N°d’ordre : 3749

THESE

PRESENTEE A L’UNIVERSITE BORDEAUX 1

ECOLE DOCTORALE SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

PAR

Maude BERNARDET

POUR L’OBTENTION DU GRADE DE DOCTEUR SPECIALITE: NEUROSCIENCES

ETUDE DES TRAITS AUTISTIQUES CHEZ UN MODELE SOURIS DU X FRAGILE

Soutenue publiquement le 16 décembre 2008 devant la commission d’examen constituée par : Catherine Belzung, Pr Rapporteur externe Pascal Branchereau, Pr Président du jury Georges Chapouthier, DR Rapporteur externe Wim Crusio, DR Directeur de thèse Tobias Hévor, Pr Membre invité Pierre Mormède, DR Membre invité

Remerciements

Je tiens en premier lieu à remercier Georges Di Scala de m’avoir accueillie au sein du Laboratoire de Neurosciences Cognitives et le remercie également de nos conversations scientifiques et non scientifiques. Il a été pour moi un directeur de laboratoire présent et attentionné, sur le soutien duquel j’ai pu compter tout au long de mon cursus dans ce laboratoire. Merci à Wim de m’avoir donné l’opportunité de travailler avec lui et de m’avoir guidée dans mes premiers pas de chercheurs. Je le remercie également de sa disponibilité et de sa joie de vivre la science. On vous dit quand la pression monte et que l’échéance pour rendre le manuscrit approche: ce n’est qu’une thèse, personne ne la lira. Bizarrement ça ne diminue pas la tension créatrice. C’est pourquoi je suis infiniment reconnaissante à mes rapporteurs Catherine Belzung et Georges Chapouthier d’avoir pris le temps de lire et de critiquer mon travail, ainsi qu’à Pierre Mormède, Tobias Hévor et Pascal Branchereau d’avoir accepté de participer à mon jury de thèse. Je tiens à remercier Lydia Schiller avec qui j’ai travaillé quasiment en binôme lors de ma deuxième année de thèse. Elle a participé à mon apprentissage de la méthode et de l’organisation, ce qui n’est pas une mince affaire. Un grand merci à Alexis, Brice et Marie-Paule pour leur aide qui m’a été très précieuse au-delà des malentendus et des incompréhensions sur les aléas de l’organisation d’un projet en formation et d’un chercheur en formation. Merci à Philippe Rosay de son travail sur la morphométrie dans la partie histologique. Merci à Yves Tupinier qui m’a fait part avec générosité de ses connaissances en matière d’enregistrement d’ultrasons. Un remerciement du fond du cœur avec les yeux humides à Daniel Cattaert pour son émulation et son investissement, ainsi qu’à Alain Marchand, pour leur aide et leur efficacité dans le traitement des données de vocalisations des souriceaux. Merci à Yoon et Yannick pour les discussions animées et leur concours sur la partie de la rigidité cognitive. Bien que cette partie reste à creuser ces discussions ont été enrichissantes et très stimulantes. Merci à Jan qui s’est investit dans le programme d’exploitation de l’expérience préliminaire de conditionnement appétitif dans des boîtes automatisées. J’espère bien que cette expérience ne restera pas dans les tiroirs. Je remercie beaucoup les animaliers pour leurs soins aux élevages : Raphaël, Laëtitia et Elodie, ainsi que Dominique, Jennifer et Nathalie.

1 Remerciements

Merci à l’ensemble des acteurs de ce laboratoire pour l’ambiance dynamique et chaleureuse qu’ils instaurent. Il a vraiment été agréable et stimulant de travailler dans un tel milieu. Un merci particulier aux quatre ours de mon bureau ces deux premières années de thèse : Pierre, Ludo, Stéphane et Sébastien. Pour leurs réponses à mes questions impromptues et parfois incongrues, pour leurs discussions, pour m’avoir fait part de leur expérience et de leur savoir. Merci à eux également pour leur guidage sur le fonctionnement du laboratoire et le monde scientifique. Ils m’ont instruite tant sur le comportement et le fonctionnement animal qu’humain. J’ai beaucoup apprécié de travailler dans cette ambiance brute de décoffrage et passionnée. Merci aux étudiants pour leur dynamisme dans l’organisation des multiples évènements créatifs et récréatifs qui ont contribué à une créer ambiance stimulante au laboratoire. Enfin je manifeste ma gratitude à l’égard de mes fondations sociales hors labo ô combien précieuses : à mes colocataires, ma famille tuyau de poêle et mon amoureux, merci de m’apporter joie et occupation, merci pour votre patience et votre amour.

A tous ceux là, et aux autres en dehors du laboratoire qui contribuent à mon bien-être et mon enrichissement quotidien, un grand MERCI.

2 Sommaire

Sommaire

Chapitre I : Introduction générale I. PROBLEMATIQUE………………………………………………………..…..…9

II. LE TROUBLE AUTISTIQUE……………………………………………………10 1. Les troubles du spectre autistique……………………………….……….……...... 10 2. Historique et définition de l’autisme……………………………………………...11 2.1. Généralités…………………………………………………………………..……..11 2.2. Diagnostic de l’autisme……………………………………………………..……..12 2.2.1 Caractéristiques diagnostiques …………………………….…………………12

2.2.2. Caractéristiques variables et troubles associés………….…………………14 2.2.3. Evolution……………………………………………………….………….…….15 3. Biologie de l’autisme……………………………………………….……….…..….16 3.1. Neuroanatomie……………………………………………………………..…..….17 3.2. Psychopharmacologie……………………………………………………………..19 4. Thérapie………………………………………………………………………….....20 5. Etiologie……………………………………………………………………………..21

III. LE SYNDROME DU X FRAGILE……………………………………………...24 1. Historique et définition………………………………………………………….....24 1.1. Généralités…………………………………………………………………………24 1.2. Symptômes ………………………………………………………………………..25 1.3. Etiologie, mode de transmission…………………………………………………..27 1.4. Variabilité phénotypique……………………………………….………………….28 1.5. Diagnostic………………………………………………………………………….29 2. Bases neuroanatomiques et moléculaires du syndrome du X fragile…………...30 2.1. Neuroanatomie du SXF……………………………………………………………30 2.2. Le gène FMR1 …………………………………………………………………….32 2.3. La protéine FMRP…………………………………………………………………33 2.4. Gènes proches : la famille de gènes FXR et leurs fonctions………………………33

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IV. MODELES ANIMAUX POUR LES MALADIES NEUROPSYCHIATRIQUES………………………………………………………...34 1. Utilité et validité des modèles animaux pour les maladies neuropsychiatriques.34 2. Modèles rongeurs pour l’autisme………………………………………………….35 2.1. Dérégulation des fonctions synaptiques chez des modèles souris pour l’autisme...36 2.2. Modèles de maladies génétiques impliquées dans l’autisme ……………………..37 2.3. Modèles mimant les effets épigénétiques potentiels à l’origine de l’autisme……..38 2.4. Souris mutantes pour des gènes candidats de l’autisme…………………………...38 2.5. Autres pistes explorées……………………………………………………..……...38

V. LES SOURIS Fmr1 KO : MODELE POTENTIEL POUR L’AUTISME……..39 1. La souris Fmr1 KO ………………………………………………………………...39 2. Données phénotypiques concernant les traits autistiques……………………...... 40

VI. OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THESE…………………………………...... 44

Chapitre II : Matériel et méthodes générales

I. ANIMAUX………………………………………………………………………...... 47 1. Souches utilisées…………………………………………………………………….47 1.1. C57BL/6J………………………………………………………………………...... 47 1.2. FVB.129P2-Fmr1 tm1Cgr/ J…………………………………………………………...47 2. Elevage………………………………………………………………………………48 2.1. Types de croisements………………………………………………………………48 2.2. Gestion de l’élevage…………………………………………………...………...... 48 2.3. Schéma expérimental ……………………………………………………………...49 2.4. Génotypage………………………………………………………………………...51

II. STATISTIQUES…………………………………………………………………...53

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Chapitre III : Résultats expérimentaux de l’étude comportementale

I. TRAITS AUTISTIQUES PRINCIPAUX…………………………………………55 1. Interactions sociales : Test de Crawley……………………………………………55 1.1. Principe…………………………………………………………………………….55 1.2. Matériel et méthodes………………………………………………………………55 1.3. Résultats……………………………………………………………………………56 1.4. Conclusion intermédiaire………………………………………………………...... 61 2. Communication sociale : Vocalisations ultrasoniques chez le souriceau isolé….62 2.1. Principe…………………………………………………………………………….62 2.2. Matériel et méthodes………………………………………………………………63 2.2.1. Spécificité de la gestion de l’élevage…………………………………………63 2.2.2. Enregistrement des vocalises……………………………………………….....63 2.3. Traitement des données et analyse………………………………………………...64 2.4. Résultats……………………………………………………………………………66 2.5. Conclusion intermédiaire………………………………………………………...... 71 3. Intérêts restreints, rigidité cognitive et stéréotypies : Labyrinthe en T………...72 3.1. Principe…………………………………………………………………………….72 3.2. Matériel et méthodes………………………………………………………………72 3.3. Résultats……………………………………………………………………………74 3.4. Conclusion intermédiaire………………………………………………………...... 75

II. TRAITS AUTISTIQUES VARIABLES………………………………………….77 1. Agressivité : test de résident-intrus…………………………………………...…...77 1.1. Principe………………………………………………………………………...…..77 1.2. Matériel et méthodes………………………………………………………...…….77 1.3. Résultats……………………………………………………………………………78 1.4. Conclusion intermédiaire……………………………………………………...…...79 2. Activité, rythme circadien et stéréotypies : Cages d’actimétrie……………...….80 2.1. Principe………………………………………………………………………….....80 2.2. Matériel et méthodes………………………………………………………………80 2.3. Résultats……………………………………………………………………………81 2.4. Conclusion intermédiaire………………………………………………………...... 85

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3. Apprentissage : labyrinthe radial…………………………………………………86 3.1. Principe…………………………………………………………………….……....86 3.2. Matériel et méthodes…………………………………………………..…………..86 3.3. Résultats………………………………………………………………...………….88 3.4. Conclusion intermédiaire………………………………………………...………...95

Chapitre IV : Etude histologique de l’hippocampe chez la souris Fmr1 KO

I. INTRODUCTION……………………………………………………...…….…...... 97

II. MATERIEL ET METHODES……………………………………...……….……97 1. Histologie………………………………………………………………....…….…...97 1.1. Perfusion………………………………………………………………....…….…..97 1.2. Préparation des sections……………………………………………….……….…..98 1.3. Coloration………………………………………………………………..…...……98 2. Morphométrie……………………………………………………………..…...…...98 2.1. Sélection des coupes………………………………………………………..…...... 98 2.2. Estimation de la taille des fibres moussues…………………………………..……98 3. Analyse statistique……………………………………………………..……..….....99

III. RESULTATS………………………….………………………………..…..……..99 IV. CONCLUSION…………………………………………………………..…..…..100

Chapitre V : Discussion générale et conclusion………103

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Chapitre VI : Références bibliographiques, annexes et abréviations

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES LISTE DES FIGURES ABREVIATIONS ANNEXES Tableau diagnostic de l’autisme du DSM-IV TR Tableaux de l’analyse statistique de l’expérience de vocalisations ultrasoniques chez les souriceaux isolés

Revue d’articles: Fmr1 KO Mice As a Possible Model of Autistic Features

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8 Introduction générale

Introduction générale

I. PROBLEMATIQUE Le X fragile est un trouble d’origine monogénique gonosomale qui touche un garçon sur 4000 et une fille sur 6000 dans la population générale (De Vries et al. , 1997). Le gène impliqué, Fmr1 , est muté et mis en silence, ce qui résulte en un phénotype caractérisé par un retard mental moyen à sévère ainsi que de nombreux autres symptômes. Le diagnostic complet d’autisme est posé sur environ 15 à 25% de la population X fragile, mais 50 à 90% présente également des traits autistiques (Hatton et al. , 2006, Rogers et al. , 2001). L’autisme est un trouble envahissant du comportement défini sur une triade de critères comportementaux qui apparaît dès les premières années de la vie d’un enfant. L’étiologie de ce trouble est mal connue, notamment en raison de la variabilité de son expression et le manque de modèles animaux pour l’étudier. L’autisme et le X fragile ont de nombreux symptômes en commun comme le retard développemental et la perturbation cognitive, une incidence accrue d’épilepsie juvénile, une coordination motrice réduite, de l’anxiété et des fonctions gastro-intestinales perturbées. Une souris Knock-Out (KO) pour le gène Fmr1 a été créée en 1994 afin de modéliser le syndrome du X fragile (The Dutch-Belgian Fragile X Consortium, 1994). Les tests biochimiques, neuroanatomiques et comportementaux montrent des similarités encourageantes avec les caractéristiques observées chez l’humain (Markham et al. , 2006, Mckinney et al. , 2005, The Dutch-Belgian Fragile X Consortium, 1994). Jusqu’à présent peu de données existent sur des tests spécifiques des traits autistiques (Mcnaughton et al. , 2008, Mineur et al. , 2006, Spencer et al. , 2005). Le travail présenté ci-après vise à développer des tests spécifiques des traits autistiques concernant les symptômes diagnostics (interactions sociales, communication, rigidité cognitive) ainsi que les symptômes variables de l’autisme (retard mental, hyperactivité, agressivité) et à évaluer les souris Fmr1 KO pour ces caractéristiques afin de vérifier si elles peuvent aussi servir comme modèle de l’autisme. Nonobstant une origine monogénique, les manifestations du X fragile sont variables et il apparaît qu’une part de cette variabilité est due à l’interaction de la mutation avec le reste du génome (fond génétique). Les effets de la mutation Fmr1 KO ont principalement été étudiés chez la lignée de souris la plus populaire en comportement C57BL/6, mais quelques études réalisées chez des souris Fmr1 KO de lignée FVB/N ou chez des hybrides F 1 de ces deux lignées indiquent que la mutation

9 Introduction générale pourrait induire des effets différents, voire opposés en fonction de leur arrière-fond génétique (Bernardet & Crusio, 2006, Dobkin et al. , 2000). Nous nous sommes intéressés à l’étude de l’interaction de la mutation avec le fond génétique dans la perspective de choisir le modèle souris le plus pertinent, d’avoir une première approche des effets paternels et maternels, et d’une intégration ultérieure des interactions moléculaires aux comportements observés.

II. LE TROUBLE AUTISTIQUE 1. Les troubles du spectre autistique Le terme « troubles du spectre autistique » est utilisé pour désigner l’ensemble des troubles envahissants du développement (TED) de la terminologie de la classification internationale des maladies, 10 ième révision (CIM-10, Organization, 2006) et du manuel diagnostic et statistique des troubles mentaux de l’association de psychiatrie américaine, 4 ième édition révisée (DSM-IV TR, American Psychiatric Association, 2000). Le terme de « spectre autistique » traduit le continuum de sévérité des troubles développementaux des fonctions cérébrales des TED dont fait partie l’autisme et qui a progressivement remplacé le concept initial du trouble unitaire « autisme infantile » décrit par Kanner (1943). Avec l’exception du trouble désintégratif, les troubles du spectre autistique sont présents – mais pas toujours dépistés – avant l’âge de trois ans. Ces troubles sont caractérisés par une altération envahissante de plusieurs secteurs du développement – capacités d’interactions sociales réciproques, capacités de communication – ou par la présence de comportements, d’intérêts stéréotypés. Le CIM-10 et le DSM-IV TR définissent cinq sous-types de TED : le trouble autistique, le syndrome d’Asperger, le TED non spécifié, le trouble désintégratif et le syndrome de Rett. Le trouble autistique fait référence à l’autisme classique décrit par Kanner qui sera détaillé dans le chapitre suivant. Le syndrome d’Asperger est un autisme sans retard mental et sans retard dans le développement du langage. Le trouble envahissant du développement non défini, également appelé « autisme atypique » est généralement un autisme modéré qui ne rencontre pas tous les critères de l’autisme au sens strict. Le trouble désintégratif est un autisme sévère acquit entre 2 et 10 ans après un développement précoce normal du langage, de la sociabilité et de la cognition. Le syndrome de Rett est un déficit génétique spécifique lié à l’X et fortement associé à des

10 Introduction générale mutations du gène MeCP2 dans lequel on observe également une régression après quelques mois de développement normal (Amir et al. , 1999, Caballero & Hendrich, 2005, Zoghbi, 2005). La prévalence de tous ces troubles confondus est de l’ordre de 2-6 pour 1000 (Chakrabarti & Fombonne, 2001, Fombonne, 2005, Williams et al. , 2006).

2. Historique et définition de l’autisme 2.1. Généralités Dans un long article détaillé de 1943, Leo Kanner, psychiatre américain, décrit le cas de onze enfants, huit garçons et trois filles, présentant des « altérations autistiques du contact affectif » (Kanner, 1943). Ces enfants présentent un tableau variable dans les étapes de leur développement, des différences individuelles dans le degré de leurs altérations cognitives et comportementales et la manifestation de caractéristiques spécifiques propres. Ils présentent aussi des caractéristiques communes essentielles qui constituent la base du syndrome autistique, en premier lieu l’incapacité « à se positionner par rapport aux gens et aux situations ordinaires dès le début de la vie ». Ces enfants sont décrits par les parents comme « auto-suffisants », étant « comme dans une coquille », agissant comme si les personnes n’étaient pas là. Ces enfants présentent également tous des traits obsessifs, des stéréotypies et de l’écholalie immédiate ou différée au moins jusque 5-6 ans. En 1944, Hans Asperger, psychiatre autrichien décrit de manière indépendante d’autres cas de garçons présentant un trouble autistique affectif sans retard mental (Asperger, 1944). Le terme « autistique », du grec « αύτος », « soi-même », initialement forgé par Eugène Bleuler pour décrire la perte de contact avec la réalité observée dans la schizophrénie, est repris de manière indépendante par les deux auteurs. Depuis ces descriptions et bien que des avancées dans la compréhension de ce trouble aient été faites, il n’a toujours pas été trouvé de marqueur biologique de l’autisme. La prévalence du trouble autistique est 4 à 5 fois plus élevée chez les garçons que chez les filles (Kanner, 1943, Tsai, 1999). La fréquence moyenne du trouble autistique dans les études épidémiologiques est de 5 cas pour 10 000. La fréquence rapportée varie de 2 à 20 cas pour 10 000 individus (Baird et al. , 2000, Bertrand et al. , 2001, Chakrabarti & Fombonne, 2001, Chakrabarti & Fombonne, 2005, Fombonne, 2003, Yeargin-Allsopp et al. , 2003). Cette variation pourrait provenir de différences méthodologiques. Une augmentation de la prévalence est également rapportée depuis plusieurs années, qui peut être expliquée par l’inclusion de critères plus larges dans la

11 Introduction générale définition du trouble et l’attention renforcée du corps médical (Fombonne, 2003). Il existe un risque accru de trouble autistique dans la fratrie des sujets atteints du trouble, 5% des frères et sœurs environ présentant aussi la pathologie. Il semble également exister un risque de difficultés développementales variées parmi les frères et sœurs des probands* (Muhle et al. , 2004).

2.2. Diagnostic de l’autisme L’autisme se manifeste avant l’âge de trois ans. Par définition si une période de développement normal a existé, elle n’a pu excéder l’âge de trois ans. Les manifestations du trouble varient beaucoup selon le stade de développement et l’âge chronologique du sujet. C’est un désordre polymorphe à spectre large. Le diagnostic de trouble autistique est posé lorsque les trois critères diagnostics sont rencontrés dans les conditions posées (voir le tableau diagnostic de l’autisme en annexe), avec un âge d’apparition comme décrit précédemment et lorsque la perturbation n’est pas mieux expliquée par le diagnostic du syndrome de Rett ni par celui de trouble désintégratif de l’enfance.

2.2.1 Caractéristiques diagnostiques Les caractéristiques essentielles du trouble de l’autisme sont un développement nettement anormal ou déficient de l’interaction sociale et de la communication, et un répertoire considérablement restreint d’activités et d’intérêts (American Psychiatric Association, 2000 ; Kanner, 1943). L’altération des interactions sociales réciproques est sévère et durable. Il peut exister une altération marquée de l’utilisation de multiples comportements non verbaux habituellement destinés à gérer l’interaction sociale et la communication. Il peut exister une incapacité à établir des relations avec les pairs correspondants au niveau du développement du sujet. Les sujets les plus jeunes peuvent montrer peu ou pas d’intérêt pour les relations d’amitié, les plus âgés peuvent s’y intéresser mais se montrer incapable de comprendre les conventions sociales. On peut observer l’absence de la tendance spontanée qu’ont les enfants à partager leurs plaisirs, leurs intérêts ou leurs réussites avec d’autres personnes. Il peut y avoir un manque de réciprocité sociale ou émotionnelle.

* proband : le premier patient à partir duquel on fait une étude familiale

12 Introduction générale

Souvent la perception qu’a l’enfant des autres personnes est très altérée. Les sujets atteints de trouble autistique peuvent ignorer les autres enfants, n’avoir aucune notion des besoins d’autrui ou ne pas remarquer la détresse d’une autre personne. La communication est, elle aussi, altérée de façon marquée et durable. Elle affecte à la fois les capacités verbales et les capacités non verbales. Il peut y avoir retard ou absence totale de développement du langage parlé. Dans les cas où le langage se développe, le timbre, l’intonation, la vitesse, le rythme ou la charge émotionnelle de celui-ci peuvent être anormaux. Les structures grammaticales sont souvent immatures, le langage est utilisé de manière stéréotypée et répétitive ou bien le langage est idiosyncrasique (ne prend sens que pour les personnes habituées au style de communication du sujet). La compréhension du langage est souvent très tardive et l’individu peut être incapable de comprendre des questions ou des directives simples. Une perturbation dans la pragmatique du langage se traduit souvent par l’incapacité à coordonner la parole avec la gestuelle ou à comprendre l’humour ou les aspects non littéraux du discours comme l’ironie ou le sous-entendu. On peut observer une altération marquée de la capacité à engager ou soutenir une conversation avec autrui. Le jeu d’imagination est souvent absent ou notablement altéré. Les jeux d’imitation spontanée ou les gestes ritualisés propres à la petite enfance et à l’enfance manquent souvent, ou bien ils surviennent hors de propos et de façon mécanique. Il se peut également que l’enfant soit incapable de jouer à « faire semblant », spontanément et à propos de tout, ou incapable d’un jeu d’imitation sociale approprié à son niveau de développement. Les sujets atteints de troubles autistiques ont des modes de comportements, d’intérêts et d’activité restreints, répétitifs et stéréotypés. Ils peuvent avoir une préoccupation exclusive circonscrite à un ou plusieurs centres d’intérêt stéréotypés restreints, préoccupation anormale soit dans son intensité, soit dans son orientation. Ils peuvent présenter une adhésion apparemment inflexible à des habitudes ou à des rituels spécifiques et non fonctionnels. Ils peuvent insister pour que les choses restent toujours pareilles et manifester une résistance ou une détresse extrême face à des changements sans importance. Des maniérismes moteurs stéréotypés répétitifs peuvent concerner les mains (battement des mains, tapotement) ou le corps entier (balancements, plongeons, oscillations). On peut observer des postures anormales (démarche sur la pointe des pieds, mouvements des mains ou postures corporelles bizarres). Les sujets atteints de troubles autistiques peuvent avoir des préoccupations persistantes pour des

13 Introduction générale objets bien précis ou pour certaines parties du corps. Ils peuvent aussi être fascinés par le mouvement et peuvent être excessivement attachés à des objets inanimés.

2.2.2. Caractéristiques variables et troubles associés Additionnellement à ces critères diagnostics, d’autres symptômes comportementaux et/ou psychiatriques d’occurrence plus variable sont relevés. Dans deux tiers des cas il existe un diagnostic associé de retard mental, qui peut aller du retard mental léger au retard mental profond (Bryson & Smith, 1998, Fombonne, 2003). Il faut prendre cette proportion en gardant à l’esprit d’une part, que le syndrome d’Asperger est défini en partie par un QI>70 (la définition du retard mental, CIM-10) et d’autre part, que le QI mesuré chez les autistes est souvent supérieur aux capacités pratiques, en général testées à l’aide de l’échelle de comportements adaptatifs de Vineland (Gould, 1977). Les autistes sans retard mental sont aussi référés comme autistes de « haut fonctionnement». Par ailleurs il est à noter que le ratio typique garçons : filles de 4 :1 rapporté dans l’autisme approche 2 :1 chez les personnes avec retard mental sévère (Bryson & Smith, 1998). Des anomalies dans le développement des capacités cognitives peuvent être observées. Le profil des capacités cognitives est habituellement hétérogène quel que soit le niveau général d’intelligence, les capacités verbales étant typiquement plus faibles que les capacités non-verbales. Parfois, des capacités particulières sont présentes (par exemple, surlexie précoce, calcul du calendrier, …). Ainsi l’estimation du vocabulaire (réceptif ou expressif) par simples mots n’est pas toujours une bonne estimation du niveau de langage car les compétences langagières réelles peuvent se situer à un niveau bien plus bas. Les sujets atteints de troubles autistiques peuvent également présenter une variété de symptômes comportementaux tel que l’anxiété, de l’hyperactivité, un déficit attentionnel, impulsivité, agressivité, des préoccupations morbides ou inhabituelles, comportements d’automutilation et surtout chez les plus jeunes, crises de colère. Les réponses aux stimuli sensoriels peuvent être étranges (par exemple : seuil élevé à la douleur, hypersensibilité au bruit et au contact physique, réactions démesurées à des lumières ou des odeurs, fascination pour certains stimuli). On peut observer des anomalies du comportement alimentaire (par exemple, restriction de l’alimentation à quelques aliments seulement) ou des troubles du sommeil (par exemple, fréquents réveils nocturnes suivis de balancements). Des perturbations de l’humeur ou de l’affect sont fréquentes (par exemple : crises de larmes ou de crises de rire

14 Introduction générale inexpliquées, absence apparente de réactions émotionnelles). L’enfant peut n’avoir aucune réaction de peur face à des dangers réels, mais une peur excessive face à des objets inanimés. On peut observer toute une variété de comportements d’automutilation. A l’adolescence ou au début de l’âge adulte, les personnes autistiques qui ont gardé des capacités de prises de conscience, peuvent présenter des réactions dépressives en réalisant la gravité de leur handicap. Un taux d’épilepsie relativement haut est observé (8-30%), particulièrement avant l’âge de 5 ans ou à l’adolescence. Le risque est lié à la sévérité de la dysfonction sous-jacente du cerveau (Fombonne, 2003, Tuchman & Rapin, 2002).

Fonctions optimisées chez les autistes Bien que l’autisme soit principalement caractérisé par ses déficits à cause de l’asociabilité et de la perte d’autonomie des sujets affectés, c’est un trouble qui suscite beaucoup d’intérêt notamment en raison des capacités prodigieuses de certains sujets. Le syndrome savant se définit par la présence d’habilités spéciales chez des personnes atteintes d’un trouble du développement tel que l’autisme ou le retard intellectuel. Ces habiletés sont supérieures à la norme et supérieures aux autres domaines de fonctionnement de l’individu et celles qui sont le plus souvent mentionnées dans la littérature concernent le calcul du calendrier, la mémoire, la musique, l’art, les habiletés arithmétiques, l’identification des nombres premiers, des talents mécaniques et linguistiques (Heaton et Wallace, 2004). La prévalence dans la population générale est de 0,06% (Hill, 1977) mais de près de 10% dans la population autiste et inversement, près de 50% des « idiots savants » sont autistes (Treffert,1999). Cependant il apparaît que certaines fonctions sont optimisées chez les autistes en général, notamment au niveau de la perception locale, ainsi que des performances améliorées dans les modalités visuelles et auditives dans différentes tâches cognitives « de bas niveau » (Mottron et al. , 2006).

2.2.3. Evolution Le trouble apparait dès l’âge de trois ans. Dans certains cas les parents voient des prémisses dès la naissance du fait du manque d’intérêt pour les interactions sociales. Les manifestations du trouble se remarquent plus facilement après l’âge de deux ans. Dans une minorité de cas les parents décrivent un développement normal pendant la toute première année, voire les deux premières années de la vie. L’évolution

15 Introduction générale du trouble autistique est continue. Les enfants d’âge scolaire et les adolescents font souvent des acquisitions dans certains domaines du développement (par exemple, à l’âge scolaire l’enfant commence à s’intéresser à la vie sociale). A l’adolescence, certains présentent une détérioration de leur comportement, tandis que d’autres s’améliorent. Cette régression/aggravation, évidente chez environ 30% de la population autiste est notamment associée avec l’apparition de convulsions. Les capacités de langage et le niveau intellectuel global sont des facteurs prépondérants dans la compensation des altérations comportementales. Les symptômes cliniques peuvent varier à différents âges (Bryson & Smith, 1998). Dans la petite enfance l’hyperactivité, les comportements stéréotypiques, l’irritabilité et les crises de colère peuvent être importants tandis que les tics comportementaux, l’agressivité et les comportements d’auto-mutilation le seront plus tard dans l’enfance. Lors de l’adolescence et à l’âge adulte, particulièrement chez les individus de haut fonctionnement, de la dépression et des troubles obsessifs-compulsifs peuvent se développer (Tsai, 1999). La revue épidémiologique de Bryson et Smith de 1998 brosse un tableau assez pessimiste du devenir des personnes autistes « Les études de suivi suggèrent que seul un faible pourcentage des sujets devient des adultes qui vivent et travaillent de manière autonome. Un certain degré d’autonomie partielle est possible dans environ un tiers des cas. L’amélioration de la détection, de la prise en charge précoce, l’amélioration du suivi psycho-éducatif et des services sociaux optimisent ces perspectives ». Effectivement, l’autisme est de mieux en mieux dépisté et de manière plus précoce. La revue sur l’intervention comportementale précoce de Geraldine Dawson parue cette année donne un indice sur les progrès réalisés depuis: « il y a dix ans, 50% des enfants diagnostiqués acquerraient un langage parlé, actuellement 75 à 95% des enfants pris en charge précocement développent un langage effectif avant l’âge de 5 ans » (Dawson, 2008).

3. Biologie de l’autisme A la fin de l’article de 1943, Kanner émet la remarque que, parmi les parents des autistes dont les cas sont relatés, certains traits communs se détachent, notamment peu sont vraiment chaleureux et dans les familles de ces enfants on retrouve beaucoup d’obsessions. Kanner relève que beaucoup de parents ont fourni des descriptions très détaillées du comportement de leur enfant et de son apprentissage. Il s’interroge sur la signification de cette méticulosité. Cette notion de parents peu

16 Introduction générale chaleureux a été reprise et développée dans la théorie des « mères réfrigérateurs » dans les années 50 par le psychanalyste Bruno Bettelheim qui refusait de prêter une origine organique à l’autisme et dont les idées ont fait école pour de nombreux psychiatres (Bettelheim, 1950, 1967). Pourtant les observations dès les années 60 d’une incidence accrue d’épilepsie dans l’autisme remettaient en question la validité de cette théorie (White et al. , 1964) et ont orienté la recherche sur des bases physiologiques à l’autisme. Les études épidémiologiques, psychiatriques, les données de la psychologie expérimentale, les autopsies, l’imagerie fonctionnelle à résonance magnétique ont depuis contribué à la compréhension de l’étiologie et des altérations neurophysiologiques de l’autisme. Même si les mécanismes ne sont pas encore percés, ces données ont indubitablement permis d’établir que l’autisme avait des sous-jacents biologiques et qu’il ne pouvait être résumé à une réaction de l’enfant à une supposée froideur de la mère.

3.1. Neuroanatomie Les études post-mortem ont permis l’observation d’altérations dans de nombreuses structures du cerveau, cependant ces observations n’ont pas toujours répliquées (voir Bauman & Kemper, 2005 pour revue). Au niveau du système limbique, l’hippocampe, l’amygdale, le cortex enthorinal, le subiculum, les corps mamillaires, le cortex cingulaire antérieur et le septum présentent des cellules de petite taille et en densité accrue à tous les âges étudiés, une observation en accord avec un développement plus court. L’analyse Golgi des neurones pyramidaux du CA1 et CA4 de l’hippocampe montrent une complexité et une étendue diminuée des ramifications dendritiques dans ces cellules (Raymond et al. , 1996). Au niveau du cervelet, la diminution dans le nombre de cellules de Purkinje a été observée de manière constante, particulièrement dans les régions de l’hémisphère postérieur inférieur du cervelet (Arin, Bauman & Kemper, 1991; Bailey et al. , 1998; Bauman & Kemper, 1996; Ritvo, Freeman & Scheibel, 1986). Il a également été observé un corps calleux réduit chez les autistes (Egaas, Courchesne & Saitoh, 1995; Hardan, Minshew & Keshavan, 2000). Une étude d’imagerie par résonance magnétique (IRM) conduite par l’équipe de Piven (Sears et al., 1999) a trouvé des noyaux caudés de volume supérieur à celui des contrôles, ainsi qu’un cortex globalement plus volumineux également. Siegel Jr. et ses collègues ont détecté lors d’une étude d’IRM fonctionnelle une réduction du

17 Introduction générale métabolisme du glucose au niveau du putamen postérieur gauche (Siegel Jr. et al., 1992). Des altérations en fonction de l’âge sont également observées : le changement observé dans le limbe vertical de la bande diagonale de Broca, les noyaux cérébelleux et les olives inférieures est de nature différente chez les sujets autistes jeunes, avec des neurones anormalement grands en grande quantité, tandis que chez les sujets autistes adultes ces neurones sont petits, pales et réduits en nombre (Bailey et al. , 1998, Bauman & Kemper, 2005a, Bauman & Kemper, 2005b). Les évènements résultants dans le nombre réduit de cellules de Purkinje pourraient avoir lieu avant que les connections entre les fibres des neurones de l’olive inférieure et les cellules de Purkinje soient formées et pourraient rendre compte d’une cause prénatale possible de l’autisme (Bauman & Kemper, 2005a). Il a été observé une augmentation du volume du cerveau des enfants avec autisme par rapport aux enfants contrôles d’âge correspondant, tandis que les cerveaux d’adultes autistes ont tendance à être plus légers que les contrôles (Bauman & Kemper, 1997; Courchesne, Carper & Akshoomoff, 2003; Hazlett et al. , 2005). L’apparition clinique de l’autisme semble être précédée de deux phases anormales de croissance : une taille de la tête réduite à la naissance puis une augmentation soudaine et excessive entre 1-2 mois et 6-14 mois (Courchesne, 2004). Plusieurs hypothèses ont été formulées telles que l’augmentation de la neurogenèse, la diminution de l’apoptose neuronale, l’accroissement de la production de cellules gliales, un élagage synaptique diminué, des anomalies de la myéline, mais aucune preuve pathologique tangible n’a encore étayé l’une de ces hypothèses. Les anomalies observées ont conduit à plusieurs hypothèses tentant d’expliquer les déficits observés dans l’autisme de manière intégrée. Les études récentes font valoir de manière générale que c’est plus le déroulement du développement qui est perturbé dans l’autisme que son produit final (Amaral et al. , 2008). L’hypothèse imputant la cause de l’autisme aux dysfonctions de l’amygdale est remise en question notamment par les études lésionnelles sur les primates (Amaral, Bauman & Schumann, 2003; Baron-Cohen et al. , 2000). D’autres hypothèses impliquent le circuit orbito- fronto-amygdale (Bachevalier & Loveland, 2006) ainsi que le système fronto-striatal et le cervelet (Nayate et al. , 2005). Le sulcus temporal supérieur (STS) joue un rôle important dans la communication sociale, or il a été trouvé un déficit morphologique et métabolique de ce dernier chez les enfants autistes (Materna et al. , 2008, Zilbovicius et al. , 2006). Par exemple, cette zone est activée de manière différentielle par des sons et

18 Introduction générale par la voix humaine, ce qui n’est pas le cas chez les autistes testés ( figure 1 , Gervais et al. , 2004). Le déficit d’attribution d’états mentaux aux autres et d’imitation spontanée que l’on observe chez les autistes met potentiellement en jeu le système miroir. Le gyrus frontal inférieur, le lobule inférieur pariétal et le STS activés chez les sujets contrôles lorsqu’un tiers fait un mouvement ou une mimique particulière, sont Figure 1: Illustration d’altération fonctionnelle dans l’autisme: localisation des anatomiquement altérés et présentent un pics d’activation du contraste voix/non-voix en imagerie fonctionnelle chez des personnes retard ou une absence d’activation chez les neuro-typiques et chez des autistes. Source: personnes autistes (Dapretto et al. , 2006; Gervais et al., 2004 Iacoboni et al. , 2005). D’un autre côté, s’il existe un déficit d’imitation spontanée, plusieurs expériences mettent en évidence qu’il y a tout de même imitation chez les autistes (Escalona, Field, Nadel & Lundy, 2002; Hamilton, Brindley & Frith, 2007). Les études d’imagerie fonctionnelle font état d’une hypo-connectivité fonctionnelle et anatomique corrélé avec la sévérité des symptômes (Just et al. , 2007, Kleinhans et al. , 2008).

3.2. Psychopharmacologie La plupart des études dans ce domaine passées en revue par Tsai dans son article de 1999 sont préliminaires et à relativiser par les limites inhérentes aux études neurochimiques de techniques et outils de mesure, d’échantillonnage des sujets, etc, mais elles suggèrent cependant un rôle important des facteurs neurochimiques dans la physiopathologie de l’autisme. Plusieurs études rapportent une hypersérotoninémie chez un tiers des personnes autistes. Todd et Ciaranello ont trouvé un anticorps circulant anti-sérotonine dans le sang et le liquide spinal d’un tiers des autistes de leur étude (Todd & Ciaranello, 1985). La fenfluramine est un agoniste indirect des récepteurs à la sérotonine dont l’utilisation semblait améliorer le QI des autistes traités avec. Son efficacité est depuis controversée. Les traitements les plus étudiés et qui semblent avoir une bonne réponse sont différents types d’inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine, inhibiteurs non sélectifs de la recapture de la sérotonine, agoniste partiel du récepteur 5-HT1A. Ils sont utilisés pour rectifier les stéréotypies, l’hyperactivité,

19 Introduction générale l’agression, les obsessions, la dépression. Le système dopaminergique est également impliqué, les antipsychotiques améliorants les symptômes stéréotypiques, agressifs, colériques et auto-agressifs, d’hyperactivité, ainsi que la coordination motrice, l’activité exploratoire, les relations affectives et les absences, surtout chez les enfants moyens (Locascio et al. , 1991). Les stimulants type amphétamines et méthylphénydate qui inhibent la recapture de la dopamine comme effet principal et sont utilisés dans le trouble attentionnel peuvent aggraver les symptômes améliorés par les antypsychotiques mais peuvent être efficaces chez les autistes avec un trouble attentionnel. D’autres pistes sont également étudiées concernant un taux diminué d’adrénaline et de noradrénaline, l’utilisation de bêta-bloquants, les neuropeptides, différentes sortes de vitamines mais les résultats sont encore parcellaires. Des études plus récentes explorent l’efficacité d’agents glutamatergique comme la mémantine qui possède des propriétés d’antagoniste des récepteurs NMDA (King & Bostic, 2006).

Parallèlement à la recherche sur l’origine des dysfonctions systémiques impliquées dans l’autisme, les recherches tentent d’en trouver la cause.

4. Thérapie La thérapie est principalement symptomatologique. Les praticiens insistent sur l’importance du dépistage précoce de l’autisme afin de prendre l’enfant en charge le plus tôt (Dawson, 2008). Les types de traitements varient en fonction des pays mais tous actuellement visent à encadrer l’enfant et accompagner l’enfant et la famille, à stimuler l’enfant le plus possible pour développer ses capacités. Les traitements comprennent des ateliers qui stimulent les sens par le contact avec les animaux, les instruments de musique, des logiciels adaptés aux enfants autistes, des ateliers d'éveil, des séances avec des psychomotriciens (observations à l’occasion d’un stage de suivi d’enfants autistiques sous la direction du Dr Schild en 2006 à l’hôpital de jour pour enfants, 31270 Cugnaux). La thérapie comportementale continue d’évoluer, notamment certains types de traitements sont sujets à controverse comme par exemple les enveloppements avec une serviette ou des habits mouillés pratiqués en France qui stimulent également les récepteurs sensoriels (Delion, 1998, Rhode, 2008, Spinney, 2008). Les ateliers amènent l’enfant à réaliser l’action qu’il a par sa personne et ses gestes sur les choses, les organismes vivants et les gens. Les enfants travaillent également avec des orthophonistes la prononciation, la syntaxe, l’hyperlexie. Ils sont

20 Introduction générale pris en charge dans des classes spécialisées ou peuvent être scolarisés, avec des auxiliaires qui assistent les enseignants si besoin. La multiplicité des prises en charge et le travail accompli peuvent permettre de compenser certains déficits par des stratégies alternatives. L’insertion des autistes dans la société dépend ensuite de la tolérance de celle-ci à la différence. Les stéréotypies, l’hyperactivité, l’agressivité, l’épilepsie, la dépression, les troubles du sommeil sont traités par la pharmacopée décrite dans le chapitre précédent classiquement utilisée pour les symptômes correspondants, avec la parcimonie et les précautions dues aux connaissances limitées des effets de molécules psychoactives sur un cerveau en développement. Environ un tiers des personnes autistes prend un traitement médicamenteux ou des compléments alimentaires de type vitamines (Aman et al. , 1995, Bauman & Kemper, 2005a, King & Bostic, 2006, Tsai, 1999).

5. Etiologie Les troubles médicaux d’origine génétique suspectée ou connue rendent compte de 10-15% de la population autistique identifiée (Chakrabarti & Fombonne, 2001; Fombonne et al. , 1997; Kielinen et al. , 2004; Ritvo et al. , 1990). Ils concernent des aberrations chromosomiques : syndrome de Down, des duplications ou délétions chromosomiques comme dans le syndrome d’Angelman (Bonati et al. , 2007), des polygonosomies (47, XXY ; 47,XYY, Konstantareas & Homatidis, 1999; Lauritsen, Mors, Mortensen & Ewald, 1999; Weidmer-Mikhail, Sheldon & Ghaziuddin, 1998), mais également des maladies monogéniques : sclérose tubéreuse, neurofibromatoses, mitochondriopathie (autosomal dominants), X fragile (récessif lié à l’X, Barton & Volkmar, 1998, Cohen et al. , 2005). Concernant les troubles autistiques idiopathiques, il a été suggéré qu’ils aient une origine virale, auto-immune, tératogénique ou génétique, ces hypothèses n’étant pas exclusives les unes des autres. Bien que l’on ne connaisse pas le mécanisme par lequel ce phénomène pourrait se produire, des infections virales très tôt dans le développement que l’ont a regroupées sous l’appellation TORCH ont été mises en cause dans certains cas dans l’apparition du trouble. TORCH est l’acronyme d’origine anglaise de Toxoplasmose, Autres (Others) ̶ comprenant la syphilis, la varicelle-zoster et le parvovirus B19 ̶ Rubéole, Cytomegalovirus et Herpès (Libbey et al. , 2005). Une réaction auto-immune ̶ à ces pathogènes ou à une intoxication au mercure ̶ est également associée à l’autisme (Cohly & Panja, 2005, Geier et al. , 2008, Kalia, 2008,

21 Introduction générale

Mason-Brothers et al. , 1990, Ritvo et al. , 1990). L’utilisation de certains médicaments pendant la grossesse est également liée à une augmentation de la fréquence de l’autisme. Les anticonvulsifs, l’acide valproïque (thymostabilisant), la thalidomide (antiémétique) par exemple, ont des effets tératogènes durant les stades précoces du développement intra-utérin. Les malformations mineures fréquentes chez les sujets autistes se produisent à ces mêmes stades (Arndt et al. , 2005). L’hypothèse d’une base génétique à l’autisme est alimentée par de nombreuses enquêtes épidémiologiques, études sur les familles et les jumeaux, ainsi que des analyses de liaison (Andres, 2002, Nicolson & Szatmari, 2003, Wassink et al. , 2004). L’héritabilité des cas d’autisme de cause inconnue a été étudiée dans les familles et chez les jumeaux. Environ 5% de la fratrie des sujets autistes développent également le trouble, un taux fortement supérieur à la prévalence dans la population générale (Chakrabarti & Fombonne, 2001, Chudley et al. , 1998, Fombonne et al. , 1997, Piven & Palmer, 1999). Tandis que les jumeaux dizygotes présentent la même prévalence de 5% trouvée dans la fratrie, les jumeaux monozygotes présentent une concordance de 60 à 90% pour l’autisme (Bailey et al. , 1995, Folstein & Rutter, 1977, Ritvo et al. , 1985, Steffenburg et al. , 1989). Il faut remarquer que ces chiffres n‘impliquent pas de manière automatique que l’environnement ait très peu d’influence sur la différence phénotypique entre individus. L’étude des familles de sujets autistes a également permis de montrer que certains traits associés à l’autisme étaient plus souvent trouvés dans la parenté des autistes que celles d’enfants contrôles. Les troubles envahissants du développement en général sont plus fréquents dans les familles d’autistes, mais également l’incidence de phobie sociale, les difficultés de communication, la préférence pour les routines (Fombonne et al. , 1997, Micali et al. , 2004, Pickles et al. , 2000). Ces traits, en général plus modérés que ceux retrouvés dans l’autisme, sont qualifiés de « phénotype élargit de l’autisme » et ont contribué à orienter la recherche vers une explication polygénique de l’autisme (Folstein & Rutter, 1988). Les études de liaison génétique menées sur les sujets autistes et leur famille ont permis de trouver de nombreux loci potentiellement liés au trouble. Plus de 100 gènes candidats ont été identifiés, la plupart étant plus ou moins spécifiques d’une population donnée (Andres, 2002, Bonora et al. , 2006, Wassink et al. , 2004). Les gènes candidats identifiés incluent des gènes impliqués dans le développement ou impliqués dans le fonctionnement de la synapse. Parmi ceux mis en avant dans plusieurs études se

22 Introduction générale trouve le gène qui encode la reeline, une glycoprotéine impliquée dans la migration des neurones corticaux et hippocampiques, ainsi que la migration des cellules de Purkinje dans le cervelet (D'arcangelo et al. , 1995). Une perte progressive de cellules de Purkinje a été observée dans le cervelet des souris hétérozygotes mâles reeler tandis que les femelles étaient épargnées (Hadj-Sahraoui et al. , 1996). Plusieurs études ont montré la transmission préférentielle d’un allèle particulier du gène reelin dans les familles avec autisme, bien que ce résultat n’ait pas été retrouvé dans d’autres (Dutta et al. , 2008, Fatemi et al. , 2005, Krebs et al. , 2002, Li et al. , 2008, Li et al. , 2004, Serajee et al. , 2006). Trois gènes homéobox ont également été mis en cause: HOXA1 , HOXB1 et engrailed-2, mais les résultats ne sont pas toujours reproduits (Gharani et al. , 2004, Ingram et al. , 2000, Wang et al. , 2008). Cependant le lien a récemment été fait entre les effets tératogènes de l’acide valproïque et l’inhibition d’histones déacétylases qui régule l’expression des gènes homéobox (Menegola et al. , 2006). Il a également été montré chez le rat que l’exposition prénatale à l’acide valproïque augmentait l’expression embryonique de Hoxa1 (Stodgell et al. , 2006). Parmi les gènes candidats impliqués dans le fonctionnement des neurotransmetteurs, les gènes GABRB3 , SLC6A4/HTT ,

GluR6 et GRM8 codant respectivement pour un récepteur GABA A, un transporteur sérotoninergique, le récepteur métabotropique au glutamate de type 6 et le récepteur métabotropique au glutamate de type 8 ont été associés à l’autisme (Bartlett et al. , 2005, Conroy et al. , 2004, Cook et al. , 1997, Dutta et al. , 2007, Guhathakurta et al. , 2008, Kim et al. , 2006, Kim et al. , 2007, Li et al. , 2008, Ma et al. , 2005, Sutcliffe et al. , 2005). Une autre approche consiste à prendre en compte la grande hétérogénéité de phénotype rencontrée dans le spectre des troubles autistiques et à étudier l’étiologie du chevauchement de la triade d’altérations principale définissant les troubles autistiques (Ronald et al. , 2006). Il a été trouvé que ces traits présentaient une forte hérédité sans influence environnementale commune significative. Ils semblent soumis à des influences génétiques distinctes. La piste de l’empreinte génétique est également étudiée (Badcock & Crespi, 2006). Elle reprend dans une dimension évolutive la théorie du « cerveau mâle extrême » développée par Simon Baron-Cohen qui postule que l’autisme pourrait être l’extrémité d’un continuum dans lequel les aptitudes sociales et de systématisation sont influencée par le genre (Baron-Cohen, 2002). Il a été montré chez les humains que des gènes soumis à l’empreinte génétique exprimés dans le cerveau jouaient un rôle dans

23 Introduction générale divers traits comportementaux (Davies et al. , 2006, Davies et al. , 2001, Davies et al. , 2005). Keverne et ses collègues ont établi le rôle invasif de l’empreinte génétique dans le cerveau en montrant expérimentalement que dans le cerveau de souris chimères, les cellules qui exprimaient exclusivement des gènes paternels contribuaient au développement du système limbique (« cerveau paternel » dans la suite du texte) tandis que les cellules avec une expression génique exclusivement maternelle proliféraient dans le cortex (le « cerveau exécutif » impliqué dans le langage, la réciprocité sociale, la planification et l’inhibition comportementale, « cerveau maternel ») (Allen et al. , 1995, Keverne et al. , 1996). Les syndromes d’Angelman, de Rett et de Turner, tous trois associés à l’autisme sont liés à des défauts d’empreinte parentale de l’expression génique. Badcock et Crespi argumentent sur cette base que l’exagération ou l’altération du cerveau paternel ou du cerveau maternel expliqueraient les ratios dans les différents phénotypes d’autisme (ratio garçon-fille de 10 :1 dans Asperger, 4 :1 dans l’autisme classique, approchant de 2 :1 dans l’autisme sévère, Bryson and Smith, 1998). La recherche explore aussi les gènes impliqués dans les pathologies monogéniques associées à l’autisme car la convergence phénotypique suggère l’altération de voies neurobiologiques communes. Notamment FMR1 qui est mis en silence dans le syndrome du X fragile et code pour la FMRP ( Fragile X Mental Retardation Protein ), impliquée dans la plasticité synaptique.

III. LE SYNDROME DU X FRAGILE 1. Historique et définitions 1.1. Généralités La mutation FMR1 à l’origine du syndrome du X fragile (SXF) est la première cause de retard mental héréditaire. Un garçon sur 4000 est diagnostiqué avec ce syndrome, les filles sont également touchées mais la compensation par l’autre chromosome X fait que leurs symptômes sont en général moins sévères (Crawford et al. , 2001). Entre 10 et 30% des personnes X fragile sont diagnostiquées autistes (Brown et al. , 1982a, Figure 2: Mise en évidence du site fragile du chromosome X par Brown et al. , 1982b). Le SXF concerne 7% de la déplétion du milieu en folate

24 Introduction générale population autiste, soit la cause héritable d’autisme la plus commune (Brown et al. , 1986). La constatation dans les études épidémiologiques sur le retard mental d’une surreprésentation de garçons a conduit dans les années 70 à postuler que ces handicaps devaient être hérités d’une manière récessive liée à l’X (Crawfurd, 1982, Lehrke, 1972, Lehrke, 1974, Turner & Turner, 1974). A la fin des années 70, plusieurs articles font état d’un retard mental lié à l’X associé à un macroorchidisme et d’autres traits phénotypiques variables (Howard-Peebles & Stoddard, 1979, Opitz et al. , 1978, Sutherland, 1977, Sutherland & Ashforth, 1979, Turner et al. , 1980, Turner et al. , 1975). Le lien est fait avec un marqueur cytologique au niveau duquel on observe un site fragile proche de la pointe du bras long du chromosome X au site Xq27.3 (figure 2 , Lubs, 1969, Sutherland & Ashforth, 1979). Le gène FMR1 impliqué dans le syndrome du X fragile est identifié plus de 10 ans après (Pieretti et al. , 1991, Verheij et al. , 1995, Verkerk et al. , 1991). L’absence d’expression de FMR1 est due avec peu d’exceptions à l’expansion de la répétition d’un triplet de nucléotides CGG qui conduit à la méthylation du promoteur, à sa mise en silence et à l’inactivation du gène (Bell et al. , 1991, Verkerk et al. , 1991).

1.2. Symptômes Les symptômes physiques ne sont pas systématiques mais on retrouve souvent des caractéristiques faciales probablement dues à une dysplasie des tissus connectifs, comme un visage allongé avec un prognathisme mandibulaire et des oreilles grandes et décollées (Hagerman et al. , 1991). Sont également souvent présents de l’hyperlaxité ligamentaire, un affaissement plantaire et une dilatation de la crosse aortique (Alanay et al. , 2007). Une augmentation du volume testiculaire est souvent observée chez les garçons, particulièrement après la puberté. Les filles hétérozygotes pour le X Fragile ont un phénotype similaire aux garçons affectés, mais de manière générale les symptômes sont atténués voir absents (Freund et al. , 1993, Reiss et al. , 1993). Chez les garçons, le symptôme clinique majeur est le retard mental modéré à sévère, avec des cas de retard léger et des cas de retard très sévère. Les sujets mâles mosaïques chez qui il existe une expression de FMR1 dans une partie de leur cellules ont un QI moyen de 60, les sujets possédant la mutation complète un QI moyen de 41 (Merenstein et al. , 1996). Le retard mental est présent dans 50-75% des cas féminins (Rousseau et al. , 1991). La phobie sociale, d’autres troubles de l’anxiété et

25 Introduction générale affectifs sont les aspects cognitifs et comportementaux les plus communément associés au X fragile chez les filles (50%). Le profil comportemental des individus avec le X fragile incluent l’anxiété, l’évitement social, l’hypersensibilité aux stimuli, l’hyperexcitabilité, l’hyperactivité, l’impulsivité, l’inattention, des colères et, en particulier chez les garçons, un comportement explosif et agressif envers les autres et soi-même (Tsiouris & Brown, 2004). Très tôt, les garçons avec SXF présentent une forte aversion pour le contact social visuel (plus de 90% des enfants), une forte aversion pour le contact tactile, une sensibilité au bruit, à la diversité des goûts de la nourriture, de la persévération et de la répétition dans le discours, des battements des mains et d’autres stéréotypies (Lachiewicz et al. , 1994, Merenstein et al. , 1996, Wolff et al. , 1989). Il est possible que l’attitude défensive généralisée sur les modalités sensorielles observée chez les enfants X fragile soit secondaire aux déficits d’ajustements de l’excitation sensorielle, comme c’est également postulé dans l’autisme. Les crises épileptiques concernent entre 20 et 25% des garçons SXF et des anomalies paroxystiques sont présentes dans les électroencéphalogrammes chez 50% des garçons SXF prépubères (Musumeci et al. , 1999, Sabaratnam et al. , 2001). Des troubles du sommeil sont fréquemment associés au tableau clinique du SXF (Gould et al. , 2000). Il est intéressant de noter que les femmes avec la mutation complète du X fragile (voir chapitre suivant) et un QI normal présentent des déficits des fonctions exécutives, des difficultés dans les interactions sociales, des difficultés d’organisation, de l’impulsivité, de la timidité, des troubles de l’humeur et d’inattention (Mazzocco et al. , 1993). Le syndrome du X fragile comprend également un profil cognitif spécifique dans lequel le traitement visuospatial est altéré (Crowe & Hay, 1990, Freund & Reiss, 1991, Hinton et al. , 1995 ). Des troubles de l’attention et de l’hyperactivité sont observés chez 80% des garçons et 35% des filles X fragiles (Bailey, 2008). Les mécanismes impliqués sont encore débattus. Les différences dans les réponses électrodermales à des stimuli lors de la comparaison de sujets X fragile avec des sujets TDA/H (trouble déficitaire de l’attention/hyperactivité) suggèrent que ces caractéristiques sont dues à l’anxiété généralisée qui submergerait le système sympathique et activerait le locus cœruleus plutôt qu’à des déficits des lobes frontaux (Miller et al. , 1999). Les individus X fragile répondent cependant bien aux traitements par des stimulants, ce qui ne corrobore pas cette hypothèse (Hagerman et al. , 2002). D’un autre côté l’efficacité d’une thérapie à la clonidine (agoniste α-2 adrénergique) chez un groupe d’enfants TDA/H pointe

26 Introduction générale l’importance du système adrénergique dans la pathophysiologie de ce trouble (Hunt et al. , 1985). Etant donné que de nombreux symptômes chevauchent entre l’autisme et le SXF et qu’une forte proportion de personnes SXF est diagnostiquée autiste, des chercheurs se sont intéressés à la spécificité des traits autistiques manifestés chez les SXF. Les symptômes liés à l’anxiété comme l’évitement du regard sont communs mais sont également beaucoup observés dans le X fragile des intérêts sociaux, la perception des émotions des autres et l’attachement aux parents (Cohen et al. , 1991). Les enfants avec autisme comparés à des enfants de QI correspondant non-autistes montrent un déficit significatif dans la reconnaissance des expressions faciales et émotionnelles (Davies et al. , 1994, Hobson, 1986). Turk et Cornish ont trouvé que malgré leur profil d’altérations sociales, communicationnelles et rituelles, les garçons X fragile reconnaissaient parfaitement les expressions faciales et émotionnelles (Turk & Cornish, 1998). Une autre étude plus récente suggère que la reconnaissance des émotions est corrélée au niveau général de développement (Wishart et al. , 2007). Cependant aucune étude convaincante n’a encore été réalisée sur des garçons X fragiles diagnostiqués autistes. Il n’y a pas de données psychopharmacologiques particulières sur le SXF. Les traitements pharmacologiques sont les traitements classiques utilisés en réponse à des symptômes particuliers et ne sont pas généralisés chez toutes les personnes affectées (Tsiouris & Brown, 2004). Les thérapies comportementales, l’encadrement, la stimulation des personnes sont les moyens privilégiés d’accompagnement du SXF. Néanmoins les recherches sur la fonction de la protéine FMRP et les modèles animaux suggèrent de nouvelles pistes thérapeutiques par l’utilisation d’antagonistes des récepteurs métabotropiques glutamatergiques de groupe 1 ou l’inhibition de la kinase activée par p21 qui restent à explorer (Bear, 2005, Hayashi et al. , 2007).

1.3. Etiologie, mode de transmission La base moléculaire de cette maladie est donc une expansion de triplets CGG, dans la région 5’ non traduite du gène FMR1 (Fu et al., Oberle et al. , 1991, Verkerk et al. , 1991, Yu et al. ). Dans la population normale la répétition CGG est polymorphique, de l’ordre de 6 à 53 (Fu et al., 1991). Les porteurs sains hommes et femmes de la prémutation possèdent une répétition de triplets CGG de 43 à 200 unités.

27 Introduction générale

L’association a été faite depuis quelques années de l’allèle prémuté du site du X fragile avec des symptômes neurodégénératifs de parkinsonisme (tremblements), des troubles des fonctions exécutives (ataxie cérébelleuse), de la démence et une ménopause précoce chez les femmes (Berry-Kravis et al. , 2007, Hagerman et al. , 2005). Ces symptômes sont vraisemblablement dus à une augmentation de l’expression de FMR1 . La mutation complète est caractérisée par la présence de plus de 200 CGGs. Le résultat de cette amplification est la méthylation du promoteur de FMR1 et des répétitions elles-mêmes, conduisant à la mise en silence de l’expression de FMR1 (Pieretti et al. , 1991, Verheij et al. , 1995). Les résultats de Bell et ses collègues sur l’hyperméthylation et l’expression clinique du SXF a confirmé l’hypothèse émise par Laird sur l’empreinte parentale à ce locus et est en accord avec un processus en deux étapes de l’expression du syndrome (Bell et al. , 1991, Laird, 1987). Laird suggérait qu’un homme porteur sain possédant un chromosome X prémuté le transmettait à ses filles phénotypiquement normales. Durant l’oogenèse précoce, lorsque les deux chromosomes X sont réactivés, le chromosome X d’origine paternelle ne peut pas réactiver la région du site du X fragile. Ce chromosome X inactivé localement par la méthylation grand-paternelle est hérité par le fils affecté qui présente une méthylation complète à ce site. Le schéma n’est pas toujours aussi simple comme le montre l’exemple d’un homme de phénotype normal possédant la mutation méthylée. La fille de cet homme n’exprime pas le X fragile mais son fils affecté par le SXF l’exprime dans 26% de ses cellules (Bell et al. , 1991). Les mécanismes d’expansion des triplets CGG, le moment auquel ces évènements ont lieu et l’occurrence de la méthylation du gène FMR1 restent encore inconnus. Chez certains individus on constate une hétérogénéité somatique de l’expansion des triplets CGG qui permet l’expression mosaïque du gène FMR1 muté.

1. 4. Variabilité phénotypique Bien que le X fragile soit monogénique, les mécanismes qui le sous- tendent ne sont pas simples. Il n’y a pas de relation strictement linéaire entre le nombre de répétitions CGG et le statut de l’allèle porté (normal, prémutation, mutation complète). Comme rapporté dans le chapitre précédent, les mécanismes d’expansion des triplets CGG, le moment auquel ces évènements ont lieu et l’occurrence de la méthylation du gène FMR1 restent encore inconnus. Plusieurs articles font état de

28 Introduction générale phénotypes différents chez des jumeaux monozygotiques soit tous deux avec la mutation complète, soit avec un nombre différent de répétitions et une expression mosaïque de la mutation chez l’un (Helderman-Van Den Enden et al. , 1999, Sheldon & Turk, 2000, Tuckerman et al. , 1985, Willemsen et al. , 2000). Le degré de mosaïsme semble être corrélé avec le degré d’affection clinique mais cela n’a pas été mis en évidence dans toutes les études (Cohen et al. , 1996, De Vries et al. , 1993, Merenstein et al. , 1996, Rousseau et al. , 1994, Staley et al. , 1993). Les résultats sont à prendre avec d’autant plus de précautions que l’on trouve des différences entre la proportion de mosaïsme dans les cellules du sang et celle de la peau (Dobkin et al. , 1996). Divers résultats rapportent une corrélation entre le taux de méthylation et le QI ou entre le taux de FMRP et le QI mais cette relation n’est pas directe (Steyaert et al. , 1996, Tassone et al. , 1999, Taylor et al. , 1994). L’expression des protéines interagissant avec la FMRP joue très certainement un rôle dans la compensation ou la non-compensation lors de la mutation de FMR1. Notamment, les protéines de la famille de la FMRP : FXR1 et FXR2 qui ont une structure proche de la FMRP et potentiellement des fonctions redondantes avec celle-ci (voir section 2.4.). L’histoire psychiatrique de la famille influence aussi les troubles psychiatriques que peuvent par la suite développer les enfants (Beardslee et al. , 1998). Il semble que, chez les garçons X fragile, la psychopathologie des parents, les services éducatifs et thérapeutiques soient plus prédictifs encore de la symptomatologie des enfants que le taux d’expression du X fragile, tandis que l’environnement quotidien semble prédictif des traits autistiques (Smalley et al. , 1995, Tsiouris & Brown, 2004). A propos de l’association du SXF avec l’autisme, étant donné que l’on considère que les troubles autistiques ont une origine polygénique, une hypothèse plausible pourrait être qu’il y ait un effet synergique du SXF avec les gènes de susceptibilité à l’autisme. Cette théorie est en accord avec l’étude de Bailey et ses collègues qui ont trouvé que les garçons SXF avec autisme avaient un QI plus bas que le reste des garçons SXF (Bailey et al. , 2001). Cet effet synergique du SXF pourrait s’exercer avec d’autres gènes.

1.5. Diagnostic L’analyse cytogénétique du site fragile du X a laissé la place dans les années 90 à l’analyse directe de l’ADN par Southern blot ou PCR, plus précise et devenue moins chère. La procédure préconisée est compilée d’après Oostra et al ., Guidelines for the diagnosis of fragile X, article qui synthétise les recommandations de

29 Introduction générale la troisième conférence internationale du X fragile à Aspen, USA en 1992 (Oostra et al. , 1993) . L’analyse est en général postnatale, à partir du moment où un retard mental est constaté ou sans retard mental dans le cas d’une histoire familiale de SXF afin de tester les porteurs de prémutation ou de mutation sans affection. Dans le cas de l’observation d’un retard mental : s’il y a une histoire familiale de retard mental sans SXF, il y a peu de probabilité que le diagnostic du SXF soit positif. On procède cependant aux mêmes analyses que dans le cas où l’étiologie est inconnue : une analyse chromosomique constitutionnelle pour détecter les aberrations chromosomiques et un Southern blot après une digestion EcoRI de l’ADN. Etant donné qu’il n’y a pas de limite précise entre une grande prémutation et une petite mutation complète, si le nombre de répétitions est sujet à caution on procède alors à une digestion de l’ADN par une enzyme sensible à la méthylation (EagI). La présence d’une méthylation permet l’identification de la mutation complète (avec mise en silence du promoteur du gène FMR1 ). Dans le cas où on cherche à évaluer si un sujet dont la famille a une histoire de SXF est porteur d’une prémutation, on effectue une évaluation moléculaire de la famille, ce qui permet la discrimination entre allèles normaux et prémutés par comparaison. On procède à une digestion EcoRI et EagI. Enfin, le diagnostic prénatal se fait en général quand il y a une histoire familiale de SXF. On effectue une double digestion EcoRI et EagI ou une PCR. Afin de discriminer l’origine des chromosomes X analysés on effectue une analyse des répétitions microsatellites CA flanquantes. Cette analyse permet la détection rapide d’un génotype normal dans plus de la moitié des cas. Cependant le nombre de diagnostics moléculaires prénataux est faible car peu fiable du fait de l’ignorance du mécanisme et du moment d’extension et de méthylation du site X fragile au cours du développement.

2. Bases neuroanatomiques et moléculaires du X fragile 2.1. Neuroanatomie du SXF Les examens microscopiques post-mortem des tissus du cerveau de personnes X fragile ont résulté dans l’observation d’un nombre de neurones dans la moyenne et d’anomalies des épines dendritiques ( figure 3 ). Celles-ci sont longues, fines, tortueuses et ressemblent aux épines immatures des contrôles sain. Par contraste on trouve très peu d’épines matures ramassées et en forme de champignon comme l’on trouve chez les sujets contrôles. En outre, la densité des épines dendritiques est

30 Introduction générale augmentée, suggérant un problème d’élagage lors de la formation des dendrites et un rôle de la FMRP dans cette fonction (Comery et al. , 1997, Irwin et al. , 2001).

ABCL

Figure 3 : Exemple de morphologie typique des épines dendritiques observées dans le syndrome du X fragile sur des neurones traités par la coloration de Golgi- Kopsch. En A, un patient SXF; en B, une personne contrôle. C: schéma des types de morphologies matures et immatures des épines dendritiques. D’après Irwin, Galvez et Greenough, 2000.

Les études d’imagerie à résonance magnétique (IRM) ont dévoilé d’autres aspects de la neuroanatomie du X fragile : il a été trouvé une augmentation du thalamus, des noyaux caudés mais aussi de l’hippocampe et de l’amygdale, du troisième et du quatrième ventricule du cervelet tandis que le gyrus temporal supérieur est réduit et que le vermis cérébelleux présente une hypoplasie (Mostofsky et al. , 1998, Reiss, 1988, Reiss et al. , 1991a, Reiss et al. , 1994, Reiss et al. , 1995, Eliez, 2001). Le vermis cérébelleux est anatomiquement connecté aux structures limbiques, dont l’hippocampe et l’amygdale. Il est impliqué dans l’exécution et la régulation des comportements moteurs, les saccades visuelles, le traitement auditif et certains aspects du langage (Baldacara et al. , 2008). Les anomalies dans le vermis cérébelleux pourraient être liées à l’hyperactivité associée au SXF ainsi qu’aux mouvements répétitifs, l’aversion tactile, les déficits d’attention et les dysfonctions du langage (Hessl et al. , 2004). Le gyrus temporal supérieur est une aire importante dans le traitement des stimuli auditifs complexes, dont le langage et son étude par IRM chez des sujets SXF jeunes montre une diminution liée à l’âge (Reiss et al. , 1994). La même étude a montré au contraire une augmentation de l’hippocampe liée à l’âge, l’hippocampe étant impliquée dans l’apprentissage, la mémoire et le traitement d’informations visuospatiales, des fonctions singulièrement altérées dans le SXF. Ces données ont été

31 Introduction générale répliquées par une autre étude mais pas par une troisième (Jakala et al. , 1997, Kates et al. , 1997). Les données sur l’augmentation de l’amygdale ne concernent qu’une étude dans laquelle une paire de jumelles monozygotiques SXF chez qui l’une avait un QI normal, tandis que l’autre présentait un QI de 47 et une amygdale 35% plus grande que celle de sa sœur (Reiss et al. , 1995). Cependant la dysfonction de l’amygdale dans un conditionnement de peur chez la souris Fmr1 KO, modèle du X fragile, appuie cette découverte (Paradee et al. , 1999). L’amygdale est impliquée dans le traitement des émotions conscientes et inconscientes. Les noyaux caudés jouent un rôle dans la régulation, l’organisation et la filtration des informations (Herrero et al. , 2002). Certains circuits fronto-sous corticaux qui impliquent les noyaux caudés sont prépondérants dans le basculement de l’attention, la planification motrice et les fonctions exécutives, toutes déficientes dans le SXF (Mazzocco et al. , 1993). Une augmentation des noyaux caudés a été observée dans plusieurs études chez de jeunes sujets SXF (Eliez et al. , 2001, Reiss et al. , 1995).

2.2. Le gène FMR1 Les hybridations in situ des ARNm de FMR1 ainsi que les études d’immunohistochimie et de western-blot réalisées pour la FMRP ont permis de localiser les régions exprimant typiquement le gène FMR1 . Il est exprimé dans les tissus humains durant le développement normal. Les ARNm de FMR1 sont hautement exprimés dans les tissus fœtaux du système nerveux central lors des 8 ième et 9 ième mois de gestation, en particulier dans le télencéphale (Abitbol et al. , 1993, Devys et al. , 1993). Tandis que le développement continue, l’expression des ARNm de FMR1 devient plus spécifique. Abitbol et ses collègues (1993) ont trouvé qu’à 25 mois d’âge, les ARNm de FMR1 sont exprimés le plus fortement dans les structures profondes (l’hippocampe, le putamen, le diencéphale), les aires ventriculaires et sous-ventriculaires, la plaque néocorticale et le cervelet. Similairement, des anticorps monoclonaux de FMRP se lient fortement aux tissus adultes (Devys et al., 1993). Dans le tissu cérébelleux, les cellules de Purkinje sont les plus réactives. Les tissus cérébraux expriment FMRP dans le cytoplasme et les régions proximales des dendrites et des axones.

32 Introduction générale

2.3. La protéine FMRP ( figure 4 ) L’épissage alternatif détermine la présence dans la protéine de signaux de localisation nucléaires ou cytoplasmiques. FMRP complexe avec d'autres protéines et peut être incorporée à des particules ribonucléaires impliquées dans la maturation des ARN ou leur transport. La FMRP et des ANRm de FMR1 sont présents dans les épines et les Figure 4: la protéine FMRP, modélisée à l’aide dendrites, et la FMRP est traduite en du logiciel Pymol (source: Anna Delprato) réponse à l’activation de récepteurs mGlu1 dans les synaptoneurosomes (Weiler et al., 1997). Il a été montré in vitro que la FMRP lie ses propres ARNm, ceux de protéines impliquées dans le développement et les ARNm de protéines impliquées dans le fonctionnement microtubule-dépendants de la synapse, ce qui indique qu’elle pourrait agir comme régulateur de la traduction activité-dépendante de la synapse (Brown et al. , 2001, Li et al. , 2001, Miyashiro et al. , 2003). Cette possibilité est appuyée par la découverte que l’induction d’une dépression à long terme dépendante de récepteurs mGlu1 est augmentée dans les cellules pyramidales de l’hippocampe chez les souris Fmr1 KO (Huber et al. , 2002). Ainsi la dépression à long terme ( long term depression , LTD) hippocampique altérée des patients X fragile peut interférer avec la formation et la maintenance normale des synapses requises pour des fonctions cognitives particulières.

2.4. Gènes proches : la famille de gènes FXR et leurs fonctions L’identification du rôle physiologique de la protéine FMRP dans le système nerveux humain pourrait être compliquée par le fait que FMR1 est un membre de la famille de gènes FXR ( Fragile X Related ) qui inclut deux autres gènes : FXR1 sur le chromosome 11 et FXR2 sur le chromosome 17 (Schenck et al. , 2001). Ces gènes sont bien conservés et ont un haut degré d’homologie, particulièrement à l’extrémité 5’ et au centre du cadre de lecture (Zhang et al., 1995). L’étude du rôle de l’expression de FMR1 dans le cerveau est compliquée par les deux autres gènes de cette famille.

33 Introduction générale

L’expression des FXR une expression partiellement chevauchante dans les cellules neuronales et les trois produits géniques peuvent former des hétérodimères in vitro (Tamanini et al. , 1999). Ces caractéristiques suggèrent que les différences entre certains de leurs rôles physiologiques puissent être subtiles et que certaines des fonctions de FMR1 , FXR1 et FXR2 puissent être complémentaires. Les mutants Fmr1 et Fxr2 montrent effectivement des caractéristiques similaires et le double mutant Fmr1/Fxr2 présente un phénotype aggravé sur certains traits comportementaux (Spencer et al. , 2006, Zhang et al ., 2008). Les mutants Fxr1 meurent peu après la naissance et le KO conditionnel Fxr1 présente des altérations musculaires (Mientjes et al. , 2004).

IV. MODELES ANIMAUX POUR LES MALADIES NEUROPSYCHIATRIQUES 1. Utilité et validité des modèles animaux pour les maladies neuropsychiatriques Dans l’autisme comme dans la plupart des maladies neuropsychiatriques (schizophrénie, maniaco-dépression, hyperactivité avec trouble de l’attention), le corps médical et les chercheurs sont confrontés à un ensemble de symptômes cliniques hétérogènes regroupés sous une appellation. Il semble que les facteurs impliqués provoquent une perturbation générale du cerveau produisant des conséquences convergentes. La recherche des circuits neurologiques impliqués peut potentiellement aider à la compréhension de l’étiologie de ces maladies. Des endophénotypes, c'est-à- dire des traits non visibles caractéristiques d’une pathologie, sont recherchés afin d’avoir des indicateurs fiables de diagnostic. Des hypothèses spécifiques expliquant les symptômes observés, leur hétérogénéité et leur émergence durant le développement manquent toujours. La recherche sur les humains, bien que très instructive, reste limitée par le manque de sujets d’étude, la variabilité interindividuelle dans les évènements vécus et le pool génétique. Il est difficile de dissocier les facteurs génétiques et environnementaux. L’investigation du cerveau n’est possible que par des méthodes non-invasives, et bien que ces méthodes soient actuellement très développées, elles gardent les limites de l’inférence sur l’activité du cerveau. Enfin, les résultats sont difficiles à répliquer. C’est pourquoi la recherche essaie d’appréhender ce type de pathologies avec des modèles animaux.

34 Introduction générale

Pour qu’un modèle animal soit considéré comme un modèle pertinent d’une condition psychiatrique décrite chez l’humain, il doit correspondre à différents critères habituellement décrits comme critères de validité de construction, de « face » et validité prédictive (Mckinney & Bunney, 1969, cité par Belzung et al. , 2005). La validité de construction tient principalement à l’identité de la cause entre le phénotype de l’animal et la maladie humaine. L’autisme est associé à des facteurs environnementaux et génétiques qui influent sur le développement, c’est pourquoi les modèles animaux doivent être construits en mimant ces effets. La validité de « face » implique une similarité du phénotype observé chez l’animal aux symptômes observés chez les patients. Cela doit correspondre à des modifications neuroanatomiques, neurochimiques, comportementales et cognitives identiques chez le modèle à ce que l’on observe chez l’humain. Enfin, la validité prédictive signifie que les traitements qui suppriment ou réduisent certains des symptômes de la maladie chez les humains réduisent également les symptômes trouvés chez le modèle animal. Quels modèles animaux pour étudier quelle pathologie ? En ce qui concerne l’autisme, les primates ont été et sont beaucoup utilisés dans l’étude des relations sociales, dans le système des neurones miroirs, la communication sociale. Leur utilisation est cependant soumise à des considérations éthiques, un coût financier élevé, un délai de développement long et le fait que les manipulations génétiques ne soient pas possibles. Ce qui n’est pas le cas des rongeurs pour les trois dernières considérations. A quels types de questions peut-on répondre avec l’utilisation de rongeurs ? Certaines caractéristiques de l’autisme concernent des traits spécifiquement humains comme regarder dans les yeux de manière appropriée, ne pas comprendre le second degré, jouer à faire semblant. Certaines altérations du comportement dans l’autisme impliquent les fonctions exécutives au niveau du cortex préfrontal, par exemple l’initiation du mouvement, la flexibilité mentale, or le cortex préfrontal est très réduit chez la souris (Striedter, 2006). Cependant les compétences d’interaction sociale, de communication et d’adaptation à l’environnement sont des aptitudes nécessaires à la survie et à la reproduction de la plupart des mammifères, dont la souris et qu’il est possible de tester.

2. Modèles rongeurs pour l’autisme Catherine Belzung et ses collègues proposent de classer les modèles pour l’autisme en quatre catégories : les animaux mutants présentant des déficits de neuropeptides impliqués dans le comportement social, les modèles mimant les effets

35 Introduction générale

épigénétiques potentiels à l’origine de l’autisme, les modèles obtenus par lésion néonatale et les modèles de maladies génétiques impliquées dans l’autisme (Belzung et al. , 2005). Le groupe de Sheryl Moy, Jessica Nadler et Jacqueline Crawley explore par ailleurs la variabilité des comportements sociaux présentés par différentes lignées de souris (Moy et al. , 2004; Moy et al. , 2008). Les modèles existants ont éventuellement pu aider à la compréhension du rôle fonctionnel de plusieurs structures mais bien souvent ils ne prennent en compte que certains aspects de l’étiologie et que quelques aspects de la symptomatologie de l’autisme. Jacqueline Crawley propose tout un panel de tests comportementaux pour phénotyper les traits autistiques chez les rongeurs (Crawley, 2004). Beaucoup de modèles parmi ceux présentés n’ont été testés que pour quelques aspects. Voici une présentation non exhaustive des modèles potentiels trouvés dans la littérature. Nous ne présentons pas les modèles lésionnels dans une catégorie particulière car ils visent plus à décortiquer les fonctions des structures étudiées et montrer leur rôle potentiel dans l’autisme qu’à donner une explication globale et ne répondent pas au critère de construction. La catégorie des déficits de neuropeptides impliqués dans le comportement social a été élargie aux défauts de fonctionnement des synapses.

2.1. Dérégulation des fonctions synaptiques chez des modèles souris pour l’autisme La perte de la fonction de la reeline, impliquée entre autres dans la migration neuronale et dont le gène a été associé à l’autisme, conduit à l’observation chez la souris d’altération motrices, d’une augmentation de l’anxiété, de déficits d’apprentissage et une neuroanatomie anormale, ainsi qu’une potentiation à long terme (long term potentiation , LTP) striatale aberrante (Badea et al. , 2007, Marrone et al. , 2006, Salinger et al. , 2003). Le taux de vocalisations ultrasoniques émises par le souriceau pour appeler sa mère lorsqu’il est isolé est plus bas que chez les souris contrôles (Ognibene et al. , 2007). Le système sérotoninergique joue un rôle dans de nombreux processus de développement notamment la neurogenèse, la migration neuronale, la migration, la différentiation, la synaptogenèse, la plasticité et la viabilité cellulaire (Gaspar et al. , 2003). Le fait que ce système soit bouleversé dans l’autisme suggère que ses fonctions neurodéveloppementales puissent être impliquées dans l’ontogenèse de ce trouble. Divers modèles ont été créés afin d’étudier cette hypothèse. Les souris déplétées en sérotonine par l’injection à la naissance de la neurotoxine spécifique 5,7-

36 Introduction générale dihydroxytryptamine dans le faisceau préfrontal médian présentent une diminution de la densité des fibres sérotoninergiques dans les régions corticales qui persiste après deux mois. Le volume de certaines régions corticales est augmenté et ces souris déplétées en sérotonine présentent à l’âge adulte des altérations de l’apprentissage social, des comportements de toilettage et de fouille de la litière qui sont intensifiés par rapport aux souris contrôle, ainsi que de l’agression sociale accrue (Boylan et al. , 2007). Beaucoup de gènes impliqués dans le métabolisme de la sérotonine ont été mutés chez la souris avec un résultat général sur l’anxiété, la dépression et l’agression (récepteurs 5-HT 1A et 1B, la monoamine oxydase A qui métabolise la sérotonine lors du développement et le transporteur sérotoninergique, SERT). La souris SERT-null présente en particulier de l’hypolocomotion, une réduction de l’exploration et des interactions sociales réduites (Kalueff et al. , 2007). Parmi les modèles de maladies génétiques impliquées dans l’autisme, certaines présentent également des défauts du fonctionnement synaptique : par exemple on retrouve un défaut de maturation des épines dendritiques dans le modèle souris du X fragile (Yan et al. , 2004) ainsi que chez les mutants Tsc1 et Tsc2 de la sclérose tubéreuse et la plasticité synaptique de l’hippocampe est affectée chez le modèle souris du syndrome de Rett, la souris KO Mecp2 (Asaka et al. , 2006, Tavazoie et al. , 2005). Des déficiences dans la LTP des souris Ube3A (m-/p+), modèle du syndrome d’Angelman ont été observées (Jiang et al. , 1998).

2.2. Modèles de maladies génétiques impliquées dans l’autisme Des études génétiques populationnelles ont trouvé une association des polymorphismes dans le gène de la phosphatase et homologue de la tensine sur le chromosome 10 (PTEN) avec de la macrocéphalie et des comportements autistiques. Les gènes impliqués dans la sclérose tubéreuse, TSC1 et TSC2 sont en aval de ce gène. Les souris chez lesquelles l’expression de Pten est inhibée dans le cortex cérébral et l’hippocampe présentent une approche sociale faible, une activité augmentée dans un nouvel environnement, une régulation sensorielle altérée et une arborisation neuronale aberrante (Greer & Wynshaw-Boris, 2006, Kwon et al. , 2006). Des caractéristiques des syndromes de Rett et d’Angelman modélisés par les souris Mecp2 KO et Ube3A (m- /p+) sont bien présents, cependant ces souris n’ont pas encore été étudiées pour des traits spécifiquement autistiques. La souris Fmr1 KO sera discutée plus en détail dans le chapitre suivant.

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2.3. Modèles mimant les effets épigénétiques potentiels à l’origine de l’autisme Chez les modèles rats sur les effets tératogènes, l’administration d’acide valproïque dans les stades précoces du développement conduit à des altérations du tronc cérébral similaires à celles que l’ont peut observer dans l’autisme. La distribution des neurones sérotoninergiques est elle aussi altérée. Au niveau comportemental on observe un retard du développement, une diminution de l’exploration sociale, des déficits de la régulation sensorielle (diminution du seuil de nociception, augmentation de la sensibilité aux stimuli sensoriels non douloureux, diminution du prepulse inhibition ), de l’hyperactivité et des comportements répétitifs et stéréotypés dans l’open-field (Schneider & Przewlocki, 2005). Le conditionnement de peur est exacerbé chez ces animaux (Markram et al. , 2008). L’administration d’acide valproïque dans les stades précoces du développement chez les souris conduit à un retard comportemental, une diminution de l’exploration sociale et une régression durant le développement néonatal et juvénile (Wagner et al. , 2006, Yochum et al. , 2008).

2.4. Souris mutantes pour des gènes candidats de l’autisme Suite à la mutation chez la souris d’une protéine impliquée dans l’expression de l’ADN, la methylCpG binding protein 1 (Mbd1 ), le phénotype observé montre la manifestation de plusieurs traits autistiques. Les souris Mbd1 (-/-) présentent une réduction de l’hippocampe et une altération de la neurogenèse hippocampique, une diminution des interactions sociales, des déficits d’apprentissage, de l’anxiété, des déficits de régulation sensorielle et une activité cérébrale sérotoninergique anormale (Allan et al. , 2008).

2.5. Autres pistes explorées Dishevelled-1 ( Dvl1 ) est un membre de la cascade de signalisation de Wingless-Int (WNT) qui joue de multiples rôles dans la migration cellulaire, la prolifération et la survie ainsi que la morphogénèse dendritique et la formation de synapses (Lijam et al. , 1997, Long et al. , 2004). WNT2 a été mis en cause parmi les gènes de susceptibilité à l’autisme et la voie de signalisation WNT semble impliquée dans la sclérose tubéreuse (Inoki et al. , 2006, Wassink et al. , 2004). Les mutants Dvl1 présentent des déficits d’interaction sociale et un branchement dendritique réduit et des

38 Introduction générale changements dans la formation des synapses mais des vocalisations normales chez des souriceaux isolés de 8 jours (Lijam et al. , 1997, Long et al. , 2004). La variabilité naturelle dans les différentes lignées de souris de laboratoire est exploitée pour explorer la variabilité des phénotypes manifestés. Les souris des lignées A/J, BALB/cByJ ou BTBR T+tf/J par exemple, montrent peu d’intérêt social (Moy & Nadler, 2008). La lignée BTBR T+tf/J notamment, qui présente une commissure hippocampique réduite et un corps calleux absent, semble présenter d’autres traits autistiques comme une absence de transmission sociale de préférence de nourriture, une altération du jeu chez les jeunes souris et des comportements répétitifs (Mcfarlane et al. , 2008, Wahlsten et al. , 2003).

V. LES SOURIS Fmr1 KO : MODELE POTENTIEL POUR L’AUTISME 1. La souris Fmr1 KO Une mutation knock-out a été induite dans le gène murin Fmr1 , similaire à 98% à l’orthologue humain, FMR1 (The Dutch-Belgian Fragile X Consortium, 1994). L’expression de la FMRP a été interrompue par une cassette néomycine dans l’exon 5 du gène (The Dutch-Belgian Fragile X Consortium, 1994). Il a été montré que le mutant Fmr1 avait une expression résiduelle d’ARN Fmr1 potentiellement due à des variants d’épissage (Yan et al., 2004). Les souris Fmr1 KO présentent cependant du macroorchidisme ainsi que des déficits cognitifs et comportementaux modérés comparables à ceux observés chez les patients humains SXF (The Dutch-Belgian Fragile X Consortium, 1994). Les dendrites anormalement fins et long caractéristiques du SXF sont retrouvés chez les jeunes souris Fmr1 KO (Comery et al. , 1997, Hinton et al. , 1991, Irwin et al. , 2001, Nimchinsky et al. , 2001, Rudelli et al. , 1985). Ces souris ont été testées pour de nombreuses tâches en regard du SXF et ont été validées pour ce syndrome (Kooy et al., 1996). La symptomatologie relativement modérée chez les Fmr1 KO peut être due à l’expression résiduelle des variants d’épissage des ARN de Fmr1 (Yan et al., 2004). Il est également possible que certaines fonctions soient mieux compensées chez les souris, c’est pourquoi nous mentionnerons également les doubles mutants Fmr1/Fxr2 dans ce chapitre (Bontekoe et al. , 2002, Spencer et al. , 2006). La souris Fmr1 KO a été produite à partir d’une lignée de cellules embryonnaires 129 et les mutants résultants ont été rétrocroisés de manière récurrente avec des animaux de fond génétique C57BL/6J (B6) et FVB/N (FVB, détails au

39 Introduction générale chapitre II). Il semble que la mutation s’exprime de manière différente chez ces deux fonds comme il sera développé dans le chapitre suivant et dans mes travaux de thèse (Ivanco & Greenough, 2002, Mineur et al. , 2002).

2. Données phénotypiques concernant les traits autistiques Les souris Fmr1 KO ont été étudiées pour de nombreux traits comportementaux et sensori-moteurs. La plupart des études jusqu’à il y a peu cherchaient à valider le modèle pour le SXF et ne s’intéressaient pas aux symptômes diagnostics de l’autisme, sauf pour le comportement social, un trait important dans le X fragile. Nous ne détaillons ici que les données des souris Fmr1 KO qui interrogent leurs caractéristiques vis-à-vis des traits présents dans l’autisme (données compilées dans la revue Bernardet et Crusio, 2006 qui se trouve en annexe et réactualisées). Le test de la chambre réfléchissante dont les parois sont couvertes par des miroirs a été développé par Seale et ses collègues sur l’observation que la plupart des animaux réagissent à leur reflet comme si c’était un autre animal (Gallup, 1968, Toubas et al. , 1990). L’appareil de test consiste en une boîte dont l’intérieur est couvert de miroir, posée au centre d’un open-field sombre. Le mur opposé à la chambre est également couvert d’un miroir. Il a été observé que les souris Fmr1 KO passaient moins de temps dans le centre réfléchissant de la boîte comparé au temps passé dans l’allée réfléchissante hors de la boîte supposée être moins anxiogénique et la chambre réfléchissante (Spencer et al., 2005). Dans le test du tube utilisé pour évaluer la dominance sociale, deux souris sont introduites aux extrémités d’un tube, celle qui recule pour laisser l’autre passer est considérée comme non-dominante. Le test du tube de dominance sociale a montré ce résultat intéressant : le nombre de matchs remportés par les souris Fmr1 KO semble dépendre de leur familiarité avec la souris opposée. Les souris Fmr1 KO ont gagné moins de matchs lorsqu’elles ne connaissaient pas la souris opposée, mais elles en ont gagné autant que les contrôles (souris possédant l’allèle du gène Fmr1 normal, « wild type », notées par la suite WT) lorsque les souris opposées étaient familières. La familiarité de l’environnement semble aussi avoir un effet sur les interactions sociales: les KO et les WT ont passé autant de temps à l’interface du compartiment dans lequel se trouvait une souris non familière lorsque la cage était non familière, mais en revanche elles ont montré un schéma d’exploration social différent lorsque la cage était familière (Spencer et al. , 2005).

40 Introduction générale

Les tests d’interaction sociale menés par Spencer et ses collègues ont montré que les souris KO présentaient une augmentation des comportement sociaux actifs quand elles étaient confrontées à des pairs WT ou KO, une augmentation des comportements sociaux réceptifs lorsque confrontées à un animal WT et une diminution des comportements sociaux réceptifs lorsque confrontées à un autre KO (Spencer et al. , 2005). Dans le test d’interaction sociale réalisé par Yann Mineur avec l’utilisation de femelles C3H ovariectomisées comme souris stimulus, les KO ont présenté une diminution de comportements sociaux en comparaison des animaux WT ( figure 6, Mineur et al ., 2006). Un test de partition (test d’interaction sociale sans contact) n’a montré aucune différence entre KO et WT ( figure 5 , Spencer et al. , 2005). Malgré des résultats divergents probablement dus à des différences de protocole, les deux groupes ont conclu à un comportement social altéré chez les KO comparés aux WT. Plus récemment, le test d’interaction indirect réalisé par McNaughton et ses collègues semble révéler des indices d’anxiété chez les KO en présence d’une souris mâle WT inconnue (Mcnaughton et al. , 2008).

30

25

20

15

10 Fréquence Fréquence des sociaux comportements 5

Tps passé à l’interface (s) la souris avec stimulus 1 2 3 4 5 Figure 6: Test d’interaction directe: Habituation Figure 5: Test d’interaction indirecte: Condition « Unfamiliar à la cage de 1 h. Essais de 2 min, intervalle cage »: pas d’habituation, « Familiar cage »: habituation de 24h. inter-essai de 10 min. Les WT sont représentés Intervalles continus de 5 min. (Spencer et al., 2005) par des carrés blanc, les KO par des carrés noirs (Mineur et al., 2006)

Un deuxième groupe des symptômes diagnostics concerne les comportements stéréotypiques et répétitifs, la résistance au changement et les activités réduites. La persévérance est le principal aspect étudié jusqu’à récemment, en général sur le fond B6. La vitesse d’extinction suivant un apprentissage pour nager jusqu’à une plateforme a été étudiée dans divers types de labyrinthes aquatiques. Trois des études

41 Introduction générale ont montré que les souris Fmr1 KO ont des latences significativement plus longues pour atteindre la plateforme dont la position a été modifiée après l’apprentissage d’une position initiale (D'hooge et al. , 1997, Kooy et al. , 1996, The Dutch-Belgian Fragile X Consortium, 1994), tandis que deux autres études n’ont pas mis en évidence de différence par rapport aux WT (Paradee et al. , 1999, Van Dam et al. , 2000). Van Dam et ses collègues ont utilisé un labyrinthe aquatique en croix et trouvé que bien que les latences d’échappement soient similaires entre WT et KO, ces derniers faisaient significativement moins d’essais corrects (Van Dam et al., 2000). Ces résultats semblent indiquer que les animaux KO sont moins flexibles que les WT et tendent à persévérer plus longtemps dans une habitude prise. Moon et ses collègues ont testé les souris Fmr1 KO dans des tâches de nose-poke (mettre la truffe dans un trou dans différentes situations afin d’obtenir une récompense appétitive dans une mangeoire). Ils ont trouvé des dysfonctions de l’attention, de l’impulsivité et une résistance au changement chez les KO par rapport aux WT (Moon et al. , 2006). Concernant les symptômes variables de l’autisme, la plupart des tests conduits sur les souris Fmr1 KO concernaient les équivalents murins de l’anxiété, du retard mental, de l’hyperactivité et des réponses idiosyncratiques aux stimuli sensoriels. Il a été observé que certaines caractéristiques étaient altérées, mais d’autres n’ont présenté aucune différence. L’anxiété est très souvent observée chez les personnes autistiques et est liée à un problème d’anticipation des évènements et des mouvements qu’on pense être à l’origine des comportements rituels (Kanner, 1943). Ce trait pourrait également être dû à une altération du fonctionnement de l’amygdale (Amaral et al. , 2003). Un défaut de l’amygdale semble effectivement être présent chez les souris Fmr1 KO comme le suggère le déficit du conditionnement aversif de trace et les interactions sociales altérées (Hayashi et al. , 2007, Zhao et al. , 2005). Cependant la plupart des tests classiques d’anxiété n’ont pas montré de différence entre les KO et les WT, ou les KO se sont montrés même moins anxieux que les WT (Dobkin et al. , 2000, Hayashi et al. , 2007, Mineur et al. , 2002, Peier et al. , 2000, Spencer et al. , 2005, The Dutch-Belgian Fragile X Consortium, 1994, Van Dam et al. , 2000, Zhao et al. , 2005). Des anomalies dans les taux de corticostérone en réponse à un stress de contention ont été observées : chez les souris Fmr1 KO mâles, la réponse est retardée par rapport aux WT. Chez les femelles KO l’augmentation de corticostérone est moins forte que chez les WT et la diminution subséquente semble également retardée (Lauterborn, 2004, Markham et al. , 2006). La FMRP se lie aux récepteurs glucocorticoïdes et leur expression est réduite

42 Introduction générale dans la région dendritique de l’hippocampe de la souris Fmr1 KO (Miyashiro et al., 2003). Cela est concordant avec les données chez les humains chez qui des dérégulations de l’axe adrénergique-pituitaire ont été rapportées (Hessl et al., 2002). Certaines études sur les capacités d’apprentissage ont indiqué un déficit des souris KO dans des tâches d’apprentissage spatial comparées aux WT (Dobkin et al. , 2000, Mineur et al. , 2002, The Dutch-Belgian Fragile X Consortium, 1994, Van Dam et al. , 2000, Yan et al. , 2004) tandis que d’autres n’ont rapporté aucun déficit (Paradee et al., 1999, Peier et al. , 2000, Yan et al. , 2004). Les déficits trouvés dans le conditionnement aversif de trace ont été lies à des déficits en LTP dans l’amygdale latérale. L’altération de la LTP a également été trouvée dans le cortex cingulaire et le cortex temporal (Hayashi et al. , 2007, Zhao et al. , 2005). Des déficits similaires ont été trouvés chez des souris Fmr1 KO de fond génétique hybride 129/FVB (Dobkin et al. , 2000). Il semble que les capacités motrices et l’agression soient normaux mais ces aspects nécessitent encore d’être étudiés (Mineur et al. , 2002, Peier et al. , 2000). L’hyperactivité semble être le trait comportemental le plus cohérent des souris Fmr1 KO de fond génétique B6 (Hayashi et al. , 2007, Mineur et al. , 2002, Peier et al. , 2000, Spencer et al. , 2005, The Dutch-Belgian Fragile X Consortium, 1994) bien que Nielsen n’ait pas relevé de différence après une observation de 5 min dans l’open-field (Nielsen et al. , 2002). L’augmentation de l’activité locomotrice chez les souris Fmr1 KO de fond génétique FVB est encore débattue, il semble qu’une différence ne soit visible qu’au bout d’un certain temps d’observation, à partir de 18 min dans les études réalisées (Nielsen et al. , 2002, Qin et al. , 2005, Zhao et al. , 2005). Bien qu’aucune différence n’ait été trouvée entre les KO et les WT dans la réponse de nociception à la chaleur, la plupart des autres réponses aux stimuli sensoriels semblent être altérées chez les KO (Zhao et al. 2005). Koekkoek et ses collègues ont rapporté que le réflexe conditionné du clignement de la paupière été altéré chez une souris Fmr1 KO conditionnel des cellules de Purkinje de fond génétique B6 (Koekkoek et al., 2005). La réponse auditive de sursaut semble être FMRP dépendante: bien que les KO de fond FVB et B6 présentent des réponses opposées, elles sont toutes deux significativement différentes des WT (Frankland et al. , 2004, Nielsen et al. , 2002, Peier et al. , 2000). En outre, les souris Fmr1 KO des deux fonds génétiques se montrent radicalement plus susceptibles aux crises audiogéniques que leurs homologues WT, ce qui pourrait provenir de l’hyperexcitabilité des neurones excitateurs et des circuits

43 Introduction générale néocorticaux observée sur fond B6 (Chen & Toth, 2001, Gibson et al. , 2008, Yan et al. , 2004). Enfin il a récemment été observé chez les B6 Fmr1 KO et Fxr2 KO un raccourcissement du rythme circadien en obscurité supérieur à celui observé chez les WT et les doubles mutants Fmr1/Fxr2 ont une activité totalement dérégulée, ce qui est à rapprocher des troubles du sommeil observés dans le SXF et l’autisme et de l’implication potentielle du système des gènes du rythme circadien dans cette pathologie (Zhang et al. , 2008).

VI. OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THESE Les travaux rapportés dans ce manuscrit visent à préciser le tableau phénotypique des traits autistiques présents chez les souris Fmr1 KO et à évaluer l’interaction du fond génétique des lignées B6 et FVB avec la mutation Fmr1 en étudiant de manière systématique l’effet de la mutation Fmr1 sur les fonds B6, FVB et leurs hybrides F1 : B6xFVB et FVBxB6. Au niveau des symptômes principaux, nous avons voulu étudier les interactions sociales déjà appréhendées chez les souris de fond génétique B6 par différentes équipes avec des résultats conflictuels et nous avons utilisé à cette fin un test semi-automatisé d’interaction indirecte dans un premier temps. Aucun test n’avait encore été réalisé au niveau de la communication sociale. Nous avons mis en place une expérience d’ enregistrement des vocalisations ultrasoniques chez les souriceaux isolés lorsqu’ils appellent leur mère et étudié le versant émetteur de la communication. Etant donné que les altérations du langage observées dans l’autisme et dans le SXF peuvent être subtiles, nous avons cherché à affiner le traitement des vocalisations pour étudier la structure des cris émis. Parallèlement nous avons vérifié la coordination motrice de base, parfois altérée dans l’autisme et le X fragile et observé la corrélation des cris émis avec la récupération maternelle. Le troisième critère diagnostic de l’autisme concernant la rigidité cognitive et les stéréotypies n’avait jusqu’ici été étudié que sur fond génétique B6 par des extinctions d’apprentissages en labyrinthe aquatique avec des succès divers. Etant donné la courte durée sur laquelle sont réalisés ces apprentissages, nous avons mis en place l’ extinction également, d’un apprentissage appétitif fortement ancré dans un labyrinthe en T . Au niveau des symptômes variables de l’autisme, l’agressivité avait été étudiée sans succès dans un paradigme de « cage neutre » sur fond B6 (Mineur & Crusio, 2002). Nous avons réalisé un test de résident-intrus suite à une période d’isolation

44 Introduction générale pour tester ce trait dans des conditions plus poussées sur tous les fonds étudiés. Les études précédentes étudiant les capacités d’apprentissage chez les souris Fmr1 KO avaient trouvé une altération modérée des performances ou une absence d’altération. Deux études avaient réalisé un test d’apprentissage spatial en labyrinthe radial sur des souris Fmr1 KO de fond B6 et de fond hybride FVBxB6 et avaient toutes deux conclu à une altération de l’apprentissage (Mineur et al. , 2002, Yan et al. , 2004). Nous avons réitéré le test d’ apprentissage spatial dans un labyrinthe radial chez tous les fonds étudiés. L’hyperactivité est un trait qui n’avait été testé en général sur de courtes durées et sur fond B6. Nous avons utilisé des cages d’activité sur deux jours pour l’explorer plus avant sur tous les fonds que nous étudiions et analyser l’habituation à un nouvel environnement, l’activité sur 24h et sa répartition dans la journée. Nous avons également poursuivi l’ étude des fibres moussues intra-infra- pyramidales (FMIIP) de l’hippocampe pour le rôle joué par l’hippocampe dans l’autisme (Bauman & Kemper, 2005a), la variabilité naturelle du volume des FMIIP chez les lignées de souris (Lipp & Wolfer, 1999) et l’observation dans deux études distinctes d’une variation opposée du volume des FMIIP induite par la mutation Fmr1 KO (Ivanco & Greenough, 2002, Mineur et al. , 2002).

45 Introduction générale

46 Matériel et méthodes générales

Matériel et méthodes générales

I. ANIMAUX 1. Souches utilisées 1.1. C57BL/6J La mutation Fmr1 KO originale a été générée par le consortium belgico- hollandais du X Fragile en 1994 (The Dutch-Belgian Fragile X Consortium, 1994) par interruption de l’exon 5 du gène cible. Un clone de cellule souche embryonnaire de la lignée 129P2, positif pour la recombinaison homologue du vecteur plasmidique contenant l’insert knock-out de Fmr1, a été injecté dans des blastocystes de souris C57BL/6J (B6) et transféré chez des femelles pseudogestantes. Les mâles chimériques ont été croisés avec des femelles de la lignée consanguine B6 pour déterminer s’il y avait transmissibilité de la mutation. Les animaux KO Fmr1 ont ensuite été croisés sur fond génétique B6, c'est-à-dire systématiquement croisés avec des animaux B6, pendant plus de 20 générations. Cette opération permet d’obtenir des animaux possédant le gène d’intérêt muté et dont le génome provient entièrement de la lignée B6, sauf les régions les plus proches du gène muté (Gerlai, 1996). La continuation du croisement des mutants avec des animaux de la lignée B6 pure sur de nombreuses générations permet de diminuer au maximum les gènes flanquant le gène invalidé provenant de la souche 129 et qui pourraient induire un biais dans les expériences. Les souris B6 Fmr1 KO que nous avons utilisées pour notre élevage proviennent de Neuromice.org (Northwestern University, Chicago, IL ; http://neuromice.org/mutantDetails.do?mgi_id=MGI%3A1857169 ).

1.2. FVB.129P2-Fmr1 tm1Cgr/ J La souche utilisée pour générer cette lignée est la souche FVB.129P2- Pde6b + Tyr c-ch /AntJ (FVB). Cette souche FVB est homozygote pour l’allèle sauvage Pde6b de la lignée 129P2/OlaHsd, ce qui fait qu’elle ne développe pas de cécité causée par la dégénérescence rétinienne dont la lignée FVB/N classique est autrement affectée (Errijgers et al. , 2007). La lignée FVB Fmr1 a été générée par rétrocroisement de la lignée B6 Fmr1 avec la lignée FVB sur plus de 20 générations (Ivanco & Greenough, 2002), par le même processus que décrit pour la lignée B6 Fmr1 . Les souris FVB Fmr1 utilisées pour notre élevage proviennent du Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA ; http://jaxmice.jax.org/strain/003024.html ).

47 Matériel et méthodes générales

2. Elevage 2.1. Types de croisements Les animaux utilisés pour les expériences proviennent de quatre types de croisements : les lignées Fmr1 KO de fond B6 et FVB, et les générations F1 des croisements hybrides réciproques de ces deux fonds génétiques : B6 Fmr1 xFVB et FVB Fmr1 xB6. Les mâles et femelles reproducteurs sont croisés à partir de l’âge de deux mois. On maintient deux lignées consanguines WT de fond génétique B6 et FVB afin d’utiliser les mâles pour le maintien des lignées Fmr1 par croisement avec une femelle +/-. Les animaux des lignées consanguines B6 et FVB sont croisés entre frères et sœurs d’une même portée. L’obtention des animaux expérimentaux (+/Y et -/Y) se fait par le croisement d’une femelle Fmr1 KO +/- avec un mâle +/Y de la lignée WT.

2.2. Gestion de l’élevage Dans les croisements Fmr1 KO on conserve uniquement des portées de 6 à 8 petits afin que l’effet de la taille de la portée soit homogène chez tous nos animaux expérimentaux. Les portées supérieures à 8 petits sont diminuées à ce nombre, en gardant le maximum de mâles. Les portées contenant moins de trois mâles sont supprimées. Le sexage des petits se fait dans les trois jours suivant la naissance, le sevrage des animaux se fait à 21 jours en cage collective par portée. A l’âge de 4 à 6 semaines, les mâles expérimentaux issus des quatre types de croisements ainsi que les femelles Fmr1 de fond B6 ou FVB sont identifiés dans une cage par un code de poinçons à l’oreille ou le motif rose/noir du bout de la queue pour certaines B6. Quelques gouttes de sang sont récupérées par incision et massage de l’extrémité de la queue pour le génotypage sur une carte de prélèvement (CloneSaverCard 96 échantillons, Whatman, FR). A l’issue du génotypage, on ne gardera des femelles que les hétérozygotes Fmr1 pour la reproduction. L’élevage reproducteur des souris se trouve dans une animalerie mutualisée de type EOPS (Exempt d’Organismes Pathogènes Spécifiques). Les animaux expérimentaux sont importés dans l’animalerie du laboratoire au moins une semaine avant le début des expériences.

48 Matériel et méthodes générales

2.3. Schéma expérimental Certains tests comportementaux peuvent avoir une influence sur les performances dans les tests suivants (Mcilwain et al. , 2001). Par exemple la recherche de nourriture dans les apprentissages appétitifs réalisés dans le labyrinthe en T et le labyrinthe radial sont facilement transposables une fois acquis. Ou encore, l’isolement des souris induit un changement tant au niveau physiologique que comportemental (Matsumoto et al. , 2005). C’est pourquoi chaque animal ne peut passer qu’un nombre limité de tests. Dans notre projet, nous avons défini deux jeux de trois ou quatre expériences combinées de manière à limiter les interférences des unes sur les autres. Les animaux testés dans l’expérience de vocalisations lors de l’isolement maternel n’ont été testés que dans cette expérience, car bien que la séparation maternelle soit limitée, elle peut potentiellement avoir des conséquences sur le comportement à l’âge adulte et notamment sur la réactivité de l’axe hypothalamo-hypophysaire qui sortent de notre champ d’étude actuel (De Kloet et al. , 2005, Millstein & Holmes, 2007, Anisman, 1998). D’autre part, étant donné le nombre de groupes expérimentaux (quatre types de croisements x deux génotypes Fmr1), l’effectif requis pour être en mesure de réaliser des analyses statistiques fiables sur les résultats (10 à 15 animaux) et la limitation du nombre d’animaux testables en une fois induite par les tests comportementaux utilisés (15 à 20 animaux maximum par cohorte dans le cas des apprentissages dans le labyrinthe en T et dans le labyrinthe radial), les expériences n’ont pas été réalisées en une fois. Les cohortes expérimentales comportaient au minimum deux fonds génétiques. Dans le premier jeu d’expériences ( figure 7), on utilisait uniquement les animaux issus des secondes portées et portées suivantes des femelles hétérozygotes Fmr1 afin de limiter la variabilité des effets maternels (Cohen-Salmon, 1987). Les animaux Fmr1 +/Y (WT) et -/Y (KO) étaient appariés dans une même portée, les animaux de supplémentaires de la portée étaient exclus. Les animaux débutaient les tests à 13±1 semaines, avec deux semaines d’écart maximum entre les animaux les plus jeunes et les plus âgées dans la cohorte. Dans ce premier jeu d’expériences les animaux passaient d’abord dans le test d’interaction indirecte de Crawley, ils étaient isolés une semaine après et mis en privation alimentaire afin de passer le test d’extinction d’un apprentissage appétitif dans un labyrinthe en T. A la fin de ce test, les animaux étaient isolés deux semaines supplémentaires pour le test de résident-intrus. Dans la semaine qui suivait ce test, les animaux étaient sacrifiés par perfusion intracardiaque et les cerveaux prélevés pour l’étude histologique de l’hippocampe.

49 Matériel et méthodes générales

Test d’interaction sociale indirecte : 1 jour

7 jours puis isolation, Extinction d’un apprentissage appétitif mise en privation dans un labyrinthe en T: 15 à 30 jours alimentaire 2 jours avant 15 jours Test d’agression de résident-intrus: 1 jour

1 à 5 jours Sacrifice Histologie

Figure 7 : Organisation du premier jeu d’expériences

Dans le deuxième jeu d’expériences ( figure 8), nous avons dû assouplir la sélection des animaux expérimentaux pour des raisons de difficultés d’élevage : les portées sont limitées à 8 petits, les premières portées sont également utilisées, et tous les mâles sont utilisés dans la limite du ratio 2 :1 d’un génotype Fmr1 par rapport à l’autre dans une portée. Les cohortes expérimentales comportent toujours deux fonds génétiques minimum. L’âge de début de test des souris a été porté à 14 ± 2 semaines, avec un mois d’écart maximum entre les animaux les plus jeunes et les plus âgés du groupe. La lignée B6 ne figure pas dans ces expériences. Suite à des problèmes de naissances dans cette lignée seuls quelques animaux ont pu être testés dont le nombre n’est pas suffisamment représentatif. Dans ce deuxième jeu d’expériences les animaux passent en test d’interaction sociale directe, 3 à 7 jours après en cage d’actimétrie, 3 à 7 jours après ils sont isolés et mis en privation alimentaire pour l’apprentissage dans le labyrinthe radial. Une semaine après la fin du labyrinthe radial ils sont filmés deux heures la nuit aux heures de pic d’activité pour vérification des stéréotypies. A la fin de ces tests les animaux sont sacrifiés par injection létale de pentobarbital.

50 Matériel et méthodes générales

Test d’interaction sociale directe: 1 jour

7 jours Actimétrie: 2 jours (isolées) Regroupement, 3 à 7 jours de repos, isolation et mise en privation Apprentissage dans un alimentaire 2 jours avant labyrinthe radial: 17 jours

7 jours Enregistrement aux pics d’activité pour déterminer la présence de stéréotypies: 1 jour

Le lendemain Sacrifice

Figure 8 : Organisation du deuxième jeu d’expériences

2.4. Génotypage Les animaux sont génotypés par technique de réaction en chaîne de la polymérase (« polymerase chain reaction », PCR). Suite au prélèvement de sang sur une carte Whatman, les échantillons sèchent à l’air libre pendant au moins deux heures. On prélève ensuite des poinçons de la carte que l’on place dans des aliquots. Le témoin négatif est un aliquot vide qui subit le protocole de la PCR comme les autres échantillons. Les échantillons sont lavés avec deux bains de 170 µL de tampon de rincage (FTA®, Whatman, FR) pendant 5 min. Les poinçons de carte doivent être blancs et débarrassés de leur hémoglobine. Suivent ensuite deux bains de 170 µL d’eau déminéralisée pendant 5 min. On élimine bien l’eau avant de rajouter 25 µL de mélange pour PCR par échantillon, composé pour un échantillon de 19 µL d’eau déminéralisée, de 2 µL de solution tampon (Tris-HCl 20 mM, pH 8.0), 1 µL de MgCl2 50 mM, (tout deux compris dans le kit Invitrogen de la Platinum Taq, Invitrogen, FR), 0,5 µL de dNTPs 10mM (Euromedex, FR), 0,625 µL de chacune des amorces 20 µM KO1 et KO2 (KO1 : 5'- CCG GTT CTT TTT GTC AAG ACC G -3' ; KO2 : 5'- CGG CAG GAG CAA GGT GAG AT -3' ; se lient à la cassette Néomycine qui interrompt l’exon 5 du gène Fmr1 et produisent un fragment de 197bp), et 0,55µL des amorces 20µM S1 et S2 (S1 : 5'- GTG GTT AGC TAA AGT GAG GAT GAT -3' et S2 : 5'- CAG GTT TGT TGG GAT TAA CAG ATC -3' ; se lient sur l’allèle sauvage de Fmr1 et produisent un fragment de 500bp). Ajout de 0,25 µl de Platinum Taq au dernier moment avant de répartir le mélange dans les aliquots et d’amplifier.

51 Matériel et méthodes générales

L’amplification des fragments d’intérêt se fait par variations de températures qui permettent tour à tour la désolidarisation des brins complémentaires d’ADN, l’hybridation des amorces avec l’ADN, l’activité de polymérisation de la Taq complémentaire au brin solitaire à partir des amorces, et ainsi de suite. Le protocole que nous avons utilisé est adapté d’après celui proposé pour génotyper les FVB Fmr1 KO sur le site des Laboratoires Jackson ( http://jaxmice.jax.org ) : 1) 94°C 3 min 2) 94°C 30sec 3) 63°C 30 sec répéter 40x 4) 72°C 1 min 5) 72°C 2 min 6) 4°C C’est la taille des fragments amplifiés qui indique le génotype de l’animal pour le gène Fmr1 (figure 9). Pour séparer les fragments en fonction de leur taille, on fait une électrophorèse sur gel d’agarose 1,5% (p/v) dont le principe utilise la charge de l’ADN pour le faire migrer au travers d’un gel dont le maillage est adapté à la taille des fragments à séparer. Plus les fragments sont petits, plus ils migreront facilement à travers le gel de l’anode vers la cathode. Du tampon de charge est ajouté aux échantillons à 10% (40% sucrose pour faire couler l’ADN au fond des puits, rouge Crésol 5mM pour visualiser le front de progression de l’électrophorèse). Les échantillons (12-16 µL) sont chargés dans les puits d’un gel d’agarose à 1,5% imprégné de BET 0,005%, intercalant de l’ADN (Euromedex, FR). Le premier puits est chargé avec 4 µL de marqueur de taille (pBR322/AluI, Fermentas France). Les échantillons migrent dans la cuve d’électrophorèse pendant 30 min et sont révélés sous lampe UV.

Bande WT 500 bp

Bande KO 197 bp

Figure 9: Résultat de PCR. Produits: WT: 500 bp, KO: 197 bp, hétérozygote (+/-): 197 et 500 bp

52 Matériel et méthodes générales

II. STATISTIQUES De manière générale, nous avons analysé nos données avec une ANOVA à deux facteurs avec le génotype Fmr1 (2 niveaux : KO et WT) et le fond génétique (4 niveaux : B6, B6xFVB, FVBxB6, FVB) comme facteurs principaux. Les analyses étaient suivies des tests post hoc appropriés ( Fisher ou Least Square Means ). Pour étudier l’évolution d’un comportement dans le temps nous avons utilisé une ANOVA de mesures répétée. Les analyses ont été réalisées sur Statview et SAS (SAS Institute Inc, USA).

53 Matériel et méthodes générales

54 Etude des traits autistiques chez la souris Fmr1 KO

Résultats expérimentaux

I. TRAITS AUTISTIQUES PRINCIPAUX 1. Interactions sociales : test de Crawley 1.1. Principe Les deux études testant les comportements sociaux chez les souris Fmr1 KO préalablement réalisées ne portaient que sur le fond B6. Elles suggéraient que le comportement social des KO présentait des caractéristiques particulières : anxiété sociale, intérêt bas mais constant pour un congénère inconnu. Nous avons choisi pour étudier l’intérêt social chez les souris Fmr1 KO et l’interaction de la mutation Fmr1 avec le fond génétique, d’utiliser un test de choix social modifié d’après Crawley, qui présente l’avantage d’être automatisable pour de nombreux paramètres avec un logiciel de videotracking (Insel, 2001, 2004).

1.2. Matériel et méthodes Ce test est effectué dans une boîte de plexiglas divisée en trois (45x60x25cm, Imetronics, Bordeaux, FR). Des ouvertures (5x15 cm) permettent à la souris testée (Souris Expérimentale, SE) d’explorer le centre et les compartiments externes. Ces derniers sont divisés inégalement en deux par une paroi de plexiglas perforé derrière laquelle sera placée une souris stimulus (SSt). Le dispositif décrit permet aux animaux de se voir, de se sentir mais non d’interagir directement ( figure 10 ). Les SSt sont des souris mâles A/JOlaHsd (Harlan, FR). Elles ne sont pas utilisées plus d’une fois par jour.

CC vide Centre Compartiment externe

ICC vide

ICC souris

CC souris

Figure 10 : Répartition des zones de mesure de l’activité de la souris expérimentale. CC : Compartiment de contention, ICC : Interface. A droite, illustration d’une souris expérimentale B6 à l’interface du CC souris.

Les cages des souris sont amenées une heure avant le début du test pour une première habituation à la pièce expérimentale (B6 : 15WT/15KO, B6xFVB :

55 Résultats expérimentaux

14WT/14KO, FVBXB6 : 13WT/13KO, FVB : 19WT/19KO). Elles sont ensuite placées individuellement dans le dispositif pour l’explorer durant dix minutes. Durant cette période d’exploration, les compartiments de contention (CC) sont vides. La SE est ensuite limitée au centre le temps d’introduire une SSt dans l’un des CC. La SE est alors autorisée à explorer l’appareil quinze minutes supplémentaires lors desquelles on enregistre son activité avec un logiciel de videotracking (Ethovision 5.0, Noldus, NL) qui permet de déterminer le trajet parcouru et différents paramètres comme la distance parcourue, la vitesse de déplacement, le temps de mobilité, les redressements, le temps passé dans les compartiments définis : centre, compartiments externes et interfaces avec le CC qui contient la souris (ICC souris) et avec le CC vide (ICC vide). La fréquence des redressements sur les pattes arrière est utilisée comme indice d’exploration de l’environnement. Le logiciel détecte un redressement lorsqu’il y a une diminution de la surface de l’animal de plus de 30% d’une image à l’autre (12 par seconde). Ethovision 5.0 détecte le centre de gravité de l’animal. Afin d’avoir une mesure plus précise de l’intérêt de la SE pour la SSt nous avons chronométré manuellement le temps où la souris a la truffe en contact avec la paroi des partitions « souris » et « vide ». La mesure manuelle de l’exploration olfactive à l’interface du CC vide est également utilisée comme mesure de l’exploration de l’environnement. L’intérêt pour le compartiment offrant la possibilité d’interagir avec l’animal stimulus est comparé à l’intérêt pour le compartiment vide. La mesure comportementale principale est le ratio de l’activité et du temps passé dans le compartiment souris par rapport au compartiment vide, ainsi que le temps passé à renifler la paroi du CC souris par rapport à celui passé à renifler la paroi du CC vide. Ces ratios sont utilisés afin de normaliser les différences d’activité des souris et faire ressortir l’intérêt pour la SSt.

1.3. Résultats Activité générale et exploration L’analyse de la distance parcourue lors du test de Crawley ( figure 11A) met en évidence des différences significatives nettes entre arrière-fonds génétiques

(F 3,114 =3,547, p=0,0168) et mutation Fmr1 (F 1,114 =10,679, p=0,0014). Le test post-hoc de Fisher confirme les différences trouvées : la lignée B6 parcours moins de distance que les trois autres fonds génétiques (B6 vs B6xFVB et FVBxB6, p<0,05 ; B6 vs FVB, p>0,005) et les KO sont plus actifs que les animaux WT ( p=0,0005). Il n’y a pas d’interaction entre fond génétique et la mutation (F3,114 =1,712, ns ).

56 Résultats expérimentaux

En analysant les autres paramètres d’activité dans ce test on constate que les différences de distances parcourues sont la conséquence des disparités que l’on trouve dans la vélocité des animaux et dans la durée de mobilité : l’ANOVA des vitesses de progression dans le dispositif de Crawley ( figure 11B) met effectivement en évidence des différences significatives robustes entre fonds génétiques et entre génotypes Fmr1 (Fond génétique :F 3,114 =4,317, p=0,0064, Mutation : F 1,114 =10,128, p=0,0019). Le test post-hoc de Fisher confirme la vitesse inférieure des souris de lignée B6 par rapport aux croisements hybrides (B6 vs B6xFVB et vs FVBxB6, p<0,05) et par rapport à la lignée FVB ( p<0,001), ainsi qu’une augmentation générale de ce paramètre chez les animaux KO ( p<0,001). Il n’y a, à nouveau, pas d’interaction entre le fond génétique et la mutation (Vélocité : F 3,114 =5,688, ns ; Mobilité : F 3,114 =0,268, ns ). La durée pendant laquelle les animaux sont mobiles (figure 11C), quoique peu variable entre les groupes (le groupe le moins mobile est celui des FVBxB6 WT, avec 710 secondes de mobilité sur les 900 secondes que dure le test, le groupe le plus mobile est celui des FVB KO avec 769 secondes de mobilité), montre à l’analyse des différences significatives solides qui vont dans le sens des paramètres précédemment décrits : l’ANOVA révèle un effet du fond génétique ainsi que de la mutation Fmr1 (Fond génétique :F 3,114 =3,500, p=0,0178, Mutation : F 1,114 =10, 575, p=0,0015), le test post-hoc de Fisher confirme une mobilité des animaux de la lignée FVB supérieure à celle des animaux B6 et FVBxB6 ( p<0,05 et p<0,01 respectivement), ainsi qu’une augmentation de la mobilité chez les KO par rapport aux WT ( p=0,001). L’analyse des redressements dans le test de Crawley ( figure 11D) met en

évidence un effet du fond génétique (F 3,114 =17,231, p<0,0001). Le test post-hoc de Fisher révèle que les animaux de la lignée FVB effectuent plus de redressements que les animaux des autres fonds génétiques (FVB vs B6, p<0,0001 ; vs FVBxB6, p<0,001 ; vs B6xFVB p<0,05) tandis que les animaux de la lignée B6 effectuent le moins de redressements (B6 vs B6xFVB, p<0,0001 ; vs FVBxB6, p<0,005). L’analyse de l’évolution de l’exploration olfactive à l’interface du CC vide au cours du test par intervalles de 5 min permet de détecter un effet global du fond génétique (F 3,113 =2, 878, p=0,0392) ainsi qu’un effet du temps (F 2,226 =3,263, p=0,0401) mais pas d’effet de la mutation ou d’interaction fond génétique x mutation. L’analyse post-hoc confirme en effet que les souris FVBxB6 passent plus de temps à renifler l’ICC vide que les animaux B6 ( p<0,01) et l’ensemble des groupes explore moins l’ICC vide en fin de test qu’en début de test (p<0,01). Lorsque l’on analyse l’évolution de la

57 Résultats expérimentaux distance parcourue au cours du temps avec une ANOVA de mesures répétées, on observe encore un effet global du fond génétique et de la mutation sur (Fond génétique :F 3,114 =3,547, p=0,0168, Mutation : F 1,114 =10,679, p=0,0014). Le temps d’exploration influe fortement sur la distance parcourue lors des trois intervalles de 5 min (F 2,228 =70,147, p<0,0001), mais cette évolution est également dépendante du fond génétique (Interaction temps x fond génétique : F 6,228 =3,911, p=0,0010). On retrouve des résultats similaires au temps total lorsqu’on analyse les changements de direction et les redressements.

A B 75 9

70 8 65 *

(m) 7 60 (cm/s) 55 6

0 0

C D 200 800 WT 180 780 KO 160 760 140 740 (s)

(s) 120 720 100 700 80

0 0 B6xFVBB6 FVB FVBxB6 B6xFVB B6 FVB FVBxB6

Figure 11 : Activité dans le test de Crawley. A) Distance (m; moy±e.s.m.) parcourue par chaque groupe d’animaux lors du test dans le dispositif. ANOVA: KO vs WT p=0,0014, effet fond génétique p=0,0168; test post hoc de Fisher * B6 vs FVB p<0,005, B6 vs FVBxB6 et B6xFVB p<0,05. B) Vitesse moyenne d’exploration (cm/s; moy±e.s.m.). ANOVA: KO vs WT p=0,0019, effet fond génétique p=0,0064; test post hoc de Fisher * B6 vs FVB p<0,001, B6 vs FVBxB6 et B6xFVB p<0,05. C) Temps de mobilité (s; moy±e.s.m.). ANOVA: KO vs WT p=0,0015, effet fond génétique p=0,0178; test post hoc de Fisher * FVB vs B6 p<0,05, vs FVBxB6 p<0,01. D) Fréquence de redressement (moy±e.s.m.). ANOVA: effet fond génétique * FVB vs B6 p<0,0001, vs FVBxB6 p<0,001, vs B6xFVB p<0,05 **B6 vs B6xFVB p<0,0001, vs FVBxB6 p<0,005.

58 Résultats expérimentaux

Interactions sociales Lorsqu’on étudie quel a été le choix du premier compartiment visité (figure 12A), on observe que les groupes d’animaux WT choisissent autant le compartiment où se trouve la SSt que le vide (Premier choix pour le compartiment souris : B6 : 8/15, B6xFVB : 8/14, FVB : 13/19, FVBxB6 : 6/13), et que tous les groupes d’animaux KO présentent la même tendance à explorer d’abord le compartiment vide et ensuite le compartiment souris (Premier choix pour le compartiment souris : B6 : 5/15, B6xFVB : 4/14, FVB : 8/19, FVBxB6 : 5/13). Cette 2 2 tendance est confirmée pour les KO par le test du χ (χ 1 = 5,46 ; p=0,0195) tandis que le même test réalisé sur les WT ne permet effectivement pas de rejeter l’hypothèse nulle de première entrée indifférente dans les compartiments ( χ2 = 1,327).

100 1.0 WT 90 0.9 KO 0.8 80 n=19 70 0.7 n=14 n=15 60 n=19 n=13 0.6 % 50 0.5 n=15 n=13 40 n=14 0.4 30 0.3 20 0.2 10 0.1 0 0 B6xFVBB6 FVB FVBxB6 B6xFVBB6 FVB FVBxB6 Figure 12: Test de Crawley. Choix de première entrée dans les compartiments externes. A) Pourcentage de premier choix pour le compartiment « souris ». Les pointillés rouges indiquent l’absence de préférence pour le compartiment « souris » ou vide en premier choix. Le n au-dessus de chaque colonne indique le nombre d’animaux dans chaque groupe. Test du χ²: KO p=0,0195. B) Ratio de la latence de 1ière entrée dans le compartiment souris par rapport à la somme des latences de 1ière entrée dans les deux compartiments (moy±e.s.m.). Les pointillés rouges indiquent que les souris expérimentales mettent à l’intérieur d’un groupe autant de temps pour entrer dans le compartiment souris que celui vide. ANOVA: KO vs WT: p=0,0029; t-test: ratio KO ≠0,5 p=0,0038.

Ainsi lorsque l’on compare les latences d’entrée du compartiment souris par rapport à la somme des latences d’entrée dans les deux compartiments ( figure 12B ), on trouve que les animaux KO sont plus longs à entrer dans le compartiment souris que dans le compartiment vide (Fond génétique : F 3,114 =0,551, ns , Mutation : F 1,114 =9,268, p=0,0029, Interaction Fond génétique x Mutation : F 3,114 =0,088, ns ). On trouve aussi cet effet lorsqu’on analyse la latence d’entrée au niveau de l’ICC souris (Fond génétique :

F3,114 =0,300, ns , Mutation : F 1,114 =6,989, p=0,0094, Interaction Fond génétique x

Mutation : F 3,114 =0,241, ns ). Ces différences WT vs KO sont confirmées par le test post- hoc de Fisher (p<0,01 et p<0,05 respectivement). Un t-test indique que le ratio de latence d’entrée des souris KO est significativement différent de 0,5 ( p=0,0038).

59 Résultats expérimentaux

L’analyse du temps passé dans le compartiment souris montre qu’il y a un effet du fond génétique sur la préférence de contact social (Fond génétique :

F3,236 =3,093 p=0,0277 ; Génotype : F 1,236 = 0,008 , ns ; Fond génétique x Génotype :

F3,236 = 0,248, ns ). Les souris FVB passent significativement plus de temps dans le compartiment souris que les B6 ( p<0,01). L’analyse de mesures répétées du temps passé à renifler l’interface du côté de la souris stimulus par intervalles de 5 min montre un effet du fond génétique et du temps mais pas d’effet de la mutation Fmr1 (Fond génétique : F 3,113 =5,353 ; p=0,0017 ; Génotype :F 1,113 =0,002, ns ; Fond génétique x Génotype : F 3,113 =0,453, ns ;

Temps :F 2,226 =4,663, p=0,0104). En effet, les souris B6 passent significativement moins de temps à renifler l’interface de la souris stimulus que les souris B6xFVB et FVBxB6 (p<0,05 et 0,001 respectivement) et les souris FVB passent significativement moins de temps à renifler l’interface de la souris stimulus que les souris FVBxB6 ( p<0,01, figure 13A). L’intérêt pour l’interface souris décroît significativement entre l’intervalle 6- 10min et 11-15min ( p<0,01). L’analyse globale ou par intervalles de 5 min du ratio du temps passé à renifler l’ICC souris sur le temps total passé à l’exploration des deux ICC ne met en

évidence aucun effet significatif (ANOVA : Fond génétique : F 3,114 =0,816, ns ,

Mutation : F 1,114 =0,251, ns, Fond génétique x Mutation : F 3,114 =0,937, ns ). Il n’y a pas d’effet des intervalles de temps au cours du test sur ces ratios, le temps passé à l’interface dans les deux compartiments évolue de manière similaire au cours du temps

(F 2,226 =1,601 ; p=0,2040). Dans l’analyse de mesures répétées on relève cependant une tendance presque significative d’interaction du temps avec la mutation (F 2, 228 =2,863, p=0,0592, figure 13B). Nous n’avons trouvé aucun effet des facteurs étudiés dans les ratios de la fréquence d’entrée dans les compartiments externes, au niveau des ICC ou dans la durée de séjour dans les compartiments et les interfaces.

60 Résultats expérimentaux

180 1.0 WT A B 0.9 KO 160 0.8 0.7 140 0.6

(s) 0.5 120 0.4 0.3 100 0.2 0.1 0 0 B6xFVBB6 FVB FVBxB6 0-5 min 6-10 min 11-15 min Figure 13: Test de Crawley. Exploration olfactive de l’interface « souris ». A) Temps total passé à renifler l’interface au cours du test (sec; moy±e.s.m.). ANOVA: effet fond génétique p=0,0017, test post hoc de Fisher * p<0,05 B6 vs B6xFVB; ** p<0,01 FVB vs FVBxB6; *** p<0,001 B6 vs FVBxB6. B) Ratio temps d'exploration olfactive interface souris sur temps d'exploration olfactive total (moy±e.s.m.) au cours du test par intervalles de 5 min. ANOVA: Tendance d’interaction du temps x génotype Fmr1 : p=0,0592.

1.4. Conclusion intermédiaire L’analyse du comportement social du test d’interaction sociale indirecte montre que les animaux KO ont une tendance significative à éviter l’entrée du compartiment où se trouve la souris stimulus en premier choix. Ce comportement se retrouve dans l’allongement de la latence pour entrer dans le compartiment et l’interface de la souris stimulus par rapport à la somme des latences de première entrée dans les deux compartiments. L’évitement initial n’est pas constant : les souris KO présentent un intérêt identique pour la souris inconnue à celui manifesté par les WT. Ce test ne montre pas de désintérêt chez les souris Fmr1 KO pour leurs congénères, en revanche il montre un effet discret mais constant d’une inhibition sociale initiale. Au niveau de l’activité, des différences entre arrière-fonds génétiques sont observés, notamment que les souris B6 ont une activité inférieure aux autres testées. Il est montré en outre une augmentation d’activité chez les KO par rapport aux WT. L’augmentation de la distance parcourue est due à l’augmentation de la vélocité et du temps de mobilité.

61 Résultats expérimentaux

2. Communication sociale : Vocalisations ultrasoniques chez le souriceau isolé 2.1. Principe Les vocalisations ultrasoniques ( ultrasonic vocalizations , USV) émises par les souriceaux non sevrés sont des sifflements dont la fréquence oscille entre 30 et 90 kHz (Branchi et al. , 2001). Elles sont associées à la récupération maternelle, c'est-à- dire au comportement de rapatriement du petit au nid par la mère. Les conditions et le profil d’émission des USV sont étudiés depuis les années 70. Les USV sont émises dans différentes conditions d’hypothermie ou de stimulation olfactive. Elles peuvent être modulées par des agents pharmacologiques ou les modifications génétiques. L’étude des USV est utilisée notamment pour étudier l’altération du comportement émotionnel lors du développement. La plupart des souriceaux avec des modifications génétiques en rapport avec le comportement social émettent moins de vocalisations à certains moments de leur développement (Moy & Nadler, 2008). C’est le cas des souris FOXP2 KO et hétérozygotes (Shu et al. , 2005). FOXP2 ( Forkheadbox ) est un gène encodant un facteur de transcription et dont la mutation chez les humains cause des troubles du langage. Les USV des souriceaux isolés sont également diminuées chez des souris mutantes pour l’ocytocine et pour le récepteur de l’ocytocine, des souris mutantes respectivement pour les sous-types 1A et 1B des récepteurs sérotoninergiques et des souris mâles reeler (Ognibene et al. , 2007,Winslow, 2000, Brunner et al. , 1999, El- Khodor et al. , 2004, Takayanagi et al. , 2005, Weller et al. , 2003). Cependant les souriceaux MeCP2 (mâles KO et femelles hétérozygotes) vocalisent plus aux jours postnataux 5 et 7, respectivement et les souris mutantes Dvl1 ne présentent pas de différence de vocalisations (Long et al. , 2004, Picker et al. , 2006 ). Les souriceaux émettent différents types de cris (Hahn & Lavooy, 2005). Par exemple la manipulation brutale provoque l’émission d’une combinaison de fréquences soniques (entre 20 Hz et 20 kHz) et de fréquences ultrasoniques (au-dessus de 20 kHz). L’isolation induit deux types de cris : les clicks et les sifflements. Les clicks durent quelques millisecondes et sont émis sur une gamme de fréquences large. Les sifflements durent autour de 40 ms et ont une fréquence principale plus nette autour de 55-75kHz. Le protocole de traitement que nous avons mis en place pour étudier les vocalisations ultrasoniques chez les souriceaux Fmr1 KO permet de quantifier les cris

62 Résultats expérimentaux mais également de les analyser qualitativement concernant leur durée, fréquence principale, variabilité de ces deux paramètres et la complexité des groupes de cris.

2.2. Matériel et méthodes 2.2.1. Spécificité de la gestion de l’élevage Les croisements sont effectués de la même manière que décrite dans le chapitre sur la gestion de l’élevage. Cependant, dans cette expérience les souris sont croisées dans une enceinte ventilée qui se trouve dans une pièce adjacente à la pièce d’enregistrement des vocalises. Les portées sont utilisées dans l’expérience à partir de la deuxième mise-bas d’une femelle. Au premier jour de l’expérience, les portées sont utilisées à partir de deux mâles et diminuées à 6 en gardant le maximum de mâles si la portée est plus grande afin de limiter le temps d’expérience que les petits passent sans leur mère à une demi-heure maximum. On n’utilise pas plus de deux portées d’une même mère dans l’effectif d’un groupe donné afin d’éviter de biaiser les résultats par le comportement maternel d’une femelle en particulier. Les femelles sont recroisées au minimum une semaine après le sacrifice de leur portée.

2.2.2. Enregistrement des vocalises Les enregistrements ont lieu en fin d’après-midi. Les souriceaux sont manipulés avec des gants pour qu’ils ne s’imprègnent pas de l’odeur de l’expérimentateur et éviter leur rejet par la mère. Le père est retiré de la cage au premier jour d’expérience. La mère est isolée dans une cage individuelle avec de l’eau et de la nourriture le temps de l’expérience. La cage contenant les petits est placée sous une lampe infrarouge 60W ( figure 14A ). Un thermomètre placé dans le nid permet de contrôler la température et de la stabiliser à 30±2°C. La température de la pièce d’enregistrement est de 20±2°C. On enregistre les vocalisations des souriceaux mâles pendant 130 sec les jours post-nataux (JPN) 1, 2, 4, 6, 8 et 10 de la manière suivante: un petit est placé dans une boîte de polystyrène (20x20x20cm) avec un fond de linoléum et un couvercle en plexiglas sous lequel est fixé le microphone d’un détecteur d’ultrasons (Bat detector U30, Ultrasound Advice, UK). Le détecteur est réglé sur la division de fréquence N÷10 et le signal peut alors être enregistré sur ordinateur avec une carte son classique. Le signal est enregistré par le logiciel Spectrogram 15 (Visualisation Software LLC, http://www.visualizationsoftware.com/gram.html ) avec

63 Résultats expérimentaux un échantillonnage de 48000 Hz en format standard WAVE (WAVEform audio format, figure 14B).

A B

Figure 14: USV chez les souriceaux isolés. A) Illustration de la pièce expérimentale. A droite, la lampe à infrarouge au- dessus du nid. Le fil dépassant du nid est celui du thermomètre (à l’arrière-fond). On voit l’intérieur de l’enceinte d’enregistrement (hors champ) sur le moniteur de contrôle à gauche. La fréquence principale du signal est divisée par 10 (boitier vert du microphone derrière l’ordinateur au centre). Le signal digital est enregistré avec une carte son classique sur le logiciel Spectrogramme. B) Exemples d’enregistrements sur Spectrogramme. De haut en bas: série de clicks , série de clicks et de sifflements irréguliers, série de sifflements réguliers.

Une caméra au dessus-du couvercle permet d’observer le comportement du souriceau dans la boîte et de noter des artefacts éventuels (escalade des parois, généralement à partir de JPN6). Suite à l’enregistrement, le souriceau est pesé, retourné sur le dos pour mesurer le temps de redressement (maximum 60s) et marqué sur le dos d’un numéro de reconnaissance à l’aide d’un marqueur métallisé non toxique (metallic 950 large, Stabilo, FR). Il est ensuite retourné au nid. Lorsque tous les petits ont été enregistrés et marqués, on procède à la récupération maternelle les 4 premiers jours où on replace la mère dans la cage de la portée que l’on remet dans l’enceinte ventilée. A la fin de l’expérience d’enregistrement des vocalisations les petits sont sacrifiés par décapitation, un échantillon de sang collecté pour génotypage et les mères sont placées en repos dans une nouvelle cage avec un nid propre. Un total de 71 animaux a été utilisé pour les analyses des enregistrements (B6 : WT=12, KO=11 ; B6 x FVB : WT=9, KO=8 ; FVB x B6 : WT=8, KO=10 ; FVB : WT=7, KO=6).

2.3. Traitement des données et analyse Les données traitées et analysées correspondent uniquement à celles des portées où les deux génotypes Fmr1 WT et KO sont représentés.

64 Résultats expérimentaux

A la suite d’une série de transformations de format les fichiers de vocalisations sont traités de manière automatisée par le logiciel Spike 2 (Cambridge Electronic Design, UK). Les fichiers enregistrés au format WAVE sont convertis en fichiers binaires pour pouvoir être importés et à nouveau convertis sous format SMR (symbolic music representation ) exploitable par Spike 2. Un script maison écrit par Daniel Cattaert permet de traiter les données des fichiers selon des paramètres que nous avons fixés. A des fins d’automatisation du traitement, les fichiers sont tous contrôlés pour les dix premières millisecondes qui ne doivent pas comporter de cri. Les fichiers sont coupés au besoin. Ils sont également contrôlés pour la durée minimale (120 sec). Le script détermine le bruit de fond en échantillonnant 10 ms en début d’enregistrement (figure 15). La division de fréquence génère l’apparition d’artefacts lorsque les cris sont puissants : on observe l’apparition d’harmoniques de la fréquence principale d’intensité inférieure. Ces artefacts apparaissent à des fréquences supérieures multiples de la fréquence principale (par exemple pour un cri à 65 kHz, les artefacts se trouveront à 130 et 195 kHz). Nous avons donc limité le traitement du signal à 120 kHz. Chaque pic du signal qui dépasse positivement ou négativement l’intensité du bruit de fond est déterminée comme « évènement » ( fig. 15-1). Lorsque la fréquence entre deux évènements dépasse 30 kHz (0,003 sec entre deux évènements), Spike 2 initie « une bouffée » ( fig. 15-2). Cette bouffée est comptée comme vocalisation si elle répond aux critères suivants : la fréquence entre deux évènements dans une vocalisation est au moins supérieure à 20 kHz, la durée minimum du cri est de 5 ms ou 20 évènements. Si deux cris sont séparés de moins de 50 ms, ils sont fusionnés ( fig. 15-6&7 ). Les vocalises étant souvent modulées et composées, nous avons créé une fonction d’analyse des vocalisations qui en quantifie les composantes discriminées par la chute de fréquence dont le seuil est établi à un tiers de la fréquence maximale de l’enregistrement (fig. 15-3&8 ). Ce traitement permet de déterminer le nombre de vocalisations, leur durée, la fréquence et l’amplitude moyenne d’un cri ainsi que l’intervalle avec le cri suivant. La variabilité de ces paramètres est également étudiée par l’analyse de leur écart-type moyen pour chaque enregistrement. Le résultat est donné sous forme de plusieurs fichiers textes par animal qui sont traités de manière automatisée sur Excel par une macro écrite avec le concours d’Alain Marchand. Le résultat est analysé avec Statview et SAS (SAS Institute Inc., USA).

65 Résultats expérimentaux

5 4 8

3

7 6 2

Bruit de fond 1

5 4 8

3

7 6 2

1

Figure 15: Quelques étapes du traitement des fichiers USV sur Spike 2. Deux exemples de cris. 1- Signal enregistré. 2- Evènements d’intensité supérieure au bruit de fond. 3- Décours temporel de la fréquence. La ligne en pointillés délimite le tiers de la fréquence maximale, seuil de découpage des composantes des vocalisations. 4- Début d’une bouffée d’évènements (fréquence supérieure à 30 kHz). 5- Fin de la vocalisation finale. 6- Bouffées. 7- Fusion si moins du 10 ms d’intervalle avec les bouffées voisines: vocalisations. 8- Composantes de la vocalisation lorsque la fréquence descend en dessous du seuil déterminé.

2.4. Résultats Développement

Le poids des souriceaux dépend du type de croisement (F 3,62 =17,250, p<0,0001). Son évolution au cours du développement est aussi dépendante du fond génétique (effet jour :F 5,310 =2167,619, p<0,0001, JPN x fond génétique : F 15,310 =8,439, p<0,0001). Au JPN 1 les souriceaux pèsent entre 1,8 et 2 g et au JPN 10 les B6 et BF x FVB pèsent autour de 6,5 g, les FVB pèsent autour de 7 g et les FVB x B6 pèsent

66 Résultats expérimentaux environ 8 g. Les FVB x B6 connaissent la croissance la plus forte et sont globalement plus lourds que les autres croisements (vs B6 et B6 x FVB, p<0,0001, vs FVB, p=0,0002). Les B6 sont significativement les moins lourds (vs FVB, p=0,0003 ; vs B6 x FVB, p=0,0102). La latence de redressement et son évolution au cours du développement est aussi dépendante du type de croisement (fond génétique : F 3,45 =23,431, p<0,0001 ;

JPN : F 5,225 =8,412, p<0,0001 ; JPN x fond génétique F 15,225 =6,550, p<0, 0001). Les souriceaux B6 sont significativement moins rapides à se redresser ( p<0,0001 vs les trois autres croisements). Effectivement la plupart d’entre eux ne sont pas capables de se retourner sur le ventre au bout de 60 sec les quatre premiers JPN mais sont à une moyenne de 1,25 sec au JPN 8. Par contraste les FVB ont une latence de redressement entre 5 et 20 sec les 8 premiers JPN. La latence de redressement des F 1 est de moins de 10 sec les premiers jours et réduit rapidement, dès le JPN 4 pour les FVB x B6 et dès le JPN 6 pour les B6 x FVB. Tous les groupes ont une moyenne de redressement inférieure à une seconde le dernier jour du test. Il n’y a aucun effet de la mutation sur le poids ou la latence de redressement, ni comme facteur principal, ni en interaction avec les autres facteurs.

Nombre de vocalisations Le nombre de vocalisations émises augmente au cours du temps

(F 5,295 =19,378, p<0,0001). La moyenne du nombre de vocalisation varie entre 65 et 90 selon les groupes au JPN 1 et entre 145 et 200 le dernier jour de l’expérience ( tableau I). Les souriceaux des croisement hybrides font significativement plus de vocalisations que les lignées pures au JPN 4 (JPN x fond génétique : F 15,295 =2,178, p=0,0072 ; jour 4 :

F3,59 =8,203, p=0,0001, B6 vs F1 : p<0,0001, FVB vs FVB x B6 : p<0,05, FVB vs B6 x FVB : p<0,01). Le nombre moyen de clicks par groupe varie entre 15 et 40 au JPN 1 et entre 7 et 30 au JPN 10, le nombre moyen de sifflements par groupe varie entre 50 et 63 au JPN 1 et entre 98 et 170 au JPN 10. La proportion de sifflements par rapport aux vocalisations totales varie très largement autour de 65%. Outre l’influence par le fond génétique (F 3,56 =20,668, p<0,0001) et l’interaction du fond génétique avec le temps

(F 15,280 =4,686, p<0,0001), on observe que chez la lignée B6 en particulier, la mutation Fmr1 a pour effet de diminuer la proportion de sifflements par rapport aux WT en fonction des jours (ANOVA : JPN x fond génétique x mutation : F 15,280 =1,829, p=0,0306 ; B6 : JPN x mutation : F 5,85 =2,811, p=0,0209, JPN 2 : F 1,17 =4,794, p=0,0428,

67 Résultats expérimentaux

JPN 8 : F 1,17 =11,877, p=0,0031). Cet effet est accompagné d’une augmentation significative du nombre de clicks au JPN 2 par rapport aux WT (F 1,24 =4,454, p=0,0454).

GT n JPN 1 JPN 2 JPN 4 JPN 6 JPN 8 JPN 10 +/Y 12 98±15 72 ±16 33 ±11 110 ±24 117 ±27 177 ±14 B6 -/Y 11 92 ±19 99 ±22 40 ±8 98 ±26 62 ±14 167 ±33 +/Y 9 108 ±13 67 ±27 143 ±27 123 ±47 160 ±48 143 ±27 B6 x FVB -/Y 8 57 ±14 102 ±22 108 ±24 153 ±39 166 ±32 151 ±24 +/Y 8 80 ±6 63 ±15 58 ±23 170 ±27 145 ±50 169 ±62 FVB -/Y 10 54 ±14 39 ±10 72 ±25 202 ±15 127 ±48 204 ±68 +/Y 7 59 ±11 34 ±10 90 ±23 175 ±40 100 ±26 150 ±46 FVB x B6 -/Y 6 78 ±18 61 ±23 147 ±32 135 ±33 154 ±43 210 ±68 Tableau I - Nombre de vocalisations (±e.s.m.) enregistrées lors de l’isolement des souriceaux durant 2 min. n: nombre de souriceaux par groupe, GT: génotype Fmr1 , JPN: âge en jours post-nataux

Paramètres des vocalisations L’ensemble des paramètres que nous avons étudiés de fréquence ultrasonique, de durée, d’amplitude des sifflements, de variabilité de ces trois paramètres et de composantes des vocalisations sont soumis à des effets jour, et/ou arrière-fond génétique, et/ou l’interaction de ces deux facteurs dont les détails sont données sous formes de tableau en annexe (données exactes de l’analyse et détail des interactions avec le temps, sans indication du sens des effets). L’analyse n’a pas détecté d’effet global du génotype mais on trouve des interactions doubles ou triples avec la mutation sur les paramètres de fréquence moyenne d’émission des vocalisations, la durée et l’écart-type de la durée moyenne des sifflements et le nombre de composantes des vocalisations sur lesquelles nous avons concentrée notre analyse ( tableau II ).

AF x M LSMeans JPN x M JPN x AF X M JPN6 JPN8 Fréquence moyenne sifflements (kHz) - - - * AF x M: * -

Durée moyenne F15,280 =1,63 sifflements (sec) * B6 WT vs KO: ** * p=0,0659 AF x M: * M: *

Ecart-type durée F5,280 =2,26 AF x M: sifflements * B6 WT vs KO: * p=0,0599 * ** M: ** Nombre de composantes des vocalisations - - *** - M: * M: ** Tableau II: Synthèse des effets de la mutation Fmr1 détectés par l’analyse statistique (ANOVA et Test post-hoc: Least Square Means). Légende: JPN: AF: arrière-fond, M: mutation, JPN: Jour post-natal. Significativité p<0,05 : *; p<0,01: **; p<0,001: ***; p<0,0001:**** Tendances indiquées pour p<0,1.

68 Résultats expérimentaux

La durée moyenne des sifflements et l’écart-type moyen de la durée des sifflements sont significativement diminués chez les KO de fond B6 de manière globale

(figure 16 : durée moyenne sifflements : fond génétique x mutation : F 3,56 =3,22, p=0,0293, LSMeans : z=3,1372, p=0,0028 ; figure 17 : écart-type moyen durée des sifflements : F 3,56 =3,05, p=0,0359, LSMean : z=2,5805, p=0,0125).

** 120 B6 120 B6 x FVB 100 100 80 80 60

(ms) 60 40 40 20 20 0 0 +/Y 120 FVB 120 FVB x B6 -/Y 100 100 80 80

(ms) 60 60 40 40 20 20 0 0 JPN 1 JPN 2 JPN 4 JPN 6 JPN 8 JPN 10 JPN1 JPN 2 JPN 4 JPN 6 JPN 8 JPN 10 Figure 16: Durée moyenne des sifflements émis par les souriceaux lors de l’isolation (ms ± e.s.m.). JPN: Jour post- natal. Détail de l’ANOVA principale dans l’annexe. Post-hoc: LSMeans, B6 WT vs KO: z= -3,1372 p=0,0028; JPN 6: B6 x FVB, KO vs WT: F 1,15 =9,975 ** p=0,0065; JPN 8: effet mutation: F 1,56 =6,5 p=0,0129;

** 120 B6 120 B6 x FVB 100 100 80 80 60 60 (ms) 40 40 20 20 0 0

120 FVB 120 FVB xB6 +/Y 100 100 -/Y 80 80 60 60 (ms) 40 40 20 20 0 0 JPN1 JPN 2 JPN 4 JPN 6 JPN8 JPN 10 JPN 1 JPN 2 JPN 4 JPN 6 JPN 8 JPN 10 Figure 17: Ecart-type de la durée moyenne des sifflements émis par les souriceaux isolés au cours de leur développement (ms ± e.s.m.). JPN: Jour post-natal. Détail de l’ANOVA principale dans l’annexe. LSMeans, B6 WT vs KO: z= -2,5805 p=0,0125, JPN 6: B6 x FVB, KO vs WT: F1,15=10,459 **p=0,0056; JPN 8: effet mutation: F1,61=6,205 p=0,0155

On observe que toutes les triples interactions convergent vers un effet de la mutation sur le fond génétique B6 x FVB au jour post-natal 6 (détails de l’ANOVA en annexe, figures 16, 17, 18 et 19 ). Les KO présentent une fréquence d’émission des sifflements plus basse, une augmentation de la durée et de la variabilité de la durée ainsi qu’une augmentation du nombre de composantes des vocalisations.

69 Résultats expérimentaux

L’effet de la mutation est également significatif au jour post-natal 6 chez les souris FVB mais seulement pour la diminution de fréquence d’émission ultrasonique et pour l’augmentation du nombre de composantes dans les vocalisations ( figures 18 et 19 ). Il est à noter que l’effet de la mutation semble plus léger chez les FVB que chez les B6 x FVB, que les KO FVB présentent aussi une tendance d’augmentation de durée des sifflements et de variabilité de la durée et que le faible effectif des animaux analysés peut rendre compte du fait que ces deux paramètres ne soient pas significativement différents. Il y a de manière similaire une convergence des doubles interactions mutation x JPN vers un effet de la mutation sur tous les fonds au jour post-natal 8 (détails de l’ANOVA en annexe, figures 16, 17, 18 et 19 ). Les KO présentent au jour post-natal une fréquence d’émission des sifflements plus haute, une diminution de la durée et de la variabilité de la durée ainsi qu’une diminution du nombre de composantes des vocalisations.

+/Y 80 Jour post-natal 6 * 80 Jour post-natal 8 75 75 -/Y 70 * 70 65 65 60 60 (kHz) 55 55 50 50

0 0 B6 x FVB B6 FVB FVB x B6 B6 x FVB B6 FVB FVB x B6 Figure 18: Fréquence moyenne des sifflements émis par les souriceaux isolés aux jour post-nataux 6 et 8 (kHz ± e.s.m.). Voir le détail de l’ANOVA principale en annexe. JPN 6: B6xFVB KO vs WT, F 1,15 =8,112 * p=0,0122 et FVB KO vs WT, F1,11 =5,112 * p=0,0450. JPN 8: effet mutation: F 1,61 =8,967 p=0,0040.

Jour post-natal 6 Jour post-natal 8 10 10 +/Y ** -/Y 8 8 * 6 6

4 4

2 2

0 0 B6 x FVB B6 FVB FVB x B6 B6 x FVB B6 FVB FVB x B6

Figure 19: Nombre moyen de composantes dans les vocalisations émises par les souriceaux isolés (±e.s.m.). Détails de l’ANOVA principale en annexe. JPN 6: B6 x FVB KO vs WT: F 1,15 =15,914 **p=0,0012, FVB KO vs WT: F 1,11 =5,855 *p=0,0340; JPN 8: KO vs WT: F 1,50 =10,453 p=0,0022.

70 Résultats expérimentaux

2.5. Conclusion intermédiaire Ces résultats montrent que la mutation Fmr1 n’interfère pas sur la quantité de vocalisations émises mais sur ses modalités. La mutation exerce un effet sur les paramètres des vocalisations tels que la fréquence ultrasonique, la durée, la variabilité de la durée et le nombre de composantes des vocalisations. Cet effet de la mutation s’exerce tout au long de l’expérience sur deux de ces paramètres (diminution de la durée et de la variabilité de la durée des cris) chez les B6, bien qu’il soit plus important aux jours 6, 8 et 10. Un effet plus spécifique de la mutation s’exerce dans les quatre paramètres pré-cités chez le croisement B6 x FVB au jour post-natal 6. On observe une diminution de la fréquence des sifflements ultrasoniques, une augmentation de la durée, de la variabilité de la durée et du nombre de composantes des vocalisations). Ces effets sont présents dans une moindre mesure mais avec une tendance semblable chez les FVB. Enfin un effet de la mutation s’exerce sur tous les fonds génétiques au jour post-natal 8 dans le sens opposé : augmentation de la fréquence des sifflements, diminution de la durée des cris, de leur variabilité et du nombre de composantes des cris.

71 Résultats expérimentaux

3. Intérêts restreints, rigidité cognitive et stéréotypies : Extinction d’un apprentissage appétitif dans un labyrinthe en T 3.1. Principe Nous avons cherché étudier à la rigidité cognitive des souris Fmr1 KO et dans ce but avons mis au point le test présenté. Il s’agit d’évaluer la capacité à explorer à nouveau le labyrinthe après un apprentissage fortement instauré. Dans ce test, les souris apprennent à trouver et manger une boulette de nourriture dans le bras appâté d’un labyrinthe en T en utilisant un protocole « non-corrigé ». Lorsqu’elles ont atteint le critère d’au moins 9 bonnes réponses sur 10 essais durant trois jours consécutifs, le labyrinthe n’est plus appâté. La latence d’extinction est mesurée comme le temps nécessaire à la souris pour explorer à nouveau le labyrinthe et avoir une performance inférieure à 7 choix du bras antérieurement appâté, toujours sur dix essais.

3.2. Matériel et méthodes Une semaine après le test de Crawley, les animaux sont pesés et isolés (B6 : 15WT/15KO, B6xFVB : 14WT/14KO, FVBxB6 : 11WT/12KO, FVB : 14WT/15KO). Ils sont mis en privation alimentaire deux jours avant l’habituation au labyrinthe. Le premier jour de la privation ils reçoivent 3g de nourriture, puis 2 et 1g. Les jours suivant les animaux sont nourris après le test et la quantité de nourriture est adaptée de manière individuelle à chaque animal pour qu’il se maintienne à 85% de son poids de référence. Les animaux passent quotidiennement une heure au repos dans la salle expérimentale après leur transfert de l’animalerie et avant leur passage dans le labyrinthe pour éviter un effet de stress du changement de pièce chez les premiers à passer. Le labyrinthe en T est constitué de 4 bras pivotants permettant de ramener la souris en position de départ sans la toucher ( figure 20 , dimensions des bras: 4x6x25cm, Imetronics, Bordeaux, FR). Le Figure 20: Labyrinthe en T. Le centre pivotant fait coulisser les bras opposé à celui du départ n’est extrémités des bras et permet de ramener les souris des mangeoires au point de départ (extrémité du bras central) sans les manipuler. Le bras jamais accessible à la souris. opposé au bras de départ est inaccessible à la souris.

72 Résultats expérimentaux

Habituation La veille du premier jour d’apprentissage, les souris sont placées dans le box de départ pendant 5 secondes avant son ouverture et passent ensuite 10 min d’exploration libre dans le labyrinthe non appâté. Les directions prises à partir du bras central sont quantifiées pour détecter un éventuel biais. Les souris reçoivent 5 petites croquettes de nourriture (contenant du lait, dairy pellets 20mg, Bio-Serv, FR) à leur retour de cage afin de les habituer à cette nourriture nouvelle. Elles sont nourries avec leur nourriture régulière après l’habituation.

Test Un des deux bras du labyrinthe est systématiquement appâté avec une petite croquette pour chaque animal donné. Si la souris a montré une préférence pour un bras lors de l’habituation, on choisi d’appâter le bras opposé à celui préféré. Si elle n’a pas montré de préférence, le bras appâté est choisi de manière aléatoire et équilibré entre les deux côtés à l’intérieur des groupes expérimentaux. Lors d’un essai, le sujet est placé dans le box de départ du bras central pendant 5 secondes avant d’ouvrir la porte. Le premier jour, si la souris visite le bras non appâté en premier on la laisse aller dans l’autre bras. On finit l’essai lorsque la nourriture est consommée ou après trois minutes. Les jours suivants on confine la souris dans le premier bras visité pendant 5 secondes avant de la ramener dans le bras central. La durée de l’essai n’est pas limitée lorsque la souris se trouve dans le bras appâté et ne consomme pas la nourriture. Les souris font 10 essais par jour, le critère d’apprentissage est atteint lorsqu’une souris fait au moins 9 bonnes réponses par séance trois jours successifs. Les souris n’ayant pas appris au bout de trente jours (1 FVBxB6 WT et 1 FVB KO), ainsi que les souris qui ont fait des crises spasmodiques ou des absences (2 FVB KO) ont été exclues du test. Lorsque le critère d’apprentissage est atteint, on cesse d’appâter le labyrinthe jusqu’à ce que la souris recommence à visiter le labyrinthe. Le critère d’extinction est fixé à un niveau intermédiaire entre l’apprentissage et le seuil de hasard : 7 essais ou moins dans le bras préalablement appâté.

73 Résultats expérimentaux

3.3. Résultats Apprentissage Les souris atteignent le critère d’apprentissage en 8 à 13 jours en moyenne selon les groupes ( figure 21 ). L’ANOVA des performances d’apprentissage révèle un fort effet de l’arrière-fond génétique (F3, 102 =5,395, p=0,0017). Elle ne permet de détecter aucun effet de la mutation ni d’interaction de la mutation avec l’arrière fond génétique (F 1, 102 =1,642, ns et F 3, 102 =1,639, ns respectivement). Le test post-hoc de Fisher confirme l’effet de l’arrière-fond : les animaux issus du croisement FVBxB6 apprennent significativement moins rapidement que les animaux B6 et FVB (p<0,05 et p<0,001 respectivement), et les souris B6xFVB apprennent significativement moins vite que les FVB (p<0,05).

16 * 14 * ** 12 10 8 WT Jours 6 KO 4 2 0 B6 B6xFVB FVB FVBxB6

Figure 21: Performances d’apprentissage dans le labyrinthe en T en jours (moy ±e.s.m.). ANOVA: effet du fond génétique F 3,102 =5,395 p=0,0017. Test post-hoc de Fisher: ** p<0,001 FVB vs FVBxB6, * p<0,05 FVB vs B6xFVB et B6 vs FVBxB6.

Extinction Lorsque l’on cesse d’appâter le labyrinthe, les souris mettent entre 2,5 et 4 jours en moyenne selon les groupes pour visiter 3 fois ou plus lors d’une session le bras qui n’a jamais été appâté. L’ANOVA réalisée sur les performances d’extinction ne met en évidence aucun effet des facteurs étudiés. L’analyse du nombre d’essais non renforcés que font les souris avant d’explorer le bras non-appâté ( figure 22A ) révèle cependant un effet de l’arrière-fond génétique (F 3, 102 =3,353, p=0,0219). Le test post- hoc de Fisher confirme cet effet. Les souris FVB font plus d’essais non renforcés que les croisements B6xFVB et FVBxB6 avant d’aller explorer l’autre bras (p<0,05 et p<0,01 respectivement).

74 Résultats expérimentaux

L’analyse du nombre d’essais avant d’alterner deux fois les bras visités lors de l’extinction ne révèle aucun effet significatif (moyenne entre 13 et 18 essais selon les groupes). L’analyse du nombre d’essais avant de visiter deux fois consécutives le bras jamais appâté ( figure 22B ) révèle une interaction entre l’arrière fond génétique et la mutation Fmr1 (moyenne entre 12 et 32 essais ; F 3, 102 =5,938, p=0,0009). Les souris B6xFVB WT font significativement plus d’essais que les KO avant de visiter deux fois consécutives l’autre bras (31,5 essais vs 13,6 essais ; F 1,23 =9,868, p=0,0046). Les animaux FVB WT présentent quant à eux une tendance à faire moins d’essais que les KO avant de visiter deux fois consécutives l’autre bras ( ; F 1,25 =3,419, p=0,0763) L’analyse des autres fonds génétiques ne révèle aucun effet de la mutation.

A * B ** 12 40 WT ** 10 35 KO 30 8 25 6 20 4 15 10 2

Essais non-renforcés 5 0 0 B6xFVBB6 FVB FVBxB6 B6xFVB B6 FVB FVBxB6

Figure 22: Extinction de l’apprentissage dans le labyrinthe en T. A) Nombre d'essais non renforcés avant de visiter le bras jamais appâté lors de l’extinction dans le labyrinthe en T (moy±e.s.m.). ANOVA: effet du fond génétique F 3,102 =3,353 p=0,0219; test post-hoc de Fisher: * FVB vs B6xFVB p<0,05; ** FVB vs FVBxB6 p<0,01. B) Nombre d'essais non renforcés avant de visiter le bras jamais appâté deux fois consécutives lors de l’extinction dans le labyrinthe en T (moy±e.s.m.). ANOVA: interaction fond génétique F 3,102 =5,938 p=0,0009, test post-hoc de Fisher: ** B6xFVB: WT vs KO p<0,01. Tendance non significative dans le groupe FVB: WT vs KO où p=0,0763.

3.4. Conclusion intermédiaire Les performances d’apprentissage sont influencées par l’arrière-fond génétique : les souris FVBxB6 mettent plus de temps à atteindre le critère d’apprentissage que les B6 et les FVB, et les B6xFVB sont plus longues à atteindre ce critère que les FVB. Il est intéressant de constater que dans cet apprentissage les animaux issus de croisements hybrides n’ont pas des performances intermédiaires ou supérieures aux animaux de lignées pures. En revanche on ne constate pas d’effet de la mutation Fmr1 ou d’interaction fond génétique et mutation sur les performances d’apprentissage. Il y a également un effet de l’arrière-fond génétique dans le nombre d’essais non renforcés que les souris font avant d’aller explorer le bras qui n’a jamais

75 Résultats expérimentaux

été appâté. Les souris FVB qui ont rapidement appris le test mettent significativement plus de temps à explorer à nouveau l’autre bras que les animaux issus des croisements hybrides B6xFVB et FVBxB6. Les KO FVB présentent une tendance à être plus longues à visiter deux fois consécutives le bras jamais appâté alors qu’elles ne sont pas plus longues dans l’extinction ni avant d’alterner deux fois les visites dans les deux bras du labyrinthe, ce qui semble indiquer un comportement d’alternance fort chez ces souris. En revanche les souris B6 x FVB KO sont significativement plus rapides que les WT pour visiter deux fois consécutives le bras jamais appâté, un résultat qui donne un indice de persévération de nature différente à celle étudiée dans ce test et qu’il serait judicieux d’examiner ultérieurement.

76 Résultats expérimentaux

II. TRAITS AUTISTIQUES VARIABLES 1. Agressivité : test de résident-intrus 1.1. Principe Différentes méthodes sont utilisées pour phénotyper la dominance ou l’agressivité chez les souris. Le test de dominance sociale dans un tube utilisé par Spencer montre que les souris Fmr1 KO sont moins dominantes, leur agressivité est diminuée lorsque la souris opposée est inconnue (Spencer et al., 2005). Dans le test d’adversaire standard réalisé chez les souris Fmr1 KO de fond B6, très peu d’attaques avaient été observées (Mineur et al. , 2002). Dans ce type de test, une souris dont l’agressivité est à caractériser est opposée à une autre dans un environnement neutre pour évaluer son statut de dominance ou d’agressivité. Nous avons décidé d’utiliser un test de résident-intrus pour augmenter la probabilité d’attaque ou de manifestations agressives et observer une éventuelle différence due à la mutation. Dans le test de résident-intrus , la souris à tester est isolée pendant plusieurs semaines, ce qui induit une modification de son comportement social (particulièrement une augmentation d’agressivité chez les mâles). Le test a lieu dans la cage de résidence de la souris expérimentale. L’adversaire standard est l’intrus, qui pénètre le territoire de la souris résidente (Crawley, 2000).

1.2. Matériel et méthodes Les animaux isolés lors du labyrinthe en T sont testés trois semaines après la fin de ce test (B6 : 15WT/15KO, B6xFVB : 13WT/13KO, FVBXB6 : 14WT/14KO, FVB : 11WT/11KO). La cage n’est pas changée pendant une semaine avant le test du résident-intrus. Le jour du test, les animaux expérimentaux et les souris stimuli (SSt), des mâles A/JOlaHsd (Harlan, Fr) utilisés dans le test d’interaction indirecte pour la faible agressivité de cette lignée (Kessler et al., 1977), sont mis dans la pièce expérimentale 1h avant pour habituation. Une SSt est ensuite introduite dans la cage d’une SE. On mesure le temps de premier contact olfactif (reniflement) et qui en est l’initiateur ainsi que la latence et le nombre de battements d’impatience de la queue du résident (« tail rattling »), souvent signe précurseur d’attaque, la latence de première attaque et la fréquence des attaques. La fréquence d’autres traits secondaires d’agressivité ou de marques d’anxiété sont également relevés : le toilettage intensif de l’intrus, les poursuites, les tentatives d’accouplement, la fouille de la litière et les

77 Résultats expérimentaux tentatives de fuite de la cage. Le test est arrêté après 10 min, durée au-delà de laquelle la probabilité d’une attaque est fortement réduite. Le test est répété le lendemain avec un intrus différent.

1.3. Résultats La latence du premier contact olfactif avec la souris intrus diminue le second jour : elle varie entre 15 et 25 s le premier jour et entre 10 et 20 s le second jour (figure 23A). L’ANOVA de mesures répétées révèle effectivement un effet temps

(F 1,100 =7,966, p=0,0058). Un effet du fond génétique est également mis en évidence

(F 1,100 =3,187, p=0,0270) : les animaux FVB mettent significativement plus de temps avant de renifler l’intrus que les animaux des autres fonds génétiques (FVB vs B6, p<0,01 ; FVB vs B6xFVB et FVBxB6, p<0,05). On a observé assez peu d’attaques lors de ce test, avec cependant une augmentation le second jour ( figure 23B). Etant donné le peu d’attaques observées nous ne présentons ici que la fréquence de souris attaquantes dans les différents groupes et non la fréquence d’attaque d’une même souris. Les souris intruses n’ont, comme attendu, jamais attaqué. Les groupes expérimentaux dans lesquels les animaux ont fait le plus d’attaques sont les groupes WT et KO du croisement FVBxB6 avec 20% le premier jour et 36% le second jour. Les animaux WT et KO de fond génétique B6 et FVB ont fait moins d’attaques, ceux issus du croisement B6xFVB n’ont jamais attaqué. L’ANOVA de mesures répétées révèle que les effets du jour et du fond génétique sont significatifs (Jour : F1,100 =4,693, p=0,0327 ; fond génétique : F 1,100 =3,581, p=0,0165). Le test post hoc de Fischer confirme que les animaux FVBxB6 attaquent significativement plus que les animaux B6 ( p<0,05) et B6xFVB ( p<0,001). On ne trouve pas d’effet de la mutation ou d’interaction fond génétique x mutation

(respectivement F 1,100 =0,499, ns ; F 1,100 =0,105, ns ). On trouve qualitativement les même résultats suite à l’analyse de la latence des battements d’impatience de la queue concernant le fond génétique

(ANOVA : F 1,100 =4,891, p=0,0033, test de Fischer : FVBxB6 vs B6, p<0,05 ; FVBxB6 vs B6xFVB : p<0,001), mais il n’y a plus d’effet du temps (F 1,100 =1,967, ns ). Les comportements de toilettage agressif de l’intrus ou de poursuite ne sont pas influencés par les paramètres de fond génétique, de mutation Fmr1 ou de temps.

78 Résultats expérimentaux

Enfin, en analysant le comportement de fouille de la litière en présence de l’intrus, on trouve un effet du fond génétique (F1,100 =3,081, p=0,0309) et le test post hoc de Fisher confirme que les animaux B6 présentent plus ce comportement que les trois autres fonds génétiques ( p<0,05).

* * A ** B 40 ** 40 35 35 30 30 25 25 20 % 20 Jour 1 (s) 15 15 Jour 2 10 10 5 5 0 0

WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO

B6xFVB B6 FVB FVBxB6 B6xFVB B6 FVB FVBxB6 Figure 23 : Test de résident-intrus. A) Latence de premier contact olfactif (sec ± e.s.m.). Diminution le second jour chez tous les groupes. ANOVA: effet temps F 1,100 =7,966 p=0,0058; effet fond génétique F 1,100 =3,187 p=0,0270. Test post-hoc de Fisher: * FVB vs B6 p<0,05; ** FVB vs B6xFVB et FVBxB6 p<0,01. B) Pourcentage de souris attaquantes lors du test de résident- intrus. ANOVA: effet temps F 1,100 =4,693 p=0,0327; effet fond génétique F 1,100 =3,581 p=0,0165. Test post-hoc de Fisher: * FVBxB6 vs B6 p<0,05; ***FVBxB6 vs B6xFVB p<0,001

1.4. Conclusion intermédiaire Ce test a permis de mettre en évidence des différences de l’arrière-fond génétique dans le nombre d’attaques constatées. Chez trois fonds génétiques on a constaté une augmentation du nombre de signes agressifs au deuxième jour. Les souris FVBxB6 attaquent plus que les souris B6 et que les B6xFVB qui elles, n’ont jamais attaqué l’intrus. Il est intéressant de noter que les deux groupes F1 sont les plus extrêmes. Cette différence réciproque indique un effet possible du chromosome Y (Roubertoux et al., 1994). Le temps de premier contact, réduit uniformément chez tous les groupes le deuxième jour est plus long chez les animaux FVB par rapport aux autres arrière- fonds. La fréquence de fouille de la litière, indicateur de stress, est plus élevée chez les souris B6 que les trois autres arrière-fonds.

79 Résultats expérimentaux

2. Activité, rythme circadien et stéréotypies : cages d’actimétrie 2.1. Principe Jusqu’à récemment l’activité des souris Fmr1 KO n’avait été mesurée dans des open-fields ou des cages d’actimétrie que sur des périodes d’une dizaine à quelques dizaines de minutes, qui ne permettent pas de discriminer l’habituation à un environnement nouveau de l’activité motrice proprement dite. L’étude de l’activité des souris en cage d’actimétrie sur plusieurs heures permet de discriminer ces deux facteurs. L’étude sur deux jours comme nous l’avons fait permet également d’étudier de manière plus approfondie les motifs d’activités des souris : la proportion d’activité diurne et nocturne, les pics d’activité, alternance des cycles d’activité-inactivité sur 24h. Elle nous permet d’appréhender chez les souris Fmr1 KO des traits tels que les troubles du sommeil et les stéréotypies qui sont souvent associés au X Fragile et à l’autisme.

2.2. Matériel et méthodes Trois à six jours après le test d’interaction sociale directe, les animaux sont placés en cage d’actimétrie individuelles pendant 48h (FVB : 19WT/18KO, FVBxB6 : 11WT/10KO, B6xFVB : 10WT/13KO). Les cages d’actimétrie ( figure 24, 11x21x17cm, Imetronics, FR) sont éclairées suivant le même cycle qu’en animalerie (lumière 7 :00-19 :00) et sont encloses dans une enceinte. Le sol est constitué d’une plaque métallique grillagée sous laquelle se trouve de la litière propre. Des cellules photoélectriques sont réparties sur deux niveaux horizontaux à l’avant et à l’arrière de la cage. La rupture des faisceaux entre les cellules correspondantes lorsque la souris bouge permet le comptage automatique de son activité horizontale (allers et retours, AR) et verticale (redressements ou sauts, RE). Les souris sont placées dans les cages à 11 :00. On vérifie le lendemain à 10 :00 la disponibilité de l’eau et de la nourriture. A la fin du test d’actimétrie les souris sont regroupées dans leur cage collective initiale dont on ne change pas la litière pendant leur absence. Figure 24: illustration des cages d’actimétrie

80 Résultats expérimentaux

Les redressements sont généralement interprétés comme un indice d’exploration (Arndt & Surjo, 2001; J. N. Crawley, 1985; Crusio, 2001). On analyse l’habituation au nouvel environnement lors des premières heures dans les cages d’actimétrie puis l’activité et l’organisation de l’activité des animaux sur 24h le deuxième jour: l’activité diurne par rapport à l’activité totale et les cycles d’activité-inactivité (AI). On définit l’inactivité par l’absence d’AR et de RE par intervalles de 10 min. Deux animaux ont été exclus des analyses (un FVB et un B6xFVB, tous deux WT) car ils présentaient une activité largement supérieure à tous les autres animaux due à des stéréotypies (hypothèse vérifiée par l’observation de leur comportement dans la cage).

2.3. Résultats Habituation : L’ANOVA des allers-retours effectués lors de la première heure passée dans les cages d’actimétrie par intervalles de 10 min ( figure 25) révèle que les KO sont significativement plus actifs que les WT (F 1,75 =6,665, p=0,0118). L’activité est

également influencée par le du fond génétique (F 2,75 = 3,650, p=0,0307). Les animaux issus du croisement FVBxB6 sont significativement plus actifs lors de la première heure que ceux des groupes FVB et B6xFVB ( p<0,05). Tous les groupes réduisent fortement leur activité locomotrice initiale au cours de la première heure, indiquant qu’ils s’habituent à la cage d’actimétrie (F 5,375 =66,094, p<0,0001). La cinétique de cette diminution est influencée par le fond génétique (F 10,375 =2,692, p=0,0034). Les KO font aussi plus de redressements au cours de la première heure que les WT (F 1,75 =9,806, p=0,0025). La fréquence des redressements lors de la première heure et par intervalles de 10 min ( figure 25) est comme pour les allers-retours soumise

à un effet du fond génétique (F 2,75 = 4,200, p=0,0187). Le test post-hoc confirme que les animaux FVBxB6, ainsi que les FVB, font plus de RE que les animaux B6xFVB

(p<0,05). L’habituation est également influencée par le fond génétique (temps : F 5,375 =

45,276, p<0,0001, temps x fond génétique : F 10,375 = 2,455, p= 0,0075). La diminution de la fréquence de RE des animaux B6xFVB est plus forte que celle des deux autres arrière-fonds (p<0,05). On observe également une tendance presque significative d’interaction du temps avec la mutation due au fait que la fréquence de redressement des WT est pratiquement à son minimum dès 40 min tandis que la fréquence de RE des KO, supérieure aux WT dès le début, continue de diminuer jusqu’au dernier intervalle

(F 5,375 = 2,161, p=0,0578).

81 Résultats expérimentaux

* A 50 Allers-retours 45 Figure 25: Cage d’actimétrie. Activité 40 lors de la première heure, intervalles de 35 10 min. 30 A) Fréquence des allers-retours (moy ± 25 20 e.s.m.). ANOVA: fond génétique : 15 F2,75 = 3,650 p=0,0307, mutation : 10 F1,75 =6,665 p=0,0118, temps: 5 F5,375 =66,094, p<0,0001, Interaction 0 entre fond génétique et le temps WT KO WT KO WT KO F10,375 =2,692 p=0,0034. Test post-hoc de Fisher: * FVBxB6 vs FVB et B6xFVB FVB FVBxB6 B6xFVB p<0,05 B) Fréquence de redressements (moy ± * B 100 Redressements e.s.m.). ANOVA: fond génétique : 90 F2,75 = 4,200 p=0,0187, mutation : 80 F1,75 =9,806 p=0,0025, temps : F 5,375 = 70 60 45,276 p<0,0001, temps x fond 50 génétique : F 10,375 = 2,455 p= 0,0075, 40 tendance d’interaction du temps avec 30 l’effet de la mutation F5,375 = 2,161 20 p=0,0578. Test post-hoc de Fisher: * 10 FVBxB6 vs FVB et B6xFVB p<0,05. 0 WT KO WT KO WT KO

B6xFVB FVB FVBxB6

L’analyse de l’habituation sur 5 heures par intervalles d’une heure montre des résultats similaires à l’habituation sur une heure. L’activité d’allers-retours et de redressement sont soumis à l’influence du fond génétique, de la mutation, du temps et d’interaction du temps avec le fond génétique ( AR : fond génétique : F 2,76 =

3,426, p=0,0376, mutation : F 1,76 =10,166, p=0,0021, temps : F 4,304 = 162,132, p<0,0001, temps x fond génétique: F 8,304 = 3,328, p=0,0011 ; RE : fond génétique : F 2,76 = 7,283, p=0,0013, mutation : F 1,76 =8,648, p=0,0043, temps : F 4,304 = 149,320, p<0,0001, temps x fond génétique: F 8,304 = 2,627, p=0,0085) mais il n’y a pas d’interaction du fond génétique avec la mutation, du temps avec la mutation ni des trois facteurs de temps, de fond génétique et de mutation entre eux. Le test post-hoc de Fisher indique que la lignée FVB a une activité supérieure au croisement B6xFVB (AR : p<0,05, RE : p<0,01) et une activité exploratoire supérieure au croisement FVBxB6 (RE : p<0,05). L’activité des animaux tant horizontale que verticale se stabilise à partir de la troisième heure (test post hoc de Fisher : AR et RE: Heure 1 vs Heure 2 : p< 0,0001, H2 vs H3 : p< 0,0001, H3 vs H4 : ns , H4 vs H5 : ns et H3 vs H5 : ns ).

82 Résultats expérimentaux

Activité : L’analyse de l’activité d’AR sur 24h le deuxième jour en cage d’actimétrie ( figure 26A) révèle une tendance non significative en ce qui concerne le fond génétique ainsi qu’un fort effet de la mutation (fond génétique : F 2,70 = 3,117, p=0,0505, mutation : F 1,70 =16,717, p<0,0001). Cet effet est unidirectionnel mais son ampleur est différente entre les groupes : ainsi l’augmentation de la fréquence moyenne d’AR chez les animaux B6xFVB KO est de 20% par rapport aux WT (Moyenne AR WT = 371, KO = 444) tandis qu’elle est de l’ordre de 90% chez les animaux FVB et FVB x B6 KO (Moyenne AR : FVB WT=408, KO=775 ; FVB x B6 WT=359, KO= 680).

A * 1000 50 B 800 40 600 (%) 30 400 20 WT KO 200 10

0 0 B6xFVB FVB FVBxB6 B6xFVB FVB FVBxB6 Figure 26: Cages d’actimétrie, second jour. A) Fréquence moyenne sur 24h d’allers-retours (moy ± e.s.m.). ANOVA: effet du fond génétique : F 2,70 = 3,117, p=0,0505, effet de la mutation : F 1,70 =16,717, p<0,0001 Test post- hoc de Fisher: * FVB vs B6xFVB p<0,05. B) Pourcentage diurne des allers-retours (moy ± e.s.m.). ANOVA: effet de la mutation F 1,69 =6,089, p=0,0161.

L’analyse des redressements sur 24h le deuxième jour en cage d’actimétrie révèle un fort effet du fond génétique et de la mutation (fond génétique :

F2,66 = 5,005, p=0,0095, mutation : F 1,66 =9,569, p=0,0029). Le test post-hoc de Fisher indique que la fréquence de RE des animaux FVB est supérieure à celle des animaux B6xFVB (p<0,01). Comme pour les AR, l’effet d’activité de RE supérieur chez les KO est unidirectionnel mais son ampleur est distincte entre les types de croisements. La différence entre WT et KO est de 70% chez les B6 x FVB, 96% chez les FVB et de 142% chez les FVBxB6 (Fréquence moyenne des RE : B6xFVB WT : 331, KO : 563 ; FVB WT : 771, KO : 1511 ; FVBxB6 WT : 497, KO :1204).

Patterns d’activité : Lorsque l’on étudie la proportion diurne de l’activité du deuxième jour de cage d’actimétrie des différents groupes de souris (figure 26B), l’ANOVA révèle un

83 Résultats expérimentaux

effet de la mutation (AR : F 1,69 =6,089, p=0,0161, RE : F 1,69 =5,340, p=0,0238). En effet, on observe que l’activité diurne des animaux WT représente 30 à 40% pour les AR et 36 à 45% pour les RE de leur activité totale, et que cette proportion est plus élevée de 5 à 10% dans tous les cas chez les animaux KO. L’analyse du nombre de cycles AI au cours des 24h de la deuxième journée ( figure 27A) révèle une interaction entre l’arrière-fond génétique et la

mutation (fond génétique : F 2,66 = 1,032, ns , mutation : F 1,66 =1,265, ns , fond génétique x

mutation : F 2,66 =5,630, p=0,0055). L’analyse par fond génétique montre que les

animaux FVB KO ont moins de cycles AI que les WT (FVB : F 1,31 =13,443, p=0,0009 ;

FVBxB6 : F 1,19 =0,090, ns ; B6xFVB : F 1,16 =2,052, ns ). L’analyse de la durée moyenne des périodes actives ( figure 27B) montre que celles-ci sont plus longues chez les KO de

manière générale (fond génétique : F 2,66 = 2,103, ns , mutation : F 1,66 =7,052, p=0,0099,

fond génétique x mutation : F 2,66 =2,261, p=0,1123). La durée moyenne des périodes inactives ( figure 27C) est significativement allongée chez les souris FVB KO (fond

génétique : F 2,66 = 1,162, ns , mutation : F 1,66 =2,306, ns , fond génétique x mutation :

F2,66 =4,370, p=0,0165, FVB KO vs WT : F 1,31 =11,058, p=0,0023). Les souris B6xFVB

KO présentent une tendance dans le sens inverse (F 1,16 =3,508, p=0,0795).

** A 20

15 WT 10 KO

5 B6xFVB FVB FVBxB6 0 B6xFVB FVB FVBxB6 **

7 B 7 c 6 6 5 5

4 4 3 3

2 2

1 1 nombre d'intervallesde 10min nombred'intervalles de 10 min 0 0 B6xFVB FVB FVBxB6 B6xFVB FVB FVBxB6 Figure 27: Cages d’actimétrie, second jour. Organisation de l’activité sur 24h. A) Nombre de périodes actives sur 24h lors du second jour en cage d’actimétrie (moy±e.s.m.). ANOVA: interaction de la mutation Fmr1 avec le fond génétique: F2,66 =5,630 p=0,0055; FVB KO vs WT: F1,31 =13,443 p=0,0009. B) Durée moyenne des cycles d’activité. ANOVA: effet génotype: F1,66 =7,052 p=0,0099. C) Durée moyenne des cycles d’inactivité. ANOVA: interaction fond génétique x mutation: F 2,66 =4,370 p=0,0165; FVB KO vs WT F 1,31 =11,058 p=0,0029; tendance B6xFVB KO vs WT: F 1,16 =3,508 p=0,0795.

84 Résultats expérimentaux

2.4. Conclusion intermédiaire Les souris Fmr1 KO présentent une habituation à la cage d’actimétrie comparable à celle des WT. L’activité exploratoire des animaux KO est plus élevée que celle des WT dans les premiers intervalles de l’heure d’habituation et connait une diminution presque significativement plus forte que celle des ces derniers au cours de l’heure. Cette tendance pourrait indiquer une réaction à l’environnement nouveau plus forte chez les KO. L’analyse des allers-retours et des redressements sur 24h le deuxième jour en cage d’actimétrie révèle un effet significatif de la mutation : les KO ont une plus grande activité que les WT. On trouve également que le fond génétique influence la fréquence des redressements et que les souris FVB en font plus que les deux autres croisements testés. On voit que l’augmentation de l’activité chez les KO n’est pas proportionnelle à l’activité des WT au cours de 24 heures mais que la proportion d’activité diurne augmente de manière significative chez les animaux KO de tous les fonds génétiques par rapport aux WT. L’analyse des cycles AI montre que l’augmentation d’activité locomotrice des KO Fmr1 n’est pas liée à un morcellement de ces cycles mais à un allongement de la durée moyenne des périodes d’activité chez tous les fonds génétiques. Chez les FVB KO en particulier on observe une augmentation de la durée de des cycles AI illustrée par la diminution du nombre de cycles AI sur 24h et l’allongement simultané de la durée moyenne des périodes d’activité et d’inactivité.

85 Résultats expérimentaux

3. Apprentissage : labyrinthe radial 3.1. Principe Le retard mental étant un symptôme prédominant dans le X fragile, de nombreuses études ont testé les capacités d’apprentissage des souris Fmr1 KO. La plupart avaient trouvé une altération modérée des performances ou une absence d’altération. Les tests ont été réalisés principalement dans des labyrinthes aquatiques, un test relativement anxiogène pour les souris, ce qui potentiellement peut avoir un impact sur les résultats observés, mais quelques autres expériences portaient sur un apprentissage olfactif, un conditionnement instrumental, ou de l’évitement passif. Cependant la majorité a étudié des souris de fond B6, seulement deux études portaient sur des souris FVB tandis l’étude exhaustive de l’équipe de Bauschwitz a utilisé des hybrides FVB x B6. S’agissant pour nous d’évaluer un apprentissage chez les souris Fmr1 KO sur plusieurs fonds génétiques, nous avons choisi d’utiliser un labyrinthe radial, notamment à cause de l’observation dans deux études distinctes d’une variation opposée du volume des FMIIP induite par la mutation Fmr1 KO (Ivanco & Greenough, 2002, Mineur et al. , 2002) et de la corrélation entre les performances d’apprentissage spatial en labyrinthe radial et le volume des champs terminaux de ces fibres (Schwegler et al., 1990). Deux études avaient réalisé un test d’apprentissage spatial en labyrinthe radial sur des souris Fmr1 KO de fond B6 et de fond hybride FVBxB6 et avaient toutes deux conclu respectivement à une altération de l’apprentissage (Mineur et al. , 2002, Yan et al. , 2004). Du fait que Mineur et Crusio (2002) avaient trouvé que les souris FVB n’avaient que de très faibles capacités d’apprentissage, nous avons utilisé ici un protocole d’apprentissage plus long (16 jours) que dans les expériences antérieures (5 jours) après qu’une expérience pilote nous ait indiqué que les souris FVB pourraient atteindre un niveau significatif d’apprentissage dans ce délai.

3.2. Matériel et méthodes Trois à sept jours après leur passage en cage d’actimétrie, les animaux sont pesés et isolés pour la mise en privation alimentaire (B6xFVB : 10WT/13KO , FVBxB6 : 11WT/8KO , FVB :13WT/5KO). Le premier jour de la privation ils reçoivent 3g de nourriture, puis 2 et 1g. Les jours suivant la quantité de nourriture est adaptée à chaque animal pour qu’il se maintienne à 85% de son poids de référence. Les

86 Résultats expérimentaux animaux sont pesés et nourris quotidiennement en fin de test. On laisse les animaux au repos pendant une heure avant le test suite au transport de l’animalerie à la salle expérimentale pour éviter tout effet de stress, notamment des premiers animaux d’une cohorte à passer. Le troisième jour de privation alimentaire les animaux sont mis dans le labyrinthe radial (figure 28, 8 bras de 6x4x25cm, Imetronics, Bordeaux, FR) non appâté pour une exploration libre de 10 min. De la nourriture non accessible et non visible est placée au bout des bras pour saturer l’air du labyrinthe en odeur et éviter que les souris repèrent ultérieurement la nourriture grâce aux indices olfactifs. Le labyrinthe est tourné chaque jour de 45° pour éviter la mémorisation des indices internes au labyrinthe et le développement d’une stratégie d’apprentissage kinesthésique. Des indices spatiaux externes sont placés de manière constante à proximité des bras du labyrinthe. Lors de Figure 28: Labyrinthe radial. En bas, une souris FVB entrainée à chercher la récompense en bout de bras. l’apprentissage le labyrinthe est appâté avec des miettes de nourriture standard (10±2mg, A04, SAFE, FR) placées à l’extrémité de chaque bras. Au début d’une séance quotidienne l’animal est placé au centre du labyrinthe radial. Les portes manipulées par l’expérimentateur s’ouvrent simultanément. Lorsque la souris place les quatre pattes dans un bras, on considère qu’elle a fait une entrée dans un bras. Quand la souris sort d’un bras, les portes du centre du labyrinthe sont fermées pendant 5 secondes pour maintenir la souris au centre et éviter les stratégies kinesthésiques, c'est-à-dire que la souris fasse toujours le même mouvement pour changer de bras (aller toujours à gauche par exemple, (Schwegler et al., 1990). La séance fini lorsque les huit miettes de nourriture ont été consommées ou

87 Résultats expérimentaux bien au bout de 30 min. L’apprentissage dure 16 jours. Les entrées nouvelles, la consommation des miettes de nourriture, ainsi que les latences pour trouver les 8 miettes sont enregistrées à l’aide du logiciel The Observer (Noldus, NL). Les latences sont divisés par le nombre d'entrées dans les bras (corrects ou non) pour avoir un indice de l'activité des animaux sans biais de leur performances cognitive. Lorsque la nourriture n’est pas mangée, cela est compté comme une « erreur de non-prise ». Quand la souris répète une visite à un bras où elle a déjà mangé la récompense, cela est compté comme « erreur de répétition ». Nous avons aussi analysé les entrées nouvelles sur 8 bras, comparables aux réponses correctes sur 8 bras quand les animaux ne font plus d’erreur de non-prise après quelques jours et permettent d’évaluer leur apprentissage du test. Le nombre total d’erreurs cumule les deux types d’erreurs. Six souris FVB (1WT/5KO) ont été exclues lors de l’analyse de ce test. La souris WT est morte dans des conditions inconnues, les cinq souris KO ont eu des crises convulsives ou des absences prolongées alternées avec des wild running (« course folle ») qui les ont empêchées de mener à bien le test. Le retrait de ces souris des analyses n’a pas entraîné de retrait des souris appariées car il restait des représentants des deux génotypes Fmr1 dans une même portée.

3.3. Résultats Entrées nouvelles sur huit : L’analyse des entrées nouvelles sur les huit premiers essais en fonction des jours montre qu’il existe des disparités entre les fonds génétiques sur ce paramètre

également ( figure 29 ; effet fond génétique : F 2,55 =7,571, p=0,0012, temps :

F15,825 =24,059, p< 0,0001, temps x fond génétique : F 30,825 = 1,758, p=0,0076). Les animaux FVB font globalement moins d’entrées nouvelles que les hybrides F 1 ( Fisher : FVB vs B6 x FVB : p=0,0030, vs FVB x B6 : p=0,0161). On observe aussi une tendance presque significative d’influence de la mutation Fmr1 sur les entrées nouvelles ainsi qu’une interaction significative de la mutation avec le fond génétique et la cinétique d’apprentissage (mutation : F2,55 =3,959, p=0,0516, temps x fond génétique x mutation: F 30,825 = 1,558, p=0,0296). L’analyse par lignée indique une diminution significative des entrées nouvelles chez les KO FVB et une tendance d’interaction du temps et de la mutation (mutation : F 1,17 =5,368, p=0,0332 ; temps x mutation : F 15,255 =1,557, p=0,0861). Chez les animaux B6 x FVB l’analyse indique une interaction significative du temps et de la mutation (F 15,315 =1,927,

88 Résultats expérimentaux

p=0,0203). Les WT font plus d’entrées nouvelles que les KO les premiers jours de l’apprentissage. La différence est significative uniquement au jour 3 où les WT en font plus que les KO, bien qu’on observe une tendance non significative dans ce sens au jour

4 (effet mutation : jour 3 : F 1,21 =7,150, p=0,0142 ; jour 4 : F 1,21 =3,517, p=0,0747).

B6 x FVB WT FVB WT 8 KO 8 KO 7 7 * 6 6 5 5 4 4 3 3 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516 Jours Jours WT FVB x B6 8 KO 7 Figure 29: Entrées nouvelles sur 8 dans le radial. 6 ANOVA: interaction temps x fond génétique x mutation: F30,825= 1,558, p=0,0296. B6 x FVB : interaction temps x 5 mutation F15,315=1,927, p=0,0203. KO vs WT, jour 3: 4 F1,21=7,150, * p=0,0142. FVB mutation : F1,17=5,368, 3 p=0,0332 ; temps x mutation : F15,255=1,557, p=0,0861. Seuil de hasard représenté en pointillés à 5,3 entrées. Test 0 de Student: jour 1: B6 x FVB KO p=0,01, FVB x B6 KO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516 p<0,05. Se reporter au texte pour les détails. Jours

L’analyse du nombre d’entrées nouvelles par rapport au seuil de hasard (probabilité de tomber sur un bras nouveau en faisant 8 entrées successives : 5,3) permet d’évaluer l’apprentissage des souris. Au premier jour on observe que tous les groupes ne sont pas au seuil de hasard, mais que les B6 x FVB et FVB x B6 KO sont

significativement en dessous (test de Student , B6 x FVB KO : t 12 =4,340, p=0,0010 ;

FVB x B6 KO : t7=2,972, p=0,208). Au deuxième jour tous les groupes sont au seuil de hasard, cependant au troisième jour les B6 x FVB KO sont encore significativement

sous ce seuil (t12 =2,313, p=0,0393). Concernant les souris B6 x FVB, les WT et KO

dépassent significativement le seuil de hasard à partir du jour 5 (WT : t 9=2,5, p=0,0339 ;

KO : t 12 =4,552, p=0,0007). Les WT et KO FVB x B6 dépassent le seuil de hasard au

jour 4 (WT : t 10 =2,596, p=0,0267 ; KO : t 7=1,162, p=0,0388), cependant les KO sont au

seuil de hasard au jour 5 et 7 et les WT aux jour 6 et 8 (jour 5 : WT : t 10 =1,086,

p=0,3028, KO : t 7=2,072, p=0,769 ; jour 6 : WT : t 10 =1,802, p=0,1017, KO : t 7=2,619,

p=0,0345 ; jour 7 : WT : t 10 =2,596, p=0,0267, KO : t 7=0,611, p=0,5605; jour 8 : WT :

89 Résultats expérimentaux

t10 =1,284, p=0,2281, KO : t 7=5,805, p=0,0007), après quoi les deux groupes basculent définitivement au-dessus du seuil de hasard. Les souris FVB WT ont un apprentissage plus lent avec des performances inégales : elles font un nombre d’entrées significativement supérieur au seuil de hasard les jours 5, 6, 7, 9, présentent une tendance non significative au jour 10 puis sont significativement au-dessus du hasard à partir de jour 11 jusqu’à la fin de l’entrainement (jour 5 : t 12 =2,765, p=0,0171 ; jour 6 : t12 =2,244, p=0,0445; jour 7 : t 12 =4,552, p=0,0007; jour 8 : t 12 =0,037, p=0,9712; jour 9 : t12 =2,191, p=0,0489 ; jour 10 : t 12 =2,165, p=0,0513; jour 11 : t 12 =4,775, p=0,0005). Il apparaît que les FVB KO n’apprennent pas du tout le test car leur nombre d’entrées nouvelles n’est significativement au-dessus du hasard qu’aux jours 5 et 14 (jour 5 : t 5=

5,200, p=0,0035 ; jour 14 : t 5=2,711, p=0,0422).

Nombre de réponses correctes sur huit essais : L’ANOVA de mesures répétées des performances réalisées sur 8 essais au cours de l’apprentissage montre qu’il existe des disparités entre les fonds génétiques (figure 30 ) et que la mutation Fmr1 interagit avec le fond génétique et la cinétique d’apprentissage (fond génétique : F 2,54 = 4,936, p=0,0107, temps : F 15,810 =26,375, p< 0,0001, temps x fond génétique : F 30,810 = 1,758, p=0,0076, temps x fond génétique x mutation: F 30,810 = 1,663, p=0,0149). Les animaux FVB font globalement moins de réponses correctes sur les 8 premiers choix que les animaux B6xFVB (Fisher : p=0,0171). Leurs performances sont significativement meilleures que celles des hybrides le premier jour de test (F 2,54 =3,840, p=0,0165, FVB vs B6 x FVB : p=0,0207, FVB vs FVB x B6 : p=0,0122). Cependant au jour 9 les FVB font moins de réponses correctes que les hybrides (F 2,54 =3,976, p=0,0047, FVB vs B6 x FVB : p=0,0456, FVB vs FVB x B6 : p=0,0370). Au jour 13 les souris B6 x FVB et au jour 16 les FVB x B6 sont meilleures que les FVB (Jour 13 : F 2,54 =4,682, p=0,0133, FVB vs FVB x B6 : p=0,0047 ; Jour 16 : F 2,54 =3,976, p=0,0245, FVB vs B6 x FVB : p=0,0370).

90 Résultats expérimentaux

8 7.5 7 ** * * 6.5 6 B6xFVB 5.5 * FVB 5 FVBxB6 4.5 4 3.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 1213141516 Jours Figure 30: Labyrinthe radial, nombre de réponses correctes sur 8 essais au cours de l’apprentissage (moy ± e.s.m.). Les animaux FVB font globalement moins de réponses correctes que les hybrides B6 x FVB. ANOVA: effet du fond génétique F2,54=4,936 p=0,0107; interaction temps x fond génétique F30,810=1,758 p=0,0076. Test de Fisher: FVB vs B6 x FVB p=0,0171. Analyse par jour se reporter au texte, jour 1: * FVB vs B6 x FVB et FVB x B6 p<0,05, jour 9: * FVB vs B6 x FVB et FVB x B6 p<0,05, jour 13: ** FVB vs B6 x FVB p<0,01, jour 16: * FVB vs FVB x B6 p<0,05.

Les animaux KO de fond génétique B6 x FVB ont un retard de performances par rapport à leurs contrôles ( figure 31 , ANOVA : temps x mutation :

F15,315 =2,574, p= 0,0012, effet mutation : Jour 1 : F 1,21 =9,364, p=0,0059, Jour 3 :

F1,21 =7,150, p=0,0142). Les FVB KO sont significativement moins bonnes que les WT

(effet mutation : F 1,19 =7,952, p=0,0109).

B6 x FVB WT FVB WT KO KO 8 8

7 7 * 6 6 * 5 * 5

4 4

3 3

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516 Jours Jours FVB x B6 WT 8 KO 7 Figure 31: Labyrinthe radial, nombre de réponses correctes sur 8 essais au cours de l’apprentissage (moy ± e.s.m.), B6 x 6 FVB et FVB KO vs WT. Les animaux KO de fond B6 x 5 FVB ont un délai de performance par rapport aux contrôles. ANOVA: interaction temps x fond génétique x mutation 4 F30,810 =1,663 p=0,0149; B6 x FVB: interaction temps x 3 mutation F15,315=2,574 p=0,0012; B6 x FVB jour 1: F1,21=9,364 ** p=0,0059, jour 3: F1,21=7,150 * p=0,0142. 0 Les animaux FVB KO ont des performances globalement 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 13 1415 16 moins bonnes que les WT: ANOVA: F 1,19 =7,952, p=0,0109. Jours

91 Résultats expérimentaux

Erreurs de non-prise : Les erreurs de non-prise sont rares et disparaissent après quelques jours d’apprentissage (effet temps : F 15,795 =12, 738, p< 0,0001). Il y a une interaction du temps avec la mutation : les animaux WT en font plus le premier jour mais les animaux KO persistent plus longtemps à en faire ( figure 32 , ANOVA : temps x mutation :

F15,795 =1, 919, p= 0,0186). Notamment les animaux FVBxB6 KO font des erreurs de ième non-prise jusqu’au 7 jour 2 WT (interaction temps x fond KO 1.5 génétique x mutation :

F30,795 =2, 937, p< 0,0001 ; 1 FVB x B6: interaction temps 0.5 x mutation : F 15,240 =3,105, p=0,0001). Ainsi à partir du 0 huitième jour le nombre total 1 2 3 4 5 6 7 Jours d’erreurs ne concerne plus Figure 32: Erreurs de non-prise lors des premiers jours que les erreurs de répétition. d’apprentissage dans le labyrinthe radial. ANOVA: interaction temps x mutation F 15,795 =1,919 p=0,0186.

Erreurs de répétition : L’analyse des erreurs de répétitions montre que les souris FVB en font de manière générale significativement plus que les souris FVB x B6 et B6 x FVB ( figure

33 , fond génétique : F 2,870 =8,670, p=0,0005 ; test post hoc de Fisher : FVB vs FVB x B6 p=0,0062 ; FVB vs B6 x FVB p=0,0009). Les souris FVB apprennent également moins bien au cours du temps (interaction temps x fond génétique : F 30,870 =1,725, p=0,0096). Effectivement l’analyse par jour du nombre d’erreurs de répétition indique que l’effet du fond génétique est significatif les jours 6, 8, 9, 13, 16 et on observe une tendance dans ce sens aux jours 7 et 12 (effet de l’arrière-fond jour 6 : F 2,58 =7,761, p=0,001 ; jour

7 : F2,58 =2,619, p=0,0815 ; jour 8 : F2,58 =9,036, p=0,0004 ; jour 9 : F2,58 =4,667, p=0,0132 ; jour 12 : F2,58 =2,659, p=0,0785 ; jour 13 : F2,58 =18,266, p<0,0001 ; jour 16 :

F2,58 =6,028, p=0,0042). Au jour 6, les hybrides B6 x FVB font significativement moins d’erreurs de répétition que les deux autres groupes (Fisher : B6 x FVB vs FVB x B6, p=0,0120 ; B6 x FVB vs FVB, p=0,0003). Les FVB x B6 sont également meilleures que les FVB à jour 9 ( p=0,0332) Aux jours 8, 13 et 16 les FVB sont moins performantes que

92 Résultats expérimentaux

les deux autres groupes (jours 8 et 13 : p<0,0001, jour 16 : FVB vs B6 x FVB : p=0,0064 ; FVB vs FVB x B6 : p=0,0050). Au dernier jour du test les souris FVB continuent à faire près de 5 erreurs de répétition en moyenne tandis que les deux autres fond génétiques en font moitié moins (Moyenne des erreurs de répétition jour 16 : FVB : 4,8 ; B6 x FVB : 2,7 ; FVB x B6 : 2,5).

20

15 *** * **** 10 *** **** B6xFVB ** 5 FVB FVBxB6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516 Jours Figure 33: Labyrinthe radial, nombre d’erreurs de répétition au cours de l’apprentissage (moy ± e.s.m.). Les souris FVB apprennent moins bien que les deux types d’hybrides F1. ANOVA: effet du fond génétique: F2,54 =8,670 p=0,0005, interaction temps x fond génétique F 30,870 =1,725 p=0,0096. Test de Fisher: FVB vs B6 x FVB p=0,0009, FVB vs FVB x B6 p=0,0062. Analyse par jour se reporter au texte, jour 6: B6 x FVB vs FVB x B6 * p<0,05, vs FVB *** p<0,001, jours 8 et 13: FVB vs hybrides F1 **** p<0,0001, jour 9: FVB x B6 vs FVB *p<0,05, jour 16: FVB vs hybrides F1 ** p<0,01.

Les KO ont également tendance à faire plus d’erreurs que les WT

(F 1,58 =3,432, p=0,0690). La tendance d’interaction du génotype Fmr1 avec le fond génétique est due au plus grand nombre d’erreurs des KO FVB que des souris contrôles

correspondantes (F 2,58 =2,697, p=0,0758, FVB WT vs KO : F 1,20 =7,018, p=0,0154).

Nombre total d’erreurs : L’ANOVA de mesures répétées du nombre total d’erreurs faites avant d’avoir consommé les huit récompenses au cours de l’apprentissage révèle un effet global du fond génétique ainsi qu’une interaction de ce dernier avec le temps (fond

génétique : F 2,54 = 5,417, p=0,0072, jour : F 15,810 =27,373, p< 0,0001, jour x fond

génétique : F 30,810 = 1,581, p=0,0255). Les animaux FVB apprennent moins bien que les hybrides B6xFVB ( Fisher : p=0,0136). Au jour 6, les souris B6 x FVB font

significativement moins d’erreurs que les FVB et que les FVB x B6 (F 2,54 =5,529, p=0,0065 ; test de Fisher : B6 x FVB vs FVB : p=0,0005 et B6 x FVB vs FVB x B6 : p=0,0107). Au jour 8, 13 et 16 l’analyse statistique établit le déficit d’apprentissage des FVB par rapport aux deux autres fonds génétiques (Jour 8 : F2,54=10,503, p=0,0001 ;

93 Résultats expérimentaux

FVB vs B6 x FVB : p=0,0001, vs FVB x B6 : p=0,0002 ; Jour 13 : F2,54=13,317, p<0,0001 ; FVB vs B6 x FVB : p<0,0001, vs FVB x B6 : p=0,0001 ; Jour 16 : F2,54=6,335, p=0,0029 ; FVB vs B6 x FVB : p=0,0181, vs FVB x B6 : p=0,0138). Au dernier jour du test les FVB continuent de faire presque 5 erreurs.

Latence 8 bras : La latence mise pour manger les huit récompenses n’est pas affectée de manière globale par le génotype Fmr1 ni le croisement (effet fond génétique :

F2,54 =1,257, ns , effet mutation : F 1,54 =1,704, ns , interaction FG x mutation : F 2,54 =0,005, ns ). L’analyse montre en revanche qu’il y a une interaction significative entre le temps, le fond génétique et la mutation ( figure 34, temps x fond génétique x mutation :

F30,810 =1,540, p= 0,0331). Les souris KO de fond B6 x FVB sont plus rapides que les WT les premiers jours, la différence n’est significative que le deuxième jour (temps x

mutation : F 15,315 =2,053, p=0,0120, jour 2 : F 1,21 =7,502, p=0,0123). La cinétique des performances de temps de souris FVB x B6 KO diffère aussi de celle de leurs contrôles : elles sont plus lentes le premier jour, deviennent plus rapides à manger toutes les récompenses que les WT sur plusieurs jours en milieu d’apprentissage et il n’y a plus de différences entre les deux groupes les 5 derniers jours (temps x mutation :

F15,255 =2,137, p=0,0089).

B6 x FVB FVB 1600 WT 1600 WT ** 1400 KO 1400 KO 1200 1200 1000 1000 (s) 800 800 600 600 400 400 200 200 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Jours FVB X B6 1600 WT 1400 KO 1200 1000 (s) 800 Figure 34: Latence mise pour compléter la séance 600 quotidienne de labyrinthe radial. ANOVA: interaction fond 400 génétique x mutation x temps: F 30,810 =1,540, p=0,0331; B6 200 0 x FVB : temps x mutation F 15,315 =2,053 p=0,210; B6 x FVB 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516 jour 2 : effet mutation F 1,21 =7,502 * p=0,0123; FVB x B6 : Jours temps x mutation F 15,255 =2,137 p=0,0089.

94 Résultats expérimentaux

Temps passé par bras : Le temps passé par bras visité diminue graduellement d’environ 45 secondes le premier jour à 20 secondes le dernier jour (F 15,885 =15,730, p<0,0001). Il n’y a aucun effet statistique de la mutation, du fond génétique ou d’interaction des facteurs étudiés dans la durée de visite par bras ( figure 35).

80 B6xFVB WT

70 B6xFVB KO FVB WT 60 FVB KO 50 FVBxB6 WT V 40 FVBxB6 KO 30

20

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 -RXUV Figure 35: Indice d’activité dans le labyrinthe radial: temps moyen passé par bras visité.

3.4. Conclusion intermédiaire Dans ce test nous retrouvons le déficit d’apprentissage des FVB dans le radial caractérisé par Mineur (Mineur & Crusio, 2002). Les entrées nouvelles sur les 8 premières entrées des FVB se stabilisent significativement au-dessus du seuil de hasard à partir du 11 ième jour d’apprentissage tandis que les B6 x FVB ne mettent que 4 jours et les FVB x B6 ont des performances intermédiaires. Les souris de fond B6 ont classiquement de bonnes performances dans ce test (Crusio & Schwegler, 2005, Jamot et al. , 1994). La mutation Fmr1 a des effets différents sur les trois fonds génétiques. Elle aggrave le déficit d’apprentissage sur le fond FVB : en effet les KO FVB ne dépassent qu’à deux occasions le seuil de hasard des entrées nouvelles, et sont toujours au hasard les deux derniers jours du test. Les KO FVB x B6 visitent significativement moins de bras que le seuil de hasard le premier jour et retournent donc

95 Résultats expérimentaux vraisemblablement dans les bras déjà visités, elles font des erreurs de non-prise jusqu’au jour 7 et sont plus longues que les WT pour compléter la séance les premiers jours. Les résultats semblent indiquer des signes d’anxiété. Néanmoins elles ne montrent aucun déficit d’apprentissage par rapport aux WT et améliorent même les performances de latence plus rapidement que les WT. Les KO B6 x FVB visitent significativement moins de bras que le seuil de hasard le premier jour et le troisième jour. Cependant, étant donné qu’elles sont plus rapides que les WT les premiers jours et de manière significative au jour 2, la signification du nombre réduit de bras visités au jour 1 semble différente et indique potentiellement une persévération à visiter les bras déjà visités qui pourrait expliquer le délai de performance de réponses correctes. Le fait que les KO B6 x FVB dépassent le seuil de hasard des entrées nouvelles en même temps que les WT montre que ce délai n’est pas dû à un déficit d’apprentissage.

96 Etude histologique de l’hippocampe chez la souris Fmr1 KO

Résultats expérimentaux

I. INTRODUCTION Comme nous l’avons évoqué dans l'introduction, l'hippocampe est une des structures affectées à la fois chez des patients autistes et des patients du syndrome du X fragile (Bauman & Kemper, 2005, Hessl et al. , 2004). L’hippocampe est formé de deux sous- stuctures en forme de U imbriqués, le gyrus denté et la corne d’Amon. La corne d’Amon est subdivisée en trois parties CA1, CA2 et CA3 sur des critères morphologiques et synaptiques. Les cellules granulaires du gyrus denté envoient leurs axones (fibres moussues) vers la zone CA3 (cité dans Toni, 2000). Des études préalables avaient montré des changements neuroanatomiques chez les souris Fmr1 KO, notamment une diminution de la taille des fibres moussues intra- et infrapyramidales (FMIIP) avait été rapporté par Mineur et al. (2002), qui utilisaient des mutants sur arrière-fond génétique C57BL/6J, tandis qu'Ivanco et Greenough (2002) rapportaient une augmentation de la taille des FMIIP chez des mutants sur arrière fond génétique FVB. Cependant, ces deux expériences étaient exécutées dans deux laboratoires différents en utilisant de méthodes morphométriques différentes. Dans la présente expérience il s'agissait d’une part de répliquer les résultats de ces chercheurs, et d’autre part de les étendre aux arrière-fonds hybrides. Nous avons utilisé la méthode de coloration de Timm pour révéler les fibres moussues de l’hippocampe par marquage des ions Zn 2+ qui y sont présents (Timm, 1958a, Timm, 1958b, Timm, 1958c). Cette méthode de coloration permet de marquer les ions métalliques lourds (Zn, Cu, Fe et Pb) dans les tissus par précipitation du complexe sulfure/argent (Danscher, 1981, Danscher & Zimmer, 1978, Haug, 1967). La perfusion avec une solution de sulfure de sodium permet de former des complexes métal-sulfure insolubles. Les dépôts d’argent permettent la visualisation de ces complexes en microscopie optique.

II. MATERIEL ET METHODES 1. Histologie 1.1. Perfusion Les mâles expérimentaux du premier jeu d’expériences (Test de Crawley, labyrinthe en T et test de résident-intrus) sont perfusés dans la semaine suivant la fin de leur dernier test, à 4 mois±1semaine (n=5 pour tous les groupes). Une fois profondément anesthésiés avec 0.7mL d’Avertin en injection intra-péritonéale (2,2,2 Tribromoethanol

[C 2H3Br 3O] 300mg/Kg; Sigma Aldrich, Steinheim, Allemagne), ils sont perfusés par voie intracardiaque avec 100 mL de sulfure de sodium à 1,17% afin d’éliminer le sang du système vasculaire et de former les complexes métal-sulfure utilisés dans la coloration de Timm puis

97 Résultats expérimentaux avec 100 mL de solution de glutaraldéhyde 3% dans du tampon phosphate Sørensen 0,15M (pH = 7,35) afin de fixer les tissus. On dissèque ensuite les cerveaux que l’on met dans une solution de fixation (solution de glutaraldéhyde 3% dans Sørensen 0,15M) contenant 20% de saccharose.

1.2. Préparation des sections Le jour suivant la perfusion les cerveaux sont enrobés, congelés et coupés au cryostat (CM3050 S ; Leica, Solms, Allemagne) à -18°C en sections horizontales de 40 µm (température de l’objet -16°C). Les sections sont montées sur des lames gélatinées (eau distillée, gélatine 1%, alun de chrome [KCr(SO 4)2,12H 2O] 0,1%, azide de sodium [NaN 3] 0,02%) et laissées à sécher sous une hotte aspirante pendant trois jours.

1.3. Coloration Les coupes sèches sont ensuite traitées par une coloration de Timm (Crusio et al. , 1990) qui consiste à immerger les coupes de cerveau dans une solution épaisse de gomme arabique (60%), hydroquinone (17g/L), du tampon citrate (2,55%) et de nitrate d’argent (0,85g/L) pendant environ 90 minutes. Elles sont ensuite déshydratées et montées pour observation au microscope.

2. Morphométrie 2.1. Sélection des coupes Dix sections sont sélectionnées par animal pour l'analyse morphométrique selon une technique standardisée. L'échantillonnage prend effet à la première coupe après la disparition de l'extension ventrale du pôle septal du fascia dentata. Une coupe sur deux est prise en considération et de fait, 5 coupes provenant de l'hippocampe droit et 5 de l'hippocampe gauche sont analysées.

2.2. Estimation de la taille des fibres moussues ( figure 36) Nous utilisons pour la morphométrie le logiciel ImageJ 1.38u (http://rsb.info.nih.gov/ij/ ; Wayne Rasband, NIH, USA). Deux mesures ont été faites : la région inférieure de l’hippocampe (somme de la région CA3 et du hilus du gyrus denté) et les fibres moussues intra-infrapyramidales FMIIP. La superficie de ces 2 champs est mesurée dans chaque coupe et la moyenne sur les 5 coupes analysées est calculée pour chaque hippocampe. La taille des FMIIP est ensuite exprimée en pourcentage relatif à la taille totale

98 Résultats expérimentaux de la région inférieure. Les mesures sont faites séparément pour les hippocampes gauches et droits.

Stratum oriens Stratum pyramidale Fibres moussues Stratum radiatum Stratum lacunosum-moleculare

FMIIP Hilus du gyrus denté

Figure 36: A) Anatomie de l’hippocampe. B) Schéma de l’organisation neuroanatomique de l’hippocampe (source: Lipp et Schwegler). La superficie des fibres moussues intra-infrapyramydales (FMIIP) est comparé à celle mesuré pour l’addition du hilus et de la région du champ amonique 3 (CA3, région grisée et délimitée du côté externe par les pointillés sur le schéma).

3. Analyse statistique Pour analyser ces résultats, nous avons utilisé une ANOVA à 2 facteurs (arrière-fond génétique et génotype Fmr1 ), ainsi qu'une ANOVA à 2 facteurs pour des mesures répétées (gauche-droit). Des moyennes de moindres carrés (" Least Squares Means ") sont calculées pour toutes les variables et ensuite comparées avec des tests post hoc utilisant la distribution normale (test de z).

III. RESULTATS Pour toutes les mesures (FMIIP gauches, FMIIP droits, et moyennes des

FMIIP) l'effet de l'arrière-fond génétique est significatif (F 3,40 =6,32, p=0,0013; F 3,40 =6,39,

99 Résultats expérimentaux

p=0,0012; et F 3,40 =7,29, p=0,0005, respectivement). Le pourcentage relatif des FMIIP est le plus important chez les B6, le plus réduit chez les FVB et intermédiaire chez les 2 arrières fonds génétiques F 1. Les tests post hoc montrent que les souris B6 ont des moyennes gauche/droit ( figure 35 ) significativement plus élevées que les souris B6*FVB ( z=3,51, p=0,0011) et les souris FVB ( z =4,23, p<0,0001), tandis que les souris FVB ont des moyennes gauche/droit significativement moins élevées que les souris FVB*B6 ( z =2,52, p=0,016). L'effet du génotype ou l'interaction génotype*arrière-fond génétique n'est significatif pour aucune mesure (toutes p>0,42). L'analyse des mesures répétées ne révèle aucune différence gauche-droit, ni comme effet principal, ni en interaction avec le génotype ou l'arrière-fond génétique.

4 WT KO

3

(%) 2

1

0 B6 B6 x FVBFVB x B6 FVB Figure 37: % relatif du volume des fibres moussues intra-infrapyramidales de l’hippocampe (moy±e.s.m.). ANOVA: effet fond génétique: F3,40 =7,29, p=0,0005. LSMeans: B6 vs B6 x FVB p<0,01; B6 vs FVB p<0,0001; FVB x B6 vs FVB p<0,05.

IV. CONCLUSION Les résultats obtenus ici sont en accord avec certains travaux antérieurs, mais en désaccord avec certains autres. D'abord, mes résultats confirment que la taille des FMIIP des hybrides est presque toujours intermédiaire entre ceux des deux parents (Bulman-Fleming et al. , 1992, Crusio et al. , 1986 , Heimrich et al. , 1985 ). Ils sont en outre en accord avec ceux de Mineur et Crusio (2002) que des FVB ont des champs terminaux des FMIIP significativement plus petits que les B6. Par contre, ces auteurs rapportaient que les FMIIP des souris FVB étaient extrêmement petites, tandis que les valeurs autour de 2% trouvé ici ne sont pas particulièrement petit comparés à d'autres souches (Crusio, 1986). Ceci s'explique peut-être par le fait que nous avons utilisé des souris FVB congéniques (voir chapitre 2) tandis que Mineur et Crusio utilisaient des souris FVB pures. Il est possible que dans le morceau de

100 Résultats expérimentaux chromosome provenant de la souche 129 intégré dans le génome de notre lignée FVB congénique soient contenus un ou plusieurs gènes influençant la taille des FMIIP. Par contraste, le fait que dans cette étude, aucune différence entre les souris WT et KO n’ait été trouvée sur aucun des arrières fonds utilisés est en désaccord avec les résultats de Mineur et coll. (2002) et de Ivanco et Greenough (2002). Les premiers avaient trouvé que les KO avaient des FMIIP plus petits que les WT sur arrière fond B6, tandis que les derniers rapportaient des FMIIP augmentés chez les KO sur arrière-fond FVB. Il est cependant à noter que nos souris B6 montrent une tendance dans la direction rapportée par Mineur et coll. (WT=3,36, KO=3,00), qui est dans l'ordre de grandeur (10-15% de différence) rapporté par ces auteurs. Il est donc possible que cette différence devienne statistiquement significative si les effectifs des différents groupes sont augmentés (prévu pour l'avenir proche).

101 Résultats expérimentaux

102 Discussion générale et conclusion

Discussion

Les travaux présentés visaient à étudier les traits autistiques présents chez le modèle souris du X fragile et déterminer son éventuelle validité en tant que modèle pour l’autisme. Parallèlement nous nous sommes intéressés à l’interaction de la mutation Fmr1 avec différents fonds génétiques dans ces traits, notamment dans l’attente qu’un fond génétique présente plus de déficits et soit plus approprié que les autres. Nous avons montré que les souris Fmr1 KO présentaient des altérations dans différents traits autistiques concernant les symptômes principaux et variables. Les mutants évitent initialement la souris stimulus dans le test d’interaction sociale indirecte. La mise au point d’une méthode originale d’analyse des vocalisations émises par les souriceaux isolés a permis de montrer une altération qualitative de la communication chez les KO aux jours post-nataux 6 et 8. Nous avons montré qu’après habituation à l’environnement dans lequel les souris sont testées l’activité est augmentée chez les KO. Nous avons également étudié la répartition de l’activité sur 24 h et trouvé que la proportion d’activité diurne des KO est augmentée par rapport aux contrôles, indiquant un rôle de la FMRP dans la régulation de la répartition de l’activité. Certains types d’altérations s’expriment plus spécifiquement chez les différents fonds génétiques : les KO FVB, B6 et B6 x FVB présentent des différences distinctes des paramètres des vocalisations qui changent par rapport aux WT. Bien que les KO des trois fonds génétiques testés en actimétrie présentent une augmentation d’activité, celle-ci se manifeste avec beaucoup plus d’ampleur chez les FVB et FVB x B6 que chez les B6 x FVB. Les souris FVB KO semblent présenter une altération des cycles d’activité qui leur est propre et la mutation n’aggrave les performances d’apprentissage spatial que sur ce fond. Les souris B6 x FVB KO présentent des indices de persévération dans l’exploration dans le labyrinthe en T et dans le labyrinthe radial qui semblent leur être propre également, tandis que les FVB x B6 KO sont les seules à donner des signes d’anxiété dans le labyrinthe radial. D’autres traits autistiques ne semblent pas être présents chez les souris Fmr1 KO que nous avons étudiées comme l’agressivité, la difficulté d’extinction d’un apprentissage, les stéréotypies ou le déficit d’habituation à un nouvel environnement.

103 Discussion

La souris Fmr1 KO est-elle un modèle valide pour étudier l’autisme ?

Le test d’interaction sociale indirecte que nous avons réalisé était le plus simple pour tester l’intérêt social chez tous les arrières fonds. Nous avons observé que les souris Fmr1 KO présentaient un évitement initial de la souris stimulus tandis que les entrées initiales des WT au contact de la souris stimulus étaient aléatoires. Il est à noter qu’on ne trouve pas d’allongement de la latence d’approche lors du test de résident- intrus, peut-être à cause de l’augmentation d’activité des KO par rapport aux WT : en effet, dans le test de Crawley, l’allongement de la latence de première entrée dans le compartiment souris est relatif à la vitesse de première entrée dans un compartiment externe. L’évitement d’approche sociale a également été observée par l’étude de Spencer et coll. (test de dominance dans un tube, 2005) et récemment celle de McNaughton et coll. (2008) dans un test similaire d’interaction sociale indirecte. Cette caractéristique subtile qui n’affecte apparemment pas l’intérêt social est donc observée de manière constante chez les KO Fmr1 sur tous les fonds génétiques étudiés. Ce trait est appelé « anxiété sociale » chez les sujets SXF humains, c’est un des points de débat des spécialistes sur l’association du X fragile et de l’autisme dont les détracteurs estiment qu’il est dû à une anxiété généralisée. Effectivement il semble que les personnes SXF autistes présentent des signes d’attachement à leurs parents et de l’intérêt pour les gens, y compris nouveaux, ce qui n’est pas le cas dans l’autisme typique (Kanner, 1943; Maes et al. , 1993). Une autre étude montre que les enfants SXF non-autistes sont capables de distinguer les étrangers de leurs parents dans leur comportement d’évitement, mais ce qui n’est pas le cas des enfants autistes typiques et SXF autistes (Cohen et al. , 1988). Chez les souris Fmr1 KO, aucune étude n’a trouvé de niveaux d’anxiété significativement différents des contrôles bien qu’il ait été montré que la FMRP joue un rôle dans la modulation de la traduction des ARNm du récepteur aux glucorticoïdes et que chez ces animaux la cinétique de cortisol suite à un stress aigu soit retardée (Markham et al. , 2006). Une expérience intéressante pour discriminer si l’évitement social initial est effectivement lié à une anxiété générale ou s’il a une spécificité sociale serait d’observer s’il y a un changement dans ce trait en administrant un anxiolytique par exemple. Dans le test d’interaction sociale directe réalisé par Mineur et coll. les KO gardaient un intérêt bas mais constant pour la souris stimulus et l’intérêt n’augmentait pas pour une nouvelle souris (Mineur et al. , 2006). Dans celui que nous

104 Discussion avons réalisé et qui sera prochainement analysé les souris sont confrontées de manière répétée lors d’essais successifs à une femelle C3H ovariectomisée et lors d’un dernier essai à une femelle différente. Nous voulons explorer le déficit d’intérêt social et le déficit de reconnaissance potentiels des Fmr1 KO plus avant, pour tester si les résultats apparemment conflictuels de l’étude sur les B6 de Mineur et Crusio et de celle de Spencer (2005) peuvent être conciliés en prolongeant les rencontres, et enfin déterminer quel sera le comportement des mutants sur les autres fonds génétiques.

L’altération des vocalises met en évidence des différences dans le nombre de clicks, la fréquence, la durée, la variabilité le nombre de composantes des cris au cours du développement. Le nombre de sifflements n’est affecté que par la variation naturelle entre lignée. Ces données sont en accord avec les symptômes que l’ont peut observer dans l’autisme ou le X fragile. Nous disposons maintenant d’une méthode d’analyse capable de discriminer les paramètres de vocalisations des différentes lignées entre elles. L’affinement de l’analyse de cette expérience nous permettra peut-être de modéliser la persévération du discours rapportée dans le X fragile. L’étude des compétences de communication des souris Fmr1 KO nécessite également d’être complétée concernant la réception d’informations et notamment au niveau d’informations émotionnelles. Nous nous sommes orientés au cours de ma thèse sur un test de transmission de préférence de nourriture. Ce test utilise le comportement des rongeurs à manger plus facilement une nourriture nouvelle lorsqu’ils l’ont reniflée dans l’haleine d’un congénère en bonne santé. Cette interaction sociale est capable de réverser une préférence spontanée pour un aliment, en général des biscuits d’alimentation classique réduits en poudre et parfumés avec différentes épices. Ce test est de manière générale délicat à mettre en place à cause du choix des épices, des étalonnages de concentrations et à cause de l’habituation rapide et durable des animaux en cas d’exposition même infime à l’odeur testée. En outre dans notre cas la tâche a été compliquée par la variabilité de préférence spontanée entre les différents groupes et le nombre de groupes qui alourdit considérablement les effectifs de l’expérience pilote qui nécessitent des démonstrateurs en sus des animaux testés (observateurs). Un test qui n’aurait pas ces inconvénients et serait éventuellement plus facile à mettre en œuvre pourrait être celui de transmission d’anxiété développé chez les rats par Knapska (Knapska et al. , 2006).

105 Discussion

L’hyperactivité est un trait courant dans le X fragile et l’autisme, or nous avons observé une augmentation substantielle des allers-retours et des redressements chez les KO des trois fonds génétiques étudiés. Chez les FVB et les FVB x B6, l’activité est quasiment doublée. Jusqu’ici l’activité n’avait été mesurée que sur quelques dizaines de minutes avec des résultats mitigés. Ces observations de courte durée ne permettent pas de discriminer l’habituation de l’activité motrice de l’animal d’une part ni de quantifier l’augmentation de l’activité d’autre part. L’étude que nous avons réalisé demande peu de manipulation mais permet d’inférer beaucoup sur le comportement des animaux. Ce système comporte des limites, puisqu’on ne connaît que l’activité de l’animal par son activité motrice horizontale et verticale et qu’on ne peut savoir avec certitude quand l’animal dort par exemple. Cependant l’augmentation de la proportion diurne de l’activité chez tous les KO est une donnée supplémentaire aux découvertes récentes d’un rôle de la FMRP dans le rythme circadien (Bakker & Oostra, 2003, Zhang et al. , 2008). La découverte d’un allongement des cycles d’activité- inactivité chez les FVB KO enrichit les perspectives par l’indication d’une participation potentielle de cette protéine au niveau de la durée des cycles veille-sommeil en interaction avec le fond génétique. De plus en plus d’études montrent que des dysfonctions dans le système circadien peuvent être la cause primaire de l’altération des comportements émotionnels. De telles dysfonctions sont observées dans les troubles de l’humeur, la maladie d’Alzheimer mais également dans les troubles du spectre autistique et des syndromes associés comme Down, Smith-Magenis, Prader-Willi et le X fragile (Barnard & Nolan, 2008, Bourgeron, 2007). Le sommeil est en général réduit, fragmenté et la latence pour s’endormir est plus longue. En outre la dimension temporelle est affectée sous différents aspects dans l’autisme en termes de situation temporelle (replacer des évènements dans le temps de manière conceptuelle) et de continuité chronologique (logique chronologique de construction d’une histoire par exemple). Les « clock genes » interviennent dans les mécanismes de régulation du rythme circadien mais également dans d’autres processus, et pourraient notamment être impliqués dans la coordination des interactions sociales altérées dans l’autisme (Wimpory et al. , 2002). L’équipe de Nelson a observé un raccourcissement du rythme circadien chez les souris Fmr1 KO et Fxr2 KO lorsqu’elles sont hébergées dans l’obscurité et une perturbation totale des rythmes d’activité chez les doubles mutants Fmr1/Fxr2 (Zhang et al. , 2008). La cinétique d’expression des clock genes est altérée dans le foie des doubles mutants, conduisant à l’hypothèse que les protéines FXR

106 Discussion

(FMRP et FXR2, potentiellement FXR1) jouent un rôle en aval du pacemaker circadien chez les mammifères. Le fait qu’ait été trouvé chez les KO FVB un allongement des cycles d’activité-inactivité mérite d’approfondir avec des outils appropriés à ce type d’étude les rythmes de veille-sommeil de ces souris. Les effectifs des animaux testés en actimétrie doivent également être prochainement complétés, notamment avec les souris de fond B6. Certains traits de l’autisme et du X fragile n’ont pas été mis en évidence dans notre étude. Notamment les souris ne semblent pas présenter de stéréotypies manifestes, les trois souris que nous avons exclues de l’analyse d’actimétrie à cause de ce comportement étaient toutes WT. L’analyse des allers-retours et des redressements aux heures de pics d’activité (19h-20h et 6h-7h) n’a pas montré de différence d’activité flagrante autre que celle rapportée dans les résultats sur 24 h. Cela est interpellant car les stéréotypies sont pourtant couramment observées dans le X fragile, en général sous la forme de battements de mains et de balancements (Tsiouris & Brown, 2004). Cependant les cages d’actimétrie que nous avons utilisé ne permettent pas de détecter les mouvements fins ou de distinguer les allers-retours consécutifs des autres et il est aussi possible que le comportement puisse être différent en cage de résidence. Des vidéos ont été réalisées aux heures de pics d’activité en cage de résidence avec une lumière rouge, une semaine après le radial chez les souris déjà testées en actimétrie. Leur analyse ultérieure permettra peut-être de discriminer des stéréotypies spécifiques. Nous nous attendions également à des différences dans l’habituation à un environnement nouveau, que nous n’avons pas observées. Les expériences pilotes d’enterrement d’objets nouveaux dans la cage de résidence que nous avons réalisées pour observer la perturbation des souris face à une perturbation de son environnement n’ont pas produit de données encourageantes non plus. Les KO Fmr1 n’ont pas présenté dans l’ensemble de difficulté d’apprentissage dans les tests étudiés, sauf dans le cas des FVB KO dans le labyrinthe radial, où la mutation a aggravé le phénotype initial des WT qui ont déjà des difficultés à apprendre ce test. Les tests de rigidité cognitive et d’agressivité n’ont pas révélé de différence significative entre les WT et les KO. Effectivement l’apprentissage dans le labyrinthe en T met en évidence une différence significative entre les souches dans le nombre d’essais effectués avant d’aller visiter le bras jamais appâté, mais ce test ne permet pas de trouver d’influence de la mutation sur l’extinction. Avec ce test nous cherchions à mettre en évidence une persévération motrice chez les KO Fmr1 . Soit nous n’avons pas utilisé un critère suffisamment

107 Discussion stringent ou un test suffisamment facile à apprendre pour mettre en place une habitude chez toutes les souris et ainsi révéler les difficultés d’extinction des KO, soit les KO ne présentent pas ce trait. Notons enfin que nous n’avons pas observé lors du développement des souriceaux de délai dans la latence de redressement quand on les place sur le dos, bien que la coordination motrice soit souvent affectée dans l’autisme et le X fragile.

Pour résumer, les souris Fmr1 KO présentent plusieurs traits autistiques mais leur phénotype autistique n’est pas complet concernant les symptômes diagnostics. Le troisième critère de l’autisme de rigidité cognitive, intérêts restreints et stéréotypies est très hétérogène. On considère en particulier qu’il peut être divisé en deux catégories sous-tendues par des composantes cognitives distinctes : 1) les actions motrices d’ordre inférieur qui englobent les stéréotypies, les comportements de violence auto-dirigée, la manipulation répétitive d’objets et 2) les comportements d’ordre supérieur telles que compulsions, rituels, insistance sur l’identité des choses et intérêts restreints (Lewis et al. , 2007). Les études cliniques rapportent que les symptômes les plus courants à ce niveau chez les X fragiles autistes sont les stéréotypies et la persévération dans le discours (Tsiouris & Brown, 2004). Nous n’avons pas observé d’évidence du premier symptôme. En regard du deuxième symptôme rapporté nous disposons maintenant d’une méthode d’analyse que nous comptons encore développer qui pourrait permettre d’approfondir l’analyse des altérations de la communication. Nous avons évoqué dans l’introduction que la notion d’autisme était remplacée depuis quelques années par le concept de troubles du spectre autistique répartis sur un continuum avec un profil diagnostic plus ou moins complet et plus ou moins sévère, notamment l’autisme atypique défini par la présentation de deux critères diagnostics sur trois. De manière similaire, le modèle Fmr1 KO montre une symptomatologie partielle du X fragile mais l’anxiété sociale, l’altération de la communication émise et l’hyperactivité sont cependant bien spécifiques de ce syndrome. Dans cette perspective, bien que ne présentant pas le profil complet de l’autisme, il nous semble que les souris Fmr1 KO soient tout de même un modèle intéressant pour comprendre les mécanismes impliqués dans la genèse des traits autistiques.

108 Discussion

La mutation Fmr1 interagit-elle avec le fond génétique ?

Nous avons effectivement pu observer que les différents fonds génétiques exprimaient des altérations de manière spécifique. Notamment les KO B6 présentent une diminution de la durée et de la variabilité de leurs vocalisations sur l’ensemble du déroulement de l’expérience. Concernant les tests d’actimétrie et du labyrinthe radial les effectifs restent à compléter. Les KO FVB x B6 présentent des indices de persévération le premier jour dans le labyrinthe radial, associé à des erreurs de prise pendant plusieurs jours, des éléments qui pourraient être le signe d’une anxiété qui n’a jusqu’ici pas été trouvée chez les souris Fmr1 KO et qu’il serait intéressant de tester dans un labyrinthe en croix par exemple. Hormis cela les altérations présentées par ce fond génétique sont intermédiaires ou plus atténuées que celles présentées par les lignées pures B6 et FVB. Les souris KO B6 x FVB sont plus intéressantes car elles expriment des traits qu’on n’observe pas chez les autres fonds génétiques. Par exemple le nombre d’essais réduit avant de visiter deux fois le même bras jamais appâté lors de l’extinction dans le labyrinthe en T et le nombre d’entrées nouvelles inférieur au seuil de hasard jusqu’au jour 3 dans le labyrinthe radial sont des signes potentiels de persévération qu’il est possible d’étudier avec un test d’alternance spontanée. Au niveau des vocalisations le profil d’altération ressemble à celui des KO FVB en plus exagéré. Toutefois l’augmentation de l’activité locomotrice est plus modeste que celle trouvée chez les KO FVB et FVB x B6.

Les KO FVB présentent le phénotype le plus marqué des animaux que nous avons étudié. La mutation Fmr1 induit un évitement initial d’approche sociale et une augmentation du pourcentage d’activité diurne comme chez les autres fonds génétiques étudiés. La mutation Fmr1 aggrave aussi le phénotype des FVB qui présentent déjà un déficit d’apprentissage dans le labyrinthe radial et exagère l’activité typiquement plus élevée que chez les B6 (Mineur & Crusio, 2002) et plus élevée que les hybrides F 1. Il est difficile d’apprécier la qualité initiale des vocalisations des souris de la lignée FVB, on peut seulement constater que les KO présentent une altération de celles-ci aux jours post-nataux 6 et 8, également observée chez les KO B6 x FVB dans des conditions similaires mais peu présentes chez les KO FVB x B6 et de manière plus homogène au cours du développement chez les KO B6. D’autres traits émergent sans

109 Discussion précédent chez les WT comme le nombre de cycles activité–inactivité réduit avec allongement de la période d’activité et d’inactivité. Nous avons également observé de nombreuses convulsions, absences et courses folles chez les souris FVB KO au cours des tests, ce qui a mené à l’exclusion des animaux concernés. L’occurrence de crises cloniques ou plus discrètes avait déjà été observée de manière informelle par Ivanco et Greenough (2002). Plus d’une douzaine de souris FVB KO sont mortes des suites identifiées de convulsions au cours de ma thèse, la quasi-totalité à la fin du labyrinthe en T ou durant le labyrinthe radial, vers l’âge de 4 mois environ, alors que les FVB WT sont considérées comme résistantes aux crises (Mclin & Steward, 2006). Le poids corporel contrôlé n’était pas en dessous de 85% du poids normal. La mortalité de souris adultes FVB KO au sein de l’animalerie était également plus fréquente. Il est connu que les souris Fmr1 KO de fond B6, FVB et hybrides F1 des deux soient fortement susceptibles aux crises audiogéniques (Chen & Toth, 2001, Musumeci et al. , 2000, Qin et al. , 2005, Yan et al. , 2004), mais par comparaison une seule souris FVB x B6 KO est morte entre le test d’interaction indirecte et le labyrinthe en T et une souris FVB WT est morte durant le labyrinthe radial, toutes deux dans des circonstances inconnues.

En conclusion, l’étude parallèle sur plusieurs fonds génétiques nous a permis d’observer trois phénomènes : 1) L’induction de caractéristiques spécifiques induites par la mutation Fmr1 , à savoir l’évitement initial d’approche sociale, l’altération des vocalisations, l’augmentation de l’activité locomotrice, l’augmentation de la proportion diurne de l’activité, 2) Une synergie de la mutation avec le phénotype initial comme observé pour l’apprentissage radial et l’activité locomotrice des FVB, 3) L’émergence de traits nouveaux résultant de l’interaction de la mutation Fmr1 avec le fond génétique illustrée par la durée et l’organisation des cycles d’activité-inactivité, les crises spontanées des KO FVB et les indices de persévération des hybrides F 1.

Ces résultats sont intéressants car ils apportent des éléments nouveaux sur l’origine encore débattue des causes de variabilité de la sévérité des symptômes du X fragile que nous avons développé en introduction (Loesch et al. , 2004). Etant donné que la mutation induite chez notre modèle l’est par interruption du gène Fmr1 , nous n’avons pas de considération de taux de FMRP différents chez nos animaux expérimentaux, si bien que la variabilité des effets observés est due uniquement au fond génétique. L’hypothèse la plus simple que l’on peut formuler sur la synergie de la

110 Discussion mutation avec le fond génétique est une compensation potentielle de la fonction de la FMRP par les protéines de sa famille FXR1 et FXR2. Les doubles mutants Fmr1/Fxr2 de fond génétique B6 qui ont été étudiés présentent effectivement des phénotypes plus lourds que les mutants Fmr1 ou Fxr2 seuls (Spencer et al. , 2006, Zhang et al. , 2008). L’expression de Fxr1 et Fxr2 pourrait par exemple être évaluée par une reverse transcriptase PCR quantitative qui quantifie les ARNm transcrits. L’interaction de la mutation avec le fond génétique pourrait être étudiée par une analyse de loci de traits quantitatifs (QTL) mais elle nécessite de mieux caractériser les comportements observés.

Conclusion

Les résultats des travaux présentés dans ces pages ont permis : 1) de confirmer et d’approfondir les données d’études précédentes concernant l’anxiété sociale et l’hyperactivité, 2) d’apporter des éléments nouveaux au phénotypage des souris Fmr1 KO concernant l’émission de communication et la répartition de l’activité, 3) d’apporter des éléments nouveaux concernant les types d’effets exercés par la mutation Fmr1 sur les traits comportementaux autistiques.

Recherches futures

Ces résultats restent encore à compléter en termes d’effectifs B6 principalement pour l’actimétrie et le labyrinthe radial. Les hybrides F 1 KO semblaient présenter des indices de persévération spontanée. Dans l’hypothèse où les souris KO B6 ne présenteraient pas ce trait dans le labyrinthe radial et qu’il semblerait être propre aux hybrides, il serait intéressant de confirmer cette hypothèse dans le cadre de notre projet de phénotypage des traits autistiques et d’étude d’interaction de la mutation Fmr1 avec un test d’alternance spontanée. L’analyse de la variation du volume relatif des fibres moussues intra- infrapyramidales de l’hippocampe doit être complétée. Ceci permettra peut-être de confirmer la tendance d’interaction opposée de la mutation Fmr1 sur les fonds B6 et

111 Discussion

FVB que nous observons dans ces résultats préliminaires ainsi que les résultats des deux études indépendantes préalables. Les effectifs du test d’interaction sociale directe doivent eux aussi être complétés en particulier pour le fond génétique B6 mais les données existantes seront traitées et analysées dans un futur proche. L’analyse de vocalisations ultrasoniques des souriceaux isolés doit être encore affinée pour la recherche de séquences de motifs vocaux. Les vocalisations ultrasoniques chez les souriceaux et les souris adultes sont très étudiées par qui s’intéresse à la communication et aux émotions. La plupart des études quantifient le nombre de vocalisations en distinguant éventuellement clicks et sifflements (Branchi et al. , 2001, Hahn & Lavooy, 2005). D’autres systèmes permettent de classer les vocalisations émises, par exemple le système Avisoft utilisé dans l’analyse des vocalisations des souriceaux BTBR (Scattoni et al. , 2008). Nous avons développé une méthode d’analyse automatisée qui permet d’appréhender à la fois des aspects quantitatifs et qualitatifs des vocalisations ultrasoniques. Les différences significatives entre lignées permettent de valider la sensibilité de ce système de traitement et d’en imaginer l’application à d’autres modèles potentiels d’altération de la communication.

112 Références bibliographiques

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Thèse présentée à la Faculté des Sciences de l'Université de Genève.

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Liste des figures et tableaux

Fig 1 : Illustration d’altération fonctionnelle dans l’autisme p. 10 Fig 2 : Site fragile du chromosome X. p. 16 Fig 3 : Exemple de morphologie typique des épines dendritiques dans le SXF. p. 23 Fig 4 : FMRP. p. 25 Fig 5 : Interaction sociale indirecte, Spencer 2005. p. 33 Fig 6 : Interaction sociale directe, Mineur 2006. p. 33 Fig 7 : Organisation du premier jeu d’expériences p. 41 Fig 8 :Organisation du second jeu d’expériences p. 42 Fig 9: Résultat de PCR. p. 43 Fig 10 : Schéma du test d’interaction indirecte p. 45 Fig 11 : Activité dans le test d’interaction indirecte p. 48 Fig 12: Interactions sociales, première entrée compartiment souris. p. 49 Fig 13: Exploration olfactive, test d’interaction indirecte p. 47 Fig 14: Vocalisations ultrasoniques chez les souriceaux isolés. p. 54 Fig 15: Étapes de traitement des fichiers d’USV. p. 56 Fig 16 : Durée moyenne des sifflements ultrasoniques. p. 59 Fig 17 : Écart type moyen de la durée des sifflements ultrasoniques. p. 59 Fig 18: Fréquence moyenne des sifflements ultrasoniques jours 6 et 8. p. 60 Fig 19: Nombre de composantes dans les vocalisations ultrasoniques. p. 60 Fig 20 : Illustration du labyrinthe en T. p. 62 Fig 21 : Performances d’apprentissage dans le labyrinthe en T en jours. p. 64 Fig 20 : Extinction de l’apprentissage dans le labyrinthe en T. p. 65 Fig 23 : Test de résident-intrus. Latence de premier contact olfactif, nombre d’attaques. p. 69 Fig 24 : Illustration de la cage d’actimétrie. p. 70 Fig 25: Cage d’actimétrie. Activité lors de la première heure. p. 72 Fig 26 : Cages d’actimétrie. Fréquence moyenne sur 24h d’allers-retours et pourcentage diurne des allers-retours p. 73 Fig 27: Cages d’actimétrie, second jour. Organisation de l’activité sur 24h. p. 75 Fig 28: Illustration du labyrinthe radial p. 77 Fig 29: Labyrinthe radial, entrées nouvelles sur 8 essais : p. 79 Fig 30 : Labyrinthe radial, réponses correctes sur 8 essais : croisements. p. 81 Fig 31 : Labyrinthe radial, réponses correctes sur 8 essais : graphiques par fond génétique, KO vs WT. p. 81 Fig 32: Erreurs de non-prise lors des premiers jours d’apprentissage dans le labyrinthe radial : WT vs KO. p. 82 Fig 33: Labyrinthe radial, nombre d’erreurs de répétition au cours de l’apprentissage : croisements. p. 83 Fig 34: Latence mise pour compléter la séance quotidienne de labyrinthe radial : graphiques par fond génétique, KO vs WT. p. 84 Fig 35: Indice d’activité dans le labyrinthe radial: temps moyen passé par bras visité. p. 85 Fig 36 : Anatomie de l’hippocampe p. 89 Fig 37 : Pourcentage relatif du volume des FMIIP p. 90

Tableau I : Nombre de vocalisations émises p. 58 Tableau II : USV , Synthèse des effets de la mutation Fmr1 détectés par l’analyse statistique p. 58 Liste des figures et tableaux Abréviations

Abréviations

AI : Activité-Inactivité AR : Aller-retour. CC : Compartiment de contention. CIM-10 : Classification nternationale des maladies, 10 ième révision DSM IV-TR : Manuel statistique et diagnostique des troubles mentaux, 4 ième édition, texte révisé Dvl1 : Dishevelled 1 . e.s.m. : erreur standard moyenne

F1 : Hybrides F 1 B6 x FVB et FVB x B6 FG : Fond génétique. FMIIP : Fibres moussues infra-intra-pyramidales. FMRP : Fragile X Mental Retardation Protein . FXR : Fragile X Related ICC : Interface du compartiment de contention. IRM : Imagerie à résonnance magnétique JPN : Jour post-natal. KO : Knock out . LTD : Dépression à long terme. LTP : Potentialisation à long terme. MeCP2 : Methyl CpG binding protein 2 . mGlu1 (récepteur): récepteur métabotropique au glutamate de type 1. PCR : Polymerase chain reaction . RE : Redressement. SE : Souris expérimentale. SSt : Souris Stimulus. STS : Sulcus temporal supérieur. SXF : Syndrome du X fragile. TDA/H : Trouble déficitaire de l’attention/Hyperactivité. TED : Troubles envahissants du développement. USV : Ultrasound vocalisation. WT : Wild type . Abréviations Annexes

Critères diagnostiques du DSM-IV-TR F84.0 [299.00] Trouble autistique

A. Un total de six ( ou plus) parmi les éléments décrits en (1), (2) et (3), dont au moins deux de (1), un de (2) et un de (3) : (1) altération quantitative des interactions sociales, comme en témoignent au moins deux des éléments suivants : (a) altération marquée dans l’utilisation, pour réguler les interactions sociales, de comportements non verbaux multiples tels que le contact oculaire, la mimique faciale, les postures corporelles, les gestes (b) incapacité à établir des relations avec les pairs correspondant au niveau du développement (c) le sujet ne cherche pas spontanément à partager ses plaisirs, ses intérêts ou ses réussites avec d’autres personnes (p. ex., il ne cherche pas à montrer, à désigner du doigt ou à apporter les objets qui l’intéressent) (d) manque de réciprocité sociale ou émotionnelle

(2) altération qualitative de la communication, comme en témoigne au moins un des éléments suivants : (a) retard ou absence totale de développement du langage parlé (sans tentative de compensation par d’autres modes de communication, comme le geste ou la mimique) (b) chez les sujets maîtrisant suffisamment le langage, incapacité marquée à engager ou à soutenir une conversation avec autrui (c) usage stéréotypé et répétitif du langage, ou langage idiosyncrasique (d) absence d’un jeu de « faire semblant » varié et spontané, ou d’un jeu d’imitation sociale correspondant au niveau de développement

(3) caractère restreint, répétitif et stéréotypé des comportements, des intérêts et des activités, comme en témoigne au moins un des éléments suivants : (a) préoccupation circonscrite à un ou plusieurs centres d’intérêts stéréotypés et restreints, anormale soit dans son intensité soit dans son orientation (b) adhésion apparemment inflexible à des habitudes ou à des rituels spécifiques et non fonctionnels (c) maniérismes moteurs stéréotypés et répétitifs (p. ex. , battement ou torsions des mains ou des doigts, mouvements complexes de tout le corps) (d) préoccupation persistante pour certaines parties des objets

B. Retard ou caractère anormal du fonctionnement, débutant avant l’âge de trois ans, dans au moins un des domaines suivants : (1) interactions sociales, (2) langage nécessaire à la communication sociale, (3) jeu symbolique ou d’imagination.

C. La perturbation n’est pas mieux expliquée par le diagnostic de syndrome de Rett ou de Trouble désintégratif de l’enfance. Arrière-fond Mutation AF x M LSMeans Jour Post-Natal JPN x AF JPN x M JPN x AF X M

F(3,58)=8,77 F(5,290)=19,56 F(15,290)=2,47 Nombre clicks p<0,0001 - - p<0,0001 p=0,0036 - -

F(3,58)=3,74 F(5,290)=16,29 F(15,290)=3,18 Nombre sifflements p=0,0159 - - p<0,0001 p=0,0001 - -

F(5,290)=19,23 F(15,290)=2,16 Total vocalisations - - - p<0,0001 p=0,0106 - -

Fréquence moyenne des F(3,56)=11,87 F(5,280)=4,68 F(15,280)=6,21 F(15,280)=2,81 sifflements (kHz) p<0,0001 - - p=0,0004 p<0,0001 - p=0,0170

F(3,56)=19,47 Ecart-type moyen de la fréquence p<0,0001 ------

Fréquence maximale moyenne F(3,56)=8,17 F(5,280)=4,13 F(15,280)=3,97 (kHz) p<0,0001 - - p=0,0016 p<0,0001 - -

Amplitude moyenne des F(3,56)=15,81 F(5,280)=13,48 F(15,280)= 6,75 vocalisations (V) p<0,0001 - - p<0,0001 p<0,0001 - -

Ecart-type moyen de l'amplitude F(3,56)=14,26 F(5,280)=12,94 F(15,280)=5,92 (V) p<0,0001 - - p<0,0001 p<0,0001 - -

Amplitude maximale moyenne F(3,56)=15,80 F(5,280)=11,72 F(15,280)=5,83 (V) p<0,0001 - - p<0,0001 p<0,0001 - -

Durée moyenne des sifflements F(3,56)=5,89 F(3,56)=3,22 B6 WT vs KO: z=3,14, F(5,280)=6,74 F(5,280)=2,46 F(15,280)=1,63 (s) p=0,0014 - p=0,0293 p=0,0028 p<0,0001 - p=0,0335 p=0,0659

F(3,56)=3,56 F(3,56)=3,05 B6 WT vs KO: z=2,58, F(5,280)=17,04 F(5,280)=2,26 F(15, 280)=1,81 Ecart type durée whistles p=0,0199 - p=0,0359 p=0,0125 p<0,0001 - p=0,0599 p=0,0442

Intervalle moyen entre les F(3,56)=5,14 F(3,56)=2,04 vocalisations (s) - - - p=0,0027 p=0,0428 - -

Ecart-type des intervalles entres F(3,56)=9,07 F(3,56)=2,27 les vocalisations - - - p<0,0001 p=0,0096 - -

Intervalle moyen entre les F(5,280)=3,31 sifflements - - - p=0,0343 - - -

Ecart-type de l'intervalle entre F(3,56)=3,74 F(5,280)=4,83 F(15,280)=2,01 les vocalisations p=0,0160 - - p=0,0022 p=0,0350 - -

Nombre moyen de composantes F(3,57)=4,71 F(5,285)=6,47 F(5,285)=2,08 F(5,285)=4,89 F(15,250)=1,57 dans les vocalisations p=0,0053 - - p<0,0001 p=0,0112 p=0,0003 p=0,0832

Détail des résultats de l’ANOVA de l’expérience de Vocalisations Ultrasoniques chez le souriceau isolé: Analyse générale. Unités de mesure des paramètres: Fréquence: kHz, Amplitude: V, Durée et intervalle: sec. Légende: AF: effet de l’arrière fond, GT: effet de la mutation, AFxGT: interaction arrière fond x mutation; Tests post hoc: Least Square Means réalisé pour les interactions AFxGT, Fisher réalisé pour les interactions JourxAF ou JourxAFxGT. JPN: Jour post-natal. Tendances indiquées pour p<0,1. JPN 1 JPN 2 JPN 4 JPN 6 JPN 8 JPN 10

AF: F(3,58)=5,22 p=0,0029 AF: F(3,58)=6,03 AF x M: F(3,58)=2,92 AF: F(3, 58)=5,43 AF: F(3,58)=4,60 AF: F(3,58)=3,98 Nombre clicks p=0,0012 p=0,0414 p=0,0023 p=0,0059 - p=0,0120

AF: F(3,58)=8,35 AF: F(3,58)=4.89 AF: F(3,58)=2.87 Nombre sifflements - - p=0,0001 p=0.0042 p=0,0439 -

AF: F(3,58)=7,90 Total vocalisations - - p=0,0002 - - -

AF: F(3,56)=11,85 AF: F(3,56)=13,63 p<0,0001 p<0,0001 AF: F(3,56)=7,64 Afx M: F(3,56)=4,11 M: F(1,56)=6,98 AF: F(3,56)=6,58 Fréquence moyenne des sifflements (kHz) - - p=0,0002 p=0,0105 p=0,0107 p=0,0007

AF: F(3,56)=6,88 AF: F(3,56)=7,02 AF: F(3,56)=9,94 AF: F(3,56)= 6,02 Fréquence maximale moyenne (kHz) - - p=0,0005 p=0,0004 p<0,0001 p=0,0013

AF: F(3,56)=11,84 AF: F(3,56)=7,09 AF: F(3,56)=10,61 AF: F(3,56)=15,72 AF: F(3,56)=14,14 AF: F(3,56)= 14,82 Amplitude moyenne des vocalisations (V) p<0,0001 p=0,0004 p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001

AF: F(3,56)=10,37 AF: F(3,56)=4,76 AF: F(3,56)=7,31 AF: F(3,56)=13,61 AF: F(3,56)=10,32 AF: F(3,56)=14,54 Ecart-type moyen de l'amplitude (V) p<0,0001 p=0,005 p=0,0003 p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001

AF: F(3,56)=11,03 AF: F(3,56)=5,57 AF: F(3,56)=9,89 AF: F(3,56)=15,87 AF: F(3,56)=13,20 AF: F(3,56)= 13,26 Amplitude maximale moyenne (V) p<0,0001 p=0,002 p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001

M: F(1,56)=6,59 p=0,0129 AF x M: F(3,56)=3,54 AF*M: F(3,56)=2,27 Durée moyenne des sifflements (s) - - - p=0,0203 p=0,0904 -

AF*M: F(3,56)=4,24 M: F(1,56)=7,38 Ecart type durée whistles - - - p=0,0091 p=0,0087 -

AF: F(3,56)=2,83 Intervalle moyen entre les vocalisations (s) - - p=0,0468 - - -

Ecart-type de l'intervalle entre les AF: F(3,56)=3,49 vocalisations - p=0,0216 - - - -

Nombre moyen de composantes dans les AF: F(3,57)=12,52 AF: F(3,57)=3,62 AF: F(3,57)=3,18 M: F(1,57)=5,03 M: F(1,57)=10,14 vocalisations p<0,0001 p=0,0183 p=0,0308 p=0,0288 p=0,0024 - Détail des résultats de l’ANOVA de l’expérience de Vocalisations Ultrasoniques chez le souriceau isolé: Analyse par jour des interactions avec le JPN. Unités de mesure des paramètres: Fréquence: kHz, Amplitude: V, Durée et intervalle: sec. Légende: AF: effet de l’arrière fond, GT: effet de la mutation, AFxGT: interaction arrière fond x mutation; Tests post hoc: Least Square Means réalisé pour les interactions AFxGT, Fisher réalisé pour les interactions JourxAF ou JourxAFxGT. JPN: Jour post-natal. Tendances indiquées pour p<0,1. Mini-Review Article TheScientificWorldJOURNAL (2006) 6, 1164–1176 ISSN 1537-744X; DOI 10.1100/tsw.2006.220

Fmr1 KO Mice as a Possible Model of Autistic Features

Maude Bernardet* and Wim E. Crusio Laboratoire de Neurosciences Cognitives, CNRS UMR 5106, Université de Bordeaux I, Bat B2 - Avenue des Facultés, 33405 Talence Cedex, France

E-mail: [email protected]

Received June 26, 2006; Revised September 1, 2006; Accepted September 6, 2006; Published September 20,2006

Autism is a pervasive developmental disorder appearing before the age of 3, where communication and social interactions are impaired. It also entails stereotypic behavior or restricted interests. Although this disorder was first described in 1943, little is still known about its etiology and that of related developmental disorders. Work with human patients has provided many data on neuropathological and cognitive symptoms, but our understanding of the functional defects at the cellular level and how they come about remains sketchy. To improve this situation, autism research is in need of valid animal models. However, despite a strong hereditary component, attempts to identify genes have generally failed, suggesting that many different genes are involved. As a high proportion of patients suffering from the Fragile X Syndrome show many autistic symptoms, a mouse model of this disorder could potentially also serve as a model for autism. The Fmr1 KO mouse is a valid model of the Fragile X Syndrome and many data on behavioral and sensory-motor characteristics of this model have been gathered. We present here an assessment of autistic features in this candidate model. We conclude that Fmr1 KO mice display several autistic-like features, but more work is needed to validate this model.

KEYWORDS: animal model, autism, autistic-like traits, behavior, Fmr1 KO mice

AN OVERVIEW OF AUTISM

Autism is classified as a developmental pervasive disorder, the diagnosis of which is based on behavioral symptoms and age of onset[1], with the earliest manifestations appearing before the age of 3. Essential behavioral features of autistic disorder fall into three classes: abnormal or altered social interactions, abnormal or altered social communication, and a restrained repertory of interests and activities. Symptoms vary greatly between individuals[2,3,4]. Due to the variable clinical picture and the accompanying blurring of diagnostic classes, estimations of the prevalence of autism vary widely, but cluster around 6 births per 1000[5,6,7,8,9,10]. The syndrome is much more frequent in boys than girls, with a ratio around 4:1. Altered nonverbal social and communicative behaviors concern social gaze, facial mimics, body postures, and gestures[1,3]. Autistic individuals often fail to establish relations with peers corresponding to their levels of development. They may not spontaneously share their interests, pleasures, or

*Corresponding author. 1164 ©2006 with author. Published by TheScientificWorld, Ltd.; www.thescientificworld.com Bernardet and Crusio: Autistic features of Fmr1 KO mice TheScientificWorldJOURNAL (2006) 6, 1164–1176

achievements with other people, and may lack social or emotional reciprocity[3,11,12]. Qualitative communication alterations include a late display or complete lack of spoken language development without compensation by nonverbal communication[1]. Even in subjects who master language sufficiently, an inability to engage or sustain a conversation with a peer can be observed. Stereotyped and repetitive use of language or idiosyncratic speech may occur. Lack of spontaneous playacting and of social imitation play according to age of development also occurs frequently. The restrictive, repetitive, and stereotyped character of behaviors, interests, and activities may be manifested by a preoccupation circumscribed to one or more interest centers that is abnormal in its intensity or in its orientation. This may also show as inflexible adhesion to habits, unspecific and nonfunctional rituals, or by stereotyped motor mannerisms or persistent preoccupation for objects or parts of the body[3,13]. The core features of autism described above, defining the diagnosis of this disorder, are also frequently associated with variable accompanying symptoms[1]. In most cases, mental retardation occurs, the severity of which varies from light to profound (see [14] for a discussion). The profile of cognitive capacities is usually heterogeneous and some particular skills may occur at a much higher level than most other skills. Individuals with autism can display a variety of behavioral traits, such as hyperactivity, attention deficit[15], impulsivity, self-injurious behavior, and, particularly in the youngest, anger crises[16]. Mood or affect perturbations are frequent[17], as are disturbed sleep patterns[18,19]. The child can lack fear in some dangerous situations, but show excessive fear in others. Responses to sensory stimuli can be abnormal, e.g., a high threshold to pain, and hypersensitivity to noise and physical contact, overreaction to lights or odors, or fascination for certain stimuli[20]. Convulsions occur in 5–38% of cases, particularly before 5 years of age or in teenagers[21].

THE PUZZLE OF AUTISM: WHAT WE KNOW AND HOW WE KNOW IT

Since its description in 1943 by Kanner[3], there have been many efforts to link the behavioral features of autism to underlying neural abnormalities. Psychiatric observations, combined with data from experimental psychology, autopsies, and anatomic and functional magnetic resonance imaging, have started to shed some light on the nature of this affliction. The anomalies observed in different brain structures have led to different hypotheses implicating dysfunctions of the amygdala[11], orbitofrontal- amygdala circuit[22], frontal-striatal system, and cerebellum[23]. In addition, alterations in various neurotransmitter systems have been postulated[2]. Many structures were found to have an altered cytoarchitecture in autistic patients' brains: corpus callosum[24,25,26], parts of the limbic system, cortex[27,28], cerebellum, and brainstem, but observations were not always replicated. In the limbic system, the hippocampus, amygdala, entorhinal cortex, subiculum, mammillary body, anterior cingulate cortex, and septum display small cell sizes and increased cell packing densities at all ages (reviewed in [29,30]). Golgi analysis of CA1 and CA4 pyramidal neurons has shown decreased complexity and extent of dendritic arbors in these cells[31]. The cerebellum is also affected. Decreases in numbers of Purkinje cells were systematically observed, particularly in the inferior posterior hemisphere regions of the cerebellum[27,32,33,34]. Alterations may also differ as a function of age. Studies suggest that neurons in the vertical limb of the diagonal band of Broca, in cerebellar nuclei, and in the inferior olive are abnormally large and numerous in young individuals with autism, but are small, pale, and significantly reduced in number in adult autistic individuals[27,29,30]. The events resulting in the observed decreased numbers of Purkinje cells may occur before the connections between fibers of the olivary neurons and the Purkinje cells are formed, and may account for a possible prenatal cause of autism (see [30]). It was found that brains of children with autism are larger than those of age-matched controls, while the brains of autistic adults tend to be lighter than controls[35]. Brain enlargement seems to be postnatal as newborns show few or no differences with controls[36]. Many mechanisms have been hypothesized to explain these observations, such as increase in neurogenesis, decrease in neuronal apoptosis, increase in glial cell production, diminished synaptic pruning, or myelin abnormalities, but none has been confirmed.

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It has been proposed that autistic disorders may have viral[37], autoimmune[38], teratogenic[39], or genetic origins[40,41], none of these hypotheses being exclusive of the others. Congenital and neonatal TORCH infections (acronym for Toxoplasmosis, Others [syphilis, varicella-zoster, and parvovirus B19], Rubella, Cytomegalovirus, and Herpes) or autoimmune reactions to these pathogens have been associated with autism[42,43]. Drug use during pregnancy has also been linked to increased frequency of autism. For example, anticonvulsants, the mood stabilizer valproic acid, and antiemetic thalidomide have teratogenic effects during early stages of intrauterine development. Minor malformations that occur frequently in people with autism are known to arise in the same stages[39]. Support for a genetic basis of autism comes from a variety of sources, such as epidemiologic surveys, family and twin studies, and linkage analyses[41,44,45]. Gross disruptions of chromosomal material account for about 5% of cases of autism[46,47,48] and 5–12% of cases arise from disorders that affect the brain and have a known genetic etiology, such as tuberous sclerosis and neurofibromatosis[49,50]. Samples of the remaining cases of idiopathic autism have been examined for heritability in family and twin studies. Around 5% of siblings of autistic individuals will also develop the disorder; a rate that is 50 times higher than the 0.1% prevalence of autism in the general population[6,51]. In addition, 60–90% of monozygotic twins are concordant for this disorder[52,53,54] and many family members of probands appear to present various autistic traits, but in a milder form[55]. Genetic linkage studies have been conducted on autistic probands and their families. Numerous loci have been found to be potentially linked to the disorder, most of them being more or less specific for a given population[44]. Candidate genes include alleles of genes implicated in development, e.g., Reelin and engrailed2, and others, such as the SERT gene (serotonin transporter; [56,57]). In conclusion, studies on humans have increased our understanding of autism and its developmental origin is now generally accepted. Nevertheless, we still lack specific hypotheses to explain not only autistic symptoms, but also their heterogeneity and their emergence during development. Human studies are limited due to the scarcity of study material, personal and uncontrollable history of individuals, variability and uncontrollability of genetic background, inability to isolate genetic and environmental factors, indirect inference of brain operation within the limitations of current noninvasive methods to investigate the brain, and the difficulty with which experimental results replicate. A valid animal model, therefore, could clearly help to advance our knowledge significantly. A major challenge of any model of autistic brain development is to take into account the neural substrates implicated and the variations that can be observed between affected individuals.

FURTHER UNDERSTANDING: LOOKING FOR ANIMAL MODELS

It will be evident that no exact mouse equivalent can exist for such exquisitely human traits as are affected in autism, or for any of the other common psychiatric disorders, for that matter. Moreover, some human brain structures hardly have an equivalent or develop differently in mice. The prefrontal cortex, for example, is thought to be involved in cognitive rigidity and is poorly developed in mice[58]. In order to be useful, however, an animal model does not need to recapitulate a human disorder or syndrome exactly. Indeed, it would appear that several of the intermediate traits (or endophenotypes) of autism can be modeled in animals[59,60]. For an animal model to be considered relevant in psychiatric research, it should meet different criteria of validity, such as construct, face, and predictive validity[61,62,63]. Thus, an acceptable animal model for autism should reflect the developmental problems discussed above to satisfy the criterion of construct validity. Face validity means that the model should display autistic-like behavioral traits resembling core symptoms of autism concerning social relations, social communication, and restricted activities, and should at least approximate most of the variable symptoms, such as anxiety, mental retardation, clumsiness, aggression, hyperactivity, abnormal sensory responses, and stereotypies. Several behavioral tasks have been designed for mice to assess autistic-like traits[64]. If indeed present, such behavioral traits could be studied in the model after challenge with possible medications used in autistic patients to

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improve particular symptoms. Predictive validity of the model would be established when these drugs reduce or improve symptoms not only in the model, but in human patients, too. Primates have been used to study social relations and social communication, but they have limitations because of their high financial cost, long developmental time span, the fact that genetic manipulation is impractical, and ethical considerations. Rodents do not suffer from these drawbacks. A limitation to the use of rodent models for autism is the difficulty to model specific human features such as social gaze and sharing of interests. Nevertheless, as we will see below, most behavioral features of autism can be modeled in mice, which therefore could render valuable models for autism. Belzung et al.[58] classified models for autism in four categories: (1) animals mutated for neuropeptides implicated in social behavior and attachment (vasopressin, oxytocin, µ-opioid receptors), (2) models of epigenetic factors implied in autism (developmental deficits in serotonin, fetal exposition to anticonvulsants or thalidomide), (3) neonatal lesions of autism-associated structures, and (4) models of genetic diseases associated with autism (e.g., Fragile X or Rett Syndrome and others). The problem with the majority of these models is that they concern only some aspects of the etiology and not the whole symptomatology, although the functional role of several structures has become better understood with their help. Moreover, most of these models have up till now only been tested for a few autistic-like traits. In what follows, we will review evidence that one of the models of Belzung's fourth category, the Fmr1 KO mouse, might also serve as a model for autism.

THE FRAGILE X SYNDROME

The FMR1 mutation underlying the Fragile X syndrome (FXS) is the most frequent cause of inherited mental retardation and is interesting here because about 10–30% of these patients are also diagnosed with autism[49,65,66,67]. FXS accounts for around 5% of the autistic population[49,68,69]. Many autistic behavioral traits are common in FXS, even in patients that are not formally diagnosed with autism. FXS also shares many of the variable features of autism such as hyperactivity[70], stereotypical behavior, aggressiveness, anxiety (particularly due to social stress[70]), disturbed sleep patterns[71], high prevalence of epilepsy[72], and impairment in sensorimotor gating[73]. Both disorders are developmental and affect more boys than girls. It is interesting to note that although due to a single mutation, FXS symptoms are very variable in quality and severity between individuals, another parallel with autism. For all these reasons, autism researchers have become increasingly interested in FXS[74]. The FMRP protein, the product of the FMR1 gene, is expressed in brain tissue and in testes. In neurons, it is localized either in the nucleus or cytoplasm[75,76,77], depending on the splicing[75]. It complexes with other proteins[78] and is implicated in mRNA transport and translation regulation[78,79,80,81]. Its own translation is thought to be dependent on synaptic activity. Although much is known about its conformation, expression pattern, and localization, its role in mental retardation remains to be elucidated. A knock-out mutation has been induced in the mouse Fmr1 gene, which is 98% similar to its human ortholog, FMR1[82]. FMRP expression was disrupted by introducing a neomycin cassette into exon 5 of the gene[82]. Recently, Yan et al.[83] observed some residual Fmr1 RNA expression in these animals that may be due to alternative splice variants. Nevertheless, Fmr1 KO mice display macroorchidism and cognitive and other behavioral deficits comparable to those of human FXS patients[82]. In addition, the abnormally long and thin dendritic spines characteristic of FXS patients are also found in young KOs[84,85,86,87,88]. Fmr1 KO mice have been tested for numerous behavioral tasks relevant to FXS and these animals have therefore been validated as a model for this disorder[89]. The relatively lighter symptomatology of the disorder that has been observed in these mice for some features may be due to the above-mentioned residual expression of splice variants of Fmr1 RNA[83]. The Fmr1 KO was produced in a 129 ES cell line and the resulting mutants were then recurrently backcrossed to both C57BL/6J (B6) and FVB/N (FVB) animals. It appears that the mutation expresses differently on these two backgrounds[90,91].

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Fmr1 KO MICE: BEHAVIORAL CHECKUP RELEVANT TO AUTISTIC TRAITS

Fmr1 KO mice have been extensively studied for a large variety of behavioral and sensorimotor traits (see Tables 1 and 2). Most studies aimed to validate these mice as a model for FXS and thus only relatively few studies have assessed behavior relevant to the core symptoms of autism. An exception is abnormal social behavior, which is also a prominent feature of FXS.

TABLE 1 Phenotypical Checkup of Fmr1 KO Mice: Behaviors Relevant to Core Symptoms of Autism

Test Background Result Ref.

Inappropriate social interactions Mirrored chamber test B6 KO < WT for % time in the mirrored chamber [94] Tube test of social dominance B6 KO < WT vs. unfamiliar WT the first time [94] KO = WT vs. unfamiliar WT the third day KO = WT vs. familiar WT Social interaction test B6 KO vs. WT: [94] Active social behavior: KO > WT Passive social behavior: KO < WT KO vs. KO, WT vs. WT: Sniffing and receptive behavior: KO > WT KO vs. C3H, WT vs. C3H: KO < WT [95] Crawley test B6 KO = WT [94] Influence of cage familiarity on B6 In an unfamiliar cage: KO = WT; in a familiar [94] response to unfamiliar social cage: KO < WT during the first 5 min, KO > partners WT after 20 min Perseverance Water maze reversal learning: Hidden-platform condition B6 KO = WT [97,98] B6 Escape latencies: KO > WT [82,89,96] B6 Path length: KO > WT [96] B6 Number of trials: KO > WT [98] B6 Rate of learning: KO = WT, [96] KO>WT [89] Visible-platform condition B6 Escape latencies: KO > WT [96] KO = WT [82] E-shaped water maze reversal B6 KO = WT [89] learning Plus-shaped water maze B6 Escape latencies: KO = WT, but rate of [98] reversal learning learning: KO < WT

Although some core symptoms, such as sharing pleasures and interests with others, can hardly be modeled in rodents, the inability to establish normal relations with peers and the lack of social reciprocity can be assessed more easily. The mirrored chamber test, for instance, was developed by Seale and his team[92] based on the notion that most animals react to their mirror image as if it was another animal[93]. The apparatus consists of a box, the interior of which is totally mirrored, laid out in the center of a dark open field; the wall opposite the chamber is also mirrored. Fmr1 KO mice were found to spend less time in the center mirrored chamber compared to total time spent in the mirrored alley (considered to be less anxiogenic) and the mirrored chamber[94]. A tube test can be used to evaluate social dominance. If two

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TABLE 2 Phenotypical Checkup of Fmr1 KO Mice: Behaviors Relevant to Variable Symptoms of Autism

Test Background Result Ref.

Anxiety Elevated plus maze FVB KO = WT [100] B6 KO = WT [91,107] FVBxB6 KO = WT [107] FVBxB6 KO less anxious than WT [83] Thigmotaxis in open-field B6 KO < WT [94,101] FVBxB6 KO < WT [83] Boli in open-field B6 KO < WT [94] Light-dark exploration B6 Transitions between compartments: KO > WT [82,101] Time spent in both compartments: KO = WT Corticosterone response to B6 Males: [104] acute stress Sham and 15 min: KO = WT 0 min: KO < WT 60 min: KO > WT Females: Sham, 0 and 60 min: KO = WT 15 min: KO < WT B6 Males: [103] No stress, 30 min stress: KO = WT 2 h stress: KO > WT Conditioned emotional response B6 KO = WT [98] Learning and memory Cross-shaped water maze FVB Correct trials: KO < WT [102] B6 Escape latencies: KO = WT [98] Correct trials: KO < WT [98] KO = WT [102] Changing position of platform in B6 KO = WT [97,98] water maze E-shaped water maze B6 KO = WT [89] Morris water maze training: Hidden-platform condition B6 Escape latencies: KO = WT [96,97,101] KO > WT [89] KO > WT the first four trials [82] FVBxB6 Escape latencies: KO > WT [83] B6 Rate of learning: KO = WT [82,89,102] FVB Rate of learning: KO < WT [102] Visible-platform condition B6 Escape latencies: KO = WT [82,96] Radial maze B6 Working memory: KO = WT [91] FVBxB6 Working memory: KO < WT the first 6 days; [83] reference memory: KO < WT; strong choice design: KO = WT Barnes maze FVBxB6 KO = WT; during probe test: KO < WT [83] Fear conditioning: context and FVB KO = WT [102] conditioned cue B6 KO = WT [98,101,102] B6 KO < WT [97] Trace fear conditioning B6 KO < WT [100] Conditioned eyelid blink reflex B6 KO < WT [109]

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TABLE 2 (continued)

Test Background Result Ref.

Learning and memory (continued) Passive avoidance (latency to B6 KO = WT [82] enter dark compartment) FVB KO = WT [108] Lever press escape/avoidance B6 KO < WT [113] task Instrumental conditioning B6 Conditioning learning : KO = WT [73] Devaluation of reward and omission of lever press : KO > WT Olfactory learning and memory FVBxB6 KO = WT [83] tasks Novel object task FVBxB6 KO = WT [83] FVB KO < WT [114] Motor abilities Rotarod motor coordination and B6 KO = WT [101] balance Aggression Neutral cage aggression test B6 KO = WT [91] Hyperactivity Open field activity B6 KO > WT [91,94,101] B6 KO = WT FVBxB6 KO = WT [107] FVB KO = WT [107] FVB KO = WT before 18 min [100] KO > WT after 18 min [108] Activity cage FVB KO > WT [114] Motor activity test B6 KO > WT [82] Idiosyncratic responses to sensory stimuli Auditory startle response B6 KO = WT, but increased response with [101] Fmr1gene containing YAC B6 KO > WT at 70 and 80 dB; KO < WT at 120 dB [107] B6 KO < WT at higher intensities, interaction [73] between genotype and intensity FVB KO < WT [110] FVB KO = WT under 110 dB; KO< WT from 110 dB [108] and above FVBxB6 KO > WT at 80 dB; KO < WT at 100, 110, and [83] 120 dB FVBxB6 KO = WT [83] Prepulse inhibition B6 KO > WT [73] B6 KO > WT at 67 dB (2 dB above background [107] noise) FVB KO > WT [110] Audiogenic seizures (AS) FVB KO after long loud sound and after age 10 weeks [110] KO >> WT (143 ± 5 days) [115] KO >> WT (45 days and under) [108] B6 and FVBxB6 KO display AS, WT do not (21 days) [83] FVB KO >> WT (30 days) [83] Hot plate and tail-flick test FVB KO = WT [100]

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mice enter a tube at opposite sides, meeting in the center, generally, one will push back the other and hence be called dominant. The number of matches won by KO mice appeared to be dependent on the familiarity of the opponent animal. Familiarity of the environment also has an effect on social interactions; KO and WT spent as much time at the interface of two compartments with an unfamiliar mouse in an unfamiliar cage, but they displayed a different pattern of social exploration when put in a familiar cage[94]. Social interaction tests conducted by Spencer et al.[94] revealed that KO mice showed increased active social behaviors when confronted with a WT or KO animal, increased receptive social behaviors when opposed to a WT, and decreased receptive social behaviors when confronted with KO peers. In the social interaction test conducted by Mineur et al.[95] using C3H ovariectomized females as stimulus mice, KO displayed decreased social behavior in comparison to WT. A partition test (noncontact version of the social interaction test) revealed no difference between KO and WT[94]. Despite some divergent results most probably due to procedural differences, both groups concluded that social behavior is abnormal in KO compared to WT. A second group of core symptoms of autism concerns repetitive and stereotypic behaviors, resistance to change, and restricted activities. To date, perseverance is the only aspect that has been investigated, mostly on a B6 genetic background. It has been studied by the rate of extinction following training to swim to a platform in various types of water mazes. Three of the studies found that Fmr1 KO mice had significantly longer latencies to reach the changed position of a platform after learning an initial position[82,89,96], whereas two other studies did not find any differences with WT[97,98]. Van Dam and colleagues[98] used a cross-shaped water maze and found that although escape latencies were similar to WT, Fmr1 KO mice made significantly less correct trials. These results seem to indicate that KO animals are less flexible than WT and tend to persist in a once learned habit longer. Regarding the variable symptoms of autism, most tests conducted on Fmr1 KO mice concerned the murine equivalents of anxiety, mental retardation, hyperactivity, and idiosyncratic responses to sensory stimuli (Table 2). Some features were found to be altered, but some showed no differences. Anxiety is very often observed in autistic people and is linked to the impairment in anticipation that is thought to be the origin of ritualistic behaviors[3]. This feature could also possibly be due to an alteration of amygdala function[99]. An amygdala defect seems indeed to be present in Fmr1 KO mice as indicated by a trace fear conditioning deficit[100] and altered social interactions. Most classical anxiety tests did not show any differences between KO and WT[98,100,101,102], however, or KO were found to be even less anxious than WT[82,91,94,101]. Abnormalities in corticosterone levels in response to restrain stress have nevertheless been shown[103,104], resulting in altered negative feedback regulation of the glucocorticoid response. In consequence, Fmr1 KO mice present a delayed response to stress and are also slower to return to baseline[104]. FMRP binds to the glucocorticoid receptors and their expression was reduced in the dendritic region of the Fmr1 KO mouse hippocampus[105]. It has indeed been reported that FXS patients have a deregulated adrenopituitary axis[106]. Some studies on learning capacities indicated a deficit of KO mice in spatial learning tasks compared to WT mice[82,83,98,102] while others did not report any deficit[83,91,97,101]. Deficits were found in trace fear conditioning and were linked to LTP deficits in the lateral amygdala and cingulate cortex[100]. Similar deficits were found in Fmr1 KO on a mixed 129/FVB hybrid genetic background[102], which were investigated in only this one study. Motor abilities and aggression have been reported to be normal[91,101], but this may need further exploration. Hyperactivity, however, seems to be the most consistent behavioral feature of Fmr1 KO mice on a B6 genetic background[82,91,94,101] although Nielsen et al.[107] reported no differences after a 5- min observation in the open field. Hyperactivity in Fmr1 KO on a FVB/N background is still controversial as they were reported not to be different from control mice[100] (as was the case in KO on an FVBxB6 hybrid background[107]), but were significantly increased when test durations were longer than 18 min[108]. Although no difference was found between KO and WT in nociception in response to heat, most other responses to sensory stimuli were found to be altered in KO[100]. Koekkoek et al.[109] reported that

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conditioned eye blink reflex was altered in a Purkinje cell specific Fmr1 KO on a B6 background. Auditory startle response also seems to be FMRP dependent; although KO on both FVB and B6 backgrounds displayed opposite responses, they were both significantly different from WT[73,101,107]. Finally, Fmr1 KO mice on both genetic backgrounds were radically more prone to audiogenic seizures than their WT homologues[83,110].

CONCLUSIONS

The Fmr1 KO mouse model has been studied for several behavioral and physiological features relevant to autism and appears to display most expected symptoms. Although mixed results have been obtained for a few behavioral features, other autism-specific features are undoubtedly impaired. Most results up till now have been obtained with KO animals on the B6 background. It should be noted that in spite of the relatively scarce data, it is clear that FVB mice also are affected by the KO mutation of Fmr1, but present a specific behavioral profile different from the one displayed by B6 KOs. In particular, the Fmr1 KO mutation was shown to have opposite effects on the sizes of the hippocampal intra- and infrapyramidal mossy fiber (IIPMF) terminal fields, depending on whether the mutation was expressed on a B6 or FVB background[90,91]. These IIPMF seem to be implicated in several behaviors[111,112]. Thus, it should be interesting to carry out more systematic studies in both the B6 and FVB backgrounds. This might render a plastic and reliable model for autism that takes into account the variability of the disorder in humans. Despite the foregoing, it is clear that much work remains to be done before Fmr1 KO mice can be validated as a model for autism. In particular, social communication and cognitive rigidity have hardly been investigated yet. Several variable features of autism, such as sleep disturbance, brain overgrowth, developmental delays, and stereotypies, also need more detailed investigation. In conclusion, the etiology of autism remains unknown and the limitations of research in humans make it necessary to develop animal models for this disorder. These models must fit construct, face, and predictive validity criteria. Several possible models exist, but few of them have been extensively studied as yet. The current short review shows that not only does the Fragile X Syndrome have a symptomatology resembling autism to a very large extent and that the validated genetic mouse model that is available for this disorder, the Fmr1 KO mouse also shows much promise as a possible model for autism.

ACKNOWLEDGMENTS

Supported by grants from the March of Dimes (12-FY05-1198), Conseil Régional d’Aquitaine, CNRS, and the University of Bordeaux I to WEC.

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This article should be cited as follows: Bernardet, M. and Crusio, W.E. (2006) Fmr1 KO mice as a possible model of autistic features. TheScientificWorldJOURNAL 6, 1164–1176. DOI 10.1100/tsw.2006.220.

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