UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS-UFAM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIODIVERSIDADE E BIOTECNOLOGIA DA REDE BIONORTE Maria Dolores Pinheiro Fonseca ESTUDO DA DIVERSIDADE E ATIVIDADE LARVICIDA DE AGARICOMYCETES LIGNOLÍTICOS (BASIDIOMYCOTA) NO ESTADO DO AMAZONAS Manaus Maio/2016 Maria Dolores Pinheiro Fonseca ESTUDO DA DIVERSIDADE E ATIVIDADE LARVICIDA DE AGARICOMYCETES LIGNOLÍTICOS (BASIDIOMYCOTA) NO ESTADO DO AMAZONAS Tese de doutorado apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Rede BIONORTE, na Universidade Federal do Amazonas, como requisito para a obtenção do Título de Doutor em Biodiversidade e Conservação. Orientador: Prof. Dr. João Lúcio de Azevedo- ESALQ Co-Orientadora: Profa. Dra. Antonia Queiroz de Lima Souza-UFAM Co-Orientadora: Profa. Dra. Tatiana Baphista Gibertoni-UFPE Manaus Maio/2016 Co-orientadora: Profa.Dra. Tatiana Baphista Gibertoni Lista de Figuras Figura 1: Mapa do estado do Amazonas e seus possui 62 municípios, nos quais 12 foram 29 visitados para coleta. Fonte: www.guiageo.com/amazonas.htm. Figura 2: Punctularia sp. Aspecto macroscópico do (A) Basidioma, (B) da superfície 47 himenial foram coletados espécimes no minicipio de Borba, Manicoré, Coari e Nova Olinda do Norte. Cultura pura cultivada em meio BDL (Batata, Dextrose, Extrato de Levedura), (C) 5 dias de crescimento, (D) 10 dias de crescimento no escuro a 28 ºC. Figura 3: Daedaleopsis flavida. Aspecto macroscópico do (A) Basidioma, (B) da superfície 47 himenial espécime coletado no minicipio de Parintins. Cultura pura cultivada em meio BDL (Batata, Dextrose, Extrato de Levedura), (C) 10 dias de crescimento, (D) 20 dias de crescimento no escuro a 28 ºC. Figura 4: Schizophyllum commune. Aspecto macroscópico do (A) Basidioma, (B) da 48 superfície himenial espécime coletados nos minicipio de Coari-Am, Careiro da Várzea, Anamã, Autazes, Parintins, Borba, Barcelos, Nova Olinda do Norte, Manaus, Manicoré, Novo Aripuanã. Cultura pura cultivada em meio BDL (Batata, Dextrose, Extrato de Levedura), (C) 15 dias de crescimento, (D) 30 dias de crescimento no escuro a 28 ºC (formou corpo de frutificação (Basidioma). Figura 5: Pycnoporus sanguineus. Aspecto macroscópico do (A) Basidioma, (B) da 48 superfície himenial espécime coletados nos minicipios de Anamã, Autazes, Borba, Manaus BR 174, Coari, Manicoré, Nova Olinda do Norte, Novo Aripuanã, Parintins, Barcelos e Presidente Figueiredo. Cultura pura cultivada em meio BDL (Batata, Dextrose, Extrato de Levedura), (C) 10 dias de crescimento, (D) 20 dias de crescimento no escuro a 28 ºC. Figura 6: Perfil eletroforético em gel agarose 0,8% corado com gel red da extração de DNA 49 das amostras de Agaricomycetes. Poço 1-Marcador molecular de 1Kb, os seguintes, as demais amostras. Figura 7: Reconstrução filogenética da família Polyporacea a partir do alinhamento dos 53 nucleotídeos relativos aos fragmentos da região ITS (rDNA). Valores de bootstrap foram gerados a partir do método de Máxima Verossimilhança (1.000.000 bootstrap). Duas sequências da espécie (Boletopsis leucomelaena e Hydnellum geogenium) foram utilizados como grupo externo. Em negrito, apresentam-se as sequências obtidas neste trabalho. Figura 8: Reconstrução filogenética da família Ganodermataceae a partir do alinhamento 56 dos nucleotídeos relativos aos fragmentos da região ITS (rDNA). Valores de bootstrap foram gerados a partir do método de Máxima Verossimilhança (1.000.000 bootstrap). Três sequências da espécie (Perenniporia medulla-panis) foram utilizadas como grupo externo. Em negrito, apresentam-se as sequências obtidas neste trabalho. Figura 9: Reconstrução filogenética da família Fomitopsidaceae a partir do alinhamento 57 dos nucleotídeos relativos aos fragmentos da região ITS (rDNA). Valores de bootstrap foram gerados a partir do método de Máxima Verossimilhança (1.000.000 bootstrap). Duas sequências da espécie (Trametes versicolor) foram utilizadas como grupo externo. Em negrito, apresentam-se as sequências obtidas neste trabalho. Figura 10: Reconstrução filogenética da família Stereaceae a partir do alinhamento dos 58 nucleotídeos relativos aos fragmentos da região ITS (rDNA). Valores de bootstrap foram gerados a partir do método de Máxima Verossimilhança (1.000.000 bootstrap). Duas sequências das espécies (Laxitextum incrustatum e Laxitextum bicolor) foram utilizadas como grupo externo. Em negrito, apresentam-se a sequência obtidas neste trabalho. Figura 11: Reconstrução filogenética da família Meruliaceae a partir do alinhamento dos 59 nucleotídeos relativos aos fragmentos da região ITS (rDNA). Valores de bootstrap foram gerados a partir do método de Máxima Verossimilhança (1.000.000 bootstrap). Duas sequências da espécie (Trametes versicolor) foram utilizadas como grupo externo. Em negrito, apresentam-se as sequências obtidas neste trabalho. Figura 12: Reconstrução filogenética da família Pleurotaceae a partir do alinhamento dos 60 nucleotídeos relativos aos fragmentos da região Its (rDNA). Valores de bootstrap foram gerados a partir do método de Máxima Verossimilhança (1.000.000 bootstrap). Sequência da espécie de Trametes versicolor foi utilizada como grupo externo. Em negrito, apresentam-se as sequências obtidas neste trabalho. Figura 13: Reconstrução filogenética de Sebipora pertencente a ordem Polyporales a partir 61 do alinhamento dos nucleotídeos relativos aos fragmentos da região Its (rDNA). Valores de bootstrap foram gerados a partir do método de Máxima Verossimilhança (1.000.000 bootstrap). Duas sequências da espécie (Trametes versicolor) foram utilizadas como grupo externo. Em negrito, apresenta-se a sequência obtida neste trabalho. Figura 14: Reconstrução filogenética da família Schizophyllaceae a partir do alinhamento 62 dos nucleotídeos relativos aos fragmentos da região Its (rDNA). Valores de bootstrap foram gerados a partir do método de Máxima Verossimilhança (1.000.000 bootstrap). Sequência da espécie de Trametes versicolor foi utilizada como grupo externo. Em negrito, apresentam-se as sequências obtidas neste trabalho. Figura 15: Dendograma por espectrometria de massa, MALDI-TOF de Agaricomycetes 64 isolados no Estado do Amazonas, adquiridos com uma matriz DHB em escala de massa de peptídeo até m/z 2000. Figura 16: Apresenta os espectros de massa analisados por MALDI-TOF das amostras dos 65 Agaricomycetes. O último espectro de cor amarela indica a amostra controle de Escherichia coli. Figura 17: Exemplo de uma análise da espectrometria de massa dos peptídeos que formam 66 uma escala de massa de compostos da espécie Trametes elegans D030 com T. elegans D078. Os picos (íons) detectados são destacados em azul e amarelo. Considerando que os picos mais elevados indicam a correspondência de posições de pico entre ambas as espécies nos espectros. Figura 18: Regressão linear dose-probit da mortalidade das larvas de Aedes aegypti 71 observados em bioensaios com extratos oriundos do micélio de Agaricomycetes sendo A=24 horas de observação e B=48horas de observação gráficas dos resultados de dose/resposta no intervalo de 24 horas com valores de Probit dos extratos oriundos do micélio de Agaricomycetes contra larvas de 3º estádio de A. aegypti. Lista de Tabelas Tabela 1: Cálculo da reação de amplificação do PCR para as amostras fúngicas. 34 Tabela 2: Quantidade de espécimes táxon e família identificados, coletados nos municípios de Autazes; Anamã; Careiro da várzea; Coari; Barcelos; Borba; Novo 41 Aripuanã; Nova Olinda do Norte; Manaus; Manicoré; Parintins e Presidente Figueiredo. As novas ocorrências no estado, as ocorrências para o norte do país e literaturas consultadas. Tabela 3: Culturas puras dos Agaricomycetes oriundas dos isolados e breve descrição 46 morfológica das colônias. Tabela 4: Lista de espécies de Agaricomycetes isolados e oriundas do GenBank utilizadas 50 na análise molecular para construção das árvores filogenéticas a partir do método de máxima verossimilhança (ML). Tabela 5: Código e nome científico dos extratos fúngicos promissores para o controle de 68 larvas, selecionados os que apresentaram melhores resultados de mortalidades controle de larvas de A. aegypti, utilizados nos bioensaios. Tabela 6: Porcentagens de mortalidade observados nos bioensaios utilizando os extratos 69 miceliais fúngicos contra larvas de A. aegypti (cepa Rockfeller). Tabela 7: Concentração letal de extratos de fungos encontradas em testes com larvas de 71 Aedes aegypti. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 10 2 JUSTIFICATIVA 13 3 OBJETIVOS 14 3. 1 Geral 14 3. 2 Específicos 14 4 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 15 4. 1 Estado do Amazonas 15 4. 2 Principais Características dos Agaricomycetes Lignolíticos 15 4. 3 Ecologia dos Agaricomycetes Lignolíticos 17 4. 4 Importância Econômica de Agaricomycetes Lignolíticos 18 4. 5 Ocorrências de Agaricomycetes na Região Norte - Amazônia 19 4. 6 Aedes aegypti Linnaeus, 1762 20 4. 6. 1 Ecologia e Biologia do Vetor 20 4 6 2 Dengue, Chikungunya e Zika 22 4. 7 Dengue, Chikungunya e Zika em Manaus –Amazonas 23 4. 8 Controle de Vetores 24 4. 9 Importância dos Extratos Fúngicos: Larvicidas 26 5 METODOLOGIA 28 5. 1 Áreas de Coleta e Procedimentos 28 5. 2 Identificação Taxonômica Clássica 29 5 3 Preparo dos Cultivos 30 5 3 1 Produção de Metabólitos Extrato Fúngico 30 5 3 2 Preparos de Culturas para Extração de DNA 31 5 4 Identificação Taxonômica Molecular 31 5 4 1 Extração de DNA 31 5 4 2 Quantificações do DNA 32 5 4 3 Purificação e Sequenciamento do DNA por PCR ExoSAP 33 5 4 4 Identificação Molecular 33 5 5 Identificação pela Técnica de MALDI-TOF Espectrometria de Massa 34 5