République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université d’ORAN Es Senia
Faculté des Sciences Département de Biologie
Thèse présentée par
Mme. CHOUGRANI FADELA Pour l’Obtention du Diplôme de Docteur Es SCIENCES en Biologie
Option: Microbiologie Alimentaire et Industrielle
Intitulée
UTILISATION DE SOUCHES LACTIQUES ISOLEES A PARTIR DU LAIT DE BREBIS ALGERIEN DANS LA FABRICATION D’UN YAOURT NATURE
et soutenue publiquement le : 29 / 06 /2008 devant le jury composé de :
Pr. BELKHODJA Moulay Président U. d'Oran Es Senia Pr. SLIMANI Miloud Examinateur U. d'Oran Es Senia Pr. LAROUS Larbi Examinateur U. Ferhat Abbes Sétif Pr. SELSELET Attou Ghalem Examinateur U. de Mostaganem Pr. BENSOLTANE Ahmed Directeur de Thèse U. d'Oran Es Senia
Résumé
Au cours de ce travail nous avons isolé et identifié 95 souches lactiques à partir de la caillette et du lait de brebis collecté de différentes régions de l’ouest Algérien à savoir Mostaganem, Mascara, Tlemcen, Aïn Tedles, Sidi Lakhdar, Hassi Mameche, Ain Guesma Tiaret et Ain Nouissy.
En ce qui concerne les tests physico-chimiques du lait de brebis, les échantillons sur les quels les dosages ont été effectués : protéines, lactose, matières grasses, matière sèche ont révélé une composition proche de celle rencontrée en littérature. Les espèces lactiques ont été identifiées sur la base des tests physiologiques, biochimiques et ainsi que sur la base de leurs profils fermentaires en utilisant le système API 20 Strep et API 50 CHL pour un nombre d’entre elles. L’identification a révélé la présence de 38 souches (40%) de Lactobacillus sp., 22 souches (23.15%) de Lactococcus sp., 16 souches (16.84%) de Streptococcus thermophilus sp., 14 souches (14.73%) de Leuconostoc sp., 3 souches (3.15%) de Pediococcus sp et 2 souches (2.10%) d’Enterococcus. Les souches ont été ensuite caractérisées sur la base de leurs propriétés technologiques. Une grande diversité de propriétés parmi les souches étudiées a été constatée. Sur la base des caractéristiques technologiques, deux souches (Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus) ont été sélectionnées à l'égard de leur bonne activité acidifiante et production d’arômes pour la préparation d'un yogourt nature. Des souches commerciales (CHR, Hansen, Denmark) ont été utilisées pour la préparation d’un yaourt dans les mêmes conditions et une étude comparative a été menée. Les analyses sensorielles ont révélé que le produit fabriqué sur la base des souches isolées possède une cohésivité et adhésivité correspondant aux produits standards. Le pH et l'acidité sont également enregistrés dans les niveaux acceptés durant toute la période de conservation. Mots clés : Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, yoghurt, propriétés technologiques, adhésivité, cohésivité, analyse sensorielle.
Abstract
During this work we have isolated and identified 95 strains of lactic acid bacteria from rennet and sheep's milk collected from different regions of Western Algeria (Mostaganem, Mascara, Tlemcen, Aïn Tedles, Sidi Lakhdar, Hassi Mameche, Ain Guesma, Tiaret and Ain Nouissy).
With regard to the physical and chemical: protein, lactose, fat, dry matter tests of sheep's milk, our samples have revealed a composition close to that encountered in literature. The lactic species have been identified on the basis of physiological, biochemical tests and on the basis of their fermentation profiles using the API system, API 20 Strep and API 50 CHL for a number of them. The identification revealed the presence of 38 strains (40%) of Lactobacillus sp., 22 strains (23.15%) of Lactococcus sp., 16 strains (16.84%) of Streptococcus thermophilus sp., 14 strains (14.73%) of Leuconostoc sp., 3 strains (3.15%) and Pediococcus sp 2 strains (2.10%) Enterococcus. The strains were then characterized on the basis of their technological properties. A wide range of properties among the studied strains has been noted. Based on the technological characteristics, two strains (Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus) were selected to their high acidifying production and their production of aromas for the preparation of a nature yogurt. Commercial strains (CHR Hansen, Denmark) were used for the preparation of a yogurt under the same conditions and a comparative study was conducted. The sensory analysis showed that the product produced on the basis of the isolated strains has a cohesiveness and adhesiveness corresponding to the standard products. The pH and acidity are also recorded in the levels accepted throughout the retention period.
Keywords: Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, yoghurt, technological properties, adhesion, cohesiveness, sensory analysis.
اﻟﻤﻠﺨﺺ
ﻗﻤﻨﺎ ﺨﻼل ﻫﺫﺍ ﺍﻟﻌﻤل ﺒﻌﺯل ﻭ ﺘﻨﻘﻴﺔ 95 ﺴﻼﻟﺔ ﺒﻜﺘﺭﻴﺎ ﺤﻤﺽ ﺍﻟﻼﻜﺘﻴﻙ ﺍﻋﺘﺒﺎﺭﺍ ﻤﻥ ﻜﺭﺸﺔ ﻭ ﺤﻠﻴﺏ ﺍﻟﻐﻨﻡ ﺍﻟﺫﻱ ﺘﻡ ﺠﻤﻌﻪ ﻤﻥ ﻤﻨﺎﻁﻕ ﻤﺨﺘﻠﻔﺔ ﺒﺎﻟﻐﺭﺏ ﺍﻟﺠﺯﺍﺌﺭﻱ ﻜﻤﺴﺘﻐﺎﻨﻡ، ﺘﻠﻤﺴﺎﻥ، ﻤﻌﺴﻜﺭ ﻋﻴﻥ ﺘﺎﺩﻟﺱ، ﺴﻴﺩﻱ ﻟﺨﻀﺭ، ﺤﺎﺴﻲ ﻤﺎﻤﺎﺵ، ﻋﻴﻥ ﻗﺴﻤﺔ، ﺘﻴﺎﺭﺕ ﻭ ﻋﻴﻥ ﻨﻭﻴﺼﻲ.
ﻓﻲ ﻤﺎ ﻴﺨﺹ ﺍﻟﺘﺤﺎﻟﻴل ﺍﻟﻔﻴﺯﻴﻭﻜﻴﻤﻴﺎﺌﻴﺔ ﻟﺤﻠﻴﺏ ﺍﻟﻐﻨﻡ ﺃﻅﻬﺭﺕ ﺍﻟﻨﺘﺎﺌﺞ ﺍﻟﺘﻲ ﺃﺠﺭﻴﺕ ﻋﻠﻰ ﻋﻴﻨﺎﺕ ﺍﻟﺤﻠﻴﺏ ﻓﻴﻤﺎ ﻴﺨﺹ ﺘﻘﺩﻴﺭ ﻨﺴﺒﺔ ﺍﻟﺒﺭﻭﺘﻴﻥ، ﺍﻟﻼﻜﺘﻭﺯ، ﺍﻟﻤﻭﺍﺩ ﺍﻟﺩﻫﻨﻴﺔ ﻭ ﺍﻟﻤﻭﺍﺩ ﻋﻠﻰ ﻭﺠﻭﺩ ﺘﻘﺎﺭﺏ ﻤﻥ ﺤﻴﺙ ﺍﻟﺒﻨﻴﺔ ﺃﻭ ﺍﻟﺘﺭﻜﻴﺏ ﻟﻤﻜﻭﻨﺎﺕ ﺤﻠﻴﺏ ﺍﻟﻐﻨﻡ ﺒﻤﺎ ﻫﻭ ﻤﻭﺠﻭﺩ ﻓﻲ ﺍﻷﺒﺤﺎﺙ ﺍﻟﻌﻠﻤﻴﺔ .
ﺘﻡ ﺘﺤﺩﻴﺩ ﻫﻭﻴﺔ ﺴﻼﻻﺕ ﺒﻜﺘﻴﺭﻴﺎ ﺍﻟﺤﻠﻴﺏ ﻋﻥ ﻁﺭﻴﻕ ﺍﻟﺘﺤﺎﻟﻴل ﺍﻟﻔﻴﺯﻴﻭﻟﻭﺠﻴﺔ، ﺍﻟﺒﻴﻭﻜﻴﻤﻴﺎﺌﻴﺔ ﻭ ﻜﺫﻟﻙ ﻋﻠﻰ ﺃﺴﺎﺱ ﻨﻅﺎﻡ ﺘﺨﻤﺭ ﺍﻟﻜﺭﺒﻭﻫﻴﺩﺭﺍﺕ ﺒﺎﺴﺘﻌﻤﺎل ﻨﻅﺎﻤﻲ API 20 Strep ﻭ API 50 CHL ﻭ ﻫﺩﺍ ﻟﻠﺘﻌﺭﻑ ﻋﻠﻰ ﻋﺩﺩ ﻤﻨﻬﺎ، ﺤﻴﺙ ﺘﻡ ﺘﻌﺭﻴﻑ 38 ﺴﻼﻟﺔ Lactobacillus sp (%40 )، 22 ﺴﻼﻟﺔ (%23.15) Lactococcus sp، 16 ﺴﻼﻟﺔ (Streptococcus thermophilus (%16.84، 14ﺴﻼﻟﺔ (%14.73) Leuconostoc sp، 3 ﺴﻼﻻﺕ (Pediococcus sp (%3.15 ﻭ ﺴﻼﻟﺘﻴﻥ (Enterococcus (%2.10 sp. ﺘﻡ ﺒﻌﺩ ﺫﻟﻙ ﺍﻨﺘﺨﺎﺏ ﺍﻟﺴﻼﻻﺕ ﺘﺒﻌﺎ ﻟﺨﺼﺎﺌﺼﻬﺎ ﺍﻟﺘﻜﻨﻭﻟﻭﺠﻴﺔ ﺤﻴﺙ ﻟﻭﺤﻅ ﻭﺠﻭﺩ ﻓﺭﻭﻕ ﻜﺒﻴﺭﺓ ﻓﻴﻤﺎ ﻴﺨﺹ ﻫﺫﻩ ﺍﻟﺨﺼﺎﺌﺹ ﺒﻴﻥ ﺍﻟﺴﻼﻻﺕ. ﺍﺴﺘﻨﺎﺩﺍ ﺇﻟﻰ ﻫﺫﻩ ﺍﻟﺨﺼﺎﺌﺹ ﺘﻡ ﺍﻨﺘﺨﺎﺏ ﺴﻼﻟﺘﻴﻥ (Streptococcus thermophilus ﻭ Lactobacillus bulgaricus) ﻨﻅﺭﺍ ﻟﻘﺩﺭﺘﻬﻤﺎ ﺍﻟﺘﺤﻤﻴﻀﻴﺔ ﺍﻟﻌﺎﻟﻴﺔ ﻭ ﺇﻨﺘﺎﺝ ﺍﻟﻨﻜﻬﺎﺕ ﻟﺘﺼﻨﻴﻊ ﻴﻐﻭﺭﺕ ﻁﺒﻴﻌﻲ. ﻓﻲ ﻨﻔﺱ ﺍﻟﻭﻗﺕ ﺍﺴﺘﻌﻤﻠﺕ ﺴﻼﻻﺕ ﺤﻤﺽ ﺍﻟﻼﻜﺘﻴﻙ ﺘﺠﺎﺭﻴﺔ (CHR, Hansen, Denmark) ﻟﺘﺼﻨﻴﻊ ﻨﻔﺱ ﺍﻟﻤﻨﺘﺞ ﻓﻲ ﻨﻔﺱ ﺍﻟﻅﺭﻭﻑ ﻟﻐﺭﺽ ﻤﻘﺎﺭﻨﺘﻬﺎ ﻤﻊ ﺍﻟﺴﻼﻻﺕ ﺍﻟﻤﻌﺯﻭﻟﺔ ﻤﺤﻠﻴﺎ. ﺃﻅﻬﺭﺕ ﻨﺘﺎﺌﺞ ﺍﻟﺘﻘﺩﻴﺭ ﺍﻟﺤﺴﻲ ﺃﻥ ﺍﻟﻤﻨﺘﺞ ﺍﻟﻤﺼﻨﻊ ﺍﻨﻁﻼﻗﺎ ﻤﻥ ﺍﻟﺴﻼﻻﺕ ﺍﻟﻤﺤﻠﻴﺔ ﻴﻤﺘﻠﻙ ﻗﻭﺓ ﺘﻤﺎﺴﻙ ﻭ ﻗﻭﺓ ﺍﻟﺘﺼﺎﻕ ﺘﺘﻨﺎﺴﺏ ﻤﻊ ﺘﻠﻙ ﺍﻟﻤﻭﺠﻭﺩﺓ ﻓﻲ ﺍﻟﻤﻨﺘﺠﺎﺕ ﺍﻟﻤﻌﻴﺎﺭﻴﺔ. ﺩﺭﺠﺔ ﺍلpH ﻭ ﺍﻟﺤﻤﻭﻀﺔ ﺘﻡ ﺃﻴﻀﺎ ﻤﻌﺎﻴﺭﺘﻬﻤﺎ ﺨﻼل ﻜل ﻓﺘﺭﺓ ﺍﻟﺤﻔﻅ ﻭ ﺘﺒﻴﻥ ﺃﻥ ﻤﺴﺘﻭﻴﺎﺘﻬﺎ ﻜﺎﻨﺕ ﻤﻘﺒﻭﻟﺔ ﺨﻼل ﻓﺘﺭﺓ ﺤﻔﻅ ﺍﻟﻤﻨﺘﺞ. ﻜﻠﻤﺎﺕ ﻤﻔﺘﺎﺤﻴﺔ: Streptococcus thermophilus ،Lactobacillus bulgaricus، ﻗﻭﺓ ﺍﻟﺘﻤﺎﺴﻙ، ﻗﻭﺓ ﺍﻻﻟﺘﺼﺎﻕ، ﺍﻟﺘﺤﺎﻟﻴل ﺍﻟﺤﺴﻴﺔ، ﺍﻟﺨﺼﺎﺌﺹ ﺍﻟﺘﻜﻨﻭﻟﻭﺠﻴﺔ، ﺍﻟﻴﻐﻭﺭﺕ.
En premier lieu, je tiens ainsi à remercier le Professeur Bensoltane Ahmed mon directeur de thèse, pour l’intérêt qu’il a toujours montré concernant mon travail, son soutien constant et une disponibilité jamais démentie. Sa grande expérience de la modélisation m’aura de plus aidé à prendre du recul vis à vis des outils et des méthodes utilisés. Je remercie Pr Selselet Attou Ghalem, Pr Slimani Miloud et Pr Larous Larbi d’avoir accepter de juger mon travail. Au Pr Belkhodja Moulay d’avoir accepter la présidence du jury, m’accordant sa confiance et ses encouragements, je tiens à exprimer mon immense reconnaissance et mon profond respect. Merci également au Pr Morsi El Soda de m’avoir accueilli au sein de l’unité de recherche technologie laitière à l’université d’Alexandrie en Egypte, il m’a constamment soutenu et donné les moyens de le mener à son terme dans de bonnes conditions. Mes remerciements s’adressent également à tous les membres de cette unité, actuels ou passés, qui ont su créer une ambiance à la fois studieuse et amicale. Enfin, mais avant tout, mes pensées vont à ma famille, mes amis et à, qui je dois d’être celui que je suis, qui me supportent depuis toujours et dans toute circonstance. Et surtout merci à toi, Abderrahim d’être à mes côtés chaque jour et de m’apporter la joie et le bonheur. Mes remerciements vont également à tous ceux qui ont participé de près ou de loin à la réalisation de ce travail.
SOMMAIRE
Pages
Résumé en français Résumé en anglais Résumé en arabe Remerciements Sommaire Liste des Figures Liste des Tableaux Liste des abréviations
Revue bibliographique Introduction 1 Analyse bibliographique 1. L’élevage ovin 3 1.1. Les races ovines en Algérie 3 1.1.1. La race Ouled Djellal 3 a-Variété Chellalia 5 b-Variété lourde (Hodnia) 5 c-Variété Djellalia 5 1.1.2. La race Rembi 5 1.1.3. La race Hamra 5 1.1.4. La race Barbarine 6 1.1.5. La Race D’men 6 1.1.6 La race Azoulai 6 1.1.7. La race Sidahou (Targui) 6 1.2. Effectif du cheptel ovin en Algérie 7 2. Le lait 7 2.1. Composition physico-chimique du lait 8 2.1.1. Eau 8 2.1.2. Matière grasse 8 2.1.3. Lactose 8 2.1.4. Caséine 8 2.1.5. Matières minérales 8 2.1.6. Vitamines 8 2.2. Caractéristiques physico-chimiques 9 2.3. Production du lait 10 2.4 Laits d'animaux laitiers 10 2.5. Lait de brebis 11 2.5.1. Production et composition du lait de brebis 11 3. La caillette 12 4. Les bactéries lactiques 12 4.1. Classification des bactéries lactiques 13 4.1.1. Taxonomie classique 14 4.1.2. Taxonomie moderne 14 4.2. Les différents genres de bactéries 16 4.2.1. Streptocoques lactiques 17 -Le groupe pyogenes 18 -Le groupe viridans 19 -Le groupe lactique 19 -Le groupe des entérocoques 19 4.2.2. Le genre Leuconostoc 20 4.2.3. Le genre Pediococcus 21 4.2.4. Le genre Lactococcus 22 4.2.5. Enterococcus 24 4.2.6. Le genre Lactobacillus 24 a.a. Lactobacillus casei 27 a.b. Lactobacillus bulgaricus 27 4.3. Origine et habitat des bactéries lactiques 28 Les espèces du genre Streptococcus 28 Les espèces du genre Lactococcus 28 Les espèces du genre Leuconostoc 28 Les espèces du genre Lactobacillus 28 Les espèces du genre Pediococcus 28 4.4. Intérêt des Bactéries Lactiques en Alimentation 30 4.4.1. Les bactéries lactiques, des acteurs précieux de l’industrie alimentaire 30 4.4.2. Principales activités microbiennes dans le lait 30 5. Le yaourt 31 5.1. Fabrication 32 -Yoghourt ferme 32 -Yoghourt brassé 33 5.2. La composition chimique du yaourt 33 5.3. Procédés de fabrication du yaourt 33 5-3-1- Préparation du lait 33 5-3-2- Addition de poudre 34 5-3-3- Concentration du lait 34 5-3-4- Homogénéisation 34 5-3-5- Traitement thermique 34 5-3-6- Pasteurisation 34 5-3-7- Refroidissement 35 5-3-8- Ensemencement 35 5-3.9- Conditionnement 35 5-10- Etuvage 35 5-3- 11-Arrêt de la fermentation (réfrigération) 36 5-4- Contamination et défaut du yaourt 36 5-5- La fermentation 39 5-6-Aspect et texture 40 5-7-Propriétés physico-chimiques et comportement des composés d’arôme 41 5-7-1 Composés aromatiques 41 5.8. Polysaccharides 42 5.9. Structure et texture du yaourt 42
5.9.1- Libération et perception des composés d’arôme dans le yaourt brassé 43
5.10. Consommation 43
5.11. Valeur nutritionnelle d'un yaourt 43
5.12. Les bienfaits du yaourt sur la santé 45 5-12.1. Digestibilité du lait 45 5-12.2. Guérison de diarrhées 45 5-12-3- Effets immunomodulateurs 46 5-12-4- Diminution du risque de cancer 46 5-12-5- Taux de cholestérol dans le sang 46 Matériel et Méthodes 47 1. Source des échantillons 47 2. Traitement de l’échantillon 47 3- Analyse physico-chimique du lait de brebis 47 3-1- Méthode d’analyse 47 3-1-1- Le pH 47 3-1-2- L’acidité 47 3-1-3-- Taux de matière grasse 48 3-1-4-- Taux de matière sèche 48 4-Isolement et identification des bactéries lactiques 48 4-1-Conditions de culture 48 4-2- Milieux de culture 48 5. Isolement, purification, caractérisation et identification 49 des souches de bactéries lactiques 5-1- Isolement 49 5-1-1. A partir de la caillette 49 5-1.2. A partir du lait 49 5-2. Purification 49 5-3-. Caractérisation et identification des souches 51 5-3-1-Examen macroscopique 51 5-3-.2. Examen microscopique 51
5-3-3-Test de production de CO2 (détermination du type fermentaire) 52 5-3-4-Test d’arginine dihydrolase (ADH) 52 5-3-5-Test de production d’acétoïne (Production de composés 52 aromatiques) 5-3-6-Recherche de la citratase 53 5-3-7-Production de dextrane 53 5-3-8-Recherche de la réductase 53 5-3-9-Test de thermorésistance 53 5-4-Test de croissance en milieux hostiles 53 a. Bouillon hypersalé 53 b. Lait de Sherman 54 5-5- Type d’hémolyse 54 5-6-Etude du profil fermentaire des souches 54 5-7-Identification des bactéries lactiques en utilisant le système API 55 5-7-1-API 20 Strep 55 a- Préparation de l’inoculum 55 b- Préparation et inoculation de la galerie 56 c- Lecture et interprétation 56
5-7-2-L’API 50 CHL 56 a- Préparation de l’inoculum 57 b- Préparation des galeries 57 c- Lecture et interprétation 57 6. Analyses microbiologiques du lait de brebis 57 6.1. Mode Opératoire 58 6-1-1-Recherche et dénombrement des germes aérobies mésophiles totaux 58 6-1-2- Recherche et dénombrement des coliformes totaux 58 a-Test de présomption 58 b-Test de confirmation 58 6-1-3-Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux 59 a-Test de présomption 59 b-Test de confirmation 59 6-1-4- Recherche de Staphylococcus aureus 59 6-1-5 – Recherche de Salmonella 59 6-1-6 – Recherche de la flore fongique 60 7. Etude de quelques Aptitudes technologiques 60 7.1. Pouvoir acidifiant 60 7.2. Activité protéolytique 62 7.2.3. Etude de l’antibiorésistance 62 7.2.3.1. Mode opératoire 62 8-Préparation du yogourt 63 8-1-Conditions de culture 63 8.2. Analyses physico-chimiques du yaourt 65 8.2.1. Mesure du pH 65 8-2-2-Mesure de l’acidité 65 8-2-3- Mesure de la viscosité 67 8-3-Tests organoleptiques du yaourt 67 8-3-1-Le goût 67 8-3-2-La Cohésivité 67 8-3-3-L’adhésivité 67 8-4- Analyses microbiologiques 68 8-4-1-Recherche de la flore pathogène dans le yaourt 68 8-4-1-1-- Coliformes totaux 68 8.4.1.2. Staphylococcus aureus 68 8.4.1.3. Salmonella 68 8.4.1.4. La flore fongique 69 8.4.1.5. Clostridium 69 9. Analyse statistique 69 Résultats et Discussion 1. Isolement et identification des souches lactiques 70 1.1. Répartition des souches obtenues 75 2. Etude de quelques aptitudes technologiques 80 2. 1- Le pouvoir acidifiant 80 2.2-Activité protéolytique 86 2.3. Antibioresistance 90 3-Analyses physico-chimiques du lait 92 4. Résultats d’analyse microbiologique du lait de brebis 92 5-Analyses physico-chimiques du yaourt 93 5. 1-Détermination du pH et de l’acidité des yaourts expérimentaux 93 5. 2-Evolution moyenne de l'acidité du yaourt préparé à base du lait 94 de brebis au cours de la fermentation 6-Propriétés rhéologiques du yaourt 97 6.1-Evolution moyenne de la viscosité du yaourt préparé à base du 97 lait de brebis au cours de la fermentation 6.2-Evolution moyenne du goût des yaourts au lait de brebis au cours 100 de la fermentation 6.2-1-Évaluation sensorielle des yaourts 100 6. 3-Evolution moyenne de l'adhésivité des yaourts au lait de brebis 101 au cours de la fermentation 6. 4-Evolution de Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus 103 thermophilus au cours de la fermentation 7. Evolution des germes de contamination des yaourts après 21ème jours 106
Conclusion 107 Références bibliographiques 109 Activités Scientifiques
Liste des Figures
Fig. 1: La race Ouled Djellal Fig. 2 : Le cheptel ovin de la région Mostaganem (Algérie) Fig. 3: Diagramme de la classification des bactéries lactiques (Sneath et al., 1986) Fig. 4: Aspect microscopique de Streptococcus thermophilus (Vue au microscope électronique) Fig 5: Aspect microscopique de Streptococcus thermophilus Fig. 6 : Lactobacilles et Streptocoques colorés au bleu de méthylène et observés au microscope optique (x 1000) Fig. 7 : Aspect microscopique de Lactobacillus bulgaricus Fig. 8: Diagramme des principales étapes dans la fabrication du yaourt (Selon Vignola, 2002) Fig. 9:Schéma représentant les différentes étapes d’isolement et purification des souches à partir du lait et de la caillette de brebis. Fig. 10 : Coupe d’un viscosimètre à chute de bille Fig. 11: Diagramme de fabrication des yaourts expérimentaux
Fig. 12 : Mesure de la viscosité Fig. 13 : Coupe d’un viscosimètre à chute de bille Fig. 14 : Aspect macroscopique des lactobacilles Lactocoques (Sur MRS) Fig. 15: Aspect macroscopique des lactocoques (Sur milieu M17) Fig. 16: Des coques isolées à partir du lait de brebis (G 1000) Fig. 17 : Aspect microscopique des lactobacilles (sur MRS) Fig. 18 : Profil fermentaire de la souche Lactococcus lactis subsp lactis (Lc7)
Fig. 19: Profil fermentaire de la souche Streptococcus thermophilus (Stp1 Fig. 20 : Variation du pH en fonction du temps des souches isolées à partir du lait et de la caillette de brebis Fig. 21 : Quantité d’acide lactique (exprimé en degré Dornic) produite par les souches isolées à partir du lait et de la caillette de brebis Fig. 22 : Quantité d’acide lactique exprimée en degré dornic produite par quelques souches isolées à partir du lait de brebis. Fig. 23 : Variation du pH en fonction du temps de quelques souches isolées à partir du lait de brebis
Fig 24 : Quantité d’acide lactique exprimée en degré dornic produite par quelques souches isolées à partir du lait de brebis. Fig. 25: Quantité d’acide lactique (en degré dorinc) produite par quelques souches testées Fig .26: Activité protéolytique chez quelques souches lactiques testées Fig. 27 : Test de sensibilité de Lactococcus lactis ssp lactis aux antibiotiques Fig. 28 : Test de sensibilité de Lactobacillus plantarum aux antibiotiques Fig. 29 : Evolution des teneurs moyennes en nombre de Streptococcus thermophilus du yaourt durant la fermentation Fig. 30: Evolution des teneurs moyennes en nombre de Lactobacillus thermophilus du yaourt durant la fermentation
Liste des Tableaux
Tableau 01: Evolution du cheptel (milliers de têtes) Sources Statistiques Agricoles 1990-1999 et FAO, 2002 Tableau 02: Constituants principaux des laits de diverses espèces animales (g/litre) FAO, 1990; Vignola, 2002. Tableau 03: Caractéristiques physico-chimiques des laits de diverses espèces animales (FAO, 1990) Tableau 04: Production de lait par espèce animale en million de tonnes (Mt) (FAO,2004) Tableau 05 : Principaux pays producteurs de lait de bufflonne, de brebis et de chèvre (FAO, 1990) Tableau 06: Classification génomique des bactéries lactiques acid bacteria. Tableau 07 : Les différents genres de bactéries lactiques et leurs caractéristiques (Novel, 1993) Tableau 8: Caractères biochimiques des Streptocoques lactiques (Desmazeaud 1992, Novel, 1993 Larpent, 1996). Tableau 09: Les principaux caractères de Leuconostoc (Novel, 1993, Larpent, 1996). Tableau 10: Caractéristiques des espèces du genre Pediococcus (Larpent et Larpent, 1990, Novel, 1993). Tableau 11 : Principaux défauts de yaourt Tableau 12: Evolution du taux des lactobacilles et Streptocoques au cours de la fermentation Tableau 13: Quantités moyennes des principaux composés de l’arôme du yogourt (Degorce-Dumas et al., 1986) Tableau 14: Energie, nutriments et composition minérale du yaourt (déterminés pour 100g).(Source : Danone World Newsletter N°2 Octobre 1993) Tableau 15: La composition du lait et du yaourt (en grammes) : Tableau 16 : Code des souches isolées à partir de la caillette de brebis Tableau 17: Code des souches isolées à partir du lait de brebis Tableau 18 : Identification et répartition des souches isolées selon les tests préliminaires Tableau 19 : Propriétés physiologiques des souches isolées Tableau 20 : Propriétés biochimiques (Profil fermentaire) des souches isolées Tableau 21: Pouvoir acidifiant des souches lactiques isolées à partir du lait et de la caillette de brebis Tableau22 : Activité protéolytique des souches lactiques isolées à partir du lait et de la caillette de brebis Tableau 23 : Evaluation de la sensibilité des souches vis-à-vis des antibiotiques utilisés (mm) Tableau 24 : Résultats d’analyses physico-chimiques du lait de brebis Tableau 25 : Evolution des teneurs moyennes en pH du lait de brebis durant la fermentation et la période de post acidification. X ± σ Tableau 26 : Evolution moyenne de pH des yaourts de lait de brebis au cours de la fermentation X ± σ Tableau 27: Evolution des teneurs moyennes en (viscosité) du lait de brebis fermentés durant la fermentation la période de post acidification X ± σ Tableau 28 : Evolution sensorielle de la cohésivité des yaourts expérimentaux au cours des périodes de fermentation et post-acidification Somme des Rangs (n=10) Tableau 29: Evolution sensorielle de l’adhésivité des yaourts expérimentaux au cours des périodes de fermentation et post-acidification Somme des Rangs (n=10)
Liste des Abréviations
°C : Degré Celcius °D : degré dornic µg: Microgramme FAO : food and agriculture organisation
CEE : Communauté économique européenne MG : matière graisse OMS : organisation mondiale de la santé A.O.A.C : Association of Official Analytical Chemists ESD: extrait sec dégraissé EPS : Exopolysaccharides UFC : unité format colonies FIL: Fédération Internationale du Lait h : Heure INRA: Institut National de la Recherche Agronomique LAB : Lactic Acid Bacteria LBBL : Laboratoire de Biochimie des Bactéries Lactiques LDH : Lactate déhydrogénase mg : Milligramme mn : Minute PCA: Plate Count Agar SF : Streptocoques Fécaux t : Temps V : Volume g : gramme J : jour Kg : kilogramme L : litre mg : milligramme ml : millilitre N : nombre de germes par millilitre pH : potentiel hydrogène F : facteur MG : matière grasse % : pourcentage BM : bleu de méthylène Subsp : sous-espèce
Analyse bibliographique INTRODUCTION
Depuis très longtemps, l’homme a mis à profit la fermentation pour conserver un nombre de ses aliments. Au cours de la fermentation, il se produit normalement des modifications à la fois de la texture et de la flaveur du produit. Les bactéries sont en général les agents de ces transformations. Pour être utilisées en industrie alimentaire et particulièrement en industrie laitière, ces bactéries doivent avoir un certain nombre de caractéristiques ; avoir une bonne activité acidifiante, un bon pouvoir protéolytique, un bon développement de l’arôme et produire d’agents épaississants (De Roissart et Luquet, 1994). Parmi les produits élaborés par les bactéries lactiques, le yogourt; un lait fermenté très apprécié par les consommateurs dont la production remonte à très longtemps dans les Balkans et en Turquie d’Asie. C’était une fabrication uniquement fermière, puis l’usage s’est répandu en Occident. Le yaourt est un probiotique car il diminue la durée de certains types de diarrhées, en particulier chez l'enfant. L'Organisation mondiale de la santé recommande de remplacer le lait par le yaourt. Dans certains pays, particulièrement en Bulgarie, le yaourt est même utilisé comme médicament pour soigner certaines maladies telles les maladies infectieuses; les maux de gorge ainsi que les infections des fosses nasales et des oreilles (Remet, 1985). Ce lait fermenté est obtenu par fermentation lactique grâce à l’action de deux bactéries, Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus à partir du lait (Codex, 2003). Le choix des ferments est capital car de lui dépendent en grande partie les qualités gustatives des yaourts.
De part le monde, le yaourt (ou yoghourt) est le lait fermenté le plus connu malgré qu’il existe d’autres produits qui s’apparentent à celui-ci tel que Le Kéfir, Koumiss, Laban, Viili (Luquet, 1990).
Le yogourt peut être obtenu avec du lait en poudre comme il peut être également produit en utilisant d’autres types de laits tel le lait de vache, de chèvre et de brebis. C’est dans cette optique que s’inscrit notre étude qui porte dans un premier temps à : Isoler et caractériser des souches lactiques à partir de la caillette et du lait de brebis. Sélectionner les souches ayant les meilleure caractéristiques technologiques telles: le pouvoir acidifiant, l’activité protéolytique, la production d’agents épaississants et d’arômes.
1 Analyse bibliographique Dans un deuxième volet nous envisageons de:
Préparer un yaourt en utilisant les souches performantes isolées et des souches lactiques commerciales Evaluer la qualité physico-chimique et microbiologique du yaourt Étudier ses propriétés organoleptiques et physico-chimiques avec étude comparative. Comparer les résultats d’analyse entre le yaourt produit à base de souches locales avec celui produit à base de souches industrielles. Mettre en évidence le rôle des bactéries lactiques et leurs utilisations dans les domaines de l’agroalimentaire et de l’alimentation (fabrication, arôme et texture des produits)
2 Analyse bibliographique 1. L’élevage ovin
1.1. Les races ovines en Algérie
Le cheptel ovin, premier fournisseur en Algérie de viande rouge, est dominé par 3 races principales bien adaptées aux conditions du milieu (Adem, 1986 ; Chellig, 1992).
la race arabe blanche Ouled Djellal, la plus importante, représente environ 58 pourcent du cheptel national,
la race Rumbi, des djebels de l’Atlas Saharien, à tête et membres fauves, représente environ 12 pourcent du cheptel.
la race rouge Béni Ighil (dite Hamra en rappel de sa couleur) des Hauts Plateaux de l’Ouest (21 pourcent du cheptel), race berbère, très résistante au froid, autochtone d’Afrique du Nord.
Quatre races secondaires ovines existent également en Algérie:
la race à laine Azoulai de l’Atlas Tellien adaptée aux parcours montagnards,
la race Dmen, saharienne de l’Erg Occidental très intéressante par sa prolificité élevée,
la race Barbarine, saharienne de l’Erg Oriental
la race Targuia-Sidaou, sans laine, race peu élevée par les touaregs du Sahara Central.
Quelques variétés plus rares sont également mentionnées telles que la Taadmit issue d'un croisement entre Ouled Djellal et les béliers Mérinos.
1.1.1. La race Ouled Djellal
Le mouton « Ouled-djellal » compose l’ethnie la plus importante des races ovines Algériennes (Fig. 1), occupant la majeure partie du pays à l’exception de quelques régions dans le sud ouest et le sud est.
La tendance à intensifier l’élevage ovin existe dans de nombreuses exploitations agricoles de la région algérienne de Sétif (Abbas et al., 2002). Parmi les questions posées par les agriculteurs, figure la possibilité de désaisonnement de la race ovine Ouled Djellal.
3 Analyse bibliographique
Fig. 1: La race Ouled Djellal Source: http://www.djelfa.org/faune.htm
Fig. 2 Le cheptel ovin de la région Mostaganem (Algérie)
4 Analyse bibliographique
La race Ouled-djellal comprend trois variétés : a-Variété Chellalia : C’est le type du mouton plus petit de taille et plus léger. C’est parmi cette variété que l’on classe la race Taadmit qui est un croisement Ouled Djellal x Mérinos d’Arles, qui est créée pour la production de la laine. Il est, aussi, intéressant de citer la variété Zâarez utilisée à cette fin. b-Variété lourde (Hodnia) : Ce mouton est plus recherché par les éleveurs à cause de son poids corporel. Cet ovin est de forme bien proportionnée, taille élevée, couleur paille claire ou blanche. La laine couvre tout le corps jusqu’aux jarrets. c-Variété Djellalia : Mouton longiligne, haut sur pattes, adapté au grand nomadisme. Il produit une laine blanche, fine et jarreuse. Le ventre et le dessus du cou sont nus pour une majorité des bêtes de cette variété
1.1.2. La race Rembi
Se distingue des deux dernières races par une couleur de la tête et des membres qui varient entre le fauve rouge et l’acajou, mais la laine est blanche, présence de cornes massives et spiralées.
C’est un animal haut sur pattes, il est considéré comme le plus grand format de mouton d’Algérie. Sa conformation est meilleure que celle de la Ouled-djellal. Il semble ainsi qu’elle est mieux adaptée que la Ouled-djellal aux zones d’altitude
1.1.3. La race Hamra
C’est un animal à peau brune avec des muqueuses noires. La tête et les pattes sont bruns rouge foncé presque noir. La laine est blanche avec du jarre volant brun roux. Présence de cornes moyennes et spiralées. L’aire de répartition de cette race est située dans le sud-ouest, elle est rencontrée également au niveau du piémont de l’atlas saharien. Elle couvre aussi le haut atlas Marocain chez les tribus des Beni-Iguil d’où elle tire son nom.
Trois variétés composent cette race : -Le type d’El-bayadh, Mecheria à couleur acajou foncé . -Le type d’El-arricha, à couleur presque noire, c’est le type le plus performant, le type même de la race.
5 Analyse bibliographique
- Le type de Malakou du chott chergui, à couleur acajou clair (Rouissat et Bensoltane, 2006).
1.1.4. La race Barbarine
C’est un animal de bonne conformation, de couleur blanche, sauf la tête et les pattes qui peuvent être bruns ou noirs. Son aire de répartition est limitée à l’est Algérien par l’erg oriental à l’est de l’oued Rhigh et dans les régions avoisinantes de la frontière Tunisienne. Cette race est remarquablement adaptée au désert de sable et aux grandes chaleurs estivales.
1.1.5. La Race D’men
L’absence de cornage est un caractère constant chez les deux sexes. La queue est fine et longue à bout blanc. La très grande hétérogénéité morphologique de la D’men, laisse apparaître trois types de populations:
- Type noir acajou, le plus répandu et apprécié. - Type brun. - Type blanc.
Les trois types présentent des queues noires à bout blanc et des caractères de productivité ne signalant aucune différence significative.
Cette race saharienne est répandue dans les oasis du sud ouest Algérien : Gourara, Touat, Tidikelt et va jusqu'à El-Goléa à l’est et se prolonge dans les zones désertiques au sud de Béchar sous le nom de race de Tafilalet ou D'men.
La race très bien implantée au Maroc, c’est là qu’elle est la plus étudiée et bien préservée.
1.1.6. La race Azoulai
C’est une race des montagnes du Tell, elle est présente tout le long des chaînes de l’atlas Tellien. Elle est petite de taille avec une toison de laine mécheuse, blanche et brillante. Il existe quelques spécimens tachetés de noir. Les cornes sont présentes chez les deux sexes, elles sont petites et spirales. Cette race ne se rencontre actuellement que dans les chaînes montagneuses du nord Algérien jusqu'à Tlemcen et Maghnia
1.1.7. La race Sidahou (Targui)
C’est la seule race Algérienne dépourvue de laine, mais à corps couvert de poils, la queue étant longue et fine. Cette race se trouve dans le grand Sahara Algérien allant de Bechar et passant par Adrar jusqu'à Djanet.
6 Analyse bibliographique
1.2. Effectif du cheptel ovin en Algérie
L’élevage, en Algérie, concerne principalement les ovins, les caprins, les bovins et les camelins. Les effectifs recensés durant la période qui s’étale de 1990 à 2001 sont représentés dans le tableau 1.
Les ovins prédominent et représentent 80 % de l’effectif global avec plus de 10 millions de têtes. L’élevage caprin vient en seconde position (13 pourcent) comprenant 50 pourcent de chèvres. L’effectif des bovins reste faible avec 1.6 - 1.7 millions de têtes (6 % de l’effectif global) dont 58 pourcent sont des vaches laitières. En Algérie, il y a une spécialisation des zones agroécologiques en matière d’élevage. L’élevage bovin reste cantonné dans le nord du pays avec quelques incursions dans les autres régions. Les parcours steppiques sont le domaine de prédilection de l’élevage ovin et caprin avec plus de 90 pourcent des effectifs qui y vivent entraînant une surexploitation de ces pâturages.
Tableau 1: Evolution du cheptel (milliers de têtes) Sources Statistiques Agricoles 1990-1999 et FAO, 2002
Année 1990 1995 1999 2000 2001 Bovins 1 393 1 267 1 650 1 650 1 700 Ovins 17 697 17 302 18 200 19 500 19 300 Caprins 2 472 2 780 3 400 3 400 3 500 Camelins 123 126 220 235 240 Total 21 685 21 475 23 470 24 785 24 740
2. Le lait
Le lait est le produit de sécrétion des glandes mammaires, des mammifères comme la vache, la chèvre et la brebis, destiné à l’alimentation du jeune animal naissant.
C’est un aliment de haute valeur nutritionnelle très riche en protéines, lipides, glucides et surtout par un apport en oligo-éléments tel que le calcium. De ce fait il occupe une place incontestable dans la ration alimentaire humaine dans la plus part des pays ayant un niveau de vie bas, moyen ou élevé (Luquet, 1990).
7 Analyse bibliographique Le lait des mammifères domestiques est un produit de consommation courante dans la plupart des civilisations humaines : lait de vache principalement, mais aussi de brebis, de chèvre, de jument, de chamelle, de dromadaire ou de bufflonne (Vignola, 2002).
2.1. Composition physico-chimique du lait
Le lait présente des caractéristiques liées à sa nature biologique, à savoir: variabilité, complexité, hétérogénéité et altérabilité. Les éléments les plus constants de sa composition méritent d'être signalés en premier et, ensuite, les fluctuations rencontrées seront associées aux facteurs qui les engendrent.
Le lait de vache a une densité moyenne égale à 1,032, il est composé de :
2.1.1- eau : présente en forte proportion, environ 87%; elle sert de véhicule aux autres constituants qui s'y trouvent, soit à l'état dissous (lactose), soit en suspension (matière grasse).
2.1.2- matière grasse: représente 3,5 à 4,5 % ; elle se présente sous forme d'une émulsion de petits globules sphériques en suspension dans le liquide. Lorsque le lait est au repos, les globules montent lentement à la surface et constituent la crème. Ils sont séparés, grâce à leur densité relativement faible, par l'écrémeuse centrifuge et se soudent sous l'action de la baratte pour former le beurre.
2.1.3- lactose: se trouve en dissolution dans le liquide. Il donne au lait sa saveur légèrement sucrée. Sous l'influence de ferments lactiques, le lactose peut se transformer en acide lactique, le lait s’acidifie.
2.1.4- caséine : c'est une matière azotée en suspension colloïdale qui a la propriété de se coaguler sous l'influence de la présure et des acides (acide lactique notamment) en enserrant dans le caillé les globules de matière grasse. La caséine est indispensable à la croissance; elle représente une partie importante des protides. C'est l'élément de base du caillage, provoquant, dans un milieu acide, ou en ajoutant de la présure, la coagulation du lait. C'est pour cette raison qu'il faut ajouter les alcools ou acide (citron) dans les crèmes en fin de préparation. 2.1.5- matières minérales: principalement phosphates, chlorures, sulfates dissous, Na, Mg et Ca. 2.1.6- vitamines : Les données concernant les vitamines sont insuffisantes que celles concernant les autres nutriments. Néanmoins, il convient de remarquer la richesse du lait de brebis, dans presque toutes les vitamines (B1, B2, B6, B12, acide nicotinique, acide folique, C, A, -carotènes) (FAO, 1995).
Constituants Vache Bufflonne Chamelle Jument Chèvre Brebis 8 Analyse bibliographique Extrait sec total 128 166 136 109 134 183 Protéines 34 41 35 25 33 57 Caséine 26 35 28 1 4 24 46 Lactose 48 49 50 60 48 46 Matières salines 9 8 8 4 7,7 9 Matières grasses 37 68 45 20 41 71 Minéraux 8 8 7 5 9 10 Tableau 2: Constituants principaux des laits de diverses espèces animales (g/litre)
Source: FAO, 1990; Vignola, 2002.
2.2. Caractéristiques physico-chimiques Les principales propriétés physico-chimiques utilisées dans l’industrie laitière sont la masse volumique et la densité, le point de congélation, le point d’ébullition et l’acidité. Les caractéristiques physico-chimiques des différents laits sont regroupées au Tableau 3. Ce tableau fait apparaître qu'une ressemblance existe entre les laits de vache et de bufflonne. La densité du lait de brebis ainsi que celle des races de chèvre à lait gras est plus élevée que celle du lait de vache. De même, la viscosité du lait de brebis est élevée. Le lait de chèvre se caractérise par un pourcentage élevé de micelles de caséine soluble (de 10 à 20 pour cent contre 1 pour cent pour le lait de vache).
Les laits sécrétés par les différentes espèces de mammifères présentent des caractéristiques communes et contiennent les mêmes catégories de composants: eau, protéines, lactose, matières grasses (lipides) et minérales. Cependant, les proportions respectives de ces composants varient largement d'une espèce à l'autre (tableau 2).
Tableau 3: Caractéristiques physico-chimiques des laits de diverses espèces animales (FAO, 1990).
Constantes Vache Bufflonne Chamelle Chèvre Brebis Energie (kcal/litre) 705 755-1 425 800 600-750 1 100 Densité du lait entier à 20 °C 1,028-1,033 1.029-1.033 1,025- 1,027-1,035 1,034- 1,038 1,039 Point de congélation (°C) -0,52-0,55 -0,544 -0,580 -0,550-0,583 -0,570 pH - 20°C 6,60-6,80 6,66-6,82 6,20-6,82 6.45-6,60 6,50-6,85 Acidité titrable (°Dornic) 15-17 14-18 - 14-18 22-25 Tension superficielle du lait 50 48,7 - 52 45-49 entier à 15 °C (dynes cm) Conductivité électrique à 25 45 x 10-4 66,2x10-4 - 43-56 x 10-4 38 x 10-4 °C (siemens) Indice de réfraction 1,45-1,46 - - 1,35-1,46 1.33-1.40 Viscosité du lait entier à 20 2,0-2,2 - - 1,8-1,9 2.86-3.93 °C (centipoises)
Note: Le signe - signifie que les données font défaut ou sont sujettes à caution
2.3. Production du lait dans le monde
9 Analyse bibliographique La production mondiale de lait s'est élevée en 2003 à 601 millions de tonnes. Elle se répartit selon les espèces laitières selon le Tableau 4.
Tableau 4 : Production de lait par espèce animale en million de tonnes (Mt)
(FAO, 2004)
2003 Production (Mt) % Lait de vache 507,4 84,4% Lait de bufflonne 72,6 12,1% Lait de chèvre 11,8 2,0% Lait de brebis 7,9 1,3% Lait de chamelle 1,3 0,2%
2.4. Laits d'animaux laitiers
La vache assure de loin la plus grande part de la production mondiale (90 pour cent) même en pays tropicaux (70 pour cent) (FAO, 1990). Ce lait est de tous le plus connu et les données qui le caractérisent sont sans doute les plus exactes. Il est logiquement aussi le produit laitier le plus consommé et étudié en nutrition humaine.
Les productions de lait de brebis et de chèvre viennent très loin derrière celles du lait de vache et de bufflonne. Chacune d'elles n'atteint pas 2 pour cent de la production laitière mondiale. L'élevage de la brebis et celui de la chèvre sont plus disséminés que celui de la bufflonne; on peut toutefois constater une certaine concentration de la production du lait de chèvre dans le sous continent indien (tableau 5).
Le lait de chèvre est la matière première de yaourts et de fromages, produits dont la fabrication est facilitée par les caractéristiques du lait de chèvre. Les teneurs en protéines et lipides du lait de chèvre sont plus élevées que celles du lait de vache. Le lait de chèvre diffère donc encore plus sensiblement du lait humain que le lait de vache (Muggli, 1982).
La production de lait de brebis est concentrée dans les pays où la production de lait de vache est limitée, mais elle concerne également des pays de grande tradition fromagère comme la France (tableau 5). Par ses caractéristiques biochimiques, le lait de brebis présente de grandes similitudes avec le lait de chèvre; il est donc très différent du lait humain.
10 Analyse bibliographique Tableau 5 : Principaux pays producteurs de lait de bufflonne, de brebis et de chèvre
(FAO, 1990)
Pays Production laitière (milliers de tonnes) Bufflonne Inde 23 600 Pakistan 10 538 Chine 1 938 Egypte 1 300 Népal 603 Italie 110 Monde 38 580 Brebis France 1 080 Turquie 893 Iran 735 Grèce 650 Italie 628 Chine 575 Monde 8 470 Chèvre Inde 1 500 Somalie 675 Pakistan 620 Turquie 524 France 460 Grèce 60 Monde 8 780
Note: La production mondiale de lait de vache est de 475 507 milliers de tonnes
2.5. Lait de brebis
2.5.1 Production et composition du lait de brebis
Le lait de brebis est nettement plus riche que le lait de vache. Sa teneur en matière sèche est de l'ordre de 200 g/l contre seulement 130 g/l pour le lait de vache. En moyenne, le lait de brebis renferme 75 g/l de matière grasse contre 40 g/l pour le lait de vache. La teneur en matières azotées est la moyenne de 60 g/l contre seulement 35 g/l pour le lait de vache.
Les teneurs en lactose (50 g/l) et en sels minéraux (11 g/l) sont également supérieures à celles du lait de vache: 47 g/l pour le lactose et 8 g/l pour les sels minéraux.
Le lait de brebis est quasi exclusivement destiné à la fabrication de fromages. La maîtrise de sa composition, notamment des teneurs en matières grasses et protéiques, est donc particulièrement importante puisque ces paramètres déterminent largement le rendement fromager (Pellegrini et al. 1997). Ainsi, les principaux objectifs de l'éleveur sont d'accroître 11 Analyse bibliographique la quantité totale de matière utile sécrétée dans le lait, d'obtenir une composition du lait aussi stable que possible au cours de la campagne de traite et de maintenir un rapport matières grasses/matières protéiques élevé, afin d'assurer une teneur adéquate en matières grasses du fromage qui conditionne sa maturation et ses caractéristiques organoleptique
Comme pour les autres ruminants laitiers, la production et la composition du lait des brebis laitières sont principalement conditionnées par les facteurs génétiques, le stade de lactation, le système de traite et l'alimentation (Bocquier et Caja 1993, Caja et Bocquier, 1998).
Bien qu'il existe de grandes différences entre races à la fois dans la production, la composition du lait et les courbes d'évolutions de ces paramètres à l'échelle de la lactation, les effets de la race sont souvent confondus avec ceux du système de production qui sont très variés (Gallego et al., 1983 et 1994, Labussière et al., 1983; Caja, 1994; Bocquier et Caja 1993, Fuertes et al., 1998) observées pendant cette période d'allaitement et traite (McKusick et al., 1998 ou 1999) ou immédiatement après le sevrage, et elles augmentent par la suite avec le stade de lactation.
3. La caillette
A la naissance du veau, une seule des poches de son estomac (la caillette) fonctionne. Le veau ne consomme que du lait mais ce lait doit être caillé pour être digéré. Pour se faire, la caillette sécrète un produit spécial, la présure. La présure sert également à faire cailler le lait pour sa transformation en fromage. Longtemps, on a récupéré cette présure dans l’estomac des veaux après l’abattage. Ceci se pratique encore aujourd’hui, dans certaines régions. Mais les industriels utilisent d’autres méthodes : les spécialistes des biotechnologies ont mis au point des produits tout aussi efficaces et bien contrôlés.
4. Les bactéries lactiques
L’essor des bactéries lactiques a bénéficié de celui des grands mammifères, producteurs de lait, commencé il y a 65 millions d’années. Il s’est accentué lorsque l’homme est passé du statut de chasseur-cueilleur à celui d’éleveur, il y a quelques 8000 ans avant J.C. Les premiers vases perforés de petits trous, retrouvés sur les rives du lac de Neufchâtel, datent de 3 000 ans avant J.C.
Dès cette époque, en Egypte, à Sumer ou en Macédoine, l’homme sait contrôler le phénomène de caillage du lait. Très rapidement donc, ces bactéries s’avèrent utiles à l’homme et contribuent à la production de nombreux produits alimentaires fermentés comme le fromage, le pain, le vin, la choucroute dans nos régions tempérées et des produits à base de céréales, de tubercules, de poisson et de viande dans les régions intertropicales.
Elles sont employées pour la fabrication, la conservation d’aliments, la production des divers produits laitiers et pour leurs effets thérapeutiques.
-En commerce, elles sont cultivées sous forme de levains. Ces ferments sont de type mésophile ou thermophile, les souches d’un ferment doivent assurer deux fonctions : l’acidification par production d’acide lactique et la production d’arômes.
12 Analyse bibliographique Les bactéries lactiques sont des cellules procaryotes, chimioorganotrophes. Elles ont une morphologie et une physiologie hétérogène. Elles doivent leur nom à la production massive d’acide lactique à partir des sources carbonées (Bugnicourt, 1995).
Il n'existe pas de définition précise des bactéries lactiques. Généralement, en bactériologie, on regroupe sous ce terme des bacilles ou des coques à Gram positif, non sporulés, catalase négative, dépourvus de cytochrome, anaérobies mais parfois aérotolérants, de culture difficile, à métabolisme fermentatif, fermentant les sucres en produisant principalement de l'acide lactique et appartenant à l'ordre des "Lactobacillales" (classe des "Bacilli", phylum des "Firmicutes").
La fermentation est dite homolactique si l’acide lactique est pratiquement le seul produit formé, et hétérolactique si d’autres composés sont aussi présents (acide acétique, éthanol,
CO2, etc.).
Les bactéries lactiques sont dépourvues de cytochromes et par conséquent, inaptes à toute respiration aérobie ou anaérobie. Ce sont des bactéries anaérobies facultatives, capables de fermentation en aérobiose comme en anaérobiose (Leveau et Bouix, 1993). Les principaux genres inclus dans les bactéries lactiques sont les genres Aerococcus, Brochothrix, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Paralactobacillus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella.
Les bactéries lactiques se rencontrent dans divers milieux naturels, on les trouve dans les produits alimentaires, abondamment dans le lait et les produits laitiers (lait caillé, leben, fromage etc.…..), dans les produits végétaux en fermentation tel que la choucroute, olives, concombre, ensilage et enfin dans les jus et les moûts des industries alimentaires.
Chez l’homme et les animaux: on y rencontre principalement le genre Lactobacillus dans le tractus alimentaire mais aussi dans les cavités naturelles (bouche, vagin….) (Pelmont, 1993).
4.1. Classification des bactéries lactiques
La classification des bactéries lactiques est complexes et a varié au cours du temps. Les auteurs qui ont eu à s’occuper de leur systématique se sont heurtés à la difficulté de pouvoir en établir une classification simple pouvant englober tous les caractères différentiels. La classification est basée sur les plus importantes caractéristiques :
La morphologie coques ou bacilles fait ressortir deux grandes familles : Streptococcacea Lactobacillacea
- La formation des tétrades, des chaînettes ou des amas, permet de déterminer le genre au sein de la même famille, d’autres critères permettent aussi de classer les bactéries en différentes espèces.
13 Analyse bibliographique - Le mode de fermentation du glucose. - La croissance à des températures diffère. - La tolérance au sel. - La formation des diffèrent isomères d’acide lactiques (L) ou (D) ou tous les deux. - Ou même l’étude de séquençage peuvent résoudre les problèmes de classification (Axelsson, 1993).
4.1.1. Taxonomie classique :
En 1957, le Bergey’s Manual a regroupé toutes les bactéries lactiques dans la famille des Lactobacteriaceae, mais cette classification a été remise en question et totalement simplifiée (Desmazeaud, 1992).
Elle s’appuie sur les caractères phénotypiques de l’espèce et du genre. La première classification était donc basée sur la morphologie, la température de croissance ; le mode de fermentation du glucose et de la forme de l’acide lactique produit, ainsi on a pu distinguer deux groupes :
1- Les homofermentaires : formés de trois sous groupes : - Thermobacterium - Streptobacterium - Streptococcus. 2- Les hétérofermentaires: formés également de deux sous groupes : - Betabacterium - Betacoccus
4.1.2. Taxonomie moderne:
Elle s’appuie principalement sur les techniques d’électrophorèse des protéines et des études des acides nucléiques, la définition de pourcentage CG de l’ADN, ce qui permet de définir une souche bactérienne du point de vue de la taxonomie moléculaire (importante pour son caractère d’exclusion).
La taxonomie actuelle investie le progrès de la génétique (hybridation ADN-ADN, ADN- ARN) de l’écologie (découverte de bactéries de milieu externe), elle inclue également les techniques modernes de séquençage d’ADN, de micro galeries d’identification, des banques de données informatisées (Bugnicourt, 1995).
La classification des bactéries lactiques a été totalement revue et simplifiée compte tenu des apports modernes de la taxonomie moléculaire (Desmazeaud, 1992).
La classification de (Bergey, 1994) sépare le monde bactérien en 35 groupes. Les bactéries lactiques BL se retrouvent dans les groupes 17 (coques Gram positives), 19 (bâtonnets réguliers Gram positifs, non sporulant) et 20 (bâtonnets irréguliers Gram positifs, non sporulants). Parmi les 11
14 Analyse bibliographique genres bactériens qu’on peut considérer comme des bactéries lactiques, seules les genres Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc et Streptococcus sont communément employés dans la fermentation lactique des produits laitiers (Fig.3) (Tableau 6
Tableau 6: Classification génomique des bactéries lactiques
famille Genre exemples Streptococcaceae Streptococcus groupables par la méthode de Lancefield o groupe A (Streptococcus pyogenes) o groupe B (Streptococcus agalactiae) o groupe C (Streptococcus equisimilis, dysgalactiae, equi, zooepidermicus) o groupe D (Streptococcus bovis, equinus, suis) o groupe N (thermophilus) non groupables par la méthode de Lancefield (streptocoques oraux) o S. pneumoniae, S. porcinus, iniae, acidominimus, milleri, mitis, mutans, morbillorum, oralis, salivarius, sanguis, thermophilus, uberis
Streptococcaceae Lactococcus appartenant au groupe N : L. lactis, garviae, plantarum, raffinolactis appartiennent aux bactéries lactiques, aux côtés de Streptococcus thermophilus par ex. Enterococcaceae Enterococcus appartenant au groupe D de Lancefield en général : E. faecalis, faecium, avium, durans, hirae, gallinarum, casseliflavus, malodoratus, mundtii Aerococcaceae Aerococcus Aerococcus viridans Leuconostocaceae Leuconostoc L. mesenteroïdes, paramesenteroides, lactis, dextramicum, cremoris, oenos Lactobacillaceae Pediococcus P. cerevisiae, acidilactici, pentosaceus, halophilus, urinae-equi
On prendra garde au fait que la taxonomie risque d'évoluer car la distinction sur la morphologie est très discutée et discutable: les Lactococcus sont très proches des Lactobacillus qui forment la famille I de la classe... et intègrent les Pediococcus. Autre surprise, Gemella est renvoyé dans les Staphylococcaceae
Bactéries Lactiques
15 Analyse bibliographique
Coques Gram Positif Bacilles Gram Positif
Asporulales Asporulales
Aérobie ou anaérobie Aérobie ou anaérobie Facultatif Facultatif Anaérobie
Peptococcaceae Streptococcaceae Lactobacillaceae
Peptococcus Lactococcus Lactobacillus Peptostreptococcus Leuconostoc Homo-fermentaire strict Rumiococcus Hétéro-fermentaire facultatif Pediococcus Sarcina Hétéro-fermentaire strict
Figure 3: Diagramme de la classification des bactéries lactiques (Sneath et al., 1986)
4.2. Les différents genres de bactéries lactiques
Les bactéries lactiques sont représentées par plusieurs genres d’importance d’ailleurs différentes (Tableau 7). Selon la morphologie, ce groupe peut être divisé en deux formes.
Coques : c’est le cas de Streptococcus, mais aussi de Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc et Pediococcus.
16 Analyse bibliographique Bacilles : Lactobacillus.
Ils se distinguent en plus par leur type fermentaire : homolactique ou hétérolactique (Kandler et Weiss, 1986). D’autres caractéristiques peuvent être rajoutées et par les quelles ont peut différencier les espèces. - la nature du peptidoglycane - les propriétés antigéniques - la nature de l’acide teichoïque - la mobilité électrophorétique de LDH (lactate déshydrogénase). - la composition saccharidique et lipidique
Le développement de la biologie moléculaire a conduit à une nouvelle classification fondée sur la présence de leurs génomes, les avantages de cette nouvelle taxonomie reposent sur la stabilité du génome, sur la possibilité de définir des relations phylogéniques entre des groupes lactiques (Garvie,1986).
Tableau 7 : Les différents genres de bactéries lactiques et leurs caractéristiques (Novel, 1993) Cellules Fermentation ADN Formes Arrangement GC%
Streptococcus Coque Chaînes homolactique 34 – 46
Leuconostoc Coque Chaînes Hétérolactique 36 – 63
Pediococcus Coque Tétrades Homolactique 34 – 42
Homolactique Lactobacillus Bacille Chaînes Hétérolactique 32 – 53
GC % : pourcentage molaire de l’ADN en base G et C (guanine et cytosine)
4.2.1. Streptocoques lactiques :
Ils font partie du groupe des bactéries lactiques qui inclut les agents des fermentations produisant de l’acide lactique : bacilles (Lactobacillaceae) et coques (Streptococcaceae). Il s’agit de bactéries Gram + à exigences nutritives parfois complexes que l’on trouve dans les produits alimentaires riches, en particulier le lait.
La famille des Streptococcaceae regroupe des genres très fréquents dans l’industrie alimentaire comme contaminants et surtout comme agents de fermentation lactique : 17 Analyse bibliographique Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus (ces trois genres étant anciennement regroupés en un genre unique Streptococcus), Leuconostoc et Pediococcus (Guiraud, 1998).
Les espèces de ce groupe se présentent comme des cellules ovoïdes, sphériques ou quelquefois allongées de 0,5 à 1,5 m de diamètre (Fig. 4 et 5). Ce sont des bactéries homofermentaires. Organisée en paires ou en chaînettes.
Ils s’agit de coques Gram +, asporulés, immobiles, généralement groupés en paires et surtout en chaînes de longueur variable. Il sont catalase -; cependant, certains pédiocoques possèdent une pseudocatalase et peuvent apparaître catalase +. Dans ces cas douteux, il faut pratiquer la recherche de la peroxydase par le test à la benzidine. Ils ont un métabolisme fermentaire produisant de l’acide lactique en quantité importante mais variable selon le genre; certains ont des activités protéasiques et peptidasiques.
La différence entre les groupes est basée sur l’arrangement des cellules et sur le type de fermentation (homo ou hétérolactique).
Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus
Ce sont des germes anaérobies facultatifs, généralement micro-aérophiles et très exigeants au point de vue nutritionnel. Ils se développent bien à 37°C. La plupart des espèces ne sont pas en général capsulées leur fermentation est homolactique et donne de l’acide lactique surtout dextrogyre. Ils ont fréquemment un pouvoir hémolytique et peuvent être groupés par des tests sérologiques. Quelques espèces sont pathogènes en dehors du cadre alimentaire : elles peuvent cependant se retrouver dans les aliments (streptocoques de mammites dans le lait) et provoquer des infections. De nombreux autres sont saprophytes, en particulier dans les produits laitiers. Certaines espèces sont abondamment utilisées dans les industries de fermentation lactique (laiterie, beurrerie, fromagerie, mais aussi saumure et salaisons). Ce sont les agents d’acidification et de coagulation lactiques en fromagerie.
Les streptocoques ont été classés au départ en quatre groupes d’espèces de Streptococcus selon les critères de sherman. Bien q’actuellement certains groupes et espèces aient été transformés en nouveaux genres, cette classification est encore parfois utilisée.
Ces bactéries se distinguent par leur capacité à se développer à des températures extrêmes 45°C pour les thermophiles et 10°C pour les mésophiles (Larpent et Larpent-Gourgaud, 1990).
Le tableau N° 8 représente les principaux caractères des Streptococcus de la flore lactique (Novel, 1993). On distingue :
-Le groupe pyogenes
Il contient des streptocoques pathogènes, hémolytiques (hémolyse β) et appartenant aux groupes sérologiques de Lancefild A B C E F G H. Ces streptocoques peuvent occasionnellement entraîner des infections d’origine alimentaire : ils sont toujours classées comme vrais Streptococcus.
18 Analyse bibliographique L’espèce type est S. pyogenes (groupe A), agent d’angines et de la scalartine. Streptococcus pyogenes possède deux hémolysines de type β (streptolysines O, S), une toxine érythrogène (qui provoque la scarlatine), des facteurs mitogènes et des enzymes lytiques (fibrinolysisnes). La contamination des produits est d’origine respiratoire et les produits incriminés sont le lait, les œufs et crèmes glacées, les pâtisseries. L’espèce S. agalactiae (groupe B) agent de mammites, est parfois rencontrée dans l’alimentation.
Le groupe viridans
Il comprend des streptocoques à hémolyse α ou γ non groupables par la méthode de Lancefield ou appartenant au groupe K.
Le genre Streptococcus regroupe un vaste ensemble de microorganismes ubiquitaires et qui comprend de nombreuses espèces. En raison de leur nombre, on distingue les espèces pathogènes des espèces commensales et saprophytes.
L’espèce S. thermophilus est un agent d’acidification fréquent dans certains fromages et surtout les yaourts.
S. thermophilus est utilisé depuis que l’homme fait fermenter le lait, soit plus de 7 000 ans. S. thermophilus est l’un des deux probiotiques obligatoirement utilisés dans la fabrication des yaourts, avec sa compagne la bactérie Lactobacillus bulgaricus.
On peut l’isoler du lait chauffé à : 45-50°C ou du lait pasteurisé (Hardie, 1986), des produits laitiers: yaourt, des matériels de laiterie, des levains artisanaux il n’aurait jamais été isolés d’autres habitats
Cette espèce lactique reste dans le genre Streptococcus, elle se distingue essentiellement des autres streptocoques lactiques par une activité fermentaire le plus souvent réduite à quelques sucres et une forte sensibilité au NaCl, sa croissance thermophile avec un optimum auteur de 42-43°C pendant 30 minutes (Garvie, 1984).
-Le groupe lactique
Il concerne les streptocoques non hémolytiques (γ) appartenant au groupe sérologique N et contient des espèces très importantes en fromagerie, S. lactis S. lactis var diacetylactis et S. cremoris désormais appelés Lactococcus lactis, Lc. cremoris etc…
-Le groupe des entérocoques
Il regroupe les streptocoques fécaux qui présentent une hémolyse α, β ou γ et qui appartiennent au groupe sérologique D. Ce sont des commensaux de l’intestin. Les espèces rencontrées dans l’alimentation sont essentiellement Streptococcus faecalis et ses variétés S. durans (=S. faecium) et S. bovis. Ils sont maintenant classés comme Enterococcus. Ce sont des germes tests de contamination fécale mais ils ne sont qu’exceptionnellement pathogènes : ce sont alors des pathogènes opportunistes avec une dose infectante forte (108 - 1010 cellules). Ils peuvent même avoir un intérêt industriel (fromagerie). Enterococcus faecalis et faecium résistent à 6.5% de NaCl et 30 min à 60°C.
19 Analyse bibliographique Tableau 8: Caractères biochimiques des Streptocoques lactiques (Desmazeaud 1992, Novel, 1993 Larpent, 1996).
Caractères Lc. lactis sp Lc Streptococcus biochimiques raffinolactis lactis diacetylactis cremoris thermophilus Morphologie 0,5 – 1 0,5 – 1 um 0,6 – 1 um ND 0,7 – 0,9 µm um ــ + + + + Culture à 10°C + ــ ــ ــ ــ Culture à 45° C + ــ + + + Culture à 40° C Culture en lait Sherman ــ à 0,1 % de bleu de + + + ND (1 méthylène ــ ــ + + + à 0,3 % de bleu de (2 méthylène Culture en bouillon hypersalé 6,5 % v v 2,5 % + + + + + ــ ــ + + + % 4,5 ــ + + + + Réductase ــ ND ــ + ــ Citratase ــ ND ــ + ــ Acétoine ــ ــ ــ + + Arginine, dihydrolase émolyse Δ δ δ δ Α
ــ Groupe de Lancefield N N N N
4.2.2. Le genre Leuconostoc
Les cellules de Leuconostoc sont des coques en paires ou en chaînes comme les Streptocoques mais cette bactérie est hétérofermentaire produisant de l’acide lactique D (-), de l’éthanol et du CO2, ces espèces sont mésophiles (optimum 20-30° C) et caractérisées par la production à partir du citrate du lait, de diacétyle et parfois par la synthèse de dextranes et de levanes extracellulaires en présence de saccharose (Bugnicourt, 1995).
Ils constituent le troisième groupe important des bactéries lactiques.
20 Analyse bibliographique Ces bactéries hétérofermentaires produisent de l'éthanol et des acides organiques à partir du lactose: elles participent à la constitution de l'arôme (Leuconostoc cremoris aromatisant) et de la saveur (Leuconostoc lactis acidifiant) lors de la fabrication de nombreux aliments où ils sont utilisés comme levains (saucisson, levain du pain au levain ....). Les Leuconostoc sont utilisés dans l'industrie laitière pour leur capacité à produire du CO2 et des composés d'arôme (diacétyle) grâce au cométabolisme du citrate et du lactose.
Exemple: Leuconostoc dextranicum et Leuconostoc mesenteroïdes interviennent dans le développement du Roquefort.
Par ailleurs, certaines espèces de ces bactéries peuvent être nuisibles aux qualités organoleptiques, en produisant des accidents de fabrication des produits acides et sucrés (piqûre lactique gazogène, viscosité, « filage ») (Guiraud, 1998).
Le tableau 09 représente les principaux caractères des Leuconostoc de la flore lactique. L’habitat naturel des espèces du genre Leuconostoc est le lait, produits laitiers, fruits, légumes…
-Dans le milieu solide : elles forment des petites colonies rondes, lisses blanchâtres. -Dans le milieu liquide : elles provoquent une turbidité uniforme.
4.2.3. Le genre Pediococcus:
Les Pediococcus sont des germes microaérophiles à besoins nutritifs complexes. Leur développement nécessite la présence de divers facteurs de croissance. De nombreuses espèces sont acidophiles et osmophiles. Leur fermentation homolactique donne parfois de l’acide lactique forme L : les osmophiles non acidophiles ne donnent que cette forme. Ils sont saprophytes et contaminent les produits végétaux.
Les bactéries appartenant à ce genre se présentent sous forme de cellules sphériques de diamètre variant entre, 1 et 0,6 µm, on ne les voit jamais en chaînettes mais souvent en paires et en tétrades. Elle se développent à 30°C (généralement entre 25 et 40°C) en milieu solide ; elles se présentent sous forme de colonies lisses, rondes blanchâtres : en milieu liquide la turbidité est uniforme et nettement repérable. Elles fermentent les sucres en produisant exclusivement de l’acide lactique (DL) ou (L+) (Desmazeaud, 1992).
Les espèces se différencient par leur tolérance à la température, au pH et NaCl et par leur spectre fermentaire (Garvie, 1986).
Leurs caractéristiques sont données dans le tableau 10. Les espèces de ce genre sont trouvées dans les végétaux frais, (fromage, peau, cavités, tractus, …).
Les pédiocoques sont formés de cellules groupées en paires ou en tétrades, ils fermentant les sucres en produisant de l’acide lactique (D+) ou (L+) leur faible activité protéolytique et chez la plupart des espèces leur incapacité d’utiliser le lactose ne leur permettent pas d’acidifier et de coaguler le lait.
21 Analyse bibliographique Les Pediocococus sont aussi caractérisés par le GC% de leur ADN (34-42%), par le peptide du PTG du type (LYS-L-ALA CD-ASP), la nature et les propriétés des LDH varient en fonction des espèces.
Ce sont des agents de dégradation en brasserie (P. damnosus =P. cerevisiae). Les pédiocoques causent des altérations (viscosité) dans les produits végétaux (choucroute, olives, etc, …) et parfois les viandes et poissons. Ils sont parfois utilisés comme levains lactiques pour les charcuteries. Les Aerococcus sont proches des Pediococcus (Guiraud, 1998).
4.2.4. Le genre Lactococcus :
Il est sous forme de coques disposées en chaîne de longueur variable homofermentaire (acide lactique L (+)), elles appartiennent au groupe N de Lancefield α hémolytique et non hémolytique avec la température optimal 30°C et ne peut pas croître à 6.5 % de NaCl et pH = 9,6 (De Roissart et Luquet; 1994).
-Les lactocoques peuvent être isolées du lait au des végétaux, elles forment un groupe distinct des autres espèces qui sont soit pathogènes pour l’homme (Sc. pyogenes) ou pour les animaux (Sc. agalactiae) soit saprophytes de la cavité orale (Sc. mutans, Sc. salvarius) ou de l’intestin (Sc. faecalis) etc... Dans la nouvelle classification ce genre est appelé Lactococcus.
Ces différences, principalement, entre elles par la présence d’un antigène de groupe dit antigène de Lancefield et par leur capacité de croître à des températures extrêmes 45°C pour les espèces thermophiles, 10°C pour les espèces mésophiles.
Des critères moléculaires permettent aussi de les distinguer.
La composition de leur peptidoglycane (PTG, variable) selon la nature de la liaison peptidique, la composition de leur ADN, mesurée par le GC% l’homologie de séquence de leur génome mesurée par hybridation ADN- ADN.
En milieu solide : elles forment des colonies blanchâtres.
En milieu liquide : la croissance est fréquemment absente près de la surface du milieu.
22 Analyse bibliographique
Figure 4: Aspect microscopique de Streptococcus thermophilus (Vue au microscope électronique) http://genome.jgi-psf.org/draft_microbes/strth/strth.home.html
Figure 5: Aspect microscopique de Streptococcus thermophilus
Figure 6 : Lactobacilles et Streptocoques colorés au bleu de méthylène et observés au microscope optique (x100)
23 Analyse bibliographique 4.2.5. Enterococcus
Les Enterococcus sont des coques gram +, catalase -, "solides" possédant un Ag du groupe D de nature acide teichoïque. Ils sont hôtes fréquents de l'intestin. Les infections provoquées sont en particulier : des infections du tractus urinaire comme E. coli, mais moins fréquemment. des endocardites. Ils sont très résistants aux Ab en particulier à toutes les céphalosporines. Dans l'ordre on trouve comme pathogènes : E. faecalis 79,6 % E. faecium 13,0 % E. durans 6,0 % E. avium 1,4 %
Le genre Enterococcus est placé dans la famille des "Enterococcaceae" (ordre des "Lactobacillales", classe des "Bacilli", phylum des "Firmicutes", domaine ou empire des "Bacteria" ou des "Eubacteria").
Ce sont des bactéries non sporulés, parfois mobiles (Enterococcus casseliflavus, Enterococcus gallinarum), aéro-anaérobies (anaérobies aérotolérantes), généralement catalase négative (Enterococcus haemoperoxidus produit une catalase après culture sur gélose au sang et une pseudocatalase, conduisant à la présence d'un léger dégagement gazeux, est parfois produite par diverses espèces), généralement homofermentaires (la fermentation du glucose conduit à la formation d'acide lactique), fermentant les sucres sans production de gaz et cultivant avec un optimum thermique de 35 °C.
Les entérocoques sont capables de résister à des conditions hostiles : culture à 10 °C ou à 45 °C, culture à pH 9,6 (ce test semble donner des résultats peu fiables et les résultats ne sont généralement pas disponibles pour les dernières espèces décrites), culture en présence de 40 p. cent de bile, culture en présence de 6,5 p. cent de NaCl, résistance à un chauffage de 60 °C durant 30 minutes. Il existe toutefois de nombreuses exceptions (Guiraud, 1998).
4.2.6. Le genre Lactobacillus
Lactobacillus est le genre principal de la famille des Lactobacillaceae. Il contient de nombreuses espèces qui sont des agents de fermentation lactique intervenant dans de nombreuses industries ou qui sont rencontrées comme contaminants. Il s’agit de bacilles souvent allongés (Fig.6); Gram +, asporulés, parfois groupés en paires ou en chaînes, généralement immobiles. Ils sont catalase - (certains ont une pseudocatalase, mais comme les pédiocoques, sont benzidine-), micro-aérophiles ou anaérobies. Ils sont un métabolisme fermentaire produisant de l’acide lactique. Certaines espèces sont homolactiques, d’autres hétérolactiques produisant des acides volatils, de l’éthanol et du
CO2 à coté de l’acide lactique. Les lactobacilles homofermentaire obligés (exemple : L. delbrueckii utilisent la voie de la glycolyse ; les pentoses et le gluconate ne sont pas 24 Analyse bibliographique fermentés. Parmi les hétérofermentaires, certains sont facultatifs (exemple L. casei) : ils utilisent la glycolyse ou le cycle des pentoses ; les pentoses et le gluconate sont fermentés par l’intermédiaire de ce dernier. Les hétérofermentaires obligés (exemple L. brevis) n’utilisent que le cycle des pentoses. Les lactobacilles exigent pour leur développement des milieux bien adaptés, riche en acides aminés, vitamines et acides gras : ils sont acidophiles. Ils sont généralement peu protéolytiques et peu lipolytiques (Guiraud, 1998).
Habituellement aérobies (anaérobies facultatifs), il existe des souches ou des variants des souches, anaérobies strict. Les Lactobacillus sont immobiles. Ils sont parfois très proches des Streptococcus, Lactococcus ou des Pediococcus malgré la morphologie, qui peut d'ailleurs être coccoïde.
Ils fermentent les hexoses en acide lactique, acide acétique ou éthanol, et en gaz carbonique. Cette production de gaz carbonique à partir des hexoses est la caractéristique principale de ces micro-organismes (Molimard et Spinnler, 1996).
Les espèces du genre Lactobacillus sont caractérisées par l’hétérogénéité de la composition de leur ADN : le GC% varie de 32 à 53% (Kandler and Weiss, 1986).
Le genre Lactobacillus a été subdivisé en 1919 par Orla Jensen en trois groupes et cette classification est encore utilisée en milieu industriel : -groupe Thermobacterium Il comprend les lactobacilles homofermentaires thermophiles qui se développent à 45°C mais pas à 15°C. Les espèces les plus fréquentes dans l’alimentation (lait, yaourts, fromages) sont L .helveticus, L. jugurti , L. bugaricus, L. lactis, L .acidophilus, L. leichamnii, L. delbrueckii, L. kefirofaciens, L. mali, etc. -groupe Streptobacterium Il regroupe les lactobacilles homofermentaires mésophiles qui se développent à 15°C (ils peuvent être occasionnellement hétérofermentaires en fonction du substrat. Il comporte les espèces L .casei qui est le lactobacille prédominant du lait, L plantarum rencontré dans la choucroute, L. curvatus, L. sake, L. acetolerans, L. graminis, L .rhamnosus, etc. -groupe Betabacterium
Il comprend les lactobacilles hétérofermentaires. Les espèces les plus fréquentes dans l’alimentation sont L. fermentum, L. buchneri, L .hilgaridii, L. sanfrancisco, etc (et Guiraud, 1998 Bottazi, 1998).
Les lactobacilles contaminent fréquemment les produits alimentaires. Ils ne sont jamais pathogènes. Dans les viandes, les lactobacilles provoquent le verdissement par action du l’H2O2 qui transforme l’hémoglobine en choléglobine. L. brevis, casei et plantarum ont une action défavorable dans la bière ainsi que dans d’autres fermentations de grains pour la production d’alcool (whisky). L. casei et plantarum altèrent aussi les jus sucrés. Dans le cidre, un mauvais goût du à l’acétate est provoqué par L. brevis, plantarum, mali, etc. Dans les produits conservés par des acides (pH 3,5-3,8 ; 4-5% d’acétique), L. acetotolerans et
25 Analyse bibliographique d’autres lactobacilles (plantarum, buchneri, brevis, delbrueckii, casei ou fructivorans) peuvent résister et causer des altérations.
Les lactobacilles sont très utilisés dans l’industrie, en laiterie, fromagerie, dans la fabrication de la choucroute et interviennent dans les saumures et charcuteries. Dans les yaourts, L. bulgaricus forme des peptides utilisés par S. thermophilus qui forme de l’acide formique qui est capable de le stimuler (synergie). L’arôme du yaourt est du à l’acétaldéhyde formé à partir de thréonine par l’aldolase de L. bulgaricus.
Divers lactobacilles (L. casei, plantarum, brevis, buchneri, etc.) interviennent pendant l’affinage des fromages. L. helveticus, lactis et bulgaricus agissent avec S. thermophilus dans les fromages à pâte cuite. Dans le kéfir, Lactobacillus kefyr, L. kefiranofaciens et d’autres lactobacilles mésophiles interviennent à coté de Candida kefir, d’autres levures, de Leuconostoc et de bactéries acétiques. Le rôle des lactobacilles est également important dans les végétaux fermentés. Dans les ensilages, il y a d’abord intervention des coliformes qui utilisent l’oxygène, puis de Leuconostoc et d’entérocoques, enfin de pédiocoques et de lactobacilles (L. plantarum, casei, brevis, curvatus, buchneri, acidophilus, graminis, etc.).
Dans la choucroute, on observe une succession de flore avec L.brevis puis plantarum, curvatus, sake, etc. Dans les cornichons on trouve Lactobacillus plantarum et brevis au coté de Leuconostoc mesenteroides, Enterococcus faecalis, Pediococcus cerevisiae. Dans le vin, les lactobacilles participent à la fermentation malo-lactique (L. plantarum et brevis) (Guiraud, 1998).
L'isolement est difficile et utilise un milieu particulier le milieu MRS en anaérobiose. Ce sont en effet des bactéries qui ont besoin de très nombreux facteurs de croissance (auxotrophie) et qui ne sont que capables de fermentation (homolactique ou hétérolactique). Elles ne sont pas capables de se développer en présence de peptones seules.
L'identification peut être faite par galerie API 50 CH avec un milieu spécial d'inoculation. La galerie API 20 A permet d'identifier des Lactobacillus anaérobies stricts.
Les habitats naturels des espèces de ce genre sont : lait fermenté, fromage. Dans un milieu liquide, elles donnent un trouble après incubation pendant 24 h à 32°C ou 45°C selon les espèces (Garvie, 1984).
Quelques espèces de lactobacilles sont utilisées industriellement pour la production du yaourt, de la choucroute, des pickles et d'autres aliments fermentés, ainsi que pour l'ensilage. Le pain au levain est fabriqué en utilisant une « culture de départ » qui est une culture symbiotique de levures et de bactéries lactiques cultivées dans un milieu constitué de farine et d'eau. Quelques boissons au yaourt contiennent des lactobacilles comme complément alimentaire. Le kimchi coréen est également fabriqué en utilisant des techniques de fermentation par l'acide lactique. Beaucoup de lactobacilles ont ce caractère exceptionnel parmi les être vivants qu'ils n'exigent pas de fer pour leur croissance et qu'ils ont une tolérance très haute envers l'eau oxygénée. Certains lactobacilles, particulièrement L. casei et L. brevis, sont parmi les plus communs des organismes qui altèrent la bière.
26 Analyse bibliographique Beaucoup de lactobacilles ont ce caractère inhabituel qu'ils opèrent en se servant du métabolisme homofermentatif (c'est-à-dire qu'ils ne produisent que de l'acide lactique à partir des sucres), et qu'ils sont aérotolérants en dépit de l'absence complète d'une chaîne respiratoire. Cette aérotolérance est dépendante du manganèse et a été étudiée (et expliquée) dans le cas du Lactobacillus plantarum. a.a Lactobacillus casei
Lactobacillus casei a été découvert il y a plus de 70 ans. C’est un probiotique ajouté dans les laits fermentés. On en distingue plusieurs souches : L. casei defensis, L. casei Shirota…Ils peuvent être ajoutés aux yaourts et laits fermentés. (LC1, Actimel, Yakult…)
Lactobacillus casei est un probiotique qui a des effets bénéfiques notamment sur les défenses naturelles. L’Agence française de sécurité des aliments a aussi reconnu qu’Actimel avec son L casei Defensis "participe à renforcer les défenses naturelles de l’organisme" dans le cadre d’une consommation quotidienne. a.b Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus delbrueckii bulgaricus (L. bulgaricus) est une bactérie à Gram positif à faible pourcentage en GC. Ce lactobacille fermente les sucres majoritairement en acide lactique et à ce titre appartient au groupe des bactéries lactiques. L. bulgaricus est l'une des 2 bactéries nécessaires à la fabrication des yaourts et laits fermentés, elle a un rôle essentiel dans le développement des qualités organoleptiques, hygiéniques et peut-être probiotiques de ces aliments (Fig. 7). En France, la consommation annuelle de yaourts atteignait 19.6 kg par habitant en 1998. On perçoit de ce fait l'intérêt économique majeur de ce lactobacille.
Figure 7 : Aspect microscopique de Lactobacillus bulgaricus
Comme son nom l’indique, cette bactérie aurait d’abord été utilisée en Bulgarie. A l’instar de Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus est utilisé depuis que l’homme fait fermenter le lait, soit plus de 7000 ans.
Lactobacillus bulgaricus est l’un des probiotiques obligatoirement utilisés pour produire des yaourts, avec son compagnon Streptococcus thermophilus.
27 Analyse bibliographique Lactobacillus bulgaricus est une bactérie qui travaille en synergie avec S. thermophilus dans la production des yaourts. Celle-ci produit l’acide lactique à partir du lactose et est essentielle pour le goût des yaourts. Son effet bénéfique pour l’homme (qui lui vaut la dénomination de probiotique) est d’améliorer la digestion du lactose et de diminuer ainsi les problèmes d’intolérance.
4.3. Origine et habitat des bactéries lactiques :
En général, les bactéries lactiques peuvent être isolées du lait, des végétaux et des aliments. Ces bactéries s’avèrent généralement sans danger et même bénéfiques à la santé lorsqu’elles sont ingérées vivantes et en nombre élevé (Luquet, 1994).
Les espèces du genre Streptococcus :
Ils sont isolés à partir du lait chauffé à 45-50° C du lait pasteurisé et des produits laitiers (yaourt). Ils sont trouvés également dans le matériel de la laiterie et dans le vin. Ils ne sont jamais isolés dans d’autres habitats (Desmazeaud, 1992).
Les espèces du genre Lactococcus :
Ils sont isolés à partir du lait ou des végétaux. Ainsi Lactococcus lactis subp lactis fut isolée la première fois par LISTER en 1873 du lait fermenté, nommé Bacterium lactis et reconnus comme agent primaire de l’acidification du lait caillé.
Lactococcus lactis subp cremoris serait plus exclusivement adaptée au lait (Desmazeaud, 1992).
Les espèces du genre Leuconostoc :
On les isole du lait, des produits laitiers, des fruits, des légumes, en particulier, de la betterave, d’où leur ancien nom de Betacoccus, des végétaux en fermentation : par exemple de la choucroute des produits de la panification et des solutions visqueuses de sucre dans les sucreries .
Les espèces du genre Lactobacillus :
Les Lactobacillus de par leur variété sont présents dans des milieux très différents. Les espèces mésophiles Lactobacillus casei subp, Lb plantarum, Lb curvatus, Lb brevis sont caractérisées par un large spectre de fermentation et sont présentes dans le lait et dans des fromages (Leveau et Bouix, 1993).
Les espèces du genre Pediococcus :
Les différentes espèces sont présentes dans des végétaux en décomposition, parfois dans les boissons comme la bière et le vin. Elles peuvent être retrouvées aussi dans les produits carnés frais ou naturels dans le lait et les produits laitiers (Garvie, 1986).
28 Analyse bibliographique
Tableau 9 : Les principaux caractères de Leuconostoc (Novel, 1993, Larpent, 1996).
Caractères Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc Leuconostoc Leuconostoc Biochimiques mesenteroides dextranicum cremoris paramesenteroides lactis oenos Culture à 10°C + + + + + + ــ + + ــ + + Culture à 37°C ــ + ــ ــ ــ ــ Culture à 39°C ــ ــ ــ ــ ــ ــ Culture à 45°C Hétérofermentation + + + + + + + + ــ + ــ ــ Citratase ــ ــ ــ ــ + + Formation de dextrane ــ ــ ــ ــ ــ ــ Arginine dihydrolase
Tableau 10: Caractéristiques des espèces du genre Pediococcus (Larpent et Larpent, 1990, Novel, 1993).
Caractères
Biochimiques Pc Pc Pc Pc Pc Pc Pc parvulus detrinicus inopinatus halophilus acidilactici pentosaceus Urinae_equi Pediococcus Pediococcus damnosus Morphologie ND ND ND 0,8-1µm 0,6-1µm 0,6-0,8µm 0,8- 1µm ND
Type d’acide lactique produit DL DL DL DL ²DL L (+) L (+) L (+) Croissance à pH: 4,2 + + - + + - - - Croissance à pH : 7,5 - + ± + + ± + - Croissance à pH: 8,5 - - - ± ± + + - Croissance à 35°C - + + + + + + + Croissance à 40°C - + - + + - + + Croissance à 45°C - - - - + - - - Croissance à différente concentration de NaCl 4 % - + + + + ± + + 6,5 % - + - + + + + - Homofermentation + + + + + + + + Diacétyl + - - - + - ND - Hydrolyse de l’arginine - - - + + - - -
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4.4. Intérêt des Bactéries Lactiques en Alimentation
Les bactéries lactiques appartiennent à un groupe de bactéries bénéfiques, dont les vertus se ressemblent, et qui produisent de l’acide lactique comme produit final du processus de fermentation. Elles sont partout dans la nature, et se trouvent aussi dans le système digestif de l’homme. Si elles sont surtout connues pour le rôle qu’elles jouent dans la préparation des laitages fermentés, elles sont utilisées également dans le saumurage des légumes, la boulangerie, la fabrication du vin, le saurissage des poissons, des viandes et des salaisons.
Leur " fabrication " implique une fermentation, processus microbien par lequel le lactose (le sucre du lait) est transformé en acide lactique. En s’accumulant dans le lait, l’acide lactique modifie les protéines et, par conséquent, la texture du lait. Les qualités et les aspects particuliers qui caractérisent les différents produits sont dus à d’autres variables telles que la température ou la composition du lait.
C’est l’acide lactique qui donne aux laitages fermentés cette saveur légèrement aigrelette caractéristique. D’autres sous-produits des bactéries lactiques donnent saveurs et arômes supplémentaires. Par exemple, l’acétaldéhyde donne au yaourt son arôme si caractéristique ; le diacétyl donne une saveur crémeuse à d’autres laitages fermentés.
4.4.1. Les bactéries lactiques, des acteurs précieux de l’industrie alimentaire
Si les bactéries lactiques sont indissociables de la fermentation du lait en yaourts ou en fromages, elles interviennent aussi dans la vinification, la salaisonnerie ou la boulangerie. Depuis plus de 50 ans, les mesures d’hygiène et l’industrialisation de la transformation laitière avec utilisation de ferments sélectionnés contribuent à réduire le potentiel biologique - microbien et enzymatique - du lait dont le rôle est déterminant dans la typicité des produits. Les collections de microorganismes, dans lesquelles l’industriel peut trouver des souches aux propriétés connues voire originales, sont indispensables pour l’avenir de l’industrie laitière. Elles sont également des outils essentiels pour la recherche, à condition que les souches soient facilement identifiables et accessibles.
4.4.2. Principales activités microbiennes dans le lait
Les bactéries lactiques sont connues par leur production de bactériocines, agents antimicrobiens naturels, et de polysaccharides exocellulaires par les bactéries lactiques. Dans le but de mieux contrôler et d’accélérer la maturation fromagère, les chercheurs s'intéressent au rôle joué par les bactéries du genre Lactobacillus et les enzymes impliquées dans l'affinage du fromage cheddar. Des efforts importants sont consentis en vue d'identifier les peptides amers et astringents du fromage et de
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caractériser les aminopeptidases qui jouent un rôle prépondérant dans la disparition de l'amertume. Finalement, les chercheurs optimisent actuellement un procédé de maturation accélérée du fromage mis au point récemment et implanté en industrie.
5. Le yaourt
Le yaourt est un lait de vache, de chèvre ou de brebis fermenté. Il forme un caillé plus ou moins liquide, légèrement acide. Ce lait fermenté est obtenu par l'action de deux bactéries lactiques : Lactobacillus bulgaricus qui apporte au yaourt son acidité et Streptococcus thermophilus qui développe les arômes. (FAO, 1975). Leurs bactéries doivent obligatoirement être ensemencées simultanément et se trouver vivantes dans le yaourt au nombre d’environ 108 bactéries vivantes par gramme (Vignola, 2002).
Cette fermentation conduit à la prise en masse du lait. Le coagulum obtenu est ferme, sans exsudation de lactosérum. Il peut être consommé en l'état coagulé ou après brassage lui donnant une consistance crémeuse ou liquide. Il peut aussi être congelé et consommé comme une glace.
Les produits finaux doivent être maintenues jusqu’à leur consommation à une température comprise entre 0°Cet 6°C pour que les bactéries lactiques restent vivantes (Syndifrais, 2002).
Le Code des principes FAO/OMS a publié deux normes relatives aux yaourts:
la norme n° A- 11 (a) (1975) pour le yaourt nature et le yaourt sucré;
la norme n°A- 11 (b) (1976) pour le yaourt aromatisé et les produits traités thermiquement après fermentation.
Le Codex Alimentarius, norme n° A- 11 (a) (1975) définit ainsi le yaourt: «Le yaourt est un produit laitier coagulé obtenu par fermentation lactique grâce à l'action de Lactobacillus bulgaricus et de Streptococcus thermophilus à partir du lait frais ainsi que du lait pasteurisé (ou concentré, partiellement écrémé, enrichi en extrait sec) avec ou sans addition (lait en poudre, poudre de lait écrémé, etc.). Les microorganismes doivent être ensemencées simultanément et se trouver vivantes dans le produit fini, à raison d’au mois 107 de bactéries par gramme rapportée à la partie lactée. La quantité d’acide lactique libre contenu dans le yaourt ne doit pas être inférieure à 0.7 g pour 100 g lors de la vente de consommateur (soit 70°D minimum) (Mahaut, 2000 ; Dehove, 2002 et Vignola, 2002).
La législation de nombreux pays exige que les bactéries du yaourt soient vivantes dans le produit mis en vente. D'autres pays admettent qu'à la suite d'un traitement thermique destiné à améliorer la durée de conservation, le produit ne contienne plus de bactéries
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vivantes. Cette pratique n'est pas recommandable, car elle modifie les propriétés du yaourt (FAO, 1998).
5.1. Fabrication
La fabrication du yaourt est relativement simple. Elle peut se faire de manière artisanale, à la maison ou de manière industrielle.
Le yaourt est fabriqué à partir de lait (entier, demi-écrémé ou écrémé), généralement de vache (mais aussi de brebis, de chèvre, de soja, etc.) ; celui-ci est pasteurisé, et souvent enrichi avec du lait en poudre. Le yaourt aura ainsi une teneur en protéines et en calcium plus importante que du lait normal. Puis, deux bactéries sont ajoutées pour la fermentation :
Streptococcus thermophilus (43 °C)
Lactobacillus bulgaricus
Les préparations laitières faites sur le même principe mais avec d'autres bactéries (Bacillus bifidus...) n'ont pas en France le droit d'être appelés « yaourt ».
Le schéma de la figure 8 résume les principales étapes de la fabrication du yaourt. Celle-ci peut subir des variantes de sorte que les étapes indiquées peuvent faire l'objet de modifications dans leur ordre comme dans leur nombre.
La figure 10 montre qu'il existe deux types de yaourts:
le yaourt ferme ou traditionnel, dont la fermentation se fait après conditionnement en pots;
le yaourt brassé, dont la fermentation se fait en cuve; le coagulum obtenu est alors dilacéré et brassé pour être rendu plus ou moins visqueux, puis conditionné en pots.
La technologie donnée ci-après concerne le lait de vache; elle peut s'appliquer sans difficultés au lait d'autres espèces utilisées seul ou en mélange.
La technologie de fabrication diverge alors en fonction du type de yogourt produit.
Yoghourt ferme
Le lait ensemencé est directement conditionné dans les emballages destinés aux consommateurs. Ces pots de Yoghourt sont incubés en chambre chaude (43°C) pendant la fermentation (2h 30 min à 3h) jusqu’à formation du caillé (environ 0.9g ac. lactique /100g), puis placés en chambre froide ou tunnel de réfrigération (2°C), pendant environ 1 à 2 heures afin d’abaisser la température du produit de 43°C à
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moins de 6°Ce refroidissement rapide permet de bloquer l’acidification. Ensuite, les yoghourts sont stockés en chambre froide à 4°C.
Yoghourt brassé
Le lait ensemencé est transféré dans un tank de fermentation où le gel une fois formé est brassé au moyen d’agitateur. La pâte obtenue est soutirée, refroidie dans des échangeurs thermiques à 4°C, puis conditionnée après ajout éventuel de pulpes ou de fruits. Ce yoghourt est ensuite stocké dans une chambre froide (Asshe, 1996).
5.2. La composition chimique du yaourt :
La réglementation rapporte une autre classification qui est en relation avec la composition chimique des produits:
- yaourt maigre contenant au maximum 1% de matière grasse.
- yaourt partiellement écrémé contenant entre (1 et 3%) de matière grasse.
- yaourt entier contenant au maximum 3% de matière grasse.
La matière sèche non grasse doit atteindre pour les trois types de yaourts 8,2% en points (Guyot, 1992).
5.3. Procédés de fabrication du yaourt :
La fabrication du yaourt comporte plusieurs étapes sont :
5.3.1. Préparation du lait :
Le lait livré à l’usine est plus ou moins écrémé pour faire, selon les cas, des yaourts maigres, des yaourts au lait entier,
On ajoute de la poudre de lait ou du lait concentré pour donner au yaourt une consistance plus ferme.
Ce traitement a de multiples effets sur la flore microbienne ainsi que sur les propriétés physico-chimiques et fonctionnelles du lait. Tout d’abord, il crée des conditions favorables au développement des bactéries lactiques. Il détruit les germes pathogènes et indésirables (Boudier, 1990).
L’extrait sec du lait est un facteur important dans la préparation car il donne une meilleure consistance et en meilleur goût au produit fini. Ainsi, les protéines améliorent sensiblement la texture et masquent l’acidité. D’autre part, la matière grasse donne une saveur douce et crémeuse au produit (Luquet, 1990). Il est possible de renforcer l’extrait sec de lait de deux façons.
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5.3.2. Addition de poudre :
Le lait est enrichi de poudre de lait écrémé jusqu'à atteindre des taux d’extrait sec dégraissé de l’ordre de 14-16% (Bourgeois, 1996).
5.3.3. Concentration du lait :
Une méthode simple à intégrer dans une ligne de fabrication continue mais elle est plus chère que la première (Assche, 1996). Elle consiste à adapter un évaporateur qui élimine l’eau à l’aide d’une pompe à vide (Bourgeois, 1996).
5.3.4. Homogénéisation :
C’est une étape très importante qui permet la rupture des globules gras de tailles différentes présentes dans le lait en très petites particules uniformes (Ebenezer, 1986). Selon Kurman, la température ne doit pas être trop élevée lors de l’homogénéisation (55°C-60°C) sous une pression de 200 atmosphères (Luquet, 1990) mais actuellement cette opération s’effectue à des températures de (85°C-90°C) (Guyot, 1992).
5.3.5. Traitement thermique :
La préparation du lait terminé, celui-ci est soumis sans atteindre à un traitement thermique, il a pour tant :
- Détruite les microorganismes peuvent être présents et la plus grande partie de la flore banale, il permet aussi la suppression éventuelle d’inhibiteurs naturels et la stimulation des bactéries par l’apparition de facteurs de croissance.
- Dénaturer une partie importante des protéines soluble pour augmenter la capacité de rétention d’eau du yaourt et de permettre à ces protéines de se fixer sur la caséine (Lemonier, 1989).
5.3.6. Pasteurisation :
La réglementation impose la présence de seulement deux bactéries dans le yaourt. La pasteurisation permet de détruire tous les autres microbes qui pourraient être présents dans le lait. Par ailleurs, la pasteurisation modifie les protéines du lait (les caséines en particulier) afin de fixer l’eau du lait.
La pasteurisation consiste à appliquer un traitement thermique de (90°C pendant cinq minutes) permettant :
- La destruction de tous les germes pathogènes et la réaction de la flore indésirable (bactéries, levures, moisissures) ainsi que l’inactivation des 8 globulines et certains enzymes (phosphatase, peroxydase).
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- La stimulation de la croissance des bactéries lactiques par la formation de facteurs de croissance tel que l’acide formique.
- Amélioration de la texture de yaourt par la dénaturation de 85 des protéines constitutives des caséines (Luquet, 1994).
5.3.7. Refroidissement :
S’effectue par l’ajustement de la température à un point auquel le levain lactique peut être ensemencé. Généralement, l’abaissement de la température est préféré à (105°- 110°F) donnant un corps doux et uniforme (Ebernezer, 1986).
5.3.8. Ensemencement :
Le lait enrichi et traité thermiquement est refroidit à 45°C, température idéale pour la vie des bactéries (Loones, 1994). Leur inoculation se fait à un taux élevé variant de 1% à 7% pour un ensemencement indirect avec un ratio Streptococcus thermophilus/Lactobacillus bulgaricus de 1.2 à 2 pour les yaourts nature et pouvant atteindre 10 pour les yaourts aux fruits (Boudier, 1990, Mahaut et al., 2000). L’ensemencement direct à partir de bactéries lactiques concentrées congelées se fait à des taux de l’ordre de 0.03% (Tableau 11).
C’est l’apport des deux catégories suivantes de bactéries lactiques vivantes qui provoquent la fermentation du lait :
Lactobacillus bulgaricus qui apporte au yaourt son acidité ; Streptococcus thermophilus qui développe les arômes.
Une obligation pour les yaourts : leurs bactéries doivent être ensemencées simultanément et se trouver vivantes dans le produit fini, à raison d’au moins 10 millions de bactéries par gramme de yaourt. La multiplication des bactéries du yaourt à différentes températures.
5.3.9. Conditionnement :
Deux types de matériaux d’emballage sont couramment utilisés pour la confection des pots de yaourt a savoir le verre et le plastique qui est particulièrement développé pour des raisons économiques, ces pots sont produits dans des conditions d’hygiène rigoureuses.
5.3.10. Etuvage :
Au cours de cet étape on assiste au développement de l’acidité du yaourt celle-ci est sous la dépendance de la température et la durée de fermentation des germes ensemencés.
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Ainsi, il est préférable d’appliquer une température proche de celle optimale de développement de Streptococcus salivarus subsp. thermophilus (42 à 45°C), plutôt qu’elle proche de l’optimum de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus (47 à 50°C) pour les raisons évoquées précédemment la température voisine de (42 à 45°C) est considérée comme étant la température symbiotique optimum entre les deux bactéries.
5.3.11. Arrêt de la fermentation : (réfrigération)
L’action du froid à 4°C freine puis suspend la fermentation et donc l’acidification en inhibant le développement des bactéries lactiques lorsque l’acidité atteint un certain seuil de 70 à 80°D.
Dans le cas du yaourt étuvé, et de 100 à 120°C dans le cas des yaourts brassés, le yaourt est soumis à un refroidissement (De Roissart et Luquet, 1994).
5.4. Contamination et défaut du yaourt
Le traitement thermique du lait de yaourt avant la fabrication étant suffisant pour détruire les micro organismes sporulés pathogènes ou non, la présence de ces germes dans le yaourt peut être que accidentelle, mais il est à noter qu’un yaourt à un PH inférieur ou égal à 4,0 (donc contenant environ 1 d’acide lactique).
En ce qui concerne les microorganismes pathogènes, les levures et les moisissures sont capables de se développer dans le yaourt.
Le traitement thermique du lait relativement important est suffisant pour détruire les levures et les moisissures.
Les principaux défauts du yaourt sont résumés dans le tableau N° 11 :
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Lait standardisé pasteurisé
Traitement thermique
Standardisation du mélange
Homogénéisation
Traitement thermique
Retenue
Refroidissement
Inoculation
Fruits dans contenant Fermentation en bassin
Dosage du mélange Refroidissement
Incubation en chambre Lissage
Refroidissement Mélange des fruits
Yogourt ferme Yogourt brassé
Fig. 8: Diagramme des principales étapes dans la fabrication du yaourt (Selon Vignola, 2002).
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Tableau 11 : Principaux défauts de yaourt
Défaut Cause Défauts d’apparence Cause Défaut du goût Cause
-Sur acidification ou -Longue conservation. post acidification. Agitation ou vibration pendant le -Forte activité Décalottage décantation -Température élevée Amertume transport protéolytique. pendant le stockage. -Trop d’arôme. -Refroidissement lent. -ensemencement trop faible. -Sur acidification. -Absence d’arômes. Manque de -mauvaise incubation. Synérèse -Teneur trop faible en Goût plat -Mauvaise activité des fermeté -matière sèche trop faible. matière sèche. levains.
-Contamination par les -Mauvais ferments -Contamination par les Trop filant Production de gaz levures ou les Goût levuré -Température d’incubation faible. levures. moisissures. -Chauffage du lait. -Mauvaise ou absence -Mauvaise activité des -Homogénéisation à température d’homogénéisation. levains. Texture élevée. Couche de crème Manque d’acidité -Incubation trop courte. sableuse -Poudrage trop fort. -Faible taux -Acidification irrégulière et faible. d’ensemencement.
Texture -Faible teneur en matière grasse. -Traitement thermique Goût de cuit granuleuse -Mauvais choix de ferments trop poussé.
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5.5. La fermentation
Les deux espèces Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus vivent en symbiose et en synergie. Lors de leur croissance les deux bactéries associées ont pour rôle principal d'abaisser le pH du lait au point isoélectrique de la caséine (pH 4,6) de façon à former un gel (ou coagulum). Outre le goût acidulé qu'elles donnent au gel, elles lui assurent une saveur caractéristique due à la production de composés aromatiques (acétaldéhyde principalement, cétone, acétoïne, diacétyle). Enfin, par la production de polysaccharides (glucanes), certaines souches ont une action dans la consistance du gel (Ott et al., 1997).
Lactobacillus delbrueckii subp. bulgaricus, ne produit que de l'acide lactique au cours de la fermentation du lactose. Il se développe bien à la température de 45 à 50 °C en acidifiant fortement le lait jusqu'à 1,8 pour cent (pH voisin de 4,5), voire, avec certaines souches, jusqu'à 2,7 pour cent d'acide lactique (pH 3,8 à 3,6).
Streptococcus salivarius, subsp. thermophilus, se développe bien de 37 à 40 °C, mais croît encore à 50 °C. Thermorésistant, il survit au chauffage à 65 °C pendant 30 minutes ou à 74 °C pendant 15 secondes. Nettement moins acidifiant que le lactobacille, il produit généralement de 0,5 à 0,6 pour cent d'acide lactique (pH voisin de 5,2). Certaines souches sont capables de supporter un pH de 4,3 à 3,8.
Le lait ensemencé, éventuellement additionné de sucre ou d’arômes naturels, est versé dans les pots de yaourts.
Les pots sont fermés et mis en étuve à une température de 43°C à 45°C pendant 2 à 3 heures pour fermentation.
Les bactéries se reproduisent par millions (tableau 12) et transforment alors une partie du sucre contenu dans le lait en acide lactique. Cette transformation s’appelle la fermentation lactique. La production d’acide lactique acidifie le lait, ce qui entraîne sa coagulation et le développement des arômes. Les pots sont ensuite refroidis entre 2°C et 4° C.
Pour se développer, les bactéries ont besoin d'acides aminés et de peptides directement utilisables. Or, le lait n'en contient que de faibles quantités permettant seulement de démarrer leur croissance. Ensuite, le lactobacille, par son activité protéolytique, attaque la caséine qui libère les peptides permettant au streptocoque de poursuivre sa croissance. De son côté, le streptocoque stimule le lactobacille par production d'acide formique. Lorsque l'on ensemence du lait avec les bactéries du yaourt, le pH (6,6-6,8) est favorable au streptocoque qui assure le départ de la fermentation lactique. L'acidité, en se développant, devient défavorable au streptocoque qui est alors relayée par le lactobacille qui poursuit son activité fermentaire jusqu'à un pH d'environ 4.34.
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Le streptocoque produit de l'acide lactique principalement sous la forme L(+), alors que le lactobacille donne surtout la forme D(-). A la fin de la fermentation, le tiers environ du lactose est transformé en acide lactique. Dans la fabrication du yaourt, l'utilisation du lactose se fait selon la voie suivante: une lactose hydrolyse le lactose en ß-galactose et en D-glucose. Ce dernier est ensuite transformé en acide pyruvique puis en acide lactique pendant que le galactose s'accumule progressivement dans le lait sans être utilisé. Ainsi, dans un lait à 6,5 pour cent (en poids) de lactose, 100 g du yaourt obtenu contiennent environ, après 2 jours de conservation, 4 g de lactose, 0,05 g de glucose, 0,05 g d'oligosaccharide et 1,5 g de galactose.
Tableau 12: Evolution du taux des lactobacilles et Streptocoques au cours de la fermentation
Température en °C (lactobacilles), en millions (streptocoques), en millions 30 834 66 35 1042 97 40 1105 221 42 1363 604 45 906 636 50 221 275
5.6. Aspect et texture
La production d’acide lactique par les bactéries a pour effet de diminuer le pH du lait. Dès que celui-ci atteint le point isoélectrique de la caséine (pH : 4,6), il y a formation d’un caillé dont la fermeté et la viscosité sont fonction, entre autres facteurs, du pH final et de l’activité protéolytique des souches. La viscosité du produit fini peut varier dans un rapport de 1 à 8 selon la souche de Sc. thermophilus et de 1 à 6 selon la souche de Lb. delbrueckii subsp.bulgaricus (Bouillanne et Desmazeaud, 1980 ; 1981).
Certaines bactéries lactiques produisent des polysaccharides qui jouent le rôle d’agents de texture et donneront au produit fini son caractère onctueux ou filant. La production de polysaccharide a été mise en évidence avec Lb.debruckii ssp.bulgaricus (Cerning et al., 1986)., ainsi qu’avec Sc. thermophilus (Cerning et al., 1988). Elle est variable suivant les souches utilisées. Les polysaccharides reliés aux micelles de caséine augmentent le pouvoir de rétention d’eau du caillé lactique et protégent ce dernier contre les traitements mécaniques durant la fabrication (pompage, réfrigération…).
Les principaux défauts de texture dont sont responsables les bactéries lactiques sont :
-la présence de sérum en surface de caillé (acidification trop forte ou trop faible donnant un gel fragile),
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-une texture trop filante (bactéries excessivement filantes ou déséquilibre entre souches),
-une texture liquide (acidification _insuffisante par défaut de croissance des bactéries),
-une texture hétérogène : présence de points blancs, texture granuleuse, texture sableuse en bouche (mauvais choix des souches et des paramètres technologiques).
5.7. Propriétés physico-chimiques et comportement des composés d’arôme
Si l’acétaldéhyde et le composé aromatique le plus caractéristique de la flaveur du yogourt, d’autres molécules intervenant dans la note aromatique ont également été identifiés (Tableau 13). Les quantités des principaux composés de l’arome varient de 1 à 4 pour l’acétaldéhyde et de 1 à 10 pour l’acétone suivant les souches utilisées. L’acétaldéhyde est principalement produit par Lactobacillus delbrueckii spp bulgaricus à partir de la thréonine, réaction catalysée par la thréonine aldolase (Marchall et al., 1983).
thr. aldolase CH3-CHOH-CHNH2-COOH NH2-CH2-COOH + CH3-CHO thréonine glycine acétaldéhyde
Tableau 13 : Quantités moyennes des principaux composés de l’arôme du yogourt (Degorge-Dumas et al., 1986)
Arôme Acétoïne Acétaldéhyde Acétone Ethanol Diacétyle Moyenne de 18 20.3 ppm 12.42 ppm 0.66 ppm 0.50 ppm 0.32 ppm Echantillons Etendues des (13.5 à (4 à 16.9) (0.18 à 1.94) (0.2 à 1.2) (0.2 à 0.5) valeurs 28)
5.7.1. Composés aromatiques
Divers composés volatiles et aromatiques interviennent dans la saveur et l'appétence du yaourt. C'est principalement le lactose qui joue un rôle dans la formation de ces composés. Parmi ceux-ci, outre l'acide lactique qui confère au yaourt son goût acidulé, c'est l'acétaldéhyde qui joue le rôle principal. Il provient en grande partie de la transformation de la thréonine. Sa concentration optimale est estimée à environ 10 ppm. Sa production est due principalement au lactobacille; elle est augmentée lorsqu'il est en association avec le streptocoque qui en élabore de faibles quantités.
Le diacétyle contribue à donner un goût délicat 11 est dû à la transformation de l'acide citrique et, secondairement, du lactose par certaines souches de streptocoques D'autres composés (acétone, acétoïne, butane-2-one, etc.) contribuent à l'équilibre et à la finesse de la saveur. Celle-ci résulte d'un choix avisé des souches, de leur capacité à produire
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dans un juste rapport les composés aromatiques et du maintien de ce rapport au cours de la conservation des levains et de la fabrication.
La saveur caractéristique du yaourt, recherchée dans le produit «nature», est, en partie, masquée dans les yaourts aromatisés, de sorte qu'on lui accorde moins d'importance, ce qui semble être une erreur.
5.8. Polysaccharides
La texture et l'onctuosité constituent, pour le consommateur, d'importants éléments d'appréciation de la qualité du yaourt.
Certaines souches bactériennes produisent, à partir du glucose, des polysaccharides qui, en formant des filaments, limitent l'altération du gel par les traitements mécaniques et contribuent à la viscosité du yaourt.
5.9. Structure et texture du yaourt
La maîtrise du comportement rhéologique du yaourt est nécessaire pour appréhender la qualité en terme de texture des produits finis. En effet, lors des étapes de fabrication, le yaourt subit des contraintes (cisaillement lors des brassages, pompages, variation de température etc.) qui vont influencer sa structure et ses propriétés rhéologiques et qui doivent être maîtrisées.
La structure et la texture du yaourt ont été largement étudiées dans la littérature (Tamime and Robinson, 1999, Sodini et al., 2004). Le yaourt brassé est constituée d’une dispersion concentrée d’agrégats protéiques qui détermine sa structure (van Marle, 1998). Il est défini comme un gel viscoélastique. Son comportement rhéologique est non-newtonien : sa viscosité dépend de la vitesse de cisaillement ou de la contrainte exercée.
Les propriétés physiques des yaourts peuvent être influencées par de nombreux facteurs : la composition du mixe laitier (en protéine mais également en matière grasse) et les traitements physiques thermique et d’homogénéisation, les ferments, les conditions de fermentation, le traitement mécanique lors du refroidissement (incluant brassage, pompage et conditionnement), ainsi que la reprise en texture au cours du stockage.
Pour cette étude, nous avons choisi deux facteurs de variation de la structure et des propriétés rhéologiques des gels : la composition en protéines et le traitement mécanique appliqué au yaourt après fermentation. Dans la partie qui suit, nous aborderons uniquement ces deux facteurs et leur influence sur la structure et les propriétés rhéologiques du produit (Tableau 1).
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5.9.1- Libération et perception des composés d’arôme dans le yaourt brassé
Une molécule d’arôme est définie comme « une molécule organique de faible masse moléculaire (inférieure à 400 g/mol), dont la pression partielle dans les conditions normales de température et de pression, est suffisamment élevée pour que cette molécule soit partiellement à l’état gazeux et puisse, au contact de la muqueuse olfactive provoquer un stimulus » (Richard, 1992).
Les molécules odorantes appartiennent donc à la classe des composés organiques volatils. Elles présentent des structures chimiques très diverses, parmi lesquelles on peut citer les hydrocarbures terpéniques, les alcools aliphatiques et cycliques, saturés et insaturés, les acides organiques, les esters, les cétones, les aldéhydes, les composés soufrés, les lactones, ainsi que divers hétérocycles azotés et oxygénés.
La caractérisation physicochimique des composés d’arôme dans une matrice nécessite la détermination de propriétés thermodynamiques (équilibre aux interfaces) et de propriétés cinétiques (coefficient de diffusion au sein d’une même phase et coefficient de transfert entre deux phases).
Les constituants non volatils du yaourt (protéines, sucres, épaississants…) peuvent interagir avec les composés d’arôme. Ils peuvent déplacer les équilibres thermodynamiques composés d’arôme / matrice et influencer la mobilité des composés d’arôme au sein de la matrice et donc la perception olfactive induite.
Dans cette partie, nous nous focaliserons uniquement sur les interactions entre les protéines laitières et les composés d’arôme et leur conséquence sur la libération des composés d’arôme et la perception olfactive. En effet, le rôle des autres constituants du yaourt et en particulier de la matière grasse sur la libération et la perception des composés d’arôme est largement décrit dans la littérature. Mais la matière grasse ne constitue pas un facteur d’étude choisi dans ce travail, même si cette dernière a un rôle important sur la structure des gels laitiers.
5.10. Consommation
Avec plus de 21 kilos de yaourts par personne en 2005, soit 170 pots chaque année, les Français, qui ont augmenté de 20 % en dix ans leur consommation, sont les plus gros consommateurs en Europe, derrière les Allemands. Le Programme national nutrition santé lancé en 2001 par le gouvernement français recommande la consommation de trois produits laitiers par jour.
5.11. Valeur nutritionnelle d'un yaourt
En plus d'être apprécié pour son goût et sa texture, le yaourt a une valeur nutritionnelle remarquable : un apport énergétique relativement faible (en moyenne 90 kcal pour un pot de 125 g de yaourt nature classique, alors que l'apport en protéines, calcium, phosphore, et riboflavine représente plus de 25 % des besoins journaliers (Tableau 1).
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Tableau 14: Energie, nutriments et composition minérale du yaourt (déterminés pour 100g) (Source : Danone World Newsletter N°2 Octobre 1993) Yaourt de Yaourt de lait Yaourt de Yaourt de lait
lait entier Partiellement écrémé lait écrémé partiellement aux fruits Energie Kj 251-314 188-265 151-233 385-425
Kcal 60-75 45-63 36-56 92-162
Matière sèche 13-19 10-15 9-15 22-26
Protéines 3,3-5,0 3,4-5,2 3,5-5,7 3,3-4,8
Lipides 3,1-4,1 1,1-1,6 0-0,5 1,0-1,6
Carbohydrates 4,5-4,9 4,5-7,0 4,8-7,7 16-19
Calcium (mg) 107-105 121-199 101-183 125-169
Sodium 40-62 48-76 38-76 45-65
Potassium 144-190 171-255 136-240 190-220
Magnésium 9-16 11-19 9-17 10-17
Phosphore 63-135 75-156 60-140 110-140
Fer (mg) 0,03-0,07 0,03-0,09 0,05-0,09 0,06-0,24
Cuivre 0,00-0,03 0,00-0,04 0,00-0,04 0,07
Zinc 0,21-0,59 0,20-0,09 0,25-0,97 0,63-0,82
Manganèse 1,3-4,0 1,2-3,8 1,5-4,8 -
Tableaux 15 : La composition du lait et du yaourt (en grammes) :
POUR 100 g de LAIT POUR 100 g de YAOURT PROTEINES 3 .5 5 LIPIDES 0.1 1 LACTOSE 5 4.5 CALCIUM 0.12 0.18 PHOSPHORE 0.1 0.14 ACIDE LACTIQUE 0 1 BACTERIES 0 0.15
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L’acidité La fermentation lactique du yogourt est de type homofermentaire. L’acidité d’un yogourt est communément exprimée en degré Dornic (0.1 g/l acide lactique) (Kandler and Kunath, 1983). Dans un yogourt, l’acidité recherchée se situe entre 100 et 130°D. Un compromis doit être trouvé d’une part dans le choix des souches, d’autre part dans les valeurs des paramètres de la technologie de fabrication pour obtenir, à la fois une vitesse d’acidification compatible avec les exigences de production industrielle, et une post-acidification faible durant la conservation.
5.12. Les bienfaits du yaourt sur la santé
La présence de 100 à 1050 millions de bactéries vivantes par millilitre de yaourt aurait des propriétés très intéressantes sur la santé de l'homme. De très nombreuses recherches n'ont cependant pas réussi à démontrer très rigoureusement ces observations.
Le yaourt est un élément du fameux régime crétois, apparemment très bénéfique pour la santé. Les ferments lactiques du yaourt contribuent à l’équilibre de la flore intestinale, ils sont d’ailleurs traditionnellement conseillés aux personnes qui suivent un traitement antibiotique (FAO, 1999).
5.12.1. Digestibilité du lait
Environ 75 % des adultes dans le monde digèrent mal le lactose, contenu en grandes quantités dans le lait. En général, cette maldigestibilité du lactose apparaît avec l'âge : l'enzyme béta-galactosidase, nécessaire pour digérer le lactose, devient infonctionnelle. Cela a pour effet des douleurs abdominales, des gaz et/ou des diarrhées lors d'une consommation de lait.
La recherche a réussi à démontrer que l'ingestion de yaourt, plutôt que du lait, diminuait la production d'hydrogène dans le test respiratoire d'hydrogène et atténuait les symptômes. Cet effet est associé aux bactéries vivantes qui lors la fermentation du yaourt, consomment une partie du lactose présent dans le lait pour le transformer en glucose et en galactose et produire de l'acide lactique. La teneur en enzyme aide également à la digestion du lactose dans les intestins. Enfin, la texture du yaourt et sa viscosité permettent un transit plus lent, laissant plus de temps aux enzymes pour la digestion (Syndifrais, 2002).
Cependant, la non tolérance au lactose est variable selon les individus. Elle peut parfois être au point de ne pas pouvoir non plus digérer un yaourt.
5.12.2 Guérison de diarrhées
Le yaourt est un probiotique car il diminue la durée de certains types de diarrhées, en particulier chez l'enfant. L'Organisation mondiale de la santé recommande de remplacer le lait par le yaourt, dans la mesure du possible, au cours du traitement de la
45
diarrhée car il est mieux toléré que le lait et peut contribuer à la prévention de la malnutrition ou à rétablir une nutrition suffisante (Verier Bathelem et Rahe 1996).
5.12.3. Effets immunomodulateurs
Il a été démontré que les yaourts améliorent différents paramètres du système immunitaire chez la souris. Chez l'homme, une étude a mis en évidence une amélioration des symptômes cliniques d'allergie nasale, mais aucune modification des paramètres étudiés.
Le yaourt n'affecte en fait pas le système immunitaire mais il peut conduire à l'augmentation des taux en lymphocytes B et cellules NK naturelles, favorisant ainsi la défense immunitaire.
5.12.4. Diminution du risque de cancer
Une étude épidémiologique récente conduite en France a montré que les personnes consommant du yaourt présentent un risque plus faible de développer des adénomes colo-rectaux importants.
5.12.5. Taux de cholestérol dans le sang
Des études ont montré que la consommation régulière de yaourt n’augmente pas la concentration plasmatique en cholestérol.
La richesse en protéines, le rendement particulièrement précieux pour les sujets en croissance, ainsi un pot de 125g de yaourt renferme 4 à 5,6 g de protéines, ce qui couvre 8 à 10 de besoins des enfants et 7 à 8 de ceux des adolescents.
Par ailleurs, le yaourt assure un apport considérable en calcium se qui correspond de 15 à 25 des apports quotidiens recommande et qui sont estimés à 900 mg pour adultes, de 700 à 1000 mg pour les enfants et 1200mg pour les adolescents (Verier Bathelem et Rahe 1996).
Les apports en vitamines sont non négligeables particulièrement ceux de groupe B (un pot de yaourt de 125g permet de satisfaire 12 à 15 des besoins quotidiens).
En autres, le yaourt peut s’intégrer à pratiquement tous les types d’aliments y compris aux régimes limités en matières grasses (un pot de yaourt ne renferme que 1,5g de lipides en moyenne) (Syndifrais, 2002).
Enfin, le yaourt dans le taux en calories ne guère 14Kcal/pot, peut permettre de maintenir l’équilibre énergétique des repas. Ce qui apparaît comme très raisonnable du regard de la consommation quotidienne couvrante (2000 à 2700 K calories) (Syndifrais, 2002).
46 Matériel et Méthodes
Matériel et Méthodes
Le lait de brebis comme les autres types de laits: vache, chèvre, chamelle représente un milieu idéal pour le développement des microorganismes et notamment les bactéries lactiques.
1. Source des échantillons
Les bactéries lactiques ont été isolées d’une part de la caillette, et d’autre part à partir des échantillons de lait de brebis collectés auprès de fermes agricoles de quelques régions de l’ouest Algérien à savoir Mostaganem, Mascara, Tlemcen, Aïn Tedles, Sidi Lakhdar, Hassi Mameche, Ain Guesma Tiaret et Ain Nouissy durant la période avril, mai des années 2000-2006.
Cette diversité de régions a pour but d’obtenir une collection de souches appartenant à des espèces lactiques différentes.
Les bactéries lactiques utilisées dans notre travail ont été isolées par nous même au laboratoire de microbiologie de l’université de Mostaganem. Quelques souches ont été identifiées au niveau du laboratoire de Biochimie des bactéries lactiques de la faculté d’Agriculture d’Alexandrie en Egypte.
2. Traitement de l’échantillon
La collecte du lait a été réalisée dans des conditions aseptiques afin d’éviter toute contamination qui peut influencer la flore lactique du lait, en lavant les mamelles de l’animal avec de l’eau tiède javellisée. La collecte du lait cru doit se faire dans un flacon stérile. Les échantillons ont été transportés au laboratoire dans des récipients isothermes pour être analysés.
3. Analyse physico-chimique du lait de brebis
3.1. Méthode d’analyse
Les analyses expérimentales sont réalisées en triple essai selon les normes de l’AOAC, 2000.
3.1.1. Le pH
Le pH est mesuré par l’utilisation d’un pH mètre étalonné par deux solutions tampons (pH=4 et pH = 7), (voir annexe).
3.1.2. L’acidité
L’acidité est déterminée par titrage de l’acide lactique à l’aide de la soude dornic (gN), en présence d’un indicateur coloré (la phénophtaléine), (voir annexe).
47 Matériel et Méthodes
3.1.3. Taux de matière grasse
Ce test est effectué selon la technique de Gerber (AOAC, 2000) selon le protocole suivant :
Dans un butyromètre, on introduit 10 ml d’acide sulfurique, puis on ajoute 11 ml de l’échantillon (lait) et 1 ml d’acide amylique. Ce mélange est agité vigoureusement en vue de dissoudre les éléments du lait. Après agitation, le mélange est centrifugé à 1200 trs/min pendant 5 min. Le butyromètre est plongé verticalement, bouchon en bas dans un bain d’eau porté à 65-70°C et les laisser pendant 5 min.
La lecture s’effectue en maintenant le butyromètre parfaitement vertical et la direction du regard doit être horizontal.
3.1.4. Taux de matière sèche
Elle est déterminée selon les méthodes décrites par l’AOAC (1960) par pesée après évaporation totale de 10 ml de l’échantillon du lait à température de 103°C.
4. Isolement et identification des bactéries lactiques
4.1. Conditions de culture
Les souches sont cultivées à 30°C et 45°C, toutes les cultures de bactéries lactiques sont incubées en aérobiose à l’exception des Lactobacilles qui parfois nécessitent une incubation en anaérobiose.
4.2. Milieux de culture
L’isolement des bactéries lactiques a été effectué sur les milieux de culture d’isolement de ces bactéries.
-Milieu MRS (De Man et al., 1960), pour la croissance des Lactobacilles et les Leuconostoc. -Milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975), pour la croissance des Lactocoques lactiques et les Streptocoques thermophiles -Milieu CHALMERS pour les Streptocoques lactiques. -Milieu TDYM, pour les Lactobacilles.
La composition des milieux (MRS, M17, TDYM, Chalmers) est indiquée en annexe I.
48 Matériel et Méthodes
5. Isolement, purification, caractérisation et identification des souches lactiques.
5.1. Isolement:
Nos souches bactériennes ont été isolées à partir de la caillette et du lait de brebis.
5.1.1. A partir de la caillette:
L’isolement à partir de la caillette s’effectue de la manière suivante: 1- Peser 1g de la caillette séchée à l’air libre après broyage en ajoutant 9 ml d’eau physiologique stérile. 2- Transvaser le broyat dans un tube à essai stérile. 3- Agiter par vortex (pendant 10 minutes) jusqu’à obtention d’une solution homogène. 4- diluer jusqu’à 10-4. 5- Prélever 1 ml de chaque dilution et ensemencer sur milieu MRS et M17. 6- Incuber à 30°C pendant 24 heures à 72 heures.
5.1.2. A partir du lait:
L’isolement des bactéries lactiques a été réalisé selon les méthodes décrites par la fédération internationale du lait (FIL, 1996). A partir de chaque échantillon du lait de brebis on prend un volume de 10 ml qu’on incube à 30°C (pour l’isolement des mésophiles) et 45°C (pour l’isolement des thermophiles) jusqu’à la coagulation par les souches endogènes ; après homogénéisation du lait coagulé par vortex des dilutions décimales sont effectuées dans l’eau physiologique stérile allant de 10-1 à 10-7.
- à partir des 3 dernières dilutions (10-5,10-6,10-7), on prélève 0,1 ml qu’on étale sur milieux gélosés MRS et M17, les boites sont ensuite incubées à 30°C et 45 °C pendant 24 heures.
5.2. Purification :
Les colonies bactériennes bien isolées de morphologie différentes sont repiquées sur bouillon MRS et M17. Après cela, une coloration de Gram est effectuée avec une recherche de la catalase. Les bactéries à Gram + et catalase - sont retenues
La purification des souches est effectuée sur milieux solides par méthode des stries, ces étapes sont répétées, jusqu’à l’obtention des colonies bien homogènes c’est à dire l’obtention des souches pures (voir figure 9).
49 Matériel et Méthodes
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
-1 -2 -3 - 5 - 6 - 7 Solution mère de lait 10 10 10 10 10 10 ou de la caillette de brebis.
M.R.S et M17 Incubation30 °C pendant 24 à 48 heures Une colonie
Bouillon M17 ou M.R.S
Incubation à 30 C° pendant 24 heures Une colonie
Incubation à 30 C° pendant 24 heures
Incubation à 30 C° pendant 24
Une colonie heures
Parafilm (souche pour manipuler) Conservation de la souche
Lait écrémé + glycérol
Figure 9: Schéma représentant les différentes étapes d’isolement et purification des souches à partir du lait et de la caillette de brebis.
50 Matériel et Méthodes
5.3. Caractérisation et identification des souches :
Concernant la caractérisation et l’identification des souches nous avons adopté les méthodes décrites par Harrigan et Mc Cance (1976) et Weiss (1992) :
-Tests de coloration de Gram,
-Recherche de la catalase ;
-Etude de la morphologie basée sur des examens macroscopiques et microscopiques,
5.3.1. Examen macroscopique:
Ce test permet de déterminer la morphologie des colonies obtenues sur des milieux solides. A l’œil nu, on peut distinguer les caractéristiques d’une colonie : la forme, la taille, la couleur, l’aspect et l’odeur.
5.3.2. Examen microscopique :
On utilise la coloration simple et la coloration de Gram, la première permet d’observer la morphologie des cellules bactériennes ; taille, forme et mode d’association : chaîne, amas, tétrades...).
L’appréciation du mode de regroupement sur une culture jeune effectuée en milieu liquide, est également un élément important pour orienter l’identification.
Les souches isolées ont subit d'autres tests d'identification. Les tests, réalisés en bouillon MRS ou M17 selon l'isolat en question, sont les suivant:
1- Croissance à 10 °C
2- Croissance à 45 °C
3- Résistance à 60 °C pendant 30 min
4- Croissance en présence de 6,5 % de NaCl
5- Croissance à pH 9,6
Les tests d’identification sont à adapter à chaque type de micro-organisme. Le résultat permet de situer la souche isolée dans la classification lorsqu’elle est connue ou de réaliser un profil caractéristique pour les souches inconnues isolées de produits naturels.
51 Matériel et Méthodes
5.3.3. Test de production de CO2 (détermination du type fermentaire) :
Ce test permet d’apprécier le type de métabolisme par lequel le substrat carboné est transformé, il consiste à mettre en évidence la formation de gaz (CO2).
Le test est effectué en inoculant le germe à tester en milieu MRS et M17 contenant une cloche de Durham puis incubé à 30 °C pendant 24 à 48 heures (Ottaviani, 1992).
Le développement d’une bactérie hétérofermentaire se manifeste par l’apparition du gaz dans la cloche de Durham qui est absent chez les bactéries homofermentaires.
5.3.4. Test d’arginine dihydrolase (ADH) :
Ce test permet de mettre en évidence la production d’arginine d’ammonium à partir de l’arginine par les bactéries lactiques en cultivant les bactéries sur milieu MRS liquide modifié contenant l’arginine 0.3% (p/v) et 0.2% citrate de sodium (p/v) (Samelis et al., 1994).
5.3.5. Test de production d’acétoïne (Production de composés aromatiques) :
Ce test est réalisé à partir du glucose par le test de Voges-Poskauer (Harrigan and McCance, 1976 ; Samelis et al., 1994).
Ce test permet de distinguer les ferments acidifiants, des ferments aromatisants. La production d’acétoïne est testée sur milieu de Clack et Lubs, en effectuant sur celui-ci après incubation à 30°C pendant 24 à 48 heures , la réaction de Voges- Proskaeur dite réaction de (VP) et qui s’applique de la façon suivante :
Dans un tube à essai, on introduit 1ml de la culture à tester, puis on ajoute 0,5 ml du réactif α-naphtol à 6 % dans l’alcool absolu (VP1) et 0,5 ml d’une solution de soude (NaOH) à 15 % dans l’eau distillée (VP2).
Les tubes sont agités soigneusement et on laisse reposer 5 à 10 minutes à température ambiante (21 à 23 °C).
La production d’acétaldéhyde par les microorganismes présente également beaucoup d’intérêt car ce composé est susceptible d’être à l’origine du développement d’une flaveur agréable (Lees et Jago, 1978).
La production d’acétoine se traduit par l’apparition d’un complexe ou anneau rouge. La composition du Clack et Lubs est donnée en ( annexe).
52 Matériel et Méthodes
5.3.6. Recherche de la citratase :
Cette enzyme n’existe que chez Lactococcus lactis subsp diacetylactis et certaines espèces du genre Leuconostoc.
La citratase est mise en évidence, par l’ensemencement du milieu Kempler et Mckay avec une culture jeune, les boîtes de Pétri sont incubées à 30 °C pendant 72 heures. La composition du milieu Kempler et Mckay est donnée en annexe .
5.3.7. Production de dextrane :
Le dextrane est produit à partir du saccharose déterminé sur milieu MRS gélosé où le glucose est remplacé par le saccharose 5% (p/v) (Hitchener et al., 1982). Ce test spécifique au genre Leuconostoc.
La production du dextrane est également testée sur milieu : MSE (Mayeux, Sandine et Elliker), après ensemencement en stries, les boites de Pétri sont incubées à 30°C pendant 24 à 48 heures.
Les souches dextranigènes sont caractérisées par la formation des colonies larges et gluantes. La composition du milieu MSE est donnée en (annexe)
5.3.8. Recherche de la réductase :
Les souches pures sont cultivées dans le lait écrémé stérilisé additionné de teinture de tournesol de façon à obtenir une coloration rose après incubation à 30 °C pendant 24 à 48 heures, seules Les Lactocoques réduisent la teinture de tournesol avant de coaguler le lait tandis que Streptococcus thermophilus acidifie et coagule le lait sans réduction antérieure.
5.3.9. Test de thermorésistance
Les cultures sont cultivées en milieu liquide (MRS ou M17 à 63 °C pendant 30 minutes (Guiraud, 1998), puis incubés à 45°C pendant 24 heures. Seules les souches thermophiles sont capables de se développer ; par contre les souches mésophiles ne se développent pas.
5.4. Test de croissance en milieux hostiles :
Différents milieux hostiles peuvent être testés : a. Bouillon hypersalé :
Les souches pures sont cultivées à 30°C en bouillon hypersalé de 4 % et 6,5 % de chlorure de sodium (NaCl).
53 Matériel et Méthodes
La croissance est appréciée par l’apparition de trouble, seules les streptocoques fécaux poussent à 6,5 % de NaCl. b. Lait de Sherman :
Ce test donne l’aptitude des bactéries à pousser en présence de bleu de méthylène. Il permet de différencier les Streptocoques lactiques thermophiles et les Lactocoques.
Lactococcus lactis est capable de pousser à 0,3 % de bleu de méthylène. Les Streptocoques fécaux se développent en présence de 0,1 % quand à Streptococcus thermophilus, elle est très sensible au colorant utilisé dans ce test (Guiraud, 1998).
5.5. Type d’hémolyse :
L’hémolyse est testée sur gélose au sang de cheval, après 24 à 36 heures d’incubation à 37 °C les colonies de streptocoques peuvent présenter l’un ou l’autre des aspects suivants :
1-colonies entourées d’une zone franche d’hémolyse, il s’agit de streptocoques β- hémolytiques
2-le milieu entourant la colonie devient verdâtre, ce qui résulte la production de peroxyde d’hydrogène par la bactérie, on est en présence d’une hémolyse α.
5.6. Etude du profil fermentaire des souches :
L’étude du profil fermentaire des souches est réalisée sur milieu M17 ou M.R.S additionné du pourpe de bromocrésol (BCP) comme indicateur du pH à 0.04 g.l-1 selon la méthode décrite par Schillinger and Lcüke (1987) où le glucose est remplacé par le composé à tester filtré sur une membrane qui est introduit en solution à concentration finale de 1% à savoir les différents sucres (lactose, glucose, galactose, arabinose, mannose, maltose, sorbose, saccharose, lévulose, cellubiose).
La préparation d’un milieu MRS BCP sans sucre s’effectue de la manière suivante : Dans des tubes à essai stériles on introduit 1 ml de ce milieu.
La culture bactérienne est centrifugée pendant 10 minutes à 3000 tours/min, on récupère le culot et on le centrifuge une deuxième fois dans l’eau physiologique stérile.
Après avoir éliminé le surnageant, on récupère le culot qui est introduit dans des conditions stériles dans des tubes contenant 1 ml milieu M17 ou MRS renfermant 0.1 ml d’un sucre bien déterminé.
Les cultures sont incubées à 37°C pendant 24 à 48 heures; le virage du pourpre au jaune désigne l’utilisation du sucre.
54 Matériel et Méthodes
5.7. Identification des bactéries lactiques en utilisant le système API
Les bactéries ont été ensuite identifiées au niveau de l’espèce ou de la sous- espèce en établissant leurs profils fermentaires à l’aide du microsystème d’identification. Pour cela nous nous avons utilisé le système API à savoir l’API 20 STREP et l’API 50 CHL. Ce type d’identification a été appliqué à un nombre réduit d’échantillons.
En utilisant ces tests, les isolats peuvent être identifiés au niveau de l’espèce par culture des souches sur milieu MRS et M17. Il s’agit d’apprécier l’aptitude des souches à métaboliser divers sucres.
5.7.1. API 20 STREP
L’API 20 Strep (BioMérieux, Marcy l’Etoile, France) est une méthode standardisée associant 20 tests biochimiques qui présentent un grand pouvoir discriminant.
Elle permet d’identifier un certain nombre de groupes ou d’espèces pour la plupart des Streptocoques et genres apparentés.
Ce système se compose d’une galerie constituée de 20 microtubes contenant les substrats déshydratés pour la mise en évidence d’enzymes ou de fermentation de sucres. Les tests enzymatiques sont inoculés avec une suspension dense, réalisée à partir d’une culture pure, qui réhydrate les substrats. Les réactions produites durant la période d’incubation se traduisent par des changements de coloration spontanés ou révélés par l’addition de réactifs.
Les tests de fermentation sont inoculés avec un milieu enrichi (contenant un indicateur de pH) qui réhydrate les sucres. La fermentation des carbohydrates entraîne une acidification se traduisant par un virage spontané de l’indicateur coloré.
La lecture de ces réactions se fait à l’aide du tableau de lecture et l’identification, du Catalogue Analytique API 20 STREP ou d’un logiciel d’identification APILAB PLUS V. 3.2.2 fourni par le fabricant. a- Pré paration de l’inoculum
Toutes les colonies issues d’une culture préparée précédemment sont recueillies par écouvillonnement puis suspendues dans 2 ml de la suspension du milieu (Réf. 20600, BioMérieux, Marcy-l’Etoile, France) ou de l’eau distillée stérile de façon à obtenir une suspension très dense avec une opacité supérieure à 4 sur l’échelle de Mc Farland (Réf. 20600).
55 Matériel et Méthodes
Après vérification de la pureté de la suspension, on prélève aseptiquement 0.6 ml de cette suspension que l’on introduit dans 5 ml de milieu API GP (BioMérieux, Marcy-l’Etoile, France) pour les tests de fermentation. b- Préparation et inoculation de la galerie
Cinq millilitres d’eau distillée sont réparties dans les alvéoles du fond du plateau plastique d’incubation pour créer une atmosphère humide. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, chaque cupule de la première moitié de la galerie (Tests VP, HIP, ESC, PYRA , αGal, βGUR, βGal, PAL et LAP) est remplie avec 150 µl approximativement (3 gouttes avec la pipette Pasteur) de la suspension précédente.
Pour le test ADH : seulement la moitié de la cupule est remplie.
Dans la deuxième moitié de la galerie (Tests RIB, ARA, MAN, SOR, LAC, TRE, INU, RAF, AMD et GLYG), le milieu API GP supplémenté avec 0.6 ml de la dense suspension est réparti dans les microtubes. Les cupules correspondant aux tests (ADH, RIP, ARA, MAN, SOR, LAC, TRE, INU, RAF, AMD et GLYG) sont recouvertes avec de l’huile de paraffine (Réf. 70100. BioMérieux, Marcy-l’Etoile, France) pour assurer les conditions anaérobiques.
Les galeries sont incubées à 30°C pour les Lactococcus et à 42°C pour les Enterococcus pendant 4 h pour la première lecture. Une deuxième lecture est notée après 24 h d’incubation. c- Lecture et interprétation
Après 4 h d’incubation des réactifs sont ajoutés aux tests VP: 1 goutte de VP1 (Réf 70420. BioMérieux) et 1 goutte VP2 (Réf. 70430. BioMérieux), pour les tests PYRA, αGal, βGUR, βGal, PAL et LAP: 1 goutte du réactif ZYM A (Réf. 70470. BioMérieux) et ZYM B (Réf. 70480. BioMérieux) sont ajoutées. La lecture des réactions est notée après 10 mn en se référant au tableau de lecture.
L’identification des souches est effectuée grâce au logiciel API LAB PLUS V 3.2.2.
5.7.2. API 50 CHL
L’API 50 CHL (Ref 50410, BioMérieux, Marcy l’Etoile, France) est un système standardisé associant 50 tests biochimiques permettant l’étude du métabolisme des hydrates de carbone des microorganismes. Ce système permet d’identifier API 50 CH est utilisé en combinaison avec API 50 CHL Medium pour l’identification des Lactobacillus et apparentés (Leuconostoc, Pediococcus et S. thermophilus).
56 Matériel et Méthodes
La galerie API 50 est constituée de 50 microtubes permettant l’étude de la fermentation de substrat, appartenant a la famille des hydrates de carbone et dérivés (hétérosides, polyacools, acides uroniques.
Les tests de fermentation sont inoculés avec API 50 CHL Medium.
Durant la période d’incubation, la fermentation se traduit par un changement de couleur dans le tube, du à une production d’acide en anaérobiose révélée par l’indicateur de pH du milieu choisi. Le premier tube, sans principe actif, sert de témoin négatif. a. Préparation de l’inoculum
La culture est cultivée sur le milieu et la température adaptés à sa croissance. Après 24 h d’incubation, une culture très dense apparaissant sur le milieu est récupérée et centrifugée à 4000 trs/mn pendant 10 mn. Le culot est homogénéisé dans 5 ml d’eau distillée, puis centrifugé une seconde fois à 4000 trs/mn pendant 10 mn.
Le culot est suspendu à nouveau dans 2 ml d’eau distillée. Un nombre (n) de gouttes de cette suspension est introduit dans 5 ml d’eau distillée stérile de façon à obtenir une opacité de 2 sur l’échelle de Mc Farland. (Réf. 50300. BioMérieux). On prélève alors à l’aide d’une pipette Pasteur 2n gouttes de la suspension initiale (2 ml) que l’on introduit dans 10 ml de milieu API 50 CHL (Ref 50410, BioMérieux). b- Préparation des galeries
Environ 10 ml d’eau distillée sont réparties dans les alvéoles du fond de la boîte de la galerie formée de 5 bandes comprenant chacune 10 tubes numérotés (0-9, 10-19, 20-29, 30-39, 40-49). La galerie est inoculée en répartissant la suspension bactérienne supplémentée par 2n gouttes à l’aide d’une pipette Pasteur.
Les cupules sont remplies avec de l’huile de paraffine. Enfin, la galerie est incubée à la température optimum de croissance du microorganisme étudié. c- Lecture et interprétation
La lecture des réactions est réalisée après 24 et 48 h en se référant au tableau de lecture. L’identification des souches est effectuée grâce au logiciel API LAB PLUS V 3.2.2.
6. Analyses microbiologiques du lait de brebis
Le lait de brebis constitue un milieu favorable pour le développement des microorganismes. Cependant, la laiterie est un secteur industriel où l’analyse microbiologique joue un rôle primordial, ou elle peut intervenir à différents stades,
57 Matériel et Méthodes depuis celui de la collecte, jusqu’à la consommation des produits finis (Bugnicourt, 1995).
6.1. Mode Opératoire :
Prélever aseptiquement une prise de lait dans un flacon stérile qui constitue donc la solution mère.
Introduire 1 ml de la solution mère à l’aide d’une pipette pasteur dans un tube contenant 9 ml du même diluant. Cette dilution est alors 10 -1.
On procède de la même manière jusqu’à l’obtention d’une dilution 10 -6.
6.1.1. Recherche et dénombrement des germes aérobies mésophiles totaux :
La flore aérobie mésophile totale a été recherchée et dénombrée selon la technique décrite par Bourgeois et Leveau (1980) qu’on peut résumer comme suit :
- Préparer des dilutions décimales allant de 10 -1 à 10-6.
-Porter aseptiquement, 1 ml dans une boîte de Pétri de chaque dilution.
-Compléter ensuite avec 20 ml de gélose PCA (Plate Count Agar).
-Les boites sont incubées à 30 °C pendant 72 heures.
La première lecture est effectuée après 24 heures, la deuxième lecture après 48 heures, par contre la troisième est réalisée après 72 heures d’incubation.
6.1.2. Recherche et dénombrement des coliformes totaux:
La recherche se fait en deux étapes : a-Test de présomption :
Ce test consiste à ensemencer une série de tubes par un milieu sélectif VBL contenant une cloche de Durham à différentes dilutions (10-4, 10-5, 10-6), à raison de trois tubes par dilution.
Le gaz présent dans les cloches de Durham est chassé, l’incubation est effectuée à 37 °C pendant 24 à 48 heures (Castaras et Bourgeois, 1980). b-Test de confirmation :
Les tubes de VBL considérés comme positifs lors du dénombrement des coliformes totaux feront l’objet d’un repiquage sur milieu eau peptonée exempte d’indole avec l’ajout de 2 gouttes du réactif de Kovacs.
58 Matériel et Méthodes
Les tubes sont incubés à 44 °C pendant 24 heures. La lecture s’effectue selon la table de Mac Crady (voir annexe).
6.1.3. Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux :
La recherche de streptocoques fécaux comporte deux étapes : a-Test de présomption :
-ensemencer une série de tubes contenant le milieu de ROTHE à différentes dilutions (10-4,10-5,10-6).
-on prend trois tubes du milieu de ROTHE pour chaque dilution. L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures. b-Test de confirmation :
Les milieux de ROTHE positifs sont reportés chacun dans un autre tube contenant le milieu EVA-LYTSKY et incubés à 37°C, pendant 24 à 48 heures. Dans ce test, la lecture est effectuée selon la table de Mac Crady.
6.1.4. Recherche de Staphylococcus aureus :
Selon la disponibilité des milieux de culture, trois techniques différentes sont recommandées :
Méthode de BAIRD PARKER Méthode d’enrichissement sur milieu GIOLLITI CONTONII. Méthode sur milieu CHAPMAN.
Nous avons utilisé la Méthode de BAIRD PARKER : La composition du milieu est mentionnée dans l’annexe V.
L’ensemencement est réalisé à partir de la dilution décimale, on porte aseptiquement 1 ml de chaque dilution dans trois boîtes contenant le milieu BAIRD PARKER
Etaler l’inoculum à l’aide d’un étaloir stérile (râteau).
Incubation à 37 °C pendant 24 à 48 heures.
6.1.5. Recherche de Salmonella :
La recherche des salmonelles est réalisée en quatre étapes (Leminor et Veron, 1989).
59 Matériel et Méthodes
1-Pré-enrichissement: la préparation de la solution mère s’effectue le plus souvent à l’aide de l’eau peptonée tamponnée (TSE), incubé à 37 °C pendant 16 à 20 heures.
2-Enrichissement : se réalise en transférant un volume du milieu de pré-enrichissement ou de suspension mère, dans des milieux sélectifs liquides.
-l’incubation s’effectue à 37°C, pendant 24 à 48 heures.
-Les milieux utilisés sont : les bouillons au sélénite.
3-Isolement et identification : à partir des milieux solides sélectifs ; la gélose Hecktoen ou la gélose (S-S).
6.1.6. Recherche de la flore fongique :
Les cultures sont réalisées sur milieu OGA à l’oxytétracycline, et incubées à 25°C, durant 3 à 5 jours.
La technique : consiste à couler le milieu en suspension dans les boites de Pétri. Puis d’ensemencer le milieu à l’aide d’un étaloir et incubation pendant 3 à 5 jours à 25 °C. Le nombre de colonies de levures et moisissures est compté (Bugnicourt, 1995).
7. Etude de quelques Aptitudes technologiques
En industrie laitière, les souches lactiques sont choisies en fonction de leurs propriétés technologiques de telle sorte que celles ci permettent l’obtention des transformations souhaitées et donnent au produit les caractères recherchés lesquels dépendent des propriétés des bactéries lactiques telles que
- La production d’acide lactique. - La production d’enzymes protéolytiques. - La production du gaz. - La production des substances aromatiques.
7.1. Pouvoir acidifiant:
Ce test permet de mesurer le pouvoir acidifiant d’une souche dans un intervalle de temps donné.
Les souches pures sont ensemencées dans des tubes contenant 9ml de lait écrémé et incubés à 30 °C, une fois le lait coagulé, les tubes sont retirés de l’étuve. Après homogénéisation, le contenu de chaque tube est transvasé dans un flacon de 200 ml de lait écrémé qu’on incube à 30 °C.
Les mesures de l’acidité sont réalisées à différentes périodes d’incubations: 0h, 2h, 4h, 6h, 8h et 24 heures.
60 Matériel et Méthodes
Le pH est mesuré à 4°C avec des sondes de pH mètre (Mettler Toledo, France), (Fig. 10) étalonné à 4°C selon les normes décrites par l’AOAC (2000).
De chaque flacon, 20 ml sont prélevés et répartis dans deux béchers à raison de 10 ml chacun. Le pH est mesuré en présence d’un indicateur coloré le phénolphtaleine, et on titre avec la soude N/9 jusqu’au virage de la couleur. Les mesures du pH et de l’acidité totale devront s’effectuer stérilement, un tube est prévu pour chaque mesure (Larpent, 1997).
Lors du changement de couleur, on note le volume de la soude écoulée et les résultats sont exprimés en degré dornic en utilisant la relation:
Acidité= V (NaOH) x 10 où : V (NaOH) : volume de la solution sodique écoulé pour titrer 10 ml de lait et sachant que 1°D correspond à 0,1g/l d’acide lactique produit (Accolas et al., 1977).
Fig. 10 : Mesure du pH
61 Matériel et Méthodes
7.2. Activité protéolytique :
L’activité protéolytique a été déterminée en milieu solide et liquide selon le protocole suivant :
-Sur milieu solide selon la méthode de Van Den Berg et al. (1993) sur milieu M17- milk agar ;
-Sur milieu liquide M17-milk tamponné à pH 7 (phosphate K/K2, 0,1M, pH7) ; l’activité protéolytique se traduit par une clarification du milieu dans le tube après incubation à 30°C pendant 48 heures. La lecture des résultats consiste à mesurer la hauteur de la partie claire du milieu.
Les souches bactériennes sont ensemencées en touches dans le milieu de culture YMA (Yeast Milk Agar), à l’aide des pipettes Pasteur stériles avec les quelles on prélève quelques gouttes d’une culture fraîche et pure.
Les milieux M17-Milk-Agar et le milieu MRS/lait solide ou liquide sont utilisés selon la même méthode avec seulement 10% de lait (100 ml de lait écrémé stérile sont mélangés avec 900 ml de milieu soit MRS ou bien M17)
On laisse les souches sécher, puis on les incube à 37°C pendant 24 à 48 heures. La lecture des résultats est effectuée par la mesure de la dimension des halos clairs autour des colonies bactériennes.
La composition du milieu YMA est donnée en annexe VI.
Le niveau de ces activités protéolytiques peut varier en fonction d’un certain nombre de facteurs physico-chimiques ou génétiques (Desmazeaud, 1983).
7.2.3. Etude de l’antibiorésistance.
Ce test permet de déterminer la sensibilité ou la résistance des souches vis-à-vis de certains antibiotiques en utilisant la méthode de diffusion en milieu solide
7.2.3.1. Mode opératoire :
A l’aide d’une pipette stérile, on prélève 0,2 ml d’une culture jeune qu’on étale sur milieu MRS ou M17 solide, puis on dépose les disques d’antibiotiques à raison de 6 à 7 disques par boite, après incubation à 30°C pendant 48 heures, la lecture des résultats est basée sur l’existence ou pas de zones d’inhibitions, par convention, nous avons considéré que pour un diamètre inférieur à 15 mm la souches est résistante et pour un diamètre supérieur ou égal à 15 mm la souche est sensible.
62 Matériel et Méthodes
8. Préparation du yogourt
En vue de connaître les performances de nos souches, nous avons procédé à la fabrication d’un yaourt nature à base de nos souches isolées et identifiées et étudier leurs propriétés organoleptiques et rhéologiques. En même temps, des souches lactiques commerciales seront utilisées en vue de les comparer avec les nôtres.
A cet effet nous avons sélectionné une souche de S. thermophilus jugée par les tests technologiques comme épaississante et une souche de L. bulgaricus.
8.1. Conditions de culture
Le levain est fabriqué à base de lait écrémé en poudre (Celia) à 13% (p/v). Après standardisation et pasteurisation à 90-95°C pendant 3 min, le produit est homogénéisé à 85°C sous une pression d’environ 250 bars.
Le mélange est ensuite refroidi à 45°C, puis 0.5 g de souches mixtes commerciales (Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus) (Rhodia Texel, France) conservées à l’état lyophilisé dont le code est YF-L811sont remises en culture et repiquées plusieurs fois dans du lait écrémé stérile. Le tout est maintenu à 45°C durant 1 h en vue d’activer les souches, ensuite conservées dans un flacon stérile jusqu’au moment de l’utilisation (Fig. 11).
Toujours à une température d’environ 45°C, le mélange ensemencé est mis en incubation durant 4 heures.
En parallèle de cette fermentation, nous avons préparé le yaourt en utilisant nos deux souches en variant les proportions des deux espèces dans le produit après conservation à 4°C pendant 21 jours.
Pour chaque cas, nous avons respecté les doses selon les normes. Concernant nos souches, nous avons utilisé des doses à des taux successifs de (1.5%, 2.5%, 3%, 3.5%) de levain avec une concentration de 2.5% pour le témoin. Les mêmes doses ont été utilisées pour le levain commercial.
Au fur et à mesure des essais, ces cultures étaient incubées 16 h à 44 °C. Elles étaient ensuite inoculées à raison de 2.5 % dans 200 ml de milieu puis incubées à 44 °C.
Après 24 h d'incubation, chaque culture était ainsi fractionnée: 9 ml servaient à la mesure de la viscosité, 10 ml à la mesure du pH.
63 Matériel et Méthodes
Lait de Brebis 1Litre de Lait Levain lyophilisé écrémé (130g /l) (0,.5g)
Pasteurisation
90°C/3 à 5 min
Incubation a 45°C Refroidissement Pendant 1 heure à 4°C
Ensemencement direct des souches (2S/L) avec différents taux
1.5% ,2.5%,3%,3.5%
Etuvage avec 45°C/4 heures
Refroidissement à 4°C
Stockage à 21 jours à 6°C
Fig. 11: Diagramme de fabrication des yaourts expérimentaux
64 Matériel et Méthodes
8.2. Analyses physico-chimiques du yaourt
8.2.1. Mesure du pH
Le pH des yaourts est mesuré à 4°C avec des sondes de pH mètre (Mettler Toledo, France), étalonnées à 4°C selon les normes décrites par l’AOAC (2000). Lors des mesures, les échantillons sont maintenus à 4°C à l'aide d'un bain thermostaté.
Les mesures de pH des produits dégustés ont été effectuées le même jour que les séances d'analyse.
8.2.2. Mesure de l’acidité
L’acidité a été également mesurée selon les méthodes décrites par l’AOAC (1995) par dosage titrimétrique de l’acide lactique à laide de l’hydroxyde de sodium en présence de la phénophtaléine comme indicateur, cette détermination s’effectue sur une prise d’essai de 10 ml du lait. Le virage est détecté par une comparaison avec des témoins.
L’acidité est estimée en degré Dornic (°D) et correspond à la chute de burette avec la soude Dornic en ml x 10.
8.2.3. Mesure de la viscosité
La viscosité du yaourt est mesurée par l’utilisation d’un viscosimètre à cylindres coaxiaux model HAAKE Viscosimeter (Mess Technik GmbH) muni d’un tube en verre et d’une bille normalisée équipée d’un chronomètre (figure 12) à 25°C et exprimé en mps.
65 Matériel et Méthodes
Fig. 12 : Mesure de la viscosité
Le principe consiste à mesurer le temps que met une bille pour parcourir une certaine distance (AB) dans un échantillon emprisonné dans un tube transparent incliné de 10 degré par rapport à la verticale (figure 13).
Figure 13 : Coupe d’un viscosimètre à chute de bille
66 Matériel et Méthodes
Chaque expérience a été répétée 3 à 5 fois afin d’avoir des résultats significatifs après une analyse statistique.
8.3. Tests organoleptiques du yaourt: Durant toute la période de post-acidification (7 ème, 14ème et 21ème jour), la qualité organoleptique des yaourts expérimentaux est évaluée par un jury composé de 10 panélistes sur une échelle de notation (1 à 7 points) et concerne trois paramètres.
8.3.1. Le goût :
Ce paramètre se rapporte seulement à l’estimation de l’acidité développée par les bactéries lactiques spécifiques dans les échantillons.
Un protocole strict a été imposé aux sujets afin de minimiser les variations interindividuelles. Lors de chaque séance, les sujets ont dégusté 15 échantillons de yaourts (5 g) à 10°C. Il leur était demandé de garder le yaourt en bouche pendant 12 secondes, puis d’avaler. Ce temps a été choisi suite à des tests préliminaires réalisés avec 10 sujets. Les sujets dégustaient les échantillons de yaourt de façon la plus naturelle possible, en conservant la bouche fermée et en avalant le produit.
Les échantillons de yaourt étaient présentés dans un ordre aléatoire. Les sujets se rinçaient l’eau. Un temps de repos de quelques minutes minimum était requis entre les échantillons.
8.3.2. La Cohésivité :
Ce test traduit la capacité maximale de déformation de l’échantillon avant de se rompre. Cette technique est réalisée à l’aide d’une cuillère.
8.3.3. L’adhésivité :
Elle traduit la puissance nécessaire pour vaincre les forces de liaisons entre la surface du coagulum et la surface des matériaux (Cette technique se fait également par une cuillère).
La texture peut être définie comme une propriété sensorielle relative au toucher. L’analyse de la texture permet une mesure objective par des mesures mécaniques.
L’importance de la texture dans l’appréciation des produits alimentaires varie selon les attentes des consommateurs.
67 Matériel et Méthodes
8.4. Analyses microbiologiques :
Le yaourt est obtenu par la fermentation du lait, à l’aide de deux bactéries, un lactobacille, dénommé Lactobacillus bulgaricus et un streptocoque, dit Streptococcus thermophilus, qui agissent ensemble. Les deux bactéries se retrouvent vivantes dans le yaourt et donc, dans la bouche du gourmet qui le consomme
Le dénombrement des germes spécifiques du yaourt est réalisé par culture d’une prise d’échantillon sur les deux milieux suivants :
* milieu M 17 incubé à 42°C pendant 24 heures pour le dénombrement de Streptococcus thermophilus
* milieu MRS incubé à 42°C pendant 24 heures pour le dénombrement de Lactobacillus bulgaricus.
Quatre dilutions ont été effectuées afin de déterminer le nombre de ces germes pendant la période de post-acidification.
8.4.1. Recherche de la flore pathogène dans le yaourt
8.4.1.1. Coliformes totaux :
Le dénombrement est effectué par culture sur milieu sélectif BCPL dans les tubes contenant une cloche de Durham. Cette méthode est réalisée en deux étapes :
a-test de présomption (Catsaras et Bourgeois., 1980)
b- test de confirmation
L’incubation se fait à 44°C pendant 24 heures. La mise en évidence est réalisée par ajout de quelques gouttes du réactif Kovacs. La lecture s’effectue selon la table de Mac-Crady
8.4.1.2. Staphylococcus aureus :
Pour mettre en évidence la présence de ces germes, les cultures ont été cultivées dans le milieu de Chapman.
8.4.1.3. Salmonella :
La recherche des Salmonella est réalisée en trois étapes (Leminor et Veron, 1989) a) Pré-enrichissement : par utilisation d’un milieu tamponnée (TSE).
68 Matériel et Méthodes b) Enrichissement : Se réalise en transférant un volume du milieu de pré enrichissement ou de suspension mère, dans des tubes contenant des milieux sélectifs liquides (Bouillon au sélénite).
L’isolement et identification est réalisé par utilisation des milieux solides sélectifs ; la gélose au vert brillant (GVB) et la gélose Hektoen.
8.4.1.4. La flore fongique :
La recherche de la flore fongique se fait par culture sur le milieu OGA à l’oxytétracycline en tenant compte du nombre de colonies de levure et moisissures (Bugnicourt, 1995)
8.4.1.5. Clostridium :
La recherche des Clostridium est effectuée selon la méthode suivante :
- Couler le milieu de viande de foie dans les boites de Pétri.
- Réaliser des dilutions de 10-1 jusqu'à 10-6.
- Apres solidification, effectuer l’ensemencement à partir de ces dilutions à l’aide d’un râteau stérile.
- Incubation à 37°C pendant 24 heures.
- Compter le nombre de colonies de Clostridium.
9. Analyse statistique
Les résultats paramétriques relatifs aux tests physico-chimiques et microbiologiques sont traités par une analyse de variance monofactorielle en randomisation totale, suivi d’une comparaison des moyennes deux à deux selon le test de Newman et Keuls. Par ailleurs, les résultats non paramétriques relatifs au goût, adhésivité et cohésivité des yaourts expérimentaux sont traités par le test de Friedman en utilisant le logiciel statbox version 6.4 (Dagnelie ,1988).
69 Matériel et Méthodes
70 Résultats et Discussion Résultats et discussion
1. Isolement et identification des souches lactiques
L’isolement et la purification des souches lactiques à partir du lait de brebis collecté des différentes régions citées en partie expérimentale nous ont permis d’isoler 95 souches lactiques dont 57 lactocoques et 38 lactocacilles (Tableau 16 et 17). Dont 44 souches de Tlemcen-Mascara et Mostaganem,23 souches de Sidi Lakhdar et Hassi Mamech,09 souches de Stidia,09 souches de AIN Guesma de Tiaret et Ain Nouissi,10 souches de Ain Tedles. Les résultats des tests physiologiques et biochimiques ont permis d’établir une pré- identification des souches lactiques. Toutes les souches isolées sont Gram positifs, catalase négatifs, ne formant pas d’endospores. Au niveau du genre, les isolats sont répartis comme suit : 38 Lactobacillus, 16 Streptococcus thermophilus, 14 Leuconostoc, 22 Lactococcus, 02 Enterococcus et 03 Pediococcus. Les souches ont été identifiées à ce stade sur la base de leurs aspects macroscopiques et microscopiques ainsi que sur la base des tests préliminaires et de tests physiologiques tels que la croissance dans des températures différentes et en milieu hypersalé. L’étude macroscopique consiste en une observation à l’œil nu. L’aspect des cultures en milieu liquide et sur gélose, permettent de déterminer la forme, la taille, la couleur et l’aspect des colonies. Ainsi, l’observation macroscopique a montré, en effet, que toutes les colonies avaient une couleur blanchâtre, bien rondes à bords lisses et laiteuses (Figure 14 et 15). En ce qui concerne l’aspect microscopique des bactéries lactiques, celles-ci apparaissent sous deux formes : -forme sphérique, de petite taille avec un diamètre entre 0,5 à 1,5 μm, plus ou moins allongée disposées en paires, en tétrades en chaînes longues, des coques isolés, ou même en amas (Fig. 16) -forme bacillaire, plus ou moins longs isolés, comme ils peuvent être disposés en paires ou en longues chaînettes (Fig. 17).
70 Résultats et Discussion
Figure 14 : Aspect macroscopique des Figure 15: Aspect macroscopique des lactobacilles Lactocoques (Sur MRS) (Sur milieu M17)
Figure 16: Des coques isolées à partir du lait Fig. 17 : Aspect microscopique des de brebis (G 1000) lactobacilles (sur MRS)
71 Résultats et Discussion
Tableau 16 : Code des souches isolées à partir de la caillette de brebis Code des souches Nom des souches Stp1 Streptococcus thermophilus Stp2 Streptococcus thermophilus Stp3 Streptococcus thermophilus Stp4 Streptococcus thermophilus Lcp1 Lactococcus lactis subsp. lactis Lcp2 Lactococcus lactis subsp. lactis Lcp3 Lactococcus lactis subsp. lactis Lb1 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Lb2 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Lb3 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Lbp1 Lacobacillus casei Lbp2 Lacobacillus casei Lbp3 Lacobacillus casei Lbp4 Lacobacillus casei
Tableau 17: Code des souches isolées à partir du lait de brebis Code des souches Nom des souches St1 Streptococcus thermophilus St2 Streptococcus thermophilus St3 Streptococcus thermophilus St4 Streptococcus thermophilus St5 Streptococcus thermophilus St6 Streptococcus thermophilus St7 Streptococcus thermophilus St8 Streptococcus thermophilus St9 Streptococcus thermophilus St10 Streptococcus thermophilus St11 Streptococcus thermophilus St12 Streptococcus thermophilus Lc1 Lactococcus lactis subsp lactis Lc2 Lactococcus lactis subsp lactis Lc3 Lactococcus lactis subsp lactis Lc4 Lactococcus lactis subsp lactis Lc5 Lactococcus lactis subsp lactis Lc6 Lactococcus lactis subsp lactis Lc7 Lactococcus lactis subsp lactis Lc8 Lactococcus lactis subsp lactis Lc9 Lactococcus lactis subsp lactis Lc10 Lactococcus lactis subsp lactis 72 Résultats et Discussion Lc11 Lactococcus lactis subsp cremoris Lc12 Lactococcus lactis subsp cremoris Tableau 17: Code des souches isolées à partir du lait de brebis (Suite)
Lactococcus lactis subsp cremoris
Lactococcus lactis subsp cremoris Lc13 Lactococcus lactis subsp cremoris Lc14 Lactococcus lactis subsp cremoris Lc15 Lactococcus raffinolactis Lc16 Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Lc17 Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln1 Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln2 Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln3 Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln4 Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln5 Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln6 Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris Ln7 Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris Ln8 Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris Ln9 Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris Ln10 Lactobacillus casei Ln11 Lactobacillus casei Lb1 Latcobacillus casei Lb2 Lactobacillus casei Lb3 Lactobacillus casei Lb4 Lactobacillus casei Lb5 Lactobacillus casei Lb6 Lactobacillus casei Lb7 Lactobacillus casei Lb8 Lactobacillus casei Lb9 Lactobacillus casei Lb10 Lactobacillus casei Lb11 Lactobacillus casei Lb12 Lactobacillus casei Lb13 Lactobacillus casei Lb14 Lactobacillus casei Lb15 Lactobacillus casei Lb16 Lactobacillus casei Lb17 Lactobacillus paracasei Lb18 Lactobacillus para casei Lb19 Lactobacillus paracasei Lb20 Lactobacillus paracasei Lb21 Lactobacillus helveticus Lb22 Lactobacillus helveticus Lb23 Lactobacillus helveticus Lb24 Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii Lb25 Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii Lbb1 Lactobacillus delbrueckii subsp lactis Lbb2 Lactobacillus delbrueckii subsp lactis Lbc1 73 Résultats et Discussion Lbc2 Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Lbc3 Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Lbc4 Tableau 17: Code des souches isolées à partir du lait de brebis (Suite)
Pediococcus halophilus
Pediococcos halophilus Pc1 Pediococcus pentosaceus Pc2 Lactococcus lactis subsp diacetylactis Pc3 Lactococcus lactis subsp diacetylactis Lcd1 Lactobacillus plantarum Lcd2 Lactobacillus pentosus Lp1 Lactobacillus rhamnosus Lp2 Enterococcus faecium Lp3 Enterococcus durans Ec1 Ec2
Il apparaît d’après les résultats obtenus que nos échantillons du lait de brebis sont prédominés par le genre Lactobacillus représentés par 38 souches soit environ 40.00%, suivis par le genre Lactococcus representés par 22 souches soit 23.15%. Le nombre des Streptococcus thermophilus isolés 16 souches soit un taux 16.84% de notre collection, puis les Leuconostoc avec un nombre de 14, soit 14.73%. Il apparaît enfin que nos isolats sont pauvres en ce qui concerle les Pediococcus et Enterococcus, leur nombre est de 3 et 2, soit des taux de 3.15% et 2.10% (Tableau 18). Nos résultats sont en désaccord avec ceux de Cheriguene (2007) ayant obtenu une flore lactique du lait de chèvre Algérien riche en Enterococcus.
Tableau N° 18 : Identification et répartition des souches isolées selon les tests préliminaires
Genres Nombre et pourcentage des isolats
Lactobacillus 38 (40.00%) Lactococcus 22(23.15%) Streptococcus thermophilus 16 (16.84%) Leuconostoc 14 (14.73%) Pediococcus 03 (3.15%) Enterococcus 02 (2.10%)
74 Résultats et Discussion
1.1. Répartition des souches obtenues Pour l’identification des souches, nous nous sommes basés sur des tests physiologiques et biochimiques (Fig. 18 et 19) (Tableaux 19 et 20) sachant que quelques souches ont été identifiées en utilisant le système API 20 Strep et API 50 CHL. Les résultats d’identification indiquent que notre collection est prédominée par le phénotype Lactobacillus casei avec un taux de 18.9%, suivie par Streptococcus thermophilus avec 16.8%, Lactococcus lactis subps lactis et Lactococcus lactis subsp cremoris avec 10.5%, Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides avec 7.3%, puis Lactobacillus paracasei et Lactobacillus helveticus avec un taux de 3.15%. D’autres espèces sont présentes parmi nos isolats mais leur taux est moins important ; il s’agit de Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii, de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, Lactococcus lactis subsp diacetylactis, Pediococcos halophilus, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus, Enterococcus faecium et Enterococcus durans dont le taux est inférieur à 1%. Nos résultats sont compatibles avec d’autres travaux ; à titre d’exemple, il a été trouvé que Lactococcus lactis subsp. lactis est plus fréquemment isolée à partir d’échantillons de lait cru (Moreno et Busani, 1990), de fromages fabriqués à base de lait cru (Centeno et al., 1996), du Raib (Hamama, 1992) et à partir de Dahi et d’échantillons de beurre dans l’Inde (Padmanabha-Reddy et al., 1994). D’autre part, selon Holler et Steele (1995), Lactococcus lactis subsp cremoris, n’a été isolée que rarement à partir de sources naturelles. Dans d’autres travaux, Crow et al. (1993) et Weerkamp et al. (1996), ont affirmé que les lactococci isolés à partir de sources naturelles ont été souvent des Lactococcus lactis subsp. lactis, alors que le phénotype Lactococcus lactis subsp cremoris, qui est commun dans les cultures industrielles à ferments mixtes, n’a été isolé que rarement. L’habitat naturel de Lactococcus lactis subsp cremoris reste incertain (Salama et al., 1995). La faible proportion de ces espèces parmi nos isolats peut être due probablement à leur incapacité à de compétition avec les autres bactéries lactiques dans les cultures mixtes (Teuber and Geis, 1981). 75 Résultats et Discussion Ces résultats témoignent de la richesse du lait de brebis en matière de la flore lactique. Plusieurs facteurs influent cette répartition à savoir l’état nutritionnel de l’animal, les régions d’isolement, les différentes méthodes d’identification ainsi que la période d’isolement.
76 Résultats et Discussion Tableau n°19 : Propriétés physiologiques des souches isolées Souches lactiques Caractéristiques
CO2 à partir NaCl NaCl Croissance Croissance 63°C pd 30 pH 9.6 ADH Citratase Acétoine Dextrane du glucose 4% 6% à 10°C à 45°C min Lactobacillus L.casei (n=21) ─ + ─ + ± ─ ─ ─ ─ ± ─ L.paracasei (n=4) ─ ─ ─ + ─ + nd ─ nd nd ─ L.helveticus (n=3) ─ + + ─ + + nd ─ ─ ─ ─ L. delbrueckii delbrueckii (n=2) ─ nd nd ─ + nd ─ ± nd nd nd L. delbrueckii bulgaricus (n=2) ─ nd nd ─ + + ─ ─ ─ ─ ─ L. delbrueckii lactis (n=2) ─ nd nd ─ + nd ─ ─ ─ ─ ─ L .plantarum (n=1) ─ + + + ─ ─ ─ ─ + + ─ L .pentosus (n=1) ─ + + ─ + nd ─ ─ ─ ─ ─ L. rhamnosus (n=1) ─ + + + + ─ ─ ─ + + ─ Lactococcus Lc. raffinolactis (n=1) ─ ─ ─ + ─ ─ nd + nd + nd Lc.lactis lactis (n=13) ─ + nd + ─ ± ─ + ─ ─ ─ Lc. Lactis cremoris (n=6) ─ ─ ─ + ─ ± + ─ + + ─ Lc. Lactis diacetylactis (n=2) + + ─ + ─ ± + + + ─ + St. thermophilus (n=16) ─ ─ ─ ─ + + ─ ─ ─ + + Leuconostoc L.mesenter mesenter (n=10) + + + + ─ + nd ─ + ─ + L.mesenter cremoris (n=4) + ─ ─ + ─ ─ ─ ─ ± + ─ Pediococcus P.halophilus (n=2) nd + + ─ ─ ─ + ─ nd ± ─ P. pentasoceus (n=1) ─ + + + ─ ─ ± + + ─ ─ Enterococcus E. faecium (n=1) ─ + + + + + + + + ─ ± E. durans (n=1) ─ + + + + ± + + + ─ ±
77 Tableau N°20 : Propriétés biochimiques (Profil fermentaire) des souches isolées Résultats et Discussion Souches lactiques Caractéristiques
Lactose Glucose Galactose Rhamnose Arabinose Mannose Maltose Sorbose Saccharose Mélibiose Cellubiose
Lactobacillus L.casei (n=21) ± + + ─ ─ nd + ─ ─ ─ + L.paracasei (n=4)dgj + + + ─ ─ + + ─ + ─ + L.helveticus (n=3) + + + ─ ─ ─ + ─ ─ ─ ─ L. delbrueckii delbrueckii (n=2) ─ + ─ ─ ─ + + ─ + ─ ─ L. delbrueckii bulgaricus (n=2) + + ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ + L. delbrueckii lactis (n=2) + + ± ─ ─ ─ + ─ + ─ ± L .plantarum (n=1) + + + ─ ± + + ─ + + + L .pentosus (n=1) + + + ─ + + + ─ + + + L. rhamnosus (n=1) + + + + ─ + + + + ─ + Lactococcus Lc raffinolactis (n=1) + + + ─ ─ + + ± + + ± clactis lactis (n=13) + + + ─ ─ + + ─ ± ─ + Lc. Lactis cremoris (n=6) + + + ─ ─ ± ─ ─ ± ─ + + ─ Lc. Lactis diacetylactis (n=2) + + ─ ─ ± ─ ± ─ +
St. thermophilus (n=16) + + ─ ─ ─ ─ ─ ─ + ± ─
Leuconostoc
─ L.mesenter mesenter (n=10) ± + + + + + ─ + ± ± ─ L.mesenter cremoris (n=4) + + ─ ─ ± ─ ─ ─ ─ + Pediococcus ─ + + ± ─ + P.halophilus (n=2) ─ + + ± +
P. pentasoceus (n=1) + + + + ─ ± ─ + + + +
Enterococcus ─ ± + + + ± E. faecium (n=1) + + ─ + + + ─ + + ─ ─ ─ + E. durans (n=1) + ─ ─
Nd : Non déterminé ; + : Réaction positive ; ─ : Réction négative ; ± : Réaction variable.
78 Résultats et Discussion
Figure 18 : Profil fermentaire de la souche Lactococcus lactis subsp lactis (Lc7)
Figure 19: Profil fermentaire de la souche Streptococcus thermophilus (Stp1)
79 Résultats et Discussion
2. Etude de quelques aptitudes technologiques : 2. 1. Le pouvoir acidifiant : L’acidification du lait est essentiellement due à la production de l’acide lactique qui varie selon les souches (Larpent, 1987). L’activité acidifiante a été estimée par culture des souches dans du lait écrémé et mesure du pH à l’aide d’un pH-mètre toutes les heures d’une part, et par titrage titrémétrique du NaOH en présence de la phénolphtaléine, d’autre part, durant 24 h. Les résultats de la production d’acide lactique par les différentes souches sont mentionnés dans le tableau 21 et représentés par les figures 20, 21, 22, 23, 24 et 25. Si la coagulation survient au moins de 6h, elle est dite rapide; et elle considérée comme moyenne si elle survient au bout de 6 à 8h ; par contre, si l’acidification ne survient qu’après 18 à 24h d’incubation, elle est considérée comme lente. D’une manière générale, on remarque que l’activité acidifiante diffère selon les genres et selon les espèces et parfois au sein de la même espèce. Ceci nous a permis de classer les différentes souches de bactéries lactiques selon leur aptitude acidifiante en trois groupes : Souches à pouvoir acidifiant élevé ou souches dites rapides si la coagulation survient en moins de 8h, ou si le taux d’acidification est ≥ 80 °D. Ce groupe est représenté par les souches Lactococcus lactis subsp cremoris Lc11, Streptococcus thermophilus St1, Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln1et Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris Ln8 ayant produit 10.00, 11.8, 09.84, 10.2 g/l d’acide lactique respectivement. D’autres souches ont également été estimées comme bonnes acidifiantes, il s’agit des souches Llc9, Lp2, Lc2, Lb19, Lbc1, Lcd1, Lcd2 et Lbc2. Ces souches ont pu acidifié le lait en moins de 8 h. Par ailleurs, la souche qui a atteint le plus grand pouvoir acidifiant en fonction du temps est Lbc2. Souches à pouvoir acidifiant moyen dont le taux d’acidification se situe dans l’intervalle : 80 ≤°D≤69.5 Les résultats obtenus indiquent qu’à t = 0 heures, le pH initial du lait écrémé se situe entre 5.8 et 6.5 pour toutes les bactéries lactiques testées, ce pH diminue en fonction du temps et il a atteint la valeur de 3.4 pour la souche Lactobacillus
80 Résultats et Discussion plantarum, 3.3 pour la souche Lactococcus lactis subsp cremoris, 3.45 pour les Lactobacillus bulgaricus, 4.8 et 4.9 pour la souche Lactococcus lactis subsp lactis, 3.1 pour les Leuconostoc et 3.6 pour et les Streptococcus thermophilus. Avec ces valeurs de pH, ces isolats sont classés comme souches à acidification moyenne. Les souches St7, Ln6, Ln11, Lc13 ont également été considérées à pouvoir acidifiant moyen. Souches à pouvoir acidifiant faible, si le taux d’acidification est: ≤69,5 °D ou lorsque les souches acidifient le lait écrémé après 24h. Cette catégorie est représentée par les souches Lc7, Ln9, Lb10, Lbb1, Ln10 et Lb5. En effet, la coagulation du lait écrémé avec ces espèces n’a eu lieu qu’après 24h d’incubation. La souche LB9 a enregistré le pouvoir acidifiant le plus faible parmi les isolats testés. La quantité d’acide lactique produite en fonction du temps est légèrement variable d’une souche à l’autre de même espèce. On remarque que le taux d’acidité varie légèrement d’une souche à l’autre au sein de la même espèce en fonction du temps. Nos résultats rejoignent ceux de Accolas et al. (1977) qui ont indiqué que les activités acidifiantes des bactéries lactiques du yogourt varient considérablement d’une souche à une autre et à l’intérieur d’une même espèce. Nos observations ont porté également sur le temps de coagulation. En effet, à l’exception des souches de Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides et Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris qui ont coagulé le lait après 24 heures d’incubation, les autres souches appartenant aux genres Lactococcus et Streptococcus ont coagulé le lait au bout de 8 heures, ce qui signifie que ces souches ont un pouvoir acidifiant plus important. Il existe une relation étroite entre le pH et le degré Dornic, le pH diminue au fur et à mesure que la quantité d’acide lactique produite augmente. A travers les résultats obtenus, on peut conclure que certaines de nos souches isolées possèdent une activité acidifiante intéressante pour la fabrication des produits laitiers. Des résultats analogues ont été mentionnés par Chamba et Prost (1989) ayant mentionné que le pouvoir acidifiant de quelques souches de Lactobacillus et Streptococcus thermophilus diminue en fonction du temps.
81 Résultats et Discussion
Tableau 21: Pouvoir acidifiant des souches lactiques isolées à partir du lait et de la caillette de brebis
0 heures 2 heures 4 heures 6 heures 8 heures 24 heures pH AC* pH AC* pH AC* pH AC* pH AC* pH AC*
Lbb1 6,4 24 6,4 33 5,6 41 5,3 44 4,8 49 4,7 56
Lbc1 6,6 34 6,2 39 5,1 53 4,5 58 4,1 64 4,1 67 St5 6,5 29 6,3 39 5,4 44 4,5 59 4,1 60 4,2 66 Ln9 6,4 26 6,4 28 6,2 33 5,5 40 4,8 49 4,7 51 Lcd1 6,4 30 6,2 39 5,3 49 4,2 61 4,2 65 4,2 68 Pc2 6,4 30 6,2 40 5,4 43 5,0 52 4,2 59 4,1 62 Lbc3 6,4 31 6,3 35 5,7 40 5,0 54 4,4 59 4,2 64
Lb10 6,5 25 6,4 34 6,3 36 5,8 40 4,9 47 4,9 51
St12 6,5 30 6,4 35 6,2 39 4,9 52 4,3 57 4,2 60
Lbb2 6,5 25 6,5 35 5,8 42 5,4 45 4,9 50 4,8 52 Ln10 6,5 27 6,5 29 6,4 35 4,8 40 4,9 49 4,9 50 Lcd2 6,5 29 6,1 40 5,2 50 4,2 61 4,2 65 4,1 68 Lb5 6,6 25 6,5 35 6,4 37 5,9 40 4,8 48 4,8 50 Lbc2 6,6 35 6,1 40 5,2 55 4,5 59 4,2 65 4,2 68 St8 65 30 6,2 40 5,4 45 4,5 58 4,2 62 4,3 65 Pc2 6,5 30 6,1 40 5,5 45 5,1 55 4,3 60 4,2 63 Lc3 6,6 29 6,5 35 6,1 40 4,9 53 4,4 58 4,2 60
Lc14 6,6 28 6,5 34 5,7 42 4,5 56 4,2 62 4,3 66 Lc15 6,5 32 6,4 36 5,8 41 5,1 55 4,4 60 4,2 65 Lb23 6,45 30,25 62 35,4 5,15 40,1 4,55 60,25 4 70 3,45 99,5 Lc11 6,4 35 6,15 35,45 4,25 45,45 4,1 50,5 3,85 82,5 3,3 100 Lb6 6,1 30,7 5,85 40,1 4,9 40,7 4,75 50 3,9 60,85 3,4 97,5 Lcp1 6,5 30,2 5,1 30,4 4,9 30,9 4,85 40,55 4 60,15 3,7 80,7 Stp1 6,05 25,5 4,85 40,15 4,1 45,15 3,95 55,75 3,8 78,5 3,6 118 Ln8 62 30,25 4,55 35,25 3,85 55,65 3,65 77,7 3,4 89,1 3,1 102 Ln1 6 40,2 4,7 40,4 4,6 45,25 42 50,3 4 71 3,1 98,4
82 Résultats et Discussion
8 7 6 5 4 pH 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 Temps (Heures)
Lb23 Lc11 Lb6 Lcp1 Stp1 Ln8 Ln1
Fig. 20 : Variation du pH en fonction du temps des souches isolées à partir du lait et de la caillette de brebis
140
120
100
80
60
40 Degré Degré Dornic (°D) 20
0 1 2 3 4 5 6 Tepms (Heures) Lb23 Lc11 Lb6 Lcp1 Stp1 Ln8 Ln1
Fig. 21 : Quantité d’acide lactique (exprimé en degré Dornic) produite par les souches isolées à partir du lait et de la caillette de brebis.
83 Résultats et Discussion
80 70 60 50 40 30
Degré Dornic (°D°) 20 10 0 0 2 Temps (Heures)
Lbc1 Lcd1 St12 Lbb1
Fig. 22 : Quantité d’acide lactique exprimée en degré dornic produite par quelques souches isolées à partir du lait de brebis.
8 7 6 5 4 pH 3 2 1 0 0 2 Temps (Heures)
Lbc1 Lcd1 St12 Lbb1
Fig. 23 : Variation du pH en fonction du temps de quelques souches isolées à partir du lait de brebis
84 Résultats et Discussion
8
7
6
5
4 pH
3
2
1
0 1 2 3 4 5 Lb19 St7 TepmsLn6 (Heures)Ln11 Lc7 Lc13
Fig. 24 : Variation du pH en fonction du temps des souches isolées à partir du lait de brebis
100 90 80 70 60 50 40 30 Degré Dornic (°D) 20 10 0 1 2 3 4 5 Temps (Heures)
Lb19 St7 Ln6 Ln11 Lc7 Lc13
Fig. 25: Quantité d’acide lactique (en degré dorinc) produite par quelques souches testées
85 Résultats et Discussion
2.2. Activité protéolytique L’activité protéolytique a été estimée par culture des souches dans le milieu YMA (YEAST MILK AGAR) solide et mesure de la croissance. Les souches sont ensemencées en touches. La protéolyse se traduit par l’apparition d’un halo clair autour des souches ensemencées après 24 h d’incubation du à la dégradation de la caséine. La mesure de la dimension du halo permet de quantifier d’une manière relative l’activité protéolytique des souches les unes par rapport aux autres. Les diamètres des zones varient de 5 à 25 mm. Les souches isolées à partir du lait de brebis montrent deux types de réponses : une croissance sans protéolyse et une croissance avec protéolyse. Les résultas de l’hydrolyse des protéines par les souches lactiques sont représentées dans le tableau 22. D’après les résultats obtenus, l’activité protéolytique est observée chez la plupart des souches testées. A cet égard, les isolats sont classés en trois catégories. Souches à pouvoir protéolytique élevé tel est le cas des souches Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc à l’exception de la souche Lactococcus lactis subsp lactis (Lc5). On remarque également que l’activité protéolytique chez les souches Lcp1, St12, Lbc3, Lp1, pc3, Lp2 et Lp3 est plus importante par rapport aux autres souches. En effet, le diamètre de la zone claire obtenu après croissance est plus important chez ces espèces (Fig. 26).
Fig. 26: Activité protéolytique chez quelques souches lactiques testées
86 Résultats et Discussion
Ces résultats obtenus sont comparables avec ceux cités par (Searles et al., 1970). D’autres souches ont par ailleurs présenté une faible activité protéolytique. Leur croissance s’est traduite par l’apparition de halos dont le diamètre est moins important. L’activité de Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides et de quelques souches appartenant au phénotype Streptococcus thermophilus parait plus faible. Les streptocoques thermophiles ont une faible activité protéolytique, ce qui n’est pas le cas des lactobacilles (El Soda et Desmazeaud, 1982). Nous avons noté que certaines souches ne possèdent aucune activité protéolytique, tel est le cas des Leuconostocs et de la souche Lactococcus lactis subsp lactis (Lc5). L’absence de l’activité protéolytique chez la souche (Lc5) résulte de la perte d’un plasmide codant pour la synthèse de la protéase : enzyme localisée au niveau de la paroi cellulaire et qui donne à la bactérie la particularité d’hydrolyse des protéines à poids moléculaire élevé qui se trouve dans le milieu de culture telle que la caséine (Gasson et David, 1984, Desmazeaud, 1996). Les souches ayant le pouvoir protéolytique le plus important que nous avons rencontré sont Lactococcus lactis subsp lactis, Lactococcus lactis subsp cremoris et Lactobacillus bulgaricus. Desmazeaud et Vassal, 1979 ont montré que les souches les plus protéolytiques sont Lactococcus surtout Lactococcus lactis subsp diacetylactis. L’activité protéolytique des bactéries lactiques est assez faible si on la compare à d’autres microorganismes tels que les Bacillus, les Pseudomonas, les levures et les moisissures (Gripon et al. 1975, Salvadori, 1966 et Novel, 1993). Enfin, cette activité qui est d’abord nécessaire au métabolisme azoté des bactéries lactiques, intervient dans les caractéristiques des produits laitiers fermentés. La protéolyse est à l’origine de l’apparition de nombreux composés aromatiques ou de leurs précurseurs, et celle-ci joue aussi un autre rôle qui porte sur la texture des fromages (Hemme et al., 1982). Rappelons que les enzymes protéolytiques peuvent être divisées en deux groupes :
87 Résultats et Discussion
- Endopeptidases
- Exopeptidases
L’activité protéolytique des bactéries lactiques est limitée mais agit à plusieurs niveaux :
- Diminue le rendement du fromage.
- Texture et saveur du fromage.
Toutefois, la mesure de cette activité pose de problèmes qui ne sont pas encore complètement résolus (Tan et al., 1993).
Tableau° 22 : Activité protéolytique des souches lactiques isolées à partir du lait et de la caillette de brebis
88 Résultats et Discussion
Évaluation Diamètre Code de la Espèces (mm) protéolyse
Lactococcus lactis subsp lactis Lcp1 16 ++
Lactococcus lactis subsp cremoris Lc11 11 + Streptococcus thermophilus Lcp1 9 + Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Lb2 7 +
Lactococcus lactis subsp lactis Lc5 0 ─ Lactobacillus casei Lb6 10 +
Lactobacillus helveticus Lb23 8 + Streptococcus thermophilus St5 22 + + +
Lactobacillus bulgaricus Lbc3 28 + + + Streptococcus lactis St12 36 + + +
Lactobacillus casei Lb10 10 + Leuconostoc mesenteroide subsp cremoris Ln9 0 ─ Streptococcus thermophilus St8 32 + + + Pediococcus halophilus Pc2 34 + + + Lactococcus lactis Lc3 36 + + + Lactobacillus delbrukii subsp bulgaricus Lc15 38 + Leuconostoc mesenteroide subsp cremoris Ln10 0 ─ Lactobacillus casei Lb19 18 + Streptococcus thermophillus St7 10 + Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln6 23 + +
Lactococcus lactis subsp cremoris Lc13 24 + + Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris Ln11 0 ─
Lactococcus lactis subsp lactis Lc7 29 + + +
Lactobacillus plantarum Lp1 24 +++
Lactococcus lactis subsp lactis Lc1 14 ++ Lactococcus raffinolactis Lc17 13 ++ Pediococcus pentosaceus Pc3 21 +++
Lactococcus lactis subsp lactis Lc9 17 ++ Lactobacillus pentosus Lp2 21 +++ Lactococcus lactis subsp lactis Lc2 12 ++ Lactobacillus rhamnosus Lp3 22 + + + Streptococcus thermophilus St6 17 + +
─ : Zone d’activité protéolytique dont le diamètre est: =0mn. + : Zone d’activité protéolytique dont le diamètre est compris entre : 5-15mm. + + : Zone d’activité protéolytique dont le diamètre est compris entre : 10-20mn. +++ : Zone d’activité protéolytique dont le diamètre ≥ 20mm (Vuillemard et al. 1990).
89 Résultats et Discussion
2.3. Antibioresistance : Les résultats des tests de l’antibiorésistance des souches lactiques sont regroupés dans le tableau 23. En effet, après avoir traité les souches lactiques avec sept antibiotiques différents et après 24h d’incubation des boites imprégnés avec les disques d’antibiotiques ensemencées en surface avec les souches isolées, nous avons remarqué la formation de zones d’inhibition autour de ces disques (Fig 27 et 28). Le diamètre des zones d’inhibition diffère selon la souche et l’antibiotique utilisé. Une grande sensibilité des souches a été remarquée envers la pénicilline. Enterococcus sp est le genre le plus résistant notamment aux tetracyclines, ces résultats sont comparables avec ceux mentionnés par Chopard et al., (2001). En fait les bactéries lactiques sont plus sensibles aux antibiotiques de la familles des lactamines (comme la pénicilline) qui représente la famille d’antibiotiques la plus utilisée en pratique clinique (Chopard et al, 2001).
Tableau 23 : Evaluation de la sensibilité des souches vis-à-vis des antibiotiques utilisés (mm)
Souches Les antibiotiques
C GM TE SP CS SSS P Lp1 S S S S S S S
Lc1 R R R R R R S
Lc17 S R S R S S S
Pc3 R S S S R R S
Lc9 R S S R R R R
Lp2 S S R R S S S
Lc2 S S R R R S S
Lb8 S S R S S S S
St6 S R S S R R R P : Pénicilline GM : gentamycine SSS : sulfamide C : chloramphénicol S : Sensible. TE : tetracycline SP : spiramycine R : Résistante. CS : colistine
90 Résultats et Discussion
Fig. 27 : Test de sensibilité de Lactococcus lactis ssp lactis aux antibiotiques
Fig. 28 : Test de sensibilité de Lactobacillus plantarum aux antibiotiques
91 Résultats et Discussion
3. Analyses physico-chimiques du lait Quelques paramètres physico-chimiques du lait de brebis ont été mesurés à savoir le pH, l’acidité et la matière sèche selon les normes de l’AOAC (2000).
Les résultats obtenus sont regroupés dans le tableau 24. Il apparaît que l’acidité titrable mesurée est légèrement faible et ne dépasse pas 21 °D en moyenne. La valeur du pH a été estimée quant à elle à 6.7 en moyenne. Il apparaît également que le lait de brebis renferme un taux d’extrait sec faible (11.5%), il en est de même pour le taux de matière grasse qui est de l’ordre de 6.5%, une valeur largement supérieure à celle de la vache. En effet, Park et al. (2007) ont indiqué que le lait de brebis est plus riche en lipides par rapport à celui de la vache. Le taux des matières azotées totales est relativement faible, il est de l’ordre de 3,50 % en moyenne, une valeur relativement inférieure aux normes. On remarque qu’il existe un écart entre les résultats obtenus et les normes dictées par (Revemal, 1982 et FAO, 1995), des compositions de lait de brebis. Ces réponses peuvent être expliqués probablement par une présence de certains facteurs influant sur ces compositions (par exemple : la nature d’aliment ingéré, les conditions climatiques, la race, ainsi qu’ à l’état physiologique de l’animal, à son régime alimentaire et même à la méthode de dosage utilisée ainsi qu’à la race.
Tableau 24 : Résultats d’analyses physico-chimiques du lait de brebis
Analyses pH °D Matière sèche Matière grasse Lait de brebis 6.7 21°D 11.5% 6.5% Les normes 6.5 ─ 6.85 22 ─ 25°D 18.3% 7.1% (Pellegrini et al., 1987 et FAO, 1995)
4. Résultats d’analyse microbiologique du lait de brebis : En général, le nombre de germes totaux obtenu dans nos échantillons (lait de brebis) est relativement moyen soit, 45.105 (germes/ml), les levures et les moisissures dans le lait sont négligeables avec un taux de 29 (germes/ml.)
92 Résultats et Discussion
Il y’a une présence notable de coliformes totaux (202 germes/ml), et de coliformes fécaux (17 germe/ml) et de Streptocoques fécaux (57 (germes/ml) en moyenne. Ainsi que de Staphylocoques, par contre, les Salmonelles sont absents (figures 14 et 15). La flore mésophile aérobie totale (MAT) : C’est l’ensemble des micro-organismes aptes à se multiplier à l’air aux températures moyennes.
Cet ensemble englobe les micro-organismes pathogène d’une part, et d’autres micro- organismes divers d’autre part. (BOURGEOIS, 1985). L’excès dans la flore mésophile signifie que le processus d’altération microbienne est fortement engagée, ceci résulte probablement d’une éventuelle contamination du lait par les coliformes totaux et fécaux ce qui caractérise leur aptitude à fermenter plus au moins rapidement le lactose. (CASTARAS et BOURGEOIS, 1980).
- les Staphylocoques accusent une quantité de 300 (germes /ml) donc le niveau de contamination est habituellement faible (BOURGEOIS, 1985).
- la présence de Streptocoques fécaux donne des informations sur l’origine de la contamination, si elle est d’origine animal ou humaine, ces germes sont plus résistants aux variations du milieu extérieur, leur présence indique que la contamination est ancienne (THOMAS,1974).
- Les levures et moisissures présentent un aspect identique aux colonies bactériennes, car elles peuvent avoir des bords irréguliers et des formes concaves ou plates.
5. Analyses physico-chimiques du yaourt 5. 1. Détermination du pH et de l’acidité des yaourts expérimentaux Les variations du pH du yaourt témoin ainsi que des échantillons acidifiés ont été étudiés. Au cours de la période de fermentation, nous avons constaté une remarquable diminution du pH pour les yaourts fabriqués à base de nos souches locales isolées ainsi que ceux fabriqués à base des souches commerciales. On constate que les valeurs de pH enregistrées sont inversement proportionnelles au taux d'inoculation des souches et en fonction de la période de fermentation ; nous avons remarqué également que les valeurs diminuent lorsque le taux d’ensemencement des souches augmente (Tableau 25 et 26). Les résultats obtenus dans cette étude concernant les dosages d'acide
93 Résultats et Discussion lactique concordent avec ceux obtenus par Tamime et Robinson (1985) ayant trouvé que la quantité d’acide lactique a augmenté de cinq fois après 3 h et demi d'incubation du lait contenant 0,15 % d'acide lactique et 12% de matière sèche, une valeur similaire à la teneur en matière sèche dans le yaourt expérimentale. Nos résultats rejoignent également ceux rapportés par Sokolinska et al. (2004) ayant indiqué que les valeurs de pH du lait au cours de la fabrication, à partir du moment où il a été inoculé avec des cultures bactériennes jusqu’à l'heure où il fut fabriqué, ont diminué, passant de 6,70 à 4,34. Les mêmes observations ont été signalées par O'neil et al. (1979). Selon d'autres auteurs (Luquet, 1990), les souches lactiques ont la capacité de fermenter le lactose en acide lactique, avec une augmentation d'acidité et une baisse de pH du lait fermenté, ce qui révèle l'influence sur la composition de l'inoculum sur le taux de croissance des bactéries telles que les Streptococcus. En effet, le développement de ces germes semble être proportionnel au taux de protéines (et donc certainement au taux d'acides aminés) dans le milieu. En outre, pendant la durée totale expérimentale, les valeurs de l'acidité sont encore plus élevées. L'analyse de variance a révélé que la période de fermentation et de la concentration progressive ont un effet significatif sur la diminution du pH. 5. 2. Evolution moyenne de l'acidité du yaourt préparé à base du lait de brebis au cours de la fermentation Concernant ce paramètre, nous avons enregistré des différences importantes entre les acidités titrables des différents traitements. En effet, l’acidité du yaourt préparé à base des souches commerciales augmente au cours de la fermentation et de post-acidification. Les valeurs enregistrées varient de 48,33 °D après 2h de fermentation à 66,34 °D après 4 heures et 88,00 °D du 7ème jour à 104,00 °D le 14ème jour et a atteint 121,67 °D le 21ème jour en moyenne pour une concentration en souches de 2,5%. Il semble qu'il existe une relation proportionnelle entre le taux d'inoculation de souches et d'acidité, le taux d'inoculation augmente proportionnellement au degré d'acidité.
94 Résultats et Discussion
Les résultats ont montré que le type de culture bactérienne appliquée au cours de l'inoculation de lait a eu un impact significatif sur l'acidité du produit obtenu. Les mêmes remarques ont été rapportées par Salji et Ismail (1983) et Sokolinska et al. (2004). L'analyse de variance a révélé que la durée de fermentation et de la concentration progressive avoir un effet significatif sur l'augmentation de l'acidité. En outre, nous avons enregistré des valeurs d'acidité moins importantes pour le yaourt préparé à base des souches isolées localement lors de la fermentation. Néanmoins, pendant la période de post-acidification, les valeurs enregistrées sont de l'ordre de 113 °D pour le lot témoin et 121 °D pour le lot 3 enfin, nous avons enregistré 132,34 °D pour le lot 5.
95 Résultats et Discussion
25 : Evolution des teneurs moyennes en pH du lait de brebis durant la fermentation et la période de post acidification. X ± σ, n = 3
Paramètre Analyse de Témoin 1,5% 2,5% 3% 3,5% variance Période
5.86 5 .42 5.88 6.10 6.10 2H 0.153 ** 0.115 00 0.012 0.017 b C b a a
4.47 5.75 5.60 5.48 5.35 4H 0.06 ** 0.072 0.01 0.409 0.121 b
Période fermentation de a a a a
5.27 4.65 5.60 5.56 5.33
7 jours ** 0.05 0.1 0.113 0.082 0.075 c a a b b
5.45 5.32 5.27 acidification
- 4.55 5.22 14 jours 0.089 0.02 0.061 ** 0.05 0.111 a ab b c b
4.49 5.26 5.11 5.19 5.05 Période post de 21 jours 0.039 0.156 0.18 0.078 ** 0.066 b a a a a
** : Hautement significatif (≤ 0.01)
A,b,c : Les Groupes Homogénes après comparaisons des moyennes
96 Résultats et Discussion
Tableau 26 : Evolution moyenne de pH des yaourts de lait de brebis au cours de la fermentation X ± σ, n = 3
Lots Témoin Lots 2 Lots 3 Lots 4 Lots 5 Effet du Lots 1 1.5 % 2.5% 3 % 3.5 % facteur Durée de fermentation
2H 5.747 5.730 5.600 5.523 5.507 ** ± ± ± ± ±
0.006 0.02 0.026 0.006 0.006 a a b c c
5H 5.283 5.373 4.957 4.873 4.683 **
± ± ± ± ±
0.047 0.015 0.286 0.110 0.055
a a b b b
7J 4.920 4.820 4.580 4.503 4.320 *** ± ± ± ± ± 0.114 0.125 0.053 0.055 0.030 a a b b c 14J 4.613 4.570 4.420 4.110 3.960 ** ± ± ± ± ± 0.340 0.080 0.070 0.130 0.200 a a ab bc c
21J 4.440 4.327 4.180 3.997 3.903 ** ± ± ± ± ± 0.135 0.040 0.090 0.050 0.061 a ab b c c
* : Significatif (≤ 0.05) ** : Hautement significatif (≤ 0.01) A,b,c : Les Groupes Homogénes après comparaisons des moyennes 6. Propriétés rhéologiques du yaourt 6.1. Evolution moyenne de la viscosité du yaourt préparé à base du lait de brebis au cours de la fermentation La viscosité du yaourt varie en fonction du temps. Les résultats obtenus indiquent que les valeurs enregistrées ont augmenté de 0,32 mps après 2h à 0,74 mps après 5h dans le lot témoin, contre 0,950 et 1,277 mps en moyenne pour le lot 2 (1,5%). Cette augmentation des valeurs de viscosité a également été enregistrée dans
97 Résultats et Discussion les lots 3 (2,5%), 4 (3%) et 5 (3,5%). Toutefois, après 5h de fermentation jusqu'au 21ème jour, la viscosité diminue de 0,74 à 0,19 mps au lot témoin et de 1,277 pour 0787 mps dans le lot 2. Cette baisse des valeurs a également été observée dans les lots 3, 4 et 5 (tableau 12 annexe ).
Tableau 27: Evolution des teneurs moyennes en (viscosité) du lait de brebis fermentés durant la fermentation la période de post acidification X ± σ, n = 3
Lots Lot 1 Lot 2 Lot 3 Lot 4 Lot 5 Analyse Témoin 1.5 % 2.5% 3 % 3.5 % de Période de variance fermentation 2.34 0,23 0.286 0.316 0,38 2H ± ± ± ± ± ** 0,01 0.017 0.005 0.034 0 a d c c b
2.83 0.43 0.555 0.745 1.22 5H ± ± ± ± ± ** 0,03 0.026 0 0.061 0.04 a e d c b
2.23 0196 0,26 0,311 0,37 7 j ± ± ± ± ± ** 0 0.037 0.035 0.028 0,044 a d c c b
2.02 0,159 0,231 0,276 0,36 14 j ± ± ± ± ± ** 0,01 0,009 0.049 0.054 0.017 a d c c b
0,178 0,09 0,189 0,239 0,33 21 j ± ± ± ± ± ** 0,072 0,01 0,03 0044 0,03 a D c c b ** : Hautement significatif (≤ 0.01) A,b,c : Les Groupes Homogénes après comparaisons des moyennes
Selon d’autres auteurs (Luquet, 1986), les streptocoques thermophiles assurent le démarrage de la fermentation et ont besoin pour le développement comme simple facteur de croissance des acides aminés qui ne sont plus disponibles dans le milieu, après une hydrolyse partielle de la caséine par les enzymes produits par Lactobacillus
98 Résultats et Discussion bulgaricus et l'augmentation du taux d'incorporation de protéines et probablement à l'origine de la croissance bactérienne, accompagnée d'une forte sécrétion d'agents texturants dans le yaourt. Vraisemblablement, la viscosité augmente proportionnellement avec le taux de souches inoculées. Nous avons enregistré des valeurs de 0.23, 0.28, 0.31 et 0.38 avec des taux de 1.5%, 2.5%, 3% et 3.5% respectivement. (Tableau27) Ces résultats peuvent être expliqués par le fait que les souches spécifiques du yaourt notamment les Streptococcus thermophilus sont à l’origine du démarrage de la fermentation lactique, alors que leurs équivalents les Lactobacillus bulgaricus l’achèvent est sont plus actives on période de post-acidification où le pH de milieu est acide (Rasic et Kurmann, 1978 et Chougrani et al., 2008). Selon Rawson et Marshall (1997), les Streptococcus thermophilus sont les germes les plus incriminés dans la production d’agent texturants exocellulaires appelés exopolysaccharides susceptibles d’interagir avec la matière protéique du lait et d’augmenter la viscosité donc la qualité rhéologique des produits. Pendant la période de post-acidification, l'activité de Streptococcus thermophilus n'est pas complètement arrêtée, mais elle est moins importante par rapport à celle de Lactobacillus bulcaricus qui produit non seulement de l'acide lactique, mais vraisemblablement une légère quantité d'agents texturants (Luquet, 1994). En revanche, la diminution de la viscosité observée pendant toute la période d’expérimentation est peut-être liée à une action hydrolytique d'une protéine exopolysaccharidique de certaines enzymes sécrétées par les bactéries lactiques inoculées pendant leur croissance. Selon Vlahopoulou et Bell (1990), les yaourts contenant des cultures traditionnelles dans lesquelles L. delbrueckii subsp. bulgaricus et S. thermophilus se trouvent à un rapport de 1:1 sont caractérisés par une viscosité plus faible que ceux dont lesquels les cultures sont dominées par les L delbrueckii subsp. bulgaricus. Les mêmes chercheurs ont signalé que la viscosité diminue d’un taux de 26,3% dans les yaourts préparés à partir de lait inoculé avec des cultures traditionnelles.
99 Résultats et Discussion
En outre, les bactéries L. delbrueckii subsp. bulgaricus conduisent à une augmentation de la viscosité du yaourt par la production de substances muqueuses spéciales de nature polyosidique (Ariga et al., 1992 et Brandt, 1997). Ces matières forment, principalement avec la caséine, des agrégats permanents de haute résistance à l'action mécanique et présentant une grande résistance au phénomène de synérèse (Gruter et al., 1993).
6.2. Evolution moyenne du goût des yaourts au lait de brebis au cours de la fermentation 6.2.1. Évaluation sensorielle des yaourts Les panélistes ont jugé le goût du yaourt préparé avec les souches commerciales en utilisant le lait de brebis inoculé à un taux de 1.5%, 2.5%, 3% et 3.5% comme meilleur par rapport au témoin (yaourt préparé avec la poudre du lait), soit une moyenne de somme des rangs de 26.66 et 30.04 et 36.75 et de 41.66 successivement contre 13.63. Cette différence dans le goût résulte probablement d'une fermentation plus importante du lactose présent dans le milieu par les bactéries lactiques (Bourgeois et Larpent, 1989). Toutefois, le jury de dégustation décrit le goût du yaourt expérimental préparé à base des souches sauvages et préparé en utilisant du lait de brebis comme plus acceptable. Après le 21ème jour de la fermentation, une légère élévation de goût a été repérée avec des valeurs allant de 13 à 19,5 points en moyenne dans le lot témoin. En ce qui concerne les lots testés, une légère baisse a été enregistrée dans les valeurs. Néanmoins, ce changement n'affecte pas les propriétés de dégustation (qualité organoleptique préservée). En termes d'analyse statistique, les deux facteurs n'ont pas d'effet significatif sur l'évolution de ce paramètre. Anifantakis et al. (1980), ont noté que les yaourts préparés avec du lait de brebis congelé est généralement de bonne qualité. D'autre part, ces mêmes auteurs ont indiqué que leur jury de dégustation, dans la plupart des cas, était plutôt insensible à la saveur du yogourt oxydé. De petites différences dans les caractéristiques sensorielles
100 Résultats et Discussion des yaourts conservés congelés préparés à partir de lait de brebis ont été observées par Katsiari et al. (2002) entre le premier et le 14ème jour de conservation au froid. Les scores de l’aspect et de la texture, ainsi que la saveur et l'acceptabilité générale de tous les yaourts ont légèrement augmenté au cours de leur conservation au froid pendant 14 jours. Une tendance similaire a été observée par Abrahamsen et Holmen (1980) pour le yaourt du lait de vache témoin. Généralement, la cohésivité est plus satisfaisante lorsque le taux de souches commerciales inoculé est plus important, avec des valeurs moyennes de 25.08, 30.93, 36.27 et 41.22 pour des taux variables de 1.5%, 2.5%, 3% et 3.5% respectivement. La cohésivité du yaourt expérimental inoculé avec des souches sauvages, durant toute la période de fermentation, est de 34 à la dose de 2.5%. Pendant ce temps, aux doses de 1.5%, 3% et 3.5%, nous avons enregistré des valeurs de 29.5, 29.5 et 26 respectivement, en moyenne (tableau voir Annexe). Selon Rawsan et Marshall (1997), cette appréciation des caractéristiques rhéologiques des yaourts (adhesivité et cohésivité) est probablement liée à des exopolysaccharides produits par les souches spécifiques du yaourt Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus. L'analyse de variance a montré l'effet significatif des deux facteurs (durée de la fermentation et taux de l'inoculum) sur le développement de la cohésion dans les yaourts testés. 6.3. Evolution moyenne de l'adhésivité des yaourts au lait de brebis au cours de la fermentation Durant le premier jour de fermentation, la valeur de l'adhésivité enregistrée est de 47 en moyenne pour le lot témoin. Cette valeur est supérieure à celle des autres lots testés (tableaux 28 et 29). Après 7 jours de la fermentation, une diminution importante dans ce paramètre a été observée dans le lot témoin, alors que dans les lots 2, 3 et 5, ce paramètre connaît une augmentation importante. À la fin de l'expérimentation, l'adhésivité connaissait une augmentation dans les lots 2 et 3 ; d'autre part, les valeurs étaient moins importantes en ce qui concerne le
101 Résultats et Discussion lot témoin. Les mêmes remarques ont été rapportées par Rawsan et Marshall (1997) et Katsiari et al. (2002) ayant indiqué une augmentation de l’adhésivité de yaourt de brebis au cours du stockage.
Tableau 28 : Evolution sensorielle de la cohésivité des yaourts expérimentaux au cours des périodes de fermentation et post-acidification Somme des Rangs (n=10)
Paramètres Lot 1 Lot 2 Lot 3 Lot 4 Lot 5 Analyse de étudiés Périodes témoin variance (jours) 1 j 47 26.5 21 35.5 20 ** c ab ab b a 7 j 15.5 37.5 39 33 25 ** a b b b b 14 j 19 41 37 28.5 24.5 * a b b ab ab 21 j 31 29.5 34 29.5 26 NS
NS : Non significatif * : Significatif (≤ 0.05) ** : Hautement significatif (≤ 0.01) A,b,c : Les Groupes Homogénes après comparaisons des moyennes
102 Résultats et Discussion
Tableau 29: Evolution sensorielle de l’adhésivité des yaourts expérimentaux au cours des périodes de fermentation et post-acidification Somme des Rangs (n=10)
Paramètres Lot 1 Lot 2 Lot 3 Lot 4 Lot 5 Analyse de étudiés Périodes témoin variance (jours) 1 j 47 23.5 22 35.5 22 ** b a a a a 7 j 16 35 35.5 32 30.5 ** a b b b b 14 j 17 39.5 38 31.5 24 ** a b b b ab 21 j 27 37 34 22 27 NS
NS : Non significatif * : Significatif (≤ 0.05) ** : Hautement significatif (≤ 0.01) A,b,c : Les Groupes Homogénes après comparaison des moyennes
6.4. Evolution de Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus au cours de la fermentation Au cours de la période de fermentation et à partir de la 2ème heure jusqu'au 14ème jour, en utilisant les souches locales isolées, nous avons noté une augmentation de manière significative du nombre de microorganismes à partir de (43 × 105 à 83 x 105) ufc/ml (52 x 105 à 88 × 105) ufc/ml (54 x105 à 91 × 105) ufc/ml et (75 × 105 à 94 x 105) ufc/ml en moyenne pour des doses 2, 2.5, 3 et 3.5% respectivement. Ceci corrobore les résultats présentés par (Bourgeois et Larpent., 1989 et Guyot., 1992), qui ont rapporté que Streptococcus thermophilus assure le démarrage de la fermentation lactique et se développent à un pH de 4.2, où ils sont inhibés alors que les souches de Lactobacillus bulgaricus, qui sont plus acidotolérants prennent le relais et achèvent la fermentation (Luquet., 1994).
103 Résultats et Discussion
En revanche, après le 14ème jusqu’au 21ème jour, nous avons enregistré une diminution relative de ce germe dans le yaourt expérimental; nous avons comptabilisé à la fin de la fermentation des valeurs (61, 67.73 et 86) × 105 ufc/ml en moyenne pour 2 doses, de 2.5, 3 et 3.5%, respectivement (Fig. 29 et 30). En ce qui concerne l'évolution de Lactobacillus bulgaricus des yaourts préparés avec du lait de brebis au cours de la fermentation en utilisant les mêmes souches sauvages nous avons remarqué au début une augmentation du nombre de ces germes de 28x105 à 72×105 ufc/ml, entre 2h et le 14ème jour pour une dose de 2.5%.
120
5 100
80
60
40
20 Nombre de germesx10 de Nombre 0 2h 5h 7j 14j 21j Durée
Lot 1 témoin Lot 2 Lot 3 Lot 4 Lot 5
Fig. 29 : Evolution des teneurs moyennes en nombre de Streptococcus thermophilus du yaourt durant la fermentation
Au cours du processus de fermentation, le nombre de Streptococcus thermophilus (18.3x105 ufc/ml après 2h et 25x105cfu/ml après 4h en moyenne) est relativement plus élevé que celui de Lactobacillus bulgaricus (10x3.105 ufc/ml et 13.3x105 ufc/ml) aux mêmes périodes. Cependant, cette tendance est inversée au cours de la post-acidification, c'est-à- dire le nombre de Lactobacillus bulgaricus comparativement à Streptococcus thermophilus est de l’ordre de 71x105 ufc/ml contre 60x105 ufc/ml le 7ème jour et 73x105 ufc/ml contre 54x105 ufc / ml le 14ème jour, puis 76x105 ufc / ml contre
104 Résultats et Discussion
54.4x105 ufc / ml le 21ème jour. Sokolinska et al. (2004) ont signalé que le nombre de bactéries appartenant aux genres Streptococcus et Lactobacillus dans le yaourt augmente immédiatement après sa fabrication. Selon Zbikowski (1997), après 21 jours de conservation, parmi toute la microflore du yaourt, un total de 45% des bactéries subit des changements quantitatifs et dans le cas des yaourts fabriqués à l'aide de cultures probiotiques, ce taux est de
100 90 5 80 70 60 50 40 30
Nombre de de germesx10 Nombre 20 10 0 2h 5h 7j 14j 21j Durée Lot 1 témoin Lot 2 Lot 3 Lot 4 Lot 5
Fig. 30: Evolution des teneurs moyennes en nombre de Lactobacillus bulgaricus du yaourt durant la fermentation105
41,1%. L'auteur a montré que, pendant la même période de conservation des yaourts fabriqués à partir de lait inoculé avec une monoculture, la survie des bactéries L. delbrueckii subsp. bulgaricus était inférieure à celle de St. thermophilus. Les travaux menées par Beal et al. (1999) ont révélé que la survie des bactéries fermentant le lait les peut fluctuer dans une fourchette de 40 à 75% et, comme règle générale, les bactéries du genre Lactobacillus survivent plus que celles du genre Streptococcus. Selon Beal et al. (1999), Streptococcus thermophilus accuse le démarrage de la fermentation lactique du yaourt; leur croissance est stimulée par les acides aminés libérés à la suite de l'activité protéolytique de Lactobacillus. Cela est reflété dans la
105 Résultats et Discussion première phase expérimentale, à savoir la fermentation par un nombre élevé de Streptococcus comparativement à Lactobacillus. Puis, au cours de la période post-acidification et lorsque l'environnement devient plus ou moins acide, la croissance des germes de Streptococcus est relativement modérée, alors que les germes Lactobacillus qui sont plus résistants à un pH acide continuent de croître. En termes de l'analyse de la variance, aucun effet significatif des deux facteurs (période de fermentation et de la concentration de l'inoculum) n’a été observé dans l'évolution de ce paramètre. 7. Evolution des germes de contamination des yaourts après 21ème jours D’après les analyses microbiologiques, la recherche des germes pathogènes a montré une présence considérable des coliformes totaux avec une présence légère des champignons et des levures ceci est dû probablement d’une contamination subie après la fermentation (après 21 jours) lors de la manipulation. Car les yaourts dont leur pH est inférieur à 4 ne contiennent pas en principe les coliformes totaux car ce pH est hostile pour leur croissance. Selon Bourgeois (1996), un yaourt présentant un pH inférieur ou égal à 4.00 et contenant donc environ 1% d’acide lactique est un milieu hostile pour les bactéries pathogènes ; l’acidité les préserve d’une éventuelle contamination microbienne. Concernant les levures et moisissures, leur prolifération dans le lait fermenté s’est exprimée seulement au 21 jour de fermentation avec un nombre important. Ce qui explique que le développement de ces germes n’a pas été entravé par les forts taux d’acidité du milieu.
106 Résultats et Discussion
Conclusion
L’objectif de ce travail était d’introduire des souches lactiques isolées localement dans la fabrication d’un yaourt et de faire une comparaison en fabricant le même produit en utilisant des souches commerciales. A l’issue des résultats d’identification des souches lactiques, le présent travail a aboutit à l’isolement de 95 isolats à partir du lait cru et de la caillette de brebis représentant des espèces appartenant aux genres Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus et Pediococcus ce qui signifie que ce type de lait contient la majorité des souches lactiques rencontrées dans l’industrie laitière. En ce qui concerne les propriétés technologiques des souches isolées, un pouvoir acidifiant ainsi qu’une activité protéolytique remarquables ont été mis en évidence chez certaines souches ce qui nous a permis de sélectionner les deux souches servant à la préparation du yaourt Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus. Les tests physico-chimiques du lait de brebis ont montré que les échantillons sur les quels les dosages ont été effectués : protéines, lactose, matières grasses, matière sèche ont révélé une composition proche de celle rencontrée en littérature. En se basant sur les résultats des tests rhéologiques effectués au cours de la fermentation et la période de post-acidification sur les yaourts expérimentaux, il résulte ce qui suit : En effet, l’acidité (Dornic) du yaourt préparé à base des souches commerciales augmente au cours de la fermentation et de post-acidification. Dans le cas de nos souches locales l’acidité a connu une augmentation par rapport au témoin avec un pH très bas de 3,93 en moyenne. Il a été donc démontré que le pH est inversement proportionnelle avec l’acidité Dornic durant toute la période de fermentation. Les variations du pH du yaourt témoin ainsi que des échantillons acidifiés ont été étudiés. Au cours de la période de fermentation, il a été constaté une remarquable
107
Résultats et Discussion Lb1
diminution du pH pour les yaourts fabriqués à base des souches locales isolées ainsi que ceux fabriqués à base des souches commerciales.
On constate que les valeurs de pH enregistrées sont inversement proportionnelles au taux d'inoculation des souches et en fonction de la période de fermentation ; nous avons remarqué également que les valeurs diminuent lorsque le taux d’ensemencement des souches augmente. La viscosité du yaourt varie en fonction du temps. Les résultats obtenus indiquent que les valeurs enregistrées ont augmenté après 5h dans le lot témoin ainsi que dans les lots testés. Par ailleurs Les panélistes ont jugé le goût du yaourt préparé avec les souches commerciales en utilisant le lait de brebis inoculé à un taux de 1,5%, 2,5%, 3% et 3,5% comme meilleur par rapport au témoin (yaourt préparé avec la poudre du lait). Toutefois, le jury de dégustation décrit le goût du yaourt expérimental préparé à base des souches sauvages et préparé en utilisant du lait de brebis comme plus acceptable. Le jury a noté la remarque quant à l’adhésivité et la cohésivité. Ce qui est à promouvoir dans les études ultérieures, c’est de mener une étude similaire et complémentaire pour la confirmation de ces résultats obtenus, comme il serait intéressant d’ajouter un ou des agents de texture afin d’améliorer la qualité rhéologique du produit fini.
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118 Annexes
Milieux d’isolement : Milieu M17 (TERZAGHI et SANDINE. 1975) : Utilisé pour la culture des lactocoques.
Lactose 5 g Peptone trypsique de caséine 2,5 g Peptone pepesique de viande 2,5 g Peptone de soja 5,0 g Extrait de leveur des hydrates 2,5 g Extrait de viande 5,0 g Glycérophosphate de sodium 19,0 g Sulfate de magnésium, 7H2O 0,25 g Acide Ascorbique 0,50 g Agar- Agar 15 g Eau distillée 1000 ml pH = 7.1 – 7.2. Dissoudre les ingrédients dans l’eau à l’ébullition, laisser refroidir à 50 °C
Milieu MRS (MAN, ROGOSA et SHARPE, 1962) Utilisé pour la culture des lactobacilles
Peptone 10 g Extrait de viande 10 g Extrait de levure 5 g Acétate de sodium 5 g K2HPO4 2 g Citrate d’ammonium 2 g MgSO4 7H2O 0,2 g MnSO4, 4H2O 0,05 g Glucose 20 g Tween 80 1 ml Agar –Agar 15 g Eau distillée 1000 ml pH = 6,2 Autoclavage 20 mn à 120 °C.
Milieu Rogosa
Tryptone 10 g Extrait de levure 5 g Glucose 20 g Tween 80 1 ml KH2PO4 6 g Citrate d’ammonium 2 g Acétate de sodium 15 g Acide Acétique glaciale 1.32 ml MgSO4, 7H2O 0.575 g MnSO4, 4H2O 0.12 g FeSO4, 7 H2O 0.034 g Eau distillée 1000 ml pH = 5.8
Test de croissance en milieux hostiles : Bouillon hypersalé : Employé pour différencier les lactocoques et streptocoques thermophiles des Streptocoques fécaux.
Peptone 15 g Extrait de viande 5 g Glucose 5 g Chlorate de sodium 65 g Eau distillée 1000 ml pH = 7,2 Autoclavage 20 mn à 120°C
Acétoine Milieu de CLARCK et LUBS Utilisé pour mettre en évidence l’acétyle Peptone 10 g Phosphate dipotassique 2 g Glucose 5 g Eau distillée 1000 ml pH = 7 Réparation en tubes à raison de 10 ml Autoclavage
Citratase Milieu de Kempler et Mc.Kay (1980)
Extrait de levure 3 g Peptone 10 g Glucose 5 g Agar 15 g Eau distillée 1000 ml pH = 6,6
Le milieu est repartit à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavés 20 mn à 120° C, au moment de l’emploi en ajoute : 1 ml d’une solution aqueuse de ferrocyanure de potassium à 10%. 1 ml d’une solution aqueuse à 2,5 % de citrate ferrique et citrate de sodium. Ces deux solutions stérilisées par filtration sont conservées à l’obscurité à 4° C.
Acidité dornic : Mode opératoire : L’acidité est déterminée par titration d’un échantillon de 10ml de yaourt à l’aide de la soude dornic (N/9) en présence d’indicateur coloré (phénol phtaléine) jusqu’à virage au rose pale. Expression des résultats :
Acidité en degré dornic = VNaOH x 10 V : volume de NaOH (N/9 nécessaire pour doser l’échantillon). Recherche et dénombrement des germes contaminants : Recherche et dénombrement des germes totaux : Milieu de culture : Gélose nutritive Dilutions : 10-1, 10-2, 10-3, , 10-4 , 10-5 Inoculation : Introduire chaque boite de pétri 1ml de l’échantillon, ensuite couler la gélose nutritive préalablement fondu et refroidi à 45°C. Incubation : Placer les boites de pétri retournées dans l’incubateur à 37°C pendant 24h à 48h. Lecture et interprétation : Retenir les boites contenant entre 30 et 300 colonies, compter toutes les colonies et exprimer les résultats par ml de produits. Recherches et dénombrement des Staphylocoques : Milieu de culture : Baird – Parker Dilutions : 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 Inoculation : Couler le flacon de Baird – Parker fondu au préalable et refroidi à 45°C dans des boites pétri. Après solidification du milieu, réaliser l’ensemencement en surface à l’aide de 4 gouttes à partir des dilutions désirées à 10-1, 10-2 à 10-3 puis les répartir en surface à l’aide d’un râteau préparé en utilisant une pipette pasteur. Incubation : Incuber les boites de pétri retournées et fermées par la para film pour maintenir l’anaérobiose à 37°C pendant 24h à 48h. Lecture et interprétation : les colonies de Staphylococcus aureus sur le milieu de Baird – Parker peuvent prendre l’aspect des colonies noires, brillantes et convexes. Le diamètre des colonies est compris entre 0,5 – 1mm à 24 heures d’incubation et 1 – 2mm à 48 heures d’incubation. Recherches des levures et moisissures : Milieu de culture : OGA à l’oxytétracycline Dilutions : 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 Inoculation : Couler le flacon d’OGA à l’oxytétarcyline fondu au préalable et refroidi à 45°C dans des boites pétri, après solidification du milieu, inoculer ces boites à l’aide d’une pipette pasteur. Incubation : Incuber à 25 °C durant 3 à 5 jours. Lecture et interprétation : Les levures ont un aspect souvent identique aux colonies bactériennes. Elles peuvent avoir des contours réguliers ou irréguliers, des formes convexes ou plates et sont pigmentées, souvent opaques. Les moisissures se présentent comme étant des colonies toujours pigmentées et a aspect velouté plus ou moins proéminent. Tableau 1 : Les résultas de la recherche de Staphylococcus aureus
Témoin 1.5% 2.5% 3% 3.5% (2.5%) 10-1 - - - - - 10-2 - 107 10 13 - 10-3 - 4 30 9 76 10-4 - - 2 - 19
Tableau2: Les résultas de la recherche des champignons et des levures.
10-1 10-2 10-3 10-4 champignons levures champignons levures champignons levures champignons Levures Témoin ______(2.5%) 1.5% + 26 + _ + _ + _
2.5% + _ + _ + _ + _
3% + 5 + _ + _ +
3.5% + 180 + _ + _ + _
Tableau 3 : Les résultas de la recherche des Clostridium.
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Témoin (2.5%) ------1.5% ------2.5% ------3% ------3.5% ------
Tableau 4 : Evolution sensorielle du goût des yaourts expérimentaux au cours des périodes de fermentation et post-acidification Somme des Rangs (n=10)
Paramètres Lot 1 Lot 2 Lot 3 Lot 4 Lot 5 Analyse de étudiés Périodes témoin variance (jours) 1 j 12,5 24,83 28,33 40,5 43 ,83 ** c b b a a 7 j 12 28,83 31,83 38,5 33,83 ** c b b a a 14 j 19 25,5 29,5 32 42 ** c bc b b a 21 j 11 27,5 30,5 36 45 ** d c bc b a
NS : Non significatif * : Significatif (≤ 0.05) ** : Hautement significatif (≤ 0.01)
Tableau 5 : Evolution sensorielle de l'adhésivité des yaourts expérimentaux au cours de la période de fermentation et de post-acidification. Somme des Rangs (n=10)
Paramètres Lot 1 Lot 2 Lot 3 Lot 4 Lot 5 Analyse étudiés témoin de variance Périodes (jours) 1 j 10 20 31 33,5 47,5 ** c c b b a 7 j 17 27,33 31,83 35 38,83 ** c b ab ab a 14 j 22,16 21,16 30 39,5 37,16 ** c c b a a 21 j 13 27 30 38,5 43,5 ** c b b a a
NS : Non significatif * : Significatif (≤ 0.05) ** : Hautement significatif (≤ 0.01)
Tableau 6: Evolution sensorielle de la cohésivité des yaourts expérimentaux au cours de la période de fermentation et de post-acidification. Somme des Rangs (n=10)
Paramètres Lot 1 Lot 2 Lot 3 Lot 4 Lot 5 Analyse de étudiés témoin variance Périodes (jours) 1 j 12,5 21,5 29 40,5 40,5 ** c b b a a 7 j 16,75 28 31,75 36,92 36,75 ** b a a a a 14 j 21,66 25,16 31 31,66 40,5 ** c c b b a 21 j 12 25,66 31,16 38 43,16 ** d c b a a NS : Non significatif * : Significatif (≤ 0.05) ** : Hautement significatif (≤ 0.01)
Tableau 7 : Evolution des teneurs moyennes en nombre de Streptococcus thermophilus du lait de brebis durant la fermentation×104
Durée (Jours) Lots 2h 5h 7j 14j 21j Lot 1(2.5%) témoin 530 750 850 890 700
Lot 2 (1,50%) 434,66667 550 715 827,5 616,3333 Lot 3 (2,50%) 517 698 832,66667 876 672,75
Lot 4(3%) 537,66667 847 872,5 911,25 728 Lot 5 (3,50%) 749,75 803 527,25 937,33333 862
Tableau 8 : Evolution des teneurs moyennes en nombre de Lactobacillus bulgaricus du lait de brebis durant la fermentation×104
Durée (Jours) Lots 2h 5h 7j 14j 21j Lot 1(2.5%)
témoin 300 550 620 750 400 Lot 2 (1,50%) 345,75 451,5 507,66667 623,5 518,75 Lot 3 (2,50%) 285,33333 496,75 556 723,5 624,75
Lot 4(3%) 374,25 568,5 682,25 811,5 666,3333 Lot 5 (3,50%) 503 599,25 817,5 845,3333 769,25
Tableau 9 : Les caractères physiologiques (Type d’hémolyse) des souches lactiques isolées à partir du lait de brebis.
Code des Type d’hémolyse Souches
espèces
Ln1 β Leuconostoc mesenteroides subsp
mesenteroides
Lcd1 β Lactococcus lactis subsp diacetylactis
Pc1 β Pediococcos halophilus
Pc2 β Pediococcus halophilus
St6 α Streptococcus thermophilus
St7 α Streptococcus thermophilus
St8 α Streptococcus thermophilus
St9 α Streptococcus thermophilus
Le type d’hémolyse : Les observations visuelles des boites contenant le gélose au sang du cheval ont montré que les souches dont les codes suivants : Ln1, Lcd1, Pc1 et Pc2 sont -hémolytiques en présence des zones transparentes autour des colonies. Par ailleurs, les souches dont les codes St6, St7, St8 et St9 est α-hémolytique en présence de zones verdâtres dut à la production de peroxyde d’hydrogène par les souches
Tableau 10 : Tableau récapitulatif, de la présence des germes totaux les germes pathogènes dans le lait de brebis Type de Germes Coliformes Coliformes Streptocoques Staphylocoques Salmonella Levure et germe totaux totaux fécaux fécaux moisissures (germes/ ml) (germes (germes / (germes / (germes / ml) (germes / / ml) ml) ml) ml)
Lait de 45.105 202 17 57 3.10² ABS 29 brebis ABS : absence
Tableau 11: Les résultas de la recherche des coliformes totaux dans le yaourt préparé
Témoin 1.5% 2.5% 3% 3.5% (2.5%) 3.5×104 30×104 0.7×104 0.7×104 0.4×104
Tableau 12 Evolution des teneurs moyennes en (viscosité) du lait de brebis fermentés durant la fermentation la période de post acidification X ± σ, n = 3
Lots Lot 1 Lot 2 Lot 3 Lot 4 Lot 5 Analyse Témoin 1.5 % 2.5% 3 % 3.5 % de Période de variance fermentation 0,320 0,950 1,067 0,997 0,287 2H ± ± ± ± ± NS 0,010 1,152 1,242 1,164 0,081
0,740 1,277 1,580 1,617 0,723 5H ± ± ± ± ± NS 0,020 1,347 1,190 1,207 0,431
0,250 0,980 0,920 0,915 0,310 7 j ± ± ± ± ± NS 0,010 1,101 1,136 1,149 0,095
0,240 0,870 0,827 0,817 0,300 14 j ± ± ± ± ± NS 0,010 0,971 1,044 1,035 0,130
0,189 0,787 0,711 0,703 0,253 21 j ± ± ± ± ± NS 0,010 0,870 0,946 0,926 0,142
NS : Non significatif
Tableau 13 : Evolution moyenne en l’acidité des yaourts de lait de brebis au cours de la fermentation Lots Témoin Lots 2 Lots 3 Lots 4 Lots 5 Effet du Durée Lots 1 1.5 % 2.5% 3 % 3.5 % facteur De fermentation 2H 51.667 53.333 63.667 68.000 73.000 ** ± ± ± ± ± 2.517 2.887 1.528 4.583 1.752 c c b ab a 5H 58.333 59.000 71.667 76.333 81.667 ** ± ± ± ± ± 3.512 2.000 7.371 11.015 7.506 b b ab a a 7J 83.000 81.100 84.333 90.667 106.000 ** ± ± ± ± ± 4.359 2.762 2.517 8.083 2.000 b b b b a 14J 104.333 100.700 105.000 105.333 114.667 NS ± ± ± ± ± 8.145 10.453 5.292 3.512 0.577
21J 113.000 110.000 121.000 126.333 132.333 * ± ± ± ± ± 7.211 5.568 10.583 12.503 2.517 a a a a a
Recherches des Salmonelles : La recherche des salmonelles se réalise sur 25g d’aliment. Elle comporte quatre étapes ; le pré enrichissement, l’enrichissement en milieux liquides, l’isolement sur milieu solide et l’identification. Pré enrichissement non sélectif : Cette recherche nécessite une pesée à part de 25g du produit à analyser qu’on doit diluer dans 225ml de TSE, à cela on doit ajouter 250ml de TSE et incuber le tout à 37°C pendant 20 heures. Enrichissement sélectif : Porter 1 ml de milieu de pré enrichissement incubé dans 10ml de bouillon sélénite cystéine SFB s/c Incubation : Sera faite à 37°C pendant 24 heures Isolement : Prélever une goutte de bouillon sélénite cystéine (dans la partie inférieure du tube)
et la porter sur milieu HEKTOEN préalablement coulé dans des boites de pétri. Laisser sécher et faire incuber les boites 24 h à 37°C. La présence des salmonelles se traduit par l’apparition des colonies avec un point noir au centre.