Carrion Zavaleta Terecita Elizabeth

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

BIOQUIMICA Tesis II Y

Actividad antibiótica y antioxidante de fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides FARMACIA PARA OPTAR EL GRADO DE BACHILLER EN DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

AUTORA: CARRION ZAVALETA, Terecita Elizabeth BIBLIOTECA

ASESOR: Mg. GANOZA YUPANQUI, Mayar Luis

TRUJILLO – PERÚ

2019

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

DEDICATORIA

A Dios, por ser la fuente de energía infinita y equilibrio en la naturaleza, aquella

motivación en momentos de mayor dificultad.

A mi madre la Sra. Eva Dorliza Zavaleta Rodríguez, por su amor, trabajo y sacrificio

en todos estos años, gracias a ti he logrado llegar hasta aquí́ y convertirme en lo que

soy.

A toda mi familia en especial a mi abuelita Teresa porqueBIOQUIMICA con sus oraciones, consejos Y y palabras de aliento hicieron de mí una mejor persona y de una u otra forma me

acompañan en todos mis sueños y metas.

FARMACIA A todo el equipo de investigación DEde la Facultad de Farmacia y Bioquímica porque con ellos aprendí el trabajo en equipo y me ayudaron a desenvolverme más en el campo

profesional de la carrera

BIBLIOTECA A mis amigos de la universidad y al grandioso grupo humano de investigación que sea

formado en el año 2018, gracias a su apoyo trabaje con empeño, dedicación y cariño, y

a todos quienes contribuyeron con un granito de arena para culminar con éxito la meta

propuesta.

Terecita Elizabeth Carrión Zavaleta

AGRADECIMIENTO

Quiero expresar mi más grande y sincero agradecimiento a mi asesor el profesor Mayer

Luis Ganoza Yupanqui, principal colaborador durante todo este proceso, quien con su

dirección, conocimiento, enseñanza y colaboración permitió́ el desarrollo de este proyecto

de investigación.

Agradezco al proyecto PIBA-2-P-247-14-FONDECYT: “Biodiversidad mixobacterial

marina del Perú: potencial fuente de biomoléculas antibióticas contra patógenos

multidrogo resistentes” financiado con fondos del FONDEYCT/CONCYTECBIOQUIMICA con convenio N°092-2014-FONDECYT, por el apoyo de losY materiales para la culminación

de la presente tesis.

Finalmente quiero agradecer a los miembros del proyecto PIBA-2-P-247-14-

FONDECYT: “Biodiversidad mixobacterialFARMACIA marina del Perú: potencial fuente de

biomoléculas antibióticas contra patógenosDE multidrogo resistentes”

BIBLIOTECA

PRESENTACIÓN

Señores miembros del jurado dictaminador:

Dando cumplimiento a lo establecido por el reglamento de trabajos de investigación de

la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, someto a

vuestra consideración y elevado criterio profesional el presente informe de Tesis II

intitulado: Actividad antibiótica y antioxidante de fracciones del extracto crudo de

Marivirga lumbricoides.

Es propicia esta oportunidad para manifestar mi sincero reconocimientoBIOQUIMICA a mi alma máter Y y su plana docente; que con su capacidad y buena voluntad, contribuyen en una formación

profesional sólida. Guardo a su criterio, señores miembros del jurado, la calificación del

presente trabajo de investigación científica. FARMACIA Trujillo, marzo de 2019 DE

CARRION ZAVALETA TERECITA ELIZABETH

BIBLIOTECA

iii

JURADO DICTAMINADOR

Dr. CAMPOS FLORIAN, JULIO VÍCTOR PRESIDENTE

BIOQUIMICA

______Mg. GANOZA YUPANQUI, MAYAR LUIS FARMACIA ASESOR DE

______Dr. QUISPE DÍAZ, IVÁN MIGUEL BIBLIOTECA MIEMBRO

RESUMEN

El objetivo de este trabajo de investigación fue evaluar la actividad antibiótica y

antioxidante de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides aislada de

origen marino. La biomasa de la bacteria se obtuvo por incubación en agar marino a 30

°C por 7 días, se empleó acetona como solvente extractor, se llevó a sequedad para obtener

el extracto crudo, se fraccionó por Sephadex LH-20, se obtuvieron fracciones que fueron

concentradas hasta extracto seco (ES), se evaluó la actividad antioxidante mediante 2,2-

difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH) y el ensayo ácido 2,2´-azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-

sulfónico) (ABTS) expresados en equivalentes de Trolox (ET) y la actividad antibiótica

mediante el método de difusión en disco y microdilución frente a Staphyloccocus aureus BIOQUIMICA ATCC 25923, Staphyloccocus aureus resistente a meticilinaY ATCC 43300, Bacillus

subtilis ATCC 6633 y Escherichia coli ATCC 25922. Se obtuvieron 3 fracciones (F1, F2

y F3) con colores diferenciados, con halos de inhibición de crecimiento bacteriano entre

7,50 y 19,25 mm, con concentracionesFARMACIA mínimas inhibitorias (CMI) y concentraciones mínimas bactericidas (CMB) entreDE 0,62 y 20,00 mg/mL .En la actividad antioxidante se obtuvieron valores entre 4,34 ± 0,38 y 16,21 ± 3,00 mg ET/g ES (DPPH), y entre 9,74 ±

0,39 y 18,23 ± 1,18 mg ET/g ES (ABTS). Se concluye que la F2 presenta mejor actividad

antibiótica como antioxidante. BIBLIOTECA Palabras claves: Marivirga lumbricoides, cromatografía, antioxidante, antibiótico.

ABSTRACT

The objective of this research was to evaluate the antibiotic and antioxidant activity of

the fractions of the isolated Marivirga lumbricoides raw extract of marine origin. The

biomass of the bacteria was obtained by incubation in marine agar at 30 °C for 7 days,

acetone was used as extractor solvent, dried to obtain the crude extract, fractionated by

Sephadex LH-20, fractions were obtained that were concentrated to dry extract (DE),

antioxidant activity was evaluated by 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH) and the

2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) assay (ABTS) expressed in Trolox

equivalents (TE) and antibiotic activity by disc diffusion and microdilution method

against Staphylococcus aureus ATCC 25923, methicillin-resistantBIOQUIMICA Staphylococcus Y aureus ATCC 43300, Bacillus subtilis ATCC 6633 and Escherichia coli ATCC 259223

fractions were obtained ( F1, F2 and F3) with differentiated colors, with halos of

inhibition of bacterial growth between 7.50 and 19.25 mm, with minimum inhibitory

concentrations (MIC) and minimum bactericidalFARMACIA concentrations (CMB) between 0.62 and

20.00 mg/mL. In the antioxidant activityDE values were obtained between 4.34 ± 0.38 and

16.21 ± 3.00 mg TE/g DE (DPPH), and between 9.74 ± 0.39 and 18.23 ± 1.18 mg TE/g

DE (ABTS). It is concluded that F2 presents better antibiotic activity as an antioxidant.

Key words: Marivirga lumbricoides, chromatography, antioxidant, antibiotic. BIBLIOTECA

INDICE

I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………..1

II. MATERIAL Y MÉTODO…………………………………………………..5

III. RESULTADOS………………………………………………………….…12

IV. DISCUSIÓN…………………………………………………………..…....17

V. CONCLUSIONES………………………………………………………….24

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………..25

VII. ANEXOS…………………………………………………………………...30 BIOQUIMICA Y

FARMACIA DE

BIBLIOTECA

vii

I. INTRODUCCIÓN

Los productos naturales han desempeñado un papel fundamental en el descubrimiento de fármacos entre ellos los nichos ecológicos marinos que son un punto de muestreo importante donde se encuentra una amplia diversidad de microorganismos como bacterias, hongos y cianobacterias, estos organismos marinos secretan varios compuestos bioactivos de utilidad farmacéutica que poseen muchas propiedades como actividad antibiótica y antioxidante [1,2].

Estos microorganismos por su mismo lugar de origen y hábitat han desarrollado una serie de estrategias metabólicas y fisiológicas, que les permite sobrevivir en este medio muy extremo, competitivo y agresivo es por ello que se ven obligados a sintetizar biomoléculas activas, en la mayoría de los casos estos poseen genomas más grandes, lo que les proporciona un repertorio metabólico mayor que les permite acceder a nutrientes escasos y/o producir metabolitos especializados bioactivos para protegerseBIOQUIMICA de ellos mismos, de Y los depredadores o incluso jugar este último papel [3]. Es por ello que cuando se enfrentan a otro microorganismo como mecanismo de defensa, secretan biomoléculas que pueden generar cierta toxicidad o inhibición en el otro microorganismo [4].

Marivirga lumbricoides es una especieFARMACIA nueva descubierta en las aguas superficiales del sur del mar de China, aerobia, heterótrofa, con pigmentación anaranjada, Gram positiva, DE del Phylum Bacteroidete en forma de bastón y deslizante. Es oxidasa y catalasa positiva, con una longitud celular más corta y un rango de crecimiento más amplio a diversas temperaturas y concentraciones salinas que las cepas de Marivirga tractuosa y Marivirga sericea [5].

Actualmente el BIBLIOTECA uso inadecuado de antibióticos tiene una relación establecida, pero compleja, siendo una causa de ello la resistencia bacteriana que es la capacidad de un microorganismo para tolerar o resistir ciertas condiciones fisicoquímicas y biológicas frente a un cambio de susceptibilidad bacteriana provocado por un agente que ha sido poco efectivo en contra de ciertos microorganismos [6]. Es por ello que la Organización Mundial de la Salud (OMS) en el 2015 aprobó un plan de acción mundial sobre la resistencia a los antimicrobianos y propuso a los países miembros mejorar la sensibilización y los conocimientos sobre la resistencia ante estos para reducir la incidencia de las infecciones reforzando la vigilancia y la investigación [7].

En los últimos años se generó una verdadera revolución en el campo de las investigaciones relacionadas con el estrés oxidativo, permitiendo establecer que la mayoría de las enfermedades crónicas están implicadas con el desequilibrio de procesos metabólicos y bioquímicos como la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), enfermedades cardiovasculares, daño oxidativo al acido desoxirribonucleico, cáncer y alteración de la visión, estos cambios originan el deterioro y muerte celular, es por ello que se busca biomoléculas con cierta capacidad antioxidante como los carotenoides o compuesto fenólicos que son sustancias capaces de neutralizar la acción oxidativa de los radicales libres manteniendo su estabilidad [8]. Además los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un equilibrio enzimático de nutrientes esenciales (como vitaminas y pigmentos) cuya función principal es prevenir la formación de radicales libres e interceptar los que ya han generado oxidación de otras moléculas [9].

Los métodos antioxidantes in vitro más usados son ABTS, DPPH, 5,5-dimetil-1-pirrolina N-óxido (DMPO) y poder antioxidante reductor del hierroBIOQUIMICA (FRAP) que reaccionan con Y las especies reactivas de oxigeno (EROs) [10]. Los métodos más aplicados son ABTS y DPPH. Ambos presentan una excelente estabilidad en ciertas condiciones, aunque también muestran diferencias. El DPPH es un radical libre que puede obtenerse directamente sin una preparación previa, mientras que el ABTS tiene que ser generado tras una reacción que puede ser química FARMACIA (persulfato potasio), enzimática (peroxidasa, mioglobulina), o también electroquímica.DE Con el ABTS se puede medir la actividad de compuestos de naturaleza hidrofílica y lipofílica, mientras que el DPPH solo puede disolverse en medio orgánico [11]. El radical ABTS+ tiene, además, la ventaja de que su espectro presenta máximos de absorbancia entre 414 y 654 nm en medio alcohólico, mientras que el DPPH presenta un pico de absorbancia a 517 nm [12]. BIBLIOTECA Los antioxidantes son moléculas que evitan el consumo de oxigeno por los tejidos humanos, especies que retardan o previenen la oxidación de otra molécula y por lo tanto puede considerarse como un reductor, gran parte de las reacciones químicas antioxidantes primarios ese pueden agrupar en las categorías de transferencia de hidrogeno–átomo un componente antioxidante dona un átomo de hidrogeno a un radical libre inestable y en este proceso se convierte en un libre más estable y/o transferencia de un solo electrón un antioxidante transfiere un solo electrón para ayudar a reducir los posibles compuestos, también se consideran que los compuestos fenólicos funcionan como oxidantes

secundarios debido a su capacidad para unirse con iones metálicos potencialmente pro- oxidativos [13, 14].

Estudios preliminares indican que la microbiota del medio marino posee una interesante fuente potencial de metabolitos antagonistas. Radhakrishnan y sus colaboradores realizaron una investigación sobre la actividad antioxidante y la actividad antimicrobiana de Streptomyces sp. D25 cuyo metabolito pigmentado mostró un 35,63% y un 96,19% de actividad de eliminación de radicales libres en el ensayo DPPH y el ensayo de óxido nítrico, respectivamente [15]. Lo mismo ocurrió en el ensayo antimicrobiano, el pigmento mostró una inhibición de 10-20 mm contra bacterias formadoras de biopelículas a 25 µg/mL. Otros estudios in vivo sobre este pigmento encuentran el camino para sus aplicaciones biomédicas [16,17].

En otras investigaciones se obtuvieron 2 aislamientos de Streptomyces parvulus de los cuales cinco presentaron actividad asparraginasa mientrasBIOQUIMICA que el décimo aislamiento VMS-A10 designado como la cepa de Streptomyces parvulusY sankarensis-A10 (NCIM- 5601, GenBank-KT906299) mostró actividad antimicrobiana contra B. subtilis, S. aureus, E. coli , P. aeruginosa, MRSA, C. albicans y A. niger con 503,33 ± 5,77; 536,66 ± 5,77; 533,33 ± 5,77; 500,00 ±10,00; 538,33 ± 5,77; 353,33 ± 11,54 y 443,33 ± 15,27 µg/mL respectivamente [18]. FARMACIA Se han demostrado que se debe DE tener diversas alternativas de fuentes naturales con propiedades antioxidantes y antibióticas es por ello que se ha visto a bien buscar en el medio marino. En el Perú se tiene un litoral extenso y diversificado con una microbiota poco estudiada la cual podría ser productiva para el hallazgo de cepas biológicamente activas, es por ello que se debe aprovechar eficientemente este recurso. Investigaciones preliminares indicanBIBLIOTECA que la microbiota del medio marino posee una interesante fuente potencial de metabolitos con actividad antibiótica [19].

Objetivo general

Determinar la actividad antibiótica y la actividad antioxidante de las fracciones obtenidas del extracto crudo de la bacteria marina Marivirga lumbricoides.

Objetivos específicos

1. Determinar la actividad antibiótica de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides, mediante el método de difusión en agar por discos sobre bacterias patógenas.

2. Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides, mediante microdilución sobre bacterias patógenas. BIOQUIMICA Y 3. Determinar la concentración mínima bactericida (CMB) de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides, en agar Mueller Hinton sobre bacterias patógenas. FARMACIA 4. Determinar la actividad antioxidante de las fracciones del extracto crudo de DE Marivirga lumbricoides mediante ABTS y DPPH.

BIBLIOTECA

II. MATERIAL Y MÉTODO

2.1. MATERIAL

2.1.1. Material biológico

Bacteria marina Marivirga lumbricoides que fue proporcionada por el proyecto PIBA-2-P-247-14-FONDECYT: “Biodiversidad mixobacterial marina del Perú: potencial fuente de biomoléculas antibióticas contra patógenos multidrogo resistentes.

2.1.2. Material de laboratorio

2.1.2.1. Material microbiológico BIOQUIMICA Y  Staphyloccocus aureus resistente a la meticilina (SARM) ATCC 43300, Escherichia coli ATCC 25922, Staphyloccocus aureus ATCC 25923 y Bacillus subtilis ATCC 6633.

FARMACIA 2.1.2.2. Material de vidrio y otros DE  Algodón 500 g, CKF  Asa bacteriológica  Balones fondo redondo de 50 mL, 100 mL y 250 mL  Espátulas BIBLIOTECA Fiolas de 10 mL, 25 mL, 50 mL y 100 mL  Gradillas  Jeringas de 3 mL y 5 mL con ajuga de 21´  Matraces de 100 mL y 250 mL, Pírex  Mechero de vidrio  Micropipetas de 1 mL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, Brand  Microplacas de 96 pocillos, Falcon  Papel de aluminio  Papel filtro 6mm, Macherey-Nagel

 Pinzas  Pizetas de plástico  Placas Petri de vidrio de 9 y 10 cm de diámetro  Probetas de 100 mL  Tubos de ensayo  Varillas de vidrio  Vasos de precipitación de 50 mL, 100 mL, 250 mL y 1000 mL

2.1.2.3. Equipos de laboratorio

 Agitador vibratorio, Heidolph  Balanza analítica, A&D  Baño de ultrasonido con calefacción, JP Selecta  Baño maría, Memmert BIOQUIMICA  Cabina de bioseguridad, BiobaseY  Espectrofotómetro, Thermo Scientific  Estufa, JP Selecta  Micropipetas multicanal de 200 µL, Brand  Micropipetas de 20 µL, 100 µL, 200 µL y 1000 µL, Brand FARMACIA  Refrigeradora, Coldex  Rotaevaporador,DE Heidolph  Ultrapurificador, Simplicity  Ultracongeladora, Arctiko

2.1.2.4. Reactivos y solventes BIBLIOTECA  Acetona, J.T. Baker  Agar Mueller-Hinton, Difco  Agar nutritivo, Difco  Agar marino - Difco  Caldo Mueller-Hinton, Difco  Cloruro de sodio, Merck  Resazurina, Sigma-Aldrich  Sephadex LH-20, Sigma-Aldrich

 2,2-difenil-1-picrilhidracilo, Sigma-Aldrich  Acetato de sodio, Merck  Ácido(±)-6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico (Trolox), Sigma-Aldrich  Ácido acético glacial, J.T. Baker  Ácido clorhídrico, J.T. Baker  Cloruro de hierro (III) hexahidratado, Sigma-Aldrich  Agua destilada  Etanol 96° G.L, CKF  Metanol, J.T. Baker

2.2. MÉTODO

2.2.1. Preparación de los extractos BIOQUIMICA Y La biomasa de Marivirga lumbricoides se obtuvo en agar marino sobre placas estériles por 7 días de incubación a 30 ºC. El extracto fue obtenido por el método de extracción liquido-solido; primero se sónico por 10 minutos a temperatura ambiente, luego se agregó acetona (1:1) y se centrifugó por 15 minutos a 5000 FARMACIA rpm, posteriormente se extrajo el sobrenadante, se colocó en un balón de fondo redondo de 250 mL y se DEconcentró en un rotaevaporador bajo presión reducida a 40 ºC hasta sequedad para obtener el extracto crudo.

2.2.2. Fraccionamiento del extracto crudo por Sephadex LH-20

Al extractoBIBLIOTECA crudo se le agregó metanol y se sónico por 5 minutos, se eluyó a través de una fase estacionaria de Sephadex LH-20, utilizando metanol como fase móvil.

El criterio para obtener las fracciones fue evaluar las tonalidades de colores por la separación. Las fracciones fueron concentradas al vacío hasta obtener extractos secos

2.2.3. Determinación de la actividad antibiótica por difusión en agar y microdilución de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides

2.2.3.1. Reactivación de las cepas patógenas y preparación del inóculo

Se reactivó SARM ATCC 43300, E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923 y B. subtilis ATCC 6633; en agar nutritivo sobre placas estériles. Se incubó a 37 °C por 18 a 24 horas hasta su crecimiento. Luego de 24 horas, se preparó la suspensión bacteriana en 10 mL de solución salina fisiológica estéril a 0,85% de cloruro de sodio ajustando a una turbidez entre 0,09 y 0,10 de absorbancia [19].

2.2.3.2. Prueba de actividad antibiótica mediante difusión en agar

BIOQUIMICA Se preparó placas Petri con agar Mueller-HintonY y se realizó el sembrado de la suspensión bacteriana previamente preparada. Luego se colocó discos de papel filtro de 6 mm de diámetro, como control positivo se utilizó seis antibióticos (ciprofloxacino, oxacilina, gentamicina, amikacina, penicilina y ampicilina) y como control negativo se utilizó DMSO agregándole 10 µL a cada disco, luego cada fracción obtenida se resuspendióFARMACIA en dimetilsulfóxido. Posteriormente se llevó a la incubadora porDE 24 horas a una temperatura constante de 37 ºC. Finalmente, se realizó la lectura utilizando una regla para medir los halos de inhibición por la parte reversa de la placa determinando así la fracción con mayor actividad antibiótica [19].

2.2.3.3. DeterminaciónBIBLIOTECA de la concentración mínima inhibitoria mediante microdilución

En una placa estéril de poliestireno para microdilución se colocó 50 µL de caldo Mueller-Hinton, luego se agregó 50 µL de cada fracción obtenida y se procedió a realizar las diluciones a la mitad a partir de 100 µL hasta el pocillo 7. Después se añadió 50 µL de la suspensión del inóculo de cada cepa patógena. Además emplearon dos controles: el primero fue el control positivo (caldo Mueller- Hinton más la suspensión bacteriana) y el segundo, el control negativo (caldo

Mueller-Hinton más la fracción del extracto).Las placas fueron incubadas a 37 °C entre 18 a 24 horas. Posteriormente, se añadió 10 µL de resazurina para la lectura, y se volvió a incubar por una 1 a 2 horas a 37 °C. Finalmente se tomó lectura de la placa teniendo como criterio la coloración por el indicador resazurina (positiva la inhibición cuando se observó el color azul (no hubo crecimiento) y, negativo, el color rosado (si hubo crecimiento) [19].

2.2.3.4. Determinación de la concentración mínima bactericida.

Para determinar la concentración mínima bactericida se dividió la placa con medio agar Muller-Hinton en 4 cuadrantes y se tomaron 5 µL de los tres últimos pocillos que se observaron de color azul y el primer pocillo se observó una coloración rosada, una vez sembrado ello se dejaron incubar entre 18 a 24 horas a 37 °C y finalmente se realizó la lectura para observar si hubo crecimiento de BIOQUIMICA las bacterias patógenas en cuadrantes positivosY de esta manera se conoce la concentración mínima bactericida [19].

2.2.4. Determinación de la actividad antioxidante de las fracciones del extracto de Marivirga lumbricoides FARMACIA

La evaluación de la actividadDE antioxidante se determinó mediante los métodos de DPPH y ABTS los cuales se fundamentan en la cuantificación de la decoloración de los radicales, debido a la interacción con especies donantes de hidrógeno o de electrones. Son radicales cromóforos que absorben a ciertas longitudes de onda generando así una reacción de oxidación [21]. BIBLIOTECA 2.2.4.1. Determinación de la actividad antioxidante mediante la eliminación del radical DPPH

Se preparó una disolución patrón de Trolox 10 mM en etanol. El ensayo se realizó con las diluciones de cada fracción obtenida del extracto crudo de Marivirga lumbricoides. Se tomó 10 µL de las diluciones con 300 µL de DPPH (0,039 mg/mL en etanol), se protegió de la luz con papel aluminio y se dejó en reposo durante 15 minutos. Luego se realizó las lecturas de absorbancias en el

espectrofotómetro a 517 nm, las determinaciones se realizaron por triplicado para cada una de las soluciones. Posteriormente se enfrentaron las concentraciones de Trolox con sus respectivas absorbancias para obtener la ecuación de la curva de calibración con Trolox. Se comparó trolox a concentraciones de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 y 1 mg/mL. Se procedió con el procedimiento descrito anteriormente, los valores se expresaron en equivalentes de Trolox (ET) por gramo de extracto seco, las mediciones se hicieron por triplicado [20].

2.2.4.2. Determinación de la actividad antioxidante mediante ABTS

Mediante este método se evalúa la decoloración de cationes radicales libres ABTS. La monocalización radical preformada de ABTS, se genera por oxidación de ABTS con persulfato de potasio y se reduce en presencia de tales BIOQUIMICA antioxidantes donadores de hidrógeno [15]. Y La reacción de ABTS con persulfato potásico incubados a temperatura ambiente 25 °C y en la oscuridad durante 16 horas. Una vez formado el radical ABTS+, se diluyeron con etanol hasta obtener un valor de absorbancia comprendiendo entre 0,70 ± 0,1 a 734 nm (longitud de onda de máxima absorbancia). Las fracciones FARMACIA del extracto crudo de la bacteria marina se diluyeron con etanol, para luego tomar 10 µL de las diluciones conDE 300 µL del radical ABTS+, luego de 4 minutos se realizaron las lecturas de las absorbancias en el espectrofotómetro a 734 nm. Para la curva de calibración se tomaron como antioxidante estándar Trolox a diferentes concentraciones entre 0,013-0,2 mg/mL en etanol, en las mismas condiciones. Los valores se expresaran en equivalente de Trolox por gramo de extractoBIBLIOTECA seco (ET/g), las mediciones se realizaron por triplicado [14].

2.2.5. Análisis de datos

Se realizó el análisis de varianza (ANOVA) para verificar la diferencia entre los diámetros generados por las fracciones, su efecto antibiótico y antioxidante, luego se realizó la comparación múltiple (Test de Tukey) utilizando un nivel de significancia del 95% (p < 0,05). Los datos fueron procesados en el software IBM SPSS Statistics versión 23.

III. RESULTADOS

Tabla 1. Diámetros de los halos de inhibición de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides frente a bacterias patógenas

Diámetro de halos (mm) Cepa Ampicilina Gentamicina Amikacina Penicilina bacteriana Ciprofloxacino Oxaciclina BIOQUIMICA DMSO F1 F2 F3 1,066 8,256 33,332 0,5 2,052 mg/mL 2,132mg/mL Y 20% mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL Staphylococcus aureus 18,50 19,25 8,00 31,00 17,50 11,75 - - NH 0 ATCC 25923 Staphylococcus aureus FARMACIA resistente a la 15,75 16,75 7,50 30,00 12,00 10,00 - - NH 0 meticilina DE ATCC 43300 Bacillus subtilis 16,75 18,75 8,00 - - - 24,50 28,75 NH 0 ATCC 6633 Escherichia coli NH 8,00 NH BIBLIOTECA------ATCC 25922 F1: Fracción 1; F2: Fracción 2; F3: Fracción 3; NH: no se observó halo; (-): no se realizo

Tabla 2. Concentración mínima inhibitoria de las fracciones del extracto crudo de

Marivirga lumbricoides frente a bacterias patógenas

CMI (mg/mL) FRACCIÓN S. aureus SARM B. subtilis E. coli ATCC ATCC ATCC ATCC 25923 43300 6633 25922

F1 2,50 5,00 2,50 20,00

F2 0,63 2,50 1,25 10,00

F3 10,00 10,00 10.00 20,00

F1: Fracción 1; F2: Fracción 2; F3: Fracción 3; SARM: StaphylococcusBIOQUIMICA aureus resistente a la meticilina Y

FARMACIA

BIBLIOTECA

Tabla 3. Concentración mínima bactericida de las fracciones del extracto crudo de

Marivirga lumbricoides.

CMB (mg/mL)

FRACCIÓN S. aureus SARM B. subtilis E. coli ATCC ATCC ATCC ATCC 25923 43300 6633 25922

F1 2,50 10,00 1,25 NH

F2 0.63 2,50 1,25 20,00

F3 10,00 20,00 20,00 NH

F1: Fracción 1; F2: Fracción 2; F3: Fracción 3, SARM: StaphyloccocusBIOQUIMICA aureus resistente a la meticilina Y

FARMACIA

BIBLIOTECA

Tabla 5 Actividad antioxidante de las fracciones del extracto crudo de Marivirga

lumbricoides por DPPH

Actividad antioxidante (mg ET/g ES) Fracciones ր 1 ր 2 ր 3 ± D.E.

F1 6,24 5,90 4,82 5,65a ± 0,74

F2 18,33 17,52 12,78 16,21b ± 2,99

F3 4,72 4,32 3,61 4,33a ± 0,38

ET: Equivalente trolox, ES: extracto seco; ր1, ր2, ր3: muestrasBIOQUIMICA : promedio; D.E: desviación estándar; a, b= grupos con diferencias significativasY (p<0,05)

FARMACIA

BIBLIOTECA

Tabla 6. Actividad antioxidante de las fracciones del extracto crudo de Marivirga

lumbricoides por ABTS

Actividad antioxidante (mg ET/g ES) Fracciones ր 1 ր 2 ր 3 X ± D.E

F1 9,35 9,74 10,12 9,74c ± 0,38

F2 19,54 17,90 17,24 18,22d ± 1,18

F3 10,60 10,33 10,20 10,37c ± 0,20

ET: Equivalente trolox, ES: extracto seco; ր1, ր2, ր3: muestras : promedio; D.E: desviación estándar; c, d = grupos con diferencias significativasBIOQUIMICA (p<0,05) Y

FARMACIA

BIBLIOTECA

IV. DISCUSIÓN

En la tabla 1 se presentó la actividad antibacteriana realizada a las fracciones del extracto

crudo de Marivirga lumbricoides frente a las especies bacterianas S. aureus, S. aureus

resistente a la meticilina, B. subtilis y E. coli, usando como controles positivos los

antibióticos ciprofloxacino, oxaciclina, ampicilina, gentamicina, amikacina y penicilina

y como control negativo DMSO al 20% utilizado como sustancia tensioactiva para la total

disolución de las fracciones. Se observó que la fracción 1 y 2 a concentración de 80

mg/mL tuvieron una mejor actividad antibiótica frente S. aureus, SARM y B. subtilis,

todas ellas del tipo Gram (+). Los valores promedio de diámetro de halos frente a S.

aureus estuvieron entre 18,5 mm, generado por la fracción 1, y 19,25 mm generado por BIOQUIMICA la fracción 2; estos resultados comparándolos con los halosY formados por los antibióticos

presentan diámetros similares especialmente con oxacilina que se encuentra a una

concentración de 2,132 mg/mL, de acuerdo con diámetros de inhibición expresados en

mm, estandarizados para cada antimicrobiano las lecturas se interpretan como sensible FARMACIA (S),>= 13 mm; intermedia (I) entre 11-12 mm y resistente(R),<= 10 mm según las DE categorías establecidas NCCLS, por lo que se afirma que los resultados se encuentran

dentro de la categoría sensible [22]. El análisis de varianza entre actividad antibacteriana

y el extracto fue menor a 0,05 por lo que existen diferencia significativa de los halos de

inhibición de lasBIBLIOTECA bacterias, además de presentar un efecto significativo de inhibición de

las fracciones, la prueba de comparación de medias de Tukey que entre la fracción 1 y 2

no existe diferencia significativa por lo que se puede observar que generaron similares

efectos sobre las cepas patógenas.

Por otro lado las fracciones 1 y 2 frente SARM generaron diámetros de halos 15,75 y

16,75 mm respectivamente, por lo que al ser comparados con los controles positivos

tiene un mayor efecto inhibitorio que oxacilina, ampicilina, gentamicina y amikacina pero

se acerca a los valores de diámetro de ciprofloxacino, sin embargo la categorías

establecidas por la NCCLS para ciprofloxacino son sensible (S),>= 21 mm; intermedia

(I) entre 16-20 mm y resistente(R),<= 15 mm, determinando así que el efecto inhibitorio

de las fases se encuentra dentro de la categoría intermedia [22]. Con referencia a los

análisis estadísticos entre estas dos fracciones no existe diferencia significativa. Se

observó que las fracciones 1 y 2 también tienen efecto inhibitorio sobre B. subtilis

formando halos de 16,75 y 18,75 mm respectivamente, mostrando mejor actividad que

las penicilinas, y acercándose a los valores de diámetro de gentamicina y amikacina que

de acuerdo con la categorías establecidas por la NCCLS, los diámetros para amikacina

son: sensible (S),>= 17 mm; intermedia (I) entre 14-16 mm y resistente(R), <= 13

determinando así que el efecto inhibitorio de ambas fasesBIOQUIMICA se encuentra dentro de la Y categoría sensible [22].

La actividad antibacteriana de las fracciones de Marivirga lumbricoides dependen de los

metabolitos bioactivos generados por ciertas bacterias marina. Una investigación FARMACIA realizada por Linares y colaboradores reportan actividad antibacteriana de bacterias DE marinas contra MRSA clínicamente relevante y contra tres cepas entero hemorrágicas de

Escherichia coli (ECEH) donde se investigó la filogenia y las características fisiológicas

de las cepas activas indicando la producción biosintética de los compuestos conocidos

como ariakemicina,BIBLIOTECA kocurina, naftiridinomicina, pumilacidinas, resistomicina y surfactina productos del comportamiento depredador o incluso como mecanismo de

defensa, entre los filos bacterianos con estas capacidades encontraron las actinobacterias,

proteobacterias y bacteroidetes que potencialmente podrían ofrecer nuevas moléculas

antimicrobianas [23].

En la tabla 2 se presentó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de las fases 1, 2 y

3, donde se observó que fase 2 a concentración 0,625; 2,5; 1,25 y 10 mg/mL tiene

actividad antibiótica contra S. aureus, SARM, B. subtilis y E. coli respectivamente.

Según los rangos aceptables de CMI (mg/mL) para cepas utilizadas en el control de los

antibiogramas mediante la técnica de dilución como por ejemplo gentamicina (0,125- 1)

y oxacilina (0,125-0,5) presenta actividad frente S. aureus; por lo que los resultados

obtenidos se encuentran dentro del rango a concentraciones similares de estos fármacos.

Por lo que puede determinar que la fracción 2 presenta actividad bactericida (tabla 4)

frente a las bacterias gran positivas que han sido utilizadas [24, 25].

Se evaluó la actividad antioxidante de las 3 fases a concentraciones de 6,25 mg/mL; 12,5

mg/mL; 6,25 mg/mL respectivamente. Los resultados fueron comparados con Trolox a

10 mM, usando diluciones entre 0,2 a 1 mM En la tabla 5 y 6 se observó la actividad BIOQUIMICA antioxidante de las fases de Marivirga lumbricoides mediante el método DPPH donde la Y fracción 2 presentaron una mayor captación de radicales libres referente a trolox con un

promedio de 16,2149 mg de equivalente Trolox/g de extracto crudo; resultados similares

se obtuvieron al ensayar con ABTS+ con un promedio de 18,2278 mg de equivalente FARMACIA Trolox/g de extracto crudo, según el estudio realizado la actividad antioxidante puede DE deberse a los pigmentos amarillo – naranja producidos por la bacteria marina. Otros

estudios similares han reportado que los pigmentos amarillos extraídos de bacterias,

como es el caso de Streptomyces sp aislada de la rizosfera Curcumae longae mostró un

28,29% de eliminaciónBIBLIOTECA de radicales a 500 µg/mL según el método de DPPH [26]. También datan que metabolitos pigmentados aislados de Virgibacillus sp asociada a la

esponja Callyspongia difusa presentaron actividad antioxidante con el radical DPPH a

una concentración 2000 μg /ml [27].

La coloración observada hace suponer la presencia de carotenoides, debido a que esta

familia de isoprenoides contienen una serie de dobles enlaces conjugados lo que

constituye el grupo cromóforo de la molécula, responsable del color y de las propiedades

de absorción de estos compuestos. La mayoría de carotenoides son sintetizados por

organismos fotosintéticos y por algunas bacterias y hongos. Estos se localizan en los

centros de reacción de los fotosistemas y en los complejos de antena unidos a proteínas

integrales de membrana donde participan en la absorción de luz y protección del aparto

fotosintético frente a daños foto oxidativos con una amplia variedad de funciones

fisiológicas [28].

Además Devihalli logro extraer carotenoides aislados de Micrococcus luteus que muestra

una significativa actividad protectora contra los UV, junto con propiedades antioxidantes

a una concentración de 3,5 a 4,5 mg/ mL Otros estudios demostraron que algunos

microorganismos producen carotenoides como por ejemplo Nannochloropsis gaditana BIOQUIMICA (astaxantina, b-caroteno), Dietzia natronolimnaea HS-1 y Chlorella zofingiensis Y (cantaxantina), Rhodoturula glutinis (b-caroteno), Monascus sp. (Ankaflavina,

monascorubramina), Ashbya gossypi (riboflavina), y Penicillium oxalicum

(antraquinona) [29]. Por lo que juegan un papel vital por que poseen diversas actividades FARMACIA farmacológicas como antioxidantes, actividad anticancerígena y antimicrobiana, también DE sirven como agentes colorantes alternativos este debido a su ventaja sobre las plantas en

términos de disponibilidad, estabilidad y fácil proceso de transmisión. Estos productores

de pigmentos amarillos- naranja tienen estructuras de nitrógeno heterocíclicas variados

filogenéticamente,BIBLIOTECA por lo que su producción depende de la ubicación de microorganismos aislados asociados con el suelo y el agua [30].

Estos metabolitos se dividen en dos grupos, carotenos y xantofilas. Los carotenos son

hidrocarburos linéales o cíclicos siendo el más abundante, alfa caroteno y beta caroteno

responsable del color naranja y las xantofilas son derivados oxigenados de los carotenos.

Las microalgas y otros microorganismos producen algunas xantofilas que actualmente

se comercializan debido a su color y capacidad antioxidante como es el caso de la

astaxantina. [31].

En otros estudios se han encontrado bacterias fotosintéticas como Agrobacterium

aurantiacum y algunos hongos capaces de sintetizar astaxantina (3,3′-hidroxi-4,4′-ceto-

β-caroteno) a partir de β-caroteno, mediante dos reacciones, una de oxigenación

catalizada por la β-caroteno cetolasa (β-caroteno-C4-oxigenasa, BKT) y otra de

hidroxilación catalizada por la hidroxilasa CHYb. Se han descrito dos rutas diferentes de

biosíntesis de la astaxantina: una que comienza con la oxigenación del β-caroteno

pasando por equinona, cantaxantina y adonirubina y otra que empieza con la hidroxilación

del β-caroteno con β-criptoxantina, zeaxantina y adonixantina como intermediarios [31]. BIOQUIMICA La primera ruta ha sido demostrada mediante análisisY funcional de las cetolasas tipo

CrtW/BKT de la bacteria marina A. aurantiacum y la microalga H. pluvialis, que sólo

aceptan β-caroteno como sustrato [32]. Además, mediante análisis de la cetolasa de C.

zofingiensis se confirmó una segunda ruta, demostrándose que el producto del gen bkt de FARMACIA esta microalga puede actuar tanto sobre β-caroteno como sobre zeaxantina [33] DE

La capacidad antioxidante de los carotenoides es actualmente objeto de gran interés

debido a sus aplicaciones en la salud humana y nutrición. El estrés oxidativo parece ser

la base de distintas enfermedades como la degeneración macular de la retina asociada a BIBLIOTECA la edad, otras retinopatías como cataratas, carcinogénesis, aterosclerosis o enfermedad de

Alzheimer, entre otras. Antioxidantes, tales como las vitaminas A, C y D, así como los

carotenoides, se están investigando para determinar sus funciones en la prevención y/o

tratamiento de estas enfermedades [34]. La ingesta de carotenoides ha demostrado ofrecer

protección frente a la degeneración macular, los daños inducidos en la piel por la luz UV

y algunas enfermedades degenerativas asociadas a la edad avanzada [34]. Diversos

estudios sugieren que las propiedades antioxidantes y otras funciones biológicas

inesperadas de los carotenoides, relacionadas con la regulación génica y la comunicación

intercelular, pueden proporcionar beneficios adicionales para la salud, como actividad

anticancerígena, estimuladora del sistema inmunitario o antiinflamatorio [35].

La degeneración macular asociada a la edad (AMD) es producida por la degeneración de

la retina y mácula, y finalmente culmina en la pérdida de la visión. Esta enfermedad afecta

mundialmente a más de 14 millones de personas, y se ha establecido una clara conexión

entre AMD y los carotenoides luteína y zeaxantina. Estas xantofilas se encuentran a altas

concentraciones en el material ocular, incluyendo la región mácula de la retina y sus

niveles se han relacionado directamente con la enfermedad y su prevención [36]. La

luteína y zeaxantina tienen capacidad antioxidante y como pigmentos absorben luz, de BIOQUIMICA esta manera pueden proteger, por tanto, el ojo tiene daños oxidativos inducidos por la luz Y azul de alta energía, ya que la luteína y zeaxantina absorben predominantemente luz azul

de baja longitud de onda. Determinando así que las especies reactivas de oxígeno inducen

apoptosis de fotorreceptores y la luteína es capaz de bloquear la apoptosis inducida por FARMACIA H2O2 de células fotorreceptores de la retina cultivadas [37]. Recientes evidencias nos DE indican que antioxidantes como las vitamina A, E y C han revelado que no existe una

relación entre su consumo y la reducción de AMD. La luteína también presenta efectos

beneficiosos sobre otras enfermedades oculares, incluyendo cataratas [38]. Estudios in

vitro con célulasBIBLIOTECA humanas e in vivo en ratas y pollos han revelado que la luteína y astaxantina inhiben procesos inflamatorios bloqueando genes proinflamatorios, en

consecuencia de la supresión del factor nuclear NF-kB. También inhiben la producción

de óxido nítrico y prostaglandina E2, así como las citoquinas pro-inflamatorias TNF alfa

(factor de necrosis tumoral alfa), y la interleuquina-1B e interleuquina-6, quimioquina

(motivo C-C) ligando 2 (CCL2) y quimioquina (motivo C-X-C) ligando 2 (CXCL2) [39].

El efecto inhibidor de la luteína y astaxantina sobre los efectos pro inflamatorios

mediados por NF-kB también estarían relacionado con la neutralización de especies

reactivas de oxígeno que activan la ruta NF-kB. Otros estudios han mostrado que la

luteína y la astaxantina en la dieta de ratas, redujeron la incidencia de carcinogénesis

inducida en vejiga, cavidad oral o colon, entre otros. Este efecto podría estar relacionado

con la capacidad de neutralizar especies reactivas, de los procesos de iniciación y

propagación de diversas formas de cáncer. [40]

BIOQUIMICA Y

FARMACIA DE

BIBLIOTECA

CONCLUSIONES

1. La actividad antibiótica de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides, evaluado con el método difusión en agar por discos determino que fracción 2 presenta una mayor actividad con halos de 19,25; 16,25; 18.25 y 8 mm contra S. aureus, SARM; B. suptilis, E. coli respectivamente.

2. La fracción 2 presenta mayor actividad antibiótica con una concentración mínima inhibitoria de 0,63 2,54; 1,25; 10,00 mg/mL frente a S. aureus, SARM; B. suptilis, E. coli respectivamente.

3. La fracción 2 presenta actividad bactericida frente a S. aureus, SARM; B. suptilis y

actividad bacteriostática frente a E. coli. BIOQUIMICA Y

4. La fracción 2 presenta una mayor actividad antioxidante con 16,21 ± 3,00 g de /gramo de

extracto mediante el método de DPPH.

FARMACIA 5. La fracción 2 presenta una mejor capacidad de reducción de radicales libres mediante el DE ensayo de ABTS con 18,23 ± 1,18mg de ET/gramo de extracto.

BIBLIOTECA

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. BIBLIOTECA

VI. ANEXOS

Anexo 1. : Curva de DPPH vs. Trolox que fue usado como estándar

Concentración Absorbancia DPPH - TROLOX 0 0,989 1.200 y = -0.6963x + 0.9849 0,2 0,843 1.000 a R² = 0.9998 0,4 0,706 ci 0.800 0,6 0,563 ban 0.600 sor 0.400

0,8 0,425 Ab 0.200 1 0,294 0.000 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Concentracion

BIOQUIMICA Y

Anexo 2. : Curva de ABTS vs. Trolox que fue usado como estándar

FARMACIA

DE Concentración Absorbancia ABTS - TROLOX 1.000 0,0 0,859 0,05 0,819 y = -0.7696x + 0.8559 0.800 R² = 0.9991 0,1 0,781 0,2 0,705 0.600

0,3 0,626 0.400 0,4 BIBLIOTECA0,551 absorvancia 0,5 0,472 0.200 0,6 0,399 0,7 0,320 0.000 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0,8 0,242 concentraciòn

Anexo 3.Actividad antibacteriana de los fármacos utilizados como controles positivos frente a bacterias patógenas.

BIOQUIMICA Y

FARMACIA DMSO: Dimetilsulfoxido; SARM: S. aureus resistente a meticilina DE

BIBLIOTECA

Anexo 4. Actividad antibiótica de las fracciones del extracto de Marivirga lumbricoides mediante discos en agar

S.A F2 MRSA F2

F3 F3 F1 F1

B.S F2 E.C

F1 F1 F3 BIOQUIMICA Y F3 F2

FARMACIA DE

BIBLIOTECA

Anexo 5. Concentraciones Mínimas Inhibitorias de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides. Fracción 2 Fracción 1

BIOQUIMICA Y Fracción 3

FARMACIA DE

BIBLIOTECA

Azul: muestras que presentan actividad antibiotica conta las cepas patogenas; Rosado: muestras que no presenta activida antibiotica; F1: Fraccion 1; F2: Fraccion 2; F3: Fraccion 3

Anexo 6. Análisis de varianza (ANOVA) de los diámetros de halos generados por las fracciones de Marivirga lumbricoides frente a Staphylococcus aureus expresados en milímetros

Suma de Media Variable gl F Sig. cuadrados cuadrática

Entre grupos 351,167 2 175,583 421,400 ,000

Dentro de 3,750 9 ,417 grupos halos(mm) Diámetro de los de Diámetro Total 354,917 11 BIOQUIMICA Y

FARMACIA DE

BIBLIOTECA

Anexo 7. Análisis de comparación múltiple (test HSD Tukey) de los diámetros de halos formado por las fracciones del extracto de Marivirga lumbricoides frente a Staphylococcus aureus.

HSD Tukey Diámetros de halos (mm)

Subconjunto para alfa = 0,05 Fracciones N a b c

Fracción 3 4 7,0000

Fracción 1 4 17,5000

Fracción 2 4 BIOQUIMICA 19,2500 Y Sig. 1,000 1,000 1,000

FARMACIA

BIBLIOTECA

Anexo 8. Análisis de varianza (ANOVA) de los diámetros de halos generados por las fracciones de Marivirga lumbricoides frente a Staphylococcus aureus resistente a meticilina expresados en milímetros.

Suma de Media Variable gl F Sig. cuadrados cuadrática

Entre grupos 230,167 2 115,083 690,500 ,000

Dentro de grupos 1,500 9 ,167 halos(mm) Diámetro de los de Diámetro Total 231,667 11 BIOQUIMICA Y

FARMACIA DE

BIBLIOTECA

Anexo 9. Análisis de comparación múltiple (test HSD Tukey) de los diámetros de halos formado por las fracciones del extracto de Marivirga lumbricoides frente a Staphylococcus aureus.

HSD Diámetros de halos (mm)

Subconjunto para alfa = 0.05 Fracciones N a b c

Fracción 3 4 7,0000

Fracción 1 4 15,7500

Fracción 2 4 16,7500

Sig. 1,000 1,000BIOQUIMICA 1,000 Y

FARMACIA DE

BIBLIOTECA

Anexo 10. Análisis de varianza (ANOVA) de los diámetros de halos generados por las fracciones de Marivirga lumbricoides frente a Bacillus suptilis expresados en milímetros.

Suma de Media Variable gl F Sig. cuadrados cuadrática

Entre grupos 882,000 2 441,000 661,500 ,000

Dentro de grupos 6,000 9 0,667 halos(mm) Diámetro de los de Diámetro Total 888,000 11

BIOQUIMICA Y

FARMACIA

BIBLIOTECA

Anexo 11. Análisis de comparación múltiple (test HSD Tukey) de los diámetros de halos formado por las fracciones del extracto de Marivirga lumbricoides frente a Bacillus suptilis

HSD Tukey Diámetros de halos (mm)

Subconjunto para alfa = 0.05 FRACCIONES N 1 2 3 Fracción 3 4 0,0000

Fracción 1 4 16,5000 Fracción 2 4 19,5000

1,000 1,000 1,000 Sig. BIOQUIMICA Y

FARMACIA

BIBLIOTECA

Anexo 12. Actividad antioxidante de las fracciones del extracto de Marivirga lumbricoides mediante DPPH y ABTS

BIOQUIMICA Y

FARMACIA

BIBLIOTECA

Anexo 13. Análisis de varianza (ANOVA) de la actividad antioxidante de las fracciones de Marivirga lumbricoides expresados en miligramos de equivalente trolox por gramo de extracto mediante el método de ABTS.

Media Suma de Variable gl cuadrátic F Sig. cuadrados a Entre grupos 134,020 2 67,010 125,98 ,000

Dentro de grupos 3,191 6 0,532 halos(mm)

Diámetro de los de Diámetro Total 137,212 8

BIOQUIMICA Y

FARMACIA

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Anexo14. Análisis de comparación múltiple (test HSD Tukey) de los diámetros de halos formado por las fracciones del extracto de Marivirga lumbricoides expresados en miligramos de equivalente Trolox por gramo de extracto mediante el método de ABTS.

HSD Actividad antioxidante (mg Eq/ g extracto seco) Tukey Subconjunto para alfa = 0,05 Fracción N a b

Fracción 1 3 9,741767

Fracción 3 3 10,379200

Fracción 2 3 BIOQUIMICA18,227827 Y Sig. 0,564 1,000

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Anexo 15. Análisis de varianza (ANOVA) de la actividad antioxidante de las fracciones de Marivirga lumbricoides expresados en miligramos de equivalente trolox por gramo de extracto mediante el método de DPPH

Variable Suma de gl Media F Sig. cuadrados cuadrática

Entre grupos 254,309 2 127,154 39,364 0,00

Dentro de 19,382 6 3,230 grupos halos(mm) Total 273,690 8 Diámetro de los de Diámetro BIOQUIMICA Y

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Anexo 16. Análisis de comparación múltiple (test HSD Tukey) de los diámetros de halos formado por las fracciones del extracto de Marivirga lumbricoides expresados en miligramos de equivalente Trolox por gramo de extracto mediante el método de DPPH.

HSD Tukey Actividad antioxidante (mg Eq/ g extracto seco)

Subconjunto para alfa = 0,05 FRACCION N 1 2

Fracción 3 3 4,335531

Fracción 1 3 5,658334

Fracción 2 3 16,214867 Sig. 0,659 BIOQUIMICA1,000 Y

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Anexo 17. Capacidad reductora (de los extractos crudos de bacterias marinas en (mg Equivalente de Trolox/g Extracto seco) por los tres métodos (DPPH, ABTS)

BIOQUIMICA Y

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BIOQUIMICA Y

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BIOQUIMICA Y

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