Общая биология

ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ УДК 579.841:577.21

БИОГЕОГРАФИЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ БАКТЕРИЙ РОДА METHYLOPILA, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ КЛИМАТИЧЕСКИХ ЗОН

Н.В. Агафонова, Е.Н. Капаруллина, Н.В. Доронина

Впервые обнаружены особенности биогеографического распространения ме- тилотрофных бактерий рода Methylopila. Региональная дифференциация выявлена у типовых представителей рода Methylopila: штаммы, выделенные из регионов со сход- ными климатическими условиями, объединены в отдельные филогруппы на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. Кроме того, образова- ние аналогичных кластеров в результате филогенетического и фингерпринт (RAPD- PCR) анализов свидетельствует о внутривидовом молекулярно-генетическом поли- морфизме штаммов, принадлежащих к виду M. oligotropha, выделенных из различных природно-климатических регионов. Ключевые слова: метилотрофные бактерии, Methylopila, Methylopila oli- gotropha, молекулярно-генетический полиморфизм, биогеография

Род Methylopila, впервые описанный Дорониной с соавторами [1], принадлежит семейству [2] порядка Rhizobiales [3]. Представители этого рода являются строго аэробными, грамотрицательными, факультативными метилотрофными бактериями, способными использовать метанол и метиламин в качестве источников углерода и энергии, реализуют сериновый путь С1-метаболизма [1, 4, 5]. В настоящее время валидно описаны следующие виды рода Methylopila (http://www.bacterio.net/methylopila.html): M. capsulata IM1T [1], M. jiangsuensis JZL-4T [5], M. musalis MUSAT [4], M. oligotropha 2395AT [6], M. henanensis LYBFD3-16A2T [7] и M. turkensis Side1T [8, 9], выделенные из природных источников (почвы, растений, подземных вод, активных илов и засоленных биотопов) в различных климатических зонах. Долгое время считалось, что в континентальных масштабах микробные виды не имеют градиента широтного разнообразия, подобных тем, которые наблюдаются у макроскопических видов [10]. Однако еще в прошлом столетии изучение особенностей распространения бактерий рода Bacillus в различных типах почв привело к формированию экогеографического направления почвенной микробиологии [11]. В настоящее время дискуссия по поводу того, демонстрируют ли виды микроорганизмов биогеографический паттерн [12], либо имеют космополитное распространение [13], по-прежнему актуальна. Исследовано географическое распространение для цианобактерий, принадлежащих к родам Synechoccocus [14] и Mastigocladus [15], для термофильных архей Sulfolobus [16] и Pyrococcus [17], для термофильных 79

Известия ТулГУ. Естественные науки. 2019. Вып. 3

бактерий, принадлежащих к родам Roseiflexus [18] и Thermus [19]. Очевидно, что разнообразие микроорганизмов, адаптированных к определенным местообитаниям, определяется экологическими факторами: содержанием органического вещества, влажностью, температурой, кислотностью среды, концентрацией элементов питания и солей. Таким образом, биогеография является важной темой исследования микробных экосистем. C момента описания вида M. oligotropha 2395AT, из образцов почвы, листьев и частей растений различных природно-климатических зон (умеренного, субтропического, экваториального климатических поясов) нами выделены и идентифицированы несколько штаммов, которые, согласно филогенетическому анализу нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, имели высокий уровень сходства с M. oligotropha 2395AT, выделенным из почвы на территории солеразработок г. Соликамска Пермского края [6]. Цель данной работы – изучение особенностей географического распространения метилотрофных бактерий рода Methylopila и молекулярно-генетического полиморфизма штаммов Methylopila oligotropha, выделенных из различных природно-климатических зон. Материалы и методы Выделение чистых культур и условия культивирования. Объектами исследования служили 9 метилотрофных штаммов, выделенных из образцов почвы, листьев и частей растений различных географически удаленных мест обитания (таблица). Накопительные и чистые культуры выделяли на среде «К» (г/л): KH2PO4 – 2,0; (NH4)2SO4 – 2,0; NaCl – 0,5; MgSO4 · 7H2O – 0,1; FeSO4 · 7H2O – 0,002; pH 7,4 и 0,5% (об/об) метанола, как описано ранее [20]. Чистоту культур проверяли световой микроскопией, а также по однородности колоний на агаризованной среде с метанолом и отсутствию роста на среде LB. В качестве референтных штаммов использовали M. oligotropha 2395AT (VKM B-2788T, CCUG 63805T) и M. capsulata IM1T (VKM B-1606T, ATCC 700716T, DSM 6130T). Изучение культуральных и физиолого-биохимических свойств изолятов. Для описания колоний, изучения морфологии и подвижности клеток штаммы выращивали на агаризованной среде «К» (―Difco‖, США, 2%). Рост изолятов при различных значениях солености (0 – 6 % NaCl) и рН (5,0 – 11,0) исследовали на среде «К». Значения рН устанавливали добавлением 1 М NaOH и 5 н HCl. Образование индола из L-триптофана анализировали с реактивом Сальковского [21]. Калибровочную кривую строили со стандартными растворами индолилуксусной кислоты.

80

Общая биология

Штаммы, использованные в работе, источники их выделения и диапазоны (оптимумы) роста рН и солености Регион Источник рН % NaCl Штамм (географические выделения штамма (оптимум) (оптимум) координаты) Территория солеразработок г. Почва, 5м от Соликамск, 5,0 – 10,0 0 – 5,0 2395AТ террикона СКРУ № Россия (8,0 – 8,5) (1,0) 2 (53°38' N, 56°46' E) Засолѐнная почва Троицкий район, Челябинская обл., 5,0 – 10,0 0 – 6,0 2a Троицкого Россия (7,0 – 9,5) (1,0) заказника (53°56' N, 61°14' E) Плоды смородины г. Казань, Россия 5,0 – 10,0 0 – 3,0 RibW красной (Ribes (55°84' N, 49°21' (7,0 – 8,5) (1,0) rubrum L.) E) Почки березы г. Пущино, Московская обл., 5,0 – 10,0 0 – 2,5 1g повислой (Betula Россия (7,5 – 8,0) (1,0) pendula L.) (54°49' N, 37°37' E) Листья лавра г. Анапа, Краснодарский 5,0 – 10,0 0 – 5,0 AnapaLavr благородного край, Россия (44°57' (7,0 – 9,5) (1,0) (Laurus nobilis L.) N, 37°17' E) Листья падуба пгт. Никита, 5,0 – 9,0 0 – 3,0 PadubW остролистного (Ilex Республика Крым, Россия (7,0 – 8,0) (1,0) aquifolium L.) (44°30' N, 34°14' E) Листья полыни г. Севастополь, Республика Крым, 5,0 – 10,0 0 – 4,0 Polyn лечебной (Artemisia Россия (7,0 – 9,0) (1,0) abrotanum L.) (44°36' N, 33°29' E) Мальдивская 5,0 – 11,0 0 – 5,0 M52 Мангровые корни республика (0°35' S, 73°04' E) (7,5 – 8,5) (0,5) Ветки рябины г. Пущино, Московская обл., 5,0 – 10,0 0 – 6,0 Sorbus (Sorbus aucuparia Россия (7,0 – 7,5) (1,5) L.) (54°49' N, 37°37' E) Ризосфера осоки г. Минск, Беларусь 5,5 – 9,5 Minsk 0 – 3 (0,5) (Carex sp. L.) (53°54' N, 27°34' E) (7,0 – 8,0)

Микроскопия. Изучение морфологии клеток в режиме фазового контраста проводили с помощью оптического микроскопа Nikon Eclipse Ci

81

Известия ТулГУ. Естественные науки. 2019. Вып. 3

(―Nikon‖, Япония), оснащѐнного камерой ProgRes SpeedXT core5 (―Jenoptik‖, Германия). Выделение и анализ ДНК. ДНК выделяли с использованием набора ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep (―Zymo Research‖, США) в соответствии с рекомендациями фирмы - производителя. Уровень ДНК- ДНК гомологии штаммов PadubW, 2a, M52 c Methylopila oligotropha 2395AT определяли методом ДНК-ДНК реассоциации [22]. Ген 16S рРНК амплифицировали ПЦР, используя универсальные для прокариот праймеры 27f и 1492r [23]. Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1 %-ном агарозном геле. Выделение и очистку фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы проводили на колонках с использованием набора Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (―Zymo Research‖, США), согласно инструкции фирмы-производителя. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили с помощью набора реактивов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing kit (―Beckman Coulter‖, США) на анализаторе CEQ2000 XL (―Beckman Coulter‖, США). Филогенетический анализ. Предварительный филогенетический скрининг сходства последовательностей гена 16S рРНК проводили по базе данных GeneBank [NCBI] с помощью пакета программ BLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov). Для более точного определения филогенетического положения изолятов нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК выравнивали c последовательностями референтных штаммов ближайших прокариот с помощью программы CLUSTAL W [24]. Филогенетический анализ выполнен при помощи программы MEGA 5 [25]. Филогенетические деревья (филограммы) строили методом присоединения соседей (―neighbor-joining‖) [26]. Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью ―bootstrap-анализа‖ 1000 альтернативных филограмм. Геномный фингерпринт (RAPD-PCR-анализ) (метод случайной амплификации полиморфной ДНК) для выявления генотипических различий между исследуемыми штаммами проводили, используя праймеры BOXA1R [27], GTG5 [28] и OPQ1 [29]. Кластерный анализ продуктов амплификации после разделения методом электрофореза в 1 %- ном агарозном геле выполнен с использованием программы PyElph 1.4 и алгоритма «neighbor-joining» [30]. Результаты и обсуждение Используя метод накопительных культур из проб почвы и частей растений, отобранных из различных географически удаленных мест обитания, выделены чистые культуры метилотрофных бактерий (таблица). Все исследуемые изоляты представлены грамотрицательными, короткими палочками, при росте на агаризованной среде ―К‖ с 0,5% метанола при 29°С образовывали точечные или круглые (1 – 2 мм в диаметре)

82

Общая биология

однородные бесцветные колонии с ровным краем, гладкой поверхностью, выпуклым профилем. Спор и простек не образовывали, размножались бинарным делением. Все штаммы росли в жидкой среде с метанолом без агрегации клеток, пигмент не образовывали. На среде с нитратом как источником азота, 0,5 % метанола и 1 % триптофана синтезировали производные индола (3,2 – 5,4 мкг/мл культуральной жидкости при ОП600 культуры 1.0). Рост наблюдался при 20 – 37 ºC и pH 5,0 – 10,0 в присутствии в среде 0,5 – 1,0 % метанола и ∼1 % NaCl. Несмотря на одинаковый оптимум роста солености штаммы RibW, PadubW, Minsk, 1g, выдерживали до 2,5 – 3 % NaCl, штаммы AnapaLavr, Polyn и M52 – до 4 – 5 % NaCl, штаммы 2a и Sorbus – до 6 % NaCl (таблица), что позволяет отнести исследуемые штаммы к галотолерантным метилотрофам. На основании анализа последовательностей гена 16S рРНК определено таксономическое положение новых изолятов. Обнаружено, что штаммы 2a, RibW и 1g имели 99,9 – 100 %, штаммы AnapaLavr и Polyn – 99,2 %, PadubW – 98,8 %, а M52 – 98,7 % сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК с представителем рода Methylopila – M. oligotropha 2395AT. ДНК-ДНК гибридизация штаммов PadubW и M52 с типовым штаммом M. oligotropha 2395AT показала высокий уровень их гомологии: 75 % и 79 %, соответственно. Следовательно, семь новых штаммов отнесены к виду M. oligotropha, несмотря на то, что они выделены из географически отдаленных мест обитания. На основании секвенирования гена 16S рРНК штаммы Sorbus и Minsk имели сходство с M. oligotropha 2395AT (99,1 % и 98,4 %, соответственно) и M. capsulata IM1T (99,5 % и 98,8 %, соответственно). Выявленный уровень ДНК-ДНК гомологии штаммов Sorbus и Minsk с M. capsulata IM1T (96 % и 79 %, соответственно) свидетельствовал об их принадлежности к этому виду. При построении филогенетического дерева, основанного на сравнении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, для новых штаммов обнаружено образование ими отдельных непересекающихся групп (рис. 1). Интересно отметить, что филограмма, построенная отдельно для типовых представителей рода Methylopila, выявила корреляцию распределения согласно географическим регионам (рис. 2): штаммы, выделенные из субтропического или экваториального регионов, образовывали кластер, отдельный от штаммов, изолированных из областей с умеренным климатом. Отличительной особенностью проведенного филогенетического анализа стало образование двух аналогичных отдельных филогрупп среди штаммов вида M. oligotropha, изолированных из разных природно- климатических зон: умеренного (2a, RibW, 1g наряду с типовой 2395АТ) и

83

Известия ТулГУ. Естественные науки. 2019. Вып. 3

субтропического или экваториального поясов (AnapaLavr, PadubW, Polyn, M52) (рис. 1, 3).

Рис. 1. Филогенетическое положение представителей рода Methylopila, основанное на результатах сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. Использован метод “neighbor- joining”. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов (эволюционное расстояние). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap» анализа 1000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 50 %). Корень определен включением последовательности Methylobacillus flagellatus KTT (DQ287787) в качестве внешней группы

Мы провели множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК для типовых представителей рода Methylopila и новых изолятов. Сравнительный анализ вариабельного участка гена 16S рРНК (район с 936 по 995 нуклеотид) для рода Methylopila выявил наличие нуклеотидных различий у штаммов M. oligotropha (рис. 4). Так штаммы «южного» происхождения – AnapaLavr, PadubW, Polyn, и М52 имели одинаковые замены в четырех позициях (в положении 963, 965, 972 и 974 нуклеотидов от начала гена) по сравнению с типовым штаммом 2395АТ и штаммами (2a, RibW и 1g), изолированными из умеренного климатического региона.

84

Общая биология

Рис. 2. Филогенетическое положение типовых видов рода Methylopila, основанное на результатах сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. Использован метод “neighbor- joining”. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов (эволюционное расстояние) (А); Географическое распределение типовых видов рода Methylopila: 1) IM1T, 2) 2395АТ, 3) JZL-1T, 4) MUSAT, 5) LYBFD-16A2T, 6) Side1T (Б)

85

Известия ТулГУ. Естественные науки. 2019. Вып. 3

Рис. 3. Филогенетическое положение штаммов M. oligotropha, основанное на результатах сравнительного анализа нуклеотидных по- следовательностей гена 16S рРНК. Использован метод “neighbor- joining”. Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 1000 нуклеотидов (эволюционное расстояние) (А); географическое распределение штаммов M. oligotropha: 1 – 2395АТ, 2 – RibW, 3 – 2a, 4 – 1g, 5 – Padub, 6 – AnapaLavr, 7 – Polyn, 8 – M52 (Б)

При этом штаммы AnapaLavr, PadubW и Polyn были абсолютно идентичны на этом участке гена 16S рРНК, а штамм М52 имел две индивидуальные замены (Т/С в позиции 942 и Т/А в позиции 979). Отметим, что замены в позициях 963, 974 (у штаммов AnapaLavr, PadubW, Polyn, М52) и 942 (у штамма М52) сближали эти бактерии с M. henanensis LYBFD3-16A2T и M. turkensis Side1T, также объединенные в кластере 86

Общая биология

«южных» культур, образованном при построении филогенетического дерева для типовых штаммов рода на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК.

Рис. 4. Фрагмент множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК типовых видов рода Methylopila и новых изолятов. Нумерация последовательностей проведен по штамму 2395АТ. Выравнивание проводили с помощью программы CLUSTAL W

Помимо филогенетического разнообразия, для штаммов, отнесенных к виду M. oligotropha, был исследован внутривидовой полиморфизм. Геномный фингерпринт наглядно проиллюстрировал то, что все исследуемые изоляты имели отличительные особенности. Электрофорез продуктов RAPD-PCR с праймерами BOXA1R, GTG5 и OPQ1 выявил разное количество (от 2 до 15) и размеры (от 300 до 4000 п.н.) полученных ампликонов (рис. 5), следовательно, профили фингерпринта для каждого штамма были уникальны во всех трех реакциях. Проведенный кластерный анализ, выполненный с использованием программы PyElph 1.4, подтвердил полиморфизм паттернов для каждого штамма и обнаружил разделение изолятов, согласно их географическому происхождению (рис. 6). Так ПЦР-фрагменты штаммов AnapaLavr, PadubW, Polyn и М52, полученные с помощью праймеров BOXA1R и (GTG)5, кластеризовались на отдельной ветви от изолятов из районов умеренного климатического пояса. При разделении с помощью праймера OPQ1 общую группу сформировали штаммы AnapaLavr, Polyn и М52, тогда как профиль штамма PadubW образовал свою собственную ветвь, отличную от изолятов как «южного», так и «умеренного» регионов. Нами впервые выявлены особенности биогеографического распространения метилотрофных бактерий рода Methylopila. Согласно

87

Известия ТулГУ. Естественные науки. 2019. Вып. 3

филограмме, показывающей положение исследуемых штаммов на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, среди разных типовых представителей рода Methylopila, а также среди штаммов одного вида M. oligotropha, имеет место региональная дифференциация.

Рис. 5. Электрофореграмма результатов фингерпринт-анализа (RAPD- PCR) с использованием праймеров BOXA1R, GTG5 и OPQ1 для штаммов M. oligotropha: 1 - RibW, 2 - AnapaLavr, 3 - 1g, 4 - M52, 5 - Polyn, 6 - Padub, 7 - 2a, 8 - 2395АТ; M – маркер молекулярных масс (GenRuler DNA Ladder Mix, “Thermo Scientific”, США)

Полученные результаты свидетельствуют о том, что бактерии, выделенные из разных природно-климатических зон, характеризуются молекулярно-генетическим разнообразием. Так штаммы, выделенные из регионов со сходными климатическими условиями, имели похожие нуклеотидные замены в гене 16S рРНК, что отражалось на филогенетическом дереве в виде четкого разделения на две филогруппы. Несмотря на то, что некоторые изоляты отнесены к виду M. oligotropha, у них обнаружены индивидуальные замены нуклеотидов в последовательностях гена 16S рРНК, отличающие одну группу от другой. Одной из основных особенностей выявленного филогенетического паттерна для штаммов M. oligotropha является то, что все «южные» штаммы, кластеризующиеся отдельно от штаммов умеренной зоны, выделены из растений в прибрежных морских или океанических зонах с субтропическим или экваториальным климатом. При этом проведенное нами множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК выявило замены, сходные с типовыми штаммами Side1T и LYBFD3-16A2T, также изолированными в регионах с субтропическим климатом (Турции и Китае, соответственно). При этом анализ геномных

88

Общая биология

фингерпринтов показал, что для каждого из штаммов характерен свой профиль RAPD-PCR-продуктов, которые при этом кластеризовались аналогично филограмме. Вероятно, популяции представителей M. oligotropha генетически относительно однородны внутри того или иного климатического региона.

Рис. 6. Кластерные диаграммы штаммов M. oligotropha, основанные на результатах RAPD-PCR-анализа с использованием праймеров BOXA1R, GTG5 и OPQ1. Кластерный анализ выполнен с использованием программы PyElph v.1.4 и алгоритма «neighbor-joining»

Исходя из исследований в области биогеографии, очевидно, что в пределах определенной среды обитания популяции больше похожи друг на друга, чем сообщества, которые географически отдалены. Такое распределение может возникнуть из-за различий в растительном покрове или климатических условиях [31]. Результаты некоторых исследований показали, что параметры окружающей среды соответствующего географического региона, оказывая существенное влияние на 89

Известия ТулГУ. Естественные науки. 2019. Вып. 3

формирование видового состава растений, в конечном итоге определяет состав бактериальных сообществ. Поэтому биогеографические аспекты могут играть доминирующую роль в разнообразии бактерий, ассоциированных с растениями [32]. Агрессивное антропогенное воздействие на природу и изменение климатических условий в различных регионах напрямую может сказываться на межвидовой и внутривидовой изменчивости микроорганизмов, а сравнительный геномный анализ разных популяций штаммов M. oligotropha со временем позволит понять основы их адаптивной эволюции. Список литературы 1. Methylopila capsulata gen. nov., sp. nov., a novel non-pigmented aerobic facultatively methylotrophic bacterium / N.V. Doronina, Y.A. Trotsenko, V.I. Krausova [et al.] // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 1313- 1321. 2. Bowman J.P. Family V. Methylocystaceae fam. nov. // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. / Eds. Brenner D.J., Krieg N.R., Staley J.T., Garrity G.M. Springer, New York: Springer, 2005. V. 2. Part C. P. 411-413. 3. Kuykendall L.D. Order IV. Rhizobiales ord. nov. //Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. / Eds. Brenner D.J., Krieg N.R., Staley J.T., Garrity G.M. Springer, New York: Springer, 2005. V. 2. Part C. P. 324. 4. Methylopila musalis sp. nov., a new aerobic facultatively methylotrophic bacterium isolated from banana fruit / N.V. Doronina, E.N. Kaparullina, T.V. Bykova [et al.] // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2013. V. 63 (5). P. 1847–1852. 5. Methylopila jiangsuensis sp. nov., an aerobic, facultatively methylotrophic bacterium / L. Li, J.W. Zheng, B.J. Hang [et al.] // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. V. 61 (7). P. 1561–1566. 6. Галофильные и галотолерантные аэробные метилобактерии из техногенных соликамских биотопов / М.Н. Порошина, Н.В. Доронина, Е.Н. Капаруллина [и др.] // Микробиология. 2013. T.82. № 4. С. 473-473. 7. Methylopila henanense sp. nov., a novel methylotrophic bacterium isolated from tribenuron methyl-contaminated wheat soil / Y.N. Wang, W.Y. Tian, W.H. He [et al.] // Antonie van Leeuwenhoek. 2015. V. 107 (2). P. 329- 336. 8. Methylopila turkiensis sp. nov. – новый аэробный факультативно метилотрофный фитосимбионт / Н.В. Агафонова, Е.Н. Капаруллина, Н.В. Доронина [и др.] // Микробиология. 2015. T.84. № 4. С. 456-465. 9. Исправленные описания Advenella kashmirensis subsp. kashmirensis subsp. nov., Advenella kashmirensis subsp. methylica subsp. nov.

90

Общая биология

и Methylopila turkiensis sp. nov. / М.Н. Шмарева, Н.В. Агафонова, Е.Н. Капаруллина [и др.] // Микробиология. 2016. Т. 85. № 5. С.617-619. 10. Fierer N., Jackson R.B. The diversity and biogeography of soil bacterial communities // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 626–631. 11. Мишустин Е.Н. Закон зональности и учение в микробных ассоциациях почвы // Усп. соврем. биол. 1954. Т. 37. Вып. 1. С. 1–27. 12. Microbial biogeography: putting microorganisms on the map / J.B.H. Martiny, B.J.M. Bohannan, J.H. Brown [et al.] // Nature Rev. Microbiol. 2006. V. 4. P. 102–112. 13. O’Malley M.A. Everything is everywhere: but the environment selects‖: ubiquitous distribution and ecological determinism in microbial biogeography // Studies in History and Philosophy of Science Part C: Studies in History and Philosophy of Biological and Biomedical Sciences. 2008. V. 39. P. 314–325. 14. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria / R.T. Papke, N.B. Ramsing, M.M. Bateson [et al.] // Environ. Microbiol. 2003. V. 5 (8). P. 650- 659. 15. Phylogeography of the thermophilic cyanobacterium Mastigocladus laminosus / S.R. Miller, R.W. Castenholz, D. Pedersen [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P. 4751–4759. 16. Whitaker R.J., Grogan D.W., Taylor J.W. Geographic barriers isolate endemic populations of hyperthermophilic archaea // Science. 2003. V. 301. P. 976–978. 17. P’aramo P., Ghosh S., DiRuggiero J. Evidence for genetic drift in the diversification of a geographically isolated population of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus // Mol. Biol. Evol. 2005. V. 22. P. 2297–303. 18. Biogeography of thermophilic phototrophic belonging to Roseiflexus / V.A. Gaisin, D.S. Grouzdev, Z.B. Namsaraev [et al.] // FEMS microbiology ecology. 2016. V.92(3). P. fiw012. 19. Wilpiszeski R.L., Zhang Z., House C.H. Biogeography of thermophiles and predominance of Thermus scotoductus in domestic water heaters // Extremophiles. 2019. V. 23(1). P. 119-132. 20. Kaparullina E.N., Trotsenko Y.A., Doronina N.V. Methylobacillus methanolivorans sp. nov., a novel non-pigmented obligately methylotrophic bacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2017. V. 67. P. 425-431. 21. Gordon S.A., Weber R.P. Colorimetric estimation of indoleacetic acid // Plant Physiol. 1951. V. 26. P. 192–195 22. Анализ ДНК-ДНК гомологии у облигатно-метилотрофных бактерий / Н.В. Доронина, Н.И. Говорухина, A.M. Лысенко [и др.] // Микробиология. 1988. Т. 57. С. 629–633. 23. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing in nucleic acid techniques in bacterial systematics. Edited by Stackebrandt E., Goodfellow M. Chichester: John Wiley and Sons. 1991. P. 115–175. 91

Известия ТулГУ. Естественные науки. 2019. Вып. 3

24. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools / J.D. Thompson, T.J. Gibson, F. Plewniak [et al.] // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4876–4882. 25. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods / K. Tamura, D. Peterson, N. Peterson [et al.] // Mol. Biol. Evol. 2011. V. 28. P. 2731–2739. 26. Saitou N., Nei M. The neighbour-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 405–425. 27. Use of repetitive DNA sequences and the PCR to differentiate Escherichia coli isolates from human and animal sources / P.E. Dombek, L.K. Johnson, S.T. Zimmerley [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 2572–2577. 28. Methylobacterium trifolii sp. nov. and Methylobacterium thuringiense sp. nov., methanol-utilizing, pink-pigmented bacteria isolated from leaf surfaces / S. Wellner, N. Lodders, S. P. Glaeser [et al.] // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2013. V. 63(7). P. 2690-2699. 29. Balachandar D., Raja P., Sundaram S.P. Genetic and metabolic diversity of pink-pigmented facultative methylotrophs in phyllosphere of tropical plants // Braz. J. Microbiol. 2008. V. 39. P. 68–73. 30. Pavel A.B., Vasile C.I. PyElph – a software tool for gel images analysis and phylogenetics // BMC Bioinformatics. 2012. V. 13. P. 9. 31. The ecology of the phyllosphere: geographic and phylogenetic variability in the distribution of bacteria on tree leaves / A. J. Redford, R. M. Bowers, R. Knight [et al.] // Environ. Microbiol. 2010. V. 12(11). P. 2885-2893. 32. Wellner S., Lodders N., Kämpfer P. Diversity and biogeography of selected phyllosphere bacteria with special emphasis on Methylobacterium spp. // System. Appl. Microbiol. 2011. V. 34(8). P. 621-630.

Агафонова Надежда Валериевна, канд. биол. наук, младший научный сотрудник, [email protected], Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, ФИЦ Пущинский научный центр биологических исследований РАН, Капаруллина Елена Николавна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник, [email protected], Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, ФИЦ Пущинский научный центр биологических исследований РАН, Доронина Нина Васильевна, д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник, [email protected], Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, ФИЦ Пущинский научный центр биологических исследований РАН

BIOGEOGRAPHY AND MOLECULAR-GENETIC POLYMORPHISM OF BACTERIA OF METHYLOPILA GENUS ISOLATED FROM DIFFERENT CLIMATE ZONES 92

Общая биология

N.V. Agafonova, E.N. Kaparullina, N.V. Doronina

For the first time features of the biogeographic distribution of methylotrophic bacte- ria of the genus Methylopila were discovered. The regional differentiation was found in type members of the genus Methylopila: strains from the regions with similar climate conditions were affiliated to separate phylogroups based on a comparison of the 16S rRNA gene se- quences. In addition, the formation of analogous clusters as a result of phylogenetic and fin- gerprint (RAPD-PCR) analyzes represents intraspecific molecular genetic polymorphism of the strains belonging to the species M. oligotropha, isolated from different climate regions. Key words: methylotrophic bacteria, Methylopila, Methylopila oligotropha, molecu- lar genetic polymorphism, biogeography.

Agafonova Nadezhda Valerievna, candidate of biological sciences, junior researcher, [email protected], Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences, Federal Research Center ―Pushchino Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences‖, Kaparullina Elena Nikolaevna, candidate of biological sciences, senior researcher, [email protected], Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences, Federal Research Center ―Pushchino Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences‖, Doronina Nina Vasil’evna, doctor of biological sciences, leading researcher, doronina@ ibpm.pushchino.ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences, Federal Research Center ―Pushchino Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences‖

93