UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA Casa abierta al tiempo

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA DE DOS MUESTRAS DE SPHAERALCEA ANGUSTIFOLIA Y LA INTERACCIÓN DEL EXTRACTO ACTIVO CON FÁRMACOS DE USO CLÍNICO

PROYECTO DOCENTE DE INVESTIGACION (PDI)

que presenta Berenice Guadarrama Flores

para obtener el titulo de Licenciada en Biología Experimental

Directora de PDI: Dra. Mariana Meckes Fischer Codirector de PDI: Dr. Rubén Román Ramos

MÉXICO DICIEMBRE, 2006

Hemos de recorrer el tiempo con sus segundos extendidos como alas buscando, buscando, buscando siguiendo ideas, persiguiendo sueños…..

América Silenciosa*

El presente trabajo de investigación se realizó en la Unidad de

Investigación Médica en Farmacología de Productos Naturales, de la

Coordinación de Investigación en Salud del Instituto Mexicano del Seguro

Social, Hospital de Pediatría del Centro Médico Nacional Siglo XXI.

El estudio es parte del proyecto “Estudio químico-biológico de

Sphaeralcea angustifolia y desarrollo de procedimientos biotecnológicos y análisis metrológico para la obtención de un potencial fármaco antirreumático de aplicación tópica apoyado por CONACYT (SALUD-

2004-CO1-50).

ASESORES DE PDI:

Dra. Mariana Meckes Fischer Instituto Mexicano del Seguro Social

Dr. Rubén Román Ramos Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa

AGRADECIMIENTOS

Hace poco más de cuatro años que mi vida cambió por completo. Jamás había tenido la sensación de vivir fuera de casa, ni tener que encarar al tiempo con la certeza de quien se sabe valiente entre caminos. No obstante, con el paso del tiempo, las casualidades y los distintos espejos del mundo te muestran que la felicidad es una fuerza maravillosa que se encuentra dentro de nosotros mismos para creer firmemente en el futuro.

Deseo agradecer profundamente a la vida. A mi madre quien me ha enseñado a contemplar el silencio. A mi padre quien siempre ha sido un poeta inquieto. Al apoyo en todo sentido a mis hermanos Ana y Héctor, gracias por darme aliento para transitar por la vida. A mis abuelos por compartir parte de su existencia conmigo. A mi tío Beto por inyectarme alegría. A Don Gus y Doña Coty por abrirme un espacio en su corazón.

Quiero agradecer muy especialmente a Mauricio, quien durante bastante tiempo ha tenido la paciencia suficiente para apoyarme profundamente, para darme su comprensión, su cariño y su amor. Gracias por hacer de cada momento una aventura llena de color y paisaje.

A la Dra. Mariana Meckes Fischer directora de PDI, por su asesoramiento científico y estímulo para seguir creciendo intelectualmente, pero sobre todo por las lecciones de vida que me obsequio a lo largo de aproximadamente un año de formación no solamente académica sino también personal. De igual forma al Dr. Rubén Román Ramos co- director de PDI por su disposición permanente por aclarar mis dudas, así como por sus formidables clases. A la Dra. Adelina Jiménez Arellanes por cada una de sus sugerencias, las cuales fueron sumamente valiosas para la realización de este trabajo. Al

Herbario del IMSS por su ayuda en la identificación taxonómica de las dos variedades de Sphaeralcea angustifolia. Al Bioterio del IMSS. Al Dr. Ricardo Vargas Orozco encargado del Bioterio de la Facturad de Medicina de la UNAM con sede en el

Hospital General, por su disposición de contribuir en el trabajo científico de los estudiantes.

Quiero enfatizar mi agradecimiento hacia cada uno de mis compañeros de laboratorio por tener la paciencia ante mis dudas de novata y por escuchar atentamente los problemas que a lo largo de este trabajo surgieron. Gracias Rosa Virginia García

Rodríguez, Omar Olivares Estrada, Daniel Díaz Flores, Martha Juárez Ciriaco, Raúl

Cervantes, Jorge Cornejo, Rosalba León Díaz, Arlene Calderón Corona, Sandra

Romero Valdez, Edgar López Fonseca, Angélica Solís Cruz.

Sin lugar a duda este trabajo no pudo haberse realizado sin la formación que recibí durante mi estancia en la Universidad Autónoma Metropolitana. Unidad Iztapalapa

(UAM-I). Gracias a todos los maestros que contribuyeron realmente en mi formación, en especial a la M. en C. Ma. de los Angeles Aguilar Santamaría por todos sus consejos, su paciencia y su amistad como persona.

Será difícil olvidar los maravillosos momentos de aquellas charlas nocturnas en la

Biblioteca de la Universidad con Mau, Juan Navarrete, David Alejo, “el Joven”, David

Trejo, “el Físico”, Lalo, Aldo, Elena, Columba, a Jacqueline; gracias por su sincera amistad y por compartir conmigo muy agradables instantes, así como a todos aquellos que aparecían de manera espontánea y me obsequiaron formidables momentos.

Por último quiero agradecer a todos aquellos que me han devuelto una sonrisa, en aquellas ocasiones cuando no encontraba la llave mágica que abre las puertas hacia el camino de las soluciones. .ABREVIATURAS

AA Acido Araquidónico

AIES Antiinflamatorios Esteroideos

AINES Antiinflamatorios No Esteroideos

CAM Complejo de Ataque a la Membrana

CCDA Citotoxicidad Celular Dependiente del Anticuerpo

COX Enzima Ciclooxigenasa

CSF Factor Estimulador de las Colonias

Dex Dexametasona

Ex Extracto activo de Sphaeralcea angustifolia

FAP Factor Activador de Plaquetas

FCNK Factor citotóxico

Fc XII Factor Hageman

HHT Acido Hidroxiheptadecatrienóico

HLA Antígeno Leucocitario Humano

Ig Inmunoglobulinas

IFN o INF Interferones

IL Interleucinas

LB Linfocitos B

5-LOX Enzima 5-lipooxigenasa

LT Leucotrienos LT Linfocitos T

MAC Medicina Alternativa Complementaria

MDA Acido Malondialdehído

MFP Moléculas Formadores de Poros

MHC Complejo Mayor de Histocompatibilidad

MHC-I Genes de clase I

MHC-II Genes de clase II

MHC-III Genes de clase III

MIF Factor de Migración de los Macrófagos

NK Células Asesinas Naturales

PA Proteasas Acidas

PC Proteínas Catiónicas

PGl Prostaciclina

PGs Prostaglandinas

PN Proteasas Neutras

SC Sistema del Complemento

TC Linfocitos T citotóxicos

TH Linfocitos T cooperadores

TNFα Factor de Necrosis Tumoral alfa

TNFβ Factor β de transformación del crecimiento

TPA 12-O-tetradecanoílforbol-13-acetato

TXA Tromboxanos INDICE

Resumen 1

Introducción 3

Sphaeralcea angustifolia (Cav.) G. Don Constituyentes químicos de Sphaeralcea angustifola 7 Actividad biológica de Sphaeralcea angustifolia 10

Inflamación 11 Inflamación aguda 12 Inflamación crónica 13

Mediadores que intervienen en la inflamación Mediadores celulares 14 Mediadores químicos 20 Mediadores de la inflamación en el plasma 22 Mediadores de la inflamación en tejidos 27

Fármacos antiinflamatorios 32 Vía de administración intranasal de fármacos 33 Interacción de agentes antiinflamatorios 37 Modelo de inflamación aguda inducida con carragenina 39

Objetivo General Objetivos particulares 43

Hipótesis 44

Metodología

Material vegetal 45 Preparación de los extractos 45

Análisis de los constituyentes de los extractos Perfil cromatográfico en capa fina (TLC) 45 Análisis por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) 46

Modelos Biológicos Edema plantar inducido con carragenina en el ratón 47 Interacción del extracto (Ex) con dexametasona 48

Resultados

Selección de la planta y del extracto CH2Cl2 a evaluar 50

Estudio comparativo sobre el efecto antiedematoso de Ex administrado por vía intranasal e intraperitoneal 52

Curva dosis respuesta del extracto (Ex) administrado vía intranasal 56

Curva dosis respuesta de la dexametasona (Dex) aplicada vía intranasal 58

Interacción de la dexametasona y el extracto CH2Cl2 en el modelo del edema Plantar inducido con carragenina en el ratón 59

Anexo 63

Discusión 66

Conclusiones 70

Referencias Bibliográficas 72

RESUMEN

El proceso inflamatorio se presenta en numerosos padecimientos, entre ellos la artritis reumatoide y otras enfermedades autoinmunes para las cuales es necesario encontrar agentes terapéuticos que permitan un mejor control del paciente. En la búsqueda de estos agentes antiinflamatorios, las plantas medicinales son un recurso natural que es necesario explorar.

El presente trabajo trata sobre Sphaeralcea angustifolia, planta de la herbolaria medicinal mexicana a la que se le atribuyen propiedades antiinflamatorias. Los estudios abordados se relacionan con la optimización de un proceso para la obtención de los extractos de diclorometano obtenidos de dos muestras de Sphaeralcea angustifolia que fueron colectadas en una misma localidad del Edo. de Hidalgo (Sph1 y Sph2) y la evaluación de la actividad antiedematosa del extracto aplicado vía nasal. Estudios químicos previos realizados señalan la presencia de β-sitosterol, α y β-amirinas, las cumarinas esculetina, esculina y escopoletina en el extracto de diclorometano. El ensayo biológico utilizado en el presente trabajo fue el modelo del edema plantar inducido en el ratón con carragenina

(inflamación aguda).

De los resultados obtenidos se desprende que las dos muestras estudiadas corresponden a la misma especie botánica (Sphaeralcea angustifolia, Cav. G. Don) y que la maceración exhaustiva de la planta manteniendo el vegetal en el disolvente orgánico a temperatura ambiente y por espacio de 1-2 semanas cada vez, es el procedimiento que permite obtener un extracto con mayor rendimiento (1.5 % para Sph1 y 1.12 para Sph2). La vía de administración del extracto fue otro de los temas abordados en este estudio y se demostró que el extracto aplicado por vía nasal en una dosis de 0.50 [mg/fosa] produce en la fase temprana del desarrollo del edema plantar (0-3 hrs), un efecto antiedematoso de menor intensidad que el administrado en una dosis de 100 [mg/fosa] por vía intraperitoneal; por el contrario, en la fase tardía (3-7 hrs) el efecto del extracto administrado vía nasal fue sostenido y superior al registrado con la administración intraperitoneal

En el campo de la investigación de productos naturales, el estudio sobre las interacciones entre fármaco-fármaco o fármaco-alimento surge en la actualidad con gran interés. En

México se observa con frecuencia, que aunado a los agentes terapéuticos prescritos en la clínica, los pacientes consumen productos herbolarios, motivo por el que es importante contemplar en la investigación de una planta medicinal los aspectos relacionados con la interacción entre fármacos. Aplicando el mismo modelo biológico se llevó a cabo el estudio sobre la interacción del extracto con dexametasona, un agente antiinflamatorio que es utilizado vía nasal para tratar el asma. Por medio de curvas log dosis respuesta se determinó la DE50 de ambos productos administrados individualmente (i.n) y en combinaciones 1:1,

1:2, 2:1, 6:1. En esta serie de estudios se demostró que el extracto tiene una potencia 4-6 veces mayor que la de dexametasona. Por medio de el análisis isobolográfico y la prueba t de Student se determinó que la interacción en las combinaciones evaluadas es de tipo sinergista.

2

INTRODUCCIÓN

La etnobotánica estudia las interrelaciones que se establecen entre los diferentes grupos culturales y el medio vegetal. De la información etnobotánica en los bancos de datos se desprende que entre 4000 y 5000 especies son utilizadas en México con fines terapéuticos.

La herbolaria medicinal es una de las más vastas del mundo y se estima que 80% de la población mexicana utiliza este recurso natural para resolver los problemas prioritarios de salud.

La inflamación es un proceso que se asocia con múltiples enfermedades. Del análisis de la información en los bancos de datos etnobotánicos se desprende que numerosas especies vegetales son utilizadas en México para tratar la inflamación, Sphaeralcea angustifolia es una de estas especies. La planta es mencionada para tratar golpes, heridas, torceduras, fracturas, accesos de tos y diarrea, afecciones todas éstas que implican el desarrollo de una respuesta inflamatoria.

El presente estudio es parte del proyecto de investigación sobre Sphaeralcea angustifolia que se lleva a cabo en la Unidad de Investigación Médica en Farmacología de Productos

Naturales, proyecto que tiene como propósito definir sobre las potencialidades que tiene el recurso natural como agente antiinflamatorio.

3 Sphaeralcea angustifolia (Cav.) G. Don

SINONIMIA BOTANICA: Phymosia cuspidata, Sphaeralcea angustfolia ssp. cuspidata

(Gray) Kearney, Sphaeralcea angustfolia sp. lobata (Woot) Kearney, Sphaeralcea angustifolia var. oblongifolia (Gray) Shinners, Sphaeralcea cuspidata (Gray) Britt,

Sphaeralcea emoryi ssp. nevadensis Kearney, Sphaeralcea emoryi var. nevadensis

(Kearney) Kearney (García 2006).

4 NOMBRE(S) COMUN(ES): Hierba del golpe, hierba del negro, vara de San José,

Tlixíhuitl (náhuatl), alvón (Aguilar, 1995; SEMARNAT).

DESCRIPCIÓN: Pertenece a la familia Malvaceae. Planta herbácea erecta de 0.5 a 1.5 m de alto, los tallos pubescentes con pelos estrellados diminutos; hojas lanceoladas, angostas y rugosas de 8 a 18 cm de longitud, bordes ondulados en ocasiones con lóbulos más grandes; flores sésiles rosadas o moradas de 1 a 2 cm acomodadas en grupos formando un racimo angosto. El fruto es de 4.5 a 6 mm de diámetro, estrellado-pubescente, usualmente incluido en el cáliz, dividido en 10 a 16 pares iguales (Argueta y col., 1994)

HABITAT: Especie de hábito terrestre, Crece en clima semiseco, seco, húmedo y templado entre los 1890 y 3900 msnm, asociada a matorral xerófilo, pastizal, bosques de pino- encino y terrenos agrícolas abandonados (Argueta y col., 1994)

DISTRIBUCIÓN: Se propaga de manera silvestre en el territorio nacional principalmente en los estados de México, Hidalgo, Chihuahua, Durango, Jalisco y Michoacán (Argueta y col., 1994).

USOS MEDICINALES: La información etnobotánica en los bancos de datos se relaciona con el empleo que tiene la planta para tratar golpes, fracturas, torceduras, heridas, accesos de tos e inflamación (Aguilar y col., 1994; Argueta y col., 1994). Para tratar los golpes, las partes aéreas de la planta fresca se muelen, se adiciona aceite y se aplica el producto localmente en la zona afectada (SEMARNAT). En el valle del Mezquital Hidalgo, se bebe una infusión de la raíz para limpiar los riñones, el mismo preparado se utiliza para limpiar

5 la matriz en caso de aborto. En el estado de México, también se toma la infusión de raíz, pero se utiliza como emoliente (Aguilar y col., 1994). El cocimiento de S. angustifolia con otras plantas es utilizado a manera de agua de tiempo para tratar diarrea crónica (Argueta y col., 1994)

CLASIFICACIÓN BOTÁNICA

Sphaeralcea angustifolia (Cav.) G. Don

Reino Plantae - plantas Subreino Tracheobionta - plantas vasculares Superdivisión Spermatophyta - plantas con semilla División Magnoliophyta - plantas con flores Clase Magnoliopsida – Dicotyledoneae Subclase Dilleniidae - Orden Malvales - Familia Malvaceae - familia de la malva Género Sphaeralcea

Especie: Sphaeralcea angustifolia (Cav.) G. Don – Vara de San José

6 CONSTITUYENTES QUÍMICOS DE Sphaeralcea angustifolia

Los estudios químicos previos realizados señalan al β-sitosterol, α y β-amirinas, esculetina, esculina y escopoletina como los posibles responsables de la actividad antiedematosa del extracto de diclorometano de Sphaeralcea angustifolia (Meckes y col., 2004; García y col.,

2006 a, b).

β-sitosterol (1): Es uno de los fitosteroles más abundantes en el Reino vegetal, habitualmente se encuentra como éster o glucósido. Comparte su estructura química con el colesterol a excepción del grupo etil en el carbono 24 de la cadena lateral. Estudios recientes revelan que una dieta rica en β-sitosterol reduce significativamente el desarrollo de hiperplasias, cáncer de colón y próstata y los niveles de colesterol en sangre. El compuesto posee actividad antiinflamatoria (Hess y Lehnert, 2005).

α y β-amirinas (2,3): Con base en la estructura de sus geninas, las saponinas triterpénicas se clasifican en tres grupos: ursano (α-amirina), oleano (β-amirina) y lupeol; son compuestos ampliamente distribuidos en el Reino vegetal y se encuentran en concentraciones importantes en alimentos verdes, productos de soya y granos. Tienen propiedades antioxidantes (impiden la oxidación de lípidos por el ataque de radicales libres). En estudios experimentales se ha demostrado que los terpenos tienen efecto contra el cáncer de pulmón, glándulas mamarias, colon, estómago, próstata, páncreas, hígado y piel. Expresan su actividad antitumoral a través de una variedad de mecanismos importantes como inhibición de la proliferación de células malignas por decrecimiento de la actividad de las proteínas oncogénicas (Tolstikova y col., 2006).

7 Cumarinas: Sólidos cristalizables de color blanco o amarillo. Presentan al UV fluorescencia azul o verde. Su estructura química cuenta con un anillo de lactona. En las plantas se encuentran como hidroxicumarinas sencillas como es el caso de 6,7- dihidroxicumarina (esculetina) (4), 6-glucósido (esculina) (5) y 6-metoxi-7 hidroxicumarina (escopoletina) (6), algunas con actividad analgésica y antiinflamatoria

(Kontogiorgis y col., 2006).

(1) (2)

8

(3)

(6)

(4) (5)

9 ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE Sphaeralcea angustifolia

En un rastreo farmacológico preliminar, el extracto de diclorometano obtenido de las hojas y tallos de S. angustifolia colectada en Atizapán, Edo. de México (ejemplar de herbario

IMSSM no.14294), administrado en una dosis de 400 mg/kg vía intraperitoneal, mostró importante actividad inhibitoria sobre la formación del edema plantar inducido con carragenina en la rata (Meckes y col., 2003). En una siguiente etapa se valoró la actividad del extracto clorofórmico en el modelo de artritis experimental ACII (adjuvante- carragenina). Los valores de inhibición en este caso fluctuaron entre 65 y 75 % en las primeras 24 horas después de administrar el proinflamatorio, bajó a 40% a las 48 horas para alcanzar los niveles del grupo control a las 72 horas. En otra serie de observaciones realizadas con el mismo modelo se administraron dosis repetidas del extracto a las 24 y 48 horas, la actividad inhibitoria registrada fue de 79% a las 48 hrs y de 51 % a las 72 horas, respectivamente (Salazar, 2003). También se ha demostrado experimentalmente el uso tópico que tiene el extracto de la planta en el modelo del edema auricular inducido en el ratón con el agente irritante 12-O-tetradecanoílforbol-13-acetato (TPA) (García, enviado a publicación). Asimismo, los efectos del extracto en modelos experimentales de inflamación crónica (artritis inducida por adyuvante) presumen cierta actividad antiartrítica

(García, enviado a publicación).

La investigación de esta especie de la herbolaria medicinal de México continúa y abarca aspectos diversos: el estudio químico, farmacológico y toxicológico, desarrollo de los procedimientos biotecnológicos para la micropropagación del vegetal y obtención de un

10 material de referencia. Aspectos todos a cubrir con el propósito de realizar en un futuro, la evaluación clínica de las potencialidades que tiene la planta como antiinflamatorio.

Basados en los resultados previos, el presente estudio valoró la actividad farmacológica de los extractos de dos muestras de Sphaeralcea angustifolia colectadas en una misma localidad. Para ello se aplicó Soxhlet como procedimiento de extracción, el cual utiliza un gradiente de temperatura superior a la ambiental. También se evaluaron los extractos en un nuevo modelo experimental (edema plantar inducido con carragenina en el ratón) y se plantea avanzar en el conocimiento sobre la actividad antiinflamatoria de la especie realizando estudios de interacción de estos extractos con un agente antiinflamatorios de uso clínico.

INFLAMACIÓN

El término “inflamación” deriva del latín inflammare, que significa encender fuego. En medicina se denomina con el sufijo itis. Es una respuesta fisiopatológica fundamental cuyo objetivo es la eliminación de cualquier estímulo nocivo introducido en el huésped y de reparar el tejido u órgano dañado. Estos estímulos nocivos incluyen agentes causales externos (microorganismos, agentes físicos, agentes químicos) y agentes causales internos

(alteraciones inmunitarias y alteraciones vasculares).

Los cuatro signos cardinales de la inflamación fueron descritos por Celsus (30 AC al 38

DC) y son: rubor (coloración roja); tumor (hinchazón); calor y dolor. Posteriormente

Galeno (130-200) añadió un quinto signo: pérdida de función. La coloración y el calor se deben a un aumento del flujo sanguíneo en el área traumática y a la constricción de las

11 vénulas. Los cambios de la microcirculación son inducidos por mediadores químicos. Estos mediadores aumentan la permeabilidad capilar para que los líquidos y las células sanguíneas pasen al espacio extravascular provocando la hinchazón y un aumento de la presión local que es el que origina el dolor (Janeway, 2003). Dependiendo de las características temporales de la inflamación definimos dos tipos de respuesta: inflamación aguda e inflamación crónica (Janeway, 2003).

Inflamación aguda:

Es la respuesta inicial a la lesión tisular de duración relativamente corta (minutos, horas o unos pocos días). En la inflamación aguda distinguimos tres puntos clave: cambios hemodinámicas, alteración de la permeabilidad vascular y modificaciones leucocitarias. Es decir, se produce una hiperhemia por dilatación de arteriolas y vénulas y apertura de los vasos de pequeño calibre. Tras esta fase aumenta la viscosidad de la sangre, lo que reduce la velocidad del flujo sanguíneo. Al disminuir la presión hidrostática en los capilares, la presión osmótica del plasma aumenta, y en consecuencia, se produce el eflujo desde los vasos sanguíneos de un líquido rico en proteínas originando el exudado inflamatorio (7).

Por tanto, la inflamación aguda se caracteriza por cambios en el calibre vascular, angiogénesis, aumento del flujo sanguíneo, aumento de la permeabilidad vascular y migración de leucocitos (predominantemente neutrófilos) desde el espacio vascular hacia el tejido dañado (diapédesis). La participación de estímulos químicos (quimiotaxis), el acumulo de un fluido rico en proteínas, de fibrina y de leucocitos en el tejido dañado son característicos en el proceso (Janeway, 2003).

12

(7)

Inflamación crónica

Cuando la inflamación dura semanas o meses se considera crónica y tiene dos características importantes: el infiltrado celular se compone fundamentalmente de macrófagos, linfocitos y células plasmáticas. La formación de tejido fibroso prevalece sobre el exudado de líquidos (Janeway, 2003). La inflamación crónica puede producirse por diversas causas: progresión de una inflamación aguda, episodios recurrentes de inflamación aguda e inflamación crónica desde el comienzo asociada frecuentemente a infecciones intracelulares (tuberculosis, lepra, etc.).

En la inflamación crónica es relevante la presencia de macrófagos y células epitelioides, linfocitos, células plasmáticas, neutrófilos, eosinófilos y fibroblastos (Janeway, 2003).

Algunas formas de inflamación crónica tienen una histología peculiar que consiste en el acúmulo de macrófagos modificados (células multinucleadas, linfocitos CD4 y CD8) que

13 forman agregados nodulares llamados granulomas (8), cuyo desarrollo es controlado por citocinas y quimiocinas, entre ellas, TNFα e IFN-γ (Abbas y Lichtman, 2004).

(8)

MEDIADORES QUE INTERVIENEN EN LA INFLAMACIÓN

MEDIADORES CELULARES

Los leucocitos son un conjunto de células sanguíneas móviles carentes de pigmento por lo que se les denomina glóbulos blancos (9). Son células con núcleo, capaces de moverse libremente mediante pseudópodos (Weil, 2004). Tradicionalmente se les clasifica en: 1) polimorfonucleares o granulocitos que agrupan, a su vez, neutrófilos, eosinófilos, y basófilos; 2) células mononucleares que comprenden a los monocitos y linfocitos, estos

últimos, son responsables de las respuestas inmunitarias (Roitt y cols., 2001, Ley, 2001).

14

(9)

Neutrófilos

Células de 7-9 um, constituyen el tipo más frecuente de leucocito (50-75%). Atraídos por quimiotaxis, los neutrófilos son los primeros en llegar a la zona dañada, su función prioritaria es fagocitar a los microorganismos, principalmente bacterias. A diferencia de los linfocitos y monocitos que circulan entre los tejidos, los neutrófilos cumplen con su función y mas tarde mueren (Roitt y cols., 2001, Ley, 2001).

Basófilos

Son los menos numerosos, constituyen sólo el 0,5% del total de las células polimorfonucelares (Weil, 2004). Tienen gránulos que sirven como depósitos para almacenar heparina, histamina y factor activador de plaquetas (FAP). Al igual que los eosinófilos, tienen en la membrana receptores para inmunoglobulinas y anticuerpos IgE, que al interactuar con el leucocito estimula la liberación de histamina (Roitt y cols., 2001,

Ley, 2001).

15

Eosinófilos

Representan 2-6 % del total de leucocitos. Son granulocitos cuya función está relacionada con la finalización de las reacciones inflamatorias, se incrementan significativamente en las reacciones alérgicas.

Monocitos y Macrófagos

Conocidos como promonocitos en su etapa de formación inicial, se convierten posteriormente en macrófagos. Los macrófagos son células fagocíticas que contienen lisosomas con enzimas que ejercen un acción microbicida contra los organismos invasores.

Poseen un núcleo reniforme con cromatina y en su membrana, receptores tales como el receptor Fc para las IgG (inmunoglobulina G). Gracias a las vacuolas que poseen, los macrófagos tienen gran capacidad de fagocitar (Cruce y Lewis, 1995).

Otras células involucradas en la respuesta inflamatoria son los fibroblastos, células especializadas del tejido conectivo que participan en la reparación de la zona dañada formando proteínas como el colágeno. Asimismo, las plaquetas son componentes celulares sin núcleo que liberan histamina y serotonina. En la inflamación, las plaquetas se adhieren al tejido dañando y forman agregados, liberan sustancias que incrementan la permeabilidad vascular y factores que activan al sistema del complemento para atraer a los leucocitos al sitio lesionado. Finalmente el factor activador de plaquetas 1-O-alquil,2-O-acetilgliceril-3- fosforilcolina (FAP) es producido por las células cebadas y los fagocitos. Sus principales funciones son inducir la activación y agregación de las plaquetas, ayudar a la quimiotaxis

16 de los eosinófilos y a la activación y degranulación de los neutrófilos y eosinófilos (Cruce y

Lewis, 1995).

La fagocitosis consiste básicamente en el reconocimiento, la ingestión celular y la digestión de agentes invasores, de materiales extraños y de células muertas. Las células se dividen en fagocíticas profesionales (neutrófilos, eosinófilos, monolitos y macrófagos) que se encargan de destruir a los antígenos y son capaces de fagocitar partículas grandes de 1 a 2 micras. Las células fagocíticas no profesionales (linfocitos, plaquetas, mastocitos, células cebadas y fibroblastos) ingieren el material extraño y después lo eliminan fragmentándolo sin procesar (exocitosis). Posteriormente, las plaquetas liberan proteínas para reparar la cicatriz del tejido dañado (Roitt y cols., 2001; Cruse y Lewis, 1995; Ley, 2001).

Linfocitos

Células mononucleares, responsables de las respuestas inmunitarias (inmune, del latín,

“estar libre de carga”). Se desarrollan a partir de progenitores linfoides inmaduros. En la inflamación de tipo crónico o tardío (48 hrs. en adelante) juegan un papel importante (Roitt y cols., 2001; Cruse y Lewis, 1995; Ley, 2001). Los linfocitos se dividen en linfocitos B

(LB) que se forman en la médula ósea y linfocitos T (LT) que se forman en el timo. Los linfocitos B están especializados en la producción de anticuerpos. Los linfocitos T son responsables de las respuestas inmunes mediadas por células, así como de funciones de cooperación para que se desarrollen todas las formas de respuestas inmunes, incluída la producción de anticuerpos por los linfocitos B (Weil, 2004).

17 Linfocitos B

Representan cerca del 5-15% de todos los linfocitos circulantes. Se producen en la médula

ósea. Se distribuyen en los tejidos linfoides secundarios, dividiéndose y diferenciándose a células plasmáticas especializadas que poseen receptores con distribución clonal, que tras interaccionar con su ligando específico (antígeno) y gracias a la acción de las citocinas secretadas por LT, producen inmunoglobulinas (Ig) denominadas anticuerpos (Ac) (Weil,

2004). Las Ig de membrana de los linfocitos B maduros constituyen parte del receptor de

Ag (10) (Roitt y cols., 2001; Cruse y Lewis, 1995; Ley, 2001).

.

(10)

Linfocitos T

Los LT se desarrollan en el timo a partir de células madre linfocíticas de la médula ósea de origen embrionario. Después expresan receptores antigénicos específicos y se diferencian en dos subgrupos. Uno expresa el marcador CD4 y el otro el CD8 (Weil, 2004). Los

18 linfocitos T se dividen en Linfocitos T “citotóxicos” (TC; células asesinas o células killers) y en linfocitos T “cooperadores” (TH; células helpers). Los linfocitos TC se activan por la presencia de células anormales (tumorales o infectadas por virus) y liberan sustancias tóxicas con el propósito de destruirla, como el factor de necrosis tumoral (TNF-α), las linfocinas (TNF-β) y el factor citotóxico NK (FCNK). Los linfocitos TH estimulan a los linfocitos Tc y cooperan con los linfocitos B para la producción de anticuerpos. Los TH liberan citocinas que activan a los fagocitos y los inducen a destruir la célula del huésped infectada por virus u otros agentes patógenos intracelulares (Roitt y cols., 2001; Cruse y

Lewis, 1995; Ley, 2001).

El receptor de linfocitos T (TCR) no reconoce, tal y como lo hacen los linfocitos B, una enorme variedad de estructuras moleculares (incluyendo hidratos de carbono) sino que está sesgado para el reconocimiento de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad

(MHC) debido a un proceso de selección que tiene lugar en el timo (Weil, 2004).

Un tercer grupo de linfocitos son las células asesinas naturales o células agresoras naturales

(natural killers NK). La NK son granulares citotóxicos que se caracterizan por tener un contenido mayor de citoplasma. Estas células carecen de receptores antigénicos, pero expresan marcadores específicos en su membrana (CD7, CD2, NK1 Y NK2). Su función principal es la destrucción de ciertas células infectadas por virus, células tumorales y células blanco recubiertas de anticuerpos IgG, a este proceso se le denomina citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (CCDA). Otra Función de estas células es su capacidad de regular la respuesta inmune a través de citocinas que liberan (IL-1 y IL-2) y puede

19 sobrevivir después de atacar a la célula blanco, liberando el proteoglucano (controitin- sulfato A) que almacena en sus vesículas (Roitt y cols., 2001; Cruse y Lewis, 1995; Ley,

2001).

COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD (MHC)

El MHC fue descubierto por su implicación en el rechazo o aceptación de transplantes o injertos de tejidos u órganos; de ahí deriva su nombre de Complejo Principal de

Histocompatibilidad (MHC, del inglés Major Histocompatibility Complex). Es un conjunto de glicoproteinas específicas de la membrana celular codificadas por un conjunto de genes alineados en una región continua del genoma. En el ratón se localiza en el cromosoma 17, y recibe el nombre de región H-2. En la especie humana se sitúa en el cromosoma 6, y se conoce como región HLA (antígeno leucocitario humano). Aunque la organización de los genes es algo diferente en ambas especies, en las dos se pueden apreciar tres grandes zonas, que determinan tres tipos de moléculas: a) Genes de clase I (MHC-I) (13), b) Genes de clase II (MHC-II) (13), c) Genes de clase III (MHC-III). Estos tres tipos de moléculas permiten al sistema inmunológico distinguir entre las células propias del organismo y las extrañas (Abbas y Lichtman. 2004).

MEDIADORES QUÍMICOS

Los mediadores químicos son sustancias endógenas que se encuentran en el plasma y los tejidos, son relevantes en el proceso inflamatorio. En el plasma hay sistemas enzimáticos

20 que juegan un papel importante en la homeostasis y el control de la inflamación, éstos son el sistema de las cininas, el sistema del complemento, el sistema de coagulación y el sistema fibrinolítico. Con excepción del sistema del complemento, los otros sistemas utilizan al factor Hageman (Fc XII) como agente que dispara la serie de reacciones en cascada, característica para cada sistema. Por otra parte en los tejidos hay mediadores químicos de la inflamación tales como aminas, lípidos ácidos, componentes lisosomales y productos generados por los linfocitos (Tabla 1).

Mediadores químicos del plasma y tejidos

PLASMA TEJIDOS 1.- Sistema de las cininas 1.- Aminas Bracidicina, calicreína Histamine, serotonina, heparina

2.- Sistema del complemento 2.- Lípidos ácidos C3a, C5a, C567 SRS-A, prostaglandinas 3.- Sistema de la Coagulación 3.- Componente Lisosomales fibirinopéptidos proteínas catiònicas proteasas ácidas proteasas neutras

4.- Sistema Fibrinolítico 5.- Citocinas plasmina

Tabla 1: Resume los mediadores químicos de la inflamación aguda de acuerdo con su origen

21 MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN EN EL PLASMA

Sistema de las cininas

El sistema de las cininas constituye un grupo de péptidos del plasma que se producen por hidrólisis enzimática (Diagrama 1). Dos importantes mediadores de la inflamación aguda son la bradicinina y la lisil-bradicinina o calidina, las cuales forman parte de las sustancias llamadas autacoides. Autacoide viene del griego (autos -> propio y akos -> Alivio) y está definido como una sustancia formada metabólicamente por un grupo de células que altera la función de otras células a nivel local (Roitt y cols., 2001).

La bradicidina es un nonapéptido (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg) vasoactivo que incrementa la permeabilidad vascular, produce dolor, vasodilatación, contracción del músculo liso e intervienen en la diapédesis de los leucocitos. El péptido se forma a partir de cininógenos del plasma por la acción enzimática de la calicreína. Esta última se origina a su vez, a partir del calicreinógeno que se activa por diversas enzimas como el factor

Hageman, el C1 activado y la trombina (Roitt y cols., 2001).

La calidina o lisil-bradicinina (lys-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Lys) es un factor que se origina por activación del sistema de la plasmina (enzima fibrinolitica generada del plasminógeno) o por las enzimas liberadas a partir de los tejidos lesionados (Roitt y cols.,

2001).

22 Sistema del complemento

El sistema del complemento (SC) es un conjunto de proteínas del plasma que da origen a diversos mediadores químicos de la inflamación como el C5, C3 y el complejo C567 transportados por la sangre. Estos mediadores producen aumento de la permeabilidad vascular, inician la movilización de los granulocitos y tienen acción quimiotáctica sobre linfocitos y monocitos (Roitt y cols., 2000; Cruse y Lewis, 1995; Ley, 2001).

Activación del sistema de las cininas

Diagrama 1: Muestra la activación del sistema de las cininas en el cual el factor de Hageman actúa sobre la precalicreína para generar calicreína (enzima) que a su vez, libera bradicinina a partir de un cininógeno molecular, sustrato. Por otra parte, la procalicreína es activada por diversas enzimas para formar calicreína hística que libera lisil-bradicinina (Roitt y cols., 2001).

23 Las funciones principales del SC se relacionan con la defensa que presenta el organismo ante la invasión de microorganismos y la eliminación de inmunocomplejos. Cuando el SC se activa ocurren 3 mecanismos importantes: la activación de los leucocitos, la opsonización y la lisis de las células blanco (Roitt y cols., 2001; Cruse y Lewis, 1995; Ley,

2001).

La activación de los leucocitos, principalmente de los fagocitos, ocurre por la interacción de las proteínas del SC con los receptores en sus membranas. Al producirse la unión con el receptor se inician y amplifican los procesos de quimiotaxis, fagocitosis, inflamación y activación celular (Roitt y cols., 2000; Cruse y Lewis, 1995; Ley, 2001).

La opsonización en un fenómeno por el cual las células blanco (o células diana) que son primordialmente microorganismos, se recubren con proteínas del sistema del complemento.

A su vez las células fagocíticas como los macrófagos presentan en su membrana receptores de unión con los factores opsonizantes lo cual facilita la adherencia e ingestión de las células opsonizadas (endocitosis) (Roitt y cols., 2001; Cruse y Lewis, 1995; Ley, 2001).

Finalmente, la activación del sistema del complemento tiene como propósito la formación de un complejo de ataque a la membrana (CAM) de la célula blanco. Por lisis enzimática, la proteína C5 se une con otras proteínas del sistema del complemento (C3b, C6, C7) formando el complejo proteico C5b6789, que genera las llamadas moléculas formadores de poros (MFP). Los linfocitos T insertan una MFP en la membrana de las células blanco y las destruyen (Roitt y cols., 2001; Cruse y Lewis, 1995; Ley, 2001).

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El SC es activado por las vías clásica y alterna. Recientemente se ha descrito una tercera vía, conocida como vía de la lectina, aun no bien entendida en su totalidad. Esta vía en la cual interviene como principal componente la lectina monosa, tiene como objetivo la destrucción de bacterias y otros microorganismos. La vía clásica del complemento es un mecanismo dirigido por anticuerpos y se inicia cuando se une el anticuerpo con dos o más dominios globulares del C1q. El C1q se une a su vez con dominios CH2 (parte de la región

Fc) de las moléculas de IgG, o bien, con los dominios de CH3 de la molécula de IgM. A diferencia de la vía clásica, la vía alterna es activada por la presencias de microorganismos y en este caso, C3 es la proteína que juega un papel importante. Ambas vías generan enzimas (Roitt y cols., 2001; Cruse y Lewis, 1995; Ley, 2001).

Muchas de las proteínas del SC requieren de la lisis proteolítica para activarse y como resultado de este proceso resultan fragmentos. Algunos fragmentos del SC estimulan la quimiotaxis y la activación de leucocitos, muy particularmente C3a y C5a. Estos dos fragmentos son quimiotácticos para los neutrófilos e intervienen en la degranulación de los basófilos y de los mastocitos. La respuesta fisiológica a este efecto es la contracción del músculo liso vascular mediada por la histamina y los leucotrienos, degradación de los mastocitos, activación y la quimiotaxis de los neutrófilos, lisis de las células extrañas como bacterias, aumento de la permeabilidad vascular y migración de los neutrófilos y monocitos fuera de los vasos sanguíneos. Al mismo tiempo, los fragmentos C3 y C4 actúan como opsoninas ya que favorecen la fagocitosis (Roitt y cols., 2001; Cruse y Lewis, 1995; Ley,

2001).

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Sistema de la coagulación

El sistema de la coagulación es desencadenado por el factor Hageman que es estimulado por el tejido lesionado o por componentes microbianos. La fibrina es un multímero entrecruzado formado a partir de la activación del fibrinógeno. La red de fibrina permite la formación de trombos y ayuda a concentrar las células fagocíticas en el sitio dañado. La trombina es la proteína que intervienen en la transformación de fibrinógeno a fibrina y cataliza la presencia de mediadores de otros sistemas, su precursora es la protrombina. De este modo, el plasma se “gelifica” reforzando la formación del coagulo constituido por células, finalmente de fibrina y fibrinopéptidos (Roitt y cols., 2001; Cruse y Lewis, 1995;

Ley, 2001).

Sistema fibrinolítico

El sistema fibrinolítico tiene la función de remover el coágulo de fibrina en el tejido lesionado. El producto final de esta vía es la plasmina, enzima proteolítica que deshace los coágulos transformados en productos de degradación que son quimiotácticos para los neutrófilos y a su vez contribuye a la respuesta inflamatoria activando al complemento por la vía clásica. La plasmina es capaz de dirigir la fibrina y otras proteínas tales como el factor XI, C1, C3, C5, entre otras. El precursor de la plasmina es el plasminógeno, proteína que se transforma por acción de otras enzimas de origen inflamatorio (calicreína y factor

Hageman), tisular, (urocinasa) o microbiano (estreptocinasa) (Roitt y cols., 2001; Cruse y

Lewis, 1995; Ley, 2001).

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MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN EN LOS TEJIDOS

Aminas

La histamina (β−aminoetilimidazol) es uno de los primeros mediadores que intervienen en la etapa temprana del proceso inflamatorio agudo, produce síntomas alérgicos y la formación del edema. En el organismo, la histamina se almacena en los gránulos citoplasmáticos de los mastocitos (células cebadas) y de los basófilos. La liberación de la histamina por el proceso de degranulación citoplasmática inicia con la interacción de un antígeno (venenos, toxinas, medicamentos, entre otros) con los anticuerpos IgE de la membrana celular de los mastocitos y basófilos. El compuesto actúa como un agente vasodilatador, relajante e inductor de la contracción del músculo liso; además, es un inhibidor de la secreción lisosomal de los neutrófilos y los basófilos (Goodman y cols,

1990, Roitt y cols., 2001; Cruse y Lewis, 1995; Ley, 2001).

La serotonina (5-hidroxitriptamina) también es otro de los autocoides que intervienen en la fase temprana de la inflamación. Es una amina vasoactiva localizada en los gránulocitos de los mastocitos, basófilos, plaquetas y, en el cerebro, induce la contracción del músculo liso y cambios en la permeabilidad vascular (Goodman y cols., 1990). Se desconoce cual es su papel exacto en la respuesta inflamatoria aguda (Roitt y cols., 2001; Cruse y Lewis, 1995;

Ley, 2001).

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Lípidos ácidos

Cuando se dañan las membranas de los macrófagos, monocitos, neutrófilos, mastocitos y otras células, se produce ácido araquidónico (AA) y el factor activador de plaquetas (FAP).

Rutas metabólicas del ácido araquidónico: El ácido araquidónico es metabolizado por dos vías. En la primera vía participa la enzima ciclooxigenasa (COX) generando mediadores de la inflamación como las prostaglandinas (PGs), y tromboxanos (TXA2) (McAdam y cols,

2000). Las prostaglandinas (PGs) (Diagrama 2) ejercen efectos sobre la presión sanguínea, la estimulación de la contracción del músculo liso, la regulación de la inflamación, la coagulación de la sangre y la respuesta inmune. También aumentan la permeabilidad y la dilatación vascular, inducen la quimiotaxis de los neutrófilos, el bloqueo de la expresión de las moléculas del MHC e inhiben la proliferación de los linfocitos T. Estos agentes son liberados por distintas células del sistema inmune, los neutrófilos producen PGE2, los monocitos, macrófagos producen PGE2 y PGF2 y las células cebadas PGD2 (en reacciones anafilácticas de hipersensibilidad tipo 1). A su vez, los TXA 2 son mediadores de la inflamación que inducen la agregación plaquetaría y son potentes vasoconstrictores. La prostaciclina (PGl2) se encuentra en las células endoteliales y se comporta como un antiagregante y vasodilatador (Diagrama 2 y 3). Las dos formas de la ciclooxigenasa son

COX-1 y COX-2. La primera es una isoforma constitutiva que se encuentra en los vasos sanguíneos, estómago y riñones, regula muchas funciones fisiológicas a través de la liberación de PGs. La COX-2 se encuentra en los tejidos, es producida en altas concentraciones durante el proceso inflamatorio (McAdam y cols, 2000).

28 En la segunda vía interviene la enzima 5-lipooxigenasa (5-LOX) presente en los leucocitos, las plaquetas y las células pulmonares. Dicha enzima interviene en la formación de leucotrienos (LT), éstos son mediadores producidos por diversas células como monocitos, los macrófagos, las células cebadas y los basófilos. Los LT son cuatro tipos: LTB4, LTC4,

LT4 y LTE4. Los leucotrienos LTC4, LTD4 y LTE4 constituyen el complejo conocido como la sustancia de acción lenta de la anafilaxia (SRS-A) Y (LTB4) es un potente quimiotáctico de neutrófilos. La función principal de estas lipoproteínas es la contracción lenta del músculo liso, el aumento de la permeabilidad vascular e intervienen en las reacciones inmediatas de hipersensibilidad de tipo I (McAdam y cols, 2000).

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Metabolismo del acido araquidónico

Diagrama 2. La ruta cíclica del metabolismo del ácido araquidónico esta ramificada conduciendo a las prostaglandinas, las prostaciclinas, y los tromboxanos.

30

Diagrama 3. Ruta cíclica y lineal del metabolismo del ácido araquidónico

Citocinas

Las citocinas son un grupo de moléculas protéicas o peptídicas, forman parte del sistema de señales que se producen entre células durante la respuesta inmunológica. Por su origen, se dividen en monocinas que son sintetizadas por los macrófagos y en linfocinas producidas por los linfocitos T activados y las células asesinas naturales (NK). Entre las monocinas se incluye a la interleucina-I (IL-1), el factor de necrosis tumoral (TNF), interferones α y β

(IFN) y factor estimulador de colonias. Las linfocinas incluyen interleucinas, interferón gamma, factor estimulador de colonias (granulocito-macrofago) linfotoxinas. Los interferones (IFN) se producen en las fases tempranas de la infección y constituyen la primera línea de defensa contra varios virus; son sintetizados por los linfocitos T, los

31 fibroblastos y otras células que son estimuladas por la presencia de virus, antigenos o lectinas. Las interleucinas (IL) son un grupo de citocinas producidas por los linfocitos TH, monocitos y otras células que promueven el crecimiento de los linfocitos T y linfocitos B

(Roitt y cols., 2001; Cruse y Lewis, 1995; Ley, 2001).

FÁRMACOS ANTIINFLAMATORIOS

Antiinflamatorios no esteroideos (AINES): Los salicilatos y su derivado ácido acetil salicílico (aspirina) son representante de este grupo de agentes antiinflamatorios. Actúan inhibiendo a la ciclooxigenasa (COX), proteína integrante de las membranas microsomales y de la membrana nuclear. La COX favorece la oxidación del AA con la formación de un endoperóxido cíclico, el PGG2, del que deriva el otro endoperóxido, el PGH2. Este, último, por acción de la protaciclinsintetasa, se transforma en prostaciclina (PGI2) que es un poderoso antiagregante y vasodilatador. Por acción de la tromboxanosintetasa se transforma en TxA2, que es un poderoso agregante plaquetario y vasoconstrictor. Finalmente, la PGH2 por la acción de la PGDsintetasa, PGEsintetasa y PGFsintetasa da origen a las prostaglandinas PGE2, PGD2 y PGF2 (Leza y Lizasoain, 2005).

Existen dos isoformas de COX, COX-1 y COX-2. La COX-1 es una enzima «constitutiva», con actividad permanente en todas las células del organismo, salvo en los hematíes. La

COX-2 es una enzima «inducida» por estímulos inflamatorios. La COX-1 es responsable de la producción continua de prostaciclina, la cual mantiene la integridad vascular, muy especialmente de la mucosa del tracto digestivo. Por intermedio de la PGE2 mantiene el

32 flujo renal. La PGD2 inhibe la agregación de las plaquetas y la degranulación de los polimorfonucleares, pero origina broncoconstricción y aumenta la vascularización en la mucosa nasal con la producción de rinitis. La PGE2 activa los leucocitos y las plaquetas produciendo fiebre, edema y eritema. Actúa de modo sinérgico con la bradicinina, la interleucina 1 (IL-1) y la histamina, produciendo broncoconstricción. Es una prostaglandina con gran actividad inflamatoria. Por tanto los efectos secundarios de los AINES se deben fundamentalmente a la inhibición de la COX-1 interrumpiéndose de esta forma la síntesis de prostaglandinas, prostaciclinas y tromboxanos (Leza y Lizasoain, 2005).

Antiinflamatorios esteroideos (AIES): El representante natural es el cortisol, hormona glucocorticoide. Estos agentes antiinflamatorios inhiben la producción de moléculas proinflamatorias, derivadas del ácido araquidónico vía la inhibición de la fosfolipasa A2, inhiben la activación de moléculas de adhesión ICAM-1, ELAM-1, citocinas IL-1, IL-2, IL-

6, IL-8, TNFα, γ-interferón y Factor Estimulante de Colonias (GM-CSF) (Shimmer y

Parker 2001).

VÍA DE ADMINISTRACIÓN INTRANASAL DE FÁRMACOS

Los beneficios que aporta la vía intranasal es la rápida instalación del efecto (latencia rápida), es una técnica no invasiva y evita el metabolismo hepático de primer paso (11).

Los fármacos pueden administrarse con spray nasal, hisopos saturados con el fármaco, con nebulizador o soluciones nasales. Las soluciones nasales son formas farmacéuticas líquidas destinadas a ser aplicadas sobre la mucosa nasal. Según el modo de aplicación se debe

33 distinguir entre las gotas nasales y los nebulizadores. Las primeras se administran por instilación sobre cada fosa nasal y se envasan en frascos cuentagotas, los nebulizadores se aplican presionando un recipiente plástico de paredes flexibles en cada fosa nasal (Esteve y

Mitjans, 2002).

(11)

El objetivo de esta terapéutica es depositar la droga en la mucosa para que alcance las venas capilares submucosas e ingresen a la circulación sistémica. Algunas fracciones del fármaco aplicado por esta vía pasarán al tracto respiratorio superior y pulmones, otra podrá depositarse en la capa de moco y otra podrá ser deglutida. El epitelio no olfatorio está altamente vascularizado y cubierto por un epitelio seudoestratificado y columnar. El moco que cubre el epitelio nasal presenta una doble capa y consiste en 95% agua, 1%-2% sal, y

2%-3% mucina. El fármaco debe ser, tanto hidrosoluble como liposoluble para alcanzar la mucosa nasal. Las ventajas de dicha vía de administración sobre las vías de administración sistémicas clásicas, oral y parenteral son: 1) el fármaco ingresa directamente al tejido diana, obteniéndose mayores concentraciones en el lugar de acción y menores en el resto del organismo con lo que se aumenta el efecto farmacológico deseado y disminuyen los efectos

34 secundarios sistémicos no deseados, 2) disminuye la cantidad de fármaco a administrar, 3) el efecto sistémico es más rápido (Esteve y Mitjans, 2002).

Dexametasona (solución nasal); Nombre Comercial: Dexametasona®.

Pertenece a la familia de los AIES (corticoide sistémico). Su semivida biológica es de 36 a

54 horas. Por sus características lipofílicas se absorbe rápida y fácilmente por la mucosa nasal, alcanzando las máximas concentraciones plasmáticas al cabo de 1-2 horas. La dexametasona y sus derivados, dexametasona fosfato sódico y dexametasona acetato son glucocorticoides sintéticos utilizados como antiinflamatorios e inmunosupresores. En la circulación sistémica, se une débilmente a las proteínas plasmáticas, siendo activa la porción no unida a las proteínas (Gries y col, 2000).

Posee como núcleo básico al ciclo pentano perhidrofenantreno. En el anillo A, el grupo cetónico en C3 y la doble ligadura entre C4 y C5 son imprescindibles para la actividad farmacológica. En el anillo B, la fluoración o cloración en C6 o en C9 incrementa los efectos farmacológicos. Para ejercer el efecto antiinflamatorio se requiere de grupos OH en el C11 del anillo C y la metilación en C16 del anillo D incrementa marcadamente la potencia del efecto. Una característica que es común para lograr la actividad antiinflamatoria de los corticoides es el hidroxilo en C17-α (12) (Gries y col, 2000).

35

(12)

La dexametasona disminuye la tetrada inflamatoria local (rubor, calor, dolor y edema)

(Gries y col, 2000) y su mecanismo de acción se vincula con la inhibición de la fosfolipasa

A2 a través de las lipocortinas, proteínas de acción anticoagulante las cuales pertenecen, a la llamada proteína anticoagulante placentaria (PAP). A su vez, las lipocortinas controlan la biosíntesis de una serie de potentes mediadores de la inflamación como son las prostaglandinas y los leucotrienos. Algunas de sus respuestas son la reducción del edema y una supresión general de la respuesta inmunológica, ya que disminuye la acumulación de líquidos, el depósito de la fibrina, la dilatación capilar y la migración de leucocitos al área.

Inhibe también la movilización y reclutamiento de macrófagos, así como la producción del

PAF, de PGs, leucotrienos y liberación de histamina, impide la interacción entre el factor quimiotáctico específico y los neutrófilos, factores todos que previenen la reacción inmunológica inflamatoria. En las reacciones de hipersensibilidad retarda la disponibilidad de linfocitos y monocitos-macrófagos, inhibe la síntesis de IgE y de ácido araquidónico e

36 incrementa el número de los receptores β−adrenérgicos en los leucocitos (Gries y col,

2000).

Entre los efectos adversos observados cabe señalar: ronquera, irritación de boca y garganta y debido a sus efectos inmunosupresores, son frecuentes las candidiasis orales. Los efectos secundarios más frecuentes después de la administración intranasal son la irritación y sequedad de la nariz y de manera muy esporádica se ha descrito perforación del tabique nasal en los pacientes tratados con glucocorticoides por está vía (Davis y col, 2000).

INTERACCIÓN DE AGENTES ANTIINFLAMATORIOS

La interacción que ocurre entre dos o más fármacos puede producir un efecto farmacológico de intensidad mayor o menor a la prevista e implica modificaciones de los efectos de uno o de ambos agentes (Berenbaum, 1989; Chou, 2006).

En el campo de la investigación de productos naturales, el estudio sobre las interacciones entre fármaco-fármaco o fármaco-alimento surge en la actualidad con gran interés (Fugh-

Berman y Ernst 2001); sin embargo, en la literatura científica, aún son escasos los reportes sobre el tipo de interacciones posibles entre agentes terapéuticos y extractos de plantas medicinales. La administración conjunta de productos naturales con los agentes terapéuticos convencionales puede inducir variaciones en la magnitud del efecto esperado.

Este tipo de interacciones ocurren por mecanismos farmacocinéticos si afectan a los procesos de absorción, distribución, metabolismo y excreción o bien, farmacodinámicos si alteran la acción farmacológica.

37

Las interacciones farmacodinámicas resultan de efectos aditivos, sinérgicos o antagónicos entre fármacos y plantas con las mismas propiedades farmacológicas. Si la administración simultánea de dos o más fármacos manifiesta efectos de manera independiente, no existe interacción y se habla de efectos aditivos (suma de efectos o interacción cero); sin embargo, si los efectos observados son de mayor o menor magnitud a los esperados, se considera que existe sinergismo o antagonismo, respectivamente.

Análisis isobolográfico

El isobolograma es un método de representación gráfica construido en un sistema de ejes de coordenadas en el que se ubican las dosis iso-efectivas (para un determinado nivel de efecto) de cada uno de los fármacos utilizados individualmente y de sus combinaciones. La combinación aditiva es una recta diagonal que une las dosis isoefectivas de los fármacos

(13) (Loewe 1927). En el análisis de interacciones con isobologramas se aplica el cálculo de las dosis teóricamente aditivas para cada nivel de efecto y su comparación estadística con las dosis que producen el mismo efecto, pero obtenidas experimentalmente.

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(13)

MODELO DE INFLAMACIÓN AGUDA INDUCIDA CON CARRAGENINA

La carragenina o carragenano es una mezcla de polisacáridos sulfatados que se obtienen frecuentemente a partir de Chondrus crispus, alga marina de la familia Rhodophyta. El nombre de carragenina se deriva de la costa Irlandesa Irish de Carragheen. Desde el punto de vista de la estructura química, estos constituyentes son copolimeros formados por unidades α-(1 3)-D-galactopiranosa y β-(1 4)-D-galactopiranosa o bien L-galactosa

(Zimecki y col., 2006). Existen varios tipos de carrageninas que difieren entre si por el número de ésteres de sulfato y/o de otros sustituyentes en la molécula:

• Carragenina tipo kappa (Tipo III): β-(1 4)-3,6-anhidro-D-galactopiranosa-4-

sulfato Es producida por la eliminación alcalina de µ-carragenina. Se obtiene de la

39 especie marina Euchema catónii. Este tipo de carragenina contiene gran cantidad de

sulfatos en su estructura, razón por la cual forma geles muy rígidos.

• Carragenina tipo lamda (Tipo IV): β-(1 4)-D-galactopiranosa-2,6-disulfato. Su

peso molecular alcanza los 600-700 kDa. Se obtiene de Gigartina pistillata o

Chondrus crispus. Es convertida en θ-carragenia por eliminación alcalina, pero en

la mayoría de casos produce carragenina tipo kappa. Contiene un grupo sulfato en

cada disacárido, no forma geles (14).

(14)

• Carragenina tipo iota (Tipo V): α-(1 4)-3,6-anhidro-D-galactopiranosa-2-sulfato. Es

producida por la eliminación alcalina de ν-carragenina. Se obtiene de Eucheuma

denticulatum y se caracteriza por formar geles flexibles.

La diferencia estructural de cada uno de los tipos de carragenina, determina la diferencia en sus actividades biológicas. Todos los tipos de carrageninas son considerados agentes

40 flogísticos, aunque los mecanismos que participan en la formación del edema suplantar en el animal de laboratorio no se conocen con certeza. En la rata, se ha descrito que durante las primeras tres horas después de la administración vía plantar de la carragenina tipo lambda, se produce un comportamiento bifásico en la formación del edema plantar (15). En la primera fase se registra un incremento gradual del edema en el transcurso de la primera hora, seguido de una segunda fase que dura hasta tres horas después de la administración de la carragenina, y que se caracteriza por un incremento abrupto que presenta el edema a partir de los 90 minutos (Vinegar y col., 1969).

(15)

El mecanismo de acción de la carragenina se vincula directamente con el proceso de respuesta inflamatoria. La secuencia de dicho proceso descrito en la rata es el siguiente:

1. Inyección suplantar de la carragenina (T0). 2. Absorción de pequeñas partículas de carragenina por las células cebadas (T0 a T10). 3. Daño a las células cebadas por la carragenina (T0 a T10).

41 4. Inicio del metabolismo del AA (T2 a T10). 5. Síntesis de Prostaglandina responsables de la hiperalgesia (T2 a T10). 6. Degranulación de células cebadas (T2 a T10). 7. Liberación de serotonina que provoca vasodilatación y en consecuencia hiperemia (T2 min a T10días). 8. Hipoalgesia producida por la serotonina liberada (T2 a T60min). 9. Gradiente osmótica (dependiente de carragenina) establecido entre el sitio de inyección y el tejido que lo rodea (T2 a T60min). 10. Desarrollo gradual del tercer factor del edema ocasionado por fuerzas de tipo osmóticas (T2 a T60min). 11. Citotoxicidad a células endoteliales causado por la absorción de carragenina (T30 a T240min). 12. Liberación de IL-1 por las células dañadas (T30 a T240min). 13. Alteración de la superficie del tejido endotelial dañado causado por la liberación de de

IL-1β y TNFα (T3hrs). 14. Adhesión de neutrófilos a la superficie del endotelio dañado (T30 a T3hrs). 15. Diapédesis de los neutrófilos (T30 a T3hrs). 16. Atracción de los neutrófilos al sitio dañado mediante quimiotaxis de una enzima liberada por las células dañadas, donde interviene la IL-8 (T30 a T3hrs). 17. Fagocitosis de la carragenina por los neutrófilos (T30 a T3hrs). 18. Daño a las vacuolas de los neutrófilos ocasionado por la carragenina (T60 a T3hrs). 19. Fusión de lisosomas a las vacuolas dañadas (T60 a T3hrs). 20. Degranulación de los lisosomas dentro de las vacuolas (T60 a T3hrs). 21. Daño a la membrana de las vacuolas ocasionada por la enzima lisosomal (T60 a T3hrs). 22. Liberación intracelular de enzimas lisosomales por los neutrófilos (T60 a T3hrs). 23. Daño enzimático ocasionado a la membrana de los neutrófilos (T60 a T3hrs). 24. Liberación de las enzimas lisosomales de los neutrófilos en el tejido dérmico (T60 a T3hrs). 25. Síntesis y liberación de PG de los neutrófilos (T60 a T3hrs). 26. La PG incrementa la permeabilidad de las células endoteliales así como también la sensibilidad de las terminaciones nerviososas. 27. Desarrollo del edema y de hiperalgesia (T60 a T3hrs). 28. Alteración de la superficie del endotelio por los neutrófilos (T60 a T3hrs). 29. Adherencia de los monolitos al endotelio (T7 a T12hrs). 30. Diapédesis en los monolitos (T7 a T12hrs). 31. Quimiotaxis de los monocitos (T7 a T12hrs). 32. Fagocitosis de los neutrófilos por los monocitos (T7 a T24hrs). 33. Disminución del edema (T7 a T24hrs). 34. Fagocitosis de los neutrófilos por los monocitos (T7 a T48hrs). 35. Disminución de la hiperemia (T24 a T72hrs). 36. Estimulación del fibroblasto y proliferación del tejido vascular de la dermis (T6 a T15dìas). 37. Incorporación de monolitos en el nuevo tejido (T6 a T15dìas). 38. La dermis vuelve a su estado normal (T15dìas). 39. Formación de edema extracelular en la epidermis (T4 a T48dìas). 40. Hiperplasia en la epidermis (T12 a T36hrs). 41. Hiperqueratosis de la epidermis (T2 a T20dìas). 42. Lo epidermis vuelve a su estado normal (T20dìas).

(Vinegar y col. 1969; Beloeil y col., 2005).

42

OBJETIVO GENERAL

El presente estudio propone la valoración química-farmacológica de los extractos de dos muestras de Sphaeralcea angustifolia colectadas en una misma localidad. Aplicando un procedimiento de extracción en Soxhlet, se determinará si mejora el contenido de los principios activos en los extractos, así como el efecto antiedematoso en un modelo experimental in vivo. Asimismo, para avanzar en el conocimiento sobre la actividad antiinflamatoria de la especie, se realizarán estudios de interacción del extracto activo con agentes antiinflamatorios de uso clínico.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

1. Obtener en Soxhlet los extractos de las dos muestras colectadas en una misma

localidad (Caxuchi en el Estado de Hidalgo).

2. Analizar el contenido de escopoletina.

3. Evaluar la actividad antiedematosa de los extractos

4. Valorar la interacción del extracto activo con un agente antiflogístico conocido

(dexametasona).

5. Analizar los resultados obtenidos

43 HIPÓTESIS

1. La extracción con un disolvente de mediana polaridad a una temperatura superior a la ambiental, podría acelerar el proceso de extracción y mejorar el contenido de los marcadores con actividad antiinflamatoria.

2. Como muchos agentes terapéuticos de origen natural, el extracto activo de Sphaeralcea angustifolia podría tener una interacción aditiva, sinergia o antagonismo con algunos de los agentes antiinflamatorios de uso clínico.

44 METODOLOGÍA

MATERIAL VEGETAL

Las dos muestras de Sphaeralcea angustifolia a estudiar fueron colectadas en la localidad de Caxuchi en el Estado de Hidalgo en el mes de mayo del 2005. Ejemplares de herbario fueron identificados por la M. en C. Abigaíl Aguilar y quedaron depositados en el Herbario de plantas medicinales IMSSM.

PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS

Las partes aéreas del material vegetal (100 g) correspondientes a las dos muestras colectadas, secas y molidas con molino eléctrico se extrajeron exhaustivamente con hexano (Hex) por medio de Soxhlet. Una vez eliminada las grasas, el vegetal se maceró con diclorometano (CH2Cl2) empleando Soxhlet en el procedimiento de extracción. Los extractos obtenidos se filtraron y concentraron a sequedad a presión reducida, calculando el rendimiento con base en el peso del material vegetal seco.

ANÁLISIS DE LOS CONSTITUYENTES DE LOS EXTRACTOS

Perfil cromatográfico en capa fina (TLC thin layer chromatography)

Con base en los estudios químicos previos realizados (García, enviado a publicación) se determinó la presencia de los marcadores en los extractos (β-sitosterol, α y β-amirinas, escopoletina, esculetina y esculina) utilizando cromatofolios de gel de sílice como fase

45 estacionaria y mezclas de Hex y AcOEt como sistema de elusión (fase móvil). Por medio de UV (λ= 256 y 320) y reacciones de coloración se detectaron los compuestos.

Análisis por cromatografía líquida de alta presión (HPLC)

De acuerdo con los estudios realizados (Olivares, 2005), para el análisis por HPLC de los extractos se utilizo el equipo de cromatografía líquida de alta precisión Waters 600 equipado con un sistema de bombas binarias, detector de diodos modelo LP-996 y

Programa Millenium. Los extractos en una concentración de 20 mg/ml se filtraron a través de filtros Waters de 0.45 µm. Alícuotas de 100 µl de la muestra se inyectaron para su separación en una columna semipreparativa de fase reversa Waters Spherisorb-S10

(10x250mm), utilizando un sistema de elusión por gradiente como se indica en la tabla 2 con disolventes grado HPLC (marca Tecsiquim y Técnica química) previamente filtrados a través de equipo Millipore. Como estándares de referencia se emplearon esculina, esculetina, escopoletina, ácido caféico y clorogénico, quercetina, rutina y canferol

(SIGMA).

Tiempo de corrida Disolventes empleados (ml/min) Volumen del flujo (min) Acetonitrilo Ac. Fórmico (aq 5%) (ml) 1 20 80 2 4 50 50 1.5 8 60 40 1.5 10 70 30 1.5 12 100 0 1.5 20 20 80 2

Tabla 2 Condiciones analíticas para el análisis por HPLC del extracto (20 mg/ml) y estandares (1mg/ml) disueltos en MeOH.

* Olivares, 2005

46 MODELOS BIOLÓGICOS

Edema plantar inducido con carragenina en el ratón (inflamación aguda)

Para la determinación del efecto antiedematoso se tomó como base la técnica descrita por

Winter y col., 1962 y estandarizada en la Unidad de Investigación Médica en Farmacología de Productos Naturales, IMSS (Juárez, 2006) para el estudio en ratones. Ratones machos de la cepa BALB-C con un peso aproximado entre 20-22 g de peso corporal, mantenidos sin ayuno previo y con acceso libre al agua se dividieron en grupos control, carragenina y extracto (cinco animales por grupo). Tanto el extracto como el vehículo (PBS con 1% de

Tween-20) en los grupos control negativo y positivo se administraron 30 min antes del agente flogístico, posteriormente se inyectaron 10 µl de carragenina tipo IV lamda (Sigma

Chemical Company, USA) al 1% en una suspensión con PBS en la región subplantar de una de las extremidades posteriores de los animales. El extracto y vehículo se administraron vía intraperitoneal (100 mg/kg) o vía intranasal (dosis variables hasta 0.50 mg/fosa). La formación del edema se midió con un micrómetro a diferentes tiempos (hasta 48 horas) y los resultados se expresaron como la diferencia del tamaño del edema respecto al valor inicial antes de la carragenina y el efecto inhibitorio sobre el edema se calculó como porciento respecto al grupo control positivo.

47 Interacción del extracto con dexametasona, antiinflamatorio de uso clínico

Siguiendo el modelo biológico arriba descrito, se procedió al estudio de la interacción entre el extracto y dexametasona, un fármaco antiinflamatorio; ambos productos se aplicaron vía intranasal. La interacción entre los fármacos se determinó aplicando el análisis isobolográfico. La eficacia del efecto antiedematoso del extracto, la dexametasona y las combinaciones en los grupos de ratones tratados con carragenina se expresó calculando los valores DE50 determinados a las 3 y 5 horas después de administrar el proinflamatorio. Para la obtención de los valores DE50 se construyeron las curvas log dosis-respuestas de los fármacos utilizando grupos de 5 animales cada uno (control y dosis x1-xn). La dosis que produce el 50% del efecto máximo (DE50) se calculó por regresión lineal de cuadrados mínimos y los errores estándares según Tallarida (2002) y Porecca (1990). Los valores

DE50 de la dexametasona (A) y del extracto (B) se marcaron en el eje de las abscisas (X) y ordenadas (Y), respectivamente, uniendo ambos puntos con una recta (línea de aditividad).

Con respecto a las interacciones entre los fármacos se administraron combinaciones de dexametazona y de extracto en proporciones 1:1, 1:2; 1:3 y 6:1. Para cada mezcla se determinó la DE50 y se comparó estadísticamente con la dosis que representa teóricamente la aditividad aplicando la fórmula:

La DE50 experimental de la mezcla en el sistema de coordenadas, en relación al valor teórico, determina el tipo de interacción. Si el valor experimental es estadísticamente diferente al valor teórico y se ubica por debajo de la línea de aditividad, la interacción es de tipo sinergista; próximo a la línea de aditividad y no significativamente diferente al valor teórico indica que no hay interacción entre los fármacos. Por arriba de la línea de aditividad

48 y significativamente diferente al valor teórico es interacción de naturaleza subaditiva o antagónica. Finalmente, el índice de interacción (factor que describe la fuerza de interacción entre los dos fármacos) es la relación DE50 experimental/DE50 teórica; cuando es <0.7 la interacción es de tipo sinergista, >1.3 es de tipo antagonista y un índice igual a 1 es interacción aditiva (Borowicz y col., 2005; Godoy, 2006).

49 RESULTADOS

Selección de la planta y del extracto CH2Cl2 a evaluar

El material vegetal previamente desengrasado y extraído con CH2Cl2 por medio de Soxhlet, mostró rendimientos de 0.39% para Sph1 y de 0.83% para Sph2. A su vez, la extracción por

Soxhlet seguida de maceración, incrementó el rendimiento de Sph1 a 0.66% y el de Sph2 a

2.66%. Finalmente, la maceración directa de los vegetales con el disolvente orgánico dio un rendimiento de 1.5% para Sph1 y de 1.12% para Sph2.

La actividad biológica de los respectivos extractos Sh1 y Sph2 obtenidos aplicando los diferentes procedimientos de extracción mencionados se muestra en la tabla 3. Los resultados en esta tabla expresan la formación del edema en el cojinete plantar medido a lo largo del estudio (Tabla 4). y el efecto producido por la administración de los extractos

(100 mg/kg i.p.) obtenidos aplicando los diferentes procedimientos. El estudio comparativo sobre el efecto antiedematoso que presentaron los extractos de las plantas Sph1 y Sph2 muestra que la maceración directa y exhaustiva con CH2Cl2 (M) inhibe el edema producido por carragenina con una intensidad mayor a la registrada con el extracto obtenido por medio de Soxhlet (Sx), pero cercana a la del extracto obtenido por Soxhlet y maceración

(Sx+M). Por otra parte, la actividad de la planta Sph1 fue ligeramente menor a la de la planta Sph2 (Tabla 5).

50

Tiempo Edema plantar X ± DS (n=5) (h) ∆= (mx-mo) mm Control (-) Sx Sx+M M 1 0.79±0.08 0.44±0.05 0.30±0.10 0.40±0.38 2 0.91±0.13 0.48±0.08 0.30±0.19 0.60±0.25 3 1.04±0.11 0.74±0.13 0.54±0.17 0.42±0.56 4 1.15±0.10 0.86±0.09 0.52±0.16 0.63±0.46 5 1.17±0.06 0.66±0.13 0.42±0.22 0.40±0.50 6 1.12±0.10 0.76±0.15 0.66±0.18 0.45±0.51 7 1.04±0.13 0.60±0.00 0.36±0.09 0.48±0.38 24 0.99±0.05 0.54±0.29 0.40±0.07 0.25±0.23 48 0.91±0.17 0.24±0.17 - 0.33±0.39

Tabla 3. Actividad de los extractos (100 mg/kg i.p) de Sph1 obtenidos por extracción con Soxhlet (Sx), Soxhlet seguido de maceración (Sx+M) y por maceración directa (M) del material vegetal

Tiempo Edema plantar X± DS (n=5) (h) ∆= (mx-mo) mm Control (-) Sx Sx+M M 1 0.79±0.08 0.24±0.05 0.30±0.22 0.46±0.11 2 0.91±0.13 0.48±0.08 0.40±0.25 0.83±0.17 3 1.04±0.11 0.70±0.07 0.34±0.31 0.18±0.09 4 1.15±0.10 0.62±0.05 0.28±0.26 0.33±0.07 5 1.17±0.06 0.46±0.24 0.56±0.29 0.26±0.08 6 1.12±0.10 0.62±0.08 0.46±0.24 0.40±0.31 7 1.04±0.13 0.60±0.16 0.30±0.26 0.38±0.30 24 0.99±0.05 0.54±0.17 0.44±0.35 0.15±0.13 48 0.91±0.17 0.16±0.09 - 0.26±0.21

Tabla 4. Actividad de los extractos (100 mg/kg i.p) de Sph 2 obtenidos por extracción con Soxhlet (Sx), Soxhlet seguido de maceración (Sx+M) y por maceración directa (M) del material vegetal

51

Tiempo % Inhibición del edema plantar (h) X ± DS (n=5) Sph1 (100 mg/kg i.p.) Sph 2 (100 mg/kg i.p.) Sx Sx+M M Sx Sx+M M 1 44.30±6.12 62.02±4.56 49.36±4.11 29.11±5.76 62.02±5.32 41.77±5.53 2 47.25±8.18 67.03±5.00 82.41±3.93 12.02±6.61 56.04±6.57 8.79±6.21 3 28.84±4.24 48.07±6.21 84.61±5.59 3.84±3.83 67.30±5.59 82.69±5.85 4 25.21±5.99 54.78±4.15 45.21±5.05 25.21±5.06 75.65±5.85 71.30±6.89 5 43.58±4.83 64.10±3.70 63.63±5.23 26.49±5.86 52.13±5.23 77.77±5.86 6 32.14±5.67 41.07±3.43 59.82±4.34 32.14±2.66 58.92±4.35 64.28±4.07 7 42.30±3.60 65.38±5.63 53.84±2.94 36.53±7.20 71.15±2.94 63.46±5.50 24 45.45±4.22 59.59±6.45 74.74±6.45 39.39±6.45 55.55±6.45 84.84±5.45 48 73.62±4.85 - 63.73±60.06 80.21±3.23 - 71.42±3.95

Tabla 5. Efecto inhibitorio sobre el edema formado con carragenina de los extractos obtenidos por Sx (Soxhlet), Sx+M (Soxhlet seguido de maceración) y M (maceración directa) de las plantas Sph1 y Sph2. Los valores se expresan como promedio ± ES respecto a los respectivos controles.

Con base en los resultados obtenidos y la cantidad de planta disponible, se seleccionó Sph1 para realizar los estudios aplicando como procedimiento de extracción la maceración directa del material vegetal con diclorometano (extracto activo Ex).

Estudio comparativo sobre el efecto antiedematoso de Ex administrado por vía intranasal e intraperitoneal

Un ensayo preliminar mostró que no había diferencia significativa entre el control negativo y el positivo en el que los animales fueron administrados vía i.n con PBS como vehículo

(Tabla 6). Asimismo, no se determinó diferencia significativa en la actividad inhibitoria

52 sobre la formación del edema plantar entre los grupo de animales tratados con una dosis de

Ex sin esterilizar y Ex esterilizado (Tabla 7).

Tiempo Edema plantar X± DS (n=5) (h) ∆= (mx-mo) mm

Control (-) Control (+)

1 0.68±0.08 0.83±0.07 2 0.77±0.08 0.84±0.13

3 1.00±0.14 0.98±0.08 4 1.15±0.09 1.24±0.11 5 1.19±0.06 1.18±0.11 6 1.19±0.15 1.18±0.08

7 1.15±0.12 1.14±0.10

24 0.99±0.09 0.91±0.12

48 0.93±0.14 1.26±0.10

Tabla 6. Administración de 12.5 µl/fosa nasal del vehículo PBS esterilizado (control positivo) en ratones administrados con carragenina en la zona plantar. Los valores se comparan respecto al grupo control negativo sin el vehículo. * p<0.05.

53

Tiempo (h) % Inhibición del edema plantar

X± DS (n=5)

sin esterilizar esterilizado

1 27.27±3.53 31.82±3.17

2 56.10±2.63 65.85±4.19

3 55.10±4.07 67.35±3.12

4 58.18±2.42 60.00±2.70

5 51.72±3.09 55.52±2.83

6 46.27±3.09 56.72±3.70

7 44.52±2.47 50.77±4.07

24 43.14±2.48 41.18±3.60

48 10.00±5.45 43.64±3.08

Tabla 7. Administración intranasal del Ex (0.50 mg/fosa) sin esterilizar y esterilizado por filtración en micropore en ratones administrados con carragenina en la zona plantar. Los valores se expresan como promedio ± ES respecto a los respectivos controles.

La tabla 8 muestra el efecto inhibitorio que produce el extracto aplicado tanto por vía intraperitoneal como por vía intranasal. La administración i.p. del extracto, 30 min antes de la carragenina, produjo un efecto inhibitorio importante a partir de la primera hora de administrado el proinflamatorio (48.94 ± 2.54 %); el efecto fue máximo entre 2 y 3 h

(98.39±1.25 y 98.15±4.19%), descendió luego a 43.28± 5.06% a las 4 h para volver a incrementarse con valores que se mantuvieron altos (entre 67.12±3.96 y 51.22±3.23%)

54 hasta las 48 horas. A su vez, el extracto administrado vía i.n. (0.50 mg/fosa) 30 min antes de la carragenina, mostró también un efecto inhibitorio sobre la formación del edema a partir de la 1ª hora (55.32±5.65%), el efecto máximo de 94.29±3.66% se registró a las 24 horas y de 70.73 % ±3.95% a las 48 horas.

Tiempo (h) % Inhibición del edema X± DS (n=5)

intraperitoneal intranasal (100 mg/kg ) (0.50 mg/fosa)

1 48.94±2.54 55.32±5.65

2 98.39±1.25 66.13±4.15

3 98.15±4.19 62.96±1.81

4 43.28±5.06 79.10±3.08 5 67.12±3.96 82.19±3.84

6 62.5±5.54 83.33±4.07 7 52.46±5.50 90.16±2.10

24 57.14±2.45 94.29±3.66 48 51.22±3.23 70.73±3.95

Tabla 8. Efecto inhibitorio del Ex (100 mg/kg i.p.; 0.50mg/fosa i.n.) sobre el edema plantar inducido con carragenina. Los valores se expresan como promedio ± ES respecto a los respectivos controles.

55 Curva dosis respuesta del Ex administrado vía intranasal

Una siguiente serie de estudios mostró el efecto inhibitorio dosis dependiente que posee el extracto sobre la formación del edema plantar en animales tratados con dosis variables de

0.01 a 0.50 mg/fosa nasal. El perfil de las curvas muestra un incremento máximo del efecto inhibitorio en las primeras 3 h, posteriormente se produce un descenso de los valores para volver a incrementarse entre 5 y 6 horas. Después de 48 h, el efecto inhibitorio aún es de intensidad con valores entre 30 y 56%.

Los resultados en la tabla 9 muestran que a la primera hora de la administración del proinflamatorio, el efecto inhibitorio de Ex es importante a partir de 0.06 mg/fosa, aunque no se registra una respuesta dosis dependiente. Después de 2 h de administrado el proinflamatorio hay una tendencia a que mantener una respuesta dependiente de la dosis.

56

Tiempo % Inhibición del edema plantar X± D.S. (n=5) (h) Dosis del Ex (mg/fosa) 0.01 0.02 0.03 0.06 0.125 0.25 0.50 1 19.10±4.02 6.38±3.04 6.38±5.28 56.96±1.47 51.89±3.80 54.43±2.27 84.81±2.68 2 13.20±3.26 50.00±3.44 47.40±4.16 58.24±2.63 67.03±4.07 62.63±2.90 71.42±2.98 3 14.50±4.68 59.00±2.86 59.00±4.98 15.38±2.09 50.00±2.28 75.00±1.75 76.92±2.15 4 7.27±3.40 41.80±2.90 50.90±4.64 25.21±1.82 51.30±3.74 66.00±2.45 72.17±1.65 5 7.81±3.17 58.90±4.14 30.50±2.65 50.42±3.84 52.13±2.98 60.68±2.31 74.35±2.99 6 2.04±3.23 6.12±3.26 4.08±4.06 41.07±3.82 44.64±5.31 53.57±2.08 60.71±2.55 7 2.80±2.96 8.41±4.15 27.10±2.77 42.30±4.58 53.84±4.56 63.46±1.52 53.84±2.44 24 2.00±1.34 6.00±1.34 12.00±2.00 43.43±2.41 61.61±2.40 65.65±3.67 71.71±1.96 48 2.33±4.65 27.9±2.32 23.30±2.85 14.28±2.33 42.85±1.61 29.67±1.61 56.04±3.61

Tabla 9. Efecto inhibitorio del Ex (0.01 - 0.50mg/fosa i.n.) sobre el edema plantar inducido con carragenina. Los valores se expresan como promedio ± ES respecto a los respectivos controles.

57 Curva dosis respuesta de la dexametasona (Dx) aplicada vía intranasal (antiinflamatorio de referencia)

La dexametasona administrada en una dosis de 0.06 mg/fosa no inhibió el edema inducido con carragenina y el efecto fue sólo moderado con la dosis de 0.125 mg/fosa. A partir de

0.250 mg/fosa, el fármaco inhibió de manera importante el edema, lográndose un efecto máximo con dosis de 0.50 y 1.0 mg/fosa. Por otra parte, el efecto inhibitorio producido por

0.250 mg/fosa fue de 28.30 ± 0.13% a la primera hora después de administrar carragenina, efecto que se incrementó a 69.10 ± 0.13% a las 5 horas para luego disminuir progresivamente hasta registrarse un valor de 29.0 ± 0.13% a las 48 horas (Tabla 10).

Tiempo % Inhibición del edema plantar X± D.S. (n=5)

(h) Dex (mg/fosa) 0.06 0.125 0.250 0.50 1.0

1 20.08±2.59 5.66±3.66 28.30±1.83 59.49±1.78 62.03±2.32 2 17.50±2.68 14.30±1.83 36.50±4.20 86.81±1.56 84.62±4.33

3 13.60±3.90 30.90±4.94 45.70±3.02 84.82±4.62 88.46±2.47 4 33.30±4.02 35.50±4.81 54.80±4.02 93.04±5.48 94.78± 2.63

5 16.40±3.40 29.10±3.20 69.10±5.45 91.45± 2.87 88.03±1.69 6 22.40±2.86 20.00±4.40 48.20±4.71 85.71±4.40 92.86±4.40

7 19.60±5.54 15.20±4.07 45.70±3.44 84.62±4.07 90.38±4.86

24 1.23±4.62 6.17±4.94 23.50±2.47 91.92± 3.90 93.94±3.02

48 25.80±3.95 6.45±8.22 29.00±4.32 80.22±3.95 84.62±3.95

Tabla 10 Efecto inhibitorio de Dex (0.06 - 1.0 mg/fosa i.n.) sobre el edema plantar inducido con carragenina. Los valores se expresan como promedio ± ES respecto a los respectivos controles.

58 INTERACCIÓN DE LA DEXAMETASONA Y EL EXTRACTO CH2Cl2 EN EL MODELO DEL EDEMA PLANTAR INDUCIDO CON CARRAGENINA EN EL RATÓN

Los valores DE50 obtenidos a partir de las curvas log dosis respuestas de dexametasona y del extracto se indican en la tabla 11. De los dos productos evaluados a las tres y cinco horas después de administrar el agente flogístico (carragenina), el extracto mostró un efecto

4-6 veces más potente que el de la dexametasona. El análisis isobolográfico demostró interacciones de tipo sinergista entre la Dex y el Ex en las combinaciones 1:1, 1:2, 2:1, 6:1

(16 y 17).

DE (µg/fosa) Potencia Tratamiento 50 3h 5h 3h 5h Dexametosona 262.12 (280.99-243.25) 201.99 (218.16-185.82) 0.61 0.41 Extracto 159.12 (170.10-148.14) 82.90 (91.99-73.81)

Tabla 11. Los valores se presentan como dosis efectiva 50 con límites de confianza del 95 %. El extracto y los antiinflamatorios fueron aplicados vía nasal 30 min antes de inyectar la carragenina. Entre paréntesis se muestran los límites de confianza a 95%.

59

add Combinación DE50 DE50 mez E Interacción Dexametasona + extracto 1:1 210.62±7.21 83.18±10.86 0.39 Sinergismo (3hrs) 1:2 193.45±6.58 105.44±10.24 0.55 Sinergismo 2:1 227.79±7.85 55.68±10.72 0.24 Sinergismo 6:1 247.41±8.57 100.35±7.73 0.40 Sinergismo Dexametasona + extracto 1:1 142.45±6.10 70.79±10.56 0.50 Sinergismo (5hrs) 1:2 122.60±5.52 95.50±10.05 0.78 Sinergismo 2:1 133.71±6.90 44.69±8.93 0.32 Sinergismo 6:1 148.23±7.33 68.09±7.71 0.46 Sinergismo

Tabla 12. Valores de DE50 (µg/kg) calculados por regresión lineal. El índice de interacción es E, add mez DE50 es calculada teóricamente y DE50 de la combinación de los productos obtenidos experimentalmente. P< 0.05 diferencia significativa entre DE50 add y DE50 mez. *P < 0.01 t- Srudent.

60

Isobolograma que muestra la combinación de Dex/Ex tres horas después de administrada la carragenina

(16). Isobolograma de la interacción entre la dexametasona y el extracto de diclorometano de Sphaeralcea angustifolia tres horas después de administrada la carragenina. Sobre los ejes se representa el valor de las DE50 de los compuestos en estudio. Los valores de las interacciones entre las mezclas en diferentes proporciones (1:1, 1:2, 2:1, 6:1) se indican con (◦) para las DE50 teóricas y (▫) para las experimentales.

61

Isobolograma que muestra la combinación de Dex/Ex cinco horas después de administrada la carragenina

(17). Isobolograma de la interacción entre la dexametasona y el extracto de diclorometano de Sphaeralcea angustifolia cinco horas después de administrada la carragenina. Sobre los ejes se representa el valor de las DE50 de los compuestos en estudio. Los valores de las interacciones entre las mezclas en diferentes proporciones (1:1, 1:2, 2:1, 6:1) se indican con (◦) para las DE50 teóricas y (▫) para las experimentales.

62 ANEXO

El análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de los constituyentes en el extracto diclorometano mostró que, debido a la alta concentración de clorofilas en el extracto crudo de diclorometano, los marcadores no se separan con alta resolución, por ello, se aplicó una microtécnica para separar el complejo de los marcadores que se ilustran en las

Fig. 18 y 19 (Díaz 2006).

63

(18)

64

(19)

65 DISCUSIÓN

Los aspectos abordados en el presente trabajo se relacionaron de manera prioritaria con la optimización de un proceso para la obtención del extracto de diclorometano de Sphaeralcea angustifolia y la evaluación de la actividad antiedematosa del extracto aplicado vía nasal.

Sphaeralce angustifolia, es una planta de la herbolaria medicinal de México utilizada para tratar golpes, edemas, torceduras e inflamación. Aunque es frecuente la mención sobre el uso tópico que tiene esta especie, también se usa vía oral para tratar la diarrea.

Estudios previos demuestran que el extracto de diclorometano de las partes aéreas inhibe el desarrrollo del edema inducido con diferentes agentes proinflamatorios en el animal de experimentación. En la rata, el extracto inhibe el edema plantar inducido con carragenina; el efecto fue significativo en la fase aguda del proceso inflamatorio (Nava, 2003). Meckes,

2004). Más adelante Salazar (2003) reportó la actividad antiedematosa del extracto en un modelo de poliartritis inducida con adyuvante de Freund y carragenina. Los efectos del extracto de diclorometano en modelos de inflamación crónica fueron recientemente abordados por García (2006) y se demostró que la administración intragástrica no reproduce el efecto en la fase aguda y crónica del proceso inflamatorio; sin embargo, la administración intraperitoneal y transdermal inhiben de manera significativa el edema inducido. Estos resultados permiten en parte, convalidar el uso tópico que se da a la planta como antiinflamatorio y dieron pauta para considerar un probable efecto del extracto administrado por vía nasal, parte importante en el desarrollo de este trabajo

66

Los antecedentes sobre el contenido de escopoletina como uno de los principios activos relevantes en el extracto (García, 2006), obligó a un rastreo inicial de dos muestras de

Sphaeralcea angustifolia que, perteneciendo a la misma zona de colecta, presentaban diferente crecimiento: Sph1 y Sph2. Por otra parte, se diseñaron diferentes procedimientos para la extracción de los vegetales con diclorometano considerando un proceso a temperatura de 40-60°C en Soxhlet y a temperatura ambiente por maceración. Los resultados obtenidos mostraron que se incrementa el rendimiento y la actividad biológica si el vegetal se somete a un proceso de extracción por Soxhlet seguido de maceración a temperatura ambiente por una semana (3 veces). Estos resultados confirman los datos reportados anteriormente respecto al rendimiento tan bajo que tiene el extracto de diclorometano (entre 0.39-1.12%) y la necesidad de prolongar el tiempo de exposición del vegetal con el disolvente orgánico para extraer de manera óptima los principios activos de interés (Olivares-Estrada, 2005; García, 2006). Acelerar la extracción por medio del aumento de la temperatura con ayuda de un sistema Soxhlet no favoreció a la obtención de un extracto con un mayor rendimiento.

Con respecto a la actividad biológica de las muestras Sph1 y Sph2, ambas identificadas botánicamente como Sphaeralcea angustifolia, se demostró que la actividad antiedematosa de Sph2 fue ligeramente mayor a la de Sph1 lo que sugiere cierta diferencia en el contenido de los principios activos en cada una de las plantas, probablemente atribuible a factores relacionados con el ciclo biológico, sin descartar factores ambientes (pH del suelo, humedad, etc). El análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de los constituyentes en el extracto diclorometano muestra que, debido a la alta concentración de

67 clorofilas en el extracto crudo de diclorometano, los marcadores no se separan con alta resolución.

Asimismo, se demostró que la actividad biológica no se modifica con la esterilización del producto por filtración (malla de 0.02 µm). En el modelo del edema plantar inducido con carragenina en el ratón, la actividad del extracto aplicado vía nasal (0.50 mg/fosa) fue mas pronunciada y sostenida que la observada con la administración intraperitoneal (100 mg/ratón), antecedente que muestra que la intensidad del efecto respecto a la dosis administrada es notablemente mayor cuando la vía de administración es la nasal. Siendo el epitelio muy vascularizado, presenta ventajas sobre las vías de administración sistémica clásicas; el fármaco alcanza al tejido dañado obteniéndose mayores concentraciones del mismo en el lugar de acción.

La interacción que ocurre entre dos o más fármacos puede producir un efecto farmacológico de intensidad mayor o menor a la prevista e implica modificaciones de los efectos de uno o de ambos agentes (Berenbaum, 1989; Chou, 2006). En el campo de la investigación de productos naturales, el estudio sobre las interacciones entre fármaco- fármaco o fármaco-alimento surge en la actualidad con gran interés (Fugh-Berman y Ernst

2001); sin embargo, en la literatura científica, aún son escasos los reportes sobre el tipo de interacciones posibles entre agentes terapéuticos y extractos de plantas medicinales. La administración conjunta de productos naturales con los agentes terapéuticos convencionales puede inducir variaciones en la magnitud del efecto esperado, se pueden incrementar los efectos que produce cada uno de los agentes utilizados en forma individual; de esta manera, en la clínica es frecuente el uso de combinaciones de dos o más fármacos para tratar

68 algunas enfermedades. Sin embargo, la potenciación de los efectos puede también presentar efectos no deseados. En México se observa con frecuencia, que aunado a los agentes terapéuticos prescritos en la clínica, los pacientes consumen productos herbolarios, motivo por el que es importante considerar incorporar en la investigación de una planta medicinal los aspectos relacionados con la interacción entre fármacos. Basados en un estudio anterior sobre el extracto de diclorometano de Sphaeralcea angustifolia en el que se demostró interacción de naturaleza sinérgica con algunos agentes antiinflamatorios de uso tópico

(García, 2006), en el presente trabajo se demostró también sinergismo entre la dexametasona y el extracto aplicados vía nasal.

El trabajo realizado es parte del proyecto de investigación que se lleva a cabo en la Unidad de Investigación Médica en Farmacología de Productos Naturales sobre Sphaeralcea angustifolia y representa una contribución al conocimiento sobre los efectos que produce el extracto administrado vía nasal. Otra contribución es el estudio relacionado con la interacción que se establece entre el extracto y la dexametasona, un agente antiinflamatorio utilizado vía nasal en pacientes con asma.

Como proyección futura de este trabajo se propone el estudio histopatológico a nivel del tracto respiratorio de ratas tratadas con el extracto administrado por vía nasal.

69 CONCLUSIONES

1. Los extractos de diclorometano de Sphaeralcea angustifolia obtenidos por tres diferentes procedimientos de extracción, mostró mayor rendimiento cuando el vegetal se somete a un proceso de extracción por Soxhlet seguido de la maceración exhaustiva a temperatura ambiente.

2. La extracción por medio de Soxhlet no favorece la obtención de un extracto con un mayor rendimiento y actividad biológica.

3. La actividad antiedematosa del extracto se incrementa cuando se prolonga el tiempo de exposición del vegetal con el disolvente orgánico.

4. El efecto antiedematoso de la muestra Sph2 no fue significativamente mayor al de la

Sph1 y el contenido de los marcadores fue similar.

5. La actividad biológica del extracto activo no se modifica con la esterilización por filtración.

6. El extracto administrado vía nasal 0.50mg/kg produce, en la fase temprana del desarrollo del edema plantar, un efecto antiedematoso de menor intensidad que el administrado en una dosis de 100 mg/kg por vía intraperitoneal, aunque superior y sostenido en la fase tardía del proceso agudo.

70 7. La vía de administración nasal presenta ventajas sobre las vías de administración sistémicas clásicas, ya que el fármaco alcanza al tejido dañado con mayor velocidad, obteniéndose mayores concentraciones del mismo en el lugar de acción.

8. La magnitud del efecto antiinflamatorio con extracto de Sphaeralcea angustifolia es mayor a la que presenta la dexametasona, administrando ambos productos por vía nasal.

9. El extracto de diclorometano de Sphaeralcea angustifolia demostró interacción de naturaleza sinérgica con la dexametasona, al ser aplicados por vía nasal en proporciones

1:1, 1:2, 2:1, 6:1.

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