IDENTIFICAÇÃO DE GENES EPIGENETICAMENTENTE INATIVADOS EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE CAVIDADE ORAL

CLÁUDIA MARIA PEREIRA

Dissertação apresentada à Fundação Antônio Prudente para a obtenção do título de Mestre em Ciências

Área de Concentração: Oncologia

Orientador: Prof. Dr. André Lopes Carvalho Co-Orientador: Dr. André Luiz Vettore de Oliveira

São Paulo 2007

FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca da Fundação Antônio Prudente

Pereira, Cláudia Maria Identificação de genes epigeneticamentente inativados em carcinoma epidermóide de cavidade oral / Cláudia Maria Pereira – São Paulo, 2007. 93p. Dissertação (Mestrado)-Fundação Antônio Prudente. Curso de Pós-Graduação em Ciências - Área de concentração: Oncologia. Orientador: André Lopes Carvalho

Descritores: 1. CAVIDADE ORAL. 2. CARCINOMA EPIDERMOIDE. 3. METILAÇÃO. 4. DEOXICITIDINA.

“Comece fazendo o que é necessário, depois o que é possível e de repente você estará fazendo o impossível”

São Francisco de Assis DEDICATÓRIA

Dedico a minha dissertação primeiramente à Santíssima Trindade e a Nossa Senhora, que estiveram sempre ao meu lado, me direcionando e protegendo durante toda esta jornada.

Dedico também aos meus pais Eure e Célia, por todo apoio, amor e carinho e por me ajudarem a conquistar este objetivo tão sonhado.

Dedico aos meus irmãos (Antônio, Fernando, Carlos, Roberto e Caio), aos meus sobrinhos e cunhadas, que estiveram sempre presentes, me apoiando, me ajudando a enfrentar todas as dificuldades e que tornaram possível a execução deste mestrado.

Dedico à minha querida Tia Santinha, minha segunda mãe, por todo carinho, pelos deliciosos doces e pelas inúmeras orações que a mim dedicou, sempre pedindo a Deus pela minha proteção e saúde.

Dedico ao meu querido Vinícius por toda sua compreensão, amor, carinho e apoio na realização deste sonho.

Dedico ao meu orientador Prof. Dr. André Lopes Carvalho e ao meu co-orientador Dr. André Luiz Vettore de Oliveira, por confiarem e acreditarem em mim durante estes dois anos.

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. André Lopes Carvalho pela sua paciência, pelos seus ensinamentos, tanto no laboratório de genética, quanto no ambulatório de cabeça e pescoço, pela oportunidade de cursar o Mestrado na Fundação Antônio Prudente, sempre me incentivando a ultrapassar fronteiras, a atingir novos horizontes, a vencer novos desafios, por toda calma e confiança em mim depositadas.

Agradeço ao meu co-orientador Dr. André Luiz Vettore de Oliveira que desde nosso primeiro contato acreditou que eu pudesse realizar trabalhos tão distintos de minha área de atuação, por ter me acolhido na equipe do Laboratório de Genética do Câncer; pelos ensinamentos que me transformaram de cirurgiã-dentista à bióloga molecular e por ter me ensinado a verdadeira postura dentro de um laboratório.

Agradeço a Dra. Addah Regina Freire, pois através de suas mãos, eu tive a oportunidade de conhecer a Fundação Antônio Prudente, um centro de excelência no ensino. Pela sua bondade, por ser um exemplo de profissional capacitado e preocupado com o bem-estar daqueles que mais padecem.

Agradeço ao Prof. Dr. Luiz Paulo Kowalski por ter me dado a oportunidade de freqüentar o Hospital do Câncer, me permitindo entender mais profundamente o paciente portador de câncer.

Agradeço à Andréa Seixas por ter dedicado horas de seu trabalho (inclusive aos sábados e domingos) para a realização de experimentos extremamente essenciais à minha tese, pela sua alegria, enorme boa- vontade e companhia nos almoços no Roda & Luz.

Agradeço a Alex Simões Satto que teve como incumbência, apresentar-me ao laboratório de genética do câncer, me ensinado a executar os primeiros protocolos e pelas horas de dedicação à minha pesquisa.

Agradeço à Maria Cristina do laboratório da Dra. Ana Maria Camargo, por todo apoio a mim dedicado durante as fases mais difíceis da minha pesquisa. Por ter me ajudado, mesmo à distância, a superar enormes barreiras e dificuldades, tornando-se uma peça-chave para o desfecho do meu trabalho.

Agradeço à querida amiga Danielle Renzoni pelo carinho com que me recebeu no laboratório, me ensinando os primeiros passos da biologia molecular, pelas longas e gostosas conversas, pela sua amizade e por ter me apresentado à cidade de São Paulo.

Agradeço à minha querida amiga, colega de laboratório e irmã-gêmea Valéria Cristina Andrade pelas noites incansáveis passadas no laboratório, entre experimentos exaustivos e muita alegria. Pela sua amizade, por ter me socorrido nas piores horas de sufoco em que me encontrei e pela sua companhia nos momentos de solidão.

Agradeço à querida amiga, colega de apartamento e laboratório Roberta Cardim Lessa pelos desabafos, comemorações, pelos passeios, pela ajuda nos experimentos, pela sua amizade e pelos cuidados a mim dedicados nas noites em que me encontrei doente e febril.

Agradeço à querida amiga e colega de laboratório Ana Carolina de Carvalho, nossa mascote do laboratório, pela sua amizade, solidariedade, pela sua alegria, companhia, pelo carinho e boa-vontade, sempre presente e disponível em importantes etapas da minha pesquisa.

Agradeço à amiga e colega de laboratório Viviane Sonaglio por seu carinho, sua amizade, por sua alegria, pelo seu profissionalismo, pela sua companhia nos cafés do Joinha, pelas consultas médicas e principalmente por dar a luz à princesinha do laboratório, a Ana Luiza.

Agradeço a mais nova amiga Mev Hernandez pelo grande e importante apoio a mim dedicados nos últimos meses do mestrado, pela sua amizade, pela solidariedade, pelo seu companheirismo e por sua alegria.

Agradeço ao amigo e colega de laboratório Luís Sakamoto pela sua enorme boa-vontade, companheirismo, gentileza e paciência (principalmente paciência), sempre me ajudando nas dificuldades que me deparei durante os meus experimentos.

Agradeço às amigas e colegas de laboratório Mariana Retori e Dra. Ivete, que mesmo desfrutando de pouco tempo de suas companhias, me ajudaram a superar barreiras como a insegurança e com o medo de transpor novos horizontes.

Agradeço à amiga e colega de laboratório Luciane Kagohara pela amizade, alegria, pelas brincadeiras, pelas dicas e orientações durantes os experimentos, necessários para os meus primeiros passos no laboratório.

Agradeço aos colegas de laboratório Fábio Piccoli pela sua alegria, pelas conversas e ensinamentos; Fabrício Carvalho, pelos ensinamentos e pela descontração; Roberta Félix, por seu enorme carinho e vontade de ajudar; à Maria Isabel por ser exemplo de profissional e mulher; Fernanda Góes por todo carinho e apoio; à mineira Manoella pelos “causos” compartilhados; à Luciana Wernersbach pela sua gentileza e presteza; à Érica por sua alegria e descontração; Benjamim Heck pela sua amizade e sinceridade; Mariana Brait e Simone pelo carinho e pelas sugestões e ao Émerson por sua amizade e dedicação. Ao Dr. Filipe Rodrigues Silva (CENARGEM-EMBRAPA) pelo trabalho desenvolvido nas análises de bioinformática que foram fundamentais para meu trabalho

Agradeço ao Dr. Mauro Ikeda pela sua amizade, educação e por todos os ensinamentos durante o atendimento ambulatorial do paciente portador de câncer de cabeça e pescoço.

Aos funcionários do Departamento de Anatomia Patológica, em nome do Dr. Fernando Soares, pela importante colaboração e contribuição com as amostras tumorais.

Agradeço ao Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital do Câncer A.C. Camargo pela importante colaboração.

Aos funcionários e alunos do Laboratório da Dra. Dirce Carraro, pelo acolhimento, pelo carinho e pela extração do RNA das amostras tumorais, tão importantes para o meu trabalho.

Agradeço às funcionárias da Biblioteca (Suely, Rose, Francyne, Elaine e Erika) que formam uma equipe maravilhosa, prestativa, competente e que foi essencial na realização do meu mestrado. Pela formatação da dissertação e pelas correções feitas na bibliografia.

A toda equipe do Serviço de Arquivo Médico e Estatístico do Hospital do Câncer A.C. Camargo (S.A.M.E.), na pessoa da Dona Hirde Contezine, pelo acolhimento, pela dedicação, pelo excelente trabalho, pelos ensinamentos e pelos bate-papos gostosos.

Agradeço ao Dr. Benedito Mauro Rossi, meu médico, pela sua humildade, pelo enorme apoio e carinho a mim dedicados e por ter me ajudado durante momentos difíceis do mestrado. Às queridas amigas Rai e Júlia pela atenção, simpatia, amizade, por toda ajuda e ensinamentos.

Agradeço a CAPES pela bolsa de estudos à mim concedida e à FAPESP pelo apoio financeiro.

Agradeço ao Instituto Ludwig pela oportunidade de desenvolver a minha pesquisa no Laboratório de Genética do Câncer, a toda sua equipe pelo convívio diário e por toda ajuda durante a realização da minha pesquisa.

Agradeço à Secretaria de Pós-graduação da Fundação Antônio Prudente (Dr. Luís Fernando Lima Reis, Ana Maria e Luciana Pitombeira) pelo carinho, pelos cuidados, pela compreensão, por estarem sempre atentos às necessidades dos alunos e pela presteza.

Agradeço ao Dr. Ricardo Gómez Santiago e Dr. Raphael Bessa pela colaboração, pelo tempo atribuído à leitura dos meus relatórios e pelas importantes sugestões.

Agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.

Agradeço à Banca Julgadora de Dissertação pelo tempo atribuído na leitura desta dissertação.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Agradeço a Deus e aos meus queridos Santo Antônio de Pádua, Santo Antônio de Santana Galvão e Santa Terezinha que me apoiaram em momentos valiosos e me socorreram nas situações difíceis.

Agradeço aos meus pais, dos quais eu tenho bastante orgulho, pelo esforço que empregaram para tornar este meu sonho possível, por terem me ensinado o que é a dedicação e o amor aos estudos e por me ajudarem a progredir em minha carreira, mesmo que isso os custasse a angústia de minha ausência.

Agradeço a todos os meus irmãos e às suas famílias pelo amor, carinho e pelo apoio financeiro, sem o qual eu não conseguiria completar essa jornada e ultrapassar novas fronteiras e também à minha querida Tia Santinha por toda a sua humildade e bondade.

Agradeço ao Vinícius pelo seu apoio, pela sua confiança, amor, carinho e companheirismo.

Agradeço a minha professora de inglês Flávia Araújo pela sua dedicação, carinho e pelos ensinamentos que foram essenciais no final de minha pesquisa, proporcionando-me a alegria de uma premiação jamais esperada.

RESUMO

Pereira CM. Identificação de genes epigeneticamentente inativados em carcinoma epidermóide de cavidade oral. São Paulo; 2007. [Dissertação de Mestrado-Fundação Antônio Prudente]

O câncer oral está entre os dez sítios mais acometidos por neoplasia maligna na população brasileira. Muitos casos são diagnosticados em fase avançada, resultando no aumento da morbidade e na diminuição da sobrevida. Esforços intensos foram empregados ao longo dos anos, objetivando esclarecer seu comportamento clínico e biológico. No entanto, apesar das inúmeras pesquisas realizadas no campo da biologia molecular, os mecanismos genéticos e epigenéticos envolvidos no câncer oral, ainda não foram completamente elucidados. Recentemente, os eventos epigenéticos passaram a receber uma atenção especial por sua relação com a expressão gênica. Na carcinogênese oral, a metilação (o evento epigenético mais freqüente) tem sido bastante descrita, presente na região promotora de importantes genes supressores tumorais. Este projeto tem como principal objetivo a identificação de genes com expressão gênica reduzida em virtude de eventos epigenéticos em amostras de CE da cavidade oral (baseado nos dados de ORESTES), com o intuito de auxiliar a compreensão dos eventos biológicos envolvidos nessa doença. Para identificar genes com expressão alterada entre os tumores da região da cabeça e pescoço e os seus correspondentes normais, foram analisados os dados disponíveis no NCBI gerados a partir de bibliotecas de ORESTES, oriundas destes tecidos. Cerca de quatorze genes que se apresentaram hipoexpressos através de análise de bioinformática foram selecionados. A expressão gênica foi avaliada através de RT-PCR nos dez primeiros genes, utilizando linhagens celulares tumorais de cabeça e pescoço. Dois deles apresentaram-se hipoexpressos: o gene CA3 na linhagem O13 e o gene FHL1 na linhagem FaDu. O tratamento dessas duas linhagens tumorais (O13 e FaDu) com o 5’-aza-dC, um conhecido agente desmetilante, foi capaz de promover a reexpressão destes dois genes. Estes genes foram então selecionados para ter sua expressão diferencial avaliada por meio de PCR em tempo real, em 20 amostras de pacientes portadores de CE primário de cavidade oral. Observou-se que o CA3 e o FHL1 apresentaram uma diminuição da expressão em 60% (12/20) e 75% (15/20) das amostras estudadas respectivamente, em relação às amostras normais. Durante as análises de seqüenciamento pós-tratamento com bissulfito de sódio do DNA de três linhagens celulares tumorais (O13, FaDu e O28) foi observado que o gene CA3 exibiu altos níveis de metilação na ilha CpG, presente em sua região promotora, tanto na linhagem na qual se encontrava hipoexpresso, quanto na linhagem onde apresentava expressão normal. O gene FHL1 nesta mesma análise apresentou a maioria dos dinucleotídeos CpGs presentes em sua ilha CpG, desmetilada. Este trabalho permitiu demonstrar que a estratégia de escolha de genes a partir a análise das bibliotecas de ORESTES foi adequada, pois genes selecionados para validação, apresentaram uma diminuição de expressão nas linhagens celulares e amostras tumorais analisadas. Apesar do 5´-aza-dC ter sido capaz de promover o aumento de expressão do CA3 e do FHL1, não foi possível estabelecer uma correlação entre a redução no nível de expressão destes genes e a presença de hipermetilação em suas regiões promotoras.

SUMMARY

Pereira CM. [Identification of epigenetically inactivated genes in oral carcinoma]. São Paulo; 2007. [Dissertação de Mestrado-Fundação Antônio Prudente]

The oral cavity is among the ten most common sites for malignant neoplasm in the Brazilian population. Most cases are diagnosed at advanced stage, resulting in increase of morbidity and decrease of overall survival. Many efforts have been made during the years, to understand its clinical and biological behavior. However, despite extensive research in the molecular biology field, genetic and epigenetic mechanisms involved in oral cancer carcinogenesis, have not yet been completely elucidated. Recentely, epigenetic events have received special attention due to their correlation with gene expression. In oral carcinogenesis, methylation (the main epigenetic event) has been described as present at the promoter region of important tumour suppressor genes. The aim of this project is to identify genes showing downregulation by epigenetic events in oral cancer samples (based on ORESTES data), and improve understanding of biological events involved in this disease. To identify genes with alterated expression in head and neck tumours, data available at NCBI (generated by ORESTES library derived from these tissues) were analyzed and compared to their normal counterparts. Fourteen genes that showed hypoexpression by bioinformatics analysis were selected. Gene expression was evaluated by RT-PCR in the first ten genes in head and neck tumour cell lines. Two of these showed hypoexpression: CA3 in O13 cell line and FHL1 in Fadu cell line. Treatment of these two tumour cell lines with 5’-aza-dC, a known demethylant agent, was capable of promoting reexpression of these two genes. Subsequently, these two genes were selected for a differential expression evaluation by real time PCR in 20 primary OSCC patient samples. CA3 and FHL1 were found to be underexpressed in 60% (12/20) and 75% (15/20) of the samples analyzed, respectively, compared to normal samples. Sodium bisulfite sequencing analysis of three tumour cell lines (FaDu, O13 e O28) demonstrated high levels of methylation in CpG island situated at promotor site of CA3 gene, in both hypoexpressed and normally expressed cell lines. In this same analysis FHL1 showed most of CpGs situated in its CpG island were demethylated. This research demonstrated that the strategy to choose genes from ORESTES library was adequate, because the genes selected for validation showed low expression levels in cell lines and tumour oral samples. Although 5´-aza-dC was able to promote a CA3 and FHL1 expression increase, it was not possible to establish a correlation between expression level decrease of these genes and the presence of hypermethylation in their promoter sites.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Gel de agarose a 1% mostrando a qualidade do RNA extraído de alguma das amostras. 44

Figura 2 Gel de poliacrilamida 8% com os produtos de amplificação do fragmento de 311pb do gene NOCTH2. 45

Figura 3 Avaliação da expressão dos genes CA3, FHL1, ANXA6, WDR26, HMGN4, C9orf64, FSTL1, CCN1, SAR1B e NFE2L1 em 5 linhagens celulares de cabeça e pescoço (O12, O13, O19, O28 e FaDu). 46

Figura 4 Avaliação da expressão do gene CA3 na linhagem celular O13 submetida ao tratamento com 5’-aza-dC. 47

Figura 5 Avaliação da expressão do gene FHL1 na linhagem celular FaDu submetida ao tratamento com 5’-aza-dC. 48

Figura 6 Seqüência de DNA após tratamento com bissulfito de sódio das Ilhas CpGs presentes nas regiões promotoras dos genes CA3 e FHL1. 51

Figura 7 Gel de agarose 1% mostrando os produtos das amplificações da ilha CpG do gene CA3 derivados das linhagens celulares O13 e O28. 52

Figura 8 Gel de agarose 1% mostrando a amplificação dos DNAs plasmidiais extraídos das colônias resultantes da clonagem das ilhas CpGs dos genes CA3 e FHL1 . 54

Figura 9 Cromatograma demonstrando presença de dinucleotídeos CpGs metilados na região promotora do gene FHL1 55

Figura 10 Perfil de metilação da ilha de CpG localizada na região promotora do gene FHL1 (31 CpGs no total). 57

Figura 11 Perfil de metilação da ilha de CpG localizada na região promotora do gene CA3 (33 CpGs no total). 59

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Bibliotecas de ORESTES incluídas neste estudo. 17

Tabela 2 Primers desenhados para avaliação por RT-PCR dos dez primeiros genes analisados neste estudo. 28

Tabela 3 Condições para as reações de RT-PCR de cada um dos 10 genes avaliados. 29

Tabela 4 Primers desenhados para amplificação das ilhas CpGs de CA3 e FHL1. 35

Tabela 5 Os 30 genes hipoexpressos em tumores da região da cabeça e pescoço segundo as análises de presença de CpG e dos dados públicos de ESTs. 39

Tabela 6 Valores das quantificações dos RNAs das amostras Tumorais (T) e Normais (B) 43

Tabela 7 Variação da expressão dos genes FHL1 e CA3 em amostras tumorais, representada por número de vezes 49

LISTA DE ABREVIATURAS

5-mC 5-metilcitosina

5’-aza 5’-azacitidina

5’-aza-dC 5-aza-2’-deoxicitidina

ACTB Homo sapiens actin, beta

ANXA6 Annexin A6

ATCC American Type Culture Collection

CE carcinoma epidermóide

CA3 Carbonic anhydrase III

CENARGEM Centro Nacional de Recursos Genéticos e Biotecnologia

C citosina

CCNI Cyclin I

CGAP Cancer Genome Anatomy Project cDNA DNA complementar

C9orf64 Chromosome 9 open reading frame 64

CH3 radical metil

CsCl cloreto de césio

Ct threshould cycle

DEPC dietil pirocarbonato

CpG bases citosina e guanina adjacentes

DMSO dimetil sulfóxido

DNA ácido desoxirribonucléico

DNMT DNA metiltransferase dNTPs deoxinucleotídeos fosfato ESTs etiquetas de seqüências expressas, cuja sigla do inglês é Expressed Sequence Tags FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FHL1 Four and a half LIM domains 1

FSTL1 Follistatin-like 1

G guanina

HDCA histona deacetilase

H3-K4 lisina 4 da histona 3

H3-K9 lisina 9 da histona 3

HMGN4 High mobility group nucleosomal binding domain 4

INCA Instituto Nacional do Câncer

M molar

µM micromolar mM milimolar

µL microlitro mL mililitro mm3 milímetros cúbicos

µg micrograma

MBP methylcytosine-binding protein

MeCP2 methyl CpG binding protein 2

MgCl2 cloreto de magnésio

NCBI National Center for Biotechnology Information

NaOH hidróxido de sódio

Ng nanograma

NOTCH2 Homo sapiens Notch homolog 2 (Drosophila)

ORESTES Open reading frame expressed sequence tags pb pares de bases PCR reação em cadeia da polimerase cuja sigla do inglês é Polimerase Chain Reaction pH potencial hidrogeniônico

PPIA Peptidylprolyl isomerase A (cyclophilin A)

RNA ácido ribonucléico

RefSeq reference sequences

RPLO Ribosomal protein, large, P0

RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction rpm rotações por minuto

SAGE Serial analysis of gene expression

SAME Serviço de Arquivo Médico

SAV SAGE Anatomic Viewer

TBP TATA box binding protein

Tm melting temperature

UCSC University of California Santa Cruz

WDR26 WD repeat domain 26

ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO 1 1.1 Câncer Oral 1 1.2 Alterações Moleculares e Carcinogênese 4 1.3 Metilação 6 1.4 Metilação e o Câncer Oral 9 1.5 ORESTES 12

2 OBJETIVOS 15 2.1 Objetivo Geral 15 2.2 Objetivos Específicos 15

3 MATERIAL E MÉTODOS 16 3.1 Critérios de bioinformática utilizados para a seleção dos genes candidatos 16 3.2 Amostras de Tecidos 20 3.3 Cultura de Células 21 3.4 Tratamento com o 5’-aza-dC 22 3.5 Extração de RNA 23 3.6 Síntese de cDNA 25 3.7 Desenho dos primers para RT-PCR 26 3.8 Quantificação da Expressão Gênica por Meio de RT-PCR em Tempo Real 30 3.9 Extração de DNA das linhagens celulares e tratamento com bissulfito de sódio 32 3.10 Identificação e Desenho de primers para a Ilha CpG 34 3.11 Clonagem e Seqüenciamento 35

4 RESULTADOS 37 4.1 Seleção dos Genes Candidatos 37 4.2 Coleta das Amostras e Extração do RNA 41 4.3 Avaliação da Síntese de cDNA 44 4.4 Avaliação da Expressão Gênica 45 4.4.1 RT-PCR 45 4.4.2 Avaliação da Expressão após Tratamento com 5’-aza-dC 46 4.4.3 Quantificação dos Níveis de Expressão em Tecidos normais e Tumorais 49 4.5 Identificação dos CGs Metilados nas Ilhas CpGs 50

5 DISCUSSÃO 61

6 CONCLUSÕES 79

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 80

ANEXOS Anexo 1 Ficha de Dados Clínicos-Pacientes A.C. Camargo Anexo 2 Ficha da Dados Clínicos-Faculdade Baiana de Odontologia Anexo 3 Termo De Consentimento Pós-Informado Anexo 4 Lista dos 64 genes hipoexpressos em ORESTES 1

1 INTRODUÇÃO

1.1 CÂNCER ORAL

O carcinoma epidermóide (CE) é a neoplasia maligna mais freqüente na cavidade oral. Esta doença origina-se nos tecidos epiteliais e chega a compreender cerca de 90% de todas as neoplasias orais (BARASCH et al.

1998).

O CE oral acomete principalmente as classes sociais menos favorecidas, como é o caso das populações dos países em desenvolvimento

(PARKIN et al. 1999). Um estudo comparativo de câncer oral, realizado em colaboração entre duas instituições especializadas em tratamento de câncer

(uma localizada num país em desenvolvimento e outra num país desenvolvido), notou visíveis diferenças na apresentação e no curso clínico dessa doença. (CARVALHO et al. 2004).

Esta localização de câncer é a sexta mais comum no mundo, sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade por câncer (DAS e

NAGPAL 2002).

Segundo informações do Instituto Nacional do Câncer (INCA), para o ano de 2006 foram estimados cerca de 13.470 novos casos de câncer para a cavidade oral e orofaringe, dentre a população brasileira colocando-a entre os dez sítios primários mais acometidos pelo câncer no país. Deste total,

10.060 casos seriam pacientes do sexo masculino e os 3.410 restantes do 2

sexo feminino, perfazendo uma proporção de 2,9:1 respectivamente

(MINISTÉRIO DA SAÚDE 2005).

Além do sexo, a idade avançada também parece ser um fator de risco para o CE oral. Cerca de 90% dos cânceres orais são registrados em indivíduos com idade superior a 45 anos (SILVERMAN 2001). Um estudo epidemiológico conduzido em três áreas metropolitanas brasileiras (São

Paulo, Curitiba e Goiânia) com pacientes portadores de câncer oral, verificou que cerca de 83,2% dos pacientes eram brancos, 76,3% residiam em áreas rurais por mais de 5 anos e 60,8% possuíam apenas o ensino primário

(FRANCO et al. 1989). A região metropolitana de São Paulo, em outro levantamento, registrou as maiores incidências de câncer de cabeça e pescoço do mundo, perdendo somente para a Índia (NAGAI et al. 1998).

Existe uma forte relação entre o tabagismo, o consumo de álcool e cânceres orais (SHAH e LYDIATT 1995). A combinação entre tabagismo e o alcoolismo foi associada à cerca de 90% dos casos de CE de cabeça e pescoço (AKANUMA et al. 1999; SHAH e LYDIATT 1995; KOWALSKI et al.

2005). No Brasil, o fumo e a ingestão de álcool são citados como os principais agentes predisponentes do CE oral. O risco desta neoplasia devido ao tabagismo é considerado bastante aumentado comparado a estudos similares em outros países (FRANCO et al. 1989; AKANUMA et al.

1999).

Apesar do CE poder estar presente em qualquer parte da cavidade oral, a língua e o assoalho bucal são as regiões mais acometidas

(AKANUMA et al. 1999; SHAH e LYDIATT 1995; SCULLY e PORTER 2000). 3

A escolha do tipo de tratamento para os cânceres de cavidade oral dependerá de uma série de fatores: do tamanho e da localização do tumor primário, do status linfonodal, da presença ou ausência de metástase à distância, do desejo e da tolerância do paciente ao tratamento (NEVILLE e

DAY 2002). Várias modalidades de tratamento são consideradas aceitáveis: cirurgia, radioterapia, quimioterapia ou a combinação de ambos (SHAH e

LYDIATT 1995; NEVILLE e DAY 2002). Entretanto, a cirurgia neste tipo de câncer é sem dúvida o método mais utilizado, pois permite a excisão completa do tumor e de linfonodos e a determinação do real estadiamento desta doença através do exame histológico da peça cirúrgica; tendo implicações tanto no prognóstico do paciente, como na avaliação da necessidade de um tratamento adjuvante (SCULLY e PORTER 2000).

Os cânceres de cabeça e pescoço nos estágios iniciais, apresentam discretas manifestações clínicas e sintomatologia, ocasionando um atraso no diagnóstico e uma diminuição na sobrevida (CALIFANO et al. 1996).

Existe uma relação entre a localização do tumor primário na cavidade bucal e o prognóstico do paciente. Alguns autores relataram que a sobrevida de cinco anos para carcinomas avançados localizados na região posterior da cavidade bucal seria menor do que 30% (SCULLY e PORTER

2000).

Dentre os fatores relacionados com o pobre prognóstico de pacientes portadores de CE oral, destaca-se o grande número de pacientes portadores deste tipo de câncer que são diagnosticados em estadios 4

avançados, tendo como conseqüência, uma abordagem terapêutica mais tardia (ZIOBER et al. 2006).

Um determinado estudo realizou uma revisão sistemática de centenas de publicações relacionadas à diferentes estratégias de screening do câncer oral, que tinham por objetivo, prevenir a mortalidade por esta doença (KUJAN et al. 2005). Infelizmente, o resultado deste estudo demonstrou que após a introdução destes programas, não foi observada a redução nas taxas de incidência e de mortalidade por câncer oral. De acordo com esses autores, seria necessário que se realizassem estudos adicionais utilizando metodologias de alta-qualidade, para a compreensão da biologia do câncer oral. Para estes, um conhecimento maior das bases genéticas do câncer oral seria um pré-requisito essencial para a obtenção de marcadores moleculares que auxiliassem no prognóstico desta doença e que poderiam ser utilizados durante os programas de screening.

1.2 ALTERAÇÕES MOLECULARES E CARCINOGÊNESE

O câncer é resultado da proliferação celular intensa, provocada por defeitos na sinalização, no ciclo celular e nos mecanismos de reparo do

DNA. O aumento da expressão dos oncogenes e/ou a diminuição da expressão dos genes supressores de tumor, está diretamente relacionado com a carcinogênese (SCULLY et al. 2000). Entretanto, os oncogenes não são suficientes para iniciar este processo. O evento determinante na transformação de uma célula pré-maligna numa célula maligna baseia-se na 5

inativação dos reguladores negativos do ciclo celular, ou seja, na inativação dos genes supressores do tumor (WILLIAMS 2000).

Vários eventos genéticos são necessários para se processar a transição celular através da hiperplasia, displasia, carcinoma in situ até o tumor invasivo e metastático (SMIRAGLIA et al. 2003). Um modelo de progressão tumoral em câncer de cabeça e pescoço foi proposto, baseado na perda de alelos nos cromossomos 3, 4, 6, 8, 9, 11,13,14 e 17 (CALIFANO et al. 1996). A detecção das perdas alélicas baseando-se neste modelo de progressão tumoral permitiu a identificação do envolvimento de importantes genes supressores de tumor com a carcinogênese oral.

As deleções ou mutações pontuais, detectadas nos genes supressores de determinados tipos de câncer, os impedem de exercer seu papel na regulação do ciclo celular. Essa condição leva ao aparecimento de células geneticamente alteradas, que ao se proliferarem dão origem às neoplasias malignas. O grande número de genes supressores tumorais que já foram descritos como hipermetilados em vários tipos de tumores, parece sugerir um papel importante para as alterações epigenéticas, na iniciação e na progressão do câncer (BAYLIN 2005). O que torna cada vez mais evidente a associação entre a presença de metilação aberrante na região promotora de genes e a perda de função dos mesmos, resultando numa vantagem seletiva às células neoplásicas (JONES e BAYLIN 2002).

6

1.3 METILAÇÃO

Eventos epigenéticos são alterações com caráter reversível, que não provocam modificações na seqüência do DNA (DAS e SINGAL 2004), mas sim no fenótipo e exercem influência nos mecanismos de expressão gênica

(BAYLIN et al. 2001).

A metilação é um evento epigenético freqüente, que ocorre através da adição de um radical metil (-CH3) a uma citosina (C) situada na posição 5’ de uma guanina (G) em dinucleotídeos CpGs, no DNA de células eucarióticas superiores (JONES e BAYLIN 2002; BAYLIN 2005).

Existe no genoma humano as denominadas “ilhas CpGs”, que são regiões contendo de 0,5 a 4 kb, ricas desses dinucleotídeos CGs e que correspondem a 1% a 2% do genoma total (GARDNER-GARDEN e

FROMMER 1987; ATTWOOD et al. 2002). Estima-se que aproximadamente

45 mil ilhas de CpGs estejam distribuídas no genoma e que essas seqüências encontram-se localizadas nas regiões promotoras e nos primeiros exons de cerca 60% dos genes (ANTEQUERA e BIRD 1993;

NAKAO 2001). Em células normais, estas regiões encontram-se protegidas da ação da metilação, por mecanismos não esclarecidos (ESTELLER 2005).

Os dinucleotídeos CpGs remanescentes que ocorrem fora das ilhas CpGs, são amplamente metilados (ATTWOOD et al. 2002).

O padrão de metilação é estabelecido ao longo da embriogênese e é estritamente controlado durante o desenvolvimento do organismo. É um processo biológico extremamente importante e sua presença está 7

relacionada ao silenciamento genético. Em células normais, a regulação da expressão de determinados genes é feita pela metilação e pode ser exemplificada pela inativação de um dos cromossomos X em células somáticas femininas e pelo imprinting genômico (silenciamento de alelos cromossômicos herdados de um dos pais) (ATTWOOD et al. 2002).

A metilação da citosina é realizada por uma família de enzimas denominadas DNA metiltransferases (DNMTs) (SINGAL e GINDER 1999;

JONES e BAYLIN 2002). As DNMTs parecem colaborar com a produção e a manutenção do padrão de metilação do DNA em células normais

(AKANUMA et al. 1999; BAYLIN et al. 2001). Existem quatro tipos de DNMts identificadas:

• a DNMT1 tem uma alta afinidade por substratos hemimetilados, o que

lhe caracteriza a função de manutenção dos padrões de metilação

(BESTOR 2000);

• a DNMT2 identificada através de pesquisas de banco de dados de

ESTs em 1998, mas que ainda não teve sua função devidamente

caracterizada (OKANO et al. 1998);

• as DNMT3 (DNMT3A e a DNMT3B) são responsáveis pela metilação

de novo (BESTOR 2000).

Três hipóteses já foram formuladas para explicar como a inibição da

transcrição gênica pode ser provocada pela adição dos radicais metil, às

citosinas presentes nas regiões promotoras: 1) A não-ligação de fatores de

transcrição aos seus sítios específicos, resultando na inibição da

transcrição gênica; 2) A presença de proteínas denominadas MBPs 8

(Methylcytosine-Binding Proteins) ligadas às regiões CpGs localizadas nas regiões promotoras, bloqueando o acesso dos fatores de transcrição aos seus sítios, 3) A formação de complexos de histonas deacetilases e proteínas de remodelagem-cromatínica co-repressoras, levando à formação de uma estrutura inativa do ponto de vista transcricional

(ATTWOOD et al. 2002).

Acredita-se que todas as três hipóteses são plausíveis e passíveis

(HERMAN e BAYLIN 2000), reforçando ainda mais o conceito de que a presença de metilação na região promotora, seria o mecanismo principal responsável pelo silenciamento de determinados genes (DE SMET et al.

1999; MULERO-NAVARRO et al. 2006; ULAZZI et al. 2007).

Substâncias com ação desmetilante, têm sido utilizadas na investigação da inativação epigenética. O 5´- azacitidina (5’-aza) e o 5´- aza-2´-deoxicitidina (5´-aza-dC) representam os dois melhores inibidores da DNA metiltransferase. O 5’- aza é um derivado da deoxicitidina com alguma modificação na posição cinco no anel de pirimidina (DAS e

SINGAL 2004). A atividade antineoplásica do 5’-aza-dC é resultado da depleção da atividade da DNMT, resultando numa hipometilação global do genoma e na reativação de genes supressores tumorais (MOMPARLER

2005). Apesar do 5’-aza e do 5’-aza-dC reduzirem significativamente os níveis de metilação genômica, estes agentes possuem ação citotóxica e mutagênica tanto in vitro, quanto in vivo (BENDER et al. 1998).

No entanto, apesar da metilação ser um importante processo biológico, este fenômeno também tem sido relacionado com o processo de 9

tumorigênese (ATWOOD et al. 2002). Diversas pesquisas têm

demonstrado a relação entre a metilação do DNA com o desenvolvimento

e a progressão de cânceres da região da cabeça e pescoço, inclusive o CE

de cavidade oral (NAKAHARA et al. 2001; NAKAYAMA et al. 2001;

SHINTANI et al. 2001; OGI et al. 2002).

1.4 METILAÇÃO E O CÂNCER ORAL

A metilação aberrante, também denominada de hipermetilação do

DNA e a sua associação com a gênese tumoral, fizeram com que houvesse um grande avanço nas pesquisas relacionadas ao assunto.

Os alvos mais freqüentes para os eventos de hipermetilação são as ilhas CpGs localizadas nas regiões promotoras dos genes (VISWANATHAN et al. 2003). A metilação aberrante das lhas CpGs pode reprimir de forma eficiente a transcrição de um determinado gene e agir como se fosse um dos

”hits” na hipótese de Knudson (two-hit hypothesis) (KNUDSON 1971) na geração de um tumor (ROBERTSON 2001). A exemplo disso, a hipermetilação observada na região promotora de determinados genes supressores de tumor, pode levar à conseqüente inativação do mesmo; favorecendo assim o aparecimento do câncer (TANAKA et al. 2003).

Diversas análises de genes envolvidos com a carcinogênese oral, apontaram para uma maior freqüência de hipermetilação na região promotora do gene CDKN2A em CEs primários (AKANUMA et al. 1999;

SHINTANI et al. 2001; VISWANATHAN et al. 2003). Alguns trabalhos citam 10

que a inativação deste importante gene supressor tumoral responsável pelo controle do ciclo celular, estaria relacionada com a presença de mutações, deleção homozigótica, mas principalmente com a presença de metilação aberrante (CODY et al. 1999; AKANUMA et al. 1999; NAKAHARA et al.

2001; SHINTANI et al. 2001).

A literatura correlaciona também, o perfil de hipermetilação dos genes

DAPK, MINT31 e DCC com as características histológicas e biológicas dos carcinomas orais (OGI et al. 2002). Foi notado que a perda de expressão de

DAPK estaria associada à presença de hipermetilação. Nos casos que apresentavam o gene MINT31 metilado, o prognóstico era pior. Quando era observada a hipermetilação na região promotora do gene DCC, encontrava- se a uma maior freqüência de invasão do tecido ósseo (OGI et al. 2002).

Uma avaliação da hipermetilação presente na região promotora de nove genes em câncer oral demonstrou haver uma forte ligação entre aspectos clínico-patológicos e o status de metilação de pelo menos seis desses genes (ISHIDA et al. 2005). Essa afirmativa pôde ser exemplificada pela forte relação observada entre o consumo de tabaco e/ou álcool e a presença de hipermetilação na região promotora dos genes supressores p14ARF e CDKN2A (ISHIDA et al. 2005).

A perda da expressão da E-caderina (gene supressor CDH1), está fortemente relacionada à disfunção do sistema de adesão célula-célula, o que possibilita a progressão tumoral (PECINA-SLAUS 2003). Um determinado estudo que procurou avaliar a expressão deste gene em linhagens celulares humanas de CE oral observou uma redução na 11

expressão da E-caderina, em virtude da presença de hipermetilação em sua região promotora (NAKAYAMA et al. 2001). Após tratamento com o agente desmetilante 5’-aza, de linhagens que apresentavam alto poder de invasão e metástase, verificou-se a restauração da expressão da E-caderina e a desmetilação das CpGs metiladas presentes na região promotora

(NAKAYAMA et al. 2001). Outro estudo correlacionou a presença de metilação em E-caderina, a redução da expressão de β-catenina com a presença de áreas metastáticas e invasivas em CE de cavidade oral (KUDO et al. 2004). Segundo estes autores a metilação da E-caderina e a degradação da β-catenina podem vir a se tornar novos marcadores para predição de metástase no câncer oral.

Apesar de inúmeras pesquisas já terem descrito o importante papel da metilação na carcinogênese oral (AKANUMA et al. 1999; SHINTANI et al.

2001; NAKAYAMA et al. 2001; OGI et al. 2002; VISWANATHAN et al. 2003;

ISHIDA et al. 2005), a contribuição causada pelo silenciamento gênico via hipermertilação na progressão de cânceres da região da cabeça e pescoço, ainda é pouco conhecida (WORSHAN et al. 2006).

A identificação de genes que são anormalmente metilados em tecidos tumorais pode se tornar uma ferramenta bastante significativa na descoberta de novos genes relevantes para a carcinogênese (LIANG et al. 1998).

As alterações epigenéticas e o acúmulo de mutações podem causar alterações nos padrões transcricionais definindo o fenótipo do câncer (REIS et al. 2005). Uma melhor maneira para se construir um painel molecular do câncer humano, seria através da definição de quais genes encontram-se 12

ativamente expressos em tecidos tumorais ou em seus tecidos normais correspondentes. Deste modo, dentro deste grupo de genes, poderíamos encontrar mutações e modificações epigenéticas, delineando então o ambiente molecular do câncer (BRENTANI et al. 2003).

Baseados neste constante esforço em tentar obter informações em relação às variações de expressão gênica entre tecidos tumorais e tecido normais correspondentes, algumas tecnologias foram desenvolvidas, a citar: as ESTs (Expressed Seqüence Tags), SAGE (Serial Analysis of Gene

Expression) e as ORESTES (Open Reading-Frame Expressed Sequence

Tags) (STRAUSBERG et al. 2002), sendo que esta última contém uma enorme quantidade de dados transcricionais, com informações importantes a respeito de genes expressos (BRENTANI et al. 2003).

1.5 ORESTES

Em 1999 foi lançado em São Paulo o Projeto Genoma Humano do

Câncer (HCGP), com financiamento da Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado de São Paulo (FAPESP) e do Ludwig Institute for Cancer Research.

Nesse projeto foram produzidas mais de 1 milhão de seqüências de genes expressos nos tumores malignos mais incidentes no Brasil (CAMARGO et al.

2001). Além de ter ajudado a ampliar o conhecimento do genoma humano, este projeto contribuiu para uma maior compreensão das diferenças genéticas entre as neoplasias e os tecidos não-tumorais correspondentes. 13

No Projeto Genoma Humano do Câncer foi utilizada uma nova tecnologia, desenvolvida por pesquisadores brasileiros, denominada

ORESTES (DIAS NETO et al. 1997). A técnica de ORESTES permite a obtenção de seqüências derivadas da região central codificante dos transcritos utilizando primers escolhidos arbitrariamente (DIAS NETO et al.

2000), em oposição à técnica convencional de ESTs que permite apenas a identificação das extremidades 5’ e 3’ dos transcritos (ADAMS et al. 1991).

O método de ORESTES mostrou-se bastante eficiente em termos de geração de transcritos, permitindo a representação de genes fracamente expressos, tornando-se um normalizador para transcritos raros (CAMARGO et al. 2001).

Essa tecnologia tem sido utilizada nos estudos de genes diferencialmente expressos e também na identificação de determinados transcriptomas (LEERKES et al. 2002; REIS et al. 2005; TOULZA et al.

2007).

Reis et al. (2005) em um amplo estudo do transciptoma de cabeça e pescoço e tireóide, analisaram mais de 230.000 ORESTES depositadas no

NCBI oriundas da cavidade oral, laringe, faringe e tireóide e selecionaram cerca de 250 candidatos a marcadores tumorais que mapearam em regiões cromossômicas descritas como amplificadas ou deletadas em tumores de cabeça, pescoço e tireóide.

A caracterização dos transcriptomas dos tecidos normais e de situações patológicas e a identificação de genes que se encontram 14

diferencialmente expressos nestas duas situações, tornou-se extremamente importante (LEERKES et al. 2002).

Para STRAUSBERG et al (2002) a utilização de diferentes fontes de dados de expressão gênica, dentre elas ORESTES, pode se constituir uma importante ferramenta no levantamento de informações sobre a biologia do câncer, bem como corroborar o desenvolvimento de novas estratégias de detecção, diagnóstico e tratamento desta doença. 15

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Este projeto tem como principal objetivo a identificação de genes com expressão gênica reduzida em virtude de eventos epigenéticos em amostras de CE da cavidade oral.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Identificar genes hipoexpressos em CE de cabeça e pescoço, através

da análise de seqüências ORESTES;

• Verificar se o tratamento com o agente desmetilante 5´-aza-dC é

capaz de reativar a expressão destes genes;

• Validar a hipoexpressão dos candidatos selecionados em amostras

tumorais;

• Identificar os dinucleotídeos CGs que se encontram metilados nas

regiões promotoras destes genes.

16

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 CRITÉRIOS DE BIOINFORMÁTICA UTILIZADOS PARA A

SELEÇÃO DOS GENES CANDIDATOS

Para identificar genes com expressão alterada entre os tumores da região da cabeça e pescoço e os seus correspondentes normais foi realizada uma análise de bioinformática através da colaboração com o grupo do Dr. Felipe Rodrigues Silva (EMBRAPA/CENARGEN). Primeiramente, as

946.260 seqüências ORESTES depositadas no NCBI foram comparadas com as 29.529 seqüências-referência de genes humanos presentes no banco de dados RefSeq (PRUITT et al. 2005), utilizando-se para isto a ferramenta blastn. O melhor hit da seqüência ORESTES com um gene humano foi utilizado para definir o gene da qual ela se originou, sem nenhuma inspeção visual. Apenas hits com e-values melhores que 1 x 10-10 foram considerados, com isso, apenas 570.214 ORESTES foram incluídas na análise. O resultado obtido foi carregado em um banco de dados relacional.

Em seguida, foram analisadas apenas as bibliotecas de tecido tumoral e de tecido normal de cabeça e pescoço, conforme descrito na

Tabela 1. Para identificar os genes com expressão alterada entre o tecido normal e o tecido tumoral da região da cabeça e pescoço, foram realizadas 3 17

comparações independentes entre os grupos de bibliotecas normais e de bibliotecas tumorais:

• Laringe Normal + Hipofaringe Normal x Tumor de Cavidade Oral

• Laringe Normal x Tumor de Laringe

• Hipofaringe Normal x Tumor de Hipofaringe

Tabela 1 - Bibliotecas de ORESTES incluídas neste estudo. Estas bibliotecas foram utilizadas para as comparações entre tecidos tumorais e tecidos normais.

Tipo de Tecido BIBLIOTECAS INCLUÍDAS Total de bibliotecas

Hipofaringe normal HN0001 a HN0015 15 (HN) Laringe normal HN0016 a HN0032 16 (LN) HT0030 a HT0135 Tumores de Laringe HT0400 (LT) HT0815 a HT0963 260 HT0964 a HT1026 HT1128 a HT1172 Tumor de hipofaringe HT0627 a HT1172 545 (HT) Tumores de cavidade oral HT0001 a HT0029 292 (AT) HT0136 a HT0399

Para identificar genes diferencialmente expressos dentro dos conjuntos analisados foi empregado o Teste Exato de Fisher (SIEGEL 1956), sendo considerados diferencialmente expressos, aqueles genes que apresentaram diferença de expressão estatisticamente significativa com p <

0,05. 18

A partir da análise de bioinformática dos dados de ORESTES, foi gerada uma lista de genes diferencialmente expressos em CE de cabeça e pescoço.

Para a seleção dos melhores candidatos foram observados os seguintes critérios:

• Só foram considerados os genes que apresentaram expressão

diminuída no tecido tumoral em relação ao tecido normal;

• Presença de Ilhas de CpG na região promotora - Utilizando as

ferramentas de busca on line disponíveis, foram localizadas as ilhas

CpGs presentes nas regiões promotoras de todos os genes

selecionados.

• Hipoexpressão no tecido tumoral em relação ao tecido normal

avaliado também através da análise do banco de dados de ESTs do

NCBI – foi também verificado se a hipoexpressão apresentada pelos

genes candidatos, obtidos através da análise de seqüências

ORESTES, seria também observada através dos dados de cabeça e

pescoço disponíveis no banco de dados públicos de EST.

• Função – Foram analisados os processos biológicos em que as

proteínas codificadas pelos genes selecionados estariam envolvidas,

se havia descrição em trabalhos anteriores associando a função com

a carcinogênese (adesão celular, ciclo celular, transdução, transcrição 19

entre outros), informações sobre o nível de expressão destes genes

em diversos tipos de cânceres ou uma possível atividade supressora

de tumores.

A avaliação destes critérios citados foi realizada utilizando-se ferramentas disponíveis on line (Quadro 1).

Quadro 1 - Informações sobre os sites da internet utilizados na seleção dos genes candidatos.

Critérios usados na Nome do website Endereço do website seleção dos genes

NCBI Nucleotide http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ query.fcgi?db=nucleotide&cmd=se arch&term=

Presença de Ilha CpG UCSC Genome www.genome.ucsc.edu na região promotora Bioinformatics

Methprimer http://www.urogene.org/methprimer /index1.html

Virtual Northern SAGE Hipoexpressão em Anatomic Viewer (SAV) http://cgap.nci.nih.gov/SAGE/Anato ESTs CGAP micViewer

NCBI GENE http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ NCBI UNIGENE query.fcgi?CMD=search&DB=gene

Gene Ontology http://www.geneontology.org/

Informações gerais Gene Cards http://bioinfo.weizmann.ac.il/cards/i (funções e processos ndex.shtml biológicos)

Source Search http://genome- www5.stanford.edu/cgi- bin/source/sourceResult

USCS Genomic Bioinformatics http://genome.ucsc.edu/

20

3.2 AMOSTRAS DE TECIDOS

Para obtenção das amostras utilizadas na etapa de validação da hipoexpressão dos genes selecionados, foi realizado um levantamento de dados no Serviço de Arquivo Médico e Estatístico (SAME) do Hospital do

Câncer A.C. Camargo, por meio de análise dos prontuários de pacientes atendidos neste hospital no período de 2000 a 2005, portadores de CE primário de cavidade oral, que não receberam qualquer tratamento prévio e que possuíam amostras disponíveis no banco de tumores desse hospital

(Anexo 1).

As amostras foram colhidas a fresco durante o ato cirúrgico e submetidas a exame intra-operatório pelo método de congelamento, para seleção de áreas tumorais representativas, livres de necrose e calcificações.

As amostras foram submetidas a congelamento rápido em nitrogênio líquido e armazenadas a -70ºC.

Além disso, foram utilizadas 10 amostras de mucosa normal proveniente de pacientes que não apresentavam nenhuma patologia prévia ou clinicamente diagnosticável em cavidade oral. Estes indivíduos foram submetidos a cirurgias pré-protéticas ou cirurgia de 3os molares inclusos na

Escola Baiana de Medicina e Saúde pública – Curso de Odontologia. Estas amostras foram colhidas no momento da cirurgia, foram congeladas imediatamente em banho de gelo seco e etanol e em seguida estocadas em freezer -70°C. 21

A população do grupo tumoral demonstrou-se formada principalmente por indivíduos do gênero masculino (80%), de cor branca (80%), tabagistas

(70%), etilistas (50%), com faixa etária com média de 59,4 anos, portadores de carcinoma epidermóide de cavidade oral primário, representadas por todos os estadios clínicos, sendo que 10% dos casos são representados pelo estadio I, 30% no estadio II, 25% no estadio III e 35% no estadio IV.

As amostras estavam representadas por assoalho bucal (4 casos), língua oral (15 casos) e área retromolar (1 caso).

A população do grupo normal demonstrou-se formada por indivíduos com faixa etária com uma média em torno de 20,9 anos, composta principalmente por indivíduos do gênero feminino (60%), de cor branca

(60%), não-etilista (100%) e não-tabagista (90%). Estas amostras estavam divididas entre os sítios anatômicos de área retromolar (5 casos), gengiva inferior (3 casos) e gengiva superior (2 casos).

A utilização das amostras foi autorizada pelas Comissões de Ética em

Pesquisa do Hospital do Câncer A.C. Camargo (Processo nº. 737/05) e da

Faculdade Baiana de Odontologia. Os dados da população foram levantados através de questionários aplicados e o termo de consentimento pós- informado foi devidamente assinado por todos os pacientes (Anexos 2 e 3).

3.3 CULTURA DE CÉLULAS

Foram utilizadas neste estudo cinco linhagens celulares derivadas de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço. As linhagens O12, O13, O19 22

e O28 foram gentilmente cedidas pelo Dr. Joseph Califano do Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Johns Hopkins University. A linhagem

FaDu é oriunda da ATCC - American Type Culture Collection

(http://www.atcc.org/) e já fazia parte do banco de linhagens celulares do

Laboratório de Genética do Câncer

As linhagens O12, O13, O19, e O28 foram cultivadas em meio RPMI e a linhagem FaDu foi cultivada em meio MEM, todas em atmosfera de 5% de CO2 a 37º C, suplementadas com 10% de soro fetal bovino e na presença de antibióticos. As linhagens celulares foram crescidas em garrafa para cultura de células com área de 75 cm2 até uma confluência de aproximadamente 80%, que corresponde à cerca de 106 células. As culturas foram replicadas a cada 2 ou 3 dias. Após o crescimento, as células foram tripsinizadas e centrifugadas (1.500 RPM por 4 minutos). O meio de cultura foi descartado e os sedimentos contendo as células foram estocados a -70º

C.

3.4 TRATAMENTO COM O 5’-AZA-DC

As mesmas linhagens celulares também foram cultivadas na presença do agente desmetilante 5’-aza-2’-deoxicitidina (5´-aza-dC) (Sigma). Em resumo, 105 células foram cultivadas por intervalos de 0, 3, 5 e 7 dias em meio de cultura apropriado a cada linhagem, contendo 1μM de 5’-aza-dC. O meio de cultura foi trocado diariamente. Durante o experimento foram determinados 4 diferentes pontos, de acordo com o tipo de tratamento que 23

as células receberam. O ponto 0 (0 dia) representou as linhagens cultivadas sem a presença do 5’-aza-dC no meio de cultura. O ponto 1 correspondeu

às linhagens tratadas com 1μM de 5’ -aza-dC durante 3 dias, enquanto que, os pontos 2 e 3 corresponderam ao tratamento das linhagens com a droga durante 5 e 7 dias. Ao final de cada ponto de tratamento as células foram recolhidas por tripsinização e estocadas à -70°C para posterior extração de

RNA e DNA.

3.5 EXTRAÇÃO DE RNA

A extração dos RNAs das amostras de tecido normal foi realizada pelo método do Trizol (Invitrogen), segundo recomendações do fabricante.

Basicamente, cada amostra foi homogeneizada com 800µL de trizol e 20µL de glicogênio (10µg/µL) e em seguida incubada por 5 minutos a temperatura ambiente. Após esta incubação foi adicionado 160µL de clorofórmio e após centrifugação por 5 minutos para separar as fases, a fase superior foi transferida para um tubo e reextraída com 800µL de Trizol e 160µL de clorofórmio. Após nova centrifugação por 5 minutos para separar as fases, a fase superior foi novamente transferida para um novo tubo e os RNAs foram precipitados pela adição de 0,7 volumes de isopropanol gelado e incubação

à -20°C, durante a noite. Após este período, os tubos foram centrifugados por 30 minutos a 4°C à 12.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o pellet lavado com 500µl de etanol 70%. O pellet foi seco (10 minutos, temperatura ambiente) e dissolvido em 40µl de água livre de RNAase. 24

O Banco de Ácidos Nucléicos do Hospital do Câncer A.C.Camargo realizou a extração das amostras tumorais seguindo o protocolo do Trizol, com pequenas alterações.

O RNA total das linhagens celulares utilizadas nesse estudo foi extraído através do método de sedimentação através de gradiente de

Cloreto de Césio (CsCl). Basicamente as células foram homogeneizadas em

9mL de Solução de Lise (4M Isotiocianato de Guanidina; 25mM Citrato de

Sódio – pH 7,0; 0,1M β-mercaptoetanol) com auxílio de um vortex. O lisado foi transferido para um tubo de ultracentrífuga contendo 4mL de Solução de

Cloreto de Césio (5,7M CsCl; 1M Acetato de Sódio) e então submetido a ultracentrifugação a 29.000 rpm por 20 horas a 20°C. Após a centrifugação e a remoção do sobrenadante, o pellet de RNA foi solubilizado em 100μL de

água livre de RNAase, sendo este último passo repetido por mais 3 vezes consecutivas, para uma maior recuperação do RNA.

Após a extração, todos os RNAs obtidos foram quantificados em espectrofotômetro (NANODROP-ND1000) e suas integridades foram avaliadas através de eletroforese em gel de agarose 1% contendo 0,5µg/mL de brometo de etídio. Para isso, utilizou-se 1,0μg de cada RNA, em um volume de 5μL acrescentando-se igual volume de tampão denaturante (2X

TAE, 7 M de Uréia e 30% de Glicerol). As amostras foram incubadas a 65°C por 10 minutos antes de serem submetidas à eletroforese.

25

3.6 SÍNTESE DE cDNA

Para a confecção das moléculas de cDNA, 2µg de RNA total foram submetidos à ação da enzima SuperScript III (Invitrogen) conforme as condições fornecidas pelo fabricante. Resumidamente, a 2µg de RNA total foi adicionado 1μL de primer Oligo dT (500μg/mL), 1µL de dNTPs (10mM)

(Invitrogen) e água DEPC suficiente para 13µL. Essa mistura foi incubada a

65°C durante 5 minutos. Em seguida, foram adicionados 4µL de 5X First

Strand Buffer, 1µL de DTT (0,1M), 1μL de RNAse out (40U/μL) e 1μL de da enzima SuperScript III (200 U/μL) (Invitrogen) perfazendo um volume final de reação de 20µL. A reação foi incubada a 50°C por 1 hora e depois inativada através de incubação a 70°C por 15 minutos. Terminada a reação, o produto da síntese foi diluído 10X pela adição de 180μL de água livre de RNAse.

A presença de moléculas de cDNA longas e completas foi avaliada através da amplificação por PCR de um fragmento do gene NOTCH 2

(NM_024408) com a utilização dos primers NOTCH2-F (5´-

TGTGGCCAACCAGTTCTCCT-3´) e NOTCH2-R (5´-

GGCAGTCATCAATATTCCTC-3´). Para isto foram utilizados 2μL de cDNA diluído; 2,5μL de tampão de reação 10X; 2 µL MgCl2 (25 mM), 0,5μL de dNTPs (10mM) (Invitrogen); 1,25μL de cada primer (10μmol) e 0,25μL de

TaKaRa Ex Taq (5 units/µL) (TaKaRa Biomedicals) em um volume final de reação de 25µL. As seguintes condições de amplificação foram utilizadas: desnaturação inicial por 5 minutos a 94°C, seguida de 35 ciclos a 94°C por 26

30 segundos, 60°C por 45 segundos e 72°C por 45 segundos, com uma fase de elongamento final a 72°C por 7 minutos.

Como controle de qualidade dos cDNA foi amplificado um fragmento do gene ACTB (NM 001101), com a utilização dos primers ACTB-F (5´-

CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3´) e ACTB-R (5´-

TCATCACCATTGGCAATGAG-3´). Para isto foram utilizados 2μL de cDNA diluído, 2,5μL de tampão de reação 10X; 1μL de MgCl2 (50mM); 0,5μL de dNTPs (10mM) (Invitrogen); 0,5 μL de cada primer (10μM) e 0,25μL de Taq

DNA Polymerase Platinum (5 units/µL) (Invitrogen) em um volume final de reação de 25µL. As seguintes condições de amplificação foram: desnaturação inicial por 2 minutos a 94°C, seguida de 35 ciclos a 94°C por

30 segundos, 58°C por 45 segundos e 72°C por 45 segundos, com uma fase de elongamento final a 72°C por 7 minutos.

Os produtos de PCR foram avaliados através de eletroforese em gel de agarose 1% corado com 0,5 mg/mL brometo de etídio.

3.7 DESENHO DOS PRIMERS PARA RT-PCR

Foram desenhados primers para análise da expressão de 10 dos genes selecionados utilizando-se o software Gene Runner - Version 3.05

(Hastings Software, Inc) (Tabela 2).

Para o desenho dos primers para análise da expressão gênica os seguintes critérios foram obedecidos: 27

• Sempre que possível, os primers foram desenhados de forma a

permitir a amplificação de todas as eventuais variantes transcricionais

que os genes apresentassem;

• O tamanho do primer deveria ser de 22 a 25 pb;

• O Tm deveria oscilar entre 55º e 65º C;

• Os primers forward e reverse foram obrigatoriamente desenhados em

exons diferentes;

• O tamanho do fragmento amplificado deveria estar entre 150 a 300

pb;

• Os primers não deveriam formar hairpins ou internal loopings;

• Os primers foram sempre desenhados o mais próximo possível da

extremidade 3 dos genes.

28

Tabela 2 - Primers desenhados para avaliação por RT-PCR dos dez primeiros genes analisados neste estudo.

Tamanho do Gene Seqüências dos primers fragmento 260 pb F: 5’- TGAAGCAGCGCGATGGGAT-3’ CA3 R: 5`- GTCAGAGCTCACGGTCATGGGC-3’ 189 pb F: 5’-CCGCTTCTGGCATGACACCT-3’ FHL1 R: 5’-ACGGTCCCCTTGTACTCCACG-3’ 191 pb F: 5’-CCGGCACAGATGAAAAGGCTC-3’ ANXA6 R: 5’-TTCTCCTCCCTCCTCACGATGC-3’ 196 pb F: 5’-TGCCAATTGCGGAGCTGACA-3’ WDR26 R: 5’-CGTCTGCTCCAAATTCACCATCAA-3’ 182 pb F: 5’- CCTTCCCTCGCCTTCCTGTTCC-3’ HMGN4 R: 5’-TGTCCTCCTCACGCTGTTCCTGG -3’

F: 5´-AGGCTCTTTTCTCAACTGCGTCCG T-3’ 191pb C9orf64 R: 5’-AGCAGCCATCTCCTTTTCCTTCCA -3’

F: 5’-CCCAGACCCAGACAGAGGAGGAG-3’ 203pb FSTL1 R: 5’ACTGGTGATTTGGCGACTGTAGCA-3’

F: 5’-GCAATTCAGAGGATCCATG-3’ 220pb CCN1 R: 5’-GGTGTGCTTGAGGGGACGGTAG-3’

F: 5’-ACCACGAAAGGCTGTTAGAGTCAAAA-3’ 146pb SAR1B R: 5’-AACCAAACATCTCTCGCAACCTCTC-3’

F: 5’-ACGGAACCTGCTAGTGGATGGAGA-3’ 167pb NFE2L1 R: 5’-CTGTTATGCTGGAAATGTCTGCTGGA-3’

F= primer forward e R= primer reverse

29

As reações de PCR foram padronizadas com a finalidade de

garantir as melhores condições de amplificação, para isto, foram testadas

diferentes temperaturas de annealing e concentrações de MgCl2. Todas as

reações de RT-PCR foram padronizadas para que a temperatura de

annealing utilizada fosse de 66°C, exceto para os genes CCN1 e NFE2L1,

cujas temperaturas foram 55ºC e 70ºC respectivamente. Na maioria das

reações foi utilizado 2mM de MgCl2, exceto para três genes: o HMGN4 e o

NFE2L1 onde a concentração utilizada foi de 1mM e para o gene CCN1

onde foram utilizados 3mM de MgCl2 (Tabela 3):

Tabela 3 - Condições para as reações de RT-PCR de cada um dos 10 genes avaliados.

Gene Temperatura de annealing (ºC) MgCl2 (mM) CA3 66 2 FHL1 66 2 ANXA6 66 2 WDR26 66 2 HMGN4 66 1 C9orf64 66 2 FSTL1 66 2 CCN1 55 3 SAR1B 66 2 NFE2L1 70 1

30

3.8 QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA POR MEIO DE

RT-PCR EM TEMPO REAL

As reações de RT-PCR em Tempo Real, foram realizadas no aparelho ABI® 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems), para os genes CA3 e FHL1. A condição básica desta reação foi : 2µL Tampão

Taq Platinum (10X), 0,8µL de MgCl2 (50 mM), 0,4µL de dNTPs (10 mM),

0,4µL de cada primer (10µM), 0,2µL de Taq Platinum DNA polimerase

(5U/μL- Invitrogen), 1µL de DMSO 100% (Sigma Chemical Co.), 0,2µL de

Sybr Green I (Invitrogen) diluído 100 vezes em água estéril, 2µL de cDNA, em volume final de reação de 20µL.

As condições de amplificação utilizadas foram: desnaturação inicial à

95°C por 2 minutos, amplificação com 40 ciclos de 95°C por 15 segundos, temperatura de annealing (68ºC para o gene CA3 e de 72ºC para o gene

FHL1) por 30 segundos e 72°C por 30 segundos.

Para o cálculo da quantificação relativa do nível de expressão foi utilizado o método do 2-ΔΔCt (LIVAK e SCHMITTGEN 2001). O método do 2-

ΔΔCt ou método comparativo de Ct é uma equação matemática onde as mudanças na expressão gênica são calculadas baseadas nas diferenças entre as amostras calibradoras (normais) e as experimentais (tumorais), normalizadas por uma referência. Vale destacar que o valor inferido à ΔCt equivale à diferença entre o valor da média dos Cts do gene de interesse e a média dos Cts do gene normalizador. Já o cálculo da fórmula ΔΔCt envolve a 31

subtração entre o valor de ΔCt para cada amostra experimental e o valor de

ΔCt para as amostras calibradoras.

Para a análise da expressão dos genes FHL1 e CA3 foi utilizada a média dos Cts dos genes RPLO, PPIA e TBP como normalizadores. A escolha destes genes baseou-se num estudo desenvolvido no nosso laboratório, que teve como objetivo a escolha de um melhor normalizador para a cavidade oral. Neste estudo foram analisadas cerca de 78 amostras

(48 amostras de CE e 25 amostras de tecido normal, todas provenientes de cavidade oral) e cerca de 10 genes mais utilizados em estudos de expressão gênica como normalizadores. O resultado final demonstrou que os genes

RPLO, PPIA e TBP foram os que se apresentaram mais estáveis nas 78 amostras (LESSA 2007).

Todas as reações foram realizadas em triplicadas, sempre com a presença de um controle positivo (músculo esquelético – CLONTECH) e um controle negativo, reação onde foram adicionados todos os reagentes exceto os cDNAs. O valor de corte para considerar a diferença de expressão foi de duas vezes. Para as quantificações foram utilizadas as médias das triplicatas. Quando uma das triplicatas apresentava discrepância de um ciclo ou mais entre as outras duas, esta era descartada e a média era realizada com o valor de Ct das duas replicatas restantes. Porém, quando a diferença entre as três era maior ou igual a um ciclo, ou quando não havia amplificação de uma das triplicatas, a reação para esta amostra era repetida.

32

3.9 EXTRAÇÃO DE DNA DAS LINHAGENS CELULARES E

TRATAMENTO COM BISSULFITO DE SÓDIO

O DNA das linhagens celulares foi extraído conforme as recomendações do fabricante do reagente Trizol utilizando um tampão de extração composto por Tiocianato de Guanidina 4M, citrato de sódio 50mM e

TRIS 1M pH 8,0. Após centrifugação, o precipitado de DNA foi lavado com isopropanol (100%) e etanol (70%), ressuspendido em 50 μL de água e armazenado a –20°C.

Em seguida o DNA extraído foi submetido ao tratamento com

Bissulfito de Sódio, conforme descrito por JERÓNIMO et al. (2003) mediante algumas adaptações. Este tratamento promove a deaminação de citosinas não-metiladas, convertendo-as em uracilas, enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas

Resumidamente, numa primeira etapa foi realizada a denaturação do

DNA, utilizando 2 μg do DNA, 1µL de Hering Sperm DNA 1ug/mL

(Invitrogen) e 2µL de NaOH 3M para um volume final de 20 µL. As amostras foram então incubadas em banho-maria a 50ºC por 20 minutos. Em seguida foram adicionados às amostras 500µL de solução de Bissulfito de Sódio pH

5,0 (meta-bissulfito de sódio 2,5M, hidroquinona 125mM e NaOH 350mM ).

As amostras então foram incubadas no escuro a 70ºC por 3 horas. O DNA foi purificado com a utilização do kit Wizard DNA Clean-up System

(PROMEGA), posteriormente lavado com 2mL de isopropanol 80% por duas vezes, seguido pela centrifugação por 3 minutos a 13.000 rpm. O DNA 33

tratado foi então eluído em 45µL de água a 80ºC. A dessulfonação do DNA foi feita através da adição de 5µL de NaOH 3M e incubação por 10 minutos

à temperatura ambiente. A precipitação do DNA, foi realizada com a adição de 75μL de acetato de amônia 5M, 350μL de etanol 100% gelado e 1μL de glicogênio (20µg/mL) e incubação overnight a -20º C. Após centrifugação (30 min., 13.000 rpm, 4°C) e descarte do sobrenadante, foram adicionados

500µL de etanol 70% gelado e repetidos os passos de centrifugação e descarte do sobrenadante. Os pellets foram deixados à temperatura ambiente por 10 minutos para sua secagem e ressuspendidos em 110µL de

água e armazenados a -70º C.

Como controle de qualidade do tratamento do DNA com o bissulfito, foi amplificado um fragmento do gene ACTB (NM 001101), com a utilização de primers desenhados para este gene pós-tratamento com bissulfito de sódio ACTB-F (5´-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3´) e ACTB-R (5´-

AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3´). Para isto foram utilizados 1μL de DNA diluído, 2,5μL de tampão de reação 10X; 1μL de MgCl2 (50mM);

0,5μl de dNTPs (10mM) (Invitrogen); 1,0μL de cada primer (10μM) e 0,25μL de Taq DNA Polymerase Platinum (5 units/µL) (Invitrogen) em um volume final de reação de 25µL. As seguintes condições de amplificação foram: desnaturação inicial por 2 minutos a 94°C, seguida de 35 ciclos a 94°C por

30 segundos, 60°C por 45 segundos e 72°C por 45 segundos, com uma fase de elongamento final a 72°C por 7 minutos.

34

3.10 IDENTIFICAÇÃO E DESENHO DE PRIMERS PARA A ILHA

CpG

Para a identificação das ilhas CpGs presentes na região promotora dos genes estudados foi adotado o critério definido por GARDINER-

GARDEN e FROMMER (1987) ou seja, o tamanho da ilha CpG maior que

200pb, a porcentagem de G+C maior que 50% e a proporção entre CpG observada/esperada maior que 0,6.

Durante a análise das ilhas CpGs, notamos uma variação no tamanho da ilhas CpG identificadas pelo site USCS e pelo site Methprimer, por isso optamos por definir como ilhas CpGs a região que correspondia ao somatório desses dois achados.

A fim de verificarmos o padrão e a distribuição da metilação dessas regiões, o desenho dos primers específicos para o seqüenciamento foi realizado, utilizando a ferramenta Methprimer . Essa ferramenta fornece a seqüência estudada, simulando o tratamento com o reagente Bissulfito de

Sódio. Deste modo nós conseguimos visualizar as citosinas anteriores à guaninas, mantidas em suas posições e todas as demais citosinas transformadas em timinas. Devemos ressaltar que estes primers não abrangeram nenhum dinucleotídeo CG. Assim durante a reação de PCR, tivemos a amplificação da mesma região em estudo, tanto em amostras altamente metiladas, quanto em amostras desmetiladas

Para o gene CA3, foram desenhados os primers para a amplificação da ilha e o tamanho do fragmento esperado foi de 493 pb (Tabela 4). 35

O fragmento correspondente à ilha de CpG presente no gene FHL1 possui 1.239 nucleotídeos, por isso a estratégia adotada para seqüenciá-la foi dividí-la em 2 fragmentos. Desenhamos o primeiro par de primers visando a amplificação de um fragmento de 450 pb e o segundo par de primers foi desenhado para amplificar um fragmento de 893pb (Tabela 4).

Tabela 4 - Primers desenhados para amplificação das ilhas CpGs de CA3 e FHL1.

Gene Seqüências dos primers Tamanho do fragmento F:5’-AGAATGTATGGAGGAAGGAGAGAGG-3’ CA3 493 pb R:5’-TAACAAAACTCTCCTAAACTAACATCCCTT-3’

F1:5’TTATTTTTTTATTGTTTGTTTTTTTTATTAGATTAT-3’ R1:5’- CTAAAACTAAAAAAATAAAAACAACAAAAACA-3’ 450 pb

FHL1 F2:5’-TGTTTTTGTTGTTTTTATTTTTTTAGTTTTAG-3’ 893pb R2:5’-CCCCCCACCTCCACCC-3’

3.11 CLONAGEM E SEQÜENCIAMENTO

Para a amplificação da ilha CpG do gene CA3 foi realizada a PCR com as seguintes condições: 2μL de DNA; 2,5μL de tampão de reação 10X;

1µL MgCl2 (50 mM); 0,5μL de dNTPs (10mM) (Invitrogen); 0,5μL de cada primer (10μM) e 0,25μL de Platinum Taq DNA Polymerase (5 units/µL)

(Invitrogen). As condições de amplificação utilizadas foram: 94ºC por 2 minutos, 35 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 65ºC por 45 segundos, 72ºC por 45 segundos e uma extensão final de 72ºC por 7 minutos. 36

Para a amplificação da ilha CpG do gene FHL1 foram utilizadas as seguintes condições: 2μL de DNA; 2,5μL de tampão de reação 10X; 1,5µL

MgCl2 (50 mM), 0,5μL de dNTPs (10mM) (Invitrogen); 0,5μL de cada primer

(10μM) e 0,25μL de Platinum Taq DNA Polymerase (5 units/µL) (Invitrogen).

As condições de amplificação utilizadas foram: 94ºC por dois minutos, 35 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 58ºC por 45 segundos, 72ºC por 45 segundos e uma extensão final de 72ºC por 7 minutos.

Os fragmentos obtidos contendo as ilhas de CpG dos genes estudados foram introduzidos no plasmídio pCR4-TOPO® utilizando o TA

Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen) segundo instruções do fabricante.

Após a ligação, a reação foi dializada contra água por 20 minutos utilizando- se os filtros VSWP01300 (Milipore) e os plasmídios recombinantes foram introduzidos em células de E. coli DH10B por eletroporação utilizando o eletroporador Gene Pulser II (BIO-RAD) e os seguintes parâmetros foram utilizados: 0,1 cm Bio Rad Cuvette, 1,8kV, 25μF e 200 ohms.

O DNA destes clones foi extraído com auxílio do GFX Micro Plasmid

Prep Kit (Amersham Pharmacia Biotech) e foram seqüenciados utilizando-se os primers M13F 5´-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3´ e M13R 5´-

TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3´ e o kit Big Dye terminator sequencing

(Applied Biosystems). As reações de seqüenciamento foram analisadas no seqüenciador ABI3100 (Applied Biosystems). 37

4 RESULTADOS

4.1 SELEÇÃO DOS GENES CANDIDATOS

Para identificar genes com expressão alterada entre os tumores da região da cabeça e pescoço e os seus correspondentes normais foram analisados os dados disponíveis no NCBI gerados a partir de bibliotecas de

ORESTES oriundas destes tecidos. Dessa análise foi gerada uma lista contendo 75 genes com diferença de expressão estatisticamente significativa entre os tumores e o tecido normal. Destes genes, 64 eram hipoexpressos e 11 eram hiperexpressos nos tumores. Como o intuito deste trabalho é verificar se a hipoexpressão de determinados genes no carcinoma epidermóide da cavidade oral pode estar relacionada com a presença da hipermetilação na região promotora destes genes, prosseguiram no estudo, apenas os 64 genes que se apresentaram hipoexpressos (Anexo 4).

O passo seguinte foi verificar se os genes selecionados possuíam ilhas CpG (regiões-alvo da hipermetilação) em suas regiões promotoras.

Para esta análise foram utilizadas as ferramentas disponíveis no site da

UCSC e o software Methprimer. Esta análise revelou que dos 64 genes previamente selecionados, apenas 30 apresentavam ilhas CpG em sua região promotora e estes 30 genes prosseguiram no estudo (Tabela 5).

Em seguida, o nível de expressão destes genes nos tumores de cabeça e pescoço, também foi avaliado através da análise dos dados 38

públicos de ESTs, utilizando a ferramenta SAGE Anatomic Viewer (SAV) no site do CGAP. Esta análise confirmou que 24 dos genes analisados estavam hipoexpressos em ESTs (Tabela 5): 39

Tabela 5 – Os 30 genes hipoexpressos em tumores da região da cabeça e pescoço segundo as análises de presença de CpG e dos dados públicos de ESTs.

Hipoexpressão em ESTs Gene ID Símbolo Nome

- NM_001100 ACTA1 Actin, alpha 1, skeletal muscle

+ NM_005181 CA3 Carbonic anhydrase III

- NM_002046 GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

+ NM_001449 FHL1 Four and a half LIM domains 1

+ NM_016103 SAR1B SAR1 gene homolog B (S. Cerevisiae)

+ NM_032307 C9orf64 Chromosome 9 open reading frame 64

- NM_021033 RAP2A RAP2A, member of RAS oncogene family

+ NM_007085 FSTL1 Follistatin-like 1

+ NM_003204 NFE2L1 Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 1

+ NM_006835 CCNI Cyclin I

+ NM_001155 ANXA6 Annexin A6

+ NM_006353 HMGN4 High mobility group nucleosomal binding domain 4

- NM_001660 ARF4 ADP-ribosylation factor 4

+ NM_002084 GPX3 Glutathione peroxidase 3 (plasma)

+ NM_025160 WDR26 WD repeat domain 26

+ NM_003262 TLOC1 Translocation protein 1

+ NM_182810 ATF4 Activating transcription factor 4

Guanine nucleotide binding protein (G protein) alpha + NM_006496 GNAI3 inhibiting activity polypeptide 3 Collagen-proline, 2-oxoglutarate 4-dioxygenase (proline 4- + NM_000917 P4HA1 hydroxylase), alpha polypeptide I + NM_005620 S100A11 S100 calcium binding protein A11

+ NM_006282 STK4 Serine/threonine kinase 4

+ NM_004396 DDX5 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 5

+ NM_001636 SLC25A6 Solute carrier family 25

+ NM_021009 UBC Ubiquitin C

+ NM_012179 FBXO7 F-box protein 7

+ NM_000540 RYR1 Ryanodine receptor 1

+ NM_173201 ATP2A1 ATPase, Ca++ transporting, cardiacmuscle, fast twitch1

+ NM_018941 CLN8 Ceroid-lipofuscinosis, neuronal 8

- NM_005620 S100A11 S100 calcium binding protein A11

- XM_113947 KIAA0565 Similar to hypothetical protein FLJ36492 40

Utilizando diversas ferramentas disponíveis on line, foram avaliados diferentes aspectos biológicos das proteínas codificadas por estes 24 genes, bem como relatos da literatura que demonstrassem a associação destes com a carcinogênese.

Nesta etapa foram adotados critérios para auxiliar a seleção dos melhores candidatos para prosseguirem no estudo:

• Foram excluídos os genes previamente descritos como oncogenes,

genes hiperexpressos ou hipermetilados em cânceres de qualquer

tipo histológico;

• Foram incluídos genes já descritos como hipoexpressos em outros

tumores; e

• Foram incluídos genes que não estivessem associados com o

processo de tumorigênese de cabeça e pescoço.

Dos 24 genes selecionados, 10 foram excluídos porque não atendiam a estes critérios . Portanto, 14 genes permaneceram no estudo.

A análise da função desempenhada pelas proteínas codificadas por estes 14 genes revelou que estas proteínas estão relacionadas com a ligação com íons (FHL1, ANXA6, CA3, RYR1, ATP2A1 e FSTL1), com a progressão no ciclo celular (WDR26 e CCN1), ligação com DNA (HMGN4) e com apoptose (CA3 e WDR26). Um dos genes selecionados ainda não teve sua função caracterizada (C9orf64) (Quadro 2):

41

Quadro 2 - Principais funções biológicas desempenhadas pelas proteínas codificadas pelos 14 genes selecionados.

Gene Função Ligação com íons metálicos e íons zinco, desenvolvimento muscular,

relacionado com crescimento celular e possível atividade supressora FHL1 tumoral Ligação com íon cálcio, ligação com proteínas com atividade catalítica, ANXA6 relacionado com adesão celular e possível atividade supressora tumoral Atividade carbonato desidratase, atividade liase, ligação com íon CA3 metálico, ligação com íon zinco e possível relação com apoptose Progressão no ciclo celular, transdução de sinal, apoptose e regulação WDR26 gênica. Dimerização de proteína, ligação sequência-específica com DNA, NFE2L1 atividade de fator de transcrição C9orf64 Função molecular desconhecida CCN1 Regulação da progressão através do ciclo celular e espermatogênese HMGN4 Ligação com o DNA FSTL1 Ligação com íon cálcio e ligação com heparina Ligação com GTP, atividade GTPase, ligação de nucleotídeos, SAR1B atividade transdutora de sinal CLN8 Codificação de domínio de proteína transmembrana Ligação com íon cálcio, atividade de liberação de canal de cálcio, RYR1 atividade receptora, liberação de IL-6 Ligação com ATP, ligação com íon cálcio, atividade hidrolase, ligação ATP2A1 com nucleotídeos e movimento de substâncias transmembrana Ligação com GTP, atividade GTPase, ligação com nucleotídeos, GNA13 transdução de sinal

Destes quatorze genes, sem obedecer a qualquer critério, selecionamos os 10 primeiros (FHL1, ANXA6, CA3, WDR26, NFE2L1

C9orf64, CCN1, HMGN4, FSTL1 e SAR1B) para prosseguirem no estudo.

4.2 COLETA DAS AMOSTRAS E EXTRAÇÃO DO RNA

Foram selecionadas 20 amostras tumorais de CE de cavidade oral congeladas. O diagnóstico foi confirmado através de análise pelo patologista

Dr. Antônio Hugo Campos do Departamento de Anatomia Patológica do

Hospital do Câncer A.C. Camargo. 42

Os casos analisados que apresentavam tecido conjuntivo, fibrose ou outros tecidos que pudessem alterar a qualidade do RNA extraído, foram semi-microdissecados pelo mesmo patologista e o material foi conservado em freezer a -70°C. Estas amostras então foram encaminhadas ao banco de

ácidos nucléicos do Hospital do Câncer A.C. Camargo para extração de

RNA segundo protocolo do reagente Trizol.

As quantidades de RNA obtidas das amostras tumorais variaram de

6,16 a 169,44 µg e das amostras normais de 26,21 a 136,34 µg. Os valores de ratio (razão de absorbância entre os valores 260/280) para amostras tumorais variaram de 1,67 a 1,84 e para as amostras normais estes valores foram de 1,89 a 1,99 (Tabela 6): 43

Tabela 6 - Valores das quantificações dos RNAs das amostras tumorais (T) e Normais (B).

Amostra Ratio µg Totais

01 T 1,83 134,88 02 T 1,81 41,28 03 T 1,80 26,16 04 T 1,71 10,72 07 T 1,83 169,44 08 T 1,70 6,16 09 T 1,67 10,48 13 T 1,77 29,36 16 T 1,80 16,16 19 T 1,80 14,48 20 T 1,80 75,60 21 T 1,83 26,80 22 T 1,82 96,12 25 T 1,80 17,88 26 T 1,82 28,4 27 T 1,71 18,88 29 T 1,80 29,24 32 T 1,79 32,64 37 T 1,84 158,64 38 T 1,80 14,24 01B 1,93 136,34 05B 1,86 31,62 12B 1,98 78,41 13B 1,99 69,81 17B 1,93 26,21 18B 1,97 51,05 20B 1,99 100,32 21B 1,97 61,58 23B 1,94 108,67 25B 1,95 33,32

Após a eletroforese em gel de agarose, foram considerados RNAs de boa qualidade aqueles que apresentaram bandas nítidas correspondentes aos RNAs ribossômicos 28S e 18S (Figura 1). Todas as 10 amostras normais e as 20 amostras tumorais prosseguiram no estudo. 44

Figura 1 - Gel de agarose a 1% mostrando a qualidade do RNA extraído de algumas das amostras. a) amostras normais e b) amostras tumorais

4.3 AVALIAÇÃO DA SÍNTESE DE cDNA

Dois microgramas de RNA total foram utilizados para a síntese de moléculas de cDNA e os produtos desta síntese foram avaliados quanto à sua qualidade por meio de RT-PCR utilizando primers localizados na extremidade 5’ do gene NOTCH2, resultando em um produto de tamanho esperado de 311 pares de base (Figura 2). Pelo fato deste gene possuir mais de 11Kb e da síntese da primeira fita de cDNA ocorrer a partir da cauda poli-A (utilizando-se moléculas de oligo-dT como iniciador), a amplificação de um fragmento localizado na extremidade 5’ deste gene indica a presença de moléculas de RNA longas e íntegras na amostra inicial e uma boa eficiência das reações de síntese de cDNA. 45

Legenda: T- Amostras tumorais. - controle negativo.

Figura 2 - Gel de poliacrilamida 8% com os produtos de amplificação do fragmento de 311pb do gene NOCTH2.

4.4 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA

4.4.1 RT-PCR

Utilizando a análise por RT-PCR, o nível de expressão dos genes

CA3, FHL1, ANXA6, WDR26, HMGN4, C9orf64, FSTL1, CCN1, NFE2L1 e

SAR1B foi avaliado nas linhagens tumorais de cabeça e pescoço.

O gene CA3 apresentou-se expresso na maioria das linhagens avaliadas, com exceção da linhagem O13, onde observamos que esse gene não se encontrava expresso. O gene FHL1 apresentou baixa expressão apenas na linhagem FaDu. Os outros oito genes (ANXA6, WDR26, HMGN4,

C9orf64, FSTL1, CCN1, SAR1B e NFE2L1) apresentaram-se expressos em todas as 5 linhagens celulares estudadas (Figura 3). 46

Legenda: O nível de expressão foi avaliado através de RT-PCR e eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. O gene ACTB foi utilizado como controle da quantidade de cDNA adicionado em cada reação de RT-PCR. (L) 100 bp DNA Ladder (Invitrogen). Nas canaletas marcadas com + e - foram adicionados controles positivo (linhagem tumoral SW 480) e negativo.

Figura 3 – Avaliação da expressão dos genes CA3, FHL1, ANXA6, WDR26, HMGN4, C9orf64, FSTL1, CCN1, SAR1B e NFE2L1 em 5 linhagens celulares de cabeça e pescoço (O12, O13, O19, O28 e FaDu).

4.4.2 Avaliação da expressão após tratamento com 5’-aza-dC

Para determinar se a metilação estaria relacionada com a baixa expressão apresentada pelos genes CA3 e FHL1 nas linhagens O13 e FaDu 47

respectivamente, o nível de expressão destes genes foi avaliado após o tratamento dessas linhagens celulares com o agente desmetilante 5’-aza-dC.

As linhagens FaDu e O13 foram cultivadas por até 7 dias na presença de 1µM de 5’-aza-dC e em seguida as células foram colhidas, seus RNAs extraídos e as moléculas de cDNA sintetizadas.

A análise de RT-PCR para o gene CA3 na linhagem O13 tratada com o 5’-aza-dC por 3, 5 e 7 dias mostrou que este gene começa a ser re- expresso já no terceiro dia de tratamento com a droga, aumentando gradativamente sua expressão, conforme se aumentava o tempo de exposição ao 5’-aza-dC (Figura 4).

Legenda: As células foram cultivadas sem a presença de 5’-aza-dC (dia 0) e na presença de 1µM de 5’-aza-dC (dias 3, 5 e 7). O nível de expressão foi avaliado através de RT-PCR e eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. O gene ACTB foi utilizado para avaliar a quantidade de cDNA adicionado em cada reação de RT-PCR. (L) 100 bp DNA Ladder (Invitrogen); (0) sem tratamento, (3) 3 dias de tratamento; (5) 5 dias de tratamento; (7) 7dias de tratamento. Na canaleta + encontra-se a linhagem tumoral HCT (controle positivo) e na canaleta – encontra-se o controle negativo (sem adição de cDNA).

Figura 4– Avaliação da expressão do gene CA3 na linhagem celular O13 submetida ao tratamento com 5’-aza-dC. 48

Fato semelhante foi verificado para o gene FHL1 que se encontrava pouco expresso na linhagem celular FaDu antes do tratamento com o 5’-aza- dC (dia 0) e a partir do terceiro dia de tratamento, já apresentava re- expressão (Figura 5).

Legenda: As células foram cultivadas sem a presença de 5’-aza-dC (dia 0) e na presença de 1µM de 5’-aza-dC (dias 3, 5 e 7).O nível de expressão foi avaliado através de RT-PCR e eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. O gene ACTB foi utilizado para avaliar a quantidade de cDNA adicionado em cada reação de RT-PCR. (L) 100 bp DNA Ladder (Invitrogen); (0) sem tratamento, (3) 3 dias de tratamento; (5) 5 dias de tratamento; (7) 7dias de tratamento. Na canaleta + encontra-se a linhagem tumoral HCT (controle positivo) e na canaleta – encontra-se o controle negativo (sem adição de cDNA).

Figura 5 – Avaliação da expressão do gene FHL1 na linhagem celular FaDu submetida ao tratamento com 5’-aza-dC.

Portanto, a análise de expressão gênica dos dez primeiros genes selecionados nas linhagens celulares avaliadas demonstrou que dois deles

(CA3 e FHL1) estavam hipoexpressos nestas linhagens e esta hipoexpressão pôde ser revertida pelo tratamento com o agente desmetilante 5´-aza-dC.

49

4.4.3 Quantificação dos níveis de expressão em tecidos normais e tumorais

Após de observar a reexpressão dos genes CA3 e FHL1 em linhagens celulares tumorais de cabeça e pescoço pelo tratamento com 5’- aza-dC, o passo seguinte foi avaliar o nível de expressão destes genes em

20 amostras de CE de cavidade oral e 10 amostras de mucosa normal através de PCR em tempo real utilizando-se o sistema Sybr Green.

A análise da quantificação da expressão do gene FHL1 revelou uma diminuição da expressão deste gene em 75% das amostras tumorais testadas (15/20) (Tabela 7).

A análise da expressão do gene CA3 revelou uma diminuição da expressão em 60% das amostras tumorais testadas (12/20) (Tabela 7):

Tabela 7 - Variação da expressão dos genes FHL1 e CA3 em amostras tumorais, representada por número de vezes.

Amostra FHL1 CA3 01T - 18,21 - 41,92 02T - 14,36 - 43,17 03T - 9.340,81 -163,70 04T - 26.740,71 -10,29 07T - 32,88 0,36 08T - 2.414,76 - 2,91 09T - 117,17 1,01 13T 1,51 - 43,73 16T - 4.667,90 1,01 17T - 3,69 - 6,41 19T - 406,42 0,41 21T 0,98 - 6,87 22T - 1.760,74 - 4,33 25T - 4,59 - 74,96 26T 0,06 0,25 27T 0,50 1,58 29T - 123,26 0,06 32T 1,03 0,59 37T - 2,14 - 6,10 38T - 8,60 - 244,11 50

Esses resultados demonstram que tanto o gene FHL1, quanto o gene

CA3, apresentaram-se hipoexpressos na maioria das amostras tumorais, em relação às amostras normais.

4.5 IDENTIFICAÇÃO DOS CGS METILADOS NAS ILHAS CPGS

Uma vez observada a reexpressão dos genes CA3 e FHL1 após o tratamento com o agente desmetilante e a hipoexpressão dos mesmos em amostras tumorais, o passo seguinte para verificar se metilação aberrante realmente poderia estar envolvida com o silenciamento desses genes, através da identificação da presença de citosinas metiladas nas ilhas de

CpG, presentes em suas regiões promotoras. Para esta análise, optamos por utilizar o seqüenciamento da ilha CpG presente na região promotora após o tratamento com bissulfito de sódio. Portanto, a estratégia adotada foi a seguinte: (1) tentar identificar linhagens que apresentassem expressão normal dos genes CA3 e FHL1 e linhagens que apresentassem hipoexpressão destes genes; (2) tratar o DNA destas linhagens com

Bissulfito de Sódio, (3) amplificar a região correspondente às ilhas de CpG destes genes, (4) clonar os fragmentos correspondentes e (5) seqüenciar dez clones de cada linhagem.

O fragmento correspondente à ilha CpG do gene CA3 abrangeu 493 pb, contendo 33 dinucleotídeos CGs (Figura 6A). Já o fragmento correspondente à ilha CpG do gene FHL1 abrangeu cerca de 1.239 nucleotídeos, contendo 144 dinucleotídeos CGs (Figura 6B). Em virtude da 51

grande extensão da ilha CpG do gene FHL1, optamos por dividí-la em dois fragmentos.

A TATAAGTGTTTAGAGATCGTAGTTAGATAGTTAGTTTGCGTTTGAAGTAATTTTTAAGTGAGGTTGTA AGAGTCGTCGGGATGTAGATTTTAGTTCGTGGTTAAGTATAATTACGATATTTTGTTTTTGTTTTTAT TTTATTTTTAAGAATGTATGGAGGAAGGAGAGAGGACGAGGTGAGGGTCGTTTGTATTTTTGTACGTC GGCGTCGGTTAGAAATTTTGTAGTTTTGAGAGAGAAGAAGAGGAGATGGAGGGGTTAGGAGTTACGAT TTTCGGGAGAGCGTAGGGAGGGGCGTGGGTGTTTTTTCGTTTATTTTCGTTTTCGTTATTTCGATAGT TGTTTCGTTTTTGGAATTTATTGGTTTTTTTTATTCGGTTTTTTAAATATTATTTTAATTTAGTTTAG TTTTTCGTTTTATTTTCGTTGATTTAATAAGGTTATGTAGTGTGCGGGGGAGTTATATAAAAGCGCGG GTTCGCGGCGATTTTGTATTACGTAGGGGAAGAGAAAGTAGGAGTCGTTTAGTACGGAGGAAGGCGAT TATGGTTAAGGAGTGGGGTTACGTTAGTTATAACGGTGAGTGTAGGTAGTCGCGATTCGGTTAGGAAG GGATGTTAGTTTAGGAGAGTTTTGTTATTGTATAGAAATGGGTAATTTTAGAGATTGTAGTGGAAAAT GTAGGAGTAGAATAAGATTTAATATTTATTGAGGTTTTTTAATTGTTAAATGTTGTTGTTTTTTTTTT TTTTTTATTTTATTTGGTTTTTTTTAGTATGGAGTTTTTATTTTTTTTGGAGAAAATTGAAGTGTAGA GAAGTTGGATTATTTGTTTAAGATTTTATTGTTTTTGAGAAGTTAGATAGTTCGAGGTTAGGTGTGAT TGGTTTTTATTTTGTTTTAT

B AGTTTTTTTTTGGTTTTTTTATATTTTTTAGGGTTTAGTTTAAATGTTATTTTTTTTTTTTTTAATTA TATTATTTGTATTTTTTTTGTATAGGTTTTATTTAAATTTGATTATTTTTTTATTTTTTTATTGTTTG TTTTTTTTATTAGATTATAAGTTTTTAGGGTAGGGTGCGTATTGTTTGTAGATAACGTTGTTATTATT AGAGTTCGGTATTGAGTTTGGTATATGGCGAGGGTTTAGTAAATTGAATGTTGAGTGAATGAGACGTT ACGCGTCGTTTTGTTATCGGTGTTTTTTGAGTGACGTTAAAACGTTTTGGATGGTGGTATTGGGATTA TGGATGGGGTTTATTTAGTTTTTTTCGGTTTGTTATTAAGGGGAGGGGTCGTCGGTGGGTTTTTCGGC GTCGTTGTAAGTTATCGGGTTTCGAAGTCGGAGGTCGAAACGGCGTGGGTTTCGAAGCGGGGTCGTTT TTTAGGGAGTGCGTAGGTTAGCGAGGATTTCGGTGAGGCGAGACGTTATTTTTATTTGGTTGTTTTTG TTGTTTTTATTTTTTTAGTTTTAGTCGTTTGTAGTGATTCGTGATTTTCGTAGGTTTTTAAGGATCGT TGCGCGAGGGAGGGGGTTCGAGGCGTTTTCGGTTCGTTTTTTTTTCGGTTTTCGGATTCGAGTCGGTT TTCGGGAAAGAGTTTGTTATCGCGTTTTCGTAGTTATTTTTTTCGCGTGTTCGGTTTTTTTTAGTGGC GGGGGTACGTGGGCGCGCGGGGTGCGTGGTAAGTCGTTTTTTTTTTTACGTTCGTTCGGTCGTTTTTC GCGCGCGCGTTTCGTATATAGTTTTCGTGTAGTGGGTAGAGTTCGGTTTCGCGCGCGTTTCGTTTCGT TTTTGGTTAGTCGCGTTCGTTTTCGCGTTTTTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGTTTTTTAGGCG CGTATTTTTTTTTTCGCGTTTTTTTCGCGTTTTATATTTATCGTTCGGCGGAGGGGGTTTAGTTCGTA GTCGTCGTCGTTATCGTCGCGTTTCGGTTTCGGTGTAGGTAGCGGTCGTCGTCGTCGAGATAGTTGCG CGGGCGAGTATTTTTACGTAGTAAGTTCGTTTTTTTTTCGTTTGTGCGCGCGTGTGTGTTTTTCGTTC GTCGGCGTTTTGGGTTTCGGGGGAGCGGTTGTTTTTTTGTTTCGTCGTCGTCGTCGTTCGGGGTTGGT TTTTGCGGTTTCGGTTGTTTGGTTTTTTAGGGTTGGGTATTGCGGTTTCGGCGGTTTCGTTGAGGTCG GGGGTTAGGGGTCGTTTCGGGTTGCGGGGTGCGGGACGAGGGATTGCGAGTGCGAGGTTTTTTTTGGT GCGTGTTTCGGTTTTTTTTGGGTTTTTGGTTCGATGGGGATTAAGAGGTAGTGGGGTGGAGGTGGGGG GGATCGGGAGTGAAATGGGGGTTTTTTATGTTTTTTTGTGCGGGGGATGGTGGGGAGTGAGGAGGGAG TGAAGGGGGGGTTTTGGTTTTGTTATTAAGGATGGCGGGTAGTGGGGGGTGGGGCGAGGTGGGGATAT TTTTTGGTTTTTTTAGTTAGGATAGTTAG

Legenda: As ilhas CpGs presentes nas regiões promotoras dos genes CA3 (A) e do FHL1 (B) identificadas pelas ferramentas disponíveis on line no UCSC Genome Bioinformatics e MethPrimer (dispostas na cor azul). Estão indicados em vermelho os dinucleotídeos CGs encontrados. Sublinhados e dispostos na verde estão as seqüências dos primers desenhados para a amplificação das ilhas CpGs sem a presença de dinucleotídeos CGs.

Figura 6 – Seqüência de DNA após tratamento com bissulfito de sódio das Ilhas CpGs presentes nas regiões promotoras dos genes CA3 e FHL1. 52

Para a amplificação da ilha CpG do gene CA3, os DNAs das linhagens celulares O13 e O28 não-tratadas com 5’-aza-dC foram extraídos e tratados com Bissulfito de Sódio. A linhagem O28 foi escolhida aleatoriamente dentre as 4 linhagens celulares tumorais onde este gene apresentou-se expresso.

Após a amplificação da ilha CpG do gene CA3, os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% (Figura 7) e logo após extraídos e purificados utilizando o Kit QIAquick Gel Extraction Kit

Protocol (Quiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

Legenda: Na canaleta + encontra-se a linhagem tumoral O19 (controle positivo) e na canaleta – encontra-se o controle negativo (sem adição de cDNA).

Figura 7 – Gel de agarose 1% mostrando os produtos das amplificações da ilha CpG do gene CA3 derivados das linhagens celulares O13 e O28.

Para a amplificação dos dois fragmentos que compunham a ilha CpG do gene FHL1, os DNAs das linhagens celulares FaDu e O28 não-tratadas com 5’-aza-dC, foram extraídos e tratados com Bissulfito de Sódio. A linhagem O28 foi escolhida aleatoriamente dentre as 4 linhagens celulares tumorais onde este gene apresentou-se expresso. Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% e logo após 53

extraídos e purificados utilizando o Kit QIAquick Gel Extraction Kit Protocol

(Quiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

Após inúmeras tentativas utilizando diferentes temperaturas, diferentes concentrações de magnésio e diferentes quantidades de DNA, não foi possível a amplificação do segundo fragmento do gene FHL1 (FHL1

F2 e R2) que possuía 893 pares de base e situava-se mais próximo ao ATG.

Tentamos desenhar novos pares de primers com a finalidade de reduzir ainda mais o tamanho desse fragmento, porém em virtude do grande número de CGs nessa região não foi possível desenhar primers que não contivessem CGs em suas seqüências. Desta forma o fragmento 1, situado mais distante do ATG e que correspondia a 450 pb, foi o escolhido para prosseguir em nosso estudo.

Os fragmentos obtidos pela amplificação das regiões contendo as ilhas CpGs dos genes CA3 e do gene FHL1 foram introduzidos no plasmídio pCR 4 –TOPO®, os DNAs plasmidiais foram extraídos, sendo logo após realizada uma PCR com os primers M13Dir e Rev com a finalidade de identificar a presença de insertos. Como resultados esperávamos um fragmento de 199pb, caso o plasmídeo estivesse vazio e fragmentos de

692pb para o gene CA3 e 649pb para o gene FHL1 (Figura 8): 54

Legenda: (A) DNAs extraídos das colônias resultantes da clonagem da ilha CpG do gene CA3 derivados das linhagens O13 e O28 (692pb) ; (B) DNAs extraídos das colônias resultantes da clonagem da ilha CpG do gene FHL1 derivados das linhagens FaDu e O28 (649 pb). Na canaleta – foi adicionado o controle negativo (sem adição de cDNA).

Figura 8 – Gel de agarose 1% mostrando a amplificação dos DNAs plasmidiais extraídos das colônias resultantes da clonagem das ilhas CpGs dos genes CA3 e FHL1 .

O passo seguinte foi determinar a seqüência de 10 clones de cada uma das construções. Deste modo, poderíamos comparar o perfil de metilação de cada CG presente na região promotora destes genes (FHL1 e

CA3) entre as linhagens que os expressam e as que não os expressam estes genes.

As análises por seqüenciamento da Ilha CpG situada na região promotora do gene FHL1, permitiu identificar a presença de determinados 55

dinucleotídeos CpGs metilados na linhagem FaDu (não expressa este gene) e ausência de metilação nos mesmos dinucleotídeos, na linhagem O28

(expressão normal de FHL1) (Figura 9).

FaDu

O28

Legenda: Após o tratamento com o bissulfito de sódio as análises por seqüenciamento dos DNAs das linhagens FaDu e O28 para o gene FHL1, demonstraram a presença de dinucleotídeos CpGs metilados na linhagem FaDu. Na linhagem O28 estes mesmos CpGs apresentaram-se desmetilados.

Figura 9– Cromatograma demonstrando presença de dinucleotídeos CpGs metilados na região promotora do gene FHL1.

No entanto, apesar de termos identificado a presença de 22 CpGs metiladas na região promotora do FHL1 na linhagem FaDu, a maioria dos

CpGs avaliados nesta região, não se apresentaram metilados. Esse resultado pôde ser melhor avaliado, verificando o percentual de metilação apresentado pelos 10 clones seqüenciados: 2 clones apresentaram 16,12% de metilação, 2 clones apresentaram 9,6 % de metilação, 2 clones apresentaram 6,45% de metilação, 2 clones apresentaram 3,2% de 56

metilação e os 2 clones restantes apresentaram 0% de metilação (Figura

10).

Por outro lado, apenas 3 CpGs foram encontrados metilados na linhagem O28 que expressa normalmente o FHL1. Estes CpGs metilados estavam distribuídos entre 3 dos 10 clones avaliados da linhagem O28, apresentando cada clone apenas 3,2% de metilação (Figura 10).

O seqüenciamento do DNA de 10 clones da linhagem FaDu após o tratamento desta com 5´-aza-dC durante 7 dias, mostrou a presença de 9

CpGs metilados. A metilação estava distribuída da seguinte maneira: 1 clone apresentou 12,9 % de metilação, 1 clone apresentou 9,6% de metilação, 2 clones apresentaram 3,2% de metilação e 6 clones apresentaram 0% de metilação (Figura 10).

57

A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314151617181920212223242526 2728 293031 Clone 1 Clone 2 Clone 3 Clone 4 Clone 5 Clone 6 Clone 7 Clone 8 Clone 9 Clone 10 B Clone 1 Clone 2 Clone 3 Clone 4 Clone 5 Clone 6 Clone 7 Clone 8 Clone 9 Clone 10 C Clone 1

Clone 2 Clone 3 Clone 4 Clone 5

Clone 6 Clone 7 Clone 8 Clone 9 Clone 10

Legenda: O DNA genômico das linhagens celulares foi extraído, tratado com Bissulfito de Sódio, um fragmento de 450 pb contendo a Ilha de CpG foi clonado e seqüenciado. Cada fileira de círculos representa um clone individual. Os círculos brancos representam os dinucleotídeos CpGs não-metilados e os círculos pretos representam os CpGs metilados. (A) linhagem celular FaDu; (B) linhagem celular O28 e (C) linhagem celular FaDu submetida a tratamento com 5’-aza-dC por 7 dias.

Figura 10- Perfil de metilação da ilha de CpG localizada na região promotora do gene FHL1 (31 CpGs no total). 58

Embora os experimentos com o 5´-aza-dC tenham demonstrado haver um aumento no nível de expressão do FHL1, a maioria dos dinucleotídeos presentes na ilha CpG deste gene estava desmetilada.

Ao contrário do FHL1, o seqüenciamento de 20 clones do gene CA3

(10 da linhagem O13 que não expressa este gene e 10 da linhagem O28 que o expressa) indicou a presença de metilação em grande parte dos 33

CpGs presentes nesta região.

Na linhagem O13, um clone apresentou 91% de metilação, 4 apresentaram 93% de metilação, 3 apresentaram 97% de metilação e 2 clones apresentaram 100% de metilação (Figura 11). Entretanto, o seqüenciamento dos 10 clones derivados da linhagem O28 demonstrou que

1 clone apresentou 75,7% de metilação, 1 clone apresentou 93% de metilação, 4 clones apresentaram 97% de metilação e outros 4 clones apresentaram 100% de metilação (Figura 11).

Como experimentos prévios haviam demonstrado que o tratamento com o agente desmetilante 5´-aza-dC era capaz de induzir a reexpressão do gene CA3 na linhagem O13 logo no terceiro dia de tratamento com esta droga, optamos por clonar e seqüenciar clones da linhagem O13 submetida ao tratamento com o 5´-aza-dC durante 7 dias. O seqüenciamento de 10 clones desta linhagem também mostrou um alto grau de metilação nesta região do DNA, sendo que um 1 clone apresentou 87% de metilação, 2 clones apresentaram 91% de metilação, 1 clone apresentou 93% de metilação, 4 clones apresentaram 97% de metilação e 2 clones apresentaram 100% de metilação (Figura 11): 59

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14 15 16 1718 19 202122232425 26272829 30 313233 A Clone 1 Clone 2 Clone 3 Clone 4 Clone 5 Clone 6 Clone 7 Clone 8 Clone 9

Clone 10 B

Clone 1 Clone 2 Clone 3

Clone 4 Clone 5

Clone 6

Clone 7

Clone 8 Clone 9 Clone 10 C

Clone 1 Clone 2 Clone 3 Clone 4 Clone 5 Clone 6 Clone 7 Clone 8 Clone 9 Clone 10

Legenda: O DNA genômico das linhagens celulares foi extraído, tratado com Bissulfito de Sódio, um fragmento de 431 pb contendo a Ilha de CpG foi clonado e seqüenciado. Cada fileira de círculos representa um clone individual. Os círculos brancos representam os dinucleotídeos CpGs não-metilados e os círculos pretos representam os CpGs metilados. (A) linhagem celular O13; (B) linhagem celular O28 e (C) linhagem celular O13 submetida a tratamento com 5’-aza-dC por 7 dias.

Figura 11 - Perfil de metilação da ilha de CpG localizada na região promotora do gene CA3 (33 CpGs no total).

60

Estes resultados sugerem que a embora os experimentos com o 5´- aza-dC tenham demonstrado haver um aumento no nível de expressão do

CA3 na linhagem O13, o seqüenciamento desta linhagem após o tratamento com o agente desmetilante, não demonstrou redução nos níveis de metilação; e que a regulação da expressão do gene CA3 independe do perfil de metilação da região avaliada, pois todas as linhagens seqüenciadas demonstraram um grande número de CpGs metilados nesta região.

61

5 DISCUSSÃO

A busca pela identificação de genes diferencialmente expressos entre os processos biológicos normais e patológicos tornou-se um importante e atrativo campo na área das pesquisas genéticas (LEERKES et al. 2000;

TOULZA et al. 2007).

Com o desenvolvimento da metodologia de ESTs por ADAMS et al.

(1991) houve um avanço considerável na obtenção de dados relacionados com a regulação e a expressão gênica, na descoberta de novos genes e na construção dos mapas genômicos. Todavia, apesar de tantos benefícios gerados, esta metodologia apresentava algumas limitações, como por exemplo: a inaplicabilidade deste método em casos de quantidade limitada de mRNA e a falta de seqüências derivadas da porção central dos transcritos, que dificultava a análise dos genes humanos (DIAS NETO et al.

1997, 2000).

Esta primeira limitação estaria relacionada com o perfil de expressão gênica. Enquanto nós temos a classe dos genes denominados abundantes, representada por genes capazes de produzir milhares cópias de mRNA por célula, é a classe dos genes raros (capazes de produzir somente um número reduzido de cópias de mRNA), no entanto, que representa a maioria da população gênica (HUANG et al. 1999; CAMARGO et al. 2001). Como o método de ESTs exige uma grande quantidade de mRNA, estes genes raros 62

acabam ficando pouco representados, prejudicando a identificação de novos transcritos (DIAS NETO et al. 1997).

A segunda limitação observada nas ESTs (a falta de informações oriundas da porção central dos transcritos), estaria relacionada à uma dificuldade no seqüenciamento do DNA e um prejuízo em relação ao tipo de informação obtida desta análise. Na técnica de ESTs, eram seqüenciadas apenas as extremidades dos cDNAs, produzindo as chamadas 5’ESTs e

3’ESTs. Diante disso, as porções internas dos genes que continham as informações necessárias para a produção de proteínas, não eram obtidas

(DIAS NETO et al. 2000).

Diante desse quadro, DIAS NETO et al. (2000) desenvolveram

ORESTES: um método alternativo e que envolveu a geração de ESTs por

RT-PCR, utilizando primers arbitrariamente selecionados. As principais vantagens do método ORESTES são: a produção de informações oriundas da porção central codificante dos transcritos; a necessidade de pouca quantidade de material para a geração de dados e a capacidade do método

ORESTES de produzir números desproporcionais de seqüências a partir de genes fracamente expressos. Esta última característica na metodologia

ORESTES conferia a este método, uma função normalizadora, em virtude de sua capacidade inerente de amostrar, com a mesma freqüência, os transcritos raros e os abundantes (CAMARGO et al. 2001). Segundo

STRAUSBERG et al. (2002) esse efeito normalizador, deve-se ao fato deste método permitir uma amostragem mais ampla das diferentes populações de transcritos, com uma menor dependência dos níveis de expressão, 63

possibilitando a descoberta de genes que se encontram expressos em níveis mais baixos nos tecidos.

Em câncer de mama, algumas pesquisas que tiveram por finalidade a identificação de novos marcadores neste tipo de câncer, conseguiram revelar novos genes que se apresentaram hiper/hipoexpressos, utilizando a tecnologia ORESTES (LEERKES et al. 2002; RADVANYI et al. 2005).

LEERKES et al. (2002) utilizando a metodologia ORESTES, combinada com análises do banco de dados de SAGE, conseguiram identificar cerca de 154 genes hiperexpressos em câncer de mama. Estes autores ressaltaram que, como o método ORESTES possui um efeito normalizador, as seqüências geradas somente a partir deste método, não poderiam ser utilizadas para uma avaliação quantitativa do padrão de expressão gênica. Para eles, esta metodologia poderia somente ser utilizada, como um ponto de partida para direcionar subseqüentes análises de avaliação de expressão.

Entretanto, foi publicado um estudo em relação à região da cabeça e pescoço, onde foi realizado o mapeamento detalhado das 213.636

ORESTEs derivadas de tecidos tumorais e não-tumorais, da região da cavidade oral, laringe, faringe e tireóide (REIS et al. 2005). Neste trabalho foram aplicadas análises de bioinformática que identificaram 238 genes diferencialmente expressos, localizados em regiões conhecidas por perdas ou amplificações em tumores de cabeça e pescoço e tireóide. Estas análises das seqüências ORESTES revelaram que os genes ZRF1 e NDRG1 apresentaram-se hiperexpressos, enquanto que o gene RAP140 exibiu uma diminuição em sua expressão, em relação ao componente normal. Esta 64

expressão diferencial foi avaliada em amostras tumorais provenientes de oito pacientes portadores de tumor de cavidade oral e nove com tumor de laringe, utilizando a metodologia de PCR quantitativa em tempo real (Real

Time-PCR), pareadas com amostras de tecido normal adjacente. O gene

RAP140 apresentou-se hipoexpresso em 50% das amostras testadas. Já o gene ZRF1 apresentou expressão aumentada em 75% das amostras de tumor de laringe e em 50% de amostras de tumor de cavidade oral e o gene

NDRG1 apresentou hiperexpressão em 50% das amostras de tumores de cavidade oral. Segundo estes autores, o método ORESTES conseguiu revelar genes diferencialmente expressos na região de cabeça e pescoço e tireóide, constituindo-se uma importante ferramenta para a identificação de novos candidatos a marcadores em câncer de cabeça e pescoço ou tumores de tireóide.

Embora ORESTES tenha sido descrito como um método normalizador, a literatura demonstra que a análise detalhada dos dados das bibliotecas de ORESTES pode ser útil na identificação de genes diferencialmente expressos. Diante disso, nós decidimos adotar este método para selecionarmos genes que estariam hipoexpressos em CE de cabeça e pescoço, com a finalidade de identificarmos possíveis candidatos que pudessem contribuir com a compreensão dos eventos moleculares envolvidos na carcinogênese oral.

Utilizando análises in silico de seqüências ORESTES, nós conseguimos identificar um grupo contendo 75 genes diferencialmente expressos em CE de cabeça e pescoço, sendo que 64 destes genes 65

apresentaram-se hipoexpressos. Os dados de hipoexpressão em ESTs e demais critérios (função, presença de ilhas CpGs na região promotora, etc) também foram utilizados durante estas análises, com a finalidade de obtermos uma melhor seleção de candidatos e de atendermos os objetivos propostos por este trabalho. Como resultado final foi gerada uma lista composta por 14 genes hipoexpressos em CE de cabeça e pescoço.

O CE é o neoplasma maligno mais comum na cavidade oral (KUDO et al. 2004). As análises de expressão gênica em CE de cavidade oral e da região de cabeça e pescoço tornam-se extremamente necessárias para a descoberta de novos marcadores moleculares, pois podem ajudar a definir subgrupos de pacientes com risco aumentado de recidivas e também podem ser úteis na otimização das terapias.

A importância dos experimentos onde avaliamos a expressão de novos candidatos justifica-se pela escassez de informações existentes em relação aos genes envolvidos nos eventos moleculares na carcinogênese oral, desde a sua origem e a sua progressão. Autores afirmam que apenas

50% dos carcinomas epidermóides situados na região anterior da língua, são curados através de cirurgia como tratamento primário e que a identificação daqueles pacientes que possuem risco aumentado para recidivas é o maior problema durante o manejo clínico da doença, o que faz com que haja uma busca maior na compreensão da biologia desta doença (BOVA et al. 1999).

A identificação de marcadores moleculares preditivos de recorrência locorregional e de aumento da sobrevida, talvez possa ajudar a selecionar 66

aqueles pacientes sujeitos a regimes de tratamento mais intensivos (BOVA et al. 1999).

Com a finalidade de identificar novos genes envolvidos com o CE oral e validar os dados de hipoexpressão obtidos nas análises de ORESTES, escolhemos aleatoriamente os 10 primeiros genes da lista e avaliamos a expressão dos mesmos através de RT-PCR, em linhagens tumorais de cabeça e pescoço que se encontravam disponíveis em nosso laboratório.

Durante essa avaliação, observamos que 8 genes apresentaram-se com expressão normal nas cinco linhagens celulares tumorais estudadas e somente 2 genes, o gene CA3 e o gene FHL1, apresentaram-se hipoexpressos em duas diferentes linhagens. Estes mesmos genes, o FHL1 e CA3 também se mostraram hipoexpressos em 75% e 60%, respectivamente, das amostras de tumor de cavidade oral avaliadas. Até o presente momento não foi encontrado na literatura, nenhum relato que demonstre a avaliação da expressão destes dois genes, em amostras de pacientes portadores de CE de cavidade oral

O gene CA3 (Carbonic Anhydrase III) pertence à família das enzimas anidrases carbônicas, que catalisam a reação de dióxido de carbono e água para formar o ácido carbônico (FRASER et al. 1989; CABISCOL e LEVINE

1996). Apesar da função fisiológica deste gene ainda não estar completamente definida, a ação do CA3 como uma proteína fosfatase, aponta para um papel na sinalização celular, principalmente em resposta ao stress oxidativo (CABISCOL e LEVINE 1996). A hipoexpressão desse gene já fora observada em carcinoma hepatocelular humano (KUO et al. 2003). 67

De acordo com estes autores, a relação do CA3 com a resposta ao stress oxidativo sugere um papel deste gene como um provável mediador de apoptose ou morte celular programada.

A proteína produzida pelo FHL1 (Four-and-Half LIM-domain) é altamente expressa em músculo esquelético e cardíaco, com função também não completamente elucidada (MCGRATH et al. 2006). Algumas pesquisas relatam atividade do gene FHL1 como fator de transcrição, podendo estar associado com adesão focal e com junções intercelulares

(BROWN et al. 1999). Este gene tem sido relacionado com a biologia de diversos tumores, como por exemplo, a leucemia aguda de células-T

(GREENE et al. 1998). A sua expressão já foi avaliada em diversas linhagens tumorais através de experimentos de Northern Blot e foi demonstrado que o FHL1 apresentou baixos níveis de expressão em linhagens de melanoma e leucemia (MORGAN e WHAWELL 2000).

Utilizando a técnica de cDNA microarray, com a finalidade de descobrir novos marcadores para o diagnóstico de lesões benignas e malignas de tireóide, foi observado, que o gene FHL1 apresentava significante hipoexpressão em carcinomas, comparado com adenomas (FRYKNAS et al.

2006). Uma outra análise, utilizando imunohistoquímica, revelou que o FHL1 apresentou ausência de expressão em amostras tumorais de astrocitoma, carcinoma de mama, carcinoma renal, hepatocarcinoma, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma prostático e melanoma comparado aos seus tecidos normais correspondentes (SHEN et al. 2006). Os autores deste último trabalho apontam para o papel deste gene como possível supressor tumoral, 68

pelo fato deste apresentar uma capacidade de inibição de aspectos específicos do crescimento celular tumoral, como por exemplo, a independência de ancoragem adquirida pelas células tumorais e a migração celular (SHEN et al. 2006).

Do grupo dos dez genes hipoexpressos avaliados neste trabalho, oito deles apresentaram-se normalmente expressos nas análises por RT-PCR em cinco linhagens tumorais de CE de cabeça e pescoço que dispúnhamos em nosso laboratório. Entretanto, em nenhum momento podemos descartar os resultados de hipoexpressão que estes candidatos apresentaram em

ORESTES. É recomendado que se façam novas avaliações de expressão utilizando outros tipos de linhagens de CE de cabeça e pescoço, antes de afirmarmos que estes genes não se encontram realmente hipoexpressos em câncer de cabeça e pescoço.

A identificação de genes que estejam hipermetilados em câncer é extremamente importante, pois o silenciamento confere um benefício para a sobrevivência destas células, por contribuir para um fenótipo neoplásico e facilitar a progressão tumoral, permitindo o acúmulo de hits genéticos e/ou epigenéticos (BAYLIN e OHM 2006).

Nos últimos anos, houve uma explosão no desenvolvimento de pesquisas que associam a presença de hipermetilação na região promotora de um gene com a carcinogênese. A presença de hipermetilação nas ilhas

CpGs, situadas dentro das regiões 5’ de genes, que exercem funções relacionadas com a supressão tumoral, leva ao silenciamento destes, resultando em um crescimento celular desregulado (ATTWOOD et al. 2002). 69

Alguns autores ressaltam que um amplo e minucioso exame do genoma de tumores que apresentam metilação aberrante pode levar à descoberta de genes novos e importantes (SUGIMURA e USHIJIMA 2000).

Com isso em mente, decidimos verificar se a hipoexpressão apresentada pelos genes CA3 e FHL1, poderia estar sendo causada pela presença de hipermetilação em suas regiões promotoras.

A metilação aberrante pode ser revertida por diversos agentes desmetilantes, entre eles o 5’-aza-dC (BENDER et al. 1998; LO et al. 1999;

OGI et al. 2002; LIU et al. 2005; CARVALHO et al. 2006). O mecanismo de reativação de genes hipoexpressos deve-se à captura da DNMT através da ligação covalente com o 5’-aza-dC, resultando em profunda hipometilação após vários ciclos de replicação do DNA (SANTINI et al. 2001). Dentre os agentes desmetilantes já estudados, demonstrou-se que o 5´-aza-dC foi o agente desmetilante mais efetivo, tanto na inibição da metilação do DNA, quanto na sua habilidade para reativar genes silenciados por metilação, em células com câncer (CHUANG et al. 2005; MOMPARLER 2005). Quando o

5´-aza-dC é incorporado pela célula, ele é fosforilado e convertido à forma trifosfato. Esta forma acaba sendo incorporada ao DNA, no lugar de uma base citosina. A substituição de um nitrogênio no lugar de um carbono (o que diferencia a estrutura química do 5’-aza-dC com a citosina), leva à formação de uma ligação covalente entre as DNMts e a fita de DNA que sofreu a substituição. Essa ligação leva posteriormente à inibição da ação desta enzima e conseqüentemente a impede de induzir a metilação nos dinucleotídeos CpGs (BAYLIN 2005). 70

Para verificar se a diminuição no nível de expressão dos genes CA3 e

FHL1, observada nas linhagens tumorais de cabeça e pescoço O13 e FaDu respectivamente, poderia estar sendo causada por metilação das ilhas CpGs presentes na região promotora destes genes, essas duas linhagens foram submetidas ao tratamento com o 5´-aza-dC. O tratamento com este agente desmetilante foi capaz de induzir a expressão de ambos os genes. Os resultados obtidos neste experimento reforçaram a hipótese de que a metilação poderia ser um dos mecanismos envolvidos com o controle da expressão dos genes CA3 e FHL1.

Diversos estudos que tiveram como objetivo investigar genes com expressão diminuída em CE de cavidade oral descreveram a utilização do agente desmetilante 5´-aza-dC. Um estudo que analisou os mecanismos de inativação do gene CDKN2A em tumores primários e linhagens celulares tumorais de CE de cabeça e pescoço, verificou que após uma análise de RT-

PCR em 11 linhagens celulares de CE oral, quatro destas linhagens apresentavam hipoexpressão do gene CDKN2A. Após o tratamento destas células com 1µM de 5’-aza-dC durante 24 horas, três linhagens tumorais voltaram a reexpressar este gene (KIM et al. 2000). Um outro estudo que avaliava a perda de expressão deste mesmo gene (CDKN2A) em cinco linhagens celulares de CE oral, utilizando este mesmo protocolo (tratamento com 1µM de 5’-aza-dC durante 24 horas), conseguiu verificar durante as análises de RT-PCR, que destas cinco linhagens que foram tratadas com o agente desmetilante, quatro delas conseguiram reexpressar o CDKN2A

(AKANUMA et al. 1999). OGI et al. (2002) avaliaram a ausência de 71

expressão do gene DAPK em linhagens celulares tumorais de CE oral e verificaram que após o tratamento destas linhagens com 1µM de 5´-aza-dC durante 72 horas, este agente desmetilante conseguiu restaurar a expressão deste gene.

Após os resultados de reexpressão dos genes FHL1 e CA3 nas linhagens FaDu e O13 com o 5’-aza-dC, tornou-se imprescindível a verificação de uma possível presença de hipermetilação na região promotora destes genes. O método de seqüenciamento pós-tratamento com Bissulfito de Sódio desde a sua introdução por FROMMER et al. (1992), foi decisivo para a ampliação das pesquisas relacionadas a metilação (ESTELLER 2006;

MUNSON et al. 2007). Este método, em comparação com os métodos de seqüenciamento utilizados anteriormente, possui dentre inúmeras vantagens, a utilização de quantidades menores de DNA (2μg necessários na reação total) e a localização exata da posição de cada 5’-mC no DNA genômico (FROMMER et al. 1991).

O seqüenciamento de uma parte da ilha CpG presente na região promotora do gene FHL1, em nosso estudo demonstrou que apenas um pequeno percentual de dinucleotídeos CpGs presentes nesta região, estava metilado. Estes resultados sugerem que a diminuição no nível de expressão deste gene, observado em linhagens e amostras tumorais, provavelmente não está diretamente relacionado com a presença de hipermetilação nesta região. Esta conclusão está embasada em dados obtidos na literatura, onde resultados de experimentos de seqüenciamento relacionam a presença de metilação em pelo menos 30% a 40% do total de CpGs localizados na região 72

promotora, com a inibição da expressão gênica (DE SMET et al. 1999;

MURAKAMI et al. 2004; STONE et al. 2004; YOUSSEF et al. 2004; MUND et al. 2005).

Já foram descritos em alguns estudos, resultados semelhantes aos nossos, onde genes apresentaram uma reativação da expressão gênica após o tratamento com o 5’-aza-dC, mas que durante as análises de seqüenciamento, não apresentaram dinucleotídeos CpGs metilados em suas regiões promotoras. BULGARELLI (2005) durante uma análise de genes diferencialmente hipoexpressos em astrocitomas, conseguiu identificar dois genes que se encontravam hipoexpressos neste tipo de tumor: o NRGN e o

OLFM1. O tratamento com o agente 5´-aza-dC, de três linhagens celulares tumorais onde estes genes apresentavam-se com expressão reduzida, foi capaz de promover um aumento no nível de expressão dos mesmos. No entanto, mesmo após verificar este aumento de expressão, não foi possível estabelecer uma correlação entre a diminuição no nível de expressão do

NRGN e OLFM1 e a presença de hipermetilação das CpGs situadas em suas regiões promotoras, porque a maioria dos dinucleotídeos situados nesta região, não se encontravam metilados. Para esta autora o tratamento com o 5´-aza-dC, pode ter promovido a desmetilação de promotores que provavelmente estariam controlando as atividades transcricionais dos genes

NRGN e OLFM1, ou pode ter induzido a desmetilação e a acetilação da lisina 9 da histona 3 (H3-K9), provocando um remodelamento da cromatina.

Em uma outra pesquisa, ZHU et al. (2001), procuraram investigar se a presença de hipermetilação na região promotora do CDKN2A e do CDKN2D, 73

seria o evento responsável pelo silenciamento destes genes em linhagens celulares de câncer de pulmão. Eles observaram que o tratamento dessas células com o 5´-aza-dC conseguiu aumentar o nível de expressão estes dois genes. Entretanto, as análises de seqüenciamento realizadas, demonstraram que somente a ilha CpG do gene CDKN2A apresentou a presença de metilação, não sendo encontrada a metilação na ilha CpG do gene CDKN2D. Para estes autores, apesar do mecanismo de indução da expressão do gene CDKN2D (que não possui resíduos metilados em sua região promotora), não ter sido ainda elucidado, a expressão deste gene provavelmente pode estar sendo controlada por fatores de transcrição codificados por outro gene (que se encontrava sob efeito da metilação), ou ainda, que a desmetilação de um enhancer situado fora da região promotora, poderia estar promovendo esse aumento de expressão observado. Numa outra análise SCHMELZ et al. (2005), utilizaram a técnica de cDNA microarray para investigar as alterações globais na expressão gênica em células de leucemia mielóide aguda, após o tratamento com o 5´-aza-dC .

Eles verificaram um aumento na expressão de 81 genes, dentre 22.000 genes analisados, após a exposição ao 5´-aza-dC. A fim de estudar mais detalhadamente o mecanismo de ação do 5´-aza-dC, estes autores escolheram 5 genes aleatoriamente (RPGR, CD14, PTPN22, calgranulina e

MPO) para análise do status de metilação, utilizando a análise de seqüenciamento após o tratamento com bissulfito de sódio. Como resultado somente o gene MPO apresentou a presença de metilação nas CpGs situadas em sua região promotora. Nenhum dos quatro genes restantes 74

(RPGR, CD14, PTPN22, calgranulina) apresentou a presença de CpGs metiladas. Para estes autores o 5´-aza-dC afetou a expressão destes genes independentemente de metilação presente na região promotora dos mesmos. Provavelmente, segundo eles, a indução provocada pelo 5´-aza- dC, talvez tenha sido causada por uma desmetilação, seguida de uma conseqüente ativação de elementos regulatórios situados upstream a estes genes.

O fato do FHL1 ter reexpressado após o tratamento com o 5´-aza-dC nos faz sugerir algumas hipóteses para explicar este aumento de expressão:

(1) Como não seqüenciamos o restante da ilha CpG deste gene, não podemos descartar a possibilidade de haver a presença de metilação na região que não pôde ser avaliada; (2) O tratamento com 5´-aza-dC pode estar promovendo a desmetilação de promotores que controlam ativadores transcricionais do gene FHL1 e, desta forma, induzindo a expressão desta proteína. Se isso for correto, é a presença destes ativadores transcricionais e não a desmetilação direta dos promotores dos genes FHL1, que induz o aumento de expressão deste gene na linhagem celular tratada com a droga desmetilante; (3) Pode ser que o tratamento com 5´-aza-dC tenha causado a desmetilação de enhancers, e com isso, estes elementos regulatórios promoveram um aumento no nível de expressão do gene FHL1; e (4) A quarta hipótese seria de que o tratamento com 5´-aza-dC poderia estar induzindo a desmetilação e a acetilação da H3-K9 e a metilação da lisina 4 da histona 3 (H3-K4), desta forma, promoveria um remodelamento da cromatina, tornando-a menos condensada, permitindo o acesso de 75

ativadores da transcrição ao sítio de ligação presente no promotor do gene

FHL1 e com isso, induzindo um aumento de expressão deste gene.

O tratamento com o 5´-aza-dC, além de inibir a metilação através da formação de uma ligação covalente entre as DNMts e a fita de DNA, pode também produzir outras modificações numa célula, como por exemplo, a ativação de genes silenciados (JONES et al. 1982) e alterações na estrutura da cromatina (HAAF e SCHIMID 1989). De acordo com uma pesquisa, durante o tratamento de linhagens celulares tumorais com o 5´-aza-dC, este análogo da citosina, conseguiu interferir na estrutura cromatínica, reduzindo drasticamente os níveis das MBPs e da metilação de H3-K9 (NGUYEN et al.

2002). Além do mais, estes autores afirmaram que a inibição da metilação de H3-K9 apresentou ser mais poderosa do que a inibição de metilação nas citosinas. Segundo eles, independentemente da ação do 5’-aza-dC na metilação das citosinas presentes no DNA, esta droga é capaz de induzir alterações na estrutura cromatínica.

Ao contrário do gene FHL1 a análise do seqüenciamento, do DNA das linhagens O13 e O28, demonstrou que o gene CA3 apresentou a presença de metilação em quase todos os CpGs presentes em sua região promotora.

Este resultado curiosamente foi observado tanto na linhagem onde este gene apresentou-se normalmente expresso (O28), quanto na linhagem onde ele se apresentou hipoexpresso (O13).

Um estudo recentemente publicado analisou a região promotora do gene CA2 (Carbonic Anhydrase II), pertencente à mesma família das anidrases carbônicas a qual pertence o gene CA3 avaliado em nosso 76

trabalho. Estes autores demonstraram que a presença de hipermetilação, na região promotora do CA2, não necessariamente reprimia sua transcrição.

Eles citam nesta pesquisa, o conceito já mencionado acima de que, promotores ativos apresentam geralmente hiperacetilação e metilação de histonas, ao contrário dos promotores reprimidos, que estão associados com a presença de metilação do DNA e com moléculas co-repressoras.

Entretanto eles demonstraram que este gene, o CA2, foge às regras e consegue apresentar simultaneamente as duas condições: tanto as modificações ativas nas histonas (acetilação de H3-K4 e altos níveis de metilação H3-K4), quanto a presença de CpGs metiladas no DNA genômico e também de moléculas co-repressoras (BRINKMAN et al. 2007).

Além de ter sido observada a presença de metilação de CA3 em ambas as linhagens celulares O13 e O28, o seqüenciamento do DNA da linhagem O13 após tratamento com o 5´-aza-dC, também não apresentou diferenças significativas nos níveis de metilação neste gene. Ao que tudo indica, mesmo o CA3 apresentando um aumento nível de expressão, o nível de CpGs metiladas presentes na região promotora deste gene não foi alterado. Provavelmente outros fatores podem estar envolvidos na regulação do CA3, como por exemplo, a presença de moléculas co-repressoras em sua região promotora como acontece no CA2.

RIETVELD et al. (2002) citam que o silenciamento do gene CA2 está relacionado com a presença de altos níveis de MeCP2 (uma MBP) em sua região promotora. Através de experimentos utilizando imunopreciptação cromatínica (ChIP), estes autores demonstraram que MeCP2 liga-se à 77

região metilada da ilha CpG localizada na região promotora do CA2 e recruta um complexo contendo histona deacetilase (HDAC2). O tratamento com o

5´-aza-dC neste estudo foi capaz de provocar o deslocamento deste complexo MeCP2-HDAC2 induzindo a transcrição do CA2.

WEIH et al. (1991) afirmam que a metilação das CpGs não é o único mecanismo capaz de impedir o acesso de fatores de transcrição aos seus sítios de ligação. De acordo com estes autores, a organização dos nucleossomos nesses sítios, representa um importante papel para a determinação de uma estrutura cromatínica acessível. O silenciamento observado em células neoplásicas e em suas células-filhas, pode estar intimamente relacionado com o aparecimento de uma cromatina transcricionalmente repressiva na região promotora (JONES e BAYLIN 2002;

BAYLIN e OHM 2006).

Portanto, os resultados obtidos em nosso trabalho sugerem que

ORESTES constitui-se uma boa ferramenta para investigar genes diferencialmente expressos em tumores, pois os dados de hipoexpressão dos genes CA3 e FHL1 obtidos in silico, foram confirmados tanto nas linhagens tumorais de cabeça e pescoço, quanto nas amostras tumorais de cavidade oral.

A hipoexpressão dos genes CA3 e FHL1 verificada nas amostras de

CE de cavidade oral, demonstrou tornar-se interessante a realização de estudos adicionais com estes genes, utilizando um maior número de pacientes, a fim de se confirmar os dados obtidos neste trabalho e efetuar uma correlação com os parâmetros clínico-patológicos; objetivando a 78

identificação de novos candidatos a marcadores moleculares envolvidos com a carcinogênese oral.

A metilação encontrada na região promotora do CA3 parece não interferir com a expressão deste gene, o que nos leva a supor que outros mecanismos, que não a presença de metilação na ilha CpG deste gene, possam estar envolvidos na regulação de sua expressão. Como a maioria dos CpGs situados na região promotora do gene FHL1, encontravam-se desmetilados, não podemos afirmar que a metilação é o evento responsável pela regulação da expressão deste gene. 79

6 CONCLUSÕES

• O método de Orestes pode ser usado como uma ferramenta de

seleção de genes diferencialmente expressos;

• Dois genes selecionados (FHL1 e CA3) apresentaram hipoexpressão

em linhagens tumorais de cabeça e pescoço. A expressão deles pôde

ser reativada pelo tratamento com o agente desmetilante 5’-aza-dC;

• Esses mesmos dois genes tiveram sua hipoexpressão validada em

amostras de tumores de cavidade oral;

• Através de experimentos de clonagem e seqüenciamento

conseguimos identificar a presença de metilação na ilha CpG situada

na região promotora no gene CA3 e utilizando esta mesma análise,

verificamos que a maioria dos CpGs presentes na região promotora

do gene FHL1 não se encontravam metilados ;

• Apesar do CA3 e do FHL1 terem demonstrado uma expressão

aumentada com o 5´-aza-dC, os resultados do seqüenciamento

destes genes nos levam a supor que outro(s) mecanismo(s), que não

a presença de metilação em suas regiões promotoras, que foram

avaliadas neste estudo, pode estar envolvido com a regulação da

expressão dos mesmos.

80

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ANEXOS

Anexo 1 - Ficha de Dados Clínicos –Pacientes A.C. Camargo

Critérios de Inclusão Critérios de Exclusão Sem tratamento prévio Tratamento prévio Carcinoma Epidermóide Outros tumores de CP previamente Língua oral , gengiva superior , gengiva inferior, soalho bucal, palato duro, Tumores múltiplos simutâneos região jugal, sulcos bulco-alveolares, área retromolar Outras histologias ou sem AP Qualquer T e qualquer N M1 Cirurgia como tratamento inicial RT ou QT prévias

IDENTIFICAÇÃO E DADOS DEMÓGRAFICOS

1. Número do estudo: ______...... [ ][ ][ ][ ] 2. RGH: ______...... [ ][ ][ ][ ][ ][ ] 3. Idade: ______anos ...... [ ][ ][ ] 4. Sexo: (1) Masculino (2) Feminino ...... [ ] 5. Raça: (1) Branca (2) Amarela (3) Negra (4) Outra ______...... [ ] 6. Residência: (1) Capital (2) Outra cidade de São Paulo (3) Outro estado ...... [ ]

HISTÓRIA CLÍNICA

7. Tempo de história: ______meses (999 se desconhecido) ...... [ ] 8. Queixas: (1) Somente do tumor primário (2) Somente metástase (3) Ambos (9) Desconhecido ... [ ] 9. Biópsia prévia: (0) Não (1) Primário (2) Linfonodo (3) Ambos ...... [ ] 10. História familiar de câncer: (0) Não (1) Pais (2) Irmãos (3) Outro parentes (9) Desconh. [ ][ ][ ] 11. Tabagismo: (0) Não (1) + (2) ++ (3) +++ (4) ++++ (9) Desconhecido ...... [ ] 12. Etilismo: (0) Não (1) + (2) ++ (3) +++ (4) ++++ (9) Desconhecido ...... [ ]

LOCO-REGIONAL

13. Local do tumor: (1) ponta de língua (2) corpo de língua (3) ponta e corpo de língua (4) sulco pelve- lingual (5) soalho (6) gengiva inferior (7) retromolar ...... [ ] 14. Extensão do tumor: (0) Não (1) língua (2) soalho (3) gengiva (4) retromolar (5) lábio (6) jugal (7) palato (8) loja amigd ...... [ ][ ][ ][ ] 15. Linha média: (1) distal >1cm (2) distal <1cm (3) chega (4) ultrapas. <1cm (5) ultrapas. >1cm ...[ ] 16. Tipo de lesão: (1) Úlcero-vegetante (2) Úlcero-infiltrativa (3) Outra ______...... [ ] 17. Diâmetro da aproximado da lesão: ______cm ...... [ ][ ] 18. Níveis de linfonodos ipislat. N+ clinicamente: (0) Não (1) I (2) II (3) III (4) IV (5) V [ ][ ][ ][ ][ ] 19. Diâmetro do maior linfonodo ipislat. +: ______cm (0) se N- ...... [ ][ ] 20. Níveis de linfonodos contralat. N+ clinical.: (0) Não (1) I (2) II (3) III (4) IV (5) V [ ][ ][ ][ ][ ]

21. Diâmetro do maior linfonodo contralat. +: ______cm (0) se N- ...... [ ][ ] 22. Mobilidade dos linfonodos: (1) Móveis (2) diminuição da mobil. (3) fixação superf. (4) fixação prof...... [ ] 23. Estádio T (atualizar UICC 87): (1) T1 (2) T2 (3) T3 (4) T4 (9) Tx ...... [ ] 24. Estádio N (atualizar UICC 87): (0) No (1) N1 (2) N2a (3) N2b (4) N2c (5) N3 (9) Nx ...... [ ]

CIRURGIA

25. Data da cirurgia: ____/_____/______...... [ ][ ][ ] 26. Cirurgia tumor primário: (1) Glossectomia parc. (2) Hemiglossect. (3) Pelveglossect. (4) Pelve(gl.)mand. marg. – Pull (5) Pelve(gl.)mand. sec. – Com. (6) Retrom. (7) Retrom. Ampliada…[ ] 27. Esvaz. cervical ipislat.: (0) Não (1) ESOH (2) ECR (3) ECRM(XI) (4) ECRM (XI+VJ) ...... [ ] 28. Esvaz. cervical contral. (simult.): (0) Não (1) ESOH (2) ECR (3) ECRM(XI) (4) ECRM (XI+VJ) [ ] 29. Esvaz. Cervical: (0) Não (1) Monobloco (2) Dibloco ...... [ ] 30. Ampliação do esvaz. Cervical: (0) Não (1) pele (2) carótida (3) hipoglosso (4) vago (5) Outros ______...... [ ][ ][ ][ ] 31. Reconstrução: (0) Não (1) língua (2) outro retalho local (3) Mc Gregor-frontal (4) Backanjian- deltop. (5) mioc. peitoral maoior (6) mioc. peitoral menor (7) outro miocut. ______(8) microcirúrgico ______...... [ ][ ] 32. Complicações imediatas: (0) Não (1) infecção (2) necrose de retalhos (3) fistula oro-cerv. (4) ruptura da carótida (5) fístula quilosa (6) infecção resp. (7) outra ______....[ ][ ][ ][ ] 33. Data da alta hospitalar: ____/____/____ ...... [ ][ ][ ]

RADIOTERAPIA PÓS-OPERATÓRIA

34. Data de início: ____/____/____ (0/0/0 se não fez) ...... [ ][ ][ ] 35. Aparelho: (0) Não fez (1)Ortov. (2) Cesium (3) Cobalto (4) Al ...... [ ] 36. Dose do campo cervico-facial: ______Gy (0 se não fez) ...... [ ][ ] 37. Dose em fossa ipislat.: ______Gy (0 se não fez) ...... [ ][ ] 38. Dose em fossa contralat.: ______Gy (0 se não fez) ...... [ ][ ] 39. Data do final: ____/____/____ (0/0/0 se não fez) ...... [ ][ ][ ]

ANATOMOPATOLÓGICO DA PEÇA DA CIRURGIA INICIAL

40. Número do AP: ______...... [ ][ ][ ][ ][ ][ ][ ] 41. Histologia do primário: (1) CEC I (2) CEC II (3) CEC III (4) CEC SOE (5) CA indef...... [ ] 42. Embolização vascular: (0) Não (1) linfática (2) sangüínea (3) ambas (4) “presente” (9) Ign...... [ ]

43. Infiltração perineural: (0) Não (1) presente (9) ignorado ...... [ ] 44. Margens: (0) livres (1) próximas (< 0,5 cm) (2) comprometidas (9) ign...... [ ] 45. Espessura: ______mm (999 se não relatado) ...... [ ] 46. Número de linfonodos comprometidos ipislat. : ______(99 se não esvaziado) ....[ ] 47. Número de linfonodos dissecados ipislat. : ______(99 se não esvaziado) ..[ ][ ][ ] 48. Nível de linfonodos comprom. ipislat. : (0) N- (1) I (2) II (3) III (4) IV (5) V (9) ign./não esv...... [ ][ ][ ][ ][ ] 49. Número de linfonodos comp. contral.: ______mm (99 se não esv.) ...... [ ] 50. Número de linfonodos dissecados contralat.: ______mm (999 se não esv.) ....[ ][ ][ ] 51. Nível de linfonodos comprom. contralatet. : (0) N- (1) I (2) II (3) III (4) IV (5) V (9) ign./não esv...... [ ][ ][ ][ ][ ]

EVOLUÇÂO

52. Data da primeira recidiva: ____/____/____ (0/0/0 se não fez) ...... [ ][ ][ ] 53. Locais de recidiva: (0) não teve (1) local (2) pescoço ipisi. (3) pescoço contra. (4) pulmão (5) osso (6) fígado (7) outras distâncias ______(8) recidiva, local ign. (9) ignorado- perdido de vista assintomático < 5 anos ...... [ ][ ][ ][ ][ ] 54. Data de diagnóstico do segundo tumor primário: ____/____/____ (0/0/0 se não fez) ....[ ][ ][ ] 55. Local do segundo tumor primário: CID-0 ______(0 se não teve).... [ ][ ][ ][ ][ ] 56. Data da última informação objetiva de segmento: ____/____/____ ...... [ ][ ][ ] 57. Status: (1) Vivo s/ doença (2) Vivo com doença (3) Morte pós-op (4) MOCA (5) Óbito p/ out/causas ______(6) Perdido de vista (definição: Para pacientes com menos de 5 anos de seguimento todos os que deixaram de retornar por um período igual ao dobro estipulado. Pacientes assintomáticos perdidos após 5 anos devem ser classificados como Vivos 000) ...... [ ]

Para pacientes perdidos de vista: Anotar nome , endereço e telefone. Entregar o prontuário aos responsáveis pela convocação de pacientes desta lista, diariamente.

Coletador de Dados: Fonte: Kowaski (1996)

Anexo 2- Ficha da Dados Clínicos –Faculdade Baiana de Odontologia

Critérios de Inclusão Critérios de Exclusão Sem tratamento prévio Tratamento prévio Carcinoma epidermóide Outros tumores de CP previamente Língua oral, gengiva superior e inferior, soalho bucal, palato duro, região Tumores múltiplos simutâneos jugal, sulcos bulco-alveolares,área retromolar Outras histologias ou sem AP Qualquer T e qualquer N M1 Cirurgia como tratamento inicial RT ou QT prévias

IDENTIFICAÇÃO E DADOS DEMÓGRAFICOS

7. Número do estudo: ______...... [ ][ ][ ][ ] 8. Nome do paciente: ______9. Idade: ______anos ...... [ ][ ][ ] 10. Sexo: (1) Masculino (2) Feminino ...... [ ] 11. Raça: (1) Branca (2) Amarela (3) Negra (4) Outra ______...... [ ]

HISTÓRIA CLÍNICA

6. História familiar de câncer: (0) Não (1) Pais (2) Irmãos (3) Outro parentes (9) Desconh. [ ][ ][ ] 7. Tabagismo: (0) Não (1) Sim (9) Desconhecido ...... [ ] 8. Etilismo: (0) Não (1) Sim (9) Desconhecido ...... [ ]

LOCO-REGIONAL

9. Local do tumor: (1) ponta de língua (2) corpo de língua (3) ponta e corpo de língua (4) sulco pelve-lingual (5) soalho (6) gengiva inferior (7) retromolar (8) fundo de sulco (9) vestíbulo ...... [ ]

CIRURGIA

16. Data da cirurgia: ____/_____/______...... [ ][ ][ ] 17. Tipo de cirurgia: ______

Para pacientes perdidos de vista: Anotar nome , endereço e telefone. Entregar o prontuário aos responsáveis pela convocação de pacientes desta lista diariamente.

Coletador de Dados: Fonte: Adaptado de Kowaski (1996)

Anexo 3 - Termo De Consentimento Pós-Informado (Obrigatório para Pesquisa Clínica em Seres Humanos – Resolução 196/96 e Resolução CNS 251/97)

I – Identificação do paciente Nome do paciente: ______Identidade nº.: ______Sexo: __ Nascimento: __/__/__ Tel (__) ______Endereço: ______Cidade: ______Estado: ___

II – Esclarecimentos

1. Justificativa e objetivos: A evolução dos tumores da região da cabeça e do pescoço é muito variável dependendo do local de origem e de diversos outros fatores. Muitos desses fatores são utilizados para decidir o tratamento a ser empregado. No entanto, muito ainda precisa ser pesquisado para se conhecer a capacidade de crescimento desses tumores e possivelmente empregar, no futuro, este conhecimento para mudar o tratamento que pode acarretar mudanças na qualidade de vida do paciente. O objetivo deste estudo é conhecer e avaliar alterações em alguns genes envolvidos com esses tipos de tumores e correlacionar esses dados com as informações da sobrevida do paciente após tratamento convencional. 2. O que é necessário para participar do estudo? Coletar amostras de tecido normal durante o ato cirúrgico 3. Existe algum risco esperado? Não há qualquer risco esperado no estudo.

4. Quais os benefícios que poderão ser obtidos pelo estudo? O estudo possibilitará a determinação dos genes que se apresentam mais freqüentemente alterados nos cânceres de vias aerodigestivas superiores. Estes dados poderão permitir o seguimento clínico adequado de pacientes futuros de acordo com os dados obtidos na análise dos genes, seguida de correlação com os dados clínicos.

5. Fui esclarecido sobre a garantia de receber resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento, a cerca dos procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos relacionados com a pesquisa e o tratamento do indivíduo. ( ) SIM ( ) NÃO

6. Fui esclarecido sobre a liberdade de retirar meu consentimento a qualquer momento sem que isso traga prejuízo quanto a continuidade do meu tratamento. ( ) SIM ( )NÃO

7. Fui esclarecido de que não haverá remuneração financeira além do previsto para as despesas do estudo. ( ) SIM ( ) NÃO

8. Fui esclarecido que não haverá indenização além das previstas por lei, em reparação a danos imediatos ou tardios, causados pela pesquisa em questão. ( ) SIM ( ) NÃO

9. Fui esclarecido sobre a segurança de que minha identidade será preservada, mantendo- se todas as informações em caráter confidencial. ( ) SIM ( ) NÃO

CONSENTIMENTO PÓS-INFORMADO

Declaro que, após ter sido convenientemente esclarecido dos riscos e benefícios deste estudo, conforme definido nos itens 1 a 9, do inciso III, consinto em participar, na qualidade de paciente, do Projeto de Pesquisa referido no inciso II. Estou ciente também de que qualquer dúvida sobre o Projeto de Pesquisa em questão, serão resolvidas com os pesquisadores principais pessoalmente ou pelo tel. (11) 3272-5000 (ramal 5125).

São Paulo, _____ de ______de 20___.

Assinatura: ______Assinatura: ______Nome paciente: ______Nome pesquisador: ______

Anexo 4 – Lista dos 64 genes hipoexpressos em ORESTES

Gene ID Símbolo Nome NM_001100 ACTA1 Actin, alpha 1, skeletal muscle NM_001155 ANXA6 Annexin A6 NM_198098 AQP1 Aquaporin 1 (Colton blood group) NM_001660 ARF4 ADP-ribosylation factor 4 NM_016607 ARMCX3 Armadillo repeat containing, X-linked 3 Activating transcription factor 4 (tax-responsive enhancer NM_182810 ATF4 element B67) NM_173201 ATP2A1 ATPase, Ca++ transporting, cardiac muscle, fast twitch 1 NM_178540 C1QTNF9 C1q and tumor necrosis factor related protein 9 NM_033197 C20orf114 Chromosome 20 open reading frame 114 NM_001010905 C6orf58 Chromosome 6 open reading frame 58 NM_032307 C9orf64 Chromosome 9 open reading frame 64 NM_005181 CA3 Carbonic anhydrase III NM_006835 CCNI Cyclin I NM_001001547 CD36 CD36 molecule (thrombospondin receptor NM_021914 CFL2 Cofilin 2 NM_001824 CKM Creatine kinase, muscle NM_018941 CLN8 Ceroid-lipofuscinosis, neuronal 8 NM_133507 DCN Decorin (DCN), NM_004396 DDX5 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 5 NM_004417 DUSP1 Dual specificity phosphatase 1 NM_012179 FBXO7 F-box protein 7 NM_001449 FHL1 Four and a half LIM domains 1 NM_007085 FSTL1 Follistatin-like 1 NM_002046 GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha NM_006496 GNAI3 inhibiting activity polypeptide 3 NM_002084 GPX3 Glutathione peroxidase 3 NM_002128 HMGB1 High-mobility group box 1 NM_006353 HMGN4 High mobility group nucleosomal binding domain 4 NM_002227 JAK1 Janus kinase 1 NM_014686 KIAA0355 KIAA0355 XM_113947 KIAA0565 KIAA0565 gene product NM_005356 LCK Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase NM_007078.2 LDB3 LIM domain binding 3

XM_498824 LOC149157 Hypothetical protein LOC149157 XM_496332 LOC440552 Similar to OK/SW-CL.16 Similar to NADH2 dehydrogenase (ubiquinone) (EC XM_497531 LOC441786 1.6.5.3) chain 1 - western lowland gorilla mitochondrion NM_002465 MYBPC1 Myosin binding protein C NM_005963 MYH1 Myosin, heavy polypeptide 1 NM_017534 MYH2 Myosin, heavy chain 2 NM_000257 MYH7 Myosin, heavy polypeptide 7 NM_079420 MYL1 Myosin, light polypeptide 1 NM_000432 MYL2 Myosin, light polypeptide 2 NM_032578 MYPN Myopalladin NM_004543 NEB Nebulin NM_003204 NFE2L1 Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 1 NM_006175 NRAP Nebulin-related anchoring protein Procollagen-proline, 2-oxoglutarate 4-dioxygenase NM_000917 P4HA1 (proline 4-hydroxylase), alpha polypeptide I NM_138316 PANK1 Pantothenate kinase 1 NM_022817 PER2 Period homolog 2 NM_145753 PHLDB2 Pleckstrin homology-like domain, family B, member 2 NM_021033 RAP2A RAP2A, member of RAS oncogene family NM_018993 RIN2 Ras and Rab interactor 2 NM_000540 RYR1 Ryanodine receptor 1 NM_005620 S100A11 S100 calcium binding protein A11 NM_016103 SAR1B SAR1 gene homolog B (S. cerevisiae) Solute carrier family 25 (mitochondrial carrier;adenine NM_001636 SLC25A6 nucleotide translocator), member 6 NM_006282 STK4 Serine/threonine kinase 4 NM_003254 TIMP1 TIMP metallopeptidase inhibitor 1 NM_003262 TLOC1 Translocation protein 1 NM_003282 TNNI2 Troponin I type 2 NM_152263 TPM3 Ttropomyosin 3 (TPM3) NM_133378 TTN Titin (TTN), NM_021009 UBC Ubiquitin C NM_025160 WDR26 WD repeat domain 26