Laboratory Diagnosis of Thalassemia

dr. mehdhrdad vanaki consultant of QA & QMS in medical lab 5 ABAN 1390

1 سخنی زيبا از آنتوان سنت اگزوپری من به ھيچ وجه خدا را لمس نکردم ولی خدائی که قابل لمس باشد که ديگر خدا نيست . اگر ھر دعائی را ھم اجابت کند ھمينطور . ھمان جا بود که برای نخستين بار حدس زدم که عظمت دعا بيش از ھر چيز در اين امر ن ھفته اساتت که پاسخاخی به آن داده نمی شود و زشتی سوداگری را به اين مبادله راھی نيستنت . اين را ھم دريافتم که آموختن دعا اموختن سکوت است و عشق فقط از جائی شروع می شود که ديگيرر ھيچ انتظاری برابریی گرفترنن ھيچ چيز وجود نداشته باشد . عشق تمرين نيايش است و نيايش تمرين سکوت thal assemi a

Genetics. y In the first 8 weeks of embryonic life the predominant forms of are:

◦ Hb Gower 1 (ζ2ε2).

◦ Hb Gower 2 (α2ε2).

◦ Hb Portland 1 (ζ2γ2). y By the 12th week embryonic

hemoglobin is replaced by Hb F (α2γ2) which represents 70 – 100% of hemoglobin in fetal life. Genetics (2). y Adult hemoglobin Hb A (α2β2) detectable from 16/40, replaces Hb F as predominant hemoglobin by 6/12 after birth, up to 30% of Hb in fetal life. y Hemoglobin HbA2 (α2Δ2) is present in utero but only very minor in normal adults. y In normal adltdults 96 – 98% of hemog lo bin is HbA, Hb A2 (2 – 3%) and HbF (<1%) constitute a minor component of the total hemoglobin. Copyright ©1997 BMJ Publishing Group Ltd.

α2∆2

α2γ2

What is thalassemia? y Genetic blood disorder resulting in a mutation or del e tion of the genes ththtat cont rol globi n production. y Normal hemoggplobin is composed of 2 alpha and 2 beta globins y Mutations in a given globin gene can cause a decrease in production of that globin, resulting in deficiency y aggreg ates become oxidized Æ damage the cell membrane, leading either to hemolysis, ineffective erythropoiesis, or both. y 2 types of thalassemia: alpha and beta. Alpha Thalassemia

y mutation of 1 or more of the 4 alpha globin genes on chromosome 16 y severity of disease depe nds on nu mbe r of genes affected y results in an excess of beta globins Silent Carriers (heterozygotes +/-)

y 3 functional alpha globin genes y No symptoms, but thalassemia could poten ti ally appear in offsp ring Alpha ThalassemiaTrait

y 2 functional globin genes y results in smaller blood cells that are liggtehter in colou r y no serious symptoms, except slight Hemoglobin H Disease

y 1 functional globin gene y results in very lightly coloured red blood cells and possib le severe ane mia y hemoglobin H is susceptible to oxidation, therefore oxidant drugs and foods are avoided y treated with folate to aid blood cell production Alpha Thalassemia Major

y no functional globin genes y death before birth (embryonic lethality)

y mutations on chromosome 11 y hundreds of mutations possible in the beta ggoblobin gene, the re fo re beta thalassemia is more diverse y results in excess of alpha globins Beta ThalassemiaTrait

y slight lack of beta globin y smaller red blood cells that are lighter in colou rdue to lac k of he mog lob in y no major symptoms except slight anemia Beta Thalassemia Intermedia

y lack of beta globin is more significant y bony deformities due to bone marrow trying to make more blood cells to replace defective ones y causes late dldevelopment, exercise intol erance, and high levels of iron in blood due to reabsorption in the GI tract y if unable to maintain hemoglobin levels between 6 gm/dl – 7 gm/dl, transfusion or splenectomy is recommended Beta Thalassemia Major

y complete absence of beta globin y enlarged spleen, lightly coloured blood cells y severe anemia y chronic transfusions required, in conjunction with chelation therapy to reduce iron (desferoxamine) Variant Hemoglobin Classification.

y The variant haemoglobins are disorders of globin chain synthesis. y Normal αβ ratio so most have normal MCV and MCH. y There are over 1000 mutations associated with the haemoglobinopathies most of which will produce variants. Variant Hemoglobin Classification.

y Initiallyyg recognized forms were classified alphabetically (Hb C, D, E), subsequent naminggy after the location of discovery. y The most common forms in Australia include Hb S, Hb E, Hb Constant Spring and Hb C. y Usually caused by point mutations. Laboratory Diagnosis of Thalassemia

dr. mehdhrdad vanaki consultant of QA & QMS in medical lab 5 ABAN 1390

24 Laboratory Diagnosis of Thalassemia

y Need to start with patient's individual history and familyyy history. Ethnic background important. y Perform ppyhysical examination: ◦ Pallor indicating anemia. ◦ Jaundice indicating hemolysis. ◦ Splenomegaly due to pooling of abnormal cells. ◦ Skeletal deformity, especially in beta thalassemia major.

25 CBC with Differential y See decrease in hemoglobin, , (MCV), and mean corpuscular hemoglobin (MCH). See normal to slightly decreased Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration (MCHC). y Will see microcytic, hypochromic pattern. y Have normal or elevated RBC count with a normal red cell vol ume di st rib uti on (RDW) . y Decrease in MCV very noticeable when compared to decrease in Hb and Hct.

26 CBC with Differential y Elevated RBC count with markedly decreased MCV differentiates thalassemia from iron deficiency anemia. y On differential, see microcytic, hypochromic RBCs (except in carrier states). See mild to moderate poikilocytosis. y In more severe cases, see markdked number of target cells and ellip tocy tes. Will see polhlychromas ia,

basophilic stippling, and NRBCs. 27 PBS in thalassemia y Thalassaemias are typically microcytic and hypochromic anemia's. y Thalasse mia causes a uuoniform microcytosis without increase in RDW (cf iron deficiency). y Hb H and Δβ thal however can cause an increased RDW. PBS y RBC often increased in thal but decreased in iron deficiency y Hb typica lly norma l in ttahalminor but decreased in intermedia and major syndromes. y MCV is the most valuable parameter in predicting thal. Alpha Thalassaemia Major - target cells, microcytosis, hypochromia, NRBCs, poikilocytes, polychromasia, basophilic stipling, tear drops. βThal Major anisocytosis, poikilocytosis, targets, tear drops, fragments, hypochromaia, basophilic stippling. In th e setti ng of Hb H di sease, a disor der in w hic h three of four a-globin chain genes are Hb H INCLUSION BODIES IN BCB STAIN nonexpressed,30–100,RETICULOCYTE:5-10%% of red cells contain typical inclusions. y HEINZ BODIES y GOLF BALL APPEARING RBC y RETICULOCYTE

y HEINZ BODY IN GIEMSA STAIN GOLF BALL APPEARING RBC

In α-thalassemia minor may be associated with as few as 1 inclusion-containing cell in 1000–10000 cells . The absence of Hb H inclusions therefore does not exclude thalassemia trait, but the presence of typical inclusions may be helpful in confirming a presumptive diagnosis. Iron Studies. y Except in the urgent situation of pregnancy iron deficiency should always be excluded and treated prior to work up for thal . y MCV and MCH are influenced by iron dfiideficiency. y Hb A2 can be lowered by iron deficiency Î falsely normal results if tested when iron deficient (false negatives). Table 1: Laboratory features in different clinical states.

Iron Chronic Iron Thalassemia Deficiency Disease Overload

Haemoglobin N or ↓ ↓ N N or ↓

Serum Fe ↓ ↓ ↑ ↑ or N

Transferrin ↑ ↓ or N ↓ N Receptor

Transferrin ↓↓ ↑N Sat. Ferritin ↓↑or N ↑ ↑ or N

MCV ↓ ↓ or N N ↓

Marrow Fe ↓↑ ↑↑

Hb H Inclusions. y Hb H is an insoluble tetramer consitiisting of four bbteta glbilobinchihains, due to a lack of alpha chains in alpha thal major. y Oxidation of these tetramers provokes precipitation which can be visualized microscopically as ‘golf ball’ inclusions. y Oxidation can be precipitated by oxidative dyes (although there is significant batch to batch variabilityyg making controls essential) . Hb H Inclusions (2). y In Hb H disease 30 – 100% of RBCS contain Hb H inclusions. y In aaplpha ttahalminor tteehere is oeone cell wwtith Hb H inclusions per 1000 – 10,000 RBCS. y Other nucleic acid and protein precipitates also stain (without ‘golf ball’ pattern). Routine screening tests for diff IDA & minor BB--thalassemiathalassemia 9RBC count 9Serum iron & ferritin & Iron store BM 9TIBC & TS index 9Hb A2 9Free erythrocyte protoporphihyrin 9CBC index ( simple & rapid) Differentiative index

y Iron deficiencyy() anemia (IDA) and beta thalassemia minor (BTM) are the most common causes of hypochromic microcytic anemia. y Many indices have been defined for rapid differentiation of these diseases via indices IDA T.T. MCV-(5.Hb)-RBC-3.4 = England formula >0 0< 99.2% 69.5% MCV/RBC = Mentzer formula >13 <13 94.6% 95.5 % MCH/RBC = Srivastava formula >3.8 <3.8 86.5% 85.7% Kawakami formula RBC <5000000 >5000000 86.2% 98% MCV.MCH / RBC 301-370 250-300 24.6% 9/7% = Kerman I

MCVMCHMCV.MCH / RBC. MCHC 8.1-13 <10.5 62% 98.7% = Kerman I

MCV-10.RBC = Kermanshahan >15 <15 90% 95.5% MINOR β--THALASSEMIATHALASSEMIA vs. IDA Discriminant β- formulas THALASSEMIA IDA

Mentzer <<1313 =>=>1313 (MCV/RBC) BeningtonBenington--SrivastavaSrivastava <<44..44=>=>44..44 (MCH/RBC)

Green & King <65 =>65 MCV2 x RDW/RDW/HbHb x 100 Ratio of >>00..99<<00..99 micro./hypo. MEAN DENSITY Hb PER LITER, MDHL

MDHL: MCHD x RBC

(Mean Cell Hb Density= MCH/MCV)

SUBJECT NORMAL β--TmTm IDA

MDHL M:M:11..7575+/+/--00..1212 F:F:11..55+/+/--00..1111 Differentiative index y 1- Kawakami index(RBC count index): ‰<5 possible IDA ‰>5 possible BTm ‰Specifity +sensitivity =84% Differentiative index y 2- mentzer index (()MCV /RBC): ‰>13 IDA ‰<13 BTm ‰Specifity +sensitivity =90% Differentiative index y 3- index Srivastava (()MCH /RBC): ‰>3.8 IDA ‰<3.8 BTm ‰Specifity +sensitivity =74% Differentiative index y 4-index England (MCV-(5.Hb)-RBC-3.4): y > 0 IDA y < 0 BTm y Specifity +sensitivity =68% راھكار جديد جھت افتراق كم خوني ناشي از فقر آھن و تاالسمي مينور با استفاده از اندكسھاي گويچه سرخ y آنمي فقر آھن و تاالسمي مينور دو عامل مھم اتيولوژي آنمي ھيپوكروم ميكروسيتر مي باشند تا كنون معادالت و نامعادالتي جھت افتراق اين دو علت با توجه به شمارش كامل سلولھاي خوني (CBC) و اندكسھاي گلبول قرمز عنوان گرديده است كه مھمترين آنھا كه حساسيت (SiiiSensitivity ) و اختصااختاصي بودن (SifiSpecifity) باالتري دارد به نام اندكس منتسر (Mentzler formula) عنوان شده است اشكال عمده در فرمول فوق الذكر استفاده از عمل تقسيم است (MCV/RBC) كه گاھي اوقات انجام آن بطور ذھني مقدور نيست با توجه به تجربيات باليني پيشنھاد استفاده از راھكار جديدي توصيه مي گردد كه عبارت است از فرمول (MCV-(10 . RBC ھمانگونه كه مشاھده مي شود ضرب فرمول فوق الذكر اعشاري است و با جابجايي مميز تعداد گويچه ھاي سرخ در گزارش CBC حاصل مي شود و از تفريق حاصل از عدد MCV عددي حاصل مي گردد كه اگر كمتر از ١٥ باشد به نفع تاالسمي مينور و باالتر از آن آنمي فقر آھن مي باشد . Differentiative index y 5- new index Kermanshahan y MCV –(RBC x 10): y >15 IDA y <15 BTm y Specifity +sensitivity =86% Reticulocyte Count yUllUsually eltdlevated. yDegree of elevation depends upon severity of thalassemia.

51 Osmotic Fragility y Have decreased osmotic fragility. y Is not veryygg useful fact for diagnosing thalassemia. y Is an inexppyensive way of screening for carrier states.

52 Brilliant Cresyl Blue Stain y Incubation with brilliant cresyl blue stain causes Hemoglobin H to precipitate. y Results in characteristic appearance of multiple discrete inclusions -golf ball appearance of RBCs. y H Inclusions smaller than Heinz bodies and are evenly distributed throughout cell.

53 Hemoglobin Electrophoresis y Important role in diagnosing and differentiating various forms of thalassemias. y Can differentiate among Hb A, Hb A2, and Hb F, as well as detect presence of abnormal such as Hemoglobin Lepore, hemoglobin Bart's, or Hemoglobin Constant Spring. y Also aids in detecting combinations of thalassemia and .

54 Electrophoresis Principle. y Separation of haemoglobins with electrophoresis at pH 8.4 (alkaline) and pH 6.2 (acid). y Scanning allows quantification of the hemoglobin present, bands are seen by stiitaining. y At alkaline pH Hb C, E, A2 and O migrate together to form a single band, Hb S, D and G also co migrate. Electrophoresis Principle (2). y At acid pH Hb C separates from E and O and Hb S separates from D and G. y y Hb E and O cannot be separated by electrophoresis neither can Hb D and G. (1) Normal (2) New born (3) Hb C trait [A-C] (4) Hb SC disease [S-C] (5) [S-S], (6) Sickle cell trait [A – S] (7) New born (8) Normal. Electrophoresis Interpretation.

HbAHbA22 range Interpretation > 7.7.00 % Rare, repeat to verify test. Exclude a structural variant. Can be due to rare β thal mutations. 33..88 –7– 7..00 % Beta thaltrait or unstable Haemoglobin.Haemoglobin. 33..44 –3– 3..77 % Fe deficiency in β thal trait ; Δ chain variant with β thal trait . Interaction of α and β thal traits; rare β thal mutations. HbS making measurement inaccurate; interaction of α --HbHb S. 22..00 –3– 3..33 % Normal. Δ and β thal (but HbF should be elevated); alpha thal trait . Rare cases of β thal trait coexisting with either Δ or α thal trait. < 2.2.00 % Δ β thlhal (but HbFFsshldblhould be elevated) . Alpha thal trait; Hb H disease; Δ variant or delta Thalassemia.Thalassemia. Iron deficiency. Electrophoresis Strengths. y Commercial, widelyyp available, rapid methods used for many years. y Gives an estimate of HbA2 level. y Identifies some variant haemoglobins which are well characterized. Electrophoresis Disadvantages. y Labor-intensive. y Inaccurate in quantification of low- concentration variants (HbA2) and in detection of fast variants (HbH, Hb Barts). y The precision and accuracy for Hb A2 using scanning of electrophoretic gels is poor (in comparison to HPLC). Electrophoresis Disadvantages (2). y Coefficient of variation (()CV) 33.6% for gel electrophoresis (mean HbA2 concentration 2.41%). y Column chromatography has CV 14.6% (mean HbA2 3.21%) and HPLC has CV 4.3% (mean HbA2 3.47%). y Î An imprecise test in comparison to other tests now available. Preparation of Haemolysate for the QuantifIcation of Haemoglobins y Lyse 2 volumes of washed packed cells in 1 volume of distilled water, and then add 1 volume of carbon tetrachloride (CCI4).Alternatively, lyse by freezing and thaw ing, then a dd 2 volumes of CCI4. y Shake the tubes vigorously for approximately 1 min, then centrifuge at 1200 g (3000 rev/min) for 30 min at 4° Transfer the supernatant to a clean sample container and adjust the Hb to 10 g/dl with water. y If an unstable Hb is suspected, organic solvents should be avoided. y Whole blood samples are best stored as washed, packed cells frozen as droplets in liqqguid nitrogen and subseq qyuently stored at - 20°C, -70° or over liquid nitrogen. Alternatively, haemolysates may also be frozen at -20° -70° or over liquid nitrogen. CelCel11uloseulose Acetate Electrophoresis at Alkaline pH y 1. Centrifuge samples at 1200 g for 5 min. Dilute 20 landa of the packed red cells with 150 landa of the haemolyzing reagent. Mix gently and leave for at least 5 min. If purifIed hlthaemolysates are used, dilut e 40 ldlandaof 10 g/dl/dl haemolysate with 150 landa of lysing reagent. y 2. With the pOwer supply disconected, prepare the electrophoresis tank by placing equal amounts of TEB buffer in each of the outer buffer compartments. Wet two chamber wicks in the buffer, and place one along each divider/ bridge support ensuring that they make good contact with the buffer. CelCel11uloseulose Acetate Electrophoresis at Alkaline pH y 3. Soak the cellulose acetate byygy lowering it slowly into a reservoir of buffer. Leave the cellulose acetate to soak for at least 5 min before use. y 4. Fill the sample well plate with 5 landa of each diluted sample or control and cover with a 50-mm overslip or a "short" glass slide to prevent evapppporation. Load a second sample well plate with Zip-prep solution. CelCel11uloseulose Acetate Electrophoresis at Alkaline pH y 5. Clean the applicator tips immediately prior to use by loading with Zip-prep solution and then applying them to a blotter. y 6. Remove the cellulose acetate strip from the buffer and blot twice between two layers of clean blotting paper. Do not allow the cellulose acetate to dry. y 7. Load the applicator by depressing the tips into the sample wells twice, and apply this fIrst loading onto some clean blotting paper. y Reload the applicator and apply the samples to the cellulose acetate. CelCel11uloseulose Acetate Electrophoresis at Alkaline pH y 8.Place the cellulose acetate plates across the bridges, with the plastic side uppermost. Place two glass slides across the strip to maintain good contact. Electrophorese at 350 V for 25 min. y 9. After 25 min ellhectrophoresis, immed dliately transfer the cellulose acetate to Ponceau S and fIx and stain for 5 min. y 10. Remove excess st tiain by washing for 5 min in the fIr St acetic acid reservoir and for 10 min in each of the remaining two. Blot once, using clean blotting paper, and leave to dry. y 11. Label the membranes and store in a protective y plastic envelope. منابع خطاالکتروفورز ھموگلوبين با توجتهه به اھمياھتت الکتروفورالکتفزز ھموگلوبيھگلنن منابع خطا بيان ميشود زيرا ھرکدام از اين خطاھا عامل تفسير نادرست الکتروفورز می گردد ‰كدورت و آلودگي بافر، بافر با PH يا قدرت يوني نامناسب . ‰آلودگيوي چ اھكھايھي نمونه گذاري، اپ لي كاتور، blotter ھا ( كاغذھاي جاذب رطوبت)، يا آلودگي پليت استات سلولز با گرد و خاك، خون يا ساير پروتئپيين ھا . ‰كدورت يا مستھلك شدن ھموليزات ‰ كھنه بودن ھموليزات (تشكيل مت ھموگلوبين) منابع خطاالکتروفورز ھموگلوبين ‰آلودگي ھموليزات، داشتن استروماي سلولي، عدم تفكيك مناسب باندھا ‰مكش نامناسب بافر درنوار استات سلولز، سبب حبس شدن ھوا يا پوسته پوسته شدن ورقه مي شود. ‰blotting نامناسب نوارھای استات سلولز ، سبب خشك شدن ا ستات سل ولز يا باقي ماندن رطوبتطت روي آن مي شود. ‰تأخير در : الف) نمونه گذاري روي نوارھاي blot شده ، ب) در برقراري جريان الكتريسته، ج) در بيرون آوردن نوارھا از چمبر، د) در رنگ آميزي نوارھا بعد از الكتروفورز سبب ايجاد خطا مي شود. منابع خطاالکتروفورز ھموگلوبين

‰مقدار نمونه گذاري نامناسب باشد. ( خيلي زياد يا كم ) ‰افزايش زمان دھيدراتاسيون و شفاف سازی که سبب کمرنگ شدن باند ھا می شود. ‰نگھداری بيش از حد CBC که عامل ايجاد مت ھموگلوبين در نمونه می باشد و طی الکتروفورز با ھموگلوبين F ممکن است اشتباه شود. ‰خوب خيسانده نشدن نوار استات که سبب ايجاد حباب ھای ھوا و پوسته پوسته شدن ورق و در نتيجه عدم حرکت مناسب باندھای ھموگلوبين می شود. منابع خطاالکتروفورز ھموگلوبين

بھتر است در ھر رديف کاری الکتروفورز يک نمونه y ھموليزات کنترل ( مخلوط خون بند ناف و خون بالغ و بيمار حاوی ھموگلوبين اس و سی ) قرار داده شود که تمام باند ھای مزبور را داشته باشد . پ ائين بودنبون قدرت يونیيوی بافربر و باال بودبونن ولتاوژژ در y فرآيند الکتروفورز روی استات سلولزروند مھاجرت ھمو گلوبين ھا را سريعتررير نموده ولویی اشکال بزرگ ان اين است که ولتاژ باال با توليد حرارت منجر به منعقد شدن ملکول ھای پروتئينی ھموگلوبين می گردد. y منابع خطاالکتروفورز ھموگلوبين

کدر بودن ھموليزات به دليل کھنه بودن ھموليزات y باند ھای اضافی و مزاحم توليد می نمايد . آلودگویی چاھک ھای نمونه گذار و اپ لي کاتور ھا y Anode Catode

H A F S,DG CA A2,CEC,E Origin PH= 8.6 Oarab

Anode Catode

origin C O-arab F,Barts PH=6 acetate at alkaline pH in a patient with sickle cell/b+ thalassaemia compound heterozygosity; ASC, control sample containing haemoglobins A, S and C. Haemoglobin electrophoresis on cellulose acetate at alkaline pH showing haemoglobinC trait (lane 4)4) and haemoglobin C/b+ thalassaemiacom ppygyoundheterozygosity (lane 5); AFSC , control sample containinghaemoglobins A, F, S anda n d C

قسمت bتصويری بسيار کمياب و جالب مربوط به خصيصه HbAS ميباشد که يک باند پارا پروتئينی نيز آنرا ھمراھی ميکند. که ممکن است با واريانتھای Hb اشتباه شود . علت اين اتفاق استفاده از خون کامل جھت تھيه ھموليزات برای الکتروفورز ميباشد. بھتر است جھت جلولگگيری از بروز خطا از خون شسته شده که پالسمالاای آن جدا شده استفاده کنيم (a) haemoglobins A and S (sickle celltrait);celltrait); (b) haemoglobins Aand H (haemoglobin(haemoglobin H disease); (c) haemoglobins Aand H (haemoglobin(haemoglobin H disease); (d)hlbihaemoglobins AdAand S (si ckl e cell tra it ); (e) haemoglobins A, F and S (sickle cell trait in a baby); (f) haemoglobins A and F (normal baby); AFSC,,pg control sample containing haemoglobins A,,, F, S and C. مبانبیی ا لكترو فورز

الكتر وفورز روشيري است كه در آن نمونه ھايي که بار الکتريکريي دارند، تحت تأثير يك ميدان الكتريكي از ميان شبکه اي متخلخل حركت مي کنند. سرعت حرکت مولکولھا در اين شرايط نه تنھاتحت تاثير بار الکتريکي شان است بلکه عواملي ديگري نظير اندازه و شکل مولکول نيز در اين امر دخيل ھستند. به ھمين دليل الکتروفورز روشي مناسب و کارآمد در جداسازي مولکوللکل مورد ا ستفاده قراقار مي گيردگد. معموال" الکتروفورز براي جداسازي مولکولھاي بزرگي چون پرو تئين ھا و اسيدھاييي نوکلئوييک به کار برده مي شود, اما در مواردي نيز براي جداسازي مولکولھاي باردار کوچکتري نظير قندھا, اسيدھاي آمينه, پپتيدھا و حتي يونھاي ساده مورد استفاده قرار مي گيرد. معموال" براي الکتروفورز يک مخلوط مولکولي, اليه نازکي از آن, بر روي شبکه اي متخلخل که محلولمحلولي را درون خود محبوس کرده است, قرار داده مي شود. پس از برقراي ميدان الکتريکي با ِاعمال اختالف پتانسيل در دو سوي اين شبکه, مولکولھاي موجود در نمونه با سرعت ھاي متفاوتمتفاوتي درون شبکه متخلخل شروع به حرکت ممي کنند. اين اختالف سرعت مبناي جداسازي در الکتروفورز است. در پايان, مولکولھاي پروتئيني مختلف به صورت باند ھايي مجزا در قسمت ھاي مختلف شبکه آشکار ممي ش وند. شبکه متخلخل در ممانعت از انتشار مولکولھا در اثر گرماي ايجاد شده به خاطر جريان الکتريکي نقش مھمي دارد. عالوه بر اين در مواردي که از ژل ھاي آگاروز و پلي آکريل آ ميد ا ستفاده مي شودشد, شبکه متخلخل نقش يک الک غربال کننده بر اساس اندازه مولکولھا را نيز ايفا مي کند. در اغلب دستگا ه ھاي الکتروفورز, ژل مابين دو محفظه ي بافري قرار مي گيرد به طوريکه ژل تنھاتنا وا سطه در عبور جريان الکت ري سيته بين اين دو محفظه باشد y جداسازي توسط الکتروفورز تحت تاثير عوامل متعددي قرار دارد. ماھيت مولکولھاي نمونه نظير بار الکتريکي و اندازه آنھا و شدت جريان و ميدان الکتريکي و باالخره اثرات محيطي نظير نوع و نحوه ي استفاده از بافرھا و حرارت ايجاد شده در حين کار عواملي ھستند که بر نحوه ي جداسازي مولکولھاي نمونه اثر مي گذارند. y اثر عوامل الکتريکي y در الکتروفورز سرعت حرکت مولکول ھا تناسب مستقيم با اختالف پتانسيل ِاعمال شده دارد. قانون اُھم Ohmدر الکتروفورز از اھميت زيادي برخوردار است VVIR=IR y y معادله قانون اھم؛ Vولتاژ يا اختالف پتانسيل برحسب ولت, Iشدت جريان بر حسب آمپر و Rمقاومت بر حسب اُھم است y معادله فيزيکي ديگر که از آھميت برخوردار است, معادله توان است. اين معادله مقدار حرارت ايجاد شده در حين الکتروفورز را مشخص مي کند. ٢P=V y/ Rيا ٢P=I Rيا P=VI y معادله معادله توان که در آن Pتوان بر حسب وات است. y اين حرارت ايجاد شده بر اثر مقاومتي است که الکترودھا, بافر مورد استفاده, و ژل دارند و به گرماي ژول Joule heatموسوم است. منابع الکتريکي Power supplyمورد استفاده در الکتروفورز ايجاد جريان مستقيم مي کنند و معموال" يکي از پارامترھاي الکتريکي,يعني ياجريان يا اختالف پتاتسيل يا توان را ثابت نگاه مي دارند. بايد توجه داشت که مقاومت مدار مورد استفاده در الکتروفورز را به ھر حال نمي توان ثابت نگاه داشت. براي مثال در حين الکتروفورز, مقاومت بافر بر اثر گرماي ژول, کاھش مي يابد. بنا بر نونعع بافر بکار رفته و پارا متر الکتريکي که ثابت نگاه داشته مي شودشد, گرماي ژوژلل در حين انجام الکتروفورز ممکن است کاھش يا افزايش يابد (جدول ١-۵). براي مثال در " "SDS-PAGEناپيوسته ثابت نگاه داشتن شدت جريان منجر به افزايش دما مي شود که نياز به سيستم خنک کننده را در چنين وضعيتي الزامي مي کند. y y ٍتاثير ثابت نگاه داشتن پارامترھاي الکتريکي در سيستم ھاي بافري مختلف y انتخاب نوع پارامتر ثابت در منبع الکتريکي در حين الکتروفورز, با در نظر گرفتن متغير ھاي مختلفي صورت مي پذيرد. براي مثال مدت زمان مورد نظر براي انجام الکتروفورز, الزام به حداقل رساندن انتشار نمونه و مقدار از دست دادن فعاليت نمونه که بر اثر حرارت و در طول زمان رخ مي دھد, و نياز به فظحفظ دماي خاص براي انجااام الکتروفورزالکتفز. معموال" پروتئين ھا با جريان ثابت الکتروفورز مي شوند, در حاليکه الکتروفورز اسيد ھاي نوکلئيک با ولتاژ ثابت انجام مي شود. y اثر سيستم ھاي بافري و pH y پروتئين ھا به علت خصوصيت آمفوتري خود تحت تاثير pHمحيطي که در آن قرار داشته باشند بارالکتريکي خاص خود را نشان مي دھند. بدين ترتيب در جداسازي توسط الکترو فورز بايد pHمحلول ھاي مورد استفاده ثابت باقي بماند از آنجا که الکتروليز آب در آنود يونھاي " "+Hو در کاتود يونھاي " "-OHايجاد مي کند, براي ثابت نگاه داشتن pHمحلولھاي مورد استفاده, آنھا بايد بافر شوند. اثر حرارت y براي حفظ تکرار پذيري, ثابت نگاه داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز بسيار مھم است. براي مثال پلپلي مريزه شدن آکريل آميد يک واکنش گرمازا است, از اينرو گرماي ايجاد شده در حين پلي مريزاسيون, به خصوص در مورد ژل ھاي غليظ تر, ممکن است با انتقال گرما باعث بروز ببي نظمنظمي در اندازه ي منافذ ژل گردد. y انتقال گرما معموال" مشکلي در ژل ھايي با غلظت کمتر از %١۵ نمي کند. به ھر حال گرماگاي زيازاد در حين الکتروفورزالکتفز مشکالت ديگري را نيز پديد مي آورد؛ شکستن شيشه ھاي الکتروفورز, آسيب به دستگاه. وقتيکه حرارت بصورت يک دست در تمتاام نقاط ژل ن باشد شکل باندھانااي جدا شده نا منظنظم می شود و در اصطالح باندھا خندان مي شوند چون نمونه ھا در رديف ھاي وسط سريع تر از رديف ھاي کناري حرکت خواھند کرد. Hemoglobin Quantitation

y Elevation of Hb A2 excellent way to detect heterozygote carrier of beta thalassemia. y Variations in ggpene expression in thalassemias results in different amounts

of Hb A2 beinggp produced. y Can also quantitate levels of Hb F.

85 Range Hb A2 y Ranggyes may differ slig gyhtly between methods and between laboratories. y For eeaxamp pe,le, in ooene of our labor atoriest he range determined for microcolumn chromatoggpyraphy was 2.2-3.3%, whereas in the other it was 2.3-3.5%. Hb A2 A2 levels y We recommend that Hb A2 levels of 3.4-3.7% be regarded as borderline and that the assay should be repeated both on the same sample and on a fresh sample y Results obtained by HPLC analysis may be 0.1-0.2% higher than the results obtained by electrophoresis with elution. y There is also evidence that Hb A2 is elevated in patient s with HIV y >45.0 level HbF: B .thalassaemia major Some cases of B.thalassaemia intermedia Neonates y 15.0-45.0% Hb F: heterozygous HPFH African type (usually more than 20%)Some cases of Pthalassaemia intermedia اندازه گيری به روش کروماتوگرافی تعويض يونی ion exchange chromatography Hb A2 اساس روش کروماتوگرافی جامد مايع است که بر اساس اتصال y و قابليت پيوند دو يون غير ھمنام به و سيله نيروی الکترو استاتيک می باشد . اگر يک ستون رزين را با گروه ھای عمل کننده منفی پر کنيم و y محلول ھموليزات را عبور دھيم کاتيون ھا ی موجود در محلول به سمت رزين ت مايلال يافته و باند شده در حالی که آنيون ھا ( ھم بار) به علت دافعه موجود به سرعت ستون را ترک نموده و الوتالت ( محلوللل جداشده) ن ھائی حضور می يابناند . از آنجائی که در يک پ ھاش خاص مواد مختلف موجود در y ھموليزات بار ھای مختلفی پيدا می کنند تنظيم اين پ ھاش در جداسازی صحيح ھموگلوبين بسيار حائز اھميت می باشد مراحل اندازه گيری به روش کروماتوگرافی تعويض يونی ion exchange chromatography HbA2 A2 ١- خيس ن مدن رزين ستونتن( سلل ولز) با بافر مخصوصخصص( بافر گالي سين با پ ھاش ٧.۵) و به حالت تعادل در آوردن رزين مصرفی ( رزين در اين حالت دارای شارژ می شود ٢-اضافه نمودن ھموليزات اماده بيمار(۵٠ الندا خون با ٢٠٠ الندا ھموليز کننده سپس ۵ دقيقه در حرارت محيط می گذاريم ) سه بار شستشو خون قبل از ھموليز پروتئين ھای مزاحم پالسما را حذف می نمايد. ٣- به محض جذب کاملکال ھ مول يزات يک ل وله مدرج زير ستونتن گذاشته و قطره قطره y بافراول(گاليسين . بدون نمک طعام ) را اضافه می نماييم . بھتر است سرعت اضافه نمودن بافر با سرعت خروج مايع الوت شده برابر باشد تا نه رزين خشک شود و نه لبريز شود ۴-با رمنفی انواع ھموگلوبين متفاوت بوده و در اين بين بارمنفی ھموگلوبين مورد y اندازه گيری از ساير ھموگلوبين ھا کمتر است لذا اين باند سريعتر از ساير ھموگلوبين ھا جدا شده و با سرعت بيشتری تخليه می گردد . ( معموال در حجم کمتر از سه سی سی تخليه می گردد) ۵- قبل از خشک شدن رزين مرحله جداسازی ساير ھموگلوبين ھا را با افزودن بافر دوم ( بافر گاليسين حاوی نمک طعام با قدرت يونی باالتر ) انجام می دھيم

Acid Elution Stain y Based on Kleihauer-Betke procedure. y Acid pH will dissolve Hemoglobin A from red cells. y Heeogobmoglobin F i sessaos resistant to denaturation and remains in cell. Stain slide with eosin. y Normal adult cells appear as "ghost" cells while cells with Hb F stain varying shades of pink. y Useful way to differentiate between pancellu lar HPFH and htheteroce lllllular

HPFH. 91 KliehauerKliehauerTestTest For HbF. y Used to detect the presence of Hb F (). y RBCS on a slide are staine d to detect the presence of Hb F. y Can distinguish hetrocellular HbF from pancellular HbF seen in HPFH. تداوم ارثی ھموگلوبين F HPFH بعد از دوران شير خوارگی سطح ھموگلوبين جنينی y کاھش نمی يابد . در نوع ھتروزيگروزيووت ٢٠ – ٣٠% y Hb F در نوع ھموزيگوت ١٠٠ – ٩٨% y Hb F در نوع ھموزيگوت تداوم ارثی ھموگلوبين اف y ھموگلوبينA / A2وجودندارد در الم خونخن محيطی ميکرو و ماکرو خفيخففف وجود داردداد y ولی کم خونی وجود ندارد و ھموگلوبين اف به طور يکنواناخت در در داخالل ھر اريتروسيت پخش شده است y روش تشخيصی قطعی : اسيد الوشن y Modified BetkeMethod for the Estimation of Hb F Principle y To measure the percentage of Hb F in a mixture of haemoglobins & sodium hydroxide is added to a lysate and, after a set time, denaturation is stopped by adding saturated ammonium sulphate. The ammonium sulphate lowers the pH and precipitates the denatured haemoglobin. y After fIltra tion, the quantity of undtddenatured (unpreciittdipitated) haemoglobin is measured. The proportion of alkali- resistant (fetal) haemoglobin is then calculated as a percentage of the total amount of haemoglobin present. Hb F control & range y A normal and a raised Hb F control should be tested with every batch of samples. y The raised Hb F control should ideally contain between 5 and 15% Hb F,and this can be prepared from a mixture of cord and adult blood. y Each laboratory must verify its own normal range, which should not differ signifIcantly from published values; y for adults the range is 0.2-1.0%. y minor thal (2-10%) y beta major thal ( 40- 90%) Hb S

به جز الکتروفورز که يک تست غربالگری و اوليه y (کيفی) جھت تعيين ھمگلوبين اس می باشد تقريبا اکثر روش ھای تشخيصی ھوگلوبين اس بر اساس کاھش حالليت ھموگلوبين در شرايط ھيپوکسی ايجاد شده می باشد. y sickling test تست داسی شکل شدن ( معرف احيا کننده متا بی سولفيت سديم يا دی تيونات y سديم ٢% تازه تھيه شده قبل از آزمايش) مخلوط کردن يک قطره خون با ۵ قطره محلول آماده y مصرف متا بی سولفيت و ھم زدن اين قطرات روی سطح الم بدون تشکيل حباب / قرار دادن المل بزرگ و پوشاندن اطراف ان با پارافين مذاب يا الک ناخن به طور دقيق به شکلی که ھوا راه نفوذ نداشته باشد y در موارد ھموزيگوزيووت حالت داسایی شکل گلبول ھای قرمرزز y کمتر از يک ساعت در گلبول ھای قرمز( در شرايط ھيپوکسيپویی) حاصل می گردد و در مواوررد ھتروزيگروزيووت زمازنن بيشتر حدود ١ الی ١.۵ ساعت مورد نياز است . تست حالليت ھموگلوبين ١-تھيه محلول کار دی تيونات سديم ( متابی سولفيت سديم) ٠.١ y گرم پودر اين ماده را با ١٠ سی سی بافر فسفات (٧.١) مخلوط نموده ٢- ٢ سی سی محلول کار فوق را داخل لوله آزمايش تميز با y ۴ قطره خون کامل بيمار مخلوط نموده و ۵ دقيقه دور ٢۵٠٠ سانتريفوژ نموده و سپس به آزامی لوله را از سانتريفوژ خارج نموده ( بدون کاربرد ترمز سانتريفوژ) ٣-بررسی محلول روئی و زيرييين: اکثر ھموگلوبين ھا در اين y معرف حل شده و در اليه محلول زيرين قرار می گيرند ولی ھموگلوبين اس که نامحلول است به دليل تشکيل شبکه پلپیی مريزه به صورت يک نوار يا باند قرمز رنگ در محلول روئی لوله قابل مشاھده خواھد بود و رسوب نخواھد کرد Routine Chemistry Tests y Indirect bilirubin elevated in thalassemia major and intermedia. y y Assessment of iron status, total iron binding capacity, and ferritin level important in differentiating thalassemia from iron deficiency anemia.

99 Other Special Procedures

y Globin Chain Testing - determines ratio of globin chains being produced. y y DNA Analy sis - Determine specific defect at molecular DNA level.

100 Differential Diagnosis of Microcytic,Microcytic, Hypochromic

RDW Serum Iron TIBC Serum FEP Ferritin

Iron Deficiency Inc Dec Inc Dec Inc

Alpha Thal Norm Norm Norm Norm Norm

Beta Thal Norm Norm Norm Norm Norm

Hb E Disease Norm Norm Norm Norm Norm

Anemia of Norm Dec Dec Inc Inc Chron ic Disease

Sideroblastic Inc Inc Norm Inc Dec Anemia

Lead Poisoning Norm Norm Norm Norm Inc 101 Automated cation-cation-exchangeexchange HPLC Automated cation-exchange HPLC is being used increasingly as the initial diagnostic method in haemoglobinopathy laboratories with a high workload. Both capital and consumable costs are higher than with haemoglobin electrophoresis. But labour costs are less; overall costs may he similar. In comparison with haemoglobin electrophoresis, HPLC has four advantages: 1. The analysers are automated and thus utilise less staff time and permit processing of large hatches. 2. Very small samples (5 landa) are suffIcient for analysis; this is especially useful in paediatric work. 3. Quantification of normal and variant haemoglobins is available on every sample. 4. A provisional identifIcation of a larger proportion of variant haemoglobins can be made. HPLC Principle. y Cation-exchange HPLC can be preformed on an automated instrument that can quantify Hb A2, Hb F, Hb A, Hb S, and Hb C. y Studies show equivalence or superiority over electrophoresis in terms of identification of variant haemoglobins and quantification of HbA2 level. y Negatively charged carboxyl molecules bound to silica make up the cartridge matrix.

HPLC Disadvantages. y Hbs may co-elute or may elute before instrument peak integration. y HbE, HbOsu Christianbourg, and HbG Copenhagen co-elute with Hb A2, making quantification impossible when these variants present. y The measurement of Hb A2 is complicated in individuals with Hb S because the Hb A2 is falsely increased by the presence of Hb S adducts. HPLC Disadvantages (2). y Capillary zone Electrophoretic method can be used to quantify Hb A2 in the presence of Hb S by eliminating interference from these adducts. y Interference can also be eliminated by the use of micro anion-exchange column methodology. y ItIntegrati on errors can result in flfalse decreases in the values obtained, although this can be minimized by applying known corrections. HPLC Disadvantages (3). y Haemoggplobinopathies cause inappropriately high HbA1c (HbNiigata, HbSherwood Forest, HbRambam, HbRaleigh). y The presence of a structural Hb variant may adversely affect the measurement of HbA1C. HPLC Strengths. y Method of choice for screening for Hb variants; for quantification of HbA2 + HbF concentrations and mandatory in neonatal screening. y Quicker and more sensitive than standard techniques for detecting HbF (in diagnosis of HPFH and monitoring sickle cell anemia). y Indeed alkaline gel electrophoresis cannot detect HbF in healthy adults or those with marggyinally increased Hb F. HPLC Strengths (2). y Can be used to characterize rare haemoglobinopathies not well detected with other methods (HbRambam). y y Established role in the diagnosis of thalassaemia and haemoglobinopathies, including with cord blood samples. HPLC Strengths (3). y HPLC should be the ppyrimary method for detecting variant hemoglobin's and simultaneous quantitation of HbA2 and HbF. y This reppplaces three separate methods: ◦ Haemoglobin electrophoresis. ◦ Quantitation of HbA2. ◦ Quantification of HbF).

Sickle Solubility Tests. y Works on principle that HbS is insoluble in deoxygenated state forming crystals that refract light and cause the solution to be turbid. y Detects HbS at conc. > 20% and differentiates HbD and G which migrate with Hb S on cellulose acetate electrophoresis at alkaline pH. y Positive results are also obtained on samples containing both HbS and beta globulin muttitations. Sickle Solubility Tests (2). y False positives can occur in leukocytosis, hyperprotienemia and unstable hemoglobin states. y False negatives can occur in patients wit h anemia or if outdated bbffuffer is used and in infants less than 6 months. y All results must be confirmed by the more accurate HbEP or HPLC. Immunoassay For Variant Hemoglobin.

y Kits are available for the immunoassay of HbS, C, E and A. y Detect the approp riate he mog lob in dow n to 5 – 10%.

y These cards however can be unreliable with intermittent failure of the method.

DNA Analysis. y Indicated when the not confirmed by other methods or when the underlying mutation important to management. y Other techniques lead to a presumptive identification of the hemoglobinopathy only. y For genetic counse ling dfiidefining the partilicular mutation or deletion is often required – this is achieved by a variety of molecular techniques. DNA Analysis (2). y DNA from WBCs, amniocytes, or chorionic tissue may be utilized for diagnosis of various α and β globin chain abnormalities. y Southern blot hybridization using restriction enzymes digesting labeled complementary probes define deletional mutations in α and rare β thal. y PCR amplifies globin genes and utilizes allele specific primers to detect known globin chain mutations eg HbS, E, D, O + several β thal. DNA Analysis (3). y PCR can be used to detect unknown mutations. y Aims to separate amplified DNA on gels or with HPLC on the principle that different amino acids migrate differently. y3 primary methods y 1-mutation analysis, y 2-DNA scanning y 3- DNA sequencing. Mutation Analysis (2). y In HK there are 15 common non deletional alpha gene defects and 23 common beta thal mutations. y HK mutations involve single base mutations and can be simultaneouslyyy tested for by printing relevant oligonucleoties onto slides. y This allows for mass screening. DNA Scanning. y Useful when screening large DNA segments or exons for nucleotide changes is necessary due to the possibility of many different mutations. y Can dissect a gene into discrete fragments eg 500 bp in size allowing mutations to be found in large genes. y Uses techniques such as SSCP (single stranded conformation polymorphism) and DGGE (denaturing gradient electrophoresis). DNA Scanning (2). y Denaturing HPLC is most common and based on different melting temps of hetroduplexes and homoduplexes which can be separated by EP. y Any putative mutations must be confirmed by DNA sequencing to distinguish mutations from neutral polymorphisms. y Hemoglobin genes are relatively small (1.6 kb with 3 exons) and DNA sequencing is increasingly accessible hence scanning is less frequently used. DNA Sequencing. y DNA sequencing is now standard practice for looking for mutations in the beta and alpha globin genes. y Indicated if mutations are not detectable with the preliminary screening and in difficult cases eg N HbA2 beta thal or silent beta thalassaemia. y Difficult cases best delineated by direct gene sequencing because a number of causative mutations result in the observed phenotype. DNA Sequencing (2). y In beta thalassaemia there can be normal HbA2 so if the mutation absolutely needs to be excluded, DNA seqqgpuencing is preferred. y Entire sequence of both α genes and most of the β globin gene can be sequenced with four primer sets. y Dye primers or fluorescently labeled M13 primers are used to initiate elongation. DNA Sequencing (3). y In heterozygous thal DNA sequence will show a mutated gene and normal nucleotide base Î easy to miss the mutated gene. y Overcome by sequencing forward and reverse strands but still necessary to visually inspect the sequence Î tedious and source of error. y Becoming cheaper and more accessible, as software is developed to assist in sequence analysis. DNA seqqg()p()puencing trace (a) forward primer, (b) reverse primer. In the reverse primer it is clear on visual inspection that there is a point mutation with both G and C being present. The forward sequence, when it has been magnified, shows a small “blip” representing the mutant C base under the normal G sequence. References:

Haemoglobinopathy Diagnosis Barbara J. Bain MBBS FRACP FRCPath منابع فارسی: سندرمھای تاالسمی و کنترل کيفی در خون شناسی مولف دکتر حبيب ﷲ گل افشان ھموگلوبين در سالمتی و بيماری مولف : دکترالدن حسينی