UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE Cochliomyia spp. DE LA COLECCIÓN CIENTÍFICA DEL CENTRO INTERNACIONAL DE ZOONOSIS”
Trabajo de Grado presentado como requisito para optar por el Título de Médico Veterinario Zootecnista
AUTOR:
Jenny Soraya Carrillo Toro
TUTOR:
Dr. Richar Iván Rodríguez Hidalgo Ph.D.
Quito, Mayo, 2015
ii
DEDICATORIA A mis padres y abuelos por su esfuerzo, sacrificio e incondicional apoyo, han sido un ejemplo de superación y lucha en mi vida; además con su templanza han sabido mostrarme el camino para alcanzar una meta; también a mi hermano Fernando y a mi compañero Roberto quienes a pesar de las circunstancias adversas han estado ahí durante mi carrera profesional.
Jenny
iii
AGRADECIMIENTOS
Quiero expresar mi más sincero agradecimiento Al Dr. Richar Rodríguez por brindarme la oportunidad de formar parte de su Proyecto y, a la vez, ser tutor de esta investigación.
A todos mis profesores que, de una u otra forma, me brindaron sus conocimientos y experiencias para mi formación a lo largo de esta carrera.
Agradezco al personal científico del Centro Internacional de Zoonosis, especialmente al Ing. Gustavo Echeverría, Dr. Juan Carlos Navarro y a la MSc. Sandra Enríquez, cuyos conocimientos me han enriquecido y han permitido concluir este proyecto.
A mis padres, hermano y a mi compañero Diego Cushicóndor, quienes contribuyeron, directa e indirectamente, para la materialización y finalización de este proyecto de tesis.
iv
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
v
INFORME DEL TUTOR
vi
APROBACIÓN DEL TRABAJO/TRIBUNAL
“IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE Cochliomyia spp. DE LA COLECCIÓN CIENTÍFICA DEL CENTRO INTERNACIONAL DE ZOONOSIS”
vii
ÍNDICE GENERAL pp. DEDICATORIA ...... ii AGRADECIMIENTOS ...... iii AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL ...... iv INFORME DEL TUTOR ...... v APROBACIÓN DEL TRABAJO/TRIBUNAL ...... vi “IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE Cochliomyia spp. DE LA COLECCIÓN CIENTÍFICA DEL CENTRO INTERNACIONAL DE ZOONOSIS” ...... vi ÍNDICE GENERAL ...... vii LISTA DE FIGURAS ...... ix LISTA DE TABLAS ...... x RESUMEN ...... xi ABSTRACT ...... xii CAPÍTULO I ...... 1 INTRODUCCIÓN ...... 1 CAPÍTULO II ...... 4 REVISIÓN DE LITERATURA...... 4 Antecedentes ...... 4 Generalidades ...... 5 Cochliomyia hominivorax ...... 6 Ciclo de vida de C. hominivorax- GBG ...... 7 Distribución Geográfica ...... 8 Cochliomyia macellaria ...... 9 Ciclo Biológico de Cochliomyia macellaria ...... 9 Distribución Geográfica ...... 9 Morfología diferencial entre C. hominivorax y C. macellaria ...... 10 Epidemiología ...... 14 Impacto Económico ...... 17 Erradicación del GBG – Cochliomyia hominivorax ...... 18 Biología Molecular en la Identificación de Insectos ...... 19 ADN Mitocondrial ...... 20 Estudios Moleculares realizados en Cochliomyia ...... 21 Filogenia ...... 21 viii
CAPÍTULO III ...... 23 MATERIALES Y MÉTODOS ...... 23 Fase de Laboratorio: Unidad de Entomología Aplicada ...... 24 Identificación y cultivo de larvas ...... 24 Identificación Morfológica de Adultos de Cochliomyia spp ...... 25 Fase de laboratorio: Biología Molecular ...... 25 Extracción y cuantificación de ADN ...... 25 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ...... 27 Análisis de Datos ...... 30 CAPÍTULO IV ...... 31 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...... 31 Identificación Morfológica ...... 31 Identificación Molecular ...... 40 Análisis Filogenéticos ...... 41 Citocromo Oxidasa subunidad I (COI) ...... 41 ARN ribosomal (12S) ...... 44 Genes combinados COI y 12S...... 46 CAPÍTULO V ...... 50 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...... 50 Conclusiones ...... 50 Recomendaciones ...... 51 BIBLIOGRAFÍA ...... 52 Anexos ...... 65
ix
LISTA DE FIGURAS pp.
Figura 1. Ciclo de vida de C. hominivorax ...... 8 Figura 2. Características del estadío larvario 3 de C. hominivorax...... 11 Figura 3. Características del estadío larvario 3 de C. macellaria ...... 11 Figura 4. Características morfológicas diferenciales entre adultos de C. hominivorax y C. macellaria...... 12 Figura 5. Mapa de distribución de los países libres del GBG ...... 14 Figura 6. Mapa de distribución de miasis por C. hominivorax ...... 15 Figura 7. Genoma mitocondrial de Insectos ...... 20 Figura 8. Adultos de C. hominivorax (izq) y C. macellaria (dcha)...... 34 Figura 9. Larvas y Adultos de C. hominivorax y C. macellaria ...... 39 Figura 10. Árbol de consenso de mayoría producido por análisis de parsimonia del gen COI...... 43 Figura 11. Árbol de consenso de mayoría producido por análisis de parsimonia del gen 12S...... 45 Figura 12. Árbol de consenso de mayoría producido por análisis de parsimonia del gen COI y 12S...... 47
x
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Características morfológicas diferenciales entre las larvas en estadío 3 de C. hominivorax y C. macellaria ...... 10 Tabla 2. Características morfológicas diferenciales entre los adultos de C. hominivorax y C. macellaria ...... 12 Tabla 3. Esquema de selección de individuos para la Identificación morfológica y molecular ...... 24 Tabla 4. Secuencia de cebadores para el COI y 12S ...... 27 Tabla 5. Reactivos utilizados para la preparación del master mix para la amplificación del gen COI ...... 28 Tabla 6. Reactivos utilizados para la preparación del master mix para la amplificación del gen 12S ARNr ...... 28 Tabla 7. Procedencia y fecha de obtención de los ejemplares ...... 31
xi
“IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE Cochliomyia spp. DE LA COLECCIÓN CIENTÍFICA DEL CENTRO INTERNACIONAL DE ZOONOSIS”
Autor: Jenny Soraya Carrillo Toro Tutor: Richar Rodríguez H. Ph.D Fecha: mayo, 2015 RESUMEN: Cochliomyia hominivorax es una mosca (Diptera: Calliphoridae) que, en su fase larvaria, es un parásito obligado que se lo conoce comúnmente como Gusano Barrenador del Ganado (GBG). La miasis causada por la mosca se encuentra en la lista de enfermedades de declaración obligatoria y ha sido considerada como un problema en la industria pecuaria y de salud pública. En el Ecuador, no existen estudios que permitan determinar la importancia de la mosca del gusano barrenador del ganado (GBG) ni su relación con otras especies; es por esto que, la finalidad de este estudio fue identificar morfológicamente y molecularmente a las poblaciones de Cochliomyia spp., mediante el uso de claves dicotómicas y analizar las relaciones evolutivas entre las especies de moscas Cochliomyia hominivorax y Cochliomyia macellaria utilizando la extracción, amplificación y secuenciación del ADN de los genes mitocondriales (COI y 12S -ADNmt). Para este estudio se utilizaron 48 ejemplares de la Colección Entomológica del Centro Internacional de Zoonosis. Los resultados permitieron identificar morfológicamente dos especies de Cochliomyia: C. macellaria con el 66,67% (32/48) y el 33.33% (16/48) de C. hominivorax. De la secuenciación se obtuvo 33 y 30 secuencias útiles para el COI y 12S, respectivamente. Los árboles filogenéticos, resultantes del análisis de COI, 12S y COI-12S (secuencias unidas), mediante el método de parsimonia máxima, mostraron la misma topología, identificando tres clados definidos, uno correspondiente a C. macellaria, el otro a C. hominivorax y el tercer clado correspondió a las muestras de grupos externos obtenidos del Genbank. En conclusión, el estudio permitió diferenciar morfológicamente dos especies de Cochliomyia las cuales fueron corroboradas con el estudio filogenético. Finalmente, se evidenció que existe una fuerte relación del lugar de origen de las larvas o moscas y su comportamiento, con la especie a la que pertenecen. PALABRAS CLAVES: MIASIS /Cochliomyia/ FILOGENÉTICA
xii
“MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR IDENTIFICATION OF Cochliomyia spp. OF THE SCIENTIFIC COLLECTION OF THE ZOONOSIS INTERNATIONAL CENTER”
Author: Jenny Soraya Carrillo Toro Tutor: Richar Rodríguez H. Ph.D Date: May, 2015
ABSTRACT Cochliomyia hominivorax is a fly (Diptera: Calliphoridae) that in its larvae phase, is an obliged parasite commonly known as Screwworm. Miasis by such fly is in the list of mandatory report diseases and has been considered as a problem in the livestock industry and public health. In Ecuador, no studies have been made to determine the relevance of the Screwworm, or its relation with other species. The purpose of the current study was morphologically and molecularly identified Cochliomyia spp. populations, by using dichotomy keys and analyzing evolutionary relations between Cochliomyia hominivorax and Cochliomyia macellaria species of flies, by using extraction, magnification and DNA sequence of mitochondrial gens (COI and 12S - DNAmt). For the study, 48 samples of the Entomologic Collection of the Zoonosis International Center were used. Results allowed morphologically identifying two species of Cochliomyia: C. macellaria with 66.67% (32/48) and 33.33% (16/48) of C. hominivorax. From the sequence, 33 and 30 useful sequences were obtained for COI and 12S, respectively. Phylogenetic trees, resulting from analysis of COI, 12S and COI-12S (united sequences), by using maximum parsimony method, showed the same topology, identifying three strains clearly defined, C. macellaria, C. hominivorax and the third correspondent to samples of external groups obtained from Genbank. It has been concluded that the study allowed a morphologic differentiation of two species of Cochliomyia, which were confirmed with the phylogenetic study. Finally, a strong relation was found between the origin place of larvae or flies and behavior, with species to which they belong. KEYWORDS: MIASIS / Cochliomyia / PHYLOGENETIC
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
La mosca del gusano barrenador del ganado (GBG), conocida como Cochliomyia hominivorax (Coquerel, 1858), en su fase larvaria, es un parásito obligado, debido a que se alimenta únicamente de tejido vivo (biontófaga). Este parásito causa graves daños en animales homeotermos, incluido el hombre, desarrollando una enfermedad parasitaria y zoonósica, conocida como miasis traumática (Moya, 2003; Forero et al., 2008). La Cochliomiasis está incluida en la lista de enfermedades, infecciones e infestaciones comunes a varias especies, y su presencia es de declaración obligatoria (OIE, 2014); además, es considerada como parte de las Enfermedades Transfronterizas en las Américas (ENTRAS) prioritarias para el Continente Americano (GF-TADs, 2007).
Las pérdidas anuales por infestación de C. hominivorax, fueron considerables en Estados Unidos, México y Centro América; mientras que, en algunas Islas del Caribe y Sudamérica continúan siendo un problema latente; por esta razón, se ha considerado más un problema para la industria pecuaria que de salud pública; no obstante, los daños que causa a los seres humanos son importantes en regiones donde prevalece este parásito (Rodríguez et al., 2011).
Existen programas para la erradicación del GBG, dentro de los que la Técnica del insecto estéril (TIE) ha alcanzado mejores resultados logrando la eliminación de este parásito de los Estados Unidos, México, Puerto Rico, las Islas Vírgenes, Curaçao y otros países de Centro América (CFSPH, 2007).
1
Sin embargo, una de las actividades importantes para llevar a cabo un programa de erradicación del GBG es establecer una correcta identificación, ya que en estudios previos se han encontrado diferencias morfológicas entre individuos de distintas poblaciones del gusano barrenador, además del alto parecido morfológico entre los adultos y larvas de C. hominivorax y Cochliomyia macellaria (Figarola, 2001; Skoda et al., 2002; Toledo, 2007).
Debido a los impedimentos taxonómicos que existen para una correcta identificación de especies, el desarrollo de métodos moleculares ha permitido abordar estos problemas empleando marcadores génicos como el uso de regiones codificantes, no codificantes, conservadas y de alta variabilidad del ADN mitocondrial. Las principales regiones de ADN mitocondrial que más han sido utilizadas en estudios evolutivos corresponden los genes de ARNs, 12S, 28S, 16S, y las subunidades I y II del citocromo oxidasa c y b (Fresia et al., 2007; Fresia et al., 2013 (Lyra et al., 2005; Lyra et al., 2009; Litjens et al., 2001; McDonagh et al., 2009; Taylor et al., 1996); así como, la región control y las subunidades del complejo NADH (Lessinger et al., 2000; Palumbi, 1996 citado por Lessinger, 1998; Toledo, 2007).
El ADN mitocondrial ha demostrado ser útil en los análisis evolutivos a partir de genes (filogenética) debido a su herencia materna, rápida tasa de divergencia y falta de recombinación (Simon et al., 1994; Kress & Erickson, 2012).
La falta de información del Gusano Barrenador del Ganado o la confusión generada con otros agentes causantes de miasis de aparente importancia en las zonas cálidas de Ecuador, establece que es necesario investigar la situación real del parasito en el país; es por eso, que esta investigación se realizó como parte del proyecto “Epidemiología molecular de parásitos y microorganismos de interés zoonósico y de Salud Pública: Gusano Barrenador del Ganado, Garrapatas y Fiebre Aftosa, financiado por la Universidad Central del Ecuador - Núcleo de Investigadores, en colaboración con el Centro Internacional de Zoonosis. Por lo anterior, el presente estudio 2
tuvo como objetivo identificar morfológicamente a las poblaciones de Cochliomyia spp., mediante el uso de claves dicotómicas y analizar los genes mitocondriales mediante herramientas bioinformáticas.
3
CAPÍTULO II REVISIÓN DE LITERATURA
Antecedentes En el Ecuador, la larva de la mosca C. hominivorax fue descrita por primera vez en un estudio realizado por Arteaga et al. (2012), aunque la mosca ha sido conocida desde mucho tiempo antes, como causante de miasis traumática, sin haber sido identificada. Miño et al. (2005), realizaron un sondeo utilizando una encuesta epidemiológica para orientar la presencia del parásito en el Ecuador sin demostrar físicamente su presencia. Del mismo modo, varios estudios realizados por Lyra (2008) y McDonagh et al. (2009) reportaron larvas de moscas colectadas en el Ecuador, las cuales fueron identificadas como C. hominivorax mediante análisis de variabilidad genética y filogenia. La importancia dada a C. hominivorax en la producción animal y en la Salud Pública, además de la dificultad en la identificación de algunos ejemplares, ha permitido el desarrollo de estudios basados en el análisis de genes (Fresia et al., 2007; Griffiths et al., 2009; Infante, 1994; Infante, 1999; Lyra et al., 2009; McDonagh et al., 2009; Narang & Degrugillier, 1995; Taylor & Peterson, 1994; Torres & Azeredo, 2009); mientras que los trabajos de Alamalakala et al. (2009), Taylor et al., 1996, Toledo, (2007), Skoda et al. (2002) y Skoda et al. (2012) se han enfocado en la diferenciación de C. hominivorax de C. macellaria. La falta de estudios en el Ecuador sobre C. hominivorax y su diferenciación con C. macellaria hace importante la presente investigación y, además, permite evaluar la importancia de Cochliomyia spp., tanto a nivel productivo como en Salud Pública.
4
Generalidades El género Cochliomyia (Diptera: Calliphoridae) posee 4 especies: C. hominivorax (Coquerel 1858), C. macellaria (Fabrícius 1775), C. aldrichi (Del Ponte 1938) y C. minima (Shannon 1926) (Dear, 1985). Las dos primeras especies son las que están comúnmente relacionadas con casos de miasis, y la semejanza morfológica entre estas dos especies ha ocasionado identificaciones erróneas; mientras que, las otras dos especies casi no se reportan como causantes de miasis (FAO, 1993b). La larva de la mosca C. hominivorax es considerada como la plaga de mayor importancia económica por su impacto sanitario en animales de sangre caliente y los seres humanos (Forero et al., 2008).
Clasificación Taxonómica de Cochliomyia spp. ( Según Wall et al., 2001; COMEXA, 2008; FAO, 1993a; COPEG, 2014, NCBI, 2014)
Reino: Animal Phylum: Arthropoda Clase: Insecta Orden: Diptera Suborden: Brachycera Familia: Calliphoridae Género: Cochliomyia Especies: C. hominivorax C. macellaria
5
Cochliomyia hominivorax
El Gusano barrenador del ganado del nuevo mundo, C. hominivorax, se ha descrito a partir de casos humanos de miasis observados por el Dr. Charles Coquerel, en 1858, en una prisión francesa de Guyana (Isla Diablo), quien encontró las larvas del díptero en los conductos nasales de cinco hombres (Touré, 1994), por lo que se le conoce vulgarmente como la “devoradora de hombres” apelativo que procede del nombre de la especie, hominivorax.
La mosca del GBG pertenece al orden de los dípteros, cuya nomenclatura fue nominada por múltiples ocasiones en diversos géneros y especies, lo que ha provocado algunas confusiones. Inicialmente, Coquerel la llamo Lucilia hominivorax y, posteriormente, otros autores la designaron como Calliphora infesta, Calliphora antrophophaga, Somomyia fulvobarbata, Cochliomyia americana y su nombre oficial actual es Cochliomyia hominivorax (del latin, Cochlio= en forma de espiral o tornillo y Myia= mosca), muy conocida comúnmente como gusano barrenador primario, gusano barrenador del Nuevo Mundo, gusano tornillo, Screwworm en inglés y Bicheira en portugués (FAO, 1993a; Bajatta, 2007; Forero et al., 2008).
Dada la gran similitud morfológica de C. hominivorax con C. macellaria, se suponía que eran la misma especie y que las pocas diferencias que presentaban se debían al medio alimenticio y ecología. Durante mucho tiempo C. hominivorax fue considerada sinónimo de C. macellaria (Rocha, 1956 citado por Lyra; Alavez, 1975). Posteriormente, el Dr. Emory Cushing y el Dr. Walter Patton, en 1933, establecieron la diferencia entre estas dos moscas (Bajatta, 2007).
6
Ciclo de vida de C. hominivorax- GBG
El ciclo de vida del gusano barrenador del ganado es holometábolo, es decir su etapa de metamorfosis es completa, pasando por fases de huevo, larva, pupa y adulto (Rodríguez et al., 2011). La hembra es monógama; mientras que, la mosca macho es polígamo (Alavez, 1975; COMEXA, 2008); una vez que es fecundada, la hembra deposita sus huevos en los bordes de heridas, en mucosas lesionadas principalmente de aberturas naturales del cuerpo e incluso en aquellas lesiones causadas por garrapatas (Rodríguez, 2011). Las moscas depositan una masa de huevos superpuestos como tejas, todos orientados en una misma dirección; cada hembra puede ovipositar, durante su vida, entre 200 a 500 huevecillos, en aproximadamente 4 posturas en varios días; la temperatura óptima para ovipositar es de 21 a 29°C (Bárcenas, 2010; Quiroz, 2003). Luego de 12 a 24 horas los huevecillos eclosionan y las larvas se introducen en el tejido del hospedador. La forma de la herida se asemeja a un túnel o bolsillo; esto debido a que las larvas laceran el tejido para alimentarse con los fluidos corporales (Quiroz, 2003). A medida que las larvas se alimentan van aumentando de tamaño, pasando por tres estadíos larvales. Después de 4 a 8 días las larvas abandonan la herida para caer al suelo y se entierran para transformarse en pupas. Finalmente, luego de 7 a 54 días, dependiendo de la temperatura ambiental, emerge la mosca adulta. El periodo de vida, en condiciones normales, desde huevo hasta adulto es de 3 a 4 semanas y en condiciones adversas su periodo puede prolongarse por 2 a 3 meses (Guimarães et al., 1983; Bajatta, 2007). La hembra alcanza su madurez sexual, después de 2 a 4 días de haber emergido de la pupa y a partir del quinto día está lista para ovipositar; se alimenta de proteínas de las heridas animales antes o después de su oviposición y de hidratos de carbono (néctar de las flores) y agua. Estas moscas pueden llegar a vivir hasta 30 días. Por el contrario, el macho alcanza su madurez sexual a las 24 horas de nacido, se alimenta 7
principalmente de néctar de flores y puede llegar a vivir hasta 14 días (FAO, 1993a; CFSPH, 2007). En caso de no encontrar una herida, una mosca puede viajar de 10 a 20 Km en climas tropicales ó 290 km en menos de dos semanas en ambientes áridos (OIE, 2013; Spradbery, 1994).
Figura 1. Ciclo de vida de C. hominivorax Fuente: CIZ (2015)
Distribución Geográfica
El GBG del nuevo mundo es originario de las regiones tropicales y subtropicales del continente Americano; históricamente estuvo distribuido desde el Centro y Sureste de los Estados Unidos, México, Centro América, Panamá, Islas del Caribe y toda Sudamérica. En la actualidad, el GBG se encuentra presente de forma endémica en América del Sur, a excepción de Chile, y en algunos países del Caribe (Cuba, República Dominicana, Haití, Trinidad-Tobago y Jamaica que se encuentra en proceso de erradicación) (Bajjata, 2007; Robinson et al., 2009; Rodríguez, 2011). No es común encontrarlo sobre los 2100 msnm (CFSPH, 2007). El gusano barrenador del nuevo mundo fue detectado en Libia en 1988; sin embargo, por la oportuna intervención epidemiológica fue erradicado en 1991(Ortiz, 2005).
8
Cochliomyia macellaria
La mosca C. macellaria, conocida como gusano barrenador secundario, fue descubierta por Fabricius en 1775 quien la denominó Musca macellaria; posteriormente, su nomenclatura ha ido cambiando a Callitroga macellaria y actualmente se la conoce como Cochliomyia macellaria (Dear, 1985; Maes et al., 1994; Whitworth, 2010)
Ciclo Biológico de Cochliomyia macellaria
El ciclo de vida incluye 4 etapas: huevo, larva, pupa y adulto. Las larvas de C. macellaria se alimentan solo de tejido necrótico (necrófaga) de cadáveres (Quiroz, 2003), aunque, se ha observado en tejido necrótico de heridas en animales vivos, por lo que se les considera invasoras secundarias. Las hembras pueden depositar hasta 1000 huevecillos en lotes de 40 a 250 huevos y, es frecuente que varias hembras se reúnan para la postura (do Valle, 1997). En condiciones favorables, la eclosión se presenta dos horas después de la oviposición y las larvas alcanzan su estadío 3 en un periodo de 6 a 20 días. Posteriormente, abandonan el tejido para empezar a pupar en un transcurso de 3 a 27 días. El periodo de vida desde huevo hasta adulto puede durar entre 9 a 39 días (FAO, 1993b). Los especímenes adultos de C. macellaria pueden vivir de 2 a 6 semanas, alimentándose de los líquidos presentes en la materia orgánica en descomposición, que también lo utilizan para su oviposición (Guimarães et al., 1983).
Distribución Geográfica
Se encuentra ampliamente distribuidos en América desde el Sur de Canadá hasta la Patagonia, incluido las Islas Galápagos y el Oeste de la India (Dear, 1985; Koller et al., 2011).
9
Morfología diferencial entre C. hominivorax y C. macellaria
Las principales características morfológicas que se utilizan en la diferenciación de estas dos especies se las observan en larva estadío 3 según las claves de la FAO (1993a); COMEXA (2008) y Florez & Wolff (2009) y, en adultos según Cushing & Hall (1937, citado por Barcellos, 1980); James (1970 citado por Guimarães et al., 1983); Dear (1985); Spradbery (2002) y Whitworth (2010), quienes describen las principales características morfológicas empleadas para su diferenciación, las cuales se detallan en la Tabla 1 y 2.
Tabla 1. Características morfológicas diferenciales entre las larvas en estadío 3 de C. hominivorax y C. macellaria
Descripción C. hominivorax C. macellaria
Espinas de 1 a 3 puntas, siendo más a Espinas pequeñas con 1 a 3 puntas, Banda de espinas menudo 1 ó 2 puntas. Fig.2ª siendo más a menudo 2 puntas. Fig. 3A
Espiráculos anteriores, los cuales presentan una prolongación (forma de Espiráculos anteriores cortos con lóbulos Espiráculos anteriores mano) cada uno de 6 a 11 lóbulos o ó papilas cortas, que varían de 8 a 12. papilas. Usualmente de 7 a 9 lóbulos. Usualmente 9 a 11 lóbulos. Fig.3A Fig.2ª
Los dos troncos traqueales presentan una pigmentación oscura que va Los dos troncos traqueales pigmentados desde el espiráculo posterior que se Troncos Traqueales de color oscuro solo hasta un tercio del encuentra en el doceavo segmento último segmento (doceavo). Fig.3C hasta el décimo o incluso el noveno segmento. Fig. 2ª
Barrenan o profundizan dentro del Localización en el hospedador Se encuentran superficialmente. tejido (lesión en forma de bolsillo)
Adaptado de: FAO,1993a; COMEXA, 2008 Florez & Wolff, 2009
10
Figura 2. Características del estadío larvario 3 de C. hominivorax: (A) aspecto lateral de la larva completa; (B) cara posterior del segmento terminal; (C) placa espiracular posterior; a = espiráculo anterior; sp = espinas; p = peritrema; ar = aberturas respiratorias; tr = troncos traqueales) Adaptado de: Laake et al., 1936 citado por OIE, 2013; COMEXA, 2008.
Figura 3. Características del estadío larvario 3 de C. macellaria: (A) aspecto lateral de la larva completa; (B) cara posterior del segmento terminal; (C) placa espiracular posterior; a = espiráculo anterior; sp = espinas; p = peritrema; ar = aberturas respiratorias; tr = troncos traqueales) Adaptado de: COMEXA, 2008; Florez & Wolff, 2009; Mendes, 2009
11
Tabla 2. Características morfológicas diferenciales entre los adultos de C. hominivorax y C. macellaria
Morfología C. hominivorax C. macellaria
Tercio inferior a la mitad de las Placas fronto – orbitales solo con Placas fronto - orbitales con setas setas de color pálido o amarillo CABEZA – Región Frontal de color negro u oscuro, fuera de las fuera de las setas frontales, (pero setas frontales. Fig.3p en algunos casos sus inserciones aparecen con puntos negros). Fig.3p
En las hembras la basicosta es de En las hembras la basicosta es de ALA color marrón oscuro a casi negro. color amarillo. Fig.3b Fig.3b
La banda central en el tórax apenas La banda central en el tórax se se extiende hacia delante de la extiende mucho más adelante de la TÓRAX sutura mesonotal, es decir la banda sutura mesonotal, es decir las tres central es más corta que las 2 bandas son del mismo tamaño. bandas laterales. Fig.3tx Fig.3tx
Quinto tergito (cuarto visible) Quinto tergito (cuarto visible) lateralmente con microtomentum ABDOMEN lateralmente sin microtomentum plateado pronunciado que parecen plateado. Fig.3ab manchas muy visibles. Fig.3ab
Adaptado de: (FAO, 1993b; OIE, 2013; Spradbery, 2002; Withworth, 2006; Withworth, 2010)
Figura 4. Características morfológicas diferenciales entre adultos de C. hominivorax y C. macellaria; p = placa fronto - orbital, vista desde arriba y lateralmente en la cabeza; b = basicosta; tx = Tórax con las bandas longitudinales; ab= abdomen dividido en tergos) Adaptado de: OIE, 2013; Spradbery, 2002.
12
En la fase adulta, las moscas del género Cochliomyia se las puede distinguir de otros géneros, que se encuentran relacionados en miasis de heridas, por la coloración del cuerpo que varía entre verde y azul metálico o púrpura azulado y la presencia de tres bandas longitudinales oscuras sobre el tórax (FAO, 1993a; OIE, 2013). Su cabeza presenta pelos de color amarillo o dorado y sus ojos son ocre rojizos; los machos se distinguen de las hembras porque tienen sus ojos casi juntos, es decir son holópticos, mientras que, en las hembras los ojos son más separados o dicópticos (Quiroz, 2003; Mendes, 2009). El color y la longitud del cuerpo no son características útiles para establecer una distinción clara entre especies; C. hominivorax puede llegar a medir de 8 a 10mm y C. macellaria de 6 a 9mm (FAO, 1993a). Según los reportes, una especie de mosca denominada Compsomyiops callipes es muy similar en apariencia a la mosca del género Cochliomyia, la cual se la puede diferenciar por sus palpos clavados y calípter oscuro (café) (Byrd & Castner, 2010; Withworth, 2006).
13
Epidemiología
Situación en América
El GBG del nuevo mundo es endémico en climas tropicales y subtropicales del Continente Americano; su distribución está determinada por las condiciones climáticas, debido a la incapacidad para sobrevivir a bajas temperaturas (FAO 1993ª, Bajatta, 2007). En la actualidad, existen países declarados libres de C. hominivorax entre los cuales se encuentran Estados Unidos, México, Libia, Puerto Rico, las Islas Vírgenes, Curaçao y Centro América (CFSPH, 2007; Rodríguez et al., 2011). Por el contrario, la mosca del GBG sigue siendo prevalente en la República Dominicana, Haíti, Trinidad y Tobago, Cuba, Jamaica y en todos los países de Sudamérica a excepción de Chile. En Sudamérica, se estima una población ganadera de 463,392 millones entre bovinos, ovinos, equinos y caprinos y una población humana de 330,750 millones, en riesgo de ser afectado por el GBG (Bajatta, 2007; Rodríguez et al., 2011).
Figura 5. Mapa de distribución de los países libres del GBG Fuente: Bajatta, 2007
14
Situación en el Ecuador
Para el periodo de Enero a Junio del 2014, La Organización Mundial de la Sanidad Animal determinó la distribución de miasis causada por C. hominivorax en animales, donde en algunos países de Centroamérica y Sudamérica esta miasis representa una enfermedad clínica; no obstante, para el Ecuador ha sido reportada como no observada en este periodo (OIE, 2015).
Figura 6. Mapa de distribución de miasis por C. hominivorax Fuente: OIE (2015)
En este contexto, en los años 80, el Dr. Gonzalo Moya Borja, mientras realizaba un estudio de Dermatobia hominis en Santo Domingo de los Tsáchilas, identificó la presencia de larvas de C. hominivorax en animales (Miño et al., 2005). Del mismo modo, en enero del 2005 el Servicio Ecuatoriano de Sanidad Agropecuaria (SESA), actual AGROCALIDAD, con la participación de la Comisión México – Americana para la erradicación del GBG plantean la necesidad de conocer la situación de esta parasitosis en las ganaderías ecuatorianas; por lo cual, se realizó una encuesta epidemiológica con el fin de determinar la presencia de la larva del GBG obteniendo como resultado, que de un total de 1255 predios encuestados, 522 fincas reportaron su presencia, alcanzando un total de 4132 animales infestados (Miño et al., 2005). 15
Para el año 2012, durante un estudio del comportamiento de C. hominivorax en una región de Manabí, se registró un porcentaje de animales infestados por esta larva de: bovinos (73.4%), porcinos (13.7%), ovinos (8.8%), equinos (5.3%), caprinos (1.8%) y caninos (0.4%); además, se observó a C. macellaria en casos de miasis en tres especies de animales (bovinos, porcinos y ovinos) (Arteaga et al., 2012). Por otro lado, en una investigación realizada en el 2014 sobre la Dinámica Poblacional del GBG en el Cantón San Miguel de los Bancos Provincia de Pichincha, se encontró 52 moscas de C. hominivorax y 23 moscas de C. macellaria, que fueron identificadas morfológicamente usando claves dicotómicas, las cuales fueron colectadas por medio de trampas aéreas a base de hígado en putrefacción (Jervis, 2014). Según la OIE para el año 2005 en el Ecuador se reporta la presencia de miasis por C. hominivorax en humanos, pero no hay información sobre el número de casos (OIE, 2015).
El GBG es un importante agente de zoonosis, en especial en zonas marginadas con condiciones sanitarias deficientes; el principal grupo de riesgo son ancianos, niños y discapacitados (Bajatta, 2007; Forero et al., 2007); es así que, se ha reportado 3 casos de miasis por C. hominivorax: un caso de infestación en una paciente de 7 años proveniente de Esmeraldas en 1994, quien presentó lesiones a nivel del pabellón auricular (Chico et al., 1994); en el año 2014, se reporta un caso de Infestación maxilar por larvas de C. hominivorax en una mujer de 24 años originaria del Cantón Santa Isabel – Provincia del Azuay, a la cual le extrajeron 100 larvas que formaban túneles larvarios en paladar duro, labio superior y mucosa del vestíbulo superior de la cavidad bucal (Alemán & Reinoso, 2014) y, de igual manera, para el año 2014, se presenta un caso de miasis orbital severa, causada por C. hominivorax en una anciana Kichwa de 91 años de edad proveniente de la Comunidad Tunipamba – Imbabura; la paciente tenía una lesión tumoral
16
ulcerada en el ojo derecho y de la cual se extrajo más de 100 larvas (Dominguez et al., en prensa)
Impacto Económico
En 1933, los investigadores del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos de América revelaron que, el origen de las pérdidas económicas causadas por miasis en las ganaderías no se debían al díptero C. macellaria, sino a una especie diferente denominada C. hominivorax que afectaba tanto a la industria ganadera y a los animales silvestres, así como también causaba lesiones en los seres humanos (Rodríguez et al., 2011; Forero et al., 2007) La larva del GBG – C. hominivorax, ha afectado enormemente la ganadería en el Continente Americano; no obstante, los factores de riesgo en los animales están relacionados, principalmente, con las prácticas de manejo (Forero et al., 2007). Rodríguez et al. (2011) mencionan que, en gran parte de América, la larva de C. hominivorax es considerada como la principal plaga de insectos del ganado debido a las infestaciones múltiples que pueden llegar a ocasionar, mutilaciones y la muerte de los animales, especialmente de terneros; los animales que no reciben tratamiento pueden morir entre 7 y 14 días por las toxinas segregadas por las larvas y por la presencia de infecciones secundarias, principalmente por bacterias oportunistas como Escherichia coli y Proteus spp. (Anziani, 2011; CFSPH, 2007).
Las pérdidas anuales por costos de mano de obra para prevención y control, tratamiento del ganado y costos de productos utilizados pueden llegar a ser altos, sin considerar la muerte de los animales (Rodríguez et al., 2011). Las pérdidas anuales reportadas para los Estados Unidos fueron de $870 millones de dólares, para México $319 millones, para Centro América $85.1 millones, el Caribe (Jamaica, República Dominicana, Haití, Trinidad y Tobago, Cuba) $128.67 millones, y para los países de Sudamérica $3591.17 millones (Rodríguez et al., 2011). En este sentido, se calcula que el promedio 17
anual de gastos en varios países, por inspección y tratamiento, es de 7.76$ por animal, por lo que sus pérdidas económicas en conjunto resultarían ser cuantiosas (Bajatta, 2007).
Erradicación del GBG – Cochliomyia hominivorax
En 1936, el Dr. Raymond Bushland desarrolló una técnica para criar considerables cantidades de insectos en forma artificial, usando una dieta a base de carne molida, sangre de bovino, agua y formol como conservante; sin embargo, en el año de 1937, el Dr. Edward Knipling fue el primero en establecer la teoría del control biológico de la mosca mediante la Técnica del Insecto estéril, la cual establece la introducción de grandes cantidades de machos sexualmente estériles en las poblaciones de insectos silvestres, con el propósito de que los huevos ovipositados por las hembras fértiles apareadas con dichos machos fueran infértiles y, por lo tanto, no exista descendencia. Por el contrario, Bushland y Hopkins, en 1951, realizaron la primera esterilización de moscas del GBG y demostraron que ambos sexos quedaban estériles (Krafsur, 1998; Baumhover, 2002; Quiroz, 2003). La técnica del insecto estéril implica la producción masiva de moscas del GBG y su esterilización en la fase de pupa por medio de radiación de rayos Gamma (Cesium 137); después, los insectos estériles son dispersados en una proporción de 10 moscas machos estériles por cada mosca hembra silvestre (Rodríguez et al., 2011).
En Estados Unidos, se crearon plantas productoras de moscas estériles del GBG que permitieron la erradicación en dicho país; sin embargo, debido a la migración de moscas de México a Estados Unidos, en 1972, se formó la Comisión México Americana para la Erradicación del Gusano Barrenador del Ganado (CMAEGBG), cuyo objetivo fue erradicar el gusano en el territorio mexicano, desde la frontera con Estados Unidos hasta la región del Istmo de Tehuantepec- México; por esta razón, la comisión desarrolló una planta productora de moscas estériles en Chiapa de Corzo, cuya capacidad de
18
producción era de 500 millones de moscas por semana; no obstante, esta planta en México desapareció una vez que se logró la erradicación de esta plaga en dicho país (Quiroz, 2003; Bajatta, 2007).
En la actualidad, la Comisión Panamá - Estados Unidos para la Erradicación y Prevención del Gusano Barrenador del Ganado (COPEG) posee la Planta productora de moscas estériles, cuya finalidad es la de proveer insectos estériles para el mantenimiento de la última Barrera biológica, cuyo objetivo es evitar el ingreso de esta plaga a la región Norte y Centro de América, siendo su capacidad de producción de 100 millones de moscas semanales (COPEG, 2014).
Biología Molecular en la Identificación de Insectos
La biología molecular juega un rol muy importante en la identificación de insectos mediante la utilización del ADN; los insectos contienen material genético (ADN nuclear y mitocondrial) que ha sido utilizado con el fin de identificar las distintas etapas de vida de los insectos (Gennard, 2007).
19
ADN Mitocondrial
El uso de ADN mitocondrial (ADNmt) ha demostrado ser eficiente para muchos grupos de animales como un marcador genético para estudios evolutivos y poblacionales, debido al predominio de la línea materna, la falta de recombinación y la rápida sustitución de nucleótidos (Fresia et al., 2007; Simon et al., 1994; Sperling et al., 1994). Lessinger et al., (2000), determinaron la secuencia del genoma mitocondrial de C. hominivorax la cual es una molécula circular de 16022 pares de bases (pb); en su genoma se encontró un gen que contiene 13 proteínas codificables, 22 genes de ARN de transferencia (ARNt) y 2 genes de ARN ribosomal (ARNr).
Figura 7. Insect mitochondrial genome Fuente: Gennard, 2012
20
Estudios Moleculares realizados en Cochliomyia
Los análisis moleculares con califóridos se ha concentrado en tres temas: genética de poblaciones, identificación de especies y filogenia o análisis evolutivos (Azeredo-Espin & Lessinger, 2006)
Dentro de las diferentes técnicas empleadas para el análisis del ADNmt destacan el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP por sus siglas en inglés), utilizando ADNmt para el análisis de poblaciones de C.hominivorax (Infante & Azeredo-Espin, 1995; Roehrdanz, 1989; Lyra et al., 2005) además de permitir la identificación y caracterización de especies del GBG (Taylor et al., 1996; Litjens et al., 2011). Con la técnica de amplificación aleatoria de ADN polifórmico (RAPD por sus siglas en ingles), Skoda et al. (2002), realizaron estudios comparativos con C. hominivorax y C. macellaria; no obstante, Alamalakala et al., (2009) utilizaron la técnica de Polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP por sus siglas en inglés) para la diferenciación de C. hominivorax de C. macellaria.
Las técnicas de fingerprinting (AFLP, RAPD) se han utilizado ampliamente en todo el mundo, permitiendo obtener resultados adecuados en la diferenciación de especies, pero ha presentado varios problemas en la interpretación de las bandas obtenidas después del corte por enzimas; es así que en la búsqueda de un mejor análisis de las secuencias se ha optado por la secuenciación y el análisis bioinformático de las mismas.
Filogenia
La filogenia determina la historia evolutiva de un grupo de organismos, utilizando matrices de información de moléculas de ADN y de morfología; con esta información se establecen árboles filogenéticos que representan la historia evolutiva de las especies, poblaciones y genes (Sadava et al., 2009). La misión de la filogenética molecular es la construcción de árboles
21
filogenéticos a partir de la inferencia de las relaciones evolutivas existentes entre las secuencias a estudiar (Page & Holmes, 2009). La máxima parsimonia es uno de los métodos más utilizados en la reconstrucción de árboles filogenéticos basado en caracteres, que tiene como principal fundamento escoger el árbol filogenético que explica la filogenia de un grupo con el menor número de pasos o eventos evolutivos (Vaca & Larralde, 2009).
Debido a su condición de parásitos del ganado y su papel como especie indicadora primaria en entomología forense, la familia Calliphoridae se encuentra entre lo filogenéticamente más estudiado de las moscas causantes de miasis (Steven, 2003; Wallman, J.F. et al., 2005); es así que los estudios filogenéticos, de varios autores como McDonagh et al., (2009) y Fresia, (2013), se han realizado en el sur, centro y norte de América. Teniendo como punto de inicio los aspectos evolutivos, las miasis se pueden agrupar en dos raíces filogenéticas distintas, considerando el comportamiento y hábitos de vida de los organismos que lo causan. En la raíz saprófaga, estos organismos estaban adaptados a la alimentación de materia orgánica en descomposición, luego pasaron a alimentarse de carcasas de animales y posteriormente de tejidos necrosados de vertebrados en descomposición; mientras que, en la raíz sanguinívora, las larvas son capaces de perforar el tegumento de otras larvas y alimentarse de su contenido corpóreo. Posteriormente, estas larvas pasaron a perforar la piel de hospedadores vertebrados y alimentarse de su sangre, haciéndose de esa forma parásitos obligados (Guimarães & Papavero, 1999; Zumpt, 1965 citado por Grella, 2011).
22
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
La investigación fue de tipo descriptiva, por medio de la que se detallaron los procesos utilizados y por ende sus resultados.
El procesamiento de las muestras se llevó a cabo en dos etapas en los laboratorios del Centro Internacional de Zoonosis-Universidad Central del Ecuador (CIZ-UCE); una en la Unidad de Entomología Aplicada (UEA), donde se realizó los estudios de identificación morfológica y, la otra, en el área de Biología Molecular, en donde se procedió a la extracción, amplificación del ADN, visualización de las bandas; posteriormente, se envió a secuenciar. Los especímenes adultos utilizados en este estudio pertenecen a la colección del CIZ-UCE, los que han sido colectados durante el año 2013 y 2014.
El origen de las muestras colectadas proviene de San Miguel de los Bancos, Saloya, Tumbaco y Quito (Valles), pertenecientes a la Provincia de Pichincha. Para el estudio se utilizaron ejemplares en estadíos juveniles (larvas) colectadas en miasis de bovinos y caninos y, moscas adultas obtenidas de trampas y cadáveres de bovinos y armadillo. Cabe señalar que los estadíos juveniles (larvas) fueron cultivadas en el laboratorio hasta la obtención de adultos mismos que fueron utilizados en los estudios moleculares.
El esquema para la selección de los individuos analizados se realizó en base a los registros del CIZ, considerando el origen, la procedencia y el estado de desarrollo de los ejemplares (Ver tabla 3).
23
Tabla 3. Esquema de selección de individuos para la Identificación morfológica y molecular
Origen Estadío # de ejemplares Procedencia (#)***
Los Bancos (2) Adultos* 3 Durán (1)
Los Bancos (3) Animal vivo Saloya (7) Larvas** 16 Tumbaco (3)
Quito (Valles) (3)
Los Bancos (7) Trampa Adultos 8 Saloya (1)
Los Bancos (8) Adultos***** 14 Cadáver Saloya (6)
Huevos**** 7 Los Bancos (7)
Total = 48 ejemplatres
*Ejemplares adultos colectados directamente del animal vivo; **Larvas criadas en el laboratorio hasta obtener adultos, ***Cantidad de ejemplares por localidad, **** Huevos criados hasta obtener moscas adultos, ***** Ejemplares adultos colectados directamente del cadáver.
Fase de Laboratorio: Unidad de Entomología Aplicada
Identificación y cultivo de larvas: Las larvas obtenidas de las heridas de animales fueron identificadas morfológicamente utilizando un estereomicroscopio y las claves para larvas del género Cochliomyia, publicadas por el COMEXA (2008), FAO (1993a,1993b), Florez & Wolff (2009) y Spradbery (2002); posteriormente, fueron criadas en el laboratorio hasta obtener adultos, según el Manual de FAO (1993a), las cuales se utilizaron para la investigación; este procedimiento fue desarrollado por el personal del CIZ y no forma parte de este trabajo.
24
Identificación Morfológica de Adultos de Cochliomyia spp: Todos los adultos (capturados o procedentes de miasis) fueron identificados utilizando un estereomicroscopio y claves dicotómicas de la FAO (1993a,1993b), Spradbery (2002), Whitworth (2010) (ver Anexo A). Una vez identificado el ejemplar adulto, se separaron dos patas en un vial de 1,5ml para la extracción del ADN.
Fase de laboratorio: Biología Molecular Las actividades realizadas fueron detalladas en este orden:
Extracción y cuantificación de ADN El procesamiento se llevó a cabo según el protocolo de Chelex, reportado por Echeverria et al. (2015).
Materiales
Cabina de bioseguridad (LABCONCO, PURIFIED® CLASS I SAFETY ENCLOSURE). Micro – Tijeras entomológicas Micro mortero a batería (Kontes, Vineland, NJ). Centrífuga (Force Micro 1624). Pipetas calibradas (Med Plus). Vórtex (Labnet Vx 100). Shaking Micro Incubator(Provocell TM ) Tubos de 1.5ml (Axygen® ) NanoDrop 2000(Thermo Scientific)
Reactivos
Ultra-PURE Distilled Water DNAse, RNAse Free ( Invitrogen®) Buffer de hidratación (100mM Tris-HCl, 50mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% SDS, 200mM sacarosa) Proteinasa K (Promega®) Buffer TEX (10mM Tris pH 8.0, 0.5mM EDTA, 1% Triton x-100) con Chelex®100 al 10%
25
Procedimiento
Pretratamiento – Hidratación de la muestra: Se suspendieron dos patas del espécimen en 250ul de buffer de hidratación (100mM Tris-HCl, 50mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% SDS, 200mM sacarosa) (Golczer & Arrivillaga, 2008) por 2 días, a temperatura ambiente.
Homogenización de la muestra: la lisis mecánica se dividió en tres etapas: a) trituración de la muestra con tijeras; b) homogenización con micromortero a batería (Kontes, Vineland, NJ); y c) centrifugación por 10 minutos a 13000 rpm.
Lisis química y recuperación de DNA: se descartó el sobrenadante y añadió 200μl de buffer TEX (10mM Tris pH 8.0, 0.5mM EDTA, 1% Triton x- 100) con Chelex®100 al 10%. Se agregó 35μl de proteinasa K (20mg/ml – en
PK buffer – 50mM Tris-HCl pH 7.4, 10mM CaCl2). La solución se incubó por 1 hora a 60°C con 1300 rpm, seguida por 10 minutos a 100°C con 1000 rpm.
Recuperación de DNA: finalmente, se centrifugó por 5 minutos a 13000 rpm y se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo.
Cuantificación: Se realizó una medición de 2μl de cada muestra con espectrofotometría, según especificaciones del programa del equipo Nanodrop 2000c y almacenó a -20°C, hasta su amplificación.
26
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Los oligonucleótidos y el programa de amplificación se tomaron de Arrivillaga et al. (2003) y Simon, et al. (1994) con las modificaciones reportadas en Echeverria et al. (2015)
Materiales
Tubos de 1.5ml (Axygen®) Tubos de 0.2ml (Bioplastics) Cabina de seguridad (LABCONCO, PURIFIED® CLASS I SAFETY ENCLOSURE). Vortex (HEIDOLPH, Reax top) Juego de Pipetas calibradas (BioPette) Termociclador Biorad (C1000 Touch Thermal Cycler)
Reactivos
Ultra-PURE Distilled Water DNAse, RNAse Free ( Invitrogen®) Cebadores CIJ1632, CIN2191, 12SBI, 12SAI (tabla 4) tomados de Arrivillaga et al. (2003) y Simon, et al. (1994) Flexi Buffer 5X Promega® MgCl2 25um Promega® dNTP Promega® GoTaq® G2 Flexi DNA Kit Promega®
Tabla 4. Secuencia de cebadores para el COI y 12S
Gen Cebadores Secuencia* Pb
COI CIJ1632 5' - TGATCAAATTTATAAT- 3' ≈540pb 5' -GGTAAAATTAAAATATAAACTTC- 3' CIN2191
12S 12SBI 5' -TACTATGTTACGACTTAT- 3' ≈400pb
12SAI 5' -AAACTAGGATTAGATACCC- 3'
* Tomado de Arrivillaga et al. (2003) y Simon, et al. (1994)
27
Procedimiento
Se preparó el master mix en un tubo de 1.5 ml. Previamente se realizaron los cálculos para un volumen de reacción final de 25 µl/tubo (Por cada reacción se incluyó un control positivo y control negativo) y se añadieron los reactivos en el orden que señala la Tabla 5 y 6.
Tabla 5. Reactivos utilizados para la preparación del master mix para la amplificación del gen COI
Reactivo Concentración final 1X [µl]
Agua 13.9
Flexi Buffer 5X Promega® 1X 5
MgCl2 25um Promega® 4Mm 4
dNTP Promega® 0.2mM 0.5
Cebador C1N2191 0.6mM 0.15
Cebador C1J1632 0.6mM 0.15
GoTaq® G2 Flexi DNA Promega® 0.07U/µl 0.35
Tabla 6. Reactivos utilizados para la preparación del master mix para la amplificación del gen 12S ARNr
Reactivo Concentración final 1X [µl]
Agua 14
Flexi Buffer 5X Promega® 1X 5
MgCl2 25um Promega® 4mM 4
dNTP Promega® 0.2mM 0.5
Cebador 12SAI 0.3mM 0.08
Cebador 12SBI 0.3mM 0.08
GoTaq® G2 Flexi DNA Promega® 0.065U/µl 0.33
28
- Se dispensó 20µl del mix en tubos de 0.2ml, colocados con anticipación a 0°C. - Una vez en el termociclador, a cada tubo de 0.2ml se le agregó 5 µl de muestra. Para el control positivo se agregó 5µl de una muestra que presentó amplicones adecuados con COI y 12SARNr. - Se amplificaron las muestras para el COI en el equipo según los parámetros: Desnaturalización inicial a 95°C durante 3 minutos, 35 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 45°C un minuto y 72°C un minuto y una extensión final de 72°C por 7 minutos. - Se amplificaron las muestras para el 12S ARNr en el equipo según los parámetros: Desnaturalización inicial a 94°C durante 5 minutos, 35 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 48°C un minuto y 72°C un minuto y una extensión final de 72°C por 10 minutos. - Las bandas se visualizaron en gel con agarosa al 2% (w/v) TBE 0.5X; se utilizó SYBR® SAFE como intercalante de ADN; las muestras se colocaron en los pocillos y, finalmente, se observó y documentó las bandas con luz UV en el foto documentador (Bio- Imaging Systems Mini Lumi). - Las bandas que presentaron una correcta amplificación en calidad y nitidez del amplicón se enviaron a secuenciar.
Secuenciación.- Para el trabajo de secuenciación de los amplicones a ser analizados, las muestras fueron enviadas a “EUROFINS GENOMICS en Estados Unidos.
29
Análisis de Datos
Los cromatogramas recibidos por la empresa Eurofins Genomics, encargada de secuenciar, se analizaron en el Software Sequencher 4.2 (Gene Codes, Ann Arbor, MI) cuya finalidad fue la de contrastar las secuencias “forward” y “reverse” para obtener una secuencia consenso libre de ruido y ambigüedades; estas últimas se reportan en el cromatograma con la letra “N” lo que significa que no existe correspondencia con alguna base específica. Posteriormente, las secuencias consenso se alinearon empleando el programa Clustal W (en MacVector versión 7.2; Accelrys, Madison, WI). El uso del programa MacVector consiste en la comparación lineal de las secuencias de aminoácidos o nucleótidos buscando resaltar zonas de homología posicional que permitan indicar las relaciones evolutivas. Del mismo modo, se verificó la identidad de las secuencias al analizar en línea con el BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, determinando la homología con secuencias publicadas en su base de datos. La matriz final se introdujo en el software PAUP 4.0a142 (Swofford, 2002) para los análisis filogenéticos, el que realizó una reconstrucción filogenética, utilizando el algoritmo de Parsimonia Máxima (Maximun Parsimony) con un método de búsqueda heurística; posterior repesado de caracteres homólogos y finalmente se realizó un consenso de mayoría de las soluciones hipotéticas resultantes.
30
CAPÍTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Identificación Morfológica Para la identificación morfológica se utilizaron 48 ejemplares adultos; mismos que se detallan en la Tabla 7. Tabla 7. Procedencia y fecha de obtención de los ejemplares
Estadío Fecha de N° Código Procedencia Dato de Captura de vida Captura
San Miguel de los 1 1C Animal Vivo-oreja A 7-nov-2013 Bancos
San Miguel de los 2 2C Animal Vivo A 20-ene-2014 Bancos
3 3C Saloya Animal Vivo A 21-ene-2014
4 4C Quito(Valles) Animal Vivo A 30-nov-2013
5 5C Quito(Tumbaco) Animal Vivo A 30-sep-2013
San Miguel de los 6 6C Trampa A 7-nov-2013 Bancos
San Miguel de los 7 7C Trampa A 7-nov-2013 Bancos
San Miguel de los 8 8C Trampa A 7-nov-2013 Bancos
San Miguel de los 9 9C Cadáver lab. A 19-nov-2013 Bancos
San Miguel de los 10 10C Cadáver lab. A 19-nov-2013 Bancos
11 31C Quito (Tumbaco) Animal Vivo A 30-sep-2013
12 32C Quito (Tumbaco) Animal Vivo A 30-sep-2013
San Miguel de los 13 33C Trampa A 7-nov-2013 Bancos
San Miguel de los 14 34C Trampa A 27-sep-2013 Bancos
31
San Miguel de los 15 35C Trampa A 27-sep-2013 Bancos
San Miguel de los 16 36C Cadáver lab. A 19-nov-2013 Bancos
San Miguel de los 17 37C Cadáver lab. A 19-nov-2013 Bancos
San Miguel de los 18 38C Cadáver lab. A 19-nov-2013 Bancos
San Miguel de los 19 39C Cadáver lab. A 19-nov-2013 Bancos
San Miguel de los 20 40C Cadáver lab. A 19-nov-2013 Bancos
San Miguel de los 21 41C Cadáver armadillo A 24-ene-2014 Bancos
San Miguel de los 22 42C Cadáver.armadillo A 24-ene-2014 Bancos
San Miguel de los 23 45C Trampa A 27-sep-2013 Bancos
24 46C Saloya Animal Vivo A 7-dic-2013
25 47C Saloya Animal Vivo A 7-dic-2013
26 48C Saloya Animal Vivo A 26-mar-2014
27 49C Saloya Animal Vivo A 26-mar-2014
San Miguel de los 28 50C Cadáver A 7-nov-2013 Bancos
29 51C Saloya Trampa A 25-oct-2013
San Miguel de los 30 52C Cadáver A 7-nov-2013 Bancos
San Miguel de los 31 54C Cadáver A 7-nov-2013 Bancos
San Miguel de los 32 55C Cadáver A 7-nov-2013 Bancos
San Miguel de los 33 56C Cadáver A 7-nov-2013 Bancos
34 57C Saloya Cadáver A 27-nov-2013
35 58C Saloya Cadáver A 27-nov-2013
36 59C Saloya Cadáver A 27-nov-2013
37 60C Saloya Cadáver A 27-nov-2013
San Miguel de los 38 61C Animal Vivo- oreja A 7-nov-2013 Bancos
32
San Miguel de los 39 62C Animal Vivo A 20-ene-2014 Bancos
San Miguel de los 40 63C Animal Vivo A 20-ene-2014 Bancos
41 64C Saloya Animal Vivo A 21-ene-2014
42 65C Saloya Animal Vivo A 21-ene-2014
43 66C Quito (Valles) Animal Vivo A 30-nov-2013
44 67C Quito (Valles) Animal Vivo A 30-nov-2013
45 68C Saloya Cadáver A 27-nov-2013
46 69C Saloya Cadáver A 27-nov-2013
San Miguel de los 47 70C Cadáver A 7-nov-2013 Bancos
48 100C Guayaquil/Guayas Animal Vivo A 5-jun-2013
A, ejemplar adulto Fuente: CIZ (2015)
Las moscas del género Cochliomyia fueron diferenciadas de otros géneros causantes de miasis en heridas, principalmente por la coloración del cuerpo y la presencia de tres bandas longitudinales oscuras sobre el tórax. Estas condiciones, en términos generales, no son compartidas por otras especies que hayan sido implicadas en las miasis de las heridas, como parásito obligatorio. Las principales características observadas en las moscas de este estudio, para discriminar entre C. hominivorax de C. macellaria, se detallan en la Figura 8.
33
a. C. hominivorax - Placas fronto - b. C. macellaria - Placas fronto - orbitales con orbitales con setas de color negro setas de color amarillo y las inserciones de las setas aparecen como puntos negros
c. C. hominivorax - Tres bandas d. C. macellaria - Tiene tres bandas longitudinales, la del centro es más corta. longitudinales negras de igual longitud.
e. C. hominivorax - En hembras las basicosta f. C. macellaria - En hembras las basicosta es de color marrón oscuro o negro. es de color amarillo.
g. C. hominivorax - Quinto tergito (cuarto h. C. macellaria - Quinto tergito (cuarto visible) visible) lateralmente sin microtomentum lateralmente con microtomentum plateado. plateado. Figura 8. Adultos de C. hominivorax (izq) y C. macellaria (dcha). (a y b) Cabeza - Vista Frontal. (c y d) Tórax - Vista dorsal. (e y f) Ala – Vista lateral. (g y h) Abdomen – Vista lateral. Fuente: CIZ (2015)
34
La identificación por claves morfológicas, en los ejemplares adultos, hasta la fecha ha presentado falencias, entre autores, que han dificultado la diferenciación certera de algunos individuos que comparten características similares. No obstante, las claves dicotómicas, reportadas en la literatura, presentan pocos caracteres únicos que permiten diferenciar entre especies; los que, en la literatura científica no muestran un consenso (Figarola, 2001;
Skoda et al., 2002; Toledo, 2007). Es por esto que, las características morfológicas que se detallan en la Fig. 8, por si solas no aportaron información clara para diferenciar a estas dos especies. Dos ejemplos claros son la descripción de colores y las bandas del tórax las que, en este estudio, resultaron ser muy subjetivas y sin valor diagnóstico, ya que no concuerdan con la descripción de los ejemplares reportados en las claves dicotómicas.
Del mismo modo, la coloración de la basicosta es característica para diferenciar entre hembras de estas dos especies lo que coincide con la literatura reportada (Spradbery, 2002); sin embargo, la principal limitante de esta característica es que no diferencia a los machos entre especies; consecuentemente, se necesitan otras estructuras (genitalia del macho) para su diferenciación. La observación de los genitales requiere de una especialización y de protocolos complejos que no fueron utilizados en este estudio.
Los registros del CIZ-UCE, respecto al origen de los especímenes, incluidos en este estudio, fueron importantes ya que permitieron, en base de la procedencia, establecer la especie de mosca adulta; es decir, los casos de miasis recuperados en animales vivos correspondieron a C. hominivorax y los que fueron colectados en cadáveres pertenecieron a C. macellaria, ya que la identificación de ejemplares en estadío larval 3 es más fácil de diferenciar que los ejemplares adultos (FAO, 1993a; Rodríguez, et al., 2011; OIE, 2013); además, el comportamiento de las larvas es muy marcado y ha permitido diferenciarlas por sus hábitos alimenticios.
35
Por todo lo anteriormente expuesto, de acuerdo con la identificación de las claves morfológicas del COMEXA (2008); FAO (1993a,1993b); Florez & Wolff (2009); Spradbery (2002) y Withworth (2010) para larvas, moscas del género Cochliomyia, y los datos obtenidos del origen de colecta, del total de ejemplares analizados, se identificaron dos especies; el 66,67% (32/48) correspondió a ejemplares de Cochliomyia macellaria y, el 33,33% (16/48) a Cochliomyia hominivorax.
Según los registros del CIZ-UCE (datos no publicados), se obtuvieron 19 ejemplares, 3 moscas adultas y 16 larvas, capturados o colectados en animales vivos. De este grupo, los 3 ejemplares adultos, capturados en la cercanías de una herida en los animales vivos, correspondieron a la especie C. macellaria; 2 de estas moscas fueron colectadas en San Miguel de los Bancos - Pichincha y una en Durán - Guayas. Es importante señalar que se evidenció la presencia de cadáveres cerca de los animales vivos que presentaban la herida; consecuentemente, es muy probable que las moscas colectadas, y que corresponden a C. macellaria, estaban buscando el ambiente adecuado para copular ya que, todos los ejemplares fueron machos en busca de hembras; según Benedito, (1992), los tejidos necrosados de la heridas simulan la presencia de un cadáver y las condiciones ideales para la reproducción. Las restantes 16 moscas adultas (originalmente colectadas como larvas) provenían de casos de miasis en bovinos originarios de Saloya y de San Miguel de los Bancos, y en caninos en la Ciudad de Quito, del sector los valles y Tumbaco (Ver tabla 7), las que fueron identificadas como C. hominivorax.
Del mismo modo, los 21 ejemplares, 14 moscas adultas capturadas en cadáveres y 7 moscas adultas cultivadas en el CIZ-UCE a partir de huevos ovipositados (Ver tabla 3), correspondieron a la especie C. macellaria. De los 21 ejemplares, 14 adultos fueron colectados de San Miguel de los Bancos y
36
Saloya, y 7 adultos cultivados (a partir de huevos ovipositados) de San Miguel de los Bancos. Finalmente, 8 ejemplares adultos colectados en trampas (7 moscas provenientes de San Miguel de los Bancos y una colectada en Saloya), confirmaron ser de la especie C. macellaria.
El origen de las muestras juega un papel muy importante para la discriminación de las dos especies; es así que, se identificó la presencia de C. hominivorax solo en los 16 casos de miasis de bovinos y de caninos; mientras que, todas las muestras colectadas fuera de una miasis resultaron ser C. macellaria; es decir, aquellas colectadas en trampas, cadáveres o simplemente capturadas en los alrededores de las heridas de los bovinos. Andrade et al., (2005) y Toledo, (2007) identificaron a C. macellaria en cadáveres y trampas, respectivamente lo que está en concordancia con este estudio. Por otra parte, Arteaga et al., (2007) y Valviesse et al., (2014), en sus investigaciones, identificaron a las dos especies asociadas en casos de miasis; la razón de este hallazgo fue que C. macellaria interviene como un invasor secundario de la herida; esto puede ser debido a la preferencia alimenticia de cada una de estas especies, lo cual concuerda con lo afirmado por Cushing & Patton, (1933), citado por Azeredo, (1982), quienes fueron los primeros en establecer la distinción entre las dos especies por sus hábitos alimenticios. Del mismo modo, Byrd & Castner, (2010), COMEXA, (2008), FAO, (1993b), Hall, (1991) y Quiroz, (2003), mencionan que el comportamiento principal de la larva de C. hominivorax es alimentarse de tejido vivo (parásito obligado en los casos de miasis); mientras que, la larva de C. macellaria se desarrolla en cadáveres o restos de carcasas. C. macellaria solo participa como un eventual invasor secundario de miasis, alimentándose de los bordes del tejido necrosado de las heridas; por esta razón, esta especie, ha ganado reconocimiento en la entomología forense como una especie principal para basar estimaciones de intervalos post mortem del fallecimiento de la víctima. En este estudio, el comportamiento de
37
estas dos especies también fue considerada como un aspecto importante para su diferenciación, gracias a los registros de colecta del CIZ-UCE (datos no publicados). Según la afirmación de Fresia et al., (2007) quienes indican que C. hominivorax es la especie más frecuente en procesos miásicos en Uruguay, este estudio desacuerda con los autores debido a que, la miasis más frecuente del área de estudio es Dermatobia hominis (observaciones personales). En Uruguay, la presencia de Dermatobia hominis es igual de importante que en el Ecuador (Conti, 2001). Del mismo modo, es importante recalcar que en el Ecuador, las especies reportadas como obligatorias, causantes de miasis, en el ganado bovino son C. hominivorax y Dermatobia hominis; hasta la fecha, no se ha reportado una especie diferente a las mencionadas.
Según los registros del CIZ, las larvas colectadas de las miasis de los animales corresponden al tercer estadio de desarrollo de Cochliomyia (datos no publicados); mismas que presentan un cuerpo liso dividido en 12 segmentos, cada uno cubierto por bandas de espinas de 1 a 3 puntas. En el borde posterior del segundo segmento, a ambos lados se encuentran los espiráculos anteriores, los cuales presentan lóbulos o papilas; mientras que, los espiráculos posteriores no se encuentran en cavidad sino expuestos en el último segmento (12 segmento), y el peritrema del espiráculo posterior es incompleto por lo que no rodea completamente a las aberturas respiratorias; sin embargo, la principal característica que se observó para diferenciar a las dos especies fueron los troncos traqueales. En este sentido, los resultados de identificación morfológica del CIZ-UCE (datos no publicados) determinaron que las larvas, colectadas en miasis de los animales, corresponden a C. hominivorax; mientras que, las larvas provenientes de huevos, ovipositados en los tubos de ensayo, pertenecen a C. macellaria. Este resultado, previamente expresado por el CIZ-UCE, confirma la
38
identificación morfológica de las moscas adultas en este estudio, como se expresa en la Fig. 9
Figura 9. Larvas y Adultos de C. hominivorax y C. macellaria (A) Larva de C. hominivorax (B) Larva de C. macellaria (C) Mosca de C. hominivorax (D) Mosca de C. macellaria. Fuente: CIZ (2015)
Algunos autores como Toledo, (2007) y Fonseca, (1999), se basaron en los caracteres detallados anteriormente en la Figura. 8 para diferenciar a las dos especies. Sin embargo, Toledo, (2007) señala que se han encontrado diferencias morfológicas entre ejemplares adultos de distintas poblaciones del GBG como la variación del color del cuerpo y los ojos, así como anormalidades en la venación de las alas, lo que es corroborado por el Servicio de Investigación agrícola del Ministerio de Agricultura de los Estados Unidos, quienes poseen 6 poblaciones del GBG (moscas adultas) provenientes de México, Costa Rica y Panamá, las mismas que presentan diferencias morfológicas.
39
Otro factor importante es que durante mucho tiempo las miasis han sido tratadas con insecticidas y esto, probablemente, ha llevado a una resistencia producto de mutaciones, como lo afirma Lachance & Hopkins, (1962) quienes encontraron 9 mutaciones en la mosca C. hominivorax que afectaban a la coloración del cuerpo, venación de las alas y otras estaban ligadas al sexo.
Por los antecedentes mencionados, estas variaciones morfológicas pueden influir en una correcta identificación; razón por la cual, estudios basados en análisis de regiones del ADNmt se han venido desarrollando, con el fin de facilitar un acercamiento para la identificación taxonómica y de relaciones entre poblaciones estudiadas de C. macellaria y C. hominivorax (Taylor et al, 1996; Litjens et al., 2001; Skoda et al., 2002; Skoda et al., 2012; Alamalakala et al., 2009; McDonagh et al., 2009; Toledo, 2007).
Identificación Molecular
La extracción de ADN y la amplificación según los protocolos publicados por Echeverría et al. (2015), permitieron obtener un ADN en buen estado. La secuenciación de los productos amplificados de las regiones COI y 12S de 48 ejemplares adultos (96 reacciones) se realizó en Eurofins Genomics. De las 48 muestras analizadas morfológicamente, realizadas la extracción, cuantificación (Ver anexo B), amplificación de ADN y enviadas a secuenciación, solo 33 y 30 muestras presentaron cromatogramas adecuados para el análisis filogenético para el gen COI y 12S ARNr respectivamente. Las muestras que presentaron problemas son 15 las cuales pertenecen a: 6 ejemplares de casos de miasis en caninos, 4 ejemplares de miasis en bovinos y 2 ejemplares adultos capturados en heridas; del mismo modo, una muestra colectada en trampa y dos muestras obtenidas en cadáveres, por lo tanto no fueron incluidas en este análisis. Probablemente, esto se debe a que presentaban exceso de ruido, es decir problemas en la
40
diferenciación de las bases nitrogenadas posiblemente por errores en el almacenamiento, extracción, secuenciación y manipulación durante el procesamiento de la muestra en los laboratorios (Ver anexo C).
Para la identificación molecular de las secuencias, se editaron las secuencias con ayuda de los cromatogramas en el programa Sequencher 4.2 y fueron introducidos en la herramienta BLAST de Pubmed; los resultados de este análisis son presentados en el Anexo D.
Análisis Filogenéticos
Las secuencias consenso de los genes citocromo oxidasa subunidad I (COI) y 12S de las muestras de estudio, como resultado dieron secuencias de una longitud de 467 pb (COI), 322 pb (12S) y al unir la información de los dos genes una longitud de 944 pb. Posteriormente, estas secuencias fueron analizadas mediante el software de alineamiento MacVector en donde se incluyó secuencias externas desde la base de datos Pubmed (Ver anexo E) y se realizó un alineamiento mediante ClustalW. Por último, mediante PAUP se realizó análisis de máxima parsimonia para obtener las relaciones filogenéticas.
Citocromo Oxidasa subunidad I (COI)
Los análisis de parsimonia máxima de los 56 taxa arrojaron como resultado 9 árboles óptimos, con un valor de longitud (L) de 387.17, Índice de consistencia (IC) de 0.91 e Índice de retención (IR) de 0.89.
En el árbol consenso de mayoría que se muestra en la Fig. 10, se pueden observar 3 grupos definidos: un primer grupo conformado por secuencias del genbank, pertenecientes a los grupos externos o de referencia; un segundo grupo en la parte interna conformado por secuencias de C. macellaria del genbank asociadas con las secuencias provenientes de muestras de trampas 41
y cadáveres. Este grupo presentó una politomía (nodos no resueltos), con un valor de apoyo del 100%; sin embargo, las muestras 10C, 36C y 37C se encuentran muy emparentadas ya que provienen de ejemplares (originalmente colectados como huevos) en cadáveres; así mismo, las secuencias 33C, 50C, y 68C se encuentran emparentadas proviniendo de trampa y cadáveres respectivamente. Adicionalmente, la secuencia de Compsomyiops fulvicrura obtenida del genbank, muestra una relación basal y hermana con el grupo de C. macellaria. Un tercer grupo, conformado por secuencias de C. hominivorax del genbank con secuencias provenientes de muestras de miasis, presentó un valor de apoyo del 100%.
42
Grupo externo
C. macellaria
C. hominivoraxC.
Grupo externo
-
Figura 10. Árbol de consenso de mayoría producido por análisis de parsimonia del gen COI.
43
ARN ribosomal (12S)
Los análisis de máxima parsimonia de los 33 taxa utilizadas arrojaron como resultado 9 árboles igualmente óptimos, con un valor de longitud (L) de 55.1, Índice de consistencia (IC) de 0.87 e Índice de retención (IR) de 0.80.
En el árbol consenso de mayoría que se muestra en la Fig. 11 se observan 3 grupos definidos, un primer grupo conformado por secuencias del genbank, pertenecientes al grupo externo o de referencia. Un segundo grupo, en la parte interna conformado por secuencias de C. macellaria provenientes de muestras de trampas y cadáveres; este grupo presentó una politomía, la misma que coincide con la observada en el árbol del gen citocromo oxidasa I y presenta un valor de apoyo del 100%. Y un tercer grupo conformado por secuencias provenientes de muestras de miasis con un valor de apoyo del 100%. Por otra parte, la secuencia de Calliphora vomitora, obtenida del genbank, manifiesta alguna relación con dos de los grupos definidos. Para este análisis, no se incluyó secuencias del genbank de C. macellaria porque no hay datos para este gen publicadas y, en el caso C. hominivorax hay secuencias (FM867729, FM867727, FM867728) que presentan problemas y se sospecha de una mala identificación ya que en los alineamientos se muestran muy distintas a las secuencias del estudio.
44
Grupo externo
C. macellaria
C. hominivorax
Figura 11. Árbol de consenso de mayoría producido por análisis de parsimonia del gen 12S.
45
Genes combinados COI y 12S
Los análisis de máxima parsimonia de los 35 taxa utilizados arrojaron como resultado 110 árboles igualmente óptimos con un valor de longitud de 577.4, Índice de consistencia (IC) de 0.91 e Índice de retención (IR) de 0.92. En el árbol de consenso de mayoría que se muestra en la Fig.12 se observan 3 grupos definidos: un primer grupo conformado por secuencias del genbank, pertenecientes al grupo externo o de referencia. Un segundo grupo, en la parte interna, conformado por C. hominivorax de secuencias provenientes de muestras de miasis que manifiestan alguna relación con Phormia regina del genbank; este grupo tiene un valor de apoyo del 100%. Y un tercer grupo, conformado por C. macellaria de secuencias provenientes de muestras de cadáveres y trampas, presentó un valor de apoyo del 100%. De forma similar a lo obtenido en el árbol del gen COI. La secuencia de Compsomyiops fulvicrura sigue manifestando relación cercana y basal con el grupo de C. macellaria
46
Grupo externo
C. hominivoraxC.
macellC.
aria
Figura 12. Árbol de consenso de mayoría producido por análisis de parsimonia del gen COI y 12S.
47
La topología de los árboles filogenéticos obtenidos para los genes COI y 12S y la combinación de los 2 genes, no revelan mayores cambios en la agrupación interna. Se puede observar la formación de tres grupos, correspondientes a las secuencias de C. macellaria, C. hominivorax y secuencias externas o de referencia; cada grupo tenía un valor de apoyo del 100%, lo que indica que el gen COI y 12S permitieron diferenciar a estas dos especies, contrario de lo reportado por McDonagh et al., (2009), quien establece que el gen COI revela un mayor grado de diferenciación que el gen 12S, el que presentó una falta de resolución en los árboles, lo que sugiere que algunas regiones del ADNmt están experimentando tasas más rápidas de evolución que otras regiones.
En la distribución interna del grupo de C. macellaria se observa politomías en los tres árboles, lo que sugiere que las muestras están muy cercanamente emparentadas; sin embargo, estas relaciones filogenéticas poco resueltas, indican la necesidad de estudiar más genes del ADNmt que aporten con más información con fines de estructura poblacional.
En el grupo de C. hominivorax, de alguna manera las muestras de miasis en el árbol del gen COI se presentan en un solo clado, cercano a las muestras de C. hominivorax del genbank, pero en una porción génica más conservada como 12s lo está asociando con grupos más lejanos, lo que nos indica que las muestras de miasis presentan alguna diferencia con las Cochliomyias hominivorax del genbank provenientes de varios lugares. Cabe mencionar que las muestras de miasis en la amplificación presentaron doble banda, por esta razón se asume la diferencia entre las C. hominivorax de miasis con las del genbank; sin embargo, no se descarta que el ambiente en el que se desenvuelven cada uno de estos grupos son diferentes y esto ha ocasionado diferencias genéticas que han dado a lugar a la divergencia evolutiva, como lo menciona Fresia et al., (2011), quienes señalan que existe variabilidad genética en las poblaciones de C. hominivorax, de la región del caribe y en Sudamérica (Norte y sur de la Amazonia), por lo que las considera
48
poblaciones independientes; por consiguiente, algunos autores como Roerhdanz (1989) y Taylor et al. (1996) señalan que las poblaciones de C. hominivorax del Norte y Centro América, en relación con las poblaciones de América del Sur, presentan un cierto grado de diferenciación.
Por lo anteriormente expuesto, Lyra et al., (2009) establecen que en la especie C. hominivorax el aislamiento geográfico puede ser la principal causa de la gran diferenciación poblacional. Por esta razón, es importante conocer las diferencias poblacionales de la especie C. hominivorax; mismas que representan un aspecto importante para el diseño de futuros programas basados en la TIE en las diferentes regiones. Del mismo modo, el requisito indispensable para la eficiencia del programa de erradicación del GBG es la correcta identificación de las especies en los sitios muestreados. La falta de este requisito podría ocasionar un serio error en la liberación de moscas estériles innecesarias, lo cual representaría un alto costo para el programa de control y erradicación de una región. Por otro lado, para declarar una zona libre, una zona infestada o una zona re infestada de GBG, dependerá de la correcta identificación de C. hominivorax.
Finalmente, la identificación morfológica de los ejemplares concuerda con los resultados obtenidos en los árboles filogenéticos; las muestras procedentes de miasis fueron identificadas morfológicamente como C. hominivorax y las muestras provenientes de cadáveres, trampas y de moscas posándose en heridas fueron identificadas como C. macellaria; esto concuerda con los datos obtenidos en los tres árboles, en los que se observan dos grupos claramente definidos, uno correspondiente a C. macellaria donde están las muestras de trampas, cadáveres y moscas capturadas en animales vivos y, el otro grupo corresponde a C. hominivorax donde están las muestras de miasis.
49
CAPÍTULO V CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones En base a las características morfológicas de las claves dicotómicas, y los datos de origen de colecta de los ejemplares, se identificaron dos especies de Cochliomyia; C. hominivorax presente en el 33.33% (16/48) de muestras colectadas de casos de miasis, y C. macellaria presente en el 66,67% (32/48) de muestras colectadas de trampas, cadáveres y adultos capturados en animales vivos. La información aportada por el gen mitocondrial Citocromo oxidasa subunidad I (COI) y el gen ribosomal (12S) del ADN mitocondrial permitió diferenciar a dos grupos de especies del género Cochliomyia, provenientes de distintos orígenes de muestreo y localidades, debido a su alta conservación y variabilidad.
50
Recomendaciones Utilizar marcadores con evidencia de mayor variabilidad como el COI subunidad II, el 28S, que permita resolver las politomías de los árboles.
Realizar la identificación morfológica de la genitalia de los machos como una característica adicional para diferenciar las especies de Cochliomyia.
Reestructurar las claves morfológicas para larvas y moscas del Género Cochliomyia.
Subir la información de las secuencias obtenidas del gen COI y 12S al genbank con la finalidad de aportar información para otros estudios y contribuir a incrementar la información del genoma de cada una de las especies de Cochliomyia.
Plantear un estudio similar, pero con un número muestral mayor, de diferentes localidades, para verificar la variabilidad genética de C. hominivorax a nivel nacional, con la finalidad de implementar un programa de control basado en la mosca estéril.
51
BIBLIOGRAFÍA
Alamalakala, L., Skoda, S., & Foster, E. (2009). Amplified fragment length polymorphism used for inter-and intraspecific differentiation of screwworms (Diptera: Calliphoridae). Bulletin of entomological research, 99(02), 139-149.
Alavez, J. (1975). Tesis Monográfica sobre el Gusano Barrenador del Ganado Cochliomyia hominivorax (Coquerel). Tesis de Pregrado. Universidad de Guadalajara, México.
Alemán, J., & Reinoso, S. (2014). Infestación maxilar por larvas Cochliomyia hominivorax. Primer reporte Ecuatoriano de debridación en miasis gingivo – maxilar. Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas, 35(N°1 ,2), pp. 21-29.
Andrade, H., Varela, A., Batista, M., & Medeiros, J. (2005). Calliphoridae (Diptera) Coletados em Cadáveres Humanos no Rio Grande do Norte. Neotropical Entomology, 34 (5), 855-856.
Anziani, O., (2011). Mosca de las bicheras (Cochliomyia hominivorax) Biología, importancia económica, aspectos epidemiológicos y tendencias estacionales en el área central de la Argentina, control. Recuperado el 21 de Noviembre del 2013, de: www.inta.gob.ar
Arrivillaga, J., Mutebi, J., Piñango, H., Norris, D., Alexander, B., Feliciangeli, M., & Lanzaro, G. (2003). The taxonomic status of genetically divergent populations of Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) based on the distribution of mitochondrial and isozyme variation.Journal of medical entomology, 40(5), 615-627.
52
Arteaga, F., Rodríguez, D., & Olivares, J. (2012). Comportamiento de Cochliomyia hominivorax (COQUEREL) y relación con otros agentes causantes de myasis, en un cantón de la región de Manabí, Ecuador. Revista de Salud Animal,34(1), 19-24.
Azeredo-Espin, A. M. (1982). Análise cariotípica de cinco especies de Calliphoridae (Díptera) do estado de São Paulo. Universidade Estadual de Campinas de São Paulo. Tese de Mestrado. Instituto de Biología, Universidad Estadual de Campinas, Sao Paulo, Brasil.
Azeredo-Espin, A.M.L. & Lessinger, A. (2006) Genetic approaches for studying myiasis causing flies: molecular markers and mitochondrial genomics. Genética, 126, 111-131.
Bajatta, C. (2007). La Cooperación Internacional en el Control, Erradicación y Prevención del Gusano Barrenador del Ganado. Recuperado el 3 de Febrero del 2014, de: http://www.rlc.fao.org/en/publications/la- cooperacion-internacional-en-el-control-erradicacion-y-prevencion-del- gusano-barrenador-del-ganado/
Bárcenas, A. (2010). Miasis por Gusano Barrenador del ganado Cochliomyia hominivorax. Tesis de Pregrado. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, México
Barcellos, C. (1980). Biologia, flutuacao populacional e patologia da" Cochliomya hominivorax"(Coquerel, 1858)(Diptera: Calliphoridae). Tesis de Doutorado. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.
53
Baumhover, A. (2002). A personal account of developing the sterile insect technique to eradicate the screwworm from Curacao, Florida and the southeastern United States. Florida Entomologist, 85(4), 666-673.
Benedito, O. (1992). Dinámica de equilibrio em populações experimentais de Cochliomyia macellaria (Diptera: Calliphoridae). Tese de Doutorado. Universidade Estadual de Campinas de São Paulo. Instituto de Biología, Sao Paulo, Brasil.
Byrd, J., & Castner, J. (Eds.). (2010). Insects of Forensic Importance. Forensic Entomology: the utility of arthropods in legal investigations (pp. 53). USA: CRC press.
Chico, M., Córdova, M., Calvopiña, M., & Guderian, R. (1994). Miasis Humana en el Ecuador. Rev Med Vozandes, 3(1): 101-06
Conti, I. (2001). Enfermedades emergentes y reemergentes en Uruguay. Rev Med Uruguay, 17:180-189.
COMEXA: Comisión México-Americana para la Erradicación del Gusano Barrenador del Ganado (2008). Manual de Identificación de Gusano Barrenador del Ganado Cochliomyia hominivorax (Coquerel) Díptera: Calliphoridae y su diferenciación de otras especies causantes de miasis. México. Recuperado el 20 de Marzo del 2014 de: http://www.flsart.org
COPEG: Comisión para la Erradicación y Prevención del Gusano Barrenador del Ganado (2014). Gusano Barrenador. Recuperado el 19 de Septiembre del 2014, de: http://www.copeg.org
CFSPH: The Center for Food Security Public Health. 2007. Miasis por el Gusano Barrenador. Recuperado el 8 de Agosto del 2013 de:
54
http://www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/es/miasis_por_el_gusano_bar renador.pdf
Dear, J. (1985). A revision of the new world Chrysomyini (Diptera: Calliphoridae). Revista Brasileira de Zoologia, 3(3), 109-169.
Dominguez, J., Cueva, J., Cusco, C., Rodríguez, R & Calvopiña, M.,(en prensa). Miasis orbital severa causada por Cochliomyia hominivorax en la región Andina de Ecuador do Valle, J. (1997). Analise da variabilidade genética de Cochliomya macellaria (Diptera: Calliphoridae): avaliação atraves do DNA mitocondrial e analise cariotipica. Universidade Estadual de Campinas de São Paulo. Tese de Mestre. Instituto de Biología, Universidad Estadual de Campinas, Sao Paulo, Brasil.
Echeverría, G., Mera, A., Carrillo, J., & Rodríguez, R. (2015). A new DNA extraction protocol for screwworm fly Cochliomyia species. (Diptera: Calliphoridae). Frontiers in Environmental Science, 2, 68.
FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y Agricultura (1993a). Manual Para el Control de la Mosca del Gusano Barrenador del Ganado - Cochliomyia hominivorax (Coquerel) (Vol. 1), Roma. Recuperado el 18 de Julio del 2013, de: http://www.fao.org/alc/file/media/pubs/1993/control_gbg_01.pdf
FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y Agricultura (1993b). Manual Para el Control de la Mosca del Gusano Barrenador del Ganado – Guía para la Identificación de las moscas del Género Cochliomyia (Díptera: Calliphoridae) (Vol. 2), Roma. Recuperado el 24 de Julio del 2013, de:http://www.rlc.fao.org/es/prioridades/transfron/miasis/pdf/doc2.pdf
55
Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution. 39: 783-791.
Figarola, J., Skoda, S., Berkebile, D., & Foster, J. (2001). Identification of screwworms, Cochliomyia hominivorax (Coquerel) (Diptera: Calliphoridae), with a monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay (MAb-ELISA). Veterinary parasitology, 102(4), 341-354.
Fonseca, J. (1999). Distribución y morfología de adultos e inmaduros de moscas califóridas (Diptera: Calliphoridae) de importancia forense en Costa Rica. Tesis de Pregrado. Universidad de Costa Rica. Facultad de Ciencias básicas. Escuela de Biología, Costa Rica.
Forero, E., Cortés, J., & Villamil, L. (2008). Problemática del Gusano Barrenador del Ganado, Cochliomyia hominivorax (Coquerel, 1858) en Colombia. Revista MVZ Córdoba, 13(2), pp. 1400-1414.
Forero, E., Cortés, J., & Villamil, L. (2007). Ecología y epidemiología del Gusano Barrenador del Ganado, Cochliomyia hominivorax (Coquerel, 1858). Revista de Medicina Veterinaria, (14), 37-49.
Florez, E., & Wolff, M. (2009). Descripción y clave de los estadios inmaduros de las principales especies de Calliphoridae (Diptera) de importancia forense en Colombia. Neotropical Entomology, 38(3), 418-429.
Fresia, P., Lanzzeri, S., Martínez, E., Carballo, M., Goñi, B., Cristina, J., & Gama, S. (2007). Primer análisis de la variabilidad del ADN mitocondrial de Cochliomyia hominivorax en animales domésticos del Uruguay. Sociedad de Medicina Veterinaria del Uruguay, 42(165-166), 9-13.
56
Fresia, P., Lyra, M., Coronado, A., & Azeredo-Espin, A. M. L., (2011).Genetic structure and demographic history of the New World Screwworm fly across its current geographic range. Journal of medical entomology, 48(2), 280-290.
Fresia, P., Azeredo-Espin, A. M. L., & Lyra, M. (2013). The Phylogeographic history of the new world screwworm fly, inferred by approximate Bayesian computation analysis. PloS one, 8(10), e76168.
Gennard, D. (2007). DNA identification of forensically important fly species. Forensic entomology (pp. 43-45). England :John Wiley & Sons.
Gennard, D. (2012). Forensic Entomology, DNA and entomotoxicology. Forensic entomology (pp. 12-13). England :John Wiley & Sons.
Golczer, G. & Arrivillaga, J. (2008). Modificación de un protocolo estándar de extracción de ADN para flebotominos pequeños (Phlebotominae: Lutzomyia). Revista Colombiana de Entomología 34 (2): 199-202.
GF – TADs: Global Framework for the Progressive Control of Transboundary Animal Diseases.(2007). Enfermedades Transfronterizas en las Américas. Recuperado el 15 de Marzo del 2014, de: http://www.rlc.fao.org/es/prioridades/transfron/gftads/webactividades.ht m.
Grella, M. (2011). Chave taxonômica interativa para espécies de dípteros califorídeos (Infraordem: Muscomorpha) do Brasil. Universidade Estadual de Campinas de São Paulo. Tese obtenção do título de Mestre em Parasitología.. Instituto de Biología, Universidad Estadual de Campinas, Sao Paulo, Brasil.
57
Guimarães, J. Papavero & Prado, A. (1983) As miiases na regiao neotropical (identificacao, biología, bibliografía). Rev Bras. Zool., 1, 239-416.
Guimarães J. & Papavero N. (1999) Myiasis in man and animals in the Neotropical Region. Bibliographic database. Editora Plêiade/Fapesp, São Paulo. 308p.
Hall, M. (1991). Screwworm flies as agents of wound myiasis. World animal review, special issue, New World screwworm: Response to an emergency, 8-17.
Infante Vargas, M. & Azeredo-Espin, A.M.L. (1995) Genetic variability in mitochondrial DNA of Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae) from Brazil. Biochemical Genetics, 33, 237-256.
Jervis, M. (2014). Dinámica poblacional del gusano barrenador del ganado (Cochliomyia hominivorax) en el periodo lluvioso de marzo a mayo, en el cantón los Bancos, provincia de Pichincha. (Tesis de Pregrado) Universidad Central del Ecuador, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Quito – Ecuador.
Koller, W., Barros, A., & Corrêa, E. (2011). Abundance and seasonality of Cochliomyia macellaria (Díptera: Calliphoridae) in Southern Pantanal, Brazil. Revista Brasileira de Parasitología Veterinaria, 20(1), 27-30.
Krafsur, E. (1998). Sterile insect technique for suppressing and eradicating insect population: 55 years and counting. Journal of Agricultural Entomology, 15(4), 303-317
58
LaChance, L. & Hopkins, D. (1962). Mutations in the screw - worm fly. Journal of Economic Entomology, 59(4), 877-880.
Lessinger, A. (1998) Análise do Genoma Mitocondrial de Dípteros causadores de miíases: Estructura, Funcão e perspectivas filogenéticas utilizando a região controle. Universidade Estadual de Campinas de São Paulo. Tese de Mestre. Instituto de Biología, Universidad Estadual de Campinas, Sao Paulo, Brasil.
Lessinger, A., Martins Junqueria, A., Lemos, T., Kemper, E., Da Silva, F., Vettore, A., & Azeredo- Espin, A. (2000). The mitocondrial genome of the primary screwworm fly Cochliomyia hominivorax (Díptera: Calliphoridae). Insect Molecular Biology. 9(5), 521-529
Litjens, P., Lessinger, A. & Azeredo Espin, A. (2001). Characterization of the screwworm flies Cochliomyia hominivorax and Cochliomyia macellaria by PCRRFLP of mitochondrial DNA. Med.Vet. EntornoI. 15: 183 — 188.
Lyra, M., Fresia, P., Gama, S., Cristina, J., Klaczko, L. B., & de Azeredo- Espin, A. M. L. (2005). Analysis of mitochondrial DNA variability and genetic structure in populations of New World screwworm flies (Diptera: Calliphoridae) from Uruguay. Journal of medical entomology, 42(4), 589-595.
Lyra, M. (2008). Variabilidade mitocondrial e morfológica em populações naturais da mosca da bicheira, Cochliomyia hominivorax. Tese de Doutorado. Universidade Estadual de Campinas de São Paulo. Instituto de Biología, Sao Paulo, Brasil.
59
Lyra, M., Klaczko, L. & Azeredo-Espin, A. M. L. (2009). Complex pattern of genetic distribution in populations of the New World screwworm fly revealed by mitochondrial DNA markers. Med. Vet. Entomol. 23: 32- 42.
McDonagh, L., García R., Stevens J. (2009). Phylogenetic analysis of New World screwworm fly, Cochliomyia hominivorax, suggests genetic isolation of some Caribbean island populations following colonization from South America. Journal compilation, The Royal Entomological Society. Medical and Veterinary Entomology 23 (Suppl. 1), 14–22
Maes, J., Peris, S., & Gonzalez, M., (1994). Catálogo de los Calliphoridae (Diptera) de Nicaragua. Revista Nicaraguense de Entomología León, 20, 15-20.
Mendes, S. (2009). Apostila Didática em Entomología Veterinaria. Universidade Federal Rural do semi-árido (pp. 18-20). Mossoró - Brasil
Miño, G., Falconí, F., and Vinueza, R. (2005). Estudio Sobre la Presencia de Miasis (Gusaneras) en las Ganaderías del Ecuador. Quito: SESA, MAG, COMEXA.
Moya, G. (2003). Erradicação ou manejo integrado das miíases neotropicais das Américas. Pesquisa Veterinária Brasileira, 23(3), 131-138.
NCBI: National Center for Biotechnology Information (2014) Taxonomy – Cochliomyia. Recuperado el 5 de Noviembre del 2014, de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=66360
OIE: Organización mundial de sanidad animal (2013). SCREWWORM (OLD WORLD AND NEW WORLD). Recuperado el 11 de Junio del 2013, de: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Animal_Health_in_the_World/do cs/pdf/Disease_cards/SCREWWORM.pdf
60
OIE: Organización mundial de sanidad animal (2014).Enfermedades, infecciones e infestaciones de la Lista de la OIE en vigor en 2014.Recuperado el 20 de Agosto del 2014, de: http://www.oie.int/es/sanidad-animal-en-el-mundo/enfermedades-de- la-lista-de-la-oie-2014/
OIE: Organización mundial de sanidad animal (2015). Zoonosis en seres humanos. Recuperado el 01 de enero del 2015, de: http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Countryinformation/Zoono ses
Ortiz, M. (2005). Evaluación de cuatro tipos de leche en la dieta larvaria de Cochliomyia hominivorax (coquerel). Universidad de la Salle. Tesis de Pregrado. Facultad de Medicina Veterinaria, Bogotá D.C.
Page, R., & Holmes, E. (2009). Molecular evolution: a phylogenetic approach. John Wiley & Sons.
Quiroz, H. (2003). Biología del Gusano Barrenador del Ganado. Imagen Veterinaria, 3(1), 11-13.
Roehrdanz, R. (1989) Intraspecific genetic variability in mitochondrial DNA of the screwworm fly (Cochliomyia hominivorax). Biochemical Genetics, 27, 551-569
Robinson, A., Vreysen, M., Hendrichs, J., & Feldmann, U. (2009). Enabling technologies to improve area‐wide integrated pest management programmes for the control of screwworms. Medical and Veterinary entomology, 23(s1), 1-7.
Rodríguez, H., Rojas, F., Álvarez, L., & Parra, A. (2011). Epidemiología y control de Cochliomyia hominivorax (Coquerel) gusano barrenador del ganado del nuevo mundo. In: H. Quiroz, J. Figueroa, F. Ibarra, M. López (Eds.), Epidemiología de enfermedades parasitarias en animales domésticos (pp. 403 – 416). México D.F. 61
Sadava, D., Heller, H., Orians, G., Purves, W., & Hillis, D. (2009). Vida la ciencia de la biología. Reconstrucción y uso de filogenias (pp. 542- 544). Ed. Médica Panamericana. USA
Simon, C., Frati, F., Beckenbach, A., Crespi, B., Liu, H., & Flook, P. (1994). Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the entomological Society of America, 87(6), 651- 701.
Skoda, S., Pornkulwat, S., & Foster, J. (2002). Random amplified polymorphic DNA markers for discriminating Cochliomyia hominivorax from C. macellaria (Diptera: Calliphoridae). Bulletin of entomological research, 92(01), 89-96.
Skoda S., Figarola, J., Pornkulwat, S. & Foster, J. (2012). Inter- and intraspecific identification of the screwworm, Cochliomyia hominivorax, using random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction. Journal of Insect Science, 13(1), 76.
Sperling, F, Anderson, G., & Hickey, D. (1994). A DNA-based approach to the identification of insect species used for postmortem interval estimation. Journal of Forensic Sciences, 39, 418-418.
Spradbery, J. (2002). A manual for the diagnosis of screw-worm fly. Commonwealth Department of Primary Industries and Energy (AGPS Press).
Spradbery, J. 1994. Screw-worm fly: A tale of two species. Agricultural Zoology Reviews 6:1.
Stevens, J. (2003) The evolution of myiasis in blowflies (Calliphoridae). Int. J. Parasitol. 33, 1105–1113
62
Swofford D. (2002). “Phylogenetic Analysis Using Parsimony”. PAUP version 4.010b. Sinauer Assoc., Inc., Sunderland, MA.
Taylor, D., & PETERSON, R. (1994). Population genetics and gene variation in primary and secondary screwworm (Diptera: Calliphoridae). Annals of the Entomological Society of America, 87(5), 626-633.
Taylor, D., Szalanski, A., & Peterson, R. (1996). Identification of screwworm species by polymerase chain reaction‐restriction fragment length polymorphism. Medical and veterinary entomology, 10(1), 63-70.
Toledo, C. (2007). Caracterización Molecular de 6 cepas del gusano barrenador del ganado Cochliomyia hominivorax (Coquerel) y de la especie Cochlíomyia macellaria (Fabricius) (Diptera: Calliphoridae). Tesis de Maestría: Panamá: Programa Centroamericano de Maestría en Entomología, Universidad de Panamá.
Torres, T., & Azeredo - Espin, A. M. L. (2009). Population genetics of New World screwworm from the Caribbean: insights from microsatellite data. Medical and veterinary entomology, 23(s1), 23-31.
Touré, M. (1994). Les myiases d’importance économique. Rev Sci Tech Off Int Epiz, 13(4), 1053-1073.
Kress, J., & Erickson, L. (2012). DNA barcodes: Methods and protocols (pp. 3-8). Humana Press.
Valviesse, V., Ferraz, A., Proença, B., Novaes, G., Magalhães, V., & Santos, C. (2014). Míiase com exposição de calota craniana causada pela associação de Cochliomyia hominivorax (Coquerel, 1858), Cochliomyia macellaria (Fabricius, 1775) e Chrysomya albiceps (Wiedemann, 1819),(Diptera: Calliphoridae) em um paciente atendido em Hospital Públ. Entomotropica, 29(3), 191-196.
63
Van der Vloedt, A., Butt, B. (1990). Programa de erradicación del gusano barrenador del Nuevo Mundo en el norte de África. Recuperado el 12 de Agosto del 2013, de: http://www.iaea.org/Publications/Magazines/Bulletin/Bull324/Spanish/3 2406483541_es.pdf
Vinuesa, M. D. L. Á., (2004). Estudios filogenéticos en la familia" Mycocaliciaceae"(mycocaliciales, ascomycota) Tesis Doctoral dissertation, Universidad Complutense de Madrid, España.
Wall, R., & Shearer, D. (2001). Adult flies (Diptera). In:Veterinary Ectoparasites: biology, pathology and control. Second Edition.(pp 83 – 113) United Kingdom:Blackwell Science Ltd.
Wallman, J., Leys, R., & Hogendoorn, K. (2005) Molecular systematics of Australian carrion-breeding blowflies (Diptera: Calliphoridae) based on mitochondrial DNA. Invert. Syst. 19, 1–15
Whitworth, T. (2006). Keys to the genera and species of blow flies (Diptera: Calliphoridae) of America north of Mexico. Proceedings of the Entomological Society of Washington, 108(3), 689-725.
Whitworth, T. (2010). Keys to the genera and species of blow flies (Diptera: Calliphoridae) of the West Indies and description of a new species of Lucilia Robineau-Desvoidy. Zootaxa, 2663, 1-35
64
Anexos Anexo A: Claves dicotómicas
Clave de identificación de las larvas en las especies de Cochliomyia (FAO,1993)
1. Larva pequeña (1,2-3,6 mm); estigmas posteriores (Fig. 15) con dos orificios pequeños, más o menos ovales, que con frecuencia se unen en el borde ventral interno en forma de V; peritrema no manifiesto; sin estigmas anteriores. Larva de la primera etapa, 2
- Larva más grande ( > 3,5 mm); estigmas posteriores (Fig. 1 5) con dos o tres hendiduras diferenciales, no unidas, rodeadas en parte por un peritreina; estigmas anteriores presentes, uno a cada lado del borde posterior del segundo segmento. Larva de la segunda o la tercera etapa, 3
2. Esqueleto cefalofáringeo no robusto, con un esclerito dorsofaríngeo pequeño; espinas más largas de unas 20,a de longitud, y en general con una Pigmentación intensa (Figs. 6, 7a) hominivorax
- Esqueleto cefalofaríngeo más robusto, con un esclerito dorsofaríngeo prominente; espinas más largas de unas 6 µ de longitud, y en general poco pigmentados (Fig. 7b) macellaria
3. Estigmas posteriores con dos hendiduras (Fig. 15). Larva de la segunda etapa, 4
- Estigma posteriores con tres hendiduras (Fig. 15). Larva de la tercera etapa, 5
4. Troncos traqueales dorsales que salen de los estigmas posteriores con una pigmentación oscura desde la unión con los estigmas hacia adelante hasta
65
llegar a un punto entre la mitad y los dos tercios del último segmento; espinas más largas de unas 55µ de longitud; estigmas anteriores normalmente con 7-9 ramas; margen posterior del segmento 11 con una banda de espinas formando un círculo completo, y margen posterior del segmento 10 con espinas en las superficies lateral y ventral solamente (Figs. 8, 9a, 10a). hominivorax
- Troncos traqueales dorsales no tan pigmentados; espinas más largas de unas 20µ de longitud; estigmas anteriores normalmente con 9-11 ramas; margen posterior de los segmentos sin espinas, excepto en las superficies venérales (Figs. 9b, 10b). macellaria
5. Troncos traqueales dorsales que salen de los estigmas posteriores con una pigmentación oscura desde la unión con los estigmas hacia adelante hasta el segmento 10 o el 9; espinas comparativamente grandes (las más largas de 130µ de longitud), con 1 a 3 puntas, normalmente 1 ó 2; cuando las espinas tienen dos puntas, están próximas entre sí y tienen los extremos más puntiagudos; estigmas anteriores con 6-11 (normalmente 7-9) ramas (Figs. 11, 12a,13a). hominivorax
- Troncos traqueales dorsales sólo pigmentados en el punto de unión con los estigmas posteriores, en la cuarta parte de atrás del último segmento; espinas comparativamente pequeñas (las más largas de 80,u de longitud), con 1-4 dientes, normalmente 2; cuando Lu espinas tienen 2 dientes, están bastante separados entre sí y tienen el extremo redondeado; estigmas anteriores con 8-12 (normalmente 9-1 1) ramas (Figs. 12b, 13b). macellaria
66
Clave de identificación de los adultos de las especies de Cochliomyia (FAO,1993)
1. Parte anterior superior de las genas con pocas o numerosas sedas negras cortas; quinto tergo de color cobrizo, al contrario de los anteriores; líneas torácicas prolongadas sobre el scutellum (Figs. 17, 18). 2
Genas con sedas totalmente amarillas; quinto tergo del mismo color que los anteriores; líneas torácicas no prolongadas sobre el scutellum (Figs. 17,18). 3
2. Quinto tergo de coloración uniforme; parafaciales de coloración amarilla; occipucio solo con pelos de color claro; machos con un par de sedas orbitales inclinadas hacia adelante al nivel del ocelo anterior (Figs. 17, 18). mínima
Quinto tergo con un par de manchas dorsales plateadas; parafaciales de color plateado; occipucio con pocas o numerosas sedas encima; macho sin sedas orbitales (Figs. 17, 18). aldrichi
3. Placas fronto-orbitales con sedas negras; sedas postgenales (barba) de color amarillo dorado; quinto tergo (= cuarto visible) sólo con una coloración lateral muy ligera; basicosta de la hembra de color entre pardo oscuro y casi negro; en las hembras, región postvértex del occipucio normalmente de color entre anaranjado rojizo y pardo; línea oscura central del tórax prolongada sólo hasta ligeramente por delante de la sutura mesonotal (Figs. 17,18). hominivorax
Placas fronto-orbitales con pelos de color claro (pero las inserciones aparecen con puntos negros); sedas postgenales (barba) amarillas, no de color amarillo dorado; quinto tergo (= cuarto visible) con una coloración blanca densa y un par de manchas plateadas laterales diferenciadas; basocosta de la hembra de color amarillos en la hembra; línea oscura central del tórax prolongada hasta muy por delante de la sutura mesonotal (Figs. 17, 18). macellaria
67
Figura 6. Vista lateral de una larva de la primera etapa de Cochliomyia hominivorax (según Laake et al., 1936).
Figura 7. Esqueleto cefalofaríngeo de la larvas de la primera etapa de Cochliomyia: a C.hominivorax; b - C. macellayia (según Laake et aL, 1936); (d, esclerito dorsofaríngeo).
Figura 8. Vista lateral de una larva de la segunda etapa de Cochliomyia hominivorax (según Laake et al., 1936)
Figura 9. Esqueleto cefalofaríngeo de larva de la segunda etapa de Cochliomyia: a - C.hominivorax; b - C. macellaria (según Laake et aL,,1936).
68
Figura 10. Aspecto dorsal de los segmentos posteriores de las larvas de la segunda etapa de Cochlíomyia: a - C. hominivorax, mostrando la pigmentación de los troncos traqueales dorsales a través de la cutícula de un ejemplar conservado en alcohol; b - C. macellaria, mostrando la ausencia de dicha pigmentación.
Figura 11. Vista lateral de una larva de la tercera etapa de Cochliomyia hominivorax (a, estigmas anteriores; 1, zona fusiforme lateral; m, gancho oral; s, espinas; 1-12, segmentos). (Según Laake et al., 1936).
Figura 12. Esqueleto cefalofaríngeo de larvas de la tercera etapa de Cochliomyia: a - C. hominivorax; b – C. macellaria (según Laake et al., 1936).
69
Figura 13. Aspecto dorsal de los segmentos posteriores de las larvas de la tercera etapa de Cochliomya: a - C. hominivorax, mostrando los troncos traqueales dorsales con una pigmentación oscura visible a través de la cutícula (puede ser necesaria la disección de larvas conservadas para separar el tejido graso opaco); b C. macellaria, mostrando la pigmentación sólo en el punto de unión de los troncos traqueales con los estigmas posteriores (según Laakee et al., 1936).
Figura 17. Vista lateral y frontal de la cabeza de una mosca calif6rida típica (f, placa frontoorbital; g, gena; oc, ocelo; op, occipucio; pg, postgena; pf, parafacial; v, vértex).
Figura 18. Detalles de un adulto de Cohliomyia: a - adulto de C. hominivorax y detalle de la base del ala (b, basicosta; m, sutura mesonotal; s, scutellum); b - adulto de C. macellaria, mostrando las franjas torácicas (según Laake et al., 1936 y Spradbery, 1991).
70
Anexo B: Cuantificación del ADN
25 47C 144,7 Concentración N° Código ng/ul 26 48C 128,7
1 1C 204,5 27 49C 126,6
2 2C 162,8 28 50C 153,9
3 3C 156 29 51C 194,9
4 4C 120,7 30 52C 213,4
5 5C 141,9 31 54C 175,3
6 6C 184,8 32 55C 174,2
7 7C 240,1 33 56C 202,9
8 8C 217,7 34 57C 199,5
9 9C 140,3 35 58C 201,2
10 10C 100,5 36 59C 156,2
11 31C 154 37 60C 164,3
12 32C 190,9 38 61C 167
13 33C 223,7 39 62C 131,6
14 34C 162,9 40 63C 120,1
15 35C 218,7 41 64C 138
16 36C 160,2 42 65C 147,5
17 37C 169,1 43 66C 150,5
18 38C 131,6 44 67C 155,5
19 39C 144 45 68C 155,7
20 40C 125,8 46 69C 151,2
21 41C 186,7 47 70C 183,1
22 42C 188,8 48 100C 158
23 45C 187,9
24 46C 207,5
71
Anexo C: Listado de las muestras utilizadas para realizar los árboles filogenéticos
Secuenciación Dato de N° Código Procedencia Captura COI 12S
San Miguel de los Animal 1 1C SNU SNU Bancos Vivo- oreja
San Miguel de los 2 2C Animal Vivo SNU SNU Bancos
3 3C Saloya Animal Vivo SNU SNU
4 4C Quito(Valles) Animal Vivo SNU SNU
5 5C Quito(Tumbaco) Animal Vivo SNU SNU
San Miguel de los 6 6C Trampa SU SU Bancos
San Miguel de los 7 7C Trampa SU SNU Bancos
San Miguel de los 8 8C Trampa SU SU Bancos
San Miguel de los Cadáver 9 9C SU SU Bancos lab.
San Miguel de los Cadáver 10 10C SU SU Bancos lab.
11 31C Quito (Tumbaco) Animal Vivo SNU SNU
12 32C Quito (Tumbaco) Animal Vivo SNU SNU
San Miguel de los 13 33C Trampa SU SU Bancos
San Miguel de los 14 34C Trampa SNU SNU Bancos
San Miguel de los 15 35C Trampa SU SU Bancos
16 36C SU SU San Miguel de los Cadáver
72
Bancos lab.
San Miguel de los Cadáver 17 37C SU SU Bancos lab.
San Miguel de los Cadáver 18 38C SU SU Bancos lab.
San Miguel de los Cadáver 19 39C SU SU Bancos lab.
San Miguel de los Cadáver 20 40C SU SU Bancos lab.
San Miguel de los Cadáver- 21 41C SU SU Bancos armadillo
San Miguel de los Cadáver- 22 42C SU SU Bancos armadillo
San Miguel de los 23 45C Trampa SU SU Bancos
24 46C Saloya Animal Vivo SNU SNU
25 47C Saloya Animal Vivo SU SU
26 48C Saloya Animal Vivo SU SU
27 49C Saloya Animal Vivo SU SU
San Miguel de los 28 50C Cadáver SU SU Bancos
29 51C Saloya Trampa SU SU
San Miguel de los 30 52C Cadáver SNU SNU Bancos
San Miguel de los 31 54C Cadáver SU SNU Bancos
San Miguel de los 32 55C Cadáver SU SU Bancos
San Miguel de los 33 56C Cadáver SU SNU Bancos
34 57C Saloya Cadáver SU SU
73
35 58C Saloya Cadáver SU SU
36 59C Saloya Cadáver SU SU
37 60C Saloya Cadáver SU SU
San Miguel de los Animal 38 61C SU SU Bancos Vivo- oreja
San Miguel de los 39 62C Animal Vivo SNU SNU Bancos
San Miguel de los 40 63C Animal Vivo SU SU Bancos
41 64C Saloya Animal Vivo SU SU
42 65C Saloya Animal Vivo SU SU
43 66C Quito (Valles) Animal Vivo SNU SNU
44 67C Quito (Valles) Animal Vivo SNU SNU
45 68C Saloya Cadáver SU SU
46 69C Saloya Cadáver SU SU
San Miguel de los 47 70C Cadáver SU SU Bancos
48 100C Guayaquil/Guayas Animal Vivo SNU SNU
SNU, secuencia no utilizada; SU, secuencia utilizada
74
Anexo D: Identificación de secuencias de COI y 12S ARNr mediante BLAST.
BLASTn COI BLASTn 12S Código de AC Secuencia Identidad (%) AC Secuencia Identidad (%) muestra 6C JQ246666 C. macellaria mitocondrial 98% FM8677 C. hominivorax 99% cox I 39 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 94% FM8677 C.hominivorax 99% cox I 41 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 93% FJ0253 Compsomyiops 98% mitocondrial cox I 69 fulvicrura 12S rRNA 7C KC602452 C. macellaria mitocondrial 99% - - - cox I HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 95% - - - cox I HM185549 C. hominivorax haplotype COI 56 94% - - - 8C KC602453 C. macellaria haplotype COI 99% FM8677 C. hominivorax 99% 39 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 95% FM8664 C. hominivorax 99% cox I 04 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 93% FJ0253 Chrysomya 98 mitocondrial cox I 66 megacephala 12S % rRNA 9C, KC617815 C. macellaria mitocondrial cox I 96% FM8664 C.hominivorax 95% 10C,36C,37C 04 12S rRNA ,38C,39C,40 HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 92% FM8677 C.hominivorax 95% C cox I 41 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 91% FM8677 C.hominivorax 95% mitocondrial cox I 38 12S rRNA 33C KC617815 C. macellaria mitocondrial cox I 99% FM8677 C. hominivorax 99% 41 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 94% FM8677 C. hominivorax 98% cox I 39 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 92% GQ4090 Chrysomya 97% mitocondrial cox I 60 rufifacies 12S rRNA 35C KC602453 C. macellaria haplotype COI 98% FM8677 C. hominivorax 99% 39 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 94% FM8677 C. hominivorax 99% cox I 34 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 93% FJ0253 Chrysomya 98 mitocondrial cox I 66 megacephala 12S % rRNA 41C KC568262 C. macellaria mitocondrial cox I 98% FM8677 C. hominivorax 99% 39 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 93% FM8664 C. hominivorax 99% cox I 04 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 92% FJ0253 Calliphora 97% mitocondrial cox I 65 vomitoria 12S rRNA 45C JQ246666 C. macellaria mitocondrial 96% FM8677 C. hominivorax 99% cox I 39 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 93% FM8677 C. hominivorax 99% cox I 34 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 92% FJ0253 Chrysomya 98 mitocondrial cox I 66 megacephala 12S % rRNA 47C HM185533 C. hominivorax haplotype COI 40 88% FM8677 C. hominivorax 99% 39 12S rRNA KC602448 C. hominivorax haplotype COI 90 88% FM8677 C.hominivorax 99% 40 12S rRNA HM185565 C. hominivorax haplotype COI 74 87% FJ0253 Compsomyiops 98 69 fulvicrura 12S % rRNA 75
48C,49C HM185513 C. hominivorax haplotype COI 16 89% FM8677 C.hominivorax 100% 41 12S rRNA
HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 89% FM8677 C.hominivorax 100% cox I 38 12S rRNA JN571556 Chrysomya megacephala 88% FM8677 C. hominivorax 99% COI 39 12S rRNA 50C KC602453 C. macellaria haplotype COI 99% FM8677 C.hominivorax 97% 40 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 95% FM8677 C. hominivorax 97% cox I 39 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 94% FJ0253 Chrysomya 95 mitocondrial cox I 66 megacephala 12S % rRNA 51C KC617815 C. macellaria mitocondrial 96% FM8677 C. hominivorax 99% cox I 39 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 93% FM8677 C.hominivorax 99% cox I 40 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 92% FJ0253 Compsomyiops 98 mitocondrial cox I 69 fulvicrura 12S % rRNA 54C JQ246666 C. macellaria mitocondrial 99% No cox I amplific o HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 95% No cox I amplific o AF295549 Compsomyiops callipes 94% No mitocondrial cox I amplific o 55C KC602452 C. macellaria mitocondrial 99% FM8677 C.hominivorax 95% cox I 09 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 95% FM8677 C.hominivorax 95% cox I 18 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 94% FJ0253 Compsomyiops 92 mitocondrial cox I 69 fulvicrura 12S % rRNA 56C JQ246666 C. macellaria mitocondrial 96% No cox I amplific o HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 93% No cox I amplific o AF295549 Compsomyiops callipes 91% No mitocondrial cox I amplific o 57C JQ246666 C. macellaria mitocondrial 99% FM8677 C. hominivorax 99% cox I 39 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 96% FM8677 C.hominivorax 99% cox I 40 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 95% FJ0253 Compsomyiops 96 mitocondrial cox I 69 fulvicrura 12S % rRNA 58C JQ246666 C. macellaria mitocondrial 99% FM8677 C. hominivorax 99% cox I 39 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 96% FM8664 C. hominivorax 99% cox I 04 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 94% FJ0253 Chrysomya 98 mitocondrial cox I 66 megacephala 12S % rRNA 59C JQ246666 C. macellaria mitocondrial 99% FM8677 C. hominivorax 99% cox I 39 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 96% FM8677 C.hominivorax 99% cox I 41 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 94% FJ0253 Compsomyiops 96 mitocondrial cox I 69 fulvicrura 12S % rRNA 60C JQ246666 C. macellaria mitocondrial 97% FM8677 C. hominivorax 99% 76
cox I 39 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 94% FM8664 C. hominivorax 99% cox I 04 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 92% FJ0253 Chrysomya 98 mitocondrial cox I 66 megacephala 12S % rRNA 61C KC568262 C. macellaria mitocondrial cox I 100% FM8677 C. hominivorax 99% 39 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 97% FM8677 C.hominivorax 99% cox I 41 12S rRNA HM185528 C. hominivorax haplotype COI 35 95% FJ0253 Compsomyiops 98 69 fulvicrura 12S % rRNA 63 C HM185533 C. hominivorax haplotype COI 40 91% FM8677 C. hominivorax 99% 39 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 91% FM8664 C. hominivorax 99% cox I 04 12S rRNA HM185549 C. hominivorax haplotype COI 56 91% FJ0253 Chrysomya 98 66 megacephala 12S % rRNA 64C HM185533 C. hominivorax haplotype COI 40 90% FM8677 C. hominivorax 99% 39 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 90% FM8664 C. hominivorax 99% cox I 04 12S rRNA HM185549 C. hominivorax haplotype COI 56 90% FJ0253 Chrysomya 98 66 megacephala 12S % rRNA 65C HM185533 C. hominivorax haplotype COI 40 91% FM8677 C. hominivorax 99% 39 12S rRNA HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 91% FM8677 C.hominivorax 99% cox I 41 12S rRNA KC602448 C. hominivorax haplotype COI 90 90% FJ0253 Compsomyiops 98 69 fulvicrura 12S % rRNA 68C JQ246666 C. macellaria mitocondrial 98% FM8677 C. hominivorax 98% cox I 39 12S rRNA
HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 94% FM8677 C.hominivorax 98% cox I 41 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 93% GQ4090 Chrysomya 97% mitocondrial cox I 60 rufifacies 12S rRNA 69C JQ246666 C. macellaria mitocondrial 97% FM8677 C. hominivorax 99% cox I 39 12S rRNA
HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 94% FM8677 C.hominivorax 99% cox I 41 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 93% FJ0253 Chrysomya 98 mitocondrial cox I 66 megacephala 12S % rRNA 70C JQ246666 C. macellaria mitocondrial 97% FM8677 C. hominivorax 99% cox I 34 12S rRNA
HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial 94% FM8677 C. hominivorax 99% cox I 39 12S rRNA AF295549 Compsomyiops callipes 93% FJ0253 Compsomyiops 98% mitocondrial cox I 69 fulvicrura 12S % rRNA
77
Anexo E: Secuencias externas tomadas de NCBI utilizadas en filogenia.
Calliphoridae Origen Número de acceso a NCBI
COI 12S
Chrysomya rufifacies - DQ647357 GQ409060
Chrysomya albiceps - HE814061 -
Chrysomya bezziana - JQ246660 -
Paralucilia pseudolyrcea - HM639978 -
Phormia Regina - KF908078 AF262957
Protophormia terranovae - KF919047 -
Lucilia sericata - JX295738 -
Hemypirellia fergusoni - DQ647329 -
Calliphora vomitora - KF919010 FJ025365
Hemilucilia segmentaria - JQ246667 -
Compsomyios fulvicrura - FJ025607 FJ025369
Cochliomyia hominivorax Colimes HM185551 -
Cochliomyia hominivorax Atacames HM185569 -
Cochliomyia hominivorax Venezuela - Colombia HM185515 -
Cochliomyia hominivorax Brasil- Paraguay- Uruguay HM185564 -
Cochliomyia hominivorax Chone HM185499 -
Cochliomyia hominivorax Guayas - FM867728
Cochliomyia hominivorax Esmeraldas - FM867727
Cochliomyia macellaria - KC602452
Cochliomyia macellaria - KC602453
Cochliomyia macellaria Colombia KC568262
Cochliomyia macellaria Colombia KC568263
Cochliomyia macellaria - KC568264
Cochliomyia macellaria - JQ246666
Cochliomyia macellaria - KC617815
Cochliomyia macellaria - -
78
79
80