UNIVERSIDAD VERACRUZANA DOCTORADO EN CIENCIAS AGROPECUARIAS

“DISTRIBUCIÓN ESPACIAL E IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA DEL COMPLEJO TAXONÓMICO Amblyomma cajennense (sensu lato) EN LAS 10 REGIONES DEL ESTADO DE VERACRUZ, MÉXICO”

TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PARA OBTENER EL GRADO DE:

DOCTORA EN CIENCIAS AGROPECUARIAS

POR: MCA. MARIEL AGUILAR DOMÍNGUEZ DIRECTOR:

DRA. DORA ROMERO SALAS DIRECTOR EXTERNO: DR. ADALBERTO PÉREZ DE LEÓN.

H. VERACRUZ, VER. NOVIEMBRE, 2018

DEDICATORIAS

A mis padres

Por su comprensión, paciencia, apoyo y ayuda en los buenos y malos momentos. Ellos han sido pilares fundamentales para que yo llegara hasta aquí.

A mi hermana

Por siempre mostrar una cara positiva en todo momento, por tus consejos y sonrisa en cualquier comento a cualquier hora. ¡Te quiero!

A mi esposo

Por tu apoyo incondicional en todo momento, por tus consejos y por no dejar que me rindiera. Por nunca soltar mi mamo y caminar juntos este difícil pero satisfactorio camino. ¡Te amo!

A todas las personas que creyeron en mi para finalizar este proyecto.

i

AGRADECIMIENTOS

En estas líneas quiero expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que con su soporte científico y humano han colaborado en la realización de esta investigación.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la aportación de Beca a lo largo de este proyecto.

A la Universidad Veracruzana por abrirme las puertas para realizar mis estudios de Doctorado.

Agradezco a mi directora y tutora la Dra. Dora Romero Salas, quien me ha guiado por este difícil camino de la investigación por más de 10 años. Agradezco sus sabios consejos, regaños, paciencia y sobre todo por su ayuda en este increíble proyecto. Siempre estaré agradecida por sus enseñanazas, ayuda y sobre todo por su sincera amistad. ¡Gracias por ser como una segunda madre para mi!

Al Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA-ARS), principalmente al Laboratorio de Investigación “Knipling-Bushland U.S. Livestock Insects Research Laboratory” por la significativa aportación a este proyecto. Agradezco al Dr. Adalberto Pérez de León, director de este laboratorio y asesor externo por compartir sus conocimientos, por sus acertadas aportaciones sí como críticas constructivas, ayuda y disponibilidad para contribuir para finalizar este proyecto en tiempo y forma.

A los integrantes de mi Comité Tutorial por la paciencia, el esfuerzo, dedicación y el apoyo que me brindaron a lo largo de estos años, pero, sobre todo, por estar siempre pendientes de mis avances y guiarme para concluir este proyecto.

A la Universidad de Texas A&A, en particular a la Dra. María Esteve Gassent por sus aportaciones desde el inicio de este proyecto y por sus sabios consejos.

Al Instituto de Ecología A. C., a la Red de Estudios Moleculares Avanzados y al Laboratorio de Microscopía Avanzada por abrirme las puertas para realizar una estancia académica y brindarme todo el apoyo y facilidades para concluir con los ii objetivos planteados. Agradezco a la Bióloga Greta Hanako por todas sus enseñanzas y compartir generosamente todo su conocimiento, así como por la paciencia y labor de enseñanza.

Al Centro de Medicina Tropical por la oportunidad de realizar parte de mi investigación. A la Dra. Ingeborg Becker por aceptarme para realizar una estancia académica. Agradezco muy sinceramente al Dr. Daniel Sokani Sánchez Montes por la paciencia y labor de enseñanza, así como por su impecable contribución a este proyecto.

A la Universidad del Valle de Texas Valle del Río Grande por brindarme la oportunidad de realizar una estancia académica.

Agradezco a la Dra. Anabel Cruz Romero y a la Dra. Nelly Ibarra Priego por su ayuda y apoyo a lo largo de este camino.

Agradezco al Dr. Zeferino García Vázquez (Q.E.P.D) porque gracias a él comenzó mi interés por el maravilloso camino de la ciencia. ¡Un abrazo hasta el cielo!

A mis compañeros del laboratorio de parasitología, estudiantes, servicio social y demás por el apoyo y colaboración en las salidas a campo y en el diagnóstico.

A los productores que colaboraron en las salidas a campo para la colecta de garrapatas, por su disponibilidad y tiempo dedicado.

iii

RESUMEN

Amblyomma mixtum anteriormente considerada como A. cajennense es una garrapata neotropical que se distribuye ampliamente desde el sur de Texas hasta la parte occidental de Ecuador. Esta garrapata parasita una gran variedad de animales, como el ganado, los caballos incluido el hombre, también es un vector competente de varios patógenos zoonóticos. El objetivo de este estudio fue describir mediante microscopía electrónica la(s) especie(s) encontrada(s) en el estado de Veracruz, México, así como determinar la distribución potencial y analizar la estructura genética de las poblaciones de A. mixtum. Se colectaron garrapatas de las diez regiones naturales de Veracruz, México, un estado endémico de esta garrapata. Fueron 40 machos y 40 hembras los que se sometieron a un análisis de microscopía electrónica, las mediciones obtenidas se analizaron para determinar la especie. Para cada variable analizada, se determinaron las estadísticas descriptivas básicas y, posteriormente, se realizó un análisis de los componentes principales para hembras y machos, dando como resultado de acuerdo con las mediciones que la especie encontrada a lo largo del estado es A. mixtum. El modelado de distribución potencial se realizó utilizando las 19 capas climáticas usando Maxent v. 3.4.1. El modelo indicó una amplia distribución para A. mixtum, con mayor probabilidad de ocurrencia a lo largo del Golfo de México y en una menor proporción de los estados del Pacíficos en México. También mostró un hábitat adecuado en varios países de América Central, como Honduras, Guatemala y Belice. Estos hallazgos se discuten en el contexto de los aspectos geográficos y ecológicos de A. mixtum desde México hasta Ecuador. Por otro lado, para probar la variabilidad intraespecífica de los fragmentos de A. mixtum se amplificó el gen mitocondrial 16s-rRNA y la subunidad 1 del Citocromo Oxidasa (COI). Noventa y seis secuencias se amplificaron a partir de las 50 muestras analizadas (96% de éxito de amplificación). Se detectaron once haplotipos en el gen 16S-rRNA y 10 más para COI. No se detectó diferenciación genética significativa en las poblaciones de A. mixtum muestreadas en el estado de Veracruz, México.

iv

ABSTRACT

Amblyomma mixtum formerly considered as A. cajennense is a Neotropical tick that is widely distributed from South Texas to the western part of Ecuador. This generalistic tick parasitizes several hosts taxa, such as cattle, horses, and humans also, is a competent vector of several zoonotic pathogens. For this reason, the aim of this study was to describe by electron microscopy the species found in the state of Veracruz, Mexico, also to determine the potential distribution of A. mixtum to establish potential risk areas for tick-borne pathogen transmission and to analyze the genetic structure of A. mixtum populations. We collected ticks from the ten natural regions of Veracruz, México an endemic state of A. mixtum. 40 males and 40 females were subjected to an electron microscopy analysis, the measurements obtained were analyzed to determine the species. For each variable analyzed, the basic descriptive statistics were determined and subsequently, an analysis of main components for females and males was carried out. Species distribution modelling was done using the 19 climatic layers using Maxent v. 3.4.1. Our model indicated a wide distribution for A. mixtum, with higher probability of occurrence along the Gulf of Mexico, and in a less proportion of the pacific states of Oaxaca and Chiapas in Mexico. It also showed a suitable habitat in several countries of Central America such as Honduras, Guatemala and Belize in which there are scatered records of this tick. Our findings are discussed in the context of geographic and ecological aspects of A. mixtum from Mexico to Ecuador as a member of the A. cajennense species complex. On the other hand, to test the intra-specific variability of A. mixtum fragments of the mitochondrial gene 16s-rRNA and cytochrome oxidase subunit 1 (COI) were amplified. Ninety-six sequences were amplified from the 50 specimens analyzed (96% amplification success). Eleven haplotypes were detected in 16S- rRNA gene and 10 more for COI. Significant genetic differentiation was not detected in the A. mixtum populations sampled in the state of Veracruz, Mexico.

v

ÍNDICE GENERAL

DEDICATORIAS...... i

AGRADECIMIENTOS ...... ii

RESUMEN ...... iv

ÍNDICE GENERAL ...... vi

ÍNDICE DE CUADROS ...... viii

ÍNDICE DE FIGURAS ...... ix

CAPÍTULO I ...... 10

1. INTRODUCCIÓN ...... 10

2. REVISIÓN DE LITERATURA ...... 12

2.1 Las garrapatas ...... 12

2.1.1 Clasificación taxonómica de las garrapatas ...... 13

2.1.2 Morfología y fisiología de las garrapatas ...... 15

1.2.3 Ecología de las garrapatas exófilas ...... 20

1.2.4 La garrapata Amblyomma cajennense (sensu lato) ...... 21

1.2.5 Estatus taxonómico de Amblyomma cajennense (s. l.) ...... 22

1.2.6 Características morfológicas de Amblyomma cajennense (s. l.) ...... 23

1.2.8 Distribución geográfica de Amblyomma cajennense (s. l.) ...... 26

1.2.9 Hospederos de Amblyomma cajennense (s. l.) ...... 27

1.3.10 Ciclo biológico de Amblyomma cajennense (s. l.) ...... 28

1.2.11 Transmisión de patógenos ...... 31

1.3 Métodos de captura de garrapatas ...... 32

1.3.1 Captura de garrapatas por contacto directo con la vegetación ...... 33

vi

1.3.2 Captura de garrapatas con dispositivos atrayentes ...... 34

1.4 La Microscopía Electrónica de Barrido ...... 34

1.5 Importancia del uso de modelos de distribución de especies ...... 35

2 HIPÓTESIS ...... 37

3 OBJETIVOS ...... 38

3.2 Objetivo general ...... 38

3.3 Objetivos específicos ...... 38

4 REFERENCIAS ...... 39

CAPÍTULO II ...... 46

Genetic structure analysis of Amblyomma mixtum populations in Veracruz State, Mexico...... 46

CAPÍTULO III ...... 47

Morphometrtics of Amblyomma mixtum in the state of Veracruz, Mexico ...... 47

CAPITULO IV ...... 61

POTENTIAL DISTRIBUTION OF Amblyomma mixtum (Koch, 1844) ...... 61

CAPÍTULO V ...... 77

DISCUSIONES GENERALES ...... 77

CONCLUSIONES GENERALES ...... 82

RECOMENDACIONES ...... 83

ANEXOS ...... 88

Anexo 1. Encuesta general ...... 88

Anexo 2. Encuesta individual ...... 93

Anexo 3. Envío de segundo artículo...... 95

vii

ÍNDICE DE CUADROS

Animales muestreados en las regiones naturales del CUADRO 1 estado de Veracruz……………………………………….. 43 Garrapatas recolectadas e identificadas de animales y CUADRO 2 vegetación en el estado de Veracruz…………………… 44 Temperatura y humedad relativa en las regiones CUADRO 3 naturales del estado de Veracruz……………………….. 45

viii

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA 1 Clasificación taxonómica de las garrapatas...... 14 FIGURA 2 Vista dorsal de A. cajennense (s. l.) macho...... 24 FIGURA 3 Vista ventral de A. cajennense (s. l) macho ...... 25 FIGURA 4 Vista dorsal de A. cajennense (s. l) hembra...... 25 FIGURA 5 Vista ventral de A. cajennense (s.l) hembra ...... 26 FIGURA 6 Distribución geográfica del complejo taxonómico A. cajennense (s.l.) 27 FIGURA 7 Ciclo biológico del complejo taxonómico A. cajennense...... 28

ix

CAPÍTULO I

1. INTRODUCCIÓN

Las garrapatas son ectoparásitos de hábitos hematófagos y constituyen uno de los grupos de parásitos de mayor importancia económica en los sistemas de producción debido a sus efectos directos y a la transmisión de patógenos. Amblyomma cajennense sensu lato es una garrapata de la familia Ixodidae que parasita a una gran cantidad de vertebrados, principalmente mamíferos. El ciclo biológico de A. cajennense s.l. consta de tres hospederos, incluido el hombre, situación que hace más complejo su control. Su distribución geográfica se extiende desde el sureste de Texas hasta el Noreste de Argentina, pasando por el Caribe, México y Centroamérica (Nava et al., 2014). A lo largo de su distribución, la garrapata A. cajennense se ha adaptado ampliamente a diferentes condiciones ecológicas, incluidos los ecosistemas tan diferentes como las praderas semiáridas y bosques secundarios subtropicales (Estrada-Peña et al., 2004). Asimismo, el área geográfica ocupada por esta garrapata se entremezcla con grandes barreras geográficas: los Andes, el Golfo de México, y los grandes ríos (Estrada-Peña et al., 2004). En México esta garrapata ha sido reportada en gran parte del territorio parasitando a múltiples especies animales domésticas y silvestres tales como bovinos, caballos, perros, venados y ciervos. A. cajennense s.l. es la segunda especie de garrapatas más importante, por sus altas infestaciones y por la transmisión de enfermedades a los animales (SENASICA, 2015). Por su gran tamaño esta garrapata succiona grandes cantidades de sangre de los animales lo que causa debilidad, pérdida de peso, enfermedades y pérdidas económicas importantes en la ganadería. Diversos autores han diferido en el estatus taxonómico de esta garrapata a lo largo de la historia, estudios morfológicos realizados a mediados del Siglo XIX y XX reportaron observaciones contrarias respecto a la taxonomía de A. cajennense, algunos autores consideraron diferencias fenotípicas (presencia y número de placas ventrales, longitud proporcional de

10

festones, ornamentación, punteado, etc.) para identificar diferentes especies dentro de A. cajennense, otros autores atribuyen diferencias morfológicas a simple polimorfismo intraespecífico (Khols, 1958). En estudios realizados durante los años 90’s, se observó la falta de variación en los hidrocarburos cuticulares de doce poblaciones geográficamente distintas de A. cajennense, apoyando esta sinonimia. Sin embargo, después de observar distintas características del desarrollo de esta garrapata (longitud y alimentación antes de la muda, preoviposición y periodos de incubación de huevos) y realizar experimentos de cruzamiento entre distintos especímenes provenientes de diferentes colonias de A. cajennense de diferentes zonas Neotropicales como Argentina, Brasil, Cuba, Estados Unidos y Trinidad pudieron encontrar diferencias (Labruna et al., 2011; Mastropaolo et al., 2011). En recientes estudios realizados en colonias de A. cajennense provenientes de Argentina, Paraguay, Venezuela, Guyana Francesa, Colombia, Ecuador, Costa Rica, Brasil, México, Perú y Estados Unidos se determinó que esta especie es un complejo de seis especies A. cajenennse s.s., A. interandinum, A. mixtum, A. patinoi, A. sculptum y A. tonelliae; determinados por diferencias morfológicas observadas mediante microscopía electrónica, por otro lado, y con el objetivo de confirmar estos hallazgos se realizaron análisis filogenéticos y valores de divergencia genética, de los que resultó que una muestra procedente de México fuera identificada como Amblyomma mixtum (Nava et al., 2014). Asimismo, se concluyó que estas seis especies han evolucionado por separado, dicha diversificación ha sido influenciada por la diversidad de climas y relieves presentes en el rango geográfico de este complejo (Beati et al., 2013). En el estado de Veracruz no se han realizado estudios donde se determine la distribución espacial del complejo de A. cajennense (s.l.) y a su vez que se identifique morfológicamente en las regiones naturales del estado. Por lo anterior, los resultados de la presente investigación serán los primeros aportes al respecto, de igual manera este conocimiento científico se podrá usar para diseñar métodos de control más eficaces contra esta garrapata.

11

2. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 Las garrapatas

Las garrapatas son artrópodos hematófagos que pertenecen a uno de los grupos de ectoparásitos más importantes existentes y que se encuentran distribuidos a nivel mundial. Pertenecen al orden Acarina (phylum Arthopoda, clase Arachnida, suborden Ixodoideda), se caracterizan por su vida de parásito, por alimentarse de diferentes tipos de mamíferos, aves y reptiles, y por realizar tres mudas a lo largo de su vida (Krantz y Walter, 2009; Nicholson et al., 2009). Se conocen casi 900 especies de garrapatas agrupadas en tres familias: Ixodidae o garrapatas duras (agrupan el 80% de las garrapatas del mundo), Nuttalliellidae (representada por una única especie) y Argasidae o garrapatas blandas (Barker y Murrell, 2004). El primer grupo presenta un escudo dorsal esclerotizado, y las garrapatas blandas (Argasidae) carecen de escudo, y presentan una cutícula externa flexible. La familia Ixodidae, es la más numerosa y la de mayor importancia médica y veterinaria (Topalis et al., 2008).

Las garrapatas presentan tres estadios: larva, ninfa y adulto (macho o hembra). Las garrapatas Ixódidae y Argasidae se diferencian tanto por su anatomía como por sus ciclos biológicos. Los ixódidos reúnen una serie de características que les confiere un potencial como vectores de agentes patógenos, se alimentan durante largos periodos de tiempo (varios días), su picadura es generalmente indolora, y permanecen fuertemente fijados sobre el hospedador. Cada estadio se alimenta una sola vez, pudiendo parasitar a una gran variedad de especies animales en diferentes tipos de hábitats. Los argásidos, por el contrario, se alimentan durante breves periodos de tiempo (minutos u horas), y frecuentemente sobre una sola especie hospedadora (Anderson y Magnarelli, 2008, Sonenshine, 1991).

Estos artrópodos son de distribución mundial, lo que implica una gran diversidad de características estructurales, fisiológicas, biológicas y de comportamiento, como sistemas para su supervivencia como la diapausa, que implica el cese de las funciones fisiológicas 12

en los periodos de clima desfavorable o en ausencia de hospederos apropiados (Mans y Neitz, 2004), además son capaces de absorber agua a partir del aire circulante, lo que facilita el mantenimiento de una población (Alekseev et al., 2004; Nava et al., 2009). Por lo cual la importancia de éstos radica tanto en su capacidad parasitaria como en su papel como vector transmisor y reservorio de diferentes enfermedades infecciosas o parasitarias, se ha identificado que una garrapata puede estar infectada hasta con tres organismos diferentes (Jeyaprakash y Hoy, 2009). Además de la capacidad de transmitir agentes patógenos, las garrapatas pueden ocasionar parálisis letal y severas toxemias como resultado de las picaduras. La pérdida de sangre (anemia) es consecuencia directa de parasitaciones masivas, ya que las garrapatas son parásitos hematófagos estrictos, y en concreto las garrapatas de la familia Ixodidae tienen una gran capacidad de consumo de sangre. En ocasiones la infestación por garrapatas puede adquirir tal magnitud que la anemia provoca la muerte del animal, o le hace susceptible a otras enfermedades a causa del debilitamiento originado (Balashov, 1998; Sunenshine y Roe, 2014). En México se han identificado 77 especies de garrapatas pertenecientes a 5 géneros de la familia Argasidae y 7 de la familia Ixodidae (Rodríguez-Vivas et al., 2006). Estas especies reportadas representan el 45% de la riqueza de especies en América Latina, lo que indica que en el país existen las condiciones ecológicas favorables para la presencia de una elevada diversidad de garrapatas (Estrada-Peña et al., 2004).

2.1.1 Clasificación taxonómica de las garrapatas

Taxonómicamente las garrapatas están incluidas en la clase Arachnida, subclase Acari, orden Parasitiformes, suborden Ixodida (Figura 1). Phylum Arthropoda Clase Arachnida Subclase Acari Orden Parisiforme Suborden Ixodida

13

Familia Subfamilia Género

FIGURA 1 Clasificación taxonómica de las garrapatas.

Se conocen tres familias de garrapatas, la Ixodidae, o “garrapatas duras”, con 692 especies incluidas en 13 géneros agrupados en dos grupos principales, Prostriata y Metastriata. La segunda familia es la Argasidae, a la cual pertenecen 186 especies pertenecientes a 5 géneros agrupados en dos subfamilias, Argasinae y Ornithodorinae. La tercera familia es Nuttalliellidae, representada por una única especie, Nuttalliella namaqua (Guglielmone et al., 2009).

14

2.1.2 Morfología y fisiología de las garrapatas

El cuerpo de las garrapatas tiene la estructura característica de los arácnidos, clase a la que pertenecen. En general, el cuerpo de las garrapatas es alargado, más largo que ancho, en los adultos no alimentados el tamaño del cuerpo, incluido el capítulo, puede medir desde poco más de 2 mm, hasta casi 30 mm (Anderson y Magnarelli, 2008). El cuerpo de las garrapatas está formado por el capítulo o gnatosoma y el idiosoma. El capítulo sostiene las partes bucales, incluidos los quelíceros (utilizados para cortar y rasgar la piel), los palpos y el hipostoma con el que se fijan al hospedador. El idiosoma se subdivide en el podosoma, el cual soporta las patas y el poro genital, y en el opistosoma, región posterior donde se encuentran las placas espiraculares y la apertura anal. La cobertura externa del cuerpo y de sus apéndices, similar al de otros artrópodos, se denomina tegumento, está constituida por la epidermis y por la cutícula, parte externa que actúa como protección primaria frente a la pérdida de agua. El tegumento sirve también como exoesqueleto, proporcionando protección frente a agresiones de tipo mecánico o físico (Sonenshine, 1991).

Diferentes estructuras, como los pelos sensoriales y cerdas, las glándulas dérmicas y las sensilas, forman parte de la cutícula. Los pelos sensoriales y cerdas están distribuidas por el cuerpo, el capítulo y las patas, siendo abundantes en las garrapatas adultas y en las ninfas, pero escasa en las larvas. Estas estructuras tienen una función mecanosensorial, y más raramente termosensorial; en los órganos sensoriales, como el órgano de Haller, las sensilas adquieren forma de poros, y tienen principalmente actividad quimiosensorial, aunque también pueden actuar como mecanosensores (Sonenshine, 1991). Las glándulas dérmicas se hallan dispersas por todo el cuerpo, las del tipo I, son más numerosas y de un tamaño de 80-100 µm en ninfas y hembras repletas, y las del tipo II, similares a las anteriores, pero que adquieren un enorme tamaño durante la repleción, llegando a las 400 µm en las hembras repletas. Estas glándulas segregan una sustancia oleosa que se distribuye por toda la superficie corporal y que se solidifica al contactar con la atmósfera. La excitación a causa de la luz intensa, calor o por irritación de tipo mecánico puede inducir la secreción por parte de las glándulas dérmicas. Esta

15

secreción tiene características impermeabilizantes y protege a las garrapatas de la desecación. Las sensilas en forma porosa son numerosas en el cuerpo de las garrapatas ixódidas, y parecen actuar, respondiendo a la distensión o alargamiento de la cutícula, si bien, otras tienen actividad mecanosensorial e incluso termoreceptora (Sonenshine, 1991). Las larvas de los ixódidos carecen de sistema respiratorio traqueal, que se encuentra, sin embargo, presente en las ninfas y en los adultos. Junto al sistema de tráqueas ramificadas, se diferencia un par de estigmas respiratorios que se encuentran situados lateralmente en el extremo terminal del idiosoma, tras las coxas del cuarto par de patas. El sistema nervioso central está concentrado en una única masa o agrupación de nervios, el singanglio, en lugar del cerebro y del cordón nervioso ventral característico de los insectos, crustáceos y de otros artrópodos (Sonenshine, 2014).

Las garrapatas duras poseen en su superficie dorsal un escudo esclerotizado, al cual se unen importantes grupos de músculos. En los machos ixódidos, el escudo recubre todo el dorso, y en numerosas especies presentan también unas láminas esclerotizadas que cubren total o parcialmente la superficie ventral. Esta característica de los machos hace que durante su alimentación experimenten solo un ligero aumento de tamaño; sin embargo, el resto de los estadios, al poseer una cutícula expansible, pueden sufrir un gran incremento por la síntesis de nueva cutícula durante la alimentación. Las garrapatas ixódidas deben permanecer fijadas durante el periodo de crecimiento de la cutícula, por lo que obligatoriamente tendrán que alimentarse lentamente, necesitando varios días para completar el proceso. Por el contrario, los argásidos, al tener una cutícula dura tienen limitada su expansión, motivo por el cual estas garrapatas se han adaptado a una rápida alimentación, desde unos minutos hasta un máximo de 1-2 horas (Sonenshine, 1991). En los géneros de garrapatas que presentan ojos, éstos se sitúan en los márgenes laterales del escudo, siendo probablemente su función la de distinguir la luz y a lo sumo el movimiento, por lo que posiblemente no tengan una detallada percepción del medio que le rodea (Sonenshine, 2014).

Las larvas y las ninfas no presentan diferenciación sexual. Los machos y las hembras presentan una abertura genital o gonoporo, que se sitúa ventralmente en el idiosoma,

16

aproximadamente a la altura del segundo par de patas. El ano también se sitúa ventralmente en el extremo posterior del cuerpo, por detrás del cuarto par de patas, estando rodeado por el surco anal (Estrada-Peña, 2015). Las garrapatas duras tienen tres estadios, larva, ninfa y adulto. A diferencia de éstas, las garrapatas blandas presentan 2 o más estadios de ninfa, dependiendo de las especies, del éxito de la alimentación y de otras variables, que darán lugar a un desarrollo del ciclo más lento (Sonenshine, 1991).

Las garrapatas poseen varias características que contribuyen a su éxito como potenciales vectores de agentes patógenos, características que las distinguen de los arácnidos y de los insectos. Una de ellas es su longevidad, a la cual se hace referencia en término de años en vez de días o semanas (Anderson y Magnarelli, 2008). Los adultos en algunas especies, las ninfas o las larvas en otras, pueden sobrevivir de un año a otro. En latitudes más hacia el norte, con clima subártico, las garrapatas a menudo requieren de 2, 3 o incluso 4 años para completar su ciclo biológico. Los argásidos refugiados en grietas, a menudo sobreviven varios años a la espera de encontrar un hospedador adecuado sobre el que alimentarse. Esta excepcional longevidad no solo permite a las garrapatas perpetuarse, sino también a los agentes patógenos que éstas portan, haciendo más difícil su control. La sangre ingerida permanece en el intestino durante largos periodos de tiempo sin ser digerida, por lo que los patógenos adquiridos durante la ingesta tampoco estarán expuestos al proceso digestivo y podrán penetrar en los tejidos de la garrapata. La sangre sin digerir sirve de reserva de alimento, y excepto durante los periodos de oviposición, es consumida gradualmente durante varios meses e incluso años. Otro aspecto remarcable de las garrapatas es la capacidad de producir un número muy elevado de huevos. Las hembras de la mayoría de las especies de ixódidos producen miles de huevos, mientras que las hembras pertenecientes a las garrapatas blandas ponen solo unos cientos de huevos tras la alimentación, si bien son capaces de realizar varios ciclos de alimentación y reproducción (Anderson y Magnarelli, 2008, Sonenshine et al., 2002).

17

Las garrapatas se alimentan en grupo, rasgan las paredes de los vasos sanguíneos de la dermis y succionan los fluidos. Los argásidos se alimentan rápidamente, consumiendo entre 5 y 10 veces su peso, en minutos o en pocas horas (Sonenshine, 1991), posteriormente, la sangre ingerida es concentrada mediante la excreción del agua a través de un poro situado entre las coxas de los dos primeros pares de patas (Anderson y Magnarelli, 2008; Sonenshine, 1991). En contraste, los ixódidos se alimentan durante periodos de tiempo más prolongados, varios días o semanas, por lo que la mayoría de las especies segregan con la saliva sustancias cementantes, que les permitirá una fijación más dura a la piel del hospedador. Para concentrar la sangre ingerida, los ixódidos emplean las glándulas salivares para eliminar periódicamente el exceso de agua de la hemolinfa. Otra forma de eliminar agua es a través de la cutícula, por transpiración, y en las heces. Estos mecanismos de concentración de la sangre hacen que el peso de las garrapatas engordadas no represente la cantidad de sangre consumida. Los ixódidos ingieren una cantidad de sangre 2-3 veces superior a su peso tras la repleción (Anderson y Magnarelli, 2008; Sonenshine, 1991). Esta voraz alimentación puede ocasionar un gran daño al hospedador, daño suficiente para producir la muerte cuando un elevado número de garrapatas parasitan a un hospedador. El éxito en la alimentación de las garrapatas está fuertemente relacionado con la capacidad de suprimir los mecanismos hemostáticos del hospedador, manteniendo el flujo de la sangre a lo largo de todo este periodo, y de suprimir la respuesta inmune del hospedador, lo cual les permite utilizar a un mismo hospedador durante todo el periodo de alimentación. Para ello, las garrapatas introducen en la saliva secretada distintas moléculas que presentan actividad farmacológica o inmunomoduladora local en el lugar de fijación de la garrapata, facilitando de forma indirecta la transmisión bilateral con éxito de distintos patógenos (Ribeiro y Francischetti, 2003).

Las garrapatas han desarrollado estrategias que les facilitan la supervivencia en el medio ambiente mientras permanecen a la espera de los hospedadores. Por ejemplo, las glándulas salivares pueden segregar con la saliva una sustancia higroscópica capaz de absorber humedad del medioambiente incluso en condiciones de subsaturación (Rudolph y Knulle, 1974). Esta capacidad permite a las garrapatas cuando comienzan a desecarse, 18

mientras se encuentran encaramadas en la vegetación, descender en busca de un microambiente más húmedo y absorber agua de la atmósfera para restaurar las pérdidas sufridas, pudiendo a continuación volver a ascender en la vegetación a la espera del hospedador (Randolph y Storey, 1999; Sonenshine, 1991). Muchas especies de garrapatas son capaces también de conservar el agua corporal bajo condiciones ambientales adversas; ello se debe a una capa lipídica bajo la cutícula superficial, así como al descenso en la frecuencia de apertura de las placas espiraculares, y a la producción de guanina, desecho fecal altamente nitrogenado que precisa de una escasa cantidad de agua para ser eliminada. Otros factores ligados al comportamiento también permiten a las garrapatas evitar la desecación; así, las garrapatas nidícolas producen feromonas que facilitan el agrupamiento de los individuos en los lugares más favorables para su supervivencia, mientras que las garrapatas no nidícolas se esconden en el suelo o en zonas de vegetación densa donde la humedad es elevada para poder reponer el agua perdida (Anderson y Magnarelli, 2008; Sonenshine, 1991).

Otra importante característica desarrollada por las garrapatas es la diapausa, que se define como un estado de baja actividad metabólica, mediado de forma neurohormonal, el cual confiere a la garrapata la capacidad de ahorro de energía mientras permanecen a la espera de un hospedador. Las garrapatas han desarrollado un sistema sensorial que les permite detectar la presencia de hospedadores, o de ciertas condiciones medioambientales que les indican la llegada de un periodo desfavorable para su supervivencia. Estos mecanismos hacen que, en las garrapatas nidícolas, que habitan en la proximidad de aves migratorias o de murciélagos, la oviposición se retrase hasta el regreso de los animales (diapausa morfogenética). Las garrapatas no nidícolas, se refugiarán en el suelo o en la vegetación en respuesta a los cambios en la duración de los días (diapausa fotoperiódica), permaneciendo inactivas, a la espera de condiciones más favorables (Sonenshine, 1991).

La capacidad de las garrapatas para detectar a los hospedadores se debe a que poseen un sistema sensorial de gran eficacia para la detección de olores, vibraciones y cambios de temperatura. Las garrapatas usan el primer par de patas de manera similar a las

19

antenas de los insectos, exponiendo el órgano de Haller a las corrientes de aire para la detección del hospedador. Las sensilas de este órgano sensorial son de tipo olfativo, gustatorio, mecanoreceptor, y probablemente también termoreceptor. Cuando las garrapatas se encuentran al acecho del hospedador, las sensilas responden al CO2, NH3, ácido láctico y a otras sustancias olorosas de los animales, al igual que a las vibraciones y la temperatura corporal de los animales de sangre caliente. Otras sensilas permiten a las garrapatas reconocer cuándo se encuentran en grietas, bajo el manto de hojas del suelo o en una zona de vegetación densa donde poder resguardarse de condiciones ambientales desfavorables (Estrada-Peña, 2015).

1.2.3 Ecología de las garrapatas exófilas

Las garrapatas exófilas (no nidícolas) son las especies de garrapatas que ocupan hábitats expuestos, como la vegetación, por ejemplo; la mayoría se encuentran en bosques, matorrales, praderas, otras permanecen enterradas en la arena o en suelos arenosos, debajo de piedras, en grietas o en cualquier otro lugar al aire libre. La mayoría de las garrapatas Ixodidae son exófilas, al menos en algún estadio de su ciclo biológico (Mannelli et al., 2012).

Las garrapatas exófilas deben de ser capaces de protegerse por sí mismas de los ambientes externos, de interpretar las adecuadas señales externar para iniciar la búsqueda de los hospederos, y de reconocer los periodos óptimos para iniciar las actividades de oviposición (Guglielmone et al., 2003), deben ser capaces de entrar en fases de diapausa como estrategia de supervivencia en periodos de condiciones ambientales adversas, de protegerse frente a la desecación y de recuperar el agua perdida en los periodos en los que permanecen a la espera de los hospederos. Estas y otras adaptaciones permiten a las garrapatas exófilas sobrevivir durante semanas e incluso meses mientras esperan a los hospederos (Sonenshine, 1991).

La mayoría de las garrapatas exófilas, especialmente aquellas que habitan en regiones templadas o subpolares, tienen un periodo de actividad bien definido para la búsqueda

20

del hospedero (Brites-Neto et al., 2015). Durante estas fases algunas especies de garrapatas exhiben un comportamiento que les hace agruparse en lugares favorables, por ejemplo, en plantas herbáceas, donde pueden engancharse al hospedero, otras, sin embargo, caminan o corren por el suelo en busca del hospedero que invadida su zona (garrapatas cazadoras). Las garrapatas que permanecen a la espera del hospedador son muy sensibles a los estímulos de los animales, especialmente al CO2, NH3 y al calor corporal (Estrada-Peña et al., 1986). La duración del periodo de búsqueda del hospedero puede variar dependiendo del rango geográfico de las especies, incluso los diferentes estadios de una especie de garrapata pueden buscar al hospedador a lo largo de diferentes periodos del año (Leonovich, 2015). Estos periodos de actividad están controlados por la respuesta de las garrapatas a los cambios de las condiciones ambientales. En las regiones templadas los cambios del fotoperiodo, la incidencia de la energía solar y la temperatura ambiental proporcionan las claves específicas que van a alterar el comportamiento de la garrapata e inducirla a iniciar la búsqueda del hospedaror (Labruna et al., 2002). En las regiones tropicales, donde las variaciones de la duración del día y la temperatura son menos pronunciadas, la alternancia entre la estación seca y lluviosa puede influir en la actividad de las garrapatas (Sonenshine et al., 2002). Una vez iniciada la actividad de búsqueda de hospedador las garrapatas pueden permanecer en este estado durante días o semanas, hasta que la deshidratación corporal les obliga a abandonar la búsqueda y desender en busca de un microambiente más protegido y húmedo. El comportamiento de las garrapatas que se desplazan activamente hacia un hospedador es totalmente diferente, éstas permanecen escondidas en un microhábitat protegido que solo abandonarán en respuesta al estímulo del hospedador (Anderson y Magnarelli, 2008).

1.2.4 La garrapata Amblyomma cajennense (sensu lato)

Amblyomma cajennense s.l. conocida comúnmente como la garrapata cayenne, es una especie que infesta a la ganadería y una gran cantidad de vertebrados incluidos el hombre y aves (Borges et al., 2002; Lopes et al., 1998; Oliviera et al., 2003; Rojas et al.,

21

1999). Esta garrapata tiene una amplia distribución, se encuentra desde el sureste de los Estados Unidos de Norteamérica hasta el Noreste de Argentina (Nava et al., 2013).

1.2.5 Estatus taxonómico de Amblyomma cajennense (s. l.)

Los taxónomos han estudiado a A. cajennense desde el siglo XVIII, asignándole diversos nombres: Acarus cajennensis Fabricius, 1787; Ixodes cajennensis Fabricius 1794; Amblyomma mixtum Koch, 1844; Amblyomma sculptum Berlese, 1888; Amblyomma parviscutatum Neumann, 1899; Amblyomma tapiri Tonelli-Rondelli, 1937 y Amblyomma finitimum Tonelli-Rondelli, 1937. Lo anterior demuestra que su taxonomía ha sido controversial, esta garrapata recolectada en Cayena, la capital de La Guyana Francesa fue descrita y nombrada por primera vez por Fabricius, posteriormente, especies morfológicamente similares fueron establecidas por Koch (1844). Amblyomma mixtum fue descrita por Koch en 1844, en garrapatas de México (revisado por Nava et al., 2014). Sin embargo, tiempo después Neummann (1899) la consideró sinónimo de A. cajennense y aunque hubo algunas controversias y se intentó volver a reubicar como especie, toda la información del siglo pasado hasta inicios del actual la refieren como A. cajennense indicando que esta se extiende en el continente americano, desde el sur de los estados de Texas y Florida, en Estados Unidos, hasta el norte de Argentina y las islas del Caribe (Estrada-Peña et al., 2004). Labruna et al. (2011) realizaron cruzamientos en poblaciones de garrapatas A. cajennense de Brasil y Colombia encontrando incompatibilidad en el cruzamiento, sugiriendo que se trataba de especies diferentes. Posteriormente, mediante estudios de ADN mitocondrial y nuclear de diferentes poblaciones de garrapatas, se concluyó que existen 6 grupos de A. cajennense (s.l.) filogenéticamente distintos y que A. cajenense (s.s.) es monofilogenético, es decir que es distinto de la anterior A. cajennense de diferentes regiones geográficas del continente, quedando delimitada a Rondonia, en la Amazonía de Brasil, y la Guayana Francesa (Beati et al., 2013) donde fue descrita originalmente por Fabricius (1787). Recientemente, Nava et al. (2014) analizaron morfológicamente los registros existentes de A. cajennense s.l. en diferentes colecciones y determinaron que A. cajennense s.s. se localiza en la región amazónica,

22

desde Rondonia, Brasil, hasta la Guayana Francesa y A. sculptum considerada sinónimo de A. cajennense, es en efecto una especie que se localiza en el norte de Argentina, Bolivia, Paraguay y la costa y centro oeste de Brasil. Dentro de este complejo fueron determinadas 3 nuevas especies, A. tonelliae en la región del Chaco, que comprende el centro-norte de Argentina hasta Bolivia y Paraguay; A. interandinum, localizada en el valle interandino de Perú y A. patinoi, en la cordillera este de Colombia. En el mismo estudio, analizaron los especímenes “tipo” de Koch comparándolos con A. cajennense (s.s.) encontrando que estas son diferentes morfológicamente; sin embargo, son idénticas a las garrapatas colectadas en Texas, México, Centro América y Ecuador, quedando, por lo tanto, reestablecida como A. mixtum con una distribución desde el sur de Texas (EUA) hasta Ecuador (Estrada-Peña, 2013). Por lo anterior, A. mixtum es la garrapata del género Amblyomma que se localiza parasitando comúnmente a los bovinos y equinos de las zonas tropicales de México y a la que el personal que realiza las actividades propias de la ganadería se ve expuesto con frecuencia.

1.2.6 Características morfológicas de Amblyomma cajennense (s. l.)

Entre los caracteres morfológicos del Amblyomma cajennense (s. l.) destaca lo siguiente (Guzmán-Cornejo et al., 2011): palpos largos, el segundo artejo más largo que ancho, generalmente ornamentado, ocelos y festones se encuentran presentes, la base del gnatosoma de forma variable y pentagonal dorsalmente. Placas adanales ausentes en el macho, pequeñas placas pueden estar presentes ventralmente en el frente de los festones. El escudo ventral puede estar presente y extenderse más allá del margen posterior de los festones del macho. Las placas estigmales son subtriangulares o en forma de coma.

Claves para la identificación de machos: El macho de Amblyomma cajennense s. l. dorsalmente presenta el escudo cubriendo en su totalidad el idiosoma, con abundantes dibujos ornamentales en color pálido, que irradian más o menos desde el centro hacia

23

los extremos, al igual que en la parte central de los festones, dando la apariencia de ser angostos (Figura 2) (por Guzmán-Cornejo et al., 2011).

FIGURA 2 Vista dorsal de A. cajennense (s. l.) macho.

Ventralmente la coxa 1 presenta dos espolones largos, siendo el externo un poco más largo, las coxas II y III presentan uno corto, ancho y plano, la coxa IV presenta un espolón largo interno. Las placas estigmatales moderadamente largas, bien esclerosadas con una superficie ligeramente cóncava (Guzmán-Cornejo et al., 2011) (Figura 3).

24

FIGURA 3 Vista ventral de A. cajennense (s. l) macho

Claves para la identificación de hembras: La hembra de Amblyomma cajennense s. l. dorsalmente presenta un escudo triangular generalmente un poco más ancho que largo, algunas veces la longitud y anchura son iguales, además presenta abundantes y pálidos dibujos ornamentales extendidos por toda la superficie del escudo, los festones presentan unos tubérculos muy esclerosados en el ángulo interno a excepción del festón central (Figura 4) (Guzmán-Cornejo et al., 2011).

FIGURA 4 Vista dorsal de A. cajennense (s. l) hembra

Ventralmente la coxa I presenta dos espolones de diferente tamaño, siendo el externo mucho más grande que el interno, las coxas II, III y IV tienen un espolón grueso, plano y

25

redondeado. También se observan los tubérculos de los festones (mamelones). El orificio genital presenta una forma de “U” muy marcada y al igual que en el macho se encuentra situado en especímenes sin alimentarse a la altura de las coxas II (Figura 5) (Guzmán- Cornejo et al., 2011).

FIGURA 5 Vista ventral de A. cajennense (s.l) hembra

1.2.8 Distribución geográfica de Amblyomma cajennense (s. l.)

La distribución del complejo A. cajennense s. l. va desde el sureste de Texas, Estados Unidos, hasta las Islas Caribe, Centro y Sudamérica (Estrada-Peña et al., 2004) (Figura 6).

26

FIGURA 6 Distribución geográfica del complejo taxonómico A. cajennense (s.l.)

El rango de presencia de esta garrapata parece estar limitado por la temperatura. Las bajas temperaturas en áreas montañosas como los Andes representan un obstáculo para la presencia o establecimiento de ésta (Guglielmone et al., 1992). En México, este ectoparásito puede ser encontrado en casi todo el territorio nacional; sin embargo, su mayor presencia ha sido reportada en Tamaulipas, Veracruz y Tabasco, posiblemente debido a las temperaturas cálidas (Illoldi-Rangel et al., 2012).

1.2.9 Hospederos de Amblyomma cajennense (s. l.)

La distribución geográfica de las diferentes especies de garrapatas está generalmente determinada por la presencia de los hospederos (Guzmán-Cornejo et al., 2011). A. cajennense s. l. es una garrapata de tres hospederos, siendo los équidos y bovinos los principales mamíferos encargados de mantener la presencia de esta garrapata en diferentes ambientes (Borges et al., 2002; Labruna et al., 2002; Oliveira et al., 2003). Sin embargo, este artrópodo ha sido encontrado, principalmente los estadios no adultos, en una gran variedad de animales incluidos los de vida libre, aves y humanos (Lopes et al., 1998; Rojas et al., 1999; Romero-Castañón et al., 2008).

27

Las garrapatas adultas prefieren localizarse sobre las patas y el abdomen en los bovinos, por otro lado, en los équidos todos los estadios pueden ser localizados en las orejas y en otras cavidades naturales, flancos, nuca y crin (Oliveira et al., 2003).

1.3.10 Ciclo biológico de Amblyomma cajennense (s. l.)

El ciclo biológico en las garrapatas consiste en cuatro estadios de desarrollo, los huevos y tres estadios parásitos (larva, ninfa y adulto). Cada estadio activo se alimenta una sola vez en su vida, aunque si las hembras han sido desprendidas forzadamente, éstas serán capaces de volver a alimentarse de algún hospedero (Sonenshine, 2014). Amblyomma cajennense (s.l.) se distingue por tener un ciclo de tres hospederos (Figura 7). Las etapas del desarrollo de su ciclo biológico están determinadas por diversos factores, tales como los factores bióticos, la disponibilidad de los hospederos y la resistencia al medio ambiente (Estrada-Peña, 2015).

FIGURA 7 Ciclo biológico del complejo taxonómico A. cajennense.

28

Las larvas tienen un periodo de incubación entre 37 y 145 días, va relacionado en forma directa con las condiciones del medio ambiente, condiciones de temperatura por debajo de los 9 ºC pueden inhibir la incubación (Labruna et al., 2003). Al término de la incubación, las larvas eclosionan, éstas buscan algún lugar donde puedan sobrevivir, tales como lo tallos de las hojas, donde pueden encontrar gran cantidad de materia orgánica en descomposición, de igual manera se protegen de los rayos de sol y el viento. Las larvas tienen un tropismo gravitatorio negativo, es decir, que caminan hacia arriba. En los pastos y arbustos las larvas se encuentran distribuidas dependiendo de la humedad relativa. Desde la eclosión, las larvas tienen una longevidad sin alimentarse entre 87 y 286 días. El hospedero es percibido por las vibraciones que ocasiona él mismo al caminar, cuando baja la intensidad luminosa se produce un cambio de posición de la garrapata en el sentido del descenso, de igual manera éstas se sienten atraídas por objetos calientes, aunque menores de 47 ºC, también existe un quimiotactismo al CO2 y al olor de ácidos grasos propios de cada animal, siempre y cuando exista una temperatura mayor a los 27ºC (Estrada-Peña et al., 2013).

La invasión del primer hospedero tiene lugar en el momento en que éste pasa por la vegetación poblada de larvas, una vez invadido el hospedero manifiestan un tropismo en las zonas anatómicas que les proporcionan mayor facilidad de sobrevivencia, tales como la región perianal, inguinal, axilar, cuello y cabeza. Las larvas se fijan en el hospedero cortando la piel con los quelíceros e introduciendo el hipostoma, doblan los palpos en el sentido paralelo a la piel y así se inicia la primera fase parasítica. Se nutren de linfa de 2 a 7 días, tras las cuales se desprenden y caen al suelo para mudar a ninfa, a este estadio se le conoce como metalarvaria. Posterior a esta fase comienza un crecimiento interno y aparece una ninfa con cuatro pares de extremidades, la muda va a durar aproximadamente 10 días (Estrada-Peña, 2015). La longevidad de las ninfas es superior a la de las larvas, es de aproximadamente 410 días durante los cuales permanecen en reposo y se mantienen de lo que comieron en estado larval. La invasión del segundo hospedero se efectúa en forma semejante a la del primero, habiendo también un tropismo hacia los sitios anatómicos más favorables del hospedero, se nutren de 3 a 13 días, tiempo en el que ingurgitan para que posteriormente se desprendan y realicen la muda a 29

adulto. Las ninfas que se transformarán en adultos macho lo hacen en un periodo más corto que las hembras; además de tener tamaño menor. Los hospederos de las ninfas pueden ser mamíferos medianos o grandes. En esta segunda fase parasítica las ninfas se desprenden del hospedero una vez que se han saciado y en forma semejante a la metalarva, se forma una metaninfa, que ya en el suelo buscan los sitios adecuados para efectuar la muda. El cambio de ninfa a adulto dura aproximadamente de 12 a 15 días (Sonenshine, 2014).

La fase adulta puede durar de 4 a 6 días sin nutrirse, en los que se conserva gracias a su nutrición ninfal, manteniéndose inactiva hasta invadir al tercer hospedero. Cuando esto sucede, hay hembras y machos maduros sexualmente. Para que la cópula se efectúe, el macho aparece primero en el hospedero, la atracción que la hembra ejerce sobre el macho se produce por medio de feromonas, cabe mencionar que los machos no alimentados son infértiles, los espermatocitos primarios cesan su desarrollo antes de comenzar la ingurgitación. La espermatogonia y los espematozoides tempranos decrecen generalmente de número y los vasos deferentes son transformados en una vesícula seminal (Estrada-Peña, 2015). Las hembras ingurgitadas abandonan al tercer hospedero y caen al suelo, en donde se lleva a cabo el resto del ciclo. El tiempo que transcurre antes de la oviposición es entre nueve y 22 días, durante este tiempo la hembra busca un lugar adecuado para ovipositar, este lugar requiere de una temperatura y humedad adecuada, por lo que el sitio debe ser protegido (Araya-Anchetta et al., 2015). Una vez que la hembra grávida (teleógina) ha encontrado el sitio adecuado, pasa a una fase de letargia en el cual no hay desplazamiento, la hembra grávida se prepara para efectuar la oviposición (tiene una duración de 19 días), para ello retracta el gnatosoma y extiende una vesícula localizada entre el gnatosoma y el escudo, ésta se agranda formando dos lóbulos que contienen gránulos (órgano de Gene), el cual secreta un material viscoso, que sirve para proteger a los huevos de la deshidratación, además de formar una masa adherente (Piña et al., 2017). Los huevecillos son recibidos por los lóbulos una vez que han sido expulsados por el oviducto, al principio los huevecillos son color amarillo-café claro, cambiando a traslúcidos, el número de huevos varía de 700 a 3,500 (Sonenshine, 2015). La incubación tiene un periodo de 37 a 174 días con una temperatura de 28 ºC y un 80 30

% de humedad relativa, tanto las bajas como las altas temperaturas tienen un efecto limitante suprimiendo la oviposición. El frío aumenta el tiempo de preoviposición, así pues, cuando nacen en primavera tienen una vida más corta que cuando nacen en invierno (Estrada-Peña, 2015).

1.2.11 Transmisión de patógenos

Las garrapatas infestan a toda clase de vertebrados, incluidos mamíferos, pájaros, reptiles y en ocasiones anfibios (Rojas et al., 1999); transmiten una gran cantidad de patógenos, más que cualquier otro artrópodo. La mayoría de las enfermedades transmitidas por garrapatas son zoonosis (Nava et al., 2009), a pesar del gran avance en la medicina y en el control con químicos, los vectores y los patógenos están ahora presentes en más zonas geográficas y en diferentes condiciones climáticas (Geraci et al., 2007).

Existen más de 16 enfermedades en humanos causadas por garrapatas y más de 19 en animales de producción y de compañía (Nicholson et al., 2009). La enfermedad de Lyme fue la primera en ser reportada en los Estados Unidos de América en los años 80’s, actualmente la incidencia ha incrementado considerablemente, habiendo más de 28,000 casos reportados anualmente (CDC, 2014). La presencia de fiebre de las rocallosas causada por Rickettsia rickettsi ha sido reportada en gran medida en los Estados Unidos de América y en las últimas décadas en Latinoamérica (Guglielmone et al., 1999). Erlichia chaffeensis es el agente etiológico de la ehrlichiosis monocítica humana considerado como uno de los patógenos de mayor riesgo para las personas, causando incluso la muerte (Rikihisa, 2015).

En las enfermedades que afectan a los animales, los agentes etiológicos de mayor importancia son las babesias entre ellas Babesia caballi y Theileria equi, causantes de la piroplasmosis equina, que es una enfermedad de caballos producida por protozoos y transmitida por garrapatas. Anteriormente Theileria equi se designaba como Babesia equi (Scoles et al., 2011).

31

Se han identificado 12 especies de garrapatas de tipo ixódico de los géneros Dermacentor, Rhipicephalus, Hyalomma y Amblyomma como vectores de B. caballi y T. equi (De Waal, 1992). Los animales infectados pueden permanecer como transportadores de estos parásitos sanguíneos por largos periodos de tiempo y actuar como fuentes de la infección para las garrapatas que actúan como vector (Eisen, 2008). Estos parásitos se encuentran en el sur de Europa, Asia, países de la Unión de Estados Independientes, África, Cuba, Sudamérica y América Central, y ciertas partes del sur de los Estados Unidos de América. Theileria equi se ha descrito también en Australia (aunque en apariencia nunca se ha establecido en esta región) y se piensa que tiene una distribución general más amplia que B. caballi (Ueti et al., 2012). Durante el ciclo de vida de Babesia, los merozoitos invaden los eritrocitos (RBCs) y se transforman allí en trofozoitos. Posteriormente, los trofozoitos crecen y se dividen en dos merozoitos redondos, ovales o piriformes. Los merozoitos maduros son capaces entonces de infectar nuevos eritrocitos y luego, el proceso de división se repite (Zobba et al., 2008). Los merozoitos de B. caballi son piriformes, miden 2-5 µm de longitud y 1.3-3.0 µm de diámetro (Ueti et al., 2008). Los pares de merozoitos unidos por sus extremos terminales son una característica diagnóstica propia de la infección por B. caballi (Xu et al., 2003). Los merozoitos de Theileria equi son relativamente pequeños, con una longitud menor de 2-3 µm, de forma redonda o ameboide. Se suelen encontrar juntos cuatro parásitos dispuestos en forma de una tétrada o la llamada Cruz de Malta, característica propia de T. equi (Ueti et al., 2008).

1.3 Métodos de captura de garrapatas La captura de garrapatas se plantea cuando se pretenden realizar estudios de presencia de especímenes en un área determinada y en hospederos determinados, de igual manera en vigilancia epidemiológica. También cuando se requiere conocer la distribución de las diferentes especies en una localidad o área en particular, así como la actividad estacional y su abundancia relativa. Para la captura de garrapatas se suelen emplear diferentes métodos, los cuales se suelen incluir en tres grupos: a) métodos de captura pasivos o por

32

contacto directo, b) métodos de atracción a distancia, c) métodos de recolección directa de hospederos fijadas en animales (Tae Chong et al., 2013).

1.3.1 Captura de garrapatas por contacto directo con la vegetación

Los métodos más ampliamente empleados para la recolecta de garrapatas no alimentadas, que permanecen al acecho del hospedero en la vegetación, son el de la bandera y el del arrastre de la manta. La bandera consiste en una gran pieza de manta, fijada sobre un largo mango a modo de bandera, que se arrastra sobre la vegetación. El tipo de tejido utilizado puede ser cualquiera. Este método es especialmente utilizado para el muestreo en áreas de matorral o arbolado muy denso, donde el arrastre de la manta presenta dificultad. Este último método es similar al anterior, pero en este caso, la manta se arrastra por encima de la vegetación tirada por una cuerda atada en los dos extremos de la barra sobre la que se fija uno de los lados de la manta. Este sistema es el ideal para superficies con una cubierta vegetal baja y uniforme. En la práctica, la diferencia entre ambos métodos es escasa, siendo a menudo empleados los términos “bandera” y “arrastre” indistintamente. Existen algunas variantes de estos métodos, una de ellas sería una sábana o manta cortada en tiras rectangulares, siendo adecuado para su uso en muestreo en el interior de la vegetación cuando ésta está muy densa. En los diferentes sistemas la manta se revisa periódicamente y se determina el número de ejemplares capturados por unidad de tiempo o de superficie muestreada. Los métodos de arrastre o de bandera tradicionales tienen la ventaja de que permiten calcular de forma precisa la superficie en la que se han recogido las garrapatas (Dantas-Torres, et al., 2013).

Los sistemas de recolecta de garrapatas descritos anteriormente deben realizarse en los periodos en los que la vegetación está seca, evitando los días de lluvias y el rocío de la mañana, puesto que la manta tiene que estar seca. Se considera que estos métodos tienen una eficiencia de captura del 8 % de la población de garrapatas presentes en el área de muestreo (Sonenshine, 1998), variando este porcentaje de forma notable dependiendo de las especies presentes y también de la persona que realiza el muestreo. La eficacia de estos métodos de muestreo es considerada inferior a los métodos de

33

atracción (Solberg et al., 1992); sin embargo, se ha constatado que algunas especies de garrapatas no responden adecuadamente al estímulo del CO2 (Keaney, 1994).

Entre las principales ventajas que presentan estos métodos de captura cabe citar la simplicidad (fácil de fabricar, de transportar, etc.) del método y la posibilidad de calcular la abundancia de garrapatas por unidad de tiempo o superficie. Por otro lado, como principal desventaja se debe mencionar la dificultad o bajo rendimiento en la captura de varios estadios de garrapata, por ejemplo, las larvas, ya que al ocupar éstas la parte más baja de la vegetación, se ve dificultado el contacto con la manta (Gray, 1985a).

1.3.2 Captura de garrapatas con dispositivos atrayentes

Entre los dispositivos atrayentes, el más utilizado es la trampa de CO2. Estas trampas atraen a las garrapatas que se encuentran a distancias de varios metros, desde 1 m para las ninfas hasta 3.5 m para los adultos (Gray, 1985b). Este tipo de trampas está especialmente indicado para garrapatas capaces de realizar desplazamientos rápidos de varios metros para alcanzar al hospedero (Solberg et al., 1992). La trampa de CO2 consiste en un contenedor térmico para nieve carbónica, con unas aperturas en la parte inferior para la difusión del CO2, y de una plataforma con una cinta adhesiva en su parte superior, donde son atrapadas las garrapatas atraídas.

Entre los principales inconvenientes del empleo de las trampas de CO2 cabría destacar, como anteriormente se ha citado, que no todas las especies o estadios de ciertas especies de garrapatas responden activamente al estímulo del CO2, junto con las dificultades de tipo logístico (fabricación de las trampas, transporte hasta el lugar de muestreo o disponibilidad de la nieve carbónica) que conlleva su uso.

1.4 La Microscopía Electrónica de Barrido

La microscopía electrónica y sus aplicaciones a la biología han hecho un rápido progreso en los últimos 10 años. El microscopio electrónico de barrido utiliza lentes electromagnéticas, sistema de vacío, aperturas y cañón de electrones. El MEB acelera

34

los electrones y los colima para formar un haz muy fino que incide sobre la superficie de la muestra produciendo varias posibilidades de obtención de imagen. Debido al tamaño pequeño de las aperturas y la longitud de onda de los electrones tan corta, se puede conseguir una gran profundidad de campo (por lo tanto, mucha más información de la muestra) comparado con la imagen que se obtendría con un microscopio óptico si se usa el mismo aumento (de la Cruz, 1992).

El microscopio electrónico de barrido (MEB) utiliza electrones en lugar de luz para formar una imagen. El haz de electrones es producido al calentarse un filamento metálico dispuesto en el cañón de electrones, en la parte superior del microscopio. Cuando los electrones son liberados del átomo, se comportan de forma análoga a la luz. Este comportamiento es el que se aprovecha en la microscopía electrónica (Reimer, 1998).

1.5 Importancia del uso de modelos de distribución de especies

Debido al impacto potencial de los vectores sobre la estructura de las comunidades biológicas y al funcionamiento de los ecosistemas, se hace necesario conocer su distribución para implementar acciones de manejo y control. Un enfoque fundamental para la comprensión y gestión de especies invasoras es determinar su distribución potencial. Diversos estudios proporcionan una visión general de la modelación de distribución de especies o una comparación de los métodos de modelación (Anderson et al., 2003; Fielding y Bell, 1997; Guisan y Zimmermann, 2000; Guisan y Thuiller, 2005; Segurado y Araújo, 2004; Zaniewski et al., 2002). Estos modelos de distribución de especies tienen por objeto predecir áreas que describan las condiciones ambientales adecuadas para la supervivencia de las especies; es decir, la distribución potencial o nicho fundamental (Anderson et al., 2003; Guisan y Thuiller, 2005). En general, estos métodos de modelación combinan datos de localidades georeferenciadas de las especies donde ha sido confirmada su presencia con variables ambientales, para crear un modelo de requerimientos de la especie de acuerdo con las variables examinadas (Anderson et al., 2003). El modelo resultante es proyectado sobre un mapa de la región de estudio que muestra la distribución potencial de las especies estudiadas. Estos mapas pueden servir 35

para detectar áreas donde las especies invasoras pueden estar presentes y donde posiblemente estarán en el futuro. El clima es un factor importante que afecta o determina la distribución de los organismos; por tal motivo, los análisis de variables climáticas ayudan a comprender el por qué una especie crece en un determinado sitio y no en otro (Lindenmayer et al., 1991).

36

2 HIPÓTESIS

Amblyomma mixtum es la especie del complejo Amblyomma cajennense (sensu lato) que se encuentra en las diez regiones del estado de Veracruz, México.

37

3 OBJETIVOS

3.2 Objetivo general

Determinar la distribución espacial y caracterizar morfológicamente las garrapatas del complejo taxonómico Amblyomma cajennense (sensu lato) recolectadas de bovinos, équidos y vegetación en las diez regiones del estado de Veracruz, México.

3.3 Objetivos específicos

• Identificar morfológicamente mediante un microscopio estereoscopio las garrapatas que pertenecen al complejo taxonómico A. cajennense (sensu lato) recolectadas en bovinos, équidos y vegetación en las diez regiones naturales del estado de Veracruz, México. • Determinar a través de microscopía electrónica de barrido la (s) especie (s) del complejo taxonómico de A. cajennense (sensu lato) recolectadas de bovinos, équidos y de la vegetación en las diez regiones del estado de Veracruz, México. • Georreferenciar la (s) especie (s) del complejo taxonómico de A. cajennense (sensu lato) en las diez regiones naturales del estado de Veracruz, México. • Determinar el área de distribución potencial del complejo taxonómico de A. cajennense (sensu lato) en las diez regiones naturales del estado de Veracruz, México. • Determinar la estructura genética de Amblyomma mixtum en el estado de Veracruz.

4 REFERENCIAS

Alekseev, A. N., Dubinina, H. V., Jushkova, O. V. (2004). First report on the coexistence and compatibility of seven tick-born pathogenes in unfed adult Ixodes Persulcatus Schulze (Acari: Ixodidae). International Journal of Medicina and Microbiology, 293 (37): 104-108. Allsopp, M. T., Lewis, B. D., Penzhorn, B. L. (2007). Molecular evidence for transplacental transmission of Theileria equi from carrier mares to their apparently healthy foals. Veterinary Parasitology, 148: 130-136. Álvarez, V. V., Bonilla, R. M. (2007). Adultos y ninfas de la garrapata Amblyomma cajennense Fabricius (Acari: Ixodidae) en equinos y bovinos. Agronomía Costarrisense, 31(1): 61-69. Anderson, J.F. y Magnarelli, L.A. (2008). Biology of ticks. Infect Dis Clin North Am; 22:195- 215. Araya-Anchettaa, A., Buscha, J. D., Scolesb, G. A., Wagne, D. M. (2015) Thirty years of tick population genetics: A comprehensive review. Infection, Genetics and Evolution 29 (2015) 164–179. Balashov, Yu. S. (1972). Bloodsucking ticks (Ixodoidea)-vectors of diseases of men and animals. Miscelaneous Publications of the Entomological Society of America, 8:163-376. Balashov, Y. S., Amosova, L. I., Grigor’eva, L. A. (1998). Transovarial and transphasic transmission of Borrelia by the taiga tick Ixodes persulcatus (Ixodidae). Parazitologiya 32: 489–494. Barker, S. C., Murrell, A. (2004). Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names. Parasitology, 129: 15-36. Beati, L., Nava, S., Burkman, J. E., Barros-Battesti, D. M., Labruna, M. B., Guglielmone, A. A., Cáceres, A. G., Guzmán-Cornejo, C. M., León, R., Durden, L. A., Faccini, J. L. H. (2013). Amblyomma cajenense (Fabricius, 1787) (Acari: Ixodidae), the Cayenne tick: phylogeofraphy and evidence for allopatric speciation. BMC Evolutionary Biology, 13: 267.

39

Berdyev, A. (1980). Ecology of Ixodid Ticks of Turkmenistan and Their Role in Natural Focal Diseases Epizootiology. Ashkhabad, Turkmenistan: Ylym. Borges, L. M. F., Oliveira, P. R., Lisboa, C. L. M., Ribeiro, M. F. B. (2002). Horse resistance to natural infestation of Anocentor nitens and Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae). Veterinary Parasitology, 104: 265-273. De la Cruz y Estrada-Peña. (1992). A simple, new improved method for Preparing ticks for examination by Scanning electron microscopy. Acarologia. De Waal, D. T. (1992). Equine piroplasmosis: a review. The British veterinary journal, 148 (1): 6-14. Dantas-Torres F.e, Lia R., Otranto D. (2013). Efficiency of flagging and dragging for tick collection. Experimental and applied acarology. (61) 1. 119-127. Reimer, L. (1998). Escanning Electron Microscopy. Germany. Ed. Board. Eisen, L. (2008). Climate change and tick-borne diseases: a research field in need of long- term empirical field studies. Int. J. Med. Microbiol. 298, 12–18. Estrada-Peña, A., Guglielmone, A. A., Mangold, A. J. (2004). The distribution and ecological “preferences”’ of the tick Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae), an ectoparasite of humans and other mammals in the Americas. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 98 (3): 283–292. Estrada-Peña A. (2015). Ticks as vectors: taxonomy, biology and ecology. Rev. Sci. Tech. 34(1): 53-65. Geraci, N. S., Johnston, S. J., Robinson, J. P., Wikel, S. K., Hill, C. A. (2007). Variation in genome size of argasid and ixodid ticks. Insect Biochemestry, 14: 2051-2088. Gordillo-Pérez, G., Vargas, M., Solórzano-Santos, F., Rivera, A., Polaco, O. J., Alvarado, L., Muñoz, O., Torres, J. (2009). Demonstration of Borrelia burgdorferi sensu stricto infection in ticks from the northeast of Mexico. Clinical Microbiology and Infection, 15: 469-498. Guglielmone, A. A., Hanadi A., Mangold A. J. (1986). Empleo del dióxido de carbono para la captura de ninfas y adultos de Amblyomma neumanni y Amblyomma cajennense. Revevista Actividad Veterinaria, 67 (5): 238-245.

40

Guglielmone, A. A., Mangold, A. J., Oyala, B. C. (1992). Ciclo de vida del Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Acari: Ixodidae) en condiciones de laboratorio. Revista de Medicina Veterinaria, 73 (4): 184-187. Guglielmone, A. A., Estrada-Peña, A., Keirans, J. E., Robbins, R. G. (2003). Ticks (Acari: xodidae) of the Neotropical Zoogeographic Region. Special Publication, International Consortium on Ticks and Tick-Borne Diseases, Atalanta, Houten, The Netherlands, pp 174. Guglielmone, A. A., Robbins, R. G., Apanaskevich, D. A., Petney, T. N., Estrada-Peña, A., Horak, I. G. (2009). Comments on controversial tick (Acari: Ixodida) species names and species described or resurrected from 2003 to 2008. Exp Appl Acarol. 48(4):311-27. Guzmán-Cornejo, C., Robbins, R., Guglielmone, A. A., Montiel-Parra, G., Pérez, T. M. (2011). The Amblyomma (Acari: Ixodidae) of Mexico: identification keys, distribution and hosts. Zootaxa, 2998: 16-38. Illoldi-Rangel, P., Chissa-Louise, R., Blake, S., Trout, F., Gordillo-Pérez, G., Rodríguez- Moreno, A., Williamson, P., Montiel-Parra, G., Sánchez-Cordero, V., Sahotra, S. (2012). Species distribution models and ecological suitability analysis for potential tick vectors of Lyme disease in México. Journal of Tropical Medicine, 2012: 10 pp. doi:10.1155/2012/959101. Jeyaprakash, A., Hoy, M. A. (2009). First divergence time estimate of spiders, scorpions, mites and ticks (subphylum: Chelicerata) inferred from mithocondrial phylogeny. Experimental and Applied Acarology, 47: 1-18. Keaney P. (1994). The Effectiveness of Various Trapping Techniques In Collecting Ixodes scapularis and Other Species of Ticks. Kohls, G.M. (1958) Amblyomma Imitator, a New Species of Ticks from Texas and Mexico and Remarks on the Synonymy of A. Cajennense (Fabricius) (Acarina-Ixodidae). The Journal of Parasitology, 44, 430-433. Krantz, G. W, Walter, D. E. (2009). A Manual of Acarology. 3erd ed. Lubbock, TX: Texas tech University Press.

41

Labruna, M.B., Kasai, N., Ferreira, F., Faccini, J. L. H., Gennari, S. M. (2002). Seasonal dynamics of ticks (Acari: Ixodidae) on horses in the state of Sāo Paulo, Brazil. Veterinary Parasitology, 105: 65-77. Labruna, M. B., Amaku M., Metzner J. A., Pinter, A., Ferreira, F. (2003). Larval behavioral diapause regulates life cycle of Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae) in Southeast Brazil.J. Med Entomol. 40(2): 170-8. Labruna, M. B., Soares, J. F., Martins, T. F., Soares, H. S., Cabrera, R. R. (2011). Cross- mating experiments with geographically different populations of Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae). Experimental and Applied Acarology, 54: 41–49. Lopes, C. M. L., Leite, R. C., Labruna, M. B., Oliveria, P. R., Borges, L. M. F., Rodrigues, Z. B., Carvalho, H. A., Freitas, C. M. V., Junior, C. R. V. (1998). Host specificity of Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Acari: Ixodidae) with comments on the drop-off rhythm. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 93(3): 347-351. Mans, B. J., Neitz, A. W. (2004). Adaptation of ticks to a blood-feeding environment: evolution from a functional perspective. Insect Biochemestry of Molecular Biology, 34: 1-17. Mannelli, A., Bertolotti, L., Gern, L., and Gray, J. (2012). Ecology of Borrelia burgdorferi sensu lato in Europe: transmission dynamics in multi-host systems, influence of molecular processes and effects of climate change. FEMS Microbiol. Rev. 36, 837– 861. Mastropaolo, M., Nava, S., Guglielmone, A. A., Mangold, A. J (2011) Biological differences between two allopatric populations of Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae) in Argentina. Exp Appl Acarol. 53(4):371–375. Mullen, G. R. and Durden, L. A. San Diego, California: Academic Press; 2002: 517-518. Nava, S., Gugliemone, A. A., Kumthong, R. (2007). The molecular basis of the Amblyomma americanum tick attachment phase. Experimental and Applied Acarology, 41: 267-287. Nava, S., Gugliemone, A. A., Mangold, A. J. (2009). An overview of systematic and evolution of ticks. Biological Science, 14: 2857-2877. Nava, S., Beati, L., Labruna, M. B., Cáceres A. G., Mangold, A. J., y Guglielmone, A. A. (2014). Reassessment of the taxonomic status of Amblyomma cajennense 42

(Fabricius, 1787) with the description of three new species, Amblyomma tonelliae n. sp., Amblyomma interandinum n. sp. and Amblyomma patinoi n. sp., and reinstatement of Amblyomma mixtum Koch, 1844, and Amblyomma sculptum Berlese, 1888 (Ixodida: Ixodidae). Ticks Tick Borne Dis. In press. Neumann, L. G. (1899). Révision de la famille des Ixodidés (Зème memoire.). Mémoires de la Sociétézoologique de France, 12: 107-294. Nicholson, W., Sunenshine, D. E., Lane, R. S., Uilenberg, G. (2009). Ticks (Ixoda). En L. A. Durden and G. Mullen (Eds), Medical and Veterinary Entomology. San Diego: Academic Press, pp. 493-542. Oliveira, P. R., Borges, L. M. F., Leite, R.C., Freitas, C. M. V. (2003). Seasonal dynamics of the Cayenne tick, Amblyomma cajennense on horses in Brazil. Medical and Veterinary Entomology, 17: 412-416. Piña, F. T.B., da Silva-Rodrigues, V., de Oliveira-Souza H. L., Garcia, M. V., Barros, J. C., de León, A. A. P., Andreotti, R. (2017). Life cycle of Amblyomma mixtum (Acari: Ixodidae) parasitizing different hosts under laboratory conditions. Exp Appl Acarol. 73(2):257-267. Ribeiro, J.M. y Francischetti, I.M. (2003). Role of arthropod saliva in blood feeding: sialome and post-sialome perspectives. Annu Rev Entomol 48:73-88. Randolph, S. E., Storey, K. (1999). Impact of microclimate on immature tick-rodent host interactions (Acari: Ixodidae): implications for parasite transmission. J Med Entomol. 36(6):741-8. Rikihisa, Y. (2015). Molecular Pathogenesis of Ehrlichia chaffeensis Infection Annual Review of Microbiology. 69: 283-304. Robinson, L. E. (1926). The genus Amblyomma. En Ticks: A monograph of the Ixodoidea. Vol. IV. Cambridge, University Press, pp. 302. Rodríguez-Vivas, R. I., Rosado A. A., Estrella, B. G., García-Vázquez, Z., Rosario-Cruz, R., Fragoso, S. H. Manual Técnico para el control de garrapatas en el ganado bovino. (2006). Publicación Técnica Número 4. Ed. INIFAP. Rojas, R., Marini, M. A., Coutinho, M. T. Z. (1999). Wild birds as hosts of Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Acari: Ixodidae). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 94(3): 315-322. 43

Romero-Castañón, S., Ferguson, B. G., Güiris, D., González, D., López, S., Paredes, A., Weber, M. (2008). Comparative parasitology of wild and domestic ungulates in the Selva Lacandona, Chiapas, Mexico. Comparative Parasitology, 75: 115-126. Rudolph, D., Knulle, W. (1974). Site and mechanism of water vapour uptake from the atmosphere in ixodid ticks. Nature. 249:84–85 Scoles G. A., Hutcheson., Schlater J. L., Hennager S. G., Pelzel M. A., Knowles, D.P. (2011). Equine Piroplasmosis associated with Amblyomma cajennense Ticks, Texas, USA. Journal of Emerging Infectious Diseases, 17 (10): 1903-1905. Scoles, G., A, Ueti, M. W. (2013). Amblyomma cajennense is an intrastadial biological vector of Theileria equi. Parasites & Vectors, 6: 306. Serra Freire, N. M. (1982). Epidemiología de Amblyomma cajennense: Ocurrencia estacional y comportamiento de dos estadios de parásitos en pastos del estado de Río de Janeiro. Arq. Univ. Rur. Rio de J. 5(2): 187-193. Sonenshine, D. E. (1991). Biology of Ticks I. New York (USA): Oxford University Press, Inc. Sonenshine, D.E.; Lane, R.S.; Nicholson, W.L. (2002). Ticks (Ixodida). In Medical and Veterinary Entomology. Mullen, G. R. and Durden, L. A. San Diego, California: Academic Press; 2002: 517-518. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. (2014). Biology of Ticks. Oxford University Press. 2nd. Edition. Tae Chong, S., Heung C. K., In-Yong, L., Thomas, M. K., Jr., Sancho, A. R., Sames W. J., Klein, T. A. (2013). Comparison of Dragging and Sweeping Methods for Collecting Ticks and Determining Their Seasonal Distributions for Various Habitats, Gyeonggi Province, Republic of Korea. Journal of Medical Entomology. 50(3): 611- 618. Tonelli-Rondelli, M. (1939). Ixodoidea Parte II-Contributo alla conoscenza della fauna ixodologica sudamericana. Rivista di Parassitologia, 3(1): 39-55. Topalis, P., Tzavlaki, C., Vestaki, K., Dialynas, E., Sonenshine, D. E., Butler, R., Bruggner, R. V., Stinson, E. O., Collins, F. H., Louis, C. (2008). Anatomical ontologies of mosquitoes and ticks, and their web browsers in VectorBase. Insect Molecular Biology, 17: 87-89. 44

Ueti, M. W., Palmar, G. H., Scoles, G. A., Kappmeyer, L. S., Knowles, D. P. (2008). Persistently infected horses are reservoirs for intrastadial tick-borne transmission of the apicomplexan parasite Babesia equi. Infectious immunology, 76: 3525-3529. Ueti MW, Mealey RH, Kappmeyer LS, White SN, Kumpula-McWhirter N, Pelzel AM, et al. (2012) Re-Emergence of the Apicomplexan Theileria equi in the United States: Elimination of Persistent Infection and Transmission Risk. Xu, Y., Zhangs, S., Bayin, C., Xuan, X., Igarashi, I., Fujisak, K., Kabeya, H., Maruyamas, M. T. (2003). Seroepidemiologic studies on Babesia equi and Babesia caballi infection in horses in Jilin province of China. Journal of Veterinary Medical Science, 65 (9): 1015-1017. Zobba, R., Ardu, M., Niccolini, S., Chessa, B., Manna, L., Cocco, R., Parpaglie, M. L. P. (2008). Clinical and laboratory findings in equine piroplasmosis. Journal Equine Veterinary Science, 28: 301-308.

45

CAPÍTULO II

Genetic structure analysis of Amblyomma mixtum populations in Veracruz State, Mexico.

Artículo aceptado. Revista: Ticks & Tick-borne Diseases Factor de impacto: 2.84 Artículo en prensa.

46

Ticks and Tick-borne Diseases xxx (xxxx) xxx–xxx

Contents lists available at ScienceDirect

Ticks and Tick-borne Diseases

journal homepage: www.elsevier.com/locate/ttbdis

Original article Genetic structure analysis of Amblyomma mixtum populations in Veracruz State, Mexico

Mariel Aguilar-Domíngueza, Sokani Sánchez-Montesb, María Dolores Esteve-Gassentd, ⁎ Carolina Barrientos-Salcedoe, Adalberto Pérez de Leónc, Dora Romero-Salasa, a Laboratorio de Parasitología, Posta Zootécnica Torreón del Molino, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, Veracruz, Mexico b Centro de Medicina Tropical, Unidad de Investigación en Medicina Experimental, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexico City, Mexico c USDA-ARS Knipling-Bushland U.S. Livestock Insects Research Laboratory and Veterinary Pest Genomics Center, Kerrville, TX, USA d Departament of Veterinary Pathobiology, Texas A&M University, TX, USA e Facultad de Bioanálisis, Universidad Veracruzana, Veracruz, Mexico

ARTICLE INFO ABSTRACT

Keywords: Amblyomma mixtum Koch, 1844 parasitizes livestock, humans, and wildlife in Mexico. However, information on Amblyomma mixtum population genetics for this tick species in the country is missing. Tick samples were collected from livestock in Population genetics ten regions across the state of Veracruz (22°28′N, 17°09′S, 93°36′E, 98°39′W) to analyze the genetic structure of Ectoparasite A. mixtum populations. Ticks were morphologically identified using taxonomic keys. In order to test the intra- Cattle specific variability of A. mixtum fragments of the mitochondrial gene 16S-rRNA and cytochrome oxidase subunit Horse 1 (COI) were amplified. Ninety-six sequences were amplified from the 50 specimens’ analyzed (96% amplifi- Veracruz Mexico cation success). Eleven haplotypes were detected in 16S-rRNA gene and 10 more for COI. Neutrality tests showed negative results in most of the locations analyzed, which is indicative of an excess of recently derived haplotypes. However, these results were not statistically significant. Minimal union network analysis revealed that there is no separation of populations by geography, and that there is an overlap of several haplotypes among diverse populations. Significant genetic differentiation was not detected in the A. mixtum populations sampled in the state of Veracruz, Mexico, this may be due to the frequent movement of livestock hosts. This is the first report on the genetic structure of A. mixtum populations in Mexico.

1. Introduction and weight loss. However, it also serves as a vector transmitting pa- thogens to animals (e.g. Anaplasma marginale) and human (e.g. Ticks are obligate hematophagous ectoparasites, which can act as Rickettsia rickettsii). In addition, other potentially zoonotic species of vectors of multiple pathogens such as bacteria, viruses, protozoa, and Rickettsia have been detected (e.g. R. amblyommatis) making A. mixtum helminths that affect human, domestic animal, and wildlife populations one of the most important tick species in veterinary medicine and (Baneth, 2014). Particularly in America, several members of the Am- public health in Mexico (Estrada-Peña et al., 2004; Guzmán-Cornejo blyomma cajennense species complex represent a problem for livestock et al., 2011; Rodríguez-Vivas et al., 2016; Sánchez-Montes et al., 2016; production and human public health, due to their adaptation to cattle Álvarez-Hernández et al., 2017; Piña et al., 2017). and their anthropophilic habits (Estrada-Peña et al., 2004; Almazan However, information related to the genetic diversity of A. mixtum et al., 2018; Labruna, 2018). Among them the species that exhibits the in Mexico is lacking. Genetic and demographic studies are essential to widest distribution is Amblyomma mixtum Koch, 1844, that has been determine the magnitude of genetic exchange among tick populations registered from southwestern Texas to Colombia (Beati et al., 2013; (Araya-Anchetta et al., 2015; Esteve-Gassent et al., 2016). This Nava et al., 2014; Rivera-Páez et al., 2016, 2018). This species has knowledge has practical implications such as the ability to understand adapted to diverse ecological niches, including semi-arid grasslands and how the movement of livestock across agroecosystems may influence subtropical secondary forests (Estrada-Peña et al., 2004). the gene flow between conspecific tick populations, and the possibility This tick species parasitizes several domestic and wild mammals, in to predict the dispersion of genes that confer resistance to ixodicides which it causes direct effects related to blood feeding such as weakness (Loaiza et al., 2010). Moreover, these studies can yield critical

⁎ Corresponding author. E-mail address: [email protected] (D. Romero-Salas). https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2018.09.004 Received 21 March 2018; Received in revised form 27 August 2018; Accepted 10 September 2018 1877-959X/ © 2018 Elsevier GmbH. All rights reserved.

Please cite this article as: Aguilar Domínguez, M., Ticks and Tick-borne Diseases, https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2018.09.004 M. Aguilar-Domínguez et al. Ticks and Tick-borne Diseases xxx (xxxx) xxx–xxx information about the divergence of lineages, discrete populations and each primer (2 μM), 12.5 μL of green GoTaq of Promega, and 8.5 μLof the timing of demographic processes that may influence the contribu- free nuclease sterile water. A negative control (reaction mix without tion of vectors in the transmission of several tick-borne pathogens. DNA), and a positive control (reaction mix and Rhipicephalus sanguineus Mitochondrial DNA (mtDNA) analysis is a powerful tool for the s. l. DNA) were both included. PCR products were resolved in 2% reconstruction of the phylogeny of species and their demographic his- agarose gels using 1 kb molecular weight marker (nucleic acid markers, tory (Mirol et al., 2008). The advantages of mtDNA for studying closely Axygen) in 1x TBE buffer. Amplicons of the expected size were sub- related taxa and populations within species are its low recombination mitted in the purification and sequencing to Laboratorio de Biología rate, maternal heredity, highly conserved structure, small effective Molecular y de la Salud, Universidad Nacional Autónoma de México. population size and relatively fast mutation rate. In ticks, the 16S-rRNA and cytochrome oxidase subunit 1 (COI) genes have a high mutation 2.5. Population genetics analysis rate, rendering them as very useful tools for intra-population studies (Esseghir et al., 1997; Ishikawa et al., 1999; Hodgkinson et al., 2003; de Sequence data were edited, and global alignments were done using Lima et al., 2017). Therefore, we planned this study to investigate the Clustal W algorithm in Mega 6.0. Sequences generated in this study genetic structure of A. mixtum populations infesting livestock in the were submitted to GenBank using the Bankit tool. In order to ascertain state of Veracruz, Mexico. Veracruz is the state in Mexico with the genetic diversity, we calculated the number of haplotypes, number of largest cattle herd, which includes approximately four million head unique haplotypes, number of mutations, number of segregating sites, (Rodriguez-Vivas et al., 2017). The A. mixtum host diversity, as well as number of unique sites, haplotypic diversity, and nucleotide diversity in the variety of ecosystems and cattle movement in the state of Veracruz DNAsp 5.10 (Librado and Rozas, 2009). Additionally, we analyzed se- suggest small differences thus, ticks were sampled across ecological lective neutrality estimating Tajimas D, Fu and Lis D tests using DnaSP regions in the state to assess genetic divergence by the amplification of v.5.10 software (Librado and Rozas, 2009). Genetic divergence between the 16S-rRNA and COI genes. population pairs were calculated with the Fixation index (Fst), and the average number of nucleotide substitutions per site (Dxy) determined 2. Materials and methods with DNAsp. To identify the relationship among haplotypes, minimal union networks were constructed using the program PopArt. 2.1. Tick collection and mapping 2.6. Phylogenetic tree reconstruction A total of 50 (23 female, 27 male) A. mixtum from cattle and equine from ten regions were collected and analyzed during August-November The best nucleotide substitution model was selected based on the 2015 and February-April 2016 (Table 1) in a convenience sampling. Akaike information criterion (AlCc) calculated in Mega 6.0. The ranch locations sampled across the ten regions in the state of Phylogenetic trees were created using the unique haplotypes detected Veracruz include diverse ecosystems that range from tropical coastal in this study (GenBank Accession Numbers MG930053-MG930063 for plains up to 1,520 m above sea level. Hosts were physically restrained 16S-rRNA gene, and MH374165-MH374174 for COI), sequences of A. and inspected for the presence of ticks, particularly in the neck, limbs mixtum from the US (GenBank Accession Numbers L34317.1, and inguinal region. All ticks were recovered from the hosts using KM519935.1 and JX573118), one sequence of A. mixtum from forceps and were fixed and preserved in ethanol. All experimental Colombia (GenBank Accession Number MF353122.1) and sequences of protocols were approved by the animal care and use committee of the several other hard tick genera (Haemaphysalys parva, Rhipicephalus ap- School of Veterinary Medicine, University of Veracruz, Veracruz, pendiculatus, and Ixodes scapularis) and a soft tick species (Argas per- Mexico. sicus) as an outgroup. For phylogenetic reconstruction, we used the software MrBayes v.3.2. (Ronquist et al., 2012), with four Markov 2.2. Morphological identification Chain Monte Carlo chains that were run for 10,000,000 generations (sampled every 1000 generations) to allow adequate time for con- Morphological characters of each tick were observed under a Motic® vergence (=0.003). The first 25% of the sampled trees were considered stereoscope microscope. These were identified according to the mor- burn in. The final tree was visualized and edited by ITOL software. phological keys from Guzmán-Cornejo et al. (2011) and Nava et al. (2014). 3. Results

2.3. DNA extraction Ninety-six sequences were amplified from the 50 specimens ana- lyzed (96% amplification success). Two samples, one from the Capital Tick DNA extraction was performed individually. Every specimen and another one from the Olmeca regions could not be amplified. was transferred to a 1.5-mL Eppendorf tube, which was placed on the Fragments of 380–400 base pairs from the 16s-rRNA gene were ob- surface of a container with liquid nitrogen. Subsequently the sample tained, and 350–370 bp in COI. was crushed with the help of a sterile pistil. Then, 500 μL of 5% Chelex® 100 Chelating Resin (Biorad, USA) solution and 20 μL of Proteinase K 3.1. Population genetics analysis (SIGMA life sciences, USA) were added per sample, and allowed to incubate at 56 °C for two hours. The samples were then centrifuged at 3.1.1. s-rRNA gene 25,000 × g for 15 min and the supernatant was collected in new tubes For population genetics analysis, we constructed an alignment with and stored at −20 °C until further use (Ballados-González et al., 2018). the 48 sequences recovered in this study. The final alignment consisted of 380 base pairs, with 370 conserved and 10 variable sites, three 2.4. Polymerase chain reaction (PCR) singletons (in positions 30, 164, and 247), and seven parsimony in- formative sites(in positions 107, 114, 164, 247, 107, 114, 129, 137, To analyze the intra-specific variability of A. mixtum, we amplified a 216, 293, and 311). fragment of ∼400 bp from the 16S-rRNA gene using a pair of oligo- We detected the presence of 11 haplotypes. The most frequent nucleotides and conditions reported by Norris et al. (1996), and a haplotype detected was H3, with 24 sequences (50%), followed by fragment of ∼379 bp from the cytochrome oxidase subunit 1 (COI) haplotypes H4 with five (10%) and H5 with four sequences (8%). The with the conditions of Hafner et al. (1994). PCR was performed in a least frequent haplotypes were H6, H7, H8 and H11, which were re- volume of 25 μL, which contained 300–500 ng of genomic DNA, 1 μLof corded once each (Table 1). Haplotype diversity (Hd) was 0.7323, and

2 M. Aguilar-Domínguez et al. Ticks and Tick-borne Diseases xxx (xxxx) xxx–xxx

Table 1 Sampling sites, hosts and haplotypes of specimens collected in this study. NA, Not amplified.

ID Region Municipality Host Latitude Longitude 16S-rRNA COI

1 Huasteca Alta Pánuco Cattle 22.0719 −98.1822 H1 H1 2 Huasteca Alta Pánuco Cattle 22.0719 −98.1822 H1 H1 3 Huasteca Alta Pánuco Equine 22.0250 −98.1764 H2 H1 4 Huasteca Alta Pánuco Equine 22.1174 −98.2047 H2 H1 5 Huasteca Alta Pánuco Equine 22.1174 −98.2047 H3 H1 6 Huasteca Baja Tuxpan Cattle 20.9404 −97.4116 H3 H1 7 Huasteca Baja Tuxpan Cattle 20.9909 −97.3967 H3 H2 8 Huasteca Baja Naranjos Equine 21.3356 −97.7633 H3 H3 9 Huasteca Baja Naranjos Equine 21.3356 −97.7633 H3 H1 10 Huasteca Baja Naranjos Equine 21.3565 −97.7316 H3 H1 11 Totonaca Tihuatlán Cattle 20.5875 −97.5283 H4 H4 12 Totonaca Tihuatlán Cattle 20.6181 −97.6144 H5 H1 13 Totonaca Tecolutla Equine 20.3711 −96.9167 H5 H1 14 Totonaca Tecolutla Cattle 20.4753 −97.0364 H6 H5 15 Totonaca Gutiérrez Zamora Cattle 20.4133 −97.0419 H5 H5 16 Nautla Nautla Cattle 20.1819 −96.8242 H4 H1 17 Nautla Nautla Cattle 20.1094 −96.8011 H4 H1 18 Nautla Nautla Cattle 20.1533 −96.8281 H4 H6 19 Nautla Nautla Equine 20.1819 −96.8242 H4 H2 20 Nautla Nautla Equine 20.1819 −96.8242 H3 H2 21 Capital Xalapa Cattle 19.5467 −96.8681 H7 H2 22 Capital Xalapa Equine 19.5467 −96.8681 H8 H6 23 Capital Xalapa Equine 19.5467 −96.8681 H2 H1 24 Capital Coatepec Equine 19.4619 −96.9881 NA NA 25 Capital Xalapa Equine 19.5467 −96.8506 H3 H1 26 Montaña Yanga Equine 18.8025 −96.7592 H3 H1 27 Montaña Orizaba Equine 18.8711 −97.0897 H3 H1 28 Montaña Coscomatepec Cattle 19.0886 −97.0531 H3 H1 29 Montaña Coscomatepec Cattle 19.0886 −97.0531 H3 H1 30 Montaña Coscomatepec Equine 19.0886 −97.0531 H3 H1 31 Sotavento Medellín Cattle 19.0844 −96.1808 H1 H1 32 Sotavento Medellín Equine 19.0328 −96.1756 H3 H6 33 Sotavento Paso de Ovejas Cattle 19.2011 −96.3839 H3 H1 34 Sotavento Paso de Ovejas Cattle 19.2733 −96.5017 H3 H1 35 Sotavento Puente Nacional Cattle 19.2283 −96.6861 H9 H1 36 Papaloapan Tierra Blanca Cattle 18.4519 −96.3822 H5 H1 37 Papaloapan Tierra Blanca Equine 18.6319 −96.1717 H3 H7 38 Papaloapan Tlacotalpan Equine 18.5544 −95.7283 H3 H7 39 Papaloapan Tlacotalpan Cattle 18.5814 −95.7489 H9 H1 40 Papaloapan Tlacotalpan Cattle 18.4067 −95.5589 H9 H8 41 Tuxtlas Catemaco Equine 18.5564 −94.9919 H3 H8 42 Tuxtlas Catemaco Cattle 18.3956 −95.1211 H3 H8 43 Tuxtlas Santiago Tuxtla Equine 18.4542 −95.2711 H10 H8 44 Tuxtlas Santiago Tuxtla Equine 18.3644 −95.4797 H10 H4 45 Tuxtlas San Andrés Tuxtla Cattle 18.6747 −95.2842 H3 H1 46 Olmeca Acayucan Cattle 18.0706 −94.9861 H3 H10 47 Olmeca Acayucan Cattle 18.0183 −95.0467 H3 H1 48 Olmeca Acayucan Equine 18.0614 −94.8844 NA NA 49 Olmeca Jesús Carranza Equine 17.5219 −95.0747 H11 H10 50 Olmeca Jesús Carranza Cattle 17.3542 −94.9658 H3 H6

Table 2 Summary statistics for polymorphisms and neutrality tests of 16S-rRNA gene from Amblyomma mixtum from Veracruz. Abbreviations: N, number of individuals; S, Number of polymorphic sites; h, number of haplotypes; hd, haplotype diversity; π, nucleotide diversity.*p < 0.05.

Locality N S h Hd π Tajima’s D Fu and Li’s D Fu and Li’sF Fu’sFs

Huasteca Alta (Ha) 5 5 2 0.6666 0.0088 2.1249 2.1249* 2.0080 3.153 Huaseca Baja (Hb) 5 0 1 0.0000 0.0000 (-) (-) (-) (-) Totonaca (To) 5 2 3 0.7000 0.0021 −0.9726 −0.9726 −0.9544 −0.829 Nautla 5 2 2 0.4000 0.0021 −0.9726 −0.9726 −0.9544 1.040 (Na) Capital 4 3 4 1.0000 0.0040 −0.7545 −0.7545 −0.6747 −2.367 (Ca) Montaña (Mo) 5 0 1 0.0000 0.0000 (-) (-) (-) (-) Sotavento (So) 5 4 3 0.7000 0.0058 0.9571 0.9571 0.9742 0.804 Papaloapan (Pa) 5 4 3 0.8000 0.0058 0.9571 0.9571 0.9742 0.804 Tuxtlas 5 2 2 0.6000 0.0032 1.4588 1.4588 1.4316 1.688 (Tu) Olmeca (Ol) 4 2 2 0.5000 0.0026 −0.7099 −0.7099 −0.6043 1.099 Total 48 10 11 0.7323 0.0045 −0.7024 −0.4249 −0.6074 −3.703

3 M. Aguilar-Domínguez et al. Ticks and Tick-borne Diseases xxx (xxxx) xxx–xxx

Table 3 Summary statistics for polymorphisms and neutrality tests of COI gene from Amblyomma mixtum from Veracruz. Abbreviations: N, number of individuals; S, Number of polymorphic sites; h, number of haplotypes; hd, haplotype diversity; π, nucleotide diversity.*p < 0.05.

Locality N S h Hd π Tajima’s D Fu and Li’s D Fu and Li’sF Fu’sFs

Huasteca Alta (Ha) 5 0 1 1.000 0.00,000 (-) (-) (-) (-) Huaseca Baja (Hb) 5 4 3 0.700 0.00533 −1.20106 −1.09380 −1.11335 0.276 Totonaca (To) 5 2 3 0.800 0.00333 0.24314 0.24314 0.23860 −0.475 Nautla 5 3 3 0.800 0.00600 1.57274 1.57274 1.57783 0.469 (Na) Capital 4 3 3 0.833 0.00556 0.16766 0.16766 0.14992 −0.133 (Ca) Montaña (Mo) 5 0 1 0.000 0.00,000 (-) (-) (-) (-) Sotavento (So) 5 1 2 0.400 0.00133 −0.81650 −0.81650 −0.77152 0.090 Papaloapan (Pa) 5 4 3 0.800 0.00733 0.95707 0.95707 0.97418 0.804 Tuxtlas 5 4 3 0.700 0.00600 −0.41017 −0.41017 −0.41751 0.469 (Tu) Olmeca (Ol) 4 4 3 0.833 0.00833 1.36522 1.36522 1.26092 0.461 Total 48 11 10 0.670 0.00488 −1.20106 0.30228 −0.22730 −3.458

Fig. 1. Minimal union network of A. mixtum from ten different populations in Veracruz, Mexico, based on 16S rRNA sequences.

Table 4 16S-rRNAGenetic distances Fst (below diagonal) and Dxy (above diagonal) between pairs of populations of A. mixtum from Veracruz.

Locality Ha Hb To Na Ca Mo So Pa Tu Ol

Ha 0.007 0.007 0.009 0.008 0.007 0.007 0.007 0.009 0.007 Hb 0.333 0.004 0.004 0.002 0.000 0.004 0.004 0.002 0.001 To 0.235 0.714 0.003 0.006 0.004 0.006 0.006 0.005 0.004 Na 0.374 0.750 0.259 0.006 0.004 0.007 0.007 0.005 0.004 Ca 0.194 0.000 0.465 0.511 0.002 0.006 0.006 0.004 0.003 Mo 0.333 0.000 0.714 0.750 0.000 0.004 0.004 0.002 0.001 So 0.107 0.214 0.330 0.440 0.140 0.214 0.005 0.006 0.005 Pa 0.109 0.214 0.330 0.440 0.140 0.214 0.250 0.006 0.005 Tu 0.313 0.250 0.510 0.432 0.129 0.250 0.227 0.227 0.003 Ol 0.212 0.000 0.357 0.471 0.000 0.000 0.111 0.111 0.154

4 M. Aguilar-Domínguez et al. Ticks and Tick-borne Diseases xxx (xxxx) xxx–xxx

Table 5 COI Genetic distances Fst (below diagonal) and Dxy (above diagonal) between pairs of populations of A. mixtum from Veracruz. NC. Not calculable.

Locality Ha Hb To Na Ca Mo So Pa Tu Ol

Ha – 0.003 0.002 0.005 0.003 0.000 0.001 0.005 0.004 0.006 Hb 0.000 – 0.005 0.005 0.005 0.003 0.003 0.006 0.006 0.008 To 0.167 0.071 – 0.007 0.005 0.002 0.003 0.007 0.006 0.008 Na 0.357 NC 0.300 – 0.005 0.005 0.005 0.008 0.008 0.010 Ca 0.167 NC 0.167 NC – 0.003 0.003 0.007 0.007 0.008 Mo 0.000 0.000 0.167 0.357 0.167 – 0.001 0.005 0.004 0.006 So 0.000 NC 0.125 0.191 NC 0.000 – 0.005 0.004 0.006 Pa 0.214 NC 0.200 0.138 0.033 0.214 0.097 – 0.007 0.009 Tu 0.250 0.115 0.222 0.237 0.133 0.250 0.167 0.020 – 0.008 Ol 0.286 0.163 0.255 0.246 0.167 0.286 0.216 0.145 0.044 –

Fig. 2. Minimal union network of A. mixtum from ten different populations in Veracruz, Mexico, based on COI sequences.

Fig. 3. Bayesian inference reconstruction of partial sequences of 380 bp of the 16S-rRNA gene of A. mixtum inferred using Hasegawa, Kishino and Yano substitution model (HKY). Numbers on each branch represent posterior probabilities. it varied between populations between 0 and 1. The variance of hap- (Table 3). lotype diversity was 0.00405, and the standard deviation of 0.064. Minimal union network analysis revealed that there is no separation Nucleotide diversity was 0.00448 and varied between populations of populations by geography, and that there is an overlap of several among 0-0.0088. Sampling variance of Pi was 0.0000004, and the haplotypes among diverse populations. Notably, haplotype 3 is the standard deviation of Pi of 0.00064 (Table 2). most widely distributed in eight of the 10 analyzed populations (80%). Neutrality tests showed negative results in most of the locations However, this haplotype was not recorded in the Huasteca Alta and analyzed, which is indicative of an excess of recently derived haplo- Totonaca regions. Haplotypes H6, H1 and H9 are related to each other, types. However, these results were not statistically significant (Table 2). but do not share a relationship with most of the other haplotypes that These data did not support the null hypothesis that populations are not are derived from Haplotype 3. The Capital region included a larger genetically different because Dxy tests showed low values that go number of unique haplotypes (H6 and H7) that are not shared with any through 0.001–0.009 (Table 3), and the same pattern was observed other population (Fig. 1). with FST, which showed low but non-significant values (0.1 p > 0.001)

5 M. Aguilar-Domínguez et al. Ticks and Tick-borne Diseases xxx (xxxx) xxx–xxx

Fig. 4. Bayesian inference reconstruction of partial sequences of 350 bp of the COI gene of A. mixtum inferred using Kimura two parameters substitution model (K2). Numbers on each branch represent posterior probabilities.

3.1.2. Cytochrome oxidase subunit 1 (COI) Haplotype network analysis of 16S-rRNA and COI sequences from A. The final alignment consisted of 300 base pairs, with 289 conserved mixtum indicated that there is no genetic structure between populations and 11 variable sites, two singletons (in positions 111, and 193), and infesting livestock across the state of Veracruz. Haplotype H3 of the nine parsimony informative sites (in positions 5, 8, 14, 20, 36, 46, 55, 16S-rRNA sequences seems to be the ancestral haplotype because it is 179, and 182) (Table 4). the most abundant occurring in 10 of the populations, and it is at the We detected the presence of 10 haplotypes. The most frequent center of the network. The same pattern was detected in Haplotype 1 haplotype detected was H1, with 27 sequences (56.3%), followed by from COI. The frequent overlap of haplotypes among populations in- haplotypes H2, H6, and H8 with four (8.3%). The least frequent hap- dicates narrow reproductive contact. The presence of 11 haplotypes of lotype was H3, which was recorded once (Table 1). Haplotype diversity 16S-rRNA and 10 from COI, in the populations sampled throughout the (Hd) was 0.6702, and it varied between populations between 0 and 1. state suggests high genetic diversity and gene flow. Populations that The variance of haplotype diversity was 0.00524, and the standard have not suffered a drastic reduction in size within evolutionary time, deviation of 0.072. Nucleotide diversity was 0.005 and varied between and in which the effects of genetic diversification are reduced, appear populations among 0-0.0083. Sampling variance of Pi was 0.0000007, to be able to retain an ancestral polymorphism (Avise et al., 1984; and the standard deviation of Pi of 0.00085 (Table 3). Hamarsheh et al., 2007). As in the case of 16S-rRNA, neutrality tests showed negative results, An apparent lack of genetic differentiation in the A. mixtum popu- confirming the excess of recently derived haplotypes (Table 3). Dxy and lations analyzed may be due to the continuous mobilization of livestock FST tests presented the same pattern observed with 16S-rRNA. None of hosts. In the state of Veracruz there are around 4 million head of cattle, the values have been significant (0.1 p > 0.001) (Table 5). which tend to be moved from south to north throughout the state. Also as the minimal union network of 16S-rRNA, there is no se- Unlike Rhipicephalus microplus infestations in livestock, A. mixtum is not paration of populations by geography. Haplotype 1 is the most widely a surveilled species in Mexico (Rodriguez-Vivas et al., 2017; Almazan distributed in all the analyzed populations. Haplotypes H8, and H10 are et al., 2018). The frequent movement of cattle infested with this tick related to each other, but do not share a relationship with most of the species across Veracruz apparently is a process promoting the genetic other haplotypes that are derived from Haplotype 1. The Totonaca re- homogeneity of A. mixtum populations along the Gulf of Mexico. Fur- gion exhibited a larger number of unique haplotypes (H4 and H5) that ther research is needed to determine if a similar situation occurs in the are not shared with any other population (Fig. 2). other Mexican states bordering the Gulf of Mexico. A. mixtum has been able to adapt to different climatic conditions 3.2. Phylogenetic reconstruction across Mexico and infestations are found commonly in equines, but the tick can parasitize other livestock (Estrada-Peña et al., 2004; Coronel- 3.2.1. s-rRNA gene Benedett et al., 2018). The movement of horses has been identified a The phylogenetic tree grouped the sequences obtained in the pre- frequent path for the dispersal of A. mixtum (Labruna et al., 2002; sent study with those of reference of A. mixtum from the United States Alvarez and Bonilla, 2007). Additionally, resistance to acaricides was and Colombia deposited in GenBank in a clade with a very high support reported in populations of A. cajennense sensu lato infesting cattle value (1.0) (Fig. 3). Additionally, the analysis revealed the presence of a Veracruz state (Alonso-Díaz et al., 2013). Further studies encompassing single subgroup: the clade integrated by the haplotypes H1, and H10 samples from the entire geographic range of this tick species in Mexico (Fig. 3). will enhance our understanding of the genetic basis of acaricide re- sistance in this tick species of veterinary and public health importance. 3.2.2. Cytochrome oxidase subunit 1 (COI) As in the case of 16S-rRNA analysis, the phylogenetic tree grouped Funding sources our ten haplotypes with the only sequence of COI from A. mixtum de- posited in GenBank, in a monophyletic clade, with a strong support of This research was supported in part through agreement with the 1.0, confirming the identification of ticks as A. mixtum (Fig. 4). USDA-ARS Knipling-Bushland U.S. Livestock Insects Research Laboratory, Kerrville, TX related to appropriated project 3094-32000- 4. Discussion 039-00-D. The authors report no financial or commercial conflicts of interest. Mariel Aguilar-Domínguez was supported by a PhD fellowship This is the first report on the genetic structure of A. mixtum popu- from CONACyT and is a doctoral student of the Program of Doctorado lations in Mexico. The entire state of Veracruz, which borders the Gulf en Ciencias Agropecuarias, Universidad Veracruzana, UV. of Mexico to the east, is part of the known geographic range for A. mixtum in Mexico. However, information on gene flow between A. Acknowledgments mixtum populations inhabiting the diverse ecosystems in Veracruz was lacking. We thank Laura Márquez Valdelamar for processing samples for

6 M. Aguilar-Domínguez et al. Ticks and Tick-borne Diseases xxx (xxxx) xxx–xxx sequencing. USDA is an equal opportunity employer. Hodgkinson, V.H., Birungi, J., Quintana, M., Dietze, R., Munstermann, E., 2003. Mitochondrial cytochrome b variation in populations of the visceral leishmaniasis vector Lutzomyia longipalpis across eastern Brazil. Am. J. Trop. Med. Hyg. 69, References 386–392. Ishikawa, E.A., Ready, P.D., De Souza, A.A., Day, J.C., Rangel, E.F., Davies, C.R., Shaw, Almazan, C., Tipacamu, G.A., Rodriguez, S., Mosqueda, J., Perez de Leon, A.A., 2018. J.J., 1999. A mitochondrial DNA phylogeny indicates close relationships between Immunological control of ticks and tick-borne diseases that impact cattle health and populations of Lutzomyia whitmani (Diptera: Psychodidae, Phlebotominae) from the production. Front. Biosci. (Landmark Ed) 23, 1535–1551. rain-forest regions of Amazonia and northeast Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 94, – Alonso-Díaz, M.A., Fernández-Salas, A., Martínez-Ibáñez, F., Osorio-Miranda, J., 2013. 339 345. Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae) tick populations susceptible or resistant to Labruna, M.B., 2018. Comparative survival of the engorged stages of Amblyomma ca- ff acaricides in the Mexican tropics. Vet Parasitol. 197, 326–331. jennense sensu stricto and Amblyomma sculptum under di erent laboratory conditions. – Alvarez, C.V., Bonilla, M.R., 2007. Adultos y ninfas de la garrapata Amblyomma cajennense Ticks Tick Borne Dis. 9, 996 1001. Fabricius (Acari: Ixodidae) en equinos y bovinos. Agron. Costarric 31, 61–69. Labruna, M.B., Kasai, N., Ferreira, F., Faccini, J.L., Gennari, S.M., 2002. Seasonal dy- Álvarez-Hernández, G., Roldán, J.F.G., Milan, N.S.H., Lash, R.R., Behravesh, C.B., namics of ticks (Acari: Ixodidae) on horses in the state of São Paulo, Brazil. Vet. Par. – Paddock, C.D., 2017. Rocky Mountain spotted fever in Mexico: past, present, and 105, 65 77. future. Lancet Infect. Dis. 17, e189–e196. Librado, P., Rozas, J., 2009. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA – Araya-Anchetta, A., Busch, J.D., Scoles, G.A., Wagner, D.M., 2015. Thirty years of tick polymorphism data. Bioinformatics 25, 1451 1452. population genetics: a comprehensive review. Infect. Genet. Evol. 29, 164–179. Loaiza, J.R., Scott, M.E., Bermingham, E., Rovira, R., Conn, J.E., 2010. Evidence for Avise, J.C., Neigel, J.E., Arnold, J., 1984. Demographic influences on mitochondrial DNA Pleistocene population divergence and expansion of Anopheles albimanus in Southern – lineage survivorship in animal populations. J. Mol. Evol. 20, 99–105. Central America. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 156 164. Ballados-González, G.G., Sánchez-Montes, S., Romero-Salas, D., Colunga Salas, P., Mirol, P.M., Routtu, J., Hoikkala, A., Butlin, R.K., 2008. Signals of demographic expan- Gutiérrez-Molina, R., León-Paniagua, L., Becker, I., Méndez-Ojeda, M.L., Barrientos- sion in Drosophila virilis. BMC Evol. Biol. 8, 59. Salcedo, C., Serna-Lagunes, R., Cruz-Romero, A., 2018. Detection of pathogenic Nava, S., Beati, L., Labruna, M.B., Cáceres, A.G., Mangold, A.J., Guglielmone, A.A., 2014. Leptospira species associated with phyllostomid bats (Mammalia: Chiroptera) from Reassessment of the taxonomic status of Amblyomma cajennense with the description Veracruz, Mexico. Transbound. Emerg. Dis. 65, 773–781. of three new species, Amblyomma tonelliae n. sp., Amblyomma interandinum n. sp. and Baneth, G., 2014. Tick-borne infections of animals and humans: a common ground. Int. J. Amblyomma patinoi n. sp., and reinstatement of Amblyomma mixtum, and Amblyomma – Parasitol. 44, 591–596. sculptum (Ixodida: Ixodidae). Ticks Tick Borne Dis. 5, 252 276. Beati, L., Nava, S., Burkman, E.J., Barros-Battesti, D.M., Labruna, M.B., Guglielmone, Norris, D.E., Klompen, J.S.H., Keirans, J.E., Black IV, W.C., 1996. Population genetics of A.A., Cáceres, A.G., Guzmán-Cornejo, C.M., León, R., Durden, L.A., Faccini, J.L., Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) based on mitochondrial 16S and 12Sgenes. J. Med. – 2013. Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Acari: Ixodidae), the Cayenne tick: Entomol. 33, 78 89. phylogeography and evidence for allopatric speciation. BMC Evol. Biol. 13, 267. Piña, F.T.B., da Silva Rodrigues, V., de Oliveira Souza Higa, L., Garcia, M.V., Barros, J.C., Coronel-Benedett, K.C., Ojeda-Robertos, N.F., González-Garduño, R., Ibañez, F.M., de León, A.A.P., Andreotti, R., 2017. Life cycle of Amblyomma mixtum (Acari: ff Rodríguez-Vivas, R.I., 2018. Prevalence, intensity and population dynamics of hard Ixodidae) parasitizing di erent hosts under laboratory conditions. Exp. Appl. Acarol. – ticks (Acari: Ixodidae) on sheep in the humid tropics of Mexico. Exp. Appl. Acarol. 74, 73, 257 267. 99–105. Rivera-Páez, F.A., Labruna, M.B., Martins, T.F., Sampieri, B.R., Camargo-Mathias, M.I., fi fi de Lima, P.H.C., Barcelos, R.M., Klein, R.C., Vidigal, P.M.P., Montandon, C.E., Fabres- 2016. Amblyomma mixtum Koch, 1844 (Acari: Ixodidae): rst record con rmation in Klein, M.H., Dergam, J.A., Mafra, C., 2017. Sequencing and comparative analysis of Colombia using morphological and molecular analyses. Ticks Tick Borne Dis 7, – the Amblyomma sculptum mitogenome. Vet. Parasitol. 247, 121–128. 842 848. Esseghir, S., Ready, P.D., Killick-Kendrick, R., Ben-Ismail, R., 1997. Mitochondrial hap- Rivera-Páez, F.A., Labruna, M.B., Martins, T.F., Perez, J.E., Castaño-Villa, G.J., Ossa- lotypes and phylogeography of Phlebotomus vectors of Leishmania major. Insect Mol. López, P.A., Gil, C.A., Sampieri, B.R., Aricapa-Giraldo, H.J., Camargo-Mathias, M.I., Biol. 6, 211–225. 2018. Contributions to the knowledge of hard ticks (Acari: Ixodidae) in Colombia. – Esteve-Gassent, M.D., Castro-Arellano, I., Feria-Arroyo, T.P., Patino, R., Li, A.Y., Medina, Ticks Tick Borne Dis. 9, 57 66. R.F., de León, A.A., Rodríguez-Vivas, R.I., 2016. Translating ecology, physiology, Rodriguez-Vivas, R.I., Grisi, L., Pérez de León, A.A., Silva Villela, H., Torres-Acosta, J.F.J., biochemistry, and population genetics research to meet the challenge of tick and tick- Fragoso Sanchez, H., Romero Salas, D., Rosario Cruz, R., Saldierna, F., Garcia borne diseases in north America. Arch. Insect Biochem. Physiol. 92, 38–64. Carrasco, D., 2017. Potential economic impact assessment for cattle parasites in – Estrada-Peña, A., Guglielmone, A.A., Mangold, A.J., 2004. The distribution and ecolo- Mexico. Rev. Mex. Cienc Pec. 8, 61 74. gical’ preferences’ of the tick Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae), an ectopar- Rodríguez-Vivas, R.I., Apanaskevich, D.A., Ojeda-Chi, M.M., Trinidad-Martínez, I., Reyes- asite of humans and other mammals in the Americas. Ann. Trop. Med. Parasitol. 98, Novelo, E., Esteve-Gassent, M.D., Pérez de León, A.A., 2016. Ticks collected from 283–292. humans, domestic animals, and wildlife in Yucatan, Mexico. Vet. Parasitol. 215, – Guzmán-Cornejo, C., Robbins, R.G., Guglielmone, A.A., Montiel-Parra, G., Pérez, T.M., 106 113. 2011. The Amblyomma (Acari: Ixodida: Ixodidae) of Mexico: identification keys, Ronquist, F., Teslenko, M., van der Mark, P., Ayres, D.L., Darling, A., Höhna, S., Larget, B., ffi distribution and hosts. Zootaxa 2998, 16–38. Liu, L., Suchard, M.A., Huelsenbeck, J.P., 2012. MrBayes 3.2: e cient Bayesian Hafner, M.S., Sudman, P.D., Villablanca, F.X., Spradling, T.A., Demastes, J.W., Nadler, phylogenetic inference and model choice across a large model space. Syst. Biol. 61, – S.A., 1994. Disparate rates of molecular evolution in cospeciation hosts and parasites. 539 542. Science 265, 1087–1090. Sánchez-Montes, S., Ríos-Muñoz, C.A., Espinosa-Martínez, D.V., Guzmán-Cornejo, C., ‘ Hamarsheh, O., Presber, W., Abdeen, Z., Sawalha, S., Al-Lahem, A., Schönian, G., 2007. Berzunza-Cruz, M., Becker, I., 2016. First report of Candidatus Rickettsia am- ’ – Genetic structure of Mediterranean populations of the sandfly Phlebotomus papatasi by blyommii in west coast of Mexico. Tick Tick Borne Dis. 7, 1139 1145. mitochondrial cytochrome b haplotype analysis. Med. Vet. Entomol. 21, 270–277.

7

CAPÍTULO III

Morphometrtics of Amblyomma mixtum in the state of Veracruz, Mexico

Artículo enviado. Revista: Pakistan Veterinary Journal. Factor de impacto: 1.217 Carta de envío: Ver Anexos.

47

Abstract A. mixtum formerly considered as A. cajennense, is the second tick of importance in bovines of the Mexican tropic as well as an important vector of pathogens. The objective of this research was to determine by electron microscopy the species found in the state of Veracruz, Mexico. 40 males and 40 females were subjected to analysis, a JEOL IT300 LV microscope was used. The measurements obtained were analyzed to determine the species. For each variable analyzed, the basic descriptive statistics were determined. Subsequently, an analysis of main components for females and males was carried out. The clusters were calculated with the outtree method and a dendrogram was made to group the specimens according to their morphometric characteristics. These analyzes were performed with SAS® version 9.2 software. With 10 main components, 77% of the morphological variation of the ticks is explained, which evidences a scarce variation between female specimens of the same species, while the dendogram grouped 6 clusters of specimens with similar characteristics. As in females and males the morphometric variability was described in 8 main components, which evidences a scarce variation between male specimens of the same species, while the dendogram grouped in 6 clusters the specimens with similar morphometric characteristics, with these results and the taxonomic keys it was determined that the only species from the A. cajennense complex distributed in the state of Veracruz is A. mixtum. Keywords: Amblyomma mixtum, morphometrics, Veracruz.

48

INTRODUCTION Ticks are ectoparasites with hematophagous habits and constitute one of the groups of parasites of most economic importance due to their direct affectation and to the transmission of pathogens. Amblyomma cajennense sensu lato is a tick of the Ixodidae family that parasites many vertebrates, mainly mammals. The biological cycle of A. cajennense s.l consists of three hosts, including human, a situation that makes their control more complex. Its geographic distribution extends from southeastern Texas to northeastern Argentina, through the Caribbean, Mexico, and Central America (Nava et al., 2014). Throughout its distribution, A. cajennense s.l tick has been widely adapted to different ecological conditions, including ecosystems as diverse as semi-arid grasslands and subtropical secondary forests (Estrada-Peña et al., 2004). In addition, the geographical area occupied by this tick is intermingled with great geographic barriers: the Andes, the Gulf of Mexico, and the great rivers (Estrada-Peña et al., 2004). This tick has been reported in Mexico all along the territory parasitizing multiple domestic and wild animal species such as cattle, horses, dogs and deer. A. cajennense s. l. is the second most important tick specie due to its high infestations and the transmission of diseases to animals (SENASICA, 2015). Due to its large size, this tick sucks large amounts of animal blood, which causes weakness, weight loss, diseases and major economic losses in livestock. In recent studies A. cajennense colonies from Argentina, Paraguay, Venezuela, French Guiana, Colombia, Ecuador, Costa Rica, Brazil, Mexico, Peru and the United States, it was determined that this species is a complex of six species A. cajenennse sensu stricto, A. interandinum, A. mixtum, A. patinoi, A. sculptum and A. tonelliae; Determined by morphological differences observed by electron microscopy, on the other hand, and with the objective of confirming these findings, phylogenetic analyzes and genetic divergence values were performed, from which a sample from Mexico was identified as A. mixtum (Nava et al., 2014). From which a sample from Mexico was identified as A. mixtum (Nava et al., 2014). The present study aimed to determine the specie present in the different ecological regions of the state of Veracruz, Mexico. For this purpose, we collected ticks and

49

identified the specie through Scanning Electron Microscopy by the measurement of the different morphological structures.

Material and Methods

Study area. The study was carried out in the state of Veracruz, Mexico. Geographical features and regionalization of the state of Veracruz. The state of Veracruz is located between the Sierra Madre Oriental and the Gulf of Mexico, at coordinates 17º 03 '18 "and 22º 27' 18" north latitude and 93º 36 '13 "and 98º 36' 00" West longitude. It limits the north with the state of Tamaulipas, the east with the Gulf of Mexico, the southeast with the states of Tabasco and Chiapas, the south and southwest with the state of Oaxaca, the west with the State of Puebla, the northeast with the states of San Luis Potosí and Hidalgo. It has an area of 72,410 km2, as well as 684 km of low and sandy coasts with narrow beach bordered by dunes and mobile dunes with bars, ponds and tips. The average state rainfall is 1,500 mm annually, rainfall occurs in summer from June to October. It is in the tropical zone, its climate is warm in all the coast; However, due to the relief of its varied soil, Veracruz has different climates (INEGI, 2010): Warm humid and subhumid climate. It comprises a larger area, approximately 80% of the territory of Veracruz, are distributed in the coastal plains of the North Gulf and South Gulf, at a maximum height of 1,000 meters. The average annual temperature is 22º to 26ºC. Humid semi-warm climate: In places with an average elevation of 1,000 to 1,600 meters above sea level, the physical characteristics favor the development of semi- warm climates, such as those prevailing on the tops of the Tuxtlecos volcanoes. The average temperature varies between 18 ° to 22 ° C. Temperate climate: It is registered in the zones with altitudes between 1,600 and 2,800 msnm.

The state is sectorized in ten natural regions called Huasteca Alta, Huasteca Baja, Totonaca, Nautla, Capital, Sotavento, Mountains, Papaloapan, Tuxtlas and Olmeca (INAFED, 2010).

50

Sampling. For the present study a sampling was carried out in the ten natural regions of the state of Veracruz. Ticks were collected from August 2014 to January 2015. Due to the great climatic and geographical diversity of Veracruz, the ten natural regions that comprise the state (Huasteca Alta, Huasteca Baja, Totonaca, Nautla, Capital, Sotavento, Mountains, Papaloapan, Tuxtlas and Olmeca) were sampled. We collected ticks from bovine, horses and vegetation in the 10 natural regions comprising the state (Table 1). Table 1. Total ticks collected in Veracruz, Mexico.

51

Number of ticks A. mixtum Host Municipality ♂ ♀ 2 2 Bovine Panuco 1 2 Equus caballus Panuco 1 Equus caballus Tampico Alto 2 2 Bovine Tuxpam 2 2 Equus caballus Naranjos Amatlán 2 2 Bos Taurus Gutiérrez Zamora 2 1 Equus caballus Gutiérrez Zamora 1 Equus caballus Papantla 2 2 Bos taurus Nautla 2 2 Equus caballus Nautla 2 2 Bos taurus Xalapa 2 1 Equus caballus Xalapa 1 Equus caballus Coatepec 2 Bos taurus Yanga 1 Equus caballus Yanga 1 Bos taurus Orizaba 2 1 Equus caballus Coscomatepec 1 Bos taurus Coscomatepec 1 1 Bos taurus Puente Nacional 1 Equus caballus Puente Nacional 1 Bos taurus Medellín 1 Bos Taurus Soledad de Doblado 1 Equus caballus Soledad de Doblado 1 Equus caballus Paso de Ovejas 2 Bos taurus Tlacotalpan 1 1 Equus caballus Tlacotalpan 1 Bos taurus Tierra Blanca 1 Equus caballus Tierra Blanca 1 Bos taurus Ignacio de la Llave 1 Equus caballus Ignacio de la Llave 1 2 Bos taurus San Andrés 1 Equus caballus San Andrés 1 Bos taurus Catemaco 2 Equus caballus Catemaco 1 Equus caballus Santiago Tuxtla 1 1 Bos Taurus Acayucan 1 1 Equus caballus Acayucan 1 1 Bos taurus San Juan Evangelista 1 Equus caballus San Juan Evangelista 1 Equus caballus Jesús Carranza

52

The specimens that were evaluated were collected from the municipalities of Panuco (N 22° 4' 18.664''O, 98° 10' 56.038''), Tampico Alto (N 22° 6' 53.392'', O 97° 50' 36.963''), Tuxpan (N 20° 59' 27.391'', O 97° 23' 47.993''), Naranjos de Amatlán, (N 21° 20' 8.102'', O 97° 45' 47.959''), Gutierrez Zamora (N 20° 24' 47.999'', O 97° 2' 30.998''), Papantla (N 20° 12' 15.998'', O 97° 17' 15.997''), Nautla (N 20° 10' 54.984'', O 96° 49' 26.997''), Xalapa (N 19° 29' 55.997'', O 96° 55' 9.998''), Coatepec (N 19° 27' 42.998'', O 96° 59' 16.998''), Yanga (N 18° 48' 9.18'', O 96° 45' 32.997''), Orizaba (N 18° 52' 16'', O 97° 5' 22.999''), Coscomatepec (N 19° 5' 19''O 97° 3' 10.998''), Puente Nacional (N 19° 20' 34.998'', O 96° 28' 6.999''), Medellín (N 18° 51' 56.999'', O 96° 17' 24.997''), Soledad de Doblado, (N 19° 3' 46.998'', O 96° 26' 7.997''), Paso de Ovejas (N 19° 16' 23.999'', O 96° 30' 5.997''), Tlacotalpan, (N 18° 36' 53.197'', O 95° 40' 13.727''), Tierra Blanca (N 18° 27' 0.288'', O 96° 22' 54.004''), Ignacio de la Llave (N 18° 43' 5.045'', O 96° 0' 52.927''), San Andrés (N 18° 27' 39.55'', O 95° 13' 19.462''), Catemaco (N 18° 30' 5.256'', O 95° 1' 51.65''), Santiago Tuxtla (N 18° 28' 3.562'', O 95° 17' 31.855''), Acayucan (N 18° 6' 43.218'', O 95° 6' 24.004''), San Juan Evangelista (N 17° 52' 31.267'', O 95° 7' 26.936'') y Jesús Carranza (N 17° 22' 1.852'', O 95° 0' 37.908'') (Figure 1).

53

FIGURE 1. Location of analyzed ticks.

Tick collection in cattle and equids. During the visit to the production units of each of the natural regions, the animals were reviewed, from head to tail. The specimens were detached to the hair by gentle traction movements with the fingers, thus avoiding the detachment of the gnatosoma and adhering to the skin of the host.

The ticks were kept in flasks with 70% ethanol correctly coded with, the natural region, host and consecutive number, the samples were taken to the Laboratory of Parasitology located in the Diagnostic Unit “Torreon del Molino” of the Veterinary Medicine College of the University of Veracruz.

Tick collection from vegetation. The vegetation ticks were collected by dragging (Álvarez and Bonilla, 2007; Serra-Freire, 1982; Guglielmone et al., 1986), a white 54

cotton flannel attached to a wooden dowel was used for this method in order to move over the vegetation. At the rear end two weights were placed for better contact with the vegetation mat. Each one (transect) consisted of zigzagging the flag over a surface area of 20 m2. At the end of each route (walk), the ticks attached to the flag were collected and placed in correctly labeled 70% ethanol containers and shipped to the Laboratory of Parasitology of the Diagnostic Unit of the College of Veterinary Medicine.

Morphological identification of specimens with a stereoscope microscope. Each of the specimens were placed on a slide with the help of small tweezers. Morphological characteristics of each tick were observed using a Motic® stereoscope microscope with camera Moticam 1000, these were identified morphologically according to the morphological keys already established by Guzmán-Cornejo et al. (2011). Males and females were separated to be quantified.

Determination of the species by scanning electron microscopy. For the determination of the species a scanning electron microscope JEOL IT300 LV was used. Selection and cleaning of samples. All the collected material was revised with the use of a stereoscopic microscope to choose the ticks that met the necessary characteristics for conventional processing scanning electron microscopy technique. Two females and two males of each region and vegetation (a tick for dorsal view image and the other image of the ventral view) were chosen. The material was cleaned by using extra fine Dumont® Antimagnetic-E tweezers and micro spatulas, once removed all material from the sample, they were cleaned with a micro brush number 5. Each tick was stored in a withe bakelite cap glass vial with 70% ethanol correctly identified. The methodology was proposed by Dixon et al., 2000 with some modifications, as described below:

Samples previously stored in 70% ethanol underwent two ultrasonic cleanings for 5 minutes each, using a Cole-Parmer® 8848 ultrasonic cleaner, then, in order to continue process dehydration, the 70% ethanol was replaced with 90% ethanol, after

55

one hour and 30 minutes to remain in 90% ethanol, finally the ticks were placed in 100% ethanol three times for 30 minutes each. Once the dehydration process with pure ethanol was completed, the samples were placed in xylene and maintained at a temperature of 40ªC for 24 h, once elapsed 24h, they were subjected to three washes of 30 min each with pure ethanol. They were then critical point dried with a dryer Quorum® model K850, where the ethanol was exchanged for CO2. Once the samples were completely dry and ethanol free, they were placed in the desired position on a polished aluminum stub covered by a conductive carbon adhesive tape and finally all the samples were coated with gold using the method of "sputter coating" using a sputter Coater Quorum® model Q150R S. All the samples were placed in the scanning electron microscope JEOL IT300 LV.

Statistical analysis data

Morphometric relationships were evaluated separately for male and females. For this, 22 and 20 morphological variables were analyzed, respectively: Total length (TL), scuptum lenght (SL), scuptum width (SW), length from apices of scapulae to posterior body margin (LA), breadth (B), length from palpal apices to cornua apices (CA), dorsal capitulum breadth (CB), dorsal capitulum length (CL), basis capituli ventral length (VL ), palpi total length (TL), length segment I (LSI), length segment II (LSII), length segment III (LSIII), width segment I (WSI), width segment II (WSII), width segment III (WSIII), Hypostome lenght (HL), Hypostome width (HW), Tarsi lenght (TL), tarsi width (TW), spiracule lenght (SL) and spiracule width (SW) (Figure 2).

56

FIGURE 2. Dorsal of male and female of A. mixtum

Was used to perform Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Averages (UPGMA) clustering and Principal Component Analysis (PCA), and to display results of these analyses. PCA was used to further define the clusters, and to evaluate the contributions of individual characters to the phenetic differences among clusters. Eigenvectors were extracted from a pair-wise matrix of Pearson product-moment

57

correlations of the characters. Phenogram (UPGMA) was then constructed from the distance matrix. All statistical analyses were done using SAS 9.0.

Results

In the PCA for females and males, nine and eight components, respectively, indicating that they carried important phenetic information. Loadings of the 22 characters morphometries onto components 1–9 are given in Table 2. Component 1, which accounts for 10% of the total variation. In contrast, component 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 and 9 explain the greater variation, around of 70% of the variation accumulate, indicating that they carry important additional information regarding mite phenetic relationships. In the distance phenogram (Fig. 3 y Fig. 4) indicates that the ticks form discrete clusters of A. mixtum males and females. Within each of these clusters, ticks do tend to cluster together for characters morphometric similars. Thus, an only phenotypic pattern of strict clustering, was observed among individuals of A. mixtum.

58

FIGURE 3. Cluster of the morphometry of A. mixtum females.

FIGURE 4. Cluster of the morphometry of A. mixtum males.

59

References

Beati, L., Nava, S., Burkman, J. E., Barros-Battesti, D. M., Labruna, M. B., Guglielmone, A. A., Cáceres, A. G., Guzmán-Cornejo, C. M., León, R., Durden, L. A. y Faccini, J. L. H. (2013). Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Acari: Ixodidae), the Cayenne tick: phylogeofraphy and evidence for allopatric speciation. BMC Evolutionary Biology. 13: 267.

Estrada-Peña A, Guglielmone A. A, Mangold AJ (2004) The distribution and ecological “preferences” of the tick Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae), an ectoparasite of humans and other mammals in the Americas. Annals of Tropical Medicine and Parasitology. 98: 283-292.

Guzmán-Cornejo C, Robbins R, Guglielmone A. A, Montiel-Parra G, Pérez TM (2011) The Amblyomma (Acari: Ixodidae) of Mexico: identification keys, distribution and hosts. Zootaxa. 2998: 16-38.

Labruna, M. B., Soares, J. F., Martins, T. F., Soares, H. S., Cabrera, R. R. (2011). Cross-mating experiments with geographically different populations of Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae). Experimental and Applied Acarology, 54: 41–49.

Mastropolo M., Nava S., Guglielmone A A. (2011). Biological differences between two allopatric populations of Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae) in Argentina. Experimental & Applied Acarology. 53(4):371-5

Nava S, Beati L, Labruna MB, Cáceres AG, Mangold AJ, Guglielmone AA (2014) Reassessment of the taxonomic status of Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) with the description of three new species, Amblyomma tonelliae n. sp., Amblyomma interandinum n. sp. and Amblyomma patinoi n. sp., and reinstatement of Amblyomma mixtum Koch, 1844, and Amblyomma sculptum Berlese, 1888 (Ixodida: Ixodidae). Ticks Tick Borne Dissease. 5(3): 252-276

60

CAPITULO IV

POTENTIAL DISTRIBUTION OF Amblyomma mixtum (Koch, 1844)

ABSTRACT

Amblyomma mixtum is a Neotropical tick which is widely distributed from South Texas to the western part of Ecuador. This generalistic tick parasitizes several hosts taxa, such as cat-tle, horses, and humans in tropical areas of Mexico, is a competent vector of several zoono-tic pathogens. For this reason, the aim of this study was to identify the potential distribution of A. mixtum to establish potential risk areas for tick-borne pathogen transmission. We collected samples from Veracruz, México an endemic state of A. mixtum, and additionally, we compiled information of the presence of this species from literature and from the Global Biodiversity Information Facility (GBIF). Species distribution modelling was done using the 19 climatic layers using Maxent v. 3.4.1. Our model indicated a wide distribution for A. mixtum, with higher probability of occurrence along the Gulf of Mexico, and in a less proportion of the pacific states of Oaxaca and Chiapas in Mexico. It also showed a suitable habitat in several countries of Central America such as Honduras, Guatemala and Belize in which there are scatered records of this tick. Our findings are discussed in the context of geograph-ic and ecological aspects of A. mixtum from Mexico to Ecuador as a member of the A. cajennense species complex.

Keywords: Amblyomma mixtum, potential distribution, Mexico.

61

INTRODUCTION

Ticks are hematophagous ectoparasites that economically affect livestock production sys-tems, due to their direct effects on the transmission of pathogens to cattle (Aragon et al., 1953; Hoogstraal and Aeschlimann 1982, Alekseev et al., 2004; Jongejan et al., 2004). These ectoparasites exhibited an important negative impact on the vertebrate hosts, like reduction of body weight, milk and meat production. On the other hand, the bites reduce the quality of leathers. Among domestic animals, they are also responsible for anemia and severe dermati-tis (Alim et al., 2012). Apart from these direct effects, the most important feature of ticks is that they are vectors, as well as reservoirs, of multiple pathogens. Particularly in America the most diverse tick genus is Amblyomma, which have a marked Neotropical affinity. Beati et al. (2013), described the identity of seven tickspecies based on several nuclear, mitochondrial, and microsatellite markers which were formerly known as the Amblyomma cajennense complex. This species is distributed in several ecological re-gions of the American Continent: A. mixtum, with is restricted from souther US to Eastern Ecuador, A. sculptum which is endemic to Brazil. Additionally, he authors described three new species: A. tonelliae, A. interandinum and A. patinoi, forming a polyphyletic complex of six species. The distribution of A. mixtum goes from the south of Texas to Western Ecuador, in Mexico is common to find it all along the Golf of Mexico, (Veracruz, Tamaulipas, Nuevo León, Tabasco, Yucatán). It is also common in Belize, Guatemala, Costa Rica and Panama, there are anly a few records in Ecuador (Almazán et al, 2016). Some data on the climatic conditions of A. mixtum in different ecological regions of Mexico (González-Cerón et al., 2009) indi-cate that this species has a presence from 1 to 1000 m above see level, and at average tem-peratures of 16 ° C (range 13 to 26 ° C) (Serra, 1982). It is associated with areas of dry and moist Meso- America and the Meso-American Seasonal Highlands and prefers sites with sustained high temperatures (Estrada-Peña et al., 2014). In Mexico this the second tick of importance in the tropics (Almazán et al., 2016), which is commonly found parasitizing bovines in the tropical zones of Mexico and

62

it has been also reported in horses, dogs, deers and human (Guzman-Cornejo et al., 2011). This tick produces high infestations and is an important vector of zoonotic diseases such as Rickettsia rickettsii and other potential tickborne pathogens such as Rickettsia amblyommatys has been recorded (Sanchez-Montes et al., 2016). However, despite of being the second most important species of tick due to its parasitism in cattle (Almazán et al, 2016), there are non studies which evaluated the potential distribution, and the climatic conditions that limit the distribution of this neotropical tick species in order to to implement management and control actions (Guzman-Cornejo et al., 2011, Almazan et al., 2016). A fundamental approach to the understanding and management of invasive spe-cies is to determine their potential distribution. Several studies provide an overview of the modeling of species distribution or a comparison of modeling methods (Guisan and Zim- mermann, 2000, Zaniewski et al., 2002, Anderson et al., 2003; Guisan and Thuiller, 2005). These models of species distribution are intended to predict areas that describe the environ-mental conditions suitable for the survival of the species; that is, the potential distribution or fundamental niche (Anderson et al., 2003; Guisan and Thuiller, 2005). In general, these modeling methods combine data from georeferenced localities of the species where their presence has been confirmed with environmental variables to create a model of require-ments for the species according to the variables examined (Anderson et al., 2003). For ex-ample, Spatial Distribution Models have been used to predict the precense of Ixodes scapu-laris, that serve as vector of Borrelia burgferi, on the Eastern sector of the transboundary region comprising Texas in the U.S and Tamaulipas, Nuevo Leon and Coahuila, Mexico, they found its distribution is expected to expand in Northeastern Texas as well as along the coastal areas, and in Mexico was found that it will maintain in the three states (Feria et al., 2014). In this sense, modeling of the ecological niche helps to explain the bioclimatic de-terminants and to delimit the distribution areas of ticks (Raghavan et al., 2016). In the present study we used all the known distribution for the specie, some of the locations used were from field work realized in the state of Veracruz because of the importance of livestock to the economy (Absalón-Medina et al., 2012). In Veracruz 63

cattle herd is currently around 3,926,683 heads of cattle, distributed in the North, Center and South regions of the state. Animal agriculture is an important component of the economy of this region. Consid-ering that in the ecological regions of Veracruz farms are classified as intensive (milk or meat production) and dual purpose (milk and meat production), and that cattle move be-tween the different areas of the state and the country, this factor increases the transfer of ticks (Román et al., 2012). For the reasons explained above, the present study aims to identi-fy morphologically individuals of A. mixtum through systemic sampling in tick- infested farms in the state of Veracruz, and to elaborate the model of the potential geographical dis-tribution of this tick species. The results of this study are pioneers in this area of knowledge and can be used to consider strategic control methods and delineate quarantine zones for this species.

Material and methods

Study area The study was carried out from August 2014 to January 2015, according to Beck et al. (2011), between August and December, peaks of greater infestation of ticks. We collected ticks from field worf all along the state of Veracruz and we also compiled information of the presence of this species from the Global Biodiversity Information. The field work comprises the ten natural regions of the state of Veracruz: Huasteca Alta, Huasteca Baja, Totonaca, Nautla, Capital, Sotavento, Mountains, Papaloapan, Tuxtlas and Olmeca (INAFED, 2010). The state is located between the Sierra Madre Occidental to the west and the Gulf of Mexico to the east, its total area is 78,815 km2 (30,431 sq mi), accounting for about 3.7% of Mexico’s total territory. The large variation of altitude results in a large mixture of climates, from cold, snow-topped mountain peaks to warm wet tropical areas on the coast. (CONABIO, 2011). 32% of the state is classified as hot and humid, 52% as hot and semi humid, 9% is warm and humid, 6% as temperate and humid and 1% is classified as cold. Hot and humid and hot and semihumid climates dominate from sea level to about 1,000 m (3,280.8 ft) above sea level. Average annual 64

temperature ranges from 22 to 26C with precip-itation varying from 2,000 mm (78.7 in) to just over 3,500 mm (137.8 in) per year. The northern part of the state as well as the higher mountain areas, are convergence zones be-tween lowland evergreen tropical forests and more temperate flora and fauna. It is also the northernmost occurrence of subhumid tropical forest in Mexico, although little of this remains, mostly on steep slopes. This tropical forest is situated in the northeastern coastal plain and extends into southern Tamaulipas state, on the east side of the Sierra Madre Oriental. The information obtained from the data base included different regions from Southern Texas to Western Ecuador.

Collection of ticks in cattle, horses and vegetation Ticks from 41 municipalities of Vercruz were collected during the field work from cattle, equines and vegetation in the 10 natural regions comprising the state. During the visit to the farms each of the animals sampled were reviewed from head to tail. The ticks were released against the hair, using gentle manual traction movements, then they were kept in flasks with 70% ethanol, correctly coded according to the natural region, host and consecutive number. These samples were transferred to the Laboratory of Parasitology, located at the College of Veterinary Medicine and Animal Science, University of Veracruz. In addition, ticks were collected from the vegetation using the flag technique (Álvarez and Bonilla, 2007). For this method, a white blanket was used; at the front and end a PVC pipe with strings was placed at its ends to move the fabric over the vegetation. At the rear end, weights were placed for better contact with the vegetation. Each route consisted in dragging the blanket in zig-zag, on a surface of 20 m2. Ticks adhered to the cloth were deposited in containers with 70% ethanol, correctly labeled for later analysis in the Diagnostic Unit of the Laboratory of Parasitology, College of Veterinary Medicine and Animal Science, University of Veracruz. Taxonomic identification of specimens All ticks collected were taxonomically identified by species, parasitic phase and gender. In each of the specimens, the morphological characteristics of each one 65

was observed using a Motic® stereoscope microscope with Moticam 1000® camera. The individuals were identi-fied morphologically according to the taxonomic keys established by Guglielmone and Nava (2010), and Guzmán- Cornejo et al. (2011), Nava et al. 2014. Males and females were kept separated to be quantified for further analysis.

Potential distribution model

The geographical coordinates of each farm sampled were recorded with a Garmin® GPS; we used the software ArcGis v. 10.5 to construct a map of the presence of ticks in the different regions of Veracruz using the WGS84 system and the Lambert conical projection. Addition-ally, we compiled information from literature of the presence of this species from the Global Biodiversity Information Facility (https://www.gbif.org/). Once, with the data set of com-plete occurrences, data that presented autocorrelation was eliminated by the realization of a variogram, following the method of Gail et al., 2014, this method stimated the spatial lag as 14 km for this species wich is the distance a variable is not longer correlated in space, this approach displays distances between two points that can produce variances.

Selection of climatic variables For the modeling of the potential distribution of A. mixtum, 19 bioclimatic variables from the WorldClim data base (Table 1). Using spatial resolution: ⁓1 km; http://www.worldclim.org/) were generated for current coditions using the ArcGis v. 10.5 software. To avoid collinearity between variables we ran a correlation analysis with a Pearson correla-tion value > 0.8, the variables selected to construct the model were, Mean Diurnal Range (BIO2), Isothermality (BIO3), Precipitation Seasonality (BIO15), Precipitation of Warmest Quarter (BIO 18), Precipitation of Warmest Quarter (BIO 19). Modeling method We constructed species distribution modeling for A. mixtum using the software Maximum Entropy Species Distribution Modeling or MaxEnt® v. 3.4.1, which 66

produces a continuous binomial probability distribution representing habitat suitability according to the climate variables. Maxent execute cloglog transformation to estimate (calculate) probability of oc-currence. The cloglog transform derives from the recently-published interpretation of MaxEnt as an inhomogeneous Poisson process, giving it a stronger theoretical justification than the logistic transform which it replaces by default (Phillips et al., 2017). We used a base map to construct the model using the biogeographic regions to avoid artifi-tial distribution limits map (e. g., political boundaries) and projected the models from Southern Texas to Northern Ecuador. The model obtained was evaluated with the AUC (Area Under the Curve) values > 0.9, it means that MAXENT performed well by generating pre-dicted niches for the presence of each species (Phillips et al., 2006). The model is a graph-ical output map in which figure out the discrimination capacity of presence (sensitivity) ver-sus the discrimination of capacity of absence (specificity) (Phillips et al., 2004). The color scale of the map signal the climatic conditions for the growth populations of the A. mixtum.

Results

Morphological identification of collected ticks A total of 3,283 ticks were collected on field. In cattle, we collected a total of 1,498 (45.6%) were collected specimens that were subsequently and identified. In the same line, we identi-fied, in equids 1,312 (39.9%) and 473 were collected from the vegetation (14.4%). Of the total number of ticks collected, 1,845 were males (56.1%) and 1,438 were females (43.8%) (Table 2). Of these specimens, 100% of adult ticks identified taxonomically were classified as A. mixtum. The collected ticks were present in different ecological niches, determined mainly by the temperature. In the Huasteca Alta, Huasteca Baja and Nautla regions, the average tempera-ture varied from 26 to 22 ° C, while in the Mountain region, the maximum temperature is 24 ° C and the minimum temperature 8 ° C; for the Sotavento and Papaloapan regions, the max-imum temperature is 27 ° C and 22 °

67

C and in the Olmeca region it has higher temperature characteristics with a maximum of 28 ° C and a minimum of 22 ° C.

Geographical distribution of A. mixtum from Texas to Ecuador. Figure 1 shows the map of the presence of ticks of the A. mixtum. In this map, we used 41 locations obtained from field work and 59 obtained from the GBIF data base, with a total of one hundred different locations.

FIGURE 1. Geographic distribution of A. mixtum by biogeographic regions.

68

Present suitable habitat for A. mixtum The model obtained a 8.272 coefficient of entropy and an AUC of 0.872 for the training data and 0.854 for the test data. Figure 2 represents the present suitable habitat for A. mixtum. This map determined that the Gulf of Mexico coast (greater proportion of Veracruz territory) has a high suitable climatic condition for the distribution of A. mixtum populations. It is important to add that the potential distribution determined, in a lesser Mexican territory proportion to the states of Tamaulipas, Tabasco, Yucatan, Campeche, Oaxaca and Chiapas, with suitable environmental conditions as habitat of this tick. On the other hand, the area of Guatemala, Belize and Honduras also shown a suitable habitat for this tick, although in less proportion. The map determined the highest probability, which meets the optimum environmental con-ditions of the ecological niche of this species, while a scale of color gradients different de-termines a low probability (<70%), which is indicator of areas that do not meet the ecologi-cal conditions. The variables that contributed the most are shown in Table 3, three out of the five variables that we used shown the highest contribution to the model, these variables are Isothermality (38.14%), Mean Diurnal Range (33.41%) and Precipitation Seasonality (Coef-ficient of Variation) (32.57%).

Discussion or Conclusions In this study it was observed that A. mixtum is parasitizing bovine and equine animals from the ten ecological regions of Veracruz (Guzman-Cornejo et al., 2011), considering average temperatures of 27 ° C and 8 ° C as maximum and minimum, respectively. This result is consistent with what was established by Estrada-Peña et al. (2004): A. mixtum is present at temperatures lower than 16 ° C, occurring in the tropics, subtropics and mountain regions (Geissert, 1999; Zsabó et al., 2009; Beck et al). Estrada-Peña et al. (2004), mention that A. cajennese (s. l) has been able to adapt to the dif-ferent climatic conditions, having as main hosts members of the to equidae family, and that these animals, by their type of work and route, can disperse with 69

more facility this tick spe-cies (Labruna et al., 2002, 2004, Álvarez and Bonilla, 2007). In the present work it can be observed that the two conditions characteristics of the hosts mentioned above were also ob-served in our study. It is important to mention that the survival of ticks depends on the para-site-host relationship (Hoogstraal and Aeschlimann 1982, Chacon et al., 2002, de Oliveira 2004). The biological diversity considered as potential hosts of for A. mixtum has decreased, yherefore, A. mixtum has developed the ability to find new hosts for its persistence, a similar number of ticks were found in the two hosts species samples, as well as in the vegetation. This observation generates generats a public health problem for cattle activity in Mexico and other countries with mixed infestation problems (Gonzalez-Ceron et al. 2009, Álvarez and Bonilla 2011, Almazan et al., 2016, Szabó et al., 2009). Regarding the sex of the ticks, a homogeneous sex ratio between males and females of 55% and 44.9% respectively was observed, considering that the collection was carried out in a random way. However, Beck et al. (2011), mention that in a field collection from March 2005 to November 2008, obtained a total of 5.2% of males and 3.3% of females, showing a bias in the number of males. This information guarantees that there is no bias in the sampling performed in this study. The results obtained in this research reveal the presence of A. mixtum, formerly considered as A. cajennense, all along the Gulf of Mexico, expanding its presence to the states of Campeche, Yucatan, it also revealed a suitable habitat in Belize, Honduras and Guatemala. This is an important starting point for studies and confirmatory diagnoses through electron microscopy, molecular biology and phylogenetics of the species to understand the ecological processes and determine the center of origin of this tick species (Beati et al., 2013). The potential distribution model developed in this work indicates that A. mixtum is an en-demic species from Mexico to Ecuador and particularly from the region known as the Coastal Plain of the Gulf of Mexico. This prediction reinforces the phylogenetic hypotheses (Beati et al., 2013) and morphological (Nava et al., 2014) that A. mixtum is a different species of A. cajennense, since its ecological niche is restricted to a geographic region, and has adapted to particular environmental 70

conditions; it is possible that this species is in a process of speciation, since its population is isolated reproductivele of the species of the complex A. cajennense and is accumulating genetic differences that distinguish it from the complex of species of which it forms part. A. mixtum shows to be a species with phenotypic plasticity restricted to the temperature and precipitation of the environment that prevail in its ecological niche, limiting its dispersion. The altitude gradient forms an important ecological barrier that could restric the geographic distribution of this species; that is, the geographical conditions of Sierra Madre Oriental that can act as an environmental barrier that might limits the distribution of this species, since at higher altitude the temperature drops, and it is possible that A. mixtum does not tolerate temperature extremes at these high-altitude conditions (Illoldi-Rangel and Escalante, 2008). The presence of A. mixtum tick in cattle, horses and the vegetation in the main cattle areas of Mexico has important implications for animal and public health, it is important to take this information into account in the control programs, as well as to extend the impact studies caused by this tick.

71

References

Absalón-Medina VA, Nicholson CF, Blake RW, Fox DG, Juárez-Lagunes FI, Canudas-Lara EG, Rueda-Maldonado BL. 2012. Tropical Animal Health Production. 44(6): 1143-1150. Alekseev, AN, Dubinina HV, Jushkova OV (2004) First report on the coexistence and com-patibility of seven tick-born pathogenes in unfed adult Ixodes Persulcatus Schulze (Acari: Ixodidae). International Journal of Medicina and Microbiology. 293 (37): 104-108. Alim MA, Das S, Roy K, Masuduzzaman M, Sikder S, Hassan MM, et al. Prevalence of hemoprotozoan diseases in cattle population of Chittagong division, Bangladesh. Pak Vet J 2012; 32: 221-224. Almazán C, Torres-Torres A, Torres-Rodríguez L, Soberanes-Céspedes N, Ortiz- Estrada M (2016) Aspectos biológicos de Amblyomma mixtum (Koch, 1844) en el noreste de México. Quehacer Científico en Chiapas. 11: 10-19. Álvarez VV, Bonilla RM (2007) Adultos y ninfas de la garrapata Amblyomma cajennense Fabricius (Acari: Ixodidae) en equinos y bovinos. Agronomía Costarrisense. 31(1): 61-69. Anderson R. P., Lew D., Peterson T. 2003. Evaluating predictive models of species’ distributions: criteria for selecting optimal models. Ecological modelling. 162(3): 211-232. Aragão BH, Fonseca F da (1953) Notas de Ixodologia; A propósito da validade de algumas espécies do gênero Amblyomma do Continente Americano (Acari: Ixodidae). Mem I Oswaldo Cruz. 51: 486-492. Beati, L., Nava, S., Burkman, J. E., Barros-Battesti, D. M., Labruna, M. B., Guglielmone, A. A., Cáceres, A. G., Guzmán-Cornejo, C. M., León, R., Durden, L. A. y Faccini, J. L. H. (2013). Amblyomma cajenense (Fabricius, 1787) (Acari: Ixodidae), the Cayenne tick: phylogeofraphy and evidence for allopatric speciation. BMC Evolutionary Bi-ology. 13: 267. Estrada-Peña A, Guglielmone AA, Mangold AJ (2004) The distribution and ecological “preferences” of the tick Amblyomma cajennense (Acari: 72

Ixodidae), an ectoparasite of humans and other mammals in the Americas. Annals of Tropical Medicine and Parasitology. 98: 283-292. Estrada-Peña A, Tarragona E. L., Vesco U., Meneghi D., Mastropaolo M., Mangold A. J., Guglielmone A. A., Nava S. 2014. Divergent environmental preferences and areas of sympatry of tick species in the Amblyomma cajennense complex (Ixodidae). Interna-tional Journal for Parasitology. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpara.2014.08.007. Feria-Arroyo T. P, Castro-Arellano I., Gordillo-Perez G., Cavazos A. L, Vargas- Sandoval M., Grover A., Torres J., Medina R. F., Pérez de León A. A., Esteve-Gassent M. D. 2014. Implications of climate change on the distribution of the tick vector Ixodes scapularis and risk for Lyme disease in the Texas-Mexico transboundary region. Par-asites & Vectors. 7: 199. Fernández-Eguiarte A, Zavala-Hidalgo J, Romero-Centeno R (2012) Meteorological drought in the Digital Climatic Atlas of Mexico. ICAN, The Newsletter of the International Coastal Atlas Network, Volume One Number 1, March 2012, p.13 Geissert K D (1999) Regionalización geomorfológica del estado de Veracruz. Investigaciones geográficas. 40: 23-47. González-Cerón F, Becerril-Pérez CM, Torres-Hernández G, Díaz-Rivera P (2009) Ticks infesting body regions of tropical milking criollo cattle in Veracruz, México. Agro-ciencia. 43: 11-19. Guglielmone, A.A., Nava, S., 2010. Hosts of Amblyomma dissimile Koch, and Amblyomma rotundatum Koch, 1844 (Acari: Ixodidae). Zootaxa 2541, 27– 49. Guisan A. and Zimmermann. 2000. Predictive habitat distribution models in ecology. Ecological Modelling. 135: 147-186. Guisan A., Thuiller W. 2005. Predicting species distribution: offering more than simple habitat models. Ecology Letters. 10(5): 435. Guzmán-Cornejo, C., Robbins, R.G., 2010. The genus Ixodes (Acari: Ixodidae) in Mexico: adult identification keys, diagnoses, hosts, and distribution. Revista Mexicana de Biodiversidad. 81: 289–298. 73

Guzmán-Cornejo C, Robbins R, Guglielmone AA, Montiel-Parra G, Pérez TM (2011) The Amblyomma (Acari: Ixodidae) of Mexico: identification keys, distribution and hosts. Zootaxa. 2998: 16-38. Hijmans RJ, Cameron SE, Parra JL, Jones PG, Jarvis A (2005) Very high resolution interpolated climate surfaces for global land areas. International Journal of Climatology. 25, 1965–1978. Hoogstraal H, Aeschlimann A (1982) Tick-hostspecificity. Bulletin de la Société Entomologique Suisse. 55: 5-32. Illoldi-Rangel P, Escalante T (2008) De los modelos de nicho ecológico a las áreas de distribución geográfica. Biogeografía 3: 7-12. Jongejan F, Uilenberg G (2004) The global importance of ticks. Parasitology. 129: 3-14. Labruna MB, Souza LPS, Menezes AC, Horta MC, Pinter A, Gennari SM (2002) Life-cycle and host specificity of Amblyomma tigrinum (Acari: Ixodidae) under laboratory con-ditions. Experimental Applied Acarology 24: 115-125. Labruna, MBLeite RC, Gobesso AA deO, Gennari SM, Kasai N (2004) Controle estratégico do carrapato Amblyomma cajennense em eqüinos. Ciência Rural. 34: 195-200. Lopes CML, de Oliveira PR, Haddad JPA, Pinheiro RR, de Freitas CMV, Paz GF, Leite RC (2000) Reproductive parameters and Conversion Efficiency Index (CEI) of Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Acari: Ixodidae) females under field and laboratory conditions. Revue Méd. Vét. 151: 945-948. Lopes CML, Leite RC, Labruna MB, de Oliveira PR, Borges LMF, Rodrigues ZB, et al. (1998) Host specificity of Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Acari: Ixodi-dae) with comments on the drop-off rhythm. Memorias Instituto Oswaldo Cruz 93: 347-351. Lopes CML, Oliveira PR, Haddad JP, Domingues LN, Pinheiro RR, Borgues LMF, Labruna MB, Leite RC (2008) Biological parameters of ticks (Amblyomma cajennense fabricius, 1787) under field and laboratory conditions in pedro leopoldo, State of Minas Gerais, Brazil Rev. Bras. Parasitol. Vet. 17: 14-17.

74

Merrow C, Smith MJ, Silander JA (2013) A practical guide to MaxEnt for modeling species’ distributions: what it does, and why inputs and settings matter. Ecography. 36(10): 1058-1069. Nava S, Beati L, Labruna MB, Cáceres AG, Mangold AJ, Guglielmone AA (2014) Reas-sessment of the taxonomic status of Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) with the description of three new species, Amblyomma tonelliae n. sp., Amblyomma interandinum n. sp. and Amblyomma patinoi n. sp., and reinstatement of Amblyomma mixtum Koch, 1844, and Amblyomma sculptum Berlese, 1888 (Ixodida: Ixodidae). Ticks Tick Borne Dissease. 5(3): 252-276. Phillips SJ, Dudík M, Schapire RE (2004) A maximum entropy approach to species distribu-tion modeling. In Proceedings of the twenty-first international conference on Machine learning (p. 83). ACM. Phillips SJ, Anderson RP, Schapire RE (2006) Maximum entropy modeling of species geo-graphic distributions. Ecological Modelling. 190(3), 231-259. Phillips SJ, Anderson RP, Dudík M, Schapire RE, Blair ME (2017) Opening the black box: an open-source release of Maxent. Ecography. doi:10.1111/ecog.03049 Raghavan RK, Goodin DG, Hanzlicek GA, Zolnerowich G, Dryden MW, Anderson GA, Gan-ta RR (2016) Maximum entropy-based ecological niche model and bioclimatic determinants of Lone Star Tick (Amblyomma americanum) niche. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 16(3): 205-211. Román HP, Aguilera RS, Patraca AF (2012) producción y comercialización de ganado y car-ne de bovino en el estado de Veracruz. Cómite Nacional de Sistema Producto Bovinos Carne. 28 p. Sanhez-Montes S, Ríos-Muñoz CA, Espinosa-Martínez DV, Guzmán-Cornejo C, Berzunza-Cruz M1, Becker I. 2016. First report of "Candidatus Rickettsia amblyommii" in west coast of Mexico. Ticks Tick Borne Dissease. 7(6): 1139- 1145.

75

Serra FNM (1982) Epidemiología de Amblyomma cajennense: Ocurrencia estacional y comportamiento de dos estadios de parásitos en pastos del estado de Río de Janeiro. Arq. Univ. Rur. Rio de J. 5: 187-193. Szabó MPJ, Labruna MB, Garcia MV, Pinter A., Castagnolli KC, Pacheco RC, VA, Castro MB, Veronez Magalhães GM, Vogliotti A, Duarte JMB (2009) Ecological aspects of the free-living ticks (Acari: Ixodidae) on animal trails within Atlantic rainforest in south-eastern Brazil. Annals of Tropical Medicine & Parasitology. 103: 57-72. Soberon J, Peterson AT (2005) Interpretation of models of fundamental ecological niches and species’ distributional areas. Biodiversity Informatics. 2: 1-10. Zaniewski A. E., AnthonyLehmann A., Overton J. M. 2002. Predicting species spatial distri-butions using presence-only data: a case study of native New Zealand ferns. Ecologi-cal modelling. 157(2-3): 261-280).

76

CAPÍTULO V

DISCUSIONES GENERALES Los resultados de esta investigación confirman la presencia de Amblyomma mixtum en el estado de Veracruz, estos hallazgos coinciden con lo publicado por Beati et al., 2014, donde determinaron que Ablyomma cajennense es un complejo de seis especies genéticamente diferentes (A. cajenennse s.s., A. interandinum, A. mixtum, A. patinoi, A. sculptum y A. tonelliae), y determinando que la especie que se encuentra distribuida en México, principalmente a lo largo del Golfo de México es A. mixtum. El análisis de redes de haplotipos de 16S-rRNA y las secuencias de COI de A. mixtum indicaron que no existe una estructura genética entre las poblaciones que infestan al ganado en el estado de Veracruz. El haplotipo H3 de las secuencias del gen 16S-rRNA parece ser el haplotipo ancestral porque es el más abundante que ocurre en 10 de las poblaciones, y se encuentra en el centro de la red; por otro lado, el mismo patrón se identificó en el Haplotipo 1 de COI. La frecuente superposición de haplotipos entre las poblaciones indica un estrecho contacto reproductivo y la presencia de 11 haplotipos de 16S-rRNA y 10 de COI en las poblaciones muestreadas en todo el estado sugiere una gran diversidad genética y flujo genético. Las poblaciones que no han sufrido una reducción drástica en el tamaño dentro del tiempo evolutivo y en las que se reducen los efectos de la diversificación genética, parecen ser capaces de retener un polimorfismo ancestral (Avise et al., 1984, Hamarsheh et al., 2007). Una aparente falta de diferenciación genética en las poblaciones de A. mixtum podría deberse a la continua movilización de los hospederos. En el estado de Veracruz hay alrededor de 4 millones de cabezas de ganado (SIAP, 2017), que tienden a trasladarse de sur a norte a lo largo de todo el estado. A diferencia de las infestaciones de Rhipicephalus microplus en el ganado, A. mixtum no es una especie vigilada en México (Rodríguez-Vivas et al., 2017; Almazan et al., 2018). El

77

movimiento frecuente de ganado infestado con esta especie de garrapatas en todo Veracruz es aparentemente un proceso que promueve la homogeneidad genética de las poblaciones de esta garrapata a lo largo del Golfo de México. A. mixtum ha sido capaz de adaptarse a diferentes condiciones climáticas en todo México y, las infestaciones se encuentran comúnmente en equinos; sin embargo, esta garrapata puede parasitar a otros animales (Estrada-Peña et al., 2004; Coronel-Benedett et al., 2018). El movimiento de caballos ha sido identificado como una manera frecuente para la dispersión de A. mixtum (Labruna et al., 2002, Álvarez y Bonilla, 2007). Además, se informó sobre la resistencia a los acaricidas en poblaciones del complejo de A. cajennense sensu lato que infestan el ganado estado de Veracruz (Alonso-Díaz et al., 2013). De acuerdo con los hallazgos del análisis morfométrico, la especie del complejo taxonómico Amblyomma cajennense sensu lato que se encuentra en el estado de Veracruz es A. mixtum. Estos resultados coinciden con lo reportado por Nava et al., 2014, donde realizaron un estudio morfológico a cada una de las seis especies que conforman el complejo taxonómico ya mencionado. Por otro lado, dentro de cada uno de estos grupos, las garrapatas tienden a agruparse por caracteres morfométricos similares. Por lo tanto, se observó un único patrón fenotípico de agrupamiento estricto entre los individuos de A. mixtum. Aunque en Brasil y otros países de Sudamérica se han registrado la presencia de una especie muy cercana, Amblyomma cajennese sensu stricto, en algunas investigaciones anteriores (da Silva et al., 2015; Bastista et al., 2018), el registro de A. mixtum es relevante porque esta especie exhibe una mayor plasticidad y se puede encontrar en un gran número de ambientes, inclusive pastizales semiáridos y bosques secundarios subtropicales con preferencia de lugares con altas temperaturas constantes (Estrada-Peña et al. , 2014). Además, A. mixtum parasita una amplia variedad de hospederos y puede aprovechar los recursos nutricionales presentes en el área (Guzmán-Cornejo et al., 2011; Nava et al., 2014; Rodríguez- Vivas et al., 2016). A. mixtum se ha adaptado muy bien al uso de ganado bovino como hospedero y no es sorprendente que se presente a lo largo de todo el estado de Veracruz. 78

El impacto de A. mixtum en la salud veterinaria está bien documentado, es una garrapata de gran tamaño que puede causar anemia si las infestaciones son lo suficientemente grandes. Los sitios donde A. mixtum se adhieren y muerden a sus hospederos pueden infectarse o pueden ser infestados de forma secundaria por larvas de moscas que causan miasis. Además, se sabe que A. mixtum ha demostrado transmitir agentes bacterianos entre el ganado, incluyendo Anaplasma marginale (Rodrigues-Vivas y Domínguez-Alpízar, 1998), por otro lado, A. mixtum es un vector importante de Rickettsia rickettsii, el agente de la Fiebre manchada de las Rocallosas en poblaciones humanas (Bustamante y Varela, 1946). Como ya se mencionó con anterioridad, se observó que A. mixtum está parasitando animales bovinos y equinos en las diez regiones ecológicas de Veracruz (Guzman-Cornejo et al., 2011), con temperaturas promedio de 27 °C y 8°C como máximo y mínimo, respectivamente. Este resultado es consistente con lo establecido por Estrada-Peña et al. (2004): A. mixtum está presente a temperaturas inferiores a 16 ° C, que se producen en los trópicos, subtrópicos y regiones de montaña (Geissert, 1999, Zsabó et al., 2009, Beck et al., 2011). Estrada-Peña et al. (2004), mencionan que A. cajennese (s.l) ha sido capaz de adaptarse a las diferentes condiciones climáticas, teniendo como principales hospederos miembros de la familia de los équidos, y que estos animales, por su tipo de trabajo y ruta, puede dispersar con más facilidad esta especie de garrapatas (Labruna et al., 2002; Labruna et al., 2004; Álvarez y Bonilla, 2007). En el presente trabajo se puede observar que las dos características de condiciones de los hodpederos mencionados anteriormente también se observaron en el estudio. Es importante mencionar que la supervivencia de las garrapatas depende de la relación parásito-hospedero (Hoogstraal y Aeschlimann 1982). La diversidad biológica considerada como hospederos potenciales de A. mixtum ha disminuido; por lo tanto, A. mixtum ha desarrollado la capacidad de encontrar nuevos hospedadores para su persistencia, se encontró un número similar de garrapatas en las dos muestras de especies de hospederos, así como en la vegetación. Esta observación genera un problema de salud pública para la actividad ganadera en

79

México y otros países con problemas de infestación mixta (González-Ceron et al., 2009, Almazan et al., 2016, Szabó et al., 2009). En cuanto al sexo de las garrapatas, se observó una proporción homogénea de sexos entre machos y hembras de 55% y 44.9%, respectivamente, considerando que la recolección se realizó de forma aleatoria. Sin embargo, Beck et al. (2010), mencionan que, en una colección de campo de marzo de 2005 a noviembre de 2008, obtuvieron un total de 5.2% de hombres y 3.3% de mujeres, mostrando un sesgo en el número de hombres. Esta información garantiza que no hay ningún sesgo en el muestreo realizado en este estudio. Los resultados obtenidos en esta investigación revelan la presencia de A. mixtum, anteriormente considerado como A. cajennense, a lo largo del Golfo de México, su presencia se expande a los estados de Campeche, Yucatán, también reveló un hábitat adecuado en Belice, Honduras, Guatemala, Honduras y parte de Ecuador, donde ya ha sido reportada esta garrapata. El modelo de distribución potencial desarrollado en este trabajo indica que A. mixtum es una especie endémica desde México hasta Ecuador y particularmente de la región conocida como Llanura Costera del Golfo de México. Esta predicción refuerza las hipótesis filogenéticas (Beati et al., 2013) y morfológicas (Nava et al., 2014) de que A. mixtum es una especie diferente de A. cajennense, ya que su nicho ecológico está restringido a una región geográfica, y se ha adaptado a condiciones ambientales particulares; es posible que esta especie se encuentre en un proceso de especiación, ya que su población está aislada reproductivamente de la especie del complejo A. cajennense y está acumulando diferencias genéticas que la distinguen del complejo de especies del que forma parte. A. mixtum muestra ser una especie con plasticidad fenotípica restringida a la temperatura y precipitación del ambiente que prevalece en su nicho ecológico, lo que limita su dispersión. El gradiente de altitud forma una importante barrera ecológica que podría restringir la distribución geográfica de esta especie; es decir, las condiciones geográficas de Sierra Madre Oriental que pueden actuar como una barrera ambiental que podría limitar la distribución de esta especie, ya que a mayor

80

altitud la temperatura disminuye, y es posible que A. mixtum no tolere temperaturas extremas ni grandes altitudes (Illoldi-Rangel y Escalante, 2008). La presencia de garrapatas A. mixtum en bovinos, equinos y la vegetación en las principales áreas ganaderas de México tiene importantes implicaciones para la sanidad animal y pública, es importante tener en cuenta esta información en los programas de control, así como continuar los estudios de impacto causados por esta especie de garrapata ya que cada día cobra mayor importancia en la ganadería bovina y otras especies animales.

81

CONCLUSIONES GENERALES

• Se identificaron morfológicamente a través de claves de identificación específicas para esta especie las garrapatas pertenecientes al complejo taxonómico A. cajennense (sensu lato) recolectadas en bovinos, équidos y vegetación en las diez regiones naturales del estado de Veracruz, México.

• Se determinó a través de microscopía electrónica de barrido que la especie del complejo taxonómico de A. cajennense (sensu lato) mediante caracteres específicos y mediciones que las garrapatas recolectadas de bovinos, équidos y de la vegetación que se encuentra en las diez regiones en el estado de Veracruz presente es Amblyomma mixtum. Su presencia en bovinos, equinos y la vegetación en las principales áreas ganaderas de México tiene importantes implicaciones para la sanidad animal y pública.

• La georreferenciación indicó la presencia de A. mixtum a lo largo de los 41 municipios muestreados localizados en las diez regiones del esta de Veracruz, lo que nos indica que esta garrapata tiene una importante presencia en los diversos ecosistemas presentes a lo largo de este estado.

• El modelo indicó una amplia distribución para A. mixtum, con mayor probabilidad de ocurrencia a lo largo del Golfo de México y en una menor proporción de los estados del Pacíficos en México. También mostró un hábitat adecuado en varios países de América Central, como Honduras, Guatemala y Belice. Estos hallazgos se discuten en el contexto de los aspectos geográficos y ecológicos de A. mixtum desde México hasta Ecuador.

• Se determinó la variabilidad intraespecífica de los fragmentos de A. mixtum, se amplificó el gen mitocondrial 16s-rRNA y la subunidad 1 del Citocromo Oxidasa (COI). Noventa y seis secuencias se amplificaron a partir de las 50 muestras analizadas (96% de éxito de amplificación). Se detectaron once haplotipos en el

82

gen 16S-rRNA y 10 más para COI. No se detectó diferenciación genética significativa en las poblaciones de A. mixtum muestreadas en el estado de Veracruz, México, esto puede ser debido al movimiento frecuente de hospedadores, entre ellos ganado. Este es el primer informe sobre la estructura genética de las poblaciones de A. mixtum en México.

RECOMENDACIONES

Se necesita más estudios que abarquen muestras de todo el rango geográfico de esta especie de garrapatas en México; con lo cual, se mejorará la comprensión de la base y estructura genética de diferentes poblaciones de esta garrapata de gran importancia para la salud veterinaria y pública. De igual manera, es importante determinar si ocurre una situación similar en los otros estados mexicanos que bordean el Golfo de México, así como en los estados de la costa del Pacífico.

A su vez, son necesarios más estudios para llevar a cabo investigaciones sistematizadas para identificar el impacto de A. mixtum en las diversas poblaciones que infesta a fin de dilucidar su relevancia en la epidemiología de algunas enfermedades transmitidas por vectores (garrapatas), así como determinar el tipo de intensidad y las medidas de control que sirva a los tomadores de decisiones.

83

REFERENCIAS

Alonso-Díaz, M.A., Fernández-Salas, A., Martínez-Ibáñez, F., Osorio-Miranda, J., 2013. Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae) tick populations susceptible or resistant to acaricides in the Mexican Tropics. Vet Parasitol. 197, 326- 331. doi: 10.1016/j.vetpar.2013.06.004.

Almazán C, Torres-Torres A, Torres-Rodríguez L, Soberanes-Céspedes N, Ortiz- Estrada M (2016) Aspectos biológicos de Amblyomma mixtum (Koch, 1844) en el noreste de México. Quehacer Científico en Chiapas. 11: 10-19.

Álvarez VV, Bonilla RM (2007) Adultos y ninfas de la garrapata Amblyomma cajennense Fabricius (Acari: Ixodidae) en equinos y bovinos. Agronomía Costarrisense. 31(1): 61-69.

Álvarez VV, Bonilla RM (2007) Adultos y ninfas de la garrapata Amblyomma cajennense Fabricius (Acari: Ixodidae) en equinos y bovinos. Agronomía Costarrisense. 31(1): 61-69.

Avise, J.C., J.E. Neigel, Arnold, J., 1984. Demographic influences on mitochondrial DNA lineage survivorship in animal populations. J Mol Evol. 20, 99-105.

Batista, H.R., Sarturi, C., Stelmachtchuk, F.N., Oliveira, D.R., Morini, A.C., Gennari, S.M., Marcili, A., Bastos, F.A.N., Barata, L.E.S., Minervino, A.H.H. 2018. Prevalence and risk factors associated with ectoparasite infestation of buffaloes in an Amazonian ecosystem. Parasit Vectors. 4, 335.

Beati, L., Nava S., Burkman, E.J., Barros-Battesti, D.M., Labruna, M.B., Guglielmone, A.A., Cáceres, A.G., Guzmán-Cornejo, C.M., León, R., Durden, L.A., Faccini, J.L., 2013. Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Acari: Ixodidae), the Cayenne tick: phylogeography and evidence for allopatric speciation. BMC Evol Biol. 13, 267. doi: 10.1186/1471-2148-13- 267.

84

Beck et al., R. Beck, L. Vojta, S. Curkovic, V. Mrljak, J. Margaletic, B. Habrun. 2010 Molecular survey of Babesia microti in wild rodents in Central Croatia Vector Borne Zoonotic Dis., 11 (2010), pp. 81-83

Bustamante ME y Varela G. III Estudios de fiebre manchada en México: Hallazgo del Amblyomma cajennense naturalmente infectado, en Veracruz. 1946. Rev Inst Salub Enfs Trop. 7, 75-78. da Silva, J. B., da Fonseca, A.H., Barbosa, J.D. 2015. Molecular characterization of Anaplasma marginale in ticks naturally feeding on buffaloes. Infect Genet Evol. 35, 38-41.

Estrada-Peña, A., Guglielmone, A.A., Mangold, A.J., 2004. The distribution and ecological 'preferences' of the tick Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae), an ectoparasite of humans and other mammals in the Americas. Ann Trop Med Parasitol. 98, 283-292. doi.org/10.1179/000349804225003316 .

Estrada-Peña A, Tarragona E. L., Vesco U., Meneghi D., Mastropaolo M., Mangold A. J., Guglielmone A. A., Nava S. 2014. Divergent environmental preferences and areas of sympatry of tick species in the Amblyomma cajennense complex (Ixodidae). Interna-tional Journal for Parasitology.

Geissert K D (1999) Regionalización geomorfológica del estado de Veracruz. Investigacio-nes geográficas. 40: 23-47.

González-Cerón F, Becerril-Pérez CM, Torres-Hernández G, Díaz-Rivera P (2009) Ticks infesting body regions of tropical milking criollo cattle in Veracruz, México. Agro-ciencia. 43: 11-19.

Guzmán-Cornejo C, Robbins R, Guglielmone AA, Montiel-Parra G, Pérez TM (2011) The Amblyomma (Acari: Ixodidae) of Mexico: identification keys, distribution and hosts. Zootaxa. 2998: 16-38.

85

Hoogstraal H, Aeschlimann A (1982) Tick-hostspecificity. Bulletin de la Société Entomologique Suisse. 55: 5-32.

Illoldi-Rangel P, Escalante T (2008) De los modelos de nicho ecológico a las áreas de distribución geográfica. Biogeografía 3: 7-12.

Labruna, M.B., Kasai N., Ferreira F., Faccini J.L., Gennari S.M., 2002. Seasonal dynamics of ticks (Acari: Ixodidae) on horses in the state of São Paulo, Brazil. Vet Par. 105, 65-77.

Labruna, MBLeite RC, Gobesso AA deO, Gennari SM, Kasai N (2004) Controle estratégico do carrapato Amblyomma cajennense em eqüinos. Ciência Rural. 34: 195-200. Nava S, Beati L, Labruna MB, Cáceres AG, Mangold AJ, Guglielmone (2014) Reassessment of the taxonomic status of Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) with the description of three new species, Amblyomma tonelliae n. sp., Amblyomma interandinum n. sp. and Amblyomma patinoi n. sp., and reinstatement of Amblyomma mixtum Koch, 1844, and Amblyomma sculptum Berlese, 1888 (Ixodida: Ixodidae). Ticks Tick Borne Dissease. 5(3): 252-276.

Rodriguez-Vivas, R.I., Grisi, L., Pérez de León, A.A., Silva Villela, H., Torres- Acosta, J.F.J, Fragoso Sanchez, H., Romero Salas, D., Rosario Cruz, R., Saldierna, F., Garcia Carrasco, D., 2017. Potential economic impact assessment for cattle parasites in Mexico. Rev Mex Cienc Pec. 8, 61-74. doi:10.22319/rmcp.v8i1.4305.

Rodríguez-Vivas, R.I., Apanaskevich, D.A., Ojeda-Chi, M.M., Trinidad-Martínez, I., Reyes-Novelo, E., Esteve-Gassent, M.D, Pérez de León, A.A., 2016. Ticks collected from humans, domestic animals, and wildlife in Yucatan, Mexico. Vet Parasitol. 215, 106-113. doi: 10.1016/j.vetpar.2015.11.010.

86

Rodríguez-Vivas, R.I. & Domínguez-Alpízar, J.L. 1998. Grupos entomológicos de importancia veterinaria en Yucatán, México. Revista Bio. 9, 26-37.

SIAP (Sistema de Información Agroalimentaria y Pesquera). 2017. Sistema de Información Agroalimentaria y Pesquera. Secretaria de Agricultura Ganadería Desarrollo Rural Pesca y Alimentación. http://www.siap.gob.mx/. (Consultado: Junio, 2018).

Szabó MPJ, Labruna MB, Garcia MV, Pinter A., Castagnolli KC, Pacheco RC, VA, Castro MB, Veronez Magalhães GM, Vogliotti A, Duarte JMB (2009) Ecological aspects of the free-living ticks (Acari: Ixodidae) on animal trails within Atlantic rainforest in south-eastern Brazil. Annals of Tropical Medicine & Parasitology. 103: 57-72.

87

ANEXOS

Anexo 1. Encuesta general

Todos los datos que usted proporcione son confidenciales y solamente serán utilizados con fines de investigación.

Fecha: Encuestador:

Nombre del propietario de la explotación:

Nombre de la explotación:

Poblado donde se ubica la explotación:

Ubicación de la explotación con GPS:

Municipio y estado donde está la explotación:

Temperatura (ºC): ______Humedad relativa: ______Coordenadas: ______

Por favor marque con una cruz la respuesta que considere le corresponde:

1. A qué tipo de ganadería se dedica? 1 ( ) Producción de carne 2 ( ) Producción de leche 3 ( ) Doble propósito (carne y 4 ( ) Píe de cría leche)

88

5 ( ) Monta (espectáculo) 6 ( ) Otro. Especifique:

2. Su ganado es nacido y criado en su rancho? 1( ) Si 2( ) No 3 ( ) Nacidos y comprados 4 ( ) Ganado a medias

3. Ha comprado ganado?. 1( ) Si 2( ) No

4. Dónde lo compró? 1 ( ) Mismo municipio 2 ( ) Otro municipio 3 ( ) Otro estado 4 ( ) Otro país

5. Ha observado la presencia de garrapatas en sus animales?

1( ) Si 2( ) No

6. ¿En qué época (meses) del año observa mayor presencia de garrapatas? ______7. ¿Qué tipo de garrapatas observa en su ganado? ______8. ¿Lo baña contra garrapata, moscas, etc.?

1( ) Si 2( ) No 3( ) A veces

9. Tipo de Baño garrapaticida:

1 ( ) Aspersión 2 ( ) Inmersión

10. Tiempo de aplicación del producto:

1 ( ) 7 Días 2 ( ) 14 Días 3 ( ) 21 Días Otro: ______

11. ¿Baña a todos los animales al mismo tiempo?

89

1( ) Si 2( ) No 3( ) A veces Cuándo? ______

12. ¿Lo desparasita?

1( ) Si 2( ) No 3( ) A veces

13. ¿Lo revisa para ver si está enfermo?

1( ) Sí 2( ) No 3( ) A veces

14. ¿Lo vacuna?

1( ) Sí 2( ) No 3( ) A veces

15. ¿Pide a un veterinario que lo revise?

1( ) Sí 2( ) No 3( ) A veces

16. ¿Al día de hoy, cuantas cabezas de bovinos y équidos tiene en su rancho? ______

17. ¿Tiene potreros para soltar a su ganado?.

1( ) Si 2( ) No 3( ) Alquila

18. ¿Qué tipo de pasto tiene en sus potreros?______

19. ¿Qué tipo de vegetación es la que predomina? ______

20. ¿Cuánto tiempo permanecen en ese potrero?______

21. ¿Tiene corral de ordeña o un lugar especial para ordeñar?

90

1( ) Sí 2( ) No

22. ¿Cuánto mide su corral de ordeña?______

23. Su ganado llega a juntarse o mezclarse junto con el ganado de otras personas en potreros comunales, en potreros ejidales, en aguajes, bebederos, o arroyos?

1( ) Si 2( ) No 3( ) A veces

24. ¿Qué manejo acostumbra darle a su ganado?

1. Lo baña 1( ) Sí 2( ) No 3( ) A veces 2. Lo desparasita 1( ) Sí 2( ) No 3( ) A veces 3. Lo revisa para ver si hay enfermos 1( ) Sí 2( ) No 3( ) A veces 4. Lo vacuna 1( ) Sí 2( ) No 3( ) A veces 5. ¿Lo revisa algún veterinario? 1( ) Sí 2( ) No 3( ) A veces

25. ¿De qué se alimenta su ganado?

1( ) Alfalfa 2( ) Rastrojos 3( ) Concentrado 4( ) Monte, pastizales. 5( ) Gallinaza 6( ) Minerales 7( ) Ensilado 8( ) Otro especifique______

26. Qué le da a su ganado en la época de seca para ayudarlo?

______

27. ¿Acostumbra desparasitar a su ganado contra parásitos internos?

1( ) Si 2( ) No 3( ) A veces

91

28. ¿Qué otros animales tiene junto con sus vacas y caballos que se junten en el corral o campo?

1( ) Cabras. 2( ) Cerdos 3( ) Borregos 4( ) Gallinas 5( ) Perros 6( ) Gatos

29. ¿Ha visto la presencia de animales silvestres?

1( ) Si 2( ) No Cuáles? ______

TOTAL DE GARRAPATAS RECOLECTADAS: BOVINOS: ______ÉQUIDOS: ______

OBSERVACIONES:

92

Anexo 2. Encuesta individual

Cédula por animal

ESPECIE ANIMAL: ______

Fecha______Municipio______Rancho______Nombre o ID del animal______Raza ______Peso aprox Kg. ______Edad (meses) ______Sexo 1 ( ) Macho 2( ) Hembra

Número de garrapatas recolectadas: ______

1. Estado físico del animal:

1( ) Muy malo 2( ) Malo 3( ) Bueno 4( ) Gordo 5( ) Muy Gordo

2. Este animal es nacido en el rancho?

1( ) Sí 2( ) No 3( ) No sabe

3. Si fue comprado, ¿en dónde se compró?

______

4. ¿En qué época del año (meses) ha observado más presencia de garrapatas?______

5. ¿Con qué frecuencia baña al animal contra garrapatas?

1( ) Cada 6 meses. 2( ) Cada 3 meses 3( ) Cada vez que tienen garrapatas (cada cuanto aprox.) ______

93

6. Tipo de baño garrapaticida que se le da a este animal:

1( ) Aspersión 2( ) Inmersión

7. ¿Este animal se ha desparasitado?

1( ) Sí 2( ) No 3( ) No sabe

8. ¿Hace cuánto tiempo se desparasitó?

1( ) Menos de un mes 2( ) De 1 a 3 meses 3( ) De 3 a 6 meses 4( ) De 6m a 1 año 5( )más del año 6( ) No sabe

9. ¿Este animal sale a pastar?

1( ) Sí ¿Cuánto tiempo permanece en el potrero?______2( ) No

OBSERVACIONES:

94

Anexo 3. Envío de segundo artículo.

95