UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS

DE TOURS

ÉCOLE DOCTORALE Santé, Sciences et Technologie

Unité INSERM 930,

Équipe 3 « neurotransmission : de l’imagerie moléculaire à la clinique »

THÈSE présentée par : Diane DUFOUR-RAINFRAY

soutenue le : 1er mars 2011

pour obtenir le grade de : Docteur de l’université François - Rabelais Discipline/ Spécialité : Sciences de la vie et de la santé

Implication du système sérotoninergique dans l’autisme : Étude de marqueurs centraux (modèle animal) et périphériques (plaquette sanguine humaine)

THÈSE dirigée par : Monsieur GUILLOTEAU Denis Professeur, Université François – Rabelais de Tours

RAPPORTEURS : Monsieur CRUSIO Wim Directeur de recherche, CNRS UMR 5287 de Talence Monsieur ZIMMER Luc Professeur, Université Lyon 1 & Hospices Civils de Lyon

JURY : Madame CHALON Sylvie Directrice de recherche, Unité INSERM 930 de Tours Monsieur CRUSIO Wim Directeur de recherche, CNRS UMR 5287 de Talence Monsieur GUILLOTEAU Denis Professeur, Université François – Rabelais de Tours Monsieur ZIMMER Luc Professeur, Université Lyon 1 & Hospices Civils de Lyon

1 Remerciements

A Monsieur Denis Guilloteau, Je vous remercie d’avoir accepté d’être mon directeur de thèse. Voici 8 ans que vous me soutenez dans mon parcours professionnel et j’espère fermement qu’il aboutira cette année. Respectueusement.

A Monsieur Wim Crusio et Monsieur Luc Zimmer Je vous remercie d’avoir accepté de juger ce travail et de m’avoir fait l’honneur d’être rapporteurs de cette thèse. Respectueusement.

A Sylvie Chalon, J’apprécie beaucoup travailler avec toi, nos conversations sont toujours fécondes et motivantes. Je te remercie aussi d’avoir relu ce travail, de l’avoir enrichi par ton expérience. Je t’adresse mes sincères remerciements.

A Monsieur Christian Andres, Merci de m’avoir un jour demandé « si je connaissais quelqu’un susceptible de vouloir être AHU en Biochimie ! ». Merci de m’avoir permis d’être AHU dans votre service de biochimie, nos deux services sont voués à fonctionner ensemble. Respectueusement.

A Patrick Vourc’h, C’est aussi grâce à toi que cette thèse aboutit. Tu es un collègue formidable, j’apprécie tes qualités humaines et professionnelles. Amicalement.

A Monsieur Jean-Claude Besnard, Je vous remercie de m’avoir dessiné un avenir dans le service de médecine nucléaire in vitro. Je vous suis très reconnaissante de votre bienveillance à mon égard. Respectueusement.

2 Je remercie :

Sylvie Bodard, Zuhal Gulhan et Emilie Jaumain pour leurs larges participations aux expérimentations animales,

Lucette Garreau pour son partage d’expérience, son appui pour l’établissement des protocoles d’études,

Marie-Paule Vilar et Jackie Vergote pour les radiomarquages.

Merci aussi à tous mes collègues du labo de recherche,

Sylvie, Sylvie et Sylvie, Francine, Laurent, Johnny, Clovis, Lucette, Jackie, Emilie et Emilie, Zuhal, Nathalie, Marie-Christine, Marie-Paule, Gaëlle, Nicolas, Stéphanie, Serge, Claire, François-Xavier, Brice, Daniel, Cathie, Kate, Mitch et encore beaucoup d’autres !

Les bureaux ne bougent pas, mais il s’y assoit beaucoup de personnes en 5 ans de thèse !

Merci enfin à tous mes collègues du laboratoire de médecine nucléaire,

Denis, Chantal, Christine, Martine, Serge, Sylvie, Josette, Evelyne, Marlène, Agnès, Clarisse, Annie, Christine, Marie-Thérèse, Nicole, Stéphanie, Jean-Louis, Evelyne, Meriem, les internes, externes et stagiaires;

et tous les collègues de l’« in vivo » !

J’espère de tout cœur continuer ma vie professionnelle auprès de vous.

3 Voici la deuxième occasion qui m’est donnée de remercier toutes les personnes qui m’entourent et qui me soutiennent dans ma vie professionnelle et familiale.

Ma belle famille et ma belle-famille : Thomas, mon cher mari Simon, Sidonie, Alice et …, mes enfants chéris Guy et Martine, mes parents Bruno et Elisabeth, mes beaux-parents Virginie ma soeur, Charles, Daphné ma filleule et Antoine Mathieu, Anne-Sophie, Maëlle, Clémentine, Luc et Max ; Marie ; Grand-Mémie Ma grand-mère Nénette, mes oncles et tantes dont Domi ma marraine

Tous mes cousins, leurs valeurs ajoutées et leurs marmots chaque année plus nombreux : Aliénor, Christophe, Victor, Arthur, Elliot mon petit filleul et Elvire; Apolline, Guyaume et…; Grégoire et Frédérique ; Martin ; Manou, Fabien, Laura, Ondine et Célimène ; Ismaël, Noémie, Maïlys, Célia et…; Marie, Thomas, Lena et Liam; Nathanaël; Benoît, Mélanie et Louise

Tous mes amis (dites-donc vous avez plus de marmots qu’en 2006 !) : Véronique, David, Marius, Félix et Angèle; Benoît, Bénédicte, Raphaël et Clémence ; Joseph, Carole et Julien ; Pierre, Elsa, Juliette et Joséphine ; Boubouille, Fanny, Basile et Valentin ; Charles, Virginie, Elia et Maé ; Elisabeth, Tony, Léna, Antoine et Malo ; Anne, Jean-Michel, Nel et Zoé ; Marco, Marine, Louise et Fantine ; Carline, Dominique, Baptiste, Hippolyte et Félix ; Virginie, Eric, Paul, Hippolyte et Inès ; Anne-Marie, Benoit, Pierre, Jean et Justine ; Nadège, Rémi, Susie et Lisa ; Nathalie, Mathias, Paul, Camille, Thomas et Léo ; Et tous les autres

4 Je dédie ce travail A mes parents qui m’ont permis de faire de longues études

(2010-2011, la dernière carte d’étudiant !)

A mon mari adoré et sa phrase favorite « Alors, ça avance ? t’as fini ta thèse ? »

A mes enfants chéris qui me demandent régulièrement

« Pourquoi tu fais encore une thèse ? »

« Pourquoi tu fais encore une thèse ? »

5 Résumé

L’autisme est une maladie neuro-développementale débutant avant l’âge de trois ans. Il est caractérisé par une altération des relations sociales et de la communication, des attitudes stéréotypées avec un répertoire restreint d’activités et d’intérêts (APA, DSM-IV, 1994). L’autisme est une maladie complexe qui implique des facteurs génétiques, épigénétiques et environnementaux (dont l’exposition à l’acide valproïque) mais l’étiologie n’est pas connue. Actuellement le diagnostic de l’autisme est basé uniquement sur des critères cliniques. Or ce diagnostic est rendu difficile en raison de l’hétérogénéité clinique de la maladie. Disposer de marqueurs de la pathogénèse de l’autisme permettrait d’améliorer la compréhension de la physiopathologie de la maladie, de compléter les arguments cliniques pour établir le diagnostic et de proposer des voies de recherche thérapeutiques ou préventives.

Notre hypothèse de travail est que certaines modifications du système sérotoninergique peuvent être des marqueurs potentiels de l’autisme. Pour tester cette hypothèse, nous avons eu recours à deux modèles d'étude : la plaquette sanguine comme modèle du système sérotoninergique périphérique humain et un modèle animal, le rat exposé en prénatal à l'acide valproïque, comme modèle du système sérotoninergique central. Pour cela, nous avons validé des outils d’exploration (radioligand) et les modèles d’étude. Puis, dans chaque modèle, nous avons étudié différents paramètres sérotoninergiques (taux de sérotonine, densité de transporteurs de la sérotonine). Nous avons montré :

- que le taux de sérotonine intraplaquettaire et la densité de transporteurs de la sérotonine peuvent être conjointement analysés chez l’homme. Dans notre échantillon, ces paramètres ne diffèrent pas significativement entre les groupes de témoins, patients autistes et apparentés du premier degré,

- que le taux de sérotonine est abaissé de 46% dans l’hippocampe des rats exposés à l'acide valproïque, sans modification de la densité de SERT à l’âge adulte.

Ces études renforcent l’intérêt de réaliser, chez des sujets avec autisme, des explorations centrales de ces potentiels marqueurs sérotoninergiques, et notamment à l’aide d’outils d’imagerie moléculaire.

6 Résumé en anglais

Autism is a neurodevelopmental disorder beginning before the age of 3 years. It is characterized by qualitative impairments in social interaction and communication, and by restricted repetitive and stereotyped patterns of behaviors, interests and activities (APA, DSM-IV, 1994). Autism is a complex disease involving genetic, epigenetic and environmental factors (e.g. valproic acid exposure) but the etiology is not known. Currently the diagnosis of autism is based on clinical criteria. However this diagnosis is difficult because of the clinical heterogeneity. Development of markers of pathogenesis for autism would improve understanding of the pathophysiology, would complete clinical arguments for diagnosis and would propose preventive or therapeutic research pathways.

Our working hypothesis is that modifications to the serotonergic system may be potential markers for autism. To test this hypothesis, we used two study models: the blood platelet as a human peripheral serotonergic system model and an animal model, rats prenatally exposed to valproic acid, as a model of the central serotonergic system. To do this, we validated exploration tools (radioligand) and study models. Then, in each model, we studied various serotonergic parameters (serotonin levels, density of serotonin transporters). We have shown that:

- platelet serotonin levels and serotonin transporters density may be jointly tested in humans. In our sample, these parameters do not significantly differ between groups of controls, patients with autism and first-degree related,

- serotonin levels were decreased by 46% in the hippocampus of rats exposed to valproic acid, and no significant modification was observed in serotonin transporters density at the adult age.

These studies reinforce the interest of central exploration of serotonergic potential markers in patients with autism and especially with molecular imaging tools.

7 Table des matières

Remerciements...... 2 Résumé...... 6 Résumé en anglais...... 7 Table des matières ...... 8 Liste des tableaux ...... 12 Liste des figures ...... 13 Liste des annexes...... 15 Introduction ...... 16 Première partie : Données générales et état de la question ...... 20 1. Système sérotoninergique et autisme...... 21 1.1. Le système sérotoninergique ...... 21 1.1.1. La sérotonine ...... 21 1.1.2. Les récepteurs de la sérotonine...... 28 1.1.3. Le transporteur de la sérotonine, SERT...... 31 1.1.4. Développement embryologique du système sérotoninergique...... 43 1.2. Le syndrome autistique...... 46 1.2.1. Historique ...... 46 1.2.2. Définition et approche clinique ...... 47 1.2.3. Épidémiologie du syndrome autistique ...... 48 1.2.4. Pathologies associées...... 49 1.2.5. Aspects génétiques de l’autisme...... 49 1.2.6. Hypothèses étiologiques liées à des facteurs environnementaux ...... 51 1.2.7. Aspects neuroanatomiques de l’autisme...... 60 1.2.8. Aspects biochimiques de l’autisme ...... 61 1.3. Le système sérotoninergique dans l’autisme...... 63 1.3.1. Les taux de sérotonine dans l’autisme...... 64 1.3.2. Les récepteurs sérotoninergiques dans l’autisme ...... 67 1.3.3. Les SERT dans l’autisme ...... 68 1.3.4. De potentiels marqueurs sérotoninergiques dans l’autisme ?...... 69 2. Outils d’exploration du système sérotoninergique dans la pathologie autistique ... 72 2.1. Méthodes et outils d’exploration in vitro/ex vivo du SERT...... 72

8 2.1.1. Études de liaison...... 72 2.1.2. Ligands spécifiques du SERT...... 73 2.2. Modèles d’étude de l’autisme ...... 77 2.2.1. Modèle périphérique humain : la plaquette sanguine...... 77 2.2.2. Modèles animaux d’étude de l’autisme...... 79 Deuxième partie : Hypothèses et Stratégie de recherche...... 84 Troisième partie : Matériels et méthodes...... 86 1. Outils d’exploration in vitro/ex vivo du SERT ...... 87 1.1. Radiomarquage du [ 3H]-MADAM...... 87 1.2. Radiomarquage de l’[ 125 I]-ADAM ...... 89 2. Modèle périphérique humain : la plaquette sanguine...... 91 2.1. Recrutement des patients et données cliniques...... 91 2.2. Dosage de la sérotonine intra plaquettaire...... 92 2.3. Étude de la densité et de l’affinité des SERT plaquettaires...... 92 2.3.1. Préparation des solutions de réaction ...... 92 2.3.2. Préparation des membranes plaquettaires...... 93 2.3.3. Dosage des protéines ...... 93 2.3.4. Études de la liaison du MADAM sur le SERT...... 94 3. Modèle animal : le rat exposé au VPA...... 95 3.1. Animaux et conditions d’élevage...... 95 3.2. Expérimentation animale...... 95 3.2.1. Schéma expérimental...... 95 3.2.2. Intoxication des rates au VPA ...... 96 3.2.3. Calendrier des expérimentations ...... 96 3.2.4. Sacrifices ...... 97 3.3. Étude comportementale ...... 98 3.3.1. Suivi du développement ...... 98 3.3.2. Tests explorant le développement moteur...... 99 3.3.3. Test explorant la réponse à une stimulation tactile...... 101 3.3.4. Tests explorant le comportement social ...... 101 3.3.5. Test explorant l’apprentissage, le repérage et la capacité d’adaptation : la piscine de Morris ...... 104 3.4. Dosage des monoamines...... 106 3.4.1. Préparation des cerveaux destinés au dosage des monoamines ...... 106

9 3.4.2. Dosage des monoamines cérébrales ...... 106 3.4.3. Dosage de la sérotonine intra plaquettaire...... 107 3.5. Étude de la densité de SERT ...... 108 3.5.1. Étude de la densité de SERT in vitro ...... 108 3.5.2. Étude de la densité de SERT ex vivo ...... 110 3.6. Statistiques ...... 111 Quatrième partie : Résultats ...... 112 1. Outils d’exploration in vitro/ex vivo du SERT ...... 113 1.1. Radiomarquage du [ 3H]-MADAM...... 113 1.2. Radiomarquage de l’[ 125 I]-ADAM ...... 115 2. Modèle périphérique humain : la plaquette sanguine...... 117 2.1. Dosage de la sérotonine intra plaquettaire...... 117 2.2. Étude de la densité et de l’affinité des SERT plaquettaires...... 118 2.2.1. Étude de la liaison du MADAM sur le SERT ...... 118 2.2.2. Transformation de Scatchard...... 119 2.2.3. Comparaison de la constante de dissociation Kd ...... 119 2.2.4. Comparaison du nombre de sites de liaison Bmax...... 120 3. Modèle animal : le rat exposé au VPA...... 122 3.1. Expérimentation animale...... 122 3.1.1. Effectif...... 122 3.1.2. Effet de l’intoxication au VPA ...... 123 3.2. Étude comportementale ...... 123 3.2.1. Suivi du développement ...... 123 3.2.2. Tests explorant le développement moteur...... 126 3.2.3. Test explorant la réponse à une stimulation tactile...... 129 3.2.4. Tests explorant le comportement social ...... 129 3.2.5. Test explorant l’apprentissage, le repérage et la capacité d’adaptation : la piscine de Morris ...... 133 3.3. Dosage des monoamines...... 134 3.3.1. Poids des cerveaux ...... 134 3.3.2. Dosage des monoamines cérébrales ...... 135 3.3.3. Dosage de la sérotonine intra plaquettaire...... 137 3.4. Étude de la densité de SERT ...... 139 3.4.1. Étude de la densité de SERT in vitro ...... 139

10 3.4.2. Étude de la densité de SERT ex vivo ...... 140 Cinquième partie : Discussion et Perspectives...... 143 Conclusion...... 152 Bibliographie...... 154 Annexes...... 180 Production scientifique en rapport avec les travaux de thèse ...... 219

11 Liste des tableaux

Tableau 1 : Subdivision des noyaux sérotoninergiques dans le cerveau...... 42 Tableau 2 : Comparaison des caractéristiques cliniques présentes chez les enfants avec autisme exposés à différents tératogènes : acide valproïque, éthanol, thalidomide et misoprostol...... 52 Tableau 3 : Caractéristiques physiques, comportementales et neuropathologiques communes observées dans différents modèles animaux d’expositions prénatales à des tératogènes...... 80 Tableau 4 : Calendrier des tests comportementaux et neurochimiques...... 97 Tableau 5 : Tableau récapitulatif des coupes cérébrales selon le point bregma...... 109 Tableau 6 : Tableau récapitulatif des coupes cérébrales selon le point bregma...... 110 Tableau 7 : Récapitulatif des effectifs ...... 122 Tableau 8 : Poids des cerveaux entiers...... 134

12 Liste des figures

Figure 1 : Formule développée de la sérotonine...... 21 Figure 2 : Synthèse de la sérotonine à partir du tryptophane ...... 22 Figure 3 : Emplacement des structures limbiques...... 28

Figure 4 : Les récepteurs 5-HT 1, 5-HT 2 et 5-HT 3...... 31 Figure 5 : Schéma du chromosome 17...... 32 Figure 6 : Gène du transporteur de la sérotonine...... 32 Figure 7 : Structure du transporteur de la sérotonine ...... 33 Figure 8 : Fonctionnement du SERT...... 34 Figure 9 : Voies sérotoninergiques centrales...... 41 Figure 10 : La synapse sérotoninergique...... 43 Figure 11 : Acide valproïque (VPA) ...... 53 Figure 12 : La synapse GABAergique ...... 54 Figure 13 : Syndrome fœtal du valproate - Anomalies faciales ...... 55 Figure 14 : Formule développée de l’éthanol...... 56 Figure 15 : Syndrome d’alcoolisme fœtal - Anomalies faciales ...... 56 Figure 16 : Formule développée de la thalidomide ...... 57 Figure 17 : Formule développée du misoprostol...... 58 Figure 18 : Formule développée du MADAM ...... 74 Figure 19 : Formule développée de l’ADAM ...... 76 Figure 20 : Période d’expositions aux tératogènes pouvant entrainer des cas d’autisme.... 81 Figure 21 : Raton de 10 jours, au cours du test de démarche...... 99 Figure 22 : Ratons de 12 jours, au cours du test de géotaxie négative à 20° ...... 100 Figure 23 : Ratons de 12 jours, au cours du test de géotaxie négative à 45° ...... 100 Figure 24 : Raton de 24 jours, au cours du test du tonus...... 101 Figure 25 : Dispositif pour le test de sociabilité à l’égard d’un rat inconnu ...... 102 Figure 26 : Test de la piscine de Morris ...... 104 Figure 27 : Chromatogrammes du radiomarquage (détection radioactive) et du contrôle (détection radioactive et UV) de l'[ 3H]-MADAM...... 114 Figure 28 : Chromatogramme du radiomarquage de l'[ 125 I]-ADAM ...... 115

13 Figure 29 : Chromatogramme du contrôle de pureté du [ 125 I]-ADAM (Détection radioactive) ...... 116 Figure 30 : Chromatogramme du contrôle de pureté du [ 125 I]-ADAM (Détection UV) ... 116 Figure 31 : Comparaison du taux de sérotonine intra plaquettaire...... 117 Figure 32 : Courbes de saturation de la liaison du MADAM sur le SERT...... 118 Figure 33 : Transformation de Scatchard de la liaison du MADAM sur le SERT...... 119 Figure 34 : Comparaison de la constante de dissociation Kd...... 120 Figure 35 : Comparaison du nombre de sites de liaison Bmax ...... 121 Figure 36 : Malformation auriculaire chez un rat du groupe VPA...... 123 Figure 37 : Évolution du poids des rates gestantes...... 124 Figure 38 : Évolution du poids des ratons mâles...... 125 Figure 39 : 1 ère partie du test de la démarche...... 126 Figure 40 : 2 ème partie du test de la démarche...... 127 Figure 41 : 1 ère partie du test de géotaxie négative...... 128 Figure 42 : 2 ème partie du test de géotaxie négative...... 128 Figure 43 : Sociabilité vis-à-vis d’un rat inconnu...... 131 Figure 44 : Sociabilité vis-à-vis d’un rat inconnu et un rat connu...... 132 Figure 45 : Nombre de changements de compartiment lors du test de sociabilité...... 132 Figure 46 : Trois premières étapes du test de la piscine de Morris...... 134 Figure 47 : Chromatogramme du dosage HPLC des monoamines cérébrales ...... 135 Figure 48 : Comparaison des concentrations en sérotonine ...... 136 Figure 49 : Comparaison des concentrations en 5-HIAA...... 136 Figure 50 : Comparaison des concentrations en noradrénaline...... 137 Figure 51 : Chromatogramme du dosage HPLC de la sérotonine plaquettaire...... 138 Figure 52 : Dosage de la sérotonine intra plaquettaire...... 138 Figure 53 : Autoradiographies au [ 3H]-MADAM...... 139 Figure 54 : Densités cérébrales des SERT in vitro ...... 140 Figure 55 : Autoradiographie au [ 125 I]-ADAM ...... 141 Figure 56 : Densités cérébrales des SERT ex vivo ...... 142

14 Liste des annexes

Annexe 1 : Critères diagnostiques du trouble autistique (DSM-IV, 1994) ...... 181 Annexe 2 : Liste des Inhibiteurs de la Recapture de la Sérotonine ...... 182 Annexe 3 : Critères du diagnostic différentiel de l’autisme et des autres Troubles Envahissants du Développement (TED)...... 183 Annexe 4 : Article de revue publié dans Neuroscience & Biobehavioral Reviews ...... 184 Annexe 5 : Article publié dans Neuroscience Letters ...... 214

15 Introduction

16 Introduction

L’autisme est un trouble envahissant du développement se manifestant dès les premières années de vie (Landa et al., 2007). Il est caractérisé par une altération des relations sociales, un déficit de la communication, des attitudes stéréotypées avec un répertoire restreint d’activités et d’intérêts (critères diagnostiques du trouble autistique du DSM IV, A.PA., 1994 (annexe 1)). Le terme d’autisme est souvent employé pour désigner l’autisme infantile décrit par Kanner (1943), mais ce terme recouvre un continuum d’entités qui peut être désigné par le terme de « troubles du spectre autistique » ou « autism spectrum disorders » (ASD) comprenant l’autisme infantile, les troubles envahissants du développement non spécifiés et le syndrome d’Asperger. L’autisme est une maladie complexe qui implique des facteurs génétiques, épigénétiques et environnementaux (Persico et Bourgeron, 2006). L’analyse des cas d’autisme associés à des expositions prénatales à différentes substances, telles que l’acide valproïque (VPA) ou l’alcool, permet de proposer l’hypothèse que ces cas d’autisme pourraient être dus à des perturbations très précoces au cours de l’embryogénèse (Dufour-Rainfray et al., 2011 (Article de revue publié dans Neuroscience & Biobehavioral Reviews, annexe 4); Ploeger et al., 2010).

Actuellement le diagnostic de l’autisme est basé sur des critères cliniques uniquement. Or ce diagnostic est rendu difficile en raison de l’hétérogénéité clinique de la maladie. Il serait utile de disposer de marqueurs de la pathogénèse de l’autisme dans le triple but d’améliorer la compréhension de la physiopathologie de la maladie, de compléter les arguments cliniques pour établir le diagnostic et de proposer des voies de recherche thérapeutique ou préventive.

Dans ce but, nous avons étudié le système sérotoninergique. En effet, le système sérotoninergique jouant un rôle dans la régulation des comportements et des processus psychologiques tels que l’humeur, l’anxiété, l’agressivité, le sommeil, les interactions sociales, il a été très tôt envisagé qu’il soit impliqué dans la pathologie autistique. Dès 1961, une équipe a montré une augmentation des taux sanguins de sérotonine chez 30% des sujets autistes (Schain et Freedman, 1961). Il a également été montré que la diminution des taux centraux de sérotonine chez les patients autistes ayant suivi des régimes abaissant les taux de tryptophane, acide aminé précurseur de la synthèse de sérotonine, entraîne une

17 aggravation des symptômes autistiques (McDougle et al., 1996). De plus, une diminution de la synthèse corticale de sérotonine a été montrée chez des enfants autistes (Chandana et al., 2005 ; Chugani et al., 1997 ; 1999). L’altération du système sérotoninergique semble également impliquer le transporteur de la sérotonine (SERT), principal acteur de la régulation des taux extracellulaires de sérotonine. En effet, il a été rapporté une diminution de la densité des SERT au niveau du cortex frontal médian chez des enfants autistes (Makkonen et al., 2008). Enfin, l’utilisation de médicaments inhibant ces SERT chez des patients autistes améliore certains symptômes tels que l’agressivité et les comportements répétés (Cook et Edwin, 1996).

Notre hypothèse est que certains cas d’autisme pourraient être dus à une perturbation précoce au cours de l’embryogénèse entrainant des modifications à long terme notamment du système sérotoninergique, et que certaines modifications de ce système pourraient être des marqueurs potentiels de l’autisme. Pour tester cette hypothèse, nous avons eu recours à deux modèles d'étude.

Le premier modèle est la plaquette sanguine humaine. En effet, les plaquettes sanguines possèdent dans leurs membranes des SERT, de structure identique aux SERT centraux, qui leur permettent de stocker de la sérotonine. L’objectif de l'étude sur ce premier modèle était d’analyser les taux de sérotonine intra plaquettaires ainsi que la densité et l’affinité des SERT dans la pathologie autistique. Ces marqueurs ont l’avantage d’être accessibles car périphériques, cependant, ils ne rendent pas directement compte des altérations centrales. C’est pourquoi nous avons également étudié plusieurs marqueurs centraux en utilisant un modèle animal.

Ce modèle consiste en une exposition prénatale au VPA chez le rat. En effet, l’augmentation de l’incidence de l’autisme chez les enfants exposés au VPA pendant la grossesse a conduit à créer un modèle animal par exposition de rats au VPA avant la fermeture du tube neural (9 ème jour de gestation). Nous avons étudié dans ce modèle certains aspects du système sérotoninergique (taux de sérotonine et quantification des SERT) au niveau central. Des études comportementales ont été menées en parallèle afin de valider le modèle et de corréler les modifications comportementales aux modifications neurochimiques. L'objectif de l'étude sur ce modèle animal est d’étudier des marqueurs centraux permettant d’ouvrir des perspectives d’explorations des systèmes

18 sérotoninergiques centraux chez l’homme notamment par imagerie moléculaire scintigraphique à l’aide de ligands spécifiques de ces marqueurs.

La première partie de ce manuscrit décrit l’intérêt d'étudier la neurotransmission sérotoninergique dans l’autisme ainsi que les outils d’exploration et les modèles d’étude de l’autisme. Après avoir énoncé les hypothèses de recherche, nous présentons ensuite, dans la deuxième partie de ce manuscrit, les matériels et méthodes ainsi que les résultats de notre travail expérimental. Enfin, nous terminons ce manuscrit par une discussion générale permettant d’interpréter les résultats obtenus et de proposer des perspectives.

19 Première partie : Données générales et état de la question

20 1. Système sérotoninergique et autisme

1.1. Le système sérotoninergique

1.1.1. La sérotonine

1.1.1.1. Structure

La sérotonine ou 5-hydroxytryptamine est un neurotransmetteur, faisant partie de la famille des monoamines.

La sérotonine a une structure indolique de type aminé (monoamine) :

NH2

HO

N

H

Figure 1 : Formule développée de la sérotonine

1.1.1.2. Synthèse

La synthèse de la sérotonine est réalisée au niveau périphérique dans les cellules chromaffines de l’intestin. Au niveau central, elle est synthétisée dans les neurones sérotoninergiques. Les études ont longtemps montré que la sérotonine ne passait pas la barrière hémato-encéphalique. Cependant Nakatani et collaborateurs (2008) ont mis en évidence, chez le rat, la présence de transporteurs de la sérotonine (SERT) dans les

21 membranes des cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique permettant l’efflux de sérotonine du cerveau vers la circulation sanguine.

La sérotonine est synthétisée à partir d’un acide aminé essentiel : le tryptophane. Le cycle aromatique de celui-ci est hydroxylé en 5-hydroxy-tryptophane par une enzyme : la tryptophane hydroxylase (TPH). Ensuite, la fonction carboxyle de l’acide aminé est décarboxylée par la L-acide aromatique décarboxylase (AADC) couplée à son co-facteur (la vitamine B6 ou phosphate de pyridoxal) donnant la sérotonine (Meunier et Shvaloff, 1992).

TPH tryptophane 5-hydroxytryptophane

AADC

sérotonine

Figure 2 : Synthèse de la sérotonine à partir du tryptophane

L’hydroxylation du tryptophane nécessite la présence d’oxygène O 2 et la réduction d’un co-facteur : la tétrahydrobioptérine BH 4. Cette hydroxylation est l’étape limitante de la synthèse de la sérotonine. De même, le taux de tryptophane est un facteur limitant de la synthèse, cependant la faible concentration cérébrale du tryptophane (10 à 30 µM) ne peut parvenir à saturer l’hydroxylase dont le Km est de 50 µM (Km représente la concentration

22 en substrat pour laquelle l’enzyme est à demi saturée). En revanche, une augmentation de l’apport alimentaire de tryptophane entraîne une augmentation de la synthèse de sérotonine et réciproquement une carence d’apport de tryptophane entraîne une diminution de la synthèse de sérotonine.

1.1.1.3. Distribution

La sérotonine est retrouvée au niveau du système nerveux central (SNC), cette fraction ne représente que 2% du taux de sérotonine totale. Elle est également retrouvée au niveau périphérique dans les plaquettes sanguines (8% du taux de sérotonine totale), le sang circulant (très faible fraction) et dans l’intestin (90% du taux de sérotonine totale).

Au niveau périphérique, la sérotonine n’est synthétisée que par les cellules chromaffines de l’intestin. Les plaquettes n’ont pas la capacité de la synthétiser, elles captent la sérotonine dans le sang circulant et la stockent.

1.1.1.4. Stockage

Après sa synthèse, la sérotonine est stockée dans des vésicules à l’intérieur desquelles elle est captée grâce à des transporteurs de la famille des « Vesicular Monoamine Transporters » VMATs ou Transporteurs Vésiculaires des Monoamines.

Les VMATs permettent l’entrée dans la vésicule d’une molécule de sérotonine contre la sortie vers le cytosol d’un proton grâce à des pompes à protons ATPase dépendantes.

Les plaquettes sanguines stockent également la sérotonine à l’intérieur de vésicules grâce aux VMATs (Mercado et Kilic, 2010).

23 1.1.1.5. Libération

Au niveau central, la dépolarisation du neurone présynaptique (entrée de Ca 2+ ) entraîne la fusion des vésicules de stockage avec la membrane, libérant la sérotonine dans l’espace synaptique.

La libération de la sérotonine est contrôlée par des auto-récepteurs :

- les récepteurs 5-HT 1A situés principalement au niveau des corps cellulaires des neurones dans les noyaux du Raphé,

- les récepteurs 5-HT 1D situés à l’extrémité terminale du neurone et dans les noyaux du Raphé.

Ces auto-récepteurs sont couplés à l’adénylate cyclase (AC) par l’intermédiaire de protéines Gi (protéines liant le GTP inhibant l’AC). L’activation de ces auto-récepteurs diminue la synthèse d’AMPc à partir d’ATP par l’AC, ce qui diminue l’excitabilité neuronale et ainsi diminue la libération de sérotonine.

De plus, d’autres neurotransmetteurs que la sérotonine interviennent dans la libération de celle-ci : il existe au niveau des extrémités terminales des neurones sérotoninergiques, des récepteurs spécifiques d’autres neurotransmetteurs (récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine, récepteurs α2A adrénergiques, récepteurs histaminiques H 3).

1.1.1.6. Inactivation

Une fois libérée, la sérotonine se fixe sur des récepteurs spécifiques, responsables de ses effets physiologiques. Cette action est limitée dans le temps et en intensité par deux processus d'inactivation qui permettent de réguler la concentration en sérotonine dans le milieu extracellulaire : la recapture du neurotransmetteur au niveau intracellulaire et le catabolisme enzymatique.

24 Recapture

La recapture est assurée par des transporteurs appartenant à la famille des canaux Na +/Cl - : les transporteurs de la sérotonine (SERT). Leur fonctionnement est décrit dans le chapitre 1.1.3 dédié aux SERT.

Catabolisme enzymatique

La voie principale du catabolisme de la sérotonine consiste en une oxydation de la fonction amine par une Monoamine Oxydase A (MAO-A) conduisant à la 5-hydroxyindole acétaldéhyde, suivie d’une acidification par l’aldéhyde déshydrogénase en acide 5- hydroxyindole acétique (5-HIAA). La MAO-A joue donc un rôle important dans la régulation des taux de sérotonine.

Dans la glande pinéale, la sérotonine est métabolisée en mélatonine par la sérotonine acétylase.

1.1.1.7. Rôles de la sérotonine

• Rôles au niveau périphérique

Au niveau périphérique, selon les récepteurs avec lesquels la sérotonine se lie, elle participe à la motilité des vaisseaux, des muscles lisses, et à l’agrégation plaquettaire.

Action cardio-vasculaire

- Vaisseaux sanguins : selon l’état vasculaire et la dose, la sérotonine provoque une vasoconstriction via les récepteurs 5-HT 2, ou une vasodilatation. Elle a une action pro- agrégante plaquettaire (pouvant favoriser les thromboses veineuses), et augmente la perméabilité capillaire. La sérotonine influence donc la tension artérielle.

25 - Coeur : la sérotonine a un effet chronotrope positif (accélère le rythme cardiaque) via les récepteurs 5-HT 4, et un effet inotrope négatif (diminue la contractilité des fibres musculaires cardiaques).

Action sur les muscles lisses

- Tube digestif : la sérotonine augmente la motilité intestinale via les récepteurs 5-HT 3 et

5-HT 4. Cette action explique les diarrhées observées dans les tumeurs carcinoïdes sécrétrices de sérotonine, et l’action anti-émétisante des antagonistes des récepteurs 5-HT 3.

- Bronches : la sérotonine a une action bronchoconstrictrice.

- Utérus : la sérotonine provoque des contractions utérines.

• Rôles au niveau central

Au niveau central, la sérotonine joue un rôle physiologique complexe dans le fonctionnement cérébral : elle intervient comme neurotransmetteur et neuromodulateur (Moll et al., 2000). Elle participe ainsi à la régulation des comportements, des stimulations sensorielles, de l’humeur (action antidépressive), des fonctions cognitives, ainsi que des comportements alimentaires, de l’agressivité et du sommeil.

Implication dans la régulation des comportements, des stimulations sensorielles, de l’humeur, des fonctions cognitives

Le système limbique reçoit de nombreuses projections de neurones sérotoninergiques, or ce système est le siège de la régulation des expressions émotionnelles, des comportements sociaux (Anderson, 2002).

En effet, le système limbique est constitué du gyrus cingulaire (recouvrant le corps calleux), de l’hippocampe, du cortex para-hippocampique, de l’amygdale, du faisceau mammillo-thalamique et du thalamus antérieur. Toutes ces structures reçoivent les

26 informations des systèmes sensoriels (cortex préfrontal, cortex associatif sensoriel), et sont en connexion avec l’hypothalamus d’où naissent les comportements.

L’amygdale est également liée aux lobes frontaux (en avant de la scissure centrale de Rolando). Ceux-ci englobent le cortex moteur (qui contrôle les mouvements fins), le cortex pré-moteur (qui participe à la sélection des séquences nécessaires à l’élaboration d’un mouvement), et le cortex préfrontal (qui adapte le mouvement en fonction du contexte). La sérotonine participe ainsi également à l’adaptation et le contrôle du comportement en fonction des informations sensorielles reçues.

Implication dans la régulation des comportements alimentaires

L’augmentation des taux de sérotonine s’accompagne d’une sensation de satiété, avec diminution de la prise alimentaire surtout glucidique. C’est pourquoi, les inhibiteurs de la recapture de la sérotonine tels que la dexfenfluramine (énantiomère D de la fenfluramine) ont une action anorexigène (la desfenfluramine et la fenfluramine ont été retirées du marché à cause de leurs effets indésirables (hypertension artérielle pulmonaire)).

27 A- Corps calleux

B- Voie olfactive

C- Corps mamillaires

D- Fornix

E- Thalamus antérieur

F- Amygdale

G- Hippocampe

H- Cortex parahippocampique

I- Gyrus cingulaire J- Noyaux hypothalamiques

Figure 3 : Emplacement des structures limbiques

1.1.2. Les récepteurs de la sérotonine

Sept types de récepteurs de la sérotonine sont actuellement connus (de 5-HT 1 à 5-HT 7) avec plusieurs sous-types, permettant de conférer des actions spécifiques à la sérotonine selon la cible cellulaire. La majorité des récepteurs de la sérotonine sont couplés à des protéines G (activatrices ou inhibitrices). Ils sont constitués de sept domaines transmembranaires réunis par des boucles intra et extracellulaires, une boucle intracellulaire permet le couplage avec la protéine G. Le récepteur de type 3 est un récepteur canal ionique.

Les récepteurs principaux sont :

28 1.1.2.1. 5-HT 1

Les récepteurs de type 5-HT 1 ont une très forte affinité pour la sérotonine. La fixation de la sérotonine modifie la configuration spatiale du récepteur, ce qui active une protéine G.

• 5-HT 1A

Ces récepteurs sont retrouvés essentiellement en position post-synaptique dans le cortex, le striatum, l’hippocampe et l’amygdale. Ils sont aussi présents au niveau pré-synaptique dans les corps cellulaires des noyaux du Raphé. Ils participent alors à la modulation de la libération de la sérotonine avec les récepteurs 5-HT 1D . Les récepteurs 5-HT 1A sont également localisés sur les corps cellulaires de neurones non sérotoninergiques, tels que les neurones utilisant la dopamine ou l’acide gamma-aminobutyrique (GABA) comme neurotransmetteur, modifiant leurs fonctions.

Au niveau périphérique, ces récepteurs interviennent dans la régulation de la motilité des muscles lisses.

Ils sont couplés négativement à l’adénylate cyclase (AC) par l’intermédiaire d’une protéine Gi. L’activation de ces récepteurs diminue la synthèse d’AMPc à partir d’ATP par l’AC ce qui entraîne une hyperpolarisation (par entrée de K+) et ainsi diminue la libération de sérotonine : rétrocontrôle négatif.

Les récepteurs couplés aux protéines G comme les 5-HT 1 et 5-HT 2 ont un temps de réaction lent dû aux intermédiaires impliqués. Le signal n'engendre pas directement de potentiel d'action mais modifie la polarisation, la sérotonine agit comme neuromodulateur.

• 5-HT 1D

Ces récepteurs sont retrouvés en position pré (auto-récepteur) et post-synaptique dans le ganglion basal, l’hippocampe, le cortex frontal et les noyaux du Raphé.

29 L’activation de ces récepteurs diminue également la libération de sérotonine par couplage négatif à l’AC. Les agonistes de ces récepteurs ont une action anti-migraineuse par un effet vasoconstricteur des artères cérébrales et blocage de la nociception cérébrale : c’est le cas du sumatriptan (ex : Imigrane®).

1.1.2.2. 5-HT 2

Les récepteurs de type 5-HT 2 ont une affinité moins grande pour la sérotonine que les 5-

HT 1. La fixation de la sérotonine modifie également la configuration spatiale du récepteur, ce qui active une protéine G inhibitrice par l’intermédiaire d’une phospholipase C. Celle-ci provoque la fermeture d’un canal potassique et donc l’accumulation intracellulaire de potassium ce qui a pour effet de dépolariser la membrane. Ainsi le seuil d’excitabilité est plus bas, le récepteur joue un rôle excitateur.

Ces récepteurs sont retrouvés au niveau périphérique et au niveau central en position post- synaptique dans le cortex, l’hippocampe et le ganglion basal.

Ils interviennent dans la régulation de la motilité des muscles lisses vasculaires et non vasculaires (utérus, iléon, trachée), et dans l’agrégation plaquettaire.

Les antagonistes des récepteurs 5-HT 2 appartiennent à la famille des antipsychotiques : c’est le cas de la rispéridone (ex : Risperdal ) indiquée dans le traitement des schizophrénies, des accès maniques et de l’agressivité.

1.1.2.3. 5-HT 3

Ces récepteurs sont des récepteurs canaux Na +/K +. Ils sont couplés positivement à l’adénylate cyclase (AC) par l’intermédiaire d’une protéine G activatrice. La fixation de la sérotonine permet l’ouverture du canal et l’entrée d’ions sodium. Ces ions positifs

30 dépolarisent la membrane. Ainsi le seuil d’excitabilité est plus bas, le récepteur joue un rôle excitateur.

Les récepteurs 5-HT 3 sont situés au niveau périphérique et central.

Les antagonistes de ces récepteurs ont une action anti-émétique : c’est le cas de l’ondansétron (Zophren  par exemple), qui est utilisé pour limiter les vomissements induits par les chimiothérapies anticancéreuses.

Figure 4 : Les récepteurs 5-HT 1, 5-HT 2 et 5-HT 3. Adapté de : www.inrp.fr/biotic/neuro/drogues/html/serotonine.htm

1.1.3. Le transporteur de la sérotonine, SERT

1.1.3.1. Le gène codant pour le SERT

Un seul gène code pour les SERT centraux et périphériques. Ce gène SLC6A4 est localisé sur le chromosome 17 en position q11-1 q12. Il est organisé en 15 exons (deux exons étant épissés de manière alternative : exons 1A et 1B).

31

Figure 5 : Schéma du chromosome 17. Adapté de : www.genome.jp/DiseaseGenes/chrom17.html.

Figure 6 : Gène du transporteur de la sérotonine (Bradley et Blakely, 1997)

Deux polymorphismes fonctionnels sont actuellement connus pour ce gène, ils affectent son expression. Ils sont constitués par une répétition variable de tandems (VNTR : Variable Number of Tandem Repeats) :

- Un polymorphisme dans le promoteur a été mis en évidence. Il possède 2 allèles : un allèle court (short « s ») constitué de 14 répétitions d’une séquence de 20-23 paires de

32 bases, et un allèle long (long « l ») constitué de 16 répétitions qui est associé à une transcription supérieure du gène du SERT.

- Un polymorphisme situé sur l’intron 2 est constitué par 9, 10 ou 12 répétitions d’une séquence de 17 paires de bases. L’allèle contenant 12 répétitions est associé à une transcription supérieure du gène du SERT.

1.1.3.2. Structure du SERT

Les SERT sont des molécules enchâssées dans la membrane plasmique, possédant 12 domaines transmembranaires hydrophobes avec une boucle extracellulaire hydrophile entre les domaines 3 et 4, les terminaisons NH 2 et COOH sont intracellulaires (Blakely et al., 1997). Ils possèdent 630 acides aminés, avec une masse de 68 kD. Les études en microscopie électronique à l’aide d’anticorps anti-SERT, montrent la présence de SERT sur les axones et les dendrites des neurones.

Milieu extracellulaire

Membrane cytoplasmique

Milieu intracellulaire

Figure 7 : Structure du transporteur de la sérotonine (Adapté de Grant, 2006) P : sites de phosphorylation ; Y : sites de glycosylation

Le SERT est la cible des antidépresseurs appartenant à la classe des Inhibiteurs Sélectifs de la Recapture de la Sérotonine (ISRS) comme la fluoxétine (ex : Prozac® ; liste des Inhibiteurs de la Recapture de la Sérotonine IRS, annexe 2). Les ISRS se lient aux SERT diminuant la recapture de la sérotonine.

33 1.1.3.3. Fonctionnement du SERT

Les SERT assurent la recapture de la sérotonine de l’espace extracellulaire vers l’espace intracellulaire. Ils appartiennent à la famille des « Solute Carrier (SLC) » et à la sous- famille 6A4. Ce sont des canaux Na +/Cl -, réalisant un co-transport de la sérotonine sous sa forme cationique 5-HT +, accompagnée d’ions Na + et Cl - vers l’espace intracellulaire tandis qu’un ion K + est transporté en sens inverse vers l’espace extracellulaire. Le maintien du gradient de concentration ionique est assuré par une ATPase Na +/K + dépendante (Blakely et al., 1997). C’est un transport saturable qui possède une grande affinité pour la sérotonine.

Figure 8 : Fonctionnement du SERT Adapté de www.cnsforum.com

34 1.1.3.4. Cinétique du transport

Le transport de la sérotonine à travers les membranes cellulaires par le SERT suit une cinétique de Michaelis et Menten. Celle-ci est décrite par la vitesse maximale de recapture (Vmax) des SERT, et la constante de Michaelis (Km). Le rapport de ces deux paramètres (Vmax / Km) traduit l’efficacité du transport. La concentration cellulaire en sérotonine dépend ainsi de ces paramètres cinétiques.

1.1.3.5. Régulation du taux de recapture

Les taux de recapture de la sérotonine sont essentiellement régulés par :

• les gradients ioniques locaux Le transport de la sérotonine étant ion-dépendant, une variation du gradient ionique influence la recapture de la sérotonine, sans modification structurale du SERT. L’entrée de la sérotonine ionisée 5-HT + en intracellulaire s’accompagne d’un contre-transport de K + qui facilite le changement conformationnel permettant la réexposition du site de fixation de la sérotonine. Ainsi, une diminution du taux intracellulaire de K + entraîne une diminution apparente de la constante d’affinité de la sérotonine pour le SERT.

• les taux extracellulaires de sérotonine Dans les neurones et les cellules gliales, les taux extracellulaires de sérotonine induisent une diminution de la densité de SERT dans les membranes limitant ainsi leur disponibilité synaptique (Blakely et al., 1998 ; Ramamoorthy et Blakely, 1999). De manière plus précise sur la plaquette sanguine, Mercado et Kilic (2010) ont montré que la relation entre les taux extracellulaires de sérotonine et la densité de SERT était biphasique : l’augmentation des taux extracellulaires de sérotonine entraîne, dans une première phase, l’augmentation de la

35 densité de SERT dans les membranes, puis, dans une seconde phase, une diminution de la densité.

• des phosphorylations

Les SERT ont des sites de phosphorylation dont la plupart sont situés aux extrémités NH 2 et COOH terminales intracellulaires. La phosphorylation, notamment par la protéine kinase C (PKC), provoque l’internalisation de SERT d’où une diminution des transporteurs au niveau de la membrane plasmique qui se traduit par une diminution du taux de recapture (Blakely et al., 1997 et 1998 ; Ramamoorthy et al., 2010). Cette régulation à court terme par la PKC semble être identique dans le cerveau et les plaquettes sanguines (Anderson et al., 1992).

1.1.3.6. Distribution des SERT

••• Au niveau périphérique Les SERT sont situés dans de nombreuses structures (Blakely et al., 1994 ; Faraj et al., 1994) :

- les membranes des plaquettes sanguines permettant notamment de stocker et libérer la sérotonine nécessaire à l’agrégation plaquettaire,

- les membranes des lymphocytes,

- les cellules de l’épithélium intestinales où ils permettent le contrôle des concentrations de sérotonine intervenant dans la motilité vasculaire, gastro-intestinale,

- les cellules de l’endothélial pulmonaire où ils permettent la régulation de la tension pulmonaire,

- les cellules de la bordure en brosse du placenta permettant le transport de la sérotonine de la circulation sanguine maternelle vers le fœtus,

- les cellules chromaffines des glandes surrénales,

36 - les cellules folliculaires de la thyroïde.

••• Au niveau central La distribution des SERT suit celle des neurones sérotoninergiques. Ces transporteurs sont situés le long des projections axonales et dendritiques, aux extrémités terminales et au niveau des corps cellulaires des neurones sérotoninergiques. Les régions cérébrales les plus riches en SERT sont : les noyaux du Raphé, l’hippocampe, l’amygdale, le thalamus, l’hypothalamus, la substance noire et le putamen. Par contre le cervelet est pauvre en SERT.

De plus, au cours du développement, des neurones non sérotoninergiques peuvent transitoirement posséder des SERT qui leurs permettent de capter et stocker la sérotonine. Ces neurones sont préférentiellement glutamatergiques et situés au niveau des aires sensitives thalamique et corticale. Le rôle de ce stockage est encore mal connu (Gaspar et al., 2003).

1.1.3.7. Variations physiologiques de la densité de SERT

••• Densité de SERT centraux

L’imagerie moléculaire par TEMP (Tomographie par émission mono-photonique) ou TEP (Tomographie par Émission de Positons) est un outil intéressant pour explorer les densités de SERT dans le cerveau de sujets vivants. Elle a notamment permis d’étudier les variations physiologiques de densité de SERT.

Effet de l’âge sur la densité de SERT centraux

Plusieurs études tendent à montrer que la densité de SERT diminue avec l’âge.

Ainsi, les études qui ont quantifié le nombre de site de liaison du SERT par imagerie TEMP et TEP dans le mésencéphale, observent une diminution linéaire comprise entre 2% (Kuikka et al., 2001) et 10,5% (Yamamoto et al., 2002) tous les 10 ans entre 20 et 80 ans.

37 Effet du genre sur la densité de SERT centraux

Une étude a mesuré les densités de SERT par imagerie TEMP dans le mésencéphale, elle ne met pas en évidence de différence entre les femmes et les hommes (Ryding et al., 2004).

••• Densité de SERT plaquettaires

Banovic et collaborateurs (2010) ont étudié les paramètres cinétiques des SERT plaquettaires sur 334 dons de sang. Ils montrent qu’il n’y a pas de variation de ces paramètres en fonction de l’âge (entre 20 et 70 ans), que ces paramètres semblent légèrement évoluer en fonction des saisons (augmentation de Vmax et Km en hiver), enfin, le Km semble légèrement plus bas chez les femmes que chez les hommes.

1.1.3.8. Modifications de la densité de SERT au cours de pathologies

Des modifications de la densité de SERT sont retrouvées dans plusieurs pathologies, notamment :

La dépression

Les ISRS sont efficaces dans les troubles dépressifs. Ces molécules inhibent la recapture de la sérotonine par les SERT, et augmentent ainsi les taux extracellulaires de sérotonine. L’augmentation des taux synaptiques de sérotonine aurait un effet anti-dépresseur. L’équipe de Leboyer a mis en évidence une augmentation des taux plaquettaires de sérotonine accompagnée d’une diminution de la densité plaquettaire des SERT chez les patients dépressifs (Leboyer et al., 1999b). L’équipe de Newport montre une altération des SERT plaquettaires dans les états dépressifs liés au postpartum (Newport et al., 2004). De plus, les études génétiques trouvent une association entre l’allèle « s » du polymorphisme du promoteur du gène SLC6A4 codant le SERT et la dépression. Cet allèle étant

38 responsable d’une expression plus faible du SERT que l’allèle « l », cette association peut expliquer la densité plus faible de SERT dans les troubles dépressifs (Rosenthal et al., 1998; Kunugi et al., 1997 ; Willeit et al., 2000).

Les Troubles Obsessionnels Compulsifs TOC

Les TOC sont améliorés par un traitement anti-dépresseur de la classe des Inhibiteurs de la Recapture de la Sérotonine (IRS) dont la cible est le SERT. C’est pourquoi le polymorphisme du promoteur du gène SLC6A4 codant le SERT a été étudié dans les TOC. L’équipe de Billett a analysé ce polymorphisme chez 72 patients atteints de TOC et 72 témoins, mais n’a pas trouvé d’association. Elle observe une légère augmentation des génotypes homozygotes « ss » ou « ll » dans le groupe patient (Billett et al., 1997).

La schizophrénie

Joyce et collaborateurs (1993) ont réalisé une étude par autoradiographie sur coupes de cerveaux humains en post-mortem en utilisant du [ 3H]-cyano-imipramine ([ 3H]CN-IMI) comme ligand des SERT. Il a montré une augmentation de la densité de SERT au niveau du striatum, et une diminution au niveau du cortex frontal et du gyrus cingulaire (constituant une partie du système limbique) chez les patients schizophrènes comparés aux témoins. Ces auteurs émettent l’hypothèse d’une altération du système sérotoninergique au niveau du système limbique chez les schizophrènes.

La maladie d’Alzheimer

L’équipe de Tejani-Butt a réalisé une étude par autoradiographie sur coupes de cerveaux humains en post-mortem en utilisant du [ 3H]-cyano-imipramine ([ 3H]CN-IMI) comme ligand des SERT (Tejani-Butt et al., 1995). Il a montré une diminution de la densité de SERT au niveau de l’hippocampe et des noyaux du Raphé.

39 L’épilepsie

L’équipe de Cupello a comparé les densités de SERT dans les membranes des plaquettes sanguines de patients épileptiques et de témoins. Elle n’observe pas de différence de densité ni d’affinité de la [ 3H]-paroxétine pour le SERT dans le groupe de patients épileptiques par rapport au groupe témoin. Par contre, cette équipe a trouvé une diminution de la densité des SERT de 25% dans le groupe de patients épileptiques ayant eu une crise d’épilepsie depuis moins de quatre jours, par rapport au groupe témoin. Les auteurs interprètent cette observation comme une adaptation du cerveau à contrôler l’excitabilité durant la crise d’épilepsie. La sérotonine, par fixation sur les récepteurs 5-HT 3 présents sur les interneurones GABAergiques du cortex cérébral et de l’hippocampe, abaisserait l’excitabilité neuronale. Ainsi, les ISRS auraient une action anticonvulsivante par augmentation de la sérotonine synaptique via la diminution de sa recapture par les SERT (Cupello et al., 2005).

L’autisme

L’étude du SERT dans la pathologie autistique fait l’objet du chapitre 1.3.3. consacré à l’étude du SERT dans l’autisme.

1.1.3.9. Les neurones sérotoninergiques

Les neurones sérotoninergiques ont un territoire de distribution très vaste.

Les corps cellulaires sont eux localisés au niveau du tronc cérébral (mésencéphale, bulbe et tronc). Ils sont regroupés en structures alignées sur le plan rostro-caudal formant les noyaux du Raphé, au nombre de neuf (B1 à B9).

Les principales voies sérotoninergiques centrales sont représentées sur la figure suivante :

40

Cortex

Thalamus

Groupe supérieur

Système limbique Cervelet

Groupe inférieur

Moelle épinière

Figure 9 : Voies sérotoninergiques centrales sur une représentation sagittale de cerveau humain (Adapté de www.cnsforum.com )

Deux groupes peuvent être distingués parmi ces neuf noyaux selon la projection des axones neuronaux :

Le groupe inférieur (B1 à B4), situé au niveau du bulbe, projette essentiellement vers la moelle épinière. Ces neurones se terminent dans la corne dorsale de la moelle : ils sont impliqués dans le contrôle des messages sensoriels et de la nociception, ils interviennent dans la régulation des activités motrices, du système autonome. De plus, il existe de nombreuses interconnections entre les différents noyaux sérotoninergiques et avec d’autres noyaux monoaminergiques intervenant également dans la régulation de ces fonctions physiologiques.

41

Le groupe supérieur (B5 à B9) est à l’origine des voies ascendantes. Les noyaux situés dans le pont se ramifient dans le tronc cérébral, le cervelet, et le système limbique (dont l’hippocampe, l’amygdale, le thalamus antérieur).

Les noyaux situés dans le mésencéphale se projettent dans les hémisphères cérébraux (Fitzgerald et Folan-Curran, 2003). Ainsi, le noyau du Raphé dorsal se projette dans le cortex frontal.

Groupe inférieur Groupe supérieur

B1 Noyau du Raphé pallidus B5 Noyau du Raphé pontique

B2 Noyau du Raphé obscurus B6 Noyau du Raphé caudal

B3 Noyau du Raphé magnus B7 Noyau du Raphé dorsal

B4 Substance grise périventriculaire B8 Noyau du Raphé médian et area postrema

B9 Noyau du Raphé segmental réticulaire

Tableau 1 : Subdivision des noyaux sérotoninergiques dans le cerveau (Adapté de Meunier et Shvaloff, 1992)

1.1.3.10. La synapse sérotoninergique

L’arrivée d’un potentiel d’action à l’extrémité terminale du neurone entraîne une dépolarisation s’accompagnant d’une entrée de calcium dans le neurone. Ce calcium provoque la libération de sérotonine à partir des vésicules de stockage. Une partie de la sérotonine libérée va se lier aux récepteurs spécifiques postsynaptiques permettant ainsi le transfert de l’information d’un neurone à l’autre, tandis qu’une autre partie va se lier aux autorécepteurs présynaptiques pour réguler la libération de sérotonine (rétrocontrôle

42 négatif). La sérotonine libérée dans la synapse est aussi recaptée par le neurone présynaptique grâce aux SERT.

Figure 10 : La synapse sérotoninergique Adapté de : www.chem.psu.edu/images/research/andrewsfig1.html.

1.1.4. Développement embryologique du système sérotoninergique

Le système sérotoninergique se met en place dés la 5 ème semaine de gestation chez l’humain, c’est l’un des plus précoces à se mettre en place. Le nombre de neurones sérotoninergiques augmente rapidement. A la 15 ème semaine de gestation, l’organisation des corps cellulaires en noyaux dénommés noyaux du Raphé, est visible (Whitaker- Azmitia, 2001). Les récepteurs et transporteurs de la sérotonine sont présents au 4 ème mois de la grossesse (ce qui correspond au 12 ème jour de gestation pour les modèles animaux de rat).

43 Une étude réalisée chez le rat par immuno-histochimie situe le début de la différenciation des cellules sérotoninergiques au 9 ème jour de gestation ce qui correspond aux 20 et 21 èmes jours chez l’humain. Les cellules migrent alors en direction caudale vers les noyaux du Raphé. L’expression de la sérotonine chez le rat débute au 12 ème jour de gestation (Miyazaki et al., 2005).

La sérotonine joue un rôle dans le développement de son propre système sérotoninergique : elle participe à la neuroformation et neuromaturation des tissus cibles (Moll et al., 2000).

Elle intervient dans la prolifération, la migration et la différenciation des cellules, la synaptogenèse, la formation des épines dendritiques, l’apoptose (Gaspar et al., 2003 ; Kahne al., 2002) :

1.1.4.1. Formation des terminaisons nerveuses

La formation des terminaisons nerveuses est sous l’influence entre autres de :

- facteurs de croissance comme par exemple le S-100β libéré par les cellules astrogliales (Whitaker-Azmitia, 2001 ; 2005),

- la sérotonine elle-même. Elle possède des actions activatrices et inhibitrices par un rétrocontrôle via les autorécepteurs 5-HT 1A et 5-HT 1D . Elle a un rôle de facteur de croissance et de régulateur de la différenciation neuronale. En effet, la sérotonine permet un rétrocontrôle négatif sur le développement de ses propres neurones.

Des taux anormalement élevés de sérotonine pendant le développement peuvent causer des pertes neuronales et des retards de maturation du cortex cérébral. Ce fait est vraisemblablement dû au rétrocontrôle négatif exercé par la sérotonine.

44 1.1.4.2. Synaptogenèse

Une étude a montré qu’une carence en sérotonine chez le rat du 10 ème au 20 ème jour post- natal entraîne une baisse de la densité synaptique au niveau de l’hippocampe (Mazer et al., 1997).

1.1.4.3. Formation des épines dendritiques

Un taux abaissé de sérotonine pendant le développement entraîne une diminution de la formation des épines dendritiques vraisemblablement par diminution de stimulation des récepteurs présynaptiques 5-HT 1A (Yan et al., 1997).

45 1.2. Le syndrome autistique

1.2.1. Historique

Le mot « autisme » vient du grec « autos » qui signifie soi-même, pour désigner la perte de contact avec la réalité, le repli sur soi observé dans la pathologie.

En 1943, Léo Kanner décrit l’autisme infantile comme un syndrome précoce caractérisé par des troubles du contact affectif (Kanner, 1943). Il s’agit d’une incapacité innée de constituer biologiquement une relation affective normale avec autrui (Messerschmitt et al., 1990). Selon Kanner, l’apparition de l’autisme est due à l’attitude et à la qualité des contacts des parents envers leurs enfants, cependant il n’exclut pas une part d’hérédité dans l’apparition de cette maladie.

En 1968 apparaît le terme « autisme » dans la seconde édition du manuel de diagnostic et de classification des troubles mentaux (Diagnostic and statistical manual of mental disorders DSM), classé comme une schizophrénie infantile.

Cette même année, Rutter propose de regrouper tous les symptômes caractérisant l’autisme en trois grandes catégories :

- manque d’intérêt à la socialisation,

- perturbation de la communication plutôt au niveau qualitatif que quantitatif,

- manque d’imagination : intérêts très limités ou comportements ritualisés.

Rutter spécifie également que les symptômes doivent apparaître avant l’âge de 3 ans (Rutter, 1968).

A la fin des années 70, Folstein et Rutter (1977) effectuent la première étude sur 21 paires de jumeaux et mettent en évidence une forte composante génétique dans l’étiologie de ce syndrome.

46 En 1980, dans la 3 ème édition du DSM apparaît la dénomination « autisme infantile » dans une nouvelle rubrique intitulée « Troubles Envahissants du Développement (TED) » ou « Pervasive developmental disorders (PDD) selon la terminologie anglaise.

En 1994, dans le DSM-IV (annexe 1), la rubrique TED comporte 5 pathologies :

- l’autisme,

- le syndrome de Rett,

- les troubles désintégratifs de l’enfance (syndrome de Heller) également appelés démence infantile ou psychose désintégrative,

- le syndrome d’Asperger,

- les troubles envahissants du développement non spécifiés (PDD-NOS).

1.2.2. Définition et approche clinique

L’autisme est une maladie neuro-développementale définie par des critères cliniques : une altération qualitative des interactions sociales, une altération qualitative de la communication verbale et non-verbale, un caractère restreint, répétitif et stéréotypé des comportements, des intérêts et des activités (DSM-IV, A.P.A., 1994).

Le diagnostic d’autisme est effectué selon des critères cliniques. Une grille établie par Volkmar et Pauls récapitule les critères permettant le diagnostic différentiel entre l’autisme et les autres TED (Volkmar et Pauls, 2003) (annexe 3).

C’est un syndrome hétérogène dans sa présentation et sa sévérité qui n’apparait pas comme une entité unique mais plutôt comme un continuum d’entités qui sont regroupées sous le terme de « troubles du spectre autistique » (Autism Spectrum Disorders (ASD)) comprenant le trouble autistique défini par Kanner, les troubles envahissants du développement non spécifiés et le syndrome d’Asperger.

47 Ainsi, dans l’autisme, le développement du langage peut varier de l’absence de langage à un langage grammaticalement complexe. L’intelligence varie du déficit sévère à une intelligence supérieure. Des défauts de compétence dans certains domaines coexistent avec des aptitudes dans d’autres (Rumsey et al., 2000). Les perceptions sensorielles (auditives, tactiles) peuvent également être perturbées.

Les traits dysmorphiques sont plus fréquents chez les patients avec autisme que chez les témoins ou les sujets sains apparentés à un sujet avec autisme. Ces traits dysmorphiques inclus des malformations des oreilles (rotation postérieure par exemple), des yeux (comme un hypertélorisme), du nez (un large pont nasal par exemple), du crâne (macrocéphalie), des membres (clinodactylie), de la peau (pigmentation) (Miles et al., 2008; Ozgen et al., 2011; Rodier et al., 1997a; Tripi et al., 2008). Aucun de ces traits dysmorphiques ne sont spécifiques de l’autisme, cependant, ils sont intéressants parce qu’ils peuvent être le témoin d’un processus étiologique particulier et de la période pendant laquelle le processus pathologique a eu lieu.

1.2.3. Épidémiologie du syndrome autistique

La prévalence des ASD est estimée à 60-70 pour 10 000 personnes, dont 20 cas de trouble autistique pour 10 000 personnes (Fombonne, 2009). Cette prévalence a tendance à augmenter depuis plusieurs années en raison d’un meilleur diagnostic et de l’affinement de la définition de l’autisme.

L’autisme touche davantage les garçons que les filles avec un sex-ratio de 4 garçons pour 1 fille (Fombonne, 2005). Il est intéressant de noter que si les filles sont moins souvent atteintes que les garçons, lorsqu’elles sont atteintes, elles présentent souvent une déficience mentale plus importante (Lenoir et Bodier, 2000).

48 1.2.4. Pathologies associées

L’autisme est fréquemment associé à d’autres pathologies (Bauman, 2010) :

- un retard mental, dans 70 % des cas,

- de l’épilepsie présente chez 30 % des autistes,

- des pathologies génétiques (sclérose tubéreuse de Bourneville, syndrome de l’X fragile, neurofibromatoses de type 1 ...),

- des maladies neurologiques (encéphalopathies d'origines variées ; maladies de surcharge (acides gras ou acides aminés organiques)).

1.2.5. Aspects génétiques de l’autisme

L’implication de facteurs génétiques prédisposant à l’autisme a été mise en évidence à partir des données épidémiologiques obtenues chez des familles d’enfants autistes.

1.2.5.1. Récurrence intrafamiliale et récurrence de la pathologie lors de gémellité

Les études de familles d’enfants autistes ont montré un risque de récurrence de l’autisme de 2 à 6% chez les apparentés du premier degré (Rutter et al., 1999). Ce risque est significativement plus élevé que dans la population générale, dans laquelle la prévalence estimée de ce trouble est de 20 pour 10 000 (Fombonne, 2009). La concordance est élevée chez les jumeaux monozygotes : plus de 60%, contre 2 à 5% chez les jumeaux dizygotes (Bailey et al., 1995 ; Levy et al., 2009). Cependant, cette concordance entre jumeaux monozygotes n’est pas de 100%, cela laisse supposer que plusieurs facteurs interviennent dans la déclaration de la pathologie (implications de plusieurs gènes et/ou facteurs environnementaux).

49 1.2.5.2. Apparition de troubles autistiques au cours de maladies monogéniques

••• Le syndrome de l’X fragile La fréquence d’autisme accompagné d’un syndrome de l’X fragile est de 5,5%. La proportion de patients atteints du syndrome de l’X fragile montrant des signes d’autisme est en moyenne de 15%. Le syndrome de l’X fragile est une maladie génétique héréditaire dont la prévalence est estimée à 6 enfants pour 10 000. Elle représente la deuxième cause connue de retard mental après la trisomie 21 et est caractérisée par un retard mental modéré à sévère, de larges oreilles, une mâchoire proéminente et un retard dans l’acquisition du langage. L’expression est variable, le retard mental étant le trait le plus commun. Ce phénotype est associé à des mutations du gène FMR1 (Fragile X Mental Retardation-1) situé sur le chromosome X, avec une répétition de triplets CGG pouvant conduire à une absence de production de la protéine FMRP qui coordonne la traduction des ARN messagers.

••• La sclérose tubéreuse La sclérose tubéreuse de Bourneville est une maladie autosomique dominante, caractérisée par des anomalies oculaires, des perturbations du cerveau, du cœur, des reins et de la peau. Plusieurs gènes sont responsables de cette maladie : le gène TSC1 localisé sur le chromosome 9, et le gène TSC2 sur le chromosome 16.

Les signes neurologiques sont prédominants et sont semblables à certains traits majeurs retrouvés dans l’autisme. On distingue, parmi ces troubles, de fréquentes crises d’épilepsie, des troubles mentaux (dont l’hyperactivité) et un retard intellectuel dans environ 75% des cas. Une proportion élevée de patients atteints de sclérose tubéreuse montre des signes d’autisme : 40 à 70% des cas (Gutierrez et al., 1998).

••• Le syndrome de Rett Le syndrome de Rett se manifeste uniquement chez les filles et est caractérisé par une régression rapide des acquisitions psychomotrices qui débute dans les 7 à 18 premiers mois

50 de la vie. Les anomalies comportementales initiales peuvent passer pour de l’autisme, mais s’ajoutent des manifestations neurovégétatives et un syndrome neurologique. Vers 3 ans, le tableau clinique a tendance à se stabiliser, avec une quasi absence de langage, aucune activité coordonnée et de nombreuses stéréotypies manuelles. Dans les années qui suivent, un syndrome pyramidal et des crises d’épilepsie apparaissent. Le syndrome de Rett est causé dans la majorité des cas par des mutations du gène MeCP2 (Methyl-CpG-binding Protein 2) situé sur le chromosome X. Les études de recherche de mutations du gène MeCP2 dans l’autisme ont mis quelques mutations en évidence (Carney et al., 2003). Toutefois d’autres études n’ont pas mis en évidence de mutation dans le gène MECP2 dans des populations d’autistes (Vourc’h et al., 2001).

1.2.6. Hypothèses étiologiques liées à des facteurs environnementaux

L’autisme est une maladie complexe, pouvant impliquer des facteurs génétiques et également environnementaux notamment pré et périnataux. En effet, des perturbations environnementales intervenant au cours des périodes pré et périnatales peuvent modifier le développement du cerveau et aboutir, au cours de la vie, à des désordres comportementaux et/ou cognitifs tels que l’autisme (Landrigan, 2010).

1.2.6.1. Cas d’autisme associés à des expositions prénatales

Parmi les facteurs environnementaux pouvant avoir un rôle étiologique dans l’autisme, l’exposition à des molécules tératogènes a été très étudiée. Les expositions prénatales à l’acide valproïque (VPA), l’éthanol, la thalidomide ou encore le misoprostol notamment ont été associées à une augmentation de l’incidence d’autisme (Bandim et al., 2003; Christianson et al., 1994; Nanson, 1992; Strömland et al., 1994).

51 Nous avons comparé les expositions à des tératogènes capable d’engendrer une augmentation de l’incidence de l’autisme afin d’en déduire des indices physiopathologiques et des orientations pour la recherche de gènes impliqués dans l'autisme. Cette comparaison fait l’objet d’une revue publiée dans Neuroscience & Biobehavioral Reviews (Dufour-Rainfray et al., 2011 ; annexe 4). Nous montrons, dans le tableau suivant, la comparaison des 4 tératogènes, puis nous détaillons les effets de l’exposition à chaque agent tératogène :

Acide valproïque Éthanol Thalidomide Misoprostol

Malformations [3] [12] [13] [5] [7] - Crâne (ex : microcéphalie, hypoplasie du visage) [3] [12] [13] [5] [11] [7] - Yeux (ex: hypertélorisme, microphtalmie) [3] [8] [13] [5] - Nez (ex : petit nez, tourné vers le haut) [3] [12] [13] [5] - Philtrum (ex: philtrum plat) [3] [12] [13] [5] - Lèvre (ex: lèvre supérieure fine) [3] [4] [8] [12] [13] [5] [11] [7] - Oreilles (ex: oreilles tournées vers l’arrière) [4] [8] [10] [12] [13] [5] [9] [11] [7] - Membres (ex: polydactylie, talipes) Aspects médicaux [5] [9] - Retard de croissance [4] [8] [13] [9] - Hernie (ex: hernie inguinale) [4] [10] [11] [7] - Problèmes visuels (ex: myopie, strabisme) - Problèmes auditifs et auriculaires (ex: otite, déficit de [4] [13] [11] [7] l’audition, surdité) - Anomalies des nerfs crâniens (ex: Syndrome de [11] [2] [7] Duane (VI), Syndrome de Möbius (VII), larmoiement anormal (VII), paralysie du nerf facial (VII)) Délai de développement [3] [4] [10] [12] [13] [5] [9] [11] [2] - Délai d’acquisition du langage Développement mental [3] [6] [10] [1] [5] [9] [11] [2] [7] - Retard mental Autres troubles comportementaux [9] - Hyperactivité Tableau 2 : Comparaison des caractéristiques cliniques présentes chez les enfants avec autisme exposés à différents tératogènes : acide valproïque, éthanol, thalidomide et misoprostol. [1], Aronson et al., 1997; [2], Bandim et al., 2003; [3], Christianson et al., 1994; [4], Dean et al., 2002; [5], Harris et al., 1995; [6], Landgren et al., 2010; [7], Miller et al., 2004; [8], Moore et al., 2000; [9], Nanson, 1992; [10], Rasalam et al., 2005; [11], Strömland et al. 1994; [12], Williams et Hersh, 1997; [13], Williams et al., 2001

52 ••• Cas d’autisme associés à des expositions à l’acide valproïque

L’acide valproïque ou acide 2-propyl-pentanoïque (VPA) fait partie des médicaments antiépileptiques couramment utilisés (exemple Dépakine®). Il est indiqué dans les crises d’épilepsie généralisées ou partielles et dans les convulsions fébriles de l’enfance. La posologie est de 20 à 30 mg/kg, avec une marge thérapeutique étroite puisque des symptômes de surdosage (se manifestant, entre autres, par de la somnolence) s’observent dès les doses supérieures à 1100 mg/j.

OH

O

Figure 11 : Acide valproïque (VPA)

L’administration de VPA entraîne une augmentation de l’activité de la glutamate décarboxylase, enzyme de synthèse du GABA. Il inhibe également la GABA transaminase et la semi-aldéhyde déshydrogénase, enzymes de dégradation du GABA. Il en résulte une augmentation des taux de GABA, neurotransmetteur inhibiteur, ce qui explique les propriétés antiépileptiques du VPA (Loscher, 2002).

53

Figure 12 : La synapse GABAergique Extrait de : www.people.eku.edu/ritchisong/301notes2.htm

Le VPA a des effets tératogènes. Ceux-ci peuvent être dus à plusieurs modes d’action tels qu’un deficit en acide folique, l’induction d’un stress oxydatif ou l’inhibition des histones déacétylases (HDAC) (Ornoy, 2009).

Ainsi, les enfants exposés au VPA pendant la grossesse peuvent présenter des anomalies caractéristiques réunies sous le terme de « syndrome fœtal du valproate ». Le VPA est responsable d’une augmentation de la fréquence d’anomalies majeures telles que des anomalies de fermeture du tube neural (spina bifida), des fentes labiales et labio-palatines, des malformations cardiaques, rénales, urogénitales et musculo-squelettique (Dodd et Berk, 2006). Les risques de malformations augmentent avec la dose et sont plus fréquents à des doses supérieures à 1000 mg/j. Le VPA est également responsable de malformations mineures affectant notamment le visage (front haut avec un rétrécissement bifrontal, nez court avec des narines antéversées, philtrum plat, lèvre supérieure mince). Enfin, le VPA

54 est responsable de troubles du développement dont l’autisme (Ardinger et al., 1988; Clayton-Smith et Donnai, 1995; DiLiberti et al., 1984; Kini, 2006; Vinten et al., 2005). Le résumé des caractéristiques du produit (RCP) indique actuellement que l’administration de VPA est déconseillée tout au long de la grossesse et stipule que quelques cas d’autisme ont été rapportés chez les enfants exposés in utero au valproate.

Figure 13 : Syndrome fœtal du valproate - Anomalies faciales http://cme.medscape.com/viewarticle/484513_3

En 1993, un premier article indique la présence de traits autistiques chez 2 des 7 enfants étudiés exposés au VPA (Laegreid et al., 1993). Puis, 7 articles de 4 équipes différentes ont rapporté des cas d’autisme chez des enfants présentant un syndrome fœtal du valproate (Bromley et al., 2008 ; Christianson et al., 1994; Dean et al., 2002; Moore et al., 2000; Rasalam et al., 2005; Williams et Hersh, 1997; Williams et al., 2001). Parmi ces articles, certains publient des séries permettant d’estimer la prévalence de cas d’autisme parmi les sujets exposés au VPA. Rasalam et collaborateurs (2005) concluent à une prévalence de 11,7% (9 enfants autistes parmi les 77 enfants exposés au VPA), Bromley et collaborateurs (2008) concluent à une prévalence de 6,3% (4 enfants autistes parmi les 64 enfants exposés au VPA).

55 ••• Cas d’autisme associés à des expositions à l’éthanol

L’alcool (nous considèrerons toujours l’éthanol) est un problème de santé public notamment parce que sa consommation augmente chez la femme enceinte dans plusieurs pays dont la France (Lamy et Thibaut, 2010).

OH

Figure 14 : Formule développée de l’éthanol

Les enfants exposés à l’éthanol peuvent présenter des anomalies caractéristiques regroupées sous le terme de « syndrome d’alcoolisme fœtal » ou « fetal alcohol syndrome » (Jones et Smith, 1973). Elles associent notamment des retards de croissance, des troubles du développement (dont des difficultés d’apprentissage) et comportementaux ainsi que des anomalies faciales (nez court, philtrum plat, lèvre supérieure mince). Cette petite molécule exerce probablement son action tératogène par plusieurs mécanismes dont la dérégulation de la prolifération, de l’apoptose et de la migration cellulaire (Goodlett et al., 2005; Liesi, 1997). Elle modifie aussi vraisemblablement les motifs épigénétiques des cellules, conduisant à une expression génique anormale (Pignataro et al., 2009; Sathyan et al., 2007).

Figure 15 : Syndrome d’alcoolisme fœtal - Anomalies faciales http://cme.medscape.com/viewarticle/499656

56 Dans une série clinique de 21 enfants avec un syndrome d’alcoolisme fœtal, adoptés de l’Europe de l’Est, 2 ont un diagnostic d’autisme (10%) (Landgren et al., 2010). Une autre étude plus large n’a pas mis en évidence d’association entre l’exposition prénatale à l’alcool (doses faibles) et l’autisme (Eliasen et al., 2010). La possible association entre l’exposition prénatale à l’alcool et l’autisme est également basée sur des cas cliniques qui décrivent des enfants présentant des comportements autistiques et un syndrome d’alcoolisme fœtal (Aronson et al., 1997; Harris et al., 1995; Nanson, 1992).

••• Cas d’autisme associés à des expositions à la thalidomide

La thalidomide ou 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline-1,3-dione a été synthétisée en 1954, et était prescrite comme sédatif y compris chez la femme enceinte.

O

N O

NH

O O

Figure 16 : Formule développée de la thalidomide

Parce que les effets de la thalidomide sont différents chez le rongeurs et chez le primates, sa tératogénicité n’a pas été anticipée (Schumacher et al., 1968). En 1962, Lenz et Knapp (1962) ont rapporté une augmentation des malformations congénitales chez les enfants exposés à la thalidomide. Ces anomalies concernent notamment les membres (phocomégalie, malpositionnement). L’effet tératogène de la thalidomide est en partie due à son action antiangiogénique (D’amato et al., 1994). La thalidomide est également capable d’interagir directement avec l’ADN ce qui lui donne de nouvelles perspectives de traitement notamment dans le traitement de cancers (Huang et McBride, 1997; Neubert et al., 1996; Thiel et al., 2000).

57 Une équipe a rapporté une possible augmentation de l’incidence d’autisme chez les enfants exposés en prénatal à la thalidomide. Parmi 86 enfants exposés à la thalidomide, 4 ont un trouble autistique. Les auteurs concluent à une incidence de 4 à 5% soit un taux d’enfants autistes 50 fois plus élevé chez les sujets exposés à la thalidomide que dans la population générale (Gillberg et al., 1991 ; Strömland et al., 1994).

••• Cas d’autisme associés à des expositions au misoprostol

Le misoprostol ou methyl 7-((1R,2R,3R)-3-hydroxy-2-((S,E)-4-hydroxy-4 methyloct-1- enyl)-5-oxocyclopentyl)heptanoate, est un dérivé des prostaglandines E1.

O O

O

OH HO

Figure 17 : Formule développée du misoprostol

C’est un médicament utilisé pour prévenir les ulcères gastriques, mais, comme il entraîne également des contractions utérines, il est utilisé pour induire des avortements hors d’un cadre médical et avec une faible efficacité.

Les enfants nés après une exposition au misoprostol peuvent présenter une hypoplasie des nerfs crâniens associé ou non à une séquence de Möbius et des malformations des membres (Coelho et al., 2000; Holmes, 2002; Marques-Dias et al., 2003).

La séquence de Möbius est caractérisée par des anomalies congénitales des nerfs crâniens (notamment le nerf facial VII), des anomalies des membres et des malformations

58 craniofaciales, des troubles du développement dont des difficultés d’apprentissage. La séquence de Möbius a des causes hétérogènes dont l’exposition au misoprostol, des saignements utérins (Pottie et al., 1999).

Dès 1984, plusieurs études ont rapporté des cas d’autisme chez des patients présentant une séquence de Möbius (Gillberg et Winnergard, 1984; Gillberg et Steffenburg, 1989; Johansson et al., 2001; Miller et al., 1998; Strömland et al., 2002).

Une étude rapporte spécifiquement 4 cas de patients autistes parmi 14 patients présentant une séquence de Möbius associée à une exposition au misoprostol (Bandim et al., 2003; Miller et al., 2004).

1.2.6.2. Cas d’autisme associés à des causes infectieuses prénatales

La rubéole survenant pendant la grossesse (rubéole congénitale), et en particulier avant la maturation de la fonction immunitaire fœtale, peut être une cause d’autisme. Une méta- analyse montre que 0,3% de l’ensemble des cas d’autisme peuvent être reliés à une rubéole congénitale (Hwang et Chen, 2010). Une infection in utero par le cytomégalovirus (CMV) peut également être la cause d’autisme (Libbey et al, 2005 ; Sweeten et Fujinami, 2004 ; Yamashita et al., 2003).

1.2.6.3. Cas d’autisme associés à des causes périnatales

Un épisode anoxique périnatal semble à l’origine de cas d’autisme : par exemple, un score d’Apgar bas à 5 minutes, une prématurité (naissance à moins de 35 semaines) (Haglund et Kallen, 2010 ; Larsson et al., 2005).

59 1.2.7. Aspects neuroanatomiques de l’autisme

Chez les enfants autistes une observation fréquente, mais dans des proportions variables, est une augmentation du périmètre crânien. Ainsi plus de 20% des enfants autistes présentent une macrocéphalie (circonférence de la tête > 97 ème percentile). La macrocéphalie observée dans l’autisme peut être le résultat d’une croissance accélérée du périmètre crânien pendant les premières années de vie suivie d’une phase de décélération (Redcay et Courchesne, 2005). Cette macrocéphalie semble due à un épaississement de certaines régions cérébrales.

En effet, les études par autopsie puis par IRM ont montré que plusieurs régions cérébrales étaient hypertrophiées chez les jeunes enfants autistes telles que l’amygdale et le cortex frontal, régions impliquées dans la régulation du comportement social et la communication (Carper et al., 2002; Carper et Courchesne, 2005; Schumann et al., 2009).

L’équipe de Wegiel (2010) a observé un large spectre d’anomalies neuropathologiques focales dans 12 des 13 cerveaux de sujets autistes analysés, et conclut que ces anomalies peuvent refléter une dysrégulation régionale de la neurogénèse, de la migration et maturation neuronale, et se traduire par des phénotypes cliniques différents.

Les études histologiques ont montré que le cortex préfrontal et temporal des enfants autistes était constitué de minicolonnes plus petites et plus compactes (Buxhoeveden et al., 2006; Casanova et al., 2002 ; 2006; Geschwind, 2009). Un nombre plus faible de neurones dans l’amygdale ainsi qu’une diminution du nombre de cellules de Purkinje dans le cervelet ont également été rapportés (Bauman et Kemper, 1985; Schumann et Amaral, 2006).

Des anomalies des nerfs crâniens ont aussi été décrites : Rodier et collaborateurs ont observé une quasi-absence du noyau du nerf facial et de l’olive supérieure avec un raccourcissement du pédoncule cérébral lors de l’autopsie d’une femme autiste (Rodier et al., 1996, 1997b).

60 1.2.8. Aspects biochimiques de l’autisme

1.2.8.1. L’acide Gamma-aminobutyrique (GABA)

Le GABA est le neurotransmetteur inhibiteur majeur du cerveau. Il participe aux mécanismes de régulation de la prolifération, migration et différenciation neuronale pendant le développement cortical. Le système GABAergique est particulièrement impliqué dans le contrôle moteur et dans la régulation de l’anxiété (Zheng et al., 2009). Des anomalies dans ce système peuvent être à l’origine d’une hyperactivité ou être la cause d’épilepsie, une affection neurologique présente chez 30% des autistes (Bauman, 2010). Le GABA est synthétisé à partir du glutamate grâce à une enzyme, la glutamate décarboxylase, qui existe sous deux isoformes (GAD65 et GAD67). Des niveaux diminués en protéines GAD65 et GAD67 dans le cervelet et le cortex pariétal de patients autistes ont été observés lors d’études post-mortem (Fatemi et al., 2002).

Il semble qu’un déséquilibre existe dans l’autisme entre le système inhibiteur GABAergique et le système excitateur glutamatergique (Bittigau et Ikonomidou, 1997).

1.2.8.2. Le glutamate

Le glutamate est le neurotransmetteur excitateur majeur du cerveau. Il se fixe sur quatre familles de récepteurs au glutamate, les récepteurs AMPA (GluR1-GluR4), les récepteurs kainate (GluR5-GluR7 et KA1, KA2), les récepteurs NMDA (NMDAR1, NMDAR2A-2D, NR3A, NR3B) et les récepteurs métabotropes (GRM1-GRM8). Le système glutamatergique est impliqué dans la prolifération cellulaire, la migration neuronale, la transmission et la plasticité synaptique, la mort cellulaire. Une étude post-mortem a montré une augmentation de l’expression des ARNm du récepteur au glutamate AMPA1 dans le cerveau d’enfants autistes comparés à des individus témoins (Purcell et al., 2001).

61 1.2.8.3. La noradrénaline

La noradrénaline est un neurotransmetteur impliqué dans le système nerveux sympathique. La plupart des neurones noradrénergiques centraux sont situés dans le locus cœruleus. Ils sont impliqués dans les processus d’éveil, d’anxiété, de mémoire et dans la réponse au stress qui semble anormalement élevée chez les patients autistes.

Dans le liquide céphalo-rachidien, les études ne mettent pas de différence en évidence entre les concentrations de noradrénaline des sujets avec autisme et des sujets témoins (Gillberg et Svennerholm, 1987).

Dans le sang, les études ayant mesuré les concentrations en noradrénaline chez des sujets avec autisme ont obtenu des résultats différents : certaines montrent des concentrations augmentées (Leboyer et al., 1992), d’autres ne mettent pas de différence en évidence (Martineau et al., 1994).

Les études ayant mesuré les concentrations sanguines en 3-methoxy-4- hydroxyphenylglycol (MHPG), un des métabolites de la noradrénaline, ne montrent pas de différence (Minderaa et al., 1994).

Dans les urines, les études ayant mesuré les concentrations en noradrénaline et en MHPG ont présenté des résultats différents : certaines montrent des concentrations augmentées (Barthélémy et al., 1988) ou diminuées (Young et al., 1979). Une étude plus récente a montré des taux urinaires de VMA, métabolite essentiellement périphérique de la noradrénaline, supérieurs chez les enfants avec autisme que chez les témoins (Kaluzna- Czaplinska et al., 2010).

1.2.8.4. La dopamine

La dopamine est un neurotransmetteur particulièrement important dans le contrôle des fonctions motrices, la cognition et la régulation de la libération d’hormones.

62 Les mesures de l’acide homovanilique (HVA), un métabolite de la dopamine, dans le liquide céphalorachidien d’enfants autistes ont donné des résultats contradictoires, allant d’une augmentation d’environ 50% à une absence d’anomalie (Gillberg et Svennerholm, 1987 ; Narayan et al., 1993).

Les études anciennes ayant mesuré les taux sanguins et urinaires de dopamine et de HVA chez des autistes n’ont pas mis de différence en évidence par rapport aux sujets témoins (Minderaa et al., 1989). Une étude récente a montré, quant à elle, des taux urinaires de HVA supérieurs chez les enfants autistes que chez les témoins (Kaluzna-Czaplinska et al., 2010).

1.2.8.5. La sérotonine

La sérotonine est sûrement le système qui a été le plus étudié dans l’autisme, nous lui consacrons le chapitre suivant.

1.3. Le système sérotoninergique dans l’autisme

Le système sérotoninergique jouant un rôle dans la régulation des comportements et des processus psychologiques tels que l’humeur, l’anxiété, l’agressivité, le sommeil, les interactions sociales, il a été très tôt envisagé que ce système soit impliqué dans la pathologie autistique. De nombreuses études ont, en effet, observé des altérations du système sérotoninergique dans l’autisme. Cependant, ce système n’est pas le seul altéré dans cette pathologie, il semble même que de nombreux systèmes de neurotransmission présentent des modifications (Lam et al., 2006). Le système sérotoninergique est vraisemblablement le système le plus étudié dans l’autisme, son étude permet d’accéder à

63 de nombreuses informations qui pourraient aider à comprendre la physiopathologie de la maladie et proposer des marqueurs.

1.3.1. Les taux de sérotonine dans l’autisme

1.3.1.1. Les taux sanguins de sérotonine

Taux sanguins physiologiques

Les taux de sérotonine sont calculés par rapport à la numération des plaquettes. Les valeurs de référence chez l’adulte sont : 3,81 ± 0,87 nmol/10 9 plaquettes.

Physiologiquement, pendant la grossesse, le taux de sérotonine plaquettaire augmente chez la mère au cours du premier trimestre pour retrouver un niveau normal au troisième trimestre (De Villard et al., 1986). Puis chez l’enfant, le taux de sérotonine plaquettaire augmente lentement au cours des premières années, puis décline à partir de 5 ans jusqu’au taux basal adulte correspondant à 50% environ du taux de l’enfant (Whitaker-Azmitia, 2001).

Taux sanguins de sérotonine chez les sujets avec autisme

Dans l’autisme, les taux sanguins de sérotonine apparaissent modifiés :

Une augmentation du taux de sérotonine dans le sang total est retrouvée chez des enfants autistes par l’équipe de Schain dès 1961 : 6 enfants autistes (avec un sévère retard mental) sur les 23 enfants étudiés ont des taux augmentés de sérotonine (Schain et Freedman, 1961). Plusieurs études retrouvent ensuite cette hypersérotoninémie d’amplitude variable (20 à 130%) chez environ 30% des enfants autistes (Anderson et al., 1990 ; Campbell et al., 1974 ; Hanley et al., 1977). Les études plus récentes ont établi que l’augmentation du taux de sérotonine dans le sang total était due à une augmentation de la concentration plaquettaire de sérotonine, le taux de sérotonine dans le plasma pauvre en plaquettes n’étant pas augmenté chez les sujets autistes (Cook et al., 1988 ; Hranilovic et al., 2007).

64 Il faut noter que certaines études ont montré une diminution des taux sanguins de sérotonine et ont conclu à un déséquilibre de la neurotransmission sérotoninergique dans l’autisme (Hérault et al., 1993).

Enfin, l’étude de Whitaker-Azmitia et collaborateurs (2001) a comparé l’augmentation des taux de sérotonine plaquettaire d’enfants avec autisme et d’enfants témoins. Cette étude montre que chez l’enfant avec autisme, l’augmentation du taux de sérotonine plaquettaire semble être progressive entre 2 et 15 ans jusqu’à 1,5 fois la valeur de l’adulte avant de diminuer jusqu’au taux basal adulte, tandis que chez l’enfant sans autisme, le taux de sérotonine diminue à partir de 5 ans jusqu’au taux basal adulte. Il est donc possible que l’hypersérotoninémie parfois observée dans l’autisme soit due à un décalage des cinétiques entre 5 et 15 ans.

Cependant l’hypersérotoninémie n’est pas spécifique de l’autisme puisqu’elle est retrouvée dans d’autres troubles envahissants du développement (Mulder et al., 2004).

Taux sanguins de sérotonine chez les sujets apparentés à un sujet avec autisme

L’étude de Leboyer montre que l’augmentation de la sérotonine plaquettaire peut être également présente chez les apparentés du 1 er degré des patients autistes (parents, frères et sœurs) (Leboyer et al., 1999a). Par contre, l’étude de De Villard et collaborateurs (1986) montre une diminution de la sérotonine plaquettaire chez les pères des enfants autistes, tandis que le taux chez la mère est normal. De plus, la dispersion des valeurs individuelles des concentrations est supérieure dans les groupes d’autistes que chez les témoins (Bursztejn et al., 1988).

Taux sanguins de sérotonine et phémotypes d’autisme

L’étude de Bursztejn suggère une corrélation positive entre la concentration en sérotonine intra plaquettaire et la sévérité des signes cliniques autistiques : retrait, stéréotypies, absence de réactions affectives (Bursztejn et al., 1988). De même De Villard observe que seuls les enfants atteints d’une forme grave d’autisme présentent une élévation

65 significative de la sérotonine plaquettaire par rapport au groupe témoin (De Villard et al., 1986). L’hypersérotoninémie pourrait donc être un marqueur d’un phénotype d’autisme.

Taux sanguins de sérotonine et catabolisme

L’hypersérotoninémie dans l’autisme pourrait être expliquée par une diminution de l’activité des enzymes du catabolisme de la sérotonine, la MAO-A en particulier qui métabolise la sérotonine en 5HIAA. Or cette enzyme est également responsable de la dégradation de la noradrénaline en 3-méthoxy-4-hydroxyphényléthylglycol (MHPG) et la dopamine en acide homovanillique (HVA). Anderson a étudié les rapports de concentrations des catécholamines et sérotonine sur leurs métabolites, le rapport sérotonine/5HIAA est diminué dans le groupe de patients autistes tandis que les rapports noradrénaline/MHPG et dopamine/HVA sont normaux (Anderson, 1987). Une autre étude a évalué, chez des garçons autistes, la relation entre le polymorphisme du gène de la MAO- A et l’expression phénotypique de l’autisme. Elle montre que l’allèle entraînant une activité plus faible de la MAO-A est associé à un phénotype plus sévère de l’autisme (Cohen et al., 2003). L’implication de la MAO-A dans l’autisme n’est donc pas clairement établie.

Hranilovic et collaborateurs (2009) ont étudié la vélocité de l’isoforme B de la MAO, isoforme présente dans les neurones sérotoninergiques et également dans les plaquettes sanguines. Ils ont montré que l’activité de l’enzyme est supérieure chez les patients autistes comparée aux sujets témoins. De plus, parmi les patients autistes, ceux présentant une hypersérotoninémie avaient une vitesse supérieure que ceux présentant une sérotoninémie normale. Les auteurs suggèrent que l’hypersérotoninémie observée dans l’autisme peut être due à un métabolisme augmenté de la sérotonine (Hranilovic et al., 2009).

1.3.1.2. Les taux centraux de sérotonine

L’implication des taux de sérotonine dans la symptomatologie de l’autisme a été mise en évidence indirectement par la diminution de l’apport en tryptophane conduisant à une

66 diminution de la synthèse de sérotonine. Or, ce régime pauvre en tryptophane aggrave le comportement stéréotypé en particulier une augmentation des balancements, de l’auto agression, de l’anxiété chez 50% des adultes autistes (McDougle et al., 1996).

De plus, l’équipe de Chugani a étudié la synthèse de sérotonine chez des enfants autistes âgés de 4 à 11 ans et leurs frères et sœurs non autistes âgés de 8 à 14 ans. L’étude a été réalisée par imagerie fonctionnelle TEP en utilisant un ligand radioactif : l’alpha[11C]- méthyl-L-tryptophane. Ce ligand est un analogue du tryptophane, précurseur de la synthèse de la sérotonine. L’équipe a montré, chez les garçons autistes, une diminution unilatérale de la synthèse centrale de la sérotonine affectant le cortex frontal, le thalamus et le cervelet, accompagnée d’une augmentation dans le noyau denté du lobe opposé. Cette asymétrie de synthèse n’a pas été retrouvée chez la fille autiste. Cette équipe a émis l’hypothèse d’une altération de la neuromodulation sérotoninergique dans l’autisme (Chandana et al., 2005 ; Chugani et al., 1997, 1999).

1.3.2. Les récepteurs sérotoninergiques dans l’autisme

Le récepteur 5-HT 2A représente un acteur important de la neurotransmission sérotoninergique et est exprimé aux niveaux central et périphérique. Des études biochimiques ont montré une réduction de la densité et de la fonction du récepteur 5-HT 2A plaquettaire chez des sujets autistes (McBride et al., 1989 ; Murphy et al., 2006 ; Safai- Kutti et al., 1988 ). Une étude en TEMP a montré une diminution de la densité des récepteurs 5-HT 2A dans le cortex de patients atteints du syndrome d'Asperger (Murphy et al., 2006). Le gène codant pour ce récepteur contient plusieurs polymorphismes qui peuvent affecter la densité et/ou l’activité du récepteur (Guhathakurta et al., 2009 ; Hranilovic et al., 2010 ; Myers et al., 2007 ; Parsons et al., 2004).

67 1.3.3. Les SERT dans l’autisme

1.3.3.1. Étude génétique du gène SLC6A4 codant le SERT

A la vue de l’hypersérotoninémie et de la possible implication du SERT, le gène SLC6A4 codant le SERT est apparu comme un bon gène candidat dans l’autisme. Ce gène possède deux polymorphismes influençant l’expression du SERT, l’un dans le promoteur, l’autre dans l’intron 2.

Plusieurs études d’association ont étudié le polymorphisme du promoteur dans l’autisme, certaines ne trouvent aucune association entre l’un des allèles et la maladie (Betancur et al., 2002 ; Kim et al., 2002 ; Maestrini et al., 2000 ; Persico et al., 2000 ; Tordjman et al., 2001 ; Zhong et al., 1999), certaines études montrent une association entre l’autisme et l’allèle long « l » lié à une expression augmentée du SERT (Coutinho et al., 2004 ; Klauck et al., 1997; Yirmiya et al., 2001). Enfin, d’autres études montrent une association entre l’autisme et l’allèle court « s », allèle lié à une expression diminuée du SERT (Conroy et al., 2004 ; Cook et al., 1997). Une étude cas-témoins réalisée dans notre unité Inserm montre une association entre l’allèle court « s » et l’autisme (Tabagh et al., en préparation).

1.3.3.2. Étude de la densité cérébrale des SERT

L’hypersérotoninémie dans l’autisme pourrait également être expliquée par une augmentation de l’activité (et/ou de la quantité) des SERT qui favorisent le stockage de la sérotonine au niveau intracellulaire. De plus, l’utilisation chez des enfants autistes de médicaments Inhibiteurs Sélectifs de la Recapture de la Sérotonine dont la cible est le SERT (ISRS, exemple : Paroxétine Déroxat®) a amélioré certains symptômes notamment une diminution des comportements répétitifs, ritualisés et de l’agressivité (Cook et Edwin, 1996). Les études de Marazziti et de Croonenberghs ont exploré les SERT plaquettaires dans l’autisme. L’étude de Marazziti montre une augmentation de la densité de SERT dans le groupe de patients autistes (Marazziti et al., 2000), l’équipe de Croonenberghs observe

68 une augmentation de l’affinité dans le groupe de patients autistes (Croonenberghs et al., 2000). Ces études appuient l’hypothèse d’une implication du transporteur de la sérotonine dans l’autisme.

L’implication des SERT dans la pathologie autistique est également montrée par une étude par TEMP, utilisant le [ 123 I]-nor-beta-CIT et qui a rapporté que la densité de SERT était diminuée dans le cortex frontal médian d’enfants autistes (Makkonen et al., 2008). Une étude par TEP, utilisant le [ 11 C]-(+)McN-5652, a rapporté que la densité de SERT était diminuée dans le cortex cingulaire et le thalamus des enfants autistes comparés aux enfants témoins (Nakamura et al., 2010). Ces études montrent que la densité de SERT pourrait être un marqueur de la pathologie autistique ou d’un sous-groupe de patients puisque ces études sont réalisées chez des enfants autistes « de bon niveau ».

1.3.4. De potentiels marqueurs sérotoninergiques dans l’autisme ?

1.3.4.1. Qu’est-ce qu’un marqueur ?

Un marqueur biologique est défini comme une caractéristique pouvant être mesurée de manière objective, et évaluée comme un indicateur d’un processus biologique normal ou pathologique ou d’une réponse pharmacologique d’une intervention thérapeutique. Idéalement, la mesure d’un marqueur devrait être non-invasive.

Un marqueur peut ne pas être spécifique de la maladie mais seulement d’un mécanisme ou d’un sous-type de la maladie.

Ainsi, Hendren et collaborateurs (2009) explique que des marqueurs de l’autisme pourraient permettre d’identifier un sous-groupe d’autisme, d’identifier des mécanismes spécifiques de la maladie ou de la pathogénèse, et de servir d’indicateur de l’efficacité d’un traitement ou d’être corrélé à l’amélioration du comportement.

Un marqueur d’une maladie peut être le reflet de la cause et/ou d’un effet à long terme.

69 1.3.4.2. Pourquoi rechercher des marqueurs dans la pathologie autistique ?

Le recours à des marqueurs est intéressant dans les pathologies dont le diagnostic clinique est probable mais pas certain comme c’est le cas de la pathologie autistique dont le diagnostic, actuellement, est uniquement basé sur des critères cliniques et que la symptomatologie peut recouvrir plusieurs syndromes. Disposer de marqueurs est aussi utile lorsque les sujets atteints ne peuvent aisément exprimer leurs symptômes soit parce le sujet est trop jeune pour s’exprimer soit parce que la pathologie atteint l’expression comme c’est également le cas dans l’autisme (Bradstreet et al., 2010).

1.3.4.3. Comment disposer de marqueurs dans la pathologie autistique ?

Idéalement, les marqueurs potentiels doivent bien sûr être étudiés dans la population cible. Cependant, dans la pathologie autistique, la prévalence est faible et le diagnostic doit pouvoir être fait dès l’enfance. Or les études cliniques sont difficiles à mettre en œuvre chez l’enfant. Il apparait ainsi que des études préalables sur des modèles animaux permettraient de sélectionner les marqueurs les plus intéressants. Parallèlement, les études des marqueurs les plus accessibles (marqueurs périphériques notamment) peuvent être réalisées directement chez l’enfant autiste.

1.3.4.4. Quels marqueurs étudier dans la pathologie autistique ?

Les différents arguments développés précédemment, sont en faveur d’une implication du système sérotoninergique dans l’autisme avec l’hypothèse d’une altération des taux de sérotonine pouvant être dus à une altération de sa recapture par le SERT.

L’exploration de ces facteurs, taux de sérotonine et densité de SERT, dans l’autisme permettrait d’apporter des éléments de réponse à cette hypothèse.

70 Le dosage des taux sanguins de sérotonine est aisé par HPLC (high performance liquid chromatography ou Chromatographie liquide haute performance selon la terminologie Française). En revanche, les taux cérébraux restent difficilement accessibles.

L’exploration des SERT centraux peut être réalisée par des examens d’imagerie scintigraphique TEP ou TEMP utilisant un ligand radiomarqué spécifique du SERT. Ces techniques sont non invasives. Elles permettraient de mettre en évidence des perturbations neurochimiques in vivo .

Cependant ces explorations peuvent être difficiles à mener chez des enfants avec autisme, c’est pourquoi le recours à des modèles d’étude de l’autisme peut être utile pour étudier de potentiels marqueurs de cette pathologie.

71 2. Outils d’exploration du système sérotoninergique dans la pathologie autistique

2.1. Méthodes et outils d’exploration in vitro/ex vivo du SERT

2.1.1. Études de liaison

Une méthode d’exploration d’un site de liaison, tel qu’un transporteur comme le SERT, est une étude de la liaison d’un ligand spécifique sur ce site.

Ces études renseignent sur l’affinité du ligand pour le site de liaison et sur la densité du site de liaison dans un fragment de tissu.

L’affinité est traduite par la constante de dissociation Kd (concentration en ligand nécessaire pour occuper la moitié des sites de liaison) : l’affinité d’un ligand pour le site de liaison est d’autant plus forte que Kd est faible.

La densité correspond à un nombre de sites de liaison (Bmax).

Ces 2 paramètres permettent de caractériser la liaison à l’équilibre d’un ligand à son site de liaison. Ces paramètres se calculent grâce à des expériences de saturation de la liaison à l’équilibre.

Ces expériences consistent à mettre une quantité constante et connue de protéines (sites de liaison) en présence de quantités croissantes d’un ligand radiomarqué, jusqu’à saturation des sites de liaison. En pratique, le ligand radiomarqué se fixe sur les sites de liaison (= fixation spécifique SB), et sur d’autres composants du milieu (= fixation non spécifique NSB) :

liaison totale (TB) = fixation spécifique (SB) + fixation non spécifique (NSB)

La fixation non spécifique (NSB) est déterminée par une série d’expériences de saturation des sites où est ajouté, en plus des protéines et du ligand radiomarqué, un autre ligand

72 spécifique du site de liaison en concentration saturante (saturation des sites de liaison). Le ligand radiomarqué ne se fixe alors que sur ses sites non spécifiques (NSB).

Les expériences de saturation permettent d’obtenir une courbe d’équation :

Kd = F (Bmax – B) / B

L’hyperbole précédente est linéarisée par l’équation (analyse de Scatchard) :

B / F = (-1/Kd)B + Bmax / Kd

Les paramètres de comparaison Kd et Bmax se calculent à partir de l’analyse de Satchard :

La pente de la courbe de Scatchard a pour équation = -1 / Kd, l’abscisse à l’origine correspond à Bmax.

2.1.2. Ligands spécifiques du SERT

La mise en place des études de liaison décrites précédemment nécessite de disposer d’un ligand radiomarqué spécifique du site de liaison étudié : le SERT.

Le SERT étant la cible des inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine, ces médicaments ont été radiomarqués pour permettre d’explorer le SERT.

Ainsi, la paroxétine, notamment, a été étudiée et utilisée pour explorer les SERT centraux et plaquettaires chez l’homme (Marazziti et al., 2000 ; Croonenberghs et al., 2000). Sa constante de dissociation pour le SERT plaquettaire varie de 0,04 à 0,16 nM, (Arranz et al., 1999 ; Croonenberghs et al., 2000 ; Maguire et al., 1998 ; Marazziti et al., 1999a, 1999b et 2000 ; Ramacciotti et al., 2003 ; Rasmussen et al., 2003). Elle présente une bonne affinité et une bonne sélectivité pour le SERT sur cerveaux de rat, cependant, elle a l’inconvénient in vitro d’avoir une fixation non spécifique non négligeable.

73 Des dérivés basés sur des substitutions du noyau diphénylsulfide ont été étudiés. Les ligands du SERT de la famille des diphénylsulfides possédent une forte affinité et une forte sélectivité pour le SERT. Dans cette famille, le MADAM qui peut être marqué au tritium est bien adapté aux études in vitro (Chalon et al., 2003), et l’ADAM qui peut être marqué à l’iode 123 ou 125 est bien adapté aux études ex vivo (Oya et al., 2000).

2.1.2.1. Le MADAM

••• Structure du MADAM

Le MADAM ou N, N-Diméthyl-2-(2-amino-4-méthylphényl thio)benzylamine est une molécule développée en vue d’une utilisation en TEP (notamment le MADAM radiomarqué au 11 C).

La caractérisation pharmacologique a été réalisée sur le MADAM radiomarqué au tritium (Chalon et al., 2003). Le marquage au tritium de ce ligand permet de le détecter in vitro grâce au rayonnement β- émis.

Figure 18 : Formule développée du MADAM ou N, N-Diméthyl-2-(2-amino-4-méthylphényl thio)benzylamine

74 ••• Caractérisation pharmacologique du MADAM

Caractérisation pharmacologique in vitro chez le rat (Chalon et al., 2003) :

Le MADAM a été validé sur cerveaux de rats : études quantitatives de la liaison du [ 3H]- MADAM sur les SERT. Les représentations de Scatchard montrent une droite indiquant un site de fixation unique du [ 3H]-MADAM sur le SERT. Le [ 3H]-MADAM se lie aux SERT des membranes corticales avec une forte affinité (Kd = 60 ± 9 pM). Son affinité pour le SERT est supérieure à celle d’autres membres de la famille des diphénylsulfides tel que l’ADAM (Kd = 0,15 ± 0,03 nM). Le nombre maximal de site de liaison (Bmax) est égal à 543 ± 181 fmol/mg de protéine. La fixation non-spécifique déterminée en présence de paroxétine à la concentration 10 -6 M est d’environ 15%. Les études de compétition montrent qu’il n’y a pas d’effet inhibiteur de la desipramine (ligand du transporteur de la noradrénaline) ni du GBR 12935 (ligand du transporteur de la dopamine). Ainsi, le MADAM est 1000 fois plus sélectif pour le SERT que pour les autres transporteurs monoaminergiques.

Caractérisation pharmacologique in vivo chez le primate puis l’homme :

Une équipe du Karolinska Institute a étudié la distribution du [ 11 C]-MADAM dans le cerveau de singes. Elle trouve une forte fixation au niveau des noyaux caudés, du putamen et du mésencéphale, régions riches en SERT, tandis qu’elle trouve une très faible fixation au niveau du cervelet, région pauvre en SERT (Halldin et al., 2005).

Les études par autoradiographie sur coupes de cerveaux humains post mortem montrent que le [ 3H]-MADAM se distribue au niveau de la glande pinéale, des noyaux caudés et putamen, des noyaux du Raphé et au niveau des régions corticales. Cette distribution correspond aux régions riches en synapses sérotoninergiques, où se localisent principalement les SERT.

L’étude de Lundberg a quantifié la liaison du [ 11 C]-MADAM sur le SERT dans le cerveau humain. La concentration en radioligand la plus importante est détectée dans les noyaux du Raphé, puis le striatum et l’hippocampe, la concentration la plus faible est détectée dans le

75 cervelet (Lundberg et al., 2005 et 2006). Ces résultats obtenus avec le [ 11 C]-MADAM in vivo chez l’homme sont en accord avec ceux obtenus avec le [ 3H]-MADAM par autoradiographie.

2.1.2.2. L’ADAM

L’ADAM, ou 2-((2-((dimethylamino)methyl)phenyl)thio)-5-iodophenylamine, est un radioligand spécifique du SERT de la famille des diphénylsulfides, comme le MADAM.

Il peut être radiomarqué à l’iode 123 en vue d’une utilisation en TEMP permettant ainsi l’étude de pathologies impliquant un dysfonctionnement de la neurotransmission sérotoninergique (Chou et al., 2009).

Ce ligand peut également être radiomarqué à l’iode 125 pour des études ex vivo des systèmes sérotoninergiques (Chalon et al., 2004).

Figure 19 : Formule développée de l’ADAM ou 2-((2-((dimethylamino)methyl)phenyl)thio)-5-iodophenylamine

••• Caractérisation pharmacologique de l’ADAM Caractérisation pharmacologique in vitro chez le rat :

76 L’ADAM se lie aux SERT avec une forte affinité (Kd = 0,15 ± 0.03 nM). Le nombre maximal de site de liaison (Bmax) est égal à 194 ± 65 fmol/mg de protéine (Choi et al., 2000 ; Oya et al., 2000).

La validation de l’ADAM dans des modèles animaux d’altération du système sérotoninergique permet son utilisation pour l’exploration de pathologie impliquant la neurotransmission sérotoninergique (Chalon et al., 2004).

Caractérisation pharmacologique in vivo chez l’homme :

L’utilisation de l’[ 123 I]-ADAM chez le sujet sain a permis de mettre en évidence la bonne sélectivité du ligand pour le SERT (Van de Giessen et Booij, 2010).

Plusieurs études ont utilisé ce ligand pour étudier la densité de SERT au cours de pathologies impliquant le système sérotoninergique telles que les troubles bipolaires (Chou et al., 2010).

2.2. Modèles d’étude de l’autisme

2.2.1. Modèle périphérique humain : la plaquette sanguine

2.2.1.1. La plaquette sanguine : modèle du système central ?

La plaquette sanguine possède des SERT dans sa membrane, ce qui lui permet de stocker et de libérer la sérotonine nécessaire à l’agrégation plaquettaire. Les SERT plaquettaires et centraux sont codés par le même gène et ont la même structure primaire (Lesch et al., 1993). De plus, les ligands des SERT comme les ISRS, se lient avec la même affinité sur les transporteurs centraux et plaquettaires. C’est pourquoi le modèle plaquettaire a été utilisé dans les études du SERT comme reflet du SERT central (Dreux et Launay, 1985).

De plus, parmi les tissus périphériques exprimant le SERT, la plaquette sanguine est d’un grand intérêt car elle exprime également deux autres acteurs synaptiques du système

77 sérotoninergique : le récepteur 5-HT 1A et la monoamine oxydase B. Ses propriétés et son accessibilité font que la plaquette sanguine est souvent utilisée comme modèle du système central et notamment pour les études de maladies neuropsychiatriques.

Cependant, il n’a pas été clairement établi que le fonctionnement des SERT plaquettaires reflétait celui des SERT centraux, leurs rôles étant différents.

L’équipe de Uebelhack a étudié les SERT centraux et plaquettaires, elle a montré une corrélation entre la vitesse maximale de recapture plaquettaire et la densité de SERT dans le mésencéphale, et a montré une corrélation entre la concentration plaquettaire de sérotonine et la densité de SERT dans le mésencéphale mais uniquement chez les sujets féminins. Cette équipe ne montre pas de corrélation entre ces paramètres chez les sujets masculins (Uebelhack et al., 2006).

Ainsi, aucune étude ne prouve que des altérations de la densité ou de la fonction des SERT périphériques prédisent les mêmes altérations centrales.

2.2.1.2. Système sérotoninergique périphérique et autisme

Dans la pathologie autistique, deux études ont exploré les SERT plaquettaires sur préparation membranaire congelée en utilisant comme ligand radiomarqué la [ 3H]- paroxétine. L’étude de Marazziti a montré une augmentation du nombre de sites de liaison dans le groupe d’autistes (20 patients de 3 à 17 ans, 15 garçons et 5 filles) par rapport à un groupe de 20 témoins appariés en âge et en sexe. Dans cette étude, l’affinité de la [ 3H]- paroxétine pour le SERT était conservée dans les deux groupes (Marazziti et al., 2000). L’équipe de Croonenberghs a, quant à elle, observé une augmentation de l’affinité de la [3H]-paroxétine pour le SERT dans le groupe d’autistes (13 garçons de 12 à 18 ans) par rapport à un groupe de 13 témoins appariés en âge et en sexe sans modification du nombre de sites de liaison (Croonenberghs et al., 2000). Il faut noter que ces études sont réalisées chez des patients dont l’intervalle d’âge est large et dont les phénotypes cliniques ne sont pas pris en compte dans l’analyse des résultats, ceci peut expliquer les différences observées entre ces deux études.

78 2.2.2. Modèles animaux d’étude de l’autisme

Les modèles animaux d’étude de l’autisme sont, pour une très large majorité, des modèles de rongeurs. En effet, les rongeurs sont des espèces faciles à élever, et peu onéreuses. Le rat a un volume sanguin et cérébral supérieur à la souris et se prête donc bien aux études cérébrales. Bien que très éloigné de l’homme surtout pour l’étude d’une maladie neuropsychiatrique, c’est un animal social qui peut se prêter aux études comportementales et aux analyses de mécanismes biologiques (Tordjman et al., 2007).

Les modèles animaux d’étude de l’autisme sont, pour beaucoup, basés sur des hypothèses physiopathologiques, dont plusieurs basés sur l’hypothèse d’une implication du système sérotoninergique (Andres, 2002). Parmi ces derniers, nous nous sommes intéressés à ceux mimant une possible étiologie de l’autisme.

En effet, l'augmentation de l'incidence de cas d'autisme, chez les enfants exposés avant la naissance à des médicaments, a encouragé la création de modèles animaux reproduisant l'exposition prénatale afin d'étudier cette hypothèse physiopathologique.

Dans notre article de revue comparant les expositions à des tératogènes capables d’engendrer une augmentation de l’incidence de l’autisme, nous avons confronté les résultats apportés par les modèles animaux exposés à ces tératogènes. Nous présentons ici un tableau récapitulatif, puis nous détaillons la comparaison des deux modèles animaux les plus pertinents (Dufour-Rainfray et al., 2011 ; annexe 4) :

79 Acide valproïque Éthanol Thalidomide

Comportements “autistic-like” ↓ du nombre et ↑ de la latence des altération du jeu social - Comportements comportements sociaux [2] [7] [11] sociaux [6] [9] [13] [14]

- Activités ↑ activités répétitives/stéréotypées

répétitives/stéréotypé [7] [13] [14] es Malformations

dysmorphie [3] microcéphalie [4] - Crâne atrophie [2] - Oreilles Aspects neuropathologiques

altération [16] altération [1] [12] - Apoptose altérations de la migration et de la altérations de la migration altérations de la migration [4] différentiation dans le pont [5], dans le dans le noyau du Raphé [8] noyau du Raphé dorsal [8] - Neurotransmission dorsal [17] ↑ du taux de sérotonine dans sérotoninergique variations du taux de sérotonine dans le ↓ du nombre de neurones l’hippocampe et le plasma cortex frontal, l’hippocampe, le sérotoninergiques [12] [18] [10] cervelet et le plasma [2] [10] [15] Tableau 3 : Caractéristiques physiques, comportementales et neuropathologiques communes observées dans différents modèles animaux d’expositions prénatales à des tératogènes. [1], Anthony et al., 2008; [2], Dufour-Rainfray et al., 2010; [3], Edwards et Dow-Edwards, 1991; [4], Hallene et al., 2006; [5], Kuwagata et al., 2009; [6], Lawrence et al., 2008; [7], Markram et al., 2008; [8], Miyazaki et al., 2005; [9], Mooney et Varlinskaya, 2010; [10], Narita et al., 2002; [11], Roullet et al., 2010; [12], Sari et Zhou, 2004; [13], Schneider et al., 2005; [14], Schneider et al., 2008; [15], Tsujino et al., 2007; [16], Yochum et al., 2008; [17], Zhou et al., 2002; [18], Zhou et al., 2005

2.2.2.1. Rat traité à l’acide valproïque

L’idée de ce modèle animal pour étudier l’autisme est née de l’observation de cas d’autisme ayant pu être induits chez les enfants pendant la grossesse. En effet, l’exposition prénatale au VPA, un antiépileptique, semble être à l’origine d’un nombre accru de naissances d’enfants autistes. Ce modèle a donc l’intérêt de se rapprocher d’une étiologie possible de l’autisme, et de mimer le développement de la pathologie.

80 Fenêtre d’exposition :

Parmi les études d’enfants exposés au VPA pendant la grossesse, il est possible de déduire que le VPA est susceptible d'entraîner des cas d'autisme pendant le premier trimestre de la grossesse (pour revue voir Arndt et al., 2005 ; Rice et Barone, 2000). Certains enfants autistes exposés avant la naissance au VPA avaient des malformations des membres indiquant une anomalie du développement intervenant au début de l'embryogénèse.

De plus, les modèles animaux ont montré qu'une exposition unique au VPA à un stade précoce de l'embryogenèse (pendant la période de la neurulation, entre E8 à E11 chez le rat, ce qui correspond à la fenêtre 18-30 ème jour chez l’homme) cause d’importantes anomalies comportementales chez les ratons mâles comparables à la symptomatologie autistique (Dufour-Rainfray et al., 2010, annexe 5 ; Markram et al., 2008. Schneider et Przewlocki, 2005 ; Schneider et al., 2008).

A cette période s’effectue également la production des premiers neurones formant les noyaux des nerfs crâniens moteurs. Or, l’exposition au VPA entre le 20 ème et le 24 ème jour de la grossesse entraîne chez l’enfant une diminution du nombre de neurones au niveau du cervelet et dans les noyaux des nerfs crâniens III (oculomoteur), V (trijumeau), VI (moteur oculaire externe), VII (facial), XII (hypoglosse) (Miller et al., 2005).

Nombre de jours après la fécondation chez le rat

0 8 11 14 16 18 Nombre de jours après la fécondation chez l'homme 0 10 20 30 40 50 60 Acide valproïque Thalidomide

Figure 20 : Période d’expositions aux tératogènes pouvant entrainer des cas d’autisme. Périodes possibles (bandes hachurées) et probables (bandes pleines) pendant lesquelles une exposition prénatale à un tératogène peut causer des cas d’autisme (Dufour-Rainfray et al., 2011)

81 Études comportementales :

Les études comportementales des rats exposés au VPA ont montré une diminution de la sensibilité à la douleur, une plus grande sensibilité aux stimuli non douloureux, une baisse de l’activité d’exploration, une diminution des comportements sociaux (Roullet et al., 2010 ; Schneider et al., 2001 ; Schneider et Przewlocki, 2005).

Étude du système sérotoninergique :

Des travaux ont montré que l’administration de VPA des rates gestantes (embryons de 9 jours) entraîne une augmentation de la concentration en sérotonine chez la progéniture au niveau du cortex frontal (Tsujino et al., 2007), ou au niveau du plasma, de l’hippocampe et du cervelet, sans modification dans le cortex (Narita et al., 2002).

La même équipe a ensuite montré que le VPA perturbait le développement du système sérotoninergique central : l’administration de VPA (800 mg/kg) à des rates Wistar gestantes (embryons de 9 jours) entraîne un changement de la distribution des neurones sérotoninergiques dans le noyau du Raphé dorsal observé chez les ratons alors âgés de 50 jours. L’hypothèse émise est une anomalie de la différenciation et de la migration des neurones sérotoninergiques (l’administration ayant lieu avant la fermeture du tube neural des embryons) s’apparentant à un retard de la maturation des cellules sérotoninergiques sans mort des progéniteurs (Miyazaki et al., 2005).

Une autre équipe a également observé des anomalies de migration des neurones sérotoninergiques dans le cerveau d’embryons de ratons de 16 jours exposés au VPA à 11 jours de la gestation (Kuwagata et al., 2009).

2.2.2.2. Rat exposé à la thalidomide

Ce modèle animal est également né de l’observation de cas d’autisme ayant pu être induits chez les enfants par des intoxications des mères pendant leurs grossesses. En effet, la thalidomide, développée à la fin des années 50 pour soulager les femmes enceintes des

82 nausées fréquentes au cours des premiers mois, a été à l’origine d’un nombre accru de malformations congénitales chez les enfants et une possible augmentation de l’incidence d’autisme.

Des modèles animaux ont donc été développés. Cependant, ce modèle animal est moins pertinent que le modèle d’exposition au VPA, car certains effets de la thalidomide chez les rongeurs sont différents de leurs effets chez les primates (Schumacher et al., 1968). À notre connaissance, aucune étude n'a analysé le comportement social des animaux à l'aide de tests discriminatoires pour la symptomatologie autistique. Vorhees et al. (2001) ont montré que l'exposition prénatale à la thalidomide induisait des différences dans l'apprentissage. Les travaux de Narita et collaborateurs (2002) ont montré que l’administration par voie orale de thalidomide (500 mg/kg) à des rates Sprague-Dawley gestantes (embryons de 9 jours) entraîne une augmentation de la concentration en sérotonine chez la progéniture dans le plasma et l’hippocampe, comme cette même équipe l’avait montré après une administration de VPA.

Cette équipe a également montré que la thalidomide perturbait le développement du système sérotoninergique central : l’administration par voie orale de thalidomide (500 mg/kg) à des rates Wistar gestantes (embryons de 9 jours) entraîne un changement de la distribution des neurones sérotoninergiques dans le noyau du Raphé dorsal observé chez les ratons alors âgés de 50 jours. L’hypothèse émise est, comme dans le cas d’une administration de VPA, une anomalie de la différenciation et de la migration des neurones sérotoninergiques s’apparentant à un retard de la maturation des cellules sérotoninergiques sans mort des progéniteurs (Miyazaki et al., 2005).

83 Deuxième partie : Hypothèses et Stratégie de recherche

84 2ème partie : Hypothèses et stratégies de recherche

Dans l’autisme, des facteurs environnementaux intervenant durant la période prénatale peuvent modifier le développement normal (effets précoces) et entraîner des altérations cliniques apparaissant plus tard dans la vie (effets tardifs).

Effets tardifs Facteurs génétiques affectant le système et environnementaux Effets précoces sérotoninergique multiples

Affectant l’expression de

gènes, le devenir de cellules... Marqueurs potentiels

Notre hypothèse est que certains cas d’autisme pourraient être dus à une perturbation précoce au cours de l’embryogénèse entrainant des modifications à long terme notamment du système sérotoninergique. Certaines modifications de ce système, telles que les taux de sérotonine et de transporteurs de la sérotonine (SERT), pourraient être des marqueurs potentiels de l’autisme.

Pour tester cette hypothèse, nous avons eu recours à deux modèles d'étude :

- la plaquette sanguine humaine. Celle-ci présente l’avantage d’être un modèle humain et de permettre l’analyse des taux de sérotonine ainsi que la densité et l’affinité des SERT dans la pathologie autistique. Cependant, ce modèle ne rend pas directement compte d’altérations centrales.

- un modèle animal d’étude de l’autisme : le rat exposé en prénatal au VPA. Celui-ci présente les avantages, notamment, de permettre d’effectuer des prélèvements cérébraux et d’analyser des altérations centrales pouvant ouvrir des perspectives d’explorations chez l’homme. Néanmoins, le rongeur reste un modèle éloigné de l’homme et ne peut remplacer les études chez ce dernier.

85 Troisième partie : Matériels et méthodes

86 1. Outils d’exploration in vitro/ex vivo du SERT

1.1. Radiomarquage du [3H]-MADAM

Principe du radiomarquage

La radiosynthèse s’effectue à partir du précurseur déméthylé du MADAM : le 3 DesméthylMADAM (synthèse réalisée par notre équipe) et d’iodure de méthyle [ H]-ICH 3.

Ce radiomarquage consiste en une substitution nucléophile d’un hydrogène de l’amine secondaire par un méthyle avec élimination d’acide hydriodique HI. Nous considérons que le méthyle ne se fixe que sur l’amine secondaire car l’amine aromatique a son doublet conjugué dans le cycle aromatique (effet mésomère) la rendant moins nucléophile donc non réactive.

Le DesméthylMADAM est dilué dans le DMF (DiMéthylFormamide) car c’est un solvant polaire dont le point d’ébullition est 160°C, ce qui évite l’évaporation lors du chauffage à 90°C.

La séparation s’effectue par HPLC sur une colonne C18 phase inverse avec une phase mobile peu polaire. Le précurseur non radiomarqué possède une amine aliphatique secondaire plus polaire que le MADAM dont l’amine aliphatique est tertiaire, il est peu retenu sur la colonne ce qui permet la séparation.

Mode opératoire du radiomarquage

Le radiomarquage s’effectue à partir d’une activité de 37 MBq d’ICH 3 à laquelle sont ajoutés 200 µL de DesméthylMADAM dilué dans le DMF. L’incubation s’effectue en plaçant le flacon de marquage dans le bain-marie sec à 90°C pendant 15 minutes, puis la réaction est stoppée en plaçant le flacon de marquage dans la glace.

La solution est purifiée par HPLC (Beckman USA) en phase inverse (colonne C18 µbondapak ; 7,8x300mm semi-préparative ; Waters) à un débit de 5 mL/min (phase mobile

87 acétonitrile/acétate d’ammonium 0,1M (30:70)). L’éluat est collecté toutes les 2 minutes. Un aliquot de 20 µL de chaque prélèvement est introduit dans une fiole à scintillation auquel sont ajoutés 6 mL de liquide scintillant (Optiphase) afin de compter l’activité de chaque fiole et de collecter la fraction correspondant au produit marqué (compteur β LKB 1215 Rackbeta ; Perkin Elmer).

Le produit marqué est ensuite concentré à l’aide d’une colonne Sep Pak (C18 Waters) pour être récupéré dans 2 mL d'éthanol 95% injectable.

Un aliquot de 5 µL est utilisé pour le contrôle tandis que le produit marqué est conservé à – 20°C.

Mode opératoire du contrôle de la solution finale par co-injection

Cent µL de MADAM non marqué sont ajoutés à l’aliquot de 5 µL de solution finale de MADAM préalablement déposé dans un flacon pour le contrôle.

Le mélange est injecté dans le système HPLC (Beckman USA) en utilisant une colonne analytique en phase inverse (C18 µbondapak 3,9x150mm ; Waters) à un débit de 1,5 mL/min (phase mobile acétonitrile/acétate d’ammonium 0,1M (30:70)). L’éluat est collecté toutes les minutes. Un aliquot de 10 µL de chaque prélèvement est introduit dans une fiole à scintillation auquel sont ajoutés 6 mL de liquide scintillant (Optiphase) afin de compter l’activité de chaque fiole et de comparer les temps de rétention obtenus en détection UV et radioactive (compteur β LKB 1215 Rackbeta ; Perkin Elmer) pour valider le radiomarquage.

Activité spécifique :

L’activité spécifique du [ 3H]-MADAM est estimée égale à celle du iodure de méthyle tritié (85 Ci/mmol) puisqu’une molécule d’iodure de méthyle tritié se fixe sur une molécule du précurseur desméthylMADAM.

88 1.2. Radiomarquage de l’[125 I]-ADAM

La radiosynthèse s’effectue à partir du précurseur stannique de l’ADAM (synthèse réalisée 125 par notre équipe) et d’iodure de sodium Na I par substitution électrophile.

Mode opératoire du radiomarquage

Le radiomarquage s’effectue à partir d’une activité 16 MBq de NaI 125 à laquelle sont ajoutés 50 µg de précurseur stannique dilué dans 100 µL d’éthanol absolu, et 25 µL chloramine T (100µg/50µL HCl 1N) comme agent oxydant. L’incubation s’effectue à température ambiante pendant 25 min, puis la réaction est stoppée en ajoutant 50 µL de métabisulfite de sodium (Na 2S2O5 50 mM). La solution est purifiée par HPLC (Beckman USA) en phase inverse (colonne C18 analytique phase inverse Hamilton PRP-1 à un débit de 1 mL/min (phase mobile acétonitrile/eau/ammoniaque 90/9,9/0,1 (v/v)). L’éluat correspondant à l’125 I-ADAM est collecté et l’activité recueillie est comptée (compteur γ Cobra II; Canberra-Packard). Le produit marqué est ensuite concentré à l’aide d’une colonne Sep Pak (C18 Waters) pour être récupéré dans 2 mL d'éthanol 95% injectable.

Un aliquot de 100 µL est utilisé pour le contrôle tandis que le produit marqué est conservé à –20°C.

Mode opératoire du contrôle de la solution finale par co-injection

Cent µL d’I-ADAM non marqué (solution éthanolique non radiomarquée synthétisée par notre équipe) sont ajoutés à l’aliquot de 100 µL de solution finale d’ 125 I-ADAM.

Le mélange est injecté dans le système HPLC (Beckman USA) en utilisant une colonne analytique en phase inverse (colonne C18 analytique Hamilton PRP-1) à un débit de 1 mL/min (phase mobile acétonitrile/eau/ammoniaque 90/9,9/0,1 (v/v)).

89 Les temps de rétention obtenus en détection UV et radioactive sont comparés afin de valider le radiomarquage.

Activité spécifique : L’activité spécifique de l’ 125 I-ADAM est estimée égale à celle de l’iodure de sodium (85 Ci/mmol) utilisé pour le marquage.

90 2. Modèle périphérique humain : la plaquette sanguine

2.1. Recrutement des patients et données cliniques

Dans ce modèle périphérique, notre objectif était de réaliser une étude associant un dosage de la sérotonine plaquettaire et la quantification de la densité et de l’affinité des SERT, à l’aide d’un ligand radiomarqué le [ 3H]-MADAM, chez des enfants avec autisme.

L’étude a porté sur 17 sujets :

- 3 enfants autistes, âgés de 8 à 21 ans, 3 garçons.

- 9 apparentés aux enfants autistes, âgés de 11 à 52 ans (moyenne = 40,3 ± 12,6 ans), 4 hommes et 5 femmes.

- 5 sujets sains non apparentés à un sujet autiste, âgés de 27 à 52 ans (moyenne = 38,3 ± 10,3 ans), 2 hommes et 3 femmes

Les enfants avec autisme sont recrutés à la consultation spécialisée de pédopsychiatrie du service d’Explorations Fonctionnelles et Neurophysiologie en Pédopsychiatrie du Pr Barthélémy, au CHU de Tours. Les enfants, recrutés selon les critères DSM-IV, sont examinés par un psychiatre et un psychologue qui réalisent : un examen psychiatrique, un examen pédiatrique (courbe de périmètre crânien, signes dysmorphiques mineurs, signes neurologiques mineurs), une évaluation neuropsychologique, une évaluation du langage et de la communication. Ces explorations cliniques sont cotées pour définir des sous-groupes cliniquement homogènes de patients. L’étude est réalisée chez l’enfant autiste et chez ses apparentés du 1 er degré (parents, frères et sœurs) afin de constater si les modifications éventuellement observées chez l’enfant autiste sont aussi présentes chez ses apparentés.

Les sujets sains n’ont pas fait l’objet d’exploration clinique, et ne sont pas appariés aux patients.

91 2.2. Dosage de la sérotonine intra plaquettaire

Une numération des plaquettes sanguines est réalisée pour chaque prélèvement (Compteur Counter LH750 analyser). Puis, le prélèvement sanguin est centrifugé (150 g, 15 min à température ambiante). Le plasma riche en plaquette (PRP) est recueilli et congelé.

Le dosage par HPLC de la sérotonine intraplaquettaire est effectué sur le PRP congelé selon le mode opératoire suivant :

Les échantillons de PRP sont purifiés sur colonne d’Amberlite. Le prélèvement est ensuite analysé par HPLC (TSP; colonne C18 Waters phase inverse 3,9x300mm; phase mobile acétate d’ammonium pH 5,0 /méthanol (85:15); débit : 0,5 mL/min).

Le résultat du dosage est rendu, en tenant compte de la numération plaquettaire, en amol/plaquette (= nmol/10 9 plaquettes).

2.3. Étude de la densité et de l’affinité des SERT plaquettaires

2.3.1. Préparation des solutions de réaction

Tampons :

Tampon de lavage : 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,45 Tampon de lyse : 5 mM EDTA, 5 mM Tris, pH 7,45 Tampon d’incubation : 50mM Tris, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, pH 7,45

Solution mère de [ 3H]-MADAM de concentration 1,5 nM, puis réalisation de 7 dilutions successives dans du tampon d’incubation.

Solution de paroxétine de concentration finale 10 -6 M

92 2.3.2. Préparation des membranes plaquettaires

Un prélèvement d’un échantillon de 30 mL de sang veineux recueilli dans des tubes EDTA est nécessaire à l’étude.

L’échantillon sanguin est rapidement centrifugé (150 g, 15 min à température ambiante) pour obtenir un plasma riche en plaquettes (PRP).

Un aliquot d’1 mL de PRP est congelé pour le dosage de la sérotonine.

Le reste du PRP est centrifugé (10 000 g, 10 min à 4°C) pour obtenir un culot plaquettaire. Le culot est lavé avec 8 mL de tampon de lavage, puis centrifugé (10 000 g, 10 min à 4°C).

Les plaquettes sont lysées en ajoutant 8 mL de tampon de lyse, puis homogénéisées (ultraturrax) et centrigugées (30 000 g, 15 min à 4°C). Cette étape est renouvellée, puis le culot est mis en suspension dans 2 mL de tampon d’incubation.

2.3.3. Dosage des protéines

La concentration protéique de la suspension de membranes plaquettaires est mesurée en utilisant l’albumine sérique bovine comme standard (Réactif coloré Biorad, spectronic 20 Genesys). Les dosages protéiques sont réalisés en double, en diluant 50 µL de la suspension de membranes plaquettaires dans 5 mL de réactif coloré Biorad dilué au cinquième. La mesure de la DO s’effectue à 595 nm. La concentration en protéines correspondant à la DO mesurée est calculée grâce à une courbe d’étalonnage préalablement réalisée.

93 2.3.4. Études de la liaison du MADAM sur le SERT

Les études de liaison sont réalisées sur 8 concentrations en [ 3H]-MADAM. Chaque essai est dupliqué.

Dans chaque tube, sont mis successivement :

- 100 µL de tampon d’incubation,

- 100 µL de tampon d’incubation ou de paroxétine 10 -6 M,

- 100 µL de solution de [ 3H]-MADAM aux différentes concentrations,

- 200 µL de suspension de membranes plaquettaires (30 µg de protéines).

Les tubes sont incubés 1h30 à 20°C, puis la suspension est filtrée (GF/C Whatman, 25 mm de diamètre) à travers des filtres papier prétraités dans du tampon d’incubation froid avec 0,05% de polyéthylènimine. Les filtres sont déposés dans des fioles à scintillation dans lesquelles sont ajoutés 6 mL de scintillant (optiphase).

Parallèlement les étalons sont préparés : 100 µL de solution de MADAM tritié aux différentes concentrations auxquels sont ajoutés 6 mL de scintillant.

L’activité contenue dans chaque fiole est comptée au moyen d’un compteur ß (LKB 1215 Rackbeta ; Perkin Elmer, France).

Les résultats sont analysés avec le programme EBDA RADLIG.

94 3. Modèle animal : le rat exposé au VPA

3.1. Animaux et conditions d’élevage

Nous avons utilisé une souche non consanguine : les rats Wistar. Les femelles gestantes ont été achetées chez CERJ Janvier (Le Genest, France). Elles ont été reçues au 6 ème jour de la gestation soit trois jours avant l’intoxication au VPA. Les rates sont installées dans des cages individuelles, la température de la pièce est réglée à 22 ± 2°C, l’hygrométrie est contrôlée (45–65%), la nourriture et l’eau sont en libre accès. Les jeunes rats sont sevrés au 21 ème jour de vie. Les expérimentations sur les animaux ont été menées en accord avec les directives de la commission de la Communauté Européenne (86/609/EEC). Les animaux utilisés pour les tests comportementaux ont été placés en lumière inversée (éclairage de 20h à 8h) afin que les tests se déroulent pendant la période sans éclairage, période où les animaux sont actifs. Les autres animaux ont été placés en cycle normal de lumière (éclairage de 8h à 20h).

3.2. Expérimentation animale

3.2.1. Schéma expérimental

G0 G6 G9 G21 P5 0 Temps = (jours) P0

Insémination des rates Réception des rates

Intoxication au VPA Mise bas Sacrifices

Suivi du poids des femelles Suivi du poids des ratons Etudes neurochimiques et tests comportementaux

Légende : G = gestation P = jour post-natal- 95 3.2.2. Intoxication des rates au VPA

L’acide valproïque (2-propylpentanoate de sodium C 8H15 NaO 2 ; Sigma P4543) est dissous dans du NaCl 0,9% injectable (laboratoire Aguettant) dans un flacon stérile, pour obtenir une solution à 250 mg/mL.

Lots de rates gestantes VPA : la solution d’acide valproïque est injectée à la dose de 600 mg/kg en intra péritonéal au 9 ème jour de gestation avec une seringue de 1 mL.

Lots de rates gestantes témoins : 0,7 mL d’une solution de NaCl 0,9% injectable est injectée en intra péritonéal au 9 ème jour de gestation (volume comparable au VPA).

3.2.3. Calendrier des expérimentations

Après la mise bas (P2), nous mesurons le sex-ratio, et nous égalisons le nombre de petits par portée (afin que les rats grandissent dans les mêmes conditions). Les mâles sont gardés préférentiellement, puisque les expérimentations sont menées sur la progéniture mâle. Pour mener l’ensemble des expérimentations, 2 séries d’expositions ont été réalisées. Lors de la 1ère série, 12 femelles ont été utilisées (6 VPA et 6 témoins). Les ratons ont permis de procéder aux études comportementales, aux dosages des monoamines ainsi qu’aux études de liaison in vitro du SERT. Lors de la 2 ère série, 20 femelles ont été utilisées (10 VPA et 10 témoins). Les ratons ont permis de procéder aux études de liaison ex vivo du SERT, ainsi qu’aux études en cours (expression du gène du SERT).

Les différentes études sont réalisées sur la progéniture mâle selon le calendrier suivant :

96 Type d’études Age (en jours) Études du Film du regroupement 2 ; 7 et 20 comportement Test du retournement 7 Démarche 10 ; 11 ; 12 ; 17 et 20 Géotaxie négative 20° 10 ; 11 et 12 Géotaxie négative 45° 10 ; 11 et 12 Ouverture des yeux 16 Déplissage des oreilles 16 Stimulation tactile oreilles 16 et 17 Tonus 24 Sociabilité (1 rat inconnu) 28 Piscine de Morris 37 Sociabilité (1 rat connu / 1 rat 31 inconnu) Reconnaissance sociale 48 Études neurochimiques Dosage des monoamines 50 Étude de la densité de SERT 50 Étude d’expression du gène du 50 SERT

Tableau 4 : Calendrier des tests comportementaux et neurochimiques

3.2.4. Sacrifices

Les rats sont sacrifiés au 50 ème jour de vie par décapitation (excepté ceux destinés à la reproduction). Les cerveaux sont ensuite prélevés et préparés selon l’expérimentation.

97 3.3. Étude comportementale

3.3.1. Suivi du développement

Ces observations sont réalisées dans le but d’étudier les effets potentiels de l’exposition au VPA sur le développement de la progéniture.

3.3.1.1. Suivi du poids

Les rates sont pesées tous les 2 à 3 jours pendant la gestation. Puis, les ratons sont pesés tous les 2 à 3 jours de leur naissance jusqu’au sacrifice.

3.3.1.2. Observation de l’ouverture des yeux

Au 16 ème jour de vie, nous observons l'ouverture des yeux chez chaque rat. Nous attribuons un score de 0 lorsque les yeux sont clos, un score de 1 lorsqu’un seul œil est ouvert, un score de 2 lorsque les deux yeux sont ouverts.

3.3.1.3. Observation du déplissage des oreilles

Au 16 ème jour de vie, nous observons le déplissage des oreilles chez chaque rat.

98 3.3.2. Tests explorant le développement moteur

3.3.2.1. Retournement

Au 7 ème jour de vie, nous plaçons le rat sur le dos, puis nous mesurons le temps qu'il met pour se remettre sur ses pattes.

3.3.2.2. Démarche

Du 10 ème au 20 ème jour de vie, nous plaçons l'animal au centre d'un cercle de 13 cm de diamètre tracé sur un support de papier blanc. Nous mesurons le temps mis par l'animal pour sortir les deux pattes antérieures du cercle et le temps mis pour sortir entièrement du cercle. Si les rats ne sont pas sortis du cercle au bout de 120 s, le test est arrêté et le temps maximal est attribué. Les données sont donc censurées à 120 s. Le test est répété sur plusieurs jours afin de suivre la progression des rats.

Figure 21 : Raton de 10 jours, au cours du test de démarche

99 3.3.2.3. Géotaxie négative

L’animal est installé au centre d’un plan incliné grillagé, la tête en bas. Nous notons le temps mis par l’animal pour se retourner de 180°, puis le temps nécessaire pour atteindre le bord supérieur du plan incliné.

Le test est réalisé du 10 ème au 12 ème jour. Pour la géotaxie à 20°, le plan est incliné de 20°, il mesure 23 cm de long et 14 cm de large. Pour la géotaxie à 45°, le plan est incliné de 45°, il mesure 21 cm de long et 14 cm de large.

Les données sont censurées respectivement à 120 et 60 s.

Ce test explore la fonction vestibulaire et le développement moteur (Kahne, 2002 ; Schneider et Przewlocki, 2005).

Figure 22 : Ratons de 12 jours, au cours du test de géotaxie négative à 20°

Figure 23 : Ratons de 12 jours, au cours du test de géotaxie négative à 45°

100 3.3.2.4. Tonus musculaire

Nous avons testé le tonus musculaire des rats au 24ème jour de vie. Le rat est suspendu par les pattes avant à un fil tendu à 25 cm de hauteur. Nous mesurons la durée pendant laquelle l’animal s'accroche au fil. Les données ne sont pas censurées.

Figure 24 : Raton de 24 jours, au cours du test du tonus

3.3.3. Test explorant la réponse à une stimulation tactile

Aux 16 ème et 17 ème jours, nous effleurons l'extrémité des oreilles à l'aide d'un coton-tige. La réponse (évitement du stimulus, tremblements des oreilles) est codée en forte, faible ou nulle. Il s’agit d’étudier la réponse à un stimulus non douloureux.

3.3.4. Tests explorant le comportement social

Les tests explorant le comportement social ont été choisis de façon à observer trois aspects de la symptomatologie autistique : l’altération des interactions sociales, l’augmentation des comportements stéréotypés et le retard d’apprentissage (Belzung et al., 2005).

101 3.3.4.1. Films du regroupement

Aux 2 ème , 7 ème et 20 ème jours de vie, nous filmons les ratons dans leurs cages sur des séquences de 5 min par cage. Nous souhaitons à travers ces films repérer des comportements distinctifs des ratons, en particulier des stéréotypies. Lors des films tournés au 2 ème jour, la mère est présente dans la cage, aux autres dates la mère est retirée afin de s’affranchir du comportement maternel. La caméra fixée sur un pied est placée au dessus de la cage plusieurs minutes avant le début de l’enregistrement afin de ne pas enregistrer l’agitation des rats créée par nos mouvements.

3.3.4.2. Test de sociabilité

Figure 25 : Dispositif pour le test de sociabilité à l’égard d’un rat inconnu

Le test se déroule dans une cage à trois compartiments communicants. Dans les compartiments des extrémités, une cage grillagée permet de placer des rats. L’animal à tester est placé dans le compartiment central (Crawley, 2004). Avant le test, chaque rat effectue un repérage du dispositif (pendant 3 min) sans la présence d’autres rats. Ce repérage a pour but de s’affranchir de la capacité d’exploration du dispositif dans la mesure de la socialisation. Le dispositif est nettoyé entre chaque rat afin de supprimer les odeurs du rat précédent.

102 Sociabilité à l’égard d’un rat inconnu

Ce test est effectué au 28 ème jour de vie. Un rat inconnu du rat à tester (rat d’une autre portée) est placé dans la cage grillagée située dans le compartiment de droite noté « R », le compartiment gauche noté « V » est vide. Le rat à tester est placé dans le compartiment central noté « I », puis chaque changement de compartiment est enregistré pendant 3 min.

Ce test a pour but d’observer le comportement d’un rat auquel est proposé le choix entre un compartiment vide et un compartiment habité par un rat inconnu.

Sociabilité à l’égard d’un rat connu et d’un rat inconnu

Ce test est effectué au 31 ème jour de vie. Un rat inconnu du rat à tester (rat d’une autre portée) est placé dans la cage grillagée située dans le compartiment de droite noté « R », un rat connu du rat à tester (rat de la même portée) est placé dans la cage grillagée située dans le compartiment de gauche noté « C ». Le rat à tester est placé dans le compartiment central noté « I », puis chaque changement de compartiment est enregistré pendant 3 min.

Le but est d’observer le comportement d’un rat auquel est proposé le choix entre des compartiments habités par des rats inconnu et connu, le seul compartiment vide est alors le compartiment initial. Nous nous sommes également intéressés au pourcentage du temps passé dans le compartiment central dans lequel les rats sont placés initialement afin de comparer l’activité d’exploration des rats.

3.3.4.3. Test de reconnaissance sociale

Au 48 ème jour, nous observons l’interaction s’établissant entre deux rats qui ne se connaissent pas, au cours de deux rencontres successives. Le test se déroule en deux étapes : tout d’abord le rat à tester est placé avec un rat inconnu (rat d’une autre portée), nous mesurons le temps où le rat à tester est au contact de l’autre rat sur une durée de 3 min. Puis, nous replaçons le rat à tester dans sa cage. Une heure après, nous remettons le rat à tester au contact du même rat qu’à la 1 ère étape, et nous mesurons à nouveau le temps

103 où le rat à tester est au contact de l’autre rat sur une durée de 3 min. Nous regardons par ce test, le temps passé par les rats au contact d’un rat déjà connu.

3.3.5. Test explorant l’apprentissage, le repérage et la capacité d’adaptation : la piscine de Morris

Ce test est réalisé au 37 ème jour de vie. Une piscine de 90 cm de diamètre et 30 cm de hauteur « divisée » en quartiers (D, H, G, B) est remplie d'une hauteur d'eau de 14 cm. L'eau est rendue opaque par des billes de plastique noires. Des repères spatiaux sont placés autours de la piscine (lampe au repère B, rideau noir et blanc au repère D, caméra sur pied au repère G, expérimentateur au repère H). Une plate-forme carrée de 5 cm de côté est placée dans le quartier D de la piscine. Les températures de l'eau et de la pièce d'expérimentation sont de 22°C.

Figure 26 : Test de la piscine de Morris

104 Le test se déroule en quatre phases :

Phase de "Familiarisation" :

L'animal se familiarise avec le dispositif, la plate-forme est apparente (placée 1 cm au dessus du niveau de l’eau). L’animal est placé sur la plate-forme pendant 1 min. Si le rat saute dans l’eau il est replacé sur la plate forme.

Ensuite, le rat est placé dans l'eau dans le quartier H (tête orientée vers le centre de la piscine). Nous mesurons le temps mis par le rat pour remonter sur la plate-forme. S’il ne l’a pas trouvée dans un délai de 60 s, nous le guidons vers cette plate-forme. Le rat est laissé 60 s sur la plate-forme. De la même façon, le rat est remis dans l'eau dans le quartier G puis B, chaque fois nous mesurons le temps mis par le rat pour remonter sur la plate- forme. A la fin de cette phase de familiarisation, le rat est séché et remis dans sa cage.

Phase d'"Habituation 1" :

La plate-forme n’est plus visible pour le rat, elle est placée 1 cm sous le niveau de l’eau. Cette phase a lieu 1 h après la phase de familiarisation. Le rat est de nouveau placé 1 min sur la plate-forme immergée. Le déroulement du test est ensuite identique à celui de la phase de familiarisation. Seul l’ordre des départs varie (quartier G puis H puis B). A la fin de cette phase d'habituation 1, le rat est séché et remis dans sa cage.

Phase d'"Habituation 2" :

Une heure après l'habituation 1, le rat effectue le même exercice, à nouveau l’ordre des passages varie (quartier B puis G puis H).

Phase "sans plate-forme" :

La plate-forme est retirée de la piscine. 1 h après la phase d'habituation 2, le rat est placé dans l'eau au centre de la piscine (tête dirigée vers le centre). Le rat est filmé pendant 60 s. Le temps passé dans chaque quartier est calculé à partir du film.

Ce test explore l'adaptation aux changements, le repérage dans l'espace et l'apprentissage (Crawley, 2004).

105 3.4. Dosage des monoamines

3.4.1. Préparation des cerveaux destinés au dosage des monoamines

Avant le sacrifice au 50 ème jour de vie, un prélèvement intracardiaque est réalisé pour le dosage de la sérotonine plaquettaire.

Les cerveaux sont pesés, puis disséqués pour prélever le cortex frontal, l’hippocampe et le cervelet. Chaque région cérébrale est pesée puis 500 µL de tampon sont ajoutés (eau ultra pure 250 mL ; acide perchlorique 12 M 1,5 mL ; EDTA 10 mg ; acide octane sulfonique 160 mg ; acide heptane sulfonique 150 mg ; Sodium disulfite 25 mg). Le prélèvement est homogénéisé à l’ultraturrax en maintenant le tube dans la glace pilée. Le tube est centrifugé à 30 000 g à 4°C pendant 20 min. Le surnageant est récupéré dans un tube et stocké à -80°C jusqu’au dosage HPLC, tandis que le culot est conservé pour le dosage des protéines.

3.4.2. Dosage des monoamines cérébrales

Le dosage des monoamines cérébrales est fait par HPLC couplée à une détection électrochimique. Les surnageants préalablement préparés à partir des régions cérébrales, sont décongelés, puis dilués (les cortex sont dilués au quart, les hippocampes et les cervelets sont dilués au demi).

Conditions d’élution :

- HPLC (Beckman USA), colonne analytique catécholamines HB 3µm (Phymep), 100x3.2 mm

106 - phase mobile : 6% acétonitrile, 6% méthanol and 88% (20 mM acide citrique, 10 mM phosphate de sodium monobasique, 3,25 mM acide octane sulfonique, 3 mM acide heptane sulfonique, 0,1 mM EDTA, 2 mM KCl, 6 mL/L acide o-phosphorique, 2 mL/L diéthylamide, pH 3)

- débit : 0,4 mL/min

- Sensibilité : 10 nA ; Potentiel : 0.61 V ; Pression : 1 kPSI

Le sang de ces rats est prélevé au préalable afin de doser la sérotonine plaquettaire et de comparer chez les mêmes animaux les taux de sérotonine centraux et périphériques.

3.4.3. Dosage de la sérotonine intra plaquettaire

Le dosage de la sérotonine est fait par HPLC couplée à une détection électrochimique selon le mode opératoire suivant :

Préparation du plasma riche en plaquettes (PRP) :

- Prélèvement intracardiaque à l’aide d’une seringue contenant de 0,5 mL d’EDTA 0,15M pour 10 mL de sang. Agitation manuelle douce,

- Obtention du PRP par centrifugation lente à 150 g, 15 min à température ambiante,

- Récupération du PRP et congélation du PRP jusqu’au dosage.

107 Préparation de l’échantillon :

- 100 µL de PRP sont précipités par l’ajout de 100µL d’agent précipitant (Precipitation Reagent, référence 3035, Chromsystems, Germany),

- 100 µL d’étalon interne sont ajoutés (Internal Standard, référence 3034, Chromsystems, Germany),

Conditions d’élution :

- HPLC (EC 2000, Thermoelectron corporation),

- Colonne analytique (HPLC column for HPLC analysis of serotonin, référence 3130, Chromsystems, Germany),

- Phase mobile (mobile phase for HPLC analysis of serotonin, référence 3031, Chromsystems, Germany),

- Débit : 0,3 mL/min

- Sensibilité : 20 nA ; Potentiel : 0,40 V

3.5. Étude de la densité de SERT

3.5.1. Étude de la densité de SERT in vitro

3.5.1.1. Préparation des cerveaux

Les cerveaux sont plongés quelques secondes dans un bain d’isopentane refroidi à -35°C par de la carboglace. Ensuite, ils sont placés dans la carboglace avant d’être congelés à - 80°C. Les coupes de 20µm sont réalisées à l’aide d’un cryotome maintenu à -21°C (Jung CM3000 Leica, Rueil-Malmaison, France). Cent coupes sont prélevées par cerveau selon

108 l’atlas « The Rat Brain in Stereotaxie Coordinates » (Paxinos et Watson, 1986), le tableau suivant reprend les coupes en fonction du point bregma. Les coupes sont montées sur des lames gélatinées puis stockées à -80°C.

Position par rapport au point bregma Régions cérébrales correspondantes

5,20 Cortex préfrontal 4,20 Cortex frontal -2,12 Hippocampe, thalamus

-3,80 Hippocampe

-4,80 Hippocampe -7,64 Noyaux du Raphé -10 Cervelet

Tableau 5 : Tableau récapitulatif des coupes cérébrales selon le point bregma (Paxinos et Watson, 1986)

3.5.1.2. Mode opératoire de l’étude de la densité de SERT in vitro

Incubation - Sécher les lames à température ambiante sous la hotte - Déposer sur chaque coupe 100 µL de solution de [ 3H]-MADAM 500 pM (liaison totale) ou de [ 3H]-MADAM + citalopram 2µM (estimation de la liaison non spécifique) - Laisser incuber 60 min à température ambiante Lavage - Remplir les cuves de lavage avec 150 mL de tampon à 4°C - Égoutter chaque lame sur le papier absorbant et les placer dans les portoirs - Placer les portoirs dans les cuves de lavage pendant 5 min - Renouveler l’opération après avoir changé le tampon Rinçage - Remplir les cuves avec 150 mL d’eau distillée à 4°C - Rincer les lames en effectuant des mouvements pendant quelques secondes - Laisser sécher les lames une nuit sur les portoirs

109 Exposition - Disposer les lames dans les cassettes - Placer au centre une gamme tritiée (GE Healthcare) - A la lumière rouge, placer un film photographique sur les lames - Fermer les boîtes et les placer au réfrigérateur pendant 3 mois à l’obscurité

3.5.2. Étude de la densité de SERT ex vivo

3.5.2.1. Mode opératoire de l’étude de la densité de SERT ex vivo

- Anesthésier le rat (isoflurane) - Injecter l’ 125 I-ADAM par voie intraveineuse (veine du pénis) - Sacrifier le rat 1h après l’injection - Congeler rapidement les cerveaux dans un bain d’isopentane refroidi à -35°C par la carboglace - Conserver les cerveaux à -80°C - réaliser des coupes de 20µm montées sur des lames gélatinées selon le tableau suivant - Sécher les lames à température ambiante - Disposer les lames dans les cassettes - A la lumière rouge, placer un film photographique sur les lames - Fermer les boîtes et les placer pendant 3 semaines à l’obscurité

Position par rapport au point bregma Régions cérébrales correspondantes

4,20 Cortex frontal et cingulaire

-4,80 Hippocampe

-7,64 Noyaux du Raphé

Tableau 6 : Tableau récapitulatif des coupes cérébrales selon le point bregma (Paxinos et Watson, 1986)

110 3.6. Statistiques

Toutes les données quantitatives sont exprimées en moyenne +/- SEM (Somme des Écarts à la Moyenne). Les résultats sont analysés par des tests non paramétriques de Mann- Whitney, les effectifs étant faibles et les distributions non Gaussiennes (en particulier les tests aux données censurées). Les tests de sociabilité et la piscine de Morris sont analysés par un test de Wilcoxon sur séries appariées.

Le seuil de significativité est fixé à p<0,05.

111 Quatrième partie : Résultats

112 1. Outils d’exploration in vitro/ex vivo du SERT

1.1. Radiomarquage du [ 3H]-MADAM

Le [ 3H]-MADAM est un ligand spécifique du SERT qui peut être utilisé lors d’étude in vitro grâce au rayonnement β- émis par l’atome de tritium.

Ses bonnes spécificité et sélectivité vis-à-vis du SERT, ainsi que sa faible fixation non spécifique font de ce radioligand un outil de choix pour l’étude in vitro du SERT.

Le radiomarquage du [3H]-MADAM consiste en une substitution nucléophile d’un hydrogène par un méthyle tritié. Les rendements de marquage obtenus sont compris entre 50 et 60%. La pureté est satisfaisante, ce qui a permis d’envisager l’utilisation de ce radioligand pour l’exploration des SERT plaquettaires humains ainsi que pour l’exploration in vitro des SERT centraux dans le modèle animal d’étude de l’autisme.

Radiomarquage : Les chromatogrammes, obtenus en détection UV et radioactive (construits à partir des résultats des comptages en scintillation liquide), montrent le profil suivant : • en UV (254 nm) : - 35 min : desméthylMADAM 3 • en radioactivité : - 4 min : [ H]-ICH 3 libre - 78 min : [ 3H]-MADAM

Contrôle : La co-injection de [ 3H]-MADAM et de MADAM non marqué permet l’identification du produit, elle montre un pic, en détection UV et en détection radioactive (chromatogrammes construits à partir des résultats des comptages en scintillation liquide), de temps de rétention similaires de 9 minutes.

113

Figure 27 : Chromatogrammes du radiomarquage (détection radioactive) et du contrôle (détection radioactive et UV) de l'[ 3H]-MADAM

114 1.2. Radiomarquage de l’[ 125 I]-ADAM

L’[ 125 I]-ADAM est également un ligand spécifique du SERT. Celui-ci peut être utilisé lors d’étude ex vivo grâce au rayonnement X émis par l’atome d’iode 125.

Comme le MADAM, il possède de bonnes spécificité et sélectivité vis-à-vis du SERT, ainsi qu’une faible fixation non spécifique.

Le radiomarquage de l’[125 I]-ADAM consiste en une substitution électrophile du groupement stannique par l’iode 125. Les rendements de marquage sont d’environ 50%. La pureté est satisfaisante, ce qui permet d’envisager l’utilisation de ce radioligand pour l’exploration ex vivo des SERT centraux dans le modèle animal d’étude de l’autisme, expérimentation complémentaire de l’exploration in vitro .

Radiomarquage : Les chromatogrammes, obtenus en détection radioactive, montrent le profil suivant : - 3 min : [ 125 I] libres - 10 min : [ 125 I]-ADAM

120,00 9,815

100,00

80,00

mV 60,00 3,449

40,00

20,00

0,00

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 Minutes

Figure 28 : Chromatogramme du radiomarquage de l'[ 125 I]-ADAM

115

Contrôle : La co-injection de l’[ 125 I]-ADAM et de l’I-ADAM non marqué permet l’identification du produit. Elle montre un pic, en détection UV et radioactive, de temps de rétention similaires de 12 minutes.

12,00 11,935

10,00

8,00

mV 6,00

4,00

2,00

0,00

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 Minutes

Figure 29 : Chromatogramme du contrôle de pureté du [ 125 I]-ADAM (Détection radioactive)

2,00 11,591

1,80

1,60

1,40

1,20 AU 1,00

0,80

0,60

0,40

0,20

0,00

2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 Minutes

Figure 30 : Chromatogramme du contrôle de pureté du [ 125 I]-ADAM (Détection UV)

116 2. Modèle périphérique humain : la plaquette sanguine

Dans ce modèle périphérique humain, notre objectif était de réaliser une étude associant un dosage de la sérotonine plaquettaire et la quantification de la densité et de l’affinité des SERT chez des enfants avec autisme.

2.1. Dosage de la sérotonine intra plaquettaire

Les taux de sérotonine intra plaquettaire ont été dosés, par HPLC, chez des enfants avec autisme, chez leurs apparentés du 1 er degré (parents, frères et sœurs) et chez des sujets sains non apparentés à un sujet autiste.

Les résultats montrent que les taux de sérotonine intra plaquettaires ne diffèrent pas entre les autistes, leurs apparentés et les sujets sains.

4.5 4

3.5 3 2.5 2 Sérotonine 1.5 (amol/plaquettes) 1 0.5 0 Sujets sains Autistes Apparentés

Figure 31 : Comparaison du taux de sérotonine intra plaquettaire chez les sujets sains (n=5), les enfants autistes (n=3) et leurs apparentés (n=9). Les données sont les moyennes ± SEM.

117 2.2. Étude de la densité et de l’affinité des SERT plaquettaires

2.2.1. Étude de la liaison du MADAM sur le SERT

Les courbes de la saturation de la liaison du MADAM sur le SERT obtenues pour chaque étude de saturation peuvent être illustrées par la figure suivante :

SB B (10 -12 M) Liaison MADAM / SERT TB

25 NSB

20

15

10

5

0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 T (10 -12 M)

Figure 32 : Courbes de saturation de la liaison du MADAM sur le SERT. T = ligand ajouté, B = sites liés, SB = liaison spécifique, TB = liaison totale, NSB = liaison non spécifique. Les concentrations sont en 10 -12 M.

La liaison totale (TB) est composée de la liaison spécifique (SB) qui sature à une concentration de ligand de 10.10 -12 M, et de la liaison non spécifique (NSB) non saturable.

118 2.2.2. Transformation de Scatchard

La transformation de Scatchard des données brutes permet de linéariser l’hyperbole précédemment obtenue. Le principe est de porter en ordonnée le rapport entre les fractions spécifiquement liée (SB) et libre (F), et de porter en abscisse la fraction liée (B).

La pente de la droite ainsi obtenue a pour équation -1/Kd, ce qui permet d’en déduire la constante de dissociation Kd. L’abscisse à l’origne correspond à Bmax, le nombre de site de liaison.

Les transformations obtenues pour chaque expérimentation peuvent être illustrées par la figure suivante :

Scatchard SB/F 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02

0,01 0,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00

B (10 -12 M)

Figure 33 : Transformation de Scatchard de la liaison du MADAM sur le SERT

2.2.3. Comparaison de la constante de dissociation Kd

La constante de dissociation Kd est calculée grâce aux études de saturation précédemment décrites. Cette constante permet de traduire l’affinité d’un ligand pour un site de liaison : plus Kd est faible et plus l’affinité est forte.

119 Les constantes de dissociation pour chaque sujet ont pu être calculées. Elles ne diffèrent pas significativement entre les trois groupes.

Cependant cette constante tend à être plus basse chez les sujets sains que chez les autistes et chez les apparentés (sujets non autistes mais apparentés à un sujet autiste). L’effectif est trop faible dans le groupe d’enfants autistes pour que cette différence soit significative (n=3).

Ainsi, l’affinité du MADAM pour le SERT tend à être inférieure chez les sujets autistes et leurs apparentés par rapport aux sujets sains. La dispersion des résultats est plus importante chez les sujets autistes et leurs apparentés que chez les sujets sains.

Kd (pmol/L) 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Sujets sains Autistes Apparentés

Figure 34 : Comparaison de la constante de dissociation Kd chez les sujets sains (n=5), les enfants autistes (n=3) et leurs apparentés (n=9). Les données sont les moyennes ± SEM.

2.2.4. Comparaison du nombre de sites de liaison Bmax

Le nombre de sites de liaison Bmax est également calculé grâce aux études de saturation précédemment décrites.

120 Celui-ci ne diffère pas significativement entre les sujets autistes, leurs apparentés et les sujets sains. Nous observons une dispersion plus large dans le groupe d’enfants autistes, peut-être due au faible effectif.

Bmax (fmol/mg de protéines)

2000

1500

1000

500

0 Sujets sains Autistes Apparentés

Figure 35 : Comparaison du nombre de sites de liaison Bmax chez les sujets sains (n=5), les enfants autistes (n=3) et leurs apparentés (n=9). Les données sont les moyennes ± SEM.

121 3. Modèle animal : le rat exposé au VPA

3.1. Expérimentation animale

3.1.1. Effectif

Pour mener l’ensemble des expérimentations, 2 séries d’expositions ont été réalisées. Trente-deux femelles ont été utilisées (16 témoins et 16 VPA). L’effectif obtenu est décrit dans le tableau suivant.

Nombre de Nombre de Nombre de Nombre sex-ratio femelles femelles ratons moyen de M / F gestantes ratons/portée Groupe 16 13 146 11,2 81 / 65 témoin Groupe 16 12 99 8,3 40 / 59 VPA

Tableau 7 : Récapitulatif des effectifs

Afin de réaliser les expérimentations avec des rats provenant des mêmes portées, seules les portées possèdant au moins 2 rats mâles ont été utilisées ici.

L’étude comportementale a été réalisée sur la 1 ère série d’exposition, avec les rats des 4 portées contenant au moins 2 rats mâles.

Le dosage des monoamines a été réalisé sur la 1 ère série d’exposition, en utilisant 1 rat mâle/portée sur ces 4 portées.

L’étude de la densité de SERT in vitro a également été réalisée sur la 1 ère série d’exposition, en utilisant 1 rat mâle/portée sur ces 4 portées.

Enfin, l’étude de la densité de SERT ex vivo a été réalisée sur la 2 ème série d’exposition, en utilisant 1 rat mâle/portée sur les 6 portées contenant au moins 2 rats mâles.

122 3.1.2. Effet de l’intoxication au VPA

3.1.2.1. Effet de l’intoxication sur les femelles gestantes

Quelques minutes après l’injection intra péritonéale de VPA, les rates ont présenté un comportement ressemblant au syndrome de surdosage aux antiépileptiques : hypotonie musculaire, hyporéflexie, qui a spontanément régressé dans les 24h.

3.1.2.2. Effet tératogène du VPA sur la progéniture

Nous avons observé, chez un raton, une malformation des deux oreilles qui pourrait être due à l’exposition au VPA. En effet, le VPA possède des propriétés tératogènes, il peut notamment entraîner des malformations faciales dont des malformations auriculaires.

Figure 36 : Malformation auriculaire chez un rat du groupe VPA

3.2. Étude comportementale

3.2.1. Suivi du développement

3.2.1.1. Évolution du poids corporel

123 ••• Poids corporel des femelles gestantes

Le poids des femelles a été mesuré tout au long de la gestation. Les poids moyens des femelles gestantes ne diffèrent pas significativement entre le groupe VPA et le groupe témoin.

Témoins Poids moyen (g) V P A 450

400

350

300

250

200 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Temps (jours)

Figure 37 : Évolution du poids des rates gestantes. Groupe VPA n = 6, groupe témoin n = 5. Les données représentées sont les poids moyens ± SEM

••• Poids corporel de la progéniture

Le poids des ratons a été mesuré de la naissance jusqu’au sacrifice (50 jours de vie). L’évolution des poids moyens des ratons mâles ne diffère pas significativement entre le groupe VPA et le groupe témoin.

124 Poids (g) Témoins 350 VPA 300 250 200 150

100

50 0 0 10 20 30 40 50 60 Age (jours)

Figure 38 : Évolution du poids des ratons mâles. Groupe VPA n = 12, groupe témoin n = 27. Les données représentées sont les poids moyens ± SEM.

3.2.1.2. Observation de l’ouverture des yeux

Au 16 ème jour de vie, 67% des ratons du groupe VPA ont les deux yeux ouverts, contre 70% dans le groupe témoin. Il n’y a donc pas de retard à l’ouverture des yeux chez les rats VPA.

3.2.1.3. Observation du déplissage des oreilles

Au 16 ème jour de vie, toutes les oreilles des ratons VPA et témoins sont dépliées (excepté le raton ayant une malformation auriculaire).

125 3.2.2. Tests explorant le développement moteur

Les résultats des tests explorant le développement moteur n’ont montré aucune différence significative entre les rats exposés au VPA et les rats témoins (tous les p > 0,083).

3.2.2.1. Retournement

Lorsque nous plaçons les rats sur le dos, les animaux du groupe VPA mettent en moyenne 1,61 ± 0,14s pour se remettre sur leurs pattes (n=12), les rats du groupe témoins mettent en moyenne 1,47 ± 0,15s (n=27). Il n’y a pas de différence significative entre les deux scores.

3.2.2.2. Démarche

Temps pour sortir les 2 pattes avant 25 (s ) * 20 * Témoins 15 VPA

10

5

0 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Age (jours)

Figure 39 : 1 ère partie du test de la démarche. Groupe VPA n = 12, groupe témoin n = 20. Les données représentées sont les temps moyens ± SEM.

126 Le test s’effectue en deux étapes pendant plusieurs jours. La première étape est la mesure du temps mis par chaque rat pour sortir les deux pattes antérieures du cercle. Au 10 ème jour, le temps mis par les rats témoins pour sortir les pattes du cercle est significativement plus long que les rats VPA (p=0,034). Cependant il n’y a plus de différence entre les deux groupes les autres jours.

La deuxième étape est la mesure du temps mis par chaque rat pour sortir entièrement du cercle. Il n’y a pas de différence entre les deux groupes.

Temps sortie complète (s) 60 Témoins 50 VPA 40 30 20 10 0 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Age (jours)

Figure 40 : 2 ème partie du test de la démarche. Groupe VPA n = 12, groupe témoin n = 20. Les données représentées sont les temps moyens ± SEM.

3.2.2.3. Géotaxie négative

Le test s’effectue en deux étapes. La première étape est la mesure du temps mis par chaque rat pour se retourner de 180° sur chaque plan incliné (à 20 et 45°). Il n’y a pas de différence entre les deux groupes pour aucune des inclinaisons du plan.

127

70 Témoins 60 VPA 50 40 30 20 10 Tempssepourretourner (s) 0 géotaxie à 20° géotaxie à 45°

Figure 41 : 1 ère partie du test de géotaxie négative. Groupe VPA n = 12, groupe témoin n = 20. Les données représentées sont les temps moyens ± SEM.

La deuxième étape est la mesure du temps mis par chaque rat pour remonter jusqu’en haut du plan incliné. Il n’y a pas de différence entre les deux groupes pour aucune des inclinaisons du plan.

Témoins 100 VPA 80

60 40 20

Temps de remontéeTemps de (s) 0

géotaxie à 20° géotaxie à 45°

Figure 42 : 2 ème partie du test de géotaxie négative. Groupe VPA n = 12, groupe témoin n = 20. Les données représentées sont les temps moyens ± SEM.

128 3.2.2.4. Tonus musculaire

Les résultats obtenus par les rats des deux groupes sont très proches : les rats du groupe VPA se maintiennent en moyenne 162 ± 38s sur la tige (n=12), contre 167 ± 39s pour les rats du groupe témoin (n=12).

3.2.3. Test explorant la réponse à une stimulation tactile

La réponse à une stimulation non douloureuse (effleurement des vibrisses) ne diffère pas significativement entre le groupe de rats exposé au VPA et le groupe témoin : 64% des rats VPA et 60% des rats témoins ont une réponse cotée « Forte » ; 36% des rats VPA et 40% des rats témoins ont une réponse cotée « faible ». Seul le rat VPA ayant une malformation auriculaire ne produit aucune réaction à la stimulation. Compte tenu de la malformation pouvant inhiber sa sensibilité tactile, ce rat a été éliminé de ce test.

3.2.4. Tests explorant le comportement social

3.2.4.1. Films du regroupement

Les séquences filmées au 2 ème jour de vie permettent essentiellement de visualiser le comportement maternel vis-à-vis de leur progéniture. Sur ces séquenes, les femelles s’activent à regrouper leurs petits sans que nous ne notions de différence entre les groupes VPA et les groupes témoins.

Les séquences filmées au 7 ème jour de vie sont tournées sans la mère. Sur ses séquences les petits dorment regroupés tous ensemble ou à plusieurs. Nous ne mettons pas en évidence de comportements différents dans les deux groupes de ratons.

129 Les séquences filmées au 20 ème jour de vie sont également tournées sans la mère. Sur ces séquences les petits cherchent à s’enfouir sous les autres, ils explorent la cage, ils se toilettent. Nous ne mettons pas en évidence de comportements différents dans les deux groupes de ratons, et notamment pas de stéréotypies.

3.2.4.2. Test de sociabilité

••• Sociabilité vis-à-vis d’un rat inconnu

Dans ce dispositif, le rat à tester explore trois compartiments. Dans le compartiment de droite il y a un rat d’une autre portée qui lui est donc inconnu, le compartiment de gauche est vide. Le rat à tester est placé dans le compartiment central, vide également.

Comparaison des deux groupes :

Ce test ne montre pas de différence entre les deux groupes, les rats passent des durées comparables dans chaque compartiment.

Comparaison au sein de chaque groupe :

Les rats passent la majorité du temps dans le compartiment habité par un rat inconnu (rats VPA 58% du temps, rats témoins 59%). Le temps passé dans le compartiment « rat inconnu » est significativement plus long que celui passé dans le compartiment initial (VPA p=0,007, témoins p=0,001) et celui passé dans le compartiment vide (VPA et témoins p=0,0005).

De plus, les rats VPA passent significativement plus de temps dans le compartiment initial que le compartiment vide (p=0,007) ce qui n’est pas le cas des rats témoins.

130

Témoins VPA 70 60 * 50 40 30 20

compartiment(%) 10

Tempschaquepassé dans 0 Compartiment vide Compartiment initial Compartiment avec rat inconnu

Figure 43 : Sociabilité vis-à-vis d’un rat inconnu. Groupes VPA et témoin n = 12. Les données représentées sont les durées moyennes ± SEM.

••• Sociabilité vis-à-vis d’un rat inconnu et d’un rat connu

Comparaison des deux groupes :

Ce test met en évidence que les rats VPA passent significativement plus de temps dans le compartiment initial que les rats témoins (p=0,035), ils restent davantage dans le seul compartiment vide que les rats témoins.

Le temps passé dans les compartiments « rat inconnu » et « rat connu » ne diffère pas entre les deux groupes, les rats passent des durées comparables dans les deux autres compartiments.

Comparaison au sein de chaque groupe :

Dans ce test, les rats passent toujours la majorité du temps dans le compartiment habité par un rat inconnu (rats VPA 43% du temps, rats témoins 46%) : le temps passé dans ce compartiment est significativement plus long que celui passé dans le compartiment initial (VPA p = 0,042, témoins p = 0,001). Cependant, le temps passé dans le compartiment « rat connu » est augmenté par rapport au test précédent où ce même compartiment était vide. Il

131 y a donc une augmentation de l’exploration du compartiment lorsqu’il est occupé par un rat.

Témoins 6 0 VPA

5 0 * 4 0

3 0

2 0

compartiment(%) 1 0 Tempschaquepassédans 0 Compartiment avec rat Compartiment initial Compartiment avec rat connu inconnu

Figure 44 : Sociabilité vis-à-vis d’un rat inconnu et un rat connu. Groupes VPA et témoin n = 12. Les données représentées sont les durées moyennes ± SEM.

Comparaison du nombre de changements de compartiment au cours du test de sociabilité :

Le nombre de passages d'un compartiment à l'autre est plus élevé dans le groupe de rats exposés au VPA que dans le groupe témoin (p = 0,024), montrant une plus grande activité locomotrice des rats VPA dans un nouvel environnement.

Figure 45 : Nombre de changements de compartiment lors du test de sociabilité. Groupes VPA et témoin n = 12. Les données représentées sont les durées moyennes ± SEM.

132 3.2.4.3. Test de reconnaissance sociale

Dans le groupe VPA lors de la 1 ère rencontre les rats passent 38% du temps en contact, contre 21% dans le groupe témoin. Lors de la 2 ème rencontre les rats VPA passent 25% du temps en contact, contre 23% dans le groupe témoin. Nous ne mettons pas en évidence de différence dans les temps passés en contact au sein des groupes VPA et témoin, ni dans la diminution du temps passé en contact lors de la 2 ème rencontre.

3.2.5. Test explorant l’apprentissage, le repérage et la capacité d’adaptation : la piscine de Morris

Trois premières étapes :

Au cours de ce test, le même exercice est réalisé trois fois. Ainsi, nous évaluons la mémorisation, l’apprentissage de l’exercice par les rats. Les rats témoins mettent significativement moins de temps à retrouver la plate-forme lors de l’habituation 2 que lors de la familiarisation (p=0,012), tandis que pour les rats VPA la différence n’est pas significative. Nous observons donc une progression au cours de ces trois étapes du test de la piscine de Morris pour les rats témoins, mais pas pour les rats exposés au VPA.

Cependant, bien que les progressions ne soit pas parallèles pour les 2 groupes, les durées mises par les rats pour retrouver la plateforme de diffèrent pas entre les groupes VPA et témoin. Il n’y a donc pas de déficit d’apprentissage mis en évidence entre les 2 groupes.

133 *

50 45 Témoins 40 VPA 35 30 25 20 Durée (s) Durée 15 10 5 0 Familiarisation habituation 1 habituation 2

Figure 46 : Trois premières étapes du test de la piscine de Morris. Groupes VPA et témoin n = 4. Les données représentées sont les durées moyennes ± SEM.

4ème étape filmée :

Cette étape se déroule sans la plateforme, nous mesurons le temps passé par les rats dans chaque quartier. Il n’y a aucune différence entre les temps passés dans chaque quartier pour les groupes VPA et témoin.

3.3. Dosage des monoamines

3.3.1. Poids des cerveaux

Cerveau entier Rats témoins 1,927 ±0,019 (n=27) Rats VPA 1,883 ± 0,030 (n=12)

Tableau 8 : Poids des cerveaux entiers. Les données sont les moyennes en gramme ± SEM.

134 Nous n’observons pas de différence significative du poids des cerveaux dans les groupes VPA et témoins.

3.3.2. Dosage des monoamines cérébrales

Le dosage des monoamines et de leurs métabolites est effectué par HPLC, la quantification est rendue possible par l’analyse conjointe d’étalons.

Ces concentrations en monoamines sont exprimées par mg de protéines dosées sur le culot de chaque structure cérébrale.

Figure 47 : Chromatogramme du dosage HPLC des monoamines cérébrales

135 Concentrations en sérotonine et métabolite 5HIAA

Dans l’hippocampe, la concentration en sérotonine est significativement plus basse (-46%) dans le groupe VPA que dans le groupe témoin (p=0,043). Dans le cortex et le cervelet, cette concentration ne diffère pas significativement entre les deux groupes.

0.40 Témoins 0.35 VPA

0.30 0.25 *

0.20 0.15 0.10 (nmol/mg proteine) 0.05

Concentrationsérotonine en 0.00 Cortex Hippocampe Cervelet

Figure 48 : Comparaison des concentrations en sérotonine dans les différentes régions cérébrales par mg de protéines, chez les rats VPA et témoins. Groupe témoin et VPA n = 4. Les données sont les moyennes ± SEM.

La concentration en métabolite de la sérotonine, le 5HIAA, tend à être diminuée dans l'hippocampe (n = 4-4) des rats exposés au VPA. Dans le cortex et le cervelet, les concentrations en 5HIAA ne diffèrent pas entre les deux groupes.

0.40 Témoins

0.35 VPA 0.30

0.25 0.20

0.15 0.10 (nmol/mgproteine) Concentration5HIAA en 0.05 0.00

Cortex Hippocampe Cervelet

Figure 49 : Comparaison des concentrations en 5-HIAA dans les différentes régions cérébrales par mg de protéines, chez les rats VPA et témoins. Groupes témoin et VPA n = 4. Les données sont les moyennes ± SEM.

136 Concentration en noradrénaline :

Dans l’hippocampe, la concentration en noradrénaline (NA) est significativement plus basse (-39%) dans le groupe VPA que dans le groupe témoin (p=0,043). Dans le cortex et le cervelet, cette concentration ne diffère pas significativement entre les deux groupes.

0.40 Témoins 0.35 VPA

0.30 * 0.25 0.20 0.15 0.10 (nmol/mg proteine) ConcentrationNA en 0.05 0.00 Cortex Hippocampe Cervelet Figure 50 : Comparaison des concentrations en noradrénaline dans les différentes régions cérébrales par mg de protéines, chez les rats VPA et témoins. Groupe témoin et VPA n = 4. Les données sont les moyennes ± SEM.

Concentration en dopamine :

Dans le cortex et l’hippocampe, la concentration en dopamine ne diffère pas significativement entre les deux groupes. Cette concentration est significativement diminuée dans le cervelet (p=0,037).

3.3.3. Dosage de la sérotonine intra plaquettaire

La sérotonine intra plaquettaire a été dosée par HPLC chez les mêmes rats que les dosages centraux précédents.

137

Figure 51 : Chromatogramme du dosage HPLC de la sérotonine plaquettaire

Au 50 ème jour de vie, nous n’observons pas de différence significative entre les taux de sérotonine intra plaquettaire des groupes VPA et témoin. La dispersion est plus importante dans le groupe VPA.

Sérotonine (nmol/L) 16000 14000 12000

10000 8000 6000 4000 2000 0 Témoins VPA

Figure 52 : Dosage de la sérotonine intra plaquettaire. Groupe témoin et VPA n = 4. Les données sont les moyennes ± SEM.

138 3.4. Étude de la densité de SERT

3.4.1. Étude de la densité de SERT in vitro

3.4.1.1. Autoradiographies du SERT utilisant l’[ 3H]-MADAM

Comme le montrent les autoradiographies, la liaison de l’[ 3H]-MADAM sur les coupes de cerveau de rat est compatible avec la distribution connue des SERT. Les plus fortes densités sont trouvées dans les noyaux du Raphé, correspondant à la localisation des corps cellulaires sérotoninergiques, et des densités plus faibles sont trouvées dans le cervelet, généralement considéré comme une région de liaison non spécifique.

FC CA3 CA3 Thal

Hypothal Amyg

+4,20 -2,12 -3,80

Coll Cereb

DR CA3 CA1 SN MnR

-4,80 -7,64 -10,04

Figure 53 : Autoradiographies au [ 3H]-MADAM de coupes coronales des cerveaux de rats montrant les régions d’intérêt (stereotaxic coordinates; Paxinos and Watson, 1986). Amyg : amygdale, CA1-3 : hippocampe, Cereb : cervelet, Coll : colliculi, DR : Raphé dorsal, FC : cortex frontal, Hypothal : hypothalamus, MnR : Raphé médian, SN: substance noire, Thal : thalamus

139 3.4.1.2. Analyse des densités de SERT in vitro

Les expérimentations révèlent qu'il n'existe pas de modification de la densité de SERT dans les régions cérébrales étudiées (tous les p > 0,057). Ces résultats indiquent que l’exposition au VPA n'a pas affecté la densité de SERT, visualisables in vitro , dans le cerveau des rats.

Figure 54 : Densités cérébrales des SERT in vitro . Groupe témoin et VPA n = 4. Les données sont les moyennes ± SEM. Amyg : amygdale, CA1-3 : hippocampe, Cereb : cervelet, Coll : colliculi, DR : Raphé dorsal, FC : cortex frontal, Hypothal : hypothalamus, MnR : Raphé médian, SN: substance noire, Thal : thalamus

3.4.2. Étude de la densité de SERT ex vivo

3.4.2.1. Autoradiographies du SERT utilisant l’[ 125 I]-ADAM

Comme le montrent les autoradiographies, la liaison de l’[ 125 I]-ADAM sur les coupes de cerveau de rat est compatible avec la distribution connue des SERT et avec les

140 autoradiographies obtenues précédemment à l’aide du [3H]-MADAM. Les plus fortes densités sont trouvées dans les noyaux du Raphé.

Le contraste entre les régions cérébrales est moins bon dans cette expérimentation ex vivo que dans l’expérimentation in vitro . Dans ce type d’expérimentation, la liaison non spécifique n’est pas soustraite. De plus, l’activité injectée aux animaux était vraissemblablement un peu faible.

FC CC

CA3 DR

+4,20 -4,80 -7,64

Figure 55 : Autoradiographie au [ 125 I]-ADAM de coupes coronales des cerveaux de rats montrant les régions d'intérêt (stereotaxic coordinates; Paxinos and Watson, 1986). CA3 : hippocampe, CC : cortex cingulaire, DR : Raphé dorsal, FC : cortex frontal

3.4.2.2. Analyse des densités de SERT ex vivo

Les études in vitro ne reflètent pas exactement les conditions d’études in vivo , notamment parce qu’elles permettent la soustraction de la liaison non spécifique, elles sont réalisées avec des concentrations en ligand choisies par rapport au nombre de site de liaison et le ligand n’est pas métabolisé. Aussi, nous avons également réalisé une analyse ex vivo de la densité de SERT à l’aide d’un ligand iodé, l’[ 125 I]-ADAM.

Les expérimentations montrent qu'il n'existe pas de modification de la densité de SERT dans les régions cérébrales étudiées (n = 6 pour les 2 groupes ; tous les p > 0,065). Ces résultats indiquent que l’exposition au VPA ne semble pas affecter la densité de SERT, visualisables ex vivo , dans le cerveau des rats.

Cette expérimentation ex vivo confirme les résultats obtenus in vitro .

141

0.16 0.14 0.12 0.10 Témoins 0.08 VPA 0.06 0.04 0.02 Ratio(ROI-cervelet)/cervelet 0.00 Cortex Cortex frontal Hippocampe Raphé dorsal cingulaire

Figure 56 : Densités cérébrales des SERT ex vivo . Groupe témoin et VPA n = 6. Les données sont les moyennes ± SEM

142 Cinquième partie : Discussion et Perspectives

143 Discussion et Perspectives

Notre hypothèse est que certains cas d’autisme pourraient être dus à une perturbation précoce au cours de l’embryogénèse entrainant des modifications à long terme notamment du système sérotoninergique. Certaines modifications de ce système pourraient être des marqueurs potentiels de l’autisme. Or, disposer de marqueurs de la pathogénèse de l’autisme pourrait d’améliorer la compréhension de la physiopathologie de la maladie, de compléter les arguments cliniques pour établir le diagnostic et de proposer des voies de recherche thérapeutique ou préventive.

1. Choix des marqueurs potentiels et des modèles d’étude

Dans cette hypothèse, nous avons analysé les articles rapportant des cas d’autisme ayant pu être causés par une exposition prénatale à des agents tératogènes. Les tératogènes les plus impliqués semblent être l’acide valproïque, l’alcool, la thalidomide et le misoprostol. Nous avons également comparé les effets de ces tératogènes dans des modèles animaux mimant une exposition prénatale. Suite à l’analyse de ces cas, nous avons constaté que ces molécules, pourtant de structures très différentes, engendrent, chez les sujets avec autisme exposés pendant la grossesse, des caractéristiques cliniques communes (telles que des malformations, des retard du développement). Dans les modèles animaux, ces molécules produisent également des effets communs tels que des altérations du système de la neurotransmission sérotoninergique.

Nous avons constaté que ces agents tératogènes étaient capables de modifier l’expression de gènes par des mécanismes épigénétiques. Parmi les gènes concernés plusieurs sont impliqués dans le développement cérébral et en particulier dans la prolifération, la différenciation, la migration des neurones et la transmission synaptique de plusieurs systèmes de neurotransmetteurs dont la sérotonine.

L’ensemble de cette analyse a fait l’objet d’un article de revue publié dans Neuroscience & Biobehavioral Reviews (Dufour-Rainfray et al., 2011 ; annexe 4).

144 Suite à cette analyse, nous avons fait le choix d’étudier, comme marqueurs potentiels de la pathologie autistique, le taux de sérotonine (l’hypersérotoninémie étant l’un des critères le plus souvent retrouvé dans l’autisme), et la densité de transporteurs de la sérotonine (SERT).

Pour étudier ces paramètres, nous avons eu recours à deux modèles d'étude : la plaquette sanguine humaine et un modèle animal d’étude de l’autisme mimant une exposition à un agent tératogène (le rat exposé en prénatal à l’acide valproïque VPA).

2. Outils d’exploration in vitro/ex vivo du SERT

Parmi les marqueurs potentiels choisis, la mesure du taux de sérotonine ne nécessite pas d’outil particulier, ce dosage étant classiquement réalisé pour les services cliniques hospitaliers. En revanche, la quantification des SERT nécessite l’utilisation de radioligands et leurs validations notamment pour la quantification des SERT plaquettaires.

Nous avons eu recours à 2 radioligands spécifiques des SERT : le MADAM que nous avons radiomarqué au tritium pour les études in vitro , et l’ADAM que nous avons radiomarqué à l’iode 125 pour les études ex vivo.

Les 2 radioligands ont une bonne spécificité vis-à-vis du SERT, ainsi qu’une faible fixation non spécifique.

Le radiomarquage du [3H]-MADAM consiste en une substitution nucléophile d’un hydrogène par un méthyle tritié. Les rendements de marquage ont été compris entre 50 et 60%. La pureté était satisfaisante, permettant l’utilisation de ce radioligand pour l’exploration des SERT plaquettaires humains ainsi que pour l’exploration in vitro des SERT centraux dans le modèle animal d’étude de l’autisme.

Le radiomarquage de l’[125 I]-ADAM consiste en une substitution électrophile du groupement stannique par l’iode 125. Les rendements de marquage ont été d’environ 50%. La pureté était satisfaisante, ce qui a permis d’utiliser ce radioligand pour l’exploration ex vivo des SERT centraux dans le modèle animal d’étude de l’autisme, expérimentation complémentaire de l’exploration in vitro .

145 2. Modèle périphérique humain : la plaquette sanguine

La plaquette sanguine est un modèle humain, accessible, possédant des SERT identiques aux SERT centraux et capable de stocker de la sérotonine.

Des taux élevés de sérotonine plaquettaires ont été retrouvés chez certains patients avec autisme (Hranilovic et al., 2007). Cependant, ce taux périphérique ne peut être utilisé seul comme un marqueur de l’autisme car il n’est pas spécifique de la maladie. En effet, des taux élevés de sérotonine plaquettaire sont également retrouvés dans d’autres pathologies telles que la schizophrénie, la maladie de Huntington ou le retard mental sévère (pour revue, voir Lam et al., 2006).

Dans ce modèle périphérique, notre objectif était de réaliser une étude associant un dosage de la sérotonine plaquettaire et la quantification de la densité des SERT plaquettaires chez des enfants avec autisme.

Le dosage de la sérotonine a pu être effectué sur tous les prélèvements sanguins. C’est un examen aisé à mettre en place et qui ne demande qu’un faible volume sanguin. Les conditions préanalytiques nécessitent simplement un acheminement rapide avant le traitement de l’échantillon.

Nous n’observons pas d’hypersérotoninémie plaquettaire chez les autistes : les taux de sérotonine ne diffèrent pas entre les groupes. Cependant, les effectifs sont faibles.

Les résultats de l’analyse des SERT montrent que :

- L’affinité du [ 3H]-MADAM pour les SERT plaquettaires chez les sujets sains est comparable à l’affinité obtenue dans les études de caractérisation de ce ligand sur les SERT cérébraux de rats (Kd ≈ 80 pM pour les SERT plaquettaires).

- Les transformations de Scatchard obtenues chez les sujets sains puis chez les patients sont analysables et permettent de déterminer des paramètres de comparaisons entre les

146 deux groupes de sujets : la constante de dissociation (Kd) et le nombre de sites de liaison (Bmax).

Nous pouvons donc conclure que ce radioligand permet d’explorer les SERT plaquettaires humains et peut permettre de comparer un état pathologique tel que l’autisme à un état témoin.

En revanche, plusieurs difficultés sont pointées :

- Le protocole, mis au point pour cette étude, permet l’analyse les SERT sur préparation membranaire « fraîche ». Ceci nécessite une analyse indépendante pour chaque patient. Le protocole pourrait être modifié en intégrant une étape de congélation du culot de plaquettes sanguines afin de différer le prélèvement de l’analyse et d’analyser plusieurs prélèvements en même temps.

- Le volume important (30 mL) de sang, indispensable à l’étude de liaison et au dosage de la sérotonine plaquettaire, a été une difficulté majeure dans cette étude. Ce volume de prélèvement est trop important pour une permettre l’analyse de ce marqueur dans une plus grande population d’enfants. Cette difficulté n’a pas permis d’avoir un grand effectif pour cette étude. Il faudrait donc modifier le protocole afin de diminuer le volume de sang nécessaire sans altérer la qualité de l’analyse.

3. Modèle animal : le rat exposé au VPA

Suite à la confrontation de différents modèles animaux d’étude de l’autisme, nous avons choisi d’utiliser un modèle mimant une possible étiologie de l’autisme : le rat exposé au 9ème jour de gestation au VPA.

Afin de valider le modèle animal choisi, nous avons réalisé une étude comportementale en utilisant des tests permettant de suivre le développement global, le développement moteur ainsi que le comportement social. Les tests explorant le développement global et moteur ne mettent pas en évidence de différence entre les rats exposés au VPA et les rats témoins. Ceci valide cet aspect de notre modèle animal puisque les critères diagnostiques de

147 l’autisme n’impliquent ni le développement global et ni le développement moteur. Le comportement social des rats a été analysé en utilisant notamment le test de la sociabilité qui permet l'exploration de deux aires de symptômes autistiques analysables chez les animaux : les troubles du comportement social et de la rigidité cognitive (Crawley, 2004). Dans ce test, les rats exposés au VPA au 9 ème jour de la gestation, montrent une tendance plus faible à initier des interactions sociales et une activité locomotrice dans un nouvel environnement plus élevée, comparés aux rats témoins.

Ces modifications comportementales étaient comparables à celles observées dans un modèle de rats exposés au VPA au 13 ème jour de la gestation pour lesquels une tendance plus faible à initier les approches sociales et une hyperactivité locomotrice ont également été trouvées (Schneider et Przewlocki, 2005 ; Schneider et al., 2008).

Ces modifications comportementales pourraient être reliées à celles observées chez les enfants nés de mères épileptiques traitées par le VPA (Vinten et al., 2009). Ces enfants exposés au VPA in utero montrent davantage de troubles du comportement, notamment une diminution de la socialisation et de l'hyperactivité.

Ce modèle animal, mimant une étiologie possible de l'autisme et dont les résultats comportementaux peuvent être reliés à ceux observés chez l’homme, semble ainsi pouvoir être adapté à une étude de potentiels marqueurs de la pathologie autistique.

L’exposition au VPA au 9 ème jour de la gestation a entrainé une diminution des concentrations de sérotonine de 46 % dans l'hippocampe de rats âgés de 50 jours comparativement aux témoins, sans modification dans le cortex et le cervelet. Ce résultat est pertinent car l'hippocampe est impliqué dans un comportement social (Sodhi et Sanders-Bush, 2004), et nous avons observé des altérations de ces compétences chez les rats exposés au VPA. En outre, les taux de sérotonine cérébrale semblent être diminués chez les personnes atteintes d'autisme (McDougle et al., 1996; Chugani et al., 1997) et nos résultats confirment cette suggestion.

En revanche, une autre étude rapporte des taux augmentés de sérotonine dans l’hippocampe de rats âgés de 50 jours et ayant été exposés au VPA au 9 ème jour de la gestation (Narita et al., 2002). La discordance entre ces résultats et les nôtres pourrait

148 s'expliquer par des différences dans le protocole expérimental telles que les régions disséquées (lobe gauche / région complète), les doses de VPA (800 mg/kg / 600 mg/kg), la voie d'administration (orale / intrapéritonéale) et les souches de rats (Sprague-Dawley / Wistar).

Au niveau périphérique, la concentration plaquettaire en sérotonine n’apparaît pas modifiée par l’exposition prénatale au VPA. Cette concentration périphérique ne reflète pas la diminution observée au niveau de l’hippocampe des rats. Ce résultat peut s’expliquer, d’une part, parce que la diminution n’affecte qu’une région cérébrale sous- entendant une régulation ou une modification locale. D’autre part, la sérotonine cérébrale ne représente que 2% de la sérotonine totale, il est donc probable qu’une diminution de la sérotonine hippocampique ne soit pas détectable au niveau sanguin, malgré d’éventuels échanges au niveau de la barrière hémato-encéphalique.

Une équipe a étudié la synthèse de sérotonine dans le cerveau d’enfants autistes par imagerie fonctionnelle TEP en utilisant l’alpha[ 11 C]-méthyl-L-tryptophane. Cette équipe a montré, chez les garçons avec autisme, une diminution unilatérale de la synthèse de la sérotonine affectant le cortex frontal, le thalamus et le cervelet, accompagnée d’une augmentation dans le noyau denté du lobe opposé (Chandana et al., 2005 ; Chugani et al., 1997, 1999).

Ces études, chez l’homme et dans un modèle animal, mettent en lumière l’importance de disposer de techniques d’exploration rendant compte de la concentration sérotoninergique centrale, car celle-ci semble pouvoir être un marqueur potentiel dans la pathologie autistique.

Plusieurs perspectives apparaissent de ces résultats :

- La nécessité de réaliser d’autres études rendant compte de la concentration centrale en sérotonine chez des sujets avec autisme,

- L’étude de la concentration de la sérotonine centrale dans la descendance de ce modèle animal. Le but est d’observer si les modifications engendrées par l’exposition au VPA sont stables et transmissibles à la descendance. Cette étude permettrait de proposer des hypothèses sur les mécanismes physiopathologiques.

149 L’exposition au VPA au 9 ème jour de la gestation semble affecter différents systèmes de neurotransmetteurs. En effet, nous avons également montré une diminution de la concentration en noradrénaline de 39 % dans l'hippocampe des rats âgés de 50 jours comparativement aux témoins, sans modification dans le cortex et le cervelet. Les taux de dopamine ne sont pas modifiés, excepté dans le cervelet mais les taux dans cette région cérébrale sont bas et l’on ne peut exclure que la modification soit liée à la sensibilité de la technique. Ces résultats indiquent que le VPA a une action directe ou indirecte sur plusieurs systèmes de neurotransmetteurs monoaminergiques dès le stade cellulaire de progéniteur (exposition au 9 ème jour de la gestation).

Comme les concentrations en sérotonine dépendent du fonctionnement des SERT, l’intérêt de l’analyse des SERT est accru par ces résultats.

Nous avons analysé la densité cérébrale de SERT par autoradiographie à l’aide d’un ligand tritié, le [ 3H]-MADAM. Les résultats ne montrent pas de modification dans les régions cérébrales étudiées.

Les études in vitro ne reflètent pas exactement les conditions d’études in vivo , notamment parce qu’elles permettent la soustraction de la liaison non spécifique, elles sont réalisées avec des concentrations en ligand choisies par rapport au nombre de site de liaison et le ligand n’est pas métabolisé.

Aussi, nous avons également réalisé une analyse ex vivo de la densité de SERT à l’aide d’un ligand iodé, l’[ 125 I]-ADAM. Les résultats ne montrent pas non plus de modification dans les régions cérébrales étudiées, confirmant l’analyse in vitro à l’aide du [3H]- MADAM.

Nos résultats ne retrouvent pas les résultats des études des SERT chez des enfants autistes « de bon niveau » par TEMP et TEP. Ces études avaient montré que la densité de SERT était diminuée dans le cortex frontal médian (Makkonen et al., 2008), le cortex cingulaire et le thalamus (Nakamura et al., 2010) des enfants avec autisme.

Cependant, notre étude ne comporte qu’un faible effectif (n=6 par groupe), et les radioligands ne sont pas les mêmes que ceux utilisés dans les études d’imagerie moléculaire chez l’homme. De plus, les études d’imagerie moléculaire chez l’homme ont

150 toutes les deux étudié un sous-groupe de sujets avec autisme puisqu’il s’agit d’enfants autistes « de bon niveau ».

Enfin, les techniques TEMP et TEP ne permettent pas encore la quantification dans des régions d’intérêt de petits volumes comme les noyaux du Raphé qui contiennent les corps cellulaires des neurones sérotoninergiques.

La densité de SERT cérébraux dans le modèle animal, n’apparaît pas ici comme un marqueur tardif de l’exposition prénatale au VPA. Néanmoins, le VPA étant capable de moduler l’expression de gènes, nous projetons d’étudier l’expression du gène SLC6A4 codant le SERT dans le modèle animal et parallèlement dans un modèle périphérique humain (leucocytes). Ceci permettrait de connaître l’effet du VPA sur l’expression du gène du SERT, en amont de la traduction protéique.

Plusieurs perspectives naissent ainsi de ces résultats :

- L’intérêt de rechercher l’origine de la diminution de la concentration en sérotonine cérébrale observée dans ce modèle animal suite à l’exposition au VPA,

- Le VPA étant capable de moduler l’expression de gènes (dont des gènes impliqués dans la différentiation des neurones sérotoninergiques et la synaptogénèse (Fukuchi et al., 2009 ; Rout et al., 2009)), il serait intéressant de comparer, dans ce modèle animal, les expressions de gènes candidats dans l’autisme et en particulier le gène codant le SERT,

- L’intérêt de réaliser d’autres études par imagerie moléculaire de la densité de SERT chez des sujets avec autisme et notamment dans différents sous-groupes cliniques de patients.

151 Conclusion

152 Conclusion

Ce travail expérimental a tout d’abord porté sur une étude de potentiels marqueurs de l’autisme sur un modèle périphérique humain : la plaquette sanguine. Ce travail a permis de montrer que le dosage de la sérotonine et la quantification des SERT plaquettaires, à l’aide du radioligand [3H]-MADAM, est possible et peut permettre de comparer un état pathologique comme l’autisme à un état témoin.

La suite du travail a porté sur l’étude de ces marqueurs potentiels sur un modèle animal : le rat exposé en prénatal au VPA. Ce deuxième volet a permis d’observer une diminution des concentrations de sérotonine de 46 % dans l'hippocampe de rats âgés de 50 jours comparativement aux rats témoins, sans modification dans le cortex, le cervelet et les plaquettes sanguines. Ce résultat peut être relié aux résultats obtenus chez l’homme qui montrent une asymétrie de la synthèse de la sérotonine dans l’autisme (Chandana et al., 2005 ; Chugani et al., 1997, 1999), et met en lumière la nécessité de réaliser des études rendant compte de la concentration centrale en sérotonine chez des sujets avec autisme.

Cette étude a montré que la densité de SERT dans les régions cérébrales étudiées n’est pas affectée par l’exposition au VPA au 9 ème jour de la gestation. Ces résultats ne peuvent être reliés aux observations faites chez des enfants autistes « de bon niveau » par TEMP et TEP, qui ont montré une densité de SERT diminuée dans le cortex frontal médian (Makkonen et al., 2008), le cortex cingulaire et le thalamus (Nakamura et al., 2010).

Ce modèle animal, mimant une étiologie possible de l'autisme, semble adapté pour une étude de potentiels marqueurs de la pathologie autistique tels que la concentration en sérotonine cérébrale. Il semble que ce modèle puisse également permettre d’étudier les effets précoces des facteurs environnementaux associés à l’autisme, et notamment des études d’expression de gènes candidat dans l’autisme tels que le gène SLC6A4 codant le SERT.

Cette étude des marqueurs centraux du système sérotoninergique dans un modèle animal ouvre des perspectives d’exploration chez l’homme. Elle soutient l’intérêt de réaliser des études rendant compte de la concentration centrale en sérotonine chez des sujets avec autisme et d’explorer, chez ces sujets, la densité de SERT par imagerie moléculaire.

153 Bibliographie

154 Bibliographie

A.P.A. Diagnostic and statistical manual of mental disorders. DSM-IV . Fourth ed. Washington DC, 1994.

Anderson, G.M. Development and neurobiology, Part 4: Serotonin in autism. Journal of the American Academy of Child & Adolescent Psychiatry , 2002, 41, 1513-1516.

Anderson, G.M. Monoamines in autism: an update of neurochemical research of a pervasive developmental disorder. Medical Biology , 1987, 65, 67-75.

Anderson, G.M., Horne, W.C., Chatterjee, D., Cohen, D.J. The hyperserotonemia of autism. Ann. N. Y. Acad. Sci ., 1990, 600, 331-340.

Andres, C. Molecular genetics and animal models in autistic disorder. Brain Res. Bull ., 2002, 57, 109-119.

Anthony, B., Zhou, F.C., Ogawa, T., Goodlett, C.R., Ruiz, J. Alcohol exposure alters cell cycle and apoptotic events during early neurulation. Alcohol Alcohol. , 2008, 43, 261-273.

Ardinger, H.H., Atkin, J.F., Blackston, R.D., Elsas, L.J., Clarren, S.K., Livingstone, S., Flannery, D.B., Pellock, J.M., Harrod, M.J., Lammer, E.J. Verification of the fetal valproate syndrome phenotype. Am. J. Med. Genet., 1988, 29, 171-185.

Arndt, T.L., Stodgell, C.J., Rodier, P.M. The teratology of autism. Int. J. Dev. Neurosci ., 2005, 23, 189-199.

Aronson, M., Hagberg, B., Gillberg, C. Attention deficits and autism spectrum problems in children exposed to alcohol during gestation: a follow-up study. Dev. Med. Child Neurol ., 1997, 39, 583-587.

155 Arranz, B., Rosel, P., Sarro, S., Zaldivar, E., Cano, R., Navarro, M., San, L. Platelet serotoninergic binding sites in alcohol-dependent patients. Alcohol and alcoholism , 1999, 34, 726-732. Bailey, A., Le Couteur, A., Gottesman, I., Bolton, P., Simonoff, E., Yuzda, E., Rutter, M. Autism as a strongly genetic disorder: evidence from a British twin study. Psychol. Med ., 1995, 25, 63-77.

Bandim, J.M., Ventura, L.O., Miller, M.T., Almeida, H.C., Costa, A.E. Autism and Möbius sequence: an exploratory study of children in northeastern Brazil. Arq. Neuropsiquiatr., 2003, 61, 181-185.

Banovi ć, M., Bordukalo-Niksi ć, T., Balija, M., Cicin-Sain, L., Jernej, B. Platelet serotonin transporter (5HTt): physiological influences on kinetic characteristics in a large human population. Platelets, 2010, 21, 429-438.

Barthelemy, C., Bruneau, N., Cottet-Eymard, J.M., Domenech-Jouve, J., Garreau, B., Lelord, G., Muh, J.P., Peyrin, L. Urinary free and conjugated catecholamines and metabolites in autistic children. J. Autism Dev. Disord., 1988, 18, 583-591.

Bauman, M., Kemper, T.L. Histoanatomic observations of the brain in early infantile autism. Neurology , 1985, 35, 866-874.

Bauman, M.L. Medical comorbidities in autism: challenges to diagnosis and treatment. Neurotherapeutics , 2010, 7, 320-327.

Belzung, C., Leman, S., Vourc’h, P., Andres, C. Rodent models for autism: a critical review. Drug Discovery Today: Disease Models , 2005, 2, 93-101.

Betancur, C., Corbex, M., Spielewoy, C., Philippe, A., Laplanche, J.L., Launay, J.M., Gillberg, C., Mouren-Siméoni, M.C., Hamon, M., Giros, B., Nosten-Bertrand, M., Leboyer, M. Serotonin transporter gene polymorphisms and hyperserotonemia in autistic disorder. Molecular Psychiatry , 2002, 7, 67-71.

156 Billett, E.A., Richter, M.A., King, N., Heils, A., Lesch, K.P., Kennedy, J.L. Obsessive compulsive disorder, response to serotonin reuptake inhibitors and the serotonin transporter gene. Molecular Psychiatry , 1997, 2, 403-406.

Bittigau, P., Ikonomidou, C. Glutamate in neurologic diseases. J. Child Neurol ., 1997, 12, 471-485.

Blakely RD, De Felice LJ, Criss Hartzell H. Molecular physiology of norepinephrine and serotonin transporters. J. Exp. Biol ., 1994, 196, 263–281.

Blakely, R.D., Ramamoorthy, S., Qian, Y., Schroeter, S., Bradley, C.C. Regulation of antidepressant-sensitive serotonin transporters. In: Neurotransmitter Transporters: Structure, Function and Regulation. Totowa, M.E.A. ed. Reith Humana Press, 1997, 2, 29- 72. Blakely, R.D., Ramamoorthy, S., Schroeter, S., Qian, Y., Apparsundaram, S., Galli, A., De Felice, L.J. Regulated phosphorylation and trafficking of antidepressant-sensitive serotonin transporter proteins. Biol. Psychiatry , 1998, 44, 169-178.

Bradley, C.C., Blakely, R.D. Alternative splicing of the human serotonin transporter gene. J. Neurochem ., 1997, 69, 1356-1367.

Bradstreet, J.J., Smith, S., Baral, M., Rossignol, D.A. Biomarker-guided interventions of clinically relevant conditions associated with autism spectrum disorders and attention deficit hyperactivity disorder. Altern. Med. Rev., 2010, 15, 15-32.

Bromley, R.L., Mawer, G., Clayton-Smith, J., Baker, G.A. Autism spectrum disorders following in utero exposure to antiepileptic drugs. Neurology , 2008, 71, 1923-1924.

Bursztejn, C., Ferrari, P., Dreux, C., Braconnier, A., Lancrenon, S. Metabolisme de la sérotonine dans l’autisme infantile. L’Encéphale , 1988, 14, 413-419.

Buxhoeveden, D.P., Semendeferi, K., Buckwalter, J., Schenker, N., Switzer, R., Courchesne, E. Reduced minicolumns in the frontal cortex of patients with autism. Neuropathol. Appl. Neurobiol ., 2006, 32, 483-491.

157

Campbell, M., Friedman, E., De Vito, E., Greenspan, L., Collins, P.J. Blood serotonin in psychotic and brain damaged children. Journal of Autism and Childhood Schizophrenia , 1974, 4, 33-41.

Carney, R-M., Wolpert, C-M., Ravan, S-A., Shahbazian, M., Ashley-Koch A., Cuccaro, M-L., Vance, J-M., Pericak-Vance, M-A. Identification of MeCP2 mutations in a series of females with autistic disorder. Pediatr. Neurol., 2003, 28, 205-211.

Carper, R.A., Courchesne, E. Localized enlargement of the frontal cortex in early autism. Biol. Psychiatry , 2005, 57, 126-133.

Carper, R.A., Moses, P., Tigue, Z.D., Courchesne, E. Cerebral lobes in autism: early hyperplasia and abnormal age effects. Neuroimage , 2002, 16, 1038-1051.

Casanova, M.F., Buxhoeveden, D.P., Switala, A.E., Roy, E. Minicolumnar pathology in autism. Neurology , 2002, 58, 428-432.

Casanova, M.F., Van Kooten, I.A., Switala, A.E., Van Engeland, H., Heinsen, H., Steinbusch, H.W., Hof, P.R., Trippe, J., Stone, J., Schmitz, C. Minicolumnar abnormalities in autism. Acta Neuropathol ., 2006, 112, 287-303.

Chalon, S., Bronquard, C., Vercouillie, J., Kodas, E., Garreau, L., Bodard, S., Emond, P., Besnard, J.C., Guilloteau, D. ADAM is an effective tool for in vivo study of serotonergic function: validation in rat models. Synapse , 2004, 52, 136-142.

Chalon, S., Tarkiainen, J., Garreau, L., Guilloteau, D. Pharmacological characterization of N,N-Dimethyl-2-(2-amino-4-methylphenyl thio)benzylamine as a ligand of the serotonin transporter with high affinity and selectivity. Journal of pharmacology and experimental Therapeutics , 2003, 304, 81-87.

Chandana, S.R., Behen, M.E., Juhász, C., Muzik, O., Rothermel, R.D., Mangner, T.J., Chakraborty, P.K., Chugani, H.T., Chugani, D.C. Significance of abnormalities in

158 developmental trajectory and asymmetry of cortical serotonin synthesis in autism. Int. J. Dev. Neurosci. , 2005, 23, 171-182.

Choi, S.R., Hou, C., Oya, S., Mu, M., Kung, M.P., Siciliano, M., Acton, P.D., Kung, H.F. Selective in vitro and in vivo binding of [(125)I]ADAM to serotonin transporters in rat brain. Synapse , 2000, 38, 403-412.

Chou, Y.H., Wang, S.J., Lin, C.L., Mao, W.C., Lee, S.M., Liao, M.H. Decreased brain serotonin transporter binding in the euthymic state of bipolar I but not bipolar II disorder: a SPECT study. Bipolar Disord., 2010, 12, 312-318.

Chou, Y.H., Yang, B.H., Chung, M.Y., Chen, S.P., Su, T.P., Chen, C.C., Wang, S.J. Imaging the serotonin transporter using (123)I-ADAM in the human brain. Psychiatry Res ., 2009, 172, 38-43.

Christianson, A.L., Chesler, N., Kromberg, J.G. Fetal valproate syndrome: clinical and neuro-developmental features in two sibling pairs. Dev. Med. Child Neurol ., 1994, 36, 361- 369.

Chugani, D., Muzik, O., Rothermel, R., Behen, M., Chakraborty, P., Mangner, T., DaSilva, E., Chugani, H. T. Altered serotonin synthesis in the Dentatothalamocortical pathway in autistic boys. Ann . Neurol ., 1997, 42, 666-669.

Chugani, D.C., Muzik, O., Behen, M., Rothermel, R., Janisse, J.J., Lee, J., Chugani, H.T. Developmental changes in brain serotonin synthesis capacity in autistic and nonautistic children. Ann. Neurol., 1999, 45, 287-295.

Clayton-Smith, J., Donnai, D. Fetal valproate syndrome. J. Med. Genet ., 1995, 32, 724- 727.

Coelho, K.E., Sarmento, M.F., Veiga, C.M., Speck-Martins, C.E., Safatle, H.P., Castro, C.V., Niikawa, N. Misoprostol embryotoxicity: clinical evaluation of fifteen patients with arthrogryposis. Am. J. Med. Genet ., 2000, 95, 297-301.

159 Cohen, I.L., Liu, X., White, B.N., Jenkins, E.C., Brown, W.T., Holden, J.J.A. Association of autism severity with a monoamine oxidase A functional polymorphism. Clinical Genetics , 2003, 64, 190-197.

Conroy, J., Meally, E., Kearney, G., Fitzgerald, M., Gill, M., Gallagher, L. Serotonin transporter gene and autism: a haplotype analysis in an Irish autistic population. Mol. Psychiatry , 2004, 9, 587-593.

Cook, E. H., Leventhal, B. L., Freedman, D. X. Free serotonin in plasma: Autistic children and their first-degree relatives. Biology & Psychiatry , 1988, 24, 488-491.

Cook, E.H. Jr, Courchesne, R., Lord, C., Cox, N.J., Yan, S., Lincoln, A., Haas, R., Courchesne, E., Leventhal, B.L. Evidence of linkage between the serotonin transporter and autistic disorder. Mol. Psychiatry , 1997, 2, 247-250.

Cook, J., Edwin, H. The serotonin system in autism. Current Opinion in Pediatrics , 1996, 8, 348-354.

Coutinho, A.M., Oliveira, G., Morgadinho, T., Fesel, C., Macedo, T.R., Bento, C., Marques, C., Ataide, A., Miguel, T., Borges, L., Vicente, A.M. Variants of the serotonin transporter gene (SLC6A4) significantly contribute to hyperserotonemia in autism. Mol. Psychiatry , 2004, 9, 264-271.

Crawley, J. Designing mouse behavioural tasks relevant to autistic-like behaviours. Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews, 2004, 10, 248-258.

Croonenberghs, J., Delmeire, L., Verkerk, R., Lin, A.H., Meskal, A., Neels, H., Van der Planken, M., Scharpe, S., Deboutte, D., Pison, G., Maes, M. Peripheral markers of serotoninergic and noradrenergic function in post-pubertal, caucasian males with autistic disorder. Neuropsychopharmacology , 2000, 22, 275-283.

Cupello, A., Favale, E., Audenino, D., Scarrone, S., Gastaldi, S., Albano, C. Decrease of serotonin transporters in blood platelets after epileptic seizures. Neurochemical Research , 2005, 30, 425-428.

160

D'Amato, R.J., Loughnan, M.S., Flynn, E., Folkman, J. Thalidomide is an inhibitor of angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1994, 91, 4082-4085.

De Villard, R., Flachaire, E., Thoulon, J.M., Dalery, J., Maillet, J., Chauvin, C., Quincy, C., Renaud, B. Etude de la concentration en sérotonine plaquettaire chez des enfants autistes et parmi les membres de leurs familles. L’Encéphale , 1986, 12, 139-142.

Dean, J.C., Hailey, H., Moore, S.J., Lloyd, D.J., Turnpenny, P.D., Little, J. Long term health and neurodevelopment in children exposed to antiepileptic drugs before birth. J. Med. Genet. , 2002, 39, 251-259.

DiLiberti, J.H., Farndon, P.A., Dennis, N.R., Curry, C.J. The fetal valproate syndrome. Am. J. Med. Genet ., 1984, 19, 473-481.

Dodd, S., Berk, M. The safety of medications for the treatment of bipolar disorder during pregnancy and the puerperium. Curr. Drug Saf., 2006, 1, 25-33.

Dreux, C., Launay, JM., Blood platelets: neuronal model in psychiatric disorders. Encephale , 1985, 11, 57-64.

Dufour-Rainfray, D., Vourc’h, P., Tourlet, S., Guilloteau, D., Chalon, S., Andres, C.R. Fetal exposure to teratogens: evidence of genes involved in autism. Neuroscience & Biobehavioral Reviews , 2011, in press.

Dufour-Rainfray, D., Vourc'h, P., Le Guisquet, A.M., Garreau, L., Ternant, D., Bodard, S., Jaumain, E., Gulhan, Z., Belzung, C., Andres, C.R., et al. Behavior and serotonergic disorders in rats exposed prenatally to valproate: a model for autism. Neurosci. Lett., 2010, 470, 55-59.

Edwards, H.G., Dow-Edwards, D.L. Craniofacial alterations in adult rats prenatally exposed to ethanol. Teratology , 1991, 44, 373-378.

161 Eliasen, M., Tolstrup, J.S., Nybo Andersen, A.M., Grønbæk, M., Olsen, J., Strandberg- Larsen, K Prenatal alcohol exposure and autistic spectrum disorders--a population-based prospective study of 80 552 children and their mothers. Int. J. Epidemiol ., 2010, 39, 1074- 1081.

Faradj, B.A., Olkowski ZL, Jackson RT. Expression of a highaffinity serotonin transporter in human lymphocytes. Int. J. Immunopharmacol ., 1994, 16, 561–567.

Fatemi, S.H., Halt, A.R., Stary, J.M., Kanodia, R., Schulz, S.C., Realmuto, G.R. Glutamic acid decarboxylase 65 and 67 kDa proteins are reduced in autistic parietal and cerebellar cortices. Biol. Psychiatry , 2002, 52, 805-810.

Fitzgerald, M., Folan-Curran, J., Neuro-anatomie clinique et neurosciences connexes . Maloine éd., 2003.

Folstein, S., Rutter, M. Infantile autism: a genetic study of 21 twin pairs. J. Child Psychol. Psychiatry , 1977, 18, 297-321.

Fombonne, E. Epidemiology of autistic disorder and other pervasive developmental disorders. J. Clin. Psychiatry , 2005, 66, 3-8.

Fombonne, E. Epidemiology of pervasive developmental disorders. Pediatr. Res. , 2009, 65, 591-598.

Fukuchi, M., Nii, T., Ishimaru, N., Minamino, A., Hara, D., Takasaki, I., Tabuchi, A., Tsuda, M. Valproic acid induces up- or down-regulation of gene expression responsible for the neuronal excitation and inhibition in rat cortical neurons through its epigenetic actions. Neurosci. Res ., 2009, 65, 35-43.

Gaspar, P., Cases, O., Maroteaux, L. The developmental role of serotonin: news from mouse molecular genetics. Nat. Rev. Neurosci ., 2003, 4, 1002-1012.

Geschwind, D.H. Advances in autism. Annu. Rev. Med., 2009, 60, 367-380.

162 Gillberg, C., Steffenburg, S. Autistic behaviour in Moebius syndrome. Acta Paediatr. Scand. , 1989, 78, 314-316.

Gillberg, C., Steffenburg, S., Schaumann, H. Is autism more common now than ten years ago? Br. J. Psychiatry , 1991, 158, 403-409.

Gillberg, C., Svennerholm, L. CSF monoamines in autistic syndromes and other pervasive developmental disorders of early childhood. Br. J. Psychiatry , 1987, 151, 89-94.

Gillberg, C., Winnergård, I. Childhood psychosis in a case of Moebius syndrome. Neuropediatrics , 1984, 15, 147-149.

Goodlett, C.R., Horn, K.H., Zhou, F.C. Alcohol teratogenesis: mechanisms of damage and strategies for intervention. Exp. Biol. Med ., 2005, 230, 394-406.

Guhathakurta, S., Singh, A.S., Sinha, S., Chatterjee, A., Ahmed, S., Ghosh, S., Usha, R. Analysis of serotonin receptor 2A gene (HTR2A): association study with autism spectrum disorder in the Indian population and investigation of the gene expression in peripheral blood leukocytes. Neurochem. Int., 2009, 55, 754-759.

Gutierrez, G-C., Smalley, S-L., Tanguay, P-E. Autism in tuberous sclerosis complex. J. Autism Dev. Disord., 1998, 28, 97-103.

Haglund, N.G., Källén, K.B. Risk factors for autism and Asperger syndrome: Perinatal factors and migration. Autism . Oct 5, 2010.

Halldin, C., Lundberg, j., Sovago, J., Gulyas, B., Guilloteau, D., Vercouillie, J., Emond, P., Chalon, S., Tarkiainen, J., Hiltunen, J., Farde, L. [ 11 C] MADAM, a new serotonin transporter radioligand characterized in the monkey brain by PET. Synapse , 2005, 58, 173- 183.

Hallene, K.L., Oby, E., Lee, B.J., Santaguida, S., Bassanini, S., Cipolla, M., Marchi, N., Hossain, M., Battaglia, G., Janigro, D. Prenatal exposure to thalidomide, altered vasculogenesis, and CNS malformations. Neuroscience , 2006, 142, 267-283.

163

Hanley, H.G., Stahl, S.M., Freedman, D.X. Hyperserotoninemia and amine metabolites in autistic and retarded children. Archives of General Psychiatry , 1977, 64, 521-531.

Harris, S.R., MacKay, L.L., Osborn, J.A. Autistic behaviors in offspring of mothers abusing alcohol and other drugs: a series of case reports. Alcohol.: Clin. Exp. Res ., 1995, 19, 660-665.

Hendren, R.L., Bertoglio, K., Ashwood, P., Sharp, F. Mechanistic biomarkers for autism treatment. Med. Hypotheses , 2009, 73, 950-954.

Hérault, J., Martineau, J., Perrot-Beaugerie, A., Jouve, J., Tournade, H., Barthelemy, C., Lelord, G., Muh, J.P. Investigation of whole blood and urine monoamines in autism. European Child and Adolescent Psychiatry , 1993, 2, 211-220.

Holmes, L.B. Teratogen-induced limb defects. Am. J. Med. Genet ., 2002, 112, 297-303.

Hranilovic, D., Blazevic, S., Babic, M., Smurinic, M., Bujas-Petkovic, Z., Jernej, B. 5- HT2A receptor gene polymorphisms in Croatian subjects with autistic disorder. Psychiatry Res ., 2010, 178, 556-558.

Hranilovic, D., Bujas-Petkovic, Z., Tomicic, M., Bordukalo-Niksic, T., Blazevic, S., Cicin- Sain, L. Hyperserotonemia in autism: activity of 5HT-associated platelet proteins. J. Neural Transm ., 2009, 116, 493-501.

Hranilovic, D., Bujas-Petkovic, Z., Vragovic, R., Vuk, T., Hock, K., Jernej, B. Hyperserotonemia in adults with autistic disorder. J. Autism Dev. Disord. , 2007, 37, 1934- 40.

Huang, P.H., McBride, W.G. Interaction of [glutarimide-2-14C]-thalidomide with rat embryonic DNA in vivo. Teratog., Carcinog., Mutagen ., 1997, 17, 1-5.

Hwang, S.J., Chen, Y.S. Congenital rubella syndrome with autistic disorder. J. Chin. Med. Assoc. , 2010, 73, 104-107.

164

Johansson, M., Wentz, E., Fernell, E., Strömland, K., Miller, M.T., Gillberg, C. Autistic spectrum disorders in Möbius sequence: a comprehensive study of 25 individuals. Dev. Med. Child Neurol ., 2001, 43, 338-345.

Jones, K.L., Smith, D.W. Recognition of the fetal alcohol syndrome in early infancy. Lancet , 1973, 302, 999-1001.

Joyce, J.N., Shane, A., Lexow, N., Winokur, A., Casanova, M., Kleinman, J. Serotonin uptake sites and serotonin receptors are altered in the limbic system of schizophrenics. Neuropsychopharmacology , 1993, 8, 315-336.

Kahne, D., Tudorica, A., Borella, A., Shapiro, L., Johnstone, F., Huang, W., Whitaker- Azmitia, P. Behavioral and magnetic resonance spectroscopic studies in the rat hyperserotonemic model of autism. Physiology & behaviour , 2002, 75, 403-410.

Kałuzna-Czapli ńska, J., Socha, E., Rynkowski, J. Determination of homovanillic acid and vanillylmandelic acid in urine of autistic children by gas chromatography/mass spectrometry. Med. Sci. Monit ., 2010, 16, CR445-450.

Kanner, L. Autistic disturbances of affective contact. Nerv. Child, 1943, 2, 217-250.

Kim, S.J., Cox, N., Courchesne, R., Lord, C., Corsello, C., Akshoomoff, N., Guter, S., Leventhal, B.L., Courchesne, E., Cook, E.H. Jr. Transmission disequilibrium mapping at the serotonin transporter gene (SLC6A4) region in autistic disorder. Mol. Psychiatry , 2002, 7, 278-288.

Kini, U., Adab, N., Vinten, J., Fryer, A., Clayton-Smith, J. Dysmorphic features: an important clue to the diagnosis and severity of fetal anticonvulsant syndromes. Arch. Dis. Child. Fetal Neonatal Ed., 2006, 91, F90-F95.

Klauck, S., Poustka, F., Benner, A., Lesch, K-L., Poustka, A. Serotonin transporter (5- HTT) gene variants associated with autism? Human Molecular Genetics , 1997, 6, 2233- 2238.

165

Kuikka, J.T., Tammela, L., Bergström, K.A., Karhunen, L., Uusitupa, M., Tiihonen, J. Effects of ageing on serotonin transporters in healthy females. Eur. J. Nucl. Med ., 2001, 28, 911-913.

Kunugi, H., Hattori, M., Kato, T., Tatsumi, M., Sakai, T., Sasaki, T., Hirose, T., Nanko, S. Serotonin transporter gene polymorphisms: ethnic difference and possible association with bipolar affective disorder. Molecular Psychiatry , 1997, 2, 457-462.

Kuwagata, M., Ogawa, T., Shioda, S., Nagata, T. Observation of fetal brain in a rat valproate-induced autism model: a developmental neurotoxicity study. Int. J. Dev. Neurosci ., 2009, 27, 399-405.

Laegreid, L., Kyllerman, M., Hedner, T., Hagberg, B., Viggedahl, G. Benzodiazepine amplification of valproate teratogenic effects in children of mothers with absence epilepsy. Neuropediatrics , 1993, 24, 88-92.

Lam, K.S., Aman, M.G., Arnold, L.E. Neurochemical correlates of autistic disorder: a review of the literature. Res. Dev. Disabil ., 2006, 27, 254-289.

Lamy, S., Thibaut, F. Psychoactive substance use during pregnancy: a review. Encephale , 2010, 36, 33-38.

Landa, R.J., Holman, K.C., Garrett-Mayer, E. Social and communication development in toddlers with early and later diagnosis of autism spectrum disorders. Arch. Gen. Psychiatry , 2007, 64, 853-864.

Landgren, M., Svensson, L., Strömland, K., Andersson Grönlund, M. Prenatal alcohol exposure and neurodevelopmental disorders in children adopted from Eastern Europe. Pediatrics , 2010, 125, e1178-e1185.

Landrigan, P.J What causes autism? Exploring the environmental contribution. Curr. Opin. Pediatr ., 2010, 22, 219-225.

166 Larsson, H.J., Eaton, W.W., Madsen, K.M., Vestergaard, M., Olesen, A.V., Agerbo, E., Schendel, D., Thorsen, P., Mortensen, P.B. Risk factors for autism: perinatal factors, parental psychiatric history, and socioeconomic status. Am. J. Epidemiol ., 2005, 161, 916- 925.

Lawrence, R.C., Bonner, H.C., Newsom, R.J., Kelly S.J. Effects of alcohol exposure during development on play behaviour and c-Fos expression in response to play behaviour. Behav. Brain Res., 2008, 188, 209-218.

Leboyer, M., Bouvard, M.P., Launay, J.M., Tabuteau, F., Waller, D., Dugas, M., Kerdelhue, B., Lensing, P., Panksepp, J. Brief report: a double-blind study of naltrexone in infantile autism. J. Autism Dev. Disord ., 1992, 22, 309-319.

Leboyer, M., Philippe, A., Bouvard, M., Mouren-Siméoni, Launay, J-M. Whole blood serotonin and plasma beta-endorphin in autistic probands and their first-degree relatives. Society of Biological Psychiatry , 1999a, 45, 158-163.

Leboyer, M., Quintin, P., Manivet, P., Varoquaux, O., Allilaire, J-F., Launay, J-M. Decrease serotonin transporter binding in unaffected relatives of manic depressive patients. Biological Psychiatry , 1999b, 46, 1703-1706.

Lenoir, P., Bodier, C. L’autisme de l’enfant : nouvelles approches pédopsychiatriques. Congrès de psychiatrie et de neurologie de langue française . Médias Flashs, Paris, 2000. Lenz, W., Knapp K. Thalidomide embryopathy. Arch. Environ. Health , 1962, 5, 100-105.

Lesch, K.P., Wolozin, B., Murphy, D., Riederer, P. Primary structure of the human platelet serotonin uptake site: identity with the brain serotonin transporter. J. Neurochem ., 1993, 60, 2319-2322.

Levy, S.E., Mandell, D.S., Schultz, R.T. Autism. Lancet , 2009, 374, 1627-1638.

Libbey, J.E., Sweeten, T.L., McMahon, W.M., Fujinami, R.S. Autistic disorder and viral infections. J. Neurovirol ., 2005, 11, 1-10.

167 Liesi P. Ethanol-exposed central neurons fail to migrate and undergo apoptosis. J. Neurosci. Res ., 1997, 48, 439-448.

Loscher, W. Basic pharmacology of valproate: a review after 35 years of clinical use for the treatment of epilepsy. CNS drugs, 2002, 16, 669-694.

Lundberg, J., Halldin, C., Farde, L. measurement of serotonin transporter binding with PET and [ 11 C]-MADAM: A test-retest reproducibility study. Synapse , 2006, 60, 256-263.

Lundberg, J., Odano, I., Olsson, H., Halldin, C., Farde, L. Quantification of 11C-MADAM binding to the serotonin transporter in the human brain. Journal of Nuclear Medicine , 2005, 46, 1505-1515.

Maestrini, E., Paul, A., Monaco, A.P., Bailey, A. Identify autism susceptibility genes. Neuron , 2000, 28, 19-24.

Maguire, K., Norman, T., Burrows, G., hopwood, M., Morris, P. Platelet paroxetine binding in post-traumatic stress disorder. Psychiatry Research , 1998, 77, 1-7.

Makkonen, I., Riikonen, R., Kokki, H., Airaksinen, M.M., Kuikka, J.T. Serotonin and dopamine transporter binding in children with autism determined by SPECT. Dev. Med. Child Neurol. , 2008, 50, 593-597.

Marazziti, D., Dell’Osso, L., Presta, S., Pfanner, C., Rossi, A., Masala, I., Baroni, S., Giannaccini, G., Lucacchini, A., Cassano, G. B. Platelet 3H-Paroxetine binding in patients with OCD-related disorders. Psychiatry Research , 1999a, 89, 223-228.

Marazziti, D., Muratori, F., Cesari, A., Masala, I., Baroni, S., Giannaccini, G., Dell’Osso, L., Cosenza, A., Pfanner, P., Cassano, G. B. Increased density of the platelet serotonin transporter in autism. Pharmacopsychiatry , 2000, 33, 165-168.

Marazziti, D., Rossi, A., Dell’Osso, L., Palego, L., Placidi G., Giannaccini, G., Lucacchini, A., Cassano, G.B. Decreased platelet 3H-Paroxetine binding in untreated panic disorder patients. Life sciences , 1999b, 65, 2735-2741.

168

Markram, K., Rinaldi, T., La Mendola, D., Sandi, C., Markram, H. Abnormal fear conditioning and amygdala processing in an animal model of autism. Neuropsychopharmacology , 2008, 33, 901-912.

Marques-Dias, M.J., Gonzalez, C.H., Rosemberg, S. Möbius sequence in children exposed in utero to misoprostol: neuropathological study of three cases. Birth Defects Res., Part A , 2003, 67, 1002-1007.

Martineau J, Hérault J, Petit E, Guérin P, Hameury L, Perrot A, Mallet J, Sauvage D, Lelord G, Müh JP. Catecholaminergic metabolism and autism. Dev. Med. Child Neurol ., 1994, 36, 688-697.

Mazer, C., Muneyyirci, J., Taheny, K., Raio, N., Borella, A., Whitaker-Azmitia, P. Serotonin depletion during synaptogenesis leads to decreased synaptic density and learning deficits in the adult rat: a possible model of neurodevelopment disorders with cognitive deficits. Brain Research , 1997, 760, 68-73.

McBride, P.A., Anderson, G.M., Hertzig, M.E., Sweeney, J.A., Kream, J., Cohen, D.J., Mann, J.J. Serotonergic responsivity in male young adults with autistic disorder. Results of a pilot study. Arch. Gen. Psychiatry , 1989, 46, 213-221.

McDougle, C., Naylor, S., Cohen, D., Aghajanian, G., Heninger, G., Price, L. Effects of tryptophan depletion in drug-free adults with autism. Arch. Gen. Psychiatry , 1996, 53.

Mercado, C.P., Kilic, F. Molecular mechanisms of SERT in platelets: regulation of plasma serotonin levels. Mol. Interv ., 2010, 10, 231-241.

Messerschmitt, P., Barthélémy, C., Canoui, P., Sauvage, D. Clinique des syndromes autistiques. Maloine éd, 1990.

Meunier, J.M., Shvaloff, A. Neurotransmetteurs . Masson éd, 1992.

169 Miles, J.H., Takahashi, T.N., Hong, J., Munden, N., Flournoy, N., Braddock, S.R., Martin, R.A., Bocian, M.E., Spence, M.A., Hillman, R.E., et al. Development and validation of a measure of dysmorphology: useful for autism subgroup classification. Am. J. Med. Genet ., 2008, 146A, 1101-1116.

Miller, M.T., Strömland, K., Gillberg, C., Johansson, M., Nilsson, E.W. The puzzle of autism: an ophthalmologic contribution. Trans. Am. Ophthalmol. Soc ., 1998, 96, 369-385.

Miller, M.T., Stromland, K., Ventura, L., Johansson, M., Bandim, J.M., Gillberq, C. Autism associated with conditions characterized by developmental errors in early embryogenesis: a mini review. Int. J. Dev. Neurosci. , 2005, 23, 201-219.

Miller, M.T., Strömland, K., Ventura, L., Johansson, M., Bandim, J.M., Gillberg, C. Autism with ophthalmologic malformations: the plot thickens. Trans. Am. Ophthalmol. Soc ., 2004, 102, 107-120.

Minderaa, R.B., Anderson, G.M., Volkmar, F.R., Akkerhuis, G.W., Cohen, D.J. Neurochemical study of dopamine functioning in autistic and normal subjects. J. Am. Acad. Child Adolesc. Psychiatry , 1989, 28, 190-194.

Minderaa, R.B., Anderson, G.M., Volkmar, F.R., Akkerhuis, G.W., Cohen, D.J. Noradrenergic and adrenergic functioning in autism. Biol. Psychiatry , 1994, 36, 237-241.

Miyazaki, K., Narita, N., Narita, M. Maternal administration of thalidomide or valproic acid causes abnormal serotonergic neurons in the offspring: implication for pathogenesis of autism. International Journal of developmental Neuroscience, 2005, 23, 287-297.

Moll, G., Mehnert, C., Wicker, M., Bock, N., Rothenberger, A., Rüther, E., Huether, G. Age-associated changes in the densities of presynaptic monoamine transporters in different regions of the rat brain from early juvenile life to late adulthood. Developmental brain research , 2000, 119, 251-257.

Mooney, S.M., Varlinskaya, E.I. Acute prenatal exposure to ethanol and social behavior: effect of age, sex, and timing of exposure. Behav. Brain Res ., 2010, In press.

170

Moore, S.J., Turnpenny, P., Quinn, A., Glover, S., Lloyd, D.J., Montgomery, T., Dean, J.C. A clinical study of 57 children with fetal anticonvulsant syndromes. J. Med. Genet. , 2000, 37, 489-497.

Mulder, E.J., Anderson, G.M., Kema, I.P., De Bildt, A., Van Lang, N.D., Den Boer, J.A., Minderaa, R.B. Platelet serotonin levels in pervasive developmental disorders and mental retardation: diagnostic group differences, within-group distribution, and behavioral correlates. J. Am. Acad. Child Adolesc. Psychiatry , 2004, 43, 491-499.

Murphy, D.G., Daly, E., Schmitz, N., Toal, F., Murphy, K., Curran, S., Erlandsson, K., Eersels, J., Kerwin, R., Ell, P., Travis, M. Cortical serotonin 5-HT2A receptor binding and social communication in adults with Asperger's syndrome: an in vivo SPECT study. Am. J. Psychiatry , 2006, 163, 934-936.

Myers, R.L., Airey, D.C., Manier, D.H., Shelton, R.C., Sanders-Bush, E. Polymorphisms in the regulatory region of the human serotonin 5-HT2A receptor gene (HTR2A) influence gene expression. Biol. Psychiatry , 2007, 61, 167-173.

Nakamura, K., Sekine, Y., Ouchi, Y., Tsujii, M., Yoshikawa, E., Futatsubashi, M., Tsuchiya, K.J., Sugihara, G., Iwata, Y., Suzuki, K., et al. Brain serotonin and dopamine transporter bindings in adults with high-functioning autism. Arch. Gen. Psychiatry , 2010, 67, 59-68.

Nakatani, Y., Sato-Suzuki, I., Tsujino, N., Nakasato, A., Seki, Y., Fumoto, M., Arita, H. Augmented brain 5-HT crosses the blood-brain barrier through the 5-HT transporter in rat. Eur. J. Neurosci ., 2008, 27, 2466-2472.

Nanson, J.L. Autism in fetal alcohol syndrome: a report of six cases. Alcohol.: Clin. Exp. Res., 1992, 16, 558-565.

Narayan, M., Srinath, S., Anderson, G.M., Meundi, D.B. Cerebrospinal fluid levels of homovanillic acid and 5-hydroxyindoleacetic acid in autism. Biol. Psychiatry , 1993, 33, 630-635.

171

Narita, N., Kato, M., Tazoe, M., Miyazaki, K., Narita, M., Okado, N. Increased monoamine concentration in the brain and blood of fetal thalidomide- and valproic acid- exposed rat: putative animal models for autism. Pediatric Research , 2002, 52, 576-579.

Neubert, R., Hinz, N., Thiel, R., Neubert, D. Down-regulation of adhesion receptors on cells of primate embryos as a probable mechanism of the teratogenic action of thalidomide. Life Sci. , 1996, 58, 295-316.

Newport, D.J., Owens, M., Knight, D., Ragan, K., Morgan, N., Nemeroff, C., Stowe, Z. Alterations in platelet serotonin transporter binding in women with postpartum onset major depression. Journal of psychiatric research , 2004, 38, 467-473.

Ornoy, A. Valproic acid in pregnancy: how much are we endangering the embryo and fetus? Reprod. Toxicol ., 2009, 28, 1-10.

Oya, S., Choi, S.R., Hou, C., Mu, M., Kung, M.P., Acton, P.D., Siciliano, M., Kung, H.F. 2-((2-((dimethylamino)methyl)phenyl)thio)-5-iodophenylamine (ADAM): an improved serotonin transporter ligand. Nucl. Med. Biol ., 2000, 27, 249-254.

Ozgen, H., Hellemann, G.S., Stellato, R.K., Lahuis, B., van Daalen, E., Staal, W.G., Rozendal, M., Hennekam, R.C., Beemer, F.A., van Engeland, H. Morphological Features in Children with Autism Spectrum Disorders: A Matched Case-Control Study. J. Autism Dev. Disord., 2011, 41, 23-31.

Parsons, M.J., D'Souza, U.M., Arranz, M.J., Kerwin, R.W., Makoff, A.J. The -1438A/G polymorphism in the 5-hydroxytryptamine type 2A receptor gene affects promoter activity. Biol. Psychiatry , 2004, 56, 406-410.

Paxinos, G., Watson, G. The rat brain in stereotaxis coordinates . Academic press, New- York, 1986.

Persico, A.M., Bourgeron, T. Searching for ways out of the autism maze: genetic, epigenetic and environmental clues. Trends Neurosci ., 2006, 29, 349-358.

172

Persico, A.M., Militerni, R., Bravaccio, C., Schneider, C., Melmed, R., Conciatori, M., Damiani, V., Baldi, A., Keller, F. Lack of association between serotonin transporter gene promoter variants and autistic disorder in two ethnically distinct samples. Am. J. Med. Genet ., 2000, 96, 123-127.

Pignataro, L., Varodayan, F.P., Tannenholz, L.E., Harrison, N.L. The regulation of neuronal gene expression by alcohol. Pharmacol. Ther., 2009, 124, 324-335.

Ploeger, A., Raijmakers, M.E., van der Maas, H.L., Galis, F. The association between autism and errors in early embryogenesis: what is the causal mechanism? Biol. Psychiatry , 2010, 67, 602-607.

Pottie, K. Is misoprostol teratogenic? Misoprostol use during early pregnancy and its association with Mobius' syndrome. Can. Fam. Physician , 1999, 45, 315-316.

Purcell, A.E., Jeon, O.H., Zimmerman, A.W., Blue, M.E., Pevsner, J. Postmortem brain abnormalities of the glutamate neurotransmitter system in autism. Neurology , 2001, 57, 1618-1628.

Ramacciotti, C., Coli, E., Paoli, R., Marazziti, D., Dell’Osso, L. Serotonergic activity measured by platelet 3H-Paroxetine binding in patients with eating disorders. Psychiatry Research , 2003, 118, 33-38.

Ramamoorthy, S., Blakely, R.D. Phosphorylation and sequestration of serotonin transporters differentially modulated by psychostimulants. Science , 1999, 285, 763-766.

Ramamoorthy, S., Shippenberg, T.S., Jayanthi, L.D. Regulation of monoamine transporters: Role of transporter phosphorylation. Pharmacol. Ther. , 2010, in press.

Rasalam, A.D., Hailey, H., Williams, J.H., Moore, S.J., Turnpenny, P.D., Lloyd, D.J., Dean, J.C. Characteristics of fetal anticonvulsant syndrome associated autistic disorder, Dev. Med. Child Neurol ., 2005, 47, 551-555.

173 Rasmussen, A., Christensen, J., Clemmensen, P.M., Dalsgaard, N.J., Dam, H., Hinderg, I., Lunde, M., Plenge, P., Mellerup, E. Platelet serotonin transporter in stroke patients. Acta Neurologica Scandinavica , 2003, 107, 150-153.

Redcay, E., Courchesne, E. When is the brain enlarged in autism? A meta-analysis of all brain size reports. Biol. Psychiatry , 2005, 58, 1-9.

Rice, D., Barone, S.J. Critical periods of vulnerability for the developing nervous system: evidence from humans and animal models. Environ. Health Perspect ., 2000, 108, 511-533.

Rodier, P.M., Bryson, S.E., Welch, J.P. Minor malformations and physical measurements in autism: data from Nova Scotia. Teratology , 1997a, 55, 319-325.

Rodier, P.M., Ingram, J.L, Tisdale, B., Croog, V.J. Linking etiologies in humans and animal models: studies of autism. Reprod. Toxicol ., 1997b, 11, 417-422.

Rodier, P.M., Ingram, J.L., Tisdale, B., Nelson, S., Romano, J. Embryological origin for autism: developmental anomalies of the cranial nerve motor nuclei. J. Comp. Neurol ., 1996, 370, 247-261.

Rosenthal, N.E., Mazzanti, C.M., Barnett, R.L., Hardin, T.A., Turner, E.H., Lam, G.K., Ozaki, N., Goldman, D. Role of serotonin transporter promoter repeat length polymorphism (5-HTTLPR) in seasonality and seasonal affective disorder. Molecular Psychiatry, 1998, 3, 175-177.

Roullet, F.I., Wollaston, L., Decatanzaro, D., Foster, J.A. Behavioral and molecular changes in the mouse in response to prenatal exposure to the anti-epileptic drug valproic acid. Neuroscience , 2010, 170, 514-522.

Rout, U.K., Clausen, P. Common increase of GATA-3 level in PC-12 cells by three teratogens causing autism spectrum disorders. Neurosci. Res ., 2009, 64, 162-169.

Rumsey, J., Ernst, M. Functional neuroimaging of autistic disorders. Mental retardation and developmental disabilities research reviews , 2000, 6, 171-179.

174

Rutter, M. Concept of autism: a review of research. J. Child Psychol. Psychiatry , 1968, 9, 1-25.

Rutter, M., Andersen-Wood, L., Beckett, C., Bredenkamp, D., Castle, J., Groothues, C., Kreppner, J., Keaveney, L., Lord, C., O'Connor, T-G. Quasi-autistic patterns following severe early global privation. English and Romanian Adoptees (ERA) Study Team. J. Child Psychol. Psychiatry, 1999, 40, 537-549.

Ryding, E., Lindström, M., Brådvik, B., Grabowski, M., Bosson, P., Träskman-Bendz, L., Rosén, I. A new model for separation between brain dopamine and serotonin transporters in 123I-beta-CIT SPECT measurements: normal values and sex and age dependence. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 2004, 31, 1114-1118.

Safai-Kutti, S., Denfors, I., Kutti, J., Wadenvik, H. In vitro platelet function in infantile autism. Folia Haematol. Int. Mag. Klin. Morphol. Blutforsch., 1988, 115, 897-901.

Sari, Y., Zhou, F.C. Prenatal alcohol exposure causes long-term serotonin neuron deficit in mice. Alcohol.: Clin. Exp. Res., 2004, 28, 941-948.

Sathyan, P., Golden, H.B., Miranda, R.C. Competing interactions between micro-RNAs determine neural progenitor survival and proliferation after ethanol exposure: evidence from an ex vivo model of the fetal cerebral cortical neuroepithelium. J. Neurosci ., 2007, 27, 8546-8557.

Schain, R.J., Freedman, D.X. Studies on 5-hydroxyindole metabolism in autistic and other mentally retarded children. J. Pediatr ., 1961, 58, 315-320.

Schneider, T., Labuz, D., Przewłocki R. Nociceptive changes in rats after prenatal exposure to valproic acid. Pol. J. Pharmacol ., 2001, 53, 531-534.

Schneider, T., Przewlocki, R. Behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid: animal model of autism. Neuropsychopharmacology , 2005, 30, 80-89.

175 Schneider, T., Roman, A., Basta-Kaim, A., Kubera, M., Budziszewska, B., Schneider, K., Przewłocki, R. Gender-specific behavioral and immunological alterations in an animal model of autism induced by prenatal exposure to valproic acid. Psychoneuroendocrinology , 2008, 33, 728-740.

Schumacher, H., Blake, D.A., Gurian, J.M., Gillette, J.R. A comparison of the teratogenic activity of thalidomide in rabbits and rats. J. Pharmacol. Exp. Ther ., 1968, 160, 189-200.

Schumann, C.M., Amaral, D.G. Stereological analysis of amygdala neuron number in autism. J. Neurosci ., 2006, 26, 7674-7679.

Schumann, C.M., Barnes, C.C., Lord, C., Courchesne, E. Amygdala enlargement in toddlers with autism related to severity of social and communication impairments. Biol. Psychiatry , 2009, 66, 942-949.

Sodhi, M.S., Sanders-Bush, E. Serotonin and brain development. Int. Rev. Neurobiol., 2004, 59, 111-174.

Strömland, K., Nordin, V., Miller, M., Akerström, B., Gillberg, C. Autism in thalidomide embryopathy: a population study. Dev. Med. Child Neurol ., 1994, 36, 351-356.

Strömland, K., Sjögreen, L., Miller, M., Gillberg, C., Wentz, E., Johansson, M., Nylén, O., Danielsson, A., Jacobsson, C., Andersson, J., et al. Mobius sequence–a Swedish multidiscipline study. Eur. J. Paediatr. Neurol ., 2002, 6, 35-45.

Sweeten, T.L., Fujinami, R.S. A potential link between measles virus and autism: age- matched control groups are essential. Pediatr. Neurol ., 2004, 30, 78.

Tejani-Butt, S.M., Yang, J., Pawlyk, A.C. Altered serotonin transporter sites in Alzheimer's disease raphe and hippocampus. Neuroreport , 1995, 6, 1207-1210.

Thiel, R., Kastner, U., Neubert, R. Expression of adhesion receptors on rat limb bud cells and results of treatment with a thalidomide derivative. Life Sci ., 2000, 66, 133-141.

176 Tordjman, S., Drapier, D., Bonnot, O., Graignic, R., Fortes, S., Cohen, D., Millet, B., Laurent, C., Roubertoux, P.L. Animal models relevant to schizophrenia and autism: validity and limitations. Behav. Genet ., 2007, 37, 61-78.

Tordjman, S., Gutknecht, L., Carlier, M., Spitz, E., Antoine, C., Slama, F., Carsalade, V., Cohen, D.J., Ferrari, P., Roubertoux, P.L., Anderson, G.M. Role of the serotonin transporter gene in the behavioral expression of autism. Mol. Psychiatry , 2001, 6, 434-439.

Tripi, G., Roux, S., Canziani, T., Bonnet Brilhault, F., Barthélémy, C., Canziani, F. Minor physical anomalies in children with autism spectrum disorder. Early Hum. Dev ., 2008, 84, 217-223.

Tsujino, N., Nakatani, Y., Seki, Y., Nakasato, A., Nakamura, M., Sugawara, M., Arita, H. Abnormality of circadian rhythm accompanied by an increase in frontal cortex serotonin in animal model of autism. Neurosci. Res . 2007, 57, 289-295.

Uebelhack, R., Franke, L., Herold, N., Plotkin, M., Amthauer, H., Felix, R. Brain and platelet serotonin transporter in humans - correlation between [123I]-ADAM SPECT and serotonergic measurements in platelets. Neuroscience Letters , 2006, 406, 153-158.

Van de Giessen, E., Booij, J. The SPECT tracer [123I]ADAM binds selectively to serotonin transporters: a double-blind, placebo-controlled study in healthy young men. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging , 2010, 37, 1507-1511.

Vinten, J., Adab, N., Kini, U., Gorry, J., Gregg, J., Baker, G.A. Neuropsychological effects of exposure to anticonvulsant medication in utero. Neurology , 2005, 64, 949-954.

Vinten, J., Bromley, R.L., Taylor, J., Adab, N., Kini, U., Baker, G.A. The behavioral consequences of exposure to antiepileptic drugs in utero. Epilepsy Behav ., 2009, 14, 197- 201.

Volkmar, F. R., Pauls, D. Autism. The Lancet , 2003, 362, 1133-1141.

177 Vorhees, C.V., Weisenburger, W.P., Minck, D.R. Neurobehavioral teratogenic effects of thalidomide in rats. Neurotoxicol. Teratol ., 2001, 23, 255-264.

Vourc'h, P., Bienvenu, T., Beldjord, C., Chelly, J., Barthelemy, C., Müh, J-P., Andres, C. No mutations in the coding region of the Rett syndrome gene MECP2 in 59 autistic patients. Eur. J. Hum. Genet ., 2001, 9, 556-558.

Wegiel, J., Kuchna, I., Nowicki, K., Imaki, H., Wegiel, J., Marchi. E., Ma, S.Y., Chauhan, A., Chauhan, V., Bobrowicz, T.W., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathol ., 2010, 119, 755-770.

Whitaker-Azmitia, P. Behavioral and cellular consequences of increasing serotonergic activity during brain development: a role in autism? International Journal of developmental Neuroscience, 2005, 23, 75-83.

Whitaker-Azmitia, P. Serotonin and brain development: role in human developmental diseases. Brain Research Bulletin , 2001, 56, 479-485.

Willeit, M., Praschak-Rieder, N., Neumeister, A., Pirker, W., Asenbaum, S., Vitouch, O., Tauscher, J., Hilger, E., Stastny, J., Brücke, T., Kasper, S.[ 123 I]beta-CIT SPECT imaging shows reduced brain serotonin transporter availability in drug-free depressed patients with seasonal affective disorder. Biological Psychiatry , 2000, 47, 482-489.

Williams, G., King, J., Cunningham, M., Stephan, M., Kerr, B., Hersh, J.H. Fetal valproate syndrome and autism: additional evidence of an association. Dev. Med. Child Neurol., 2001, 43, 202-206.

Williams, P.G., Hersh, J.H. A male with fetal valproate syndrome and autism. Dev. Med. Child Neurol. , 1997, 39, 632-634.

Yamamoto, M., Suhara, T., Okubo, Y., Ichimiya, T., Sudo, Y., Inoue, M., Takano, A., Yasuno, F., Yoshikawa, K., Tanada, S. Age-related decline of serotonin transporters in living human brain of healthy males. Life Sci. , 2002, 71, 751-757.

178

Yamashita, Y., Fujimoto, C., Nakajima, E., Isagai, T., Matsuishi, T. Possible association between congenital cytomegalovirus infection and autistic disorder. J. Autism Dev. Disord ., 2003, 33, 455-459.

Yan, W., Wilson, C., Haring, J. 5-HT1a receptors mediate the neurotrophic effect of serotonin on developing dentate granule cells. Developmental Brain Research , 1997, 98, 185-190.

Yirmiya, N., Pilowsky, T., Nemanov, L., Arbelle, S., Feinsilver, T., Fried, I., Ebstein, R.P. Evidence for an association with the serotonin transporter promoter region polymorphism and autism. Am J Med Genet , 2001, 105, 381-386.

Yochum, C.L., Dowling, P., Reuhl, K.R., Wagner, G.C., Ming, X. VPA-induced apoptosis and behavioral deficits in neonatal mice. Brain Res., 2008, 1203, 126-132.

Young, J.G., Cohen, D.J., Caparulo, B.K., Brown, S.L., Maas, J.W. Decreased 24-hour urinary MHPG in childhood autism. Am. J. Psychiatry , 1979, 136, 1055-1057.

Zheng, F., Adelsberger, H., Müller, M.R., Fritschy, J.M., Werner, S., Alzheimer, C. Activin tunes GABAergic neurotransmission and modulates anxiety-like behavior. Mol. Psychiatry, 2009, 14, 332-346.

Zhong, N., Ye, L., Ju, W., Brown, W.T., Tsiouris, J., Cohen, I. 5-HTTLPR variants not associated with autistic spectrum disorders. Neurogenetics , 1999, 2, 129-131.

Zhou, F.C., Sari, Y., Li, T.K., Goodlett, C., Azmitia, E.C. Deviations in brain early serotonergic development as a result of fetal alcohol exposure. Neurotox. Res., 2002, 4, 337-342.

Zhou, F.C., Sari, Y., Powrozek, T.A. Fetal alcohol exposure reduces serotonin innervation and compromises development of the forebrain along the serotonergic pathway. Alcohol.: Clin. Exp. Res., 2005, 29, 141-149.

179 Annexes

180 Annexe 1 : Critères diagnostiques du trouble autistique (DSM-IV, 1994)

Critères diagnostiques du F84.0 [299.00] Trouble autistique

I. A. 1. A. Un total de six (ou plus) parmi les éléments décrits en (1), (2) et (3), dont au moins deux de (1), un de (2) et un de (3) :

(1) Altération qualitative des interactions sociales, comme en témoignent au moins deux des éléments suivants : (a) altération marquée dans l’utilisation, pour réguler les interactions sociales, de comportements non verbaux multiples, tels que le contact oculaire, la mimique faciale, les postures corporelles, les gestes (b) incapacité à établir des relations avec les pairs correspondant au niveau de développement (c) le sujet ne cherche pas spontanément à partager ses plaisirs, ses intérêts, ou ses réussites avec d’autres personnes (p. ex., il ne cherche pas à montrer, à désigner du doigt ou à apporter les objets qui l’intéressent) (d) manque de réciprocité sociale ou émotionnelle

(2) altération qualitative de la communication, comme en témoigne au moins un des éléments suivants : (a) retard ou absence totale de développement du langage parlé (sans tentative de compensation par d’autres modes de communication, comme le geste ou la mimique) (b) chez les sujets maîtrisant suffisamment le langage, incapacité marquée à engager ou à soutenir une conversation avec autrui (c) usage stéréotypé et répétitif du langage, ou langage idiosyncrasique (d) absence d’un jeu de « faire semblant » varié et spontané, ou d’un jeu d’imitation sociale correspondant au niveau du développement

(3) caractère restreint, répétitif et stéréotypé des comportements, des intérêts et des activités, comme en témoigne au moins un des éléments suivants : (a) préoccupation circonscrite à un ou plusieurs centres d’intérêt stéréotypés et restreints, anormale soit dans son intensité, soit dans son orientation (b) adhésion apparemment inflexible à des habitudes ou à des rituels spécifiques et non fonctionnels (c) maniérismes moteurs stéréotypés et répétitifs (p. ex., battements ou torsions des mains ou des doigts, mouvements complexes de tout le corps) (d) préoccupations persistantes pour certaines parties des objets

I. A. 2. B. Retard ou caractère anormal du fonctionnement, débutant avant l’âge de trois ans, dans au moins l’un des domaines suivants : (1) interactions sociales, (2) langage nécessaire à la communication sociale, (3) jeu symbolique ou d’imagination.

I. A. 3. C. La perturbation n’est pas mieux expliquée par le diagnostic de Syndrome de Rett ou de Trouble désintégratif de l’enfance.

181 Annexe 2 : Liste des Inhibiteurs de la Recapture de la Sérotonine

Inhibiteurs Sélectifs de la Recapture de la Sérotonine ISRS Paroxétine Deroxat® Fluoxétine Prozac® Fluvoxamine Floxyfral® Citalopram Séropram® Sertraline Zoloft®

Inhibiteurs de la Recapture de la Sérotonine et de la Noradrénaline Venlafaxine Effexor® Milnacipram Ixel®

Inhibiteurs de la Recapture de la Sérotonine non sélectifs (Antidépresseurs tricycliques) Clomipramine Anafranil® Imipramine Tofranil® Amitriptyline Laroxyl®

182 Annexe 3 : Critères du diagnostic différentiel de l’autisme et des autres Troubles Envahissants du Développement (TED) Adapté de Volkmar et Pauls, 2003

Traits Autisme Syndrome Syndrome de Troubles Troubles Caractéristiques d’Asperger Rett désintégratifs envahissants du de l’enfance développement non spécifiés

Age d’apparition 0-36 Habituellement 5-30 >24 Variable (mois) >36

Sex-ratio H>F H>F F M>F H>F (Homme/Femme)

Perte des Variable Généralement Sévère Sévère Généralement non compétences non

Aptitudes sociales Très pauvres Pauvres Variables Très pauvres Variables

Intérêts restreints Variables Sévères RAS RAS Variables (stéréotypies)

Histoires familiales Quelquefois Fréquent Habituellement Non Inconnu similaires non

Épisodes Communs Non communs Fréquents Communs Non Communs épileptiques

Ralentissement de la Non Non Oui Non Non croissance du périmètre crânien

Niveau intellectuel Retard mental Retard mental Retard mental Retard mental Retard mental sévère à modéré à sévère à normal sévère sévère normal normal

Issue Pauvre à Favorable à bon Très pauvre Très pauvre Favorable à bon favorable

183 Annexe 4 : Article de revue publié dans Neuroscience & Biobehavioral Reviews (IF = 7.8)

184 Fetal exposure to teratogens: evidence of genes involved in autism?

Diane Dufour-Rainfray 1,2,3,* , Patrick Vourc’h 1,2,3 , Sébastien Tourlet 1, Denis Guilloteau 1,2,3 , Sylvie Chalon 1,2,3 , Christian R. Andres 1,2,3

1UMR INSERM U930, CNRS ERL 3106, Université François Rabelais de Tours, Tours, France 2CHRU de Tours, Tours, France 3IFR135, Imagerie fonctionnelle, Tours, France

*Corresponding author: Diane Dufour-Rainfray, INSERM U930, Laboratoire de Biophysique médicale & pharmaceutique, UFR des Sciences pharmaceutiques, 31 avenue Monge , 37200 Tours, France Tel: 33 (0)2 47 36 72 41; Fax: 33 (0)2 47 36 72 24 e-mail: [email protected]

Abstract Dufour-Rainfray, D., Vourc’h, P., Tourlet, S., Guilloteau, D., Chalon, S. and Andres, C.R. Fetal exposure to teratogens: evidence of genes involved in autism? NEUROSCI BIOBEHAV REV XX(X) XXX-XXX, 2010.- Environmental challenges during the prenatal period can result in behavioral abnormalities and cognitive deficits that appear later in life such as autism. Prenatal exposure to valproic acid, ethanol, thalidomide and misoprostol has been shown to be associated with an increased incidence of autism. In addition, rodents exposed in utero to some of these drugs show autism-like abnormalities, including brain changes and lifelong behavior dysfunction. Our aim is to summarize current understanding of the relationship between in utero exposure to these drugs and autism in humans and in autism-like animal model phenotypes. It also highlights the importance of these models to understanding the neurobiology of autism, particularly in the identification of susceptibility genes. These drugs are able to modulate the expression of many genes involved in processes such as proliferation, apoptosis, neuronal differentiation and migration, synaptogenesis and synaptic activity. It seems essential to focus research on genes expressed during early neurodevelopment which may be the target of mutations or affected by drugs such as those included in this review. Keywords Alcohol; Autistic spectrum disorder; Ethanol; Misoprostol; Thalidomide; Valproate; Epigenetics

185 1. Introduction Autism is a neurodevelopmental disorder characterized by qualitative impairments in social interaction and communication, and by restricted repetitive and stereotyped patterns of behaviors, interests and activities (A.P.A., DSM-IV, 1994). It is not a single disorder but a continuum of clinical entities termed “autism spectrum disorders” (ASD), comprising autistic disorder defined by Kanner in 1943, pervasive developmental disorder not otherwise specified and Asperger’s syndrome. Autism is the neuropsychiatric disorder with the highest genetic component (Levy et al., 2009). Although several causal or susceptibility genes have been identified, most cases have no known origin. The temporal and spatial expression of the genes involved in the brain can be influenced by gene- environment interactions. Environmental challenges during prenatal and early postnatal periods can modify brain development and result in behavioral abnormalities and cognitive deficits that appear later in life, such as autism (Landrigan, 2010). Among the environmental factors that may have an etiological role in autism, drug exposure has been the most frequently studied. Prenatal exposure to valproic acid (VPA), ethanol, thalidomide or misoprostol has been reported to be associated with an increased incidence of autism (Bandim et al., 2003; Christianson et al., 1994; Nanson, 1992; Strömland et al., 1994). Rodents exposed to VPA in utero show autism-like abnormalities, involving brain changes and lifelong behavior dysfunction (Dufour-Rainfray et al., 2010; Markram et al., 2008; Roullet et al., 2010; Schneider et al., 2005, 2008). The aim of this review is to summarize current understanding of the relationship between in utero exposure to VPA, ethanol, thalidomide or misoprostol and autism in humans and in autism-like animal model phenotypes. It also highlights the importance of these models to understanding the neurobiology of autism, particularly in the identification of new susceptibility genes in this complex disorder.

2. VPA, ethanol, thalidomide and misoprostol as teratogens Valproic acid, or 2-propyl-pentanoic acid, is a commonly used antiepileptic drug (AED) (figure 1). Its mechanism of action is related to an increase in brain concentrations of gamma-aminobutyric acid (GABA), the major inhibitory neurotransmitter. Because it can cause birth defects in humans, it is classified as a pregnancy category D medicine by the American Food and Drug Administration. Children exposed to VPA can display characteristic abnormalities grouped under the name “fetal valproate syndrome” (DiLiberti et al., 1984). The teratogenic effects of VPA may be related to several actions such as folic acid deficiency, induction of oxidative stress and inhibition of histone deacetylases (HDAC) (Ornoy, 2009). Ethanol abuse is a public health problem in part because its consumption in pregnant women is increasing in many countries (Lamy and Thibaut, 2010). Children exposed to ethanol may present characteristic abnormalities grouped under the term “fetal alcohol syndrome” (Jones and Smith, 1973) and defined by the International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems (ICD-10, 2007). This small molecule (figure 1) probably exerts its teratogenic effects by several mechanisms such as deregulation of cell proliferation, migration and apoptosis (Goodlett et al., 2005; Liesi, 1997). It may also modify the epigenetic pattern of cells, leading to abnormal gene expression (Pignataro et al., 2009; Sathyan et al., 2007). Thalidomide, or 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline-1,3-dione, was first synthesized in the 1950s, and prescribed as a sedative (figure 1). Because the effects of thalidomide on rodents are different from those on primates (Schumacher et al., 1968), its potent teratogenicity in human was not anticipated. In 1962, Lenz and Knapp (1962) reported

186 increased congenital malformations in children following thalidomide exposure. Such exposure produced a spectrum of malformations and functional problems grouped under the term “fetal thalidomide syndrome”. The teratogenic effect of thalidomide might be due to its anti-angiogenic action (D’amato et al., 1994), but its mechanism of action remains unclear. In particular, thalidomide may inhibit cell migration by down-regulation of adhesion receptors and might interact directly with DNA (Huang et al., 1997; Neubert et al., 1996; Thiel et al., 2000). Misoprostol, or methyl 7-((1R,2R,3R)-3-hydroxy-2-((S,E)-4-hydroxy-4-methyloct- 1-enyl)-5-oxocyclopentyl)heptanoate, is a methyl ester of prostaglandin E1 (figure 1). Misoprostol is used to prevent gastric ulcers but, as it causes uterine contractions, it is also used for self-induced abortion but its effectiveness is low. Children born after misoprostol exposure present cranial nerve hypoplasia, sometimes associated with Möbius sequence, and malformation of limbs (Coelho et al., 2000; Holmes, 2002; Marques-Dias et al., 2003). The size, chemical structure and pharmacological effects of the four drugs are different. However, because all four have been associated with increased incidence of autism, they may have common actions on neurodevelopmental processes involved in the etiology of autism.

3. Association between teratogenic exposure and autism An association between autism and in utero exposure to the teratogenic drugs VPA, ethanol, thalidomide and misoprostol has been recorded in epidemiological studies. Three clinical series have been published concerning in utero VPA exposure. In a series of 57 children exposed to AED, 4 children had a diagnosis of autism (7%), among whom 3 were exposed to VPA alone or VPA in combination with another AED such as carbamazepine (Moore, 2000). Later, Rasalam et al. (2005) reported 12 patients with autism (11 children diagnosed as autistic and 1 child with Asperger’s syndrome) among 260 children exposed to AED. The authors concluded that the prevalence of autism in children exposed to AED was 1.9 to 4.6% compared to 0.25% in the general population, corresponding to an 8-18 fold increased rate (Chakrabarti and Fombonne, 2001). When only the autistic children exposed to VPA alone or VPA in combination were considered, the prevalence increased to 11.7% (9 out of 77 children) (Rasalam et al., 2005). In a more recent series of 249 children exposed to AED, 7 children had a diagnosis of autism (2.8%), 4 being among 64 exposed to VPA alone (6.3%) (Bromley et al., 2008). In a series of 21 children with fetal alcohol syndrome adopted from Eastern Europe, 2 had a diagnosis of autism (10%) (Landgren et al., 2010). Another larger series has been published the same year and no association was found between average alcohol consumption and ASD (n=401) or infantile autism (n=157) (Eliasen et al., 2010). The possibility of an association between ethanol and autism is also based on case reports describing autistic behaviors in children with fetal alcohol syndrome (Aronson et al., 1997; Harris et al., 1995; Nanson, 1992). One Swedish study reported a series of 86 patients with thalidomide embryopathy. Four of these patients met the criteria for autistic disorder. The authors concluded to a 50- fold higher rate of autism in patients with thalidomide embryopathy than in the general population (Gillberg et al., 1991; Strömland et al., 1994). Möbius sequence is characterized by congenital cranial nerve defects (especially the facial nerve VII) possibly due to injury during the first trimester of the pregnancy, in particular misoprostol exposure (Pottie et al., 1999). As early as 1984, studies reported a high frequency of autistic symptoms in Möbius sequence (Gillberg and Winnergard, 1984; Gillberg and Steffenburg, 1989; Johansson et al., 2001; Miller et al., 1998; Strömland et al., 2002). Misoprostol exposure was reported in a Brazilian study which revealed that 4

187 patients among 14 patients with Möbius sequence and misoprostol exposure had autism or autistic-like behavior (Bandim et al., 2003; Miller et al., 2004). Other epidemiological studies would be helpful to confirm the involvement of these four drugs in the etiology of some cases of autism. Little additional information will become available since VPA is currently inadvisable during pregnancy; thalidomide and misoprostol are absolutely contraindicated during pregnancy and when there is a possibility of pregnancy. However, pregnant women still consume ethanol and this represents a challenge for medicine.

4. Importance of the period of exposure The period of exposure to environmental factors is of particular interest in order to deduce the possible window of vulnerability and to understand the action of these drugs on brain development. VPA is an AED and this treatment has been typically taken throughout pregnancy. It is only possible to deduce from case reports that the period of exposure to VPA that is likely to result in autism is the first trimester of pregnancy (for review see Arndt et al., 2005). In the case described by Williams, VPA was taken 2 or 3 years before the pregnancy and continued until the end of the fifth month of pregnancy (Williams et al., 1997). In the cohort reported by Moore et al., VPA or another AED were taken in the first trimester in all cases, and continued during the second and third trimesters of pregnancy in 51 of 57 cases (Moore et al., 2000). The autistic children exposed prenatally to VPA had craniofacial and limb malformations, which indicated an early defect of embryogenesis, but the possibility that autism could have resulted from later effects could not be excluded. However, rat models have shown that a single exposure to VPA at an early stage of embryogenesis (during the period of neurulation, i.e. between E8 to E11) caused significant behavioral abnormalities in juvenile male offspring comparable to autistic symptomatology, and possible craniofacial malformations (ear malformations) (Dufour- Rainfray et al., 2010; Markram et al., 2008; Schneider et al., 2005; 2008). It thus seems that the period of exposure to VPA most likely to result in autism in humans may be around the period of neurulation, i.e. between the 18 th day (neural plate invagination) and the 28-30 th days (closure of the neuropores) of pregnancy (for review see Rice and Barone, 2000). Case reports on ethanol exposure have not been able to define precisely the period which could be crucial for autism: the quantities and periods of ethanol consumption are often not confessed or erroneous. Furthermore, as for VPA, ethanol consumption can take place throughout pregnancy. These variations may explain why studies reported association between alcohol consumption and autism, and others not. Studies on animal models have not provided more clarification regarding a possible vulnerable period because of chronic exposure protocols. Case reports on thalidomide exposure have provided more information on a possible critical period of vulnerability. Thalidomide has induced malformations of various organs according to the date of exposure. It has thus been possible to identify the window of exposure in autistic children for this drug. The sensitive period for the teratogenicity of thalidomide (all defects considered) was estimated to be from 20 to 36 days post- fertilization (Lenz and Knapp, 1962; Smithells and Newman, 1992). Strömland et al. estimated from their report on four cases of children with thalidomide embryopathy and autism that teratogenic effect occurred between 20 and 24 days post-fertilization (Miller et al., 2005; Strömland et al., 1994). As for thalidomide, case reports on misoprostol exposure provide information regarding a possible period of vulnerability for autism. Because misoprostol is used for

188 abortion, it is taken early during pregnancy. Patients with autism in Bandim et al.’s study (2003) were exposed to misoprostol during the first trimester of pregnancy, and simultaneous malformations suggested that exposure could occur between 4 and 6 weeks post-fertilization. Thus, reports on cases of autism associated with in utero exposure have made it possible to determine that the period of vulnerability probably occurs during the first trimester of pregnancy. Associated abnormalities suggest a more precise period between 18 and 42 days post-fertilization in humans, which corresponds to 8 and 15 days post- fertilization in the rat model (figure 2). This period corresponds to a very active phase of proliferation, migration, and apoptosis of cells of the neural lineage (Rice and Barone, 2000). In conclusion, cases of autism could be due to an impairment occurring early in embryogenesis. Ploeger et al. (2010) recently proposed the hypothesis that pleiotropic effects during early organogenesis could explain the association between embryonic impairments and the development of autism.

5. Clinical features of children with autism exposed to teratogens Autism is associated with other conditions such as mental retardation and epilepsy in 70% and 25% of cases, respectively (Chakrabarti and Fombonne, 2001; Levy et al., 2009, Yeargin-Allsopp et al., 2003). In addition, dysmorphic features are more frequent in autistic patients than controls or siblings. These dysmorphic features include abnormalities of the ears (e.g. posterior rotation of the outer ears), eyes (e.g. hypertelorism, deep-set eyes), nose (e.g. wide nasal bridge), cranium (e.g. macrocephaly, micrognathia), limbs (e.g. clinodactyly, tapering finger, pes planus) and skin (e.g. patchy pigmentation) (Miles et al., 2000, 2008; Miles and Hillman, 2000; Ozgen et al., 2010; Rodier et al., 1997a; Tripi et al., 2008). None of these abnormalities are specific or sensitive for the diagnosis of autism; however, they are of interest because they can represent a particular etiological process and could be evidence of the period of injury. Fetal valproate syndrome is recognized as a clinical entity characterized by specific patterns of facial and organ abnormalities involving respiratory, cardiovascular, genitourinary and musculoskeletal systems, and developmental disabilities (Ardinger et al., 1988; Clayton-Smith and Donnai, 1995; DiLiberti et al., 1984; for review see Kini, 2006). An initial article in 1993 indicated autistic traits in two out of seven children prenatally exposed to VPA (Laegreid et al., 1993). This was followed by six articles from three different teams published on children with fetal valproate syndrome and autism which provided details of clinical features (Christianson et al., 1994; Dean et al., 2002; Moore et al., 2000; Rasalam et al., 2005; Williams and Hersh, 1997; Williams et al., 2001) (Table 1). The typical features of fetal alcohol syndrome are classified into 3 groups: craniofacial and organ malformations, growth deficiency, intellectual development retardation and social difficulties. Several studies have reported descriptions of children with autism and fetal alcohol syndrome (Aronson et al., 1997; Harris et al., 1995; Landgren et al., 2010; Nanson, 1992) (Table 1). Fetal thalidomide syndrome is characterized by abnormalities of the craniofacial structures, extremities and internal organs (Smithells and Newman, 1992). Only one article has been published on 4 children with fetal thalidomide syndrome and autism (Strömland et al., 1994) (Table 1). Misoprostol produces uterine contractions leading to hypoperfusion and to malformations of limbs, brainstem, spinal cord, intestine or tongue (Holmes, 2002). Misoprostol seems to be responsible for cases of Möbius sequence characterized by cranial nerve palsy (Marques-Dias et al., 2003). One study reported four cases of patients with Möbius sequence and associated autism following exposure to misoprostol during

189 pregnancy (Bandim et al., 2003). This study provides few details of clinical symptoms associated with autism other than Möbius sequence and mental retardation (Table 1). Table 1 shows that similarities exist between the clinical signs present in autistic children exposed to the different teratogens, i.e. VPA, ethanol, thalidomide or misoprostol. In particular, it is interesting to note that they present malformations of the outer ears, eyes and limbs. These malformations could be evidence of the early period of injury during pregnancy. Autistic children exposed to the different teratogens also display speech or language delay and mental retardation. All these similarities may result from a common pathogenesis.

6. Neuropathology of ASD patients Autopsy studies and later MRI studies showed that the brain growth of autistic children was sometimes faster than controls early during the first year of life, and then decelerated (Redcay and Courchesne, 2005). Several regions such as the amygdala and frontal cortex, regions involved in social behavior and communication, have been found to be enlarged in young children with autism (Carper et al., 2002; Carper and Courchesne, 2005; Schumann et al., 2009). Histology studies have shown smaller and more compact minicolumns in the prefrontal and temporal cortex in children with autism (Buxhoeveden et al., 2006; Casanova et al., 2002 and 2006; for review see Geschwind, 2009). One study reported fewer neurons in the amygdala of patients with autism (Schumann and Amaral, 2006), and a reduction in the number of Purkinje cell in the cerebellum has also been observed (Bauman and Kemper, 1985; Ritvo et al., 1986). Wegiel et al. (2010) reported heterotopias and dysplastic changes in the brain of patients with autism. Brainstem abnormalities have been described, particularly in cranial nerves. Rodier et al. reported a near-complete absence of the facial nucleus and superior olive with shortening of the brainstem in the autopsy of a woman with autism (Rodier et al., 1996, 1997b). It was suggested that this autistic woman could have been exposed to ethanol in utero because her mother was an alcoholic. Autistic patients exposed to thalidomide may also have cranial nerve injury as they present Duane syndrome, facial nerve palsy and/or abnormal lacrimation (Strömland et al., 1994). The serotonergic system has been extensively investigated in neurotransmission studies as it is involved in the regulation of several behaviors that are abnormal in autism and as serotonin (5-HT) levels have been shown to be increased in the whole blood of patients with autism (Anderson et al., 1990; Schain and Freedman, 1961). Positron emission tomography (PET) studies have reported that 5-HT synthesis is reduced in the frontal cortex and thalamus and increased in the contralateral dentate nucleus in children with autism compared to siblings (Chandana et al., 2005; Chugani et al., 1997 and 1999). Single-photon emission computed tomography (SPECT) and PET studies have demonstrated that the density of the serotonin transporter (SERT), which regulates 5-HT levels, is reduced in the medial frontal cortex (Makkonen et al., 2008), the cingulated cortex and the thalamus (Nakamura et al., 2010) in children with autism. Other neurotransmission systems may be impaired in autism (Lam et al., 2006). An imbalance thus seems to exist between the inhibitory GABAergic and excitatory glutamatergic systems (Bittigau and Ikonomidou, 1997). In particular, glutamic acid decarboxylase enzyme (GAD), involved in the synthesis of GABA, has been reported to be decreased postmortem in the brains of autistic patients (Fatemi et al., 2002). The dopaminergic system may also be impaired in autism. In particular, dopamine transporter binding was reported to be significantly higher in the orbitofrontal cortex of one autistic group (Nakamura et al., 2010).

190 Patients with autism exposed to teratogenic drugs have not to our knowledge been subjected to neuroanatomical studies, and it is thus not possible to compare the changes in autistic patients with or without teratogenic exposure.

7. Teratogenic drugs and autistic-like behaviors in animal models The increase in the incidence of cases of autism in children prenatally exposed to drugs has encouraged the creation of animal models reproducing prenatal exposure in order to study the pathophysiological hypothesis in a more complex animal. We previously reported the existence of 15 different rodent models of autism (Andres, 2002). As proposed by Belzung et al. (2005), two of the three areas of autistic symptoms can be analyzed in animals, i.e. deficits in social behavior and stereotypies or cognitive rigidity. The qualitative communication impairment may be difficult to be compared with vocalization in animals. Animal models differ in several points and these need to be taken into account for comparisons. The first point is determination of the first day of gestation. The majority of authors consider that the presence of a vaginal plug provides confirmation of mating, designated as embryonic day 0 (E0) by several authors (e.g. Kuwagata et al., 2009) and as E1 by others (e.g. Narita et al., 2002), and this creates a one day shift. The second issue is the day of exposure. The day of exposure varies in many studies, with single administration from E9 to E13 (Dufour-Rainfray et al., 2010; Ge et al., 2004; Ingram et al., 2000; Kuwagata et al., 2009; Markram et al., 2008; Miyazaki et al., 2005; Narita et al., 2002; Rinaldi et al., 2007, 2008a, 2008b; Rodier et al., 1996, 1997b; Schneider et al., 2001, 2005, 2007, 2008; Snow et al., 2008; Stanton et al., 2007; Tsujino et al., 2007; Yochum et al., 2008) . The day of exposure may be chosen in an animal model according to the pathophysiological hypothesis being explored. For example, because autistic children might have been exposed to drugs between 20 and 24 days post-fertilization, many studies have targeted the corresponding period in the animal model, e.g. 8 and 10.5 days’ gestation in the rat (Rice and Barone, 2000). Table 2 compares physical, behavioral and neuropathological features observed in different animal models of prenatal teratogen exposure. The model of VPA exposure proposed by Rodier in 1996 is one of the most frequently studied animal models of autism. Ear malformations have been reported, which could be compared to abnormalities observed in some autistic patients (e.g. posterior rotation of the outer ear). Reported behavioral abnormalities could be related to the abnormalities observed in autistic patients (e.g. decreased social interactions and sensitivity to pain, increased sensitivity to non-painful stimuli and repetitive/stereotypic-like activity). At the neuropathology level, abnormalities in the cerebellum, cortex and cranial nerve nuclei can be linked to the abnormalities observed in autism (Rodier et al., 1996, 1997b). Analysis of neurotransmitters in the VPA model showed that several systems were impaired. The serotonergic system has been the most often studied and presents modifications such as impaired differentiation and migration of the serotonergic neurons to the dorsal raphe nucleus at postnatal day 50 (PND50) (Miyazaki et al., 2005). Many studies of animal models of prenatal ethanol exposure have chosen to expose embryos over a long period of gestation, reproducing a similar pattern of absorption as in humans (Lawrence et al., 2008), and few studies have chosen to expose animals at a precise stage (Mooney and Varlinskaya, 2010). Ethanol exposure in animal models causes social behavior disorders such as changes in social play (Kelly et al., 2000; Lawrence et al., 2008, Mooney and Varlinskaya, 2010). However tests analyzing autistic-like behaviors more thoroughly still need to be performed on rats in order to consider them as models for autism. Histological studies have shown that prenatal exposure to ethanol in mice affects

191 the serotonergic neurons, e.g. retarding their migration and decreasing their numbers in the dorsal and median raphe nucleus (Sari and Zhou, 2004; Zhou et al., 2002). It was also shown to reduce the number of serotonergic immunostained fibers in the medial forebrain bundle and along the projecting pathway (Zhou et al., 2005). In utero exposure to thalidomide is not an appropriate model in rodents since the effects of thalidomide in rodents are different from their effects in primates (Schumacher et al., 1968). However, Vorhees et al. (2001) reported that long prenatal exposure (E7 to E18) to thalidomide in the rat induced differences in learning. To our knowledge, no study has analyzed social behavior of animals using discriminatory tests for autistic-like symptomatology. Brain studies in rats have reported a shift in the distribution of serotonergic neurons in the dorsal raphe nucleus, as well as increased serotonin levels in the hippocampus and plasma, comparable to results obtained by the same team following exposure to VPA (Miyazaki et al., 2005; Narita et al., 2002). The model of prenatal misoprostol exposure has not to our knowledge been tested as a potential animal model for autism. As presented in Table 2, physical, behavioral and neuropathological similarities exist between the different animal models of prenatal teratogen exposure. In particular, the different models indicate that these teratogens generate disorders of cell migration (e.g. serotonergic neurons) and modulate apoptosis.

8. Suggested drug mechanisms VPA, ethanol, thalidomide and misoprostol are multi-target drugs. Some of their actions are able to generate disorders of neurodevelopment. The cellular and molecular mechanisms affected by in utero exposure to these drugs have not been fully established. Several studies have revealed changes in the expression profile of many genes (Table 3). A significant number of these genes are involved in the development, maturation and/or function of specific brain regions, some of which are involved in autism (Hard et al., 2005; Rowland et al., 2001; William et al., 1997). For example, Rout et al. (2009) recently showed that the addition of one of the three teratogens (valproate, alcohol or thalidomide) to neuron-like PC12 cells leads to a significant increase in the expression of transcription factor GATA-3. GATA-3 is known to regulate the expression of numerous genes involved in several processes during brain development, such as that of differentiation of serotonergic neurons. Protein expression in developing and mature neurons is controlled at the DNA level by specific transcription factors and by epigenetic mechanisms. Epigenetics refers to transitory or stable changes in gene expression caused by diverse biochemical modification of histones, methylation of DNA (CpGs dinucleotides), and interference with microRNA transmitted from cell to cell during cell division. The concentration of many neuronal proteins is also controlled by the ubiquitin pathway. Several genes of this pathway are down regulated after ethanol exposure (Gutala et al., 2004; Liu et al., 2004). The involvement of members of the ubiquitin pathway genes is suspected in the etiology of autism (Glessner et al., 2009; Vourc’h et al., 2003). Embryos exposed to VPA show a decrease in folic acid, indirectly affecting their metabolism and antioxidant balance (Wegner et al., 1992). As the fetal antioxidant defense mechanisms are immature, oxidative stress may be responsible for brain damage. VPA is also known to directly affect epigenetic mechanisms by inhibition of histone deacetylases (HDACs), which are nuclear and cytoplasmic enzymes that decrease the levels of acetylation of the core histones H2A, H2B and H3 (Gurvich et al., 2005; Phiel et al., 2001). The regulation of histone acetylation status affects nucleosome compaction and chromatin structure, and dynamically affects the transcriptional regulation of many genes. In vitro experiments have shown that, by inhibiting HDACs, VPA leads to increased acetylation of

192 histone H3. The resulting modification of the compaction of chromatine is responsible for increased accessibility of demethylases to DNA, and thus to DNA demethylation (Detich et al., 2003). VPA analogs lacking the inhibitory action of HDACs do not modify gene expression profiles and are not teratogenic in mice (Menegola et al., 2006). Ethanol increases reactive oxygen species (ROS) in the developing brain, and this is often associated with an increase in apoptosis (Heaton et al., 2002; Lee et al., 2005). Ethanol also affects epigenetic regulation. It is responsible for DNA methylation of CpGs islands, which is associated with an increase in gene transcription. Moreover, ethanol modifies the state of methylation, acetylation and phosphorylation of specific lysines of H3 histones. Methylation of lysine 4 and acetylation of lysine 9 are associated with increased gene transcription. The action of ethanol on histone acetylation is not direct, but could be a consequence of its metabolism. Indeed pyrazole, an inhibitor of ethanol dehydrogenase (ADH), and methyl cynamide, an inhibitor of aldehyde dehydrogenase (ALD), reduce histone acetylation caused by ethanol, suggesting that ethanol metabolism could lead to increased histone acetyl transferase (HAT) activity (Park et al., 2005). Ethanol is also responsible for the methylation of lysine 9 on H3, which is associated with a reduction in gene expression (Kim and Shukla, 2006). It also indirectly induces the phosphorylation of serines 10 and 28 of H3 by activating intracellular MAP kinases. Thalidomide might interact with a receptor or intracellular molecules that remain to be identified. It might also interact directly with DNA leading to modifications of the normal pattern of DNA methylation, and consequently to modifications of gene expression (Holliday et al., 1998; Huang et al., 1997). A recent study showed that a teratogenic dose of thalidomide (20 mg/kg) changes global gene expression profiles in the monkey embryo on day 26 of gestation (Ema et al., 2009). Misoprostol is a prostaglandin E analog which binds to four subtypes of receptors (EP1-4) (Sugimoto and Narumiya, 2007). Activation of these G protein-coupled receptors modifies intracellular levels of Ca 2+ and inositol (EP1), and stimulates (EP2, EP4) or inhibits (EP3) adenylate cyclase and consequently the intracellular level of cAMP, resulting in modification of gene expression (Breyer et al., 2001).

9. Evidence of autism genes from studies on animal and cellular models Our study of the literature shows that a large number of genes whose expression is modified by these toxic molecules are related to the following biological processes: proliferation/apoptosis balance, neuronal differentiation and connectivity, and circulatory system (Table 4). 9.1. Regulation of proliferation/apoptosis balance The enlarged cerebral regions (in particular the frontal cortex and amygdala) observed in autistic patients may result from abnormal control of the proliferation/apoptosis balance during brain development (Redcay and Courchesne, 2005). VPA is a known neuroprotective factor involving the activation of cell survival factors such as the PI3-kinase/Akt signaling pathway, and the induction of neurotrophic/neuroprotective proteins such as brain-derived neurotrophic factor (BDNF), the anti-apoptotic factors heat-shock protein 70 (hsp-70) and BCL2, and glutathione S- transferase (Chen et al., 1999; Frey et al., 2006; Yuan et al., 2001). These actions appear to be mediated by the HDAC inhibitory action of VPA. VPA is also a glycogen synthase kinase 3 beta (GSK-3beta) inhibitor (De Sarno et al., 2002). It is interesting to note that this enzyme is inactivated in mice deleted for PTEN, a gene whose mutations are present in 5% of autistic patients with macrocephaly (Kwon et al., 2006; McBride et al., 2010). VPA may also increase the proliferation of cells of the neuronal lineage during brain development. Indeed, in vitro studies have shown that VPA increases the proliferation of

193 neuronal progenitors derived from stem cells, and enhances their differentiation into GABAergic neurons (Laeng et al., 2004). Similarly, misoprostol may act on neurogenesis. Indeed, the injection of another prostaglandin E analog, sulprostone, in the hippocampus of rat brain stimulated neural stem cell proliferation (Uchida et al., 2002). Analysis of the transcriptome of monkey embryos exposed to thalidomide revealed up-regulation of the expression of many genes involved in cell growth, such as genes encoding cell cycle progression proteins (Ema et al., 2009). Recent studies on ethanol intoxication have also indicated possible changes in the expression of miRNA involved in proliferation, apoptosis, and neuronal differentiation (Sathyan et al., 2007; Zhou et al., 2009). All these findings support the need for further examination of genes encoding members and regulators of the PI3K/Akt and GSK-3beta pathways in autism. They also demonstrate the need for new studies on genes regulating apoptosis such as BCL2, DRAK2 encoding a kinase whose expression is greatly increased in cortical neurons after exposure to VPA, and NEG, a NGF-stimulated gene whose expression is reduced by VPA action (Fukuchi et al., 2009; Miller et al., 2003).

9.2. Neuronal differentiation Neuropathology studies have reported various changes in cell differentiation and migration in several brain regions in autistic patients (Bauman and Kemper, 2005; Pickett and London, 2005). Correct neuron size and neurite outgrowth are crucial for proper neuronal transmission. The induction of neuronal differentiation is partly under the control of several transcription factors. Studies showed that VPA promotes neuronal differentiation by induction of proneural bHLH-type transcription factors, such as Ngn1, Math1 and NeuroD (Hiesh et al., 2004; Tu et al., 2009). VPA is known to be a positive regulator of neurite outgrowth by persistent activation of the ERK pathway (Yuan et al., 2001). It also increases the expression of proteins such as synapsin 1 and the neurofibromatosis 2 tumor suppressor merlin, participating in neurite outgrowth (Hsieh et al., 2004). Mutations in the merlin gene inhibit the ability to control changes in the actin cytoskeleton (Scoles et al., 1998). Ema et al. (2009) recently suggested that thalidomide could modify the differentiation and maturation of neurons by up-regulation of Rho family GTPases and guanine nucleotide exchange factors (GEFs). The GEFs DOCK1 and ARHGEF7 are two examples of such genes involved in cytoskeletal organization whose expression is modified by thalidomide. Similarly, the activation of prostaglandin EP3 receptors by prostaglandins induces neurite retraction via small GTPase Rho (Katoh et al., 1996). Ethanol also acts on neurite outgrowth and neuronal migration during brain development (Mooney et al., 2004). Abnormal neuronal migration may result from modification of the expression of many genes encoding cell adhesion molecules such as beta-integrins 3 and 5 and alpha- and beta-laminins (Miller et al., 2006; Vangipuram et al., 2008). As previously mentioned, abnormalities have been reported in the migration of serotonergic neurons during the embryogenesis of VPA-treated rodents (Miyazaki et al., 2005). The migration of serotonergic precursors requires several proteins such as Sonic hedgehog (Shh), FGF4 and FGF8, the expression of which is modified by VPA and thalidomide, and HOXA1, the production of which is affected by VPA and ethanol exposure (Bosley et al., 2007; Miyazaki et al., 2005; Stodgell et al., 2006; Wentzel and Eriksson, 2009). Early prenatal exposure also induces a demethylation of Wnt/beta-catenin pathway genes Wnt1 and Wnt2 (Wang et al., 2010). The Wnt/beta-catenin pathway interacts with Shh and regulates neurogenesis (Tang et al., 2010). Ito et al. (2010) suggested that these modifications of FGF8 and BMPs by thalidomide require ubiquitin-dependent proteolysis. They showed that thalidomide inhibited the ubiquitin ligase activity of the Cereblon-DBB1-Cul4A

194 complex. Cereblon has already been linked to autosomal recessive non-syndromic mental retardation. It would be interesting to test genes encoding proteins of this complex and their protein targets (still unknown) in autism. Several genes involved in the dynamics of the actin cytoskeleton and in cell adhesion have already been reported to be involved in the pathogenesis of autism (e.g. nrCAM, TSC1/2 and NF1 (Folstein and Rosen-Sheidley, 2001; Hutcheson et al., 2004; Mbarek et al., 1999; Rosser and Packer, 2003)). Studies involving VPA, ethanol and thalidomide suggest a role in autism for other candidate genes encoding proteins with similar roles, such as syndecans and proteins of the Nogo receptor pathway.

9.3. Synaptic connectivity and neuronal transmission Findings from neuroimaging and genetic studies indicate that both structural and functional brain connectivity is abnormal in autism. These studies have suggested abnormalities of the mechanism of synaptogenesis and function of several neurotransmitter systems, such as the serotonergic system and the regulation of the excitatory-inhibitory (glutamate/GABA) balance (Kelleher and Bear, 2008; Levitt et al., 2004; Tabuchi et al., 2007). The hypothesis of abnormalities of synaptic maturation and connectivity have been supported in autism since the discovery of rare mutations in the NLGN3, NLGN4 and NRXN1 genes encoding synaptic cell adhesion proteins and in the SHANK2 and 3 genes encoding scaffolding proteins of post-synaptic density (PSD) in autistic patients (Berkel et al., 2010; Durand et al., 2007; Jamain et al., 2003; Kim et al., 2008; Kirov et al., 2007; Laumonnier et al., 2004; Moessner et al., 2007). Interestingly, NLGN3 expression was found to be reduced in several brain regions of mice exposed in utero to VPA, such as the hippocampus (Kolozsi et al., 2009). Other genes involved in synaptogenesis whose expression is affected after VPA exposure are MAGUIN1, MAGI2, ROBO2, CIP98, SEC1 and RAB3A (Bosetti et al., 2005; Fukuchi et al., 2009). Several neurotransmission systems believed to be implicated in autism show changes after in utero exposure to VPA, ethanol or thalidomide. These drugs induce changes in gene expression which can result in an imbalance between neuronal excitation (Glutamatergic system) and inhibition (GABAergic system) in the brain (Fukuchi et al., 2009). Indeed VPA exposure alters the expression of several proteins of GABAergic neurons, such as the GABA A receptor subunits alpha-4 and gamma-2, GABA B receptor 1c, GAD65 and KCC2 (Bosetti et al., 2005; Fukuchi et al., 2009). It may also decrease the expression of the GAD67 and RELN genes which are demethylated (Dong et al., 2007). Prostaglandin E also induces rapid down regulation of GABA A receptor subunits in neurons via an EP3-dependent pathway (Tsuchiya et al., 2008). Ethanol and VPA affect the expression of many genes of the excitatory glutamatergic system. Immunohistochemical experiments have suggested that VPA alters the expression of the vesicular glutamate transporter (VGLUT). Ethanol exposure is followed by an increase in NR1 and NR2B levels, key subunits in NMDA receptors (Gulya et al., 1991; Kumari et al., 2005; Shukla et al., 2008). Prostaglandin E facilitates glutamatergic synaptic transmission by acting on EP2 receptors (Yang et al., 2009). Results from studies on ethanol suggest that it may be interesting to analyze several genes from other neurotransmission systems in autism. For example, several genes encoding proteins regulating the circadian rhythm (beta-endorphin, Per1, 2 and 3) show changed expression after ethanol exposure (Chen et al., 2004 and 2006).

9.4. Blood system

195 Abnormalities of development or functioning of the blood system could participate in the etiology of autism. Indeed, maternal hypertension and fetal distress have been thought to be risk factors for autism in some studies. Moreover, neuroimaging studies have reported brain hypoperfusion in autistic patients (Wilcox et al., 2002; Boddaert and Zilbovicius, 2002). Several events that affect vasculogenesis (the generation of blood vessels from undifferentiated mesodermal cells) and angiogenesis (the generation of new blood vessels from endothelial cells of existing blood vessels) may induce neurological defects by action on neurogenesis and neuronal migration (Hallene et al., 2006). For example this link was clearly shown by the brain abnormalities in rats with altered expression of VEGF receptor A (Haigh et al., 2003). Administration of toxic drugs such as thalidomide results in events that can alter vasculogenesis and angiogenesis, and consequently lead to brain abnormalities. Indeed, Hallene et al. (2006) reported that prenatal exposure of rats (E15) to thalidomide induced neuroarchitectural changes and that this was due to altered vasculogenesis during brain development. VPA is also known to be a drug that affects blood vessel development by inhibiting angiogenesis (Michaelis et al., 2004). It is interesting to note that VPA activates PPARgamma (peroxisome proliferator activated receptor gamma), a protein involved in the regulation of angiogenesis. Several studies have suggested that PPARgamma regulates angiogenesis through the regulation of expression of cytokines (VEGF, FGF) that stimulate migration, proliferation and survival of endothelial cells (Biscetti et al., 2009). Similar roles have been suggested for PPARgamma in neural stem cells and neurons (Miglio et al., 2009; Wang et al., 2009). VPA also acts in neurons by preventing hypoxia-induced neuronal apoptosis (Li et al., 2008), mediated by its action on histone acetylation leading to activation of the NF-kappa B pathway. It can thus be hypothesized that some brain abnormalities observed in autistic patients may be the consequence of oxygen deprivation (e.g. hypoxia) during early development. Although this hypothesis needs testing with further experiments, it could be interesting to analyze several genes involved in vasculogenesis, angiogenesis or responses to hypoxia, and whose expression is affected by one of the four teratogenic drugs, in relation to autism.

10. Concluding remarks Comparison of the effects and mechanisms of four drugs, i.e. valproic acid, ethanol, thalidomide and misoprostol, that have been reported to increase the risk of autism, provide important evidence regarding the mechanisms underlying this developmental disease. These drugs affect development at a very early stage of pregnancy, estimated between the 18 th and the 42 th day. They can induce autism, and also malformations of the ears, eyes and limbs, along with language delay and mental retardation. Exposure of animals to these drugs during gestation can cause behavioral changes which may be related to those observed in patients with autism. Moreover, these animal models show that these drugs produce deregulation of the proliferation / apoptosis balance, and of migration of neurons, including serotonergic neurons, differentiation and synaptogenesis. These same processes involve proteins encoded by genes mutated or affected by copy number variants (CNVs) in some patients with autism (Marshall et al., 2008; Szatmari et al., 2007). These four drugs appear to have different mechanisms of action, but are all able to modulate the expression of many genes. Epigenetic modulations of gene expression appear to be implicated. Many of the above mentioned genes have not been studied in autism to date. Normal brain development requires specific patterns of neuronal connections. Establishing these connections requires correct differentiation of neurons, neurite outgrowth, synaptogenesis, and synaptic activity. Expanding research on animals exposed

196 to valproic acid, ethanol, thalidomide or misoprostol in early pregnancy will certainly help to define and study further the cellular and molecular mechanisms affected in autism, and to identify new genes involved in this disease.

Acknowledgements The authors thank Sylvie Mavel for figure 1.

Conflict of interest All authors declare that they have no conflicts of interest.

Submission declaration We state that this work has not been published previously and is not under consideration for publication elsewhere. We state that its publication is approved by all authors and by the responsible authorities of the laboratory. This work, if accepted, will not be published elsewhere without the written consent of the copyright-holder.

Contributors Authors D. Dufour-Rainfray and P. Vourc’h, were responsible for the concept, the bibliography and the writing of the manuscript. Author S. Tourlet is responsible for the analysis of ontology genes. Authors D. Guilloteau, S. Chalon and C.R. Andres were responsible for the concept and the correction of the manuscript. All authors have approved the final manuscript.

Role of funding source Funding for this article was provided by Inserm and the University of Tours. The funding sources had no further role in the concept and the redaction of this review and in the decision to submit the paper for publication.

197 References

Anderson, G.M., Horne, W.C., Chatterjee, D., Cohen, D.J., 1990. The hyperserotonemia of autism. Ann. N. Y. Acad. Sci. 600, 331-340. Andres, C., 2002. Molecular genetics and animal models in autistic disorder. Brain Res. Bull. 57, 109-119. A.P.A., 1994. Diagnostic and statistical manual of mental disorders. DSM-IV. Fourth ed. Washington DC. Ardinger, H.H., Atkin, J.F., Blackston, R.D., Elsas, L.J., Clarren, S.K., Livingstone, S., Flannery, D.B., Pellock, J.M., Harrod, M.J., Lammer, E.J., et al., 1988. Verification of the fetal valproate syndrome phenotype. Am. J. Med. Genet. 29, 171-185. Arndt, T.L., Stodgell, C.J., Rodier, P.M., 2005. The teratology of autism. Int. J. Dev. Neurosci. 23, 189-199. Aronson, M., Hagberg, B., Gillberg, C., 1997. Attention deficits and autism spectrum problems in children exposed to alcohol during gestation: a follow-up study. Dev. Med. Child Neurol. 39, 583-587. Bandim, J.M., Ventura, L.O., Miller, M.T., Almeida, H.C., Costa, A.E., 2003. Autism and Möbius sequence: an exploratory study of children in northeastern Brazil. Arq. Neuropsiquiatr. 61, 181-185. Bauman, M., Kemper, T.L., 1985. Histoanatomic observations of the brain in early infantile autism. Neurology 35, 866-874. Bauman, M.L., Kemper, T.L., 2005. Neuroanatomic observations of the brain in autism: a review and future directions. Int. J. Dev. Neurosci. 23, 183-187. Belzung, C., Leman, S., Vourc’h, P., Andres, C., 2005. Rodent models for autism: a critical review. Drug Discovery Today: Disease Models 2, 93-101. Berkel, S., Marshall, C.R., Weiss, B., Howe, J., Roeth, R., Moog, U., Endris, V., Roberts, W., Szatmari, P., Pinto, D., et al. 2010. Mutations in the SHANK2 synaptic scaffolding gene in autism spectrum disorder and mental retardation. Nat. Genet. 42, 489-491. Biscetti, F., Straface, G., Pitocco, D., Zaccardi, F., Ghirlanda, G., Flex, A., 2009. Peroxisome proliferator-activated receptors and angiogenesis. Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 19, 751-759. Bittigau, P., Ikonomidou, C., 1997. Glutamate in neurologic diseases. J. Child Neurol. 12, 471-485. Boddaert, N., Zilbovicius, M., 2002. Functional neuroimaging and childhood autism. Pediatr. Radiol. 32, 1-7. Bosetti, F., Bell, J.M., Manickam, P., 2005. Microarray analysis of rat brain gene expression after chronic administration of sodium valproate. Brain Res. Bull. 65, 331-338. Bosley, T.M., Salih, M.A., Alorainy, I.A., Oystreck, D.T., Nester, M., Abu-Amero, K.K., Tischfield, M.A., Engle, E.C., 2007. Clinical characterization of the HOXA1 syndrome BSAS variant. Neurology 69, 1245-1253. Breyer, R.M., 2001. Prostaglandin EP1 receptor subtype selectivity takes shape. Mol. Pharmacol. 59, 1357-1359. Bromley, R.L., Mawer, G., Clayton-Smith, J., Baker, G.A., 2008. Autism spectrum disorders following in utero exposure to antiepileptic drugs. Neurology 71, 1923-1924. Buxhoeveden, D.P., Semendeferi, K., Buckwalter, J., Schenker, N., Switzer, R., Courchesne, E., 2006. Reduced minicolumns in the frontal cortex of patients with autism. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 32, 483-491. Carper, R.A., Courchesne, E., 2005. Localized enlargement of the frontal cortex in early autism. Biol. Psychiatry 57, 126-133.

198 Carper, R.A., Moses, P., Tigue, Z.D., Courchesne, E., 2002. Cerebral lobes in autism: early hyperplasia and abnormal age effects. Neuroimage 16, 1038-1051. Casanova, M.F., Buxhoeveden, D.P., Switala, A.E., Roy, E., 2002. Minicolumnar pathology in autism. Neurology 58, 428-432. Casanova, M.F., Van Kooten, I.A., Switala, A.E., Van Engeland, H., Heinsen, H., Steinbusch, H.W., Hof, P.R., Trippe, J., Stone, J., Schmitz, C., 2006. Minicolumnar abnormalities in autism. Acta Neuropathol. 112, 287-303. Chakrabarti, S., Fombonne, E., 2001. Pervasive developmental disorders in preschool children. JAMA 285, 3093-3099. Chandana, S.R., Behen, M.E., Juhász, C., Muzik, O., Rothermel, R.D., Mangner, T.J., Chakraborty, P.K., Chugani, H.T., Chugani, D.C., 2005. Significance of abnormalities in developmental trajectory and asymmetry of cortical serotonin synthesis in autism. Int. J. Dev. Neurosci. 23, 171-182. Chen, B., Wang, J.F., Hill, B.C., Young, L.T., 1999. Lithium and valproate differentially regulate brain regional expression of phosphorylated CREB and c-Fos. Mol. Brain Res. 70, 45-53. Chen, C.P., Kuhn, P., Advis, J.P., Sarkar, D.K., 2004. Chronic ethanol consumption impairs the circadian rhythm of pro-opiomelanocortin and period genes mRNA expression in the hypothalamus of the male rat. J. Neurochem. 88, 1547-1554. Chen, C.P., Kuhn, P., Advis, J.P., Sarkar, D.K., 2006. Prenatal ethanol exposure alters the expression of period genes governing the circadian function of beta-endorphin neurons in the hypothalamus. J. Neurochem. 97, 1026-1033. Christianson, A.L., Chesler, N., Kromberg, J.G., 1994. Fetal valproate syndrome: clinical and neuro-developmental features in two sibling pairs. Dev. Med. Child Neurol. 36, 361- 369. Chugani, D.C., Muzik, O., Behen, M., Rothermel, R., Janisse, J.J., Lee, J., Chugani, H.T., 1999. Developmental changes in brain serotonin synthesis capacity in autistic and nonautistic children. Ann. Neurol. 45, 287-295. Chugani, D.C., Muzik, O., Rothermel, R., Behen, M., Chakraborty, P., Mangner, T., Da Silva, E.A., Chugani, H.T., 1997. Altered serotonin synthesis in the dentatothalamocortical pathway in autistic boys. Ann. Neurol. 42, 666-669. Clayton-Smith, J., Donnai, D., 1995. Fetal valproate syndrome. J. Med. Genet. 32, 724- 727. Coelho, K.E., Sarmento, M.F., Veiga, C.M., Speck-Martins, C.E., Safatle, H.P., Castro, C.V., Niikawa, N., 2000. Misoprostol embryotoxicity: clinical evaluation of fifteen patients with arthrogryposis. Am. J. Med. Genet. 95, 297-301. D'Amato, R.J., Loughnan, M.S., Flynn, E., Folkman, J., 1994. Thalidomide is an inhibitor of angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 4082-4085. De Sarno, P., Li, X., Jope, R.S., 2002. Regulation of Akt and glycogen synthase kinase-3 beta phosphorylation by sodium valproate and lithium. Neuropharmacology 43, 1158- 1164. Dean, J.C., Hailey, H., Moore, S.J., Lloyd, D.J., Turnpenny, P.D., Little, J., 2002. Long term health and neurodevelopment in children exposed to antiepileptic drugs before birth. J. Med. Genet. 39, 251-259. Detich, N., Bovenzi, V., Szyf, M., 2003. Valproate induces replication-independent active DNA demethylation. J. Biol. Chem. 278, 27586-27592. DiLiberti, J.H., Farndon, P.A., Dennis, N.R., Curry, C.J., 1984. The fetal valproate syndrome. Am. J. Med. Genet. 19, 473-481.

199 Dong, E., Guidotti, A., Grayson, D.R., Costa, E., 2007. Histone hyperacetylation induces demethylation of reelin and 67-kDa glutamic acid decarboxylase promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4676-4681. Dufour-Rainfray, D., Vourc'h, P., Le Guisquet, A.M., Garreau, L., Ternant, D., Bodard, S., Jaumain, E., Gulhan, Z., Belzung, C., Andres, C.R., et al., 2010. Behavior and serotonergic disorders in rats exposed prenatally to valproate: a model for autism. Neurosci. Lett. 470, 55-59. Durand, C.M., Betancur, C., Boeckers, T.M., Bockmann, J., Chaste, P., Fauchereau, F., Nygren, G., Rastam, M., Gillberg, I.C., Anckarsater, H., et al., 2007. Mutations in the gene encoding the synaptic scaffolding protein SHANK3 are associated with autism spectrum disorders. Nat. Genet. 39, 25-27. Eliasen, M., Tolstrup, J.S., Nybo Andersen, A.M., Grønbæk, M., Olsen, J., Strandberg- Larsen, K., 2010. Prenatal alcohol exposure and autistic spectrum disorders--a population- based prospective study of 80 552 children and their mothers. Int. J. Epidemiol. 39, 1074- 1081. Ema, M., Ise, R., Kato, H., Oneda, S., Hirose, A., Hirata-Koizumi, M., Singh, A.V., Knudsen, T.B., Ihara, T., 2010. Fetal malformations and early embryonic gene expression response in cynomolgus monkeys maternally exposed to thalidomide. Reprod. Toxicol. 29, 49-56. Fatemi, S.H., Halt, A.R., Stary, J.M., Kanodia, R., Schulz, S.C., Realmuto, G.R., 2002. Glutamic acid decarboxylase 65 and 67 kDa proteins are reduced in autistic parietal and cerebellar cortices. Biol. Psychiatry 52, 805-810. Folstein, S.E., Rosen-Sheidley, B., 2001. Genetics of autism: complex aetiology for a heterogeneous disorder. Nat. Rev. Genet. 2, 943-955. Frey, B.N., Andreazza, A.C., Ceresér, K.M., Martins, M.R., Valvassori, S.S., Réus, G.Z., Quevedo, J., Kapczinski, F., 2006. Effects of mood stabilizers on hippocampus BDNF levels in an animal model of mania. Life Sci. 79, 281-286. Fukuchi, M., Nii, T., Ishimaru, N., Minamino, A., Hara, D., Takasaki, I., Tabuchi, A., Tsuda, M., 2009. Valproic acid induces up- or down-regulation of gene expression responsible for the neuronal excitation and inhibition in rat cortical neurons through its epigenetic actions. Neurosci. Res. 65, 35-43. Ge, Y., Belcher, S.M., Light, K.E., 2004. Alterations of cerebellar mRNA specific for BDNF, p75NTR, and TrkB receptor isoforms occur within hours of ethanol administration to 4-day-old rat pups. Dev. Brain Res. 151, 99-109. Geschwind, D.H., 2009. Advances in autism. Annu. Rev. Med. 60, 367-380. Gillberg, C., Steffenburg, S., 1989. Autistic behaviour in Moebius syndrome. Acta Paediatr. Scand. 78, 314-316. Gillberg, C., Steffenburg, S., Schaumann, H., 1991. Is autism more common now than ten years ago? Br. J. Psychiatry 158, 403-409. Gillberg, C., Winnergård, I., 1984. Childhood psychosis in a case of Moebius syndrome. Neuropediatrics 15, 147-149. Glessner, J.T., Wang, K., Cai, G., Korvatska, O., Kim, C.E., Wood, S., Zhang, H., Estes, A., Brune, C.W., Bradfield, J.P., et al., 2009. Autism genome-wide copy number variation reveals ubiquitin and neuronal genes. Nature 459, 569-573. Goodlett, C.R., Horn, K.H., Zhou, F.C., 2005. Alcohol teratogenesis: mechanisms of damage and strategies for intervention. Exp. Biol. Med. 230, 394-406. Gulya, K., Grant, K.A., Valverius, P., Hoffman, P.L., Tabakoff, B., 1991. Brain regional specificity and time-course of changes in the NMDA receptor-ionophore complex during ethanol withdrawal. Brain Res. 547, 129-134.

200 Gurvich, N., Berman, M.G., Wittner, B.S., Gentleman, R.C., Klein, P.S., Green, J.B., 2005. Association of valproate-induced teratogenesis with histone deacetylase inhibition in vivo. FASEB J 19, 1166-1168. Gutala, R., Wang, J., Kadapakkam, S., Hwang, Y., Ticku, M., Li, M.D., 2004. Microarray analysis of ethanol-treated cortical neurons reveals disruption of genes related to the ubiquitin-proteasome pathway and protein synthesis. Alcohol.: Clin. Exp. Res. 28, 1779- 1788. Haigh, J.J., Morelli, P.I., Gerhardt, H., Haigh, K., Tsien, J., Damert, A., Miquerol, L., Muhlner, U., Klein, R., Ferrara, N., et al., 2003. Cortical and retinal defects caused by dosage-dependent reductions in VEGF-A paracrine signaling. Dev. Biol. 262, 225-241. Hallene, K.L., Oby, E., Lee, B.J., Santaguida, S., Bassanini, S., Cipolla, M., Marchi, N., Hossain, M., Battaglia, G., Janigro, D., 2006. Prenatal exposure to thalidomide, altered vasculogenesis, and CNS malformations. Neuroscience 142, 267-283. Hard, M.L., Abdolell, M., Robinson, B.H., Koren, G., 2005. Gene-expression analysis after alcohol exposure in the developing mouse. J. Lab. Clin. Med. 145, 47-54. Harris, S.R., MacKay, L.L., Osborn, J.A., 1995. Autistic behaviors in offspring of mothers abusing alcohol and other drugs: a series of case reports. Alcohol.: Clin. Exp. Res. 19, 660- 665. Heaton, M.B., Paiva, M., Mayer, J., Miller, R., 2002. Ethanol-mediated generation of reactive oxygen species in developing rat cerebellum. Neurosci. Lett. 334, 83-86. Holliday, R., 1998. The possibility of epigenetic transmission of defects induced by teratogens. Mutat. Res. 422, 203-205. Holmes, L.B., 2002. Teratogen-induced limb defects. Am. J. Med. Genet. 112, 297-303. Hsieh, J., Nakashima, K., Kuwabara, T., Mejia, E., Gage, F.H., 2004. Histone deacetylase inhibition-mediated neuronal differentiation of multipotent adult neural progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16659-16664. Huang, P.H., McBride, W.G., 1997. Interaction of [glutarimide-2-14C]-thalidomide with rat embryonic DNA in vivo. Teratog., Carcinog., Mutagen. 17, 1-5. Hutcheson, H.B., Olson, L.M., Bradford, Y., Folstein, S.E., Santangelo, S.L., Sutcliffe, J.S., Haines, J.L., 2004. Examination of NRCAM, LRRN3, KIAA0716, and LAMB1 as autism candidate genes. BMC Med. Genet. 5, 12. Ingram, J.L., Peckham, S.M., Tisdale, B., Rodier, P.M., 2000. Prenatal exposure of rats to valproic acid reproduces the cerebellar anomalies associated with autism. Neurotoxicol. Teratol. 22, 319-324. Ito, T., Ando, H., Suzuki, T., Ogura, T., Hotta, K., Imamura, Y., Yamaguchi, Y., Handa, H., 2010. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science 327, 1345-1350. Jamain, S., Quach, H., Betancur, C., Rastam, M., Colineaux, C., Gillberg, I.C., Soderstrom, H., Giros, B., Leboyer, M., Gillberg, C., et al., 2003. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat. Genet. 34, 27- 29. Johansson, M., Wentz, E., Fernell, E., Strömland, K., Miller, M.T., Gillberg, C., 2001. Autistic spectrum disorders in Möbius sequence: a comprehensive study of 25 individuals. Dev. Med. Child Neurol. 43, 338-345. Jones, K.L., Smith, D.W., 1973. Recognition of the fetal alcohol syndrome in early infancy. Lancet 302, 999-1001. Kanner, L., 1943. Autistic disturbances of affective contact. Nerv. Child 2, 217-250. Katoh, H., Negishi, M., Ichikawa, A., 1996. Prostaglandin E receptor EP3 subtype induces neurite retraction via small GTPase Rho. J. Biol. Chem. 271, 29780-29784.

201 Kelleher, R.J., 3rd, Bear, M.F., 2008. The autistic neuron: troubled translation? Cell 135, 401-406. Kelly, S.J., Day, N., Streissguth, A.P., 2000. Effects of prenatal alcohol exposure on social behavior in humans and other species. Neurotoxicol. Teratol. 22, 143-149. Kim, H.G., Kishikawa, S., Higgins, A.W., Seong, I.S., Donovan, D.J., Shen, Y., Lally, E., Weiss, L.A., Najm, J., Kutsche, K., et al., 2008. Disruption of neurexin 1 associated with autism spectrum disorder. Am. J. Hum. Genet. 82, 199-207. Kim, J.S., Shukla, S.D., 2006. Acute in vivo effect of ethanol binge drinking on histone H3 modifications in rat tissues. Alcohol Alcohol. 41, 126-132. Kini, U., Adab, N., Vinten, J., Fryer, A., Clayton-Smith, J., 2006. Dysmorphic features: an important clue to the diagnosis and severity of fetal anticonvulsant syndromes. Arch. Dis. Child. Fetal Neonatal Ed. 91, F90-F95. Kolozsi, E., Mackenzie, R.N., Roullet, F.I., deCatanzaro, D., Foster, J.A., 2009. Prenatal exposure to valproic acid leads to reduced expression of synaptic adhesion molecule neuroligin 3 in mice. Neuroscience 163, 1201-1210. Kumari, M., Anji, A., 2005. An old story with a new twist: do NMDAR1 mRNA binding proteins regulate expression of the NMDAR1 receptor in the presence of alcohol? Ann. N. Y. Acad. Sci. 1053, 311-318. Kuwagata, M., Ogawa, T., Shioda, S., Nagata, T., 2009. Observation of fetal brain in a rat valproate-induced autism model: a developmental neurotoxicity study. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 399-405. Kwon, C.H., Luikart, B.W., Powell, C.M., Zhou, J., Matheny, S.A., Zhang, W., Li, Y., Baker, S.J., Parada, L.F., 2006. Pten regulates neuronal arborization and social interaction in mice. Neuron 50, 377-388. Laegreid, L., Kyllerman, M., Hedner, T., Hagberg, B., Viggedahl, G., 1993. Benzodiazepine amplification of valproate teratogenic effects in children of mothers with absence epilepsy. Neuropediatrics 24, 88-92. Laeng, P., Pitts, R.L., Lemire, A.L., Drabik, C.E., Weiner, A., Tang, H., Thyagarajan, R., Mallon, B.S., Altar, C.A., 2004. The mood stabilizer valproic acid stimulates GABA neurogenesis from rat forebrain stem cells. J. Neurochem. 91, 238-251. Lam, K.S., Aman, M.G., Arnold, L.E., 2006. Neurochemical correlates of autistic disorder: a review of the literature. Res. Dev. Disabil. 27, 254-289. Lamy, S., Thibaut, F., 2010. Psychoactive substance use during pregnancy: a review. Encephale 36, 33-38. Landgren, M., Svensson, L., Strömland, K., Andersson Grönlund, M., 2010. Prenatal alcohol exposure and neurodevelopmental disorders in children adopted from Eastern Europe. Pediatrics 125, e1178-e1185. Landrigan, P.J., 2010. What causes autism? Exploring the environmental contribution. Curr. Opin. Pediatr. 22, 219-225. Laumonnier, F., Bonnet-Brilhault, F., Gomot, M., Blanc, R., David, A., Moizard, M.P., Raynaud, M., Ronce, N., Lemonnier, E., Calvas, P., et al., 2004. X-linked mental retardation and autism are associated with a mutation in the NLGN4 gene, a member of the neuroligin family. Am. J. Hum. Genet. 74, 552-557. Lawrence, R.C., Bonner, H.C., Newsom, R.J., Kelly S.J., 2008. Effects of alcohol exposure during development on play behaviour and c-Fos expression in response to play behaviour. Behav. Brain Res. 188, 209-218. Lee, R.D., An, S.M., Kim, S.S., Rhee, G.S., Kwack, S.J., Seok, J.H., Chae, S.Y., Park, C.H., Choi, Y.W., Kim, H.S., et al., 2005. Neurotoxic effects of alcohol and acetaldehyde during embryonic development. J. Toxicol. Environ. Health A 68, 2147-2162. Lenz, W., Knapp K., 1962. Thalidomide embryopathy. Arch. Environ. Health 5, 100-105.

202 Levitt, P., 2004. Neuroscience. Sealing cortical cell fate. Science 303, 48-49. Levy, S.E., Mandell, D.S., Schultz, R.T., 2009. Autism. Lancet 374, 1627-1638. Li, Y., Liu, B., Sailhamer, E.A., Yuan, Z., Shults, C., Velmahos, G.C., deMoya, M., Shuja, F., Butt, M.U., Alam, H.B., 2008. Cell protective mechanism of valproic acid in lethal hemorrhagic shock. Surgery 144, 217-224. Liesi P., 1997. Ethanol-exposed central neurons fail to migrate and undergo apoptosis. J. Neurosci. Res. 48, 439-448. Liu, J., Lewohl, J.M., Dodd, P.R., Randall, P.K., Harris, R.A., Mayfield, R.D., 2004. Gene expression profiling of individual cases reveals consistent transcriptional changes in alcoholic human brain. J. Neurochem. 90, 1050-1058. Makkonen, I., Riikonen, R., Kokki, H., Airaksinen, M.M., Kuikka, J.T., 2008. Serotonin and dopamine transporter binding in children with autism determined by SPECT. Dev. Med. Child Neurol. 50, 593-597. Markram, K., Rinaldi, T., La Mendola, D., Sandi, C., Markram, H., 2008. Abnormal fear conditioning and amygdala processing in an animal model of autism. Neuropsychopharmacology 33, 901-912. Marques-Dias, M.J., Gonzalez, C.H., Rosemberg, S., 2003. Möbius sequence in children exposed in utero to misoprostol: neuropathological study of three cases. Birth Defects Res., Part A 67, 1002-1007. Marshall, C.R., Noor, A., Vincent, J.B., Lionel, A.C., Feuk, L., Skaug, J., Shago, M., Moessner, R., Pinto, D., Ren, Y., et al., 2008. Structural variation of chromosomes in autism spectrum disorder. Am. J. Hum. Genet. 82, 477-488. Mbarek, O., Marouillat, S., Martineau, J., Barthelemy, C., Muh, J.P., Andres, C., 1999. Association study of the NF1 gene and autistic disorder. Am. J. Med. Genet. 88, 729-732. McBride, K.L., Varga, E.A., Pastore, M.T., Prior, T.W., Manickam, K., Atkin, J.F., Herman, G.E., 2010. Confirmation study of PTEN mutations among individuals with autism or developmental delays/mental retardation and macrocephaly. Autism Res. 3, 137- 141. Menegola, E., Di Renzo, F., Broccia, M.L., Giavini, E., 2006. Inhibition of histone deacetylase as a new mechanism of teratogenesis. Birth Defects Res., part C 78, 345-353. Michaelis, M., Michaelis, U.R., Fleming, I., Suhan, T., Cinatl, J., Blaheta, R.A., Hoffmann, K., Kotchetkov, R., Busse, R., Nau, H., et al., 2004. Valproic acid inhibits angiogenesis in vitro and in vivo. Mol. Pharmacol. 65, 520-527. Miglio, G., Rattazzi, L., Rosa, A.C., Fantozzi, R., 2009. PPARgamma stimulation promotes neurite outgrowth in SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Neurosci. Lett. 454, 134-138. Miles, J.H., Hadden, L.L., Takahashi, T.N., Hillman, R.E., 2000. Head circumference is an independent clinical finding associated with autism. Am. J. Med. Genet. 95, 339-350. Miles, J.H., Hillman, R.E., 2000. Value of a clinical morphology examination in autism. Am. J. Med. Genet. 91, 245-253. Miles, J.H., Takahashi, T.N., Hong, J., Munden, N., Flournoy, N., Braddock, S.R., Martin, R.A., Bocian, M.E., Spence, M.A., Hillman, R.E., et al., 2008. Development and validation of a measure of dysmorphology: useful for autism subgroup classification. Am. J. Med. Genet. 146A, 1101-1116. Miller, G., 2006. Neuroscience. New neurons strive to fit in. Science 311, 938-940. Miller, M.T., Strömland, K., Gillberg, C., Johansson, M., Nilsson, E.W., 1998. The puzzle of autism: an ophthalmologic contribution. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 96, 369-385. Miller, M.T., Strömland, K., Ventura, L., Johansson, M., Bandim, J.M., Gillberg, C., 2004. Autism with ophthalmologic malformations: the plot thickens. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 102, 107-120.

203 Miller, M.T., Strömland, K., Ventura, L., Johansson, M., Bandim, J.M., Gillberg, C., 2005. Autism associated with conditions characterized by developmental errors in early embryogenesis: a mini review. Int. J. Dev. Neurosci. 23, 201-219. Miller, M.W., Jacobs, J.S., Yokoyama, R., 2003. Neg, a nerve growth factor-stimulated gene expressed by fetal neocortical neurons that is downregulated by ethanol. J. Comp. Neurol. 460, 212-222. Miyazaki, K., Narita, N., Narita, M., 2005. Maternal administration of thalidomide or valproic acid causes abnormal serotonergic neurons in the offspring: implication for pathogenesis of autism. Int. J. Dev. Neurosci. 23, 287-297. Mooney, S.M., Siegenthaler, J.A., Miller, M.W., 2004. Ethanol induces heterotopias in organotypic cultures of rat cerebral cortex. Cereb. Cortex 14, 1071-1080. Mooney, S.M., Varlinskaya, E.I., 2010. Acute prenatal exposure to ethanol and social behavior: effect of age, sex, and timing of exposure. Behav. Brain Res. In press. Moore, S.J., Turnpenny, P., Quinn, A., Glover, S., Lloyd, D.J., Montgomery, T., Dean, J.C., 2000. A clinical study of 57 children with fetal anticonvulsant syndromes. J. Med. Genet. 37, 489-497. Nakamura, K., Sekine, Y., Ouchi, Y., Tsujii, M., Yoshikawa, E., Futatsubashi, M., Tsuchiya, K.J., Sugihara, G., Iwata, Y., Suzuki, K., et al., 2010. Brain serotonin and dopamine transporter bindings in adults with high-functioning autism. Arch. Gen. Psychiatry 67, 59-68. Nanson, J.L., 1992. Autism in fetal alcohol syndrome: a report of six cases. Alcohol.: Clin. Exp. Res. 16, 558-565. Narita, N., Kato, M., Tazoe, M., Miyazaki, K., Narita, M., Okado, N., 2002. Increased monoamine concentration in the brain and blood of fetal thalidomide- and valproic acid- exposed rat; putative animal models for autism. Pediatr. Res. 52, 576-579. Neubert, R., Hinz, N., Thiel, R., Neubert, D., 1996. Down-regulation of adhesion receptors on cells of primate embryos as a probable mechanism of the teratogenic action of thalidomide. Life Sci. 58, 295-316. Nicholas, B., Rudrasingham, V., Nash, S., Kirov, G., Owen, M.J., Wimpory, D.C., 2007. Association of Per1 and Npas2 with autistic disorder: support for the clock genes/social timing hypothesis. Mol. Psychiatry 12, 581-592. Ornoy, A., 2009. Valproic acid in pregnancy: how much are we endangering the embryo and fetus? Reprod. Toxicol. 28, 1-10. Ozgen, H., Hellemann, G.S., Stellato, R.K., Lahuis, B., van Daalen, E., Staal, W.G., Rozendal, M., Hennekam, R.C., Beemer, F.A., van Engeland, H., 2010. Morphological Features in Children with Autism Spectrum Disorders: A Matched Case-Control Study. J. Autism Dev. Disord. 2010 may 15. Park, P.H., Lim, R.W., Shukla, S.D., 2005. Involvement of histone acetyltransferase HAT in ethanol-induced acetylation of histone H3 in hepatocytes: potential mechanism for gene expression. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 289, G1124-1136. Phiel, C.J., Zhang, F., Huang, E.Y., Guenther, M.G., Lazar, M.A., Klein, P.S., 2001. Histone deacetylase is a direct target of valproic acid, a potent anticonvulsant, mood stabilizer, and teratogen. J. Biol. Chem. 276, 36734-36741. Pickett, J., London, E., 2005. The neuropathology of autism: a review. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 925-935. Pignataro, L., Varodayan, F.P., Tannenholz, L.E., Harrison, N.L., 2009. The regulation of neuronal gene expression by alcohol. Pharmacol. Ther. 124, 324-335. Ploeger, A., Raijmakers, M.E., van der Maas, H.L., Galis, F., 2010. The association between autism and errors in early embryogenesis: what is the causal mechanism? Biol. Psychiatry 67, 602-607.

204 Pottie, K., 1999. Is misoprostol teratogenic? Misoprostol use during early pregnancy and its association with Mobius' syndrome. Can. Fam. Physician 45, 315-316. Rasalam, A.D., Hailey, H., Williams, J.H., Moore, S.J., Turnpenny, P.D., Lloyd, D.J., Dean, J.C., 2005. Characteristics of fetal anticonvulsant syndrome associated autistic disorder. Dev. Med. Child Neurol. 47, 551-555. Redcay, E., Courchesne, E., 2005. When is the brain enlarged in autism? A meta-analysis of all brain size reports. Biol. Psychiatry 58, 1-9. Rice, D., Barone, S.J., 2000. Critical periods of vulnerability for the developing nervous system: evidence from humans and animal models. Environ. Health Perspect. 108, 511- 533. Rinaldi, T., Kulangara, K., Antoniello, K., Markram, H., 2007. Elevated NMDA receptor levels and enhanced postsynaptic long-term potentiation induced by prenatal exposure to valproic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 13501-13506. Rinaldi, T., Perrodin, C., Markram, H., 2008a. Hyper-connectivity and hyper-plasticity in the medial prefrontal cortex in the valproic Acid animal model of autism. Front. Neural Circuits 2, 4. Rinaldi, T., Silberberg, G., Markram, H., 2008b. Hyperconnectivity of local neocortical microcircuitry induced by prenatal exposure to valproic acid. Cereb. Cortex 18, 763-770. Ritvo, E.R., Freeman, B.J., Scheibel, A.B., Duong, T., Robinson, H., Guthrie, D., Ritvo, A., 1986. Lower Purkinje cell counts in the cerebella of four autistic subjects: initial findings of the UCLA-NSAC Autopsy Research Report. Am. J. Psychiatry 143, 862-866. Rodier, P.M., Bryson, S.E., Welch, J.P., 1997a. Minor malformations and physical measurements in autism: data from Nova Scotia. Teratology 55, 319-325. Rodier, P.M., Ingram, J.L, Tisdale, B., Croog, V.J., 1997b. Linking etiologies in humans and animal models: studies of autism. Reprod. Toxicol. 11, 417-422. Rodier, P.M., Ingram, J.L., Tisdale, B., Nelson, S., Romano, J., 1996. Embryological origin for autism: developmental anomalies of the cranial nerve motor nuclei. J. Comp. Neurol. 370, 247-261. Rosser, T.L., Packer, R.J., 2003. Neurocognitive dysfunction in children with neurofibromatosis type 1. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 3, 129-136. Roullet, F.I., Wollaston, L., Decatanzaro, D., Foster, J.A., 2010. Behavioral and molecular changes in the mouse in response to prenatal exposure to the anti-epileptic drug valproic acid. Neuroscience 170, 514-522. Rout, U.K., Clausen, P., 2009. Common increase of GATA-3 level in PC-12 cells by three teratogens causing autism spectrum disorders. Neurosci. Res. 64, 162-169. Rowland, T.L., McHugh, S.M., Deighton, J., Ewan, P.W., Dearman, R.J., Kimber, I., 2001. Differential effect of thalidomide and dexamethasone on the transcription factor NF-kappa B. Int. Immunopharmacol. 1, 49-61. Sacco, R., Papaleo, V., Hager, J., Rousseau, F., Moessner, R., Militerni, R., Bravaccio, C., Trillo, S., Schneider, C., Melmed, R., et al., 2007. Case-control and family-based association studies of candidate genes in autistic disorder and its endophenotypes: TPH2 and GLO1. BMC Med. Genet. 8, 11. Sari, Y., Zhou, F.C., 2004. Prenatal alcohol exposure causes long-term serotonin neuron deficit in mice. Alcohol.: Clin. Exp. Res. 28, 941-948. Sathyan, P., Golden, H.B., Miranda, R.C., 2007. Competing interactions between micro- RNAs determine neural progenitor survival and proliferation after ethanol exposure: evidence from an ex vivo model of the fetal cerebral cortical neuroepithelium. J. Neurosci. 27, 8546-8557. Schain, R.J., Freedman, D.X., 1961. Studies on 5-hydroxyindole metabolism in autistic and other mentally retarded children. J. Pediatr. 58, 315-320.

205 Schneider, T., Labuz, D., Przewłocki R., 2001. Nociceptive changes in rats after prenatal exposure to valproic acid. Pol. J. Pharmacol. 53, 531-534. Schneider, T., Przewłocki, R., 2005. Behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid: animal model of autism. Neuropsychopharmacology 30, 80-89. Schneider, T., Roman, A., Basta-Kaim, A., Kubera, M., Budziszewska, B., Schneider, K., Przewłocki, R., 2008. Gender-specific behavioral and immunological alterations in an animal model of autism induced by prenatal exposure to valproic acid. Psychoneuroendocrinology 33, 728-740. Schneider, T., Ziòłkowska, B., Gieryk, A., Tyminska, A., Przewłocki, R., 2007. Prenatal exposure to valproic acid disturbs the enkephalinergic system functioning, basal hedonic tone, and emotional responses in an animal model of autism. Psychopharmacology 193, 547-555. Schumacher, H., Blake, D.A., Gurian, J.M., Gillette, J.R., 1968. A comparison of the teratogenic activity of thalidomide in rabbits and rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 160, 189- 200. Schumann, C.M., Amaral, D.G., 2006. Stereological analysis of amygdala neuron number in autism. J. Neurosci. 26, 7674-7679. Schumann, C.M., Barnes, C.C., Lord, C., Courchesne, E., 2009. Amygdala enlargement in toddlers with autism related to severity of social and communication impairments. Biol. Psychiatry 66, 942-949. Scoles, D.R., Huynh, D.P., Morcos, P.A., Coulsell, E.R., Robinson, N.G., Tamanoi, F., Pulst, S.M., 1998. Neurofibromatosis 2 tumour suppressor schwannomin interacts with betaII-spectrin. Nat. Genet. 18, 354-359. Shukla, S.D., Velazquez, J., French, S.W., Lu, S.C., Ticku, M.K., Zakhari, S., 2008. Emerging role of epigenetics in the actions of alcohol. Alcohol.: Clin. Exp. Res. 32, 1525- 1534. Smithells, R.W., Newman, C.G., 1992. Recognition of thalidomide defects. J. Med. Genet. 29, 716-723. Snow, W.M., Hartle, K., Ivanco, T.L., 2008. Altered morphology of motor cortex neurons in the VPA rat model of autism. Dev. Psychobiol. 50, 633-639. Stanton, M.E., Peloso, E., Brown, K.L., Rodier, P., 2007. Discrimination learning and reversal of the conditioned eyeblink reflex in a rodent model of autism. Behav. Brain Res. 176, 133-140. Stodgell, C.J., Ingram, J.L., O'Bara, M., Tisdale, B.K., Nau, H., Rodier, P.M., 2006. Induction of the homeotic gene Hoxa1 through valproic acid's teratogenic mechanism of action. Neurotoxicol. Teratol. 28, 617-624. Strömland, K., Nordin, V., Miller, M., Akerström, B., Gillberg, C., 1994. Autism in thalidomide embryopathy: a population study. Dev. Med. Child Neurol. 36, 351-356. Strömland, K., Sjögreen, L., Miller, M., Gillberg, C., Wentz, E., Johansson, M., Nylén, O., Danielsson, A., Jacobsson, C., Andersson, J., et al., 2002. Mobius sequence–a Swedish multidiscipline study. Eur. J. Paediatr. Neurol. 6, 35-45. Sugimoto, Y., Narumiya, S., 2007. Prostaglandin E receptors. J. Biol. Chem. 282, 11613- 11617. Szatmari, P., Paterson, A.D., Zwaigenbaum, L., Roberts, W., Brian, J., Liu, X.Q., Vincent, J.B., Skaug, J.L., Thompson, A.P., Senman, L., et al., 2007. Mapping autism risk loci using genetic linkage and chromosomal rearrangements. Nat. Genet. 39, 319-328. Tabuchi, K., Blundell, J., Etherton, M.R., Hammer, R.E., Liu, X., Powell, C.M., Sudhof, T.C., 2007. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science 318, 71-76.

206 Tang, M., Villaescusa, J.C., Luo, S.X., Guitarte, C., Lei, S., Miyamoto, Y., Taketo, M.M., Arenas, E., Huang, E.J., 2010. Interactions of Wnt/beta-catenin signaling and sonic hedgehog regulate the neurogenesis of ventral midbrain dopamine neurons. J. Neurosci. 30, 9280-9291. Thiel, R., Kastner, U., Neubert, R., 2000. Expression of adhesion receptors on rat limb bud cells and results of treatment with a thalidomide derivative. Life Sci. 66, 133-141. Tripi, G., Roux, S., Canziani, T., Bonnet Brilhault, F., Barthélémy, C., Canziani, F., 2008. Minor physical anomalies in children with autism spectrum disorder. Early Hum. Dev. 84, 217-223. Tsuchiya, H., Oka, T., Nakamura, K., Ichikawa, A., Saper, C.B., Sugimoto, Y., 2008. Prostaglandin E2 attenuates preoptic expression of GABAA receptors via EP3 receptors. J. Biol. Chem. 283, 11064-11071. Tsujino, N., Nakatani, Y., Seki, Y., Nakasato, A., Nakamura, M., Sugawara, M., Arita, H., 2007. Abnormality of circadian rhythm accompanied by an increase in frontal cortex serotonin in animal model of autism. Neurosci. Res. 57, 289-295. Uchida, K., Kumihashi, K., Kurosawa, S., Kobayashi, T., Itoi, K., Machida, T., 2002. Stimulatory effects of prostaglandin E2 on neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat. Zoolog. Sci. 19, 1211-1216. Vangipuram, S.D., Grever, W.E., Parker, G.C., Lyman, W.D., 2008. Ethanol increases fetal human neurosphere size and alters adhesion molecule gene expression. Alcohol.: Clin. Exp. Res. 32, 339-347. Vorhees, C.V., Weisenburger, W.P., Minck, D.R., 2001. Neurobehavioral teratogenic effects of thalidomide in rats. Neurotoxicol. Teratol. 23, 255-264. Vourc'h, P., Martin, I., Bonnet-Brilhault, F., Marouillat, S., Barthelemy, C., Muh, J.P., Andres, C., 2003. Mutation screening and association study of the UBE2H gene on chromosome 7q32 in autistic disorder. Psychiatr. Genet. 13, 221-225. Wang, W.M., Zhang, H.D., Jin, Y.M., Zhu, B.B., Chen, N., 2009. PPAR-gamma agonists inhibit TGF-beta1-induced chemokine expression in human tubular epithelial cells. Acta Pharmacol. Sin. 30, 107-112. Wang, Z., Xu, L., Zhu, X., Cui, W., Sun, Y., Nishijo, H., Peng, Y., Li, R., 2010. Demethylation of Specific Wnt/beta-Catenin Pathway Genes and its Upregulation in Rat Brain Induced by Prenatal Valproate Exposure. Anat. Rec. In press. Wegiel, J., Kuchna, I., Nowicki, K., Imaki, H., Wegiel, J., Marchi. E., Ma, S.Y., Chauhan, A., Chauhan, V., Bobrowicz, T.W., et al., 2010. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathol. 119, 755- 770. Wegner, C., Nau, H., 1992. Alteration of embryonic folate metabolism by valproic acid during organogenesis: implications for mechanism of teratogenesis. Neurology 42, 17-24. Wentzel, P., Eriksson, U.J., 2009. Altered gene expression in neural crest cells exposed to ethanol in vitro. Brain Res. 1305 Suppl., S50-60. Wilcox, J., Tsuang, M.T., Ledger, E., Algeo, J., Schnurr, T., 2002. Brain perfusion in autism varies with age. Neuropsychobiology 46, 13-16. Williams, G., King, J., Cunningham, M., Stephan, M., Kerr, B., Hersh, J.H., 2001. Fetal valproate syndrome and autism: additional evidence of an association. Dev. Med. Child Neurol. 43, 202-206. Williams, P.G., Hersh, J.H., 1997. A male with fetal valproate syndrome and autism. Dev. Med. Child Neurol. 39, 632-634. Yang, H., Zhang, J., Breyer, R.M., Chen, C., 2009. Altered hippocampal long-term synaptic plasticity in mice deficient in the PGE2 EP2 receptor. J. Neurochem. 108, 295- 304.

207 Yeargin-Allsopp, M., Rice, C., Karapurkar, T., Doernberg, N., Boyle, C., Murphy, C., 2003. Prevalence of autism in a US metropolitan area. JAMA 289, 49-55. Yochum, C.L., Dowling, P., Reuhl, K.R., Wagner, G.C., Ming, X., 2008. VPA-induced apoptosis and behavioral deficits in neonatal mice. Brain Res. 1203, 126-132. Yuan, P.X., Huang, L.D., Jiang, Y.M., Gutkind, J.S., Manji, H.K., Chen, G., 2001. The mood stabilizer valproic acid activates mitogen-activated protein kinases and promotes neurite growth. J. Biol. Chem. 276, 31674-31683. Zhou, F.C., Sari, Y., Li, T.K., Goodlett, C., Azmitia, E.C., 2002. Deviations in brain early serotonergic development as a result of fetal alcohol exposure. Neurotox. Res. 4, 337-342. Zhou, F.C., Sari, Y., Powrozek, T.A., 2005. Fetal alcohol exposure reduces serotonin innervation and compromises development of the forebrain along the serotonergic pathway. Alcohol.: Clin. Exp. Res. 29, 141-149. Zhou, R., Yuan, P., Wang, Y., Hunsberger, J.G., Elkahloun, A., Wei, Y., Damschroder- Williams, P., Du, J., Chen, G., Manji, H.K., 2009. Evidence for selective microRNAs and their effectors as common long-term targets for the actions of mood stabilizers. Neuropsychopharmacology 34, 1395-1405.

208 Figure captions

Figure 1: Chemical structures of valproic acid, ethanol, thalidomide and misoprostol

O

OH

N O

O NH

O O Valproic acid Thalidomide

O O

O

OH HO OH

Ethanol Misoprostol

Figure 2: Possible (crosshatched band) and probable (full band) periods during which exposure to teratogens is likely to cause autism

day post-fertilization in rat 0 8 11 14 16 18 day post-fertilization in human

0 10 20 30 40 50 60 Valproic acid

Ethanol

Thalidomide

Misoprostol

209 Table captions

Table 1: Clinical features reported in children with autism exposed to teratogens

Valproic acid Ethanol Thalidomide Misoprostol

Malformations

- Cranium (e.g. microcephaly, midface hypoplasia, micrognathia) [3] [12] [13] [5] [7] - Eye (e.g. epicanthic folds, hypertelorism, microphtalmos, coloboma) [3] [12] [13] [5] [11] [7] - Nose (e.g. upturned nose, small nose) [3] [8] [13] [5] - Philtrum (e.g. flat philtrum) [3] [12] [13] [5] - Lip (e.g. thin upper lip) [3] [12] [13] [5] - Ears (e.g. posteriorly rotated ears, low-set ears) [3] [4] [8] [12] [13] [5] [11] [7] - Limb (e.g. polydactyly, olygodactyly, talipes,) [4] [8] [10] [12] [13] [5] [9] [11] [7] Medical aspects

- Growth retardation [5] [9] - Hernia (e.g. inguinal) [4] [8] [13] [9] - Visual problems (e.g. myopia, strabismus) [4] [10] [11] [7] - Hearing problems (e.g. otitis media, deficit, deafness) [4] [13] [11] [7]

- Cranial nerves alterations (e.g. Duane syndrome (VI), Möbius [11] [2] [7] syndrome (VII), abnormal lacrimation (VII), facial nerve palsy (VII)) Developmental delay

- Speech or language delay [3] [4] [10] [12] [13] [5] [9] [11] [2] Mental development

- Mental retardation [3] [6] [10] [1] [5] [9] [11] [2] [7] Other behavioral disorder

- Hyperactivity [9]

Comparison of clinical features present in autistic children exposed to the different teratogens: valproic acid, ethanol, thalidomide or misoprostol. [1], Aronson et al., 1997; [2], Bandim et al., 2003; [3], Christianson et al., 1994; [4], Dean et al., 2002; [5], Harris et al., 1995; [6], Landgren et al., 2010; [7], Miller et al., 2004; [8], Moore et al., 2000; [9], Nanson, 1992; [10], Rasalam et al., 2005; [11], Strömland et al. 1994; [12], Williams and Hersh, 1997; [13], Williams et al., 2001

210 Table 2: Physical, behavioral and neuropathological common features observed in different animal models of prenatal teratogen exposures

Valproic acid Ethanol Thalidomide

Autistic-like behaviors

↓ number and ↑ latency of social alteration in social play

- social behaviors behaviors [2] [8] [12] [14] [15] [7] [10]

↑ repetitive/stereotypic-like activity - repetitive/stereotypic- like activity [8] [14] [15] Malformations

- Cranium dysmorphy [3] microcephaly [4]

- Ears atrophy [2] Neuropathological aspects

- Apoptosis alteration [17] alteration [1] [13] alteration [5]

migration and differentiation migration alteration in DRN alterations in pons [6] in DRN [9] migration alteration [4] [9] [18] - Serotonergic 5-HT level variations in frontal cortex, ↑ 5-HT in hippocampus [11] ↓ number of 5-HT neurons neurotransmission hippocampus, cerebellum and plasma ↑ 5-HT in plasma [11] [13] [19] [2] [11] [16]

5-HT, serotonin; DRN, dorsal raphe nucleus [1], Anthony et al., 2008; [2], Dufour-Rainfray et al., 2010; [3], Edwards and Dow- Edwards, 1991; [4], Hallene et al., 2006; [5], Hyakkoku et al., 2008; [6], Kuwagata et al., 2009; [7], Lawrence et al., 2008; [8], Markram et al., 2008; [9], Miyazaki et al., 2005; [10], Mooney and Varlinskaya, 2010; [11], Narita et al., 2002; [12], Roullet et al., 2010; [13], Sari and Zhou, 2004; [14], Schneider et al., 2005; [15], Schneider et al., 2008; [16], Tsujino et al., 2007; [17], Yochum et al., 2008; [18], Zhou et al., 2002; [19], Zhou et al., 2005

211 Table 3: Specific biological processes to which belong the genes whose expression is modified in vivo or in vitro by the addition of the toxic molecules (genes reported in the literature). All biological processes in this table are affected by at least three of the four toxic molecules (valproic acid, ethanol, thalidomide, misoprostol) (Gene ontology database, http://www.geneontology.org ). GO, Gene ontology.

GO accession number Biological processes

GO:0006979 response to oxidative stress GO:0009408 response to heat GO:0009725 response to hormone stimulus GO:0014070 response to organic cyclic substance GO:0042493 response to drug GO:0006355, 0010552, 0010628, regulation of transcription 0010468, 0045449, 0045944

GO:0007165 signal transduction GO:0007186 G-protein coupled receptor protein signaling pathway GO:0007264 small GTPase mediated signal transduction GO:0016055 Wnt receptor signaling pathway GO:0006468 protein amino acid phosphorylation GO:0018105 peptidyl-serine phosphorylation GO:0018107 peptidyl-threonine phosphorylation GO:0032880 regulation of protein localization GO:0051291 protein heterooligomerization GO:0007155 cell adhesion GO:0030036 actin cytoskeleton organization

212 Table 4: General biological processes to which belong the genes whose expression is modified in vivo or in vitro by the addition of the toxic molecules (genes reported in the literature). All biological processes in this table are affected by at least three of the four toxic molecules (valproic acid, ethanol, thalidomide, misoprostol) (Gene ontology database, http://www.geneontology.org ). GO, Gene ontology.

GO accession number Biological processes

Balance proliferation/apoptosis GO:0008283, 0042127 cell proliferation GO:0006915, 0043065 apoptosis GO:0006916, 0043066 anti-apoptosis GO:0043524 negative regulation of neuron apoptosis Neuronal differentiation and connectivity GO:0007399 nervous system development GO:0009653 anatomical structure morphogenesis GO:0030154, 0045596 cell differentiation GO:0001764 neuron migration GO:0030336 negative regulation of cell migration GO:0007411 axon guidance GO:0007268 synaptic transmission Blood system GO:0001569 patterning of blood vessels GO:0001570 vasculogenesis GO:0001666 response to hypoxia GO:0002053 positive regulation of mesenchymal cell proliferation

213 Annexe 5 : Article publié dans Neuroscience Letters (IF = 1.9)

214

215

216

217

218 Production scientifique en rapport avec les travaux de thèse

219 Production scientifique en rapport avec les travaux de thèse

Articles internationaux

- Dufour-Rainfray, D. , Vourc’h, P., Tourlet, S., Guilloteau, D., Chalon, S., Andres, C.R. Fetal exposure to teratogens: evidence of genes involved in autism. Neuroscience & Biobehavioral Reviews , 2011, in press.

- Dufour-Rainfray, D. , Vourc’h, P., Le Guisquet, A.M., Garreau, L., Ternant, D., Bodard, S., Jaumain, E., Gulhan, Z., Belzung, C., Andres, C.R., Chalon, S., Guilloteau, D. Behavior and serotonergic disorders in rats exposed prenatally to valproate: a model for autism. Neuroscience letters , 2010, 470, 55-59.

- Tabagh, R., Andres, C.R., Védrine, S., Cherpi-Antar, C., Thepault, R-A., Mignon, L., Dufour-Rainfray, D., Moraine, C., Vourc’h, P. Study of the serotonin transporter (SLC6A4) and BDNF genes in French patients with non syndromic mental deficiency. BMC Medical Genetics , 2010, 22, 11-30.

Communication orale

Exploration du système sérotoninergique dans l’autisme. Études clinique et expérimentale. 12 ème Journées Francophones de Recherche en Néonatologie, 14 et 15 décembre 2006, Paris

Posters nationaux et internationaux

- Dufour-Rainfray D. , Jaumain E., Vourc’h P., Ternant D., Bodard S., Le Guisquet A-M., Gulhan Z., Garreau L., Tabagh, R., Belzung C., Chalon S., Andres C.R., Guilloteau D. Behavioral and serotonin system impairment in prenatally VPA-exposed rat. 9 ème colloque de la société des neurosciences, Bordeaux, 26-29/05/2009.

- Dufour-Rainfray, D. , Garreau, L., Chalon, S., Besnard, J.-C., Guilloteau, D. [3H]MADAM as a high efficient probe for study of platelet serotonin transporter. Annual Congress of the European Association of Nuclear Medicine, Helsinki, 4- 8/09/2004.

220

Diane DUFOUR-RAINFRAY

Implication du système sérotoninergique dans l’autisme : Étude de marqueurs centraux (modèle animal) et périphériques (plaquette sanguine humaine)

Résumé

Disposer de marqueurs pour l’étude de l’autisme permettrait d’améliorer la compréhension de la physiopathologie, de compléter les arguments cliniques diagnostiques et de proposer des voies de recherche thérapeutiques ou préventives. Notre hypothèse est que certaines modifications du système sérotoninergique peuvent être des marqueurs potentiels de l’autisme. Pour tester cette hypothèse, nous avons eu recours à deux modèles : la plaquette sanguine humaine et un modèle animal, le rat exposé en prénatal à l’acide valproïque. Nous avons montré : - que le taux de sérotonine intraplaquettaire et la densité de transporteurs de la sérotonine peuvent être analysés chez l’homme. Ces paramètres ne diffèrent pas entre les groupes de témoins, autistes et apparentés du premier degré, - que le taux de sérotonine est abaissé de 46% dans l’hippocampe des rats exposés à l’acide valproïque, sans modification de la densité de transporteurs. Ces études renforcent l’intérêt de réaliser, chez des sujets avec autisme, des explorations centrales de ces potentiels marqueurs sérotoninergiques, et notamment à l’aide d’outils d’imagerie moléculaire.

Mots-clés : Modèle animal ; Autoradiographie ; Hippocampe ; Maladie neuro-développementale ; Exposition prénatale ; Transporteur de la sérotonine

Résumé en anglais

Development of markers of pathogenesis for autism would improve understanding of the pathophysiology, would complete clinical arguments for diagnosis and would propose preventive or therapeutic research pathways. Our hypothesis is that modifications to the serotonergic system may be potential markers for autism. To test this hypothesis, we used two study models: the human blood platelet and an animal model, rats prenatally exposed to valproic acid. We have shown that: - platelet serotonin levels and serotonin transporters density may be jointly tested in humans. These parameters do not significantly differ between groups of controls, patients with autism and first-degree related, - serotonin levels were decreased by 46% in the hippocampus of rats exposed to valproic acid, and no significant modification was observed in serotonin transporters density. These results reinforce the interest of central explorations. These studies reinforce the interest of central exploration of serotonergic potential markers in patient with autism and especially with molecular imaging tools.

Keywords : Animal model; Autoradiography; Hippocampus; Neurodevelopmental disorder; Prenatal exposure; Serotonin transporter 221