Tesis Doctoral

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS

AGENTES CONDUCTORES DEL PROCESO DE ECLOSIÓN CAPSULAR: Crepipatella dilatata COMO MODELO DE ESTUDIO

TESIS DOCTORAL

PAOLA VIVIANA ANDRADE VILLAGRAN VALDIVIA – CHILE

2016

AGENTES CONDUCTORES DEL PROCESO DE ECLOSIÓN CAPSULAR: Crepipatella dilatata COMO MODELO DE ESTUDIO

Tesis presentada a la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias

por

PAOLA VIVIANA ANDRADE VILLAGRAN

Valdivia - Chile

2016

Dedicada a mi pequeña Leonor

AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer a todas las personas que de alguna u otra forma han aportado en el desarrollo de mi tesis. Dar las gracias a mi familia por el apoyo y la paciencia. También quisiera agradecer a las personas que trabajan en el laboratorio y a mis compañeros del Doctorado, por hacer siempre mas agradable y entretenida mi estadia en la universidad. Agradecer a mi profesor patrocinante Dr. Oscar Chaparro, por el apoyo, la paciencia y los consejos durante todos estos años de estudio. A mi comisión evaluadora, Dr. Antonio Brante, Dr. Kurt Paschke, Dr. Jorge Navarro, por participar en el proceso de evaluación. Dar las gracias al Doctor Luis Vargas por permitirme hacer uso de su laboratorio y a Ricardo por ayudarme con los analisis bioquímicos.

Gracias a Conicyt por la beca de Doctorado nacional, que me permitió dedicarme con tranquilidad al Doctorado. A la beca de gastos operacionales 21120654 otorgada por Conicyt para el desarrollo de la tesis. También agradecer a la Dirección de Postgrado, Dirección de Investigación y Desarrollo, Escuela de Graduados de la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile, por el apoyo económico otorgado durante mi asistencia a diferentes Congresos. Finalmente agradecer al proyecto Fondecyt 1141052 “Hatching process in brooding molluscs: More complex that thougth before”, otorgado al Doctor Oscar Chaparro , por las facilidades logisticas y operacionales otorgadas durante el desarrollo de mi tesis de Doctorado.

INDICE GENERAL

INDICE GENERAL I

INDICE DE TABLAS IV

INDICE DE FIGURAS V

RESUMEN XI

ABSTRACT XIV

INTRODUCCION GENERAL 1

CAPITULO 1: WHO CONTROLS HATCHING IN THE BROODING ESTUARINE GASTROPOD Crepipatella dilatata? 9

SUMMARY 9

INTRODUCTION 10

MATERIAL AND METHODS 13

RESULTS 19

DISCUSSION 22

TABLES 28

FIGURES 30

REFERENCES 40

CAPITULO 2: ACCIÓN BIOMECÁNICA Y OSMÓTICA: POSIBLES MECANISMOS DE ECLOSIÓN CAPSULAR EN Crepipatella dilatata 46

RESUMEN 46

INTRODUCCIÓN 47

METODOLOGÍA 51

RESULTADOS 58

DISCUSIÓN 62

TABLAS 69

FIGURAS 70

REFERENCIAS 82

CAPITULO 3: ACCIÓN ENZIMÁTICA INTRACAPSULAR COMO MECANISMO DE ECLOSIÓN EN EL GASTRÓPODO INCUBADOR Crepipatella dilatata 89

RESUMEN 89

INTRODUCCIÓN 90

METODOLOGÍA 94

RESULTADOS 98

DISCUSIÓN 100

FIGURAS 106

REFERENCES 110

DISCUSION GENERAL Y CONCLUSIONES 116

REFERENCIAS (introducción y discusión general) 124

III

INDICE DE TABLAS

CAPITULO 1

Table 1. Crepipatella dilatata. Nested Anova performed for the effect of hatching time (initial and final) nested in the different egg-brood on the average number of juveniles, total number of offspring, shell length of juvenile, and the offspring biomass in each hatched capsule. Bold p-values indicate statistical significance. 28

Table 2. Crepipatella dilatata. Mean content characteristics of capsules hatched (n = 295) and nonhatched (n = 34) (mean ± SD). Different letter means significant differences for each variable between hatched and non-hatched capsules. 29

CAPITULO 2

Tabla 1. Crepipatella dilatata. Promedio de la longitud de concha de juveniles pre-eclosión (n = 4 capsulas), larvas veligeras (n = 5 capsulas) y larvas veligeras donde no se identificó la presencia de rádula (n = 4 capsulas), y tamaño promedio de sus respectivas rádulas. Valores promedio ± desviación estandar. 69

INDICE DE FIGURAS

CAPITULO 1

Fig. 1 Crepipatella dilatata. Degree of synchronization in hatching among egg capsules within a brood. Y-axis shows the time between hatching of the first egg capsule in a brood and the last egg capsule in the same egg mass. The broods considered in the graph correspond to those in which at least 50% of the capsules had hatched. n = 23 broods. HT: hatching time, NC: number of capsules. 30

Fig. 2 Crepipatella dilatata. A) Mean number of metamorphosed juveniles and C) total offspring (veliger and juveniles) per capsule, hatched at the beginning and at the end of the hatching period from each individual egg mass (n = offspring from 33 egg capsules). Initial hatching (full circles) represent the 25% of those capsules hatched at the beginning and the open circles represent the 25% of those at the end of the hatching period for each egg mass (brood). Mean of juveniles (B) and total offspring (D) in hatched capsules at the beginning and at the end of hatching period for a 33 different egg masses. Different letter on bars show significant differences. Lines on bar show SD. 31

Fig. 3 Crepipatella dilatata. (A) Mean shell length of the metamorphosed juveniles and (C) mean offspring biomass from capsules hatched at the beginning and at the end of the hatching period for each egg mass (n = 33 capsules). Initial hatching (full circles) represent the 25% of those capsules hatched earlier and the open circles represent the 25% of the last hatched capsules in relation of the total time spent during the hatching process for each egg mass. Mean juvenile shell length (B) and mean offspring biomass (D) in capsules hatched at the beginning and at the end of the hatching period for the 33 egg masses. Different letter on bars show significant differences. Lines on bar show SD. 33

Fig. 4 Crepipatella dilatata. Relationship between developmental stage (metamorphosed, not yet metamorphosed) and egg capsule status (hatched, not yet hatched) on juvenile mean shell length. Bars represent the mean shell length of metamorphosed juveniles (n = 293 egg capsules) and non-metamorphosed veligers (n = 77 egg capsules) from hatched capsules and metamorphosed juveniles (n = 34 egg capsules) and non-metamorphosed veligers (n = 24 egg capsule) from non-hatched capsules. Vertical lines above bars indicate SD and different letters signify significant differences between means. 35

Fig. 5 Crepipatella dilatata. Total number of brooded offspring per capsule and its relation with (A) juvenile shell length at metamorphosis (n = offspring from 293 egg capsules) and (B) offspring brooded biomass (n = offspring from 283 egg capsules) recorded in hatching capsules. SLJ: Shell length of juveniles, OBB: Offspring brooded biomass, TNO: Total number of offspring. Each dot represents the mean value from one capsule. 36

Fig. 6 Crepipatella dilatata. Relationship between mean shell length of metamorphosed juveniles, mean number of metamorphosed juveniles, and mean number of nurse eggs remaining for hatched (n = 283) and non-hatched (n = 34) egg capsules, respectively. 37

Fig. 7 Crepipatella dilatata. Effect of capsule mates on the timing of hatching over 7 days. A) Percentage of capsules opening from different broods, kept individually (n = 59 capsules from 11 broods) or grouped (n = 59 capsules from 11 broods, 2-10 capsules form each brood) with their capsule mates. B) Mean percentage of hatching in all capsules kept individually or grouped. * = non-hatched capsule. Different letters mean significant differences. Bars represent SD. 38

VI estimated multiplying the average time used in laying one capsule (see M & M) by the total hatched capsule number in each experimental brood. B) Mean time (h) spend during capsular laying and the hatching process in each capsule brood (n = 23). Numbers above the bars represent the number of capsules in each brood. Different letters mean significant differences. Bars mean SD. 39

CAPITULO 2

Fig. 1 Crepipatella dilatata. A) Rádula de juvenil pre-eclosión provenientes desde capsulas con desarrollo embrionario en estadío avanzado. B) Juvenil pre-eclosión. 70

Fig. 2 Crepipatella dilatata. Relación entre la longitud de concha promedio de larvas y juveniles encapsulados, con la longitud de rádula promedio. Círculos negros corresponden a juveniles pre-eclosión (n = 42 juveniles en total provenientes de 4 capsulas), círculos grises indican larvas veligeras (n = 23 veligeras en total provenientes de 5 capsulas), y círculos blancos representa larvas veligeras donde no se observó rádula (n = 52 veligeras provenientes de 4 capsulas). Cada capsula proviene de una postura diferente. Barras indican SD. 71

Fig. 3 Crepipatella dilatata. A) Microfotografía de MEB mostrando la zona de eclosión interna de una capsula con veligeras en estadio de desarrollo intermedio. ZH indica zona de eclosión. B) Zona de eclosión maximizada de acuerdo a Fig.3 A. Ancho de rádula de las veligeras encapsuladas corresponde a 33 µm. 72

Fig.4 Crepiaptella dilatata. Microfotografía de MEB en A) Zona de eclosión interna de una capsula con estadío de desarrollo embrionario final (pre-eclosión). HZ indica zona de eclosión. B) zona de eclosión maximizada de acuerdo a Fig.4 A. Ancho promedio de rádula de los juveniles pre-eclosión corresponde a 40 µm. 73

VII

Fig. 5 Crepipatella dilatata. Microfotografía de MEB en A) Zona de eclosión interna de capsulas eclosionadas. B) zona de eclosión interna maximizada de acuerdo a Fig. 5 A. HZ indica zona de eclosión. Ancho de rádula de juveniles corresponde a 40 µm. 74

Fig. 6 Crepipatella dilatata. Microfotografía de MEB en zona de eclosión externa de la capsula de C. dilatata. A) Exterior de capsula con embriones en estadio de desarrollo avanzado (juveniles pre-eclosión). B) Detalle de la zona de eclosión externa en capsulas con embriones con nivel de desarrollo avanzado. C) Exterior de capsula eclosionada. D) Detalle de zona de eclosión externa en capsulas eclosionadas. HZ indica zona de eclosión. 75

Fig. 7 Crepipatella dilatata. A) Concentración osmótica del fluido obtenidos de capsulas con diferentes niveles de desarrollo de los embriones encapsulados. Barras indican desviación estandar. B) Osmolalidad promedio registrada en el fluido de capsulas con diferentes estadíos de desarrollo embrionario y en el agua de mar. Barras indican desviación estandar. Diferentes letras indican diferencias significativas. 76

Fig. 8 Crepipatella dilatata. Variación del peso del fluido intracapsular a través del desarrollo embrionario, incluyendo capsulas con desarrollo inicial (n = 15), intermedio (n = 17) y avanzado (n = 19). Barras indican SD. Letras diferentes indican diferencias significativas. 78

Fig. 9 Crepipatella dilatata. Ingreso promedio de agua en capsulas con diferente nivel de desarrollo embrionario y expuestas a diferentes condiciones de salinidad. Barras indican desviación estandar. Diferentes letras indican diferencias significativas entre los diferentes estados de desarrollo embrionario intracapsular. 79

Fig. 10 Crepipatella dilatata. Calcio disuelto en el fluido intracapsular a través del desarrollo embrionario. Agua de mar usada como control. Barras indican desviación estandar. Letras indican diferencias significativas. 80

VIII

Fig. 11 Crepipatella dilatata. Participación porcentual de los principales elementos del fluido obtenido de capsulas con diferente nivel de desarrollo embrionario (inicial n = 2 capsulas; intermedia n = 2 capsulas; final n = 2 capsulas) y del agua de mar. Barras indican SD. 81

CAPITULO 3

Fig. 1 Crepipatella dilatata. Efecto de ´sustancia de eclosion´ producida por juveniles excapsulados manualmente (desde capsulas con desarrollo avanzado, juveniles ´ready to hatch´) sobre la zona de eclosión interna de capsulas con desarrollo inicial que fueron vaciadas previamente. A) Porcentaje de capsulas que eclosionaron, presentaron debilitamiento en la zona de eclosión, y no eclosionaron, tanto para capsulas que fueron expuestas a “sustancia de eclosión” de juveniles excapsulados (n = 8, tratamiento), como para capsulas que fueron usadas como control (C1: n = 3, capsulas cerradas mantenidas con juveniles excapsulados, C2: n = 6, capsulas abiertas sin juveniles excapsulados. N total = 9). B) Porcentaje de eclosión (capsulas abiertas y con debilitamiento de la zona de eclosión) de capsulas mantenidas en tratamiento y de capsulas usadas en el control. * = sin eclosion. 106

Fig. 2 Variación de la actividad proteolítica total presente en el fluido intracapsular (posturas con desarrollo intermedio n = 10 y final n = 6) y en los embriones con concha (posturas con desarrollo intermedio n = 6 y final n = 7) a través del desarrollo intracapsular. Lineas verticales sobre barras indican DE. Diferentes letras indican diferencias significativas entre los estadíos de desarrollo para el fluido y para los embriones, respectivamente. 107

Fig.3 Variación de la concentración de proteínas totales presentes en el fluido intracapsular (posturas con desarrollo intermedio n = 10 y final n = 6) y en los embriones (posturas con desarrollo intermedio n = 6 y final n = 7) a través del desarrollo intracapsular. Lineas verticales sobre barras indican DE. Diferentes letras indican diferencias significativas entre los diferentes estados de desarrollo para el fluido y los embriones respectivamente. 108

Fig. 4 Histoquímica de la pared capsular de C. dilatata. A) Tinción con azul de alcián de capsula con desarrollo inicial. CE: capa externa. CI: capa interna. Microscopio optico (X100). B) Tinción con hematoxilina-eosina de capsula con desarrollo inicial. C1 capa interna. C2: capa intermedia. C3: capa interna. Microscopio optico (X40). Interior: interior de la capsula. Exterior: exterior de la capsula. 109

RESUMEN

La incubación de embriones al interior de estructuras secundarias protectoras, como capsulas y masas gelatinosas, es una estrategia frecuente entre los gastropodos marinos. Muchas veces, la salida de los embriones (larvas o juveniles) desde las estructuras envolventes es gatillada por las condiciones ambientales externas. Sin embargo, en especies donde además de la presencia de capsulas, hay cuidado parental, no existe mucha información sobre cuales son los mecanismos que participan del proceso de apertura capsular y posterior salida de los embriones. Por lo mismo, el objetivo principal de esta investigación es determinar cuales son los mecanismos de eclosión en el gastropodo Calyptraeideo, incubador y con desarrollo directo, Crepipatella dilatata. En el primer capítulo se identifica si la apertura capsular es controlada por los embriones incubados y cuales serían las características embrionarias intracapsulares, al momento de la eclosión. Esto permitiría predecir el momento en que la progenie realiza el abandono de la capsula. Capsulas mantenidas individualmente fueron monitoreadas diariamente hasta observar la salida de juveniles. Así se determino la secuencia de eclosión de las capsulas de cada postura. De cada capsula eclosionada, todo el material (juveniles, larvas y/o huevos nutricios) fue separado, identificando el nivel de desarrollo embrionario, la cantidad de juveniles, de larvas veligeras, y huevos nutricios. Igualmente, se obtuvo la longitud de concha, y la biomasa seca total del contenido intracapsular de cada capsula. Capsulas hermanas no eclosionadas, fueron procesadas de igual forma que las eclosionadas. Los resultados indican que la eclosión de las capsulas ocurre sin la presencia de la hembra incubante. El tiempo de eclosion mostró gran variación entre posturas, la cúal no estuvo relacionada al número de capsulas, ni a su edad. Se observaron diferencias en el número de juveniles metamorfoseados, tamaño de concha, biomasa total incubada y número de huevos nutricios, entre las capsulas eclosionadas y las no-eclosionadas. El tiempo de eclosión también vario entre capsulas de una postura, identificándose menor cantidad de progenie y

XI menor número de juveniles metamorfoseados en las capsulas que eclosionaron al inicio del proceso de eclosión. Sin embargo, el tamaño de concha promedio y la biomasa total dentro de cada capsula, no varia a través del proceso de eclosión. Cabe destacar, que la eclosión de una capsula, no gatilla la apertura de las capsulas adyacentes. De acuerdo a lo anterior, la apertura de la capsula ocurre desde el interior, solo después de que la mayoría de los huevos nutricios han sido consumidos, una gran proporción de la progenie ha metamorfoseado a juvenil, y los juveniles han alcanzado una longitud de concha promedio mayor a 1.36 mm. En el segundo capítulo, se determina si la eclosión en C. dilatata es regulada mediante una acción biomecánica, como ha sido descrita en algunos gastrópodos, donde se ha identificado el uso de la rádula para permitir el escape de los embriones, o si la eclosión es consecuencia de un mecanismo osmótico que conlleve un aumento en el ingreso de agua y por presión, se rompa el envoltorio y se genere la eclosión de la larva. Las observaciones de microscopia electrónica de barrido sobre las paredes capsulares en el área de eclosion, tanto interna como externa, no muestran rastros de ramoneo, tanto por parte de los embriones incubados (pared interna) como por la hembra incubante (pared externa). De acuerdo a lo anterior, es posible descartar la participación de la hembra en el proceso de apertura capsular, por lo menos mediante el uso de la radula. Tambien se descarta el ramoneo de los juveniles como mecanismo de hatching. La presencia de la rádula se identificó en estadio de veliger intermedia (700 µm long concha). La osmolalidad del fluido en capsulas con desarrollo inicial fue la mas alta y esta disminuyó en capsulas con desarrollo embrionario intermedio y avanzado, igualando la concentración osmotica del agua de mar. La disminución en la concentración de calcio en el fluido intracapsular, a medida que avanza el desarrollo embrionario, también coincidio con la disminución de la osmolidad. En general, se observó variación en la proporción de los elementos químicos identificados en el fluido, a través del desarrollo embrionario. A pesar de que ocurren cambios en la osmolalidad del fluido intracapsular, y de que hay un aumento en el contenido de liquido al interior de capsulas con desarrollo intermedio, la capsula no llega a abrirse producto del ingreso de agua. Por lo tanto, la acción osmótica no gatilla, por lo menos directamente, la eclosión en las capsulas de C. dilatata. El tercer capítulo relaciona

XII la eclosión con una acción de tipo bioquímica. Las paredes capsulares de C. dilatata estan compuestas mayoritariamente por proteínas. Nuestros análisis identificaron la presencia de proteasas totales en el fluido intracapsular, durante los estadios de desarrollo embrionario más avanzados. Observandose un notorio aumento (100%) en la actividad de las proteasas totales del fluido al interior de capsulas en estadio pre-eclosión respecto de capsulas con desarrollo intermedio. A pesar de que no hubo diferencias significativas entre larvas veligeras y juveniles pre-eclosión, fue posible observar un leve aumento en los juveniles pre-eclosión. Cambios en las proteínas totales del fluido también fueron observadas, disminuyendo drasticamente su contenido desde capsulas intermedias a capsulas con desarrollo avanzado. La histoquímica de la pared capsular identificó presencia de carbohidratos ácidos y neutros, y proteínas ácidas y básicas. Sin embargo, no fue posible diferenciar la zona de eclosión capsular. Por lo tanto, los resultados obtenidos, permiten sugerir que la eclosión en C. dilatata es manejada por los embriones en estadio avanzado (veligeras y juveniles), quienes mediante la síntesis de enzimas proteolíticas degradan la zona de eclosión capsular, compuesta principalmente de proteínas. La síntesis de proteasas ha sido relacionada a procesos digestivos, por lo que probablemente en C. dilatata, comienza con el desarrollo de las habilidades alimentarias de los embriones, siendo la apertura capsular un efecto secundario de la constante actividad proteolítica sintetizada por los embriones. En conclusión, ni la accion biomecanica ni osmotica son responsables, por si solas, de la eclosión capsular. Sin embargo es probable que aporten de forma indirecta en el proceso de eclosión en conjunto con la acción bioquímica, identificada como el principal gatillante intracapsular, de este importante proceso. Y aunque la hembra no participa en la eclosión, ramoneando directamente sobre la capsula, es posible que desempeñe otro papel en este proceso, como por ejemplo en la sincronización de la eclosión o aumentando el porcentaje de capsulas eclosionadas exitosamente.

XIII

ABSTRACT

Embryos brooding within secundaries safeties structures, like capsules and gelatinous masses, is an frequent strategy between marines gastropods. Many times, the output of the embryos (larvaes or juveniles) is triggered for the external environmental conditions. However, in species, where in addition to the presence of capsules, there is parental care, there is little information about on which are the mechanism that participate in the capsular opening process and the subsequent output of the embryos. The principal goal of this research is to determine which are the hatching mechanism in the gastropod Calyptraeideo,brooding and with direct development, Crepipatella dilatata. In the first chapter will determined if the capsuler opening is controlled for the brooding embryos and identify the embryonic characteristics, at the hatching moment. This would allow predicting the time in which the offspring leaves the capsule. Capsules kept individually were monitored dialy until observing the output of juveniles, which allowed to determine the hatching secuence of each brood. From each hatched capsule, all the material (juveniles, larvaes and/or nurse eggs) was separated, identifying the level of te embryonic development, the amount of juveniles, veligeras larvaes, and nurse eggs. Equally, the shell length and the total dry biomass encapsulated was obtained. Sibling capsules no-hatched, were processed as the hatched. The results indicate that hatching of the capsules ocurrs without the brooding female presence. The hatching time showed large variation between broods, which was not related to the capsules number, nor to its age. Differences in the juveniles metamorphosed number, shell length, total brooding biomass and nurse eggs number, between hatched and no-hatched capsules. The hatching time also varied between capsules within brood, identifying smaller number of offspring and metamorphosed juveniles in the capsules hatched at the beginning of the process hatching. However, the average shell length and the total biomass within each capsule does not vary through the hatching process. It should be noted that the hatching of a capsule does not trigger the

XIV opening of the adjacent capsules. According to the above, the opening of the capsule occurs from the inside, only after most of the nutritional eggs have been consumed, a large proportion of the offspring has metamorphosed to juvenile, and the juveniles have reached a shell length average greater than 1.36 mm. In the second chapter, will determinate if the hatching in C. dilatata is controlled through a biomechanical action, as has been decribed in some gastropods, where the use of the radula has been identified to allow the escape of the embryos, or if the hatching is the consequence of an osmotic mechanism that leads to an increase in the water intake and by pressure, the membranes are broken and the larval hatching ocurrs. The SEM observations on the capsular walls in the hatching area, both internal and external, not show grazing traces, both by the encapsulated embryos (internal wall) and by brooding female (external wall). Agree with te above, is possible to discard the female participation in the capsular aperture process, at least through radular use. Also discard the juveniles grazing as hatching mechanism. The presence of radula was identificated in veligera intermediate stage (700 µm shell length). The osmolality of the fluid in initial development capsules was the highest, and this decreased in intermediate and advanced embryonic development capsules, equaling the osmotic concentration of sea water. The decrease in calcium concentration in the intracapsular fluid, as the embryonic development progresses, also coincides with the decrease in osmolality. In general, variation in the proportion of the chemical elements identified in the fluid was observed, through the embryonic development. Although changes in the osmolality of the intracapsular fluid occur and there is an increase in the liquid content inside capsules with intermediate development, the capsule does not open to the product of the water intake. Therefore, the osmotic action not trigger, at least directly, the hatching in the capsules of C. dilatata. The third chapter relates the hatching to a biochemical action. The capsular walls of C. dilatata are composed mainly of proteins. Our analyzes identified the presence of total proteases in the intracapsular fluid, during the embryonic development level most advanced. Observing a marked increase (100%) in the total proteases activity within pre- hatching capsules compared to intermediate development capsules. Although there were no significant differences between veligeras larvae and juvenile pre-hatching, it was possible

XV to observe a slight increase in pre-hatching juveniles.. Changes in total proteins in the fluid were also observed, drastically reducing their content from intermediate capsules to capsules with advanced development. The histochemistry of the capsular wall identified the presence of acid and neutral carbohydrates, and acidic and basic proteins. However, it was not possible to differentiate the capsular hatch zone. Therefore, the results suggest that hatching in C. dilatata is managed by advanced development embryos (veligeras y juveniles) who, through the synthesis of proteolytic enzymes, degrade the area of capsular hatching, composed mainly of proteins. The synthesis of proteases has been related to digestive processes, so probably in C. dilatata, begins with the development of the alimentary abilities of the embryos, being the capsular opening a secundary effect of the constant proteolytic activity synthesized by the embryos. In conclusion, neither the biomechanical nor the osmotic action are responsible, on their own, for the capsular hatching. However, they are likely to contribute indirectly to the hatching process together with the biochemical action, identified as the main intracapsular trigger, of this important process. And although the female does not participate in hatching, by grazing directly on the capsule, it may play a different role in this process, for example in hatching synchronization or increasing the porcentaje of capsular hatching succes.

XVI

INTRODUCCIÓN GENERAL

El cuidado parental como estrategia reproductiva, puede implicar la incubación directa de los embriones al interior de la hembra. Sin embargo, muchas veces, el cuidado parental puede implicar también la incubación al interior de estructuras envolventes (capsulas o masas gelatinosas), que son depositadas por la madre. Con este modo de desarrollo, se otorga protección física a la progenie durante la ontogenia temprana (Fretter, 1984). En los invertebrados marinos, la clase Gastrópoda tiene una alta diversidad de estrategias reproductivas, especialmente entre los Prosobranquios. En las especies marinas de este grupo, la encapsulación de embriones corresponde a uno de los modos de reproducción observadas con mayor frecuencia (e.g. Fusitriton magellanicus, Penchaszadeh and De Mahieu, 1975; Cymatium corrugatum, Ramon, 1991; Concholepas concholepas, Paschke, 1992; Cymatium pileare, Muthiah and Sampath, 2000; Thais chocolata, Romero et al., 2004; Coronium coronatum, Pastorino et al., 2007; Argobuccinum pustulosus, Gallardo et al., 2012; Buccinum undatum, Smith and Thatje, 2013). A pesar de ser la encapsulación bastante generalizada entre los gastropodos marinos, el desarrollo intracapsular suele tener características especie- especificas. Es posible identificar variaciones en la extensión del periodo encapsulado, en el nivel de desarrollo de los embriones al momento de eclosionar, y por sobre todo, en las características particulares de forma y composición de las capsulas envolventes. La capsula envolvente, ha sido normalmente identificada como una estructura con función protectora (Pechenik, 1979, 1982), y en general, está formada estructuralmente, por una pared capsular multilaminada. En ellas puede o no identificarse un área específica por donde suele ocurrir la eclosión de las larvas o juveniles. La pared capsular, en términos generales, se encuentra compuesta por capas de distinto grosor y composición bioquímica. En el caso de gastrópodos calyptraeideos (e.g. Crepipatella fecunda, Ojeda and Chaparro, 2003; Crepidula fornicata y Crepidula coquimbensis, 2

Brante et al., 2008; Crepipatella dilatata, Segura et al., 2010) sus capsulas están compuestas por una pared formada por dos capas, un externa de consistencia fibrosa y compacta y una capa interna gruesa y de consistencia esponjosa. También se ha identificado en otras especies de gastropodos, que la pared capsular es multilaminar y puede estar constituida por cuatro capas, las que difieren entre si, tanto en su composición y consistencia como en su grosor (Ilyanassa obsoleta, Sullivan and Maugel, 1984; Ocenebra erinacea, Hawkins and Hutchinson, 1988;).

El área de eclosión o de liberación de las larvas o juveniles puede presentarse, en algunas especies, como un tapón ubicado sobre la zona apical de la capsula, identificado particularmente en capsulas sin cuidado materno físico (Nassarius obsoletus, Pechenik, 1975; Coronium coronatum, Pastorino et al., 2007). En otras especies, el área de liberación embrionaria puede corresponder a una sutura en la parte superior de la capsula (Crepipatella fecunda, Ojeda and Chaparro, 2003; Buccinanops cochlidium, Averbuj and Penchaszadeh, 2010; Argobuccinum pustulosum, Gallardo et al., 2012). Esta zona de eclosión capsular, por donde ocurrirá la salida de larvas o juveniles, toma gran importancia al momento de finalizar el desarrollo intracapsular, ya que la apertura de esta área es fundamental para permitir la liberación de los descendientes desde las capsulas hacia el exterior. El momento de la salida de los embriones (larvas o juveniles), al final del período de desarrollo intracapsular, está asociado al momento en que los eclosionantes han desarrollado las capacidades necesarias para llevar a cabo el proceso de eclosión, asi como los requerimientos necesarios para la vida fuera de la capsula (Warkentin, 2011). Por lo tanto, la efectividad de los mecanismos que permiten la apertura capsular, y eclosión de la progenie, en un momento específíco del desarrollo intracapsular, es de vital importancia para el éxito de las especies que presentan encapsulación.

Diferentes mecanismos de eclosión han sido descritos entre los invertebrados marinos. En especies donde hay cuidado parental directo, muchas veces es la hembra quien controla la eclosión, y depende de las condiciones ambientales del entorno (Oyarzun and 3

Strathmann, 2011; Branscomb et al., 2014; Lesoway et al., 2014). Sin embargo, en muchas especies donde la eclosión ocurre sin la presencia materna, no esta claro aún cuales son los factores, intra o extracapsulares, que pueden accionar los mecanismo de eclosión, particularmente sobre la participación de los embriones.

Los estudios sobre eclosión, en general identifican tres mecanismos principales, como posibles controladores del proceso de eclosión en los invertebrados marinos. Uno de los registrados con mayor frecuencia, corresponde al mecanismo bioquímico (Hancock, 1956; Takeuchi et al., 1979; Sullivan and Maugel, 1984; Sullivan and Bonar, 1985; Hawkins and Hutchinson, 1988; De Vries and Forward, 1991; Fan et al., 2010; Li and Kim, 2013) . Sin embargo, la mayoria de las especies donde ha sido descrito este mecanismo como responsable de la eclosión, corresponden a especies donde la salida del embrion ocurre directamente desde el huevo, sin estructuras protectoras envolventes de por medio. Asi por ejemplo, ocurre con algunos crustaceos braquiuros, donde la eclosión de las larvas zoeas, coincide con la presencia de enzimas proteoliticas (De Vries and Forward, 1991). Para el caso de gastrópodos, la poca evidencia que existe sobre la acción bioquímica como mecanismo de eclosión, indica que la apertura capsular estaría controlada por enzimas generada por los embriones en estados pre-eclosión. Las enzimas actúan desde el interior de la capsula, permitiendo que se abra la zona capsular de liberación de los embriones (Pechenik, 1975; Sullivan and Maugel, 1984; Hawkins and Hutchinson, 1988). La apertura capsular, sería posible, debido a que la estructura capsular está compuesta en su mayor parte por proteínas (Ocenebra erinacea, Hawkins and Hutchinson, 1988; C. fecunda, Chaparro and Flores, 2002, Ojeda and Chaparro, 2003;). La acción enzimática ocurre generalmente en una zona específica de la capsula, ya sea en la región del tapón (Pechenik, 1975; Pastorino et al., 2007) o en un sector más extendido, con forma de cierre y que normalmente se ubica en la parte apical de la capsula (Ojeda and Chaparro, 2003; Averbuj and Penchaszadeh, 2010). Lo anterior, parecería altamente probable, si se considera que en el gastropodo Ilyanassa obsoleta, el tapón capsular (área de eclosión) es continuidad de las capas más internas de la pared capsular (Sullivan and Maugel, 1984), 4

paredes que en algunos gastrópodos han sido identificadas como más laxas y menos compactas (Ojeda and Chaparro, 2003; Brante et al., 2008; Segura et al., 2010). La degradación del tapón capsular ha sido descrito como un proceso muy rápido, que respondería a pulsos en la producción de enzimas proteolíticas (Pechenik, 1975), pero también ha sido descrito actuando de forma gradual, a través del tiempo de desarrollo de los embriones (Hancock, 1956). El efecto de estas sustancias proteolíticas pareciera ser especie-especifica (Pechenik, 1975; Sullivan and Maugel, 1984).

El otro mecanismo de eclosión corresponde a la ruptura de la capsula como consecuencia del aumento del volumen intracapsular. Esto respondería a una entrada abundante de agua, producto de la concentración osmótica en el interior de la capsula (Davis, 1968). El ingreso de agua al interior de la capsula donde se desarrollan los embriones, se ve posibilitado por la semipermeabilidad de las paredes capsulares (Pechenik, 1982; Brante, 2006; Segura et al., 2010). En este mecanismo, se ha identificado que al final del desarrollo encapsulado se produce una disminución de la concentración osmótica del fluído intracapsular a consecuencia de un abundante ingreso de agua hacia el interior de la capsula (Davis, 1968; Maeda-Martínez, 2008). Esta situación conlleva un aumento del volumen capsular, lo cual impacta, mediante presión física, en la apertura del cierre de eclosión (Davis, 1959; Hawkins and Hutchinson, 1988). Aumentos en el peso de las capsulas, asociado a cambios en la concentración osmótica, particularmente en embriones cercanos a eclosionar, también han sido asociados a la entrada de agua debido al aumento de la concentración osmótica intracapsular (Hawkins and Hutchinson, 1988). Sin embargo, más que un mecanismo que actúe por sí solo, pareciera ser que actúa en complemento con la actividad proteolítica generada por los embriones encapsulados (Pechenik, 1975; Hawkins and Hutchinson, 1988).

Por último, se ha identificado la accion bio-mecánica como detonante de la eclosion capsular (Weber, 1977). En este mecanismo, se ha registrado la actividad directa de los embriones sobre la zona de apertura capsular, ya sea a través de la acción radular 5

(desarrollo directo), o mediante el movimientos de la ciliatura velar (en especies con desarrollo mixto) permitiendo con ésto, la destruccion del tapón o cierre capsular, y finalmente la eclosión de las larvas y/o juveniles (Leiva et al., 1998; Smith and Thatje, 2013). En cualquiera de estos mecanismos de eclosión, la abertura capsular parece estar fuertemente ligada al contenido y a las características de la biomasa embrionaria encapsulada, y la dirección del proceso de eclosión parece, finalmente, estar manejada por los embriones encapsulados.

Si la ruptura capsular estuviera principalmente dirigida por los embriones contenidos en el envoltorio, muchos aspectos relacionados con las características de los embriones encapsulados podrían conjugarse en el proceso de eclosión. Así por ejemplo, la talla mínima de eclosión para las larvas o juveniles, densidad embrionaria, o la biomasa total encapsulada podrían jugar un rol preponderante en el proceso de escape desde las capsulas. En el gastrópodo Nassarius obsoletus se ha sugerido la presencia de una concentración mínima de embriones encapsulados para que se genere una efectiva degradación del tapón capsular (Pechenik, 1975). En especies encapsuladoras con desarrollo directo, la proporción de juveniles metamorfoseados respecto de las larvas no metamorfoseadas en una misma capsula, podría ser preponderante en el proceso de ruptura, particularmente si la ruptura del cierre capsular depende de la acción enzimática que pudiese ser generada solo por los individuos metamorfoseados. Así, el número de estos juveniles parecería determinante en las capacidades de ruptura capsular en función a los niveles mínimos de enzima que puedan llevar a cabo la degradación del área de escape.

El gastrópodo Crepipatella dilatata, corresponde a la especie modelo que se utiliza en este trabajo. Este gastropodo Calyptraeideo se caracteriza por presentar un desarrollo directo, en el interior de capsulas que son incubadas por las madres hasta que los juveniles eclosionan y abandonan la capsula (Collin, 2003). En esta especie, el desarrollo directo de los embriones está basado en la presencia de huevos nutricios que sirven de alimento extraembrionario. La masa capsular es adherida al sustrato (rocas o conchas de 6

congéneres), a través de un delgado pedúnculo y es incubada en la cavidad paleal de la hembra durante varias semanas, hasta la eclosión de los juveniles (Gallardo, 1979; Chaparro et al., 1999; Chaparro et al., 2008a). Las paredes de las capsulas de C. dilatata están compuestas por dos capas, una capa externa, compacta y delgada y otra interna, esponjosa y de mayor grosor (Segura et al., 2010). En la zona superior de la capsula, al igual que en todos los calyptraeideos, es posible identificar una zona de eclosión capsular, como una sutura o un cierre que va de lado a lado. La salida de los embriones siempre ocurre en la zona del cierre capsular y no en otros sectores de la capsula, lo cual debería implicar una condición bioquímica-estructural diferente al resto de la capsula. Sin embargo, no hay información sobre las características de este cierre ni de los agentes conductores que participan de la apertura capsular.

En especies como C. dilatata, donde además de la encapsulación de embriones se lleva a cabo un proceso de cuidado materno de la postura, agentes externos a la capsula podrían participar del proceso de ruptura capsular. Esta especie ha sido identificada como ramoneadora-suspensívora, presentando una rádula taenioglossa bien desarrollada, que durante el cambio de estadio reproductivo, pasa de tener una función activa en la colecta de alimento, ramoneando el sustrato en la etapa de macho móvil, a tener una función de conducción del cordón mucoso con alimento, desde el canal lateral del cuello hacia la boca durante su etapa de hembra sésil (Chaparro et al., 2005). En esta fase de individuo sésil, la rádula de la hembra serviría como mecanismo de limpieza del sustrato, donde se deposita la masa capsular, y también para la limpieza externa de las paredes capsulares durante la incubación (Chaparro et al., 2009). En consideración a la presencia radular en la madre, que se ubica justo encima de la masa de capsulas y directamente sobre el área del cierre capsular, bien pudiera pensarse en que ésta también tendría participación en la ruptura capsular facilitando la eclosión de los juveniles. La participación activa de la madre en el proceso de eclosión, ha sido registrada en otros invertebrados marinos que también presentan procesos incubatorios. En el poliqueto Boccardia proboscidea, la madre es la responsable de la eclosión embrionaria, usando su cuerpo para romper las capsulas, cuando 7

las condiciones ambientales son favorables, y liberar finalmente a las larvas (Oyarzun and Strathmann, 2011).

De acuerdo a los antecedentes mencionados, el objetivo de este trabajo es determinar el rol de los embriones en el proceso de eclosión, e identificar los posibles mecanismos de eclosión, de origen intra o extracapsular, que participan de la apertura capsular y salida de los juveniles en el gastropodo incubador Crepipatella dilatata, ya sea que participen de forma independiente o complementaria.

El presente estudio será presentado en tres capítulos, donde se abordaran de manera separada las diferentes hipótesis planteadas en la investigación. El primer capítulo está centrado en determinar una posible participación de los embriones en el proceso de eclosión, identificando en primer lugar si la eclosión ocurre en ausencia materna, y posteriormente, identificar características embrionarias que se relacionen al momento en que ocurre la apertura capsular y liberación de los juveniles. La hipótesis que se pondrá a prueba es la siguiente “La eclosión capsular está dirigida por el material encapsulado, por lo tanto, la secuencia en que eclosionan las capsulas de una misma postura está determinada por las características de los embriones en el interior de ellas al momento de la apertura capsular”.

El objetivo del segundo capítulo estará centrado en determinar posibles mecanismos de eclosión, identificando si hay una acción osmótica que participe en la apertura de la capsula como mecanismo de eclosión. De igual forma se determina una posible acción rádular sobre la zona de eclosión capsular, lo que permitiría que la capsula se abra. El efecto de ramoneo como mecanismo de eclosión será identificado por una parte, intracapsularmente, considerando un posible ramoneo por parte de los juveniles encapsulados, sobre la zona de eclosión, y por otra parte, se determinara un posible ramoneo materno sobre la zona de eclosión externa de la capsula, como un mecanismo de eclosión capsular. Las hipótesis que se pondrán a prueba en este capítulo son las 8

siguientes: 1.- “El aumento de la osmolalidad intracapsular, al final del desarrollo embrionario, genera un aumento en el ingreso de agua hacia el interior de la capsula, aumentando el volumen capsular y permitiendo con ello la apertura de la capsula en la zona de eclosión”, 2.- “Juveniles pre-eclosión de C. dilatata, provistos de una rádula desarrollada, tienen la capacidad de intervenir directamente en el proceso de eclosión, utilizando esta estructura como una herramienta para abrir la capsula desde el interior” y, 3.- “Las hembras incubadoras participan directamente en el proceso de apertura capsular mediante el uso de su rádula, la que es utilizada para ramonear sobre la zona de liberación, permitiendo con ello la eclosión y salida de los juveniles”.

El tercer y último capítulo está enfocado directamente en identificar la participación de enzimas proteolíticas, actuando como un mecanismo bioquímico sobre la zona de eclosión interna de las capsulas en estado de desarrollo pre-eclosión, y a determinar si la presencia de estas proteasas ocurre a través del desarrollo embrionario encapsulado avanzado o aparecen solo durante el período previo a la eclosión. La hipótesis puesta a prueba en este capítulo corresponde a la siguiente “La eclosión de juveniles desde capsulas en el gastrópodo C. dilatata, está conducida por un proceso enzimático de origen embrionario intracapsular, a través del cual se logra la apertura de la capsula en una zona predeterminada para la eclosión”.

CAPITULO 1.

WHO CONTROLS HATCHING IN THE BROODING ESTUARINE GASTROPOD Crepipatella dilatata?

SUMMARY

Encapsulated embryos are generally thought to play an active role in escaping from egg capsules or egg masses. However, for species that brood their egg capsules, the factors controlling the timing of hatching are largely unclear, particularly the degree to which hatching is controlled by the embryos rather than by the mother, and the degree to which the hatching of one egg capsule influences the hatching of sister egg capsules within the same brood. We studied aspects of hatching using the direct-developing gastropod Crepipatella dilatata, which includes nurse eggs in its egg capsules and broods clusters of egg capsules for at least several weeks before metamorphosed juveniles are released. The animals were collected from Quempillén estuary, Chiloé Island. Isolated egg capsules were able to hatch successfully, in the absence of the mother. Moreover, the hatching of one capsule did not cause adjacent sister capsules to hatch. Hatched and un-hatched sister egg capsules from the same egg mass differed significantly in the number of metamorphosed juveniles, average shell size, offspring biomass (juveniles + veliger larvae), and the number of nurse eggs remaining per egg capsule. Differences in when egg capsules hatched within 10

a single egg mass were not explained by differences in egg capsule age. Hatching occurred only after most nurse eggs had been ingested, most offspring had metamorphosed into juveniles, and juveniles had reached a mean shell length >1.36 mm. Whether the mother has any role to play in coordinating the hatching process remains to be determined.

KEY WORDS: Hatching, embryo, capsule, gastropod, metamorphosis, nurse egg.

INTRODUCTION

Many marine gastropod species develop as embryos within gelatinous masses or egg capsules, from which they eventually hatch (e.g., Ilyanassa obsoleta (= Nassarius obsoletus), Pechenik, 1975; Sullivan and Bonar, 1984; Ocenebra erinacea, Hawkins and Hutchinson, 1988; Crepidula adunca, Crepidula lingulata, Collin, 2000; Voluta musica, Penchaszadeh and Miloslavich, 2001; Rissoa italiensis, Russo and Patti, 2005; Fusitriton oregonensis, Strathmann and Strathmann, 2007; Alderia spp., Krug, 2007; Elysia stylifera, Allen et al., 2009; Argobuccinum pustulosum, Gallardo et al., 2012; Odontocymbiola magellanica Bigatti et al., 2014). Life cycle is either “mixed” (Pechenik, 1979), in which case individuals eventually emerge from encapsulating structures as veliger larvae and continue their development in the plankton until settlement and metamorphosis, or “direct” in which metamorphosis takes place within the egg capsules or other protective structures, so that individuals emerge as juveniles. In both cases, emergence from the encapsulating structure (“hatching”) is an important physiological and ecological event, representing a major transition between habitats, and between stages of development within a life cycle (Warkentin, 2011).

We know surprisingly little about how the timing of hatching is controlled. In some species, the vital process of opening the encapsulating structure for hatching is apparently controlled by the mother, in response to variations in environmental conditions such as changes in temperature, food availability, or predator presence (Clare, 1997; Oyarzun and Strathmann, 2011; Branscomb et al., 2014). But in other species, particularly those in which the mother abandons her embryos after depositing the egg masses or egg capsules, hatching must be directed from inside the encapsulating structure, by the developing embryos themselves (Pechenik, 1975; Weber, 1977; Sullivan and Bonar, 1984; Hawkins and Hutchinson, 1988). Regardless of the hatching mechanism, capsule opening seems to depend on developmental level of the encapsulated embryos.

The timing of hatching may also be related to embryo size. Sizes at hatching can be widely variable within a species, particularly when development includes the presence of “nurse eggs,” which do not develop beyond one or two cleavages, at the most, and serve as a food source for developing embryos (Spight, 1976; Rivest, 1983; Leiva et al., 1998; Guler and Lok, 2014). The degree of variability in the growth rates of embryos within such capsules is mainly attributed to the number of nurse eggs available per embryo, and the extent to which some embryos ingest more nurse eggs than their colleagues (Spight, 1976; Rivest, 1983; Chaparro et al., 1999). Wide variation in hatching sizes has been observed in numerous gastropod species (Buccinum isaotakii, Ilano et al., 2004; Hexaplex trunculus, Vasconcelos et al., 2004; Coronium coronatum, Pastorino et al., 2007; Trophon geversianus, Cumplido et al., 2011). However, the role of growth rates and embryo size in the timing of hatching is poorly understood, and the extent to which hatching is triggered by the consumption of all nurse eggs within an egg capsule has not previously been examined.

The timing of hatching could also be related to the age of the egg capsules or egg mass, but it has been generally described as an event more restricted in time than the hatching process of the same capsule mass (Vasconcelos et al., 2004; Smith and Thatje, 12

2012; Lesoway et al., 2014). However, until now, no studies have looked specifically at the degree to which variation in the timing of hatching among egg capsules within an egg mass can be explained by variation in when each capsule within an egg mass was deposited by the mother.

Calyptraeid gastropods (family Calyptraeidae, with approximately 100 species; Collin, 2003) present a particularly interesting situation in that mothers and offspring may both be involved in determining when hatching occurs. Females deposit their embryos in a cluster of distinct egg capsules, and then brood those capsules beneath their shells for at least several weeks (Crepidula convexa, Hendler and Franz, 1971; Crepidula adunca, Crepidula lingulata, Collin, 2000; Crepidula fecunda, Ojeda and Chaparro, 2004; Crepidula coquimbensis, Crepidula fornicata, Brante et al., 2008; Crepidula navicella Lesoway et al., 2014). The calyptraeid gastropod Crepipatella dilatata, the model species in the research described here, exhibits direct intracapsular life cycle(Gallardo, 1979; Collin, 2003), producing a cluster of thin-walled, triangular, balloon-like capsules with stalks, the bottoms of which are attached to the shell or rock to which the female adheres (Gallardo, 1979). The capsules themselves are brooded in the female’s mantle cavity, above the foot and beneath the shell (Chaparro et al., 2008a). Each egg mass typically contains about 25 egg capsules, which are brooded by the female for several weeks until hatching (Gallardo, 1979; Chaparro et al., 1999, 2008a). There is a conspicuous suture that runs along the upper-middle part of each egg capsule (Gallardo, 1979; Chaparro et al., 2008a); at hatching, this area becomes “unzipped,” allowing the juveniles to escape. The egg capsules are transparent, making it easy to determine the developmental stage of the embryos within, which in this species tends to be very similar among the embryos from any given egg mass (Galllardo, 1979; Chaparro et al., 1999). In addition to the embryos themselves, most capsules in this species contain a large number of nurse eggs, which serve as an extraembryonic food source for the developing embryos (Gallardo and Garrido, 1987). Normally, only about 8% of the eggs develop into embryos in this species, with the remaining 92% serving as nurse eggs (Gallardo, 1979). 13

Our goal in this research was to determine the extent to which developing embryos of C. dilatata can control the timing of hatching, without any contribution by the mother. In particular, we determined the contribution of egg capsule biomass, juvenile size, the number of embryos per capsule, the size distribution of embryos, and the percentage of metamorphosed juveniles within capsules relative when hatching occurred. We also determined whether the hatching of one egg capsule within an egg mass stimulated hatching in adjacent egg capsules, examined the relationship between the number of nurse eggs present inside the capsules and the timing of hatching, and studied the relationship between when the various capsules within an egg capsule were deposited by the mother and timing of hatching. To what extent do any of these characteristics allow us to predict when capsules of this species will open and hatching will occur?

MATERIAL AND METHODS

1.- Collection and maintenance of biological material.

Adults of C. dilatata were collected from Quempillén estuary, Ancud, Chiloé Island (41° 52’ S, 73° 46’ W) during October and December 2013 (spring, Southern Hemisphere), immediately transferred to the laboratory, and maintained for up to 5 days in aquaria with filtered, sterilized (UV irradiated), 1 µm-filtered seawater and constant aeration. Water was changed daily and the animals were fed ad libittum with pure cultures of the unicellular alga Isochrysis galbana.

To obtain capsules, females of C. dilatata were detached from the original substrate (bivalve shells or rocks) to which they had been attached. Capsule masses were carefully removed from brooding females and the developmental stage of the embryos was identified. We only used egg masses that contained embryos in an advanced pre-hatching 14

stage of development, with dark brown egg capsules; pigmented, shelled embryos, a well- developed foot.

2.- Experimental design.

Capsules of each egg mass were carefully separated, and then each was placed in a 12 cm3 container with 10 mL of seawater (31 psu) that had been previously filtered, UV- sterilized, and well oxygenated. The seawater was changed daily and all containers with the egg capsules were maintained at ≈15 °C. Temperature and salinity are in the range recorded for the estuary during summer season (Chaparro et al. 2008b). The capsules were monitored in the morning and evening of each day, to determine when hatching occurred. Hatching was said to occur when at least one juvenile was found outside the capsule, and the opening through which the juveniles had emerged was evident. Once about 60 % of capsules from each egg mass had hatched (relative to the total initial capsule number), we removed the remaining intact egg capsules and examined and weighed their contents (see below). The hatching process was identified in broods from 51 different females over the course of this study. However, only 23 of those egg masses did at least 50% of the capsules hatch. The egg masses used in these experiments (51 in total) had from 4 - 24 capsules each. We also collected information from 14 broods whose egg capsules did not hatch during the study. Dead, non-hatched capsules were not included in the analysis.

2.1- Sequence of hatching and capsule processing.

The day that the first capsule of each egg mass opened was defined as day 1 for that egg mass. When a capsule opened and released its juveniles, we removed it from its container along with any associated juveniles and any un-metamorphosed veliger larvae and nurse eggs. Then, using a stereoscopic (Olympus SZ51) at 25X magnification, we determined the developmental level of all offspring. For most egg capsules in this study, 15

the developmental stage at hatching was not uniform: offspring were either scored as larvae (with a velum) or juveniles (without a velum) (Chaparro et al., 2012; Pechenik and Heyman, 1987).

The larvae and juveniles of each newly-opened egg capsule were photographed at 25X magnification using a digital camera attached to a stereomicroscope, using the software Micrometrics SE Premium. Images were subsequently processed using Image Pro-Plus 5.0 software. We then measured the shell length of each individual and determined the number of juveniles and larvae present in each hatched capsule. We also quantified the number of nurse eggs present in each hatched capsule. Subsequently, the total content of each capsule (nurse eggs, larvae and juveniles) were deposited onto a previously washed glass fiber filter, dried, and weighed in a microbalance. The filters with their contents were then washed rapidly with distilled water to remove seawater salts, dried for 24-48 h at 60 ºC, and then weighed to determine the dry weight of the biomass contained in each capsule. When nurse eggs were still present, the nurse egg dry weight was discounted to determine the total encapsulated biomass of the larvae and juveniles that might potentially be participating in the hatching process. We considered the nurse eggs not to be active in the hatching process, since egg capsules that only have nurse eggs, with no developing embryos, never opened, even when offspring from sister capsules in the same egg mass had successfully hatched. To estimate NE dry weights in egg capsules at hatching, the number of nurse eggs found in each capsule was multiplied by the average nurse egg dry weight (2.58 ± 0.54 µg) previously determined for this species by Chaparro et al. (2012).

The contents of un-hatched egg capsules were also observed under the stereomicroscope and photographed, after manually opening the capsules. We then quantified the contents, following the same procedure already described for hatched capsules. This information allowed us to compare the contents of hatched capsules with those that had not yet hatched. 16

2.2- Effect of sister capsules in the process of hatching.

In 11 egg masses containing advanced pre-hatching embryos, we asked whether a hatched egg capsule would trigger the hatching of sister capsules, or conversely whether hatching was independent of events occurring in adjacent capsules. Half of the egg capsules from an egg mass (4 to 20 egg capsules) were maintained together in a small container (5 mL of seawater), while the other capsules from the same egg mass were individually placed in different small containers of the same 5 mL volume. The individual capsules and grouped capsules were monitored daily for hatching. When a capsule hatched inside a container of grouped capsules, both the hatched capsule and its contents were kept there to determine their effect on adjacent capsules. Both individual and grouped egg capsules were observed for at least 7 days after the first hatching, or until mortality was observed in the un-hatched capsules. The seawater (31 psu; 15 °C, oxygenated, filtered, and UV irradiated) of each small container was changed daily; similarly, females naturally replace the water in their mantle cavity frequently, through the action of their gill cilia, during the pumping action (Mardones et al., 2013).

2.3- Maternal time investment in the process of capsular oviposition.

This part of the study was undertaken to determine the relationship between the time required for females to complete the deposition of an egg mass and the time observed when hatching occurred. Females of C. dilatata were separated from the original substrate and then allowed to re-attach onto transparent acrylic plates, which would allow us to directly observe capsules being deposited within the female mantle cavity. The females were then returned to the estuary from which they had been collected. After several months, the females were returned to the laboratory and kept in aerated aquaria with seawater being pumped in continuously from the nearby estuary, maintaining natural conditions, with natural food supplied directly from the estuary. Whenever a female began ovipositing, we filmed the process at 10X magnification using a stereomicroscope with a 17

camera attached. Subsequent analysis of the videos allowed us to quantify the average time elapsed between the deposition of one egg capsule and the time until the next egg capsule was deposited. Thus we were able to estimate the total time taken to deposit complete egg masses, by knowing the total number of capsules in each egg mass and the time taken to deposit each one. The estimated time invested in ovoposition by each female was compared with the time required for hatching of the first and last egg capsules of each egg mass.

3.- Statistical analysis.

Linear regression analyses were used to identify association between the number of egg capsules in an egg mass and the time spent in hatching, as well as to determine the degree of association between shell length of metamorphosed individuals and the total number of embryos in the capsule, and to identify a possible association between the embryonic encapsulated biomass and the total number of embryos. Each linear regression model was analyzed using ANOVA to determine whether slope differed significantly from zero.

To identify differences in the mean of metamorphosed juveniles within an egg mass and between different broods, we compared the contents of those capsules hatched (2-12 capsules per brood) at the beginning (earliest 25%) and at the end (later 25%) during the hatching sequence in each egg mass. Considering that the time was measured in days, for this analysis we used only those egg masses in which egg capsules within a brood hatched over 2 or more days. For the analysis, we used a nested ANOVA, where hatching time (beginning and ending) was nested within egg masses. The same analyses were conducted to identify differences in the total number of offspring per capsule, the total offspring biomass (larvae plus juveniles) per capsule, and the mean shell length of metamorphosed individuals from each egg capsule. Data for number of metamorphosed juveniles, 18

encapsulated offspring biomass and total number of embryos per capsule were transformed to natural logarithms to meet the assumption of homogeneity of variance.

One-way ANOVA was used to identify differences between hatched and un-hatched egg capsules, comparing the number of juveniles metamorphosed per capsule, the offspring biomass, and average shell length per capsule. The same analyses were used to identify differences in the percentage of hatching between capsules maintained individually with those capsules maintained in natural groups. Percentages were arc-sin transformed before analysis.

To identify differences in the number of nurse eggs between hatched and non- hatched capsules we used the nonparametric Mann-Whitney analysis, because the data did not met the assumptions for parametric statistics. All analyzes were conducted after verifying assumptions of normality and homogeneity of variance.

A logistic regression analysis was used to predict the probability that hatching occurs based on some predictive variables. We used as variables juvenile shell length, encapsulated biomass of offspring, the number of metamorphosed juveniles, and the number of nurse eggs per capsule present at the moment of egg capsule opening. The response variable was binomial, corresponding to either non-hatching or hatching.

To determine variation in the amount of time taken for all egg capsules within an egg mass to hatch, we estimated coefficients of variation. For these calculations, we used only egg masses from which at least 50 % of the original capsules had hatched (n = 23).

RESULTS

1.- Capsular hatching and characteristics of the capsule content.

The number of capsules per brood mass accounted for only about 17% of the 2 variation in time to hatching (r = 0.17, ANOVA: F(1,21) = 4.254, p = 0.051, n = 23, Fig. 1). There was also great variation in the number of days from the start to the finish of hatching for sister capsules from individual broods; the coefficient of variation for those broods in which at least the half of the capsules hatched was 52 % ± 2%, n = 23 broods. Within an individual brood of egg capsules, the mean time from the start of hatching to the finish was 5.95 ± 2.96 days (mean ± SD, n = 23 broods) (Fig. 1). For 60% of egg masses, capsule mortality was lower than 25%.

The average number of juveniles metamorphosed per egg capsule varied throughout the hatching period within an egg mass, and between different broods, showing a small, but significant increase from the first capsules within a brood to hatch (12 ± 6 metamorphosed juveniles, n = 33 egg masses) to the last to hatch (14 ± 9 metamorphosed juveniles, n = 33 egg masses (Table 1A, Fig. 2A, B). The total number of offspring per capsule also varied throughout the hatching period in each egg mass and between the different broods, showing a significant increase in the amount of offspring from capsules hatched at the end of the period of capsule opening (initial: 13 ± 6; final: 14 ± 8, n = 33 egg masses) (Table 1B, Fig. 2 C, D). However, there were no significant differences in the mean shell length of metamorphosed juveniles that hatched at the beginning and at the end of the capsular hatching period for individual egg masses, or between the different broods (n = 33 egg masses, Table 1 C, Fig. 3A, B). The biomass of encapsulated offspring did not differ between those capsules that hatched at the beginning of the hatching period to those that hatched at the end of the hatching period for each egg mass (n = 33 egg masses, Table 1D, Fig 3 C, D). However, there was a significant difference in mean offspring biomass between the different broods (Table 1D). In some broods, hatching was fairly synchronous, 20

with as little as two days between hatching of the first and last capsules within an egg mass. For other broods, however, capsules within a single egg mass hatched over up to 13 days.

Hatching generally occurred after most embryos had metamorphosed to the juvenile stage: the average number of metamorphosed juveniles in hatched capsules was almost three times higher than that observed in unhatched capsules (one-way ANOVA: F(1, 327) = 42.5778, p < 0.0001, Table 2). An average of 94 % of juveniles per capsule had already metamorphosed by the time of hatching, while only about 34 % of individuals had metamorphosed within examined capsules that had not yet hatched. Similarly, hatched egg capsules contained only 6% as many nurse eggs as were found in unhatched capsules (Mann-Whitney U Test, U = 1216.0, p < 0.0001, Table 2). Finally, the average biomass of encapsulated offspring was 20 % higher in hatched capsules (1.26 ± 0.54 mg, n = 283 capsules) than in those that remained unhatched (1.01 ± 0.81 mg, n = 34 capsules) (one- way ANOVA: F (1,315) = 5.817, p = 0.0164, Table 2).

Mean shell length of progeny was related to both developmental stage (metamorphosed or not metamorphosed) and whether or not they had hatched (two-way

ANOVA: F(1,424) = 23.591, p < 0.0001. Fig. 4). In particular, the shells of juveniles at hatching (1.36 ± 0.25 mm, n = 293 capsules) were 30 % larger than those of individuals that had hatched before metamorphosing, 20 % larger than those that had metamorphosed but had not yet hatched, and 32 % larger than those of veligers found in the unhatched capsules (Fig. 4).

The number of encapsulated offspring varied among broods from 2 to 42 embryos per egg capsule, and the mean size of the hatched juveniles was inversely related to the 2 number of offspring per capsule (r = 0.26, ANOVA: F (1,291) = 104.95, p < 0.0001, n = 293, Fig. 5A). Capsules containing more offspring at hatching had a larger total biomass than 2 those containing fewer offspring (r = 0.18, ANOVA: F(1,281)= 62.06, p < 0.0001, n = 283, Fig. 5B). There was a greater probability of hatching for egg capsules containing few or no 21

nurse eggs (NE) and a large number of metamorphosed juveniles (J), and when those juveniles had larger mean shell lengths (SL) (Fig. 6, logistic regression: Ln (p/1-p)= -6.075 + 0.262 (J) + 13.758 (SL) – 0.018 (NE);).

2.- Effect of sister capsules on hatching.

For the egg capsules that were allowed to remain grouped, the hatching of one egg capsule did not cause sister capsules in the same egg mass to hatch on the same day. Relatively fewer egg capsules maintained in groups hatched, compared with those maintained individually (one-way ANOVA: F(1,20) = 13.28; p = 0.0016, Fig. 7). From the 11 grouped egg masses, only 4 contained at least one egg capsule that hatched, whereas in capsules maintained individually, at least one egg capsule hatched from each one of the 11 of the egg masses used.

3.- Female capsule laying sequence.

The average time between the laying of one egg capsule and the following capsule within the same egg mass was approximately 1.5 h (88 ± 9 minutes, n = 5 females). Extrapolating this information to the egg masses that were monitored for hatching times, and according to the number of hatched capsules, the estimated time that females spent depositing a complete mass of egg capsules was always less than the range of times to hatching within a brood. The time taken for females to deposit an egg mass on average accounted for only 9 ± 6 % of the time taken for all of the capsules within an egg mass to hatch (one-way ANOVA: F(1,44) = 292.17, p < 0.0001, Fig. 8); that is, variation in the time taken for egg capsules within an egg mass to hatch was not well-explained by differences in the amount of time females took to complete the depositing that egg mass.

DISCUSSION

The average time spent by C. dilatata in depositing each egg capsule (about 1.5 h) was about 3 to 4.5 times longer than that reported for the related calyptraeid species Crepidula navicella (Lesoway et al., 2014), a species that also has direct development and nurse eggs. Although the hatching process in C. navicella is apparently managed entirely by the female (Lesoway et al., 2014), the hatching process in both species represents a longer period of time than that spent in laying the egg capsules within an egg mass. The total time spent in the process of depositing an egg mass for C. navicella varied from 2.6 to 9 h, while time to complete hatching of all capsules within an individual egg mass in that species varied from a few hours to a few days (Lesoway et al., 2014). In C. dilatata it took 3 to 22 h for females to deposit a complete egg mass, while the time required for all capsules in an egg mass to hatch varied from 48 to 312 h. The time taken for all capsules of a given female to hatch was not related to time spent in the capsule-laying process; indeed, the estimated time taken for oviposition in C. dilatata corresponded to only 9 % of the recorded time taken for all capsules from that egg mass to hatch. This degree of independence suggests that the process that drives the timing of capsular opening is driven from inside the egg capsule by the pre-hatching embryos; thus the time of hatching is not pre-determined at the time of egg capsule formation.

The fact that intact capsules did not open in the presence of hatched sister capsules also supports the idea that the stimulus for capsule opening comes from inside the egg capsule. Indeed, the timing of hatching varied substantially among egg capsules within a brood, suggesting that the timing of hatching varies with developmental rates of the embryos within individual egg capsules. In the marine gastropod Ilyanassa obsoleta (= Nassarius obsoletus), hatching is controlled by the release of a chemical hatching substance by encapsulated embryos, and a single veliger can produce enough of that chemical to open its egg capsule (Pechenik, 1975). Note that in our study, encapsulated embryos hatched in the absence of the mother, confirming that the presence of the mother is not necessary for 23

hatching to occur. However, it is possible that female incubation could play some role in the hatching process, for example in synchronizing the process by releasing chemicals that stimulate their encapsulated offspring to release a hatching substance. While egg capsules of this species are able to hatch in the absence of the mother, it is still possible that the large variation observed in the hatching sequences of sister capsules within a brood in our study could be attributable to the brooder’s absence. Females of the estuarine crustacean Sesarma haematocheir apparently synchronize the hatching of their zoea, which showed more uniformity in hatching times than when the embryos were removed from the mother (Saigusa, 2000).

In our study, when the egg capsules of C. dilatata opened, most but not all of the embryos had already metamorphosed. There were also substantial differences in shell lengths among metamorphosed and not-yet-metamorphosed individuals at hatching. Wide variation in size and stage of development at hatching is common in marine gastropod species that provide their developing embryos with nurse eggs (Thais emarginata, Acanthina spirata, Spight, 1976; Saerlesia dira, Rivest, 1983; Crepidula adunca, Collin, 2000; Chorus giganteus, Leiva et al 1998; Hexaples trunculus, Güler and Lök, 2014; Vasconcelos et al., 2004). As we have found for C. dilatata, Güler and Lök (2014) found that when hatching occurred in the muricid gastropod Hexaplex trunculus, some of the embryos hatched as metamorphosed juveniles while the rest still had velar lobes. Moreover, those veligers continued swimming in the water column for two days after hatching before metamorphosing (Güler and Lök, 2014).

In the case of C. dilatata, the total embryonic biomass (veligers + juveniles) and the average juvenile shell lengths at hatching for capsules hatching late were similar to that found in capsules from the same egg mass that hatched earlier. However, within an egg mass the number of juveniles (metamorphosed) and the total number of offspring increased in capsules hatched to the end of hatching period, compared with capsules hatched early. Capsules containing many offspring may have required a longer time to reach the total 24

biomass or juveniles size needed to cause the capsules to open. Sizes at hatching seen in this study are within the range (0.8 - 1.8 mm) indicated for this same species by Zelaya et al. (2012). Probably the smaller size and lower biomass in capsules containing a large number of offspring that not hatched at the beginning of the hatching period is related to food availability, since the presence of more embryos should reduce the number of nurse eggs available to each individual for ingestion, affecting the rate of development and subsequently delaying the time until metamorphosis.

There was a significant difference in the mean shell lengths of metamorphosed and non-metamorphosed individuals from hatched capsules. In general, metamorphosed individuals were typically 30% larger than unmetamorphosed embryos. These size differences could be a consequence of the amount of nurse eggs eaten by embryos, which could be related to the differences in the proportion of embryos and nurse eggs packed into each capsule, setting up different degrees of competition for nurse eggs among the developing embryos. In calyptraeid gastropods with direct development, only a small percentage of eggs continue their embryonic development as larvae (e.g. 7 % C. navicella, Lesoway et al., 2014; 8 % C. dilatata, Gallardo, 1979), leaving many nurse eggs available as food for the embryos within the capsule. However, even with an abundance of nurse eggs per embryos, there is typically an unequal consumption of nurse eggs during encapsulated development (Averbuj and Penchaszadeh, 2010). In C. dilatata, these differences in developmental stage and shell size at hatching could be compensated for by a deliberate extension of the brooding period by the mother: after offspring exit the egg capsule into the mantle cavity; hatched offspring can be retained within the female mantle cavity for a period before they leave the mother (Segura et al., 2014). This retention behavior might allow hatched veligers to complete velum resorption during this "additional incubation period” under maternal shell protection.

This study shows that the process of metamorphosis does not trigger immediate hatching in C. dilatata, and indeed is not related to when hatching occurs. After some egg 25

capsules within a brood had hatched, we recorded the presence of metamorphosed juveniles in sister egg capsules that had not yet hatched. However, the average size of those juveniles was significantly lower than the average size of metamorphosed juveniles from hatched capsules, suggesting that growth and development must continue after metamorphosis before hatching can take place, probably making use of the nurse eggs that still remained inside the egg capsule. According to our results, unhatched capsules showed a large number of nurse eggs (174 ± 182 nurse eggs) compared to those in hatched sister capsules (10.5 ± 35 nurse eggs) from the same egg mass. Many capsules have not remaining nurse eggs.

Large variation in the size of offspring measured from the same egg mass has been documented in various species that exhibit embryonic cannibalism (Brante et al., 2013; Cumplido et al., 2011). This cannibalistic behavior and its subsequent effect on hatching sizes of survivors has also been observed for larvae of C. fecunda, after experimentally killing a percentage of embryos within an egg capsule using mechanical pressure (Cubillos et al., 2007). In that species this extra food supply for incubated surviving embryos caused an early hatching of the survivors. In that species, capsules are not naturally provided with nurse eggs. However, the capsules that hatched first (with dead siblings consumed as additional exogenous food) presented a wide variation in the sizes of shelled larvae at hatching. The authors identified some especially large larvae at the time of hatching, and suggested that these individuals may have induced the hatching process (Cubillos et al., 2007).

The smaller sizes of C. dilatata embryos hatching from capsules with a greater number of embryos indicates decreased food intake among individual capsule-mates. Linear regression analysis indicates that only 25% of the variation in the size of the hatched offspring is explained by the number of the encapsulated embryos per egg capsule. Despite the coeficiente of the model is low, there was a significant relationship between embryos number and their hatching size, which has also been observed in other brooding gastropod 26

species that encloses nurse eggs within their egg capsules (Searlesia dira, Rivest, 1983; Buccinanops cochlidium, Averbuj and Penchaszadeh, 2010). Embryos development inside capsule could be influenced by oxygen availability (Cohen and Strathmann, 1996; Lardies and Fernandez, 2002). In the gastropod Acanthina monodon, the embryos number change according the oxygen available inside capsules (Lardies and Fernandez, 2002).

The number of embryos per egg capsule varied substantially among sister capsules in C. dilatata (coefficient of variation: 40% ± 15%). We were not able to record the initial number of nurse eggs per capsule in our studies with C. dilatata, but in other gastropods, the initial number of nurse eggs does not vary significantly between the sisters capsules within an egg mass (Thais emarginata, Spigth, 1976; Nucella ostrina, Lloyd and Gosselin, 2007; C. navicella, Lesoway et al., 2014); thus the distribution of nurse eggs among egg capsules seems less variable than the number of embryos per capsule. How females control the allocation of nurse eggs and embryos to egg capsules is not known.

The timing of capsular opening and the subsequent hatching of the encapsulated offspring in C. dilatata seems to depend mainly on developmental rate, while the hatching size depends largely on the number of nurse eggs consumed inside the capsule. When these features are combined (a large number of large juvenile metamorphosed combined with few remaining nurse eggs), the probability that hatching occurs is increased. This suggests that the moment of hatching in C. dilatata is determined by at least some of the embryos within a capsule reaching a stage of development at which they can activate the hatching mechanism, allowing the subsequent release of the progeny. Whether the hatching mechanism for C. dilatata is mediated chemically or mechanically remains to be determined.

ACKNOWLEDGMENT

The authors thank Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica-Chile (CONICYT- Chile) for the Doctoral Fellowship 21120654 given to PA-V and to Fondo Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (FONDECYT-Chile) Grant 1141052 to ORC.

Table 1. Crepipatella dilatata. Nested Anova performed for effect of hatching time (initial and final) nested in the different egg-brood on the average number of juveniles, total number of offspring, shell length of juvenile, and the offspring biomass in each hatched capsule. Bold p-values indicate statistical significance.

A.-Number of juveniles df MS F p Intercept 1 88.19 2707.86 <0.001 Brood 32 0.20 6.20 <0.001 Hatching time (brood) 33 0.06 1.96 0.007 Error 77 0.03

B.-Total number of offpring Intercept 1 94.97 3230.61 <0.001 Brood 32 0.17 5.94 <0.001 Hatching time (brood) 33 0.05 1.90 0.011 Error 77 0.02

C.-Shell length of juveniles Intercept 1 161.14 1290.37 <0.001 Brood 32 0.06 0.49 0.984 Hatching time (brood) 33 0.02 0.20 0.999 Error 77 0.12

D.-Offspring biomass Intercept 1 0.170864 7.115348 0.009313 Brood 32 0.097714 4.069110 0.000000 Hatching time (brood) 33 0.037241 1.550826 0.059101 Error 77 0.024014

Metamorphosed Nurse eggsOff Offspring biomass Juvenile shell Capsule conditions juveniles (juvs cap -1) (NE cap-1) (mg cap-1) size (mm cap-1) Hatched 11.8 ± 7 (a) 10.5 ± 35 (a) 1.26 ± 0.5 (a) 1.36 ± 0.25 (a) Non-hatched 3.7 ± 5 (b) 174 ± 182 (b) 1.01 0.8 (b) 1.09 ± 0.18 (b)

FIGURES

14 HT= 0.3613 * NC + 3.0816 R²= 0.168; p= 0.051 12

Hatching time (d) time Hatching 4

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

-1 Capsules Brood

40 40 A) B) Initial hatching 35 35 Final hatching

-1 30 30

25 25 b

20 a 20

15 15

10 10

Number of juveniles capsule of juveniles Number 5 5

0 0 40 40 C) D) 35 35

-1 30 30

25 b 25

20 a 20

15 15

10 10

Total offspring capsule

5 5

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Initial Final -1 Brood Hatching time Brood

(brood). Mean of juveniles (B) and total offspring (D) in hatched capsules at the beginning and at the end of hatching period for 33 different egg masses. Different letter on bars show significant differences. Lines on bar show SD.

2.0 2.0 A) B)

-1 Initial hatching 1.8 Final hatching a 1.8

1.6 1.6 a

1.4 1.4

1.2 1.2

1.0 1.0

Shell length of juveniles (mm) Capsule Shell(mm) length juveniles of 0.8 0.8 4.0 4.0 C) D) 3.5 3.5

-1

3.0 3.0

2.5 2.5 a 2.0 2.0 a

1.5 1.5

1.0 1.0

Offspring biomass (mg) Capsule Offspring biomass (mg) 0.5 0.5

0.0 0.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Initial Final -1 Brood Hatching time Brood

Fig. 3 Crepipatella dilatata. (A) Mean shell length (mm) of the metamorphosed juveniles and (C) mean offspring biomass (mg) from capsules hatched at the beginning and at the end of the hatching period for each egg mass (n = 33 capsules). Initial hatching (full circles) represent the 25% of those capsules hatched earlier and the open circles represent the 25% of the last hatched capsules in relation of the total time spent during the hatching process 34

for each egg mass. Mean juvenile shell length (B) and mean offspring biomass (D) in capsules hatched at the beginning and at the end of the hatching period for the 33 egg masses. Different letter on bars show significant differences. Lines on bar show SD.

1.8 a Metamorphosed 1.6 Non-metamorphosed

1.4 b b 1.2 b

1.0

0.8

0.6

Mean shellMean length (mm) 0.4

0.2

0.0 Hatched Non-hatched Egg capsules status

2.0 A)

(mm)

-1 1.8 SLJ = 1.503 - (0.0124 * TNO) R2= 0.26; p < 0.0001 1.6

1.4

1.2

1.0

Mean juvenile shell length Capsule 0.8 0 10 20 30 40 50

4.0 B)

(mg) 3.5 -1 OBB = 0.859 + (0.0329 * TNO) 2 3.0 R = 0.173; p < 0.0001

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

Offspring brooded biomass Capsula 0.0 0 10 20 30 40 50 Total offspring Capsule -1

Hatched 35 Non-hatched

15 Number of juveniles of Number 10

Juvenile shell length (mm) 0 1.8 1.5 1.2 700 0.9 500 600 300 400 0.6 200 0 100 Number of nurse eggs

100 A) B) Grouped 90 Individual 80

70 b 60

40 a 30

Percent hatching (%) hatching Percent

10 * * 0 * * * * * 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Grouped Individual Brood number Egg capsules status

400 Hatching time A) B) Capsular deposition time 11 300 9 13

200

Hours 15 10 7 10 7 8 5 7 13 4 2 6 3 100 8 11 7 4 8 5 10 a

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Deposition Hatching Broods Egg mass situation

Fig. 8 Crepipatella dilatata. A) Estimated time of maternal investment in the capsular laying process and time registered of hatching for each brood. The broods controlled were those in which at least 50% of capsules had hatched. The capsular laying time for each female was estimated multiplying the average time used in laying one capsule (see M & M) by the total hatched capsule number in each experimental brood. B) Mean time (h) spend during capsular laying and the hatching process in each capsule brood (n = 23). Numbers above the bars represent the number of capsules in each brood. Different letters mean significant differences. Bars mean SD.

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CAPITULO 2.

ACCIÓN BIOMECÁNICA Y OSMÓTICA: POSIBLES MECANISMOS DE ECLOSIÓN CAPSULAR EN Crepipatella dilatata

RESUMEN

Diferentes mecanismos de eclosión han sido identificados en invertebrados marinos. En gastropodos encapsuladores, la eclosión embrionaria podría incluir cambios en la concentración osmótica del fluido intracapsular, o la participación directa de las veligeras y/o juveniles a través de la acción mecánica de la ciliatura velar de veligeras o del ramoneo de los juveniles sobre la zona de eclosión. También, la acción radular materna, podría ser partícipe del proceso de eclosión. En la presente investigación se pretende determinar en el gastropodo con desarrollo directo y cuidado parental, Crepipatella dilatata, si la acción mecánica radular, materna o embrionaria, o los cambios osmóticos del fluido intracapsular son capaces de llevar a cabo la eclosión de los juveniles encapsulados. La posible participación de la hembra incubadora y de los embriones encapsulados utilizando su rádula para abrir la capsula, se determinó mediante análisis de microscopio electrónico de barrido de la zona de eclosión en capsulas con diferentes niveles de desarrollo. Se identificó la 47

presencia y se midió el tamaño radular, tanto en adultos como en larvas y juveniles pre- eclosión. El mecanismo osmótico como participante de la eclosión, se midió a través de los cambios de la concentración osmótica del fluido intracapsular en capsulas conteniendo diferentes niveles de desarrollo embrionario. Igualmente, en capsulas con diferentes estadios de desarrollo embrionario, se determinó la cantidad de fluido intracapsular (g), la concentración de calcio en el fluido y la presencia de los principales elementos químicos. También, se cuantificó la capacidad de ingreso de agua al interior de las capsulas con diferentes niveles de desarrollo embrionario, cuando éstas fueron expuestas a diferentes niveles salinos. Los resultados indican que ni la radula de la hembra, de las larvas veligeras o de los juveniles pre-eclosión participan del proceso de apertura capsular. La radula aparece en veligeras encapsuladas de aproximadamente 810 µm de long concha. La concentración osmótica del fluido intracapsular disminuye en capsulas con desarrollo avanzado, coincidiendo con las menores concentración de calcio en los estadios más avanzados. Por su parte, el cambio en la osmolalidad del fluido intracapsular, así como el aumento en el contenido de líquido en capsulas expuestas a medio hipotónico, no consiguen la apertura capsular, de manera que este mecanismo no es el responsable, por si solo, del hatching de los juveniles en C. dilatata, lo cual permite sugerir que la eclosión ocurre gatillada por otros mecanismos, posiblemente de tipo bioquímico.

INTRODUCCION

La eclosión es un complejo proceso que suele ser considerado como una etapa de transición entre diferentes estados de desarrollo, dentro del ciclo de vida de un organismo (Warkentin, 2011a). Este proceso está presente en diferentes grupos zoológicos, tales como anfibios, aves, peces, crustáceos y gastrópodos (Croxall et al., 1992; De Vries and Forward, 1991, Spight; 1976, Warkentin, 2011b; Yamagami, 1981). En el caso de los gastrópodos marinos, la eclosión ocurre en especies que presentan desarrollo mixto o directo, 48

emergiendo desde las estructuras protectoras (ej. capsula, masa gelatinosa), larvas veligeras o juveniles metamorfoseados, respectivamente (Mileikovsky, 1971; Pechenik, 1975; Spight, 1975; Thorson, 1950).

La oportuna salida de los embriones (larvas o juveniles), al final del período de desarrollo intracapsular, pareciera estar determinada por el momento en que se alcanzan los características necesarias para llevar a cabo el proceso de eclosión, y por otra parte, por el desarrollo de las condiciones necesarias que permitan a los eclosionantes, sobrevivir fuera de la capsula (Warkentin, 2011a). Una eclosión anticipada podría generar la salida de embriones que aún no están morfológica y/o fisiológicamente preparados para habitar el medio externo, pudiendo afectar funciones vitales como la alimentación, o procesos relevantes como metamorfosis y asentamiento. Por otra parte, la eclosión tardía, puede causar la muerte de los embriones, ya sea por falta de alimento, falta de oxígeno o aumento de toxinas al interior de las capsulas (Branscomb et al., 2014; Brante et al., 2008; Warkentin, 2011a). No obstante lo anterior, algunos invertebrados marinos tienen la capacidad de regular la salida de sus embriones. Esto puede estar determinado por las condiciones ambientales, pudiendo adelantar o retrasar el proceso de eclosión (Clare, 1997; Oyarzun and Strathmann, 2011; Warkentin, 2011a,b).

La plasticidad de eclosión generalmente, ocurre en especies donde, aparte de la protección brindada por la estructura envolvente, hay además un cuidado parental directo. En estos casos, es la madre incubadora quien maneja la apertura capsular (Branscomb et al., 2014; Lesoway et al., 2014; Oyarzun and Strathmann, 2011). Sin embargo, en especies donde la eclosión no está sujeta a una acción materna directa (ej: ruptura de la capsula), y más bien depende de los embriones al interior de la capsula, se han descrito diferentes mecanismos de eclosión, siendo particularmente tres de ellos los más frecuentemente registrados entre los gastrópodos (Hawkins and Hutchinson, 1988; Weber, 1977). El primero corresponde a una acción de tipo bioquímico, donde los juveniles pre-eclosión (desarrollo directo) o las larvas veligeras (desarrollo mixto), generan una sustancia con 49

actividad enzimática, la cual permitiría la apertura de la capsula (Hawkins and Hutchinson, 1988; Pechenik, 1975; Sullivan and Bonar, 1985; Sullivan and Maugel, 1984). Un segundo mecanismo de eclosión corresponde a una acción de tipo biomecánico, y se refiere a una participación física directa por parte de los embriones incubados (Weber, 1977). En el caso de especies con ciclo de vida mixto, las larvas serían capaces de disgregar el tapón capsular, por ejemplo, mediante el movimiento de la ciliatura velar (Leiva et al., 1998). En gastropodos con ciclo de vida directo, donde la metamorfosis ocurre al interior de la capsula, se ha descrito que los juveniles, con una rádula ya desarrollada, son capaces de ramonear sobre la zona de eclosión, lo cual facilita la abertura capsular (Bigatti et al., 2014; Smith and Thatje, 2013). El tercer mecanismo de apertura capsular corresponde a la acción osmótica, y sugiere que al final del desarrollo intracapsular, debido a un aumento de la concentración osmótica en el fluido intracapsular, se gatilla un mayor ingreso de agua hacia el interior de la capsula, aumentando también el volumen capsular y la presión capsular interna, lo cual terminaría por abrir la capsula (Davis, 1968; Hawkins and Hutchinson, 1988; Maeda-Martínez, 2008). Este mecanismo de eclosión ha sido descrito en copepodos de agua dulce y marinos, donde el proceso de eclosión es osmóticamente controlado (Davis, 1959; Marshall and Orr, 1954), a pesar de que en varios casos de invertebrados marinos, se ha descrito que las estructuras envolventes como capsulas y masas gelatinosas, actúan parcialmente, como protectores de cambios en la salinidad (Chaparro et al., 2008a; Pechenik, 1979, 1982, 1983; Woods and DeSilets, 1997).

En diferentes especies de crustaceos decapodos (Neopanope sayi, Sesarma cinereum, Uca pugilator) se ha evidenciado el aumento del volumen del huevo en un 15% de su tamaño, durante el periodo de 24 horas previas a la eclosión. Esta acción osmótica actuaría en forma conjunta con un mecanismo de tipo bioquímico (De Vries and Forward, 1991). Cambios en el volumen capsular, asociado a alteraciones en la concentración osmótica han sido identificados en el gastropodo Ocenebra erinacea. Hawkins and Hutchinson (1988), identificaron que capsulas expuestas a medios hipotónicos, aumentaron su volumen capsular y disminuyeron su concentración osmótica. Por otra parte, cambios en 50

la concentración osmótica del fluido intracapsular, a través del desarrollo embrionario, también han sido descritos en el gastrópodo Calypatraeideo Crepidula fornicata, identificándose una disminución de la concentración osmótica en capsulas con desarrollo avanzado pre-eclosión, lo cual ha permitido sugerir que este cambio podría estar relacionado con la eclosión capsular (Maeda-Martínez, 2008).

La presencia de diferentes iones y de moléculas orgánicas e inorgánicas en el fluido intracapsular son esenciales para mantener un medio osmótico adecuado para el desarrollo de los embriones. Hay evidencia que la concentración de algunos de estos iones cambia a medida que los embriones se desarrollan, lo cual generalmente coincide con cambios estructurales de la pared capsular, como ocurre con la concentración de calcio presente en el fluido intracapsular del calyptraeideo Crepidula fornicata (Maeda-Martínez, 2008). En la presente investigación se utiliza como especie modelo, al gastrópodo hermafrodita, con desarrollo directo Crepipatella dilatata (Collin, 2003, Gallardo, 1979). Este Calyptraeideo presenta incubación de sus embriones al interior de capsulas, las cuales son adheridas a sustratos duros, como conchas o rocas y protegidas físicamente bajo el cuerpo de la hembra. Cada postura tiene en promedio, entre 20 y 25 capsulas, las que son mantenidas en la cavidad paleal de la hembra hasta que los juveniles eclosionan (Chaparro et al., 2008a, Chaparro et al., 1999, Gallardo, 1979). Al interior de cada capsula, es posible encontrar dos tipos de huevos, aquellos que se desarrollarán como embriones hasta eclosionar como juveniles, y los huevos nutricios, que serán consumidos por los embriones para sustentar su desarrollo al interior de la capsula (Chaparro and Pascke, 1990, Gallardo and Garrido, 1987). La capsula de forma triangular, presenta una zona específica en la parte superior, similar a un cierre, por el cual emergen los juveniles durante la eclosión (Chaparro et al., 2008a). A pesar de que no hay información sobre la presencia de rádula en larvas o juveniles pre-eclosión al interior de las capsulas, se ha identificado una rádula funcional y activa en juveniles de C. dilatata desde el primer día de eclosionados (Chaparro et al., 2005). Lo anterior hace evidente la posibilidad de que juveniles pre-eclosión puedan poseer una rádula desarrollada y en función a eso, participen del proceso de eclosión ramoneando 51

sobre la zona de apertura desde el interior de la capsula. Por otra parte, la participación de la hembra incubadora en la apertura capsular, no ha sido descrito, pero se ha identificado la presencia de una rádula taenioglossa bien desarrollada (Chaparro et al., 2001), así como el uso de ésta en el movimiento y limpieza de las capsulas durante el proceso incubatorio (Chaparro et al., 2009). De esta forma, podría ser factible un posible uso de la rádula materna en la eclosión de su progenie.

En consideración a lo anterior, el objetivo de este trabajo es determinar sí el mecanismo de eclosión en el gastrópodo Crepipatella dilatata es accionado desde el exterior, siendo la hembra incubante, mediante el uso de la rádula, la responsable de la apertura capsular, o por el contrario, si este proceso de eclosión es manejado por el contenido embrionario, desde el interior de la capsula, identificando una posible acción biomecánica y/u osmótica que puedan actuar, por si solas o en conjunto, como posibles gatillantes de la eclosión.

METODOLOGIA

1.- Obtención del material biológico y selección de posturas

Individuos adultos de Crepipatella dilatata fueron obtenidos desde el Estuario de Quempillen, Ancud, Isla de Chiloé (41° 52’ S, 73° 46’ W). Estos fueron trasladados hasta el laboratorio y mantenidos ahí, por no más de 5 días, en acuarios con agua de mar (31 psu), previamente filtrada a 1 µm, esterilizada con UV, y oxigenada mediante burbujeo. Se realizó recambio de agua diario y los individuos fueron alimentados ad libitum con cultivos puros de la microalga Isochrysis galbana.

Durante la obtención de las capsulas, las hembras fueron desprendidas del sustrato (rocas o conchas de moluscos), y se colectaron cuidadosamente las oviposturas. Para identificar el estado de desarrollo de los embriones de cada postura, ellas fueron observadas bajo una lupa estereoscópica. Las capsulas de C. dilatata son transparentes, por lo cual fue posible observar su interior sin necesidad de abrirlas. Las posturas fueron separadas en tres categorías, de acuerdo al nivel de desarrollo de los embriones: a) capsulas iniciales, donde solo hubo presencia de huevos (nutricios y embrionarios), b) intermedias, donde se identificó la presencia de larvas veligeras, independiente de la longitud de concha, y c) finales, donde fue posible observar en su mayoría juveniles metamorfoseados (pre- eclosión) y nula, o muy baja, presencia de huevos nutricios.

2) Ramoneo como mecanismo de eclosión.

2.1- Presencia de rádula en estadios pre-eclosión.

Para identificar la presencia de rádula en larvas-juveniles encapsulados y su posible participación en la apertura capsular, se utilizaron capsulas con nivel de desarrollo intermedio y avanzado, provenientes de diferentes posturas. La rádula de juveniles pre- eclosión fue identificada siguiendo la metodología de Manríquez et al. (2012). Los juveniles pre-eclosión, provenientes de 4 posturas diferentes con desarrollo avanzado (n = 4 capsulas) fueron introducidas en una solución compuesta de partes iguales (3ml) de H2O2 (20%) y NaOH (0.1 N), mantenidas en ebullición durante 30 minutos a 100°C. Una vez transcurrido el tiempo, el material obtenido fue separado y enjuagado 3 veces con agua destilada, para finalmente ser observado bajo la lupa estereoscópica. Las rádulas identificadas fueron separadas y observadas bajo el microscopio óptico (X40), fotografiándolas a través de una cámara conectada a éste, utilizando el software Q Capture Pro 6.0. Por último, las imágenes obtenidas fueron analizadas a través del software Image Pro plus 5.0 para calcular la longitud y ancho de las rádulas. El ancho se midió en el extremo anterior, utilizado para ramonear. 53

Con este método no fue posible identificar rádula en estadios de veligeras tempranas e intermedias. Por lo cual, para obtener la rádula de estas larvas, ellas se pusieron en portaobjetos y se aplastaron suavemente con un cubreobjetos. La observación se hizo directamente bajo el microscopio. Se utilizaron larvas, provenientes de 9 capsulas intermedias obtenidas desde diferentes posturas. Las rádulas identificadas fueron fotografiadas (40X) y medidas utilizando la metodología descrita anteriormente. Tanto los juveniles pre-eclosión como las larvas veligeras utilizadas para identificar rádula, fueron previamente fotografiadas bajo la lupa a través del software Micrometrics SE Premium, para obtener el tamaño de su concha.

2.2- Acción radular de larvas-juveniles encapsulados.

Capsulas en estadio de desarrollo intermedio, final y recién eclosionadas (capsulas en proceso de hatching), fueron colectadas para determinar una posible actividad de ramoneo de los embriones-juveniles pre-eclosión sobre la zona interna de apertura capsular. No se utilizaron capsulas en estadio inicial, debido a que ellas solo contienen embriones sin concha, y sin estructuras sólidas. Se separaron al azar 2 capsulas desde cada una de las 2 oviposturas utilizadas (n = 4 capsulas), identificado previamente el nivel de desarrollo de los embriones. Cada capsula fue abierta cuidadosamente, vaciando todo el contenido embrionario. Durante el proceso de fijación, cada capsula fue mantenida durante 30 minutos en glutaraldehido al 2%, en frio, agitando suavemente cada 5 minutos para que el fijador penetrara en la muestra. Transcurrido el tiempo, las capsulas fueron enjuagadas 2 veces con buffer fosfato cada 10 minutos, de manera de extraer el glutaraldehido. Una vez fijadas, las muestras se deshidrataron a través de una batería de alcoholes (15, 30, 50, 75, 90, 100 % alcohol), manteniéndose durante 10 minutos en cada concentración. Luego de ésto, se les aplicó el punto crítico, y se montaron en portaobjetos de manera que la zona de eclosión, quedara expuesta al observador por la región interna de la capsula, región que se observó para identificar una eventual acción radular de los juveniles pre-eclosión. 54

Finalmente, las muestras fueron bañadas en oro para su posterior observación al microscopio electrónico de barrido.

2.3.- Ramoneo materno como mecanismo de eclosión.

Para obtener el tamaño de la rádula materna, se procedió a separar 4 hembras incubantes tomadas aleatoriamente, desde las cuales se obtuvo la rádula mediante disección bajo la lupa estereoscópica. Las rádulas fueron limpiadas con agua oxigenada (20 volumenes), observadas y fotografiadas bajo la lupa, utilizando el software Micrometrics SE Premium. Posteriormente las imágenes fueron procesadas con el software Image-Pro plus 5.0, para obtener las dimensiones. Las dimensiones de la rádula materna sirvieron como referencia del tamaño de las posibles marcas dejadas por el ramoneo materno, sobre la zona de eclosión externa de la capsula.

Para determinar la participación activa de la rádula de la hembra incubante en el proceso de eclosión capsular, se usaron capsulas en estadio de desarrollo final y recién eclosionadas, las cuales fueron observadas a través de microscopía electrónica de barrido. Se utilizaron 2 capsulas por nivel de desarrollo embrionario. El procesamiento de las capsulas fue el mismo descrito anteriormente para identificar actividad de ramoneo de los embriones. Sin embargo, la posición del montaje de las capsulas fue diferente, ya que en este caso las capsulas expusieron la zona de eclosión de la pared externa hacia el observador, de manera de facilitar la observación de eventuales marcas de ramoneo por parte de la hembra.

3) Acción osmótica como mecanismo de eclosión.

3.1- Concentración osmótica de capsulas con diferentes niveles de desarrollo. Posturas con diferentes niveles de desarrollo embrionario fueron seleccionadas al azar para identificar diferencias en la concentración osmótica del fluido intracapsular. Se utilizaron 19 posturas con desarrollo inicial, 40 con desarrollo intermedio y 16 posturas con desarrollo avanzado (pre-eclosión). Cada capsula de cada postura fue separada y secada cuidadosamente con papel absorbente para eliminar el agua adherida a las paredes externas de la capsula, luego bajo una lupa estereoscópica y utilizando una jeringa de 1 ml, se extrajo el fluido intracapsular. El fluido obtenido de cada postura fue congelado (-80°C) durante el periodo de almacenamiento. Para cuantificar la concentración osmótica del fluido intracapsular de cada postura se utilizó un Osmometro Advanced modelo 3320 micro-osmometer, el cual permite cuantificar la osmolalidad de pequeños volumenes (20 µl). Se utilizó agua de mar filtrada como control.

Desde cada capsula de la que se obtuvo el fluido, se registró el tamaño de las larvas y/o juveniles pre-eclosión, a través de una cámara adherida a una lupa utilizando el software Micrometrics SE Premium. Los tamaños de concha fueron obtenidos a través del software Image pro plus 5.0.

3.2- Variaciones en el contenido de agua a través del desarrollo intracapsular.

Se utilizaron capsulas con diferentes niveles de desarrollo, inicial (n = 15), intermedio (n = 16) y avanzado (n = 19). Cada capsula fue secada cuidadosamente para eliminar el agua adherida a las paredes externas de la capsula y posteriormente fue pesada en una balanza analítica (sensibilidad 0.00001 g). Una vez obtenido el peso, se procedió a extraer el líquido desde el interior de la capsula, pinchándola con una pequeña aguja, permitiendo la salida de éste y no del contenido embrionario (huevos, larvas y/o juveniles). 56

Cuando las capsulas estuvieron sin líquido en su interior fueron pesadas nuevamente y por diferencia, se calculó el porcentaje de fluido presente en cada capsula.

3.3- Capacidad de ingreso de agua en capsulas con diferentes niveles de desarrollo.

Para identificar ingreso de agua como un posible mecanismo de ruptura capsular, capsulas completas con diferentes estadios de desarrollo embrionario fueron expuestas a diferentes niveles de salinidad. Una vez seleccionadas las capsulas de cada nivel de desarrollo embrionario (inicial, intermedio y avanzado), fueron secadas cuidadosamente por el exterior usando papel absorvente, para obtener su peso inicial utilizando una microbalanza (0.00001 g).

Posteriormente, cada capsula fue expuesta a una salinidad especifica. Se utilizaron 3 réplicas para cada salinidad (32, 20, 10 psu y agua destilada) por cada estadio de desarrollo, las que fueron mantenidas en pequeños acuarios (300 µl) durante 24 horas. Transcurrido el tiempo indicado, cada capsula, fue examinada para identificar su condición (abierta o cerrada). Luego, ellas fueron nuevamente secadas y pesadas en la microbalanza para obtener las diferencias de peso, lo que correspondería al peso del agua ingresada.

3.4- Elementos químicos presentes en el fluido intracapsular.

Para identificar los elementos químicos presentes en el fluido al interior de las capsulas, se seleccionaron al azar 2 cápsulas de cada estadío de desarrollo embrionario (inicial, intermedio y final). Desde el interior de cada capsula se extrajo cuidadosamente el fluido, utilizando la metodología descrita anteriormente. Luego, desde cada muestra de fluido se tomó una gota utilizando una pipeta Pasteur, la cual fue depositada sobre una cinta de carbón, y se mantuvo en un desecador hasta la eliminación del agua. Una vez que las muestras se secaron, fueron analizadas al microscopio electrónico de barrido, obteniéndose la información sobre los elementos constituyentes y su participación porcentual en el 57

respectivo fluido intracapsular. La composición elemental de la cinta de carbón fue descontado de los respectivos análisis (presencia de Carbón y Oxigeno). Se utilizó agua de mar filtrada y esterilizada con UV como control (n = 2). La cuantificación de los elementos se realizó utilizando el microscopio electrónico de barrido (INCA 2000, Oxford instruments), acoplado con un analizador de energía dispersiva (EDS).

3.5- Concentración de calcio en el fluido intracapsular.

Capsulas con diferentes niveles de desarrollo (inicial n = 8, intermedio n = 10 y final n = 14) fueron separadas al azar y utilizadas para extraer el fluido intracapsular. Cada capsula fue cuidadosamente secada con papel absorbente para eliminar el agua adherida a las paredes externas de la capsula. Posteriormente, la obtención del fluido desde el interior de las capsulas fue realizada, bajo una lupa estereoscópica, utilizando una pequeña jeringa, la cual permitió separar el fluido del material embrionario (huevos, larvas, juveniles). El fluido fue mantenido a -20 °C hasta su análisis. Para la cuantificación de calcio se utilizó el kit comercial Calcium A III del laboratorio Spinreact. Cuantificación de la concentración de calcio también fue realizada en muestras de agua de mar, las cuales fueron utilizadas como control. Se utilizó un volumen de muestra de 3 µl y se hicieron 2 réplicas por muestra.

3) Análisis estadístico.

Un análisis de regresión simple, y un posterior ANOVA para contrastar su significancia, fue realizado para identificar una posible relación entre el tamaño de la concha (longitud) de los embriones (larvas y juveniles pre-eclosión) y el tamaño de su rádula (longitud y ancho).

Para determinar la existencia de diferencias en la concentración osmótica del fluido intracapsular, entre capsulas con diferentes niveles de desarrollo embrionario, se realizó un 58

ANOVA de 1 vía con su respectivo test a posteriori de Tukey. Este mismo análisis estadístico se llevó a cabo para determinar posibles cambios en el contenido de agua intracapsular, expresado como porcentaje, a través del desarrollo. También fue usado para identificar diferencias en el contenido de calcio del fluido intracapsular, entre capsulas con diferentes niveles de desarrollo, y por último para determinar si la proporción de los diferentes elementos identificados en el fluido intracapsular varía entre diferentes estados de desarrollo embrionario.

Un ANOVA de 2 vías se realizó para determinar el efecto, tanto de la salinidad como del nivel de desarrollo embrionario, en el ingreso de agua hacia la capsula. Los datos de la cantidad de agua ingresada en cada capsula, expresada como porcentaje respecto del peso inicial, fue transformada a la raíz cuadrada para cumplir con los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza.

RESULTADOS

1) Ramoneo como mecanismo de eclosión.

1.1- Identificación de rádula en estadios pre-eclosión.

Se identificó la presencia de rádula en juveniles pre-eclosión (Fig. 1), cuya longitud de concha promedio, por capsula, varío entre 1003 ± 50 µm y 1220 ± 37 µm (n = 4 capsulas) (Tabla 1). También se observó presencia de rádula en larvas veligeras, provenientes de capsulas con desarrollo intermedio, y cuyo tamaño de concha promedio por capsula, varío entre 810 ± 65 µm y 904 ± 115 µm (n = 5 capsulas) (Tabla 1). Sin embargo, en larvas veligeras menos desarrolladas cuyo tamaño promedio por capsula, fluctuó entre 502 ± 30 µm y 593 ± 71 µm, no se identificó la presencia de rádula (n = 4 capsulas). 59

Tomando en cuenta los tamaños embrionarios (larvas veligeras y juveniles) en los cuales fue posible identificar rádula, el análisis de regresión lineal indica que la variación en los tamaños de la rádula es explicado en un 82% por el tamaño de la concha de las larvas y 2 juveniles pre-eclosión (R = 0.82, Anova: F1,7 = 32.82, p < 0.001, Fig. 2). Sin embargo, el ancho radular promedio observado en larvas y juveniles pre-eclosión depende solo en un 2 33% de la longitud promedio de su concha (R = 0.33, Anova: F1,7 = 3.56, p < 0.101, Tabla 1).

1.2- Efecto radular embrionario.

Considerando las dimensiones (largo y ancho) de las rádulas identificadas en larvas veligeras, no se observó daño atribuible a la acción radular de éstas, sobre la zona interna de apertura capsular, en capsulas con embriones con desarrollo intermedio (Fig. 3), con desarrollo avanzado (Fig. 4), ni en capsulas recientemente eclosionadas (Fig. 5).

1.3- Efecto radular materno.

Hembras con una longitud de concha promedio de 26 ± 5.8 mm, poseen una longitud radular de 2.3 ± 0.5 mm y un ancho radular de 0.47 ± 0.06 mm. Considerando las dimensiones de la rádula observada en las hembras, no se identificó, en la zona de eclosión por el lado externo de la capsula, daño atribuible a ramoneo por parte de la hembra incubante en capsulas con nivel de desarrollo embrionario avanzado (Fig. 6 A, B), ni tampoco en capsulas ya eclosionadas (Fig. 6 C, D).

2) Acción osmótica como mecanismo de eclosión.

2.1- Concentración osmótica de capsulas con diferentes niveles de desarrollo.

Se identificó una disminución de la osmolalidad (MOsm Kg-1) al interior de las capsulas, a medida que avanzó el desarrollo de los embriones (Fig. 7A). La concentración osmótica del fluido capsular en estadios encapsulados avanzados (juveniles pre-eclosión) disminuyó significativamente respecto del fluido de capsulas con menor desarrollo (Anova

1 vía: F3,74 = 14.770, p < 0.001. Fig. 7B). El fluido intracapsular en capsulas con desarrollo avanzado, cercano a la eclosión, presentó una concentración osmótica similar al agua de mar. Sin embargo, la osmolalidad del fluido de capsulas con desarrollo embrionario inicial e intermedio, fue significativamente mayor que la osmolalidad del agua de mar (Fig. 7B).

2.2- Contenido del fluido intracapsular a través del desarrollo encapsulado.

El contenido de líquido al interior de las capsulas varío significativamente entre capsulas con diferente nivel de desarrollo embrionario (Anova 1 vía: F2,48 = 15.6793, p < 0.001, Fig. 8). El peso promedio del contenido del fluido de capsulas con desarrollo intermedio (8.78 ± 1.9 mg) fue mayor en un 68% respecto del observado en capsulas con desarrollo inicial (5.1 ± 1.3 mg). Sin embargo, en capsulas con desarrollo embrionario avanzado, el contenido de fluido disminuyó (6.5 ± 1.9 mg), con una reducción de 25% respecto del peso de fluído identificado en capsulas con desarrollo intermedio.

2.3- Ingreso de agua en capsulas con diferentes niveles de desarrollo.

Transcurridas las 24 horas de exposición, ninguna de las capsulas presentó apertura en la zona de eclosión ni ruptura de la pared, independiente de la salinidad del agua a la cual fueron expuestas. Sin embargo, se observó mortalidad total de los embriones al interior de aquellas capsulas expuestas a las salinidades más bajas (10 psu y agua destilada). Se 61

observó un efecto significativo del estado de desarrollo embrionario (inicial, intermedio y avanzado), sobre el porcentaje de agua ingresada a la capsula respecto del peso inicial

(Anova de 2 vías: Estado desarrollo: F2,24 = 7.24, p = 0.003, Fig. 9). Capsulas con estadio de desarrollo intermedio presentaron mayor porcentaje de agua ingresada (14.84 ± 13.22 % media ± DS) en comparación con las capsulas con desarrollo inicial (5.28 ± 6.04 % media ± DS) y avanzado (3.91 ± 3.61 % media ± DS), independiente de la salinidad a la cual fueron sometidas. Sin embargo, capsulas expuestas a bajas salinidades presentaron un notorio aumento, aunque estadísticamente no significativo, en el porcentaje de ingreso de agua (agua destilada: 11.16 ± 10.87 %; 10 psu: 12.47 ± 13.73 % media ± DS, Fig. 9), en contraste a las capsulas mantenidas en salinidades mayores (20 psu: 4.66 ± 5.90 % media ± DS; 32 psu: 3.76 ± 2.64 % media ± DS, Fig. 9), independiente del nivel de desarrollo embrionario.

2.4- Concentración de calcio en el fluido intracapsular.

Una disminución significativa de la concentración de calcio se observó en el fluido intracapsular de capsulas con desarrollo embrionario intermedio (7.505 ± 0.34 mmol L-1, media ± SD) y avanzado (7.309 ± 0.33 mmol L-1, media ± SD), respecto del fluido de -1 capsulas con desarrollo inicial (8.158 ± 0.72 mmol L , media ± SD) (Anova 1 vía: F3,30 = 7.16, p < 0.000, Fig. 10). La concentración promedio de calcio en el fluido de las capsulas con desarrollo intermedio y avanzado fue similar a la concentración de calcio presente en el agua de mar (6.916 ± 0.43 mmol L-1, media ± SD).

2.5- Elementos químicos en el fluido intracapsular.

Se identificaron 6 elementos principales en el fluido intracapsular en todas las capsulas, independiente del nivel de desarrollo embrionario. Estos elementos correspondieron a cloro, calcio, sodio, potasio, magnesio y azufre. Estos elementos también estuvieron presentes en el agua de mar. La participación del Cl superó el 67%, sin variar 62

significativamente entre el fluido de capsulas con distinto nivel de desarrollo embrionario ni en el agua de mar (Anova 1 vía: F3,4 = 3.67, p = 0.12, Fig. 11). Sin embargo, el porcentaje de Ca del fluido proveniente de capsulas en estadío intermedio, fue mayor en un promedio de 34% respecto de lo registrado en el fluído de los demás estadíos, y en un 20% respecto del registrado en el agua de mar (Anova 1 vía: F3,4 = 22.25, p = 0.005, Fig. 11). Por su parte, el Na aumentó significativamente su participación porcentual en el fluido intracapsular de estadios intermedio y final, respecto del porcentaje observado en el agua de mar (Anova 1 vía: F3,4 = 10.76, p = 0.02, Fig. 11). De forma contraria, el K disminuyó significativamente su importancia porcentual en el fluido intracapsular de los estadíos intermedio y final, respecto de lo registrado en el agua de mar (Anova 1 vía: F3,4 = 14.61, p = 0.012, Fig. 11). El porcentaje de Mg presente en el agua de mar fue significativamente mayor que lo observado en el fluido de todos los estadíos de desarrollo (Anova 1 vía: F3,4 = 28.53, p = 0.003, Fig. 11). Por su parte, el S disminuyó significativamente en el fluido de capsulas con desarrollo intermedio y final, respecto de aquellas con desarrollo inicial y el agua de mar (Anova 1 vía: F3,4 = 22.66, p = 0.005, Fig. 11).

DISCUSIÓN

La hembra incubante de C. dilatata no participa del proceso de eclosión embrionario, al menos mediante la utilización directa de su rádula. Esto se corrobora por la ausencia de huellas de ramoneo atribuibles a la acción radular de la hembra sobre la zona de eclosión, en la pared externa de la capsula y para ninguno de los diferentes estadios de desarrollo embrionario. No obstante lo anterior, es posible que la presencia física de la hembra sobre las capsulas, podría tener algún rol en la sincronización de la eclosión, permitiendo que la apertura capsular ocurra dentro de un rango de tiempo limitado. Así por ejemplo, en el cangrejo estuarino Sesarma haematocheir se observó una mayor sincronización en el proceso de eclosión cuando los embriones estaban siendo incubados 63

por la hembra, que cuando ellos estuvieron excluidos de la protección materna (Saigusa, 2000).

Por otra parte, se ha descrito la existencia de especies donde se ha identificado participación parental directa en el proceso de apertura capsular (Lesoway et al., 2014, Oyarzun and Strathmann, 2011). En el caso específico de los Calyptraeideos, se ha identificado que en la especie Crepidula navicella, la hembra incubante es la responsable de la apertura capsular y posterior liberación de la progenie (Lesoway et al., 2014). El hecho de que la hembra de C. dilatata no utilice la rádula para abrir las capsulas, y que éstas puedan llevar a cabo la eclosión sin la presencia materna, permite sugerir que la eclosión podría estar manejada desde el interior de la capsula. Uno de los mecanismos gatillantes de la eclosión, y que puede actuar directamente sobre la apertura capsular, es el uso, por parte de los embriones avanzados pre-eclosión, de estructuras tales como la ciliatura velar de las veligeras o de la rádula de juveniles pre-eclosión. Esta acción física se realizaría sobre la zona de eclosión, mediante la disgregación o el ramoneo del área de apertura capsular, de manera de permitir la posterior salida de la progenie (Bigatti et al., 2014, Leiva et al., 1998, Smith and Thatje, 2013). En el gastrópodo Volutidae Odontocymbiola magellanica, se identificó la acción radular de los juveniles, como mecanismo de eclosión desde la capsula. En esta especie fueron evidentes los rastros del ramoneo dejados por los juveniles en la zona de eclosión (Bigatti et al., 2014). Contrariamente, en el caso de C. dilatata, el análisis de microscopia electrónica de barrido sobre la pared interna, en la zona de eclosión de las capsulas, permitió descartar la participación directa de la rádula de los juveniles pre-eclosión, ya que no se observó evidencia de ramoneo sobre ella, a pesar de que la rádula está presente en la progenie encapsulada desde antes que ocurra el proceso de metamorfosis.

De acuerdo a nuestros resultados, los cambios en la concentración osmótica del fluido intracapsular, a través del desarrollo de C. dilatata, por sí solos, no tendrían el efecto suficiente para abrir la capsula, y permitir la salida de los juveniles. Esto quedó demostrado 64

en los experimentos, donde las capsulas que fueron expuestas a diferentes salinidades, a pesar de que sufrieron un fuerte ingreso de agua hacia el interior (hasta un 15 % del fluido inicial), esto no fue suficiente para generar la apertura de la zona de eclosión capsular. En el ambiente natural, es poco probable que las capsulas incubadas permanezcan expuestas a salinidades menores a 22 psu, ya que a esta salinidad la hembra incubante, se aisla del exterior y deja de bombear agua hacia la cavidad paleal, lugar donde mantiene los embriones encapsulados (Chaparro et al., 2008a, Chaparro et al., 2008b). Por lo tanto, si las capsulas no se abrieron, al ser expuestas a bajas salinidades en condiciones de laboratorio, (menores a 22 psu), las posibilidades de que el ingreso excesivo de agua pueda abrir la capsula en condiciones naturales, parece muy improbable. A diferencia de lo anterior, en crustaceos de agua dulce se ha observado que la eclosión es osmóticamente regulada, ya que la expansión de la membrana interna ocurre debido al ingreso de agua al interior del huevo (Davis, 1959, 1964, Marshall and Orr, 1954). Este proceso ha sido registrado en varias especies de copépodos de agua dulce, donde el ingreso de agua al huevo, hace que la membrana interna aumente más de dos veces su volumen inicial. Esto a su vez, hace que aumente la presión sobre la membrana externa la cual termina por romperse, permitiendo finalmente la eclosión de la larva nauplio (Davis, 1959). Diferencias en la concentración osmótica, entre el fluido del huevo donde permanecen los embriones y el medio externo, también han sido identificadas en diferentes especies de crustáceos intermareales. En éstos se ha observado una mayor concentración osmótica al interior del huevo respecto del medio externo, niveles que son mantenidos a través de gran parte del desarrollo embrionario, hasta que ocurre el proceso de eclosión (Seneviratna and Taylor, 2006, Taylor and Seneviratna, 2005).

Por su parte, Maeda-Martínez (2008) describió diferencias en la concentración osmótica entre el fluido intracapsular y el agua de mar, en el caso del gastrópodo Calyptraeideo Crepidula fornicata, y al igual que en C. dilatata, identificó una disminución de la osmolalidad en las capsulas con juveniles pre-eclosión, terminando por igualar la concentración osmótica del agua de mar. Lo anterior, hace evidente que la disminución de 65

la osmolalidad en C. dilatata, podría ser consecuencia de un fuerte ingreso de agua de mar hacia el interior de la capsula, facilitado a su vez, por la disminución del espesor de la pared capsular que ocurre hacia el final del desarrollo encapsulado (Maeda-Martínez, 2008). Existe amplia evidencia en especies de gastropodos encapsuladores que a medida que avanza el desarrollo embrionario ocurre un desgaste de la capa interna de la pared capsular (Brante, 2006, Brante et al., 2008, Hawkins and Hutchinson, 1988, Ojeda and Chaparro, 2003, Zabala et al., 2015). En C. dilatata también se ha registrado esta situación, donde la capa interna de la pared en capsulas con desarrollo intermedio (conteniendo veligeras) disminuye en aproximadamente un 50% respecto del grosor observado en capsulas con desarrollo inicial (conteniendo trocoforas) (Segura et al., 2010).

De acuerdo a nuestros resultados, capsulas con desarrollo intermedio presentaron una mayor cantidad de fluido intracapsular que capsulas iniciales, lo cual coincide con el adelgazamiento de la pared interna capsular descrita por Segura et al. (2010). Esta disminución de la pared podría permitir un mayor ingreso de agua hacia el interior de la capsula, corroborando la información obtenida desde capsulas expuestas a bajas salinidades, donde el mayor porcentaje de agua ingresado hacia la capsula fue registrado también en capsulas con presencia de larvas veligeras. No obstante, la disminución en la cantidad de fluido intracapsular y el porcentaje de agua ingresado, en capsulas con desarrollo avanzado, respecto de lo registrado en capsulas con desarrollo intermedio, podría estar relacionada al aumento en biomasa embrionaria, debido al crecimiento de la progenie encapsulada, con lo cual disminuiría el espacio disponible para un ingreso mayor de agua. Por otra parte, la mayor concentración osmótica registrada al comienzo del desarrollo intracapsular, podría indicar que al inicio del desarrollo embrionario, existe una alta concentración de iones, que serían retenidos en el interior, gracias a la baja permeabilidad de la pared a estos iones y a grandes moléculas, pero que permite el ingreso de agua, oxígeno y pequeñas moléculas orgánicas (Brante, 2006, Brante et al., 2008, Leroy et al., 2012, Maeda-Martínez, 2008, Pechenik, 1982, 1983). En el calyptraeideo Crepidula fornicata, se identificó que las paredes capsulares son impermeables al ingreso de calcio 66

extracapsular durante el desarrollo embrionario inicial (Maeda-Martínez, 2008). Sin embargo, Taylor (1973), describió para gastropodos de agua dulce una gran permeabilidad de la pared en capsulas con desarrollo inicial (pre-gastrula). En el caso de C. dilatata, la alta osmolalidad inicial podría ser mantenida hasta el estado de desarrollo intermedio, momento en el cual, si bien hay una disminución en el espesor de la pared y un aumento en la permeabilidad capsular (Segura et al., 2010), la capsula continuaría siendo impermeable a la salida de ciertos iones y moléculas contenidos en el interior.

No obstante, al final del desarrollo embrionario, la concentración osmótica del fluido intracapsular se iguala a la osmolalidad del agua de mar. Esta situación puede estar relacionada a la disminución del espesor de la pared interna identificada en capsulas con desarrollo avanzado (conteniendo juveniles pre-eclosión) respecto de capsulas con desarrollo de veligeras (Segura et al., 2010), lo cual puede tener efectos en la salida de solutos desde la capsula (desechos por ejemplo) o en la entrada de agua, ya que el grosor de la pared podría estar relacionado a la velocidad de cambio osmótico (Pechenik, 1982).

La pared capsular constituye una membrana compleja, que actúa de forma selectiva en el transporte de solutos y que cambia su permeabilidad a través del desarrollo embrionario. Cambios observados en la proporción de la mayoría de los elementos presentes en el fluído intracapsular de C. dilatata, a través del desarrollo, dan cuenta de la dinámica estructural de la pared capsular. El calcio es uno de los iones más importantes durante la ontogenia temprana en gastrópodos, ya que su presencia, no solo es importante para la formación de la concha de los embriones, sino que también ha sido descrito como un componente indispensable en la regulación de la actividad muscular de algunos moluscos (Kendrick-Jones et al., 1970, Rüegg, 2012, Shumway and Parsons, 2011, Twarog, 1967, Twarog and Muneoka, 1973). La alta concentración de calcio registrada en el fluído de capsulas con embriones iniciales en C. dilatata, coincide con la alta osmolalidad registrada en esta etapa del desarrollo. Esto permite asumir que al momento de la postura capsular, los embriones serían almacenados junto con un stock de calcio y, 67

posiblemente, un conjunto de otros iones necesarios para el desarrollo embrionario inicial (Ebanks et al., 2010a, Ebanks et al., 2010b, Maeda-Martínez, 2008). La disponibilidad inicial de calcio intracapsular disminuye en los estados de desarrollo embrionarios posteriores, igualándose a la concentración de calcio presente en el agua de mar. Montory et al. (2009) describieron una situación similar para C. dilatata, identificando solo para capsulas con veligeras, concentraciones de calcio similares a la presentes en el agua de mar. La disminución del calcio en el fluido de capsulas con etapas de desarrollo más avanzadas (veliger a juvenil pre-eclosión), puede deberse al uso del calcio intracapsular almacenado al momento de la postura. El posterior adelgazamiento de la pared capsular podría permitir el ingreso de nuevo calcio desde el medio externo, con lo cual los embriones podrían continuar con el proceso de calcificación y usar este ion en otros procesos fisiológicos que dependen de su presencia. Una situación similar ha sido descrita en el gastrópodo de agua dulce Lymnaea stagnalis, donde el stock de calcio depositado por la hembra dentro de las capsulas al momento de la postura, es usado totalmente por los embriones antes del proceso de eclosión, adquiriendo el calcio faltante desde el agua circundante, utilizando el bicarbonato producido endógenamente para mantener las condiciones de alcalinidad necesarios para una calcificación exitosa hasta el momento en que ocurre la eclosión (Ebanks et al., 2010b). Por otra parte, en el gastropodo Odontocymbiola magellanica, cuya capsula es de conformación calcárea, la concentración de calcio en el fluido intracapsular no varía a través del desarrollo embrionario, probablemente debido al aporte de calcio presente en la pared capsular (Bigatti et al., 2014).

En conclusión, la acción radular materna no tiene una participación activa como mecanismo de eclosión capsular. Igualmente, es posible excluir la acción radular embrionaria como mecanismo de apertura capsular. A pesar de que la rádula está presente desde el estado veliger, no hay evidencias físicas sobre la pared capsular interna que permitan asumir que los juveniles pre-eclosión, la utilizarían para generar la ruptura capsular. Por otro lado, nuestros resultados hacen posible descartar la acción osmótica como probable mecanismo de eclosión. Si bien existen cambios osmóticos entre los 68

primeros estadios de desarrollo (inicial e intermedio) y el medio externo (agua de mar), y con ello, un aumento en el ingreso de líquido hacia la capsula, este mayor volumen intracapsular no es capaz de abrir, por sí solo, el área de eclosión de la capsula. Sin embargo, no es posible descartar por completo la acción osmótica, ya que esta podría conjugarse con otros mecanismos y actuar en conjunto, por ejemplo, con una posible acción bioquímica. Complementando lo anterior, las variaciones de salinidad que ocurren de forma natural en el estuario, podrían jugar un rol importante en los cambios osmóticos intracapsulares, considerando que la salidad en un ciclo mareal en la época estival, puede fluctuar fácilmente entre 25 y 32 psu (Chaparro et al. 2008). El rol real de estos cambios deberían ser parte de fuuros estudios.

AGRADECIMIENTOS

Los autores dan las gracias a la Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica-Chile (CONICYT- Chile) por la beca de Doctorado Nacional 21120654 otorgada a PA-V y al Fondo Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (FONDECYT-Chile) 1141052 otorgada a ORC.

TABLAS

Tabla 1. Crepipatella dilatata. Promedio de la longitud de concha de juveniles pre- eclosión (n = 4 capsulas), larvas veligeras (n = 5 capsulas) y larvas veligeras donde no se identificó la presencia de rádula (n = 4 capsulas), y tamaño promedio de sus respectivas rádulas. Valores promedio ± desviación estandar.

Nivel de Longitud de Longitud de Ancho de N° total de desarrollo concha (µm) rádula (µm) rádula (µm) larvas-juveniles

Larvas veligeras 52 558.39 ± 41.7 sin rádula - -

Larvas veligeras 865.49 ± 35.6 63.33 ± 5.9 33.78 ± 10.1 23

Juveniles pre- 42 1087.66 ± 94.9 107.36 ± 29.8 0.88 ± 8.5 eclosión

FIGURAS

Fig. 1 Crepipatella dilatata. A) Rádula de juvenil pre-eclosión provenientes desde capsulas con desarrollo embrionario en estadío avanzado. B) Juveniles pre-eclosión.

180 Juveniles 160 Veligers Veligers without radula 140

120 RL= -113.271 + 0.203 * SL 100 R2= 0.82 p< 0.001 80

Mean radula (µm) Mean length 20

400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 Mean shell length (µm)

2D Graph 1

Fig. 2 Crepipatella180 dilatata. Relación entre la longitud de concha promedio de larvas y juveniles encapsulados,160 con la longitud de rádula promedio. Círculos negros corresponden a juveniles pre140 -eclosión (n = 42 juveniles en total provenientes de 4 capsulas), círculos grises indican120 larvas veligeras (n = 23 veligeras en total provenientes de 5 capsulas), y círculos blancos100 representa larvas veligeras donde no se observó rádula (n = 52 veligeras provenientes80 de 4 capsulas). Cada capsula proviene de una postura diferente. Lineas

Y Data Y 60 verticales y horizontales indican DE. 40

400 600 800 1000 1200 1400 X Data 72

Fig. 5 Crepipatella dilatata. Microfotografía de MEB en A) Zona de eclosión interna de capsulas eclosionadas. B) zona de eclosión interna maximizada de acuerdo a Fig.5 A. HZ indica zona de eclosión. Ancho de rádula de juveniles corresponde a 40 µm.

1400 A)

1300 Initial Development Intermediate Development ) Final development

-1

1200

1100

1000

Osmolality (MOsm Kg (MOsm Osmolality

900

800 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Embryos Shell Length (µm) 1400 B)

1200 a a

)

-1 b 1000 b

800

600

400

Osmolality (MOsm Kg (MOsm Osmolality

200

0 Initial Intermediate Final Sea water Level of Development

Fig. 7 Crepipatella dilatata. A) Concentración osmótica del fluido obtenido de capsulas con diferentes niveles de desarrollo de los embriones encapsulados. Lineas vericales sobre barras indican desviación estandar. B) Osmolalidad promedio registrada en el fluido de capsulas con diferentes estadíos de desarrollo embrionario y en el agua de mar. Lineas 77

sobre barras indican desviación estandar. Diferentes letras indican diferencias significativas.

12 b

10 a

) -1 a

(mg capsule 4

Mean weight of intracapsular fluid

0 Initial Intermediate Final Level of development

Fig. 8 Crepipatella dilatata. Variación del peso del fluido intracapsular a través del desarrollo embrionario, incluyendo capsulas con desarrollo inicial (n = 15), intermedio (n = 17) y avanzado (n = 19). Lineas sobre barras indican DE. Letras diferentes indican diferencias significativas.

50 32 psu b 45 20 psu 10 psu a 40 Distilled water

25 a 20

Water influx (%) influx Water 15

0 Initial Intermediate Final Level of development

Fig. 9 Crepipatella dilatata. Ingreso promedio de agua en capsulas con diferente nivel de desarrollo embrionario y expuestas a diferentes condiciones de salinidad. Lineas verticales sobre barras indican desviación estandar. Diferentes letras indican diferencias significativas entre los diferentes estados de desarrollo embrionario intracapsular.

10 a

)

-1 b b 8 b

Calcium L concentration (mmol

0 Initial Intermediate Final Sea water Level of development

Fig. 10. Crepipatella dilatata. Calcio disuelto en el fluido intracapsular a través del desarrollo embrionario. Agua de mar usada como control. Lineas verticales sobre barras indican desviación estandar. Letras indican diferencias significativas.

120

100 Ca

60 Cl

Porcentaje (%) Porcentaje 40

K 20 S Mg Na 0 Early Intermediate Advanced Seawater Level of development

REFERENCIAS

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CAPITULO 3

ACCIÓN ENZIMÁTICA INTRACAPSULAR COMO MECANISMO DE ECLOSIÓN EN EL GASTRÓPODO INCUBADOR Crepipatella dilatata

RESUMEN

Entre los mecanismos de eclosión identificados en los invertebrados marinos, la eclosión provocada por actividad enzimatica, es la más frecuente. En especies donde la eclosión implica abandonar estructuras secundarias como masas gelatinosas o capsulas, la acción bioquímica como mecanismo de eclosión no ha sido muy abordado. El objetivo de este trabajo es determinar, en el gastrópodo Calyptraeideo Crepipatella dilatata, si la eclosión de los juveniles desde las capsulas, ocurre gatillada por un mecanismo de tipo bioquímico, especificamente por actividad de proteasas. Desde capsulas de C. dilatata, en estadíos de desarrollo intermedio y final, se extrajo el fluído intracapsular y se cuantificó la actividad proteolítica total y las proteínas totales. También se realizaron experimentos para probar si la “sustancia de eclosión” actúa desde el interior de la capsula. Nuestros resultados, indican la presencia de una “sustancia de eclosión”, relacionada a la presencia de los juveniles pre-hatching, capaz de abrir la capsula por la zona de eclosión, y que actúa 90

sólo desde el interior de la capsula. Esta información concuerda con la actividad proteolítica total identificada en el fluído intracapsular, que se observa en los estadios de desarrollo embrionario considerados en este trabajo, y que se duplica en el fluído de capsulas con desarrollo avanzado conteniendo juveniles pre-eclosión. Esta actividad proteolítica observada en el fluído intracapsular es sintetizada por los juveniles pre-eclosión que se encuentran al interior de la capsula. La acción proteolítica en la eclosión, se asocia a la composición bioquímica de la capsula, compuesta mayoritariamente por proteínas (básicas y ácidas). En resumen, la eclosión en C. dilatata está gatillada por enzimas proteolíticas sintetizadas por los juveniles, al interior de capsulas con desarrollo terminal, que son capaces de actuar sobre la zona específica de apertura capsular.

KEY WORDS: hatching, biochemical mechanism, capsule, gastropod

INTRODUCCIÓN

El proceso de eclosión en gastropodos con desarrollo embrionario al interior de masas gelatinosas o capsulas, incluye la salida de larvas (desarrollo mixto) o juveniles (desarrollo directo) hacia el ambiente externo. Estas estructuras envolventes suelen ser consideradas como protectoras durante la ontogenia temprana de los invertebrados (Pechenik, 1979, 1982; Purchon, 1977). La eclosión implica la existencia de una progenie preparada morfológica y fisiológicamente para abandonar la protección capsular, momento que ha sido descrito como una compleja etapa de transición entre estados de desarrollo dentro del ciclo de vida de un organismo (Warkentin, 2011a). Sin embargo, el ´timing´ de eclosión puede variar dentro de posturas de una misma especie e incluso entre posturas de un mismo individuo (Warkentin, 2011a, 2011b). La salida anticipada o retrasada de los embriones desde sus estructuras protectoras, puede estar inducida por factores ambientales de tipo biótico tales como presencia de congéneres, depredadores o alimento (Branscomb et 91

al., 2014; Miner et al., 2010; Oyarzun and Strathmann, 2011; Strathmann et al., 2010) y/o por factores abióticos como cambios en la temperatura, salinidad o luz ambiental (Armstrong et al., 2013; Collin et al., 2016; Gallardo and Cancino, 2009; Oyarzun and Strathmann, 2011; Şen, 2005). Muchas veces, cuando hay presencia de cuidado materno, la respuesta a estos inductores o controladores del proceso de eclosión, es llevada a cabo por la hembra (Lesoway et al., 2014; Oyarzun and Brante, 2015; Oyarzun and Strathmann, 2011). Sin embargo, en especies sin cuidado parental, la eclosión debería ocurrir cuando los embriones encapsulados estén preparados morfológica y fisiológicamente para la eclosión, o cuando reciban estímulos que reflejen un ambiente externo favorable para la salida (Branscomb et al., 2014; Miner et al., 2010). Lo anterior, implica que cuando los embriones son los encargados del proceso de hatching, ellos deben utilizar algún mecanismo de eclosión eficiente, que les permita la apertura de la capsula o estructura envolvente.

Entre los mecanismos asociados a la eclosión, la acción bioquímica, ha sido frecuentemente mencionada como uno de los principales controladores de este proceso en invertebrados marinos (De Vries and Forward, 1991; Fan et al., 2010; Hancock, 1956; Hawkins and Hutchinson, 1988; Li and Kim, 2013; Sullivan and Bonar, 1985; Sullivan and Maugel, 1984; Takeuchi et al., 1979). En gastropodos marinos con presencia de estructuras protectoras, se ha sugerido la participación de enzimas con una posible acción proteolítica, provenientes de embriones en estado avanzado, específicamente de larvas (desarrollo mixto) o juveniles (desarrollo directo) en estadio pre-eclosión, lo cual permitiría la apertura de la capsula o estructura envolvente, y con ello la liberación de la progenie (Gallardo et al., 2013; Pechenik, 1975; Sullivan and Bonar, 1985). La efectividad de estas enzimas proteolíticas, estaría directamente relacionada con la composición bioquímica de las capsulas, debido a su alto contenido proteíco (Chaparro and Flores, 2002; Ojeda and Chaparro, 2003; Sullivan and Maugel, 1984). Lo anterior, ha sido registrado en el gastropodo encapsulador, sin cuidado parental, Ilyanassa obsoleta donde el tapón capsular está compuesto por tres glicoproteínas mayores, las cuales sufren la acción degradante de 92

una ´sustancia´ producida por los embriones en estadios de desarrollo avanzado (Sullivan and Maugel, 1984). Se ha descrito que las capsulas tienen una conformación multilaminar, logrando diferenciarse al menos, una capa interna gruesa, de consistencia esponjosa, y una capa externa delgada de consistencia dura-fibrosa (Brante et al., 2008; Hancock, 1956; Hawkins and Hutchinson; 1988, Ojeda and Chaparro, 2003; Segura et al., 2010; Sullivan and Maugel, 1984). En las capsulas, se identifica además, una zona de eclosión, descrita como un cierre, que recorre una parte importante de la capsula (Averbuj and Penchaszadeh, 2010; Ojeda and Chaparro, 2003) ó un tapón mucoso (Pastorino et al., 2007; Pechenik, 1975), ambos ubicados en la zona apical de la capsula. La degradación del tapón capsular podría ser un proceso muy rápido, el cual respondería a pulsos en la producción de enzimas proteolíticas (Pechenik, 1975). No obstante lo anterior, también se ha descrito una degradación gradual del área de eclosion, a través del tiempo de desarrollo de los embriones (Hancock, 1956).

La zona de eclosión capsular, por su lado interno, se encuentra en contacto directo con el fluido intracapsular que baña a los embriones. En investigaciones previas, se ha descrito presencia de proteínas, lípidos y carbohidratos en el fluído intracapsular de diferentes especies de gastrópodos (Bigatti et al., 2014; Ojeda and Chaparro, 2003; Penchaszadeh and Miloslavich, 2001; Stöckmann-Bosbach and Althoff, 1989) . En el calyptraeideo C. fecunda, Ojeda and Chaparro (2003) identificaron disminución de la concentración de proteínas totales presentes en el fluído intracapsular, a medida que el desarrollo embrionario-larval avanzo. Sin embargo información sobre actividad enzimática es escasa.

En el gastropodo C. dilatata, los embriones se desarrollan al interior de capsulas que son mantenidas en la cavidad paleal de la hembra hasta que el proceso de eclosión ocurre. Desde las cápsulas, emergen pequeños juveniles, que reclutan inmediatamente al bentos (Collin, 2003; Chaparro et al., 2008; Chaparro et al., 1999), en las cercanías de la madre. Este desarrollo directo, se consigue gracias a que en el interior de las capsulas, la madre 93

hace disponible huevos nutricios que son consumidos por la progenie. Esta situación permite el desarrollo ontogenético temprano dentro de las capsulas, donde además se lleva a cabo la metamorfosis, la que da origen a juveniles suficientemente desarrollados como para abandonar la capsula en forma exitosa (Chaparro and Pascke, 1990; Gallardo and Garrido, 1987). La capsula de C. dilatata es de forma triangular, y posee una zona de eclosión diferenciada como un cierre sobre la zona apical (Chaparro et al., 2008). Cada postura, adherida a sustrato duro (ej. rocas o conchas de moluscos), posee en promedio un total de 20 capsulas (Chaparro et al., 1999; Gallardo, 1979). La pared capsular está conformada por dos capas, una capa externa delgada pero de consistencia firme, que mantiene sus características durante todo el desarrollo, y una capa interna de consistencia blanda, cuyo grosor va disminuyendo a medida que el desarrollo embrionario avanza (Segura et al., 2010). De acuerdo a Chaparro et al. (2012), veligeras iniciales encapsuladas presentan alto contenido de lípidos y proteínas, cuya concentración va en aumento junto con el avance del desarrollo embrionario hasta que ocurre la metamorfosis. Los mismos autores identificaron una pequeña disminución en el contenido de proteínas totales en los juveniles pre-eclosión, al final del periodo de encapsulación, entre el proceso de la metamorfosis y la eclosión. No obstante, información sobre acción enzimatica, asociada al proceso de eclosión para esta especie, no existe.

En consideración a los antecedentes mencionados, el objetivo principal de este trabajo es identificar, en el gastrópodo incubador Crepipatella dilatata, una posible acción proteolítica, de origen intracapsular, sobre la zona de apertura capsular durante el proceso de eclosión, sin la presencia materna. También determinar si esta actividad enzimática es producida por los embriones durante el desarrollo intracapsular, ó en algún momento específico de su ontogenia temprana al interior de la capsula.

METODOLOGÍA

1.- Colecta y mantención del material de estudio.

Ejemplares adultos de Crepipatella dilatata fueron obtenidos desde el Estuario Quempillén, Ancud, Isla de Chiloé (41° 52’ S, 73° 46’ W), durante la temporada de incubacion en primavera-verano (noviembre - enero). Una vez colectados, los especímenes fueron trasladados hasta la Universidad Austral de Chile. En el laboratorio fueron mantenidos, por no más de 5 días, en acuarios con agua de mar filtrada (1 µm), esterilizada (UV) y con aireación constante. Se realizó recambio de agua diariamente y fueron alimentados ad libitum con una dieta pura de microalga Isochrysis galbana.

2.- Selección de capsulas.

Para la obtención de las posturas, se procedió a desprender cuidadosamente los adultos de C. dilatata desde el sustrato al cual estaban adheridos (rocas, conchas). Cada postura, fue clasificada dentro de una categoría de desarrollo pre-establecido: desarrollo inicial (solo presencia de huevos en el interior de las cápsulas), desarrollo intermedio (presencia de veligeras y huevos nutricios) y desarrollo final (presencia de juveniles avanzados pre-eclosión, ´listos para eclosionar´). Las capsulas son transparentes, por lo cual fue posible observar el interior sin abrirlas. La identificación del nivel de desarrollo se realizó, observando directamente las capsulas bajo una lupa estereoscópica Olympus SZ51 con magnificación de 1.5.

3.- Actividad enzimática intracapsular.

Para identificar una posible acción enzimática generada por juveniles pre-eclosión sobre la zona de eclosión, capsulas en estado inicial (n = 8) fueron abiertas cuidadosamente por la zona cercana al pedúnculo (dejando intacta la zona de eclosión). Las capsulas fueron 95

vaciadas del contenido embrionario. Luego, cada capsula vacía fue mantenida junto con un grupo de juveniles pre-eclosión (n = 15 juveniles por capsula) excapsulados previamente, en pequeños recipientes (microplacas) con un volumen de agua de mar filtrada (UV) de aproximadamente 100 µl, durante 24 horas. Como control se utilizaron tres capsulas enteras (no abiertas) con desarrollo inicial, las que también fueron mantenidas con el mismo número de juveniles pre-eclosión, excapsulados manualmente. También se realizó un segundo control para identificar una posible acción de microorganismos (ej. bacterias y hongos) sobre la zona de eclosión, para lo cual seis capsulas con desarrollo inicial, vaciadas previamente, fueron mantenidas individualmente, solo con agua de mar. Transcurrido el período de exposición, las capsulas, abiertas y cerradas, fueron observadas bajo el estereomicroscopio para identificar la condición de la zona de eclosión capsular (abierta o cerrada).

4.- Obtención del fluído intracapsular en capsulas con diferentes niveles de desarrollo embrionario.

Para cuantificar proteínas totales y actividad proteolítica total, se separaron posturas con capsulas en los niveles de desarrollo más avanzados (intermedio y final). Se utilizaron, 10 posturas con desarrollo intermedio y 6 posturas con desarrollo final. Cada capsula, de cada postura, fue previamente secada con papel absorvente, para eliminar cualquier rastro de agua adherida a las paredes externas. Luego, en frío y bajo la lupa estereoscópica con aumento de 20X, se procedió a extraer cuidadosamente el fluído intracapsular desde el interior de cada capsula utilizando una jeringa de 1 ml. Una vez obtenido el fluído intracapsular de cada postura, este fue almacenado separadamente a -80°C hasta su posterior análisis.

5.- Procesamiento de embriones encapsulados para cuantificación de proteínas totales y actividad proteolítica.

Posturas con desarrollo intermedio (n = 9) y desarrollo final (n = 8), fueron usadas para cuantificar proteínas totales y actividad de proteasas totales en los embriones encapsulados. Las capsulas fueron diseccionadas bajo un estereomicroscopio (20X). En las posturas con desarrollo intermedio, solo se utilizaron las larvas veligeras excluyendo los huevos nutricios remanentes, y en las posturas con capsulas avanzadas pre-eclosión, se utilizaron solo juveniles. En todas las capsulas el material embrionario fue separado del fluido intracapsular. Cada muestra embrionaria fue puesta en buffer fosfato y homogenizada utilizando un sonicador ultrasónico, durante aproximadamente 1 minuto, para facilitar la ruptura celular. Durante este procedimiento, las muestras fueron mantenidas en hielo. El volumen de buffer fosfato en el cual fue homogenizada la muestra, se determinó de acuerdo al peso de la muestra, que fue previamente obtenido utilizando una microbalanza (0.00000g). Cada muestra fue homogenizada en 10 volumenes de buffer trizma [50 mmolar], pH 6.9 (Santa Cruz, biotechnology lab), y posteriormente fueron centrifugadas a 20000 rpm, durante 30 minutos a 4°C, de acuerdo a Vargas-Chacoff et al. (2014). Luego se extrajo el sobrenadante, el cual fue almacenado a -80°C para el posterior análisis de proteasas totales.

6.- Cuantificación de actividad proteolítica total.

Para la cuantificación de la actividad proteolítica total se utilizó, tanto para el análisis del fluído como de los embriones, una modificación del protocolo de Saborowski et al. (2006). Se utilizó buffer trizma [50 mmolar], pH 6.9 (Santa Cruz, biotechnology lab) y caseína al 1% en buffer trizma, como sustrato. El volumen de muestra usado en la lectura de la actividad proteolítica fue de 40 µl. Se utilizaron dos blancos, uno donde se reemplazó la muestra por buffer y el otro donde la muestra fue sustituida por agua desionizada. La lectura se realizó en un lector de microplacas Anthos Zenyth 200 rt, a 280 nm, utilizando el 97

software ADAP donde se dejó consumir el sustrato durante 30 minutos a 37°C. La actividad proteolitíca total fue expresada como actividad específica (U/mg proteín).

7.- Cuantificación de proteínas totales.

Para la cuantificación de proteínas totales, tanto del fluído intracapsular como de los embriones, se utilizó el kit comercial BCA, del laboratorio Pierce. Se utilizaron 10 µl de muestra y para obtener la concentración de proteínas totales se realizó una curva con estandares de albumina (0, 5, 10 y 20 µg/µl). La lectura se realizó a 562 nm en un lector de microplacas Anthos Zenyth 200 rt, después de una incubación de 30 minutos a 37°C.

8.- Histoquímica de pared capsular.

Capsulas en estadios de desarrollo embrionario inicial, intermedio y avanzado, fueron seleccionadas para realizar análisis histoquímicos. Se utilizaron dos capsulas por cada estadio, provenientes de hembras diferentes. Cada capsula fue cuidadosamente abierta por la zona del pedunculo, dejando la zona de eclosión intacta. Las capsulas fueron fijadas en formalina al 7% diluida con agua de mar, durante una semana. Posteriormente, fueron deshidratadas en una batería de alcoholes (50%, 70%, 80%, 90%, 95% y 100%) e incluidas en parafina. Utilizando un micrótomo, se hicieron secciones histológicas de 7 µm de espesor. Las secciones fueron realizadas longitudinalmente, abarcando parte de la zona de eclosión y de la pared capsular.

Los análisis histoquímicos fueron realizados de acuerdo a Ojeda and Chaparro (2003). La tinción de PAS (ácido peryódico de Shiff) fue utilizada para identificar mucopolisacaridos neutros y la tinción con azul de alcián, se utilizó para detectar mucopolisacáridos ácidos. Las proteínas fueron detectadas con hematoxicilina-eosina (hematoxilina identifica proteínas ácidas y la eosina proteínas básicas).

9.- Análisis estadístico.

Diferencias en la concentración de proteasas totales y proteínas totales, entre el fluido intracapsular proveniente de capsulas con diferente nivel de desarrollo embrionario fueron identificadas mediante Anova de 1 vía. El mismo análisis fue utilizado para identificar cambios en el contenido de proteasas totales y proteínas totales entre embriones con diferentes niveles de desarrollo. Datos de actividad proteolítica en el fluido fueron transformados a logaritmo natural para cumplir con los supuestos de homogeneidad de varianza.

Un Anova de dos vías fue realizado para determinar posibles diferencias en la actividad proteolítica total entre los embriones y el fluido intracapsular, a través de los niveles de desarrollo embrionario: intermedio y final.

RESULTADOS

1.- Efectividad de ´sustancia eclosionante´ intracapsular sobre apertura de la capsula.

Un 37% de las capsulas con desarrollo inicial (vaciadas previamente), presentaron apertura total en su zona de eclosión, luego de ser expuestas a la presencia de juveniles en estado pre-eclosión. El 63% restante de las capsulas presentaron un notorio desgaste y debilitamiento del área de eclosión, tanto que al manipularlas durante la observación bajo lupa, se abrieron fácilmente. Capsulas iniciales cerradas (C1: con su contenido intacto mantenidas con juveniles excapsulados) y abiertas (C2: sin su contenido embrionario mantenidas sin juveniles excapsulados) utilizadas como control, no mostraron indicios de debilitamiento ni de eclosión en su zona de apertura capsular (Fig. 1).

2.- Actividad proteolítica total.

La actividad proteolítica cuantificada en el fluído intracapsular aumentó significativamente a través del desarrollo embrionario al interior de la capsula (Anova 1 vía: F1,14 = 6.77, p = 0.02, Fig. 2). El incremento alcanzó niveles mayores al 100% en capsulas con desarrollo embrionario final (24.73 ± 8.5 U mg proteína -1, media ± DS) respecto de la actividad observada en el fluido de capsulas conteniendo veligeras (11.92 ± 4.5 U mg proteína -1). Sin embargo, la actividad proteolítica total encontrada en los embriones, no mostró diferencias significativas entre los diferentes niveles de desarrollo cuantíficados (Anova 1 vía: F1,11 = 2.27, p = 0.15, Fig. 2). No obstante lo anterior, en juveniles pre-eclosión (17.28 ± 3.08 U mg proteína -1) fue posible identificar un leve aumento, pero no significativo, en la actividad proteolítica total promedio, respecto de lo observado en larvas veligeras de capsulas con desarrollo intermedio (14.66 ± 3.17 U mg proteína -1).

El anova de dos vías indica que hay un efecto del estadio de desarrollo embrionario sobre la actividad proteolítica (Anova 2 vías: F1,25 = 6.97, p = 0.01, Fig. 2). Sin embargo la la actividad proteolítica no varía entre el fluido y los embriones (Anova 2 vías: F1,25 = 0.64, p = 0.42) y tampoco existe interacción entre ambos factores (Anova 2 vías: F1,25 = 3.04, p = 0.09).

3.- Cuantificación de proteínas totales.

No se observó cambios significativos de la concentración de proteínas totales en el fluido intracapsular entre los estadios de desarrollo embrionario considerados (Anova 1 vía:

F1,14 = 1.98, p = 0.18, Fig. 3). Sin embargo, se observa una disminución aproximadamente del 40% en la concentración de proteinas totales en el fluido de capsulas con desarrollo embrionario final (1.3 ± 0.8 mg ml-1, media ± DS) respecto del fluido de capsulas conteniendo larvas veligeras (2.1 ± 1.2 mg ml-1). De similar forma, la concentración de 100

proteínas totales en los embriones, tampoco varío significativamente entre veligeras y juveniles pre-eclosión (Anova 1 vía: F1,11 = 1.54, p = 0.24, Fig. 3).

4.- Histoquímica de la capsula.

Los análisis histoquímicos, muestran presencia de mucopolisacáridos neutros y ácidos en la pared capsular, durante todo el desarrollo embrionario. Carbohidratos ácidos son identificados en la capa externa de la capsula (Fig. 4A). Por su parte, la tinción de hematoxilina-eosina permitió diferenciar tres niveles en su composición química y que conforman la pared capsular. Una delgada capa externa (C1), donde se identificaron proteínas ácidas, una segunda capa (C2) de mayor grosor conformada por proteínas básicas y la capa más interna (C3) donde también se observó proteínas ácidas (Fig. 4B). Sin embargo, a través de este análisis histoquímico no fue posible diferenciar la zona de eclosión del resto de la pared capsular.

DISCUSIÓN

La actividad enzimática como mecanismo de eclosión, ha sido descrita en varios invertebrados marinos, particularmente en especies donde el embrión eclosiona directamente desde un huevo (crustáceos: De Vries and Forward, 1991, Fan et al., 2010; equinodermos: Li and Kim 2013, Takeuchi et al., 1979). Sin embargo, en especies donde el embrión (larva-juvenil) emerge desde capsulas, la información de la acción enzimática como responsable de la apertura capsular es escasa, particularmente sobre el tapón o zona de eclosión. De acuerdo a nuestros resultados en el gastropodo C. dilatata, es posible sugerir una participación directa de enzimas proteolíticas sobre la zona de eclosión en capsulas con desarrollo embrionario final. Por una parte, la apertura o debilitamiento de la zona de eclosión, de capsulas con desarrollo inicial, expuestas a la acción de una “sustancia 101

de eclosión” producida por juveniles encapsulados (´listos para eclosionar´), demuestra que efectivamente, la zona de apertura capsular presenta una conformación bioquímica diferente al resto de la capsula, que es susceptible a la acción de enzimas específicas generadas por los juveniles encapsulados. En experimentos similares, Pechenik (1975) identificó una situación equivalente en el gastropodo Nassarius obsoletus, observando la destrucción del tapón capsular en un corto periodo de tiempo (24 hrs).

Por otra parte, nuestros resultados en C. dilatata indican que hay presencia de actividad proteolítica total, tanto en los embriones como en el fluido intracapsular. La actividad de las proteasas del fluido intracapsular cambia a medida que los embriones se desarrollan, llegando a aumentar su actividad en un 100% en el fluido de capsulas con juveniles ´listos para eclosionar´, respecto del fluido proveniente de capsulas con desarrollo intermedio conteniendo larvas veligeras. Considerando que el fluido intracapsular se encuentra en contacto directo con las paredes internas de la capsula, y que el mayor componente bioquímico identificado en las paredes capsulares de diferentes gastropodos corresponde a proteínas (Chaparro and Flores, 2002; Ojeda and Chaparro, 2003; Paschke, 1992; Sullivan and Maugel, 1984), es probable que este notorio aumento de la actividad proteolítica total, en capsulas con juveniles, actúe degradando la zona del cierre capsular, permitiendo finalmente la apertura de la capsula y la salida de los juveniles.

Los análisis histoquímicos de la pared capsular indican presencia de mucopolisacáridos neutros y básicos, en capsulas conteniendo embriones en todos los niveles de desarrollo. Esto, coincide con los resultados obtenidos en la pared capsular de otra especie de Calypatraeideo, C. fecunda (=C. peruviana) donde también se identificaron carbohidratos en la pared de capsulas con desarrollo embrionario temprano, identificandose la presencia de mucopolisacaridos neutros y ácidos (Chaparro and Flores, 2002; Ojeda and Chaparro, 2003). La presencia de proteínas en la pared capsular de C. dilatata, es coincidente con la información disponible respecto de la composición bioquímica capsular de varios gastropodos. En todas ellas, las proteínas son el mayor componente (Chaparro 102

and Flores, 2002; Hawkins and Hutchinson, 1988; Ojeda and Chaparro, 2003; Sullivan and Maugel, 1984). En C. dilatata la tinción de hematoxilina-eosina, permitió observar diferencias en las proteínas de la pared capsular, pudiendo identificarse proteínas ácidas formando una delgada capa externa y otra interna, además se identificaron proteínas básicas conformando una capa intermedia, la cual presentó un mayor grosor. Aunque descripciones previas de la pared capsular, indican que esta conformada por dos capas (Segura et al., 2010), no se ha descrito de forma diferenciada la conformación bioquímica de cada una; de acuerdo a nuestros resultados las proteínas estan presentes en ambas capas. En el gastrópodo Ilyanassa obsoleta, se observó presencia de proteínas básicas en las dos capas más externas de la capsula (Sullivan and Maugel, 1984). Considerando que las proteínas han sido descritas como el mayor componente bioquímico de la pared capsular en calyptraeideos (Chaparro and Flores, 2002; Ojeda and Chaparro, 2003), y que hay una diferenciación de estas proteínas entre las capas que conforman la pared, es posible que la acción de enzimas proteolíticas actúe degradando la zona de eclosión.

Evidencia de actividad proteolítica al interior de las capsulas, ha sido registrada anteriormente en el gastropodo Ilyanassa obsoleta, donde Sullivan and Bonar (1984) identificaron que la liberación de la “sustancia de eclosión” coincidió con la presencia de una alta actividad proteolítica. Actividad de enzimas proteolíticas también ha sido identificada en embriones de crustáceos braquiuros que eclosionan directamente desde el huevo (De Vries and Forward, 1991). En crustáceos submareales la actividad enzimática se evidencia varias horas antes de que ocurra la eclosión, mientras que en los crustáceos inter y supramareales la liberación de enzimas proteolíticas ocurrió muy cercana al proceso de eclosión (De Vries and Forward, 1991). No obstante lo anterior, la presencia de actividad enzimática en crustáceos es coincidente con el periodo cuando ocurre la ruptura de la membrana del huevo (De Vries and Forward, 1991). La actividad proteolítica, responsable de la apertura capsular, probablemente sea especie-especifica, ya que la intensidad y el momento de liberación enzimática varía entre las especies, relacionándose, además con el habitat ocupado por la especie (De Vries and Forward, 1991; Pechenik, 1975). 103

A diferencia del significativo cambio observado en la concentración de proteasas totales en el fluido intracapsular, entre capsulas con desarrollo intermedio y avanzado pre- eclosión de C. dilatata, no ocurrió lo mismo con la actividad proteolítica observada en los embriones. Sin embargo, se evidenció un leve aumento, aunque no significativo, en la actividad proteolítica de los juveniles pre-eclosión respecto de las larvas veligeras provenientes de capsulas con desarrollo intermedio. Por otra parte, de acuerdo al anova de dos vías, tampoco se identificó diferencias significativas en la actividad proteolítica entre embriones (veligeras y juveniles) y fluido intracapsular, lo cual permite sugerir que las enzimas proteolíticas presentes en el fluido serían sintetizadas por los embriones (larvas- juveniles) encapsulados.

No se observaron cambios significativos en la concentración de proteínas totales, tanto en el fluido intracapsular como en los embriones, entre capsulas con desarrollo intermedio (conteniendo veligeras) y capsulas con desarrollo final (conteniendo juveniles pre-eclosión). Sin embargo, la concentración de proteínas totales presentes en el fluido de capsulas con juveniles pre-eclosión, disminuyó notoriamente en un 40% respecto de la concentración observada en el fluido de capsulas conteniendo larvas veligeras. Esta disminución, podría asociarse al consumo de estas proteínas, por parte de los embriones al interior de la capsula, como una fuente de alimento complementaria al consumo de huevos nutricios. Disminución del contenido de materia orgánica del fluido intracapsular (ej: proteínas, lípidos y carbohidratos) también ha sido descrito en otros gastropodos encapsuladores (Bigatti et al., 2014; Brante et al., 2009; Ojeda and Chaparro, 2003; Penchaszadeh and Miloslavich, 2001; Stöckmann-Bosbach and Althoff, 1989). El consumo de proteínas y otros componentes necesarios para sustentar el desarrollo embrionario al interior de la capsula, ha sido descrito en el calyptraeideo Crepidula fornicata (sin huevos nutricios), las cuales tendrían la capacidad de incorporar materia orgánica disuelta desde el ambiente (Brante et al., 2009; Leroy et al., 2012).

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Respecto del contenido de proteínas totales en los embriones de C. dilatata, tampoco presentó variaciones significativas entre el estadio de larva veligera y juvenil pre- eclosión. Sin embargo, Chaparro et al. (2012) registraron un aumento en el contenido de proteínas totales expresado por embrión, a medida que el desarrollo avanza, identificándose el peak en el estadio veliger avanzada, previo a la metamorfosis (1000 µm SL, 4.82 µg por larva). En este trabajo los autores utilizaron un amplio rango de estadios embrionarios, lo que explica este aumento de las proteínas totales registrada durante el desarrollo encapsulado. Esta tendencia a aumentar el contenido de proteínas en los embriones a medida que se desarrollan al interior de capsulas, ha sido registrado en varios especies de gastrópodos encapsuladores (Bigatti et al., 2014; Chaparro et al., 2012; Martínez et al., 2008; Penchaszadeh and Miloslavich, 2001).

De acuerdo a nuestros resultados, la apertura de capsulas en estado de desarrollo avanzado de C. dilatata, es controlada por los juveniles encapsulados, mediante la producción de enzimas proteolíticas que actúan directamente sobre la zona de eclosión. El aumento en la actividad de las proteasas dentro de la capsula, no debería ser atribuido solamente a la accion de apertura capsular, ya que ella puede estar relacionada a la alimentación de los embriones encapsulados sobre los huevos nutricios, considerando que dentro de las enzimas digestivas se ha descrito un grupo de proteasas que actua sobre los enlaces peptidicos de macromoleculas proteícas (Collin and Starr, 2013; Saborowski et al., 2006). Collin and Starr (2013) identificaron diferentes enzimas presentes en los embriones de varias especies de gastrópodos, observando en general una variación de la actividad enzimática, dependiendo del modo de desarrollo (planctotrófico, adelfofágico o lecitotrófico), y también del nivel de desarrollo embrionario. Si las proteasas que participan en el proceso digestivo y en la apertura capsular son enzimas diferentes o las mismas actuando de forma diferenciada, es una interrogante que no ha sido abordada en este trabajo. Por lo mismo, investigaciones posteriores deberian abordar el tema, dilucidando si la presencia de estas proteasas esta relacionada primariamente con los 105

procesos digestivos de los embriones, y su participación en el proceso de eclosión, es mas bien de orden secundario.

En conclusión, en el gastropodo incubador con desarrollo directo C. dilatata, fue posible identificar la presencia de proteasas, tanto en larvas veligeras y juveniles pre- eclosión como en el fluído intracapsular. No obstante lo anterior, se identificó un aumento significativo en la actividad de las proteasas totales del fluído, hacia el final del periodo de desarrollo intracapsular, el cual coincide con una alta actividad proteolítica presente en los juveniles pre-eclosión. De acuerdo a lo anterior, es posible sugerir, que el aumento de la actividad enzimática proteolítica, podría estar relacionada directamente con la apertura de la capsula, específicamente en la zona de eclosión, que presenta, al igual que el resto de la capsula, una estructura bioquímica principalmente compuesta por proteínas.

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FIGURAS

120 120 A) B) Treatment 100 Control 1 100 Control 2

80 80

60 60

40 (%) Hatching Percentage (%) Percentage 40

20 20

0 * * 0 Hatched Weakening Non hatched T C1 C2 Capsule status Capsule status

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)

-1 Fluid Offspring b

a 20 a a

Enzymatic specific activity (U mg protein mg (U activity specific Enzymatic 0 Intermediate Final Level of development

Fig. 2: Variación de la actividad proteolítica total presente en el fluido intracapsular (posturas con desarrollo intermedio n = 10 y final n = 6) y en los embriones con concha (posturas con desarrollo intermedio n = 6 y final n = 7) a través del desarrollo intracapsular. Lineas verticales sobre barras indican DE. Diferentes letras indican diferencias significativas entre los estadíos de desarrollo para el fluido y para los embriones, respectivamente.

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a Fluid Offspring

)

-1 a

2 a a

Protein (mg ml Protein (mg

0 Intermediate Final Level of development

Fig. 3: Variación de la concentración de proteínas totales presentes en el fluido intracapsular (posturas con desarrollo intermedio n = 10 y final n = 6) y en los embriones (posturas con desarrollo intermedio n = 6 y final n = 7) a través del desarrollo intracapsular. Lineas verticales sobre barras indican DE. Diferentes letras indican diferencias significativas entre los diferentes estados de desarrollo para el fluido y los embriones respectivamente.

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Fig. 4: Histoquímica de la pared capsular de C. dilatata. A) Tinción con azul de alcián de capsula con desarrollo inicial. CE: capa externa. CI: capa interna. Microscopio optico (X100). B) Tinción con hematoxilina-eosina de capsula con desarrollo inicial. C1 capa interna. C2: capa intermedia. C3: capa interna. Microscopio optico (X40). Interior: interior de la capsula. Exterior: exterior de la capsula.

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DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES

En invertebrados marinos, el proceso de eclosión puede ser manejado por la hembra incubante, quien, de acuerdo a las condiciones ambientales (e.j. físico-químicos: salinidad, temperatura, luminosidad, ciclos mareales; biológicos: presencia de congeneres, depredadores), controla el ´timing´ de la eclosión de su progenie (Branscomb et al., 2014; Clare, 1997; Lesoway et al., 2014; Oyarzun and Brante, 2015; Oyarzun and Strathmann, 2011). Sin embargo, cuando hay cuidado parental de la postura, el rol de los embriones encapsulados en la liberación desde la capsula, no está muy definido. En C. dilatata, gastropodo Calyptraeideo incubador, las capsulas fueron capaces de eclosionar sin la presencia de la hembra, haciendo evidente que los embriones juegan un rol importante en el control de la apertura capsular y posterior liberación. De acuerdo a los resultados de esta investigación, el momento en que ocurre la eclosión de la progenie está relacionado con la presencia de un alto número de grandes juveniles pre-eclosion (metamorfoseados), y una nula o muy baja presencia de huevos nutricios en el interior de las capsulas. En capsulas sin embriones, no se llevó a cabo el proceso de hatching. En general, en capsulas que no eclosionaron, pero con embriones en su interior, provenientes de posturas donde hubo eclosión de capsulas hermanas, se observó bajo porcentaje de individuos metamorfoseados, con pequeños tamaños de concha y gran cantidad de huevos nutricios disponibles para ser consumidos. Ademas, capsulas eclosionadas no provocaron la eclosión de capsulas hermanas, lo cual confirma que la eclosión es manejada principalmente por los embriones encapsulados, cuando estos alcanzan estadios avanzados de desarrollo.

Al momento de la eclosión, no todos los embriones, dentro de una capsula, presentaron el mismo nivel de desarrollo, a pesar de que la mayoría ya había metamorfoseado. Este pequeño porcentaje, cercano al 6%, aun mantenía el nivel de larva veligera, y sus tamaños fueron menores que los individuos hermanos, metamorfoseados. Estas diferencias en la tasa de desarrollo embrionario dentro de una capsula, podría ser explicado por el consumo desigual de huevos nutricios (Chaparro et al., 1999; Güler and 117

Lök, 2014; Leiva et al.; 1998, Rivest, 1983; Spight, 1976). Variación en tamaños y en estado de desarrollo durante la eclosión, como ocurre en C. dilatata, también ha sido registrada en gastropodos marinos que presentan huevos nutricios durante el desarrollo intracapsular (Thais emarginata, Acanthina spirata, Spight, 1976; Saerlesia dira, Rivest, 1983; Crepidula adunca, Collin, 2000; Chorus giganteus, Leiva et al., 1998; Hexaples trunculus, Güler and Lök, 2014; Vasconcelos et al., 2004). Diferencias en el nivel de desarrollo embrionario intracapsular, también fueron observadas entre capsulas hermanas dentro de una postura, lo cual se asocia a una gran variación en la sincronía y secuencia de eclosión capsular. Estas diferencias podrían ser explicadas por la distribución de huevos nutricios y embriones en cada capsula (Spight, 1976). En general, se ha observado que la distribución de huevos nutricios es más constante entre capsulas de una misma postura, siendo el número de embriones el que más varía (Lesoway et al., 2014; Lloyd and Gosselin, 2007; Spight, 1976). En consideración a ésto, es probable que capsulas con menor cantidad de embriones, al tener mayor cantidad de alimento (huevos nutricios) disponible por embrión, alcancen en menor tiempo el nivel de desarrollo necesario que les permita eclosionar, tal como ha sido identificado por Cubillos et al. (2007) para la especie simpátrica C. fecunda cuando se le hace disponible alimento extraembrionario.

Dentro de la variación observada en el tiempo de eclosión entre capsulas hermanas de C. dilatata, hay que considerar la existencia de variables que no fueron abordadas en esta investigación, y que pudieran impactar en la sincronía de eclosión capsular. Asi por ejemplo, el efecto materno sobre la sincronización de la eclosión de capsulas hermanas dentro de una postura. En relación a ésto, hay evidencias que indican que la presencia materna juega un rol activo en la sincronización del proceso de eclosión. Saigusa (2000) observó en el crustaceo Sesarma haematocheir, que la eclosión de las larvas zoeas, en presencia de la hembra, fue altamente sincronizada, respecto de aquellas larvas eclosionadas sin presencia materna . También hay evidencias de variaciones en los tiempos de eclosión entre capsulas mantenidas en laboratorio y ambiente natural. Asi, Collin et al. (2016) observaron plasticidad de eclosión en capsulas del gastropodo sin cuidado materno, 118

Nerita scabricosta, indicando que capsulas mantenidas en laboratorio demoraron el doble de tiempo en eclosionar que las mantenidas en ambiente natural, observando además diferencias en el tiempo de desarrollo embrionario al interior de la capsula. Por lo tanto, cabe la posibilidad de que los tiempos de eclosión observados en la secuencia de eclosión de C. dilatata, cambie en condiciones de ambiente natural. La incubación materna también podría estar relacionada con el exito de eclosión de todas las capsulas que presentan embriones. A pesar de que la mayoría de las capsulas eclosionaron exitosamente, sin la presencia de la hembra, también se observó mortalidad en capsulas hermanas no- eclosionadas. En la mayoria de las posturas (60%), la mortalidad capsular, por postura, estuvo bajo el 25%. Observandose un par de casos donde la mortalidad sobrepaso el 70% de las capsulas por postura. Probablemente, en condiciones naturales con presencia materna, el exito de la eclosión capsular sea mayor.

En consideración a los resultados obtenidos, la primera hipotesis puesta a prueba “La eclosión capsular está dirigida por el material encapsulado, por lo tanto, la secuencia en que eclosionan las capsulas de una misma postura está determinada por las características de los embriones en el interior de ellas al momento de la apertura capsular”, es aceptada.

Tomando en cuenta que la eclosión en C. dilatata, es controlada principalmente por los embriones encapsulados, existen diversos mecanismos de eclosión que podrían participar en la apertura de la capsula. Tres son los mecanismos de eclosión frecuentemente mencionados entre los invertebrados marinos: mecanismo con acción bioquímica, osmótica y biomecanico (Hawkins and Hutchinson, 1988; Weber, 1977).

Respecto al mecanismo osmótico, mencionado como responsable de la eclosión en invertebrados marinos, se ha descrito que la concentración osmótica al interior del huevo juega un papel importante, permitiendo el ingreso de agua, y con ello el aumento del volumen del huevo, lo cual finalmente lleva a la ruptura de las membranas y la salida del embrión- larva (Davis, 1959, 1968; Hawkins and Hutchinson, 1988; Maeda-Martínez, 119

2008; Marshall and Orr, 1954). Para el caso de gastropodos, con presencia de capsulas, no existe información al respecto, sin embargo, considerando que las capsulas en general han sido descritas como estructuras protectoras semipermeables (Brante, 2006; Maeda- Martínez, 2008; Pechenik, 1982; Segura et al., 2010), es posible que cambios en la concentración osmótica al interior de la capsula, puedan tener un rol en el ingreso de agua aumentando el volumen capsular (Maeda-Martínez, 2008). En C. dilatata, fue posible identificar cambios en la concentración osmótica del fluído intracapsular a medida que los embriones se desarrollaban, llegando a igualar la osmolalidad presente en el agua de mar. Por lo tanto, al inicio del desarrollo embrionario encapsulado, la concentración osmótica en el fluído intracapsular fue mayor que en el agua de mar. Nuestros resultados se asemejan a los obtenidos para el calyptraeideo C. fornicata, donde también se identificó una disminución en la osmolalidad del fluido intracapsular a través del desarrollo de los embriones (Maeda-Martínez, 2008). La alta osmolalidad al interior de las capsulas durante los primeros estadios de desarrollo, podría permitir un mayor ingreso de agua aumentando con esto el volumen capsular en los estadios mas avanzados, facilitado también, por el adelgazamiento de las paredes en capsulas con desarrollo embrionario avanzado (Brante, 2006; Brante et al., 2008; Hawkins and Hutchinson, 1988; Ojeda and Chaparro, 2003; Segura et al., 2010; Zabala et al., 2015). Sin embargo, para el caso de C. dilatata, es posible descartar el ingreso de agua como un potencial gatillante de la eclosión. Lo anterior, basado en los resultados de los experimentos de exposición capsular a diferentes salinidades, donde las capsulas aumentaron el contenido de agua en su interior, pero no llegaron a experimentar la apertura capsular.

Por lo tanto, la hipotesis que fue puesta a prueba indicando que “El aumento de la osmolalidad intracapsular, al final del desarrollo embrionario, genera un aumento en el ingreso de agua hacia el interior de la capsula, aumentando el volumen capsular y permitiendo con ello la apertura de la capsula en la zona de eclosión”, es aceptada solo parcialmente. Si bien, hubo una mayor concentración osmótica al interior de la capsula, esta fue, contrariamente a lo esperado, observada al inicio del desarrollo embrionario 120

intracapsular, identificándose un mayor contenido de líquido en capsulas con desarrollo intermedio y no al final del periodo intracapsular. El ingreso de agua hacia la capsula no causó la apertura de la cápsula.

Un segundo mecanismo de eclosión sugerido, en varias especies de gastrópodos encapsuladores, corresponde a una acción de tipo biomecánica, donde los embriones con desarrollo avanzado (larvas- juveniles), son capaces de utilizar estructuras corporales como la radula (juveniles prehatching) o la ciliatura velar (veligeras), en la apertura de la capsula (Bigatti et al., 2014; Leiva et al., 1998; Smith and Thatje, 2012; Weber, 1977). Sin embargo, en C. dilatata, la rádula de los juveniles pre-eclosión encapsulados no participa en el proceso de apertura capsular, ya que a través de la microscopía electrónica de barrido, no se observó ningún tipo de huella dejada por el posible ramoneo de los juveniles sobre la zona interna de eclosión. Debido a que la rádula fue observada en juveniles pre-eclosión, e incluso en larvas veligeras encapsuladas, la hipótesis que indica que “Juveniles pre- eclosión de C. dilatata, provistos de una rádula desarrollada, tienen la capacidad de intervenir directamente en el proceso de eclosión, utilizando esta estructura como una herramienta para abrir la capsula desde el interior” es aceptada solo parcialmente.

Por otra parte, los resultados de microscopía electrónica de barrido sobre la zona de eclosión externa, demuestra que la hembra incubante, tampoco participa de la apertura capsular, por lo menos mediante el uso directo de su rádula. Evidencia de la participación materna en el proceso de eclosión ha sido descrito para el calyptraeideo C. navicella, donde Lesoway et al. (2014) observaron que la hembra incubante controla la apertura de la capsula. Contrariamente en C. dilatata, donde se ha descrito la participación de la radula materna en la limpieza de las capsulas incubadas, la apertura capsular no se encuentra relacionada con el ramoneo materno. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, no se puede descartar que la hembra incubante tenga un rol en la sincronización de la eclosión de todas las capsulas dentro una postura. El rol de la hembra incubante en gastropodos calyptraeideos no ha sido investigado anteriormente, lo cual deja abierta la posibilidad para 121

un futuro trabajo donde se aborde este tema. Por lo tanto, y de acuerdo a los resultados obtenidos, se rechaza la hipotesis que pone a prueba la participación de la hembra incubante: “Las hembras incubadoras participan directamente en el proceso de apertura capsular mediante el uso de su rádula, la que es utilizada para ramonear sobre la zona de liberación, permitiendo con ello la eclosión y salida de los juveniles”.

Por otra parte, de acuerdo a los resultados en C. dilatata, se puede sugerir, finalmente, que el principal mecanismo de eclosión corresponde a una acción de tipo bioquímica, que actúa desde el interior de la capsula, manejada por los embriones en estado avanzado de desarrollo (juveniles pre-eclosión). La actividad enzimática como mecanismo de eclosión ha sido descrita en varias especies de invertebrados marinos, principalmente en especies donde la eclosión de los embriones-larvas, ocurre directamente desde el huevo (De Vries and Forward, 1991; Fan et al., 2010; Hancock, 1956; Li and Kim, 2013; Takeuchi et al., 1979). En estas especies se ha observado que las enzimas participan degradando las membranas externas del huevo, lo cual permite finalmente la salida de los embriones. Sin embargo, en especies donde el desarrollo ontogenético ocurre al interior de estructuras envolventes con funcion protectora (capsulas o masas gelatinosas), como ocurre en C. dilatata, la información disponible sobre los mecanismos de eclosión que participan en este proceso, es escasa. Dentro de los trabajos que abordan directamente los tipos de eclosión en gastropodos encapsuladores se indica que la participación de una “sustancia de eclosión” podrían estar envuelta en la apertura capsular (Hawkins and Hutchinson, 1988; Pechenik, 1975; Sullivan and Bonar, 1984).

En el caso de C. dilatata, fue posible observar la presencia de actividad proteolítica durante los estadios embrionarios encapsulados más desarrollados (capsulas con veligeras y juveniles), sin embargo la actividad detectada en el fluído intracapsular aumentó significativamente en capsulas con desarrollo final, coincidiendo con un leve aumento de la actividad proteolítica identificada en los juveniles pre-eclosión. El anova de dos vías indicó que la actividad proteolítica no varía entre el fluido y los embriones encapsulados. Por lo 122

que esta similitud en la actividad enzimática, permite sugerir que serían los embriones encapsulados quienes sintetizan las proteasas que estan presentes en el fluído, y que estas enzimas serían sintetizadas desde el estadio de desarrollo intermedio por las larvas veligeras, causando un efecto acumulativo de desgaste, a través del tiempo, sobre la zona de eclosión capsular. La presencia de estas enzimas proteolíticas sintetizadas por los individuos más avanzadosy que poseen habilidades de alimentación, pudiera tener como función primaria el proceso de alimentación y además participar de forma secundaria en la apertura capsular. Varias proteasas han sido identificadas en procesos digestivos de invertebrados marinos (Collin and Starr, 2013; Saborowski et al., 2006). Por lo tanto, en especies donde hay consumo de huevos nutricios, como C. dilatata, es posible que exista una síntesis constante de enzimas digestivas, por lo cual las proteasas identificadas en el fluido y en los embriones actúen en ambos procesos: digestión y eclosión. La identificación de enzimas específicas no fue realizada en este trabajo, quedando como tópicos para futuras investigaciones.

La acción de enzimas proteoliticas sobre la zona de eclosión capsular en C. dilatata, está relacionada a la composición bioquímica de las paredes capsulares, principalmente a la zona de apertura capsular. Los analisis de histoquímica identifican la presencia de proteínas, tanto básicas como ácidas, a lo largo de toda la pared capsular, incluyendo la zona de eclosión. Por lo tanto esta zona con alto contenido proteíco, en relación a los demás componentes bioquímicos, sería altamente susceptible a la acción proteolítica de enzimas sintetizada por los juveniles pre-eclosión. Sin embargo, como no fue posible, mediante la técnica de histoquímica, diferenciar la composición bioquímica entre la zona de eclosión y el resto de la pared capsular, aún permanece como incognita el por qué la capsula se abre sobre una zona específica. Por lo tanto la hipotesis “La eclosión de juveniles desde capsulas en el gastrópodo C. dilatata, está conducida por un proceso enzimático de origen embrionario intracapsular, a través del cual se logra la apertura de la capsula en una zona predeterminada para la eclosión”, es aceptada. La identificación de actividad proteolítica como principal gatillante de la apertura capsular, deja en evidencia 123

que los mecanismos descritos para especies donde la eclosión ocurre directamente desde el huevo, son aplicable a la eclosión de embriones desde estructuras secundarias que brindan protección.

En conclusión, la eclosión en Crepipatella dilatata, sería controlada por los embriones incubados. El principal mecanismo de eclosión corresponde a una acción de tipo proteolítica, generada por juveniles encapsulados pre-eclosión. Esta acción enzimática actuaría sobre una zona específica de la capsula, que posee un alto contenido de proteínas, haciéndola susceptible a la actividad proteolítica. Sin embargo, es muy probable que este mecanismo no actúe de forma aislada en el proceso de eclosión, si no que mas bien se trate de una acción conjunta con otros factores o procesos que ocurren al interior de la capsula y también fuera de ellas. En el caso de la acción osmótica, cuya participación directa e independiente sobre la apertura capsular, es inicialmente descartada, ya que el ingreso de agua y el subsecuente aumento de volumen, no consiguen hacer efectivo el proceso de eclosion. No obstante lo anterior, la participacion de este mecanismo sobre la apertura capsular, no puede ser desechado por completo, ya que potencialmente puede actuar en concordancia con otros mecanismos. Asi, los cambios osmóticos en el interior de la capsula durante el desarrollo embrionario, podrían de alguna forma actúar en conjunto con el mecanismo enzimático, considerando el ambiente natural donde habita la especie, el cual presenta fluctuaciones diarias de salinidad y temperatura. Por otra parte, para que se desplieguen los mecanismos principales y/o complementarios del proceso de eclosión, es necesario que los embriones hayan alcanzado el nivel de desarrollo adecuado al interior de la capsula, el que se asociaría con la metamorfosis. Sin embargo, el desarrollo de estructuras que le permitan abrir la capsula, de forma mecánica y directa, como la rádula, pareciera no tener implicancia en la apertura capsular, a pesar de que la radula está presente desde el estadio veliger encapsulada. Si bien, la eclosión ocurre sin la presencia de la madre, y la radula materna no participa directamente en la apertura capsular, es probable que la hembra incubante cumpla otro tipo de función durante el proceso de eclosión, como por ejemplo, sincronizar la apertura capsular o participar en la limpieza capsular, o en la 124

oxigenación de las capsulas, aumentando con esto las probabilidades de una eclosión exitosa para toda la postura. Por lo tanto, a pesar de que el principal gatillante de la apertura capsular identificado en este trabajo, corresponde a la actividad enzimática sintetizada por los juveniles-pre-eclosión, es probable que este mecanismo no actúe por si solo, sino que ocurra en conjunto con otros factores, actuando de forma complementaria o sinérgica, para finalmente permitir la transición desde un ambiente protegido encapsulado a uno mas expuesto, pero independiente.

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