Determination of some hematologic effect the Persian Gulf blackfin stonefish, (Pseudosynanceia melanostigma), venom on albino mice blood

Item Type thesis

Authors Zolfaghari, Mohammad

Publisher Islamic Azad University, Science and Research Branch, Tehran, Marine Biology

Download date 07/10/2021 10:40:37

Link to Item http://hdl.handle.net/1834/36477

معاونت پژوهش و فن آوري به نام خدا منشور اخالق پژوهش با ياري از خداوند سبحان و اعتقاد به اين كه عالم محضر خداست و همواره ناظر بر اعمال انسان و به منظور پاس داشت مقام بلند دانش و پژوهش و نظر به اهميت جايگاه دانشگاه در اعتالي فرهنگ و تمدن بشري، ما دانشجويان و اعضاء هيات علمي واحدهاي دانشگاه آزاد اسالمي متعهد ميگرديم اصول زير را در انجام فعاليت هاي پژوهشي مد نظر قرار داده و از آن تخطي نكنيم: 1- اصل حقيقت جويي: تالش در راستاي پي جويي حقيقت و وفاداري به آن و دوري از هرگونه پنهان سازي حقيقت. 2- اصل رعايت حقوق: التزام به رعايت كامل حقوق پژوهشگران و پژوهيدگان )انسان، حيوان و نبات( و ساير صاحبان حق 3- اصل مالكيت مادي و معنوي: تعهد به رعايت كامل حقوق مادي و معنوي دانشگاه و كليه همكاران پژوهش 4- اصل منافع ملي: تعهد به رعايت مصالح ملي و در نظر داشتن پيشبرد و توسعه كشور در كليه مراحل پژوهش 5- اصل رعايت انصاف و امانت: تعهد به اجتناب از هرگونه جانب داري غير علمي و حفاظت از اموال، تجهيزات و منابع در اختيار 6- اصل رازداري: تعهد به صيانت از اسرار و اطالعات محرمانه افراد، سازمانها و كشور و كليه افراد و نهادهاي مرتبط با تحقيق 7- اصل احترام: تعهد به رعايت حريمها و حرمتها در انجام تحقيقات و رعايت جانب نقد و خودداري از هرگونه حرمت شكني 8- اصل ترويج : تعهد به رواج دانش و اشاعه نتايج تحقيقات و انتقال آن به همكاران علمي و دانشجويان به غير از مواردي كه منع قانوني دارد. 9- اصل برائت: التزام به برائت جويي از هرگونه رفتار غيرحرفهاي و اعالم موضع نسبت به كساني كه حوزه علم و پژوهش را به شائبههاي غيرعلمي ميآاليند.

أ

دانشگاه آزاد اسالمي واحد علوم و تحقيقات

تعهد نامه اصالت رساله يا پايان نامه

اينجانب محمد ذوالفقاري دانش آموخته مقطع كارشناسي ارشد ناپيوسته در رشته زيست شناسي دريا كه

LD50 " در تاريخ 42/11/1931 از پايان نامه خود تحت عنوان استخراج و تعيين زهر ماهي فرياله خال

سياه خليج فارس و بررسي عالئم هماتولوژيكي ايجاد شده توسط زهر در موش آزمايشگاهي" با كسب

نمره 1/11 و درجه ...... دفاع نموده ام بدينوسيله متعهدمي شوم: 1( اين پايان نامه / رساله حاصل تحقيق وپژوهش انجام شده توسط اينجانب بوده ودر موواردي كوه از دستاوردهاي علمي وپژوهشي ديگران )اعم از پايان ناموه، كتواب، مقالوه و...... ( اسوتفاده نمووده ام، مطابق ضوابط ورويه موجود ، نام منبع مورد استفاده وساير مشخصات آن را در فهرست مربوط ذكر و درج كرده ام. 4( اين پايان نامه / رساله قبال براي دريافت هيچ مدرک تحصيلي )هم سطح، پايين تر يا باالتر( درساير دانشگاه ها وموسسات آموزش عالي ارائه نشده است. 9( چنانچه بعد از فراغت تحصيل قصد استفاده وهرگونه بهره برداري اعم از چاپ كتاب ، ثبت اختراع و ....ازاين پايان نامه داشته باشم، از حوزه معاونت پژوهشي واحد مجوزهاي مربوطه را اخذ نمايم. 2( چنانچه در هر مقطع زماني برخالف موارد فوق ثابت شود ، عواقوب ناشوي ازآن را موي پوذيريم و واحد دانشگاهي مجاز است با اينجانب مطابق ضوابط ومقررات رفتوار نمووده ودر صوورت ابطوال مدرک تحصيلي ام هيچگونه ادعايي نخواهم داشت.

نام ونام خانوادگي : محمد ذوالفقاري تاريخ و امضاء:

ب

دانشگاه آزاد اسالمي واحد علوم و تحقيقات )تهران( دانشکده علوم پایه-گروه زیست شناسي

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسي ارشد گرایش جانوران دریا

عنوان: استخراج و تعيين LD50 زهر ماهي فریاله خال سياه خليج فارس و بررسي عالئم هماتولوژیکي ایجاد شده توسط زهر در موش آزمایشگاهي

اساتيد راهنما دکتر شهال جميلي دکتر حسين ذوالفقاریان

نگارش محمد ذوالفقاری

پائيز 59

ت

تقدير و تشكر

بود اول آن خجسته پرگار نام ملكي كه نيستش يار

سپاس و ستايش تو راست اي خالق بي همتا كه همواره الطاف بي كرانت روشنگر راهم بوده و نيروي

اليزال تو گشاينده مشكالت. امروز هر چه دارم از مهربانيها و بخشندگيهاي توست. افسوس كه زبان قاصر

از حمد توست، زيرا كه تو بي نهايتي و من ذرهاي از كران بي كران تو.

با تشكر از حمايت هاي اساتيد راهنماي ارجمند جناب آقاي دكتر حسين ذوالفقاريان و سركارخانم دكتر

شهال جميلي به خاطر راهنمائي ها و پشتيباني هميشگي شان در طي اين تحقيق و كمک هاي ايشان در

جهت پيشرفت توانائيهايم.

و با سپاس ويژه از آقايان مهندس هدايت، شهبازي، ربيعي و خيراله پور كه در جهت پيشرفت اين تحقيق از

هيچ كمک و راهنمائي دريغ نكرده و صبورانه تجارب علمي ارزشمندشان را در اختيارم گذاشتند.

از اعضاي محترم هيئت علمي گروه زيست شناسي دانشگاه آزاد اسالمي واحد علوم و تحقيقات و نيز هيئت

علمي مؤسسه تحقيقات واكسن و سرم سازي رازي كرج، رياست و كارمندان محترم بخش سروتراپي و

جانوران سمي بويژه مهندس ربيعي و هدايت سپاسگزارم.

موفقيت امروز من بدون حمايت هاي اساتيد بزرگوار در طي ساليان تحصيلم امكان پذير نبود، از ايشان و از

تمامي دوستانم به خاطر تمام اوقاتي كه با هم داشتيم، صميمانه تشكر مي كنم.

ث

تقديم به دستان مهربان مرحومه مادر عزيزم كه موفقيت و ارتقاي علمي فرزندانش منتهاي آرزويش

بود، به پاس آسايشي كه در جهت آسايش ايشان از خود دريغ كرد.

تقديم به روح پدر مرحوم و عزيزم كه استواري را از او آموختم. راهنمايي او همواره روشن گر مسير

زندگيم بود و موفقيت امروز من بدون حمايت هايش ممكن نبود.

تقديم به روح پرفتوح همسر مهربانم كه در نقاط محروم و دور دست هميشه يار و ياورم بود.

ج

فهرست مطالب

چكيده ...... 1

فصل اول: كليات ...... 4 1- مقدمه ...... 9

1-1 ماهيان زهري ...... 6 1-4 ماهيان زهري با سموم برون ريز ...... 6 1-9 ماهيان زهري ...... 1 1-2 خليج فارس و استان بوشهر ...... 8 1-1 آبزيان خليج فارس ...... 14 1-6 نحوه ي عملكرد سموم ...... 14

1-1 گروه سنگ ماهيان )فرياله ها( ...... 16 1-8 جايگاه فرياله خال سياه خليج فارس در سلسله جانوري و پراكنش جهاني آن ...... 13 1-3 مورفولوژي فرياله ي خال سياه و مسموميت با زهر آن ...... 42 1-12 اهداف پژوهش ...... 44 1-11 اهدافي كه پس از اتمام پژوهش دنبال خواهند شد ...... 44

فصل دوم: مروري بر ادبيات و پيشينه تحقيق ...... 49

فصل سوم: مواد و روشها ...... 99

9-1 روش هاي آزمايشگاهي ...... 92 9-1-1 تخليص ...... 92 9-1-4 دياليز ...... 91 9-1-9 سانتريفوژ ...... 96

9-1-2 اسپكتروفتومتري ...... 98

ح

9-1-1 پروتئين سنجي ...... 22 9-1-6 الكتروفورز ...... 21 9-1-1 مواد تسهيل كننده حالليت پروتئينها در الكتروفورز ...... 22 9-1-8 سديم دودسيل سولفات پلي اكريل آميد ژل الكتروفورز )SDS-PAGE( ...... 22 9-1-3 ساختمان ژل پلي اكريل آميد ...... 26 9-1-12 انواع ژل هاي استفاده شده در الكتروفورز ...... 28

9-1-11 تكنيک هاي رنگ آميزي ژل ...... 23 9-1-14 روش سنجش لخته ...... 14 9-1-19 آزمايش هاي سيستم انعقادي ...... 14 PT 9-1-19-1 زمان پروترومبين ) ( ...... 14 9-1-19-4 زمان نسبي ترومبوپالستين فعال شده )aPTT( ...... 19

9-1-12 هماتوكريت ...... 19 9-1-11 سلول هاي قرمز خون ...... 12 9-1-16 سلول هاي سفيد خون ...... 12 9-1-11 هموگلوبين ...... 11

9-1-18 پالكت ها ...... 16 9-4 ليست مواد مصرفي و تجهيزات مورد استفاده ...... 16

9-9 منطقه مورد مطالعه ...... 18 9-2 استخراج و آماده سازي زهر خام ...... 18 9-1 دياليز زهر ...... 62

9-6 اندازه گيري مقدار پروتئين عصاره ي زهر خام ماهي ...... 62

9-1 الكتروفورز عصاره اوليه زهر ...... 64 9-8 طريقه آماده سازي ژل و كار با دستگاه SDS-PAGE ...... 62

9-3 روش رنگ آميزي با كوماسي آبي ...... 61 9-12 بررسي فعاليت هموليتيک زهر و اجزاي آن ...... 68

خ

9-11 آزمايش Main براي تعيين LD50 زهر ماهي فرياله خال سياه ...... 63 9-14 آزمايش Main براي تعيين LD50 زهر ماهي فرياله خال سياه ...... 63 9-19 دوز كشندگي )LD50( ...... 12 9-12 طرز تهيه زهر تزريقي ماهي فرياله خال سياه ...... 11 9-11 بررسي اثرات زهر ماهي فرياله خال سياه بر روي فاكتورهاي هماتولوژيكي خرگوش ...... 14 9-16 اندازه گيري انعقاد خون )CT( ...... 19 CT 9-11 روش دوم اندازه گيري زمان انعقاد خون ) ( ...... 12 9-18 اندازه گيري عناصر خوني خرگوش هاي شاهد ...... 16 9-13 اندازه گيري PT و PTT ...... 11

فصل چهارم: نتايج و يافته ها ...... 11 2-1 استخراج و آماده سازي زهر خام ...... 18

2-4 ميزان پروتئين زهر خام ماهي فرياله خال سياه خليج فارس ...... 18

2-9 دوز كشندگي )LD50( ...... 13 2-2 الگوي الكتروفورتيک زهر فرياله ...... 81 2-1 نتايج مربوط به اثر زهر فرياله بر روي سلول هاي خوني موش آزمايشگاهي ...... 84

فصل پنجم: بحث و نتيجه گيري ...... 81

منابع ...... 31 چكيده انگليسي ...... 122

د

فهرست جدول ها

جدول 1-1: اثرات توكسين هاي جانوري بروي كانال هاي يوني ...... 11 جدول 1-9: مواد مورد استفاده در تحقيق ...... 16 جدول 4-9: تجهيزات مورد استفاده در تحقيق ...... 11

جدول 9-9: محلول بافر نمونه ...... 69 جدول 9-2: دستور العمل ساخت ژل جدا كننده و ژل جمع كننده به مقدار 1/1 ميلي ليتر ...... 62 جدول 9-1: محاسبه حجم هاي مورد نياز از محلول زهر ماهي فرياله خال سياه خليج فارس ...... 12 جدول 2-1: ميزان جذب پروتئين موجود در زهر خام ماهي با توجه به غلظت BSA ...... 18 جدول 2-4: تعيين غلظت هاي اوليه ...... 13 جدول 2-9: انجام تست اصليLD50 ...... 82 جدول 2-2: نتايج تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر RBC خرگوش ...... 84 جدول 2-1: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر WBC خرگوش ...... 84 جدول 1-6: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر MCV خرگوش ...... 89 MCH جدول 2-1: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر خرگوش ...... 89

جدول 2-8: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر MCHC خرگوش ...... 89 Hb جدول 2-3: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر خرگوش ...... 89

جدول 2-12: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر HCT خرگوش ...... 89

جدول 2-11: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر PT و PTT خرگوش ...... 89 جدول 2-14: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر PLT خرگوش ...... 82

جدول 2-19: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر CT و BT خرگوش ...... 82

ذ

فهرست شكل ها

شكل 1-1: نقشه ي جغرافيايي خليج فارس ...... 12 شكل 1-4: نقشه جغرافيايي استان بوشهر ...... 11 شكل 1-9: خار فرياله به همراه غده ي زهري ...... 11 شكل 1-2: خارج ساختن خارها از غالف براي دفاع ...... 11 شكل 1-1: ساختار خار زهري فرياله ...... 11 شكل 1-6: نحوه ي تزريق زهر فرياله با خار ...... 13 شكل 1-1: پراكنش جهاني فرياله ي خال سياه خليج فارس ...... 42

شكل 1-8: تصوير طبيعي از سنگ ماهي خال سياه )فرياله( ...... 41 شكل 1-3: دياليز با استفاده از غشاء نيمه تراوا ...... 96 شكل 1-12: دستگاه سانتريفيوژ يخچال دار ...... 98 شكل 1-11: دستگاه اسپكتروفتومتر ...... 93 شكل 1-14: اساس روش اسپكتوفتومتري ...... 22 شكل 1-19: گروه فنلي واحد هاي تيروزين در حضور معرف فولين ...... 21

شكل 1-12: ساختمان سديم دود سيل سولفات ...... 26 شكل 1-11: پليمريزاسيون اكريلآميد و بيس اكريلآميد ...... 21 شكل 1-16: مراحل انجام الكتروفورز ...... 23 شكل 9-1: منطقه مورد نمونه برداري از ماهي فرياله ...... 18 شكل 9-4: استخراج و آماده سازي زهر خام ...... 13

شكل 9-9: سانتريفيوژ مايع رويي زهر ...... 62 شكل 9-2: دستگاه الكتروفورز ...... 61 شكل 9-1: نحوه تزريق زهر به موش آزمايشگاهي ...... 63 شكل 9-6: توزين خرگوش جهت تزريق زهر ...... 14

شكل 1-1: اندازه گيري زمان انعقاد خون خرگوش ...... 19

ر

شكل 9-8: خون گيري از قلب خرگوش جهت آزمايشات انعقاد ...... 19

شكل 2-1: ژل SDS PAGE با رنگ آميزي كوماسي بلو ...... 84

فهرست نمودارها

نمودار 1-1: اثرات پاتوفيزيولوژيک سموم جانوري...... 16 نمودار 2-1: منحني استاندارد حاصل از سنجش غلظتهاي مختلف محلول استاندارد BSA ...... 18

ز

چكيده: زهر جانوري و گياهي با منشاء موجودات دريايي و پروتئين هاي موجود در آن، منبعي براي استخراج

داروهايي جهت درمان درد، سرطان، بيماري هاي عفوني، بيماري هاي خود ايمن، آلرژي ها و فشارخون مي

باشند. در اين رساله، فرياله خال سياه خليج فارس از نظر ويژگي هاي زهرشناختي، تعيين حداقل دوز كشنده )LD50( و برخي از اثرات زيستي آن نظير اثرات هماتولوژيک، مورد بررسي قرار خواهد گرفت. زهر خام از 412 قطعه ماهي فرياله خال سياه خليج فارس جدا گرديد. ميزان پروتيين زهر خام اين ماهي اندازه گيري گرديد. زهرخام به ميزان 1LD50 و 3LD50 به خرگوش هاي تحت مطالعه از طريق عضالني تزريق شد. پارامترهاي هماتولوژيک خون PT و PTT و CBC قبل و بعد از تزريق زهر مورد ارزيابي قرار گرفت و در نهايت الكتروفورز جهت ارزيابي وزن مولكولي زهر خام ماهي انجام شد. ميزان پروتئين زهر خام 991 ميكروگرم/ميلي ليتر بدست آمد. با تزريق زهر، به 16 موش، حداقل LD50 معادل تقريبي 422 ميكروگرم به ازاي هر موش محاسبه شد. ميزان WBC ،RBC قبل از تزريق زهر به 3 ترتيب mm 64/6 و 1/1 بدست آمد. مقادير قبل از تزريق MCH= 21 pg ،MCV=64.3 fl، Hb=13.95 g/dl ،MCHC=32.6% و HCT=42.8% مي باشد. زمان PT و PTT به ترتيب 1/8 و 3 41 ثانيه ثبت گرديد و مقدار پالكت در حدود microliter/ 10 231 بود. بعد از تزريق زهر، ميزان RBC، 3 WBC به ترتيب mm 1/1 و 9/6 بدست آمد. مقادير بعد از تزريق MCH= 22 ،MCV=65.3 fl Hb=12.7 g/dl ،MCHC=33.7% ،pg و HCT=37.7% بدست آمد. زمان PT و PTT به ترتيب 3 11 و 92 ثانيه ثبت گرديد و مقدار پالكت در حدود microliter/ 10 23 بود. نتايج نشان مي دهد كه شكستگي سلول هاي خوني RBC ,WBC و تغييرات در ميزان اين پارامترها بعد از تزريق زهر ماهي رخ داده است و روند كاهشي داشته است.

واژگان كليدي: فرياله ي خال سياه خليج فارس، اثرات هماتولوژيک، LD50، استان بوشهر

1

فصل اول

کليات تحقيق

2

1- مقدمه:

اقيانوس ها، اين اكوسيستم هاي وسيع و كم شناخته شده، به عنوان منابع منحصر به فردي از محصوالت

طبيعي و متنوع محسوب مي شوند. صرف نظر از اين جنبه كه اقيانوس منبعي از پروتئين ارزان مي باشد،

ديگر استفاده هاي آن نظير اهميت دارويي نهفته در آن بسيار منحصر به فرد مي باشد. شمار فراوان و فزاينده

اي از تركيبات طبيعي و مواد شيميايي نوين در اقيانوس ها وجود دارند كه فعاليت هاي زيستي آنها مي

تواند براي توليد داروهاي مختلفي با خواص گوناگون مفيد بوده و مورد استفاده قرار گيرند ) ,Bhakuni

.)et al, 2005;1

محيط زيست دريايي منبعي استثنايي از محصوالت فعال طبيعي مي باشد كه طبيعت ساختاري و شيميايي

آنها در محصوالت طبيعي خشكي ها يافت نمي شود. موجودات دريايي هر روز براي غذا و بقا مي جنگند

و در اين جنگاوري زير آبي تركيبات شيميايي اي به كار گرفته مي شوند كه منبع بالقوه اي از تركيبات

دارويي مي باشند )Bhakuni, et al, 2005;1(.

بيومولكول هاي استخراج شده از موجودات آبزي ويژگي هاي زيست فعال وزيست پزشكي قدرتمندي

دارند. تالش هاي به عمل آمده براي توسعه ي داروهاي دريايي منجر به كشف موادي با خواص ضد

سرطان، آنتي بيوتيكي، تنظيم كننده ي رشد، هموليتيک، ضد انعقاد، ضد درد، ضد اسپاسم، كاهنده يا فزاينده

ي فشار خون و حتي عوامل ضد ايدز گرديده است. تا اين زمان تقريبا 16222 محصول متنوع از موجودات

دريايي جدا شده اند كه منجر به توليد 6822 مقاله گرديده است )Bhakuni, et al, 2005;1(.

بيوتوكسين هاي به دست آمده از موجودات زنده ي دريايي غالباً توجه زيست شناسان را به خود

معطوف داشته اند زيرا آنها اثر قابل توجهي بر روي موجودات زنده جوامع دريايي از خود نشان مي دهند.

بسياري از موجودات دريايي مي توانند مستقيماً قرباني خود را مجروح، مسموم و آلوده به زهر نمايند.

3

بيوتوكسين ها در سرتاسر سري هاي فيلوژنيكي جانوران دريايي يافت مي شوند. براي مطالعه ي بيوتوكسين

هاي دريايي انگيزه هاي عملي قابل توجهي وجود دارد زيرا همچون ديگر توكسين ها از نظر زيستي بسيار

فعال بوده و بنابراين از نظر پژوهش هاي زيست پزشكي، مفيد مي باشند )Bhakuni, et al, 2005;1(.

توكسين هاي دريايي از نظر شيميايي چالش برانگيزترين اهداف محسوب مي شوند كه اين امر به دليل

پيچيدگي هاي ساختماني و محدوديت دسترسي به آنها مي باشد. براي فارماكولوژيست ها و بيوشيميست

ها، توكسين هاي دريايي به دليل قدرت عمل و ويژه بودنشان، بسيار جذاب مي باشند.

توكسين هاي دريايي داراي طيف وسيعي از فعاليت هاي زيستي مي باشند و اغلب اين فعاليت ها با

مقادير اندكي از توكسين القاء مي شوند. اين موضوع مؤيد اين اصل مي باشد كه توكسين ها مولكول هاي

بسيار قدرتمندي مي باشند. فعاليت هاي زيستي اي كه توسط توكسين ها بروز داده مي شوند براي

موجودات هدف، زيان آور مي باشند، زيرا عمل توكسين هم حفاظت از موجود زهري از خطر حمله ي

ساير موجودات مي باشد و هم باعث بي حركت نمودن شكار و يا مرگ آن مي گردد. بر خالف اثرات زيان

آور عمومي در موجودات هدف، توكسين ها اين قابليت را دارند كه براي تأثير بر روي موجودات غير هدف

و به ويژه توليد داروهاي انساني به كار گرفته شوند. اهميت علمي بيوتوكسين هاي دريايي امروزه يكي از

موضوعات مهم در علوم پزشكي محسوب مي شود. به دليل ديدگاه هاي عمومي و منفي در مورد

بيوتوكسين ها كه تصور عام بر زيان آور بودن آنها مي باشد، اهميت و خواص اين دسته از تركيبات طبيعي،

عمدتاً ناشناخته مانده است. امروزه فعاليت هاي پژوهشي بر روي بيوتوكسين ها به دليل خواص

فارماكولوژيک و بيوشيميايي آنها براي توليد آنتي توكسين ها يا رمزگشايي از ويژگي هاي باليني آنها قابل

توجيه مي باشد )Halstead, et al., 1970 and 2001 and Concon, 1988(.

4

چشم انداز علم زهر شناسي زيستي )بيوتوكسيكولوژي( بر اساس داشتن دانش مطلق در مورد هر موجود

زنده و حل معماهاي پيچيده ي بيولوژيكي و بيوشيميايي است كه منجر به نتايج محسوس در مورد حفظ

سالمت انسان و منافع اقتصادي گردد بنا نهاده شده است. توكسين هاي طبيعي سمومي منحصر به فرد مي

باشند، كه داراي برخي از ويژگي هاي مشترک هستند و از گياهان، ميكروارگانيسم ها يا جانوران به دست

مي آيند. يكي از ويژگي هاي معمول آنها تأثير بر روي متابوليسم و فرايندهاي زيستي با ورود مقدار اندكي

توكسين در بدن جاندار مي باشد )Halstead, et al., 1970 and 2001 and Concon, 1988(.

بيوتوكسين ها اساساً دو نوع مي باشند: توكسين هاي گياهي و توكسين هاي جانوري. شمار فراواني از

موجودات دريايي تهديدي براي انسان محسوب مي شوند كه اين موضوع ناشي از گزش، ايجاد جراحت

،نيش زدن و يا وجود مواد زهري در گوشت، خون و... مي باشد. در چند دهه ي گذشته پژوهش در زمينه

زهر شناسي زيستي ماهيان، ابعاد جديدي پيدا كرده است. انواع ماهيان زهري، طبيعت و منبع توكسين ها و

وضعيت حاكم بر زهري بودن آنها مباحث مورد عالقه در اين زمينه مي باشند. موضوع منبع اكتسابي زهري

بودن ماهي نه تنها براي اطالعات مربوط به پادزهرها از اهميت برخوردار است بلكه عرصه اي براي كشف

مواد شيميايي زيست فعال جديد يا تركيبات بيوديناميک با ارزش درماني بر روي بشر باز نموده است.

شماري از دانشمندان، ماهيان زهري را به دو گروه تقسيم كرده اند ) Halstead, et al., 1970 and

.)2001 and Concon, 1988

الف( گروه ماهيان سمي1 كه وقتي به مصرف مي رسند باعث مسموميت انسان مي شوند.

ب( ماهيان زهري يا خار زهري4 كه به وسيله ي ساختارهاي غده اي مجهز به اندام هاي زخم زننده

توليد جراحت و يا بيماري مي نمايند.

1Phanerotoxic 2Acanthotoxic

5

حد واسط ماهيان زهري و خارزهري، ماهيان كرينوتوكسيک1 مي باشند كه زهر را در ساختارهاي غده

اي توليد مي كنند ولي اندام زهرآگين ندارند و زهر را تزريق نمي كنند )Klaassen, et al., 1999(.

1-1 ماهيان سمي

پژوهش هاي به عمل آمده در چند دهه ي اخير، دانش بشر را بر روي انواع ماهيان زهري، طبيعت و

منبع توكسين ها و شرايط حاكم بر سميت آنها افزايش داده است. مشكل اصلي پيش روي زهرشناسان

دريايي، تغيير پذيري و غير قابل پيش بيني زهري بودن اين گروه از تركيبات زيستي مي باشد. درجه ي

زهري بودن اين ماهيان ممكن است متناوبا در نوسان باشد. مواد زهري در ماهيان مي توانند در يک اندام يا

بافت خاص متمركز شوند. با توجه به اينكه توكسين در چه بافتي حضور دارد، ماهيان زهري به گروه هاي

زير تقسيم مي شوند )Stewart, et al., 1969(:

الف- ماهيان زهري گوشت4 مانند بادكنک ماهيان

ب- ماهيان زهري گناد9 مانند برخي از باربوس ماهيان

ج- ماهيان زهري خون2 مانند مارماهي موري

د- ماهيان كبد زهري1 مانند برخي از كوسه ها

1-2 ماهيان زهري با سموم برون ريز6

اين نوع ماهيان، حد واسط بين ماهيان سمي و زهري مي باشند. مانند بادكنک ماهيان، تنه ماهيان، جعبه

ماهيان، وزغ ماهيان، گاوماهيان و گربه ماهيان. اين گروه قادرند كه موادي زهري را از پوست خود ترشح

1Crinotoxic 2Ichthyosarcotoxic 3Ichthyootoxic 4Ichthyohaemotoxic 5Ichthyohepatotoxic 6Ichthyocrinotoxic

6

كنند. اين مواد قادرند ديگر جانوران دريايي را ناتوان ساخته يا آنها را دفع نمايند ) ,.Klaassen, et al

1999(. به نظر مي رسد اين ترشحات داراي خاصيت آنتي بيوتيک بوده و ماهيان را از ميكروارگانيسم هاي

فراوان و مهاجم در محيط دريايي در امان مي دارند. اين ماهيان سلول هاي تخصصي يا غددي در پوست

دارند اما فاقد شيوه ها و اندام هاي تزريق زهر مي باشند. ترشحات غده اي در محيط اطراف آنها رها مي

شوند )Perriere,et al., 2003(. اين توكسين ها غالبا توكسين هاي موكوسي ناميده مي شوند. غدد

زهري اين دسته از ماهيان در مكانيزم دفاعي توليد كننده مواد اخطار دهنده يا دور كننده به ويژه تحت

شرايط استرس مي باشند )Deo, 2000(.

1-3 ماهيان زهري

ماهيان تقريبا نيمي از مهره داران روي زمين را تشكيل مي دهند و تقريبا 44222 گونه ماهي در 12 راسته

و 221 خانواده وجود دارند. از اين ميان، تقريبا 1422 گونه ماهي دريايي زهري وجود دارند كه شامل

سپرماهيان گزنده، عقرب ماهيان، گورخرماهيان، سنگ ماهيان، وزغ ماهيان، منجم ماهيان و گونه هايي از

كوسه ها، موش ماهيان، جراح ماهيان و... مي باشند )Smith, et al., 2006(. غالب اين ماهيان غير مهاجر

و كند حركت بوده و تمايل به زندگي در آبهاي كم عمق و زيستگاه هاي حفاظت شده دارند ) ,Maretic et al., 1988(. به نظر مي رسد كه اين تمايل به سمت كم فعاليتي، رابطه ي نزديكي با تكامل اندام زهري

آنها دارد )Cameron, et al., 1973(. گرچه فقط شمار اندكي از گونه هاي ماهيان زهري قادر به ايجاد

مرگ و مير در انسان مي باشند، اما بسياري از ديگر گونه ها مي توانند مسموميت هاي شديدي را ايجاد

نمايند. مسموميت با اين ماهيان، صرف نظر از خطر جاني، با درد شديد همراه بوده و زهر آنها حاوي

7

بسياري از تركيبات فعال زيستي مي باشد. بنابراين، اين گونه ها به عنوان منبعي از تركيبات فارماكولوژيک

از اهميت خاصي برخوردار بوده و مي توانند ابزارهايي مفيد براي پژوهش هاي مختلف محسوب گردند.

ماهيان زهري، زهر خود را توسط ساختار غده اي توليد مي كنند و به اندام هاي زخم كننده )دندان،

نيش، خار، ...( مجهز مي باشند تا بتوانند زهر خود را تزريق كنند )Church, et al., 2002(. اندام زهري

معموالً متشكل از خارهايي است كه ممكن است در نواحي پشتي، سينه اي، سرپوش آبششي، شانه، لگني،

مخرجي و دمي قرار گرفته باشند و اين به گونه ي ماهي بستگي دارد )Williamson, et al., 1995(.

وقتي كه خار، بافت را سوراخ مي كند غالف پوششي خار، كه آن را در بر گرفته است پاره شده و زهر وارد

زخم مي گردد )Church, et al., 2002(.

از آنجايي كه زهر جانوران گوناگون، به ويژه ماهيان، طيف وسيعي از اثرات فارماكولوژيک بر روي

اعصاب، عضالت و سيستم قلبي-عروقي انسان دارد پروتئين هاي زهر، منبعي براي ظهور داروها براي

درمان درد، سرطان، بيماري هاي عفوني، بيماري هاي خود ايمن، آلرژي ها و فزوني فشار خون محسوب

مي شوند. غالب اين داروها از محصوالت طبيعي، مشتق مي شوند اما بيشتر موجودات زنده از جمله ماهيان،

اخيراً براي شناسايي مولكول هاي زيستي فعال مورد آزمايش قرار گرفته اند )Smith, et al., 2006(.

تا اين زمان، بيشتر توجهات معطوف زهر مارها و عقرب هاي گوناگون بوده است كه از آنها داروهايي را

جهت درمان سرطان جداسازي نموده اند. اما، ماهيان در حال حاضر به عنوان گروه غالب جانوران زهري در

بين مهره داران محسوب مي شوند كه داراي منابع دست نخورده اي از تركيبات سودمند پزشكي مي باشند.

1-4 خليج فارس و استان بوشهر

خليج فارس در 42 تا 92 درجه و 92 دقيقه عرض شمالي نسبت به خط استوا و 28 تا 16 درجه و 41

دقيقه طول شرقي از نصف النهار گرينويچ قرار دارد. اين خليج توسط تنگه هرمز به درياي عمان و از طريق

8

آن به درياهاي آزاد مرتبط است. از بين كشورهاي همسايه خليج فارس، كشور ايران بيشترين مرز آبي

مشترک را با خليج فارس دارا ميباشد. طول مرز آبي كشور ايران با خليج فارس، با احتساب جزاير در

حدود 1822 كيلومتر و بدون احتساب جزاير در حدود 1222 كيلومتر ميباشد. طول خليج فارس از تنگه

هرمز تا آخرين نقطه پيشروي آن در جهت غرب در حدود 821 كيلومتر است. عريض ترين بخش خليج

فارس 182 مايل )432 كيلومتر( ميباشد. عميق ترين نقطه خليج فارس با عمق 39 متر در 11 كيلومتري

تنب بزرگ و كم عمق ترين نقطه آن با عمقي بين 12 تا 92 متر در سمت غرب ميباشد. همچنين جزاير

متعددي در خليج فارس وجود دارند.

آب و هواي خليج فارس خشک و نيمه استوايي است. در تابستان دما گاهي تا 12 درجه سانتي گراد

ميرسد و ميزان تبخير بيشتر از ميزان آبهاي وارده ميشود. در زمستان دما تا 9 درجه سانتي گراد هم

گزارش شده است. در عين شوري زياد آب خليج فارس، 422 چشمه آب شيرين در كف و 41 چشمه آب

كامال شيرين در سواحل آن جريان دارند كه منشا همگي آنها از كوههاي زاگرس در ايران است. آبهاي

شيريني كه وارد خليج فارس ميشوند عمدتاً محدود به روان آبهاي كوههاي زاگرس در ايران و كوههاي

تركيه و عراق است. رودخانههاي اروند، كارون، جراحي، مند، دالكي و ميناب بزرگترين و پرآب ترين

رودخانههايي هستند كه به خليج فارس ميريزند كه بيشتر سرچشمههاي آنها در كوههاي زاگرس قرار

دارند. در كرانه جنوبي آبهاي ورودي به خليج فارس بسيار كم است كه موجب باال بودن رسوبات كربناتي

در اين بخش شدهاست. به دليل محصور بودن، اثر اقيانوس بر خليج فارس بسيار ناچيز است و به همين

علت سرعت جريانهاي زيرين و افقي آن بسيار كم و در حدود 12 سانتي متر در ثانيهاست. شوري بيشتر

خليج فارس نسبت به اقيانوس موجب پيدايش جريان آبي از اقيانوس هند به خليج فارس ميشود كه به

موازات ساحل ايران و بر خالف جهت چرخش عقربه هاي ساعت است. جريان ذكر شده با كاهش دما و

9

شوري همراه است به طوري كه در تنگه هرمز مقدار نمک 9666 گرم در ليتر و در انتهاي شمال غربي و در

دهانه كارون در حدود 22 گرم در ليتر است. ميزان بارندگي در سواحل جنوبي كمتر از 1 سانتي متر در سال

و در سواحل شمالي بين 42 تا 12 سانتي متر در سال است.

شكل 1-1: نقشه جغرافيايي خليج فارس

از نظر ريخت شناسي، خليج فارس نامتقارن و شيب ساحل جنوبي آن آرام تر از ساحل شمالي است. به

عبارت ديگر، محور طولي درياي پارس آن را به دو قسمت تقسيم مي كنند يكي تک شيب پايدار جنوبي كه

پيش بوم سپر عربستان است و شيب بسيار آرام دارد و ديگري بخش ناپايدار شمالي است كه قسمتي از

رشته كوههاي چين خورده زاگرس و تغييرات شيب آن 111 سانتي متر در هر كيلومتر است. كرانه جنوبي

خليج فارس، به ويژه در شرق شبه جزيره قطر، منطقه وسيع و كم عمقي )12 تا 42 متر( است كه به طور

عمده با ريخت شناسي بست، محيط تبخيري و منطقه جزر و مدي مشخص است. )تصوير 1-1(

11

استان بوشهر، بين 41 درجه و 12 دقيقه تا 92 درجه و 16 دقيقه عرض شمالي و 12 درجه و 6 دقيقه تا

14 درجه و 18 دقيقه طول شرقي در جنوب غربي ايران و حاشية خليج فارس واقع گرديده است. از شمال

به استان خوزستان و قسمتي از استان كهكيلويه و بوير احمد، از جنوب به خليج فارس و قسمتي از استان

هرمزگان، از مشرق به استان فارس و از مغرب به خليج فارس محدود شده است. مساحت استان بوشهر در

حدود 49169 كيلومتر مربع )2/1 درصد مساحت كل كشور( و از نظر وسعت هفدهمين استان كشور

محسوب مي گردد. آب و هواي استان از نوع گرم صحرائي بوده كه در مجاورت دريا، هوا گرم و مرطوب و

در مناطق دور از دريا گرم و خشک مي باشد. )تصوير 1-4(

شكل 4-1: نقشه جغرافيايي استان بوشهر

11

1-5 آبزيان خليج فارس

بنا بر بررسي دانشمندان زهر شناسي و ماهي شناسي در حدود 4222 جانور زهرآگين در آب هاي

دريايي جهان وجود دارند كه از سه طريق زنش1، گزش4 و نماتوسيست9 موجب مسموميت زهري2 در

انسان و يا موجودات دريايي مي گردند )Sitprija, et al., 2008(.

ماهيان سمي به دو دسته تحت عنوان ماهيان كريپتوتوكسيک1 و فانروتوكسيک6 تقسيم مي شوند. آبزيان

زهري خود بر اساس محل توليد زهر و طبيعت شيميايي آن به گروههاي مختلفي تقسيم مي گردند. آبزيان

زهري نيز به آن دسته اطالق مي شوند كه زهر خود را از طريق اندام سوراخ كننده يا زخم زننده تزريق مي

نمايند و زهر در غدد خاصي متمركز شده است )مانند سفره ماهيان يا حلزون هاي مخروطي(. از حدود

622 گونه ماهي موجود در خليج فارس در حدود 18% آنها يعني حدود 32 گونه سمي مي باشند كه حدود

نيمي از آنها زهري هستند. آبزيان زهري غالباً داراي توكسين هايي هستند كه بر روي سيستم قلبي-عروقي

اثر مي گذارند و آبزيان سمي بيشتر بر روي سيستم معده اي-روده اي تأثير مي گذارند ),Tu 1988(.

1-6 نحوه عملكرد سموم

پروتئين ها و پلي پپتيدهاي موجود در سموم از طريق تاثير بر كانال هاي يوني و گيرنده هاي موجود در

غشاي سلولي عمل مي نمايند. عمل پلي پپتيدها و پروتئين ها بر روي كانال هاي يوني و گيرنده هاي

موجود بر روي غشاهاي تحريک پذير از طريق وارساني1 سيگنال ها باعث آزاد شدن انتقال دهنده هاي

1 -Bite 2 -Sting 3 -Nematocyst 4 -Envenomation 5-Cryptotoxic Phanerotoxic یا Venomous- 6 7-Transduction

12

عصبي1 شده و باعث تاثير بر روي سيستم عصبي –عضالني4 مي شوند. آنزيم ها مي توانند باعث

گسستگي9 غشاء، تشكيل منفذ2، تخريب ساختار سلولي –اسكلتي1 شده، از طريق عمل بر سطوح گوناگون

مسير انعقاد6 باعث آزاد شدن واسطه هاي التهابي1 و مؤثر بر عروق شوند. آنزيم هاي پروتئوليتيک و

8 A2 فسفوليپاز علل مهم ناهنجاري هاي سلولي و آسيب هاي بندايشي)انعقادي( محسوب مي شوند. آنزيم

هاي جانوري به شكل غير مستقيم به ويژه فسفوليپاز A2 و متالوپروتئازها مي توانند باعث القاي آزادسازي

واسطه هاي مؤثر بر عروق و سيتوكين هاي3 پيش التهابي12 شوند كه نهايتاً باعث تغييرات هموديناميكي و

آسيب به عضو مي گردند. نشانه هاي قلبي-عروقي در اين موارد، شايع مي باشند. اين سموم همچنين مي

توانند از طريق ايجاد چسبندگي مولكول ها، فعال سازي مكمل، ايجاد راديكال هاي آزاد، نفوذپذيري عروقي

فزاينده و لزوجت خون، منجر به فرايند التهابي شوند )Sitprija, et al., 2008(.

واكنش هاي موضعي شامل درد، تورم و قرمز شدن مي باشند و اگر اين فرايندها شديد باشند مي توانند

باعث ايجاد تغييرات هموديناميكي شوند. واكنش هاي ايمني شناختي غالباً به صورت پاسخ هاي آلرژيک

نظير ايجاد جوش و خيز )ادم( مي باشند. در حاالت شديد، شوک آنافيالكسي و عاليم قلبي-عروقي رخ

خواهند داد )Tu,1988; and Arias,2006(.

برخي سموم جانوري بر روي كانال هاي عصبي عمل مي كنند و باعث قطبيت و عدم قطبيت غشاهاي

حساس مي شوند كه بر روي پتانسيل عمل و عملكرد عصبي-عضالني تأثيرمي گذارند. كلسيم درون سلولي

1-Neurotransmitter 2-Neuromuscular 3 -Lysis 4 -Pore 5 -Cytoskeletal 6 -Coagulation 7-Inflammatory 8-Coagulopathy 9-Cytokines 10 -Proinflammatory

13

كه به وسيله كانال هاي كلسيمي تنظيم مي شوند، ترشح و رهاسازي انتقال دهندگان عصبي را كنترل مي

كند. باز شدن كانال هاي كلسيم به وسيله دپالريزاسيون يا تحريک ليگاند، كلسيم درون سلولي را افزايش

داده و انتقال دهندگان عصبي رها مي شوند. در مقابل، بسته شدن كانال هاي كلسيم به وسيله توكسين ها يا

قطبيت شديد، ترشح انتقال دهندگان عصبي را كاهش مي دهد. فعال شدن كانال هاي سديم و بسته شدن

كانال هاي پتاسيم و كلريد باعث عدم قطبيت مي شود. باز شدن كانال هاي پتاسيم و كلريد و بسته شدن

كانال هاي سديم باعث قطبش شديد مي شود )Watters, et al., 2004(.

تعدادي از توكسين هاي جانوران دريايي از طريق اثر بر كانال هاي يوني باعث بروز عاليم عصبي-

عضالني مي شود. برخي از توكسينها در جايگاه متفاوتي از كانال هاي سديم عمل مي نمايند. جايگاه يک

به تترودوتوكسين، ساكسيتوكسين و µ-كونوتوكسين پيوندخورده و رسانايي كانال ها را مسدود ميكنند

.)Fermini, et al., 2008(

توكسين شقايق دريايي به جايگاه 9 پيوند خورده و به آرامي آن را غير فعال مي نمايد. در برخي از سلول

هاي اپي تليال فزوني كلسيم درون سلولي باعث پيشبرد تراوش آنزيم ها يا هورمون ها مي گردد

.)Sitprija, et al., 2008; and Mirzajani, 1999 (

مهار برخي از مكانيسم هاي انتقالي مي تواند به تغييرات الكتروليت سرم منجر شود. فزوني پتاسيم و

كاستي سديم خون دراثر توكسين برخي از كيسه تنان دريايي منجر به مهار آنزيم Na-K-ATPase شده و

باعث برون رفت پتاسيم و درون رفت سديم مي شود. برخي از توكسين ها بر روي غشاي سلول، منافذي را

ايجاد مي كنند كه نتيجه ي آن برون رفت و درون رفت يون ها مي باشد. درون رفت سديم باعث تورم

سلول ها مي شود. درون رفت مقادير فراواني از كلسيم مي تواند باعث مرگ سلول گردد. برخي ديگر از

سموم، گيرنده هاي استيل كولين را در محل اتصال عصب-عضله مسدود نموده و منجر به ضعف عضالني و

14

فلج مي گردند. اين عمل، پس-سيناپسي مي باشد ) ;Sitprija, et al., 2008; and Balceloux, 2008

.)and Yazawa,et al., 2007

توكسين هاي موسكاريني، پيوند خوردن كولينوكليدينل بنزيالت را با گيرنده هاي استيل كولين

موسكاريني مهار مي نمايند. برخي از فاسيكولين هاي توكسين، استيل كولين استراز را مهار مي نمايند، در

نتيجه باعث پيشبرد عملكرد پيش-سيناپسي از طريق مهار آزاد سازي انتقال دهندگان عصبي از انتهاي عصب

مي شوند. برخي از گيرنده هاي مربوط به انتقال عصبي، گيرنده هاي كاتكول آمين، سروتونين، گلوتامات،

اوپيوئيد )شبه افيون( و گاما- آمينوبوتيريک اسيد مي باشند. برخي از سموم جانوري مي توانند از طريق اثر

بر روي كانال هاي يوني و گيرنده ها بر روي انتقال عصبي اثر بگذارند ) Sitprija, et al., 2008; and

Singletary, et al., 2005( )جداول 1-1 و 4-1(.

جدول 1-1: اثرات توكسين هاي جانوري بروي كانال هاي يوني

15

نمودار 1-1: اثرات پاتوفيزيولوژيک سموم جانوري

1-7 گروه سنگ ماهيان )فرياله ها(:

اين ماهيان بطور كلي وابسته به كف بوده و عموماً در حوضچه هاي جزر و مدي و نواحي آبسنگي يافت

مي شوند. اين ماهيان از خطرناک ترين ماهيان محسوب مي شوند. در منطقه ي اقيانوسي هند-آرام

پراكندگي دارند. داراي غدد پوستي زگيل مانند مي باشند. اندام زهري اين ماهيان از 14 تا 19 خار پشتي، 4

خار سينه اي و 9 خار مخرجي تشكيل شده است. خارهاي سينه اي با غده ي زهري ارتباط ندارند )شكل

هاي 9-1 تا Tu,1988; and Lager, et al., 2012; and Sattari, et al., 2010( )1-1(.

16

شكل 9-1: خار فرياله به همراه غده ي زهري

شكل 2-1: خارج ساختن خارها از غالف براي دفاع

شكل 1-1: ساختار خار زهري فرياله

17

هر خار در يک غالف پوششي قرار گرفته است. در قاعده هر خار يک جفت غده زهري واقع شده است

كه زهر توليد شده را از طريق يک شكاف طولي كه در ناحيه قدامي-جانبي خار واقع شده است آزاد مي

نمايد. تخمين زده مي شود كه 4 غده زهري خارپشتي سنگ ماهي 12- 1 ميلي گرم زهر دارد، كه حاوي

پروتئين هاي آنتي ژنيک با وزن مولكولي باال مي باشند. عمل اصلي زهر سنگ ماهي، فلج مستقيم عضله و

در نتيجه فلج عضالت قلبي، غير ارادي و اسكلتي مي باشد ) Watters, et al., 2004; and

Singletary, et al., 2005(. زهر از طريق يک فشار مكانيكي و ايجاد يک زخم مستقيماً تزريق مي شود

كه ممكن است بخش هايي از غالف خار و خود خار نيز وارد زخم شود )شكل Tu, 1988( )1-6(.

زهر اين ماهيان غير قابل دياليز است و رنگ شيري دارد كه قدرت زهري آن تا 28- 42 ساعت پس از

مرگ ماهي نيز باقي مي ماند. زهر سنگ ماهي فرياله خال سياه خليج فارس داراي عواملي مي باشد كه بر

روي دستگاه قلبي-عروقي و عصبي-عضالني اثر مي گذارد و باعث افزايش نفوذپذيري عروق و فيبريالسيون

بطني1 مي شود. زهر اين ماهي اثر هموليتيک و هيالورونيدازي دارد. همچنين اين زهر مي تواند منجر به

گشاد شدن عروق وابسته به آندوتليوم4 و افت فشار خون سريع و غير قابل برگشت گردد كه باعث مرگ

+ M3 PKC ATP K مي شود. اثرات ديگر اين زهر مهار جريان حساس به از مسير گيرنده موسكاريني مي

باشد ) Fermini, et al., 2008; and Sattari, et al., 2010; and Ouanov, et al., 2010(.

پنج گونه سمي سنگ ماهيان: Synaceia melanostigma Synaceia guttata Synaceia horrida Synaceia trachynis Synaceia verrucosa

1 -ventricular fibrillation 2 -vasodilationEndothelium – dependent

18

شكل 1-6: نحوه تزريق زهر فرياله با خار

1-8 جايگاه فرياله ي خال سياه خليج فارس در سلسله ي جانوري و پراكنش جهاني آن )شكل 1-7( مشخصات تاكسونومي اين ماهي به شرح زير مي باشد:

سلسله: جانوران )Animalia(

شاخه: طنابداران )Chordata(

زير شاخه: مهره داران )Vertebrata(

فوق رده: ماهيان استخواني )Osteichthyes(

رده: شعاع بالگان )Actinopterygii(

زير رده: نوبالگان )Neopterygii(

زير رده: ماهيان استخواني )Teleostei(

راسته: عقرب ماهي شكالن )Scorpaeniformes(

خانواده: سنگ ماهيان )Synanceiidae(

جنس: سودوسينانسيا )Pseudosynanceia(

گونه: مالنوستيگما )P. melanostigma(

19

شكل 1-1: پراكنش جهاني فرياله ي خال سياه خليج فارس

1-9 مورفولوژي فرياله ي خال سياه و مسموميت با زهر آن:

بدن اين ماهي فاقد فلس بوده ولي داراي برجستگي هاي زگيل مانند مي باشد. چشمانش كوچک و به

صورت پشتي بر روي سر قرارگرفته ،به خوبي از هم جدا بوده و به سمت باال قرار گرفته اند.دهان در

موقعيت خلفي قرار گرفته و سر داراي حاشيه هاي اندكي مي باشد. خارهاي قرار گرفته بر روي سر خيلي

تكامل يافته نمي باشند. خارهاي پشتي داراي غده هاي زهري مي باشند. اين ماهي خارهاي سينه اي بلندي

دارد كه تا قسمت بااليي باله هاي مخرجي امتداد يافته اند و اندكي لكه هاي خاكستري تا زرد كمرنگ و

سفيد در ناحيه ي شكمي به رنگ شيري مي باشند. بر روي بخش نرم باله ي پشتي يک ناحيه ي سفيد رنگ

به صورت قدامي قرار دارد. باله پس از آن در ناحيه ي خلفي به رنگ سياه در مي آيد. بخش خارجي و

خلفي باله ي مخرجي سياه رنگ مي باشد. باله ي دمي سفيد يا اندكي صورتي بوده و يک حاشيه ي نوار

مانند پهن به رنگ سياه دارد. باله هاي سينه اي داراي لبه هاي سياه پهني مي باشند. طول استاندارد آن 19 و

طول كل آن حداكثر 18 سانتي متر )شكل 8-1( مي باشند )Randall, 1996(.

21

شكل 8-1: تصوير طبيعي از سنگ ماهي خال سياه )فرياله(

زهر ماهي فرياله مخلوطي از اجزاي فعال مي باشد. مشكالت حاصله از اين زهر شامل مسموميت

عصبي، مسموميت كليوي، مسموميت عضالني، خيز، خونريزي ناشي از فعال شدن پروتئين هاي انعقادي و

خونريزي داخل عروقي، درد از محل جراحت به اطراف آن، فلج موضعي، بي حسي پوست، ايسكمي به

همراه اريتما و كبودي در اطراف آن، تورم گسترده، سفت شدگي و خيز در اندام مجروح، لنفادنوپاتي )تورم

غدد لنفاوي( و نكروز بافتي مي باشند. تظاهرات سيستميک عبارتند از سختي تنفس، بي نظمي قلبي، افت

فشار خون، ضعف عمومي عضالني، تشنج، فلج و مرگ. عوارض آن ممكن است شامل عفونت زخم،

گرانولوم پوستي و نوروپاتي باشند. زهر سنگ ماهي مي تواند با كند كردن دپالريزاسيون در غشاي عضالني

باعث بلوكه شدن هدايت الكتريكي شود. عالوه بر اين، زهر سنگ ماهي داراي توكسينهاي سيتوتوكسيک

ميباشد )Hodgson, 2012(.

21

1-11 اهداف پژوهش با توجه به اهميت باليني و پژوهشي كه اين تحقيق دارا مي باشد مي توان به موارد ذيل به عنوان اهداف

آن اشاره نمود:

1- بررسي دوز كشندگي زهر خام

4-بررسي پروفايل الكتروفورتيک زهر )الكتروفورز(

9- بررسي اثرات هماتولوژيک زهر خام بر روي خرگوش آزمايشگاهي نژاد Dutch

2- بررسي اثرات و ارزيابي ميزان اثر بخشي زهر خام بر روي خر گوش آزمايشگاهي نژاد Dutch

1-11 اهدافي كه پس از اتمام پژوهش دنبال خواهند شد

1- بررسي تكميلي اثرات هماتولوژيک زهر و فراكسيون هاي زهري

4- بررسي تكميلي اثرات دارويي

9- بررسي امكان تهيه ي پادزهر بومي از زهر فرياله

22

فصل دوم

مروری بر ادبيات و پيشينه تحقيق

23

بر اساس نظر هالستيد1 )1312 و 1318( مطالعه بر روي زهر ماهيان به زمان ارسطو باز مي گردد اما تا

اواخر قرن 13 هيچ گزارش در مورد مطالعات انجام شده بر روي خواص شيميايي، فارماكولوژيک يا

فيزيولوژيک سموم وجود ندارد )Halstead,et al., 1970; and 1978(.

بوتارد )Bottard, 1889( اولين مطالعات توصيفي بر روي ريخت شناسي اندام هاي زهري عقرب ماهيان

را به انجام رسانيد و اولين پژوهشگري است كه مطالعاتي در مورد اثرات فارماكولوژيک و خصوصيات

شيميايي زهر ماهيان را انجام داد. وي همچنين اولين فردي بوده است كه اندام زهري شير ماهي را شرح

داده است )Halstead, et al., 1955(.

بر اساس كاوش هاي كتابخانه اي و بررسي منبع هاي موجود، پس از بوتارد پژوهشگران گوناگوني

مطالعات مختلفي را بر روي انواع ماهيان سمي و زهري به انجام رسانيده اند كه به تفكيک سال در پي

خواهند آمد:

هالستيد اثرات بيولوژيک زهر عقرب ماهي Scorpaena guttata را مورد مطالعه قرار داد ) ,Halstead

1951(. اين پژوهشگر بر روي زهر و غده زهري گربه ماهي مكزيكي Halstead, et ( Galeichthysfelis al., 1953( و گربه ماهي شرقي Plotosus lineatus و زهر عقرب ماهي Scorpaena guttata

مطالعاتي را نيز انجام داده است );Halstead, et al., 1954(.

راسل4 و همكاران اثرات قلبي-عروقي زهر سپرماهي گزنده Urobatis halleri را بر روي موش

صحرايي مورد بررسي قرار دادند )Russell, et al., 1974(.

- درسال 1362، كادزو9 اثر زهر سپر ماهي گزنده بر روي كبد و ايجاد آسيب هاي كبدي توسط زهر را

مورد بررسي قرار داد )Cadzow, 1960(.

- در سال 1361، آوستين1 و همكاران برخي از اثرات فارماكولوژيک زهر Synanceia horrida را

مورد بررسي قرار دادند )Austin, et al.,1961(.

1 Halstead 2 Russel 3 cadzow

24

- در سال 1364، ساندرز و همكاران اثرات قلبي – عروقي زهر سنگ ماهي Synanceia horrida را

مورد مطالعه قرار دادند )Saunders, et al., 1962(.

- در سال 1311، شافر4 و همكاران برخي از خواص شيميايي زهر عقرب ماهي Scorpaena guttata

را مورد مطالعه قرار دادند )Schaeffer, et al., 1971(.

- در سال 1319، كارلسون و همكاران مطالعاتي بر روي خواص فارماكولوژيک زهر عقرب ماهي

Scorpaena guttata انجام دادند )Carlson, et al., 1973(.

- در سال 1316، كراس9 مطالعاتي را بر روي جراحات ناشي از زهر سپرماهي گزنده در انسان به انجام

رساند )Cross, 1976(.

- در سال 1389، الحسن2 و همكاران بر روي اثرات فارماكولوژيک ترشحات پوستي گربه ماهي خليج

فارس Arius thalassinus در التيام سريع زخم ها مطالعاتي را انجام دادند ) ,.Al-Hassan, et al

.)1983

- در سال 1382، كرومانسكي1 اثر زهر شير ماهي Pterois volitans را بر روي قلب ايزوله ي ماهي

مورد بررسي قرار داد )Choromanski, et al., 1984(.

- در سال 1381، كيزر6 و همكاران، مطالعاتي را در مورد مسموميت انسان توسط زهر ماهيان خانواده ي

عقرب ماهيان انجام دادند )Kizer, et al. 1985(.

- در سال 1381، ناير1 و همكاران ، پژوهشي در مورد توكسين غير پروتئيني زهر شير ماهي Pterois volitans انجام دادند )Nair, et al., 1985(.

1 Austin 2 Schaeffer 3 Cross 4 Al-Hassan 5 Choromanski 6 Kizer 7 Nair

25

- در سال 1381، شيومي1 و همكاران، عامل كشنده زهر گربه ماهي شرقي Plotosus lineatus را

خالص سازي نمودند )Shiomi, et al., 1987(.

- در سال 1381، الحسن و همكاران پژوهشي را در مورد اثرات فارماكولوژيک ترشحات پوستي گربه

ماهي خليج فارس Arius thalassinus انجام دادند )Al-Hassan, et al., 1987(.

- در سال 1383، فنر4 و همكاران ، مطالعاتي در مورد اثرات كشنده و غير كشنده ي مسموميت با زهر

سپر ماهي گزنده انجام دادند )Fenner, et al., 1989(.

- در سال 1383، كوهن9 و همكاران، اثرات عصبي-عضالني عصاره خارهاي زهري شير ماهي Pterois volitans را مورد مطالعه قرار دادند )Cohen, et al., 1989(.

در سال 1383، شيومي و همكاران، اثر هموليتيک و فعاليت كشندگي زهر شش گونه ماهي زهري را

مورد بررسي قرار دادند )Shiomi, et al., 1989(.

- در سال 1332، سادرلندز2 اثرات باليني مسموميت با زهر سنگ ماهي را مورد بررسي قرار داد

.)Sutherlands, et al., 1983(

- در سال 1332، لولين1 و همكاران و آكوت6 اثرات باليني مسموميت بر اثر زهر سنگ ماهي را مورد

مطالعه قرار دادند )Acott, 1990 ; Llewellyn, et al.,1990(.

- در سال 1331، پوه1 و همكاران به خالص سازي و تعيين برخي از خصوصيات فاكتور كشنده زهر

سنگ ماهي Synanceia horrida پرداختند )Poh, et al., 1991(.

- در سال 1331، كرگر8، يک سم سيتوتوكسيک در زهر سنگ ماهي Synanceia trachynis را

شناسايي نمود )Kreger, 1991(.

1 Shiomi 2 Fenner 3 Cohen 4 Sutherlands 5 Lewellyn 6 Acott 7 Poh 8 Kreger

26

- در سال 1339، شيومي و همكاران ويژگي هاي فاكتور كشنده ي زهر سنگ ماهي Synanceia verrucosa را بررسي نمودند )Shiomi, et al.,1993(.

- درسال 1332، آودي1 و همكاران به بررسي اثرات فارماكولوژيک زهر گربه ماهي هندي Plotosus canius پرداختند )Auddy, et al., 1994(.

- در سال 1332، جي وي4 و همكاران، يک مطالعه مروري مفصل بر روي زهرها و توكسين هاي انواع

سنگ ماهيان به انجام رساندند )Gwee, et al., 1994(.

- در سال 1332، هاپكينز9 و همكاران، اثرات فارماكولوژيک زهر سنگ ماهي Synanceia trachynis

را مورد مطالعه قرار دادند )Hopkins, et al., 1994(.

- در سال 1331، ساويات2 و همكاران، اثر زهر خام سنگ ماهي Synanceia verrucosa را بر روي

گيرنده هايb-Adrenoceptor عضله قلب موش را مورد مطالعه قرار دادند )Sauviat, et al., 1995(.

- در سال 1331، گارنيه1 و همكاران، خواص آنزيمي زهر سنگ ماهي Synanceia verrucosa را

مورد بررسي قرار داده و پس از خالص سازي فاكتور كشنده، اثرات ضد فشار خون و سيتوليتيک آن را مورد

مطالعه قرار دادند )Garnier, et al., 1995(.

- در سال 1336، آودي و همكاران، زهر گربه ماهي هندي Plotosus canius از نظر كشندگي مورد

بررسي قرار دادند )Auddy,et al., 1996(.

- در سال 1336، چان6 و همكاران، اثرات باليني زهر سنگ ماهيان را مورد پايش قرار دادند ) Chan, et

)al., 1996

1 Auddy 2 Gwee 3 Hopkins 4 Sauviat 5 Garnier 6 Chan

27

- در سال 1336،آبه1 و همكاران، پروتئين كارديولپوتين4 قلبي را از زهر سنگ ماهي Synanceia verrucosa را جدا سازي نمودند )Abe, et al., 1996(.

- در سال 1336، گارنيه و همكاران، وجود نوراپي نفرين و ديگر آمين هاي بيوژنيک را در زهر سنگ

ماهيان مورد بررسي قرار دادند )Garnier, et al.,1996(.

- در سال 1338، هاپكينز و همكاران، اثرات قلبي-عروقي زهر سنجاب ماهي Gymnapistes marmoratus را مورد مطالعه قرار دادند )Hopkins, et al., 1998(.

- در سال 1333، چرچ9 و همكاران، فعاليت زهر سنجاب ماهي Gymnapistes marmoratus را از

نظر آزادسازي كاتكوالمين هاي درون زاد را مورد بررسي قرار دادند )Church, et al., 1999(.

- در سال 4222، چرچ و همكاران، وجود تركيبات كولينو ميمتيک 2 را در زهر سنگ ماهي

Synanceia trachynis را مورد بررسي قرار دادند )Church, et al., 2000(.

- در سال 4222، چرچ و همكاران، وابسته به دوز بودن اثرات قلبي-عروقي و عصبي-عضالني را در

زهر سنگ ماهي ماهي Synanceia trachynis را مورد بررسي قرار دادند )Church, et al., 2000(.

- در سال 4222، چرچ و همكاران، تشابهات فارماكولوژيک زهر هاي ماهيان زهري را مورد مطالعه قرار

دادند )Church, et al., 2000(.

- در سال 4222، ساويات و همكاران، اثرات پروتئين تراكي نياليزين حاصله از زهر سنگ ماهي

Synanceia trachynis را مورد بررسي قرار دادند )Sauviat, et al., 2000(.

- در سال 4222، لي1 و همكاران، منشأ باكتريايي تترودوتوكسين بادكنک ماهي Fugu vermicularis

را مورد مطالعه قرار دادند )Lee, et al., 2000(.

1 Abe 2 Cardioleputin 3 Church 4 Cholinomimetic 5 Lee

28

- در سال 4222، نئوز-وازكوئزا1 و همكاران، سميت و پراكنش تترودوتوكسين در گوشت بادكنک ماهي

را مورد مطالعه قرار دادند )Nuez, et al., 2000(.

- در سال 4222، هاهن4 و همكاران، فعاليت بيولوژيک زهر ماهي Notesthes robusta را مورد

بررسي قرار دادند )Hahn, et al., 2000(.

- در سال 4222، مونير9 و همكاران، توانايي تراكي نياليزين را در آزادسازي كاتكوالمين ها را مورد

بررسي قرار دادند )Meunier, et al., 2000(.

- در سال 4221، محمود2 و همكاران، مطالعاتي در مورد برخي از اثرات سم بادكنک

ماهيChelonoden patoca به انجام رسانيدند )Mahmud, et al., 2001(.

- در سال 2001، چرچ و همكاران، پژوهشي در مورد خنثي سازي اثرات قلبي-عروقي زهر سنجاب

ماهي با استفاده از پادزهر سنگ ماهي .Synanceia sp انجام دادند ) Church, et al.,2001(.

- در سال 4224، چرچ و همكاران، اثر آدرنرژيک و كولينرژيک زهر شير ماهي Pterois volitans بر

روي فعاليت قلبي-عروقي را مورد بررسي قرار دادند )Church, et al., 2002(.

- در سال 4224، خو، مطالعاتي بر روي پروتئين هاي زيست فعال زهر سنگ ماهيان گوناگون انجام داد

.)Khoo, et al., 2002(

- در سال 4224، آنونو1 و همكاران، اثر پروتئين تراكي نياليزين و توانايي آن در ايجاد منفذ بر روي

غشاي سلولي را مورد بررسي قرار دادند )Ouanounou, et al., 2002(.

- در سال 4224، ايبيستر6 و همكاران، مطالعات باليني را بر روي مسموميت با سم بادكنک ماهي به انجام

رساندند )Isbister , et al., 2002(.

1 Nuez-Vaazqueza 2 Hahn 3 Meunier 4 Mahmud 5 Ouanounu 6 Ibister

29

- در سال 4229، حداد1 و همكاران، عالئم باليني و جراحات ناشي از مسموميت با زهر عقرب ماهيان

گوناگون را مورد پايش قرار دادند )Haddad, et al., 2003(.

- در سال 4229، چرچ و همكاران، به بررسي نوسانات يون كلسيم داخل عروقي در اثر مسموميت با

زهر خانواده عقرب ماهيان پرداختند )Church, et al., 2003(.

- در سال 4229، السيد4 و همكاران، سميت توكسين بادكنک ماهي درياي سرخ Pleuranacanthus scleratus را مورد بررسي قرار دادند )El-Sayed, et al., 2003(.

- در سال 4229، پرير9 و همكاران، كرينوتوكسين ها، آكانتوتوكسين ها و ترشحات پوستي گربه ماهي ها

و فعاليت هاي بيولوژيک آنها را مورد بررسي قرار دادند )Perriere, et al., 2003(.

- در سال 4222، گش2 و همكاران، پروفايل تغييرات فصلي سميت را در 2 گونه بادكنک ماهي در

منطقه بنگال را مورد بررسي قرار دادند )Ghosh, et al., 2004(.

- در سال 4222، موهوري1 و همكاران، اثرات فارماكولوژيک عصاره خام خارهاي زهري زروک ماهي

Scatophagus argus را مورد مطالعه قرار دادند )Muhuri, et al., 2004(.

- در سال 4221، شكوهين6، مطالعاتي عمومي بر روي سم چند گونه بادكنک ماهي انجام داد

.)Shokuhin, et al., 2005(

- در سال 4221، كوداما1 و همكاران، مطالعاتي عمومي بر روي سم بادكنک ماهي انجام دادند

.)Kodama, et al., 2005(

- درسال 4221، سوسا-روزالس8 و همكاران، بررسي فعاليت هاي بيولوژيكي مهم را در زهر ماهي

Thalassophryne maculosa را مورد بررسي قرار دادند )Sosa-Rosales, et al., 2005(.

1 Haddad 2 El-Sayed 3 Perriere 4 Ghosh 5 Muhuri 6 Shokuhin 7 Kodama 8 Sosa-Rosales

31

- در سال 4221، وو1 و همكاران، مطالعاتي بر روي باكتري مولد تترودوتوكسين در بادكنک ماهي

Fugu rubripes انجام دادند )Wu, et al., 2005(.

- در سال 4221، فيگوردو و همكاران، خواص بيولوژيک زهر عقرب ماهيان را مورد بررسي قرار دادند

.)Figueiredo, et al., 2005(

- در سال 4226، ماگالهس4 و همكاران، گروهي از پروتئين هاي حاصله از زهر ماهي

Thalassophryne nattereri به نام نترين ها 9شناسايي و خواص بيولوژيک و بيوشيميايي آن ها را

مورد بررسي قرار دادند )Magalha˜es, et al., 2006(.

- در سال 4221، هوانگ2 و همكاران، يک سلسله بررسي هاي باليني در مورد مسموميت با سم تترودو

توكسين انجام دادند )Hwang, et al., 2007(.

- در سال 4221، عبدالموله1 و همكاران، به بررسي پاسخ بيوشيميايي و فيزيولوژيک نسبت به القاي سم

بادكنک ماهي L.lagocephalus اقدام نمودند )Abdelmouleh, et al., 2007(.

- در سال 4228، سعودي و همكاران، سميت هماتولوژيک عصاره بدست آمده از گوشت بادكنک ماهي

L.lagocephalus را مورد مطالعه قرار دادند )Saoudi, et al., 2008(.

- در سال 4221، راموس6 و همكاران، خواص بيولوژيک و بيوشيميايي موكوس و زهر گربه ماهي

Cathorops spixii مورد بررسي و با هم مقايسه كردند )Ramos, et al., 2007(.

- در سال 4221، سوپراني1 و همكاران ، اثر زهر سنگ ماهي Scorpaena plumeri را بر روي سلول

هاي گليوبالستوماي كشت داده شده موش مورد بررسي قرار دادند )Soprani, et al., 2007(.

- در سال 4223، سعودي و همكاران، مسموميت كبدي ناشي از سم تترودوتوكسين در بادكنک ماهي L.lagocephalus را مورد بررسي قرار دادند )Saoudi, et al,. 2009(.

1 Wu 2 Magalhaes 3 Natterins 4 Hwang 5 Abdelmouleh 6 Ramos 7 Soprani

31

- در سال 4214، پريتيويراج1 و همكاران مطالعاتي بر روي تركيبات فعال زيستي زهر سنگ ماهي Synanceia horrida انجام دادند )Prithiviraj, et al., 2012(. - در سال 4219، خورا و همكاران، خصوصيات فارماكولوژيک زهر ماهيان خانواده ي عقرب ماهيان را مورد بررسي قرار دادند )Khora, et al., 2013(. Pseudosynanceia melanostigma - در سال 1939 تحقيق بر روي ماهي فرياله خال سياه خليج فارس ) (

انجام گرفت. در اين تحقيق اثر زهر ماهي بر روي عوامل هماتولوژيک و سطح سرمي آنزيم هاي موش

صحرايي بررسي شد و سطح سرمي آنزيمهاي كراتين فسفوكيناز، الكتات دهيدروژناز، گلوتامات-

اگزالواستات ترانس آميناز، گاماگلوتاميل ترانس پپتيداز، فسفاتاز قليايي و آميالز، الكتروليتهاي سرم شامل

سديم، پتاسيم و كلسيم و نيز شمارش كامل سلولهاي خوني اندازهگيري شدند. در نهايت مشخص شد كه

سطح سرمي آنزيمهاي مورد بررسي و نيز سطح پتاسيم، كلسيم و شمارش گلبولهاي سفيد خون در گروهي

از موشهاي صحرايي كه مورد تزريق زهر خام فرياله ماهي قرار گرفته بودند در مقايسه با گروه كنترل

افزايش چشمگيري يافته ولي سطح هموگلوبين و شمارش گلبولهاي قرمز خون و نيز سطح سديم سرمي

كاهش معنيداري را نشان دادند. افزايش سطح سرمي آنزيمهاي كبدي- ماهيچهاي و نيز كاهش سطح

هموگلوبين خون ميتواند نشانگر وجود احتمالي رابدوميوليز و هموليز و هپاتوتوكسيسيتي سم فرياله ماهي

باشند )وزيري و همكاران، 1939(.

1 Prithiviraj

32

فصل سوم

مواد و روش ها

33

3-1 روش هاي آزمايشگاهي:

3-1-1 تخليص

در يک روند خالص سازي كامالً مناسب، هر مرحله بايد منجر به حذف آلودگي ها و مواد ناخواسته و

افزايش پيش رونده در فعاليت ويژه پروتئين مورد نظر گردد. البته همانطور كه گفته شد، نه تنها افزايش در

فعاليت ويژه ايجاد نمي شود، بلكه تقريباً هميشه از فعاليت كمي نيز كاسته مي شود، لذا تالش براي افزايش

غني سازي در حين كاستن از ميزان كاهش فعاليت پروتئين، هدف اصلي در هر طرح خالص سازي مي

باشد. بنابراين بايد با تقسيم مراحل خالص سازي به چند بخش يک سري روش هاي آناليتيكال را براي هر

بخش طراحي كرد. مانند طراحي يک روش سريع و قابل اعتماد براي پروتئين هدف، تعيين ميزان خلوص

مورد نظر، محاسبه مقدار كلي پروتئين در نمونه و در نهايت انتخاب روش هاي حذف آلودگي ها. بهترين

روش براي پروتئين هدف روشي است كه بافرها و مواد مورد استفاده در آن با پروتئين ميانكنش نداشته

باشند و فعاليت آن حفظ شود. انواع تكنيک هاي نظير سانتريفوژ، رسوب دهي با نمک، اولترا فيلتراسيون،

انواع روش هاي كروماتوگرافي، الكتروفورز و Electro Elution در پروسه هاي تخليص پروتئين ها

كاربرد دارند. تعيين خلوص پروتئين هدف نيز اغلب با روش هايي نظير SDS-PAGE، الكتروفورز لوله

موئين، كروماتوگرافي و اسپكترومتري جرمي تعيين مي شود. روش هاي پروتئين سنجي نظير الوري، بيوره

و ... نيز براي تعيين مقدار كلي پروتئين به كار مي روند. روش برادفورد اغلب براي نمونه هايي كه حاوي

مقادير زيادي ليپيد هستند و احتمال واكنش با روش الوري را دارند مناسب است )بابائي و همكاران،

.)1934

34

3-1-2 دياليز1

از قديمي ترين روش هاي حذف نمک هاي با وزن مولكولي پائين يا تعويض بافر، دياليز مي باشد. اين

تكنيک براساس خصوصيت نيمه تراوايي غشاي جداكننده محلول پروتئيني از بافر دياليز عمل مي كند.

جنس كيسه دياليز سلولزي است و در اندازه هاي مختلف توليد مي شود بسته به ماده اي كه دياليز مي كنيم،

بايد از كيسه هاي مخصوص )محدوده بين 1222- 12222 دالتون(، مي توان استفاده كرد. خاصيت نيمه

تراوايي به cut-off غشاء دياليز بستگي دارد و مولكول هاي كمتر از يک وزن مولكولي مشخص را از خود

عبور مي دهد در حالي كه ماكرومولكول ها نمي توانند از غشاء عبور كنند )بابائي و همكاران، 1934(..

از اين تكنيک زماني استفاده مي كنيم كه بخواهيم از برخي مواد و ناخالصي هاي مشكل زا مثل نمک ها

و يون ها، خالص شويم. پروتئين ها به دليل بزرگي ملكول هايشان از جدار نيمه تراوا عبور نمي كنند، ليكن

آب و ساير ملكول هاي كوچک و يون ها از آن عبور كرده و از كيسه خارج مي شوند. جريان حركت يون

ها در دياليز طبق قانون انتشار صورت مي گيرد. هميشه يون ها از جايي كه غلظت آنها فراوان است به

سمت جايي كه غلظت آنها كم است در حركت هستند. اين حركت مستقل از حركت ساير يون ها مي باشد

و هر نوع يون مستقل از يون هاي ديگر، هميشه از جايي كه تعداد آنها بيشتر است، به جايي كه تعدادشان

كمتر است حركت مي كنند. اين حركت تا جايي ادامه پيدا مي كند، كه غلظت هر نوع از يون ها در داخل و

خارج كيسه دياليز برابر شود و به تعادل غلظتي برسند )شكل 3-1( همچنين ممكن است اين فراواني در

خارج از كيسه باشد. پس نتيجه آن حركت يون ها از خارج به سمت داخل خواهد بود. در هنگام دياليز

ممكن است، انواعي از يون ها به داخل نفوذ كنند و همزمان انواع ديگري از آنها، به خارج بروند.

1 dialysis

35

همانطور كه گفته شد، پروسه دياليز براساس اختالف غلظت محلول ها در دو سوي غشاء انجام مي

گيرد و در صورت برابر بودن غلظت هاي دو طرف، سرعت انتشار مواد ورودي و خروجي با هم برابر مي

شود، لذا كاهش غلظت نمک در محلول پروتئين فقط با تعويض بافر دياليز امكان پذير است، پس در طي

پروسه دياليز چندين بار بايد بافر عوض شود. هنگام دياليز بايد بافر مدام با يک همزن مغناطيسي درحال

چرخش باشد. از طرفي سرعت انتشار بستگي به دما و ويسكوزيته محلول دارد، اگرچه دماي باال سبب

افزايش سرعت انتشار مي شود اما در اغلب موارد )بخصوص در هنگام كار با پروتئين ها( الزم است كه

دياليز در دماي 8-2 انجام شود.

شكل 9-1: دياليز با استفاده از غشاء نيمه تراوا

3-1-3 سانتريفوژ1

يک روش متداول براي تفكيک مولكول ها مي باشد كه ذرات را با ايجاد نيروي گريز از مركز و بر

اساس رسوب دهي از هم تفكيک مي كند. قدرت سانتريفوژ براساس مقدار نيروي وارده به ذرات تعيين مي شود.

سانتريفيوژ دستگاهي است كه با ايجاد نيروي گريز از مركز، نيروي وارد بر ذرات موجود در محلول را

افزايش داده و ته نشين شدن آنها را سرعت مي بخشد )شكل 12-1( به ذراتي كه به حالت تعليق در يک

1 Centrifugation

36

محلول قرار دارند، نيروهاي مختلف و مخالف هم وارد مي شود. در هنگام سانتريفيوژ دو نيرو به ذره وارد

مي شود: نيروي وزن كه نتيجه اثر نيروي ثقل بر جرم جسم است و نيروي حاصل از حركت دوراني

يكنواخت سانتريفيوژ كه سرعت زاويه اي را ايجاد مي كند، سعي در راسب ساختن ذره دارند. در صورتي

كه نيروي انتشار و نيروي اصطكاک ايجاد شده از طرف محلول، با دو نيروي فوق مخالفت دارند. اگر

چنانچه دو نيروي اول بر دو نيروي دوم غالب شوند، در اين صورت ذرات معلق در محلول، با سرعتي

معين كه متناسب با جرم و حجم ذره است، شروع به ته نشين شدن خواهد نمود. چهار نكته اساس راسب

شدن را نشان مي دهد:

1- هرچه جسم يا مولكول، پر حجم و سنگين باشد، حركت آن جسم سريعتر از اجسام كم حجم و سبک

خواهد بود.

4- هر چه جسم يا مولكول متراكم تر باشد، يعني حجم نسبي كمتري داشته باشد، حركت آن سريعتر

خواهد بود.

9- هر چه محلول متراكم تر باشد، حركت جسم يا مولكول كندتر صورت خواهد گرفت.

2- هر چه ضريب اصطكاک بيشتر باشد، حركت جسم يا مولكول كندتر صورت خواهد گرفت.

معمول ترين كاربرد اين تكنيک رسوب دادن ذرات است، اما عالوه براين يكي از كاربردهاي مهم آن

تعيين وزن مولكولي ذره مي باشد. بدين ترتيب با محاسبه سرعت رسوب گذاري )-Sedimentation cofficont(، مي توان از آن براي تعيين وزن مولكولي، تعيين خلوص ماده، جدا كردن و مشخص كردن

مواد موجود در محلول هاي مورد آزمايش استفاده نمود.

نسبت نيرويي كه سانتريفيوژ به ذره وارد مي كند به نيرويي كه جاذبه به ذره وارد مي كند عبارتست از

-2 cms 980 . و با g يا (RCF (relative centrifugical field نمايش داده مي شود:

37

2 -1 2 RCF (g) = [4 Π (rev min ) r / 3600] 980 RCF (g) = (1.11×10-5) (rev min-1)2 r rev min همان دور بر دقيقه )rpm( و r شعاع روتور است.

روش كار به اين صورت است كه محلول مورد نظر را داخل تيوب هاي مخصوص مي ريزيم و در

محفظه مخصوص لوله ها كه روتور ناميده مي شود، قرار مي دهيم، در ضمن نحوه قرارگيري لوله ها در

دستگاه بايد دو به دو مقابل هم و باالنس باشند )بابائي و همكاران، 1934(.

شكل 9-4: دستگاه سانتريفيوژ يخچال دار

3-1-4 اسپكتروفتومتري1

يكي از مهمترين روش هاي تجزيه اي كه در اختيار بيوشيمي دان ها قرار دارد، اسپكتروفتومتري است. اين

روش بر اين حقيقت استوار است كه ساختار مولكولي ويژه در محلول مي تواند طول موج خاصي از نور

تابيده شده را بيش از ساير اجزاء جذب كند و با بررسي جذب در آن طول موج مي توان از نظر كيفي و

كمي ماده مورد نظر را بررسي كرد. اسپكتروفتومتر بر اساس دو تكنيک پايه گذاري شده است:

الف- طيف سنجي

1 Spectrophotometry

38

ب- رنگ سنجي

بخش اسپكترومتر قسمتي است كه نور مونوكروم را به وجود مي آورد و داراي منبع نور، عدسي، شكاف ها،

مونوكروماتورها )صافي يا منشور( مي باشد و بخش فتومتر داراي ابزار سنجش نور است. يک دستگاه

اسپكتروفتومتر تک پرتويي )شكل 11-1( از اجزاء زير ساخته شده است:

منبع نور، موازي ساز يا عدسي، تكفام ساز، گزينشگر طول موج يا شكاف، كووت، سلول فتو الكتريک،

نمايشگر يا گالوانومتر

شكل 9-9: دستگاه اسپكتروفتومتر

جذب نور توسط يک محلول رنگي از قانون بير-المبرت تبعيت مي كند. مطابق قانون بير-المبرت هنگامي

كه نور از محلول عبور مي كند ميزان جذب نور به غلظت ماده مورد نظر و يا به قطر لوله يا مسيري كه نور

در لوله طي كرده است )b( بستگي دارد. به عبارت ديگر، هر اندازه غلظت ماده مورد نظر و قطر لوله بيشتر

باشد، نور بيشتري جذب مي شود و نور كمتري از محلول عبور مي كند )شكل 14-1(. بنابراين مي توان

نوشت: A= log Io/It = bC = OD b مسير عبور نور بر حسب سانتي متر، C غلظت محلول مورد نظر و A جذب نهايي مي باشد. Io شدت

پرتو قبل از عبور از نمونه. It شدت پرتوي عبور يافته از نمونه است.

39

شكل 9-2: اساس روش اسپكتروفتومتري

اسپكتروفتومترها مستقيماً براي اندازهگيري شدت نور در طول موج هاي مختلف استفاده مي شود و ميتواند

نماينده درصد نورتابشي مخابره شده يا جذب شده باشد. با استفاده از اين اطالعات و مقايسه آن با

دانسيتهها و دادههاي به دست آمده ميتوان اسپكتروسكوپي را به عنوان يک ابزار استفاده كرد. مقايسه

طيفها براي تعيين غلظت جوهر حل شده موجود در حالل مثال خوبي است. بدين ترتيب كه با ثبت نور

ارسال و دريافت شده در طول موجي خاص و بررسي طول موج جذب شده توسط حالل ميتوان به

غلظت آن پي برد. سپس آناليز محلول با غلظت ناشناخته، با داده هاي معلوم مقايسه مي شود و به كمک

تناسب غلظت محاسبه مي گردد. اين عمل براي محلولهايي كه در آنها چندين نوع حالل وجود دارد نيز

قابل استفاده است، البته به دقت بيشتري در آناليز طول موج ها احتياج دارد )بابائي و همكاران، 1934(.

3-1-5 پروتئين سنجي

الف( پروتئين سنجي به روش الوري1

يكي از متداول ترين روش هاي پروتئين سنجي محسوب مي شود كه در بيشتر شرايط جايگزين قابل

قبولي براي ساير روش هاي دشوار و پر هزينه سنجش پروتئين شده است روش الوري بر اساس دو واكنش

صورت مي گيرد و پي ريزي شده است:

1 Lowry

41

1( واكنش بيوره: در آن باندهاي پپتيدي پروتئين ها تحت شرايط قليايي با مس واكنش مي دهند و يون

+ Cu توليد مي كنند كه با معرف فولين )Folin reagent( واكنش مي دهد.

4( واكنش Folin-ciocalteau: اساس اين روش متكي بر تشخيص و اندازه گيري اسيد آمينه هايي با

بنيان فنلي مي باشد، در واقع اكسيداسيون اسيدهاي آمينه آروماتيک باعث احياء شدن فسفوموليبد و

تنگستات )Phosphomolybdo tungastate( و تبديل آن به هتروپلي موليبدينيوم آبي خواهد شد، كه

اين واكنش منجر به توليد رنگ آبي غليظ خواهد شد و غلظت آن تا حدودي به مقدار تيروزين )Tyrosin(

و تريپتوفان موجود در پروتئين وابسته است )شكل 19-1(. دقت و حساسيت اين روش حدود mg/ml

21/2 است و به خوبي براي سنجش محلول هاي پروتئين با غلظت بين mg/ml 1/2-21/2 قابل استفاده

است )بابائي و همكاران 1934(.

شكل 9-1: گروه فنلي واحد هاي تيروزين در حضور معرف فولين يک رنگ آبي ارغواني توليد مي كند. )شدت رنگ در اثر

وجود مقادير متفاوت پروتئين است(.

3-1-6 الكتروفورز

به دليل بار دار بودن ماكرومولكولهاي زيستي مانند DNA و پروتئينها، مي توان با قراردادن آنها در

يک ميدان الكتريكي، آنها را بر اساس خواص فيزيكي مانند شكل فضايي، وزن مولكولي و بار الكتريكي

41

تفكيک كرد. اين امر توسط فناوري مهم جداسازي پروتئينها، بر اساس مهاجرت پروتئينهاي باردار در

ميدان الكتريكي، طي فرايندي به نام الكتروفورز انجام مي شود. به طور كلي، اين روشها براي تخليص

مقادير زياد پروتئينها مورد استفاده قرار نميگيرد، زيرا معموال روشهاي جايگزين سادهتري وجود دارد و

روشهاي الكتروفورز اغلب داراي اثرات جانبي بر روي ساختمان و بنابراين عملكرد پروتئينها ميباشند.

هرچند، الكتروفورز بهعنوان يک روش جداسازي مفيد ميباشد. روش الكتروفورز در رشتههاي بيولوژي،

بيوشيمي، داروشناسي، پزشكي، ژنتيک، بيولوژي مولكولي و.... كاربرد وسيعي دارد )بابائي و همكاران 1934(.

در واقع مهاجرت ذرات باردار تحت اثر يک ميدان الكتريكي را الكتروفورز گويند. اساس كار

الكتروفورز بر خاصيت اسيد و باز مي باشد، از اين رو هر تركيبي كه داراي بار الكتريكي بشود، مي توان

براي جدا سازي آن از اين روش استفاده نمود. بسياري از مولكول هاي زيستي مهم نظير اسيد هاي آمينه،

پپتيدها، پروتئين ها، نوكلئوتيدها و اسيد هاي نوكلئيک داراي گروه هاي قابل يونيزه هستند، بنابراين در هر pH اي در محلول به صورت اجزاي باردار شده ي كاتيوني و آنيوني وجود دارند. بسته به نوع بار خالص،

اين اجزا تحت اثر يک ميدان الكتريكي به سمت كاتد و يا آند مهاجرت مي كنند. يكي از مزاياي الكتروفورز

اين است كه ميتوان پروتئينهاي جداشده را مشاهده نمود و اين به محقق امكان ميدهد تا بتواند سريعاً

تعداد پروتئينهاي مختلف موجود در مخلوط يا شدت خلوص يک فراورده پروتئيني را برآورد نمايد.

الكتروفورز امكان تعيين بعضي از خصوصيات مهم پروتئينها، نظير نقطه ايزوالكتريک و حدود وزن

مولكولي را فراهم ميسازد )بابائي و همكاران 1934(.

براي آناليز مولكول هاي زيستي بيشتر از ژل هاي آگاروز پلي آكريل آميد در الكتروفورز استفاده مي

شود. آگاروز معموال در غلظت هاي 1 ٪ و 9 ٪ استفاده مي شود. خواص ژل به پيوندهاي هيدروژني درون

مولكولي و بين مولكولي ميان زنجيره هاي طويل آگاروز بستگي دارد. اندازه ي روزنه در ژل توسط غلظت

42

ژل قابل كنترل است. به طوري كه روزنه هايي با اندازه بزرگ از غلظت هاي پائين ژل و روزنه هايي با

اندازه كوچک از غلظت هاي باالتر ژل نتيجه مي شود. ژل هاي آگاروز براي الكتروفورز پروتئين ها و اسيد

هاي نوكلئيک مناسب هستند.

مزيت عمده ي ژل هاي آگاروز در دسترس بودن آنها در دماي ذوب پائين )C° 61-64( است. ژل هاي

آكريل آميد با محتواي 9 تا 92 ٪ آكريل آميد ساخته مي شوند. بنابراين ژل هايي با درصد پائين آكريل آميد

)9 ٪( اندازه روزنه شان بزرگ است و در الكتروفورز پروتئين ها استفاده مي شود. اين ژل ها در جدا سازي

DNA نيز كاربرد دارند.

در بعضي موارد استفاده از ژل هاي گراديان در سيستم ژل الكتروفورز مي تواند در زيست شناسي كاربرد

داشته باشد. در اين نوع به جاي ژلي با اندازه روزنه ي يكنواخت، از ژل هايي استفاده مي شود كه اندازه ي

روزنه در نقاط مختلف آن متفاوت است. در اين نوع ژل ها، غلظت آكريل آميد 1 ٪ در ابتداي ژل تا 41 ٪

در انتهاي ژل متفاوت است. اختالف در غلظت آكريل آميد، سبب تفاوت اندازه روزنه ها در ژل مي شود.

در ابتداي ژل كه غلظت آكريل آميد كم است )1 ٪( اندازه روزنه ها زياد و در انتهاي ژل با غلظت باالي

آكريل آميد اندازه ي روزنه ها كوچكتر است. مزيت اين نوع ژل ها اين است كه تعداد بيشتري از پروتئين

ها با وزن مولكولي متفاوت از يكديگر جدا مي شوند. پروتئين هايي كه وزن مولكولي پائيني دارند، مي

توانند از روزنه هاي كوچكتر عبور كنند و در انتهاي ژل باند تشكيل دهند و پروتئين ها با وزن مولكولي باال

در همان ابتداي ژل باقي مي مانند. دو پروتئيني كه داراي اندازه هاي مشابه هستند ولي جرم مولكولي آنها با

يكديگر متفاوت است به كمک اين روش از يكديگر جدا مي شوند. بنابراين استفاده از روش ژل گراديان

مي تواند درجه تفكيک و همچنين خلوص پروتئين ها را )نسبت به ژل با اندازه هاي روزنه يكسان( بسيار

افزايش دهد )بابائي و همكاران 1934(.

43

3-1-7 مواد تسهيل كننده حالليت پروتئينها در الكتروفورز

پروتئينهايي كه به راحتي به حالت محلول در نمي آيند و يا در طي آزمايش دچار واكنشهاي بين مولكولي

ميشوند، در روش هاي الكتروفورز به سادگي تفكيک نميشوند. در اين حالت ميتوان از موادي كه باعث

افزايش حالليت آنها ميشوند استفاده نمود.

از مواد تسهيل كننده حالليت پروتئينها در الكتروفورز ميتوان مواد زير را نام برد:

اوره: از موادي است كه براي جلوگيري از مجتمع شدن پروتئينها بكار ميرود. اوره بار الكتريكي پروتئين

ها را تغيير نميدهد و در غلظت هاي كم تاثير چنداني در ساختمان پروتئين ندارد ولي در غلظتهاي باالتر

پروتئين را واسرشته ميكند.

دترجنتها: از جمله مواد متداول در افزايش حالليت پروتئين بخصوص پروتئينهاي غشائي هستند. اين

مواد چون درحذف اتصاالت آبگريز كه در بر همكنش پروتئين ها با يكديگر و پروتئينها با ليپيدها موثرند،

مهمترين مواد در محلول سازي پروتئينهاي غشايي محسوب ميشوند )بابائي و همكاران 1934(.

دترجنتها شامل چهارگروه زير ميباشند:

غيريوني: مانند تريتون X122 ، لوبرول PX و بريج 96-T

آمفوتري: مانند چَپس و زويترجنتها )از شماره 6-9 تا 9-12(

آنيوني: مانند سديم دودسيل سولفات )SDS(

كاتيوني

SDS-PAGE 3-1-8 سديم دودسيل سولفات پلي اكريل آميد ژل الكتروفورز ) (

SDS يک دترجنت يونيزه با بار منفي ميباشد )شكل 12-1( كه طي ساليان متمادي براي حل نمودن

پروتئينهاي غشاء مورد استفاده قرار گرفته است. اين ماده با اتصال به پروتئينها باعث واسرشته شدن آنها

44

ميگردد. پس از محلولسازي پروتئينها آنها را ميتوان به وسيله الكتروفورز يا روشهاي ديگر از هم جدا

نمود. چون پروتئينهاي غشايي عموماً در محلولهاي آبي قابل حل نميباشند، بنابراين SDS را به محيطي

كه براي جداسازي به كار برده ميشود نيز ميافزايند تا مانع از رسوب پروتئينها در محيط ژل گردد.

در اين شرايط SDS به رشتههاي پلي پپتيدي وصل ميشود )به ازاي هر دو مولكول اسيد آمينه يک مولكول

SDS به پلي پپتيد اتصال مييابد( و پروتئينها را به زير واحدهاي تشكيل دهنده شان تجزيه مينمايد و با

پليپپتيدها پيوندهاي يوني تشكيل ميدهد. تجزيه اين پيوندها باعث جداشدن زير واحدهاي پروتئيني و

بازشدن زنجيرههاي پلي پپتيدي و در نتيجه امكان اتصال SDS به تمام ساختمان پروتئين ميشود. مقدار

SDS در بافر نمونه بايستي بارها بيشتر از مقدار پروتئين باشد. زيرا در صورت اشباع نشدن پروتئينها با

SDS، حركت الكتروفورزي و وزن مولكولي آنها با هم تناسبي ندارد. بدين لحاظ رعايت نسبت وزن SDS

به پروتئين، بخصوص در محلولهايي با غلظت باالي پروتئين از اهميت ويژه اي برخوردار است. حرارت

جدا شدن زير واحدهاي پروتئينهاي چند واحدي و اشباعشدن زنجيرههاي پلي پپتيدي با SDS را تسهيل

مينمايد. عالوه بر اين حرارت سبب غيرفعال كردن بسياري از پروتئازها ميشود كه امكان تجزيه پروتئينها

را توسط آنزيمهاي مختلف از بين ميبرد )بابائي و همكاران، 1934(.

SDS-PAGE يک وسيله قدرتمند براي جداسازي و تعيين اندازه مولكولي به حساب ميآيد. در -SDS

PAGE براي آماده نمودن نمونههاي پروتئيني، آنها را در محلول حاوي SDS و يک نوع ماده احياء كننده

)معموالً β-مركاپتواتانول( مي گذارند و به مدت چند دقيقه در حرارت آب جوش قرار ميدهند.

مركاپتواتانول با احياء پيوندهاي دي سولفيدي )كه در نگهداري ساختار سوم پروتئين نقش مهمي دارند(

ساختار سوم پروتئين ها را بهم مي ريزد و SDS نيز به پروتئين ها پيوند مي شود و آنها را غير طبيعي مي

45

كند. در اين شرايط پروتئين ها ساختار ميله اي شكل به خود مي گيرند و همراه مولكول هاي SDS با بار

منفي هستند.

با حضور SDS، پيوندهاي دي سولفيدي، آبگريز و هيدروژني شكسته ميشوند و ساختار پروتئين كامالً از

يكديگر باز ميشود. بنابراين پروتئينها در SDS-PAGE تماماً بار منفي مي گيرند و در دامنه وسيعي از pH به طرف آند حركت ميكنند. از آنجا كه نسبت بار الكتريكي به جرم مولكولي در اين پلي پپتيدها نسبتاً

مشابه است، جداسازي پروتئينها در الكتروفورز تحت چنين شرايطي تقريباً به طور كامل وابسته به تفاوت

در وزن مولكولي آنها است

Molecular Formula: CH3 (CH2)11 OSO3Na Molecular Weight: 288/38

شكل 9-6: ساختمان سديم دود سيل سولفات

SDS به قندها متصل نميشود. به همين دليل پروتئينهايي كه بخش قندي آنها بزرگ است SDS كمتري

نسبت به وزن مولكولي به خود ميگيرند. كاهش تراكم بار منفي در اين گونه مواد باعث تحرک كمتر آنها در

الكتروفورز ميگردد و به اين دليل وزن مولكولي آنها بيش از حد طبيعي تخمين زده ميشود )بابائي و

همكاران 1934(.

3-1-9 ساختمان ژل پلي اكريل آميد

ژل پلياكريلآميد يک پليمر بيبار و غيرفعال )از نظر شيميايي( است كه ظاهري شفاف دارد و از تركيب

اكريلآميد و بيس اكريل آميد )N,N'-methylene bis acrylamide( حاصل ميشود )شكل 1-11(.

46

بيس اكريلآميد به صورت نوارهاي عرضي اين پليمر را به طور منظم به هم ارتباط ميدهد، طوري كه منافذ

با قطر معين و يكسان در ژل ايجاد ميشود.

شكل 9-1: پليمريزاسيون اكريلآميد و بيس اكريلآميد

پليمريزاسيون ژل با اضافه كردن آمونيوم پرسولفات )يا ريبوفالوين( شروع ميشود و با افزودن TEMED

)N,N,N',N'-tetramethyel ethylene diamine( كه به عنوان كاتاليزور عمل ميكند، تسريع

ميشود.

TEMED موجب تشكيل راديكالهاي آزاد از پرسولفات آمونيوم ميشود و اين راديكالها پليمريزاسيون

را باعث ميشوند. چون بار آزاد موجود در TEMED براي اين پروسه ضروري است لذا در pH پائين

پليمريزاسيون كامالً متوقف ميشود )بنابراين در مواقعي كه سيستم بافري خيلي اسيدي است بايد از

كاتاليتهاي مناسب ديگر مثل سولفيت سديم يا اسيد اسكوربيت يا سولفات آهن استفاده شود.( اين در واقع

يک روش شميايي است )بابائي و همكاران 1934(.

47

3-1-11 انواع ژل هاي استفاده شده در الكتروفورز

دو نوع ژل در هنگام استفاده الكتروفورز به كار مي رود:

ژل جدا كننده پروتئين ها )Separating gel(

ژل جمع كننده پروتئين ها )Stacking gel(

ژل جدا كننده پروتئين كه در طرفين صفحات شيشه اي قرار مي گيرد به طول 12 سانتي متر است و در آن

نمونه ها از يكديگر تفكيک مي شوند. با رسيدن باندهاي پروتئيني متحرک )اليههاي بسيار نازک( به ابتداي

ژل جدا كننده )ژل پائيني(، پروتئين ها در يک شرايط ثابت از نظر اختالف پتانسيل الكتريكي و pH حركت

ميكنند و براساس اندازه و بار الكتريكي از همديگر جدا ميشوند. با توجه به اندازه منافذ ژل مولكولهاي

كوچكتر از آزادي حركت بيشتري نسبت به مولكول هاي بزرگ برخودار هستند.

ژل جمع كننده پروتئين ناحيه كوچكتري به طول يک سانتي متر در قسمت بااليي ژل جداكننده است كه

نمونه هاي پروتئيني در آنجا قرار مي گيرد. وظيفه اين ناحيه تغليظ نمونه پروتئيني قبل از ورود به ناحيه ژل

جدا كننده است. اندازه روزنه هاي ژل اين ناحيه بزرگ است و به نمونه پروتئيني اجازه مي دهد كه تحت

اثر ميدان الكتريكي آزادانه حركت كند.

در ژل بااليي با برقرار شدن اختالف پتانسيل الكتريكي هر جزء نمونه با توجه به تحرک الكتروفورزي خود

در بين دو يون جلو دار )داراي تحرک الكتروفورزي زياد( و يون تعقيب كننده )داراي تحرک الكتروفورزي

كم( قرار ميگيرند. بدين ترتيب هر پروتئيني كه در جلوي اين باند باشد سريعاً به عقب رانده ميشود و هر

پروتئيني كه در پشت اين باند قرار گيرد به جلوي يون تعقيب كننده رانده ميشود. به نحوي كه پروتئين ها

به صورت اليههاي بسيار نازكي با ضخامت چند ميكرون در مي آيند كه در حد فاصل دو يون فوق حركت

خواهند كرد )بابائي و همكاران 1934(.

48

هنگامي كه ميدان الكتريكي در طرفين ژل برقرار مي شود، نمونه هاي قرار گرفته در قسمت باالي ژل شروع

به حركت مي كنند. ژل جدا كننده نقش غربال مولكولي دارد. مولكول هايي با اندازه هاي بزرگتر به دليل

عامل اصطكاک كندتر از مولكول هاي كوچكتر حركت مي كنند )شكل 1-16(.

شكل 9-8: مراحل انجام الكتروفورز

پس از اتمام الكتروفورز و قطع ميدان الكتريكي ژل در محلول هاي بخصوص رنگ آميزي مي شود و پس

از رنگ آميزي باند هاي مختلفي در نقاط متفاوت بر روي ژل مشاهده مي شود، بدين ترتيب مي توان نمونه

ها را از يكديگر جدا و تخليص كرد. جرم مولكولي يک پروتئين را مي توان با مقايسه ميزان تحريک پذيري

آن نسبت به سايرين تعيين كرد.

3-1-11 تكنيک هاي رنگ آميزي ژل

گاهي اوقات پس از الكتروفورز مثالً به منظور بررسي خلوص يک پروتئين، آگاهي از اجزاي يک مخلوط

پروتئيني، تعيين وزن مولكولي و محاسبه مقدار نسبي پروتئين يا بررسي الكتروفورزي پروتئين در واكنش با

مواد ديگر، الزم است كه باندهاي پروتئيني جدا شده در ژل را رنگ آميزي نمود. تعداد زيادي از رنگ هاي

49

شيميائي براي رنگ آميزي پروتئين ها در ژل وجود دارند كه برخي از آنها عبارتند از: Bromophenol

Fast Green ،Blue وAmido Black. برخي از اين رنگ ها ترجيحاً براي پروتئين هاي خاصي به كار

مي روند: مثالً ليپوپروتئين ها با Oil Red O رنگ مي شوند در حالي كه گليكوپروتئين ها قادر به شناسائي

با يک رنگ قرمز حاصل از اكسيداسيون آنها با periodic acid و متعاقباً احياء با fuchsin sulfurous acid )واكنش گر Schiff’s( مي باشند. در بين رنگ هاي شيميائي كوماسي بلو )Coomassie Blue(،

بيشترين حساسيت را دارد. پروتئين ها با رنگ هاي فلورسنت نيز قابل روئيت اند )بابائي و همكاران

.)1934

در ادامه به بررسي دو نوع رنگ آميزي كوماسي بلو و نيترات نقره خواهيم پرداخت:

الف: رنگ آميزي كوماسي بلو

كوماسي بلو رايج ترين و پر استفاده ترين رنگ براي رنگ آميزي پروتئينها در الكتروفورز ميباشد. از

جمله مزيتهاي رنگ آميزي با كوماسي آبي ميتوان به حساسيت نسبتاً باال، ثبات رنگ آميزي براي مدت

هاي طوالني و سادگي رنگ آميزي اشاره نمود، بنابراين زماني كه هدف از رنگ آميزي، تعيين مقدار نسبي

پروتئين باشد و تعيين خلوص يا مشاهده اثرات پروتئيني روي ژل مدنظر نباشد، رنگ آميزي كوماسي بلو

مناسب ترين روش به نظر مي رسد.

خصوصيات رنگ آميزي كوماسي بلو

اين رنگ آميزي نيازمند محيط اسيدي براي جذب الكتريكي بين مولكول هاي زمينه )dye( و گروه هاي

آمين پروتئين ها مي باشد. جذب يوني همراه با نيروي واندروالس منجر به اتصال كمپلكس هاي پروتئين-

51 dye به هم مي شود كه اين اتصاالت با رقيق سازي در شرايط مناسب، برگشت پذيرند. رنگ كوماسي بلو

سه برابر رنگ Fast green و شش برابر رنگ Amido black حساسيت دارد. اين حساسيت باالتر مي

تواند به علت تشكيل واكنش هاي بيشتر بين پروتئين و زمينه باشد.

ب: رنگ آميزي نيترات نقره

حساسيت اشكال مختلف روش نقره دهها تا صدها برابر روش كوماسي بلو است. در بعضي از روش هاي

نقره تا 1/2 نانوگرم پروتئين در هر باند قابل تشخيص است. از جمله اشكاالت اين روش وقت گير و گران

بودن اين روش و نياز آن به مواد شيميايي با خلوص باال ميباشد. اثر آئينهاي نقره و عدم يا ضعف رنگ

پذيري بعضي از پروتئين ها از مشكالت ديگر اين روش است.

استفاده از نقره براي رنگ آميزي پروتئينها در الكتروفورز توسط اسوتيزر و همكارانش در سال 1313

ميالدي مطرح گرديد. از آن زمان تاكنون بيش از صد مقاله در مورد اشكال مختلف رنگ آميزي با روش

نيترات نقره به چاپ رسيده است.

در مطالعاتي كه خلوص پروتئين اهميت دارد يا زماني كه روئيت اثرات پروتئيني در ژل الزم باشد، بايد از

رنگ آميزي با حساسيت باالي نقره استفاده كرد. روش هاي رنگ آميزي نقره را مي توان به سه بخش

تقسيم كرد: رنگ هاي Diamine silver، رنگ هاي nondiamine development silver و رنگ

هاي photoreduction silver.

رنگ هاي Diamine silver براي رنگ آميزي باندهاي پروتئين در ژل هاي ضخيم تر از يک ميلي متر

استفاده مي شوند. رنگ هاي nondiamine development silver، عموماً بسيار سريع تر از رنگ هاي diamine عمل مي كند و براي ژل هاي با ضخامت يک ميلي متر يا كمتر كاربرد دارند، رنگ هاي

51 photoreduction silver نيز اغلب سرعت باال دارد اما به علت حساسيت بسيار پائين معموالً استفاده

نمي شوند )بابائي و همكاران 1934(.

3-1-12 روش سنجش لخته

آزمايش هاي لخته، هنوز از شايع ترين روش هايي است كه در آزمايشگاه هاي هموسوتاز بوه كوار موي

روند. در روش سنجش لخته، زمان تشكيل لخته در مخلوط نمونه با معرف بعد از افزودن معورف شوروع و

اندازه گيري مي شود. سنجش لخته به عنوان يک آزمايش غربالگري براي ارزيابي عملكرد كل مسير سيستم

انعقادي و يا براي سنجش اجزاء جداگانه در مسيرهاي پيش برنده انعقاد و ضد انعقاد بوه كوار موي رود. بوه

منظور افزايش دقت آزمون هاي سنجش لخته بايد به گونه ايي طراحي شود كوه زموان تشوكيل لختوه را در

محدوده ي مورد انتظار بيش از 12 و كمتر از 422 ثانيه اندازه گيري كند.

3-1-13 آزمايش هاي سيستم انعقادي

معموال سيستم انعقادي پالسما به شكل سيستماتيک بررسي مي شود. سنجش هايي براي بررسي

عملكرد مسير خارجي و يا داخلي انعقاد بدين منظور طراحي شده اند كه در آن آنزيم ها، كوفاكتورها و مهار

كننده هاي دخيل در مسيرهاي مربوط و همچنين اثر داروها و اتو آنتي بادي ها مورد ارزيابي قرار گيرند.

مهمترين آزمايش ها عبارتند از:

PT 3-1-13-1 زمان پروترومبين ) (

اين تست براي ارزيابي مسير خارجي انعقاد خون است. زمان پروترومبين نمايي از مقدار كل

پروترومبين در خون به دست مي دهد. خوني كه از بيمار گرفته مي شود بالفاصله اكساالته مي شود تا هيچ

52

مقداري از پروترومبين نتواند به ترومبين تبديل شود. در مرحله بعد مقدار زيادي يون كلسيم و فاكتور بافتي

به طور ناگهاني با خون اكساالته مخلوط مي شود. يون كلسيم اثر اكساالت را خنثي مي كند و فاكتور بافتي،

واكنش تبديل پروترومبين به ترومبين را از راه مسير خارجي لخته شدن فعال مي كند. زمان الزم براي انجام

انعقاد موسوم به زمان پروترومبين(PT) است زيرا مدت اين زمان به طور عمده توسط غلظت پروترومبين

تعيين مي شود. اين تست بيشتر نسبت به كاهش فاكتورهاي اين مسير خارجي يعني فاكتور VII و همچنين

Rizzo F, et al., 2008 X V مسير مشترک كه شامل فاكتورهاي ، پروترومبين و است، حساس مي باشد ) (.

aPTT 3-1-13-2 زمان نسبي ترومبوپالستين فعال شده ) (

اين تست براي ارزيابي مسير داخلي انعقاد خون است. از اين آزمايش براي بررسي عوامل مسير داخلي

انعقاد يعني پري كاليكرين، كنينوژن با وزن ملكولي (HMWK) و فاكتورهاي VIII, IX, XI, XII و

كمبود فاكتورهاي مسير مشترک يعنيX ،V و پروترومبين استفاده مي شود. اين تست از آغاز روند انعقاد

مسير داخلي تا مراحل پاياني تشكيل لخته را اندازه گيري مي كند. اين تست قادر به ارزيابي فاكتور VII،

XIII و عوامل ضد انعقاد نيست. در اين آزمايش در حضور يون كلسيم و فسفوليپيد معرف به خون

اكساالته اضافه شده، سپس زمان انعقاد به همان روش زمان پروترومبين تعيين مي گردد ) Rizzo F, et

.)al., 2008

3-1-14 هماتوكريت:

به نسبت درصد گويچههاي قرمز در خون، هماتوكريت 1يا خون بهر گفته ميشود. مثالً هرگاه

هماتوكريت شخص 22 باشد منظور آن است كه 22 درصد حجم خون را گويچهها يا گلبول هاي قرمز و

1 Hematocrit

53

باقيمانده آن را پالسما تشكيل ميدهد. هماتوكريت مردان طبيعي بطور متوسط 24 و هماتوكريت متوسط

زنان طبيعي 98 است. افزايش هماتوكريت همراه با ازدياد چسبندگي خون بوده و ميتواند به ايجاد ترومبوز

عروقي منجر شود )Purves, et al., 2004(.

3-1-15 سلول هاي قرمز خون

سلول هاي قرمز خون )RBC(، اين سلول هاي قرمز يا همان گلبول هاي قرمز، در واقع اصلي ترين

قسمت خون و عامل رنگ قرمز آن هستند. رنگ قرمز به دليل وجود مادهاي به نام هموگلوبين است كه

كمک مي كند گلبول قرمز، اصلي ترين وظيفه خود يعني حمل و نقل اكسيژن و دي اكسيدكربن را انجام

دهد. گلبول هاي قرمز وسيله حمل و نقل اكسيژن از ريه به بقيه سلول هاي بدن هستند. مقادير طبيعي آن

بين 1/2 تا 1/6 ميليون در هر ميكروليتر خون مي باشد. اين عدد براي خانم ها مقداري كمتر و در كودكان

مقداري بيشتر است. بسته به آزمايشگاه و نوع كيت مورد استفاده، ممكن است مقياس شمارش اين سلول

فرق كند. خوردن داروهايي مثل كلرامفنيكل هم باعث كاهش RBC مي شود )گل افشان و شناسا 1984(.

3-1-16 سلول هاي سفيد خون

اندازه گيري مقدار گلبول هاي سفيد خون )WBC( يكي از روش هاي اصلي تعيين وجود عفونت در

بدن است. چون اين سلول ها كه جزو سيستم دفاعي بدن هستند در شرايط بيماري هاي عفوني و غيرعفوني

واكنش هاي مختلفي از خود نشان مي دهند. شمارش WBCها دو جزء دارد. يكي مقدار كلي گلبول هاي

سفيد در يک ميلي ليتر خون و جزء ديگر شمارش جزء به جزء اين سلول ها چون گلبول سفيد خود

متشكل از پنج نوع مختلف است كه كم و زياد شدن هر كدام از اين انواع معني خاص خود را دارد.

54

مقادير طبيعي: در بزرگساالن و بچه هاي باالتر از 4 سال مقدار گلبول سفيد بين 1 تا 12 هزار در هر ميلي

ليتر خون طبيعي است. عمل اصلي گلبول سفيد مبارزه با عفونت و حذف عوامل خارجي و مزاحم است و

در مواقع آلرژي ها هم اين سلول ها مسوول بروز واكنش هستند. تغيير هر كدام از انواع WBC معني

خاص خود را دارد و ممكن است نشان دهنده عفونت با ميكروب، ويروس و يا حتي استرس باشد. فعاليت

WBC شديد بدني و ورزش سنگين هم براي مدتي باعث باال رفتن تعداد در خون مي شود.

3-1-17 هموگلوبين

در برگه هاي آزمايش مختلف ممكن است به صورت هاي مختلف HGB ،Hg، يا Hgb نوشته شود.

اين عالئم مخفف كلمه، يكي از عناصر اصلي تشكيل دهنده گلبول قرمز به نام هموگلوبين هستند. اين ماده

كه در آن آهن به كار رفته خود از اسيد آمينه تشكيل شده و جايگاههاي مختلفي براي تركيب با اكسيژن

دارد. هموگلوبين در جايي كه اكسيژن زياد وجود دارد با آن تركيب مي شود و در محيط كم اكسيژن آن را

آزاد مي كند )گل افشان و شناسا 1984(.

اندازه گيري مقدار كلي هموگلوبين در واقع نوعي نشان دهنده تعداد گلبول هاي قرمز است. مقادير

طبيعي: مقدار طبيعي براي آقايان بين 12 تا 18 گرم در هر دسي ليتر است و براي خانم ها مقادير بين 14 تا

16 گرم در هر دسي ليتر طبيعي محسوب مي شود. محدوده خطر: هموگلوبين زير 1 و باالي 42 مقادير

بحراني به حساب ميآيند و حتما نيازمند رسيدگي فوري هستند .نكته: مقدار Hgb در بارداري كاهش مي

يابد چون با اينكه خونسازي كمي بيشتر شده است اما حجم مايع بدن و خون باال رفته و مقداركلي

هموگلوبين در هر دسي ليتر آن كاهش مي يابد. زندگي در ارتفاع هم به خاطر نياز بيشتر بدن به اكسيژن و

كمبود اكسيژن محيط باعث توليد بيشتر هموگلوبين مي شود )گل افشان، 1984(.

55

3-1-18 پالكت ها

پالكت ها )Plt(، اجزاي كوچک ديسک شكلي هستند كه در خون وجود دارند و از بقيه سلول هاي

خوني بسيار كوچكترند. اين ساختارها حاوي آنزيم هايي هستند كه باعث انعقاد خون مي شوند و وظيفه

اصلي آنها جلوگيري از خونريزي و خارج شدن گلبول قرمز از داخل رگ است. به غير از كنترل سيستم

انعقادي خون، از ميزان پالكت براي بررسي روند بهبود نارسايي مغز استخوان و بيماري هاي خوني هم

استفاده مي شود. مقادير طبيعي: پالكت بين 112 هزار تا 222 هزار در هر ميلي متر مكعب خون براي

بزرگساالن طبيعي است. در نوزادان اين مقدار كمي بيشتر است. محدوده خطر: پالكت زير 12 هزار يا بيشتر

از يک ميليون كامالً غيرطبيعي است و نيازمند توجه ويژه است. قرص هاي ضدبارداري باعث باال رفتن

مقدار پالكت مي شوند. در حالي كه استامينوفن پالكت را كاهش مي دهد )گل افشان و شناسا 1984(.

3-2 ليست مواد مصرفي و تجهيزات مورد استفاده: جدول 1-9: مواد مورد استفاده در تحقيق

مواد الزم جهت انجام تست هاي انعقادي كيت 4ml ، PT از شركت Diagon كيت 2ml ، PTT از شركت Diagon Diagon 4ml Calcium Chioride كلسيم كلرايد ) ( ، از شركت پالسما طبيعي سيتراته تازه خرگوش زهر حاصل سنگ ماهي فرياله خال سياه

مواد الزم جهت سنجش پروتئين ها معرف فولين سيوكالتو )Folin-ciocalteu Phenol reagent( از شركت Merck كربنات سديم )Na2CO3( از شركت Merck سديم هيدروكسايد )NaOH( از شركت Merck

56

سديم تارتارات )NaKC4H4O6.4H2O( از شركت Fisher سولفات مس )Cu So4.5H2O( از شركت Merck نمونه هاي استاندارد پروتئين با غلظت 1mg/ml از سرم آلبومين گاوي )BSA(

مواد الزم جهت الكتروفورز اكريل آميد )Acrylamide( از شركت Merck تريس )(Tris (hydroxmethyl aminomethane( از شركت Merck 4-مركاپتواتانول )Mercaptoethanol-2( از شركت Merck تترا اتيل متيل اتيلن دي آمين )TEMED( از شركت Merck برومو فنل بلو )Bromo phenol blue( از شركت Merck سديم دودسيل سولفات )SDS( از شركت Merck گليسرول از شركت Merck آمونيوم پرسولفات )Ammonium persulfate( از شركت Merck بيس اكريل آميد )N,N´,Methylene Bisacrylamide( از شركت BIO-RAD پروتئين ماركر از شركت BIO-RAD

مواد الزم جهت رنگ آميزي ژل الكتروفورز متانول از شركت Merck اسيد استيک گالسيال از شركت Merck رنگ كوماسي بلو )Coomassie Brilliant blue R-250( از شركت BIO-RAD

جدول 4-9: تجهيزات مورد استفاده در تحقيق نوع دستگاه Centrifuge Sigma Digital scale Precisa (XR 305 A) Electro Eluter Bio-Rad model 422 ElectroPhoresis Tank Bio-Rad Frizer -20 Revo Geldoc Bio-Rad

57

Horizontal Shaker VELP-Vortex Incubator Memmet Magnetic stirrer VELP (AREC-T) PH meter DENVER-Meridian (MR-10) Power supply Bio-Rad PAC 1000 Spectrophotometer LKB-Biochrom Bain-marie Julabo 13A Dialysis bag Sigma

3-3 منطقه مورد مطالعه منطقه مورد نمونه برداري در اين پژوهش مناطق ساحلي با بستر گلي به ويژه جزاير عباسک و مناطق

خوري شهرستان بوشهر بود )شكل 9-1(.

شكل 9-3: منطقه مورد نمونه برداري از ماهي فرياله

3-4 استخراج و آماده سازي زهر خام

تعداد 412 قطعه سنگ ماهي فرياله خال سياه از صيادان بندر بوشهر خريداري و ماهي هاي صيد شده به

بخش جانوران سمي موسسه تحقيقات واكسن و سرم سازي رازي كرج منتقل گرديد و پوست اطراف

58

خارهاي پشتي، سينه اي و مخرجي جدا و ابتدا خارها ي متصل به غده زهري باله پشتي و ساير باله ها به

كمک قيچي استخوان بر از قاعده بريده شد و 122 عدد غده از اين تعداد ماهي آماده شد كه به مدت 42

ساعت در محلول كلريد سديم 11/. موالر در دماي 2 درجه سانتيگراد آنكوبه گرديد. پس از مدت زمان 42

ساعت، محلول بدست آمده به مدت 42 دقيقه در دماي 2 درجه سانتيگراد با دور g × 14222 در

سانتريفيوژ يخچال دار قرار گرفت و محلول رويي جمع آوري و به عنوان عصاره زهر خام ناميده شد. سپس

محلول به دست آمده ابتدا با كيسه دياليز با اندازه منافذ 44 كيلو دالتون به مدت 42 ساعت در دماي 2 درجه

سانتيگراد دياليز و آنگاه ليوفيليزه شد.

شكل 9-12: استخراج و آماده سازي زهر خام

59

شكل 9-11: سانتريفيوژ مايع رويي زهر

3-5 دياليز زهر:

براي جدا سازي نمک ها از زهر، عصاره خام در آب مقطر حل گرديد و به داخل كيسه مخصوص

دياليز منتفل شد. سپس كيسه را داخل يک بشر روي همزن در داخل يخچال دماي 2 درجه سانتيگراد به

مدت يک شبانه روز قرار گرفت و آب داخل بشر را در طي اين مدت 4-9 بار تعويض شد. در نهايت زهر

ليوفيليزه شده و براي استفاده هاي بعدي در دماي 42- درجه سانتيگراد نگهداري شد.

3-6 اندازه گيري مقدار پروتئين عصاره ي زهر خام ماهي

ميزان پروتئين موجود در زهر به روش لوري به كمک دستگاه اسپكتروفتومتر اندازه گيري شد ) ,Lowry

.)1976

معرف هاي مورد نياز:

NaOH Na CO A محلول : شامل كربنات سديم )3 2 ( و سود ) ( به نسبت وزني 1:1

4 گرم سود را در 122 ميلي ليتر آب مقطر حل كنيد و 12 گرم كربنات سديم را به آن اضافه كنيد.

W/V ٪ B محلول : محلول 4 ) ( سديم تارتارات

61

براي تهيه اين معرف يک گرم سديم تارتارات در 12 ميلي ليتر آب مقطر حل كنيد.

W/V ٪ C محلول : سولفات مس 1 ) (

122 ميلي گرم سولفات مس را در 12 ميلي ليتر آب مقطر حل كنيد.

C B A Lowry stock reagent D محلول ) (: محلول ، و به نسبت 1:1:122 با هم مخلوط كنيد.

معرف فولين 2/1: معرف فولين را با آب مقطر در يک ظرف تيره به نسبت 1:1 مخلوط كنيد.

BSA mg/ml پروتئين استاندارد: نمونه هاي استاندارد با غلظت 1 از سرم آلبومين گاوي ) ( تهيه مي شود.

روش كار:

مقادير Blank( 2 µg/1000µl(، 12، 42، 12، 122، 422، 122 و 1222 از پروتئين استاندارد

)BSA )1 mg/ml و رقت هاي 1:422 و 1:222، از محلول پروتئيني مورد آزمايش را در لوله هاي

جداگانه تهيه كنيد و حجم تمام لوله ها را با آب مقطر به 1222µl برسانيد، سپس مجدداً به هريک

1222µl آب مقطر و سپس 4 ميلي ليتر معرف D اضافه كنيد و اجازه دهيد تا 1 دقيقه در دماي آزمايشگاه

بماند. در مرحله بعد به تک تک لوله ها 122µl معرف فولين اضافه كنيد و پس از ورتكس كوتاه در

تاريكي به مدت 92 دقيقه قرار دهيد )گروه فنلي واحدهاي تيروزين در حضور معرف فولين يک رنگ آبي

ارغواني توليد مي كند(. جذب نوري تمام لوله ها را پس از كاليبراسيون دستگاه اسپكتروفتومتر با محلول

بالنک در طول موج 112 نانومتر بخوانيد و نمودار استاندارد براي تعيين مقدار پروتئين مجهول، را تهيه

كنيد. در نهايت غلظت پروتئين مجهول با استفاده از جذبي )OD( كه در محدوده جذب پروتئين استاندارد

قرار دارد، طبق معادله خط y = Bx + A محاسبه و مقدار بدست آمده را در رقت پروتئين ضرب كنيد.

Y = مقدار جذب نوري در 112 نانومتر B = عرض از مبدا

61 x = غلظت نمونه )µg/100µl( A = شيب خط

3-7 الكتروفورز عصاره اوليه زهر

محلولهاي الزم جهت آماده سازي ژل SDS-PAGE:

1- محلول استوک اكريل آميد و بيس اكريل آميد )A(:

4/43 گرم اكريلآميد و 8/2 گرم بيس اكريلآميد وزن نماييد و با آب مقطر تا حجم نهايي 122 ميلي ليتر

رقيق كنيد. سپس محلول با كاغذ واتمن شماره يک صاف گردد. )محلول در ظرف تيره و در تاريكي و در

دماي C° 2 به مدت سه ماه قابل استفاده ميباشد(. در هنگام كار با اكريلآميد و بيس اكريلآميد از تماس

آن با دست خودداري كنيد و توزين آن را در زير هود با دستكش انجام دهيد.

4- محلول ژل پائين: )Resolving gel )B: تريس-اسيد كلريدريک 1/1 موالر، pH =8/8: 11/18 گرم

تريس را در 12 ميلي ليتر آب مقطر حل كنيد و سپس با استفاده از اسيد كلريدريک pH محلول را روي

8/8 تنظيم شود، آنگاه محلول تا حجم نهايي 122 ميلي ليتر رقيق گردد. اين محلول در دماي C° 2 به مدت

يک ماه قابل نگهداري است.

9- محلول ژل باال: )Stacking gel )D: تريس- اسيد كلريدريک 1/2 موالر، pH = 6/8:

21/6 گرم تريس در 62 ميلي ليتر آب مقطر حل و با اسيد كلريدريک pH را در حدود 8/6 تنظيم كنيد و با

آب مقطر تا حجم 122 ميلي ليتر رقيق گردد. اين محلول در دماي C° 2 به مدت يک ماه قابل نگهداري

است.

2- محلول ده درصدي SDS:

62

12 گرم SDS در 32 ميليليتر آب مقطر حل كنيد و تا حجم 122 ميلي ليتر محلول رقيق گردد )محلول در

دماي اتاق قابل نگهداري است(.

1- محلول 12 ٪ آمونيوم پرسولفات:

1/2 گرم آمونيوم پرسولفات در يک ميلي ليتر آب مقطر حل شود. اين محلول بايد تازه تهيه گردد و محلول

در دماي C° 2 به مدت يک ماه قابل استفاده ميباشد.

6- محلول بافر نمونه )Sample buffer(:

براي تهيه اين محلول مواد زير با هم مخلوط گردد:

جدول 9-9: محلول بافر نمونه Tris-HCl، 1/2 موالر، ml pH = 6/8 1 گليسرول ml ٪12 1 محلول ml SDS ٪12 4 محلول 1٪ برموفنول بلو )در آب( ml 1 مركاپتواتانول ml 2/1 آب مقطر ml 2/1 جمع ml 12

محلول بافر نمونه در دماي C° 42- به مدت چند هفته تا يک ماه قابل استفاده ميباشد.

1- محلول بافر الكترود )بافر مخزن - Running buffer(:

9 گرم تريس، 2/12 گرم گاليسين و يک گرم SDS را در يک ليتر آب مقطر حل كنيد )pH اين محلول

در حدود 9/8 مي باشد و نياز به تنظيم ندارد(. محلول به صورت تازه تهيه شود.

TEMED -8 )12 ٪(:

63

1/2 ميلي ليتر TEMED و 3/2 ميلي ليتر آب مقطر را با هم مخلوط كنيد )محلول تازه تهيه شود(. نقش

كاتاليزور را به عهده دارد و نوروتوكسيک است.

3- پروتئين استاندارد:

براي تعيين وزن مولكولي پروتئين هاي موجود در محلول از پروتئين استاندارد با وزن مولكولي مشخص

استفاده مي شود.

نكته: در اكثر آزمايشگاه ها و مراكز تحقيقاتي از ژل پائين با غلظت 14 درصد و ژل باال با غلظت 2 درصد

استفاده مي شود، كه براي راحتي كار مقادير آن در جدول 2-9 خالصه شده است.

جدول 2-9: دستور العمل ساخت ژل جدا كننده و ژل جمع كننده به مقدار 1/1 ميلي ليتر Stacking Gel Resolving Gel Material X٪ ٪12 ٪7.5 ٪4 Acrylamid/Bis٪30 0.99 ml 1.875 ml 3 ml 0.25×X ml 0.5 M Tris-Hcl, pH=6.8 1.89 ml ------1.5 M Tris-Hcl, pH=8.8 ---- 1.875 ml 1.875 ml 1.875 ml SDS٪10 75 μl 75 μl 75 μl 75 μl di H2O 4.5 ml 3.625 ml 2.5 ml 5.5–(0.25×X) ml APS٪10 37.5 μl 37.5 μl 37.5 μl 37.5 μl TEMED 7.5 μl 3.75 μl 3.75 μl 3.75 μl Total Volume 7.5 ml 7.5 ml 7.5 ml 7.5 ml

SDS-PAGE 3-8 طريقه آماده سازي ژل و كار بادستگاه :

ابتدا صفحات شيشهاي را كامالً با الكل تميز كنيد. سپس دو صفحه شيشه اي را به صورت عمودي، رو به

روي هم روي يک سطح صاف به گونه اي كه احتمال نشت محلول ژل از حد فاصل شيشهها نباشد قرار

دهيد و توسط گيره دستگاه اين دو صفحه را محكم نگهداريد.

64

محلول ژل جدا كننده )ژل پائين( با درصد T مورد نياز )جدول 2-9( را تهيه كنيد. اجزاي ژل پائين غير از

TEMED را در يک ظرف مناسب بريزيد و محلول را حدود 92 ثانيه با پمپ خالء از هوا تخليه كنيد.

سپس TEMED را اضافه كنيد و پس از هم زدن محلول به دقت در قالب شيشه اي با استفاده از پيپت يا

سمپلر تا ارتفاع مناسب بريزيد. بعد از حدود چند دقيقه )به منظور صافشدن سطح ژل و جلوگيري از

تماس هوا با آن( مقداري آب مقطر )يا ايزوپروپانول اشباع با آب( با استفاده از سمپلر يا پيپت به آرامي از

كنار شيشه روي سطح ژل به نحوي كه با ژل مخلوط نگردد بريزيد. ژل پائين معموالً در مدت زماني 21-11

دقيقه منعقد ميشود. ژل منعقد شده به وضوح از آب مقطر روي آن به دليل تفاوت در ضريب شكست نور

قابل تشخيص ميباشد.

بعد از انعقاد ژل پائين، محلول ژل باال )ژل جمع كننده( نيز طبق جدول 2-9 تهيه كنيد. )در ژل يكنواخت

كننده با برقرار شدن اختالف پتانسيل الكتريكي اجزاي نمونه براساس تحرک الكتروفورزيشان در بين دو

يون جلودار و تعقيب كننده قرار ميگيرند و به صورت اليه هاي بسيار نازک با ضخامت چند ميكرون در

مي آيند آنگاه با رسيدن به ژل جداكننده اجزاي نمونه بر اساس اندازه از همديگر جدا مي شوند(.

اجزاي ژل باال به غير از TEMED را در يک ظرف مناسب بريزيد و آب روي ژل پائين را تخليه كنيد.

برايحذف قطرات باقي مانده آب حدود يک ميلي ليتر از محلول ژل باال را در جدار داخلي شيشه

بچرخانيد و مجدداً تخليه كنيد. به بقيه محلول ژل باال TEMED اضافه كنيد و پس از هم زدن سريعاً تا

ارتفاع مناسب روي ژل پائين بريزيد و سپس شانه را با دقت در ژل باال فرو كنيد. ژل باال معموالً در حدود

42-11 دقيقه منعقد ميشود.

پس از انعقاد ژل قبل از درآوردن شانه، انتهاي دندانههاي آن را روي شيشه با ماژيک مشخص كنيد اين كار

به منظور تشخيص چاهکها و تسهيل در نمونهگذاري ميباشد.

65

شانه را خارج كرده و قالب شيشه اي را از گيره ها جدا كنيد و در تانک الكتروفورز قرار دهيد. درون تانک

الكتروفورز بافر تانک )مخزن( را تا ارتفاع مناسب بريزيد. هر گونه حباب هوا در انتهاي ژل را با تزريق بافر

توسط پيپت يا سمپلر خارج كنيد.

محلول پروتئيني را با توجه به غليظ يا رقيق بودن آن به نسبت 1:1 يا 9:1 با بافر نمونه )41 ميكروليتر بافر

نمونه و 41 يا 11 ميكروليتر محلول پروتئيني( مخلوط كنيد و به مدت 12 دقيقه درون آب جوش قرار دهيد.

SDS و -مركاپتواتانول موجود در بافر نمونه منجر به دناتوره شدن پروتئين ها مي شود و رنگ بروموفنل

بلو نشانگر پائين آمدن ماكرومولكول ها در حين الكتروفورز مي باشد و اتمام كار را مشخص مي كند.

مقداري از آنها با بافر نمونه در داخل تيوپ هايي مخلوط كنيد و به مدت 12 دقيقه در آب جوش قرار

دهيد. سپس مقداري از آنها )حدود 42-11 ميكروليتر( را با سرنگ هامليتون و كمک شانه مخصوص نمونه

گذاري به دقت در چاهکها بريزيد ) به دليل وجود گليسرول نمونه در ته چاهک قرار ميگيرد(.

در چاهک ديگر ساير نمونه ها و در يكي از چاهک هاي ژل، پروتئين استاندارد )ماركر وزن مولكولي( را

بريزيد.

كابلهاي دستگاه را به الكترودهاي مربوط متصل كنيد. سپس چنانچه دستگاه مجهز به سيستم خنک كننده

باشد ولتاژ را روي 112 تا 422 ولت قرار دهيد و چنانچه دستگاه مجهز به چنين سيستمي نباشد ولتاژ را

روي 122 ولت تنظيم نماييد. شدت جريان الكتريكي ثابت حدود 92-42 ميلي آمپر مناسب ميباشد )شكل

.)9-2

قبل از رسيدن رنگ نشانگر )برمو فنول بلو( به انتهاي ژل جريان برق را قطع كنيد.

66

بعد از قطع جريان برق، قالب شيشه اي را از تانک الكتروفورز جدا كنيد و در كف دست قرار داده دهيد و

به آرامي دو صفحه شيشه اي را از هم جدا كنيد. ژل بااليي را جدا نماييد و بقيه ژل براي رنگ آميزي به

ظرف پالستيكي منتقل كنيد.

شكل 9-12: دستگاه الكتروفورز

2-7 روش رنگ آميزي با كوماسي آبي

اين روش در مدت زمان كم پروتئين ها را در يک زمينه تميز رنگ آميزي مي كند. افزودن اتانول و سولفات

آمونيوم به محلولي از آبي كوماسي R-412 در اسيد فسفريک رقيق، رنگ مذكور را به سمت شكل كلوئيدي

آن سوق مي دهد. در طي رنگ آميزي، تعادلي بين اشكال كلوئيدي و فرم پراكنده مولكولي رنگ وجود دارد.

فرم پراكنده رنگ وارد ماتريكس ژل مي شود و پروتئين ها را رنگ مي كند. در حالي كه فرم كلوئيدي بيرون

نگه داشته مي شود و به اين ترتيب از رنگ آميزي زمينه پرهيز مي شود.

مواد مورد نياز: كوماسي آبي R-412 ، متانول، اسيداستيک گالسيال، آب مقطر.

وسايل مورد نياز: ظرف درب دار شيشه اي يا استيل يا پالستيكي، مزور، ترازو، قاشقک فلزي، شيكر

67

محلولهاي مورد نياز:

محلول رنگ آميزي: 41/2 گرم كوماسي آبي R -412 در 141 ميلي ليتر متانول حل كنيد و سپس به آن 41

سي سي اسيداستيک و 122 سي سي آب مقطر اضافه نمائيد. اين محلول را توسط كاغذ واتمن شماره 1

صاف كنيد.

محلول رنگ بر: 122 ميلي ليتر متانول، 122 ميلي ليتر اسيد استيک گالسيال و 822 ميلي ليتر آب مقطر را به

هم اضافه كنيد و خوب هم بزنيد.

روش كار:

ژل را در ظرف پالستيكي قرار دهيد و آن را دو بار به مدت 9 دقيقه در آب مقطر، توسط شيكر به آرامي

شيک نماييد. پس از اين كار به ظرف محتوي ژل محلول رنگ آميزي به اندازه اي كه سطح ژل را بپوشاند

اضافه كنيد. ژل را به مدت دو ساعت روي شيكر با سرعت آرام قرار دهيد و سپس محلول رنگ آميزي را

خارج كنيد و ژل را دوباره با آب مقطر شستشو دهيد. آنگاه درون ظرف درب دار حاوي ژل محلول رنگ بر

اضافه كنيد. پس از مدت زماني محلول رنگ بر تيره مي شود، اين محلول رنگ بر تيره را با محلول تازه

تعويض كنيد. اين كار را چند بار تا زماني كه زمينه ژل شفاف و باندهاي پروتئيني به وضوح ديده شود

تكرار كنيد. اين عمل حدود 4 تا 9 ساعت طول ميكشد )شكل 12(.

3-9 بررسي فعاليت هموليتيک زهر و اجزاي آن

براي بررسي فعاليت هموليتيک زهر فرياله از روش گارنيه و همكاران بر روي گلبول هاي قرمز شسته

شده خرگوش استفاده گرديد )Garnier, et al., 1995(. به اين منظور به يک ميلي ليتر نمونه از زهر

محلول در كلريد سديم 112 ميلي موالر )با غلظت هاي 1/.، 4، 1/9 و 1 ميكروگرم در ميلي ليتر(، 422

68

ميكروليتر از سوسپانسيون 4% اريتروسيت هاي مذكور اضافه گرديد و به مدت 92 دقيقه در دماي اتاق

نگهداشته شد. سوسپانسيون مذكور به مدت 1 دقيقه در يک سانتريفيوژ يخچال دار با دور 9222 دور در

دقيقه سانتريفيوژ گرديد و جذب مايع رويي در طول موج 122 نانومتر قرائت شد تا ميزان هموگلوبين آزاد

شده مشخص گردد. در نهايت درصد هموليز از رابطه ي زير محاسبه شد:

OD test -OD Saline[ / ]OD H2o -OD saline[ ×122[ = درصد هموليز

Read and Muench 3-11 آزمايش براي تعيين سميت زهر ماهي فرياله خال سياه:

در آزمايشات بعدي از زهر خشک يک محلول حاوي 1 ميلي گرم زهر در 1 ميلي ليتر سالين ساخته شد

كه غلظت آن 1 ميلي گرم در ميلي ليتر يا 1222 ميكروگرم در ميلي ليتر مي باشد و چهار دوز مختلف 122،

422، 922 و 222 ميكروگرم در ميلي ليتر از هر كدام از اين دوز ها به چهار سرموش آزمايشگاهي 42 18-

گرمي به صورت IV از طريق وريد دم تزريق گرديد )تصوير 1-9( تا حدود LD50 تعيين شود. براي

تشخيص گروه موش ها از رنگ آميزي استفاده گرديد.

شكل 9-11: نحوه تزريق زهر به موش آزمايشگاهي

69

LD50 Main 3-11 آزمايش براي تعيين زهر ماهي فرياله خال سياه:

حجم 4 ميلي ليتر از هر غلظت را به 2 سرموش )هر موش 1/2 ميلي ليتر( تزريق شد و ميزان مرگ و مير

پس از 42 ساعت مورد بررسي قرار گرفت. پس از تزريق زهر به موش آزمايشگاهي به صورت داخل

وريدي به منظور تعيين متوسط دوز كشندگي عاليم باليني مانند لرزش، چرخش، فلج بخشي از بدن، تعرق،

خروج ادرار، خروج بزاق از دهان، نكروز و كبود شدگي و مرگ ناگهاني بررسي شد.

جدول 9-9: محاسبه حجم هاي مورد نياز از محلول زهر ماهي فرياله خال سياه خليج فارس

حجم ساالين استوک ميزان زهر براي 4 ميزان زهر براي هر موش رنگ و نهايي ميلي ليتر ميلي ليتر موش در 2 ميلي ليتر در 5/1 ميلي ليتر ساالين تعداد موش cc 2 سر موش 112 622µg 2/6 1/2 4 پشت قرمز cc 1/181=41/1×112 2 سر موش 162 µg 2/16 1/42 4 132 پشت آبي cc 41/1× 1/181 2 سر موش 342µg 2/34 1/28 4 9/492 = 492 پشت سبز cc 2 سر موش 1/41×492/9 = 412 1282µg 1/28 2/34 4 پشت سفيد

LD50 3-12 دوز كشندگي ) (

در نهايت ميزان متوسط دوز كشندگي از رابطه ي زير محاسبه گرديد:

درصد مرده كمتر از 12-12 ×log 1.25 = A درصد مرده كمتر از 12 - درصد مرده بيشتر از 12

71

B= دوز كمتر از log 12

LD50 = Antilog A+B حجم 4 ميلي ليتر از هر غلظت را به 2 موش )هر موش 1/2 ميلي ليتر( تزريق شد و ميزان مرگ و مير را

پس از 42 ساعت مورد بررسي قرار گرفت.

با مشخص كردن LD50 )دوز 1LD50 و3LD50(، اثرات زهر مورد نظر بر روي عناصر خوني خرگوش

مورد بررسي قرار گرفت و حاالت مختلف حيوان را به تناوب در زمان هاي مختلف )هر 1 دقيقه يكبار(

مشاهده شد. 42 ساعت پس از تزريق از طريق خون گيري مستقيم از قلب خرگوش ها، خون مورد نظر

تهيه شد و عناصر خوني را از قبيل: WBC،RBC ،HCT ،MCV ،MCH ،MCHC پالكت و .... به

روش هاي خاص آزمايشگاهي اندازه گيري شد.

3-13 طرز تهيه زهر تزريقي ماهي فرياله خال سياه:

مقدار 12 ميلي گرم زهر توزين شد و در 12 ميلي ليتر سرم فيزيولوژي حل گرديد )با غلظوت 1mg/ml( و

از اين استوک 422 ميكرو ليتر تهيه شد )يعني همان 1LD50 از زهر ماهي مورد نظر(. بوراي تهيوه 3LD50

بديهي است كه 9 برار مقدار مورد نظر باال يعني 614 ميكروگرم از زهر استوک )1mg/ml( با سمپلر 1222

جدا گرديد و مقدار 1LD50 را به يک خرگوش و مقودار ديگور 3LD50 بوه خرگووش دوم بصوورت IV

تزريق شد. پس از كنترل طي 42 ساعت از قلب خرگوش ها بصورت مستقيم خونگيري بعمل آمد و پس از

اندازه گيري فاكتور هاي خوني مانند BT ،DIFF ،CBC، به آزمايشگاه ارسال شد.

71

3-14 بررسي اثرات زهر ماهي فرياله خال سياه بر روي فاكتورهاي هماتولوژيكي خون خرگوش سفيد

Dutch آزمايشگاهي نژاد

به منظور بررسي اثر زهر ماهي فرياله خال سياه بر روي پارامترهاي هماتولوژيک، تعداد دو سر خرگوش

Dutch سالم و نر با وزن 4222 و 1312 گرم از بخش پرورش حيوانات آزمايشگاهي موسسه رازي

تحويل گرفته شد، كه پس از قرنطينه )آمادگي براي تست( عوامل هماتولوژيک آنها مورد بررسي قرار

گرفتند. اولين عاملي كه مورد بررسي قرار گرفت زمان سيالن )BT( و زمان انعقاد )CT( خون بود كه به

ترتيب ذيل به اثرات آن بر روي فاكتور هاي مهم خون خرگوش پرداخته شد.

شكل 9-16: توزين خرگوش جهت تزريق زهر

روش كار:

براي انجام BT، ابتدا گوش خرگوش ضد عفوني گرديد و با نوک تيز يک لنست استريل ضربه آهسته

اي به گوش زده شد تا خون به خارج از گوش جريان پيدا كند. به محض جريان خون استارت كرونومتر

زده شد و تا زمان بند آمدن آن، قطرات خون با كاغذ صافي )واتمن( خشک گرديد. اين عمل تا جايي انجام

شد )هر ده ثانيه يک بار( كه ديگر قطره خوني به كاغذ واتمن آغشته نشود كه نشان دهنده پايان سيالن خون

72

مي باشد. در اين لحظه كرونومتر متوقف شد و زمان آن ثبت و ياداشت گرديد كه اين زمان مساوي مدت

زماني است كه سيالن خون خرگوش بند مي آيد.

شكل 9-11: اندازه گيري زمان انعقاد خون خرگوش

CT 3-15 اندازه گيري انعقاد خون ) (:

مقدار 1 ميلي ليتر از خون قلب خرگوش شاهد توسط سرنگ استريل برداشت شد و بدون هيچگونه ماده

ضد انعقادي آن را داخل يک لوله آزمايش ريخته و زمان انعقاد آن توسط كرونومتر يادداشت گرديد. سپس

خون به صورت مايل داخل لوله تكان داد شد و هر چند لحظه يكبار آن را مشاهده نموده تا زمان لخته شدن

خون داخل لوله مشخص شود. زماني كه خون كامالً لخته و منعقد شد، به محض مشاهده لخته، زمان

كرونومتر را متوقف مي كنيم و زمان ثبت شده به عنوان زمان انعقاد خون يادداشت گرديد.

شكل 9-18: خون گيري از قلب خرگوش جهت آزمايشات انعقاد

73

CT 3-16 روش دوم اندازه گيري زمان انعقاد خون ) (:

در اين روش حدود يک ميلي ليتر خون از قلب خرگوش گرفته شد و به يک اساليد )الم( كه از قبل

آماده شده بود، سه قطره از اين خون بالفاصله روي الم ريخته و كرونومتر زده شد و از دقيقه دو به بعد هر

سي ثانيه يكبار با يک لنست استريل خون را بطرف باال كشيده تا زماني كه اولين رشته هاي فيبريني مشاهده

گرديد، كرونومتر متوقف شد و زمان يادداشت گرديد كه اين زمان برابر با تعداد ثانيه اي است كه خون

خرگوش منعقد مي گردد )گل افشان و شناسا 1984(.

3-17 اندازه گيري عناصر خوني خرگوش هاي شاهد

براي انجام اين آزمايش ابتدا موضع محل خونگيري با الكل طبي 12 درجه بصورت حلزوني از مركز به

محيط ضد عفوني شد، پس از پيدا كردن موضع محل خونگيري )قلب خرگوش(، با سرنگ 1 ميلي ليتر با

زاويه 21 درجه به گونه اي كه برش سوزن به سمت باال باشد وارد قلب خرگوش شد. پس از گرفتن خون

به مقدار كافي، سوزن از سرنگ جدا گرديد و به آرامي 4 ميلي ليتر از خون خرگوش وارد لوله حاوي ماده

ضد انعقاد نمک دي پتاسيوم اتيلن دي آمين تترا استيک اسيد گرديد. سپس چندين بار لوله حاوي ماده ضد

انعقاد و خون را سر و ته مي كنيم، تا با هم مخلوط شوند و از انعقاد خون جلوگيري بعمل آيد. در ادامه

لوله هاي آزمايشگاهي به آزمايشگاه مربوطه منتقل گرديد. براي انجام آزمايش CBC )شمارش كامل سلول

هاي خوني( از دستگاه شمارنده سلولي استفاده شد )مهبد امير، 1981(.

پارامترهايي كه با اين روش اندازه گيري مي شوند شامل: گلبول هاي هاي سفيد )WBC(، گلبول هاي

قرمز )RBC(، هموگلوبين )Hb(، ميانگين حجم گويچه اي )MCV(، ميانگين هموگلوبين گويچه اي

)MCH(، ميانگين غلظت هموگلوبين گويچه اي )MCHC(، هماتوكريت )HCT(، پالكت، انواع گلبول

هاي سفيد و ... مي باشد.

74

PTT PT 3-18 اندازه گيري و :

PT :

براي انجام اين آزمايش يک لوله آزمايش هموليز 14×122 انتخاب شد و داخل آن 422 ميكروليتر

سيترات سديم 4/9 درصد ريخته شد و به ميزان 8/1 ميلي ليتر خون گرفته شده از قلب خرگوش از كنار

ديواره لوله به آرامي وارد لوله آزمايش شد. لوله آزمايش چندين بار سر و ته گرديد تا كامالً مخلوط شود.

لوله هاي حاوي خون و ماده ضد انعقاد به مدت 12 دقيقه با دور 9222 سانتريفيوژ گرديد تا پالسماي آن

جدا شود. نمونه پالسما به همراه دو عدد لوله آزمايش هموليز داخل بن ماري 91 درجه سانتي گراد قرار

داده شد و داخل دو عدد لوله هاي آزمايش ديگر 422 ميكرو ليتر از محلول ترمبو پالستين كلسيم ريخته شد

و آن را به مدت 12 دقيقه در بن ماري قرار ميدهيم. سپس 122 ميكروليتر از نمونه پالسما همزمان با زدن

كرنومتر به يكي از لوله حاوي 422 ميكرو ليتر ترمبوپالستين كه قبالً درون بن ماري دماي 91 درجه سانتي

گراد آماده كرده بوديم اضافه شد و در حالي كه در بن ماري است تكان داده و از ثانيه 12 به بعد در صورت

لوله به مدت 9-2 ثانيه در داخل بن ماري به آرامي تكان داده شد و سريعاً آن را بيرون آورده و براي ديدن

رشته فيبرين، لوله را در مقابل نور چراغ مطالعه نگاه مي كنيم با مشاهده رشته فيبرين كرنومتر را متوقف مي

كنيم، مجدداً اين عمل را يكبار ديگر انجام مي دهيم تا معدل آن بعنوان زمان PT گزارش گردد )دكتر سيد

امير مهبد چاپ سوم سال 1981(.

:PTT

براي انجام اين آزمايش يک لوله آزمايش همو ليز 14×122 انتخاب شد و داخل آن 422 ميكرو ليتر سيترات

سديم 4/9 درصد ريخته و به ميزان 8/1 ميلي ليتر خون گرفته شده از قلب خرگوش از كنار ديواره لوله به

آرامي وارد لوله آزمايش مي كنيم. لوله آزمايش چندين بار با سر و ته كردن كامالً مخلوط شد، لوله حاوي

75

خون و ماده ضد انعقاد را به مدت 12 دقيقه با دور 9222 سانتريفيوژ گرديد تا پالسماي آن جدا شود. در

داخل يک لوله هموليز 122 ميكروليتر از نمونه با 122 ميكرو ليتر activated Partial ( aPTT thromboplastin time( اضافه شد و پس از مخلوط كردن و به مدت 1-9 دقيقه در بن ماري 91 درجه قرار

گرفت.

پس از مدت فوق، 122 ميكروليتر كلريد كلسيم به لوله اضافه شد و مخلوط گرديد و همزمان كرونومتر

استارت زده شد. در حالي كه هر 1 ثانيه لوله را به آرامي تكان مي دهيم، پس از گذشت 12 ثانيه لوله را از

بن ماري خارج نموده و همانگونه كه در مورد PT ذكر گرديد به محض مشاهده لخته فيبرين كرونومتر را

متوقف مي كنيم و زمان سپري شده به عنوان PTT گزارش مي شود ) دكتر سيد امير مهبد چاپ سوم سال

.)1981

76

فصل چهارم

نتایج و یافته ها

77

4-1 استخراج و آماده سازي زهر خام

با توجه به اينكه از هر دو غده زهري 1 ميلي گرم زهر استخراج مي شود، كه در نهايت از آن 4122 ميلي

گرم )1/4 گرم( زهر استخراج گرديد و براي استفاده هاي بعدي در دماي اتاق نگهداري شد.

4-2 ميزان پروتئين زهر خام ماهي فرياله خال سياه خليج فارس

ميزان پروتئين در سم ماهي فرياله خال سياه در حدود 991 ميكروگرم/ميلي ليتر محاسبه شد.

جدول 1-2: ميزان جذب پروتئين موجود در زهر خام ماهي با توجه به غلظت BSA )1 ميلي گرم/ميلي ليتر( جذب نوري استاندارد 2 2

12 2/221 جذب نوري نمونه 2/211 42 261/2 رقت 422 مجهول 2/246 12

126/2 رقت 222 مجهول 2/221 122 422 2/211

122 2/11 1222 2/941

نمودار 1-2: منحني استاندارد حاصل از سنجش غلظت هاي مختلف محلول استاندارد BSA

78 y = 0.0003x + 0.0065 0.065=0.0003x + 0.0065 x= 195 µg/ml y = 0.0003x + 0.0065 0.106=0.0003x + 0.0065 x= 331 µg/ml

جدول 4-2 تعيين غلظت ها ي اوليه جهت شروع كار )Rugh Test( ميزان محلول حجم محلول ميزان سالين ميزان سم در سم در1 وضعيت موش تزريقي رنگ موش mg/ml ml 1/2 ميلي ليتر ml

زنده 122µg 2/1 2/2 2/1 سفيد مرگ µg 2/4 2/9 2/1 422 قرمز مرگ µg 2/9 2/4 2/1 922 آبي مرگ 222µg 2/2 2/1 2/1 قرمز آبي چون موشهاي تزريق شده با 422 ميكرو گرم در 1/2 ميلي ليتر بالفاصله تلف شدند . پس حدود LD50

مشخص گرديده كه ميتواند بين 112 تا 412ميكرو گرم باشد لذا از 112 شروع كرده و جهت تعيين رقت

هاي بعدي عدد فوق را در 41/1 ضرب مي كنيم.

LD50 4-3 دوز كشندگي ) (

متوسط دوز كشندگي از روش اسپيرمان- كاربر معادل11 ±422 ميكروگرم به ازاي هر موش

آزمايشگاهي مي باشد. چون موش هاي تزريق شده با 422 ميكرو گرم در 1/2 ميلي ليتر بالفاصله تلف

79

شدند. پس حدود LD50 مشخص گرديد كه مي تواند بين 112 تا 412 ميكروگرم باشد لذا كار با 112

ميكروگرم شروع شد و جهت تعيين رقت هاي بعدي عدد فوق را در 41/1 ضرب مي كنيم )جدول 2-4(.

در نهايت ميزان متوسط دوز كشندگي از رابطه ي زير محاسبه گرديد:

درصد مرده كمتر از 12-12 ×log 1.25 = A درصد مرده كمتر از 12 - درصد مرده بيشتر از 12

B= دوز كمتر از log 12

LD50 = Antilog A+B

رقتي كه كمتر از 12 درصد تلفات داشته را در نظر مي گيريم )يعني 132( و لگاريتم آن را محاسبه مي كنيم

جدول 9-2: انجام تست اصليLD50

مرگ پس از 24 ساعت غلظت زهر در 5/1 ميلي ليتر رنگ 4 سر موش هر غلظت ---- 112 ميكروگرم 2 سر موش پشت قرمز ---+ 132 ميكروگرم 2 سر موش پشت آبي ++++ 492 ميكروگرم 2 سر موش پشت سبز ++++ 412 ميكروگرم 2 سر موش سفيد + موش مرده و - موش زنده

log 190=2.28 2.28+0.032=2.31 antilog 2.31=204 µg/mouse

يعني LD50 زهر 411 مي باشد و براي تعيين دامنه تغييرات، به روش Spearman And Karber

عمل مي كنيم log1.25 N (  ( N  دز صددرصد مرده log N  2

81

150 190 230 0/4 1/4 4/4

0.0969 4 Log 230  .(0 1 4  ) 4 2

log1.25 4 log 230   (0 1 4  ) 4 2

2.3617  0.0726

 2.4343  271.8 LD50  Antilog  2.2891194.58

 271.8 LD50 194.58

پس LD50 زهر با دامنه تغييرات به شرح باال مي باشد.

4-4 الگوي الكتروفورتيک زهر فرياله

الگوي الكتروفورزي )SDS-PAGE( عصاره اوليه يا زهر خام ماهي فرياله بر روي ژل پلي آكريل آميد

با غلظت1/14% بالغ بر 3 باند پروتئيني بوده است كه از وزن مولكولي 42 تا 142 كيلودالتون را در بر مي

گيرند )تصوير 2-1(. Rate of flow = RF

فاصله پيموده شده توسط هر نمونه پروتئين R  فاصله پيموده شده توسط رنگ f

81

شكل 1-2: ژل SDS PAGE با رنگ آميزي كوماسي بلو

4-5 نتايج مربوط به اثر زهر فرياله بر روي سلول هاي خوني موش آزمايشگاهي

اين عوامل شامل گلبول هاي هاي سفيد )WBC( ، گلبول هاي قرمز )RBC(، هموگلوبين )Hb(، ميانگين

حجم گويچه اي )MCV(، ميانگين هموگلوبين گويچه اي )MCH(، ميانگين غلظت هموگلوبين گويچه

اي )MCHC( و هماتوكريت )HCT( مي باشند كه به ترتيب در جداول 2-2 تا 19-2 درج شده اند.

جدول 2-2: نتايج تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر RBC خرگوش نژاد Dutch سه دوز كشنده يک دوز كشنده شاهد پارامتر 200 µg/mice 612 µg/mice Total RBC × 106 mm3 6.62 5.77 5.41

جدول 1-2: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر WBC خرگوش نژاد Dutch سه دوز كشنده يک دوز كشنده شاهد پارامتر 204 µg/mice 612 µg/mice 6 3 WBC × 10 mm 7.1 6.3 12.4

82

جدول 6-2: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر MCV خرگوش نژاد Dutch سه دوز كشنده يک دوز كشنده شاهد پارامتر 204 µg/mice 612 µg/mice MCV (fl) 64.35 65.3 66.4

جدول 1-2: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر MCH خرگوش نژاد Dutch سه دوز كشنده يک دوز كشنده شاهد پارامتر 204 µg/mice 612 µg/mice MCH pg 21.0 22.0 22.7

جدول 8-2: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر MCHC خرگوش نژاد Dutch سه دوز كشنده يک دوز كشنده شاهد پارامتر 204 µg/mice 612 µg/mice MCHC (%) 32.6 33.7 34.3

جدول 3-2: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر Hb خرگوش نژاد Dutch سه دوز كشنده يک دوز كشنده شاهد پارامتر 204 µg/mice 612 µg/mice Hb (g/dl) 13.95 12.7 12.3

جدول 12-2: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر HCT خرگوش نژاد Dutch سه دوز كشنده يک دوز كشنده شاهد پارامتر 204 µg/mice 612 µg/mice HCT (%) 42.8 37.7 35.9

جدول 11-2: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر PT و PTT خرگوش نژاد Dutch سه دوز كشنده يک دوز كشنده شاهد پارامتر 204 µg/mice 612 µg/mice PT sec 8.50 15 16.30 PTT sec 27 34 35

83

جدول 14-2: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر PLT خرگوش نژاد Dutch سه دوز كشنده يک دوز كشنده شاهد پارامتر 204 µg/mice 612 µg/mice PLT 103/microliter 495 49 31

جدول 19-2: تاثيرات هماتولوژيک زهر استون فيش خليج فارس بر CT و BT خرگوش نژاد Dutch سه دوز كشنده يک دوز كشنده شاهد پارامتر 204 µg/mice 612 µg/mice CT min 3.1 4.35 4.57 BT min 3 6.2 6.9

*Significant difference relative to the control (p≤0.05).pg=pictogram; fl=femtoliter; g/dL=gram/deciliter; HCT=Hematocrit RBC: red blood cell number; WBC: leukocytes count; MCV: mean corpuscular volume; MCH: mean corpuscular hemoglobin; MCHC: mean corpuscular hemoglobin concentration.

84

فصل پنجم

بحث و نتيجه گيری

85

زهرهاي جانوران دريايي، در مقايسه با ديگر جانوران زهر آگين نظير مار و عقرب كمتر مورد توجه و

بررسي قرار گرفته اند و به طور كل اطالعات اندكي در مورد اين منابع مهم بيولوژيک وجود دارد. اين

كمبود اطالعات اساساً ناشي از دشواري استخراج زهر، ناپايداري و متنوع بودن تركيبات دريايي مي باشد.

بنابراين مطالعه بر روي زهر ماهي بسيار چالش برانگيزتر مي باشد. مطالعه بر روي زهر دريايي نه تنها ما را

به سوي شناسايي تركيبات مضر رهنمون مي شود بلكه ما را با تركيباتي آشنا مي سازد كه از نظر دارويي و

پزشكي بسيار مفيد مي باشند. افزون براين مطالعه بر روي مكانيسم زهر و نحوه عملكرد آن در سامانه هاي

زيستي درک و فهم بهتري از آنها به دست مي دهد.

بنا به گفته محققين، سنگ ماهيان خطرناک ترين و زهري ترين ماهيان آب هاي دريايي محسوب مي

شوند )Halstead,1988., and Russell 1965(. زهر اين گروه از ماهيان مجموعه اي از توكسين هاي

گوناگون با خصوصيات فارماكولوژيک متنوع و ويژگي هاي بيولوژيک فراوان مي باشد. به طوري كه هريک

از آنها به شكل بالقوه مي توانند منبعي از داروهاي مفيد باشند )Prithiviraj, et al., 2012(.

فرياله كه موضوع اين پژوهش مي باشد نيز از اين گروه ماهيان بوده و با توجه به ناشناخته بودن

خصوصيات توكسينولوژيک زهر آن، به عنوان موضوع مورد مطالعه انتخاب گرديد.

يكي از مالک ها و شاخص هاي قدرت زهر جانوران غلظت پروتئين آن مي باشد، به طوري كه غلظت

باالي پروتئين مي تواند شاخصي براي افزوني قدرت و خواص فارماكولوژيک متنوع آن باشد ) ,.Tu, et al

and Church, et al., 2002(. در مطالعه حاضر ميزان پروتئين زهر از غلظت نسبتاً بااليي برخوردار بود

كه بنا به نظر شماري از پژوهندگان اين شاخه از دانش بيوشيمي، اين غلظت مي تواند بازتابي از توان

كشندگي زهر باشد كه در LD50 نمود پيدا مي كند )Church, et al., 2002(. متوسط دوز كشنده به

دست آمده از زهر خام در مقايسه با ساير گونه هاي سنگ ماهي با گونه S.horrida مشابهت دارد

86

)Saunders, et al., 1962(. از آنجايي كه زهر ماهيان از نظر شيميايي و هم از نظر فارماكولوژيک با زهر

جانوران خشكي زي متفاوت مي باشد )Russell,et al., 1974(. شماري از ويژگي هاي مهم آنها با هم

مشترک مي باشد )Church, et al., 2002(. ماهيان زهري در درجه اول، زهر را براي دفاع از خود توليد

مي كنند، بنابراين وجود نشانه هاي مشترک در هنگام مسموميت با زهر ماهيان زهري به چشم مي خورند.

زهرهاي جانوران به عنوان عوامل بالقوه ي فارماكولوژيک و ابزارهاي فيزيولوژيک شناخته مي شوند.

تغييرات رفتاري در خرگوش هاي مسموم شده از طريق تزريق داخل وريدي زهر با تغييرات گزارش

شده در اثر مسموميت با ساير ماهيان زهري قابل مقايسه بوده با اين تفاوت كه برخي از نشانه هاي رفتاري

از شدت بيشتري برخوردار مي باشند. زهر خام فرياله در موش با عاليم گزارش شده در سنگ ماهي

S.verrucosa، مشابه بوده و شامل مرگ ناگهاني به همراه نشانه هايي چون تشنج، خيز ريوي، عدم تعادل

عضالني، فلج، ادرار، سيخ شدن موهاي بدن و لرزش بودند )Garnier, et al., 1995(. نشانه هايي مانند

سيخ شدن موهاي بدن و حركات تند و سريع، حركات چرخشي و متعاقب آن فلج اندام عقبي و مرگ

ناگهاني از ديگر عاليم مشاهده شده بود كه توسط ساير پژوهندگان نيز گزارش گرديده بود ) Lopes, et

.)al., 1998

بنا به نظر برخي از پژوهشگران زهر شناسي ليوفيليزه نمودن زهرخام و فراكسيون هاي آن نقش مهمي در

عدم ثبات فعاليت كشندگي و از دست دادن يا كاسته شدن اين فعاليت دارد )Russell, et al.,1974(.

عليرغم اين گزارش، در اين تحقيق چنين اتفاقي رخ نداد و زهر فعاليت خود را حفظ نمود.

يكي از فعاليت هاي مهم زهر خام اثر هموليتيک يا همان اثر بر اريتروسيت هاي شسته شده گونه هاي

جانوري مي باشد و تقريباً تمامي ماهيان زهري در زهر خود داراي اين نوع فعاليت مي باشند ) ,Church et al.,2002(. زهر فرياله بر روي اريتروسيت هاي شسته شده خرگوش اثر هموليتيک از خود نشان داد.

87

چنين نتيجه اي با ساير بررسي هاي انجام شده بر روي ساير گونه هاي ماهيان زهري به ويژه سنگ ماهيان

قابل مقايسه مي باشد )Weiner, 1959 and Chhatwal, et al., 1992(

همانگونه كه در نتايج مشخص مي باشد شاخص هاي گلبول هاي قرمز نيز اندازه گيري شدند كه عبارتند

از هماتوكريت )Hct(، ميانگين حجم گلبولي )MCV(، ميانگين هموگلوبين گلبولي )MCH( و ميانگين

غلظت هموگلوبين گلبولي )MCHC(.

هماتوكريت كه حجم اريتروسيت ها براساس درصد مي باشد يكي از شاخص هاي مهم هماتولوژيک در

ارزيابي انواع آنمي و وضعيت هموليتيک مي باشد و كاهش آن هميشه با كاهش هموگلوبين همراه است

)Weiser, et al., 1983(. در اين بررسي هر دو مقدار هماتوكريت و هموگلوبين كه قبالً در مورد آن

بحث گرديد روند كاهشي معني داري در هر دو گروه آزمايشي موش هاي آزمايشگاهي داشته اند و

همانگونه كه اشاره شد دليل آن تخريب وسيع ايتروسيت ها مي باشد كه منجر به بروز هموليز داخل عروقي

شده و باعث افت درصد هماتوكريت مي گردد.

ميانگين حجم گلبولي يكي از مهم ترين شاخص هاي اريتروسيتي مي باشد كه در واقع ميانگين حجمي

گلبول هاي قرمز محسوب مي شود و در بروز كمبود آهن در اثر هموراژ و خونريزي كاهش پيدا مي كند

)Harvey, et al., 2000(. نتايج به دست آمده نيز مويد اين وضعيت مي باشند كه قبال به تفصيل در

مورد آن بحث گرديد. نتايج آزمون هاي آماري نيز نشان دهنده تفاوت معني دار گروه كنترل با گروه هاي

تيمار شده با زهر فرياله مي باشند.

شاخص ميانگين هموگلوبين گلبولي نيز از شاخص هايي است كه مي توان از آن در ارزيابي هاي

هماتولوژيک استفاده نمود )Kaneko, 2008(. بنا به گفته پژوهشگران، اين شاخص در اريتروسيت هايي

88

با كمبود آهن كاهش مي يابد زيرا آهن براي سنتز هموگلوبين نرمال مورد نياز مي باشد ) ,Harvey

2000(. نتايج نشان دهنده ي كاهش هموگلوبين از 31/19 به 9/14 مي باشند.

در اين بررسي ميانگين هموگلوبين گلبولي نيز كاهش داشته است كه چون در واقع بازتابي از هموگلوبين

مي باشد و رابطه ي مستقيمي با ميانگين حجم گلبولي دارد و همچنين در كمبود آهن كاهش مي يابد

)Harvey, et al., 2000(. هر گونه تغييري در هموگلوبين و ميانگين حجم گلبولي در مورد اين شاخص

نيز صادق مي باشد در كل مي توان نتيجه گيري نمود كه اين شاخص ها به دليل بروز كم خوني ناشي از

خونريزي و تخريب گسترده ي سلول هاي خوني روند كاهشي داشته اند كه اين مي تواند به دليل اثر

سيتوليتيک زهر مورد آزمايش باشد )Harvey, et al., 2000(، اما در مورد WBC مقدار كشنده سم در

1LD50 باعث سركوب نسبي گلبول هاي سفيد خون شده ولي در دوز 3LD50 بعلت تحريک هورمون هاي

استرس زا )اپي نفرين( احتماال باعث آزاد سازي WBC از جداره رگها و ذخاير Marginal Pool شده و

در نتيجه افزايش WBC را شاهد هستيم )خون شناسي ديويد سن(.

نتيجه گيري:

با توجه به نتايج به دست آمده مي توان نتيجه گيري نمود كه:

1- زهر فرياله يک كمپلكس پروتئيني و پپتيدي محسوب مي گردد.

4- زهر فرياله يک زهر، خون گرا، مي باشد. كه روي فاكتورهاي خوني اثر معني داري دارد

9- اين زهر با زهر ساير سنگ ماهيان از نظر فعاليت آنزيمي متفاوت مي باشد.

2- زهر از پايداري نسبتاً بااليي در مقابل سرما و ليوفيليزاسيون برخوردار مي باشد.

1- تزريق اين سم به خرگوش باعث سركوب پالكت ها و هموليز فاكتور هاي خون وكاهش آنها مي شود.

89

6- زهر فرياله يک زهر چند عملكردي است و قادر به ايجاد اثرات هماتولوژيک مختلف و گسترده در قرباني مي گردد.

پیشنهادات:

1- استفاده از الكتروفورز دو بعدي در بررسي زهر خام و فراكسيون هاي آن

4- بررسي بيشتر و كامل تر اثر هموليتيک بر روي گونه هاي بيشتر و با غلظت بيشتر بر روي خون انسان

9- بررسي مكانيسم عمل اثرات فارماكولوژيک زهر و استفاده از مدل هاي حيواني متنوع تر

2- بررسي تكميلي فاكتورهاي هموئوستاتيک در مدل حيواني متنوع تر

1- به دليل اطالعات كم در زمينه سموم ماهيان، و درگير شدن افراد ماهيگير با اين سموم، بهتر است در

مورد سرم هاي ضد سم كارهاي تحقيقاتي صورت گيرد.

6- در تزريق دوز 3LD50 اين زهر به خرگوش آيا باعث تحريک مغز استخوان و يا هورمون هاي

استرس زا ميشود يا خير؟ مكانيزم تحريک آن چگونه است؟

91

منابع بابائي، مهدي. و [ديگران].1934. مباني و روش هاي كروماتوگرافي و الكتروفورز. تهران: انتشارات آواي فهيم. شهبازي، ملک نيا. )1911(. بيوشيمي عمومي. تهران: انتشارات دانشگاه تهران. گل افشان، حبيب اهلل. و شناسا، عبدالحسين. مباني انعقاد خون و روش هاي آزمايشوگاهي. شويراز: دانشوگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني فارس. مهبد امير، سيد علي. )1981(. اصول، كاربرد و تفسير آزمايش ها در هماتولوژي عملي. تهران: نشر اشراقيه. وزيريزاده، امير. و [ديگران]. 1939. اثر زهر خام ماهي فرياله خال سياه خليج فارس ) Pseudosynanceia melanostigma( بر روي عوامل هماتولوژيک و سطح سرمي آنزيمهاي موش صحرايي. ماهنامه طب جنوب، 11)2(: 149-194.

Abdelmouleh A, Belbahri L, El Feki A. 2007. Biochemical and physiological responses in wistar rat after administration of puffer fish (Lagocephalus lagocephalus) flesh. J Food Agric Environ. 2: 107-111.

Abe T, Sumatora M, Hashimoto Y, Yoshihara J, Shimamura Y, Fukami J. 1996. Purification and Properties of a Cardioactive Toxin, Cardioleputin, from stone fish, Synanceja verrucosa. Journal of Venomous Animals and Toxins. 9, 2:165- 179. Acott CJ. 1990. Stonefish envenomation. Undersea Biomed Res. 117, 242: 146. Al-Hassan JM, Thomson M, Criddle R. 1983. Accelerated wound healing by a preparation from skin of the Persian Gulf catfish. The Lancet. 321:1043-1044. Al-Hassan JM, Thomson M, Ali M, Criddle RC. 1987. Toxic and pharmacologically active secretions from the Persian Gulf catfish (Arius thalassinus, Ruppell). Journal of Toxicology. Toxin Reviews. 6:1-43. Arias HR. 2006. Marine Toxins Targeting Ion Channels. J Mar Drugs. 4: 37-69. Auddy B, Gomes A. 1996. Indian catfish (Plotosus canius, Hamilton) venom. Occurrence of lethal protein toxin (toxin-PC). Adv Exp Med Biol. 391: 225- 229. Auddy B, Alam, M, Gomes A. 1994. Pharmacological actions of the venom of the Indian catfish (Plotosus canius Hamilton). Indian J Med Res. 99: 22-25.

91

Austin L, Cairncross KD, McCallum IAN. 1961. Some pharmacological actions of the venom of the stonefish Synanceja horrida. Arch mt Pharmacodyn. 131:339- 347. Balceloux DG. 2008. Medical Toxicology of Natural Substances: Foods, Fungi, Medicinal Herbs, Plants, and Venomous Animals. Canada: A John Wiley & Sons, INC Publications: 1325-1330. Bhakuni DS, Rawat DS. 2005. Bioactive Marine Natural Products. In: Bioactive Marine Natural Products. Anamaya Publisher, New Delhi, India: 1 - 382. Bottard LA. 1889. Les Poissons Venimeux. Octave Doin, Paris: 220-241. Cadzow WH. 1960. Puncture wound of the liver by stingray spines. Med J Australia. 1, 24: 936-937. Cameron A M, Endean R. 1973. Epidermal secretions and the evolution of venom glands in fishes. Toxicon. 11: 401-410. Carlson RW, Schaeffer RC, Wigham H, Weil MH, Russell FE. 1973. Some pharmacological properties of the venom of the scorpionfish Scorpaena guttata -II. Toxicon. 11:167-180. Chan TY, Tam LS, Chan LY. Stonefish sting: an occupational hazard in Hong Kong. Ann Trop Med Parasitol. 90: 675–676. Chhatwal DF. 1992. Biological properties of crude venom extract. Choromanski JM, Murray F, Weber LJ. 1984. Responses of the isolated buffalo sculpin heart to stabilized venom of the lionfish (Pterois volitans). Proc West Pharmacol Soc. 27: 229-232. Church JE, Hodgson WC. 2002. Adrenergic and cholinergic activity contributes to the cardiovascular effects of lionfish (Pterois volitans) venom. Toxicon. 40, 6: 787–796. Church JE, Hodgson WC. 2000. Dose-dependent cardiovascular and neuromuscular effects of stonefish (Synanceja trachynis) venom. Toxicon. 38, 3: 391–407. Church JE, Hodgson WC. 2000. Evidence for the presence of a Cholinomimetic in the venom of the stonefish (Synanceja trachynis). Proc Aust Soc Clin Exp Pharmacol. Toxicol. 7: 90-98.

92

Church JE, Hodgson W C. 2000. Similarities in the pharmacological activity of venoms from Australian fish. Proc Aust Soc Clin Exp Pharmacol. Toxicol. 8: 15-21. Church J E, Hodgson WC. 2001. Stonefish (Synanceia spp.) antivenom neutralises the in vitro and in vivo cardiovascular activity of soldierfish (Gymnapistes marmoratus) venom. Toxicon. 39, 2–3: 319–324. Church, JE, Hodgson WC. 1999. The release of endogenous catecholamines contributes to the cardiovascular activity of soldierfish (Gymnapistes marmoratus) venom. Proc Aust Soc Clin Exp Pharmacol. Toxicol. 6: 91. Church JE, Moldrich RX, Beart PM, Hodgson WC. 2003. Modulation of intracellular Ca2+ levels by Scorpaenidae venoms. Toxicon. 41, 6: 679–689. Cohen AS, Olek AJ. 1989. An extract of lionfish (Pterois volitans) spine tissue contains acetylcholine and a toxin that affects neuromuscular transmission. Toxicon. 27: 1367 - 1376. Concon JM.1988. Food toxicology, Principle and concepts Part A. Marcel Dekker lnc, New York. Cross B. 1976. The unusual stingray injury-the skin diver at risk. Med J Australia. 2: 947-948. Deo DA. 2000. Ichthyocrinotoxicity of marine catfishes of Mumbai coast. Central Institute of Fisheries Education, Versova: 31-53. Fenner PJ, Williamson JA, Skinner, RA. 1989. Fatal and non-fatal Stingray envenomation. Med J Aust. 151: 621- 625. Figueiredo SG. 2005. Biological properties of the venom from the scorpionfish (Scorpaena plumieri) and purification of a gelatinolytic protease. Toxicon. 45, 7: 843–850. Ghosh S, Hazra AK, Banerjee S, Mukherjee B. 2004. The seasonal toxicological profile of four puffer fish species collected along Bengal coast, India. Ind J Mar Sci. 33: 276-280. Gwee MCE, Gopalakrishnakone P, Yuen R, Khoo HE, Low KSY. 1994. A review of stonefish venoms and toxins. Toxicon. 64: 509–528. Haddad JV, Martins IA, Makyama HM. 2003. Injuries caused by scorpionfishes (Scorpaena plumieriBloch, 1789 and Scorpaena brasiliensis Cuvier, 1829) in

93

the Southwestern Atlantic Ocean (Brazilian coast): epidemiologic, clinic and therapeutic aspects of 23 stings in humans. Toxicon.42, 1: 79–83. Hahn ST, O'Connor JM. 2000. An investigation of the biological activity of Bullrout (Notesthes robusta) venom. Toxicon. 38: 79-89. Halstead BW, Courville DA. 1970. Poisonous and Venomous Marine Animals of the World. Washington, DC, US Government. 3: 121-145. Halstead BW, Smith. 1954. Presence of an axillary venom gland in the oriental catfish, Plotosus lineatus. Copeia. 2: 153-154. Halstead BW. 1951. Injurious effects from the sting of the scorpionfish, Scorpaena guttata - with report of a case. Cal J Med. 74, 5: 395-396. Halstead BW, Kuninobu LS, Hebard HS. 1953. Catfish stings and the venom apparatus of the Mexican catfish, Galeichthys felis (Linnaeus) Trans. Am Microscop Soc.72, 4: 297-314. Halstead BW. 1970. Poisonous and Venomous Marine Animals of the World, USGP, Washington, DC. 3: 1006-1019. Halstead BW. 1978. Poisonous and Venomous Marine Animals of the World. Rev ed Darwin Press, Princeton. 1043-1054. Halstead BW, Ocampo RR, Modglin FR. 1955. A study on the comparative anatomy of the venom apparatus of certain North American stingrays. J Morphol. 7, 1:1-14. Halstead BW. 1988. Scorpionfishes. In: Poisonous and Venomous Marine Animals of the World, Second Revised Edition. Princeton: The Darwin Press. 839-906. Halstead BW. 2001. Fish toxins. In: Food borne disease handbook Kui, YH Kitts. D and Stansfield. PS. Marcel and Dekker lnc. 660-671. Harvey JW. 2000. Microcytic anemias. In “ Schalm’s Veterinary Hematology” BFFeldman , JG. Zinkl, and NC Jain. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia. 200–204. Hodgson E2012. Toxicology & Human Environments. Academic Press, 1th Ed. USA. NC: 450-463. Hopkins BJ, Hodgson WC, Sutherland S K. 1994. Pharmacological studies of stonefish (Synanceja trachynis) venom. Toxicon. 1994. 32: 1197-1210.

94

Hopkins BJ, Hodgson W C. 1998. Cardiovascular studies on venom from the soldierfish (Gymnapistes marmoratus). Toxicon. 36, 7: 973–983. Hwang DF, Noguchi T. 2007. Tetrodotoxin Poisoning. Adv Food Nutr Res. 52: 141-236. Isbister GK, Son J, Wang F, Maclean CJ, Lin CSY, Ujma J, Balit CR, Smith B, Milder DG, Kiernan MC. 2002. Pufferfish poisoning: a potentially life- threatening condition. Med J Aust. 177: 650-653. Kaneko JJ. 2008. Clinical Biochemistry of Domestic Animals. 4th Edn. San Diego: Academic Press. 890-900. Khora SS. 2013. Pharmacological Potentials of Scorpaenidae Fish Venom. Int J Drug Dev Res. 5, 3: 77-86. Kizer KW, McKinney HE, Auerbach PS. 1985. Scorpaenidae envenomation: a five-year Poison Center experience. JAMA. 253, 6: 807-810. Klaassen CD, Watkins JB. 1999. Casarett and DouIl's Toxicology. The Basic Science of Poisons, McGraw-Hill, New York. Kodama M, Sato S. 2005. Pufferfish toxin. In: Bureau of Environmental Health. Ministry of Health and Welfare, Japan. The Manual for the Methods of Food Sanitation Tests. Food Hyg Assoc Tokyo. 756-763. Kreger AS, Molgo J, Comella JX, Hansson B, Thesleff S. 1993. Effects of stonefish (Synanceia trachynis) venom on murine and frog neuromuscular junctions. Toxicon. 31: 307-317. Kreger AS. 1991. Detection of a cytolytic toxin in the venom of the stonefish (Synanceia trachynis). Toxicon. 29: 733-743. Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly Of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680–685. Lee MJA, Jeong DY, Kim WS, Kim HD, Kim CH, Park WW. 2000. A tetrodotoxin -producing Vibrio-strain, LM-1, from the puffer fish Fugu vermicularisradiatus. App Env Microbiol. 2000. 66: 1698-1701. Lopes-Ferreira M, Barbaro KC, Cardoso DF, Moura-Da-Silva AM, Mota L. 1998. Thalassophryne nattereri fish venom: biological and biochemical characterization and serum neutralization of its toxic activities. Toxicon. 36: 405-410.

95

Magalhaes GS, Junqueira-de-Azevedo ILM, Lopes-Ferreira M, Loernzini DM, Moura-da-Silva AM. 2006. Transcriptome analysis of expressed sequence tags from the venom glands of the fish Thalassophryne nattereri. Biochimie. 88, 6: 693–699. Mahmud Y, Tanu MB, Takatani T, Asayama E, Arakawa O, Noguchi, T. 2001. Chelonodon patoca, a highly toxic marine puffer in Japan. J Nat Toxins. 10: 69- 74.

Maretic Z. 1988. Marine toxins and venoms. In: Handbook of Natural Toxins. 3: 379-444. Meunier FA, Mattei C, Chameau P, Lawrence G, Colasante CS, Kreger A, Dolly JO, Molgo J. 2000. Trachynilysin mediates SNARE-dependent release of catecholamines from chromaffin cells via external and stored Ca2+. JCell. Sci. 113: 1119–1125. Mirzajani F. 1999. Characterization of venom proteins from Pseudocerastes Persicus persicus (dissertation). (Karachi): University of Karachi: 127-132. Muhuri D, Karmakar S, Dasgupta SC, Nagchaudhuri AK. 2004. Pharmacological studies on the venomous spotted butterfish (Scatophagus argus Linn) sting extract on experimental animals. Indian J Exp Biol. 42, 5:461–467. Nair MSR, Cheung P, Leong L, Ruggieri GD. 1985. A non-proteinaceous toxin from the venomous spines of the lionfish Pterois volitans (Linnaeus). Toxicon. 23: 525-527. Nuez-Vaàzqueza EJ, Yotsu-Yamashitab M, Sierra-Beltrana AP, Yasumoto T. Ochoaa JL. 2000. Toxicities and distribution of tetrodotoxin in the tissues of pufferfish found in the coast of the Baja California Peninsula, Mexico. Toxicon. 38: 729-734. Ouanounou G, Malo M, Stinnakre J, Kreger AS, Molgo J. 2002. Trachynilysin, a neurosecretory protein isolated from stonefish (Synanceia trachynis) venom, forms nonselective pores in the membrane of NG108-15 cells, J Biol Chem. 277: 39119–39127. Ouanov G, Malo M, Stinnakre J, Kreger AS, Molgo J. 2002. Trachinilysin. A neurosecretory protein isolated from stonefish (Synanceia trachynis) venom,

96

from nonselective pores in the membrane of NG108-cel. J Biol Chem and Mol Biol. 277, 42: 39119-39127. Perriere C, Perriere F. 2003. Poisonous catfishes; venom apparatus, acanthotoxins, Crinotoxin and other skin secretions. In: Catfishes Vol.l: Arsalia G, Kapoor BK, Chardon M, Diogo R. Science Publishers Inc. UK. 487-496. Poh CH, Yuen R, Khoo HE, Chung MCM, Gwee M, Gopalakrishnakone P. 1991. Purification and partial characterisation of stonustoxin (lethal factor) from Synanceja horrida venom. 1991. Comp Biochem Physiol. 9: 793-798. Prithiviraj N, Sasikala R, Annadurai D. 2012. Bioactive Properties of the Stone Fish Synanceia horrida (Thomas, 1984) Spine Venom. International Journal of Pharmaceutical & Biological Archives. 3(5):1217-1221. Purves WK, Sadava D, Gordon H. Orians, H. Craig Heller. 2004. Life: The Science of Biology. 7th ed. Sunderland, Mass: Sinauer Associates. 954-965. Ramos AD, Conceição K, Pimenta DC, Lopes-Ferreira M. 2007. Biochemical and biological variation between the mucus and the sting venom from the catfish Cathorops spixii. J Venom. Anim Toxins incl. Trop Dis. 13, 1: 25-31. Randall JE. 1996. Coastal Fishes of Oman. University of Hawaii Press, Hawaii, USA: 110-136. Rizzo F, Papasouliotis K, Crawford E, Dodkin S, Cue S. 2008. Measurement of prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT) on canine citrated plasma samples following different storage conditions, Research in Veterinary Science. 85: 166–170. Russell FE, Brodie AF. 1974. Venoms of reptiles In: Chemical Zoology. Vol IX, Academic Press, New York. 632-644. Russell FE. 1965. Marine toxins and venomous and poisonous marine animals. In: Advances in Marine Biology, Vol 3, Russell FE Ed. London: Academic Press: 255-385. Saoudi M, Abdelmouleh A, Ellouze F, Jamoussi K, El Feki A. 2009. Oxidative stress and hepatotoxicity in rats induced by poisonous pufferfish Lagocephalus lagocephalus meat. J Venom Anim Toxins.15: 424-443. Saoudi M, Abdelmouleh A, Jamoussi K, Kammoun A, El Feki A. 2008. Hematological toxicity associated with tissue extract from poisonous fish

97

Lagocephalus lagocephalus-influence on erythrocyte function in wistar rats J Food Sci. 73: 155-159. Sattari M, Shahsavani D, Shafii S. 2010. Ichthyology (2). Guilan University Publications: 53-61. Saunders PRS, Rothman VA, Chin HP. 1962. Cardiovascular actions of venom of the stonefish Synanceja horrida. Am J Physiol. 203, 3: 429-432. Sauviat MP, Meunier FA, Kreger A, Molgo J. 2000. Effects of trachynilysin, a protein isolated from stonefish (Synanceia trachynis) venom, on frog atrial heart muscle. Toxicon. 38: 945–959. Sauviat MP, Garnier JP, Goudey-Perriere F, Perriere C. 1995. Does crude venom of the stonefish (Synanceja verrucosa) activate b-adrenoceptors in the frog heart muscle. Toxicon. 33, 9: 1207–1213. Schaeffer RC, Carison RW, Russell FE. 1971. Some chemical properties of the venom of the scorpionfish Scorpaena guttata. Toxicon. 9: 69-78. Shiomi K, Hosaka M, Fujita S, Yamanaka H, Kituchi, T. 1989. Venoms from six species of marine fish: lethal and haemolytic activities and their neutralization by commercial stonefish antivenom. Mar Biol. 103: 285-289. Shiomi K, Hosaka M, Kituchi T. 1993. Properties of lethal factor in stonefish Synanceja verrucosa venom, Nippon Suis. Gakk. 59: 1099-1103 Shiomi K, Taleamiya M, Yamanaka H, Kikudi T. 1987. Purification of a lethal factor from Oriental cat fist Plotosus ifneatus. Toxicon. 5, 7: 1275-1280. Shokuhin E, Kensa S. 2005. Puffer toxin. In: Environmental Health Bureau, Ministry of Health and Welfare, Ed. (Manual for Methods for Food Sanitation Testing). Tokyo. 756-770. Siddiq A. 2007. Characterization of venom proteins from two species of scorpionfish group; Hypodytes rubripinnis & Synanceja verrucosa. International Center of Chemical and Biological Sciences: Karachi University: 75-83. Sitprija S, Sute Parak S. 2008. Animal Toxins: An Overview, As Biomed. 2, 6: 451-457. Smith WL, Wheeler WC. 2006. Venom evolution widespread in fishes. J Hered. 97, 3: 206-217.

98

Soprani J, Silva PRO, Soares MA, Figueiredo SG, Santos RG. 2007. Effect of scorpionfish (Scorpaena plumieri) venom on cultured murine glioblastomas cells [RT2]. J Venom Anim Toxins incl Trop Dis. 13, 1: 27-30. Sosa-Rosales JI, Piran-Soares AA, Farsky SH, Takehara HA, Lima C, Lopes- Ferreira M. 2005. Important biological activities induced by Thalassophryne maculosa fish venom. Toxicon. 45, 2:155–161. Stewart W, Randall HDJ. 1969. Fish Physiology. Academic Press. 3. Sutherlands SK. 1983. Genus Synanceia (Linnaeus), Stonefishes: S. verrucosa (Block & Schneider) &S trachynis Richardson. In: Australian Animal Toxins, The Creatures, Their venoms and Care of the Poisoned Patient. Melbourne: Oxford University Press: 654-662. Tu W. 1988. Marine Toxins and Venoms. Basel Marcell Dekker INC: 21-27. Wang J, Yazawa K, Hao L, Onoue Y, Kameyama M. 2007. Verrucotoxin inhibits KATP channels in cardiac myocytes through a muscarinic M3 receptor-PKC pathway. Eur J Pharmacol. 563, 1-3: 172-179. Watters MR, Stommel EW. 2004. Marine neurotoxins: Envenomation and Contact toxins. Cur Tre Opt in Neurology. 6: 115-123. Weiner S. 1959. Observations on the venom of the stonefish (Synanceja trachynis). Aled J Arcrt. 1: 620-27. Weiser MG, Kociba GJ. 1983. Erythrocyte macrocytosis in feline leukemia virus associated anemia. Vet Pathol. 20: 687-697. Williamson JA. 1995. Clinical toxicology of venomous Scorpaenidae and other selected fish stings. ln: J Meier and J White, Editors, Clinical Toxicology of Animal Venoms and Poisons. CRC Press: 142-158. Wu Z, Yang Y, Xie L, Xia G, Hu J, Wang S, Zhang R. 2005. Toxicity and distribution of tetrodotoxin-producing bacteria in puffer fish Fugu rubripes collected from the Bohai Sea of China. Toxicon. 46: 471-476. Yazawa K, Wang JW, Haol Y, Onoue Y, Kameyama M. 2007. Verrucotoxin, a stonefish venom, modulates calcium channels activing in Guinea-Pig ventricular myocytes. Brit J Pharm. 151: 1198-1203.

99

Abstract: Toxins produced by flora and fauna and its proteins as well as valuable pharmaceutical compounds. They contain proteins used in producing painkillers, drugs for treating cancer, infectious diseases, allergy, blood pressure, etc.

In this study on 250 Blackfin Stonefish, we investigated the LD50 and hematological effects of the toxin produced by this fish along with its pharmacological and enzymatic properties investigated by other researchers.

One and three LD50 of venom injected IM in Rabbits under study was cbc total protein and وPTT و administered IV and different parameter like PT SDS-PAGE venom electrophoresises were studied before and 24 hours after venom injection. The total protein was estimated 331 µg/ml and the level of RBC ،WBC were 6.62 and 7.1 mm3 before venom treatment and reduce to 6.3 and 5.7 mm3 و after venom injection. The ،MCH= 21 pg ،MCHC=32.6% ،Hb=13.95 g/dl =HCT=42.8% were before venom treatment and reduce to MCV=65.3 fl ،MCH HCT=37.7% after venom injection و pg ،MCHC=33.7% ،Hb=12.7 g/dl 22 The PT and PTT reduce after venom treatment (before venom treatment were PT=8.5 second & PTT = 27 second and after venom injection PT=15 second & PTT = 34 second) the platelete count reduce after venom injection (befor venom=495 103/microliter and after venom was 49 103/microliter). Our results showed that the venom caused a significant reduction In WBC ,RBC Hb, Hct, and platelete count which is due to lysis of cell after venom treatment.

Keywords: Toxic fish, Blackfin stonefish, LD50, hematologicalcharacteristics, partial analysis

111

Islamic Azad University Science and Research Branch Faculty of Marine Science and Technology

A Thesis for the MSc Degree

Determination of Some hematologic effect the Persian Gulf Blackfin Stonefish, (Pseudosynanceia melanostigma), Venom on albino mice blood

Thesis Advisor: Dr. Shahla Jamili

Dr. Hossein Zolfagharian

By: Mohammad Zolfaghari

Autumn 2016

111