Universidade Federal do Rio de Janeiro Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências
Juliana Silva Nascimento De Novais
Caracterização da matéria prima vegetal e atividade biológica das folhas de Senna alata (L.) Roxb. Em acessos na caatinga (BA) e restinga (RJ), Brasil
MACAÉ-RJ, 2017
Universidade Federal do Rio de Janeiro Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências
Juliana Silva Nascimento De Novais
Caracterização da matéria prima vegetal e atividade biológica das folhas de Senna alata (L.) Roxb. Em acessos na caatinga (BA) e restinga (RJ), Brasil
Dissertação a ser apresentada pela aluna Juliana Silva Nascimento de Novais ao Programa de Pós Graduação em Produtos Bioativos e Biociencias, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Campus UFRJ Macaé, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof Dr Gilberto Dolejal Zanetti Co-orientação: Prof. Drª Elaine dos Anjos da Cruz da Rocha
Macaé, RJ 2017
CARACTERIZAÇÃO DA MATÉRIA PRIMA VEGETAL E ATIVIDADE BIOLÓGICA DAS FOLHAS DE SENNA ALATA (L.) ROXB. EM ACESSOS NA CAATINGA (BA) E RESTINGA (RJ), BRASIL
Juliana Silva Nascimento de Novais
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Produtos Bioativos e Biociencias da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
Aprovada em 30 de Outubro de 2017.
______Prof Dr Arídio Mattos Junior
______Prof Dr Edison Luis Santana de Carvalho
______Prof Dra Michelle Frazão Muzitano
______Orientador: Prof Dr Gilberto Dolejal Zanetti
______Coorientadora: Profa Dra Elaine dos Anjos da Cruz da Rocha
Macaé, RJ 2017
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter me presenteado com o dom da vida. Gostaria de agradecer a diversas pessoas pela ajuda, apoio, contribuição, atenção e paciência, sem os quais tornaria a realização desse trabalho imensamente árduo. Estas são: Meu esposo, por apoiar, participar e está sempre disposto a me ajudar em uma participação direta na concretização dos meus sonhos. Pela paciência durante incontáveis horas em que tive que está no laboratório ou escrevendo durante madrugadas. Pelo amor que ameniza a dor e torna tudo possível. À minha mãe e minha irmã pelo amor incondicional, pelas palavras doces e duras de amor e de encorajamento, por sempre se fazerem tão presentes mesmo a distância sendo um abismo. Sou grata ao meu orientador Gilberto Zanetti por nunca escolher o caminho mais fácil ou conveniente, mas por sempre escolher o caminho certo. Por ter acreditado em mim quando eu própria não podia. Pelo carinho e amizade dispensados a mim. Por cumprir de maneira graciosa e exemplar o sentido da palavra “mentor” na sua definição mais completa. Pela sua brilhante capacidade científica. Pela sua incansável dedicação no desenvolvimento da carreira de cada um dos seus alunos. Pelas suas aulas que iam além do assunto proposto, de forma didática e interessante. Pelo exemplo de inspiração. Agradeço também a minha coorientadora Elaine da Rocha, por generosamente abrir as portas do seu laboratório e compartilhar seu conhecimento e recurso no desenvolvimento desse trabalho. Por ter me abraçado e por não ter medido esforços em me ajudar e apoiar. Por não olhar simplesmente naquilo que se investiga, mas se preocupar de forma generosa com quem está investigando. Pelo exemplo de paciência, sabedoria e liderança. Aos técnicos e amigos do Instituto de ciência e tecnologia de Macaé, em especial, Jobert e Jéssyca, que foram sempre presentes durante esses anos e me ajudaram no desenvolvimento desse trabalho. Aos docentes, Denise, Edison e Michelle, por me ensinarem que além de cérebros brilhantes haviam corações generosos e dispostos a ajudar. Por toda auxílio, conselhos e apoio no desenvolvimento desse estudo. Ao professor Arídio que aceitou contribuir com esse trabalho. Agradeço universidade de Taubaté em especial a colaboração da professora Josseara Beralto, que mesmo sem me conhecer me apoiou no que foi preciso para concluir os experimentos. A equipe da secretaria de coordenação do PRODGRADBIO, principalmente, a Andreia e o Leonardo pela atenção, paciência e carinho. Enfim a todas as pessoas que contribuíram direta e indiretamente na realização desse trabalho e que porventura tenham sido omitidas, meus sinceros agradecimentos.
RESUMO
NOVAIS, Juliana Silva Nascimento. Caracterização da Matéria prima vegetal e atividade biológica das folhas de Senna alata (L.) Roxb. em acessos na caatinga (BA) e restinga (RJ), Brasil. Macaé, RJ, 2017. Dissertação (Mestrado em ciências) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Macaé, 2017.
Senna alata (L.) Roxb. é uma leguminosa arbustiva da família Fabaceae introduzida na caatinga e na restinga do Brasil. Essa espécie possui utilização tradicional para fins medicinais o que motivou este estudo que visa caracterizar as folhas e identificar, comparativamente, as atividades biológicas de Senna alata (L.) Roxb. em acessos na caatinga (BA) e restinga (RJ). Após a coleta, o material foi desidratado e levado a pó. Obtiveram-se extratos etanólicos a 40 % por maceração e, este extrato bruto seco, foi resuspenso em diferentes solventes de acordo com o ensaio a ser realizado. Optou-se pelo extrato etanólico a 40 % uma vez que os acessos apresentaram maior teor extrativo nesta concentração de solventes. As folhas nos dois acessos apresentaram morfo-anatomia semelhante pelas técnicas farmacopeias, destacando-se como marcador os tricomas tectores e a presença de estômatos nas duas faces da epiderme. Também se obteve resultados de pureza satisfatórios aos padrões farmacopeicos. Detectou-se flavonoides, saponinas hemolíticas, antraquinonas e mucilagem para os dois acessos e taninos apenas no acesso da restinga. O teor total de polifenois e de flavonoides foi semelhante nos dois acessos. O perfil cromatográfico foi obtido em cromatoplacas de sílica gel com sistema eluente constituído por hexano: acetato de etila (1:1) e vanilina sulfúrica mantida a 100º C por 5 minutos como agente cromogênico, revelando 2 bandas semelhantes para os acessos. A determinação da atividade antibacteriana por bioautografia demonstrou que os dois acessos inibiram o crescimento de Staphylococcus aureus e Escherichia coli. A atividade alelopática frente a diásporos de Lactuca sativa demonstrou potencial alelopático em extratos nas concentrações a partir de 0,5 %, sujerindo atividade inseticida e herbicida. O extrato dos acessos não demonstrou citotoxidade nas concentrações 50 e 100 μg/mL pelo método de {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio]}, nas concentrações testadas. A atividade anti-inflamatória avaliada pela dosagem de óxido nítrico e fator de necrose tumoral alfa por células intraperitoneais de camundongo Swiss, induzido por lipopolissacarídeo e o polissacarídeo Zymosan. Observou-se um potencial efeito anti- inflamatório sobre macrófagos peritoneais quando estimulados com lipopolissacarídeo e tratados com os 2 acessos na concentração 100 µg/mL, e em macrófagos estimulados por Zymosan, após tratamento a partir de 50 µg/mL do acesso caatinga e 100 µg/mL do acesso restinga. Os extratos apresentam baixa toxidez aguda via intraperitoneal em camundongos Swiss, com concentração letal de 40 e 60 g/kg nos acessos da caatinga e restinga, respectivamente e os níveis de lactato desidrogenase mantiveram-se normais. Os resultados obtidos foram semelhantes para os acessos de Senna alata na caatinga e restinga, sendo que os extratos estudados revelaram baixa toxidez e resultados promissores nas atividades biológicas testadas, conferindo para as folhas de à Senna alata potencialidade real no desenvolvimento de um fitoterápico.
Palavras chaves: Fabaceae; Senna alata; Farmacobotânica; Plantas medicinais; Atividades biológicas; Anti-inflamatório; Toxidez; Citotoxidade.
ABSTRACT
NOVAIS, Juliana Silva Nascimento. Characterization of vegetable raw materials and biological activity of the leaves of Senna alata (L.) Roxb. in access in the caatinga (BA) and restinga (RJ), Brazil. Macaé, RJ, 2017. Dissertation (master of science)-Federal University of Rio de Janeiro, Macaé, 2017.
Senna alata (L.) Roxb. is a shrubby legume of the Fabaceae family introduced in the caatinga and the restinga areas of Brazil. This species is traditionally used for medicinal purposes. Therefore this study aims to compare the characterization and identification of leaves, the biological activities of Senna alata (L.) Roxb. in access from the caatinga (Bahia) and restinga (Rio de Janeiro). After collection, the material was dehydrated and taken to dust. Ethanolic extracts were obtained at concentration of 40% by maceration. This crude extract, was ressuspended in various solvents according to the test being performed. We opted for the 40% ethanolic extract once the hits presentedthe most extractive content in this concentration of solvents. The leaves showed morpho-anatomy by using Pharmacopoeias techniques, including tectores and estomatic trichomes types. It was also observed satisfactory results of purity according to Pharmacopeia standards. It were detected flavonoids, haemolytic saponins, anthraquinones and mucilage for both access and tannins only in resting access. The total content of polyphenols and flavonoids was similar both accesses. The chromatographic profile was retrieved from cromatoplates of silica gel with eluent system of hexane: ethyl acetate (1:1) and sulfuric vanillin at 100 ºC for 5 minutes as chromogenic agent, revealing two similar bands to both accesses. The determination of antibacterial activity obtained by bioautography showed that the two approaches accesses inhibited the growth of Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Alelopatic activity, were evaluated in Lactuca sativa diaspores and showed allelopathic potential in extracts at concentrations of 0.5 %, which suggested insecticide and herbicide activity. The cytotoxic potential was evaluated by {bromide [3-(4.5-dimetiltiazol-2yl)-2.5-diphenyl tetrazolium]} and both accesses were not cytotoxic at tested concentrations. The in vitro anti-inflammatory activity was evaluated by determination of nitric oxide and tumor necrosis factor alpha produced by intraperitoneais mouse cells induced by lipopolysaccharide and Zymosan polysaccharide. The results indicated that both accesses of Senna alata have an effective anti-inflammatory activity on peritoneal macrophages at 100 µg/mL after lipopolysaccharide stimulation. Using the Zymosan stimuli, it was observed an anti-inflammatory activity with 50 µg/mL of in the caatinga access and at 100 µg/mL of restinga access. The extracts feature low acute toxicity after intraperitoneal administration in Swiss mice, with lethal dose at 40 mg/kg and 60 mg/kg for access of the caatinga and restinga, respectively. The lactate dehydrogenase levels remained normal. The results were similar to those of Senna alata in caatinga and restinga, being extracts studied revealed low toxicity and promising results on biological activities tested, giving to the leaves of the Senna alata real capability in developing a phytotherapeutic.
Key words: Fabaceae; Senna alata; Farmacobotânica; Medicinal plants; Biological activities; Anti-inflammatory; Toxicity; Cytotoxicity.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Aspecto geral de Senna alata (L.) Roxb...... 23 Figura 2 Estruturas químicas encontradas em Senna alata (L.) Roxb...... 25 Figura 3 Estrutura química básica da antraquinona...... 25 Figura 4 Transformação de {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio]} (MTT) em { E, Z- 1- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -1,3-difenilformasan } (Formasan)...... 31 Figura 5 Aspecto geral das folhas de Senna alata (L.) Roxb...... 53 Figura 6 Venação da folha de Senna alata (L.) Roxb. acesso caatinga...... 54 Figura 7 Venação da folha de Senna alata (L.) Roxb. acesso restinga...... 55 Figura 8 Aspecto geral das folhas desidratadas de Senna alata (L.) Roxb...... 55 Figura 9 Secção paradérmica da lamina foliar de Senna alata (L.) Roxb. acesso caatinga..... 56 Figura 10 Secção paradérmica da lamina foliar de Senna alata (L.) Roxb. acesso restinga...... 57 Figura 11 Glanulometria por tamisação das folhas em pó de Senna alata (L.) Roxb...... 61 Figura 12 Reta obtida a partir da curva padrão de ácido gálico no ensaio de quantificação de fenolicos totais de Senna alata (L.) Roxb. nos acesso caatinga e restinga...... 68
Figura 13 Gráfico obtido a partir da curva de calibração realizada com rutina na obtenção do teor total de flavonoides nos extratos das folhas de Senna alata (L.) Roxb. nos acessos caatinga e restinga...... 69 Figura 14 Representação do perfil cromatográfico obtido para os extratos etanólicos a 40 % a partir das folhas de Senna alata (L.) Roxb., sobre cromatofolhas de sílica gel G 60 F254...... 71 Figura 15 Germinabilidade (%) de Lactuca sativa L. frente extratos de Senna alata (L.) Roxb. obtidas na caatinga (A) e na restinga (B) nas concentrações de 0,5, 1 e 2 %...... 74 Figura 16 Teste de viabilidade do extrato de Senna alata (L.) Roxb. das soluções extrativas dos acessos catinga e restinga nas concentrações de 50 µg/mL e 100 µg/mL em macrófagos pelo método de 3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio...... 76 Figura 17 Inibição da citocina TNF-α após tratamento com extrato hidroetanólico de Senna alata (L.) Roxb, caatinga e restinga, das células RAW-264-7, estimuladas com LPS 78 Figura 18 Produção de óxido nítrico os grupos tratados com Senna alata(L.) Roxb...... 79 Figura 19 Inibição da citocina TNF-α após tratamento com extrato hidroetanólico de Senna alata (L.) Roxb. caatinga e restinga, das células RAW-264-7, estimuladas com Zymosan...... 81 Figura 20 Produção de NO nos grupos tratados com Senna alata (L.) Roxb. nos acessos de restinga e caatinga...... 82 Figura 21 Potencial tóxico de Senna alata (L.) Roxb. acesso caatinga e restinga...... 83 Figura 22 Liberação da LDH em soro sanguíneo de camundongos Swiss tratados com extratos de Senna alata (L.) Roxb...... 84
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Microorganismos utilizados nos ensaios de bioautografia...... 39 Tabela 2 Características macroscópicas das folhas de Senna alata (L.) Roxb...... 54 Tabela 3 Características microscópicas em das folhas de Senna alata (L.) Roxb. nos acessos restinga e caatinga...... 56 Tabela 4 Descrição macroscópica e organoléptica das folhas em pó de Senna alata (L.) Roxb...... 60 Tabela 5 Determinação físico-química referente à pureza das folhas de Senna alata (L.) Roxb...... 63 Tabela 6 Determinação do teor extrativo dos extratos hidroetanólicos obtidos a partir das folhas de Senna alata (L.) Roxb...... 64 Tabela 7 Triagem fitoquimica dos extratos etanólicos a 40% obtidos a partir das folhas de Senna alata (L.) Roxb. dos acessos restinga e caatinga...... 65 Tabela 8 Conteúdo de fenólicos totais de Senna alata caatinga e restinga em mg de ácido gálico/g por amostra...... 68 Tabela 9 Conteúdo de flavonoides totais de Senna alata caatinga e restinga em mg de rutina/g por amostra...... 70 Tabela 10 Tabela 10 Halos de inibição obtidos em bioautografia dos extratos de Senna alata (L.) Roxb., acesso caatinga e restinga, frente a Staphilococcus aureus e Escherichia coli...... 73
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A3P Programa da agenda ambiental na administração pública AAs Ácido acetilsalicílico AcOEt Acetato de Etíla AINEs Anti-inflamatórios não esteroidais AIEs Anti-inflamatórios esteroidais ANOVA Análise de variância ARMDS Antirreumáticos modificadores da doença AVC Acidente vascular cerebral Ca Caatinga CCD Cromatografia de camada delgada CEUA Comissão de ética no uso de animais CONAMA Conselho nacional do meio ambiente CP Controle positivo DC Células dendríticas
DL50 Dose letal de 50 % DMSO Dimetilsufoxido DMSO-c Dimetilsulfoxido completo EtOH Etanol FMS Fenazina metosulfato IE Índice estomático Ig Imunoglobulina IkB Inibidor de Kappa B IL-2 Imugnoglobina 2 I.p Intra peritoneal LDH Lactato desidrogenase LES Lúpus eritematoso sistêmico LPS Lipopolissacarideo MTS Tetrazólio MTT {Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil tetrazólio]} NAD Difosfopiridino nucleotídeo NF-KB Fator nuclear kappa B NO Óxido nítrico OMS Organização mundial da saúde PA Padrão analítico PIB Produto interno bruto PBS Tampão fosfato salino PNPMF Programa nacional de plantas medicinal e fitoterápico PNPIC Política nacional de práticas integrativas e complementares
Re Restinga Rf Fator de retenção PRRs Receptores de reconhecimento padrões SUS Sistema único de saúde TNFα Fator de necrose tumoral-alfa UFC Unidade formadora de colônia UV Ultra violeta XTT 2,3-bis (2-metoxi-4nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)carbonil]-2H-hidróxido de tetrazólio Zy Zymosan
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...... 14
1.1 Caatinga x Restinga ...... 18
1.2 Família Fabaceae ...... 19
1.3 Senna alata (L.) Roxb...... 22
1.4 Emprego medicinal de Senna alata (L.) Roxb...... 23
1.5 Substâncias químicas no gênero Senna e Senna alata (L) Roxb...... 23
1.6 Atividades biológicas ...... 26
1.6.1 Atividade antimicrobiana em bioautografia ...... 27
1.6.2 Alelopatia: interferências sobre comunidades vegetais...... 28
1.6.3 Atividade citotóxica pelo método MTT ...... 30
1.6.4 O processo inflamatório e o estimulo por lipopolissacarídeo (LPS) e zymosan (Zy) ...... 31
1.6.5 Toxidez aguda ...... 35
1.7 A importância de estudos sobre Senna alata como medicinal ...... 36
2. OBJETIVOS ...... 38
2.1 Objetivo Geral ...... 38
2.2 Objetivos Específicos ...... 38
3. MATERIAL E MÉTODOS ...... 39
3.1 Material vegetal ...... 39
3.2 Solventes, reagentes e substâncias referência utilizadas ...... 39
3.3 Micro-organismos ...... 39
3.4 Cultura de Macrofagos ...... 39
3.5 Animais ...... 40
3.6 Análise morfo-anatômica das folhas de Senna alata ...... 40
3.6.1 Análise Morfológica ...... 40
3.6.2 Análise Anatômica ...... 41
3.7 Determinação do teor de extrativos ...... 42
3.8 Análise físico-química das folhas pulverizadas de Senna alata ...... 43
3.9 Análise fitoquímica dos extratos das folhas de Senna alata ...... 44
3.9.1 Determinação do pH dos extratos ...... 45
3.9.2 Determinação de antraquinona ...... 45
3.9.3 Determinação de saponinas ...... 45
3.9.4 Determinação de saponinas hemolíticas ...... 45
3.9.5 Determinação de flavonoides ...... 46
3.9.6 Determinação de mucilagem ...... 46
3.9.7 Determinação de taninos ...... 47
3.9.8 Determinação do teor de polifenois totais ...... 47
3.9.9 Determinação do teor de flavonoides totais ...... 47
3.9.10 Perfil cromatográfico dos extratos em cromatografia de camada delgada (CCD) ...... 48
3.10Determinação de atividades biológicas dos extratos das folhas de Senna alata...... 48
3.10.1 Determinação da atividade antibacteriana ...... 48
3.10.2 Determinação da atividade alelopática ...... 49
3.10.3 Viabilidade celular pelo MTT ...... 49
3.10.4 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vitro ...... 50
3.10.5 Determinação da toxidez intraperitoneal aguda ...... 51
3.11 Análise estatística dos resultados ...... 52
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 53
4.1 Morfo-anatomia e caraterização organoléptica das folhas de Senna alata ...... 53
4.1.1 Análise macroscópica ...... 53
4.1.2 Análise microscópica ...... 56
4.1.3 Análise macro-microscópica e organoléptica das folhas em pó ...... 59
4.2 Análise físico-química ...... 62
4.3 Determinação do teor extrativo ...... 64
4.4 Triagem fitoquímica dos extratos ...... 65
4.4.1 Determinação de polifenois totais ...... 67
4.4.2 Determinação de flavonoides totais ...... 69
4.4.3 Perfil cromatográfico em cromatografia de camada delgada ...... 71
4.5 Atividades biológicas ...... 73
4.5.1 Atividade antibacteriana ...... 73
4.5.2 Atividade alelopática ...... 74
4.5.3 Viabilidade celular pelo método MTT ...... 76
4.5.4 Atividade anti-inflamatória in vitro com LPS ...... 77
4.5.5 Atividade anti-inflamatória in vitro com Zymosan ...... 80
4.5.6 Toxidez aguda ...... 83
5. CONCLUSÕES ...... 86
REFERENCIAS ...... 88
14
1. INTRODUÇÃO A valorização da medicina tradicional nos mais diferentes países começou a ser mais estimulada quando a Organização Mundial de Saúde (OMS), no ano de 1978, reconheceu e recomendou as plantas como medicinais, como medida para minimizar a falta de medicamentos, principalmente no atendimento primário à saúde (Akerelle, 1988; Gottlieb, 1993). A utilização de plantas com objetivos medicinais é bastante difundida em todo o mundo. Na Alemanha, por exemplo, já no final do século passado, 70 % dos médicos em clínica geral prescreviam fitoterápicos (Blumentahl, 1998). No Brasil, conforme Veiga Junior (2008) as plantas medicinais são muito utilizadas em diversas formas de tratamentos de saúde, apesar da disponibilidade de medicamentos alopáticos. Sempre é ressaltado que há a necessidade de aliar esse conhecimento popular a estudos científicos para minimizar situações preocupantes que a falta de informações pode gerar, tanto para a população quanto para a ciência, a exemplo dos possíveis efeitos da automedicação (Ferreira et al., 2005; Aquino, 2008). Em 2006, foram publicadas políticas governamentais voltadas para o setor de plantas medicinais e, desde então, o governo federal do Brasil, em parceria com um número elevado de prefeituras, têm estruturado programas para o uso de fitoterápicos por meio do decreto 5813/2006, a exemplo da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicas (PNPMF), portaria interministerial 2960/2008 e a Política Nacional de Práticas Integrativas e complementares (PNPIC), portaria 971/2006, integrado ao Sistema Único de Saúde (SUS). Essas iniciativas foram tomadas com o objetivo claro de contribuir consideravelmente para o uso racional de fitoterápico, e na promoção de ações efetivas que constitui na distribuição de medicamentos fitoterápicos. Tais políticas trazem como diretrizes, dentre outras ações, o incentivo à pesquisa sobre as plantas medicinais, priorizando a biodiversidade do país, motivando as instituições de pesquisas e as indústrias farmacêuticas buscarem estratégias para avançar etapas na obtenção de novos fitomedicamentos, obedecendo ao controle de qualidade (Brasil, 2014; Brasil, 2016). Existem requisitos de qualidade que a produção de medicamentos obrigatoriamente obedece, os quais passam, por exemplo, pela avaliação dos componentes empregados na sua produção. Para cumprir essas exigências, a 15
Farmacopéia Brasileira, inclui monografias de diversas plantas utilizadas como medicinais destacando experimentos e as padronizações necessárias que garantem minimamente a qualidade dessas plantas como drogas vegetais numa linha de produção de medicamentos (Farmacopeia Brasileira, Ed. V, 2010). Mais de 70 espécies vegetais que ocorrem no Brasil possuem monografias publicadas na quinta edição da Farmacopeia Brasileira (2010), onde são apresentados os critérios para definir a identidade, bem como pureza e teor de constituintes químicos. Ressalta-se que a preparação de uma monografia oficial sobre determinada planta medicinal exige estabelecer as características botânicas, químicas, farmacológicas e toxicológicas, além de estudos científicos mais detalhados, incluindo a analise morfo-anatômica, a padronização química e testes de pureza nos procedimentos de fabricação de um fitoterápico a partir de drogas vegetais (Simões e Schenkel, 2001; Maciel et al., 2002; Veiga e Pinto, 2005; Brasil, 2014). As análises físico-químicas, por exemplo, são procedimentos que aperfeiçoam a qualidade na produção de medicamentos e, consequentemente, imprimem uma maior segurança na qualidade na obtenção de um fitoterápico (Abifito, 2003; Brasil, 2014; Kroes, 2014). O estudo farmacobotânico em conjunto com avaliações físico químicas, contribui no controle de qualidade, padronização das composições química das drogas, tornando o seu uso eficaz e seguro, pois é comum que espécies distintas, pertencentes a diferentes famílias, sejam confundidas e empregadas para um mesmo fim terapêutico pelo fato de apresentarem características morfológicas semelhantes ou nome popular comum. Assim é que as análises morfo-anatômicas fornecem subsídios que contribui na padronização dos insumos e permitem a diferenciação entre as amostras, inclusive entre espécies botanicamente próximas (Amaral et al., 2005; Kremer et al., 2005). Por outro lado, tem-se de ter claro que o perfil químico e consequentemente a atividade biológica de plantas medicinais pode ser afetado pelas condições de cultivo, manufatura, comercialização e distribuição. A biossíntese dos metabólitos secundários sofre variações em função de diferenças fisiológicas, genéticas no qual se encontra o vegetal. Também, horário de colheita, condições de armazenagem, secagem, métodos de 16 extração, a forma como é feito o processamento e o tipo embalagem interfere no resultado final utilizada (Sahoo et al., 2010; Folashade et al., 2012). Além de possíveis falsificações e equívocos com a droga vegetal que se fará uso em uma pesquisa ou na linha de produção de um medicamento, destaca-se que a época, local e condição em que uma droga é coletada são fatores de suma importância no que se refere a quantificação de seus metabólitos secundários. Estudos relatam que a quantidade e, às vezes, até mesmo a natureza dos constituintes químicos ativos não é constante durante todo o ano, nem em todos os locais em que a planta ocorre naturalmente ou é cultivada. É comum o relato de variações sazonais no conteúdo de praticamente todas as classes de metabólitos secundários. A temperatura, luz, disponibilidade de água também estão diretamente envolvidos na composição química das plantas (Grace, 1998; Hogedal, 2000; Agerbirk, 2001; Tattini, 2004; Voltolino e Santos, 2011). Para garantir que os medicamentos disponíveis no mercado farmacêutico sejam seguros e eficazes é necessário que estes cumpram as normas técnicas para a produção e o controle de qualidade. Na indústria farmacêutica, o controle de qualidade das drogas de origem vegetal é de fundamental importância para garantir a qualidade do produto final, e, consequentemente, do medicamento comercializado ao paciente. Além dos ensaios para aprovação, todos os medicamentos devem passar também por estudos de estabilidade, conforme determinado pela resolução RE nº 01 de 29 de julho de 2005 (Brasil, 2005; Oliveira, 2009). Nos procedimentos rotineiros de análise da qualidade, geralmente é preconizado o emprego de metodologias em controle físico-químico e farmacobotânica, sendo necessária à correlação entre os parâmetros analisados e a finalidade a que se destina o medicamento. O controle de qualidade procura avaliar as drogas, quanto a identificação correta (parte usada e espécie botânica), pesquisas qualitativa e quantitativa de marcadores químicos (muitos deles, princípios ativos) e de impurezas e falsificações, segundo as monografias das farmacopeias e publicações científicas. Na ausência de parâmetros estabelecidos, padrões de drogas são utilizados para comparação (Simões et al., 2001). Para isso são feitos muitos tipos de teste tais como: índice de intumescência, densidade relativa, testes de 17 pureza e impurezas, teste de metais pesados, chumbo, umidade, perda por secagem, cinzas totais, saponinas. Todos os procedimentos devem ser realizados de acordo com os protocolos das farmacopeias e darão resultados que devem ser padronizados para cada droga vegetal diante de suas singularidades (Brasil, 2010). O uso popular e mesmo tradicional não são suficientes para validar as plantas medicinais como medicamentos eficazes e seguros (Simões et al., 2001). Neste sentido, as plantas medicinais não se diferenciam de qualquer outro produto sintético. Se a intenção é utilizar uma planta medicinal como medicamento, ela deve ter sua ação comprovada e sua toxicidade potencial avaliada cientificamente como qualquer outro medicamento (Brandão, et al., 2006; Melo et al., 2007; Brandão et al., 2009a). Contudo, a partir do estabelecimento dos parâmetros de qualidade para a matéria-prima, e considerando-se um planejamento adequado e um controle do processo de produção do produto final, a qualidade do medicamento estará, em grande parte, assegurada. Portanto, a qualidade da matéria-prima vegetal é a determinante inicial da qualidade do fitoterápico, mas não garante a eficácia, a segurança e a qualidade do produto final (Oliveira, 2009). Ressalta-se ainda que o controle de qualidade de drogas vegetais deve ser realizado em todas as etapas que envolvem a produção das mesmas, como parte do cultivo racional (solo, luminosidade, temperatura, irrigação), colheita e pós colheita, embalagem e armazenagem adequadas, para que o produto final atenda aos requisitos de qualidade para um medicamento (Brasil, 2005; Oliveira, 2009). Questões como as descritas acima demarcam o quanto é importante considerar tanto o manejo, como o local onde a planta é cultivada, por constituírem determinantes importantes para garantir a qualidade, a eficiência e a eficácia de um medicamento, podendo interferir diretamente na quantidade e características dos metabolitos secundários presentes na planta (Souza et al., 2010). Nesse sentido, este trabalho traz um estudo comparativo farmacobotânico, físico-químico, fotoquímico e biológico de Senna alata (L.) Roxb. de acessos da caatinga (BA) e da restinga do Brasil.
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1.1 Caatinga x Restinga O Brasil abriga vários biomas, como por exemplo, a restinga e a caatinga. A Caatinga ocorre exclusivamente em território brasileiro, com abrangência de 70 % da região nordeste e ainda parte de Minas Gerais, totalizando 11 % do território nacional (Giulietti et al., 2003; Leal et al., 2003; Araújo e Sobrinho, 2009). Na linguagem tupi, caatinga significa Mata Branca (caa = Mata + tinga = branca). A razão para esta denominação reside no fato dessa vegetação apresentar-se verde somente em pequenas épocas de chuva, o que é raro. No restante do ano, a caatinga é vista sem folhas, normalmente em vegetação baixa, o que permite que a vista penetre sem dificuldade até grande distância, sobressaindo a cor clara dos caules que ficam esbranquiçados na ausência da folhagem (Maciel et al., 2010). Outras características peculiares das plantas da caatinga são encontradas na presença de caules e raízes suculentas que armazenam água e nutrientes, além do ciclo de vida dessas plantas que em geral é curto e comumente há dormência nas sementes. Essas plantas, em grande número são utilizadas pelos sertanejos como alimentos, remédios, plantas forrageiras e fontes de madeira e de energia (Maciel et al., 2010; EMBRAPA, 2012). Giulietti, 2003, afirmou que apesar desse bioma encontrar-se bastante alterado, especialmente nas terras mais baixas, contém uma variedade de tipos vegetacionais, com elevado número de espécies vegetais e remanescentes de vegetação ainda bem preservada, que incluem um número expressivo de táxons endêmicos. Diferente da caatinga, em um espaço geográfico formado por depósitos à linha da costa, onde se encontram diferentes comunidades que recebem influência marinha, encontra-se a restinga. Essa vegetação está localizada ao longo da faixa litorânea, na Zona Costeira (mais de 8,5 mil Km de extensão em terras brasileiras), elas são marcadas por uma grande variedade de paisagens que se repetem ao longo do litoral (EMBRAPA, 2012). O CONAMA (Conselho Nacional de Meio Ambiente) em 2002, na resolução 3303/2002, art.2°, definiu restinga como:
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Depósito arenoso paralelo a linha da costa, de forma geralmente alongada, produzido por processos de sedimentação, onde se encontram diferentes comunidades que recebem influência marinha, também consideradas comunidades edáficas por dependerem mais da natureza do substrato do que do clima. A cobertura vegetal nas restingas ocorre mosaico, e encontra-se em praias, cordões arenosos, dunas e depressões, apresentando, de acordo com o estágio sucessional, estrato herbáceo, arbustivos e abóreo, este último mais interiorizado. (CONAMA, 2002, resolução 3303/2002, art. 2°)
Assim é que a restinga pode ser encontrada como resultado de diferentes fenômenos naturais, onde as principais formações deste bioma que ocorrem no extenso litoral brasileiro encontram-se de São Paulo a Alagoas (Amaral, 2008). Frequentemente faz-se referência ao fato das restingas no Brasil apresentarem poucos endemismos, o que comumente é justificado pelo fato das áreas da planície costeira ser relativamente recentes do ponto de vista geológico (Rizzini, 1979; Araújo e Henriques, 1984, Silva, 1990). No Rio de Janeiro, a restinga está formada a partir de sedimentos depositados pelo mar, trazidos ou da plataforma continental ou por retrabalhado nos sedimentos quem vem pelos rios depositados na praia (Silva, 1990). Conforme autores como Irwin e Barneby (1982), citado por Rodrigues e colaboradores (2005), apesar das variabilidades geológicas e climáticas, existem espécies vegetais que são comumente encontradas tanto na caatinga quanto na restinga, e outras espécies vegetais são introduzidas nestes biomas, como é o caso de Senna alata. Essa coexistência em biomas diferentes acarreta algumas peculiaridades à pesquisa, pelo fato de os vegetais apresentarem características específicas de acordo o ambiente onde estão inseridos (Souza et al., 2010).
1.2 Família Fabaceae A família botânica Fabaceae é popularmente conhecida como leguminosa, e constitui-se na terceira maior família de angiospermas, com 19325 espécies abrigadas em 727 gêneros (Lewis et al., 2005). É comum encontrá-las em uma grande extensão do globo terrestre, principalmente em regiões com condições tropicais de alta temperatura e umidade, estando também presente em menor número nas regiões temperadas (Lima et al., 1994). As leguminosas são reconhecidas por ser uma família de “múltiplo uso”, o que provavelmente está relacionado com sua elevada diversidade em 20 espécies. O potencial econômico dessa família é amplamente conhecido, pois muitas espécies fornecem madeiras, óleos e resinas de boa qualidade. Produzem matéria prima para perfumes, tinturas e fármacos, sendo muitas espécies utilizadas como ornamental. É comum também o consumo dos seus frutos. Além disso, devido associação que fazem com bactérias capazes de fixar nitrogênio, diversas espécies desta família são empregadas como adubo natural (Lewis e Owen, 1989; Costa et al., 2008). Uma particularidade das espécies que constituem a família Fabaceae está na plasticidade de hábitos de crescimento, o que incluem ervas, lianas e plantas arbustivas de diferentes tamanhos. O caule apresenta folha composta ou recomposta e as suas flores são tipicamente chamativas para atrair polinizadores, além disso, essa família é normalmente reconhecida devido a presença de frutos com formato de vagem (Judd, 2002). Para Fabaceae são reconhecidas as subfamílias: Caesalpinioideae, Mimosoideae e Papilionoideae (ou Faboideae), conforme Lorenzi (2002) e Judd (2002). Nesse trabalho destaca-se a subfamília Caesalpinoidea que possui aproximadamente 154 gêneros e 2800 espécies, com ocorrências nas regiões tropicais e subtropicais, principalmente na América do Sul, África tropical e sudeste da Ásia, sendo pouco representada na América do norte e em outras regiões temperadas (Cowan, 1981; Lewis, 1987; Lewis e Polhill, 1998, Judd, 2002). No Brasil foram catalogados aproximadamente 178 gêneros e aproximadamente 1550 espécies (Barroso et al., 1978; Lorenzi, 2002). De acordo com Lewis e Polhill (2005), existem 4 tribos atualmente aceitas para Caepinoideae: Caesalpinieae, Cassieae, Cercideae e Detarieae. A espécie vegetal que trata esse estudo, Senna alata, pertence a tribo Cassieae que compreende seis gêneros (Apuleia, Cassia, Chamaecrista, Dialium, Martiodendron e Senna) muito similares, principalmente Cassia e Senna, (Lorenzi, 2002; Costa et al., 2008). Irwin e Barneby (1982) fizeram diferenciações indispensáveis a serem observadas e incluídas nas chaves de identificação para estes dois gêneros. Senna distingue-se de Cassia principalmente pelos filetes retos, mais curtos ou até duas vezes o comprimento das anteras, pelas anteras basifixas e pela presença de nectários extraflorais na maioria das espécies. Por outro lado, Senna difere de Chamaecrista principalmente pela ausência de bractéolas (excepcionalmente 21 presentes), pelo androceu zigomorfo e pelos legumes que podem ser indeiscentes (Lorenzi, 2002). O gênero Senna é monofilético e é o segundo maior gênero da tribo Cassieae com aproximadamente 300 espécies de distribuição pantropical, das quais cerca de 200 espécies são americanas (Irwin e Barneby, 1982; Lewis, 2005). No Brasil tem-se cerca 80 espécies, das quais, 26 ocorrem exclusivamente neste país (Souza e Bortoluzzi, 2012). O trabalho realizado por Irwin e Barneby (1982), o mais abrangente para o gênero, caracteriza o mesmo pelas flores amarelas, normalmente assimétricas, sem bractéolas no pedicelo, androceu heteromórfico e anteras basifixas, bem como folhas comumente com nectários entre os pares de folíolos e frutos predominantemente indeiscentes. Segundo Lewis e colaboradores (2005), o gênero possui muitas espécies com propriedades medicinais. Outras têm sua madeira empregada na construção civil ou como ornamental, no paisagismo e arborização de ruas, parques e jardins, devido a grande beleza no período do seu florescimento (Lorenzi, 2002). Varias espécies de Senna são utilizadas na medicina popular. A maioria delas foi descritas e classificadas cientificamente pelos botânicos Irwin e Barneby, Philip Miller (Mill), pelo médico e botânico escocês William Roxburgh (Roxb.) e pelo alemão Carl Ludwig Willdenow (Will) também botânico, médico e farmacêutico. Entre as espécies catalogadas por esses autores, destaca-se S. alexandrina, S. corymbosa, S. didymobotrya, S. italica, S. reticulata, S. spectabilis e S. sophera, todas com nome popular como sene, fedegoso ou cássia. As folhas da maioria destas plantas citadas são utilizadas como laxante por apresentar antraquinonas em sua constituição química (Ibrahim e Osman, 1995; Khan et al., 2001; Somchit et al., 2003; Ordoñez et al., 2004; Barrese et al., 2005; Plantamed, 2016). Dentre estas espécies, há destaque para Senna alexandrina, também cognominada de Cassia angustifolia, descrita pelo botânico inglês de origem escocesa Philip Miller (Mill). Senna alexandrina é popularmente conhecida como Sene, e é considerada como planta medicinal, com vasta utilização em fitoterapia sendo prescrito para as atividades laxativa, purgativa e em tratamento de constipação intestinal, além de possuir componentes que auxiliam no combate de verme e alivio de flatulência. Nativa no Egito, onde é cultivada comercialmente, S. alexandrina também cresce em vários outros 22 locais do oriente, no entanto o potencial dos seus constituintes químicos não se revela quando cultivado fora das condições climáticas adaptativas (Blumenthal et al., 1998; Heber, 2004; ANVISA, 2016).
1.3 Senna alata (L.) Roxb. Senna alata (L.) Roxb. (Figura 1), pertence à família Fabaceae. Nativa do norte da América do Sul, essa espécie vegetal se tornou cosmopolita tropical, com vasta distribuição geográfica na África, Ásia, além de toda a América tropical, onde é cultivada desde os Estados Unidos da América até a Argentina. Esta planta é também conhecida pela sinonímia de Cassia alata, e possui denominações populares como alcapulco, “fedegoso gigante”, “fedegosão (ao odor dessa espécie que não se compara a nenhum outro, considerando Suigeneres)”, “mangerioba-do-pará”, “mangerioba-grande (devido quando torradas são utilizadas no preparo de uma bebida semelhante ao café)”, “mata-pasto-grande (sugestivo ao potêncial contaminante em áreas de pastoreiro)”, “café-beirão”, “candelabro amarelo e dartrial” (Irwin e Barneby, 1982; Nascimento e Queiroz, 2012; Souza e Bortoluzzi, 2012). Constitui-se uma espécie perene e arbustiva muito frequente dentro e no entorno de cidades, ocorrendo naturalmente em áreas de pastagens, beira de estradas e terrenos baldios, preferencialmente em lugares úmidos, havendo tendência a formação de estandes puros (Souza F., 1995; Lorenzi, 2000). A planta apresenta caule fino com circunferência no nível do solo de 34,2 cm, com 2 m de altura e copa esgalhada e espalhada em todas as direções, algumas vezes muito ramificada a partir da base. Trata-se de uma planta pioneira e perene de crescimento rápido declinando o seu desenvolvimento após 2-3 anos de estabelecimento no local (Irwin e Barneby, 1982; Rodrigues et al., 2005; Souza e Bortoluzzi, 2012). Em geral é tratada como uma planta daninha, constituindo-se em um problema de ordem bioeconômica a limitar o desempenho produtivo e a rentabilidade da atividade agrícola (Rodrigues et al., 2009). Contudo, por outro lado, tem uso etnofarmacológico como já descrito neste trabalho e ainda, conforme Viana e colaboradores (2008) e Medeiros e colaboradores (2011) esta planta pode ser uma importante ferramenta no controle de pragas agrícolas, eficaz no controle de micro-organismos, através do uso dos seus 23 extratos, uma vez que a quimiotaxonomia aponta constituinte como flavonoides e outros polifenois no gênero.
A B
Figura 1 Aspecto geral de Senna alata (L.) Roxb. Legenda : (A) Acesso caatinga; (B) Acesso Restinga. Fonte: Nascimento, 2016.
1.4 Emprego medicinal de Senna alata (L.) Roxb.
As folhas de Senna alata são utilizadas popularmente devido as suas propriedades medicinais. Na Índia, todas as partes da planta são utilizadas nos sistemas de medicina ayurvedica, unani e alopática, principalmente como finalidade digestiva (Damodaran e Venkataraman, 1994). Pesquisas apontaram que também são utilizadas popularmente no tratamento de anemia, blenorragia, congestão do fígado, hemorróidas, herpes, malária, pano branco, tratamento e prevenção da erisipela, sarnas, tumores, leucemia, tuberculose, câncer e inflamações (Ibrahim e Osman, 1995; Khan et al., 2001, Somchit et al., 2003, Awal et al., 2004; Barrese et al., 2005 e Pieme et al., 2006). As folhas, inflorescências e raízes de S. alata têm atividade biológica comprovada como sendo antimicrobiana eficaz no tratamento de dermatites, blenorragia e herpes, além de ser diurética e laxativa. No entanto, além dessas propriedades terapêuticas, essa planta deve ser ministrada com cuidado, pois é suspeita de ser tóxica aos rins e, ainda, considerada abortiva (Lorenzi, 2000; Plantamed, 2016). 1.5 Substâncias químicas no gênero Senna e Senna alata (L) Roxb. Em vegetais, tem-se muitos metabólitos secundários que são substâncias químicas capazes de atuarem diretamente no crescimento, desenvolvimento, reprodução e defesa dos organismos principalmente contra a 24 herbivoria e ao ataque do oxigênio produzido dentro da planta pela máquina fotossintetizante (Foye e Williams, 1995; Fraga, 2001; Stamp, 2003). Segundo Gupta e Singh (1991), espécies do gênero Senna são ricas em flavonoides, antraquinonas, taninos e saponinas. Além disso, foram relatados para esse gênero esteroides, alcaloides piperidínicos e isoquinolínicos, cromonas, lactonas, estilbenos e triterpenos (Alemayehu e Abegaz, 1996; Valencia et al., 2000). Apesar da correlação de compostos entres os gêneros da subfamília Caesalpinoide, as espécies se diferem entre si devido a existência ou ausência dessas substâncias químicas naturais (Alemayehu et al., 1998). As folhas de S. alata são ricas em cristais de oxalato de cálcio, ao longo de suas nervuras - característica da subfamília Caesalpinioideae, além de flavonoides e antraquinonas que foram encontrados em células epidérmicas e em células dispersas no parênquima paliçádico, especialmente nas proximidades da nervura mediana (Barrese et al., 2005). Segundo Ordoñez (2004), as folhas possuem flavononas, flavonas e xantonas além de esteroides livres e taninos catéquicos. No sistema biológico, os flavonoides apresentam capacidade antioxidativa (esta constitui a atividade mais elucidada pelos estudos até agora desenvolvidos), atividades anti-inflamatórias e de efeito vasodilatador, ação antialérgica, atividade contra o desenvolvimento de tumores, anti-hepatotó- xica, antiulcerogênica, atuação antiplaquetária, bem como ações antimicrobianas e antivirais. Os flavonoides podem inibir vários estágios dos processos que estão diretamente relacionados com o início da aterosclerose, como ativação de leucócitos, adesão, agregação e secreção de plaquetas (Lemmens, 2015), além de atividades hipolipidêmicas e aumento de atividades de receptores de LDL (Koes et al., 1994; Peterson, 1998; Zuanazzi e Montanha, 2010). Moriyama e colaboradores (2001; 2003) reportaram a presença kampferol-3-O-gentiobioside e Luteolina (Figura 2) em folhas de S. alata, demonstrando que durante o período de outubro a dezembro há decréscimo no conteúdo destes flavonoides.
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A B
A
Figura 2 Estruturas químicas encontradas em Senna alata (L.) Roxb. Legenda: (A) kampferol-3-O- gentiobioside; (B) 3',4',5,7-tetrahidroxiflavona (Luteolina). Fonte: Novais, 2017.
O gênero Senna é rico em antraquinona, que constitui uma classe de compostos químicos com diversas propriedades biológicas e farmacológicas. Para Barrese (2005), estes compostos em Senna alata comprova a propriedade antimicotica. As antraquinonas pertencem à classe das quinonas, constituem o grupo mais numeroso das quinonas naturais. Entre as características de sua estrutura destaca-se a presença de dois grupos carbonílicos que formam um sistema conjugado de três anéis (Liu, 2009), como mostra a figura 3.
Figura 3 Estrutura química básica da antraquinona. Fonte: Novais, 2017.
As antraquinonas estão presentes largamente no reino vegetal e para a farmácia apresentam uma variedade de funções biológicas, tais como laxantiva, diurética, fitoestrogênica, estimulante de imunidade, antifúngica, antiviral e agente anticancerígeno (Moraes, 2010). Mais da metade das 26 antraquinonas naturais são encontradas em fungos, a exemplo das espécies Penicillium e Aspergillus e em liquens. Existem alguns casos isolados encontrados em insetos, como o ácido carmínico, extraído das fêmeas da colchinilha (Dactylopius coccus), um inseto hemíptero da família dos coccídeos, muito perniciosos às plantas cultivadas (Liu, 2009; Moraes, 2010). Oliveira (2012) identificou a presença de 53 antraquinonas descritas para o gênero Senna. Entre esses, 24,5 % dos compostos presentes nos registros encontrados são dímeros, 18,9 % são glicosídeos e 56,6 % são antraquinonas livres. Alemayehu e colaboradores (1996) e Valência e colaboradores (2000), constataram em S. alata, a presença de 1,5,7-trihidroxi-3 metilantraquinona (emodina) e senosidio A e B, o que justifica o potencial laxativo de suas folhas. Devido à proximidade das espécies, S. alata apresenta composição química similar à S. alexandrina, a exemplo da presença de emodina, antraquinona, flavonoide do tipo campferol, mucilagens, cristais de oxalato de cálcio e senosídio A e B (Blumenthal et al., 1998; Heber, 2004; Ordoñez, 2004; Barrese et al., 2005; Liu, 2009). Essas substâncias quimicas podem estar diretamente relacionadas à função biológica desta planta.
1.6 Atividades biológicas Estudar as atividades biológicas ou farmacológicas que uma determinada droga apresenta é essencial para descrever os efeitos benéficos ou adversos dela sobre os seres vivos. Esses efeitos podem ser revelados a partir de modelos in vitro ou in vivo (Fraga, 2001). A utilização de modelos in vitro como estratégia de redução do número de animais é proposto em clássicos como o livro “The Principle of Humane Experimental Technique” de Russel e Bruch em 1959. Assim é que, em princípio, deve-se utilizar a atividade in vivo para confirmação dos resultados encontrados nos testes in vitro quanto satisfatória ou, quando o teste in vitro não é suficiente para avaliação da atividade em questão, a exemplo do estudo dos agentes esquistossomicida (Araújo, et al., 2016). 27
1.6.1 Atividade antimicrobiana em bioautografia Os métodos mais utilizados para detecção da atividade antimicrobiana são ensaios in vitro, que normalmente não trazem informações sobre o modo de ação do extrato vegetal. As avaliações in vitro podem ser realizadas por difusão, diluição ou bioautografia. Essas metodologias objetivam identificar se um extrato, fração ou molécula possui ou não atividade antimicrobiana, além de avaliar a intensidade dessa atividade e identificar os componentes do extrato da planta com atividade frente a bactérias ou fungos (Zachino, 2001; Ostrosky et al., 2008). A bioautografia é um protocolo comumente utilizado na pesquisa de produtos naturais desde 1946, quando foi utilizado pela primeira vez por Goodall e Levi. Constitui-se um método prático que basea-se no desenvolvimento dos micro-organismos, junto a uma cromatografia em camada delgada formando zonas de inibição em bandas específicas em seus Rfs na cromatoplaca. Esta prática permite o biomonitoramento para o isolamento e purificação de substâncias químicas que tenham atividade antimicrobiana desejada a patir de um extrato vegetal. Para tanto, deve-se atentar à qualidade da cromatografia, da suspensão bacteriana e as condições de incubação das cromatoplacas (Botz et al., 2005; Colorado et al., 2007; Hostettmann et al., 2008). Por outro lado, apesar de ser considerado simples e de baixo custo, esse ensaio, quando utilizado em meio ágar, não é apropriado para análise de compostos que não se difundem facilmente nesse hidrocoloide (Khurram et al., 2009). Para tanto, existem três métodos bioautográficos que são utilizados: bioautografia de contato, método de sobreposição do ágar e a biautografia direta (Scorzoni et al., 2007). Nos dois primeiros métodos utiliza-se ágar enquanto que no terceiro método esse hidrocoloide não é utilizado. Na bioautografia de contato (método realizado neste estudo), as cromatoplacas são colocadas nas placas de petri e cobre-se a mesma com o meio de cultura onde os micro-organismos são inoculados. Já no ensaio de sobreposição do ágar, a placa de petri é coberta primeiramente com o meio de cultura onde os micro-organismos são inoculados e as cromatoplacas são sobrepostas a ele. Estes experimentos são vantajosos principalmente pelo fato de apresentar resultados satisfatórios a compostos polares ou moderadamente polares (Botz et al., 2005; Choma, 2005; Khurram et al., 2009). A bioautografia 28 direta utiliza apenas a cultura líquida do micro organismo, que cresce diretamente sobre a cromatoplaca, de forma que este terceiro subtipo de bioautografia é apropriado para análise de compostos que não se difundem facilmente no ágar (Horváth et al., 2010). Nas três variações da bioautografia, após o período de incubação dos micro-organismos, em que a cromatoplaca dentro da placa de petri com o meio onde o micro organismo está se desenvolvendo, é mantida em estufa, borrifa- se sal tetrazolico que é convertido quase que imediatamente em formasan, corando de vermelho os locais com atividade antimicrobiana. Assim é que se formam manchas claras pela inibição de crescimento do micro-organismo utilizado e, essas manchas, apresentam-se bem localizadas, demarcando no cromatograma as zonas de inibição nos respectivos Fatores de retenção (Rfs) e dessa forma, apontando as bandas com atividade antimicrobiana para cada micro-organismo utilizado (Choma, 2005; Valgas et al., 2007).
1.6.2 Alelopatia: interferências sobre comunidades vegetais Nas comunidades vegetais, as plantas interagem entre elas de maneira positiva, negativa ou neutra. Comumente, as plantas vizinhas interagem de maneira negativa, por exemplo, enquanto algumas espécies absorvem maior quantidade de nutrientes outras não conseguem absorver o suficiente para sua sobrevivência, ocorrendo, consequentemente o crescimento de uma planta ou a inibição de ambas. Os metabólitos secundários sintetizados por plantas, frequentemente geram efeitos em outros organismos e, em muitos casos, possuem a função de compostos químicos de defesa ou aleloquímicos (Mota, 1975; Chom e Kim, 2004; Macias, 2007). No ano de 1969, Muller determinou o termo interferência como as interações entre os organismos vizinhos. Por este termo ser muito abrangente, em 1977, Szczepanski o subdividiu em alelopatia, alelospolia e alelomediação. Contudo, há de se destacar que o termo alelopatia, utilizado para denominar essas interferências, foi criado por Molisch em 1937 tendo origem no grego allelon = de um para outro, pathós = sofrer, conforme Souza (2006). A alelopatia é uma interferência caracterizada pela introdução de substâncias químicas por um organismo vivo de forma que estes componentes venham a prejudicar o desenvolvimento normal de outros componentes da 29 comunidade. A alelospolia, também denominada de competição, é caracterizada toda vez que um organismo vivo, consegue absorver o máximo de nutrientes, luz e água, prejudicando o desenvolvimento das plantas vizinhas. A alelomediação ou interferência indireta, se caracterizada por ser uma modificação física no ambiente que é provocada por um organismo com reflexos aos seres vivos vizinhos (Szczepanski, 1977; Muller, 1969; Formagio, 2010). É importante ressaltar que o conceito de alelopatia descreve a capacidade de um vegetal interferir de forma natural no desenvolvimento da vegetação adjacente, por meio de substâncias químicas denominadas “aleloquímicos” liberados no ambiente, quem venham promover qualquer efeito direto ou indireto, danoso ou benéfico, sobre outra planta (Rice, 1984; Rizvi et al., 1992; Rodrigues et al. 1999; Macías, 2007). Os aleloquímicos são liberados na atmosfera ou no solo por quatro vias: exsudação radicular, lixiviação, volatilização e decomposição dos resíduos da planta. A exsudação radicular é a liberação de compostos na forma líquida (aminoácidos, nucleotídeos), através das raízes, diretamente no solo. A lixiviação ocorre com a liberação de compostos exsudados na forma líquida (compostos fenolicos e alcaloides como é o caso da cafeína e a nicotina), normalmente pelas folhas que são lavados da planta por ação da água da chuva ou irrigação e carregados até o solo. Na volatilização há a liberação de compostos como o limoneno, mirceno e o mentol que são micromoléculas que se localizam normalmente em estrutras epidérmicas e se volatizam com facilidade. Por fim, a última via de liberação da-se pela decomposição de restos vegetais, havendo a liberação de compostos químicos, como isoflavonas e antocianinas, na medida em que os restos vegetais vão sendo decompostos por micro-organismos ao longo do tempo (Carvalho, 2013). Independente da forma que ocorre a inibição, a interferência pode ser aproveitada de forma positiva na produção de inseticidas, repelentes de insetos, venenos usados na pesca, para o desenvolvimento de produtos biológicos com ação sobre plantas (bio-herbicidas) na agricultura e +no controle de plantas daninhas a uma determinada cultura através da rotação/sucessão de culturas ou no uso de cobertura viva na entressafra e no uso de cobertura morta (Chom e Kim, 2004; Souza, 2006). Conforme Malheiros 30 e Peres (2001) e Macías (2007), entre os aleloquímicos comumente citados como responsáveis por causarem efeitos diretos e indiretos estão os terpenos, alcaloides, flavonoides, ácidos graxos de cadeia longa e lactonas insaturadas. Os terpenos, por exemplo, podem atuar como inseticidas, como por exemplo, o pineno, o limoneno, o mirceno e os peretroides além de algumas saponinas. Podem, ainda, atuarem como repelentes ou atrativos de insetos como muitos óleos essenciais e lactonas sesquiterpênicas, ou mesmo como compostos tóxicos e exemplo do phorbol, algumas saponinas e resinas. Dentre os flavonoides destacam-se os isoflavonoides que funcionam como inseticidas e as antocianinas que funcionam como atrativos de insetos.
1.6.3 Atividade citotóxica pelo método MTT O termo citotoxicidade, segundo NIH (2001), significa causa de efeitos tóxicos como morte celular, devido, por exemplo, alterações na permeabilidade da membrana celular ou inibição enzimática. Com isso testes de viabilidade celular in vitro são utilizados para verificar citotoxicidade aguda, dentre os quais está o ensaio de proliferação celular {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difenil tetrazólio]} (MTT), conforme NIH (2001) e Lazzarini (2015). Em geral, os ensaios de atividade citotóxica medem a prorção de células viáveis após um procedimento traumático. Conforme definido na ISO 10993-5 (2009), pode-se avaliar a citotoxicidade por análise morfológica das celulas ou por analises de aspectos referentes ao metabolismo celular. Os testes validados para esse fim são o 3T3 NRU, teste de citotoxicidade para formação de colônias, MTT, MTS e XTT (2,3-bis (2-metoxi-4nitro-5-sulfofenil)-5- [(fenilamino) carbonil]-2H-hidroxido de tetrazólio) de citotoxicidade (NIH, 2001; ICCVAM, 2006). O ensaio do MTT é um teste colorimétrico usado para avaliar a viabilidade celular em que as desidrogenases mitocondriais, presentes apenas em células metabolicamente viáveis, clivam o anel de tetrazólio, transformando sua coloração amarela em violeta, pela formação do composto formasan {E, Z- 1-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-1,3-difenilformasan}, cristais insolúveis em soluções aquosas (figura 4). Dessa forma, a produção de formasan reflete o estado funcional da cadeia respiratória, sendo sua formação diretamente proporcional 31
à atividade mitocondrial e a viabilidade celular (Rutala e Weber, 1999; Lazzarini, 2015).
Redução Mitocondrial
MTT Formazan
Figura 4 Transformação de {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio]} (MTT) em { E, Z- 1- (4,5- dimetiltiazol-2-il) -1,3-difenilformazan } (Formazan). Fonte: Novais, 2017.
1.6.4 O processo inflamatório e o estimulo por lipopolissacarídeo (LPS) e zymosan (Zy) A inflamação ou flogose (do latim inflamare, do grego fhlogos, que significa pegar fogo) é uma reação complexa dos tecidos conjuntivos vascularizados em resposta a estímulos endógenos ou exógenos que podem causar dano celular. Os estímulos endógenos são derivados de degenerações ou necroses tissulares e de alterações na resposta imunológica, por imunocomplexos ou reações autoimunes. Os estímulos exógenos referem-se à indução por agentes físicos químicos e biológicos (Lima et al., 2009; Brasileiro Filho, 2011). Um fenômeno irritativo como um trauma, promove uma resposta rápida do organismo, resposta esta que é mediada principalmente pelos leucócitos. Assim é que num quadro inflamatório existem sinais marcantes, os chamados danos teciduais, que provocam no local da inflamação calor, rubor, edema e dor seguido da perda de função dos tecidos em casos mais avançados. Cada um destes sinais corresponde ao avanço do quadro inflamatório (Iwalewa et al., 2007; Lima et al., 2009). A inflamação pode ser aguda ou crônica, tanto uma quanto a outra possui os mesmos mecanismos iniciais, o que as diferem são o tempo de exposição ao agente agressor, o tipo de agente e a resposta imune. A 32 inflamação aguda é de curta duração, totalizando alguns minutos a no máximo dois dias, dependendo do estímulo causal. Suas principais características são a exsudação de fluidos e proteínas do plasma e emigração de leucócitos, predominantemente neutrófilos. A inflamação crônica é menos uniforme do que a inflamação aguda, apresentando duração mais longa e caracterizando-se histologicamente pela presença de linfócitos e macrófagos, proliferação de vasos sanguíneos (neoangiogênese) e tecido conjuntivo denominado fibroplasia (Janeway, 2002; Bechara, 2006; Lopes e Amaral, 2013). Quando o estímulo desencadeante do processo inflamatório é controlado por tratamento, a inflamação é inibida. Contudo, toda vez que o estímulo não for devidamente tratado, o indivíduo que sofre a inflamação pode chegar a um estado crônico desse processo inflamatório, a exemplo das neoplasias, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico (LES), acidente vascular cerebral (AVC), Alzheimer e artrite reumatoide (Ballou et al., 1993; Baumann et al., 1994; Ticani, 2003). Na defesa contra agentes infecciosos a resposta imune é fundamental em todo o processo, contituindo o principal impedimento para a ocorrência de infecções disseminadas. Assim é que o quadro de infecção envolve uma ação coordenada entre o sistema imunológico e o tecido no qual ocorreu a lesão, sendo comum o surgimento de outras doenças caso a inflamação não seja controlada (Tilley et al., 2001; Machado, 2004; Zhou et al., 2007; Rang e Dale, 2008; Lima et al., 2009). Experimentalmente, uma inflamação pode ser induzida por diferentes métodos in vivo ou in vitro (Mogilski et al., 2016). Um método frequentemente utilizado para o estímulo da inflamação in vitro tem sido realizado com o lipopolissacarídeo (LPS). O LPS é uma endotoxina presente em bactérias gram-negativas que consiste de uma estrutura composta por duas camadas de açúcar e uma camada lipídica, uma parte hidrofílica e outra hidrofóbica, respectivamente, sendo que a porção lipídica é considerada a responsável pela maior ação antigênica. A presença de LPS, mesmo que em pequena quantidade, é identificada pelos monócitos, que através de uma resposta imunológica inata passa a expressar diferentes moléculas A sinalização intracelular induzida pela interação do LPS com seus receptores desencadeia a ação de genes relacionados à resposta inflamatória aguda por intermédio de 33 citocinas pró-inflamatórias a exemplo do TNF-α (Rietschel et al., 1994; Chen e Greene, 2004; Tuin et al., 2006; Gosh e Hayden, 2008). Assim como o estímulo à resposta imunológica frente a um processo inflamatório realizado com o LPS, tem-se o polissacarídeo zymosan (Zy) como sendo outro estímulo à essa resposta imunológica. Zy é um polissacarídeo proveniente da parede de Saccharomyces cerevisiae, capaz de ativar macrófagos e induzir a liberação de mediadores inflamatórios. O Zy é utilizado em ensaios por administração via intraperitoneal em animais de laboratório, pois estudos demonstram que a inflamação induzida por estímulos com o Zy é dependente da presença de células tipo macrófagos e mastócitos residentes na cavidade peritoneal. Estas células são altamente secretórias e produzem mediadores inflamatórios e anti-inflamatórios. O polissacarídeo Zy é reconhecido pelos macrófagos através do receptor dectina-1, que é expresso predominantemente em monócitos, macrófagos e neutrófilos e em uma população de células T do baço. Ressalta-se também que o Zy é capaz de estimular a produção de citocinas inflamatórias e pode ativar o sistema complemento na ausência de imunoglobulinas. Além disso, esse polissacarídeo é capaz de induzir a maturação de células dendríticas in vitro e estimular a produção de IL-2 por essas células, indicando a ligação entre as respostas imunológica inata e adaptativa (Underhill et al., 1999; Ribeiro et al., 2000; Granucci et al., 2003; Mazur-Bialy et al., 2012; Mogilski et al., 2016). Neste processo onde se tem LPS ou Zy como estímulos à resposta imunologica frente à inflamação, as células de defesa do organismo são ativadas em meio inflamatório, promovendo a liberação de citocinas, como TNF-α, que acabam por induzir a morte de células tumorais combatendo a inflamação (Meffert e Baltimore, 2005; Mogilski et al., 2016). O TNF-α é uma citocina altamente pró-inflamatória que apresenta propriedades benéficas ou injuriantes no processo inflamatório, constituindo-se como principal mediador da resposta inflamatória aguda a bactérias gram- negativas e outros patógenos. Essa citocina é produzida em macrófagos, linfócitos, neutrófilos e células epiteliais e atua estimulando o recrutamento de neutrófilos e monócitos para locais da infecção, tornando-os ativos para na 34 eliminação dos micro-organismos invasores (Sordillo et al., 1991; Abbas e Lichtman, 2005; Bannerman, 2009). Em ensaios biológicos o TNF-α é utilizado como sinalizador da inflanção. A produção dessa citocina pode ser estimulada tanto in vivo quanto in vitro. Quando testado in vivo, o TNF-α exerce atividade antitumoral e induz a síntese de mediadores como prostaglandinas e glicocorticoides. Quando testado in vitro, essa citocina estimula mitose de fibroblastos, células musculares lisas e células do tipo B e T, indicando citotoxicidade, através da atividade imunomodulatória anti-inflamatória, além de induzir a ação de genes envolvidos com a inflamação, reparo tecidual, resposta imune e efeitos antitumorais (Beyaert e Fiers, 1998; Esteves, 2017). Com a ativação do TNF-α, provocada pelo quadro infeccioso, os macrófagos e neutrófilos são estimulados a produzir óxido nítrico (NO), que pode ser utilizado como outro marcador da resposta inflmatória. Ocorre que, como efeito da inflamação, a molécula de NO combina-se com moléculas de oxigênio e provoca a morte dos micro-organismos presentes nos macrófagos e neutrófilos. Sendo assim, essa molécula citotóxica, atua como alerta do organismo, promovendo uma resposta imune durante a infecção. O surgimento de moléculas de NO é uma característica marcante nos processos infecciosos, podendo está relacionado à patogenia de diversas doenças, tais como a esclerose múltipla, o mal de parkinson, o alzheimer e o diabetes (Arturo et al., 2010; Hart e Tapping, 2012; Salemme et al., 2016). Apesar da descoberta de medicamentos eficazes do tratamento da inflamação, existem os efeitos colaterais e a suspeita de efeitos cardiovasculares potencialmente tóxicos, como foi o caso do medicamento rofecoxib, retirado do mercado farmacêutico em setembro de 2004. Com isso, novas opções terapêuticas no tratamento de inflamações são comumente exploradas (Juni e Dieppe, 2004; Wannmacher, 2005). Para contornar o quadro clínico de uma inflamação, tem-se fármacos extensamente empregados, sendo estes os não-esteroidais (AINEs), os anti- reumáticos (ARMDs), os glicocorticoides e os anti-inflamatórios estereoidais (AIEs), que também estão sendo incluídos na condição de fármacos imunossupressores devido à inibição da transcrição de citocinas iniciadoras da inflamação, algumas quimiocinas e, a expressão das enzimas cicloxigenases. 35
Dessa forma, por exemplo, os AIEs atuam na diminuição do acúmulo e função de células que participam das reações inflamatórias e imunes, como linfócitos, monócitos, macrófagos, eosinófilos, neutrófilos, mastócitos e basófilos (Rang e Dale, 2008; Balbino, 2011).
1.6.5 Toxidez aguda A toxidez de uma planta medicinal ou de suas partes é um dos critérios relevantes a serem avaliados em estudos de viabilidade na produção racional de um medicamento. Essa avaliação tem como objetivo verificar os efeitos tóxicos das substâncias químicas da planta num outro organismo vivo, determinar a dosagem segura, bem como o tempo e a via de administração (Klaassen et al., 2012; Ruppenthal, 2013). Ocorre que qualquer planta medicinal apresenta algum grau de toxidez, contudo, esse fato não invalida o seu uso em tratamento de enfermidades. O que distingue esses dois universos (medicinal e tóxico), é a dose segura (Luand, 1976). Por isso, o estudo da atividade toxicológica de uma planta ou substâncias químicas é relevante, a fim de encontrar a dose segura da droga vegetal, o seu tempo e a via de administração, a tornando candidata a um medicamento. Em contato com o agente biológico, o agente químico com potêncial tóxico, imediatamente inicia os sintomas de intoxicação que rapidamente evolui para sinais visíveis que vão de simples irritação nos olhos e perda de pêlos a sintomas mais severos como diarreia, vômitos, dificultade de locomoção e óbito. A avaliação da dose com efetivo potêncial tóxico se da pelo valor da dose letal (DL50), onde é verificada a quantidade de mortes de animais de uma mesma espécie quando em exposição com a substância química (Brito, 1994; Hayes, 1994; Ruppenthal, 2013). A intoxicação pode ser do tipo aguda, quando decorre de um único contato com a/as substâncias danosas em um período máximo de 24 horas com efeitos que vão de imediato a no máximo duas semanas. Esse tipo de estudo busca verificar órgãos alvo de intoxicação da substâcia química para delinear os níveis de dose em estudos mais prolongados. Intoxicação do tipo sobreaguda ou subcrônica, se da em exposições repetidas a substâncias químicas em um período inferior ou igual a 1 mês para o tipo sobreaguda e 1 a 3 meses para o tipo subcrônica, com estudos efetivos nos órgãos alvo, 36 demarcando aqueles mais suceptiveis, além do que, esse periodo de 3 meses de estudo permite delimitar a dose máxima na qual não observa-se efeito. Para exposição prolongada, superior a 3 meses, classificada como intoxicação crônica, pode-se prever a dose máxima livre de toxicidez, além dos efeitos tóxicos a partir de exposição prolongada, e o mecanismo de ação da substância química estudada (Fukushima, 2008; Ruppenthal, 2013). Para estudos de toxidade com plantas medicinais deve-se considerar não apenas a dose, mas também outros fatores que interferem na sua toxidez como as propriedades físico-quimicas do extrato, local e período de coleta e mesmo as condições de cultivo da planta que foi administrada, uma vez que a química da planta é uma resposta ao ambiente externo e sua fenologia, geralmente, trás diferenças marcantes em sua composição química. Soma-se a estas questões a via de introdução dos extratos da planta, bem como a dose e a concetração extrativa por dose, além da frequência de administração (Fukushima, 2008; Silva, 2014). A administração de uma droga pode se dar por via enteral ou parenteral, a primeira refere-se às vias oral, sublingual, cutâneo e retal e a segunda refere- se às vias diretas à corrente sanguínea. Nos organismos, estudos de toxicologia são realizados principalmente por via gastrintestinal (ingestão), pulmonar (inalação) e cutânea (contato), havendo também estudos realizados por via endovenosa, intraperitoneal, subcultânea, intramuscular, intradérmica e oral. A via a ser utilizada deve ser escolhida de acordo com a forma farmaceutica (pomada, comprimido, injeção, supositório, xarope, etc) que irá se estabelecer pela ação da droga no organismo, bem como de acordo com área de toxicologia em estudo, por exemplo, estudos de toxicologia ambiental ou ocupacional sugerem-se a via pulmonar ou cultânea (Lima, 2008; ANVISA, 2013; Montanha et al., 2013; Brito, s.d.).
1.7 A importância de estudos sobre Senna alata como medicinal Senna alata age como planta pioneira em biomas muito adversos como a caatinga e a restinga. Nesses ambientes, assim como outras plantas, é utilizada tradicionalmente como medicinal pelas populações locais e apresenta 37 estudos iniciais referentes principalmente a sua química, com algumas descrições de flavonoides e antraquinonas. Apesar da utilização de Senna alata como medicinal, para que a mesma venha a ser inserir no mercado de drogas vegetais e mesmo de produtos farmacêuticos, os extratos devem ser avaliados nas diversas áreas como a físico-química, fitoquímica, farmacologia e tecnologia farmacêutica, além de produzir padrões em que sua utilização como fitoterápico seja otimizada. Por outro lado, a quinta edição programa da agenda ambiental na administração pública (A3P), lançada em 2009, afirma que 50 % do PIB (Produto Interno Bruto) brasileiro dependem da biodiversidade encontrada no país. Este indicativo aponta para a necessidade de se buscar formas eficazes de pensar em desenvolvimento, preservando os recursos naturais, seja para produção de medicamentos, melhoramento genético ou em outras questões (Scheffer, 1999; Correia, 2015). Sendo assim, este trabalho objetiva determinar padrões referentes aos acessos de Senna alata nas regiões de restinga e caatinga, fundamentalmente em controle botânico de qualidade e parâmetros físico-químico das folhas pulverizadas ou em extratos obtidos a partir das suas folhas, bem como explorar algumas atividades biológicas na tentativa de avaliar semelhanças e diferenças entre os dois acessos citados. Com isso contribui-se com informações substanciais sobre o potencial dessa planta em ser utilizada futuramente como um possível anti-inflamatório de baixa toxidez ou mesmo como antimicrobiano ou bio-herbicida.
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2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral Este trabalho tem como objetivo geral determinar as características farmacobotânicas, físico-química, e investigar as atividades biológicas de Senna alata (L.) Roxb. obtidas em acessos da caatinga (BA) e da restinga (RJ), comparando possíveis semelhanças ou diferenças entre as mesmas.
2.2 Objetivos Específicos Determinar características organolépticas, macro e microscópicas das folhas de Senna alata como insumos farmacêuticos; Determinar o teor extrativo a partir das folhas pulverizadas de Senna alata; Determinar parâmetros físico-quimicos das folhas pulverizadas ou em extrato de Senna alata; Determinar a atividade antibacteriana do extrato a 40 % de Senna alata por bioautografia; Determinar a atividade alelopática de Senna alata frente à Lactuca sativa; Determinar a atividade citotóxica dos extratos de Senna alata pela técnica MTT; Determinar a atividade anti-inflamatória de Senna alata in vitro induzida por LPS e Zymosan; Determinar a toxidez aguda de Senna alata na administração por via intraperitoneal em camundongos.
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3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material vegetal O material vegetal deste trabalho constituiu-se de folhas de Senna alata (L.) Roxb., coletado em patrimônio privado na zona rural da cidade de Mucugê, BA, e nas proximidades do bairro Barreto na Cidade de Macaé, RJ. As coletas foram realizadas no mês de agosto de 2015. O material foi identificado por Dra Ana Paula Lima do Couto Santos, conforme exsicatas 186333 e 225664, depositadas junto ao Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana – HUEFS. Parte do material vegetal foi desidratada, pulverizado em moinho de facas modelo Modelo 340, Adamo® e armazenado em frasco âmbar para posterior obtenção dos extratos. O material restante foi utilizado na investigação macroscópica da folha íntegra.
3.2 Solventes, reagentes e substâncias referência utilizadas Os solventes utilizados foram do grau de padrão analítico (P.A.) da Tedia® ou Sigma-Aldrich®. Todas as soluções foram preparadas com água destilada e purificada no sistema Milli Q. Plus®. O meio de cultura utilizada para os microorganismos foi ágar Muller Hinton (HIMEDIA®). Todas as substâncias referência utilizadas foram do tipo pró analise de procedência Merck®.
3.3 Micro-organismos Para determinação da atividade antimicrobiana, utilizou-se bactérias Gram + e Gram -, conforme tabela 1.
Tabela1 Micro organismos utilizados no ensaio de bioautografia.
Micro organismos Coleção de Cultura Staphylococcus aureus BAA-1026 Escherichia coli 33876
3.4 Cultura de Macrofagos Para esse estudo, foi utilizada a linhagem de macrófagos RAW 264.7 de camundongos, obtida do laboratório no laboratório de investigação biológica da Universidade de Taubaté (UNITAU). As células foram mantidas em nitrogênio liquido (criopreservação) em solução de congelamento composta por meio 40
DMEM suplementado com 10 % de Dimetilsufóxido (DMSO) e 90 % de soro bovino fetal (SBF). Para os ensaios de estimulação in vitro as células foram descongelas a temperatura ambiente e expandida em dois frascos de cultura celular em meio DMEM completo (DMEM-c), mantidos a temperatura de 37° C em estufa incubadora umitificada contendo 95 % de ar e 5 % de CO2. Após a formação da monocamada de células, o meio DMEM-c foi descartado e adicionado novo meio (15 mL de DMEM-c). O meio contendo as células foi retirado e pipetado em dois tubos esterilizados de 50 mL. Centrifugou-se os frascos a 1500 rpm, durante 10 min, para separação das células do meio. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e 10 mL de DMEM-c foi adicionado em cada tubo contendo as células. A contagem das células foi efetuada na câmara Neubauer, partindo-se da suspensão de 1 mL diluída em 10 vezes em solução azul Trypan para avaliação da viabilidade celular e para contagem total do número de macrófagos. Para os ensaios, as células forma colocadas em meio de cultura de 96 poços de acordo com a concetração exigida em cada experimento e incubadas overnight em DMEM-c a 37° C, com 95 % de O2 e 5 % de CO2.
3.5 Animais Camundongos Swiss machos adultos foram utilizados com 6 semanas de vida, provenientes do biotério de criação do Campus UFRJ-Macaé. Os camundongos foram mantidos no biotério de experimentação do LPBio/UFRJ – Macaé em temperatura aproximada de 25° C e promoveu-se o ciclo de 12 horas-luz no biotério. Água filtrada e ração peletizada em livre acesso. O experimento foi aprovado pela comissão de ética em uso de animais, sob protocolo n° MAC042.
3.6 Análise morfo-anatômica das folhas de Senna alata
3.6.1 Análise Morfológica A análise morfológica das folhas fresca e da droga foi efetuada a olho nú, quando necessário fez-se uso de estereomicroscópio binocular (aumento de 10 x), tomando por base para descrição macroscópica Hickey (1974), Oliveira e Akisue (1991), Gattuso e Gattuso (1999). 41
3.6.2 Análise Anatômica A analise anatômica foi realizada em secções paradermica. O estudo da epiderme na face adaxial e abaxial dos folíolos foi obtido por lâminas temporárias com secções a mão livre de material fresco, corados com azul de toluidina a 0,05 % (p/v) segundo Oliveira e Akisue (1989), Gattuso e Gattuso (1999) e Farmacopéia Brasileira V ed. (2010). O material foi observado em microscópio binocular de campo claro e registrado em fotomicrografia obtidas em câmara digital e analisados segundo Esau (1985), Cutter (1987), Gattuso e Gattuso (1999), Dickison (2000), Appezzato-da-Glória e Carmello-Guerreiro (2003).
3.6.2.1 Determinação do índice Estomático A determinação do índice estomático foi realizada em secções paradermica segundo descrito por Gattuso e Gattuso (1999). As observações para a contagem dos estômatos foram feitas em microscópio com aumento de 10 X. Para cada amostra realizou-se 10 determinações e o índice estomático se deu conforme a média obtida. O resultado foi calculado conforme a equação abaixo:
Equação 1: I = S x 100 E + S Em que: I = Índice de estômatos S = Número de estômatos na superfície determinada da folha; E = Número total de células epidérmicas na mesma área (incluindo os Tricomas que apareceram).
3.6.2.2 Análise das folhas pulverizadas As características de cor, textura, odor e sabor foram analisados tomando por base Oliveira e Akisue (2005) e Farmacopéia Brasileira V ed. (2010). As características macroscópicas (forma, ângulos, bordos, coloração, superfície e consistência das fraturas) da droga em pó foram analisadas em esteriomicroscópio binocular tomando por base a técnica utilizada por Gattuso e Gattuso (1999) e Oliveira e Akisue (2005). As características microscópicas da droga em pó foram analisadas em lâminas semi-temporárias, com glicerina 42 a 50 % (v/v) como meio de inclusão, utilizando como corante o azul de toluidina a 0,05 % (v/v), tomando por base Gattuso e Gattuso (1999).
3.6.2.3 Análise de Granulometria Para a análise granulométrica, seguiu-se a metodologia apresentada por OMS (1992). Para a tamisação usou-se 100 gramas da droga submetida à passagem forçada, realizada a 60 vibrações por segundo durante 30 minutos, em uma sequencia de tamises (abertura de malhas correspondente a 70, 92, 165, 232 e 331 µm), de maior a menor abertura de malha. Em seguida, as frações da droga em pó foram retiradas dos tamises, bem como do coletor do tamisador, e calculadas as porcentagens de retenção em cada tamis. Para o cálculo do resultado foi considerada a média das triplicatas expressas em porcentagem (%, p/p). Os resultados foram expressos graficamente, sendo que o diâmetro médio da malha do tamis foi obtido por regressão linear (Alberton e Ribeiro, 2001) e a classificação da droga em pó seguiu Who (1992) e Farmacopéia Brasileira V ed. (2010).
3.7 Determinação do teor de extrativos De acordo com a metodologia descrita por Simões e Spetizer (2004), as folhas desidratadas e pulverizadas, foram submetidas ao preparo do extrato etanólico nas concentrações 20, 40, 60, 80 e 95 % (m/v), por maceração. Estes extratos foram preparados a 10 %, ou seja, utilizou-se 10 g da droga para 100 mL de solvente nas diferentes concentrações de etanol descritas acima. Foi adotada a extração pelo período de 4 horas com agitação constante a cada 30 minutos com bastão de vidro. Para evitar incidência de luz, as vidrarias foram envolvidas em papel alumínio. O material foi filtrado por 3 vezes e levado para secagem em estufa de ar circundante a 40° C. Ao término de 24 horas, obteve- se o extrato bruto seco que foi quantificado e pesado em balança de alta precisão, depositado em recipiente de vidro âmbar hermeticamente fechado e armazenado a 4° C. O teor de extrativos foi calculado em massa percentual, pela a média de três determinações segundo a equação 2:
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Equação 2:
% Te = Ps x 100 / Pf
Em que: Te = Teor de extrativos (%; m/m) Ps = Peso inicial da amostra Pf = Peso final da amostra
3.8 Análise físico-química das folhas pulverizadas de Senna alata Os ensaios físico-quimicos referentes à pureza e integrudade da droga em pó abrangeram a pesquisa de material estranho, umidade e cinzas totais e insolúveis em ácido, de acordo com os critérios farmacopeicos e recomendações da Organização Mundial de Saúde. Todos os ensaios foram realizados em triplicata com os resultados obtidos pela média dos valores obtidos nos ensaios (Who, 1998; Farmacopeia Brasileira, V ed.).
3.8.1 Determinação de material estranho Com o auxilio de uma lupa (aumento de 10 X, as amostras foram analisadas pelo método de quarteamento). Todo o material estranho foi separado e pesado em balança eletrônica de precisão. O resultado foi expresso em porcentagem de elementos estranhos, com base no peso da tomada de ensaio.
3.8.2 Determinação da umidade A determinação da umidade da droga em pó foi realizada pelo método gravimétrico em que 3 g das folhas em pó foram dessecadas em estufa a 105º C, por 5 horas, e após este tempo, foram colocadas em dessecador para posterior pesagem. Continuou-se pesando o material, em intervalos de 1 hora, até massa constante, calculando-se a porcentagem de água em relação a amostra seca ao ambiente, utilizando a equação 3 abaixo:
Equação 3: % umidade = Pu – Ps / Pa x 100
Em que: Pu = peso úmido (béquer + amostra) Ps = peso seco (béquer após 5 horas de estufa) Pa = peso da amostra
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3.8.3 Cinzas totais Nesse ensaio, 3 g da folha desidratada e pulverizada foram colocadas em cadinho de cálcio devidamente pesado. O material foi incinerado em mufla, aumentando gradativamente a temperatura até 450º C, em seguida, foi resfriado em dessecador e pesado. Para determinação das cinzas totais, calculou-se a porcentagem das cinzas resultantes após o processo em relação a amostra úmida inicial, utilizando a equação 4 abaixo.
Equação 4: % cinzas totais = Pu – Ps / Pa x 100
Em que: Pu= peso úmido (cadinho + amostra) Ps= peso seco (cadinho após a incineração) Pa= peso da amostra
3.8.4 Cinzas insolúveis em ácido O resíduo obtido no ensaio de cinzas totais (item 3.7.1.3) foi fervido durante 5 minutos com 25 mL de solução de ácido clorídrico a 7 % (p/v), em um cadinho coberto com vidro de relógio. O vidro de relógio foi lavado com 5 mL de água quente e as amostras (resíduo e lavagem do vidro de relógio) foram filtradas em papel de filtro isento de cinzas. Em seguida, lavou-se o papel de filtro com água quente até pH neutro e transferiu para o cadinho original, cujo conteúdo foi seco sob chapa quente e incinerado em mufla a 500 °C, durante 4 h. O teor de cinzas insolúveis em ácido foi calculado como percentual pela média de três determinações em relação.
3.9 Análise fitoquímica dos extratos das folhas de Senna alata Para a determinação do teor de constituintes químicos utilizou-se as metodologias empregadas por Namba (1988), OMS (1992), por Sharapin (2000) e pela Farmacopéia Brasileira V ed. (2010). Todos os experimentos foram analisados em triplicata.
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3.9.1 Determinação do pH dos extratos Para determinação do pH do extrato das folhas de S. alata foi realizado a leitura em pHmetro calibrado em pH de 4 a 9. O experimento foi realizado em triplicata e os resultados equivalem à média dessas medições.
3.9.2 Determinação de antraquinona Para determinação de antraquinona, agitou-se 1 g da droga em pó com 10 mL de éter etílico. Na solução etérea adicionou-se 1 mL de amônia diluída e agitou-se novamente. Esse constitui um teste qualitativo onde como efeito da mistura ocorre a mudança para coloração rósea no caso positivo. Sendo caracterizado pela presença ou ausência dessa substância.
3.9.3 Determinação de saponinas Para a determinação de saponina, realizou-se teste quantitativo, onde aqueceu-se 2 g do material vegetal pulverizado com 10 mL de água destilada sob refluxo, durante 10 minutos. Esfriou-se e filtrou-se para um tubo de ensaio, completando-se para 10 mL o volume final. Agitou-se o tubo no sentido do seu comprimento, vedado com uma rolha, durante 15 segundos. Deixou-se em repouso por 30 minutos. Verificou-se em seguida o aparecimento de um anel de espuma persistente por 2 horas ao menos, de aproximadamente 1 cm de altura no caso positivo, conforme equação 5.
Equação 5: IE= 1000 (1) A
Em que: IE= Indice de espuma A= Volume do decocto usado para preparação da diluição
3.9.4 Determinação de saponinas hemolíticas Para avaliação citotóxica de S. alata sobre eritrócito, utilizou-se o teste de hemólise seguindo o protocolo descrito por Rangel e colaboradores, 1997. Para isso, utilizou-se sangue de camundongo, cedido pela equipe de pesquisa e experimentação Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ-IMCT, Macaé). Assim, uma amostra do sangue (2 mL) foi misturado a NaCl 0,96 % na proporção 1:30, e centrifugado a 2000 rpm por 3 vezes de 5 minutos para 46 obtenção dos eritrócitos. O sedimento da ultima centrifugação foi ressuspenso em uma concentração final de 0,5 %. Às amostras extrativas foram adicionados Tampão fosfato salino (PBS) pH 7,0 e procedeu-se a diluição seriada onde obteve-se soluções com concentrações finais igual a 62,5, 125, 250, 500 e 1000 μg/mL, a elas foram adicionadas 2 mL da suspensão de eritrócitos. Como controle negatigo utilizou-se suspensão de eritrocitos com NaCl a 0,96 % (0 % de hemólise) e como controle positivo utilizou-se a suspensão de eritrócitos mais 100 μg/mL de Triton X-100 a 1 % (100 % de hemólise). As misturas foram incubadas sob agitação lenta e constante (100rpm) por 1 hora a 22 ± 2° C. Decorrido esse tempo, as amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 2000 rpm e a hemólise foi quantificada por espectrofotometria a 540 nm. Considerou-se como resultado a média das triplicadas.
3.9.5 Determinação de flavonoides Para determinação de flavonoides, utilizou-se método qualitativo colorimétrico, onde foram dissolvidos 25 mg de extrato bruto seco em 5 mL de metanol em um tubo de ensaio. Adicionou-se fragmentos de magnésio seguro por uma pinça e 0,5 mL de ácido clorídrico (HCl) concentrado. Ao final foi determinada a presença de flavonoides pela efervescência e o surgimento de uma coloração avermelhada na mistura.
3.9.6 Determinação de mucilagem Para a pesquisa de mucilagens mediu-se o volume ocupado por 1 g da droga pulverizada, em proveta de 25 mL. Adicionou 25 mL de água (agente intumescente) e agitou-se por 1 minuto a cada 10 minutos, por 1 hora. Como efeito do experimento, após 3 horas, em temperatura ambiente, a diferença do volume (mL) inicial e final ocupado pelo material vegetal, constitui o índice de intumescência da amostra calculado a partir da equação 6: Equação 6 IT= Vi –Vf
Em que: Vi= Volume inicial ocupado pelo material vegetal Vf= Volume final ocupado pelo material vegetal
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3.9.7 Determinação de taninos Para a determinação de taninos, utilizou-se de método qualitativo. Para isso, dissolveu-se 5 mg do extrato etanólico a 40 % em 5 mL de água destilada, e posteriormente este material foi filtrado. Adicionou-se 2 gotas de solução etanólica de FeCl3 a 1 % (v/v). Qualquer mudança na coloração ou formação de precipitado é indicativo de reação positiva para taninos.
3.9.8 Determinação do teor de polifenois totais O teor de Polifenois totais dos extratos a 40 % (v/v) foi determinado com o reagente Folin-Ciocalteau (uma mistura de fosfomolibdato de amônio e ácido fosfotungstato), descrito por Chandra e Meija (2004). Neste ensaio, as amostras de extrato bruto seco a 40 % (v/v) obtidos a partir das folhas de S. alata em acessos na restinga e caatinga, foram diluídas em água, adicionando-se uma mesma alíquota de reativo de folin-Ciocalteau, levando-se a incubação no escuro por 5 minutos, quando acrescentou-se igual volume de carbonato de sódio a 20 % (v/v). Após incubação de 10 minutos, mediu-se a absorvância das amostras a 760 nm em um espectrofotômetro UV/visível. Como branco substituiu-se a amostra por água. A curva padrão foi obtida utilizando-se soluções referência de ácido gálico nas concentrações de 12,5, 25, 50, 100 e 200 µg/mL. A partir dos resultados da absorvância e das concentrações de ácido gálico dos extratos, foi construído um gráfico da equação da reta por regressão linear para calcular o teor de polifenois totais do analito.
3.9.9 Determinação do teor de flavonoides totais A dosagem total de flavonoides foi realizada de acordo com Rio (1996) e Markhan (1982), a partir da construção de uma curva de calibração, utilizando rutina como substância referência. As amostras de extrato bruto seco a 40 % (v/v) obtidos a partir das folhas de Senna alata obtidos em acessos na restinga e caatinga foram diluídas em metanol a 70 % (p/v), adicionou-se 7,5 % (m) de cloreto de alumínio a 5 % em metanol (v) e, após repouso de 30 minutos no escuro, realizou-se a leitura a 425 nm em espectrofotômetro UV/visível. 48
Como branco substituiu-se a amostra por água. A curva padrão foi obtida utilizando-se a solução referência rutina nas concentrações de 12,5, 25, 50, 100 e 200 µg/mL. A partir dos resultados da absorvância das concentrações de rutina dos extratos, foi construído um gráfico da equação da reta por regressão linear para calcular o teor de flavonoides totais.
3.9.10 Perfil cromatográfico dos extratos em cromatografia de camada delgada (CCD) Para obtenção do perfil cromatográfico os extratos obtidos a partir das folhas de S. alata foram cromatografados em CCD, sobre cromatofolhas de sílica gel G 60 F254, empregando-se sistemas eluentes e reveladores segundo Wagner e Bladt (1996). Com auxilio de tubos capilares de vidro, os extratos foram aplicados nas cromatoplacas, formando manchas semelhantes e regulares. A fase móvel escolhida neste estudo foi a de uma mistura de hexano e acetato de etila (1:1). A migração cromatográfica foi de 5 cm. Após eluição utilizou-se vanilina sulfúrica em estufa a 100º C por 5 minutos como agente homogênico. As placas foram observadas sob luz ultravioleta, sendo registrados os resultados em Fator de retenção (Rfs). Utilizou-se rutina e quercetina como substâncias referência.
3.10 Determinação de atividades biológicas dos extratos das folhas de Senna alata
3.10.1 Determinação da atividade antibacteriana A atividade antimicrobiana do extrato hidroetanólico de S. alata foi determinada pelo método de bioautografia conforme Holetz (2002). Utilizaram- se bactérias do tipo Gram-positivas (Staphylococcus aureus) e Gram-negativas (Escherichia coli), conforme tabela 1. Os extratos foram cromatografados (item 3.9.10) e após a migração dos extratos aplicou-se nas placas cromatográfica o padrão antibiótico. A placa cromatográfica foi depositada em placa de Petri estéril em câmara de fluxo laminar. A suspensão padrão dos micro-organismos a 1,5 x 108 UFC/mL foi inoculada sobre a mesma com o auxílio do swab em seguida foram mantidas em estufa a 35° C por 24 h. Passado o período de incubação o bioautograma foi revelado por nebulização de solução aquosa de 49 trifenil-2,3,5 cloreto de tetrazóleo a 2 % e novamente levado a estufa a 35º C por 1 h. A presença de substâncias químicas ativas foi caracterizada pela visualização de halo de inibição em torno das bandas cromatográficas. O experimento foi realizado em triplicata e registrado por fotografia digital. Como padrão de antibiótico, utilizou-se amoxicilina tri-hidratada (875 µg/mL).
3.10.2 Determinação da atividade alelopática A atividade alelopática das amostras foi determinada por bioensaios de inibição da germinação de diásporos de Lactuca sativa L. var. Grand rapids, em solução aquosa com extrato de S. alata a 0,5, a 1,0 e a 2,0 % (v/v), à temperatura ambiente de 25° C ± 2º C. Em cada experimento foram semeadas 20 diásporos por placa de Petri (9 mm de diâmetro) sobre camada tripla de papel filtro umedecido com 5 mL da solução análise. A contagem dos diásporos que germinaram deu-se em intervalos de 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24 e 48 horas após a distribuição das sementes, baseando-se na emissão de radícula com cerca de 2 mm além do estado da plântula (cor, tamanho, consistência e espessura) observadas sob lupa com 10 x de aumento (Hartmann et al., 2001; Souza et al., 2005; Ferreira et al., 2007; Gusman et al., 2008). Como controle positivo, utilizou-se água destilada. Os resultados foram representados graficamente com a média das triplicatas. Determinou-se a viabilidade dos diásporos não germinados pelo desenvolvimento de coloração rósea na parte interna dos mesmos expostos por secção transversal. Para tanto, as sementes passaram 24 h no escuro e à temperatura de 30° C, em solução aquosa de cloro-2,3,5-trifenil cloreto de tetrazólio a 1 % (v/v).
3.10.3 Viabilidade celular pelo MTT O teste de citotoxidez in vitro foi efetuado utilizando o ensaio de viabilidade celular através do MTT, conforme NIH (2001). Os sobrenadantes das culturas celulares de macrófagos RAW 264.7 foram obtidos em cultura destas células na concentração de 5 x 104 células/mL, tratadas com os extratos de S. alata nas concentrações 50 e 100 µg/mL. Após 24 horas, adicionou-se o MTT (5 mg/mL) em PBS durante 4 horas a 37° C. Após essa incubação, a placa foi centrifugada a 1800 rpm por 5 minutos. Retirou-se o sobrenadante e adicionou-se à placa 200 µL de DMSO. A absorvância foi medida em 50 espectrofotômetro de placas de cultura (SLT Spectra®) a um comprimento de onda de 490 nm. Como controle branco, utilizou-se 200 µL de DMSO. Os valores da viabilidade celular foram expressos em porcentagem média conforme a absorbância determinada nos grupos estudados. A liberação específica foi calculada de acordo com os controles: macrófagos não-tratados e estimulados (controle negativo), e macrófagos tratados com 1 % (v/v) de Triton X-100 (controle positivo).
3.10.4 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vitro Os ensaios foram realizados no laboratório de produtos bioativos (LPBio) no Campus Macaé UFRJ seguindo a metodologia descrita por Mori e colaboradores (2000) e Zhao e colaboradores (2008).
3.10.4.1 Estímulo com LPS Em uma placa de 96 poços foi depositado 100 µL de macrofagos da linhagem RAW 264.7 na quantidade de 2 x 105 células/mL. Após duas horas na estufa a (37° C, 5 % de CO2), a placa foi centrifugada a 2000 rpm por 10 minutos a 10° C retirou-se o sobrenadante e aplicou-se os estímulos de LPS na concentração de 1 µg/mL e os extratos etanolicos a 40 % (v/v) de S. alata acesso caatinga e restinga retomado em água nas concentrações 25, 50 e 100 µg/mL (1:1) v/v. Após 24 horas em estufa, o sobrenadante foi retirado e estocado à -80° C para dosagem de TNF-α e NO.
3.10.4.1.1 Avaliação da capacidade inibitória de Senna alata sobre a produção de TNF-α Para quantificação de TNF-α, os sobrenadantes dos macrofagos RAW 264.7 tratados com LPS conforme item 3.9.4.1, foram desgelados em temperatura ambiente para a dosagem do TNF-α por kit de ELISA, de acordo com as especificações do fabricante (ReD Systems Quantikine). Como controle negativo utilizou-se sobrenadante da cultura de macrófagos não tratados com extratos de Senna alata e não estimulados com LPS e como controle positivo utilizou-se macrófagos estimulados com LPS (1 µg/mL) e não tratados com os extratos de Senna alata. A leitura foi realizada em espectofotômetro UV a 450 nm.
51
3.10.4.1.2 Avaliação da capacidade inibitória de Senna alata sobre a produção de óxido nítrico Para quantificação de nitrito, os sobrenadantes dos macrofagos RAW 264.7 tratados com LPS conforme item 3.10.4.1, foram desgelados em temperatura ambiente. Como controle negativo utilizou-se sobrenadante da cultura de macrófagos não tratados com extratos de Senna alata e não estimulados com LPS e como controle positivo utilizou-se macrófagos estimulados com LPS (1 µg/mL) e não tratados com os extratos de Senna alata. A dosagem de NO foi realizada pelo método de Griess. A leitura foi realizada em espectrofotômero a 540 nm. Os resultados foram expressos graficamente. 3.10.4.2 Estímulo com Zymosan A indução de inflamação a partir do polissacarídeo Zy, foi realizada conforme Rocha (2003). Em uma placa de 96 poços foi depositado 100 µL de suspensão de células peritoneais de camundongos Swiss por poço, na 5 . quantidade de 2 x 10 células Após duas horas na estufa a 37° C e 5 % de CO2 para adesão dos macrófagos na placa, a mesma foi centrifugada a 2000 rpm por 10 min a 10° C. Foi retirado o sobrenadante e adicionado os estímulos de Zy na concentração de 1 µg/mL e os extratos etanolicos a 40 % (v/v) de S. alata acesso caatinga e restinga retomado em água nas concentrações de 25, 50 e 100 µg/mL, (1:1) v/v. Após esse procedimento, levou-se o material novamente à estufa para incubação por 24 horas, quando foi retirado o sobrenadante para as dosagens de TNF e NO, conforme os itens 3.10.4.1.1 e 3.10.4.1.2.
3.10.5 Determinação da toxidez intraperitoneal aguda O ensaio de toxidez foi realizado pela metodologia de Brito (1994). Utilizou-se 45 camundongos Swiss adultos (45 ± 2 dias de vida). Foram utilizados 1 grupo controle negativo (recebendo apenas solução salina), e 4 grupos teste tratados com o extrato de Senna alata obtidas do acesso caatinga, 4 grupos teste tratados com o extrato de Senna alata obtidas do acesso restinga, em diferentes concentrações. O extrato etanólico de S. alata a 40 % (v/v) seco foi dissolvido em PBS e os grupos testados receberam os respectivos extratos nas doses 16, 32, 40 e 60 g/kg, por via intraperitoneal. 52
Realizou-se a observação ininterrupta nas primeiras 2 horas e em seguida em 4, 6, 8, 12, 24, 32 e 48 horas. Os parâmetros de toxidez avaliados e registrados foram: sinais de depressão, excitação, convulsão, salivação, lacrimejamento, efeitos sobre a defecação, micção, respiração, locomoção e óbito dos animais, além da concentração do LDH.
3.10.5.1 Quantificação da liberação de enzima citoplasmática lactato desidrogenase (LDH) em animais submetidos à toxidez aguda O sangue dos animais que foram submetidos ao teste de toxidez aguda nas várias concentrações de extrato de S. alata dos acessos caatinga e restinga foi coletado por punção cardíaca logo após a eutanásia dos animais utilizados no ensaio 3.10.5. O soro do sangue foi separado por centrifugação a 2000 rpm em 10 minutos e utilizou-se o kit ezimático Doles® para a quantificação do LDH. Adicionou-se ao soro 250 µL de alúmen férrico em 4 mL de substrato do kit enzimático (solução de 0,1 M de lactato e 0,05 M de o- fenantrolina em solução tampão tris 0,2 M, pH 8,8), mantendo-se em estufa a 37° C por 2 minutos. Em seguida foi adicionado fenazina metosulfato (FMS) e difosfopiridino nucleotído (NAD) na proporção de 1:20, mantendo-se em estufa por mais 5 minutos, para então determinar a concentração de LDH, que representa uma indicação indireta de citotoxicidade na absorvância de 510 nm. Os reagentes foram manipulados na ausência de luz. Como controle positivo utilizou-se amostra de soro sanguíneo em DMSO a 1 % na proporção 1:1 (v/v). Como controle negativo utilizou-se o soro sanguíneo dos animais.
3.11 Análise estatística dos resultados Neste trabalho todos os resultados são apresentados como médias ± erro padrão da média (SEM) do número de experiências (n) indicado nas figuras ou nas suas legendas. A significância das diferenças entre dois grupos de valores foi calculada pelo teste t de Student não emparelhado. Quando um grupo de valores foi comparado com três ou mais grupos, a significância das diferenças foi analisada pelo teste ANOVA seguido do teste de Bonferroni. Os valores de p inferiores a 0,05 (p < 0,05) foram considerados como representando diferenças significativas. Para construção dos gráficos, utilizou- 53 se o software GraphPad Prism 7.0. Todos os experimentos foram realizados em triplicatas (n = 3), sendo as médias consideradas como resultados.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Morfo-anatomia e caraterização organoléptica das folhas de Senna alata
4.1.1 Análise macroscópica Uma das atribuições da Farmacobotânica é realizar a analise morfo- anatômica de drogas vegetais, visando a sua autenticidade e padronização de um material vegetal. Neste trabalho realizou-se um estudo para enfatizar as características morfoanatômicas marcantes nas folhas de S. alata que sejam úteis na autenticidade das mesmas como insumo farmacêutico. S. alata é um subarbusto contituido por pares de folíolos. Ressalta-se que as características macroscópicas dessa espécie nos acessos restinga e caatinga são em geral muito semelhantes para estes dois acessos, diferenciando-se, principalmente, pela quantidade e tamanho dos folíolos, que apresentam-se maiores e em maior quantidade no acesso caatinga, além disso, diferenciam-se pela presença de um maior número de tricomas no acesso caatinga, onde ocorre aglomeração de tricomas na face adaxial. Essas características demarcam as diferenças mais consistentes entre os acessos, conforme pode ser verificado na figura 5 e tabela 2.
.
Figura 5 Aspecto geral das folhas de Senna alata (L.) Roxb. Legenda: A. face adaxial e abaxial do acesso Caatinga; B. face adaxial e abaxial do acesso restinga. Regua: 1 cm.
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Tabela 2 Determinação de características macroscópicas das folhas de Senna alata (L.) Roxb.
PARTES CARACTERÍSTICA ESTRUTURAS CONSTINTUINTES CAATINGA RESTINGA Possui 10-12 cm de Possui 5-7,5 cm de Tamanho comprimento e 3-5 cm de comprimento e 2,3-4,4 cm largura de largura Discolores, na face adaxial Coloração = Verde-oliva opaco Nervação Camptódroma = Consistência Membranácea =
Lisa, com tricomas, esparços na Lisa, com tricomas face adaxial e aglomerados na Superfície esparsos na face adaxial e face abaxial próximo a nervura Limbo face abaxial central Forma Oblongas = Bordo Inteiro =
Ápice Retuso = Base Assimétrica = Folha penaticomposta Folha penaticomposta bifoliada bifoliada do tipo Divisão do Limbo do tipo paripenada, constituíd a paripenada, constituída por por 7 a 13 pares de folíolos. 5 a 10 pares de folíolos. Triangulares, persistentes, Triangulares, persistentes, Estípulas assimétricas com 1,4-1,6 x 0,7- assimétricas com 1,2-1,6 x 1,1 cm 0,4-0,9 cm Reto e curto com 0,4 a 1,2 cm Pecíolo Tamanho = de comprimento
O padrão de venação em uma folha também é uma característica consistente na descrição das espécies e drogas de origem vegetal. Tomando por base Hickey (1974), nos dois acessos (restinga e caatinga) de S. alata, pode-se observar que a nervação apresenta o padrão geral do tipo camptódroma, com a nervura central proeminente apenas na face adaxial. A venação terciária é reticulada. A última marginal é incompleta. A areolação é desenvolvida, geralmente quadrangular (por vezes pentagonal) e as vênulas são ramificadas, figura 6 e 7.
Figura 6 Venação da folha de Senna alata (L.) Roxb. acesso caatinga. Legenda: P. Detalhes da venação primária; S. Detalhe da venação secundária; T. Detalhe da venação Terciária. Régua: 1 mm. 55
Figura 7 Venação da folha de Senna alata (L.) Roxb. acesso restinga. Legenda: P. Detalhes da venação primária; S. Detalhe da venação secundária; T. Detalhe da venação Terciária . Régua: 1 mm.
Macroscopicamente, a folha de S. alata segue o padrão geral da subfamília Caesalpinoideae apresentando-se composta por folíolos de bordo inteiro e com a venação principal camptódroma, conforme Metcalfe e Chalk (1950). As características macroscópicas de S. alata diferem de S. alexandrina, conforme a Farmacopéia Brasileira V Ed. (2010), basicamente na forma dos folíolos e ápice, que para esta espécie é elíptica e aguda, respectivamente. O padrão geral de venação, assim como a assimetria da base do limbo nos folíolos também são o mesmo para estas duas espécies. S. alexandrina também apresenta tricomas esparsos, mas neste caso estes tricomas possuem textura áspera, o que não foi observada em S. alata. Os folíolos dos acessos, quando desidratados, apresentam cor verde- mate, podendo se verificar além das características descritas anteriormente, ondulações marcantes no limbo que as tornam suavemente côncavas, como podem ser observadas na figura 8.
Figura 8 Aspecto geral das folhas desidratadas de Senna alata (L.) Roxb. Legenda: A. face abaxial e adaxial dos folíolos do acesso caatinga; B.face abaxial e adaxial do folíolo do acesso restinga. Régua: 1 cm. 56
O padrão que os folíolos de S. alata assumem quando desidratados difere do padrão da droga de S. alexandrina, uma vez que nesta planta os folíolos permanecem planos, praticamente sem dobraduras, e a coloração também difere uma vez que em S. alexandrina assume um tom de verde- amarelado, conforme Oliveira e Akisue (2005).
4.1.2 Análise microscópica Em secção paradérmica os acessos restinga e caatinga de S. alata são semelhantes (Tabela 3 e figuras 9 e 10). Pôde-se verificar as células epidérmicas ondeadas com as paredes espessas tanto na face adaxial quanto na face abaxial. Os estômatos se fazem presentes em ambas as faces epidérmicas, demarcando o padrão anfiestomático. Estes estômatos são do tipo paracítico e muito raramente anisocítico, com índice estomático maior na face abaxial. Observou-se tricomas tectores unicelulares pouco alongado e eretos, com o ápice afilado.
Tabela 3 Determinação das características microscópicas das folhas de Senna alata (L.) Roxb. em secção paradérmica nos acessos restinga e caatinga.
SUPERFICIE DO LIMBO
ACESSO ESTRUTURA Adaxial Abaxial
Estômatos Paracítico =
Unicelular de ápice afilado e Tricomas tectores = CAATINGA cutícula espessa e lisa Células epidérmicas Ondeadas = Índice estomático 43,0 ± 3 73,49 ± 2 Estômatos Paracítico = Mais esparsos. Unicelular de Tricomas tectores ápice afilado e cutícula = RESTINGA espessa e lisa Células epidérmicas Ondeadas = Índice estomático 44,13 ± 2 71,02 ± 2
1
2 3
Figura 9 Secção paradérmica da lamina foliar de Senna alata (L.) Roxb. acesso caatinga. Legenda: A. Epiderme na face abaxial; B. Epiderme na face adaxial; C. Detalhe evidenciando tricoma tector unicelular na face adaxial; 1. Células epidérmica; 2. Estômato; 3. Tricoma tector; Régua: 20 μm. Aumento de 40 x.
57
1 2 3
Figure 10 Secção paradérmica da lamina foliar de Senna alata (L.) Roxb. acesso restinga. Legenda: A. Epiderme na face abaxial; B. Epiderme na face adaxial; C. Detalhe evidenciando tricoma tector unicelular na face adaxial; 1. Células epidérmica; 2.Estômatos; 3. Tricoma tector. Régua: 20 μm. Aumento de 40 x. Notou-se a presença de tricoma na face adaxial e abaxial de Senna alata nos acessos estudados, no entanto, na superfície adaxial esses tricomas apresentam-se débeis, podendo-se perceber a inserção do mesmo na epiderme em sua extremidade inferior, como um ponto preto. A presença de tricomas tectores é uma característica microscópica semelhante a S. alexandrina, a presença de tricomas tectores, conforme a Farmacopéia Brasileira V ed. (2010). No entanto, essses tricomas se diferenciam nas duas espécies em relação a sua forma, pois, em S. alexandrina, os tricomas se apresentam curvos e ásperos, o que não foi observado em S. alata Luna (2013) relata que em Senna occidentallis, os tricomas se limitam a face abaxial. As células epidérmicas são diferentes entre estas duas espécies vegetais, uma vez que em S. alexandrina estas células apresentam a forma poligonal e em S. alata são ondeadas. Esses dados mostram que apesar da similaridade das espécies, que são facilmente confundidas no uso populacional, existem diferenças microscópicas que auxiliam a diferenciação da espécie. Solereder (1908), Metcalfe e Chalk (1950) e Watson (1981) comentam que o tipo mais comum de estômato na subfamília Caesalpinoideae é o paracítico, como foi verificado neste trabalho para S. alata, dados que corroboram com os estudos realizados com S. alexandrina. Contudo, Metcalfe e Chalk (1950) mencionam que muitos gêneros desta subfamília, em especial Senna, apresentam estômatos confinados à superfície inferior, obedecendo ao padrão denominado hipoestomático. S. alata não segue este padrão usual para Caesalpinoideae e sim o padrão anfiestomático, fato observado nos dois 58 acessos estudados de S. alata, o que demarca uma singularidade relevante para esta espécie vegetal. Em relação ao índice estomático sabe-se que o mesmo é um caracter anatômico constante para as espécies vegetais. Esta questão é relevante uma vez que pode ser utilizado na autenticação de uma droga vegetal, uma vez que não é o índice e sim o desempenho dos estômatos que vai variar com a influência da luz, da umidade do solo e do ar. Segundo Larcher (2006) e Tatagiba e colaboradores (2007) essas características ambientais provocam um deficit de pressão de vapor próximo a lâmina foliar, influenciando na abertura do estomato e consequentemente na função dessas estruturas. A partir dos estudos realizados por Larcher (2006) e Tatagiba e colaboradores (2007), pode-se entender que a característica anfietomática de S. alata, é uma das justificativas do potencial adaptativo e pioneirismo dessa espécie vegetal que consegue apresentar alto desenvolvimento mesmo em condições relevantes de salinidade e intenso calor. Por outro lado, levando em conta Marabesi (2007), pode-se indicar que o rápido desenvolvimento de S. alata tem relação com a alta taxa de fotossíntese alinhada a condutância estomática em nível foliar, fato que abastece a planta de amido e assegura seu desenvolvimento. Outras carcaterísticas foliares descritas para essa S. alata sugere mecanismo de adaptação a ambientes com excesso de calor, favorecendo a menor reflexão de luz e proteção dos estomatos, a exemplo da epiderme apresentar parede celular expessa, característica adaptativa ressaltada por Monteiro e colaboradores (1985) e Fahn (1990). Em relação aos tricomas salienta-se que são apêndices da epiderme estão presentes em diversos órgãos das plantas, segundo Fahn (1990). Os tricomas tectores que são os de cobertura, como os que foram observados nas folhas de S. alata são úteis para afastar ou fazer chamariz de alguns animáculos e ainda por promover um microclima na camada epidérmica, evitando a transpiração excessiva da planta. Assim é que essas estruturas, além de proteção contra herbívoros, aumentam a superfície de absorção de água da planta, o que é uma característica marcante de espécies da caatinga (Henrique, 2008). Essa informação referente a presença de tricomas nas espécies da caatinga corrobora ao fato de ter-se encontrado um maior número 59 de tricomas tectores nas folhas do acesso caatinga em relação ao acesso restinga, como pode ser verificado na tabela 2. Ressalta-se que os espécimes estudados foram retirados de biomas de clima tropical, e assim é que caatinga e restinga, por apresentarem diferenças diferenças climática marcantes ditarão caracteristicas morfo-anatômicas adaptativas as mesmas variantes nas espécies locais. Contudo, salienta-se que S. alata é uma espécie introduzida nestes biomas, logo suas características morfo-anatômicas gerais serão preservadas, mas por adaptação local, seus tecidos e órgãos estarão adaptados em algumas questões como número de tricomas e espessamento cuticular. Com média de temperatura anual em nos ultimos 3 anos entre 29,8 ± 4,2° C, a caatinga apresentou nos meses mais secos (entre junho e agosto) a temperatura do solo com média de 60º C ± 10 º C durante todo o ano. Além dessas condições climáticas rigorosas, a umidade desse bioma apresentou valores entre 45 % e 60 % com ventos fortes e secos. Essa característica, associada aos demais elementos climáticos, determinam a aridez dessa paisagem. Na restinga a temperatura anual encontra-se entre 24 ± 4° C, com meses mais secos também entre Junho e Agosto. A temperatura do solo desse bioma, variou entre 45 e 50º C, com umidade relativa do ar entre 60 e 80 %. Outro fator que também difere nesses biomas é a salinidade presente na restiga. Essas caracteristicas ambientais salientadas acabam por promover a retenção de água pela planta resguardando as funções fotossinteticas e conservando a homeostase iônica (Esteves, 2008; EMBRAPA, 2012; Clima tempo, 2017; Climate, 2017).
4.1.3 Análise macro-microscópica e organoléptica das folhas em pó O pó das folhas de S. alata Ca e Re apresentaram características macroscópicas e organolépticas similares entre si, salientando-se que o pó é homogêneo, as fraturas são predominantemente ovaladas com os bordos sinuosos e reentrâncias suaves. A característica que varia é o sabor, pois o acesso da caatinga apresentou-se marcadamente amargo enquanto que o acesso da restinga é levemente amargo (tabela 4). Microscopicamente os dois acessos (restinga e caatinga) também apresentaram-se semelhantes, com estruturas que seguem o padrão já 60 descrito neste trabalho, ressaltando-se a presença dos tricomas tectores unicelulares de ápice afilado, fragmentos de epiderme com as células epidérmicas ondeadas e paredes celulares expessas, bem como os estômatos do tipo paracíticos.
Tabela 4 Descrição macroscópica e organoléptica das folhas pulverizadas de Senna alata (L.) Roxb.
Fratura Tamanho Coloração Forma Borda CAATINGA A maioria com Suaves Homogênea em tom Pó fino forma ovalada reentrâncias verde-mate A maioria com Suaves Homogênea em tom RESTINGA Pó fino forma ovalada reentrâncias de verde-mate Sabor Odor Superfície Consistência CAATINGA Marcadamente Suave, Lisa Membranácea amargo Suigeneres Levemente Suave, RESTINGA Lisa Membranácea amargo Suigeneres
Tomando-se por base Oliveira e Akisue (2005) e a Farmacopeia Brasileira V Ed. (2010) e Oliveira e colaboradores (2012), os folíolos pulverizados de S. alata em relação a S. alexandrina diferem basicamente no que se refere a cor do pó, pois S. alexandrina possui o pó dos folíolos na cor verde-amarelado, enquanto que S. alata possui o pó dos folíolos na cor verde- mate. O pó dos folíolos destas duas espécies em questão é similar no sabor amargo, contudo a diferença encontrada no sabor (mais ou menos amargo) para os folíolos em pó de S. alata, entre os dois acessos, deve estar relacionada à constituição química desses acessos em estudo pela variação de classes químicas ou mesmo devido a maior ou menor proporção de metabólitos das mesmas classes químicas. . A forma das céluas epidérmicas e a cutícula do tricoma tector apresentam-se com diferenças microscópicas marcantes no pó de S. alexandrina e S. alata. Em S. alexandrina a forma das células epidérmicas é poligonal e a cutícula do tricoma tector é rugosa, enquanto que na análise microscópica do pó de S. alata neste trabalho pode-se verificar que as células epidérmicas possuem forma ondeada e os tricomas tectores apresentam cutícula expessa, mas sem rugosidades. Por fim há de se diferenciar também pelo fato de o tricoma em S. alata ser reto e em S. alexandrina ser inclinado. 61
O ensaio granulométrico realizado com as folhas em pó de S. alata evidenciou que o material concentra-se nos tamises com abertura de 92 a 165 µm, com diâmetro médio da malha de 0,125 µm (Ca) e 0,115 (Re), conforme pode ser observado na figura 11, classificando-se como um pó fino, conforme FAPI (2006), WHO (1998) e Farmacopeia Brasileira V Ed. (2010).
Figura 11 Glanulometria por tamisação das folhas em pó de Senna alata (L.) Roxb. Resultados expressos em porcentagem (%) p/p. Legenda: Acesso caatiga (A); restinga (B). (n = 3). As estruturas histológicas de dos órgãos vegetais são heterogêneos. A moagem das folhas desidratadas de S. alata neste trabalho foi obtida em moinho de facas. Ressalta-se que o pó de uma planta como produto final é variável por características como a consistência do material vegetal, bem como pelo equipamento no qual a pulverização foi realizada, e o tamanho da partícula pode variar, inclusive, de acordo com a velocidade e característica do moinho utilizado no processo de pulverização da planta (Simões et al., 2003; Politi, 2009). Sobre a consistência do material, esses mesmos autores comentam que, a granulometria do material vegetal pode apresentar-se fortemente compactada, a exemplo das sementes, caules e raízes ou então com textura mais delicada, quando realizada a partir das folhas e flores. Essas 62 características influenciam diretamente na eficiência da extração. O resultado da granulometria obtido neste trabalho para os acessos de S. alata, apresentou-se como sendo um pó fino, contudo para S. alexandrina, Almeida (2005) e Severo (2013) obtiveram pó das folhas classificado como grosso, enquanto que Luna (2013), para S. occidentalis obteve pó das folhas de classificado como médio. Ressalta-se que as duas espécies vegetais citadas apresentam consistência membranácea, e também, no processo, foi utilizado moinho de facas para a moagem, em todos os trabalhos citados. Trata-se de três espécies de plantas do mesmo gênero e, possivelmente, a velocidade utilizada ou mesmo o tamis de recolhimento do pó e, mesmo o tempo de secagem da planta antes da pulverização pode ter sido fatores determinantes para esses resultados. Também deve-se levar em consideração de que o material de S. alexandrina, em geral, apresenta uma quantidade considerável de frutos junto as folhas, conforme Farmacopéia Brasileira V ed. (2010), o que deve ser determinante para os resultados destes trabalhos serem classificados com granulometria diferente.
4.2 Análise físico-química Os ensaios de pureza são essenciais para comprovar a integridade da droga em pó e os interferentes que podem ocorrer devido o cultivo e manuseio no processo de colheita e pós-colheita da mesma. A caracterização da pureza da droga, quanto à presença de material estranho, teor de umidade e cinzas das amostras analisadas, teve seus valores correspondentes a quantidades permitidas pela Farmacopeia Brasileira V Ed. (2010), que corresponde a no máximo 2,0 % de material estranho, 12,0 % de umidade, 13,0 % de cinzas totais e 10,0 % de cinzas insolúveis em ácido, como pode ser verificado na tabela 5.
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Tabela 5 Determinação físico-química referente à pureza das folhas de Senna alata (L.) Roxb. (n = 3).
Ensaios de pureza Senna alata Ca Senna alata Re (%) (%) Material estranho 0,28 ± 0,02 0,23 ± 0,03 Água 11,8 ± 1,10 9,10 ± 1,20 Cinzas totais 8,12 ± 0,40 12,87 ± 1,00 Cinzas insolúveis em ácido 4,72 ± 0,50 6,22 ± 0,70 pH 7,0 6,0
A análise dos valores referentes à pureza dos folíolos como drogas vegetais constitui resultado inédito para S. alata. A avaliação do teor de umidade presente na droga vegetal é importante na medida em que serve de parâmetro para a produção industrial, pois entre outras questões revela dados sobre as condições da conservação da droga vegetal para que se venha ter os cuidados necessários em sua preservação. O excesso de umidade acarreta em ação de enzimática e consequente degradação de constituintes químicos, além disso, facilita a proliferação de micro-organismos (Galina, 2003). Dependendo das condições de processamento e da composição química do vegetal, minerais podem aparecem nas cinzas sob a forma de óxidos, sulfatos, fosfatos, silicatos, cloretos. A determinação de cinzas em amostras vegetais é importante por indicar equilíbrio microbiano e estabilidade físico-química da droga. Figueiredo (2005) afirma que o teor de cinzas insolúveis em ácido está relacionado principalmente com a presença de areia no extrato. Essa informação pode justificar o fato do acesso restinga ter apresentado maior quantidade em comparação à caatinga. Com relação ao teor de cinzas entre os extratos do experimento neste trabalho, os valores foram elevados, no entanto dentro do permitido pela Farmacopéia Brasileira V Ed. (2010). Estas cinzas são resíduos inorgânicos remanescentes da queima da matéria orgânica, que é transformada em CO2,
H2O e NO2. A composição das cinzas corresponde à quantidade de substâncias minerais presentes, devido às perdas por volatilização ou mesmo pela reação entre os componentes (Chaves et al., 2004). Salienta-se que muitos dos minerais são vitais para a saúde, visto que atuam no crescimento do corpo e seu metabolismo, nas contrações musculares 64 e também no balanceamento da água, entre muitos outros processos (Wardilaw et al., 1994). Os resultados da tabela 4 de S. alata, mostram-se similares quando comparados com os dados de S. alexandrina descrina na Farmacopéia brasileira V Ed. (2010), uma vez que se tem para esta espécie comercial o valor de 12 % para as cinzas totais e 3% para as cinzas insolúveis em ádico.
4.3 Determinação do teor extrativo A determinação do teor extrativo de S. alata permitiu verificar que o rendimento do extrato a 10 % da droga vegetal (p/v), usando como solvente etanol nas concentrações a 20, 40, 60, 80 e 95 %, obtiveram maior rendimento em etanol a 40 % (v/v). Este resultado foi muito próximo às extrações com etanol a 20 e 60 %, conforme apresentado na tabela 6.
Tabela 6 Determinação do teor extrativo dos extratos hidroetanólicos obtidos a partir das folhas de Senna alata (L.) Roxb. Ensaio realizado em triplicatas nas concentrações 20, 40, 60, 80 e 95 % de etanol. (n = 3).
Solução extrativa em Teor extrativo de Senna Teor extrativo de Senna etanol alata (L.) Roxb. Ca alata (L.) Roxb. Re (%) v/v (%) p/p (%) p/p 20 21,54 ± 1,02 21,18 ± 1,40 40 23,89 ± 1,07 22,57 ± 1,00 60 20,98 ± 2,00 19,10 ± 1,12 80 16,10 ± 2,00 16,12 ± 2,00 95 09,90 ± 1,00 10,12 ± 1,00
O ensaio referente à determinação do teor extrativo é de suma importância, pois antes de executar uma extração, deve-se levar em consideração uma série de fatores que interferem nesta operação tais como granulometria do material em pó, polaridade do solvente, acidez do meio, agitação, temperatura, tempo de extração e tocixidade do solvente (Soares et al., 1998), pois a estrutura histológica de um órgão vegetal é bastante heterogênea o que influencia diretamente na eficiência da extração. A composição química do gênero Senna, rico principalmente em flavonoides e antracênicos, fez com que neste trabalho se optasse pela extração com etanol. Também se utilizou etanol devido a polaridade e menor índice de toxicidade dessa substância em relação a outros solventes 65 comumente utilizado em extrações. Waksmundzka e colaboradores (2008) ressalta que, como os extratos vegetais possuem moléculas polares e apolares, a utilização de solvente com polaridade intermediária contribui para separar os compostos químicos de maneira mais eficiente, a não ser que se objetive uma determinada classe química de metabólitos. Na escolha de um método extrativo, deve-se avaliar a eficiência, a seletividade, a estabilidade das substâncias extraídas e o custo do processo escolhido, considerando principalmente a finalidade do extrato que se quer preparar (Costa, 1994; Simões e Spetizer, 2003). Assim é que, apesar de não ter havido grandes diferenças entre o teor extrativo nos extratos entre etanol a 20 %, 40 % e 60 %, optou-se por utilizar a extração a 40 % de etanol por representar uma economia média em etanol e em tempo e energia ao se evaporar o solvente.
4.4 Triagem fitoquímica dos extratos Em relação ao perfil fitoquímico qualitativo de S. alata, com a demarcação da presença de classes químicas nos extratos obtidos a partir das folhas, pode-se afirmar que os acessos da caatinga e restinga, apresentaram perfis semelhantes, conforme tabela 7.
Tabela 7 Triagem fitoquimica dos extratos etanólico a 40 % obtidos a partir das folhas de Senna alata (L.) Roxb. acesso caatinga e restinga. Ensaios S. alata caatinga S. alata restinga Mucilagem - índice de intumescência 1,3 ± 0,1 mL 1,0 ± 0,1 mL Saponinas - índice de Espuma 1,0 ± 0,1 cm 1,0 ± 0,1 cm Saponinas hemolíticas - grau de Hemólise < 10 % < 10 % Antraquinonas Presente Presente Flavonoides Presente Presente Taninos Taninos Ausente
A prospecção fitoquímica de uma planta geralmente tem como objetivo principal o conhecimento das classes dos compostos químicos presentes no extrato vegetal obtido a partir de um órgão específico da mesma. No que se refere ao gênero Senna sabe-se que o mesmo possui um perfil químico em que se sobressai os flavonoides e as antraquinonas, relatado por autores como Viegas e colaboradores (2005). Neste trabalho, as classes químicas encontradas nos extratos analisados foram fiéis aos padrões para o gênero e 66 subfamília de S. alata, encontrando-se as mesmas classes químicas que em S. obtusifolia (L.) H.S. Irwin e Barneby e S. angustifolia Vahl. e S. occidentalis (Lorenzzi, 2002; Lombardo et al., 2009; Schulz, 2012). Ressalta-se que os resultados obtidos também corroboram com os ensaios histoquímicos de Rodrigues e colaboradores (2011) para as folhas de S. alata, em que identificaram antraquinonas, flavonoides, saponinas e taninos em material obtido na Amazonia Oriental. Ocorreu presença marcante de mucilagem nos dois acessos de S. alata, com maior índice no acesso caatinga. A mucilagem é um polímero de alta massa molecular que apresenta a capacidade de se complexar com moléculas de água e por isso a presença marcante em cactos e outras plantas suculentas ou não que ocorrem naturalmente em locais sob sol pleno e baixo regime de águas. Estes metabólitos, por vezes, formam uma solução viscosa, produzidas como exsudatos para a proteção de danos mecânicos ou a ataques microbianos, que a planta tenha sofrido. Um exemplo de ocorrência de mucilagens é o gênero Aloe, em que estes metabólitos ocorrem em grande quantidade no tecido parenquimático das folhas (Thaiz e zeiger, 2002; Lulinski et al., 2003). Farmacologicamente é uma classe química que apresenta propriedade cicatrizante, anti-inflamatória, laxativa, expectorante e antiespasmódica. A determinação da presença de saponinas neste trabalho foi obtida pelo índice de espuma e/ou determinação do grau da atividade hemolítica (Simões e Spetizer 2003; Farmacopeia Brasileira Ed. V, 2010). Destaca-se que a determinação da presença destes metabólitos em S. alata foi obtida pela intensa formação de espuma e também pela atividade hemolítica em grau baixo por hemólise de eritrócitos mesmo que em baixo grau (tabela 6) para os dois acessos de S. alata. Ressalta-se que a palavra hemólise é definida na literatura como um rompimento da membrana da hemácia, causando a liberação da hemoglobina e outros componentes internos no líquido circundante indicando que não está havendo danos à membrana celular dos eritrócitos (Brandão et al., 2006), representando grau de toxidez dos extratos o que necessariamente deve ser analisado em outros ensaios - o que foi averiguado neste trabalho em testes seguintes. A presença de saponinas está relatada para S. occidentalis e S. reticulata por Okwu (2001), Ogunkunle e 67 colaboradores (2006), Rodrigues e colaboradores (2009) e Alonso e colaboradores (2015). Esta classe química de metabólitos apresenta um amplo espectro de atividades biológicas e farmacológicas, estando associadas a toxidez quando apresentam a capacidade de produzir hemólise e, muitas vezes, estão relacionadas a atividade antimicrobiana (Lacaille et al., 1996). A atividade hemolítica das saponinas faz parte do sistema de proteção do vegetal contra ataques de predadores como insetos e outros animáculos (Bruneton, 1999), e pode estar ligada a atividade espermicida, anti-inflamatória e antimicrobiana apresentada por uma variedade de plantas (Lacaille et al., 1996).
Em outro ensaio, os extratos de S. alata em contato com o NH4OH as amostras apresentaram coloração rósea o que constitui reação positiva para antraquinona. Este grupo de compostos químicos é marcante para esta família botânica e reflete a possibilidade de um maior potencial alelopático, bem como atividade anti-inflamatória, vasodilatadora, ou ainda atividade anticarcinogênica (Alemayehu et al., 1998; Machado, 2011; Rasul et al., 2011; Lu et al., 2013; Vitorino et al., 2013). Quanto à presença de taninos, foi detectada pelo aparecimento de precipitado exposto ao cloreto férrico. Segundo Costa (1975), soluções aquosas de cloreto férrico em contato com taninos podem causar alteração para a cor verde-enegrecida, o que foi observado apenas para o acesso caatinga de S. alata. Os taninos, algumas vezes, são relacionados ao sistema de defesa das plantas em representantes da subfamília Caesalpinoideae (Polhill et al., 1981; Ordoñes, 2004; Barrese et al., 2005).
4.4.1 Determinação de polifenois totais Na determinação dos compostos fenólicos totais das amostras de S. alata, fez-se a curva de calibração com ácido gálico e obteve-se a equação da reta para o cálculo dos compostos fenólicos totais como equivalentes de ácido gálico nas amostras. O coeficiente de determinação (r2) entre x e y, no valor de 0,9987, comprovou a correlação positiva entre a massa de ácido gálico (mg) e a absorvância (760 nm) dos acessos estudados (figura 12). O conteúdo de polifenois encontrados nas amostras em análise demonstrou resultados semelhantes para os dois acessos de S. alata com 68 média de 22,21 ± 0,01 mg de ácido gálico/g para acesso Ca e 21,79 ± 0,01 mg de ácido gálico/g de para o acesso Re (Tabela 8) em extratos etanólicos a 40 %, obtidos a partir das folhas desta planta.
Figura 12 Reta obtida a partir da curva padrão de ácido gálico no ensaio de quantificação de fenolicos totais de Senna alata (L.) Roxb. Resultados obtidos pela média (n = 3) dos extratos dos acessos caatinga e restinga.
Tabela 8 Conteúdo de fenolicos totais da Senna alata Ca e Re em mg de ácido gálico/g por amostra. Legenda: mg AG/g amostra = mg de ácido gálico por g da amostra.
Amostras Fenólicos totais (mg AG/g amostra) Senna alata Ca 22,21 ± 0,01 Senna alata Re 21,79 ± 0,01
Este experimento referente ao conteúdo total de polifenois em uma planta ou em seus órgãos é elementar neste tipo de estudo que visa a possibilidade de inserir uma planta na perspectiva da produção de um produto farmacêutico, tendo em vista que vários estudos demonstram os polifenois como compostos químicos marcadamente responsáveis pela atividade antioxidante (Gupta e Singh, 1991; Wang et al., 1996; Taiz e Zaiger, 2002). Estes resultados são compatíveis com o perfil fitoquímico obtido neste estudo para as folhas da planta em questão (tabela 6), e é uma primeira contribuição na padronização de parâmetros para o controle de qualidade para esta planta como insumo farmacêutico. Há de se considerar que espécies do gênero Senna apresentam em sua composição química polifenois como cumarinas, flavonoides, taninos e 69 antraquinonas (Lombardo et al., 2009). Por outro lado, ressalta-se, que os polifenois estão diretamente envolvidos com a disponibilidade hídrica e radiação solar, fatores relevantes tanto na restinga como na caatinga, interferindo diretamente na composição química e mesmo na fenologia das plantas (Mota, 1975; Taiz e Zaiger, 2002). A presença de polifenois que este ensaio demarca para as folhas de S. alata corroboram com os resultados em estudos fitoquímicos para o gênero Senna. Viegas e colaboradores (2006) constataram que as folhas e frutos de Senna occidentalis são fontes majoritárias de polifenois, destacando- sesobretudo pela presença de compostos antraquinônicos e flavonoídicos A presença de compostos fenolicos também foi confirmada em Senna reticulata por Santos, (2004) e Zuanassi (2004), onde o estudo fitoquímico de suas raízes revelou a presença de cumarinas, taninos e flavanonas. A presença de polifenois pode estar associada ao potêncial anti-inflamatório e relaxante muscular, além da inibição de peroxidação lipídica, o que já foi constatado para S. occidentallis.
4.4.2 Determinação de flavonoides totais Com a curva padrão, obtida a partir das absorvâncias referentes a concentrações crescentes de rutina através da equação da reta, com R2 de 0,997 foi possível obter as concentrações de (mg/mL) de flavonoides presentes nas amostras de S. alata expressos em rutina (Figura 13). Os resultados do doseamento de flavonoides foram de 10,12 ± 0,08 mg de rutina/g para acesso Ca e 9,78 ± 0,1 mg de rutina/g para o acesso Re, como consta na tabela 9.
Figura 13 Gráfico obtido a partir da curva de calibração realizada com rutina na obtenção do teor total de flavonoides nos extratos das folhas de Senna alata (L.) Roxb. nos acessos caatinga e restinga. (n = 3). 70
Tabela 9 Conteúdo de flavonoides totais de Senna alata Caatinga e Restinga em mg de rutina/g por amostra. Legenda: mg rutina/g amostra = mg de ácido gálico por g da amostra.
Amostras Fenólicos totais (mg rutina/g amostra) Senna alata Ca 10,12 ± 0,08 Senna alata Re 9,78 ± 0,10
A determinação do teor de uma classe de substâncias químicas pode servir como parâmetro, mesmo que inicial, tanto para um controle de qualidade como também para se otimizar as quantidades desta classe química através de variáveis nos processos de cultivo, colheita e pós colheita da planta. Ocorre que a marcação das quantidades de uma classe química presente na constituição química de uma planta, registra como a mesma irá reagir frente às condições do habitat, e, consequentemente, demarcará as melhores características climáticas-edáficas a serem observadas em seu cultivo e outros processos com vistas a uma maior produção destes constituintes químicos (Vigo et al., 2004; Freire et al., 2006). Apesar de a espectrofotometria no UV/Vis apresentar limitações de seletividade e especificidade, principalmente tratando-se de matrizes complexas como as drogas vegetais, esta técnica apresenta confiabilidade suficiente para a sua adoção no controle de qualidade da espécie em questão, além da simplicidade operacional e rapidez na obtenção dos resultados (Moffat et al., 2004). A presença de flavonoides é relatada em todas as partes das plantas do gênero Senna (Gobbo-Neto e Lopes, 2007), sendo que esta classe de substâncias químicas (além das antraquinonas) são os marcadores químicos responsáveis por diversas atividades farmacológicas desempenhadas no gênero Senna (Viega, J., 2005; Rodrigues et al. 2009). Os resultados obtidos neste estudo identificam que entre o conteúdo fenólico existente nas amostras de S. alata, cerca de 50 % constitui-se de flavonoides. O teor de flavonoides em S. alata também foi obtido por Moriyama e colaboradores (2013) com a planta coletada na Indonésia. Estes autores demonstraram que o teor de flavonoides é maior entre janeiro a setembro, com pico (4 %) em Janeiro. Assim é que o teor de flavonoides nos acessos testados (caatinga e restinga) são praticamente o dobro do que se obtem na indonésia para esta planta (Moriyama et al., 2003; Rodrigues et al., 2009). Por outro lado, 71 os resultados obtidos neste trabalho para o teor de flavonoides são próximos ao que Nogueira (2009) obteve para o extrato hidroetanólico de Senna macranthera em que o teor de flavonoides chegou a aproximadamente 50 % dos fenois totais. Por vez, este mesmo autor chegou ao resultado de 70 % de flavonoides do conteúdo total de polifenais ao utilizar metanol como solvente extrator.
4.4.3 Perfil cromatográfico em cromatografia de camada delgada Neste estudo objetivou-se verificar o comportamento químico dos extratos de S. alata em diferentes fases móveis para se obter a presença do maior número de bandas, com seus Rfs, além de marcar as que são comuns e diferentes aos dois acessos testados (Re e Ca). A fase móvel escolhida foi hexano: acetato de etila (1:1) e como agente cromogênico utilizou-se vanilina sulfúrica a 100º C por 5 minutos (Figura 14). Neste sistema cromatográfico obteve-se 6 bandas para o acesso caatinga (Rf: 0,21, 0,23, 0,38, 0,52, 0,77 e
0,97) e 4 bandas para o acesso restinga (Rf: 0,17, 0,42, 0,77, 0,97), tendo-se somente duas bandas com Rf semelhantes (Rf: 0,77, 0,97).
Figura 14 Representação do perfil cromatográfico obtido para os extratos etanólicos a 40 % a partir das folhas de Senna alata (L.) Roxb., sobre cromatofolhas de sílica gel G 60 F254. Fase móvel constituída por uma mistura de hexano: acetato de etila (1:1) e vanilina sulfúrica com tratamento de temperatura a 100º C por 5 min como agente cromogênico. Legenda: 1. Banda cromatográfica do extrato de S. alata Ca; 2. Bandas cromatográficas do extrato de S. alata Re; 3. Bandas cromatográficas do padrão rutina; 4. Bandas cromatrográficas do padrão quercetina.
A cromatografia em camada delgada visa, principalmente, desenvolver um perfil cromatográfico para os extratos em estudo bem como, demonstrar as diferenças e similaridades que se pode encontrar nos dois acessos em questão 72 através das bandas detectadas. Para tanto, se fez um estudo com diversas fases móveis e agentes cromogênicos para um estudo do comportamento dos extratos obtidos a partir das folhas de S. alata sobre cromatofolhas de sílica gel
G 60 F254, tomando por base o estudo de Wagner e Bladt (1996). Em que pese as diferença de fatores ambientais existente entre os acessos estudados, ocorrem duas bandas que são comum nesses acessos, o que sugere que apesar da diferença climática entre os biomas, existem substâncias em comum entre os dois acessos. O estabelecimento de um perfil cromatográfico em cromatografia de camada delgada (CCD) é corriqueiramente utilizado como uma técnica farmacopeica que, apesar de ser simples, caracteriza inúmeras drogas vegetais, de acordo com a Farmacopeia Brasileira Ed. V (2010). Engel e colaboradores (2008) encontraram diferenças nos perfis químicos em plantas do gênero Bauhinia, comercializadas como sendo pata- de-vaca, através da observação de perfil cromatográfico em CCD. Estes resultados mostram uma falta de padronização do material vegetal comercializado. As amostras neste caso devem corresponder a plantas de espécies diferentes ou a cultivares, épocas e manejos diferentes. Esses fatores citados interferem nos resultados de análise em uma CCD e mostram a necessidade de uma padronização em processos como na coleta e tratamento do material vegetal. Deve-se comentar ainda que, por outro lado, a época de coleta e a fase de desenvolvimento da planta podem desenvolver perfis cromatográficos diferentes entre o extrato de uma mesma espécie devido a variação climpatica existência em cada estação do ano. Tendo acesso a esses resultados, que confirma a presença de compostos químicos capazes de atuar no sistema biológico de forma positiva, nos estudos seguintes, são realizados teste de atividade biológica, que buscará verificar se esses compostos são eficazes no controle antibacteriano e no tratamento da inflamação, sendo também testado o potencial citotóxico e tóxico dos extratos em diferentes concentrações.
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4.5 Atividades biológicas
4.5.1 Atividade antibacteriana A bioautografia é considerada um ensaio qualitativo, que permite detectar na cromatografia as bandas que apresentam atividade antimicrobiana a partir da formação de halos de inibição (Holetz, 2002). O ensaio bioautográfico demonstrou que o extrato etanolico a 40 % obtido a partir das folhas de S. alata dos acessos caatinga e restinga, apresentam bandas cromatográficas com atividade antibacteriana para as duas cepas utilizadas (Tabela 10).
Tabela 10 Halos de inibição obtidos em cromatografia dos extratos de Senna alata, acesso caatinga e restinga, frente a Staphilococcus aureus e Escherichia coli.
DIÂMETRO DOS HALOS DE INIBIÇÃO (cm) Linhagens Senna alata Ca (R ) Senna alata Re (R ) bacterianas f f Amoxicilina 0,21 0,23 0,38 0,52 0,77 0,97 0,17 0,42 0,77 0,97
Staphylococcus - 1,26 - - 0,62 - 0,89 - 0,74 - 1,2 aureus
Escherichia coli 0,12 - 0,91 - 0,52 0,61 0,20 - 0,54 0,94 1,4
Para a bactéria gram negativa Escerichia coli, observou-se inibição do crescimento em 4 e 3 bandas no acesso Ca e Re, respectivamente. Para a bactéria gram positiva Staphylococcus aureus, obteve-se inibição em 2 bandas para os acessos em estudo. Destaca-se que duas bandas, Rf 0,17 e 0,77, inibiram o crescimento das duas sepas em análise e, para S. aureus, o Rf 0,23 do acesso Ca demonstrou halo de inibição superior ao encontrado no padrão utilizado de amoxicilina. Os resultados obtidos somam-se ao estudo de Silva e colaboradores (2017), em que extratos de S. alata mostraram-se eficiente como agente antibacteriano frente à Xanthomonas axonopodis, com redução de 37,82 % da doença do maracujazeiro, correspondendo a um resultado muito significativo quando comparado ao padrão utilizado no controle fitopatogenico (Óxicloreto de cobre). Por outro lado, o potencial antibacteriano de extratos obtidos a partir de caule e folhas de S. obtusifolia foi negativo para A. aureus e E. coli nos estudos de Cordeiro (2006) e Rodrigues e colaboradores (2011) , diferente dos resultados para S. alata, neste trabalho. 74
Vale ressaltar que nos estudos realizados por Timothy (2012), o extrato aquoso das folhas de S. alata apresentou maior inibição de E. coli em comparação com o extrato etanólico, e para bactéria Salmonella typhi, o extrato hidroetanólico a 95 % mostrou maior eficiência.
4.5.2 Atividade alelopática Os dados referentes à germinabilidade e crescimento da radícula de Lactuca sativa frente aos extratos das folhas de S. alata em diferentes concentrações mostraram interações significativas entre os acessos da espécie vegetal em questão versus concentração dos extratos. Os resultados evidenciaram que os diásporos de L. sativa, sofreram efeito quando em contato com os extratos do acesso Ca e Re em todas as concentrações do experimento (Figura 15).
Figura 15 Germinabilidade (%) de Lactuca sativa L. frente extratos de Senna alata (L.) Roxb. Valores expressos pela média das triplicatas (n = 3). Legenda: A. acesso caatinga; B. acesso restinga; Concentrações: 0,5, 1 e 2 %. Diferença estatística significante em relação ao grupo controle (p ˂ 0,05).
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A viabilidade das sementes não germinadas foi verificada pela secção das sementes transversalmente, após tratamento com solução aquosa de cloro-2,3,5-trifenil cloreto de tetrazólio a 1 % (v/v). Neste ensaio detectou-se que 10 % das sementes estavam inviáveis e o restante (90 % das sementes não germinadas) desenvolveram cor rosa, indicando a viabilidade das mesmas. Os diásporos de L. Sativa frente à água pura completou o processo germinativo em 12 horas com 98 % dos diásporos germinados. No entanto, as características analisadas indicaram que os extratos de S. alata tiveram uma influência negativa na germinação dos diásporos de L. sativa, visto que nas concentrações 0,5 e 1 %, houve retardo germinativo e protrusão radicular após 12 horas para o acesso caatinga e 18 horas para o acesso restinga e, após 48 horas, para os extratos nas concentrações de 0,5 e 1 % teve-se germinabilidade de inferior a 10 %, nos dois testados. Já, na concentração do extrato a 2 %, mesmo após 48 horas, não se verificou nenhum desenvolvimento germinativo dos diásporos de L. sativa, constatando completa inibição da germinação. Com o teste do tetrazólio nos diásporos não germinados constatou-se que um percentual muito baixo (10 %) estava viáveis o que indica de fato a atividade alelopática dos extratos utilizados. Em relação ao comprimento radicular, os resultados indicaram que houve efeito negativo no desenvolvimento das sementes germinadas frente aos extratos de S. alata, pois quando comparadas com o controle (água pura) o desenvolvimento radicular foi comprometido severamente. Estes dois fatos apontam para um efeito alelopático do extrato em análise. Com os resultados obtidos neste ensaio pode-se inferir que os extratos testados desenvolvem atividade alelopática e que os mesmos apresentam substâncias aleloquimicas, provocando forte interferência no desenvolvimento dos diásporos de L. sativa. Este resultado corrobora com os estudos realizados por Agbagwa e colaboradores (2003), em testes de alelopatia para extratos de S. alata frente à celosia argentea e, como no presente estudo, também obtiveram efeitos alelopáticos. Com isso tem-se o indicativo de uma possível atividade inseticida e herbicida para o extrato testado, conforme Bansal e Bhan (1993), Souza (1995), Lorenzi, (2000) e Rodrigues (2011). Neste sentido, soma-se a informação de Barrese e colaboradores (2005) que registra o cultivo 76
na África de S. alata ao redor das casas para espantar formigas. Por outro lado, Polhill e colaboradores (1981) e Taiz e Zeiger (2002) explicam que uma planta pode reduzir o crescimento das plantas vizinhas pela liberação de aleloquímicos no solo, isso pode ter como consequência a chance maior de acesso à luz, à água e aos nutrientes e, portanto, propiciar sua maior adaptação evolutiva. Com base no estudo fitoquimico realizado nesse trabalho, pode-se afirmar que S. alata possui classes de compostos orgânicos que apresentam atividade fitoquímica o que pode justificar o potencial alelopático dessa planta, a exemplo das antraquinonas, flavonoides e taninos (encontrado no acesso Ca).
4.5.3 Viabilidade celular pelo método MTT Não foi observada redução da viabilidade celular após o tratamento de macrófagos com os extratos de S. alata. Os extratos Ca e Re não causaram citotocidez nas concentrações testadas, em comparação com macrófagos lisados com Triton-X (controle de lise celular máxima) e, não tratado, conforme figura 16.
Figura 16 Viabilidade do extrato de Senna alata (L.) Roxb. nos acessos catinga e restinga. Nas concentrações de 50 e 100 µg/mL em macrófagos pelo método de 3-(4,5dimetiltiazolio-2-il)-2,5-difenil tetrazólio. Valores expressos pela média das triplicatas. Legenda: C +. controle positivo: macrófagos estimulados e não tratados; Controle negativo: Triton X. Leitura a 570 nm; Diferença estatística significante em relação ao grupo controle (p˂0,05). A citotoxicidade, em geral, é avaliada com a finalidade de verificar o quão seguro as diferentes substâncias podem ser e em quais concentrações essa segurança e citotoxidez são observadas para que permaneça na triagem como candidatos a nova droga. Os resultados dos testes efetuados nas células tratadas com os extratos de S. alata não apresentaram diferenças consideráveis entre os acessos Ca e 77
Re, nas concentrações testadas, apresentando-se próximos ao controle positivo. Esse resultado sugere citotoxicidade baixa ou ausente para esses extratos, podendo assim ser considerado seguro em formulações farmacêuticas. Esta foi a primeira vez que estudos de citoxidade por MTT no gênero Senna foram abordados em pesquisa científica, no entanto, outras técnicas de verificação de citotoxicidade já foram testadas com plantas do gênero Senna onde também apresentaram baixa mortalidade celular. Lombardo (2008) avaliou o potêncial citotóxico de Senna occidentallis a partir do método MTS, que se difere do MTT principalmente pela formação de cristais solúveis em água. O autor verificou que, a concentração hidroetanólica testada superior a 0,38 % (p/v), é considerada tóxica, causando morte da população celular, logo nas primeiras 24 horas de contato com a cultura apresentando viabilidade celular inferior a 50 %. Estudos realizados com outros gêneros da subfamília Caesalpinoide podem ser também compados a esses resultados. Kayano e colaboradores (2011) e Zanin e colaboradores (2012) verificaram, a partir de espécies do gênero Caesalpinia resultados satisfatórios em relação a citotoxidade das espécies testadas (C. pyramidalis, Caesalpinia pluviosa e C. férrea), onde demostraram toxicidade a protozoários causadores da malária severa em humanos e ao mesmo tempo não apresentaram efeito citotoxico significativo em células de camundongos Swiss. Rosário (2010) também verificou o potencial citotóxico de espécie da sunfamília Caesalpinoideae. Segundo o autor, a Copaifera langsdorffii, não exerceu efeito citotóxico significativo nas concentrações de 10 a 100 μg/mL para macrófagos estimulados com LPS. Esses resultados foram importantes para o conhecimento da dosagem segura de S. alata nos estudos conseguintes e, além disso, motivam a continuidade da investigação a fim de verificar o potêncial anti-inflamatorio dos acessos estudados.
4.5.4 Atividade anti-inflamatória in vitro com LPS Verificou-se a produção de NO e TNF-α induzidos por LPS, demonstrando os efeitos anti-inflamatórios dos extratos das folhas de S.alata 78 dos acessos Ca e Re sobre a linhagem celular estudada. Os resultados apresentados foram comparados com estudos realizados com espécies do mesmo gênero ou família, devido à inexistência de estudos de atividade anti- inflamatória com a S. alata.
4.5.4.1 Inibição da produção de TNF-α Neste ensaio, avaliou-se a produção da citocina TNF-α produzida por macrófagos tratados com o extrato de S. alata, em comparação com a produção da citocina por células do grupo controle LPS, não tratadas. Para isso, o sobrenadante da cultura celular foi obtido após o tratamento com extratos de S. alata do acesso caatinga e restinga e estimulados com LPS (1µg/mL) por 24 horas. No acesso caatinga, a inibição da liberação do TNF-α foi significativa (p < 0.05) apenas após o tratamento com o extrato na concentração 100 µg/mL (464,0 ± 36.7 pg/mL) quando comparado ao controle positivo (CP) (1143.0 ± 118.0 pg/mL). As concentrações de 50 µg/mL e 25 µg/mL não foram ativas, quando comparadas ao CP, conforme apresentado na figura 17.
Figura 17 Inibição da citocina TNF-α após tratamento com extrato de Senna alata (L.) Roxb, caatinga e restinga, das células RAW-264-7, estimuladas com LPS. Valores expressos pela média das triplicatas. Legenda: Concentração extrativa: 25, 50 e 100 µg/mL; CN. Produção basal de citocina da célula sem estímulo e sem tratamento; CP. Células estimuladas com LPS e sem tratamento; (*) Diferença significativa em comparação ao grupo controle P<0.05. O extrato hidroetanólico de S. alata do acesso restinga, na concentração 100 µg/mL (774.0 ± 50.4 pg/mL) apresentou uma inibição estatisticamente significativa frente à liberação do TNF-α, quando comparada ao CP (1143 ± 118 pg/mL). Os resultados sugerem um efeito inibitório sobre a produção TNF- α, concentração dependente, nos dois acessos avaliados, sem diferenças entre restinga e caatinga. Este resultado é inédito para a espécie S. alata, sugerindo 79 um potencial efeito anti-inflamatório associado à inibição da produção desta citocina. A produção da citocina TNF-α foi citada por Galdino (2012) em estudo realizado com S. angustifólia, onde o extrato de Sene estimulou a produção das citocinas IL-1, IL-6 e TNF-α, que promoveram a reabsorção das células trifoblásticas de camundongos gestantes, com um efeito pró-inflamatório contrário ao aqui observado.
4.5.4.2 Inibição da produção de oxido nítrico in vitro A atividade inibitória do extrato hidroetanólico de S. alata na produção de NO por macrófagos estimulados com lipopolissacarídeos (LPS) foi estatisticamente significante quando comparado aos resultados obtidos em macrófagos controles, não tratados. Não foram observadas diferenças significativas entre as concentrações de 12,5 e 25 µg/mL de S. alata, em comparação com o controle LPS. Com a concentração de 50 µg/mL de S. alata, a produção de NO foi estatisticamente menor (p < 0,05) quando comparado ao grupo controle LPS, com o acesso Ca inibindo 44,21 ± 3,04 % e o extrato aquoso do acesso RE inibindo 16,11 ± 3,22 da produção de NO induzida por LPS (figura 18).
Figure 18 Produção de óxido nítrico nos grupos tratados com Senna alata (L.) Roxb. acesso caatinga e acesso restinga. Valores expressos pela média das triplicatas. Legenda: C. controle positivo - macrófagos estimulado por LPS. (*) Diferença significativa em comparação ao grupo controle (p˂0,05).
Ambos os acessos foram ativos sobre a inibição da produção de NO, apenas na concentração 50 μg/mL, sugerindo um efeito concentração- dependente. Esses resultados demonstram uma eficiência na redução do 80 processo inflamatório induzido por LPS. Esse resultado já era esperado, pois espécies do mesmo gênero, como S. angustifolia e outras espécies da família Fabaceae apresentaram resultados similares (Almeida, 2005; Rodrigues, et al. 2009; Severo, 2013). O NO é um importante mensageiro intercelular nos mamíferos, exercendo sinalização intracelular, sem receptores transmembranosos, o que torna o NO um eficiente e rápido elemento de resposta não só do sistema imunológico, mas também em outros importantes sistemas do organismo. Portanto, o NO é um importante alvo terapêutico de substâncias antiinflamatórias (Alemayehu et al. 1998; Jesus, 2016; Silva, 2015).
4.5.5 Atividade anti-inflamatória in vitro com Zymosan No estudo com o Zymosan, assim como o realizado com o LPS, foi verificada a produção de NO e TNF-α após o estímulo em macrófagos. Os efeitos anti-inflamatórios dos extratos das folhas de S.alata estimulados com Zy apresentaram similaridade na redução de NO nos extratos dos dois acessos caatinga e restinga na concentração de 50 μg/mL (figura 19), contudo, houve diferenciação na dosagem de TNF-α que apresentou maior inibição no extrato da restinga, com redução da produção a partir de 25 μg/mL. (figura 20).
4.5.5.1 Inibição da produção de TNF-α A citocina TNF-α, foi quantificada no sobrenadante obtido da cultura de macrófagos, após tratamento com extratos hidroetanólicos de S alata do acesso caatinga e restinga e estimulados com Zy (1 µg/mL) por 24 horas. No acesso caatinga, a inibição da liberação do TNF-α foi significativa (p < 0,05) após tratamento com o extrato etanólico nas concentrações 100 µg/mL (684,12 ± 38,21 pg/mL) e 50 µg/mL (678,12 ± 39,46 pg/mL) quando comparado ao controle positivo (984 ± 97,0 pg/mL). A concentração de 25 µg/mL não apresentou diferença significativa quando comparado ao controle positivo indicando um efeito inibitório concentração-dependente, conforme figura 19.
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Figura 19 Inibição da citocina TNF-α após tratamento com extrato de Senna alata (L.) Roxb. dos caatinga e restinga, das células RAW-264-7, estimuladas com Zymosan. Valores expressos pela média das triplicatas;. Legenda: CN – controle negativo: produção basal de citocina da célula sem estímulo e sem tratamento; CP- controle positivo : células estimuladas com LPS e sem tratamento. (*) Diferença significativa em comparação ao grupo controle P<0.05 em relação ao grupo CP.
Os extratos de S. alata nos acessos restinga e caatinga responderam aos estímulos com LPS e Zy de forma similar. Ressalta-se que o extrato etanólico a 40 % de S. alata do acesso restinga, apresenta concentração dependente da dosagem, sendo que se obteve uma maior inibição liberação do TNF-α mesmo quando comparada ao controle positivo (984 ± 97,0 pg/mL), na concentração 100 µg/mL (441,0 ± 31,1 pg/mL).
4.5.5.2 Inibição da produção de óxido nítrico A atividade inibitória do extrato hidroetanólico de S. alata na produção de NO por macrófagos estimulados com o polissacarídeo Zy foi estatisticamente significante quando comparado aos resultados obtidos em macrófagos controles não tratados. Nos resultados, assim como nos ensaios de estímulo com LPS, apenas a concentração 50 g/mL inibiu significativamente a produção de NO induzida por Zy, sendo de 37,21 ± 3,04 % frente ao extrato obtido do acesso Ca e 32,11 ± 3,22 no acesso Re. Esses resultados estão expressos na figura 20. 82
Figura 20 Produção de NO nos grupos tratados com Senna alata (L.) Roxb., nos acessos de restinga e caatinga. Valores expressos pela média das triplicatas; Legenda: C. Controle positivo - macrófagos estimulado s por Zymosan. (*) Diferença significativa em comparação ao grupo controle (p ˂ 0,05).
Rosário (2010) encontrou resultados similares para espécie da sub família Caesalpinoideae (Copaifera langsdorffii). Ele verificou que o tratamento intraperitoneal da inflamação induzida por LPS, provocou diminuição da produção de citocinas nas concentrações a partir de 50 µg/mL em macrófagos. No entanto, em estudo realizado por Mariano Souza (2005), foi testada a atividade anti-inflamatória (induzida por Zy) de Senna occidentalis em ratos. O autor verificou que apesar dos extratos atuarem satifatoriamete no controle da inflamação aguda e crônica, promovendo a diminuição na produção de citocinas inflamatórias em macrófagos intraperitoneais, a utilização dessa planta promoveu alteração no timo e no baço e efeitos tóxicos sobre os eritrócitos dos animais tratados com extratos de S. occidentalis concentração acima de 4 %. A atividade anti-inflamatória de S. alata aqui observada, nos modelos de estímulo tanto com LPS quanto com Zymosan, pode estar associada à presença de substâncias como os flavonoides que apresentam atividade anti- inflamatória cientificamente comprovada in vivo e in vitro (Middleton et al., 2000; Birt, 2006; Filho et al., 2008; de Queiroz et al., 2010). Verificou-se que a presença de flavonoides em extratos vegetal influi na redução da produção de citocinas mediadoras da inflamação e apresenta favorável à ação de inibidores da ciclooxigenase, lipoxigenase e óxido nítrico sintase (Middleton et al., 2000). Esses estudos corroboram também com a pesquisa desenvolvida por Motta (2013), onde foi atribuido à quantidade de flavonoides existente Macuna pruriens o efeito antinociceptivo e a redução da atividade anti-inflamatória do 83 extrato, que inibiu o edema de orelha em camundongos, causado pelo óleo de crótom em 63%. O estudo do extrato etanólico a 40 % obtido a partir das folhas de S. alata além de apresentar ação antibacteriana possui atividade anti-inflamatória, sendo ativa na inibição da liberação de citotoxinas. Além disso, possui potencial alelopático, o que aponta sua utilização como herbicida. Além de apresentar baixa citotoxidade in vitro e toxidade in vivo o que realça o seu potencial medicinal e fortalece a sugestão de seu uso como fitoterápico.
4.5.6 Toxidez aguda O teste de toxidez aguda mostrou que os extratos hidroetanólicos podem ser tóxicos em altas doses. Os extratos foram testados por via intraperitoneal nas doses 16, 32, 40 e 60 g/kg e os valores de DL50 mostraram que os extratos obtidos das folhas de S. alata acesso restinga são os menos tóxicos, com DL50 igual a 30 g/kg, enquanto que no acesso caatinga a DL50 obtida foi 33,3 g/kg. Esses valores podem ser observados na figura 21.
Figura 12 Potencial tóxico de Senna alata (L.) Roxb. acesso caatinga e restinga. Valores expressos pela média das triplicatas. Legenda: CA. acesso caatinga; RE: acesso restinga; Concentrações 16, 32, 40 e 60 g/kg.
Nos grupos em que ocorreu óbito, os animais apresentaram sinais característicos de intoxicação (prostração, lacrimejamento e pelagem eriçada na região do pescoço, bem como ficaram menos ativos na movimentação), já nas primeiras 2 horas. Os primeiros 2 óbitos ocorreram após 8 horas e mais 2 óbitos ocorreram próximo as 24 horas, por fim das 32 horas outros 2 óbitos 84 foram registrados. Nos grupos das doses 40 g/kg Ca e 60 g/kg Re foi observado um óbito por horário registrado. Esses resultados, conforme Schorderet (1992) e outros autores, não representam toxidez considerável, pois relatam que doses letais médias acima de 5 g/kg são consideradas não tóxicas. A atividade tóxica dos extratos de S. alata obtidos na caatinga e restinga apresentou-se menos tóxico do que os resultados encontrados por Pieme (2006), para a mesma espécie obtida no centro sul da África, onde foi observada uma dose letal média de 18,50 g/kg, em ratos, com ausência de danos histopatológico do fígado mesmo em períodos prologados de administração. Em que pese as variantes do experimento realizado neste trabalho com a de Pieme (2006) como o local de coleta que deve imprimir um diferencial na composição química do extrato e mesmo o tipo de animal testado, vale ressaltar que, segundo este autor, neste trabalho em ratos, o extrato etanólico de S. alata sugeriu proteção de hepatócitos e promoveu uma melhora na arquitetura do fígado.
4.5.6.1 Liberação de enzima citoplasmática lactato desidrogenase (LDH) Neste ensaio constatou-se que ocorreu baixa liberação de LDH no soro de camundongos swiss, em todas as concentrações testadas com os extratos de S. alata (acesso caatinga e restinga). Os resultados desse ensaio evidenciaram dose dependente, ou seja, a quantidade de LDH no soro dos animais aumentou proporcionalmente ao aumento das concentrações testadas dos extratos de S. alata (figura 22).
A B Figura 2 2 Liberação da LDH em soro sanguíneo de camundongos Swiss tratados com extratos de Senna alata (L.) Roxb. (n=5). Legenda: A. Extratos de Senna alata acesso caatinga; B. Extratos de Senna alata acesso restinga; CN. Controle negativo: Soro sanguineo dos camundongos Swiss sem tratamento com os extratos; CP. Controle positivo: Soro sanguíneo dos camundongos swiss com DMSO a 1 %.
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Os resultados obtidos neste ensaio sugerem que a toxidez acometida nos camundongos swiss, até mesmo a seguida por óbito (Ca 40 e Re 60 g/kg) deve não ter ocasionado alterações renais, infarto do miocárdio ou qualquer lesões hepáticas, uma vez que o valor da LDL liberada no soro desses animais foi baixa, próximo ao controle negativo. Segundo Balls e colaboraores (1992) os valores para a LDH liberada no soro de sangue de camundongos, conforme o tempo de vida desses animais apresenta quantidade referencia entre 74 a 253 unidade por litro (U/L), para não ter hemólise nas amostras testadas. Como os valores obtidos neste ensaio estão todos dentro da faixa referencia proposta pelo autor citado, pode-se afirmar que não houve hemólise neste teste e que os valores obtidos da LDH no soro dos animais nesta faixa etária são normais, não podendo ser tomado como um indicativo de que houve morte celular seguida de rompimento de membrana, o que é classificado como necrose (Balls et al., 1992; Lantto et al., 2009). Pieme (2006), utilizando extrato etanólico a 80 % obtido a partir das folhas de S. alata, coletadas no centro sul da África, determinou capacidade protetora de hepatócitos de ratos para este extrato. Em outro trabalho com Senna, de Rajan e colaboradores (2009) com Cassia tora, corroboram com os resultados obtidos neste ensaio, pois trabalho este autor verificou a capacidade hepatoprotetora de Cassia tora, que apresenou efeitos satisfatórios contra danos ao fígado de ratos albinos. Os resultados obtidos destes autores corroboram com o ensaio que se realizou e apontam para o uso seguro de S. alata como medicinal em doses e formulações conhecidas.
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5. CONCLUSÕES
As características macro e microscópicas dos acessos de S. alata na restinga e na caatinga são semelhantes e apresentam a forma, o ápice e a presença de estômatos nas duas faces epidérmicas e tricomas de cutícula lisa como caracteres úteis na autenticação das folhas como insumos farmacêuticos.
Os acessos de S. alata, apresentaram similaridade de teor extrativo sendo maior no extrato etanólico a 40 %;
As amostras apresentaram índices de pureza compatível com as requeridas na V edição da Farmacopéia Brasileira. A diferença básica entre os acessos reside no fato do acesso caatinga apresentar taninos e extrato com maior pH. O teor total de polifenois e de flavonoides foi semelhante nos dois acessos estudados;
O perfil cromatográfico em CCD apresenta 2 bandas semelhantes para os acessos da restinga e caatinga;
Detectou-se atividade antibacteriana por bioautografia nos acessos obtidos na caatinga e na restinga, indicando atividade de amplo espectro, tanto para bactérias gram positivas como para gram negativas;
Ficou determinada atividade alelopática dos extratos de S. alata, com diminuição de germinabilidade de diásporos de L. sativa e descaracterização das radículas, principalmente no acesso da caatinga, denotando possível atividade inseticida e bio-herbicida para estes extratos;
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Os extratos etanólico a 40 % oriundos das folhas de S. alata acesso caatinga e restinga não apresentaram citotoxidez pelo método MTT, pois não houve interferência desses extratos na viabilidade de macrófagos, sugerindo a ausência de morte celular por necrose.
Os testes in vitro com LPS e Zy sugeriram que os extratos são eficazes no controle de TNF e NO em macrófagos, principalmente nas concentrações 100 µg/mL e 50 µg/mL, sem diferença entre os dois acessos.
A toxidez aguda da droga testada pode ser considerada como baixa,
uma vez que em camundongos Swiss, determinou-se DL50 apenas nas doses acima de 30 g/kg, sem elevação dos níveis séricos de LDH.
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