyacrylamidgelen, 700 A15 193 und 800er Kanal des LI-COR® Sequenzierers.

Ergebnisse der Primertests für die zehn plastidären Mikrosatellitenloci aus Weising & Gardner (1999; ccmps) nach Auftrennung der PCR- A16 194 Produkte auf 1,5%igen Agarosegelen.

Ergebnisse der Primertests für ausgewählte plastidäre ccmp-Loci (Weising & Gardner) nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 6%igen A17 194 Polyacrylamidgelen, 700 und 800er Kanal des LI-COR® Sequenzierers.

Zusammenstellung der Allelfrequenzen über sieben nukleäre Mikrosatellitenloci in 949 Pflanzenproben aus 70 Populationen von Vinca minor A18 195 innerhalb von vier Großregionen sowie von 18 Cultivaren.

A19 Beobachtete Heterozygotie über sieben Mikrosatellitenloci in 70 Populationen in vier Großregionen von Vinca minor. 198

A20 Erwartete Heterozygotie über sieben Mikrosatellitenloci in 70 Populationen in vier Großregionen von Vinca minor. 199

A21 Inzuchtkoeffizient FIS über sieben Mikrosatellitenloci in 70 Populationen in vier Großregionen von Vinca minor. 200

A22 'Allelic Richness' über sieben Mikrosatellitenloci in 70 Populationen in vier Großregionen von Vinca minor. 201

Private Allele in Vinca minor-Populationen westlich der Alpen (40) und südlich der Alpen (43 bis 67) und ihre Frequenz in der jeweiligen A23 202 Population (N=967, 70 Populationen, 18 Cultivare).

Übersicht über die Verteilung der 310 auf Basis der Alleldaten an sieben nukleären Mikrosatellitenmarkern ermittelten Multilocus-Genotypen A24 203 (MLG) in 967 Vinca minor-Akzessionen aus 70 Populationen und 18 Cultivaren.

Ergebnisse der Übertragbarkeitstests für ausgewählte nukleäre Vimi- und ngVm-Loci nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 6%igen A25 211 Polyacrylamidgelen, 700er und 800 Kanal des LI-COR® Sequenzierers.

159

A1: Übersicht über die mittels nukleärer Mikrosatellitenmarker populationsgenetisch untersuchten Pflanzenproben von Vinca minor. Es wurden 949 individuelle Proben von 70 Fundorten sowie 18 Cultivar-Proben eingesetzt. Pop-Nr.: Populationsnummer, N: Stichprobenumfang, ID: Identifikationsnummer, Höhe ü. NN [m]: Höhe über Normalnull in Metern Bes.: Besonderheit der Blüten; R: rötlichviolette Blüten, G: gefüllte Blüten, W: weiße Blüten BoGa: Botanischer Garten, Fa.: Firma AT: Österreich (1: Burgenland, 3: Niederösterreich, 7: Tirol, 9: Wien); BE: Belgien (VLG: Flandern); CA: Kanada (ON: Ontario); CH: Schweiz (AG: Aargau, VS: Wallis); DE: Deutschland (BB: Brandenburg, BW: Baden-Württemberg, HE: Hessen, N: Niedersachsen, NW: Nordrhein-Westfalen, RP: Rheinland-Pfalz, SH: Schleswig-Holstein, ST: Sachsen-Anhalt, TH: Thüringen); FR: Frankreich (A: Elsaß, N: Midi-Pyrénées, U: Provence-Alpes-Côte d’Azur, V: Rhône-Alpes); HR: Kroatien (18: Istrien); IT: Italien (21: Piemont, 25: Lombardei, 32: Trentino-Südtirol, 34: Venetien, 45: Emilia-Romagna, 52: Toskana, 57: Marken), LI: Liechtenstein (VDZ: Vaduz); LX: Luxemburg (G: Grevenmacher)

Pop- Sammler/ Höhe ü. Multilocus- Fundortangaben Bes. Proben-ID N Geographische Koordinaten Herdengröße Nr. Herkunft NN [m] Genotyp-Nr.

DE, RP, Römischer Tempel Koblenz ID222 bis ID228 1 7 Möller, S. 50.311222 7.539139 293 200 x 500 1

DE, HE, Wüstung Bad Emstal DE282 bis DE286 2 5 Möller, S. 51.23975 9.265472 315 30 x 40 1

DE, N, Burgruine Hünenburg DE001 bis DE010 3 10 Möller, S. 51.987194 9.278111 138 30 x 5 1

DE, TH, Schlachtfelder Jena DE186 bis DE190 4 10 Möller, S. 50.971111 11.569028 368 5 x 15 1

DE192 50.970833 11.568917 368 1 x 1

DE193 50.971278 11.568750 368 1 x 1

DE194 50.971361 11.569139 367 1 x 1

DE195 50.971500 11.568639 368 1 x 1

DE196 50.970694 11.568972 368 1 x 1

DE, HE, Grab Bad Emstal DE287 bis DE291 5 5 Möller, S. 51.228278 9.261833 250 3 x 3 1

DE, RP, Cochem DE141 bis DE150 6 10 Möller, S. 50.150472 7.152361 131 50 x 50 1

DE090, DE091, DE096, DE097, DE102, DE103, DE108, DE109, DE114, DE115, DE, NW, Neandertal 7 13 Möller, S. 51.224883 6.9747646 108 3 x 30 1 DE120, DE121, DE124

DE, NW, Wüstung Elten DE176 bis DE185 8 10 Zirpel, M. 51.863966 6.1657699 52 3 x 5 9

DE, HE, Römerkastell Saalburg ID075 bis ID084 9 10 Möller, S. 50.270028 8.5661492 431 10 x 12 2

DE, HE, Burgruine Boyneburg ID151 bis ID152 10 8 Möller, S. 51.101528 10.007250 473 2 x 3 2

ID155, ID157 51.100528 10.007778 478 4 x 6 10. Anhang 10. ID159, ID160 51.099278 10.009861 474 5 x 10

ID163, ID164 51.097806 10.015389 478 20 x 30 160 DE, HE, Burgruine Falkenstein ID166 bis ID169 11 4 Möller, S. 51.253620 9.2969488 442 20 x 25 2

DE, HE, Burgruine Malsburg ID214 bis ID221 12 8 Möller, S. 51.411414 9.2603568 375 5 x10 2

DE, HE, Burgruine Ebersburg ID236 bis ID247 13 12 Möller, S. 50.473756 9.8516834 659 50 x 100 2

DE, ST, Wüstung Schleesen ID253 bis ID262 14 10 Wojacki, J. 52.030586 12.3714774 137 60 x 100 2

DE, HE, Wüstung Schlierbach ID192 15 21 Möller, S. 51.155639 10.110972 244 1 x 1 2

ID193 bis ID196 51.155722 10.111389 243 2 x 4

ID197 bis ID200 51.156139 10.111556 243 4 x 5

ID201 bis ID204 51.156333 10.111694 240 3 x 7

ID205 bis ID208 51.156333 10.111944 240 5 x 8

ID209 bis ID212 51.156417 10.111972 240 10 x 12

DE, RP, Römischer Tempel Bremm DE151 bis DE160 16 10 Möller, S. 50.10925 7.123361 359 100 x 100 10

DE, HE, Emser Berg ID176 bis ID177 17 11 Möller, S. 51.254417 9.297583 395 4 x 5 3

ID180 bis ID181 51.261111 9.272222 395 3 x 7

ID184, ID185, ID187 51.227889 9.271444 394 6 x 13

ID188 bis ID191 51.227944 9.271167 395 10 x 15

LU, G, Müllerthal LX001 bis LX010 18 10 Möller, S. 49.796250 6.372250 284 25 x 20 3

DE, SH, Kollund/Krusau DK001 bis DK005 19 5 Stolz, C. 54.833000 9.425000 17 unbekannt 3

BE, VLG, Wasserschloss Humbeek BE032 bis BE041 20 10 Ronse, A. 50.977861 4.374056 21 unbekannt 3

AT, 3, Ortholz AU039 bis AU44, AU45, AU057 21 9 Möller, S. 48.194898 15.220790 250 7 x 10 3

LI, VDZ, Vaduz ID065 bis ID068 22 4 Möller, S. 47.140911 9.525897 588 5 x 8 6

CH AG, Ruine Schenkenberg CH003 bis CH12 23 10 Möller, S. 47.442250 8.101430 630 20 x 5 6

DE, BW, Schorndorf DE321 bis DE325 24 5 Schubert, K. 48.819140 9.505360 369 4 x 5 4

CH, VS, Château de la Soie CH013 bis CH22 25 10 Möller, S. 46.240020 7.319120 680 2 x 4 4

DE, RP, Burgruine Montfort DE272 bis DE281 26 10 Möller, S. 49.764583 7.767528 230 40 x 50 11

DE, HE, Kassel, Alte Mühle W DE331 bis DE336 27 6 Möller, S. 51.271650 9.487720 179 5 x 6 12 10. Anhang 10. BE, VLG, Ename BE001 bis BE010 28 10 Möller, S. 50.858056 3.649361 51 10 x 15 5

AT, 7, Ötztal AU001, AU005 bis AU015 29 10 Schubert, K. 47.231889 10.87100 683 2 x 3 13 161

AT, 3, Burgruine Zelking AU047 bis AU056 30 10 Möller, S. 48.184985 15.26772 295 10 x 30 14

DE, HE, Burgruine Weidelsburg ID113 bis ID120, ID134, ID135 31 10 Möller, S. 51.273167 9.145694 348 100 x 20 1, 16

DE, HE, Burgruine Igelsburg ID139 bis ID147 32 9 Möller, S. 51.335889 9.371417 430 40 x 50 1, 15

FR, A, Château de Hohenstein FR007bis FR010, FR011 bis FR015 33 13 Möller, S. 48.567306 7.310500 460 5 x 20 4, 17

FR037 bis FR040 48.567472 7.310694 468 5 x 9

DE, TH, Rautal Jena JE007 bis JE012 34 12 Gerber, U. 50.961306 11.583778 338 30 x 40 1

R/G JE013 bis JE018 7

DE, BB, Sutschketal DE011, DE012, DE020, DE021, DE024 bis DE026, DE028, DE029 35 21 Möller, S. 52.250111 13.610500 54 30 x 30 6

R DE032 bis DE037, DE041 bis DE044 8

DE016 18

DE, N, Hasbruch DE046, DE047 36 24 Möller, S. 53.075611 8.498250 41 1 x 1 5

DE048 bis DE057 53.074444 8.500222 41 10 x 3

DE084 bis DE085 53.077222 8.498250 41 2 x 3

R DE063, DE064, DE067, DE071, DE072, DE074, DE075, DE077, DE078, DE087 53.075472 8.495361 41 2 x 4 7

FR, N, Montagne Noire 1 FR124 bis FR133 37 10 Möller, S. 43.407450 2.257450 728 20 x 100 27

FR, U, Massif des Maures FR144 bis FR153 38 10 Möller, S. 43.241320 6.328250 184 10 x 30 28

FR, N, Montagne Noire 2 FR134 bis FR143 39 10 Möller, S. 43.444470 2.705650 662 20 x 50 29 bis 31

FR, V, Montagne de Vuache FR094 bis FR113 40 20 Möller, S. 46.035370 5.962260 533 20 x 50 32 bis 47

FR, V, Chartreuse de la Pomier FR083 bis FR092 41 10 Möller, S. 46.086570 6.108030 770 5 x 10 48 bis 55

FR, V, Le Petit Bois FR114 bis FR123 42 10 Möller, S. 46.168320 5.477720 648 15 x 30 56 bis 62

IT, 21, Lagoni de Mercurago ID001 bis ID004 43 35 Möller, S. 45.742722 8.544361 254 5 x 5 63 bis 73

ID005 bis ID008 45.741472 8.543194 262 5 x 6

ID009 bis ID014 45.740222 8.541250 268 10 x 15

ID015 bis ID020 45.738944 8.544444 286 4 x 8 10. Anhang 10. ID020 bis ID022 45.733506 8.542694 286 3 x 4

ID023 bis ID028 45.737278 8.546333 286 12 x 15 162 ID029 bis ID035 45.743917 8.545250 248 15 x 16

IT, 25, Valle del Ticino ID036 bis ID038 44 13 Möller, S. 45.781583 8.656222 319 4 x 5 74 bis 80

ID039 bis ID042 45.781611 8.657111 319 5 x 5

ID043 45.781167 8.659667 368 1 x 2

ID045, ID048 45.782278 8.663028 368 3 x 6

ID049 bis ID052 45.783417 8.663472 332 2 x 10

IT, 25, Bosco del Ginestre IT013 bis IT037 45 25 Möller, S. 45.332174 8.944141 92 20 x 40 81 bis 93

IT, 45, Boschi di Carrega IT043 bis IT050, IT052, IT053 46 10 Möller, S. 44.724500 10.211722 190 50 x 5 94 bis 100

IT, 34, Foresta Fontana IT138, IT140, IT142, IT144, IT146, IT148, IT150, IT152, IT154, IT156, 47 24 Möller, S. 45.200083 10.752111 21 100 x 10 101 bis 123

IT158, IT160, IT164, IT166, IT168, IT170, IT172, IT174, IT176 45.202833 10.749639 22 100 x 10

IT178, IT180, IT182, IT184, IT186 45.199583 10.754611 21 30 x 1

IT, 25 Parco Alto Milanese IT205 bis IT209 48 48 Möller, S. 45.599950 8.880410 221 5 X 10 124 bis 134

IT210 bis IT230 45.598750 8.880400 221 20 x 100

IT231 bis IT252 45.595490 8.880600 220 15 X 50

IT, 45, Croara IT253 bis IT280, IT282 bis IT284 49 30 Möller, S. 44.93575 9.58592 165 200 x 300 135 bis 162

IT, 25, San Gervasio IT285 bis IT295, IT297, IT299 bis IT308, IT310 bis IT317 50 30 Möller, S. 45.61752 9.52018 155 300 x 400 163 bis 191

IT, 34, Bosco Baredi Selva di Arvonchi IT320 bis IT345 51 26 Möller, S. 45.78750 13.12139 8 10 x 20 192 bis 197

IT, 25, Rio Vallone IT346 bis IT373, IT375 bis IT378 52 28 Möller, S. 45.59264 9.43372 183 10 x 40 198 bis 218

HR, 18, Ponte Porton (nördlich) CR001 bis CR010 53 10 Möller, S. 45.36819 13.71310 118 5 x 7 219 bis 223

HR, 18, Ponte Porton (südlich) CR011 bis CR020 54 10 Möller, S. 45.35341 13.74116 44 10 x 20 224 bis 230

SL, Nova Gorica, N Nova Gorica SLO01 bis SLO10 55 10 Möller, S. 45.98250 13.65617 77 5 x 6 231 bis 235

SL, Nova Gorica, Zagomila SLO11 bis SLO19 56 9 Möller, S. 46.00502 13.62868 86 5 X 10 236 bis 242

SL, Nova Gorica, Zagomila 2 SLO20 bis SLO28 57 9 Möller, S. 46.02362 13.60720 89 10 x 20 243 bis 250

SL, Kanal ob Soči, Ročinj SLO29 bis SLO38 58 10 Möller, S. 46.10811 13.65838 168 10 x 35 251 bis 259

SL, Tolmin, Kozlov Rob SLO39 bis SLO60, SLO64 bis SLO67, SLO69, SLO73 59 25 Möller, S. 46.18865 13.72638 340 300 x 500 260 bis 283

SL, Bovec, Südlich Bovec SLO74 bis SLO91, SLO93 60 18 Möller, S. 46.32533 13.52089 382 5 x 50 284 bis 301 Anhang 10.

IT, 25, Palude Brabbia ID053 bis ID056 61 12 Möller, S. 45.783667 8.709806 261 15 x 20 302 bis 303

163 ID057 bis ID060 45.78375 8.710361 261 5 X 10

ID061 bis ID064 45.783806 8.71125 262 10 x 12

IT, 21, Agognate IT192 bis IT204 62 13 Möller, S. 45.47265 8.58975 161 3 x 6 304

IT, 45, Bosco di Santa Franca IT038 bis IT042 63 5 Möller, S. 44.860778 9.896056 163 10 x 5 305

IT, 52, Valle del Torrente Carfalo IT057, IT058, IT060, IT062, IT064, IT065, IT066 bis IT069 64 10 Möller, S. 43.543 10.880639 318 30 x 10 306

IT, 57, Selva di Castelfidardo IT099 bis IT137 65 39 Möller, S. 43.46875 13.588889 12 20 x 200 307

IT, 32, Rovine di Castel Boymont IT001 bis IT010 66 10 Pfeiffer, I. 46.494722 11.2525 257 150 x 180 308, 309

IT, 52, Castello di Montalfina IT071 bis IT098 67 28 Möller, S. 42.686278 11.957139 542 40 x 45 310

CA, ON, Sault Ste. Marie CA001 bis CA010 68 10 Antunes, P. 46.49484 -84.35933 203 unbekannt 3

CA, ON, Riverwood Conservancy CA037 bis CA046 69 10 Dickinson, T. 43.565831 -79.673018 178 unbekannt 3

CA, ON, Rattray Marsh CA047 bis CA056 70 10 Dickinson, T. 43.519096 -79.605624 75 unbekannt 3

'Atropurpurea' R CV001 1 BoGa Jena 7

'Azurea' G CV002 1 BoGa Jena 19

'Acorea' G CV003 1 BoGa Jena 19

'Multiplex' R/G CV004 1 BoGa Jena 7

'Rubra' R CV005 1 BoGa Jena 8

'Gertrude Jekyll' W CV006 1 BoGa Jena 20

'Anna'® CV007 1 Fa. Stauden Junge 22

'Sabinka' CV008 1 Fa. Stauden Junge 23

'Argenteovariegata' CV009 1 Fa. Stauden Stade 24

'Elisa'® W CV010 1 Fa. Stauden Stade 25

'Grüner Teppich' CV011 1 Fa. Stauden Stade 2

'Josefine'® CV012 1 Fa. Stauden Stade 26

'Marie'® CV013 1 Fa. Stauden Stade 20

'White Power' W CV014 1 Fa. Stauden Stade 21

'Bowles Variety' CV015 1 Fa. Stauden Stade 5

'Aureovariegata' CV016 1 Fa. Stauden Stade 5 Anhang 10.

'Alba' W CV017 1 BoGa Münster 21

164 'Hawaii'® CV018 1 BoGa Münster 4

A2: Übersicht über die 297 mittels plastidärer Mikrosatellitenmarker phylogeographisch untersuchten Pflanzenproben von Vinca minor. Für Proben aus der populationsgenetischen Analyse ist die Populationsnummer (Pop-Nr., siehe A1) angegeben, für Proben aus Herbarien sind die auf dem Herbarbeleg verzeichneten Fundortangaben und, sofern vorhanden, geographische Koordinaten sowie die vom Herbarium vergebene Akzessionnummer angegeben. Proben von einem Fundort sind durch horizontale Linien gekennzeichnet. N: Stichprobenumfang pro Fundort, ID: Identifikationsnummer. Bes.: Besonderheit der Blüten; R: rötlichviolette Blüten, G: gefüllte Blüten, W: weiße Blüten Geographische Angaben: BG: Bulgarien (343: Südostbulgarien, 412: Oblast Sofia); AU: Australien (VIC: Victoria); AT: Österreich (1: Burgenland, 3: Niederösterreich, 7: Tirol, 9: Wien); BE: Belgien (VLG: Flandern); CA: Kanada (NS: Nova Scotia, ON: Ontario, QC: Quebec); CH: Schweiz (AG: Aargau, GR: Graubünden, TI: Tessin, VD: Waadt, VS: Wallis); CZ: Tschechische Republik (PR: Prag); DE: Deutschland (BB: Brandenburg, BW: Baden-Württemberg, HE: Hessen, MV: Mecklenburg-Vorpommern, N: Niedersachsen, NW: Nordrhein- Westfalen, RP: Rheinland-Pfalz, SH: Schleswig-Holstein, ST: Sachsen-Anhalt, TH: Thüringen); E: Spanien (CT: Catalunya); HR: Kroatien (18: Istrien); IT: Italien (21: Piemont, 25: Lombardei, 32: Trentino-Südtirol, 34: Venetien, 45: Emilia-Romagna, 52: Toskana, 57: Marken); LI: Liechtenstein (VDZ: Vaduz); LX: Luxemburg (G: Grevenmacher, L: Luxemburg); FR: Frankreich (A: Elsaß, B: Aquitaine, F: Centre, G: Champagne-Ardenne, J: Île-de-France, K: Languedoc-Roussillon, M: Lothringen, N: Midi-Pyrénées, O: Nord-Pas-de-Calais, R: Pays de la Loire, S: Picardie, U: Provence-Alpes-Côte d’Azur, V: Rhône-Alpes); GB: Großbritannien (EE: Ost-England, SEE: Südost-England, SEW: Südost-Wales, SWE: Südwest-England); RO: Rumänien (CJ: Cluj); SE: Schweden (AB: Stockholms län, D: Södermanlands län, E: Östergötlands län, K: Blekinge län, M: Skåne län, O: Västra Götalands län, T: Örebro län, U: Västmanlands län, X: Gävleborgs län); US: Vereinigte Staaten von Amerika (CT: Connecticut, MA: Massachussets, MD: Maryland, NY: New York, WV: West Virginia) Abkürzungen für Herbarien und andere Institutionen: ACAD: E. C. Smith Herbarium, Irving Biodiversity Collection, Acadia University, BAIL: Herbarium des Conservatoire Botanique National de Bailleul, BM: Botany Collections, British Museum of Natural History, BoGaJ: Botanischer Garten Jena, BoGaM: Botanischer Garten Münster, BR: Herbarium of the National Botanic Garden of Belgium, ER: Herbarium Erlangense, Institut für Botanik und Pharmazeutische Biologie, Universität Erlangen-Nürnberg, FCO: Herbarium Oviedo, Department of Organisms and Systems Biology, University of Oviedo, FL: Abteilung Geographie, Universität Flensburg, HAL: Herbarium der Martin-Luther Universität Halle- Wittenberg, HEID: Botanischer Garten und Herbarium, Universität Heidelberg, HUJ: Herbarium Natural History Collections, Hebrew University of Jerusalem, JME: Herbarium des Jura-Museum Eichstätt, KL: Botanischer Garten & Kärntner Landesherbar, Kärtner Botanikzentrum, Landesmuseum für Kärnten, MEL: Royal Botanic Gardens, National Herbarium of Victoria (MEL), MJG: Herbarium des Instituts für Spezielle Botanik und Botanischer Garten, Johannes Gutenberg-Universität Mainz, NHMN Sofia: Botany Department, National Museum of Natural History, Sofia, NY: The William and Lynda Steere Herbarium, New York Botanical Garden, P: National Museum of Natural History, Paris, PR: Department of Botany, Charles University Praha, QFA: Herbier Louis-Marie, Université Laval, Quebec, S: General Herbarium, Botanical collections, Swedish Museum of Natural History, SJ: Firma Studen Junge, SS: Firma Stauden Stade, STUT: Herbarium des Staatlichen Museums für Naturkunde Stuttgart, TUB: Herbarium Tubingense, Institut für Biologie der Universität Tübingen, ULM: Herbarium und Botanischer Garten Ulm, WUP: Herbarium der Biologischen Station Mittlere Wupper

Proben- Pop-Nr. o. Herbarium Fundortangaben Bes. N Sammler Sammeldatum Koordinaten Haplotyp ID (ggf. Akzessionsnummer)

DE, RP, Römischer Tempel Koblenz D222 1 1 Möller, S. 23.05.11 50.311222 7.539139 H1

DE, HE, Wüstung Bad Emstal DE282 2 1 Möller, S. 17.07.13 51.239750 9.265472 H1

DE, N, Burgruine Hünenburg DE001 3 1 Möller, S. 15.11.11 51.987194 9.278111 H1

DE, TH, Schlachtfelder Jena DE192 4 1 Möller, S. 30.11.12 50.971111 11.569028 H1 Anhang 10.

DE, HE, Grab Bad Emstal DE287 5 1 Möller, S. 17.07.13 51.228278 9.261833 H1

DE, RP, Cochem DE141 6 1 Möller, S. 14.06.13 50.150472 7.152361 H1 165 DE, NW, Neandertal DE090 7 1 Möller, S. 12.04.12 51.224883 6.9747646 H1

DE, NW, Wüstung Elten ID176 8 1 Zirpel, M. 17.09.12 51.863966 6.1657699 H1

DE, HE, Römerkastell Saalburg ID75 9 1 Möller, S. 10.11.10 50.270028 8.5661492 H1

DE, HE, Burgruine Boyneburg DE151 10 1 Möller, S. 03.04.11 51.101528 10.007250 H1

DE, HE, Burgruine Falkenstein ID166 11 1 Möller, S. 05.02.11 51.253620 9.2969488 H1

DE, HE, Burgruine Malsburg ID214 12 1 Möller, S. 15.02.11 51.411414 9.2603568 H1

DE, HE, Burgruine Ebersburg ID236 13 1 Möller, S. 10.05.11 50.473756 9.8516834 H1

DE, ST, Wüstung Schleesen ID253 14 1 Wojacki, J. 02.06.11 51.155639 10.110972 H1

DE, HE, Wüstung Schlierbach ID192 15 1 Möller, S. 10.03.11 52.030586 12.3714774 H1

DE, RP, Römischer Tempel Bremm ID151 16 1 Möller, S. 12.06.13 50.10925 7.123361 H1

DE, HE, Emser Berg ID176 17 1 Möller, S. 07.02.11 51.254417 9.297583 H1

LX, G, Müllerthal LX02 18 1 Möller, S. 15.06.13 49.796250 6.372250 H1

DE, SH, Kollund/Krusau DK01 19 1 Stolz, C. 19.09.13 54.833000 9.425000 H1

BE, VLG, Wasserschloss Humbeek BE32 20 1 Ronse, A. 20.10.12 50.977861 4.374056 H1

AT, 3, Ortholz AU39 21 1 Möller, S. 10.03.14 48.194898 15.22079 H1

LI, VDZ, Vaduz ID65 22 1 Möller, S. 30.01.14 47.140911 9.525897 H1

AT, 3, Ruine Schenkenberg CH03 23 1 Möller, S. 01.03.14 47.442250 8.101430 H1

DE, BW, Schorndorf DE321 24 1 Schubert, K. 11.06.14 48.819140 9.505360 H1

CH, VS, Château de la Soie CH13 25 1 Möller, S. 10.03.14 46.240020 7.319120 H1

DE, HE, Kassel, Alte Mühle W DE331 27 1 Möller, S. 15.06.14 51.271650 9.487720 H1

BE, VLG, Ename BE01 28 1 Möller, S. 02.04.12 50.858056 3.649361 H1

AT, 7, Ötztal AU01 29 1 Schubert, K. 10.08.11 47.231889 10.87100 H1

AT, 3, Burgruine Zelking AU49 30 1 Möller, S. 10.03.14 48.184985 15.26772 H1

DE, HE, Burgruine Weidelsburg ID113 31 1 Möller, S. 17.01.11 51.273167 9.145694 H1

DE, HE, Burgruine Igelsburg ID139 32 1 Möller, S. 21.02.11 51.335889 9.371417 H1

DE, TH, Rautal Jena JE007 34 4 Gerber, U. 05.09.11 50.961306 11.583778 H1

JE010 34 Gerber, U. 05.09.11 50.961306 11.583778 H1

R/G JE013 34 Gerber, U. 05.09.11 50.961306 11.583778 H2

R/G JE016 34 Gerber, U. 05.09.11 50.961306 11.583778 H2

DE, BB, Sutschketal DE011 35 3 Möller, S. 29.03.12 52.250111 13.610500 H1

DE016 35 Möller, S. 29.03.12 52.250111 13.610500 H1 10. Anhang 10. R DE032 35 Möller, S. 29.03.12 52.250111 13.610500 H2

DE, N, Hasbruch DE046 36 2 Möller, S. 31.03.15 53.075611 8.498250 H1

166 R DE063 36 Möller, S. 31.03.15 53.075472 8.495361 H2

DE, BW, Argenauen DE298 STUT 1 Brielmaier, G. W. --.10.71 - H1

DE, BW, Argental R DE299 STUT 1 Brielmaier 03.05.71 - H2

DE, BW, Blutsberg Kapelle DE300 STUT 1 Bussmann, R. --.10.85 - H1

DE, BW, Büchsenberg DE252 1 Möller, S. 04.10.13 48.071814 7.607943 H1

DE, BW, Gewannflur Untersohltal DE314 TUB 1 Fahrbach, K. 05.05.00 - H1

DE, BW, Hardt Kalkhofen DE303 STUT 1 Rosenbauer, S. 23.04.96 - H1

DE, BW, Kattenhorn DE302 STUT 1 Rösch, M. 04.04.95 - H1

DE, BW, Kiesental DE297 ULM 1 Starnecker, G. 26.04.00 - H1

DE, BW, Kressbronn DE306 HAL 31070 1 Eichler, M. 28.05.44 - H1

DE, BW, L169 DE222 1 Möller, S. 03.10.13 48.098208 9.018048 H1

DE, BW, Schönbuch/Schloss Roseck DE304 STUT 1 Wrede 14.05.75 - H1

DE, BW, Sommerberg DE210 1 Möller, S. 03.10.13 48.750576 8.537428 H1

DE, BW, Staufen Weinberg DE242 1 Möller, S. 04.10.13 47.885494 7.734267 H1

DE, BW, Stettener Schloss DE200 1 Möller, S. 03.10.13 49.268832 9.773028 H2

DE, BW, Tübingen DE312 TUB 1 Blochmann 22.04.11 - H1

DE, BW, Weilerburg DE313 TUB 1 Krauss, H. A. 14.04.12 - H1

DE, BY, Erlangen Biologikum DE318 ER 1 Nezadal, W. 21.11.13 - H1

DE, BY, Felsengarten DE126 1 Pfeiffer, I. 19.08.11 49.983186 11.320243 H1

DE, BY, Fuchsberg Zandt DE292 JME 1 Dorr - - H1

DE, BY, Hetzleser Berg DE316 ER 1 Heller, S. 03.05.08 - H1

DE, BY, Lierheim DE294 JME 1 Schneid 12.05.04 - H1

DE, BY, Mariaberg DE301 STUT 1 Miksch 19.07.92 - H1

DE, BY, Michelsberg DE296 JME 1 Schneid 01.05.06 - H1

DE, BY, Mönau nähe Keltengrab DE319 ER 1 Nezadal, W. 21.11.13 - H1

DE, BY, Schloss Grünsberg DE317 ER 1 Heller, S. 12.05.06 - H1

DE, BY, Seiboldsdorf DE132 1 Möller, S. 22.03.13 47.85 12.637222 H3

DE, BY, Wemding DE293 JME 1 Schneid 13.04.04 - H1

DE, HE, Bad Sooden-Allendorf Römerlager ID102 1 Möller, S. 01.10.10 51.250139 9.977444 H1

DE, HE, Kastell Holzhausen DE199 FL 1 Stolz, C. 13.09.13 50.215 7.948 H1

DE, HE, Niederwalddenkmal DE127 1 Möller, S. 03.07.11 49.980406 7.893911 H1

DE, HE, Susberg DE315 MJG 1 Moore, A. J. 14.04.12 - H1 Anhang 10.

DE, MV, Hellbusch Kemnitzerhagen DE307 HAL 130079 1 Dörfelt, H. 28.05.68 - H1

DE, NW, Lochbachtal DE305 WUP 1 Hölting 13.04.80 - H1 167

DE, NW, Monheim DE295 JME 1 Lang - - H1

DE, RP, Burg Montfort DE262 1 Möller, S. 05.10.13 49.765364 7.767993 H1

DE, RP, Rheinsteig DE174 1 Weising, K. 26.08.12 50.176664 7.670039 H1

DE, ST, Hexentanzplatz DE125 1 Möller, S. 25.06.11 51.729932 11.019824 H1

DE, TH, Burgruine Scharfenburg ID229 1 Möller, S. 26.04.11 50.914444 10.397222 H1

DE, TH, Jechaer Forst DE311 HAL 103199 1 Werner, K. 25.04.54 - H1

DE, TH, Kloster Reinhardsbrunn ID170 1 Möller, E. 25.02.11 50.864018 10.554085 H1

DE, TH, Steinklöbe Ziegelrodaer Forst DE308 HAL 105632 1 Werner, K. 07.05.55 - H1

DE, TH, Tal Naschhausen DE309 HAL 105640 2 Werner, K. 20.05.56 - H1

DE310 HAL 5865 Werner, K. 20.05.56 - H1

AT, 1, Donnerskirchen Kaisereiche AU37 HEID 401668 1 Grünewald & Kaszkin 09.05.84 - H1

AT, 3, Wienerwald Helental AU36 HEID 401370 1 Kohnle & Roth 01.05.87 - H1

AT, 9, Lainzer Tiergarten AU38 HUJ 123002 1 Bojko, H. 29.03.13 - H1

BE, VLG, Kortrijk, Bossuit, Kanal BE42 BR 1 Verloove, F. 24.09.97 - H1

BE, VLG, Kortrijk, Ozveytbos, Kanal BE43 BR 1 Verloove, F. 18.09.96 - H1

BE, VLG, Lommel Rytenstraat BE45 BR 1 Barandre, R. 01.05.87 - H1

CH, GR, St. Hilarien FR064 P 4220700 1 Kintschi, C. 01.10.66 - H1

CH, VD, Bois de Chenaulaz CH02 HUJ 123000 1 Pfister, J.-L. 02.05.53 - H1

CZ, JM, Pouzdřany CZ01 HUJ 122996 1 Mrkov, O. - H1

CZ, PR, Schloss Konopiště CZ7A PR 2 Koubek, T. - 49.78027 14.65720 H3

CZ8A PR Koubek, T. - 49.78027 14.65720 H3

LX, L, Ginzebierg, Därebresch LX11 HEID 803951 1 Bonblet, L. 16.04.08 - H1

NL, LI, Bunderbos-Bundefelle NE01 HUJ 122997 1 Jacobs, M. 05.05.51 - H1

NL, LI, Kruisberg BE44 BR 1 Barandre, R. 14.01.04 - H1

PL, MA, Carpinetum Dabrowa PL01 HAL 25412 1 Magalski, J. 14.04.39 - H1

FR, A, Château de Hohenstein FR007 1 Möller, S. 01.10.13 48.567306 7.310500 H1

FR, A, Château du Nideck FR047 1 Möller, S. 01.10.13 48.574998 7.284968 H1

FR, A, Sigolsheim FR072 P 5207497 1 De Retz, B. 05.05.73 - H1

FR, A, Vallee de la Lucelle FR076 P 5236310 1 De Retz, B. 22.04.34 - H1

FR, F, Villiers-le-Morhier FR080 P 5236316 1 De Retz, B. 20.09.44 - H1

FR, G, Bois de Verpant G FR69 P 4533983 1 Desplantes, G. 03.05.32 - H6 Anhang 10.

FR, J, Bois de Meudon FR062 P 4220246 2 Humbert, H. --.04.09 - H1

FR, J, Bois de Meudon FR078 P 5236314 De Retz, B. 12.04.42 - H1 168 FR, J, Bois des Gonards FR079 P 5236315 1 De Retz, B. 14.05.42 - H1

FR, J, Forêt de Fontainebleau FR077 P 5236312 1 De Retz, B. 14.03.61 - H1

FR, M, Forêt Domaniale du Haut Jure FR068 P 4533978 1 Ninck, O. 17.04.10 - H1

FR, M, Meurthe-et-Moselle FR074 P 5236260 1 - --.05.1898 - H1

FR, O, Forêt domaniale de Desvres FR001 BAIL 97/99-660 1 - --.--.97 - H1

FR, R, Bois du Châteney FR059 P 42220121 1 Seyrat, A. XX.03.12 - H1

FR, S, Bois de Holmont FR060 P 4220232 1 Hibon, G. 03.06.09 - H1

FR, S, Château-Thierry, Bois Pierre FR081 P 5236324 1 Janowicz, S. 12.04.18 - H1

FR, S, Forêt de Compiègne FR065 P 4529033 1 Delpature, E. --.04.32 - H1

FR, S, Forêt de Halatte FR57b P 56272 1 Gaume, R. 26.03.12 - H1

FR, S, Neuville-Bosc FR082 P 5236252 2 Meslin, R. --.09.70 - H1

FR073 P 4534052 Meslin, R. --.09.70 - H2

GB, EE, Finchingfield GB09 BM 1 Vaughan, E. 09.05.1884 - H1

GB, EE, Tile Wood GB05 BM 1 Jermyn, S. T. --.--.55 - H1

GB, SEE, Hampshire-Mortimer GB04 BM 1 Hall, P. M. --.--.41 - H1

GB, SEE, National History Museum London GB06 BM 1 Curot-Lodeon, E. --.--.08 - H1

GB, SEE, Sheep Leas GB08 BM 1 Gerrans, M. B. 15.04.49 - H1

GB, SEW, Fernside Tintern Forest GB10 BM 1 Ward, P. S. 15.04.56 - H1

GB, SWE, Dorset-Marshwood W GB02 BM 2 Hall, P. M. - - H1

W GB03 BM Hall, P. M. - - H1

GB, SWE, Plympton GB07 BM 1 - 11.06.70 - H1

SE, AB, Freilichtmuseum Skansen S12 S S10-15494 1 Lundin, C. 30.05.38 - H1

SE, AB, Frescati S07 S N139-7 1 Malmgren, U. 03.07.98 - H1

SE, D, Tullinge alter Garten S09 S N475-322 1 Odelvik, G. 10.06.00 - H1

SE, D, Tullinge Kirche S10 S S98-6104 1 Jungstedt, H. 19.05.46 - H1

SE, E, Slattefors S08 S N464-106 1 Lundborg, A. 15.05.00 - H1

SE, K, Vämö Friedhof S01 S BL-6153 1 Lenander, H. 13.06.31 - H1

SE, M, Odensjö S03 S N05138-2734 1 Niordson, N. 13.05.83 - H1

SE, M, Vram S06 S N0652-70 1 Karlsson, T. 22.04.72 - H1

SE, O, Enåsa S04 S N0534-567 1 Folke, I. 04.06.83 - H1

SE, T, Skyberga S11 S S10-15484 1 Broddeson, E. 26.05.49 - H1

SE, U, Sala alter Garten Silbermine S02 S N0233-47 1 Lundquvist, N. 07.05.02 - H1 Anhang 10.

SE, X, Torsåker Kirche S05 S N0586-101 1 Odelvik, G. & H. 31.05.03 - H1

FR, N, Montagne Noire 1 FR124 37 1 Möller, S. 13.03.14 43.407450 2.257450 H1 169 FR, U, Massif des Maures FR144 38 1 Möller, S. 14.03.14 43.241320 6.328250 H1

FR, N, Montagne Noire 2 FR134 39 1 Möller, S. 13.03.14 43.444470 2.705650 H1

FR, V, Montagne de Vuache FR94 40 1 Möller, S. 11.03.13 46.035370 5.962260 H2

FR, V, Chartreuse de la Pomier FR83 41 1 Möller, S. 11.03.13 46.086570 6.108030 H2

FR, V, Le Petit Bois FR114 42 1 Möller, S. 11.03.13 46.168320 5.477720 H1

FR, B, Bois de Ménuse am Fluss Lède FR067 P 4533974 2 Jeanjean, F. 13.03.13 - H1

FR075 P 5236303 Jeanjean, F. 13.03.13 - H1

FR, K, Forêt de la Loubatière FR061 P 4220234 1 Labat, J. N. 30.09.89 - H1

FR, N, Limogne-en-Quercy FR071 P 5207496 1 Giraudias, L. 10.04.73 - H1

FR, V, Petit-Saléve FR66 P 4533944 1 Charpin, A., Cretton, N., Hainard, P. 17.05.73 - H2

FR, V, Poliénas, Wald FR58 P 4220119 1 Mercurin, L. 31.03.46 - H2

FR, V, zwischen Chambery & Les Echelles FR057a MJG 1 Mecker, U. 23.04.65 - H1

ES, CT, Ripollès, Serra de Bufadors de Beví ES01 FCO 44628 1 Vicens, J. 24.04.98 - H1

IT, 21, Lagoni de Mercurago ID01 43 7 Möller, S. 29.01.11 45.742722 8.544361 H1

ID05 43 Möller, S. 29.01.11 45.741472 8.543194 H1

ID09 43 Möller, S. 29.01.11 45.740222 8.541250 H1

ID15 43 Möller, S. 29.01.11 45.738944 8.544444 H1

ID20 43 Möller, S. 29.01.11 45.733506 8.542694 H1

ID23 43 Möller, S. 29.01.11 45.737278 8.546333 H1

ID29 43 Möller, S. 29.01.11 45.742722 8.544361 H1

IT, 25, Valle del Ticino ID36 44 4 Möller, S. 29.01.11 45.781583 8.656222 H1

ID43 44 Möller, S. 29.01.11 45.781167 8.659667 H1

ID39 44 Möller, S. 29.01.11 45.781611 8.657111 H5

ID49 44 Möller, S. 29.01.11 45.782278 8.663028 H5

IT, 25, Bosco del Ginestre IT021 45 2 Möller, S. 18.03.13 45.332174 8.944141 H1

IT037 45 Möller, S. 18.03.13 45.332174 8.944141 H1

IT, 45, Boschi di Carrega IT043 46 3 Möller, S. 19.03.13 44.724500 10.211722 H1

IT047 46 Möller, S. 19.03.13 44.724500 10.211722 H2

IT053 46 Möller, S. 19.03.13 44.724500 10.211722 H2

IT, 34, Foresta Fontana IT138 47 3 Möller, S. 21.03.13 45.200083 10.752111 H1

IT158 47 Möller, S. 21.03.13 45.202833 10.749639 H2

IT178 47 Möller, S. 21.03.13 45.199583 10.754611 H2 Anhang 10.

IT, 25, Parco Alto Milanese IT205 48 3 Möller, S. 14.03.14 45.599950 8.880410 H2

IT210 48 Möller, S. 14.03.14 45.598750 8.880400 H1 170 IT231 48 Möller, S. 14.03.14 45.595490 8.880600 H1

IT, 45, Croara IT253 49 4 Möller, S. 15.03.14 44.93575 9.58592 H1

IT262 49 Möller, S. 15.03.14 44.93575 9.58592 H1

IT270 49 Möller, S. 15.03.14 44.93575 9.58592 H1

IT276 49 Möller, S. 15.03.14 44.93575 9.58592 H1

IT, 25, San Gervasio IT285 50 4 Möller, S. 14.03.14 45.61752 9.52018 H1

IT293 50 Möller, S. 14.03.14 45.61752 9.52018 H4

IT299 50 Möller, S. 14.03.14 45.61752 9.52018 H4

IT312 50 Möller, S. 14.03.14 45.61752 9.52018 H4

IT, 34, Bosco Baredi Selva di Arvonchi IT320 51 2 Möller, S. 15.03.14 45.78750 13.12139 H2

IT326 51 Möller, S. 15.03.14 45.78750 13.12139 H2

IT, 25, Rio Vallone IT346 52 2 Möller, S. 14.03.14 45.59264 9.43372 H2

IT350 52 Möller, S. 14.03.14 45.59264 9.43372 H2

HR, 18, Ponte Porton (nördlich) CR01 53 2 Möller, S. 16.03.14 45.36819 13.71310 H1

CR07 53 Möller, S. 16.03.14 45.36819 13.71310 H1

HR, 18, Ponte Porton (südlich) CR12 54 3 Möller, S. 16.03.14 45.35341 13.74116 H3

CR15 54 Möller, S. 16.03.14 45.35341 13.74116 H3

CR16 54 Möller, S. 16.03.14 45.35341 13.74116 H3

SL, Nova Gorica, N Nova Gorica SLO01 55 2 Möller, S. 17.03.14 45.98250 13.65617 H1

SLO04 55 Möller, S. 17.03.14 45.98250 13.65617 H1

SL, Nova Gorica, Zagomila SLO16 56 2 Möller, S. 17.03.14 46.00502 13.62868 H2

SLO18 56 Möller, S. 17.03.14 46.00502 13.62868 H2

SL, Nova Gorica, Zagomila 2 SLO22 57 3 Möller, S. 17.03.14 46.02362 13.60720 H1

SLO22 57 Möller, S. 17.03.14 46.02362 13.60720 H1

SLO24 57 Möller, S. 17.03.14 46.02362 13.60720 H1

SL, Kanal ob Soči, Ročinj SLO29 58 2 Möller, S. 17.03.14 46.10811 13.65838 H1

SLO33 58 Möller, S. 17.03.14 46.10811 13.65838 H1

SL, Tolmin, Kozlov Rob SLO47 59 4 Möller, S. 17.03.14 46.18865 13.72638 H1

SLO69 59 Möller, S. 17.03.14 46.18865 13.72638 H1

SLO39 59 Möller, S. 17.03.14 46.18865 13.72638 H2

SLO65 59 Möller, S. 17.03.14 46.18865 13.72638 H2

SL, Bovec, Südlich Bovec SLO75 60 2 Möller, S. 17.03.14 46.32533 13.52089 H1 Anhang 10.

SLO80 60 Möller, S. 17.03.14 46.32533 13.52089 H1

IT, 25, Palude Brabbia ID53 61 2 Möller, S. 30.01.11 45.783667 8.709806 H1 171 ID57 61 Möller, S. 30.01.11 45.78375 8.710361 H2

IT, 21, Agognate IT192 62 1 Möller, S. 14.03.14 45.47265 8.58975 H1

IT, 45, Bosco di Santa Franca IT38 63 1 Möller, S. 19.03.13 44.860778 9.896056 H7

IT, 52, Valle del Torrente Carfalo IT57 64 1 Möller, S. 20.03.13 43.543 10.880639 H3

IT, 57, Selva di Castelfidardo IT099 65 1 Möller, S. 21.03.13 43.46875 13.588889 H1

IT, 32, Rovine di Castel Boymont IT001 66 2 Pfeiffer, I. 21.05.12 46.494722 11.2525 H1

IT006 66 Pfeiffer, I. 21.05.12 46.494722 11.2525 H1

IT, 52, Castello di Montalfina IT071 67 1 Möller, S. 20.03.13 42.686278 11.957139 H1

IT, 32, Schloss Thun IT190 1 Pfeiffer, I. 05.04.13 46.269258 11.085205 H2

IT, 32, Schlossruine Altenburg IT189 1 Pfeiffer, I. 05.04.13 46.471177 11.267890 H2

IT, 45, Abbazia di Monteveglio IT54 1 Möller, S. 31.03.2013 44.471783 11.095978 H3

IT, 25, Parco del Roccolo IT011 1 Möller, S. 29.03.13 45.550469 8.910744 H1

SL, Bovec, Bovec Herde 1 SLO1P PR 2 Koubek, T. - 46.346783 13.53695 H1

SLO2P PR Koubek, T. - 46.346783 13.53695 H1

SL, Bovec, Bovec Herde 2 SLO4S PR 2 Koubek, T. - 46.347233 13.5352 H1

SLO5S PR Koubek, T. - 46.347233 13.5352 H1

SL, Bovec, Bovec Herde 3 SLO1S PR 1 Koubek, T. - 46.332817 13.5914 H2

SL, Bovec, nördlich Bovec SLO94 2 Möller, S. 17.03.14 46.344831 13.57528 H1

SLO95 Möller, S. 17.03.14 46.344831 13.57528 H1

HR, 18, Kaiserwald Berg San Daniele HR02 KL BB161226 1 Starmühler, U. & W. 11.05.00 44.883 13.8835 H1

HR, 18, Stefansbad HR03 KL BB161227 1 Starmühler, U. & W. 06.05.00 45.375683 13.894883 H1

CH, TI, Lugano CH01 STUT 1 Aßmann, A. 05.09.57 - H1

BG, 343, Luftschiffhafen BG01 TUB 1 Krauss, V. 09.05.84 - H1

BG, 412, Garten Negovan BG02 NHNM Sofia 1 Dimitrov, D. 01.05.28 - H1

RO, CJ, Friedhof Hajongard RO_FR063 P 4220693 2 Péterfi, M. 12.05.21 - H1

RO01 HUJ Peterfi, M. 12.05.21 - H1

CA, ON, Sault Ste. Marie CA01 68 1 Antunes, P. 05.08.13 46.49484 -84.35933 H1

CA, ON, Riverwood Conservancy CA37 69 1 Dickinson, T. 10.07.14 43.565831 -79.673018 H1

CA, ON, Rattray Marsh CA47 70 1 Dickinson, T. 12.07.14 43.519096 -79.605624 H1

CA, QC, Sainte-Pétronille CA11 QFA 1 Cinq-Mars, L. & Lemieux, G. 21.02.13 - H1

CA, QC, Sainte-Pétronille CA14 QFA 82-60 1 Tardif, B. 07.03.13 - H1

CA, QC, Sainte-Pétronille CA17 QFA 90-232-M 1 Garneau, M., Roy, C. & Thibault, M. 16.05.61 - H1 Anhang 10.

CA, QC, Sainte-Pétronille, Avenue Royale CA12 QFA 16 1 Yelle, S. 21.02.13 - H1

CA, QC, Sainte-Pétronille, Sainte-François CA13 QFA 1 Masson, P. 08.03.13 - H1 172 CA, QC, Sainte-Pétronille, Nähe Bot. Garten van Hende CA18 QFA 83-043-M 1 Garneau, M. & Fiset, S. 29.05.83 - H1

CA, QC, Sainte-Pétronille, Stift der Ursulinen CA19 QFA 89-008-M 1 Garneau, M. & Roy, C. 23.08.52 - H1

CA, QC, Île d’Orléans CA15 QFA 10 1 Lechevalier, H. --.03.17 - H1

CA, QC, Île d’Orléans CA16 QFA 37 1 Lévesque, A. 12.03.14 - H1

CA, QC, Montmorency CA20 QFA 1048 1 Poisson, F. & Garneau, M. 27.05.82 - H1

CA, QC, Montmorency, Compagnons de Cartier CA21 QFA 79-45 1 Gervais, C. 25.05.46 - H1

CA, QC, Brophy Plantage CA22 QFA B81-460 1 Bernard, J.-P. 14.06.56 - H1

CA, QC, Friedhof Belmont CA23 QFA B77-459 3 Bernard, J.-P. 31.08.90 - H1

CA30 QFA 73-13 Gauthier, R. 17.05.77 - H1

US09 NY 2200822 Gauthier, R. 02.06.73 - H1

CA, QC, Friedhof St. Patrick CA24 QFA C-1-77 1 Roy, C. 09.06.83 - H1

CA, QC, Gomin CA25 QFA 516 1 Cinq-Mars, L. 16.05.89 - H1

CA, QC, Cap Blanc CA26 QFA 53-10 1 Cayouette, R. 04.07.98 - H1

CA, QC, Ste-Foy/Chemin des Quatre-Bourgeois CA27 QFA B92 1 Bernard, J. P. 10.06.79 - H1

CA, QC, Universität Laval CA28 QFA 1 Gauthier, R. 05.10.81 - H1

CA, QC, Cap Rouge CA29 QFA 1 Lechevalier, G. 20.07.77 - H1

CA, QC, Sillery CA31 QFA 82-25 2 Tardif, B. & Légaré, C. 27.05.45 - H1

CA, QC, Sillery CA32 QFA 81-61 Tardif, B. & Marquis, É. C. 07.05.53 - H1

CA, QC, Universität Laval CA33 QFA 47 1 Garneau, M. & Roy, C. 16.07.74 - H1

CA, QC, Mégantic CA34 QFA 66310 1 Hamel, C. 11.05.72 - H1

CA, QC, Cap à l'Aigle CA35 QFA 1 Parent, L. 20.05.45 - H1

CA, QC, Universität McGill CA36 QFA 53/2 1 Bernard, J.-P. 02.06.73 - H1

CA, NS, Berwick CA58 ACAD 55966 1 Bentley, P. A. 15.05.82 45.09390 -64.69303 H1

CA, NS, Churchills Lake CA59 ACAD ECS010071 1 Hersey, R. E. & MacQuarrie, P. 31.05.81 43.98574 -66.14534 H1

CA, QC, Bienville CA60 ACAD 71288 1 - 18.05.78 46.82252 -71.1756 H1

US, WV, Greenbrier östlich von Richwood US01 NY 42221 1 Nelson, J. B. 22.04.95 38.233 -80.383 H1

US, NY, Ice Pond Nature Preserve US02 NY 1070579 1 Atha, D. E. & Buck, W. R. 29.04.07 41.4525 -73.615278 H1

US, NY, New York Botanical Garden US03 NY 1088034 1 Atha, D. E. 13.04.09 40.860833 -73.873333 H1

US, MD, Preston Bahnschienen US04 NY 2200828 1 Longbottom, W. D. 13.04.10 38.707778 -75.908333 H1

US, CT, Wethersfield Sumpf US05 NY 2200826 1 Hill, S. R. 11.05.92 - H1

US, NY, Long Island Sound US06 NY 2200827 1 Pruski, J. F. 07.05.83 - H1

US, MD, Baltimore Green Road US07 NY 2200824 1 Link, J. A. 27.04.80 - H1 Anhang 10.

US, MA, Nantucket Island US08 NY 2200823 1 MacKeever, F. C. 05.05.65 - H1

US, MD, Idylwild Wildlife Management Area US10 NY 220829 1 Longbottom, W. D. 02.04.10 - H1 173

AU, VIC, Dandenong Ranges National Park W A01 MEL 2040653A 1 Reid, J. C. 24.09.97 -37.8853 145.3478 H1

AU, VIC, Bot. Garten Melbourne W A02 MEL 2034728A 1 Tonkin, J. E. 18.09.96 - H1

AU, VIC, Falls Creek A03 MEL 2269724A 1 Blood, K. L. 14.01.04 -36.8667 147.2667 H1

'Atropurpurea' R CV01 BoGa J 1 - - - H2

'Azurea' G CV02 BoGa J 1 - - - H1

'Acorea' G CV03 BoGa J 1 - - - H1

'Multiplex' R/G CV04 BoGa J 1 - - - H2

'Rubra' R CV05 BoGa J 1 - - - H2

'Gertrude Jekyll' W CV06 BoGa J 1 - - - H1

'Anna'® CV07 SS 1 - - - H1

'Sabinka' CV08 SJ 1 - - - H2

'Argenteovariegata' CV09 SS 1 - - - H1

'Elisa'® W CV10 SS 1 - - - H1

'Grüner Teppich' CV11 SS 1 - - - H1

'Josefine'® CV12 SS 1 - - - H1

'Marie'® CV13 SS 1 - - - H1

'White Power' W CV14 SS 1 - - - H1

'Bowles Variety' CV15 SS 1 - - - H1

'Aureovariegata' CV16 SS 1 - - - H1

'Alba' W CV17 BoGaM 1 - - - H1

'Hawaii'® CV18 BoGaM 1 - - - H1 10. Anhang 10.

174 10. Anhang

A3: Protokoll zur DNA-Isolierung aus getrocknetem Blattmaterial nach der Standard-CTAB-Methode. Modifiziert nach Weising et al. (2005).

Geräte, Materialien und Reagenzien Geräte Waage (Sartorius BP 310 S) Kugelmühle (Retsch MM 300) Thermomixer (Thermomixer Compact, Eppendorf, Hamburg) Zentrifuge (Variofuge 3.0 R mit Schwenkrotoren, Heraeus Instruments, München) Zentrifuge (Centrifuge 5804 R, Eppendorf, Hamburg) Trockenschrank (Heraeus) Vortex Mixer classic Materialien Carbonkugeln 2 ml-Reaktionsgefäße 1,5 ml-Reaktionsgefäße Reagenzien CTAB-Puffer-DNA-Isolationspuffer 2 % CTAB (Cetyl-Trimethyl-Ammonium-Bromid) 1,4 M NaCl 0,1 M Tris-HCl pH8 20 mM EDTA 0,2% ß-Mercaptoethanol (vor Gebrauch zugeben) Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) 100 % Isopropanol 70 % Ethanol TE-Puffer (pH 8) 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA RNAseA-Lösung (100 mg/ml, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA)

Vorgehensweise

Etwa 20 bis 30 mg getrocknetes Blattmaterial wurden in 2 ml-Reaktionsgefäße überführt und mit Hilfe von zwei Carbonkugeln in der Kugelmühle bei einer Frequenz von 28 für 1 min 30 sec zerkleinert. Zum zerkleinerten Pflanzenmaterial wurde je 500 μl auf 60 °C vorgewärmter, frisch mit je 1 μl ß-Mercaptoethanol versetzter CTAB-Isolationspuffer hinzugefügt. Dieses Gemisch wurde für mindestens 30 min im Thermomixer bei einer Drehzahl von 1.100 rpm inkubiert.

Danach wurde den Proben 500 μl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) zugegeben. Die Suspension wurde nochmals für 10 min im Thermomixer bei RT inkubiert und dabei emulgiert und anschließend zur Phasentrennung zentrifugiert (4.000 rpm, 30 min, RT, Heraeus Variofuge 3.0R). Die obere, wässrige Phase wurde mit einer Pipette vorsichtig in ein neues Reaktionsgefäß überführt.

Unter Zugabe von 0,6 Volumenanteilen (ca. 250 μl) kaltem Isopropanol und vorsichtigem Durchmischen fällt die DNA in Form eines fädigen Präzipitats aus. Um eine größere Ausbeute zu erzielen, wurden die Proben bis zu zwei Stunden bei -20 °C inkubiert. Die anschließende Zentrifugation (14.000 rpm, 4 °C, 20 min, Eppendorf Centrifuge 5804R) führte zur Sedimentation der ausgefällten DNA am Boden des Reaktionsgefäßes. Nach dem Dekantieren des wässrigen Überstandes wurde das Pellet mit 500 μl kaltem 70%igen Ethanol durch vorsichtiges Schwenken der Reaktionsgefäße gewaschen und zentrifugiert (14.000 rpm, 4 °C, 5 min, Eppendorf Centrifuge 5804R). Nach Verwerfen des Überstandes und Trocknen der Proben bei RT oder bei 50 °C im Trockenschrank wurde das Pellet in 200 μl TE-Puffer gelöst und mit 0,1 μl RNAseA- Stammlösung über Nacht bei Raumtemperatur einem RNA-Verdau unterzogen. Nach der Überprüfung des DNA-Gehalts durch Agarosegelelektrophorese (vgl. 2.5.1) wurde die DNA auf eine standardisierte Konzentration von 10 ng/μl verdünnt und bei -20 °C eingelagert.

175 10. Anhang

A4: Protokoll zur DNA-Isolierung aus getrocknetem Blattmaterial nach der Sorbitol-Variante der CTAB- Methode. Von Tel-Zur et al. (1999), modifiziert nach Krapp (2009).

Geräte, Materialien und Reagenzien Geräte s. A3 zusätzlich: Mörser und Pistill Materialien s. A3 zusätzlich: 15 ml-Falcon-Röhrchen Reagenzien Sorbitol-Waschpuffer, pH 8 100 mM Tris-HCl 5 mM EDTA 0,35 M Sorbitol 1 % v/v ß-Mercaptoethanol (vor Gebrauch zugeben) 1 % w/v PVP-40 (vor Gebrauch zugeben) Extraktionspuffer (3x CTAB-Puffer), pH 8 100 mM Tris-HCl 20 mM EDTA 3 M NaCl 3 % w/v CTAB 1 % v/v ß-Mercaptoethanol (vor Gebrauch zugeben) 1 % w/v PVP-40 (vor Gebrauch zugeben) Sarkosyl (30 % wässrige Lösung) Chloroform/Isoamylalkohol (24:1 v/v) 3 M Natriumacetatlösung, pH 5,2 100 % Isopropanol 70 % Ethanol TE-Puffer, pH 8 (s. A3) RNAseA-Lösung (100 mg/ml, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA)

Vorgehensweise

Von frischem Pflanzenmaterial wurden 500 mg unter Zugabe von flüssigem Stickstoff gemörsert, von Trockenmaterial je nach Verfügbarkeit bis zu 50 mg in der Kugelmühle zerkleinert. Nach Überführung in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen wurde 4 °C kalter Sorbitol-Waschpuffer bis zum Endvolumen von 14 ml zugegeben, geschüttelt und fur 20 min auf Eis inkubiert. Durch Zentrifugation (4.000 rpm, 25 min, 4 °C, Variofuge 3.0 R) wurden Zellwandtrümmer und Organellen sedimentiert, der Überstand verworfen. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt.

Das nach der letzten Zentrifugation erhaltene Pellet wurde in 600 μl Extraktionspuffer und 30 μl 30%igem Sarkosyl suspendiert und für etwa 60 min bei 60 °C im Wasserbad lysiert. Nach Zugabe von 600 ml Chloroform/Isoamylalkohol und Inkubation für 20 min unter Schwenken erfolgte eine Phasentrennung durch Zentrifugation (4.000 rpm, 20 min, RT, Heraeus Variofuge 3.0 R). Von der wässrigen oberen Phase wurden bis zu 1.000 μl in ein frisches 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Nach einer zweiten Zentrifugation (10.000 rpm, 10 min, RT, Eppendorf Centrifuge 5804 R) wurden bis zu 800 μl der wässrigen Phase in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt ohne ein eventuell vorhandenes Pellet zu zerstören. Aus dieser Lösung wurde die DNA durch Zugabe von 80 μl Natriumacetatlosung und 600 μl Isopropanol gefällt. Nach einer Inkubation bei 4 °C über Nacht und einer weiteren Zentrifugation (14.000 rpm, 20 min, 4 °C, Centrifuge 5804R) wurde der resultierende Überstand verworfen. Nach Zugabe von 500 μl 70 % Ethanol zum Pellet wurde erneut zentrifugiert (14.000 rpm, 10 min, RT, Eppendorf Centrifuge 5804R). Nach dem erneuten Abgießen des Überstandes wurde die DNA im Heizschrank bei 50 °C getrocknet. Nach dem Lösen in 100 μl TE-Puffer wurden 0,1 μl RNaseA- Stammlösung zugegeben und die RNA über Nacht bei Raumtemperatur verdaut. Die Konzentration und Qualitat der gewonnenen DNA wurde mittels Agarosegelelektrophorese überprüft (vg. 2.5.1), die DNA gegebenenfalls auf 10 ng/μl verdünnt und bei -20 °C eingelagert.

176 10. Anhang

A5: Übersicht über die 210 im assemblierten cDNA (Transkriptom)-454-Datensatz ermittelten Mikrosatellitenmotive, aufgschlüsselt nach Anzahl an Wiederholungseinheiten. Die mit n. d. bezeichneten Felder liegen unterhalb der Schwelle für die Definition eines Mikrosatelliten des betreffenden Typs.

SSR-Motiv Anzahl an Wiederholungseinheiten Gesamt

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 >15

A n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2744 10786 13530 C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 28 74 102 AT n.d. n.d. n.d. 105 199 127 112 67 69 85 46 35 307 1152 AG n.d. n.d. n.d. 131 239 202 91 61 60 47 27 23 122 1003 AC n.d. n.d. n.d. 38 75 30 28 13 18 12 7 7 30 258 CG n.d. n.d. n.d. 3 1 1 5 ACT n.d. n.d. 408 234 169 93 73 57 28 36 20 31 134 1283 AAG n.d. n.d. 390 166 53 78 9 2 3 1 702 AAT n.d. n.d. 225 105 58 41 27 17 15 8 12 10 46 564 AGC n.d. n.d. 202 45 30 7 4 288 ATC n.d. n.d. 173 48 21 19 3 1 1 1 267 AGG n.d. n.d. 171 48 17 4 2 242 ACG n.d. n.d. 117 39 29 13 14 5 5 4 1 6 233 ACC n.d. n.d. 119 61 35 3 3 3 224 AAC n.d. n.d. 107 52 23 14 7 1 1 1 3 1 210 CCG n.d. n.d. 54 23 7 3 1 88 ACGT n.d. 537 305 183 112 91 66 62 47 37 34 31 137 1642 AACT n.d. 112 54 42 15 12 15 9 8 1 2 3 7 280 AAGT n.d. 83 50 18 17 11 11 6 5 2 1 3 207 AAAT n.d. 43 13 4 3 2 1 2 1 69 ACCT n.d. 39 15 6 7 1 68 AACG n.d. 48 9 3 1 61 AATT n.d. 38 3 1 1 43 ACGG n.d. 17 6 1 3 1 1 1 30 AAAG n.d. 5 12 2 2 21 AAGG n.d. 12 4 1 17 AAAG n.d. 11 1 1 2 15 ATCC n.d. 10 10 AATC n.d. 8 8 ATAC n.d. 2 3 3 8 ACCG n.d. 4 3 1 8 AACC n.d. 5 1 1 7 AAAC n.d. 5 5 ATAG n.d. 5 5 AGGG n.d. 2 1 3 CCCG n.d. 3 3 AAGC n.d. 1 1 ACTC n.d. 1 1 AACGT 413 177 111 45 37 31 22 16 9 8 2 3 16 890 ACCGT 156 75 35 13 12 10 3 4 3 1 2 4 318 AACTT 47 16 8 3 1 1 76 AAAAT 44 24 1 1 70 AAACT 29 13 3 4 1 1 1 52 AAAGT 22 9 3 1 1 1 37 AAGGT 23 9 1 1 34 AACCT 28 3 1 1 1 34 AAAAG 19 2 21 ACCCT 9 7 3 19

177 10. Anhang

AAATT 13 3 1 17 AACGG 13 1 14 AAAGG 9 2 2 13 ACGGG 4 4 2 2 10 AAATC 9 9 AAACG 7 2 1 9 AAAAC 6 1 1 8 ACACT 3 4 7 ACCGG 5 1 1 7 ATACT 6 6 AAGAG 4 1 5 AAGGG 4 1 5 AATAC 3 1 4 AAGCC 2 2 4 AATAT 3 1 4 AGGCG 4 4 AAACC 2 1 3 AACCG 2 1 3 ACTCT 3 3 ACCTG 3 3 AGCCC 1 2 3 AGAGG 2 1 3 AGGGG 2 1 3 AGAGG 1 2 3 AACCC 2 2 ATCTC 2 2 ACACC 2 2 ACCGC 1 1 2 ACCCC 1 1 AAAGC 1 1 AATAG 1 1 AATTC 1 1 AACAC 1 1 AACAG 1 1 ATAGC 1 1 ATCCG 1 1 ACAGG 1 1 ACTCC 1 1 ACCAG 1 1 ACCTC 1 1 ACGAG 1 1 AGAGC 1 1 AGGGC 1 1 CCCGG 1 1 AACGTT 52 32 15 8 4 1 3 2 2 119 AAACGT 36 13 2 4 3 4 2 1 2 67 AAAAAT 41 10 3 4 1 2 61 AACGGT 35 9 8 3 2 1 58 AACCGT 31 13 5 2 2 2 55 ACTGCC 39 39 ACCGGC 12 9 27 ACTCTC 3 23 1 27 ACCCGT 16 2 3 1 1 23 ACCTCC 7 10 17 AAGAGC 11 1 3 15

178 10. Anhang

AAGAGG 4 6 5 15 ACCGGG 11 1 1 13 AACCTT 6 2 1 9 AAAAAG 7 1 8 AAGATG 7 1 8 AGCCGG 7 1 8 AAAAGG 7 7 AAATTG 7 7 AAACCC 5 2 7 AAAGTT 4 1 2 7 AATCTG 7 7 AACCCT 4 1 2 7 AAGGCG 7 7 ACTACC 5 2 7 AAAAGT 6 6 AAACTT 4 1 1 6 AAACGG 5 1 6 AAAGAG 6 6 AACAGT 6 6 AAGGGT 5 1 6 ACCTGC 2 4 6 ACCGCC 5 1 6 ACTCCG 6 6 AGCCCC 4 2 6 AAAACT 3 2 5 AAAGGT 4 1 5 AACTCC 4 1 5 AACCAG 5 5 AATCCC 4 1 5 ATCAGC 5 5 ACCGGT 2 1 1 1 5 AAAATT 3 1 4 AAATGC 4 4 AAACCT 4 4 AAAGCC 4 4 AATATC 4 4 AACACC 4 4 AACAGC 2 2 4 AAGGAG 4 4 ACAGCC 1 1 1 1 4 ACCACG 4 4 ACGGGG 2 2 4 AAAACC 1 2 3 AAAACG 1 2 3 AAATCG 3 3 AATGAG 2 1 3 AATGAT 2 1 3 AAGCCG 3 3 ATCACC 3 3 ATCCTC 3 3 ATCGTC 2 1 3 ACTCCC 2 1 3 AAAATC 2 2 AAATTC 2 2 AATACT 1 1 2

179 10. Anhang

AATCAG 2 2 AATGGT 2 2 AACATC 1 1 2 AACTCG 1 1 2 AAGGGG 2 2 ACTCGG 2 2 ACTGCT 2 2 ACTGGG 2 2 ACCTGG 2 2 ACGCCG 2 2 ACGGAG 2 2 AGCAGG 1 1 2 AGCCTC 2 2 AAAAAC 1 1 AAAATG 1 1 AAATAG 1 1 AAATGG 1 1 AAACAC 1 1 AAACAG 1 1 AAAGGC 1 1 AATAGT 1 1 AATTCC 1 1 AATCAC 1 1 AATCGC 1 1 AATGGC 1 1 AACCAC 1 1 AACCCC 1 1 AACCTC 1 1 AACGAG 1 1 AAGATC 1 1 AAGCAC 1 1 AAGCAG 1 1 AAGCGG 1 1 AAGCTG 1 1 ATCTCC 1 1 ATCTGC 1 1 ATCGGC 1 1 ACACAG 1 1 ACAGGC 1 1 ACCAGC 1 1 ACCCAG 1 1 ACCCTC 1 1 ACCCCG 1 1 ACCCCT 1 1 ACCGTC 1 1 ACGAGG 1 1 AGAGCG 1 1 AGAGGC 1 1 AGAGGG 1 1 AGCTCC 1 1 AGCCGC 1 1 AGCCTG 1 1 Gesamt 1469 1536 2678 1465 1189 804 505 327 276 246 155 145 823 25253

180 10. Anhang

A6: Übersicht über die 89 im assemblierten genomischen 454-Datensatz ermittelten Mikrosatellitenmotive, aufgschlüsselt nach Anzahl an Wiederholungseinheiten. Die mit n. d. bezeichneten Felder liegen unterhalb der Schwelle für die Definition eines Mikrosatelliten des betreffenden Typs.

SSR-Motiv Anzahl an Wiederholungseinheiten Gesamt

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 >15 A n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 174 365 539 C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 8 7 15 AT n.d. n.d. n.d. 16 31 38 27 14 17 14 11 7 32 207 AG n.d. n.d. n.d. 26 35 18 22 14 11 5 5 3 31 170 AC n.d. n.d. n.d. 18 15 18 10 6 4 4 3 9 87 AAT n.d. n.d. 31 14 12 6 2 2 5 6 3 2 5 88 AAG n.d. n.d. 21 10 2 1 1 35 AAC n.d. n.d. 9 9 4 3 1 26 ACC n.d. n.d. 10 5 1 2 18 ATC n.d. n.d. 9 3 2 2 16 AGG n.d. n.d. 8 2 1 1 12 ACT n.d. n.d. 3 1 4 CCG n.d. n.d. 2 1 3 AGC n.d. n.d. 1 1 2 AAAT n.d. 13 1 14 AAAC n.d. 3 3 AAAG n.d. 2 2 AAAT n.d. 1 1 AATT n.d. 1 1 AATG n.d. 1 1 AACT n.d. 1 1 AAGT n.d. 1 1 ATAC n.d. 1 1 ATCC n.d. 1 1 ATGC n.d. 1 1 ACTC n.d. 1 1 ACGT n.d. 1 1 AAAAT 9 1 10 ACCCC 5 4 9 AAAAC 5 1 6 AAAAG 6 6 AAAAC 3 1 1 5 AAATC 4 4 ACACG 4 4 ACCCG 1 2 3 AATCT 2 2 ACCGG 2 2 AGAGG 2 2 CCCCG 1 1 2 AAAAT 1 1 AAACG 1 1 AATAT 1 1 AATCC 1 1 AATGG 1 1 AACAT 1 1 AACCT 1 1 AACCC 1 1 AAGAC 1 1

181 10. Anhang

ATACT 1 1 ACACC 1 1 ACGAG 1 1 ACGGC 1 1 AGCCG 1 1 AGGCG 1 1 AGGGG 1 1 CCCGG 1 1 AAAAAT 4 4 AAAAAG 3 1 4 AAACAC 1 1 2 AAACTC 2 2 AAAGCC 2 2 AACTCC 2 2 AAGATG 2 2 AAGGAG 2 2 ATCACC 1 1 2 ACACTC 2 2 ACCTCC 1 1 2 AAAATC 1 1 AAAACC 1 1 AAATTT 1 1 AAATTG 1 1 AATAAC 1 1 AATGAT 1 1 AATGAG 1 1 AACAAG 1 1 AACCCC 1 1 AACGAT 1 1 AAGCAG 1 1 AAGCCC 1 1 ATATCC 1 1 ATCTCC 1 1 ATCCCC 1 1 ACTACC 1 1 ACCCCC 1 1 ACCGCC 1 1 ACGAGG 1 1 ACGCCC 1 1 AGAGCC 1 1 AGCCTC 1 1 Gesamt 72 63 107 105 104 90 63 36 37 25 23 197 449 1371

182 10. Anhang

A7: Eigenschaften der 60 für Primertests selektierten Primperpaare zur Amplifikation nukleärer Mikrosatellitenloci aus dem cDNA (Transkriptom)-454-Datensatz. Angegeben sind die Primersequenzen in 5'-3'-Richtung, die spezifische Schmelztemperatur, der prozentuale GC-Gehalt der Primersequenz, die aus den Sequenzdaten erwarteten (erw.) Fragmentlängen der amplifizierten Mikrosatelliten in Basenpaaren (bp) sowie das flankierte Mikrosatelliten-Motiv. Die mit * bzw. ** markierten Primer wurden am 5'-Ende mit einer universellen M13-Sequenz versehen (Schuelke, 2000); *: GTTGTAAAACGACGGCCAGT, **: CAGGAAACAGCTATGACC. fw: Vorwärts-Primer, rev: Rückwärts-Primer. Primerpaare, die in den Primertests in V. minor polymorphe, distinkte Banden generierten sind grau unterlegt markiert.

Herkunftssequenz Primername Primersequenz (5'-3') TM (°C) GC-Gehalt (%) Erw.Fragmentlänge (bp) Mikrosatellitenmotiv

UR1|SRR098690.135404.2 Vimi01fw * AGACGGAGGAGATAGAGAGTG 55,2 52,4 150 (AG)13 Vimi01rev CGAACAAACCGAAAACAAAC 58,2 40

UR1|SRR098690.455352.2 Vimi02fw * GGAAAAGCAATGTTCAAGAG 55,1 40 231 (AT)21 Vimi02rev CGGAACGTAAAGAAAGTAAGG 55,9 42,9

UR1|SRR098690.323455.2 Vimi03fw * CCTGCCATTTCATGTTAGAC 55,7 45 202 (AT)26 Vimi03rev CGTTGTTAGTTAGGTTAGTAGG 50,7 40,9

UR1|SRR098690.173305.2 Vimi04fw * GTGGTTTTGCAGGTCAAATA 56,2 40 243 (AT)28 Vimi04rev AGTTCTTCGTGTAGTCGTAGTGT 55 43,5

UR1|SRR098690.174055.2 Vimi05fw * TTCTTCTCATCCCCATCTC 55 47,4 154 (CT)20 Vimi05rev ACGACGACCACCACTACTAC 55,1 55

UR1|SRR098690.362397.2 Vimi06fw TTCTCTTAGGACCACAATGG 55,2 45 234 (GA)13 Vimi06rev ** CACTTACCTACCTTTCCTCGT 55,2 47,6

UR1|SRR098690.173135.2 Vimi07fw GTACAATCCAAGAAGCACTCA 55,5 42,9 181 (GA)22 Vimi07rev ** CGAACGGGAAGGAGTAATA 55,3 47,4

UR2|SRR098690.464306.2 Vimi08fw CGTAGTATTGCGTGTGTGC 56,3 52,6 157 (GT)16 Vimi08rev ** CGGGTGGATAACATTACATT 54,9 40

UR2|SRR098690.536690.2 Vimi09fw TATTCAGCTCCTCTTGGTAAG 54 42,9 211 (TA)27 Vimi09rev ** TACTAGACACACGACAACGAC 53,8 47,6

UR1|SRR098690.318310.2 Vimi10fw TCAACTTCTGGTGACTGAGAT 54,8 42,9 137 (TG)16 Vimi10rev ** GTTAAAAGGTAACGACGGAAC 55,6 42,9

UR1|SRR098690.245280.2 Vimi11fw ATCACCTTGGTACAACAACAC 54,9 42,9 230 (AAT)23 Vimi11rev ACTACCCAAACGAAGATTGA 54,8 40

UR2|SRR098690.482104.2 Vimi12fw GGTACAACAACACAAACACA 52,6 40 229 (AAT)24 Vimi12rev ACTAACCCCAAACGAAGATT 55,3 40

UR2|SRR098690.493420.2 Vimi13fw CGTAGTATGTCACCTTGGTA 51,1 45 172 (AAT)24 Vimi13rev CTATTCCGTAGTTCTTGTCTGA 53,9 40,9

UR1|SRR098690.444501.2 Vimi14fw TCTTGAAATCAGTAGCACCAG 55,6 42,9 109 (ATC)11 Vimi14rev GGTGTTTGAGCAGTTACCATA 55,3 42,9

UR1|SRR098690.354831.2 Vimi15fw CAATTAGAGCACCCATAACAG 55 42,9 156 (CTT)11 Vimi15rev CTTAGAGCACCCACTCCAT 55,2 52,6

UR1|SRR098690.185430.2 Vimi16fw CACGTAGTATTGGAAGTGGAG 54,9 47,6 199 (TAA)15 Vimi16rev GCTCTGATTATTCTGTTGCTG 55,3 42,9

UR2|SRR098690.471561.2 Vimi17fw TGAATCCTAATCTCTGTGGTG 55,2 42,9 132 (TAA)15 Vimi17rev GTTGGAGGAGAAGCAGAATA 54,6 45

UR1|SRR098690.314747.2 Vimi18fw CGTAGTATATTTAGGGCAACC 53,4 42,9 219 (TAT)13 Vimi18rev TCCCCTCTCGGCTAAGAT 57,3 55,6

UR2|SRR098690.481548.2 Vimi19fw ACCGCAAAGCGTAAATAGT 55,2 42,1 176 (TTA)17 Vimi19rev CATCCCATCAGGAAACTAAA 55,2 40

UR2|SRR098690.483450.2 Vimi20fw GAACTGAAACGAGAACAGAAG 54,3 42,9 169 (TTC)12 Vimi20rev CTCATCCATACATTACAAGAGC 54,1 40,9

C6_2654 Vimi21fw AAACCGAAACTAAGGTAAGGA 54,9 38,1 131 (CT)23 Vimi21rev ACGTAGTATGGTGTTTGTTCG 55,3 42,9

CUR1_10142 Vimi22fw TCGACACGACCACTCTACTAT 54,9 47,6 151 (CT)20

183 10. Anhang

Vimi22rev TATTTCCTTTGTTCAAGCAGA 55,3 33,3

CUR1_17265 Vimi23fw AATTCACACAAAGCCAGAATA 55 33,3 167 (AT)21 Vimi23rev GAAGTAAAGTAAGTACGTCGTTG 53 39,1

CUR1_18698 Vimi24fw CAAGGTAATGTAGCCTCTGAA 54,8 42,9 147 (GA)16 Vimi24rev TCTCGTCTCGTTACTCGTACT 54,4 47,6

C5_3867 Vimi25fw * CCGTTTTCCTATTCATTTTCT 55,2 33,3 133 (TGT)14 Vimi25rev CCTGAACCTGGAATTAGAACT 55,1 42,9

C7_1669 Vimi26fw * GTGGTTGTTGTAACAGAGGAA 55,2 42,9 162 (TTA)14 Vimi26rev GGAAACTCAAATCCTTCTGA 54,4 40

CUR1_10355 Vimi27fw ACGTAGTATGGCTACTCGACA 55,1 47,6 162 (GTT)16 Vimi27rev ** AGCAGTGTCCTCCTCAGAT 54,7 52,6

CUR1_16304 Vimi28fw ATCACCTTGGTACAACAACAC 54,9 42,9 157 (AAT)22 Vimi28rev TCATTCCAGTTCTTGTCTGAT 54,7 38,1

CUR1_19599 Vimi29fw CCTCTATCTTCGTCCCAGTAT 55 47,6 157 (TAT)19 Vimi29rev ** TCAAGGGAGTTGGAAACTACT 55,6 42,9

C7_1918 Vimi30fw CGTCTAACGGTTCTACTAACG 54,5 47,6 275 (TACG)15 Vimi30rev GACGAGTACGACGGTCAA 55,5 55,6

C4_445 Vimi31fw * CTTTTTAGTCAGGAGGAGCAG 56 47,6 175 (GAA)9 Vimi31rev TATTGTTGCCGAGGATGTAC 55,6 40

Contig_1209 Vimi32fw * GGAGCGGTTTTGAAGTATTA 54,7 40 162 (ATT)10 Vimi32rev CCCCTAACCAAACAATAGAA 54,4 40

Contig_1485 Vimi33fw * AACGGATACTTTCTCAATCG 54,9 40 156 (GCT)7 Vimi33rev CCTCATAAATCAATCAGACTCC 55,4 40,9

Contig_1512 Vimi34fw * TCTCATTTACTCCCAACCTTC 55,1 42,9 163 (TAT)14 Vimi34rev TTTGTGTCTGTAGCTTCTCG 55,9 42,9

Contig_4065 Vimi35fw * ACATCACTGTCTACCTAACAAG 51,2 40,9 147 (AAC)9 Vimi35rev GGTCTTGGTGTTGAATATGG 55,3 45

Contig_6272 Vimi36fw TAGGGAAAAGCTGAGTAATCC 55,3 42,9 198 (CAT)9 Vimi36rev ** GTTTTGGTAGTGGGTTTGAC 54,5 45

Contig_6419 Vimi37fw CCAGTTCTTGCTGATAATTG 53,5 40 202 (TTA)22 Vimi37rev ** GACGTAGAAGGACATAGAATAG 50,3 40,9

Contig_7370 Vimi38fw AAGTTACGGTTGTATGAGCAC 54,5 42,9 177 (CTA)17 Vimi38rev ** ACGGTAGGTAGGTAGGTACG 53,5 55

Contig_7487 Vimi39fw CTAGTGAAGCAAGATCAGCTC 54,6 47,6 155 (ACC)10 Vimi39rev ** TCCATCCCTTTTACAGTTTC 54,3 40

Contig_7511 Vimi40fw TCTGTGGTGATGTGATGAAC 54,6 42,9 181 (TAA)9 Vimi40rev ** ATAAGAACTTGTCCCCCTTC 54,8 45

C1_5151 Vimi41fw * TTCAGGATGTGGTGGTGT 55,4 50 159 (CCA)10 Vimi41rev GCATCAAACACTTGAGATACC 54,8 42,9

C1_7300 Vimi42fw * TCTACGAGGACACGAGGTAG 55,5 55 248 (AGT)13 Vimi42rev CGTACACTACTACTACAACGGTA 51,8 43,5

C2_6926 Vimi43fw * GCTGCTTAGACTTCTGATTTC 53,7 42,9 144 (ATT)13 Vimi43rev GAGTCCCTGTTTCTGTTGAT 54,1 45

C3_8979 Vimi44fw * TCATCTCACAAGAGCTGTAAC 53 42,9 104 (AAT)12 Vimi44rev AGTGAAGAAACAAGGGGAAT 55,3 40

C5_6984 Vimi45fw * CGGGAATAGCAGTAAGAGAAT 55,4 42,9 160 (TAT)11 Vimi45rev TCTTCTTGGTCTTGGTATCCT 55,5 42,9

C7_1658 Vimi46fw * GTTACGTTACGTTCGTTCGTT 57 42,9 151 (TCG)11 Vimi46rev TAACCCGTTAACCCTTAACCT 56,8 42,9

C7_2501 Vimi47fw * CACCAATCCAAATGACCTAA 55,9 40 162 (TAT)11 Vimi47rev TCCGAAAACACCTCTCTTTA 55,1 40

CUR1_10331 Vimi48fw * ACATGCATGATGGTTGTACTT 55,5 38,1 298 (GTA)12 Vimi48rev TCGTATCCTACCTTTGTTTGT 54 38,1

184 10. Anhang

CUR1_10437 Vimi49fw CGACAAACTACAAAGAAAGGA 54,8 38,1 151 (AAC)14 Vimi49rev ** AACAACCCTTGTAATGGAAAT 55,2 33,3

CUR1_13900 Vimi50fw * ACACAAACACAAACACAACAA 54,9 33,3 133 (AAT)26 Vimi50rev TCTGATAATTAGAAGGCCGTA 54,4 38,1

C3_5884 Vimi51fw AGTTAGGACGACTATCACGAA 54,2 42,9 138 (CT)14 Vimi51rev ** GGTGCTCTGCTTATTCATTAC 54,3 42,9

C7_153 Vimi52fw ACACGTAGTATGGCGGATA 54,1 47,4 127 (GA)14 Vimi52rev ** AGTTAGTTCGTTGTTGTCGTG 55,5 42,9

C7_235 Vimi53fw ACACCTGAGAATAGAGGTTCC 54,9 47,6 162 (TC)19 Vimi53rev ** CCAAACCATTTCCATCTAAG 54,8 40

C3_5955 Vimi54fw TCACGACCAACCAAGTTAG 54,6 47,4 294 (AT)20 Vimi54rev ** ATTCAACTACTGCGGCTTAAC 56,3 42,9

C7_1726 Vimi55fw AACAGAGGCTATACGAGACAA 54,3 42,9 163 (AT)20 Vimi55rev ** CCGTTACTTACCGTTACGTTC 56,5 47,6

C4_4844 Vimi56fw ACGTGAGTAGGTAAGGTAAGGT 53,9 45,5 105 (TA)21 Vimi56rev ** CCCACCCCAAAATATCAA 56,6 44,4

C3_5937 Vimi57fw GCAGGGAAAAAGAAAGAAGA 56,3 40 218 (AT)24 Vimi57rev ** CTCATCAACAAAAGGGAATG 55,7 40

C4_5629 Vimi58fw GCTAGAAACTGATGAAAGTGC 54,4 42,9 160 (AT)25 Vimi58rev ** TAACGTAACCAACCACACCTA 55,7 42,9

CUR1_20786 Vimi59fw TGATTGTCGATGTGCTTATCT 55,9 38,1 175 (AT)27 Vimi59rev ** GTACGACGACGACACAACTAT 55,3 47,6

CUR1_10145 Vimi60fw ACGAGAGACGTAGTAGTCGTG 54,7 52,4 162 (GT)28 Vimi60rev ** GACCAAACCAAGTCGTGA 55,2 50

185 10. Anhang

A8: Eigenschaften der 35 für Primertests selektierten Primperpaare zur Amplifikation nukleärer Mikrosatellitenloci aus dem genomischen 454-Datensatz. Angegeben sind die Primersequenzen in 5'-3'-Richtung, die spezifische Schmelztemperatur, der prozentuale GC-Gehalt der Primersequenz, die aus den Sequenzdaten erwarteten (erw.) Fragmentlängen der amplifizierten Mikrosatelliten in Basenpaaren (bp) sowie das flankierte Mikrosatelliten-Motiv. Die mit * bzw. ** markierten Primer wurden am 5'-Ende mit einer universellen M13-Sequenz versehen (Schuelke, 2000); *: GTTGTAAAACGACGGCCAGT, **: CAGGAAACAGCTATGACC. fw: Vorwärts-Primer, rev: Rückwärts-Primer. Primerpaare, die in den Primertests in V. minor polymorphe, distinkte Banden generierten sind grau unterlegt markiert.

Herkunftssequenz Primername Primersequenz (5'-3') TM (°C) GC-Gehalt (%) Erw.Fragmentlänge (bp) Mikrosatellitenmotiv

Contig45 ngVm01fw * TACTCCCTCCATTCCCTATTA 55,4 42,9 196 (AG)16

ngVm01rev CTACTACTACCTAACCCTCCTAC 50,5 47,8

HTFSLT102FSVJ9 ngVm02fw * AGATCCCAGGTAGATTTCTTG 55,0 42,9 121 (GA)16

ngVm02rev GGTTGGTTCTTGTTCTTCTCT 55,1 42,9

HTFSLT102JKV6G ngVm03fw * TCAGATACTTCGAGCACTGTC 55,6 47,6 150 (CA)14

ngVm03rev CCCTAACGGGAATAACAAAT 55,7 40,0

HTFSLT102FUZ2Z ngVm04fw * CTTGTCTTATCCCTGCTGTAA 54,8 42,9 157 (AC)14

ngVm04rev CCTCCTCCACAATTCTTTATC 55,4 42,9

Contig_5521 ngVm05fw * TTTTGCCGACTTCTTATGTT 56,0 40,0 249 (CA)14

ngVm05rev CTTTATGTTCCTTGCTTCCA 55,6 40,0

HTFSLT102JKVN2 ngVm06fw * ACACTTTCAATGCCCAGA 54,9 44,4 146 (TA)13

ngVm06rev ACCGTTACTTTTCGGGTTAT 55,4 40,0

HTFSLT102JYWBN ngVm07fw * GCATAATTGGTGCAGTTTAG 53,6 40,0 138 (TTA)16

ngVm07rev GGGCAATAAAAATTCTCCTC 55,5 40,0

HTFSLT102HYHU9 ngVm08fw * CATTGATGATTAGCTCTCAC 50,6 40,0 210 (TTA)16

ngVm08rev GATGGAAAGAGATGTTGAGTC 53,7 42,9

Contig947 ngVm09fw CATCACTTCTTCCTCTTCACA 55,4 42,9 191 (TAT)15

ngVm09rev ** GTGAGTTTGACCCTGCTTAAT 56,0 42,9

HTFSLT102H70IY ngVm10fw GGATTGTTCCTTTGGTCTATC 55,2 42,9 130 (TAT)15

ngVm10rev ** TTCTTGTCTGTTGTTCTAGC 50,5 40,0

HTFSLT102JMM8L ngVm11fw CTCAAGGCTAAATTGATAGC 52,1 40,0 195 (ATA)14

ngVm11rev ** TGACATCTCTGTTCAAGTACAC 52,8 40,9

Contig_2603 ngVm12fw AGAGAACCCATGCACTTAAA 55,0 40,0 195 (TAT)13

ngVm12rev ** AGCTCGAACCCAAATAAGAT 55,6 40,0

HTFSLT102F7LTL ngVm13fw GTCGGCCTCTTAACAAAAA 55,5 42,1 194 (ATA)13

ngVm13rev ** AGGGGTCTAACAAAAGAACA 53,9 40,0

HTFSLT102F2W3Z ngVm14fw ATGTTAAAGTTGGGGGTAGAG 55,0 42,9 156 (ATT)12

ngVm14rev ** AGAGAGGTCGCAATCTTGTAT 55,7 42,9

Contig_83 ngVm15fw CATGTCCTTTATTCTAGCTG 50,2 40,0 173 (AAT)12

ngVm15rev ** TCTCAAGTGTGCTACTCATAG 50,6 42,9

HTFSLT102JVWPE ngVm16fw * TGATTGGACGCTCAAACT 55,1 44,4 140 (TA)12

ngVm16rev TACGACCGAGAATGAGAAGTA 55,2 42,9

HTFSLT102JT192 ngVm17fw * TCCCTAGTCTTCTTGATGATG 54,4 42,9 102 (GA)12

ngVm17rev CATGTTCTGCTTGTCTTTCTC 55,2 42,9

HTFSLT102IKGJI ngVm18fw * ATTTACGGGATGCCAGTT 55,4 44,4 148 (CT)12

186 10. Anhang

ngVm18rev GAGGAGGAGGAGGAGATTTAT 55,5 47,6

HTFSLT102IJIKP ngVm19fw * AGACTTGGCTTTGAGCTTC 54,8 47,4 147 (GA)12

ngVm19rev GGTGCGTCTCTCATCTATCT 54,4 50,0

HTFSLT102G406S ngVm20fw * AGGTAAGGAAGCAAGAAACTC 54,6 42,9 229 (AC)12

ngVm20rev GCGAATGGTAGTTATTGTCTC 54,1 42,9

HTFSLT102IQDXV ngVm21fw * ATAATCAATGCCACCCACT 55,3 42,1 148 (CT)11

ngVm21rev CTAATGAGGATTTGGAAGACTC 54,8 40,9

HTFSLT102IDFZ3 ngVm22fw * CCACAAAGAGAAGAGAGGAGT 55,3 47,6 150 (CT)11

ngVm22rev ATTGAGGTGGAGCACAGTAA 55,8 45,0

Contig249 ngVm23fw * GGTTTGGGCTTAAATCACTT 55,9 40,0 148 (AT)11

ngVm23rev AGGTTCATCTCAATTCTTGG 54,2 40,0

HTFSLT102I03ER ngVm24fw * TTCAAGCCCTTCTATTCC 52,7 44,4 160 (CT)11

ngVm24rev TATATTCTGGACGGTGGAG 53,4 47,4

Contig_38 ngVm25fw * CCAAGCAAAGTGGCTAAA 55,0 44,4 205 (GA)11

ngVm25rev CAAGATTCGACACAAAGGTT 55,3 40,0

HTFSLT102HV0D3 ngVm26fw ACGGCTATGCTACAGACAATA 55,2 42,9 130 (GA)11

ngVm26rev ** GAAGATAGAAATGGAGTGAGGT 54,2 40,9

Contig_543 ngVm27fw AAGTCATTTCTCCAATGTCC 54,0 40,0 136 (TC)11

ngVm27rev ** CTAGGGAGTTTATGGGATTG 53,9 45,0

HTFSLT102G0GUM ngVm28fw GGACGGAGGGAGTAGAAA 55,1 55,6 168 (TA)11

ngVm28rev ** AGCTATGAAGTGCTGGTCTC 54,7 50,0

HTFSLT102FZCQW ngVm29fw ACATCGAATACTCTGCAACAC 55,3 42,9 172 (AT)11

ngVm29rev ** GTGCTCACTCTAACACTATCA 50,4 42,9

Contig_960 ngVm30fw TTACAGTCCACTCCATGTTT 53,0 40,0 180 (TA)11

ngVm30rev ** GATTCGATATTCGGCTCAA 56,3 42,1

Contig_2178 ngVm31fw TGTGTGCATAATTCGAGAAG 54,9 40,0 142 (TATT)6

ngVm31rev ** TGAAAGTGTGATAGAGGTGACA 55,8 40,9

HTFSLT102HIVO2 ngVm32fw GTGGTTCGAGAATAGTGATGA 55,2 42,9 141 (TGTT)6

ngVm32rev ** GAAACGGATAATAACTCACACC 55,4 40,9

HTFSLT102FLFH5 ngVm33fw ACACTCGCAATCAACTCTATG 55,5 42,9 181 (AGTG)6

ngVm33rev ** CTCTGTTGCATCGACATATTAG 55,2 40,9

HTFSLT102JXDVO ngVm34fw GCGCTCGATCAACATATTA 54,9 42,1 199 (TCTT)5

ngVm34rev ** TCCTAGTCCAAGAACTCACAA 55,0 42,9

HTFSLT102JKXVX ngVm35fw GAAACTATTGGTGTGTATGCTC 54,0 40,9 155 (TTTA)5

ngVm35rev ** TTAGCTTATCCTTGTCCTG 50,5 42,1

187 10. Anhang

A9: Ergebnisse der Primertests für die 60 nukleären Mikrosatellitenloci aus dem cDNA (Transkriptom)- 454-Datensatz (Vimi-Loci) nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 1,5%igen Agarosegelen. Auftragsreihenfolge (v. l. n. r.): Vinca minor ID_01, V. minor ID_126, V. major BONN, C. roseus BONN (Pflanzenset 1, V. difformis & V. herbacea fehlen in der Darstellung, vgl. Tab. 3 in 2.1.1), Negativkontrolle. In einigen Gelen ist zusätzlich der Längenstandard (S) abgebildet.

188 10. Anhang

A10: Ergebnisse der Primertests für die 35 nukleären Mikrosatellitenloci aus dem genomischen 454- Datensatz (ngVm-Loci) nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 1,5%igen Agarosegelen. Auftragsreihenfolge (v. l. n. r): Vinca minor ID_01, V. minor ID_126, V. major BONN, V. minor KS_VM454_01, M. gigantea, M. pearsonii (Pflanzenset 2, V. herbacea und V. difformis fehlen in der Darstellung, vgl. Tab. 3 in 2.1.1), Negativkontrolle. In einigen Gelen ist zusätzlich der Längenstandard (S) abgebildet.

189 10. Anhang

A11: Ergebnisse der Primertests für ausgewählte nukleäre Vimi- und ngVm-Loci nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 6%igen Polyacrylamidgelen, 700er Kanal des LI-COR® Sequenzierers. Auftragsreihenfolge (v. l. n. r.): Vinca minor ID_01, V. minor ID_126, V. major BONN, V. minor KS_VM454_01 (Pflanzensets 1 und 2, V. herbacea und V. difformis, Catharanthus roseus, Macaranga gigantea und M. pearsonii nicht dargestellt, vgl. Tab. 3 in 2.1.1.), Negativkontrolle. Exemplarisch ist zusätzlich der Längenstandard (S) abgebildet.

190 10. Anhang

A12: Ergebnisse der Primertests für ausgewählte nukleäre Vimi- und ngVm-Loci nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 6%igen Polyacrylamidgelen, 800er Kanal des LI-COR® Sequenzierers. Auftragsreihenfolge (v. l. n. r.): Vinca minor ID_01, V. minor ID_126, V. major BONN, V. minor KS_VM454_01 (Pflanzensets 1 und 2, V. herbacea und V. difformis, Catharanthus roseus, Macaranga gigantea und M. pearsonii nicht dargestellt, vgl. Tab. 3 in 2.1.1.), Negativkontrolle. Exemplarisch ist zusätzlich der Längenstandard (S) abgebildet.

191 10. Anhang

A13: Eigenschaften der 14 für Primertests selektierten Primperpaare zur Amplifikation plastidärer Mikrosatelliten (plastidäre Sequenzen abgeleitet aus dem genomischen 454-Datensatz). Angegeben sind die Primersequenzen in 5'-3'-Richtung, die spezifische Schmelztemperatur, der prozentuale GC-Gehalt der Primersequenz und die aus den Sequenzdaten erwarteten (erw.) Fragmentlängen der amplifizierten Mikrosatelliten in Basenpaaren (bp). Die mit * bzw. ** markierten Primer wurden am 5'-Ende mit einer universellen M13-Sequenz versehen (Schuelke, 2000); *: GTTGTAAAACGACGGCCAGT, **: CAGGAAACAGCTATGACC. fw: Vorwärts-Primer, rev: Rückwärts-Primer. Primerpaare, die in den Primertests in V. minor polymorphe, distinkte Banden generierten sind grau unterlegt markiert.

Herkunftssequenz Primername Primersequenz (5'-3') TM (°C) GC-Gehalt (%) Erw. Fragmentlänge (bp)

Contig 5 cpVm01fw * TCATACGGCAAGAGTCATTGG 61,0 47,6 246

cpVm01rev AGAAGTTCTGTTTCGAACCC 56,0 45,0

Contig 2 cpVm02fw * GAACCCGGAACATACCATTGG 63,4 52,4 239

cpVm02rev GCTAGAAGGAGTCGGCGG 61,0 66,7

Contig 2 cpVm03fw * GCCTTCCAAGCTAACGATGC 62,1 55,0 207

cpVm03rev ACGCTTTGCATTCCGATTCC 64,5 50,0

Contig 2 cpVm04fw * GCACATATAGGACAAACACCCC 60,5 50,0 209

cpVm04rev AATGAAGTATCCAGGCTCCG 59,2 50,0

Contig 2 cpVm05fw GTTTGTGACGCTGAGCCG 61,1 61,1 198

cpVm05rev ** AAGACTATGCCTTCGCCC 55,6 55,6

Contig 6 cpVm06fw CTGGTGGTATCAAAACGCCG 63,6 55,0 185

cpVm06rev ** ACGGAACAATAGTATCATTGGGG 61,2 43,5

Contig 2 cpVm07fw CACATCAATTCTCGAGCCCC 62,9 55,0 177

cpVm07rev ** AGAGAAATGAGTTTTGGGTGTGC 61,7 43,5

Contig 55 cpVm08fw * TGGAAAGATAAAATGTGTAACC 53,6 31,8 153

cpVm08rev TCAGCAATAGGTTCATTCGC 58,9 45,0

Contig 42 cpVm09fw * CAAGATTGTTTAGACCGCACC 59,6 47,6 132

cpVm09rev GCCTTTTCCTCTATGTTCGGC 62,3 52,4

Contig 8 cpVm10fw * ATCATACGCCTTGGGATCGG 64,3 55,0 114

cpVm10rev AATGGCTCGGCTATCTCACC 61,5 55,0

Contig 59 cpVm11fw * AGGACTAATATATATTCTTGGGG 52,8 34,8 86

cpVm11rev ACTGATAGAACAAGCACAATCC 56,0 40,9

Contig 2 cpVm12fw CGCATCTTTTGATGCATACG 50,2 45,6 85

cpVm12rev ** GAACCTAAAAGAAAGAGGAC 47,3 40,4

Contig 26 cpVm13fw CGAAATCATATTGTTATTTT 39,4 20,0 72

cpVm13rev ** GGATTGCTAAATTTGGACCA 48,9 40,1

Contig 43 cpVm14fw GTGGTAGAAAAATGGAGGAT 53,2 40,0 78

cpVm14rev ** GCATTACACAATCTCCAAGA 53,7 40,0

192 10. Anhang

A14: Ergebnisse der Primertests für die 14 plastidären Mikrosatellitenloci aus dem genomischen 454-Datensatz (cpVm-Loci) nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 1,5%igen Agarosegelen. Auftragsreihenfolge (v. l. n. r): Vinca minor ID_01, V. minor ID_126, V. major BONN, V. minor KS_VM454_01, M. gigantea, M. pearsonii (Pflanzenset 3, vgl. 2.1.1), Negativkontrolle. In einigen Gelen ist zusätzlich der Längenstandard (S) abgebildet.

A15: Ergebnisse der Primertests für ausgewählte plastidäre cpVm-Loci nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 6%igen Polyacrylamidgelen, 700 und 800er Kanal des LI-COR® Sequenzierers. Auftragsreihenfolge: Vinca minor ID_01, V. minor ID_126, V. major BONN, V. minor KS_VM454_01; M. gigantea, M. pearsonii fehlen in der Darstellung (Pflanzenset 3, vgl. 2.1.1), Negativkontrolle. Exemplarisch ist zusätzlich der Längenstandard (S) abgebildet.

193 10. Anhang

A16: Ergebnisse der Primertests für die zehn plastidären Mikrosatellitenloci aus Weising & Gardner (1999; ccmps) nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 1,5%igen Agarosegelen. Auftragsreihenfolge: Vinca minor ID_01, V. minor ID_126, V. major BONN, V. minor KS_VM454_01 (Pflanzenset 4, vgl. 2.1.1), Negativkontrolle. In einigen Gelen ist zusätzlich der Längenstandard (S) abgebildet.

A17: Ergebnisse der Primertests für ausgewählte plastidäre ccmp-Loci (Weising & Gardner) nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 6%igen Polyacrylamidgelen, 700 und 800er Kanal des LI-COR ® Sequenzierers. Auftragsreihenfolge: Vinca minor ID_01, V. minor ID_126, V. minor KS_VM454_01, V. major BONN (Pflanzenset 4, vgl. 2.1.1), Negativkontrolle. Exemplarisch ist zusätzlich der Längenstandard (S) abgebildet.

194 10. Anhang

A18: Zusammenstellung der Allelfrequenzen über sieben nukleäre Mikrosatellitenloci in 949 Pflanzenproben aus 70 Populationen von Vinca minor innerhalb von vier Großregionen sowie von 18 Cultivaren.

Mitteleuropa Locus Allele Westlich der Alpen Südlich der Alpen Nordamerika Cultivare inkl. der Alpen

N=362 N=70 N=487 N=30 N=18 Vimi25 133 0,28 0,29 0,56 136 0,23 0,45 0,43 0,33 139 0,29 0,86 0,15 0,25 142 0,38 145 0,13 148 0,51 151 0,25 154 0,35 0,18 0,12 0,50 0,14 157 0,25 158 0,12 0,27 0,50 160 0,63 0,14 163 0,37 0,33 0,83 164 0,71 166 0,34 169 0,71 0,17 172 0,92 175 0,13 181 0,13 184 0,13 Vimi27 157 0,25 160 0,25 163 0,22 0,10 0,62 0,56 166 0,17 169 0,14 0,62 172 0,14 0,12 175 0,18 178 0,75 0,12 0,34 0,33 181 0,65 0,39 0,45 1,00 0,17 184 0,14 0,74 187 0,15 0,11 0,39 0,28 190 0,20 0,14 0,44 0,28 193 0,15 0,28 196 0,22 0,60 0,11 199 0,14 0,29 0,88 202 0,13 205 0,71 0,82 208 0,68 211 0,38 217 0,25 220 0,38 223 0,38 Vimi34 183 0,13 186 0,82 189 0,29 0,10 0,13 0,36 192 0,50 0,51 195 0,88 0,13 0,44 0,19 198 0,26 0,22 0,51 0,50

195 10. Anhang

201 0,54 204 0,12 0,14 0,13 0,50 0,56 207 0,14 0,36 210 0,31 0,24 0,83 0,22 213 0,14 0,66 0,28 216 0,66 0,14 219 0,36 0,24 222 0,36 0,71 0,12 0,56 225 0,26 228 0,62 231 0,25 234 0,25 237 0,71 0,41 240 0,82 Vimi43 156 0,25 159 0,30 162 0,14 165 0,43 168 0,28 0,17 0,72 0,50 0,25 171 0,25 0,32 0,74 0,50 0,33 174 0,71 0,88 177 0,68 180 0,15 0,86 0,32 0,28 183 0,78 0,28 186 0,12 0,43 0,64 0,28 189 0,79 0,83 0,28 192 0,15 0,71 0,35 0,28 195 0,16 0,11 0,12 198 0,14 0,80 201 0,37 204 0,14 207 0,14 0,79 0,38 0,11 210 0,71 0,72 0,28 213 0,26 216 0,13 219 0,36 0,71 0,13 0,14 222 0,13 Vimi53 150 0,41 157 0,34 0,71 0,39 0,50 0,14 158 0,31 0,39 0,33 0,50 0,19 160 0,39 0,71 0,72 0,28 162 0,29 0,33 0,83 0,36 164 0,82 166 0,48 168 0,44 170 0,38 172 0,20 174 0,13 0,32 176 0,54 0,14 178 0,36 0,79 0,23 0,14 180 0,16 0,56 182 0,23 184 0,43 186 0,62 188 0,82 190 0,38

196 10. Anhang

192 0,62 194 0,25 196 0,13 198 0,51 200 0,25 202 0,41 204 0,62 206 0,13 208 0,13 ngVm24 168 0,25 172 0,44 0,79 0,15 0,50 0,33 174 0,99 176 0,38 178 0,28 0,82 180 0,14 0,50 0,97 182 0,49 0,80 0,50 0,50 0,50 184 0,28 0,71 0,28 0,11 186 0,75 0,56 188 0,29 190 0,72 ngVm26 136 0,41 138 0,44 0,19 0,11 0,11 140 0,19 0,17 0,22 0,56 142 0,29 0,91 0,56 144 0,38 0,56 145 0,29 0,12 146 0,25 147 0,28 0,12 0,85 0,11 148 0,43 0,38 149 0,47 0,34 0,15 1,00 0,44 150 0,29 0,12 0,56 152 0,55 0,14 0,13 0,11 154 0,45 156 0,38 158 0,47 160 0,72 162 0,38 164 0,92 166 0,11 168 0,51 170 0,51 172 0,13

197 10. Anhang

A19: Beobachtete Heterozygotie über sieben Mikrosatellitenloci in 70 Populationen in vier Großregionen von Vinca minor. Links: Mitteleuropa (Population 1 bis 36), Kanada (Population 68 bis 70); rechts: westlich der Alpen (Population 37 bis 42), südlich der Alpen (Population 43 bis 67).

Pop 25 27 34 43 53 24 26 ∅ Pop 25 27 34 43 53 24 26 ∅

1 1 1 1 1 1 0 0 0,71 37 1 1 1 1 1 0 0 0,71 2 1 1 1 1 1 0 0 0,71 38 1 1 1 1 1 0 0 0,71 3 1 1 1 1 1 0 0 0,71 39 1 1 1 1 1 0 1 0,86 4 1 1 1 1 1 0 0 0,71 40 0,6 0,75 0,8 1 0,85 0,6 0,45 0,72 5 1 1 1 1 1 0 0 0,71 41 0,4 1 1 1 1 0,5 0,9 0,83 6 1 1 1 1 1 0 0 0,71 42 1 0,1 0,9 1 0,2 0,1 0 0,47 7 1 1 1 1 1 0 0 0,71 43 0,4 0,37 0,71 0,8 0,86 0,49 0,14 0,54 8 1 1 1 1 1 0 0 0,71 44 0,85 1 0,92 1 0,69 0,62 0,31 0,77 9 1 0 1 1 1 0 0 0,57 45 0,36 1 1 0,96 0,92 0,48 0,2 0,7 10 1 0 1 1 1 0 0 0,57 46 0,1 0,9 1 0,7 0,8 0,6 0,6 0,67 11 1 0 1 1 1 0 0 0,57 47 0,63 0,92 0,79 0,79 0,88 0,5 0,17 0,67 12 1 0 1 1 1 0 0 0,57 48 0,42 1 0,94 1 0,92 0,42 0,44 0,73 13 1 0 1 1 1 0 0 0,57 49 0,17 0,77 0,63 0,83 0,83 0,5 0,63 0,62 14 1 0 1 1 1 0 0 0,57 50 0,3 0,63 0,9 0,87 0,83 0,73 0,73 0,71 15 1 0 1 1 1 0 0 0,57 51 1 0,26 0,96 0,74 1 0 0,11 0,58 16 1 0 1 1 1 0 0 0,57 52 0,25 0,93 0,93 0,96 0,96 0,5 0,64 0,74 17 1 0 1 1 1 1 0 0,71 53 1 0,78 1 1 0,78 0,11 0 0,67 18 1 0 1 1 1 1 0 0,71 54 1 0,9 1 0,2 1 0,2 0,6 0,7 19 1 0 1 1 1 1 0 0,71 55 0,8 0,6 0,3 1 1 0,8 0,7 0,74 20 1 0 1 1 1 1 0 0,71 56 0,33 0,89 0,78 1 0,89 0,22 0,44 0,65 21 1 0 1 1 1 1 0 0,71 57 0,56 0,89 1 0,89 1 0,22 0,22 0,68 22 1 1 1 1 1 0 0 0,71 58 0,5 0,9 1 0,7 0,8 0,5 0,1 0,64 23 1 1 1 1 1 0 0 0,71 59 0,84 0,88 0,6 0,8 0,88 0,24 0,24 0,64 24 1 0 1 1 1 1 0 0,71 60 0,56 0,67 0,89 0,83 0,67 0,61 0,33 0,65 25 1 0 1 1 1 1 0 0,71 61 0,67 0,67 0 1 1 1 1 0,76 26 1 1 1 1 0 0 1 0,71 62 1 1 1 1 0 1 0 0,71 27 1 1 1 1 1 1 1 1 63 0 0 1 0 1 1 1 0,57 28 1 1 1 1 1 1 1 1 64 1 1 1 1 0 0 0 0,57 29 1 1 1 1 1 1 0 0,86 65 1 1 1 1 0 0 1 0,71 30 1 1 1 1 0 0 1 0,71 66 1 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,57 31 0,9 0,9 0,9 0,9 1 0 0 0,66 67 0 1 1 1 1 1 1 0,86 32 1 0,8 0,8 0,8 1 0 0 0,63 33 0,92 0 0,92 0,92 1 1 0 0,68 34 1 1 1 1 1 0,5 0 0,79 35 1 1 1 1 1 0,52 0,52 0,8 36 1 1 1 1 1 1 0,58 0,94 68 1 1 1 1 1 0 0 0,71 69 1 1 1 1 1 0 0 0,71 70 1 1 1 1 1 0 0 0,71

198 10. Anhang

A20: Erwartete Heterozygotie über sieben Mikrosatellitenloci in 70 Populationen in vier Großregionen von Vinca minor. Links: Mitteleuropa (Population 1 bis 36), Kanada (Population 68 bis 70); rechts: westlich der Alpen (Population 37 bis 42), südlich der Alpen (Population 43 bis 67).

Pop 25 27 34 43 53 24 26 ∅ Pop 25 27 34 43 53 24 26 ∅

1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36 37 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36 2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36 38 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36 3 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36 39 0,5 0,5 0,5 0,58 0,5 0 0,5 0,44 4 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36 40 0,54 0,80 0,78 0,76 0,73 0,69 0,74 0,72 5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36 41 0,32 0,65 0,63 0,73 0,67 0,38 0,6 0,57 6 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36 42 0,59 0,1 0,54 0,63 0,18 0,1 0,34 0,35 7 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36 43 0,34 0,35 0,70 0,77 0,83 0,74 0,7 0,63 8 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36 44 0,66 0,71 0,87 0,87 0,64 0,75 0,76 0,75 9 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0 0 0,28 45 0,45 0,82 0,83 0,8 0,7 0,72 0,69 0,72 10 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0 0 0,28 46 0,49 0,67 0,76 0,81 0,72 0,52 0,75 0,67 11 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0 0 0,28 47 0,63 0,79 0,85 0,85 0,9 0,6 0,8 0,78 12 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0 0 0,28 48 0,47 0,79 0,79 0,81 0,81 0,58 0,69 0,71 13 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0 0 0,28 49 0,35 0,62 0,79 0,83 0,83 0,62 0,78 0,69 14 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0 0 0,28 50 0,52 0,69 0,9 0,9 0,89 0,77 0,87 0,79 15 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0 0 0,28 51 0,63 0,4 0,74 0,66 0,6 0 0,11 0,45 16 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0 0 0,28 52 0,23 0,71 0,85 0,87 0,87 0,58 0,77 0,7 17 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,36 53 0,65 0,71 0,65 0,75 0,54 0,4 0,2 0,56 18 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,36 54 0,65 0,66 0,71 0,19 0,5 0,18 0,42 0,47 19 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,36 55 0,66 0,42 0,26 0,62 0,72 0,48 0,46 0,51 20 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,36 56 0,36 0,73 0,78 0,82 0,82 0,36 0,64 0,65 21 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,36 57 0,60 0,62 0,78 0,81 0,82 0,44 0,59 0,67 22 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36 58 0,47 0,66 0,81 0,79 0,7 0,46 0,6 0,64 23 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36 59 0,71 0,82 0,72 0,83 0,77 0,28 0,79 0,7 24 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,36 60 0,69 0,62 0,83 0,86 0,74 0,56 0,71 0,72 25 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,36 61 0,44 0,44 0 0,61 0,72 0,72 0,61 0,51 26 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,5 0,36 62 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,5 0 0,36 27 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 63 0 0 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0,29 28 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 64 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0,29 29 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,43 65 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 1 0,36 30 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,5 0,36 66 0,75 0,63 0,63 0,38 0,38 0,38 0,00 0,45 31 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,35 67 0 1 1 1 1 1 1 0,43 32 0,5 0,48 0,48 0,48 0,5 0 0 0,34 33 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,36 34 0,63 0,75 0,75 0,75 0,75 0,38 0,5 0,64 35 0,75 0,63 0,64 0,75 0,75 0,63 0,63 0,68 36 0,74 0,74 0,74 0,62 0,62 0,5 0,66 0,66 68 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36 69 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36 70 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,36

199 10. Anhang

A21: Inzuchtkoeffizient FIS über sieben Mikrosatellitenloci in 70 Populationen in vier Großregionen von Vinca minor. Links: Mitteleuropa (Population 1 bis 36), Kanada (Population 68 bis 70); rechts: westlich der Alpen (Population 37 bis 42), südlich der Alpen (Population 43 bis 67). NA: nicht ermittelbar.

Pop 25 27 34 43 53 24 26 ∅ 25 27 34 43 53 24 26 ∅

1 -1 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 37 -1 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 2 -1 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 38 -1 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 3 -1 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 39 -1 -1,00 -1,00 -0,70 -1,00 NA -1,00 -0,94 4 -1 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 40 -0,083 0,084 0,00 -0,29 -0,14 0,154 0,409 0,022 5 -1 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 41 -0,2 -0,51 -0,57 -0,32 -0,46 -0,29 -0,47 -0,42 6 -1 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 42 -0,682 0,000 -0,65 -0,55 -0,06 0,000 1,000 -0,29 7 -1 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 43 -0,175 -0,04 -0,01 -0,02 -0,02 0,356 0,802 0,162 8 -1 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 44 -0,245 -0,38 -0,02 -0,11 -0,04 0,223 0,619 0,016 9 -1 NA -1 -1 -1 NA NA -1 45 0,217 -0,21 -0,18 -0,18 -0,29 0,351 0,721 0,038 10 -1 NA -1 -1 -1 NA NA -1 46 0,813 -0,31 -0,27 0,187 -0,07 -0,11 0,245 0,052 11 -1 NA -1 -1 -1 NA NA -1 47 0,031 -0,13 0,091 0,090 0,054 0,192 0,799 0,162 12 -1 NA -1 -1 -1 NA NA -1 48 0,121 -0,26 -0,17 -0,22 -0,12 0,292 0,378 -0,03 13 -1 NA -1 -1 -1 NA NA -1 49 0,531 -0,22 0,211 0,017 0,014 0,213 0,208 0,111 14 -1 NA -1 -1 -1 NA NA -1 50 0,433 0,103 0,018 0,052 0,078 0,064 0,169 0,113 15 -1 NA -1 -1 -1 NA NA -1 51 -0,572 0,368 -0,29 -0,11 -0,66 NA -0,03 -0,28 16 -1 NA -1 -1 -1 NA NA -1 52 -0,08 -0,29 -0,08 -0,09 -0,09 0,161 0,184 -0,04 17 -1 NA -1 -1 -1 -1 NA -1 53 -0,485 -0,04 -0,49 -0,29 -0,40 0,750 1,000 -0,14 18 -1 NA -1 -1 -1 -1 NA -1 54 -0,5 -0,32 -0,36 -0,03 -1,00 -0,06 -0,39 -0,44 19 -1 NA -1 -1 -1 -1 NA -1 55 -0,171 -0,39 -0,13 -0,59 -0,34 -0,64 -0,50 -0,40 20 -1 NA -1 -1 -1 -1 NA -1 56 0,143 -0,15 0,059 -0,16 -0,02 0,439 0,360 0,052 21 -1 NA -1 -1 -1 -1 NA -1 57 0,130 -0,38 -0,22 -0,03 -0,16 0,543 0,660 0,038 22 -1 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 58 -0,023 -0,32 -0,19 0,166 -0,10 -0,05 0,847 0,045 23 -1 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 59 -0,164 -0,06 0,189 0,062 -0,12 0,175 0,707 0,112 24 -1 NA -1 -1 -1 -1 NA -1 60 0,222 -0,05 -0,04 0,061 0,126 -0,06 0,554 0,120 25 -1 NA -1 -1 -1 -1 NA -1 61 -0,467 -0,47 NA -0,61 -0,35 -0,35 -0,61 -0,47 26 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 -1 62 -1 -1 -1 -1 NA -1 NA -1 27 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 63 NA NA -1 NA -1 -1 -1 -1 28 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 64 -1 -1 -1 -1 NA NA NA -1 29 -1 -1 -1 -1 -1 -1 NA -1 65 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 -1 30 -1 -1 -1 -1 NA NA -1 -1 66 -0,286 -0,57 0,250 -0,29 -0,29 -0,29 NA -0,23 31 -0,80 -0,80 -0,80 -0,80 -1 NA NA -0,84 67 NA -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 32 -1,00 -0,64 -0,64 -0,64 -1 NA NA -0,78 33 -0,85 NA -0,85 -0,85 -1 -1 NA -0,91 34 -0,57 -0,29 -0,29 -0,29 -0,29 -0,29 -1 -0,18 35 -0,31 -0,59 -0,56 -0,31 -0,31 0,185 0,909 -0,18 36 -0,33 -0,33 -0,33 -0,60 -0,60 -1,00 0,132 -0,41 68 -1 NA -1 -1 -1 -1 NA -1 69 -1 NA -1 -1 -1 -1 NA -1 70 -1 NA -1 -1 -1 -1 NA -1

200 10. Anhang

A22: 'Allelic Richness' über sieben Mikrosatellitenloci in 70 Populationen in vier Großregionen von Vinca minor. Links: Mitteleuropa (Population 1 bis 36), Kanada (Population 68 bis 70); rechts: westlich der Alpen (Population 37 bis 42), südlich der Alpen (Population 43 bis 67).

Pop 25 27 34 43 53 24 26 ∅ Pop 25 27 34 43 53 24 26 ∅

1 2 2 2 2 2 1 1 1,71 37 2 2 2 2 2 1 1 1,71

2 2 2 2 2 2 1 1 1,71 38 2 2 2 2 2 1 1 1,71

3 2 2 2 2 2 1 1 1,71 39 2 2 2 2,65 2 1 2 1,95

4 2 2 2 2 2 1 1 1,71 40 3,11 4,42 4,22 4,19 3,70 3,43 4 3,87

5 2 2 2 2 2 1 1 1,71 41 1,90 3,25 2,90 4,04 3,27 1,95 2,85 2,88

6 2 2 2 2 2 1 1 1,71 42 2,80 1,40 2,40 3,20 1,65 1,40 2,31 2,16

7 2 2 2 2 2 1 1 1,71 43 2,12 2,43 4,07 4,67 4,78 3,86 3,63 3,65

8 2 2 2 2 2 1 1 1,71 44 3,18 3,58 5,82 5,73 3,34 3,95 4,06 4,24

9 2 1 2 2 2 1 1 1,57 45 1,97 4,70 4,96 4,56 3,63 3,53 3,54 3,84

10 2 1 2 2 2 1 1 1,57 46 2,38 3,65 4,55 5,21 3,83 2,39 4,30 3,76

11 2 1 2 2 2 1 1 1,57 47 3,52 4,50 5,28 5,26 6,30 2,89 4,63 4,62

12 2 1 2 2 2 1 1 1,57 48 1,98 4,18 4,28 4,56 4,48 3,08 3,24 3,68

13 2 1 2 2 2 1 1 1,57 49 1,99 3,53 4,62 5,04 5,08 3,28 4,46 4

14 2 1 2 2 2 1 1 1,57 50 2,90 3,66 6,16 6,03 5,82 4,19 5,65 4,92

15 2 1 2 2 2 1 1 1,57 51 3,05 2,46 3,75 2,89 2,77 1,00 1,43 2,48

16 2 1 2 2 2 1 1 1,57 52 1,88 3,91 5,12 5,52 5,52 3,50 4,46 4,27

17 2 1 2 2 2 2 1 1,71 53 3,57 3,60 3,57 4,28 2,68 1,97 1,71 3,05

18 2 1 2 2 2 2 1 1,71 54 3,20 3,30 4,05 1,80 2,00 1,65 1,98 2,57

19 2 1 2 2 2 2 1 1,71 55 2,94 1,98 1,81 2,80 3,84 2,00 1,99 2,48

20 2 1 2 2 2 2 1 1,71 56 2,30 4,15 4,52 5,24 5,24 2,30 2,92 3,81

21 2 1 2 2 2 2 1 1,71 57 3,12 2,85 4,65 5,06 5,24 1,99 2,70 3,66

22 2 2 2 2 2 1 1 1,71 58 2,70 4,16 5,11 4,68 4,17 1,99 3,03 3,69

23 2 2 2 2 2 1 1 1,71 59 3,63 4,74 4,32 5,02 4,69 2,09 4,46 4,14

24 2 1 2 2 2 2 1 1,71 60 3,51 3,64 4,98 5,51 4,34 2,53 3,62 4,02

25 2 1 2 2 2 2 1 1,71 61 1,98 1,98 1,00 2,81 3,62 3,62 2,81 2,55

26 2 2 2 2 1 1 2 1,71 62 2 2 2 2 1 2 1 1,71

27 2 2 2 2 2 2 2 2 63 1 1 2 1 2 2 2 1,57

28 2 2 2 2 2 2 2 2 64 2 2 2 2 1 1 1 1,57

29 2 2 2 2 2 2 1 1,86 65 2 2 2 2 1 1 2 1,71

30 2 2 2 2 1 1 2 1,71 66 3,80 2,90 2,90 1,95 1,95 1,95 1 2,35

31 2 2 2 2 2 1 1 1,71 67 1 2 2 2 2 2 2 1,86

32 2 2 2 2 2 1 1 1,71

33 2 1 2 2 2 2 1 1,71

34 2,88 3,76 3,76 3,76 3,76 1,94 2 3,12

35 3,69 2,84 2,86 3,69 3,69 2,84 2 3,09

36 3,65 3,65 3,65 2,82 2,82 2 2,90 3,07

68 2 1 2 2 2 2 1 1,71

69 2 1 2 2 2 2 1 1,71

70 2 1 2 2 2 2 1 1,71

201 10. Anhang

A23: Private Allele in Vinca minor Populationen westlich der Alpen (40) und südlich der Alpen (43 bis 67) und ihre Frequenz in der jeweiligen Population (N=967, 70 Populationen, 18 Cultivare).

Population Locus Allel Frequenz

40 Vimi25 164 0,025

43 Vimi53 150 0,057

45 Vimi27 223 0,060

46 Vimi25 184 0,050

46 Vimi27 157 0,100

47 Vimi25 175 0,021

47 Vimi53 196 0,021

47 Vimi53 200 0,042

47 Vimi53 206 0,021

48 Vimi53 208 0,010

49 Vimi43 156 0,033

49 Vimi43 222 0,017

49 ngVm24 168 0,033

50 Vimi25 157 0,033

50 Vimi27 202 0,017

50 Vimi34 183 0,017

51 Vimi34 240 0,148

52 Vimi25 181 0,018

52 ngVm26 144 0,054

52 ngVm26 164 0,161

59 Vimi25 151 0,040

59 ngVm26 172 0,020

60 Vimi25 142 0,083

60 Vimi25 145 0,028

60 Vimi27 160 0,056

60 ngVm26 146 0,056

61 ngVm26 136 0,167

67 ngVm24 188 0,500

202 10. Anhang

A24: Übersicht über die Verteilung der 310 auf Basis der Alleldaten an sieben nukleären Mikrosatellitenmarkern ermittelten Multilocus-Genotypen (MLG) in 967 Vinca minor-Akzessionen aus 70 Populationen und 18 Cultivaren.

Die Multilocus-Genotypen, die pSex-Werte und deren Signifikanz wurden mit MLGSim v. 2.0 (Stenberg et al. 2003) ermittelt. Pop.: Population, Cult.: Cultivar, N: Stichprobenzahl, MLG: Multilocus-Genotyp, Sign.: Signifikanzlevel. ***: hochsignifikant, ns: nicht signifikant.

Pop./ Proben-IDs N MLG pSex Sign. Vimi25 Vimi27 Vimi34 Vimi43 Vimi53 ngVm24 ngVm26 Cult.

1 ID222 bis ID228 7 136 139 181 190 198 210 168 195 157 162 172 172 147 147

2 DE282 bis DE286 5 136 139 181 190 198 210 168 195 157 162 172 172 147 147

3 DE001 bis DE010 10 136 139 181 190 198 210 168 195 157 162 172 172 147 147

DE186 bis DE190, DE192 bis 4 10 136 139 181 190 198 210 168 195 157 162 172 172 147 147 196

5 DE287 bis DE291 5 136 139 181 190 198 210 168 195 157 162 172 172 147 147

6 DE141 bis DE150 10 136 139 181 190 198 210 168 195 157 162 172 172 147 147 1 5.31797e14 *** DE090, DE091, DE096, DE097, DE102, DE103, DE108, DE109, 7 13 136 139 181 190 198 210 168 195 157 162 172 172 147 147 DE114, DE115, DE120, DE121, DE124

ID113 bis ID118, ID120, 31 9 136 139 181 190 198 210 168 195 157 162 172 172 147 147 ID134, ID135

ID139 bis ID140, ID142 bis 32 8 136 139 181 190 198 210 168 195 157 162 172 172 147 147 ID147

34 JE007 bis JE012 6 136 139 181 190 198 210 168 195 157 162 172 172 147 147

9 ID075 bis ID084 10 139 154 181 181 189 210 171 180 157 158 182 182 149 149

ID151 bis ID152, ID155, 10 ID157, ID159, ID 160, ID163, 8 139 154 181 181 189 210 171 180 157 158 182 182 149 149 ID164

11 ID166 bis ID169 4 139 154 181 181 189 210 171 180 157 158 182 182 149 149

12 ID214 bis ID221 8 2 4.90719e14 *** 139 154 181 181 189 210 171 180 157 158 182 182 149 149

13 ID236 bis ID247 12 139 154 181 181 189 210 171 180 157 158 182 182 149 149

14 ID253 bis ID262 10 139 154 181 181 189 210 171 180 157 158 182 182 149 149

15 ID192 bis ID 212 21 139 154 181 181 189 210 171 180 157 158 182 182 149 149

CV011 'Gruener Teppich' 1 139 154 181 181 189 210 171 180 157 158 182 182 149 149

ID176 bis ID177, ID180, 17 ID181, ID184, ID185, ID187 11 154 158 181 181 198 204 168 171 157 158 172 182 149 149 bis ID191

18 LX001 bis LX010 10 154 158 181 181 198 204 168 171 157 158 172 182 149 149

19 DK001 bis DK005 5 154 158 181 181 198 204 168 171 157 158 172 182 149 149

20 BE032 bis BE041 10 3 0 *** 154 158 181 181 198 204 168 171 157 158 172 182 149 149

21 AU039 bis AU44, AU45, AU057 9 154 158 181 181 198 204 168 171 157 158 172 182 149 149

68 CA001 bis CA010 10 154 158 181 181 198 204 168 171 157 158 172 182 149 149

69 CA037 bis CA046 10 154 158 181 181 198 204 168 171 157 158 172 182 149 149

70 CA047 bis CA056 10 154 158 181 181 198 204 168 171 157 158 172 182 149 149

24 DE321 bis DE325 5 136 154 181 181 195 210 168 186 160 162 172 182 140 140

25 CH013 bis CH22 10 136 154 181 181 195 210 168 186 160 162 172 182 140 140

FR007bis FR009, FR011 bis 4 0 *** 33 12 136 154 181 181 195 210 168 186 160 162 172 182 140 140 FR015, FR037 bis 40

CV018 'Hawaii'® 1 136 154 181 181 195 210 168 186 160 162 172 182 140 140

28 BE001 bis BE010 10 5 1.4877e14 *** 139 154 178 190 189 204 168 171 158 162 172 182 149 152

36 DE046 bis DE057, DE084, 14 139 154 178 190 189 204 168 171 158 162 172 182 149 152 DE085

203 10. Anhang

CV015 'Bowles Variety' 1 139 154 178 190 189 204 168 171 158 162 172 182 149 152

CV016 'Aureovariegata' 1 139 154 178 190 189 204 168 171 158 162 172 182 149 152

22 ID065 bis ID068 4 154 158 178 181 189 210 180 186 157 162 182 182 140 140

23 CH003 bis CH12 10 154 158 178 181 189 210 180 186 157 162 182 182 140 140 6 1.24345e14 *** DE011, DE012, DE020, DE021, 35 DE024 bis DE026, DE028, 9 154 158 178 181 189 210 180 186 157 162 182 182 140 140 DE029

34 JE013 bis JE018 6 136 163 163 196 195 222 171 219 158 178 172 182 138 138

DE063, DE064, DE067, DE071, 36 DE072, DE074, DE075, DE077, 10 136 163 163 196 195 222 171 219 158 178 172 182 138 138 DE078, DE087 7 0 ***

CV001 'Atropurpurea' 1 136 163 163 196 195 222 171 219 158 178 172 182 138 138

CV004 'Multilpex' 1 136 163 163 196 195 222 171 219 158 178 172 182 138 138

DE032 bis DE037, DE041 bis 35 11 136 163 181 187 189 195 192 219 158 178 172 184 150 150 DE044 8 0 *** CV005 'Rubra' 1 136 163 181 187 189 195 192 219 158 178 172 184 150 150

8 DE176 bis DE185 10 9 2.22045e16 *** 136 139 181 190 198 210 168 195 158 162 172 172 147 147

16 DE151 bis DE160 10 10 8.43769e15 *** 139 154 181 181 189 213 171 180 157 158 182 182 149 149

26 DE272 bis DE281 10 11 2.78666e14 *** 139 154 181 190 189 204 168 195 162 162 182 182 147 152

27 DE331 bis DE336 6 12 5.26246e14 *** 154 158 178 190 198 210 168 171 157 162 172 182 149 152

29 AU001, AU005 bis AU015 10 13 0 *** 133 136 181 199 195 222 186 207 158 162 180 184 140 140

30 AU047 bis AU056 10 14 1.9873e14 *** 133 136 169 190 204 207 171 186 158 158 178 178 140 149

32 ID141 1 15 1.52145e12 ** 136 139 181 181 198 198 195 195 157 162 172 172 147 147

31 ID119 1 16 136 136 181 181 198 198 195 195 157 162 172 172 147 147

33 FR010 1 17 154 154 181 181 210 210 186 186 160 162 172 182 140 140

35 DE016 1 18 154 163 181 187 195 210 186 192 158 162 172 182 140 150

CV002 'Azurea' 1 136 139 190 196 189 195 171 219 162 178 182 182 149 149 19 1.45439e14 *** CV003 'Acorea' 1 136 139 190 196 189 195 171 219 162 178 182 182 149 149

CV006 'Gertrude Jekyll' 1 133 160 178 190 210 216 171 207 162 176 182 186 149 149 20 4.4853e14 *** CV013 'Marie'® 1 133 160 178 190 210 216 171 207 162 176 182 186 149 149

CV014 'White Power' 1 136 139 178 190 189 210 168 171 157 162 172 182 147 147 21 8.97988e11 ns CV017 'Alba' 1 136 139 178 190 189 210 168 171 157 162 172 182 147 147

CV007 'Anna'® 1 22 136 160 178 178 210 216 171 183 158 176 182 184 149 149

CV008 'Sabinka' 1 23 136 136 178 193 195 213 189 210 180 180 172 184 149 149

CV009 'Argenteovariegata' 1 24 139 154 178 181 189 210 168 207 162 162 172 172 152 152

CV010 'Elisa'® 1 25 139 160 178 190 189 216 168 168 157 176 172 182 142 142

CV012 'Josefine'® 1 26 136 160 178 190 189 216 168 207 157 176 182 184 144 144

37 FR124 bis FR133 10 27 3.38707e-011 *** 154 158 178 181 198 204 168 171 157 162 182 182 152 152

38 FR144 bis 153 10 28 1.42109e-014 *** 136 169 190 205 210 222 171 174 158 162 182 182 149 149

39 FR134 bis 140 7 29 0 *** 136 154 181 190 204 210 171 195 158 162 182 182 147 149

39 FR141, 142 2 30 3.38707e-011 *** 136 154 181 190 204 210 171 198 158 162 182 182 147 149

39 FR143 1 31 136 154 181 190 204 210 171 195 158 162 182 182 149 149

40 FR105, 108 2 32 0 *** 136 136 184 187 189 198 168 195 158 178 180 182 138 140

40 FR095, 099 2 33 4.50751e-014 *** 136 139 163 178 198 210 168 171 158 162 172 184 138 138

40 FR094, 106, 107 3 34 4.56302e-014 *** 136 136 163 181 189 195 168 195 158 174 182 182 140 147

40 FR096 1 35 136 154 163 199 189 237 171 189 160 174 182 184 140 140

40 FR097 1 36 136 136 178 181 189 192 171 195 158 158 182 182 138 147

40 FR098 1 37 136 154 163 163 189 192 168 171 158 162 180 182 140 140

40 FR100 1 38 136 136 181 181 195 195 171 189 178 178 182 182 138 148

40 FR101 1 39 136 164 163 187 189 198 195 207 158 174 172 180 142 142

40 FR102 1 40 154 158 178 181 192 198 168 171 158 162 180 184 138 149

40 FR103 1 41 136 158 163 199 189 189 168 186 162 174 172 184 140 140

204 10. Anhang

40 FR104 1 42 136 136 181 181 192 198 168 207 162 174 172 172 142 142

40 FR109 1 43 136 139 187 199 189 189 171 180 158 174 180 182 138 138

40 FR110 1 44 136 158 187 199 195 210 171 180 162 174 172 182 138 138

40 FR111 1 45 154 158 178 187 192 195 168 171 162 162 182 182 145 145

40 FR112 1 46 136 158 181 181 192 192 168 189 158 162 172 172 138 138

40 FR113 1 47 136 139 178 178 195 198 168 195 158 178 172 180 138 147

41 FR083, 084, 092 3 48 0 *** 136 136 163 187 195 219 171 189 174 178 182 184 138 148

41 FR085 1 49 136 136 181 187 195 198 189 207 162 174 182 182 138 138

41 FR086 1 50 136 158 181 187 195 198 186 189 162 174 182 182 138 140

41 FR087 1 51 136 158 181 187 195 198 186 192 158 178 182 182 138 140

41 FR088 1 52 136 136 172 187 195 219 171 189 162 174 182 184 138 148

41 FR089 1 53 136 158 181 187 195 198 180 186 174 178 182 182 138 140

41 FR090 1 54 136 136 163 187 195 219 171 189 162 174 182 184 138 148

41 FR091 1 55 136 158 181 187 195 198 186 189 174 178 182 182 138 140

42 FR114, 115, 116, 118 4 56 3.4972e-014 0 139 158 181 181 198 210 180 207 158 158 182 182 149 149

42 FR117 1 57 139 158 181 181 198 210 180 210 158 158 182 182 149 149

42 FR119 1 58 139 158 172 181 210 210 207 219 158 162 172 182 149 149

42 FR120 1 59 136 158 181 181 198 210 180 207 158 158 182 182 149 149

42 FR121 1 60 139 158 181 181 198 210 180 207 158 162 182 182 149 149

42 FR122 1 61 154 158 181 181 189 210 180 186 158 158 182 182 145 145

42 FR123 1 62 139 158 181 181 198 210 180 207 158 158 182 182 147 147

43 ID023 bis 029 7 63 3.38618e14 *** 133 136 178 178 189 228 162 183 157 162 172 180 142 142

43 ID009, 010 2 64 0 *** 133 136 178 181 189 228 180 183 162 184 174 184 154 154

43 ID030 bis 035 6 65 4.03011e14 *** 136 136 178 178 189 189 183 183 157 182 186 186 145 145

43 ID001 bis 004 4 66 0 *** 136 136 178 178 189 189 183 192 150 182 186 186 145 145

43 ID005 bis 008 4 67 1.62093e14 *** 136 136 178 193 189 192 189 198 172 172 172 180 140 140

43 ID019, 021, 022 3 68 3.45279e14 *** 136 136 178 196 195 231 171 204 162 184 174 174 145 145

43 ID016, 017 2 69 4.95159e14 *** 136 136 178 199 192 210 171 204 162 184 172 174 145 145

43 ID011 bis 014 4 70 0 *** 136 148 178 178 204 222 174 183 172 178 186 186 142 152

43 ID015 1 71 136 136 178 184 189 195 168 192 162 172 174 174 142 142

43 ID018 1 72 133 136 184 196 189 222 183 192 162 162 174 182 140 142

43 ID020 1 73 136 136 178 178 189 231 204 204 178 184 174 182 158 158

44 ID040, 042 2 74 1.69864e14 *** 133 133 196 199 192 198 189 192 160 172 172 172 149 149

44 ID036, 037 2 75 2.9976e15 *** 133 136 181 199 195 204 162 171 157 160 174 174 158 158

44 ID049 bis 052 4 76 4.05231e14 *** 133 139 196 199 210 222 177 180 172 172 174 186 142 158

44 ID045, 048 2 77 0 *** 136 139 178 199 222 228 168 192 160 170 182 186 147 147

44 ID038 1 78 133 136 181 199 186 207 171 192 160 172 172 172 149 149

44 ID039 1 79 133 136 178 181 189 189 180 201 164 172 178 182 168 168

44 ID043 1 80 136 148 178 181 192 204 195 198 160 172 172 182 149 149

45 IT013, 020, 023, 032 bis 035 7 81 0 *** 133 133 178 181 207 231 165 195 157 158 182 182 156 156

IT014, 015, 021, 022, 026, 027, 45 7 82 1.75415e14 *** 133 136 172 175 189 225 165 192 157 160 172 174 154 154 029

45 IT016 1 83 133 133 178 181 207 231 165 165 157 158 182 182 156 156

45 IT017 1 84 133 133 181 184 213 231 195 198 158 158 172 182 142 156

45 IT018 1 85 136 136 178 196 210 231 168 180 158 174 174 184 154 154

45 IT019 1 86 133 136 175 178 210 222 192 207 160 172 172 172 140 156

45 IT024 1 87 136 136 178 223 189 204 159 198 157 176 186 174 158 158

45 IT025 1 88 136 136 178 223 189 204 159 198 157 176 174 186 158 158

45 IT028 1 89 136 136 172 178 189 207 180 192 157 160 172 174 154 154

45 IT030 1 90 133 133 196 199 189 192 159 192 157 157 172 172 138 154

45 IT031 1 91 133 133 196 199 189 192 159 192 157 174 172 172 138 154

205 10. Anhang

45 IT036 1 92 133 136 175 178 189 204 171 198 160 174 186 186 142 158

45 IT037 1 93 133 133 172 223 195 222 195 198 157 158 174 174 138 138

46 IT052, 053 2 94 4.04121e14 *** 136 136 175 178 192 210 201 216 158 170 172 182 140 148

46 IT048, 049 2 95 0 *** 136 136 175 181 192 210 174 189 158 172 172 182 154 166

46 IT045, 046 2 96 1.43219e14 *** 166 166 175 178 201 210 216 216 158 172 182 182 149 149

46 IT043 1 97 136 136 175 175 189 210 183 183 160 172 172 172 149 149

46 IT044 1 98 166 166 157 175 189 195 171 186 170 172 182 184 140 140

46 IT047 1 99 136 136 157 178 189 210 180 183 176 176 172 182 149 158

46 IT050 1 100 136 184 175 184 207 219 180 216 158 158 182 182 140 149

47 IT138, 142 2 101 0 *** 136 172 175 184 192 201 186 201 176 182 172 172 160 160

47 IT140 1 102 136 166 178 211 201 225 195 198 174 184 172 182 152 152

47 IT144 1 103 136 136 181 181 213 213 168 189 182 198 172 184 140 140

47 IT146 1 104 136 169 175 178 192 204 183 183 176 196 172 182 152 152

47 IT148 1 105 136 166 178 181 192 201 183 192 158 180 172 172 156 156

47 IT150 1 106 163 166 175 181 207 216 189 189 184 200 172 172 145 147

47 IT152 1 107 136 136 181 181 192 216 183 189 160 172 182 182 156 156

47 IT154 1 108 133 136 178 205 192 219 183 195 158 176 172 172 140 140

47 IT156 1 109 136 172 178 181 213 219 183 189 158 172 172 182 152 152

47 IT158 1 110 136 136 175 184 195 201 171 195 162 204 172 182 152 152

47 IT160 1 111 136 136 178 181 192 213 183 189 176 206 182 182 140 152

47 IT164 1 112 136 136 178 205 201 216 189 189 180 194 182 190 152 152

47 IT166 1 113 136 175 178 181 198 198 168 189 182 200 172 172 140 152

47 IT168 1 114 136 136 169 175 195 216 192 195 162 174 184 184 149 149

47 IT170 1 115 136 172 178 181 201 201 195 195 172 198 182 182 152 152

47 IT172 1 116 160 172 172 184 192 201 192 198 158 180 172 182 140 140

47 IT174 1 117 136 172 181 199 207 207 189 195 158 168 182 190 142 142

47 IT176 1 118 136 136 178 205 219 219 192 195 180 192 182 182 152 152

47 IT178 1 119 166 166 178 181 201 216 180 180 180 180 172 182 147 147

47 IT180 1 120 166 166 178 181 201 216 180 192 180 180 172 182 145 147

47 IT182 1 121 136 172 181 205 207 213 189 195 180 180 172 174 156 156

47 IT184 1 122 136 172 175 205 195 207 180 189 178 198 172 172 156 156

47 IT186 1 123 133 136 175 178 192 201 180 186 158 164 172 182 156 156

48 IT210 bis 230 19 124 4.44089e14 *** 133 133 184 199 222 228 159 213 162 176 172 172 142 158

48 IT233 bis 236, 238 5 125 0 *** 133 136 178 208 189 234 168 195 166 172 172 172 145 145

48 IT231, 232, 240, 242 bis 250 12 126 1.74305e14 *** 133 136 178 208 189 234 168 195 166 172 174 182 145 145

48 IT213, 219 2 127 3.93019e14 *** 133 136 184 187 192 222 168 213 158 176 172 172 142 142

48 IT205 bis 208 4 128 9.21485e15 *** 136 136 175 199 189 207 162 165 158 158 172 186 158 158

48 IT209 1 129 136 136 181 184 204 204 183 198 184 208 180 184 142 142

48 IT237 1 130 136 136 178 199 192 234 168 171 166 178 172 172 149 149

48 IT239 1 131 136 136 178 184 189 189 192 195 158 166 174 174 149 149

48 IT241 1 132 133 133 175 178 204 234 159 195 160 166 182 184 142 145

48 IT251 1 133 136 136 178 208 222 234 168 174 172 176 174 182 145 152

48 IT252 1 134 133 136 175 178 234 234 159 189 157 166 174 182 142 142

49 IT262, 270 2 135 0 *** 136 136 175 178 210 210 180 198 158 170 174 182 142 150

49 IT273, 274 2 136 0 *** 136 136 178 178 201 201 165 174 174 178 174 174 140 140

49 IT253 1 137 133 133 178 217 219 222 165 174 158 166 182 182 150 150

49 IT254 1 138 136 172 178 199 189 219 165 174 170 172 182 182 145 158

49 IT255 1 139 133 133 178 178 201 219 183 186 158 166 182 182 140 140

49 IT256 1 140 136 136 178 199 207 219 165 174 170 172 182 182 145 145

49 IT257 1 141 136 136 178 178 201 201 156 177 176 176 174 174 140 154

206 10. Anhang

49 IT258 1 142 133 133 184 199 201 219 183 183 158 194 172 182 140 142

49 IT259 1 143 136 136 178 178 225 225 174 177 158 166 174 182 140 145

49 IT260 1 144 133 136 178 184 201 225 171 180 174 176 182 186 140 145

49 IT261 1 145 133 136 178 184 219 225 165 171 158 174 182 182 145 154

49 IT263 1 146 133 136 175 178 201 219 174 198 158 180 172 182 140 145

49 IT264 1 147 136 136 178 199 201 201 177 177 158 172 172 174 140 149

49 IT265 1 148 136 136 178 196 201 210 165 174 170 174 182 182 140 150

49 IT266 1 149 136 136 175 178 210 225 171 198 158 174 182 182 145 150

49 IT267 1 150 136 136 178 199 201 219 165 174 158 178 174 182 140 140

49 IT268 1 151 136 136 175 199 201 207 174 183 176 204 182 186 140 140

49 IT269 1 152 136 136 175 178 210 210 180 198 158 166 174 182 142 150

49 IT271 1 153 136 136 178 199 189 201 165 165 158 176 182 182 140 140

49 IT275 1 154 136 136 178 178 207 213 168 174 172 202 182 182 145 149

49 IT276 1 155 136 136 178 184 210 219 156 177 170 178 174 180 142 142

49 IT277 1 156 136 136 175 178 201 201 165 165 178 178 174 182 140 154

49 IT278 1 157 136 136 178 217 201 222 165 177 170 170 174 182 145 145

49 IT279 1 158 133 133 178 196 216 219 174 174 158 158 168 168 140 150

49 IT280 1 159 136 136 178 184 201 201 165 183 158 170 182 182 152 152

49 IT282 1 160 133 136 178 178 189 189 165 177 158 158 178 182 149 154

49 IT283 1 161 136 136 178 196 195 201 165 222 170 174 172 172 140 150

49 IT284 1 162 136 136 178 196 195 201 165 198 158 188 172 182 145 152

50 IT285, 286 2 163 0 *** 136 136 175 178 189 192 174 183 164 172 174 182 145 170

50 IT287 1 164 133 133 175 175 198 222 198 204 172 184 174 174 145 166

50 IT288 1 165 136 136 175 178 189 207 186 198 184 190 174 186 158 166

50 IT289 1 166 136 157 178 178 201 231 174 198 176 184 182 182 145 147

50 IT290 1 167 136 136 175 178 195 210 183 186 172 172 180 182 149 162

50 IT291 1 168 133 133 175 178 195 228 183 183 158 172 182 182 166 168

50 IT292 1 169 136 160 175 181 219 228 186 204 170 174 174 174 145 166

50 IT293 1 170 136 136 175 175 198 219 189 204 172 192 174 174 145 145

50 IT294 1 171 136 136 175 178 201 201 198 198 158 176 174 182 149 168

50 IT295 1 172 136 136 172 178 183 222 186 195 158 204 172 184 145 166

50 IT297 1 173 160 169 178 178 186 195 186 192 158 188 176 186 160 170

50 IT299 1 174 136 136 175 178 195 234 168 207 168 176 174 186 145 156

50 IT300 1 175 136 136 181 181 195 201 186 210 158 162 182 186 150 162

50 IT301 1 176 133 133 175 196 195 222 171 186 176 188 174 182 145 154

50 IT302 1 177 136 136 175 181 186 222 168 186 174 174 182 182 138 149

50 IT303 1 178 136 160 175 175 222 228 204 204 162 162 182 186 166 166

50 IT304 1 179 139 160 178 178 207 228 195 207 170 174 172 172 145 147

50 IT305 1 180 133 136 178 178 186 195 183 198 158 162 180 182 145 145

50 IT306 1 181 136 136 175 178 216 222 180 189 172 182 180 182 145 160

50 IT307 1 182 136 160 196 208 195 225 162 189 158 158 180 182 138 138

50 IT308 1 183 136 136 175 178 189 195 180 207 172 172 178 180 147 154

50 IT310 1 184 136 136 175 199 195 195 183 198 162 170 172 186 145 145

50 IT311 1 185 136 136 199 202 195 228 195 210 158 176 174 182 140 140

50 IT312 1 186 136 136 178 178 192 195 174 186 172 174 180 186 152 152

50 IT313 1 187 136 136 175 184 213 222 174 198 162 182 180 182 149 154

50 IT314 1 188 133 157 175 175 204 210 174 216 176 184 174 174 149 166

50 IT315 1 189 136 136 175 205 204 204 177 198 162 190 180 182 149 158

50 IT316 1 190 133 133 178 181 201 210 168 180 170 182 180 182 145 166

50 IT317 1 191 136 160 175 175 213 222 186 186 162 172 182 186 138 138

207 10. Anhang

51 IT338, 341 2 192 0 *** 133 136 199 199 192 240 171 189 158 160 182 182 140 140

51 IT322 bis 325 4 193 1.17684e14 *** 133 163 175 184 216 240 174 174 158 168 182 182 140 140

51 IT327 bis 345 17 194 0 *** 133 166 175 175 204 228 171 189 158 160 182 182 140 140

51 IT320 1 195 133 163 175 184 216 240 174 174 158 168 182 182 140 145

51 IT321 1 196 133 163 175 184 216 216 174 174 158 166 182 182 140 145

51 IT326 1 197 133 136 178 178 204 216 171 189 158 160 182 182 140 147

52 IT355, 363 2 198 5.09592e14 *** 136 136 175 178 186 189 189 198 174 178 182 184 154 164

52 IT350, 353, 356, 359, 361, 362 6 199 2.07612e14 *** 136 136 175 178 204 225 168 177 172 184 182 182 149 154

52 IT358, 360 2 200 0 *** 136 136 178 199 189 207 201 210 176 202 182 190 144 149

52 IT346 1 201 136 136 181 181 195 222 183 198 178 198 182 186 145 149

52 IT347 1 202 136 136 175 178 204 225 168 177 172 184 182 182 149 164

52 IT348 1 203 136 136 175 178 186 189 198 198 172 174 182 186 164 164

52 IT349 1 204 136 154 175 178 186 189 189 198 174 178 172 184 154 164

52 IT351 1 205 136 181 178 184 204 207 165 195 176 188 176 176 156 156

52 IT352 1 206 136 154 178 199 189 207 201 210 176 202 182 190 149 149

52 IT354 1 207 136 154 169 178 198 204 168 180 162 174 182 182 149 149

52 IT357 1 208 136 154 178 181 198 204 168 180 162 174 182 182 149 149

52 IT364 1 209 136 136 169 178 198 204 168 180 162 174 182 182 149 149

52 IT365 1 210 136 136 175 178 189 225 168 189 174 184 182 184 154 160

52 IT366 1 211 136 136 175 178 189 219 198 201 174 178 180 184 164 164

52 IT367 1 212 136 136 178 178 195 195 195 201 178 178 174 186 140 140

52 IT368 1 213 136 136 172 175 204 225 168 177 172 186 182 182 149 154

52 IT369 1 214 136 136 178 199 189 207 201 210 176 198 182 190 145 149

52 IT373 1 215 136 136 175 184 189 207 192 198 170 178 182 182 149 149

52 IT375 1 216 133 136 184 193 195 222 180 195 158 162 180 186 144 164

52 IT377 1 217 136 136 169 178 198 204 168 180 162 174 182 182 150 150

52 IT378 1 218 133 136 178 184 195 195 171 195 162 176 180 190 156 162

53 CR006 bis 010 5 219 0 *** 133 136 175 178 204 222 189 201 158 160 182 182 149 149

53 CR001 1 220 133 154 190 217 204 213 168 174 160 162 180 180 149 149

53 CR002 1 221 133 166 175 175 204 228 168 174 160 160 182 182 140 140

53 CR004 1 222 133 160 217 217 198 204 198 201 160 160 180 182 149 149

53 CR005 1 223 133 154 190 217 204 213 171 189 160 162 180 180 149 149

54 CR013, 014 2 224 1.02918e13 *** 133 160 208 217 198 228 201 201 158 160 180 180 142 149

54 CR011, 017 2 225 3.43059e14 *** 133 160 208 217 198 231 201 201 158 160 180 180 142 149

54 CR012, 018 2 226 4.66294e15 *** 133 160 211 217 198 228 201 201 158 160 180 180 142 149

54 CR015 1 227 133 154 190 217 198 213 171 201 158 160 180 180 149 149

54 CR016 1 228 136 160 190 208 204 228 186 201 158 160 180 180 149 149

54 CR019 1 229 136 160 208 217 198 207 201 201 158 160 180 182 149 149

54 CR020 1 230 136 160 208 208 198 207 201 201 158 160 180 182 149 149

55 SLO05 bis 010 6 231 0 *** 163 169 163 178 198 198 168 177 158 166 180 182 140 149

55 SLO01 1 232 133 133 178 178 198 222 174 177 172 192 182 182 140 140

55 SLO02 1 233 133 163 178 178 198 222 168 174 166 184 182 182 140 140

55 SLO03 1 234 133 133 178 178 198 222 174 177 158 184 180 182 140 140

55 SLO04 1 235 163 169 178 178 198 198 168 177 172 184 180 182 140 149

56 SLO16, 017, 019 3 236 1.40998e14 *** 133 133 175 178 198 213 171 189 172 192 182 182 140 149

56 SLO11 1 237 136 154 181 190 213 231 195 210 158 204 182 182 142 142

56 SLO12 1 238 133 133 178 199 210 210 183 195 166 178 182 182 142 142

56 SLO13 1 239 133 133 175 181 216 216 174 186 164 182 182 184 140 140

56 SLO14 1 240 133 133 175 178 198 213 171 189 158 158 182 182 140 149

56 SLO15 1 241 133 136 178 178 207 210 183 192 158 172 180 182 140 140

208 10. Anhang

56 SLO18 1 242 133 136 181 217 213 216 183 189 158 164 180 180 149 149

57 SLO25, 026 2 243 0 *** 133 133 175 178 201 213 177 189 170 172 180 182 140 140

57 SLO20 1 244 133 136 175 199 198 213 168 213 158 188 182 182 149 149

57 SLO21 1 245 133 136 175 199 198 213 168 168 158 188 182 182 149 149

57 SLO22 1 246 133 133 175 199 201 216 177 192 172 184 180 180 140 140

57 SLO23 1 247 136 160 175 199 198 222 177 204 158 172 180 180 145 145

57 SLO24 1 248 136 163 175 199 210 213 177 213 176 188 182 182 140 149

57 SLO27 1 249 136 163 178 199 198 201 183 213 158 164 182 182 149 149

57 SLO28 1 250 133 133 199 199 189 198 168 192 158 166 182 182 140 149

58 SLO29, 030 2 251 0 *** 133 160 178 187 213 216 174 174 158 204 180 182 142 142

58 SLO31 1 252 133 133 178 199 213 219 177 192 158 160 180 182 142 142

58 SLO32 1 253 133 133 178 178 213 222 177 219 158 158 182 182 140 140

58 SLO33 1 254 133 133 178 220 198 237 174 189 158 184 180 180 138 138

58 SLO34 1 255 133 160 175 178 198 210 177 186 158 158 182 182 140 140

58 SLO35 1 256 133 133 169 178 213 237 171 189 158 176 182 182 140 140

58 SLO36 1 257 136 169 175 178 222 237 174 177 160 184 180 182 140 149

58 SLO37 1 258 133 133 178 199 213 222 171 177 158 176 180 182 140 140

58 SLO38 1 259 133 160 178 217 201 213 171 171 172 176 182 182 140 140

59 SLO45, 060 2 260 2.60902e14 *** 136 163 178 199 213 213 171 174 158 182 182 182 140 140

59 SLO39 1 261 133 136 175 175 210 213 171 174 166 182 182 182 140 142

59 SLO40 1 262 133 136 166 217 222 237 177 177 158 166 180 182 145 145

59 SLO41 1 263 151 163 178 193 210 216 171 177 158 172 182 182 149 149

59 SLO42 1 264 133 133 178 217 207 213 198 207 158 168 180 182 145 145

59 SLO43 1 265 136 136 175 193 195 213 174 183 158 166 182 182 142 148

59 SLO44 1 266 136 163 178 193 213 231 168 177 158 190 182 182 145 145

59 SLO46 1 267 136 136 193 199 213 213 174 177 158 182 172 182 140 140

59 SLO47 1 268 133 163 175 193 213 234 168 174 158 158 182 182 145 145

59 SLO48 1 269 133 133 199 217 210 210 177 177 172 184 184 184 145 145

59 SLO49 1 270 133 136 178 178 213 213 171 174 158 158 182 184 145 145

59 SLO50 1 271 133 136 166 178 210 213 171 171 160 184 180 182 149 149

59 SLO53 1 272 133 163 199 217 213 213 168 204 158 172 182 182 147 147

59 SLO55 1 273 133 136 175 178 213 213 168 201 166 180 182 182 149 168

59 SLO56 1 274 151 163 178 199 213 213 171 177 158 166 182 182 149 149

59 SLO57 1 275 133 136 178 199 210 216 165 168 158 188 182 182 140 149

59 SLO58 1 276 133 136 166 178 213 213 168 177 158 184 182 182 170 170

59 SLO59 1 277 133 136 166 199 213 231 168 177 158 168 182 184 147 147

59 SLO64 1 278 136 169 175 199 213 222 171 177 166 180 182 182 149 172

59 SLO65 1 279 133 166 199 205 204 228 174 180 166 172 182 182 149 149

59 SLO66 1 280 133 136 175 175 210 222 177 189 158 158 182 182 140 140

59 SLO67 1 281 133 166 199 205 204 228 180 180 166 172 182 182 149 149

59 SLO69 1 282 133 163 169 199 201 222 174 174 158 164 182 182 149 149

59 SLO73 1 283 133 169 175 199 210 210 174 189 158 162 182 182 140 142

60 SLO74 1 284 133 145 178 199 213 225 168 174 158 166 180 182 149 149

60 SLO75 1 285 133 133 178 178 210 213 177 195 180 186 180 182 140 149

60 SLO76 1 286 133 133 178 178 210 210 189 189 158 172 182 182 140 149

60 SLO77 1 287 163 163 160 160 210 213 171 174 158 184 180 180 140 142

60 SLO78 1 288 133 136 178 178 201 201 174 177 158 168 180 182 140 142

60 SLO79 1 289 136 136 178 199 201 222 168 189 158 158 180 182 142 142

60 SLO80 1 290 133 133 175 178 213 219 171 174 166 176 180 184 140 140

60 SLO81 1 291 142 163 178 220 198 222 168 216 158 172 182 182 149 149

209 10. Anhang

60 SLO82 1 292 136 136 178 220 213 222 165 165 158 158 182 182 146 146

60 SLO83 1 293 133 136 178 187 213 219 177 207 158 172 180 182 149 149

60 SLO85 1 294 133 142 175 199 219 213 177 177 172 172 180 180 142 142

60 SLO86 1 295 133 133 178 178 210 222 168 171 158 180 180 182 145 145

60 SLO87 1 296 133 163 178 184 213 219 171 195 166 184 180 184 140 142

60 SLO88 1 297 133 136 175 178 201 222 174 213 158 158 180 182 140 149

60 SLO89 1 298 142 163 178 178 198 222 168 216 172 172 182 182 149 149

60 SLO90 1 299 133 163 175 178 213 216 174 177 158 162 182 182 140 140

60 SLO91 1 300 133 136 178 199 201 210 174 177 166 180 182 184 140 140

60 SLO93 1 301 136 136 178 199 213 225 174 207 158 158 180 182 149 149

61 ID053 bis 056 4 302 0 *** 136 136 178 178 189 189 159 171 174 186 184 186 136 152

61 ID057 bis 064 8 303 1.28786e14 *** 136 139 175 178 189 189 171 177 170 184 172 182 149 152

62 IT192 bis 204 13 304 0 *** 133 136 166 184 192 204 189 207 158 158 174 186 152 152

63 IT038 bis 042 5 305 0 *** 136 136 175 175 189 192 183 183 160 162 172 178 149 156

IT057, 058, 060, 062, 064 bis 64 10 306 0 *** 136 154 178 190 204 222 186 207 162 162 182 182 152 152 069

65 IT099 bis 137 39 307 0 *** 154 160 196 208 204 222 195 198 158 158 182 182 147 152

66 IT001 bis 005 5 308 4.54081e14 *** 133 169 184 187 210 216 174 186 158 172 182 182 140 140

66 IT006 bis 010 5 309 4.31877e14 *** 136 154 184 193 195 195 174 174 158 158 180 182 140 140

67 IT071 bis 098 28 310 1.32117e14 *** 154 154 187 190 210 216 186 195 158 168 182 188 140 147

210 10. Anhang

A25: Ergebnisse der Übertragbarkeitstests für ausgewählte nukleäre Vimi- und ngVm-Loci nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 6%igen Polyacrylamidgelen, 700er und 800 Kanal des LI-COR ® Sequenzierers. Auftragsreihenfolge (v. l. n. r.): V. minor ID_01, V. minor KS_VM454_01, V. major BONN, V. herbacea GIES und V. difformis STUT; vgl. Tab. 3 in 2.1.1.), Negativkontrolle. Zusätzlich ist jeweils links und rechts der PCR-Produkte der Längenstandard (S) abgebildet.

211 11. Referenzen

11. Referenzen

Wissenschaftliche Tätigkeiten

Oktober 2007 bis Juli 2009 Tutorin für Biometrie, Institut für Mathematik, Abteilung Statistik, Universität Kassel (Prof. C. Müller)

Oktober 2011 bis Februar 2014 Wissenschaftliche Hilfskraft für Botanik, Institut für Biologie, Abteilung Systematik & Morphologie der Pflanzen, Universität Kassel (Prof. K. Weising)

Februar 2012 bis März 2015 Promotion an der Universität Kassel, Institut für Biologie, Abt. Systematik & Morphologie der Pflanzen, Universität Kassel (Prof. K. Weising) Finanzierung über ein Stipendium der Universität Kassel

Beiträge bei Meetings und Konferenzen

September 2011 Botanikertagung, Berlin

Posterbeitrag: 'Population genetic structure of Vinca minor (Apocynaceae), an indicator plant for ancient urban settlements in Central Europe'

Dezember 2012 Quo vadis, Systematik? Ein Workshop der GBS/DBG, Veranstalterin: Dr. Birgit Gemeinholzer, Gießen

Vortrag: 'Populationsgenetik & Phylogeographie des Kulturreliktzeigers Vinca minor L. (Apocynaceae)'

März 2014 BioDivEvo, Dresden (joint conference: 15th annual meeting of the GBS, 22nd international symposium of the DBG)

Vortrag: 'Veni, vidi, vici: genetic bottlenecks and clonal propagation accompanied the introduction of Vinca minor L. (Apocynaceae) to Central Europe'

212 11. Referenzen

Qualifikationsarbeiten

Möller, S. (2011). Populationsgenetische Untersuchungen am Kleinen Immergrün (Vinca minor L., Apocynaceae). Diplomarbeit. Systematik und Morphologie der Pflanzen, Fachbereich 10, Naturwissenschaften, Institut für Biologie, Universität Kassel, Kassel.

Publikationen in Fachzeitschriften

Moeller, S., Wöhrmann, T., Huettel, B., & Weising, K. (2015). Development of 18 polymorphic microsatellite markers for Vinca minor (Apocynaceae) via 454 pyrosequencing. Angenommen bei Applications in Plant Science.

Moeller, S., & Weising, K. Contrasting patterns of clonal diversity in native and introduced populations of the relic of cultivation Vinca minor (Apocynaceae). In Vorbereitung.

Moeller, S., Schynawa, S., Will, M., & Weising, K. Zur Bestäubung und Myrmekochorie bei Vinca minor L. (Apocynaceae) in Nordhessen. In Vorbereitung.

213 12. Erklärung

12. Erklärung

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig, ohne unerlaubte Hilfe Dritter angefertigt und andere als die in der Dissertation angegebenen Hilfsmittel nicht benutzt habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder unveröffentlichten Schriften entnommen sind, habe ich als solche kenntlich gemacht. Dritte waren an der inhaltlich-materiellen Erstellung der Dissertation nicht beteiligt; insbesondere habe ich hierfür nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Kein Teil dieser Arbeit ist in einem anderen Promotions- oder Habilitationsverfahren verwendet worden.

Kassel, im Januar 2015

Sina Möller

214 Danksagung

Danksagung

Der Universität Kassel danke ich für die finanzielle Unterstützung durch ein Promotionsstipendium und durch Mittel der Zentralen Forschungsförderung (ZFF), ohne die diese Arbeit nicht hätte entstehen können.

Herrn Prof. Dr. Kurt Weising danke ich, dass er mir die Möglichkeit zur eigenverantwortlichen Umsetzung meiner lokal geprägten Forschungsinteressen gegeben hat. Mein herzlicher Dank geht auch an Frau Prof. Dr. Elvira Hörandl, die sich als Spezialistin für asexuelle Pflanzen freundlicherweise als Zweitgutachterin dieser Arbeit zur Verfügung gestellt hat.

Meine Eltern bin ich zu tiefen Dank verpflichtet. Ihr seid sicherlich maßgeblich für mein großes Interesse an der Natur 'verantwortlich'. Bei meiner Berufswahl habt Ihr mir nie reingeredet und damit maßgeblich dazu beigetragen, dass ich mich der 'Wissenschaft des Lebens' verschrieben habe und dieses Werk hier entstanden ist. Mein Dank gebührt Euch auch für das Asyl und die die Versorgung meiner langohrigen, fusselnden Findelkinder, wenn ich mal wieder in der Welt auf Immergrünjagd war. Danke für alles! Auch Xenia, Collin, Tanja und Dome danke ich für die Unterstützung und die schönen Stunden fernab der Uni. Stefanie danke ich für die großartige Hilfe beim Übergang vom Uni- ins Arbeitsleben.

Ein riesengroßes Dankeschön geht an Heiko, ohne den diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Ohne zu meckern hast Du uns während meiner straff organisierten Sammelreisen sicher durch halb Europa gelenkt, Dich stundenlang mit mir bei Wind und Wetter durch italienische Wälder geschlagen, Untiere gebändigt und mich nebenbei mit stets gut gefüllten Fresskörben und aufmunternden Worten bei Laune gehalten. Auch bei größeren Silicagelkatastrophen in Deinem Auto, italienischen Kamikaze-Fahrern und Frühstücksbuffets 'a la Abruzzese' hast Du Deine Ausgeglichenheit nie verloren. Für Deine Unterstützung bei den Reisen, Dein ungebrochenes Interesse am Kleinen Immergrün, Deine Hilfe bei der Vorbereitung meiner 'geliebten' Vorträge, Deine Unterstützung kurz vor Abgabe der Arbeit und Deine permanente Motivation danke ich Dir unendlich. Ein Multitalent wie Du sollte eigentlich einen Ehrendoktor bekommen. Und im nächsten Urlaub halte ich nicht mehr Ausschau nach Vinca minor. Versprochen! Obwohl... vielleicht können wir nur ganz kurz mal auf Malta gucken ;-)?

Der gesamten Arbeitsgruppe Morphologie und Systematik der Universität Kassel danke ich für das wirklich angenehme Arbeitsklima. Ein besonderes Dankeschön geht dabei an meine

215 Danksagung

Büromitstreiter Tina und Kai. Ihr hattet immer wohltuende Worte zum Thema Großbaustelle Promotion auf Lager und habt mir damit öfters den Tag gerettet. Auch für Euren großartigen Humor, die fachliche Unterstützung und die angenehme Teamarbeit bei der Betreuung von Abschlusskandidaten möchte ich Euch vielmals danken. Einen herzlicher Dank gilt auch Tinas tierischen Mitarbeitern, die mit Ihren Körperfunktionen des Öfteren für offene Fenster, aber auch für gute Laune gesorgt haben. Daniela, Irene, Christine und Frau Pfeiffer danke ich für die fortwährende fachliche, organisatorische und moralische Unterstützung. Natascha, Ronny und Malte gilt mein Dank für die schönen Mittagspausen, Kaffepläuschchen und die gemeinsamen Besuche auf Tagungen. Von meinen 'temporären' Kollegen möchte ich vor allem Laura, Sarah und Nadine für die lustige und abwechslungsreiche Zeit danken. Mein Dank gilt auch meinen Praktikanten sowie meinen Bachelorabsolventen und Staatsexamenskandidaten Laura, Melanie, Sarah, Diana, Thorben und Christian. Die Arbeit mit Euch hat mir viel Spaß gemacht und ich habe durch Euch viel dazu gelernt. Den Gärtnern Astrid, Sabine und Ralph danke ich für die kompetente Betreuung meiner Sorgenkinder im Gewächshaus und den guten Tipps und Ideen zu ihrer Pflege.

Ein großes Dankeschön geht zu guter letzt an alle Personen, Institutionen, Botanischen Gärten und Herbarien, die mich mit Vinca-Pflanzenmaterial unterstützt haben. Hierbei zu nennen sind insbesondere Tomaš Koubek, Ulrike Gerber, Günther Theißen, Pedro Antunes, Tim Dickinson, Christian Stolz, Anne Ronse, Filip Verloove sowie meine Kollegen Malte, Kai und Frau Pfeiffer.

216