UNIVERSITE DE REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE U.F.R. DE MEDECINE ECOLE DOCTORALE SCIENCES, TECHNOLOGIES, SANTE (547)

THÈSE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE Discipline : Biochimie

Présentée et soutenue publiquement Par Anne-Pascaline BOULEAU-MARTIN

Le 23 septembre 2014

Identification et caractérisation de métalloprotéases de Toxoplasma gondii

Matrice Extracellulaire et Dynamique Cellulaire (MEDyC) CNRS UMR 7369 Protozooses, transmises par l’alimentation : circulation et pathogénie EA 3800 SFR CAP-Santé : FED 4231

Membres du Jury

Monsieur le Professeur Hervé PELLOUX (Grenoble) : Rapporteur/Président Monsieur le Professeur Ermanno CANDOLFI (Strasbourg) : Rapporteur Madame le Professeur Isabelle VILLENA (Reims) : CoDirecteur de thèse Monsieur le Docteur Georges BELLON (Reims) : CoDirecteur de thèse Monsieur le Docteur William HORNEBECK (Reims) : Invité Madame le Docteur Erika BOURGUET (Reims) : Invité

N° attribué par la bibliothèque | | | R | E | I | | | | | |© Remerciements

Le travail réalisé dans cette thèse a été effectué au sein des laboratoires de Parasitologie-Mycologie et de Biochimie-Biologie Moléculaire. Je tiens à adresser ma profonde reconnaissance à Madame le Professeur Isabelle Villena et Monsieur le Professeur François-Xavier Maquart pour m’avoir accueillie au sein de leurs équipes respectives et pour leurs précieux conseils et leurs soutiens.

Je tiens à remercier Monsieur le Docteur Georges Bellon qui a dirigé ce travail de recherche. Je vous remercie pour vos nombreux conseils et pour votre soutien lors de la rédaction de ce manuscrit.

Je remercie Monsieur le Professeur Hervé Pelloux et Monsieur le Professeur Ermanno Candolfi d’avoir accepté d’être rapporteurs de ma thèse et de juger ce travail.

Je tiens à remercier chaleureusement Monsieur le Docteur William Hornebeck pour avoir accepté de participer à ce jury. Merci infiniment pour vos conseils et remarques si précieuses.

Je tiens à remercier Mademoiselle le Docteur Erika Bourguet pour avoir accepté d’examiner ce travail. Merci pour ta disponibilité et ton aide. (Bisous à Salomé !)

Je tiens à remercier chaleureusement Monsieur le Docteur Dominique Aubert pour ces nombreuses idées et son aide précieuse pour la bibliographie. Merci pour tous les conseils que vous m’avez donné pendant nos réunions de recherche.

Je tiens particulièrement à remercier Madame le Docteur Sandie Escotte-Binet pour son soutien indispensable tout au long de ce travail. Je me souviendrais de tous les moments passés devant nos chromatographies à réfléchir à la stratégie à employer et à sa mise en place, pas toujours facile ! Merci pour ton aide, tes conseils. Bonne continuation à toi (et ta Camille !).

Je remercie ensuite Mademoiselle le Docteur Christelle Doliwa. Tu m’as soutenu dans les durs moments, tu as toujours été là quand j’en avais besoin. Merci pour tes conseils et ton soutien indéfectible. Je te souhaite tout le bonheur que tu mérites. Je remercie l’ensemble du personnel hospitalier du service de parasitologie du CHU et tout particulièrement Régine pour tes supers idées, Sandrine, Francine, Naïma, Emilie notre spécialiste « biomol’ », Laurence et Laurence ! Merci pour votre disponibilité si précieuse.

Je tiens à remercier les personnes qui m’ont aidé grâce à leurs conseils techniques toujours très pertinents. Le Docteur Christine Terryn et le Docteur Frédéric Velard pour la réalisation de magnifiques observations de notre parasite ! Coco pour ta grande disponibilité, tu as toujours trouvé le produit dont j’avais besoin.

Je remercie également les personnes de notre équipe que j’ai côtoyée pendant ma thèse : Marie-Lazarine Poulle, Loïc Favennec ainsi que Cécile, Marie-Amélie. Nos rencontres ont toujours été très agréables et chaleureuses.

Je remercie aussi le Docteur Roselyne Garnotel pour ses conseils et son aide.

Je remercie chaleureusement Hélène, Aurore et Floriane pour nos pauses café et nos déjeuners qui m’ont permis de résoudre certains problèmes techniques et de nous changer les idées pendant ces quelques minutes.

Je remercie tous les stagiaires que j’ai côtoyé durant ces quatre années : Marion et Léa qui m’ont aidée pour mes travaux, Annabelle, Alexandre, Younès (j’ai adoré discuter de ton sujet de stage si différent de mes travaux) et Jérémy (bonne chance pour la suite, sur le bouleau d’Afrique j’espère! Merci beaucoup pour ton aide lors de ma fin de thèse).

Je remercie également toutes les personnes qui ont fait de ma thèse, un moment très agréable : Julien, Joan, Jing, Jenifer, André ainsi que toutes les personnes du 3 ème étage et Christine tout spécialement pour tes conseils, Sylvie, Aymeic, Valérie, Halima, Sophie, Medhi, Chantal, Saad et Jérôme et également Nathalie, Aurélie, Claire, Yves J. et Stéphanie.

Je remercie également Yves G. pour sa grande disponibilité et sa gentillesse.

Pour terminer, je remercie tout spécialement mon « cocoon familial » pour leur soutien et leur disponibilité tout au long de ces quatre années. Merci à mon mari Antony et ma fille Axelle pour tout le bonheur que vous m’apportez chaque jour. Merci à mes parents, à ma sœur Anne-Valérie, mon « grand frère » Cyril et mon neveu Jules pour votre soutien sans faille. Vous avez fait de ces quatre années, un grand bonheur tant au niveau professionnel que personnel. Vous avez tout mon amour ! A Antony et Axelle , AA mes parents, A Nanou, Cyril et Jules

Résumé

Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire intracellulaire obligatoire appartenant à la famille des Apicomplexa . Chez les protozoaires, les protéases possèdent des rôles clés au niveau du cycle parasitaire, et sont ainsi considérées comme des facteurs de virulence. Chez T. gondii , les métallopeptidases pourraient être impliquées dans la traversée des différentes barrières biologiques. A l’heure actuelle, seules cinq métallopeptidases de T. gondii ont été décrites : une aminopeptidase N, deux toxolysines, une leucine aminopeptidase et une FtsH1 peptidase. Lors de l’étude de l’influence de l’invasion de monocytes humains par T. gondii sur le profil d’expression des métalloprotéases matricielles monocytaires, nous avons mis en évidence une protéase parasitaire présentant à la fois des propriétés gélatino- et élastinolytique. Le but de ce travail est de caractériser, purifier et identifier cette gélatinase de T. gondii . Dans un premier temps, nous avons caractérisé la gélatinase d’environ 100 kDa sécrétée par T. gondii comme étant une MMP-9 like (métallo-endopeptidase à zinc) mais ne possédant pas le même processus d’activation que les MMPs humaines. Dans un deuxième temps, après purification partielle par une série de chromatographie chélatrice de zinc, nous avons identifié par spectrométrie de masse la gélatinase comme étant la TGME49_227948 annotée dans ToxoDB. Cette protéase présente les domaines protéiques d’une métalloprotéase à zinc de la sous-famille M16C, et est proche au niveau de sa structure 3D de la chaîne A de la 2FGE présente chez Arabidopsis Thaliana . Afin de confirmer l’annotation de ToxoDB, nous avons séquencé l’extrémité 5’ de l’ARNm de cette protéase. Cependant, nos résultats expérimentaux ne sont pas en concordance avec l’annotation prédite dans la base de données ToxoDB. La séquence en acides aminés de cette protéase, nous a permis de synthétiser deux anticorps polyclonaux spécifiques afin de mettre en évidence deux formes de 140 kDa et 100 kDa et donc d’émettre l’hypothèse que cette protéase pourrait être clivée afin d’être activée. De plus, cette métalloprotéase a été détectée par western blot dans le cytosol des parasites mais elle est aussi secrétée dans le milieu conditionné. Par immunolocalisation, la protéase est présente au sein du parasite, au niveau du cytosol sans localisation préférentielle dans un organite particulier. Dans ce travail, nous avons montré que la gélatinase parasitaire sécrétée par T. gondii pourrait dégrader des composés de la matrice extracellulaire, d’où son rôle potentiel dans le mécanisme de traversée des barrières biologiques.

Abstract

Toxoplasma gondii is an intracellular protozoan parasite which belongs to the Apicomplexa phylum. In protozoans, proteases have key roles in the parasitic cycle. They thereby are considered as virulence factors. In T. gondii , metallopeptidases may be involved in the crossing of biological barriers. Currently, only five metallopeptidases from T. gondii are described: an aminopeptidase N, two toxolysins, one leucine aminopeptidase and one FtsH1 peptidase. During the study of the influence of human monocytes invasion by T. gondii on the monocytic matrix metalloproteases expression profile, we brought out a parasitic protease showing gelatino- and elastinolytic properties. The aim of this study is to characterize, purify and identify this gelatinase from T. gondii . First we characterized the 100 kDa-gelatinase secreted by T. gondii as an MMP-9-like (zinc metalloendopeptidase) but its activation process is different from human MMPs. Then, after the partial purification by a series of zinc-chelate chromatographies, we identified by mass spectrometry the gelatinase as the TGME49_227948 annotated in ToxoDB. This protease has M16C subfamily zinc-metalloprotease protein domains and is close to the 3D structure of the A chain of the 2FGE in Arabidopsis thaliana . In order to confirm the ToxoDB annotation, we sequenced the 5’ end of the mRNA of this protease. Nevertheless our experimental results are not in the line with the predicted annotation in ToxoDB database. The amino acids sequence of this protease allowed us to synthesize two specific polyclonal antibodies in order to highlight two forms, 140 kDa and 100 kDa, and to emit the hypothesis that this protease could be cleaved to be activated. Moreover this metalloprotease was detected by Western Blot in the cytosol of the parasites but it can also be secreted in the conditioned medium. By immulocalization, the protease is present in the cytosol of the parasite without any preferential localization in a particular organelle. In this study, we showed that the parasitic gelatinase secreted by T. gondii could degrade extracellular matrix compounds, which could explain its potential role in the mechanism involved in the crossing of biological barriers.

Sommaire

Liste des figures Liste des tableaux Liste des abréviations Liste des publications et des communications

INTRODUCTION ...... 1

Contexte scientifique ...... 2

Toxoplasma gondii ...... 3 I/ Découverte du parasite Toxoplasma gondii ...... 3 II/ Les stades parasitaires de Toxoplasma gondii ...... 4 II-1/ Le tachyzoïte ...... 4 II-2/ Le bradyzoïte ...... 6 II-3/ Le sporozoïte ...... 7 III/ Le cycle parasitaire de Toxoplasma gondii ...... 7 IV/ Organisation moléculaire de Toxoplasma gondii ...... 9 IV-1/ Les protéines de surface (SAG)...... 9 IV-2/ Les protéines des organelles sécrétoires ...... 9 IV-2-1/ Les protéines des micromènes (MIC) ...... 10

IV-2-2/ Les protéines des rhoptries (ROP) ...... 10

IV-2-3/ Les protéines des granules denses (GRA) ...... 11

V/ Le processus d’invasion de la cellule-hôte par T. gondii ...... 11 VI/ Les barrières biologiques traversées par T. gondii ...... 15 VI-1/ Description des barrières biologiques traversées par T. gondii ...... 15 VI-2/ Rôle des protéases sécrétées par T. gondii dans le mécanisme d’invasion ...... 17

Les protéases ...... 21 I/ Généralités sur les protéases ...... 21 I-1/ Classification des protéases ...... 21 I-2/ Les différentes familles de protéases selon MEROPS ...... 23 I-2-1/ Les protéases à acide aspartique...... 23

I-2-2/ Les protéases à cystéine ...... 23

I-2-3/ Les protéases à acide glutamique ...... 25

I-2-4/ Les métalloprotéases ...... 25

I-2-5/ Les protéases à asparagine ...... 27

I-2-6/ Les protéases à site catalytique mixés ...... 27

I-2-7/ Les protéases à sérine ...... 27

I-2-8/ Les protéases à thréonine ...... 28

II/ Les métalloprotéases présentes chez T. gondii ...... 29 II-1/ Métalloprotéases : étude in silico chez T. gondii ...... 29 II-2/ Rôles des métalloprotéases de T. gondii ...... 42

But de l’étude ...... 44

MATERIELS ET METHODES ...... 45

Culture cellulaire ...... 46 I/ La lignée cellulaire Vero ...... 46 I-1/ Description de la lignée cellulaire ...... 46 I-2/ Entretien de la lignée cellulaire ...... 46 II/ La souche virulente RH de T. gondii ...... 47 II-1/ Description de la souche RH ...... 47 II-2/ Entretien de la souche RH...... 47 II-2-1/ Multiplication des tachyzoïtes in vitro ...... 47

II-2-2/ Multiplication des tachyzoïtes in vivo ...... 48

III/ Coloration des cellules infestées ...... 48 Synthèse d’anticorps polyclonaux dirigés contre la TGME49_227948 ...... 49 I/ Synthèse d’anticorps polyclonaux ...... 49 I-1/ Recherche de la séquence antigénique ...... 49 I-2/ Recherche et production des protéines KLH...... 50 I-3/ Tests et validation des sérums pré-immuns pour l’immunisation ...... 50 I-4/ Production des anticorps ...... 51 I-5/ Analyses des anticorps ...... 52 II/ Immunomarquage des tachyzoïtes ...... 53 II-1/ Principe ...... 53 II-2/ Mode opératoire ...... 53 III/ Test d’invasion en présence d’anticorps analysé par vidéomicroscopie ...... 54

Méthodes biochimiques ...... 56 I/ Préparation des échantillons ...... 56 I-1/ Milieux conditionnés ...... 56 I-2/ Extraction des protéines ...... 57 I-3/ Dosage protéique ...... 58 II/ Méthodes chromatographiques ...... 59 II-1/ Chromatographie de gel filtration ...... 59 II-2/ Chromatographie d’affinité sur gélatine-agarose...... 62 II-3/ Chromatographie chélatrice de zinc...... 64 III/ SDS-PAGE ...... 65 IV/ Zymographie ...... 66 IV-1/ Principe ...... 66 IV-2/ Mode opératoire ...... 66 IV-2-1/ Etude de l’activité gélatinolytique en présence d’inhibiteurs ...... 67

IV-2-2/ Etude de l’activité gélatinolytique en présence d’APMA ...... 69

IV-2-3/ Influence de la température et du pH sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase parasitaire ...... 70

IV-2-4/ Influence des anticorps sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase parasitaire ...... 71

V/ Spectrofluorimétrie ...... 71 V-1/ Principe ...... 71 V-2/ Mode opératoire ...... 72 VI/ Western-blotting ...... 74 VI-1/ Principe ...... 74 VI-2/ Mode opératoire ...... 74 VII/ Electrophorèse en deux dimensions ...... 75 VII-1/ Principe ...... 75 VII-2/ Mode opératoire ...... 76 VII-2-1/ Préparation de l’échantillon ...... 76

VII-2-2/ 1 ère dimension : Isoélectrofocalisation ...... 76

VII-2-3/ 2 ème dimension : SDS-PAGE ou zymographie ...... 77

Méthodes de biologie moléculaire ...... 78 I/ Extraction des ARNs totaux ...... 78 II/ Technique 5’RACE ...... 78 II-1/ Principe ...... 79 II-2/ Mode opératoire ...... 80

Etude in silico de la structure de la protéase parasitaire par bioinformatique ...... 82 I/ Alignement de séquences ...... 82 II/ Recherches de modifications post-traductionnelles ...... 82 III/ Détermination de la structure 3D putative d’une protéine ...... 83 IV/ Détermination des peptides antigéniques potentiels de la TGME49_227948 ...... 83

Statistiques ...... 84

RESULTATS ...... 85

Partie I. Mise en évidence et caractérisation d’une protéase à activité gélatinolytique sécrétée par Toxoplasma gondii ...... 86 I/ Mise en évidence de la gélatinase sécrétée par T. gondii ...... 86 I-1/ Comparaison de l’activité gélatinolytique provenant de tachyzoïtes obtenus in vivo et in vitro ...... 86 I-2/ Etude de l’activité élastinolytique de la protéase sécrétée par T. gondii ...... 88 I-3/ Détermination expérimentale de la masse moléculaire de la gélatinase sécrétée par T. gondii ...... 89 I-3-1/ Détermination de la masse moléculaire de la gélatinase par chromatographie de gel filtration ...... 89

I-3-2/ Détermination de la masse moléculaire de la gélatinase par zymographie ...... 90

I-4/ Cinétique de sécrétion de la gélatinase étudiée ...... 91 II/ Caractérisation physico-chimique de la gélatinase étudiée ...... 93 II-1/ Influence de la température sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase sécrétée ...... 93

II-2/ Influence du pH sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase sécrétée ...... 94

II-3/ Détermination du point isoélectrique de la gélatinase sécrétée...... 95

III/ Caractérisation biochimique de la gélatinase étudiée ...... 97 III-1/ Étude des effets de l’APMA sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase sécrétée ...... 97 III-2/ Étude des effets de différents inhibiteurs sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase sécrétée ...... 100 III-2-1/ Inhibiteurs généraux de protéases ...... 100

III-2-2/ Inhibiteurs spécifiques des MMPs ...... 101

Partie II. Purification et identification de la métalloprotéase à zinc ...... 107 I/ Purification de la GP100 par différentes techniques chromatographiques ...... 107 I-1/ Chromatographie de gel filtration ...... 107 I-2/ Chromatographie d’affinité sur gélatine-agarose ...... 109 I-3/ Chromatographie chélatrice de zinc ...... 112 I-4/ Association des trois techniques chromatographiques ...... 114 II/ Identification de la TGME49_227948 par spectrométrie de masse ...... 116 II-1/ Purification partielle par chromatographie chélatrice de zinc ...... 116 II-2/ Etude de la zinc métalloprotéase 2, putative ...... 118 II-3/ Détermination expérimentale de l’extrémité N-terminale de la TGME49_227948 par technique 5’RACE ...... 126 II-4/ Identification in silico des protéases appartenant à la famille M16 ...... 130 III/ Caractérisation de la TGME49_227948 ...... 134 III-1/ Production d’anticorps dirigés contre la TGME49_227948 ...... 134 III-1-1/ Etude bioinformatique de la TGME49_227948 ...... 134

III-1-2/ Identification de la structure 3D de la TGME49_227948 ...... 136

III-1-3/ Production des anticorps ...... 138

III-2/ Etude de la localisation de la TGME49_227948 ...... 147 III-3/ Effets sur l’invasion de T. gondii ...... 149 IV/ Caractérisation de la GP100 ...... 152 IV-1/ Etude des effets des anticorps sur l’activité gélatinolytique de la GP100...... 152

DISCUSSION ...... 154

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ...... 171

BIBLIOGRAPHIE ...... 174

Liste des figures

Figure 1 : Structure d’un tachyzoïte, forme proliférative de T. gondii , observée au microscope (Dubey et al. , 1998) ...... 4

Figure 2 : Mécanisme d’endodyogénie (Nishi et al. , 2008) ...... 5

Figure 3 : Structure d’un bradyzoïte (Dubey et al. , 1998) ...... 6

Figure 4 : Représentation schématique de la structure d’un sporozoïte (Dubey et al. , 1998) ... 7

Figure 5 : Cycle parasitaire de T. gondii (Hunter and Sibley, 2012) ...... 8

Figure 6 : Schématisation de la jonction mobile avec les différentes protéines impliquées (Tonkin et al. , 2011) ...... 13

Figure 7 : Schématisation du processus d’invasion de T. gondii dans une cellule-hôte (Hunter and Sibley, 2012) ...... 14

Figure 8 : Schéma de la migration de T. gondii au travers des barrières biologiques (Barragan and Sibley, 2003) ...... 16

Figure 9 : Représentation schématique des trois hypothèses de traversée de barrières biologiques par T. gondii (Lambert and Barragan, 2010) ...... 17

Figure 10 : Protéases impliquées dans le processus d’invasion de la cellule-hôte par T. gondii (Santos and Soldati-Favre, 2011) ...... 18

Figure 11 : Illustration simplifiée du système endosomal de T. gondii situé au pôle apical (Dou and Carruthers, 2011) ...... 24

Figure 12 : Classification des métalloprotéases à zinc (d’après Hooper, 1994) ...... 26

Figure 13 : Représentation schématique de la structure d’une protéine de type rhomboïde-like située en intramembranaire (M Santos et al. , 2012) ...... 28

Figure 14 : Alignements multiples de séquences en acides aminés de l’aminopeptidase N (famille M1) de T. gondii (TGME49_024460, TGME49_024350 et TGME49_021310) et de l’aminopeptidase N humaine (Genbank™ accession no. P15144) ...... 30

Figure 15 : Représentation schématique des domaines présents au niveau des protéases des familles M16A, B et C (d'après Ohtsuka et al. , 2009) ...... 34

Figure 16 : Représentation schématique de la structure 3D de la Presequence PreP chez Arabidopsis thaliana (A) et son mécanisme d’action (B) (Johnson et al. , 2006) ...... 36 Figure 17 : Schématisation des différentes isoformes potentielles de la falcilysine synthétisée chez Plasmodium falciparum en fonction de ces différents adressages (Ralph, 2007) ...... 37

Figure 18 : Adressage multiple de la falcilysine au sein du parasite Plasmodium falciparum adressages (Ralph, 2007) ...... 38

Figure 19 : Schéma explicatif des différentes étapes réalisées pour l’obtention des protéines sécrétées par les tachyzoïtes (milieu conditionné) et les protéines cytosoliques (cytosol) ...... 56

Figure 20 : Schéma illustrant le protocole utilisé pour l’extraction et la séparation des protéines membranaires et cytosoliques ...... 58

Figure 21 : Principe de la chromatographie de gel filtration (Voet and Voet, 2005) ...... 60

Figure 22 : Schéma du montage réalisé pour le fonctionnement de la chromatographie de gel filtration ...... 61

Figure 23 : Principe de la chromatographie d’affinité (Voet and Voet, 2005) ...... 63

Figure 24 : Formule chimique du composé EBGA utilisé pour la synthèse des inhibiteurs .... 68

Figure 25 : Schéma explicatif du mécanisme d’activation des MMPs par l’APMA (d’après Grzela et al. , 2011) ...... 69

Figure 26 : Représentation schématique du clivage de la DQ-gélatine ...... 72

Figure 27 : Représentation schématique de l’électrophorèse en 2 dimensions (Harder et al. , 1999) ...... 76

Figure 28 : Technique 5’RACE (d’après le protocole du fabricant) ...... 79

Figure 29 : Mise en évidence de la gélatinase parasitaire de masse moléculaire supérieure à 92 kDa par zymographie en gel de gélatine ...... 87

Figure 30 : Etude de la gélatinase sécrétée par T. gondii dans les fractions membranaires et cytosoliques par zymographie en gel de gélatine ...... 88

Figure 31 : Etude de la gélatinase parasitaire par zymographie en gel d’élastine...... 88

Figure 32 : Courbe de calibration de la chromatographie de gel filtration sur Bio Gel P100 (Biorad) ...... 90

Figure 33 : Détermination de la masse moléculaire de la gélatinase parasitaire par zymographie en gel de gélatine ...... 91

Figure 34 : Cinétique de sécrétion de la gélatinase issue de milieu conditionné des tachyzoïtes de la souche RH analysée par zymographie en gel de gélatine ...... 92

Figure 35 : Graphique représentant les activités gélatinolytiques relatives en fonction de la température utilisée ...... 93 Figure 36 : Graphique représentant les activités gélatinolytiques relatives en fonction du pH utilisé ...... 94

Figure 37 : Cartographie des protéines sécrétées par T. gondii présentes dans le milieu conditionné 18 h après analyse par 2D-SDS-PAGE (A) et par 2D-zymographie (B) ...... 96

Figure 38 : Dégradation de la DQ-gélatine par la MMP-9 humaine (A) et par la gélatinase parasitaire (B) analysée par spectrofluorimétrie ...... 98

Figure 39 : Effet de l’APMA sur la gélatinase parasitaire analysé par zymographie (A) et par spectrofluorimétrie en utilisant la DQ-gélatine (B) ...... 99

Figure 40 : Effets de différents inhibiteurs de protéases à large spectre sur l’activité gélatinolytique de la protéase parasitaire analysés par zymographie ...... 101

Figure 41 : Effets des TIMP-1 (A) et -2 (B) sur l’activité gélatinolytique de la protéase parasitaire analysés par spectrofluorimétrie en utilisant la DQ-gélatine et exprimés en pourcentage d’activité gélatinolytique relative (C) ...... 103

Figure 42 : Effets des inhibiteurs synthétiques EBGA 1 à 7 et 10 sur l’activité gélatinolytique de la MMP-9 humaine et de la protéase parasitaire analysés par zymographie ...... 104

Figure 43 : Effets des inhibiteurs synthétiques EBGA 4 (A) et 5 (B) sur l’activité gélatinolytique de la protéase parasitaire analysés par spectrofluorimétrie ...... 105

Figure 44 : Chromatographie de gel filtration. Profil d’élution obtenu (A) et analyse des fractions par zymographie (B) et par SDS-PAGE après coloration au nitrate d’argent (C) .. 109

Figure 45 : Profil d’élution (absorbance à 230 nm, tracé noir continu et à 280 nm, tracés en pointillés) obtenu par chromatographie d’affinité sur gélatine-agarose (A). Analyse des fractions par zymographie (B) et par SDS-PAGE après coloration au nitrate d’argent (C) .. 111

Figure 46 : Profil d’élution (absorbance à 230 nm, tracé noir continu et à 280 nm, tracé en pointillés) obtenu par chromatographie chélatrice de zinc (A). Analyse des fractions par zymographie (B) et par SDS-PAGE après coloration au nitrate d’argent (C) ...... 113

Figure 47 : Stratégie employée pour la purification de la protéase parasitaire ...... 114

Figure 48 : Analyse des fractions obtenues après l’association des trois chromatographies . 115

Figure 49 : Analyse par SDS-PAGE et par zymographie des protéines purifiées par chromatographies chélatrices de zinc ...... 116

Figure 50 : Résultats obtenus par analyse par spectrométrie de masse de la bande découpée sur le gel SDS-PAGE ...... 117

Figure 51 : Alignement de séquences entre les protéines TGME49_027950 ( T. gondii ), NCLIV_045460 ( N. caninum ) et PF13_0322 ( P. falciparum ) réalisé à l’aide de logiciel ClustalW2 ...... 121 Figure 52 : Domaines composant la TGME49_227948 prédits par le logiciel InterProScan 122

Figure 53 : Alignement de séquences entre les protéines TGME49_227948 ( T. gondii ), NCLIV_045460 ( N. caninum ) et PF3D7_1360800 ( P. falciparum ) ...... 125

Figure 54 : Alignement de la séquence obtenue par 5’RACE dans la base de données GenBank ...... 127

Figure 55 : Alignement obtenu entre la séquence obtenue par 5’RACE et le début de la séquence génomique de la TGME49_227948 ...... 129

Figure 56 : Graphique obtenu avec le logiciel NetNGlyc 1.0 Server permettant la prédiction de sites de N-glycosylations ...... 135

Figure 57 : Schéma des modifications post-traductionelles de la TGME49_227948 ...... 136

Figure 58 : Résultats obtenus par analyse de la séquence protéique de la TGME49_027950 (A) et de la TGME49_227948 (B) par le logiciel CBLAST ...... 137

Figure 59 : Représentation de la structure 3D de la TGME49_227948 réalisée à l’aide du logiciel VMD ...... 138

Figure 60 : Localisation de la séquence DEKEAADAVRLRGEDEAPRPRE au niveau de la structure 3D (A) et de la séquence protéique (B) de la TGME49_227948 ...... 140

Figure 61 : Localisation de la séquence KKKRALVPTKDEGTVGE au niveau de la structure 3D (A) et de la séquence protéique (B) de la TGME49_227948 ...... 141

Figure 62 : Spécificité du premier anticorps polyclonal (sérums immunisés des lapins 1 (A) et 2 (B)) analysée par western-Blot ...... 142

Figure 63 : Analyse de la spécificité du premier anticorps polyclonal ...... 143

Figure 64 : Analyse de la spécificité du second anticorps polyclonal ...... 144

Figure 65 : Description des différentes protéines reconnues par les anticorps dirigés contre la TGME49_227948 ...... 145

Figure 66 : Localisation de la TGME49_2 27948 dans des tachyzoïtes par co- immunomarquages avec ROP2, MIC2 et GRA7 ...... 147

Figure 67 : Reconstruction en 3D du co-marquage réalisé avec l’anticorps anti-TGME49_227948 et l’anticorps dirigé contre la protéine ROP2 ...... 148

Figure 68 : Effet de l’anticorps polyclonal dirigé contre une séquence située à proximité de son site catalytique de la TGME49_227948 sur cultures cellulaires de tachyzoïtes de T. gondii ...... 149

Figure 69 : Nombre de cellules lysées au cours du temps en présence de sérum pré-immun (SPI) ou de 10 µL d’anticorps ...... 150 Figure 70 : Effets de l’anticorps dirigé contre une séquence située à proximité du site catalytique sur l’activité gélatinolytique de la MMP-9 humaine (A) et de la GP100 (B, C et D) déterminée par zymographie...... 152

Figure 71 : Alignements des séquences protéiques de la MMP-9 humaine ou murine et la séquence reconnue par l’anticorps dirigé contre la TGME49_227948...... 153

Liste des tableaux

Tableau I : Métalloprotéases putatives de T. gondii ...... 31

Tableau II : Etapes du protocole d’immunisation 90 jours ...... 51

Tableau III : Valeurs des tests ELISA obtenues par les différents sérums pour le lapin 1 (A) et le lapin 2 (B) obtenus par la société Thermoscientific pour la synthèse du premier anticorps (site catalytique) ...... 52

Tableau IV : Anticorps primaires et secondaires utilisés en immunomarquage ...... 54

Tableau V : Protéines utilisées pour la calibration de la chromatographie gel filtration ...... 61

Tableau VI : Caractéristiques des inhibiteurs EBGA 1 à 7 et 10 ...... 68

Tableau VII : Anticorps primaires et secondaires utilisés en western-blotting de type enzymatique ...... 75

Tableau VIII : Programme d’isoélectrofocalisation pour une bandelette de 7 cm ...... 77

Tableau IX : Caractéristiques des standards utilisés, pour la détermination par chromatographie de gel filtration de la masse moléculaire de la gélatinase parasitaire ...... 89

Tableau X : Homologues de la TGME49_027950 identifiés à l’aide du logiciel EuPathDB 118

Tableau XI : Homologues de la peptidase M16 inactive domain-containing protein (TGME49_227948) de T. gondii chez deux autres membres de la famille Apicomplexa : N. caninum , P. falciparum ...... 123

Tableau XII : Identification des métalloprotéases putatives et/ou décrites appartenant à la famille M16 dans la base de données ToxoDB ...... 132

Tableau XIII : Localisation potentielle de la protéase TGME49_227948 réalisée à l’aide du logiciel PSORT ...... 134

Liste des abréviations

AAA ATPases Asoociated with a variety of cellular Activities AAP Abridged Anchor Primer ADN Acide DésoxyriboNucléique ADNc ADN complémentaire ADP Adénosine DiPhosphate AMA1 Apical Membrane Antigen 1 APMA 4-Aminophenylmercuric acetate ARN Acide RiboNucléique ARNm ARN messager Atp Animal-TyPe ATP Adénosine TriPhosphate βMPP Sous-unité β de la MPP BSA Bovine Serum Albumine BZ Bradyzoïte CDPKs Calcium Dependent-Protein Kinases CPB CathePsine B-like CPC CathePsine C-like CPL CathePsine L-like CRB Centre de Ressources Biologiques dCTP Désoxy-Cytosine TriPhosphate DEPC DiEthylPyroCarbonate dNTP Désoxy-Nucléotide TriPhosphate DO Densité Optique DQ Dye Quenched DTT DiThioThréitol EC number Enzyme Commission number ECL ElectroChemiLuminescence EDTA Ethylène Diamine Tétra-Acétique eIF2 eukaryotic Initiation Factor 2 ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EuPtr EuPitrilysine FRM1 FoRMine 1 Fts Filamentation temperature sensitive GPI GlycosylPhosphatidylInositol GRA Protéines des GRAnules denses GSP Gene-Specific Primer IDE Insulin-Degrading Enzyme IEF IsoElectroFocalisation IMC Internal Membrane Complex IMDM Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium IMP Inner Membrane Peptidase KLH Keyhole lympet hemocyanin LAP Leucine AminoPeptidase MetAP2 Methionine AminoPeptidase de type 2 MIC Protéines des MICromènes MIP Mitochondrial Intermediate Peptidase MMLV-RT Moloney Murine Leukemia Virus-RT MMP Matrix MetalloProtease MPP Mitochondrial Processing Peptidase MSP Major Surface Protein NEM N-EthylMaleimide NK Natural Killer NTPase Nucléoside TriPhosphatase PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PCR q PCR quantitative PfEMP1 Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 PM Poids Moléculaire PMSF Fluorure de PhénylMéthylSulfonyle PP2C Protein Phosphtase 2C PreP Pre-sequence Peptidase Ptr Pitrilysine PV Parasitophorous Vacuole PVM PV Membrane RACE Rapid Amplification of cDNA Ends RAPD-PCR Random Amplification of Polymorphic DNA-PCR RE Réticulum Endoplasmique RFLP-PCR Restriction Fragment Lengh Polymorphism-PCR ROM RhOMboïd protein RON RhOptry Neck protein ROP Protéines des ROPhtries RT Reverse Transcriptase S2P Site 2 Peptidase SAG Surface AntiGen SDS Sodium Dodécyl Sulfate SIDA Syndrome de l’ImmunoDéficience Acquise SPZ Sporozoïte SRS SAG-Related Sequence SUSA SAG-Unrelated Surface Antigen SVF Sérum de Veau Fœtal TAE Tris Acétate EDTA TBS Tris Buffered Saline TBS-T TBS-Tween TdT Terminal deoxynucleotidyl Transferase T. gondii Toxoplasma gondii TgPI T. gondii Protease Inhibitor TG-SDS Tris Glycine-SDS TIMP Tissue Inhibitors of MetalloProteases TLN1 Toxolysin 1 TLN4 Toxolysin 4 ToxoDB Toxoplasma DataBase Tris [Tris(hydroxyméthyl)]aminométhane TZ Tachyzoïte VAC VAcuolar Compartment VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine VP Vacuole Parasitophore

Liste des publications et des communications

Communications orales :

A-P. Martin , E. Buache, S. Escotte-Binet, G. Bellon, W. Hornebeck, R. Garnotel, D. Aubert and I. Villena. Evidence and partial characterization of a metalloprotease from Toxoplasma gondii. XI European Multicolloquium of Parasitology, Cluj-Napoca ; Roumanie. 25-29 juillet 2012.

A-P. Bouleau , E. Buache, S. Escotte-Binet, G. Bellon, W. Hornebeck, R. Garnotel, D. Aubert et I. Villena. Mise en évidence et caractérisation d’une métallopeptidase de Toxoplasma gondii. Club Toxoplasme, Hôpital Cochin, Paris 5 ; France. 8 juin 2012.

A-P. Bouleau , E. Buache, S. Escotte-Binet, G. Bellon, W. Hornebeck, R. Garnotel, D. Aubert et I. Villena. Mise en évidence et caractérisation d’une métalloprotéase de Toxoplasma gondii. Journée des jeunes chercheurs, SFR Cap-Santé, Reims ; France. 20 mai 2011. Ï Prix spécial « Boehringer Ingelheim » pour la meilleure communication orale.

Communications affichées :

A-P. Martin , G. Bellon, S. Escotte-Binet, D. Aubert, E. Bourguet, J. Sapi, W. Hornebeck et I. Villena. Étude in silico de la métallopeptidase TGME49_227948 de Toxoplasma gondii . 12th International congress on toxoplasmosis, Oxford ; Angleterre. 9 au 11 mai 2012.

A-P. Martin , G. Bellon, S. Escotte-Binet, D. Aubert, E. Bourguet, J. Sapi, W. Hornebeck et I. Villena. Étude in silico de la métallopeptidase TGME49_227948 de Toxoplasma gondii . Société Française de Parasitologie, Dijon ; France. 15 au 17 mai 2013. A-P. Bouleau , M. Bricout, S. Escotte-Binet, R. Geers, D. Aubert, G. Bellon et I. Villena. Mise en évidence et caractérisation de métalloprotéinases de Toxoplasma gondii et de Neospora caninum. Congrès de la société Française de Parasitologie, Rennes ; France. 9 au 11 mai 2012.

A-P. Bouleau , E. Buache, S. Escotte-Binet, G. Bellon, W. Hornebeck, R. Garnotel, D. Aubert et I. Villena. Mise en évidence et caractérisation d’une métalloprotéase de Toxoplasma gondii. Congrès de la société Française de Parasitologie, Strasbourg ; France. 18 au 20 mai 2011.

A-P. Bouleau , G. Bellon, E. Buache, S. Escotte-Binet, W. Hornebeck, R. Garnotel, D. Aubert and I. Villena. Evidence and partial characterization of a metalloprotease from Toxoplasma gondii. Scientific Meeting CRP Santé Luxembourg – SFR CAP Santé, Reims ; France, 28 octobre 2011.

Formations suivies

Septembre - Octobre 2011 : Diplôme Universitaire d’Expérimentation Animale de Niveau I (Université de Reims Champagne-Ardenne). INTRODUCTION

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Introduction

Contexte scientifique

Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire intracellulaire obligatoire appartenant à la famille des Apicomplexa , parasites envahissant les cellules par un mécanisme actif d’invasion. Le cycle biologique de T. gondii fait intervenir deux types d’hôtes : l’hôte définitif (chat et autres félidés) et de nombreux hôtes intermédiaires (mammifères et oiseaux). Après contamination (généralement par voie orale), les parasites se multiplient dans les cellules intestinales, puis diffusent dans tout l’organisme et peuvent atteindre tous les tissus où ils s’enkystent. Les lieux privilégiés d’enkystement sont les muscles et le cerveau. T. gondii est capable d’envahir tout type cellulaire. Pour diffuser dans tout l’organisme, l’implication de protéases semble nécessaire. Une étude antérieure (thèse d’université E. Buache, URCA 2008) menée au sein des équipes EA 3800 et UMR 7369 sur l’influence de l’invasion de monocytes humains par T. gondii a permis de mettre en évidence, sur le profil d’expression des métalloprotéases matricielles monocytaires, une protéase parasitaire de masse moléculaire apparente d’environ 94 kDa présentant à la fois des propriétés gélatino- et élastinolytiques (Buache et al. , 2007).

Les protéases constituent un large groupe d’enzymes jouant un rôle dans la plupart des phénomènes biologiques (Li et al. , 2012). Elles sont classées, selon la classification de MEROPS : « the peptidase database » (http://merops.sanger.ac.uk) en 9 clans différents : les protéases à acide aspartique, les protéases à acide glutamique, les cystéines protéases, les métalloprotéases, les asparagines protéases, les sérines protéases, les thréonines protéases, les protéases à activité catalytique mixte et les protéases non classées.

Chez les protozoaires, les protéases possèdent des rôles clés, au niveau du cycle parasitaire ou dans la pathogénicité des maladies dont ils sont responsables, et sont ainsi considérées comme des facteurs de virulence (Carruthers, 2006).

Dans la famille des Apicomplexa , chez des parasites tels que Plasmodium falciparum et Cryptosporidium parvum , des métalloprotéases ont déjà été décrites (Wu et al. , 2003; Abrahamsen et al. , 2004). Chez T. gondii , les métalloprotéases pourraient jouer un rôle crucial dans la traversée des différentes barrières biologiques telles que l’intestin, le cerveau et l’œil ou encore le placenta en cas de transmission materno-fœtale (Barragan and Sibley, 2003).

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Introduction

Toxoplasma gondii

La toxoplasmose est une anthropozoonose cosmopolite due à Toxoplasma gondii , un parasite protozoaire. C’est l’une des infections parasitaires les plus répandues ; elle est l’une des principales causes de morbidité dans le monde (Montoya and Liesenfeld, 2004) et en France, environ 30% de la population adulte est immunisée (Nogareda et al. , 2013). La séroprévalence est corrélée avec les habitudes alimentaires et l’hygiène de vie d’une population (Montoya and Liesenfeld, 2004). Plusieurs modes de contamination humaine existent dont les principaux sont l’ingestion de kystes lors de la consommation de viandes crues ou insuffisamment cuites (Tenter, 2009) ou d’oocystes sporulés présents dans les aliments souillés. La transmission de kystes par greffes d’organes et la transmission de tachyzoïtes in utero d’une mère à son fœtus peuvent être une autre voie de contamination humaine. De même, la transmission de tachyzoïtes libres contenus dans le sang, la salive, le lait ou lors d’accidents au laboratoire, est plus exceptionnelle.

I/ Découverte du parasite Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire intracellulaire obligatoire responsable de la toxoplasmose. Il a été découvert en 1908 à l’Institut Pasteur de Tunis par Charles Nicolle et Louis Herbert Manceaux, après qu’une épidémie eut touché des rongeurs de laboratoire ( Ctenodactylus gondii) (Nicolle and Manceaux, 1909). T. gondii appartient à l’ordre des Coccidies, au phylum des Apicomplexa qui est défini par la présence d’un complexe apical incluant des organelles sécrétoires et au genre Toxoplasma . Ce genre possède une seule espèce Toxoplasma gondii au sein de laquelle sont individualisées de nombreuses souches (Dardé et al. , 1992; Su et al. , 2012).

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Introduction

II/ Les stades parasitaires de Toxoplasma gondii

Le cycle de T. gondii présente trois stades infectieux : le tachyzoïte, le bradyzoïte et le sporozoïte.

II-1/ Le tachyzoïte

Le tachyzoïte (dérivé du grec tachy : à multiplication rapide) est la forme proliférative à multiplication intracellulaire obligatoire, présente lors de la phase aiguë de l’infection. Il infecte les cellules nucléées de l’hôte et s’y multiplie au sein d’une vacuole parasitophore. Il s’agit une cellule en forme d’arc de 6 à 10 μm de long et 2 à 5 μm de large, avec une extrémité antérieure effilée et une extrémité postérieure plus large et plus arrondie. Comme tous les Apicomplexa , T. gondii possède dans sa partie antérieure un complexe apical comprenant un conoïde, des rhoptries, des micronèmes, et des granules denses (Dubey et al. , 1998). Une autre structure typique des Apicomplexa est l’apicoplaste contenant une molécule d’ADN circulaire de 35 kb, dérivant d’un chloroplaste ancestral dont le rôle est encore mal défini. Le toxoplasme est aussi caractérisé par un complexe membranaire composé de trois membranes superposées, d’un noyau, d’une unique mitochondrie, d’un réticulum endoplasmique et d’un appareil de Golgi ( Figure 1).

Figure 1 : Structure d’un tachyzoïte, forme proliférative de T. gondii , observée au microscope (Dubey et al. , 1998) A gauche, la représentation schématique d’un tachyzoïte et à droite sa structure observée au microscope électronique à balayage.

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Introduction

Le tachyzoïte est capable d’envahir tout type cellulaire nucléé (Carruthers and Sibley, 1997). La pénétration est un phénomène actif et très rapide (30 à 60 secondes). Le parasite s’internalise alors dans la cellule-hôte en s’entourant d’une vacuole parasitophore dans laquelle il se multiplie par endodyogénie (Figure 2). Il s’agit d’une multiplication intracellulaire asexuée au cours de laquelle deux cellules-filles sont assemblées dans une cellule-mère intacte et polarisée ; la multiplication s’effectue ensuite à l’intérieur du parasite initial pour former des rosettes avant lyse de la cellule. Ce phénomène conduit à la mort de la cellule-hôte et l’invasion rapide des cellules voisines. Le taux d’invasion varie suivant la souche parasitaire et le type de cellule-hôte (Kaufman and Maloney, 1962; Appleford and Smith, 1997). La forme tachyzoïte est fragile dans le milieu extérieur.

Cellule mère Division 2 cellules filles

Mitochondrie IMC

Réticulum Endoplasmique

Noyau

Organelles apicales

Figure 2 : Mécanisme d’endodyogénie (Nishi et al. , 2008)

Lorsque le parasite commence à se diviser, apparaissent deux complexes membranaires internes (IMC). Le noyau, le réticulum endoplasmique et la mitochondrie se divisent et les organelles apicales des deux cellules-filles se forment. Le cytoplasme entier est divisé entre les deux cellules-filles et le complexe membranaire interne de la cellule-mère se lyse. Enfin, un clivage divise les deux cellules-filles à partir du pôle antérieur. Cette division se déroule sur toute la longueur de la cellule jusqu’au pôle postérieur.

Lors de l’instauration de l’immunité spécifique chez l’homme, il y a interconversion de la forme tachyzoïte vers la forme bradyzoïte ou forme végétative conduisant à la formation de kystes (Bhopale, 2003).

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Introduction

II-2/ Le bradyzoïte

Le bradyzoïte (dérivé du grec brady : à multiplication lente) est une forme de latence et de résistance intracellulaire. Sa morphologie est très comparable à la forme tachyzoïte avec une plus grande abondance en grains d’amylopectine et en micronèmes (Figure 3 ). Cette transformation s’accompagne de la modification de la vacuole parasitophore avec un épaississement de la membrane ainsi que de la matrice pour aboutir ainsi à la formation du kyste toxoplasmique intracellulaire. Les kystes (10 à 200 μm) sont des formes de résistance et de dissémination. Ils peuvent contenir jusqu’à un millier de bradyzoïtes dont le métabolisme est adapté à une vie quiescente (Tomavo, 2001). La transformation des tachyzoïtes en bradyzoïtes et de la vacuole parasitophore en kyste intervient très rapidement après l’infection (dès 48 heures en culture cellulaire; dès le 6 ème jour après l’infection dans la toxoplasmose expérimentale de la souris).

Figure 3 : Structure d’un bradyzoïte (Dubey et al. , 1998) A gauche, la représentation schématique d’un bradyzoïte et à droite sa structure observée au microscope électronique à balayage.

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Introduction

II-3/ Le sporozoïte

Les sporozoïtes sont présents au nombre de huit dans un oocyste sporulé. Ces derniers sont formés lors de la reproduction sexuée chez l’hôte définitif. Durant la phase aiguë de l’infection, des milliers d’oocystes non sporulés sont émis dans les fèces du chat. Ils mesurent entre 10 et 12 μm de diamètre et contiennent une masse unique, le sporoblaste. Après sporulation dans le milieu extérieur, il se forme deux sporocystes contenant chacun quatre sporozoïtes ( Figure 4 ). Leur morphologie est peu différente en microscopie optique et électronique aux autres stades (Speer and Dubey, 1998).

Figure 4 : Représentation schématique de la structure d’un sporozoïte (Dubey et al. , 1998)

III/ Le cycle parasitaire de Toxoplasma gondii

Le cycle parasitaire comprend deux phases : une phase de multiplication sexuée qui a lieu chez l’hôte définitif uniquement (le chat et d’autres félidés) et une phase de multiplication asexuée chez les hôtes intermédiaires (tous les animaux à sang chaud) ( Figure 5 ). Le cycle sexué, ou gamétogonie, se déroule dans le système digestif de l’hôte définitif après ingestion de kystes contenus dans les tissus de leur proie ou d’oocystes matures souillant l’eau et les végétaux. Les parasites latents contenus dans les kystes sont libérés et pénètrent dans les cellules de l’épithélium intestinal où ils se multiplient de façon active par

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Introduction divisions cellulaires, appelée endodyogénie, avant de se différencier en gamétocytes mâles et femelles. La fécondation conduit à la formation d’oocystes non sporulés excrétés par millions dans les fèces des félidés. Dans le milieu extérieur, les oocystes deviennent infectieux en un à cinq jours par un processus de maturation appelée sporogonie qui permet la formation des sporozoïtes. Les oocystes sporulés sont hautement infectieux et extrêmement résistants dans l’environnement (Dubey, 1995). Le cycle asexué, ou schizogonie, s’effectue tant chez l’hôte définitif que chez les hôtes intermédiaires (tous les mammifères dont l’homme, et les oiseaux). La contamination est liée habituellement à l’ingestion de kystes (contenant des centaines de bradyzoïtes) présents dans les tissus d’autres hôtes intermédiaires. Après rupture des kystes, s’effectue une phase de multiplication active sous forme de tachyzoïtes qui se disséminent rapidement dans tout l’organisme. Les parasites s’enkystent ensuite préférentiellement dans les tissus à faible immunité (muscles striés et système nerveux central) mais aussi au niveau d’autres viscères et de l’œil.

Figure 5 : Cycle parasitaire de T. gondii (Hunter and Sibley, 2012)

Le chat, hôte définitif, est le lieu de la réplication sexuée. La fusion des gamètes conduit à la formation d'oocystes qui sont excrétés dans les matières fécales de chat et subissent une méiose dans l'environnement pour produire huit sporozoïtes. Chez l'hôte intermédiaire, tel que les rongeurs, la réplication asexuée se produit. L’infection aiguë est due à la présence de tachyzoïtes alors que les bradyzoïtes, ingérés via l'alimentation, conduisent à l'infection chronique à long terme. Les oocystes sont capables de survivre dans l'environnement pendant de longues périodes de temps, et les oocystes sporulés (qui sont infectieux) peuvent contaminer les aliments et l’eau, fournissant une voie d'infection pour les hôtes intermédiaires.

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Introduction

IV/ Organisation moléculaire de Toxoplasma gondii

Comme tous les organismes intracellulaires appartenant au phylum Apicomplexa , T. gondii possède une organisation cellulaire polarisée grâce à la présence notamment d’un complexe situé au pôle antérieur (Figure 1). La composition de la surface du parasite est fortement modifiée au cours de l’interconversion bradyzoïte/tachyzoïte. Ces derniers possèdent une structure similaire mais produisent un phénotype différent dans la cellule selon les molécules exprimées. T. gondii est composée de deux types de protéines : les protéines de surface et les protéines contenues dans les organelles sécrétoires que sont les micromènes, les rhoptries et les granules denses.

IV-1/ Les protéines de surface (SAG)

La membrane plasmique du parasite est recouverte de nombreuses protéines qui sont d’une grande variété. Ces protéines regroupent la Superfamille des SRS (SAG1-related sequence) (Jung et al. , 2004). Elles sont divisées en deux sous-familles dont les membres prototypes sont SAG1 et SAG2A, respectivement. Elles sont ancrées à la membrane par un groupement glycosylphosphatidylinositol (GPI) (Manger et al. , 1998). Les protéines SAG, notamment de SAG1, sont impliquées dans l’attachement initial du tachyzoïte à la cellule-hôte. L’utilisation d’anticorps dirigés contre SAG1 inhibe l’attachement du parasite à la cellule-hôte de 71% (Mineo and Kasper, 1994). De plus, des tachyzoïtes mutants déficients en SAG3 sembleraient présenter une diminution d’invasion de deux fois par rapport aux parasites non mutés (Dzierszinski et al. , 2000). SAG2 serait impliqué dans l’orientation du parasite sur la cellule-hôte (Grimwood and Smith, 1996).

IV-2/ Les protéines des organelles sécrétoires

Les protéines contenues dans les organelles sécrétoires participent directement à la pénétration du parasite, à la formation de la vacuole parasitophore ainsi qu’à la survie du parasite dans la cellule-hôte. Ces protéines sont sécrétées séquentiellement lors de l’invasion.

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Introduction

IV-2-1/ Les protéines des micromènes (MIC)

Les micronèmes sont localisés au niveau apical du parasite et sont généralement orientés selon l’axe principal du parasite dans la région apicale et à la périphérie du parasite (Dubey et al. , 1998). Ces petits organites allongés jouent un rôle essentiel dans la survie et la propagation parasitaire. Les protéines MIC sont impliquées dans la motilité, l’invasion et la virulence (Cérède et al. , 2005). Actuellement, une vingtaine de protéines ont été identifiées. Les protéines MIC sont libérées lors du contact initial du parasite avec la cellule-hôte et participent à l’attachement du parasite à la membrane de la cellule-hôte (Carruthers, 2002). Leur sécrétion est provoquée par la mobilisation du calcium intracellulaire parasitaire (Carruthers and Sibley, 1999). Les protéines MIC pourraient être impliquées dans la formation de l’interface de liaison entre le parasite et la membrane plasmique. La diminution d’expression d’AMA1 ( Apical Membrane Antigen 1 ), une protéine de micronèmes, empêche la formation de la jonction mobile ainsi que l’invasion (Mital et al. , 2005). De plus, AMA1 est associée aux protéines RON2, 4 et 5 au niveau de la jonction mobile. Ceci contribue à la création d’une interface entre T. gondii et la membrane plasmique. Ce complexe semble aussi participer à l’exclusion de certains marqueurs hôtes de l’intérieur de la vacuole parasitophore en formation, permettant ainsi la survie du parasite (Alexander et al. , 2005).

IV-2-2/ Les protéines des rhoptries (ROP)

Les rhoptries sont des organelles sécrétoires uniques et essentielles pour le parasitisme des Apicomplexa . Le parasite T. gondii contient généralement 12 rhoptries, chacune mesurant 2 à 3 µm de long (Dubey et al. , 1998), regroupées au pôle antérieur du parasite. Les rhoptries, très conservées dans le phylum des Apicomplexa , sont suspectées d’avoir un rôle essentiel dans le cycle intracellulaire de ces pathogènes. Les protéines sécrétées par les rhoptries sont de deux types : les protéines du bulbe des rhoptries appelées ROPs et les protéines du cou des rhoptries appelées RONs (Dubremetz, 2007). Il existe 60 protéines de rhoptries connues à ce jour soit identifiées de manière putative soit décrites dans la littérature, dont 48 protéines ROPs et 12 protéines RONs (Camejo et al. , 2014; Lamarque et al. , 2012). Les protéines ROPs sont sécrétées dans la vacuole parasitophore ou dans la cellule-hôte et les protéines RONs s’associent à la protéine AMA1 pour la formation de la jonction mobile (Alexander et al. , 2005).

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Introduction

Les protéines ROPs sont ensuite relarguées durant l’invasion. Elles migrent vers trois localisations principales : la lumière de la vacuole parasitophore (VP), la membrane de la VP ou à l’intérieur de la cellule-hôte. La protéine ROP1 s’accumule dans la lumière de la VP en formation (Ossorio et al. , 1992; Håkansson et al. , 2001). La protéine ROP2 migre généralement vers la membrane de la VP (Beckers et al. , 1994; Carey et al. , 2004). Deux protéines, PP2C (protéine phosphatase 2C) et ROP16, ont été observées dans le noyau. Ce processus intervient très rapidement, puisque ces protéines sont retrouvées dans le noyau 15 minutes après l’invasion (Gilbert et al. , 2007; Saeij et al. , 2007). Les protéines ROP16 et ROP18 sont également décrites comme des facteurs de virulence chez T. gondii (Saeij et al. , 2006).

IV-2-3/ Les protéines des granules denses (GRA)

Les granules denses sont des vésicules sécrétrices de 200 nm de diamètre entourées d’une membrane unique dont leur nombre varie entre 3 et 15 par parasite. Ils possèdent un rôle majeur dans les modifications structurales de la vacuole parasitophore (Mercier et al. , 2005). Les protéines des granules denses sont libérées à l’intérieur de la vacuole parasitophore pendant et après l’invasion de la cellule-hôte. Il existe environ 20 protéines des granules denses (GRA1 à 10, 12 et 14-17, 19-22, 24), deux NTPase I et II ( Nucleoside Triphosphatase hydrolase ), deux inhibiteurs de protéases, TgPI 1 et 2, la cyclophiline (Cy-18) et une protéine patatine-like (Ahn et al. , 2005; Bougdour et al. , 2013; Braun et al. , 2013; Cesbron-Delauw, 1994; Hsiao et al. , 2013; Michelin et al. , 2009; Okada et al. , 2013; Rome et al. , 2008). Elles interviennent dans le recrutement des nutriments et dans l’inhibition des voies apoptotiques de la cellule-hôte (Carruthers, 2002; Mercier et al. , 2005; Nash et al. , 1998). Elles participent également à l’invasion, à la survie intracellulaire du parasite et à sa multiplication (Cha et al. , 2001)

V/ Le processus d’invasion de la cellule-hôte par T. gondii

Le processus d’invasion consiste en une succession d’évènements qui se déroule très rapidement en moins de 30 secondes. Le mode de pénétration de T. gondii est complexe et distinct de ceux utilisés par d’autres micro-organismes intracellulaires tels que Trypanosoma cruzi notamment (Sibley and Andrews, 2000). En effet, il ne s’agit ni de phagocytose ni d’endocytose. T. gondii , sous sa forme invasive, utilise un mode de pénétration active

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Introduction caractérisé par l’internalisation du parasite sans destruction de la membrane plasmique de la cellule-hôte.

- Attachement-Reconnaissance

T. gondii utilise le phénomène de « gliding », mouvement antéro-postérieur, pour se déplacer jusqu’à la cellule-hôte car il ne possède ni cils ni flagelles. Ce déplacement appelé « gliding motility » nécessite la participation de l’actine et de la myosine du parasite (Brossier and Sibley, 2005; Meissner et al. , 2002). Le parasite s’attache, de manière transitoire, à la surface de la cellule-hôte à l’aide de ses protéines de surfaces, les SAG (Surface Antigens), les SRS (SAG-related sequences) et les SUSA (SAG-unrelated surface antigens) (He et al. , 2002; Pollard et al. , 2008). Suite à cet attachement, un premier signal permet l’augmentation du calcium cytosolique et ainsi la sécrétion des protéines contenues dans les micromènes est déclenchée au pôle apical des tachyzoïtes. Cette sécrétion induit la formation d’une liaison forte entre le parasite et la cellule-hôte (Carruthers and Boothroyd, 2007).

- Formation de la jonction mobile

Un second signal permet l’exocytose des protéines contenues dans les rhoptries. En effet, RON2, 4 et 5 se lient à AMA1 (Alexander et al. , 2005; Straub et al. , 2009). RON2 est une protéine transmembranaire exposant sa région N-terminale du côté cytosolique de la membrane de la cellule-hôte et sa partie C-terminale à la surface de la cellule-hôte. Via une courte séquence extracellulaire, RON2 permet une interaction directe avec la protéine AMA1 (Lamarque et al. , 2011; Tonkin et al. , 2011). Toutes ces protéines forment la jonction mobile. Cette jonction forme une interface entre le parasite et la membrane de la cellule-hôte. Cette zone de restriction étroite se déplace vers le pôle postérieur du parasite en formant une enveloppe ( Figure 6).

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Introduction

Figure 6 : Schématisation de la jonction mobile avec les différentes protéines impliquées (Tonkin et al. , 2011) La formation de la jonction mobile repose sur la sécrétion des protéines RONs (RON2, RON4 et RON5) qui sont exportées dans la cellule-hôte.

La jonction mobile semblerait jouer également un rôle de tamis moléculaire permettant de réaliser une sélection, une filtration, des protéines de la cellule-hôte. Cette filtration pourrait être essentielle pour la survie du parasite et la formation de la vacuole parasitophore (Charron and Sibley, 2004).

- Formation de la vacuole parasitophore

Lors de l’attachement du parasite et de l’invagination de la membrane de la cellule-hôte, la protéine ROP1 est libérée aussi bien dans la cellule-hôte qu’au sein de la vacuole formée (Håkansson et al. , 2001). Ces protéines permettent donc la formation de la vacuole parasitophore (Sibley, 2011). Puis, ROP16 et PP2C migrent vers le noyau de la cellule-hôte et ROP2, 5, 18 vont se fixer au niveau de la membrane de vacuole parasitophore (Bradley and Sibley, 2007; Boothroyd and Dubremetz, 2008). La vacuole parasitophore résiste à l'acidification et la fusion avec les endosomes et les lysosomes, de plus elle recrute les mitochondries et le réticulum endoplasmique de son hôte afin de permettre l'apport de nutriments. D’après les observations réalisées pendant le processus d’invasion, il est suggéré que le parasite module certaines fonctions de la cellule-hôte afin de permettre sa survie intracellulaire (Hunter and Sibley, 2012).

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Introduction

Cette vacuole est aussi composée de lipides provenant à la fois du parasite et de la cellule- hôte (Håkansson et al. , 2001)

- Formation d’un réseau intravacuolaire

Immédiatement après la formation de la vacuole parasitophore, les granules denses libèrent leur contenu au niveau du tiers antérieur du parasite permettant la maturation de la vacuole et la formation d’un réseau tubulaire (Leriche and Dubremetz, 1990). Au contact de la membrane plasmique, ces protéines libérées permettent la formation de pores fonctionnels afin de créer un échange de molécules de petits poids moléculaires entre le parasite et le cytosol de la cellule-hôte.

Les différentes étapes du processus d’invasion de T. gondii dans la cellule-hôte sont schématisées dans la figure 7.

Figure 7 : Schématisation du processus d’invasion de T. gondii dans une cellule-hôte (Hunter and Sibley, 2012)

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Introduction

VI/ Les barrières biologiques traversées par T. gondii

VI-1/ Description des barrières biologiques traversées par T. gondii

T. gondii pénètre généralement dans l’organisme par voie orale selon un mécanisme bien décrit. Après l’ingestion d’oocystes présents dans les aliments contaminés par des excréments de chats ou de bradyzoïtes contenus dans de la viande crue contaminée, les parasites vont traverser la barrière intrinsèque de l’intestin qui est formée de cellules épithéliales et de jonctions serrées. Les parasites se multiplient ensuite dans les entérocytes et se transforment en tachyzoïtes. Ces derniers peuvent ensuite envahir les vaisseaux lymphatiques pour atteindre la lymphe, puis les ganglions lymphatiques et enfin arriver dans la circulation sanguine. Les tachyzoïtes traversent alors les barrières endothéliales pour atteindre différents sites tels que certains organes (cerveau, rétine…) ou les muscles où ils se transforment en bradyzoïtes. Les tachyzoïtes peuvent aussi directement traverser l’endothélium des vaisseaux sanguins au niveau de l’intestin (Tardieux and Ménard, 2008).

Pour atteindre toutes ces cibles variées, T. gondii doit traverser différentes barrières biologiques (Figure 8) et pour cela il utilise probablement des protéases. Après ingestion par voie orale, les tachyzoïtes traversent la barrière intrinsèque de l’intestin formée de cellules épithéliales. Les tachyzoïtes peuvent atteindre le système nerveux central en franchissant la barrière méningo-encéphalique et la rétine qui sont formées de cellules endothéliales et de capillaires. De plus, lors d’une grossesse, T. gondii peut traverser les villosités placentaires qui séparent la circulation maternelle de la circulation fœtale (Pfaff et al. , 2005).

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Introduction

Figure 8 : Schéma de la migration de T. gondii au travers des barrières biologiques (Barragan and Sibley, 2003)

Dans un premier temps , T. gondii traverse l’épithélium intestinal, puis des barrières biologiques telles que la barrière hémato-encéphalique ou placentaire. Le passage du parasite T. gondii dans les différents tissus est indiqué par des flèches vertes. T. gondii peut envahir le système nerveux central (a), le placenta (b) et l’intestin (c).

Trois hypothèses sont possibles pour élucider le mode d’invasion de T. gondii au travers de ces différentes barrières biologiques. Elles sont décrites dans la figure 9.

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Introduction

Figure 9 : Représentation schématique des trois hypothèses de traversée de barrières biologiques par T. gondii (Lambert and Barragan, 2010) I. Lorsque le parasite est en position extracellulaire, il va pouvoir utiliser deux modes de passages, paracellulaire ou transcellulaire. Dans le premier cas, T. gondii franchit la barrière biologique en passant entre les cellules au niveau des jonctions et utilise son mécanisme de motilité pour migrer entre les cellules sans modifier l’intégrité de la barrière. Dans le second cas, les parasites pénètrent à l’intérieur des cellules au niveau de leur pôle apical des cellules endothéliales pour ressortir du côté basolatéral. II. Le second mode d’action est réalisé par les tachyzoïtes en position intracellulaire. Les parasites utilisent les leucocytes pour traverser les barrières biologiques. Ce mécanisme est décrit sous la forme de cheval de Troie. Les leucocytes migrent selon leur voie de passage habituelle, c’est-à-dire entre les cellules de la barrière, et de ce fait, permettent la migration des parasites. III. Le troisième mode d’action utilise des ligands situés sur la barrière biologique qui induisent la sortie des parasites à l’extérieur des leucocytes. Ainsi, T. gondii peut traverser la barrière entre les cellules.

Après la traversée de barrières biologiques, les parasites se situent dans la matrice extracellulaire et au sein du tissu conjonctif composé de collagène et d’élastine notamment.

VI-2/ Rôle des protéases sécrétées par T. gondii dans le mécanisme d’invasion

Le processus d’invasion de T. gondii au sein d’une cellule-hôte fait intervenir principalement deux de ces organelles que sont les micronèmes puis les rhoptries. Les protéases sécrétées par ces deux organelles vont donc jouer un rôle essentiel dans les différentes étapes de ce processus.

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Introduction

Comme nous l’avons décrit précédemment, ce processus peut être décomposé en quatre étapes, avec la sécrétion de protéases spécifiques afin de réaliser différentes actions (Figure 10 ).

Figure 10 : Protéases impliquées dans le processus d’invasion de la cellule-hôte par T. gondii (Santos and Soldati-Favre, 2011) Différentes protéases sont impliquées au cours des phases composant le processus d’invasion de T. gondii dans une cellule-hôte : avant l’attachement (A), au moment de l’augmentation du calcium cytosolique donc de la libération des protéines des micronèmes (B), lors de l’exocytose des protéines contenues dans les rhoptries (C) et après pénétration du parasite dans la cellule (D).

T. gondii possède six protéases rhomboïdes, qui sont des sérines protéases. Ces enzymes clivent le domaine transmembranaire de leurs substrats et sont sécrétées à différents stades du cycle du parasite et dans différents compartiments. En effet, Tg ROM1 est localisée dans l’appareil de Golgi et les micromènes, cependant elle n’est pas libérée pendant l’invasion (Brossier et al. , 2008). Tg ROM2 et Tg ROM3 sont principalement exprimées dans les sporozoïtes, avec une expression beaucoup plus faible dans les tachyzoïtes (Brossier et al. ,

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Introduction

2005). En revanche, Tg ROM4 et Tg ROM5 sont localisées au niveau de la membrane du parasite avec une distribution ubiquitaire pour Tg ROM4 et principalement au pôle basal pour Tg ROM5. Tg ROM6 quant à elle est localisée dans la mitochondrie (Brossier et al. , 2008). Tg MIC2, 6 et 8 ainsi que Tg AMA1 sont localisées sous forme de complexes dans les micronèmes. Lors de l’étape d’attachement-reconnaissance du parasite à la cellule-hôte, le parasite vient se fixer à la cellule par un phénomène de « gliding motility ». Lors de ce processus, deux formines ( Tg FRM1 et 2) permettent le contrôle de la croissance des filaments d’actine afin de permettre l’entrée du parasite dans la cellule (Daher et al. , 2010). Notons qu’une troisième formine ( Tg FRM3) a récemment été mise en évidence et la perte de son domaine C-terminal provoque une diminution importante de la croissance du parasite (Daher et al. , 2012). Puis, une augmentation du calcium cytosolique, impliquant 8 protéines kinases calcium-dépendantes (CDPKs) (Nagamune and Sibley, 2006), permet la sécrétion des protéines contenues dans les micromènes (Figure 10A). Tg MIC2 s’associe à Tg M2AP (MIC2-associated protein) pour former un hétérohexamère qui joue un rôle dans le phénomène de « gliding motility », l’attachement et l’invasion du parasite (Huynh and Carruthers, 2006). La formation de ce complexe s’effectue en deux étapes : dans un premier temps l’assemblage se fait dans le réticulum endoplasmique, puis dans un second temps une maturation protéolytique s’effectue pour permettre leur stockage dans les micronèmes (Zhou et al. , 2004). De plus, MIC2 subit un processus protéolytique : en N-terminal par la MPP2 puis en C-terminal par la MMP1 lorsqu’il est excrété (Carruthers et al. , 2000). Tg MIC6 se complexe avec deux adhésines Tg MIC1 et 4. Tg MIC8 s’associe à Tg MIC3 afin de permettre la sécrétion du contenu des rhoptries, les protéines RONs (Kessler et al. , 2008). Les MICs transmembranaires présentes dans chaque complexe Tg MIC2, Tg MIC6, Tg MIC8 et Tg AMA1 ont une structure comprenant un ectodomaine qui permet l’établissement de connexions entre les récepteurs de la cellule-hôte et le parasite, un domaine transmembranaire et une queue cytoplasmique courte (Santos and Soldati-Favre, 2011). Les MICs vont être clivées au niveau de leurs domaines transmembranaires par les protéases rhomboïdes afin d’être excrétées (Sheiner et al. , 2010) (Figure 10B). AMA1 est une protéase particulièrement bien décrite dans la littérature pour son rôle essentiel dans le processus d’invasion de T. gondii . En effet, des études ont montré que

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Introduction l’utilisation d’un anticorps dirigé contre cette protéine diminue de 40% l’invasion de nouvelles cellules-hôtes (Hehl et al. , 2000). Cette protéase a aussi été caractérisée pour son rôle dans la réplication du parasite d’où la possibilité de double action des protéines de l’invasion pour réaliser le switch entre la forme invasive et la réplication du parasite (Santos et al. , 2011). La formation de la vacuole parasitophore fait intervenir les protéines ROP2, 4 et 5 ainsi qu’AMA1. Les protéines MICs sont alors clivées par Tg ROM4 afin d’être éliminées de la surface du parasite, ce qui permet la pénétration du parasite dans la cellule-hôte (Figure 10C). AMA1 interagit ensuite avec les protéines des rhoptries, RON2, 4 et 5. Bradley et al. ont réalisé une analyse protéomique des protéines contenues dans les rhoptries et ont ainsi mis en évidence plusieurs protéases impliquées dans l’interaction T. gondii -cellule hôte (Bradley et al. , 2005). Les ROP1, 2, 4, 8 et 9 sont impliquées dans le processus d’invasion avec également deux autres protéases, la protéine subtilisine-like Tg SUB2 (une sérine protéase) et la cathepsine B-like appelée Toxopain-1 (une cystéine protéase). Tg SUB2 a été démontrée comme indispensable pour le processus d’invasion. De plus, une mutation de son gène ne peut pas être compensée par la Tg SUB1, laquelle est sécrétée par les micromènes et a été caractérisée pour son implication dans la maturation des protéines des micronèmes (Miller et al. , 2003; Lagal et al. , 2010).

A la fin du processus d’invasion, Tg ROM5 clive les protéines MICs qui étaient restées à la surface du parasite permettant ainsi la fermeture de la vacuole parasitophore. Tg ROM4 clive AMA1 qui, par son domaine cytosolique, semble favoriser la transcription de gènes impliqués dans la réplication du parasite (Figure 10D).

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Introduction

Les protéases

I/ Généralités sur les protéases

Les protéases sont des enzymes qui hydrolysent la liaison peptidique formée entre deux acides aminés successifs. Ces enzymes sont classées en fonction de leurs homologies de structure ; il s’agit de la classification MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/) (Rawlings et al. , 2014). De plus, chaque enzyme possède une nomenclature EC basée sur le mode d’action et les sites de coupures ; il s’agit de la nomenclature EC (« enzyme commission number ») (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/) qui est détaillée au sein de la base de données ToxoDB. Cette base de données regroupe toutes les informations disponibles sur le génome de T. gondii ainsi que de nombreux logiciels permettant l’étude des gènes et de leurs protéines associées (Gajria et al. , 2008).

I-1/ Classification des protéases

- Classification MEROPS :

La base de données MEROPS, créée en 1996, classe les protéases en fonction de leur homologie de structure. Dans un premier temps, les protéases sont classées en famille, c’est-à-dire en fonction de l’homologie de séquence, de leur similitude significative dans leur séquence en acides aminés. Les protéases sont regroupées par rapport à leur type catalytique. Il existe neuf familles désignées par une lettre: Aspartique (A), Cystéine (C), Glutamique (G), Métallique (M), Asparagine (A), Mixé (P), Sérine (S), Thréonine (T) et Inconnu (U). Cette lettre est suivie par un numéro unique regroupant les enzymes ayant la même action. Dans certains cas, une lettre est également ajoutée afin de regrouper les protéases ayant le même type de site catalytique, c’est-à-dire le même positionnement des acides aminés impliqués dans la réaction enzymatique. Ainsi, par exemple, la famille M16 regroupe toutes les protéases nécessitant un ion métallique pour réaliser leur réaction enzymatique et possédant un site catalytique du type

H88 E91 H92 E162 E169 . Nous pouvons distinguer trois sous-familles : M16A, B et C.

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Introduction

- Nomenclature EC :

Cette nomenclature EC est basée sur le type de réactions catalysées. Cette classification se compose de quatre chiffres successifs écrite de la façon suivante : EC X.X.X.X.

Le premier chiffre indique le type de réaction catalysée. Il en existe 6 :

- EC 1 désigne les enzymes catalysant une réaction d’oxydo-réduction (échange d’électrons entre deux réactifs), nommées oxydo-réductases.

- EC 2 désigne les enzymes réalisant un transfert de groupements fonctionnels tel qu’un groupement méthyle entre deux molécules, appelées transférases.

- EC 3 désigne les enzymes réalisant une hydrolyse (rupture d’une liaison covalente à

l’aide d’une molécule d’H 2O), nommées hydrolases.

- EC 4 désigne les enzymes catalysant la rupture de liaisons chimiques pour des réactions autres que l’hydrolyse et l’oxydo-réduction, appelées lyases.

- EC 5 désigne les enzymes catalysant une réaction d’isomérisation (réarrangement intramoléculaire), nommées isomérases.

- EC 6 désigne les enzymes catalysant une réaction de couplage entre deux molécules en formant des liaisons covalentes, appelées ligases.

Les trois chiffres suivants donnent des informations beaucoup plus précises sur la réaction enzymatique. Ainsi, le deuxième chiffre désigne le type de groupement ou de composé impliqué dans la réaction, le troisième chiffre caractérise le type de réaction impliqué et le dernier chiffre est le numéro de série désignant une enzyme spécifiquement.

Pour illustrer ces classifications, nous pouvons prendre l’exemple de la toxolysine-4 classée comme M16A car il s’agit d’une métallopeptidase possédant un domaine HEXXH dans sa séquence en acides aminés, appelée pitrilysine. La toxolysine-4 est classée comme 3.4.24.56 au sein de la base de données ToxoDB. Il s’agit donc d’une hydrolase ayant une action sur les liaisons peptidiques, référencée comme métalloendopeptidase et permettant la dégradation de l’insuline, plus couramment appelée insulysine.

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Introduction

I-2/ Les différentes familles de protéases selon MEROPS

I-2-1/ Les protéases à acide aspartique

Les protéases à acide aspartique ont une structure très conservée composée de deux lobes et possédant une dyade catalytique composée d’acides aspartiques (un dans chaque lobe) (Dunn, 2002). Elles sont généralement synthétisées sous forme zymogène et sont activées par clivage protéolytique de leur pro-domaine inhibiteur. Ces protéases possèdent un large éventail de fonctions telles que la dégradation des nutriments et l’activation des molécules de signalisation. Ces protéases sont caractérisées par leur inhibition spécifique à la pepstatine A (Marciniszyn et al. , 1976). Au niveau de T. gondii , sept protéases à acide aspartique putatives, nommées Tg ASP1 à 7, ont été identifiées par homologie avec les protéases de cette famille présentes dans le génome humain et dans les génomes des Apicomplexa (Shea et al. , 2007) et par la présence du domaine InterProScan IPR001641 . Ces sept protéases ont été annotées comme appartenant à la famille des protéases à acide aspartique car elles possèdent les motifs caractéristiques de cette famille : les deux résidus catalytiques d'acide aspartique (dans les motifs conservés DTG/DTG or DTG/DSG), une région pro responsable de la forme zymogène inactive, une boucle de polyproline et une séquence protéique prévue pour se replier sur le site actif. Dans leur étude, Shea et al. ont caractérisé la Tg ASP1 et démontre que cette protéase est présente uniquement dans la forme invasive de T. gondii , le tachyzoïte. Ils décrivent la maturation protéolytique et la localisation subcellulaire de cette protéase dans le cycle cellulaire. Tg ASP1 montre une localisation ponctuelle associée au système sécrétoire dans les cellules, et est relocalisé ensuite au niveau du complexe de membrane interne des cellules-filles nouvellement créées pendant la réplication (Shea et al. , 2007). Aucune autre protéase à acide aspartique Tg ASP n’a été caractérisée.

I-2-2/ Les protéases à cystéine

Les protéases à cystéine, aussi appelées protéases à thiol, utilise un groupement thiol pour réaliser leur fonction d’hydrolyse. Ces protéases sont caractérisées par leur inhibition spécifique par le NEM et l’iodoacétamide.

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Introduction

T. gondii possède cinq protéases à cystéine : une cathepsine L (Tg CPL), une cathepsine B-like (Tg CPB) et trois cathepsines C-like (Tg CPC1, 2 et 3). Les cathepsines jouent un rôle dans l'invasion de la cellule-hôte, dans la réplication et l'absorption de nutriments (Dou and Carruthers, 2011). L'utilisation d’inhibiteurs spécifiques a révélé que les protéases à cystéine sont également impliquées dans la maturation des protéines des micromènes et des rhoptries ainsi que dans la biogenèse de certains organites subcellulaires (Teo et al. , 2007). T. gondii a un système endosomal très proche de ceux des cellules eucaryotes mais avec des caractéristiques qui lui sont propres ( Figure 11). Les cathepsines L et B (toxopain-1), ont été localisées dans le compartiment vacuolaire (VAC) qui a récemment été mis en évidence dans le système endosomal de T. gondii (Miranda et al. , 2010; Parussini et al. , 2010).

Figure 11 : Illustration simplifiée du système endosomal de T. gondii situé au pôle apical (Dou and Carruthers, 2011)

Abréviations utilisées : B : Cathepsine B-like, C : Cathepsine C- like, EE : Endosome précoce, ER : Réticulum endoplasmique, Go : Appareil de Golgi, IMC : complexe membranaire interne, L : Cathepsine L-like, LE : Endosome tardif, M : Micronème, MP : Microporeux, N : Noyau, PLV : Vacuole de la plante-like, PV : Vacuole parasitophore, PVM : Membrane de la vacuole parasitophore, R : Rhoptries, VAC : compartiment vacuolaire.

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Introduction

I-2-3/ Les protéases à acide glutamique

Les protéases à acide glutamique, aussi appelées protéases scytalidoglutamiques, sont nommées ainsi car elles possèdent un acide glutamique, généralement en position 136, comme résidu catalytique (Fujinaga et al. , 2004). A l’heure actuelle, dans la littérature, aucune protéase à acide glutamique n’a été mise en évidence chez T. gondii ni chez d’autres Apicomplexa . Au sein de la base de données MEROPS, deux sous-familles G1 et G2 existent. Nous pouvons citer l’exemple de la peptidase scytalidoglutamique qui a récemment été décrite chez le champignon Scytalidium lignicolum (Fujinaga et al. , 2004).

I-2-4/ Les métalloprotéases

Les métalloprotéases sont des enzymes qui utilisent systématiquement un ion métallique, tel que Zn 2+ , Mg 2+ , dans leur mécanisme enzymatique tel que la catalyse d’une liaison peptidique. Cette famille est divisée en 70 sous-familles d’après la base de données MEROPS, nommées M1 à M98 (plusieurs sous-familles ayant été regroupées). De nombreux inhibiteurs permettent d’identifier les protéases appartenant à cette famille : l’EDTA, l’1-10 phenanthroline, la bestatine et le batimastat notamment. Hooper (1994) a caractérisé quatre familles des métalloprotéases à zinc et a ainsi proposé la classification suivante ( Figure 12).

Parmi les métalloprotéases à zinc, la moitié possède une séquence consensus de type HEXXH et sont appelées les zincines formant la première famille. Les deux histidines de cette séquence constituent les deux premiers ligands de l’atome de zinc, alors que le glutamate polarise la molécule d’eau impliquée dans l’hydrolyse de la liaison peptidique. De ce fait, toutes les zincines possèdent une nomenclature EC débutant par 3.4. De plus, au sein de ces zincines, Hooper a décrit 8 sous-familles distinctes : les thermolysines, les endopeptidases 24-11, les angiotensines convertases, les aminopeptidases, les astacines, la sous-famille serratia, les reprolysines et les matrixines.

La seconde famille décrite par Hooper est représentée par les inverzincines caractérisées par un motif inversé de fixation au zinc HXXEH. Il s’agit d’un petit groupe de métalloprotéases à zinc qui ont également été décrites chez l’homme, le rat et la drosophile (Becker and Roth, 1992). Par exemple, une enzyme de cette famille, appelée pitrilysine

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Introduction

(EC 3.4.24.55), a été décrite chez Escherichia coli avec la séquence consensus GXXHBXEHBXBXG (Hooper, 1994).

La troisième famille correspond aux carboxypeptidases caractérisées par un domaine de fixation au zinc HXXE. Deux carboxypeptidases A et B font parties de ce groupe et possèdent le domaine DXGBHXREWBXXA. D’autres carboxypeptidases ont été décrites chez certaines bactéries telles que Thermoactinomyces vulgaris et Streptomyces griseus (Hooper, 1994).

La quatrième famille est celle des DD-carboxypeptidases avec un motif de fixation au zinc plus court HXH. Ces enzymes sont appelées ainsi car elles clivent la D-alanyl-D-alanine (Dideberg et al. , 1980). Une de ces enzymes a été séquencée et cristallisée chez Streptomyces albus (Joris et al. , 1983; Labischinski et al. , 1984).

Figure 12 : Classification des métalloprotéases à zinc (d’après Hooper, 1994)

La classification a été réalisée en fonction de la séquence en acides aminés permettant la fixation de l’ion zinc. Les caractères en italique et en gras représentent les acides aminés identifiés pour cette liaison au zinc, ceux en gras sont impliqués dans la fonction de catalyse. La lettre B représente un acide aminé non polaire, et la lettre X est un acide aminé quelconque.

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Introduction

A ce jour, cinq métalloprotéases ont été décrites chez T. gondii : une aminopeptidase (Berthonneau et al. , 2000), deux toxolysines (Hajagos et al. , 2012; Laliberté and Carruthers, 2011), une leucine aminopeptidase (LAP) (Jia et al. , 2010) et une FtsH1 (Karnataki et al. , 2009).

Les métalloprotéases présentes chez T. gondii seront plus précisément décrites dans le chapitre suivant « Les métalloprotéases présentes chez T. gondii ».

I-2-5/ Les protéases à asparagine

Récemment, Rawlings et al. ont mis en évidence une nouvelle famille de protéases, les protéases à asparagine. En effet, ces protéases ont la particularité de réaliser des auto-clivages d’une asparagine au niveau d’un groupement carbonyle. Elles possèdent une activité lyase, d’où leur nomenclature EC 4. Nous pouvons citer l’exemple de la protéase à asparagine, Tsh, présente chez Escherichia coli où son précurseur est auto-clivé pour libérer un large domaine C-terminal jouant le rôle d’auto-transporteur (Rawlings et al. , 2011). A l’heure actuelle, dans la littérature, aucune protéase de T. gondii , ni d’autres Apicomplexa , n’a encore été caractérisée comme appartenant à cette famille.

I-2-6/ Les protéases à site catalytique mixés

Les protéases de ce groupe possèdent des sites catalytiques dits mixés car elles possèdent des cystéines, des sérines et des thréonines. Au sein de la base de données MEROPS, une seule protéase est décrite dans ce groupe : l’aminopeptidase DmpA présente chez la bactérie Ochrobactrum anthropi (Fanuel et al. , 1999). A l’heure actuelle, dans la littérature, aucune protéase de T. gondii , ni d’autres Apicomplexa , n’a encore été caractérisée comme appartenant à cette famille.

I-2-7/ Les protéases à sérine

Les protéases à sérine sont caractérisées par une triade catalytique composée de chaînes latérales contenant trois acides aminés : une histidine (His 57), un acide aspartique (Asp 102) et une sérine (Ser 195). Le Fluorure de PhénylMéthylSulfonyle (PMSF) est un inhibiteur bien connu de cette famille (Hedstrom, 2002). Cette famille se compose de deux

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Introduction parties selon la structure des protéines : les chymotrypsines et les subtilisines (Madala et al. , 2010). Chez T. gondii , les protéases à sérine sont notamment représentées par les protéines rhomboïdes-like (M Santos et al. , 2012) dont la structure est représentée dans la figure 13. Ces protéases permettent l’activation et donc la libération des protéines membranaires dans le but de déclencher une cascade de signalisation cellulaire pouvant conduire à la prolifération du parasite. Par exemple, la protéase MPP1 (Mitochondrial Processing Protease-1) a été montrée comme pouvant cliver Tg MIC2 (Brossier et al. , 2003), Tg MIC6 (Howell et al. , 2005), Tg MIC12 (Opitz et al. , 2002) et Tg AMA1 (Zhou et al. , 2004) qui eux sont impliqués dans des étapes distinctes du processus d'invasion.

Figure 13 : Représentation schématique de la structure d’une protéine de type rhomboïde-like située en intramembranaire (M Santos et al. , 2012)

I-2-8/ Les protéases à thréonine

Ces enzymes sont caractérisées par la présence d’un acide aminé thréonine au niveau de leur site actif. Selon la description de la base de données MEROPS, cette famille pourrait avoir une fonction potentielle dans le renouvellement des protéines intramembranaires. A l’heure actuelle, dans la littérature, aucune protéase de T. gondii , ni d’autres Apicomplexa , n’a encore été caractérisée comme appartenant à cette famille.

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Introduction

II/ Les métalloprotéases présentes chez T. gondii

II-1/ Métalloprotéases : étude in silico chez T. gondii

Au sein de notre laboratoire, une étude in silico du génome de T. gondii , à partir de la base de données ToxoDB, a été réalisée. Les métalloprotéases représentent la famille de peptidases la plus diversifiée au niveau de leurs actions catalytiques et sont classées selon la base de données MEROPS. La plupart des métalloprotéases présentent un domaine pentapeptidique très conservé HEXXH (Jongeneel et al. , 1989). Les familles de métallopeptidases homologues sont toutes regroupées dans un clan, celui-ci est basé sur des similitudes dans le repli des protéines, l'arrangement des résidus du site actif et des motifs dans la séquence. En analysant la base de données ToxoDB et en accord avec MEROPS, seules seize familles de métallopeptidases sont représentées chez T. gondii : M1, M3, M13, M14, M16, M17, M18, M20, M22, M24, M28, M41, M48, M50, M67 et M76 ( Tableau I ), données non publiées.

Afin de classer et d’identifier toutes les familles des métalloprotéases putatives de T. gondii présentes dans son génome, nous avons recherché les différentes signatures des métalloprotéases (motifs PFAM) (http://pfam.sanger.ac.uk/) dans la base de données ToxoDB. Ainsi, les motifs consensus des peptidases prédites ont ensuite été confrontés à l’algorithme Interpro Search (http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/), logiciel regroupant de nombreux domaines protéiques consensus chez différentes espèces. Le domaine peptidique reconnu a été retenu pour permettre le classement des métallopeptidases toxoplasmiques (Figure 14 : Exemple de classification pour la famille M1 (aminopeptidase N)).

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Introduction

GAMEN

LLLC

D

Figure 14 : Alignements multiples de séquences en acides aminés de l’aminopeptidase N (famille M1) de T. gondii (TGME49_024460, TGME49_024350 et TGME49_021310) et de l’aminopeptidase N humaine (Genbank™ accession no. P15144) Le motif GAMEN, caractéristique de la famille M1 aminopeptidase, est très bien conservé. La position de l’ion zinc putatif (L), du résidu glutamyl conservé impliqué dans l’activité catalytique (C) et le donneur de proton putatif conservé (D) sont indiquées en gras au-dessus des séquences. Les résidus identiques sont indiqués en fond noir, alors que les résidus similaires sont en fond gris. Le nombre d'acides aminés pour chaque séquence est indiqué sur la gauche. La position des « gap » est indiquée par des traits pleins. Les alignements ont été effectués en utilisant l'algorithme ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) avec la matrice BLOSUM 62.

A la fin de cette étude, 50 métalloprotéases ont été identifiées dans le génome de Toxoplasma dont 5 sont publiées et les 45 autres qui ont été analysées par PCR et RT-PCR afin de confirmer leur présence et leur expression au niveau de la souche de référence RH (données non publiées). Elles sont regroupées dans 16 familles décrites dans la base de données MEROPS : trois M1 (aminopeptidase N), trois M3 (thimet oligopeptidase), une M13 (néprilysine), quatre M14 (carboxypeptidase), onze M16 (pitrilysine), une M17 (leucyl aminopeptidase), une M18 (aminopeptidase I), deux M20 (glutamate carboxypeptidase), deux M22 (O-sialoglycoprotein endopeptidase), neuf M24 (méthionyl aminopeptidase), une M28 (aminopeptidase S), trois M41 (aminopeptidase FtsH), une M48 (Ste 24 aminopeptidase), une M50 (peptidase S2P), six M67 (peptidase Poh1) et une M76 (Atp23 peptidase) (Tableau I ).

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Introduction

Tableau I : Métalloprotéases putatives de T. gondii Nous avons utilisé les motifs PFAM (http://pfam.sanger.ac.uk/) en association avec la base de données MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/) et la base de données ToxoDB (http://www. Toxodb.org/, version 7.2) pour déterminer les familles. Les motifs peptidases putatifs ont été étudiés en utilisant l’algorithme InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/) et le classement des familles est fondé sur la base de données MEROPS.

Famille Nombre d’acides Sous-famille identifiée Nom Description dans ToxoDB (MEROPS) aminés dans MEROPS (Blast)

TGME49_224350 1419 aminopeptidase N, putative M1

M1 TGME49_221310 1069 aminopeptidase N protein M1A

TGME49_224460 970 aminopeptidase N, putative M1B TGME49_226420 667 peptidase family M3 protein M3 M3 TGME49_272670 1094 peptidase family M3 protein M3A TGME49_216150 506 peptidase family M3 protein M3B M13 TGME49_295640 1038 peptidase family M13 protein M13 TGME49_265780 2803 Flagellar/basal body protein M14 TGME49_271870 1321 zinc carboxypeptidase superfamily protein M14A M14 TGME49_253170 2204 zinc carboxypeptidase, putative M14B TGME49_202910 318 zinc carboxypeptidase superfamily protein M14C

TGME49_202680 563 peptidase M16, alpha subunit, putative M16B

TGME49_253890 1604 peptidase M16 inactive domain-containing protein M16B TGME49_235680 1692 peptidase M16 inactive domain-containing protein M16B TGME49_244480 357 peptidase M16 inactive domain-containing protein M16A TGME49_206510 2340 Toxolysin TLN4 (TLN4) M16A M16 TGME49_257010 1023 Sporozoite developmental protein M16A TGME49_269885 1645 Rhoptry metalloprotease toxolysin TLN1 (TLN1) M16A TGME49_227948 1306 Peptidase M16 inactive domain containing-protein M16C

TGME49_236210 509 Peptidase M16 family protein, putative M16B

TGME49_314850 2174 hypothetical protein M16A TGME49_214490 1353 Peptidase M16 inactive domain containing-protein M16C M17 TGME49_290670 781 leucyl aminopeptidase LAP (LAP) M17 M18 TGME49_297970 508 aspartyl aminopeptidase M18 M20 TGME49_213060 3086 WD domain, G-beta repeat-containing protein M20A TGME49_213520 514 peptidase M20D, amidohydrolase M20A

M22 TGME49_202310 580 O-sialoglycoprotein endopeptidase X

TGME49_274110 1659 glycoprotease family protein X

M24 TGME49_248850 416 methionine aminopeptidase M24 TGME49_211330 697 methionine aminopeptidase M24A

TGME49_257730 484 methionine aminopeptidase, type I, putative M24B

TGME49_305460 480 putative methionine aminopeptidase 2 M24A TGME49_205460 480 methionine aminopeptidase, type II, putative M24C

TGME49_279390 462 proliferation-associated protein 2G4, putative M24D

TGME49_221670 1198 transcriptional elongation factor FACT140 M24 TGME49_261600 886 creatinase domain-containing protein M24B

TGME49_233310 599 peptidase D, putative M24B

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Introduction

Famille Nombre d’acides Nom Description dans ToxoDB Sous-famille (MEROPS) aminés

M28 TGME49_225850 1555 peptidase, M28 family protein M28 ATP-dependent metallopeptidase HflB subfamily TGME49_202630 1188 M41 protein ATP-dependent metallopeptidase HflB subfamily M41 TGME49_300020 1021 M41 protein TGME49_259260 1250 membrane protein FtsH1 M41

M48 TGME49_221170 432 CAAX metallo endopeptidase M48A

M50 TGME49_266140 378 peptidase, M50 family protein M50

TGME49_251500 600 eukaryotic initiation factor-3, subunit 3, putative M67A

TGME49_231970 2538 pre-mRNA processing splicing factor PRP8 (PRP8) M67C

TGME49_228190 346 eukaryotic initiation factor-3, subunit 5, putative M67A M67 TGME49_269250 343 Mov34/MPN/PAD-1 family protein M67A TGME49_269840 314 proteasome regulatory subunit M67A TGME49_308590 489 Mov34/MPN/PAD-1 family protein M67A M76 TGME49_257110 618 hypothetical protein M76

Afin d’illustrer ce tableau regroupant toutes les métalloprotéases retrouvées chez T. gondii , chaque famille va être détaillée au travers d’un ou plusieurs exemples soit chez T. gondii lorsqu’elle est présente, soit chez un autre protozoaire (Plasmodium falciparum , Neospora caninum …) lorsqu’elle est décrite.

- Famille M1 :

La famille M1 est composée exclusivement d’aminopeptidases. Chez T. gondii , une seule protéase est décrite comme telle grâce à l’utilisation d’inhibiteurs : cette protéase de 110 kDa est inhibée par les principaux inhibiteurs de métalloprotéases, le o-phenanthroline et l’EDTA alors que le phosphoramidon et d’autres inhibiteurs des sérines, cystéines et aspartiques protéases n’ont aucun effet sur son activité enzymatique (Berthonneau et al. , 2000). La fonction de cette aminopeptidase n’est pas encore décrite. Par rapport à sa masse moléculaire décrite, cette protéase pourrait correspondre à la TGME49_224460 de notre tableau ci-dessus. Cette aminopeptidase présente une nomenclature EC 3.4.11.2 indiquant qu’elle possède une fonction aminopeptidase qui permet la libération d’une alanine du côté N-terminal d’un peptide.

En parallèle, chez Plasmodium falciparum , plusieurs aminopeptidases ont été décrites comme jouant un rôle dans le catabolisme de l’hémoglobine vacuolaire (Dalal and Klemba,

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Introduction

2007). Plus précisément, l’aminopeptidase PfA-M1 possédant le domaine GAMEN caractérisée comme métallopeptidase à zinc, a été identifiée au stade schizonte érythrocytaire et son inhibition par la bestatine empêche la croissance parasitaire (Florent et al. , 1998; Jones et al. , 2011).

- Famille M3 :

La famille M3 regroupe toutes les oligopeptidases . Chez T. gondii , une oligopeptidase a été mise en évidence lors de l’identification de gènes régulateurs du développement de ce parasite. Cette oligopeptidase a été identifiée par l’utilisation de micro-arrays lors d’une étude montrant que cette enzyme synthétisée au stade bradyzoïte est impliquée dans la régulation des voies métaboliques spécifiques au bradyzoïte (Cleary et al. , 2002).

De plus, dans la base de données ToxoDB, seule la TGME49_272670, protéase de la famille M3, est caractérisée par sa nomenclature EC 3.4.24.59 avec une localisation mitochondriale. A l’heure actuelle, cette protéase n’a pas encore été plus précisément décrite dans la littérature.

- Famille M13 :

Au sein du parasite T. gondii , la famille M13 est présente. Cette famille est composée des protéases appelées néprilysines, d’après la base de données MEROPS. Cette famille est actuellement très peu décrite quel que soit le parasite étudié. Sa caractéristique principale réside dans sa structure globale : au niveau de son extrémité N-terminale se situe une courte séquence cytoplasmique (27 résidus), suivie d'un segment hydrophobe (23 résidus) qui permet à l'enzyme de s’ancrer à la membrane cellulaire. La majeure partie de la protéine, située au niveau extracellulaire, comprend deux domaines renfermant une grande cavité centrale contenant le site actif. Le domaine situé à l’extrémité N-terminale présente un repli qui rappelle celui présent dans les thermolysines et il contient les résidus du site actif. Un second domaine contrôle l'accès des substrats au site actif et empêche le clivage de protéines.

Cependant, nous pouvons noter que la TGME49_295640 a été décrite dans ToxoDB avec une nomenclature EC 3.4.24.71 lui conférant une fonction potentielle d’endothéline-convertase.

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Introduction

- Famille M14 :

Actuellement quatre protéines sont décrites dans ToxoDB comme appartenant à la famille M14 car elles présentent des fonctions carboxypeptidases. Elles peuvent donc cliver des acides aminés au niveau C-terminal d’une séquence protéique grâce à leur site de reconnaissance spécifique des groupements carbonyles libres.

Deux protéases sont également décrites par leur nomenclature EC, la TGME49_253170 et la TGME49_202910. La TGME49_253170 est caractérisée comme 3.4.17.12 (carboxypeptidase M) car elle clive les acides aminés arginine ou lysine en C-Terminal. La TGME49_202910, une 3.4.17.1 (carboxypeptidase A), clive tous les autres acides aminés situés en C-terminal sauf l’arginine, la lysine et la proline (Voet and Voet, 2005).

- Famille M16 :

Cette famille regroupe onze protéases caractérisées par un site catalytique dit inversé HXXEH. L’acide aminé glutamate dans la séquence HXXEH est indispensable pour la réaction de catalyse.

Cette famille est composée de trois sous-familles appelées M16A, B et C. La différence réside dans la composition précise du site catalytique (Figure 15).

Figure 15 : Représentation schématique des domaines présents au niveau des protéases des familles M16A, B et C (d'après Ohtsuka et al. , 2009) Le site de fixation au zinc est représenté par des pointillés. IDE : insulin-degrading enzyme ; Ptr : pitrilysine; βMPP : sous-unité β de la MPP (mitochondrial processing peptidase) ; PreP : presequence peptidase; EuPtr : eupitrilysine.

Le point commun entre chaque famille est la présence du site de fixation au zinc

HXXEH 74 E. Les membres de la famille M16A et M16C sont composés de quatre domaines dont un seul possède le site de fixation au zinc, alors que les membres de la famille M16B

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Introduction sont des hétérodimères composés de deux sous-unités identiques dont une possède le site de fixation au zinc.

La protéase de la famille M16A la plus représentative est l’insulinase humaine (IDE). Cette métalloprotéase à zinc est impliquée dans la dégradation de l’insuline et de la β- amyloïde (Shen et al. , 2006). Des insulinases sont également présentes chez différents parasites et notamment chez T. gondii où elles sont localisées dans les rhoptries (Bradley et al. , 2005).

En ce qui concerne la famille des M16B, les MPP (Mitochondrial Processing Protease) sont très représentatives. Comme leur nom l’indique, elles sont impliquées dans le processus protéolytique de la mitochondrie. Elles agissent avec les IMP (inner membrane peptidase) et les MIP (mitochondrial intermediate peptidase) afin de permettre l’adressage des protéines dans les différents compartiments de la mitochondrie (Gakh et al. , 2002).

A l’heure actuelle chez T. gondii , deux métalloprotéases ont été décrites comme appartenant à la famille des M16A : la toxolysine-1 (TGME49_269885) et la toxolysine-4 (TGME49_206510).

La toxolysine-1 est une métalloprotéase à zinc sécrétée par les rhoptries. Elle possède un pro-domaine situé dans sa région N-terminale, responsable de son adressage à cette organelle. De plus, Hajagos et al ont montré que cette protéase n’était pas essentielle pour la croissance in vitro ou la virulence in vivo grâce à la construction de mutants pour le gène codant cette protéase (Hajagos et al. , 2012). Son mécanisme d’action n’a pas encore été mis en évidence.

La toxolysine-4, stockée dans les micronèmes, est sécrétée après une forte augmentation du calcium. Cette protéase pourrait donc avoir un rôle au cours de l’invasion où une augmentation du calcium est impliquée dans l’attachement du parasite à la cellule-hôte. De plus, cette protéase semble posséder une maturation complexe car six formes de cette protéase ont été mises en évidence allant de 260 kDa (forme précurseur probable) à 34 kDa (forme de dégradation) (Laliberté and Carruthers, 2011).

La présequence PreP est une enzyme appartenant à la famille M16C présente chez Arabidopsis thaliana . Cette métalloprotéase est impliquée dans la dégradation des peptides d’adressage dans la mitochondrie et les chloroplastes (Moberg et al. , 2003). Cette enzyme a été cristallographiée et son mécanisme d’action détaillé. En effet, elle est composée de deux sous-unités (Figure 16A) et son mécanisme peut être décrit comme une « ouverture-

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Introduction fermeture » ( Figure 16B) (Johnson et al. , 2006). Le substrat peut se fixer à cette enzyme quand celle-ci est en position dite ouverte. Il y a alors fermeture, c’est-à-dire repli des deux sous-unités l’une vers l’autre permettant la dégradation du substrat puis réouverture de l’enzyme.

A B

Figure 16 : Représentation schématique de la structure 3D de la Presequence PreP chez Arabidopsis thaliana (A) et son mécanisme d’action (B) (Johnson et al. , 2006) La structure 3D a été obtenue par superposition de deux moitiés de l’enzyme MPP (A). Le mécanisme d’action proposé par la Presequence PreP est indiqué dans le schéma B.

De plus, une protéine de la famille M16C, la falcilysine (PF3D7_1360800) a été particulièrement bien décrite chez Plasmodium falciparum . Cette protéase a plusieurs fonctions d’où l’existence de deux nomenclatures EC différentes décrites dans EuPathDB : 3.4.24 (métalloendopeptidases) et 4.4.1.21 (S-ribosylhomocysteine lyase).

Cette protéase est présente dans la vacuole parasitophore et est impliquée dans le catabolisme de l’hémoglobine (Eggleson et al. , 1999; Murata and Goldberg, 2003). D’après une étude réalisée par Ralph (2007), cette enzyme possède différentes isoformes dérivant de multiples adressages au sein du parasite Plasmodium falciparum (Figure 17). Son peptide signal est clivé, permettant ainsi son adressage au niveau de la vacuole parasitophore et de l’apicoplaste ( Figure 17A). De plus, après des modifications post-traductionnelles telles que des phosphorylations ou glycosylations, la protéine pourra être adressée dans un autre compartiment ( Figure 17B). Le clivage de peptide responsable de l’adressage à la vacuole parasitophore et à l’apicoplaste (épissage alternatif) va permettre un nouvel adressage au

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Introduction niveau de la membrane de la vacuole parasitophore (Figure 17C). La protéine pourra également être traduite différentiellement à partir d’un codon d’initiation situé plus en aval dans la séquence codant pour le peptide signal, il y a alors un raccourcissement de la séquence et donc un adressage différent à la mitochondrie ( Figure 17D). Pour finir, un dernier adressage est possible au niveau de la mitochondrie lorsque la protéine est tronquée (épissage alternatif) (Figure 17E).

Figure 17 : Schématisation des différentes isoformes potentielles de la falcilysine synthétisée chez Plasmodium falciparum en fonction de ces différents adressages (Ralph, 2007) A : Adressage à la vacuole parasitophore ou à l’apicoplaste ; B : Adressage à la vacuole parasitophore ou à l’apicoplaste avec la présence de modifications post-traductionnelles ; C : Adressage à la membrane de la vacuole parasitophore ; D : Adressage mitochondrial d’une protéine tronquée ; E : Adressage mitochondrial.

Ces différents épissages permettent de conclure que la falcilysine peut être présente dans trois compartiments parasitaires : la vacuole parasitophore, l’apicoplaste par clivage du peptide signal et la mitochondrie par des épissages plus complexes (Figure 18).

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Introduction

Figure 18 : Adressage multiple de la falcilysine au sein du parasite Plasmodium falciparum adressages (Ralph, 2007)

- Famille M17 :

La famille M17 est composée d’aminopeptidases à leucine. Cette famille est la première à avoir été décrite pour son besoin en deux ions métalliques nécessaires à son activité de catalyse (Burley et al. , 1990). Ces deux ions sont dits « co-catalytiques ». L’inhibiteur caractéristique de cette famille est la bestatine.

Une LAP (Leucine AminoPeptidase) a été décrite chez T. gondii . Il s’agit d’une exopeptidase localisée dans le cytoplasme des parasites. Cette protéase a été caractérisée comme appartenant à la famille M17 par son inhibition par la bestatine. Son rôle reste encore à déterminer (Jia et al. , 2010) .

Nous pouvons également noter qu’une M17 a été mise en évidence chez Plasmodium falciparum . Elle est présente à tous les stades intra-érythrocytaires et particulièrement au stade trophozoïte où la synthèse protéique est augmentée. Elle semble être impliquée dans la régulation du stock d’acides aminés libres et de ce fait, pourrait être une nouvelle cible thérapeutique (Maric et al. , 2009; McGowan et al. , 2010; Skinner-Adams et al. , 2010).

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Introduction

- Famille M18 :

Cette famille se compose d’aspartyl aminopeptidases (3.4.11.21). Ces enzymes clivent des acides aminés aspartiques ou glutamiques situés en N-terminal d’une chaîne peptidique. Une M18 (PfM18AAP) a été décrite chez Plasmodium falciparum et est synthétisée aux stades érythrocytaires. Elle est exprimée dans le cytosol des parasites et est exportée au niveau de la membrane de la vacuole parasitophore. Elle agit en synergie avec d’autres aminopeptidases afin de réaliser la dégradation de protéines telle que l’hémoglobine. Sa délétion est létale pour le parasite, provoquant des dommages intracellulaires et fait donc d’elle une cible thérapeutique potentielle (Teuscher et al. , 2007; Spicer et al. , 2014). A l’heure actuelle, dans la littérature, aucune protéase de cette famille n’a été décrite chez T. gondii .

- Famille M20 :

Cette famille comprend des carboxypeptidases à glutamate. Comme la famille M17, elle se caractérise par la présence d’ions métalliques co-catalytiques. A l’heure actuelle, dans la littérature, aucune protéase de cette famille n’a été décrite chez T. gondii .

- Famille M22 :

Cette famille est composée de protéines fixant la fétuine, une protéine synthétisée par le foie et retrouvée dans le sang. Une protéase de cette famille a été identifiée putativement chez T. gondii , pour ses capacités à fixer en intracellulaire la fétuine (Gross et al. , 1993) mais son rôle plus précis n’a pas été décrit. Une protéase de cette famille a été mise en évidence chez Neospora caninum avec une masse moléculaire de 65 kDa, fixant la fétuine, isolée par chromatographie d’affinité et localisée au pôle apical des tachyzoïtes. Elle est libérée de façon continue dans le milieu environnant et possède également une activité gélatinolytique mise en évidence par zymographie. Cette métalloprotéase permet la dégradation de protéines glycosylées et semble être impliquées dans l’interaction hôtes-parasites (Vonlaufen et al. , 2007).

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Introduction

- Famille M24 :

Les protéases appartenant à cette famille sont appelées des méthionines aminotransférases. Elles permettent de cliver des résidus méthionine présents au niveau N-terminal. Ces sont des protéases impliquées dans la biosynthèse des protéines (Cleary et al. , 2002). En effet, il a été mis en évidence que la méthionine aminopeptidase de type 2 (MetAP2) agissait comme inhibiteur de la phosphorylation du facteur de transcription eIF2 α et les auteurs ont conclu qu’elle pourrait jouer un rôle crucial dans la prolifération des cellules endothéliales (Griffith et al. , 1997) . A l’heure actuelle, dans la littérature, aucune protéase de cette famille n’a été décrite chez T. gondii .

- Famille M28 :

Cette famille est composée d’aminopeptidases et de carboxypeptidases ayant pour particularité deux ions zinc co-catalytiques. Nous pouvons citer l’exemple d’une M28 (Ybr074) présente dans le réticulum endoplasmique de la levure Saccharomyces cerevisiae (Hecht et al. , 2013). Cette protéase est une protéine transmembranaire glycosylée dont la fonction n’a pas encore été détaillée (Hecht et al. , 2013). A l’heure actuelle, dans la littérature, aucune protéase de cette famille n’a été décrite chez T. gondii .

- Famille M41 :

Les protéases de cette famille sont des métalloprotéases ATP-dépendantes, aussi appelées FtsH peptidases. Ces protéases sont impliquées dans la dégradation des protéines non-thermostables, leur activité augmente quand la température augmente ou lors d’un stress osmotique. Ces protéases jouent donc un rôle dans la protection contre le stress environnemental. Une protéase M41 a été décrite chez T. gondii , il s’agit de la FtsH1. Cette protéase est une hexamère transmembranaire contenant un domaine AAA (ATPases associated with a variety of cellular activities) nécessaire à sa fonctionnalité. Elle est localisée au niveau des membranes de l’apicoplaste et la mitochondrie. Par la technique de pulse-chase, les auteurs ont montré que deux clivages étaient réalisés sur cette séquence protéique : un premier en

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Introduction

N-terminal puis en second en C-terminal. Cela permet l’adressage spécifique de cette FtsH1 (Karnataki et al. , 2007, 2009). A l’heure actuelle, sa fonction n’a pas encore été déterminée.

- Famille M48 :

La famille M48 se compose de métalloendopeptidases. Le site catalytique est composé d’un ion zinc tétraédrique coordonné par deux histidines dans le motif HEXXH, un troisième résidu encore indéterminé et une molécule d'eau. Le glutamate à l'intérieur du motif HEXXH est supposé être un résidu catalytique. La mutagenèse dirigée des résidus glutamate et histidine du motif HEXXH de l’endopeptidase Ste24, présente chez Saccharomyces cerevisiae , a confirmé que ces deux acides aminés étaient essentiels pour la réaction de catalyse (Fujimura-Kamada et al. , 1997). A l’heure actuelle, dans la littérature, aucune protéase de cette famille n’a été décrite chez T. gondii .

- Famille M50 :

La famille M50 se compose de métalloendopeptidases à zinc. Le site catalytique est représenté par le motif HEXXH dont le glutamate semble être indispensable si nous nous référons à toutes les autres métalloendopeptidases décrites dans les autres familles. Mais cette hypothèse n’a pas été vérifiée par mutagenèse dirigée sur la peptidase S2P (Site 2 peptidase) présente chez l’homme. Après remplacement du glutamate du motif HEXXH par un acide aspartique, l’activité de la peptidase S2P est conservée (Yu and Kroos, 2000). A l’heure actuelle, dans la littérature, aucune protéase de cette famille n’a été décrite chez T. gondii .

- Famille M67 :

La famille M67 se compose d’isopeptidases permettant la libération de molécules d’ubiquitine sur les protéines ubiquitinilées. Le motif caractéristique de leur site catalytique est HXH où l’ion zinc est également indispensable pour la fonctionnalité de l’enzyme. Une protéase de la famille M67 a été identifiée chez Saccharomyces cerevisiae , la PSMD14 dont la fonction n’a pas été caractérisée. Six protéases de cette famille ont été identifiées in silico comme appartenant à cette famille mais aucune n’a été décrite dans la littérature à ce jour.

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Introduction

- Famille M76 :

La famille M76 se compose d’endopeptidases qui ont pour fonction de réaliser la synthèse d’ATP à partir d’ADP et de phosphate et ce processus s’effectue au niveau de la mitochondrie. Ces enzymes contiennent un motif de fixation au zinc HEXXH. L’Atp23 (aminal-type) peptidase a été décrite chez l’homme comme appartenant à cette famille et jouant un rôle de protéine chaperonne pour l’enzyme F1Fo-ATP synthase, enzyme bien décrite dans la synthèse d’ATP (Osman et al. , 2007). A l’heure actuelle, dans la littérature, aucune protéase de cette famille n’a été décrite chez T. gondii .

II-2/ Rôles des métalloprotéases de T. gondii

T. gondii est un parasite intracellulaire obligatoire qui peut traverser de nombreuses barrières biologiques telles que la barrière intestinale, la barrière endothéliale, la barrière méningo-encéphalique ou encore la barrière placentaire. Pour ce faire, la synthèse de métalloprotéases semble nécessaire pour dégrader les différents composants de ces membranes. T. gondii est capable de traverser la membrane basale afin de diffuser dans tout l’organisme (Barragan and Sibley, 2003). La membrane basale est composée de la laminine, des collagènes de type III, IV et VII, ainsi que des glycosaminoglycanes. De plus, pour se déplacer, T. gondii doit passer au sein de la matrice extracellulaire composée d’élastine et de glycoprotéines. Toutes ces molécules peuvent être clivées par des gélatinases ou élastases par exemple. Les plus connues dans le génome humain sont les MMP-2 et -9 aussi appelées gélatinases A et B. Ces enzymes ont été classées au sein de la famille M10 (métalloendopeptidases) selon la classification MEROPS. D’après l’étude in silico décrivant toutes les métalloprotéases putatives et/ou publiées dans le génome de T. gondii (Tableau I ), nous remarquons qu’aucune protéase de la famille M10 n’est présente. Nous pouvons donc en déduire que la traversée des barrières biologiques réalisés par ce parasite implique d’autres familles de protéases telles que les enzymes possédant une activité gélatinolytique et/ou élastinolytique. Ahn (2001) a mis en évidence plusieurs protéases (80, 70 et 42 kDa) à activité gélatinolytique. Ces gélatinases (EC 3.4.24.24) ont été décrites dans le milieu conditionné de tachyzoïtes de la souche RH.

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Introduction

Leur étude porte principalement sur la protéase de 42 kDa qui a été caractérisée comme une métalloprotéase car sa fonction de gélatinase est inhibée en absence d’ions calcium. Cependant, par l’utilisation de différents inhibiteurs, cette même enzyme semble appartenir à la famille des sérines protéases (Ahn et al. , 2001). Cet exemple nous montre la bi-fonctionnalité de certaines protéines présentes dans le génome de T. gondii . La gélatinase de 80 kDa a également été étudiée et classée dans la famille des métalloprotéases calcium-dépendantes (Song and Nam, 2003). Sa fonction n’a été encore définie. A ce jour, le rôle de la gélatinase de 70 kDa n’a pas été décrit.

A l’heure actuelle, cinq métalloprotéases sont décrites chez T. gondii : - une aminopeptidase N (famille M1, aminopeptidase N ( Homo sapiens )) (Berthonneau et al. , 2000), - deux toxolysines (famille M16, pitrilysine ( Homo sapiens )) (Hajagos et al. , 2012; Laliberté and Carruthers, 2011), - une leucine aminopeptidase (famille M17, leucyl aminopeptidase ( Bos taurus )) (Jia et al. , 2010), - et une FtsH1 peptidase (famille M41, FtsH peptidase ( Escherichia coli )) (Karnataki et al. , 2007, 2009).

Parmi ces cinq métalloprotéases, seules deux ont été démontrées comme impliquées dans le processus d’invasion de T. gondii au sein de la cellule-hôte ; il s’agit des toxolysines-1 et -4 (Hajagos et al. , 2012; Laliberté and Carruthers, 2011).

Au sein de notre laboratoire (Thèse d’E. Buache), des travaux réalisés sur la modulation des propriétés d’adhésion et d’invasion de cellules THP-1 infestées par T. gondii ont permis de mettre en évidence une contre-régulation des pro-MMP-2 et -9. Cette étude a également permis de mettre en évidence une gélatinase d’une masse moléculaire apparente de 94 kDa. Cette protéase à activité gélatinolytique sécrétée par le parasite T. gondii pourrait donc jouer un rôle dans la dégradation du collagène présent dans le tissu conjonctif et donc dans la traversée des barrières biologiques. L’étude des autres métalloprotéases potentielles serait donc intéressante pour identifier les protéases impliquées dans les mécanismes responsables de la traversée des barrières biologiques.

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Introduction

But de l’étude

L’objectif de ce travail a été d’identifier et de caractériser des métalloprotéases présentes dans le génome de T. gondii par des approches biochimiques, protéomiques et de biologie moléculaire.

Dans une première partie, nous avons caractérisé de manière physico-chimique et biochimique une gélatinase sécrétée par le parasite T. gondii . Nous avons ainsi étudié son activité enzymatique sur différents substrats, déterminé expérimentalement sa masse moléculaire et, grâce à l’utilisation d’inhibiteurs, classé cette enzyme dans la famille des métalloendopeptidases de type MMP-9 like.

Dans une seconde partie, nous avons mis en place une stratégie afin de purifier la gélatinase précédemment mise en évidence. La spectrométrie de masse nous a permis d’identifier des séquences peptidiques appartenant à la métalloprotéase TGME49_227948. Nous avons ensuite caractérisé toutes les protéases de la famille M16 présentes dans le génome de T. gondii . Grâce à la caractérisation in silico de la TGME49_227948, deux anticorps ont été synthétisés permettant de reconnaître spécifiquement une région proche du site catalytique et un domaine situé côté C-terminal de la séquence protéique. Le premier anticorps nous a permis d’émettre des hypothèses sur la fonction de la TGME49_227948.

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MATERIELS ET METHODES

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Matériels et Méthodes

Culture cellulaire

I/ La lignée cellulaire Vero

I-1/ Description de la lignée cellulaire

La lignée cellulaire Vero a été isolée à partir de cellules épithéliales de rein de singe vert d’Afrique Cercopithecus aethiops (CCL-81, American Type cellular Collection Rockville, MA, USA). La lignée a été développée le 27 mars 1962 par Y. Yasumura et Y. Kawakita à l’Université de Chiba (Japon). Il s’agit de cellules adhérentes fusiformes qui prolifèrent en formant un tapis cellulaire qui sont un excellent hôte pour la multiplication rapide des tachyzoïtes de T. gondii (Saadatnia et al. , 2010).

I-2/ Entretien de la lignée cellulaire

Les cellules adhérentes sont cultivées en milieu IMDM/Glutamax ® (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium ) (Invitrogen, France) additionné de 5% (v/v) de Sérum de Veau Fœtal (SVF) (Biowest, France) décomplémenté 30 min à 56°C et filtré, et additionné de 1% d’antibiotiques (pénicilline-streptomycine) (Invitrogen). Les cellules sont entretenues dans des flacons de 25 cm 2 ou 75 cm 2 (Nunc, Dutscher, France) sous un volume de 5 ou 15 mL de milieu complet respectivement et sont placées dans une étuve à 37°C sous atmosphère humide avec 5% de CO 2. Tous les 3 à 4 jours, les cellules sont rincées, deux fois, avec du PBS pH 7,2 (Invitrogen) puis incubées en présence de 0,05 % Trypsine/EDTA (Invitrogen) pendant 5 min à 37°C. Du milieu IMDM contenant 5% de SVF est ajouté pour stopper l’action de la trypsine. La viabilité des cellules est alors évaluée par la méthode d’exclusion au bleu trypan (Boyse et al. , 1964). Un taux de viabilité de 95% est considéré comme nécessaire et les cellules peuvent alors être utilisés comme cellules-hôtes dans l’invasion de T. gondii . Après numération grâce à une cellule de Kova ® Slide, le nombre de cellules désiré est ensemencé dans des flacons de culture : 1 million pour une flasque 25 cm 2 ou 3 millions pour une flasque 75 cm 2.

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Matériels et Méthodes

II/ La souche virulente RH de T. gondii

La souche RH utilisée, lors de cette étude, provient du Centre de Ressources Biologiques Toxoplasma (CRB Toxoplasma , France).

II-1/ Description de la souche RH

La souche RH a été isolée aux Etats-Unis en 1939 chez un enfant de six ans mort d’encéphalite dans le cas d’une toxoplasmose congénitale (Sabin, 1941). L’inoculation à des souris du surnageant de broyats de cerveau a provoqué la mort des souris entre le 17 ème et le 21 ème jour. De nouvelles souris infestées avec des broyats d’organes d’animaux morts ont survécu sept à huit jours. Depuis 1939, la souche RH est utilisée dans de nombreux laboratoires dans le monde par multiples passages intrapéritonéaux de tachyzoïtes chez la souris, tous les 3 à 4 jours. Cette souche dite de référence est utilisée dans de nombreux travaux réalisés sur T. gondii .

II-2/ Entretien de la souche RH

II-2-1/ Multiplication des tachyzoïtes in vitro

Les tachyzoïtes sont cultivés sur les cellules Vero en présence de milieu IMDM/Glutamax ® supplémenté de 2% de SVF décomplémenté, filtré et additionné de 1% d’antibiotiques (pénicilline-streptomycine). Le ratio est de 1 : 1, c’est-à-dire un tachyzoïte inoculé en présence d’une cellule. Lorsque les tachyzoïtes se situent en extracellulaire, il est nécessaire de réaliser un repiquage. Pour cela, les cellules sont ensemencées dans des flacons de cultures et après 3 heures nécessaires à l’adhésion des cellules, les tachyzoïtes sont mis en contact avec les cellules. Après numération grâce à une cellule de Kova ® Slide, le nombre de tachyzoïtes désiré est ensemencé dans les flacons de culture. La croissance parasitaire s’effectue à 37°C en atmosphère saturée en humidité et contenant 5% de CO 2.

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Matériels et Méthodes

II-2-2/ Multiplication des tachyzoïtes in vivo

- Multiplication des tachyzoïtes sans cellules TG 180 La souche parasitaire RH provoque une ascite chez la souris contenant de nombreux parasites. La rapidité de formation de cet ascite est proportionnelle au nombre de parasites inoculés. La souche est entretenue par inoculation tous les 3 à 4 jours de 3,5.10 5 tachyzoïtes dans la cavité péritonéale de souris Swiss femelles (Charles River, France). Ensuite, 5 mL de sérum physiologique sont injectés dans le péritoine de la souris. Ce liquide de lavage péritonéal (LLP) contenant les tachyzoïtes est récupéré à l’aide d’une seringue pour être injecté, après numération sur cellule de Kova ® Slide, à une nouvelle série de souris.

- Multiplication des tachyzoïtes avec cellules TG 180 Afin d’obtenir un meilleur rendement, la souche RH peut être inoculée dans le péritoine de la souris simultanément avec des cellules sarcomateuses murines TG 180 (Desmonts and Remington, 1980). Les cellules TG 180 sont entretenues dans un modèle murin par injection intrapéritonéale de 200 µL d’une suspension de sérum physiologique contenant 1,1.10 8 cellules/mL. Le recueil de l’ascite et le passage des cellules sont effectués tous les 10 jours. La suspension de parasites est obtenue par inoculation à des souris Swiss de 200 µL d’une solution contenant 3,5.10 5 parasites et 8.10 6 cellules sarcomateuses TG 180 permettant la multiplication rapide. Après 3 jours, les parasites sont récupérés par injection de 5 mL de sérum physiologique dans la cavité péritonéale des souris. Le LLP ainsi obtenu est déposé dans une cellule de Kova ® Slide afin de réaliser la numération des parasites.

III/ Coloration des cellules infestées

Après fixation au méthanol, les cellules sont hydratées avec 200 µL de PBS pendant 10 min avant d’être colorées à l’aide du kit RAL 555 (RAL Diagnostics, France). Chaque puits est incubé 1 min en présence d’éosine puis 5 min en présence de bleu de méthylène. L’excès de colorant est ensuite éliminé par plusieurs lavages au PBS. L’observation est réalisée sur le vidéomicroscope Zeiss Axiovert 200M (Zeiss, Allemagne) en collaboration avec le Dr Frédéric Velard, ingénieur de la plate-forme d’Imagerie Cellulaire et Tissulaire – IBiSA, Université de Reims Champagne-Ardenne.

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Matériels et Méthodes

Synthèse d’anticorps polyclonaux dirigés contre la TGME49_227948

Afin de pouvoir étudier l’expression, la localisation et la fonction de la protéase parasitaire, nous avons réalisé la synthèse de deux anticorps : le premier est dirigé contre une séquence proche du site catalytique et le second du côté C-terminal de la séquence protéique.

I/ Synthèse d’anticorps polyclonaux

La synthèse des deux anticorps polyclonaux a été réalisée par la société Thermoscientific. Cette synthèse nécessite plusieurs étapes décrites ci-après allant de la recherche de la séquence antigénique à la purification de l’anticorps polyclonal synthétisé.

I-1/ Recherche de la séquence antigénique

La société Thermoscientific a réalisé l’étude de la séquence de la TGME49_027950 afin de déterminer les peptides antigéniques les plus immunogènes. Dans le but d’obtenir le peptide antigénique correspondant à nos attentes, nous avons précisé certains critères : - Pour le premier anticorps, le peptide antigénique devait être situé proche du site catalytique de la protéase, ceci dans le but d’obtenir un anticorps potentiellement bloquant afin de déterminer la fonction de cette protéase. - Pour le deuxième anticorps, nous avons souhaité utiliser un peptide antigénique situé dans la région C-terminal de la protéase afin d’être plus spécifique de notre séquence protéique. - L’application principale souhaitée est le western-blotting pour identifier toutes les formes existantes de cette protéase.

Cette identification a été réalisée avec le logiciel Antigen Profiler (http://www.pierce- antibodies.com/customantibodies/peptide-design-antigen-profiler.cfm) qui utilise un ensemble d’algorithmes permettant de déterminer les peptides qui provoqueront une bonne réponse immunitaire. Ce logiciel permet également l’analyse des résidus modifiés (acétylation, glycosylation, phosphorylation…), la détermination des structures secondaires, des peptides

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Matériels et Méthodes signaux... De plus, ce logiciel aligne automatiquement le peptide identifié avec la base de données GenBank afin de s’assurer de la spécificité de la séquence obtenue. Afin de déterminer le meilleur peptide antigénique, nous avons également réalisé une étude à l’aide du logiciel EMBOSS (http://emboss. sourceforge.net/). Nous avons ainsi obtenu une liste importante de peptides potentiels. Une liste de critères a alors été établi afin d’identifier le peptide antigénique optimal : - Le peptide devait être composé d’environ 20 acides aminés, - Le peptide ne devait pas être retrouvé sur la séquence de l’orthologue chez P. falciparum ni avoir d’homologie avec un autre génome (utilisation du logiciel PSI-Blast, http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/psiblast/), - Le peptide devait être retrouvé à l’extérieur de structure 3D de la protéine et proche du site actif (1 er anticorps) ou du côté C-terminal (2 ème anticorps), - Le peptide ne devait pas se retrouver dans une structure secondaire telle qu’une hélice α ou un feuillet β.

Après notre validation définitive, le peptide a été synthétisé par la société. Le peptide immunogène a ensuite été purifié pour obtenir 90% de pureté, par chromatographie liquide intégrée et spectrométrie de masse, afin d’obtenir la meilleure réponse immunitaire possible et donc la production d’un anticorps de bonne qualité.

I-2/ Recherche et production des protéines KLH

La société Thermoscientific a choisi la protéine carrier. KLH (Keyhole Lympet Hemocyanin) est la protéine immunogène la plus utilisée lors de la préparation d'antigènes peptidiques pour la production d'anticorps. Cette combinaison peptide antigénique-protéine KLH permet, de favoriser la réponse immunitaire donc d’augmenter le rendement de production de l’anticorps.

I-3/ Tests et validation des sérums pré-immuns pour l’immunisation

Avant immunisation des lapins avec le peptide antigénique choisi, nous devons vérifier et donc choisir les deux lapins à utiliser. Les sérums pré-immuns sont testés, par western-blot, pour savoir si des anticorps contenus dans ceux-ci pourraient éventuellement reconnaître des protéines toxoplasmiques.

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Matériels et Méthodes

Pour cela, nous déposons 50 µg de protéines contenus dans le milieu conditionné 18 h (cf I-1 dans « Méthodes Biochimiques ») ainsi que 50 µg de protéines totales extraites au RIPA (cf I-2 dans « Méthodes Biochimiques ») sur un gel de polyacrylamide en présence ou non de β-mercapto-éthanol. Nous réalisons ensuite un western-blot (cf VI dans « Méthodes Biochimiques ») en utilisant comme anticorps primaire, les sérums pré-immuns à différentes concentrations (1/100, 1/250, 1/500, 1/1000) et comme anticorps secondaire une IgG dirigée contre l’espèce « lapin » dilué au 1/3000.

I-4/ Production des anticorps

Après le choix des deux lapins, l’immunisation peut commencer selon le protocole suivant (Tableau II):

Tableau II : Etapes du protocole d’immunisation 90 jours CFA : Adjuvant complet ; SQ : sous-cutané ; IFA : Adjuvant incomplet.

Ainsi, les deux lapins reçoivent une première injection du complexe peptide antigénique/protéine carrier à J1, puis une seconde injection à J14. Une troisième injection est réalisée à J42 et une dernière à J56. Le sérum est recueilli trois fois durant tout le protocole : à J28, J56 et J70/72.

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Matériels et Méthodes

I-5/ Analyses des anticorps

- Tests et validation des sérums immunisés Afin d’obtenir un anticorps avec la meilleure affinité possible, nous avons eu la possibilité de tester les sérums collectés à J28, J56 et J70/72 des deux lapins. Dans un premier temps, Thermoscientific nous a indiqué le titre par des tests ELISA obtenus pour tous les sérums (Tableau III ):

Tableau III : Valeurs des tests ELISA obtenues par les différents sérums pour le lapin 1 (A) et le lapin 2 (B) obtenus par la société Thermoscientific pour la synthèse du premier anticorps (site catalytique) A B

Ensuite, nous avons réalisé un western-blot pour tester la spécificité des anticorps obtenus. Pour cela, nous déposons 50 µg de protéines contenues dans le milieu conditionné 18 h (cf I-1 dans « Méthodes Biochimiques ») ainsi que 50 µg de protéines totales extraites au RIPA (cf I-2 dans « Méthodes Biochimiques ») sur un gel de polyacrylamide en présence ou non de β-mercapto-éthanol. Nous réalisons ensuite un immunomarquage (cf VI dans « Méthodes Biochimiques ») en utilisant comme anticorps primaire, les sérums à J28, J56 et J70/72 des deux lapins à différentes concentrations (1/500, 1/1000) et comme anticorps secondaire des IgG de chèvre dirigées contre le lapin dilué au 1/3000.

- Purification de l’anticorps polyclonal

Après choix et validation du sérum, les anticorps polyclonaux contenus dans celui-ci sont purifiés. Pour cela, le sérum choisi est concentré par précipitation au sulfate d’ammonium. En parallèle, une chromatographie est préparée par fixation du peptide antigénique, contre lequel l’anticorps a été synthétisé, sur la matrice. Le sérum choisi concentré est mis en contact avec la colonne. Les anticorps purifiés sont élués par l’utilisation d’un gradient de pH. De nouveau, le titre par ELISA est ensuite réalisé.

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Matériels et Méthodes

II/ Immunomarquage des tachyzoïtes

II-1/ Principe

Cette technique consiste en la détection et la localisation d’une ou plusieurs protéines grâce à l’utilisation d’anticorps spécifiques. Le principe repose sur la réaction entre un anticorps primaire et un secondaire couplé à un fluorochrome. Cette technique est particulièrement intéressante pour observer des co-localisations.

II-2/ Mode opératoire

Les tachyzoïtes sont lavés 3 fois avec du PBS +Ca 2+ /+Mg 2+ (Invitrogen, France). Les tachyzoïtes sont comptés et 10 millions de parasites sont utilisés pour chaque condition testée. Après centrifugation à 1400 g pendant 10 min, 150 µL de PAF à 4% (emsdiasum, PA, USA) sont ajoutés sur les culots. Les tubes sont ensuite vortexés et une incubation de 15 min est nécessaire pour obtenir une bonne fixation des tachyzoïtes. Nous ajoutons 850 µL de PBS froid avant de réaliser une centrifugation à 1400 g pendant 10 min. Puis, nous ajoutons 150 µL d’une solution de Triton X100 à 0,1% pendant 5 min afin de perméabiliser les membranes des parasites. Nous ajoutons de nouveau 850 µL de PBS froid et une centrifugation à 1400 g pendant 10 min est réalisée. Les sites non spécifiques sont saturés avec une solution de PBS contenant 3% de BSA (Sigma, France) pendant 30 min à température ambiante à raison de 150 µL/condition. Après une centrifugation à 1400 g pendant 10 min, l’anticorps primaire est incubé avec les parasites à la concentration voulue (Tableau IV) pendant 1 h à température ambiante dans 500 µL de PBS contenant 1% de BSA. Après une centrifugation à 1400 g pendant 10 min, l’anticorps secondaire couplé à un Alexa fluor est incubé avec les parasites à la concentration voulue ( Tableau IV) pendant 45 min à température ambiante dans 500 µL de PBS contenant 1% de BSA. En cas de double (ou triple) marquage, les deuxièmes (ou troisièmes) anticorps primaires et secondaires sont ajoutés selon le même protocole que les premiers. Après une centrifugation à 1400 g pendant 10 min, nous ajoutons 500 µL de PBS froid pour chaque condition. Après deux centrifugations à 1400 g pendant 10 min, les parasites marqués sont repris dans 200 µL d’Aqua-poly/Mount (Polysciences). Ensuite, nous utilisons 30 µL de la solution d’Aqua-poly/Mount contenant les tachyzoïtes marqués pour faire un montage entre lame et lamelle. Les marquages sont observés avec le microscope Confocal (Zeiss) présent au niveau

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Matériels et Méthodes de la plate-forme d’Imagerie Cellulaire et Tissulaire – IBiSA, Université de Reims Champagne-Ardenne et en collaboration avec le Dr Christine Terryn, ingénieur de cette plate- forme.

Tableau IV : Anticorps primaires et secondaires utilisés en immunomarquage

Référence Espèce Dilution Fournisseur Anticorps Anti-TGME49_227948 Lapin 1/100 Thermoscientific, France primaires (site catalytique) (à façon) Anti-TGME49_227948 Lapin 1/100 Thermoscientific, France (domaine C-terminal) (à façon) Anti- SAG1 Souris 1/200 Argene Biosoft, France Anti-MIC2 Souris 1/2000 Dr JF. Dubremetz CNRS/UMR5235 (Montpellier) Anti-ROP2 Souris 1/2000 Dr JF. Dubremetz CNRS/UMR5235 (Montpellier) Anti-GRA7 Souris 1/2000 Ref 5-241-178 (Bonhomme et al. , 1998) Anticorps Anti-lapin couplé Alexa Chèvre 1/2000 Invitrogen, France secondaires fluor 568 Anti-souris couplé Alexa Chèvre 1/2000 Invitrogen, France fluor 488 Anti-souris couplé Chèvre 1/100 Thermoscientific, France Dylight 633

III/ Test d’invasion en présence d’anticorps analysé par vidéomicroscopie

Les cellules Vero sont ensemencées dans des plaques 24 puits à raison de 70 000 cellules par puits dans 1 mL de milieu IMDM complet. Après 3 h à 37°C, temps nécessaire à leur adhésion, les cellules sont rincées au PBS pH 7,2 afin d’éliminer le SVF. Les cellules sont ensuite remises en présence d’IMDM additionné de 1% d’antibiotiques (pénicilline- streptomycine). Les tachyzoïtes sont lavés trois fois, avec du PBS pH 7,2 suivi de centrifugations (1 600 g, 10 min), puis comptés à l’aide de cellule de Kova® Slide. Les parasites sont alors pré-incubés en présence d’anticorps. Différents volumes (1, 2, 5 ou 10 µL) de l’anticorps dirigé contre une séquence située proche du site catalytique, à une concentration de 0,35 mg/mL sont mis en contact avec 280 000 parasites pendant 15 min à température ambiante. Le mélange parasites/anticorps est alors directement déposé dans les plaques 24 puits ensemencées avec 70 000 cellules. Le ratio utilisé est alors de 4 : 1 (4 tachyzoïtes pour 1 cellule).

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Matériels et Méthodes

Chaque puits est filmé toutes les heures pendant 48 heures afin d’observer l’effet de l’anticorps sur l’invasion et/ou la multiplication des parasites. La vidéomicroscopie est réalisée à 37°C en atmosphère saturée en humidité et contenant 5% de CO 2 à l’aide d’un microscope Zeiss AxioVert 200M (Zeiss, Allemagne) et en collaboration avec le Dr Frédéric Velard, ingénieur de la plate-forme d’Imagerie Cellulaire et Tissulaire – IBiSA, Université de Reims Champagne-Ardenne. Afin de calculer l’index d’invasion, après 6 heures d’incubation, chaque puits est lavé afin d’éliminer les parasites extracellulaires, c’est-à-dire ceux qui n’ont pas infesté les cellules. Après fixation au méthanol (200 µL/puits), les cellules et les parasites sont colorés avec le kit RAL 555 (RAL Diagnostics, France) selon les instructions du fabricant (cf III dans « Culture cellulaire »). Les cellules infestées peuvent alors être comptées et le ratio nombre de cellules infestées / nombre de cellules totales déterminé.

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Matériels et Méthodes

Méthodes biochimiques

I/ Préparation des échantillons

I-1/ Milieux conditionnés

Les tachyzoïtes produits in vivo ou in vitro sont lavés trois fois avec du PBS, lequel est éliminé par centrifugation (1 600 g, 10 min). Le nombre total de parasites est déterminé à l’aide d’une cellule de Kova ® Slide. Les parasites sont ensuite incubés dans du milieu IMDM seul à raison de 5.10 8/mL. Après différents temps d’incubation (1 min, 5 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h et 18 h) à 37°C, nous réalisons une centrifugation (1 600 g, 10 min) afin de séparer les parasites et le surnageant correspondant au milieu conditionné. Les milieux conditionnés sont ensuite filtrés sur une membrane de 0,45 µm (Merck Millipore, France) puis aliquotés et stockés à -20°C. Les culots contenant les tachyzoïtes sont également conservés à -20°C (Figure 19).

5mL de LLP/souris

150 souris 3 lavages au PBS 4j Récupération de culos contenant les tachyzoïtes : 60.10 9 + centrifugations parasites (1600g, 10min) (150 souris) Inoculation de tachyzoïtes de la Récupération du liquide de lavage 150 souris = 750mL de LLP souche virulente RH péritonéal (LLP) de souris

APPLICATIONS

Purification Récupération du surnageant et du culot de 18h Sécrétion des parasites dans du milieu (Chromatographies d’affinité) tachyzoïtes de culture seul à 37 °C à raison de 500 000 parasites/mL Filtration du surnageant soit 120mL + centrifugation Caractérisation (membrane de 0.45 µm) Zymographie en gel de gélatine (1600g, 10min) (Tests avec inhibiteurs, pI

Figure 19 : Schéma explicatif des différentes étapes réalisées pour l’obtention des protéines sécrétées par les tachyzoïtes (milieu conditionné) et les protéines cytosoliques (cytosol)

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Matériels et Méthodes

I-2/ Extraction des protéines

Après sécrétion et centrifugation, les parasites et les milieux conditionnés sont séparés (cf I-1 dans « Méthodes Biochimiques »). Les culots de parasites peuvent alors être lysés selon deux protocoles en fonction des protéines que nous souhaitons en extraire.

- Protéines totales : Pour obtenir les protéines totales, nous incubons les culots secs de tachyzoïtes avec un tampon de lyse contenant du RIPA (Tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, NP-40 1% (v/v), Sodium deoxycholate 0,5% (v/v), SDS 0,1% (v/v), Triton X100 1% (v/v), pH 7,4). Le volume du tampon est adapté à raison de 3.10 9 parasites/mL. Après incubation pendant 30 min dans la glace en homogénéisant régulièrement, le mélange est centrifugé à 12 500 g pendant 15 min à 4°C. Les protéines totales sont alors présentes dans la fraction soluble. Les échantillons sont ensuite dosés et conservés à -80°C avant utilisation.

- Protéines cytosoliques et membranaires : Pour extraire et séparer les protéines cytosoliques et membranaires (Figure 20 ), les culots secs de tachyzoïtes sont incubés, dans un premier temps, avec un tampon de lyse contenant du triton X100 [(Tris HCl 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Triton X100 1% (v/v)] à raison de 3.10 9 parasites/mL et deux cycles de congélation/décongélation à -20°C sont réalisés. Une centrifugation est réalisée à 10 000 g pendant 15 min. Après centrifugation, le surnageant (fraction soluble) est séparé du culot (fraction insoluble). Le surnageant (fraction soluble) ainsi obtenu est mis, dans un deuxième temps, en présence de Triton X114 à raison de 100 µL pour 10 9 parasites pendant 5 min à 40°C. Après centrifugation (300 g, 3 min), deux phases sont obtenues : une phase aqueuse supérieure contenant les protéines cytosoliques hydrophiles et une phase détergente inférieure contenant les protéines membranaires hydrophobes. Le culot (fraction insoluble) obtenu après incubation avec le tampon de lyse contenant du triton X100, est ensuite dissout dans un tampon RIPA (Tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, NP-40 1% (v/v), Sodium deoxycholate 0,5% (v/v), SDS 0,1% (v/v), Triton X100 1% (v/v), pH 7,4). Après centrifugation (10 000 g, 10 min), la fraction insoluble correspondant au surnageant est ainsi obtenue. Les différents échantillons protéiques obtenus sont dosés, aliquotés et stockés à -80°C avant utilisation.

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Matériels et Méthodes

Figure 20 : Schéma illustrant le protocole utilisé pour l’extraction et la séparation des protéines membranaires et cytosoliques

I-3/ Dosage protéique

Le dosage des protéines extraites est réalisé selon la méthode de Bradford (Bradford, 1976). Cette technique est un dosage colorimétrique basé sur la modification de l’absorbance. L’intensité de la coloration (absorbance) est alors directement proportionnelle à la concentration en protéines de l’échantillon, que nous déterminons par lecture sur une courbe d’étalonnage réalisée avec une gamme étalon de BSA. La gamme d’étalonnage est préparée à partir d’une solution-mère d’albumine à 2 mg/mL (kit Coomassie Plus Protein Assay (Thermoscientific, France)). Dix microlitres de chaque étalon ainsi que les échantillons à doser, si besoin dilués au 1/10 ème ou 1/100ème , sont déposés en dupliquât dans une plaque 96 puits. Trois cents microlitres de réactif Coomassie Plus Protein Assay sont alors ajoutés dans chaque puits. Après 5 min d’incubation à température ambiante, l’absorbance est lue à 595 nm à l’aide du lecteur de plaque Asys UVM 340 (Biochrom, UK).

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Matériels et Méthodes

II/ Méthodes chromatographiques

Les méthodes chromatographiques sont des techniques analytiques basées sur l’utilisation des propriétés physiques ou chimiques connues des substances à séparer contenues dans une solution. Le but a été d’exploiter différentes caractéristiques de notre protéine d’intérêt préalablement déterminées, afin de réaliser sa purification partielle à l’aide de plusieurs techniques chromatographiques. Lors de l’utilisation de différentes chromatographies en série, nous devons toujours débuter par une caractéristique assez générale pour finir par une propriété particulière. Ainsi, nous avons utilisé trois types de chromatographies dans l’ordre suivant : - Une chromatographie de gel filtration séparant les protéines en fonction de leur masse moléculaire, - Puis une chromatographie d’affinité sur gélatine-agarose retenant uniquement les protéines ayant une affinité pour cette molécule, - Et pour finir, une chromatographie chélatrice de zinc permettant de fixer les protéines ayant un domaine de liaison à l’ion Zn 2+ .

II-1/ Chromatographie de gel filtration

Principe : La chromatographie de gel filtration a pour principe la séparation des protéines en fonction de leur masse moléculaire. La matrice utilisée est constituée de billes poreuses ayant un diamètre variable, déterminé en fonction de la protéine à extraire. Ainsi, les plus grosses molécules vont passer entre les billes et sont dites « exclues » alors les plus petites vont traverser à l’intérieur des pores et sont dites « inclues ». Les protéines exclues vont donc sortir plus rapidement de la colonne par rapport aux protéines plus petites qui sont retenues dans la matrice ( Figure 21) (Voet and Voet, 2005).

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Matériels et Méthodes

Figure 21 : Principe de la chromatographie de gel filtration (Voet and Voet, 2005)

Après avoir déposé l’échantillon contenant les protéines à séparer en haut de la colonne, le tampon de lavage (appelé aussi solvant) est appliqué de façon constante dans la colonne. Les protéines ayant les plus hautes masses moléculaires, représentées en bleu sur le schéma, sont dites « exclues » de la matrice et sortent donc en premier de la colonne. Alors que les plus petites protéines, représentées en rouge sur le schéma, sont dites « inclues » dans les billes et sortent donc plus tard.

Pour notre étude, nous avons choisi d’utiliser une matrice Bio Gel P100 (Biorad). Celle-ci séparent les protéines ayant une masse moléculaire compris entre 5 et 100 kDa ; ce qui permet d’adapter la séparation à notre protéine d’intérêt de 100 kDa.

Mise en place : Dans un premier temps, la matrice correspondant aux billes poreuses doit être reconstituée. Pour cela, 16 g de matrice lyophilisé sont mélangés dans 1 L de tampon d’élution (NaHPO 4 0,05M, NaCl 0,15M, pH 7). La matrice se réhydrate pendant 12 h à température ambiante et est ensuite placée dans une colonne de 30 cm de hauteur et 1,6 cm de diamètre (colonne XK16, GE Healthcare). Le dépôt de la matrice dans la colonne doit être minutieux pour éviter la formation de bulles. L’excès de tampon est éliminé et la colonne est ensuite parfaitement lavée avec 2 volumes de colonnes, soit 60 mL, de tampon d’élution avant de recevoir l’échantillon à analyser. Pour une bonne reproductibilité des résultats, le système a été automatisé en utilisant une pompe péristaltique FH 100 (ThermoScientific, France) permettant d’avoir un débit constant et continu dans la colonne (Figure 22). Un réservoir contenant le tampon d’élution est placé en amont de la pompe et un collecteur de fractions FC 205 (Gilson, France) est connecté en sortie de colonne. Un lecteur d’absorbance est disposé entre la colonne et le

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Matériels et Méthodes collecteur de fractions afin de visualiser les pics d’élution des molécules contenues dans le mélange analysé, en mesurant l’absorbance à 230 nm (molécules organiques) et à 280 nm (mesure des acides aminés aromatiques).

Réservoir contenant le tampon de lavage

ou d’élution Réservoir eau milli Q filtrée Colonne gel filtrationColonne 30cm de 30 cm

Lecteur de DO Lecteur de DO

Pompe Pompepéristaltique péristaltique Collecteur de fractions (80) Débit 1mL/min(1mL/min) Collecteur de fractions (1mL) automatisé

EnregistreurEnregistreur dede DO densité optique Figure 22 : Schéma du montage réalisé pour le fonctionnement de la chromatographie de gel filtration

Le tampon de lavage est aspiré grâce à la pompe péristaltique (débit 1 mL/min) afin d’être déposé sur la colonne. Ce flux permet d’éluer les protéines en fonction de leur masse moléculaire. Les différentes fractions sont analysées par le lecteur de densité optique (puis enregistrées par traçage du profil d’élution par l’enregistreur de DO) et recueillies dans un collecteur de fractions.

Calibration : Après la mise en place de la matrice dans la colonne, la calibration de la colonne doit être réalisée avec des protéines de masses moléculaires connues afin de déterminer le temps de rétention de notre protéine d’intérêt. La calibration a été réalisée avec les kits contenant des standards soit de hautes masses moléculaires (high molecular weight gel filtration kit), soit de faibles masses moléculaires (low molecular weight gel filtration kit) (Amersham, France). Les protéines choisies pour réaliser la calibration sont les suivantes (Tableau V) :

Tableau V : Protéines utilisées pour la calibration de la chromatographie gel filtration

Composé PM (kDa) Catalase 232 Aldolase 158 BSA 67 Chymotrypsine 25 Ribonucléase A 6

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Matériels et Méthodes

Après avoir reconstitué les différents calibrants comme indiqué dans le protocole du fabricant, 1 mL de chacun d’eux est disposé séparément sur le haut de la colonne. Le débit de la pompe est de 1 mL/min et ainsi le volume et le temps d’élution de la molécule au travers de la matrice ont pu être déterminés. Entre chaque calibrant, la colonne est parfaitement lavée, c’est-à-dire jusqu’à ce que la DO soit de 0 à 230 et 280 nm. Cette étape de calibration permet la détermination de la masse moléculaire de notre protéase d’intérêt. Pour ceci, nous calculons le Kav qui est égal à (Ve-V0)/(Vt-V0) où Ve est le volume d’élution, V0 le volume mort et Vt le volume total. Ainsi la courbe de calibration peut être tracée, représentée par le Kav en fonction du logarithme de la masse moléculaire.

Utilisation avec un mélange contenant notre protéine d’intérêt : Après lavage de la colonne, le haut de la colonne est asséché pour y déposer notre échantillon, correspondant à 1 mL de milieu conditionné 18 h soit l’équivalent de 5.10 8 parasites (cf I-1 dans « Méthodes Biochimiques »). Après 2 min, le temps nécessaire à la pénétration de l’échantillon dans la matrice, la pompe péristaltique est connectée à la colonne afin d’appliquer un débit constant et précis de 1 mL/min. Le lecteur d’absorbance permet d’observer le pic correspondant à la sortie des différentes protéines contenues dans le milieu conditionné 18 h en mesurant les absorbances à 280 nm. Une lecture de l’absorbance est également réalisée manuellement à 230 nm (molécules organiques). Les fractions éluées sont recueillies et analysées par zymographie et SDS-PAGE. Avant passage d’un nouvel échantillon, la colonne est lavée jusqu’à l’obtention d’une densité de 0 à 230 et 280 nm.

II-2/ Chromatographie d’affinité sur gélatine-agarose

Principe : La chromatographie sur gélatine-agarose est une chromatographie d’affinité. Cette technique a pour principe d’accrocher les protéines ayant une affinité pour la molécule fixée à la matrice ; ici la gélatine (Figure 23) (Voet and Voet, 2005).

Mise en place : La matrice de gélatine-agarose (GE Healthcare) est commercialisée prête à l’emploi. Pour cela, 5 mL (ce volume correspondant donc à un volume de colonne) de cette matrice sont déposés dans une colonne de 5 cm de hauteur de 1 cm de diamètre. Après 30 min de

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Matériels et Méthodes sédimentation, la matrice est lavée 5 fois avec 5 mL de tampon de lavage (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4).

Figure 23 : Principe de la chromatographie d’affinité (Voet and Voet, 2005)

La matrice dite poreuse est composée de billes d’agarose sur lesquelles sont fixées, par des liaisons covalentes, un ligand, tel que la gélatine. L’échantillon est incubé avec la matrice afin de permettre aux protéines ayant une affinité pour la gélatine de se complexer avec cette molécule. Les protéines non affines pour cette molécule pourront être directement éluées par lavage de la colonne.

Utilisation avec un mélange contenant notre protéine d’intérêt : Après les différents lavages précédemment décrits, l’échantillon, soit 1 mL de milieu conditionné 18 h mélangé avec 1 mL de tampon de liaison (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4), peut être déposé en haut de la colonne. La colonne, préalablement fermée aux deux extrémités, est alors mise sous agitation sur un rotor à 4°C pendant une nuit afin de permettre aux molécules ayant une affinité pour la gélatine de se fixer sur la matrice. Après sédimentation des billes, la matrice est lavée avec du tampon de lavage jusqu’à l’obtention d’une densité de 0 à 230 et 280 nm. Les protéines non fixées à la matrice, donc n’ayant pas d’affinité pour le ligand, la gélatine, sont éliminées de la colonne. Ensuite l’élution, c’est-à-dire la séparation des protéines de la matrice par rupture de la liaison entre la protéine et la gélatine, peut être réalisée selon différentes protocoles : - Soit par utilisation de l’urée, - Soit par utilisation d’un pH très acide.

Etant donné l’importance de l’affinité de notre protéase, nous avons choisi d’utiliser l’urée pour l’étape d’élution. Le tampon d’élution (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, Urée 8 M, pH 7,4) est alors déposé sur le haut de la colonne à raison d’un seul volume de colonne, soit 5 mL. Les fractions éluées sont recueillies et analysées par zymographie et SDS-PAGE. La

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Matériels et Méthodes colonne est ensuite lavée avec du tampon de lavage jusqu’à l’obtention d’une densité de 0 à 230 et 280 nm.

Régénération : Afin de pouvoir utiliser de nouveau la colonne, il est indispensable de procéder à sa régénération de la façon suivante :

- trois volumes de colonne de tampon A (NaHCO 3 0,1M, NaCl 0,5M, pH 8,4) - trois volumes de colonne de tampon B (Acétate 0,1M, NaCl 0,5M, pH 4) Ce cycle est alors réalisé trois fois. Pour finir, trois volumes de colonne de tampon de lavage sont déposés sur la colonne afin de neutraliser et stabiliser le pH.

II-3/ Chromatographie chélatrice de zinc

Principe : La colonne chélatrice de zinc permet de fixer toutes les protéines possédant un domaine de fixation pour l’ion Zn 2+ autrement dit ayant une affinité pour cet ion métallique.

Mise en place : La matrice utilisée est la matrice Chelating Sepharose Fast flow (GE Healthcare), permettant de fixer différents ions métalliques. Au vu des caractéristiques que nous avons identifié pour la protéase étudiée, nous avons choisi de fixer des ions Zn 2+ sur cette matrice. Pour cela, 30 mL, soit un volume de colonne, de matrice chelating-sepharose sont déposé minutieusement dans une colonne XK16 (GE Healthcare). Les billes sont ensuite compactées en appliquant un débit de 1mL/min dans la colonne à l’aide d’une pompe péristaltique. Deux volumes de colonne de tampon de fixation (Na 2HPO 4 0,02M, NaCl 0,5M, pH 7,2) permettent de laver la colonne. Deux volumes de colonne de solution saline (NaCl 0,5M) sont ensuite appliqués ainsi qu’autant d’eau milliQ. Trois volumes de colonne de 2+ solution de zinc (ZnCl 2 0,2M, pH inférieur à 5,5) sont utilisés pour fixer l’ion Zn sur la colonne. Un test utilisant du bicarbonate de sodium est utilisé pour vérifier la bonne fixation de l’ion sur la colonne : la solution de bicarbonate de sodium forme un précipité en contact avec l’ion. La colonne est donc chargée en zinc lorsqu’un précipité se forme en sortie de colonne démontrant ainsi que la colonne est saturée pour cet ion. Enfin, cinq volumes de colonne d’eau milliQ sont utilisés pour laver complètement la matrice. Il est alors nécessaire

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Matériels et Méthodes d’équilibrer la colonne avec trois volumes de colonne de tampon de fixation avant de pouvoir déposer l’échantillon.

Utilisation avec un mélange contenant notre protéine d’intérêt : Deux millilitres de milieu conditionné 18 h additionné à 2 mL de tampon de fixation sont déposés en haut de la matrice. Afin de permettre à l’échantillon de se fixer sur la colonne, celle-ci est mise en circuit fermé (colonne branchée directement et uniquement avec la pompe péristaltique) et un débit inférieur à 1mL/min y est appliqué pendant une nuit à 4°C. Le lendemain, après avoir paramétré le lecteur d’absorbance (blanc réalisé avec le tampon de fixation ou d’élution), la matrice est lavée pour éluer toutes les protéines non fixées à la colonne à l’aide du tampon de lavage (Na 2HPO 4 0,02M, NaCl 0,5M, pH 7,2). L’élution peut commencer quand l’absorbance est de 0 à 230 et 280 nm. Un volume de colonne de tampon d’élution (imidazole 0,5M, Na 2HPO 4 0,02M, NaCl 0,5M) est alors utilisé. Les fractions contenant les protéases sont recueillies et analysés par zymographie et SDS-PAGE. La colonne est ensuite lavée jusqu’à l’obtention d’une absorbance de 0 à 230 et 280 nm.

Régénération : Afin de pouvoir utiliser de nouveau la colonne, il est indispensable de procéder à sa régénération de la façon suivante : cinq volumes de colonne de tampon de régénération

(EDTA 0,05M, Na 2HPO 4 0,02M, NaCl 0,5M), puis deux volumes de colonne de tampon de fixation et enfin deux volumes de colonne d’eau milliQ sont utilisés. Il faut ensuite reprendre le protocole par deux volumes de colonne de solution saline et charger de nouveau la colonne en ion zinc.

III/ SDS-PAGE

La technique de SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) permet de séparer les protéines en fonction de leur masse moléculaire. Vingt à cent microgrammes de protéines sont préparées avec du tampon échantillon (Tris HCl 50 mM, bleu de bromophénol 0,1% (m/v), SDS 2% (v/v), glycérol 20% (v/v), pH 6,8) en présence ou non de 8% de β-mercapto-éthanol. Les échantillons préparés avec du β-mercapto-éthanol sont ensuite chauffés 5 min à 95°C. Ils sont déposés dans un gel de polyacrylamide composé d’un gel de concentration à 4% d’acrylamide et d’un gel de séparation à 8 ou 10% d’acrylamide. Les échantillons migrent alors à ampérage constant de

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Matériels et Méthodes

20 mA/gel dans un tampon de migration (Tris 25 mM, glycine 192 mM, SDS 0,1%, pH 8,3) (Euromedex, France) jusqu’à la sortie du front de migration. Les gels sont ensuite incubés entre 40 min et une nuit à température ambiante dans un tampon fixateur [éthanol 50% (v/v), acide acétique 10% (v/v)] La révélation se fait par coloration du gel au nitrate d’argent avec le kit ProteoSilver (Sigma-Aldrich) conformément aux instructions fournies par le fabricant.

IV/ Zymographie

IV-1/ Principe

La zymographie est une technique dérivée du SDS-PAGE permettant d’analyser l’activité d’une protéase. En effet, au gel de SDS-PAGE classique est incorporé de la gélatine ou de l’élastine qui pourra être dégradée par des protéases à activité gélatinolytique ou élastinolytique (Vandooren et al. , 2013).

IV-2/ Mode opératoire

Dix microlitres d’échantillon à analyser sont préparés avec le tampon échantillon pour zymographie (Biorad, France). Ils sont ensuite déposés sur un gel de polyacrylamide composé d’un gel de concentration à 4% d’acrylamide et d’un gel de séparation à 8 ou 10% d’acrylamide contenant 0,1% de gélatine ou 15 mg d’α-élastine. Les échantillons migrent à voltage constant (200 V) dans un tampon de migration (Tris 25 mM, glycine 192 mM, SDS 0,1%, pH 8,3) (Euromedex, France) jusqu’à la sortie du front de migration. La cuve de migration est placée dans une chambre froide à 4°C pendant toute la migration. Les gels sont ensuite incubés dans du triton X100 à 2,5% pendant deux fois 30 min afin de redonner leur conformation aux protéases et ainsi leur permettre de retrouver leur activité gélatinolytique potentielle. Une étape d’incubation pendant 18 h à 37°C dans du tampon d’incubation (Tris

50 mM, NaCl 200 mM, CaCl 2 5 mM, pH 7,6) est nécessaire pour permettre la dégradation de la matrice. Les gels sont ensuite colorés au bleu de Coomassie R-250 (Biorad, France) pendant 15 min et sont incubés dans un tampon de décoloration [Acide acétique 10% (v/v), Méthanol 20% (v/v)] pendant 20 min. Les protéases à activité gélatinolytique ou élastinolytique sont alors visibles sous forme de bandes blanches car la gélatine, ou l’élastine, non dégradées seront colorées en bleu. La quantification des bandes obtenues est réalisée par

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Matériels et Méthodes mesure de la densitométrie. L’activité gélatinolytique est alors exprimée en pourcentage par rapport au témoin (conditions sans traitement). Afin de déterminer la masse moléculaire de notre gélatinase d’intérêt, nous avons utilisé deux marqueurs de masses moléculaires différentes (High Range et Dual Color, Biorad, France) déposés dans les puits situés de part et d’autre du puits contenant dix microlitres de milieu conditionné 18 h. Après migration et révélation, les résultats sont analysés avec le logiciel ImageLab (Biorad) permettant la détermination automatique du poids moléculaire des bandes souhaitées.

IV-2-1/ Etude de l’activité gélatinolytique en présence d’inhibiteurs

- Inhibiteurs généraux de protéases Afin de caractériser la protéase parasitaire, nous avons étudié les effets de différents inhibiteurs de protéases à large spectre (Sigma) qui sont incorporés au tampon d’incubation : - inhibiteurs de cystéine protéase : N-éthylmaléimide (NEM) 1 mM et Iodoacétamide 1 mM - inhibiteur de sérine protéase : Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) 2 mM - inhibiteurs d’aspartique protéase : Pepstatine A 1 µM - inhibiteurs de leucine aminopeptidase : Bestatine 10 µM - inhibiteurs d’ions divalents : Ethylène diamine tétra-acétique (EDTA) 5 mM et 1-10 phenanthroline 1 mM - inhibiteur des thermolysines : phosphoramidon 10 µM - inhibiteurs des MMPs : BB94/batimastat 10 -9 M

Le milieu conditionné 18 h est analysé par zymographie en gel de gélatine, puis les gels sont placés dans le tampon d’incubation pendant 18 h à 37°C en absence ou en présence des divers inhibiteurs. Les résultats sont analysés après coloration et décoloration du gel. L’activité gélatinolytique relative est déterminée par mesure de la densitométrie des aires de bandes du gel et rapportée au témoin sans inhibiteur à l’aide de l’appareil ChemiDoc et du logiciel ImageLab (Biorad, France).

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Matériels et Méthodes

- Inhibiteurs spécifiques des MMPs Des inhibiteurs spécifiques des MMPs ont été synthétisés par l’Institut de chimie moléculaire de Reims UMR 7312. Pour cela, la galardine ® a été utilisée comme base de la synthèse chimique ( Figure 24) (Moroy et al. , 2007). Des groupements contenant un nombre croissant de groupements méthyles ont été fixés sur cette molécule. Ceci a pour but d’apprécier la profondeur du site catalytique d’une enzyme. Ainsi, huit inhibiteurs ont été réalisés dont les structures sont résumés dans le tableau VI .

()n

O O H N HO N H M e O

N H

Figure 24 : Formule chimique du composé EBGA utilisé pour la synthèse des inhibiteurs Le nombre n représente le nombre de groupe méthyle. Ce nombre diffère entre chaque inhibiteur.

Tableau VI : Caractéristiques des inhibiteurs EBGA 1 à 7 et 10 Pour chaque inhibiteur, sont précisés le nombre de groupements méthyles qui le compose et sa masse moléculaire théorique.

Nombre de groupement Masse molaire Nom méthyle ajouté (g/mol)

EBGA1 6 427,53

EBGA2 7 441,56

EBGA3 8 455,59

EBGA4 9 469,61

EBGA5 10 483,64

EBGA6 11 497 ,66

EBGA7 14 539,74

EBGA10 18 595,85

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Matériels et Méthodes

Le milieu conditionné 18 h est analysé par zymographie en gel de gélatine, puis les gels sont placés dans le tampon d’incubation pendant 18 h à 37°C en absence ou en présence des différents inhibiteurs à une concentration de 10 -5 M. Les résultats sont analysés après coloration et décoloration du gel. L’activité gélatinolytique relative est déterminée par mesure de la densitométrie des aires de bandes du gel et rapporté au témoin sans inhibiteur, à l’aide de l’appareil ChemiDoc et du logiciel ImageLab (Biorad, France).

IV-2-2/ Etude de l’activité gélatinolytique en présence d’APMA

L’APMA (4-Aminophenylmercuric acetate) (Sigma-Aldrich) est un agent organomercuriel qui permet le démasquage du site enzymatique des MMPs grâce à la rupture de la liaison zinc-cystéine (Van Wart and Birkedal-Hansen, 1990; Chen et al. , 1993). L’APMA provoque alors un changement conformationnel des MMPs humaines engendrant le clivage du pro-domaine en N-terminal et aboutissant à la forme active des MMPs ( Figure 25).

Figure 25 : Schéma explicatif du mécanisme d’activation des MMPs par l’APMA (d’après Grzela et al. , 2011)

Les pro-MMPs sont activées par un processus allostérique par l’action de l’APMA ou du SDS. Les deux formes zymogène et active sont visibles par zymographie. Pour contrôler la réaction, de la pro-MMP-9 humaine est utilisée. Pour cela, un aliquot contenant 10 µg d’enzyme contenu dans 10 µL est dilué avec 90 µL de tampon Tris-Tween

(Tris 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl 2 20 mM, Tween 20 0,01% (v/v). La pro-MMP-9 humaine est ensuite aliquotée par 5 µL soit 0,5 µg d’enzyme.

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Matériels et Méthodes

Pour observer l’effet de l’APMA, 0,65 nM de MMP-9 humaine (soit un aliquot) ou de milieu conditionné équivalent sont pré-incubés avec 4 µL d’une solution d’APMA à 20 mM préparé dans du NaOH à 0,1M ainsi que 31 µL de tampon Tris-Tween, pendant 1 h 30 min à 37°C. La MMP-9 activée doit être utilisée extemporanément. Après migration dans un gel de zymographie, les gels sont mis dans le tampon d’incubation pendant 18 h à 37°C. Les résultats sont analysés après coloration et décoloration du gel.

IV-2-3/ Influence de la température et du pH sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase parasitaire

- Effet du pH sur l’activité gélatinolytique : Afin de caractériser l’activité gélatinolytique de la protéase parasitaire, nous avons utilisé différentes compositions pour les tampons d’incubation dans le but de déterminer son pH optimal. Voici les différents tampons utilisés :

- pH 5,5 : MES (2-[N-morpholino] ethanesulfonic acid) 10 mM, CaCl 2 5 mM

- pH 6,5 : PIPES (piperazine-N,N'-bis[ethanesulfonic acid]) 10 mM, CaCl 2 5 mM - pH 7,5 : HEPES ( N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid]) 10 mM,

CaCl 2 5 mM

- pH 8,6 : Tris-HCl (tris [hydroxymethyl] aminomethan) 10 mM, CaCl 2 5 mM

- pH 9,5 : CHES (2-[N-cyclohexylamino]-1-propanesulfonic acid) 10 mM, CaCl 2 5 mM

- pH 10,5 : CAPS (3-[cyclohexylamino]-1-propanesulfonyl fluoride) 10 mM, CaCl 2 5 mM

Dix microlitres de milieu conditionné 18 h (cf I-1 dans « Méthodes Biochimiques ») sont déposés sur un gel de zymographie. Après migration, les gels sont incubés dans un bain de triton X100 deux fois 30 min. Ensuite, les gels sont mis dans les différents tampons d’incubation pendant 18 h à 37°C. Les résultats sont analysés après coloration et décoloration du gel. L’activité gélatinolytique relative est déterminée par mesure de la densitométrie des aires de bandes du gel et rapporté au témoin sans inhibiteur à l’aide de l’appareil ChemiDoc et du logiciel ImageLab (Biorad, France).

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Matériels et Méthodes

- Effet de la température sur l’activité gélatinolytique : Dix microlitres de milieu conditionné 18 h (cf I-1 dans « Méthodes Biochimiques ») sont déposés sur un gel de zymographie. Après migration, les gels sont incubés dans un bain de triton X100 deux fois 30 min. Dans le but de caractériser la température optimale de cette activité gélatinolytique, le tampon d’incubation à pH 8,6 est placé à 37°C, 56°C, 60°C et 75°C. Les résultats sont analysés après coloration et décoloration du gel. L’activité gélatinolytique relative est déterminée par mesure de la densitométrie des aires de bandes du gel et rapporté au témoin sans inhibiteur, à l’aide de l’appareil ChemiDoc et du logiciel ImageLab (Biorad, France).

IV-2-4/ Influence des anticorps sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase parasitaire

Pour observer l’effet de l’anticorps situé au niveau du site catalytique, 0,65 nM de MMP-9 humaine préalablement activée par l’APMA ou dix microlitres de milieu conditionné 18 h, de cytosol extrait au Triton X100 ou au RIPA, sont pré-incubés avec 1, 2, 5 ou 10 µL d’une solution contenant l’anticorps dirigé contre une région située au niveau du site catalytique (à une concentration de 0,35 µg/mL), pendant 15 min à 37°C. Après migration dans un gel de zymographie, les gels sont mis dans le tampon d’incubation pendant 18 h à 37°C. Les résultats sont analysés après coloration et décoloration du gel.

V/ Spectrofluorimétrie

V-1/ Principe

Afin de quantifier les effets de différentes molécules sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase parasitaire, nous avons utilisé une technique de spectrofluorimétrie en utilisant la DQ-gélatine (Dye quenched gélatine) comme substrat naturel. En effet, ce substrat a la propriété d’émettre de la fluorescence à 535 nm lorsqu’il est clivé par une gélatinase (Vandooren et al. , 2011) (Figure 26).

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Matériels et Méthodes

Figure 26 : Représentation schématique du clivage de la DQ-gélatine

Lorsque la DQ-gélatine est clivée, cela libère les fluorochromes présents et après excitation à 492 nm, une fluorescence peut être détectée à 535 nm. L’intensité de fluorescence est donc proportionnelle à l’activité enzymatique des gélatinases présentes dans l’échantillon.

V-2/ Mode opératoire

La solution-mère de DQ-gélatine (Invitrogen, France) est préparée à 1 mg/mL dans du tampon Tris-Tween, aliquotée par 40 µL puis conservée à -20°C. Au moment de l’utilisation, la solution-mère doit être diluée avec 760 µL de tampon Tris/Tween (solution intermédiaire à 5 µg/mL). Cette solution-fille peut être de nouveau congelée à -20°C si besoin.

Une mise au point de la technique a été nécessaire afin de déterminer la quantité d’enzyme à utiliser. Pour cela, nous avons réalisé différentes gammes de MMP-9 humaine à 2,6, 1,3, 0,65 et 0,32 nM et de milieu conditionné 18 h concentré dix fois avec 10, 20, 40, 60 et 80 µL.

- Effets de l’APMA sur l’activité gélatinolytique de la protéase parasitaire : Soixante microlitres de milieu conditionné 18 h, concentré dix fois, sont activés ou non avec l’APMA (cf IV-2-2 dans « Méthodes Biochimiques »). Puis, les échantillons sont incubés dans un tampon Tris-Tween [Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 20 mM CaCl 2 0,01% Tween 20 (v/v)] contenant 2,5 µg/mL de DQ TM -gélatine (Invitrogen, France). Les variations de fluorescence sont ensuite enregistrées toutes les 2,5 min pendant 1 h à 37°C à l’aide du spectrofluorimètre Mithras LB940 (Berthold Technologies, Germany). Les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission utilisées sont de 492 nm et 535 nm, respectivement. Les contrôles sont réalisés en présence ou absence d’APMA et de NaOH 0,1 M.

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Matériels et Méthodes

- Effets des inhibiteurs naturels des MMPs, les TIMP-1 et -2, sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase parasitaire : Soixante microlitres de milieu conditionné 18 h, concentré dix fois, sont incubés ou non en présence d’inhibiteurs naturels des MMPs. Des gammes de TIMPs ont été réalisées. Pour le TIMP-1 : 5 µM, 2,5 µM, 625 nM et 250 nM ont été étudiés. Pour le TIMP-2 : 2,5 µM, 625 nM, 250 nM, 62,5 nM et 31,25 nM ont été analysés. La pré-incubation avec TIMP-1 ou -2 est réalisée pendant 15 min. Puis, les échantillons sont incubés dans un tampon

Tris-Tween [Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 20 mM CaCl 2, 0,01% Tween 20 (v/v)] contenant 2,5 µg/mL de DQ TM -gélatine (Invitrogen). Les variations de fluorescence sont ensuite enregistrées toutes les 2,5 min pendant 1 h à 37°C à l’aide du spectrofluorimètre Mithras LB940 (Berthold Technologies, Germany). Les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission utilisées sont de 492 nm et 535 nm, respectivement.

- Effets des inhibiteurs synthétiques des MMPs, EBGA 4 et 5, sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase parasitaire : Soixante microlitres de milieu conditionné 18 h, concentré dix fois, sont incubés ou non en présence d’EBGA 4 et 5 à des concentrations de 10 -5 ou 10 -8 M. La pré-incubation avec EBGA 4 ou 5 est réalisée pendant 15 min. Puis, les échantillons sont incubés dans un tampon

Tris-Tween [Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 20 mM CaCl 2, 0,01% Tween 20 (v/v)] contenant 2,5 µg/mL de DQ TM -gélatine (Invitrogen). Les variations de fluorescence sont ensuite enregistrées toutes les 2,5 min pendant 1 h à 37°C à l’aide du spectrofluorimètre Mithras LB940 (Berthold Technologies, Germany). Les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission utilisées sont de 492 nm et 535 nm respectivement.

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Matériels et Méthodes

VI/ Western-blotting

VI-1/ Principe

Le western blot est une technique permettant la détection et l’identification des protéines spécifiques contenues dans un échantillon à l’aide d’anticorps. Les protéines de l’échantillon sont séparées selon leur masse moléculaire par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose afin de les rendre accessibles à la détection par les anticorps. Après saturation des sites d’interactions non-spécifiques, la membrane est incubée avec l’anticorps spécifique de la protéine d’intérêt (anticorps primaire). Puis le complexe antigène- anticorps formé est reconnu par un deuxième anticorps (anticorps secondaire) dirigé spécifiquement contre l’anticorps primaire. La révélation des protéines d’intérêt se fait alors par chimioluminescence.

VI-2/ Mode opératoire

Vingt à cinquante microgrammes de protéines sont préparés avec du tampon échantillon 4X [240mM Tris pH 6,8, SDS 8% (v/v), glycérol 40% (v/v), bleu de bromophénol 0,02% (m/v)] contenant ou non 8% de β-mercaptoéthanol, puis chauffés à 95°C pendant 5 min afin de réduire les ponts disulfure. Les échantillons sont déposés dans un gel de polyacrylamide composé d’un gel de concentration à 4% d’acrylamide et d’un gel de séparation à 8 ou 10% d’acrylamide. Un marqueur de masses moléculaires (7,5 µL, Euromedex, France) est utilisé pour contrôler la bonne migration des protéines de l’échantillon. La migration s’effectue sous une tension constante de 20 mA/gel pendant 1 h 30 min dans un tampon de migration (Tris 25 mM, glycine 192 mM, SDS 0,1%, pH 8,3) (Euromedex, France). Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose (Biorad). L’électrotransfert est réalisé dans le tampon de transfert 1X (Tris 48 mM, glycine 49 mM, méthanol 20%, pH 8,2) (Euromedex, France) pendant 1 h 10 sous un voltage constant de 120 V dans la glace. Après le transfert, la membrane est placée dans du tampon TBS (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) pendant 10 minutes, puis saturée une nuit à 4°C sous agitation douce dans une solution de saturation composée de 5% de lait écrémé (m/v) dilué dans du TBS. Après un lavage de 10 min au TBS-T (tampon TBS supplémenté avec 5% de Tween 20), la membrane est incubée avec l’anticorps primaire (Tableau VII ) dilué dans la solution de saturation

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Matériels et Méthodes pendant 1 h à température ambiante sous agitation douce. Après trois lavages de 10 min au TBS-T, la membrane est incubée, pendant 1 h à température ambiante, avec un anticorps secondaire (Tableau VII ), couplé à la peroxydase et dirigé contre l’anticorps primaire, dilué dans la solution de saturation sous agitation douce. Après trois lavages de 10 min au TBS-T et un lavage de 10 min au TBS, l’activité de la peroxydase est révélée par chimioluminescence (kit ECL Prime, Amersham). L’observation des bandes s’effectue à l’aide l’appareil ChemiDoc et du logiciel ImageLab (Biorad).

Tableau VII : Anticorps primaires et secondaires utilisés en western-blotting de type enzymatique Référence Espèce Dilution Fournisseur Anticorps Anti-TgME49_227948 Lapin 1/500 Thermoscientific, France primaires (site catalytique) (à façon) Anticorps Anti-lapin couplé HRP Chèvre 1/3000 Biorad, France secondaires

VII/ Electrophorèse en deux dimensions

VII-1/ Principe

L’électrophorèse bidimensionnelle permet la séparation des protéines contenues dans un mélange complexe (O’Farrell, 1975). Cette technique est composée de deux étapes : une première séparation des protéines s’effectue selon leur point isoélectrique par isoélectrofocalisation (IEF), puis une deuxième séparation en fonction de leur masse moléculaire apparente par SDS-PAGE ( Figure 27).

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Matériels et Méthodes

Figure 27 : Représentation schématique de l’électrophorèse en 2 dimensions (Harder et al. , 1999)

Les protéines présentes dans un échantillon donné vont dans un premier temps être séparées selon leur point isoélectrique. Elles seront, dans un second temps, séparées en fonction de leur masse moléculaire.

VII-2/ Mode opératoire

VII-2-1/ Préparation de l’échantillon

Le milieu conditionné 18 h (cf I-1 dans « Méthodes Biochimiques »), est concentré dix fois à l’aide d’un concentrateur possédant un seuil de coupure à 50 kDa (Amicon ultra cut-off 50 kDa, Millipore) après centrifugation à 3500 g pendant 30 min. L’échantillon est ensuite préparé à l’aide du kit 2D-clean-up (GE healthcare) afin d’éliminer les contaminants (sels, lipides, acides nucléiques et phénoliques) présents. Le dosage protéique des échantillons est ensuite réalisé (cf I-3 dans « Méthodes Biochimiques »).

VII-2-2/ 1ère dimension : Isoélectrofocalisation

Préalablement à la première étape d’isoélectrofocalisation, une bandelette de gels de 1 ère dimension doit être réhydratée avec du tampon de réhydratation composé du tampon échantillon 2X (8M urée, 2% CHAPS) contenant 0,2% d’ampholytes correspondant au gradient de pH utilisé (ampholytes IPG buffer, Biorad). Cent microgrammes de protéines contenues dans du milieu conditionné 18 h concentré sont prélevés et le volume est complété

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Matériels et Méthodes

à 400 µL avec du tampon de réhydratation. La bandelette de gel de polyacrylamide à 4% de pH 3-10, 7 cm (Ready Strip TM IPG Strip, Biorad) est ensuite déposée côté gel contre l’échantillon. L’ensemble est alors recouvert d’huile minérale pour éviter la déshydratation de la bandelette. Cette étape est réalisée à température ambiante pendant une nuit. Le lendemain, la bandelette réhydratée avec l’association tampon de réhydratation et échantillon protéique est placée dans l’appareil d’IEF Protean IEF cell (Biorad, France). Un papier buvard imbibé d’eau milliQ est déposé à chaque extrémité de la bandelette d’IEF. Le programme suivant est ensuite lancé (Tableau VIII ) :

Tableau VIII : Programme d’isoélectrofocalisation pour une bandelette de 7 cm

Étape 1 250 V 20 min Linéaire Étape 2 4000 V 2 h Linéaire Étape 3 15 000 Vh / Rapide Étape 4 250 V ∞ Linéaire

Après cette première dimension, les bandelettes sont soit conservées à -80°C en les congelant très rapidement, soit directement utilisées pour réaliser la seconde dimension.

VII-2-3/ 2ème dimension : SDS-PAGE ou zymographie

Avant de réaliser la seconde dimension, une étape d’équilibration est nécessaire afin d’équilibrer les protéines dans le SDS. Pour cela, les bandelettes sont incubées dans du tampon d’équilibration [Tris-HCl 75 mM, urée 6 M, Glycérol 30 % (v/v), SDS 2 % (v/v)] pendant deux fois 15 min sous agitation douce avec le tampon d’équilibration (sans DTT). Les bandelettes sont ensuite déposées sur un gel SDS-PAGE ou un gel de zymographie à 10% d’acrylamide et sont scellées au gel par une solution d’agarose à 0,5% (p/v). Les tampons et les conditions de migration utilisées sont identiques à ceux décrits dans les paragraphes III pour le SDS-PAGE et IV pour la zymographie.

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Matériels et Méthodes

Méthodes de biologie moléculaire

I/ Extraction des ARNs totaux

Les ARN totaux sont isolés avec le kit RNeasy Mini Kit (Qiagen, France), conformément aux instructions fournies par le fabriquant. Un culot de 30 millions de parasites est mis en présence du tampon de lyse RLT, contenant de l’isothiocynate de guanidinium et du β-mercaptoéthanol (10 µL/mL) permettant l’inactivation des ribonucléases. Le lysat obtenu est déposé dans une colonne QIAshredder (Qiagen, France) et centrifugé à 14,000 g pendant 2 min afin d’éliminer, par une action mécanique, la majeure partie des débris cellulaires et d’obtenir un échantillon parfaitement homogénéisé. L’ajout de 600 µL d’éthanol 70% permet la précipitation de l’ARN. La solution est alors déposée à la surface d’une colonne de purification (QIAamp, Qiagen, France) ne retenant que les brins d’ARN dont la taille est supérieure à 200 nucléotides. Après plusieurs lavages, les ARN sont élués dans 40 µL d’eau exempte de DNAse et RNAse (Sigma, France). L’intégrité des ARN extraits est vérifiée par électrophorèse en gel d’agarose 2% (p/v) contenant 0,01% (v/v) de GelRed TM (FluoProbes ®, Interchim) dans du tampon TAE 1X (solution Tris Acétate EDTA, Gibco) pendant 1 h 10 min sous une tension de 90 V. La concentration en ARN est alors déterminée par lecture de l’absorbance à 260 nm à l’aide du TM spectrophotomètre Nanovue (GE Healthcare). Le rapport d’absorbance Abs 260 /Abs 280 permet d’analyser la pureté de l’échantillon ; ce rapport doit être compris entre 1,7 et 1,9. Les ARN totaux sont conservés à -80°C.

II/ Technique 5’RACE

Les techniques RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) permettent de déterminer de façon expérimentale les extrémités d’une séquence nucléique à partir de son ARNm. Pour la technique de 5’RACE, une queue poly(C) est fixée expérimentalement du côté 5’ des ARNm.

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Matériels et Méthodes

II-1/ Principe

Pour la technique de 5’ RACE, cinq étapes doivent être réalisées (Figure 28). La synthèse du premier brin d'ADNc est réalisée à partir de l’ARNm en utilisant une amorce spécifique du gène (GSP1) Å et l’enzyme SuperScript TM II RT Ç. Après la synthèse du premier brin d'ADNc, la matrice d'ARNm initiale est éliminée par traitement avec la RNase Mix É (mélange de RNase H, spécifique de l'ARN et des molécules d'ADN hétéroduplex, et la RNase T1). L’ADNc est purifié à l’aide d’une colonne S.N.A.P. afin d’éliminer les dNTP non incorporés, l’amorce GSP1 et les protéines. Une queue homopolymérique est ajoutée à l'extrémité 3' de l'ADNc en utilisant l’enzyme TdT et des dCTP Ñ. Comme la réaction d’ajout de la queue poly(C) est réalisée dans un tampon compatible avec la PCR, tout le contenu de la réaction peut être directement amplifié par PCR, sans intermédiaire d’extractions organiques, de précipitations d'éthanol, ou de dilutions. L'amplification par PCR est réalisée à l'aide d’une Taq ADN polymérase, d’une amorce nichée spécifique du gène, nommée GSP2 qui s'apparie à un site situé à l'intérieur de la molécule d'ADNc, et d’une nouvelle amorce d'ancrage contenant une déoxyinosine appelé AAP (Abridged Anchor Primer) Ö.

Figure 28 : Technique 5’RACE (d’après le protocole du fabricant)

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Matériels et Méthodes

II-2/ Mode opératoire

1ère partie : Synthèse de l’ADNc Dans un microtube de 500 µL, nous ajoutons dans l’ordre : 2,5 µL de l’amorce GSP1 dont la solution-mère est à 10 µM et 2 µg d’ARN totaux extraits des tachyzoïtes (cf I dans

« Méthodes de biologie moléculaire »). Le volume est ensuite ajusté à 15,5 µL d’H 2O-DEPC. Le mélange est incubé 10 min à 70°C pour dénaturer l’ARNm dans le thermocycleur Mastercycler personal (Eppendorf). Le tube est ensuite placé 1 min dans la glace. Une brève centrifugation (1 000 g, 5 sec) est réalisée. Ensuite, nous ajoutons dans l’ordre : 2,5 µL de tampon de PCR 10X fourni dans le kit, 2,5 µL de MgCl 2 à 25 mM, 1 µL du mélange de dNTP et 2,5 µL de DTT. Après avoir mélangé doucement et réalisé une brève centrifugation, le mélange est chauffé à 42°C pendant 1 min. Un microlitre de SuperScript TM II RT est ajouté et incubé à 42°C pendant 50 min. L’élongation est finalisée à 70°C pendant 15 min. Les tubes sont ensuite centrifugés et équilibrés à 37°C. Un microlitre de mélange RNAse H et RNAse T1 est ajouté dans chaque tube afin de dégrader les différentes formes d’ARN présentes et, après avoir mélangé minutieusement, le tout est placé à 37°C pendant 30 min. Après une brève centrifugation, le tube est placé dans la glace et la manipulation peut être stoppée. L’échantillon est conservé à -20°C.

2ème partie : Purification de l’ADNc cible par utilisation des S.N.A.P. colonnes La solution de fixation doit être préalablement équilibrée à température ambiante et, pour chaque échantillon à purifier, 100 µL d’eau stérile distillée (eau PPi) sont chauffés à 65°C. Nous ajoutons 120 µL de solution de fixation (6 M NaI) dans chaque tube contenant l’ADNc cible obtenu lors de la première partie de cette technique. Une fois homogénéisé, le mélange c’est-à-dire le complexe ADNc/NaI, est immédiatement transféré sur une colonne SNAP et centrifugé (13 000 g, 20 sec). L’éluat obtenu est gardé pour vérifier la bonne fixation de l’ADNc sur la colonne. 400 µL de tampon de lavage 1X (1 mL de tampon de lavage concentré, 18 mL d’eau PPi, 21 mL d’éthanal absolu) froid (4°C) sont déposés sur la colonne et les tubes sont centrifugés (13 000 g, 20 sec). Cette étape de lavage est effectuée trois fois. Après avoir jeté l’éluat, deux lavages avec de l’éthanol à 70% sont réalisés à 13 000 g pendant 20 sec. Après un dernier lavage à l’éthanol 70% à 13 000 g pendant 1 min, les ADNc sont élués de la colonne par ajout de 50 µL d’eau PPi préalablement chauffée à 65°C. Une dernière

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Matériels et Méthodes centrifugation à 13 000 g pendant 20 sec est réalisée pour éluer l’ADNc. La manipulation peut être stoppée et l’échantillon placé à -20°C ou à 4°C à court terme.

3ème partie : Fixation à l’ADNc de la queue oligo-dc par l’enzyme TdT Dans un tube de 500 µL, nous ajoutons dans l’ordre : 6,5 µL d’eau DEPC, 5 µL de tampon 5X de la queue poly(C), 1 µL de dCTP et 10 µL de l’ADNc purifié sur la colonne SNAP. Les tubes sont incubés 3 min à 94°C puis placés 1 min dans la glace. Après une centrifugation brève, les tubes sont de nouveau placés dans la glace. Un microlitre de l’enzyme TdT est ajouté et mélangé doucement. Les échantillons sont incubés 10 min à 37°C puis 10 min à 65°C pour inactiver l’enzyme TdT. Les tubes sont ensuite déposés dans la glace. La manipulation peut être stoppée et l’échantillon stocké à 4°C.

4ème partie : PCR sur l’ADNc possédant une queue poly(C) Le thermocycleur permettant de réaliser la PCR est équilibré à 94°C. Dans un microtube de 200 µL placé dans la glace, nous ajoutons dans l’ordre : 31,5 µL d’eau DEPC,

5 µL de tampon de la Dream Taq polymerase (Fermentas) contenant déjà du MgCl 2, 1 µL dNTP, 2 µL de l’amorce GSP2 dont la solution-mère est à 10 µM, 2 µL de l’amorce AAP et 5 µL de l’ADNc obtenu précédemment. Ensuite, 0,5 µL de la Dream Taq polymerase (Fermentas) est ajouté dans chaque tube et mélangé doucement. Une centrifugation brève est ensuite réalisée. Les tubes sont ensuite placés dans le thermocycleur Mastercycler personal (Eppendorf) et incubés 2 min à 94°C afin d’activer la Dream Taq polymerase. Puis, l’amplification se déroule sur 35 cycles de 1 min à 94°C (dénaturation) suivies de 1 min à 71°C (hybridation) et de 2 min à 72°C (élongation). Une dernière étape est réalisée à 72°C pendant 7 min. Les échantillons sont ensuite placés à 4°C. Les résultats sont analysés sur un gel à 2% d’agarose en déposant 10 µL de produits de PCR.

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Matériels et Méthodes

Etude in silico de la structure de la protéase parasitaire par bioinformatique

Le but de cette étude in silico de la protéase parasitaire identifiée lors de la purification partielle par chromatographies est de mieux caractériser cette molécule grâce à différents logiciels informatiques.

I/ Alignement de séquences

Tout d’abord, nous avons souhaité déterminer les homologies de séquences entre différents orthologues de la TGME49_227948. Pour cela, nous avons utilisé le logiciel ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Ce logiciel permet d’aligner au minimum deux séquences soit nucléiques soit protéiques.

II/ Recherches de modifications post-traductionnelles

L’étude des modifications post-traductionnelles a été réalisée sur la séquence putative de la TGME49_227948 décrite dans ToxoDB (http://toxodb.org/toxo/). Plusieurs logiciels sont disponibles pour déterminer, de façon putative, les modifications post-traductionnelles présentes sur une séquence protéique donnée. Les logiciels sont définis pour un type d’organisme donné. A l’heure actuelle, T. gondii ne possède pas de logiciels qui lui soient propres pour étudier ses modifications post-traductionelles. Nous avons donc choisi d’utiliser des logiciels utilisés pour les organismes eucaryotes. Voici la liste des différentes modifications post-traductionnelles étudiées avec leur logiciel associé : - Les sites de N-glycosylations avec NetNGlyc 1.0 Server (http://www .cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) - Les sites de O-glycosylations avec NetOGlyc 1.0 Server (http://www.cbs. dtu.dk/services/NetOGlyc/) - L’étiquette d’adressage mitochondrial a été identifiée grâce aux logiciels iPSORT (http://ipsort.hgc.jp/) et MitoProt II (http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html) - Les différents domaines PFAM ont été identifiés avec le logiciel InterProScan.

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Matériels et Méthodes

III/ Détermination de la structure 3D putative d’une protéine

Lorsqu’une protéine n’a jamais été purifiée ou cristallographiée, nous pouvons déterminer théoriquement sa représentation en 3D, d’au moins une partie de sa séquence. Pour cela, des logiciels réalisent des alignements de structures, et non plus de séquences comme précédemment. En ce qui concerne la TGME49_227948, nous avons utilisé le logiciel cBlast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) afin de rechercher une molécule de structure très proche ayant déjà été cristallisée. Ainsi la séquence codante de la protéine TGME49_227948 obtenue dans la base de données ToxoDB est confrontée à la base de données PDB (Protein Data Bank). Ensuite, à l’aide du logiciel CPH model (http://www.cbs.dtu.dk/services/ CPHmodels/), nous avons obtenu un fichier query regroupant toutes les données nécessaires à la reconstruction 3D qui est réalisée grâce au logiciel VMD (Visual Molecular Dynamics 1.8.4). Nous avons ainsi obtenu la représentation 3D d’une partie de notre protéase en prenant pour référence la protéine identifiée par cBlast. La représentation 3D peut ensuite être améliorée en mettant en évidence certains acides aminés. Ceci a été utilisé dans le paragraphe suivant IV pour visualiser la localisation du peptide antigénique choisi pour réaliser la synthèse d’un anticorps polyclonal, afin que celui-ci se situe à l’extérieur de la molécule et soit donc accessible. Le logiciel VMD permet également de mettre en évidence les structures secondaires présentes telles que les hélices α et les feuillets β.

IV/ Détermination des peptides antigéniques potentiels de la TGME49_227948

Différents logiciels existent pour déterminer sur une séquence protéique donnée, les séquences antigéniques les plus favorables pour créer une bonne réponse immunitaire et ainsi permettre la synthèse d’un anticorps chez un animal donné.

Nous avons choisi d’utiliser deux logiciels différents afin de confronter les résultats obtenus : le logiciel EMBOSS (http://emboss.sourceforge.net/) et Antigen Profiler (http://www.pierce-antibodies.com/custom-antibodies/peptide-design-antigen-profiler.cfm).

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Matériels et Méthodes

Statistiques

Les expériences réalisées en dupliquât, sont représentées sous la forme de la moyenne ± écart-type. La significativité des résultats a été déterminée par l’utilisation du test t de Student et présentée de la façon suivante : - * : p < 0,05 - ** : p < 0,01 - *** : p < 0,001

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RESULTATS

85

Résultats

Partie I. Mise en évidence et caractérisation d’une protéase à activité gélatinolytique sécrétée par Toxoplasma gondii

Une étude antérieure menée au sein des équipes EA 3800 et UMR 7369 (thèse d’université E. Buache, URCA 2007) portant sur l’influence de l’invasion de monocytes humains par T. gondii , a permis de mettre en évidence une protéase parasitaire de masse moléculaire apparente d’environ 94 kDa présentant à la fois des propriétés gélatino- et élastinolytiques (Buache et al. , 2007). Dans cette première partie, nous proposons de caractériser biochimiquement cette gélatinase nouvellement décrite. Le milieu conditionné utilisé dans nos expériences a été obtenu à partir de tachyzoïtes de T. gondii issus de liquide de lavage péritonéal (LLP) de souris dont la production a été effectuée sans ajout de cellules TG 180. Cependant pour les expériences de spectrofluorimétrie et de protéomique (2D-SDS-PAGE et 2D-zymographie), la production de tachyzoïtes de T. gondii a été réalisée après amplification par des cellules TG 180 afin d’obtenir une quantité suffisante de protéines pour réaliser l’ensemble de ces expériences.

I/ Mise en évidence de la gélatinase sécrétée par T. gondii

I-1/ Comparaison de l’activité gélatinolytique provenant de tachyzoïtes obtenus in vivo et in vitro

Pour débuter cette étude, nous avons étudié la présence de gélatinases dans le milieu conditionné 18 h et dans le cytosol provenant de tachyzoïtes de la souche RH issus de LLP de souris (in vivo ) ou issus de cultures cellulaires (in vitro ). Le milieu conditionné et le cytosol ont été analysés par zymographie en gel de gélatine ( Figure 29).

Les résultats de la figure 29 montrent la présence d’une gélatinase parasitaire dont la masse moléculaire apparente est supérieure à celle de la MMP-9 humaine (92 kDa) confirmant ainsi les résultats précédémment obtenus au laboratoire (Buache et al. , 2007).

Cette gélatinase est présente en quantité importante dans le milieu conditionné et le cytosol provenant des tachyzoïtes obtenus in vivo , et en très faible quantité dans le cytosol des

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Résultats tachyzoïtes obtenus in vitro . La gélatinase n’est pas détectable dans le milieu conditionné provenant des tachyzoïtes obtenus in vitro et dans le milieu conditionné des cellules Vero seules.

Par mesure de la densitométrie, nous pouvons dire que l’activité gélatinolytique présente dans le cytosol est quantitativement 25 fois plus importante dans les tachyzoïtes issus de LLP de souris que ceux issus de cultures cellulaires.

Par ailleurs, la gélatinase parasitaire est retrouvée préférentiellement dans le cytosol des tachyzoïtes obtenus in vivo comparativement au milieu conditionné. Cela indique que la majorité de cette gélatinase n’a pas encore été excrétée complètement après 18 h d’incubation.

A B Milieu conditionné Cytosol

MMP-9 RH RH Cellules MMP-9 RH RH humaine In vivo In vitro Vero humaine In vivo In vitro

92 kDa 92 kDa

Figure 29 : Mise en évidence de la gélatinase parasitaire de masse moléculaire supérieure à 92 kDa par zymographie en gel de gélatine Les milieux conditionnés (A) et les cytosols extraits au RIPA (B) obtenus à partir de tachyzoïtes de la souche RH issus de LLP de souris ( in vivo ) ou de cultures cellulaires (in vitro ) sont analysés par zymographie en gel de gélatine. Le milieu conditionné des cellules Vero est utilisé comme contrôle et la MMP-9 humaine est utilisée comme référence.

Afin de déterminer la localisation de la gélatinase parasitaire, nous avons séparé les protéines cytosoliques, des protéines membranaires en réalisant une extraction protéique au Triton X114. Les fractions extraites sont analysées par zymographie en gel de gélatine (Figure 30 ).

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Résultats

RH RH In vivo In vitro

MMP-9 Prot. Prot. Prot. Prot. humaine mb Cyt. mb Cyt.

92 kDa

Figure 30 : Etude de la gélatinase sécrétée par T. gondii dans les fractions membranaires et cytosoliques par zymographie en gel de gélatine Le cytosol des tachyzoïtes est extrait en présence de Triton X114 afin de séparer les protéines membranaires des protéines cytosoliques. Les fractions obtenues sont analysées par zymographie en gel de gélatine. La MMP-9 humaine est utilisée comme référence. Les résultats de la figure 30 montrent la présence d’une gélatinase, d’une masse moléculaire supérieure à 92 kDa, dans les fractions cytosoliques et membranaires des tachyzoïtes issus de LLP de souris, confirmant ainsi les résultats de la figure 29. La gélatinase parasitaire est également observée dans la fraction cytosolique des tachyzoïtes issus de cultures cellulaires. Dans les deux conditions in vivo et in vitro , la gélatinase est présente majoritairement dans la fraction cytosolique. Nous pouvons donc émettre l’hypothèse que la gélatinase mise en évidence, a une localisation préférentiellement cytosolique.

I-2/ Etude de l’activité élastinolytique de la protéase sécrétée par T. gondii

Nous nous sommes ensuite interessés à l’activité élastinolytique potentielle de la gélatinase sécrétée par T. gondii . Pour cela, nous avons analysé le milieu conditionné 18 h par zymographie en gel d’élastine ( Figure 31).

MMP-9 Milieu humaine conditionné

92 kDa

Figure 31 : Etude de la gélatinase parasitaire par zymographie en gel d’élastine Le milieu conditionné 18 h de tachyzoïtes issus de LLP de souris est analysé par zymographie en gel d’élastine. La MMP-9 humaine est utilisée comme référence.

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Résultats

Nous observons la présence d’une protéase possédant une activité élastinolytique dans le milieu conditionné 18 h obtenu à partir de tachyzoïtes issus de LLP de souris (Figure 31).

La masse moléculaire apparente de cette élastase a été estimée à 100 kDa par l’utilisation du logiciel Imagelab (Biorad). Celle-ci est donc identique à celle de la gélatinase précédemment mise en évidence, nous pouvons en déduire que T. gondii sécréte une protéase ayant une activité gélatino- et élastinolytique et possédant une masse moléculaire apparente supérieure à 92 kDa.

I-3/ Détermination expérimentale de la masse moléculaire de la gélatinase sécrétée par T. gondii Afin de pouvoir définir précisément la masse moléculaire de la gélatinase parasitaire, deux techniques ont été utilisées.

I-3-1/ Détermination de la masse moléculaire de la gélatinase par chromatographie de gel filtration

La chromatographie de gel filtration, utilisée pour la purification partielle de cette protéase (cf. Partie II des Résultats), a permis de caractériser de façon précise la masse moléculaire de la gélatinase étudiée. Pour chaque calibrant, nous avons mesuré le volume et le temps d’élution. Les résultats sont présentés dans le Tableau IX. Nous avons pu ainsi calculer le coefficient de partage (Kav) de la façon suivante :

Kav = (V E-V0)/(V t-V0)

où V E est le volume d’élution, V 0 le volume mort et V t le volume total.

Tableau IX : Caractéristiques des standards utilisés, pour la détermination par chromatographie de gel filtration de la masse moléculaire de la gélatinase parasitaire

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Résultats

Le volume et le temps d’élution de chaque standard sont déterminés en sortie de la colonne par mesure de l’absorbance des protéines à 280 nm.

Une courbe de calibration a pu être ensuite déterminée représentant le Kav en fonction du logarithme de la masse moléculaire (Figure 32).

0,600

0,500 Catalase

0,400 Kav 0,300 Aldolase

0,200 Protéase y = -0,422ln(x) + 0,751 parasitaire 0,100 R² = 0,99 BSA Chymotrypsine 0,000 Ribonucléase A 1 10 Échelle logarithmique PM

Figure 32 : Courbe de calibration de la chromatographie de gel filtration sur Bio Gel P100 (Biorad) Pour chaque calibrant, le temps et le volume d’élution sont déterminés par la mesure d’absorbance à 280 nm des protéines en sortie du gel. Ces deux valeurs permettent de calculer le coefficient de partage Kav de la façon suivante : (Ve-V0)/(Vt-V0) où Ve est le volume d’élution, V0 le volume mort et Vt le volume total.

En reportant la valeur du Kav de notre protéase parasitaire, nous obtenons une valeur de 4,58 sur cette échelle logarithmique et donc nous en déduisons une masse moléculaire de 97,51 kDa (Figure 32).

I-3-2/ Détermination de la masse moléculaire de la gélatinase par zymographie

Le milieu conditionné 18 h contenant la gélatinase parasitaire, a également été analysé par zymographie en gel de gélatine. Notre échantillon est encadré par deux marqueurs de masses moléculaires, Dual color et High range (Biorad) ( Figure 33 ).

90

Résultats

Dual Mil. High color Cond. Range

250 kDa 204 kDa

150 kDa 123 kDa 100 kDa 80 kDa

75 kDa

75 kDa

Figure 33 : Détermination de la masse moléculaire de la gélatinase parasitaire par zymographie en gel de gélatine La gélatinase parasitaire (Mil. Cond.) est encadrée par deux marqueurs de masses moléculaires (Dual color et High range, Biorad).

Après migration dans un gel de zymographie, la masse moléculaire de la gélatinase parasitaire a été estimée, à l’aide du logiciel E-capt (Vilber-Lourmat), à 103 kDa (Figure 33).

Grâce à l’association de la chromatographie de gel filtration et du SDS-PAGE, la masse moléculaire expérimentale de la gélatinase parasitaire est comprise entre 103 et 97 kDa.

Pour la suite de nos travaux, nous nous proposons de nommer cette gélatinase sécrétée par T. gondii , GP100 pour Gélatinase Parasitaire d’environ 100 kDa.

I-4/ Cinétique de sécrétion de la gélatinase étudiée

Afin d’analyser la sécrétion des gélatinases de T. gondii , les tachyzoïtes issus de LLP de souris, à une concentration de 500 millions/mL, sont placés dans du milieu de culture IMDM. Le milieu conditionné est récupéré à différents temps de sécrétion et analysé par zymographie en gel de gélatine (Figure 34).

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Résultats

MMP-9 MMP-9 1 min 5 min 30 min 1h 2h 4h 6h 18h humaine murine

100 kDa 92 kDa 78 kDa

110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Relative Relative gelatinolytic (%) activity

Activité Activité gélatinolytique relative (%) 0 0 5 10 15 TempsTime (h)(h)

Figure 34 : Cinétique de sécrétion de la gélatinase issue de milieu conditionné des tachyzoïtes de la souche RH analysée par zymographie en gel de gélatine Dix microlitres de milieu conditionné collecté à chacun des temps de la cinétique de sécrétion (1 min, 5 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h et 18 h) sont analysés par zymographie. Après quantification des zymogrammes par mesure de la densitométrie des bandes correspondantes à la GP100, les activités gélatinolytiques relatives à chaque temps de la cinétique de sécrétion, ont été déterminées.

Lors de cette cinétique de sécrétion, nous observons sept gélatinases présentes. De la masse moléculaire la plus importante à la plus faible, sont retrouvées : - Une gélatinase supérieure à 200 kDa dès la première minute de cette cinétique de sécrétion, augmente de façon temps-dépendante, - Une seconde gélatinase supérieure à 100 kDa également dès la première minute de cette cinétique de sécrétion, augmente de façon temps-dépendante, - La GP100, présente dès la première minute de cette cinétique de sécrétion, elle augmente de façon temps-dépendante. La GP100 est la gélatinase en quantité majoritaire, sécrétée par T. gondii dans ces conditions, - Une quatrième et cinquième gélatinase (de masses moléculaires inférieures à 100 kDa) à partir de 30 min, - Les deux dernières gélatinases à partir de 4 h, avec des masses moléculaires inférieures à 78 kDa. Toutes ces gélatinases (7) sont présentes à 18 h.

92

Résultats

Pour la suite de notre étude, nous utiliserons donc le milieu conditionné 18 h contenant la quantité la plus importante de GP100.

II/ Caractérisation physico-chimique de la gélatinase étudiée

Pour poursuivre notre étude, nous avons déterminé les caractéristiques physico- chimiques de la gélatinase d’intérêt : température, pH optimum de son activité gélatinolytique et son point isoélectrique.

II-1/ Influence de la température sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase sécrétée

La température optimale de l’activité gélatinolytique de la GP100 est déterminée par incubation du milieu conditionné 18 h, après migration dans un gel de zymographie, à différentes températures (37°C, 56°C, 60°C et 75°C). Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 35.

100 kDa

100

80

60

40

20 Relativegelatinolytic activity (%)

Activité gélatinolytique relative (%) 0 37C° 56C° 60C ° 75C° Temperature (° C)

Figure 35 : Graphique représentant les activités gélatinolytiques relatives en fonction de la température utilisée

Les bandes de zymographies correspondantes aux histogrammes sont représentées au-dessus de chaque température. Dix microlitres de chaque échantillon sont analysés par zymographie. Après quantification des zymogrammes par mesure de la densitométrie de chaque bande, les activités gélatinolytiques relatives ont été déterminées.

La protéase parasitaire GP100 possède une activité gélatinolytique optimale (100%) à 37°C . Cette activité diminue de 35%, 55% et 100% à 56°C, 60°C et 75°C, respectivement ( Figure 35).

93

Résultats

II-2/ Influence du pH sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase sécrétée

Le pH optimum de l’activité gélatinolytique de la GP100 est déterminé par incubation du milieu conditionné 18 h, après migration dans un gel de zymographie, dans des tampons d’incubation de pH différents allant de pH 5,5 à pH 10,5. L’incubation est réalisée à 37°C. Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 36.

100 kDa

100

80

60

40

20 Relativegelatinolytic activity(%)

Activité gélatinolytiquerelative (%) 0 5,5 6,5 7,5 8,6 9,5 10,5 pH

Figure 36 : Graphique représentant les activités gélatinolytiques relatives en fonction du pH utilisé Les bandes de zymographies correspondantes aux histogrammes sont représentées au-dessus de chaque pH. Dix microlitres de chaque échantillon sont analysés par zymographie. Après quantification des zymogrammes par mesure de la densitométrie de chaque bande, les activités gélatinolytiques relatives ont été déterminées.

Les résultats de la figure 36 indiquent que l’activité gélatinolytique maximale est obtenue à un pH de 8,6. De plus, 95% de l’activité gélatinolytique maximale persiste à un pH de 9,5. Aux pH de 5,5, pH 6,5 et pH 7,5, nous observons une diminution de l’activité gélatinolytique de 38%, 22% et 10%, respectivement. L’activité gélatinolytique est inhibée à plus de 80% à un pH de 10,5 (Figure 36). L’activité gélatinolytique est donc optimale à 37°C pour des valeurs de pH comprises entre 8,6 et 9,5.

94

Résultats

II-3/ Détermination du point isoélectrique de la gélatinase sécrétée

La caractérisation de la gélatinase GP100 se poursuit par la détermination de son point isoélectrique. Pour cela, nous avons réalisé des expériences de protéomique (2D-SDS-PAGE et 2D-zymographie). La mise au point de la technique de 2D-zymographie a été réalisée grâce à l’utilisation de la MMP-9 humaine dont les caractéristiques sont décrites dans la littérature (Pucci-Minafra et al. , 2001).

Le milieu conditionné 18h a été concentré huit fois afin d’obtenir une concentration suffisante de la gélatinase parasitaire GP100 visible par 2D-zymographie. De plus, une étape supplémentaire de purification de notre échantillon a été nécessaire afin d’éliminer les contaminants tels que les détergents et les sels. L’échantillon est ensuite soumis à la première dimension, l’isoélectrofocalisation puis, à la deuxième migration dans un gel SDS-PAGE (2D-SDS-PAGE) ou un gel de zymographie (2D-zymographie) (Figure 37).

La figure 37A montre un gel de 2D-SDS-PAGE représentant la cartographie des protéines sécrétées dans le milieu conditionné 18 h. Nous pouvons observer la présence de nombreuses protéines ayant une masse moléculaire inférieure à 50 kDa dans une gamme de pH comprise entre 4 et 10. La gélatinase parasitaire GP100 ne semble pas être présente car aucun spot protéique de masse moléculaire 100 kDa n’est observé. Parallèlement, grâce à la sensibilité de la technique, nous avons caractérisé, par 2D-zymographie (Figure 37B) le point isoélectrique de la GP100 à 5,8. L’intensité du spot à 100 kDa est très faible et nous observons d’autres spots d’intensité plus importante à des masses moléculaires plus faibles. Il est probable que notre échantillon ait subi une importante dégradation, lors de la première dimension, due à l’action de plusieurs détergents (comme l’urée par exemple).

95

Résultats

A pH 3 pH 10 PM

200 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa

20 kDa

B pH 3 pH 10

MMP -9 humaine 92kDa

Figure 37 : Cartographie des protéines sécrétées par T. gondii présentes dans le milieu conditionné 18 h après analyse par 2D-SDS-PAGE (A) et par 2D-zymographie (B)

Cent microgrammes de protéines sécrétées contenues dans le milieu conditionné 18 h concentré sont analysés par 2D-SDS-PAGE (A) afin d’observer l’ensemble des protéines présentes et par 2D- zymograhie (B) afin d’observer l’ensemble des gélatinases sécrétées par T. gondii .

96

Résultats

III/ Caractérisation biochimique de la gélatinase étudiée

Après avoir caractérisé de façon physico-chimique la GP100, nous nous sommes intéressés à sa caractérisation biochimique. Pour cela, nous avons étudié les effets de l’APMA, un activateur des MMPs humaines, et de différents inhibiteurs généraux et spécifiques de protéases.

III-1/ Étude des effets de l’APMA sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase sécrétée

Pour poursuivre la caractérisation de la gélatinase, nous avons étudié l’effet de l’APMA (4-Aminophenylmercuric acétate), un activateur des métalloprotéases de mammifères, sur la protéase parasitaire. L’APMA est un agent organomercuriel qui permet le démasquage du site enzymatique des MMPs grâce à la rupture de la liaison zinc-cystéine. L’APMA provoque alors un changement conformationnel des MMPs humaines engendrant le clivage du pro-domaine en N-terminal et donc occasionnant un changement de masse moléculaire, et aboutissant à la forme active des MMPs (Chen et al. , 1993).

Deux techniques ont été utilisées : A) dans un premier temps, la zymographie en gel de gélatine en pré-incubant notre échantillon avec l’APMA avant la migration dans le gel et B) dans un second temps, en mesurant l’activité sur DQ-gélatine par spectrofluorimétrie après avoir réalisé une pré-incubation similaire. Préalablement à toute manipulation par spectrofluorimétrie, nous avons dû déterminer la quantité d’enzyme à utiliser pour observer les effets potentiels de l’APMA. Nous avons donc comparé par cette technique, la dégradation de la DQ-gélatine par la MMP-9 humaine et par la gélatinase parasitaire, forme enzymatique principale présente dans le milieu conditionné 18 h. Les différentes gammes de concentrations réalisées sont présentées dans la figure 38.

97

Résultats

A

350000

300000

250000

200000 MMP-9 2,6nM 150000 MMP-9 1,3nM 100000 MMP-9 0,65nM 50000 MMP-9 0,325nM Intensitéfluorescencede (UA) Intensité de fluorescence (UA) fluorescence Intensité de 0 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 55,0 60,0 TempsTemps (min)(min)

B 350000

300000

250000

200000 Protéase 80µL

150000 Protéase 60µL Protéase 40µL 100000 Protéase 20µL 50000 Intensité de fluorescence (UA) Intensité de fluorescence

Intensitéfluorescence de (UA) Protéase 10µL 0 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 55,0 60,0 TempsTemps (min) (min)

Figure 38 : Dégradation de la DQ-gélatine par la MMP-9 humaine (A) et par la gélatinase parasitaire (B) analysée par spectrofluorimétrie La MMP-9 humaine (A) et le milieu conditionné 18 h (B) sont mis en présence de la DQ-gélatine. Différentes concentrations de ces enzymes ont été testées. La dégradation de cette molécule est analysée toutes les 2,5 min pendant 1 h par la mesure de l’intensité de fluorescence émise à 535 nm.

Pour obtenir une dégradation équivalente de la DQ-gélatine par la protéase parasitaire et la MMP-9 humaine (200 000 UA d’intensité de fluorescence), nous devons utiliser soixante microlitres de milieu conditionné 18 h concentré dix fois et 0,65 nM de MMP-9 humaine dans chaque puits. Les paramètres à utiliser pour la technique de spectrofluorimétrie étant validés, nous avons pu déterminer les effets de l’APMA sur la gélatinase parasitaire.

98

Résultats

Afin d’étudier les effets de l’APMA, nous pré-incubons les deux enzymes avec l’APMA pendant 1 h 30 min à 37°C (protocole préalablement validé avec la MMP-9 humaine). Ensuite, les échantillons sont analysés soit sur un gel de zymographie ( Figure 39A), soit mis en présence de DQ-gélatine et analysés par spectrofluorimétrie ( Figure 39B).

A MMP-9 humaine Protéase parasitaire APMA - + - +

Forme zymogène (92 kDa) 100 kDa Forme active (85 kDa)

B

120000 APMA

100000 NaOH 0,1M ControlContrôle 80000

60000

40000

Fluorescenceintensity (AU) 20000

Intensité de fluorescence (UA) defluorescence Intensité 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 TempsTime (min) (min)

Figure 39 : Effet de l’APMA sur la gélatinase parasitaire analysé par zymographie (A) et par spectrofluorimétrie en utilisant la DQ-gélatine (B)

Le milieu conditionné 18 h est pré-incubé avec l’APMA lequel a été solubilisé dans une solution de NaOH 0,1 M. Les échantillons sont ensuite analysés par zymographie en utilisant la MMP-9 humaine comme contrôle positif de la réaction (A). Les échantillons sont également analysés par étude de la dégradation de la DQ-gélatine par spectrofluorimétrie réalisée toutes les 2,5 min pendant 1 h par la mesure de l’intensité de fluorescence émise à 535 nm (B).

Par la technique de zymographie ( Figure 39A), nous observons une diminution de la masse moléculaire de la MMP-9 humaine de 92 kDa (forme zymogène) à 85 kDa (forme active) par la perte de son pro-domaine. Avec la gélatinase parasitaire GP100, nous n’observons pas de modification de sa masse moléculaire. Il semble donc que l’APMA n’ait pas d’effet sur la gélatinase étudiée.

99

Résultats

Pour confirmer ces résultats, nous avons utilisé une technique plus sensible, la spectrofluorimétrie (Figure 39B). Nous observons une augmentation de l’intensité de fluorescence (correspondant donc à la quantité de DQ-gélatine dégradée) en présence d’APMA. Mais cet effet est également observé en présence uniquement du tampon dans lequel est solubilisé l’APMA, une solution de NaOH à 0,1 M (pH basique). Cet effet est donc dû au pH et non à l’APMA. Ces résultats confirment les résultats précédemment décrits (Figure 36), indiquant que le pH optimal de l’activité gélatinolytique de la protéase parasitaire étudiée est basique.

En conclusion, la GP100 ne semble pas activable par le même processus que celui des MMPs humaines. Il pourrait également s’agir d’une forme déjà activée ou bien encore d’une forme ne possédant pas de pro-domaine d’activation.

III-2/ Étude des effets de différents inhibiteurs sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase sécrétée

La caractérisation biochimique se poursuit par l’utilisation de différents inhibiteurs de protéases, à large spectre ou plus spécifiques des MMPs humaines, afin de caractériser et classer la GP100 dans l’une des familles décrites selon la classification MEROPS.

III-2-1/ Inhibiteurs généraux de protéases

Nous avons étudié les effets de différents inhibiteurs à large spectre sur la gélatinase d’intérêt : inhibiteurs de cystéine protéase (NEM et Iodoacétamide), inhibiteur de sérine protéase (PMSF), inhibiteur d’aspartique protéase (pepstatine A), inhibiteur de leucine aminopeptidase (bestatine), inhibiteurs d’ions divalents (EDTA et 1-10 phenanthroline), inhibiteur des thermolysines (phosphoramidon) et inhibiteur des MMPs (BB94/batimastat).

Chacun des différents inhibiteurs étudiés est ajouté dans le tampon d’incubation habituel utilisé pour la zymographie, après migration du milieu conditionné 18 h dans un gel de zymographie, pendant 18 h à 37°C puis l’activité gélatinolytique de la gélatinase d’intérêt est déterminée (Figure 40 ).

100

Résultats

humanMMP-9 MMP-9humaine

100Protéase kDa parasitaire toxoplasmic protease

110 100 90 *

80 70 * 60 50 40 30 *** 20 *** *** 10 *** 0 Activité gélatinolytique relative (%) Contrôle NEM Iodo. PMSF Pep. A Bestatine EDTA 1-10 phe. Phospho. Batimastat

Figure(%) activity Relative gelatinolytic 40 : Effets de différents inhibiteurs de protéases à large spectre sur l’activité gélatinolytique de la protéase parasitaire analysés par zymographie

Après migration des échantillons (MMP-9 humaine et milieu conditionné 18 h contenant la protéase parasitaire) dans des gels de zymographie, les inhibiteurs sont ajoutés au tampon d’incubation. L’effet des inhibiteurs est observé après 18 h d’incubation à 37°C. Après quantification des zymogrammes par mesure de la densitométrie de chaque bande, les activités gélatinolytiques relatives ont été déterminées. (n=7)

Les résultats montrent que l’activité gélatinolytique de la protéase n’est pas inhibée en présence de NEM, iodoacétamide, PMSF, pepstatine A et bestatine. Ceci permet de conclure que la protéase parasitaire n’appartient pas aux familles des cystéines protéases, des sérines protéases, des aspartiques protéases, des leucines aminopeptidases ni aux thermolysines. L’activité gélatinolytique de la GP100 est inhibée de 30% par le batimastat et de plus de 80% par l’EDTA et le 1-10 Phenanthroline.

Nous pouvons donc en déduire que la gélatinase parasitaire possède les caractéristiques d’une métallo-endopeptidase à ion divalent (Zn 2+ , Ca 2+ , Ni 2+ …). En se référant à la classification MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/), la GP100 pourrait appartenir à l’une des sept familles suivantes : M3, M13, M16, M22, M41, M48 ou M50.

III-2-2/ Inhibiteurs spécifiques des MMPs

Au vu des résultats précédents, de nombreuses similitudes ont été décrites entre la MMP-9 humaine et la gélatinase étudiée. Dans un premier temps, nous avons donc choisi d’étudier les effets des TIMPs, inhibiteurs naturels des MMPs afin de différencier ces deux enzymes. Puis dans un second temps, nous analyserons l’effet d’inhibiteurs synthétiques spécifiques de MMPs produits par l’Institut de Chimie Moléculaire de Reims (UMR 7312).

101

Résultats

- Inhibiteurs spécifiques des MMPs, les TIMP-1 et -2

Afin de pouvoir analyser les effets des TIMP-1 et -2 sur la gélatinase parasitaire, une gamme de TIMP-1 et -2 a été réalisée et l’activité de la gélatinase a été analysée sur DQ-gélatine par spectrofluorimétrie. Nous avons testé les concentrations de 5 µM, 2,5 µM, 625 nM et 250 nM de TIMP-1 (Figure 41A) et de 2,5 µM, 625 nM, 250 nM, 62,5 nM et 31,25 nM de TIMP-2 (Figure 41B). Le milieu conditionné 18 h contenant la gélatinase parasitaire ou la MMP-9 humaine sont pré-incubés 15 min avec les différentes concentrations de TIMP-1 et -2. Après ajout de la DQ-gélatine, les différentes conditions sont analysées par spectrofluorimétrie ( Figure 41).

Les résultats obtenus avec le TIMP-1 montrent une diminution significative de l’intensité de fluorescence de 10 % aux concentrations de 625 nM et 5 µM. Pour les autres concentrations, 250 nM et 2,5 µM, aucune variation significative n’a été observée sur l’activité gélatinolytique de la gélatinase parasitaire ( Figure 41A).

Les résultats obtenus avec le TIMP-2 montrent une augmentation de l’activité gélatinolytique de 25% en présence de 31,25 nM de TIMP-2. Avec des concentrations plus élevées, entre 62,5 nM et 2,5 µM de TIMP-2, nous observons une diminution significative d’environ 10% de l’activité enzymatique ( Figure 41B).

Pour comparer les effets des TIMPs entre les deux protéases, nous avons choisi d’analyser la concentration de 625 nM pour ces deux inhibiteurs (Figure 41C). Nous observons une diminution significative de 10 % avec les TIMP-1 et -2 sur l’activité gélatinolytique de la protéase parasitaire. Avec la MMP-9 humaine, une diminution de 80 % avec le TIMP-1 et de 70 % avec le TIMP-2 est observée.

Les TIMPs ont une affinité très forte pour la MMP-9 humaine et beaucoup plus faible pour la GP100. Au vu de ces résultats et des résultats précédents avec les inhibiteurs généraux, nous pouvons donc en conclure que la GP100 appartient à la famille des gélatinases apparentées à la MMP-9.

102

Résultats

Figure 41 : Effets des TIMP-1 (A) et -2 (B) sur l’activité gélatinolytique de la protéase parasitaire analysés par spectrofluorimétrie en utilisant la DQ-gélatine et exprimés en pourcentage d’activité gélatinolytique relative (C) Différentes gammes de TIMP-1 (A) et de TIMP-2 (B) ont été pré-incubées avec la protéase parasitaire. L’analyse a été réalisée par spectrofluorimétrie et les résultats sont représentés dans le graphe C, en utilisant la MMP-9 comme contrôle positif de la réaction d’inhibition. (n=3)

- Inhibiteurs synthétiques spécifiques des MMPs

Nous avons ensuite testé différents inhibiteurs plus spécifiques des MMPs, synthétisés par l’UMR 7312. Ces inhibiteurs permettent d’obtenir des informations sur la configuration du site catalytique de la gélatinase parasitaire GP100. En effet, les différents inhibiteurs testés EBGA 1 à 7 et 10 possèdent des chaînes aliphatiques de tailles croissantes (nombre croissant de groupements méthyles), apportant des données sur la profondeur du site catalytique.

103

Résultats

Les inhibiteurs, à une concentration de 10 -5 M, sont ajoutés dans le tampon d’incubation habituel utilisé pour la zymographie après migration de la MMP-9 humaine et du milieu conditionné 18 h dans un gel de zymographie. Les inhibiteurs sont incubés 18 h à 37°C.

Les résultats obtenus sont présentés ci-dessous (Figure 42) :

MMP-9 humaine Protéase parasitaire 120

100 * * * * 80 * * * * ** 60 **

40

20 *** *** 0 Activitégélatinolytique relative(%)

Figure 42 : Effets des inhibiteurs synthétiques EBGA 1 à 7 et 10 sur l’activité gélatinolytique de la MMP-9 humaine et de la protéase parasitaire analysés par zymographie

Les inhibiteurs, à une concentration de 10 -5M, ont été ajoutés au tampon d’incubation. L’effet des inhibiteurs est observé après 18 h d’incubation. L’EDTA est utilisé comme témoin pour contrôler la réaction. Après quantification des zymogrammes par mesure de la densitométrie de chaque bande, les activités gélatinolytiques relatives ont été déterminées. (n=3)

Nous observons une diminution de 20 à 30 % de l’activité gélatinolytique de la MMP-9 humaine et de la gélatinase parasitaire en présence des inhibiteurs EBGA 1, 2, 3, 5, 6, 7 et 10. En présence de l’inhibiteur EBGA4, l’activité gélatinolytique de la gélatinase parasitaire est inhibée de 44 % et celle de la MMP-9 humaine de 41%.

Les résultats étant très similaires pour les deux enzymes, il semblerait que la protéase parasitaire possède un site catalytique ayant une profondeur proche de celle de la MMP-9 humaine.

Pour vérifier ces résultats, nous utilisons la technique de spectrofluorimétrie, plus sensible que la technique de zymographie. La protéase parasitaire est pré-incubée pendant 15 min en présence des inhibiteurs EBGA 4 et 5 à deux concentrations différentes, 10 -5M et

104

Résultats

10 -8M. Les effets de ces inhibiteurs sont ensuite analysés par ajout de DQ-gélatine et l’activité gélatinolytique est mesurée à l’aide d’un spectrofluorimètre (Figure 43).

A

400000 EBGA 4 10-5M EBGA 4 10-8M 350000 controle

300000

250000

200000

150000

Intensité fluorescencede (UA) 100000

50000

0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 Temps (min)

B

400000 EBGA 5 10-5M EBGA 5 10-8M 350000 controle

300000

250000

200000

150000 Intensité fluorescence de (UA) 100000

50000

0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 Temps (min)

Figure 43 : Effets des inhibiteurs synthétiques EBGA 4 (A) et 5 (B) sur l’activité gélatinolytique de la protéase parasitaire analysés par spectrofluorimétrie

Les inhibiteurs EBGA 4 et 5, à des concentrations de 10 -5 M et 10 -8 M, ont été pré-incubés avec le milieu conditionné 18 h contenant la gélatinase parasitaire pendant 15 min avant d’être analysés par spectrofluorimétrie. La dégradation de la DQ-gélatine est analysée toutes les 2,5 min pendant 1 h par la mesure de l’intensité de fluorescence émise à 535 nm. Les contrôles ont été réalisés sans l’ajout d’inhibiteurs.

Avec une concentration de 10 -8 M quel que soit l’inhibiteur utilisé, EBGA 4 ou 5, nous n’observons aucune diminution de l’activité gélatinolytique de la gélatinase parasitaire. En revanche, en présence d’une concentration plus importante (10 -5 M), l’activité gélatinolytique de la gélatinase parasitaire est diminuée de 50% avec EBGA 4 et de 40% avec EBGA 5 (Figure 43).

105

Résultats

Ceci confirme que la gélatinase parasitaire semble posséder des caractéristiques similaires à la MMP-9 humaine au niveau de la profondeur de son site catalytique.

En conclusion de cette première partie, nous pouvons conclure que T. gondii sécrète une gélatinase d’une masse moléculaire d’environ 100 kDa, que nous avons nommée GP100, laquelle possède également une activité élastinolytique. La GP100 est une métallo-endopeptidase à zinc appartenant, selon la classification MEROPS, à l’une des sept familles suivantes : M3, M13, M16, M22, M41, M48 ou M50. De plus, elle a été caractérisée comme une protéase de type MMP-9 like possédant une profondeur de site catalytique proche de celle de la MMP-9 humaine.

La GP100 mise en évidence est donc capable de dégrader la gélatine, une forme dénaturée du collagène ainsi que l’élastine. La poursuite de l’étude de cette protéase semble donc très intéressante vis-à-vis de son action dans le cadre des processus invasifs de T. gondii par dégradation des composés de la matrice extracellulaire et des barrières biologiques.

106

Résultats

Partie II. Purification et identification de la métalloprotéase à zinc

Afin d’identifier la gélatinase GP100 caractérisée dans la partie I, il est nécessaire de réaliser sa purification par différentes techniques chromatographiques. Les caractéristiques connues de cette protéine sont utilisées pour déterminer la stratégie de purification à employer. Ainsi, nous commençons toujours par une chromatographie se basant sur une caractéristique générale telle que la masse moléculaire pour terminer par une chromatographie d’affinité, beaucoup plus spécifique de la protéine à purifier. Après l’étape de purification, l’étude d’une protéine est possible à l’aide d’anticorps afin de déterminer sa localisation, ses différentes formes et sa fonction.

I/ Purification de la GP100 par différentes techniques chromatographiques

D’après les expériences réalisées dans la partie I, plusieurs caractéristiques ont pu être utilisées pour purifier la GP100. La chromatographie de gel filtration se base sur sa masse moléculaire (100 kDa). La chromatographie d’affinité sur gélatine-agarose a été utilisée car la protéase possède une activité gélatinolytique. Et enfin, la chromatographie chélatrice de zinc a été utilisée de par ses propriétés à capter les ions divalents. Pour réaliser les différentes techniques chromatographiques, nous avons dû utiliser un milieu conditionné 18 h contenant une quantité importante de la GP100 à purifier, pour cela, nous avons produit les parasites dans un modèle murin/cellules TG 180 (Desmonts and Remington, 1980).

I-1/ Chromatographie de gel filtration

La première étape de la purification de la gélatinase parasitaire de 100 kDa consiste à utiliser une colonne de gel filtration. La matrice utilisée, P100 Biogel (BIORAD), permet de retenir les protéines de masses moléculaires inférieures ou égales à 100 kDa, notamment la GP100.

107

Résultats

Nous avons déposé 2 mL de milieu conditionné 18 h sur la matrice, soit l’équivalent d’un milliard de tachyzoïtes, et nous avons élué les protéines en appliquant le tampon d’élution de cette chromatographie (Figure 44).

Sur le profil d’élution représentant l’absorbance à 280 nm en fonction du temps (Figure 44A), nous observons deux pics : le premier représente les protéines exclues de la matrice (partie ascendante du pic) ou incluses avec une masse moléculaire proche de 100 kDa (partie descendante du pic) et le second représente les protéines incluses dans la matrice avec des masses moléculaires inférieures à 100 kDa.

En comparant le profil d’élution avec l’analyse des fractions éluées par zymographie en gel de gélatine ( Figure 44B), nous observons que la protéase GP100 est éluée au niveau de la partie descendante du premier pic soit à 35 min.

Ainsi, la protéase étant présente en quantité importante dans les fractions éluées n°4 à n°6, celles-ci sont donc regroupées. Les fractions n° 7 à 10 contiennent également la gélatinase parasitaire, cependant la quantité y étant plus faible, celles-ci ne sont pas retenues pour la suite de l’étude. Le rendement de cette chromatographie est de 89% (Figure 44).

Cette chromatographie de gel filtration ne se base que sur la masse moléculaire, de ce fait, toutes les protéines sont éluées de la colonne en commençant par les plus hautes masses moléculaires.

L’étude des protéines totales des fractions éluées n° 4 à 6, par gel de polyacrylamide coloré au nitrate d’argent (Figure 44C), montre la présence de nombreuses autres protéines, principalement de masses moléculaires inférieures à 70 kDa, d’où la nécessité de réaliser, au minimum, une seconde étape pour la purification de la protéase.

108

Résultats

A

A280nm (u.a.)

Début de la collecte des fractions Protéase parasitaire

Fractions 1 à 10 mL 0 35 65 95 125 155 185 215 245 275

B C N° des fractions éluées

MMP-9 Pool fractions Ech. Pool fractions humaine 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 4 à 6 PM déposé 4 à 6

170 130 100 70

55

40

35

Figure 44 : Chromatographie de gel filtration. Profil d’élution obtenu (A) et analyse des fractions par zymographie (B) et par SDS-PAGE après coloration au nitrate d’argent (C) Deux millilitres de milieu conditionné 18 h sont déposés sur la colonne. Les protéines éluées sont détectées en sortie de colonne par la mesure de l’absorbance à 280 nm (A). Les différentes fractions obtenues ainsi que le pool des fractions contenant la gélatinase d’intérêt (Fractions 4 à 6) sont analysés par zymographie en gel de gélatine (B) et SDS-PAGE (C).

I-2/ Chromatographie d’affinité sur gélatine-agarose

La seconde technique utilisée pour la purification de la gélatinase parasitaire GP100 est une chromatographie d’affinité sur gélatine-agarose. Cette matrice permet de fixer toutes les protéines ayant une affinité pour la molécule de gélatine. Par exemple, les MMPs ont une très bonne affinité pour cette matrice car ces enzymes possèdent des domaines de type fibronectines, responsables de la fixation à la gélatine (Mikhailova et al. , 2012). La GP100 ayant une activité gélatinolytique, elle présente donc une affinité pour la gélatine.

109

Résultats

Un millilitre de milieu conditionné 18 h, soit l’équivalent de 500 millions de tachyzoïtes, est déposé sur le gel de gélatine-agarose. Après élution des protéines non fixées, les protéines ayant une affinité pour la gélatine sont éluées avec un tampon contenant 8M d’urée (Figure 45).

Sur le profil d’élution représentant l’absorbance à 230 nm en fonction du temps (Figure 45A), deux parties sont observées. La première (à gauche du graphique) représente les protéines non fixées sur la matrice donc n’ayant pas d’affinité pour la gélatine. La seconde correspond à l’élution des protéines fixées à la matrice.

Le recueil des fractions débute dès le début du pic de l’absorbance à 230 nm et s’arrête à la fin de ce même pic (Figure 45A). Les fractions correspondantes à ce pic d’absorbance sont regroupées et analysées par zymographie ( Figure 45B) et SDS-PAGE ( Figure 45C).

Les résultats de la figure 45B indiquent que la gélatinase parasitaire est éluée, avec un rendement de 85 %.

En SDS-PAGE (Figure 45C), nous observons qu’une majorité des protéines ne se fixent pas sur la matrice confirmant que très peu de gélatinases sont présentes dans l’échantillon, mais de nombreuses protéines sont encore présentes dans le pool des fractions éluées. De plus, nous n’observons pas de bandes pouvant correspondre à la GP100.

Nous devons donc coupler à cette technique une autre étape afin d’améliorer la purification de la protéase dans notre échantillon.

110

Résultats

A 3 Absorbance 230nm

Absorbance 280nm 2,5

2 Protéase parasitaire

1,5 Début de la collecte Absorbance des fractions 1

0,5

0

BC

Pool Pool Fraction fractions Fraction fractions MMP-9 Ech. non urée, lav. MMP-9 Ech. non urée, lav. humaine déposé fixée 7 et 8 humaine déposé fixée 7 et 8

Figure 45 : Profil d’élution (absorbance à 230 nm, tracé noir continu et à 280 nm, tracés en pointillés) obtenu par chromatographie d’affinité sur gélatine-agarose (A). Analyse des fractions par zymographie (B) et par SDS-PAGE après coloration au nitrate d’argent (C) Un millilitre de milieu conditionné 18 h est déposé sur la colonne. Les protéines éluées, par utilisation de l’urée, sont détectées en sortie de colonne par la mesure de l’absorbance à 230 nm et 280 nm (A). Les différentes fractions obtenues ainsi que le pool des fractions contenant la gélatinase d’intérêt sont analysés par zymographie en gel de gélatine (B) et SDS-PAGE (C).

111

Résultats

I-3/ Chromatographie chélatrice de zinc

Pour cette troisième chromatographie, nous avons utilisé l’affinité de la GP100 pour un ion divalent. En effet, l’activité gélatinolytique de la GP100 est inhibée par l’EDTA, chélateur d’ions divalents. Comme la moitié des métalloprotéases fonctionne avec un ion zinc, cet ion a été choisi pour être fixer sur la matrice (Hooper, 1994).

Deux millilitres de milieu conditionné 18 h, soit l’équivalent d’un milliard de tachyzoïtes, sont déposés sur la matrice. Après élimination des protéines non fixées, les protéines ayant une affinité pour le zinc sont éluées avec un tampon contenant de l’imidazole (Figure 46).

Sur le profil d’élution ( Figure 46A), nous observons qu’un faible pourcentage de protéines ne se fixe pas à la matrice. Toutes les fractions contenues dans le pic d’élution sont collectées et regroupées pour être analysées par zymographie en gel de gélatine (Figure 46B) et par SDS-PAGE (Figure 46C).

Les protéines éluées contiennent la GP100 ( Figure 46B), cependant nous observons que le rendement de cette chromatographie (27%) est beaucoup plus faible que celui de la chromatographie d’affinité sur gélatine-agarose (85%).

Les résultats de la figure 46C montre que de nombreuses protéines ne se fixent pas sur la matrice et de plus, les fractions éluées et regroupées contiennent encore un nombre important de protéines. De plus, nous n’observons pas de bandes pouvant correspondre à la GP100.

Afin d’essayer de purifier cette gélatinase parasitaire et obtenir une quantité suffisante (de l’ordre du dixième de nanogramme) pour réaliser son identification par spectrométrie de masse, il semble donc nécessaire de coupler ces trois chromatographies.

112

Résultats

A Protéase parasitaire

3 AbsorbanceAbsorbance 230230nm AbsorbanceAbsorbance 280230nm 2,5

2

1,5 Début de la collecte

Absorbance des fractions 1

0,5

0

BC

Pool Pool Fraction Fraction fractions fractions non MMP-9 Ech. non I, I+1 à MMP-9 Ech. I, I+1 à fixée humaine déposé fixée +3 humaine déposé +3

Figure 46 : Profil d’élution (absorbance à 230 nm, tracé noir continu et à 280 nm, tracé en pointillés) obtenu par chromatographie chélatrice de zinc (A). Analyse des fractions par zymographie (B) et par SDS-PAGE après coloration au nitrate d’argent (C) Deux millilitres de milieu conditionné 18 h sont déposés sur la colonne. Les protéines éluées, par utilisation de l’imidazole, sont détectées en sortie de colonne par la mesure de l’absorbance à 230 nm et 280 nm (A). Les différentes fractions obtenues ainsi que le pool des fractions contenant la gélatinase d’intérêt sont analysés par zymographie en gel de gélatine (B) et par SDS-PAGE (C).

113

Résultats

I-4/ Association des trois techniques chromatographiques

Afin de réaliser la purification de la GP100, les trois chromatographies précédemment décrites ont été réalisées en série. Le schéma de la stratégie utilisée est présenté ci-dessous (Figure 47) :

2 x Gélatine- 1 x colonne chélatrice 6 x Gel filtration agarose de zinc

+ 1 mL de Colonne 1

tampon de lavage Gel filtration 1mL de milieu conditionné 18 h

Fractions éluées

Pool + Concentration Colonne 2

Gélatine Pool obtenu après agarose la colonne 1 (1 mL) + 2 mL de tampon de fixation

Fractions éluées

Pool + Concentration + dialyse Colonne 3

Colonne chélatrice Pool obtenu après de zinc la colonne 2 (1 mL) + 3 mL de tampon de fixation

Concentration Fractions éluées

< 1mL Figure 47 : Stratégie employée pour la purification de la protéase parasitaire

Les trois chromatographies sont réalisées en série dans l’ordre suivant : gel filtration, gélatine-agarose et chélatrice de zinc. Entre chaque chromatographie, les fractions éluées sont analysées par zymographie puis rassemblées et concentrées avant d’être déposées sur la matrice suivante.

114

Résultats

Les capacités de fixation des différentes matrices étant différentes, trois chromatographies de gel filtration sont réalisées avant le dépôt sur la colonne de gélatine- agarose et deux chromatographies d’affinité sur gélatine-agarose avant le dépôt sur le gel chélateur de zinc.

Les résultats de cette stratégie de purification sont présentés dans la figure 48. Après chaque étape, les fractions sont regroupées et concentrées. Après la chromatographie chélatrice de zinc, les fractions éluées sont regroupées et concentrées en vue de leur analyse par SDS-PAGE (Figure 48A) et par zymographie en gel de gélatine (Figure 48B).

A B MMP-9 MMP-9 PM (kDa) Pool humaine PM (kDa) Pool humaine

1 1 170 170 130 130

95 2 95 3 3 72 72

55 4 55 5 5

Figure 48 : Analyse des fractions obtenues après l’association des trois chromatographies Les protéines obtenues après les trois chromatographies sont analysées par SDS-PAGE (A) et par zymographie (B). Un marqueur de masses moléculaires et la MMP-9 humaine sont utilisés comme référence.

Les résultats de la figure 48A indiquent cinq bandes d’intensité majoritaires numérotées de 1 à 5 : deux sont de masses moléculaires supérieures à 92 kDa et trois de masses moléculaires inférieures.

Par zymographie ( Figure 48B), nous observons trois bandes : une de masse moléculaire supérieure à 92 kDa (n°1) et deux de masses moléculaires inférieures à 92 kDa (n°3 et 5). Les bandes n°1, 3 et 5 semblent correspondre à celles observées sur le gel de SDS- PAGE. Nous notons que la bande n°1 quantitativement majeure présente sur le gel SDS- PAGE possède une activité gélatinolytique très faible comparativement aux bandes n°3 et 5.

Nous avons alors découpé et analysé au spectromètre de masse les bandes n°1, 3 et 5 obtenues par SDS-PAGE. L’analyse, réalisée par la société Alphalyse, n’a pas permis

115

Résultats d’identifier les protéines présentes dans les échantillons. D’après cette société, le problème d’identification semblait être dû au fait que les échantillons contenaient trop d’ion zinc qui pourraient être des contaminants importants pour le protocole utilisé en spectrométrie de masse.

II/ Identification de la TGME49_227948 par spectrométrie de masse

II-1/ Purification partielle par chromatographie chélatrice de zinc

Après cet échec d’identification des protéines présentes dans le pool issu des trois chromatographies réalisées en série, nous avons opté pour une purification utilisant successivement trois chromatographies chélatrices de zinc dont les fractions éluées ont été poolées.

Comme décrit précédemment, toutes les fractions éluées de ce gel et contenant la gélatinase parasitaire ont été regroupées et concentrées afin d’être analysées par zymographie et SDS-PAGE ( Figure 49 ).

Pool de trois chromatographies chélatrice de zinc PM (kDa) SDS-PAGE Zymographie

250

150

100

75

Figure 49 : Analyse par SDS-PAGE et par zymographie des protéines purifiées par chromatographies chélatrices de zinc Les fractions contenant la GP100 provenant de l’élution de trois chromatographies chélatrices de zinc ont été regroupées, concentrées et analysées par SDS-PAGE (piste du milieu) et par zymographie (piste de droite). Un marqueur de masses moléculaires (PM) est utilisé comme référence.

116

Résultats

Les résultats de la figure 49 indiquent, par SDS-PAGE ( Figure 49, piste du milieu ), que les fractions rassemblées contiennent quatorze bandes pouvant correspondre à au moins quatorze protéines. Par zymographie ( Figure 49, piste de droite ), quatre bandes possédant une activité gélatinolytique sont visibles : deux de masses moléculaires supérieures à 250 kDa et deux autres de masses moléculaires inférieures ou égales à 100 kDa.

Les deux gels étant parfaitement superposables par rapport aux marqueurs de masses moléculaires et à la MMP-9 humaine, nous pouvons observer qu’une bande au niveau du gel SDS-PAGE est située exactement au même niveau que la bande possédant l’activité gélatinolytique la plus intense. La masse moléculaire apparente de cette bande est d’environ 100 kDa et pourrait correspondre à la GP100.

Cette bande de SDS-PAGE a été découpée puis analysée par spectromètre de masse par la société Alphalyse. Les résultats sont présentés dans la figure 50 .

Figure 50 : Résultats obtenus par analyse par spectrométrie de masse de la bande découpée sur le gel SDS-PAGE

Ce résultat permet donc la mise en évidence d’une protéine zinc métalloprotéase 2 putative, nommée TGME49_027950, avec un pourcentage de recouvrement de 24%, autrement dit que 24% de la séquence protéique de la TGME49_027950 a été couverte par l’ensemble des séquences identifiés par spectrométrie de masse à partir de la bande analysée. Deux autres protéines ont également été identifiées : MIC2 et le précurseur de la chaîne gamma du fibrinogène de la souris avec 21% et 24% de recouvrement respectivement (Figure 50 ).

La TGME49_027950 correspond à une métalloprotéase à zinc d’une masse moléculaire théorique de 190 kDa composé de 1728 acides aminés. Cette métalloprotéase

117

Résultats possède des homologues au niveau des souches RH et VEG dont les séquences en acides aminés sont identiques. Le logiciel InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/) a permis de déterminer que la TGME49_027950 présentait des domaines M16C avec un motif inversé de liaison au zinc HXXEH(X) nE.

II-2/ Etude de la zinc métalloprotéase 2, putative

Nous avons ensuite identifié les homologues de cette protéine, à l’aide du logiciel EuPathDB (http://eupathdb.org/eupathdb/). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau X .

Tableau X : Homologues de la TGME49_027950 identifiés à l’aide du logiciel EuPathDB % Espèces Gène Nom Nomenclature EC identité zinc metalloprotease 2, T. gondii TGME49_027950 100% Non décrit putative Mitochondrial présequence N. caninum NCLIV_045460 67% 3.4.24.- protease, précureur P. Falciparum PF13_0322 Falcilysin 35% 4.4.1.21 et 3.4.24.- P. vivax: PVX_115000 Falcilysin, putative 32% Non décrit

La TGME49_027950 possède trois homologues : une protéine mitochondriale NCLIV_045460 présente chez Neospora caninum et une protéine, la falcilysine, présente chez Plasmodium falciparum (PF13_0322) et chez Plasmodium vivax (PF13_115000).

Nous avons alors réalisé un alignement des séquences de ces trois homologues à l’aide du logiciel ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) (Figure 51). Les peptides indiqués en rouge sont ceux retrouvés au spectromètre de masse lors de l’identification de la bande de 100 kDa présentée dans la figure 49. De plus, la présence d’un signal peptide au niveau de TGME49_027950 a été analysée avec le logiciel SignalP 3.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/).

118

Résultats

Peptide signal TGME49_027950 1 MSISLATLPLAGGLAVPPQEKTQRSQSGALRVPSSPPTPKADPSTPEHTSAFEKLKIHQI NCLIV_045460 1 ------PF13_0322 1 ------

TGME49_027950 61 AMRVVKVAELQRRLRHKKLAPLQDEEQIAALSGIRLENVLAFRNLVSATKRATAASVPIG NCLIV_045460 1 ------PF13_0322 1 ------

TGME49_027950 121 EKDPLLGRTTLALSIFNIPTEVQRRITDKDRWRRLFPAARGERPGGGLTLLFLALMAEAC NCLIV_045460 1 ------PF13_0322 1 ------

TGME49_027950 181 RRFDEADVYVIQLLVRKASRLEELTEEERACVQRAFNRRIQRSKHSLKQVTALERAFDAR NCLIV_045460 1 ------PF13_0322 1 ------

TGME49_027950 241 RDAGQPNRTYRLAEVAAYKERLKDDIVRHCYAIVWAVTHLIMPSPGSAATQMFSYKWIAT NCLIV_045460 1 ------PF13_0322 1 ------

TGME49_027950 301 AFRQVTQFTDSVPQYQCLQLAESNYQQAVNVAK TDTTLRPCDMLR IETLISWANFLFYNL NCLIV_045460 1 ------PF13_0322 1 ------

TGME49_027950 361 EKR QEALASAR ETLQEAIAQLETVPEEHFAEVVEALQILMK SVWRWNQESR KDAMWFSRC NCLIV_045460 1 ------PF13_0322 1 ------

TGME49_027950 421 QR MRFSV VSA PMA TPS TATGS PP VSSPC SSSVQ RRG-LS LGK RA TIPSF LA SG RRP AGLS NCLIV_045460 1 ------MAT PLG LLG SASSA PP SSPGS SFLRC REAPAA LAR PQ SAPDSW ACS RRPVGVA PF13_0322 1 ------MN LTKLM KVIGYI

TGME49_027950 480 SVLSSPIRAAAAISVAAAFASQ VPSLTALLS -- SISCS-SPAP N-PLAFTCLP PPAC PLP NCLIV_045460 54 SLLSSP FRAAAALTMAAA VASQAPSLTALLS -- SMCTQFA PAP VA PLAFSHPF PAAC LPS PF13_0322 14 N IIT NC VQSFTNRADKKR YNVF AKSFINT INTN------

TGME49_027950 536 AQ KGPL STPAAPST PREVPR SPSSASAWA SPAF SASS QSPCYS AFA LPSTAN AW EGR LFS NCLIV_045460 112 TS KPGA SHPLSHGV PTTFLA SPTCAASPL S--LSSIL QQPAGR GGP LASPS-AW QGRLFS PF13_0322 47 ------LYT

TGME49_027950 596 VMPAA ALSSGSR GASAAQAEGAGSL TTL AAPAHPAF VVTSQDTVPELHL AV TEYVHRKTG NCLIV_045460 169 VMPAATLAL ADQ AEK PESLR----HSAD ASP SHPAFDITSQEAVPELHLT ATEYVHKKTG PF13_0322 50 FKAVMSKTPEWIHEK ------SP KHNS YDI IEKRYNE EFK MTYTVYQHKK AK

* ^^^*

TGME49_027950 656 AHVVSLTVP S-TEKEK VFCIAFRTPV VDSTGVPHILEHSVLSGS AKYPVKEPFAELLKGS NCLIV_045460 225 ARVMSLTVPE-NETEKVFCI CLRTPV ADSTGVPHILEHSVLSGS NKYPLKEPFAELLKGS PF13_0322 96 TQ VISL GTN DPL DVEQA FAFY VKTLTHSGK GIPHILEHSVLSGS KN YNYKNSI GLLEKGT H..EH ^^^

TGME49_027950 715 LYSYLNASTYPDRTLYPVAS AND EDFYNLA NVYFDAVFQPRAVRD PD VLLQEGWRLEVTS NCLIV_045460 284 MYSYLNASTYPDRT CYPVASVNDKDFYNLA DVYFDAVFQPRAIRD ET VLLQEGWRLEVTS PF13_0322 156 LHTHLNA YTFNDRTVYMA GSMNNKDFFNIMG VY MDSVFQP NV LENKY IFET EGW TY EV EK E

119

Résultats

^^^ TGME49_027950 775 EDEKE AADAVRLRGEDEA PR PR ERRRKLAYQGVVLNEMKGVYSSPEALLWK AQM QTLFPD NCLIV_045460 344 ED AKAE GDAVRLRGDGE LDES RKRKRKLAFQGVVLNEMRGVYSSPEALLWKAQM ETLFPD PF13_0322 216 LK EDEK------GKAEIPQM KDY KVSFNGIVYNEMKG AL SSP LED LYHEE MKY MFPD E +++ TGME49_027950 835 IP AYFHDSGGDP EV IK TLSFDDFVAFYNRFYHPSNARIFFWGSDNVLDRLNFVDRNL NNL NCLIV_045460 404 IP SYAHDSGGDP QDIKTLTFD AFKEFYNRFYHPSNAKIFFWGSD DVMRRL DFVDKNL EA L PF13_0322 267 N-VHSNN SGGDP KEITN LTYEEFKEFY YKNYNPKKV KVFFFSKN NPT ELLNFVD QY LGQL Y

TGME49_027950 895 Q VPK TCDRAVEASSAVPSQPLLPSPRRVTR TFPAPKEQLED FVTV SMVLDP ------NCLIV_045460 464 EVPKTC NRAIEASS VVPSQPLLPAPTRVTR VFPAPKEQLEDLVTV NLVLDP ------PF13_0322 326 DYS KYR DDAVE S--- VEY QTYKK GPFY IKKKYGDHS EEK ENLVSVAW LLNPKVDKTNNHN

TGME49_027950 946 ------LGVAVPTPFQR QTLGVLTHLLVGTSPSPLYR ALTESGLGK NCLIV_045460 515 ------MGFP VPTPFQR LSLTILSHLLMGTS ASPLYRALTESGLGK PF13_0322 383 NNHSNNQSSENNGYSNGSHSSD LSLEN PTDYFV LLIINN LLIHTPE SVLYKALTDCGLG N

TGME49_027950 986 QVMG-ELEDGLKHLIFTAGLKGIPQQS AED S--- SVVDK VE QIVLDCLEK HAREGFSEEA NCLIV_045460 555 QVIG -GIEDGLKHLLFSAGLKGVPQQSE GG T--- SAVDKIEEIVLECLEKHAREGFTDEA PF13_0322 443 NVI DR GL NDSLVQY IFS IGLKGI KR NNEKIKNFDK VHYE VEDVIM NA LKKVV KEGF NKS A

TGME49_027950 1042 IEAAINSREFLLREFNTGTFPK GLAVI REM AALWTEDRDPVEGLRFE EHFEELRRRLK SG NCLIV_045460 611 IDASINS TEF RLREFNTGSFPKGLAVI QEMTA GWTEDRDPVDGLRFE GHLEELRRRLKSG PF13_0322 503 VEASIN NI EFILKEANLK TS-KSIDF VFEMT SKLNYN RDPLLIFE FE KY LNI VK NKIKNE

TGME49_027950 1102 EPVFQNLLQ------KFFIGNPHR ATIHLR ADPDEEARR EA QEK AEI SA NCLIV_045460 671 EPLFENLL RNYLRSGLLSALCSAASA RHFIGN THRATIHLRADPDEEARREA KDKEEI EE PF13_0322 562 PMYL EKF VE------KHFI NNAHR SV ILLEGDENYAQEQ ENL EK QELKK

TGME49_027950 1145 LQASLSSE KLD FLEKQT KELKARQMAEDPPEAL ATLPTLSL EDVDKEGEEIPT ------NCLIV_045460 731 VEASLSSEELD ALE TQT IELKAKQMAEDPPEAL RTLPTLTLQDVD AEGEEIPT ------PF13_0322 605 RIENFNEQ EKEQVIKNFE EL SKYKN AEESPE HLNKF PIISISDLNKKTL EVPVNVYFTNI

TGME49_027950 1198 ------SIE PFLD NCLIV_045460 784 ------TIESYLD PF13_0322 665 NENNNIMETYNKLKTNEHMLKDNMDVFLKKYVLKNDKHNTNNNNNNNNNMDYSFT ETKY E

TGME49_027950 1205 GRAAILRH VLPTSGILY ADVAFPLHTL AVEDLQYL SLF SRLTVEAGTSTKDEATLIHHIG NCLIV_045460 791 GRAALLRH ALPT AGILYVDLAFPLHTLTLDEL RYL ALF GRLLVEAGTSTKDEA AIVHHIG PF13_0322 725 GNVP IL VYE MPTTGIVYLQFV FSLDH LTVDEL AYL NLF KT LILENK TNK RSSEDF VILRE

TGME49_027950 1265 RYTGGILPVTDIR TLHEK QD EVADPY LSVGYFVLKGKVLK PHIHELF ATMAEVMTDANLG NCLIV_045460 851 RYTGGIS SVTDIRTLH PNPR EIADPYQSAGYFIIKGK ALK SRIPELF STIAEIMTDANLG PF13_0322 785 KNI GSMSANVA LYSKD DH LN-VTDKYNAQ ALFNLEMH VL SH KCN DALNIAL EAVKESDFS

TGME49_027950 1325 NARRGREILKETLSSLEAAFLHSGHAVAASRILASLTTTGYISELRGGYAYLEFIK DLKK NCLIV_045460 911 NGRRGKEILKETLSSLEAAFLHSGHAMASSRILASLT VTGYISE QRHGHAYLEFIKDLKK PF13_0322 844 NKKK VI DILK RK ING MKTT FSEKGYAILMKY VKAHLNSKH YAHN IIY GY ENYLK LQEQLE

TGME49_027950 1385 QADKDWAPIEAKLKSIR GKLLQAQR EQLLVNLTGEADVLEKATSPSTAGGR ALA AAV KAM NCLIV_045460 971 QAD EDW SPI QE KLVTIR EKLL KAQREQLLINLTGD ETT LE AATSP AH AGGRALA EAV QAL PF13_0322 904 L AENDFKT LENI LV RIR NKIFNKK-- NLMVSVTSDYGA LKHLFVN SNESL KNLVSYFEEN

120

Résultats

TGME49_027950 1445 RRDPPHSHSPHS SRHSHT LDGKR AVTPCPWGEELKK KRALVPTKDEGTVGEGFVIPTQVN NCLIV_045460 1031 RTG------ASSHHAC LDGKRGVHPCPWG AELKKKHGLLQV KEEGTVGEGFVVPT RVN PF13_0322 962 D KY------INDMQNKVNDP TVMG WNEEIKSKK---LFD EE KVKK EFFVLPT FVN

TGME49_027950 1505 YVGLGGRLFKPGEPFSGSTAVATRALSTGYIWDSVRVQGGAYGSSFRSDFTGIFLFTSYR NCLIV_045460 1083 YVGLGGRLF APGEPYVGASAVAVRALSTGYIWD NIRVVGGAYGSFFRSDFTGTFLFTSYR PF13_0322 1008 S VSMSGILFKPGE YLDP SFT VIVAAL KNS YLWDTVR GLNGAYG VFADI EY DGSVVFLSAR

TGME49_027950 1565 DPHLRETL QKYLGAA EALR HFAETLDERAR TR AILGVIRDLDQPTQNDQK GYR GLWEAIQ NCLIV_045460 1143 DPHLRDTL KRYLGAGAGL HQ FAE NLDER SLTRAVIGVLRDLDQPT PNDQKGYRALW QT IQ PF13_0322 1068 DP NLEK TL AT FRES AKGLRKMADTMTEND LLRYII NT IGT IDKPRRGIELSKLSFLRL IS

TGME49_027950 1625 GQSKEDR QRYRREVLGTSPEAIR AFAQRLEASLRGELRSRTLKEY-TLDRERVA DSSL P- NCLIV_045460 1203 GETKEDRQRFRKEVLQTTAA DIRAFADRLEA QLGGE ARRRQLEEGSL LERERVA ASSL SA PF13_0322 1128 N ES EQ DR VE FRK RIMNTKK ED FYK FAD LLE SK VN------

TGME49_027950 1683 ED SF RARN LVTVVVGSRTAFDDAARQDADLVY SLRSVMGD IKPNAN--- NCLIV_045460 1263 DE AL KTPS LVSVVVGSKTAFDEASRQD PA IVY KMK RVMGD GAADPEDSA PF13_0322 1162 ----EFEKN IVII TTKEK ANEYI ANV DGE FKKV LIE------

Figure 51 : Alignement de séquences entre les protéines TGME49_027950 (T. gondii ), NCLIV_045460 (N. caninum ) et PF13_0322 (P. falciparum ) réalisé à l’aide de logiciel ClustalW2

Le motif caractéristique de la famille M16 HXXEH(X)nE est encadré en vert. Les peptides indiqués en rouge sont ceux retrouvés au spectromètre de masse lors de l’identification de la protéine de 100 kDa. Le peptide signal putatif en jaune a été déterminé grâce au logiciel SignalP 3.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/). Les homologies entre les trois séquences sont représentées à l’aide du logiciel boxshade 3.21 (http://www.ch.embnet.org/ software/BOX_form.html) : les acides aminés en noir sont identiques pour les trois séquences et ceux en gris possèdent une homologie. Les ligands au zinc (*), les résidus du site actif (^) et les résidus conservés (+) sont notés au-dessus des séquences alignées.

La composition du site catalytique caractéristique des protéases M16C a été retrouvée sur les séquences protéiques des trois homologues et est défini comme suit :

HILEHN28 E78E118 Y172 .

Après chromatographies chélatrices de zinc, nous avons identifié, par spectrométrie de masse et avec un pourcentage de recouvrement de 24 %, une protéine zinc métallopeptidase 2, putative appelée TGME49_027950 dans ToxoDB. Cependant, par comparaison avec la protéine homologue chez Neospora caninum NCLIV_045460, nous avons noté l’absence de la séquence peptidique comprenant les acides aminés n° 1 à 427. De plus, lors de l’identification par spectrométrie de masse, aucune des séquences identifiées par spectrométrie de masse n’a été retrouvée entre les acides aminés n° 1 et 332.

121

Résultats

En octobre 2012, une modification d’annotation de la TGME49_027950 a été effectuée au sein de ToxoDB par l’équipe du Professeur Soldati-Favre, confirmant ainsi nos observations.

Ainsi, La TGME49_027950 a été divisée en deux protéines bien distinctes :

- La TGME49_227952 (14-3-3 superfamily protein) : une protéine appartenant à la superfamille 14-3-3,

- Et la TGME49_227948 (peptidase M16 inactive domain-containing protein) : une protéine contenant le domaine peptidique de la famille M16. Il s’agit de la métalloprotéase que nous avons précédemment purifiée.

La TGME49_227948 possède une masse moléculaire théorique de 142 kDa et se compose de 1306 acides aminés regroupés dans 13 exons. La séquence en acides aminés de la TGME49_227948 est identique à celle de TGME49_027950 à l’exception des acides n°1 à 422 qui ont été supprimés. Cette métalloprotéase possède des homologues au niveau des souches RH et VEG dont les séquences en acides aminés sont identiques.

L’appartenance de la protéine TGME49_227948 à la famille M16C avec un motif inversé de liaison au zinc HXXEH(X)E a été confirmée à l’aide du logiciel InterProScan (Figure 52).

Figure 52 : Domaines composant la TGME49_227948 prédits par le logiciel InterProScan

Les résultats de la figure 52 indiquent la présence de quatre domaines permettant de classer la TGME49_227948 dans la famille des métalloprotéases M16C : un domaine caractéristique des peptidases M16-like (IPR011249), un domaine des peptidases M16

122

Résultats

(IPR011237) et son domaine M16C associé (IPR013578) et un domaine C-terminal des peptidases M16 (IPR007863).

De nouveau, la recherche des homologues de la TGME49_227948 chez d’autres Apicomplexa à l’aide du logiciel NCBI-Blast a été réalisée (http://www.ebi.ac.uk/ Tools/sss/ncbiblast/). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-après (Tableau XI).

Tableau XI : Homologues de la peptidase M16 inactive domain-containing protein (TGME49_227948) de T. gondii chez deux autres membres de la famille Apicomplexa : N. caninum , P. falciparum Espèces Gène Nom Nomenclature EC

peptidase M16 inactive domain- T. gondii TGME49_227948 containing protein

Mitochondrial presequence protease N. canimun NCLIV_045460 3.4.24- (Precursor), related

P. falciparum PF3D7_1360800 falcilysin (FLN) 4.4.21 3.4.24-

D’après la Tableau XI, la TGME49_227948 possède deux homologues : la NCLIV_045460 présente chez N. caninum qui a une localisation mitochondriale et qui est caractérisée comme métallopeptidase (3.4.24) et la PF3D7_1360800, appelée falcilysine présente chez P. falciparum qui est caractérisée comme S-ribosylhomocysteine lyase (4.4.21) et métallopeptidase (3.4.24).

Les trois homologues ont été alignés, grâce au logiciel ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/), afin d’analyser plus précisément leurs séquences et d’identifier le site catalytique.

La figure 53 présente l’alignement entre ces trois protéines homologues.

123

Résultats

TGME49_227948 MRFSVVSAPMATPSTATGSPPVSSPCSSSVQRRG-LSLGKRATIPSFLASGRRPAGLSSV 59 NCLIV_045460 -----MATPLGLLGSASSAPPSSPGSSFLRCREAPAALARPQSAPDSWACSRRPVGVASL 55 PF3D7_1360800 ------MNLTKLMKVIGYINI 15 : : * .:

TGME49_227948 LSSPIRAAAAISVAAAFASQVPSLTALLSSISCS-SPAPN-PLAFTCLPPPACPLPAQKG 117 NCLIV_045460 LSSPFRAAAALTMAAAVASQAPSLTALLSSMCTQFAPAPVAPLAFSHPFPAACLPSTSKP 115 PF3D7_1360800 ITNCVQSFTNRADKKRYNVFAKSFINTINTN------46 ::. .:: : : . *: :.:

TGME49_227948 PLSTPAAPSTPREVPRSPSSASAWASPAFSASSQSPCYSAFALPSTANAWEGRLFSVMPA 177 NCLIV_045460 GASHPLSHGVPTTFLASPTCAASPLS--LSSILQQPAGRGGPLASPS-AWQGRLFSVMPA 172 PF3D7_1360800 ------LYTFKAV 53 *::. ..

TGME49_227948 AALSSGSRGASAAQAEGAGSLTTLAAPAHPAFVVTSQDTVPELHLAVTEYVHRKTGAHVV 237 NCLIV_045460 ATLALADQAEKPESLR----HSADASPSHPAFDITSQEAVPELHLTATEYVHKKTGARVM 228 PF3D7_1360800 MSKTPEWIHEK------SPKHNSYDIIEKRYNEEFKMTYTVYQHKKAKTQVI 99 : : . :* * :: : .: *:::: * * *:*: ::*:

TGME49_227948 SLTVPS-TEKEKVFCIAFRTPVVDSTGVPHILEHSVLSGSAKYPVKEPFAELLKGSLYSY 296 NCLIV_045460 SLTVPE-NETEKVFCICLRTPVADSTGVPHILEHSVLSGSNKYPLKEPFAELLKGSMYSY 287 PF3D7_1360800 SLGTNDPLDVEQAFAFYVKTLTHSGKGIPHILEHSVLSGSKNYNYKNSIGLLEKGTLHTH 159 ** . . : *:.*.: .:* . ...*:************ :* *:.:. * **:::::

TGME49_227948 LNASTYPDRTLYPVASANDEDFYNLANVYFDAVFQPRAVRDPDVLLQEGWRLEVTSEDEK 356 NCLIV_045460 LNASTYPDRTCYPVASVNDKDFYNLADVYFDAVFQPRAIRDETVLLQEGWRLEVTSEDAK 347 PF3D7_1360800 LNAYTFNDRTVYMAGSMNNKDFFNIMGVYMDSVFQPNVLENKYIFETEGWTYEVEKLKED 219 *** *: *** * ..* *::**:*: .**:*:****..:.: :: *** ** . . .

TGME49_227948 EAADAVRLRGEDEAPRPRERRRKLAYQGVVLNEMKGVYSSPEALLWKAQMQTLFPDIPAY 416 NCLIV_045460 AEGDAVRLRGDGELDESRKRKRKLAFQGVVLNEMRGVYSSPEALLWKAQMETLFPDIPSY 407 PF3D7_1360800 EK------GKAEIPQMKDYKVSFNGIVYNEMKGALSSPLEDLYHEEMKYMFPDN-VH 269 .: .: : *::::*:* ***:*. *** *:: :*: :*** :

TGME49_227948 FHDSGGDPEVIKTLSFDDFVAFYNRFYHPSNARIFFWGSDNVLDRLNFVDRNLNNLQVPK 476 NCLIV_045460 AHDSGGDPQDIKTLTFDAFKEFYNRFYHPSNAKIFFWGSDDVMRRLDFVDKNLEALEVPK 467 PF3D7_1360800 SNNSGGDPKEITNLTYEEFKEFYYKNYNPKKVKVFFFSKNNPTELLNFVDQYLGQLDYSK 329 ::*****: *..*::: * ** : *:*.:.::**:..:: *:***: * *: .*

TGME49_227948 TCDRAVEASSAVPSQPLLPSPRRVTRTFPAPKEQLEDFVTVSMVLDP------523 NCLIV_045460 TCNRAIEASSVVPSQPLLPAPTRVTRVFPAPKEQLEDLVTVNLVLDP------514 PF3D7_1360800 YRDDAVES---VEYQTYKKGPFYIKKKYGDHSEEKENLVSVAWLLNPKVDKTNNHNNNHS 386 : *:*: * *. .* :.: : .*: *::*:* :*:*

TGME49_227948 ------LGVAVPTPFQRQTLGVLTHLLVGTSPSPLYRALTESGLGKQVMG 567 NCLIV_045460 ------MGFPVPTPFQRLSLTILSHLLMGTSASPLYRALTESGLGKQVIG 558 PF3D7_1360800 NNQSSENNGYSNGSHSSDLSLENPTDYFVLLIINNLLIHTPESVLYKALTDCGLGNNVID 446 ...: .* : * ::.:**: *. * **:***:.***::*:.

TGME49_227948 -ELEDGLKHLIFTAGLKGIPQQSAEDS---SVVDKVEQIVLDCLEKHAREGFSEEAIEAA 623 NCLIV_045460 -GIEDGLKHLLFSAGLKGVPQQSEGGT---SAVDKIEEIVLECLEKHAREGFTDEAIDAS 614 PF3D7_1360800 RGLNDSLVQYIFSIGLKGIKRNNEKIKNFDKVHYEVEDVIMNALKKVVKEGFNKSAVEAS 506 ::*.* : :*: ****: ::. . .. ::*:::::.*:* .:***...*::*:

TGME49_227948 INSREFLLREFNTGTFPKGLAVIREMAALWTEDRDPVEGLRFEEHFEELRRRLKSGEPVF 683 NCLIV_045460 INSTEFRLREFNTGSFPKGLAVIQEMTAGWTEDRDPVDGLRFEGHLEELRRRLKSGEPLF 674 PF3D7_1360800 INNIEFILKEANLKTS-KSIDFVFEMTSKLNYNRDPLLIFEFEKYLNIVKNKIKNEPMYL 565 **. ** *:* * : *.: .: **:: . :***: :.** ::: ::.::*. :

TGME49_227948 QNLLQ------KFFIGNPHRATIHLRADPDEEARREAQEKAEISALQAS 726 NCLIV_045460 ENLLRNYLRSGLLSALCSAASARHFIGNTHRATIHLRADPDEEARREAKDKEEIEEVEAS 734 PF3D7_1360800 EKFVE------KHFINNAHRSVILLEGDENYAQEQENLEKQELKKRIEN 608 ::::. :.**.*.**:.* *..* : .:* :* *:. .

124

Résultats

TGME49_227948 LSSEKLDFLEKQTKELKARQMAEDPPEALATLPTLSLEDVDKEGEEIPT------775 NCLIV_045460 LSSEELDALETQTIELKAKQMAEDPPEALRTLPTLTLQDVDAEGEEIPT------783 PF3D7_1360800 FNEQEKEQVIKNFEELSKYKNAEESPEHLNKFPIISISDLNKKTLEVPVNVYFTNINENN 668 :..:: : : .: **. : **:.** * .:* :::.*:: : *:*.

TGME49_227948 ------SIEPFLDGRAA 786 NCLIV_045460 ------TIESYLDGRAA 794 PF3D7_1360800 NIMETYNKLKTNEHMLKDNMDVFLKKYVLKNDKHNTNNNNNNNNNMDYSFTETKYEGNVP 728 *. :*...

TGME49_227948 ILRHVLPTSGILYADVAFPLHTLAVEDLQYLSLFSRLTVEAGTSTKDEATLIHHIGRYTG 846 NCLIV_045460 LLRHALPTAGILYVDLAFPLHTLTLDELRYLALFGRLLVEAGTSTKDEAAIVHHIGRYTG 854 PF3D7_1360800 ILVYEMPTTGIVYLQFVFSLDHLTVDELAYLNLFKTLILENKTNKRSSEDFVILREKNIG 788 :* : :**:**:* :..*.*. *::::* ** ** * :* *..:.. :: : *

TGME49_227948 GILPVTDIRTLHEKQDEVADPYLSVGYFVLKGKVLKPHIHELFATMAEVMTDANLGNARR 906 NCLIV_045460 GISSVTDIRTLHPNPREIADPYQSAGYFIIKGKALKSRIPELFSTIAEIMTDANLGNGRR 914 PF3D7_1360800 SMSANVALYSKDDHLN-VTDKYNAQALFNLEMHVLSHKCNDALNIALEAVKESDFSNKKK 847 .: . . : : . : ::* * : . * :: :.*. : : : * :.::::.* ::

TGME49_227948 GREILKETLSSLEAAFLHSGHAVAASRILASLTTTGYISELRGGYAYLEFIKDLKKQADK 966 NCLIV_045460 GKEILKETLSSLEAAFLHSGHAMASSRILASLTVTGYISEQRHGHAYLEFIKDLKKQADE 974 PF3D7_1360800 VIDILKRKINGMKTTFSEKGYAILMKYVKAHLNSKHYAHNIIYGYENYLKLQEQLELAEN 907 :***..:..::::* ..*:*: . : * *. . * : *: ::: : *::

TGME49_227948 DWAPIEAKLKSIRGKLLQAQREQLLVNLTGEADVLEKATSPSTAGGRALAAAVKAMRRDP1026 NCLIV_045460 DWSPIQEKLVTIREKLLKAQREQLLINLTGDETTLEAATSPAHAGGRALAEAVQALRTG-1033 PF3D7_1360800 DFKTLENILVRIRNKIFNKK--NLMVSVTSDYGALKHLFVNSNESLKNLVSYFEENDKY- 964 *: .:: * ** *::: : :*::.:*.: .*: : . : *. .:

TGME49_227948 PHSHSPHSSRHSHTLDGKRAVTPCPWGEELKKKRALVPTKDEGTVGEGFVIPTQVNYVGL1086 NCLIV_045460 ------ASSHHACLDGKRGVHPCPWGAELKKKHGLLQVKEEGTVGEGFVVPTRVNYVGL1086 PF3D7_1360800 ------INDMQNKVNDPTVMGWNEEIKSKK---LFDEEKVKKEFFVLPTFVNSVSM1011 : . *. *:*.*: .:* . * **:** ** *.:

TGME49_227948 GGRLFKPGEPFSGSTAVATRALSTGYIWDSVRVQGGAYGSSFRSDFTGIFLFTSYRDPHL1146 NCLIV_045460 GGRLFAPGEPYVGASAVAVRALSTGYIWDNIRVVGGAYGSFFRSDFTGTFLFTSYRDPHL1146 PF3D7_1360800 SGILFKPGEYLDPSFTVIVAALKNSYLWDTVRGLNGAYGVFADIEYDGSVVFLSARDPNL1071 .* ** *** : :* . **...*:**.:* .**** :: * .:* * ***:*

TGME49_227948 RETLQKYLGAAEALRHFAETLDERARTRAILGVIRDLDQPTQNDQKGYRGLWEAIQGQSK1206 NCLIV_045460 RDTLKRYLGAGAGLHQFAENLDERSLTRAVIGVLRDLDQPTPNDQKGYRALWQTIQGETK1206 PF3D7_1360800 EKTLATFRESAKGLRKMADTMTENDLLRYIINTIGTIDKPRRGIELSKLSFLRLISNESE1131 ..** : :. .*:::*:.: *. * ::..: :*:* . : . .: . *..:::

TGME49_227948 EDRQRYRREVLGTSPEAIRAFAQRLEASLRGELRSRTLKEY-TLDRERVADSSLP-EDSF1264 NCLIV_045460 EDRQRFRKEVLQTTAADIRAFADRLEAQLGGEARRRQLEEGSLLERERVAASSLSADEAL1266 PF3D7_1360800 QDRVEFRKRIMNTKKEDFYKFADLLESKVN------1161 :** .:*:.:: *. : **: **:.:

TGME49_227948 RARNLVTVVVGSRTAFDDAARQDADLVYSLRSVMGDIKPNAN--- 1306 NCLIV_045460 KTPSLVSVVVGSKTAFDEASRQDPAIVYKMKRVMGDGAADPEDSA 1311 PF3D7_1360800 EFEKNIVIITTKEKANEYIANVDGEFKKVLIE------1193 . . : ::. ...* : :. * : : Figure 53 : Alignement de séquences entre les protéines TGME49_227948 ( T. gondii ), NCLIV_045460 ( N. caninum ) et PF3D7_1360800 ( P. falciparum ) Le motif caractéristique de la famille M16C HXXEH(X)E est encadré en vert. L’étiquette de localisation mitochondriale en jaune a été déterminée grâce au logiciel iPSORT (http://ipsort.hgc.jp/predict.cgi) et MitoProt II (http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/mitoprot.html).

125

Résultats

La TGME49_227948 présente un signal d’adressage mitochondrial constitué des acides aminés n°1 à 30. De plus, le site catalytique des métalloprotéases de la famille M16C est présent dans la séquence protéique des trois homologues : HILEHN 28 E78E118 Y172 chez T. gondii et N. Caninum et HILEHN28E78E118 Y163 chez P. falciparum .

II-3/ Détermination expérimentale de l’extrémité N-terminale de la TGME49_227948 par technique 5’RACE

Lors de la nouvelle annotation de la protéine zinc métalloprotéase 2 putative, les 422 premiers acides aminés ont été supprimés. Mais lors de l’identification par spectrométrie de masse après purification par chromatographie, nous avions retrouvé des peptides à partir de l’acide aminé n° 332. Afin de définir expérimentalement le début de la séquence codant la TGME49_227948, nous avons réalisé la technique 5’RACE sur des tachyzoïtes de T. gondii , permettant de créer au niveau de l’extrémité 5’ d’un ARN messager une queue poly(C), équivalente à la queue poly(A) présente en 3’, analysable par PCR.

Pour cela, nous avons extrait l’ARNm de tachyzoïtes et réalisé cette technique de 5’RACE. Les produits de PCR obtenus ont été séquencés par la société Genoscreen.

Afin de pouvoir interpréter les résultats, différents alignements ont été réalisés.

Dans un premier temps, nous avons réalisé un alignement entre la séquence obtenue après séquençage et la séquence codante de la TGME49_227948. Nous avons obtenu un alignement partiel entre les deux séquences. Sur le fragment séquencé composé de 796 nucléotides, 480 s’alignaient avec le début de la TGME49_227948 (données non montrées). Nous avons alors réalisé un second alignement au sein de GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ) ( Figure 54).

126

Résultats

Figure 54 : Alignement de la séquence obtenue par 5’RACE dans la base de données GenBank

Nous retrouvons un alignement entre la séquence obtenue par 5’RACE et la TGME49_027950 avec un pourcentage de recouvrement de 60% et un pourcentage d’identité de 99%. Cet alignement obtenu par GenBank est identique à celui que nous avons réalisé avec la nouvelle annotation c’est-à-dire sur la séquence de la TGME49_227948.

Etant donné qu’une partie de séquence obtenue par 5’RACE ne s’aligne pas avec la séquence codante de la TGME49_227948 ou de la TGME49_027950, nous avons réalisé un nouvel alignement entre la séquence obtenue par 5’RACE et la séquence génomique de la TGME49_227948 (Figure 55).

127

Résultats

TGME49_227948 ------TTTCTGCCGTTCAACGA 17 5RACE NNNNNNNNGNNGNNNNNTTNNTCTNGACTTNGTTNNTGCGGTTTTTCTNCCGTTNANCGA 60 *****.***** * ***

TGME49_227948 ACCCACAAGGGAATCTTGCCGCTAGACTTTGAGGCTGAAGTGCGATTGCTGCCACGGAAC 77 5RACE ACCCACAAGGGAATCTTGCCNNTAGGCTTTGAGGNNGAAGTGNGATTGCTGNCACGGAAC 120 ********************. ***.******** .****** ******** ********

TGME49_227948 GCCGTGTAATAATAGCGTGCCGAGGGACTGAGGGGCACTCTGAAACGTTTCTTTGTGGCC 137 5RACE GCCGTGTAATAATAGCGTCCCGAGGGANTGAGGGGCACTNTGAAACGTTTCTTTGTGGCC 180 ****************** ******** *********** ********************

TGME49_227948 TCTGCGACGTCTTCCGCCTCGATTTCTAACTGTTTCTCTACAGTTTTGTAGTTTATCACT 197 5RACE TCCGCGACGTCTTCCGCCTCGATTTCTAACTGTTTCTCTACAGTTTTGTAGTTTATCACT 240 ** *********************************************************

TGME49_227948 CCAACATCCAGACGCCACACCGGGAAAGAGTGTGGGGGTGCACTACGTTTGAGGTAGGTT 257 5RACE CCAACATCCAGACGCCACACCGGGAAAGAGTGTGGGGGTGCACTTCGTTTGAG------293 ********************************************:********

TGME49_227948 CCGCGTTTCACCGAAGTTCCGGTGGCTAGCGCCGTTTCTCGGCGTCACCCCGTCACGCAT 317 5RACE ------

TGME49_227948 CGCACGATAGAGTCCTCCCTTTTTTGCAGCGGGCATGTAGCTTGTGGATTTTTCTCTCGT 377 5RACE ------

TGME49_227948 TTTCGCTTCTGGTCACGAGATTCCCGGTTTGCTGGTTCGCGAGATCCTGACGTCGCCGGG 437 5RACE ------

TGME49_227948 ATGCGCCGCGTTCGTACACTTCGCCGGCGCATTTCTCGCCGTCGACAAGAAAGCGCGTTC 497 5RACE ------

TGME49_227948 TGGTCGCAGAGACAGCGTTGAAAAGGAGAGATGGCGAGGTTGAGAGATTCGCATGCAGCA 557 5RACE ------

TGME49_227948 CCGGAAACGCAGTTTACTCATGACCGACCTACAACCGTGGTGTCTTGGTCGCATGAACGA 617 5RACE ------

TGME49_227948 CAAAGCTTGGCAGCTGGCCCGCAGCCGCCTTTCTCGCAGTCGCCGCGGATGGCGCGAATT 677 5RACE ------

TGME49_227948 CCACATGTCGATCGCCCGTGTTCCCCGCCATAAAAAATTGCTACGATTGTCACCATTTGT 737 5RACE ------

TGME49_227948 TTTCTGAACATTTGAAGCCTCACTGCAAGCAACCACGCACGCATCTTTGTTCCCCTGCGC 797 5RACE ------

TGME49_227948 CGCTGCTGCCGCGTCGACTTCGTTGAGGGACTCCGAAAAAGTCCCGTCGAGTAGCTTTAG 857 5RACE ------

TGME49_227948 ATCGTAGCATTTCCGCCGCATCCTGAGTCCTTTCGGACTCTTGAGGACCCTATGGGAACA 917 5RACE ------

TGME49_227948 CAGTCTGCTCGGGGGTTTGCATGTTTGGACGGGCGCCGAATGATTTTAAAGTGTCAGTAG 977 5RACE ------

TGME49_227948 AGAAAACTCCACCACAGCAAAGCGTTCTCCCGCCCCCGACTTGTTTTCCTTTCGCTCTTC 1037 5RACE ------

TGME49_227948 CTCCCACATGCTATCCGCTGTCTGTCCGTGCTGTCTGTGCTCTCTTTGCTGTCTTTTGCG 1097 5RACE ------

128

Résultats

TGME49_227948 TGTTTCAGGTGGTTTTCTCGCTGTCAGCGCATGCGTTTCTCCGTTGTCTCAGCCCCGATG 1157 5RACE ------GAGGTTTTTTCGCTGTCAGCGCATGCGTTTCTCCGTTGTCTCAGCCCCGATG 345 *:****** *******************************************

TGME49_227948 GCGACGCCGTCGACCGCGACTGGGTCACCTCCGGTCTCTTCTCCGTGCTCTTCGTCTGTC 1217 5RACE GCGACGCCGTCGACCGCGACTGGCTCACCTCCGGTCTCTTCTCCGTGCTCTTCGTCTGTC 405 *********************** ************************************

TGME49_227948 CAGCGCCGAGGCCTGTCGCTGGGGAAGCGAGCGACCATTCCCAGTTTCTTGGCGAGCGGC 1277 5RACE CAGCGCCGAGGCCTGTCGCTGGGGAAGCGCGCGACCATTCCCAGTTTCTTGGCGAGCGGC 465 *****************************.******************************

TGME49_227948 CGTCGGCCCGCGGGTCTCTCCTCTGTGTTGTCTTCGCCGATCCGTGCGGCTGCAGCGATC 1337 5RACE CGTCGGCCCGCGGGTCTCTCCTCTGTGTTGTCTTCGCCGATCCGTGCGGCTGCAGCGATC 525 ************************************************************

TGME49_227948 AGTGTGGCCGCAGCTTTCGCGAGTCAGGTGCCTTCGTTGACAGCTCTTCTTTCCTCGATT 1397 5RACE AGTGTGGCCGCAGCTTTCGCGAGTCAGGTGCCTTCGTTGACAGCTCTTCTTTCCTCGATT 585 ************************************************************

TGME49_227948 TCCTGTTCTTCTCCTGCACCGAATCCTCTCGCCTTCACCTGTTTGCCGCCGCCTGCCTGT 1457 5RACE TCCTGTTCTTCTCCTGCACCGAATCCTCTCGCCTTCACCTGTTTGCCGCCGCCTGCCTGT 645 ************************************************************

TGME49_227948 CCACTCCCTGCACAGAAAGGTCCGCTTTCGACTCCTGCTGCGCCCAGCACCCCGCGCGAA 1517 5RACE CCACTCCCTGCACAGAAAGGTCCGCTTTCGACTCCTGCTGCGCCCAGCACCCCGCGCGAA 705 ************************************************************

TGME49_227948 GTCCCCAGATCTCCCTCGAGCGCCTCCGCCTGGGCCTCGCCTGCGTTCAGCGCCTCGTCG 1577 5RACE GCCCCCAGATCTCCCTTGAGCGCCTCCGCCTGGGCCTCGCCTGCGTTCAGCGCCTCGTCG 765 * ************** *******************************************

TGME49_227948 CAGTCGCCGTGCTACTCCGCATTTGCGTTGCCTTCAACTGCGAACGCGTGGGAAGGACGG 1637 5RACE CAGTCGCCGTGCTANNNCGCNNNNNNNNNNN------796 ************** . *** ......

TGME49_227948 CTCTTCTCCGTGATGCCTGCCGCCGCGCTGAGCAGCGGCTCGCGAGGGGCGTCCGCCGCC 1697 5RACE ------

TGME49_227948 CAGGCCGAAGGCGCTGGCTCTCTGACGACGCTTGCAGCGCCTGCGCACCCTGCGTTCGTC 1757 5RACE ------

TGME49_227948 GTGACTTCCCAGGACACAGTGCCGGAGCTGCATCTGGCGGTCACTGAGTACGTCCACCGG 1817 5RACE ------

TGME49_227948 AAGACAGGCGCCCACGTGGTGAGCTTGACTGTGCCGTCGACTGAGAAGGAGAAAGTCTTC 1877 5RACE ------

Figure 55 : Alignement obtenu entre la séquence obtenue par 5’RACE et le début de la séquence génomique de la TGME49_227948 La séquence surlignée en vert représente un exon. La séquence non surlignée est un intron.

La première partie du fragment de 5’RACE s’aligne avec la région annotée comme le premier intron, située sur la séquence de la TGME49_227948 dans la base de données ToxoDB ( Figure 55). La seconde partie s’aligne avec l’exon suivant.

Il est probable que la première partie du fragment de 5’ RACE soit situé dans un exon non codant et que le site de traduction démarre dans l’exon 2.

129

Résultats

Pour confirmer la taille globale du gène codant pour la TGME49_227948 et proposer de rectifier l’annotation, nous utiliserons une technique de PCR avec des amorces permettant d’encadrer cette région au niveau de l’ADN complémentaire et génomique.

II-4/ Identification in silico des protéases appartenant à la famille M16

Dans le but de déterminer la composition du site catalytique caractéristique de la famille M16, nous avons cherché à identifier toutes les protéases appartenant à cette famille au sein de ToxoDB (Tableau XII).

Pour cela, nous avons recherché les protéases de la famille M16 chez les homologues N. Caninum et P. falciparum pour ainsi faire le lien avec les protéases putatives dans ToxoDB.

Chaque protéine identifiée a été soumise à trois logiciels de prédictions afin de confirmer l’appartenance à la famille M16 : InterProScan, Pfam et blast MEROPS.

Le logiciel InterProScan nous indique la présence de domaines spécifiques dont les dénominations sont les suivantes :

- IPR011249 : domaine des métalloenzyme, LuxS/M16 peptidase-like - IPR011237 : domaine des protéases de la famille M16 - IPR011765 : domaine N-terminal des protéases de la famille M16 - IPR007863 : domaine C-terminal des protéases de la famille M16 - IPR001431 : domaine de fixation du l’ion zinc présent chez les protéases de la famille M16 - IPR013578 : domaine associé des protéases de la famille M16

Le logiciel EMBL-EBI (search Pfam, http://pfam.xfam.org/search/) présente les différents domaines potentiels que composent les protéases analysées :

- PF00675 : Peptidase_M16 - PF05193 : Peptidase_M16_C - PF08367 : Peptidase_M16_C associated

130

Résultats

Les peptidases M16 sont composées de deux domaines structurellement apparentés. L’un est le domaine actif de la peptidase, tandis que l’autre est inactif. Les deux domaines permettent de maintenir le substrat comme une pince.

Le logiciel blast MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast /merops/advanced) permet de classer les protéases dans les sous-familles M16 A, B ou C selon leur pourcentage d’identité.

Le nom de la protéase analysée, sa nomenclature EC, sa masse moléculaire prédictive et ses fonctions sont décrits au sein de la base de données ToxoDB.

Les résultats sont présentés dans le tableau XII.

Grâce à cette étude in silico des bases de données ToxoDB et EuPathDB ( Tableau XII), nous avons pu mettre en évidence la présence de 12 protéases décrites ou putatives appartenant à la famille M16 et présentes dans le génome de T. gondii : 6 appartenant à la sous-famille M16A, 4 à la sous-famille M16B et 2 à la sous-famille M16C. La métalloprotéase que nous étudions, la TGME49_227948, est caractérisée comme une M16C. Toutes les protéases M16A présente des fonctions d’insulinases (EC 3.4.24.56) alors que les protéases M16B semblent être des enzymes impliquées dans des mécanismes mitochondriaux (EC 3.4.24.64). Les protéases M16C n’ont pas encore été caractérisées dans la nomenclature EC.

131

Résultats

Tableau XII : Identification des métalloprotéases putatives et/ou décrites appartenant à la famille M16 dans la base de données ToxoDB

Nom Prédiction InterProScan Prédiction Pfam Prédiction Nomenclature PM Fonctions putatives Références (ToxoDB) MEROPS EC Prédit (ToxoDB) TGME49_244480 Metalloenzyme LuxS/M16 peptidase-like (IPR011249) Peptidase_M16 (PF00675) M16A 3.4.24.56 41 kDa Protéolyse, activité Non publiée peptidase M16 inactive 75% Insulysin catalytique, Peptidase_M16_ inactive domain-containing Peptidase M16 domain (IPR011237) 3,50e-80 métalloendopeptidases, domain (PF05193) protein Peptidase M16, N-terminal domain (IPR011765) fixation ion zinc, fixation ion métallique Peptidase M16, C-terminal domain (IPR007863) Peptidase M16, zinc-binding site (IPR001431) TGME49_244490 Metalloenzyme LuxS/M16 peptidase-like (IPR011249) Peptidase_M16_ inactive M16A 3.4.24.56 66 kDa activité catalytique, Non publiée insulysin, putative domain (PF05193) 32,80% Insulysin fixation ion métallique Peptidase M16 domain (IPR011237) 4,20e-19

TGME49_257010 Metalloenzyme LuxS/M16 peptidase-like (IPR011249) Peptidase_M16 (PF00675) M16A 3.4.24.56 114 kDa Protéolyse, activité Non publiée sporozoite 47,10% Insulysin catalytique, Peptidase_M16_ inactive developmental protein Peptidase M16 domain (IPR011237) 1,40e-278 métalloendopeptidases, domain * 2 (PF05193) Peptidase M16, N-terminal domain (IPR011765) fixation ion zinc, fixation ion métallique Peptidase M16, C-terminal domain (IPR007863) Peptidase M16, zinc-binding site (IPR001431) TGME49_269885 Metalloenzyme LuxS/M16 peptidase-like (IPR011249) Peptidase_M16_ inactive M16A 3.4.24.56 182 kDa Protéolyse, activité (Hajagos et al. , rhoptry domain (PF05193) 93,50% Insulysin catalytique, 2012) metalloprotease Peptidase M16 domain (IPR011237) 2,50e-99 métalloendopeptidases, toxolysin TLN1 fixation ion zinc, fixation ion métallique TGME49_206510 Metalloenzyme LuxS/M16 peptidase-like (IPR011249) Peptidase_M16 (PF00675) M16A 3.4.24.56 256 kDa Protéolyse, activité (Laliberté and toxolysin TLN4 81,59% Insulysin catalytique, Carruthers, 2011) Peptidase_M16_ inactive Peptidase M16 domain (IPR011237) 5,60e-82 métalloendopeptidases, domain (PF05193) Peptidase M16, N-terminal domain (IPR011765) fixation ion zinc, fixation ion métallique, Peptidase M16, C-terminal domain (IPR007863) Se fixe dans la partie apical du parasite TGME49_236210 Metalloenzyme LuxS/M16 peptidase-like (IPR011249) Peptidase_M16 (PF00675) M16B 3.4.24.64 56 kDa Protéolyse, activité Non publiée peptidase M16 family 66,01% Mitochondrial catalytique, Peptidase_M16_ inactive protein, putative Peptidase M16 domain (IPR011237) 4,90e-145 processing métalloendopeptidases, domain (PF05193) Peptidase M16, N-terminal domain (IPR011765) peptidase fixation ion zinc, fixation ion métallique Peptidase M16, C-terminal domain (IPR007863) Peptidase M16, zinc-binding site (IPR001431)

132

Résultats

TGME49_202680 Metalloenzyme LuxS/M16 peptidase-like (IPR011249) Peptidase_M16 (PF00675) M16B 3.4.24.64 62 kDa Protéolyse, activité Non publiée peptidase M16, alpha 100% Mitochondrial catalytique, Peptidase_M16_ inactive subunit, putative Peptidase M16 domain (IPR011237) 3,90e-113 processing métalloendopeptidases, domain (PF05193) Peptidase M16, N-terminal domain (IPR011765) peptidase fixation ion zinc, fixation ion métallique Peptidase M16, C-terminal domain (IPR007863) TGME49_253890 Metalloenzyme LuxS/M16 peptidase-like (IPR011249) Peptidase_M16 (PF00675) M16B Non décrit 176 kDa Protéolyse, activité Non publiée peptidase M16 inactive 100% catalytique, Peptidase_M16_ inactive domain-containing Peptidase M16 domain (IPR011237) 2,70e-105 métalloendopeptidases, domain * 2 (PF05193) protein Peptidase M16, N-terminal domain (IPR011765) fixation ion zinc, fixation ion métallique Peptidase M16, C-terminal domain (IPR007863) TGME49_235680 Metalloenzyme LuxS/M16 peptidase-like (IPR011249) Peptidase_M16 (PF00675) M16B 3.4.24.64 186 kDa Protéolyse, activité Non publiée peptidase M16 inactive 76,28% Mitochondrial catalytique, Peptidase_M16_ inactive domain-containing Peptidase M16 domain (IPR011237) 1,60e-95 processing métalloendopeptidases, domain * 2 (PF05193) protein Peptidase M16, N-terminal domain (IPR011765) peptidase fixation ion zinc, fixation ion métallique Peptidase M16, C-terminal domain (IPR007863) TGME49_227948 Metalloenzyme LuxS/M16 peptidase-like (IPR011249) Peptidase_M16_ inactive M16C Non décrit 142 kDa Protéolyse, activité Non publiée peptidase M16 inactive domain (PF05193) 89,96% catalytique, domain-containing Peptidase M16 domain (IPR011237) 5,20e-244 métallopeptidases, protein Peptidase M16, C-terminal domain (IPR007863) Peptidase M16 C associated métalloendopeptidases, (PF08367) fixation ion zinc, Peptidase M16, zinc-binding site (IPR001431) fixation ion métallique Peptidase M16C associated (IPR13578) TGME49_214490 Metalloenzyme LuxS/M16 peptidase-like (IPR011249) Peptidase_M16 (PF00675) M16C Non décrit 148 kDa Protéolyse, activité Non publiée peptidase M16 inactive 83,77% catalytique, Peptidase_M16_ inactive domain-containing Peptidase M16 domain (IPR011237) 5,30e-235 métalloendopeptidases, domain (PF05193) protein Peptidase M16, N-terminal domain (IPR011765) fixation ion zinc, fixation ion métallique Peptidase M16, C-terminal domain (IPR007863)

133

Résultats

III/ Caractérisation de la TGME49_227948

Dans le but de réaliser la synthèse d’anticorps polyclonaux dirigés contre la métalloprotéase à zinc, la TGME49_227948, nous avons déterminé la structure 3D de cette protéine afin de localiser les séquences antigéniques potentielles.

III-1/ Production d’anticorps dirigés contre la TGME49_227948 III-1-1/ Etude bioinformatique de la TGME49_227948

Une étude bioinformatique de la séquence protéique de la TGME49_227948 a été réalisée afin de définir la localisation potentielle et la présence de sites potentiels de modifications post-traductionnelles au sein de cette protéine.

Dans un premier temps, une analyse bioinformatique grâce au logiciel PSORT II (http://psort.hgc.jp/form.html) a permis de déterminer la localisation potentielle de cette protéase ( Tableau XIII ).

Tableau XIII : Localisation potentielle de la protéase TGME49_227948 réalisée à l’aide du logiciel PSORT Localisation Probabilité Réticulum endoplasmique 0.55 Noyau 0.21 Lysosome 0.19

Cette métalloprotéase à zinc serait présente dans le réticulum endoplasmique avec une probabilité de 0,55. Elle pourrait également être localisée dans le noyau et le lysosome mais de façon plus minoritaire, avec des probabilités de 0,21 et 0,19, respectivement (Tableau XIII ).

Ces résultats sont en accord avec ceux rapportés dans les figures 29 et 30 suggérant que la GP100 pourrait être localisée dans le cytosol de T. gondii .

134

Résultats

Dans un second temps, nous avons identifié les sites de N-glycosylation potentiels à l’aide du logiciel NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) (Figure 56).

Figure 56 : Graphique obtenu avec le logiciel NetNGlyc 1.0 Server permettant la prédiction de sites de N-glycosylations

La figure 56 suggère que la TGME49_227948 possèderait deux sites putatifs de N-glycosylations situés au niveau des acides aminés Asn 298 et Asn 993 .

Grâce à nos résultats précédents, nous proposons un schéma présentant l’ensemble des modifications post-traductionnelles déterminées : les N- et O- glycosylations, le peptide d’adressage mitochondrial ainsi que les sites de phosphorylations décrits dans la base de données ToxoDB (Figure 57).

De plus, les différents domaines PFAM ont été identifiés afin de confirmer la classification MEROPS de la TGME49_227948 décrite dans la figure 52.

La TGME49_227948 présente plusieurs modifications post-traductionnelles ( Figure 57 ) :

- Onze O-glycosylations putatives dont dix entre les acides aminés n°12 et 137 situé dans l’exon 1 et la dernière dans l’exon 8 en position 794,

- Deux N-glycosylations putatives situées au niveau des acides aminés n° 298 (exon 1) et 993 (exon 11),

- Deux phosphorylations décrites dans la base de données ToxoDB situées au niveau des acides aminés n° 352 (exon 1) et 728 (exon 6).

135

Résultats

Les domaines PFAM nous confirme l’appartenance de la TGME49_227948 à la famille M16C avec la présence d’un domaine caractéristique du site catalytique des M16C (exon 1) et d’un domaine M16C associé (exons 6 à 10).

12/17 121/127/136 15/19 126/134/137 298 794 993 352 728 P P OO OOOOO N O N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1 454 496 584 657 689 746 768 828 879 963 1080 1215 1306

HXXEH X45 EX 44 EX 53 Y

382 472 705 960 Site catalytique Domaine M16C associé M16C PF8367

1…13 Exons Domaine PFAM Etiquette d’adressage mitochondrial

O-glycosylation putative O

N-glycosylationputative P N Site de phosphorylation

Figure 57 : Schéma des modifications post-traductionelles de la TGME49_227948

Chaque exon est représenté par un rectangle numéroté. Les numéros des acides aminés délimitant chaque exon sont indiqués. Les sites de N-glycosylations (rouge) et de O-glycosylations putatives (orange) ont été déterminés avec les logiciels NetNGlyc 1.0 Server (http://www .cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) et NetOGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/), respectivement. Les phosphorylations (vert) ont été décrites dans ToxoDB. L’étiquette d’adressage mitochondrial a été identifiée grâce aux logiciels iPSORT (http://ipsort.hgc.jp/) et MitoProt II (http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html) et représentée en bleu sur le schéma. Les différents domaines PFAM sont indiqués en violet avec le numéro du premier et dernier acide aminé qui les composent.

III-1-2/ Identification de la structure 3D de la TGME49_227948

La TGME49_227948 étudiée n’ayant été ni purifiée ni cristallographiée à ce jour, nous avons utilisé le logiciel CBLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) afin de rechercher une protéine de structure très proche ayant déjà été cristallisée (Figure 58).

136

Résultats

A

B

Figure 58 : Résultats obtenus par analyse de la séquence protéique de la TGME49_027950 (A) et de la TGME49_227948 (B) par le logiciel CBLAST Le logiciel CBLAST a confronté la séquence protéine de la TGME49_027950 (A) et de la TGME49_227948 (B) à la banque de données PDB afin de trouver une protéine de structure proche et de conformation connue.

Nous avons déterminé que la chaîne A de la 2FGE présente chez Arabidopsis Thaliana a une structure très proche de la TGME49_027950 avec un pourcentage de recouvrement de 56% (Figure 58A) et de la TGME49_227948 avec une pourcentage de 78% (Figure 58B). Etant donné que le pourcentage d’identité entre la chaîne A de la 2FGE et la protéine TGME49_027950 ou la protéine TGME49_227948 est toujours de 36% (Figure 58), nous pouvons donc en conclure que la chaîne A de la 2FGE permettra d’obtenir, par homologie, une structure 3D identique pour les deux annotations de la métalloprotéase à zinc (TGME49_027950 et TGME49_227948).

A l’aide des logiciels CPH model (http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/) et VMD (Visual Molecular Dynamics 1.8.4), la représentation en 3D de la TGME49_227948 a été obtenue pour les acides aminés en position 209 à 1232, soit 1034 acides aminés sur un nombre d’acides aminés total de 1306 (Figure 59).

137

Résultats

Figure 59 : Représentation de la structure 3D de la TGME49_227948 réalisée à l’aide du logiciel VMD Les différentes structures secondaires sont visibles : les hélices α et les feuillets β. Les deux histidines caractéristiques du site catalytique des M16C HXXEH sont représentées en rouge.

La figure 59 nous montre la représentation 3D de la TGME49_227948 avec les deux histidines du site catalytique mises en évidence. Nous pouvons observer la présence d’une structure en forme de "V" (situé en bas sur l’image de gauche). La poche du site catalytique est située au-dessus de cette structure en "V".

III-1-3/ Production des anticorps

Afin d’étudier la métalloprotéase purifiée, nous avons réalisé la synthèse de deux anticorps. La détermination de la séquence antigénique utilisée pour la synthèse du premier anticorps a été réalisée à partir de la séquence protéique de la TGME49_027950. En ce qui concerne le second anticorps, nous avons ensuite utilisé la séquence protéique de la TGME49_227948, qui avait nouvellement été annotée. Les deux peptides antigéniques utilisés pour la synthèse des deux anticorps ayant été choisis sur la séquence protéique commune dans l’ancienne et la nouvelle annotation, ils seront donc tous deux caractéristiques de la TGME49_227948. Le premier anticorps a été choisi pour être dirigé contre une séquence située à proximité du site catalytique alors que le second est dirigé contre une séquence situé côté C- terminal.

138

Résultats

- Identification des séquences antigéniques afin de réaliser la synthèse d’anticorps polyclonaux dirigés contre la TGME49_227948

Dans un premier temps, afin de pouvoir définir la fonction de la TGME49_227948, nous avons choisi une séquence antigénique situé au niveau du site catalytique dans le but d’obtenir un anticorps potentiellement bloquant.

Dans un second temps, afin de pouvoir identifier toutes les formes potentielles (précurseurs, actives, dégradées) de cette métalloprotéase, nous avons choisi une séquence antigénique située côté C-terminal.

A l’aide des logiciels EMBOSS (http://emboss.sourceforge.net/) et Antigen Profiler (http://www.pierce-antibodies.com/custom-antibodies/peptide-design-antigen-profiler.cfm), 74 séquences ont été trouvées. Une liste de critères a alors été établie afin d’identifier la séquence antigénique optimale :

- La séquence peptidique doit être composée d’environ 20 acides aminés, - La séquence peptidique ne doit pas être retrouvée sur la séquence de l’orthologue chez P. falciparum ni avoir d’homologie avec un autre génome (utilisation du logiciel PSI- Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)).

Grâce à ces critères, 40 séquences potentielles ont été éliminées. Pour les 34 restantes, nous avons analysé leur localisation au niveau de la structure 3D de la protéine. Afin d’être accessible, la séquence antigénique doit être retrouvée à l’extérieur de structure 3D de la protéine et ne doit pas se situer dans une structure secondaire de type hélice α ou feuillet β.

-Anticorps dirigé contre une séquence située à proximité du site catalytique :

Le peptide KEAADAVRLRGE a été retenu avec un score 4.2/5 avec le logiciel Antigen Profiler. Après analyse par la société Thermoscientific, le peptide antigénique final a été rallongé de 10 acides aminés afin qu’il soit plus immunogène. Sa séquence est la suivante : DEKEAADAVRLRGEDEAPRPRE composé de 22 acides aminés. Il est situé entre les acides aminés n° 354 et 375 au niveau de l’exon 1. La figure 60 indique la localisation de cette séquence au niveau de la structure 3D et de la séquence protéique de la TGME49_227948.

139

Résultats

A

B 12/17 121/127/136 298 15/19 126/134/137 794 993 352 728 P P OO OOOOO N O N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1 454 496 584 657 689 746 768 828 879 963 1080 1215 1306

HXXEH X45 EX 44 EX 53 Y

382 472 705 Domaine M16C associé 960 PF8367

Figure 60 : Localisation de la séquence DEKEAADAVRLRGEDEAPRPRE au niveau de la structure 3D (A) et de la séquence protéique (B) de la TGME49_227948 La séquence antigénique finale DEKEAADAVRLRGEDEAPRPRE est représentée en jaune dans la structure 3D (A) et est indiquée sur la séquence protéique par une flèche rouge (B).

-Anticorps dirigé contre une séquence située côté C-terminal de la TGME49_227948 :

La séquence KKKRALVPTKDEGTVGE a été retenue et confirmée par la société Thermoscientific avec un score 4.8/5 avec le logiciel Antigen Profiler. Elle est composée de 17 acides aminés et est située entre les acides aminés n°1057 et 1074 au niveau de l’exon 11.

La figure 61 indique la localisation de cette séquence au niveau de la structure 3D et de la séquence protéique de la TGME49_227948.

140

Résultats

A

B 12/17 121/127/136 15/19 126/134/137 298 794 993 352 728 P P OO OOOOO N O N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1 454 496 584 657 689 746 768 828 879 963 1080 1215 1306

HXXEH X45 EX 44 EX 53 Y

382 472 705 Domaine M16C associé 960 PF8367

Figure 61 : Localisation de la séquence KKKRALVPTKDEGTVGE au niveau de la structure 3D (A) et de la séquence protéique (B) de la TGME49_227948 La séquence antigénique KKKRALVPTKDEGTVGE est représentée en jaune dans la structure 3D (A) et est indiquée sur la séquence protéique par une flèche rouge (B).

Pour la synthèse des deux anticorps, le protocole de 90 jours a été choisi afin d’obtenir une réponse immunitaire satisfaisante chez le lapin et ainsi obtenir une quantité suffisante d’anticorps.

Préalablement à toute immunisation, nous avons testé les sérums pré-immuns de cinq lapins afin d’en choisir deux qui ne possédaient aucun anticorps pouvant détecter des protéines de T. gondii .

-Validation du 1 er anticorps polyclonal dirigé contre une séquence située à proximité du site catalytique :

Après le protocole de 90 jours, le sérum d’un des deux lapins immunisé a été choisi afin de réaliser la purification de l’anticorps polyclonal qui permettait la meilleure détection de notre protéine d’intérêt. Au vu du titre obtenu par test ELISA (cf Partie "Matériels et méthodes"), nous avons choisi d’utiliser uniquement les sérums à J70/72 des deux lapins.

141

Résultats

Puis, nous avons testé ces sérums par western-blot sur trois extraits protéiques différents (Figure 62).

A B - ß-mercaptoéthanol + ß-mercaptoéthanol - ß-mercaptoéthanol + ß-mercaptoéthanol

Mil. Cyt. Cyt. Mil. Cyt. Cyt. Mil. Cyt. Cyt. Mil. Cyt. Cyt. PM T+ Cond (RIPA) (Trit.) Cond (RIPA) (Trit.) PM T+ Cond (RIPA) (Trit.) Cond (RIPA) (Trit.) . . . . 170 170 130 130 100 100 70 70 55 55 40 40

35 35 25 25

Figure 62 : Spécificité du premier anticorps polyclonal (sérums immunisés des lapins 1 (A) et 2 (B)) analysée par western-Blot Trois extraits protéiques ont été analysés par western-blot en présence ou non de β-mercapto-éthanol : les protéines contenues dans le milieu conditionné 18 h obtenus sans cellules TG 180 (Mil. Cond.), les protéines cytosoliques de T. gondii extraites avec du RIPA (Cyt. (RIPA)) et les protéines cytosoliques de T. gondii extraites avec du Triton X100 (Cyt. (Trit.)). Les sérums immunisés ont été utilisés au 1/200 et l’anticorps secondaire anti-lapin HRP au 1/3000. T+ : Protéine SAG1 (30 kDa) de T. gondii . PM : Marqueurs de masses moléculaires. Avec les sérums immunisés J70/72 des deux lapins (Figure 62), nous détectons une protéine cytosolique d’environ 130 kDa en absence de β-mercaptoéthanol et de 120 kDa en présence de β-mercaptoéthanol. La forme cytosolique à 120 kDa est également détectée avec le sérum du lapin 2 en absence de β-mercaptoéthanol.

L’anticorps synthétisé reconnaît donc deux formes de la TGME49_227948 dans les conditions testées, préférentiellement en conditions réductrices. La forme détectée à environ 130 kDa pourrait correspondre à la TGME49_227948 décrite dans ToxoDB (142 kDa, masse moléculaire prédite).

Le titre en anticorps du lapin 1 étant environ 4 fois plus important que celui du lapin 2, nous avons choisi de réaliser la purification de l’anticorps polyclonal à partir du sérum du lapin 1. Après la purification de l’anticorps, nous avons déterminé la spécificité de l’anticorps synthétisé. Pour cela, nous avons mis l’anticorps en présence du peptide contre lequel il a été synthétisé et avons réalisé un western-blot sur les protéines du cytosol extraites avec du RIPA (Figure 63).

142

Résultats

Ac au 1/500 Ac au 1/1000 Ac au 1/2000 +1µg +2µg +1µg +2µg +1µg +2µg PM seul peptide peptide seul peptide peptide seul peptide peptide

170

130

100

70

55

40

Figure 63 : Analyse de la spécificité du premier anticorps polyclonal Cinquante microgrammes de protéines cytosoliques issus des tachyzoïtes obtenus in vivo (produits sans cellules TG 180) ont été analysés par western-blot en utilisant l’anticorps au 1/500, 1/1000 ou 1/2000 en présence ou non d’un ou deux microlitres de peptide.

Nous observons une diminution de l’intensité de la bande en présence d’une quantité croissante du peptide antigénique pour toutes les dilutions de l’anticorps purifié (1/500, 1/1000 et 1/2000) ( Figure 63). Nous pouvons en conclure que le premier anticorps dirigé contre une séquence située au niveau du site catalytique de la TGME49_227948 est spécifique de la bande observée à environ 130 kDa.

-Validation du 2ème anticorps polyclonal dirigé contre une séquence situé côté C-terminal de la TGME49_227948 :

Le même protocole de validation pour le deuxième anticorps a été réalisé. Le sérum immunisé à J70/72 du lapin ayant la meilleure réponse immunitaire vis-à-vis du peptide antigénique, c’est-à-dire la valeur d’absorbance la plus importante au niveau du test ELISA, a été utilisé pour réaliser la purification du deuxième anticorps polyclonal. L’anticorps purifié ainsi obtenu a été testé en western-blot pour vérifier sa spécificité Pour cela, nous avons mis l’anticorps en présence du peptide contre lequel il a été synthétisé. L’expérience est réalisée avec le milieu conditionné 18 h (Figure 64).

143

Résultats

Ac au 1/500 Ac au 1/1000 Ac au 1/2000 PM +1µg +2µg +1µg +2µg +1µg +2µg seul peptide peptide seul peptide peptide seul peptide peptide

170

130

100

70

55

40

Figure 64 : Analyse de la spécificité du second anticorps polyclonal Cinquante microgrammes de protéines contenues dans le milieu conditionné 18 h obtenus à partir de tachyzoïtes (obtenus avec cellules TG 180) issus de LLP de souris ont été analysés par western-blot en utilisant l’anticorps au 1/500, 1/1000 ou 1/2000 en présence ou non de un ou deux microlitres de peptide.

Nous observons une disparition de la bande d’intérêt à 100 kDa reconnue par cet anticorps en présence d’une quantité croissante du peptide antigénique pour toutes les dilutions de l’anticorps purifié (1/500, 1/1000 et 1/2000) ( Figure 64). Ceci nous permet de conclure que le deuxième anticorps polyclonal dirigé contre une séquence située côté C-terminal de la séquence protéique de la TGME49_227948 est spécifique de la bande révélée à 100 kDa.

- Spécificité des anticorps : essais comparatifs Afin d’identifier les différentes formes de la TGME49_227948, nous avons analysé différents extraits protéiques par western-blot en conditions dénaturantes ou non et après révélation par les deux anticorps dirigés contre la TGME49_227948 ( Figure 65). Nous avons testé les protéines présentes dans le milieu conditionné 18 h et le cytosol extrait au RIPA provenant de: - Tachyzoïtes issus de LLP de souris (inoculation sans cellules TG 180) ( Figure 65A) - Tachyzoïtes issus de LLP de souris (inoculation avec cellules TG 180) ( Figure 65B) - Tachyzoïtes issus de cultures cellulaires (Figure 65C) - Cellules TG 180 seules (Figure 65D)

144

Résultats

A 1er Anticorps (site catalytique) 2ème Anticorps (C-terminal)

- ß-mercaptoéthanol + ß-mercaptoéthanol - ß-mercaptoéthanol + ß-mercaptoéthanol

PM Mil. Cond. Cytosol PM Mil. Cond. Cytosol PM Mil. Cond. Cytosol PM Mil. Cond. Cytosol 170 170 170 130 130 130 170 130 100 100 100 100 70 70 70 70 55 55 55 55 40 40 40 40 35 35 35 35

25 25 25 25 B 1er Anticorps (site catalytique) 2ème Anticorps (C-terminal)

- ß-mercaptoéthanol + ß-mercaptoéthanol - ß-mercaptoéthanol + ß-mercaptoéthanol

PM Mil. Cond. Cytosol PM Mil. Cond. Cytosol PM Mil. Cond. Cytosol PM Mil. Cond. Cytosol

170 170 170 170 130 130 130 130

100 100 100 100 70 70 70 70

55 55 55 55

40 40 40 40 C 1er Anticorps (site catalytique) 2ème Anticorps (C-terminal)

- ß-mercaptoéthanol + ß-mercaptoéthanol - ß-mercaptoéthanol + ß-mercaptoéthanol

PM Mil. Cond. Cytosol PM Mil. Cond. Cytosol PM Mil. Cond. Cytosol PM Mil. Cond. Cytosol

170 170 170 170 130 130 130 130 100 100 100 100 70 70 70 70

55 55 55 55

40 40 40 40

D 1er Anticorps (site catalytique) 2ème Anticorps (C-terminal)

- ß-mercaptoéthanol + ß-mercaptoéthanol - ß-mercaptoéthanol + ß-mercaptoéthanol

PM Mil. Cond. Cytosol PM Mil. Cond. Cytosol PM Mil. Cond. Cytosol PM Mil. Cond. Cytosol

170 170 170 130 130 130 170 100 100 100 130 70 70 100 70

55 55 70 55 55 40 40 40 40 35

Figure 65 : Description des différentes protéines reconnues par les anticorps dirigés contre la TGME49_227948 Cent microgrammes de protéines contenues dans le milieu conditionné 18 h et le cytosol de tachyzoïtes issus de LLP de souris (inoculation sans cellules TG 180) (A), de tachyzoïtes issus de LLP de souris (inoculation avec cellules TG 180) (B), tachyzoïtes issus de cultures cellulaires (C) ou de cellules TG 180 seules (D) ont été analysés en conditions non réductrices ou réductrices par western-blot en utilisant les deux anticorps polyclonaux dirigés contre la TGME49_227948. PM : marqueurs de masses moléculaires.

145

Résultats

Avec les échantillons provenant de tachyzoïtes issus de LLP de souris sans inoculation de cellules TG 180 ( Figure 65A), nous observons une bande d’environ 130 kDa quelques soient les conditions utilisées et quelque soit l’anticorps utilisé. Une seconde bande est détectée avec une masse moléculaire supérieure à 200 kDa dans le milieu conditionné, avec le deuxième anticorps et dans des conditions non réductrices. Après réduction cette bande disparaît.

Avec les échantillons provenant de tachyzoïtes issus de LLP de souris avec inoculation avec des cellules TG 180 ( Figure 65B), nous observons une bande de 100 kDa dans le milieu conditionné révélée par les deux anticorps et dans des conditions réductrices. Le premier anticorps détecte une autre protéine de 45 kDa dans le milieu conditionné après réduction par le β-mercapto-éthanol. Deux bandes d’environ 100 et 130 kDa sont observées dans le cytosol avec le premier anticorps dans des conditions non réductrices ou réductrices. Le second anticorps détecte une autre protéine de 75 kDa dans le milieu conditionné en conditions non réductrices. Aucune bande cytosolique n’est observée avec le second anticorps.

Avec les échantillons provenant de tachyzoïtes issus de cultures cellulaires, nous observons avec les deux anticorps une seule bande d’environ 130 kDa présente dans le milieu conditionné et en conditions non réductrices ( Figure 65C). Aucune autre bande n’est observée dans les autres conditions testées.

Avec les échantillons provenant de cellules TG 180 seules (Figure 65D), nous observons avec les deux anticorps une seule bande de 140 kDa présente dans le milieu conditionné et en conditions non réductrices. Le deuxième anticorps révèle trois autres bandes de masse moléculaire supérieure à 170 kDa ainsi qu’une autre protéine de 75 kDa dans le milieu conditionné en conditions non réductrices. La réduction fait apparaitre trois bandes de masses moléculaires comprises entre 60 et 45 kDa dans le milieu conditionné et une protéine de 55 kDa dans le cytosol en conditions réductrices. En résumé, la TGME49_227948 dont la masse moléculaire prédite est de 142 kDa, semble être détectée au niveau des protéines contenues dans le milieu conditionné et du cytosol issus de tachyzoïtes produits in vivo sans l’aide de cellules TG 180. Une protéine de 100 kDa est détectée dans le milieu conditionné issus de tachyzoïtes produits dans un modèle murin/cellules TG 180. Nous pouvons donc émettre l’hypothèse qu’il s’agirait d’une forme activée de la TGME49_227948, donc potentiellement de la GP100.

146

Résultats

III-2/ Etude de la localisation de la TGME49_227948

Dans le but de localiser la métalloprotéase à zinc, la TGME49_227948, des co-immunomarquages ont été réalisés avec l’anticorps polyclonal dirigé contre une séquence située à proximité du site catalytique de la TGME49_227948 et avec trois anticorps dirigés contre des protéines caractéristiques des organelles sécrétoires de T. gondii : les protéines MIC2 (micromènes), ROP2 (rhoptries) et GRA7 (granules denses).

Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 66.

MIC2 TGME49_227948 Merge

ROP2 TGME49_227948 Merge

GRA7 TGME49_227948 Merge

Figure 66 : Localisation de la TGME49_227948 dans des tachyzoïtes par co- immunomarquages avec ROP2, MIC2 et GRA7 Les tachyzoïtes ont été marqués avec l’anticorps anti-TGME49_227948 (site catalytique) ainsi que ROP2 ou MIC2 ou GRA7.

147

Résultats

Nous n’observons aucune co-localisation entre la TGME49_227948 et MIC2, ROP2 ou GRA7. Les résultats de la figure 66 indiquent donc que la TGME49_227948 ne semble pas localisée dans l’un des trois organelles (micronèmes, rhoptries et granules denses).

Cependant, ce marquage nous permet de confirmer que la TGME49_227948 possède bien une localisation cytosolique.

Afin de confirmer ces résultats, nous avons réalisé la reconstruction en 3D du co-marquage effectué entre la TGME49_227948 et la protéine ROP 2 à l’aide du logiciel Imarys ( Figure 67) .

Figure 67 : Reconstruction en 3D du co-marquage réalisé avec l’anticorps anti-TGME49_227948 et l’anticorps dirigé contre la protéine ROP2 Les images du plan z sont regroupées afin de permettre la reconstruction 3D du co-marquage réalisé (à gauche). Cette reconstruction est présentée en indiquant les volumes représentés pour chaque marquage (à droite).

Cette reconstruction 3D confirme la localisation cytosolique de la TGME49_227948 et également que cette métalloprotéase n’est pas localisée dans l’un des trois organelles sécrétoires (micronèmes, rhoptries, granules denses) (Figure 67).

148

Résultats

III-3/ Effets sur l’invasion de T. gondii

Afin de déterminer la fonction potentielle de la TGME49_227948, nous avons utilisé l’anticorps polyclonal dirigé contre une séquence située à proximité de son site catalytique pour tenter d’inhiber l’activité de cette protéase.

Nous avons pré-incubé les tachyzoïtes avec des quantités variables d’anticorps et le mélange a été déposé sur un tapis de cellules Vero préalablement réalisé. Après 6 h et 48 h, une coloration est réalisée pour observer les cellules et tachyzoïtes présents.

Après 6 h, nous n’avons observé aucune modification du nombre de cellules infestées en présence ou non d’anticorps (données non montrées), alors qu’après 48 h, des effets sont observés (Figure 68).

Contrôle Sérum pré-immun

1µL d’anticorps 2µL d’anticorps

5µL d’anticorps 10µL d’anticorps

Figure 68 : Effet de l’anticorps polyclonal dirigé contre une séquence située à proximité de son site catalytique de la TGME49_227948 sur cultures cellulaires de tachyzoïtes de T. gondii Les tachyzoïtes ont été pré-incubés avec 1, 2, 5 ou 10 µL d’anticorps ou 10 µL de sérum pré-immun. Puis le mélange tachyzoïtes-anticorps est incubé sur un tapis de cellules Vero non confluent. Après 48 h, une coloration avec le kit RAL est réalisée. Le contrôle correspond à l’absence d’anticorps.

149

Résultats

Nous observons, en présence d’un microlitre d’anticorps, une augmentation du nombre de cellules non infestées par rapport au contrôle sans anticorps ou au contrôle avec le sérum pré-immun où la totalité des cellules sont infestées par le parasite ( Figure 68 ). De plus, cet effet semble être proportionnel à la quantité d’anticorps utilisé.

Ensuite, nous avons déterminé le nombre de cellules lysées au cours du temps (Figure 69). Les premières cellules sont lysées après 25 h d’incubation en présence de sérum pré-immun et après 31 h avec 10 µL d’anticorps. Après 48 h, le nombre de cellules lysées est deux fois plus important dans le contrôle qu’en présence de 10 µL d’anticorps.

700 Contrôle (SPI) 600 avec 10µL Anticorps 500 400 300 200 100

Nombre Nombre de cellules lysées/puits 0 0 10 20 30 40 50 Temps (heures)

Figure 69 : Nombre de cellules lysées au cours du temps en présence de sérum pré- immun (SPI) ou de 10 µL d’anticorps Le tapis a été observé toutes les heures pendant 48h et le nombre de cellules lysées a été compté. (n=1)

La TGME49_227948 semble donc avoir un effet sur la multiplication de T. gondii .

150

Résultats

En conclusion de cette partie, nous avons identifié une métalloprotéase à zinc, la TGME49_227948 grâce à sa purification partielle utilisant une technique de chromatographie chélatrice de zinc. Son étude in silico nous a permis de mettre en évidence différentes modifications post-traductionnelles (N- et O-glycosylations, phosphorylations) ainsi que la présence d’un signal d’adressage mitochondrial.

La structure en 3D de la TGME49_227948 a été déterminée par homologie de séquence avec la chaîne A de la 2FGE présente chez Arabidopsis Thaliana .

Nous avons ensuite réalisé la synthèse de deux anticorps polyclonaux dirigé contre une séquence située à proximité du site catalytique pour le premier et contre une région située côté C-terminal pour le second.

L’utilisation du premier anticorps nous a permis de confirmer la localisation cytosolique de la métalloprotéase et d’émettre l’hypothèse que la TGME49_227948 pourrait être impliquée dans le mécanisme de multiplication de T. gondii .

151

Résultats

IV/ Caractérisation de la GP100

IV-1/ Etude des effets des anticorps sur l’activité gélatinolytique de la GP100

Afin de déterminer la spécificité des anticorps vis-à-vis de la GP100, nous avons étudié les effets de l’anticorps polyclonal dirigé contre la séquence proche du site catalytique de la TGME49_227948 sur son activité gélatinolytique par zymographie (Figure 70 ). Nous avons incubé le milieu conditionné 18 h ou la MMP-9 humaine, pendant 15 min, en présence de 1, 2, 5 ou 10 µL d’anticorps. Les résultats sont présentés dans la figure 70 .

Anticorps

Sans 1µL 2µL 5µL 10µL Sans 1µL 2µL 5µL 10µL

152

Résultats

Cependant, cet anticorps bloque également l’activité gélatinolytique de la MMP-9 humaine. Cette activité est retrouvée à 75%, 67% et 18% en présence de 2, 5 et 10 µL d’anticorps (Figure 70A). Les résultats de la figure 70 montrent donc que cet anticorps permet d’inhiber l’activité de la GP100 mais aussi celle de la MMP-9 humaine.

Les mêmes expériences ont été réalisées en présence du deuxième anticorps polyclonal mais aucune inhibition de l’activité gélatinolytique n’a été détectée ni sur la GP100 ni sur la MMP-9 humaine.

En conclusion, l’anticorps dirigé contre une séquence proche du site catalytique de la TGME49_227948 inhibe partiellement l’activité gélatinolytique de la GP100. Cet anticorps reconnaît également la MMP-9 humaine.

Comme le montre l’alignement entre les séquences protéiques de la MMP-9 humaine ou murine et la séquence reconnue par l’anticorps dirigée contre la TGME49_227948, un épitope commun reconnu par l’anticorps pourrait expliquer ces résultats ( Figure 71).

MMP-9 Homo Sapiens RGDGRLWCATTSNFDSDKKWGFCPDQGYSLFLVAA HEFGH ALGLDHSSVP TGM49_227948 ------

MMP-9 Homo Sapiens EALMYPMYRFTEGPPLHKDDVNGIRHLYGPRPEPEPRPPTTTTPQPTAPP TGM49_227948 ------D----EKEAADAVR-LRGEDEAPRPRE------: .*: .:.:* * * *.**

MMP-9 Mus Musculus RRDGRLWCATTSNFDTDKKWGFCPDQGYSLFLVAA HEFGH ALGLDHSSVP TGM49-227948 ------

MMP-9 Mus Musculus EALMYPLYSYLEGFPLNKDDIDGIQYLYGRGSKPDPRPPATTTTEPQPTAPP TGM49_227948 ------D----EKEAADAVR-LRGEDEAPRPRE------: :*: *.:: * *... * ** Figure 71 : Alignements des séquences protéiques de la MMP-9 humaine ou murine et la séquence reconnue par l’anticorps dirigé contre la TGME49_227948. Le domaine HEXXH des MMP-9 humaine et murine est indiqué en jaune.

153

DISCUSSION

154

Discussion

L’interaction de T. gondii avec les barrières biologiques est un facteur déterminant dans le développement de la toxoplasmose. En effet, lors d’une contamination orale, T. gondii traverse initialement l’épithélium intestinal, puis se dissémine dans des tissus plus profonds en traversant notamment des barrières biologiques, comme par exemple la barrière placentaire et la barrière hémato-encéphalique, pour atteindre les sites immunologiquement privilégiés (Lambert and Barragan, 2010).

L’identification des protéases impliquées dans le processus de traversées des barrières biologiques paraît donc indispensable pour comprendre les mécanismes intervenant dans l’invasion tissulaire de T. gondii (Kim, 2004).

Les protéines ayant des activités gélatinolytiques sont particulièrement intéressantes à étudier car elles permettent la dégradation des composés des tissus conjonctifs et de la matrice extracellulaire. Les MMPs-2 et -9 sont les gélatinases les mieux caractérisées ; il s’agit d’endopeptidases à zinc calcium-dépendantes qui dégradent les composés de la matrice extracellulaire tels que les collagènes, l’élastine, la gélatine, des glycoprotéines de la matrice, et des protéoglycannes.

Pour réaliser nos travaux, nous avons utilisé la souche de référence de type I, la souche RH, car les souches de ce génotype possèdent une capacité de transmigration importante décrite au niveau de l’intestin de souris comparativement aux souches de type II et III. Une sous-population de parasites de la souche de type I, a été mise en évidence pour ses capacités de migration à longue distance (110 µm comparativement à 70 µm pour les parasites de souche de type II) permettant une augmentation des capacités migratoires in vivo . Cette sous- population a alors été clonée par micromanipulation et a été capable de migrer au travers de monocouches de cellules polarisées et de la matrice extracellulaire. Cela suggère un rôle important dans la dissémination du parasite (Barragan and Sibley, 2002).

Afin de mieux comprendre ce mécanisme d’invasion, une précédente thèse réalisée au sein de notre laboratoire, a permis d’analyser le profil d’expression des métalloprotéases matricielles monocytaires lors de l’invasion de monocytes humains par T. gondii . Lors de cette étude, il a été mis en évidence une diminution de la pro-MMP-9 et -2 par les cellules THP-1 associée à une diminution de la sécrétion de TIMP-2. De plus, il a été mis en évidence la présence d’une gélatinase sécrétée par T. gondii avec une masse moléculaire apparente de 94 kDa (Buache et al. , 2007).

155

Discussion

A la suite de ces travaux, nous nous sommes intéressés à l’étude de cette gélatinase sécrétée par T. gondii , puis, nous avons analysé le rôle des métalloprotéases de T. gondii dans les mécanismes biologiques du parasite.

156

Discussion

L’étude de la gélatinase de masse moléculaire apparente à 94 kDa sécrétée par T. gondii

Dans cette étude, nous avons caractérisé d’un point de vue physico-chimique et biochimique la gélatinase initialement décrite au laboratoire (Buache et al. , 2007), sécrétée par le parasite T. gondii .

Nous avons démontré que T. gondii sécrète une protéase d’environ 100 kDa, que nous avons proposé de nommer GP100, ayant des activités gélatinolytique et élastinolytique et qui est présente en quantité majoritaire dans le milieu conditionné 18 h. Nous avons identifié, par zymographie en gel de gélatine, d’autres gélatinases sécrétées par T. gondii dans le milieu conditionné 18 h à partir de tachyzoïtes issus de LLP de souris. Six autres bandes sur le zymogramme sont observées : deux de masses moléculaires supérieures à 100 kDa, deux inférieures à 100 kDa et deux inférieures à 78 kDa.

Les travaux réalisés par Song and Nam, mettent en évidence la sécrétion de trois gélatinases de 80, 70 et 42 kDa dans le milieu conditionné de tachyzoïtes issus de LLP de souris de 1 h (Song and Nam, 2003). Aucune de ces trois gélatinases n’a été détectée dans le milieu conditionné 18 h que nous avons analysé. Au même temps de sécrétion de 1 h, nous avons observé la présence de gélatinases dont aucune ne correspond à celles décrites par Song. Les tachyzoïtes utilisés pour ces deux études sont obtenus à partir d’un modèle murin, les souris Swiss (souris non consanguines) pour notre étude et les souris Balb/c (souris consanguines) pour l’étude de Song. Cependant, il a été démontré qu’il n’y avait pas de différence au niveau de la dose létale entre des souris Swiss et Balb/c infestées par des oocystes de T. gondii (Dubey et al. , 2012) . La différence au niveau des espèces de souris utilisées ne semble donc pas pouvoir expliquer la différence des profils de sécrétion obtenus par zymographie en gel de gélatine.

Une autre différence se situe au niveau de la purification des tachyzoïtes : l’équipe de Song a réalisé une purification des tachyzoïtes par gradient de Percoll alors que nous avons réalisé trois centrifugations avec du PBS. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons également utilisé un gradient de Percoll à 40% et avons obtenu des résultats similaires par zymographie au niveau de la sécrétion des gélatinases dans nos deux milieux conditionnés 1h et 18 h,

157

Discussion confirmant que les gélatinases que nous avons mises en évidence sont différentes de celles de l’équipe de Song.

Parmi les trois gélatinases mises en évidence par Song, deux ont été caractérisées : la gélatinase de 80 kDa et celle de 42 kDa sont inhibées par l’EDTA impliquant leur appartenance à la famille des métalloprotéases. Les protéines de 80 et 42 kDa ainsi que la GP100 sont donc trois métalloprotéases. Afin de continuer leur caractérisation, il serait intéressant de réaliser leur purification totale ou leur clonage, et ainsi analyser les effets de différents substrats synthétiques. Nous pourrions alors définir leurs sites de coupure et émettre des hypothèses sur leur mode d’action. Par exemple, une métalloprotéase présente chez T. gondii classée dans la famille M17 grâce à son inhibition par la bestatine (inhibiteur spécifique de la famille M17) a été caractérisée comme une leucine aminopeptidase grâce à sa capacité à cliver efficacement le substrat fluorogénique synthétique Leu-MCA (Jia et al. , 2010). A l’heure actuelle, aucun inhibiteur connu n’est capable d’inhiber spécifiquement une famille de métalloprotéases, à l’exception de la bestatine pour les protéases M17.

En outre, la protéine de 42 kDa a été identifiée comme étant la protéine ROP6. Cette gélatinase est donc localisée au niveau des rhoptries, ce qui suggère son implication au niveau du processus d’invasion. La gélatinase GP100 que nous avons étudiée, ne semble pas être localisée dans les rhoptries, son rôle reste encore à déterminer.

En ce qui concerne le pH optimal de la GP100, nous l’avons déterminé à 8,6. Toutefois, 50 % de l’activité gélatinolytique persiste à un pH de 5,5 et 95 % à un pH de 9,5. L’activité gélatinolytique de la GP100 est donc optimale dans des conditions physiologiques mais elle possède une tolérance importante au pH. Cette tolérance a déjà été retrouvée au niveau de protéases présentes chez de nombreuses bactéries, permettant ainsi leur survie dans des conditions extrêmes (Lund et al. , 2014). La GP100 semble donc pouvoir s’adapter à des conditions drastiques suggérant que cette protéase pourrait être importante pour la survie du parasite.

Dans notre étude, nous avons mis en évidence la présence de sept gélatinases sécrétées par T. gondii dans un milieu conditionné de 18 h. Ces différentes activités gélatinolytiques détectées par zymographie peuvent correspondre :

- Soit à sept gélatinases génétiquement distinctes sécrétées par le parasite,

- Soit à une protéine avec un processus de maturation protéolytique multiple,

158

Discussion

- Soit à deux ou plusieurs gélatinases issues de l’épissage différentiel de gènes.

La deuxième hypothèse a été décrite pour la toxolysine-4, métalloprotéase qui possède de nombreuses formes entre 260 et 34 kDa (Laliberté and Carruthers, 2011).

La troisième hypothèse a déjà été décrite chez Plasmodium falciparum pour la falcilysine. Ainsi, il a été démontré que cette métalloprotéase subissait un épissage protéolytique alternatif important permettant quatre adressages différents (vacuole parasitophore, apicoplaste, membrane et mitochondrie) d’où la présence de formes de différentes masses moléculaires (Ralph, 2007). Ces adressages multiples pourraient permettre à une protéase d’avoir plusieurs fonctions selon sa localisation.

Par ailleurs, la métalloprotéase FtsH1 décrite chez T. gondii a été analysée par une technique de pulse-chase. Cette technique permet de marquer de façon radioactive, par addition d’acide aminé marqué, des protéines lors de leur synthèse et ainsi permet l’étude de leur dégradation au cours du temps. Ceci a permis de mettre en évidence un double clivage de l’enzyme FtsH1 en positions N- et C-terminales. De ce fait, la FtsH1 possède des masses moléculaires variant de 170 à 115 kDa en fonction des différents clivages (Karnataki et al. , 2009). Il sera donc intéressant de réaliser cette technique de pulse-chase avec la GP100 afin de valider l’une des trois hypothèses émises ci-dessus.

L’utilisation de l’APMA a permis de mettre en évidence que la GP100 ne possède pas le même processus d’activation que les MMPs humaines. La GP100 semble donc ne pas avoir de pro-domaine clivable au niveau d’une liaison zinc-cystéine. La GP100 pourrait soit être synthétisée sous forme activée, soit être activée par un autre mécanisme tel que l’interaction avec une autre métalloprotéase. Il existe des processus similaires pour certaines métalloprotéases, ainsi la pro MMP-9 humaine est activée par la MMP-2 qui est elle- même activée par la MT1-MMP (Toth et al. , 2003).

Une autre caractéristique très intéressante de la GP100 est sa capacité à dégrader également l’élastine, en plus de la gélatine. Ces deux composés sont retrouvés au niveau de la matrice extracellulaire et de la lame basale. Nous pouvons donc assimiler ces activités à celle de la MMP-9 humaine. Toutefois, l’utilisation des TIMP-1 et -2, inhibiteurs naturels des MMPs de mammifères, a permis de démontrer que les activités catalytiques de la MMP-9 humaine et de la GP100 sont bien distinctes car l'activité de la GP100 n’est inhibée qu’à 10% avec les TIMPs alors que celle de la MMP-9 humaine l’est à plus de 70%.

159

Discussion

Les résultats obtenus avec les inhibiteurs spécifiques synthétisés par l’Institut de Chimie moléculaire, indiquent que la profondeur du site catalytique de ces deux enzymes pourrait être assez similaire. Nous pouvons donc supposer que la GP100 et la MMP-9 humaine sont capables de cliver des substrats ayant des compositions similaires. L’étude des effets d’autres substrats pourrait nous permettre de continuer la caractérisation du site catalytique de la GP100 et ainsi déterminer sa composition.

Au vu de nos résultats, nous pouvons donc émettre l’hypothèse que la GP100 possède des propriétés proches de celles de la MMP-9 de mammifère et peut être assimilée à une enzyme de type MMP-9 like.

Il est intéressant de souligner que chez Trypanosoma Cruzi , une gélatinase de 97 kDa a été mise en évidence dans le milieu conditionné et l’extrait cytosolique de ces parasites. Cette gélatinase a été classée dans la famille des métalloprotéases et plus particulièrement comme une protéine MMP-9 like par western-blotting à l’aide d’un anticorps anti-MMP-9 humaine. Une seconde protéine MMP-9 like a également été caractérisée dans le milieu conditionné et avec une masse moléculaire apparente de 85 kDa. La gélatinase MMP-9 like de 97 kDa est présente dans les trypomastigotes, forme circulante de T. Cruzi , et les amastigotes, forme quiescente intracellulaire. Cela suggère l’implication de cette gélatinase dans le mécanisme d’infection par T. Cruzi (Nogueira de Melo et al. , 2010).

Dans cette première partie, nous avons démontré la présence d’une protéase sécrétée par T. gondii possédant des propriétés protéolytiques comparables à celles d’autres métalloprotéases de types gélatino- et élastinolytique. Nous pouvons donc émettre l’hypothèse que la GP100 permettrait la dégradation du collagène IV ainsi que de l’élastine qui sont les deux constituants majeurs de la matrice extracellulaire. En dégradant ces composés, la GP100 pourrait faciliter l’infestation du parasite T. gondii au sein de l’organisme.

160

Discussion

Après sa caractérisation biochimique, nous avons tenté de réaliser la purification de la GP100 en utilisant une stratégie composée de trois techniques chromatographiques.

Lors de la validation de ces trois méthodes chromatographiques, nous avons obtenu des rendements très différents d’une technique à une autre. En effet, les chromatographies de gel filtration et de gélatine-agarose nous ont permis d’obtenir de bons rendements (supérieur à 80 %) alors qu’avec la chromatographie chélatrice de zinc nous avons obtenu seulement 27 %. De plus, lors de cette validation de méthodes, nous n’avons pas observé de protéines pouvant correspondre à la gélatinase de 100 kDa sur les gels SDS-PAGE alors que son activité gélatinolytique était parfaitement visible par zymographie. Cela nous amène à conclure que la GP100 possède une activité catalytique importante sur la gélatine, activité détectée à partir de quantités très faibles de l’enzyme, probablement inférieure à 0,1 ng qui est la limite de détection de la coloration au nitrate d’argent.

L’association en série des trois chromatographies suivie de l’analyse par zymographie en gel de gélatine, nous a permis de démontrer la présence de trois bandes. Par comparaison avec les six bandes que nous avions décrites dans le milieu conditionné 18 h ( Figure 34 ), seule la GP100 est retrouvée après les trois chromatographies. En effet, les deux gélatinases décrites avec une masse moléculaire supérieure à 100 kDa ont été éliminées lors de la première étape de la chromatographie gel filtration. Les quatre gélatinases d’une masse moléculaire inférieure à 100 kDa ont été éliminées avec la chromatographie chélatrice de zinc. Après l’association de ces trois chromatographies, nous avons donc détecté la présence de trois bandes : une de masse moléculaire supérieure à 170 kDa, une inférieure à 100 kDa et la dernière inférieure à 55 kDa. Nous émettons les hypothèses que la bande de masse moléculaire supérieure à 170 kDa d’activité gélatinolytique très faible pourrait être la forme précurseur de la GP100. Ce précurseur pourrait alors être clivé afin de permettre son activation et ainsi correspondre à la bande de masse moléculaire inférieure à 100 kDa. La masse moléculaire apparente de cette bande ne correspond pas exactement à celle de la GP100 ( Figure 48 ) mais étant donné que c’est la gélatinase majoritaire sécrétée par T. gondii nous supposons que cette bande pourrait correspondre à notre gélatinase d’étude. La différence de masse moléculaire pourrait être due aux différents tampons d’élution utilisés dans les trois techniques chromatographies ; en effet, l’urée et l’imidazole contenus dans ces tampons pourraient dégrader partiellement la GP100. La bande inférieure à 55 kDa pourrait être une forme dégradée de la GP100 laquelle conserve une activité gélatinolytique, ou bien correspondre à une gélatinase distincte. La première hypothèse nous semble la plus

161

Discussion vraisemblable car, en gel de zymographie, l’activité gélatinolytique présente un aspect de « smear » évoquant une dégradation de l’enzyme.

L’analyse par SDS-PAGE et coloration au nitrate d’argent, montre une bande quantitativement majeure d’environ 170 kDa et une bande d’environ 100 kDa mais qui ne possède pas d’activité gélatinolytique en gel de zymographie. Cette protéine d’environ 100 kDa pourrait correspondre soit à la GP100 mais dépourvue d’activité gélatinolytique suite aux différentes chromatographies, soit à une autre protéine bien distincte. La dernière bande visible uniquement par électrophorèse SDS-PAGE coloré au nitrate d’argent possède une masse moléculaire apparente d’environ 55 kDa et pourrait correspondre à la forme dégradée de la GP100 ou à une autre protéine ayant une affinité pour la gélatine et l’ion zinc.

La difficulté de la purification de la GP100 vient du fait, que la dernière chromatographie utilisée, la chromatographie chélatrice de zinc, possédait un rendement très faible.

L’analyse par spectrométrie de masse des bandes d’intérêt s’étant avérée négative, nous avons utilisé une autre stratégie pour identifier la protéine correspondante à la GP100. Nous avons identifié dans la fraction éluée du gel chélateur de zinc, une protéine de 100 kDa qui s’est révélée, après analyse par spectrométrie de masse, correspondre à la zinc métalloprotéase 2, putative, nommée TGME49_027950 et ré-annotée comme TGME49_227948.

La modification d’annotation de la protéine identifiée est en accord avec les séquences peptidiques déterminées au spectromètre de masse puisqu’aucune de ces séquences n’avait été retrouvée dans les 322 premiers acides aminés de la TGME49_027950. Afin de déterminer expérimentalement le début de la séquence codante de cette métalloprotéase à zinc, nous avons réalisé la technique de 5’ RACE. Le séquençage du produit de PCR obtenu a été aligné avec la séquence génomique de la TGME49_227948. Sur les 796 nucléotides séquencés, les 293 nucléotides présents du côté 5’ se situaient dans une région annotée comme un intron dans la base de données ToxoDB et les 503 suivants dans une région annotée comme un exon. Cet exon correspond au début de la séquence codante de la TGME49_227948 alors que l’intron se situe plus au début de la séquence génomique de la TGME49_227948. Il serait intéressant de définir à partir de quel codon d’initiation ATG est réalisée la transcription de cette séquence et ainsi obtenir la séquence codante globale de la TGME49_227948.

162

Discussion

Nous suggérons donc que la première partie de la séquence obtenue après la 5’RACE corresponde à un exon non codant. La traduction commencerait véritablement au niveau du deuxième exon et donc la séquence codante correspondrait à celle décrite actuellement dans la base de données ToxoDB. Ce mécanisme d’exon non traduit, ou « saut d’exon », a déjà été décrit chez Plasmodium , permettant la synthèse de différentes protéines, à partir d’un même gène. Ces protéines sont impliquées à différentes étapes de cycle parasitaire (Singh et al. , 2004).

De plus, la masse moléculaire théorique de la TGME49_227948 est de 142 kDa alors que nous avons analysé une bande de 100 kDa à partir d’un gel SDS-PAGE coloré au nitrate d’argent. Cette différence de masse moléculaire pourrait s’expliquer par un clivage protéolytique de la protéine à 142 kDa. Ce phénomène est décrit pour la métalloprotéase FtsH1 présente chez T. gondii qui est soumise à différents types de processus protéolytiques. Cette enzyme est en effet présente sous quatre formes : une forme précurseur décrite à 170 kDa, une à 154 kDa dû au clivage de son domaine N-terminal, une à 140 kDa dû au clivage de son domaine C-terminal et une à 115 kDa dû au clivage des deux domaines N- et C-terminaux (Karnataki et al. , 2009).

Une seconde métalloprotéase, la falcilysine présente chez P. falciparum , est soumise au même type de processus. En effet, selon son adressage, elle pourrait subir des clivages en N-terminal ou au milieu de sa séquence protéique. De ce fait, la masse moléculaire pourrait être fortement diminuée (Ralph, 2007).

Au vu des peptides retrouvés par spectrométrie de masse, nous pouvons émettre l’hypothèse que la TGME49_227948 possède deux types de clivage : un clivage du côté N- terminal aboutissant à une protéine d’environ 100 kDa sans activité gélatinolytique et un clivage du côté C-terminal aboutissant à une protéine d’environ 100 kDa avec activité gélatinolytique.

Une troisième protéine a été identifiée par spectrométrie de masse avec un pourcentage de recouvrement important de 21%, la protéine MIC2. Cette protéine possède une masse moléculaire théorique de 82 kDa (ToxoDB), cependant deux formes ont été identifiées par SDS-PAGE : une de masse moléculaire de 115 kDa et une seconde entre 95 et 100 kDa (Carruthers et al. , 2000). La possibilité d’un complexe formé entre la TGME49_227948 et la protéine MIC2 a été invalidée lors de la réalisation de co-immunomarquages qui n’a pas permis de mettre en évidence une co-localisation de ces deux protéines.

163

Discussion

Après cette identification, nous avons déterminé la structure 3D de la TGME49_227948 par homologie de séquence avec la chaîne A de la 2FGE présente chez Arabidopsis Thaliana . Du fait de cette homologie, nous pouvons émettre l’hypothèse que ces deux protéines possèdent des mécanismes enzymatiques similaires. Il a été démontré que la protéine 2FGE avait un mécanisme d’action décrit comme une alternance d’ouverture-fermeture : le substrat vient se fixer sur l’enzyme qui est en position ouverte, puis elle se referme pour le dégrader et s’ouvre de nouveau pour libérer les produits obtenus (Johnson et al. , 2006). De plus, cette enzyme 2FGE a été démontrée comme impliquée dans la dégradation de peptides au niveau de la mitochondrie et du chloroplaste (Moberg et al. , 2003).

Après la synthèse de deux anticorps polyclonaux dirigés contre le TGME49_227948, nous avons confirmé la présence d’une forme à 120 kDa dans le milieu conditionné 18 h et le cytosol des parasites. De plus, nous avons observé une bande spécifique à 100 kDa pouvant correspondre à la GP100 et donc à une forme activée de la TGME49_227948. Afin de confirmer ces hypothèses, il serait nécessaire de réaliser une immunoprécipitation avec les deux anticorps et analyser les potentielles activités gélatinolytiques présentes.

Pour les autres formes détectées par western-blot avec les deux anticorps, il est nécessaire de tester de nouveau leur spécificité en présence des peptides contre lesquels ils ont été réalisés afin de confirmer qu’il s’agisse des différentes formes d’épissage protéolytique de la TGME49_227948. Dans ce cas, nous pourrions en conclure que cette métalloprotéase à zinc est soumise comme un grand nombre des enzymes de T. gondii à un processus de maturation complexe.

164

Discussion

Nous pouvons résumer nos travaux dans cette première partie :

- Nous avons caractérisé la présence d’une gélatinase d’environ 100 kDa sécrétée uniquement par des tachyzoïtes de T. gondii issus de LLP de souris et que nous avons proposé de nommer GP100,

- Cette GP100 est une métallo-endopeptidase à zinc possédant les caractéristiques d’une MMP de type MMP-9 like,

- Après chromatographies chélatrices de zinc, nous avons identifié la TGME49_227948 qui est une métalloprotéase à zinc dont l’annotation de son extrémité N-terminale reste encore à définir. L’utilisation de deux anticorps a permis d’émettre l’hypothèse de l’existence d’un processus de maturation protéolytique important.

A ce jour, le lien entre la GP100 et la TGME49_227948 n’a pas encore été établi avec certitude.

165

Discussion

Le rôle des métalloprotéases dans la biologie du parasite T. gondii

Lors de ces travaux de thèse, nous avons identifié, par spectrométrie de masse, une métalloprotéase à zinc, la TGME49_227948, appartenant à la sous-famille des M16C. A l’heure actuelle, chez T. gondii , cinq métalloprotéases ont été décrites dans la littérature : une appartient à la sous-famille M1 (Berthonneau et al. , 2000), deux à la sous-famille M16A (Hajagos et al. , 2012; Laliberté and Carruthers, 2011), une à sous-famille M17 (Jia et al. , 2010) et une à la sous-famille M41 (Karnataki et al. , 2007, 2009). Excepté pour la protéase de la sous-famille M1, leur rôle a été déterminé. Chez les autres Apicomplexa tel que Plasmodium falciparum , les métalloprotéases sont beaucoup mieux décrites ; elles peuvent avoir des rôles très variés : au niveau de la réplication du parasite, de la maturation des protéines, de l’adressage des protéines mais aussi dans le processus d’invasion au sein de la cellule-hôte.

La protéine de la sous-famille M17 (leucine aminopeptidase) présente chez T. gondii , a été décrite pour son rôle dans la régulation de la synthèse protéique. En effet, cette protéine pourrait libérer des acides aminés lors de l’étape finale du catabolisme des protéines (Fujimura-Kamada et al. , 1997). Chez P. falciparum , une protéase de cette même famille M17 a été caractérisée pour son rôle dans l’étape finale du catabolisme des protéines. Cette protéase est l’enzyme majoritaire présente dans le cytosol du parasite et permet la régulation des acides aminés libres provenant des protéines cytosoliques. Les leucines aminopeptidases sont également responsables du maintien osmotique de l’érythrocyte et de ce fait, sont indispensables à la survie des parasites au sein de l’hôte (Stack et al. , 2007).

Une protéine de la famille M1 a été caractérisée, chez P. falciparum , pour son rôle dans le développement du parasite. Cette protéase possède le domaine catalytique

HEXXHX 18 E associé à une tyrosine en position 551 nécessaire à la catalyse, ainsi que le domaine GAMEN en position 431 à 435 spécifique des métalloprotéases de la famille M1 (Florent et al. , 1998). Une autre protéase, de la famille M1, a été décrite comme impliquée dans le processus d’invasion d' Eimeria tenella . Cette métalloprotéase est inhibée par la bestatine, l’amastatine et nécessite des ions Zn 2+ pour être fonctionnelle. Elle est synthétisée

166

Discussion sous forme d’un précurseur de 120 kDa et est clivée pour obtenir deux formes à 96 et 68 kDa. Cette enzyme est présente au stade intracellulaire du parasite, et plus précisément dans le cytosol et le noyau (Gras et al. , 2014). La mise en évidence de ces formes suggère l’existence d’un pro-domaine et d’un épissage protéolytique, permettant ainsi l’activation et éventuellement la relocalisation de cette métalloprotéase.

Nous pouvons émettre les mêmes hypothèses pour la GP100 et pour la TGME49_227948 avec une forme précurseur et plusieurs formes d’activations dues aux clivages d’un ou plusieurs domaines.

De plus, des inhibiteurs spécifiques des métalloprotéases décrites précédemment chez P. falciparum , les protéases M1 et M17, ont permis de démontrer leur rôle respectif. La protéase de la famille M1 est impliquée dans le processus de dégradation de l’hémoglobine alors que l’inhibition de la protéase de la famille M17 est létale au début du cycle parasitaire (Harbut et al. , 2011). Des inhibiteurs de ces deux enzymes, indispensables à la survie du parasite P. falciparum , sont en cours d’études car ils pourraient représenter de futurs médicaments anti-paludiques (Kannan Sivaraman et al. , 2013). Notons que chez P. vivax , une métalloprotéase de la famille M17 a également été décrite dans le mécanisme de dégradation de l’hémoglobine, des inhibiteurs de cette enzyme ont aussi été identifiés comme des médicaments potentiels (Lee et al. , 2010).

Les FtsH (Filamentation temperature sensitive) sont des métalloprotéases avec une activité AAA (ATPase associated with various cellular activities) et un domaine de fixation de l’ion Zn 2+ . Elles sont impliquées dans la dégradation des protéines membranaires au niveau de la mitochondrie et du chloroplaste. T. gondii en possède trois dont une, la FtsH1, a été décrite par Karnataki et al. (2007, 2009). Cette enzyme FtsH1 possède également un important processus protéolytique au niveau de ces domaines N- et C-terminaux.

Les métalloprotéases synthétisées par les Apicomplexa peuvent également être impliquées dans le processus de maturation des protéines. Ainsi, chez T. gondii , la toxolysine-4 (TGME49_206510) est une métalloprotéase de la famille M16A qui est une maturase intervenant dans la régulation protéolytique des protéines MICs (Laliberté and Carruthers, 2011). Cette enzyme est donc également impliquée dans le processus d’invasion où les protéines MICs participent au processus de « gliding motility » et à l’invasion de la cellule-hôte (Saouros et al. , 2012)

167

Discussion

Les métalloprotéases sont aussi impliquées dans le trafic des protéines. Une protéase de la famille M18 présente chez P. falciparum , la PfM18AAP, permet à plusieurs protéines du parasite d’être localisées dans la vacuole parasitophore et induit également la dégradation et le renouvellement des protéines parasitaires (Sivaraman et al. , 2012). Le knock-down de cette protéase conduit à un phénotype létal, d’où l’intérêt de développer des médicaments contre cette enzyme, représentant ainsi une cible thérapeutique potentielle (Teuscher et al. , 2007). La détermination de sa structure cristallisée a permis de décrire plus précisément le site catalytique de cette enzyme et pourra ainsi permettre de réaliser le design d’inhibiteurs spécifiques (Sivaraman et al. , 2012) . Grâce à la réalisation de la structure cristallisée de la TGME49_227948, la caractérisation précise de son site catalytique permettrait de déterminer la structure d’inhibiteurs spécifiques et ainsi décrire les fonctions de cette métalloprotéase toxoplasmique.

Les métalloprotéases peuvent également être impliquées dans le mécanisme d’invasion du parasite par la cellule-hôte. Une métalloprotéase a particulièrement bien été décrite chez Leishmania amazonensis , la gp63 ou MSP (major surface protein). Il s’agit d’une métalloprotéase qui appartient à la famille M8, appelée aussi les Metzincines. Elle est exprimée majoritairement au niveau de la surface des parasites (Silva-Almeida et al. , 2012). Cette enzyme est inhibée par le 1-10-phenanthroline mais pas par la bestatine, la leupeptine, l’ABESF, la pepstatine A, l’E-64 et l’aprotinine (Jaffe and Dwyer, 2003). Cette métalloprotéase est exprimée au stade promastigote (forme extracellulaire) et amastigote (forme intracellulaire). La gp63 a été caractérisée dans la classification EC comme 3.4.24.36, aussi appelée leishmanolysine (Mazumder et al. , 2010). Elle présente de nombreuses similarités avec les MMPs. Elle possède une activité gélatinolytique, elle est donc capable de dégrader au moins un composé de la matrice extracellulaire. Elle nécessite un ion Zn 2+ pour être fonctionnelle. De plus, la gp63 serait synthétisée sous forme d’un précurseur possédant un pro-domaine du côté N-terminal de sa séquence protéique qui permettrait la régulation de l’activité enzymatique (McMaster et al. , 1994). Le domaine C-terminal de la gp63 a été démontré comme indispensable à la fonction catalytique de l’enzyme, et particulièrement les acides aminés 180 à 211 de ce domaine (Mazumder et al. , 2010).

Cette activité gélatinolytique est également retrouvée chez la GP100 de T. gondii . La gélatinase que nous avons étudiée étant capable de dégrader deux composés de la matrice extracellulaire, la gélatine et l’élastine, il serait intéressant d’étudier son action sur d’autres

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Discussion composés tels que les collagènes de type I et IV. Ainsi, nous pourrions comparer les rôles biologiques potentiels de la GP100 avec ceux de la gp63.

La réalisation de différentes constructions tronquées de la GP100 permettraient de déterminer la fonction de chacun des domaines de la protéine et ainsi savoir s’ils sont indispensables ou non à la survie du parasite T. gondii .

Récemment, le rôle de cette métalloprotéase gp63 a été étudié à travers la culture de promastigotes dans un modèle 3D de collagène de type I. Ce modèle permet d’observer partiellement, les effets des parasites sur la matrice extracellulaire. En présence de promastigotes, la matrice de collagène I est réorganisée, ainsi après 72 h, environ 23 % de la matrice est dégradée. Cet effet est significativement diminué en présence d’inhibiteurs de cystéines protéases mais cette diminution n’est pas retrouvée en présence d’inhibiteurs de sérines protéases. L’incubation avec l’anticorps anti-gp63 provoque une diminution significative de la dégradation du collagène et de ce fait, modifie la migration des parasites. Au vu des observations précédentes, les auteurs ont conclu que cette migration était due à l’action de métalloprotéases et de cystéines protéases (Petropolis et al. , 2014).

Il a déjà été montré la corrélation entre la dégradation de la matrice extracellulaire et l’inflammation (Cox and Erler, 2011). De ce fait, une désorganisation de cette matrice est souvent observée dans de nombreuses maladies. Ainsi, le remodelage du collagène par les parasites pourrait jouer un rôle essentiel dans le processus d’infection.

D’après les activités que nous avons décrites pour la GP100, nous pouvons donc émettre l’hypothèse que cette gélatinase pourrait, comme la gp63 de Leishmania , être capable de désorganiser une matrice 3D du collagène I et donc modifier la transmigration de tachyzoïtes de T. gondii au travers de cette matrice. Il serait donc intéressant de réaliser la même expérience avec du collagène de type IV qui est le constituant majeur des lames basales.

Le rôle des métalloprotéases dans l’invasion a déjà été démontré pour une protéase de la famille M16A. Après une augmentation du calcium, la toxolysine-4 est sécrétée au niveau des micromènes d’où son rôle potentiel au cours de l’invasion (Laliberté and Carruthers, 2011). De plus, cette enzyme qui possède un processus de maturation protéolytique complexe ayant lieu dans ou après le compartiment trans-golgien, est la première enzyme appartenant à la famille M16A qui décrit un tel processus de maturation (Laliberté and Carruthers, 2011).

169

Discussion

Ce type de processus s’effectue habituellement pour les protéines MICs et ROPs (Miller et al. , 2003).

Une métalloprotéase de la famille M16C a été identifiée, caractérisée et cristallisée ; il s’agit de la séquence PreP présente chez Arabidopsis Thaliana . De plus, cette protéine nous a permis de réaliser la structure 3D de la métalloprotéase que nous avons étudiée, la TGME49_227948 grâce à leurs homologies de structure. Grâce à cette homologie, nous pouvons émettre l’hypothèse que ces deux enzymes possèdent des sites catalytiques assez proches et donc des mécanismes d’action potentiellement semblables. Ainsi, la séquence PreP a été caractérisée pour son rôle dans la dégradation des peptides issus de la mitochondrie et du chloroplaste. L’équipe de Moberg a réalisé la synthèse de la protéine recombinante de la Séquence PreP en réussissant à respecter l’intégrité du site catalytique, de la spécificité du substrat et de la localisation intracellulaire (Moberg et al. , 2003). Des expériences de mutagenèses ont permis de caractériser la fonctionnalité de plusieurs domaines présents au niveau de la séquence PreP. Ainsi, il a été démontré que cette enzyme est composée d’un peptide d’adressage à la mitochondrie et au chloroplaste constitué de 85 acides aminés. Les 995 acides aminés restants forment la protéine mature (Johnson et al. , 2006).

D’après les différents exemples décrits, nous observons que les métalloprotéases d’une même sous-famille possèdent des rôles assez similaires. De ce fait, nous pouvons émettre l’hypothèse que la TGME49_227948 pourrait être impliquée dans le processus d’invasion de T. gondii. Notre étude préliminaire réalisée in vitro en incubant les tachyzoïtes en présence de l’anticorps polyclonal dirigé contre une séquence proche du site catalytique, a montré une forte diminution du nombre de cellules infectées par T. gondii après 48 h suggérant un rôle de cette protéase dans l’invasion.

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CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

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Le rôle des métalloprotéases dans la biologie du parasite T. gondii n’est pas encore décrit avec précision dans la littérature. Plusieurs métalloprotéases ont été identifiées avec des rôles variés dans la maturation et le trafic des protéines et aussi dans l’invasion de la cellule- hôte. L’identification des métalloprotéases ainsi que l’étude de leurs fonctions sont donc importantes pour la compréhension des différents mécanismes impliqués. La mise en évidence d’une gélatinase sécrétée par T. gondii nous a amené à réaliser sa caractérisation ainsi qu’à identifier les métalloprotéases présentes dans le génome de T. gondii et plus particulièrement celles appartenant à la famille M16.

Dans la première partie de notre étude, nous avons caractérisé les propriétés enzymatiques que de la GP100. Celle-ci possède une activité gélatinolytique optimale dans des conditions physiologiques et a un point isoélectrique de 5,8. Par l’utilisation de différents inhibiteurs, cette enzyme a été identifiée comme une métallo-endopeptidase à ions divalents (Zn 2+ , Ca 2+ , Ni 2+ …) pouvant appartenir aux familles suivantes : M3, M13, M16, M22, M41, M48 ou M50. L’ensemble de nos résultats nous suggère qu’il s’agit d’une enzyme de type MMP-9 like, dont le mode d’activation est distinct de celui des MMPs de mammifères. Des analyses complémentaires, par l’utilisation de substrats synthétiques fluorogéniques, seront nécessaires afin de préciser la classification précise de la GP100 et ainsi pouvoir déterminer les sites de coupures préférentiels de cette métalloprotéases. Ceci nous permettra d’émettre des hypothèses sur ces fonctions potentielles.

Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons identifié par spectrométrie de masse une protéine correspondant à la TGME49_227948, une métalloprotéase à zinc. La modification d’annotation du génome dans la banque de données ToxoDB de cette protéine, réalisé par l’équipe du Pr Soldati-Favre, nous a amené à déterminer expérimentalement le début de sa séquence nucléotidique. Nous avons effectivement retrouvé par la technique de 5’ RACE une partie de la séquence nucléotidique correspondant au premier exon de la TGME49_227948 mais l’autre partie de la séquence du côté 5’ correspond à un intron situé au début de la séquence génomique de la TGME49_227948. Ce résultat tend à démontrer que des études complémentaires seront nécessaires pour élucider complètement l’organisation du gène codant TGME49_227948. Nous proposons de réaliser l’amplification de la séquence codante globale de la TGME49_227948 avec l’utilisation de différents couples d’amorces afin de définir son extrémité 5’. Ces résultats pourront alors être analysés en collaboration avec l’équipe du Pr Soldati-Favre.

172

Nous avons ensuite réalisé la synthèse d’anticorps polyclonaux dirigés contre une séquence proche du site catalytique et du côté C-terminal. Leur utilisation nous a permis d’émettre les hypothèses que la TGME49_227948 est synthétisée sous la forme d’un précurseur de 140 kDa, probablement clivé en une forme à 100 possédant une activité gélatinolytique. D’autres formes d’environ 50-60 kDa pourraient être issues de la protéolyse de cette enzyme. Il serait intéressant de réaliser une technique de pulse-chase afin de valider cette hypothèse.

Grâce à l’utilisation des anticorps polyclonaux bloquant reconnaissant une séquence proche du site catalytique, nous pouvons émettre l’hypothèse que la TGME49_227948 est impliquée dans la multiplication du parasite. Afin de déterminer précisément son rôle, il serait nécessaire de synthétiser un inhibiteur spécifique de cette métalloprotéase à zinc afin d’étudier in vitro et in vivo le rôle de cette enzyme.

Afin de confirmer le rôle de la TGME49_227948 dans la biologie de T. gondii et probablement dans la multiplication de parasite au sein de la vacuole parasitophore, la réalisation d’un knock-out ou d’un knoch-down pour le gène codant la TGME49_227948 permettrait d’observer les effets de l’inhibition ou de la diminution de cette métalloprotéase, respectivement, sur la biologie de T. gondii . Ces souches mutantes pourraient être étudiées dans des modèles in vitro de culture 3D de collagène et dans des modèles in vivo murins. Le rôle de cette protéase pourrait ainsi continuer à être caractérisé. La réalisation et la purification d’une protéine recombinante de la TGME49_227948 permettraient de compléter sa caractérisation et d’élucider son implication dans la biologie du parasite grâce à des expériences de surexpression notamment. De plus, cette protéine recombinante pourrait être analysée par zymographie afin de détecter son activité gélatinolytique potentielle dans le but de pouvoir conclure que la TGME49_227948 correspond à la gélatinase GP100.

Ces perspectives permettraient ainsi de mieux comprendre le rôle de la métalloprotéase TGME49_227948 dans la biologie de T. gondii .

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BIBLIOGRAPHIE

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BOULEAU-MARTIN Anne-Pascaline Identification et caractérisation de métalloprotéases de Toxoplasma gondii Identification and characterization of metalloproteases from Toxoplasma gondii

Résumé Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire intracellulaire obligatoire appartenant à la famille des Apicomplexa. Chez les protozoaires, les protéases possèdent des rôles clés au niveau du cycle parasitaire, et sont ainsi considérées comme des facteurs de virulence. Chez T. gondii , les métallopeptidases pourraient être impliquées dans la traversée des différentes barrières biologiques. A l’heure actuelle, seules cinq métallopeptidases de T. gondii ont été décrites : une aminopeptidase N, deux toxolysines, une leucine aminopeptidase et une FtsH1 peptidase. Lors de l’étude de l’influence de l’invasion de monocytes humains par T. gondii sur le profil d’expression des métalloprotéases matricielles monocytaires, nous avons mis en évidence une protéase parasitaire présentant à la fois des propriétés gélatino- et élastinolytique. Le but de ce travail est de caractériser, purifier et identifier cette gélatinase de T. gondii . Dans un premier temps, nous avons caractérisé la gélatinase d’environ 100 kDa sécrétée par T. gondii comme étant une MMP-9 like (métallo-endopeptidase à zinc) mais ne possédant pas le même processus d’activation que les MMPs humaines. Dans un deuxième temps, après purification partielle par une série de chromatographie chélatrice de zinc, nous avons identifié par spectrométrie de masse la gélatinase comme étant la TGME49_227948 annotée dans ToxoDB. Cette protéase présente les domaines protéiques d’une métalloprotéase à zinc de la sous-famille M16C, et est proche au niveau de sa structure 3D de la chaine A de la 2FGE présente chez Arabidopsis Thaliana . Afin de confirmer l’annotation de ToxoDB, nous avons séquencé l’extrémité 5’ de l’ARNm de cette protéase. Cependant, nos résultats expérimentaux ne sont pas en concordance avec l’annotation prédite dans la base de données ToxoDB. La séquence en acides aminés de cette protéase, nous a permis de synthétiser deux anticorps polyclonaux spécifiques afin de mettre en évidence deux formes de 140 kDa et 100 kDa et donc d’émettre l’hypothèse que cette protéase pourrait être clivée afin d’être activée. De plus, cette métalloprotéase a été détectée par western blot dans le cytosol des parasites mais elle est aussi secrétée dans le milieu conditionné. Par immunolocalisation, la protéase est présente au sein du parasite, au niveau du cytosol sans localisation préférentielle dans un organite particulier. Dans ce travail, nous avons montré que la gélatinase parasitaire sécrétée par T. gondii pourrait dégrader des composés de la matrice extracellulaire, d’où son rôle potentiel dans le mécanisme de traversée des barrières biologiques.

Abstract Toxoplasma gondii is an intracellular protozoan parasite which belongs to the Apicomplexa phylum. In protozoans, proteases have key roles in the parasitic cycle. They thereby are considered as virulence factors. In T. gondii , metallopeptidases may be involved in the crossing of biological barriers. Currently, only five metallopeptidases from T. gondii are described: an aminopeptidase N, two toxolysins, one leucine aminopeptidase and one FtsH1 peptidase. During the study of the influence of human monocytes invasion by T. gondii on the monocytic matrix metalloproteases expression profile, we brought out a parasitic protease showing gelatino- and elastinolytic properties. The aim of this study is to characterize, purify and identify this gelatinase from T. gondii . First we characterized the 100 kDa-gelatinase secreted by T. gondii as an MMP-9-like (zinc metalloendopeptidase) but its activation process is different from human MMPs. Then, after the partial purification by a series of zinc-chelate chromatographies, we identified by mass spectrometry the gelatinase as the TGME49_227948 annotated in ToxoDB. This protease has M16C subfamily zinc-metalloprotease protein domains and is close to the 3D structure of the A chain of the 2FGE in Arabidopsis thaliana . In order to confirm the ToxoDB annotation, we sequenced the 5’ end of the mRNA of this protease. Nevertheless our experimental results are not in the line with the predicted annotation in ToxoDB database. The amino acids sequence of this protease allowed us to synthesize two specific polyclonal antibodies in order to highlight two forms, 140 kDa and 100 kDa, and to emit the hypothesis that this protease could be cleaved to be activated. Moreover this metalloprotease was detected by Western Blot in the cytosol of the parasites but it can also be secreted in the conditioned medium. By immulocalization, the protease is present in the cytosol of the parasite without any preferential localization in a particular organelle. In this study, we showed that the parasitic gelatinase secreted by T. gondii could degrade extracellular matrix compounds, which could explain its potential role in the mechanism involved in the crossing of biological barriers. Mots-clés Toxoplasma gondii – gélatinase – métalloprotéase à zinc– chromatographie – barrières biologiques – invasion Keywords Toxoplasma gondii – gelatinase – zinc metalloprotease – chromatography – biological barriers – invasion Laboratoire de Parasitologie-mycologie EA 3800 Laboratoire de Biochimie médicale et Biologie moléculaire UMR 7369 UFR Médecine – SFR Cap Santé FED 4231 UFR Médecine – SFR Cap Santé FED 4231 51, rue Cognacq Jay 51, rue Cognacq Jay 51095 Reims Cedex 51095 Reims Cedex