PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Diplomová práce

Adéla Horáková

Brno 2019

PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Analýza genomických defektů podmiňujících klonální evoluci chronické lymfocytární leukémie

Diplomová práce

ADÉLA HORÁKOVÁ

Vedoucí práce: Mgr. Karla Plevová, Ph.D.

Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno

Brno 2019

Bibliografický záznam

Autor: Bc. Adéla Horáková Přírodovědecká fakulta, Masarykova Ústav experimentální biologie

Název práce: Analýza genomických defektů podmiňujících klonální evoluci chronické lymfocytární leukémie

Studijní program: Experimentální biologie

Studijní obor: Molekulární biologie a genetika

Vedoucí práce: Mgr. Karla Plevová, Ph.D.

Akademický rok: 2018/2019

Počet stran: 80

Klíčová slova: Chronická lymfocytární leukémie, TP53, klonální evoluce, celoexomové sekvenování

Bibliographic Entry

Author: Bc. Adéla Horáková Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis: Analysis of genomic defects underlying clonal evolution in chronic lymphocytic leukemia

Degree programme: Experimental Biology

Field of Study: Molecular Biology and Genetics

Supervisor: Mgr. Karla Plevová, Ph.D.

Academic Year: 2018/2019

Number of Pages: 80

Keywords: Chronic lymphocytic leukemia, TP53, clonal evolution, whole-exome sequencing

Abstrakt

Chronická lymfocytární leukémie je nejčastější leukémií v západním světě a její průběh je velmi heterogenní. U části pacientů dochází během onemocnění k zisku aberací spojených se zhoršením nemoci a rozvojem rezistence k protinádorové léčbě. Z klinického hlediska má zásadní význam nalezení takových znaků leukemických buněk, např. genových mutací, které by umožnily identifikaci pacientů v riziku tohoto nepříznivého průběhu. V rámci diplomové práce byla u vybraného souboru pacientů provedena analýza dat z celoexomového sekvenování a označeny geny potenciálně zodpovědné za nepříznivou klonální evoluci chronické lymfocytární leukémie.

Abstract

Chronic lymphocytic leukemia is the most common leukemia in the western world and its clinical course is very heterogenous. In a subgroup of patients, a gain of aberrations connected with deterioration of the disease course occurs and resistence to anticancer treatmeant often develops. From the clinical point of view, identification of progression markers of leukemic cells, for example genetic mutations, which would allow distinguishing patients at risk of unfavourable course, has a crucial importance. In the scope of this diploma thesis, analysis of whole-exome sequencing data in a selected group of patients was performed with the aim to identify genes potentially responsible for unfavourable clonal evolution of chronical lymphocytic leukemia.

Poděkování

Na tomto místě bych chtěla především poděkovat své školitelce Mgr. Karle Plevové, Ph.D. za pomoc při vypracování této práce, cenné odborné rady, připomínky a věnovaný čas. Dále bych chtěla poděkovat své konzultance Mgr. Kamile Stránské, za odborný dohled a pomoc při zpracování experimentální části práce a za množství velmi praktických rad. V neposlední řadě bych ráda poděkovala všem laborantkám, bioinformatikům a dalšímu odbornému personálu, který mi pomohl ze všech úskalí, která se během zpracování této práce vyskytla. A nakonec bych chtěla poděkovat své rodině, bez jejíž podpory a pomoci by tato práce nevznikla.

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Text práce jsem vypracovala podle pravidel a zodpovídám za jeho jazykovou správnost.

Brno, 9. května 2019 …………………………………. Adéla Horáková

Obsah:

1. Seznam použitých zkratek ...... 9

2. Úvod a problematika ...... 10

2.1. Chronická lymfocytární leukémie ...... 10

2.1.1. Charakteristika CLL buněk ...... 10

2.1.2. Diagnostika ...... 11

2.1.3. Prognóza ...... 12

2.1.4. Terapie ...... 13

2.2. Způsoby detekce genomických změn ...... 14

2.2.1. Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) ...... 14

2.2.2. Analýza metafázních chromozomů (G pruhování)...... 14

2.2.3. CGH a čipové technologie ...... 15

2.2.4. MLPA a techniky založené na polymerázové řetězové reakci ...... 16

2.2.5. Sekvenování DNA ...... 16

2.3. Genetické abnormality a klonální vývoj CLL...... 18

2.3.1. Delece lokusu 13q14 ...... 18

2.3.2. Delece lokusu 17p13 a mutace TP53 ...... 18

2.3.3. Delece lokusu 11q22-q23 ...... 19

2.3.4. Trisomie chromozomu 12 ...... 20

2.3.5. Translokace ...... 20

2.3.6. Komplexní karyotyp ...... 20

2.3.7. Další strukturní a numerické aberace ...... 21

2.3.8. Somatické genové mutace a změny v expresi genů ...... 22

2.3.9. Klonální vývoj ...... 29

3. Cíle diplomové práce ...... 30

4. Materiál a metody ...... 31

4.1. Sběr materiálu ...... 32 7

4.2. Separace buněk z periferní krve ...... 32

4.3. Analýza chromozomových aberací metodou FISH ...... 33

4.4. Stanovení mutace TP53 ...... 34

4.5. Izolace DNA ...... 34

4.5.1. Izolace nádorové DNA pomocí QIAcube ...... 35

4.5.2. Izolace nenádorové DNA ...... 35

4.5.3. Kontrola kvality a kvantity DNA ...... 35

4.5.4. Hodnocení kvality DNA pomocí gelové elektroforézy ...... 36

4.6. Celoexomové sekvenování ...... 37

4.6.1. Příprava knihovny na sekvenování pomocí Truseq kitu ...... 37

4.6.2. Příprava knihovny na sekvenování pomocí Nextera kitu ...... 37

4.6.3. Měření koncentrace a hodnocení kvality DNA fragmentů ...... 37

4.6.4. Sekvenování ...... 38

4.6.5. Analýza dat ...... 39

5. Výsledky ...... 41

5.1. Hodnocení pacientů ...... 41

5.1.1. Pacienti s neexpandující mutací TP53 ...... 41

5.1.2. Pacienti s expandující mutací TP53...... 42

5.2. Celoxomové sekvenování ...... 44

5.2.1. Hodnocení kvality DNA v rámci přípravy knihovny ...... 44

5.2.2. Kontrola správnosti přiřazení vzorků ...... 45

5.2.3. Analýza získaných dat ...... 46

6. Diskuze ...... 53

7. Souhrn ...... 56

8. Summary ...... 57

9. Přehled literatury ...... 58

8

1. Seznam použitých zkratek

aCGH Array comparative genomic hybridization; komparatitivní genomová hybridizace na čipu BCR B-cell receptor; B-buněčný receptor BTK Brutonova tyrozinkináza CD Cluster of differentiation CGH Comparative genomic hybridization; Komparativní genomová hybridizace CLL Chronická lymfocytární leukémie del delece DNA Deoxyribonukleová kyselina FCR Fludarabin, cyklofosfamid, rituximab FISH Fluorescenční in situ hybridizace FISH-IS FISH v suspenzi IgA/D/G/M Imunoglobulin A/D/G/M IGHV Immunoglobulin heavy chain variable regions MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification NGS Next-generation sequencing; sekvenování nové generace PCR Polymerázová řetezová reakce PI3Kδ fosfatidylinositol-3-kináza RNA Ribonukleová kyselina RT-MLPA Reverse transcriptase multiplex ligation-dependent probe amplification TP53 Tumor protein 53

9

2. Úvod a problematika 2.1. Chronická lymfocytární leukémie Chronická lymfocytární leukémie (CLL) je lymfoproliferativní onemocnění zařazující se mezi B-buněčné malignity (původ odvozen od B-lymfocytů). Jedná se o nejčastější typ leukémie dospělých v západním světě. Medián věku pacientů v době diagnózy je mezi 67 a 72 roky (Hallek et al., 2015). Zajímavostí je dosud nevysvětlený častější výskyt u mužů než u žen (Molica, 2006) a také rozdílná incidence v některých populacích, např. v populacích amerických Indiánů a Asiatů (Shenoy et al., 2011). Bylo identifikováno několik faktorů, např. alergie, astma, život nebo práce na farmě (kvůli expozici pesticidům a herbicidům) atd., asociovaných se zvýšeným rizikem vzniku CLL (Slager et al., 2014). U přibližně 12 % pacientů byla zjištěna familiární zátěž (Mauro et al., 2006). Jde o onemocnění vyznačující se obrovským stupněm genetické a epigenetické heterogenity. Díky tomu jsou mezi pacienty, byť zařazenými do stejného klinického stádia, fenotypové rozdíly, obzvláště pacienti s nemutovanými imunoglobulinovými geny mají různorodý klinický průběh (Pepper et al. 2015). Vlivem této variability je CLL prakticky neléčitelným onemocnění, u kterého však je vysoká pravděpodobnost přežití (od data diagnózy) delšího 5let (např. podle www.cancerresearchuk.org., je tato šance ≥70%). CLL je onemocnění vhodné pro studium klonální evoluce nádorů, neboť jde o nízce maligní onemocnění, které se obvykle nevyznačuje rychlou progresí a zisk nových aberací v rámci klonálního vývoje se vyskytuje u 17-26 % pacientů (Holmes et al., 2016). Klonální vývoj je patrný obzvláště u pacientů v relapsu onemocnění, kdy vlivem podané terapie dochází k změně klonální architektury. Riziková je především expanze klonů s mutací TP53, neboť ta výrazně zhoršuje prognózu pacientů (Malčíková et al., 2015). Pro objasnění mechanismů, které zapříčiňují vznik změn v klonální architektuře, a identifikaci mutací, které mohou usnadňovat, nebo naopak bránit expanzi určitých klonálních populací, se stále častěji využívají techniky sekvenování nové generace (NGS, next-generation sequencing).

2.1.1. Charakteristika CLL buněk CLL je onemocnění zralých monoklonálních B-lymfocytů, které se akumulují v krvi, kostní dřeni a v sekundárních lymfoidních tkáních. Na svém povrchu CLL buňky exprimují různé povrchové znaky, např. CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD79b, FMC7 aj. Hodnocena je také úroveň exprese povrchových imunoglobulinů (ve většině případů IgM a/nebo IgD; zřídka IgG nebo IgA; Scarfo et al., 2016). Z morfologického hlediska se jedná 10 o malé, zralé lymfocyty s úzkým okrajem cytoplazmy, hustým jádrem s nezřetelnými nukleosomy a s částečně agregovaným chromatinem (Hallek, 2015).

2.1.2. Diagnostika CLL je nízce maligní onemocnění často diagnostikované v asymptomatickém stádiu na základě náhodného zjištění zvýšené lymfocytózy, která je definována přítomností více než 5x109/l zralých monoklonálních B-lymfocytů v periferní krvi přetrvávající alespoň 3 měsíce. Pokud se u pacienta příznaky projeví, je možné pozorovat různé nespecifické symptomy. K potvrzení diagnózy je potřeba stanovení krevního obrazu s diferenciálním rozpočtem leukocytů, provedení krevního nátěru a imunofenotypizace (Hallek et al., 2008). Imunofenotypizace slouží k posouzení klonality B-lymfocytů a ke stanovení povrchových znaků (viz tabulka 1) exprimovaných CLL buňkami, které umožňují odlišení CLL od jiných B-lymfoproliferativních onemocnění, jakými jsou například lymfom z plášťových buněk nebo folikulární lymfom aj. (Scarfo et al., 2016). V rámci posouzení klonality se hodnotí exprese lehkých řetězců kappa nebo lambda (Hallek, 2015). Průtokovou cytometrií se posuzuje přítomnost exprimovaných povrchových molekul, např. exprese CD38, která je spojena s horším průběhem onemocnění a kratším přežitím (Ibrahim et al., 2001).

Tabulka 1: Vybrané znaky exprimované na povrchu CLL buněk (Scarfo et al., 2016) Znak Úroveň exprese Komentář CD5 Pozitivní T-buněčný antigen, exprese nižší než u T-lymfocytů CD19 Pozitivní CD20 Pozitivní Exprese nižší než u normálních B-lymfocytů CD22 Slabá až negativní CD23 Vysoká Exprese vyšší než u normálních B-lymfocytů. Aktivační marker CD38 Slabá / vysoká Prognostický marker, vysoká exprese asociována s nemutovaným stavem imunoglobulinových genů CD79b Slabá až negativní Exprese nižší než u normálních B-lymfocytů, ovlivňuje aktivitu B-buněčného receptoru. CD200 Pozitivní Důležitý znak využívaný v diferenciální diagnostice FMC7 Negativní Důležitý znak využívaný v diferenciální diagnostice IgM/IgD Slabá až negativní zřídka také IgG nebo IgA V krevním nátěru se hledají leukemické buňky s charakteristickou morfologií. Spolu s CLL buňkami jsou pozorovány prolymfocyty, jejichž vyšší hladina je spojena s horší prognózou (Melo et al., 1987), větší nebo atypické buňky a prakticky vždy jsou přítomny tzv. Gumprechtovy jaderné stíny, což je označení pro zbytky rozpadlých CLL buněk (Fumi et al., 2014). Procentuální množství poškozených buněk ve vzorku může být novým

11 prognostickým markerem CLL. Nízké procento rozmazaných buněk (˂30 %, v některých studiích ˂20 %) koreluje s přítomností negativních CLL markerů, např. expresí CD38, del11q22 a del17p13 (Mohamed & Safwat, 2018).

2.1.3. Prognóza Klinický průběh onemocnění je velmi heterogenní. Ne všichni pacienti musí podstupovat léčbu, u některých se volí léčebná strategie „watch and wait“, tzn., že pacienti v asymptomatickém stádiu, ale i pacienti ve středním riziku, mohou být pouze pozorováni bez zahájení léčby. U těchto pacientů má onemocnění indolentní charakter a nemusí ovlivňovat délku ani kvalitu života (Hallek, 2005). V rámci hodnocení rizika a nutnosti podání léčby se stanovuje klinické stádium CLL (určení stupně aktivity nemoci), přítomnost somatických hypermutací ve variabilní části těžkého řetězce imunoglobulinu (IGHV), a pomocí molekulárních a cytogenetických vyšetření se hodnotí chromozomové aberace a genové mutace (např. stav genu TP53; Smolej & Šimkovič, 2016; Hallek et al., 2015). U CLL se používají dva klinické klasifikační systémy, a to dle Raie, který původně rozlišoval 5 skupin, později byl zredukován na 3, a dle Bineta, který definuje 3 klinická stádia. Oba stážovací systémy hodnotí postižené oblasti a přítomnost/nepřítomnost anémie a trombocytopenie (Rai et al., 1975, Binet et al., 1981, Rai & Montserrat, 1987). Jedním ze standardních vyšetření je hodnocení mutací v IGHV genech, které jsou součástí B-buněčného receptoru (BCR), neboť samotný mutační status je významným ukazatelem prognózy. B-lymfocyty během svého zrání v germinálních centrech po antigenní stimulaci prodělávají somatické hypermutace imunoglobulinových genů, díky čemuž se zvyšuje variabilita imunoglobulinů a tím i schopnost organismu účinně reagovat na antigenní podměty. Přibližně u poloviny pacientů jsou tyto somatické hypermutace detekovány v míře, která přesahuje 2 % mutací ve srovnání se zárodečnou sekvencí (Hamblin et al., 1999). Na základě srovnání identity klonální sekvence zjištěné z CLL buněk a nejbližší germinální sekvence IGHV je možné rozlišit dvě skupiny pacientů – s mutovanými IGHV geny a s nemutovanými IGHV geny. Pokud je identita IGHV genů větší než 98 %, jedná se o pacienty s nemutovanými IGHV geny. Tato skupina se vyznačuje horší prognózou a je spojena s častějším výskytem nepříznivých mutací např. v genech TP53, EGR2 aj. (Zenz et al., 2008; Young et al., 2017). V rámci rutinní diagnostické praxe se za účelem stanovení prognózy, standardně metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH), hodnotí 4 chromozomální aberace –

12 del11q22, trisomie chromozomu 12, del13q14 a del17p13. Žádná z dosud nalezených mutací nebyla identifikována jako kauzální, proto stanovení žádné z nich není nutné pro potvrzení diagnózy. Ovšem některé z identifikovaných mutací jsou brány jako významné ukazatele ovlivňující prognózu a léčebnou odpověď pacientů.

2.1.4. Terapie U pacientů v nižším klinickém stádiu by zahájení terapie nepřineslo významný prospěch, proto se volí pouze jejich sledování. Léčba je obvykle zahájena až při aktivním onemocnění, které způsobuje pacientům obtíže, jakými jsou např. selhání kostní dřeně, masivní splenomegalie, významná únava aj. Po individuálním posouzení pacienta a přihlédnutí k jeho celkovému zdravotnímu stavu se volí vhodný způsob léčby. Posuzuje se přítomnost nebo nepřítomnost změn v TP53 a zda se jedná o léčbu první linie, nebo léčbu relapsu onemocnění (Hallek, 2015). Standardní léčbou u pacientů s normální funkcí ledvin a bez komorbidit je kombinace fludarabinu a cyklofosfamidu s rituximabem, tzv. FCR režim. Pro pacienty s komorbiditami anebo s poškozenou funkcí ledvin je vhodná např. monoterapie chlorambucilem nebo kombinace chlorambucilu s anti-CD20 protilátkami (Scarfo et al., 2016). V léčbě CLL se používají i jiné monoklonální protilátky, např. ofatumumab (plně lidská protilátka anti-CD20) a alemtuzumab (humanizovaná protilátka anti-CD52). Alemtuzumab je vhodnou alternativou při léčbě pacientů s del17p, kteří neodpovídají na léčbu režimem FCR (Rodrigues et al., 2016). Nové poznatky na poli molekulární biologie a genetiky vedly k vývoji řady dalších léčebných přípravků vhodných zejména pro určité podskupiny pacientů, kteří neodpovídají uspokojivě na léčbu standardními postupy. K nejvýznamnějším patří ibrutinib, idelalisib a venetoclax, které jsou používány pro léčbu vysoce rizikových pacientů, např. s del17p anebo s mutací TP53. Ibrutinib je inhibitor Brutonovy tyrozinkinázy BTK, jež je klíčovou komponentou BCR dráhy. Podáván je buď samostatně nebo v rámci studií v kombinaci např. s obinutuzumabem (Moreno et al., 2019) nebo umbralisibem (Davis et al., 2019). Idelalisib je inhibitor proteinu PI3Kδ, což je isoforma fosfatidylinositol-3-kinázy přednostně exprimovaná B-lymfocyty (Furman et al., 2014). Venetoclax inhibuje Bcl2 protein, a tím způsobuje apoptózu CLL buněk (Stilgenbauer et al., 2016). V rámci studií se u relabovaných nebo refrakterních pacientů s del17p hodnotí i jiná léčiva, např. acalabrutinib aj. (Byrd et al., 2016).

13

2.2. Způsoby detekce genomických změn Existuje několik technik založených na různých principech, které jsou používané k detekci genomických změn u CLL. Vhodné je při analýze genomických defektů kombinovat jednotlivé techniky, neboť při použití jen jedné, by mohlo dojít ke zkreslení výsledků.

2.2.1. Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) Analýzu je možné provést na buňkách v interfázi (interfázní FISH) i v metafázi (metafázní FISH). Používají se fluorescenčně značené DNA sondy, které se vážou na principu komplementarity ke specifickým cílovým sekvencím. Díky fluorescenčnímu značení je možné zachytit ve fluorescenčním mikroskopu vzniklý signál (Baliakas et al., 2014). V rámci hodnocení abnormalit u CLL se využívá několik sond, které jsou komerčně dostupné a pokrývají specifické genetické abnormality identifikované jako časté a prognosticky významné. Jedná se zejména o del13q, del11q (ATM), del17p (TP53), a trizomii chromozomu 12 (O'Malley et al., 2011). Analýzou těchto oblastí je FISH schopna identifikovat chromosomální aberace až v 80 % případů. Zisk nových aberací v rámci klonálního vývoje se vyskytuje u 17-26 % CLL pacientů a zůstává do značné míry nepředvídatelný (Holmes et al., 2016). Současnými metodami se analyzuje omezený počet buněk, což může vést ke zkreslení výsledků, zásadní je ovšem možné nezachycení malých subklonálních populací s jinými změnami, než má dominantní klon (rizikové jsou především mutace TP53). Zavedením nových technik je snaha eliminovat nedostatky metody. Např. tzv. FISH v suspenzi (FISH-IS) je nová vysoce výkonná metodika, která v sobě spojuje metodu FISH, průtokovou cytometrii a nové metody pro digitální zobrazení a analýzu obrazů s vysokým rozlišením. Tato metoda je schopna automaticky analyzovat tisíce buněk, díky čemuž detekuje i chromozomální abnormality malých subklonů (Do et al., 2017).

2.2.2. Analýza metafázních chromozomů (G pruhování). G pruhování je konvenční cytogenetickou analýzou, při níž se hodnotí mitoticky aktivní dělící se buňky. Metafázní chromozomy jsou barveny podle zavedeného postupu, díky čemuž je možné pozorovat pruhování charakteristické pro jednotlivé chromozomy. Rekurentní abnormalita je potvrzena přítomností stejné abnormality u alespoň dvou buněk (v případě ztráty chromozomu u tří).

14

Pro provedení této techniky je potřeba mít buňky v metafázi, čehož se u CLL buněk dosahuje otížně. U CLL se většina leukemických buněk nachází v G0 nebo časné G1 fázi a tyto buňky neodpovídají na stimulaci řadou aktivátorů B lymfocytů (Decker et al., 2002). Pro zisk metafázních buněk se používá stimulace mitogeny, protože CLL buňky mají nízký mitotický index. Vyzkoušena byla řada standardních mitogenů, např. phytohemaglutinin, lipopolysacharid z Escherichia Coli nebo tzv. „pokeweed“ mitogen (mitogen z líčidla amerického), avšak s nízkou úspěšností a s detekcí abnormálních klonů jen ve 40-50 % případů (Heerema et al., 2010). Až stimulace pomocí CpG-oligonukleotidu DSP30 spolu s interleukinem-2 poskytla konzistentní a reprodukovatelné výsledky. Aberace v karyotypu jsou tímto postupem detekované v 80–91 % případů, přičemž některé ze zjištěných aberací, a to téměř v 1/3 případů, postihují oblasti, které nepokrývá analýza pomocí FISH (Heerema et al., 2010; Kotkowska et al., 2011, Rigolin et al., 2015).

2.2.3. CGH a čipové technologie Komparativní genomová hybridizace (CGH) je založena na srovnávání DNA pacienta s referenční DNA (většinou DNA od několika jedinců). Vzorky jsou štěpeny a značeny odlišnými fluorochromy a poté se nechají hybridizovat s metafázními chromozomy. Díky softwaru je možné analyzovat změny v poměru fluorescenčních signálů podél jednotlivých chromozomů, a identifikovat tak zisky nebo ztráty DNA sekvencí. CGH na čipu, tzv. array CGH, nebo aCGH, znamenala zlepšení v detekci chromosomálních změn, neboť dokáže identifikovat i submikroskopické změny. Nepoužívají se metafázní chromozomy, ale dochází k hybridizaci značených vzorků k DNA sondám ukotveným na nosiči. Používají se buď přímo namnožené genomové sekvence, nebo uměle syntetizované oligonukleotidy. K hodnocení prognosticky významných chromosomálních změn u CLL je aCGH ideální, neboť balancované translokace (které tato metoda není shopná identifikovat) jsou u ní relativně vzácné a aberace jsou převážně tvořeny zisky nebo ztrátami sekvencí genomu (Gunn et al., 2009). V některých studiích vykázala aCGH stejné výsledky jako FISH v 95,5 % případů, přičemž rozdíl byl v neshodných případech u aCGH způsoben nízkým podílem buněk s danou aberací ve vzorku (méně než 30 %). Navíc, díky hodnocení celého genomu, jsou identifikovány aberace nedetekované FISH sondami a lze hodnotit i aberace indikující vývoj klonů (Gunn et al., 2008). V dnešní době jsou rozšířeny také SNP čipy, které obsahují sondy cílené do oblastí jednonukleotidových polymorfismů. SNP čipy oproti aCGH navíc poskytují tu výhodu,

15

že umožňují detekci oblastí se ztrátou heterozygozity (LOH) bez změny počtu kopií (cnLOH, copy neutral LOH). Pozoruhodné je, že u některých pacientů se LOH nacházejí v oblastech typicky amplifikovaných nebo deletovaných u CLL (Pfeifer et al., 2007).

2.2.4. MLPA a techniky založené na polymerázové řetězové reakci Technika MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) je založena na hybridizaci specifických sond k cílovým sekvencím. Jedna sonda se skládá ze dvou oligonukleotidů, po hybridizaci ke komplementární sekvenci dochází k jejich ligaci a amplifikaci pomocí univerzálních primerů, přičemž jeden z primerů je fluorescenčně značený, což umožní vizualizaci produktů během separace fragmentů pomocí kapilární elektroforézy. Díky tomu je možné stanovit relativní počet kopií DNA sekvencí ve vzorku. Zatímco interfázní FISH je velmi omezena množstvím použitých sond v jedné reakci, u MLPA se používá i 50-60 sond různé délky v jedné reakci, která je založena na multiplexní polymerázová řetězová reakce (PCR). Díky tomu je MLPA schopna detekovat změny v počtu kopií, změny v metylacích anebo bodové mutace ve více oblastech současně. Nízký podíl aberantních klonálních buněk v hodnoceném vzorku může vést k falešně negativním výsledkům MLPA. Obecně lze však říci, že tato metoda je spolehlivá, pokud vzorek obsahuje 25-30 % aberantních buněk (Véronèse et al., 2013). MLPA není schopna ve srovnání s interfázní FISH spolehlivě rozlišit mozaiky, naopak lze pomocí ní detekovat i vzácné chromozomální aberace a mikrodelece. Interfázní FISH je poté vhodné použít pro ověření výsledků získaných metodou MLPA (Alhourani et al., 2014). Modifikace této techniky, tzv. RT-MLPA (reverse transcriptase multiplex ligation-dependent probe amplification), je základem funkčního testu ATM-p53, který je schopen s vysokou mírou spolehlivosti identifikovat abnormality v TP53 a ATM na základě analýzy exprese downstream genů ATM-TP53 dráhy v odpovědi na poškození DNA (te Raa et al., 2015).

2.2.5. Sekvenování DNA Sekvenování přineslo obrovský pokrok v identifikaci změn v DNA. Je možné sledovat vývoj klonálních populací v čase, identifikovat řídící mutace (mutace zapříčiňující vývoj onemocnění a zisk nových maligních vlastností), mutace v nekódujících oblastech aj. V rutinní diagnostické praxi má stále nezastupitelné místo Sangerovo sekvenování, např. pro stanovení mutačního statusu IGHV (Stamatopoulos et al., 2017), ve výzkumu se dnes používá např. pro ověřování výsledků. Pro výzkumné účely a diagnostiku se stále více

16 používá NGS, které s sebou přináší řadu výhod, ale i nevýhod. Jde však o spolehlivou, citlivou a reprodukovatelnou metodu pro diagnostiku genových mutací. NGS je schopno identifikovat mutace přítomné i v malých klonálních populacích buněk, které mohou negativně ovlivňovat prognózu a které mohou mít dopad na způsob léčby (Rigolin et al., 2016). Použití NGS také vedlo k objasnění signálních drah, jejichž role byla neznámá nebo nejasná (Rodríguez-Vicente et al., 2017). Nespornou výhodou je analýza velkého počtu genů a vzorků současně. Např. u genu ATM je možné hodnotit všechny exony najednou, což nebylo dříve pomocí přímého sekvenování možné (Sutton et al., 2015). NGS má potencionál nahradit jiné metody používané při diagnostice. Je schopna detekovat delece, inzerce, substituce, změny v počtu kopií a translokace, včetně vyvážených změn. Existuje několik platforem NGS, které se používají pro studium CLL. Pro využití konkrétní techniky v diagnostice je nutné zajistit vysokou, dobře definovanou analytickou přesnost, obzvlášť v klinicky významných oblastech, dobré pokrytí, robustnost a reprodukovatelnost metody (Sutton et al., 2015). V této diplomové práci byla využita platforma od firmy Illumina, která je založena na principu můstkové PCR a následné sekvenace syntézou. Vlastnímu sekvenování předchází příprava tzv. knihovny, jejímiž stěžejními kroky jsou fragmentace vstupní DNA a připojení adaptérů. Během vlastního sekvenování dochází k denaturaci fragmentů získaných při přípravě knihovny a jejich navázání na povrch skleněného čipu (tzv. flow cell) prostřednictvím oligonukleotidů, komplementárních k použitým adaptérům. Prostřednictvím PCR dochází k tzv. můstkové (klastrové) amplifikaci, čímž dojde k vytvoření dvouřetězcové molekuly. Dvouřetězcové molekuly jsou denaturovány na jednořetězce a templátové molekuly jsou odmyty. Volné konce DNA se naváží na vedlejší komplementární oligonukleotidy a dochází k extenzi olikonukleotidů, vzniku můstků a celý cyklus se znovu opakuje. Tímto dochází k zisku shluků jednotlivých amplifikovaných fragmentů, které jsou imobilizovány na jednom místě. Vlastní sekvenování probíhá prostřednictvím primerů komplementárních k použitým adaptorům a přidáváním čtyř značených (pomocí různých fluorochromů) nukleotidů, které fungují jako reversibilní terminátory. Detektor sekvenátoru po inkorporaci značeného nukleotidu zachytí odpovídající signál, dále je enzymaticky odstraněna značka a opět přidána směs značených nukleotidů, aby došlo k prodloužení řetězce (Bennett, 2004; www.illumina.com)

17

2.3. Genetické abnormality a klonální vývoj CLL V této kapitole budou zmíněny 4 nejčastější, standardně hodnocené aberace a některé změny, které s nimi souvisí a také další identifikované aberace jejichž dopad není vždy znám.

2.3.1. Delece lokusu 13q14 del13q14 je nejčastější aberace nacházená v 50-60 % případů CLL. Obvykle je spojována s příznivou prognózou (Döhner et al., 2000) a může se vyskytovat v monoalelické i bialelické formě (Garg et al., 2012). Případy s del13q14 je možné rozdělit do dvou podskupin podle rozsahu delece a přítomnosti/nepřítomnosti genu RB1. Velikost delece je různá, od delece velkých oblastí až po submikroskopické změny. Minimální deletovaná oblast zahrnuje geny TRIM13, mirR-3613, KCNRG, DLEU2, miR16-1, miR-15a a DLEU1 (Grygalewicz et al., 2016). DLEU2 a DLEU1 kódující dlouhé nekódující RNA zapojené do signální dráry NF-κB a jsou často deletovány u různých nádorů (Garding et al., 2013).

2.3.2. Delece lokusu 17p13 a mutace TP53 Identifikace delece krátkého raménka chromozomu 17, del17p13, je spojena s nejhorší prognózou a krátkým přežitím pacientů. V 70 % případů je del17p způsobena translokacemi, v menší míře delecí, vznikem izochromozomu i(17q) nebo monozomií (Chapiro et al., 2018). V deletované oblasti se obvykle nachází významný nádorový supresorový gen TP53. S del17p je dále spojován rekurentní výskyt delecí 3p, 4p nebo 9p a to až u poloviny případů (Yu et al., 2017). Současná přítomnost del17p a zisku 8q24 je významným nezávislým markerem krátkého přežití pacientů (Chapiro et al., 2018). U pacientů s del17p bývají v porovnání s pacienty bez delece častěji mutovány např. geny NOTCH1, RPS15, DDX3X a GPS (Yu et al., 2017). Gen TP53 se podílí na základních životních funkcích buňky, např. se účastní kontroly průchodu buňky buněčným cyklem, apoptózy a senescence. Defekty TP53 jsou detekovány u méně než 10 % nově diagnostikovaných případů, ale jejich prevalence se zvyšuje až na 40-50 % u pacientů refrakterních na léčbu (te Raa & Kater, 2016). Byla identifikována malá podskupina pacientů, kteří přestože nesou del17p13 a mutace TP53, přežívají déle a onemocnění má u nich stabilní průběh, aniž by vyžadovalo léčbu po mnoho let. Tato podskupina je spojena s mutovaným stavem IGHV genů (Best et al., 2009), nepříznivou prognózou, rezistencí na léčbu a zkrácenou délkou telomer (Thomay et al., 2017). Mutaci

18

TP53 nese více než 90 % pacientů s del17p13, v nepřítomnosti del17p byly identifikovány u asi 5 % neléčených pacientů (Malčíková et al., 2018). Typicky se uvádí, že záchyt mutací TP53 Sangerovým sekvenováním je možný, pokud se vyskytují ve více než 20 % sekvenovaných alel. Díky pokročilejším technikám, jako je NGS s vysokým pokrytím (ultra-deep-NGS), je možné u CLL identifikovat malé subklony leukemických buněk s mutovaným TP53 (Rossi et al., 2014), které se mohou objevit před terapií a v jakémkoli relapsu. Obecně lze říci, že mutace TP53 expandující během relapsu, je možné zachytit ještě před předchozí terapií (Malčíková et al., 2015). Subklony s mutovaným TP53 mají nepříznivý prognostický dopad jako klonální defekty, neboť po terapii, která může vést k eliminaci dominantního klonu bez mutace, mohou tyto subklony převládnout (Malčíková et al., 2015). Pozorován byl i současný výskyt několika velmi malých populací nesoucích TP53 mutace, které následně mohou simultánně expandovat. Identifikace pacientů se subklonálními TP53 mutovanými populacemi je důležitá z hlediska volby alternativního léčebného postupu (Malčíková et al., 2015).

2.3.3. Delece lokusu 11q22-q23 del11q22-q23 je spojena s agresivnějším průběhem CLL a vyskytuje se až u 20 % pacientů u nichž bývá pozorován charakteristický klinický obraz (Goy et al., 2017). del11q se častěji vyskytuje u pacientů s nemutovaným stavem IGHV genů, nadměrnou expresí CD38 a ZAP-70, del13q (až v 63 % případů; Jain et al., 2015) a krátkými telomerami (Rose-Zerilli et al., 2014). CLL buňky s del11q mají změněný metabolismus glutaminu, což by mohla být příčina snížené metabolické plasticity a jejich přecitlivělosti na metabolický stres (Galicia-Vazquez et al., 2018). Zajímavostí je pozorování klonální evoluce a s ní spojený vývoj cytogenetických abnormalit u subkonálních populací v nepřítomnosti léčby (Goy et al., 2017). V oblasti del11q22-q23 se nachází tumor supresorový gen ATM, jehož mutace byli identifikovány u 30-40 % pacientů s del11q (Kalla et al., 2007). S del11q se pojí i mutace jiných genů, často zmiňované jsou geny BIRC3 a SF3B1. BIRC3 je negativní regulátor nekanonické NF-κB dráhy. Jeho mutace jsou detekovány u 83 % případů s del11q a u téměř všech případů s delecí ATM (Rose-Zerilli et al., 2014). SF3B1 hraje roli v metabolismu RNA (viz kapitola 2.3.7.3.) a jeho mutace jsou detekovány v ~36 % vzorků s del11q (Wang et al., 2011).

19

2.3.4. Trisomie chromozomu 12 Trisomie chromozomu 12 je třetí nejčastější chromozomální aberací (v 10-20 % případů) a často se vyskytuje samostatně. Byla klasifikována jako prognostický marker se středním dopadem (Döhner et al., 2000). Z této skupiny je možné vyčlenit podskupiny, spojené s přítomností doprovodných genových aberací nebo jejich absencí (izolovaná trisomie 12), které se vyznačují společnými klinickými a biologickými znaky (viz kapitola 2.3.6. – současná trisomie chromozomu 12 a 19; Baliakas et al., 2014). S trisomií chromozomu 12 jsou spojovány mutace v genu NOTCH1. Současný výskyt těchto dvou abnormalit je dáván do spojitosti s nemutovanými IGHV geny a špatnou prognózou (del Giudice et al., 2012).

2.3.5. Translokace Translokace jsou u CLL považované za relativně vzácné, některé studie je ovšem identifikovaly až v 34 % případů (Brejcha et al., 2014). Reciproké translokace nejčastěji zahrnují oblasti 13q, 14q, 18q, 17p, 17q, 2p, 1p, 5q a 11q (Baliakas et al., 2014). Jednou z identifikovaných translokací je t(14;18)(q32;q21), která zahrnuje lokus pro těžký imunoglobulinový řetězec a gen BCL2. U CLL nemá diagnostický význam a její prognostický dopad je nejednoznačný (Tang et al., 2013; Chen et al., 2016). Translokací dochází k aktivaci a nadměrné expresi genu BCL2 (Pekarsky et al., 2018). Nemusí se jednat jen o sekundárně vzniklou aberaci, ale může jít i o časnou patogenetickou abnormalitu, neboť byla nalezena také v kmenových buňkách a v několika z těchto případů dokonce i jako jediná abnormalita. (Tang et al., 2013; Chen et al., 2016). t(4;14)(p16;q32) je známá z mnohočetného myelomu, kde vede k nadměrné expresi genů NSD2 a FGFR3. U CLL je její význam nejasný, uvažuje se však o jejím spojení s agresivnějším průběhem onemocnění (Geller et al., 2014). Dále byla pozorována t(2;11)(q22.1;q21) vedoucí k vytvoření fúzního onkogenu CXCR4/MAML2, který je potenciálním terapeutickým cílem (Acunzo et al., 2014). Kromě těchto translokací bylo identifikováno mnoho dalších balancovaných i nebalancovaných.

2.3.6. Komplexní karyotyp Přítomností alespoň 3 strukturních a/nebo numerických aberací bývá obvykle definován komplexní karyotyp (Haferlach et al., 2007). Nově se definuje tzv. „high“ komplexní karyotyp, který je definován přítomností ≥ 5 chromozomálních aberací, a který se vyznačuje obzvláště agresivním klinickým průběhem (Jaglowski et al., 2012; Baliakas

20 et al., 2014). Obecně je komplexní karyotyp nezávislý prognostický faktor, který má negativní klinický dopad, a to i u pacientů s jinak příznivým profilem (mutované IGHV geny, izolovaná del13q; Baliakas et al., 2014). Výjimkou jsou případy se souběžnými trisomiemi chromozomu 12 a 19 (případně 18), které vykazují příznivější klinickobiologický profil, zahrnující významně zvýšenou expresi CD38 a mutované IGHV geny (Ibbotson et al., 2012). Komplexní karyotyp je spojen s nemutovanými IGHV geny, expresí CD38, vysokou frekvencí del17p, del11q (Baliakas et al., 2014) a s častými přestavbami chromosomu 13, které vedou ke ztrátě miR16 a miR-15a (Puente et al., 2015). S komplexním karyotypem souvisí i masivní intrachromozomální přestavby zvané chromothripse, které jsou pozorovány u 2-3 % pacientů s CLL. U nádorů s chromothripsií obecně je pozorován významně vyšší výskyt mutací TP53 (ve 26 %) a v případě CLL také častější inaktivace SETD2 (ve 26 %; Puente et al., 2015). Komplexní karyotyp se posuzuje i v rámci podání nových léčiv, např. ibrutinibu (Thompson et al., 2015) nebo venetoclaxu (Anderson et al., 2017).

2.3.7. Další strukturní a numerické aberace Mezi rekurentní aberace identifikované u CLL s nízkou frekvencí patří např. delece 6q, zisky 2p24, úplné nebo částečné trisomie chromozomů 18, 19 a ztráty chromozomů X, Y, 17 a 18 aj. Některé aberace jako např. zisky 2p, 3q a 8q a delece 8p se běžně nevyskytují samostaně, ale byly pozorovány zároveň s jinými aberacemi, zvláště u pacientů s komplexním karyotypem (Véronèse et al., 2013; Haferlach et al., 2007; Cosson et al., 2014). Současný výskyt trisomie chromozomu 12 a 19 (Schwaenen et al., 2004) byl z velké části (v 72 % případů) doprovázen dalšími strukturálními nebo numerickými abnormalitami (Baliakas et al., 2016), např. trisomií chromozomu 18 (Ibbotson et al., 2012) nebo del13q14 (Stevens-Kroef et al., 2009). Pacienti zařazení do této skupiny vykazují společné charakteristické znaky (Schwaenen et al., 2004; Baliakas et al., 2016). Zisk 2p se ve studiích objevil až ve 28 % případů (Chapiro et al., 2010), přičemž většina pacientů vykazuje velké 2p zisky. Identifikovány byly dvě minimální amplifikované oblasti, první obsahuje gen TTC27, druhá 9 genů, např. BCL11A, REL a XPO1 (Cosson et al., 2017). Zisk 2p je asociován s rizikovými faktory, např. s nemutovaným stavem IGHV genů, del17p13 (Pfeifer et al., 2007), del11q a rezistencí (gen XPO1 zde hraje ústřední roli) na FCR léčbu, ibrutinib a R-idelalisib. Onkogeny REL a MYCN a geny BCL11A, MSH2, byly navrženy jako kandidátní geny asociované s 2p ziskem (Cosson et al., 2017).

21

Dalšími rekurentními aberacemi identifikovanými u CLL jsou např. amplifikace oblasti 8q24 (MYC) a 3q26 (PIK3CA), del6q (FOXO3 a ZNF292), del2q37 (SP140 a SP110), del3p21 (SMARCC1 a SETD2), del8p a del10q24 (NFKB2) aj. (Puente et al., 2015; Brown et al., 2012; Jarošová et al., 2017).

2.3.8. Somatické genové mutace a změny v expresi genů Mezi rekurentně mutované geny u CLL patří např. NOTCH1, SF3B1, ATM atd. Tyto geny lze rozdělit do skupin podle signálních drah a buněčných procesů, kterých se účastní.

2.3.8.1.Signalizace pomocí BCR BCR signalizační dráha (viz obr. 1) hraje důležitou roli v patogenezi CLL, v některých studiích dokonce nejdůležitější (Stevenson et al., 2011; Herishanu et al., 2011; Dühren-von Minden et al., 2012). U CLL může docházet ke konstitutivní autonomní signalizaci BCR receptoru, která je nezávislá na antigenu (Dühren-von Minden et al., 2012). Bylo identifikováno několik rekurentně mutovaných genů u CLL, jejichž produkty jsou zapojeny do této signální dráhy a jsou zodpovědné za abnormální BCR signalizaci. Mezi tyto geny patří BTK a PLCG2, jejichž mutace jsou spojeny s rezistencí pacientů k léčbě ibrutinibem a progresí onemocnění (Woyach et al., 2014). Jejich mutace byly nalezeny až u 85 % pacientů s relapsem po léčbě ibrutinibem. Jelikož se objevují relativně brzy (medián 9,3 měsíce) mohou být potencionálně využity jako indikátory budoucího relapsu (Woyach et al., 2017). Dále byly nalezeny mutace v genech CD79A a CD79B (Puente et al., 2015).

Obr. 1.: BCR signální dráha s hlavními účastníky, kteří jsou do ní zapojeni. Přes BCR receptor se aktivují dráhy MAPK(ERK), NF-κB a AKT (převzato z Efremov et al., 2012).

22

2.3.8.2.Signalizace pomocí TLR Gen MYD88 je mutován v 2-8 % případů CLL. Mutace tohoto genu je spojena s CD38 negativitou, mutovaným stavem IGHV genů a je prediktorem nepříznivé prognózy v této podskupině pacientů (Qin et al., 2017). MYD88 je součástí interleukin-1 (IL-1) a TLR signální dráhy (viz obr. 2), které regulují zánětlivou odpověď. Díky mutaci v MYD88 dochází k aktivaci IL-1/TLR drah a také k aberantní aktivaci NF-κB signální dráhy, což vede ke zvýšení přežití CLL buněk (Baer et al., 2017). TRAF2 je gen z rodiny faktorů asociovaných s receptorem TNF (TRAF), které fungují jako dokovací molekuly pro kinázy a další proteiny zapojené do signalizace TLR a TNFR, a katalyzují ubikvitinaci různých cílových molekul. Narušení funkce Traf2 vede u transgenních myší k rozvoji CLL (Pérez-Chacón et al., 2012). Nalezeny byly také mutace v genu TRAF3, jehož inaktivace podněcuje přežití B lymfocytů. Deaktivace TRAF3 vedou ke konstitutivní aktivaci NF-κB2, snížení hladiny PKCδ v jádře, aberantní expresi MCC nebo SOX5 u B-buněčných malignit (Moore et al., 2015). Dále byly identifikovány mutace v genech TRAF6, IRAK2, IRAK4, IRAK1, TLR5 a TLR6 (Martínez-Trillos et al.; 2014; Roos-Weil et al., 2016).

Obr. 2: TLR signální dráha s hlavními účastníky. TLR působí jako okamžité molekulární sentinely vrozené imunity a působí také jako můstek mezi vrozenou a adaptivní imunitní odpovědí (převzato z Muzio et al., 2012; upraveno).

2.3.8.3.MAPK (ERK) signální dráha Přibližně 5 % pacientů nese mutaci v jednom z členů (viz obr. 3) MAPK (ERK) signální dráhy, která hraje klíčovou roli při regulaci embryogeneze, proliferace, diferenciace, migrace a přežití buněk. Deregulace této dráhy se pojí s nepříznivými klinickými rysy a její členové mohou být farmakologicky inhibováni (Giménez et al., 2019). Mezi geny, jejichž mutace byly identifikovány, se řadí BRAF, KRAS, NRAS, MAPK1 a MAP2K1 (MEK1), MAPK2 (MEK2), PTPN11 aj. (Wang et al., 2011; Landau et al., 2015; Giménez et al., 2019). Gen BRAF kóduje serin-threoninovou kinázu, která aktivuje ERK proteiny (Garnett & Marais, 2004). U CLL se mutace v genu BRAF vyskytují u ~3 % pacientů (Jebaraj et al., 23

2013). Zajímavostí je, že mutace v genu BRAF se u CLL vyskytují v jiném místě genu, než je tomu u jiných malignit, což naznačuje jiný mechanismus působení (Laudau et al., 2015). Mutace v genu KRAS byli identifikovány u ~2,6 -6,2 % pacientů, přičemž většina je detekována na subklonální úrovni. KRAS by mohl hrát potencionální úlohu v odolnosti vůči chemoterapii chlorambucilem s rituximabem (Herling et al., 2016). Souběžné mutace BRAF, KRAS a NRAS jsou pozorovány u 9 % pacientů s CLL a jsou spojeny s trizomií chromozomu 12, nemutovanými IGHV geny a jsou častější u mužů (Kanagal-Shamanna et al., 2015).

Obr. 3: MAPK (ERK) signální dráha (převzato z https://www.tocris.com/pathways/mapk-signaling-pathway; upraveno)

2.3.8.4.NF-κB signální dráha Signalizace prostřednictvím NF-κB hraje klíčovou úlohu v zánětlivé reakci, imunitní odpovědi, proliferaci a buněčném přežití. Aktivace této dráhy v nádorových buňkách podporuje růst a proliferaci, tvorbu metastáz a zabraňuje apoptóze (Vaisitti et al., 2017; Frenzel et al., 2011). NF-κB je transkripční faktor složený z 5 proteinů – p50 (NFKB1), p52 (NFKB2), p65 (RELA), RelB (RELB) a c-Rel (REL). U CLL má zvláště podjednotka p65 úlohu při tzv. Richterově transformaci, což je transformace CLL na agresivnější lymfom, převážně na velkobuněčný difuzní B-lymfom (Arruga et al., 2017; Vaisitti et al., 2017). NF-κB signální dráha (viz obr. 4) je důležitá u různých B buněčných malignit a identifikovány byly mutace v zástupcích nekanonických i kanonických cest (Roos-Weil et al., 2016). Na rozdíl od jiných B-buněčných malignit je její aktivace nezávislá na změnách v TNFAIP3 (Frenzel et al., 2011). U CLL pacientů byly pozorovány mutace v genu NFKBIE, který kóduje negativní regulátor NF-κB IκBε. Díky jeho mutacím dochází ke snížení inhibice p65, jeho zvýšené fosforylaci a jaderné translokaci. Tato mutace se více vyskytuje u agresivnějších případů,

24 je spojena se špatnou prognózou, kratší dobou do první léčby, stereotypním BCR a změněnou odpovědí na inhibitory BCR, např. vyšší senzitivitou k ibrutinibu (Mansouri et al., 2015). BIRC3 společně s produkty genů TRAF2 a TRAF3 negativně reguluje MAP3K14, což je centrální aktivátor nekanonické dráhy NF-κB. Identifikace mutace BIRC3 není v době diagnózy CLL častá, nalezena však byla ve vyšší frekvenci (24 %) u pacientů refrakterních na léčbu fludarabinem, a obecně je tato abnormalita spojena se špatnou prognózu a nemutovaným stavem IGHV genů (Rossi et al., 2012; Baliakas et al., 2015). IKZF3 kóduje transkripční faktor z rodiny Ikaros. Identifikovány byli nejen jeho mutace, ale především nadměrná exprese v CLL buňkách a epigenetická modifikace jeho promotorové oblasti (Nuckel et al., 2009; Burns et al., 2018). Dále byly nalezeny mutace v genech NFKB2, REL, IKZF1, PAX5, NKAP, EGR2, A20 (Puente et al.; 2015; Roos-Weil et al., 2016; Burns et al., 2018). Obr. 4: NF-κB signální dráha aktivovaná přes TLR, BCR a CD40, hvězdičkou jsou označeny rekurentně mutované geny (převzato z Mansouri et al., 2016; upraveno).

2.3.8.5.NOTCH signální dráha NOTCH1 kóduje transmembránový protein, který je součástí NOTCH signální dráhy (viz obr. 5) a který se podílí na buněčné diferenciaci, proliferaci a apoptóze (Scarfo et al., 2016). Gen NOTCH1 je mutován u 10–15 % nově diagnostikovaných případů CLL (Benedetti et al., 2018) a jeho mutace jsou spojovány s agresivnějším klinickým průběhem, nemutovaným stavem IGHV, stereotypním BCR, trisomií chromozomu 12 a také vyšším rizikem Richterovy transformace (mutace NOTCH1 pozorovány u ~30 % pacientů, kteří tuto transformaci prodělali; Arruga et al., 2017). Pozorované mutace NOTCH1 vedou ve většině případů ke ztrátě tzv. PEST domény (součást intracelulární domény NOTCH1, zkráceně N(1)ICD, PEST doména je důležitá pro její proteasomovou degradaci; Roos-Weil, et al., 2016). Tyto mutace podporují růst a usídlování buněk, neboť stabilizují molekulu a ta zůstává v jádře transkripčně aktivní delší

25 dobu (Arruga et al., 2017). Zdokumentována je u CLL také častá aktivace N(1)ICD nezávislá na mutaci NOTCH1 (Fabbri et al., 2017). Popsány byly mutace dalších genů zapojených do NOTCH signalizační dráhy, např. mutace genů SPEN a FBXW7. Gen SPEN kóduje transkripční represor, který je klíčový v embryogenezi a během vývoje (Légaré et al., 2015) a u CLL jsou jeho mutace spojovány s Richterovou transformací (Fabbri et al., 2013). FBXW7 kóduje E3 ligázu, která zajišťuje ubikvitinaci a tím degradaci produktu genu NOTCH1. Mutace FBXW7 vedou ke stabilizaci a konstitutivní signalizaci NOTCH signalizační dráhy (Wang et al., 2011) a také mají vliv na produkt genu MYC, neboť gen FBXW7 hraje roli při jeho degradaci (Yada et al., 2004). Obr. 5: NOTCH signální dráha (převzato z https://www.tocris.com/pathways/notch-signaling- pathway; upraveno).

2.3.8.6.Metabolismus RNA (sestřih a transport mRNA) V rámci CLL je nejvýznamnějším členem patřícím do drah metabolismu RNA gen SF3B1. Tento gen kóduje podjednotku sestřihového faktoru 3b, která je součástí spliceozomu. Mutace v tomto genu se vyskytují u 3-10 % nově diagnostikovaných pacientů s CLL, jejich četnost však stoupá až na 20 % u pacientů v relapsu a refrakterních na léčbu fludarabinem. Je spojován např. s nemutovaným stavem IGHV, špatnou prognózou, del11q a CD38 pozitivitou aj. (Wang et al., 2011; Jeromin et al., 2014; Zhang et al., 2017). Díky mutacím v genu SF3B1 dochází k nesprávnému sestřihu pre-mRNA, což má za následek široké změny v genové expresi a sestřihu mnoha genů v různých signálních drahách. Například dochází ke dysregulaci exprese TERC a TERT a tím k ovlivnění regulace udržování telomer, dále k modulaci NOTCH signální dráhy prostřednictvím alternativního sestřihu DVL2 a ke změně odpovědi na poškození DNA upregulací KLF8 (Wang et al., 2016). Ovlivněn je také sestřih mRNA genů SLC23A2, TCIRG1 a FOXP1 aj. (Quesada et al., 2012). S mutací SF3B1 jsou asociované mutace GCC2, MAP3K7, TPP2 a ZNF91, (Wang et al., 2016).

26

Rekurentně mutovaným genem, který se objevuje v rámci mnoha studií je gen KLHL6, jehož funkce zatím není plně známa. Podle studie u difuzního velkobuněčného B-lymfomu se jedná o E3 ligázu pro protein roquin2 (Choi et al., 2018). Mezi další mutované geny spojené s metabolismem RNA patří DDX3, XPO1, DIS3, SRSF1, U2AF2, CELF4, NXF1, XPO4, FUBP1, EWSR1 aj. (Ramsay et al., 2013; Landau et al., 2015). DDX3 kóduje ATP-dependentní RNA helikázu, která se účastní metabolismu RNA, konkrétně transkripce, translace, sestřihu, transportu mRNA, regulace zánětlivé odpovědi, apoptózy, regulace buněčného cyklu aj. (Wang et al., 2011). Mutace v genu DDX3 jsou asociovány s nemutovaným stavem IGHV, ZAP-70 pozitivitou a jsou častější v relapsu onemocnění po terapii, než u pacientů se stabilním průběhem nemoci (Ojha et al., 2015). Tento gen hraje roli v rozvoji různých nádorových onemocnění, avšak jeho role je komplikovaná, neboť u některých nádorů funguje jako nádorový supresor a u jiných se účastní progrese onemocnění (He et al., 2018). Gen XPO1 kóduje exportin 1, který je zapojen do nukleocytoplazmatického exportu proteinů a mRNA a podílí se na regulaci transkripce (Roos-Weil et al., 2016). Jeho mutace jsou spojeny s nemutovaným stavem IGHV, CD38 a ZAP-70 pozitivitou (Jain et al., 2016). Nadměrná exprese je asociována se špatnou prognózou a rezistencí na léčbu (Cosson et al., 2017).

2.3.8.7.Dráhy reagující na poškození DNA, buněčný cyklus a apoptózu Geny zodpovědné za udržení integrity genomu jsou jedněmi z nejčastěji mutovaných genů u nádorových onemocnění obecně. Nejdůležitějším z těchto genů je TP53, jeho mutace byly identifikovány u zhruba poloviny všech nádorů. Defekty TP53 jsou způsobeny mutací genu nebo delecí 17p13 (viz kapitola 2.1.3.2.). ATM kóduje protein účastnící se kontroly integrity genomu, regulace buněčného cyklu a apoptózy (Rossi & Gaidano, 2016). Mutace genu ATM nebo jeho delece vlivem del11q má za následek selhání opravných mechanismů, jež může vést k chromozomovým fúzím, vytváření zlomů na chromozomech a k celkové genomové nestabilitě (Thomay et al., 2017). Mutace ATM se vyskytuje u 12–14 % pacientů (Guarini et al., 2012). Kombinace del11q a mutace genu ATM je spojena s narušením reakce na alkylační činidla a purinové analogy (Jiang et al., 2016). V některých studiích ATM mutace vykazovala špatný prognostický dopad, asociaci s nemutovaným stavem IGHV genů a kratší interval do první léčby (Guarini et al.,

27

2012). V jiných studiích ovšem toto zjištěno nebylo, proto zůstává klinický dopad mutace ATM nejasný (Jiang et al., 2016). Gen POT1 kóduje jaderný protein, který je součástí shelterinového komplexu, jenž se podílí na regulaci délky telomer. Mutace v POT1 byly identifikovány v 3,5 % případů CLL a CLL buňky s touto mutací se vyznačují četnými telomerickými a chromozomálními abnormalitami (Speedy et al., 2016). Gen MGA kóduje supresor transkripční aktivace genu MYC a je inhibitorem MYC indukované buněčné transformace. Mutace v genu MGA jsou asociovány s Richterovou transformací (De Paoli et al., 2013). Mezi další rekurentně mutované geny u CLL, které pravděpodobně modulují aktivitu MYC patří PTPN11 a FUBP1 (Landau et al., 2015).

2.3.8.8.Remodelace chromatinu a změny transkripce Epigenetické procesy, díky nimž dochází ke změnám genové exprese, jsou důležitými mechanismy, které se uplatňují při vzniku a vývoji leukémie. Některé nedávné studie potvrdily důležitost metylace DNA a posttranslační modifikace histonů pro prognózu CLL (Van Damme et al., 2016). Mezi mutované geny remodelující strukturu chromatinu u CLL patří např. SETD2, CHD2, ZMYM3, HIST1H1E, MLL2, ARID1A (Damm et al., 2012; Landau et al., 2013; Puente et al., 2015; Parker et al., 2016). SETD2 kóduje histon-lysin metyltransferázu, která hraje roli v aktivaci transkripce a podílí se na udržení genomické integrity. Mutace způsobující ztrátu funkce SETD2 narušují opravu DNA a vedou ke genomické nestabilitě. U CLL jsou mutace v SETD2 spojeny s chromotripsí, mutací v TP53 a agresivnějším onemocněním (Parker et al., 2016). Mutace MED12 byly nalezeny u různých nádorů, včetně CLL a to v 1,3-8,8 % případů (Wu et al., 2017). Tento gen kóduje jednu z podjednotek čtvrtého, kinázového transkripčního mediátoru, který reguluje aktivitu mobilizovaných transkripčních faktorů (Park et al., 2018). Zjištěna byla změna transkripce mnoha genů, např. byla zaznamenána vysoká exprese CLLU1, která se zdá být pro CLL jedinečná a má potencionální prognostickou hodnotu její dopad je ovšem stále nejasný (Gonzales et al., 2013; Abur et al., 2018). Nadměrná exprese NFATC1, který je hypometylován v rozdílné míře v jednotlivých souborech pacientů v různém stádiu progrese onemocnění (Wolf et al., 2018). Změny exprese se týkaly také genů spojených s kmenovostí buněk, např. genů ZNF207, ID3 a PIGR, genů regulujících zánět a pomáhajících buňce zvládat stres, mezi něž např. patří geny SLC6A4 a MIF (Mayer et al., 2018) nebo genů zodpovědných za metylaci DNA a posttranslační modifikace histonů,

28 jako jsou HDAC6, HDAC7, HDAC10, SIRT3, SIRT5 a SIRT6, a celé řady dalších genů, např. ROR1 (Cui et al., 2016), EZH2 (Szurián et al., 2018), PIM1, PIM2 (Bialopiotrowicz et al., 2018), CXCR4 (Peled et al., 2018).

2.3.9. Klonální vývoj Nádorová onemocnění se vyvíjí neustále se opakujícími procesi klonální expanze, genetické diverzifikace a klonální selekce. Klíčovým tlakem pro spontánní změnu klonální architektury je tkáňové mikroprostředí. Dalším, velmi závažným činitelem, na nějž musí nádory reagovat, je podaná terapie, ta může neúmyslně zapříčinit expanzi rezistentních klonů, a dokonce zlepšit jejich životaschopnost a maligní potenciál (Greaves & Maley, 2012). Obecně byly identifikovány 3 typy průběhu CLL: bez evoluce, s lineárním vývojem, který je spojen s Richterovou transformací a s rozvětvenou evolucí (spojena se špatnou prognózou a vývojem onemocnění; Roos-Weil et al., 2016). Zisk nových mutací v průběhu CLL byl považován za neobvyklý. Později, díky zavedení nových technik a postupů, byli popsány např. klonální změny, identifikovány tzv. „driver“ (řídící) mutace (poskytují buňce selekční výhodu), časné mutace a i mutace, které expandují v pokročilejších stádiích (Stilgenbauer et al., 2007). Dnes už je klonální evoluce brána jako ústřední rys progrese CLL. Pozorována je změna klonální heterogenity, vznik a expanze subklonů. Během těchto změn dochází ke vzniku driver mutací (např. v genech SF3B1, TP53), které jsou doprovázeny selektivně neutrálními mutacemi (Hernández-Sánchez et al., 2016; Burger et al., 2016). Akumulace driver mutací postupně zkracuje dobu do první léčby nezávisle na klonální architektuře, somatických hypermutacích IGHV a klinickém stádiu dle Bineta. S přítomností velkého množsví subklonálních populací souvisí mutační diverzita nádoru, která může být příčinou klinické heterogenity CLL (Nadeu et al., 2018). Klonální vývoj je patrný zvláště u pacientů v relapsu, kdy dochází vlivem terapie k potlačení původního klonu v důsledku expanze agresivnější subklonální populace. Příkladem zaznamenávajícím evoluční dynamiku CLL je cílená léčba ibrutinibem, kdy dochází až u 31 % pacientů ke klonálnímu posunu, který je spojen se ziskem mutací v genech BTK a PLCG2 (Landau et al., 2017). V některých případech může být přítomnost malé populace rezistentních subklonů detekována již před zahájením léčby. Pozorovány byly např. minoritní klony nesoucí mutaci TP53 (Malčíková et al., 2015). Mutace v subklonálních populacích, které jsou schopny zapříčinit rezistenci, nemusí poskytovat žádnou výhodu bez selekčního tlaku terapie (Burger et al., 2016).

29

3. Cíle diplomové práce

V rámci diplomové práce byly analyzovány dvě skupiny CLL pacientů: s mutací TP53 expandující v relapsu po protinádorové léčbě a s minoritní mutací TP53 po léčbě neexpandující. Z klinického hlediska má nalezení molekulárních znaků, které ovlivňují expanzi mutace TP53, zásadní význam, aby bylo možné rozpoznat pacienty v riziku. Identifikací takovýchto znaků ještě před podáním terapie by mohlo vést k její vhodné optimalizaci, čímž by se předešlo selekci rezistentních klonů.

Cílem diplomové práce bylo: I. U vybraného souboru provést retrospektivní analýzu pomocí celoexomového sekvenování II. Vybrat geny potencionálně zodpovědné za nepříznivou klonální evoluci CLL III. Porovnat získaná data s literaturou

30

4. Materiál a metody Chemikálie použité při zpracování vzorků v rámci diplomové práce: • Ficoll-Paque® PLUS (GE Healthcare) • RosetteSepTM Human B Cell Enrichment Coctail a RosetteSepTM CD3+ Depletion Coctail (STEMCELL Technologies Inc.) • 2% FBS v PBS; (FBS, Fetální bovinní sérum) (MP Biomedicals, LLC) • PBS (phosphate-buffered saline) (Laboratorní lékárna FN Brno) • Roztok pro osmotickou lyzi (1x) - 1,55M NH4Cl; 0,1M NH4HCO3; 1,3mM EDTA • 10 % DMSO (dimethylsulfoxid) ve FBS (Sigma) • DNeasy® Blood & Tissue Kit (Qiagen) • MagCore® Genomic DNA Tissue Kit (RBCBioscience) • XL CLL Probe Kit (XL DLEU/LAMP/12cen + XL ATM/TP53) (MetaSystem Probes) • Nextera XT library preparation kit (Illumina) • Qubit™ dsDNA BR (Broad Range) Assay Kit (ThermoFisher Scientific) • Qubit™ dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit (ThermoFisher Scientific) • Agaróza (Serva) • 1x TBE pufr (Tris-borát-EDTA) (Laboratorní lékárna FN Brno) • GelRedTM Nuclei acid (Biotium) • Velikostní marker GeneRuler 50bp DNA ladder (Thermo Scientific) • TruSeq® Exome Library Prep Kit (24 samples) (Illumina) • High Sensitivity D1000 ScreenTape (Agilent Technologies) • DNF-474 High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit, (1 bp - 6,000 bp) (Agilent Technologies) • High Sensitivity D1000 Sample Buffer (Agilent Technologies) • NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2.5 (150 cycles) (Illumina) • PhiX (10nM) (Illumina)

Přístroje použité v rámci zpracování diplomové práce: • QIAcube (Qiagen) • MagCore® HF16 auto-extraction instrument (RBCBioscience) • MiSeq (Illumina)

31

• Thermo Scientific™ NanoDrop™ One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer (ThermoFisher Scientific) • Qubit® 2.0 Fluorometr (Invitrogen) • C1000 TouchTM thermal cycler (Bio-rad) • Focused-ultrasonicator Covaris S220 (Covaris®) • 2200 TapeStation instrument (Agilent Technologies) • Fragment AnalyzerTM Automated CE Systém (Advanced Analytical) • NextSeqTM 500 Sequencing systém (Illumina) • Alliance Mini HD9 - Uvitec (UVITEC Cambridge)

4.1. Sběr materiálu V diplomové práci byly využity vzorky periferní krve pacientů s CLL, kteří jsou v péči na Interní hematologické a onkologické klinice Fakultní nemoncice Brno. Vybráni byli pacienti se známým vývojem mutace TP53 v nádorovém klonu, u kterých byl dostupný odběr před první léčbou a v relapsu CLL. Expanze mutantního klonu byla definována mutací TP53 detekovanou v relapsu CLL pomocí NGS, jejíž alelická frekvence překročila 10 % a/nebo vzrostla alespoň10x od prvního záchytu. Pro porovnání byly vyšetřeny vzorky pacientů s minoritní mutací TP53, u nichž nedošlo k její expanzi. Pacienti stvrdili souhlas s odběrem pro výzkumné účely podpisem informovaného souhlasu.

4.2. Separace buněk z periferní krve Vzorky heparizované periferní krve přicházejí do Fakultní nemocnice a jsou zpracovány ihned po příjmu. Pro účely NGS byla separována frakce B-lymfocytů. Buňky byly separovány gradientovou centrifugací, při které se použilo médium Ficoll-Paque® PLUS od firmy GE Healthcare a k zisku pufirikovaných B lymfocytů byly použity kity RosetteSep od výrobce STEMCELL Technologies Inc. (RosetteSepTM Human B Cell Enrichment Coctail a RosetteSepTM CD3+ Depletion Coctail). Kity RosetteSep obsahují specifické protilátky díky nimž dochází k navázání nežádoucích buněk na erytrocyty a k vytvoření hustých imunorosett které při centrifugaci klesají do spodní vrstvy hustotního gradientu. Samotné zpracování (viz obr. 6) probíhalo následovně: • K plné krvi přidat 50µl na 1ml krve Human B Enrichment kitu a 25µl na 1ml krve CD3+ depletion kitu.

32

• Směs krouživým pohybem promíchat a nechat inkubovat při pokojové teplotě 20 minut • Směs naředit v poměru 1:1 2% FBS/PBS (fetální bovinní sérum) a opatrně nanést na 3ml média Ficoll-Paque (6ml směsi na 3 ml média). • Centrifugace 30 minut při 1470rpm • Pasteurovou pipetou přenést vrstvu B-lymfocytů do nové zkumavky • Doplnit zkumavky 2% FBS/PBS v poměru 1:1 a promíchat • Centrifugace 1200rpm po 10 minut • Osmotická lyze: Odsát supernatant a sediment resuspendovat v chlazeném lyzačním pufru (1x) plastovou Pasteurovou pipetou. • Centrifugace 1200rpm po 10 minut • Odsát supernatant a sediment resuspendovat v 2 % FBS/PBS Pasteurovou pipetou • Centrifugace 1200rpm po 10 minut • Odsát supernatant a sediment resuspendovat v čerstvém 10 % DMSO (dimethylsulfoxid) ve FBS, separované buňky uložit do tekutého dusíku.

Obr. 6: Separace populace CLL buněk pomocí RosetteSep (převzato z https://www.stemcell.com/products/brands/rosettesep-immunodensity-cell-separation.html; upraveno).

4.3. Analýza chromozomových aberací metodou FISH V rámci rutinní diagnostické praxe byly stanoveny základní chromozomové aberace metodou FISH. Vyšetření vybraných oblastí (viz obr. 7) provedla Cytogenetická laboratoř, CMBGT, IHOK, FN Brno za použití XL CLL Probe Kit (XL DLEU/LAMP/12cen + XL ATM/TP53) (MetaSystem Probes).

33

Obr. 7: Na obrázku jsou znázorněny oblasti chromozomů, na které cílí sondy z XL CLL Probe Kit (převzato z https://metasystems-probes.com/en/probes/xl/d-5044-100-tc/, 24.4.2019)

4.4. Stanovení mutace TP53 Pro detekci mutací TP53 bylo použito NGS s vysokým pokrytím, které probíhalo v rámci rutinní diagnostiky. Oblasti kódující exony 2-11 a přilehlá sestřihová místa byly amplifikovány pomocí primerů navržených v Sekci nádorové genomiky, CMBGT, IHOK, FN Brno. Pro přípravu knihoven byla použita chemie Nextera XT library preparation kit (Illumina), vlastní sekvenování probíhalo na přístroji MiSeq (Illumina) s využitím sekvenační chemie pro čtení 2x150 bp.

4.5. Izolace DNA Pro účely studie byly od všech pacientů získány vzorky nenádorové DNA ze stěrů z bukální sliznice. Nádorová DNA u skupiny pacientů s expandující mutací byla izolována ze separovaných B lymfocytů, získaných před léčbou a v progresi po léčbě, po níž došlo k expanzi klonu s TP53 mutací. U pacientů se stabilní minoritní mutací TP53 byly získány vzorky nádorové DNA před první léčbou a následně po jedné až pěti liniích léčby. U každého vzorku DNA byla změřena koncentrace a byla hodnocena kvalita získané DNA pomocí elektroforézy.

34

4.5.1. Izolace nádorové DNA pomocí QIAcube Ze separovaných buněk bylo odebráno 5x10-6 buněk. Z nich byla následně izolována DNA na přítroji QIAcube pomocí chemie DNeasy® Blood & Tissue Kit (Qiagen). DNA byla izolována dle návodu dodávaného výrobcem (viz obr. 8).

Obr. 8: Schéma izolace DNA pomocí přístroje a chemie firmy Qiagen (převzato z https://www.qiagen.com/us/shop/sample- technologies/dna/genomic-dna/dneasy-blood-and-tissue- kit/#productdetails; upraveno).

4.5.2. Izolace nenádorové DNA Z buněk získaných ze stěru bukální sliznice byla izolována nenádorová DNA pomocí přístroje MagCore® HF16 auto-extraction instrument a příslušné chemie obsažené v MagCore® Genomic DNA Tissue Kit od firmy RBCBioscience. Izolace DNA (viz obr. 9) probíhala podle návodu dodávaného výrobcem. Tato metoda používá náplně, které obsahují proteinkinázu K a chaotropní soli k lýze buněk a degradaci proteinů. DNA je navázána na magnetické kuličky a po odmytí kontaminantů se purifikovaná DNA eluuje elučním pufrem s nízkým obsahem solí. Purifikovaná DNA má délku ~ 20-30kb.

Obr. 9: Schéma izolace DNA pomocí přístroje MagCore (převzato z https://www.labgene.ch/nucleic-acids-purification/151-magcore-hf16.html; upraveno).

4.5.3. Kontrola kvality a kvantity DNA Pro měření koncentrace DNA izolované z krevních vzorků byl použi přístroj Thermo Scientific™ NanoDrop™ One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer. Změřena byla

35 koncentrace vzorků a poměr absorbancí při vlnových délkách 260nm, 230nm a 280nm. Poměry (260/280 a 260/230) absormance při jednotlivých vlnových délkách odráží čistotu měřené DNA. Pokud je poměr výrazně nižší (< 1,8) je vzorek kontaminován proteiny nebo fenolem, vyšší poměr odráží kontaminaci RNA. Pro přesnější hodnoty byla koncentrace změřena také na přístroji Qubit® 2.0 Fluorometr (Invitrogen) za použití chemie Qubit™ dsDNA BR (Broad Range) Assay Kit a Qubit™ dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit (oba kity od ThermoFisher Scientific). Měření pobíhalo podle následujícícho schématu (viz obr. 10) a při každém samostatném měření byly vytvořeny nové standardy.

Obr. 10: Příprava vzorků a standardů pro měření koncentrace na přístroji Qubit (převzato z http://www.science.smith.edu/cmbs/wp-content/uploads/sites/36/2015/09/Tutorial-from- sample-to-analyzed-data-using-Qiime-for-analysis.pdf; upraveno).

4.5.4. Hodnocení kvality DNA pomocí gelové elektroforézy Kvalita izolované DNA byla zhodnocena pomocí gelové elektroforézy na 1% agarózovém gelu. Elektroforéza probíhala při napětí 5-10V/cm 45-60 minut. DNA byla zvýrazněna pomocí GelRed™ a srovnána k 50bp žebříčku. Gely byly foceny na přístoji Alliance Mini HD9 - Uvitec (UVITEC Cambridge).

36

4.6. Celoexomové sekvenování 4.6.1. Příprava knihovny na sekvenování pomocí Truseq kitu Příprava knihovny pro exomové sekvenování probíhala podle návodu dodávaného výrobcem (Truseq Exome Library Prep Reference Guide). Použit byl TruSeq® Exome Library Prep Kit (24 samples) od firmy Illumina. Postup zahrnuje fragmentaci genomické DNA a přidání adaptérových sekvencí, aby došlo k vytvoření indexované knihovny pro sekvenování. Při přípravě byl použit Termocycler Bio-rad s deep-well nástavcem. Vstupním materiálem bylo 100ng genomové DNA získané od pacientů s CLL. Příprava knihovny probíhala dle doporučení výrobce. Fragmentace probíhala na přístroji Focused-ultrasonicator Covaris S220 (od firmy Covaris®), metoda 150bp-280s při teplotě 6-8°C. Kvantifikace knihoven proběhna na přístroji Qubit a kontrola kvality na přístroji TapeStation. Během přípravy byly spojovány 3 knihovny (3-plex), kdy vstupním materiálem bylo 250ng obohacených DNA fragmentů od každého vzorku, tedy v případě 3-plexu do reakce vstupovalo celkem 750ng DNA. Kvantifikace knihoven proběhla na přístroji Qubit a kontrola kvality byla provedena na přístroji TapeStation.

4.6.2. Příprava knihovny na sekvenování pomocí Nextera kitu Příprava knihoven některých vzorků byla provedena pomocí Nextera® Exome Library Prep Kit (Illumina) podle doporučení výrobce. Jde o starší typ chemie, který byl později nahrazen TruSeq® Exome Library Prep Kitem (24 samples). Autorka práce přípravu knihoven pomocí zmíněného kitu neprováděla, ale využila data získaná uvedeným postupem z důvodu jejich komplementarity s vlastními daty.

4.6.3. Měření koncentrace a hodnocení kvality DNA fragmentů V rámci přpravy knihovny pro exomové sekvenování byla provedena validace, která zahrnovala kvantifikaci knihovny a kontrolu její kvality. Validace byla provedena dvakrát v rámci přípravy knihovny. Hodnoceny byly vzorky pacientů zpracovávané během přípravy v době před spojením do vlastní knihovny a poté již připravená knihovna. Kvantifikace probíhala na přístroji Qubit® 2.0 Fluorometr (Invitrogen) za použití speciálních zkumavek Qubit® assays tubes a příslušné chemie Qubit™ dsDNA BR (Broad Range) Assay Kit (ThermoFisher Scientific). Pro kontrolu kvality vzorků bylo provedeno měření na přístroji 2200 TapeStation za použití chemie High Sensitivity D1000 ScreenTape a High Sensitivity D1000 Sample Buffer

37

(Agilent Technologies). Postup zahrnoval nejprve zředění knihovny pomocí RSB pufru (0,5µl knihovny + 4,5µl RSB) a vlastní přípravu (viz obr. 11) vzorku pro měření.

Obr. 11: Postup přípravy vzorku pro měření na přístroji TapeStation, jako vstupní DNA byla použita 10 krát naředěná knihovna pomocí RSB (převzato z https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G2964- 90000_TapeStation_USR_ENU.pdf; upraveno)

Alternativně byl pro kontrolu kvality použit Fragment AnalyzerTM Automated CE System (Advanced Analytical; viz obr. 12), za použití chemie DNF-474 High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit, (1 bp - 6,000 bp) (Agilent Technologies). Vzorky byly nanášeny do 96 jamkové destičky. Postupovalo se podle doporučení výrobce.

Obr. 12: Schéma měření na přístroji Fragment Analyzer, kde detekce nukleové kyseliny je prováděna navrženou optickou platformou složenou z LED zdroje světla, objektivu kamery a CCD detektoru. Napájecí zdroj poskytuje vhodné napětí pro elektrokinetické vstřikování vzorku a elektroforézu (převzato z https://www.aati- us.com/instruments/fragment-analyzer/; upraveno)

4.6.4. Sekvenování Sekvenování připravených knihoven probíhalo na přístroji NextSeqTM 500 Sequencing system od firmy Illumina. Byla použita sekvenační chemie NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2.5 (150 cycles) (Illumina), která umožňuje čtení 2x75 bp. Vstupním materiálem byla

38 připravená indexovaná knihovna, naředěná pomocí TE pufru, na požadovanou výslednou koncentraci ~4nM. Příprava probíhala dle doporučení výrobce za přidání 1,3µl 1% PhiX (10nM). Základní princip sekvenování je zobrazen na obr. 13.

Obr. 13: Zjednodušené schéma NGS na platformě od firmy Illumina (převzato z https://www.illumina.com/documents/products/illumina_sequencing_introduction.pdf; upraveno)

4.6.5. Analýza dat Analýza dat získaných z celoexomového sekvenování probíhala ve spolupráci s bioinformatikem Mgr. Karolem Pálem z CEITEC, MU. Pro bioinformatickou analýzu byl použit “pipeline manager” bcbio-nextgen (https://github.com/bcbio/bcbio-nextgen), který byl vytvořen na základě ověřených postupů pro analýzu sekvenačních dat. Analýza byla spouštěna na základě konfiguračních souborů, ve kterých byly definovány hlavní kroky a programy využité při analýze každého vzorku. Bcbio-nextgen zajišťuje paralelní spouštění a synchronizaci jednotlivých programů. Hlavní kroky analýzy zahrnovaly mapování surových dat ve formátu fastq na lidský referenční genom (verze GRCh37), odstranění PCR duplikátů po mapování, “variant calling”, tzn. vyhledávání somatických variant programem GATK Mutect2 a anotaci variant programem Variant Effect Predictor. Extrahované varianty byly následně převedeny do tabulkového formátu vhodného pro jejich další manuální filtrování. 39

Následná manuální filtrace, kterou autorka práce prováděla samostatně, probíhala podle několika kritérií (u dat získaných za použití Nextera kitu byla zvolena přísnější kritéria): • Celkový počet čtení na danou pozici ≥10 ve všech odběrech daného pacienta • Zahrnuty pouze protein kódující geny a pouze varianty v exomech a přilehlých sestřihových místech • Zahrnuty mutace typu missense (substituční bodová mutace), frameshift (posunová mutace), splice (střihové mutace), start lost (bodová mutace, měnící start kodon v non-start kodon), stop gain/lost (bodová mutace mající za následek vznik předčasného stop kodonu/ abnormální prodloužení proteinu v důsleku nefunkčního stop kodonu). • Odfiltrovány mutace s nízkým dopadem • Alelická frekvence alespoň v jednom nádorovém vzorku ≥0,15 • Rozdíl alelické frekvence mezi nádorovými vzorky ≥0,15, pokud došlo k nárůstu nebo ztrátě dané mutace. Po provedení manuální filtrace byly vybrané geny porovnány s dostupnou literaturou a databázemi. Odfiltrovány byly také polymorfismy a případné artefakty. Byly označeny takové geny, které jsou rekurentně mutované u CLL, případně jsou součástí drah, které jsou u CLL aberantně regulované, nebo jsou popisovány v souvislosti s funkcí B-lymfocytů. Zařazení do signálních drah proběhlo dle dat dostupných na GeneCards®: The Human Gene Database (dostupné na www.genecards.org).

40

5. Výsledky 5.1. Hodnocení pacientů V rámci této diplomové práce bylo hodnoceno 20 pacientů (celková charakteristika souboru uvedena v tabulce 2). Šlo o retrospektivní studii, do níž bylo vybráno 8 pacientů s neexpandující (stabilní minoritní mutace; viz tabulky 3 a 4) a 12 pacientů s expandující (viz tabulky 5 a 6) mutací TP53. Od každého pacienta byly získány a hodnoceny 3 vzorky DNA – nenádorová DNA získaná ze stěru z bukální sliznice; nádorová DNA získaná před léčbou a nádorová DNA z pozdějšího odběru odebraná po léčbě. U pacientů s expandující mutací byl 2. odběr nádorové DNA uskutečněn po léčbě, po níž došlo k expanzi mutace TP53.

Tabulka 2: Klinická charakteristika celého souboru pacientů, kteří byli hodnoceni v rámci této diplomové práce. Počet Medián věku Medián doby Medián Přežití Mutační pacientů pacientů při do první délky (žijí/ status IGHV diagnóze léčby přežití zemřeli) (mutované/ (měsíce) (měsíce) nemutované Ženy 8 58 26 116 2/6 1/7 Muži 12 63 35 106 5/7 2/10 Celkově 20 59 33 113 7/13 3/17

5.1.1. Pacienti s neexpandující mutací TP53 U testovaných pacientů alelická frekvence mutace TP53, která neexpandovala (resp. byla stabilní) v relapsu onemocnění, nepřekročila 10%, nebo vzrostla méně než 10x v následných odběrech v provnání se záchytovým vzorkem. Do této skupiny bylo zařazeno 8 pacientů (4 ženy, 4 muži). Srovnání klinických znaků pacientů v rámci této skupiny je uvedeno v tabulce 3. Průměrný věk pacientů při diagnóze v této skupině byl 64,75 měsíců. U 3 pacientů byla v době diagnózy pomocí FISH zachycena izolovaná del13q; 3 pacienti nesli současně del13q a del11q, 1 pacient nesl izolovanou del11q a 1 trisomii 12.

Tabulka 3: Souhrn klinických znaků u pacientů s neexpandující mutací TP53. Počet Medián věku Medián doby Medián Přežití Mutační pacientů pacientů při do první délky (žijí/ status IGHV diagnóze léčby přežití zemřeli) (mutované/ (měsíce) (měsíce) nemutované Ženy 4 61 37 108 1/3 0/4 Muži 4 68 20 81 2/2 1/3 Celkově 8 67 33 98 3/5 1/7

41

Tabulka 4: Klinická charakteristika pacientů s neexpandující mutací TP53, kteří byli

hodnoceni v rámci diplomové práce.

)

před

měsíce

RAI

Stav

BINET

Pacient

Pohlaví

Celkové přežití Celkové

léčbou/poléčbě

Věk při diagnóze při Věk

FISHpři diagnóze

Alelická frekvence Alelická

Mutační status IGHV status Mutační

nejpočetnější mutace mutace nejpočetnější

Doba mezi odběry ( odběry mezi Doba Doba do Doba (měsíce) první léčby p.G266E: 0,55% / 51 BRNO0311 F 54 40 98 D U del13q 0 A 0,2% del13q p.H168R: 0,28% / 70 BRNO0475 F 60 34 162 D U I A del11q 4,71% del13q p.R280G: 0,14% / 23 BRNO0503 F 62 18 42 D U 0 A del11q 2,49% p.R273H: 0,14% / 40 BRNO0823 M 67 32 113 D U del11q 0 A 3,25% c.673-1_688del: 1% / 49 BRNO1416 F 69 67 118 L U 12+ I A 1,42% p.R248G: 0,07% / 50 BRNO1428 M 68 37 99 L M del13q 0 A 0,23% del13q p.G244S: 0,42% / 41 BRNO1530 M 68 8 63 D U II unk del11q 0,35% c.672+1G>C: 0,4% / 36 BRNO1794 M 70 0 42 L U del13q III B 1,02% (F=žena/M=muž; L=žije/D=zemřel; U=nemutovaný/M=mutovaný IGHV status; unk = údaj není známí)

5.1.2. Pacienti s expandující mutací TP53 U pacientů zařazených do této skupiny došlo k expanzi mutantního klonu, která je definovaná nově detekovanou mutací TP53 v relapsu CLL, jejíž alelická frekvence při vyšetření pomocí NGS překročila 10 % a vzrostla alespoň 10x od prvního záchytu. Do této skupiny bylo zařazeno 12 pacientů (4 ženy, 8 mužů). Pro srovnání pacientů v rámci této skupiny viz tabulka 5. Průměrný věk pacientů v době diagnózy byl 56,33 měsíců. 5 pacientů mělo v době diagnózy del13q, 4 pacienti neměli pomocí FISH žádné detekované abnormality, 1 pacient nesl del13q, 1 pacient del11q a u 1 pacienta byla detekována současně del13q, del11q a trisomie 12.

42

Tabulka 5: Souhrn klinických znaků u pacientů s expandující mutací TP53. Počet Medián Medián Medián Přežití Mutační status pacientů věku doby do délky (žijí/ IGHV pacientů při první léčby přežití zemřeli) (mutované/ diagnóze (měsíce) (měsíce) nemutované Ženy 4 55 15 118 1/3 1/3 Muži 8 56 63 138 3/5 1/7 Celkově 12 56 40 128 4/8 2/10

Tabulka 6: Klinická charakteristika hodnocených pacientů s expandující mutací TP53.

s IGHV s

RAI

Stav

BINET

Pacient

Pohlaví

Celkové přežití Celkové

léčbou/poléčbě

Věk při diagnóze při Věk

FISHpři diagnóze

Alelická frekvence Alelická

Mutační statu Mutační

nejpočetnější mutace před mutace nejpočetnější

Doba mezi odběry (měsíce) odběry mezi Doba Doba do Doba (měsíce) první léčby wt / BRNO0047 M 49 98 242 L U del13q I A 114 p.R248Q 33,4% c.559+33_54del22n: BRNO0126 M 58 78 180 D U del13q 0 A 55 0,52% / 94% wt / BRNO0149 F 64 54 115 D U neg 0 A 47 p.V272M 25,4% wt / BRNO0332 M 57 48 135 D U neg I A 70 p.P278L 42,02% p.R110L: 0,15% / BRNO0365 M 51 22 59 D M del13q I A 57 50% p.G105D: 2,3% / BRNO0462 M 55 80 141 L U neg 0 A 28 67% wt / BRNO0627 F 56 1 121 D U del13q IV C 118 p.G266V 20,6% p.R282W: 0,3% / BRNO0843 M 70 84 154 D U neg unk unk 48 16,7% p.Y163H: 0,19% / BRNO0859 F 53 17 135 L M del13q I A 42 38% del13q c.582delT: 0,2% / BRNO1284 F 46 12 59 D U del11q III C 45 69% 12+ del13q p.R248Q: 0,01) / BRNO1404 M 69 32 73 D U I B 34 del11q 41% p.K132R: 0,9% / BRNO1503 M 48 18 82 L U del11q II B 27 88,6% (F=žena/M=muž; L=žije/D=zemřel; U=nemutovaný/M=mutovaný IGHV status; wt=wild type, intaktní; unk=údaj není známý)

43

5.2. Celoxomové sekvenování 5.2.1. Hodnocení kvality DNA v rámci přípravy knihovny Očekávaná distribuce DNA fragmentů jednotlivých vzorků je v rozmezí od ~200bp do ~400bp. U elektroforetogramu vzorků byla v některých případech vidět mírná kontaminace adaptérovými dimery (~150bp), nebo byl pozorován druhý vrchol, zapříčiněný konkatemerem knihovny (~550-1000bp). V našem případě se velikost fragmentů u připravených knihoven většinou pohybovala okolo ~300bp. Na obr. 14 a 15 jsou uvedeny příklady měření na Tapestation a na obr. 16 a 17 na přístroji Fragment Analyzer.

Obr. 14: Příklad elektroforetogramu vzorku z relapsu pacienta BRNO0823 získaného na přístroji TapeStation.

Obr. 15: Příklad elektroforetogramu výsledné knihovny na přístroji TapeStation.

44

Obr. 16. Příklad elektroforetogramu vzorku před spojením do knihovny pacienta BRNO1416 získaný na přístroji Fragment Analyzer.

Obr. 17: Elektroforetogram výsledné knihovny získaný na přístroji Fragment Analyzer.

5.2.2. Kontrola správnosti přiřazení vzorků Pro správné zhodnocení genových mutací, které by mohly ovlivňovat klonální evoluci, je žádoucí kontrolovat, zda nedošlo k záměně vzorků mezi pacienty. Pro tento účel byly porovnávány SNP mezi vzorky, příslušejícími jednomu pacientovi (viz obr. 19 a 20).

45

Obr. 19: Srovnání alelických frekvencí SNP nenádorové DNA pacienta BRNO0047 (N1788) s nádorovou DNA stejného pacienta před léčbou (T1454). Jak je vidět na obrázku, při správném přiřazení vzorků se alelické frekvece shlukují kolem hodnot 0, 0,5 a 1, což odpovídá homozygotnímu a heterozygotnímu stavu.

Obr. 20: Srovnání alelických frekvencí SNP nenádorové DNA pacienta BRNO0047 (N1788) s nádorovou DNA stejného pacienta po léčbě (T2180) při níž došlo k expanzi mutace TP53. Jak je vidět na obrázku, při správném přiřazení vzorků se alelické frekvece shlukují kolem hodnot 0, 0,5 a 1, což odpovídá homozygotnímu a heterozygotnímu stavu.

5.2.3. Analýza získaných dat Podle vybraných filtrovacích parametrů byly u jednotlivých pacientů vybrány geny potencionálně modulující klonální evoluci. Dále byly označeny expandující, stabilní a vytrácející se mutace.

5.2.3.1.Pacienti s neexpandující mutací TP53 U všech pacientů v této skupině proběhla analýza podle vybraných paramentrů, s mediánem 31 identifikovaných mutací na pacienta a rozptylem od 18 do 33 mutací (příklad identifikovaných genů u konkrétního paciena, které nesly mutace, uveden v tabulce 7). Celkem bylo identifikováno 69 expandujících, 94 stabilních a 65 eliminujících se genových

46 mutací (viz tabulka 8). Nalezeno bylo 22 mutantních variant ve 12 rekurentně mutovaných genech vyskytujících se u CLL (viz tabulka 9). Identifikovány byly stabilní mutace (jejich rozdíl mezi alelickými frekvencemi je menší než 0,1; viz tabulka 10), dále byly vybrané geny zařazeny do signálních drah spojených s patogenezí CLL nebo s funkcí B-lymfocytů (viz tabulka 11).

Tabulka 7: Ukázka filtrovaných genů u pacienta BRNO0311 před zhodnocením dle dostupné literatury a databází. Alelická Alelická Rozdíl alelické Směr Gen Chromozom frekvence T1 frekvence T2 frekvence vývoje

NFATC2IP 16 0,23 0 0,23 ↓ EPS8 12 0,204 0 0,204 ↓ GSG2 17 0,199 0 0,199 ↓ MT-ND5 MT 0,191 0 0,191 ↓ SCN5A 3 0,676 0,509 0,167 ↓ PHLDA1 12 0,151 0,125 0,026 → XPO1 2 0,582 0,581 0,001 → PELO 5 0 0,15 0,15 ↑ COCH 14 0 0,198 0,198 ↑ ATP8B3 19 0 0,213 0,213 ↑ FBF1 17 0,032258 0,251 0,219 ↑ SLC22A3 6 0 0,249 0,249 ↑ CORO2A 9 0,12766 0,396 0,268 ↑ LRRIQ3 1 0,184615 0,458 0,273 ↑ USP27X X 0,207792 0,576 0,368 ↑ SF3B1 2 0,219 0,611 0,392 ↑ NFATC1 18 0,099 1 0,901 ↑ TCP10L 21 0,076 1 0,924 ↑ (Vysvětlivky: T1=nádorový vzorek odebraný před léčbou; T2=nádorový vzorek po léčbě)

47

Tabulka 8: Celkové počty expandujících, stabilních a eliminujících se mutací v podskupině pacientů se stabilní mutací TP53 před zhodnocením jednotlivých genů. Expandující Stabilní Eliminující se Celkový počet Pacient mutace mutace mutace mutací BRNO0311 11 2 5 18 BRNO0475 11 16 5 32 BRNO0503 6 10 15 31 BRNO0823 13 4 15 32 BRNO1416 6 16 8 30 BRNO1428 7 16 6 29 BRNO1530 8 11 4 23 BRNO1794 7 19 7 27 Medián ve 8 14 7 30 skupině

Tabulka 9: Přehled rekurentních mutací v podskupině pacientů se stabilní mutací TP53. Pacient Gen Pozice (start p.) Chromozom SF3B1 198267483 2 BRNO0311 XPO1 61719472 2 SACS 23915740 13 BRNO0475 SF3B1 198266834 2 SMARCA4 11169539 19 RPS15 1440414 19 BRNO0503 SACS 23911407 13 TCF4 52924574 18 ATM 108170479 11 BIRC3 102201928 11 BRNO0823 BIRC3 102207693 11 NXF1 62564037 11 SF3B1 198266709 2

48

DUX4L4 191003282 4 BRNO1416 MED12 70339215 X SF3B1 198266837 2 BIRC3 102207656 11 BRNO1428 DUX4L4 191003402 4 RB1 48916839 13 BIRC3 102207732 11 BRNO1530 NXF1 62563760 11

Tabulka 10: Přehled vybraných zasažených signálních drah u pacientů s neexpandující TP53

mutací. V tabulce je také uvedeno rozdlení mutací daného pacienta do těchto vybraných drah.

Signální dráha

RNO0823

BRNO0311 BRNO0475 BRNO0503 B BRNO1416 BRNO1428 BRNO1530 BRNO1794 počet Celkový mutací Metabolismus RNA 2 1 2 4 4 4 3 20 Apoptóza 1 1 1 3 B-buněčná signalizace 2 1 3 1 1 2 10 Signalizace přes Rho GTpázu 1 1 1 3 Remodelace genomu/chromatinu 1 1 1 1 4 Buněčný cyklus 1 2 3 2 1 2 11 MAPK/ERK signální dráha 1 1 3 2 3 3 13 NF-κB signální dráha 2 1 1 1 1 6 Odpověď na poškození DNA 1 2 3 Notch signální dráha 1 1 2

5.2.3.2.Pacienti s expandující mutací TP53 U pacientů s expandující mutací TP53 proběhla analýza dat stejným způsobem jako u předešlé skupiny pacientů s výsledným mediánem 29 identifikovaných mutací na pacienta a rozptylem 18-38 mutací. Celkově bylo identifikováno 142 expandujících mutací, 108 stabilních a 84 eliminujících se mutací (viz tabulka 11). Bylo identifikováno 33 mutantních variant ve 14 rekurentně mutovaných genech (viz tabulka 12). Následně bylo provedeno

49 zařazení genů do signálních drah spojených s CLL nebo s funkcí B-lymfocytů (viz tabulka 13). Mezi zajímavé geny může například patřit KAT8, HERC2, U2AFA aj.

Tabulka 11: Celkové počty expandujících, stabilních a eliminujících se mutací v podskupině pacientů s expandující mutací TP53 před zhodnocením jednotlivých genů. Expandující Stabilní Eliminující se Celkový počet Pacient mutace mutace mutace mutací BRNO0047 11 12 1 24 BRNO0126 14 9 13 36 BRNO0149 19 6 10 35 BRNO0332 8 15 6 29 BRNO0365 22 3 13 38 BRNO0462 6 10 2 18 BRNO0627 12 3 10 25 BRNO0843 1 19 2 22 BRNO0859 9 14 10 33 BRNO1284 24 3 10 37 BRNO1404 13 11 1 25 BRNO1503 8 4 9 21 Medián ve 12 10 10 27 skupině

Tabulka 12: Přehled rekurentních mutací v podskupině pacientů s expandující mutací TP53. Pacient Gen Pozice (start p.) Chromozom BRNO0047 TP53 7577538 17 BRNO0126 CDH3 68713806 16 SF3B1 198267484 2 TFCP2 51501122 12 BRNO0149 TP53 7577539 17 TP53 7577124 17 RPS15 1440424 19 BRNO0332 TFCP2 51510124 12

50

TP53 7577105 17 CDH3 68719113 16 CPS1 211503880 2 BRNO0365 INHBA 41730083 7 TP53 7577096 17 TP53 7579358 17 MED12 70339253 X RPS15 1440458 19 BRNO0462 TP53 7579373 17 XPO1 61719472 2 INHBA 41729971 7 RB1 48947629 13 BRN0627 RPS15 1440429 19 SF3B1 198265476 2 BRNO0843 CCND2 4409146 12 ATM 108098351 11 CCND2 4409117 12 BRNO0859 SF3B1 198267481 2 TP53 7578443 17 BRNO1284 TP53 7578266 17 CPS1 211452857 2 SF3B1 198267481 2 BRNO1404 SMARCA4 11152022 19 TP53 7577538 17 BRNO1503 TCF4 52946794 18

Tabulka 13: Přehled zasažených signálních drah u pacientů s expandující TP53 mutací.

84

Signální dráha

mutací

BRNO0047 BRNO0126 BRNO0149 BRNO0332 BRNO0365 BRNO0462 BRNO0627 BRNO0843 BRNO0859 BRNO12 BRNO1404 BRNO1503 Celkový počet Celkový Metabolismus RNA 3 3 1 4 5 1 2 1 2 22 Apoptóza 1 1 1 1 1 2 1 8 51

B-buněčná signalizace 1 1 2 Signalizace přes Rho 1 1 2 1 5 GTpázu Remodelace 1 1 1 1 1 1 2 1 9 genomu/chromatinu

Buněčný cyklus 2 1 1 1 2 2 9 MAPK/ERK signální 4 2 2 6 1 2 1 4 1 4 27 dráha

NF-κB signální dráha 1 1 2 Odpověď na 2 4 4 4 1 1 1 3 2 1 23 poškození DNA

Notch signální dráha 2 1 1 1 5

52

6. Diskuze Metody NGS patří v současnosti mezi klíčové pro objasnění genetické a epigenetické heterogenity CLL na klonální i subklonální úrovni. Díky velkému množství dat z NGS je možné provádět matematické modelování, jehož cílem je pochopení mechanismů patogeneze CLL, nebo např. predikce odpovědi na podanou léčbu. Po finanční, informativní a časové stránce se celoexomové sekvenování ukázalo jako vhodný nástroj pro studium klonální heterogenity tohoto onemocnění. Díky získaným datům lze studovat klíčové procesy vzniku a klonálního vývoje CLL. V této diplomové práci byla pro celoexomové sekvenování využita platforma firmy Illumina. Použitá chemie při dodržení manuálu umožňuje získat knihovny v dostatečné kvalitě a koncentraci. Pro analýzu získaných dat byly poté využity bioinformatické postupy navržené přímo pro tento projekt. Díky současným poznatkům je jasné, že nádory nevznikájí díky mutacím v pár genech, ale že jde o složitý proces postupné kumulace jednotlivých mutací. Průměrně jde o 40-100 genových alternací, s jen 5-15 driver mutacemi na nádor. V tomto modelu se většina mutací vyskytuje s nízkou frekvencí, takže je obtížné určit jejich dopad, ale z převážné části jde o tzv. passenger mutace, které byly náhodně přítomny v klonu, jenž získal selekční výhodu vlivem mutací v driver genech (Bozic et al., 2010). CLL je obecně velmi heterogenní onemocnění, které se vyznačuje značnou klonální a subklonální heterogenitou. Jednotlivé buněčné populace mohou být relativně stabilní nebo, nejčastěji pod vlivem podané terapie, může docházet k změnám v klonální architektuře a k expanzi agresivních suklonů (Campo et al., 2018). S tímto vývojem je spojen i zisk mutací, který je pozorován u 17-26% pacientů (Holmes et al., 2016). Bylo identifikováno několik rekurentně mutovaných genů, které mají vliv na klonální evoluci, např. geny TP53, ATM, MYD88 aj. (Landau et al., 2013). Obecně nádory hromadí mutace v driver genech, což vede k zvýšení životaschopnosti klonu a ke zvýšení rychlosti klonální expanze. Z tohoto důvodu je identifikace rekurentně mutovaných genů zajímavá, neboť jsou to kandidáti na potencionální driver geny. Většina mutací získaných během vývoje nádoru nezvyšuje selekční výhodu mutovaného klonu, jedná se o tzv. passenger mutace. Tyto mutace nemají funkční dopad a většinou se vyskytují s nízkou frekvencí. (Bozic et al., 2010). V této studii byla pravděpodobně většina identifikovaných mutací tohoto typu, neboť velká část mutací se vyskytovala s nízkou frekvencí a také v genech, které nemají souvislost s žádnou signální dráhou popisovanou v souvislosti s patogenezí CLL.

53

V publikovaných datech se vyskytuje řada rekurentně mutovaných genů. V této práci bylo identifikováno 17 z nich, jednalo o následující geny: XPO1, SACS, SF3B1, SMARC14, RPS15, RB1, TCF4, ATM, BIRC3, NXF1, DUX4L4, MED12, TP53, CDH3, TFCP2, CPS1 a INHBA. Hlavním představitelem skupiny rekurentně mutovaných genů je gen TP53 (role v buněčném cyklu a v reakci na poškození DNA), jehož frekvence výskytu roste z 10% v době diagnózy až na 40-50% u pacientů refrakterních na léčbu (te Raa & Kater, 2016). Mutace v tomto genu mají obecně selekční výhodu a vlivem podané terapie může dojít k jejich expanzi a tyto klony mohou nakonec v populaci převládnout. Byla také identifikována podskupina pacientů u níž, přestože nesou mutace TP53, k expanzi daných subkonů nedochází (Malčíková et al., 2015). V této diplomové práci byly hodnoceny mutace, které potencionálně mohou buď umožnit expanzi subklonů s mutací TP53, nebo jí naopak zabránit. Dalším identifikovaným rekurentně mutovaným genem je XPO1 (role v sráze metabolismu RNA; pomocí NGS identifikován u <5% pacientů s CLL), jehož mutace mají nejednoznačný klinický dopad (Jain et al., 2016). Obdobně byly pozorovány mutace genu SF3B1 (taktéž zapojený do dráhy metabolismu RNA), které se vyskytují u 3-10 % nově diagnostikovaných pacientů s CLL a jejichž četnost stoupá až na 20 % u pacientů v relapsu (Wang et al., 2011). Tato dimplomová práce si konkrétně kladla za cíl identifikovat mutace modulující klonální evoluci u pacientů s nízcefrekventní mutací TP53. Pro účely studie bylo hodnoceno 20 pacientů, 8 s neexpandující mutací v TP53, a 12, u nichž došlo pod vlivem terapie k expanzi mutace TP53. Na základě získaných dat byly identifikovány u jednotlivých pacientů geny potencionálně zodpovědné za nepříznivou klonální evoluci. U podskupiny s expandující mutací TP53 bylo celkem identifikováno 343 mutací, z nich 142 expandovalo zároveň s mutantním TP53 klonem, 108 jich zůstalo stabilních a jsou tedy kompatibilní s mutací TP53, a nakonec 84, které vymizeli a je tedy předpoklad že nejsou kompatibilní s TP53 mutací. U skupiny s minoritní TP53 mutací měli potencionálně vliv na klonální evoluci stabilní mutace, které by mohli bránit jeho expanzi. Dalším zajímavým přístupem k hodnocení potencionálního dopadu daných mutací se jeví jejich posuzování v kontextu zasažených signálních drah. U CLL jmezi rekurentně poškozené dráhy patří B- buněčná signalizace, NOTCH signální dráha, NF-κB signální dráha, dále dráhy odpovědi na poškození DNA, buněčného cyklu. RNA metabolismu, apoptózy a remogelace chromatinu (Puente et al., 2015). Tento přístup byl použit i v této práci. U identifikovaných genů, získaných po manuální filtraci, byla posuzována příslušnost k jedné z výše uvedených, bylo vybráno i několik dalších, rekurentně mutovaných signálních drah.

54

Většina takto zhodnocených genů se v tomto kontextu jevila jako nezajímavá, neboť nebyli zapojeni do žádně z drah a ani nebyly identifikovány jako rekurentně mutované u CLL. Zbylé geny byly zařazeny do jednotlivých signálních drah. Z těchto genů se jeví jako zajímavý např. gen BAG3, který je jedním z nových potencionálních terapeutických cílů (Zhu et al., 2014); nebo NFATC1, který je u CLL hypometylován (Wolf et al., 2017). Celkem bylo v této práci u pacientů s minoritní TP53 mutací hodnoceno zařazení v rámci signálních drah u 222 mutací, z nichž 49 bylo zjištěno, že by mohlo souviset s CLL, neboť se jednalo o mutace v členech rekurentně mutovaných signálních drah tohoto onemocnění. Ve skupině pacientů s expandující mutací TP53 bylo hodnoceno 343 mutací, z nichž bylo vybráno 79, které byly přiřazařazeny k příslušným rekurentně mutovaným drahám. V podskupině pacientů s minoritní TP53 mutací se nejčastěji vyskytovali mutace v dráze metabolismu RNA, MAPK/ERK signální dráze a ve skupině genů hrajících roli v buněčném cyklu. U pacientů s expandující mutací naopak převažovali mutace v genech zařazených do MAPK/ERK signální dráhy, následovaly geny účastnící se odpověďi buňky na poškození DNA a také metabolismu RNA. Techniky NGS nám dnes umožňují lépe chápat procesy odehrávající se běhěm klonální evoluce a identifikovat driver mutace. Za současného využití matematického modelování je možné vytvářet modely pravděpodobného vývoje onemocnění. Sladění dat získaných z NGS s klinickými a epidemiologickými znaky je ovšem stále velmi složité. Bude potřeba ještě mnoha studií, aby byly vytvořeny účinnější modely a mohlo dojít k jejich precizní aplikaci v klinické praxi.

55

7. Souhrn

„Analýza genomických defektů podmiňujích klonální evoluci chronické lymfocytární leukémie“

Předmětem této práce bylo u vybraného souboru pacientů provést retrospektivní analýzu genových mutací a jejich vývoj v čase za využití techniky celoexomového sekvenování. Hodnoceno bylo 20 pacientů, 12 s expandující mutací TP53 a 8 s minoritní, stabilní, mutací TP53. Všechny získané vzorky byly podrobeny celoexomovému sekvenování a následné analýze dat. U pacientů byly manuální filtrací podle zvolených parametrů vybrány mutace potencionálně zodpovědné za nepříznivou klonální evoluci. V případě skupiny s expandující TP53 mutací bylo identifikováno celkem 343 mutací (142 expandujících, 108 stabilních a 84 eliminujících se mutací), a u skupiny s minortiní TP53 mutací 222 mutací (z nichž pravněpodobně největší výpovědní hodnotu mělo 94 stabilních mutací; 15 z nich bylo zařazeno do signálních drah rekurentně mutovaných u CLL), které potencionálně mohou ovnivňovat klonální evoluci. U všech vybraných mutací bylo hodnoceno zařazení do jedné ze signálních drah rekurentně mutovaných u CLL na základě srovnání s dostupnou literaturou. Výsledkem byla u pacientů s minoritní TP53 mutací identifikace 76 mutací a u pacientů s expandující TP53 mutací identifikace 109 mutací, které jsou součástí u CLL rekurentně mutovaných signálních drah. Výsledky práce mohou být použity pro budoucí predikci vývoje klonální evoluce.

56

8. Summary

„Analysis of genomic defects underlying clonal evolution in chronic lymphocytic leukemia“

The aim of this diploma thesis was to perform a retrospective analysis of gene mutations and their development over time using a whole-exome sequencing in chronic lymphocytic leukemia patients (CLL). Twenty CLL patients were evaluated: 12 with expanding TP53 mutation and 8 with stable minor TP53 mutation. All samples were subjected to the whole-exome sequencing and subsequent data analysis. In the whole cohort, mutations possibly responsible for unfavourable clonal evolution were with manually filtered on the basis of selected parameters. Selected mutations were categorized into signaling pathways recurrently mutated in CLL through comparison with available literature. In case of the group with expanding TP53 mutation, 343 mutations in total (142 expanding, 108 stable and 84 diminishing mutations) were identified, whereas in the group with stable minor TP53 mutation, 222 mutations were found, out of which 94 stable mutations could potentially preclude TP53 mutation expansion; 15 of them were assigned into signaling pathways recurrently mutated in CLL. As a result, 76 mutations were identified in patients with stable minor TP53 mutations and 109 mutations were identified in patients with expanding TP53 mutation. The results of the work thesis can be used for the future prediction of clonal evolution of chronic lymphocytic leukemia.

57

9. Přehled literatury

Abur, U., Ogur, G., Akar, O. S., Altundag, E., Aymelek, H. S., Ozatli, D. & Turgut, M. 2018. Impact of Fluorescent In Situ Hybridization Aberrations and CLLU1 Expression on the Prognosis of Chronic Lymphocytic Leukemia: Presentation of 156 Patients from Turkey. Turk J Haematol. 35 (1): 61-65. Acunzo, M., Romano, G., Wernicke, D., Balatti, V., Rassenti, L. Z., Dell'Aquila, M., Kipps, T. J., Pekarsky, Y. & Croce, C. M. 2014. Translocation t(2;11) in CLL cells results in CXCR4/MAML2 fusion oncogene. Blood. 124 (2): 259-262. Alhourani, E., Rincic, M., Othman, M. A. K., Pohle, B., Schlie, C., Glaser, A. & Liehr, T. 2014. Comprehensive chronic lymphocytic leukemia diagnostics by combined multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA) and interphase fluorescence in situ hybridization (iFISH). Mol Cytogenet. 7 (1): 79. [online]. DOI: 10.1186/s13039-014-0079-2. Anderson, M. A., Tam, C., Lew, T. E., Juneja, S., Juneja, M., Westerman, D., Wall, M., Lade, S., Gorelik, A., Huang, D. C. S., Seymour, J. F. & Roberts, A. W. 2017. Clinicopathological features and outcomes of progression of CLL on the BCL2 inhibitor venetoclax. Blood. 129 (25): 3362-3370. Arruga, F., Gizdic, B., Bologna, C., Cignetto, S., Buonincontri, R., Serra, S., Vaisitti, T., Gizzi, K., Vitale, N., Garaffo, G., Mereu, E., Diop, F., Neri, F., Incarnato, D., Coscia, M., Allan, J., Piva, R., Oliviero, S., Furman, R. R., Rossi, D., Gaidano, G. & Deaglio, S. 2017. Mutations in NOTCH1 PEST domain orchestrate CLL19-driven homing of chronic lymphocytic laukemia cells by modulating the tumor suppressor gene DUSP22. Leukemia. 31 (9): 1882-1893. Baliakas, P., Iskas, M., Gardiner, A., Davis, Z., Plevová, K., Nguyen-Khac, F., Malčíková, J., Anagnostopoulos, A., Glide, S., Mould, S., Stepanovska, K., Brejcha, M., Belessi, C., Davi, F., Pospíšilová, S., Athanasiadou, A., Stamatopoulos, K. & Oscier, D. 2014. Chromosomal translocations and karyotype complexity in chronic lymphocytic leukemia: A systematic reappraisal of classic cytogenetic data. Am J Hematol. 89 (3): 249- 255. Baliakas, P., Hadzidimitriou, A., Sutton, L. A., Rossi, D., Minga, E., Villamor, N., Larrayoz, M., Kminkova, J., Agathangelidis, A., Davis, Z., Tausch, E., Stalika, E., Kantorova, B., Mansouri, L., Scarfo, L., Cortese, D., Navrkalova, V., Rose-Zerilli, M. J. J., Smedby, K. E., Juliusson, G., Anagnostopoulos, A., Makris, A. M., Navarro, A.,

58

Delgado, J., Oscier, D., Belessi, C., Stilgenbauer, S., Ghia, P., Pospisilova, S., Gaidano, G., Campo, E., Strefford, J. C., Stamatopoulos, K. & Rosenquist, R. 2015. Recurrent mutations refine prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 29 (2): 329-336. Baliakas, P., Puiggros, A., Xochelli, A., Sutton, L. A., Nguyen-Khac, F., Gardiner, A., Plevova, K., Minga, E., Hadzidimitriou, A., Walewska, R., McCarthy, H., Ortega, M., Collado, R., González, T., Granada, I., Luño, E., Kotašková, J., Moysiadis, T., Davis, Z., Stavroyianni, N., Anagnostopoulos, A., Strefford, J. C., Pospisilova, S., Davi, F., Athanasiadou, A., Rosenquist, R., Oscier, D., Espinet, B. & Stamatopoulos, K. 2016. Additional trisomies amongst patients with chronic lymphocytic leukemia carrying trisomy 12: the accompanying chromosome makes a difference. Haematologica. 101 (7): e299-302. Baer, C., Dicker, F., Kern, W., Haferlach, T. & Haferlach, C. 2017. Genetic characterization of MYD88-mutated lymphoplasmacytic lymphoma in comparison with MYD88-mutated chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 31 (6): 1355-1362. Benedetti, D., Tissino, E., Pozzo, F., Bittolo, T., Caldana, C., Perini, C., Martorelli, D., Bravin, V., D'Agaro, T., Rossi, F. M., Bomben, R., Santinelli, E., Zaja, F., Pozzato, G., Chiarenza, A., Di Raimondo, F., Del Poeta, G., Rossi, D., Gaidano, G., Dal Bo, M., Gattei, V. & Zucchetto, A. 2018. NOTCH1 mutations are associated with high CD49d expression in chronic lymphocytic leukemia: link between the NOTCH1 and the NF- kappa B pathways. Leukemia. 32 (3): 654-662. Bennett S. 2004. Solexa Ltd. Pharmacogenomics. 5 (4): 433–438. Best, O. G., Gardiner, A. C., Davis, Z. A., Tracy, I., Ibbotson, R. E., Majid, A., Dyer, M. J. S. & Oscier, D. G. 2009. A subset of Binet stage A CLL patients with TP53 abnormalities and mutated IGHV genes have stable disease. Leukemia. 23 (1): 212-214. Bialopiotrowicz, E., Gorniak, P., Noyszewska-Kania, M., Pula, B., Makuch- Lasica, H., Nowak, G., Bluszcz, A., Szydlowski, M., Jablonska, E., Piechna, K., Sewastianik, T., Polak, A., Lech-Maranda, E., Budziszewska, B. K., Wasylecka- Juszczynska, M., Borg, K., Warzocha, K., Czardybon, W., Galezowski, M., Windak, R., Brzozka, K. & Juszczynski, P. 2018. Microenvironment-induced PIM kinases promote CXCR4-triggered mTOR pathway required for chronic lymphocytic leukaemia cell migration. J Cell Mol Med. 22 (7): 3548-3559. Binet, J. L, Auquier, A., Dighiero, G., Chastang, C., Piguet, H., Goasguen, J., Vaugier, G., Potron, G., Colona, P., Oberling, F., Thomas, M., Tchernia, G., Jacquillat, C., Boivin, P., Lesty, C., Duault, M. T., Monconduit, M., Belabbes, S. & Gremy, F. 1981.

59

A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis. Cancer. 48 (1): 198-206. Bozic, I., Antal, T., Ohtsuki, H., Carter, H., Kim, D., Chen, S., Karchin, R., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. & Nowak, M. A. 2010. Accumulation of driver and passenger mutations during tumor progression. Proc Natl Acad Sci USA, 107 (43): 18545- 18550. Brejcha, M., Stoklasova, M., Brychtova, Y., Panovska, A., Stepanovska, K., Vankova, G., Plevova, K., Oltova, A., Horka, K., Pospisilova, S., Mayer, J. & Doubek, M. 2014. Clonal evolution in chronic lymphocytic leukemia detected by fluorescence in situ hybridization and conventional cytogenetics after stimulation with CpG oligonucleotides and interleukin-2: A prospective analysis. Leukemia Research. 38 (2): 170-175. Brown, J. R., Hanna, M., Tesar, B., Werner, L., Pochet, N., Asara, J. M., Wang, Y. Y. E., dal Cin, P., Fernandes, S. M., Thompson, C., MacConaill, L., Wu, C. J., Van de Peer, Y., Correll, M., Regev, A., Neuberg, D. & Freedman, A. S. 2012. Integrative Genomic Analysis Implicates Gain of PIK3CA at 3q26 and MYC at 8q24 in Chronic Lymphocytic Leukemia. Clin Cancer Res. 18 (14): 3791-3802. Burger, J. A., Landau, D. A., Taylor-Weiner, A., Bozic, I., Zhang, H., Sarosiek, K., Wang, L., Stewart, C., Fan, J., Hoellenriegel, J., Sivina, M., Dubuc, A. M., Fraser, C., Han, Y., Li, S., Livak, K. J., Zou, L., Wan, Y., Konoplev, S., Sougnez, C., Brown, J. R., Abruzzo, L. V., Carter, S. L., Keating, M. J., Davids, M. S., Wierda, W. G., Cibulskis, K., Zenz, T., Werner, L., Dal Cin, P., Kharchencko, P., Neuberg, D., Kantarjian, H., Lander, E., Gabriel, S., O'Brien, S., Letai, A., Weitz, D. A., Nowak, M. A., Getz, G. & Wu, C.J. 2016. Clonal evolution in patients with chronic lymphocytic leukaemia developing resistance to BTK inhibition. Nat Commun. 7: 11589. [online]. DOI: 10.1038/ncomms11589. Burns, A., Alsolami, R., Becq, J., Stamatopoulos, B., Timbs, A., Bruce, D., Robbe, P., Vavoulis, D., Clifford, R., Cabes, M., Dreau, H., Taylor, J., Knight, S. J. L., Mansson, R., Bentley, D., Beekman, R., Martin-Subero, J. I., Campo, E., Houlston, R. S., Ridout, K. E. & Schuh, A. 2018. Whole-genome sequencing of chronic lymphocytic leukaemia reveals distinct differences in the mutational landscape between IgHV(mut) and IgHV(unmut) subgroups. Leukemia. 32 (2): 332-342. Byrd, J. C., Harrington, B., O'Brien, S., Jones, J. A., Schuh, A., Devereux, S., Chaves, J., Wierda, W. G., Awan, F. T., Brown, J. R., Hillmen. P., Stephens, D. M.,

60

Ghia, P., Barrientos, J. C., Pagel, J. M., Woyach, J., Johnson. D., Huang, J., Wang, X., Kaptein, A., Lannutti, B. J., Covey, T., Fardis, M., McGreivy, J., Hamdy, A., Rothbaum, W., Izumi, R., Diacovo, T. G., Johnson, A. J. & Furman, R. R. 2016. Acalabrutinib (ACP- 196) in Relapsed Chronic Lymphocytic Leukemia. N Engl J Med. 374 (4): 323-332. Campo, E., Cymbalista, F., Ghia, P., Jäger, U., Pospisilova, S., Rosenquist, R., Schuh, A. & Stilgenbauer, S. 2018. TP53 aberrations in chronic lymphocytic leukemia: an overview of the clinical implications of improved diagnostics. Haematologica, 103 (12): 1956-1968. Cosson, A., Chapiro, E., Belhouachi, N., Cung, H. A., Keren, B., Damm, F., Algrin, C., Lefebvre, C., Fert-Ferrer, S., Luquet, I., Gachard, N., Mugneret, F., Terre, C., Collonge-Rame, M. A., Michaux, L., Rafdord-Weiss, I., Talmant, P., Veronese, L., Nadal, N., Struski, S., Barin, C., Helias, C., Lafage, M., Lippert, E., Auger, N., Eclache, V., Roos-Weil, D., Leblond, V., Settegrana, C., Maloum, K., Davi, F., Merle-Beral, H., Lesty, C. & Nguyen-Khac, F. 2014. 14q deletions are associated with trisomy 12, NOTCH1 mutations and unmutated IGHV genes in chronic lymphocytic leukemia and small lymphocytic lymphoma. Genes Chromosomes Cancer. 53 (8): 657-666. Cosson, A., Chapiro, E., Bougacha, N., Lambert, J., Herbi, L., Cung, H. A., Algrin, C., Keren, B., Damm, F., Gabillaud, C., Brunelle-Navas, M. N., Davi, F., Merle- Beral, H., Le Garff-Tavernier, M., Roos-Weil, D., Choquet, S., Uzunov, M., Morel, V., Leblond, V., Maloum, K., Lepretre, S., Feugier, P., Lesty, C., Lejeune, J., Sutton, L., Landesman, Y., Susin, S. A. & Nguyen-Khac, F. 2017. Gain in the short arm of chromosome 2 (2p+) induces gene overexpression and drug resistance in chronic lymphocytic leukemia: analysis of the central role of XPO1. Leukemia. 31 (7): 1625-1629. Cui, B., Ghia, E. M., Chen, L. G., Rassenti, L. Z., DeBoever, C., Widhopf, G. F., Yu, J., Neuberg, D. S., Wierda, W. G., Rai, K. R., Kay, N. E., Brown, J. R., Jones, J. A., Gribben, J. G., Frazer, K. A. & Kipps, T. J. 2016. High-level ROR1 associates with accelerated disease progression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 128 (25): 2931- 2940. Cuneo, A., Rigolin, G. M., Bigoni, R., De Angeli, C., Veronese, A., Cavazzini, F., Bardi, A., Roberti, M. G., Tammiso, E., Agostini, P., Ciccone, M., Della Porta, M., Tieghi, A., Cavazzini, L., Negrini, M. & Castoldi, G. 2004. Chronic lymphocytic leukemia with 6q− shows distinct hematological features and intermediate prognosis. Leukemia. 18 (3): 476-483.

61

Damm, F., Nguyen-Khac, F., Fontenay, M. & Bernard, O. A. 2012. Spliceosome and other novel mutations in chronic lymphocytic leukemia and myeloid malignancies. Leukemia. 26 (9): 2027-2031. Davids, M. S., Kim, H. T., Nicotra, A., Savell, A., Francoeur, K., Hellman, J. M., Bazemore, J., Miskin, H. P., Sportelli, P., Stampleman, L., Maegawa, R., Rueter, J., Boruchov, A. M., Arnason, J. E., Jacobson, C. A., Jacobsen, E. D., Fisher, D. C. & Brown, J. R. 2019. Umbralisib in combination with ibrutinib in patients with relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia or mantle cell lymphoma: a multicentre phase 1-1b study. Lancet Haematol. 6 (1): e38-e47. Decker, T., Schneller, F., Hipp, S., Miething, C., Jahn, T., Duyster, J. & Peschel, C. 2002. Cell cycle progression of chronic lymphocytic leukemia cells is controlled by cyclin D2, cyclin D3, cyclin-dependent kinase (cdk) 4 and the cdk inhibitor p27. Leukemia. 16 (3): 327-334. De Paoli, L., Cerri, M., Monti, S., Rasi, S., Spina, V., Bruscaggin, A., Greco, M., Ciardullo, C., Fama, R., Cresta, S., Maffei, R., Ladetto, M., Martini, M., Laurenti, L., Forconi, F., Marasca, R., Larocca, L. M., Bertoni, F., Gaidano, G. & Rossi, D. 2013. MGA, a suppressor of MYC, is recurrently inactivated in high risk chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 54 (5): 1087-1090. del Giudice, I., Rossi, D., Chiaretti, S., Marinelli, M., Tavolaro, S., Gabrielli, S., Laurenti, L., Marasca, R., Rasi, S., Fangazio, M., Guarini, A., Gaidano, G. & Foa, R. 2012. NOTCH1 mutations in +12 chronic lymphocytic leukemia (CLL) confer an unfavorable prognosis, induce a distinctive transcriptional profiling and refine the intermediate prognosis of +12 CLL. Haematologica. 97 (3): 437-441. Do, C. H., Lower, K. M., Macardle, C. & Kuss, B. J. 2017. Trisomy 12 assessment by conventional fluorescence in-situ hybridization (FISH), FISH in suspension (FISH-IS) and laser scanning cytometry (LSC) in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet. 216: 142- 149. Döhner, H., Stilgenbauer, S., Benner, A., Leupolt, E., Kröber, A., Bullinger, L., Döhner, K., Bentz, M. & Lichter P. 2000. Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 343 (26): 1910-1916. Dühren-von Minden, M., Übelhart, R., Schneider, D., Wossning, T., Bach, M. P., Buchner, M., Hofmann, D., Surova, E., Follo, M., Köhler, F., Wardemann, H., Zirlik, K.,

62

Veelken, H. & Jumaa, H. 2012. Chronic lymphocytic leukaemia is driven by antigen- independent cell-autonomous signalling. Nature. 489 (7415): 309-312. Efremov, D. G., Wiestner, A. & Laurenti, L. 2012. Novel Agents and Emerging Strategies for Targeting the B-Cell Receptor Pathway in CLL. Mediterr J Hematol Infect Dis. 4 (1): e2012067. [online]. DOI: 10.4084/MJHID.2012.067. Fabbri, G., Khiabanian, H., Holmes, A. B., Wang, J. G., Messina, M., Mullighan, C. G., Pasqualucci, L., Rabadan, R. & Dalla-Favera, R. 2013. Genetic lesions associated with chronic lymphocytic leukemia transformation to Richter syndrome. J Exp Med. 210 (11): 2273-2288. Fabbri, G., Holmes, A. B., Viganotti, M., Scuoppo, C., Belver, L., Herranz, D., Yan, X. J., Kieso, Y., Rossi, D., Gaidano, G., Chiorazzi, N., Ferrando, A. A. & Dalla- Favera, R. 2017. Common nonmutational NOTCH1 activation in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (14): E2911-E2919. Frenzel, L. P., Claus, R., Plume, N., Schwamb, J., Konermann, C., Pallasch, C. P., Claasen, J., Brinker, R., Wollnik, B., Plass, C. & Wendtner, C. M. 2011. Sustained NF- kappaB activity in chronic lymphocytic leukemia is independent of genetic and epigenetic alterations in the TNFAIP3 (A20) locus. Int J Cancer. 128 (10): 2495-2500. Fumi, M., Martins, D., Pancione, Y., Sale, S. & Rocco, V. 2014. Automated quantification of apoptosis in B-cell chronic lymphoproliferative disorders: a prognostic variable obtained with the Cell-Dyn Sapphire (Abbott) automated hematology analyzer. Int Jnl Lab Hematol. 36 (6): 628-635. Furman, R. R., Sharman, J. P., Coutre, S. E., Cheson, B. D., Pagel, J. M., Hillmen, P., Barrientos, J. C., Zelenetz, A. D., Kipps, T. J., Flinn, I., Ghia, P., Eradat, H., Ervin, T., Lamanna, N., Coiffier, B., Pettitt, A. R., Ma, S., Stilgenbauer, S., Cramer, P., Aiello, M., Johnson, D. M., Miller, L. L., Li, D., Jahn, T. M., Dansey, R. D., Hallek, M. & O'Brien, S. M. 2014. Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 370 (11): 997-1007. Galicia-Vazquez, G., Smith, S. & Aloyz, R. 2018. Del11q-positive CLL lymphocytes exhibit altered glutamine metabolism and differential response to GLS1 and glucose metabolism inhibition. Blood Cancer J. 8 (1): 13. [online]. DOI: 10.1038/s41408-017- 0039-2. Garding, A., Bhattacharya, N., Claus, R., Ruppel, M., Tschuch, C., Filarsky, K., Idler, I., Zucknick, M., Caudron-Herger, M., Oakes, C., Fleig, V., Keklikoglou, I.,

63

Allegra, D., Serra, L., Thakurela, S., Tiwari, V., Weichenhan, D., Benner, A., Radlwimmer, B., Zentgraf, H., Wiemann, S., Rippe, K., Plass, C., Dohner, H., Lichter, P., Stilgenbauer, S. & Mertens, D. 2013. Epigenetic Upregulation of IncRNAs at 13q14.3 in Leukemia Is Linked to the In Cis Downregulation of a Gene Cluster That Targets NF-kB. PLoS Genet. 9 (4): e1003373. [online]. DOI: 10.1371/journal.pgen.1003373. Garg, R., Wierda, W., Ferrajoli, A., Abruzzo, L., Pierce, S., Lerner, S., Keating, M. & O'Brien, S. 2012. The prognostic difference of monoallelic versus biallelic deletion of 13q in chronic lymphocytic leukemia. Cancer. 118 (14): 3531-3537. Garnett, M. J. & Marais, R. 2004. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4): 313-319. Geller, M. D., Pei, Y., Spurgeon, S. E., Durum, C. & Leeborg, N. J. 2014. Chronic lymphocytic leukemia with a FGFR3 translocation: case report and literature review of an uncommon cytogenetic event. Cancer Genet. 207 (7-8): 340-343. Giménez, N., Martínez-Trillos, A., Montraveta, A., Lopez-Guerra, M., Rosich, L., Nadeu, F., Valero, J. G., Aymerich, M., Magnano, L., Rozman, M., Matutes, E., Delgado, J., Baumann, T., Gine, E., González, M., Alcoceba, M., Terol, M. J., Navarro, B., Colado, E., Payer, A. R., Puente, X. S., López-Otín, C., Lopez-Guillermo, A., Campo, E., Colomer, D. & Villamor, N. 2019. Mutations in the RAS-BRAF-MAPK-ERK pathway define a specific subgroup of patients with adverse clinical features and provide new therapeutic options in chronic lymphocytic leukemia. Haematologica. 104 (3): 576-586. Gonzalez, D., Else, M., Wren, D., Usai, M., Buhl, A. M., Parker, A., Oscier, D., Morgan, G. & Catovsky, D. 2013. CLLU1 expression has prognostic value in chronic lymphocytic leukemia after first-line therapy in younger patients and in those with mutated IGHV genes. Haematologica. 98 (2): 274-278. Goy, J., Gillan, T. L., Bruyere, H., Huang, S. J. T., Hrynchak, M., Karsan, A., Ramadan, K., Connors, J., Toze, C. L. & Gerrie, A. S. 2017. Chronic Lymphocytic Leukemia Patients With Deletion 11q Have a Short Time to Requirement of First-Line Therapy, But Long Overall Survival: Results of a Population-Based Cohort in British Columbia, Canada. Clini Lymphoma Myeloma Leuk. 17 (6): 382-389. Greaves, M. & Maley, C. C. 2012. Clonal evolution in cancer. Nature. 481 (7381): 306-313. Grygalewicz, B., Woroniecka, R., Rygier, J., Borkowska, K., Rzepecka, I., Lukasik, M., Budzilowska, A., Rymkiewicz, G., Blachnio, K., Nowakowska, B., Bartnik,

64

M., Gos, M. & Pienkowska-Grela, B. 2016. Monoallelic and biallelic deletions of 13q14 in a group of CLL/SLL patients investigated by CGH Haematological Cancer and SNP array (8x60K). Mol Cytogenet. 9 (1): 1. [online]. DOI: 10.1186/s13039-015-0212-x. Guarini, A., Marinelli, M., Tavolaro, S., Bellacchio, E., Magliozzi, M., Chiaretti, S., De Propris, M. S., Peragine, N., Santangelo, S., Paoloni, F., Nanni, M., Del Giudice, I., Mauro, F. R., Torrente, I. & Foa, R. 2012. ATM gene alterations in chronic lymphocytic leukemia patients induce a distinct gene expression profile and predict disease progression. Haematologica. 97 (1): 47-55. Gunn, S. R., Mohammed, M. S., Gorre, M. E., Cotter, P. D., Kim, J., Bahler, D. W., Preobrazhensky, S. N., Higgins, R. A., Bolla, A. R., Ismail, S. H., de Jong, D., Eldering, E., van Oers, M. H. J., Mellink, C. H. M., Keating, M. J., Schlette, E. J., Abruzzo, L. V. & Robetorye, R. S. 2008. Whole-genome scanning by array comparative genomic hybridization as a clinical tool for risk assessment in chronic lymphocytic leukemia. J Mol Diagn. 10 (5): 442-451. Gunn, S. R., Hibbard, M. K., Ismail, S. H., Lowery-Nordberg, M., Mellink, C. H. M., Bahler, D. W., Abruzzo, L. V., Enriquez, E. L., Gorre, M. E., Mohammed, M. S. & Robetorye, R. S. 2009. Atypical 11q deletions identified by array CGH may be missed by FISH panels for prognostic markers in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 23 (5): 1011-1017. Haferlach, C., Dicker, F., Schnittger, S., Kern, W. & Haferlach, T. 2007. Comprehensive genetic characterization of CLL: a study on 506 cases analysed with chromosome banding analysis, interphase FISH, IgV(H) status and immunophenotyping. Leukemia. 21 (12): 2442-2451. Hallek, M. & German CLL Study Group. 2005. Chronic lymphocytic leukemia (CLL): first-line treatment. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2005 (1): 285-291. Hallek, M., Cheson, B. D., Catovsky, D., Caligaris-Cappio, F., Dighiero, G., Dohner, H., Hillmen, P., Keating, M. J., Montserrat, E., Rai, K. R. & Kipps, T. J. 2008. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12): 5446-5456. Hallek, M. 2015. Chronic lymphocytic leukemia: 2015 Update on diagnosis, risk stratification, and treatment. Am J Hematol. 90 (5): 446-460.

65

He, Y., Zhang, D., Yang, Y. F., Wang, X. X., Zhao, X. Y., Zhang, P., Zhu, H. X., Xu, N. Z. & Liang, S. F. 2018. A double-edged function of DDX3, as an oncogene or tumor suppressor, in cancer progression. Oncol Rep. 39 (3): 883-892. Heerema, N. A., Byrd, J. C., Dal Cin, P. S., Aquila, M. L. D., Koduru, P. R. K., Aviram, A., Greaves, A. W., Brown, J. R., Rai, K. R., Kipps, T. J., Kay, N. E. & Van Dyke, D. L. 2010. Stimulation of chronic lymphocytic leukemia cells with CpG oligodeoxynucleotide (ODN) gives consistent karyotypic results among laboratories: a CLL Research Consortium (CRC) Study. Cancer Genet Cytogenet. 203 (2): 134-140. Herishanu, Y., Pérez-Galán, P., Liu, D., Biancotto, A., Pittaluga, S., Vire, B., Gibellini, F., Njuguna, N., Lee, E., Stennett, L., Raghavachari, N., Liu, P., McCoy, J. P., Raffeld, M., Stetler-Stevenson, M., Yuan, C., Sherry, R., Arthur, D. C., Maric, I., White, T., Marti, G. E., Munson, P., Wilson, W. H. & Wiestner, A. 2011. The lymph node microenvironment promotes B-cell receptor signaling, NF-kappaB activation, and tumor proliferation in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 117 (2): 563-574. Herling, C. D., Klaumünzer, M., Rocha, C. K., Altmüller, J., Thiele, H., Bahlo, J., Kluth, S., Crispatzu, G., Herling, M., Schiller, J., Engelke, A., Tausch, E., Döhner, H., Fischer, K., Goede, V., Nürnberg, P., Reinhardt, H. C., Stilgenbauer, S., Hallek, M. & Kreuzer, K. A. 2016. Complex karyotypes and KRAS and POT1 mutations impact outcome in CLL after chlorambucil-based chemotherapy or chemoimmunotherapy. Blood. 128 (3): 395-404. Hernández-Sánchez, M., Radova, L., Kotaskova, J., Tamborero, D., Rodriguez, A. E., Plevova, K., Abaigar, M., Bikos, V., Benito, R., Takacova, S., Quijada, M., Martin, A. A., Alcoceba, M., de Coca, A. G., Doubek, M., Gonzalez, M., Lopez-Bigas, N., Pospisilova, S. & Hernandez-Rivas, J. M. 2016. Blood. Analysis of Clonal Evolution in Chronic Lymphocytic Leukemia from Inactive to Symptomatic Disease Prior Treatment Using Whole-Exome Sequencing. 128 (22): 3206. Holmes, P. J., Peiper, S. C., Uppal, G. K., Gong, J. Z., Wang, Z. X. & Bajaj, R. 2016. Efficacy of DSP30-IL2/TPA for detection of cytogenetic abnormalities in chronic lymphocytic leukaemia/small lymphocytic lymphoma. Int J Lab Hematol. 38 (5): 483-489. Chapiro, E., Leporrier, N., Radford-Weiss, I., Bastard, C., Mossafa, H., Leroux, D., Tigaud, I., De Braekeleer, M., Terre, C., Brizard, F., Callet-Bauchu, E., Struski, S., Veronese, L., Fert-Ferrernline S., Taviaux, S., Lesty, C., Davi, F., Merle-Beral, H., Bernard, O. A., Sutton, L., Raynaud, S. D. & Nguyen-Khac, F. 2010. Gain of the short

66 arm of chromosome 2 (2p) is a frequent recurring chromosome aberration in untreated chronic lymphocytic leukemia (CLL) at advanced stages. Leuk Res. 34 (1): 63-68. Chapiro, E., Lesty, C., Gabillaud, C., Durot, E., Bouzy, S., Armand, M., Le Garff-Tavernier, M., Bougacha, N., Struski, S., Bidet, A., Laharanne, E., Barin, C., Veronese, L., Prie, N., Eclache, V., Gaillard, B., Michaux, L., Lefebvre, C., Gaillard, J. B., Terre, C., Penther, D., Bastard, C., Nadal, N., Fert-Ferrer, S., Auger, N., Godon, C., Sutton, L., Tournilhac, O., Susin, S. A. & Nguyen-Khac, F. 2018. "Double-hit" chronic lymphocytic leukemia: An aggressive subgroup with 17p deletion and 8q24 gain. Am J Hematol. 93 (3): 375-382. Chen, W. F., Miao, Y., Wang, R., Wu, Y. J., Qiu, H. R., Xu, W., Li, J. Y., Fan, L. & Xu, X. 2016. t(14;18)(q32;q21) in chronic lymphocytic leukemia patients: Report of two cases and a literature review. Oncol Lett. 12 (6): 4351-4356. Choi, J., Lee, K., Ingvarsdottir, K., Bonasio, R., Saraf, A., Florens, L., Washburn, M. P., Tadros, S., Green, M. R. & Busino, L. 2018. Loss of KLHL6 promotes diffuse large B-cell lymphoma growth and survival by stabilizing the mRNA decay factor roquin2. Nat Cell Biol. 20 (5): 586-596. Ibbotson, R., Athanasiadou, A., Sutton, L. A., Davis, Z., Gardiner, A., Baliakas, P., Gunnarsson, R., Anagnostopoulos, A., Juliusson, G., Rosenquist, R., Oscier, D. & Stamatopoulos, K. 2012. Coexistence of trisomies of chromosomes 12 and 19 in chronic lymphocytic leukemia occurs exclusively in the rare IgG-positive variant. Leukemia. 26 (1): 170-172. Ibrahim, S., Keating, M., Do, K. A., O'Brien, S., Huh, Y. O., Jilani, I., Lerner, S., Kantarjian, H. M. & Albitar, M. 2001. CD38 expression as an important prognostic factor in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood. 98 (1): 181-186. Jain, P., Keating, M., Thompson, P. A., Trinh, L., Wang, X. M., Wierda, W., Ferrajoli, A., Burger, J., Kantarjian, H., Estrov, Z., Abruzzo, L., O'Brien, S. 2015. High fluorescence in situ hybridization percentage of deletion 11q in patients with chronic lymphocytic leukemia is an independent predictor of adverse outcome. Am J Hematol. 90 (6): 471-477. Jain, P., Kanagal-Shamanna, R., Wierda, W., Keating, M., Sarwari, N., Rozovski, U., Thompson, P., Burger, J., Kantarjian, H., Patel, K. P., Medeiros, L. J., Luthra, R. & Estrov, Z. 2016. Clinical and molecular characteristics of XPO1 mutations in patients with chronic lymphocytic leukemia. Am J Hematol. 91 (11): E478-E480.

67

Jaglowski, S. M., Ruppert, A. S., Heerema, N. A., Bingman, A., Flynn, J. M., Grever, M. R., Jones, J. A., Elder, P., Devine, S. M., Byrd, J. C. & Andritsos, L. A. 2012. Complex karyotype predicts for inferior outcomes following reduced-intensity conditioning allogeneic transplant for chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol. 159 (1): 82-87. Jarošová, M., Hruba, M., Oltova, A., Plevová, K., Kruzova, L., Kriegova, E., Fillerova, R., Koritakova, E., Doubek, M., Lysak, D., Prochazka, V., Mraz, M., Indrak, K. & Papajik, T. 2017. Chromosome 6q deletion correlates with poor prognosis and low relative expression of FOXO3 in chronic lymphocytic leukemia patients. Am J Hematol. 92 (10): E604-E607. Jebaraj, B. M., Kienle, D., Bühler, A., Winkler, D., Döhner, H., Stilgenbauer, S. & Zenz, T. 2013. BRAF mutations in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 54 (6): 1177-1182. Jeromin, S., Weissmann, S., Haferlach, C., Dicker, F., Bayer, K., Grossmann, V., Alpermann, T., Roller, A., Kohlmann, A., Haferlach, T., Kern, W. & Schnittger, S. 2014. SF3B1 mutations correlated to cytogenetics and mutations in NOTCH1, FBXW7, MYD88, XPO1 and TP53 in 1160 untreated CLL patients. Leukemia. 28 (1): 108-117. Jiang, Y., Chen, H. C., Su, X., Thompson, P. A., Liu, X., Do, K. A., Wierda, W., Keating, M. J. & Plunkett, W. 2016. ATM function and its relationship with ATM gene mutations in chronic lymphocytic leukemia with the recurrent deletion (11q22.3-23.2). Blood Cancer J. 6 (9): e465. [online]. DOI: 10.1038/bcj.2016.69. Kalla, C., Scheuermann, M. O., Kube, I., Schlotter, M., Mertens, D., Dohner, H., Stilgenbauer, S. & Lichter, P. 2007. Analysis of 11q22-q23 deletion target genes in B-cell chronic lymphocytic leukaemia: Evidence for a pathogenic role of NPAT, CUL5 and PPP2R1B. Eur J Cancer. 43 (8): 1328-1335. Kanagal-Shamanna, R., Luthra, R., Luthra, M., Lu, X., Routbort, M., Jain, N., Keating, M., Medeiros, L. J., Wierda, W. & Patel, K. P. 2015. RAS/RAF Pathway Mutations Define a Distinct Subset of Chronic Lymphocytic Leukemia. Blood, 126 (23): 1730. Kotkowska, A., Wawrzyniak, E., Blonski, J. Z. Robak, T. & Korycka-Wolowiec, A. 2011. Chromosomal aberrations in chronic lymphocytic leukemia detected by conventional cytogenetics with DSP30 as a single agent: Comparison with FISH. Leuk Res. 35 (8): 1032- 1038.

68

Landau, D. A., Carter, S. L., Stojanov, P., McKenna, A., Stevenson, K., Lawrence, M. S., Sougnez, C., Stewart, C., Sivachenko, A., Wang, L., Wan, Y., Zhang, W., Shukla, S. A., Vartanov, A., Fernandes, S. M., Saksena, G., Cibulskis, K., Tesar, B., Gabriel, S., Hacohen, N., Meyerson, M., Lander, E. S., Neuberg, D., Brown, J. R., Getz, G. & Wu, C. J. 2013. Evolution and impact of subclonal mutations in chronic lymphocytic leukemia. Cell. 152 (4): 714-726. Landau, D. A., Tausch, E., Taylor-Weiner, A. N., Stewart, C., Reiter, J. G., Bahlo, J., Kluth, S., Bozic, I., Lawrence, M., Bottcher, S., Carter, S. L., Cibulskis, K., Mertens, D., Sougnez, C. L., Rosenberg, M., Hess, J. M., Edelmann, J., Kless, S., Kneba, M., Ritgen, M., Fink, A., Fischer, K., Gabriel, S., Lander, E. S., Nowak, M. A., Doehner, H., Hallek, M., Neuberg, D., Getz, G., Stilgenbauer, S & Wu, C. J. 2015. Mutations driving CLL and their evolution in progression and relapse. Nature. 526 (7574): 525-530. Landau, D. A., Sun, C., Rosebrock, D., Herman, S. E. M., Fein, J., Sivina, M., Underbayev, C., Liu, D., Hoellenriegel, J., Ravichandran, S., Farooqui, M. Z. H., Zhang, W., Cibulskis, C., Zviran, A., Neuberg, D. S., Livitz, D., Bozic, I., Leshchiner, I., Getz, G., Burger, J. A., Wiestner, A. & Wu C. J. 2017. The evolutionary landscape of chronic lymphocytic leukemia treated with ibrutinib targeted therapy. Nat Commun. 8 (1): 2185. [online]. DOI: 10.1038/s41467-017-02329-y. Légaré, S., Cavallone, L., Mamo, A., Chabot, C., Sirois, I., Magliocco, A., Klimowicz, A., Tonin, P. N., Buchanan, M., Keilty, D., Hassan, S., Laperriere, D., Mader, S., Aleynikova, O. & Basik, M. 2015. The Estrogen Receptor Cofactor SPEN Functions as a Tumor Suppressor and Candidate Biomarker of Drug Responsiveness in Hormone-Dependent Breast Cancers. Cancer Res. 75 (20): 4351-4363. Malčíková, J., Stano-Kozubik, K., Tichy, B., Kantorova, B., Pavlova, S., Tom, N., Radova, L., Smardova, J., Pardy, F., Doubek, M., Brychtova, Y., Mraz, M., Plevová, K., Diviskova, E., Oltova, A., Mayer, J., Pospisilova, S. & Trbusek, M. 2015. Detailed analysis of therapy-driven clonal evolution of TP53 mutations in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 29 (4): 877-885. Malčíková, J., Tausch, E., Rossi, D., Sutton, L. A., Soussi, T., Zenz, T., Kater, A. P., Niemann, C. U., Gonzalez, D., Davi, F., Diaz, M. G., Moreno, C., Gaidano, G., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R., Stilgenbauer, S., Ghia, P. & Pospisilova, S. 2018. ERIC recommendations for TP53 mutation analysis in chronic lymphocytic leukemia-update on methodological approaches and results interpretation. Leukemia. 32 (5): 1070-1080.

69

Mansouri, L., Sutton, L. A., Ljungstrom, V., Bondza, S., Arngarden, L., Bhoi, S., Larsson, J., Cortese, D., Kalushkova, A., Plevova, K., Young, E., Gunnarsson, R., Falk- Sorqvist, E., Lonn, P., Muggen, A. F., Yan, X. J., Sander, B., Enblad, G., Smedby, K. E., Juliusson, G., Belessi, C., Rung, J., Chiorazzi, N., Strefford, J. C., Langerak, A. W., Pospisilova, S., Davi, F., Hellstrom, M., Jernberg-Wiklund, H., Ghia, P., Soderberg, O., Stamatopoulos, K., Nilsson, M. & Rosenquist, R. 2015. Functional loss of IκBε leads to NF-kappa B deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia. J Exp Med. 212 (6): 833-843. Mansouri, L., Papakonstantinou, N., Ntoufa, S., Stamatopoulos, K. & Rosenquist, R. 2016. NF-κB activation in chronic lymphocytic leukemia: A point of convergence of external triggers and intrinsic lesions. Semin Cancer Biol. 38: 40-48. Martínez-Trillos, A., Pinyol, M., Navarro, A., Aymerich, M., Jares, P., Juan, M., Rozman, M., Colomer, D., Delgado, J., Gine, E., Gonzalez-Diaz, M., Hernández-Rivas, J. M., Colado, E., Rayon, C., Payer, A. R., Terol, M. J., Navarro, B., Quesada, V., Puente, X. S., Rozman, C., López-Otin, C., Campo, E., López-Guillermo, A. & Villamor, N. 2014. Mutations in TLR/MYD88 pathway identify a subset of young chronic lymphocytic leukemia patients with favorable outcome. Blood. 123 (24): 3790-3796. Mauro, F. R., Giammartini, E., Gentile, M., Sperduti, I., Valle, V., Pizzuti, A., Guarini, A., Giannarelli, D. & Foà, R. 2006. Clinical features and outcome of familial chronic lymphocytic leukemia. Haematologica. 91 (8):1117-20. Mayer, R. L., Schwarzmeier, J. D., Gerner, M. C., Bileck, A., Mader, J. C., Meier-Menches, S. M., Gerner, S. M., Schmetterer, K. G., Pukrop, T., Reichle, A., Slany, A. & Gerner, C. 2018. Proteomics and metabolomics identify molecular mechanisms of aging potentially predisposing for chronic lymphocytic leukemia. Mol Cell Proteomics. 17 (2): 290-303. Melo, J. V., Catovsky, D., Gregory, W. M. & Galton, D. A. G. 1987. The relationship between chronic lymphocytic leukaemia and prolymphocytic leukaemia. IV. Analysis of survival and prognostic features. Br J Haematol. 65 (1): 23-29. Molica, S. 2006. Sex differences in incidence and outcome of chronic lymphocytic leukemia patients. Leuk Lymphoma, 47 (8): 1477-1480. Mohamed, A. A. E. H. & Safwat, N. A. 2018. New insights into smudge cell percentage in chronic lymphocytic Leukemia: A novel prognostic indicator of disease burden. Egypt J Med Hum Genet. 19 (4): 409-415.

70

Moore, C. R., Edwards, S. K. E. & Xie, P. 2015. Targeting TRAF3 Downstream Signaling Pathways in B cell Neoplasms. J Cancer Sci Ther. 7 (2): 67-74. Moreno, C., Greil, R., Demirkan, F., Tedeschi, A., Anz, B., Larratt, L., Simkovic, M., Samoilova, O., Novak, J., Ben-Yehuda, D., Strugov, V., Gill, D., Gribben, J. G., Hsu, E., Lih, C. J., Zhou, C., Clow, F., James, D. F., Styles, L. & Flinn, I. W. 2019. Ibrutinib plus obinutuzumab versus chlorambucil plus obinutuzumab in first-line treatment of chronic lymphocytic leukaemia (iLLUMINATE): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol. 20 (1): 43-56. Muzio, M. Fonte, E. & Caligaris-Cappio, F. 2012. Toll-like Receptors in Chronic Lymphocytic Leukemia. Meditter J Hematol Infect Dis. 4 (1): e2012055. [online]. DOI: 10.4084/MJHID.2012.055. Nadeu, F., Clot, G., Delgado, J., Martín-García, D., Baumann, T., Salaverria, I., Beà, S., Pinyol, M., Jares, P., Navarro, A., Suárez-Cisneros, H., Aymerich, M., Rozman, M., Villamor, N., Colomer D., González, M., Alcoceba, M., Terol, M. J., Navarro, B., Colado, E., Payer, Á. R., Puente, X. S., López-Otín, C., López-Guillermo, A., Enjuanes, A. & Campo, E. 2018. Clinical impact of the subclonal architecture and mutational complexity in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 32 (3): 645-653. Nuckel, H., Frey, U. H., Sellmann, L., Collins, C. H., Duhrsen, U. & Siffert, W. 2009. The IKZF3 (Aiolos) transcription factor is highly upregulated and inversely correlated with clinical progression in chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol. 144 (2): 268-270. Ojha, J., Secreto, C. R., Rabe, K. G., Van Dyke, D. L., Kortum, K. M., Slager, S. L., Shanafelt, T. D., Fonseca, R., Kay, N. E. & Braggio, E. 2015. Identification of recurrent truncated DDX3X mutations in chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol. 169 (3): 445- 448. O'Malley, D. P., Giudice, C., Chang, A. S., Chang, D., Barry, T. S., Hibbard, M. K., Chen, R. & Chen, S. T. 2011. Comparison of array comparative genomic hybridization (aCGH) to FISH and cytogenetics in prognostic evaluation of chronic lymphocytic leukemia. Int Jnl Lab Hem. 33 (3): 238-244. Park, M. J., Shen, H. L., Spaeth, J. M., Tolvanen, J. H., Failor, C., Knudtson, J. F., McLaughlin, J., Halder, S. K., Yang, Q. W., Bulun, S. E., Al-Hendy, A., Schenken, R. S., Aaltonen, L. A. & Boyer, T. G. 2018. Oncogenic exon 2 mutations in Mediator subunit MED12 disrupt allosteric activation of cyclin C-CDK8/19. J Biol Chem. 293 (13): 4870- 4882.

71

Parker, H., Rose-Zerilli, M. J. J., Larrayoz, M., Clifford, R., Edelmann, J., Blakemore, S., Gibson, J., Wang, J., Ljungstrom, V., Wojdacz, T. K., Chaplin, T., Roghanian, A., Davis, Z., Parker, A., Tausch, E., Ntoufa, S., Ramos, S., Robbe, P., Alsolami, R., Steele, A. J., Packham, G., Rodriguez-Vicente, A. E., Brown, L., McNicholl, F., Forconi, F., Pettitt, A., Hillmen, P., Dyer, M., Cragg, M. S., Chelala, C., Oakes, C. C., Rosenquist, R., Stamatopoulos, K., Stilgenbauer, S., Knight, S., Schuh, A., Oscier, D. G. & Strefford, J. C. 2016. Genomic disruption of the histone methyltransferase SETD2 in chronic lymphocytic leukaemia. Leukemia. 30 (11): 2179-2186. Pekarsky, Y., Balatti, V. & Croce, C. M. 2018. BCL2 and miR-15/16: from gene discovery to treatment. Cell Death Differ. 25 (1): 21-26. Peled, A., Klein, S., Beider, K., Burger, J. A. & Abraham, M. 2018. Role of CXCL12 and CXCR4 in the pathogenesis of hematological malignancies. Cytokine. 109: 11- 16. Pepper, C., Buggins, A. G. S., Jones, C. H., Walsby, E. J., Forconi, F., Prate, G., Devereux, S., Stevenson, F. K. & Fegan, C. 2015. Phenotypic heterogeneity in IGHV- mutated CLL patients has prognostic impact and identifies a subset with increased sensitivity to BTK and PI3Kδ inhibition. Leukemia. 29 (3): 744-747. Pérez-Chacón, G., Llobet, D., Pardo, C., Pindado, J., Choi, Y., Reed, J. C. & Zapata, J. M. 2012. TNFR-Associated Factor 2 Deficiency in B Lymphocytes Predisposes to Chronic Lymphocytic Leukemia/Small Lymphocytic Lymphoma in Mice. J Immunol, 189 (2): 1053-1061. Pfeifer, D., Pantic, M., Skatulla, I., Rawluk, J., Kreutz, C., Martens, U. M., Fisch, P., Timmer, J. & Veelken, H. 2007. Genome-wide analysis of DNA copy number changes and LOH in CLL using high-density SNP arrays. Blood. 109 (3): 1202-1210. Puente, X. S., Bea, S., Valdes-Mas, R., Villamor, N., Gutierrez-Abril, J., Martin- Subero, J. I., Munar, M., Rubio-Perez, C., Jares, P., Aymerich, M., Baumann, T., Beekman, R., Belver, L., Carrio, A., Castellano, G., Clot, G., Colado, E., Colomer, D., Costa, D., Delgado, J., Enjuanes, A., Estivill, X., Ferrando, A. A., Gelpi, J. L., Gonzalez, B., Gonzalez, S., Gonzalez, M., Gut, M., Hernandez-Rivas, J. M., Lopez-Guerra, M., Martin-Garcia, D., Navarro, A., Nicolas, P., Orozco, M., Payer, A. R., Pinyol, M., Pisano, D. G., Puente, D. A., Queiros, A. C., Quesada, V., Romeo-Casabona, C. M., Royo, C., Royo, R., Rozman, M., Russinol, N., Salaverria, I., Stamatopoulos, K., Stunnenberg, H. G., Tamborero, D., Terol, M. J., Valencia, A., Lopez-Bigas, N.,

72

Torrents, D., Gut, I., Lopez-Guillermo, A., Lopez-Otin, C. & Campo, E. 2015. Non- coding recurrent mutations in chronic lymphocytic leukaemia. Nature. 526 (7574): 519-524. Qin, S. C., Xia, Y., Miao, Y., Zhu, H. Y., Wu, J. Z., Fan, L., Qiao, C., Xu, W. & Li, J. Y. 2017. MYD88 mutations predict unfavorable prognosis in Chronic Lymphocytic Leukemia patients with mutated IGHV gene. Blood Cancer J. 7 (12): 651. [online]. DOI: 10.1038/s41408-017-0014-y. Quesada, V., Conde, L., Villamor, N., Ordonez, G. R., Jares, P., Bassaganyas, L., Ramsay, A. J., Bea, S., Pinyol, M., Martinez-Trillos, A., Lopez-Guerra, M., Colomer, D., Navarro, A., Baumann, T., Aymerich, M., Rozman, M., Delgado, J., Gine, E., Hernandez, J. M., Gonzalez Diaz, M., Puente, D. A., Velasco, G., Freije, J. M. P., Tubio, J. M. C., Royo, R., Gelpi, J. L., Orozco, M., Pisano, D. G., Zamora, J., Vazquez, M., Valencia, A., Himmelbauer, H., Bayes, M., Heath, S., Gut, M., Gut, I., Estivill, X., Lopez-Guillermo, A., Puente, X. S., Campo, E. & Lopez-Otin, C. 2012. Exome sequencing identifies recurrent mutations of the splicing factor SF3B1 gene in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (1): 47-52. Rai, K. R., Sawitsky, A., Cronkite, E. P., Chanana, A. D., Levy, R. N. & Pasternack, B. S. 1975. Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 46 (2): 219-234. Rai, K. R. & Montserrat, E. 1987. Prognostic factors in chronic lymphocytic leukemia. Semin Hematol. 24 (4): 252-256. Ramsay, A. J., Rodriguez, D., Villamor, N., Kwarciak, A., Tejedor, J. R., Valcarcel, J., Lopez-Guillermo, A., Martinez-Trillos, A., Puente, X. S., Campo, E., Lopez-Otin, C. & Quesada, V. 2013. Frequent somatic mutations in components of the RNA processing machinery in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 27 (7): 1600-1603. Rigolin, G. M., del Giudice, I., Formigaro, L., Saccenti, E., Martinelli, S., Cavallari, M., Lista, E., Tammiso, E., Volta, E., Lupini, L., Bassi, C., Bardi, A., Sofritti, O., Daghia, G., Cavazzini, F., Marinelli, M., Tavolaro, S., Guarini, A., Negrini, M., Foà, R. & Cuneo, A. 2015. Chromosome aberrations detected by conventional karyotyping using novel mitogens in chronic lymphocytic leukemia: Clinical and biologic correlations. Genes Chromosomes Cancer. 54 (12): 818-826. Rigolin, G. M., Saccenti, E., Bassi, C., Lupini, L., Quaglia, F. M., Cavallari, M., Martinelli, S., Formigaro, L., Lista, E., Bardi, M. A., Volta, E., Tammiso, E., Melandri, A., Urso, A., Cavazzini, F., Negrini, M. & Cuneo, A. 2016. Extensive next-generation

73 sequencing analysis in chronic lymphocytic leukemia at diagnosis: clinical and biological correlations. J Hematol Oncol. 9 (1): 88. Rodrigues, C.A., Gonçalves, M.V., Ikoma, M.R.V., Lorand-Metze, I., Pereira, A.D., de Farias, D.L.C., de Lourdes Lopes Ferrari Chauffaille, M., Schaffel, R., Ribeiro, E. F. O., da Rocha, T.S., Buccheri, V., Vasconcelos, Y., de Piratininga Figueiredo, V.L., Chiattone, C.S. & Yamamoto, M. 2016. Diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: recommendations from the Brazilian Group of Chronic Lymphocytic Leukemia. Rev Bras Hematol Hemoter. 38 (4): 346-357. Rodriguez-Vicente, A. E., Bikos, V., Hernandez-Sanchez, M., Malcikova, J., Hernandez-Rivas, J. M. & Pospisilova, S. 2017. Next-generation sequencing in chronic lymphocytic leukemia: recent findings and new horizons. Oncotarget. 8 (41): 71234-71248. Roos-Weil, D., Nguyen-Khac, F. & Bernard, O. A. 2016. Chronic lymphocytic leukemia: Time to go past genomics? Am J Hematol. 91 (5): 518-528. Rose-Zerilli, M. J., Forster, J., Parker, H., Parker, A., Rodríguez, A, E,, Chaplin, T., Gardiner, A., Steele, A. J., Collins, A., Young, B. D., Skowronska, A., Catovsky, D., Stankovic, T., Oscier, D. G. & Strefford, J. C. 2014. ATM mutation rather than BIRC3 deletion and/or mutation predicts reduced survival in 11q-deleted chronic lymphocytic leukemia: data from the UK LRF CLL4 trial. Haematologica. 99 (4): 736-742. Rossi, D., Fangazio, M., Rasi, S., Vaisitti, T., Monti, S., Cresta, S., Chiaretti, S., Del Giudice, I., Fabbri, G., Bruscaggin, A., Spina, V., Deambrogi, C., Marinelli, M., Fama, R., Greco, M., Daniele, G., Forconi, F., Gattei, V., Bertoni, F., Deaglio, S., Pasqualucci, L., Guarini, A., Dalla-Favera, R., Foa, R. & Gaidano, G. 2012. Disruption of BIRC3 associates with fludarabine chemorefractoriness in TP53 wild-type chronic lymphocytic leukemia. Blood. 119 (12): 2854-2862. Rossi, D., Khiabanian, H., Spina, V., Ciardullo, C., Bruscaggin, A., Fama, R., Rasi, S., Monti, S., Deambrogi, C., De Paoli, L., Wang, J. G., Gattei, V., Guarini, A., Foa, R., Rabadan, R. & Gaidano, G. 2014. Clinical impact of small TP53 mutated subclones in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 123 (14): 2139-2147. Rossi, D. & Gaidano, G. 2016. The clinical implications of gene mutations in chronic lymphocytic leukaemia. Br J Cancer. 114 (8): 849-854. Scarfo, L., Ferreri, A. J. M. & Ghia, P. 2016. Chronic lymphocytic leukaemia. Crit Rev Oncol Hematol. 104: 169-182.

74

Shenoy, P. J., Malik, N., Sinha, R., Nooka, A., Nastoupil, L. J., Smith, M. & Flowers, C. R. 2011. Racial Differences in the Presentation and Outcomes of Chronic Lymphocytic Leukemia and Variants in the United States. Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 11 (6): 498-506. Schwaenen, C., Nessling, M., Wessendorf, S., Salvi, T., Wrobel, G., Radlwimmer, B., Kestler, H. A., Haslinger, C., Stilgenbauer, S., Döhner, H., Bentz, M. & Lichter P. 2004. Automated array-based genomic profiling in chronic lymphocytic leukemia: development of a clinical tool and discovery of recurrent genomic alterations. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (4): 1039-1044. Slager, S. L., Benavente, Y., Blair, A., Vermeulen, R., Cerhan, J. R., Costantini, A. S., Monnereau, A., Nieters, A., Clavel, J., Call, T. G., Maynadié, M., Lan, Q., Clarke, Ch. A., Lightfoot, T., Norman, A. D., Sampson, J. N., Casabonne, D., Cocco, P. & de Sanjosé, S. 2014. Medical History, Lifestyle, Family History, and Occupational Risk Factors for Chronic Lymphocytic Leukemia/Small Lymphocytic Lymphoma: The InterLymph Non- Hodgkin Lymphoma Subtypes Project. J Natl Cancer Inst Monogr. 2014 (48): 41-51. Smolej L. & Šimkovič, M. 2016. Practical approach to management of chronic lymphocytic leukemia. Arch Med Sci. 12 (2): 448-456. Speedy, H. E., Kinnersley, B., Chubb, D., Broderick, P., Law, P. J., Litchfield, K., Jayne, S., Dyer, M. J. S., Dearden, C., Follows, G. A., Catovsky, D. & Houlston, R. S. 2016. Germ line mutations in shelterin complex genes are associated with familial chronic lymphocytic leukemia. Blood. 128 (19): 2319-2326. Stamatopoulos, K., Agathangelidis, A., Rosenquist, R. & Ghia P. 2017. Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 31 (2): 282-291. Stevens-Kroef, M., Simons, A., Gorissen, H., Feuth, T., Weghuis, D. O., Buijs, A., Raymakers, R. & van Kessel, A. G. 2009. Identification of chromosomal abnormalities relevant to prognosis in chronic lymphocytic leukemia using multiplex ligation-dependent probe amplification. Cancer Genet Cytogenet. 195 (2): 97-104. Stevenson, F. K., Krysov, S., Davies, A. J., Steele, A. J. & Packham, G. 2011. B- cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 118 (16): 4313-4320. Stilgenbauer, S., Eichhorst, B., Schetelig, J., Coutre, S., Seymour, J. F., Munir, T., Puvvada, S. D., Wendtner, C. M., Roberts, A. W., Jurczak, W., Mulligan, S. P., Böttcher, S., Mobasher, M., Zhu, M., Desai, M., Chyla, B., Verdugo, M., Enschede, S. H., Cerri, E., Humerickhouse, R., Gordon, G., Hallek, M. & Wierda, W. G. 2016.

75

Venetoclax in relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with 17p deletion: a multicentre, open-label, phase 2 study. Lancet Oncol. 17 (6): 768-778. Stilgenbauer, S., Sander, S., Bullinger, L., Benner, A., Leupolt, E., Winkler, D., Kröber, A., Kienle, D., Lichter, P & Döhner, H. 2007. Clonal evolution in chronic lymphocytic leukemia: acquisition of high-risk genomic aberrations associated with unmutated VH, resistance to therapy, and short survival. Haematologica. 92 (9): 1242-1245. Sutton, L. A., Ljungström, V., Mansouri, L., Young, E., Cortese, D., Navrkalova, V., Malcikova, J., Muggen, A. F., Trbusek, M., Panagiotidis, P., Davi, F., Belessi, C., Langerak, A. W., Ghia, P., Pospisilova, S., Stamatopoulos, K. & Rosenquist, R. 2015. Targeted next-generation sequencing in chronic lymphocytic leukemia: a high-throughput yet tailored approach will facilitate implementation in a clinical setting. Haematologica. 100 (3): 370-376. Szurián, K., Csala, I., Marosvári, D., Rajnai, H., Dezsõ, K., Bödör, C., Piurkó, V., Matolcsy, A. & Reiniger, L. 2018. EZH2 is upregulated in the proliferation centers of CLL/SLL lymph nodes. Exp Mol Pathol. 105 (2): 161-165. Tang, G. L., Banks, H. E., Sargent, R. L., Medeiros, L. J. & Abruzzo, L. V. 2013. Chronic lymphocytic leukemia with t(14;18)(q32;q21). Hum Pathol. 44 (4): 598-605. te Raa, G. D., Moerland, P. D., Leeksma, A. C., Derks, I. A., Yigittop, H., Laddach, N., Loden-van Straaten, M., Navrkalova, V., Trbusek, M., Luijks, D. M., Zenz, T., Skowronska, A., Hoogendoorn, M., Stankovic, T., van Oers, M. H., Eldering, E. & Kater, A. P. 2015. Assessment of p53 and ATM functionality in chronic lymphocytic leukemia by multiplex ligation-dependent probe amplification. Cell Death Dis. 6: e1852. [online]. DOI: 10.1038/cddis.2015.223. te Raa, G. D. & Kater, A. P. 2016. TP53 dysfunction in CLL: Implications for prognosis and treatment. Best Pract Res Clin Haematol. 29 (1): 90-99. Thomay, K., Fedder, C., Hofmann, W., Kreipe, H., Stadler, M., Titgemeyer, J., Zander, I., Schlegelberger, B. & Gohring, G. 2017. Telomere shortening, TP53 mutations and deletions in chronic lymphocytic leukemia result in increased chromosomal instability and breakpoint clustering in heterochromatic regions. Ann Hematol. 96 (9): 1493-1500. Thompson, P. A., O'Brien, S. M., Wierda, W. G., Ferrajoli, A., Stingo, F., Smith, S. C., Burger, J. A., Estrov, Z., Jain, N., Kantarjian, H. M. & Keating, M. J. 2015. Complex Karyotype is a Stronger Predictor Than Del(17p) for an Inferior Outcome in

76

Relapsed or Refractory Chronic Lymphocytic Leukemia Patients Treated With Ibrutinib- Based Regimens. Cancer. 121 (20): 3612-3621. Vaisitti, T., Gaudino, F., Ouk, S., Moscvin, M., Vitale, N., Serra, S., Arruga, F., Zakrzewski, J. L., Liou, H. C., Allan, J. N., Furman, R. R. & Deaglio, S. 2017. Targeting metabolism and survival in chronic lymphocytic leukemia and Richter syndrome cells by a novel NF-kappa B inhibitor. Haematologica. 102 (11): 1878-1889. Van Damme, M., Crompot, E., Meuleman, N., Maerevoet, M., Mineur, P., Bron, D., Lagneaux, L. & Stamatopoulos, B. 2016. Characterization of TET and IDH gene expression in chronic lymphocytic leukemia: comparison with normal B cells and prognostic significance. Clin Epigenetics. 8: 132. [online]. DOI: 10.1186 / s13148-016-0298-y. Véronèse, L., Tournilhac, O., Combes, P., Prie, N., Pierre-Eymard, E., Guieze, R., Veyrat-Masson, R., Bay, J. O., Vago, P. & Tchirkov, A. 2013. Contribution of MLPA to routine diagnostic testing of recurrent genomic aberrations in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet. 206 (1-2): 19-25. Wang, L. L., Lawrence, M. S., Wan, Y. Z., Stojanov, P., Sougnez, C., Stevenson, K., Werner, L., Sivachenko, A., DeLuca, D. S., Zhang, L., Zhang, W. D., Vartanov, A. R., Fernandes, S. M., Goldstein, N. R., Folco, E. G., Cibulskis, K., Tesar, B., Sievers, Q. L., Shefler, E., Gabriel, S., Hacohen, N., Reed, R., Meyerson, M., Golub, T. R., Lander, E. S., Neuberg, D., Brown, J. R., Getz, G. & Wu, C. J. 2011. SF3B1 and Other Novel Cancer Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. N Engl J Med. 365 (26): 2497-2506. Wang, L. L., Brooks, A. N., Fan, J., Wan, Y. Z., Gambe, R., Li, S. Q., Hergert, S., Yin, S. Y., Freeman, S. S., Levin, J. Z., Fan, L., Seiler, M., Buonamici, S., Smith, P. G., Chau, K. F., Cibulskis, C. L., Zhang, W. D., Rassenti, L. Z., Ghia, E. M., Kipps, T. J., Fernandes, S., Bloch, D. B., Kotliar, D., Landau, D. A., Shukla, S. A., Aster, J. C., Reed, R., DeLuca, D. S., Brown, J. R., Neuberg, D., Getz, G., Livak, K. J., Meyerson, M. M., Kharchenko, P. V. & Wu, C. J. 2016. Transcriptomic Characterization of SF3B1 Mutation Reveals Its Pleiotropic Effects in Chronic Lymphocytic Leukemia. Cancer Cell. 30 (5): 750- 763. Wolf, C., Garding, A., Filarsky, K., Bahlo, J., Robrecht, S., Becker, N., Zucknick, M., Rouhi, A., Weigel, A., Claus, R., Weichenhan, D., Eichhorst, B., Fischer, K., Hallek, M., Kuchenbauer, F., Plass, C., Dohner, H., Stilgenbauer, S., Lichter, P. & Mertens, D. 2018. NFATC1 activation by DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia

77 correlates with clinical staging and can be inhibited by ibrutinib. Int J Cancer. 142 (2): 322- 333. Woyach, J. A., Furman, R. R., Liu, T. M., Ozer, H. G., Zapatka, M., Ruppert, A. S., Xue, L., Li, D. H., Steggerda, S. M., Versele, M., Dave, S. S., Zhang, J., Yilmaz, A. S., Jaglowski, S. M., Blum, K. A., Lozanski, A., Lozanski, G., James, D. F., Barrientos, J. C., Lichter, P., Stilgenbauer, S., Buggy, J. J., Chang, B. Y., Johnson, A. J. & Byrd, J. C. 2014. Resistance mechanisms for the Bruton's tyrosine kinase inhibitor ibrutinib. N Engl J Med. 370 (24): 2286-2294. Woyach, J. A., Ruppert, A. S., Guinn, D., Lehman, A., Blachly, J. S., Lozanski, A., Heerema, N. A., Zhao, W., Coleman, J., Jones, D., Abruzzo, L., Gordon, A., Mantel, R., Smith, L. L., McWhorter, S., Davis, M., Doong, T. J., Ny, F., Lucas, M., Chase, W., Jones, J. A., Flynn, J. M., Maddocks, K., Rogers, K., Jaglowski, S., Andritsos, L. A., Awan, F. T., Blum, K. A., Grever, M. R., Lozanski, G., Johnson, A. J. & Byrd, J. C. 2017. BTKC481S-Mediated Resistance to Ibrutinib in Chronic Lymphocytic Leukemia. J Clin Oncol. 35 (13): 1437-1443. Wu, B., Slabicki, M., Sellner, L., Dietrich, S., Liu, X. Y., Jethwa, A., Hullein, J., Walther, T., Wagner, L., Huang, Z. Q., Zapatka, M. & Zenz, T. 2017. MED12 mutations and NOTCH signalling in chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol. 179 (3): 421-429. Yada, M., Hatakeyama, S., Kamura, T., Nishiyama, M., Tsunematsu, R., Imaki, H., Ishida, N., Okumura, F., Nakayama, K. & Nakayama, K. I. 2004. Phosphorylation- dependent degradation of c-Myc is mediated by the F-box protein Fbw7. EMBO J. 23 (10): 2116-2125. Young, E., Noerenberg, D., Mansouri, L., Ljungström, V., Frick, M., Sutton, L. A., Blakemore, S. J., Galan-Sousa, J., Plevova, K., Baliakas, P., Rossi, D., Clifford, R., Roos-Weil, D., Navrkalova, V., Dörken, B., Schmitt, C. A., Smedby, K. E., Juliusson, G., Giacopelli, B., Blachly, J. S., Belessi, C., Panagiotidis, P., Chiorazzi, N., Davi, F., Langerak, A. W., Oscier, D., Schuh, A., Gaidano, G., Ghia, P., Xu, W., Fan, L., Bernard, O. A., Nguyen-Khac, F., Rassenti, L., Li, J., Kipps, T. J., Stamatopoulos, K., Pospisilova, S., Zenz, T., Oakes, C. C., Strefford, J. C., Rosenquist, R. & Damm, F. 2017. EGR2 mutations define a new clinically aggressive subgroup of chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 31 (7): 1547-1554. Yu, L. J., Kim, H. T., Kasar, S. N., Benien, P., Du, W., Hoang, K., Aw, A., Tesar, B., Improgo, R., Fernandes, S. M., Radhakrishnan, S., Klitgaard, J. L., Lee, C., Getz, G.,

78

Setlur, S. R. & Brown, J. R. 2017. Survival of Del17p CLL Depends on Genomic Complexity and Somatic Mutation. Clin Cancer Res. 23 (3): 735-745. Zenz, T., Kröber, A., Scherer, K., Häbe, S., Bühler, A., Benner, A., Denzel, T., Winkler, D., Edelmann, J., Schwänen, C., Döhner, H. & Stilgenbauer, S. 2008. Monoallelic TP53 inactivation is associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia: results from a detailed genetic characterization with long-term follow-up. Blood. 112 (8): 3322-3329. Zhang, Z. H., Chen, S., Chen, S., Chen, G., Zhang, R., Li, J. H. & Qu, J. H. 2017. SF3B1 mutation is a prognostic factor in chronic lymphocytic leukemia: a meta-analysis. Oncotarget. 8 (41): 69916-69923. Zhu, H., Wu, W., Fu, Y., Shen, W., Miao, K., Hong, M., Xu, W., Young, K. H., Liu, P.& Li J. 2014. Overexpressed BAG3 is a potential therapeutic target in chronic lymphocytic leukemia. Ann Hematil, 93 (3): 425-435.

Internetové zdroje: Agilent Technologies, Inc. [online]. 2019. [citováno 14.4.2019]. Dostupné z ˂https://www.aati-us.com/instruments/fragment-analyzer/˃. Agilent Technologies, Inc. [online]. 2019. [citováno 14.4.2019]. Dostupné z ˂https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G2964- 90000_TapeStation_USR_ENU.pdf˃. Cancer Research UK. [online]. 2019. [citováno 11.4.2019]. Dostupné z ˂www.cancerresearchuk.org˃. GeneCards®: The Human Gene Database. [online]. 2019. [citováno 8.5.2019]. Dostupné z ˂https://www.genecards.org/ ˃. GitHub, Inc. [online]. 2019. [citováno 6.5.2019]. Dostupné z ˂https://github.com/bcbio/bcbio-nextgen ˃. Illumina, Inc. [online]. 2019. [citováno 28.3.2019]. Dostupné z ˂www.illumina.com˃. Illumina, Inc. [online]. 2019. [citováno 15.4.2019]. Dostupné z ˂https://www.illumina.com/documents/products/illumina_sequencing_introduction.pd˃. LABGENE Scientific SA. [online]. 2019. [citováno 10.4.2019]. Dostupné z ˂https://www.labgene.ch/nucleic-acids-purification/151-magcore-hf16.html˃.

79

QIAGEN. [online]. 2019. [citováno 11.4.2019]. Dostupné z ˂https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/genomic-dna/dneasy-blood-and- tissue-kit/#productdetails˃. Regina Lamendella. (2015). Tutorial from sample to analyzed data using Qiime for analysis [pdf] Juniata College, USA. Dostupné z ˂http://www.science.smith.edu/cmbs/wp- content/uploads/sites/36/2015/09/Tutorial-from-sample-to-analyzed-data-using-Qiime-for- analysis.pdf˃ STEMCELL Technologies Inc. [online]. 2019. [citováno 10.4.2019]. Dostupné z ˂https://www.stemcell.com/products/brands/rosettesep-immunodensity-cell-separation.html˃. Tocris Bioscience; Bio-Techne R&D Systems s.r.o. [online]. 2019. [citováno 25.2.2019]. Dostupné z ˂https://www.tocris.com/pathways/notch-signaling-pathway˃. Tocris Bioscience; Bio-Techne R&D Systems s.r.o. [online]. 2019. [citováno 25.2.2019]. Dostupné z ˂https://www.tocris.com/pathways/mapk-signaling-pathway˃.

80