RENORBIO Mape

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia - RENORBIO

Mapeamento cromossômico de genes ribossomais em espécies de peixes estuarinos da família Gerreidae (Pisces, Perciformes) – Identificação de uniformidade cariotípica e sua empregabilidade com fins biotecnológicos - REPROGEN -

LEONARDO LUIZ CALADO

Natal/RN 2013

RENORBIO Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Biociências Laboratório de Genética de Recursos Marinhos - L.G.R.M

Mapeamento cromossômico de genes ribossomais em espécies estuarinas da família Gerreidae – Identificação de uniformidade cariotípica e sua empregabilidade com fins biotecnológicos - REPROGEN –

LEONARDO LUIZ CALADO

Tese apresentada ao programa de pós- graduação em Biotecnologia - RENORBIO/Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia

Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina

Natal/RN 2013

LEONARDO LUIZ CALADO

______Prof. Dr. George Shigueki Yasui (Membro Externo - USP)

______Profª. Drª. Liliane de Lima Gurgel Souza (Membro Externo - IFRN)

______Prof. Dr. José Garcia Junior (Membro externo – IFRN)

______Prof. Dr. Marcelo Francisco de Nóbrega (Membro externo – UFRN)

______Prof. Dr. Wagner Franco Molina (Orientador - Presidente da banca - UFRN)

“....Navegar é preciso, viver não é preciso....” Fernando Pessoa

A Ana Lúcia e Wilson dedico

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por esta única oportunidade de modificar minha visão de mundo por intermédio de novos conhecimentos e àqueles que de forma direta ou indireta contribuíram para que este feito se concretizasse. Aos meus queridos pais que me ensinaram tudo o que guardo no meu ser e que sempre, em tudo que fiz foram os responsáveis diretos pelo apoio em todos os âmbitos. A Anelisa, namorada, esposa, amiga, companheira que aturou ao meu lado mais esta empreitada de vida. A aquele que foi orientador e mentor, Wagner Franco Molina, que com paciência e sutileza sempre me incentivou e contribuiu para meu engrandecimento enquanto homem e aprendiz de pesquisador. Aos membros da banca, sempre prontos a contribuir construtivamente para a melhora do trabalho. A Rede Nordeste de Biotecnologia, RENORBIO, pelas condições dadas para a execução do trabalho e pela oportunidade de ampliação de conhecimento dentro de um multidisciplinar programa. Ao Conselho Nacional de Pesquisa, CNPq, pelo fomento do projeto por concessão de bolsa, imprescindível para a execução do mesmo. Aos meus amigos, Uedson, Layse, Pablo, Giroldo, Rodrigo Pantera, Paulo TT, Clóvis, Washington, Valdir pai e filho, Guinga, Amanda, Vanessa, Carla, Eurico Pofessor, Dom Cabeça, Marcela, Mestre Mieli, Rafael Dois de Ouro, Sassá, todos os “Capoeira”, pela amizade e auxílio nas horas difíceis e ainda bem, nas fáceis também...... A Garcia por me ajudar na identificação dos animais e me ensinar a me virar com exemplares tão iguais.

A minha família, principalmente meus tios, Titone, Tia Nem, TiNiltinho, que como no mestrado também foram responsáveis por mais esta etapa vencida. A minha segunda família Lavrense, Rubinho, Rose, Rian, Rubia, Dona Marta, Priscila, Robinho, Dri, Jadir, Patricia e tantos outros que sem eles não estaria cumprindo mais esta etapa de vida. A toda forma viva, principalmente aquelas que foram objeto deste estudo que, sem o seu sacrifício este não seria possível, afinal é estudando a morte que se entende a vida.

SUMÁRIO

RESUMO ...... i Abstract ...... ii LISTA DE FIGURAS ...... iii LISTA DE TABELAS ...... v Introdução ...... 15 A família Gerreidae – Carapebas e carapicus ...... 16 Marcadores citogenéticos ...... 18 Objetivos ...... 20 Objetivos específicos ...... 20 Material e Métodos ...... 21 Material ...... 20 Técnicas citogenéticas ...... 22 Preparações cromossômicas ...... 22 Bandamentos cromossômicos ...... 23 Identificação de padrões heterocromáticos (bandamento C) ...... 24 Detecção de Regiões Organizadoras de Nucléolos (Ag-RONs) ...... 24

Fluorocromos GC- e AT-específicos (CMA3 e DAPI) ...... 24 Hibridação fluorescente in situ (FISH) – Sondas 18S e 5S ...... 25 Microfotografias e captura de imagens ...... 26 Referências bibliográficas ...... 25

CAPÍTULO I - CYTOGENETIC STUDIES OF ATLANTIC MOJARRAS (PERCIFORMES - GERREIDAE): CHROMOSOMAL MAPPING OF 5S AND 18S RIBOSOMAL GENES USING DOUBLE-FISH Abstract ...... 30 Introduction ...... 31 Material and Methods ...... 32 Specimens and chromosomal preparations ...... 332 Chromosomal banding ...... 32 Fluorescent in situ hybridization (FISH) ...... 33 Results ...... 33 Discussion ...... 35 Acknowledgements ...... 39 References ...... 39

CAPÍTULO II - EVOLUTIONARY DYNAMICS OF rDNA GENES IN THE CHROMOSOMES OF THE Eucinostomus FISHES: CYTOTAXONOMIC AND KARYOEVOLUTIVE IMPLICATIONS Abstract ...... 46 Introduction ...... 47 Material and Methods ...... 48 Specimens and chromosome preparations ...... 48 Chromosome banding ...... 48 Fluorescent in situ hybridization (FISH) procedures ...... 49 Results ...... 49 Discussion ...... 52 Acknowledgments ...... 56 References ...... 56

CAPÍTULO III - CORRELAÇÃO ENTRE DIVERGÊNCIA CITOGENÉTICA E HIBRIDAÇÃO INTERESPECÍFICA E SEU USO NA PISCICULTURA MODERNA Hibridação interespecífica e seu uso na aquicultura moderna ...... 63 Resumo ...... 63 Introdução ...... 64 Hibridação na aquicultura ...... 64 Citogenética e hibridação ...... 66 Hibridação em espécies nativas ...... 73 Considerações finais e perspectivas ...... 73 Referências bibliográficas ...... 75

RESUMO

Os Perciformes são dominantes no ambiente marinho, contituindo a maior e mais diversificada ordem de peixes dentre os teleósteos. Muitas de suas famílias, como os Gerreidae, conhecidos popularmente como carapicus, carapebas, ou mojarras, têm um alto potencial econômico, no que se diz respeito à piscicultura marinha, extrativismo e pesca esportiva. Informações genéticas destas espécies são de fundamental importância para seu manejo e produção. Mesmo assim, das 13.000 espécies de peixes marinhos descritos, apenas 2% foram estudadas sob o ponto de vista citogenético e menos de 1% sobre suas características reprodutivas. A reprodução induzida, a citogenética e a criopreservação de gametas, representam importantes áreas aplicadas de estudo em peixes. No presente trabalho análises citogenéticas foram empregadas na caracterização genética de espécies da família Gerreidae, ocorrentes no litoral do Nordeste do Brasil. Diferentes métodos de identificação de regiões cromossômicas foram empregados por meio de técnicas convencionais (Ag-RONs, bandamento C), coloração com fluorocromos base-específicos (DAPI-CMA3), e mapeamento cromossômico de genes ribossomais marcadores DNAr 18S e 5S, através da hibridação in situ com sondas fluorescentes (FISH). As seis espécies analisadas revelaram marcante conservadorismo cromossômico. Os genes ribossomais 18S e 5S quando analisados em perspectiva filogenética, demonstram dinâmica evolutiva variada, podendo apresentar estase em alguns grupos e maior dinamismo em outros. As análises por duplo-FISH dos sítios 18S e 5S se revelaram eficientes marcadores citotaxonômicos nos cariótipos homogêneos deste grupo de espécies. Os padrões cariotípicos identificado, além dos aspectos evolutivos do cariótipo identificados, são sugestivos de baixo potencial de barreiras pós- zigóticas, instigando pesquisas futuras de prospecção de hibridação interespecífica destas espécies de valor comercial.

Palavras-chave: Piscicultura marinha; citogenética de peixes; processos biotecnológicos; hibridação interespecífica.

Abstract

Perciformes are dominant in the marine environment, characterized as the largest and most diverse fish group. Some families, as Gerreidae, popularly known as silver jennies, carapebas, or mojarras have a high economic potential to marine fish farming, natural explotation and game fishing. Genetic information of these species are of fundamental importance for their management and production. Despite exist over 13,000 marine fish species described, only 2% were cytogenetically analyzed and less than 1% have some reproductive characteristics known. Induced breeding, cytogenetic characterization and cryopreservation of gametes, represent important areas in applied fish studies. In this project cytogenetic analyzes were performed to acess genetic aspects of Gerreidae species, distributed in coastal and estuarine regions of Northeast Brazil. Different methods for identifying chromosomal regions were employed using conventional techniques (Ag-NORs, C-banding), staining with base-specific fluorochromes (DAPI-

CMA3), and physical mapping of ribosomal genes 18S and 5S rDNA, through hybridization in situ with fluorescent probes (FISH). The six species analyzed showed remarkable chromosome conservatism. The 18S and 5S ribosomal genes when analyzed in phylogenetic perspective demonstrate varied evolutionary dynamics, suggesting ocurrence of stasis process in some groups and greater dynamism in others. Double FISH with 18S and 5S probes showed both how efficient cytotaxonomic markers in the homogeneous karyotypes of this group of species. The karyotypic pattern identified in addition to the evolutionary aspects of karyotype, are suggestive of existence of low potential of post-zygotic barrier, prompting further research to prospect for artificial interspecific hybridization of these species of commercial importance.

Keywords: Marine pisciculture, fish cytogenetics; biotechnological processes, interspecific hybridization.

LISTA DE FIGURAS

Introdução

Figura 1. Mapa da distribuição biogeográfica dos Gerreidae no litoral brasileiro e suas respectivas áreas de ocorrência. 18

Figura 2. Exemplares da família Gerreidae coletados para análise, Diapterus auratus (a), Diapterus rhombeus (b), Eucinostomus argenteus (c), Eucisnostomus gula (d), Eucinostomus melanopterus (e), Eugerres brasilianus (f) e Ulaema lefroyi (g). Barra=5cm. 21

Figura 3. Pontos de coleta e espécimes de Gerreidae obtidos ao longo da zona costeira do Rio Grande do Norte. 22

Capítulo I

Figura 1. Karyotypes of Diapterus auratus (a, b), D. rhombeus (c, d) and Eugerres brasilianus (e, f), with the use of conventional staining (a, c, e) and C- banding (b, d, f). The differentiated interstitial heterochromatic pattern in E. brasilianus can be observed in (f) Bar=5µm. 34

Figura 2. Nucleolus organizer pairs of D. auratus (a), D. rhombeus (b) (pair 1) and E. brasilianus (c) (pair 6), revealed by silver nitrate, CMA3 and DAPI. Bar=5µm. 35

Figura 3. Chromosomal mapping by double-FISH with 18S rDNA (red) and 5S rDNA (green) probes in Diapterus auratus (a), D. rhombeus (b) and Eugerres brasilianus (c). Bar=5µm. 36

Capítulo II

Figura 1. Karyotypes of Eucinostomus argenteus (a, b), E. gula (c, d) and E. melanopterus (e, f) with conventional staining (a, c, e) and C-banding (b, d, f). Bar = 5μm. 50

Figura 2. Fluorescent pattern of Eucinostomus argenteus chromosomes (a) stained with CMA3 showing GC-rich pericentromeric heterochromatin on most chromosome pairs. Detail of the nucleolar organizer pair (pair 22) subjected to silver impregnation and staining with base-specific fluorochrome (b, c, d) and mapping of telomeric sequences (TTAGGG)n (e, f, g) in E. argenteus (b, e), E. gula (c, f) and E. melanopterus (d, g), respectively. Bars = 5μm. 51

Figura 3. Location of 18S (red) and 5S (green) ribosomal genes using dual color FISH mapping in E. argenteus (a), E. gula (b) and E. melanopterus (c). Bar = 5μm. 52

Figura 4. Idiogram representing the three stages of chromosomal location of ribosomal sites in Eucinostomus species. First pattern is represented by both 5S and 18S sites in interstitial position on different chromosome pairs chromosomes; second, represented by both 5S and 18S sites in the terminal position on different chromosomes; and third, both 5S and 18S sites are colocated on a single pair in interstitial position. 55

Capítulo III Figura 1. Quantidade de DNA genômico em representantes de três principais Ordens de peixes, evidenciando a grande variação no conteúdo genômico médio em Osteichthyes. 6 8

LISTA DE TABELAS

Capítulo III

Tabela 1. Exemplos de hibridação interespecífica em quatro Ordens de peixes e correspondentes padrões cariotípicos dos pares heterólogos. 69

Introdução

A captura de espécies aquáticas tradicionais já atingiu a sua capacidade máxima de suporte, cerca de 100 milhões de toneladas por ano. Tendo em vista o progressivo crescimento populacional e subsequente demanda por proteína de origem animal, há a uma possibilidade do esgotamento destes estoques pesqueiros em uma escala global (FAO 2010). Tentando atenuar essa situação, o cultivo de organismos aquáticos vem se tornando a alternativa mais sustentável ao fornecimento de alimentos de origem marinha para população mundial. O potencial do Brasil essa atividade é enorme, tendo em vista as suas dimensões continentais de 8.547.404 Km2 e extensa linha costeira. Além disso, é detentor de algumas das maiores bacias hidrográficas do planeta, representando 12% das reservas mundiais de água doce com 5,5 milhões de ha de águas represadas e condições edafoclimáticas, hidrológicas e topográficas muito favoráveis à aquicultura (Sidonio et al., 2012). Praticada em todos os Estados brasileiros, a aquicultura abrange principalmente a piscicultura (cultivo de peixes), a carcinicultura (cultivo de camarões), a malacocultura (cultivo de moluscos: ostras e mexilhões) e a ranicultura (cultivo de rãs). As espécies cultivadas no país, de forma experimental e/ou comercial, somam aproximadamente 64, dentre as quais, algumas descritas de forma geral são apontadas como destaque camarões marinhos (60.128 ton. em 2002), carpas (54.567 ton. em 2002), tilápias (32.460 ton. em 2002) e moluscos (15.533 ton. em 2001) (MMA, 2006). Na década de 1990 a aquicultura nacional se firmou no contexto econômico brasileiro de fornecimento de alimentos, época na qual a produção chegava à cerca de 25.000 ton/ano. Nos anos 2000 e 2001 estima-se que os diversos setores da mesma (piscicultura, carcinicultura, malacocultura e outros) tenham ultrapassado 150.000 e 210.000 toneladas produzidas respectivamente, e nos 5 anos subseqüentes a aquicultura brasileira cresceu cerca de 25% ultrapassando no ano de 2011 o patamar de 620.000 toneladas e crescimento de 31% em relação ao ano de 2010 (MPA, 2013; Sonoda, 2006). O consumo brasileiro de pescado nacional, em torno dos 15,14 kg/hab/ano, está próximo à média mundial, que alcança 15,60 kg/hab/ano. Apesar disso ainda existem discrepâncias entre diferentes regiões do país, o que levou à implantação de programas

16 governamentais para desenvolvimento aquícola para cumprimento de metas de elevação de até 3 kg/hab/ano. Quando se fala em consumo per capita de pescado no Brasil por região, aquela que mais consome é a região Norte, com 62,63 kg/hab/ano, seguidos respectivamente pelo Nordeste, 11,54 kg/hab/ano, Sudeste, 3,65 kg/hab/ano, Sul, 3,99 kg/hab/ano e Centro-Oeste 3,20 kg/hab/ano. O desenvolvimento do setor vem recebendo mais fomento governamental no decorrer dos anos através de criação de linhas de crédito específicas. Assim a publicação de instruções normativas como a abertura da águas da união para o cultivo de organismos aquáticos mediante o Decreto n° 2.869 de 09 de dezembro de 1998 e instrução normativa ministerial n° 9 de 11 de abril de 2001, criação do Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA), pela lei nº 11.958 de 29 de Junho de 2009 e a implantação do Plano Safra da pesca e Aquicultura em 25 de outubro de 2012 que visa até 2014 dobrar a produção de pescado fomentando assistência técnica, pesquisas no setor, despescas programadas no período de defeso e em consequência até o ano de 2015 aumentar o consumo per capita por ano de 9 Kg para 13,8 Kg, acima do preconizado pela Organização Mundial da Saúde (OMS). As particularidades fisiográficas regionais e diversos ecossistemas marinhos no litoral brasileiro permitem caracterizar este território como um ambiente heterogêneo, determinando através das suas características bióticas e abióticas uma rica ictiofauna, tanto em diversidade como em quantidade de espécies, segundo Menezes (2003) desde o Cabo Orange até o Chuí em uma abrangência de 200 milhas náuticas da Zona Econômica Exclusiva, 1297 espécies de peixes marinhos tem ocorrência documentada. Dentre as diversas Ordens de peixes que habitam o litoral, a dos Perciformes se destaca por sua ampla distribuição, não só no Brasil, como em diversos mares e oceanos do mundo. As relações filogenéticas de suas espécies ainda não são bem definidas e são as causas de muitas controvérsias (Lauder & Liem, 1983). Muitas de suas famílias apresentam um alto valor comercial para piscicultura marinha, como também são importantes na pesca comercial e esportiva.

A família Gerreidae – Carapebas e carapicus

A família Gerreidae, se destaca entre os Perciformes por apresentar espécies de peixes de alto valor comercial. No Brasil, os termos carapeba e carapicu, derivam de

17 acará-peba e acará-picu, que, em linguagem tupi-guarani, significam respectivamente peixe achatado ou largo (Cará-largo) e peixe alongado (Cará-comprido). Abundantes em águas tropicais e subtropicais do Atlântico e do Pacífico, esta família é comumente encontrada em todo litoral brasileiro (Bordin et al., 2007). No Brasil, as espécies Eucinostomus melanopterus e Diapterus rhombeus são seus maiores representantes. São peixes de médio a pequeno porte, comprimidos lateralmente e caracterizados por suas bocas extremamente protrusivas e reprodução e recrutamento anuais com picos sazonais em meses cuja temperatura são mais altas e o regime de chuvas contribui para um aumento da proporção entre machos e fêmeas e consequentemente à reprodução (Aguirre-León & Díaz-Ruiz, 2006; Olaya-Nieto & Appeldoorn, 2004; Nelson, 1994). São espécies que se alimentam de uma gama de presas de hábitos bentônicos, como anfípodas, crustáceos, bivalves, copépodas, foraminíferos, ovos de peixes, dentre outros (Kerschner et al., 1985). Geralmente ocorrem em áreas costeiras rasas e sobre partes inferiores enlameadas e arenosas, nos estuários ou em lagoas hipersalinas. Devido à sua relativa abundância em ambientes estuarinos, estas espécies têm certa facilidade de captura, o que já constitui um valor comercial agregado (Cervigon, 1993), sobretudo como alternativa de cultivo nas fazendas de camarão espalhadas pelo Nordeste do Brasil. Para os taxonomistas, a importância econômica desigual entre espécies da família Gerreidae, contribuiu de forma controversa para o estabelecimento de caracteres taxonômicos morfológicos com certo grau de subjetividade. Os membros da família Gerreidae são um dos maiores e representativos grupos de peixes das regiões tropicais e subtropicais, possuindo ampla distribuição na região neotropical (Figura 1), distribuindo-se na maioria dos oceanos, principalmente no Atlântico, Pacífico e Índico. Na costa do Atlântico se distribuem do Estado da Flórida (EUA), Ilhas Bermudas até o estuário do Rio da Prata, na fronteira entre Uruguai e Argentina, principalmente em áreas estuarinas (Solari et al., 2010). Dos quinze gêneros já descritos, quatro são constantemente encontrados em águas do Atlântico (Diapterus, Eucinostomus, Eugerres e Ulaema), totalizando 13 das 44 espécies conhecidas (De La Cruz Aguero et al., 2011; Andreata, 2006; Gilmore Jr., 2002). São abundantes em áreas de estuários de rios e mangues, juntamente com representantes das famílias Clupeidae, Engraulidae, Mugilidae e Centropomidae sendo consideradas importantes para a manutenção do equilíbrio do ecossistema (Castellanos-Galindo et al., 2012).

Figura 1. Mapa da distribuição geográfica dos Gerreidae no litoral brasileiro e algumas de suas principais áreas de ocorrência.

Marcadores citogenéticos

No decorrer das últimas décadas, a genética vem se apresentando como uma ferramenta essencial na elucidação da definição de populações e espécies. Dentre estas linhas de pesquisa, a citogenética tem se constituído uma forte aliada, através da identificação de caracteres citotaxonômicos. A citogenética representa uma importante área de pesquisas ictiogenéticas, que tem no Brasil, um dos maiores expoentes mundiais. A caracterização citogenética de espécies e populações possibilita a identificação de polimorfismos, casos de espécies crípticas, sinonímias e diferenças populacionais sutis, os quais possibilitam o manejo adequado quanto à conservação e a exploração racional dos estoques pesqueiros. Segundo Wilkins (1981), as análises genéticas em espécies com poucas informações prévias devem ser iniciadas por níveis básicos de detecção, coleta e avaliação da variabilidade das populações nativas. Tais dados poderão ser usados tanto para o cultivo

19 intensivo quanto para elucidação de aspectos da biologia e da estrutura das populações. Neste sentido, as bases da piscicultura moderna vêm demonstrando uma essencial contribuição prestada pela incorporação de metodologias genéticas em espécies sob cultivo, entre elas, a citogenética. Entretanto, apenas 2% das espécies marinhas possuem alguma informação citogenética disponível (Brum, 1996). Grupo dominante no ambiente marinho, os peixes da ordem Perciformes são caracterizados por uma notável homogeneidade cromossômica, tendo uma porcentagem pequena de seus representantes que carregam os números diploides mais elevados ou abaixo do que seu número básico (Molina & Bacurau, 2006). Estes fatores de homogeneidade podem ser explicados pela ausência de barreiras físicas definitivas, e consequentemente, ausência de isolamento geográfico, associados à grande capacidade de dispersão e distribuição destas espécies (Lacson, 1992). Estes fatores explicam a estabilidade e a ampla distribuição do cariótipo com 48 cromossomos acrocêntricos, indicando um valor modal e a condição conservada desse tipo de cariótipo, proposto como primitivo para esta ordem (Ohno, 1970; LeGrande & Fitzsimons, 1988; Vitturi et al., 1992). Este cariótipo basal é encontrado em muitas famílias, como Carangidae (Caputo et al., 1996), Haemulidae (Brum, 1996), Gerreidae (Molina & Bacurau, 2006; Ruiz-Carus & Uribe-Alcocer, 2004), dentre outros. Devido à ampla diversidade dos Perciformes, diversas famílias carecem de informações citogenéticas. Neste sentido, pelo menos um cariótipo de uma espécie está disponível para 50 das 150 famílias de Perciformes, demonstrando com isso, uma lacuna notável sobre o conhecimento citogenético de um grande número de espécies (Brum, 1996). Esta falta de informações pode estar associada à natureza das espécies ou aos parcos esforços dirigidos ao estudo de alguns grupos, sobretudo, espécies estuarinas, como no caso da família Gerreidae (Molina & Bacurau, 2006). Quando existente, a maioria dos dados citogenéticos de espécies marinhas ou estuarinas, é baseado em técnicas convencionais que envolvem a definição da morfologia cromossômica, o bandamento C e a identificação de cístrons ribossomais pela técnica de Ag-RONs (Molina, 2007; Ruiz-Carus & Uribe-Alcocer, 2004). Partindo da obtenção destes dados torna-se de destacada importância à identificação citogenética e morfológica dos membros da família Gerreidae presentes nos estuários e ao longo de parte do litoral do Rio Grande do Norte. Estudos desta natureza são necessários para possíveis detecções de potenciais espécies crípticas, assim como identificar aquelas que possam ser utilizadas em cultivo para mitigação dos

20 impactos causados pela sobreexplotação dos recursos pesqueiros, antes que se atinja a capacidade suporte dos mesmos como ocorrem com diversas outras espécies. Em adição a cariotipagem destas espécies tras informações pertinentes para a formação de híbridos que podem auxiliar em pesquisas voltadas para a piscicultura, a poliploidização e a quantificação de conteúdo de DNA.

Objetivos

Este trabalho visou caracterizar detalhadamente os padrões cromossômicos de seis espécies de peixes de importância comercial da família Gerreidae, de ocorrência em áreas estuarinas e ao longo do litoral brasileiro, através de técnicas citogenéticas convencionais e mapeamento físico de genes ribossomais. Espera-se que tais processos subsidiem uma melhor compreensão da taxonomia do grupo, determinação de marcadores citotaxonômicos e nível de divergência cariotípica com vistas ao uso futuro para fins biotecnológicos e de conservação biológica.

Objetivos específicos

 Determinação da macroestrutura cariotípica de seis espécies da família Gerreidae nas áreas estuarinas do litoral brasileiro, identificando suas tendências evolutivas e mecanismos de mudança;  Estabelecimento dos padrões cromossômicos estruturais de seis espécies de Gerreidae pelo uso de bandamentos cromossômicos para identificação das regiões organizadoras de nucléolos e da heterocromatina constitutiva e pelo

emprego de fluorocromos base-específicos (DAPI - CMA3);  Mapeamento cromossômico dos genes ribossomais 18S e 5S por meio de hibridação in situ com sondas fluorescentes (FISH);  Correlacionar padrões de divergência cromossômica e a obtenção natural ou artificial de hibridação interespecífica em peixes de diferentes Ordens.

Material e Métodos

Material

Exemplares das espécies Diapterus auratus Ranzani, 1942 (n=14), D. rhombeus Cuvier, 1829 (n=18), Eucinostomus argenteus (Baird & Girard, 1855) (n=10), E. gula (Quoiy & Gaimard, 1824) (n=8), E. melanopterus (Bleeker, 1863) (n=9), Eugerres brasilianus (n=18) Cuvier, 1830 (Figura 2) foram coletadas nas áreas dos maiores estuários do Estado do Rio Grande do Norte (Canguaretama, Potengi e Macau) (Figura 3), bem como em fazendas de criação de camarão, onde algumas espécies ocorrem como fauna acompanhante. Os espécimes foram capturados usando diferentes apetrechos de pesca, direcionados ao ambiente onde a coleta se desenvolveu e/ou particularidades de cada grupo taxonômico. Entre os métodos de captura empregados, foram utilizados tarrafas, redes de espera, equipamentos de mergulho (livre e/ou autônomo), linha e anzol. Ocasionalmente, pescadores artesanais foram requeridos para a obtenção de espécimes de difícil acesso.

Figura 2. Exemplares da família Gerreidae utilizados nas análises citogenéticas. Diapterus auratus (a), D. rhombeus (b), Eucinostomus argenteus (c), E. gula (d), E. melanopterus (e) e Eugerres brasilianus (f). Barra = 5cm.

Os espécimes coletados foram selecionados mediante suas condições físicas, acondicionados em sacos plásticos com adição de oxigênio puro, onde foram mantidos até a sua chegada e acomodação em tanques, nas dependências do laboratório de Genética de Recursos Marinhos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para desenvolvimento das práticas citogenéticas. Os espécimes utilizados nas preparações cromossômicas foram fixados em formol por 5 dias e transferidos para álcool etílico 85% para identificação taxonômica, armazenamento e depósito de exemplares testemunhos em coleções ictiológicas na Universidade Federal do Rio Grande do Norte. A identificação das espécies foi realizada por meio de chaves de identificação taxonômica.

Figura 3. Pontos de coleta e espécimes de Gerreidae obtidos ao longo da zona costeira do Rio Grande do Norte.

Técnicas citogenéticas

Preparações cromossômicas

A estimulação da divisão celular foi realizada por meio da inoculação intraperitoneal de agentes mitogênicos em cada indivíduo, por um período de 24 a 48 horas (Molina, 2001; Molina et al., 2010). Posteriormente, os animais foram sacrificados para retirada de fragmentos do rim anterior a partir dos quais suspensões celulares foram empregadas para obtenção de cromossomos mitóticos, segundo a técnica de Gold et al. (1990).

Bandamentos cromossômicos

As suspensões celulares foram gotejadas em lâminas e coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato (pH 6,8) para a caracterização cariotípica dos espécimes. As melhores metáfases foram selecionadas para caracterização do número diploide e definição do cariótipo. Os cromossomos foram classificados em grupos quanto à posição do centrômero (Levan et al., 1964), e organizados no cariótipo em ordem decrescente de tamanho.

Identificação de padrões heterocromáticos (bandamento C)

A heterocromatina constitutiva foi evidenciada pelo bandamento C (Sumner, 1972). As lâminas com preparações cromossômicas foram tratadas com uma solução de HCl 0,2 N, à temperatura ambiente, durante 13 minutos e, a seguir, submersas numa solução de hidróxido de bário 5%, à temperatura ambiente, por 1 minuto. Logo após, foram lavadas em solução de HCl 0,2N, incubadas em solução salina 2xSSC aquecida a 60°C por 30 minutos. Os cromossomos foram corados com Giemsa 5%, diluído em tampão fosfato pH 6,8 durante 8 minutos. Após cada um dos passos acima, as lâminas foram lavadas com água destilada e secas ao ar.

Detecção de Regiões Organizadoras de Nucléolos (Ag-RONs)

Para a detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) ativas, foi utilizado o procedimento descrito por Howell e Black (1980), empregando nitrato de prata

(AgNO3). As lâminas foram tratadas com uma mistura contendo duas partes de uma solução aquosa de gelatina 2% (acrescida de ácido fórmico 1% na proporção de 1ml para cada 100ml de solução) e quatro partes de uma solução de AgNO3 50%. O material foi recoberto com lamínula e incubado em estufa à 60°C, por aproximadamente 5 minutos. A lamínula foi então retirada com jatos de água destilada e posteriormente os cromossomos corados com Giemsa 5% por cerca de 30 segundos. Após esse período, as lâminas foram lavadas em água corrente e secas à temperatura ambiente.

Fluorocromos GC- e AT-específicos (CMA3 e DAPI)

A coloração dupla por fluorocromos base-específicos (CMA3 e DAPI) seguiu a metodologia descrita por Christian et al. (1998). Para tanto, as preparações cromossômicas foram incubadas em formamida 70%/2xSSC à 70ºC por 2 minutos. Posteriormente, as lâminas foram banhadas por duas vezes por 2 minutos em 2xSSC à temperatura ambiente. As lâminas foram então transferidas para uma bateria de álcool 70%, 85% e 100%, e sequencialmente desidratadas por 2 minutos em cada banho. Após secagem, foram adicionados 80µl de cromomicina A3 em cada lâmina, permanecendo 30 minutos em câmara escura à 4oC. Após este período, as lâminas foram banhadas três

25 vezes em tampão PBS 1x, dois minutos em cada banho e imediatamente montadas com 80 µl de solução de DAPI/Antifading (0,2 µg/ml).

Hibridação fluorescente in situ (FISH) – Sondas 18S e 5S

A hibridação in situ fluorescente (FISH), foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Pinkel et al. (1986) com algumas modificações. As sondas foram marcadas por nick translation (BioNick Labeling System – Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A solução de hibridação consistiu de 200 µl de formamida 50%, 80 µl de sulfato dextrano 50%, 40 µl de 20xSSC, 80 µl de água q.s.p., perfazendo um volume total de 400 µl, sendo adicionado 1,5 µg de sonda (DNA marcado com biotina). Em seguida, a solução de hibridação foi transferida para um banho fervente, durante 10 minutos, para desnaturação do DNA e, imediatamente após, para um recipiente com gelo, impedindo a renaturação por choque térmico. As lâminas, contendo as preparações cromossômicas, foram lavadas com tampão PBS 1x por 5 minutos à temperatura ambiente, sob agitação e, posteriormente desidratadas em série alcoólica (70%, 85% e 100%). Em seguida, foram submetidas a digestão com RNAse (100 µg/ml) por 1 hora e 30 minutos, em câmara úmida a 37°C, e lavadas em soluções salinas. O material foi desidratado em uma série alcoólica, 5 minutos em cada banho e tratado com formamida 70%/2xSSC a 70°C, por 5 minutos, para denaturação dos cromossomos. Uma nova desidratação em série alcoólica foi realizada. Após tal procedimento foi aplicado, sobre a lâmina, 50 µl da solução de hibridação contendo a sonda denaturada, permanecendo em câmara úmida overnight a 37oC. Transcorrido esse tempo, as lâminas foram lavadas em solução de formamida 50%/2xSSC a 42oC por 10 minutos, três vezes em 0,1xSSC a 60°C, 5 minutos em cada lavagem e em solução Tween20 (0,05%/2xSSC), sob agitação, por 5 minutos. Em seguida foi realizado um tratamento com 90 µl de NFDM 5% (non fat dry milk – leite em pó desnatado) em 4xSSC, por 15 minutos à temperatura ambiente. A detecção da sonda foi realizada depositando, sobre as lâminas, 70 µl de FITC (fluoresceína isotil cianato-avidina conjugada) a 0,25 µg/µl, por 30 minutos, em câmara úmida, com três lavagens sucessivas de 5 minutos com Tween20. O sinal de hibridação foi amplificado através da deposição de 70 µl de anti-avidina biotina-conjugada, por 30 minutos, com três lavagens adicionais de 5 minutos com Tween20. Este ciclo e o tratamento com FITC

26 foram repetidos mais uma vez. Finalizando, a lâmina foi desidratada em série alcoólica (70%, 85% e 100%) durante 5 minutos em cada banho. Os sinais de hibridação foram detectados com avidina-FITC e os cromossomos contra-corados com iodeto de propídio (50 µg/ml) ou DAPI (0,2 µg/ml).

Microfotografias e captura de imagens

As preparações cromossômicas convencionais foram analisadas e fotografadas em microscópio óptico. As preparações de FISH e de fluorocromos base específicos foram analisadas sob aumento de 1000X em fotomicroscópio de epifluorescência Olympus BX50, equipado com sistema digital de captura de imagens DP-70 Olympus.

Referências bibliográficas

Aguirre-León, A. & Díaz-Ruiz, S. 2006. Estructura de tallas madurez gonadica y alimentacion del pez Diapterus rhombeus (Gerreidae) en el sistema fluvio-deltaico Pom-Atasta, Campeche, México. Revista de Biologia Tropical 54, 599-611.

Andreata, J.V. 2006. Sobre as espécies de Eucinostomus Baird & Girard in Baird, 1855, que ocorrem em águas brasileiras (Actinopterygii, Perciformes, Gerreidae). Estudos de Biologia 28, 13-25.

Bordin, D., Costa, M. D. P., Frisanco, D., Duarte, L., Souza-Conceição, J. M. & Spach, H. L. 2007. Estágios iniciais do ciclo de vida de Gerreidae ocorrentes em duas praias estuarinas do litoral de Santa Catarina (Baía da Babitonga, São Francisco do Sul) In: VIII Congresso de Ecologia do Brasil, Caxambu - MG Anais... Caxambu – MG 2007.

Brum, M. J. I. 1996. Cytogenetic studies of Brazilian marine fish. Brazilian Journal of Genetics 19, 421-427.

Caputo, V., Marchegiani, F. & E Olmo. 1996. Karyotype differentiation between two species of carangid fishes, genus Trachurus (Perciformes, Carangidae). Marine Biology 127, 193-199.

Castellanos-Galindo, G.A., Krumme, U., Rubio, E.A. & Saint-Paul, U., 2012. Spatial variability of mangrove fish assemblage composition in the tropical eastern Pacific

Ocean. Reviews in Fish Biology and Fisheries. DOI 10.1007/s11160-012-9276-4

Cervigon, F. M. Los peces marinos de Venezuela, 2nd edition, Vol. 2. Caracas, Fundacion Cientifica Los Roques, 498 p. 1993.

Christian, A., Mcniel, E., Robinson, J., Drabeck, R., Larue, S., Waldren, W. & Bedfort, J. 1998. A versatile image analysis approach for simultaneous chromosome identification and localization of FISH probes. Cytogenetics and Cell Genetics 82, 172- 179.

De La Cruz Agüero, J., García Rodríguez, F.J., Cota Gómez, V.M., Chollet Villalpando, J.G. & Vergara Solana, F.J., 2011. Length–weight relations of selected species of the family Gerreidae (Actinopterygii: Perciformes) from the Mexican coast. Acta Ichthyologica Et Piscatoria 41, 67-69.

FAO 2006 Yearbook. Fishery Statistics. Aquaculture production 2004, V. 90, n.2, p. 178. FAO. 2006.

Gilmore Jr. R. G.; Carpenter, K.E. 2002. (ed.) The living marine resources of the Western Central Atlantic. Volume 2: Bony fishes part 1 (Acipenseridae to Grammatidae). FAO Species Identification Guide for Fishery Purposes and American Society of Ichthyologists and Herpetologists Special Publication 5, 601-1374.

Gold Jr., L. C., Shipley, N. S. & Powers, P. K., 1990. Improved methods for working with fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding. Journal of Fish Biology 37, 563-575.

Howell, W. M. & Black, D. A. 1980. Controlled silver staining of nucleolus organizer region with protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia 36, 1014-1015.

Kerschner, B.A., Peterson, M.S. & Gilmore Jr., R.G., 1985. Ecotopic and Ontogenetic Trophic Variation in Mojarras (Pisces: Gerreidae). Estuaries 8, 311-322.

Lacson, J. M. 1992. Minimal genetic variation among samples of six species of coral reef fishes collected at La Parguera, Puerto Rico, and Discovery Bay, Jamaica. Marine Biology 112, 327-331.

Lauder, C. V. & Liem, K. F. 1983. The evolution and interrelationships of the Actinopterygian fishes. Bulletin of the Museum of Comparative Zoology 150, 95-197.

Legrande, W. H. & Fitzsimons, J. M. 1988. Chromosome numbers of some gulf coast sciaenid fishes. Copeia 2, 491-493.

Levan, A., Fredga, K., Sandberg, A.A. 1964. Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas 52, 201-220.

Ministério do Meio Ambiente/Caderno setorial de recursos hídricos: agropecuária. 2006. Secretaria de Recursos Hídricos. – Brasília: MMA,. 96p.

Ministério da Pesca e Aquicultura. Consumo de pescado no Brasil aumenta 23,7% em dois anos. Disponível em: http://www.mpa.gov.br/index.php/imprensa/noticias/2226- consumo-de-pescado-no-brasil-aumenta-237-em-dois-anos. Acesso em: 03 Dez. 2013, 13:18:23

Molina, W.F. 2007. Chromosomal changes and stasis in marine fish groups. in: Pisano E, Ozouf-Costaz C, Foresti F, Kapoor BG (eds): Fish cytogenetics, 69-110.

Molina, W.F. 2001. An alternative method for mitotic stimulation in fish cytogenetics. Chromosome Science 5, 149-152..

Molina, W.F., Bacurau, T.O.F. 2006. Structural and Numerical Chromosome Diversification in Marine Perciformes (Priacanthidae and Gerreidae) The Japan Mendel Society Cytologia 71(3), 237–242.

Molina W.F., Alves, D.E.O., Araújo, W.C., Martinez, P.A., Silva, M.F.M., Costa G.W.W.F. 2010. Performance of human immunostimulating agents in the improvement of fish cytogenetic preparations. Genetic and Molecular Research 9, 1807-1814.

Nelson, J.S. 1994. Fishes of the world. 3 Ed. New York. John Willey e Sons. p. 600.

Ohno, S. 1970. Evolution by gene duplication. New York. Springer-Verlag, p. 160.

Olaya-Nieto, C.W., Appeldoorn, R.S. 2004. Edad y Crecimiento de la Mojarra Rayada, Eugerres plumieri (Cuvier), en la Ciénaga Grande de Santa Marta, Colombia. 56th Gulf and Caribbean Fisheries Institute 55, 337-347.

Pinkel, D., Straume, T., Gray, J.W. 1986. Cytogenetic analysis using quantitative, high- sensivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 83, 2934-2938.

Ruiz-Carus, C.R., Uribe-Alcocer B.M. 2004. Karyotype analysis of Eucinostomus argenteus, E. gula, E. harengulus, and Eugerres plumieri (Teleostei, Gerreidae) from Florida and Puerto Rico. Environmental Biology of Fishes 67, 269–276.

Sidonio, L., Cavalcanti, I., Capanema L., Morch, R., Magalhães, G., Lima, J., Burns, V., Júnior, A. J. A., Mungioli, R. 2012. Panorama da aquicultura no Brasil: desafios e oportunidades. BNDES Setorial 35: 421 - 463.

Sonoda, D. Y. 2006. Demanda por pescados no Brasil entre 2002 e 2003, 117p, Tese (Doutorado Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz), Piracicaba, São Paulo 2006

Solari, A., Garcia, M. L., Jaureguizar, J. A. 2010. First record of Eucinostomus melanopterus, Bleeker 1863 (Perciformes, Gerreidae) from the Río de la Plata estuary. Journal of Applied Ichthyology 26, 485-487.

Sumner, A. T. 1972. A single technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Experimental Cell Research 75, 304-306.

Vitturi, R., Catalano, E., Barbieri, R. 1992. Karyological and molecular characterization of Mullus surmuletus and Mullus barbatus (Pisces, Mullidae). Cytologia 57, 65-74.

Wilkins, N. P. 1981. The rationale and relevance of genetics in aquaculture: an overview. Aquaculture 22, 209-228.

CAPÍTULO I

Artigo publicado no jornal Aquaculture Research, 44: 829-835, 2012. DOI: 10.1111/j.1365-2109.2012.03089.x

Cytogenetic studies of Atlantic mojarras (Perciformes - Gerreidae): chromosomal mapping of 5S and 18S ribosomal genes using double-FISH

Leonardo Luiz Calado1, Luiz Antônio Carlos Bertollo2, Gideão Wagner Werneck Felix da Costa1 and Wagner Franco Molina1

1 Department of Cellular Biology and Genetics, Biosciences Center, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil. 2 Department of Genetics and Evolution, Federal University of São Carlos, São Carlos, Brazil.

Abstract

Fishes of the family Gerreidae, mainly species of the genera Diapterus and Eugerres, have high potential for cultivation, because of their saline tolerance. A detailed cytogenetic analysis of Diapterus auratus, Diapterus rhombeus and Eugerres brasilianus was conducted using conventional staining, C-banding, Ag-NOR, AT/GC- specific fluorochrome staining, and mapping of ribosomal sequences with 5S and 18S rDNA probes. All the species exhibited symmetrical karyotype, 2n=48 acrocentric chromosomes. The Ag-NORs and 18S rDNA are present in the interstitial position on pair 1 (genus Diapterus) and on pair 6 in Eugerres brasilianus. The 5S rDNA sites, located in the interstitial position (pair 11), are conserved in the three species. Heterochromatic regions are similar in the Diapterus species, showing a pattern of

31 reduced and centromeric bands, differing from E. brasilianus, where, in addition to these, more prominent interstitial bands were observed. GC-rich regions are located at ribosomal sites. Karyotypic comparison between Diapterus and Eugerres reveals similarity in chromosomal macrostructure, differing in C-positive heterochromatin distribution and position of 18S sites, indicating the occurrence of structural microrearrangements. Although complementary analyses are needed, the similarities observed for these and other species suggest the possibility of breaking postzygotic barriers and their potential use, through induced interspecific or intergeneric hybridizations.

Keywords: aquaculture, chromosomal markers, estuarine fish, FISH, karyotypic stasis.

Running title: Chromosomal cytomarkers in Atlantic mojarras

Introduction

Most members of the family Gerreidae inhabit estuaries, hypersaline lakes, as well as freshwater coastal areas. They are usually small to mid-sized, silver colored, with laterally compressed body and have a ventral, protractile mouth as their main characteristic (Cervigon 1993; Nelson 2006). It is represented in the Atlantic by the genera Diapterus, Eugerres, Eucinostomus, Gerres and Ulaema (Eschmeyer 1998). Gerreidae are a phylogenetically unstable group, due to complex morphological characters and subjectivity found in some descriptions of their species. A morphological subdivision has been proposed, individualizing two subgroups, Diapterus and Eugerres, which exhibit serrated inferior margin of the preoperculum, and Eucinostomus and Gerres, where it is smooth (Iwatsuki et al. 2001; Ruiz-Carus & Uribe-Alcocer 2003, 2004). The same subdivision has been confirmed by molecular phylogenetic analyses, using mitochondrial 12S and 16S rDNA sequences and Rhodospin and RAG1 nuclear genes (Chen et al. 2007). Gerreidae are an important commercial resource on occurrence areas in the Atlantic (Grijalva-Chon et al. 1996), with diverse species well adapted to the vast shrimp production areas, indicating their potential use in conjunction with aquaculture, as suggested for other fish species such as the Asian sea bass (Lates calcarifer), grouper (Epinephelus spp.), mullet (Mugil spp.) and milk fish (Chanos spp.) (Ravisankar et al.

2005). Indeed, species of the family Gerreidae have been considered for cultivation (Bensam 2000), with some measure of success in in vitro induction and reproduction, as evidenced by Eugerres brasilianus, the largest species in the family (Eiras-Stofella & Fanta 1991; Avila-Poveda & Lamouroux-López 2007). Chromosomal characteristics of commercially important fish have been increasingly used in the implementation of biotechnological techniques (e.g. Rab 1991; Flajshans et al. 1992; Jacobina et al. 2011). Although there has been a rise in cytogenetic studies in marine and estuarine species, information is still very limited or even absent for a number of these groups. In Gerreidae, for example, cytogenetic data are scarce (e.g. Ruiz-Carus & Uribe-Alcocer 2004). With the aim of contributing to future management programs for Gerreidae species, we present the chromosomal characters of three species from this family: Diapterus auratus (Irish mojarra), D. rhombeus (rhombic mojarra) and Eugerres brasilianus (Brazilian mojarra), with the use of conventional staining, detection of C-positive heterochromatin distribution, nucleolus organizer regions (NORs) and GC- and AT-rich chromosomal regions, as well as mapping of ribosomal sequences by double-FISH, with 5S and 18S rDNA probes.

Material and Methods

Specimens and chromosomal preparations

Fifty specimens from the following three species of Gerreidae were analyzed: D. auratus (n=14), D. rhombeus (n=18) and E. brasilianus (n=18) from the state of Rio Grande do Norte, Northeast Brazil, collected at the mouth of the Cunhaú River (6⁰18’26.97”S; 35⁰01’55.45”O), in Canguaretama and in the Açu River delta in Guamaré (5⁰05’42.33”S; 36⁰16’31.66”O). Before chromosomal preparations, specimens were submitted to in vivo mitotic stimulation for 24 hours, by intramuscular and intraperitoneal innoculation of fungal and bacterial antigen complexes (Molina 2001; Molina et al. 2010). After specimens were anesthetized with clove oil (eugenol) and sacrificed, renal tissue was removed for chromosomal preparations. Metaphase chromosomes were obtained from cell suspensions of anterior rim fragments using the short-term in vitro method (Gold et al. 1990). Cell suspensions were dripped onto slides covered with a film of distilled water heated at 60oC. Around 30 metaphases were analyzed in each individual in order to determine chromosome number. The best

33 metaphases were photographed with an Olympus BX50 epifluorescence microscope and Olympus DP70 digital image capture system.

Chromosomal banding

Heterochromatic regions and nucleolus organizer regions were identified by C- banding (Sumner 1972) and silver nitrate staining – Ag-NORs, respectively (Howell &

Black 1980). CMA3/DAPI fluorochrome staining was used to identify GC- and AT-rich regions (Barros-e-Silva & Guerra 2009). Slides aged for three days were stained with -1 -1 CMA3 (0.1 mg.ml ) for 60 min and restained with DAPI (1 µg.ml ) for 30 min. Slides were then mounted in glycerol:McIlvaine buffer pH 7.0 (1:1), aged for three days and analyzed under an epifluorescence microscope equipped with an appropriate filter set.

Fluorescent in situ hybridization (FISH)

Double FISH was performed using the method described by Pinkel et al. (1986), with modifications. The 18S and 5S rDNA probes were obtained by primer amplification via polymerase chain reaction (PCR), with DNA from Prochilodus argenteus (Hatanaka & Galetti 2004) and Leporinus obtusidens (Martins & Galetti Jr 1999), respectively. The 18S rDNA probe was labeled with biotin-dUTP and the 5S rDNA with digoxigenin-dUTP. The 18S probe was detected with avidin-fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugate and anti-avidin, whereas the 5S rDNA probe was detected with anti-digoxigenin conjugate and Rodhamin. Images of the best metaphases were captured under appropriate filters, as described previously for CMA3/DAPI fluorochromes.

Results

Diapterus auratus, D. rhombeus and E. brasilianus exhibited symmetric karyotypes, with 2n=48 acrocentric chromosomes (FN=48) (Fig. 1a, c, e). Chromosomes of these species decrease gradually in size with very little difference between the closest pairs.

Figure 1. Karyotypes of Diapterus auratus (a, b), D. rhombeus (c, d) and Eugerres brasilianus (e, f), with the use of conventional staining (a, c, e) and C- banding (b, d, f). The differentiated interstitial heterochromatic pattern in E. brasilianus can be observed in (f) Bar=5µm.

In species D. auratus and D. rhombeus, NORs are located interstitially on the first karyotype pair, while in E. brasilianus they are found in the same position on chromosome pair 6, where they were identified by both silver nitrate impregnation (Fig. 2) and in situ hybridization with 18S rDNA probes (Fig. 3). Chromosome mapping of 5S rDNA ribosomal subunits showed sites in the interstitial position on a single chromosome pair, apparently homeologous between species and tentatively identified as pair 11 (Fig. 3). Reduced heterochromatic blocks are present in centromeric regions and chromosome terminals of three species (Fig. 1b, d, f). In E. brasilianus, in addition to centromeric regions, more conspicuous heterochromatic interstitial blocks are present on most chromosomal pairs (Fig. 1f). CMA3/DAPI fluorochrome staining revealed GC- positive regions associated to 18S ribosomal sites (Fig. 2).

Figure 2. Nucleolus organizer pairs of D. auratus (a), D. rhombeus (b) (pair 1) and E. brasilianus (c) (pair 6), revealed by silver nitrate, CMA3 and DAPI. Bar=5µm.

Discussion

Karyotypic analyses of the two Diapterus species and E. brasilianus showed notable intrageneric similarity, with marked conservatism in most chromosomal characteristics analyzed, as well as a number of common intergeneric characteristics. In general, the data revealed chromosomal patterns typical of several families of Perciformes (Galetti et al. 2000).

Figure 3. Chromosomal mapping by double-FISH with 18S rDNA (red) and 5S rDNA (green) probes in Diapterus auratus (a), D. rhombeus (b) and Eugerres brasilianus (c). Bar=5µm.

Evolutionally, the presence of 2n=48 mono-brachial chromosomes, ribosomal sites situated on a single pair of chromosomes, reduced heterochromatic content dispersed in centromeric and teleomeric regions seem to represent basal conditions for Perciformes (Galetti et al. 2000; Molina 2007). Indeed, some families in this order have demonstrated elevated interspecific chromosomal conservatism, despite the use of different cytogenetic methodologies (Motta-Neto et al. 2011). Some earlier studies on Gerreidae highlighted relative chromosomal conservatism in other species of Diapterus,

Eugerres and Eucinostomus (Ruiz-Carus & Uribe-Alcocer 2004; Molina & Bacurau 2006; Cipriano et al. 2008). The 18S ribosomal sites, as well as the location of Ag-NORs/GC+, showed equilocal location on chromosome 1 of the karyotype of Diapterus species and on pair 6 of E. brasilianus, indicating that nucleolus organizer regions are characterized by single sites, a condition considered plesiomorphic in fish (Cross et al. 2006). A similar situation occurs with mapping of 5S ribosomal sites, in this case located exclusively on pair 11 of the karyotype of the three species. Thus, chromosomes bearing 18S ribosomal genes in Diapterus species, and 5S, in all the species, are likely homeologous, reinforcing the similarity and karyotypic symmetry within this family. The evolution of ribosomal sequences seems to be associated to the level of karyotypic diversification of a group. This, in Characiformes and Salmoniformes, where karyotype structure is more diversified between species, greater intra and interpopulational diversity is observed in terms of location and frequency of 18S and 5S rDNA sites (e.g. Fujiwara et al. 1998; Ferro et al. 2001; Vicari et al. 2003; Mantovani et al. 2005; Fernandes & Martins-Santos 2006). On the other hand, in Perciformes, a markedly conservative group with respect to karyotype macrostructure and heterochromatic content, a more stable condition is usually found at these sites (Molina & Galetti 2002; Vicari et al. 2006; Motta-Neto et al. 2011). The diversity of situations observed, for both 18S and 5S rDNA sequences, demonstrates their evolutionary independence, reinforced by frequent non-synthenic arrangements of these genes in fish, as observed in D. auratus, D. rhombeus and E. brasilianus and suggested as a basal condition in Teleostei (Martinez et al. 1996; Suzuki et al. 1996; Martins & Galetti 1999, 2000). Although chromosomal mapping of 5S ribosomal sites has been decisive in discriminating several populations and fish species, often phylogenetically close (Aguilar & Galetti 2008; Motta-Neto et al. 2011), this is not the case for Gerreidae, where intergeneric chromosomal differences are observed only in the positioning of 18S sites, demonstrating recent diversification in this group, or even their slow evolution or evolutionary stasis. This conclusion is corroborated by the short genetic distance between species of genera Diapterus, Eugerres and Eucinostomus estimated from allozymic polymorphic systems (Ruiz-Carus & Uribe-Alcocer 2003). However, despite karyotypic similarities observed, a certain intergeneric difference is found in relation to C-positive heterochromatic distribution. Heterochromatic blocks are present in centromeric regions and to a lesser degree in

38 interstitial and terminal regions. In this respect, E. brasilianus differs from Diapterus species since it exhibits a richer pattern of interstitial blocks. Centromeric distribution of heterochromatin seems to restore the ancestral pattern for the family Gerreidae, given that this same condition is present in a number of other Perciformes, such as Serranidae, Lutjanidae and Haemulidae (Molina et al. 2002; Aguilar & Galetti 1997; Rocha & Molina 2008; Motta-Neto et al. 2011). The sharing of the same pattern of heterochromatic blocks on chromosomes by two Diapterus species, in addition to conservatism of the other characteristics analyzed, suggests evolutionary maintenance of ample homeologous chromosomal segments between their chromosomes. Thus, differentiated interstitial heterochromatic blocks in chromosomes of E. brasilianus suggest a more derived condition. Extensive rearrangements have been suggested as molders of the karyotype of some species of Perciformes (Molina & Galetti 2004). However, a more parsimonious possibility for the occurrence of equilocal heterochromatic regions in several chromosomal pairs, as observed in E. brasilianus, would be dispersion of repetitive sequences during the interphase. The physical proximity of these sequences during the interphase, due to the arrangement adopted by chromosomes in the interphase nucleus, might favor their dispersion (Schweizer & Loidl 1987). Indeed, radial metaphase figures oriented with the centromeres, involving non-homologous acrocentric chromosomes, are often found in chromosomal complements of Perciformes (Aguilar et al. 1998; Molina & Galetti 2002), corroborating this hypothesis. Phylogenetic proximity, suggested for Diapterus and Eugerres (Chen et al. 2007; Ruiz-Carus & Uribe-Alcocer 2003), is not ruled out by the chromosomal patterns identified. Karyotypic similarities exhibited by Gerreidae species could establish weak postzygotic barriers, favoring likely interspecific hybridizations, practices routinely used in the commercial production of other fish species. With the potential use of Gerreidae representatives in fish culture programs, species discrimination using cytogenetic markers could be very useful in the management and individualization of those destined for cultivation, a technique already used in other fish species (Morán et al. 1994). Chromosomal analyses have been used in commercially important species to identify chromosomal polymorphisms and their role in the lethality and productivity of reproducers (Porto-Foresti et al. 1998), determine ploidy level (Fopp-Bayat & Woznicki 2006) and characterize hybrids (e.g. Galetti 1991; Pendás et al. 1995). For Gerreidae, which contain species that are difficult to distinguish

39 morphologically and meristically, identifying cytogenetic markers may be particularly appropriate. The present study demonstrated that, despite marked karyotypic similarity, E. brasilianus can be differentiated from Diapterus species by their C- banding pattern and nucleolus organizer pairs. Thus, investigating other cytogenetic markers may also allow individualization of additional karyotypic characteristics, with potential use in cultivation and management programs.

Acknowledgements

The authors thank the National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq - Proc. 141234/2009-1) for financial support and the research scholarship awarded to LLC and José Garcia Jr. for taxonomic identification of the specimens.

References

Aguilar C.T., Corrêa M.M.O. & Galetti P.M. (1998) Chromosome associations by centromeric heterochromatin in marine fishes. Chromosome Science 2, 73–76.

Aguilar C.T. & Galetti P.M. (1997) Chromosomal studies in South Atlantic serranids (Pisces, Perciformes). Cytobios 89, 105–114.

Aguilar C.T. & Galetti P.M. (2008) Chromosome mapping of 5S rRNA genes differentiates Brazilian populations of Leporellus vittatus (Anostomidae, Characiformes). Genetic and Molecular Biology 31, 188–194.

Avila-Poveda O.H. & Lamouroux-López S.L. (2006) Saline acclimation of striped mojarra Eugerres plumieri (Cuvier 1830) and optimal dosage of carp pituitary extract (CPE) to induce spawning. Reviews in Fish Biology and Fisheries 17, 11-19.

Barros-e-Silva A.E. & Guerra M. (2009) The meaning of DAPI bands observed after C- banding and FISH procedures. Biotechnic and Histochemistry 4, 1-11.

Bensam P. (2000) A review of marine finfish culture experiments in India. In: Marine Research and Management (ed. by Pillai V.N., Menon N.G.), pp. 802-817. Central Marine Fisheries Research Institute, Kochi.

Cervigon F. (1993) Los peces marinos de Venezuela, Fundacion Cientıfica Los Roques, DF, VEN.

Chen W.J., Ruiz-Carus R. & Ortí G. (2007) Relationships among four genera of mojarras (Teleostei: Perciformes: Gerreidae) from the western Atlantic and their tentative placement among percomorph fishes. Journal of Fish Biology 70, 202-218.

Cipriano R.R., Fenocchio A.S., Artoni R.F., Molina W.F., Noleto R.B., Kantek D.L.Z. & Cestari M.M. (2008) Chromosomal studies of five species of the marine fishes from the Paranaguá bay and the karyotypic diversity in the marine Teleostei of the Brazilian coast. Brazilian Archives Biology Technology 51, 303-314.

Cross I., Merlo A., Manchado M., Infante C., Cañavate J.P. & Rebordinos L. (2006) Cytogenetic characterization of the sole Solea senegalensis (Teleostei: Pleuronectiformes: Soleidae): Ag-NOR, (GATA)n , (TTAGGG)n and ribosomal genes by one-color and two-color FISH. Genetica 128, 253-259.

Eiras-Stofella D.R. & Fanta E. (1991) Ontogenesis of Eugerres brasilianus (Cuvier, 1830) (Pisces - Gerreidae) obtained by fertilization “in vitro”. Revista de Biología Marina 26, 21-36.

Eschmeyer W.N. (1998) Catalog of fishes. California Academy of Science, CA, USA.

Fernandes C.A. & Martins-Santos I.C. (2006) Mapping of the 18S and 5S ribosomal RNA genes in Astyanax altiparanae Garutti & Britski, 2000 (Teleostei, Characidae) from the upper Paraná river basin, Brazil. Genetics and Molecular Biology 29, 464-468.

Ferro D.A.M, Néo D., Moreira-Filho O. & Bertollo L.A.C. (2001) Nucleolar organizing regions, 18S and 5S rDNA in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): populations distribution and functional diversity. Genetica 110, 55-62.

Flajshans M., Rab P. & Dobosz S. (1992) Frequency analyses of active NORs in nuclei of artificially induced triploid fishes. Theoretical and Applied Genetics 85, 68-72.

Fopp-Bayat D. & Woznicki P. (2006) Verification of ploidy level in sturgeon larvae. Aquaculture Research 37, 1671-1675.

Fujiwara A., Abe S., Yamaha E., Yamazaki F. & Yoshida M.C. (1998) Chromosomal localization and heterochromatin association of ribossomal RNA gene loci and silver- stained nucleolar organizer regions in salmonid fishes. Chromosome Research 6, 463- 471.

Galetti P.M. (1991) Chromosome complement of induced hybrids of the fish Prochilodus marggravii and Prochilodus affinis (Prochilodontidae, Characiformes). Revista Brasileira de Genética 14, 203-207.

Galetti P.M., Aguilar C.T. & Molina W.F. (2000) An Overview of marine fish cytogenetics. Hydrobiologia 420, 55-62.

Gold L.C., Shipley N.S. & Powers P.K. (1990) Improved methods for working with fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding. Journal of Fish Biology 37, 563-575.

Grijalva-Chon M., Núñez S., Quevedo R. & Castro L. (1996) Ictiofauna de la laguna costera La Cruz. Sonora. Ciencias Marinas 22, 129-150.

Hatanaka T. & Galetti P.M. (2004) Mapping of the 18S and 5S ribosomal RNA genes in the ﬁsh Prochilodus argenteus Agassiz, 1829 (Characiformes, Prochilodontidae). Genetica 122, 239-244.

Howell W.M. & Black D.A. (1980) Controller silver staining of nucleolus organizer region with protective colloidal developer: a 1 - step method. Experientia 36, 1014- 1015.

Iwatsuki Y., Kimura S. & Yoshino T. (2002) A new species: Gerres microphthalmus (Perciformes: Gerreidae) from Japan with notes on limited distribution, included in the “G. ﬁlamentosus complex”. Ichthyological Research 49, 133-139.

Jacobina U.P., Cioffi M.B., Souza L.G.R., Calado L.L., Tavares M., Manzella Jr. J., Bertollo L.A.C. & Molina W.F. (2011) Chromosome mapping of repetitive sequences in Rachycentron canadum (Perciformes: Rachycentridae): implications for karyotypic evolution and perspectives to biotechnological uses. Journal of Biomedicine and Biotechnolology 2011, 218-231.

Mantovani M., Abel L.D.S. & Moreira-Filho O. (2005) Conserved 5S and variable 45S rDNA chromosomal localisation revealed by FISH in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Genetica 123, 211-216.

Martinez J.L., Morán P., Garcia-Vazquez S. & Pendás A.M. (1996) Chromosomal localization of the major and 5S rRNA genes in the European eel (Anguilla anguilla). Cytogenetics and Cell Genetics 73, 149-152.

Martins C. & Galetti P.M. (1999) Chromosomal localization of 5S rDNA genes in Leporinus fish (Anostomidae, Characiformes). Chromosome Research 7, 363-367.

Molina W.F. (2001) An alternative method for mitotic simulation in fish cytogenetics. Chromosome Science 5, 149-152.

Molina W.F. (2007) Chromosomal changes and stasis in marine fish groups. In: Fish Cytogenetics (ed. by Pisano E., Ozouf-Costaz C., Foresti F., Kapoor B.G.), pp. 69-110, Science Publishers, EN, UK.

Molina W.F., Alves D.E.O., Araújo W.C., Martinez P.A., Silva M.F.M. & Costa G.W.W.F. (2010) Performance of human immunostimulating agents in the

43 improvement of fish cytogenetic preparations. Genetics and Molecular Research 9, 1807-1814.

Molina W.F. & Bacurau T.O.F. (2006) Structural and numerical chromosome diversification in marine Perciformes (Priacanthidae and Gerreidae). Cytologia 71, 237- 242.

Molina W.F. & Galetti P.M. (2002) Robertsonian rearrangements in the reef fish Chromis (Perciformes, Pomacentridae) involving chromosomes bearing 5S rRNA genes. Genetics and Molecular Biology 25, 373-377.

Molina W.F. & Galetti P.M. (2004) Karyotypic changes associated to the dispersive potential on Pomacentridae (Pisces, Perciformes). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 309, 109-119.

Molina W.F., Maia-LIma F.A. & Affonso P.R.A.M. (2002) Divergence between karyotypical pattern and speciation events in Serranidae ﬁsh (Perciformes). Caryologia 55, 299-305.

Morán P., Pendás A.M., García-Vázquez E. & Izquierdo J. (1994) Genetic variation among Atlantic salmon in six Spanish rivers. Journal of Fish Biology 45, 831-837.

Motta-Neto C.C., Cioffi M.B., Bertollo L.A.C. & Molina W.F. (2011) Extensive chromosomal homologies and evidence of karyotypic stasis in Atlantic grunts of the genus Haemulon (Perciformes). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 401, 71-79.

Nelson J.S. (2006) Fishes of the World. John Wiley and Sons New York, NY, USA.

Pendás A.M., Morán P., Martínez J.L. & García-Vázquez E. (1995) Aplications of 5S rDNA in Atlantic salmon, brown trout, and in Atlantic salmon x brown trout hybrid identification. Molecular Ecology 4, 275-276.

Pinkel D., Straume T. & Gray J.W. (1986) Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America 83, 2934-2938.

Porto-Foresti F., Oliveira C., Rigolino M.G., Tabata Y.A. & Foresti F. (1998) Possible lethal effect related to an inversion involving the nucleolar organizer region in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Cytogenetics and Cell Genetics, 81 131-138.

Ráb P. (1991) Fish cytogenetics and its application in fish reproductive biology. Bulletin of the Institute of Zoology Academia Sinica 16, 357-373.

Ravisankar T., Sarada C. & Krishnan M. (2005) Diversification of fish culture and exports among major shrimp-producing countries of Asia: A spatial and temporal analysis. Agricultural and Resource Economics Review 18, 187-195.

Rocha E.C. & Molina W.F. (2008) Cytogenetic analysis in western Atlantic snappers (Perciformes, Lutjanidae). Genetics and Molecular Biology 31, 461-467.

Ruiz-Carus R. & Uribe-Alcocer M. (2003) Phylogenetic assessment of Eucinostomus gula, Eugerres plumieri, and Diapterus auratus (Pisces: Gerreidae) based on allozyme and mtDNA analyses. Caribbean Journal of Science 39, 109-115.

Ruiz-Carus R. & Uribe-Alcocer M. (2004) Karyotype analysis of Eucinostomus argenteus, E. gula, E. harengulus, and Eugerres plumieri (Teleostei, Gerreidae) from Florida and Puerto Rico. Environmental Biology of Fishes 67, 269-276.

Schweizer D. & Loidl J. (1987) A model for heterochromatin dispersion and the evolution of C-band patterns. Chromosomes Today 9, 61-74.

Sumner A.T. (1972) A simple technique for demonstrating centromeric heterocromatin. Experimental Cell Research 75, 304-306.

Suzuki H., Sakurai S. & Matsuda Y. (1996) Rat rDNA spacer sequences and chromosomal assignement of the genes to the extreme terminal region of chromosome 19. Cytogenetics and Cell Genetics 72, 1-4.

Vicari M.R., Artoni R.F. & Bertollo L.A.C. (2003) Heterochromatin polymorphism associated with 18S rDNA: a differential pathway among Hoplias malabaricus fish populations. Cytogenetic and Genome Research 101, 24-28.

Vicari M.R., Moreira F.O., Artoni R. & Bertollo L.A.C. (2006) Basic and molecular cytogenetics in freshwater Cichlidae (Osteichthyes, Perciformes) Karyotypic conservationism and divergence. Caryologia 59, 260-266.

CAPÍTULO II

Artigo submetido no Journal of Biotechnology and Biomedicine

Evolutionary dynamics of rDNA genes in the chromosomes of the Eucinostomus fishes: cytotaxonomic and karyoevolutive implications

L. L. Calado, L. A. C. Bertollo§, M. B. Cioffi§, G. W. W. F. da Costa, U. P. Jacobina, W. F. Molina*

Department of Cell Biology and Genetics, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. §Department of Genetics and Evolution, Federal University of São Carlos, São Carlos, São Paulo, Brazil.

Abstract

Several chromosomal features of Gerreidae fish have demonstrated to be conservative. In this group, it is unclear whether the high degree of chromosomal stasis is maintained when analyzing more dynamic regions of chromosomes, such as rDNA sites that generally have a higher level of variability. Thus, cytogenetic analyses were performed on three Atlantic species of the genus Eucinostomus using conventional banding (C- banding, Ag-NOR), AT and GC-specific fluorochromes and FISH mapping of telomeric sequences and 5S and 18S rDNA sites. The results showed that although the karyotypical macrostructure of these species is similar (2n=48 chromosomes, simple Ag-NORs seemingly located on homeologous chromosomes and centromeric heterochromatin pattern), there are differences in the position of rDNA ribosomal subunits 5S and 18S. Thus, the ribosomal sites have demonstrated to be effective cytotaxonomic markers in Eucinostomus, presenting a different evolutionary dynamics in relation to other chromosomal regions and allowing access to important evolutionary changes in this group.

Keywords: karyotype stasis, chromosome evolution, mojarras, synteny.

Introduction

The family Gerreidae comprises 50 species of small to medium-sized fish living in shallow coastal estuarine waters, with wide distribution in tropical and subtropical latitudes (Nelson, 2006). In some areas they constitute typical groups of mangrove environments (Osório et al., 2011), where they represent an abundant and important component of the food chain in areas of high biological productivity (Grijalva-Chon et al., 1996; Ramírez-Luna et al., 2008). Some species have been considered potential candidates for intensive cultivation (Cervigon, 1993; Bensam, 2000; Calado et al., 2012). In Atlantic waters this group of fish comprises the genera Diapterus, Eugerres, Eucinostomus, Gerres and Ulaema (Eschmeyer, 1998), with cytogenetic data available only for the first three of these genera. Karyotypic studies have demonstrated to be a useful tool in taxonomy (cytotaxonomy) and identification of relationship patterns and or phylogenies (cytosystematic), particularly in groups with cryptic taxonomic characters in some life stages. Previous cytogenetic analyses of Eucinostomus, Diapterus, and Eugerres have demonstrated the potential for taxonomic discrimination of Ag-NORs sites (Ruiz-Carus & Uribe-Alcocer, 2004) and of the mapping of 18S and 5S rDNA sequences in the species identification of this family (Calado et al., 2012). The chromosomal mapping of ribosomal subunits, which are dynamic regions able to spread within the genome (Andronico et al., 1985; Schubert et al., 1992; Dubcovsky & Dvorak, 1995; Galian et al., 1995; Reed & Phillips, 1995b; Shishido et al., 2000), has received increasing attention in the indirect identification of karyotype diversification in Perciformes, especially for species identification (Molina et al., 2011; 2012b) and/or fish stocks (Accioly et al., 2012). Thus, in this study, cytogenetic data obtained from three species of the genus Eucinostomus, silver mojarra E. argenteus (Baird & Girard, 1855), jenny mojarra E. gula (Quoy & Gaimard, 1824) and flagfin mojarra E. melanopterus (Bleeker, 1863), are presented, employing different methodologies of classical and molecular cytogenetics, including dual-color FISH chromosomal mapping of 18S and 5S rDNA ribosomal and telomeric (TTAGGG)n sequences. The data reveal the dynamism of the 18S and 5S ribosomal units in the genome of the species of the genus Eucinostomus resulting from chromosomal rearrangements not detectable by analysis of macrochromosomes,

48 constituting effective markers for the better understanding of evolutionary processes occurring in this group.

Material and Methods

Specimens and chromosome preparations

Twenty seven specimens of three species of Eucinostomus (Gerreidae) were analyzed: E. argenteus (n=10, 6 males, 4 females), E. gula (n=8, 5 males, 3 females), and E. melanopterus (n=9, 4 males, 5 females), collected from the base levels of the Cunhaú river (6⁰18'26.97"S 35⁰01'55.45"W) in Canguaretama, and from the Açu River in Guamaré (5⁰05'42.33"S 36⁰16'31.66"W), in the state of Rio Grande do Norte, northeast region of Brazil. Prior to the chromosome preparations, the specimens were subjected to in vivo mitotic stimulation for 24 hours, by intramuscular and intraperitoneal inoculation of complexes of bacterial and fungal antigens (Molina et al., 2010). The specimens were anesthetized with clove oil (Eugenol) and euthanized for the removal of kidney tissue. Metaphase chromosomes were obtained from cell suspensions of fragments of the anterior kidney by in vitro methodology of short duration (Gold et al., 1990). Cell suspensions were dripped onto slides coated with a film of distilled water heated to 60oC. About 30 metaphases were analyzed in each specimen to define the chromosome number and morphology. The best metaphases were photographed under an Olympus BX50 epifluorescent microscope with a digital camera (Olympus DP70).

Chromosome banding

The heterochromatic regions and ribosomal sites were identified using the techniques of Sumner (1972) and Howell & Black (1980), respectively. GC-rich chromosomal regions were evidenced by the CMA3 fluorochrome (chromomycin A3), using DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) as a counterstain (Barros-e-Silva and -1 Guerra, 2009). Briefly, three-day old slides were stained with CMA3 (0.1 mg ml ) for 60 min and restained with DAPI (1 µg ml-1) for 30 min. Next, the slides were mounted in glycerol: McIlvaine buffer pH 7.0 (1:1) and kept for three days at 4oC before being analyzed in an epifluorescence microscope under appropriate filters.

Fluorescent in situ hybridization (FISH) procedures

Fluorescent in situ hybridization (FISH) was performed, with minor modifications, according to the methodology recommended by Pinkel et al. (1986). The 5S and 18S rDNA sequences were detected by dual-color FISH. The 5S and 18S rDNA probes, containing 200bp and 1400bp, respectively, were obtained by PCR from the nuclear DNA of Prochilodus lineatus (Hatanaka & Galetti, 2004), using the primers A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’ and B 5’-CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al., 1995), NS1 5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’ and NS8 5’-TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA-3’ (White et al., 1990), respectively. The 5S and 18S rDNA probes were labeled with biotin-14-dATP and digoxigenin-11-dUTP, respectively, by nick translation according to the manufacturer's recommendations

(Roche, Germany). The telomeric DNA sequence (TTAGGG)n was also used as a probe, previously generated by PCR (PCR-DIG Probe Synthesis Kit, Roche) using

(TTAGGG)5 and (CCCTAA)5 as primers (Ijdo et al., 1991). The chromosomes were treated with DNAse-free RNAse (20mg ml-1 in 2×SSC) at 37°C for 1 hour with pepsin (0.005% in HCl 10mM) at 37°C for 10 minutes, fixed with 1% formaldehyde for 10 minutes, then dehydrated in an alcohol series. Chromosomes were then denatured in 70% formamide/2×SSC at 72°C for 5 minutes. The hybridization solution consisted of 50% formamide, 2xSSC, 10% dextran sulfate and the denatured probe (5ng uL-1). After hybridization for 18 hours at 37°C, the slides were washed in 15% formamide/0.2×SSC at 42°C for 20 minutes, 0.1×SSC at 60°C for 15 minutes and Tween20 0.5%/4×SSC at room temperature. The hybridization signals of digoxigenin-labeled probes were detected using anti-Digoxigenin-rhodamine conjugate (Roche) and Anti-Avidin FITC conjugate (Sigma) was used for the biotinylated probes. The chromosomes were counterstained with Vectashield/DAPI (1.5 µg ml-1) (Vector).

Results

Eucinostomus argenteus, E. gula and E. melanopterus have 2n = 48 acrocentric chromosomes (FN = 48) [Fig. 1(a), (c), (e)]. The karyotypes are quite symmetrical with little size difference between the pairs. Conspicuous heterochromatic blocks were found in the pericentromeric regions of chromosomes in the three species analyzed [Fig. 1(b), (d), (f)]. However, the heterochromatic segments are more expanded in E. argenteus than in the other species

(Fig. 1b). Ag-NORs sites were identified in all three species only on chromosome pair 22, though in varying positions, since they are interstitially located in E. argenteus and E. melanopterus and in terminal position in E. gula [Fig. 2(b), (c), (d)]. A precise +/ - correlation was observed between the Ag-NORs and 18S/CMA3 DAPI sites in the three species [Fig. 2(b), (c), (d)]. In E. argenteus the pericentromeric heterochromatin is GC-positive both in ribosomal sites and most chromosome pairs [Fig. 2(a)].

Figure 1. Karyotypes of Eucinostomus argenteus (a, b), E. gula (c, d) and E. melanopterus (e, f) with conventional staining (a, c, e) and C-banding (b, d, f). Bar = 5μm.

Mapping of 5S rDNA subunits showed simple sites in the three species, but located on different chromosomes. In E. argenteus these sites are located interstitially on pair 11. In E. gula they are located in the terminal position of the short arms on pair 6, and in E. melanopterus they are located in interstitial position and co-located with the 18S rDNA sites on the long arm of pair 22 [Fig. 3(a), (b), (c)]. FISH with telomeric probes (TTAGGG)n showed markings exclusively in the terminal region of the chromosome [Fig. 2(e), (f), (g)].

Figure 2. Fluorescent pattern of Eucinostomus argenteus chromosomes (a) stained with CMA3 showing GC-rich pericentromeric heterochromatin on most chromosome pairs. Detail of the nucleolar organizer pair (pair 22) subjected to silver impregnation and staining with base-specific fluorochrome (b, c, d) and mapping of telomeric sequences (TTAGGG)n (e, f, g) in E. argenteus (b, e), E. gula (c, f) and E. melanopterus (d, g), respectively. Bars = 5μm.

Figure 3. Location of 18S (red) and 5S (green) ribosomal genes using dual color FISH mapping in E. argenteus (a), E. gula (b) and E. melanopterus (c). Bar = 5μm.

Discussion

Eucinostomus species show a highly conserved karyotypic macrostructure (2n=48, FN=48). High intrageneric similarity has also been observed among mojarras of the genera Diapterus and Eugerres (Calado et al., 2012). This karyotypic pattern, close

53 to the putative basal karyotype in Perciformes (Molina, 2007; Motta-Neto et al., 2012), is not only present in representatives of the Gerreidae (Ruiz-Carus & Uribe-Alcocer, 2004; Molina & Bacurau, 2006; Calado et al., 2012), but also frequent among Perciformes (Arai, 2011). Together with macrostructural features, some chromosomal traits of Eucinostomus appear to be highly conserved, such as simple Ag-NORs sites (C+/GC+/DAPI-) and pericentromeric heterochromatin regions. Marine Perciformes exhibit a high karyotypic stability in some groups, showing evidence of karyotypic stasis (Molina, 2007), where the cytogenetic differences fall short of the phenotypic variation between closely related species (Molina et al., 2002; Motta-Neto et al., 2011). In contrast, the karyotypes of some families of Perciformes, although subjected to a slower evolutionary rate in relation to the fixation of structural rearrangements, have revealed some hypervariable chromosomal regions, especially those represented by ribosomal sites or positions adjacent to them (Affonso & Galetti, 2005; Lima-Filho et al., in press). Thus, in groups of fish with higher karyotypic stability, the mapping of the ribosomal subunits has proved to be a particularly effective method in the identification and quantification of chromosome dynamics, especially among cogeneric species, as suggested by the Eucinostomus species analyzed in this study. In fact, analyses involving the mapping of 18S and 5S sequences and characterization of GC-rich regions in these species reveal diagnostic cytogenetic markers, enabling the identification of unique chromosomal differences between them. GC-positive extra-NORs heterochromatic segments in E. argenteus, not present in E. gula and E. melanopterus, represent a peculiar character of this species. This condition, although unusual, has been reported in some fish species (Affonso & Galetti, 2005; Molina et al., 2012a, b), with suggestions that the high content of GC-rich regions around the karyotype could favor the occurrence of chromosomal rearrangements (Margarido & Galetti, 2000; Martinez et al., 2011). Aside from this characteristic derived from heterochromatin in E. argenteus (GC-rich), all species present mainly centromeric heterochromatin. Such heterochromatin distribution pattern is considered conserved and widespread in Perciformes, particularly in marine groups (Molina, 2007). Less conserved, the mapping with 5S and 18S ribosomal sequences exhibited interspecific variation thus demonstrating that ribosomal sites may be effective cytotaxonomic markers or provide indications of the occurrence of chromosomal rearrangements, especially among species that show low karyotypic diversity (e.g. Motta-Neto et al., 2011). Thus, although the 18S rDNA sites are simple and apparently

54 located on a homeologous chromosome pair in the three species analyzed (pair 22), they have different positions on chromosomes, occurring in interstitial position in E. argenteus and E. melanopterus and in terminal position of the short arm in E. gula, suggesting intrachromosomal rearrangements. The activity of the nucleolar organizer regions on a single chromosome pair may have provided a rare and casual interstitial colocalization of the 18S and 5S genes in E. melanopterus. In fish, 5S and 18S rDNA multigene families are most often located on different chromosome pairs, which seem to represent the most common and possibly basal condition for the arrangement of these ribosomal genes (Martins & Galetti, 1999). Thus, they may evolve independently and are subject to individual selective pressure (Amarisinghe & Carlson, 1998). Occasionally, in Perciformes, both 5S and 18S rDNA sites may be diversified (Motta- Neto et al., 2011), standing out as efficient population markers (Accioly et al., 2012; Lima-Filho et al., 2012), and may be associated with chromosome rearrangements (Molina & Galetti, 2002; Jacobina et al., 2012). In several fish species the 5S rDNA sites are located in interstitial position on the chromosomes, as in salmonids (Fujiwara et al., 1998), anostomids (Martins & Galetti, 2000), and parodontids (Vicente et al., 2001), among many others. In fact, this location has also been the most common among Eucinostomus species. However, it is not yet clear whether this condition is a plesiomorphic characteristic of this particular genus, a question that may be answered with accumulating evidence from the mapping of these genes in a larger number of species. Eventually, 5S and 18S sites may exhibit synteny, located on the same chromosome. Although this spatial conformation is unusual, it has been observed in some species of fish, as in Salmo salar (Morán et al., 1994), Oreochromis niloticus (Pendás et al., 1994), Triportheus nematurus (Diniz et al., 2008), Hoplias malabaricus (Cioffi et al., 2009). The syntenic adjacent location detected in E. melanopterus, indicates an autapomorphic condition for this species, since the dual color FISH mapping in other species of this and other Gerreidae genera reveal a non-syntenic position of ribosomal genes (Calado et al., 2012). Interestingly, in E. argenteus and E. gula both ribosomal sites are located on separate chromosomes, and they exhibit variations in intrachromosomal location (terminal, interstitial), whereas in E. melanopterus they are interstitially co-located on a single pair. These various physical arrangements of rDNA sites show their relative mobility in the genome, unlike other

55 chromosomal regions such as the centromeric and telomeric sequences, which seem to be less dynamic in evolutionary terms. By the position of the ribosomal sequences in the karyotypes of the three species of Eucinostomus, as with previous data by dual color FISH mapping in species of Diapterus and Eugerres, it is feasible to distinguish three stages of chromosomal location of ribosomal sites of Gerreidae [Fig. (4)]. The first pattern, observed in E. argenteus, is represented by both 5S and 18S sites in interstitial position on different chromosome pairs. This pattern may correspond to the baseline condition of Gerreidae, considering its greater frequency among species and a possible advantage that the interstitial location of ribosomal genes could confer against disruptive chromosomal rearrangements (Martins & Galetti, 1999). Thus, the second pattern, present only in E. gula among the Gerreidae, corresponds to a derived condition, represented by both 5S and 18S sites in the terminal position on different chromosomes. Finally, the rare third pattern corresponds to an autapomorphy in E. melanopterus, represented by both 5S and 18S sites colocated on a single pair in interstitial position.

Figure 4. Idiogram representing the three stages of chromosomal location of ribosomal sites in Eucinostomus species. First pattern is represented by both 5S and 18S sites in interstitial position on different chromosome pairs chromosomes; second, represented by both 5S and 18S sites in the terminal position on different chromosomes; and third, both 5S and 18S sites are colocated on a single pair in interstitial position.

Telomeric probes have usually been employed in the identification of traces of recent evolutionary chromosomal rearrangements, as has been identified in Salmoniformes (Salvadori et al., 1995), Characiformes (Cioffi et al., 2010), Perciformes (Gornung et al., 1998; Slijepcevic, 1998), among other groups. The mapping of repetitive sequences (TTAGGG)n in the karyotypes of the three species indicates a

56 unique location in the terminal portions of all chromosomes of the complement. The failure to detect ectopic sites and maintenance of the basal diploid number, associated with the dynamics presented by ribosomal sequences, suggests that the distribution of ribosomal genes in interstitial or terminal positions may be due to transposition or paracentric inversions, the latter a process rarely detected among fish (e.g. Porto-Foresti et al., 2004). The macrokaryotypic conservatism observed in Eucinostomus, whose greatest detectable variation is related to the dynamics of ribosomal sites in the karyotype, finds support in previous evidence found in other genera of Gerreidae (Calado et al., 2012). In this karyoevolutionary context, with reduced rates of chromosomal diversification, cytogenetic analyses employing recent advances in molecular cytogenetics emerge as an interesting model to track the processes of diversification within the group.

Acknowledgments

The authors thank the National Research Council (CNPq - Proc. 141234/2009-1) for financial support and research grant provided to L. L. Calado and J. Garcia Jr. for taxonomic identification of specimens.

References

Accioly, I.V., Bertollo, L.A.C., Costa, G.W.W.F., Jacobina, U.P. & Molina, W.F. (2012). Chromosomal population structuring in Carangids (Perciformes) between the north-eastern and south-eastern coasts of Brazil. African Journal of Marine Science. 34 (3). http://dx.doi.org/10.2989/1814232X.2012.689671

Affonso, P.R.A.M. & Galetti, P.M. Jr. (2005). Chromosomal diversiﬁcation of reef ﬁshes from genus Centropyge (Perciformes, Pomacanthidae). Genetica. 123, 227-233.

Amarisinghe, V. & Carlson, J.E. (1998). Physical mapping and characterization of 5S rRNA genes in Douglas-fir. American Genetics Association. 89, 495-500.

Andronico, F., De Lucchini, S., Graziani, F., Nardi, I., Batistoni, R. & Barsacchi-Pilone G. (1985). Molecular organization of ribosomal RNA genes clustered at variable

57 chromosomal sites in Triturus vulgaris meridionalis (Amphibia, Urodela). Journal of Molecular Biology. 186, 219-229.

Arai, K. (2011). Fish Karyotypes - A Check List. New York: Springer.

Barros-e-Silva, A.E. & Guerra M. (2009). The meaning of DAPI bands observed after C-banding and FISH procedures. Biotechnology and Histochemistry. 4, 1-11.

Bensam, P. (2000). A review of marine finfish culture experiments in India. In Marine Research and Management (Pillai V.N. & Menon N.G., eds.), pp. 802–817. Kochi: Central Marine Fisheries Research Institute.

Calado, L.L., Bertollo, L.A.C., Costa, G.W.W.F. & Molina, W.F. (2012). Cytogenetic studies of Atlantic mojarras (Perciformes - Gerreidae): chromosomal mapping of 5S and 18S ribosomal genes using double-FISH. Aquaculture Research, 44, 829-835.

Cervigon, F. (1993). Los peces marinos de Venezuela. Caracas: Fundacion Cientıfica Los Roques.

Cioffi, M.B., Martins, C., Centofante, L., Jacobina, U. & Bertollo, L.A.C. (2009). Chromosomal variability among allopatric populations of Erythrinidae fish Hoplias malabaricus: mapping of three classes of repetitive DNAs. Cytogenetic Genome Research. 125, 132–141.

Cioffi, M.B., Martins, C., Bertollo, & L.A.C. (2010). Chromosome spreading of associated transposable elements and ribosomal DNA in the fish Erythrinus erythrinus. Implications for genome change and karyoevolution in fish. BMC Evolutionary Biology. 10, 271. doi:10.1186/1471-2148-10-271

Diniz, D., Moreira-Filho, O. & Bertollo, L.A.C. (2008). Molecular cytogenetics and characterization of a ZZ/ZW sex chromosome system in Triportheus nematurus (Characiformes, Characidae). Genetica. 133, 85-91.

Dubcovsky, J. & Dvorak, J. (1995). Ribosomal RNA multigene loci: nomads of the Triticeae genomes. Genetics. 140, 1367-1377.

Eschmeyer, W.N. (1998). Catalog of fishes. San Francisco: California Academy of Science.

Fujiwara, A., Abe, S., Yamaha, E., Yamazaki, F. & Yoshida, M.C. (1998). Chromosomal localization and heterochromatin association of ribossomal RNA gene loci and silver-stained nucleolar organizer regions in salmonid fishes. Chromosome Research. 6, 463-471.

Galian, J., Serrano, J., De la Rua, P., Petitpierre, E. & Juan, C. (1995). Localization and activity of rDNA genes in tiger beetle (Coleoptera: Cicindelinae). Heredity. 74, 524- 530.

Gold Jr., L.C., Shipley, N.S. & Powers, P.K. (1990). Improved methods for working with fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding. Journal of Fish Biology. 37, 563-575.

Gornung, E., Gabrielli, I. & Sola, L. (1998). Localization of the (TTAGGG)n telomeric sequence in zebrafish chromosomes. Genome. 41, 136-138.

Grijalva-Chon, M., Núñez, S., Quevedo, R. & Castro, L. (1996). Ictiofauna de la laguna costera La Cruz Sonora. Ciencias Marinas. 22, 129–150.

Hatanaka, T. & Galetti Jr., P.M. (2004). Mapping of the 18S and 5S ribosomal RNA genes in the ﬁsh Prochilodus argenteus Agassiz, 1829 (Characiformes, Prochilodontidae). Genetica. 122, 239-244.

Howell, W.M. & Black, D.A. (1980). Controller silver staining of nucleolus organizer region with protective colloidal developer: a 1 - step method. Experientia. 36, 1014- 1015.

Ijdo, J.W., Wells, R.A., Baldini, A. & Reeders, S.T. (1991). Improved telomere detection using a telomere repeat probe (TTAGGG)n generated by PCR. Nucleic Acids Research. 19, 4780.

Jacobina, U.P. (2012). Parâmetros citogenéticos de espéciess comerciais de Carangidae (Perciformes), com vistas a sua empregabilidade na conservação biológica e piscicultura marinha, Centro de Ciências Biológicas. Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, p. 152.

Lima-Filho, P.A., Bertollo, L.A.C., Cioffi, M.B., Costa, G.W.W.F. & Molina, W.F. (2012) Karyotype divergence and explosive spreading of 5S rDNA sequences between darter and emerald gobies (Ctenogobius, Gobiidae). Journal of Biomedicine and Biotechnology. (in press).

Lima-Filho, P.A., Molina, W.F., Cioffi, M.B. & Bertollo, L.A.C. (2012) Chromosomal and morphological divergences in Atlantic populations of the frillfin goby Bathygobius soporator (Gobiidae, Perciformes). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 434, 63-70.

Margarido, V.P. & Galetti Jr., P.M. (2000). Amplification of a GC-rich heterochromatin in the freshwater fish Leporinus desmotes (Characiformes, Anostomidae). Genetic and Molecular Biology. 23(3),569-573.

Martinez, P.A., Jacobina, U.P. & Molina, W.F. (2011). Comparative cytogenetics and heterochromatic patterns in two species of the genus Acanthostracion (Ostraciidae: Tetraodontiformes). Marine Genomics. 4, 215-220.

Martins, C. & Galetti Jr., P.M. (1999). Chromosomal localization of 5S rDNA genes in Leporinus fish (Anostomidae, Characiformes). Chromosome Research. 7, 363-367.

Martins, C. & Galetti Jr., P.M. (2000). Conservative distribution of 5S rDNA loci in Schizodon (Pisces, Anostomidae) chromosomes. Chromosome Research. 8, 353-355.

Molina, W.F. (2007). Chromosomal Changes and Stasis in Marine Fish Groups 1, In Fish Cytogenetics (Pisano, E., Ozouf-Costaz, C., Foresti, F. & Kapoor, B.G., eds.), pp. 69-110. Enfield: Science Publishers.

Molina, W.F., Alves, D.E.O., Araújo, W.C., Martinez,P.A., Silva, M.F.M. & Costa G.W.W.F. (2010). Performance of human immunostimulating agents in the improvement of fish cytogenetic preparations. Genetic and Molecular Research. 9, 1807-1814.

Molina, W.F. & Bacurau, T.O.F. (2006). Structural and numerical chromosome diversification in marine Perciformes (Priacanthidae and Gerreidae). Cytologia. 71, 237- 242.

Molina, W.F., Costa G.W.W.F., Cioffi, M.B. & Bertollo, L.A.C. (2012a). Chromosomal differentiation and speciation in sister-species of Grammatidae (Perciformes) from the Western Atlantic. Helgoland Marine Research. 66, 363-370.

Molina, W.F., Maia-Lima F.A. & Affonso, P.R.A.M. (2002). Divergence between karyotypical pattern and speciation events in Serranidae fish (Perciformes). Caryologia 55, 299–305.

Molina, W.F., Motta-Neto, C.C., Sena, D.C.S., Cioffi, M.B. & Bertollo, L.A.C., (2012b). Karyoevolutionary aspects of Atlantic hogfishes (Labridae – Bodianinae), with evidence of an atypical decondensed argentophilic heterochromatin. Marine Genomics. 6, 25– 31.

Molina, W.F. & Galetti Jr., P.M., (2002). Robertsonian rearrangements in the reef fish Chromis (Perciformes, Pomacentridae) involving chromosomes bearing 5s rRNA genes. Genetic and Molecular Biology. 25, 373-377.

Morán, P., Pendás, A.M., García-Vázquez, E. & Izquierdo, J. (1994). Genetic variation among Atlantic salmon in six Spanish rivers. Journal of Fish Biology. 45, 831-837.

Motta-Neto, C.C., Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C., Molina, W.F., 2011. Extensive chromosomal homologies and evidence of karyotypic stasis in Atlantic grunts of the genus Haemulon (Perciformes). J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 401, 71-79.

Motta-Neto, C.C., Lima-Filho, P.A., Araujo, W.C., Bertollo, L.A.C. & Molina, W.F. (2012). Differentiated evolutionary pathways in Haemulidae (Perciformes): karyotype stasis versus morphological differentiation. Reviews in Fisheries Biology and Fisheries. 22 (2), 457-465. http://link.springer.com/article/10.1007/s11160-011-9236-4?null.

Nelson, J.S. (2006). Fishes of the World. New York: John Wiley and Sons.

Osório, F.M., Godinho, W.O. & Lotufo, T.M.C. (2011). Fish fauna associated to mangrove roots at the Pacoti River estuary. Biota Neotropical. 11 (1), 415-420

Pendás, A.M., Móran, P., Freije, J.P. & Garcia-Vásquez, E. (1994). Chromosomal location and nucleotide sequence of two tandem repeats of the Atlantic salmon 5S rDNA. Cytogenetic and Cell Genetic. 67.

Pendás, A.M., Móran, P., Martínez, J.L., García-Vázquez, E. (1995). Aplications of 5S rDNA in Atlantic salmon, brown trout, and in Atlantic salmon x brown trout hybrid identification. Molecular Ecology. 4, 275-276.

Pinkel, D., Straume, T. & Gray, J.W. (1986). Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 83, 2934-2938.

Porto-Foresti, F., Oliveira, C., Gomes, E.A., Tabata, Y.A., Rigolino, M.G. & Foresti, F. (2004). A lethal effect associated with polymorphism of the NOR-bearing chromosomes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Genetic and Molecular Biology. 27(1), 51-54.

Ramírez-Luna, V., Navia, A.F. & Rubio, E.A. (2008). Food habits and feeding ecology of an estuarine fish assemblage of Northern Pacific Coast of Ecuador. Pan-american Journal of Aquatic Science. 3, 361-372.

Reed, K.M. & Phillips, R.B. (1995b). Molecular characterization and cytogenetic analysis of highly repeated DNAs of lake trout, Salvelinus namycush. Chromosoma. 104, 242-251.

Ruiz-Carus, R. & Uribe-Alcocer, M. (2004). Karyotype analysis of Eucinostomus argenteus, E. gula, E. harengulus, and Eugerres plumieri (Teleostei, Gerreidae) from Florida and Puerto Rico. Environmental Biology of Fishes. 67, 269-276.

Salvadori, S., Deiana, A., Elisabetta, C., Floridia, G., Rossi, E. & Zuffardi, O. (1995).

Colocalization of (TTAGGG)n telomeric sequences and ribosomal genes in Atlantic eels. Chromosome Research. 3, 54-58.

Schubert, I., Schriever-Schwemmer, G., Werner, T. & Adler, I-D. (1992). Telomeric signals in Robertsonian fusion and fission chromosomes: implications for the origin of pseudoaneuploidy. Cytogenetic and Cell Genetics. 59, 6-9.

Shishido, R., Sano, Y. & Fukui, K. (2000). Ribosomal DNAs: an exception to the conservation of gene order in rice genomes. Molecular and General Genetics. 263, 586- 59.

Slijepcevic, P. (1998). Telomeres and mechanisms of Robertsonian fusion. Chromosoma. 107, 136-140.

Sumner, A.T. (1972). A simple technique for demonstrating centromeric heterocromatin. Experimental Cell Research. 75, 304-306.

Vicente, V.E., Jesus, C.M. & Moreira-Filho, O. (2001). Chromosomal localization of 5S and 18S rRNA genes in three Parodon species (Pisces, Parodontidae). Caryologia. 54, 365-369.

White, T.J., Bruns, T., Lee, S. & Taylor, J. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: a guide to methods and applications. pp. 315-322. San Diego: Academic Press Inc.

CAPÍTULO III

Correlação entre divergência citogenética e hibridação interespecífica e seu uso na piscicultura moderna

Leonardo Luiz Calado e Wagner Franco Molina

1Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Brasil

Resumo

Na aquicultura a hibridação interespecífica faz parte de uma ampla gama de processos biotecnológicos que visam auxiliar o melhoramento e cultivo de espécies. A aplicação de técnicas clássicas e modernas de reprodução artificial aliado às análises genéticas tem propiciado proles viáveis interespecíficas com maior resistência, desempenho zootécnico e taxa de sobrevivência pós-reprodução. Similaridades cariotípicas (estrutural e composicional) são importantes pré-requisitos para identificar pares heterólogos de espécies geradoras de híbridos viáveis. Até o momento não existem relações estabelecidas entre os níveis de diferenciação cariotípicas e o sucesso na produção de peixes híbridos. Assim, aqui é apresentada uma revisão preliminar onde são analisados dados citogenéticos de híbridos interespecíficos de quatro importantes Ordens de peixes. Diante da similaridade cariotípica exibida em alguns grupos de Perciformes, é possível que a quebra de barreiras pós zigóticas possa ser mais tolerada do que se imaginava. Dados citogenéticos e de conteúdo de DNA se mostram parâmetros úteis que poderão vir a integrar futuros programas de obtenção de hibridação interespecíficas com interesse comercial.

Palavras Chave: Barreiras pós-zigóticas, Perciformes, biotecnologia, piscicultura, reprodução, hibridação interespecífica.

Introdução

Hibridação na aquicultura

A hibridação é definida como a reprodução entre grupos ou indivíduos geneticamente distintos e pode envolver cruzamento dentro de espécies, como linhagens diferentes, ou entre espécies, e seu bloqueio é tido como principal responsável pelo processo de especiação. Testes de hibridação, além de favorecer a elucidação de relações taxonômicas entre as espécies, contribui para o entendimento experimental de questões evolutivas, ecológicas, fisiológicas e comportamentais. Um maior grau heterose ou vigor híbrido presente em proles híbridas podem ser transferidos para gerações subsequentes e produzir indivíduos com maior produtividade. Inicialmente os principais objetivos no estudo de híbridos, tanto naturais, como artificiais, vem sendo a identificação dos parentais; características biológicas específicas em relação às espécies parentais; desempenho descrito como heterose ou vigor híbrido e o nível de esterilidade expressa na F1 (Hubbs, 1955; Purdom, 1993), entre outros. Com intuito de melhorar a produção em cultivos aquícolas, práticas de hibridação visam atingir o máximo aproveitamento do vigor genético por transferência de genes desejáveis por cruzamentos de espécies distintas. Assim, espera-se transferir das espécies doadoras o máximo de caracteres que possam melhorar o desempenho das espécies para maior adaptação ao cultivo. Características tais como, qualidade de carne, taxa de crescimento, ganho de peso, taxa de sobrevivência após reprodução, tolerância às variações do meio, manipulação da razão sexual, produção de animais estéreis, resistência às doenças, em suma, traços que superem o desempenho zootécnico dos parentais são bem vistos e buscados pelos programas de hibridação (Abbott et al., 2013; Bartley et al., 2001; Lexer et al., 2003; Manchado et al., 2005; Santos et al., 2002). A hibridação ocorre frequentemente de forma natural para algumas famílias de peixes (Hubbs, 1955). Em geral, híbridos naturais têm sido reconhecidos por coloração diferenciada ou padrões corporais intermediários entre os parentais, obtidas tanto por dados morfométricos (e.g. comprimento padrão, zoológico, diâmetro do olho, entre outros), como merísticos (e.g. contagem de raios das nadadeiras e escamas). Atualmente métodos relacionados à genética molecular citogenética e identificação de diferenças proteicas vêm sendo crescentemente utilizados (Artoni et al., 2000; Marques, 2002; Quist et al., 2009; Torres et al., 2004).

Com a maximização de novas práticas e mercados, o número de espécies aquaticas cultivadas até 2010 elevou-se para 541, destas 371 são de peixes tendendo a aumentar para cerca de 600 em poucos anos. Contudo, do total supracitado apenas cinco são provenientes de cruzamentos entre espécies diferentes, tem cultivo estabelecido e possuem produção comercial, caso das tilápias africanas, carpas chinesas, salmões do Atlântico, catfishes e os híbridos formados por Characiformes como Pacu e Tambaqui, principalmente em países cuja aquicultura já está bem desenvolvida (FAO, 2012). Desde o fim do século 19, um grande número de estudos vem sendo desenvolvidos quanto à hibridação natural ou artificial de peixes (Chevassus, 1983; FAO, 2012). No Brasil, a utilização da hibridação interespecífica na aquicultura é comum, desde o início dos anos 1980, quando a prática foi introduzida pelo Departamento Nacional de Obras Contra a Seca (DNOCS). O objetivo foi promover uma maior amplitude de indivíduos com características desejáveis para o repovoamento de açúdes, lagos de hidrelétricas e, por conseguinte, incrementar a produção de peixes onde ainda era incipiente a disponibilidade de água e consequentemente de pescado (Toledo-Filho et al., 1998). Em peixes o processo de hibridação ocorre com maior frequência que em outros grupos de vertebrados. Alguns fatores são propostos para que a alta incidência de híbridos entre grupos taxonômicos relacionados sejam mais abundantes, tais como, fertilização externa, mecanismos frágeis de isolamento comportamental, limitada competição por habitat de desova, baixa complexidade do habitat e susceptibilidade para contatos secundários entre formas envolvidas no acasalamento (Scribner et al., 2001). A hibridação pode resultar em um aumento da adaptabilidade aos ambientes alterados por algum motivo e é mais comum entre espécies que divergem geneticamente menos que 10%, devido ao favorecimento das chances da formação de híbridos viáveis (Mallet, 2005). Neste sentido, a introgressão gênica natural pode ocorrer quando híbridos férteis produzem proles viáveis com espécies parentais (Montanari et al., 2012). De acordo com a FAO (2012), a partir de 1956 foram registrados 212 híbridos, entre os de ocorrência natural e os obtidos artificialmente. Destes, 30 são marinhos, porém esse número é certamente superior, necessitando de maior investigação. A hibridação artificial é um processo que pode ser implementado em diversos organismos espécies, principalmente em peixes, devido à características favoráveis como fecundação externa, territorialismo, diferentes níveis de isolamento reprodutivo

(Hubbs, 1955), além de avançado conhecimento do manejo e indução reprodutiva em inúmeras espécies. Apesar das inúmeras vantagens e de híbridos comerciais importantes, devem ser destacados alguns problemas relacionados à hibridação que podem ser mitigados com protocolos de biossegurança. Entre os riscos assinalados, o escape de híbridos pode, em níveis variáveis, levar à degradação de habitats, competição por alimento e introgressão genética com espécies parentais (Allendorf et al., 2001; Diana, 2009; Rhymer and Simberloff, 1996) . É desejável inicialmente a um programa de hibridação que seja realizada a caracterização genética de espécies e populações parentais e, principalmente, do produto híbrido obtido após cruzamento artificial. Normalmente, híbridos são estéreis ou de baixa fertilidade, características estas que podem ser vantajosas e desejadas. Em caso de escape acidental de híbridos estéreis, o risco de introgressão de genes em populações nativas, neste caso, é evitado (Toledo-Filho et al., 1994; Schwenk et al., 2008). De fato, a esterilidade em híbridos tende a ser comum, contudo, também tem sido descritos híbridos sub-férteis ou mesmo com capacidade reprodutiva completa (Allendorf et al., 2001; Hulata, 1995; Rosenfield et al., 2004). Tendo em vista a incipiência e a necessidade de informações citogenéticas a respeito dos híbridos, seus impactos e sua possível utilidade na aquicultura, torna-se imperativo o levantamento de dados, assim como vislumbrar tendências sobre formas de cultivo, melhores ferramentas para detecção e monitoramento. Visando contribuir com uma nova abordagem sobre o processo de hibridação interespecífica, aqui foi realizada uma prospecção inicial sobre o relacionamento entre similaridades cariotípicas dos parentais como indicador do sucesso de hibridação e assim estimar possíveis cruzamentos com maior probabilidade de geração de híbridos.

Citogenética e hibridação

Historicamente a análise de dados merísticos e morfométricos constituem as principais formas de identificação utilizadas para distinção de híbridos (Campton, 1990). Com o passar dos anos outras técnicas de identificação vêm sendo utilizadas para este fim, partindo das aloenzimas que datam de 1967 (Koehn and Rasmussen, 1967), a métodos mais recentemente difundidos como o DNA mitocondrial, DNA nuclear e a quantificação de material genético por citometria de fluxo (Scribner et al., 2001).

Com a reprodução artificial a quebra de barreiras comportamentais, biológicas, geográficas dentre outros mecanismos reprodutivos de isolamento podem ser transpostos, permitindo assim que a hibridação interespecífica possa ser utilizada como método comercial viável (Bartley et al., 2001), tendo como limitante em alguns casos, apenas a instabilidade genética dos híbridos. Dados cromossômicos das espécies podem constituir características potencialmente favoráveis à quebra de barreiras pós-zigoticas. O número haploide/diploide e a fórmula cromossômica (Tabela 1), podem ser utilizados preliminarmente como possíveis indicadores desta possibilidade (Gomes et al., 2012). Entre os parâmetros citogenéticos a serem avaliados estão a compatibilidade cromossômica entre os parentais, tanto numérica, quanto estrutural, quantidade de DNA genômico e de DNA repetitivo. Além disso, características cariotípicas específicas, podem ser utilizadas como marcadores citotaxonômicos, se mostram particularmente úteis na identificação de produtos híbridos. Entre estes marcadores, destacadamente vem sendo utilizada a frequência e localização de genes ribossomais, além de outras sequências repetitivas. Entre as regiões informativas, os sítios ribossomais pela facilidade de identificação e robustez se mostra de grande importância na identificação de híbridos (Pendás et al., 1995; Scribner et al., 2001; Nirchio et al., 2003; Porto- Foresti et al., 2008). A compatibilidade cromossômica pode ser um bom indicador de possibilidade de rompimento de barreiras pré e pós-zigóticas e consequente cruzamento e produção de F1 viável. Menores similaridades genéticas mais reduzidas entre os parentais, em geral promovem híbridos estéreis (Bartley et al., 2001; Raesly et al., 1990; Scribner et al., 2001). A quantidade de DNA genômico pode ser mais um indicador de marcante divergência interespecífica. Peixes pertencentes à mesma Ordem tendem a apresentar conteúdos de DNA quantitativamente mais semelhantes. O nível de interferência da variação do conteúdo de DNA na hibridação entre espécies, ainda não foi convenientemente estudado, contudo, a análise deste parâmetro entre cruzamentos interespecíficos já obtidos sugere que similaridade quantitativa possa ser uma premissa para a ocorrência de hibridação (Figura 1).

Figura 1. Quantidade de DNA médio em três Ordens de peixes evidenciando a variação no tamanho genômico em Osteichthyes.

Além das análises citogenéticas convencionais, outras metodologias de análise estrutural dos cromossomos, como bandas de replicação derivadas da incorporação do análogo de base 5-bromodioxiuridina (5-Brdu), coloração por fluorocromos base específicos para regiões ricas em AT (DAPI) e GC (Cromomicina A3) e mapeamento de genes e sequências através de hibridização fluorescente in situ podem externar com maior precisão o grau de divergência entre espécies parentais (Porto-Foresti et al., 2010).

Tabela 1. Híbridos naturais e artificiais em peixes e padrões cromossômicos das espécies parentais.

Ordem/Família Espécie 2n Fórmula cariotípica NF Cruzamento Híbrido Tipo de hibridação Tamnaho do genoma pg/cell Localidade Fonte Acipenseriformes Acipenseridae Acipenser ruthenus 118 82M/SM + 36A/MC 200 3,7 FCM;8,3 FCM Vasiliev, 1985; Birstein and Vasiliev, + Acipenser ruthenus x Acipenser baeri Artificial Russia Acipenser baeri 248 1987; Birstein et al., 1993; Vasiliev et al., 1980; Vasiliev and Sokolov, 1980; Fontana, 1994 Anguiliformes Anguillidae Anguilla anguilla 38 12M + 10SM + 16A 60 + Anguilla anguilla x Anguilla japonica Artificial Müller et al., 2012 Anguilla japonica 38 12M + 10SM + 16A 60 Anguilla australis 38 20M/SM + 18A 58 Nishikawa et al., 1971; Kobaiashi and + Anguilla australis x Anguilla japonica Possível Anguilla japonica 38 20M/SM + 18A 58 Kimura, 1975 Anguilla anguilla 38 12M + 10SM + 16A 60 Nishikawa et al., 1971; Kobaiashi and + Anguilla anguila x Anguilla japonica Natural Anguilla rostrata 38 12M + 10SM + 16A 60 Kimura, 1976 Atheriniformes Atherinidae Menidia beryllina 48 10M + 24SM + 14ST/A 82 Menidia beryllina x Menidia peninsulae Natural USA(LA) Korth, 1987 Menidia peninsulae Menidia menidia 48 4M + 14SM + 12ST + 18A 66 Menidia menidia x Menidia peninsulae Natural USA(LA) Korth, 1987 Menidia peninsulae Clupeiformes Clupeidae Brevoortia patronus 46 2M + 2SM + 42A 46 USA (Atlantic) Doucette Jr. and Fitzsimons, 1988; Brum, + Brevoortia patronus x Brevoortia pectinata Possível Brevoortia pectinata 46 2M + 2SM + 42A 46 Brazil 1996 Brevoortia smithi 46 2M + 2SM + 42A 46 USA (Atlantic) + Brevoortia smithi x Brevoortia pectinata Possível Doucette Jr. and Fitzsimons, 1988 Brevoortia pectinata 46 2M + 2SM + 42A 46 USA (Atlantic) Brevoortia pectinata 46 2M + 2SM + 42A 46 Brazil + Brevoortia pectinata x Brevoortia aurea Possível Brum et al., 1992; Brum, 1996 Brevoortia aurea 46 2M + 2SM + 42A 46 Brazil Dorosoma cepedianum 46 2SM + 4ST + 42A 50 2.0 FCM USA (LA) Fitzsimons et al., 1981; Gregory, 2008 Dorosoma cepedianum x Dorosoma petenense Artificial Dorosoma petenense 46 2SM + 2ST + 44A 50 USA (LA) Engraulidae Engraulis japonicus 48 48A 48 2.8*FCM Japan Ojima and Yamamoto, 1990; Ohno et al., Engraulis japonicus x Engraulis mordax Possível Engraulis mordax 48 48A 48 3.0FD, 3,8 BFA East pacific 1969; Hinegardner and Rosen, 1972 Characiformes Anostomidae Leporinus elongatus 54 54M/STM 108 Artificial + Leporinus macrocephalus x Leporinus elongatus Leporinus macrocephalus 54 32M + 21SM + 1ST 108 Characidae Colossoma macropomum 54 20M + 34SM 108 Artificial + Colossoma macropomum x Piaractus mesopotamicus Porto-Foresti et al., 2008 Piaractus mesopotamicus 54 20M + 34SM 108 Colossoma macropomum 54 20M + 34SM 108 Artificial + Colossoma macropomum x Piaractus brachypomus Piaractus brachypomus 54 28M + 26SM 108 Cypriniformes Cyprinidae Barbus barbus 100 12M + 48SM/ST + 40A 160 + Barbus Barbus x Barbus meridionalis Natural Berrebi & Berrebi, 1993 Barbus meridionalis 100 22M + 20SM + 12ST + 46A 142 Barbus canis 150 76M + 24SM + 50A 226 Israel (Jordan R.) + Barbus canis x Capoeta damascina Natural Gorshkova et al., 2002 Capoeta damascina 148 78M/SM + 32ST + 38A 258 Jordan Carassius carassius 100 20M + 44SM/ST + 36A 164 3,8 FD + Carassius carassius x Cyprinus carpio Artificial Framce Hafez et al., 1978a; Hafez et al., 1978b Cyprinus carpio 100 20M + 32SM/ST + 48A 152 3,6FD Cirrhinus molitorella 50 16M + 24SM + 10ST 90 Gui et al., 1985; Yu et al., 1989; Ren and + Cirrhinus molitorella x Sinilabeo decorus Artificial China (Guangdong) Sinilabeo decorus 50 10M + 18SM+ 10ST + 12A 78 Yu, 1993; Ren et al., 1992 Ctenopharyngodon idella 48 18M + 22SM + 8ST/A 88 + Ctenopharyngodon idella x Megalobrama terminalis Artificial China (Hunan) Hulata, 2001; Liu, 1987 Megalobrama terminalis 48 18M + 22SM + 8ST 88 Ctenopharyngodon idella 48 18M + 22SM + 8ST/A 88 + Ctenopharyngodon idella x Megalobrama amblycephala Artificial China (Hubei) Hulata, 2001; Zan and Song, 1979 Megalobrama amblycephala 48 20M + 24SM + 4ST 92 Cyprinella lutrensis 50 50M/SM 100 Gold et al., 1979; Gold, 1984; Gold and Cyprinella lutrensis x Cyprinella venusta Natural USA (TX) Cyprinella venusta 50 48M/SM + 2ST/A 98 Price, 1985 Labeo rohita 50 10M + 14SM + 6ST+20A 74 + Labeo rohita x Catla catla Artificial India John et al., 1993, Nagpure et al., 2001 Catla catla 50 10M + 16SM + 8ST+16A 76

Tabela 1. Continuação

Ordem/Família Espécie 2n Fórmula cariotípica NF Cruzamento Híbrido Tipo de hibridação Tamnaho do genoma pg/cell Localidade Fonte Luxilus cornutus 50 6M + 40SM + 4A 96 Luxilus cornutus x Luxilus chrysocephalus Natural USA Luxilus chrysocephalus 50 6M + 40SM + 4ST/A 96 Powers and Gold, 1992 Luxilus cornutus 50 6M + 40SM + 4A 96 + Luxilus cornutus x Luxilus cerasinus Artificial USA Luxilus cerasinus 50 8M + 28SM + 14ST/A 86 Scardinius erythrophtalmus 50 16M + 26SM + 8ST/A 92 Rab and Roth, 1989; Vinogradov, 1998; Scardinis erythrophtalmus x Rutilus rutilus Natural Danube R, Elbe R. Rutilus rutilus 50 16M + 28SM + 6ST/A 94 2,6FCM Mayr et al., 1986 Hypophthalmichthys molitrix 48 18M + 22SM + 8ST 88 + Hypophthalmichthys molitrix x Aristichthys nobilis Artificial Aristichthys nobilis 48 18M + 22SM + 8ST 88 Hulata, 2001 Ctenopharyngodon idella 48 18M + 22SM + 8ST/A 88 + Ctenopharyngodon idella x Aristichthys nobilis Artificial Aristichthys nobilis 48 18M + 22SM + 8ST 88 Anabarllius alburnops 48 12M + 24SM + 12ST 84 Anabarilius alburnops x Anabarilius andersoni Possível China (Kunming Lake) Anabarilius andersoni 48 12M + 24SM + 12ST 84 Anabarllius grahami 48 14M + 20SM + 14ST 82 China (Yunnan) Anabarilius alburnops x Anabarilius grahami Possível Zan and Song, 1980 Anabarllius alburnops 48 14M + 20SM + 14ST 82 China (Kunming Lake) Anabarilius alburnops 48 12M + 24SM + 12ST 84 China (Yunnan) Anabarilius alburnops x Anabarilius grahami Possível Anabarilius macrolepis 48 12M + 24SM + 12ST 84 China (Kunming Lake) Danio albolineatus 50 10M + 39SM + 1A 99 Fontana et al., 1970; Suzuki et al., 1995; Danio albolineatus x Danio rerio Possível 2,8FD; (3,4-3,6) 4,6 FCM Asia Danio rerio 50 10M + 39SM + 1A 99 Vinogradov, 1998; Gregory, 2008 Alburnus alburnus 50 16M + 10SM + 16ST + 8A 76 Cataudella et al., 1977; Gregory, 2008; Alburnus alburnus x Rutilus rutilus Natural (2,6FCM); (2,6FCM) Italy; Danube R, Elbe R. Rutilus rutilus 50 16M + 28SM + 6ST/A 94 Rab and Roth,1989; Vinogradov, 1998 Alburnus alburnus 50 16M + 10SM + 16ST + 8A 76 Rab and Roth,1989; Vasiliev, Alburnus alburnus x Blicca bjoerkna Natural (2,5FCM) Europe Blicca bjoerkna 50 14M + 26SM /ST + 10A 90 1985; Gregory, 2008 Alburnus alburnus 50 16M + 10SM + 16ST + 8A 76 Cataudella et al., 1977; Bianco et al., Alburnus alburnus x Rutilus rubilio Natural (2,5FCM) Italy Rutilus rubilio 50 18M + 10SM + 16ST + 6A 78 2004; Gregory, 2008 Alburnus albidus 50 16M + 26SM + 8ST/A 92 Cataudella et al., 1977; Gregory, 2009; Alburnus alburnus x Abramis brama Natural (2,5FD) Italy ;Framce Abramis brama 50 12M + 18SM/ST + 20A 92 Hafez et al., 1978a; Hafez et al., 1978b Cyprinodontiformes Cyprinodontidae Aphanius dispar 48 92 + Aphanius dispar x Aphanius fasciatus Artificial Italy Karbe,1961; Vitturi et al.,1995 Aphanius fasciatus 48 48ST/A 48 Cyprinodon bovinus 48 2M + 14SM+ 32ST 64 Sharpnack and Fitzsimons, 1980; + Cyprionodon bovinus x Cyprionodon variegatus Artificial (3,2 BFA) USA(TX) Cyprinodon variegatus 48 2M + 14SM+ 32ST 64 Hinegardner and Rosen, 1972 Cyprinodon pecosensis 48 2M + 14SM+ 32ST 64 + Cyprionodon peconensis x Cyprionodon variegatus Artificial (3,2 BFA) USA(TX) Stevenson,1981 Cyprinodon variegatus 48 2M + 14SM+ 32ST 64 Fundulidae Fundulus heteroclitus 48 48ST/A 48 2,7 FCM, 2,6 FIA Chen and Ruddle, 1970; Chen, 1971; + Fundulus heteroclitus x Fundulus diaphanus USA(CT) Fundulus diaphanus 48 4SM + 44A 48 3,0 FCM Gregory, 2008; Hardie and Hebert, 2004 Poecilidae Gambusia affinis 48 48A 48 1,8 FCM Japan (Kochi) + Gambusia affinis x Gambusia nobilis Artificial Gambusia nobilis 48 48A 48 USA (TX) Itahashi and Kawase, 1975; Ojima and Gambusia affinis 48 48A 48 1,8 FCM Japan (Kochi) Yamamoto, 1990; Campos and Hubbs, + Gambusia affinis x Gambusia halbrooki Artificial Gambusia halbrooki 48 48A 48 1,5 FCM, 1,7 BFA USA (NC) 1971; Schultz, 1967; Cimino, 1974 Poeciliopsis monacha 48 48A 48 1,3 FCM, 1,4 FD + Poeciliopsis monacha x Poeciliopsis lucida Artificial Mexico Poeciliopsis lucida 48 48A 48 1,3 FCM, 1,4 FD Esociformes Esocidae Esox masquinongy 50 50A 50 2,3 FCM, 2,2 FIA Esox masquinongy x Esox lucius Natural Canadá Esox lucius 50 50A 50 2,6 FD Alvarez et al., 1991; Vinogradov, 1998 Esox lucius 50 50A 50 2,6 FD Esox lucius x Esox niger Natural North USA;Canadá Hardie and Hebert; 2003 Esox niger 50 50ST/A 50 1,8 FIA Esox niger 50 50ST/A 50 1,8 FIA Esox niger x Esox americanus Natural North USA;Canadá Esox americanus 50 50A 50 2,4 FD

Tabela 1. Continuação

Ordem/Família Espécie 2n Fórmula cariotípica NF Cruzamento Híbrido Tipo de hibridação Tamnaho do genoma pg/cell Localidade Fonte Siluriformes Clariidae Clarias batrachus 50 16M + 8SM + 14ST + 12A 74 + Clarias batrachus x Clarias garepinus Artificial Clarias garepinus 56 20M + 16SM + 10ST + 10A 92 Clarias macrocephalus 54 24M + 20SM + 6ST + 4A 98 Rishi,1978; Nagpure et al.,2000; Wu et + Clarias macrocephalus x Clarias garepinus Artificial India, Thailand Clarias garepinus 56 20M + 16SM + 10ST + 10A 92 al., 1986; Teugels et al., 1992 Heterobranchus longifilis 52 6M + 25SM + 21A 83 + Heterobranchus longifilis x Clarias garepinus Artificial Clarias garepinus 56 20M + 16SM + 10ST + 10A 92 Ictaluridae Ictalurus punctatus 58 18M + 14SM+ 26ST 90 USA (AL) + Ictalurus punctatus x Ictalurus furcatus Artificial LeGrande, 1981; LeGrande, 1984 Ictalurus furcatus 58 18M + 14SM+ 26ST 90 2,0 FCM, 2,1 FD USA (LA) Pimelodidae Pseudoplatystoma fasciatum 56 18M + 16SM + 10ST + 12A 88 + Pseudoplatystoma fasciatum x Pseudoplatystoma corruscans Artificial Pseudoplatystoma corruscans 56 18M + 14SM + 10ST + 14A 90 Salmoniformes Salmonidae Salmo salar 58 16M/SM + 42A 74 Russia + Salmo salar x Salmo trutta Artificial Salmo trutta 78 20M/SM + 58A 98 Armenia Oncorhynchus clarki 68 36M/SM + 32ST 104 5,2 FCM USA(CA) + Oncorhynchus clarki x Oncorhynchus mykiss Artificial Gold and Gall, 1975; Gold et Oncorhynchus mykiss 60 44M/SM + 2ST + 14A 104 USA (E. Pacific) al.,1977;Johnson et al., 1987; Ueda, Oncorhynchus tshawytsha 68 32M + 4SM+ 32A 104 5,2 FCM, 6,1 FD Japan + Oncorhynchus tshawytsha x Oncorhynchus kisutch Artificial 1985; Ohno et al., 1969; Phillips et al., Oncorhynchus kisutch 60 48M/SM + 12ST 108 5,2 FCM, 4,9 FIA USA 1985; Hardie and Hebert, 2003; Oncorhynchus apache 56 50M/SM + 6 ST/A 106 USA (AZ) + Oncorhynchus apache x Oncorhynchus mykiss Artificial Benirschke and Hsu, 1971; Phillips and Oncorhynchus mykiss 60 44M/SM + 2ST + 14A 104 Rab, 2001; Phillips and Ihssen, 1985; Salvelinus alpinus 80 20M/SM + 60ST/A 100 + Salvelinus alpinus x Salvelinus namaycush Artificial Hardie and Hebert, 2004; Al-Sabti, 1985; Salvelinus namaycush 84 16M/SM + 68ST/A 100 5,7-6,3 FIA N. America Raicu and Taisescu, 1977; Gregory, Salmo marmoratus 80 22M/SM + 58ST/A 102 Croatia + Salmo marmoratus x Salmo trutta fario Artificial 2008; Cavender and Kimura, 1989; Ueda Salmo trutta fario 80 24M/SM + 56A 104 6,3 FCM, 5,8 FD Rumania and Ojima, 1983; Ojima, 1963; Frolov Salvelinus fontinalis 84 18M/SM + 66ST/A 102 6,5 FD Japan + Salvelinus fontinalis x Salvelinus confluentus Artificial and Miller, 1991Hulata, 2001 Salvelinus confluentus 78 24M/SM + 58ST/A 102 USA(MT) Salvelinus confluentus 79 24M/SM + 58ST/A 103 USA(MT) + Salvelinus confluentus x Salvelinus malma Artificial Salvelinus malma 82 14M + 4SM+ 64ST/A 100 Russia (Prymorye) Scorpaeniformes Cottidae Cottus poecilopus 48 8M/SM + 40A 56 Terashima and Ida, 1991;Vitturi and Cottus poecilopus x Cottus gobius Natural Europa Cottus gobius 48 10M/SM + 38ST/A 58 Rasotto, 1990 Perciformes Centrarchidae Enneacanthus glorious 48 48A 48 Enneacanthus glorious x Enneacanthus obesus Natural Enneacanthus obesus 48 48A 48 Lepomis macrochirus 48 48A 48 Lepomis macrochirus x Lepomis microlophus Natural Lepomis microlophus 48 48A 48 Lepomis macrochirus 48 48A 48 Lepomis macrochirus x Lepomis humilis Natural Lepomis humilis 48 48A 48 Lepomis macrochirus 48 48A 48 Roberts, 1964; Hardie and Hebert, 2004; Lepomis macrochirus x Lepomis megalotis Natural Lepomis megalotis 48 48A 48 Busack and Thorgaard, 1980; Ohno et al., Lepomis macrochirus 48 48A 48 1968; Becak et al., 1966; Benirschke and Lepomis macrochirus x Lepomis auritus Natural USA(NC, TX, WV) Lepomis auritus 48 48A 48 Hsu, 1971; Fontana et al., 1970; Ojima Lepomis gulosus 48 48A 48 and Yamamoto, 1990; Thompson et al., Lepomis gulosus x Lepomis gibosus Natural Lepomis gibbosus 48 48A 48 1991; Tiersch et al., 1989 Lepomis gulosus 48 48A 48 Lepomis gulosus x Lepomis auritus Natural Lepomis auritus 48 48A 48 Lepomis gulosus 48 48A 48 Lepomis gulosus x Lepomis cyanelus Natural Lepomis cyanellus 48 48A 48 Lepomis gulosus 48 48A 48 Lepomis gulosus x Lepomis macrochirus Natural Lepomis macrochirus 48 48A 48

Tabela 1. Continuação

Ordem/Família Espécie 2n Fórmula cariotípica NF Cruzamento Híbrido Tipo de hibridação Tamnaho do genoma pg/cell Localidade Fonte Lepomis gulosus 48 48A 48 Lepomis gulosus x Lepomis microplophus Natural Lepomis microlophus 48 48A 48 Lepomis cyanellus 48 48A 48 Lepomis cyanellus x Lepomis auritus Natural Lepomis auritus 48 48A 48 Lepomis cyanellus 48 48A 48 Lepomis cyanellus x Lepomis microlophus Natural Lepomis microlophus 48 48A 48 Lepomis cyanellus 48 48A 48 Lepomis cyanellus x Lepomis humilis Natural Lepomis humilis 48 48A 48 Lepomis gibbosus 48 48A 48 Lepomis gibbosus x Lepomis humilis Natural Lepomis humilis 48 48A 48 Lepomis gibbosus 48 48A 48 Lepomis gibbosus x Lepomis auritus Natural Lepomis auritus 48 48A 48 Lepomis gibbosus 48 48A 48 Lepomis gibbosus x Lepomis megalotis Natural Lepomis megalotis 48 48A 48 Lepomis megalotis 48 48A 48 Lepomis megalotis x Lepomis humilis Natural USA(NC, TX, WV) Lepomis humilis 48 48A 48 Lepomis gibbosus 48 48A 48 Lepomis gibbosus x Lepomis cyanellus Natural Lepomis cyanellus 48 48A 48 Lepomis gibbosus 48 48A 48 Lepomis gibbosus x Lepomis macrochirus Natural Lepomis macrochirus 48 48A 48 Micropterus dolomieu 46 2SM + 44A 48 Micropterus dolomieu x Micropterus punctulatus Natural 2,0FIA Micropterus punctulatus 46 2M/SM + 44ST/A 48 Micropterus dolomieu 46 2SM + 44A 48 Micropterus dolomieu x Micropterus salmoides Natural 2,0FCM Micropterus salmoides 46 2M/SM + 44A 48 Micropterus dolomieu 46 2SM + 44A 48 Micropterus dolomieu x Micropterus treculi Natural Micropterus treculli 46 2M/SM + 44ST/A 48 Micropterus salmoides 46 2M/SM + 44A 48 Micropterus salmoides x Micropterus treculi Natural Micropterus treculli 46 2M/SM + 44ST/A 48 Pomoxis nigromaculatus 48 48A 48 + Pomoxis nigromaculatus x Pomoxis annularis Natural 2,1FCM Pomoxis annularis 48 48A 48 Cichlidae Oreochromis mossambicus 44 6SM + 38ST/A 50 + Oreochromis mossambicus x Oreochromis niloticus Artificial Oreochromis niloticus 44 2M + 18SM + 24ST 64 Oreochromis mossambicus 44 6SM + 38ST 50 + Oreochromis mossambicus x Oreochromis aureus Artificial Majumdar and McAndrew, 1986; Oreochromis aureus 44 8SM + 2ST + 34A 50 Africa Thompson, 1981; Harvey et al., 2002; Oreochromis niloticus 44 2M + 18SM + 24ST 64 + Oreochromis niloticus x Oreochromis aureus Artificial Vervoort, 1980 Oreochromis aureus 44 8SM + 2ST + 34A 50 Oreochromis mortimeri 44 18M/SM + 26A 62 + Oreochromis mossambicus x Oreochromis niloticus Artificial Oreocromis macrochir 44 6SM + 38ST/A 50 Sparidae Pagrus pagrus 48 2SM + 46A 50 + Pagrus pagrus x Pagrus auriga Artificial Manchado et al ., 2005 Pagrus auriga 48 48A 48 Gerreidae Diapterus auratus 48 48A 48 Diapterus auratus x Diaptrus rhombeus Possível Diaptrus rhombeus 48 48A 48 Eucinostomus argenteus 48 48A 48 Eucinostomus argenteus x Eucinostomus melanopterus Possível Eucinostomus melanopterus 48 48A 48 Eucinostomus argenteus 48 48A 48 Eucinostomus argenteus x Eucinostomus gula Possível Eucinostomus gula 48 48A 48 Eucinostomus melanopterus 48 48A 48 Eucinostomus melanopteruss x Eucinostomus gula Possível Eucinostomus gula 48 48A 48 Eugerres brasilianus 48 48A 48 Eugerres brasilianus x Diapterus rhombeus Possível Diapterus rhombeus 48 48A 48

Hibridação em espécies nativas

Dentro da aquicultura mundial, diversas espécies já possuem híbridos viáveis e sob produção. Peixes, crustáceos e moluscos estão entre os mais pesquisados e utilizados (Fu et al., 2004; Hulata, 2001; Misamore and Browdy, 1997; Ribi, 2000). Um dos primeiros relatos, não dirigido à aquicultura relata cruzamentos extremos entre Fundulus heteroclitus e Scomber scombrus (Newman, 1918), considerado um dos mais divergentes registrados. Em aquicultura a hibridação é comumente utilizada para melhoramento da produção e suas variações, com intuito de aproveitar ao máximo o vigor híbrido da F1. Mundialmente, alguns grupos de peixes se destacam no cenário aquícola, entre estes, os salmonídeos. Espécies desta família vêm sendo frequentemente utilizadas em programas de piscicultura e produção de híbridos como Salmão do Atlântico (Salmo salar) x Truta Marron (Salmo trutta). Na Ordem Anguilliformes, existem diferentes híbridos entre enguias utilizadas na piscicultura no Japão (Hulata, 2001; Müller et al., 2012). No Brasil, devido à considerável variedade de espécies cultiváveis e a condições edafoclimáticas favoráveis, a exploração das características favoráveis dos híbridos vem sendo utilizadas. Híbridos entre o tambaqui (Colossoma macropomum), espécie da bacia Amazônica, com o pacu (Piaractus mesopotamicus), espécie originária da bacia do Pantanal, estão entre os mais cultivados e estudados na produção aquícola de água- doce. Outros híbridos também vem se destacando na piscicultura nacional, como Piauçu (Leporinus macrocephalus) x Piapara (Leporinus elongatus) e Cachara (Pseudoplatystoma fasciatum) x Pintado (Pseudoplatystoma corruscans) (Almeida- Toledo et al., 1995; Porto-Foresti et al., 2008; Porto-Foresti et al., 2007; Santos et al., 2002). Pode-se aferir que padrões cariotípicos similares são mais frequentemente encontrados entre os parentais de híbridos já descritos. A inclusão de dados cromossômicos de um maior número de parentais permitirá estabelecer o grau de inferência dos padrões cariotípicos no processo de hibridação.

Considerações finais e perspectivas

A partir do aporte resolutivo de dados citogenéticos obtidos para representantes Atlânticos da família Gerreidae, será possível posteriormente correlacioná-los com o nível de isolamento reprodutivo presente entre as espécies em cruzamentos

74 interespecíficos e intergenéricos. A descrição cariotípica macroestrutural e numérica dos Gerreidae estudados corrobora uma acentuada estase cariotípica encontrada dentro dos Perciformes, que em geral apresentam 48 cromossomos e igual número fundamental. As análises de heterocromatina constitutiva, regiões organizadoras de nucléolo, fluorocromos base-específicos vem confirmando a estabilidade cariotípica da família. Os genes ribossomais 18S e 5S identificados por hibridização fluorescente in situ (FISH) demostram, sob perspectiva filogenética, uma maior dinâmica evolutiva em relação a outras regiões cromossômicas, constituindo eficientes marcadores citotaxonômicos neste grupo de espécies. Os dados obtidos além de colaborarem com o entendimento de padrões evolutivos, especiação e diversificação deste grupo de peixes poderão ser utilizados como indicadores favoráveis à formação de híbridos. A continuidade destes estudos, prevê a reprodução artificial e criopreservação gamética, cuja execução pretende alçar os representantes da família Gerreidae a condições favoráveis de produção comercial.

Referências bibliográficas

Abbott, R., Albach, D., Ansell, S., Arntzen, J. W., Baird, S. J. E., Bierne, N., Boughman, J. W., Brelsford, A., Buerkle, C. A., Buggs, R., Butlin, R. K., Dieckmann, U., Eroukhmanoff, F., Grill, A., Cahan, S. H., Hermansen, J. S., Hewitt, G., Hudson, A. G., Jiggins, C., Jones, J., Keller, B., Marczewski, T., Mallet, J., Martinez-Rodriguez, P., Most, M., Mullen, S., Nichols, R., Nolte, A. W., Parisod, C., Pfennig, K., Rice, A. M., Ritchie, M. G., Seifert, B., Smadja, C. M., Stelkens, R., Szymura, J. M., Vainola, R., Wolf, J. B. W., Zinner, D., 2013. Hybridization and speciation. Journal of Evolutionary Biology 26, 229-246.

Al-Sabti, K., 1985. Chromosomal studies by blood leukocyte culture technique on three salmonids from Yugoslavian waters. Journal of Fish Biology 26, 5–12.

Allendorf, F. W., Leary, R. F., Spruell, P., Wenburg, J. K., 2001. The problems with hybrids: setting conservation guidelines. Trends Ecolgy and Evolution 16, 613-622.

Almeida-Toledo, L. F., Bigoni, A. P. V., Bernardino, G., Filho, S. A. T., 1995. Chromosomal location of NORs and C bands in F1 hybrids of bighead carp and silver carp reared in Brazil. Aquaculture 135 277-284.

Alvarez, M. C., Otis, J., Amores, A., Guise, K., 1991. Short-term cell culture technique for obtaining chromosomes in marine and freshwater fish. Journal of Fish Biology 39, 817– 824.

Arcement, R. J. and Rachlin, J. W., 1976. A study of the karyotype of a population of banded killifish (Fundulus diaphanus) from the Hudson River. Journal of Fish Biology 8, 119–125.

Arefjev, V. A., 1983. Polykaryographic analysis of sheap sturgeon, Acipenser nudiventris (Acipenseridae). Journal of Ichthyology 23(2), 26–35.

Artoni, R. F., Vicari, M. R., Bertollo, L. A. C., 2000. Citogenética de Peixes Neotropicais: Métodos, Resultados e Perspectivas. Biological and Health Sciences 6, 43-60.

Bartley, D. M., Rana, K., Immink, A. J., 2001. The use of inter-specific hybrids in aquaculture and fisheries. Reviews in Fish Biology and Fisheries 10, 325-337.

Becak, W., Becak, M. L., Ohno, S.,1966. Intraindividual chromosomal polymorphism in green sunfish (Lepomis cyanellus) as evidence of somatic segregation. Cytogenetics 5, 313–320.

Benirschke, K. and Hsu, T. C., 1971. Chromosome atlas: Fish, amphibians, reptiles and birds. Vol. 1. Springer-Verlag, Berlin, 248p.

Bianco, P. G., Aprea, G., Balletto, E., Capriglione, T., Fulgione, D., Odierna, G., 2004. The karyology of the cyprinid genera Scardinius and Rutilus in southern Europe. Ichthyology Research 51, 274–278.

Birstein, V. J. and Vasiliev, V. P., 1987. Tetraploid-octoploid relationships and karyological evolution in the order Acipenseriformes (Pisces). Karyotypes, nucleoli, and nucleolus organizer regions in four acipenserid species. Genetica 72, 3–12.

Birstein, V. J., Poletaev, A. I., Goncharov, B. F., 1993. DNA content in Eurasian sturgeon species determined by flow cytometry. Cytometry 14, 377–383.

Brum, M. J. I., 1996. Cytogenetic studies of Brazilian marine fish. Brazililian Journal of Genetics, 19, 421–427.

Brum, M. J. I., Galetti Jr., P. M., Oliveira Correa, M. M., Aguilar, C. T., 1992. Multiple sex chromosomes in South Atlantic fish, Brevoortia aurea, Clupeidae. Brazilian Journal of Genetics 15, 547–553.

Busack, C. A. and Thorgaard, G. H., 1980. Karyotype of the Sacramento perch, Archoplites interruptus. California Fish and Game 66, 189–191.

Campos, H. H. and Hubbs, C., 1971. Cytomorphology of six species of gambusiine fishes. Copeia 1971, 566–569.

Campton, D. E., 1990. Application of biochemical and molecular genetic markers to analysis of hybridization, in: D. H. Withmore (Ed.), Eletrophoretic and isolectric focusing techniques in fisheries management. CRC Press, Ann Arbor, 242-258.

Cataudella, S., Sola, L., Muratori, R. A., Capanna, E., 1977. The chromosomes of 11 species of Cyprinidae and one Cobitidae from Italy, with some remarks on the problem of polyploidy in the Cypriniformes. Genetica 47, 161–171.

Cavender, T. M. and Kimura, S., 1989. Cytotaxonomy and interrelationships of Pacifific basin Salvelinus. Physiology and Ecology 1, 49–68.

Chen, T. R., 1971. A comparative chromosome study of twenty killifish species of the genus Fundulus (Teleostei: Cyprinodontidae). Chromosoma 32, 436–453.

Chen, T. R. and Ruddle, F. H., 1970. A chromosome study of four species and a hybrid of the killifish genus Fundulus (Cyprinodontidae). Chromosoma 29, 255–267.

Chevassus, B., 1983. Hybridization in fishes. Aquaculture 33, 245-262.

Cimino, M. C., 1974. The nuclear DNA content of diploid and triploid Poeciliopsis and other poeciliid fishes with reference to the evolution of unisexual forms. Chromosoma 47, 297–307.

Diana, J. S., 2009. Aquaculture Production and Biodiversity Conservation. BioScience 59, 27-38.

Doucette Jr. A. J. and Fitzsimons, J. M., 1988. Karyology of elopiform and clupeiform fishes. Copeia, 1988: 124–130.

FAO, 2012. The state of world fisheries and aquaculture. Fisheries and Aquaculture Department, Rome.

Fitzsimons, J. M. and Doucette Jr., A. J., 1981. Karyology of the shads Dorosoma cepedianum and D. petenense (Osteichthyes: Clupeiformes). Copeia 1981, 908–911.

Fontana, F., Chiarelli, B., Rossi, A. C., 1970. Il cariotipo di alcune specie di Cyprinidae, Centrarchidae, Characidae studiate mediante colture ≪ in vitro ». Caryologia 23, 549– 564.

Fontana, F., 1994. Chromosomal nucleolar organizer regions in four sturgeon species as markers of karyotype evolution in Acipenseriformes (Pisces). Genome 37, 888–892.

Frolov, S. V. and Miller, I. N., 1991. Karyotypes of Salvelinus malma and S. leucomaenis from North Primorye. Chromosome Information Service 52, 12–14.

Fu, H., Gong, Y., Wu, Y., Xu, P., Wu, C., 2004. Artificial interspecific hybridization between Macrobrachium species. Aquaculture 232, 215-223.

Gomes, F., Schneider, H., Barros, C., Sampaio, D., Hashimoto, D., Porto-Foresti, F., Sampaio, I., 2012. Innovative molecular approach to the identification of Colossoma macropomum and its hybrids. Anais Da Academia Brasileira De Ciencias 84, 517-525.

Gold, J. R., Avise, J. C., Gall, G. A. E., 1977. Chromosome cytology in the cutthroat trout series, Salmo clarki (Salmonidae). Cytologia 42, 377–382.

Gold, J. R. and Gall, G. A. E., 1975. Chromosome cytology and polymorphism in the California High Sierra golden trout (Salmo aguabonita). Canadian Journal of Genetics and Cytology 17, 41–53.

Gold, J. R. and Li, Y. C., 1994. Cytosystematic evidence that the genus Richardsonius belongs in the Western clade of phoxinin cyprinids. Copeia 1994, 815–818.

Gold, J. R., Whitlock, C. W., Karel, W. J., Barlow Jr., J. A., 1979. Cytogenetic studies in North American minnows (Cyprinidae). VI. Karyotypes of thirteen species in the genus Notropis. Cytologia 44, 457–466.

Gold, J. R. and Price, H. J., 1985. Genome size variation among North American minnows (Cyprinidae). I. Distribution of the variation in five species. Heredity 54, 297– 305.

Gorshkova, G. V., Gorshkov, S. A., Golani, D., 2002. Karyotypes of Barbus canis and Capoeta damascina (Pisces, Cyprinidae) from the Middle East. Italian Journal of Zoology 69, 191–194.

Gregory, T. R., 2008. Animal genome size database. http://www.genomesize.com/

Gui, J. F., Li, Y. C., Li, K., Hong, Y. H., Zhou, T., 1985. Studies on the karyotypes of Chinese cyprinid fishes. VI. Karyotypes of three tetraploid species in Barbinae and one tetraploid species in Cyprininae. Acta Genetica Sinica 12, 302–308. (In Chinese with English abstract)

Hafez, R., Labat, R., Quillier, R., 1978a. Estude cytogenetique chez quelques especes de cyprinides de la region Midi-Pyrenees. Bulletin de la Société d'Histoire Naturelle de Toulouse 114, 122–159.

Hafez, R., Labat, R., Quillier, R., 1978b. Teneurs nucleaires en A.D.N. et relations evolutives dans la famille des cyprinides (Teleostei). Bulletin de la Société d'Histoire Naturelle de Toulouse 114, 71–84.

Hardie, D. C. and Hebert, P. D. N., 2004. Genome-size evolution in fishes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 61, 1636–1646.

Hardie, D. C. and Hebert, P. D. N., 2003. The nucleotypic effects of cellular DNA content in cartilaginous and ray-finned fishes. Genome 46, 683–706.

Harvey, S. C., Powell, S. F., Kennedy, D. D., McAndrew, B. J., Penman, D. J., 2002. Karyotype analysis of Oreochromis mortimeri (Trewavas) and Sarotherodon melanotheron (Ruppell). Aquaculture Research 33, 339–342.

Hubbs, C. L., 1955. Hybridization between Fish Species in Nature. Systematic Zoology 4, 1-20.

Hulata, G., 1995. A Review of Genetic-Improvement of the Common Carp (Cyprinus- Carpio L) and Other Cyprinids by Crossbreeding, Hybridization and Selection. Aquaculture 129, 143-155.

Hulata, G., 2001. Genetic manipulations in aquaculture: a review of stock improvement by classical and modern technologies. Genetica 111, 155-173.

Hinegardner, R. and Rosen, D. E., 1972. Cellular DNA content and the evolution of Teleostean fishes. American Naturalist 106, 621–644.

Itahashi, M. and Kawase, H., 1975. Karyotype analysis in five species belonging to Cyprinodontidae, Teleostomi. Bulletin of Aichi University Education (Natural Science) 24, 153–160.

John, G., Barat, A., Lakra, W. S., 1993. Localization of nucleolar organizer regions in Labeo (Cyprinidae). La Kromosomo II 70, 2381–2384.

Johnson, O. W., Utter, F. M., Rabinovitch, P. S., 1987. Interspecies differences in salmonid cellular DNA identified by flow cytometry. Copeia 1987, 1001–1009.

Karbe, L., 1961. Cytologische Untersuchung der Sterilitatserscheinungen bei anatolischen Zahnkarpfen, ein Beitrag zum Speziationsproblem. Mitteilungen aus dem Hamburgischen Zoologischen Museum und Institut. 59, 73–104.

Kobayasi, H. and Kimura, Y., 1975. On the chromosomes of leucocytes from Japanese and European eels (Anguilla). Japan Women’s University Academic Journal, 22: 169– 174. (In Japanese with English summary)

Koehn, R. K. and Rasmussen, D. I., 1967. Polymorphic and monomorphic serum esterase heterogeneity in Catastomid fish population. Biochemistry and Genetics 1, 131- 144.

Korth, J. W. and Fitzsimons, J. M., 1987. Karyology of three species of eastern North American atherinid fishes. Copeia 1987, 505–509.

LeGrande, W. H., 1981. Chromosomal evolution in North American catfishes (Siluriformes: Ictaluridae) with particular emphasis on the madtoms, Noturus. Copeia 1981, 33–52.

LeGrande, W. H., Dunham, R. A., Smitherman, R. O., 1984. Karyology of three species of catfishes (Ictaluridae: Ictalurus) and four hybrid combinations. Copeia 1984, 873– 878.

Lexer, C., Randell, R. A., Rieseberg, L. H., 2003. Experimental hybridization as a tool for studying selection in the wild. Ecology 84, 1688-1699.

Liu, S. Y., 1987. Studies on cytogenetics of Ctenopharyngodon idellus, Megalobrama terminalis and their triploid F1 hybrid. Acta Hydrobiologica Sinica 11, 52–58. (In Chinese with English abstract)

Majumdar, K. C., McAndrew, B. J., 1986. Relative DNA content of somatic nuclei and chromosomal studies in three genera, Tilapia, Sarotherodon and Oreochromis of the tribe Tilapiini (Pisces, Cichlidae). Genetica 68, 175–188.

Mallet, J., 2005. Hybridization as an invasion of the genome. Trends in Ecology & Evolution 20, 229-237.

Manchado, M., Ponce, M., Asensio, E., Infante, C., de la Herrán, R., Robles, F., Garrido-Ramos, M. A., Ruiz Rejón, M., Cárdenas, S., 2005. Pagurta, híbrido interespecífico de pargo Pagrus pagrus (L., 1758) (♀) × hurta Pagrus auriga Valenciennes, 1843 (♂): caracterización fenotípica y molecular. Boletin Instituto Español de Oceanografia 21, 219-224.

Marques, D. K. S., 2002. Aplicação da biologia molecular em programas de conservação de recursos pesqueiros, in: EMBRAPA (Ed.). EMBRAPA Pantanal, Corumbá, 22.

Mayr, B., Rab, P., Kalat, M., 1986. NORs and counterstain-enhanced flfluorescence studies in Cyprinidae of different ploidy level. Genetica 69, 111–118.

Misamore, M. and Browdy, C. L., 1997. Evaluating hybridization potential between Penaeus setiferus and Penaeus vannamei through natural mating, artificial insemination and in vitro fertilization. Aquaculture 150, 1-10.

Montanari, S. R., van Herwerden, L., Pratchett, M. S., Hobbs, J.-P. A., Fugedi, A., 2012. Reef fish hybridization: lessons learnt from butterflyfishes (genus Chaetodon). Ecology and Evolution 2, 310-328.

Müller, T., Horváth, Á., Takahashi, E., Kolics, B., Bakos, K., Decsi, K., Kovács, B., Taller, J., Urbányi, B., Bercsényi, M., Horváth, L., Adachi, S., Arai, K., Yamaha, E., 2012. Artificial hybridization of Japanese and European eel (Anguilla japonica × A. anguilla) by using cryopreserved sperm from freshwater reared males. Aquaculture 350-353, 130-133.

Nagpure, N. S., Kushwaha, B., Srivastava, S. K., Ponniah, A. G., 2000. Karyomorphology of African catfish Clarias gariepinus (Clariidae). Chromosome Science 4, 43–44.

Nagpure, N. S., Kushwaha, B., Srivastava, S. K., Ponniah, A. G., 2001. Comparative cytogenetic studies in Indian major carps Labeo rohita, Catla catla and Cirrhinus mrigala (Cyprinidae, Pisces). Chromosome Science 5, 153–158.

Newman, H. H., 1918. Hybrids between Fundulus and mackerel. A study of paternal heredity in heterogenic hybrids. Journal of Experimental Zoology 26, 391-421.

Nirchio, M., Fenocchio, A. S., Swarça, A. C., Pérez, J. E., Granado, Á., Estrada, A., Ron, E., 2003. Cytogenetic characterization of hybrids offspring between Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) and Piaractus brachypomus (Cuvier, 1817) from Caicara del Orinoco, Venezuela. Caryologia 56, 405-411.

Nishikawa, S., Amaoka, K., Karasawa, T., 1971. On the chromosomes of two species of eels (Anguilla). Chromosome Information Service 12, 27–28.

Ohno, S., Muramoto, J., Klein, J., Atkin, N. B., 1969. Diploid-tetraploid relationship in clupeoid and salmonoid fish. in: Darlington, C. D. and Lewis, K. R. (eds) Chromosomes today. Vol. 2. Oliver & Boyd, Edinburgh, pp. 139–147.

Ohno, S., Wolf, U., Atkin, N. B., 1968. Evolution from fish to mammals by gene duplication. Hereditas 59, 169–187.

Ojima, Y. and Yamamoto, K., 1990. Cellular DNA contents of fishes determined by flow cytometry. La Kromosomo II 57, 1871–1888.

Ojima, Y., Maeki, K., Takayama, S., Nogusa, S., 1963. A cytotaxonomic study on the Salmonidae. Nucleus 6, 91–98.

Park, E. H. and Grimm, H., 1981. Distribution of C-band heterochromatin in the ZW sex chromosomes of European and American eels (Anguillidae, Teleostomi). Cytogenetics and Cell Genetics 31, 167–174.

Pendás, A. M., Morán, P., Martínez, J. L., García-Vázquez, E., 1995. Aplications of 5S rDNA in Atlantic salmon, brown trout, and in Atlantic salmon x brown trout hybrid identification. Molecular Ecology 4, 275-276.

Phillips, R. B. and Rab, P., 2001. Chromosome evolution in the Salmonidae (Pisces): an update. Biological Reviews 76, 1–25.

Phillips, R. B. and Ihssen, P. E., 1985. Chromosome banding in salmonid fish: nucleolar organizer regions in Salmo and Salvelinus. Canadian Journal of Genetics and Cytology 27, 433–440.

Phillips, R. B., Zajicek, K. D., Utter, F. M., 1985. Q band chromosomal polymorphisms in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha). Copeia 1985, 273–278.

Porto-Foresti, F., Hashimoto, D. T., Alves, A. L., Almeida, R. B. C., Senhorini, J. A., Bortolozzi, J., Foresti, F., 2008. Cytogenetic markers as diagnoses in the identification of the hybrid between Piaucu (Leporinus macrocephalus) and Piapara (Leporinus elongatus). Genetics and Molecular Biology 31, 195-202.

Porto-Foresti, F., Hashimoto, D. T., Senhorini, J. A., Foresti, F., 2010. Hibridação em piscicultura: monitoramento e perspectivas, in: B. Baldisseroto, L. C. Gomes (Eds.), Espécies nativas para piscicultura no Brasil, 2 ed. UFSM, Santa Maria, 608.

Porto-Foresti, F., Nunes, T., Bortolozzi, J., Senhorini, J. A., Oliveira, C., Foresti, F., 2007. Identification of cytogenetic markers in Pseudoplatystoma fasciatum (cachara), Pseudoplatystoma corruscans (pintado), and their hybrids "cachapinta" and "pintachara" used in aquaculture programs. Aquaculture 272, S301-S302.

Powers, P. K. and Gold, J. R., 1992. Cytogenetic studies in North American minnows (Cyprinidae). XX. Chromosomal NOR variation in the genus Luxilus. Copeia 1992, 332–343.

Purdom, C. E., 1993. Hybridization. in: Purdom, C. E. (ed), Genetics and Fish Breeding, 1 ed. Chapman & Hall, London, pp. 1-277.

Quist, M. C., Bower, M. R., Hubert, W. A., Parchman, T. L., McDonald, D. B., 2009. Morphometric and Meristic Differences among Bluehead Suckers, Flannelmouth Suckers, White Suckers, and Their Hybrids: Tools for the Management of Native Species in the Upper Colorado River Basin. North American Journal of Fisheries Management 29, 460-467.

Rab, P., 1986. A note on the karyotype of the sterlet, Acipenser ruthenus (Pisces, Acipenseridae). Folia Zoologica 35, 73–78.

Rab, P. and Roth, P., 1989. Chromosome studies of European leuciscine fishes (Pisces: Cyprinidae). Karyotype of Rutilus pigus virgo and R. rutilus. Folia Zoologica 38, 239– 245.

Raesly, R. L., Stauffer, J. R., Denoncourt, R. F., 1990. Hybridization between Etheostoma zonale and Etheostoma olmstedi (Teleostei, Percidae), Following an Introduction Event. Copeia, 584-588.

Raicu, P. and Taisescu, E., 1977. Cytogenetic study in Salmo irideus and S. trutta fario. Cytologia 42, 311–314.

Ren, X. H., Cui, J., Yu, Q., 1992. Chromosomal heterochromatin differentiation of cyprinid fishes. Genetica 87, 47–51.

Ren, X. H. and Yu, X. J., 1993. Characterization of nucleolar organizer regions of twelve species of Chinese cyprinid fishes. Caryologia 46, 201–207.

Rhymer, J. M. and Simberloff, D., 1996. Extinction by hybridization and introgression. Annual Reviews in Ecology and Systematic 27, 83-109.

Ribi, G., 2000. Frequency of interspecific matings and of hybrid offspring in sympatric populations of Viviparus ater and V. contectus (Mollusca: Prosobranchia). Biological Journal of the Linnean Society 71, 133-143.

Rishi, K. K., 1978. Chromosomal homogeneity in two Indian catfishes. Geobios 5, 121– 123.

Roberts, F. L., 1964. A chromosome study of twenty species of Centrarchidae. Journal of Morphology 115, 401–409.

Rosenfield, J. A., Nolasco, S., Lindauer, S., Sandoval, C., Kodric-Brown, A., 2004. The Role of Hybrid Vigor in the Replacement of Pecos Pupfish by Its Hybrids with Sheepshead Minnow. Conservational Biology 18.

Santos, V. H., Foresti, F., Oliveira, C., Toledo, L. F. A., Toledo-Filho, S. A., Bernadino, G., 2002. Synaptonemal complex analysis in the fish species Piaractus mesopotamicus and Colossoma macropomum, and in their interspecific hybrid. Caryologia 55, 73-79.

Schwenk, K., Brede, N., Streit, B., 2008. Introduction. Extent, processes and evolutionary impact of interspecific hybridization in animals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 363, 2805-2811.

Scribner, K. T., Page, K. S., Bartron, M. L., 2001. Hybridization in freshwater fishes: a review of case studies and cytonuclear methods of biological inference. Reviews in Fish Biology and Fisheries 10, 293-323.

Sharpnack, L. A. and Fitzsimons, J. M., 1980. Karyology of four species of cyprinodont fishes from the Louisiana Gulf Coast. Proceedings Louisiana Academy Science 43, 39– 45.

Schultz, R. J., 1967. Gynogenesis and triploidy in the viviparous fish Poeciliopsis. Science 157, 1564–1567.

Stevenson, M. M., 1981. Karyomorphology of several species of Cyprinodon. Copeia 1981, 494–498.

Suzuki, A., Taki, Y., Mochizuki, M., Hirata, J., 1995. Chromosomal speciation in Eurasian and Japanese Cyprinidae (Pisces, Cypriniformes). Cytobios 83, 171–186.

Teugels, G. G., Ozouf-Costaz, C., Legendre, M., Parrent, M., 1992. A karyological analysis of the artifificial hybridization between Clarias gariepinus (Burchell, 1822) and Heterobranchus longififilis (Valenciennes, 1840) (Pisces; Clariidae). Journal of Fish Biology 40,81–86.

Terashima, H. and Ida, H., 1991. Karyotypes of three species of the family Cottidae (Scorpaeniformes). Japan Journal of Ichthyology 37, 358–362.

Toledo-Filho, S. A., Almeida Toledo, L. F., Foresti, F., Calcagnotto, D., Santos, S. B. A. F., Bernadino, G., 1998. Programas genéticos de seleção, hibridação e endocruzamento aplicados à piscicultura, São Paulo. pp. 55.

Toledo-Filho, S. d. A., Almeida Toledo, L. F., Foresti, F., Bernadino, G., Calcagnotto, D., 1994. Monitoramento e conservação genetica em projeto de hibridação entre pacu e tambaqui, Cadernos de Ictiogenética 2. CCS/USP, São Paulo.

Thompson, K. W., 1981. Karyotypes of six species of African Cichlidae (Pisces: Perciformes). Experientia 37, 351–352.

Thompson, K. W. (1991) Cytotaxonomy of the Bantam sunfish Lepomis symmetricus (Centrarchidae). I. Robertsonian variation in a population from the Yazoo river basin in Mississippi (U.S.A.). Caryologia 44, 109–114.

Tiersch, T. R., Chandler, R. W., Wachtel, S. S., Elias, S., 1989. Reference standards for flow cytometry and application in comparative studies of nuclear DNA content. Cytometry 10, 706–710.

Torres, R. A., Matoso, D. A., Artoni, R. F., 2004. Genética de Peixes Neotropicais II Biologia Molecular de Peixes Neotropicais. Publicatio UEPG Ciência Biologia e Saúde 10 27-37.

Ueda, T., 1985. Chromosomes of salmonid fishes. Marine Science 17(2), 95–101.

Ueda, T., Ojima, Y., 1983. Karyotypes with C-banding patterns of two species in the genus Salvelinus of the family Salmonidae. Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, 59, 343–346.

Vasiliev, V.P., 1985. Evolutionary karyology of fishes. Publishing House Nauka, Moscow.

Vasiliev, V. P. and Sokolov, L. I., 1980. A method of studying karyotypes in the Chondrostei. Tsitologiya 22, 1106–1109. (In Russian with English summary)

Vasiliev, V. P., Sokolov, L. I., Serebryakova, E. V., 1980. Karyotype of the Lena River Siberian sturgeon Acipenser baeri Brandt and some aspects of the karyotype evolution in Acipenseriformes. Voprosy Ikhtiologii 20, 814–822.

Vervoort, A., 1980. The karyotypes of seven species of Tilapia (Teleostei: Cichlidae). Cytologia 45, 651–656.

Vinogradov, A. E., 1998. Genome size and GC-percent in vertebrates as determined by flow cytometry: the triangular relationship. Cytometry 31, 100–109.

Vitturi, R., Catalano, E., Colomba, M. S., Montagnino, L., Pellerito, L., 1995. Karyotype analysis of Aphanius fasciatus (Pisces, Cyprinodontiformes): Ag-NORs and

C-band polymorphisms in four populations from Sicily. Biologisches Zentralblatt 114, 392–402.

Vitturi, R. and Rasotto, M. B., 1990. Karyotype analysis of Cottus gobio L. (Pisces, Cottidae). Cytobios 62, 81–86.

Wu, G. M., Xin, C. B., Chen, Y. L., 1986. A comparative study on the karyotypes of four species of catfish. Acta Genetic Sinica 13(3), 213–220. (In Chinese with English abstract)

Yu, X. J., Zhou, T, Li, Y. C., Li, K., Zhou, M., 1989. Chromosomes of Chinese freshwater fishes. Science Press, Beijing.

Zan, R. G. and Song, Z., 1979. Analysis and comparison between the karyotypes of Ctenopharyngodon idellus and Megalobrama amblycephala. Acta Genetica Sinica 6(2), 205– 210. (In Chinese with English abstract)

Zan, R. G. and Song, Z., 1980. Studies of the karyotypes of eight species of fishes in Cyprinus and Anabarilius. Zoological Research 1, 141–150. (In Chinese with English abstract)