Tesis Doctoral
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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS AGENTES CONDUCTORES DEL PROCESO DE ECLOSIÓN CAPSULAR: Crepipatella dilatata COMO MODELO DE ESTUDIO TESIS DOCTORAL PAOLA VIVIANA ANDRADE VILLAGRAN VALDIVIA – CHILE 2016 AGENTES CONDUCTORES DEL PROCESO DE ECLOSIÓN CAPSULAR: Crepipatella dilatata COMO MODELO DE ESTUDIO Tesis presentada a la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias por PAOLA VIVIANA ANDRADE VILLAGRAN Valdivia - Chile 2016 Dedicada a mi pequeña Leonor AGRADECIMIENTOS Quiero agradecer a todas las personas que de alguna u otra forma han aportado en el desarrollo de mi tesis. Dar las gracias a mi familia por el apoyo y la paciencia. También quisiera agradecer a las personas que trabajan en el laboratorio y a mis compañeros del Doctorado, por hacer siempre mas agradable y entretenida mi estadia en la universidad. Agradecer a mi profesor patrocinante Dr. Oscar Chaparro, por el apoyo, la paciencia y los consejos durante todos estos años de estudio. A mi comisión evaluadora, Dr. Antonio Brante, Dr. Kurt Paschke, Dr. Jorge Navarro, por participar en el proceso de evaluación. Dar las gracias al Doctor Luis Vargas por permitirme hacer uso de su laboratorio y a Ricardo por ayudarme con los analisis bioquímicos. Gracias a Conicyt por la beca de Doctorado nacional, que me permitió dedicarme con tranquilidad al Doctorado. A la beca de gastos operacionales 21120654 otorgada por Conicyt para el desarrollo de la tesis. También agradecer a la Dirección de Postgrado, Dirección de Investigación y Desarrollo, Escuela de Graduados de la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile, por el apoyo económico otorgado durante mi asistencia a diferentes Congresos. Finalmente agradecer al proyecto Fondecyt 1141052 “Hatching process in brooding molluscs: More complex that thougth before”, otorgado al Doctor Oscar Chaparro , por las facilidades logisticas y operacionales otorgadas durante el desarrollo de mi tesis de Doctorado. INDICE GENERAL INDICE GENERAL I INDICE DE TABLAS IV INDICE DE FIGURAS V RESUMEN XI ABSTRACT XIV INTRODUCCION GENERAL 1 CAPITULO 1: WHO CONTROLS HATCHING IN THE BROODING ESTUARINE GASTROPOD Crepipatella dilatata? 9 SUMMARY 9 INTRODUCTION 10 MATERIAL AND METHODS 13 RESULTS 19 DISCUSSION 22 I TABLES 28 FIGURES 30 REFERENCES 40 CAPITULO 2: ACCIÓN BIOMECÁNICA Y OSMÓTICA: POSIBLES MECANISMOS DE ECLOSIÓN CAPSULAR EN Crepipatella dilatata 46 RESUMEN 46 INTRODUCCIÓN 47 METODOLOGÍA 51 RESULTADOS 58 DISCUSIÓN 62 TABLAS 69 FIGURAS 70 REFERENCIAS 82 II CAPITULO 3: ACCIÓN ENZIMÁTICA INTRACAPSULAR COMO MECANISMO DE ECLOSIÓN EN EL GASTRÓPODO INCUBADOR Crepipatella dilatata 89 RESUMEN 89 INTRODUCCIÓN 90 METODOLOGÍA 94 RESULTADOS 98 DISCUSIÓN 100 FIGURAS 106 REFERENCES 110 DISCUSION GENERAL Y CONCLUSIONES 116 REFERENCIAS (introducción y discusión general) 124 III INDICE DE TABLAS CAPITULO 1 Table 1. Crepipatella dilatata. Nested Anova performed for the effect of hatching time (initial and final) nested in the different egg-brood on the average number of juveniles, total number of offspring, shell length of juvenile, and the offspring biomass in each hatched capsule. Bold p-values indicate statistical significance. 28 Table 2. Crepipatella dilatata. Mean content characteristics of capsules hatched (n = 295) and nonhatched (n = 34) (mean ± SD). Different letter means significant differences for each variable between hatched and non-hatched capsules. 29 CAPITULO 2 Tabla 1. Crepipatella dilatata. Promedio de la longitud de concha de juveniles pre-eclosión (n = 4 capsulas), larvas veligeras (n = 5 capsulas) y larvas veligeras donde no se identificó la presencia de rádula (n = 4 capsulas), y tamaño promedio de sus respectivas rádulas. Valores promedio ± desviación estandar. 69 IV INDICE DE FIGURAS CAPITULO 1 Fig. 1 Crepipatella dilatata. Degree of synchronization in hatching among egg capsules within a brood. Y-axis shows the time between hatching of the first egg capsule in a brood and the last egg capsule in the same egg mass. The broods considered in the graph correspond to those in which at least 50% of the capsules had hatched. n = 23 broods. HT: hatching time, NC: number of capsules. 30 Fig. 2 Crepipatella dilatata. A) Mean number of metamorphosed juveniles and C) total offspring (veliger and juveniles) per capsule, hatched at the beginning and at the end of the hatching period from each individual egg mass (n = offspring from 33 egg capsules). Initial hatching (full circles) represent the 25% of those capsules hatched at the beginning and the open circles represent the 25% of those at the end of the hatching period for each egg mass (brood). Mean of juveniles (B) and total offspring (D) in hatched capsules at the beginning and at the end of hatching period for a 33 different egg masses. Different letter on bars show significant differences. Lines on bar show SD. 31 Fig. 3 Crepipatella dilatata. (A) Mean shell length of the metamorphosed juveniles and (C) mean offspring biomass from capsules hatched at the beginning and at the end of the hatching period for each egg mass (n = 33 capsules). Initial hatching (full circles) represent the 25% of those capsules hatched earlier and the open circles represent the 25% of the last hatched capsules in relation of the total time spent during the hatching process for each egg mass. Mean juvenile shell length (B) and mean offspring biomass (D) in capsules hatched at the beginning and at the end of the hatching period for the 33 egg masses. Different letter on bars show significant differences. Lines on bar show SD. 33 V Fig. 4 Crepipatella dilatata. Relationship between developmental stage (metamorphosed, not yet metamorphosed) and egg capsule status (hatched, not yet hatched) on juvenile mean shell length. Bars represent the mean shell length of metamorphosed juveniles (n = 293 egg capsules) and non-metamorphosed veligers (n = 77 egg capsules) from hatched capsules and metamorphosed juveniles (n = 34 egg capsules) and non-metamorphosed veligers (n = 24 egg capsule) from non-hatched capsules. Vertical lines above bars indicate SD and different letters signify significant differences between means. 35 Fig. 5 Crepipatella dilatata. Total number of brooded offspring per capsule and its relation with (A) juvenile shell length at metamorphosis (n = offspring from 293 egg capsules) and (B) offspring brooded biomass (n = offspring from 283 egg capsules) recorded in hatching capsules. SLJ: Shell length of juveniles, OBB: Offspring brooded biomass, TNO: Total number of offspring. Each dot represents the mean value from one capsule. 36 Fig. 6 Crepipatella dilatata. Relationship between mean shell length of metamorphosed juveniles, mean number of metamorphosed juveniles, and mean number of nurse eggs remaining for hatched (n = 283) and non-hatched (n = 34) egg capsules, respectively. 37 Fig. 7 Crepipatella dilatata. Effect of capsule mates on the timing of hatching over 7 days. A) Percentage of capsules opening from different broods, kept individually (n = 59 capsules from 11 broods) or grouped (n = 59 capsules from 11 broods, 2-10 capsules form each brood) with their capsule mates. B) Mean percentage of hatching in all capsules kept individually or grouped. * = non-hatched capsule. Different letters mean significant differences. Bars represent SD. 38 Fig. 8 Crepipatella dilatata. A) Estimated time of maternal investment in the capsular laying process and time registered of hatching for each brood. The broods controlled were those in which at least 50% of capsules had hatched. The capsular laying time for each female was VI estimated multiplying the average time used in laying one capsule (see M & M) by the total hatched capsule number in each experimental brood. B) Mean time (h) spend during capsular laying and the hatching process in each capsule brood (n = 23). Numbers above the bars represent the number of capsules in each brood. Different letters mean significant differences. Bars mean SD. 39 CAPITULO 2 Fig. 1 Crepipatella dilatata. A) Rádula de juvenil pre-eclosión provenientes desde capsulas con desarrollo embrionario en estadío avanzado. B) Juvenil pre-eclosión. 70 Fig. 2 Crepipatella dilatata. Relación entre la longitud de concha promedio de larvas y juveniles encapsulados, con la longitud de rádula promedio. Círculos negros corresponden a juveniles pre-eclosión (n = 42 juveniles en total provenientes de 4 capsulas), círculos grises indican larvas veligeras (n = 23 veligeras en total provenientes de 5 capsulas), y círculos blancos representa larvas veligeras donde no se observó rádula (n = 52 veligeras provenientes de 4 capsulas). Cada capsula proviene de una postura diferente. Barras indican SD. 71 Fig. 3 Crepipatella dilatata. A) Microfotografía de MEB mostrando la zona de eclosión interna de una capsula con veligeras en estadio de desarrollo intermedio. ZH indica zona de eclosión. B) Zona de eclosión maximizada de acuerdo a Fig.3 A. Ancho de rádula de las veligeras encapsuladas corresponde a 33 µm. 72 Fig.4 Crepiaptella dilatata. Microfotografía de MEB en A) Zona de eclosión interna de una capsula con estadío de desarrollo embrionario final (pre-eclosión). HZ indica zona de eclosión. B) zona de eclosión maximizada de acuerdo a Fig.4 A. Ancho promedio de rádula de los juveniles pre-eclosión corresponde a 40 µm. 73 VII Fig. 5 Crepipatella dilatata. Microfotografía de MEB en A) Zona de eclosión interna de capsulas eclosionadas. B) zona de eclosión interna maximizada de acuerdo a Fig. 5 A. HZ indica zona de eclosión. Ancho de rádula de juveniles corresponde a 40 µm. 74 Fig. 6 Crepipatella dilatata. Microfotografía de MEB en zona de eclosión externa de la capsula de C. dilatata. A) Exterior de capsula con embriones en estadio de desarrollo avanzado (juveniles pre-eclosión). B) Detalle de la zona de eclosión externa en capsulas con embriones con nivel de desarrollo avanzado. C) Exterior de capsula eclosionada. D) Detalle de zona de eclosión externa en capsulas eclosionadas. HZ indica zona de eclosión. 75 Fig. 7 Crepipatella dilatata. A) Concentración osmótica del fluido obtenidos de capsulas con diferentes niveles de desarrollo de los embriones encapsulados.