UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI Programa De Pós-Graduação Em Produção Vegetal

UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal

Kamila Antunes Alves

MORFOLOGIA DE SEMENTES E PLÂNTULAS E CULTIVO IN VITRO DE ESPÉCIES DE DROSERA DE CAMPOS RUPESTRES

Diamantina 2019 2

Kamila Antunes Alves

MORFOLOGIA DE SEMENTES E PLÂNTULAS E CULTIVO IN VITRO DE ESPÉCIES DE DROSERA DE CAMPOS RUPESTRES

Tese apresentada ao Curso de Pós- Graduação Stricto Sensu em Produção Vegetal da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, para obtenção do título de “Doutor”.

Orientadora Prof.a Dr.a Marcela Carlota Nery

Coorientadora Prof.a Dr.a Miranda Titon

Diamantina - MG 2019 3

FICHA CATALOGRÁFICA

AGRADECIMENTOS

A Deus por me inspirar, fortalecer e permitir essa conquista, e por estar ao meu lado em todos os momentos da minha vida. À Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM) pela oportunidade de realizar meu Doutorado e por todo apoio que sempre tive dentro da instituição. Ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, ao Laboratório de Sementes e ao Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas (DAF), por disponibilizar a estrutura física, corpo docente, que possibilitaram a realização desse trabalho. À Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e a Coordenadoria de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de recursos financeiros para realização desta pesquisa. Aos meus queridos pais Ivan Kleber David Alves e Rosana Antunes dos Santos Alves, pela educação, exemplo, paciência e confiança. Apesar das dificuldades encontradas no dia a dia, nunca desistiram e sempre me ensinaram o caminho do bem, amo muito vocês. Ao meu amado Tiago Alves Rodrigues, pelo companheirismo, dedicação, incentivo e paciência. À minha família, em especial minha madrinha Rosanilda, meu padrinho Jairo, minhas tias Laninha e Ilian, e minha vozinha Adir, que me apoiam e acreditam na minha capacidade desde que eu nasci e que vibram e se sentem orgulhosos com minhas conquistas. Ao meu querido amigo Dayvson Costa, pelo apoio incondicional, pela ajuda nas coletas, ensinamentos e momentos mais que especiais, tornando possível a realização deste sonho. À minha amiga Flavia Campos, por estar comigo desde do início dessa caminhada, pela amizade sincera, apoio e carinho de sempre. À minha orientadora Professora Drª. Marcela Carlota Nery, por me aceitar em seu grupo de pesquisa, pela orientação, confiança e respeito ao longo dessa etapa, muito obrigada. À minha coorientadora ProfessoraDrª Miranda Titon, pela orientação, colaboração e incentivo, pelo exemplo de profissional, muito obrigada. 6

Aos amigos do Laboratório de Sementes (NES) e técnico, em especial Fabiano, Tiago e Soryana, pela amizade, ajuda nos trabalhos e agradável convivência, pelo estímulo e pela força. Eterna gratidão à Tiago de Oliveira Sousa, sem sua ajuda, apoio e amizade nada disso seria possível. A Paulo Gonella, pela importante contribuição, pelo estimulo, incentivo e paciência em compartilhar seus conhecimentos. À Cintia Fialho e Michael Willians, pela valiosa amizade, pelas grandes contribuições neste trabalho, pela presteza, dedicação e paciência, muito obrigado. A todos do Laboratório de Cultura de Tecidos do Departamento de Engenharia Florestal da UFVJM, em especial Ana Caroline, Thalyta e Vitória, pelo apoio incondicional e pelos maravilhosos momentos juntas. Ao programa de intercâmbio ERASMUS, à Universidade de Cádiz – Espanha e ao Professor Fernando Ojeda, por me acolher e contribuírem para o meu aprendizado. Ao programa Institucional de Doutorado-sanduíche no Exterior (PDSE), à Universidade de Córdoba – Espanha e todos do laboratório de Bioquímica e Fisiologia Vegetal, em especial Professor Manuel Pineda e Professor Gregório, por todo conhecimento compartilhado, por me acolherem com tanto carinho e permitirem vivenciar uma das maiores experiências da minha vida. Ao Instituto Estadual de Florestas - IEF por permitirem a coleta das sementes na área da Unidade de Conservação. Gostaria de agradecer também a todos que direta ou indiretamente contribuíram na realização deste trabalho, meu muito obrigada!

RESUMO

MORFOLOGIA DE SEMENTES E PLÂNTULAS E CULTIVO IN VITRO DE ESPÉCIES DE DROSERA DE CAMPOS RUPESTRES

Objetivou-se com esse trabalho estudar a influência da luz e da temperatura na germinação in vitro e ex vitro de sementes de Drosera latifolia, D. hirtella, D. montana e D. schwackei, caracterizando morfologicamente as sementes e plântulas, além de desenvolver um protocolo para germinação in vitro, desenvolvimento de plantas e criopreservação de sementes de D. schwackei. Na caracterização física avaliou-se o peso de mil sementes e o grau de umidade. Para a determinação das características morfológicas foram avaliadas a biometria das sementes e suas características externas. Os testes de germinação foram conduzidos in vitro e ex vitro, para cada espécie, por meio de testes com quatro temperaturas constantes (15ºC, 20ºC, 25ºC e 30ºC), bem como presença e ausência de luz. Concluiu-se que as quatro espécies são sensíveis à luz e os melhores resultados de germinação foram obtidos nas temperaturas de 20ºC e 25ºC. Na segunda etapa do trabalho, realizou-se um ensaio de desinfestação com as sementes de D. schwackei. Após esse processo, as sementes de D. schwackei foram inoculadas em diferentes concentrações do meio de cultura MS (1/3, 1/2 e 100%) para a análise de germinação. Uma parte das plântulas obtidas a partir do teste de germinação foi transferida para um novo meio de cultura, com diferentes concentrações do meio MS (1/3, 1/2 e 100%) para a indução do desenvolvimento. A outra parte das plântulas foi subcultivada em meio MS 1/3 dos sais, com diferentes concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0 e 1,5 mg.L-1), visando verificar a capacidade de multiplicação do explante. Os melhores resultados para a germinação das sementes, desenvolvimento das plântulas e o cultivo in vitro de D. schwackei, foram obtidos utilizando-se o meio MS1/3 e MS1/2. Já as baixas concentrações de BAP favoreceram o crescimento das plantas in vitro, apesar destas não promoverem brotações. As plântulas obtidas dos experimentos in vitro foram aclimatizadas e o musgo Sphagnum foi o mais indicado. As sementes de D. schwackei foram armazenadas em criotubos e imersas em botijão contendo nitrogênio líquido e mantidas por 1, 6, 12, 24, 48, 120 horas. A criopreservação não interferiu no desenvolvimento e na morfologia das plantas em nenhum período de armazenamento.

Palavras-chave: qualidade de sementes; plantas carnívoras; conservação. 8

ABSTRACT

SEED AND SEEDLING MORPHOLOGY AND IN VITRO CROP OF RUPESTRIC FIELDS DROSERA SPECIES

The objective of this work was to study the influence of light and temperature on in vitro and ex vitro germination of seeds of Drosera latifolia, Drosera hirtella, Drosera montana and Drosera schwackei, to characterize seeds and seedlings morphologically, also to develop a protocol for germination in vitro, plant development and cryopreservation of D. schwackei seeds. In the physical characterization were evaluated, one thousand seed weight and moisture content. For the determination of the morphological characteristics the biometrics of the seeds, as well as their external characteristics, were evaluated. Germination tests were conducted in vitro and ex vitro for each species. Four constant temperatures (15ºC, 20ºC, 25ºC and 30ºC), presence and absence of light were tested. It was concluded that the four species are light sensitive and the best germination results were obtained at temperatures of 20ºC and 25ºC. In the second stage of the work, a disinfestation test with D. schwackei seeds was carried out. After disinfestation, D. schwackei seeds were inoculated in different concentrations of MS culture medium (1/3, 1/2 and 100%) for germination analysis. Part of the seedlings obtained from the germination test were transferred to a new culture medium, with different concentrations of the MS medium (1/3, 1/2 and 100%), to induce development. The other part of the seedlings were subcultured in MS medium 1/3 of the salts, with different BAP concentrations (0.0, 0.5, 1.0 and 1.5 mg.L-1), aiming to verify the multiplication capacity from explant. Best results for seed germination, seedling development and in vitro cultivation of D. schwackei were obtained using MS1/3 and MS1/2 medium. Low concentrations of BAP favored plant growth in vitro, although they did not promote sprouts. Seedlings obtained from in vitro experiments were acclimatized and Sphagnum moss was the most suitable. Drosera schwackei seeds were stored in cryotubes and immersed in a canister containing liquid nitrogen and kept for 1, 6, 12, 24, 48, 120 hours. Cryopreservation did not interfere with plant development and morphology in any storage period.

Keywords: seed quality; carnivorous plants; conservation.

LISTA DE FIGURAS

ARTIGO CIENTÍFICO I. Pág.

Figura 1 Espécies estudadas: A- Droserahirtella; B-Droseralatifolia; C- 21 Droseramontana; D-Droseraschwackei.

Figura 2 Área de coleta das sementes dasespécies estudadas. 22

Figura 3 Sementes fotografadas em papel milimetrado para então serem medidas pelo programa ANATI QUANTI. Na ordem, as espécies D. hirtella; D. latifolia;

D. montana; D. schwackei 23

Sementes das espécies de Droseras. A- D. hirtella; B- D. latifolia; C- D. Figura 4 montana e D- D. Schwackei. 26

Figura 5 Estádios de desenvolvimento de plântulas de Drosera. schwackei. Na ordem, protrusão da raiz primária (A), crescimento da radícula (B), emissão de

cotilédones, plântula com protófilos fechados (C), desprendimento do tegumento e abertura dos cotilédones (D), plântula já com folhas 28 modificadas em armadilhas (E). Legenda: ct Cotilédone; ep Epicótilo; hp – – – Hipocótilo; prf – Primeiras folhas; rd – Radícula; rs – Raiz secundária; rp – Raiz primária; Tg – Tegumento.

Figura 6 Partes constituintes de uma plântula normal. A- D. hirtella; B- D. latifolia; 28 C- D. montana; D- D. schwackei.

Partes constituintes de uma plântula normal de D. latifolia. A- Radícula; B- 29 Figura 7 Hipocótilo; C- Parte aérea; D- Tegumento.

ARTIGO CIENTÍFICO II.

Figura 1 Processo completo do desenvolvimento in vitro de D.schwackei. 46

Figura 2 Crescimento de plântulas em função da concentração de sais do meio MS aos 52 30 dias de cultivo. 1- Ágar/Água; 2- MS 1/3 de sais; 3- MS 1/2 de sais; 4- MS 100% dos sais.

Figura 3 Plântulas normais obtidas da germinação de sementes de D.schwackei 55

armazenadas em nitrogênio líquido (-196°C) por 120 horas. A- radícula; B- hipocótilo; C- cotilédones; D- tegumento; E- parte aérea.

Figura 4 Crescimento in vitro de plantas de D.schwackeiem diferentes concentrações 55 de sais do meio de cultura MS. A- Ágar; B- 1/3; C- 1/2; D- 100%.

Figura5 Crescimento in vitro de plantas de D.schwackeiem diferentes concentrações 59 de BAP. A- 0,0 mg.L-1; B- 0,5 mg.L-1; C- 1,0 mg.L-1 e D- 1,5 mg.L-1.

Figura 6 Planta de D. schwackei aclimatizada em musgo sphagnum. 60

LISTA DE TABELAS

ARTIGO CIENTÍFICO I. Pág.

Tabela 1 Comprimento, largura e massa de matéria seca das sementes de D. latifolia; 28 D.hirtella; D.montana e D. schwackei.

Tabela 2 Germinação (G) e índice de velocidade de germinação (IVG) em diferentes 31 temperaturas (°C) para as espécies de Droseraex vitro.

Tabela 3 Germinação (G) e índice de velocidade de germinação (IVG) em diferentes 32 temperaturas (°C) para as espécies de Drosera in vitro.

ARTIGO CIENTÍFICO II.

Tabela 1 Germinação (%) e Índice de velocidade de germinação (IVG) in vitro de 50 sementes de D.schwackei em função das concentrações de hipoclorito de sódio (% de cloro ativo) e diferentes tempos de imersão.

Tabela 2 Valores médios da percentagem de germinação (%G), índice de velocidade 52 de germinação (IVG) e altura a parte aérea de plântulas (mm) em função das diferentes concentrações de sais do meio MS.

Tabela 3 Germinação de sementes de D.schwackei armazenadas em nitrogênio líquido (-196°C) por 0, 1, 6, 12, 24, 48 e 120 horas. Médias seguidas pela mesma 55 letra nas colunas não diferem significativamente entre si pelo teste Tukey (p≤0,05).

Tabela 4 Efeito das concentrações de sais do meio MS na altura da parte aérea (APA), 57 número de folhas (NF), número de raízes (NR) e comprimento da maior raiz (CMR) de D.schwackei.

Tabela 5 Efeito das concentrações de BAP em meio MS 1/3 dos sais na altura da parte 58 aérea (APA), número de folhas (NF), número de raízes (NR) e comprimento da maior raiz (CMR) de D.schwackei.

SUMÁRIO

Pág. RESUMO.……………………………………………………………………………. i ABSTRACT….………………………………………………………………….…… ii LISTA DE TABELAS..…………………………………………………………...…. iii INTRODUÇÃO GERAL……………………………………………………….……. 15 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.………………………………………………. 16 ARTIGO CIENTIFICO I: Caracterização morfológica e influência da luz e da temperatura na germinação de sementes de espécies do gênero Drosera L...... 19 RESUMO...... 20 ABSTRACT...... 20 INTRODUÇÃO...... 21 MATERIAL E MÉTODOS...... 23 Material Vegetal...... 23 Caracterização física das sementes...... 24 Caracterização morfológica de sementes e plântulas...... 24 Germinação das sementes...... 25 RESULTADOS E DISCUSSÃO...... 26 Caracterização física das sementes...... 27 Caracterização morfológica de sementes e plântulas...... 27 Germinação das sementes...... 31 CONCLUSÕES...... 37 AGRADECIMENTOS...... 37 REFERÊNCIAS...... 37 ARTIGO CIENTIFICO II: Criopreservação de sementes, germinação e desenvolvimento in vitro de Drosera schwackei...... ……...... 42 RESUMO...... 43 ABSTRACT...... 44 INTRODUÇÃO...... 45 MATERIAL E MÉTODOS...... 46 Desinfestação de sementes ...... 47 Germinação in vitro...... 47 Desenvolvimento de plântulas...... 48 Aclimatização...... 49 Criopreservação de sementes...... 50 Analise Estatística...... 50 13

RESULTADOS E DISCUSSÃO...... 51 Desinfestação de sementes...... 51 Germinação in vitro...... 52 Criopreservação de sementes...... 55 Desenvolvimento de plântulas e Aclimatização...... 57 CONCLUSÕES...... 62 AGRADECIMENTOS...... 63 REFERÊNCIAS...... 63

INTRODUÇÃO GERAL

O comportamento carnívoro vegetal sempre gerou grande interesse devido aos seus mecanismos de atração e captura das presas para a nutrição dos organismos. As plantas carnívoras atraem e digerem presas animais, beneficiando-se dos produtos finais da digestão no crescimento geral (Juniper et al., 1989; Adamec, 1997). Embora essas plantas ocorram em todo o mundo, a maior diversidade é encontrada no Hemisfério Sul (Fleischmann et al., 2016). Atualmente são reconhecidas quatro grandes linhagens de plantas carnívoras (APG IV, 2016), em cinco ordens de angiospermas (Poales, Caryophyllales, Oxalidales, Ericales e Lamiales), divididas em 11 famílias, 20 gêneros e cerca de 800 espécies (Pereira et al., 2012; McPherson, 2010; Fleischmann et al., 2016). Dentre as famílias botânicas de plantas carnívoras, a Droseraceae Salisb destaca-se por sua complexidade taxonômica. A família é composta por três gêneros: Aldrovanda L., amplamente distribuído na África, Europa, Ásia e Oceania; Dionaea J.Ellis, restrito aos estados da Carolina do Norte e Carolina do Sul, nos Estados Unidos, ambos monotípicos e Drosera Linnaeus, reportado como cosmopolita, incluindo quase a totalidade das espécies descritas (Gonella, 2012; Gonella, 2017). A Drosera L. é o gênero mais icônico e diverso, pois produz armadilhas pegajosas, além de ter mais de 250 espécies atualmente descritas e representantes que ocorrem em todos os continentes, exceto na Antártida e em todas as zonas climáticas, com exceção das regiões polares (Fleischmann et al., 2016). No Brasil, são registradas 31espécies de Drosera, distribuídas em todos os Estados brasileiros, com 19 espécies endêmicas para o país (Gonella, 2019). A maioria das espécies de Drosera é perene, hemicriptofíticas e produzem inflorescências em forma de cimos escorpióides simples (Diels 1906, Robinson et al. 2017, Fleischmann et al. 2018). As plantas do gênero Drosera possuem grande relevância econômica na medicina ocidental. Após serem utilizadas de diferentes formas desde o século XVI, a partir de 1900, passaram a ser empregadas também no tratamento de tosse e de doenças como o resfriado comum, a bronquite, a asma e outros problemas respiratórios, pois possuem efeito relaxante sobre a musculatura dos brônquios (Wolf; Heinz, 2004). Algumas espécies de Drosera já foram enquadradas sob risco de extinção devido a diversas razões, como as atividades ligadas à agricultura, à pecuária, à produção de energia e à mineração; à urbanização; à poluição; às modificações nos 15 sistemas naturais; à competição com espécies invasoras e ao uso indiscriminado em indústrias de chás, em países do sudeste asiático (Jennings & Rohr, 2011; Majumdar et al., 2011). Drosera cendeensis, por exemplo, é ameaçada pela coleta indiscriminada para uso na medicina tradicional na Venezuela (Gonella, 2016). As plantas carnívoras têm as espécies que mais sofrem com ameaças de extinção, devido a sua grande exigência quanto à qualidade ambiental (Ferreira et al., 2013). Como agravante, estima-se que aproximadamente 80% das espécies de plantas carnívoras conhecidas, cerca de 750, ainda não compõem a Lista Vermelha de Espécies Ameaçadas de Extinção da International Union for Conservation of Nature, o que dificulta a elaboração de estratégias de conservação (IUCN, 2015). De maneira geral, há poucas informações disponíveis sobre o comportamento das espécies nativas, o que dificulta o estabelecimento de técnicas que permitam a conservação e exploração dessas espécies. Estudos preliminares são essenciais e servem como ponto de partida na exploração do conhecimento e das inúmeras formas de conservação e utilização dessas espécies. Objetivou-se com esse trabalho estudar a influência da luz e da temperatura na germinação in vitro e ex vitro de sementes de Drosera latifolia (Eichler) Gonella & Rivadavia, D. hirtella A.St.-Hil., D.montana A.St.-Hil.e D. schwackei (Diels) Rivadavia, caracterizando morfologicamente as sementes e plântulas, além de desenvolver um protocolo para germinação in vitro, desenvolvimento de plantas e criopreservação de sementes de D. schwackei.

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ARTIGO CIENTÍFICO I: Caracterização morfológica e influência da luz e da temperatura na germinação de sementes de espécies do gênero Drosera L.

CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E INFLUÊNCIA DA LUZ E DA TEMPERATURA NA GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE ESPÉCIES DO GÊNERO DROSERA

RESUMO: O gênero Drosera é um grande grupo de plantas carnívoras que têm a capacidade de aprisionar em armadilhas foliares, insetos e, dificilmente, pequenos animais. Muitas espécies de Drosera encontram-se ameaçadas de extinção por destruição dos hábitats, agravadas por questões intrínsecas à própria biologia reprodutiva, dificultando seu estabelecimento em campo quando se visa tanto à exploração econômica, quanto a conservação. Objetivou-se com esse trabalho estudar a germinação in vitro e ex vitro de sementes de Drosera latifolia, D. hirtella, D. montana e D. schwackei na sob presença e/ou ausência de luz e temperatura, bem como caracterizar morfologicamente as sementes e plântulas. Na caracterização física avaliou- se o peso de mil sementes e o grau de umidade. Para a determinação das características morfológicas foi avaliada a biometria das sementes e suas características externas. Os testes de germinação foram conduzidos em in vitro e ex vitro, para cada espécie. Foram testadas quatro temperaturas: 15ºC; 20ºC; 25ºC; 30°C constantes e presença e ausência de luz. As quatro espécies de Drosera apresentam sementes pequenas e leves, possuem testa reticulada com variação de cor do castanho escuro ao preto. A germinação é do tipo epígea e a plântula é fanerocotiledonar. São sensíveis à luz, com resposta nula de germinação no escuro, caracterizando-as como fotoblásticas positivas. Melhores resultados de germinação foram obtidos nas temperaturas de 20ºC e 25ºC, para todas as espécies.

Palavras-chave: qualidade de sementes; plantas carnívoras; conservação.

MORPHOLOGICAL CHARACTERIZATION AND INFLUENCE OF LIGHT AND TEMPERATURE ON SEED GERMINATION OF SPECIES OF THE GENUS DROSERA

ABSTRACT: The genus Drosera is a large group of carnivorous plants that have the ability to trap insect prey in their leaves, which are modified in traps. Many species of Drosera are threatened with extinction due to habitat destruction, aggravated by issues 20 intrinsic to their reproductive biology, making their establishment in the field difficult for both economic exploitation and conservation. The objective of this work was to study in vitro and ex vitro germination of seeds of Drosera latifolia, D. hirtella, D. montana and D. schwackei in the presence or absence of light at different temperatures and to characterize the seeds and seedlings morphologically. For the determination of the morphological characteristics the biometrics of the seeds was evaluated, as well as their external characteristics. Germination tests were conducted in vitro and ex vitro for each species. Four temperatures were tested: 15°C; 20°C; 25°C; 30°C and presence and absence of light. The four Drosera species have small and lightweight seeds with outer integument forehead, dark brown to black color. The seedling is phanerocotyledonary- epigeal. They are light sensitive, characterizing them as positive photoblastics. Better germination results were obtained at temperatures of 20ºC and 25ºC, for all species.

Keywords: seed quality; carnivorous plants; conservation.

INTRODUÇÃO

O gênero Drosera é um grande grupo de plantas carnívoras compreendendo cerca de 250 espécies (Fleischmann et al., 2018). Juntamente com outras famílias botânicas com representantes carnívoros, que despertam grande curiosidade nos botânicos e no público em geral pela sua capacidade de aprisionar, em armadilhas foliares, insetos ou, mais raramente, outros pequenos animais. As suas folhas atraem, prendem e digerem a presa usando os nutrientes resultantes para suplementar o pouco que elas podem obter nos substratos pobres onde crescem (Rice, 2011). A biologia única e o hábito carnívoro de Drosera spp. ganharam o interesse de horticultores que as cultivam como plantas ornamentais, economicamente importantes (Barthlott et al., 2004), também valorizadas por suas propriedades medicinais (Kawiak et al., 2011). Muitas espécies de Drosera encontram-se ameaçadas de extinção devido as razões antrópicas e ambientais e algumas são enquadradas como vulneráveis ou criticamente ameaçadas de extinção, na Lista Vermelha de Espécies Ameaçadas da União Internacional para Conservação da Natureza (Majumdar; Datta; Shankar, 2010; Jennings; Rohr, 2011; Iucn, 2015). 21

Um dos fatores mais importantes, relacionados ao forte endemismo e a redução da propagação das plantas de Drosera em seu habitat, diz respeito a problemas com a germinação, baixa estabilidade de condições edafoclimáticas, que são agravadas por questões intrínsecas à própria biologia reprodutiva, fazendo com que seu estabelecimento em campo quando se visa tanto à exploração econômica, quanto a conservação seja dificultoso. Sendo assim, estudos relacionados à morfologia e fisiologia das plântulas e sementes são muito importantes, pois podem colaborar para uma melhor compreensão do comportamento das espécies, assim como permitir desenvolver métodos de propagação (Silva et al., 2014; Tian, et al., 2010). Além da importância para o reconhecimento de espécies em campo, a utilização da morfologia descritiva da germinação e de plântulas facilita a interpretação de testes de germinação, que se baseiam em avaliações de plântulas normais e anormais, a realização de trabalhos científicos (Oliveira, 1993; Araújo & Matos, 1991), o auxílio na compreensão da dinâmica de populações vegetais, bem como o reconhecimento do estádio de sucessão das espécies (Oliveira, 1993; Donadio & Demattê, 2000). Durante a germinação ocorre uma sequência de processos fisiológicos que são influenciados tanto pela temperatura, quanto pela presença e ausência de luz, dessa forma, torna-se necessário estudar a influência desses fatores para compreender o processo germinativo de espécies do gênero Drosera (Ferreira et al., 2007). A temperatura influencia as reações bioquímicas que regulam o metabolismo necessário para iniciar o crescimento do embrião e, em consequência, a porcentagem e a velocidade de germinação (Carvalho & Nakagawa, 2000). A temperatura considerada ótima para a germinação é aquela na qual a semente expressa o seu potencial máximo em originar plântulas normais no menor tempo possível (Mayer & Poljakoff-Mayber, 1989). As maiorias das espécies tropicais e subtropicais apresentam comportamento variável quanto à temperatura de germinação, sendo a faixa de 20ºC a 30ºC considerada ideal (Borghetti & Ferreira, 2004; Borghetti, 2005). Em ambientes naturais, as sementes podem ser encontradas sob diferentes regimes de luz e temperatura, que é necessária para a germinação de espécies denominadas fotoblásticas positivas. Já as fotoblásticas negativas germinam melhor quando há limitação de luz, existindo ainda as indiferentes, que não apresentam sensibilidade à luz (Taiz & Zeiger, 2004). Não há estudos relacionando a luz e a temperatura nos processos germinativos das espécies do gênero Drosera, reafirmando a 22 importância desse trabalho, como forma de subsidiar o planejamento de estratégias para a sua conservação. Objetivou-se com este trabalho estudar a influência da luz e da temperatura na germinação in vitro e ex vitro de sementes de Drosera latifolia, D. hirtella, D. montana e D. schwackei e caracterizar morfologicamente as sementes e plântulas.

MATERIAIS E MÉTODOS

Material Vegetal

Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Sementes do Departamento de Agronomia e Laboratório de Cultura de Tecidos do Departamento de Engenharia Florestal da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM), Diamantina – MG. Foram utilizadas sementes coletadas de quatro espécies do gênero Drosera, a saber, D. hirtella, D. latifolia; D. montana; D. schwackei (Figura 1), coletadas no Parque Estadual do Biribiri (PEBI), entre os meses de março a maio de 2018. A área de estudo no PEBI encontra-se entre as coordenadas, 43˚ 35’ 12” a 43˚ 35’ 14” de longitude Oeste e 18˚ 11’ 51” a 18˚ 11’ 54” de latitude Sul (Figura 2). O Parque possui uma área de 16.998,66 hectares e está situado na região do Alto Vale do Rio Jequitinhonha, na parte sudeste do município de Diamantina. As sementes foram coletadas e armazenadas em câmara fria (10 ºC e 70% UR).

A A B C D

Figura 1. Espécies estudadas: A- Drosera hirtella; B- Drosera latifolia; C- Drosera montana; D- Drosera schwackei 23

Figura 2. Área de coleta das sementes das espécies estudadas.

Caracterização física das sementes

Foi determinando o peso de mil sementes e o grau de umidade das sementes das quatro espécies de Drosera. O peso de mil sementes foi estipulado segundo metodologia descrita por Brasil (2009), onde oito repetições de 100 sementes foram pesadas em balança analítica de precisão, além de calculado o desvio padrão e o coeficiente de variação, sendo os resultados expressos em gramas. O grau de umidade foi obtido pelo método de estufa, a partir de quatro amostras de 100 sementes, secas em estufa a 105 °C, em copos de papel alumínio, por 24 horas e pesadas em balança analítica (Brasil, 2009).

Caracterização morfológica de sementes e plântulas

As sementes foram medidas com auxílio de lupa pelo software ANATI QUANTI em uma amostragem de quatro repetições de 25 sementes por espécie (Figura 24

3), sendo o comprimento e a largura considerada como a maior distância entre as extremidades (Garcia & Diniz 2003). A morfologia foi descrita por meio da caracterização dos aspectos externos da semente. Observou-se a coloração, textura, consistência do tegumento, forma, bordo, posicionamento do hilo, micrópila e funículo, com utilização de 50 sementes de cada espécie. As descrições morfológicas das sementes foram feitas através de observações realizadas em microscópio óptico, com base no trabalho realizado por Barroso et al. (1999). A partir de quatro amostras de 100 sementes foi realizado o peso da massa seca, após secagem em estufa a 65 °C, por 48 h, através de balança analítica de precisão (Brasil, 2009).

Figura 3. Sementes fotografadas em papel milimetrado para então serem medidas pelo programa ANATI QUANTI. Na ordem, as espécies D. hirtella; D. latifolia; D. montana; D. schwackei

Para a caracterização morfológica das fases de germinação e características das plântulas, 30 sementes de cada espécie foram semeadas em placas de Petri, contendo como substrato três folhas de papel Germitest, mantidas em germinador tipo Biochemical Oxygen Demand (B.O.D.) a 25 ºC, sob luz contínua. As avaliações foram realizadas diariamente após a primeira emissão de radícula, sendo consideradas plântulas quando os eofilos encontravam-se totalmente formados. Em todas as etapas de germinação até a formação da plântula foram descritos e demonstrados os seguintes elementos vegetativos: tipo de germinação; radícula; colo; hipocótilo; epicótilo; cotilédones; e protofilos. As fotos foram feitas com lupa fotográfica, a partir de material bem desenvolvido e representativo de cada fase. Os termos empregados para essas fases estão de acordo com Barroso et al. (1999).

Germinação das sementes

Realizou-se um pré-teste de desinfestação das sementes, com duas concentrações de hipoclorito de sódio (1% e 2%) e quatro tempos de imersão (1, 3, 5 e 10 minutos). As sementes foram então desinfestadas por 1 minuto em álcool 70%, seguido de 10 minutos em hipoclorito de sódio 2,0% (i. a.) e depois realizada a tríplice lavagem com água deionizada, seguida da distribuição de 50 sementes em cada placa de Petri. Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial de 4 x 2 (4 temperaturas e 2 luminosidades), com quatro repetições de 50 sementes para cada espécie. Foram implantados dois experimentos, ex vitro e in vitro. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do programa estatístico “R” versão 3.5.0. Para o teste de germinação ex vitro, foram testadas quatro temperaturas constantes de 15ºC; 20ºC; 25ºC e 30°C com e sem presença de luz, constituindo-se oito tratamentos e quatro repetições. O experimento foi conduzido para cada espécie, sendo utilizado como recipiente as placas de Petri com três folhas de papel germitest, umedecidas com água destilada, na proporção de 2,5 vezes a massa do papel (volume/massa). Para germinação in vitro, as sementes foram desinfestadas em câmara de fluxo laminar, lavadas com água destilada e autoclavada. Assim como na germinação ex vitro, foram testadas quatro temperaturas: 15ºC; 20ºC; 25ºC; 30°C constantes na presença e ausência de luz, constituindo-se oito tratamentos e quatro repetições para cada espécie, sendo utilizadas como recipientes placas de Petri com meio constituído apenas de ágar e água. Os testes de germinação foram realizados em câmaras de germinação tipo B.O.D. (Biochemical Oxygen Demand) sob luz (30 μmol.m-2.s-1) e escuro. A simulação da condição de escuro contínuo foi feita com a envoltura das placas em papel alumínio, sendo os experimentos montados e o acompanhamento feito em câmara escura, com luz verde de segurança (Souza & Pereira 1992). A germinação foi avaliada diariamente por 30 dias, com auxílio de um microscópio estereoscópio. O índice de velocidade de germinação de sementes também foi calculado (Maguire, 1962).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Caracterização física das sementes

O grau de umidade das sementes das espécies de Drosera variou de 28,66% a 20,36%, não diferindo entre espécies. Esse grau de umidade pode ser considerado elevado, com base no pequeno tamanho das espécies. O alto teor de água apresentado pelas espécies pode estar relacionado ao seu habitat, pois quase sempre estão presentes em regiões alagadiças ou ambientes úmidos.

Caracterização morfológica das sementes e plântulas

A morfologia da semente é considerada um dos mais importantes caracteres na identificação das espécies, particularmente no gênero Drosera (Diels, 1906; Wynne, 1944; Brummer-Dinger, 1955; Fernández-Pérez, 1965). As quatro espécies estudadas possuem sementes endospermadas, funiculada (funículo persistente), com micrópila pequena e circular de cor preta, localizados na região basal. A testa é reticulada, de cor castanho-preta. Verificou-se que as sementes apresentam diferenças na forma, tamanho e micromorfologia, e que as diferenças de tamanho são causadas pelo crescimento das regiões micropilar e ou calazal (Figura 4). As quatro espécies de Drosera possuem sementes pequenas e leves. Em D. montana e D. hirtella tanto a região micropilar como a calazal são pouco estendidas, diferindo das demais. O tamanho, a massa e o peso de mil sementes das espécies D. hirtellae e D. montana foram menores em relação as outras duas espécies. A Drosera hirtella apresenta sementes ovoides, 3,6 µm de comprimento, 2,09 µm de largura, testa reticulada, preta (Figura 4A). Sementes de D. Montana são obovais a elipsoides com 3,51 µm de comprimento, 2,03 µm de largura, testa reticulada e cor preta (Figura 4C). Foi possível observar que em sementes de D. latifolia (Figura 4B) ocorrem expansões bem evidentes nas regiões micropilar e calazal, nas outras espécies estudadas, tais expansões não são evidentes. Sementes de D. latifólia apresentaram maior comprimento e largura que as demais espécies, com 10,13 µm de comprimento, 2,90 µm de largura. Possuem sementes ovoides a obovoides, testa reticulada e cor castanha escuro. Fazendo com que possa ser considerada maior, quando comparadas com sementes das outras espécies estudadas (Figura 4B). Dessa maneira, facilitando seu 27

estabelecimento no ambiente, pois as sementes que possuem maior reserva nutritiva podem fixar-se mais facilmente (Carvalho & Nakagawa, 2000), ou seja, podem apresentar germinação mais efetiva, o que veremos a seguir. Observou-se também maior valor de massa seca e peso de mil sementes para D. schwackei, que apresenta sementes oblongo-fusiformes, 6,12 µm de comprimento e 2,43µm de largura (Tabela 1), testa reticulada e cor preta (Figura 4D).

micrópila A B calaza C calaza D micrópila

tegumento tegumento tegumento tegumento

micrópila calaza micrópila calaza

Figura 4. Sementes das espécies de Drosera. A- D. hirtella; B- D. latifolia; C- D. montana e D- D. schwackei.

Tabela 1 - Comprimento, largura e massa de matéria seca das sementes de D. latifolia; D.hirtella; D.montana e D. schwackei. Espécies Comprimento (µm) Largura (µm) PMS (mg) Matéria seca(mg) D. hirtella 3.67 ± 0.08c 2.09 ± 0.04c 0.0074 ± 0.0004c 0.0005± 0.00d D. latifolia 10.13 ± 0.08a 2.90 ± 0.04a 0.0157 ± 0.0004b 0.0011 ± 0.00b D. montana 3.51 ± 0.08c 2.03 ± 0.04c 0.0081 ± 0.0004c 0.0007 ± 0.00c D. schwackei 6.12 ± 0.08b 2.43 ± 0.04b 0.0178 ± 0.0004a 0.0013 ± 0.00a CV (%) 3.03 4.12 5.87 10.64 Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

As sementes das quatro espécies de Drosera podem ser consideradas muito pequenas, tendo comprimento médio menor que 1 mm e massa seca menor que 0,0015 mg. O tamanho das sementes afeta muitos aspectos da ecologia das plantas (Moles et al., 2005), e tem relação direta com o comportamento germinativo (Leishmann et al., 2000) e a longevidade no solo (Thompson et al., 1993). Segundo Harper et al. (1970), existe relação entre o tamanho das sementes e a necessidade de luz para germinação. 28

Sementes grandes estão associadas com hábitats sombreados (Leishman et al., 2000), enquanto que as de pequeno tamanho são associadas com hábitats abertos (Leishman & Westoby, 1994; Seiwa & Kikuzawa, 1996), habitat característico dos campos rupestres, ecossistema onde a maiorias das espécies do gênero Drosera são encontradas. A germinação das sementes das espécies de Droseras é do tipo epígea e a plântula é fanerocotiledonar. Os cotilédones são funcionais, foliáceos e fotossintetizantes, como observado também por Diels, (1906); Stevens (2001) e Watson & Dallwitz (1992), pois durante a germinação seus cotilédones são visíveis e elevados acima do nível do solo e expandem-se liberando o tegumento (Cavichiolo; Boerger; Marques, 2009). Geralmente, a germinação inicia-se a partir 10º dia e se estende até o 20º dia com a protrusão e expansão da radícula e subsequente elevação do hipocótilo. Inicialmente, os cotilédones permanecem envoltos pelo tegumento e aproximadamente após 15 dias a plântula libera e abre os cotilédones, iniciando-se o desenvolvimento dos eofilos (Figura 5). Os cotilédones das espécies estudadas são de cor verde, opostos, cordiformes, membranáceos, com base truncada, ápice retuso e margens inteiras. A raiz primária, inicialmente, é de cor branca e pilosa, sendo o hipocótilo longo, cilíndrico, verde claro e glabro. Esse tipo de desenvolvimento das plântulas, bem como a morfologia dos cotilédones e eofilos, são típicos de espécies heliófilas (Vogel, 1980). Tais características representam vantagens estratégicas para as espécies em ambientes abertos. Uma vez que proporcionam um rápido desenvolvimento inicial, pouco dependente das reservas das sementes, quando comparadas às espécies que possuem cotilédones de reserva (Gogosz, 2013). A função de órgão fotossintetizante ligada aos cotilédones é característica essencial para a classificação quanto à estratégia de regeneração, estando diretamente ligada a espécies heliófilas ou colonizadoras de habitat efêmeros com maior disponibilidade de luz em clareiras naturais (Vogel, 1980; Ferreira & Borghetti, 2004), coincidindo com a frequente condição ecológica observada para as espécies. Para melhor entendimento, dividiu-se todo processo de germinação em fases. Na primeira fase da germinação, onde as sementes já se encontravam intumescidas, a testa desprendeu-se, entretanto o tégmen permaneceu aderido ao albúmen. A raiz primária de coloração esbranquiçada, espessa e lisa, rompeu o tegumento na região basal da semente, próximo ao hilo (Figura 5A). A segunda fase 29 ficou evidenciada pelo crescimento do hipocótilo e das raízes secundárias, 14 dias após a semeadura (Figura 5B). Na terceira fase observou-se o surgimento dos cotilédones, com o tegumento ainda aderido a plântula (Figura 5C). A quarta fase caracterizou-se pela emissão dos primórdios foliares, que ocorreu 16 dias após a semeadura (Figura 5D). As plântulas apresentavam raízes secundárias evidentes e numerosas próximas ao colo, de coloração marrom claro; hipocótilo verde-esbranquiçado, reto, cilíndrico e glabro; dois cotilédones opostos, iguais, persistentes, coloração verde-clara, cilíndrico. Na quinta fase (Figura 5E), as folhas já modificadas, apresentaram tentáculos e mucilagem.

0 – 12 dias 14 dias 15 dias 16 dias 18 dias tg tg tg prf ct

hp hp hp fm rd rd rd rp rs A B C D pr E Figura 5. Estádios de desenvolvimento de plântulas de Drosera schwackei. Na ordem, protrusão da radícula (A), crescimento da radícula (B), emissão de cotilédones, plântula com protófilos fechados (C), desprendimento do tegumento e abertura dos cotilédones (D), plântula já com folhas modificadas em armadilhas (E). Legenda: ct – Cotilédone; fm – folhas modificadas; hp – Hipocótilo; prf – Primórdios foliares; rd – Radícula; pr – Pelos radiculares rp – Raiz primária; rs – Raiz secundária; tg – Tegumento.

Na Figura 6 podemos observar com detalhes uma plântula normal e suas partes constituintes. Braga et. Al., (2013) reforçam que é de extrema importância conhecer as características biométricas de sementes e plântulas, como subsídio a diferenciação de espécies no nível de gênero, na relação desta variabilidade com os fatores ambientais. Foram realizadas as medições em plântulas normais de cada espécie estudada, que podem ser observadas na Figura 7. Assim como suas respectivas sementes, D. hirtella e D. montana, apresentaram plântulas menores (1,70 mm e 1,94 mm). A D. hirtella apresentou o hipocótilo reduzido, 0,53 mm e a D. montana radícula reduzida, 0,40 mm, porém, suas partes áreas não apresentaram significativas diferenças entre as demais espécies. A D. schwackei apresentou plântulas maiores, assim como sua parte aérea, hipocótilo e radícula. 30

D C

Figura 6. Partes constituintes de uma plântula normal de D. latifolia. A- Radícula; B- Hipocótilo; C- Parte aérea; D- Tegumento.

ct ct ct hp ct hp hp hp rd rd A B rd C rd D Figura 7. Partes constituintes de uma plântula normal. A- D. hirtella; B- D. latifolia; C- D. montana; D- D. schwackei. Legenda: ct – Cotilédone; hp – Hipocótilo; rd – Radícula.

A descrição do processo germinativo, juntamente com a morfologia de plântulas, constitui importante elemento de reconhecimento de espécies. Há necessidade de contínuos estudos voltados ao processo germinativo e estádios iniciais de espécies da família Droseraceae, pois se trata de uma importante família nos campos rupestres.

Germinação das sementes

As sementes das quatro espécies de Drosera necessitaram de luz para iniciarem o processo de germinação tendo resposta nula de germinação quando mantidas no escuro, o que as caracteriza como fotoblásticas positivas. 31

Observou-se que as espécies de Drosera apresentam sementes pequenas e fotoblásticas positivas, sendo capazes de germinar apenas nas camadas superficiais do solo, onde são expostas à luz, que é necessária para a quebra da fotodormência. Outros estudos mostram que sementes pequenas de espécies de campos rupestres, como espécies do gênero Syngonanthus, apresentam comportamento fotoblástico positivo (Sá e Carvalho & Ribeiro, 1994; Garcia & Diniz, 2003), o que sugere um padrão germinativo para as espécies desse tipo de ambiente. Assim como algumas espécies de sempre-viva, como Syngonanthus elegans, Syngonanthus venustus e Syngonanthus elegantulus, as espécies de Drosera crescem em diferentes condições edáficas, habitando solos secos, úmidos e até alagados, mas sempre expostas a sol e alta luminosidade. Para o gênero Drosera, o pequeno tamanho das sementes e a necessidade de luz para germinação podem ser considerados estratégias adaptativas a ambientes abertos, expostos ao sol, como os campos rupestres (Scatena et al., 1999). As diferentes temperaturas influenciaram na germinação das sementes de todas as espécies estudadas. Porcentagens superiores de germinação, para todas as espécies foram obtidas a 20°C e 25°C, sendo inferior nas temperaturas de 15°C e 30°C (Tabela 2), exceto para D. latifolia, que apresentou porcentagem de germinação intermediária sob a temperatura de 30°C. A faixa de temperatura ótima para maioria das espécies situa-se entre 20°C e 30ºC (Melo Junior et al., 2018), estendendo-se até os 35ºC. Salienta-se que sob temperaturas altas, a velocidade de absorção de água e as atividades enzimáticas tornam-se mais elevadas fazendo com que as sementes germinem rapidamente (Carvalho & Nakagawa, 2012).

Tabela 2 - Germinação (G) e índice de velocidade de germinação (IVG) em diferentes temperaturas (°C) para as espécies de Droseras ex vitro. Temperatura (ºC) G (%) IVG Início G (dias) D. hirtella 15 4ab 0.07ab 20 5ab 0.11ab 22 25 8a 0.18a 30 2b 0.03b CV (%) 21.31 7.20 D. latifolia 15 28c 0.57d 20 94a 3.60b 10 25 94a 4.53a 32

30 63b 1.75c CV (%) 13.61 9.93 D. montana 15 4b 0.07b 20 24a 0.59a 14 25 22a 0.58a 30 2b 0.04b CV (%) 26.21 25.54 D. schwackei 15 9b 0.18c 20 74a 1.73b 12 25 72a 2.14a 30 12b 0.21c CV (%) 23.02 22.06 Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

No estabelecimento ex vitro de sementes de Drosera hirtella, o início da germinação ocorreu aos 22 dias após a semeadura. O maior percentual de germinação ocorreu a 25ºC de temperatura, demonstrando baixa germinação. A 30ºC a germinação foi quase nula (2%). O IVG (índice de velocidade de germinação) para D. hirtella teve o mesmo comportamento da germinação, aumentou sob temperatura a 25 ºC e diminuiu a 30ºC (Tabela 2). Assim como a germinação ex vitro e na germinação in vitro, o percentual de germinação foi inferior, com relação às outras espécies estudadas (Tabela 3).

Tabela 3 - Germinação (G) e índice de velocidade de germinação (IVG) em diferentes temperaturas (°C) para as espécies de Drosera in vitro. Temperatura G (%) IVG Início G (dias) D. hirtella 15 2a 0.04ab 20 5a 0.09a 22 25 5a 0.09a 30 2a 0.03b CV (%) 53.07 47.40 D. latifolia 15 22b 0.40c 20 93a 3.76a 10 25 91a 4.09a 30 90a 2.97b CV (%) 5.78 7.06 D. montana 15 6b 0.11c 33

20 37a 1.08a 14 25 11b 0.34b 30 3b 0.07c CV (%) 34.38 33.29 D. schwackei 15 33b 0.69c 20 86a 3.32ab 10 25 85a 3.66a 30 77a 2.74b CV (%) 9.88 13.57 Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

A germinação de D. montana ex vitro iniciou a partir do 14º dia, semelhante a D. hirtella em comparação com as demais espécies, apresentou baixa germinação. Temperaturas extremas de 15ºC e 30ºC promoveram menor germinação (Tabela 2). A maior porcentagem de germinação foi observada a 20ºC e 25ºC. O IVG das sementes de D. montana nas temperaturas 20ºC e 25ºC foram maiores em relação as outras temperaturas. De acordo com Melo Junior et al. (2018) a velocidade de germinação é um bom índice para avaliar a ocupação de uma espécie em um determinado ambiente, pois a germinação rápida é característica de espécies, cuja estratégia é de se estabelecer no ambiente o mais rápido possível, aproveitando condições ambientais favoráveis. A germinação in vitro de D. montana em temperatura de 20ºC pode ser observada maior porcentagem que os demais tratamentos (Tabela 3). O IVG teve o mesmo comportamento da germinação, com maiores valores a 20ºC. As sementes apresentaram capacidade germinativa em limites bem definidos de temperatura, o que segundo Probert, (1992), determina os padrões de distribuição das espécies. A porcentagem de germinação de D. hirtella e D. Montana foi considerada inferior em comparação as outras espécies estudadas, nas duas condições (ex vitro e in vitro), as sementes também se apresentaram menores e leves, com menor peso, tamanho e massa seca, o que pode estar relacionado ao seu estabelecimento devido a uma menor reserva energética (Oliveira; Scheleder; Favero, 2006). Essa menor taxa germinativa poderia estar relacionada também à ausência de algum fator específico que desencadeia a germinação em massa. Por exemplo, como essas espécies têm o ciclo rápido, seria vantajoso para elas germinarem na época que garantiria maiores chances de sucesso das plântulas desenvolverem-se. Como as sementes são liberadas no fim da época seca (caracterizada pela diminuição do fotoperíodo - outono), pode ser possível que as 34 sementes possuem uma forma de detectar o aumento do fotoperíodo para germinarem na época mais favorável. Segundo Borghetti & Ferreira (2004), o tempo médio de germinação de cada espécie é uma estratégia para que ela se estabeleça num determinado ambiente, aproveitando as condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento de novos indivíduos. A espécie D. latifolia em condições ex vitro, teve a germinação iniciada n 10º dia e dentre todas estudadas, foi a que apresentou maior porcentagem de germinação. A porcentagem final de germinação foi elevada e semelhante na faixa de 20ºC a 25 ºC (Tabela 2) e a menor porcentagem foi verificada na temperatura de 15ºC. Maior IVG a 25 ºC. Outra geminação semelhante foi observada nas condições in vitro de D. latifolia, exceto na temperatura a 30 ºC, onde ela apresentou uma porcentagem maior que na germinação ex vitro, provavelmente condicionado pela estabilidade da umidade nas condições in vitro. Nas sementes expostas às temperaturas de 30ºC foi observado um alto índice de plantas anormais, que é um indicativo de perda da viabilidade nessa temperatura. Sementes de várias espécies do cerrado germinam entre 10ºC e 45ºC (Felippe & Silva 1984). Entretanto, altas temperaturas, como 35ºC, podem reduzir significativamente a taxa de germinação em algumas Melastomataceae, como na Tibouchina grandifolia, T. benthaminae e T. moricandiana (Andrade 1995). Também foram observadas alterações na morfologia das plântulas de Maquira sclerophylla (Moraceae) submetidas a 35ºC (Miranda & Ferraz 1999). Estas alterações incluem a formação de raiz primária pouco desenvolvida e com extremidade necrosada, pouca ou nenhuma raiz secundária, epicótilo atrofiado, eófilos reduzidos e/ou necrosados. A germinação in vitro das sementes de D. latifolia deu início no 10º dia e apresentou uma taxa superior a 90% nas temperaturas entre 20ºC, 25ºC e 30ºC (Tabela 3). O IVG foi menor na temperatura a 15ºC e maior a 20 e 25ºC. A espécie D. schwackei assim como D. latifolia, apresentou porcentagem final de germinação elevada, maior que 70%, nas temperaturas de 20ºC e 25ºC, iniciando o processo no 12º dia, na condição ex vitro. Nas temperaturas extremas de 15ºC e 30ºC houve uma redução da germinação (Tabela 2). Verificou-se maior IVG a 25ºC e menor a 15ºC e 30ºC, apresentando-se quase nulo na faixa de temperatura mais baixa. A germinação de sementes D. schwackei in vitro deu início no 10º dia, após a montagem do teste. A porcentagem de germinação foi superior que na condição ex vitro. Ela apresentou larga amplitude de germinação, com maior porcentagem a 20ºC, 35

25ºC e 30ºC (Tabela 3). O IVG foi distinto em todas as temperaturas, com valor mais elevado a 25ºC. A germinação de D. latifolia e D. schwackei ocorreu em uma faixa de temperatura mais ampla (20ºC a 30ºC), condições também observadas para espécies de Eriocaulaceae e Velloziaceae, famílias com grande representatividade nos campos rupestres (Garcia & Diniz 2003). A temperatura de 25ºC pode ser considerada ótima para germinação de todas as espécies estudadas. Houve um decréscimo no percentual de germinação na temperatura de 15ºC e 30ºC. Em temperaturas mais baixas, as sementes iniciaram a germinação mais tarde, devido à diminuição da sua atividade metabólica, retardaram a velocidade do processo germinativo (Marcos Filho, 2015). É conhecido que temperaturas elevadas alteram a permeabilidade das membranas e promovem desnaturação de proteínas necessárias à germinação, enquanto que baixas temperaturas retardam as atividades metabólicas, propiciando, assim, a redução no percentual de germinação e atraso no processo germinativo (Bewley & Black 1994). O fato de as altas temperaturas inibirem o processo germinativo das espécies de Droseras pode estar relacionado com a sua ocorrência em hábitats alagados. Alta umidade dos solos causa diminuição na amplitude de flutuações térmicas (Klips & Peñalosa 2003), o que pode afetar a resposta germinativa das sementes destas espécies. Assumindo que as sementes correspondem a um conjunto organizado de células, cujo metabolismo depende essencialmente da atividade acoplada de diversas enzimas, seria esperado que, em determinadas temperaturas, a inativação de proteínas ocasionada por temperaturas extremas resultaria em um desequilíbrio metabólico que comprometeria a germinação (Marcos Filho, 2005). Isso pode, possivelmente, explicar a redução do percentual germinativo das sementes de D. latifolia, D. hirtella, D. montana e D. schwackei submetidas a 15ºC e 30ºC. Na maioria das sementes a temperatura influencia a velocidade e a porcentagem de germinação, pois altera a velocidade de absorção de água e das reações metabólicas das reservas necessárias para a sobrevivência da plântula (Baskin & Baskin1988; Bewley & Black 1994). Os resultados sugerem que o endemismo de D. hirtella, D. montana, D. latifolia e D. schwackei pode ser determinado pelas características germinativas de suas sementes, uma vez que necessita de condições ambientais muito específicas para o início do processo germinativo e estabelecimento da nova plântula. 36

O conhecimento dos fatores como luz e temperatura, que regulam pequenas populações é crítico para a conservação de espécies raras (Quilichini & Debussche 2000; De Lange & Norton 2004) e é fundamental para o entendimento da dinâmica das espécies vegetais e da comunidade (Brown et al. 2003). Os dados e informações do presente trabalho são relevantes para subsidiar programas de reabilitação ambiental e conservação por meio da propagação por sementes de espécies nativas (ABNT 1998). Uma vez que o gênero Drosera, tem potencial para inúmeras áreas, seja ecológica, bioquímica, molecular ou até mesmo ornamental.

CONCLUSÕES

- As sementes de Drosera latifolia, Drosera hirtella, Drosera montana e Drosera schwackei germinam somente na presença de luz, sendo consideradas fotoblásticas positivas. - As sementes de todas as espécies estudadas germinam em uma estreita faixa de temperatura de 20ºC e 25°C. - As quatro espécies de Drosera estudadas apresentam sementes pequenas e leves, possuem testa reticulada e cor castanha escuro a preto. A germinação é do tipo epígea e a plântula é fanerocotiledonar.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ARTIGO CIENTÍFICO II: Criopreservação de sementes, germinação e desenvolvimento in vitro de Drosera schwackei (Droseraceae)

CRIOPRESERVAÇÃO DE SEMENTES, GERMINAÇÃO E DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE DROSERA SCHWACKEI (DROSERACEAE)

RESUMO: Um dos grupos mais vulneráveis à extinção é o das plantas carnívoras, por motivos tais como: a fragmentação e a destruição dos hábitats e suas exigências específicas quanto à qualidade ambiental. O presente estudo foi realizado com o objetivo de desenvolver um protocolo para germinação in vitro, desenvolvimento de plantas e criopreservação de sementes de Drosera schwackei (Droseraceae), espécie ameaçada de extinção .Foi realizado um experimento de desinfestação, em DIC em esquema fatorial 2x4 (duas concentrações de hipoclorito de sódio e quatro tempos de imersão), com quatro repetições. Foram avaliadas as variáveis: contaminação (fúngica e bacteriana), germinação e o índice de velocidade de germinação (IVG). A desinfestação das sementes de D. schwackei com solução de hipoclorito de sódio de 2% de cloro ativo com 10 minutos de imersão foi eficiente e estimulou a germinação. Foi realizado um teste de germinação, no qual as sementes foram inoculadas em diferentes concentrações do meio de cultura MS (MS1/3; MS1/2; MS100% dos sais e o controle – água/ágar). O cultivo in vitro de D. schwackei em meio MS1/3 e MS1/2 favoreceu a germinação in vitro de sementes e crescimento de plântulas. Também foram realizados dois experimentos para verificar o desenvolvimento in vitro das plântulas: diferentes concentrações de sais do meio MS (1/3; 1/2 e 100%) e meio de cultura MS1/3 dos sais suplementado com diferentes concentrações de BAP. Baixas concentrações de BAP favoreceram o crescimento das plantas in vitro. As sementes de D. schwackei foram armazenadas em criotubos e imersas em botijão contendo nitrogênio líquido (- 196ºC) e mantidas por 1, 6, 12, 24, 48, 120 horas, exceto o grupo controle que foi inoculado no mesmo dia. A criopreservação não interferiu no desenvolvimento e na morfologia das plantas em nenhum período de armazenamento. O musgo Sphagnum é o mais indicado para a aclimatização de plântulas de D. schwackei provenientes de cultivo in vitro.

Palavras-chave: Conservação; plantas carnívoras; micropropagação.

SEED CRYOPRESERVATION, GERMINATION AND IN VITRO DEVELOPMENT OF DROSERA SCHWACKEI 44

ABSTRACT: One of the most vulnerable groups to extinction is carnivorous plants, for reasons such as habitat fragmentation and destruction, and their specific requirements for environmental quality. The present study was carried out to acquire a protocol for in vitro germination, plant development and seed cryopreservation of endangered species Drosera schwackei (Droseraceae). A disinfestation experiment was carried out in a 2x4 factorial (two sodium hypochlorite concentrations and four immersion times), with four replications. The following variables were evaluated: contamination (fungal and bacterial), germination and germination speed index (GVI). The disinfestation of D. schwackei seeds with 2% sodium hypochlorite solution with 10 minutes of immersion was efficient and stimulated germination. A germination test was performed, where the seeds were inoculated in different concentrations of MS culture medium (MS1/3; MS1/2; MS 100% of salts and the control - water/agar). In vitro cultivation of D. schwackei in MS1/3 and MS1/2 media favored in vitro seed germination and seedling growth. Two experiments were also performed to verify in vitro development of seedlings: Different salt concentrations of MS medium (1/3; 1/2 and 100%) and MS1/3 supplemented with different BAP concentrations. Low BAP concentrations favored plant growth in vitro. Drosera schwackei seeds were stored in cryotubes and immersed in a canister containing liquid nitrogen (-196ºC) and kept for 1, 6, 12, 24, 48, 120 hours, except for the control group that was inoculated on the same day. Cryopreservation did not interfere with plant development and morphology in any storage period. Sphagnum moss is the most suitable for acclimatization of D. schwackei seedlings from in vitro cultivation.

Keywords: Conservation; carnivorous plants; micropropagation.

INTRODUÇÃO

O gênero Drosera L. possui aproximadamente 250 espécies descritas, com presença em todos os continentes (Fleischmann et al., 2018). No Brasil, ocorrem 32 espécies do gênero, sendo que 20 são endêmicas (Gonella, 2019). Suas espécies apresentam emergências glandulares na face adaxial das folhas, cobertas por gotas de uma secreção mucilaginosa ácida e enzimática, que responsáveis pela captura de insetos (Juniper et al., 1989; Ellison & Adamec, 2018). 45

Há uma crescente valorização econômica das espécies de Drosera, associada à importância ornamental dessas plantas. Elas também são amplamente utilizadas na medicina popular. Seus extratos são incluídos em preparações herbais usadas na terapia de infecções do trato respiratório (Egan & Van der Kooy, 2013). Acredita-se que as propriedades terapêuticas resultem da presença de compostos bioativos que podem ser usados na produção de drogas farmacêuticas (Banasiuk et al., 2012). Um dos grupos mais vulneráveis à extinção é o das plantas carnívoras, por motivos tais como a fragmentação e a destruição dos seus hábitats (IUCN, 2015), bem como sua grande exigência quanto à qualidade ambiental (Ferreira et al., 2013). Como agravante, estima-se que aproximadamente 80% das espécies de plantas carnívoras conhecidas, cerca de 750, ainda não compõem a Lista Vermelha de Espécies Ameaçadas de Extinção da International Union for Conservation of Nature (IUCN). Isso dificulta a elaboração de estratégias de conservação (IUCN, 2015), pois essa vulnerabilidade torna-se mais grave no caso de espécies que são endêmicas e com distribuição restrita, como a Drosera schwackei. A Drosera schwackei apresenta distribuição restrita a algumas localidades de Minas Gerais e está ameaçada de extinção, principalmente, por apresentarem populações pequenas, geralmente em locais de atividades ligadas à agricultura, à pecuária, à produção de energia e à mineração. Esses locais estão expostos a poluição e a urbanização (Rivadavia, 2008; Gonella, 2012). A compreensão detalhada de características relacionadas à sobrevivência, crescimento, reprodução e competição de populações de plantas em respectivos hábitats é um pré-requisito para o desenvolvimento de estratégias eficazes para a sua conservação (Martinez-Sanchez et al., 2011; Münzbergová, 2005; Schemske et al., 1994). Em particular, a preservação de espécies ameaçadas é uma tarefa urgente para a manutenção da biodiversidade (IUCN, 2013). Embora as sementes nativas de qualidade sejam reconhecidas como a forma mais viável para acelerar o estabelecimento de plantas em um ambiente degradado, seja por meio da semeadura direta ou da produção de mudas, nem sempre a procedência, disponibilidade ou manejo e uso delas são consideradas em investimentos de restauração ambiental. Sendo assim, é comum que a falta de conhecimento de aspectos da tecnologia de sementes de determinadas espécies nativas acabe por impedir ou atrasar o processo de restauração ambiental. 46

De acordo com Lédo et al. (2007), a germinação in vitro é a forma mais comum de estabelecimento de material e apresenta algumas vantagens como explantes mais viáveis e responsivos. Assim, o uso de técnicas de cultivo in vitro pode melhorar a taxa de germinação em menor período de tempo, utilizando menos espaço para obtenção de mudas mais uniformes e melhor qualidade fitossanitária (Carvalho et al., 2012). É crescente a necessidade de otimizar a propagação in vitro de diversas espécies, visando também sua conservação a longo prazo em criobancos (Oliveira- Filho, 1994; Souza, 2003). A técnica de criopreservação tem sido vista como uma ferramenta promissora para o armazenamento em longo prazo dos recursos genéticos vegetais (Santos, 2000). Além de oferecer algumas vantagens como inibir totalmente as reações químicas, que podem causar danos às células (Mazur, 1984) e a ação dos agentes internos e externos que podem afetar a integridade das sementes, mantendo também a integridade genética do material criopreservado (Stanwood, 1985). Sobre isso, Gonzaga et al. (2003) afirmam que o método de criopreservação é o que melhor que se adapta para o armazenamento de sementes ameaçadas de extinção, principalmente para o seu metabolismo, permitindo recuperá-las posteriormente. As sementes são a maneira natural das plantas propagarem-se no ambiente de origem, e, com elas, é possível a manutenção da espécie por longos períodos de tempo. Programas de melhoramento genético visam aperfeiçoar técnicas que elevam e mantenham a qualidade do material biológico, fazendo com que haja um prolongamento no que tange a longevidade da semente de forma previsível (Santos, 2000). Para isso, estabelecer bancos de sementes para a preservação de espécies ameaçadas de extinção é de suma importância (Suzuki et al., 2015). Tendo isso em vista, o presente estudo foi realizado com o objetivo de desenvolver um protocolo para germinação in vitro, desenvolvimento de plantas e criopreservação de sementes de Drosera schwackei.

MATERIAIS E MÉTODOS

(UFVJM). Foram utilizadas sementes de Drosera schwackei coletadas no Parque Estadual do Biribiri (PEBI), entre os meses de março a maio de 2018. As sementes foram coletadas e armazenadas em câmara fria (10 ºC e 50% UR), até se obter uma quantidade adequada para iniciar os testes.

Desinfestação de sementes

O experimento foi realizado em DIC em esquema fatorial 2x4 (duas concentrações de hipoclorito de sódio e quatro tempos de imersão), com quatro repetições, contendo 30 sementes por repetição. As sementes foram levadas à câmara de fluxo laminar e a desinfestação superficial iniciou-se pela imersão em solução de etanol a 70% (v/v), por 1 minuto. Em seguida, foram efetuados os tratamentos que consistiram em diferentes tempos (1, 3, 5 ou 10 minutos) de imersão em solução de hipoclorito de sódio (NaOCl), em duas distintas concentrações de cloro ativo 1,0% e 2,0% (v/v), seguida de quatro enxágues das sementes em água destilada e esterilizada em autoclave. Após a desinfestação, foi conduzido o teste de germinação. Um total de 30 sementes de cada tratamento foi distribuído em placa de petri com meio MS (Murashige e Skoog, 1962) de meia força (metade da concentração de sais), sem reguladores de crescimento. As placas foram mantidas a 25 °C ± 2 °C com fotoperíodo de 16 horas e densidade de fluxo luminoso de 36 μmol m-2 s-1. Foram avaliadas as variáveis: contaminação (fúngica e bacteriana), germinação (%) e o índice de velocidade de germinação (IVG). A avaliação do número de sementes contaminadas e germinadas foi feita diariamente por um período de 30 dias (Maguire, 1962).

Germinação in vitro

No ensaio visando à germinação in vitro de Drosera schwackei, efetuou-se, primeiramente, a desinfestação pela imersão das sementes em solução de etanol a 70% (v/v) por 1 minuto, sucedida pela imersão em solução de hipoclorito de sódio a 2,0% (v/v) durante 10 minutos. Posteriormente, foram realizados quatro enxágues das sementes em água destilada e esterilizada em autoclave. As sementes foram inoculadas em diferentes concentrações do meio de cultura MS (MS1/3; MS1/2; MS100% dos sais 48

e o controle – água/ágar), acrescidas de 30g L-1 de sacarose e 7 g L-1 de ágar. O pH do meio foi ajustado para 5,8 antes da autoclavagem a 121 ºC durante 20 minutos. Após a inoculação, as sementes foram mantidas em câmara de crescimento com densidade de fluxo luminoso de 36 μmol m-2 s-1, temperatura de 25 °C ± 2 °C e fotoperíodo de 16 horas. O experimento foi montado com 4 tratamentos e quatro repetições, sendo 1 placa de petri com 50 sementes por repetição. A avaliação da germinação foi realizada diariamente por 30 dias, registrando-se a porcentagem de sementes germinadas em cada tratamento e o Índice de Velocidade de Germinação (IVG) calculado segundo Maguire (1962). Após 30 dias, avaliou-se o comprimento da parte aérea das plântulas germinadas com auxílio do paquímetro digital.

Desenvolvimento de plântulas

As plântulas obtidas a partir do teste de germinação (Figura 1) foram subcultivadas em meio MS, nos diferentes tratamentos. Realizou-se 2 experimentos para verificar o desenvolvimento in vitro das plântulas: 1- Diferentes concentrações de sais do meio MS (1/3; 1/2 e 100%); 2- Meio de cultura MS1/3 dos sais suplementado com diferentes concentrações de BAP (6-benzilamino-purina).

DESINFESTAÇÃO GERMINAÇÃO

ACLIMATIZAÇÃO SELEÇÃO DE PLÂNTULAS DESENVOLVIMENTO DAS SUBCULTIVO PLÂNTULAS

Figura 1. Processo completo do desenvolvimento in vitro de D. schwackei.

No primeiro experimento, as plântulas ao atingirem 1 cm ± 0,5 de altura, foram subcultivadas em tubos de ensaio contendo meio de cultura MS, com diferentes concentrações de sais (1/3; 1/2; 100% e o controle – água/ágar), com quatro repetições por tratamento, sem reguladores de crescimento. Na condução do segundo experimento, as plântulas foram subcultivadas em tubos de ensaio com meio de cultura MS 1/3 dos sais, suplementado com reguladores de crescimento, uma auxina (ácido naftalenoacético-ANA) na concentração de 0.2 mg.L-1 e quatro concentrações da citocinina BAP (6-benzilamino-purina). Os tratamentos consistiram de concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0 e 1,5 mg.L-1) com quatro repetições por tratamento. Nos dois experimentos, cada repetição foi composta por seis tubos de ensaio, contendo uma plântula em cada, totalizando 96 tubos. Os meios de cultura foram acrescidos de 30g L-1 de sacarose e 7 g L-1 de ágar. O pH do meio foi ajustado para 5,8 antes da autoclavagem a 121ºC durante 20 minutos. Após o transplantio das mudas na câmara de fluxo laminar, os tubos foram transferidos para sala de crescimento com temperatura de 25 °C ± 2 °C e fotoperíodo de 16 horas, durante 6 semanas, após o qual a altura da parte aérea, número de folhas, número de raízes, comprimento da maior raiz e número de brotos foram registrados.

Aclimatização

Realizou-se um ensaio para avaliação do comportamento e sobrevivência das plantas ex vitro. As plantas oriundas da primeira fase do experimento de desenvolvimento in vitro, de aproximadamente 16 semanas, foram transferidas para copos plásticos, contendo quatro diferentes tipos de substratos, dispostos em uma bandeja. Os substratos utilizados foram: Plantmax® (substrato comercial), fibra de coco com vermiculita (70% fibra de coco+30% vermiculita), casca de arroz com vermiculita (70% casca de arroz+30% vermiculita) e o musgo Sphagnum. A bandeja foi coberta com plástico filme no início, para aumentar a umidade relativa. As plantas foram irrigadas com auxílio de uma piceta com água destilada, diariamente e pré acondicionadas em BOD sob temperatura a 25°C e luz constante, por cerca de 60 dias.

Criopreservação de sementes

Foi avaliado o teor de água das sementes antes de serem congeladas em nitrogênio líquido (-196ºC). A avaliação foi realizada de acordo com método da estufa a 105°C (Brasil, 2009), utilizando cinco subamostras com 100 sementes cada. As sementes foram pesadas em balança analítica para obter o peso fresco. Em seguida, as amostras foram mantidas em estufa a 105ºC por 24 h e pesadas novamente para obter o peso seco. As sementes de D. schwackei foram armazenadas em criotubos e imersas em botijão contendo nitrogênio líquido (- 196ºC) e mantidas por 1, 6, 12, 24, 48, 120 horas, exceto o grupo controle que foi inoculado no mesmo dia. A manutenção das sementes em nitrogênio líquido foi realizada no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da UFVJM. Após a conclusão de cada período de armazenamento, os criotubos contendo as sementes foram removidos do nitrogênio líquido e descongelados à temperatura ambiente por uma hora. A etapa seguinte foi a desinfestação em fluxo laminar no qual as sementes foram imersas por um minuto em etanol (70%) e por dez minutos em hipoclorito de sódio (2,0% de cloro ativo), na sequência foram realizadas quatro lavagens com água estéril. As sementes foram inoculadas em placas de Petri contendo meio Murashige e Skoog (Murashige & Skoog, 1962) com metade das concentrações salinas (MS 1/2) suplementado com 30g L-1de sacarose e 7 g L-1de ágar. O pH do meio nutritivo foi ajustado entre 5,6 e 5,8 e, em seguida, esterilizado em autoclave por 20 min a 121 ºC. As unidades experimentais foram mantidas em sala de crescimento a 25 °C ± 3ºC sob luz branca fluorescente (fluxo luminoso de 36 μmol m-2 s-1) e fotoperíodo de 16h por 30 dias. A porcentagem de germinação das sementes foi avaliada por 30 dias após a inoculação. As variáveis analisadas consistiram em percentual de germinação (%G) e índice de velocidade de germinação (IVG). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC) com quatro repetições de 25 sementes cada.

Analise Estatística

Os experimentos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do programa estatístico “R” versão 3.5.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Desinfestação das sementes

Não houve diferenças significativas entre os tratamentos com diferentes concentrações e tempos de imersão com hipoclorito de sódio, para a análise de contaminação. Houve interação entre os fatores tempo de imersão e concentração de hipoclorito de sódio para germinação e índice de velocidade de germinação (Tabela 1). As desinfestações dos tratamentos 1,0% e 2,0%, em 1, 3, 5 e 10 minutos de imersão, foram eficazes para controlar a contaminação, não apresentando nenhum indício de contaminação via propágulo. De acordo com Barrueto Cid e Zimmermann (2006), o hipoclorito de sódio é o produto mais eficiente na desinfestação de explantes.

Tabela 1. Germinação (%) e Índice de velocidade de germinação (IVG) in vitro de sementes de D. schwackei em função das concentrações de hipoclorito de sódio (% de cloro ativo) e diferentes tempos de imersão. 1% 2% Tempo (min) G% IVG G% IVG

1 70a 1,37b 85a 1,74b 3 85a 1,73a 95a 2,11ab 5 73a 1,63ab 93a 2,03ab 10 80a 1,60ab 99a 2,44a CV(%) 9,3 8,56 7,95 10,62 * Médias seguidas pelas mesmas letras na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.

Pôde ser verificado uma maior porcentagem de germinação das sementes, com o aumento das concentrações de hipoclorito e do tempo de imersão. Numericamente, o maior tempo de imersão somado a maior concentração do hipoclorito de sódio, proporcionou a maior porcentagem de germinação, representando um acréscimo de 30% sobre o percentual de germinação do tratamento com menor concentração e tempo de imersão. Maiores valores de IVG também foram observados nos tratamentos de maior concentração e tempo de imersão (Tabela 1). A maior porcentagem de germinação foi observada no tratamento de 2% e 10 minutos de imersão, o mesmo foi observado por Galvanese et al. (2007), no qual os períodos maiores de imersão em hipoclorito de sódio tiveram alta eficiência em sua 52 pesquisa, ao analisar a desinfestação das sementes de espécies do gênero Aechmea (Bromeliaceae). O início da germinação se deu no décimo dia para todos os tratamentos e seguiram a mesma tendência ao longo do tempo, com germinação sempre crescente. Resultados que Silva (2010) também observou uma melhora na desinfestação e germinação com concentrações mais elevadas e maiores tempos de imersão em hipoclorito de sódio, sendo o melhor resultado observado no tratamento com hipoclorito de sódio a 5% por 20 minutos, com até 0% de contaminação das sementes. Segundo Rocha (2005), o hipoclorito de sódio é um potente oxidante e sua ação pode ser resultante de modificações nas propriedades das membranas celulares do tegumento ou no fornecimento de oxigênio adicional para a semente. Isso faz com que haja um aumento da germinação. O que pode explicar o fato dos tratamentos com 2% de hipoclorito de sódio, imersos por um período de 10 minutos, apresentarem germinação superior ao tratamento com 1% de hipoclorito de sódio, em um menor tempo de imersão. Provavelmente, essas concentrações mais elevadas com maior tempo de exposição das sementes, tenham aumentado a permeabilidade do tegumento das sementes de D. schwackei, promovendo maior germinação. As concentrações de cloro ativo não afetaram o vigor das sementes de D. schwackei mensurado pelo índice de velocidade de germinação (Tabela 1). A desinfestação de sementes é uma importante etapa para o estabelecimento da propagação in vitro, uma vez que o insucesso dessa fase compromete todo o seu material. Por isso que diversos autores têm analisado a melhor forma de proceder na fase de desinfestação (Galvanese et al., 2007; Pereira et al., 2008; Aoyama et al., 2012). Até o presente momento, não há protocolo de desinfestação desenvolvido para as espécies estudadas.

Germinação in vitro

As concentrações de sais no meio de cultura influenciaram a porcentagem de germinação de D. schwackei. As sementes iniciaram a germinação no 10º dia, em todos os tratamentos. A maior germinação das sementes foi observada no meio MS1/2 e MS1/3 dos sais (Tabela 2). Estes resultados estão de acordo com Pêgo et al. (2013), que observaram menor germinabilidade de sementes de Syngonanthus elegantulus 53

(Eriocaulaceae), espécie nativa de campos rupestres, com maiores concentrações de sais no meio MS. O meio MS contém 14 sais na sua composição e é o mais concentrado, o que pode ter afetado a percentagem de germinação das sementes, o IVG e o comprimento das plântulas de D. schwackei, por causa da pressão osmótica, fato este observado nos resultados deste trabalho. A diminuição da concentração de sais proporcionou as maiores taxas de germinação. Concentrações médias de sais no meio favorecem a germinação da semente e o comprimento das plântulas. Concentrações menores dos sais proporcionam menor pressão osmótica que a de um meio rico em nutrientes, favorecendo, assim, a absorção de água pela semente e, consequentemente, sua germinação. Em trabalho realizado por Reis et al. (2008), as concentrações dos sais do meio MS influenciaram significativamente a germinação de sementes de Melissa officinalis (Lamiaceae). O vigor das sementes, avaliado pelo IVG, também apresentou comportamentos distintos, em função das concentrações do meio de cultura. O menor IVG foi observado na maior concentração de 100% dos sais.

Tabela 2 – Valores médios da percentagem de germinação (%G), índice de velocidade de germinação (IVG) e altura da parte aérea de plântulas (mm) em função das diferentes concentrações de sais do meio MS. Meios G (%) IVG Comprimento de plântula (mm) Ágar 86ab 3.34a 2,94c MS 1/3 93a 3.25a 4,39a MS 1/2 96a 3.56a 3,61b MS 100% 77b 2.32b 2,79c CV (%) 7,78 9,63 6,92 * Médias seguidas pelas mesmas letras na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a5% de probabilidade.

Em relação ao comprimento de plântulas, houve diferenças nos resultados de acordo com as concentrações de sais. Diretamente proporcional as taxas de germinação, no meio de cultura sem suplementação de sais ou na concentração mais elevada destes, a plântula apresentou tendência de menor crescimento. No meio composto de apenas com água e ágar e no meio com maiores concentrações de sais, houve menor desenvolvimento da plântula (Tabela 2). No desenvolvimento da plântula in vitro, apenas a água e ágar não são suficientes para a manutenção da plântula in vitro, 54 o uso do carboidrato e dos sais, mostra ser necessário para a suplementação do meio de cultura. Nos outros meios que têm suplementação média (MS1/3 e MS1/2), as plântulas apresentaram maior crescimento. Observa-se que a presença dos sais e do carboidrato mostrou ser necessária para a manutenção da plântula in vitro por um período mais longo (Figura 2). Assim como a falta de suplementação afetou o crescimento das plântulas, o alto teor de sais (MS100%) também reduziu o seu crescimento. Estes resultados assemelham-se com os de Pêgo et al. (2013) e Santos et al. (2006), pois estudando sempre-vivas (espécies também nativas dos campos rupestres), observaram que diminuir a concentração de sal no meio de cultura afetou positivamente o crescimento in vitro de Syngonanthus elegantulus e Comantera mucugensis. Estes resultados são provavelmente devido à adaptação da sempre-viva, assim como das Drosera, a solos rasos e pobres, característicos de campos rupestres, nos quais essas são encontradas.

1 2 3 4 Figura 2. Crescimento de plântulas em função da concentração de sais do meio MS aos 30 dias de cultivo. 1- Ágar/Água; 2- MS 1/3 de sais; 3- MS 1/2 de sais; 4- MS 100% dos sais.

A partir dos resultados observados pelas diferenças entre os tratamentos, recomenda-se o uso do MS1/3, tanto pelo bom desenvolvimento apresentado pelas plântulas, quanto pela economia de material, bem como pelo tempo de manutenção da plântula in vitro. A alta produção de sementes por fruto da espécie associada à elevada taxa de germinação in vitro, permite a obtenção de um grande número de indivíduos, sem a necessidade de multiplicação via indução de brotos laterais, geralmente associadas ao uso de reguladores de crescimento (Grattapaglia & Machado 1998; Droste et al. 2005). A propagação a partir de sementes permite a manutenção da variabilidade genética dos 55 indivíduos propagados, que se tornam primordiais para programas de conservação in situ, por meio da reintrodução em ambiente natural (Benson 1999; Pinto et al. 2010).

Criopreservação de sementes

O teor de água apresentado pelas sementes de D. schwackei foi de 20%. As sementes com baixo teor de água são mais propícias à criopreservação por reduzir a possibilidade de formação de cristais de gelo intracelulares durante o congelamento. A ruptura do sistema de endomembranas resulta em perda da permeabilidade seletiva e compartimentalização celular, causando danificação ao tecido vegetal (Santos, 2000; Goldfarb et al. 2010; Kaviani et al. 2009) e inviabiliza o desenvolvimento de uma nova planta. As sementes criopreservadas apresentaram porcentagens de germinação final acima de 80% para todos os tratamentos estudados, com exceção do controle. A porcentagem de germinação foi elevada e apresentou um resultado distinto. As sementes criopreservadas apresentaram maior porcentagem de germinação do que as sementes não criopreservadas, demonstrando que a temperatura negativa pode promover um estimulo à germinação, semelhante a uma quebra de dormência. Com relação ao início da germinação, todos os tratamentos, incluindo o tempo 0 (sementes não criopreservadas), iniciaram a germinação ao mesmo tempo, a partir do 11º dia. O tratamento que apresentou menor índice de velocidade de germinação foi o controle, diferindo significativamente das sementes armazenadas (Tabela 3). A criopreservação não interferiu no desenvolvimento e na morfologia das plantas em nenhum período de armazenamento. As plantas que germinaram emitiram raízes e folhas que apresentaram a coloração verde intensa (Figura 3). Os dados evidenciam que a exposição a nitrogênio líquido (-196ºC) não interferiu na qualidade fisiológica das sementes conservadas por até 120 horas. Segundo Chetverikova (2011), cerca de 86% dos trabalhos envolvendo criopreservação de sementes não apresentaram mudanças nas taxas germinativas, mesmo quando criopreservadas por períodos superiores a 360 dias. Além disso, alguns trabalhos com espécies nativas encontraram resultados favoráveis à criopreservação de sementes em cactáceas (Veiga-barbosa et al., 2010; Marchi et al., 2013; Bárbara et al. 2015), Caesalpinia leiostachya (Lacerda et al., 56

2002), Apuleialeio carpa (Salomão 2002), Bixaor ellana (Corlett, 2004), Jatropha curcas (Prada et al., 2015) e Zephyranthes sylvatica (Silva et al., 2014). Os dados apresentados reiteram que a criopreservação das sementes de D. schwackei pode ser uma alternativa viável para conservação da espécie em longo prazo.

Tabela 3 - Germinação de sementes de Drosera schwackei armazenadas em nitrogênio líquido (-196°C) por 0, 1, 6, 12, 24, 48 e 120 horas. Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem significativamente entre si pelo teste Tukey (p≤0,05).

Tempo (hora) G (%) IVG 0 75b 1,44b 1 95ª 2,01a 6 93ª 1,64ab 12 91ª 1,88ab 24 90ab 1,83ab 48 90ab 1,73ab 120 89ab 1,74ab CV (%) 7,50 11,74 * Médias seguidas pelas mesmas letras na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.

Diferentes estudos já relataram a ausência de efeitos negativos da criopreservação na germinação de sementes de diversas espécies, como por exemplo, Drosophyllum lusitanicum, Helianthus annuse Hymusloto cephalus (Gonçalves & Romano, 2009; Pérez-García e González Benito, 2008; Zaidi et al., 2010). Os resultados obtidos também indicam que a taxa de resfriamento gradual não é necessária, porque a imersão direta de criotubos com sementes no nitrogênio líquido não diminuiu as porcentagens de germinação das diferentes espécies. Este fato simplifica muito o processo de criopreservação e, significativamente, reduz os custos (Gonçalves & Romano, 2009; Zaidi et al., 2010). Portanto, a criopreservação é um método confiável e econômico para conservação de sementes de D. schwackei.

C D E

B B

A A

Figura 3. Plântulas normais obtidas da germinação de sementes de D. schwackei armazenadas em nitrogênio líquido (-196°C) por 120 horas. A- radícula; B- hipocótilo; C- cotilédones; D- tegumento; E- parte aérea.

Desenvolvimento de plantas in vitro e aclimatização

O cultivo de plântulas na presença de diferentes concentrações de macronutrientes não influenciou negativamente a sobrevivência das plântulas de D. schwackei, que foi de 100% em todos os tratamentos. Também não foram observadas clorose e necrose nas folhas das plântulas (Figura 4), mesmo nos meios com as menores concentrações de macronutrientes. Indicando que as plântulas não apresentaram deficiência de nutrientes reguladores de processos metabólicos, como nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio e enxofre (Taiz & Zeiger 2004; Marenco & Lopes 2011; Marschner 2012). Porém, a influência dos diferentes tratamentos pode ser observada em todos os parâmetros morfológicos avaliados nas plântulas.

A B C D

Figura 4. Crescimento in vitro de plantas de D. schwackei em diferentes concentrações de sais do meio de cultura MS. A- Ágar; B- 1/3; C- 1/2; D- 100%.

Os valores médios registrados para altura da parte aérea e número de folhas, foram significativamente maiores quando as plântulas foram cultivadas no meio MS1/3 (Tabela 4), bem como o número de raízes e comprimento da maior raiz. Os tratamentos com os meios MS1/2 proporcionaram plântulas com valores estatisticamente intermediários para número de folhas, número de raízes e comprimento da maior raiz, enquanto que o meio MS100% não se mostrou benéfico para o crescimento das plântulas, que apresentaram valores significativamente menores para todas as variáveis analisadas. No tratamento composto apenas de ágar e água, a altura da parte aérea, número de folhas produzidas, número de raízes e comprimento da maior raiz por plântula, foi significativamente menor no que os demais tratamentos com o meio MS, afirmando que, mesmo em concentrações menores, os macronutrientes são fundamentais para o desenvolvimento das plântulas de D. schwackei.

Tabela 4. Efeito das concentrações de sais do meio MS na altura da parte aérea (APA), número de folhas (NF), número de raízes (NR) e comprimento da maior raiz (CMR) de D. schwackei. Tratamento APA NF NR CMR T1= Ágar 3,10c 6,12d 1,37c 3,81b T2= 1/3 12,74 a 24,66 a 8,79a 9,30 a T3= 1/2 6,80b 14,87b 2,58b 7,89 ab T4= 100% 6,04 b 11,99c 1,87c 6,55b * Médias seguidas pelas mesmas letras na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.

Os resultados registrados para Vrieseain curvata (Bromeliaceae) corroboram com a constatação de que menores concentrações de macronutrientes beneficiam o crescimento e o desenvolvimento in vitro de diversas espécies (Torres et al., 1998), inclusive de bromeliáceas (Mercier & Kerbauy 1994; Tamakiet al., 2007; Kuritaet al., 2014; Martins et al., 2015), família de grande relevância nos campos rupestres. Indivíduos de Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker apresentaram maior crescimento da parte aérea, maior massa seca de raízes e da parte aérea em meio MS contendo de zero a 50% da concentração original de macronutrientes (Fráguas et al., 2002). Em relação à formação do sistema radicular nas plântulas de D. schwackei, as concentrações de macronutrientes menores do que a original no meio MS foram benéficas. O tratamento MS1/3 proporcionou maior número de raízes e maior 59 comprimento das raízes por plântula, e os tratamentos MS1/2 e MS100%, não diferiram significativamente entre si. O uso de meios com concentrações reduzidas de macronutrientes pode estimular a formação e o crescimento das raízes, como observado também por Grattapaglia & Machado (1998). Para a D. schwackei, o aumento gradativo da concentração de sais no meio MS levou ao decréscimo linear dos parâmetros morfológicos avaliados, sendo o meio com a menor concentração de sais (MS1/3) considerado adequado para o cultivo desta espécie. O habito carnívoro de D. schwackei pode ser um fator importante na menor exigência de nutrientes minerais. De modo geral, obtêm-se nutrientes por meio da captura e digestão de pequenos insetos, justificando, assim, os resultados observados. Tanto que se observa que o sistema radicular dessas plantas é subdesenvolvido, apresentando poucas ramificações, mas bastantes pelos radiculares, provavelmente pra aumentar a absorção de água. A resposta dos explantes D. schwackei para as diferentes concentrações da citocinina BAP são apresentados na Tabela 5. Com o aumento das doses de BAP, verificou-se uma progressiva redução em tamanho e número dos explantes, em todas as variáveis analisadas no meio MS1/3. As menores concentrações de BAP proporcionaram melhores resultados na altura da parte aérea, número de folhas, número de raízes e comprimento da maior raiz, verificando-se um comportamento linear decrescente, pois à medida que se aumentou a concentração de BAP, houve a redução dessas variáveis (Figura 6).

Tabela 5. Efeito das concentrações de BAP em meio MS 1/3 dos sais na altura da parte aérea (APA), número de folhas (NF), número de raízes (NR) e comprimento da maior raiz (CMR) de D. schwackei. Tratamento APA NF NR CMR T1= 0,0mg.L-1de BAP 16,75 a 18,83 a 11,16 a 5,29 a T2= 0,5mg.L-1de BAP 11,44 b 14,67 b 4,29 b 3,00 b T3= 1,0mg.L-1de BAP 8,91 bc 7,62 c 2,46 b 2,03 bc T4= 1,5mg.L-1de BAP 6,66 c 5,37 c 2,25 b 1,33 c * Médias seguidas pelas mesmas letras na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.

Nenhum dos tratamentos promoveu a formação de brotos, por isso, essa variável não foi analisada estatisticamente. O mesmo resultado foi relatado por Almeida 60 et al. (2002) em Ananasc omosus (L.) Merrill, que verificaram a diminuição do número ou a ausência total de brotações para maiores concentrações de BAP. Ao analisar a altura da parte aérea, observaram-se diferenças significativas com a redução da concentração da citocinina, melhores resultados foram obtidos com o meio sem adição de BAP. Resultados semelhantes foram obtidos por Jayaram & Prasad (2007) para Drosera indica com baixas concentrações de citocininas (zeatina e cinetina) foram observados melhores resultados, enquanto altas concentrações resultaram em retardamento do crescimento da parte aérea. Na análise do número de raízes e comprimento da maior raiz, os tratamentos sem adição de BAP, foram significativamente superiores que os demais, porém, ao observar os resultados entre os tratamentos com adição de BAP, esses não diferiram entre si. O efeito inibitório das citocininas na regeneração de raízes e no alongamento de brotos é relatado em várias espécies (Huetteman & Preece, 1993; Khawar et al., 2004; Eapen et al., 2004; Flores et al., 2007). Segundo Rech Filho et al, (2005), este comportamento, provavelmente, pode estar relacionado com a fitotoxidez causada pelo regulador de crescimento. Este resultado sugere que sejam utilizadas concentrações menores de regulador vegetal. As plantas nos tratamentos de concentrações maiores também se apresentaram sadias, desenvolvidas e com sistema radicular, porém bem menores, com menor parte área, número de folhas e raízes. Esses resultados sugerem a redução em concentrações mínimas dessa citocinina, pois, apesar de muito importante, podem promover efeito inverso, quando utilizadas em concentrações inadequadas. Outra sugestão seria o estudo de um balanço entre citonina e auxina, para estimular e controlar o desenvolvimento in vitro. As citocininas são muito utilizadas durante a fase de multiplicação in vitro, pois promovem a quebra da dominância apical, maximizam o número de brotos regenerados, favorecendo a propagação in vitro. No entanto, em concentrações não adequadas, podem causar distúrbios fisiológicos característicos nas plantas, como redução no alongamento, encurtamento dos entrenós, vitrificação, inibição do enraizamento, entufamento e outros (George, 1996). Segundo Pattnaik et al. (1996) e Huetteman & Preece (1993), concentrações inferiores a 5 M de BAP são eficientes para a proliferação e crescimento de brotos in vitro, contudo teores mais elevados reduzem o comprimento dos brotos, o tamanho das folhas e inibem o enraizamento. De acordo com Flores et al. (2007), uma alternativa para minimizar os efeitos das 61 citocininas no crescimento da parte aérea e no enraizamento de plantas in vitro é a transferência dos brotos para um meio nutritivo isento de regulador de crescimento.

A B C D

Figura 5. Crescimento in vitro de plantas de D. schwackei em diferentes concentrações de BAP. A- 0,0mg.L-1; B- 0,5 mg.L-1; C- 1,0 mg.L-1 e D- 1,5 mg.L-1.

Com relação à aclimatização das plantas obtidas a partir do cultivo in vitro, os substratos estudados podem ser divididos em três grupos de acordo com a taxa de sobrevivência durante a fase de aclimatização. Alta taxa de sobrevivência foi observada na quinta semana, usando o musgo sphagnum e a casca de arroz misturada com vermiculita. Por contraste, um terço das plantas sobreviveu no mesmo período usando uma mistura de fibra de coco com vermiculita. Finalmente, quase 90% das plantas morreram quando Plantmax® foi usado como substrato. As plântulas de D. schwackei submetidas a aclimatização apresentaram, aos 60 dias em BOD, 50% de sobrevivência e aos 90 dias, 25% de sobrevivência. Essa baixa taxa de sobrevivência mostra a fragilidade dos tecidos de D. schwackei o que, possivelmente, dificultou seu estabelecimento ex vitro. Na aclimatização, as plantas sofrem muitos estresses durante a transferência das condições in vitro para as condições ex vitro. O tipo de substrato, dependendo de suas características físico-químicas, entre elas sua capacidade de retenção de água, influencia na sobrevivência, crescimento e desenvolvimento das plântulas (Moreira et al., 2006). O primeiro tratamento no qual foi observada a morte das plantas foi o tratamento com Plantmax®. Aos 35 dias após as plantas serem transferidas para o substrato, já se observou morte total. O Plantmax® é um substrato comercial que mistura diferentes materiais: casca de pinus, turfa, vermiculita expandida e carvão moído, oferecendo granulometria específica, formada pela diferença de tamanho e de partículas dos materiais envolvidos (Schuck et al., 2012). Porém, para a espécie D. schwackei não se mostrou eficiente, ou seja, não favorece e garante a sobrevivência das 62 plântulas. Resultados semelhantes foram encontrados com as sempre-vivas Syngonanthus elegantulus (Pegô et al., 2013) e Syngonanthus elegans (Pêgo et al., 2014), com baixas porcentagens de plântulas aclimatizadas 43% e 25,6% respectivamente, sugerindo ser necessário avaliar outros tipos de substratos e a pré- aclimatização. Danos às plantas que não sobreviveram, começaram com a aparência de seca e murcha das folhas, que continuou progredindo até a sua morte. O efeito do substrato na altura das plantas durante a fase de aclimatização não foi tão aparente como na taxa de sobrevivência. Basicamente, houve uma gradiente na altura, as plantas crescendo em sphagnum sendo maiores que aquelas de tratamentos com casca de arroz e vermiculita. Plantas mantidas em musgo (sphagnum) em BOD, com temperatura a 25 ºC e luz constante produziram folhas com mucilagem pegajosa, capaz de capturar insetos. A escolha de substratos adequados é importante para alcançar altas taxas de sobrevivência durante a aclimatização de plantas in vitro para condições in vivo. É desejável usar substratos que permitam certo grau de retenção, mas que, ao mesmo tempo, permita também uma boa drenagem e arejamento de raízes. Também é importante que os substratos não transportem cargas elevadas de substâncias saprófitas ou agentes infecciosos que podem danificar as plantas durante o processo de aclimatização (Robinson e Galán-Sáuco 2009, Chandra et al. 2010). O musgo sphagnum atende as características acima mencionadas, além da alta capacidade de retenção de água, o Sphagnum apresenta pH ideal para essas plantas, que é bastante ácido, sendo responsável pela maior taxa de sobrevivência e pela produção de plantas maiores e mais saudáveis (Figura 6).

Figura 6. Planta de D. schwackei aclimatizada em musgo sphagnum.

CONCLUSÕES

1- A desinfestação das sementes de D. schwackei com solução de hipoclorito de sódio de 2% de cloro ativo com 10 minutos de imersão mostrou-se eficiente e estimulou a germinação. 2- O cultivo in vitro de D. schwackei em meio MS1/3 e MS1/2 favoreceu a germinação in vitro de sementes e crescimento de plântulas. 3- As sementes de D. schwackei podem ser criopreservadas em nitrogênio líquido (-196ºC) sem o comprometimento da sua qualidade fisiológica até 120 horas de armazenamento. 4- O meio MS1/3 proporcionou maior desenvolvimento das plântulas de D. schwackei. 5- Baixas concentrações de BAP favorecem o crescimento das plantas in vitro.

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