I N a U G U R a L D I S S E R T a T I O N

Home , GABA analogue, KCNQ channels

Synthese und Charakterisierung von Liganden spannungsabhängiger KV7-Kaliumkanäle auf Grundlage der Arzneistoffe Flupirtin und Retigabin

I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n

zur

Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der

Universität Greifswald

vorgelegt von Christian Bock

Greifswald, Mai 2019

Dekan: Prof. Dr. Werner Weitschies

1. Gutachter: Prof. Dr. Andreas Link 2. Gutachter: Prof. Dr. Holger Stark

Tag der Promotion: 19.07.2019 Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ...... IV

1 Einleitung und Zielstellung ...... 1

1.1 Physiologie spannungsabhängiger KV7-Kaliumkanäle ...... 1 1.2 Modulation von KV7-Kanälen...... 2 1.3 Das Analgetikum Flupirtin ...... 3 1.4 Das Antikonvulsivum Retigabin ...... 4 1.5 Bindetasche von Retigabin und Flupirtin ...... 4 1.6 Bisher publizierte KV7-Kanal-Öffner ...... 5 1.7 Therapeutisches Potential von KV7-Kanalöffnern ...... 7 1.8 Zielstellung der vorliegenden Arbeit ...... 7

2 Methoden und Ergebnisse ...... 8 2.1 Synthese der Flupirtin-Analoga ...... 8 2.2 Synthese der Retigabin-Analoga ...... 13 2.3 Synthese des Pyrimidin-Sulfids ...... 15 2.4 Bestimmung des Oxidationspotentials ...... 16 2.5 Bestimmung der Lipophilie ...... 17 2.6 Bestimmung der KV7.2/3-Modulation ...... 17 2.7 Bestimmung der Hepatotoxizität ...... 17

3 Diskussion und Ausblick ...... 19

4 Literaturverzeichnis ...... 22

5 Publikationen ...... 29

Synthesis and potassium KV7 channel opening activity of thioether analogues of the analgesic flupirtine ...... 29 Flupirtine Analogues: Explorative Synthesis and Influence of Chemical Structure on KV7.2/KV7.3 Channel Opening Activity ...... 35 How to replace the lost keys? Strategies towards safer KV7 channel openers ...... 40 Sulfide Analogues of Flupirtine and Retigabine with Nanomolar KV7.2/KV7.3 Channel Opening Activity ...... 60 Flupirtine and Retigabine as Templates for Ligand-based Drug Design of KCNQ2/3 activators ...... 75 Simultaneous quantification of acidic and basic flupirtine metabolites by supercritical fluid chromatography according to European Medicines Agency validation ...... 87 Thioether als Modulatoren von KV7.2/KV7.3-Kanälen ...... 101

6 Veröffentlichungsverzeichnis...... 152 6.1 Wissenschaftliche Artikel ...... 152 6.2 Patentschrift ...... 152 6.3 Posterpräsentationen ...... 152

Abkürzungsverzeichnis

ACN Acetonitril ALAT Alanin-Aminotransferase ALS amyotrophe Lateralsklerose ASAT Aspartat-Aminotransferase BfArM Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte BFNE benigne familiäre Neugeborenenepilepsie DCM Dichlormethan DMA N,N-Dimethylanilin DMAP 4-(Dimethylamino)pyridin DMF N,N-Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid

EC50 Konzentration, bei der ein halbmaximaler Effekt auftritt EPA United States Environmental Protection Agency FILI flupirtine induced liver injury FLIPR fluorescent imaging plate reader

GABA -Aminobuttersäure HATU O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium-hexafluorphosphat HEK human embryonic kidney cells

IKs repolarisierender Kaliumstrom

+ IM M-type K current IMS imaging mass spectrometry

LD25 Konzentration, welche die Zellviabilität auf 75 % senkt mAChR muskarinischer Acetylcholinrezeptor mCPBA meta-Chlorperoxybenzoesäure NBS N-Bromsuccinimid NSAR nichtsteroidales Antirheumatikum

PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphonat PLC Phospholipase C PRAC Pharmacovigilance Risk Assessment Center SAR structure activity relationship Ssm Scolopendra subspinipes mutilans

Abkürzungsverzeichnis

TAMH transforming growth factor-a transgenic mouse hepatocyte TFA Trifluoressigsäure THF Tetrahydrofuran TsCl para-Toluensulfonsäurechlorid VSD voltage-sensing domain (Spannungssensor-Domäne) ZNS zentrales Nervensystem

Einleitung und Zielstellung

1 Einleitung und Zielstellung

1.1 Physiologie spannungsabhängiger KV7-Kaliumkanäle Bereits im Jahr 1980 konnte durch Brown und Adams ein spannungsabhängiger Kaliumstrom in sympathischen Neuronen des nordamerikanischen Ochsenfrosches (Rana catesbeiana) nachgewiesen werden[1]. Dabei wurde mittels Voltage-Clamp-Experimenten gezeigt, dass die Stärke des Kaliumstroms vom Membranpotential abhängig ist. Während bei Potentialen unter −60 mV kein Kaliumstrom zu beobachten war, steigerte sich dieser mit zunehmendem Potential in sigmoider Form und erreichte ein Plateau bei ca. −10 mV. Die zu beobachtende Hemmung des Kaliumstroms durch Aktivierung muskarinerger Rezeptoren führte zur Benennung desselben als M-current (IM). Die dem Ionenstrom zugrunde liegenden Kanäle konnten erst ca. 20 Jahre später identifiziert werden. Zunächst wurde 1996 durch Wang et al. das Gen für das KVLQT1-Protein (später als KV7.1 bekannt) beschrieben, welches aufgrund seiner Ähnlichkeit zu schon bekannten spannungsabhängigen Kaliumkanälen als eben solcher Kanal identifiziert wurde[2]. Die überwiegende Expression des Proteins in Herz und in der Niere, aber die Abwesenheit im Gehirn zeigte, dass es sich nicht um die molekulare Grundlage des IM handeln konnte. Im selben Jahr wurde auch der nKQT2-Kanal (später als KV7.2 bezeichnet) durch die Entschlüsselung des Genoms eines Fadenwurms (Caenorhabiditis elegans) entdeckt[3]. Der dritte Vertreter der Proteinfamilie konnte [4] 1998 als KCNQ3 (später als KV7.3 bezeichnet) identifiziert werden . Wenige Monate danach wurde dann ein [5] heteromerer Kanal aus KV7.2- und KV7.3-Untereinheiten als Grundlage des IM publiziert . Komplettiert wurde die KV7-Familie durch die Entdeckungen von KCNQ4 (KV7.4) im Jahre 1999 sowie KCNQ5 (KV7.5) im Jahre 2000[6,7].

[6,8] Die Proteine der KV7-Familie sind aus 676–932 Aminosäuren aufgebaut . Diese teilen sich auf in sechs transmembranäre Domänen (S1–S6), sowie eine Schlaufe zwischen S5–S6 und lange intrazelluläre C- und N- Termini (siehe Abbildung 1). Der Abschnitt S1–S4 fungiert als Spannungssensor-Domäne (voltage-sensing domain, VSD), während von dem Abschnitt S5–S6 die ionenselektive Pore gebildet wird. KV7-Kanäle werden aus vier Untereinheiten aufgebaut, wobei fast ausschließlich Tetramere aus Poren-formenden -Untereinheiten

(KV7.1–5) funktionsfähige Kanäle bilden. Lediglich das KV7.1-Protein neigt dazu auch mit Poren-losen - Untereinheiten (vor allem KCNE1 und KCNE3) Kanäle zu bilden[8,9]. Neben den möglichen Homotetrameren, welche aus vier gleichen -Untereinheiten bestehen, werden auch häufig Heterotetramere aus zwei verschiedenen -Untereinheiten beschrieben. Diese setzten sich in symmetrischer Weise zusammen (siehe

Abbildung 1). Die Affinität der Untereinheiten zueinander ist verschieden stark ausgeprägt. So bildet das KV7.1- Protein bevorzugt homomere Kanäle oder assembliert, wie bereits erwähnt, mit -Untereinheiten.

Heterotetramere mit anderen -Untereinheiten sind für KV7.1 nicht beschrieben. Die KV7.2-Untereinheit kann Homotetramere ausbilden, diese zeigen allerdings einen elffach niedrigeren Kaliumstrom als das Heterotetramer mit KV7.3, entsprechend sollte die physiologische Bedeutung dieser Homotetramere von [5] vernachlässigbarer Bedeutung sein . Für KV7.3 gilt Gleiches, so zeigt das Homotetramer einen deutlich geringeren Kaliumstrom als das Heterotetramer mit KV7.2. KV7.3 bildet allerdings zusätzlich Kanäle mit KV7.4 bzw. KV7.5. Auch für das KV7.4-Protein sind Homotetramere beschrieben und neben der bereits erwähnten [8] Konjugation mit KV7.3 werden auch Heterotetramere mit KV7.5 berichtet .

KV7-Kanäle kommen ubiquitär im menschlichen Körper vor, allerdings zeigt sich ein Subtyp-spezifisches Verteilungsmuster. Während KV7.1 vor allem im Herzen nachgewiesen werden kann und dort die Grundlage [10] für den repolarisierenden Kaliumstrom (IKs) bildet , kommen alle anderen Subtypen in den verschiedensten neuronalen Geweben vor und bilden die molekulare Grundlage für den IM. KV7.2, KV7.3 und KV7.5 werden im [11] gesamten zentralen Nervensystem (ZNS) exprimiert , KV7.4 hingegen nur in definierten Regionen wie dem [12] Innenohr und bestimmten dopaminergen Nervenzellen . Zusätzlich treten KV7.4 und KV7.5 häufig in glatten Muskelzellen wie Blutgefäßen, dem Gastrointestinaltrakt, Bronchien sowie der Blase auf[13]. Eine Aktivierung der KV7-Kanäle, z. B. durch die Depolarisation des Membranpotentials durch ein Aktionspotential, führt zu einem Kaliumausstrom aus der Zelle und damit zu einer Hyperpolarisation[14]. Entsprechend wird die Zelle dadurch weniger erregbar. Da KV7-Kanäle langsam aktivierend und nicht inaktivierbar sind, wird vor allem

Einleitung und Zielstellung

repetitives neuronales Feuern unterdrückt, sie fungieren also als eine Art Bremse in Nervenzellen und beugen Übererregbarkeiten, wie z.B. bei chronischen Schmerzen oder Epilepsien, vor. Die wichtige Rolle der KV7- Kanäle für verschiedene physiologische Funktionen lässt sich mit Krankheitsbildern verdeutlichen, welche auf fehlerhaften KV7-Proteinen beruhen. So konnten Mutationen von KV7.1-Proteinen als Ursache für ein [15] pathologisch verlängertes QT-Intervall (Long-QT-Syndrom) identifiziert werden . Mutationen von KV7.2 und KV7.3 Proteinen wurden als ursächlich für die benigne familiäre Neugeborenenepilepsie (BFNE) nachgewiesen. Von KV7.4-Proteinen ist bekannt, dass diese für den Hörvorgang von immenser Bedeutung sind, entsprechend konnten Mutationen dieser Proteine mit einem fortschreitenden Hörverlust (DFNA2) assoziiert werden[12].

Abbildung 1: Links, Blick von der extrazellulären Seite auf das Homotetramer aus zwei KV7.2-Untereinheiten (blau) sowie zwei KV7.3- Untereinheiten (grau). Die Struktur wurde mittels Homology-Modeling auf Grundlage der kristallisierten KV1.2/2.1-Chimäre erhalten. Rechts, Seitenansicht der KV7.2-Untereinheit mit ihrem langen N-Terminus (blau) sowie den 6 transmembranären Domänen S1 (rot), S2 (grün), S3 (orange), S4 (gelb), S5 (magenta), S6 (cyan) und der intramembranären Schlaufe (braun).

1.2 Modulation von KV7-Kanälen

Wie bereits erwähnt hängt die Öffnungswahrscheinlichkeit der KV7-Kanäle vor allem vom Membranpotential ab. So liegen, abhängig von der Subtyp-Zusammensetzung, im Bereich von −20 bis −40 mV ca. 50 % der Kanäle im offenen Zustand vor[16]. Mit zunehmenden Membranpotential nimmt die Öffnungswahrscheinlichkeit in sigmoider Form zu und erreicht im schwach negativen Bereich ihr Plateau. Allerdings kann die Kanalaktivität auch spannungsunabhängig beeinflusst werden. So wird Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) benötigt, [17] um die offene Konformation des Kanals zu stabilisieren . Dementsprechend führt eine Senkung der PIP2- Konzentration, z.B. durch Aktivierung von muskarinischen Acetylcholinrezeptoren (mAChR) und resultierende [18] Phospholipase C (PLC)-katalysierte PIP2-Hydrolyse zu KV7-Kanal-Inaktivierung . In einer aktuellen

Publikation konnte außerdem -Aminobuttersäure (GABA) als endogener Ligand an KV7-Kanälen nachgewiesen werden[19]. So beschreiben Manville et al., dass in Anwesenheit von GABA die Aktivierungskurve von KV7-Kanälen zu negativeren Membranpotentialen verschoben wird. Somit nimmt auch beim Ruhemembranpotential und bei schwachen Depolarisationen ein höherer Anteil die offene Konformation ein, es resultiert ein größerer Kaliumausstrom. Effekte wurden dabei an KV7.2/3, KV7.4 und KV7.5 beobachtet, es konnte kein Einfluss auf KV7.1 und KV7.2 nachgewiesen werden. Wenig überraschend wurde kurze Zeit später [20] auch Gabapentin als hochpotenter Aktivator von KV7-Kanälen beschrieben . Vor allem die Öffnungswahrscheinlichkeit des KV7.2/3-Heterotetramers und von KV7.5-Kanälen kann durch das Antikonvulsivum gesteigert werden, wobei halbmaximale Effekte (EC50) schon bei nanomolaren Konzentrationen beobachtet werden. Auch verschiedene Naturstoffe üben einen Einfluss auf KV7-Kanäle aus, so nutzt der Chinesische Rotkopfhundertfüßer (Scolopendra subspinipes mutilans, Ssm) einen hochpotenten Kaliumkanalblocker um seine Beute zu erlegen. Das Peptid Ssm Spooky Toxin inhibiert dabei KV7.1, KV7.2, 2

Einleitung und Zielstellung

[21] KV7.4 und KV7.5 und soll dadurch das respiratorische, vaskuläre und zentralnervöse System blockieren . Entgegengesetzt dazu konnte in einer nichttoxischen Fraktion des Giftes des Skorpions Androctonus australis [22] ein Peptid nachgewiesen werden, welches KV7.4-Kanäle aktiviert . Neben diesen natürlich vorkommenden Substanzen wurde bereits eine Vielzahl synthetisch generierter Verbindungen auf eine KV7-Kanal- modulierende Wirkung hin untersucht und dadurch hochpotente Modulatoren identifiziert (siehe Kapitel 1.6). Zur Marktreife gebracht haben es bisher allerdings nur zwei eng miteinander verwandte Verbindungen, auf welche im Folgenden näher eingegangen werden soll.

1.3 Das Analgetikum Flupirtin Ähnlich wie der M-current wurde auch das Triaminopyridin Flupirtin (1, siehe Abbildung 2) in den 1980er Jahren entdeckt und anschließend in die Schmerz-Therapie eingeführt, ohne den genauen Wirkmechanismus zu [23] kennen . So konnte erst Anfang des 21. Jahrhunderts die KV7-Kanal-modulierende Wirkung von 1 identifiziert werden[24]. Als Analgetikum mit zusätzlich muskelrelaxierendem Effekt bei akuten und chronischen Schmerzen wurde 1 1984 in Deutschland zugelassen[25]. Während Nebenwirkungen wie Übelkeit, Schwindel und Schläfrigkeit bereits bei der Markteinführung bekannt waren, konnten im Rahmen der Pharmakovigilanz mit zunehmenden Verschreibungen auch schwerwiegende Arzneimittelreaktionen beobachtet werden. So wurden bis 2013 330 Fälle von Leberschädigungen unter einer Flupirtin-Medikation berichtet, davon 49 Fälle mit Leberversagen und 15 mit tödlichem Ausgang oder notwendiger Lebertransplantation. Entsprechend wurde der Arzneistoff vom Pharmacovigilance Risk Assessment Committee (PRAC) neu bewertet und die maximale Therapiedauer auf zwei Wochen beschränkt, unter wöchentlicher Kontrolle der Alanin-Aminotransferase- (ALAT) und Aspartat-Aminotransferase (ASAT)-Spiegel. Außerdem war Flupirtin nur indiziert, wenn gegen Opioide oder nichtsteroidale Antirheumatika (NSAR) Kontraindikationen vorlagen[26]. Initiiert vom Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM) wurde das Nutzen-Risiko-Verhältnis von 1 durch das PRAC 2018 erneut bewertet. Da trotz der Anwendungsbeschränkung noch immer 23 Fälle von Leberversagen unter Flupirtin-Medikation auftraten, wurde empfohlen die Zulassung für Flupirtin-haltige Arzneimittel zu widerrufen. Zwar muss die European Medicines Agency (EMA) diese Empfehlung zunächst noch übernehmen, von den Herstellern wurde 1 allerdings schon vom Markt genommen. Der exakte Toxizitätsmechanismus von 1 ist noch nicht nachgewiesen, dennoch geben einige Veröffentlichungen Aufschluss über eine mögliche in vivo-Toxifizierung. So konnte zunächst unter in vitro- Bedingungen ein Glutathion-Addukt von 1 nach vorhergehender Oxidation mittels Peroxidasen erhalten werden[27]. Postuliert wird dabei eine Oxidation zu Azachinondiiminen (3 und dessen ortho-Isomer, siehe Abbildung 2), welche mit Nucleophilen abreagieren. Unterstützt wird diese Hypothese durch den Nachweis von Cystein-Konjugaten von 1 in Probanden nach peroraler Verabreichung des Arzneistoffes[28]. Die intermediär gebildete Verbindung 3 könnte entsprechend zunächst mit dem körpereigenen Glutathion (GSH) reagieren, nach dem Erschöpfen der GSH-Spiegel aber kovalent an Leberenzyme binden und somit direkt toxisch wirken, oder eine Immunreaktion hervorrufen. Gerade ältere Patienten, bei denen generell niedrigere GSH- Konzentrationen beobachtet werden[29], wären damit einem hohen Risiko für Flupirtin-induzierte Leberschädigungen (flupirtine induced liver injuries, FILI) ausgesetzt. Zusätzlich konnte in einer aktuellen Publikation eine genetische Komponente mit einem erhöhten FILI-Risiko assoziiert werden[30]. So wurde für Patienten mit einer Mutation im humanen Leukozytenantigen-System ein 19-fach höheres Risiko für FILI nachgewiesen. Eine immunologische Reaktion auf modifizierte Leberenzyme als Ursache für FILI scheint somit noch wahrscheinlicher zu sein. Diese Hypothese könnte auch erklären, warum einige Patienten nach Jahren der Einnahme von hohen Dosen 1 keine Auffälligkeiten zeigen, während andere innerhalb weniger Wochen mit erhöhten ALAT- und ASAT-Werten reagieren[31].

Einleitung und Zielstellung

Abbildung 2: Strukturen der Arzneistoffe Flupirtin (1) und Retigabin (2) sowie eines postulierten Flupirtin-Metaboliten 3.

1.4 Das Antikonvulsivum Retigabin Ausgehend von 1 wurden viele weitere strukturell hochanaloge Verbindungen synthetisiert und resultierend Retigabin (2) 2011 zur Behandlung von Epilepsien durch die EMA und die U.S. Food & Drug Administration (FDA) zugelassen[32]. Die fast identischen Strukturen der Arzneistoffe lassen auf gleiche pharmakodynamische Eigenschaften schließen und so überrascht es wenig, dass 2 ebenfalls KV7-Kanäle öffnet und als Nebenwirkung vor allem Schwindel, Schläfrigkeit und Verwirrtheit auftreten[33]. Unter Retigabin-Therapie wurden allerdings keine erhöhten Risiken für Leberschädigungen oder ein Anstieg der ASAT- und ALAT-Konzentrationen berichtet. Frei von schwerwiegenden Nebenwirkungen ist 2 aber auch nicht, so werden im Median nach vier Jahren Therapiedauer Blauverfärbungen in Geweben beobachtet[34]. Vor allem Lippen, Nägel, Gaumen und die Binde- sowie Lederhaut des Auges sind von den Verfärbungen betroffen[35]. Bereits 2015 war bekannt, dass es sich bei den Farbstoffen um unlösliche Pigmente aus Retigabin-Dimeren handelt, deren Entstehung und Struktur allerdings nicht beschrieben wurde[36]. In einer aktuellen Veröffentlichung konnte mittels bildgebender Massenspektrometrie (imaging mass spectrometry, IMS) die Anreicherung von Phenazinen und verwandten Strukturen in der Aderhaut von Ratten nachgewiesen werden, nachdem diese für 91 bzw. 271 Tage mit 2 behandelt wurden[37]. In Anwesenheit von Melanin und Sauerstoff soll 2 dabei analog zu 1 zum para- Azachinondiimin oxidieren, welches zu Dimeren weiterreagiert (4 und 5, siehe Abbildung 3). Zwar ist die Blauverfärbung reversibel nach dem Absetzten von 2 und verschwindet nach einigen Jahren[38], dennoch führten die Befunde zur genaueren Begutachtung durch die FDA und der daraus folgenden Empfehlung regelmäßige Augenuntersuchungen unter Retigabin-Therapie durchzuführen, da ein potentieller Sehverlust nicht auszuschließen war[34]. Die EMA erneuerte die Zulassung von 2 im Jahr 2016, da noch immer eine positive Nutzen-Risiko-Balance festzustellen war, dennoch wurden alle Retigabin-haltigen Arzneimittel von der Firma GlaxoSmithKline zum Juli 2017 von Markt genommen[39].

Abbildung 3: In der Aderhaut von Ratten nach längerer Behandlung mit 2 detektierbare Dimere 4 und 5.

1.5 Bindetasche von Retigabin und Flupirtin

Sowohl 1 als auch 2 verschieben die Aktivierungskurve von KV7-Kanälen zu negativeren Potentialen und stabilisieren die offene Konformation[40]. Dabei werden alle Subtypen in etwa gleich potent moduliert, lediglich [16,41] an KV7.1-Kanälen zeigen beide Arzneistoffe keine Wirkung . Der Bindungsmodus von 2 wurde in den letzten 15 Jahren zunehmend besser verstanden, sodass mittlerweile die Bindetasche grob bestimmt werden kann. Zunächst konnten Wuttke et al. mit Hilfe von chimären KV7-Kanälen die Region der Bindetasche auf die Poren- [42] formende S5–S6-Region einschränken . So waren die Wildtypen des KV7.2-Kanals sensitiv für 2, nach dem Austausch von S5–S6 durch die Porenregion des KV7.1-Kanals konnte die Retigabin-Modulation allerdings aufgehoben werden. Umgekehrt konnten KV7.1-Kanäle durch 2 geöffnet werden, wenn die Aminosäuren von 4

Einleitung und Zielstellung

S5–S6 des KV7.2-Subtyps eingebaut wurden. Durch gezielte Punktmutationen wurden anschließend einzelne Aminosäuren für die Retigabin-Bindung verantwortlich gemacht. So liegt die Übereinstimmung der [14] Aminosäuresequenzen zwischen den KV7-Subtypen zwar nur bei 31–65 % , allerdings ist die Porenregion deutlich homologer (siehe Abbildung 4).

Abbildung 4: Aminosäuresequenzen der transmembranären Domänen S5 und S6 sowie der intramembranären Schlaufe der einzelnen KV7-Subtypen. Schwarz eingerahmt sind Aminosäuren, die für eine Retigabin-Modulation essentiell sind. Verwendet wurden die Aminosäuresequenzen, die in der UniProt-Datenbank für die KCNQ-Gene hinterlegt sind.

Durch Vergleich der Aminosäuren von KV7.1 mit denen der anderen -Untereinheiten konnten Aminosäuren identifiziert werden, welche von potentieller Bedeutung für die Retigabin-Bindung sind. Gezielte Mutationen dieser Aminosäuren zeigten den essentiellen Einfluss von W236, L243, L275, L299 und G301 (Nummerierung [42,43] bezogen auf die KV7.2-Aminosäuresequenz) . Die immense Bedeutung von W236 wurde in einer späteren Publikation untermauert, indem gezeigt wurde, dass das Indol-NH-Proton des Tryptophans eine Wasserstoff- Brückenbindung mit dem Carbonyl-Sauerstoff von 2 eingeht[44]. Durch Berechnung der Kanal-Konformation im geöffneten und geschlossenen Zustand sowie Docking von 2 in die postulierte Bindetasche konnten weitere Interaktionen gefunden werden. So scheint die 4-Fluorbenzyl-Struktur essentiell für die Stabilisierung der offenen Konformation zu sein, da diese --Interaktionen zwischen W265 und F343 (Nummerierung [45] entsprechend der KV7.3-Aminosäuresequenz) unterbindet .

1.6 Bisher publizierte KV7-Kanal-Öffner Die Struktur von 1 und 2 wurde in zahlreichen Arbeiten modifiziert, wobei auch größere strukturelle Eingriffe toleriert wurden. Ein einheitliches Bild aus Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (structure activity relationship, SAR) konnte aus diesen Daten allerdings nicht generiert werden. Lemmerhirt et al. unterzogen das Triamino- Grundgerüst von 1 verschiedenen Alkylierungen und konnten dabei Verbindungen erhalten, die in etwa so potent sind wie 2 an KV7.2/3. Die Hypothese das die Toxizität der Verbindungen direkt von ihrer Oxidierbarkeit abhängt, welche mittels Cyclovoltammetrie bestimmt wurde, musste zwar verworfen werden, dafür konnte gezeigt werden, dass eine leichte Oxidierbarkeit für die Aktivität der Verbindungen benötigt wurde[46]. Bei der dänischen Firma NeuroSearch konnten Dalby-Brown et al. durch Einführen von Amiden anstelle der Carbamat- Struktur und Ersetzen der primären Aminogruppe durch Heterocyclen die Potenz von 1 deutlich überbieten. Die aktivste Verbindung 6 konnte dabei sogar eine EC50 im subnanomolaren Bereich erzielen [47,48] (EC50 = 0,32 nmol/L) . Auch die Firmen Pfizer und Grünenthal entwickelten eine Vielzahl an Verbindungen, die hochpotente Modulatoren von KV7-Kanälen sind, strukturell allerdings deutlich stärker von 1 sowie 2 abweichen[49]. Interessante Eigenschaften zeigen dabei die Verbindungen 7 und 8 von Grünenthal. Diese unterscheiden sich nur durch die Art und Position eines Substituenten in der Seitenkette des Amids, dennoch ist 7 ein Kaliumkanalöffner und 8 ein Blocker von KV7.2.3-Kanälen. Mit Hilfe geringfügiger struktureller Modifikationen von 1 und 2 konnten bereits Verbindungen erhalten werden, welche eine verbesserte Subtyp- Spezifität aufweisen. So zeigten Kumar et al., dass die Selektivität ihrer Verbindungen für KV7.2/3-Kanäle im Vergleich zu KV7.4 und KV7.5 zunahm, wenn anstelle des 4-Fluoro-Substituenten eine 3-Trifluormethyl-Gruppe in die benzylische Seitenkette eingeführt wurde[50]. In einer aktuellen Publikation wurde auch der umgekehrte Fall beschrieben, so führte das Anfügen von sterisch anspruchsvollen Substituenten an das sekundäre Amin von 2 zu Verbindungen wie dem Ethinylderivat 9 (Abbildung 5) welche keine Wirkung auf KV7.2 ausüben, aber [51] den Kaliumausstrom in KV7.4 und KV7.5 deutlich steigern .

Einleitung und Zielstellung

Abbildung 5: Übersicht einiger bisher publizierter KV7-Kanal-Modulatoren, darunter die aktivste bekannte Verbindung 6, sowie der Kanalöffner 7 und der strukturell eng verwandte Blocker 8. Außerdem dargestellt ist der KV7.4- und KV7.5-selektive Kanalöffner 9.

Neben diesen noch teilweise an 1 und 2 erinnernden Strukturen, wurde auch eine Reihe grundverschiedener Modulatoren der KV7-Familie beschrieben. So konnte die US-amerikanische Firma ICAgen bereits 2002 eine Reihe von Amiden als Kaliumkanal-Öffner patentieren[52]. Zwar ähneln die Verbindungen der Benzylaminopyridin-Struktur von 1, dennoch lassen viele Publikationen darauf schließen, dass durch diese Verbindungen eine andere Bindetasche adressiert wird. Für ICA-027243 (10) konnte entsprechend gezeigt werden, dass die Kanal-Interaktionen im Bereich von S1–S3 stattfinden sollten, also in der VSD[53]. Das Selektivitätsprofil der Verbindungen scheint einen Vorteil gegenüber 1 und 2 zu bieten, da vor allem das KV7.2/3-Heterotetramer von den Substanzen aktiviert wird. Nur geringe Affinitäten konnten für KV7.1, KV7.4 und [54] Kv7.3/5 beschrieben werden . Neben der Verschiebung der Aktivierungskurve zu negativeren Potentialen induzieren die ICA-Verbindungen auch einen spannungsunabhängigen Kaliumstrom in KV7.2-Subtypen, durch die Reaktivität der 2-Chlorpyridinstruktur ist 10 allerdings als potentiell toxisch einzustufen[55]. Bereits 2005 [56] wurde bekannt, dass auch die NSARs Meclofenaminsäure und Diclofenac KV7-Kanäle öffnen . Durch Derivatisierung der Carbonsäure-Funktion zu Amiden mit terminaler Hydroxygruppe (siehe Verbindung 11, Abbildung 6) konnte anschließend die KV7-Modulation von der Cyclooxygenase-Hemmung separiert und damit die Selektivität verbessert werden[57]. Die Bindetasche der Verbindungen wird ebenfalls in der VSD vermutet[58]. Durch die Firma Bristol-Myers Squibb konnten auch optisch aktive Verbindungen dargestellt und hinsichtlich ihrer KV7-Aktivität untersucht werden. Vor allem die S-Enantiomere ihrer Substanzen wie 12 zeigen trotz der strukturellen Unterschiede ähnliche Eigenschaften wie 2. So werden die gleichen KV7-Subtypen aktiviert und wahrscheinlich auch die gleiche Bindetasche adressiert[59]. Die Potenz der Verbindungen ist allerdings deutlich [60] größer . Eine weitere Leitstruktur für die Entwicklung von KV7-Kanalöffnern konnte durch Qi et al. veröffentlich werden[61]. Die Verbindungen inkorporieren ausgedehnte planare Systeme (siehe Verbindung 13) und [62] modulieren alle KV7-Untereinheiten außer KV7.3 ähnlich potent wie 1 . Auch für diese Verbindungen wird eine andere Bindetasche vermutet als für 1 und 2[63].

Abbildung 6: Strukturen verschiedener KV7-Kanalöffner, darunter die ICA-Verbindung 10, das Diclofenac-Derivat 11, sowie (S)-2 von Bristol-Myers Squibb (12) und QO-58 (13).

Zusätzlich zur Liganden-gesteuerten Aktivierung von KV7-Kanälen konnten auch andere Mechanismen für deren Öffnung publiziert werden. Von dem Antimykotikum Zink-Pyrithion ist schon länger bekannt, dass es in der Lage ist alle KV7-Subtypen zu aktivieren mit Ausnahme von KV7.3 und es wurde davon ausgegangen, dass es als Ligand an einer anderen Stelle bindet als 2[64]. In einer aktuellen Veröffentlichung konnte allerdings gezeigt werden, dass die Verbindung nur als Ionophor fungiert, also als Vehikel welches Ionen, in diesem Fall Zink, durch Membranen transportiert[65]. Die erhöhte intrazelluläre Zink-Konzentration senkt die Abhängigkeit der Kanal-Aktivität von der PIP2-Konzentration, was zu einer erhöhten Öffnungswahrscheinlichkeit führt. 6

Einleitung und Zielstellung

Außerdem konnten Schwefelwasserstoff-freisetzende Verbindungen mit einer KV7-Kanalöffnung assoziiert werden. So zeigten Mannelli et al., dass verschiedene Isothiocyanate die Aktivität von KV7.2/3-Kanälen steigerten, während die analogen Isocyanate keine Wirkung zeigten. Die zusätzliche Applikation von H2S- bindenten Substanzen negierte den Effekt der Isothiocyanate[66] Weitere Informationen zu den verschiedenen Konzepten neuartiger KV7-Kanalöffner finden sich in der Übersichtsarbeit „How to replace the lost keys? Strategies towards safer KV7 channel openers“ welche Teil dieser Promotionsarbeit ist (siehe Kapitel 5). Trotz der zum Teil vielversprechenden Eigenschaften der eben besprochenen KV7-Kanalöffner konnte keine Substanz über Phase-II-Studien hinaus voranschreiten. Als sinnvollste Leitstruktur für weitere Untersuchungen stellt sich damit das langjährig erprobte Flupirtin (1) heraus.

1.7 Therapeutisches Potential von KV7-Kanalöffnern

Für KV7-Kanalöffner ist eine Vielzahl potentieller Indikationen denkbar, was vor allem im ubiquitären Vorkommen der Kanäle und ihrer physiologischen Bedeutung begründet ist. Die effektive Behandlung von verschiedensten Schmerzzuständen ist vor allem für 1 bereits hinreichend belegt worden. Von besonderem Interesse sollten KV7-Modulatoren allerdings bei der Behandlung von neuropathischen Schmerzen sein, da herkömmliche Analgetika dabei oft nur unzureichend wirksam sind. Die Behandlung durch Kanalmodulation auf spinaler und supraspinaler Ebene könnte dabei die Wirksamkeit erhöhen[67]. Auch das Missbrauchspotential von Opioiden oder die Magenschädigung durch NSARs könnte umgangen werden. Neuronale Übererregbarkeit muss sich nicht nur in Form von Schmerzen äußern, sondern tritt häufig auch in Form von Epilepsien auf. Diese lassen sich, wie 2 zeigt, mit KV7-Kanalöffnern therapieren. Ein Zusatznutzen könnte dabei vor allem bei Neugeborenenepilepsie erzielt werden, wie in verschiedenen Tiermodellen gezeigt wurde[68]. Neben diesen bereits etablierten Indikationen für KV7-Modulatoren gibt es noch viele weniger bekannte Einsatzgebiete. So könnten bedeutende Fortschritte durch 1 und 2 bzw. deren Derivate in der Behandlung von Tinnitus erzielt werden[69]. Auch für die amyotrophe Lateralsklerose (ALS) gibt es derzeit keine zuverlässige Therapieoption. Vielversprechend sind deshalb die protektiven Eigenschaften von 2 für Motoneuronen, welche eine Verlangsamung der Progression von ALS bewirken sollten und auch im Rahmen von klinischen Studien getestet werden[70]. Auch eine antidepressive Wirkung konnte, vor allem für 2, festgestellt werden und wird derzeit in Phase-II-Studien näher untersucht[71]. Während diese Indikationen vor allem auf der Öffnung von KV7.2/3-Kanälen beruhen, gibt es auch für Modulatoren von KV7.4- und KV7.5-Kanälen Anwendungsmöglichkeiten. Diese betreffen vor allem Zustände, die durch Kontraktion glatter Muskelzellen hervorgerufen werden[13]. So könnte die Therapie von Bluthochdruck, Asthma oder einer überaktiven Blase durch die Einführung von KV7-Modulatoren entscheidende Fortschritte erzielen.

1.8 Zielstellung der vorliegenden Arbeit

Im Rahmen dieser Promotionsarbeit sollen neuartige KV7-Kanalöffner entwickelt werden, welche sich strukturell eng an 1 und 2 orientieren. Somit lässt sich wenigstens zum Teil auf das breite Wissen um die beiden Arzneistoffe zurückgreifen und es ist eine größere Chance auf eine gute Verträglichkeit gegeben, da beide Wirkstoffe generell gut toleriert werden. Als größtes Problem während der Therapie mit 1 und 2 stellten sich Nebenwirkungen heraus, welche wahrscheinlich auf eine oxidative Verstoffwechslung zurückzuführen sind. Auf der anderen Seite war eine leichte Oxidierbarkeit in der Veröffentlichung von Lemmerhirt et al. auch ein grundlegendes Kriterium für die KV7-Kanalöffnung. Diese Interaktion bedarf weiterer Erforschung, dementsprechend soll es Ziel dieser Arbeit sein vor allem die oxidativen Eigenschaften der Arzneistoffe durch chemische Modifikation zu variieren und den Einfluss auf die Aktivität und Toxizität zu untersuchen. Nach dem eindeutigen Strukturnachweis mittels verschiedener instrumenteller Methoden soll die Oxidierbarkeit der Verbindungen durch Bestimmung des anodischen Oxidationspotentials cyclovoltammetrisch quantifiziert und der Aktivität der Verbindungen gegenübergestellt werden. Damit lassen sich Aussagen darüber treffen, ob die KV7.2/3-öffnende Wirkung von 1 und 2 bzw. der abgeleiteten Derivate untrennbar mit deren Toxizität verbunden ist. Zusätzlich ermöglicht der schrittweise Austausch der Substituenten der Triaminopyridin-Struktur von 1 das Aufstellen von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen, wodurch auch Rückschlüsse auf die Art der Interaktion zwischen Ligand und KV7-Kanal gezogen werden können. 7

Methoden und Ergebnisse

2 Methoden und Ergebnisse

2.1 Synthese der Flupirtin-Analoga Die Verwendung eines zentralen Pyridin-Ringes scheint, im Hinblick auf 1 und 2, zunächst die schlechtere Wahl zu sein. So ist das Phenyl-Analogon Retigabin ca. sechsmal potenter als Flupirtin und weniger lebertoxisch. Auf der anderen Seite zeigen neueste Untersuchungen, dass 2 zur Bildung von Phenazinen neigt, welche sich in pigmentierten Geweben anreichern. Diese Nebenwirkung ist noch schwieriger mit in vitro-Experimenten abschätzbar als Hepatotoxizität, sodass das Gefahrenpotential von Retigabin-Analoga schwer quantifizierbar und kaum vorhersagbar ist. Eine analoge Reaktion von 1 zu entsprechenden Tetraazaanthracenen ist bisher nicht beschrieben und auch sehr unwahrscheinlich, da diese Reaktion unter nucleophilem Angriff eines sekundären Amines auf ein Pyridin-Stickstoffatom über die Bildung eines instabilen Hydrazines verlaufen müsste. Entsprechend sollten Flupirtin-Analoga das Hauptaugenmerk dieser Promotion darstellen. Die Synthese von KV7-Kanalöffnern mit zentralem Pyridin-Ring startete in jedem Fall beim 2,6-Dichlor-3-nitropyridin (15, siehe Schema 1). Dieses wurde am Anfang der Arbeiten an der vorliegenden Dissertation zunächst durch Nitrierung von 2,6-Dichlorpyridin (14) gewonnen, im späteren Verlauf aber kommerziell erworben[46]. Auf die verschiedenen Derivatisierungen dieser Vorstufe wird in den folgenden Kapiteln näher eingegangen. 2.1.1 Sulfid-Analoga von Flupirtin Die Einführung einer Sulfid-Brücke anstelle des sekundären Amins von 1 sollte die Bildung von para- Chinoniminen verhindern, vor allem da der Schwefel als eine Art Opferanode fungieren kann und zu Sulfoxiden abreagiert (siehe Kapitel 2.1.2). Der simultane Austausch des primären Amins durch Pyrrolidin, unter Erhalt von tertiären Aminen, sollte die Oxidation des zentralen Pyridin-Ringes komplett unterbinden.

Schema 1: a) H2SO4, HNO3, 105 °C für 16 h; b1) NH3, Ethanol, 0 °C für 3 h, 25 °C für 16 h; b2) Pyrrolidin, DCM, 0 °C für 4 h, 25 °C für 16 h; c) Na2S•9H2O, S8, NaOH, Ethanol, 80 °C für 2,5–4,5 h; d) Alkylbromid, NaOH, DMF, 25 °C für 1–5 h; e1) SnCl2•2H2O, Ethanol, Argon-Atmosphäre, 70 °C für 24–48 h; e2) Fe, NH4Cl, 2-Propanol/Wasser, 90 °C für 2–4 h; e3) H2-Atmosphäre, Raney-Nickel, THF, 0,5–5 h; f) Acylierungs-Reagenz, Et3N, 0–40 °C für 2–16 h; g) NBS, NH4Cl, THF/ACN, 0 °C für 2,5 h.

Die Synthese der Derivate startete wie bereits erwähnt bei 14 (siehe Schema 1), welches in Nitriersäure zum Rückfluss erhitzt wurde um 15 in ca. 50%iger Ausbeute zu erhalten[46]. Anschließend wurde 15 unter Eiskühlung entweder mit Ammoniakgas behandelt oder mit überschüssigem Pyrrolidin versetzt um die Verbindungen 16 bzw. 17 in nahezu quantitativen Ausbeuten zu erhalten[72]. Die nachfolgende Thiol-Bildung mit Thioharnstoff als Schwefelquelle und Mikrowellen-gestützter, sowie konventioneller Synthese lieferte nur geringe Ausbeuten von bis zu 24 %[73]. Durch Verwendung von Natriumsulfid-Nonahydrat und elementaren Schwefel konnten die Ausbeuten der Thiol-Bildung auf bis zu 93 % (18) bzw. 75 % (19) gesteigert werden[74]. Um Informationen über mögliche SAR zu erhalten, sollten die erhaltenen Thiole 18 und 19 anschließend zu verschiedenen Sulfiden umgesetzt werden. Dazu wurden diese in deprotonierter Form mit den entsprechenden Alkylbromiden zur Reaktion gebracht, wobei üblicherweise quantitative Umsetzungen zu beobachten waren[75]. Die entsprechenden Zwischenprodukte 20–28 sind in Tabelle 1 mit ihren Ausbeuten aufgeführt. Im letzten zweigeteilten Reaktionsschritt wurde zunächst die Nitrogruppe reduziert und das intermediäre Amin direkt mit verschiedenen Carbonsäurederivaten acyliert. Während die Reduktion unter Wasserstoff-Atmosphäre mit Palladium-Aktivkohle-Katalysator keine quantitative Umsetzung erreichte, konnte mit Zinn-(II)-chlorid-Dihydrat in Ethanol eine vollständige Reaktion beobachtet werden[76]. Nachteilig waren allerdings die langen 8

Methoden und Ergebnisse

Reaktionszeiten und die schlechte Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Auch Eisenpulver zusammen mit Ammoniumchlorid erzielte gute Umsetzungen, wobei allerdings auch viele undefinierte Nebenprodukte auftraten. Die schnellste und sauberste Reduktion wurde durch Raney-Nickel-katalysierte Hydrierung erzielt. Zur selektiven Umsetzung des N3-Amins erfolgte die abschließende Acylierung unter Eiskühlung bei der Verwendung von Carbonsäurechloriden (Amidbildung), bzw. bei Raumtemperatur (25 °C) oder sogar 40 °C bei Einsatz von Chlorameisensäureethylester (Carbamatbildung). Die erhaltenen Derivate sind ebenfalls mit ihren Ausbeuten in Tabelle 1 dargestellt und konnten in dem wissenschaftlichen Artikel „Sulfide Analogues of Flupirtine and Retigabine with Nanomolar KV7.2/KV7.3 Channel Opening Activity” veröffentlicht werden. Zusätzlich wurden diese in der Patentschrift „Thioether als Modulatoren von KV7.2/KV7.3-Kanälen“ beim Deutschen Patent und Markenamt angemeldet (siehe Kapitel 5). Da vor allem die Position 5 des Pyridin-Ringes für Reaktionen mit Nucleophilen zugänglich ist, sollte diese durch Einführen eines Brom-Atoms blockiert werden. Außerdem lassen sich durch das Einführen des Substituenten weitere Aussagen zu SAR treffen. Zur Synthese von 41 sollte 29 in einem Schritt direkt bromiert werden. Dazu wurde entsprechend der Vorschrift von Csuk et al. 29 mit N-Bromsuccinimid in Gegenwart von Ammoniumchlorid bei 0 °C zur Reaktion gebracht[77]. Zwar war die Ausbeute nach Aufarbeitung deutlich geringer als in der Veröffentlichung von Csuk et al. (29 % vs. 99 %), dabei wurde allerdings auch das weniger stabile Carbamat anstelle eines Nitroderivates verwendet.

Tabelle 1: Übersicht über die synthetisierten Sulfide und die erzielten Ausbeuten. Die Reste R1 und R2 der Zielverbindungen entsprechen denen der links davon beschriebenen Zwischenstufe.

Zwischenstufe Zielverbindung Ausbeute Ausbeute R1 R2 R3 (%) (%) 29 Ethoxy 73 20 NH2 4-Flurobenzyl 70 30 Propyl 35 31 tert-Butyl 53 21 NH2 Benzyl 83 32 Ethoxy 33 22 NH2 3,4-Difluorbenzyl 97 33 Ethoxy 56 23 NH2 4-(Trifluormethyl)benzyl 101 34 Ethoxy 72 4-(Pentafluor-6- 24 NH 99 35 Ethoxy 52 2 sulfany)benzyl 25 NH2 Cyclohexylmethyl 58 36 Propyl 19 37 3,5-Dimethoxybenzyl 20 26 N-Pyrrolidinyl Isobutyl 97 38 2-(3,5-Difluorphenyl)ethyl 41 27 N-Pyrrolidinyl Cyclohexylmethyl 13 39 3,5-Dimethoxybenzyl 9 28 NH2 Cyclopropylmethyl 84 40 2-(3,5-Difluorphenyl)ethyl 33

2.1.2 Synthese von Sulfoxiden und Sulfonen Wie am Beispiel des Arzneistoffes Albendazol gut belegt ist, werden organische Sulfide häufig zu Sulfoxiden und Sulfonen metabolisiert[78]. Entsprechende Metabolite sind auch für die im Kapitel 2.1.1 synthetisierten Verbindungen naheliegend. Deshalb sollte die Darstellung und Charakterisierung einiger Sulfoxide und Sulfone auch Gegenstand dieser Promotionsarbeit sein. Dafür wurden die jeweiligen Sulfide mit Hilfe von meta- Chlorperoxybenzoesäure (mCPBA) entsprechend der Vorschrift von Barry et al. oxidiert (siehe Schema 2). Während die Zugabe eines leichten Überschusses Oxidationsmittels (1,1 Äquivalente) fast ausschließlich in

O R3 O R3 O R3

NH NH NH a b O R2 R2 S N R1 R2S N R1 S N R1 O O Schema 422: -a)46 mCPBA (1,1 Äquivalente), DCM,29, 30, 032 °C-34 für 1–6 h; b) mCPBA (>2 Äquivalente),47-50 DCM, 0 °C, 2–6 h. einer Bildung von racemischen Sulfoxiden resultierte, konnte mit einem größeren Überschuss (>2 Äquivalente) gezielt Sulfone synthetisiert werden. Beide Reaktionen fanden unter tropfenweiser Zugabe des

Methoden und Ergebnisse

Oxidationsmittels bei 0 °C statt, um die Bildung von N-Oxiden zu verhindern. Die erhaltenen Sulfoxide 42-46 sowie die entsprechenden Sulfone 47-50 sind in Tabelle 2 zusammengefasst und konnten mit ihren Sulfid-Vorstufen in den Publikationen „Synthesis and potassium KV7 channel opening activity of thioether analogues of the analgesic flupirtine“ sowie „Explorative Synthesis and Influence of Chemical Structure on KV7.2/KV7.3 Channel Opening Activity”, welche Gegenstand dieser Promotionsarbeit sind (siehe Abschnitt 5), veröffentlicht werden.

Tabelle 2: Übersicht über die synthetisierten Sulfoxide und Sulfone sowie die erzielten Ausbeuten. Die Reste R1, R2 und R3 der Sulfone entsprechen denen der links davon beschriebenen Sulfoxide.

Sulfoxid Sulfon Ausbeute Ausbeute R1 R2 R3 (%) (%)

42 NH2 4-Fluorbenzyl Ethoxy 65 47 26 43 NH2 4-Fluorbenzyl Propyl 89 44 NH2 Benzyl Ethoxy 16 48 55 45 NH2 3,4-Difluorbenzyl Ethoxy 37 49 51 46 NH2 4-(Trifluormethyl)benzyl Ethoxy 59 50 41

2.1.3 Synthese von N6- und O6-substituierten Derivaten Ähnlich zu den vorhergehend besprochenen Sulfiden, vermögen auch Etherbrücken und tertiäre Aminogruppen in Position 6 von 1 die Bildung von para-Chinoniminen zu unterbinden, ohne die Elektronen-schiebenden Eigenschaften der sekundären Aminogruppe zu negieren. Sie sollten deshalb ebenfalls im Rahmen dieser Promotionsarbeit dargestellt werden. Die Synthese entsprechender Derivate ging von Verbindung 16 aus (siehe Schema 3). Durch Reaktion von 16 mit verschiedenen passend substituierten Aminen im Mikrowellenreaktor unter Zuhilfenahme von Triethylamin als Hilfsbase, konnten sekundäre und auch tertiäre Amine erhalten werden. Die resultierenden Verbindungen 51–58 wurden anschließend mit Wasserstoff-Gas und Palladium- Aktivkohle-Katalysator zu Triaminopyridinen reduziert und abschließend mit Chlorameisensäureethylester selektiv in Position 3 zum Carbamat acyliert. Die Reaktionszeiten der Reduktion stiegen dabei deutlich mit zunehmender Kettenlänge des N6-Substituenten an (2 bis 48 h), die Dauer der Carbamatbildung wurde davon nicht beeinflusst. Der hohe sp3-C-Atom-Anteil und die resultierende hohe Flexibilität der N6-Substituenten sorgte außerdem für eine sehr langsame bzw. ausbleibende Kristallisation. Viele der Verbindungen 59–66 wurden deshalb als Hydrochlorid-Salze isoliert (siehe Tabelle 3), wobei dies bei einigen Verbindungen auch zu starker Hygroskopie führte. So konnte Verbindung 64 zwar eindeutig charakterisiert werden, dennoch wurde auf eine biologische Testung verzichtet. O O

NO2 NH2 NH a b c

1 1 1 R N NH2 R N NH2 R N NH2 51-58 51a-58a 59-66 NO2 O O Cl N NH2 16 NO2 NH2 NH d e1, e2 c R1 R1 R1 O N NH2 O N NH2 O N NH2 67, 68 67a, 68a 69, 70

Schema 3: a) Amin, Et3N, 2-Propanol, 120 °C für 15 min im Mikrowellenreaktor; b) H2, Pd/C, 2-Propanol, 25 °C für 2–48 h; c) Chlor- ameisensäureethylester, Et3N, 0–40 °C für 2 bis 16 h; d) Alkohol, NaH, THF oder Toluen, 0 °C für 30 min, 25 °C für 22 h; e1) H2, Pd/C, 2-Propanol, 25 °C für 17 h; e2) Fe, NH4Cl, 2-Propanol, H2O, 90 °C für 4 h.

Die Darstellung von O6-Etherderivaten ging ebenfalls von 16 aus. Dabei erfolgte die Substitution des Chloratoms allerdings unter stark basischen Bedingungen, da die eingesetzten Alkohole nur eine geringe Nucleophilie aufwiesen, die korrespondierenden Alkoholate aber bereitwillig mit 16 reagierten. Entsprechend wurde die Reaktion unter Eiskühlung und Einsatz von Natriumhydrid statt Triethylamin durchgeführt[79]. Die anschließende Reduktion musste für 67 ebenfalls angepasst werden, da eine Palladium-katalysierte Hydrierung 10

Methoden und Ergebnisse wahrscheinlich eine Spaltung der Benzylether-Struktur nach sich gezogen hätte. Entsprechend erfolgte die Reduktion unter Einsatz von Eisenpulver und Ammoniumchlorid, die abschließende Carbamatbildung verlief analog zu den bereits beschriebenen Derivaten 59–66.

Tabelle 3: Übersicht über die synthetisierten N6-Amine sowie O6-Ether und die erzielten Ausbeuten. Die Reste R1 der Zielverbindungen entsprechen denen der links davon beschriebenen Zwischenstufe.

Zwischenstufe Zielverbindung Ausbeute Ausbeute R1 Salz (%) (%) 51 N-Morpholinyl 86 59 HCl 28 52 3-(N-Morpholinyl)propylamin 68 60 2 HCl 34 53 2-(N-Morpholinyl)ethylamin 77 61 2 HCl 14 54 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-yl 93 62 freie Base 7 55 4-Methylpiperazin-1-yl 84 63 freie Base 22 56 3-(1H-imidazol-1-yl)propylamin 59 64 freie Base 34 57 Cyclopropylamin 75 65 HCl 44 58 Cyclopentylamin 76 66 HCl 27 67 4-Fluorbenzyloxy 45 69 HCl 38 68 2-(N-Morpholinyl)ethoxy 54 70 HCl 26

2.1.4 Synthese von O2-Derivaten Um auch die Bildung von ortho-Chinoniminen auszuschließen ohne auf die Elektronen-schiebenden Einfluss der primären Aminogruppe von 1 zu verzichten, wurde die Synthese von einem Hydroxy-Derivat und verschiedenen daraus hervorgehenden Ethern angestrebt. Dabei wurden verschiedene Synthese-Routen durchlaufen (siehe Schema 4 und Schema 5). So startete die Synthese des Hydroxy-Derivates 73 und des Methylethers 75 mit der Diazotierung und Phenolverkochung von 16. Der resultierende Intermediat 71 wurde anschließend mit 4-Fluorbenzylamin zum entsprechenden sekundären Amin 72 umgesetzt. Dieses konnte mit Hilfe von Iodmethan und Kaliumcarbonat in den Methylether 74 überführt werden[80]. Sowohl 72 als auch 74 wurden im letzten Reaktionsschritt unter Palladium-Aktivkohle-Katalyse hydriert und mit Chlorameisensäureethylester zum Carbamat umgesetzt. Während dieser zweigeteilte Reaktionsschritt mit 2- Propanol als Lösungsmittel und Triethylamin als Hilfsbase keine vollständige Umsetzung und eine Reihe undefinierter Nebenprodukte hervorbrachte, konnte durch Einsatz von Pyridin als Lösungsmittel und Hilfsbase eine quantitative Reduktion und Carbamoylierung beobachtet werden. Die direkte Methylierung von 73 zu 75 mit Iodmethan und Silber-(I)-Carbonat schlug fehl[81].

Schema 4: a) H2SO4, NaNO2, H2O, 25 °C für 10 min; b) 4-Fluorbenzylamin, Et3N, 2-Propanol, 90 °C für 16 h; c) H2, Pd/C, Pyridin, 25 °C für 2,5 h anschließend Chlorameisensäureethylester, 0 °C für 4 h; d) Iodmethan, K2CO3, DMF, 25 °C für 2 h; f) Iodmethan, Ag2CO3, DCM, 25 °C für 40 h.

Zusätzlich sollten für die Gewinnung von SAR noch weitere Ether-Derivate mit ausgedehnteren Alkylresten synthetisiert werden. Dazu wurde im ersten Schritt 15 mit Alkoholen und Natriumhydrid zu den 2-Propyl- und 11

Methoden und Ergebnisse

Benzylethern 76 und 77 umgesetzt. Es folgte das Einführen des sekundären Amins durch Reaktion mit 4- Fluorbenzylamin und Triethylamin im Mikrowellenreaktor. Aufgrund vermuteter Instabilitäten der Ether unter Palladium-katalysierter Hydrierung, erfolgte die Reduktion wiederum mit Eisenpulver und Ammoniumchlorid. Da die abschließend durch Chlorameisensäureethylester-Zugabe gebildeten Ethylcarbamate nur schlecht kristallisierten, wurden zusätzlich die strukturell hochanalogen Buttersäureamide 81 und 83 durch Umsatz der intermediären Amine mit Buttersäurechlorid gebildet.

Schema 5: a) 2-Propanol bzw. Benzylalkohol, NaH, Toluen, 0 °C für 1 h, 25 °C für 16 h; b) 4-Fluorbenzylamin, Et3N, 2-Propanol, 2,5 bzw. 4,5 h bei 120 °C im Mikrowellenreaktor; c) Fe, NH4Cl, 2-Propanol/Wasser, 90 °C für 3 h anschließend Acylierungsreagenz, Et3N, 0 °C für 3 h.

Tabelle 4: Übersicht der synthetisierten O2-Derivate von 1 mit ihren jeweiligen Ausbeuten.

Zwischenprodukt Zielverbindung Ausbeute Ausbeute R1 R1 X (%) (%) 71 60 73 27 72 40 75 19 74 56 80 2-Propyl O 17 76 2-Propyl 67 81 2-Propyl N 43 78 2-Propyl 97 82 Benzyl O 51 77 Benzyl 74 83 Benzyl N 8 79 Benzyl 97

2.1.5 Austausch der Carbamat-Gruppe Auch der Austausch des Carbamates durch stabilere Amide und Imide sollte, vor allem in Hinblick auf eine mögliche Aktivitätssteigerung der Verbindungen, vorgenommen werden. Da die Bildung des Ethyl-Carbamates den letzten Schritt der Flupirtin-Synthese darstellt, konnte zunächst auf diese Synthese-Route zurückgegriffen werden (siehe Schema 6) [46,77]. So wurde Verbindung 15 mit 4-Fluorbenzylamin und Triethylamin zum entsprechenden sekundären Amin 84 umgesetzt. Im Gegensatz zu den Literatur-Vorschriften erfolgte die Reaktion allerdings bei 120 °C im Mikrowellenreaktor, wodurch innerhalb von 20 min ein quantitativer Umsatz und abschließend eine Ausbeute von 99 % erzielt werden konnte. Anschließend erfolgte die Palladium- Aktivkohle-katalysierte Reduktion der Nitrogruppe mittels Wasserstoff-Gas. Das intermediäre Amin 84a konnte daraufhin mit verschiedenen aktivierten Carbonsäure-Derivaten umgesetzt werden. So führte die Reaktion mit Carbonsäurechloriden zu den Amid-Derivaten 85-90. Umsetzung mit meta-Tolylisocyanat oder para- Tolylisothiocyanat lieferte das Harnstoff-Derivat 91 bzw. den Thioharnstoff 92. Zusätzlich wurde das Sulfonamid 93 dargestellt durch Umsetzung von 84a mit para-Toluensulfonsäurechlorid (TsCl) und die Imid-Derivate 94 und 95 durch Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid bzw. Phthalsäureanhydrid. Die Synthese der Amide R-87, S-87 und 89 war nach der Amidbildung noch nicht abgeschlossen, da Phthalimid-geschützte Aminosäurechloride für die Reaktion eingesetzt wurden. Dementsprechend musste noch das terminale Amin durch Reaktion mit Hydrazin-Hydrat freigesetzt werden. Mit Ausnahme von 93 wurden die übrigen Derivate 85– 94 als Hydrochlorid-Salze formuliert, um eine bessere Löslichkeit in den biologischen Assays zu gewährleisten. Das Hydrochlorid von 93 war stark hygroskopisch, sodass das Hydrogensulfat isoliert wurde. Die verschiedenen Derivatisierungen der Positionen 2, 3 und 6 des Pyridin-Ringes von 1 konnten in der Publikation „Flupirtine and Retigabine as Templates for Ligand-based Drug Design of KCNQ2/3 activators“ in der Fachzeitschrift Organic and Biomolecular Chemistry veröffentlicht werden (siehe Kapitel 5).

Methoden und Ergebnisse

NO NO 2 a 2

Cl N NH2 N N NH2 15 H F 84 b

NH2

N N NH2 H F 84a

c d e f g

2 H H O R O R1 O N S N O O S 2 NH NH NH NH N R

O N NH2 N NH2 N NH2 N NH2 N NH2 85-89 90 91 92 93, 94

Schema 6: a) 4-Fluorbenzylamin, Et3N, 2-Propanol, 120 °C für 20 min; b) H2, Pd/C, THF, 40 °C für 20 h; c) Carbonsäurechlorid, Et3N, 25 °C für 1–2 h, für R-87, S-87 und 89 anschließend Hydrazin-Hydrat, 65 °C für 24 h; d) meta-Tolylisocyanat, 25 °C für 1 h; e) para- Tolylisothiocyanat, 25 °C für 5 h; f) TsCl, Et3N, 25 °C für 2,5 h; g) Säureanhydrid, H2SO4, Toluen, Wasserabscheider, 110 °C für 2 h.

Tabelle 5: Übersicht der synthetisierten Derivate 85-94 und ihrer Ausbeuten.

Amid Sonstige Imid Ausbeute Ausbeute R2 Ausbeute R1 (%) (%) (%) 85 4-Nitrophenyl 40 90 21 93 H 421 86 4-Fluorphenyl 26 91 44 94 anneliertes Benzen 38 R-87 1-Amino-2-phenylethan-1-yl 362 92 38 S-87 1-Amino-2-phenylethan-1-yl 192 88 4-Aminophenyl 28 89 Aminomethyl 292

2.2 Synthese der Retigabin-Analoga 2.2.1 Darstellung von Amid-Derivaten Wie im Kapitel 1.4 bereits gezeigt wurde, ist 2 noch immer für die Epilepsie-Behandlung in Europa zugelassen und stellt damit auch eine potenzielle Leitstruktur für weitere KV7-Kanalöffner dar. Entsprechend sollten auch Verbindungen mit einem zentralen Phenyl-Ring synthetisiert werden. Da die Patent-Synthese von 2 eine achtstufige Reaktionskaskade darstellt und die Carbamat-Bildung dabei schon im ersten Schritt erfolgt, schien diese Methode ungeeignet um verschiedene Amid-Derivate von 2 zu synthetisieren[82]. Alternativ wurde 2 als Ausgangsstoff gewählt, der zunächst aus Trobalt-Tabletten mittels Mörsern und Flüssig-Flüssig-Extraktion isoliert werden musste (siehe Schema 7). Anschließend wurde die primäre Aminogruppe in Position 2 durch Reaktion mit Phthalsäureanhydrid unter Wasserabscheidung als Phthalimid geschützt. Dabei konnten nahezu quantitative Ausbeuten (92 %) erzielt werden. Nachfolgend wurde das Carbamat gespalten, sodass die resultierende primäre Aminogruppe in Position 3 mit verschiedenen Carbonsäuren derivatisiert werden konnte. Die Spaltung erfolgte zum einen durch saure Hydrolyse mit Bromwasserstoff in Essigsäure (51 % Ausbeute), zum anderen durch Reaktion mit Trimethylsilyliodid und Methanol, wodurch die korrespondierende Carbamidsäure entsteht, welche spontan zum primären Amin und Kohlenstoffdioxid zerfällt (36 % Ausbeute). Die Amid-Bildung erfolgte daraufhin durch Reaktion von 96 mit 4-Fluorbenzoesäure bzw.

1 Isoliert wurde das Hydrogensulfat, die übrigen Derivate wurden als Hydrochloride isoliert. 2 Dargestellt sind die kombinierten Ausbeuten von Reduktion, Amidbildung und Phthalimid-Abspaltung. 13

Methoden und Ergebnisse

3,5-Difluorphenylessigsäure unter Verwendung von O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium- hexafluorphosphat (HATU) als Kupplungsreagenz. Während bei der Synthese von 98 auch das Isomer isoliert werden konnte, bei dem die sekundäre Aminogruppe von 96 zum Amid umgesetzt wurde, blieb diese Nebenreaktion bei der Synthese von 97 aus. Im abschließenden Reaktionsschritt musste die primäre Amine 99 und 100 aus den Phthalimiden 97 und 98 freigesetzt werden, was durch Reaktion mit Hydrazin-Hydrat realisiert wurde. O O

NH a N NH2 H F 2 b

O O

NH O F N O F O 95 NH O O c d f NH N HCl

NH N NH2 2 O H O 99 97 F N O F O O F 96 NH e O g NH F N F N NH2 H 100 O F 98

Schema 7: a) Mörsern und Flüssig-Flüssig-Extraktion (Ethylacetat/H2O); b) Phthalsäureanhydrid, H2SO4, Toluen, Wasserabscheider, 110 °C für 6 h; c) HBr; Essigsäure, 25 °C für 64 h; d 4-Fluorbenzoesäure, HATU, Hünig-Base, DMF, 40 °C für 18 h; e) 3,5- Difluorphenylessigsäure, HATU, Hünig-Base, DMF, 25 °C für 6 h; f) Hydrazin-Hydrat, Methanol/2-Propanol; 25 °C für 17 h; g) Hydrazin- Hydrat, THF/2-Propanol/Methanol, 25 °C für 24 h. 2.2.2 Synthese des Retigabin-Sulfids Analog zu den Verbindungen aus Kapitel 2.1.1 sollte auch von 2 ein Derivat synthetisiert werden, bei welchem die sekundäre Aminogruppe durch einen divalenten Schwefel in Form eines Sulfids ersetzt ist. Die Synthese des entsprechenden Derivates startete beim 4-Brom-2-fluoranilin (101, siehe Schema 8). Dieses wurde im ersten Reaktionsschritt mit 71%iger Ausbeute zum Nitroderivat 102 oxidiert, unter Verwendung von Wasserstoffperoxid in Trifluoressigsäure (TFA)[83]. Anschließend wurde selektiv das Fluoratom nucleophil substituiert mit Hilfe von Ammoniakgas, wobei 86 % von 103 isoliert werden konnten. Die nachfolgende Thiol- Bildung gestaltete sich schwieriger als bei den Flupirtin-Analoga, da es bei der Umsetzung mit Natriumsulfid- Nonahydrat und Schwefel auch zur Bildung von Disulfiden des Produktes kam. Verbindung 105 machte dabei ca. zwei Drittel der Ausbeute aus. Auch eine Kupfer-(II)-katalysierte Thiol-Bildung mit 1,2-Ethandithiol als Schwefelquelle konnte dieses Verhältnis nicht verbessern[84]. Während das Thiol 104 direkt unter basischen Bedingungen zum Sulfid alkyliert werden konnte, musste die Disulfid-Bindung von 105 vor einer möglichen Alkylierung zunächst gespalten werden. Es zeigte sich allerdings, dass auch diese Reaktion als Eintopf- Synthese möglich war. So wurde 105 mit Hilfe von Natriumborhydrid zu 104 reduziert und durch die unmittelbare Zugabe von 4-Fluorbenzylbromid zum gewünschten Produkt 106 in 74%iger Ausbeute umgesetzt[85]. Da eine Reduktion von 106 und anschließende Carbamoylierung nur ein Gemisch der kaum zu trennenden Isomere 107 und 110 ergab, musste das primäre Amin von 106 zunächst geschützt werden. So konnte durch Umsetzung mit Di-tert-butyldicarbonat das Boc-geschützte Derivat 108 erhalten werden. Anschließend erfolgte die 14

Methoden und Ergebnisse

Reduktion mit Wasserstoff-Gas und Raney-Nickel-Katalysator sowie die Carbamat-Bildung mit Chlorameisensäureethylester[86]. Abschließend wurden die Boc-Schutzgruppen durch saure Hydrolyse mit Trifluoressigsäure abgespalten, sodass 110 erhalten werden konnte.

Schema 8: a) H2O2, TFA, 80 °C für 1 h; b) NH3, Ethanol, 0 °C für 3 h, 25 °C für 16 h; c) 1,2-Ethandithiol, CuSO4•5H2O, KOH, DMSO/H2O, Argon-Atmosphäre, 60 °C für 23 h; d) 4-Fluorbenzylbromid, NaOH, DMF, 25 °C für 30 min, e) NaBH4, K2CO3, 4-Fluorbenzylbromid, Ethanol, 25 °C für 2 h; f) H2, Raney-Nickel, THF, 40 °C für 16 h anschließend Chlorameisensäureethylester, Hünig-Base, 25 °C für 4 h; g) Boc2O, DMAP, THF, 25 °C für 44 h; h) H2, Raney-Nickel, THF, 40 °C für 2 h anschließend Chlorameisensäureethylester, Hünig- Base, 40 °C für 40 h; i) TFA, DCM, 25 °C für 30 min.

2.3 Synthese des Pyrimidin-Sulfids Neben den unter 2.2 beschriebenen Vorteilen eines zentralen Phenyl-Ringes, könnte auch ein Pyrimidin-Ring einige Vorteile gegenüber dem Pyridin-Zyklus von 1 bieten. So sollte das zusätzliche Stickstoff-Atom eine Bindung an endogene Nucleophile erschweren, da Stickstoff nur unter Ausbildung einer positiven Formalladung in tetravalenter Weise reagiert. Andererseits wäre es auch interessant zu beobachten, welchen Einfluss die Art des zentralen Aromaten auf die Aktivität der Verbindungen ausübt. Entsprechend sollte ein Sulfid mit Pyrimidin- Ring synthetisiert werden. Ausgangspunkt der Synthese war 5-Nitrouracil (111, siehe Schema 9), welches durch Reaktion mit Phosphoroxychlorid und N,N-Dimethylanilin (DMA) zum 2,6-Dichlor-5-nitropyrimidin 112 umgesetzt wurde[87]. Anschließende Aminolyse mit wässriger Ammoniaklösung (25 %) ergab nach selektivem Austausch des 4-Chlor-Substituenten, 113 in 85%iger Ausbeute[88]. Es folgte die Thiol-Bildung durch Reaktion mit Natriumsulfid-Nonahydrat und elementaren Schwefel. Die Reaktion lief unvollständig ab, sodass nach Aufreinigung nur 42 % 114 erhalten werden konnten. Nach erfolgter Alkylierung von 114 mit 4- Fluorbenzylbromid im basischen Milieu, umfasste der letzte Reaktionsschritt wieder die Reduktion der Nitrogruppe und Carbamoylierung des resultierenden Amins. Entgegen der Synthese von 110 war eine Nebenreaktion durch Acylierung des 4-Amino-Substituenten nicht zu erwarten, da die Elektronen-ziehenden Einflüsse der Pyrimidin-Stickstoff-Atome vor allem jenen Substituenten betreffen und dessen Nucleophilie abschwächen sollten. Dementsprechend wurde auf die Verwendung von Schutzgruppen verzichtet und 115 direkt zur Zielverbindung umgesetzt. Die Reduktion erfolgte unter Verwendung von Wasserstoffgas und Raney-

Methoden und Ergebnisse

Nickel-Katalysator, die Carbamatbildung durch Reaktion mit Chlorameisensäureethylester, woraufhin 116 in 31%iger Ausbeute erhalten werden konnte.

Schema 9: a) POCl3, DMA, 110 °C für 2 h; b) konz. NH3(aq), Ethanol, 0 °C für 2,5 h; c) Na2S·9H2O, S8, NaOH, Ethanol, 80 °C für 5 h; d) 4-Fluorbenzylbromid, NaOH, DMF, 25 °C für 1 h; e) H2, Raney-Nickel, THF, 25 °C für 24 h anschließend Chlorameisensäureethylester, Et3N, 25 °C für 6 h, 40 °C für 5,5 h.

2.4 Bestimmung des Oxidationspotentials Die erhaltenen Zielverbindungen sollten auf ihre Oxidierbarkeit hin untersucht werden, um eine mögliche Korrelation zwischen Oxidationspotential und Aktivität zu bestätigen. Dazu wurde unter den gleichen Bedingungen, wie von Lemmerhirt et al. vorgeschlagen, verfahren[46]. Für die Messung wurden 10 µmol der Verbindung mit 10 mL wässrigem TRIS-Puffer (0,1 mol/L, pH = 7,4) versetzt und für drei Minuten in ein Ultraschallbad gestellt. Die resultierende, meist suspensionsartige Mischung wurde in das Probengefäß gegeben und für drei Minuten mit Stickstoff entlüftet. Die anschließende Messung startete bei einer Spannung von −0,5 V und steigerte sich mit 0,1 V/s auf 1,0 V, wobei in 5 mV-Schritten die Stromstärke gemessen wurde. Zur Vervollständigung des Zykluses wurde die Spannung anschließend von 1,0 bis −0,5 V invertiert und ebenfalls die resultierenden Stromstärken gemessen. Von den so erhaltenen Zyklen wurden 3–5 gemessen, für die Bestimmung der Oxidierbarkeit wurde allerdings nur der erste Zyklus herangezogen, da die nachfolgenden Messungen schwächere Signale ergaben. Das lag eventuell an einer Polymerisierung der oxidierten Intermediate an der Oberfläche der Glassy-Carbon-Elektrode. Dementsprechend musste die Arbeitselektrode nach jeder Messung gesäubert werden, wobei eine Suspension von Al2O3 in Wasser auf einem rauen Tuch verteilt und die Elektrode darauf poliert wurde. Die Bestimmung des anodischen Peak-Potentials (Epa) erfolgte automatisch durch die Software (797 VA Computrace 1.3.1) und ist für alle aktiven Zielverbindungen in Tabelle 6 dargestellt. Exemplarisch sind die Cyclovoltammogramme der Sulfide mit zentralem Benzen- (110), Pyridin- (29) und Pyrimidin-Ring (116) in Abbildung 7 visualisiert.

4,0 Epa 3,0

2,0

1,0 I [µA] 0,0

-1,0

-2,0 -0,5 0 0,5 1 U [V]

Abbildung 7: Cyclovoltammogramme der Sulfide 29 (blau), 110 (orange) und 116 (grün).

Methoden und Ergebnisse

2.5 Bestimmung der Lipophilie Da sich im Laufe der Promotionsarbeit zeigte, dass vor allem Verbindungen mit ausgedehnten lipophilen Strukturen KV7-Kanäle zu öffnen vermochten, sollte dieser Zusammenhang näher untersucht werden. Die Quantifizierung der Lipophilie erfolgte dabei durch Bestimmung des LogD7,4-Wertes mittels HPLC-Assays entsprechend der Leitlinie (OPPTS 830.7570) der US Environmental Protection Agency (EPA)[89]. Es wurden zunächst die Retentionszeiten und daraus resultierende Kapazitätsfaktoren k′ verschiedener Referenzen mit bekanntem LogD7,4-Wert bestimmt und Logk′ in Abhängigkeit vom LogD7,4-Wert dargestellt. Es resultierte eine Kalibrationsgerade, mit welcher die Lipophilie einer Verbindung, ausgedrückt als LogD7,4-Wert, durch Bestimmung des Kapazitätsfaktors berechnet werden konnte. Ein Beispiel-Chromatogramm der Referenzen und eine Kalibrationsgerade sind in Abbildung 8 illustriert. Die LogD7,4-Werte der aktiven Verbindungen sind in Tabelle 6 zusammengefasst.

mAU % B.Conc 1,2

1500 90 1 80 1250 70 0,8 1000 60 y = 0,2551ln(x) + 0,5585 ′ 750 50 0,6 R² = 0,9793

40 500 Logk 0,4 30 250 20 0,2 10 0 0 0 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 55,0 min 0 2 4 6 LogD7,4 Abbildung 8: Links, Chromatogramm der Referenz-Mischung „S12“ mit Uracil, Pyridin, Benzylalkohol, Acetanilid, Acetophenon, Methylbenzoat, Ethylbenzoat, Benzophenon, Phenylbenzoat, Diphenylether, Dibenzyl und Triphenylamin. Rechts, die resultierende Kalibriergerade mit den LogD7,4-Werten der ebengenannten Referenzen aufgetragen gegen deren Logk′-Werte.

2.6 Bestimmung der KV7.2/3-Modulation

In Kooperation mit dem Arbeitskreis von Prof. Patrick J. Bednarski der Universität Greifswald konnte auch die Aktivität der Verbindungen an KV7.2/3-Heterotetrameren untersucht werden. Für den zellbasierten Assay wurden HEK 293-Zellen (human embryonic kidney cells), welche KV7.2/3 überexprimieren sowie das FLIPR Kalium-Assay-Kit der Firma Molecular Devices, verwendet. Zur Charakterisierung der Aktivität wurden die EC50 und Emax der Verbindungen bestimmt. Die halbmaximale Effektkonzentration (EC50) ist die Konzentration einer Substanz, bei der der halbmaximale Effekt (in diesem Fall halbmaximaler Thallium-Einstrom) zu beobachten ist. Die intrinsische Aktivität einer Verbindung wird durch deren Emax-Wert beschrieben. Dabei handelt es sich in diesem Fall um das maximale Fluoreszenz-Signal welches durch die entsprechende Substanz detektiert wurde in Relation zu Flupirtin-Maleat (definiert als 100 %). Eine Zusammenfassung der EC50- und Emax-Werte findet sich in Tabelle 6, ein Beispiel der erhaltenen Aktivitätskurven in Abbildung 9.

2.7 Bestimmung der Hepatotoxizität Die Bestimmung der Hepatotoxizität erfolgte ebenfalls im Arbeitskreis von Prof. Bednarski. Dabei wurde zum einen die humane Ziellinie HEP-G2 (human hepatocellular carcinoma cells) zum anderen die murine Zelllinie TAMH (transforming growth factor- transgenic mouse hepatocytes) eingesetzt. Beide sind etablierte Modelle zur Charakterisierung von Leberschädigungen[90]. Der toxische Effekt der Verbindungen wurde durch [46] Bestimmung der Zellviabilität mittels MTT-Assays und Berechnung der LD25-Werte quantifiziert . Die LD25 wurde in diesem Fall als die Konzentration definiert, welche in der Lage ist, die Zellviabilität auf 75 % zu senken. Die Bestimmung der Zellviabilität erfolgte nach 24 h Inkubation der Zellen mit der jeweiligen Substanz. Aufgrund der geringen Wasserlöslichkeit der Verbindungen war eine Bestimmung der gängigeren LD50-Werte nicht möglich. Eine Zusammenfassung der LD25-Werte aller aktiven Verbindungen, sowohl für TAMH- als auch für 17

Methoden und Ergebnisse

HEP-G2-Zellen ist in Tabelle 6 aufgelistet, ein Beispiel für die Toxizität-Konzentrations-Korrelation findet sich in Abbildung 9.

3 150

125

2 100 F/F  75

corr. 1 50 Zellviabilität[%] 25

0 0

1 0.1 1 10 100 0.1 10 0.01 100 0.001 c [µM] 0.0001 0.00001 c [µM] 0.000001 Abbildung 9: Links, Darstellung der Verstärkung des Kalium-Ausstromes (corr. F/F) in Abhängigkeit von der Konzentration von 1 (grün), 2 (orange) und der potentesten synthetisierten Verbindung 38 (blau). Rechts, Darstellung der Zellviabilität in Abhängigkeit von der Konzentration des Sulfid-Analogons von Flupirtin (29) in TAMH-Zellen (blau) und HEP-G2-Zellen (orange).

Tabelle 6: Zusammenfassung der experimentell bestimmten Eigenschaften der Verbindungen, welche eine KV7-Kanalöffnung bewirken.

3 Epa LogD7,4 EC50 Emax LD25 TAMH LD25 HEP-G2 LD25/EC50 [mV] [µM] [%] [µM] [µM] 1 251 2,96 0,918 ± 0,099 100 103 ± 47 74 ± 40 81 2 205 2,57 0,147 ± 0,012 134 ± 16 > 400 269 ± 166 1829 29 464 3,54 1,279 ± 0,293 93 ± 13 > 40 > 40 31 30 530 3,43 2,134 ± 0,457 140 ± 11 19 ± 11 > 63 9 31 530 3,49 4,544 ± 1,457 118 ± 28 > 63 > 63 14 32 455 3,45 1,746 ± 0,347 110 ± 15 91 ± 10 97 ± 72 52 33 460 3,66 0,771 ± 0,076 96 ± 9 25 ± 3 > 30 32 34 459 3,91 0,237 ± 0,022 115 ± 19 13 ± 6 > 20 55 35 452 4,10 0,240 ± 0,066 78 ± 10 > 10 > 10 42 36 558 3,97 1,320 ± 0,440 120 ± 19 6 ± 2 102 ± 61 5 37 k.O.4 4,70 0,0245 ± 0,0069 141 ± 11 > 125 > 125 5102 38 k.O.4 4,73 0,0014 ± 0,0001 136 ± 13 35 ± 27 38 ± 18 25000 39 k.O.4 5,10 0,021 ± 0,006 162 ± 9 16 ± 5 > 125 762 40 477 3,86 0,515 ± 0,035 117 ± 22 155 ± 86 75 ± 25 146 75 316 3,76 0,133 ± 0,011 129 ± 14 66 ± 40 ca. 60 496 80 351 5,36 1,865 ± 0,458 121 ± 24 n.b.5 n.b.5 n.b.5 81 396 4,02 0,0037 ± 0,0020 165 ± 6 28 ± 8 54 ± 26 7568 83 422 4,32 0,0042 ± 0,0005 154 ± 6 9 ± 3 51 ± 26 2143 85 255 3,44 2,130 ± 0,398 75 ± 16 > 16 > 16 8 86 281 3,30 0,300 ± 0,083 116 ± 17 > 63 30 ± 14 100 88 386 2,64 12,917 ± 1,412 84 ± 8 > 500 > 500 39 90 220 3,63 0,361 ± 0,062 134 ± 4 > 31 > 31 86 99 227 3,30 0,065 ± 0,010 104 ± 4 25 ± 20 45 ± 22 385 100 233 3,58 0,0038 ± 0,0015 127 ± 9 16 ± 9 > 32 16000 110 406 3,24 0,166 ± 0,035 128 ± 2 > 50 > 50 301 116 636 2,71 1,024 ± 0,298 122 ± 4 > 80 > 80 78

3 Unterscheiden sich beide Zelllinien hinsichtlich der LD25, so wurde der kleinere Wert für die Berechnung herangezogen. Konnte keine LD25 bestimmt werden wurde die maximal lösliche Konzentration eingesetzt. 4 Keine Oxidation, im gesamten getesteten Bereich von −0,5 V bis 1,0 V konnte kein Oxidationspeak beobachtet werden. 5 Die Zellviabilitäten streuten zu stark, sodass keine LD25 berechnet werden konnte 18

Diskussion und Ausblick

3 Diskussion und Ausblick

Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden verschiedene strukturelle Veränderungen an 1 und 2 vorgenommen um die Bildung von toxischen Metaboliten zu unterbinden und um den Einfluss der Verbindungen auf Kaliumkanäle der KV7-Familie zu bestimmen. Außerdem galt es das hypothetische Vorliegen einer Korrelation zwischen Aktivität und Oxidierbarkeit der Verbindungen zu untersuchen. Letzteres konnte durch die generierten Daten nicht bestätigt werden. So wurden Verbindungen erhalten, die schon bei niedrigen Spannungen oxidieren und dennoch keine KV7-Kanäle zu öffnen vermögen. Dazu zählen vor allem die Verbindungen 59–66 welche allesamt im Bereich von 306 bis 432 mV oxidieren und keine Kanalöffnung bewirken, aber auch 85 welche bei 255 mV oxidiert und nur mit schwacher Potenz KV7-Kanäle öffnet (EC50 = 2,1 µM, Emax = 75 %). Auf der anderen Seite konnte für einige Verbindungen keine (37–39) oder nur eine schwache Oxidationsneigung (40) unter den getesteten Bedingungen festgestellt werden, trotzdem zählten sie zu den aktivsten getesteten Substanzen. Entsprechend konnte eine alleinige Abhängigkeit der Aktivität vom Oxidationspotential nicht festgestellt werden. Auf der anderen Seite wurde, wie schon von Lemmerhirt et al. beschrieben[46], ebenfalls keine Korrelation zwischen dem Oxidationspotential und der Hepatotoxizität der Verbindungen gefunden. So zeigten auch schwer oxidierbare Verbindungen eine leberschädigende Wirkung im MTT-Assay. Dabei gilt allerdings zu beachten, dass eine elektrochemische Oxidation nur eingeschränkt Rückschlüsse auf enzymatisch katalysierte Oxidationen in biologischen Systemen zulässt. So sollten die Verbindungen bei zukünftigen Toxizitäts-Tests eventuell vorher mit Peroxidasen inkubiert werden, wie von [27] Methling et al. beschrieben . Unterschiedliche LD25-Werte mit und ohne Peroxidasen-Zusatz könnten dabei Aufschlüsse über toxische Metabolite geben.

Eine Trennung der Aktivität von der Toxizität von 1 und 2 erscheint möglich, da die unerwünschten Arzneimittelwirkungen, die zur Markrücknahme geführt haben, nicht mit dem Wirkungsmechanismus verknüpft sind, sondern wahrscheinlich durch die Oxidation zu Chinondiiminen entstehen. Die im Rahmen dieser Arbeit dargestellten Verbindungen, die durch ein verändertes Design die Bildung solcher reaktiven Intermediate vermeiden, sollten weder die Hepatotoxizität von 1 aufweisen noch die unter Retigabin-Therapie aufgetretenen Blauverfärbungen hervorrufen. Während die Ausbildung von Gewebe-Verfärbungen im Rahmen dieser Dissertation nicht untersucht werden konnte, wurde die Hepatotoxizität der Verbindungen in zwei Zelllinien bestimmt. Dabei zeigten auch solche Verbindungen toxische Effekte, die kaum zur Ausbildung von Chinondiimin-Strukturen neigen sollten. So führte der Austausch der sekundären Aminstruktur durch eine Sulfid-Brücke zu deutlich stabileren Verbindungen, was sich auch im Oxidationspotential der Substanzen niederschlägt (siehe 29–40). Dennoch wurden LD25-Werte erhalten, welche zum Teil deutlich niedriger sind als bei 1. Die zusätzliche Derivatisierung der primären Aminogruppe zu cyclischen tertiären Aminen (37–39) konnte zwar eine Oxidation komplett unterbinden, dennoch wurde die Viabilität von Leberzellen im Toxizitätsassay beeinträchtigt. Auch das Einfügen von Etherbrücken statt der sekundären Aminbrücke (69 und 70) bzw. der primären aromatischen Aminogruppe (75, 80–83) senkte die Oxidationsneigung im Vergleich zu 1, dennoch blieb eine Hepatotoxizität nicht aus. Da die im Rahmen dieser Arbeit erhalten Verbindungen allerdings zum Teil auch in deutlich niedrigeren Konzentrationen wirksam sind als 1, liefert ein direkter Vergleich der LD25-Werte ein verzerrtes Bild. Angelehnt an den therapeutischen Index wurde für die Verbindungen deshalb der Quotient aus LD25 und EC50 berechnet (siehe Tabelle 6). Dabei zeigt sich, dass 2 einen deutlich größeren Quotienten aufweist als 1, aber von einigen der hier vorgestellten Verbindungen noch deutlich überboten wird. So ist der LD25-Wert von 38 25.000-mal größer als ihre EC50, entsprechend sollte unter therapeutischen Konzentrationen keine Hepatotoxizität beobachtet werden. Ähnlich sieht es bei dem Sulfid 37, dem Ether 81 und dem Retigabin- Analogon 100 aus. All diese Verbindungen überbieten die therapeutische Sicherheit von 2 deutlich. Da eine Azachinondiimin-Bildung vor allem bei 37 und 38 sehr unwahrscheinlich ist, sollten auch Blauverfärbungen durch diese Substanzen ausbleiben.

Diskussion und Ausblick

Neben dem Einfluss der Struktur auf die Toxizität sollten auch Struktur-Aktivitäts-Beziehungen durch die synthetisierten Verbindungen generiert werden. Es zeigte sich, dass das sekundäre Aminelement durch eine Sulfidbrücke ausgetauscht werden kann, ohne dass es zu einem nennenswerten Verlust an Aktivität kommt (siehe 1 und 29). Von Bedeutung scheint eher die lipophile 4-Fluorbenzyl-Stuktur zu sein. Während das Einfügen von hydrophoberen Resten mit einem Anstieg des LogD7,4-Wertes und einer Steigerung der Potenz der Verbindungen einherging (siehe 29, 32–35), führten hydrophilere Reste zu einem starken Absinken des LogD7,4-Wertes und einem kompletten Aktivitäts-Verlust (59–66). Sehr ähnliche Effekte konnten beobachtet werden, wenn die primäre Aminogruppe von 1 durch lipophilere Strukturen ausgetauscht wurde. So sind die Verbindungen 81 und 83 nicht nur deutlich lipophiler als 1, sondern auch ca. 230-mal potenter. Der Vergleich von 38 und 40 unterstützt diesen Trend. Der Austausch der primären Aminogruppe von 38 durch einen Pyrrolidin-Rest (40) führt wiederum zum starken Anstieg der Lipophilie und 370-fach gesteigerter Potenz. Eine generelle Korrelation zwischen Lipophilie und Kanalaffinität der aktiven Verbindungen lässt sich mit der hydrophoben Natur der Bindetasche (siehe Abbildung 10) erklären. So scheinen vor allem unspezifische, hydrophobe Interaktionen zwischen Ligand und Kanal möglich zu sein. Zusätzlich ist auch das Carbonyl- Element von entscheidender Bedeutung. So waren sowohl ein Thioharnstoff (91) als auch ein Sulfonamid (92) inaktiv, während ein vergleichbares Harnstoff-Derivat (90) potenter war als 1. Diese Daten decken sich mit den Erkenntnissen von Kim et al., wonach der Carbonyl-Sauerstoff mittels Wasserstoff-Brückenbindung mit Trp236 [44] der KV7.2-Untereinheit interagiert . Generell konnte die Aktivität der Verbindungen deutlich gesteigert werden durch das Einführen von Amiden mit Methylen- bzw. Ethylen-verbrückten Phenylresten (siehe Verbindungen 37–39), ähnlich wie von Dalby-Brown et al. publiziert (Verbindung 6)[47]. Dies lässt sich wiederum mit unspezifischen Wechselwirkungen erklären, da sich der Ethylcarbamat-Rest in eine große lipophile Tasche zu erstrecken scheint, welche durch sperrige Amide besser ausgefüllt werden kann (siehe Abbildung 10). Auch die Art des zentralen Aromaten übt einen Einfluss auf die Aktivität der Verbindungen aus. So sind Phenyl- Derivate ca. fünf- bis achtfach potenter als die entsprechenden Pyridinyl-Analoga (siehe 1 vs. 2, 36 vs. 110 und 86 vs. 99). Das Einführen eines weiteren Stickstoff-Atoms in den Ring führte, unter Erhalt eines Pyrimidin- Ringes, zu einer Verbindung mit ähnlicher Potenz wie das entsprechende Pyridinyl-Analogon (36 vs. 116).

2 50 1 −LogEC 0 2 3 4 5 6 -1

-2 LogD7,4

Abbildung 10: Links, Korrelation der –LogEC50-Werte der aktiven Verbindungen in Abhängigkeit vom LogD7,4-Wert. Rechts, Verbindung 29 in der postulierten Bindetasche (KV7.2/3-Heterotetramer), welche aufgrund der Kristallstruktur vom KV1.2/2.1-Kanal und der Aminosäuresequenzen von KV7.2 und KV7.3 mittels Homology-Modeling erhalten wurde. Rote Bereiche markieren dabei hydrophile Strukturen, weiß dargestellte Oberflächen zeigen lipophile Bereiche an.

Während die im Rahmen dieser Dissertation synthetisierten Verbindungen bereits hinreichend auf ihre KV7.2/3- modulierende Wirkung hin untersucht werden konnten und hochpotente KV7-Öffner mit überlegener maximaler Effektivität gefunden werden konnten, blieben Testungen der anderen Untereinheiten wegen des sehr großen Arbeitsaufwands bisher aus. Dabei wäre eine Selektivität für KV7.2- und KV7.3-Untereinheiten ein therapeutischer Fortschritt im Vergleich zu 1 und 2, da diese über die Öffnung von KV7.4-Kanälen auch zu Harnverhalt führen. Eine Modulation von KV7.1 sollte ebenfalls ausgeschlossen werden, da ansonsten kardiale Nebenwirkungen resultieren könnten. Für zukünftige Projekte wäre die Aktivitäts-Bestimmung der Verbindungen hinsichtlich der übrigen Untereinheiten entsprechend von großer Bedeutung und es konnte 20

Diskussion und Ausblick

bereits durch Kooperation mit einer belgischen Arbeitsgruppe initiiert werden. Außerdem wären pharmakokinetische Daten der Sulfide von Interesse, da das Schicksal von organischen Schwefel-Derivaten in vivo nur schwer vorherzusagen ist. So ist vom Anthelminthikum Albendazol bekannt, das es innerhalb kürzester Zeit nahezu vollständig zum Sulfoxid oxidiert wird[91]. Entsprechend könnte eine biologische Wirkung der vielversprechenden Sulfide bei peroraler Gabe ausbleiben, da die Sulfoxide 42–46 und Sulfone 47–50 keine KV7-Öffnung bewirkten. In diesem Falle stünden aber Leitstrukturen für kurzwirksame, parenteral applizierbare Wirkstoffe für die Intensivmedizin zur Verfügung, bei der eine neurologische Wirkung mit Beendigung einer Infusion aufgehoben wäre, wie das bei dem hydrolysierbaren, kürzestwirksamen 1-Adrenozeptorblockern Esmolol und Landiolol realisiert wurde. Andererseits wird auch der Fall beschrieben, bei dem Sulfoxide in vivo zu den entsprechenden Sulfiden reduziert werden und somit Verbindungen wie 42–46 besser wasserlösliche Prodrugs darstellen könnten[92]. Um den Bereich der Spekulationen wieder zu verlassen bleibt als Fazit, das die Aufgabenstellung dieser Arbeit erreicht werden konnte, und sowohl Flupirtin- als auch Retigabin-Derivate mit gesteigerter Potenz und maximalem Effekt an KV7-Kanälen dargestellt und charakterisiert werden konnten als auch das Verhältnis von Toxizität zu Aktivität dramatisch verbessert werden und SAR abgeleitet werden konnten. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind in großen Teilen bereits publiziert oder zur Publikation eingereicht, die Publikationen und Manuskripte finden sich auf den folgenden Seiten.

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4 Literaturverzeichnis

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Publikationen

5 Publikationen

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Beiträge der Autoren Christian Bock

 Etablierung und Durchführung der Synthesen  analytische Charakterisierung der Verbindungen  Erstellen des Manuskripts Kristin Beirow

 Durchführung der biologischen Testungen Abdrrahman S. Surur

 Synthese einiger Verbindungen Lukas Schulig

 Erstellen des Homology-Models Anja Bodtke

 Durchführung der HRMS-Messungen Patrick J. Bednarski

 Erstellen des Manuskripts Andreas Link

 Anleitung der Bearbeitung der Fragestellung  Erstellen des Manuskripts

Christian Bock Andreas Link

Organic & Biomolecular Chemistry

COMMUNICATION

Synthesis and potassium KV7 channel opening activity of thioether analogues of the analgesic Cite this: Org. Biomol. Chem., 2018, 16, 8695 ﬂupirtine† Received 12th October 2018, Accepted 29th October 2018 Christian Bock, Kristin Beirow, Abdrrahman S. Surur, Lukas Schulig, Anja Bodtke, DOI: 10.1039/c8ob02530d Patrick J. Bednarski and Andreas Link * rsc.li/obc

Flupirtine, an opener of neuronal voltage gated potassium chan- (DILI).3 Since the hepatotoxicity of 1 is an obstacle to a future nels (KV7.2/3), has been used as a therapeutic alternative for pain use as an analgesic, the search for analogues with a better treatment in patients refractory to NSAIDs and opioids. Because safety profile while retaining or even improving the KV7.2/3 ﬂupirtine is associated with rare but fatal drug-induced liver injury channel opening potency would seem a worthwhile drug- that may result from the formation of toxic metabolites upon design goal. metabolic oxidation, we synthesized novel derivatives with the In previous work, we designed flupirtine analogues that goal of identifying equally active and ultimately safer KV7.2/3 would prohibit the formation of azaquinone diimines like 2 channel openers. Four thioether analogues were designed to lack a and 3 by introducing methyl groups onto the oxidizable N nitrogen atom that would be a prerequisite for the formation of atoms.4 We determined the oxidative potentials of the toxic para-quinone diimines, and form sulfoxide and sulfone metabolites instead. KV7.2/3 channel opening activity and hepatotoxicity data of twelve novel ﬂupirtine analogues, four thioethers and their respective sulfoxide and sulfone metabolites are reported.

The centrally acting analgesic flupirtine (1) is believed to act by opening voltage gated potassium channels (KV7.2/3) in the membranes of nerve cells of the CNS, leading to a hyperpolarization of the membrane potential, thus suppressing pain mediation and repetitive neuronal firing (as observed in convulsions). Until recently, the drug was regarded as safe for short-term use and thus an attractive alternative to NSAIDs and opiates in pain control.1 However, fatal drug-induced liver injury in a small number of patients has led to its removal in 2018 from the European market. It was recently shown that 1 can be metabolized to cysteine and mercapturic acid conjugates in humans, evidence that 1 is oxidized in vivo to reactive azaquinone diimines 2 and 3, which can react covalently with glutathione (Fig. 1).2 Subsequent depletion of glutathione levels could result in the covalent interaction with other nucleophiles such as liver proteins and cause drug-induced liver injury

Pharmaceutical and Medicinal Chemistry, Institute of Pharmacy, University of Greifswald, Friedrich-Ludwig-Jahn-Str. 17, 17487 Greifswald, Germany. E-mail: [email protected] †Electronic supplementary information (ESI) available: Analytical data for all synthesized compounds and methods describing the cyclovoltammetry, log D7.4 ﬂ determinations, in vitro hepatotoxicity and Kv7.2/3 channel opening experi- Fig. 1 Structure of KV channel opener upirtine (1), elusive metabolites ments. See DOI: 10.1039/c8ob02530d 2 and 3 and product 4 of phase II drug metabolism.

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N-methylated analogues electrochemically by cyclic voltammetry and attempted to correlate these results with both the

KV7.2/3 (KCNQ2/3) opening activity, determined by an established assay with HEK293 cells overexpressing these channels, and the in vitro hepatotoxicity, determined by a cytotoxicity assay with the mouse hepatocyte cell line TAMH. In the initial test set of alkylated derivatives, a link was found between the oxidation potentials of the compounds and their EC50 values for potassium channel opening activity but not between oxidation potential and cytotoxicity in TAMH cells.4 Here, we report another approach to modify chemical stability towards oxidation by replacement of the benzylic NH of 1 Fig. 2 Concentration–response curves of 1 (as maleate salt) and 6d via fl with bioisosteric, divalent S. It was envisioned that the oxi- determined after 30 min exposure thallium- ux assay in HEK293 cells expressing K 7.2/3; data were normalised to control (1% DMSO); dative pathway of the sulfides might be directed away from oxi- V values are the mean ± SD (n ≥ 3); EC50 values calculated from log(con- dations to azaquinone intermediates and towards oxidations centration)-response curves which were fitted to a four-parameter to sulfoxides5 and sulfones, which would be expected to be logistic equation. less hepatotoxic. This altered oxidative pathway could help to attenuate hepatotoxicity while retaining or even improving on the KV7.2/3 opening activity. E – The synthesis of the novel thioether analogues 6a–d of 1 Table 1 Comparisons of anodic peak potentials ( pa)of6a d and metabolites 7a–d, and 8a–d, log D values, LD values after 24 h in started with the trisubstituted pyridine 5 (Scheme 1). In 7.4 50 TAMH cells and EC50 values towards KV7.2/3 channels in HEK293 cells analogy to Artemov et al., the thiol was deprotonated6 and 1 2 a b c c reacted with the respective benzyl bromides at room tempera- Entry R R Epa [mV] Log D7.4 LD50 [µM] EC50 [µM] ture to yield the corresponding sulfides. Palladium-catalysed 1 336 ± 5 2.96 487 ± 51 0.9 ± 0.1 reduction under a hydrogen atmosphere failed to convert the 6a F H 464 ± 10 3.54 >40 1.3 ± 0.3 nitro group quantitatively under reported conditions.7 Clean 6b H H 455 ± 3 3.45 >250 1.8 ± 0.4 conversion was accomplished using iron powder in 2-propa- 6c F F 460 ± 3 3.66 >30 0.8 ± 0.1 6d CF3 H 459 ± 3 3.91 >20 0.2 ± 0.0 nol/water with NH4Cl. The intermediates were transformed to 7a F H 653 ± 5 2.64 >125 >10 6a–d by reaction with ethyl chloroformate at 40 °C. Sulfoxides 7b H H 645 ± 10 2.50 >1000 >10 7a–d were obtained by oxidation of 6a–d with meta-chloroper- 7c F F 639 ± 11 2.80 >250 >10 8 7d CF3 H 626 ± 3 3.20 >100 >10 oxybenzoic acid (mCPBA). To end the reaction at the sulfoxide 8a F H 717 ± 10 2.91 >125 >10 step, we used only a small excess of the oxidizing agent and 8b H H 709 ± 5 2.75 >500 >10 added it dropwise at 0 °C. Sulfones 8a–d were synthesized in 8c F F 719 ± 8 3.07 >125 >10 8d CF H 711 ± 3 3.42 >30 >10 an analogous fashion by oxidation of 6a–d with at least two 3 equivalents of mCPBA. a Measured as 1 mM solutions in 100 mM TRIS-buffer pH 7.4, shown b 1 13 are mean values ± SD from 3–4 independent measurements. Log D7.4 After structural confirmation (i.e., H-NMR, C-NMR, MS) c values were determined using an HPLC method (n = 2). EC50- and of the compounds 6–8, their anodic peak potentials (E ) were – pa LD50-values are means and standard deviations of 4 5 independent 4 measured by cyclic voltammetry and lipophilicity (log D7.4)by determinations. an RP-HPLC method. The potential for hepatotoxicity of the synthesized analogues was evaluated in a transgenic mouse hepatocyte (TAMH) model by means of the MTT cytotoxicity for 1 and 6d. The end-points for all these studies are collected 4 assay as described previously. The KV7.2/3 channel opening in Table 1. By replacing the benzylic nitrogen of 1 for sulfur, activity was assessed by a fluorescence-based cellular thallium the anodic peak potentials, and thus the resistance to oxi- flux assay with HEK293 cells overexpressing these channels.9 dation, were increased from 336 to ca. 460 mV (Table 1). As Fig. 2 shows the representative concentration-response curves expected, a further increase in the peak potentials was

Scheme 1 Synthesis of thioethers 6a–d and putative sulfoxide and sulfone metabolites rac-7a–d and 8a–d. (i) Alkyl bromide, NaOH, DMF, r.t., 3 h.

(ii) Fe, NH4Cl, 2-propanol/water, reﬂux, 5 h. (iii) Ethyl chloroformate, triethylamine, 0 °C, 2 h, r.t., 5 h. (iv) mCPBA, DCM, 0 °C, 1–5 h. (v) mCPBA (>2 eq.), DCM, 0 °C, 2–7h.

8696 | Org. Biomol. Chem.,2018,16, 8695–8699 This journal is © The Royal Society of Chemistry 2018 Organic & Biomolecular Chemistry Communication achieved when the sulfide was modified to either a sulfoxide or a sulfone. In contrast, substitutions in the benzylic ring had no influence on the anodic peak potentials.

The log D7.4 of the sulfide 6a increased relative to 1 by 0.60. On the other hand, oxidation of the sulfide to the sulfoxide reduced lipophilicity by ca. 10-fold. Further oxidation to the sulfone led to a slight increase in lipophilicity relative to the sulfoxides. As expected, the introduction of fluorine led to increases in log D7.4 values by values of ca. 0.15 for each F atom. The LD50 for 1, obtained by the MTT assay after exposing the TAMH mouse hepatocyte cell line for 24 h, was 487 µM. However, the limiting solubility of the new compounds hin- dered our ability to determine their LD50 values in this assay.

Nonetheless, it can be seen in Table 1 that the LD50 values of none of the compounds were reached even at the highest soluble concentrations. According to thallium-flux KV7.2/3 channel-opening assay, the most potent compound from this study was the thioether 6d, with an EC50 value of 0.24 µM, leading to a significant left-shift of the concentration-response Fig. 3 Predicted binding pose of compound 6a and unfavourable inter- curve and a higher maximal effect compared to 1 (Fig. 2). As actions of sulfone 8a (lower right corner). The docking was performed proof of principle, the small loss in activity associated with the by using an induced fit with the force field based MM/GBVI scoring method as implemented in MOE (see the ESI†). exchange of said NH of 1 by S in 6a from EC50 0.9 µM to 1.3 µM could be more than compensated by the introduction of a second F into 6c (EC50 = 0.8 µM) or replacement of F by CF3 in the benzylic moiety in 6d (EC50 = 0.2 µM), presumably to cross-check the proposed binding mode. The assumption due to stronger lipophilic interactions. that 6c and 6d are more active than 1 and 6a due to additional While all the sulfides showed activity in this assay, none of lipophilic contacts is in accordance with this docking pose. the sulfoxides or sulfones were active at concentrations below However, especially another hydrophobic pocket on the 10 µM. Two possibilities for these differences in activity are: bottom side leaves room for larger substituents in position 3 (1) the higher anodic peak potentials of the sulfoxides and sul- of the pyridine ring and could be exploited in the future. As fones relative to the sulfides make them less active than the can be seen from Fig. 3, sulfide 6a adopts a conformation that sulfides; indeed, 1 with the lowest peak potential in the series avoids steric clashes in the region of the sulfur atom. In con- of p-fluorophenyl derivatives is the most potent (compare 1 trast, the two additional oxygen atoms of the sulfones 8a–d with 6a). We observed a similar relationship with the group of should lead to an unfavourable interaction in this bridging 4 N-methylated analogues of 1. (2) The reduced lipophilicity of region. This rationalization was confirmed by negative results the sulfoxides and sulfones relative to the sulfides makes them for the sulfones 8a–d (Table 1). While this is obvious for 8a–d, less active; however, the log D7.4 of 1 is 2.96, which is similar to it is not so straightforward to explain the low activity for that of the inactive sulfoxide 8a (2.91). Thus, there does not the sulfoxides 7a–d. At least the R-enantiomers of the appear to be a simple relationship between activity and chiral sulfoxides 7a–d lacking an oxygen atom in the critical lipophilicity. position might be anticipated to avoid such unfavourable To rationalize further the finding that the sulfide analogues interactions. are active while the sulfoxides and sulfones are not, we explored a molecular modelling approach. Because the crystal structures of the KV7.2/3 channel are not available, we chose to Conclusions visualize the supposed binding mode by means of a homology model based on a heteromeric approach and published experi- Thioethers 6c and d are more potent as KV7.2/3 channel mental data (Fig. 3).10,11 While these modelling results are not openers compared to the clinically effective drug flupirtine (1). suited to predict a new generation of KV channel openers, it Thus the development of thio-analogues of known drug 1 may can be deduced from the anticipated binding mode in Fig. 3 result in more effective KV channel openers by helping to sep- that the sulfur atom will not alter the orientation of the arate pharmacological activity from toxicity. Putative metab- benzylic moiety relative to 1 and thus, that this aromatic olites resulting from hepatic or intracellular oxidation, namely binding motif will be buried in the hydrophobic cleft formed sulfoxides 7a–d and sulfones 8a–d, are of interest for the pre- by amino acid residues L272, L314, L311 and F344 as the diction of toxicity of oxidative metabolites and thus were made upper boundary of the presumed binding site. We have taken available for biological evaluation. These sulfoxides and sul- into account the experimentally determined important resi- fones were inactive as KV7.2/3 channel openers, and impor- dues11 as well as other derivatives described in the literature12 tantly, avoid the formation of reactive azaquinone diimines.

This journal is © The Royal Society of Chemistry 2018 Org. Biomol. Chem.,2018,16, 8695–8699 | 8697 Communication Organic & Biomolecular Chemistry

Experimental Synthesis of sulfone 8a Synthesis of thioether 6a 6a (1 mmol, 0.32 g) was dissolved in 20 mL DCM and cooled to 0 °C. mCPBA (2 eq., 2 mmol, 0.63 g of a 55% mixture with 6-[(4-Fluorobenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amine (5 mmol, 1.4 g) water) was dissolved in 20 mL DCM and added dropwise over a was suspended in 30 mL water and 50 mL 2-propanol. Iron period of 1 hour. The solution was stirred for further 45 min at powder (3 eq., 15 mmol, 0.84 g) and NH4Cl (4.5 eq., 0 °C. The resulting suspension was filtered and the residue 22.5 mmol, 1.2 g) were added and the suspension was refluxed was washed with DCM. The filtrate was washed with 3 × for 5 hours. The resulting dark brown mixture was filtered and 100 mL sat. NaHCO3 solution and 100 mL brine. The organic evaporated to dryness. The residue was diluted with 150 mL phase was evaporated and purified by flash chromatography water and washed three times with 60 mL ethyl acetate. The (puriFlash® 450 system from Interchim, 25 g silica column, combined organic layers were washed with 150 mL brine and mobile phase: n-hexane/ethyl acetate, gradient: 1 CV 10% ethyl dried over Na2SO4.Et3N (1.4 eq., 7 mmol, 0.97 mL) was added acetate, 10 CV 10–80% ethyl acetate, 5 CV 80% ethyl acetate). and the solution was cooled to 0 °C. A solution of ethyl chloro- The solid was washed with small quantities of diethyl fomate (1.2 eq., 6 mmol, 0.57 mL) in 5 mL ethyl acetate was ether and dried under reduced pressure at 40 °C. Pink solid added dropwise. After 2 hours additional ethyl chlorofomate (m.p.: 168–171 °C). Yield: 0.09 g (25.5%). Compound (1,2 eq., 6 mmol, 0.57 mL) was added at r.t., 5 hours later, 1 purity: 100.0%. Rf = 0.41 (n-hexane/ethyl acetate). H-NMR ethyl chlorofomate (0.6 eq., 3 mmol, 0.29 mL) and Et3N [ppm]: δ = 1.26 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 4.16 (q, 2H, J = 7.0 Hz), (0.7 eq., 3.5 mmol, 0.49 mL) were added. After 2 hours the 4.61 (s, 2H), 6.64 (s, 2H), 7.00 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.13–7.17 reaction was completed and the solution was washed with (m, 2H), 7.22–7.25 (m, 2H), 7.95 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 9.05 (s, 200 mL water and 200 mL saturated brine. After drying with 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14.4, 56.1, 60.9, 111.5, 115.2 (d, 2C, Na2SO4 and evaporation to dryness, the resulting solid was 2 4 JC,F = 22 Hz), 123.3, 124.8 (d, JC,F = 3 Hz), 127.4, 133.0 (d, 2C, recrystallized from DCM. The product was dried at 40 °C 3J = 8 Hz), 147.3, 151.3, 153.9, 160.9 and 163.3 (d, 1J = 245 – C,F C,F under reduced pressure. Brown solid (m.p.: 140 142 °C). Yield: Hz). IR [cm−1]: ˜ν = 1232, 1462, 1511, 1634, 1714, 2979, 3305, 0.75 g (47%). Compound purity: 100.0%. Rf = 0.83 (cyclo- 3445. HRMS: [C H N O FS + H]+ req.: 354.0918, found: 1 δ 15 16 3 4 hexane/ethanol/Et3N 6 : 2 : 2). H-NMR [ppm]: = 1.22 (t, 3H, 354.0930. J = 7.1 Hz), 4.09 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 4.29 (s, 2H), 5.94 (s, 2H), 6.43 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.07–7.12 (m, 2 H), 7.40–7.45 (m, 3H), 8.57 (m, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14.5, 32.6, 60.3, 109.3, 115.0 2 3 Conﬂicts of interest (d, 2C, JC,F = 21 Hz), 115.2, 130.7 (d, 2C, JC,F = 8 Hz), 131.8, 4 135.0 (d, JC,F = 3 Hz), 150.2, 152.8, 154.4, 159.9 and 162.3 There are no conflicts of interest to declare. 1 −1 (d, JC,F = 243 Hz). IR [cm ]: ˜ν = 1454, 1678, 2984, 3145, 3260, + 3403. HRMS: [C15H16N3O2FS + H] req.: 322.1020, found: 322.1027. Acknowledgements

AL and PJB are recipients of grants DFG LI 765/7-1 and DFG Synthesis of sulfoxide 7a BE 1287/6-1 by the Deutsche Forschungsgemeinschaft. C. B. 6a (0.5 mmol, 0.17 g) was dissolved in 10 mL DCM and cooled and K. B. are funded by these grants. to 0 °C. meta-Chloroperoxybenzoic acid (mCPBA, 1.1 eq., 0.55 mmol, 0.17 g of a 55% mixture with water) was dissolved in 10 mL DCM and added dropwise within 30 min. The solu- Notes and references tion was stirred for 3 hours, while the product precipitated as a white solid. The suspension was evaporated to dryness and 1 A. S. Nair, Anesth. Analg., 2018, 126, 1425; L. Puljak, Curr. purified by flash chromatography (mobile phase: DCM/MeOH Med. Res. Opin., 2018, DOI: 10.1080/ 95 : 5). The product was washed with diethyl ether, sat. 03007995.2018.1528217; S. Kaplan, B. Ehlken and

NaHCO3 solution and water and dried under reduced pressure X. Hamann, Curr. Med. Res. Opin., 2018, DOI: 10.1080/ at 40 °C. Light pink solid (m.p.: 202–204 °C). Yield: 0.11 g 03007995.2018.1499507.

(65.1%). Compound purity: 100.0%. Rf = 0.58 (n-hexane/ethyl 2 E. Scheuch, K. Methling, P. J. Bednarski, S. Oswald and acetate 5 : 5). 1H-NMR [ppm]: δ = 1.25 (t, 3H, J = 7.1 Hz), 3.99 W. Siegmund, J. Pharm. Biomed. Anal., 2015, 102, 377– (d, 1H, J = 13.0 Hz), 4.14 (q, 2H, J = 7.0 Hz), 4.32 (d, 1H, J = 385. 13.0 Hz), 6.38 (s, 2H), 6.72 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 7.05–7.12 (m, 4H), 3 K. Konishi, T. Fukami, T. Ogiso and M. Nakajima, Biochem. 7.82 (d, 1H, J = 7.5 Hz), 8.86 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14.5, Pharmacol., 2018, 155, 242–251. 2 57.6, 60.7, 108.7, 114.9 (d, 2C, JC,F = 21 Hz), 120.5, 126.6 (d, 4 C. J. Lemmerhirt, M. Rombach, A. Bodtke, P. J. Bednarski 4 3 – JC,F = 3 Hz), 129.5, 132.2 (d, 2C, JC,F = 8 Hz), 152.0, 154.2, and A. Link, ChemMedChem, 2015, 10, 368 379. 1 −1 154.6, 160.7 and 163.0 (d, JC,F = 244 Hz). IR [cm ]: ˜ν = 1219, 5 J. D. Turner, R. Sharma, G. Al Jayoussi, H. E. Tyrer, 1466, 1532, 1731, 2978, 3213, 3294, 3347. HRMS: J. Gamble, L. Hayward, R. S. Priestley, E. A. Murphy, + [C15H16N3O3FS + H] req.: 338.0969, found: 338.0978. J. Davies, D. Waterhouse, D. A. N. Cook, R. H. Clare,

8698 | Org. Biomol. Chem.,2018,16,8695–8699 This journal is © The Royal Society of Chemistry 2018 Organic & Biomolecular Chemistry Communication

A. Cassidy, A. Steven, K. L. Johnston, J. McCall, L. Ford, 9 C. D. Weaver, D. Harden, S. I. Dworetzky, B. Robertson and J. Hemingway, S. A. Ward and M. J. Taylor, Proc. Natl. Acad. R. J. Knox, SLAS Discovery, 2004, 9, 671–677. Sci. U. S. A., 2017, 114, E9712–E9721. 10 W. Lange, J. Geißendörfer, A. Schenzer, J. Grötzinger, 6 V. A. Artemov, V. L. Ivanov, A. V. Koshkarov, G. Seebohm, T. Friedrich and M. Schwake, Mol. Pharmacol., A. M. Shestopalov and V. P: Litvinov, Chem. Heterocycl. 2009, 75, 272–280. Compd., 1998, 34,96–101. 11 V. Barrese, F. Miceli, M. V. Soldovieri, P. Ambrosino, 7 F. K. Hansen and D. Geﬀken, J. Heterocycl. Chem., 2012, 49, F. A. Iannotti, M. R. Cilio and M. Taglialatela, Clin. 321–328. Pharmacol., 2010, 2, 225–236. 8 N. Barry, N. Brondel, S. E. Lawrence and A. R. Maguire, 12 I. Dorange and B.-M. Swahn, Annu. Rep. Med. Chem., 2011, Tetrahedron, 2009, 65, 10660–10670. 46,53–65.

This journal is © The Royal Society of Chemistry 2018 Org. Biomol. Chem.,2018,16, 8695–8699 | 8699 Publikationen

Flupirtine Analogues: Explorative Synthesis and Influence of Chemical Structure on KV7.2/KV7.3 Channel Opening Activity Abdrrahman S. Surur, Kristin Beirow, Christian Bock, Lukas Schulig, Markus M. Kindermann, Anja Bodtke, Werner Siegmund, Patrick J. Bednarski und Andreas Link Publiziert in der Fachzeitschrift ChemistryOpen 2019, 8, 41–44. DOI: 10.1002/open.201800244

Beiträge der Autoren Abdrrahman S. Surur

 Synthese der Verbindungen  analytische Charakterisierung der Verbindungen  Erstellen des Manuskripts Kristin Beirow

 Durchführung der biologischen Testungen Christian Bock

 Etablieren der Synthese Lukas Schulig

 Erstellen des Homology-Models Markus M. Kindermann

 Berechnung der Geometrie und der HOMOs der Verbindungen Anja Bodtke

 Durchführung der HRMS-Messungen Werner Siegmund

 Finanzierung von Abdrrahman S. Surur Patrick J. Bednarski

 Erstellen des Manuskripts Andreas Link

 Anleitung der Bearbeitung der Fragestellung  Erstellen des Manuskripts

Christian Bock Andreas Link

DOI: 10.1002/open.201800244 Communications

1 2 3 Flupirtine Analogues: Explorative Synthesis and Influence 4 5 of Chemical Structure on KV7.2/KV7.3 Channel Opening 6 Activity 7 8 Abdrrahman S. Surur,[a] Kristin Beirow,[a] Christian Bock,[a] Lukas Schulig,[a] 9 Markus K. Kindermann,[a] Anja Bodtke,[a] Werner Siegmund,[b] Patrick J. Bednarski,[a] and 10 [a] 11 Andreas Link* 12 th 13 Dedicated to Bernd Clement on the occasion of his 70 birthday and retirement as university professor 14 15 Neuronal voltage-gated potassium channels K 7.2/K 7.3 are 16 V V diseases that are characterized by neuronal over-activity, sensitive to small-molecule drugs such as flupirtine, even 17 including pain, stress, anxiety and epilepsy. While 1 is regarded though physiological response occurs in the absence of ligands. 18 safe in short-term use for acute pain, a recent clinical study Clinically, prolonged use of flupirtine as a pain medication is 19 provided indirect evidence that 1 can be oxidized in healthy associated with rare cases of drug-induced liver injury. Thus, 20 volunteers to unstable ortho- or para-azaquinone diimines 3a safety concerns prevent a broader use of this non-opioid and [2] 21 and/or b (Figure 1) as reactive metabolites. While neither non-steroidal analgesic in therapeutic areas with unmet medical 22 needs such as hyperactive bladder or neonatal seizures. With 23 the goal of studying influences of chemical structure on activity 24 and toxicity of flupirtine, we explored modifications of the 25 benzylamino bridge and the substitution pattern in both rings 26 of flupirtine. Among twelve derivatives, four novel thioether 27 derivatives showed the desired activity in cellular assays and 28 may serve as leads for safer K channel openers. 29 V 30 31 32 33 Flupirtine (1) is a non-opioid and non-steroidal, centrally acting 34 analgesic with a unique mode of action. The analgesic effect of 35 1 is believed to be associated with the opening of hetero- 36 tetrameric voltage-gated potassium channels, consisting of the 37 subunits KV7.2 and KV7.3, which are encoded by KCNQ2 and 38 KCNQ3, leading to membrane potential stabilization and [1] decreased excitability. The KV7.2/KV7.3 channel generates M- 39 Figure 1. Structure of KV channel openers 1 and 2, elusive metabolites 3a 40 currents that control the subthreshold excitability of the cell and b, product 4 of phase II drug metabolism, and direct thio-analogue 5 of 1 used for theoretical comparison in Figure 2 B). 41 membrane, therefore, drugs that stabilize the open state of 42 KV7.2/KV7.3 channels could be used in a broad range of CNS 43 44 compound 3a nor 3b could be identified directly, their [a] A. S. Surur, K. Beirow, C. Bock, L. Schulig, Dr. M. K. Kindermann, formation was deduced from presence of cysteine metabolites 45 Dr. A. Bodtke, Prof. Dr. P. J. Bednarski, Prof. Dr. A. Link in biological fluids,[2] formed by reactions of the reactive 46 Institute of Pharmacy 47 University of Greifswald intermediates with glutathione to yield adducts such as 4. While Friedrich-Ludwig-Jahn-Str. 17, 17489 Greifswald, Germany it is not known whether reactive electrophiles 3a or 3b are the 48 Fax: (+49) (0)3834 864895 causative agent for drug-induced liver injury (DILI), safety issues 49 E-mail: [email protected] 50 [b] Prof. Dr. W. Siegmund lead to a termination of a clinical study with 1 in hyperactive Center of Drug Absorption and Transport (C_DAT) bladder in 2013.[3] 51 Greifswald Although 1 was approved for use as a centrally acting 52 Supporting information for this article is available on the WWW under 53 https://doi.org/10.1002/open.201800244 analgesic in a number of European countries until 2018, it was 54 ©2019 The Authors. Published by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. not approved as an anticonvulsant. Two recent animal studies This is an open access article under the terms of the Creative Commons however have demonstrated that 1 terminates seizures in 55 Attribution Non-Commercial NoDerivs License, which permits use and dis- 56 tribution in any medium, provided the original work is properly cited, the neonatal mammals effectively, and that a combination of 1 and [4] 57 use is non-commercial and no modifications or adaptations are made. diazepam is superior to diazepam alone. Because the closely-

1 related KV channel opener retigabine (2) had been used as Table 1. Residues R1–R3 in intermediates 8a–h, thioethers 9a–d,f–h and 2 antiepileptic, until it was also withdrawn from the market in thioester 9e, and sulfoxides 10a–d 3 2017, this additional indication for 1 would seem a logical Entry R1 R2 R3 Yield[a] [%] endeavor. To date, treatment options for severe cases of status 4 8a NH 4-Fluorobenzyl 85 epilepticus are scarce. 2 5 8b NH2 4-Phenylbenzyl 90 Follow-up substance 2 marketed as Trobalt® has been taken 6 8c NH2 3,5-Dimethoxybenzyl 76 of the market by GSK, last year. One of the main reasons was a 8d NH2 2-Pyridylmethyl 88 7 8e NH 4-Fluorbenzoyl 82 blueish tissue discoloration.[5] While the exact structure of the 2 8 8f NH2 Piperidylethyl 87 blue dye could not be resolved, it is most likely that the 9 8g NHCH3 Benzyl 89 formation of polymers of 2 is the cause for this adverse effect. 8h CH3 4-Fluorobenzyl 66 10 9a NH 4-Fluorobenzyl 3,4-Difluorophenyl 35 Based on earlier findings that 1 and its metabolites can only be 2 11 9b NH2 4-Phenylbenzyl Ethoxy 38 traced to a limited extent in excretes, we speculate that 12 9c NH2 3,5-Dimethoxybenzyl Ethoxy 52 diimines such as 3a and b could form insoluble polymers 9d NH2 2-Pyridylmethyl Ethoxy 30 13 9e NH 4-Fluorbenzoyl Ethoxy 28 in vivo, as well. This hypothesis is supported by the report, that 2 14 9f NH2 Piperidylethyl Ethoxy 32 DILI caused by 1 is not influenced by typical polymorphisms of 15 9g NHCH3 Benzyl 3,5-Difluorobenzyl 8 metabolic enzymes but associated to Human leucocyte antigen 9h CH3 4-Fluorobenzyl Ethoxy 84 16 10a NH 4-Fluorobenzyl 3,4-Difluorobenzyl 30 (HLA) genotype.[6] It seems possible, that polymerization in vivo 2 17 10b NH2 4-Phenylbenzyl Ethoxy 88 triggers an immune response that could lead to the observed 18 10c NH2 3,5-Dimethoxybenzyl Ethoxy 18 10d CH 4-Fluorobenzyl Ethoxy 25 19 hepatotoxicity. Consequently, the search for flupirtine ana- 3 20 logues with a better safety profile seems worthwhile. [a] Isolated yield. 21 The tendency of 1 to form 3a or 3b or polymers may be 22 attributed to electronic features such as oxidation potentials. By 23 calculating the molecular orbitals of flupirtine (Figure 2) one 24 sulfur atom is envisioned to hinder the possible formation of 25 azaquinone metabolites like 3a. Compounds 9b–9g and 26 compounds 10b–10c have other rings or different substitution 27 patterns in place of the 4-fluorobenzyl group (Table 1). 28 Compounds 9g-9h and 10d, on the other hand, have a methyl 29 or methyl amine moiety instead of a primary amine. This 30 modification, owning to the absence of primary amine, may 31 result in analogues with little tendency to form metabolites like 32 3b. In addition, the ethyl carbamate of 1 was replaced with Figure 2. A) HOMO of flupirtine (1); B) HOMO of equally active but putatively fluoro-substituted phenyl or benzyl groups to give compounds 33 non-toxic lead 5. 34 9a, 9g and 10a, respectively. The rational for this bulky, 35 lipophilic modification comes from the recent patent literature [8] 36 on this class of compounds. 37 finds that the highest occupied molecular orbital (HOMO) and In an initial test set of systematically alkylated flupirtine 38 HOMO-1 are localized around the pyridine ring. This explains derivatives reported earlier, EC50 values for their KV7.2/KV7.3 [9] 39 the oxidation susceptibility of the heterocyclic ring to form channel opening activity correlated with oxidation potentials. 40 azaquinone diimine metabolites. The same calculation for In order to evaluate this proposed connection, we followed a 41 deazathio-flupirtine 5 showed that the HOMO orbital will shift similar approach to increase stability towards oxidation. By 42 from pyridine to the sulfur atom. This flupirtine analogue 5 is replacement of the secondary amino group connecting the two 43 equally active as 1 but non-toxic in vitro and was thus selected aromatic moieties in 1 by a thioether or thioester group in 9a– 44 as a starting point for the synthesis of more potent flupirtine h, we aimed to alter the oxidation pathway of the molecule [7] 45 analogues. Our experiments on the oxidation of thio-ana- while retaining or even improving biological activity. 46 logues to sulfoxides with a stoichiometric equivalent of m- The synthesis of most of the compounds was commenced 47 chloroperbenzoic acid also confirm this computational result. In with the amination of 2,6-dichloro-3-nitropyridine yielding 48 order to alter these unfavorable electronic features of 1, we intermediates 6a or b (Scheme 1). The only exceptions were the 49 synthesized flupirtine analogues with modifications that should syntheses of compounds 7c, 8h, 9h and 10d, which instead 50 avoid the formation of azaquinone diimines and polymers started with 6-bromo-2-methyl-3-nitropyridine (6c). The halo- 51 in vivo. gen substituents in 6a–c were unambiguously replaced by a 52 To plan the modifications of 1, we divided its chemical thiol group. Subsequently, thioether analogues were synthe- 53 structure into four regions; the 4-fluorobenzyl moiety, the sized by straightforward nucleophilic attack of the thiol group 54 secondary amine linker, the primary amine substituent, and the on reactants with different cyclic structures in β-position. 55 carbamate group. All analogues reported here have a sulfur Following the thioether synthesis, the 3-nitro group in 8a--h 56 containing functional group in place of the secondary amine was reduced to a primary amine with various classical reducing 57 linker. As shown in the HOMO calculation, the placement of this agents and then acylated to give the corresponding carbamate

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figure 3. Concentration-response curves of 1 (as maleate salt) and 9g 10 obtained with fluorescence-based thallium-flux KV7.2/3 channel-opening 11 assay; determined after 30 min exposure; data were normalized to control � � 12 (1% DMSO); values are the mean SD (n 3); EC50 values calculated from log(concentration)-response curves which fit a four-parameter logistic 13 equation. 14 15 16 17 The closely related deazathio-flupirtine analogues 9a and b Scheme 1. Synthesis of compounds 8a–h, 9a–h and 10a–d (for residues R1, are as active as the marketed drug 1. The less similar compound 18 2 3 ° R ,R in 8a–10d consult Table 1). a) for 6a: aq. NH3 (25%), 2-propanol, 35 C, 9g is even markedly more potent and effective (Figure 3). 19 5 days; for 6b, methylamine, triethylamine, acetonitrile, 0 °C 10 min, then rt, Thioester 9e was inactive in the tested concentration range, 20 30 min; b) Na2S·9 H2O, S8, NaOH, ethanol, reflux, 3–6 h; c) for 8a–d and 8f–h: 21 alkylating agents, aq. KOH (10%), DMF, rt, 1 h; for 8e: 4-fluorobenzoyl which shows that a sulfide bridge is the much better chloride, triethylamine, 2-propanol, reflux, overnight; d) for 9b–f, 9h: SnCl2 ·2 bioisosteric surrogate for the amino bridge than a thioester in 22 ° H2O, absolute ethanol, 70 C, argon, overnight - 48 h, then triethylamine, ° its thionoester form. The products of the chemical oxidation 23 acylating agent, 40 C, 3 h - overnight; for 9a: iron powder, NH4Cl, 4:1 ethanol/water, 100 °C, 1 h, then triethylamine, acylating agent, 0 °C, 1.5 h; for experiments demonstrated that formation of reactive diimines 24 ° 9g: iron powder, NH4Cl, 4:1 ethanol/water, 100 C, 2 h, then acylating agent, does not occur but instead the oxidative reactivity is shifted 25 HATU, 40 °C, overnight e) m-chloroperbenzoic acid, dichloromethane, 0 °C, 26 2 h. towards relatively benign S-oxidation, at least in the sulfide 27 series, as was anticipated. Oxidation is generally hampered in 28 comparison to 1, as the anodic peak potentials (Epa) are higher. 29 The resulting oxidation products, namely sulfoxides and 30 9b–f, and h or amide analogues 9a and g in yields varying sulfones, are putative metabolites that could also form from 31 between 8 and 84%. metabolic oxidation. Therefore, their cell toxicity is of interest 32 The important anthelmintic albendazole, belonging to and selected derivatives (10a–d) were thus evaluated for 33 chemical family of alkylarylthioethers, is rapidly oxidized to in vitro hepatotoxicity in hepatocellular models with that use [13] 34 albendazole sulfoxide and subsequently to albendazole sulfone the TAMH and HEP-G2 cell lines. [11] 35 (not shown). Albendazole sulfoxide is considered to be the Except for compounds 1, 9a, c, and d, LD50 values after 24 h 36 therapeutically active form of the drug, even so re-reduction could not be determined due to a lack of aqueous solubility. To 37 inside the parasites contributes significantly to the mode of gain another quantitative indicator of toxicity, LD25 values after 38 action. However, the role of albendazole metabolism for the 48 h, which could be determined at lower concentrations where 39 toxicity in humans is unknown. In the case of 9a and b, we water solubility was not an issue, were determined for the most 40 similarly anticipate that the main reaction products of oxidation promising compounds. The LD25 for highly potent and effective � � 41 might be sulfoxides 10a and b, respectively (Scheme 1). In 9g is 6 3 and 4 4 μM in the TAMH and HEP-G2 cell lines, 42 order to investigate the toxicity of these putative metabolites respectively, and thus considerably lower than for 1 (Table 2). 43 along with their parent compounds, we prepared the sulfoxides However, this increase in cell toxicity is more than compensated 44 10a–d. For sulfoxidation, sulfides 9a–d were treated with by the superior KV7.2/3 channel opening activity of 9g 45 almost a stoichiometric equivalent (1.1 equivalents) of m- compared to 1, yielding better safety indices of 400 versus 112 [12] 46 chloroperbenzoic acid in an ice cold water bath as described. and 267 versus 81 in the TAMH and HEP-G2 cell lines, 47 After structural confirmation by NMR and MS experiments, respectively. Because 9g has the highest logD7.4 within this 48 the compounds were studied electrochemically by measuring series of compounds, lipophilicity but not oxidizability or 49 the oxidation potential with cyclic voltammetry. KV7.2/KV7.3 resulting reactivity might be important for the underlying 50 channel opening activity were measured by a fluorescence- mechanisms of action and toxicity. [9] 51 based cellular thallium flux assay as described previously. To Based on these findings, we conclude that the development 52 assess for possible hepatotoxicity, the synthesized analogues of thio-analogues of known drugs 1 and 2 may result in KV7.2/ 53 were evaluated with both a transgenic mouse hepatocyte 7.3 channel openers with more favorable therapeutic indices 54 (TAMH) and human hepatoma (HEP-G2) cell line by using the than flupirtine. Because they do not form reactive oxidation 55 MTT-assay. products in vitro they could even help to separate structure- 56 activity from structure-toxicity relationships. 57

1 Table 2. Anodic peak potentials (Epa) of flupirtine (1) and derivatives 9a–h and 10a–d, EC50 and Emax values towards KV7.2/3 channels in HEK293 cells and 2 LD50 (24 h exposure) and LD25 values (48 h exposure) in TAMH cells and HEP-G2 cells as well as toxicity/activity ratios. [a] [b] [c] [c] [c] [d] [d] [d] 3 Entry Epa [mV] logD7.4 EC50 [μM] Emax [%] LD50 [μM] LD25 [μM] Tox./Act. LD50 [μM] LD25 [μM] Tox./Act. 4 1 350 2.96 0.918�0.099[e] 100 487�51 103�47 112 547�111 74�40 81 5 9a 442 3.90 0.26�0.082 100�23 >30 13�04 50 8�3 4�1 15 > > [f] [f] 6 9b 452 4.34 0.253�0.042 69�9 63 14�13 55 250 n.d. n.d. 9c 450 3.61 >10 – >250 n.d. [f] n.d. [f] 134�22 n.d. [f] n.d. [f] 7 9d 499 2.62 >10 – >1000 n.d. [f] n.d. [f] 831�149 n.d. [f] n.d. [f] 8 9e 573 3.00 >10 – >125 n.d. [f] n.d. [f] >250 n.d. [f] n.d. [f] > > [f] [f] > [f] [f] 9 9f 573 2.04 10 – 500 n.d. n.d. 500 n.d. n.d. 9g 631 4.27 0.015�0.002 147�9 >7.5 6�03 400 >10 4�4 267 10 9h 855 3.85 0.269�0.031 129�3 >10 >10 - >30 25�16 93 11 10a 628 3.24 >10 – >100 n.d. [f] n.d. [f] >125 n.d. [f] n.d. [f] > > [f] [f] > [f] [f] 12 10b 654 3.72 10 – 63 n.d. n.d. 63 n.d. n.d. 10c 442 2.81 >10 – >500 n.d. [f] n.d. [f] >500 n.d. [f] n.d. [f] 13 10d n.o.[g] 3.02 >10 – >500 n.d. [f] n.d. [f] >500 n.d. [f] n.d. [f] 14 [a] Determined with 1.0 mM compound in 100 mM TRIS-buffer (pH 7.4); [b] EC50- and LD50-values are means and standard deviations of 4–5 independent 15 determinations; [c] determined using TAMH cells; [d] determined using HEP-G2 cells; [e] flupirtine maleate salt was used; [f] not determined; [g] non- 16 oxidizable. 17 18 19 Experimental Section Keywords: medicinal chemistry · ion channels · oxidation · 20 structure-activity relationships · sulfides 21 N-[6-(Benzylthio)-2-(methylamino) 22 pyridin-3-yl]-2-(3,5-difluorophenyl)acetamide (9g) 23 Compound 8g (2.8 mmol, 771 mg), iron powder (28 mmol, 1.57 g) 24 and ammonium chloride (28 mmol, 1.5 g) were suspended in 15 mL 25 ethanol 20%. The suspension was stirred at 100 °C for 2 hours, [1] C. Gomis-Perez, M. V. Soldovieri, C. Malo, P. Ambrosino, M. Taglialatela, 26 filtered over diatomaceous earth, and the filter washed with ethyl P. Areso, A. Villarroel, Front. Mol. Neurosci. 2017, 10, 117. acetate. The filtrate was poured into water. The collected precip- [2] E. Scheuch, K. Methling, P. J. Bednarski, S. Oswald, W. Siegmund, J. 27 Pharm. Biomed. Anal. 2015, 102, 377–385. itate was washed with ethyl acetate. 2,6-Dichlorophenyl acetic acid 28 [3] A. Douros, E. Bronder, F. Andersohn, A. Klimpel, M. Thomae, H.-D. (2.8 mmol, 600 mg) and O-(7-azabenzotriazole-1-yl)-N,N,N’,N’-tetra- 29 Orzechowski, R. Kreutz, E. Garbe, Eur. J. Clin. Pharmacol. 2014, 70, 453– methyluroniumhexafluorophosphate (HATU, 5.6 mmol, 2.1 g) were 459; and (Erratum) 2015, 71, 387. 30 added and the mixture was stirred at 40 °C overnight. The product [4] a) D. Sampath, R. Valdez, A. W. White, Y. H. Raol, Neuropharmacology 31 was separated using silica gel chromatography (solvent: ethyl 2017, 123, 126–135; b) T. Zhang, M. S. Todorovic, J. Williamson, J. Kapur, 32 acetate/hexane). The combined product containing fractions were Ann. Clin. Transl. Neurol. 2017, 4, 888–896. evaporated to dryness. The residue was dissolved in ethanol and [5] T. Garin Shkolnik, H. Feuerman, E. Didkovsky, I. Kaplan, R. Bergman, L. 33 water was added to precipitate the product. Lavender colored solid Pavlovsky, E. Hodak, JAMA Dermatol. 2014, 150, 984–989. [6] a) W. Siegmund, C. Modeß, E. Scheuch, K. Methling, M. Keiser, A. Nassif, 34 = ° 1 (yield 8%); purity 100%; mp: 201–202 C; H NMR (400 MHz, D. Rosskopf, P. J. Bednarski, J. Borlak, B. Terhaag, Br. J. Clin. Pharmacol. 35 = DMSO-d6): δ 9.25 (s, 1H), 7.40 (m, 2H), 7.30 (m, 4H), 7.13 (m, 3H), 2015, 79, 501–513; b) P. Nicoletti, A. N. Werk, A. Sawle, Y. Shen, T. J. 36 6.41 (d, J=7.8 Hz, 1H), 6.23 (d, J= 4.6 Hz, 2H), 4.38 (s, 2H), 3.70 (s, Urban, S. A. Coulthard, E. S. Bjornsson, I. Cascorbi, A. Floratos, T. 13 37 2H), 2.89 (d, J= 4.6 Hz, 2H); C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ=168.7, Stammschulte, U. Gundert-Remy, M. R. Nelson, G. P. Aithal, A. K. Daly, 38 163.4 (dd, J= 13 Hz, J=244 Hz, 2 C), 153.2, 151.6, 140.4 (t, J= 10 Hz, Pharmacogenet. Genomics, 2016, 26, 218–224. 1 C), 138.9, 133.2, 128.6 (2 C), 128.3 (2 C), 126.8, 115.1, 112.7 (dd, J= [7] a) DE 102018212006.4; b) C. Bock, K. Beirow, A. S. Surur, L. Schulig, A. 39 6 Hz, J=17 Hz, 2 C), 107.9, 102.2 (t, J= 26 Hz, 1 C), 41.8, 33.3, 27.9; Bodtke, P. J. Bednarski, A. Link, Org. Biomol. Chem. 2018, 16, 8695–8699. 40 ~= [8] C. Bock, A. Link, Fut. Med. Chem. 2019, 11, in press. IR: v 3442, 3404, 3269, 1652, 1591, 1496, 1389, 1230, 1119, 991, [9] C. J. Lemmerhirt, M. Rombach, A. Bodtke, P. J. Bednarski and A. Link, 41 À1 À 696 cm ; HRMS-ESI m/z [MÀH] calcd for C14H16N4O2S: 398.1144, ChemMedChem. 2015, 10, 368–379. 42 found: 398.1157. For synthetic details of other compounds see [10] A. Bottoni, M. Calvaresi, A. Ciogli, B. Cosimelli, G. Mazzeo, L. Pissani, E. 43 supporting information. Severi, D. Spinelli, S. Superchi, Adv. Synth. Catal. 2013, 355, 191–202. 44 [11] J. D. Turner, R. Sharma, G. Al Jayoussi, H. E. Tyrer, J. Gamble, L. Hayward, R. S. Priestley, E. A. Murphy, J. Davies, D. Waterhouse, D. A. N. Cook, R. H. 45 Clare, A. Cassidy, A. Steven, K. L. Johnston, J. McCall, L. Ford, J. 46 Hemingway, S. A. Ward, M. J. Taylor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2017, 114, 47 Acknowledgements E9712-E9721. [12] a) V. Barrese, F. Miceli, M. V. Soldovieri, P. Ambrosino, F. A. Iannotti, M. R. 48 Cilio, M. Taglialatela, Clin. Pharmacol. 2010, 2, 225–236; b) A. S. Surur, L. 49 AS is thankful for support for the article processing charge from Schulig, A. Link, Arch. Pharm. Chem. Life Sci. 2019, 352: e1800248.. 50 the DFG (German Research Foundation, 393148499) and the Open [13] a) A. Van Summeren, J. Renes, F. G. Bouwman, J.-P. Noben, J. H. M. van Access Publication Fund of the University of Greifswald. CB was Delft, J. C. S. Kleinjans, E. C. M. Mariman, Toxicol. Sci. 2011, 120, 109–122; 51 b) M. Davis, B. D. Stamper, BioMed Res. Int. 2016, DOI: 10.1155/2016/ 52 supported by DFG grant LI 765/7-1, KB by DFG BE 1287/6-1. 4780872. 53 54 Conflict of Interest 55 Manuscript received: November 6, 2018 56 Revised manuscript received: November 26, 2018 ■■■ ■■■■ 57 The authors declare no conflict of interest. Version of record online: ,

How to replace the lost keys? Strategies towards safer KV7 channel openers Christian Bock und Andreas Link Publiziert in der Fachzeitschrift Future Medicinal Chemistry 2019, 11, 337–355. DOI: 10.4155/fmc-2018-0350

Beiträge der Autoren Christian Bock

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Christian Bock Andreas Link

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How to replace the lost keys? Strategies toward safer KV7 channel openers

Christian Bock1 & Andreas Link*,1 1Pharmaceutical & Medicinal Chemistry, Institute of Pharmacy, University of Greifswald, Friedrich-Ludwig-Jahn-Str. 17, 17487 Greifswald, Germany *Author for correspondence: Tel.: +49 383 4420 4893; Fax: +49 383 4420 4895; [email protected]

The highly structurally similar drugs flupirtine and retigabine have been regarded as safe and effective for many years but lately they turned out to exert intolerable side effects. While the twin molecules share the mode of action, both stabilize the open state of voltage-gated potassium channels, the form and severity of adverse effects is different. The analgesic flupirtine caused drug-induced liver injury in rare but fatal cases, whereas prolonged use of the antiepileptic retigabine led to blue tissue discoloration. Because the adverse effects seem unrelated to the mode of action, it is likely, that both drugs that occupied important therapeutic niches, could be replaced. Reasons for the clinically relevant toxicity will be clarified and future substitutes for these drugs presented in this review.

First draft submitted: 26 July 2018; Accepted for publication: 30 November 2018; Published online: 25 February 2019

Keywords: DILI • drug-induced liver injury • ezogabine • flupirtine • KV7 • retigabine • voltage-gated potassium channel

Just recently two unique drugs with advantageous features compared with the established standard therapies have been removed from the market, thus leaving numerous patients without adequate treatment. Those two, flupirtine 1 and retigabine 2 (USAN: ezogabine), are stabilizing the opened state of voltage-gated potassium channels of the KV7 family (Figure 1). While their strikingly similar chemical structures are difficult to distinguish at first glance, their major drawbacks are surprisingly different and most probably not related to the analogous mode of action. After usage over an extended period of time, both drugs were shown to cause unexpected effects after generally being well tolerated at comparably high doses. In this review, recent insights on both drugs are pointed out and possible explanations for their adverse drug effects are given. Furthermore, the possible use of such molecular keys in additional indications is discussed and the potential advantages to the current therapy highlighted. Finally, compounds are presented that have been reported to modulate KV7 channels and their promising way toward a safer replacement for 1 and 2 is discussed.

KV7 channels The KV7 channels belong to a group of voltage-gated, potassium selective ion channels which had their first appearance in 1980 when Brown et al. described a voltage-sensitive potassium current [1]. The five different KV7.1– five proteins consist of 676–932 amino acids, arranged in six transmembrane domains (S1–S6) with long intracellular C- and N-termini [2]. The S1–S4 are known to form the voltage-sensing domain (VSD), while S5 and S6, together with a loop between them, are building the ion-selective pore. Despite the fact that there are only five different KV7 proteins, the number of different channels is significant as the proteins tend to form homotetramers as well as heterotetramers. The heteromeric channels consist of two different subunits, each being present twice to form the tetramer. The preferences of KV7 proteins to assemble in a homo- or heteromeric fashion seems to be determined by the carboxyl-terminus [3,4], but also CaM was shown to exert an influence on the assembly [5].TheKV7.1 proteins are usually forming homomeric channels or assemble with single-transmembrane subunits encoded by KCNE genes [6].TheKV7.2 proteins are found in homomeric channels, but in conjunction with KV7.3, the currents of the channel are repothere rted to be larger [7,8]. The same applies to KV7.3 proteins as the homomeric channels show only a small conductance, whereas the channel formation together with KV7.4 or KV7.5 subunits yields channels

10.4155/fmc-2018-0350 C 2019 Newlands Press Future Med. Chem. (Epub ahead of print) ISSN 1756-8919 Review Bock & Link

O O

N N NH H 2 F

Compound 1 (flupirtine)

O O

N NH H 2 F

Compound 2 (retigabine) Figure 1. Flupirtine (1) and retigabine (USAN: ezogabine 2).

with higher current amplitudes [8]. Furthermore, KV7.4 and KV7.5 are assembling with each other, but also form functional homotetramers [8]. As different as the channel subunit composition is their distribution in the human body. While KV7.1 is found predominantly in the heart, all the others are expressed in the brain and other neuronal tissues with KV7.2, KV7.3 and KV7.5 being present in various areas, whereas KV7.4 can almost exclusively be found in dopaminergic neurons and in the auditory system [9,10]. Additionally, KV7 proteins show a high occurrence in smooth muscle cells, especially KV7.4 and KV7.5 are expressed commonly in the gastrointestinal tract, blood vessels and airway tissues [11–13].TheKV7 channels are activated at fairly negative potentials around -60 mV resulting in a potassium efflux, thus hyperpolarizing the membrane potential. While the neuronal KV7 channels are forming the so-called M-current, regulating neuronal excitability via the aforementioned hyperpolarization mechanism, KV7.1 is responsible for the IKs current in cardiac myocytes leading to their repolarization, especially under elevated heart rates [14]. The important role of KV7 channels in physiological procedures is shown by various channelopathies leading to clinically relevant impairments. For example, mutations of KV7.1 proteins are associated with delayed repolarization of cardiomyocytes, leading to LQT1 syndrome [15]. Abnormalities of KV7.2 and KV7.3 are reported for benign familial neonatal convulsions and developmental delay [16], while an altered KV7.4 function is correlated with loss of hearing (for review on channelopathies see [17]) [10]. The opening probability of voltage-gated KV7 channels is mainly influenced by the membrane potential, but also nonelectrochemical pathways are influencing their behavior (reviewed [18]). A major role for channel activity plays PIP2 which is needed to maintain the open state [19]. Accordingly, depletion of PIP2, as through the activation of muscarinic acetylcholine receptors (mAChR) and resulting in phospholipase C induced PIP2 hydrolysis, are associated with KV7 channel inhibition [20].But also CaM and even the membrane fluidity influenced by cholesterol content of the plasma membrane exert an effect on the channel activity [21,22]. A recent publication was able to proof γ-aminobutyric acid (GABA) and related structures to modulate KV7 channels [23]. The neurotransmitters are reported to bind to a conserved tryptophan residue (Trp236 in KV7.2 and Trp265 in KV7.3), thus stabilizing the open channel conformation and shifting the voltage-dependent activation toward more negative potentials. Besides those endogenous ligands, also natural products were shown to modulate KV7 channels. Especially, the euphorbiaceae Mallotus oppositifolius seems to contain compounds that are capable of influencing potassium currents [24]. The polyphenol mallotoxin (also known as rottlerin) and isovaleric acid exerted the most prominent effects by increasing currents in KV7.2 and KV7.4 channels. Among animals, channel modulators are reported with different effects. While a scorpion venom, containing the peptide AaTXKβ(2–64), amplifies currents in KV7.2/3andKV7.4 [25], the golden head centipede uses a small peptide (previously described as Ssm Spooky Toxin) that blocks all KV7 subunits except for KV7.3 in an equipotent fashion [26].

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The analgesic flupirtine The first authorized substance targeting KV7 channels was flupirtine (1). It has been used as an analgesic drug with muscle relaxing properties as reviewed [27]. It was approved for the treatment of acute and chronic pain in Europe since 1984 [28]. With increasing prescriptions, especially in Germany, an increased number of adverse drug reactions (ADR) were observed. While symptoms like nausea, drowsiness and vertigo were reported earlier already, the appearance of liver injuries raised concerns about the safety of 1 later [29–31]. Therefore, 1 was re- reviewed by the Pharmacovigilance Risk Assessment Committee (PRAC) in 2013, investigating a total of 330 liver injuries associated with flupirtine (1) medication, 49 of them including liver failure and 15 with a fatal outcome or liver transplantation. Because proof of efficacy in treating chronic pain was lacking and together with the rare, but relevant risk of drug-induced liver injuries (DILI), prescription of 1 was limited to short-term use, from that point in time. The maximal therapy duration was shortened to 2 weeks under weekly control of liver enzymes. Furthermore, 1 was only regarded as indicated when opioids or nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) were contraindicated [32]. In 2018, the drug was again under investigation of the PRAC, resulting in the recommendation to withdraw the marketing authorization of flupirtine-containing drugs [33]. According to the review by the authority, the restrictions established in 2013 were not followed appropriately; thus, still 23 cases of acute liver failure were reported since then. While the recommendation of the PRAC is yet to be adopted by the EMA, this practically terminates the use of 1 in Europe. Because 2 has been taken off the market (vide infra), previously, the only molecular keys to this target family are lost, leaving a highly appreciated mode of action unexploited.

Toxicity & metabolism of flupirtine Even after more than 30 years of use, the hepatotoxicity of 1 is still poorly understood. The prevalence for DILI is reported to be as low as 0.8 in 10,000 patients [34], although Douros et al. calculated a much higher risk for DILI under flupirtine (1) medication than for all other compared drugs [35]. An asymptomatic rise in ALT, AST and bilirubin plasma levels are reported in up to 31% of patients treated with 1 [31]. The mechanism seems to be neither predictable nor dose-dependent as Pulse et al. presume [36], making it an idiosyncratic liver injury. The mainly observed elevated ALT levels are rather characteristics of a hepatocellular type of liver injury than for a cholestatic one [31,37]. An immune-mediated reaction appears to be very unlikely as the eosinophil count is rarely elevated and symptoms of hypersensitivity are not reported [38]. A probable toxification mechanism of 1 has been elucidated by Methling et al. as they synthesized a glutathione conjugate of the drug (see Figure 2) [39]. According to their findings, metabolism through cytochrome P450 enzymes and monoamine oxidase A and B seems unlikely, but extensive oxidation by peroxidases was observed. The corresponding unstable intermediates 3 or 4 could react with any nucleophilic moiety like thiols from cysteine residues, thus covalently modifying liver proteins (Figure 2). Further evidence for this pathway was published by Scheuch and Siegmund et al. as they were able to identify two additional sulfide conjugates of 1 in the urine of healthy volunteers (Figure 3) [40,41]. The presence of up to 12% of sulfide conjugates (relative to bioavailable parent compound) shows the importance of oxidative metabolism. Presumably, in healthy subjects, the reactive quinone diimines are intercepted by glutathione as also indicated by the dose-dependent glutathione consumption in vitro [42]. But under glutathione depletion, as often found in elderly [43], 3 and 4 might react with liver proteins leading to hepatotoxicity. These findings suggest that the toxic effect of 1 correlates with its oxidizability. A series of compounds synthesized by Lemmerhirt et al. could not support this hypothesis as even compounds stable toward oxidation under experimental conditions showed LD50-values comparable with those of 1 in a TAMH cell-assay [44]. An interesting addition to the existing hypothetic toxicity model was published by Nicoletti et al. as they showed a 19-fold higher risk for flupirtine-induced liver injuries for patients carrying a gene modification of the human leukocyte antigen system [45]. While there are no other genetic risk factors known yet, an influence of the genome on the expression of DILI under flupirtine (1) medication seems pretty likely as the drug is well tolerated over years of use by some patients and others respond within days with an increase of plasma liver enzyme levels [31,46].

The antiepileptic retigabine In 2011, the second drug targeting KV7 channels was approved ‘as adjunctive treatment of partial onset seizures with or without secondary generalization in adults aged 18 years and above with epilepsy’ [47]. Retigabine (2) was marketed as TrobaltR (rINN: retigabine) in Europe and PotigaR (USAN: ezogabine) in the USA by GlaxoSmithKline plc. (GSK) after showing efﬁcacy in three studies with a total of 1,244 patients. The mode of action of 2 is similar

future science group 10.4155/fmc-2018-0350 Review Bock & Link

O O

N N NH H F

Compound 3 (ortho quinone diimine)

O O

N N NH2 F

Compound 4 (para quinone diimine)

OH H O N O O O O O HO N H S NH NH2

N N NH H 2 F Figure 2. Postulated quinone diimines 3 and 4 of Compound 5 (glutathion conjugate) flupirtine (1) and the in vitro generated glutathione conjugate 5.

to that of 1, which is not surprising as the chemical structures are almost identical. Correspondingly, the ADR are also quite similar with dizziness, somnolence and confusion state being reported most often [48–50]. In contrast to 1, 2 shows no significant hepatotoxicity or changes in plasma liver transaminases. But in 2013 cases of blue coloration of different tissues under retigabine (2) medication were published [51]. Especially, the hard palate, nails, lips and the conjunctiva showed discoloration after years of retigabine (2)intake[52,53]. The retinal pigmentations raised concerns about a potential vision loss under retigabine therapy. Thus, the US FDA and GSK recommended eye examinations every 6 months and discontinuation of the medication when eye discolorations are observed [51]. Analysis of biopsy samples yielded the absence of iron accumulations and other metal-chelations, also impurities or a change in melanogenesis were ruled out by GSK. Initial investigations could not find 2 in discolored tissues 19 using F-nuclear magnetic resonance analysis and mass spectrometry [52]. Later on, dimers of 2 and dimers of its main metabolite were found, partly in conjunction with melanin, in rats and humans [54].Thepigmentswere found especially in discolored tissue and might be responsible for the abnormal pigmentation under retigabine (2) therapy. No further information about the structure or the formation of those in vivo dimers in man has been published yet, but the theory received support by the synthesis of two retigabine (2) dimers 8 and 9 (Figure 4) and by identification of hydrophenazines and their oxidation products in rodents at GSK [55]. The incidence rate of the discolorations appears to be 3.6% per patient-year with a median onset of approximately 4 years. After discontinuation of the medication, the blue discoloration resolves gradually within a couple of years [56]. In 2016, the European Medicines Agency (EMA) acknowledged a still favorable benefit-risk balance for TrobaltR despite the reported adverse drug effects and renewed the marketing authorization [57]. Nevertheless, GSK stopped the distribution of TrobaltR and PotigaR in 2017 due to its very limited usage.

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O OH

O O H2N S NH

N N NH H 2 F

Compound 6 (cystein conjugate)

O OH O O O N H S NH

N N NH H 2 F

Compound 7 (acetylcystein conjugate) Figure 3. Sulfide metabolites 6 and 7 of flupirtine (1) found in humans.

H N NH O O O 2 NH O N H N NH H 2 F

Compound 8 (C-C retigabine dimer) F

H N 2 O O O N NH O N NH H 2 F

Compound 9 (N-C retigabine dimer) Figure 4. Synthetically obtained dimers 8 and 9 of retigabine (2).

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Retigabine metabolism The main metabolites found in plasma and urine are the retigabine-N 2-glucuronide and the retigabine-N 4- glucuronide with an eightfold higher concentration in urine of the N2-conjugate with respect to the N4-glucuronide. Also, N-acetylation after cleavage of the carbamate-moiety is observed leading to an amide-metabolite comparable with D13223 from metabolism of 1 [40,58]. While cyclization products could be identiﬁed in rats, they were absent in humans [59]. This shows that, unlike 1, 2 is not heavily metabolized via oxidation but is rather undergoing Phase-II reactions. These variances in metabolic transformations might explain the astonishing differences in hepatotoxic potential between 1 and 2 although differing only by the pyridine N-atom of 1 replaced by a methine group in 2. However, 2 should not form reactive quinone diimines similar to 3 and 4 as no sulﬁde conjugates comparable with 6 or 7 could be found yet. Accordingly, reactions with liver enzymes may not occur, rendering 2 a nonhepatotoxic drug.

Therapeutic potential of flupirtine & retigabine Due to the profound physiologic influences of KV7 channels and the nonselective interaction of 1 and 2 toward the different KV7.2–5 subunits, both drugs showed positive modulations in many impairments and diseases. This makes them possible therapeutic options for many still not adequately addressed disorders. Both drugs have been successfully tested in the management of different pain models. Besides many clinical trials showing the efficacy of 1 especially against lower back pain, it was also shown to effectively suppress pain after surgical interventions in different tissues recently while being well tolerated [60–62]. But also chronic pain states were mitigated effectively [46,63], especially the combination of 1 with tapentadol (not shown) displayed synergistic effects in the treatment of long-lasting pain [64]. While the prior mentioned pain states are well addressable with other analgesics like opioids and NSAIDs, the picture is far more complicated in practice. The abuse of oxycodone and other opioids in the USA has posed a severe threat to public health and has been dubbed an opioid epidemic [65].In Europe, the volume of proton pump inhibitor prescriptions used to prevent gastric side effects of NSAIDs is much higher than what seems advisable [66]. What is more, neuropathic pain is often resistant to usual analgesics and needs further therapy options. Although KV7 channels are reported to be downregulated in injured nerves [67,68], 1 and 2 showed promising properties in animal models and in humans suffering from neuropathic pain [69–71]. Also, hyperalgesia or allodynia might be suppressed by KV7 channel openers as shown for 2 in a bone cancer pain model [72]. Correspondingly, in 2011, 1 was tested in a Phase-IIb/III-study against neuropathic pain in cancer patients, which was inadequately treatable with opioids (EudraCT number: 2011-00122-99). No data about the outcome of the study has been published yet. The anticonvulsive potential of 2 has been sufficiently proven as it is authorized as an antiepileptic drug, but also disorders derived from KV7.2 channelopathies might be treatable with 2 as could be demonstrated, recently [16,73]. Predictably, 1 exerts efficacy against neuronal hyperexcitability as well. Hongo et al. reported a shorter duration of seizure-like events in an in vitro assay [74]; furthermore, 1 was shown to prevent seizures in different animal models [75,76]. Especially, the neonatal seizure terminating characteristics of 1 have been verified lately in an animal model [77]. Phenobarbital (not shown), the current first-line therapy of neonatal seizures is associated with a variety of ADRs and poor efficacy in some patients, as pointed out by Sampath et al. [77]. Correspondingly, 1 might hold the hidden potential to add a considerable benefit to the current pharmacotherapy of the most frequent neurological problem in the nursery. Additionally, 1 was shown to be effective in terminating the status epilepticus. Especially, the combination with diazepam (not shown) seems to terminate the neuronal disorder faster than diazepam alone, thus minimizing the risk of neuronal damage [78]. In general, 1 shows neuroprotective properties as shown lately in a cell assay and two mouse models [79–81], contrary to the earlier reported flupirtine-induced cell death of hippocampal cell cultures [82]. Moreover, a wide range of psychological disorders might be modulated by 1 and 2 as KV7 channels are also influencing serotonergic and dopaminergic neurotransmission (summarized by Hansen et al.) [83]. While recent findings display the impact of KV7.4 channels on depression-like behavior in rats [84], another study shows an antidepressant activity of 1 and 2 through an active resilience mechanism mediated by KV7.3 channels [85]. Resultantly, in 2014 a clinical trial with 18 patients suffering from major depressive disorder was conducted (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02149836). Although the outcome is not public, the ongoing recruitment for a bigger study with 48 patients (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03043560) hints at a positive effect of 2.Also, anxiolytic [86,87], antimanic and antischizophrenic properties are found especially for 2 [88,89]. Recent findings also show an influence of KV7.2/3 channels on alcohol dependency; accordingly, 2 was shown to decrease alcohol

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consumption in mice models [90,91]. But also different types of dependency or drug addiction might be treatable with KV7 channel openers as reduced rewarding effects of cocaine were shown under flupirtine (1) medication in animal testing [92]. Flupirtine (1) was also tested as a treatment for tinnitus, as its N-methyl-d-aspartate (NMDA) receptor antago- nistic features were believed to possibly improve the symptoms. From 24 patients taking a comparatively small dose of 100 mg 1 twice a day for 3 weeks, only one benefited from the therapy but discontinued the medication due to ADRs [93]. Later, it was shown that KV7 channels might play an important role in the development of tinnitus and that 2 could prevent tinnitus establishment in mice [94,95]. The study claimed that tinnitus could result from reduced KV7.2/3 activity, possibly through noise-induced upregulation of mAChR. Resultantly openers of this ion channel might prevent tinnitus development or improve the symptoms. These findings were further supported by a cell assay, showing that especially 2 was able to suppress tinnitus-like activity [96]. Also, the neuroprotective properties of 2 were discussed to be the pharmacological basis for the sought after ability to prevent tinnitus development [97]. To date, no clinical trials have been performed to estimate the potential of 2 for tinnitus treatment [98]. The frequent occurrence of KV7 channels in smooth muscle cells also leads to a variety of potential applications for drugs that modulate these channels (see [99] for review). Especially, overactive bladder and continence issues derived from it have been under intensive investigations. All five members of the KV7 family have been found in the detrusor muscle of guinea pigs, where the addition of 1 and 2 led to reduced excitability [100,101]. Recently, the human detrusor muscle was also shown to express KV7 channels with KV7.4 being the predominant species [102], thus making KV7 channel openers promising drugs to treat overactive bladder syndrome. In animal models, 2 was able to reduce detrusor overactivity and increased bladder capacity, further underlining the potential therapeutic value of the drug [103]. But until now there was only one clinical trial conducted (EudraCT Number: 2006-004854- 26) using 1 to treat overactive bladder syndrome in elderly woman. Unfortunately, the study had to be aborted because of significantly elevated liver enzymes during flupirtine (1) medication and no data about the outcome was published [31]. A promising new application for 2 might be amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The idea to use potassium channel openers to reduce axonal excitability, resulting in decreased excitotoxicity of motor neurons, has already been postulated in 2011 after findings of Shibuya et al. [104]. Neuroprotective properties of 2 have been shown in vitro using patch-clamp recordings of motor neurons. The survival of those cells was improved through reduced hyperexcitability [105]. Retigabine (2) might also suppress motor neuron bursting activity, thus preventing cell death and additionally avoid the formation of reactive oxygen species to accomplish neuroprotection [106]. Subsequently, two clinical trials have been initiated to confirm the efficacy of 2 in reducing neuronal excitability in ALS patients (EudraCT number: 2015-001431-20, ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02450552). In one of those studies, 2 was able to modulate multiple excitability parameters by hyperpolarization of the resting membrane potential, while riluzole (not shown), the only approved treatment for ALS had no influence on those variables [107]. Especially, a reduction of the strength-duration time constant under retigabine (2) medication was observed, possibly slowing the progression of ALS, as lower strength-duration time constant was correlated with longer survival times, earlier [108]. Unfortunately, no correlation between excitability and disease progression was found in this study. Results from the second clinical trial have not yet been published.

KV7 channel openers related to flupirtine & retigabine The exact mode of action and binding site of 1 and 2 has not been known for the longest time, but the last decade improved the understanding of the mechanistic details of the action of both drugs, dramatically. Especially, the synthesis of new analogs and the exchange of whole domains as well as single amino acids of KV7 proteins led to important findings. Both drugs are reported to target KV7 channels to dampen neuronal excitability, thus resulting in a variety of physiological effects. Although the general consent is, that especially the modulation of the KV7.2/3 heterotetramer is responsible for their efficacy in numerous indications related to overexcitability and pain, 2 is far from being selective toward this channel. As summarized by Blackburn-Munro et al., 2 is also increasing the current of all other KV7 channels except for KV7.1 [109]. The EC50 values are in the low micromolar range and the highest affinity is reported for KV7.3 with an EC50 of 0.6 µM. For 1 no data about subtype selectivity is published, but it can be assumed based on the high similarity of both drugs, that it also exerts an influence on KV7.2–5. Retigabine (2) is reported to stabilize the open conformation of KV7 channels, possibly by interrupting π–π interactions between a tryptophan and a phenylalanine moiety as calculations show [110]. Furthermore, the activation curve of the KV7 channels is shifted toward more negative potentials (leftward shift) by 2. Thus, a higher potassium efflux is

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S1–S4 S5–S6 L299 L275

E130 L243

W236 I134 A181

F137

A306 R207

R210

L275 F168

V225 L249

V224

Y226

Figure 5. Overview of exploited interaction sites in KV7.2 channels. Blue indicates amino acids important for retigabine (2) binding, the other colors label possible interaction sites for compounds discussed below: zinc pyrithione (13) in orange, QO-58 (16) in cyan and violet for structures related to ICA-027243 (14).

observed at low membrane potentials [111]. The binding site of 2 is thought to be constructed of the pore region, as indicated by chimeric KV7.2 channels with S5 and S6 domains as well as the loop between them (S5–S6) of KV7.1. The exchange of the sequence left the chimeric KV7.2 channel insensitive to retigabine (2), on the other hand, a chimaera of KV7.1 with S5–S6 domains of KV7.2 was sensitive to the drug [112]. As the amino acid sequence of the pore regions is highly similar between the KV7 proteins, there are only a few amino acids possibly responsible for the retigabine (2) binding (Figure 5). The single exchange of those amino acids showed the importance of Trp236 and Gly301 for the retigabine related activation of KV7.2. Further experiments on KV7.3 yielded an expanded pool of amino acids being suspected to form the binding side of 2 [113]. The Leu272 in the S5 segment, Leu314 in the loop between S5 and S6 as well as Leu338 in the S6 domain (similar to Leu243, Leu275, Leu299 in KV7.2 proteins) were found to be critical and are conserved in KV7.2–5 proteins but absent in KV7.1. Deeper insight into the type of bond between Trp236 (Trp265 in KV7.3) and retigabine (2) was generated by alterations in the indole-side chain of the amino acid [114]. By connecting the indole-ring with its nitrogen atom to the methylene linker of the amino acid, consequently eliminating the -N-H proton, the sensitivity of the channel toward 2 was completely lost. Normal connection in position 3 of the indole in Trp265 and the additional introduction of ﬂuorine atoms in positions 5, 6 and 7 yielded functional channels with increased sensitivity toward 2. This shows a possible hydrogen bond donor function of Trp265, as a more polarized bond between nitrogen and hydrogen leads to an increased hydrogen bond strength between the amino acid and a hydrogen bond acceptor moiety of 2, thus increasing the afﬁnity of the drug for the channel.

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OF O O O O NH NH NH N F N NN N N O S N NH H 2 O F O F3C

10 11 12

Figure 6. Structures of NS15370 (10), PF-05020182 (11) and a sulfur analog (12).

Besides the mentioned potassium channel activation, retigabine (2) and, to a greater extent, flupirtine (1)are reported to also act as allosteric modulators of GABA receptors and thus are believed to exert a part of their analgesic effect by increased activation of those anion channels by GABA. Especially, GABAA receptors containing δ-subunits seem to be sensitive to flupirtine (1) modulation [115]. For pain mediating neurons, both GABA receptor and KV7 channel activation, seem to have a similar influence on neuronal dampening, while KV7 channels might have a predominant impact in other tissues [116]. Numerous compounds were synthesized and tested for their KV7 channel modulation that stick close to the structure of 1 and 2, thus most likely addressing the same binding pocket. The probably closest analogs were published by Lemmerhirt et al. with the best compound (not shown) being as active as 2 but also more toxic [44]. The tested initial hypothesis that the toxicity of flupirtine analogs correlate to their oxidizability could not be proven, but a connection between the oxidation potential and the activity of their compounds could be found. This displays the possibility of an active species derived from flupirtine by oxidation being responsible for its biologic activity. A great boost of activity in this class of compounds was accomplished in 2013 by Dalby-Brown et al. as they presented a substance encoded NS15370 (10)(Figure 6) [117]. While 10 was approximately tenfold more active than 2 with EC50 values around 100 nM, one of the compounds within the series showed half-maximal activity even below nanomolar concentrations [118]. Compound 10 is comparably active at KV7.2, KV7.2/3, KV7.4 and KV7.5 channels, strongly leftward shifting their activation curve. At low concentrations, 10 is not influencing the maximal current, while at high concentrations the compound shows an inhibiting effect on the conductance. The compound was found to effectively reduce the firing frequency of neurons in vitro and prevent seizures in different rat models [117]. Furthermore, 10 showed strong vasorelaxant effects in vitro [119]. A series of compounds aiming for a reduced risk of DILI by removing the aniline structure of 2 was published by Davoren et al. [120]. The PF-05020182 (11) is as active as 2 and shows the same subtype selectivity. IC50-values for hepatotoxicity could not be calculated in concentrations up to 300 µM, thus showing its low hepatotoxic potential. Also, 11 was able to prevent rats from seizures in maximal electroshock (MES) experiments. The structure of 11 was evolved further in a recent paper by substituting both heterocycles [121]. The resulting compounds were as active as 11, additionally, the most promising hit (not shown) was tested for its pharmacokinetic profile in rats. No data about further in vivo studies are reported yet. In another approach to improve the properties of 2, its central phenyl core was fluorinated, yielding SF0034 (not shown) [122]. The compound is reported to be more potent than 2 in opening KV7.2/3 channels but does not show noticeable effects on KV7.4 and KV7.5. SF0034 is believed to reduce neuronal excitability through KV7.2/3 activation as it reduced firing in wild-type pyramidal neurons but failed at modifying neurons with KV7.2 deletion. The analog also showed activity in vivo as it prevented seizures and even tinnitus development in mice. Further modification of the structure of 2 led to a heterologous series published by Kumar et al. [123]. They were able to show that introduction of a trifluoromethyl group in position 4 of the benzyl moiety led to a more potent KV7.2/3 opener, while the introduction in position 3 increased the selectivity for KV7.2/3. Just recently, our working group published a series of compounds that replaced the secondary amine function of flupirtine by a sulfide bridge [124]. This should minimize the risk of quinone diimine formation as oxidations should rather take place at the sulfur bridge yielding sulfoxides or sulfones, respectively. While the introduction of sulfur lowered the potency of the compounds slightly, the introduction of a trifluoromethyl substituent instead of the fluorine atom could compensate for that yielding a more potent yet possibly less toxic compound (12). The aforementioned possible sulfoxide and sulfone metabolites were also synthesized and tested, showing no KV7

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Cl O O N O S N 2+ N N Zn N H H O S F 13 F 14 15

F3C FO ONH N N NO N NH N 2 H F O O HN NO ClN Cl Cl Cl 2 16 18

NO2

Figure 7. Structures of zinc pyrithione (13), ICA-027243 (14), ML213 (15), (S)-2 (16), NH29 (17) and QO-58 (18).

channel modulation and no hepatotoxicity up to maximum soluble concentrations. The lower activities of the sulfoxides are well in line with the literature as a recent review showed a similar trend [125].

Structurally divergent KV7 openers The existence of a different binding pocket in KV7 channels was postulated based on the finding that zinc pyrithione (13) is not competing with retigabine (2) for its binding site and shows a different subtype selectivity (Figure 7) [126,127]. While 13 is increasing potassium currents in KV7.1 proteins, it shows no activity for KV7.3 channels. Furthermore, the substitution of Trp236 in KV7.2 by leucine does not abolish the effect of 13.In contrast to 2, the zinc complex is increasing the maximal channel conductance drastically and induces a stronger leftward shift of the channel activation curve. The combination of both drugs was shown to exert a bigger influence on KV7.4 channels than the single compounds, possibly adding a benefit to the treatment of disorders derived from channelopathies of KV7.4 as postulated by Leitner et al. [128]. A recent publication investigated the current amplification by 13 and other zinc complexes, showing that not the pyrithione but rather the increased intracellular zinc concentration, mediated by 13 as an ionophore, is responsible for the modulation of KV7 channels [129].The augmentation is believed to be achieved by abolishing the PIP2-dependency of KV7 channels leading to larger currents under normal conditions as well as under PIP2-depletion. While all other KV7 channels benefit from increased zinc concentrations, KV7.3 is reported not to be activated by 13. The authors claim that possibly because the channel has the highest affinity for PIP2, it is saturated under normal conditions and reaches its maximal conductance without the addition of zinc ions. Indeed, Gao et al. were able to show that Kv7.3 could be augmented by 13 if a mutant of this channel was used that has a lower affinity toward PIP2. They also mention that KV7 channel activation by 13 could be abolished by the addition of a zinc-binding chelator, further underlining the importance of zinc ions for KV7 activation. In 2001, a series of small (aza)benzanilides was patented, which were reported to open voltage-gated potassium channels [130]. The most potent compound ICA-027243 (14) shows a much higher selectivity for KV7.2/3 heterotetramers than KV7.4 channels and only minor modulation of KV7.3/5. At high concentrations, an inhibition of KV7.1 channels was reported [131]. The aza-anilide 14 also increases channel conductance and shifts the activation curve of KV7 channels toward more negative potentials. Additionally, a voltage-independent current is induced and the compounds are reported to drastically slow down the channel closure [132,133]. Important for the channel modulation seems to be the amide linker and the correct positions of the pyridyl nitrogen as well as the fluorine

10.4155/fmc-2018-0350 Future Med. Chem. (Epub ahead of print) future science group How to replace the lost keys? Strategies toward safer KV7 channel openers Review atom. But especially the chlorine or bromine atoms of the pyridine moiety are of great importance for the slower deactivation as demonstrated by test results of a series of close analogs [133,134]. The binding site of 14 appears to be different from that of 2 as well, as channel mutation experiments indicate [135].TheKV7.2 channel is sensitive to 14, but the introduction of the S1–S3 domains of KV7.5 abolishes the effect of the drug. To the contrary, 14 opens channels consisting of KV7.5 with S1–S3 domains of KV7.2. Therefore, binding to the voltage sensing domain, with a special focus on S1–S3, seems to be likely for 14. Resultantly, the activity of the compound is not dependent on Trp236, as also shown by Padilla et al. [135]. Mutagenesis experiments and computer simulations with a desfluoro derivative of 14 (not shown) revealed the importance of Glu130, Ile134, Arg207 and Arg210 [136]. Further information about the binding properties of the ICA compounds and their subtype selectivity were published recently, using the close analog ICA-069673 (not shown). Ala181 and Phe168 (both located in S3 of KV7.2 and replaced in KV7.3) seem to be of importance for the channel modulation. While Phe168 could be replaced by other aromatic moieties to conserve ICA sensitivity, interesting effects were observed when replacing Ala181. The substitution of alanine by proline yielded a functional channel that showed an increased conductance through ICA-069673 modulation as does the wild-type, but the leftward shift of the channel activation was almost eliminated [137]. The ICA compounds were proven to be effective in animal epilepsy models [138], ICA-069673 even advanced to a Phase I trial [134]. The anilide ML213 (15) closely related to the ICA compounds showed a comparable subtype selectivity as 2. While the initial publication only postulated a positive modulation of KV7.2, KV7.2/3andKV7.4 channels [139], later investigations also reported effects on KV7.5 and KV7.4/5 [140]. The currents of KV7.2 were increased almost fivefold by 15 and the activation curve was shifted leftward as well. Modifications of the structure were poorly tolerated as the introduction of halogens instead of the methyl groups decreased the potency as did the exchange of the phenyl ring by pyridine. Also, the substitution of the aliphatic cycle by a phenyl residue led to a reduced activity [139]. This highlights the small window for optimization of those anilide-structures as already seen at the ICA compounds. It is also questionable whether 14 and 15 are sharing the same binding pocket as their subtype selectivity is different, and the introduction of a pyridine moiety or a second phenyl structure in 15 led to decreased or absent activities. Anilide 15 was reported to strongly suppress spinal wind-up, thus possibly stopping pain mediation on a spinal level [141]. By pronounced activation of KV7.4 15 also exerts strong vasorelaxant effects on smooth muscles as in the detrusor and blood vessels [119,142]. While most synthesized derivatives of 1 and 2 are achiral structures showing no need to differentiate between enantiomers, Bristol-Meyers Squibb developed a series of acrylamides bearing one stereocenter [143,144].TheS- enantiomers showed high potencies in opening KV7.2 channels and were able to reduce excitability in in vitro assays with hippocampal slices of rats, whereas the R-enantiomers showed almost no activity. The properties of acrylamides (S)-1 (not shown) and (S)-2 (16) were further investigated, showing that both are enhancing KV7.2, KV7.2/3, KV7.4 and KV7.5 channels while inhibiting KV7.1. They are reported to shift the channel activation curve leftward and prolong channel deactivation, thus leading to an increased current. At high membrane potentials, a current reduction of KV7.2 channels is induced by both compounds. The binding pocket seems to overlap with the one of 2 as the acrylamides are also dependent on Trp236 and no increased effect is observed by coadministration of acrylamide (S)-1 and retigabine (2) [145,146]. The inhibitory effects of 16 toward KV7.2 could be amplified by the introduction of a methyl group leading to the tertiary amide (not shown) [147]. The resulting compound inhibited KV7.2 channels with an IC50 of 7.4 µM while opening KV7.4 channels with an EC50 of 5.7 µM. This further highlights the possibility of obtaining subtype selective compounds that still target the retigabine (2) binding site. With meclofenamic acid and diclofenac (both not shown) two already established COX inhibiting analgesics were reported to act as KV7 channel modulators in 2005 [148]. Both are increasing the currents of KV7.2 and KV7.3 homotetramers as well as the corresponding heterotetramer by left-shifting their activation curves and slowing channel deactivation. The KV7.1 and a variety of other potassium channels are reported to be insensitive to those analgesics. While both drugs were able to suppress action potentials in cortical neurons, diclofenac showed a much stronger suppression of epilepsy symptoms in MES experiments compared with meclofenamic acid. Based on these findings a series of compounds related to the NSAIDs was synthesized and tested by Peretz et al. [149]. They were able to show that the introduction of esters instead of carboxylic acids conserved the COX inhibiting and KV7 activating features of the compounds. On the other hand, structures bearing an amide moiety only modulated KV7 channels, thus separating COX inhibition from KV7 amplification. Of great importance for potassium channel activation seems to be a terminal hydroxyl group in the side chain of the ester/amide as the absence of this functionality lead to inactive derivatives or even Kv7 channel blockers. Furthermore, Peretz et al. showed that introduction of

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electron-withdrawing substituents on the aromatic motifs increases the left-shifting of the channel activation curve. One of the esters reported showed depression of neuronal ﬁring in dorsal root ganglion as well as antiepileptic properties in an MES model. An amide, in a later publication called NH29 (17)(Figure 2), was further investigated for its subtype selectivity and demonstrated a prominent activation of KV7.2, a slight inactivation of KV7.1 and no interaction with KV7.4. KV7.3 could only be activated if a mutant (A316T) was used. The binding site of the diphenylamines was thought to be different to retigabine’s as an additional effect was observed when both drugs were applied together. This idea was underlined as meclofenamic acid and diclofenac were able to increase currents in the retigabine insensitive mutant W236L of KV7.2 [150]. A more detailed picture of the binding site was published in 2010 as Peretz et al. found the VSD to be responsible for the modulation by 17 through mutation experiments and computer simulations [151]. Especially, the exchange of Leu197 and the arginine residues in positions 198, 207 and 214 weakened the sensitivity of the KV7.2 channel toward 17. The homology modeling revealed a cleft including Lys120, Tyr127, Glu130, Leu200 and Arg207, which show various interactions when docked with 17. Of special interest, for the channel to obtain the open conformation seems to be a salt bridge between Glu130 and Arg207, which is possibly stabilized by 17. As shown lately, 17 is also interacting with VSDs of different ion channels like TRPV1, leading to channel inhibition [152]. Another family of KV7 channel openers with a strongly divergent structure compared with 1 and 2, are the pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7(4H)-ones, so-called QOs [153,154]. The most active compound QO-58 (18)modulates all KV7 channels except for the KV7.3 homotetramer by left-shifting the activation curve and mildly slowing the deactivation [155]. The potency is comparable with 2 as EC50 values for KV7.1, KV7.2, KV7.4 and KV7.3/5 channels are in the low micromolar range, as well. The binding site is not described in detail yet, but the substitution of Trp236 did not abolish the effect of 18 on KV7.2 channels. On the other hand, exchange of Val224, Val225 and Trp226 of KV7.2 eliminated the effect of 18 but not the modulation by 2 [155]. A different binding site is therefore highly probable. By virtue of the high lipophilicity of 18, a lysine salt was formulated and tested in animal models, wherein the compound could show analgesic effects in two pain models [156]. A whole new approach in KV7 channel modulation was followed by Mannelli et al. as they used small isothiocyanate-based structures to increase the potassium current [157]. Their experiments revealed a leftward shift of the KV7.2/3 activation curve and prolonged channel deactivation by H2S-releasing compounds. Further- more, the activity of those molecules was proven in a neuropathic pain model in mice. While structures bearing an isothiocyanate-moiety were correlated with pain reduction, an isocyanate-analog failed in suppressing the pain. The simultaneous injection of human hemoglobin, which is known to bind H2S, or XE991 (a KV7.1–5 inhibitor) abolished the analgesic effects of the isothiocyanates, further underlining the H2S-dependent KV7 channel modulation. A more detailed summary of potassium channel modulators, including a variety of potassium channel blockers can be found in a recent review by Miceli et al. [158].

Conclusion This review showed a variety of possible new therapeutic indications for 1, still, a comeback of the drug seems to be unlikely. Especially, the chronic usage as in long-lasting pain, hypertension, overactive bladder or tinnitus is questionable without deeper insights into the toxicity mechanism of 1. The identification of mutations in the human leukocyte antigen system as a genetic risk factor for DILI under flupirtine medication appears promising, yet not all cases of severe liver injuries could be explained with this mutation. Further research is needed to uncover the hepatotoxicity of 1 on a molecular level and to help to predict toxic effects of flupirtine analogs or their metabolites. If the toxicity problem could be properly addressed, for example, by patient stratification, future short-term use of 1 would appear to be worthy of investigation, especially for the yet insufficiently treated neonatal seizures and the status epilepticus. The fate of 2 appears to be much more appealing as it is still approved and considered a safe drug by the EMA and the FDA. The most striking ADR, the discoloration of various tissues, is not as severe as DILI and also mostly reversible. Promising advances could be achieved in the treatment of ALS, tinnitus, and neuropathic pain. Still, it would be favorable to further improve the pharmacotherapy by introducing new analogs of 2. Promising candidates were developed that pursue different approaches to deal with the ADRs of 2 while retaining or even improving the potency of the drug. As 10 is tenfold more active, the amount of toxic metabolites derived from the parent compound would be reduced considerably. In compound 11, the potential for dimer formation is minimized by replacement of the aniline structure and sterical hindrance by methoxy groups. While those two drug candidates might address the discoloration issue of 2, thus improving long-term therapy, 13 and the ICA compounds could

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additionally circumvent ADRs associated with a lack of subtype selectivity for KV7.2/3 channels. The modulation of all KV7 subunits (except for KV7.1) by 2 is usually well tolerated but also has some drawbacks as the vasorelaxant effect mediated by KV7.4 opening is leading to urinary retention. Future analogs should therefore speciﬁcally target KV7.2/3 channels and reduce the possibility for dimerization or oxidative metabolism to obtain drug candidates with reduced toxicity and improved compatibility.

Future perspective The ﬁeld of KV7 channel openers is still under intensive investigation, thus more drug candidates with improved features are very likely to be discovered. Also, the increasing understanding of the distribution and the physiological roles of the different KV7 subtypes is helping to design selective modulators to target disorders more precisely. But also some of the already known ligands are offering promising features and have been positively tested in many animal studies. Therefore, the approval of new drugs to replace ﬂupirtine and retigabine, the lost keys for potassium channel opening, within the next 10 years seems to be highly probable.

Executive summary

Flupirtine • Flupirtine is an analgesic that got approved 1984 in Europe. • Severe cases of liver injuries occurred under flupirtine medication leading to restrictions in flupirtine usage. • Reactive metabolites might be responsible for its toxicity. • Withdrawn from market in the European Union in 2018. Retigabine • Introduced in 2011 as an anticonvulsant drug in the USA and Europe. • Blue tissue discoloration associated with retigabine medication possibly caused by dimerization of the drug. • Withdrawn from the worldmarket by GlaxoSmithKline in 2017.

KV7 channel openers related to flupirtine & retigabine • Flupirtine and retigabine bind to a pocket within the pore-forming domain. • A variety of analogs were synthesized that show increased activity (NS15370), reduced toxicity (PF-05020182) or better selectivity (SF0034) but target the same binding site.

Divergent KV7 channel openers • Zinc pyrithione shows stronger current amplification, also targetsV K 7.1 channels and most likely uses a different mode of action.

• ICA-027243 and related compounds show an improved selectivity for KV7.2/3 channels and bind to the voltage-sensing domain.

• The acrylamides (S)-1 and (S)-2 are exerting mixed effects on KV7 channels.

Acknowledgments Figure 5 was generated by L Schulig.

Financial & competing interests disclosure A Link is the recipient of a grant by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (LI 765/7-1). C Bock is funded by this grant. The authors have no other relevant affiliations or financial involvement with any organization or entity with a financial interestinor financial conflict with the subject matter or materials discussed in the manuscript apart from those disclosed. No writing assistance was utilized in the production of this manuscript.

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• Development of subtype selective KV7openers.

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future science group 10.4155/fmc-2018-0350 Publikationen

Sulfide Analogues of Flupirtine and Retigabine with Nanomolar KV7.2/KV7.3 Channel Opening Activity Christian Bock, Abdrrahman S. Surur, Kristin Beirow, Markus M. Kindermann, Lukas Schulig, Anja Bodtke, Patrick J. Bednarski und Andreas Link Publiziert in der Fachzeitschrift ChemMedChem 2019 (geplant für Issue 8). DOI: 10.1002/cmdc.201900112

Beiträge der Autoren Christian Bock

 Synthese der Verbindungen  analytische Charakterisierung der Verbindungen  Erstellen des Manuskripts Abdrrahman S. Surur

 Synthese der Verbindungen  analytische Charakterisierung der Verbindungen Kristin Beirow

 Durchführung der biologischen Testungen Markus M. Kindermann

 Berechnung der Geometrie und der HOMOs der Verbindungen Lukas Schulig

 Erstellen des Homology-Models Anja Bodtke

 Durchführung der HRMS-Messungen Patrick J. Bednarski

 Erstellen des Manuskripts Andreas Link

 Anleitung der Bearbeitung der Fragestellung  Erstellen des Manuskripts

Christian Bock Andreas Link

DOI: 10.1002/cmdc.201900112 Full Papers

Very Important Paper Sulfide Analogues of Flupirtine and Retigabine with Nanomolar KV7.2/KV7.3 Channel Opening Activity Christian Bock, Abdrrahman S. Surur, Kristin Beirow, Markus K. Kindermann, Lukas Schulig, Anja Bodtke, Patrick J. Bednarski, and Andreas Link*[a] Dedicated to Prof. Dr. Hans-Hartwig Otto on the occasion of his 80th birthday.

The potassium channel openers flupirtine and retigabine have toward the formation of more benign metabolites. Structure– proven to be valuable analgesics or antiepileptics. Their recent activity relationship studies were performed to evaluate the withdrawal due to occasional hepatotoxicity and tissue discol- KV7.2/3 channel opening activity of 45 derivatives. Sulfide ana- oration, respectively, leaves a therapeutic niche unfilled. Meta- logues were identified that are devoid of the risk of quinone bolic oxidation of both drugs gives rise to the formation of formation, but possess potent KV7.2/3 opening activity. For ex- electrophilic quinones. These elusive, highly reactive metabo- ample, flupirtine analogue 3-(3,5-difluorophenyl)-N-(6-(isobu- lites may induce liver injury in the case of flupirtine and blue tylthio)-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl)propanamide (48)has m tissue discoloration after prolonged intake of retigabine. We 100-fold enhanced activity (EC50 = 1.4 n ), a vastly improved examined which structural features can be altered to avoid the toxicity/activity ratio, and the same efficacy as retigabine in vi- detrimental oxidation of the aromatic ring and shift oxidation tro.

Introduction

In Germany in 2017, 62 % of the 672 million prescribed daily The five KV7.1–KV7.5 proteins form homo- and heterotetra- defined doses (DDD) for treating pain consisted of opioids, meric channels and are expressed throughout the human while 34% were nonsteroidal anti-inflammatory drugs body with definite distribution patterns for each protein. The [1] (NSAIDs). Patients that tolerate neither NSAIDs because of predominant form in the central nervous system are the KV7.2 gastrointestinal bleeding nor opioids because of adverse ef- and KV7.3 proteins, and thus opening of the heterotetramer fects such as addiction, constipation, or respiratory depression, KV7.2/3 is believed to be the main mode of action of 1 for sup- were often treated with flupirtine (1; 5.3 million DDD in 2017). pressing pain and convulsions. While the analgesic properties Due to its distinctive mode of action, triaminopyridine 1 filled of 1 have been shown in various studies in humans,[6] the po- a therapeutic niche for these patients for more than 30 years. tential of 1 for the treatment of epilepsy has only recently However, in 2018 flupirtine was withdrawn in the European been considered based on results from rodent models and in- Union because of insufficient control of drug-induced liver directly by the approval and use of the identically substituted injury (DILI) in rare but fatal cases.[2] triaminobenzene, retigabine (2), as an antiepileptic drug.[7] The analgesic effect of 1 is thought to be achieved by two The mechanism underlying DILI after prolonged flupirtine mechanisms. On the one hand, 1 increases the affinity of g- use is not entirely understood, but evidence indicates that the aminobutyric acid for GABAA receptors, especially in pain-medi- drug might be metabolized to reactive intermediates (3 and its ating neurons.[3] On the other hand, 1 increases the opening ortho-azaquinone diimine isomer), that react with endogenous probability of voltage-dependent potassium channels of the nucleophiles.[8] Specifically, the detection of cysteine conju- [4] KV7 family. The activation of KV7 channels leads to potassium gates in the urine of healthy subjects after oral administration efflux, thus hyperpolarizing the membrane potential of neu- of 1 strongly indicates the formation of reactive intermediates rons, leading to decreased forwarding of action potentials. As of flupirtine.[9] Presumably, upon oxidation of 1, electrophile 3

KV7 channels are slow activating and non-inactivating, especial- is formed, which reacts with bio-nucleophiles, as could be ly repetitive neuronal firing is intercepted, thus making them shown in vitro by oxidation of 1 with peroxidases and conjuga- validated drug targets for the control of pain and epilepsy.[5] tion with glutathione.[10] Surprisingly, 2 has not been associated with hepatotoxicity, but was nevertheless recently removed [a] C. Bock, A. S. Surur, K. Beirow, Dr. M. K. Kindermann, L. Schulig, from the European market for causing blue discoloration of Dr. A. Bodtke, Prof. Dr. P. J. Bednarski, Prof. Dr. A. Link various tissues after extended intake.[11] A recent publication Institute of Pharmacy, University of Greifswald, Friedrich-Ludwig-Jahn-Str. found derivatives of 2 in the choroid of rats by imaging mass 17, 17489 Greifswald (Germany) spectrometry after treatment with the anticonvulsant.[12] The E-mail: [email protected] authors suspect that 2 is also converted into quinone diimines Supporting information and the ORCID identification number(s) for the author(s) of this article can be found under: 4, which then dimerize into hydrophenazine structures and https://doi.org/10.1002/cmdc.201900112. become oxidized to phenazinium ions (e.g. 5), causing the

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Figure 1. Structures of the approved drugs flupirtine (1) and retigabine (2) and their proposed toxification pathways via quinone diimines 3 and 4.

blue pigmentation (Figure 1).[13] In contrast to 1, this pathway seems to be dependent on melanin, as 5 could not be detected in albino rats and thus is dominant in pigmented tissues as the skin and eyes. The side effects of 2 are less severe than 1 and mostly reversible.[14] Aiming to develop safer alternatives for the treatment of pain and epilepsy, we have attempted to separate activity from toxicity by altering the oxidative behavior of 1 and 2 by replacing the secondary amino group with a sulfide bridge. While the steric properties are arguably retained, oxidation of the aromatic core should be avoided and instead the sulfur atom oxidized to non-electrophilic and potentially less toxic metabolites. To gain further insight into the structure–activity

relationship (SAR) of the sulfide analogues, we synthesized a Scheme 1. Synthesis of sulfide analogues of flupirtine: a) 1. NH3, ethanol, limited library of compounds bearing a variety of functional 3h,08C, 16 h, RT, 2. morpholine, MeCN, 30 min, 08C, 3 h, RT, 3. pyrrolidine, CH Cl , 1 h, 08C, 16 h, RT, 4. methylamine, Et N, MeCN, 10 min, 08C, 30 min, groups while keeping the methylene–sulfur–aromatic core 2 2 3 RT, 16–95 % yield; b) Na2S·9H2O, S8, NaOH, ethanol, 3–5 h, reflux, 32–75 %; motif. After structure confirmation, we tested the compounds c) alkyl bromide, KOH, DMF, 1–5 h, RT, 13–97 % yield; see Table 1 for R2 in

for their ability to augment potassium currents in KV7.2/3 chan- 17–35. nels and their toxicity in TAMH and Hep-G2 cells. Furthermore, we characterized the compounds by cyclic voltammetry, because a correlation between oxidizability and activity was sus- version; that is, up to 93 % of 12 could be obtained.[18] Under pected earlier.[15] To rationalize the results obtained from the basic conditions 12 was subsequently alkylated by a variety of biological evaluation, we also applied homology modeling and different alkyl bromides in a quantitative manner.[19] A summa- molecular docking to identify potential interactions within the ry of the intermediates is listed in Table 1. binding pocket. The final step included reduction of the nitro group as well as selective carbamoylation of the resulting primary amino group at position 3 (Scheme 2). We did not isolate the inter- Results mediate diaminopyridine, as those compounds tend to form ortho-quinone diimines and therefore show insufficient stabili- Chemistry ty. Our initial attempt to reduce the nitro group with a palladi- The synthesis of the sulfide analogues 36–60 of flupirtine um catalyst under hydrogen atmosphere, which is convenient began with 2,6-dichloro-3-nitropyridine (6), as we described in for nitrogen analogues of flupirtine,[15] failed to achieve com- recent publications for a limited set of such sulfides (see plete conversion. Better results were obtained when the reduc- Schemes 1 and 2).[16] After replacement of the 2-chloro sub- tion was conducted with tin(II) chloride dihydrate in ethanol. stituent by various nitrogen species, formation of the thiol at The observed reduction was quantitative, yet the reaction position 6 was conducted. While thiourea as a sulfur source times were quite long (up to 48 h) and not reproducible. The only yielded a small amount of thiol (24 % yield),[17] elemental use of iron powder and ammonium chloride shortened the re- sulfur and sodium sulfide resulted in a nearly quantitative con- action time to three hours, but also produced some undefined

& ChemMedChem 2019, 14,1–14 www.chemmedchem.org 2 2019 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ÝÝ These are not the final page numbers! Full Papers

of using the nitro precursor 17, we tried to directly brominate Table 1. Overview of the synthesized precursors 17–35 (see Scheme 2). compound 36 (Scheme 4). The carbamate moiety proved to be Entry R1 R2 stable under the reaction conditions, and 65 could be isolated in 29% yield. 17 NH2 4-fluorobenzyl

18 NH2 benzyl Another possibility of reducing the reactivity of the aromatic 19 NH2 3,4-difluorobenzyl moiety to prevent the formation of dimers or conjugates with 20 NH2 4-(trifluoromethyl)benzyl endogenous nucleophiles is to exchange the pyridine core for 21 NH 4-(pentafluoro-l6-sulfanyl)benzyl 2 another heterocycle. We chose to use a pyrimidine motif, as 22 NH2 cyclohexylmethyl 23 1-pyrrolidinyl cyclohexylmethyl the ring position that equals position 5 of the pyridine is occu- 24 1-pyrrolidinyl isobutyl pied by nitrogen. Because nitrogen is tetravalent when posi- 25 NH2 cyclopropylmethyl tively charged, only the pyrimidine ring is less likely to form 26 NH cyclobutylmethyl 2 covalent bonds with other molecules. For the synthesis of ana- 27 NH2 (pyridin-2-yl)methyl

28 NH2 (piperidin-1-yl)ethyl logue 69 we started with 5-nitrouracil (66, see Scheme 5). The 29 NH2 2,4-dimethoxybenzyl pyrimidine base was reacted to form the corresponding di- ’ 30 NH2 1,1 -biphenyl chloro derivative by holding at reflux in phosphoryl chloride 31 NHCH3 benzyl [21] 32 4-morpholinyl 4-fluorobenzyl with dimethyl aniline as described by Whittaker and Jones.

33 NH2 (tetrahydropyran-2-yl)methyl For the following amination, the compound was dissolved in 34 4-morpholinyl (1,3-dioxolan-2-yl)methyl ethanol and treated with aqueous ammonia at 08C to obtain 35 CH3 4-fluorobenzyl 68 in 85% yield. The intermediates 67 and 68 resemble the structure of cyanuric chloride; thus it is not surprising that the compounds are quite labile to hydrolysis and require rapid workup and dry storage. The procedures for sulfide formation and carbamoylation were similar to those of the pyridine analogues described above. The phenyl ring core of 2 would appear to be a superior

choice for KV7 channel openers than a pyridine ring because 2

Scheme 2. Reduction and acylation: a) 1. SnCl2·2H2O, ethanol, 16–48 h, does not show the same hepatotoxic potential as 1. Therefore, 8 70 C, 2. Fe, NH4Cl, H2O/2-propanol, 3–5 h, reflux, 3. H2, Raney nickel, THF, we also synthesized the thio analogue of 2 bearing a sulfur 8 1–5 h, RT; b) acylating reagent, Et3N or EtN(iPr)2, 0–40 C, 1–24 h, 9–74 % bridge. We started from the commercially available 2-fluoro-4- yield; see Table 2 for R1–3 in 36–60. bromoaniline (70, see Scheme 6). In the first step, 70 was oxidized to the corresponding nitro derivative 71 by using hydro- byproducts. The cleanest conversion was achieved with Raney gen peroxide in trifluoroacetic acid.[22] nickel under hydrogen atmosphere, showing quantitative Subsequently, the fluoro substituent was replaced selectively yields within a couple of hours. Without any workup the for- via nucleophilic substitution with gaseous ammonia, yielding mation of different amide and carbamate derivatives was exe- 72. While the formation of the thiol went smoothly with the cuted by dropwise addition of triethylamine and acylating pyridine derivatives (see above), the introduction of a sulfur agents. While the formation of amides was carried out at 08C atom into 72 was more troublesome. At first, again, elemental to achieve better selectivity toward N3-acylation, the carba- sulfur as well as sodium sulfide were used for the reaction, moylation usually took place at 408C, as the reactivity of the yielding only 26% of 73. The majority of the product was con- ethyl chloroformate was significantly lower. The compounds verted into the disulfide, yielding 43 % of 74 after workup by thus obtained are summarized in Table 2. flash chromatography. In a second attempt, 1,2-ethanedithol Because position 5 of the pyridine ring is susceptible to sub- was used as a sulfur source and copper(II) sulfate as a catalyst stitution reactions with endogenous proteins or peptides,[9,10] for thiol formation as reported by Liu et al.[23] Again, the major- we introduced a methyl group at this position to prevent such ity of the product formed consisted of disulfides and only 38% toxic reactions. The synthesis of the corresponding derivative of 73 could be isolated. The formation of disulfides could pos- started with 2-chloro-5-methyl-3-nitropyridine (61), which was sibly be prevented by the addition of dithiothreitol, yet we did converted into the corresponding N-oxide using hydrogen per- not try to improve the reaction any further, as 74 could also oxide–urea and trifluoroacetic acid anhydride (Scheme 3). Next, be reacted to the desired sulfide 75 in a one-pot reaction. By 62 was reacted with phosphoryl chloride to obtain 63. The fol- reduction of the SÀS bond using sodium borohydride and sub- lowing amination, sulfide formation, and ultimately reduction sequent alkylation with 4-fluorobenzyl bromide, 75 could be and carbamoylation were conducted in analogy to the previ- obtained in 74% yield.[24a] While a patent describes the synthe- ously described pyridine derivatives. sis of 2 by hydrogenation of the 2-nitroaniline intermediate We also wanted to investigate whether electron-withdraw- and carbamoylation of the resulting ortho-diamine,[24b,c] our ating substituents at position 5 of the pyridine ring can influence tempt to react 75 to 77 failed, as only a mixture of 77 and its the biological activity or toxicity relative to 64. Therefore, bro- isomer could be isolated. Supercritical-fluid chromatography mination was performed with N-bromosuccinimide and ammo- with diode array detection (SFC-DAD) investigations showed nium chloride as described by Csuk et al.[20] However, instead that both isomers were formed in equal amounts, and thus a

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Table 2. Overview of the synthesized sulfide analogues 36–77 in comparison to 1 and 2.

1 2 3 [a] m [b] [c] m [d] [e] Entry R R R Epa [mV] EC50 [m ] Efficacy [%] LD25 [m ] LogD7.4 TAMH Hep-G2 1 251 0.918Æ 0.099 100 103Æ 47 74Æ 40 2.96 2 205 0.147Æ 0.012 134Æ16 >400 269Æ 166 2.57

36 NH2 4-fluorobenzyl ethoxy 464 1.279Æ 0.293 93Æ13 > 40 >40 3.54

37 NH2 4-fluorobenzyl butyl 530 2.134Æ 0.457 140Æ11 19 Æ11 >63 3.43

38 NH2 4-fluorobenzyl isobutyl 530 4.544Æ 1.457 118 Æ28 > 63 >63 3.49

39 NH2 4-fluorobenzyl 3,4-difluorophenyl 430 0.260Æ 0.082 100Æ23 8Æ54Æ 1 3.90

40 NH2 4-fluorobenzyl 3,5-difluorobenzyl 487 0.066Æ 0.013 114 Æ16 >5 > 7.5 4.00

41 NH2 benzyl ethoxy 455 1.746Æ 0.347 110 Æ15 91 Æ10 97Æ 72 3.45

42 NH2 3,4-difluorobenzyl ethoxy 460 0.771Æ 0.076 96Æ925Æ 3 >30 3.66

43 NH2 4-(trifluoromethyl)benzyl ethoxy 459 0.237Æ 0.022 115 Æ19 13Æ 6 >20 3.91 6 44 NH2 4-(pentafluoro-l -sulfanyl)benzyl ethoxy 452 0.240Æ 0.066 78Æ10 > 10 >10 4.10

45 NH2 cyclohexylmethyl butyl 558 1.320Æ 0.440 120Æ19 6Æ2 102Æ61 3.97 46 1-pyrrolidinyl cyclohexylmethyl 3,5-dimethoxybenzyl n.o.[f] 0.021Æ 0.006 162Æ916Æ 5 > 125 5.10 47 1-pyrrolidinyl isobutyl 3,5-dimethoxybenzyl n.o.[f] 0.0245Æ 0.0069 141 Æ11 >125 > 125 4.70 48 1-pyrrolidinyl isobutyl (3,5-difluorophenyl)ethyl n.o.[f] 0.0014Æ 0.0001 136Æ13 35Æ27 38Æ 18 4.73

49 NH2 cyclopropylmethyl (3,5-difluorophenyl)ethyl 477 0.515Æ 0.035 117 Æ22 155Æ 86 75Æ 25 3.86

50 NH2 cyclobutylmethyl 3,5-difluorobenzyl 514 0.021Æ 0.003 107Æ744Æ23 41Æ 23 4.03

51 NH2 (pyridin-2-yl)methyl ethoxy 497 >10 – 503 Æ270 405Æ 157 2.62

52 NH2 (piperidin-1-yl)ethyl ethoxy 605 >10 – >500 284Æ 178 2.04

53 NH2 3,5-dimethoxybenzyl ethoxy 449 >10 – 75Æ55 48Æ 37 3.61 ’ 54 NH2 1,1 -biphenyl ethoxy 447 0.253Æ 0.042 69Æ914Æ 4 132Æ97 4.34 55 4-morpholinyl 4-fluorobenzyl ethoxy 542 0.109Æ 0.078 119 Æ10 >125 47Æ 36 4.60 56 4-morpholinyl 4-fluorobenzyl 3,5-difluorobenzyl 651 0.0009Æ 0.0004 127Æ9 >5 >20 4.73

57 NH2 (tetrahydropyran-2-yl)methyl 3,5-difluorobenzyl 598 1.348Æ 0.185 106Æ17 >125 108Æ61 3.68 58 4-morpholinyl (1,3-dioxolan-2-yl)methyl 3,5-difluorobenzyl 596 0.122Æ 0.031 112Æ11 141Æ 99 119Æ75 3.85

59 NHCH3 benzyl 3,5-difluorobenzyl 422 0.015Æ 0.002 147Æ9 >7.5 >10 4.23 [f] 60 CH3 4-fluorobenzyl ethoxy n.o. 0.269Æ 0.031 129Æ3 > 10 >30 3.85 64 406 0.447Æ 0.293 72Æ4 > 15 >20 3.94 65 487 >10 – >7.5 > 7.5 4.17 69 636 1.024Æ 0.298 122Æ4 > 80 >80 2.71 77 406 0.166Æ 0.035 128Æ2 > 50 >50 3.24 m m [a] Measured as 10 m solution in Tris buffer (100 m , pH 7.4). [b] EC50 values were obtained in HEK293 cells overexpressing KV7.2/3 channels; values are

means and standard deviations (n3). [c] Calculated relative to the maximum flupirtine-induced fluorescence signal. [d] LD50 values were determined by

MTT assay after 24 h exposure; values are means and standard deviations (n3). [e] LogD7.4 values were determined by an HPLC method (n2). [f] No oxidation took place between À0.5 V and 1.0 V.

workup of the 1:1 mixture did not seem promising.[25] Corre- spondingly, we Boc-protected the primary amine of 75 to obtain 76. Hydrogenation using Raney nickel as a catalyst and following carbamoylation with ethyl chloroformate and N,N-diisopropylethylamine produced the correct carbamate. After chromatographic workup, the Boc groups were removed using trifluoroacetic acid in dichloromethane, resulting in the formation of 77.

8 Scheme 3. Synthesis of 64: a) urea-H2O2, TFAA, CH2Cl2, 30 min, 0 C, 36 h, RT,

82% yield; b) POCl3, 5 h, reflux, 74% yield. Total yield of the five-step synthesis to obtain 64 from 63:7%.

Scheme 5. Synthesis of 69: a) POCl3, DMA, 2 h, reflux, 53% yield; b) 25% 8 aqueous NH3, ethanol, 3 h, 0 C, 85% yield. Total yield of the four-step syn- 8 Scheme 4. Bromination of 36: a) NBS, NH4Cl, THF/MeCN, 2 h, 0 C, 29% yield. thesis to obtain 69 from 68:11%.

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the introduction of a sulfur bridge as replacement for an amine shifts oxidation away from the formation of quinone diimines. The sulfoximine moiety is an underrepresented sulfur functional group in medicinal chemistry.[28] It is similar to sulfones, yet incorporates a slightly basic nitrogen atom and shows increased water solubility. Thus, we aimed to prepare the sulfoximine analogue of 36, keeping close to the structure of lead 1. The synthesis of sulfoximines usually begins with the corresponding sulfoxides, which are reacted with sodium azide or other nitrogen sources.[29] Our attempt to react 78 to give sulfoximine 95 using ammonium carbamate and diacetoxyiodo- benzene failed, as the carbamate moiety is not stable under these conditions. Therefore, we went a step back and tried to directly convert 17 into the sulfoximine by using a method reported by Xie and co-workers.[30] After chromatographic workup, 51% of the desired product 93 could be obtained. The downside of this reaction cascade is the need for carbamate formation at the end of the reaction sequence. As mentioned above, the sulfoximine nitrogen is basic and can react with electrophiles such as ethyl chloroformate. Nevertheless, we avoided the use of protecting groups and tried to reduce 93 and form the ethyl carbamate. After chromatographic workup, 95, its isomer 96, and the biscarbamoylated product 94 were isolated (Scheme 8). In a preceding publication, Lemmerhirt et al. investigated a possible correlation between toxicity and oxidizability of 1 and a series of close analogues, in analogy to the mechanism of toxicity of acetaminophen and its metabolite NAPQI.[15] While the initial hypothesis could not be proven, a relation between

the anodic peak potential (Epa) obtained by cyclic voltammetry

Scheme 6. Synthesis of 77:a)H2O2 (30%), TFA, 30 min, RT, 1 h, reflux, 71% (CV) and the activity of their compounds was observed; sub- 8 yield; b) NH3, ethanol, 3 h, 0 C, 16 h, RT, 86% yield; c) 1,2-ethanedithiol, stances that were oxidized at voltages below 400 mV were 8 CuSO4·5H2O, KOH, DMSO/H2O, 23 h, 60 C, yield of 73: 38%; d) NaBH4,K2CO3, able to open K 7 channels, whereas compounds that were oxi- 4-fluorobenzyl bromide, 90 min, RT, 74% yield; e) 4-fluorobenzyl bromide, V dized at higher voltages failed to show activity in the cell- NaOH, DMF, 45 min, RT, 91% yield; f) Boc2O, THF, 25 h, RT, 89% yield; g) H2, 8 8 Raney nickel, 1 h, RT, 4 h, 40 C; h) ethyl chloroformate, EtN(iPr)2,40h,40 C; based assay. To gain further insight into this hypothesis, the i) TFA, CH2Cl2, 30 min, RT. Combined yields of g), h) and i): 9%. redox potential of the sulfur-containing analogues was measured again by CV in the same manner as reported. In general, substitution of the secondary amine by sulfur leads to an in-

By replacing the secondary amine of 1 and 2 by sulfur, it is crease in oxidation potential: in comparing 1 (Epa =251 mV) very likely that the metabolic pathways of the compounds are with its sulfur congener 36 (Epa =464 mV), the redox potential different. Organically bound sulfur is easy oxidizable and tends changed by almost 200 mV (Figure 2). The same applies to 2 to form sulfoxides and sulfones, catalyzed by flavin monooxy- and 77, where a difference of 200 mV was also observed. genases (FMO) or cytochrome P450 (CYP) enzymes, as ob- In addition, a large difference between the different sulfur served in albendazole.[26] Correspondingly, our sulfide ana- oxidation states was also observed, as shown in Figure 3. logues are likely to undergo facile sulfur oxidation in vivo. To When oxidizing 36 to 78, again an increase of nearly 200 mV investigate the activity and the toxicity of those putative me- was detected (Epa =464 mV vs. 653 mV). Further oxidation to tabolites, the corresponding sulfoxides and sulfones were also the corresponding sulfone 89 increased the oxidation potential prepared. A variety of sulfoxides and sulfones were synthesized by an additional 60 mV (Epa =717 mV). Exchange of the alkyl

(Table 3) by oxidation of the sulfides using meta-chloroperoxy- residues of the sulfides had barely any influence on the Epa, benzoic acid (m-CPBA). The addition of one equivalent of oxi- whereas replacing the carbamate moiety by amides markedly dizing agent resulted in almost exclusive formation of racemic decreased the oxidizability; see the comparison of 36 with 37 sulfoxides, as proven by SFC-MS separation by the same (Epa =464 mV vs. 530 mV, respectively). The aromatic core also method as reported by Hofstetter et al.[27] A larger excess (> had an influence on the oxidative behavior. While the phenyl 2 equivalents) lead to the formation of the optically inactive and pyridyl cycles were oxidized at 406 and 464 mV, respec- sulfones (Scheme 7). The clean conversion of the sulfides tively, the pyrimidine ring was oxidized at 636 mV. We also ob- under oxidative conditions also underlines our hypothesis that tained compounds that were resistant to oxidation at all ap-

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Table 3. Overview of sulfoxides 78–88, sulfones 89–92, and sulfoximine 95.

1 2 [a] m [b] [c] m [d] [e] Entry R R Epa [mV] EC50 [m ] Efficacy [%] LD25 [m ] LogD7.4 TAMH Hep-G2 78 4-fluorobenzyl ethoxy 653 >10 – >125 >125 2.64 79 benzyl ethoxy 645 >10 – 713Æ294 878 Æ414 2.50 80 3,4-difluorobenzyl ethoxy 639 >10 – >250 >250 2.79 81 4-(trifluoromethyl)benzyl ethoxy 626 >10 – >100 >100 3.20 82 4-fluorobenzyl butyl 709 >10 – >500 >500 2.49 83 3,5-dimethoxybenzyl ethoxy 442 >10 – 78Æ70 244 2.81 84 1,1’-biphenyl ethoxy 654 >10 – 41Æ20 >63 3.72 85 4-fluorobenzyl 3,4-difluorphenyl 628 >10 – 77Æ37 >125 3.24 86 4-fluorobenzyl 3,5-difluorobenzyl 707 >10 – 135 Æ23 73Æ45 3.24 87 n.o.[f] >10 – >500 >500 3.02 88 463 >10 – >500 >500 3.10 89 4-fluorobenzyl ethoxy 717 >10 – 146Æ127 62Æ20 2.91 90 benzyl ethoxy 709 >10 – 118Æ8 >500 2.75 91 3,4-difluorobenzyl ethoxy 719 >10 – >125 >125 3.07 92 4-(trifluoromethyl)benzyl ethoxy 711 >10 – >30 >50 3.42 95 n.d.[g] >10 – >125 >125 n.d.[g] m m [a] Measured as 10 m solution in Tris buffer (100 m , pH 7.4). [b] EC50 values were obtained in HEK293 cells overexpressing KV7.2/3 channels; values are

means and standard deviations (n3). [c] Calculated relative to the maximum flupirtine-induced fluorescence signal. [d] LD50 values were determined by

MTT assay; values are means and standard deviations (n3). [e] LogD7.4 values were determined by an HPLC method (n 2). [f] No oxidation took place between À0.5 V and 1.0 V. [g] Not determined.

Scheme 7. Synthesis of sulfoxides and sulfones: a) m-CPBA (1.1 equiv), 8 8 CH2Cl2,0 C, 1–4 h, 16–89 % yield; b) m-CPBA (>2 equiv), CH2Cl2,0 C, 2–6 h, 25–55 % yield; see Table 3 for R1–2 in 78–92.

plied voltages up to 1 V. All of them (46, 47, 48, and 60) lack

the primary amino group and instead incorporate a pyrrolidin- Scheme 8. Sulfoximine formation: a) PhI(OAc)2,H2NCO2NH4, methanol, 1 h, 8 8 yl or methyl residue. RT, 51% yield; b) SnCl2·2H2O, 2 h, 70 C, ethyl chloroformate, Et3N, 2 h, 40 C, yield of 95:1%.

Biology channels and complexed with a specific dye, as a function of [31] To determine the KV7.2/3 channel opening properties of our compound concentration (Figure 4). The efficacy of the com- synthesized compounds, we used a cell-based assay with pounds was calculated relative to the maximal flupirtine-in- HEK293 cells overexpressing these channels. Compound po- duced fluorescence signal. Representative concentration–activi- tency was determined by measuring the intensity of the fluo- ty curves are shown in Figure 4. For a summary of the activity

rescence signal after thallium entered the cells through KV7 data, see Tables 2 and 3. Retigabine (2) shows about six-fold

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by a sulfide is generally well tolerated. Thus we modified the substituents of the pyridine core and the core itself to obtain more active compounds, derive SARs of this class of compounds, and investigate their hepatotoxic potential. First, the 4-fluorobenzylic moiety was modified to overcome the minimal loss of potency. Removal of the 4-fluorine atom lowered m potency even further (41,EC50 =1.75 m ), while the introduction of an additional fluorine atom led to a modest increase m (42,EC50 =0.78 m ). Similar to the data obtained by Kumar et al., a trifluoromethyl as well as a pentafluorosulfanyl group improved potency around six-fold (43 and 44).[32] The draw- back of 44 is its lower efficacy (78 %). The introduction of a second phenyl moiety improves potency in a similar manner, m while also showing lower efficacy (54,EC50 =0.25 m , 69% effi- Figure 2. Cyclic voltammograms of flupirtine (1, *) and sulfide analogue 36 cacy). An attempt to introduce groups more hydrophilic than ~ ( ). the 4-fluorobenzyl motif, i.e., pyridinomethyl (51) and piperidi- noethyl (52), yielded inactive compounds. As especially lipophilic compounds seem to have favorable

activities, we decided to determine LogD7.4 values of our compounds by an HPLC method. A correlation could be found in this set of compounds, as potencies increased with increasing

lipophilicity. Compounds with LogD7.4 >3.5 were active, with only one exception: the quite lipophilic dimethoxy derivative

53 (LogD7.4 =3.61) turned out to be inactive. As a rule, com-

pounds with LogD7.4 < 3.5 showed no channel opening properties. Next we aimed to increase potency by exchanging the carbamate moiety for more stable amide structures. Although bulky aliphatic amides have been reported to be highly active,[33] our sulfide derivatives with butyric acid (37 and 45) Figure 3. Cyclic voltammograms of 36 (~), 78 (*), and 89 (&). as well as pivalic acid amides (38) only yielded potencies in m the micromolar range (EC50 =1.32–4.54 m ). However, in the case of 37 significantly better efficacy (140 %) was noted. To further increase the potency of the sulfides, we incorporated the template published by Dalby-Brown et al. bearing a 3,5-di- fluorophenylacetic acid amide and a morpholine moiety.[34] The corresponding sulfide analogue 56 showed high potency in m opening KV7.2/3 channels with an EC50 value of 0.0009 m . Keeping the amide structure constant, the rest of the molecule was altered, again showing a correlation between activity and

lipophilicity. The least hydrophobic analogue 57 (LogD7.4 = m 3.68) is less active than 1 (EC50 = 1.35 m ). With increasing lipophilicity (57<58 <40< 50< 59<56) again the channel open-

ing activity increased, peaking with 56 (LogD7.4 =4.73), which is about 1000 times more active than 1 and shows higher efficacy (147%). The carboxylic amide structure was also shortened by removing the methylene bridge yielding 39, which is three times less active than 40. When prolonging the amide chain by a methylene group, mixed effects were observed. Figure 4. Concentration–response curves of flupirtine (1, &), retigabine (2, While the simultaneous substitution of the 4-fluorobenzyl resi- ~), and compound 48 (*). Data are the meanÆSD of at least three independent experiments. due by a cyclopropylmethyl group (49) lowered the potency eightfold, introduction of an isobutyl moiety and replacement

of the NH2 group by pyrrolidine yielded one of the most m greater potency and 34 % greater efficacy than the flupirtine potent compounds of the entire series (48,EC50 = 0.0014 m ). (1). Interestingly, the sulfide analogue 36 is only slightly less To investigate the influence of electron-donating substituents m m potent than 1 (EC50 = 1.28 m vs. 0.92 m ) with similar efficacy. in the amide chain, fluorine was replaced by methoxy groups; This result shows that the substitution of the secondary amine the resulting derivatives, bearing a pyrrolidine motif and isobu-

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m tyl (46,EC50 =0.021 m ) or cyclohexylmethyl residues (47, Oxidizing the sulfides to sulfoxides or sulfones led to lower m EC50 = 0.025 m ), were highly active and more efficacious than toxicity in the hepatic cell lines; for example, compare 41 with 1. its respective sulfoxide (79) and sulfone (90). While the sulfide To complete the SAR, we also modified the pyridine core by 41 was as toxic as 1, the sulfoxide 79 was ten times less toxic. either adding substituents or replacing it with other rings. The corresponding sulfone 90 was less toxic in TAMH cells When adding a methyl group at position 5 (64), potency dou- than 41 and nontoxic in the Hep-G2 line up to the maximum m m bled (EC50 =0.447 m ), whereas efficacy decreased (72%). Even soluble concentration of 500 m . Surprisingly, big differences stronger effects were observed when the methyl group was between both cell lines were observed for a couple of com-

shifted into position 2, replacing the primary amino group. The pounds. While 45 was less toxic than 1 in Hep-G2 cells (LD25 = resulting sulfide 60 was more potent and efficacious than 64. 102 mm), it exceeded the toxicity of flupirtine 16-fold in TAMH m On the other hand, introduction of the sterically more de- cells (LD25 = 6 m ). Moreover, the reversed case was observed

manding electron-withdrawing bromine atom at position 5 as 49 was half as toxic in TAMH cells as in Hep-G2 cells (LD25 = m (65) abolished the KV7 opening properties completely (EC50 > 155 vs. 75 m ). In general, the TAMH cell line was more suscep- 10 mm). Similar to 1 and 2, replacement of the pyridine for a tible to toxicity than the Hep-G2 line. phenyl ring (77) increased the potency about eight-fold, while the introduction of a second nitrogen atom into the ring re- Computations sulted in a moderately active pyrimidine analogue (69).

Finally, we determined the KV7 channel opening properties Until now there are no reports of X-ray crystal structures of the

of the sulfoxides and sulfones to obtain information about the KV7 family of ion channels. Nevertheless, we were interested in biological activity of the putative metabolites of the sulfide de- visualizing the binding site to help rationalize probable interac- rivatives. None of the compounds showed channel opening actions of our compounds with binding site amino acids. Toward tivity at concentrations up to 10 mm (Table 3). this goal, homology modeling with the structure of the crystal-

In addition to improved activity, it was important to also de- lized KV1.2/2.1 channel and the sequences of KV7.2 and KV7.3 termine the toxicity of the compounds, because it was due to were used as described in earlier publications to obtain a het- toxicity that the two drugs 1 and 2 were removed from the erotetramer (Figure 6).[36] market. For this purpose, in vitro cell-based assays (MTT assay) In accordance with previously published modeled binding with two cell lines of hepatic origin—TAMH and Hep-G2 sites, our model is of a rather hydrophobic character, with leu- cells—were used. Both cell lines have been used in the past as cine and phenylalanine being the predominant species. Espe- in vitro tools for the prediction of liver toxicity.[35] The poor cially the 4-fluorobenzyl moiety and the carbamate residue are water solubility of some of the compounds turned out to be a directed toward extended hydrophobic pockets. On the other problem, and thus the rather high concentrations needed for hand, the space around the sulfide is quite limited, as is the determination of less pronounced toxic effects could often not cavity where the pyridine core is located. Our modeling ap- be achieved. We therefore decided to express the toxicity as proach revealed a hydrogen bond between the primary amino

LD25 values (concentration which decreased cell viability to group of 36 and L299 of KV7.2. Furthermore, hydrogen bonds

75%) instead of the more commonly used LD50. The toxicity between the hydroxy group of S303 and the primary amine as data are summarized in Tables 2 and 3. A general trend on the well as the carbonyl moiety of 36 are predicted. impact of replacing the secondary amine by sulfur could not To gain a better understanding as to where in the molecule m be found. While 1 showed an LD25 value of about 100 m in oxidation takes place, we decided to calculate the highest oc- both cell lines, little decrease in cell viability by the sulfur ana- cupied molecular orbitals (HOMO) of 1, 36 and 47. The elec- logue 36 was observed up to the maximal soluble concentra- trons of the HOMO are the energetically least favorable of a tion of 40 mm (Figure 5). molecule, and are thus more likely to be lost during oxidation. As shown in Figure 7, the HOMO of 1 is located at the pyridine ring, which underlines the hypothesis that azaquinone diimines are formed upon oxidation of 1. These electronic features change significantly through the exchange of the secondary amine, as shown by the calculated HOMOs of 36. The lone pairs of the sulfide are estimated to form the HOMO, whereas the p electrons of the pyridine ring are calculated to constitute the fourth highest occupied molecular orbital (HOMO-3). Thus, it would be predicted that 36 undergoes sulfur oxidation to form sulfoxides and sulfones rather than ring oxidation, which is well in line with the products we obtained by oxidation using m-CPBA. Similar results were found when the HOMOs of the structurally more divergent compound 47 were calculated. The electrons of the sulfide lone

Figure 5. Concentration–viability curves of 1 (&) and 36 (~) in Hep-G2 cells. pairs form the HOMO, while the HOMO-1 is located at the car- Data are the meanÆSD of at least three independent experiments. bonyl oxygen. These calculations predict that the pyridine

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Figure 6. Predicted orientations of 36 (cyan) and 48 (brown) in the proposed binding site. For a better comparison, the ligand interaction diagrams of both structures are shown at right.

Figure 7. Left: Comparison of the five HOMOs of 1 and two of its sulfide analogues, 36 and 47. Right: The calculated lowest unoccupied molecular orbital (LUMO) and HOMOs of 47.

moiety should be less susceptible to oxidation, as the corre- fide residue had some impact on the potency of the com- sponding p electrons form the HOMO-2, which is energetically pounds, altering the carbamate moiety was found to have a much more favorable (À6.88 eV vs. À6.21 eV). greater influence on activity. Replacement of the NH by a sulfur atom also strongly modified the oxidative behavior, Discussion making the compounds more stable, thus higher voltages were needed for oxidation in voltammetry experiments. The Our results show that the secondary amino group of flupirtine loss of oxidizability made us expect a loss of activity as well, as

(1) could be replaced by a sulfide bridge without losing the a correlation between oxidation potential and KV7.2/3 opening [15] KV7 channel opening properties. While the structure of the sul- activity was published earlier. However, this was not the

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case. While the inactivity of the sulfoxides and sulfones was tivity of the new compounds should be retained or even in- well in line with the hypothesis, as they were difficult to oxi- creased. Future studies will focus on the in vivo effects of the dize, all of the sulfides showed anodic peak potentials above new lead compounds in animal models. 400 mV, but still the majority of them were active in opening

the KV7.2/3 channel. The most potent compounds were not even oxidizable, showing half-maximal current amplification at Conclusions low nanomolar concentrations. On the other hand, structures The synthesis and characterization of novel sulfide analogues with low E (e.g., 51, 53 and 65) failed to modulate the potas- pa of flupirtine (1) and retigabine (2) yielded highly active openers sium channel. Therefore, a simple relationship between redox of K 7.2/3 heterotetramers showing high efficacy and potency potential and activity could not be established. In search for V at single-digit nanomolar concentrations. The replacement of other criteria for activity, we decided to determine the lipophi- NH by sulfur increased the resistance to oxidation, thus poten- licity of the compounds at pH 7.4 (which is the pH of the activ- tially suppressing the in vivo toxification, especially as the pu- ity determination), as extended hydrophobic amide chains re- tative sulfoxide und sulfone metabolites were found to be less sulted in high potencies. In comparing the LogD values ob- 7.4 toxic than the parent compounds. Because formation of qui- tained by HPLC with the activity data, we again found no none diimines is highly unlikely with the new compounds, and simple correlation. While four of the most potent compounds the activity/toxicity ratio could be improved considerably, sul- (46, 47, 48 and 56) also were those with the highest LogD , 7.4 fide derivatives of 1 and 2 might prove valuable templates for another compound, 64, which is also quite hydrophobic, did the design of safe replacements for the withdrawn drugs. not open KV7.2/3 channels. On the other hand, the least lipophilic compounds 51 and 53 were inactive, as could have been expected. Nevertheless, compound 77 had the third Experimental Section lowest LogD7.4 value among the sulfides and still showed potent channel modulation. Synthesis: Detailed information for the synthetic procedures for To gain further insight into the binding of the compounds, compounds 7–10, 12–60, 62–65, 67–69, 71–93, 95, and 96 including melting points, NMR, and LC–MS data can be found in the Sup- we attempted to visualize the binding site by homology mod- porting Information. All commercial reagents and solvents were eling. In our model, the 4-fluorobenzyl moiety of 36 stretches used without further purification. Reaction monitoring by TLC was into a hydrophobic pocket composed of leucine and phenyla- performed on silica gel 60 F254 aluminum plates from Merck by lanine (Figure 6). This is consistent with the experimental data using UV light (l=254 nm and 366 nm) for visualization. NMR that confirmed that the exchange of the benzyl motif for the spectra were recorded with a Bruker Avance III instrument at 1 13 more hydrophilic pyridyl of piperidyl scaffolds abolished KV7 400 MHz ( H NMR) and 101 MHz ( C NMR). The samples were mea- channel opening activity, as seen in the case of 51 and 52.On sured in [D6]DMSO solution (unless stated otherwise) with tetrame- 8 the other hand, introduction of lipophilic substituents (see 43, thylsilane as an internal standard at 25 C. If in doubt, two-dimen- sional NMR measurements (HSQC, HMBC) were applied to assign 44 and 54) increased the potency of the compounds, high- signals to the corresponding atoms. HRMS data were obtained lighting the importance of hydrophobic interactions within the with an LC-IT-TOF (Shimadzu) by using electrospray ionization. IR binding pocket. When replacing the ethoxy group of the car- spectra were recorded on an Alpha FT-IR spectrometer from Bruker bamate by different benzyl moieties, resulting in amide deriva- with the help of ATR technology (diamond probe head). Melting tives, higher potencies were observed as well (see 40 and 59). points were measured automatically with a Melting Point M-565 in- Also, the carbamate extends into a hydrophobic cleft in our strument (Büchi). Compound purities were determined by HPLC model. Replacement of the primary amino group by bulky with DAD (applying the 100% method at 220 nm). Flash chroma- groups increased the potency of the compounds dramatically, tography was performed (unless stated otherwise) on a glass column using silica gel 60 from Carl Roth with a particle size of as illustrated by the comparison between 48 and 49 or 36 and 20–45 mm. The flow rate was adjusted to approximately 55. When using bulky amides and replacing the benzylic sul- 25 mLminÀ1 by applying pressure with compressed air. Preparative fide moiety by small aliphatic residues, highly potent com- HPLC was performed using a preparative chromatography system pounds were still obtained (46, 47, 48 and 50). The docking from Shimadzu and a LiChrospher 100 RP-18 end-capped (250 simulations of those compounds exhibited a different binding 25 mm) column from Merck. mode as for the carbamate derivatives (e.g., 36 vs. 47; see Selected synthetic procedures for ligands 36 and 48: Compound Figure 6). The most stable pose was found to be flipped, with 16 (5 mmol, 1.4 g, see Supporting Information) was suspended in the amide chain pointing toward L314 and the small sulfide water (30 mL) and 2-propanol (50 mL). Iron powder (3 equiv,

chain being positioned in the bigger cleft near F254. The com- 15 mmol, 0.84 g) and NH4Cl (4.5 equiv, 22.5 mmol, 1.2 g) were pounds of the present work were not only designed to achieve added and the suspension was held at reflux for 5 h. The resulting high potencies, but also to abolish adverse drug reactions of 1 dark-brown mixture was filtered and evaporated to dryness. The and 2. It could be shown by calculations and by chemical oxi- residue was diluted with water (150 mL) and extracted with ethyl acetate (360 mL). The combined organic layers were washed dation, that the formation of quinone diimines should be limit- with brine (150 mL) and dried over Na2SO4.Et3N (1.4 equiv, 7 mmol, ed to a minimum by replacing the secondary amine for a sul- 0.97 mL) was added and the solution was cooled to 08C. A solution fide. Thus, our findings suggest that the hepatotoxicity and of ethyl chloroformate (1.2 equiv, 6 mmol, 0.57 mL) in ethyl acetate the formation of blue discoloration should be decreased rela- (5 mL) was added dropwise. After 2 h additional ethyl chlorofor- tive to flupirtine and retigabine, while the pharmacological ac- mate (1.2 equiv, 6 mmol, 0.57 mL) was added at RT; 5 h later, ethyl

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chloroformate (0.6 equiv, 3 mmol, 0,29 mL) and Et3N (0.7 equiv, RPMI 1640 (PAN Biotech), supplemented with 10% heat-inactivated 3.5 mmol, 0.49 mL) were added. After 2 h the reaction was com- fetal bovine serum (FBS; Sigma–Aldrich) and 1% penicillin/strepto- pleted, and the solution washed with water (200 mL) and brine mycin (PAN Biotech) and were incubated at 378C in a humidified

(200 mL). After drying with Na2SO4 and evaporation to dryness, the incubator with 95% air/5 % CO2. resulting solid was recrystallized from dichloromethane. The product 36 was dried at 408C under reduced pressure. For the synthe- TAMH cells were detached from the flask when 90% confluent À1 sis of 48, compound 23 (1 mmol, 0.28 g, see Supporting Informa- with trypsin-EDTA (Sigma–Aldrich), resuspended with 0.25 mgmL tion) was suspended in THF (10 mL), and one spatula of Raney soybean trypsin inhibitor (Sigma–Aldrich) in DMEM/F12. After cen- nickel was added. The mixture was stirred under hydrogen atmos- trifugation the cell pellet was resuspended in DMEM/F12 media m phere for 1 h at RT. Subsequently, triethylamine (1.4 equiv, supplemented with 5% PANEXIN NTA (PAN Biotech), 10 m nicoti- À1 1.4 mmol, 0.2 mL) as well as a solution of (3,5-difluorophenyl)pro- namide (Sigma–Aldrich) and 10 mgmL gentamicin sulfate (PAN panoyl chloride (1.0 equiv, 1.0 mmol, 0.20 g) in dichloromethane Biotech). Cell number of suspension was evaluated using an EVE (1.1 mL) were added dropwise and the suspension was stirred for Automated Cell Counter (NanoEnTek) and 20000 cells/well/200 mL 30 min at RT. The catalyst was filtered off, and the filtrate was dilut- DMEM/F12 media were seeded into 96-well plates (#83.3924.300, ed with water (100 mL). The mixture was extracted with diethyl Sarstedt). Plates were incubated until cells became confluent (usu- ether (100 mL) and washed with water (100 mL), a saturated solu- ally 48 h after seeding). Medium was removed and replaced by tion of NaHCO (100 mL) as well as brine (100 mL). The organic 200 mL/well DMEM/F12 media supplemented with 5% PANEXIN 3 m phase was evaporated to dryness, and the resulting solid was re- NTA (PAN Biotech), 10 m nicotinamide (Sigma–Aldrich) and À1 crystallized from ethanol/water (9:1) to yield compound 48. 10 mgmL gentamicin sulfate (PAN Biotech) and containing a serial dilution series of test compounds (5–9 concentrations) pre- Cyclic voltammetric analyses: Oxidation potentials of the compared in DMSO (BioScience-grade; Carl Roth). In control wells 1% pounds were obtained by using a 797 VA Computrace device from DMSO was present. Wells without cells were used to determine Metrohm. Working electrode: glassy carbon, reference electrode: background signal and were treated as control wells. Every respec- Ag/AgCl/KCl 3m, auxiliary electrode: Pt. The compound (10 mmol) tive condition was run in triplicate. After 24 h exposure to test was suspended in 10 mL of Tris buffer (100 mm, pH 7.4) and soni- compounds, medium was aspirated off, 125 mL DMEM/F12 media cated for 3 min. The mixture was poured into the glass sample supplemented with 20% (v/v) of 2.5 mgmLÀ1 solution of 3-(4,5-di- holder and degassed by nitrogen for 3 min at room temperature. methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Alfa Starting at À0.5 V the voltage was increased to 1.0 V at a rate of Aesar) in phosphate-buffered saline (PBS) was added to wells and 0.1 VsÀ1, while the current was recorded in 0.05 V steps. Once 1.0 V plates were incubated 2.5–4 h in a humidified incubator at 378C. was reached, the voltage was inverted until À0.5 V at the same Again, medium was removed from wells and generated formazan rate to obtain a full cycle. Five of those cycles were recorded, but crystals were dissolved in 50 mL DMSO (for synthesis) (Carl Roth). only the first sweep was used to determine the anodic peak poten- Absorbance was measured at l=570 nm with a SpectraMax 190 tial (Epa) as it gave the strongest signal. The consecutive cycles microplate reader (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). Cell via- showed lower currents, most likely because of polymerization of bility was obtained by dividing absorbance values for each treat- the oxidized compounds on the surface of the working electrode. ment condition by that measured for control wells expressed in

Thus, the graphite surface had to be polished after every measure- percent (both previously corrected for background). The LD25 value ment with an alumina oxide suspension in water which was dis- of a compound represents its concentration where cell viability de- tributed on a patch of cloth. The Epa was determined automatically creases by 25%. This value was determined by plotting log(con- using the software: 797 VA Computrace 1.3.1. centration) of test compound versus related cell viability and performing linear regression analysis in Microsoft Excel (2013). When Lipophilicity determination: The lipophilicity of the compounds at even the highest tested concentration of a compound could not pH 7.4 was determined by using an RP-HPLC method. First, a cali- decrease cell viability to/below 75%, LD25 was indicated as greater bration curve was established by plotting the log(retention factor) than the highest tested concentration. Determined values are the ’ (logk ) of several references against their literature logP value. With mean of at least three independent experiments Æ standard devia- the help of the resulting logarithmic equation, the LogD7.4 values tion (SD). of our compounds could be calculated after determination of their logk“. More details are given in the Supporting Information. Hep-G2 cells were detached from the flask by trypsin-EDTA (Sigma–Aldrich) when 70% confluent and suspended in RPMI In vitro toxicity: TGF-a transgenic mouse hepatocytes (TAMH) 1640. Cells were counted with an EVE Automated Cell Counter were a gift from Prof. Sidney D. Nelson (formerly Department of (NanoEntek) and 15000 cells/well/100 mL RPMI 1640 media were Medicinal Chemistry, University of Washington, Seattle, USA). seeded into 96-well plates (Sarstedt). Cells were allowed to attach HEK293 cells expressing Kv7.2/3 were purchased from SB Drug Dis- for 24 h in a humidified incubator at 378C. Test compounds and covery (Glasgow, UK). TAMH cells were maintained in a T75 flask controls were then added to the wells of the plates as previously with Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Nutrient Mixture F-12 described for TAMH cells. (DMEM/F12 1:1 mix; PAN Biotech), supplemented with 5% PANEX- IN NTA (PAN Biotech), 10 mm nicotinamide (Sigma–Aldrich) and HEK293 cells were detached from the flask by TrypLE Express 10 mgmLÀ1 gentamicin sulfate (PAN Biotech). HEK293 cells were (Thermo Fisher Scientific) when 80% confluent and resuspended cultured in a T75 flask with minimum essential medium with non- in MEM. After centrifugation the cell pellet was again resuspended essential amino acids (MEM; Thermo Fisher Scientific), supplement- in MEM. Cell number of suspension was counted with an EVE Au- ed with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS; Sigma–Al- tomated Cell Counter, and 60000 cells/well/100 mL MEM were drich), 2 mml-glutamine (Sigma–Aldrich), 4 mgmLÀ1À1 blasticidin S- seeded into black-walled 96-well plates with clear bottom HCl (Merck), 1% penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific) (4titude). Cells were allowed to attach for 24 h in a humidified in- and 0.78 mgmLÀ1 G418 sulfate (Carl Roth). Both cell lines were incubator at 378C and formed a near confluent monolayer. FLIPR 8 cubated at 37 C in a humidified incubator with 95% air/5% CO2. Potassium Assay Kit (Molecular Devices) was used to determine

The Hep-G2 cell line was cultured in a T75 flask (Sarstedt) with KV7.2/3 channel opening activity of test compounds according to

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the manufacturer’s instructions. Briefly, an equal amount of Load- Fock (HF) method resulted in electron density distributed over the ing Buffer containing 5 mm probenecid (Santa Cruz Biotechnology) entire molecule, assignment to a specific region of a molecule was (pH 7.4) was added to wells and incubated for 1 h at room temper- accordingly difficult. The electron ratios were converted with the ature in the dark. Serial dilution series of test compounds (5–9 con- help of NBO method into a vivid orbital, natural bonding orbital centrations) were prepared in DMSO (BioScience-grade) (Carl Roth) (NBO), which made it possible to assign orbitals to individual struc- and incubated with cells for another 30 min at room temperature tural elements. in the dark. Control wells contained 1% DMSO. Plates were placed in an Infinite F200 Pro plate reader (Tecan) and background fluorescence (baseline) for each well was bottom read at excitation/ Acknowledgements emission wavelengths: 485/535 nm for approximately 20 s. Then, + m + m 50 mL Stimulus Buffer (c(K )=25 m , c(Tl ) =15 m ) was added A.L. and P.J.B. are recipients of grants DFG LI 765/7-1 and DFG BE to each well and fluorescence intensity was recorded immediately 1287/6-1 by the Deutsche Forschungsgemeinschaft. The supply of every 2.5–3 s continuously for a further 2 min. The recorded data computing resources by the HPC computational center at the were transferred to Microsoft Excel (2013). The ratio readout of maximal fluorescence intensity change of a compound’s concentra- University of Rostock is gratefully acknowledged. We thank Ms. tion at a specific time point was divided by the average of fluores- Anne Schüttler, Ms. Maria Hühr, and Mr. Michael Eccius for excel- cence intensities of baseline (DF/F) and analogous determined lent technical assistance. value for control was subtracted (corr. DF/F). At the chosen specific time point, the sum of DF/F of all concentrations belonging to a dilution series of a compound became maximal. Corr. DF/F values Conflict of interest were plotted versus log(concentration) of a compound, fitted to a four-parameter logistic equation, and EC50 values were calculated The authors declare no conflict of interest. with GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA, USA). Indicated EC50 values are the mean of at least three independent experiments Æ standard deviation (SD). Keywords: flupirtine · KCNQ · KV7 · retigabine · sulfides

Molecular modeling: Molecular modeling studies were performed [1] U. Schwabe, D. Paffrath, W.-D. Ludwig, J. Klauber, Arzneiverordnungs- with the Molecular Operating Environment (MOE) software suite Report 2018, Springer, Heidelberg, 2018. (version 2018.01).[37] The default parameters were used if not ex- [2] a) “Assessment report for flupirtine containing medicinal products”, Eu- plicitly specified. The sequences of the voltage-gated potassium ropean Medicines Agency, document EMA/404308/2013, June 24, 2013: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Referrals_ channels KV7.2 and KV7.3 were taken from the UniProt entries O43526 and O43525. Both were aligned to the K 1.2 template document/Flupirtine-containing_medicines/Recommendation_provid- V ed_by_Pharmacovigilance_Risk_Assessment_Committee/ (PDB ID: 2R9R) in an alternating manner. Only the first 351 resi- WC500146103.pdf (accessed March 19, 2019); b) “Withdrawal of pain dues, containing the membrane-associated S1–S6 subunits, were medicine flupirtine endorsed”, European Medicines Agency, document taken into account. All four pore-forming chains were modeled at EMA/153044/2018, March 23, 2018: http://www.ema.europa.eu/docs/ once to prevent unusual side chain positions. A total of 10 main en_GB/document_library/Press_release/2018/03/WC500246353.pdf (ac- chain models with 10 side chain models each were calculated at a cessed March 19, 2019). temperature of 300 K. The final homology model was protonated [3] F. Klinger, M. Bajric, I. Salzer, M. M. Dorostkar, D. Khan, D. D. Pollak, H. with Protonate3D and energy-optimized. The binding site was de- Kubista, S. Boehm, X. Koenig, Br. J. Pharmacol. 2015, 172, 4946 –4958. fined as all residues within 4.5 of residue W265, which was previ- [4] F. Klinger, P. Geier, M. M. Dorostkar, G. K. Chandaka, A. Yousuf, I. Salzer, ously described as an important residue for the binding of retiga- H. Kubista, S. Boehm, Br. J. Pharmacol. 2012, 166, 1631 –1642. [5] W. Dalby-Brown, H. Hansen, M. Korsgaard, N. Mirza, S.-P. Olesen, Curr. bine. AMBER force-field parameters and AM1-BCC charges were as- Top. Med. Chem. 2006, 6, 999 –1023. signed to all ligands prior to molecular docking. The placement of [6] a) M. A. Überall, G. H. H. Mueller-Schwefe, B. Terhaag, Curr. Med. Res. 30 poses was performed with the Triangle Matcher with London Opin. 2012, 28, 1617 –1634; b) H. Lee, V. de Vito, M. Giorgi, H. Yun, Eur. dG scoring and flexible ligands. All generated binding poses were J. Pharmacol. 2015, 762, 350 –356. refined with an Induced Fit and MM/GBVI scoring. A total of 10 [7] a) T. Zhang, M. S. Todorovic, J. Williamson, J. Kapur, Ann. Clin. Trans. final poses for each ligand were calculated, visually inspected and Neurol. 2017, 4, 888 –896; b) D. Sampath, R. Valdez, A. M. White, Y. H. cross-checked with additional 20 compounds from literature and Raol, Neuropharmacology 2017, 123, 126 –135. patents using the same procedure and the obtained retigabine [8] C. Bock, A. Link, Future Med. Chem. 2019, 11, 337– 355. binding mode as template. The ligands were obtained as follows: [9] E. Scheuch, K. Methling, P. J. Bednarski, S. Oswald, W. Siegmund, J. Pharm. Biomed. Anal. 2015, 102, 377–385. [10] K. Methling, P. Reszka, M. Lalk, O. Vrana, E. Scheuch, W. Siegmund, B. Conformational analysis: Gaussian 09 program package, Revision Terhaag, P. J. Bednarski, Drug Metab. Dispos. 2009, 37, 479– 493. E.01 and Gaussian 16, Revision A.03 were used to perform confor- [11] S. Clark, A. Antell, K. Kaufman, Ther. Adv. Drug Saf. 2015, 6, 15– 19. [38] mational analysis and molecular geometry computations. The [12] M. R. Groseclose, S. Castellino, Chem. Res. Toxicol. 2019, 32, 294 –303. B3LYP hybrid exchange-correlation function along with the Pople’s [13] A. S. Surur, C. Bock, K. Beirow, K. Wurm, L. Schulig, M. K. Kindermann, A. 6-311++G(d,p) or 6-311++G(3df,2p) split-valence basis set was Bodtke, W. Siegmund, P. J. Bednarski, A. Link, Org. Biomol. Chem. 2019, used. The calculations took place at a high level with respect to submitted. the basis set of the ab initio calculation and were accordingly time- [14] S. V. Mathias, B. W. Abou-Khalil, Epilepsy Behav. Case Rep. 2017, 7,61– consuming. The important molecular orbitals of 1, 36 and 47 were 63. [15] C. J. Lemmerhirt, M. Rombach, A. Bodtke, P. J. Bednarski, A. Link, Chem- calculated from their corresponding most stable conformers. The MedChem 2015, 10, 368 –379. B3LYP hybrid exchange-correlation function along with the Pople’s [16] a) C. Bock, K. Beirow, A. S. Surur, L. Schulig, A. Bodtke, P. J. Bednarski, A. 6-311++G(d,p) was employed. For better clarity and comparabili- Link, Org. Biomol. Chem. 2018, 16, 8695– 8699; b) A. S. Surur, K. Beirow, ty, the electron ratios were calculated after assembly of natural C. Bock, L. Schulig, M. K. Kindermann, A. Bodtke, W. Siegmund, P. J. Bed- bonding orbital (NBO) model. In most cases, the standard Hartree– narski, A. Link, ChemistryOpen 2019, 8, 41– 44.

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ChemMedChem 2019, 14,1–14 www.chemmedchem.org 13 2019 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim & These are not the final page numbers! ÞÞ FULL PAPERS

C. Bock, A. S. Surur, K. Beirow, The road to hell is paved with oxida- M. K. Kindermann, L. Schulig, A. Bodtke, tion. Flupirtine may be innocuous by P. J. Bednarski, A. Link* itself, but suffers from oxidative biotransformation into toxic metabolites, && – && leaving its validated target (KV7 chan- Sulfide Analogues of Flupirtine and nels) vastly underexploited. Herein we

Retigabine with Nanomolar KV7.2/ present a library of sulfide analogues of

KV7.3 Channel Opening Activity flupirtine that change the track from toxic quinone imine metabolism in favor of benign sulfoxide formation. The rationale of this approach is supported by structure–activity relationship studies.

& ChemMedChem 2019, 14,1–14 www.chemmedchem.org 14 2019 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ÝÝ These are not the final page numbers! Publikationen

Flupirtine and Retigabine as Templates for Ligand-based Drug Design of KCNQ2/3 activators Abdrrahman S. Surur, Christian Bock, Kristin Beirow, Konrad Wurm, Lukas Schulig, Markus K. Kindermann, Anja Bodtke, Werner Siegmund, Patrick J. Bednarski und Andreas Link Publiziert in der Fachzeitschrift Organic and Biomolecular Chemistry 2019. DOI: 10.1039/c9ob00511k Abdrrahman S. Surur

 Synthese der Verbindungen  analytische Charakterisierung der Substanzen  Erstellen des Manuskripts Christian Bock

 Synthese der Verbindungen  analytische Charakterisierung der Substanzen Kristin Beirow

 Durchführung der biologischen Testungen Konrad Wurm

 Synthese der Verbindungen Lukas Schulig

 Erstellen des QSAR-Modells Markus K. Kindermann

 Berechnung der Geometrie und der HOMOs der Verbindungen Anja Bodtke

 Durchführung der HRMS-Messungen Werner Siegmund

 Finanzierung von Abdrrahman S. Surur Patrick J. Bednarski

 Erstellen des Manuskripts Andreas Link

 Anleitung der Bearbeitung der Fragestellung  Erstellen des Manuskripts

Christian Bock Andreas Link

Organic & Biomolecular Chemistry

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Flupirtine and retigabine as templates for ligand- based drug design of KV7.2/3 activators† Cite this: DOI: 10.1039/c9ob00511k Abdrrahman S. Surur, a Christian Bock,a Kristin Beirow,a Konrad Wurm,a Lukas Schulig, a Markus K. Kindermann,a Werner Siegmund,b Patrick J. Bednarskia and Andreas Link *a

Drug induced liver injury (DILI) and tissue discoloration led to the recent discontinuation of the therapeutic use of the closely related drugs ﬂupirtine and retigabine, respectively. Experience gained with

these drugs strongly suggests that heterotetramer, voltage-gated potassium channels 2 and 3 (KV7.2/3) are valid targets for effective treatment of pain and epilepsy. Because the adverse effects are not related to the mechanism of action, it appears promising to investigate chemical modifications of these clinically validated, drug-like leads. In the present retro-metabolic drug design study, a series of 43 compounds

were synthesized and characterized with regard to KV7.2/3 opening activity and eﬃcacy. The most active

compound 22d displays excellent potency (EC50 = 4 nM) and efficacy (154%) as a KV7.2/3 opener. Limited aqueous solubility hampered toxicity testing at concentrations higher than 63 µM, but this concentration Received 1st March 2019, was nontoxic to two hepatocellular cell lines (HEP-G2 and TAMH) in culture. The slightly less active but Accepted 5th April 2019 more soluble compound 25b (EC50 = 11 nM, efficacy 111%) showed an improved toxicity/activity ratio DOI: 10.1039/c9ob00511k compared to flupirtine by three orders of magnitude and represents an attractive lead structure for the rsc.li/obc development of safer analgesics and antiepileptics.

+ Voltage-gated “M-type” (KCNQ, KV7) K channels are low- identified as a KV7.2/3 opener post hoc (Fig. 1). Moreover, threshold channels that regulate spike-frequency adaptation, recent results indicated 1 as an extremely eﬀective treatment 1,2 bursting, and hyper-excitatory states. KV7 channels are com- option for neonatal seizures in rats and provide the basis for a posed of a homomeric or heteromeric assembly of subunits. possible trial in newborn humans.8 However, rare but severe

Published on 08 April 2019. Downloaded by Universitat Greifswald 4/24/2019 5:12:40 PM. The heterodimer of KV7.2 and KV7.3 is the most abundant and adverse drug reactions, namely drug induced liver injury (DILI) 3 9 a predominant contributor of the so-called M-current (IM). associated with 1 excluded such an investigation. Last year, Recently, attention has been focused on M-channels because the European Medicines Agency (EMA) recommended the neural dysfunction is considered a causative factor in diseases withdrawal of 1 from the market.10 with unmet medical needs including tinnitus, neonatal epi- The precise nature behind the molecular cause of DILI in lepsy and pain. Chronic tinnitus aﬀects 5–15% of the world patients treated with 1 is still unknown, but evidence is mount-

population and channelopathy of KV7.2/3 is considered a main ing that 1 is not a noxious agent as such but can form toxic cause in the development of tinnitus.4 Concerning epilepsy, a metabolites in patients.11 For instance, cysteine- and N-acetyl 25% reduction in Kv7.2/3 appears to shift the neuronal excit- cysteine-conjugates of 1 were identified in human urine (not ability to epileptogenic levels in early infancy.5 An underlying shown), providing evidence for the formation of reactive, elec- feature of neuropathic pain is sustained excitability of nocicep- trophilic intermediates.12 This led to the hypothesis that oxi-

tive sensory fibres, where IM is one of the major factors modify- dation of 1 could result in the formation of highly reactive and ing the tonic excitability of neurons.6,7 thus elusive para-orortho-azaquinone diimines (3a and 4a) Flupirtine (1) is an atypical analgesic that alleviates pain in vivo. Nucleophilic attack of the azaquinone diamine by with a mode of action divergent from NSAIDs and opioids, glutathione followed by the metabolic transformation to cysteine or N-acetyl cysteine conjugates (i.e., mercapturic acids) would explain the presence of these metabolites in the aPharmaceutical and Medicinal Chemistry, Institute of Pharmacy, urine of some patients. In analogy to the notorious University of Greifswald, Friedrich-Ludwig-Jahn-Str. 17, 17487 Greifswald, Germany. N-acetylbenzoquinoneimine (NAPQI) formed after overdosing E-mail: [email protected] b with acetaminophen, the azaquinone diimine metabolites 3a Center of Drug Absorption and Transport (C_DAT) Greifswald, Germany ﬀ †Electronic supplementary information (ESI) available. See DOI: 10.1039/ and 4a may a ect both the pharmacological activity and DILI c9ob00511k associated with the use of 1.

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Paper Organic & Biomolecular Chemistry

which are more difficult to oxidize than flupirtine and retiga- ff 19 bine, are still e ective as KV7.2/3 channel opening agents. In the present work, we have used classical medicinal chemistry strategies like variation of stereo-electronic effects and extension or alteration of substitution patterns to design

new and improved KV7.2/3 channel openers that are more resistant to oxidation than the clinically validated lead structures 1 and 2. It was envisioned that by avoiding an increase in the number of atoms, the desirable biopharmaceutical properties of 1 and 2 such as oral bioavailability could be maintained. Here we describe the synthesis, physicochemical characterization and evaluation as openers of Kv7.2/3 channels of 43 drug-like analogues, some of which show dramatic increases in channel opening potency. A reported relationship between the oxidation potential and activity of flupirtine analogues was reinvestigated, and the factor hydrophobicity was also investigated.

Design cycle one The commencement of the ligand design envisioned easily oxidizable analogues to test the previous hypothesis that oxidiz- Fig. 1 Chemical structures of flupirtine (1), retigabine (2), elusive metabolites (3a–d and 4a–d), dimers (5e–h)of3c,d, and 4c,d, and ability at a lower potential is a requirement for the KV7.2/7.3 20 hypothetical, analogous but improbable dimers (5a–d)of3a,b and 4a,b. channel opening activity of flupirtine and analogues. At the same time, large increases in the lipophilicity of the derivatives were initially regarded as undesirable. Analogues 7a–g were designed in this fashion, and all of them have a different sub- Structural optimization of 1 led to the development of the stituent in place of the 4-fluorobenzyl amino substituent of 1. desazaflupirtine derivative retigabine (2) with improved anti- The synthesis of these compounds is outlined below seizure efficacy in a rat maximal electroshock seizure test, mar- (Scheme 1).

keted as Trobalt®. Retigabine (2) is a unique anti-epileptic due In addition to the anodic peak potentials (Epa) that charac- to the novel mechanism of action, which created optimism to terize the ease of oxidation of analogues 7a–g, lipophilicity was be able to tackle epileptogenesis. In addition, 2 was found also investigated as a critical physicochemical property to prevent the behavioural signs of tinnitus in mice. (Table 1). With the exclusion of 7f, which was more resistant to

Published on 08 April 2019. Downloaded by Universitat Greifswald 4/24/2019 5:12:40 PM. Unfortunately, 2 has been reported to cause bluish pigmenta- oxidation than 1, all other analogues turned out to be oxidiz-

tion of ocular tissues, fingernails, toenails, and skin around able at lower potentials than 1 (Ep.a. = 350 mV). Lipophilicity

the eye and lips. The use of 2 thus came to a halt eight years was assessed as log D7.4 by using a reversed-phase HPLC – after approval.13 16 While the molecular basis of the observed method (see ESI†), which is useful for comparing close struc- bluish pigmentation is not completely understood, a very tural analogues.

recent study revealed a conserved distribution of 2 and dimers The physicochemical parameter log D7.4 was quantified to melanin-containing ocular tissues and proposed these because of its general importance in activity and toxicity. The dimers as causative agents of this adverse eﬀect.17 The oxi- common feature among analogues 7a–g is the exchange of the dation of 2 to quinone diimines 3c and 4c and its N-acetylated aromatic 4-fluorophenyl substituent for less planar, sp3-rich decarbethoxy metabolite to 3d and 4d could be the initial step alicyclic moieties. As planned, analogues 7a–g displayed lower

in a cascade of reactions that proceed only in melanin-contain- log D7.4 values. ing tissues. Analogues 7h–k diﬀer from 1 by variation of the methylamino linker while retaining the rest of the molecular scaﬀold. Because the methylamino group has been thought to be part Results and discussion of the core pharmacophore and thus important for activity, we tested this assumption with molecules 7h–k. The extended Since the metabolic oxidation of both flupirtine and retigabine and shortened analogues, 7h and 7i, were synthesized for this is likely to play a central role in their respective toxicities, we purpose. For the amide and ether analogues 7j and 7k, respect- have been working to identify analogues that lack the capacity ively, additional synthetic steps not described in Scheme 1 of oxidation while maintaining and even improving on the were necessary (for details see Chemical synthesis). 18 KV7.2/3 opening activity. For example, in a previous com- Interestingly, none of the compounds of this design cycle

munication we reported that thioether analogues of flupirtine, exhibited KV7-channel opening activity.

Org. Biomol. Chem. This journal is © The Royal Society of Chemistry 2019 View Article Online

Organic & Biomolecular Chemistry Paper

Scheme 1 Synthesis of analogues 7a–k; (a) aq. NH3 (25%), 2-propanol, 35 °C, 5 days; (b) 6a & 6i: amine reagent, triethylamine, 2-propanol, reﬂux, overnight for 3 days; for 6b–h: amine reagents, triethylamine, 2-propanol, microwave (110–120 °C, 15–30 min); and (c) 7a–j:H2, Pd/C, 2-propanol/

pyridine, rt, 2.5–28.5 h, then triethylamine (only 7h–i), acylating agent, 0 °C – rt, 2–4h;7k: iron powder, NH4Cl, 2-propanol/water, reﬂux, 4 h, then triethylamine, acylating agent, 0 °C – rt, 2 h.

Table 1 Synthesized analogues: anodic peak potential (Epa), potency, eﬃcacy and toxicity

a b ﬃ c c,d e d,e Entry Epa [mV] Log D7.4 EC50 [μM] E cacy [%] LD25 [μM] Tox/Act. LD25 [μM] Tox/Act. 1 350 2.96 0.918 100 103 112 74 81 2 205 2.57 0.147 134 >400 — 269 1,830 7a 286 3.12 >10 — >500 — 172 — 7b 331 1.68 >10 — >500 — >500 — 7c 321 2.02 >10 — >1000 — >1000 — 7d 306 2.80 >10 — 505 330 — 7e 346 1.22 >10 — >1000 — >1000 — 7f 381 1.74 >10 — >1000 — >1000 — 7g 346 1.41 >10 — >1000 — >1000 — 7h 208 3.23 >10 — 134 — 128 — 7i 217 2.80 >10 — 163 — 99 — 7j 467 2.62 >10 — >20 — >20 — 7k 412 3.26 >10 — 117 — >125 — 11a 499 3.21 1.074 118 121 113 198 184 11b 504 n.d. 2.039 124 125 61 139 68 11c 494 3.19 5.688 92 144 25 76 13 11d 238 4.73 >10 — 15 — 123 — 11e 230 3.08 >10 — >40 — >40 — 11f 316 3.76 0.133 129 66 496 60 451 f f f f

Published on 08 April 2019. Downloaded by Universitat Greifswald 4/24/2019 5:12:40 PM. 11g 351 5.36 1.865 121 n.d. n.d. n.d. n.d. 11h 266 3.74 0.109 119 164 1505 94 862 12a 351 2.49 3.26 125 111 34 220 68 12b 386 1.82 >10 — >500 — 144 — 12c 371 3.21 >10 — 147 — 66 — 12d 386 3.21 >10 — 62 — 42 — 12e 366 2.64 12.92 84 500 39 500 39 12f 385 3.44 2.13 75 >16 >16 12g 255 3.62 0.36 134 >31 >31 12h 220 3.30 0.30 116 >63 30 100 12i 281 3.58 0.023 119 68 2,956 55 2391 12j 230 3.71 >10 — >63 — >63 — 12k 220 2.38 >10 — >500 — >500 — 12l 225 3.53 >10 — >16 — >16 — 16a 227 3.30 0.065 104 25 385 45 692 16b 232 3.58 0.0038 115 16 4211 >32 21a 197 3.11 >10 — >125 — >125 — 21b 235 3.98 0.073 155 >125 71 973 22a 206 3.86 >10 — 49 — 45 — 22b 210 3.62 >10 — 56 — >63 — 22c 243 2.80 4.814 81 >125 >125 22d 422 4.32 0.0042 154 9 2,143 51 12 143 22e 316 4.02 0.0037 165 28 7,568 54 14 594 25a 253 4.29 0.026 125 >15 >30 25b 373 3.58 0.0113 111 212 18 761 231 20 442 25c 222 n.d. 5.817 160 >50 >100

a b Determined with 1.0 mM compound in 100 mM TRIS-buﬀer (pH 7.4). EC50 and LD25 are means of 4–5 independent determinations. c d e f Determined using TAMH cells. LD25 divided by EC50. Determined using HEP-G2 cells. Displayed an abnormal hepatotoxicity profile (see the ESI).

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Paper Organic & Biomolecular Chemistry

Design cycle two mation of electrophiles 4a–b, minimizing possible hepato- Primary aromatic amines may aﬀect the activity of a drug toxicity associated with these reactive metabolites. The slightly molecule positively owing to possible hydrogen bonding or diminished in vitro hepatotoxicity of 11a may be explained by – other intermolecular interactions with the active site. The restricting the formation of ortho-quinone diimines 4a b; the stable conformer of 1 generated in silico displays an intra- residual toxicity of 11a could be attributed to the formation of – molecular hydrogen bond between the primary amino group para-quinone diimines 3a b, as this oxidation is not blocked and the carbonyl oxygen, which may be important for sterical by methylation. – pre-organization and binding to the target.19 This idea is sup- In addition to 11a, 2-deamino-2-methyl-flupirtines 11b c ported by a report that the removal of the primary amino also have the amino group replaced by a methyl group but on group from 1 is detrimental to activity.20 On the other hand, top the electronic features of the benzylamine moiety have primary aromatic amines can result in the formation of toxic been modified. In 11b, the 4-fluoro substituent was omitted metabolites such as hydroxyl amines and quinone imines. and replaced with an electron donating methoxy group in 11c. Likewise, a reactive hydroperoxide metabolite of 1 has been Both analogues 11b and c were found to be active but less so reported.21 Therefore, it was important to know if the primary than 11a. To gain further insight into steric factors, analogues – amino groups of 1 and 2 are part of the pharmacophore or 11e h were synthesized. Compound 11d contains a methyl- not. Various strategies can be used to assess the pharmacologi- ated, secondary amino group in position 2. This minimal cal significance of such primary amino groups. Methyl groups extension abolished the activity and increased the hepatotoxic were used to hinder hydrogen bonding by replacing the amino property in TAMH cells, which is in line with the notion that group for this group, which has a similar steric demand but is the formation of quinone diimines is not suppressed by this incapable of hydrogen bonding (11a–11c) (Scheme 2). modification. The loss of activity however was surprising Secondary and tertiary amines (11d and 11h) as well as the because a far greater modification to a tertiary dimethylamino 20 corresponding phenol and methoxy congeners 11e–11g were group reportedly preserved activity. In the case of 11e, the also evaluated. Surprisingly, 11a retained complete activity primary aromatic amino group was exchanged for a phenolic compared to 1 (Table 1) although it was previously known that hydroxyl group. Such a moiety manifests both hydrogen bond omission of a substituent at this position leads to a loss of acceptor and donor characteristics. In contrast to 11a, 11e was activity.20 Thus, replacement strategies seem promising. The found inactive. This observation undermines the idea that methyl substituent is suited to avoid the formation of a hydrogen bonding by the primary amino group of 1 is essen- hydroxyl amine species and could as well hamper the for- tial. Moreover, the inactivity and ease of oxidation of 11e indicated that a low oxidation potential is not predictive of KV7.2/3 opening activity (Fig. 2). Inspection of the cyclovoltammogram of 11e reveals the unique absence of reduction signals in the reverse sweeps (Fig. 2). Keto–enol tautomerization is a likely explanation for this deviation in redox behavior.

Published on 08 April 2019. Downloaded by Universitat Greifswald 4/24/2019 5:12:40 PM. Design cycle three The next strategy was introduction of either smaller or bulkier substituents in lieu of the ethoxycarbonylamino side chain (Fig. 3). A shorter aminomethylcarbonylamino chain in 12b proved detrimental to activity. The introduction of additional phenyl rings in both stereochemically possible orientations (R)- in 12c and (S)- in 12d likewise resulted in a loss of activity. In fact, 12d displayed higher hepatotoxicity than 1. The 4-

Scheme 2 Synthesis of 11a–h; (a) for 5: see Scheme 1; for 8a: methylamine, triethylamine, acetonitrile, 0 °C, 40 min, then rt, 30 min – 3 h; for 8b: 2-propanol, NaH, toluene (anhydrous), argon, 0 °C, then rt, over-

night; (b) 9a: conc. H2SO4, NaNO2 (aq.), stepwise addition; (c) for 10a–d: amine reagents, triethylamine, 2-propanol, microwave (120 °C, 15–30 min); for 10e–f: amine reagent, triethylamine, 2-propanol, reﬂux,

overnight; (d) 10g:K2CO3, dimethylformamide (anhydrous), iodo- methane, rt, 2 h; (e) for 11a–d: Pd/C, H2, 2-propanol, rt, 4 h – overnight, then triethylamine, ethyl chloroformate, rt, 2–5 h; for 11e–f: Pd/C, pyri-

dine, H2, rt, 3.5–22.5 h, then 0 °C, ethyl chloroformate, 2.5–3 h; for 11g: iron powder, NH4Cl, 2-propanol/H2O, reﬂux, 3 h, then triethylamine, ethyl chloroformate, 0 °C, 3 h. Fig. 2 Cyclovoltammograms of 1, 11e and 25b.

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Organic & Biomolecular Chemistry Paper

Fig. 3 The chemical structures of 12a–i.

Scheme 3 Synthesis of 16a–b; (a) 13: 2, phthalic anhydride, toluene, reﬂux, 6 h; (b) 14: hydrobromic acid (32% in acetic acid), rt, 64 h; (c) (amino)benzamido derivative 12e opened KV7.2/3 channels 15a–b: carboxylic acid, HATU; diisopropylethylamine, dimethyl- while showing a low hepatotoxicity profile in TAMH cells. The formamide, rt – 40 °C, 6–18 h; (d) 16a–b: hydrazine hydrate, methanol/ corresponding 4-nitro congener 12f increased the channel 2-propanol, rt, 17 h. opening activity further but also led to increased hepatotoxicity. The urea analogue 12g exhibited a greater than two- fold increase in potency compared to 1 but the liver cell tox- both analogues increase activity by several fold. The 3,5- icity could not be excluded above 31 µM. difluorobenzyl residue in 16b (EC = 3.8 nM) evidently Previous work has shown that remodeling the ethoxy 50 resulted in a surge in activity. The log D of 16a and 16b is residue of 1 with fluoroaromatic substituents can lead to 7.4 3.30 and 3.58, respectively, which indicates that the substitu- increases in activity.22,23 In our case, the 4-fluorophenyl substi- ents did not alter the hydrophobicity of the analogues to a tuent in 12h led to slightly improved activity and hepatotoxic great extent. properties while the 3,5-difluorobenzyl substituent in 12i led

to a clear boost in potency (EC50 = 23 nM). Analogues lacking a carbonyl group in the side chain were Design cycle four synthesized to judge the importance of the carbonyl moiety of 1. This was the case with compound 12j, which was suspected Cysteine- and N-acetylcysteine conjugates of 1 were isolated from human urine, as mentioned earlier.12 The conjugations

Published on 08 April 2019. Downloaded by Universitat Greifswald 4/24/2019 5:12:40 PM. to be responsible for inactivity. This idea is rationalized as the carbonyl oxygen of 2 has been implicated in hydrogen bond formation with the indole NH of Trp265.24 Trp265 is considered crucial as its repositioning completely abolished the activity of 2. Analogue 12k has a cyclic side chain with no hydrogen bond donor and shows no hepatotoxicity up to 500 µM but no activity as well. Therefore, a phenyl ring was annulated in 12l to increase the bulkiness of the dioxopyrroli- dinyl substituent of 12k, anticipating a shift towards activity while preserving the better hepatotoxicity profile. Compound 12l, however, was devoid of activity. The cyclization in 12k–l and the resulting loss of the hydrogen bond donating –NH group may in part be responsible for the inactivity. Lemmerhirt et al. reported a similar loss of activity following a 20 methyl substitution of the ethoxycarbonylamino side chain. Scheme 4 Synthesis of 21a–b; 17: urea-hydrogen peroxide, triﬂuoroa- Thus, the secondary amide group was then preserved in the cetic anhydride, dichloromethane, ice-cold water bath, 30 min, then rt,

rest of the analogues described here. 36 h; (b) 18: phosphorus oxychloride, reﬂux, 5 h; (c) for 19a: aq. NH3 It seemed worthwhile to explore alterations in the ethoxy- (25%), 2-propanol, 35 °C, 5 days; for 19b: amine reagents, triethylamine, carbonylamino side chain of 2 with substituents that have acetonitrile, 0 °C, 40 min, then rt, 3 h; (d) for 20a: amine reagents, triethylamine, dimethyl sulfoxide, microwave (100 °C, 2.5 h); for 20b: already been proven to be beneficial for KV7.2/3 activity. amine reagents, triethylamine, 2-propanol, reﬂux, 24 h; (e) for 21a–b:

Subsequently, 4-fluorophenyl (16a) and 3,5-difluorobenzyl Pd/C, H2, 2-propanol, rt – 40 °C, overnight – 24 h, then triethylamine, (16b) residues were selected (Scheme 3). Compared to 1 or 2, acylating agent, rt, 1 h – until completion.

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Paper Organic & Biomolecular Chemistry

occurred at C-5 of pyridine and 21a was synthesized by intro- increase in hydrophobicity to an acceptable level. Analogue ducing a methyl substituent at the exact position (Scheme 4). 22d has a benzyloxy group at C-2 and a butanamide side A methyl substituent in position C-5 was considered to act chain, which led to a dramatic 200-fold increase in potency as a metabolic blocker to avoid the formation of conjugates with respect to 1. An isopropyoxy substituent led to the even and perhaps indirectly prevent the liver injury caused by 1. more potent analogue 22e. Although both compounds turned However, 21a was found inactive and oﬀers no improvement in out to be more hepatotoxic than 1 in vitro, the increase in tox- toxicity compared to the hepatotoxicity of 1. The primary icity is more than compensated by the superior channel amino group of 21a was exchanged for a morpholine ring, opening activity, yielding better safety indices compared to 1 yielding 21b, which showed very promising biological activity. in Hep-G2 cells. For example, 22d and 22e have safety indices

Analogue 21b (EC50 = 73 nM), together with 11h, demonstrated of 12 143 and 14 594, respectively, versus a ratio of 81 in the a positive impact of a morpholino substituent at position 2 of case of 1 (Table 1). the central ring. Activity favoured substitutions for the ethoxycarbonylamino side chain and the primary amino group were put together in – Design cycle five the design of 25a c (Scheme 5) before the favorable influence of the replacement of 4-fluorobenzyl by a cyclopropyl group The strategy underlying design cycle 5 was to consolidate substi- was unraveled. Analogue 25a was thus equipped with cyclo- tuents that increase in activity into one structure. The ethoxycar- hexylamino and morpholino substituents for the 4-fluoroben- bonylamino side chain of 7a was replaced with the benzyloxycar- zylamino and primary amino groups, respectively. The substi- bonylamino and 3,4-difluorobenzoylamino side chains, respect- tuents intended to, in addition to increase activity, convey ease ively, in the corresponding derivatives 22a and 22b (Fig. 4). Both of oxidation and improve water solubility. As predicted, 25a oxidize at lower CV potentials but exhibit no activity. was exceedingly potent (EC50 = 26 nM). However, the fall in The analogue 22c was synthesized as an analogue of inactive solubility associated with increased lipophilicity (log D7.4 = 22b, whereby the cyclohexylamino moiety was replaced by a 4.29) was a limiting factor for the evaluation of hepatotoxicity smaller cyclopropylamino group. Unpredictably, 22c was the since the highest concentration that could be reached was only first active analogue identified with an alicyclic moiety in place 15 μM. of the 4-fluorobenzylamino substituent. Consequently, doubt The next systematic strategy was to exchange the cyclohexyl- surfaced that the early generalization that the 4-fluorophenyl amino moiety of 25a for still another morpholino ring to and methylamino linkers are mandatory for activity was not correct. On closer inspection, analogue 22c and other active analogues with an alicyclic moiety in place of the 4-fluorobenzyl group of the molecule that have been published, however, need to have in addition an aromatic side chain on the other side of the structure.22,23,25 Thus, a reversal of the binding mode that forces the aromatic side chain into the pocket occupied by the 4-fluorobenzylamino tail of 1 has to be taken into account to Published on 08 April 2019. Downloaded by Universitat Greifswald 4/24/2019 5:12:40 PM. explain the activity of 22c. The inactivity of analogues 7a–g with no aromatic side chain is consistent with this explanation. Analogue 11f displayed a seven-fold increase in potency compared to 1. The methoxy substituent of 11f was swapped for bulky ether moieties with only a subtle aliphatic variation of the ethoxycarbonylamino side chain in order to limit the

Scheme 5 Synthesis of 11h and 25a–c; (a) 23a–b: amine reagents, triethylamine, acetonitrile, 0 °C, 40 min, then rt, 30 min – 3 h; (b) for 24a: amine reagents, triethylamine, 2-propanol, reﬂux, overnight – 24 h; for 24b: amine reagent, triethylamine, dimethyl sulfoxide, microwave

(100 °C, 2 h); (c) 11h & 25a–c: Pd/C, H2, ethyl acetate/2-propanol, rt – 40 °C, overnight, then triethylamine, acylating agent, 0 °C – 40 °C, Fig. 4 The chemical structures of analogues 22a–e. 1–4h.

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Organic & Biomolecular Chemistry Paper

further increase water solubility. Accordingly, the dimorpho- The molecular orbital calculation (Fig. 7) for 25b predicted lino analogue 25b was synthesized, which showed a less lipo- the lone pairs of electrons on the carbonyl oxygen atom as

philic character (log D7.4 = 3.58), better solubility, and the highest occupied molecular orbital (HOMO). This

improved activity (EC50 = 11.3 nM) compared to 25a. Besides indicates that the oxidation of 25b switches the formation of the impressive 80-fold increase in potency compared to 1 metabolites away from reactive intermediates that are toxic to (Fig. 5), 25b also displayed safe hepatoxicity profiles in both liver cells.

TAMH (LD25 = 212 μM) and HEP-G2 (LD25 = 231 μM) cell lines Based on MS data, Groseclose and Castellino proposed a (Fig. 6). Safety indices of 18 761 and 20 442 with the TAMH plausible mechanism for the formation of dimers of 2 by the and HEP-G2 cells, respectively, were calculated for 25b.An reaction of 3c with a second para-quinone-diimine resulting attempt to identify the oxidation products of 25b following from the cleavage of the urethane and acylation of the N atom exposure to two equivalents of m-chloroperbenzoic acid failed, which was unsubstituted in 2 yielding a regioisomer of 5f. The illustrating the desired resistance to oxidation. postulated formation of the analogous regioisomer of 5e from 3c and a second para-quinone-diimine with a carbamate requires that the only primary N atom of 2 would be ethoxycar- bonylated in vivo, and this seems less plausible. Therefore, we suggest the mechanism as shown in Fig. 1, initiated by the attack of para-quinone-diimines 3c and d on the opposite side of the reaction partner in its ortho-quinone diimine forms 4c and d. Subsequent oxidation of the hydrophenazines to phenazinium cations and dealkylation to phenazines has been reported.17 Remarkably, the absence of detectable levels of these dimers in plasma indirectly explains the safe clinical hepatotoxicity profile of 2. A comparable formation of hitherto unknown aza-phenazinium salts in the case of the highly analogous 1 is improbable. An initial attack of 3a–b on nitrogen – Fig. 5 The dose–response curve of the reference ﬂupirtine (1) and 25b. atoms of 4a d would be compulsory for the formation of flupirtine dimers 5a–d but is unlikely. Consequently, metabolism of 1 disallows generation of phenazinium dimers, explaining the absence of tissue discoloration even after prolonged intake of 1. Recently, DILI associated with 1 was reported to involve a class II human leucocyte genotype. It seems possible that polymerization in other tissues to unknown compounds in vivo triggers an immune response that could lead to hepatotoxicity seen in a small number of patients receiving 1 but 26

Published on 08 April 2019. Downloaded by Universitat Greifswald 4/24/2019 5:12:40 PM. none in the case of 2. The balance of lipophilicity, aqueous solubility, biological activity and hepatotoxicity profiles makes 25b the most advanced lead structure analogue of this project. In a continued eﬀort to identify improved substituents for the ethoxycarbonylamino residue, the 3,5-methoxybenzyl group, – Fig. 6 Concentration toxicity curves of 25b in TAMH and HEP-G2 liver reported to improve activity and solubility to a higher extent cell lines after 48 h. than 3,5-difluorobenzyl,27 was identified. The target molecule 25c bearing this 3,5-methoxybenzyl group instead of the 3,5-difluorobenzyl group in 25b, however, showed reduced

channel opening activity (EC50 =5.82μM). A possible explanation was suggested by a conformation analysis of 25b and 25c. The stable conformation calculated for 25b revealed that the 3,5-difluorophenyl ring lies close to the 2-morpholino substituent but its replacement with a bulky 3,5- dimethoxy substituent in 25c forces a shift in the conformation away from the favoured one of 25b,whichmaylead to lower biological activity.

X-ray crystal structures of KV7.2/3 heteromers are not available, yet. Therefore, ligand-based drug design approaches instead of structure-based design were the methods of choice Fig. 7 The highest occupied molecular orbital (HOMO) of 25b. in this study. To design analogues that could fill the empty

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Paper Organic & Biomolecular Chemistry

therapeutic niche effectively, the surrounding of the pharma- chromatography was performed (unless stated otherwise) on a cophore of 1 was partitioned into four major parts: the 4-fluor- glass column using silica gel 60 from Carl Roth with a particle ophenyl tail, the methylamino linker, the primary amine sub- size of 20–45 µm. The flow rate was adjusted to approximately − stituent and the ethyl carbamate side chain. 25 mL min 1 by applying pressure with compressed air. Oxidation potentials of the compounds were obtained by using a 797 VA Computrace device from Metrohm. Working Conclusions electrode: glassy carbon, reference electrode: Ag/AgCl/KCl 3 M, auxiliary electrode: Pt. The compound (10 µmol) was sus- − An important consideration during retro-metabolic drug pended in 10 mL of TRIS buffer (100 mmol L 1, pH 7.4) and design is to consider not only the structure–activity relation- sonicated for 3 min. The mixture was poured into the glass ships that lead to increased pharmacological potency but also sample holder and degassed by nitrogen for 3 min at room structure–metabolism relationships that can affect toxicity. temperature. Starting at −0.5 V the voltage was increased to − The new analogues of flupirtine and retigabine were designed 1.0 V with a speed of 0.1 V s 1, while the current was recorded in five iterative cycles to improve the desired pharmacological in 0.05 V steps. Once 1.0 V was reached, the voltage was activity while reducing adverse effects on liver cells. The inverted until −0.5 V with the same speed to obtain a full present study confirms that the structures of 1 and 2 are cycle. Five of these cycles were recorded but only the first

amendable to such a retro-metabolic drug design approach, sweep was used to determine the anodic peak potential (Epa) which successfully led to dramatic improvements in the as it gave the strongest signal. The consecutive cycles showed desired biological activities. The replacement of the primary lower currents, most likely because of polymerization of the amino group with a morpholino or bulky ether substituents oxidized compounds on the surface of the working electrode. resulted in a dramatic improvement in terms of channel Thus, the graphite surface had to be polished after every opening potencies. Moreover, substituted aromatic groups in measurement with an alumina oxide suspension in water

place of the ethoxycarbonylamino side chain also improved which was distributed on a patch of cloth. The Epa was deter- the activities of analogues. An amide moiety at position 3 of mined automatically with the software 797 VA Computrace the central pyridine was found to be the single most important 1.3.1. structural feature crucial for potent activity. The most active The lipophilicity of the compounds at pH 7.4 was deter- derivatives 16b, 22d and 22e are characterised by nanomolar mined by using a RP-HPLC method. First, a calibration curve

activities (i.e.,EC50 values of ca. 4 nM) and a superior eﬃcacy was established by plotting the log(retention factor) (log k′)of

of 154% (22d) on the Kv7.2/3 channel. Moreover, the slightly several references against their literature log P. With the help less active compound 25b (potency: 11 nM, eﬃcacy: 111%) of the resulting logarithmic equation, the log D7.4 values of our showed an outstanding toxicity/activity index (2 × 104), which compounds could be calculated after determination of their can be rationalized by its resistance to oxidation. This mole- log k′. More details are given in the ESI.† cular feature avoids the formation of quinone diimines that are believed to be the causative agents of fatal liver failure in Chemical synthesis –

Published on 08 April 2019. Downloaded by Universitat Greifswald 4/24/2019 5:12:40 PM. the case of flupirtine, or give rise to dimerization and tissue Analogues 7a g were synthesized by replacing the 4-fluoroben- discoloration in the case of retigabine. zyl side group of 1 with various alicyclic groups. The synthesis was initiated by amination of 2,6-dichloro-3-nitropyridine (Scheme 1). This was followed by coupling of 5 with various Experimental amino reagents to synthesize 6a–g. The intermediates were reduced by using palladium under a hydrogen atmosphere Synthetic procedures, melting points, and NMR and HRMS and then subsequently carbamoylated to yield analogues 7a–g. data are summarized in the ESI.† All commercial reagents and The structural details of all synthesized analogues and solvents were used without further purification. Reaction intermediates, together with synthetic procedures and struc- – control via TLC was performed on silica gel 60 F254 aluminium tural characterization, are provided in the ESI.† Analogues 7h plates from Merck by using UV-light (λ = 254 nm and 366 nm) k have diﬀerent substitution patterns in place of the methyl- for visualization. NMR spectra were recorded with a Bruker amino linker of 1. Among those analogues, slight modifi- Avance III instrument at 400 MHz (1H-NMR) and 101 MHz cations of Scheme 1 were implemented to synthesize 7j–k. The (13C-NMR), respectively. The samples were measured in DMSO- synthesis of 7j required a further amination of the 6-chloro

d6 solution (unless stated otherwise) with tetramethylsilane as moiety of intermediate 5 and the resulting compound was an internal standard at 25 °C. HRMS spectra were obtained coupled with 4-fluorobenzoyl chloride, reduced and carbamoy- with an LCMS-IT-TOF (Shimadzu) by using electrospray ioniza- lated to yield 7j. The synthesis of 7k, on the other hand, tion. IR spectra were recorded on a Bruker optics Alpha FT-IR encompasses a pre-reduction of 4-fluorobenzaldehyde to spectrometer equipped with a diamond single ATR probehead. 4-benzyl alcohol, which is then coupled with 5. Melting points were measured automatically with a Melting In design cycle two, substitution or replacement of the Point M-565 (Büchi). The purity of compounds was determined primary amine of 1 was employed to synthesize analogues by HPLC with DAD detection (100% method at 220 nm). Flash 11a–h. The synthesis started with the treatment of 2,6-

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dichloro-3-nitropyridine with diﬀerent amino or alcoholic medium with non-essential amino acids (MEM) (Thermo reagents (Scheme 2). Following the substitution of the 2-chloro Fisher Scientific), supplemented with 10% heat-inactivated moiety, a 4-fluorobenzyl group was coupled on the other end fetal bovine serum (FBS) (Sigma Aldrich), 2 mM L-glutamine − of the pyridine. (Sigma Aldrich), 4 μgmL 1 blasticidin S-HCl (Merck), 1% peni- Analogues 12a–l in design cycle three have diﬀerent groups cillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific) and 0.78 mg − in place of the ethoxycarbonylamino side chain of 1 and were mL 1 G418 sulfate (Carl Roth). All cell lines were incubated at

synthesized by varying the acylating agents at the end of the 37 °C in a humidified incubator with 95% air/5% CO2. sequence outlined in Scheme 1. Among 12a–l, pretreatments were necessary to protect the amino group in analogues MTT cell viability assay 12b–d. The amino group of the starting amino acids was pro- TAMH cells detached from the flask when ∼90% confluent tected using phthalic anhydride, followed by the conversion of with trypsin-EDTA (Sigma Aldrich), suspended in the presence − the carboxylic acid to acyl chloride using thionyl chloride. A of 0.25 mg mL 1 soybean trypsin inhibitor (Sigma Aldrich) in deprotection after the final acylation procedure yielded ana- DMEM/F12. After centrifugation, the cell pellet was resus- logues 12b–d. In addition, analogues 12k–l required an pended in DMEM/F12 media. Cells were counted with an additional step following the final acylation step shown in EVE™ Automated Cell Counter (NanoEnTek, S. Korea) and Scheme 1; an eventual treatment with sulfuric acid was necess- 20 000 cells per well per 200 μL DMEM/F12 media were seeded ary to effect ring closure. into 96 well plates (Sarstedt). The plates were incubated until Varying the ethoxycarbonylamino side chain was also cells became confluent (approximately 48 h after seeding). extended to lead 2 (Scheme 3). Retigabine (2) was the starting The HEP-G2 cells were detached from the flask using material for the preparation of 16a–b. Initially, the primary trypsin-EDTA (Sigma Aldrich) when ∼70% confluent and sus- amino group was protected using phthalic anhydride. The pended in RPMI 1640. Cells were counted with an EVE™ ethyl carbamate was then cleaved using hydrobromic acid, Automated Cell Counter and 15 000 cells per well per 100 µL which was trailed by the coupling of fluoro-substituted aro- RPMI 1640 medium were seeded into 96 well plates (Sarstedt). matic groups and removal of the protecting group. The cells were allowed to attach for 24 h in a humidified incu- In design cycle four, analogues 21a–b were synthesized as bator at 37 °C. the 5-methyl substituted analogues of 1 following the path out- In triplicate, the medium was removed in both cell lines lined in Scheme 4. Additional synthetic procedures – oxidation and replaced by 200 μL per well of respective media containing of the pyridine nucleus and subsequent chlorination using a serial dilution series of test compounds (5–9 concentrations) phosphorus oxychloride – were essential before starting the prepared in DMSO (BioScience-grade) (Carl Roth). The back- amination of the pyridine ring. ground signal was determined using controls with 1% DMSO Compounds 22a–e are analogues of 1 with at least two and wells lacking cells. Untreated wells containing cells and different substitutions in place of the primary aromatic amino 1% DMSO in the respective media were used as controls. group, ethoxycarbonylamino side chain or the 4-fluorobenzyl Following 24 h exposure to the test compounds, the medium tail. The general Scheme 1 was followed for the synthesis of was aspirated off, and 125 μL of the respective medium, sup- −1

Published on 08 April 2019. Downloaded by Universitat Greifswald 4/24/2019 5:12:40 PM. these analogues with the exception that the primary amino plemented with 20% (V/V) of 2.5 mg mL solution of 3-(4,5-di- group was not fully preserved. Moreover, analogues 25a–c methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) underwent simultaneous modifications of the primary amino (Alfa Aesar) in phosphate buﬀered saline (PBS), was added to group, the 4-fluorobenzyl amino group and the ethoxycarbony- the wells and the plates were incubated for 2.5–4 h in a lamino side chain and were synthesized as per Scheme 5. humidified incubator at 37 °C. Supernatant was aspirated oﬀ and crystals were dissolved in DMSO. The absorbance was Biological evaluations measured at λ = 570 nm with a SpectraMax 190 microplate

Cell culture. The TAMH cells were a gift of Dr Sidney reader (Molecular Devices). Cell viability (T/Ccorr) was obtained D. Nelson (University of Washington, Seattle, USA) and cul- by dividing the absorbance values for each treatment con- tured in T75 flasks with Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/ dition through that measured for control wells expressed in % Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 1 : 1 mix) (PAN Biotech), (both corrected for background without cells).

supplemented with 5% PANEXIN NTA (PAN Biotech), 10 mM The LD25 is the estimated concentration that reduces the T/ −1 nicotinamide (Sigma Aldrich) and 10 μgmL gentamicin Ccorr to 75% and was determined by plotting the (log)concen- sulfate (PAN Biotech). The HEP-G2 cells were purchased tration of the test compound versus T/Ccorr and performing from the Leibniz-Institute-Deutsche Sammlung von linear regression analysis in Microsoft Excel (2013). The deter- Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, mined values are the mean of at least three independent Germany) and were cultured in a T75 flask (Sarstedt) with experiments ± standard deviation (SD). RPMI 1640 (PAN Biotech), supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) (Sigma Aldrich) and 1% penicil- KV7.2/3 channel opening assay

lin/streptomycin (PANBiotech). The KV7.2/3 transformed HEK293 cells were detached from the flask using TrypLE HEK293 cells were obtained from SB Drug Discovery (Glasgow, Express (Thermo Fisher Scientific) when ∼80% confluent and UK) and cultured in a T75 flask with minimum essential suspended in MEM. After centrifugation the cell pellet was

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resuspended in MEM. Cells were counted with an EVE™ wish to acknowledge the excellent technical assistance of Anne Automated Cell Counter and 60 000 cells per well per 100 μL Schüttler, Maria Hühr and Michael Eccius. MEM were seeded into black walled 96 well plates with a clear bottom (4titude). Cells were allowed to attach for 24 h in a humidified incu- References bator at 37 °C, forming a near confluent monolayer. A FLIPR® Potassium Assay Kit (Molecular Devices, USA) was used to 1 D. A. Brown and G. M. Passmore, Br. J. Pharmacol., 2009, – determine the KV7.2/3 channel opening activity of test com- 156, 1185 1195. pounds according to manufacturer’s instructions. Briefly, an 2 P. Delmas and D. A. Brown, Nat. Rev. Neurosci., 2005, 6, equal amount of loading buﬀer containing 5 mM probenecid 850–862. (Santa Cruz Biotechnology, USA) (pH 7.4) was added to wells 3A.P.Stewart,J.C.Gómez-Posada,J.McGeorge, and incubated for 1 h at room temperature in the dark. M. J. Rouhani, A. Villarroel, R. D. Murrell-Lagnado and Serial dilution series of test compounds (5–9 concentrations) J. M. Edwardson, J. Biol. Chem., 2012, 287, 11870–11877. were prepared in DMSO (BioScience-grade) (Carl Roth, 4 S. Li, V. Choi and T. Tzounopoulos, Proc. Natl. Acad. Germany) and incubated with cells for another 30 min at Sci. U. S. A., 2013, 110, 9980–9985. room temperature in the dark. Control wells contained 1% 5 M. A. Rogawski, Trends Neurosci., 2000, 23, 393–398. DMSO. Plates were placed in an Infinite® F200 Pro plate 6 K. Rose, L. Ooi, C. Dalle, B. Robertson, I. C. Wood and reader (Tecan, Switzerland) and the background fluorescence N. Gamper, Pain, 2011, 152, 742–754. (baseline) for each well was bottom read at the excitation/ 7 E. Cisneros, C. Roza, N. Jackson and J. A. López-García, emission wavelength: 485 nm/535 nm for approximately 20 s. Front. Cell. Neurosci., 2015, 9, 470. Then, 50 μLStimulusBuﬀer (c(K+)=25mM,c(Tl+)=15mM) 8 D. Sampath, R. Valdez, A. M. White and Y. H. Raol, was added to each well and the fluorescence intensity was Neuropharmacology, 2017, 123, 126–135. recorded immediately every 2.5–3 s continuously for a 9 European Medicines Agency, Assessment report for flupir- further 2 min. tine containing medicinal products, 2013. The recorded data were transferred to Microsoft Excel (2013). 10 European Medicines Agency, Withdrawal of pain medicine Theratioreadoutofthemaximalfluorescenceintensitychange flupirtine endorsed, 2018. Press release 23/03/2018, down- of a compound’s concentration at a specific time point was loaded 01/03/2019 from https://www.ema.europa.eu/en/ divided through the average of fluorescence intensities of the news/withdrawal-pain-medicine-flupirtine-endorsed. baseline (ΔF/F) and an analogously determined value for the 11 C. Bock and A. Link, Future Med. Chem., 2019, 11, 337– control was subtracted (corr. ΔF/F). At the chosen specific time 355. point the sum of ΔF/F of all concentrations belonging to a 12 E. Scheuch, K. Methling, P. J. Bednarski, S. Oswald and dilution series of a compound became maximal. Corr. ΔF/F W. Siegmund, J. Pharm. Biomed. Anal., 2015, 102, 377–385. values were plotted versus log(concentration) of a compound, 13 Y. Ihara, Y. Tomonoh, M. Deshimaru, B. Zhang, T. Uchida,

fitted to a four parameter logistic equation and EC50 values were A. Ishii and S. Hirose, PLoS One, 2016, 11, e0150095.

Published on 08 April 2019. Downloaded by Universitat Greifswald 4/24/2019 5:12:40 PM. calculated according to the software GraphPad Prism 6 (La Jolla, 14 M. J. Gunthorpe, C. H. Large and R. Sankar, Epilepsia,

California, USA). The indicated EC50 values are the mean of at 2012, 53, 412–424. least three independent experiments ± standard deviation (SD). 15 S. V. Mathias and B. W. Abou-Khalil, Epilepsy Behav. Case – The Emax value indicates the intrinsic activity of a com- Rep., 2017, 7,61 63. pound relative to flupirtine. It was determined by calculating 16 S. Jankovic and I. Ilickovic, Expert Opin. Drug Discovery, the diﬀerence of the lowest and highest corr. ΔF/F values of an 2013, 8, 1429–1437. obtained sigmoidal curve of a compound when corr. ΔF/F 17 M. R. Groseclose and S. Castellino, Chem. Res. Toxicol., values were plotted versus log(concentration) and related to the 2019, 53, 294–303.

Emax of flupirtine maleate that was defined as 100%. The Emax 18 C. Bock, K. Beirow, A. S. Surur, L. Schulig, A. Bodtke, value of a compound is the mean of at least three independent P. J. Bednarski and A. Link, Org. Biomol. Chem., 2018, 16, experiments ± standard deviation (SD). 8695–8699. 19 A. S. Surur, K. Beirow, C. Bock, L. Schulig, M. K. Kindermann, A. Bodtke, W. Siegmund, Conﬂicts of interest P. J. Bednarski and A. Link, ChemistryOpen, 2019, 8,41–44. 20 C. J. Lemmerhirt, M. Rombach, A. Bodtke, P. J. Bednarski There are no conflicts to declare. and A. Link, ChemMedChem, 2015, 10, 368–379. 21 K. Methling, P. Reszka, M. Lalk, O. Vrana, E. Scheuch, W. Siegmund, B. Terhaag and P. J. Bednarski, Drug Metab. Acknowledgements Dispos., 2009, 37, 479–493. 22 C. Jessen, W. Dalby-Brown and D. Strøbæk, AL and PJB are recipients of grants DFG LI 765/7-1 and DFG Tetrahydropyran-aminopyridine derivatives and their BE 1287/6-1 by the Deutsche Forschungsgemeinschaft. We medical use, WO 2010/026104A1, 2010.

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23 W. Dalby-Brown, C. Jessen and D. Strøbæk, Substituted pyr- 26 P. Nicoletti, A. N. Werk, A. Sawle, Y. Shen, T. J. Urban, idine derivatives and their medical use, WO 2010/094644 S. A. Coulthard, E. S. Bjornsson, I. Cascorbi, A. Floratos, A1, 2010. T. Stammschulte, U. Gundert-Remy, M. R. Nelson, 24 R. Y. Kim, M. C. Yau, J. D. Galpin, G. Seebohm, C. A. Ahern, G. P. Aithal and A. K. Daly, Pharmacogenet. Genomics, 2016, S. A. Pless and H. T. Kurata, Nat. Commun., 2015, 6, 8116. 26, 218–224. 25 W. Dalby-Brown, C. Jessen and D. Strøbæk, Substituted pyr- 27 C. Bock, A. S. Surur, K. Beirow, M. K. Kindermann, idine derivatives and their medical use, WO 2010/094645 L. Schulig, A. Bodtke, P. J. Bednarski and A. Link, A1, 2010. ChemMedChem, 2019, DOI: 10.1002/cmdc.201900112. Published on 08 April 2019. Downloaded by Universitat Greifswald 4/24/2019 5:12:40 PM.

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Simultaneous quantification of acidic and basic flupirtine metabolites by supercritical fluid chromatography according to European Medicines Agency validation Robert K. Hofstetter, Mahmoud Hasan, Georg M. Fassauer, Christian Bock, Abdrrahman S. Surur, Steven Behnisch, Christoph W.Grathwol, Felix Potlitz, Tobias Oergel, Werner Siegmund und Andreas Link Publiziert in der Fachzeitschrift Journal of Chromatography A (accepted manuscript). DOI: 10.1016/j.chroma.2019.04.067

Beiträge der Autoren Robert K. Hofstetter

 Entwickelung und Validierung der Methode  Synthese der Standards  Erstellen des Manuskripts Mahmoud Hasan

 Mithilfe bei der Durchführung der Studie Georg M. Fassauer

 Mithilfe bei der Diskussion des Manuskripts Christian Bock

 Synthese der internen Standards Abdrrahman S. Surur

 Synthese der internen Standards Steven Behnisch

 Mithilfe bei der statistischen Auswertung Christoph W. Grathwol

 Mithilfe bei der Synthese der Metaboliten Felix Potlitz

 Mithilfe bei der Entwicklung und Validierung der Methode Tobias Oergel

 Mithilfe bei der Durchführung der Studie Werner Siegmund

 Durchführung der Studie

Publikationen

Andreas Link

 Anleitung der Bearbeitung der Fragestellung  Erstellen des Manuskripts

Christian Bock Andreas Link

Journal of Chromatography A xxx (xxxx) xxx-xxx

Contents lists available at ScienceDirect Journal of Chromatography A

journal homepage: www.elsevier.com

Simultaneous quantification of acidic and basic flupirtine metabolites by supercritical fluid chromatography according to European Medicines Agency validation Robert K. Hofstetter a, Mahmoud Hasan b, Georg M. Fassauer a, Christian Bock a, Abdrrahman S. Surur a, Steven Behnisch a, Christoph W. Grathwol a, Felix Potlitz a, Tobias Oergel a, Werner Siegmund b, Andreas Link a, ⁎ a Institute of Pharmacy, Pharmaceutical and Medicinal Chemistry, University of Greifswald, Greifswald, Germany b Department of Clinical Pharmacology, Center of Drug Absorption and Transport (C_DAT), University of Greifswald, Greifswald, Germany

ARTICLE INFO ABSTRACT

Article history: Supercritical fluid chromatography (SFC) holds the potential to become an orthogonal method to HPLC/UH- Received 22 February 2019 PLC in xenobiotic metabolism studies, due to its outstanding capacity to simultaneously separate highly simi- Received in revised form 15 April 2019 lar (as HPLC) and physicochemically different analytes (problematic using HPLC). Paucity of guideline-con- Accepted 24 April 2019 form validation, however, has been a major obstacle to clinical application of SFC, even in cases where bio- Available online xxx transformation yields chemically dissimilar metabolites that require more than one HPLC method for comprehensive analysis. Here, a method based on supercritical fluid chromatography coupled to single quadru- Keywords: pole MS detection was developed to simultaneously quantify the divisive analgesic flupirtine and its acidic Supercritical fluid chromatography and basic metabolites, represented by 4-fluorohippuric acid (4-FHA) and the active metabolite D-13223 re- Validation spectively, using custom-made synthetic internal standards. Experimental data on the fundamental retention Flupirtine mechanisms under supercritical conditions, indicating the importance of halogen and π-π-bonding for specific Metabolism retention on polysaccharide-based stationary-phases, is discussed. Compared to previous HPLC methods, the Halogen bonds Green chemistry novel method offers higher versatility in terms of the target metabolite range (addressing both acidic and basic metabolites within a singular method), faster analysis (7.5 min), and compliance with green chemistry principles. Validation was performed according to EMA criteria on bioanalytical method validation, demonstrating selectivity, carry-over, calibration curve parameters (LLOQ, range, and linearity), within- and between-run accuracy and precision, dilution integrity, matrix effect and stability. For proof-of-concept, the SFC method was applied to clinical samples of human urine obtained after single intravenous (100 mg), single oral (100 mg), and repeated oral administration (400 mg). Flupirtine, D-13223, and 4-FHA could be quantified, shedding light on the extent of oxidative flupirtine metabolism in humans in the context of the unresolved biotoxification that has led to the withdrawal of specific neuronal KV7 openers. © 2019.

1. Introduction cal carbon dioxide (scCO2) and conventional solvents (polar modifiers such as methanol, acetonitrile, or even water [2]) may make SFC cou- Counterintuitively, simultaneous quantification of lipophilic pre- pled to UV or MS detection [3,4] a fast, green, and orthogonal addi- cursor drug substances and their hydrophilic metabolites can be chal- tion to the armory of separation techniques in xenobiotic metabolism lenging, even though separation of dissimilar analytes appears studies and even targeted metabolomics [5] that may be of particu- straightforward. The reason being that analyte polarity range in HPLC, lar use for spanning more than one HPLC elution mode: Taguchi et the most commonly employed chromatographic method in metabo- al. demonstrated the utility of SFC in cases of extreme polarity dif- lism studies, is limited by mutually incompatible elution modes de- ferences, separating 17 fat-/water-soluble vitamins (logP-range from fined by the choice of mobile and stationary phase, e.g. reversed-phase −2.11 to 10.12) within as little as 4 min [6]. In comparison, Lämmer- (RP), normal-phase (NP), hydrophilic interaction chromatography hofer et al. approached a similar mixture of vitamins by developing an (HILIC), ion-exchange chromatography (IEC). Although RP spans equally versatile but 2D HPLC method (HILIC × RP) [7]. Sen et al. the widest polarity range among HPLC elution modes, simultane- extended the application range of SFC further into domains tradition- ously addressing polar analytes may require sophisticated 2D tech- ally reserved for HILIC when phenotyping metabolites as hydrophilic niques or the transition from one elution mode to another (along as logP = −7 [8] with time-consuming equilibration periods) in order to prevent the However, robust SFC instrumentation containing cooled pump risk of methodology-related blind spotsUNCORRECTED [1]. Miscibility of supercriti heads and electronically controlled PROOF back pressure regulators (BPR) has been realized only recently [9]. Thus, even though chiral and preparative SFC applications in the pharmaceutical and biomedical sector [10–13] have raised academic and industrial awareness [14], ⁎ Corresponding author at: Pharmaceutical and Medicinal Chemistry, Institute of Pharmacy, Friedrich-Ludwig-Jahn-Str. 17, D-17489 Greifswald, Germany. the number of comprehensively validated methods is still far from Email address: [email protected] (A. Link) https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.04.067 0021-9673/ © 2019. 2 Journal of Chromatography A xxx (xxxx) xxx-xxx

Table 1 Analytes included in the study and their MS-properties, pKa values and chemical structure. Hydrolysis of flupirtine followed by N-acetylation yields the active metabolite D-13223 (quantified here using the synthetic analogue AS77 as internal standard), whereas oxidative degradation produces 4-fluorohippuric acid (4-FHA), quantified using the difluorinated analogue 3,4-difluorohippuric acid (3,4-FHA).

Analyte Structure

flupirtine a pKa: 7.50 M: 304.13 g/mol m/z: 305 (+) IS-group: 1

D-13223 a pKa: 7.59 M: 274.12 g/mol m/z: 275 (+) IS-group: 1

AS77 a pKa: 7.87 M: 318.15 g/mol m/z: 319 (+) IS of group 1

UNCORRECTED PROOF Journal of Chromatography A xxx (xxxx) xxx-xxx 3

Table 1 (Continued)

Analyte Structure

4-fluorohippuric acid (4-FHA) pKa: 3,17 M: 195.05 g/mol m/z: 194 (-) IS-group: 2

3,4-difluorohippuric acid (3,4-FHA) pKa: 2.85 M: 215.04 g/mol m/z: 214 (-) IS of group 2

HPLC, leaving behind doubts regarding practical applicability and ro- sponding acid) = 7.59) from human urine. Synthetic access to methy- bustness of modern SFC [15]. We seek to address the gap between lated flupirtine (AS77) and difluorinated hippuric acid (3,4-FHA) of- SFC’s claims and perceived utility by developing, validating and clin- fers an alternative to deuterated standards. Method development gives ically applying a quantitative bioanalytical method for the analgesic detailed information on the influences of stationary phase materials, flupirtine. mobile phase composition, column temperature, and injection solvent. The triaminopyridine carbamate flupirtine is substrate to esterases, Validation is performed according to the guideline on bioanalytical N-acetyltransferases (NAT), glucuronosyltransferases (UGT), glu- method validation laid out by the European Medicines Agency (EMA) tathione S-transferases (GST), cytochromal oxidation (CYP450), and [24]. For proof-of-concept, the novel method was applied to clinical glycine N-acyltransferases (GLYAT) [16]. Although the utility of SFC samples obtained from a pharmacokinetic study in healthy volunteers. in regards to logD range has been qualitatively demonstrated [6,8], In the context of epidemic opioid abuse [25] and chronic un- quantitative aspects have not been addressed, nor did previous reports der-treatment of pain [26], KV7-modulators such as flupirtine are focus on analyte pKa-range, a crucial parameter in determining ionic attractive alternatives to non-steroidal anti-inflammatory drugs interactions with the stationary phase [17]. Previous in vivo studies (NSAIDs) since they are not limited by respiratory depression or of flupirtine metabolism utilized RP-HPLC coupled with fluorescence gastrointestinal bleeding [27,28]. However, unresolved flupirtine in- [18] or tandem mass (MS/MS) detection [19–21] and targeted analytes duced liver injury (FILI) due to an as of yet elusive metabolite has retaining flupirtine’s basic triaminopyridine-moiety such as the active resulted in EMA’s recommendation to withdraw flupirtine, despite metabolite D-13223. To the best of our knowledge, reports of acidic excellent tolerance in short-term use [29] and mounting evidence metabolites in humans required separate analytical methods (for mer- of additional benefits in fields with unmet therapeutic needs such capturic acid derivatives M-424 and M-466) [16,22] or entailed ra- as memory impairment, tinnitus, Creutzfeldt-Jakob disease, brain is- dioactive labelling (inclusion of 4-fluorohippuric acid, 4-FHA) [23]. chemia, cocaine dependency, and epilepsy [30]. This has given rise to Herein we report the developmentUNCORRECTED of a versatile, time-saving and a rich body of synthetically modified PROOF analogues of flupirtine, aimed eco-friendly method based on SFC-MS capable of simultaneously at retaining efficacy while avoiding toxicity [31–36]. In the absence quantifying flupirtine along with acidic (represented by 4-FHA; of a more thorough understanding of the biotoxification of flupir- pKa = 3.17) and basic biotransformation products (D-13223; pKa (cor- tine, these efforts remain empirical until suitable analytical tools pro- re vide the theoretical frame 4 Journal of Chromatography A xxx (xxxx) xxx-xxx

Fig. 1. A) Dosage and administration route of flupirtine in the clinical study providing the urine samples that served as proof-of-concept for the novel SFC-MS-quantification method. The study consisted of low-dose single-application, either orally (immediately releasing Katadolon® IR) or intravenously (Katadolon® inject), and multiple dose oral application of Katadolon® long (consisting of IR extended release (ER) flupirtine). Colored bars indicate the ratio of flupirtine (magenta), D-13223 (orange) and 4-FHA (green) excreted renally over three days after single-dose administration and two days after final dose of multiple-administration. B) Stationary phases for column screening were 1) C18-RP (XTerra and Gemini-C18), 2) ether-linked phenyl phase (Synergi Polar-RP), 3) L20 USP dihydroxypropane (Lichrosorb Diol), 4) amino-end-capped silica (Luna NH2) and 5) polysaccharide-based phase (Lux Amylose-2). C) Empirical effects of changes in mobile phase composition on elution. Methanol (left) showed higher elution power than 2-propanol (right). Whereas the effects of pH-modifying additives were reconcilable with NP-behavior in 2-propanol (charge-dependent retention of acidic analytes), elution by methanol is suggestive of more complex retention mechanisms. Ammonia in methanol offered the shortest run times, while the same additive in 2-propanol yielded the highest resolution and reversal of elution order. Total flow: 3 mL/min; modifier gradient: 0–1 min (5%), 1–7 min (30%), 7–25 min (30%), 25–27 min (5%), 27–30 min (5%). work for rational drug-design [37]. Additionally, a deeper understand- lators (BPR), a SIL-30AC autosampler, a CTO-20AC column oven, ing of individual metabolic profiles could be used to develop a policy a DGU-20A5R degasser and a CBM-20 A communication module. for patient stratification that prevents flupirtine administration to indi- Columns (Synergi Polar-RP, Luna NH2, and Lux Amylose-2) were viduals predisposed to FILI. Thus, after more than 30 years of clini- purchased from Phenomenex (Aschaffenburg, Germany; cal use and shortly after its withdrawal, flupirtine metabolism studies 150 × 4.6 mm, 5 µm), except for Gemini C18 and Lichrosorb Diol have re-gained their momentum [21,38,39]. (VWR, Karlsruhe, Germany; 100 × 4.6 mm, 5 µm) and XTerra MS C18 (Waters, Milford, MA; 100 × 2.1 mm, 3.5 µm). The chromatography system was directly coupled to a Shimadzu LCMS-2020 sin- 2. Material and methods gle quadrupole mass spectrometer controlled by LabSolutions Version 5.82 software. Chemicalize was used for calculation of pKa [40]. 2.1. Chemicals 2.3. Chromatographic and mass spectrometry conditions Carbon dioxide was purchased in 99.995% purity from Air Liquide

(Düsseldorf, Germany). Methanol (Carl Roth, Karlsruhe, Germany), Separations were carried out using mixtures of scCO2 and a mod- 2-propanol and acetonitrile (VWR, Karlsruhe, Germany), formic acid ifier (methanol or 2-propanol), either pure or containing an additive (Fisher Scientific, Geel, Belgium) and 25% aqueous ammonia (ammonia or formic acid). Scouting runs were performed on six sta- (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) was obtained in LC–MS grade tionary phases comprising RP, hybrid and NP materials. Oven temper- purity. Flupirtine and D-13223 were provided by AWD.pharma (Dres- ature was investigated in 5 °C increments between 30 and 50 °C. den, Germany); all other analytes, i.e. 4-fluorohippuric acid (4-FHA), The final method utilized a lux amylose-2 stationary phase methylated flupirtine (AS77) and 3,4-difluorohippuric acid (150 × 4.6 mm, 5 µm) protected by a guard cartridge equipped with (3,4-FHA), were prepared according to supplementary material and the same material (4 × 3.0 mm) and heated to 40 °C. The mobile phase their identity verified by HRMS and NMR (S1: Synthesis). Stock and consisted of (A) scCO2 and (B) pH-adjusted modifier (0.075% am- working solutions were prepared weekly in MS-grade methanol and monia and 0.225% water in methanol). Total-flow was set to 4 mL/ stored at −20 °C and 4 °C, respectively. min, operating in gradient-mode: 0–6 min (5–25% B; ‘separation’), 6.01–6.5 min (25% B; ‘wash’), 6.51–7 min (25–5% B; ‘return to start- 2.2. Analytical instruments UNCORRECTEDing conditions’), 7.01–7.5 (5% B; ‘equilibration PROOF’). Pre- and post-column BPRs were set to 400 bar and 150 bar, respectively. A contin- Data acquisition was realized using a Nexera SFC/UHPLC switch- uous ESI spray was realized by supplying 0.1 mL/min of make-up ing system (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) consisting of one (methanol). Both injection volume and needle wash solvent LC-30ADSF pump for liquid CO2, two LC-20ADXR pumps for de- (methanol) were set to 5 µL. Optimization of mass spectrometry con- livering modifier/make-up, two SFC-30 A back pressure regu ditions yielded an interface voltage of 4.5 kV, with nitrogen as nebulizing (1.5 L/min) and Table 2 Results of column screening regarding retention time (Rt), retention factor (k) and symmetry factor (As) of flupirtine and its metabolites in SFC. A general increase in retention can be seen with increasing polarity of stationary phases, except for the polysaccharide-based material (Lux), which showed reasonable retention and peak shapes for all metabolites.

Analyte Parameter Column

XTerra* Gemini Synergi Diol Luna Lux

flupirtine Rt (min) 0.29 0.70 2.58 2.91 5.00 4.88 k 0.31 0.86 3.41 7.01 7.22 8.52 As 1.53 1.35 1.17 5.55 0.79 1.14 D-13223 Rt (min) 0.33 0.89 3.54 3.98 7.13 5.06 k 0.48 1.37 5.04 9.97 10.72 8.88 As 1.78 1.46 1.22 3.71 0.89 1.14 AS77 Rt (min) 0.26 0.62 2.17 2.00 3.47 3.95 k 0.15 0.66 2.70 4.50 4.71 6.71 As 1.38 1.30 1.12 1.53 0.91 1.38 4-FHA Rt (min) 0.54 2.22 2.91 4.73 30.04 4.03 k 1.42 4.92 3.97 12.04 48.40 6.87 As 2.40 2.25 2.35 0.92 1.70 1.39 3,4-FHA Rt (min) 0.51 2.34 2.75 4.57 28.89 3.84 k 1.28 5.25 3.68 11.59 46.52 6.51 As 2.61 2.23 2.14 0.86 1.04 1.38 Trend Retention-times

Chromatographic conditions as described in 2.3. * In case of XTerra, flow-rate was limited to 2 mL/min due to its reduced inner diameter. UNCORRECTED PROOF 6 Journal of Chromatography A xxx (xxxx) xxx-xxx

2.4. Sample preparation

Urine (200 µL) was spiked with 10 µL of internal standard solution (20 µg/mL of each AS77 and 4-FHA in methanol; final concentration 0.95 µg/mL) and vortexed for 10 s. Macromolecular matrix components were precipitated by addition of 800 µL of ice-cold acetonitrile and further vortexing for 1 min. After centrifugation for 15 min at 3200×g, the supernatant was used for analysis.

2.5. Validation parameters

Validation was performed according to EMEA/CHMP/EWP/ 192217/2009, the European Medicines Agency’s (EMA) guideline on bioanalytical method validation [24]. This guideline covers selectiv- Fig. 2. Impact of column temperature on retention times of flupirtine metabolites. Re- ity, carry-over, calibration curve parameters (LLOQ, range, linearity), tention of acidic analytes increases with temperature but decreases for basic analytes, within-/between-run accuracy and precision, dilution integrity, matrix prompting a partial reversal of elution order. effects and stability. Calibration curves in human urine were prepared daily and included quality control samples (QCs, consisting of spiked drying gas (5 L/min). Desolvation line, heat block, and interface tem- human urine) equal to 10% of total analytical samples. perature of the final method were set to 250 °C, 200 °C, and 350 °C, respectively. Analytes containing a basic moiety (flupirtine, D-13223, 2.6. Clinical application AS77) were detected in positive mode as [M+H]+, while the corresponding hippuric acid derivatives (4-FHA, 3,4-FHA) were detected − The validated assay was applied to urine samples of four healthy in negative mode as [M−H] (Table 1). Integration was performed us- volunteers of a clinical study group (male and female, 20–32 years, ing LabSolutions software (internal standard method, linear regres- 51.5–102 kg, height 162–197 cm, BMI 19.4–26.7 kg/m2), who gave sion, non-weighted for heteroscedasticity). Instrumentation is summa- informed written consent according to current international and na rized in the supplementary material S2.

UNCORRECTED PROOF

Fig. 3. A) Effects of different reconstitution solvents on selectivity and sensitivity of SFC separation and MS detection. Flupirtine metabolites were reconstituted in either methanol (green), acetonitrile (blue), 2-propanol (red) or water (black), resulting in the respectively color-coded signal-to-noise ratios (S/N) and additional matrix peaks (black mark). B) SFC-MS-chromatogram of a clinical application sample. Instrumental details are given in Section 2.3. Journal of Chromatography A xxx (xxxx) xxx-xxx 7

Table 3 Selectivity (signal ratio of blank urine and LLOQ-spiked samples, i.e. 100 ng/mL) and carry-over (identical procedure, but performed after ULOQ-analysis, i.e. 5 µg/mL).

Parameter Analyte Source Mean Acc.

1 2 3 4 5 6 ratio criteriaa

Selectivity Flupirtine 0.0% 0.1% 0.1% 0.0% 0.2% 0.1% 0.1% 20% D-13223 2.3% 0.6% 0.2% 3.7% 0.5% 0.5% 1.3% 20% 4-FHA 4.1% 8.4% 4.9% 4.4% 7.9% 1.6% 5.2% 20% AS77 0.0% 0.2% 0.0% 0.1% 0.2% 0.2% 0.1% 5% 3,4-FHA 0.6% 0.6% 1.6% 0.2% 0.2% 0.5% 0.6% 5% Carry-over Flupirtine 0.2% 1.1% 0.4% 1.3% 1.7% 0.7% 0.9% 20% D-13223 6.9% 6.7% 3.2% 7.4% 9.2% 4.6% 6.3% 20% 4-FHA 2.7% 10.1% 8.2% 11.8% 3.2% 0.8% 6.1% 20% AS77 0.0% 0.2% 0.0% 0.1% 0.2% 0.1% 0.1% 5% 3,4-FHA 0.7% 0.6% 1.8% 0.2% 0.2% 0.5% 0.7% 5% a Guideline on bioanalytical method validation [24].

Table 4 T01676246). The initial-controlled, randomized, cross-over study Linearity parameters and retention times for flupirtine and its metabolites D-13223 and consisted of three segments, summarized in Fig. 1A: single i.v.-infu- 4-FHA over 3 days, expressed in mean values ± SD (n = 3). sion (100 mg flupirtine, Katadolon® inject, 50 mL over 30 min), sin- ® Analyte Retention Slope Intercept r2 gle oral application (100 mg flupirtine, Katadolon hard capsules, im- mediate release dosage form), and repeated oral application (400 mg time (min) mean mean Mean flupirtine daily for eight days, Katadolon® S long, extended release SD SD SD Flupirtine 4.85 0.7220 0.0249 0.9992 dosage form). An interim period of at least seven days was observed ± ± ± between each segment to ensure wash-out. Subjects’ health, as ascer- 0.0397 0.0207 0.0003 tained pre- and post-study by physical examination, routine clinical D-13223 5.03 0.4425 0.0056 0.9989 chemistry, history and haematological screenings for substance abuse, ± ± ± 0.0113 0.0061 0.0004 hepatitis B and C viruses as well as HIV, showed no change during the 4-FHA 3.71 0.4754 −0.0195 0.9973 study. For single dose administration, urine was collected in 24-h-in- ± ± ± tervals from one day before and up to three days after administration. 0.0195 0.0149 0.0010 For repeated administration, 24-h urine was sampled one day before and after final dose. All samples were stored at −20 °C until quantita- tional regulations (EudraCT2007-007483-17; ClinicalTrials.gov NC tive analysis.

Table 5 Within- and between-run accuracy and precision for flupirtine and its metabolites (nwithin-run = 5; nbetween-run = 3, over the course of 3 days).

Analyte QC Nominal Mean determined (ng/mL) Accuracy (%)a Precision (%)a

(ng/mL) within-run between-run within-run between-run within-run between-run Flupirtine LLOQ 100 110 95 9.9 −5.2 11.8 9.7 low 300 320 296 6.8 −1.4 3.1 5.9 medium 2000 2,030 2,094 1.5 4.7 3.2 1.4 high 4000 4,017 4,060 0.4 1.5 1.0 2.2 D-13223 LLOQ 100 96 92 −3.6 −8.3 12.3 14.9 low 300 298 271 −0.8 −9.6 5.4 7.7 medium 2000 1,809 1,909 −9.6 −4.5 1.7 13.7 high 4000 3,595 3,723 −10.1 −6.9 3.0 11.7 4-FHA LLOQ 100 114 106 13.6 5.7 6.8 6.4 low 300 322 305 7.4 1.6 4.3 6.7 medium 2000 1,978 2,023 −1.1 1.2 3.8 7.4 high 4000 3,976 4,026 −0.6 0.7 4.5 3.7 a Acceptance criteria according to EMA-guideline on bioanalytical method validation: ±15% (±20% at LLOQ) [24].

Table 6 Benchtop-, rack-, freezer- and freeze-thaw-stability of quality control samples of the SFC-MS assay for flupirtine, D-13223 and 4-FHA in urine.

Analyte Level Stability (%) Freeze-thaw cycles

Benchtopa Rackb Freezerc 1st (%) 2nd (%) 3rd (%) Flupirtine low QC 102.0 102.3 94.2 101.6 93.2 94.7 high QC 98.4 99.0 104.0 105.8 105.3 103.8 D-13223 low QCUNCORRECTED 103.5 101.9 86.8 96.7 95.1PROOF 90.9 high QC 97.8 97.6 86.7 88.3 93.8 89.2 4-FHA low QC 98.5 100.5 107.7 95.9 98.8 98.4 high QC 100.9 99.9 96.3 93.1 100.6 104.7 a 3h at 23 °C. b 6h at 4 °C. c 6 weeks at −80 °C. Stability is expressed in percent of the respective concentrations. 8 Journal of Chromatography A xxx (xxxx) xxx-xxx

3. Results and discussion matograms can be found in supplementary information S3. To our surprise, polysaccharide-based Lux Amylose-2 yielded better peak 3.1. Method development and optimization shapes than traditional Si-based stationary phases, even though use of this column is typically associated with chiral separations [44,45]. Since this is the first SFC investigation into flupirtine and its Selective retention of analytes on the polar polysaccharide backbone metabolites, method development began with a screening of viable substituted with non-polar 5-chloro-2-methylphenylcarbamate groups stationary phases, followed by an investigation of the effects of mod- was attributed to π-π-interaction and halogen-bonding. Since both ba- ifier, additives, and finally gradient and temperature optimization. sic and acidic analytes could be separated from each other and – as At each stage of the process, focus was placed on expediency, demonstrated for clinical samples – from interfering matrix compo- peak-shape, and greenness, as indicated by selectivity, elution time nents within less than 5.5 min, this stationary phase was used for fur- (RT), asymmetry factor (As), and minimal use of organic modifiers ther optimization. This not only follows the general trend of non-chiral (B). applications on polysaccharide-based chiral stationary phases (‘chiral is the new achiral in SFC’) [46], but also opens up the path towards 3.1.1. Screening of stationary phases enantioselective investigations of chiral flupirtine analogues (sulfox- Reversed-phase C18-silica (Xterra MS C18, Gemini-C18), hy- ides) currently in development [32]. brid-phase ether-, diol- and NH2-modified silica (Synergi Polar-RP, LiChrosorb Diol, Luna NH2), and polysaccharide-based material (Lux 3.1.2. Mobile phase composition and elution mode Amylose-2) was included in the initial screening (Fig. 1B). In order to establish similarities/differences between SFC and con- A review of the literature on HPLC-methods for flupirtine indi- ventional modes of chromatography (NP/RP/HILIC), a gradient of cated reasonable success with alkylated stationary phases such as C18 methanol or 2-propanol was added to scCO2 to study the effects of [19,22,41] in HPLC, but at the same time revealed the challenges as- modifier constitution on separation. In HPLC, the behavior of poly- sociated with simultaneous analysis of both the lipophilic parent drug saccharide-based stationary phases resembles that of either RP or and its polar metabolites, demanding the use of two different station- HILIC, depending on mobile phase composition: Organic eluents fa- ary phases for acidic/hydrophilic and basic/lipophilic analyte classes vor RP-like elution mechanisms (analyte retention increases with in- (NP and RP) [22]. Switching between modes of elution (RP and NP) creasing mobile phase polarity), while HILIC-behavior is observed within a single run conflicts with problems of eluent solubility and the under aqueous conditions (analyte retention decreases with increasing need for extensive equilibration in HPLC. In a loosely related study water content). Chankvetadze et al. discuss this seemingly contradic- on the metabolism of fluorapacin (not shown) where 4-FHA is formed tory behavior and its implications on chiral separations in great detail as well, the high percentage of aqueous buffer in a gradient elution re- [47]. Indeed, separation appears to be facilitated by specific retention quired extreme run times of 26.86 min for 4-FHA and 52.80 min for rather than polarity-based distribution. Hydrogen bonding, π-π-inter- the related 4-fluoro benzoic acid [42]. actions, van der Waals interactions [48] and, most recently, halogen In principle, SFC should be able to cover a wider target analyte po- bonds (XBs) [49] have been demonstrated to influence analyte reten- larity range, due to the excellent miscibility of hexane-like scCO2 and tion on polysaccharide-based stationary materials in HPLC. Our find- polar modifiers, as well as extremely short equilibration times (due ings corroborate similar effects to play a role in SFC (Fig. 1C). to the superior mass transfer). However, preliminary experiments cor- As previous reports on 5-chloro-2-methylphenylcarbamate-modi- roborated that plain C18-columns, such as Gemini C18 (moderate hy- fied amylose materials suggested [44], eluting power of scCO2 grew drophobicity, low polarity) and XTerra C18 (decreased hydrophobic- both through increase of modifier concentration (data not shown) and ity, slightly higher polarity [43]) were not suitable for simultaneous modifier polarity (E°methanol>E°2-propanol). This observation is compat- analysis of both basic/non-polar and acidic/polar compounds using ible with NP/HILIC-like elution behavior, as the character of the SFC, either. On these columns, flupirtine and D-13223 exhibited in- mobile phase in SFC is dominated by the prevailing influence of sufficient retention (k<<1), whereas polar metabolites exhibited poor hexane-like, lipophilic scCO2. Interestingly, elution order in addi- symmetry (As>>2) due to extreme tailing. This is hardly surprising, tive-free methanol suggested additional retention mechanisms, since as the lipophilic nature of scCO2 used in SFC exhibits higher elut- small, polar compounds such as 4-FHA and 3,4-FHA were shown to ing power for lipophilic compounds on plain RP columns. Hence, po- elute prior to the less polar analytes flupirtine and D-13223. Here, both lar and hybrid stationary phases were included in the initial screen- the stationary material and the analytes could act simultaneously as ing, results of which are summarized in Table 2. Exploiting possible XB-donors (Cl > F) as well as acceptors (free electron pairs in car- π-π-interactions towards a polar endcapped, ether-linked phenyl phase bonyl O, N, and aromatic π-donors). The effects of protic co-solvents, (Synergi Polar-RP), retention and selectivity for the amino-pyridine which are known to destabilize XBs (using their free electron pairs to containing compounds flupirtine (k = 2.58) and D-13223 (k = 3.54) compete for XB-donators and, more significantly, forming hydrogen could be greatly improved. However, peak symmetry of hippuric acid bonds to disrupt XB-acceptors [49]) may contribute to their eluting derivatives was still poor (As>2), although an improvement to plain power. This effect is more pronounced for methanol than 2-propanol, C18 columns could be observed. Similar selectivity was obtained which (due to its stereo-electronic properties) is better able to access with LiChrosorb Diol, a L20 USP column characterized by chem- the groves and ravines found in the polysaccharide material, and thus ically bonded dihydroxypropane groups. However, the increase in explains faster elution with methanol than with 2-propanol. (unspecific) hydrophilic interactions and hydrogen bonds led to im- In methanol, π-π-interactions may explain why flupirtine and its – mense tailing (As>>5 for flupirtine), as well as wider and thus less active metabolite D-13223 (which contain both, a benzene- and a pyri- intensive–peaks in general. Another polar material often used in NP, dine-moiety) are retained longer than analytes containing only one HILIC, and even IEC is silica end-capped with NH2-groups, rep- aromatic moiety (4-FHA, 3,4-FHA). Methylation, which contributes resented here by a Luna column. WhileUNCORRECTED selective in the separation only marginally to total size, may PROOFattenuate these interactions when of flupirtine analogues, its capacity as a weak anion exchanger led applied directly to the pyridine-ring, and indeed AS77 was the least to an immense disparity in retention times between acidic and ba- retained compound in most chromatograms. However, the steric ef- sic analytes (k4-FHA = 48.40 vs kFlu = 0.79), that could not be recon- fect of an additional methyl group can be pronounced despite the ciled with eco-friendly principles (i.e., elution of these compounds small size. Thus it remains speculative whether the interesting find necessitated extreme amounts of organic modifiers). Chro Journal of Chromatography A xxx (xxxx) xxx-xxx 9 ing, that AS77 always elutes prior to the closely related analytes, is 3.1.5. Optimization of flow-rate, pressure, make-up and MS caused by steric or electronic effects. parameters In 2-propanol, acids were shown to elute faster in presence of In accordance with recent reports from Takeda et al. [53], variation 0.075% formic acid (favoring protonation and a non-ionized state) of flow-rate between 2 and 4 mL/min entailed only minor increases than in the presence of 0.075% ammonia (favoring deprotonation/ion- in pressure at no expense of resolution. The flow-rate was therefore ization), thus obeying NP-like principles. This parameter gave control set at 4 mL/min for shortest run-time. Variation of BPR pressure from over metabolite elution order, a recurring feature during subsequent 120 to 150 did not produce significant effects on resolution. As shown method development. In methanol, on the other hand, both acidic and by Fujito et al. [54], MS response was most intensive using make-up basic additives improved peak-shape and increased elution power. The flow-rates of 0.1 mL/min of either methanol or 2-propanol, the former effects of formic acid were less pronounced, possibly due to differ- of which was used in the final method. Optimization of MS parameters ences in acidity depending on the solvent mixture, and mainly lim- (interface voltage, nebulizing- and drying gas, desolvation line-, heat ited to improving peak shape. Ammonia decreased retention of all an- block-, and interface temperature) yielded the final method described alytes (including hippuric acid derivatives) and greatly improved sig- in Section 2.3. A typical chromatogram obtained from application to nal intensities. Empirically, complete resolution of all analytes was urine of a healthy volunteer is represented in Fig. 3B. achieved using 0.075% ammonia in 2-propanol. Nevertheless, a mixture of methanol and 0.075% ammonia was used in the final method 3.2. Validation (favoring speed over separation), since MS detection provided selectivity void of isobaric interference between analytes. 3.2.1. Selectivity The method was shown to differentiate a total of five compounds (flupirtine, D-13223, AS77, 4-FHA, 3,4-FHA) from endogenous ma- 3.1.3. Temperature effects on selectivity trix components. Selectivity was demonstrated by comparison of Temperature and pressure are critical parameters in SFC, since blank urine to urine spiked to yield 100 ng/mL of each target ana- they determine the physical state of the mobile phase. However, the lyte (i.e., the lower limit of quantification, LLOQ). The procedure was critical point of CO2 changes dramatically depending on modifier performed on urine from six individual sources (healthy volunteers and additive presence, leading to states neither accurately supercrit- aged 26–33). EMA-requirements require corresponding peak areas to ical nor liquid, that are also termed ‘subcritical’ or ‘enhanced fluid- be ≤20% for analytes and ≤5% for internal standards. As shown in ity’ [50]. While properties do not change abruptly, the transition often Table 3, results for flupirtine (0.1% of blank signal), D-13223 (1.3%), affects selectivity. Fig. 2 summarizes the inverse effects temperature 4-FHA (5.2%), AS77 (0.1%) and 3,4-FHA (0.6%) were well within was shown to exert on lipophilic/basic analytes (flupirtine, D-13223, guideline recommendation. AS77) as opposed to hippuric acid derivatives (4-FHA, 3,4-FHA), leading to partial reversal of elution order. At 30 °C, full resolution 3.2.2. Carry-over of all analytes could be obtained. For the final method, however, an Carry-over from one run to the next was investigated by first ana- oven temperature of 40 °C was selected, since this temperature al- lyzing urine spiked at the upper limit of quantification (ULOQ, 5 µg/ lowed for shortest total run-time and highest reproducibility. Chro- mL) and subsequently a blank urine sample. Acceptance criteria are matograms can be found in the supplementary information S4. The in- identical to those of selectivity (≤20% for target analytes, ≤5% for ternal standards, which were initially chosen for their chemical sim- internal standards). As shown in Table 3, results for flupirtine (0.9% ilarity and common ionization patterns, exhibited behavior (slope) in of blank signal), D-13223 (6.3%), 4-FHA (6.1%), AS77 (0.1%) and response to temperature changes identical to their corresponding tar- 3,4-FHA (0.7%) were well within guideline recommendation. get analytes, corroborating the suitability of AS77 as internal standard for basic analytes (flupirtine and D-13223) and 3,4-FHA for hippuric 3.2.3. Lower limit of quantification acid derivatives (4-FHA). LLOQ, characterized by EMA as the lowest calibration standard [Please insert Fig. 2] [24], was set as to reflect urine excretion of metabolites at therapeutic levels [16]. Thus, 100 ng/mL was set for all analytes, each yielding peak areas of at least 5 times the response of blank samples (see 3.2.1 3.1.4. Effect of the injection solvent Selectivity). The injection (dilution) solvent is of particular importance in hy- phenated techniques involving mass spectrometry and samples of bi- 3.2.4. Calibration curve ological origin [51]. To investigate its effects, 200 µL of spiked urine Calibration curves (n = 3) were prepared by diluting stock solu- samples were diluted with 800 µL of water, 2-propanol, methanol tions with blank urine to 14 different calibration levels (100, 200, 300, or acetonitrile. Both water and 2-propanol were shown to negatively 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000 and 5000 ng/ affect peak shape and matrix interference (urine), but not retention mL), as to reflect the therapeutic range [16]. Extraction was per- times. In water (dilute-and-shoot), additional signals in negative mode formed on 200 µL of urine, in order to extend the method’s appli- MS could be observed, most likely stemming from renally excreted cation scope to cover future animal studies on small rodents, where amino acids. Up to 20-fold increases of signal-to-noise (S/N) ratios of sample volumes can become a limiting factor. A robust, reproducible, analytes could be realized by salting out and protein denaturation us- homoscedastic and linear relationship (r2≥0.997) was confirmed for ing ice-cold methanol or acetonitrile (Fig. 3A). Salting out by acetoni- all analytes according to EMA guideline and by Mandel’s fitting test. trile placed the lowest strain on the analytical apparatus, albeit yield- Linearity parameters and retention times are given in Table 4. All ing the lowest signal intensities for acidic compounds [52]. Since pri- but one of 126 (14 (n calibration levels) · 3 (n calibration curves) · 3 ority was placed on accuracy, precisionUNCORRECTED and reproducibility (in order (n analytes)) standards were within PROOF 15% of back-calculated to nom- to pass validation) instead of sensitivity, the latter was used in the final inal concentration, with only one standard (4-FHA at 200 ng/mL on method. Full chromatograms can be found in supplementary informa- day 1) deviating by 18.8% (see DataSet, Mendeley data). Thus, the tion S5. method was found in compliance with EMA-guideline requirements 10 Journal of Chromatography A xxx (xxxx) xxx-xxx for calibration curves (at least 75% of calibration standards must be 4. Conclusion within ±20% at LLOQ; ±15% at higher concentrations). Successful validation of an SFC-MS-method allowed for simultaneous and reliable quantification of the parent drug flupirtine, acidic 3.2.5. Within- and between-run accuracy and precision 4-FHA, and basic D-13223 from urine. While understanding of re- Validation of within-run parameters was performed by analyz- tention mechanisms still remains murky, our findings provide exper- ing quintuplicates of quality control samples (QCs) at 4 levels: 100 imental data that supports the existence of π-π- and halogen bond- (LLOQ), 300 (low QC), 2000 (medium QC) and 4000 ng/mL (high ing on polysaccharide-based stationary phases outside HPLC. Results QC). Between-run parameters were determined by analyzing individ- obtained by applying the novel method to samples from a clinical ually prepared QCs from three runs on three consecutive days. Ac- study were in alignment with well-documented excretion rates of un- curacy is expressed as the relative error, i.e., the difference between altered flupirtine and its active metabolite D-13223 [19,22]. Reports nominal and back-calculated concentration, divided by nominal con- surrounding oxidative degradation to 4-FHA in humans are rare, how- centration. Precision is represented by the coefficient of variation. ever, and based solely on one peer-reviewed study that entailed ra- As shown in Table 5, values were within guideline recommendation dioactive labelling and only partial quantification [23]. Our findings (±20% for LLOQ and ±15% at all other levels). not only support the existence of this pathway at administration of therapeutically relevant doses, but further suggest SFC to be a feasible 3.2.6. Dilution integrity and arguably more versatile tool in quantitative drug metabolism stud- Urine samples, initial results of which indicated concentrations be- ies. Indeed, this is the first report of simultaneous spectrometric de- yond ULOQ, were diluted tenfold and re-analyzed. In order to demon- tection of both acidic and basic metabolites of flupirtine. We venture strate dilution integrity, blank urine (n = 5) was spiked at twice the the prediction that the advantageous properties of SFC will lead to a ULOQ (10 µg/mL) and diluted tenfold with water to yield 1 µg/mL. continuation of the recent wave of lipidomics [56], metabolism studies Flupirtine, D-13223 and 4-FHA were subject to minor over-estimation [57,58], food-related [59,60], and even on-line applications [61,62], (8.8%, 8.0% and 3.0%, respectively), the extent of which was well and that guideline-conform validation and the use of stationary phases within guideline specification (±15%). Precision was similar to undi- specifically designed for SFC [14] will pave the way towards clinical luted samples (6.8%, 3.7% and 6.3%, respectively) and thus within implementation of biomedical SFC. specification (±15%). Funding

3.2.7. Matrix effects AL is recipient of grant DFG LI 765/7-1 by the German Research Compliance with EMA-guidelines requires matrix effects to be in- Foundation. vestigated at two levels (lower QC and near ULOQ) and CVs after IS-normalization to be within 15%. Accordingly, matrix factors (MFs) Acknowledgements and IS-normalized MFs of each analyte were calculated as ratio of peak area in presence and absence of matrix (six lots) [55]. For flupir- We are deeply grateful to Prof. Mladen V. Tzvetkov, Prof. Stefan tine, D-13223 and 4-FHA, minor ion suppression at lower QC (MFs: Oswald and Dr. Eberhard Scheuch for providing clinical samples and 0.83, 0.88, 0.87, respectively) and high concentration levels (MFs: helpful advice. 0.93, 0.98, 0.95) was found to be reproducible (CVs≤8.3%) and thus within the accepted analytical error of the method. References

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UNCORRECTED PROOF Publikationen

Thioether als Modulatoren von KV7.2/KV7.3-Kanälen Christian Bock, Abdrrahman S. Surur, Kristin Beirow, Patrick J. Bednarski und Andreas Link Eingereicht als Patent bei „Deutsches Patent- und Markenamt“ am 18.07.2018 (Patent pending)

Beiträge der Autoren Christian Bock

 Synthese der Verbindungen  analytische Charakterisierung der Verbindungen  Erstellen des Manuskripts Abdrrahman S. Surur

 Synthese der Verbindungen  analytische Charakterisierung der Verbindungen Kristin Beirow

 Durchführung der biologischen Testungen Patrick J. Bednarski

 Erstellen des Manuskripts Andreas Link

 Anleitung der Bearbeitung der Fragestellung  Erstellen des Manuskripts

Christian Bock Andreas Link

101

Benachrichtigung über den Eingang einer Patentanmeldung mit der epoline®-Software für die Online- Einreichung

epoline Einreichungsnummer: 800653354

Anmeldung eingegangen am: 18 Juli 2018

Anmeldung erhalten von: epoline®-Software für die Online-Einreichung

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Digitale Signatur: 24:72:B8:09:40:AD:43:CD:52:E3:46:3E:7A:FD:60:54:7C :2C:EB:19

Eigentümer: CN=Alexander Dick 44911

Seriennummer: 160136379996703000280720468553199432394

Herausgeber: CN=European Patent Office CA G2,O=European Patent Office

Daten zum vorliegenden Vorgang:

Amtliches Aktenzeichen: 102018212006.4

Vorgangstyp: Patentanmeldung

Anmeldeamt: Deutsches Patent- und Markenamt

Titel der Patentanmeldung: Thioether als Modulatoren von Kv7.2/Kv7.3-Kanälen

Anmelder: Universität Greifswald

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Die Information in dieser Mitteilung ist vertraulich und rechtlich geschützt. Sie ist ausschließlich für den Gebrauch durch die natürliche oder juristische Person gedacht, an die sie adressiert ist bzw. für diejenigen Personen, die autorisiert sind, diese Information zu erhalten. Sollten Sie nicht der rechtmäßige Empfänger sein, werden Sie hiermit informiert, dass jedwede Bekanntmachung, Vervielfältigung oder Verteilung der Inhalte dieser Mitteilung verboten und ungesetzlich ist. Das Deutsche Patent- und Markenamt übernimmt keinerlei Haftung für jedwede schädliche Software, die in oder mit dieser Mitteilung oder als Anhang daran übertragen wird. Weitergehende Informationen erhalten Sie unter: http://www.dpma.de Universität Greifswald VVB21219DE Finale Fassung V2, 16. Juli 2018

Thioether als Modulatoren von Kv7.2/Kv7.3-Kanälen

Die Erfindung betrifft eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) umfassend eine Thioether- Struktur, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie Verbindungen erhalten oder erhältlich nach 5 diesem Verfahren.

Eine neuronale Übererregbarkeit spielt eine entscheidende Rolle bei chronischen Schmerzen, Epilepsie oder Migräne. ln diesem Kontext stellt die Hyperpolarisation des Ruhemembran- potentials bestimmter Neurone durch Öffnung von Kaliumkanälen und die daraus folgende 10 verringerte Generierung von Aktionspotentialen einen therapeutischen Ansatz dar, der bereits durch die Arzneistoffe Flupirtin und Retigabin klinisch genutzt wird. Beide Arzneistoffe stehen aber in Zusammenhang mit seltenen aber schwerwiegenden unerwünschten Arzneimittel- wirkungen (vide infra) und sicherere Nachfolgersubstanzen dieser Arzneistoffe sind erforderlich, um eine wichtige therapeutische Alternative für zahlreiche Indikationen zu erhalten. 15 Ein spannungsabhängiger, langsam aktivierender und nicht inaktivierender Kaliumionenstrom, der im zentralen und peripheren Nervensystem auftritt, ist an der Steuerung des Feuerungs- verhaltens und damit an der Regulierung der Erregbarkeit einer Vielzahl neuronaler Zellen beteiligt.[1] Die molekulare Basis des M-Stroms bilden Kv7-Kaliumkanäle. ln den meisten 20 Neuronen überwiegen Kv7.2- und Kv7.3-Untereinheiten.[2] Daneben kommen Kv7-Kalium- kanäle auch in den primären Sinneszellen des lnnenohrs, in Skelettmuskelzellen und in Zellen der glatten Muskulatur vor.[3-5] Ähnlich wie bei anderen spannungsgesteuerten Kaliumkanälen bilden jeweils vier Untereinheiten einen Kanal. Dabei können sowohl Homo- als auch Hetero- tetramere gebildet werden.[6,7] Der Effekt der Arzneistoffe Flupirtin und Retigabin auf Kv7- 25 Kanäle ist abhängig davon aus welchen Untereinheiten sie aufgebaut sind.[8] Flupirtin und Retigabin wirken auf molekularer Ebene insbesondere über eine Stabilisierung der offenen Konformation der heterotetrameren Kv7.2/Kv7.3-Kanäle, die genaue Bindungsstelle konnte bisher nur durch Berechnungen abgeschätzt aber nicht durch Kristallstrukturanalyse bestimmt werden.[7-10] 30 Flupirtin wurde vom Chemiewerk Hornburg (später ASTA Medica) entwickelt. Es gehört chemisch betrachtet zur Klasse der Triaminopyridine und wird in Europa seit 1984 als Anal- getikum mit muskelrelaxierenden Eigenschaften eingesetzt.[7] Es ist durch die EMA zur Schmerzbehandlung zugelassen und als Maleat-Salz in Form von Kapseln, Tabletten oder 35 Injektionslösungen erhältlich. Der Wirkstoff erreicht seinen schmerzlindernden Effekt auf spinalen und supraspinalen Ebenen.[11] Opiodrezeptoren sind dabei genauso wenig an der

Wirkung beteiligt wie eine Beeinflussung der Prostaglandinsynthese, alpha1- oder alpha2- Adreno- oder 5-HT-Rezeptoren.[12-14] Flupirtin ist ein positiver Modulator von Kv7-Kalium-

kanälen und öffnet Kv7.2/7.3-Kanäle mit einer EC50 von ungefähr 5 µM.[15] Bei niedrigen 40 mikromolaren Plasmakonzentrationen (2-6 µM), welche für einen analgetischen Effekt nötig sind, gilt dies als der hauptsächliche Wirkmechanismus von Flupirtin.[16]

Universität Greifswald VVB21219DE -2-

Des Weiteren gibt es Indizien dafür, dass Flupirtin den Effekt von GABA am GABAA-Rezeptor verstärkt.[17] Flupirtin ist zugelassen für die Therapie von akuten und chronischen Schmerzen, beispielsweise bei schmerzhaften Verspannungen, degenerativen Gelenkerkrankungen, Spannungskopfschmerzen, Tumorschmerzen, Regelschmerzen oder postoperativen 5 Schmerzen. Basierend auf dem Wirkungsmechanismus von Flupirtin sind theoretisch weitere Indikationen möglich. Dazu zählen multiple Sklerose, Tinnitusprophylaxe, überaktive Blase, neuropathische Schmerzen, periphere Neuropathien und Fibromyalgien.[13] Weiterhin verfügt Flupirtin über neuroprotektive Eigenschaften, die potentiell therapeutisch nutzbar sind.[18] Studien an Patienten mit postoperativen oder Tumorschmerzen haben gezeigt, dass Flupirtin in 10 etwa die gleiche analgetische Wirkstärke wie schwache Opioide besitzt.[19·20] Flupirtin galt lange Zeit allgemeinhin als gut verträglich. Schlaflosigkeit, Schläfrigkeit, Schwindel, trockener Mund, Erbrechen und Unwohlsein im Magen-Darm-Bereich sind die häufigsten Nebenwirkungen. Im Rahmen der Pharmakavigilanz wurde jedoch ein ernst zu nehmendes Problem ersichtlich. Bis 2013 wurden 800 unerwünschte Arzneimittelwirkungen gemeldet. Mehr 15 als ein Drittel dieser Meldungen beschreiben Leber- oder Gallenerkrankungen. Aus der Gesamtzahl aller Fallberichte endeten 24 tödlich und für 17 von diesen wurden wiederum lebertoxische Reaktionen berichtet. Nach einer erneuten Nutzen-Risiko-Bewertung besteht für Flupirtin-haltige Arzneimittel eine Einschränkung der therapeutischen Zielgruppe und eine Begrenzung der Behandlungsdauer auf zwei Wochen. [12] Mittlerweile hat der 20 Pharmakavigilanz-Ausschuss (PRAC) der Europäischen Arzneimittelagentur EMA empfohlen, die Zulassungen für alle Flupirtin-haltigen Arzneimittel (Katadolon® und andere) zu widerrufen.[22]

In höheren Dosen verfügt Flupirtin auch über antikonvulsive Eigenschaften. Eine strukturelle 25 Optimierung führte zur Entwicklung des deutlich potenteren, hochanalogen Wirkstoffs Retigabin, der in der Folge als Antiepileptikum zugelassen wurde.[23] Flupirtin und Retigabin sind nachfolgend dargestellt: O O O O

NH NH

N N NH2 N C NH2 H H H F F Flupirtin Retigabin 30 Der postulierte Wirkmechanismus von Retigabin ist vergleichbar mit dem von Flupirtin. Damit besitzt Retigabin einen gänzlich anderen Angriffspunkt als alle anderen aktuell verfügbaren Antiepileptika. Retigabin ist in nahezu jedem Epilepsie-Tiermodell aktiv mit einem GesamtprofiI, welches sich von jedem anderen Antiepileptikum unterscheidet.[23] Das macht es zu einem 35 unverzichtbaren Arzneistoff bei Arzneimittel-resistenten Epilepsien.[24, 25]

Die häufigsten unerwünschten Arzneimittelwirkungen während einer Behandlung mit Retigabin (Trobalt ®) sind Benommenheit, Müdigkeit, Kopfschmerz, Verwirrtheit und Schwäche. Darüber hinaus wurden bei 12% der Behandelten renale und urologische Störungen beobachtet. 40 Retigabin verursacht eine Harnretention, die über die Aktivierung von Kv7-Kanälen in der Universität Greifswald VVB21219DE -3- glatten Muskulatur der Blase zu erklären ist.[26] Im Gegensatz zu einigen anderen Antiepileptika ist Retigabin jedoch nicht mit kardialer, hämatologischer oder hepatischer Toxizität assoziiert und ist weder teratogen noch reproduktionstoxisch. Des weiteren besitzt Retigabin nur ein geringes Potential für Arzneimittelinteraktionen, da es Leberenzyme weder 5 induziert noch inhibiert.[6] Diese Eigenschaften machen Retigabin im Allgemeinen zu einem gut verträglichen Antiepileptikum. Berichte aus klinischen Langzeitstudien über Pigment- veränderungen (Verfärbung) von Augengeweben einschließlich der Retina und blaugraue Verfärbungen der Haut, Lippen und Nägel führten jedoch zu einer Anwendungsbeschränkung. Retigabin ist inzwischen nur noch als Zusatztherapie für pharmakaresistente fokale Krampf- 10 anfälle mit oder ohne sekundärer Generalisierung bei erwachsenen Patienten mit Epilepsie zugelassen, wenn andere geeignete Arzneimittel unzureichend wirkten oder nicht vertragen wurden.[27] lm Juni 2017 erfolgte letztendlich die weltweite Marktrücknahme von Trobalt® durch GlaxoSmithKline. Eine mögliche Erklärung für die beobachtetet Toxizität ist die Bildung toxischer Metabolite.[28] ln Greifswald wurde deshalb eine klinische Studie durchgeführt, in der 15 Hinweise auf entstandene Oxidationsprodukte (Chinondiimine) gefunden wurden, die in Folgereaktionen Dimere bzw. Trimere bildeten und sich mit Glutathion zu entsprechenden Konjugaten umsetzen ließen.[29] Diese Glutathionkonjugate werden in Folgereaktionen wahrscheinlich zu Cystein- und Mercaptursäurekonjugaten metabolisiert.[30] Es wurde aus diesen Befunden abgeleitet, dass die Chinondiiminintermediate des Flupirtins für die 20 Hepatotoxizität verantwortlich sind.[31] Dies ist beispielsweise für Paracetamol und Diclofenac bekannt, die ebenfalls Chinoniminintermediate bilden.[32,33]

ln einer weiteren in vitro Reaktion konnte die Carbamatgruppe des Flupirtins durch Schweine- leberesterasen gespalten werden. Die so entstandene primäre, aromatische Aminogruppe 25 wurde wiederum von menschlichen N-Acetyltransferasen zum Metaboliten D13223 acetyliert. Dieser zeigte sich im Vergleich zu Flupirtin als weniger reaktiv gegenüber Peroxidasen. Die entsprechenden Chinondiimine konnten in vitro detektiert werden, d.h. sie sind relativ stabil.[29] Dies erklärt eventuell auch, dass der Metabolit D13223 des Flupirtins weniger hepatotoxisch ist als Flupirtin selbst.[31] Der N-acetylierte Metabolit von Flupirtin verfügt darüber hinaus noch 30 über etwa ein Viertel der analgetischen Wirkung der Muttersubstanz.[34] Der Metabolismus von Retigabin unterscheidet sich etwas von dem des Flupirtins. Gemeinsam ist, dass auch Retigabin durch Acetylierung und Glucuronidierung verstoffwechselt wird. Beide Metabolite wurden in menschlichem Urin nach oraler Einmalgabe von 600 mg Retigabin detektiert.[35] Wie beim Metabolismus von Flupirtin konnte keine Beteiligung der Cytochrom P450 Monooxy- 35 genasen nachgewiesen werden.[36] Oxidative Prozesse scheinen im Retigabin-Metabolismus eine geringere Rolle zu spielen als beim Flupirtin. Über die in vivo Bildung von Dimeren gibt es keine Berichte. Dousa et al. identifizierten jedoch Retigabindimere als prozessbezogene Verunreinigungen aus der Retigabinsynthese. [37] Duggan et al. synthetisierten fluorierte Retigabinanaloga, um zu Analoga mit besseren Eigenschaften zu gelangen, ohne aber dabei 40 ein spezielles Augenmerk auf die Metabolisierung zu legen.[38] Bei der Firma Grünenthal wurde die Struktur der an sich als sicher und gut verträglich erwiesenen Arzneistoffe Flupirtin und Retigabin gänzlich verlassen, so dass zwar die damit verbundenen Probleme vermieden werden, aber eben auch nicht mehr auf die ungewöhnlich breiten Anwendungserfahrungen Universität Greifswald VVB21219DE -4- bezüglich der bei den allermeisten Patienten guten Langzeitverträglichkeit der bewährten Strukturen Bezug genommen werden kann.[39]

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung neuer Verbindungen, die eine 5 ähnlich gute Wirksamkeit aufweisen wie beispielsweise Flupirtin bzw. Retigabin und bei denen die strukturbedingte Toxizität aufgehoben ist.

Die Aufgabe wurde gelöst mit Verbindung der allgemeinen Formel (I)

10 , wobei

R1 ausgewählt ist aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe und

-NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoffatom und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5- Alkylgruppe oder

15 miteinander und mit dem Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C3- bis C9- Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom und C1- bis C3-

Alklygruppe aufweist und gegebenenfalls zusätzlich zum Stickstoffatom der NR1aR1b- Gruppe mindestens ein weiteres Heteroatom im Cyclus, bevorzugt ein Stickstoff- oder 20 Sauerstoffatom, aufweist;

R2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, wobei mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus Stickstoff- und Sauerstoffatom umfasst ist, C6- bis C12-Arylgruppe; und C5- bis C11-Heteroarylgruppe, wobei die C1- 25 bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10- Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe, oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe

jeweils mindestens einen weiteren Substituenten R2a aufweist, wobei R2a ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F), verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe, verzweigter oder 30 unverzweigter (per)halogenierter C1- bis C3-Alkylgruppe (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkoxygruppe, und wobei die C3- bis C10- Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe ein oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind;

35 R3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis

C10-Alkoxygruppe; verzweigter oder unverzweigter C1-C10-Alkylgruppe und -(CH2)p-C6- bis C12-Arylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Universität Greifswald VVB21219DE -5- Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und C1- bis C3-Alkoxygruppe aufweist und wobei die C6- bis C12-Arylgruppe einen oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind;

R4 ausgewählt ist aus Wasserstoff, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt Br) und verzweigter 5 oder unverzweigter C1-C5-Alkylgruppe; X ein Stickstoffatom oder eine –CH- Gruppe ist; n Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3 ist; m Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist; und p Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist. 10 Es wurde gefunden, dass ein Ersatz des N-Atoms der sekundären Aminogruppe von Flupirtin bzw. Retigabin durch ein Schwefelatom die Eigenschaften der erhaltenen Moleküle so verändert, dass eine Oxidation nicht mehr am dreifach substituierten Ring sondern an der Thioetherbrücke stattfindet. Vorteilhafterweise werden die Thioether durch Oxidationsmittel 15 nicht zu toxischen Chinondiiminen, sondern zu Sulfoxiden oxidiert, die anders als die Chinodiimine des Flurpitins chemisch unreaktiv sind und nicht mit körpereigenen Nukleophilen reagieren können, womit die Grundlage der Toxizität auf molekularer Ebene aufgehoben ist. Die gebildeten Sulfoxide, die auch die wahrscheinlichen Metaboliten in vivo darstellen, sind nicht per se toxisch und es konnte gezeigt werden, dass durch Veränderung des 20 Substitutionsmusters stärker wirksame Thioether erhalten werden können, deren Sulfoxid- metaboliten nicht hepatotoxisch sind.

Überraschenderweise zeigen die neu dargestellten Thioether in vitro eine mindestens gleichwertige Wirkung auf Kv7 .2/7.3-Kanäle wie Flupirtin und Retigabin, d.h. es handelt sich

25 um potentielle Kv 7.2/3-Öffner; mittels eines Kaliumkanal-Assays wurde die Kaliumkanalaktivität

der Substanzen basierend auf EC50 und Emax belegt. Die halbmaximale Effektkonzentration

(EC50) ist die Konzentration einer Substanz, bei der der halbmaximale Effekt des eingesetzten Kaliumkanal-Assays zu beobachten ist, wenn die logarithmierte Konzentration einer Substanz gegen die zugehörigen korrigierten ΔF/F-Werte geplottet wird, womit die Wirkungsstärke 30 (Potenz) einer Verbindung charakterisiert wird. Die intrinsische Aktivität einer Test-Verbindung

wird durch deren Emax-Wert beschrieben. Dabei handelt es sich um die maximale Antwort, bezogen auf den eingesetzten Assay, welche durch die entsprechende Test-Substanz möglich

ist (Plateaueffekt). Bei der Auswertung des eingesetzten Assays wurde Emax des als Referenz verwendeten Flupirtins, welches als Maleat eingesetzt wurde (Flupirtinmaleat), auf 100 % 35 festgelegt und die maximalen Antworten der jeweiligen Substanz der allgemeinen Formel (I) relativ auf diesen Wert bezogen.

Je niedriger der EC50-Wert, desto höher ist die Potenz, während je größer der Emax-Wert ist, desto stärker wirksam ist die Verbindung. Viele Verbindungen der allgemeinen Formel (I)

40 zeigten einen niedrigen EC50-Wert von weniger als 0,9 mikromolar (Mikromol pro Liter). Emax lag bei allen aktiven Verbindungen der allgemeinen Formel (I) bei mindestens 60 %, woraus ein zumindest dem Flupirtinmaleat annhähernd vergleichbarer Kaliumefflux zu erwarten ist; viele

der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weisen Emax-Werte von mehr als 100 % auf, was einen stärkeren Kaliumefflux im Vergleich zum Flupirtinmaleat anzeigt. Universität Greifswald VVB21219DE -6-

Zur Beurteilung des hepatotoxischen Potentials einer Substanz wurde der IC50-Wert verwendet.

Als IC50 wurde die Konzentration einer Verbindung definiert, bei welcher die Viabilität der Zellen

auf 50 % sank. Aus dem Zusammenspiel der Ergebnisse von KV7.2/3-Öffnungsaktivität und den 5 Hepatotoxizitäts-Ergebnissen in vitro ist ersichtlich, dass insgesamt Verbindungen der allgemeinen Formel (I) die Wirkung der Referenzsubstanz Flupirtinmaleat deutlich übertreffen.

In einer Ausführungsform der Verbindung der allgemeinen Formel (I) ist n Null. In einer Ausführungsform der Verbindung der allgemeinen Formel (I) ist m 1. In einer Ausführungsform 10 der Verbindung ist X ein Stickstoffatom.

Der Rest R1 ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder

unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe und -NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoffatom und verzweigter oder unverzweigter C1- bis

15 C3-Alkylgruppe oder miteinander und mit dem Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C4- bis C6-, bevorzugt C4,-Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C4- bis C6-, bevorzugt C4,- Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoff- atom und C1- bis C3-Alklygruppe aufweist und gegebenenfalls zusätzlich zum Stickstoffatom

der NR1aR1b-Gruppe mindestens ein weiteres Sauerstoffatom im Cyclus aufweist; wobei R1

20 weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NH2-Gruppe, Methylgruppe,

NH(CH3)-Gruppe, Pyrrolidin-Gruppe und Morpholin-Gruppe, weiter bevorzugt Pyrrolidin- Gruppe.

Der Rest R2 ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mono- oder Difluorphenyl-

25 Gruppe; CF3-Phenyl-Gruppe; F5S-Phenyl-Gruppe; C4- bis C8-Cycloalkylgruppe, bevorzugt Cyclohexyl-Gruppe, Cyclobutyl-Gruppe oder Cyclopropyl-Gruppe; verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe, bevorzugt 2-Propyl-Gruppe; Biphenyl-Gruppe; Pyridin- Gruppe; Piperidin-Gruppe; Tetrahydropyran-Gruppe; Dioxolan-Gruppe und Phenyl-Gruppe,

wobei die Phenyl-Gruppe mindestens einen Substituenten R2a ausgewählt aus Wasserstoffatom

30 und Methoxy-Gruppe aufweist; wobei R2 weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C4- bis C8-Cycloalkylgruppe, bevorzugt Cyclohexyl-Gruppe, Cyclobutyl-Gruppe oder Cyclopropyl-Gruppe, weiter bevorzugt Cyclohexyl-Gruppe; und verzweigter oder

unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe, bevorzugt 2-Propyl-Gruppe; wobei R2 weiter bevorzugt eine Cyclohexyl-Gruppe oder 2-Propyl-Gruppe ist. 35

Der Rest R3 ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethoxy-Gruppe, Propyl-

Gruppe, tert-Butyl-Gruppe, -(CH2)p-Phenylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und Methoxy-Gruppe

aufweist und wobei p Null oder 1 oder 2 ist; wobei R3 weiter bevorzugt eine (CH2)p- 40 Phenylgruppe ist, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und Methoxy-Gruppe aufweist und wobei p 1 oder 2 ist.

Der Rest R4 ist bevorzugt ein Wasserstoffatom, ein Bromatom oder eine Methyl-Gruppe, weiter bevorzugt ein Wasserstoffatom. Universität Greifswald VVB21219DE -7-

In einer Ausführungsform der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) ist n Null; m ist 1; X ist

ein Stickstoffatom, R1 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NH2-Gruppe,

Methylgruppe, NH(CH3)-Gruppe, Pyrrolidin-Gruppe und Morpholin-Gruppe, bevorzugt

5 Pyrrolidin-Gruppe; R2 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cyclohexyl-Gruppe und 2-

Propyl-Gruppe; R3 ist eine -(CH2)p-Phenylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und Methoxy-Gruppe

aufweist, wobei p 1 oder 2 ist; und R4 ist ein Wasserstoffatom.

10 In einer bevorzugten Ausführungsform der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weist die Verbindung die Formel (Ia) auf:

(Ia).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) 15 weist die Verbindung die Formel (Ib) auf:

O O

O S N N

(Ib).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weist die Verbindung die Formel (Ic) auf: F

O F NH

S N N

20 (Ic).

Bei der Verbindung der Formel (Ic), welche die im experimentellen Teil beschriebene potenteste Substanz 11 ist, werden so niedrige Substanzkonzentrationen (0,0014 µMol pro Liter) zur Universität Greifswald VVB21219DE -8- Erreichung des halbmaximalen Effekts auf Kaliumkanäle benötigt, dass toxische Effekte bei der resultierenden Dosierung sehr unwahrscheinlich sind. Die ermittelten Toxizitätsdaten zeigen, dass bei den durch Löslichkeit im Testmedium limitierten Konzentrationen von 63 µMol pro Liter

für Verbindung 11 keine toxischen Effekte beobachtet wurden und der IC50 daher als größer als

5 63 µMol pro Liter angegeben werden kann. Entsprechend ist das Verhältnis von IC50 zu EC50 mindestens 85-mal größer bei Substanz 11 als bei Flupirtinmaleat. Leberschädigungen während der Therapie sollten damit weniger wahrscheinlich sein. Auch der biologische Effekt

der Testsubstanz sollte größer sein (z.B. stärkere Analgesie), da Emax bei über 100 % lag und somit ein stärkerer Kaliumefflux zu erwarten ist als mit Flupirtinmaleat. 10 Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I),

wobei R1, R2, R3, R4, X, n, m und p die gleiche Bedeutung haben wie voranstehend zu den 15 Verbindungen der allgemeinen Formel (I) definiert, umfassend: (i) Bereitstellen einer Nitro-Verbindung der allgemeinen Formel (II)

wobei R1, R2, R4, m und n die gleiche Bedeutung haben wie voranstehend zu den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) definiert; 20 (ii) Umsetzen der Nitro-Verbindung der allgemeinen Formel (II) gemäß (i) mit einer

Verbindung H-R3, wobei R3 die gleiche Bedeutung hat wie voranstehend zu den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) definiert, unter Erhalt einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).

25 Die Erfindung betrifft weiterhin Verbindung der allgemeinen Formel (I), erhalten oder erhältlich nach einem Verfahren wie voranstehend beschrieben.

Weiterhin betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I)

Universität Greifswald VVB21219DE -9-

, wobei

R1 ausgewählt ist aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe und -

NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus 5 Wasserstoffatom und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5- Alkylgruppe oder

miteinander und mit dem Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C3- bis C9- Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom und C1- bis C3-

Alklygruppe aufweist und gegebenenfalls zusätzlich zum Stickstoffatom der NR1aR1b- 10 Gruppe mindestens ein weiteres Heteroatom im Cyclus, bevorzugt ein Stickstoff- oder Sauerstoffatom, aufweist;

R2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, wobei mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus Stickstoff- und Sauerstoffatom 15 umfasst ist, C6- bis C12-Arylgruppe; und C5- bis C11-Heteroarylgruppe, wobei die C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10- Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe, oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe

jeweils mindestens einen weiteren Substituenten R2a aufweist, wobei R2a ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt 20 F), verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe, verzweigter oder unverzweigter (per)halogenierter C1- bis C3-Alkylgruppe (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkoxygruppe, und wobei die C3- bis C10- Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe ein oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche 25 kondensiert oder separiert sind;

R3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis

C10-Alkoxygruppe; verzweigter oder unverzweigter C1-C10-Alkylgruppe und -(CH2)p-C6- bis C12-Arylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und C1- bis C3-Alkoxygruppe 30 aufweist und wobei die C6- bis C12-Arylgruppe einen oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind;

R4 ausgewählt ist aus Wasserstoff, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt Br) und verzweigter oder unverzweigter C1-C5-Alkylgruppe; X ein Stickstoffatom oder eine –CH- Gruppe ist; 35 n Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3 ist; m Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist; und Universität Greifswald VVB21219DE -10- p Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist; oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung als Arzneimittel, bevorzugt als Human- oder Veterinär-Arzneimittel, weiter bevorzugt als Human-, Kleintier- oder Heimtier-Arzneimittel. 5 Bevorzugte Ausführungsformen der Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung als Arzneimittel, bevorzugt als Human- oder Veterinär-Arzneimittel, weiter bevorzugt als Human-, Kleintier- oder Heimtier-Arzneimittel sind eingangs beschrieben im Hinblick auf die Verbindung der allgemeinen Formel (I) selbst; das gleiche gilt für die entsprechenden pharmazeutisch 10 akzeptablen Salze, d.h. auch für die pharmazeutisch akzeptablen Salze sind die die gleichen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) wie eingangs beschrieben im Hinblick auf die Verbindung der allgemeinen Formel (I) selbst, bevorzugt; gleiches gilt auch für Verbindungen der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren. Besonders bevorzugt wird eine Verbindung der Formel (Ia), oder eine 15 Verbindung der Formel (Ib), oder eine Verbindung der Formel (Ic), eingesetzt, was auch die Verwendung eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes umfasst; weiter bevorzugt wird eine Verbindung der Formel (Ic) eingesetzt, wobei dies ebenfalls die Verwendung eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes umfasst.

20 Pharmazeutisch verträgliche Salze sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Berge et al. "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19 (1977) beschrieben. „Pharmazeutisch ver- trägliches Salz“ bedeutet ein nicht-toxisches, organisches oder anorganisches Säureadditions- salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I), wobei die Verbindung der allgemeinen Formel (I) im Säureadditionssalz in kationischer Form vorliegt. Das pharmazeutisch akzeptable 25 Salz ist insgesamt neutral geladen.

Ein pharmazeutisch verträgliches Salz kann aus einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einer organischen oder anorganischen Säure hergestellt werden. Das Salz kann in situ während der Isolation und Aufreinigung der Verbindung der allgemeinen Formel (I) hergestellt 30 werden oder durch separate Reaktion einer aufgereinigten Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure und anschließender Isolation des erzeugten Salzes.

Bevorzugt ist das Anion des pharmazeutisch akzeptablen Salzes ausgewählt aus der Gruppe 35 bestehend aus Sulfat, Pyrosulfat, Bisulfat, Sulfit, Bisulfit, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Chlorid, Bromid, Iodid, Acetat, Propionat, Decanoat, Caprylat, Acrylat, Formiat, Isobutyrat, Caprat, Heptanoat, Propiolat, Oxalat, Malonat, Succinat, Suberat, Sebacat, Fumarat, Maleat, Butin-1,4-dioat, Hexin-1,6-dioat, Benzoat, Chlorobenzoat, Methylbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Phthalat, 40 Terephthalat, Sulfonat, Xylolsulfonat, Phenylacetat, Phenylpropionat, Phenylbutyrat, Citrat, Lactat, β-Hydroxybutyrat, Glycolat, Tartrat, Methansulfonat, Propansulfonat, Naphthalen-1- sulfonat, Naphthalen-2-sulfonat, Mandelat, Adipat, Alginat, Mucat, Aspartat, Benzolsulfonat, Butyrat, Camphorat, Camphersulfonat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Glucoheptanoat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Hexanoat , 2-Hydroxyethan- Universität Greifswald VVB21219DE -11- sulfonat, 2-Napthalensulfonat, Nicotinat, Nitrat, Palmitat, Pectinat, Persulfat, Picrat, Pivalat, Salicylat, Thiocyanat, Tosylat, Arginat und Undecanoat.

In einer Ausführungsform wird die Verbindung der allgemeinen Formel (I) als Säureadditions- 5 salz in Form des Chlorids, Sulfats, Mesylats, Besylats, Tosylats oder des Mono-, Di- oder Tricarbonsäuresalzes eingesetzt, wobei die Mono-, Di- oder Tricarbonsäure bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fumarsäure, Malonsäure, Apfelsäure, Succinsäure, Milchsäure, Glycolsäure, Maleinsäure, Zitronensäure, Asparginsäure und Mandelsäure. 10 Die Verbindung der allgemeinen Formel (I) wird allein oder als Mischung von zwei oder mehr Verbindungen der allgemeinen Formel (I) eingesetzt bzw. als pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder als Mischung von zwei oder mehr pharmazeutisch akzeptablen Salzen von Verbindungen der allgemeinen Formel (I). Gleichfalls können 15 Mischungen aus einer oder mehreren Verbindung(en) der allgemeinen Formel (I) mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Salz(en) von Verbindung(en) der allgemeinen Formel (I) eingesetzt werden.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie 20 voranstehend beschrieben oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung als Schmerzmittel.

25 In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung bei der Tinnitusbehandlung oder –prävention. 30 In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung bei der 35 Behandlung oder Prävention von Krampfzuständen, bevorzugt bei der Behandlung oder Prävention von neonatalen Krampfzuständen.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder 40 erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, Abhängigkeit, Manie, bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie. Universität Greifswald VVB21219DE -12-

Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zubereitung umfassend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben oder erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables 5 Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Prävention oder Behandlung von Schmerzzuständen, zur Prävention oder Behandlung von Tinnitus oder zur Prävention oder Behandlung von Krampfzuständen umfassend die Verabreichung einer präventiv oder 10 therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben, oder einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).

15 Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, Abhängigkeit, Manie, Bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie, umfassend die Verabreichung einer präventiv oder therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben, oder einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder 20 erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung, welche zumindest anteilig mit einer Veränderung von Kv7.2/Kv7.3-K+-Kanälen einhergeht, 25 umfassend die Verabreichung an einen Probanden (human oder Tier), welcher einer solchen Behandlung oder Prävention bedarf, einer therapeutisch oder präventiv aktiven Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben, oder einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der 30 allgemeinen Formel (I).

Die Erfindung betrifft ebenso eine Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben, oder einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder eines 35 pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments, insbesondere eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung von Schmerzzuständen, zur Prävention oder Behandlung von Tinnitus oder zur Prävention oder Behandlung von Krampfzuständen oder zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, 40 Abhängigkeit, Manie, bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen weiter erläutert, ohne sie hierauf zu beschränken.

Universität Greifswald VVB21219DE -13- Beispiele

1. Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I)

5 1.1 Herstellung der Nitro-Vorstufen

1.1.1 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin

10 10 mmol 6-Amino-5-nitropyridin-2-thiol (1.71 g) wurden in 40 ml DMF gelöst und 4,3 ml 3 M NaOH hinzugefügt. Der dunkelbraunen Lösung wurden 10 mmol 4-Fluorbenzylbromid zugesetzt und für 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Produkt durch Zugabe von 100 ml Wasser präzipitiert. Abschließend wurde das Produkt mit 200 ml Wasser und 200 ml n-

Hexan gewaschen. Gelber Feststoff (Smp.: 139–141 °C). Ausbeute: 1,98 g (70,0 %). Rf = 0.35 15 (n-Hexan/Ethylacetat). 1H-NMR [ppm]: δ = 4,46 (s, 2H), 6,61 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,13 (m, 2H), 7,53 (m, 2H), 8,15 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 8,18 (bs, 2H). 13C-NMR [ppm]: δ = 32,2, 110,3, 115,1 (d, 2 3 4 2C, JC,F = 22 Hz), 123,5, 131,1 (d, 2C, JC,F = 8 Hz), 134,2 (d, JC,F = 3 Hz), 134,5, 153,1, 160,1 1 -1 und 162,5 (d, JC,F = 242 Hz), 166,3. IR [cm ]: ν̃ = 1342, 1558, 3332, 3456.

20 1.1.2 weitere Nitro-Vorstufen

Weitere Thioether-Vorstufen wurden in analoger Weise gemäß der Synthese aus 1.1.1 synthetisiert. Tabelle 1 zeigt die jeweiligen Edukte und die daraus erhaltene Nitro-Verbindung.

25 Tabelle 1 Übersicht der synthetisierten Thioether-Vorstufen und der zur Synthese eigesetzten Edukte. Edukte Produkt

6-[(3,4-Difluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2- amin

3-Nitro-6-{[4- (trifluormethyl)benzyl]thio}pyridin-2-amin Universität Greifswald VVB21219DE -14- Edukte Produkt

6-(Benzylthio)-3-nitropyridin-2-amin

6-[(Cyclohexylmethyl)thio]-3-nitropyridin-2- amin

6-[(Cyclopropylmethyl)thio]-3-nitropyridin- 2-amin

6-[(Cyclobutylmethyl)thio]-3-nitropyridin-2- amin

3-Nitro-6-{[4-(pentafluor-λ6- sulfanyl)benzyl]thio}pyridin-2-amin O N+ O–

S N N

6-[(Cyclohexylmethyl)thio]-3-nitro-2- (pyrrolidin-1-yl)pyridin

6-(Isobutylthio)-3-nitro-2-(pyrrolidin-1- yl)pyridin Universität Greifswald VVB21219DE -15- Edukte Produkt

6-{[(1,1′-Biphenyl)-4-ylmethyl]thio}-3- nitropyridin-2-amin

3-Nitro-6-[(pyridin-2-ylmethyl)thio]pyridin- 2-amin

6-[(3,5-Dimethoxybenzyl)thio]-3- nitropyridin-2-amin

6-[(4-Fluorbenzyl(thio]-5-methyl-3- nitropyridin-2-amin

6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-2-methyl-3- nitropyridin

6-(Benzylthio)-N-methyl-3-nitropyridin-2- amin

3-Nitro-6-{[2-(piperidin-1- yl)ethyl]thio}pyridin-2-amin Universität Greifswald VVB21219DE -16- Edukte Produkt

4-(6-{[(1,3-Dioxolan-2-yl)methyl]thio}-3- nitropyridin-2-yl)morpholin

3-Nitro-6-{[(tetrahydro-2H-pyran-2- yl)methyl]thio}pyridin-2-amin

1.2 Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I)

1.2.1 Ethyl-{2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat 5

In einem 3-Hals-Kolben wurden 3,65 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (1,02 g)

mit 18,6 mmol SnCl2•2H2O (5,1 eq, 4,2 g) vorgelegt und in 40 ml Ethanol suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde unter Argon-Atmosphäre für 25 h auf 70 °C erhitzt. Anschließend wurde

10 auf 40 °C abgekühlt und 37,2 mmol Et3N (10,2 eq, 5,16 ml) sowie 4,6 mmol Chlorameisen- säureethylester (1,26 eq, 0,44 ml) hinzugefügt. Nach 30 min wurde die Temperatur auf 55 °C erhöht und für eine Stunde gehalten. Nach abkühlen auf Raumtemperatur wurde der Ansatz über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, in DCM aufgenommen und mit Wasser gewaschen. 15 Evaporation der organischen Phase und waschen des Rückstandes mit n-Hexan ergab das

saubere Produkt. Farbloser Feststoff (Smp.: 138–140 °C). Ausbeute: 0,75 g (47 %). Rf = 0,83 1 (Cyclohexan/Ethanol/Et3N 6:2:2). H-NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 3H, J = 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J = 7,1 Hz), 4,29 (s, 2H), 5,94 (s, 2H), 6,43 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,07–7,12 (m, 2 H), 7,40–7,45 13 2 (m, 3H), 8,57 (m, 1H). C-NMR [ppm]: δ = 14,5, 32,6, 60,3, 109,3, 115,0 (d, 2C, JC,F = 21 Hz), 3 4 20 115,2, 130,7 (d, 2C, JC,F = 8 Hz), 131,8, 135,0 (d, JC,F = 3 Hz), 150,2, 152,8, 154,4, 159,9 und 1 -1 162,3 (d, JC,F = 243 Hz). IR [cm ]: ν̃ = 1454, 1678, 2984, 3145, 3260, 3403. HRMS: + [C15H16N3O2FS + H] berechnet: 322,1020, gemessen: 322,1027.

Universität Greifswald VVB21219DE -17- 1.2.2 Ethyl-[2-amino-6-(benzylthio)pyridin-3-yl]carbamat

2,31 mmol 6-(Benzylthio)-3-nitropyridin-2-amin (0,60 g) wurden in einer Mischung aus 15 ml 5 Wasser und 25 ml Isopropanol suspendiert. 6,93 mmol Eisenpulver (3 eq, 0,39 g) und 10,4

mmol NH4Cl (4,5 eq, 0,56 g) wurden hinzugefügt und die Suspension für 6 h zum Rückfluss erhitzt. Die resultierende dunkelbraune Mischung wurde filtriert und der Rückstand mit 50 ml

Isopropanol gewaschen. Anschließend wurden 13,9 mmol Et3N (6,0 eq, 1,91 ml) und 5,54 mmol Chlorameisensäureethylester (2,4 eq, 0,53 ml) hinzugefügt. Zur Vervollständigung der Reaktion 10 wurden nach einer sowie zwei Stunden jeweils 5,54 mmol Chlorameisensäureethylester hinzugefügt. Nach zusätzlichen 5 Stunden wurde die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand in 100 ml Ethylacetat aufgenommen. Die organische Phase wurde mit 2×100 ml Wasser und 100 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach

Trocknung über Na2SO4 wurde das Rohprodukt mittels Flashchromatographie gereinigt (Mobile 15 Phase: n-Hexan/Ethylacetat 7:3) und der resultierende braune Feststoff mit wenig eiskaltem Diethylether gewaschen. Hellblauer Feststoff (Smp.: 100–101 °C). Ausbeute: 0,23 g (33,0 %). 1 Rf = 0.72 (Cyclohexan/Ethanol/Et3N 6:2:2). H-NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 3H, J = 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J = 7,1 Hz), 4,30 (s, 2H), 5,93 (s, 2H), 6,44 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,21 (t, 1H, J = 7,3 Hz), 7,28 (t, 2H, J = 7,3 Hz), 7,39–7,41 (m, 3H), 8,57 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,5, 33,5, 60,3, 20 109,2, 115,2, 126,8, 128,3 (2C), 128,8 (2C), 131,8, 138,6, 150,5, 152,7, 154,4. IR [cm-1]: + ν̃ = 1457, 1681, 2975, 3140, 3281, 3405. HRMS: [C15H17N3O2S + H] berechnet: 304,1114, gemessen: 304,1099.

1.2.3 Ethyl-{2-amino-6-[(3,4-difluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat 25

5 mmol 6-[(3,4-Difluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (1,49 g) wurden in einer Mischung aus 30 ml Wasser und 50 ml Isopropanol suspendiert. 15 mmol Eisenpulver (3,0 eq, 0,84 g) und

22,5 mmol NH4Cl (4,5 eq, 1,2 g) wurden hinzugefügt und die Mischung für 3,5 h zum Rückfluss 30 erhitzt. Die resultierende Suspension wurde filtriert und der Rückstand mit 100 ml Isopropanol

gewaschen. 15 mmol Et3N (3,0 eq, 2,07 ml) sowie 6 mmol Chlorameisensäureethylester (1,2 eq, 0,57 ml) wurden zur Lösung gegeben und für 2 h bei 40 °C gerührt. Zur Vervollständigung

der Reaktion wurden weitere 5,5 mmol Chlorameisensäureethylester sowie 5 mmol Et3N hinzugefügt. Nach weiteren 5 h wurde die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt, der 35 Rückstand in 100 ml Ethylacetat aufgenommen und mit 2×100 ml Wasser sowie 100 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Das Rohprodukt wurde mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: n-Hexan/Ethylacetat 7:3) aufgereinigt. Farbloser Feststoff (Smp.: 137–140 °C). Universität Greifswald VVB21219DE -18-

1 Ausbeute: 0,95 g (56,0 %). Rf = 0,39 (n-Hexane/Ethylacetate 7:3). H-NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 3H, J = 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J = 7,1 Hz), 4,29 (s, 2H), 5,99 (s, 2H), 6,42 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,24–7,36 (m, 2H), 7,40 (d, 1H, J = 6,3 Hz), 7,45–7,50 (m, 1H), 8,57 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ 2 2 = 14,5, 32,2, 60,4, 109,3, 115,3, 117,1 (d, JC,F = 17 Hz), 117,8 (d, JC,F = 17 Hz), 125,7 (dd, 3 4 3 4 5 JC,F = 6 Hz, JC,F = 3 Hz), 132,0, 137,0 (dd, JC,F = 6 Hz, JC,F = 4 Hz), 147,2 und 149,6 (dd, 1 2 1 2 JC,F = 245 Hz, JC,F = 13 Hz). 147,8 und 150,2 (dd, JC,F = 245 Hz, JC,F = 13 Hz), 152,9, -1 154,4. IR [cm ]: ν̃ = 1203, 1454, 1510, 1674, 2991, 3149, 3272, 3396. HRMS: [C15H15N3O2F2S + H]+ berechnet: 340,0926, gemessen: 340,0919.

10 1.2.4 Ethyl-(2-amino-6-{[4-(trifluormethyl)benzyl]thio}pyridin-3-yl)carbamat

In einem 3-Hals-Kolben wurden 1.52 mmol 3-Nitro-6-{[4-(trifluormethyl)benzyl]thio}pyridin-2-

amin (0,50 g) sowie 7,9 mmol SnCl2•2H2O (5,2 eq, 1,79 g) vorgelegt und in 20 ml Ethanol 15 suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde unter Argon-Atmosphäre für 23 h auf 70 °C erhitzt.

Anschließend wurde der Ansatz auf 40 °C abgekühlt und 15,4 mmol Et3N (10,2 eq, 2,14 ml) sowie 1,9 mmol Chlorameisensäureethylester (1,27 eq, 0,18 ml) hinzugefügt. Nach 30 min wurde die Temperatur auf 55 °C erhöht und für eine weitere Stunde gerührt. Nach anschließendem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Suspension über Kieselgur filtriert 20 und der Rückstand mit Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand in DCM aufgenommen. Nach waschen der organischen Phase

mit Wasser und anschließender Trocknung über Na2SO4 wurde das Lösemittel im Teilvakuum entfernt und der Rückstand mit n-Hexan gewaschen. Farbloser Feststoff (Smp.: 166–168 °C). 1 Ausbeute: 0,42 g (74,0 %). Rf = 0,58 (n-Hexan/Ethylacetate 7:3). H-NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 25 3H, J = 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J = 7,1 Hz), 4,39 (s, 2H), 5,97 (s, 2H), 6,44 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,41 (d, 1H, J = 5,6 Hz), 7,64 (s, 4H), 8,57 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,5, 32,8, 60,4, 109,3, 4 2 115,3, 122,9 and 125,6, 125,1 (q, 2C, JC,F = 4 Hz), 127,4 (q, JC,F = 32 Hz), 129,6 (2C), 131,8, 144,1, 149,6, 152,7, 154,4. IR [cm-1]: ν̃ = 1113, 1460, 1685, 2980, 3174, 3307, 3423. HRMS: + [C16H16N3O2F3S + H] berechnet: 372,0988, gemessen: 372,0970. 30 1.2.5 Ethyl-(2-amino-6-{[4-(pentafluor-λ6-sulfanyl)benzyl]thio}pyridin-3-yl)carbamat

O O

S N NH2

F5S 2 mmol 3-Nitro-6-((4-(pentafluor-λ6-sulfanyl)benzyl)thio)pyridin-2-amin (0,78 g) wurden in einer 35 Mischung aus 12 ml Wasser und 20 ml Isopropanol suspendiert. Nach Zugabe von 6 mmol

Eisenpulver (3,0 eq, 0,34 g) und 9 mmol NH4Cl (4,5 eq, 0,48 g) wurde für 2 h zum Rückfluss Universität Greifswald VVB21219DE -19- erhitzt. Die Suspension wurde anschließend filtriert und der Rückstand mit 100 ml Isopropanol

gewaschen. Dem Filtrat wurden 10 mmol Et3N (5 eq, 1.38 ml) und 2,4 mmol Chlorameisen- säureethylester (1,2 eq, 0,23 ml) zugegeben und der Ansatz auf 40 °C erhitzt. Nach 1,5 h wurden erneut 2,4 mmol Chlorameisensäureethylester hinzugefügt und für weitere 7 h gerührt. 5 Anschließend wurde die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand in 50 ml Ethylacetat aufgenommen und mit 2×50 ml Wasser sowie 50 ml gesättigte Kochsalzlösung gewaschen. Das Rohprodukt wurde anschließend mittels Flashchromatographie (Mobile Phase n-Hexan/Ethylacetat 7:3). Blauer Feststoff (Smp.: 157–158 °C). Ausbeute: 0,45 g (52,4 %). 1H- NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 3H, J = 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J = 7,1 Hz), 4,39 (s, 2H), 5,97 (s, 2H), 6,44 10 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,42 (d, 1H, J = 6,1 Hz), 7,64 (d, 2H, J = 8,5 Hz),7,80 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 13 3 8,57 (s, 1H). C-NMR [ppm]: δ = 14,5, 32,2, 60,3, 109,3, 115,4, 125,7 (t, 2C, JC,F = 5 Hz), 2 -1 129,7 (2C), 131,9, 144,2, 149,4, 151,3 (q, JC,F = 15 Hz), 152,8, 154,4. IR [cm ]: ν̃ = 827, 1076, + 1218, 1461, 1507, 1649, 1693, 2992, 3163, 3325, 3392. HRMS: [C15H16N3O2F5S2 + H] berechnet: 430,0677, gemessen: 430,0684. 15 1.2.6 N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}buttersäureamid

1 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,28 g) wurden in 15 ml Isopropanol suspendiert und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit 20 Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 5 h gerührt. Dem

Ansatz wurden 1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1,2 mmol Buttersäurechlorid (1,2 eq, 0,12 ml) in 2 ml Ethylacetat über 10 min topfenweise hinzugefügt. Nach 2 h wurde der Katalysator abfiltriert und das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt, in wenig Isopropanol gelöst und mit Wasser präzipitiert. Der Feststoff wurde 25 abfiltriert, aus DCM umkristallisiert und mit wenig n-Hexan gewaschen. Hellgelber Feststoff (Smp.: 163–164 °C). Ausbeute: 0,11 g (34,5 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,91 (t, 3H, J = 7,4 Hz), 1,60 (se, 2H, J = 7,4 Hz), 2,28 (t, 2H, J = 7,4 Hz), 4,30 (s, 2H), 5,90 (s, 2H), 6,44 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,10 (m, 2H), 7,44 (m, 2H), 7,44 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 8,98 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ 2 3 = 13,6, 18,5, 32,6, 37,7, 109,2, 115,0 (d, 2C, JC,F = 21 Hz), 115,2, 130,7 (d, 2C, JC.F = 8 Hz), 4 1 -1 30 132,7, 135,0 (d, JC,F = 3 Hz), 150,6, 152,9, 159,9 und 162,3 (d, JC,F = 243 Hz), 171,5. IR [cm ]: + ν̃ = 753, 1208, 1456, 1504, 1589, 1650, 2960, 3147, 3334. HRMS: [C16H18N3OFS + H] berechnet: 320,1227, gemessen: 320,1232.

1.2.7 N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}pivalinsäureamid 35

Universität Greifswald VVB21219DE -20- 1 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,28 g) wurden in 10 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 4,5 h gerührt. Dem Ansatz wurden

1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1,3 mmol 5 Pivalinsäurechlorid (1,3 eq, 0,16 ml) in 2 ml THF über 10 min topfenweise hinzugefügt. Nach 2 h wurde der Katalysator abfiltriert und das Produkt durch Zugabe von Wasser präzipitiert. Der Feststoff wurde abfiltriert und aus Toluen umkristallisiert. Hellgelbe Plättchen (Smp.: 165– 166 °C). Ausbeute: 0,17 g (53,3 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,21 (s, 9H), 4,32 (s, 2H), 5,70 (s, 2H), 6,47 (d, 1H, J = 7,9 Hz), 7,08–7,12 (m, 2H), 7,20 (d, 1H, J = 7,9 Hz), 7,43–7,47 (m, 2H), 8,68 (s, 13 2 10 1H). C-NMR [ppm]: δ = 27,3 (3C), 32,5, 109,5, 115,0 (d, 2C, JC,F = 21 Hz), 115,2, 130,7 (d, 3 4 1 2C, JC,F = 8 Hz), 135,0 (d, JC,F = 4 Hz), 151,6, 154,4, 159,6 und 162,3 (d, JC,F = 243 Hz), 177,0. IR [cm-1]: ν̃ = 753, 1220, 1440, 1504, 1590, 1647, 2960, 3181, 3381. HRMS: + [C17H20N3OFS + H] berechnet: 334,1384, gemessen: 334,1388.

15 1.2.8 N-{2-Amino-6-[(cyclohexylmethyl)thio]pyridin-3-yl}buttersäureamid

2 mmol 6-[(Cyclohexylmethyl)thio]-3-nitropyridin-2-amine (0,53 g) wurden in 20 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines 20 Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 1 h gerührt. Die Suspension

wurde auf 0 °C abgekühlt und 1,4 mmol Et3N (2,8 eq, 0,39 ml) zugesetzt. Anschließend wurde eine Lösung von 2,4 mmol Buttersäurechlorid (1,2 eq, 0,25 ml) in 2 ml THF über 10 min tropfenweise hinzugefügt. Nach 3 h wurde der Reaktionsansatz filtriert und dem Filtrat 120 ml Wasser zugesetzt. Das Produkt wurde abfiltriert und zwei Mal aus Toluen umkristallisiert. 25 Hellgelber Feststoff (Smp.: 107–109 °C). Ausbeute: 0,11 g (18,7 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,91 (t, 3H, J = 7,4 Hz), 0,97 (m, 2H), 1,10–1,23 (m, 3H), 1,48 (m, 1H), 1,59 (se, 2H, J = 7,3 Hz), 1,65– 1,68 (m, 3H), 1,81 (d, 2H, J = 11,4 Hz), 2,28 (t, 2H, J = 7,4 Hz), 2,94 (d, 2H, J = 6,6 Hz), 5,79 (s, 2H), 6,43 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,42 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 9,00 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 13,6, 18,5, 25,5 (2C), 25,9, 32,1 (2C), 36,4, 37,5, 37,7, 109,2, 114,8, 132,7, 151,9, 152,9, 171,4. IR 30 [cm-1]: ν̃ = 1227, 1454, 1504, 1588, 1644, 2849, 2925, 3157, 3319, 3395. + HRMS: [C16H25N3OS + H] berechnet: 308,1791, gemessen: 308,1797.

1.2.9 2-(3,5-Dimethoxyphenyl)-N-[6-(isobutylthio)-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl]acetamid

35 1 mmol 6-(Isobutylthio)-3-nitro-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin (0,28 g) wurden in 10 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons Universität Greifswald VVB21219DE -21- unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 0,5 h gerührt. Anschließend wurde die

Suspension auf 0 °C abgekühlt. Dem Ansatz wurden 1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1,2 mmol 2-(3,5-Dimethoxyphenyl)acetylchlorid (0,26 g) in 1,5 ml DCM über 15 min zugetropft. Nach 3 h wurden der Mischung 100 ml Wasser zugesetzt 5 und mit 100 ml Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde mit 2×100 ml Wasser und

gesättigter Kochsalzlösung gewaschen sowie über Na2SO4 getrocknet. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt woraufhin ein grünes Öl zurückblieb. Dieses kristallisierte bei Lagerung im Kühlschrank aus und konnte anschließend aus Methanol umkristallisiert werden. Leicht grünliche Nadeln (Smp.: 137–138 °C). Ausbeute: 0,09 g (19,8 %). 1H-NMR [ppm]: 10 δ = 0,97 (d, 6H, J = 6,7 Hz), 1,77 (t, 4H, J = 6,6 Hz), 1,87 (sep, 1H, J = 6,7 Hz), 2,99 (d, 2H, J = 6,7 Hz), 3,37 (t, 4H, J = 6,6 Hz), 3,51 (s, 2H), 3,73 (s, 6H), 6,39 (t, 1H, J = 2,3 Hz), 6,48 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 6,50 (d, 2H, J = 2,4 Hz), 7,12 (d, 1H, J = 7,9 Hz), 9,39 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 21,7 (2C), 24,9 (2C), 28,4, 37,5, 42,9, 48,1 (2C), 55,1 (2C), 98,4, 107,2 (2C), 109,4, 114,5, 137,8, 137,9, 152,8, 153,9, 160,3 (2C), 169,5. IR [cm-1]: ν̃ = 1054, 1148, 1203, 1439, 1515, + 15 1594, 1649, 2863, 2959, 3256. HRMS: [C23H31N3O3S + H] berechnet: 430,2159, gemessen: 430,2171.

1.2.10 N-{6-[(Cyclohexylmethyl)thio]-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl}-2-(3,5- dimethoxyphenyl)acetamid 20

1 mmol 6-[(Cyclohexylmethyl)thio]-3-nitro-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin (0,32 g) wurden in 10 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 1 h gerührt. Dem Ansatz

25 wurden 1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1,2 mmol 2-(3,5-Dimethoxyphenyl)acetylchlorid (0,26 g) in 1,5 ml DCM über 15 min zugetropft. Nach 1 h wurde die Suspension filtriert und das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt. Der

Rückstand wurde in Diethylether aufgenommen und mit Wasser, gesättigter NaHCO3-Lösung

und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 30 getrocknet und nach entfernen des Lösemittels aus Methanol umkristallisiert. Das Produkt wurde anschließend mittels präparativer HPLC aufgereinigt (Gradient: 50–90 % Methanol/Wasser, selbstgepackte C18-Säule). Dabei präzipitierte das Produkt nachdem der Methanol am Rotationsverdampfer entfernt wurde. Farbloser Feststoff (Smp.: 142–144 °C). Ausbeute: 0,04 g (8,5 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,95–0,98 (m, 2H), 1,09–1,24 (m, 5H), 1,55–1,82 35 (m, 10H), 2,98 (d, 2H, J = 5,8 Hz), 3,37 (m, 4H), 3,51 (s, 2H), 3,73 (s, 6H), 6,39–6,50 (m, 4H), 7,11 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 9,39 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 24,9 (2C), 25,6 (2C), 25,9, 32,1 (2C), 36,0, 37,7, 42,9, 48,1 (2C), 55,1 (2C), 98,4, 107,2 (2C), 109,4, 114,4, 137,8, 137,9, 152,9, 153,9, 160,3 (2C), 169,6. IR [cm-1]: ν̃ = 1064, 1142, 1200, 1446, 1517, 1589, 1650, 2848, 2919, + 3243. HRMS: [C26H35N3O3S + H] berechnet: 470,2472, gemessen: 470,2485. 40 Universität Greifswald VVB21219DE -22- 1.2.11 3-(3,5-Difluorphenyl)-N-[6-(isobutylthio)-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl]propionsäureamid

1 mmol 6-(Isobutylthio)-3-nitro-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin (0,28 g) wurden in 10 ml THF gelöst und 5 eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 1 h gerührt. Dem Ansatz wurden

1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1 mmol 3-(3,5- difluorphenyl)propanoylchlorid (1,0 eq, 0,20 g) in 1,1 ml DCM über 10 min hinzugefügt. Nach 30 min wurde der Katalysator abfiltriert, dem Reaktionsansatz 100 ml Wasser zugesetzt und das 10 Produkt mit 100 ml Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde mit 100 ml Wasser,

100 ml gesättigter NaHCO3-Lösung und 100 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach

trocknen der Etherphase über Na2SO4 und Evaporation des Lösemittels resultierte ein grüngefärbter Feststoff welcher aus einer Ethanol/Wasser-Mischung (9:1) umkristallisiert wurde. Farbloser Feststoff (Smp.: 138–140 °C). Ausbeute: 0,17 g (40,6 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,97 (d, 15 6H, J = 6,7 Hz), 1,77 (t, 4H, J = 6,6 Hz), 1,87 (sep, 6,7 Hz), 2,62 (t, 2H, J = 7,3 Hz), 2,92 (t, 2H, J = 7,3 Hz), 2,99 (d, 2H, J = 6,6 Hz), 3,32 (t, 4H, J = 6,6 Hz, 6,48 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 6,97–7,08 (m, 3H), 7,06 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 9,26 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 21,7 (2C), 25,0 (2C), 28,4, 2 2 30,2, 36,2, 38,9, 48,1 (2C), 101,4 (t, JC,F = 26 Hz), 109,4, 111,6 (dd, 2C, JC,F = 18 Hz, 3 3 JC,F = 6 Hz), 114,4, 137,8, 146,0 (t, JC,F = 9 Hz), 152,7, 154,0, 160,0 und 163,5 (dd, 2C 1 3 -1 20 JC,F = 246 Hz, JC,F = 14 Hz), 170,7. IR [cm ]: ν̃ = 849, 1110, 1232, 1449, 1515, 1592, 1643, + 2845, 2961, 3267. HRMS: [C22H27N3OF2S + H] berechnet:420,1916, gemessen: 420,1904.

1.2.12 N-{2-Amino-6-[(cyclopropylmethyl)thio]pyridin-3-yl}-3-(3,5-difluorphenyl)propion- säureamid 25

2 mmol 6-[(Cyclopropylmethyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,45 g) wurden in 20 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 3 h gerührt. Dem Ansatz wurden

30 2,8 mmol Et3N (1,4 eq, 0,39 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 2 mmol 3-(3,5- difluorphenyl)propanoylchlorid (1,0 eq, 0,40 g) in 2,2 ml DCM über 10 min hinzugefügt. Nach 1 h wurde der Katalysator abfiltriert und die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt. Der resultierende grüne Feststoff wurde zwei Mal aus einer Ethanol/Wasser-Mischung (8:2) umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 122–125 °C). Ausbeute: 0,24 g (33,1 %). 1H-NMR Universität Greifswald VVB21219DE -23- [ppm]: δ = 0,24–0,28 (m, 2H), 0,49–0,54 (m, 2H), 1,02–1,11 (m, 1H), 2,66 (t, 2H, J = 15,3), 2,94 (t, 2H J = 15,2 Hz), 2,99 (d, 2H, J = 7,0 Hz), 5,81 (s, 2H), 6,44 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,00–7,07 (m, 3H), 7,37 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 9,03. 13C-NMR [ppm]: δ = 5,5 (2C), 10,8, 30,4, 34,9, 36,4, 101,4 (t, 2 2 3 JC,F = 26 Hz), 109,1, 111,4 (dd, 2C, JC,F = 18 Hz, JC,F = 6 Hz), 114,5, 132,8, 145,9 (t, 3 1 3 5 JC,F = 9 Hz), 152,2, 153,1, 161,1 und 163,5 (dd, 2C, JC,F = 246 Hz, JC,F = 14 Hz), 170,4. IR [cm-1]: ν̃ = 771, 832, 968, 1114, 1463, 1523, 1592, 1639, 3091, 3154, 3283, 3465. HRMS: + [C18H19N3OF2S + H] berechnet: 364,1290, gemessen: 364,1282.

1.2.13 Ethyl-{2-amino-5-brom-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat 10

0,5 mmol Ethyl-{2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat (0,17 g) wurden in einer Mischung aus 5 ml THF und 5 ml ACN gelöst, 0,05 mmol Ammoniumacetat (0,1 eq, 0,004 mg) zugesetzt und der Reaktionsansatz auf 0 °C abgekühlt. Portionsweise wurden anschließend 15 0,5 mmol N-Bromsuccinimid (1 eq, 0,09 g) hinzugefügt. Nach 2h wurde die Suspension am Rotationsverdampfer eingeengt und das Rohprodukt mittels MPLC (Gradient: 0–100 % Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Das resultierende Produkt wurde anschließend aus DCM umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 171–173 °C). Ausbeute: 0,06 g (28,5 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,23 (t, 3H, J = 7,1 Hz), 4,11 (q, 2H, J = 7,1 Hz), 4,33 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 7,07–7,11 20 (m, 2H), 7,47–7,50 (m, 2H), 7,71 (s, 1H), 8,73 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,4, 32,9, 60,6, 2 3 4 101,2, 114,9 (d, 2C, JC,F = 21 Hz), 116,2, 131,0 (d, 2C, JC,F = 8 Hz), 133,5, 135,1 (d, JC,F = 3 1 -1 Hz), 151,4, 154,3, 159,9 und 162,3 (d, JC,F = 243 Hz). IR [cm ]: ν̃ = 755, 837, 1054, 1217, + 1265, 1434, 1505, 1608, 1664, 2985, 3244, 3362, 3470. HRMS: [C15H15N3O2FSBr + H] berechnet: 400,0125, gemessen: 400,0113. 25 1.2.14 Ethyl-{2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]-5-methylphenyl}carbamat

1,75 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl(thio]-5-methyl-3-nitropyridin-2-amin (0,51 g) wurden zusammen mit

30 17,5 mmol Eisenpulver (10 eq, 0,95 g) und 17,5 mmol NH4Cl (0,94 g) in einer Mischung aus 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für 4 h zum Rückfluss erhitzt und anschließend über Kieselgur filtriert. Der Rückstand wurde mit 50 ml Ethylacetat gewaschen und dem Filtrat 50 ml Wasser zugesetzt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase mit 2×50 ml Ethylacetat extrahiert. Den vereinten organischen Phasen wurden

35 17,5 mmol Et3N (10 eq, 2,4 ml) sowie 2,21 mmol Chlorameisensäureethylester (1,3 eq, 0,21 ml) zugesetzt und die Lösung bei 40 °C über Nacht gerührt. Die resultierende Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: 0 Ethylacetat/n-Hexan/0,1 % Et3N). Farbloser Feststoff (Smp: 114-115 C). Ausbeute: 0.08 g Universität Greifswald VVB21219DE -24- (22,14%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,56 (s, 1H), 7,45 (m, 2H), 7,31 (s, 1H), 7,10 (m, 2H), 5,70 (s, 2H), 4,36 (s, 2H), 4,12 (q, J= 7,04 Hz, 2H), 1,98 (s, 3H), 1,25 (t, J= 6,96 Hz, 2H); 13C NMR [ppm]: δ= 162,2 (d, J= 243 Hz, 1C), 154,5, 135,6 (d, J= 3 Hz, 1C), 131,0 (d, J= 8 Hz, 2C), 117,0, 115,0 (d, J= 21 Hz, 2C), 60,3, 31,8, 16,6, 14,5; IR [cm-1]: ṽ = 3446, 3355, 3287, 1679, 1509, 1442, 1259, + 5 1219, 1083. HRMS: [C16H18N3O2FS + H] berechnet: 3336,1177, gemesssen: 336,1171.

1.2.15 Ethyl-{6-[(4-fluorbenzyl)thio]-2-methylpyridin-3-yl}carbamat

H N O

O S N

F 10 1,8 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-2-methyl-3-nitropyridin (0,50 g) und 9 mmol SnCl2•2H2O (5 eq, 2,03 g) wurden in 20 ml Ethanol suspendiert und unter Argon-Atmosphäre bei 70 °C über Nacht

gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C abgesenkt und 18,36 mmol Et3N (10,2 eq, 2,56 ml) sowie 2,34 mmol Chlorameisensäureethylester (1,3 eq, 0,22 ml) zugesetzt. Nach 3 h wurde die Suspension über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 30 ml Ethanol 15 gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer aufkonzentriert und das Produkt durch Wasserzugabe präzipitiert. Beiger Feststoff (Smp.: 102-103 0C); Ausbeute: 0.6 g ( 84%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,99 (s, 1H), 7,60 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,13 (m, 3H), 4,36 (s, 2H), 4,13 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 2,40 (s, 3H), 1,25 (t, J= 7,1 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 162,3 (d, J= 243 Hz, 1C), 154,4, 152,0, 134,7 (d, J= 3 Hz, 1C), 132,8, 130,8 (d, J= 8 Hz, 2C), 129,5, 119,5, 20 115,1 (d, J=21 Hz, 2C), 60,43, 32,8, 20,8, 14,5; IR [cm-1]: ṽ = 3284, 2980, 1689, 1509, 1442, + 1250, 1061; HRMS: [C16H17N2O2FS + H] berechnet: 321.1068, gemessen: 321.1060.

1.2.16 N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}-3,4-difluorbenzamid

25 5 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (1,40 g) wurden zusammen mit 50 mmol

Eisenpulver (10 eq, 2,80 g) und 50 mmol NH4Cl (10 eq, 2,68 g) in einer Mischung aus 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für eine Stunde zum Rückfluss erhitzt und anschließend über Kieselgur filtriert. Dem Filtrat wurden 50 ml Wasser 30 zugesetzt und mit 2×50 ml Ethylacetat extrahiert. Der organischen Phase wurden 7,5 mmol

Et3N (1,5 eq, 1,05 ml) zugesetzt und die Lösung auf 0 °C abgekühlt. 5 mmol 3,4- Difluorbenzoylchlorid (1 eq, 0,63 ml) wurden tropfenweise über 30 min zugegeben und die Mischung anschließend für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Durch Aufkonzentration der Lösung am Rotationsverdampfer und Lagerung im Kühlschrank präzipitierte das Produkt und 35 konnte abschließend aus DCM umkristalllisiert werden. Farbloser Feststoff (Smp.: 150-151 0C). Ausbeute: 0.68 g (35%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,64 (s, 1H), 8,08 (m, 1H), 7,86 (d, J= 2,0 Hz, 1H), 7,63 (m, 1H), 7,56 (m, 2H), 7,34 (d, 1H), 7,13 (m, 2H), 6,49 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 6,09 (s, 2H), 4,34 (s, 2H); 13C NMR [ppm]: δ= 167,3, 162,3 (d, J= 241 Hz, 1C), 154,6, 152,5, 150,3, 147,8, Universität Greifswald VVB21219DE -25- 135,2, 135,0 (d, J= 3 Hz, 1C), 130,8 (d, J= 8 Hz, 2C), 125,4, 117,5 (d, J= 9 Hz, 1C), 117,3 (d, J= 9 Hz, 1C), 115,1 (d, J= 21 Hz, 2C), 114,1, 109,0 , 32,5; IR [cm-1]: ṽ = 3396, 3298, 3150, + 1629, 1504, 1462, 1226, 750; HRMS: [C19H14N3OF3S + H] berechnet: 388.0737, gemessen: 388.0747. 5 1.2.17 Ethyl-(6-{[(1,1′-biphenyl)-4-ylmethyl]thio}-2-aminopyridin-3-yl)carbamat

2 mmol 6-{[(1,1′-Biphenyl)-4-ylmethyl]thio}-3-nitropyridin-2-amin (0,68 g) wurden zusammen mit

10 10 mmol SnCl2•2H2O (2,26 g) in 20 ml Ethanol suspendiert und unter Argon-Atmosphäre bei 70 °C für 24 h gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C reduziert und 20,4 mmol

Et3N (10,2 eq, 2,85 ml) sowie 2,6 mmol Chlorameisensäureethylester (1,3 eq, 0,25 ml) zugesetzt. Der Reaktionsansatz wurde über Nacht gerührt und die Suspension anschließend über Kieselgur filtriert. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer aufkonzentriert und das 15 Produkt durch Wasserzugabe gefällt. Abschließend wurde aus DCM umkristallisiert. Beiger Feststoff (Smp.: 165-167 0C); Ausbeute: 0.3 g (38 %); 1H NMR [ppm]: δ= 8,58 (s, 1H), 7,65 (m, 2H), 7,60 (m, 2H), 7,50 (m, 5H), 7,56 (m, 1H), 6,48 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 5,96 (s, 2H), 4,35 (s, 2H), 4,12 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 1,24 (t, J= 7,1 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 154,9, 154,2, 152,0, 139,6, 139,5, 130,8 (2C), 129,9, 128,9 (2C), 127,5, 126,5 (2C), 126,4 (2C), 120,1, 108,6, 60,6, 58,7, -1 20 14,4; IR [cm ]: ṽ = 3484, 3290, 3161, 1703, 1622, 1460, 1219, 1065, 747; HRMS: [C21H21N3O2S - H]- berechnet: 378,1282, gemessen: 378,1272.

1.2.18 Ethyl-{2-amino-6-[(3,5-dimethoxybenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat

25 2,5 mmol 6-[(3,5-Dimethoxybenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,80 g) wurden zusammen mit

12,5 mmol SnCl2•2H2O (5 eq, 2,82 g) in 20 ml Ethanol suspendiert und unter Argon- Atmosphäre bei 70 °C über Nacht gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C

gesenkt und der Suspension 25,5 mmol Et3N (10,2 eq, 3,5 ml) sowie 3,25 mmol 30 Chlorameisensäureethylester (1,3 eq, 0,31 ml) zugesetzt. Nach 4 h wurde der Reaktionsansatz über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 60 ml Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Das Produkt wurde abschließend in wenig Ethanol gelöst und durch Wasserzugabe präzipitiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 84-85 0C); Ausbeute = 35 0.46 g (52%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,57 (bs, 1H), 7,41 (d, J= 5,1 Hz, 1H), 6,57 (d, J= 2,1 Hz, 2H), 6,44 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 6,34 (t, 1H), 5,94 (s, 2H), 4,22 (s, 2H), 4,12 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 3,70 (s, 6H), 1,24 (t, J= 7,0 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 160,2 (2C), 154,4, 152,8, 150,4, 140,9, 131,8, Universität Greifswald VVB21219DE -26- 115,2, 109,4, 106,7 (2C), 98,7, 60,3, 55,1 (2C), 33,7, 14,5; IR: ṽ = 3475, 3285, 3163, 2935, -1 + 1685, 1598, 1520, 1460, 1202, 1148, 1057 cm ; HRMS: [C17H21N3O4S + H] berechnet: 364.1326, gemessen: 364.1317.

5 1.2.19 Ethyl-{2-amino-6-[(pyridin-2-ylmethyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat

1 mmol 3-Nitro-6-[(pyridin-2-ylmethyl)thio]pyridin-2-amin (0,26 g) wurden zusammen mit 4,6

mmol SnCl2•2H2O (4,6 eq, 1,04 g) in 10 ml Ethanol suspendiert und unter Argon-Atmosphäre 10 bei 70 °C für 22 h gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C abgesenkt und 10,2

mmol Et3N (10,2 eq, 1,4 ml) sowie 1,3 mmol Chlorameisensäureethylester (0,12 ml) zugesetzt. Der Reaktionsansatz wurde über Nacht gerührt und anschließend über Kieselgur filtriert. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand mit Wasser versetzt und mit DCM extrahiert. Die organische Phase wurde evaporiert und der Rückstand mittels 15 Flashchromatographie aufgereinigt. Brauner Feststoff (Smp.: 129-131 0C); Ausbeute: 0.09 g (30%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,57 (s, 1H), 8,49 (d, J= 4,3 Hz, 1H), 7,73 (m, 1H), 7,50 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 7,41 (d, J= 6,0 Hz, 1H), 7,25 (m, 1H), 6,49 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 5,94 (s, 2H), 4,39 (s, 2H), 4,12 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 1,24 (t, J= 7,1 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 158,2, 154,5, 152,8, 150,3, 149,0, 136,7, 131,9, 130,1, 123,1, 122,1, 115,2, 109,2, 60,4, 45,6, 35,7, 14,5; IR [cm-1]: ṽ = + 20 3361, 3227, 2979, 2929, 1721, 1524, 1456, 1245, 1221, 1071; HRMS: [C14H16N4O2S +H] berechnet: 305.1067, gemessen: 305.1061.

1.2.20 Ethyl-(2-amino-6-{[2-(piperidin-1-yl)ethyl]thio}pyridin-3-yl)carbamat

25 1 mmol 3-Nitro-6-{[2-(piperidin-1-yl)ethyl]thio}pyridin-2-amin (0,28 g) wurden zusammen mit 4,6

mmol SnCl2•2H2O (4,6 eq, 1,02 g) in 10 ml Ethanol suspendiert und unter Argon-Atmosphäre bei 70 °C für 25 h gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C gesenkt und 10,2

mmol Et3N (10,2 eq, 1,4 ml) sowie 2,6 mmol Chlorameisensäureethylester (2,6 eq, 0,24 ml) 30 zugesetzt. Die Suspension wurde für weitere 3 h gerührt, anschließend über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 60 ml Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand mit 50 ml Wasser versetzt und mit DCM extrahiert. Die organische Phase wurde abschließend evaporiert. Brauner Feststoff (Smp.: 136-137 0C); Ausbeute: 0.1 g (32%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,55 (s, 1H), 7,40 (d, J= 6.1 Hz, 1H), 6,44 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 5,82 (s, 35 2H), 4,12 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 3,14 (q, J= 8,8 Hz, 2H), 2,50 (m, 2H), 2,38 (m, 4H), 1,51 (m, 4H), 1,39 (m, 2H), 1,24 (t, J= 7,1 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 154,5, 152,8, 151,1, 131,9, 114,9, 109,3, 60,3, 58,2, 53,8 (2C), 26,9, 25,5 (2C), 24,0, 14,5; IR [cm-1]: ṽ = 3341, 3212, 2934, 1713, + 1530, 1452, 1214, 1065; HRMS-ESI m/z [C15H24N4O2S +H] berechnet: 325.1693, gemessen: 325.1698. 40 Universität Greifswald VVB21219DE -27- 1.2.21 N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}-2-(3,5-difluorpheny)acetamid

1,5 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,42 g) wurden zusammen mit 15 mmol

5 Eisenpulver (10 eq, 0,84 g) und 15 mmol NH4Cl (10 eq, 0,81 g) in einer Mischung aus 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für eine Stunde zum Rückfluss erhitzt, anschließend über ein Papierfilter filtriert und der Rückstand mit 75 ml

Ethylacetat gewaschen. Dem Filtrat wurden 1,5 mmol Et3N (1 eq, 0,21 ml) sowie 2 mmol 2-(3,5- Difluorphenyl)acetylchlorid zugesetzt und für 1 h bei 40 °C gerührt. Anschließend wurde die 10 Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Abschließend wurde aus Ethanol umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp: 166-167 0C). Ausbeute: 0.08 g (21,4%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,29 (s, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,40 (d, J= 7,96 Hz, 1H), 7,12 (m, 5H), 6,44 (d, J= 7,96 Hz, 1H), 6,00 (s, 2H), 4,31 (s, 2H), 3,71 (s, 2H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,5, 163,4 (dd, J= 13 Hz, J= 15 240 Hz, 2C), 162,3, 159,9, 153,3, 151,4, 140,4 (t, J= 10 Hz, 1C), 135,0 (d, J= 3 Hz, 1C), 133,2, 130,8 (d, J= 8 Hz, 2C), 115,1 (d, J= 21 Hz, 2C), 114,6, 112,7 (dd, J= 7 Hz, J= 18 Hz, 2C), 109,1, 102,2 (t, J= 26 Hz, 1C), 41,8, 32,5; IR [cm-1]: ṽ = 3404, 3179, 1644, 1505, 1454, 1223, + 1119, 839; HRMS: [C14H16N4O2S +H] berechnet: 404,1039, gemessen: 404,1038.

20 1.2.22 N-[6-(Benzylthio)-2-(methylamino)pyridin-3-yl]-2-(3,5-difluorphenyl)acetamid

2,8 mmol 6-(Benzylthio)-N-methyl-3-nitropyridin-2-amin (0,77 g) wurden zusammen mit

28 mmol Eisenpulver (10 eq, 1,57 g) und 28 mmol NH4Cl (10 eq, 1,50 g) in einer Mischung aus 25 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für 2 h zum Rückfluss erhitzt, die Suspension anschließend über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 2×50 ml Ethylacetat gewaschen. 50 ml Wasser wurden zugesetzt und die Phasen getrennt. Die wässrige Phase wurde mit 2×50 ml Ethylacetat extrahiert und den vereinten organischen Phasen wurden 5,6 mmol HATU (2 eq, 2,10 g) sowie 2,8 mmol 2,6-Dichlorphenylessigsäure 30 (1 eq, 0,60 g) zugesetzt und die Mischung bei 40 °C über Nacht gerührt. Die Suspension wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Das Rohprodukt wurde in wenig Ethanol gelöst und durch Wasserzugabe präzipitiert. Lavendelfarbener Feststoff (Smp.: 201-202 0C); Ausbeute: 0.08 g (8%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,25 (s, 1H), 7,40 (m, 2H), 7,30 (m, 4H), 7,13 (m, 3H), 6,41 (d, J= 7,8 35 Hz, 1H), 6,23 (d, J= 4,6 Hz, 2H), 4,38 (s, 2H), 3,70 (s, 2H), 2,89 (d, J= 4,6 Hz, 2H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,7, 163,4 (dd, J= 13 Hz, J= 244 Hz, 2C), 153,2, 151,6, 140,4 (t, J= 10 Hz, 1C), 138,9, 133,2, 128,6 (2C), 128,3 (2C), 126,8, 115,1, 112,7 (dd, J= 6 Hz, J= 17 Hz, 2C), 107,9, 102,2 (t, J= 26 Hz, 1C), 41,8, 33,3, 27,9; IR [cm-1]: ṽ = 3442, 3404, 3269, 1652, 1591, 1496, Universität Greifswald VVB21219DE -28-

- 1389, 1230, 1119, 991, 696; HRMS: [C14H16N4O2S – H] berechnet: 398.1144, gemessen: 398.1157.

1.2.23 N-(2-Amino-6-{[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl]thio}pyridin-3-yl)-2-(3,5-difluorphenyl)- 5 acetamid

a) 2-(3,5-Difluorphenyl)acetylchlorid

10 mmol 3,5-Difluorphenylessigsäure (1,72 g) wurden in 15 ml trockenem DCM gelöst und 10 unter Stickstoffatmosphäre 11 mmol Oxalylchlorid (1,1 eq, 0,93 ml) hinzugefügt. Dem Reaktionsansatz wurden vorsichtig 4 Tropfen trockenes DMF zugesetzt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Lösung wurde ohne weitere Aufreinigung für weitere Reaktionen eingesetzt.

15 b) N-(2-Amino-6-{[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl]thio}pyridin-3-yl)-2-(3,5- difluorphenyl)acetamid

0,8 mmol 3-Nitro-6-{[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl]thio}pyridin-2-amin (0,22 g) wurden

20 zusammen mit 8 mmol Eisenpulver (10 eq, 0,45 g) und NH4Cl (10 eq, 0,43 g) in einer Mischung aus 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für 3 h zum Rückfluss erhitzt, die Suspension anschließend über ein Papierfilter filtriert und der Rückstand

mit 50 ml Ethylacetat gewaschen. Dem Filtrat wurden 1,5 mmol Et3N (1,9 eq, 0,17 ml) und 1,2 mmol 2-(3,5-Difluorphenyl)acetylchlorid aus (a) zugesetzt. Die Lösung wurde für 1,5 h auf 25 40 °C erwärmt und anschließend im Rotationsverdampfer eingeengt. Das Produkt wurde abschließend mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Farbloser Feststoff ( Smp.: 136-137 0C). Ausbeute: 0.21 g (54%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,27 (s, 1H), 7,38 (d, J= 7,96 Hz, 1H), 7,14 (m, 3H), 6,44 (d, J= 7,96 Hz, 1H), 5,91 (s, 2H), 3,87 (m, 1H), 3,70 (s, 2H), 3,40 (m, 3H), 3,21 (m, 2H), 1,78 (m, 7H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,5, 163,4 (dd, J= 30 13 Hz, J= 244 Hz, 2C), 153,3, 152,1, 140,4 (t, J= 10 Hz, 1C), 133,3, 114,3, 112,7 (dd, J= 7 Hz, J= 19 Hz, 2C), 109,1, 102,2 (t, J= 26 Hz, 1C), 76,4, 67,5, 41,8, 34,9, 30,6, 25,4, 22,7; IR [cm-1]: + ṽ = 3305, 3180, 2940, 1645, 1463, 1114, 671; HRMS: [C14H16N402S +H] berechnet: 394,1395, gemessen: 394,1390.

35 Universität Greifswald VVB21219DE -29- 1.2.24 N-(6-{[(1,3-Dioxolan-2-yl)methyl]thio}-2-morpholinopyridin-3-yl)-2-(3,5- difluorphenyl)acetamid

5 2 mmol 4-(6-{[(1,3-Dioxolan-2-yl)methyl]thio}-3-nitropyridin-2-yl)morpholin (0,65 g) wurde in 15 ml THF suspendiert und zwei Spatelspitzen Raney-Nickel zugesetzt. Der Reaktionsansatz wurde mittels Ballon unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und für 2 h bei Raumtemperatur

gerührt. Anschließend wurden 2 mmol Et3N (1 eq, 0,28 ml) sowie 3 mmol 2-(3,5- Difluorphenyl)acetylchlorid aus 1.2.23 (a) zugesetzt und für weitere 4 h gerührt. Die Suspension 10 wurde danach über Kieselgur filtriert, das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Abschließend wurde das Produkt aus Ethanol umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 104 - 105 0C). Ausbeute: 0.24 g (27%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,34 (s, 1H), 7,73 (d, J= 8,20 Hz, 1H), 7,17 (m, 3H), 6,92 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 5,08 (t, J= 4,52 Hz, 1H), 3,94 (m, 2H), 3,84 (m, 2H), 3,75 (s, 15 2H), 3,44 (m, 4H), 3,35 (m, 4H), 3,05 (m, 4H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,2, 163,5 (dd, J= 13 Hz, J= 243 Hz, 2C), 154,2, 150,5, 140,1 (t, J= 10 Hz, 1C), 134,5, 120,8, 115,0, 112,5 (dd, J= 7 Hz, J= 17 Hz, 2C), 102,5, 102,3, 65,8 (2C), 64,6 (2C), 48,7 (2C), 42,2, 32,5; IR [cm-1]: ṽ = 3265, + 1657, 1516, 1463, 1118, 958; HRMS: [C14H16N4O2S +H] berechnet: 452,1450, gemessen: 452,1452. 20 1.2.25 N-{2-Amino-6-[(cyclobutylmethyl)thio]pyridin-3-yl}-2-(3,5-difluorphenyl)acetamid

2 mmol 6-[(Cyclobutylmethyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,48 g) wurden in 15 ml THF 25 suspendiert und 2 Spatelspitzen Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mittels Ballon unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und für 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Suspension über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 75 ml

Ethylacetat gewaschen. Das Filtrat wurde auf 0 °C abgekühlt und 2 mml Et3N (1 eq, 0,28 ml) sowie 2 mmol 2-(3,5-Difluophenyl)acetylchlorid tropfenweise zugesetzt. Nach 2 Stunden wurde 30 die Lösung am Rotationsverdampfer aufkonzentriert, worauf das Produkt präzipitierte. Abschließend wurde aus DCM umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 199 -200 0C). Ausbeute: 0.47 g (65%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,99 (s, 1H), 7,81 (d, J= 8,00 Hz, 1H), 7,14 (m, 3H), 6,71 (d, J= 8,12 Hz, 1H), 3,82 (s, 2H), 3,22 (d, J= 7,56 Hz, 2H), 2,07 (m, 2H), 1,85 (s, 4H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,9, 163,4 (dd, J= 13 Hz, J= 245 Hz, 2C), 151,5, 140,1 (t, J= 10 Hz, 1C), 35 134,6, 112,8 (dd, J= 7 Hz, J= 17 Hz, 2C), 110,8, 102,3 (t, J= 26 Hz, 1C), 41,7, 37,3, 34,2, 27,1 Universität Greifswald VVB21219DE -30-

-1 + (2C), 17,4; IR [cm ]: ṽ = 3071, 1650, 1524, 1251, 1115, 991, 838; HRMS: [C14H16N4O2S +H] berechnet: 364,1290, gemessen: 364,1287.

2. In vitro Untersuchungen 5 2.1 eingesetzte Substanzen

Die in den in vitro Untersuchungen eingesetzten Substanzen sind in Tabelle 2 gezeigt.

10 Tabelle 2 in den in vitro Untersuchungen eingesetzten Substanzen Nummer Struktur Name O O Ethyl-2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)- NH amino]-3-pyridincarbamat-Maleat Vergleichs (Flupirtin-Maleat) N N NH2 beispiel 1 H COOH F HOOC

Ethyl-{2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)- thio]pyridin-3-yl}carbamat 1

Ethyl-(2-amino-6-{[4-(trifluormethyl)- benzyl]thio}pyridin-3-yl)carbamat 2

Ethyl-{2-amino-6-[(3,4- difluorbenzyl)thio]pyridin-3- 3 yl}carbamat

Ethyl-{2-amino-5-brom-6-[(4- fluorbenzyl)thio]pyridin-3- 4 yl}carbamat

Ethyl-(2-amino-6-{[4-(pentafluor-λ6- sulfanyl)benzyl]thio}pyridin-3- 5 yl)carbamat

Universität Greifswald VVB21219DE -31- Nummer Struktur Name N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)- thio]pyridin-3-yl}buttersäureamid 6

N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)- thio]pyridin-3-yl}pivalinsäureamid 7

N-{2-Amino-6-[(cyclohexylmethyl)- thio]pyridin-3-yl}buttersäureamid 8

N-{6-[(Cyclohexylmethyl)thio]-2- (pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl}-2-(3,5- 9 dimethoxyphenyl)acetamid

2-(3,5-Dimethoxyphenyl)-N-(6- (isobutylthio)-2-[pyrrolidin-1- 10 yl)pyridin-3-yl]acetamid

3-(3,5-Difluorphenyl)-N-(6- [isobutylthio)-2-(pyrrolidin-1- yl)pyridin-3-yl]propionsäureamid 11

N-{2-Amino-6-[(cyclopropylmethyl)- thio]pyridin-3-yl}-3-(3,5- difluorphenyl)propionsäureamid 12

Ethyl-{2-amino-6-[(pyridin-2- 13 ylmethyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat

Ethyl-(2-amino-6-{[2-(piperidin-1- 14 yl)ethyl]thio}pyridin-3-yl)carbamat

Universität Greifswald VVB21219DE -32- Nummer Struktur Name Ethyl-[2-amino-6-(benzylthio)pyridin- 3-yl]carbamat (6b) 15

Ethyl-{2-amino-6-[(3,5-dimethoxybenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat 16

Ethyl-(6-{[(1,1′-biphenyl)-4- ylmethyl]thio}-2-aminopyridin-3- yl)carbamat 17

Ethyl-{6-[(4-fluorbenzyl)thio]-2- methylpyridin-3-yl)carbamat 18

N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)- thio]pyridin-3-yl}-3,4- 19 difluorbenzamid

N-[6-(Benzylthio)-2- (methylamino)pyridin-3-yl]-2-(3,5- 20 difluorphenyl)acetamid

Ethyl-{2-amino-6-[(4- fluorbenzyl)thio]-5- 21 methylphenyl}carbamat

N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)- thio]pyridin-3-yl}-2-(3,5- 22 difluorphenyl)acetamid

N-(2-Amino-6-{[(tetrahydro-2H- pyran-2-yl)methyl]thio}pyridin-3-yl)- 23 2-(3,5-difluorphenyl)acetamid

Universität Greifswald VVB21219DE -33- Nummer Struktur Name F F N-(6-{[(1,3-Dioxolan-2- yl)methyl]thio}-2-morpholinopyridin- O 3-yl)-2-(3,5-difluorphenyl)acetamid 24 NH

O S N N O O N-{2-Amino-6-[(cyclobutylmethyl)thio]pyridin-3-yl}-2-(3,5- 25 difluorphenyl)acetamid

2.2 Kaliumkanal-Assay

Heute ist es die gängige Meinung, dass die analgetische Wirkung von Flupirtin durch seine 5 Öffnung der heterodimeren 7.2/3-Kaliumkanäle im ZNS zustande kommt. Deswegen wurde eine In-Vitro-Screening-Methode etabliert, um die Öffnung dieses Kanals in den mit humanen

Kaliumkanal-Kv 7.2/3 transfektierten Zellen durch Testsubstanzen zu evaluieren.[40] Das

Prinzip des Assays beruht darauf, dass HEK 293 Zellen, welche Kv 7.2/3 (spannungsabhängige Kaliumkanäle 7.2/3) exprimieren, mit einem Thallium-sensitiven Farbstoff beladen werden, der 10 durch zellinterne Esterasen zum aktiven Thallium-komplexierenden Agens gespalten wird.

Dieser bildet mit Thallium-Ionen, welche durch geöffnete Kv 7.2/3 einströmen, fluoreszierende

Komplexe. Die Intensität des Thallium-Signals ist proportional zur Anzahl der geöffneten Kv

7.2/3-Kanäle. Da es sich bei den Test-Substanzen um potentielle Kv 7.2/3-Öffner handelt, ist der Assay geeignet, um die Kaliumkanalaktivität der Substanzen zu ermitteln. 15

Zur Charakterisierung dieser Eigenschaft wird die EC50 und Emax einer Test-Substanz bestimmt.

Die halbmaximale Effektkonzentration (EC50) ist die Konzentration einer Substanz, bei der der halbmaximale Effekt des im folgend beschriebenen Assays zu beobachten ist, wenn die logarithmierte Konzentration einer Substanz gegen die zugehörigen korrigierten ΔF/F-Werte 20 geplottet wird. Damit wird demnach die Potenz einer Verbindung charakterisiert. Die intrinsische

Aktivität einer Test-Verbindung wird durch deren Emax-Wert beschrieben. Dabei handelt es sich um die maximale Antwort, bezogen auf den vorliegenden Assay, der Plateaueffekt, welche

durch die entsprechende Test-Substanz möglich ist. Hierzu wurde Emax des als Referenz verwendeten Flupirtinmaleats auf 100 % festgelegt und die maximalen Antworten der Test- 25 Substanzen relativ auf diesen Wert bezogen.

Für den zellbasierten Assay wurden HEK 293-Zellen (human embryonic kidney cells, SB-HEK-

Kv7.2/7.3, SB Drug Discovery), welche Kv 7.2/3 exprimieren, verwendet. Diese adhärenten Zellen wurden in Zellkulturflaschen (z. B. TC-Flasche T75, Standard, #83.3911, Sarstedt) im

30 Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit mit MEM (Minimum Essential Medium, #10370047, Thermo Fisher), welches 10 % FBS (fetales Kälberserum, F7524, Sigma Aldrich, hitzeinaktiviert), 2 mM L-Glutamin (G7513, Sigma Aldrich), 4 µg/ml Blasticidin S HCl (#203350- Universität Greifswald VVB21219DE -34- 25, VWR), 1 % Penicillin-Streptomycin-Mix (#15070063, Thermo Fisher) und 0,78 mg/ml G418- sulfat (CP11.2, Carl Roth) beinhaltet, kultiviert. Am Vortag des Experiments wurden Zellen, die ungefähr 80 % Konfluenz aufwiesen, mit phosphatgepufferter Salzlösung (z. B. L1825, Biochrom) gewaschen, mithilfe von TrypLE™ Express (1x) (#12604013, Thermo Fisher) vom 5 Zellkulturflaschenboden abgelöst (2 min bei 37 °C), dann mit MEM suspendiert, anschließend bei 1000 rpm 2 min zentrifugiert und nach Überstandabnahme erneut in MEM resuspendiert. Die Zellzahl der Suspension wurde mit dem automatischen Zellzählmessgerät EVE™ (NanoEnTEK) bestimmt. Daraufhin wurden 60 000 Zellen/Well/100 µL in 96 Well Vision Plates™ (sterile schwarze TC-behandelte 96 Well Mikrotiterplatten mit optischem Boden, 4ti-

10 0221, 4titude) ausgesät und 24 h bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert.

Für die Messung der Kaliumkanalaktivität der Substanzen wurde der FLIPR® Kalium-Assay-Kit (R8222 Explorer Version, Molecular Devices) verwendet. Der Assay wurde nach Anleitung des Herstellers durchgeführt, worauf im Folgenden näher eingegangen wird. Zur Herstellung des 15 Loading Buffers wurde Komponente C in 30 µL DMSO (#A994.2, Carl Roth) gelöst und zusammen mit 10 ml Komponente B in das Gefäß der Komponente A überführt. Durch Mischen wurde eine homogene Lösung erzeugt. Zusätzlich wurde dem Loading Buffer Probenecid (sc- 202773A, Santa Cruz Biotechnology) in einer Konzentration von 5 mM hinzugefügt, wobei zunächst von diesem Additiv eine 500 mM Stammlösung in 1 N NaOH-Lösung angefertigt 20 wurde, die darauffolgend 1:1 (V/V) mit Komponente B verdünnt wurde. Der pH-Wert des Loading Buffers wurde anschließend mit 1 M HCl auf 7,4 mittels pH-Elektrode eingestellt. Zu den Zellen wurden 100 µL/Well Loading Buffer zugegeben. Anschließend wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur 1 h inkubiert. Von den zu testenden Verbindungen wurde jeweils eine serielle Verdünnungsreihe (mindestens fünf Konzentrationen) in DMSO (#A994.2, Carl Roth) 25 angefertigt, wobei die Konzentrationen dem 100fachen der gewünschten späteren in-Well Konzentrationen betrugen. Die Zellen wurden mit den vorbereiteten Substanzkonzentrationen, welche im Verhältnis 1:100 (V/V) hinzugefügt wurden, weitere 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Negativkontrolle beinhaltete nur Lösungsmittel (1 % DMSO). Für die Fluoreszenzintensitätsmessungen (485 nm Exzitation, 535 nm Emission, Messmodus 30 Boden) wurde das Mikrotiterplattenlesegerät Infinite® F200 Pro (Tecan) verwendet. Die zu vermessende Platte wurde ins Gerät eingebracht. In einer Zeitspanne von 20 s, wobei alle 2,5-3 s Messwerte vom Gerät aufgenommen wurden, wurde die Fluoreszenzintensität jedes Wells bestimmt (Hintergrundmessung). Danach wurde zügig im Verhältnis 1:5 (V/V) Stimulus Buffer,

welcher 7,5 mM Tl2SO4, 12,5 mM K2SO4 und 1x Chloride-free Buffer in destilliertem Wasser 35 enthielt, zu den einzelnen Wells gegeben. Die Fluoreszenzintensität der jeweiligen Wells wurde ungefähr für weitere 2 min periodisch alle 2,5-3 s bestimmt. Die Bestimmung der Kaliumkanalöffnungsaktivität einer Verbindung anhand der aufgenommenen Daten erfolgte in mehreren Schritten. Zunächst wurde für jede Verdünnungsstufe einer Substanz deren Fluoreszenzintensitätsänderung zu einem definierten Zeitpunkt gegenüber der gemittelten 40 Fluoreszenzintensitäten der Hintergrundmessung berechnet (ΔF/F). Des Weiteren wurde dieses ermittelte Ergebnis um den analog berechneten Wert der Negativkontrolle bereinigt (korr. ΔF/F). Beim erwähnten definierten Zeitpunkt (t) war die Summe der jeweiligen um die Negativkontrolle korrigierten Fluoreszenzintensitätsänderungen der Verdünnungsreihe einer Substanz maximal. Durch visuelle Inspektion eines zugehörigen Fluoreszenzintensität-Zeit-Diagramms Universität Greifswald VVB21219DE -35- (Fluoreszenzintensität korrigiert um Negativkontrolle, relativ auf jeweiligen Hintergrund bezogen) wurde die Auswahl des Zeitpunkts kontrolliert. Folgende Gleichung fasst die beschriebene Berechnung zusammen:

Fi(t) bzw. Fk(t) ist die Fluoreszenzintensität zu einem definierten Zeitpunkt (Erläuterung s.o.)

einer Test-Substanzkonzentration bzw. der Negativkontrolle. ist der Mittelwert der Fluoreszenzintensitäten, welche während der Hintergrundmessung generiert wurden. Mithilfe 10 der GraphPad Prism Software (Version 6) wurde eine nichtlineare Regression der berechneten korrigierten ΔF/F-Werte und der zugehörigen logarithmierten Konzentrationswerte einer Verbindung durchgeführt, wobei als Passform der Kurve die vorgefertigte Gleichung „log(Agonist) gegen Effekt“ (variabler Anstieg, 4 Parameter) verwendet wurde, um unter

anderem einen EC50-Wert zu generieren. Beim Emax-Wert einer Substanz handelt es sich um die 15 Differenz des höchsten und niedrigsten korr. ΔF/F-Werts (Angabe im Auswertedatenblatt der jeweiligen nichtlinearen Regressionsanalyse durch Software) der erhaltenden sigmoidalen Kurve prozentual bezogen auf den maximal erreichten Aktivität des als Referenzsubstanz verwendeten Flupirtinmaleats.

20 Abbildung 1 zeigt zwei repräsentative Dosis-Wirkungskurven für die Öffnung des Kv 7.2/3 Kaliumkanals durch Flupirtinmaleat bzw. die wirkungsstärkste Substanz 11. Aus diesen Kurven

sind sowohl die Wirkungsstärke als EC50-Wert als auch die intrinsische Aktivität der Substanz

als Emax zu vermitteln. Je niedriger der EC50-Wert, desto höher ist die Wirkungsstärke (auch

Potenz genannt), während je größer der Emax-Wert ist, desto stärker wirksam ist die Verbindung. 25 2.3 Hepatocytenviabilitätsassy

Die Nebenwirkung von Flupirtin, die auch für seinen Entzug vom Markt verantwortlich war, ist die Hepatotoxizität. Aus diesem Grund wurden zwei Zellkulturmodelle für Hepatotoxizität 30 entwickelt, um auf toxische Wirkung der neuen Substanzen zu testen und toxische Kandidaten frühzeitig zu identifizieren. Als Zellviabilitätsassay wurde der etablierte MTT-Viabilitätsassay durchgeführt.[41] Das Prinzip des Assays beruht darauf, dass viable Zellen in der Lage sind, das gelbe, wasserlösliche MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) zum unlöslichen violetten Formazanprodukt durch mitochondriale Dehydrogenasen zu 35 reduzieren (unter Verbrauch von NADH bzw. NADPH), dessen Absorption dann photometrisch bestimmt werden kann. Der erste zellbasierte Assay wurde mit der TAMH-Zelllinie der Maus (transforming growth factor-α transgenic mouse hepatocytes) durchgeführt, der bereits in früheren Arbeiten mit Flupirtin [41] als auch mit anderen hepatotoxischen Wirkstoffen Anwendung fand und als Prädiktor von Hepatotoxizität nützlich ist.[42] Zum anderen wurde eine 40 humanen Hepatokarzinomzelllinie, die HEP-G2 (human hepatocellular carcinoma cells) als zweites Hepatotoxizitätsmodell benutzt [43], um mit einem humanen Zelllinien die Ergebnisse aus dem TAMH-Zellinie zu vergleichen. Beide Zelllinien wachsen als Monolayer in Kultur, die TAHM-Zelllinien in serumfreiem Medium, die HEP-G2-Linie in Kulturmedium mit 10 % fötalem Kälberserum. Universität Greifswald VVB21219DE -36-

Die beiden adhärenten Zelllinien wurden in Zellkulturflaschen (z. B. TC-Flasche T75, Standard,

#83.3911, Sarstedt) im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit mit, im Falle der TAMH-Zelllinie, DMEM/F12 (1:1 Mix) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12, 5 P04-41500, PAN Biotech), welches 5 % Panexin NTA (P04-95750, PAN Biotech), 10 mM Nicotinamid (N0636, Sigma Aldrich) und 0,1 % (V/V) 50 mg/ml Gentamicinsulfat-Lösung (in destilliertem Wasser, P06-03001P, PAN Biotech) beinhaltet, oder, HEP-G2-Zellen betreffend, mit RPMI 1640 (P04-16500, PAN Biotech), das 10 % FBS (fetales Kälberserum, F7524, Sigma Aldrich, hitzeinaktiviert) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Mix (P06-07100, PAN Biotech) enthält, 10 kultiviert.

TAMH-Zellen, welche eine Konfluenz von mindestens 80 % aufwiesen, wurden mit HBSS (Hanks balanced salt solution, P04-34500, PAN-Biotech) gewaschen, mithilfe von Trypsin- EDTA-Lösung (T3924, SigmaAldrich), die ca. 10 s auf den Zellen verweilte, vom 15 Zellkulturflaschenboden abgelöst (noch 2 min bei 37 °C), dann mit Soybean Trypsin Inhibitor (T6522, Sigma Aldrich) suspendiert, anschließend bei 400 g 5 min zentrifugiert und nach Überstandabnahme mit DMEM/F12 (1:1 Mix) resuspendiert. HEP-G2-Zellen wiederum, welche eine Konfluenz von ungefähr 70 % aufwiesen, wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung (z. B. L1825, Biochrom) gewaschen, mithilfe von Trypsin-EDTA-Lösung vom Zellkulturflaschen- 20 boden abgelöst (ca. 5 min bei 37 °C), dann mit RPMI 1640 suspendiert, anschließend bei 125 g 5 min zentrifugiert und nach Überstandabnahme erneut mit RPMI 1640 resuspendiert. Die Zellzahl beider Zellsuspension wurde mit dem automatischen Zellzählmessgerät EVE™ (NanoEnTEK) bestimmt. Von den murinen Zellen wurden anschließend 20 000 Zellen/Well/200 µL in 96 Well TC-Platten, Cell+, F (#83.3924.300, Sarstedt) ausgesät und 2-3 Tage bis zur

25 vollständigen Konfluenz bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Von den humanen Zellen wurden 15 000 Zellen/Well/100 µL in 96 Well TC-Platten, Standard, F

(#83.3924, Sarstedt) ausgesät und 24 h bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Von den zu testenden Verbindungen wurde jeweils eine serielle Verdünnungsreihe (mindestens fünf Konzentrationen) in DMSO (#A994.2, Carl Roth) angefertigt, wobei die Konzentrationen 30 dem 100fachen der gewünschten späteren in-Well Konzentrationen betrugen. Nach erfolgter Inkubation beider Zelllinien wurde das jeweilige in den Platten befindliche Medium verworfen und die Wells nach einem bestimmten Muster mit jeweils 200 µL/Well mit den im nachfolgenden beschriebenen verschiedenen Lösungen beladen. Die angefertigte Verdünnungsreihe einer Substanz wurde dem entsprechendem Medium im Verhältnis 1:100 (V/V) beigemischt und zu 35 den Zellen gegeben. Kontroll-Wells enthielten die entsprechenden Zellen, welche nur mit dem jeweiligen Medium und 1 % DMSO behandelt wurden. Wells, welche keine Zellen, sondern nur das entsprechende Medium mit 1 % DMSO enthielten, wurden zur Bestimmung des Hintergrunds herangezogen (Blank). Jede Bedingung wurde mindestens als Triplikat bestimmt.

Die Platten wurden 24 h bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Anschließend 40 wurde jegliche Flüssigkeit aus den Platten entfernt und eine Mischung aus dem jeweiligen Medium und einer 2,5 mg/ml MTT-Lösung (in Dulbecco’s Puffer, L11939.06, Alfa Aesar) im Verhältnis 1:5 (V/V) zu den Zellen gegeben. Es folgte eine Inkubation von 1,5-4 h bei 37 °C, 5

% CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit. Nun wurden die Platten komplett von der zugegebenen Mischung befreit und entstandene Formazankristalle mithilfe von DMSO (#7029.2, Carl Roth) in Universität Greifswald VVB21219DE -37- Lösung gebracht. Die Absorption der einzelnen Wells wurde bei λ = 570 nm mit dem SpectraMax 190 Mikroplattenlesegerät inkl. SoftMax Pro Software (Molecular Devices) ermittelt. Die Viabilität der mit der zu testenden Substanz behandelten Zellen wurde im Verhältnis zur Kontrolle angegeben. Dazu wurde der Absorptionswert eines einzelnen Wells, welches Zellen 5 beinhaltete, die mit einer Verdünnungsstufe der Substanz behandelt wurden (T), durch den Mittelwert der Absorptionswerte der Kontroll-Wells () dividiert und mit 100 multipliziert. Beide Terme wurden zuvor um den Mittelwert der gemessenen Absorptionen der Wells für die Blank-Bestimmung () korrigiert. Somit ergibt sich folgende Formel:

Zur Beurteilung des hepatotoxischen Potentials einer Substanz wurde der IC50-Wert verwendet.

Als IC50 wurde die Konzentration einer Verbindung definiert, bei welcher die Viabilität der Zellen auf 50 % sank. Zur Bestimmung dieser wurde wiederum mithilfe der MS Excel Software (2013, 15 Microsoft) eine Analyse der linearen Regression der ermittelten Viabilitäten und der zugehörigen (logarithmierten) Konzentrationen einer Substanz durchgeführt und mittels der sich

ergebenden linearen Gleichung die IC50 bestimmt.

Die Ergebnisse der Hepatoxizitäts-Untersuchung sind in Tabelle 3 zusammengefasst. In den

20 meisten Fällen konnte kein IC50-Wert berechnet werden, weil die obere Löslichkeitsgrenze der Substanzen in Zellkulturmedium unterhalb die 50% toxische Konzentration lag; d.h. die

Substanzen fiel aus, bevor eine IC50-Konzentration erreicht werden konnte.

2.4 Ergebnisse der biologischen Testung 25 Tabelle 3 fast die gesamten biologischen Testergebnisse der synthetisierte Substanzen zusammen und vergleicht sie mit der Referenzsubstanz Flupritinmaleat. Aus dem

Zusammenspiel der Ergebnisse von KV7.2/3-Öffnungsaktivität und den Hepatotoxizitäts- Ergebnissen in vitro ist ersichtlich, dass insgesamt Verbindungen der allgemeinen 30 Strukturformen (I) die Wirkung von der Referenzsubstanz Flupirtinmaleat deutlich übertreffen.

Insbesondere Verbindungen mit einem niedrigen EC50-Wert, bevorzugt einem EC50-Wert von weniger als 0,9 mikromolar (Mikromol pro Liter), weiter bevorzugt von weniger als 0,1, weiter bevorzugt von weniger als 0,01 mikromolar, sind besonders geeignet. Bei der potentesten Substanz 11 werden so niedrige Substanzkonzentrationen (0,0014 µMol pro Liter) zur 35 Erreichung des halbmaximalen Effekts auf Kaliumkanäle benötigt, dass toxische Effekte bei der resultierenden Dosierung sehr unwahrscheinlich sind. Die ermittelten Toxizitätsdaten zeigen, dass bei den durch Löslichkeit im Testmedium limitierten Konzentrationen von 63 µMol pro Liter

für Verbindung 11 keine toxischen Effekte beobachtet wurden und der IC50 daher als größer als

63 µMol pro Liter angegeben werden kann. Entsprechend ist das Verhältnis von IC50 zu EC50 40 mindestens 85-mal größer bei Substanz 11 als bei Flupirtinmaleat. Leberschädigungen während der Therapie sollten damit weniger wahrscheinlich sein. Auch der biologische Effekt

der Testsubstanz sollte größer sein (beispielsweise stärkere Analgesie), da Emax bei über 100 % lag und somit ein stärkerer Kaliumefflux zu erwarten ist als mit Flupirtinmaleat.

45 Universität Greifswald VVB21219DE -38- Tabelle 3

Ergebnisse der KV7.2/3-Öffnungsaktivitäts-Untersuchung und der Hepatoxizitäts-Untersuchung

Hepatotoxizität in vitro

KV7.2/3-Öffnungsaktivität TAMH HEP-G2

IC50 [µM] ± SD IC50 [µM] ± SD

Nr. EC50 [µM] ± SD [µM] Emax [%] [µM] [µM] Vergleichs- beispiel 1 0,918 ± 0,099 (n=6) 100 487 ± 51 (n=4) 547 ± 111 (n=7) 1 1,279 ± 0,293 (n=4) 93 ± 13 > 40 (n=3) > 40 (n=3) 2 0,237 ± 0,022 (n=3) 115 ± 19 > 20 (n=4) > 20 (n=4) 3 0,771 ± 0,076 (n=4) 96 ± 9 > 30 (n=4) > 30 (n=4) 4 > 10 (n=2) - >7.5 (n=4) >7.5 (n=4) 5 0,240 ± 0,066 (n=4) 78 ± 10 > 30 (n=4) nicht bestimmt 6 2,134 ± 0,457 (n=3) 140 ± 11 > 63 (n=4) > 63 (n=5) 7 4,544 ± 1,457 (n=3) 118 ± 28 > 63 (n=4) > 63 (n=5) 8 1,320 ± 0,440 (n=3) 120 ± 19 52 ± 16 (n=4) > 250 (n=5) 9 0,021 ± 0,006 (n=3) 162 ± 9 > 125 (n=3) > 125 (n=4) 10 0,0245 ± 0,0069 (n=3) 141 ± 11 > 125 (n=3) > 125 (n=4) 11 0,001378 ± 0,00006 (n=3) 136 ± 13 >63 (n=3) >63 (n=4) 12 0,515 ± 0,035 (n=3) 117 ± 22 > 250 (n=3) > 250 (n=4) 13 > 10 (n=3) - > 1000 (n=5) 831 ± 149 (n=3) 14 > 10 (n=4) - > 500 (n=3) > 500 (n=3) 15 1,746 ± 0,347 (n=3) 110 ± 15 > 250 (n=3) 221 ± 102 (n=5) 16 > 10 (n=2) - > 250 (n=3) 134 ± 22 (n=4) 17 0,253 ± 0,042 (n=3) 69 ± 9 > 250 (n=2) > 250 (n=4) 18 0,269 ± 0,031 (n=3) 129 ± 3 > 10 (n=5) > 30 (n=3) 19 0,260 ± 0,082 (n=4) 100 ± 23 > 30 (n=3) 8 ± 3 (n=4) 20 0,015 ± 0,002 (n=3) 147 ± 9 > 7.5 (n=3) > 10 (n=3) 21 0,447 ± 0,293 (n=3) 72 ± 4 > 63 (n=3) 58 ± 12 (n=4) 22 0,066 ± 0,013 (n=3) 114 ± 16 > 5 (n=6) > 10 (n=3) 23 1,348 ± 0,185 (n=3) 106 ± 17 > 250 (n=4) 203 ± 59 (n=4) 24 0,122 ± 0,031 (n=3) 112 ± 11 > 250 (n=2) > 250 (n=2) 25 0,021 ± 0,003 (n=3) 107 ± 7 > 63 (n=3) > 63 (n=4)

5 Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1. zeigt repräsentative Dosis-Wirkungskurven für die Öffnung des Kv 7.2/3 Kaliumkanals durch Flupirtinmaleat und Substanz 11; Abb. 2. zeigt repräsentative Dosis-Viabilitätskurven für Flupirtinmaleat in TAMH und 10 HEP-G2-Zelllinien.

Universität Greifswald VVB21219DE -39- Angeführte Literatur

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1. Verbindung der allgemeinen Formel (I)

5 , wobei

R1 ausgewählt ist aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe und -

NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoffatom und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-

10 Alkylgruppe oder miteinander und mit dem Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C3- bis C9- Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom und C1- bis C3-Alklygruppe aufweist und gegebenenfalls

zusätzlich zum Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe mindestens ein weiteres 15 Heteroatom im Cyclus aufweist;

R2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10- Heterocycloalkylgruppe, wobei mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus Stickstoff- und Sauerstoffatom umfasst ist, C6- bis C12-Arylgruppe; und C5- bis 20 C11-Heteroarylgruppe, wobei die C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10- Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe, oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe jeweils mindestens einen weiteren

Substituenten R2a aufweist, wobei R2a ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, Halogenatom, verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3- 25 Alkylgruppe, verzweigter oder unverzweigter (per)halogenierter C1- bis C3- Alkylgruppe und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkoxygruppe, und wobei die C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe ein oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind;

30 R3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkoxygruppe; verzweigter oder unverzweigter C1-C10-Alkylgruppe

und -(CH2)p-C6- bis C12-Arylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom und C1- bis C3-Alkoxygruppe aufweist und wobei die C6- bis C12-Arylgruppe einen oder mehrere Ringsysteme 35 umfasst, welche kondensiert oder separiert sind; Universität Greifswald VVB21219DE -43-

R4 ausgewählt ist aus Wasserstoff, Halogenatom und verzweigter oder unverzweigter C1-C5-Alkylgruppe; X ein Stickstoffatom oder eine –CH- Gruppe ist; n Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3 ist; 5 m Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist; und p Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist.

2. Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, wobei n Null ist und/oder m 1 ist und/oder X ein Stickstoffatom ist. 10 3. Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei

R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter

C1- bis C3-Alkylgruppe und -NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoffatom und verzweigter oder 15 unverzweigter C1- bis C3- Alkylgruppe oder miteinander und mit dem

Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C4- bis C6-Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C4- bis C6-Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom und C1- bis C3-Alklygruppe

aufweist und gegebenenfalls zusätzlich zum Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe 20 mindestens ein weiteres Sauerstoffatom im Cyclus aufweist; und/oder

R2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mono- oder Difluorphenyl-Gruppe;

CF3-Phenyl-Gruppe; F5S-Phenyl-Gruppe; C4- bis C8-Cycloalkylgruppe; verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe; Biphenyl-Gruppe; 25 Pyridin-Gruppe; Piperidin-Gruppe; Tetrahydropyran-Gruppe; Dioxolan-Gruppe und Phenyl-Gruppe, wobei die Phenyl-Gruppe mindestens einen Substituenten

R2a ausgewählt aus Wasserstoffatom und Methoxy-Gruppe aufweist; und/oder

R3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethoxy-Gruppe, Propyl-Gruppe,

30 tert-Butyl-Gruppe, -(CH2)p-Phenylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom und Methoxy-Gruppe aufweist und wobei p Null oder 1 oder 2 ist; und/oder

R4 ein Wasserstoffatom, ein Bromatom oder eine Methyl-Gruppe ist. 35 4. Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Verbindung die Formel (Ia)

(Ia) Universität Greifswald VVB21219DE -44- oder (Ib)

O O

O S N N

(Ib) oder (Ic) F

O F NH

S N N

(Ic). 5 5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I),

wobei R1, R2, R3, R4, X, n, m und p die gleiche Bedeutung haben wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert, umfassend: 10 (i) Bereitstellen einer Nitro-Verbindung der allgemeinen Formel (II)

wobei R1, R2, R4, m und n die gleiche Bedeutung haben wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert; (ii) Umsetzen der Nitro-Verbindung der allgemeinen Formel (II) gemäß (i) mit einer

15 Verbindung H-R3, wobei R3 die gleiche Bedeutung wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert hat, unter Erhalt einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).

Universität Greifswald VVB21219DE -45- 6. Verbindung der allgemeinen Formel (I), erhalten oder erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 5.

7. Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß 5 Anspruch 6 oder pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6 zur Verwendung als Arzneimittel.

8. Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß 10 Anspruch 6 oder pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6 zur Verwendung als Schmerzmittel und/oder zur Verwendung bei der Tinnitusbehandlung oder -prävention und/oder zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Krampfzuständen und/oder zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer 15 Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, Abhängigkeit, Manie, bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie.

9. Pharmazeutische Zubereitung umfassend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6 oder ein pharmazeutisch 20 akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6.

Universität Greifswald VVB21219DE -46- Zusammenfassung

Die Erfindung betrifft eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) umfassend eine Thioether- Struktur, ein Verfahren zu deren Herstellung und Verbindungen erhalten oder erhältlich nach 5 diesem Verfahren. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I), oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Verwendung als Schmerzmittel und/oder zur Verwendung bei der Tinnitusbehandlung oder -prävention und/oder 10 zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Krampfzuständen und/oder zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, Abhängigkeit, Manie, bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie. Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zubereitung umfassend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder eine Verbindung der allgemeinen 15 Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I). Universität Greifswald VVB21219DE -47-

Abb. 1 Universität Greifswald VVB21219DE -48-

Abb. 2 Veröffentlichungsverzeichnis

6 Veröffentlichungsverzeichnis

6.1 Wissenschaftliche Artikel Nicole Rüger, Georg M. Fassauer, Christian Bock, Thomas Emmrich, Anja Bodtke und Andreas Link: Substituted tetrazoles as multipurpose screening compounds, Mol. Divers. 2017, 21, 9-27. Christian Bock, Kristin Beirow, Abdrrahman S. Surur, Lukas Schulig, Anja Bodtke, Patrick J. Bednarski und Andreas Link: Synthesis and potassium KV7 channel opening activity of thioether analogues of the analgesic flupirtine, Org. Biomol. Chem. 2018, 16, 8695-8699.

Christian Bock und Andreas Link: How to replace the lost leys? Strategies towards safer KV7 channel openers, Future Med. Chem. 2019, 11, 338-355. Abdrrahman S. Surur, Kristin Beirow, Christian Bock, Lukas Schulig, Markus K. Kindermann, Anja Bodtke, Werner Siegmund, Patrick J. Bednarski und Andreas Link: Flupirtine Analogues: Explorative Synthesis and Influence of Chemical Structure on KV7.2/KV7.3 Channel Opening Activity, ChemistryOpen 2019, 8, 41-44. Christian Bock, Abdrrahman S. Surur, Kristin Beirow, Markus M. Kindermann, Lukas Schulig, Anja Bodtke, Patrick J. Bednarski und Andreas Link: Sulfide Analogues of Flupirtine and Retigabine with Nanomolar KV7.2/KV7.3 Channel Opening Activity, ChemMedChem 2019, 8. Abdrrahman S. Surur, Christian Bock, Kristin Beirow, Konrad Wurm, Lukas Schulig, Markus K. Kindermann, Anja Bodtke, Werner Siegmund, Patrick J. Bednarski und Andreas Link: Flupirtine and Retigabine as Templates for Ligand-based Drug Design of KCNQ2/3 activators, Org. Biomol. Chem. 2019. Robert K. Hofstetter, Mahmoud Hasan, Georg M. Fassauer, Christian Bock, Abdrrahman S. Surur, Steven Behnisch, Christoph W. Grathwol, Felix Potlitz, Tobias Oergel, Werner Siegmund und Andreas Link: Simultaneous quantification of acidic and basic flupirtine metabolites by supercritical fluid chromatography according to European Medicines Agency validation, J. Chrom. A (accepted manuscript).

6.2 Patentschrift Christian Bock, Abdrrahman S. Surur, Kristin Beirow, Patrick J. Bednarski und Andreas Link: Thioether als Modulatoren von KV7.2/KV7.3-Kanälen, Deutsches Patent- und Markenamt (eingereicht am 18.07.2018, patent pending).

6.3 Posterpräsentationen Christian Bock, Christian Lemmerhirt und Andreas Link: Synthesis and characterization of potassium channel openers with N-benzyl-aminopyridine structure, DPhG-Tagung 2015, Düsseldorf Christian Bock, Abdrrahman S. Surur, Kristin Beirow, Patrick J. Bednarski und Andreas Link: Synthesis and characterization of trisubstituted pyridine derivatives as modulators of the potassium channel KV7.2/3, DPhG- Tagung 2017, Saarbrücken.

152

Eigenständigkeitserklärung

Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Greifswald noch einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde. Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbstständig verfasst und keine anderen als die darin angegebenen Hilfsmittels und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten ohne Kennzeichnung übernommen habe.

Christian Bock

Danksagung

Zunächst möchte ich mich herzlich bei Prof. Dr. Andreas Link bedanken, da er mir die Möglichkeit gab diese Promotion in seinem Arbeitskreis anzufertigen und diese abschließend auch begutachtet. Ich danke außerdem für die Vergabe des spannenden Themas und die Hilfestellung bei der Bearbeitung desselben – vor allem aber für die Unterstützung bei dem Veröffentlichen der generierten Ergebnisse in verschiedenen Fachzeitschriften. Außerdem gilt mein Dank Prof. Dr. Patrick J. Bednarski für die biologische Evaluation der synthetisierten Verbindungen in seinem Arbeitskreis, wodurch die aufgestellten Aktivitäts- und Toxizitätshypothesen erst untersucht werden konnten. Ich möchte mich hiermit auch nochmal ausdrücklich bei meinen Diplomanden – Till Kasch, Simon Dehmel, Sebastian Jankow, Samuel Kamenz und Konrad W. Wurm – bedanken, da diese mir nicht einfach nur Arbeit abgenommen, sondern vielmehr durch eigene Ideen das Thema weiterentwickelt und vielseitiger gestaltet haben. Außerdem trugen sie auch stets zu einer großartigen Arbeitsatmosphäre im Labor bei. Auf diesem Wege möchte ich Konrad auch viel Erfolg bei der Weiterführung der Untersuchungen am Arzneistoff Flupirtin wünschen. Das Labor und auch das Büro musste ich fast nie allein bekleiden, sondern hatte die längste Zeit das große Vergnügen beides mit Abdrrahman S. Surur zu teilen. Ich danke ihm für die großartige Zusammenarbeit und den regen Ideen- und Wissensaustausch über drei Jahre hinweg. Außerdem bin ich ihm für die erzwungene Verbesserung meiner Englischkenntnisse zu großem Dank verpflichtet und wünsche ihm viel Erfolg für seine weitere wissenschaftliche Laufbahn. Für die Etablierung und Durchführung der Assays für Aktivität und Toxizität möchte ich mich bei Kristin Beirow und Anne Schüttler bedanken. Außerdem sei an dieser Stelle Maria Hühr für das Vermessen der NMR-Proben, Dr. Anja Bodtke für die Aufnahme von Massenspektren und Michael Eccius für die Anfertigung der IR-Spektren gedankt, da mir so eine Menge Arbeit abgenommen wurde. Generell möchte ich mich bei allen ehemaligen und aktuellen Mitarbeitern der PMC-Arbeitskreise bedanken, welche mich während der Promotion begleitet haben. So war nicht nur die Arbeit in der Universität stets von einer angenehmen Atmosphäre geprägt, auch die außeruniversitären Aktivitäten halfen mir über misslungene Synthesen hinwegzusehen. Vor allem aber die regelmäßigen Zusammenkünfte an der Kaffeemaschine in der Garderobe werden mir in guter Erinnerung bleiben. Zwar konnten die Konversationen nicht immer einer Bildungseinrichtung gerecht werden, dennoch sorgten diese für herrliche Zerstreuung und konnte auch immer auf konstruktive Ideen bei Fragestellungen gezählt werden. In diesem Zusammenhang danke ich Dr. Georg M. Fassauer, Dr. Steffen Vojacek, Robert K. Hofstetter, Christoph W. Grathwol, Stefan Lohmann und Hasi. Nicht zuletzt möchte ich mich bei meiner Mama – Undine Bock – bedanken, welche mir erst die Möglichkeit eröffnete über 20 Jahre meines Lebens für Bildung aufzuwenden. Die stetige Unterstützung bei allen Entscheidungen war eine große Hilfe und Grundvoraussetzung für das Gelingen meines universitären Werdeganges. Den Abschluss dieser Dissertation soll die Danksagung an meine Freundin Grit Laubenstein bilden. Sie verstand es immer, mir den Rücken freizuhalten und so Zeit und Raum zu schaffen, welche für die Durchführung und Auswertung von wissenschaftlichen Untersuchungen zwingend notwendig ist. Außerdem sorgte sie auch für den nötigen Druck, ohne den ich die Forschung an Flupirtin wohl noch Jahre hätte weiterführen können. Man kann ihren Einfluss auf die Promotion damit mit einem Katalysator gleichsetzen, welcher zu einer Beschleunigung des Vorgangs führte.