Rôle De La Voie Mtorc1/S6K Et RSK Dans Le Métabolisme Énergétique

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Rôle de la voie mTORC1/S6K et RSK dans le métabolisme énergétique

Thèse

Michaël Shum

Doctorat en médecine moléculaire Philosophiae doctor (Ph. D.)

Québec, Canada

Thèse

Michaël Shum

Sous la direction de :

André Marette, directeur de recherche Résumé

Rôles de la voie mTORC1/S6K1 et RSK dans la résistance à l’insuline et le métabolisme énergétique

Le complexe 1 de la Ser/Thr kinase mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) (mTORC1), son médiateur en aval, S6K1, (p70 S6 kinase) et RSK (p90 ribosomal S6 kinase) sont des régulateurs clés de la signalisation de l’insuline et du métabolisme énergétique. La voie mTORC1/S6K contrôle la prolifération, la croissance cellulaire, la synthèse protéique, la lipogenèse, la biogenèse mitochondriale et inhibe l’autophagie. L’une des particularités importantes de cette voie de signalisation est l’intégration de différents signaux tels les facteurs de croissance, le statut énergétique, l’oxygène et les nutriments. Ainsi, la voie mTORC1/S6K1 est suractivée par l’excès de nutriments et ses kinases sont bien connues pour être suractivées dans l'obésité. De plus, RSK est une kinase en aval de la voie des MAPK (mitogen-activated protein kinase) et est connue pour réguler la prolifération, la croissance cellulaire et activer la voie mTORC1. Parmi les activateurs de RSK, on retrouve l’insuline et l’hyperglycémie. Ainsi, mTORC1/S6K1 et RSK sont impliquées dans le développement de la résistance à l’insuline, de l’obésité et du diabète de type 2. Dans une première étude publiée dans la revue Diabetologia, nous avons évalué l’impact de l’inhibition pharmacologique de S6K1 par le PF-4708671 sur la résistance à l’insuline et le métabolisme énergétique. Pour ce faire, nous avons utilisé des myotubes (L6) et des hépatocytes (FAO) en culture et montrés que l’inhibition de S6K1 augmente le captage de glucose musculaire et diminue la production hépatique de glucose. Par la suite, nous avons utilisé un modèle de souris obèse induit par une diète riche en gras afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’inhibition pharmacologique de S6K1. Ces études nous ont permis de montrer que l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique de S6K1 améliore la tolérance au glucose et la phosphorylation d’Akt. Mécanistiquement, nous avons démontré dans un 2ième temps que le PF inhibe non seulement l’activité de S6K1, mais inhibe aussi l’activité du complexe I mitochondrial causant une augmentation de l’activité de l’AMPK (AMP activated protein kinase) et une inhibition de l’ACC (acetyl- CoA carboxylase). Parallèlement, nous avons montré dans une 3e étude, publiée dans J. Biol. Chem., que l'inhibition de RSK1 par l’inhibiteur pharmacologique (BI-D1870) ou d’un mutant RSK1 dominant négatif (DN-RSK1), diminue la phosphorylation d’IRS-1 sur la S1101. Par ailleurs, l’expression du DN-RSK1 augmente l’action de l’insuline sur le transport du glucose musculaire et la production de glucose hépatique. Ainsi, nous avons montré que RSK1 est un nouveau régulateur de la signalisation de l’insuline en phosphorylant la S1101 d’IRS-1. Nous proposons ainsi que l’inhibition de S6K1 et de RSK1 sont des approches thérapeutiques potentielles afin de traiter la résistance à l’insuline et le diabète de type 2.

Mots clés : mTORC1, S6K1, RSK, MAPK, résistance à l’insuline, obésité, PF-4708671

iii

Abstract

Role of mTORC1/S6K1 and RSK on insulin resistance and energy metabolism

The Ser/Thr kinase mTOR complex 1 (mammalian Target Of Rapamycin) (mTORC1), his downstream effectors S6K1 (p70 ribosomal S6 kinase) and RSK (p90 ribosomal S6 kinase) are key regulators of insulin signaling and energy metabolism. The mTORC1/S6K1 pathway regulates cellular proliferation, growth, protein synthesis, lipogenesis, mitochondrial biogenesis, insulin signaling and inhibits autophagy. One of the most important roles of this signaling pathway is to integrate differents signals such as growth factors, energy status, oxygen, and nutrients. Thus, the mTORC1/S6K1 pathway is overactivated by nutrient excess conditions such as obesity. In addition, RSK is a downstream kinase of MAPK (mitogen-activated protein kinase) and it is also known to regulates cell proliferation, growth and to activate the mTORC1 pathway. Insulin and hyperglycemia are known to be among RSK activators. Therefore, mTORC1/S6K1 and RSK are involved in insulin resistance, obesity and type 2 diabetes. In a first study published in Diabetologia journal, we evaluated the effect of S6K1 inhibition with a selective S6K1 inhibitor, PF-4708671, on insulin resistance and energy metabolism. We used myotubes (L6) and hepatocytes (FAO) and observed that S6K1 inhibition increases glucose uptake in muscle and decrease glucose production in hepatocytes. In both cell type, S6K1 inhibition increases insulin-stimulating Akt phosphorylation. In addition, we treated obese mice fed high-fat diet for 1-week with S6K1 inhibitor. Mice treated with PF-4708671 have improved glucose tolerance and insulin-stimulating Akt phosphorylation in muscle, adipose tissue, and liver compared to obese mice treated with vehicle. Mechanistically, we showed in a 2nd study that this inhibitor inhibits S6K1 activity but also mitochondrial complex 1 which is associated with an increase in AMPK activation. Along with this study, we showed in a 3rd study published in J. Biol. Chem., that RSK1 phosphorylates directly IRS-1 on Ser1101 and RSK inhibition, by using either a RSK inhibitor (BI-D1870) or dominant-negative RSK1, improves insulin stimulating Akt phosphorylation as well as increasing glucose uptake in myotubes and inhibiting hepatic glucose production in vitro. Therefore, we demonstrated that RSK is a novel regulator of insulin signaling by phosphorylation Ser1101 of IRS-1. In conclusion, we are proposing that S6K1 inhibition and RSK1 inhibition are potential therapeutics targets to treat insulin resistance and type 2 diabetes.

Keywords : mTORC1, S6K1, RSK, MAPK, insulin resistance, obesity, PF-4708671

Table des matières

Résumé ...... iii Abstract ...... iv Table des matières ...... v Liste des tableaux ...... vii Liste des figures ...... viii Liste des abréviations ...... x Remerciements ...... xii Avant-propos ...... xiv Articles ...... xv I-Introduction ...... 1 1.1 Le syndrome métabolique ...... 1 1.1.1 L’obésité ...... 2 1.1.2 Le diabète de type 2 ...... 3 1.2 L’insuline et le métabolisme...... 4 1.2.1 L’insuline ...... 4 1.2.2 Les effets de l’insuline dans le muscle squelettique ...... 5 1.2.3 Les effets de l’insuline dans le foie ...... 6 1.2.4 Les effets de l’insuline dans le tissu adipeux ...... 6 1.2.5 La résistance à l’insuline ...... 7 1.3 La signalisation de l’insuline ...... 7 1.4 mTOR ...... 17 1.4.1 mTORC1 ...... 18 1.4.2 mTORC2 ...... 32 1.5 S6K ...... 33 1.6 mTORC1/S6K1 : une voie clé du métabolisme ! ...... 36 1.7 p90 ribosomal S6 kinase (RSK) ...... 43 1.8 La mitochondrie ...... 48 1.8.1 La structure de la mitochondrie ...... 48 1.8.2 La chaine respiratoire oxydative...... 50 1.8.3 La production d’énergie par la mitochondrie ...... 51 1.8.4 Mécanisme de régulations des fonctions mitochondriales ...... 54 1.8.5 La mitochondrie et son rôle dans les maladies métaboliques...... 67 II-Problématique et objectifs du projet de recherche...... 72 2.1 L’inhibition pharmacologique de S6K1 et la signalisation de l’insuline ...... 73 2.2 L’inhibition de RSK et la signalisation de l’insuline ...... 74 Chapitre I ...... 76 Avant-propos ...... 76 Pharmacological inhibition of S6K1 increases glucose metabolism and Akt signalling in vitro and in diet-induced obese mice ...... 77 Résumé ...... 78 Abstract ...... 79 Introduction ...... 80 Methods ...... 82

Results ...... 84 Discussion ...... 88 References ...... 93 Figure legends ...... 97 ESM Methods ...... 107 Chapitre II ...... 111 Avant-propos ...... 111 PF-4708671 regulates energy homeostasis by acting on both S6K1 inhibition and mitochondrial complex 1...... 112 Résumé ...... 113 Introduction ...... 114 Methods ...... 115 Results ...... 117 Discussion ...... 119 References ...... 124 Legends to figures ...... 129 Chapitre III ...... 136 Avant-propos ...... 136 Insulin activates RSK (p90 ribosomal S6 kinase) to trigger a new negative feedback loop that regulates insulin signalling for glucose metabolism...... 137 Résumé ...... 138 Abstract ...... 139 Methods ...... 141 Results ...... 143 Discussion ...... 149 References ...... 154 Legends to Figures ...... 159 IV-Discussion générale...... 168 VI-Conclusion ...... 184 Bibliographie ...... 185

Liste des tableaux

Chapitre I

Table 1 Effect of 7-day PF-4708671 and rapamycin treatment on weight, food intake and metabolic variables of treated mice ...... 96

vii

Liste des figures

Introduction Figure 1 : Interaction entre le tissu adipeux et les macrophages dans le dévelopement de la lipotoxicité...... 2 Figure 2 : La voie de signalisation activée par l’insuline et IGF-1 (insulin growth factor). 8 Figure 3 : Boucle de rétro-inhibition induite par mTORC1/S6K1 et ERK sur la voie PI3K/Akt...... 12 Figure 4 : Activation du transport de glucose par l’insuline et la contraction dans le muscle...... 14 Figure 5 : Régulation de la transcription des gènes de la gluconéogenèse hépatique lors du jeûne et en phase postprandiale...... 16 Figure 6 : Les complexes mTORC1 et mTORC2 ...... 17 Figure 7 : Régulation de l’activation de la voie mTORC1...... 19 Figure 8 : Les signaux en amont de mTORC1...... 21 Figure 9 : La régulation de l’AMPK et ses fonctions ...... 23 Figure 10 : L’hexokinase régule la glycolyse et l’autophagie via mTORC1...... 24 Figure 11 : Régulation de l’activation de mTORC1 par les acides aminés et l’insuline à la surface des lysosomes...... 26 Figure 12 : Les effets en aval de mTORC1...... 28 Figure 13 : Régulation de l’initiation de l’autophagie par mTORC1 ...... 30 Figure 14 : Structure de S6K...... 34 Figure 15 : L’activation de RSK et ses fonctions...... 44 Figure 16. La structure de la mitochondrie...... 50 Figure 17 : Chaîne de respiration oxydative mitochondriale...... 51 Figure 18 : Le métabolisme énergétique...... 53 Figure 19 : Régulation du métabolisme mitochondrial par mTOR...... 55 Figure 20 : Modifications post-traductionelles régulant les fonctions mitochondriales. .... 56 Figure 21 : Le dynamisme mitochondrial et l’homéostasie énergétique ...... 58 Figure 22 : La mitophagie...... 59 Figure 23 : Composition des MAMs...... 61 Figure 24 : Régulation des MAMs par mTORC2/Akt...... 62 Figure 25: Oxydation de l’oxygène par la chaîne respiratoire oxydative mitochondriale. . 63 Figure 26 : Rôle des ROS dans le développement des dysfonctions mitochondriales et métaboliques...... 64 Figure 27: Rôle des ROS comme molécules de signalisation dans le contrôle de l’autophagie lors du jêune...... 66 Figure 28 : L’homéostasie de la morphologie mitochondriale...... 70 Figure 29: Structure de l’inhibiteur PF-4708671 ...... 74 Figure 30 : Modifications post-traductionnelles d’IRS1 en réponse aux acides aminés et à l’insuline ...... 75

viii

Chapitre I Figure. 1: Time-dependent S6K1 inhibition by PF-4708671. Insulin signalling analysis after time-dependant S6K1 inhibition by PF-4708671...... 97 Figure. 2: S6K1 inhibition decreased glucose production and increased Akt phosphorylation in hepatocytes...... 97 Figure. 3: S6K1 inhibition increased glucose uptake and increased Akt phosphorylation in L6 myotubes...... 97 Figure. 4: S6K1 inhibition improved glucose tolerance while rapamycin exacerbated glucose intolerance in HF-fed mice...... 98 Figure. 5: PF-4708671 did not reproduce the deleterious effect of chronic rapamycin on hepatic gluconeogenesis...... 98 Figure. 6: S6K1 inhibition increased Akt phosphorylation...... 98 Figure. 7: S6K1 inhibition did not decrease S6 phosphorylation in HF-fed obese mice. ... 99 ESM Figure 1: MSK and CREB phosphorylation are not inhibited by PF-4708671 ...... 99 ESM Figure 2: IRS1 S1101 phosphorylation is inhibited by S6K1 inhibition ...... 99

Chapitre II Figure 1: PF-4708671 induced basal muscle glucose uptake and decreased basal hepatocyte glucose production...... 129 Figure 2: PF-4708671 rapidly increased AMPK phosphorylation before inhibiting S6K1 in normal conditions...... 129 Figure 3: PF-4708671 decreased mitochondrial spare respiratory capacity and inhibited acutely mitochondrial complex I activity in muscle cells...... 129 Figure 4: PF-4708671 decreased mitochondrial spare respiratory capacity and acutely inhibited mitochondrial complex I activity in hepatocytes...... 130 Figure 5: PF-4708671 did not increase glucose uptake by activating AMPK ...... 130

Chapitre III Figure 1: The IRS-1 scaffold protein presents putative residues that could be phosphorylated by the RSK kinase...... 159 Figure 2: RSK1 is activated in insulin-targeted cell lines ...... 159 Figure 3: Insulin stimulation of L6 myocytes promotes the RSK1-dependent phosphorylation of Ser1101 of IRS-1 ...... 160 Figure 4: Inhibition of RSK1 activity improves insulin sensitivity in L6 cells ...... 160 Figure 5: Inhibition of RSK1 activity improves insulin sensitivity in hepatocytes...... 160 Figure 6: RSK1-DN improves insulin sensitivity in pathological conditions in L6 cells . 161

Discussion Figure 31 : La signalisation de l’insuline dans l’obésité suite à l’inhibition de S6K1 et RSK...... 182

Liste des abréviations

4E-BP1/2 eIF4E-binding protein 1/2 AMPK AMP activated protein kinase Akt v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 CREB cAMP response element-binding protein Deptor DEP domain-containing mTOR-interacting protein ERK1/2 Extracellular signal-regulated kinase 1/2 eIF4E eukaryotic translation initiation factor 4E ER Endoplasmic reticulum FOXO Forkhead box O GAP GTPase activating protein G6Pase Glucose -6-phosphatase GTT Glucose tolerance test HFD High Fat Diet HNF4α Hepatocyte nuclear factor 4α IGF1 Hepatocyt Insulin growth factor 1 IRS-1 Insulin Receptor Substrate-1 e nuclear factor 4α IR Récepteur de l'insuline MAPK Mitogen/Microtubule Activated Protein Kinase MKP-1 Phosphatase-1 des MAP kinases mLST8 Mammalian lethal with SEC13 protein 8 (GβL) mSin1 Mammalian stress-activated protein kinase interacting protein MSK1 Mitogen and stress activated kinase 1 mTOR Mitogen Mamalian Target of Rapamycin mTORC1/2 Mammalian target of rapamycin complex 1/2 and stress NO Mammalia Nitric oxide NAD(P)Hactivated kinase 1 Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate n target of PDGF Facteur de croissance dérivé des plaquettes (platelet-derived growth PI3Krapamycin Phosphoinositidefactor) 3-Kinase PKCcomplex 1/2 Protéine kinase C PGC1α Peroxisome proliferator-activated receptor γ, coactivator 1 α PP2A Protéine phosphatase 2A PPARγ Proliferator Peroxisome Activated Receptor Gamma

PTT Pyruvate tolerance test PIP3 Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate Rag Ras -related GTP-binding protein

Raptor Regulatory-associated protein of mTOR REDD1 Protein transcriptional regulation of DNA damage response 1 Rheb Ras -homolog enriched in brain Rictor Rapamycin -insensitive companion of mTOR ROS Espèce réactive à l’oxygène (Reactive Oxygen Species) RSK p90 ribosomal S6 kinase

RTK Récepteur à activité tyrosine kinase S6K1 p70 ribosomal S6 kinase TSC1 Tuberous sclerosis 1 (tubérine) TSC2 Tuberous sclerosis 2 (hamartine)

Remerciements

Le Doctorat est une grande étape dans la vie et la carrière d’un scientifique. Cette longue entreprise amène bien sûr ses lots de moments difficiles, mais aussi de moments des plus gratifiants ! Pourtant, les innombrables heures passées au laboratoire ne m’ont pas découragé de continuer ma passion de chercher à comprendre la biologie humaine. Ces années ont été pour moi, des années où j’ai pu m’accomplir à plusieurs niveaux, autant au niveau scientifique que personnel. Que ce soit durant les moments les plus faciles ou les plus difficiles, j’ai eu le support de gens merveilleux qui m’ont appuyé tout au long de ce doctorat.

J’aimerais tout d’abord remercier mon directeur de thèse Dr. André Marette. Merci à toi de m’avoir soutenu, encouragé et surtout transmis ta passion pour la recherche. Je n’oublierai jamais toutes les opportunités que tu m’as données au cours de mon doctorat. Te côtoyer ces dernières années fut très enrichissant et m’a permis de pousser plus loin mes perspectives de carrières. La rigueur et la qualité scientifiques de ton laboratoire en fait un exemple à suivre. Ce fut un vrai plaisir de travailler avec toi au cours des dernières années et j’espère continuer à le faire dans le futur.

Merci à tous mes collègues, plus particulièrement à Kerstin Bellmann et Philippe St-Pierre pour m’avoir supervisé et grandement aidé tout au long de mon Doctorat. À Bruno Marcotte, Patricia Mitchell, Marie-Julie Dubois et Michael Schwab pour leurs assistances techniques et scientifiques, à Geneviève Pilon pour sa passion pour la recherche et ses niaiseries. Un énorme merci aussi aux techniciennes qui m’ont aidé avec mes nombreux procotoles d’animaux. Merci également à tous les étudiants et stagiaires postdoctoraux du laboratoire pour leur aide autant scientifiquement que socialement. Merci aussi au Dr. Mathieu Laplante pour ta collaboration et pour m’avoir appris beaucoup de chose sur mTOR. Je voudrais remercier aussi Nicolas Smadja-Lamère pour ses qualités et nos discussions scientifiques. Vous avez tous participé plus que vous pensez au succès de cette thèse. Je garderai un souvenir très heureux de vous avoir côtoyés et je me considère privilégié d’avoir appris à connaitre chacun d’entre vous.

xii

J’ai également eu la chance de faire un stage au Brésil à l’Université de Campinas et je voudrais remercier le Dr. Anibal E. Vercesi de m’avoir si bien accueilli dans son laboratoire. Cette expérience fut très enrichissante et formatrice pour ma carrière. Je n’oublierai jamais ce séjour chez vous. Merci également à Alessandro Salerno de m’avoir permis de bien m’intégrer à la culture et au milieu scientifique brésilien. Un énorme merci à Mauro Sola-Penna, Patricia Zancan et Gigi pour m’avoir fait visiter Rio de Janeiro !

J’aimerais aussi remercier les membres du jury qui ont pris le temps de réviser cette thèse soit Dr. Yves Deshaies, Dr. André Tchernof et Dre Julie St-Pierre. Merci également au Fonds de Recherche du Québec – Santé et Diabète Québec pour leur support financier à mes travaux de recherche publiés dans cette thèse.

Plus proche de moi, j’aimerais remercier ma mère Johanne, ma grand-mère Lucette, mon père Wing, mon frère Samuel, ma sœur Jennifer, Jean-Michel, Alycia et Benjamin pour m’avoir toujours soutenu malgré les absences et la distance. Je suis très chanceux de vous avoir dans ma vie. Merci aussi à mes beaux-parents, Gertrude et Marc. J’aimerais remercier également tous mes amis qui m’ont aidé, plus qu’ils ne le pensent au succès de cette thèse. Que ce soit par les activités, les partys ou encore le sport, vous avez contribué à ce que je garde un équilibre de vie durant ce doctorat.

L’écriture de cette thèse et ce doctorat a été possible grâce à la personne qui compte le plus à mes yeux soit celle qui partage ma vie depuis déjà 14 années, Anne-Marie. C’est vrai que le temps du Bal des Finissants est déjà très loin, mais si nous avons parcouru tout ce chemin ensemble c’est parce que tu es une personne exceptionnelle et forte. Ton support indéfectible dans les moments plus difficiles m’a aidé à garder le cap et surtout à poursuivre ma passion pour la recherche. J’ai la chance d’avoir une amoureuse qui est aussi une partenaire dans tout ce que j’entreprends et avec qui je partage toutes mes passions incluant la science. Ton amour, tes encouragements et ton opinion, qui ont une valeur inestimable pour moi, m’ont donné la force d’affronter tous les problèmes et je suis certain qu’ils continueront de le faire jusqu’à la fin, lorsque nous serons des petits vieux…

xiii

Avant-propos

Le présent ouvrage est déposé à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval pour l'obtention du diplôme de Philosophiae Doctor ès Sciences (Ph.D.). Cette thèse porte sur le rôle des kinases mTORC1/S6K1 et RSK dans la régulation de la signalisation de l’insuline et du métabolisme énergétique. La thèse comprend une introduction générale qui discute de la problématique actuelle de l’épidémie d’obésité et de diabète de type 2, ainsi que de l’importance de la voie mTORC1/S6K et RSK dans la régulation de la signalisation de l’insuline et la régulation du métabolisme énergétique dans différents tissus. L’introduction dresse également un portrait général des découvertes récentes sur la voie de signalisation mTORC1/S6K et RSK et de leurs implications dans le métabolisme. On y retrouve également une description détaillée des mécanismes périphériques qui gouvernent le métabolisme énergétique et celui du glucose. Les chapitres I, II et III forment le corps de l’ouvrage et exposent certaines découvertes en lien avec les sujets sur lesquels j’ai eu le plaisir de travailler à travers mes études graduées. Ces chapitres sont sous forme d'articles scientifiques rédigés en anglais. Les chapitres I et III sont déjà publiés dans des journaux scientifiques tels qu'ils ont été présentés aux éditeurs en vue de leur publication. Cependant, le chapitre II est toujours en préparation en vue d’une soumission prochaine. Ces ouvrages scientifiques sont suivis d’une discussion générale appuyée de perspectives de recherche pertinentes en lien avec la littérature la plus récente.

xiv

Articles

ǂ Articles présents sous forme de Chapitre dans cette thèse

Articles publiés

ǂSmadja-Lamère N.*, Shum M.*, Déléris P., Roux PP., Abe JI. and Marette A. Insulin activates the p90 S6 kinase RSK to trigger a new negative feedback loop to regulate insulin signalling for glucose metabolism. J Biol Chem. 2013 Oct 25;288(43):31165-76 * Co- premier auteurs

Xu E, Forest MP, Schwab M, Avramoglu RK, St-Amand E, Caron AZ, Bellmann K, Shum M, Voisin G, Paquet M, Montoudis A, Lévy E, Siminovitch KA, Neel BG, Beauchemin N, Marette A. Hepatocyte-specific Ptpn6 deletion promotes hepatic lipid accretion, but reduces NAFLD in diet-induced obesity: Potential role of PPARγ, Hepatology. 2014 May;59(5):1803-15.

ǂShum M., Bellman K, St-Pierre P and Marette A., Pharmacological inhibition of S6K1 increases glucose metabolism and Akt signalling in vitro and in diet-induced obese mice, Diabetologia, 2016 Mar;59(3):592-603

Articles en preparation

Shum M., Bosoi C., Lachance D., Le Quang K., Laplante M. and Marette A. DEPTOR overexpression prevent cardiac dysfunction induced by high-fat-diet in mice.

ǂShum M., Bellemare V., Bosoi C. and Marette A. PF-4708671 regulates cellular energy homeostasis by inhibiting both S6K1 and mitochondrial complex I activity

I-Introduction

1.1 Le syndrome métabolique

Le syndrome métabolique est par définition un regroupement de facteurs de risque qui augmentent les probabilités de maladies cardiovasculaires et de diabète de type 2 chez un individu. Ces facteurs de risque comprennent l’obésité abdominale (circonférence de la taille élevée), un taux élevé de triglycérides, un taux faible de cholestérol à lipoprotéine de haute densité (HDL), des LDL de petites tailles et denses, un profil prothrombotique et pro- inflammatoire, une hyperglycémie à jeun et une tension artérielle élevée. Les résultats de l’Enquête canadienne sur les mesures de la santé (ECMS) menée de 2012 à 2013 révèlent qu’environ 21 % des adultes de 18 à 79 ans sont atteints du syndrome métabolique. Plus précisément, le syndrome métabolique correspond majoritairement à un débalancement entre l’apport calorique (nutrition) et la dépense énergétique (sédentarité). En effet, le syndrome métabolique est associé à un apport énergétique plus important ce qui induit, bien souvent, l’obésité et qui est grandement influencé par des facteurs génétiques et environnementaux. De plus, cet excès d’apport calorique chronique est également associé à des pathologies vasculaires et inflammatoires qui contribuent à l’augmentation de la formation des plaques athéromateuses augmentant ainsi le risque de maladies cardiovasculaires.

L’un des médiateurs importants des dommages tissulaires et du dysfonctionnement des organes que l’on retrouve dans le syndrome métabolique est la lipotoxicité (1-3). Elle survient lorsque les dépôts, majoritairement les tissus adipeux, ne peuvent plus stocker de façon adéquate l’excès de lipides ingérés ce qui crée un débordement des lipides vers les tissus non adipeux tels que le foie, les muscles squelettiques, le pancréas et le cœur. Ainsi, l’accumulation de gras ectopique dans les organes maigres (foie, muscles, pancréas et cœur) entraine une dysfonction de ces organes. Parmi les effets engendrés par la lipotoxicité, on y retrouve une hyperlipidémie, l’accumulation de métabolites lipidiques toxiques, une résistance à l’insuline, une diminution de la sécrétion d’insuline, une mauvaise utilisation des substrats énergétiques et l’inflammation qui contribuent à la dysfonction des organes et au développement du syndrome métabolique (Figure 1).

Figure 1 : Interaction entre le tissu adipeux et les macrophages dans le développement de la lipotoxicité. L’interaction entre les adipocytes et les macrophages entraine une dysfonction métabolique favorisant la lipotoxicité. Les facteurs génétiques et environnementaux (ex. : surplus énergétique chronique) influencent la biologie des adipocytes menant à l’hypertrophie et l’hypoxie des adipocytes ainsi qu’une réponse du stress du réticulum endoplasmique (ER stress). Ces effets induisent l’activation de voies inflammatoires (JNK et NF- κB) et éventuellement la nécrose des adipocytes qui stimulent la relâche d’adipokines et d’hormones qui recrutent les macrophages. Les macrophages activés dans le tissu adipeux sécrètent plusieurs cytokines qui induisent une résistance à l’insuline, une diminution du captage de lipides et une augmentation de la lipolyse. Ainsi le tissu adipeux résistant à l’insuline crée un débordement des lipides vers les tissus maigres tels que le foie, le muscle squelettique, le pancréas, le cœur et les celles endothéliales. L’accumulation de lipides dans ces tissus induit une altération de leurs fonctions et augmente le risque d’évènements cardiovasculaires. CHF (Congestive heart failure), CRP (C-reactive protein), HGP (hepatic glucose production), IL-6 (interleukin-6), JNK (c-Jun N-terminal kinase), NAFLD (nonalcoholic fatty liver disease), NASH (nonalcoholic steatohepatitis), NF-κΒ (nuclear factor-κΒ), T2DM (type 2 diabetes mellitus), TNF-α (tumour necrosis factor-α). (Adapté de (4))

1.1.1 L’obésité

L’obésité est fondée sur l'indice de masse corporelle (IMC), qui est une mesure qui tient compte à la fois du poids et de la taille (IMC = poids (kg) / taille (m2)) et qui est facilement utilisée en clinique. C’est avec l’IMC que les gens sont classés en surpoids ou obèses et dont les valeurs de ces catégories ont été déterminées selon le risque cardiovasculaire

2 associé à l’IMC (5). En 2014, Statistique Canada a publié des données canadiennes sur l’obésité reposant sur l'IMC provenant du poids et de la taille autodéclarés. Lorsque l’on combine les personnes obèses et les personnes faisant de l’embonpoint, 61,8 % des hommes (8,2 millions) et 46,2 % des femmes (6,1 millions) présentaient un excédent de poids. En 2014, environ un jeune sur quatre de 12 à 17 ans faisait de l’embonpoint ou était obèse. De plus, selon l’Organisation Mondiale de la Santé, 39% de la population mondiale était en surpoids en 2014. Selon les estimations, 51% de la population mondiale sera obèse d’ici 2030 ce qui en fait un problème de santé et socioéconomique d’envergure internationale (6).

L'obésité est une composante importante du syndrome métabolique et c’est un facteur de risque pour de nombreuses maladies chroniques, en particulier les maladies cardiovasculaires et le diabète de type 2. Plusieurs facteurs peuvent augmenter la prévalence de l'obésité tels que la sédentarité, les mauvaises habitudes alimentaires, le tabagisme, le statut social et l’embonpoint. L’obésité est caractérisée, entres autres, par une capacité d’extension du tissu adipeux blanc qui consiste en une hyperplasie et une hypertrophie des adipocytes (3). Le tissu adipeux blanc est non seulement le principal tissu d’entreposage des lipides, mais c’est également un tissu qui régule l’homéostasie énergétique. Lorsque ce tissu commence à atteindre sa capacité maximale d’entreposage, une inflammation et une résistance à l’insuline s’installent contribuant aux débordements des lipides vers des tissus maigres (Figure 1) (3, 7). Par ailleurs, le tissu adipeux blanc comprend plusieurs dépôts dans différentes régions du corps humain. Parmi les plus importants, il y a le tissu adipeux sous-cutané et intra-abdominal (viscéral). Il est bien connu depuis quelques années que les risques cardiovasulaires associés à l’obésité sont plutôt reliés à la distribution de la masse adipeuse que le poids total de la masse adipeuse. Plusieurs études ont montré aussi que c’était plutôt le tissu adipeux viscéral qui était associé à une augmentation du risque cardiovasculaire que le tissu adipeux sous-cutané.

1.1.2 Le diabète de type 2

L’évolution du diabète de type 2 est caractérisée par une progression lente sur plusieurs décennies menant à une intolérance au glucose suivi d’une hyperglycémie postprandiale, puis à un stade plus avancé, d’une hyperglycémie à jeun. Elle est, entre autres, caractérisée

3 par une diminution de la capacité du pancréas à sécréter de l’insuline en réponse au glucose (GSIS) ainsi qu’une résistance à l’insuline dans plusieurs tissus tels que le muscle squelettique, le foie et les tissus adipeux. La résistance à l’insuline se décrit comme une diminution de l’action de l’insuline dans les tissus périphériques et est une étape prédiabétique (voir section 1.2.5). Ainsi, le pancréas peut augmenter la sécrétion d’insuline pour compenser la perte de son efficacité et maintenir une glycémie normale. Ces effets sont donc associés à une hyperglycémie causée par une incapacité des niveaux d’insuline à augmenter suffisamment le transport du glucose dans les tissus périphériques et à diminuer la production hépatique de glucose. L’hyperglycémie est responsable de plusieurs effets néfastes du diabète dont des complications microvasculaires telles la rétinopathie, la néphropathie, la neuropathie diabétique et pouvant mener jusqu’à l’amputation des membres inférieurs (8). Elle est également associée à des complications macrovasculaires tels l’athérosclérose, les maladies coronariennes et les accidents cérébrovasculaires (8). La recherche des dernières décennies nous suggère que la cause exacte du diabète de type 2 est multifactorielle et très complexe. Selon la Fédération Internationale du Diabète (IDF), 415 millions de personnes étaient atteintes du diabète en 2015 et jusqu’à 642 millions d’ici 2040 pourraient en souffrir.

1.2 L’insuline et le métabolisme

1.2.1 L’insuline

L’une des composantes importantes du diabète de type 2 est l’hormone insuline. L’insuline est une hormone qui fut découverte au départ par la recherche d’une substance liant le pancréas au diabète mellitus « sucré ». L’extraction et la purification de cette hormone furent possibles grâce à la collaboration des chercheurs canadiens Frédéric Banting, Charles Best, J.J.R. MacLeod et James Collip en 1920-1922 (9). Fédéric Banting et J.J.R. MacLeod reçurent même un prix Nobel de physiologie ou médecine en 1923 pour leurs travaux sur la découverte de l’insuline. Par la suite, la majorité des travaux scientifiques portant sur l’insuline ont concerné la formulation et différents modificateurs de l’action de l’insuline. L’insuline est surtout connue pour sa capacité à diminuer la glycémie sanguine. En 1950, Levine et collègues ont montré que l’effet de l’insuline sur l’utilisation du glucose était causé par une augmentation de la perméabilité membranaire au glucose (10). 20 ans plus

4 tard, en 1971, c’est au tour du groupe de Roth de faire une importante avancée en découvrant le récepteur à l’insuline (11). Ces découvertes importantes menèrent donc à l’étude d’un nouveau domaine de recherche c’est-à-dire les effets moléculaires de l’insuline. Depuis, l’insuline a été démontrée comme jouant un rôle métabolique important dans la glycolyse, la synthèse du glycogène, la lipogenèse et la gluconéogenèse hépatique.

La concentration de glucose plasmatique est maintenue à l’équilibre en fonction de la quantité qui entre dans la circulation (taux d’apparition) et la quantité qui est éliminée ou utilisée par les tissus (taux de disparition). Il y a trois sources majeures de glucose soit l’absorption intestinale provenant des repas, la glycogénolyse ou la gluconéogenèse. La glycogénolyse consiste en la production de glucose causée par le clivage des molécules de glycogène alors que la gluconéogenèse est la réaction inverse de la glycolyse qui consiste à produire du glucose à partir principalement de pyruvate, lactate et de certains acides aminés. La glycogénolyse et la gluconéogenèse sont en partie dépendantes du glucagon, une hormone produite par les cellules α du pancréas. Durant les premières heures de jeûne, la glycogénolyse est la première source de glucose disponible puis la gluconéogenèse hépatique participe au maintien de la glycémie lors de jeûne plus prolongé. Le glucagon favorise ces processus afin de rendre disponible le glucose aux autres tissus lors du jeûne (12). À l’inverse, l’insuline favorise le captage de glucose dans les tissus périphériques et active la glycolyse afin d’augmenter la synthèse de glycogène et l’oxydation du glucose pour produire de l’énergie (12). De plus, l’insuline inhibe également la gluconéogenèse hépatique (12). L’insuline est donc une hormone importante pour la régulation physiologique du métabolisme du glucose.

1.2.2 Les effets de l’insuline dans le muscle squelettique

Le muscle squelettique est le principal tissu captant du glucose induit par l’insuline. Des sujets sains soumis à un clamp euglycémique-hyperinsuliémique ont montré qu’environ 80% du captage du glucose stimulé par l’insuline était situé au niveau des muscles squelettiques (13, 14). En comparaison, seulement 10% du glucose est capté par le tissu adipeux après un repas (14). L’insuline stimule le transport du glucose dans le muscle squelettique via le transporteur du glucose 4 (GLUT4, voir section 1.3.2). Le muscle utilise le

5 glucose capté comme source d’énergie (via la glycolyse) ou l’emmagasine sous forme de glycogène. Indépendamment de l’insuline, le transport de glucose dans le muscle squelettique peut également être stimulé par la contraction musculaire et l’exercice (15-18).

1.2.3 Les effets de l’insuline dans le foie

Le foie est un autre organe régulé par l’insuline. En effet, l’insuline stimulée par la prise alimentaire inhibe la production hépatique de glucose et la glycogénolyse (19). En effet, l’insuline diminue la gluconéogenèse hépatique en diminuant l’expression de deux enzymes clés soit la G6Pase (glucose-6-phosphatase) et PEPCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase) (20). À l’opposé, lors d’un jeûne, l’insuline plasmatique diminue alors que le glucagon augmente favorisant ainsi la production de glucose hépatique. L’insuline joue également un rôle important sur le métabolisme lipidique hépatique en stimulant la lipogenèse et l’estérification des acides gras pour être stockée sous forme de triglycérides.

En plus d’être un organe important pour l’homéostasie énergétique, le foie est le site principal de la clairance de l’insuline. En effet, 80 % de l’insuline est éliminé par le foie et le reste est éliminé en partie par les reins et les muscles squelettiques (21). Par ailleurs, une diminution de la clairance de l’insuline hépatique est observée chez les patients intolérants au glucose, les obèses et ceux présentant une stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) ce qui contribue à une augmentation des niveaux plasmatiques d’insuline (22).

1.2.4 Les effets de l’insuline dans le tissu adipeux

Bien que la principale fonction du tissu adipeux soit de stocker des lipides sous forme de triglycérides, plusieurs découvertes récentes ont montré que le tissu adipeux sécrète plusieurs hormones, cytokines et adipokines qui influencent l’homéostasie énergétique et la résistance à l’insuline (23). Tout comme dans le muscle squelettique, l’insuline stimule le captage de glucose dans les tissus adipeux via GLUT4. La glycolyse induite par l’insuline augmente la formation de glycérol-3-phosphate qui est estérifié avec des acides gras libres pour former des triglycérides. L’insuline augmente également le captage des acides gras au niveau du tissu adipeux en augmentant l’activité de la lipoprotéine lipase (LPL) qui hydrolyse les triglycérides provenant des very low density lipoprotein (VLDL) et des chylomicrons. À l’inverse, l’insuline inhibe également la lipolyse (l’hydrolyse des

6 triglycérides) dans le tissu adipeux en inhibant la lipase hormono-sensible (HSL) favorisant ainsi la lipogenèse.

1.2.5 La résistance à l’insuline

Comme mentionné plus haut, l’insuline est une hormone très importante dans la régulation de l’homéostasie énergétique. Cependant, différentes perturbations métaboliques chroniques peuvent entrainer une diminution de son action comme une surexposition à des quantités élevées de nutriments, l’accumulation de lipides ectopiques et l’inflammation. La résistance à l’insuline apparait lorsque les principaux tissus cibles de l’insuline ne réussissent pas à répondre à un niveau normal d’insuline. Ainsi, pour une même concentration d’insuline les effets induits par l’insuline comme le captage de glucose sont moindres chez un individu résistant à l’insuline. Afin de contrer l’augmentation de la glycémie, la concentration élevée de glucose stimule la sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas ce qui entraine une hyperinsulinémie. Dans des situations d’hyperglycémie chronique, les cellules β vont compenser ces élévations de glucose sanguin par une sécrétion plus importante d’insuline jusqu’à épuisement des stocks d’insuline de ces cellules, ce qui entrainera une diminution de la masse et éventuellement l’apoptose des ilots de Langerhans (ilots composés de cellules β). Dès lors, le pancréas ne pourra plus sécréter suffisamment d’insuline pour contrôler la glycémie ce qui contribuera de manière plus importante à l’hyperglycémie et à la glucotoxicité (24, 25).

La résistance à l’insuline est associée avec une augmentation de la production hépatique de glucose et une diminution du captage de glucose musculaire. Elle contribue également à diminuer le captage d’acide gras et à augmenter la lipolyse du tissu adipeux favorisant ainsi la lipotoxicité et le dépôt de lipides ectopiques notamment au niveau du foie, mais aussi dans les muscles squelettiques et cardiaques (2, 4) (Figure 1). Par ailleurs, la résistance à l’insuline est impliquée dans une variété de pathologies incluant l’obésité, l’hypertension, l’infection chronique, les maladies cardiovasculaires et elle est une étape précoce dans le développement du diabète de type 2 (2, 26).

1.3 La signalisation de l’insuline

L’action de l’insuline passe par un récepteur de type tyrosine (Tyr) kinase qui peut aussi être activé par l’IGF-1 (Insulin growth factor). L’activation du récepteur à l’insuline joue

7 un rôle important dans la prolifération, la survie cellulaire, la synthèse de protéines, le transport du glucose, la lipogenèse, la gluconéogenèse et la synthèse de glycogène (figure 2). Mécanistiquement, la liaison de l’insuline à son récepteur entraine une autophosphorylation de la partie intracellulaire du récepteur qui à son tour va phosphoryler les substrats intracellulaires de l’insuline IRS (insulin receptor substrate) dont IRS1-6, qui vont servir de site d’arrimage pour d’autres protéines possédant des domaines SH2 (Src- homology 2) et qui vont activer à leur tour différentes voies de signalisation. Parmi celles- ci, la voie de la PI3K (phosphoinositol 3-kinase)/Akt et la voie des MAPK (mitogen- activated protein kinases) ont été le plus étudié.

Figure 2 : La voie de signalisation activée par l’insuline et IGF-1 (insulin growth factor). L’activation des récepteurs à l’insuline et d’IGF-1 par leurs ligands amorce une cascade de phosphorylation. Suite à la liaison des ligands à leurs récepteurs, un changement de conformation des récepteurs ainsi qu’une autophosphorylation est induite et mène au recrutement des substrats des récepteurs tels que les protéines IRS et Shc. Shc active la voie RAS-MAPK alors que les protéines IRS activent la voie PI3K-Akt par le recrutement et l’activation des protéines PI3K. L’activation de la PI3K génère le second messager PIP3 qui, attaché à la membrane plasmique, permet le recrutement et l’activation de PDK1 qui active à son tour Akt et les PKC atypiques. Akt participe à la plupart des effets métaboliques de l’insuline régulant le transport de glucose, la synthèse de lipides, la synthèse de protéines, la gluconéogenèse et la synthèse de glycogène. Akt

8 joue aussi un rôle important dans le cycle cellulaire et la survie cellulaire. La voie Shc-Grb2-Sos-Ras-Raf- MAPK contrôle la prolifération cellulaire et la transcription de plusieurs gènes. (Adapté de (27))

Les protéines PI3K sont activées suite à leur liaison aux protéines IRS qui elles-mêmes sont liées aux récepteurs de l’insuline actifs via leur domaine SH2 (Figure 2). Une fois activés, les PI3K phosphorylent la PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate) afin de générer un second messager la PIP3 (phosphatidylinositol 4,5-triphosphate). Par la suite, PIP3 permet le recrutement de Akt à la membrane plasmique via son domaine PH (pleckstrin homology) où elle est activée par une série de phosphorylations dont les plus étudiées sont les Thr308 et Ser473. La phosphorylation du site Thr308 est initiée par la PDK1 (3-phosphoinositide- dependent protein kinase 1) (28) alors que la Ser 473 est principalement phosphorylée par le complexe de protéines mTORC2 (mechanistic target of rapamycin complex 2, décrit à la section 1.4.2 (29). La phosphorylation du site Thr308 augmente l’activité d’Akt d’environ 30 fois, mais elle nécessite la phosphorylation de la Ser473 pour être complètement active (30).

Akt phosphoryle plusieurs substrats dont TSC2 (tuberous sclerosis complex 2), PRAS40 (proline-rich Akt substrate of 40 KDa), GSK3β (glycogen synthase kinase 3β) et FoxO (forkhead box class O) (Figure 2). En régulant le complexe de protéines TSC et PRAS40, Akt active mTORC1 (mechanistic target of rapamycin complex 1). Premièrement, le complexe TSC est un complexe qui régule négativement la petite GTPase RHEB (Ras homolog enriched in brain) nécessaire à l’activation de mTORC1. Ce complexe est composé de TSC1, TSC2 et TBC1D7. Afin de réguler le complexe TSC, Akt phosphoryle directement 5 résidus de TSC2 (S939, S981, S1130, S1132 et T1462) (31-33). Une fois phosphorylée par AKT, TSC2 est inhibé ce qui l’empêche d’inactiver RHEB permettant ainsi à RHEB d’activer mTORC1 (Figure 3). Plusieurs rôles régulés par la voie PI3K/Akt telles la croissance, la prolifération et la survie cellulaire, sont également régulés en partie par l’activation de la voie mTORC1. En effet, mTORC1 est connu pour jouer un rôle majeur dans la synthèse protéique en activant deux de ses substrats 4E-BP1 (eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E)-binding proteins) et S6K (p70 ribosomal S6 kinase) (voir section 1.5). 4E-BP1 facilite le recrutement de la petite sous-unité ribosomale (40S) à l’extrémité 5’ de l’ARN (34, 35) alors que S6K1 augmente la biogenèse des ribosomes et

9 active la traduction protéique (36). Deuxièmement, Akt peut également activer mTORC1 en inhibant l’interaction entre Raptor et PRAS40 (proline-rich Akt substrate of 40 KDa), un inhibiteur endogène de mTOR (37). PRAS40 interagit avec Raptor, une sous-unité du complexe mTORC1, inhibant ainsi son interaction avec ses substrats.

La GSK3β est connue pour inhiber la glycogène synthase. Or Akt inhibe GSK3β favorisant donc la synthèse de glycogène (38). GSK3β est également important dans la croissance cellulaire en inhibant la voie Wnt/β-caténine ce qui stimule la dégradation de la β-caténine (39). La β-caténine semble jouer un rôle important dans l’hypertrophie des muscles squelettiques agissant comme un facteur de transcription (40). Cette kinase a aussi été montrée pour inhiber la traduction de l’ARNm en bloquant l’activité de eukaryotic initiation factor 2B (eIF2B) suggérant que GSK3β pourrait réguler la synthèse protéique.

De plus, Akt phosphoryle négativement FOXO, l’empêchant de transloquer au noyau et agir comme facteur ou cofacteur de transcription (41). FOXO est connu pour augmenter la transcription de gènes impliqués dans la gluconéogenèse hépatique (voir section 1.3.3) (42- 44). Ainsi, l’insuline et l’activation subséquente de la voie PI3K/Akt inhibe FOXO permettant la réduction de l’expression des gènes de la gluconéogenèse hépatique (43). Par ailleurs, Akt stimule aussi la lipogenèse de novo par plusieurs mécanismes, dont l’activation de la voie mTORC1, mais aussi directement par l’inhibition de INSIG2 (Insulin induced gene 2), un suppresseur de l’activité du SREBP1c (sterol regulatory element- binding-protein 1c) qui régule positivement la lipogenèse (45).

Alternativement à la voie PI3K/Akt, l’insuline stimule aussi la voie des MAPK qui est activée par l’interaction entre la molécule adaptatrice Grb2, SOS (son-of-sevenless) et les protéines IRS. En effet, Grb2 et SOS vont permettre le recrutement de shc (Src-homology- 2-containing protein) et de Gab1 (Grb2-associated binder-1) qui vont activer la petite GTPase Ras qui à son tour pourra activer la cascade d’activation de MEK/ERK. La voie MEK/ERK est connue pour son rôle important dans la prolifération et la croissance cellulaire (Figure 2)(27).

1.3.1 Les boucles de rétrocontrôle négatif

La voie PI3K et MAPK sont régulées par l’insuline, mais également par les protéines de la cascade de signalisation qui vont assurer un rétrocontrôle intracellulaire notamment en inhibant les protéines IRS tout en amont de la cascade de signalisation (Figure 3). Une phosphorylation en sérine/thréonine (Ser/Thr) du récepteur à l’insuline et des IRS est associée à une diminution de l’activité de ces protéines alors qu’une phosphorylation en tyrosine des IRS et du récepteur à l’insuline est associée à une activation de ces protéines (46-49). Plusieurs des protéines assurant un rétrocontrôle négatif sur la signalisation de l’insuline sont des protéines en aval de PI3K telles que la aPKC (protéine kinase C atypique), ERK1/2, mTOR et S6K1 (50). En effet, mTORC1 et S6K1 peuvent phosphoryler certains résidus sérine/thréonine d’IRS inhibant l’activation des protéines IRS et par conséquent l’activité d’Akt. mTORC1 phosphoryle IRS1 sur les Ser636, Ser312, Ser616 (51-53) et S6K1 phosphoryle IRS1 sur les Ser307, Ser527, Ser270, Ser1101 (53- 55). De plus, mTORC1 peut aussi diminuer l’interaction entre les protéines IRS et le récepteur à l’insuline via GRB10 (growth factor receptor binding protein 10) (56). Additionellement, S6K1 a été montré pour également phosphoryler Sin1, une composante essentielle de mTORC2, sur la Thr86 et la Thr398 ce qui induit la dissociation du complexe mTORC2 et donc son inactivation (57). S6K1 peut aussi phosphoryler rictor sur la Thr1135 (58), mais ce site ne semble pas affecter l’activité kinase de mTORC2 (59, 60). Ainsi mTORC1, S6K1, ERK1/2 et aPKC vont diminuer l’activité du récepteur à l’insuline par sa phosphorylation en Ser/Thr, stimulant ainsi son internalisation et sa dégradation (61-64).

Figure 3 : Boucle de rétro-inhibition induite par mTORC1/S6K1 et ERK sur la voie PI3K/Akt. Suite à l’activation du récepteur à l’insuline, la voie PI3K-Akt est activée et stimule l’activation des protéines mTORC1, S6K1 et les PKC atypiques. L’activation du récepteur à l’insuline stimule également la voie des MAPK dont ERK et RSK font partie. À la fois, mTOR, S6K1, ERK et les PKC atypiques régulent la signalisation de l’insuline en médiant une boucle de rétrocontrôle négatif en phosphorylant les résidus Ser d’IRS-1. De plus, S6K1 est également connu pour réguler négativement l’activité de mTORC2 en phosphorylant Rictor et Sin1. (Adapté de (58))

Par ailleurs, plusieurs de ces voies sont aussi activées par des facteurs qui induisent ou favorisent la résistance à l’insuline comme; la tumour necrosis factor-α (TNF-α) (65), les acides gras non estérifiés (NEFA) (66, 67), les acides aminés (68-70), le stress oxydatif cellulaire (71, 72) et l’angiotensine II (73, 74). Plusieurs études ont également montré chez des modèles animaux ou humains résistants à l’insuline qu’une signalisation de l’insuline défectueuse était le plus souvent due à des perturbations posttraductionnelles induites, entres autres, par mTORC1 et S6K1 (55, 69).

1.3.2 Le rôle d’Akt dans le transport du glucose

La famille d’Akt est composée de trois isoformes d’Akt (1,2,3) ayant chacun leur propre gène d’expression (75). Malgré leur forte homologie et des rôles similaires, les modèles génétiques de délétions de chacune des isoformes ou des délétions de deux isoformes d’Akt ont révélé que Akt1 jouait un rôle important dans la survie cellulaire, alors qu’Akt2 est important pour le métabolisme du glucose puisque les souris Akt2 KO sont diabétiques et qu’Akt3 est important pour le développement du cerveau (76). Ainsi, la voie PI3K/Akt est importante non seulement pour la croissance et la prolifération cellulaire, mais également pour le contrôle du métabolisme énergétique. Parmi les rôles d’Akt dans le contrôle du métabolisme énergétique, l’induction de l’entrée de glucose cellulaire est l’un des rôles d’Akt les plus étudiés. L’insuline active Akt et permet ainsi la translocation du GLUT4 (Glucose Transporter 4) à partir des vésicules intracellulaires vers la membrane plasmique dans les adipocytes et les cellules musculaires (77-79). Au niveau du foie, c’est plutôt GLUT2 qui assure l’entrée et l’export de glucose (80). Pour ce faire, Akt régule la protéine AS160 (Akt substrate of 160 kDa), aussi connue sous le nom TBC1D4 (Figure 4) (81). La AS160 maintient la Rab-GTPase inactive ce qui retient les vésicules intracellulaires contenant les GLUTs dans le cytosol. Une fois que l’insuline stimule l’activation d’Akt, Akt inactive AS160 ce qui augmente l’activité de la Rab-GTPase permettant ainsi aux vésicules de fusionner avec la membrane plasmique et augmenter le nombre de transporteurs de glucose à la membrane cellulaire (Figure 4) (81, 82).

De plus, l’exercice peut également stimuler le captage de glucose indépendamment d’Akt via l’activation de l’AMPK (81). L’AMPK détecte le statut énergétique par le ratio cellulaire de AMP/ATP et elle peut également être activée par l’augmentation des niveaux de Ca2+ suite à la contraction musculaire. Selon les besoins, l’entrée de glucose sert à produire de l’énergie (ATP) via la glycolyse et la phosphorylation oxydative mitochondriale qui est nécessaire à la croissance, la survie et les différentes fonctions tissulaires.

Figure 4 : Activation du transport de glucose par l’insuline et la contraction dans le muscle. L’insuline stimule Akt en activant à la fois PDK1 et mTORC2. Une fois Akt actif, il phosphoryle à son tour les protéines AS160 et TBC1D1 ce qui augmente la liaison de la protéine 14-3-3 à AS160/TBC1D1. Cette liaison inactive AS160/TBCBD1 et induit une inhibition de protéines Rab-GTPase ce qui favorise l’activation de Rab-GTP. La forme Rab-GTP stimule ensuite les vésicules contenant les transporteurs de glucose GLUT4 à fusionner avec la membrane plasmique augmentant ainsi la quantité de transporteurs à la membrane et le transport de glucose à l’intérieur de la cellule. L’épuisement des stocks d’énergie reflété par un ratio élevé d’AMP/ATP et l’élévation des concentrations intracellulaires de Ca2+ induits par la contraction musculaire mènent à l’activation de l’AMPK. L’AMPK est activée directement par un ratio élevé d’AMP/ATP ainsi que par la phosphorylation de la Thr172 d’AMPK par la LKB1 et la CaMKK (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase). Une fois l’AMPK activée, elle phosphoryle AS160 et TBC1D1 sur plusieurs sites et favorise également la translocation des transporteurs de glucose GLUT4 vers la membrane plasmique afin d’augmenter le transport de glucose. (Adapté de (81))

Alternativement, l’excès de glucose présent dans la circulation stimule son stockage hépatique sous forme de glycogène ou encore sous forme de triglycérides. En effet, le glucose peut être stocké sous forme de glycogène puise qu’Akt phosphoryle négativement la glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) augmentant ainsi la synthèse de glycogène au niveau du muscle et du foie (83). De plus, le glucose peut également être stocké sous forme de triglycérides au niveau du tissu adipeux ou du foie en étant converti en glycérol via la glycérol-3-phosphate déshydrogénase (84).

1.3.3 Le rôle d’Akt dans la production hépatique de glucose

Le foie participe de façon très importante au maintien de l’homéostasie énergétique en régulant, entre autres, la glycémie. La production de glucose provenant du foie consiste en l’activation de la gluconéogenèse, l’inverse de la glycolyse, à partir du pyruvate, du lactate, du glycérol et des acides aminés. La production hépatique de glucose est dépendante des niveaux circulants de nutriments et d’hormones. En effet, le jeûne induit une diminution des niveaux d’insuline et une augmentation du glucagon causant une augmentation de la production hépatique de glucose. Cette augmentation maintient les besoins énergétiques des différents organes. À l’inverse, après un repas, les niveaux circulant d’insuline augmentent en réponse aux nutriments, diminuant ainsi la production hépatique de glucose. De plus, certaines hormones de stress, tel que le cortisol, peuvent augmenter la gluconéogenèse via l’activation du GR (glucocorticoid receptor).

La production hépatique de glucose est activée notamment en contrôlant des enzymes clés de la gluconéogenèse telle que le G6Pase (glucose 6 phosphatase) et PEPCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase) (Figure 5). Plusieurs facteurs de transcription régulent l’expression de ces enzymes dont CREB (cAMP response element binding protein), FoxOs (forkhead box class Os), HNF4α (hepatocyte nuclear factor 4 alpha), C/EBPα (CCAAT/enhancer-binding protein alpha) et qui sont régulés eux-mêmes par plusieurs cofacteurs comme CBP (CREB binding protein)/p300, CRTC2 (CREB regulated transcription co-activator 2), PGC-1α (peroxysome proliferator-activated receptor gamma co-activator 1 alpha) (Figure 5) (85).

L’insuline joue un rôle important dans l’inhibition de la gluconéogenèse hépatique en activant la voie PI3K/Akt. En effet, Akt phosphoryle négativement FOXO sur les sites Thr24, Ser256 et Ser319 (41). Ces phosphorylations empêchent FOXO de transloquer au noyau pour induire la transcription de certains gènes, dont PEPCK et G6Pase. Ainsi, l’activation de la voie PI3K/Akt au niveau du foie inhibe la gluconéogenèse hépatique, favorise la glycolyse et favorise également la synthèse de glycogène.

Figure 5 : Régulation de la transcription des gènes de la gluconéogenèse hépatique lors du jeûne et en phase postprandiale. (A) Lors d’un jeûne, la sécrétion pancréatique de glucagon augmente activant la PKA (protéine kinase A) qui phosphoryle CREB. De plus, PKA entraine également la déphosphorylation de CRTC2 en inhibant SIK (salt- induced kinase) et en activant les phosphatases PP2B et SMEK/PP4C. Une fois CREB et CRTC2 activés, ils transloquent au noyau et forment un complexe avec un co-activateur CBP/p300 afin d’activer la transcription de PGC-1α. Ensemble, CREB, CRTC2, PGC-α et FoxO1 régulent l’expression des enzymes de la gluconéogenèse PEPCK et G6Pase. (B) La prise alimentaire réduit la sécrétion de glucagon et augmente la sécrétion de l’insuline par le pancréas ce qui active la signalisation de l’insuline dans le foie. L’activation d’Akt par l’insuline induit l’activation de SIK ce qui stimule la phosphorylation de CRTC2 et induit la phosphorylation de FoxO1, empêchant leurs translocations au noyau. Puis, l’insuline augmente aussi l’activité des répresseurs de la transcription des gènes gluconéogéniques tels que SHP, DAX-1 et TCF7L2. (Adapté de (43))

1.4 mTOR

La protéine mTOR (mechanistic target of rapamycin) est une sérine (Ser)/thréonine (Thr) kinase qui est inhibée par la rapamycine (86). mTOR se retrouve dans deux complexes soit mTORC1 et mTORC2 qui ont chacun différentes sous-unités et différents substrats. mTORC1 est défini par l’interaction entre la kinase mTOR, la protéine d’échafaudage Raptor ainsi que PRAS40 (proline-rich Akt substrate 40kDa). À la fois mTORC1 et mTORC2 contiennent mLST8/GbL (mammalian lethal with Sec13 protein 8), Tti1/Tel2 (TELO2-interacting protein 1 homolog/telomere length regulation protein TEL2 homolog) qui sont nécessaires à l’assemblage du complexe et à sa stabilité ainsi que la protéine régulatrice DEPTOR. Finalement, mTORC2 est défini par les protéines Rictor, mSin1 et Protor-1/2 (Figure 6). Par ailleurs, les complexes mTOR agissent comme des éléments centraux où plusieurs signaux de facteurs de croissance, de nutriments et de stress convergent afin de réguler la croissance cellulaire et le métabolisme. L’activation de ces voies active des processus anaboliques et inhibe ceux qui sont cataboliques.

Figure 6 : Les complexes mTORC1 et mTORC2 La kinase mTOR est la composante catalytique centrale de mTORC1 et mTORC2. Les deux complexes ont à la fois des partenaires similaires et distincts, mais ils présentent des fonctions différentes (voir le tableau de la figure). (Adapté de (87))

1.4.1 mTORC1

Il y a plusieurs facteurs activant la voie mTORC1 soit les facteurs de croissance, les acides aminés, les lipides, le glucose, le statut énergétique et l’oxygène. L’activation de mTORC1 par l’insuline ou IGF-1 emprunte la voie canonique PI3K/Akt/TSC décrite à la section 1.3. L’activation d’Akt par l’insuline enlève l’inhibition du complexe TSC sur RHEB permettant ainsi à RHEB d’activer mTORC1 au niveau des lysosomes (Figure 7). L’activation de Rheb est contrôlée par les protéines GTPase (GAP) qui stimulent l’hydrolyse de la guanine triphosphate (GTP) en guanine diphosphate (GDP) alors que les guanine nucleotide exchange factors (GEFs) induit, à l’inverse, la dissociation de GDP pour le remplacer par le GTP (88). Le seul régulateur de l’activation directe de Rheb connu est le complexe TSC de par son activité GAP. En fait, le complexe TSC inhibe Rheb en favorisant sa conformation inactive, c’est-à-dire Rheb-GDP, ce qui l’empêche d’être reconverti en Rheb-GTP et ainsi activer mTORC1 (89, 90, 91, 92). Ainsi Rheb change constamment de conformation entre Rheb-GTP (actif) et Rheb-GDP (inactif) en fonction des différents stimuli. Afin d’activer mTORC1, Rheb-GTP interagit directement avec des membres du complexe mTORC1 soit mTOR, mLST8 et Raptor (93-95). De plus, de par sa spécificité, Rheb est nécessaire à l’activation de mTORC1 par la voie PI3K/Akt stimulée par l’insuline (Figure 7).

Figure 7 : Régulation de l’activation de la voie mTORC1. La voie mTORC1 est activée par les facteurs de croissance et l’insuline (voir section 1.3 pour plus de détails). À la fois, les voies de signalisation ERK et PI3K/Akt régulent l’activation de mTORC1 en régulant le complexe TSC à la surface des lysosomes (voir la section 1.4.1.1 pour plus de détails). (Adapté de (87))

1.4.1.1 Tuberous sclerosis complex (TSC), un centre d’intégration régulant l’activité de mTORC1

Le complexe TSC agit comme un noyau pour intégrer plusieurs signaux tels que les niveaux d’énergie via la protéine AMPK (5' AMP-activated protein kinase), les facteurs de croissance, l’inflammation, les dommages à l’ADN et l’oxygène (Figure 8). En effet, le complexe TSC1/2 est inhibé par les facteurs de croissance qui activent ERK, RSK et Akt. De plus, l’inflammation active la voie mTORC1 en inhibant également TSC1/2 par l’activation de I kappa β kinase (IKKβ). La voie canonique Wnt peut aussi inhiber TSC1/2

19 afin d’activer mTORC1 en enlevant l’inhibition que GSK3β exerce sur TSC1/2, alors que l’hypoxie par l’activation de REDD1 et le déficit d’énergie via l’activation de l’AMPK activent TSC1/2 afin d’inhiber mTORC1 (96). Récemment, deux autres voies non classiques d’activation de mTORC1 ont aussi été montrées, soit les voies Hippo et Notch, qui sont toutes deux impliquées dans la prolifération et la croissance cellulaires. En effet, la voie Hippo et son effecteur, en aval de cette voie YAP (Yes-associated protein), régule l’activation de mTORC1 et mTORC2 en augmentant l’expression du microARN miR-29 diminuant l’expression de la PTEN (Phosphatase and tensin homolog) (97, 98). Ainsi la voie Hippo empêche PTEN de convertir PIP3 en PIP2 ce qui augmente l’activation de la voie PI3K/Akt et mTORC1/2. L’autre voie non classique activant mTORC1 est la voie Notch où des ligands Delta et Jagged exprimés à la surface d’autres cellules lient les récepteurs Notch provoquant la libération d’un NICD (Notch intracellular domain) qui transloque ensuite au noyau pour agir sur la transcription de gènes (99). Des travaux ont montrés que la voie Notch augmente l’expression protéique de raptor et participe au développement de la stéatose hépatique (100, 101). Cependant, d’autres études seront nécessaires afin de bien évaluer l’impact de ces nouvelles voies de signalisation sur l’activation de mTORC1, notamment dans les pathologies ou mTORC1 est suractivé.

Figure 8 : Les signaux en amont de mTORC1. À la fois mTORC1 et mTORC2 sont contrôlés par des facteurs de croissance (a) et la voie Hippo (h) alors que mTORC1 est aussi régulé par l’inflammation (b), la voie de signalisation Wnt (c), l’hypoxie (d), les dommages à l’ADN (f) et le statut énergétique via la régulation de TSC1/2. mTORC1 est aussi activé par les acides aminés (g) à la surface des lysosomes. (Adapté de (102))

1.4.1.2 La régulation de mTORC1 par l’AMPK

L’AMPK est une protéine hétérotrimérique comprenant les sous-unités α, β, γ (Figure 9). Il y a deux isoformes α (α1 et α2) et β (β1 et β2). Alors que la sous-unité γ a trois isoformes (γ1, γ2, γ3). La sous-unité α est celle qui contient le domaine catalytique alors que les deux autres détectent les niveaux d’énergie. La sous-unité β peut se lier au glycogène (103) et la sous-unité γ interagit avec l’adenosine triphosphate (ATP), l’adenosine diphosphate (ADP) et l’adenosine monophosphate (AMP) (104). Ainsi les sous-unités β et γ détectent les niveaux d’énergie. Lorsque le glycogène se lie moins à l’AMPK et que l’ATP est remplacée par l’ADP, cela entraine l’activation de l’AMPK. En général, l’AMPK stimule les voies cataboliques afin de restaurer les niveaux d’énergie disponibles pour la cellule et diminue l’activité des voies anaboliques. L’AMPK peut aussi être activé par deux kinases 21 soit par la CAMKK2 (Ca2+/calmodulin-activated protein kinase kinase) qui est activée par l’augmentation des niveaux de calcium et par la LKB1 (liver kinase B1) qui assure une phosphorylation activatrice de base sur l’AMPK (Thr172) (105).

Une des voies anaboliques les plus importantes qui est inhibée par l’AMPK est la voie mTORC1. En effet, l’AMPK phosphoryle et active le complexe TSC sur la Thr1227 et la Ser1345 de TSC2 (106) inhibant ainsi mTORC1 comme décrit en détail à la section 1.4.1. L’AMPK peut aussi inhiber Raptor, une composante essentielle de mTORC1, en phosphorylant les résidus Ser722 et Ser392 ce qui inhibe l’activité de mTORC1 (107). Par conséquent, l’AMPK inhibe la régulation de mTORC1 sur la prolifération, la croissance cellulaire, la lipogenèse et l’autophagie. Parmi les autres rôles de cette kinase, l’AMPK régule aussi le métabolisme lipidique en diminuant la synthèse d’acides gras et en augmentant l’oxydation des lipides par l’inhibition de l’acetyl-CoA carboxylase 1 et 2 (ACC1/2) (Figure 9). En effet, ACC est responsable de la conversion de l’acétyl-CoA en malonyl-CoA. Ce dernier sert de point de départ à l’élongation des acides gras et inhibe également le transport d’acides gras vers la mitochondrie en inhibant la carnitine palmitoylransferase (CPT-1). En plus de réguler l’autophagie indirectement par l’inhibition de la voie mTORC1, plusieurs études ont récemment montré que l’AMPK active directement l’autophagie en régulant positivement ULK1 (108-115).

Figure 9 : La régulation de l’AMPK et ses fonctions L’AMPK est un régulateur important de la voie mTORC1/S6K1 en régulant positivement TSC1/2. L’AMPK est activé par de hauts ratios d’AMP/ATP et d’ADP/ATP qui sont induits par l’hypoglycémie, l’épuisement des substrats énergétiques et l’hypoxémie menant ainsi à l’activation de LKB1. CaMKKβ active AMPK en réponse à l’augmentation de Ca2+ intracellulaire. L’AMPK active les voies cataboliques comme l’oxydation des lipides via l’inhibition de ACC2 et l’autophagie via ULK1/2. À l’inverse, AMPK inhibe les voies anaboliques telles que ACC1 qui régulent la lipogenèse et mTOR qui contrôle la croissance cellulaire et la synthèse protéique. (Adapté de (116))

L’AMPK est régulé par le statut énergétique qui est représenté en partie par les ratios ATP/AMP. Ce ratio est, entre autres, modulé par la disponibilité des substrats énergétiques. Le glucose par la glycolyse et le cycle de Krebs augmente la production d’ATP et favorise un ratio élevé ATP/ADP ce qui inactive l’AMPK. Au départ, la modulation de l’activité de mTORC1 par le glucose était considérée comme étant induit seulement par l’AMPK (117). Cependant, de récents travaux suggèrent que l’hexokinase II, une enzyme importante de la glycolyse qui convertit le glucose en glucose-6 phosphate, interagit directement avec mTORC1 afin d’inhiber son activité (118). En fait, en absence de glucose, l’hexokinase II se lie à mTORC1 afin d’enlever son inhibition sur l’autophagie (Figure 10).

Figure 10 : L’hexokinase régule la glycolyse et l’autophagie via mTORC1. En présence de glucose, la glycolyse peut être activée afin de former du pyruvate. Le glucose active mTORC1 qui régule l’expression de gènes codant pour des enzymes glycolytiques tels que l’HK2 (hexokinase 2), la GAPDH (glycéraldéhyde-3 phosphase déhydrogénase) et les GLUT (transporteurs de glucose). Lorsque la cellule se retrouve dans des conditions avec de faibles concentrations de glucose, l’AMPK est activé ce qui inhibe mTORC1. De plus, l’hexokinase 2 libre peut interagir avec mTORC1 afin d’inhiber son activité. Par ailleurs, GAPDH est connu aussi pour interagir avec RHEB bloquant ainsi l’activation de mTORC1. Ensemble, ils régulent négativement mTORC1 afin de bloquer l’inhibition exercée par mTORC1 sur l’autophagie. Ainsi, l’augmentation de l’autophagie permet à la cellule de dégrader des protéines et différentes organelles afin de subvenir à ses besoins. (Adapté de (119))

1.4.1.3 La régulation de mTORC1 par les acides aminés mTORC1 agit comme un noyau central du métabolisme énergétique en détectant divers signaux tels les nutriments. L’un des plus étudiés, régulant l’activation de mTORC1, sont les acides aminés notamment les acides aminés branchés (BCAA) : leucine, isoleucine et valine (120, 121). Afin d’activer mTORC1, les acides aminés stimulent son recrutement à la surface des lysosomes (Figure 11).

Plus précisément, mTORC1 est recruté au niveau des lysosomes par l’activation de la famille des petites protéines GTPases Rag (122, 123). Les régulateurs du statut de phosphorylation des Rag sont Ragulator et GATOR1. Ragulator fon8ctionne comme un GEF (guanine nucleotide exchange factors) pour RagA et RagB qui consiste à remplacer une molécule de guanine diphosphate (GDP) par une molécule de guanine triphosphate (GTP) sur RagA/B afin de stimuler son activité. GATOR1 fonctionne comme une protéine GTPase (GAP) pour RagA et RagB en remplacant une molécule de GTP par une molécule de GDP (124, 125). Chez les mammifères il y a 4 protéines Rag (A-D) et qui forment des couples d’hétérodimères soit Rag A ou B avec Rag C ou D. La présence d’acides aminés promeut la formation d’hétérodimères actifs où RagA/B est lié à un GTP et RagC/D à un GDP alors que l’absence d’acide aminé induit l’inverse (RagA/B-GDP)(RagC/D-GTP). En présence d’acides aminés, (RagA/B-GTP)(RagC/D-GDP) est actif et permet ainsi le recrutement de mTORC1 au niveau des lysosomes et son activation par Rheb (Figure 11). La localisation de Ragulator au niveau des lysosomes dépend de plusieurs protéines dont la v-ATPase (vacuolar H(+)-adenosine triphosphatase ATPase) qui est une pompe à protons qui se retrouve entre autres à la membrane des lysosomes et qui est également importante pour pomper des protons dans certains compartiments comme les lysosomes. La v-ATPase interagit avec Ragulator afin de réguler les Rag pour activer mTORC1 en réponse aux acides aminés (126). Une autre protéine qui permet la localisation de mTORC1 à la surface des lysosomes est p62 aussi appelé sequestosome 1 (SQSTM1). p62 se lie au Rag ATPase et Raptor en réponse aux acides aminés mais p62 n’est pas sensible à l’insuline et est indépendant de Ragulator (127).

Cependant, la détection spécifique des acides aminés semble plutôt être effectuée par des PAT (proton-assisted amino acid transporter) qui transportent directement certains acides aminés. Parmi eux, il y a la SLC38A9, une protéine lysosomale qui fonctionne comme un transporteur à faible affinité pour l’arginine, mais aussi pour la glutamine, l’asparagine, l’histidine et la lysine. Il est aussi essentiel à l’activation de mTORC1 (Figure 11) (128- 130). Ce mécanisme permet de détecter les acides aminés provenant des lysosomes, mais il y a également des mécanismes permettant de détecter les acides aminés cytosoliques afin

25 de réguler mTORC1 (Figure 11). Parmi eux, il y a la LRS (Leucyl-tRNA synthetase) permettant à la leucine d’activer RagD (131). Aussi, la FLCN (cytosolic folliculin) et la FNIP (cytosolic folliculin and interacting protein) qui active RagC et RagD en présence d’acides aminés (132). La leucine peut aussi être détectée par la Sestrin 2 qui active RagA et B directement ou bien encore indirectement via GATOR 2 (133). Récemment, CASTOR1 a été montré pour agir comme détecteur d’arginine afin d’inhiber GATOR2 en absence d’arginine (134). Par contre, l’arginine peut aussi stimuler mTORC1 en régulant la voie TSC/Rheb (135).

Figure 11 : Régulation de l’activation de mTORC1 par les acides aminés et l’insuline à la surface des lysosomes. (A) En absence d’acides aminés et d’insuline, mTORC1 est dans le cytoplasme alors que TSC est localisé au niveau des lysosomes. (B) La présence d’acides aminés induit l’inhibition de GATOR1 par GATOR2, l’activation de la Rag GTPases, la localisation de mTORC1 à la surface des lysosomes ainsi que le recrutement de Rheb au niveau des lysosomes. Cependant, TSC1/2 continue d’inhiber RHEB ce qui maintient mTORC1 inactif. (C) L’insuline induit l’inhibition de TSC ce qui l’exclut des lysosomes permettant ainsi à RHEB d’être activé. L’insuline stimule aussi la dissociation de PRAS40 de mTORC1 puis mTORC1 peut interagir avec RHEB et devenir actif. (Adapté de (136))

D’autres mécanismes alternatifs sont également impliqués dans la détection des acides aminés afin d’activer mTORC1. Entre autres, la MAP4K3 (MAP kinase regulator) est nécessaire pour détecter les acides aminés stimulant mTORC1 et semble nécessiter également l’interaction avec les Rag GTPases afin de promouvoir la croissance cellulaire (137, 138). La Vps34 (Class III PI3-kinase) qui catalyse la production de PIP3 semble aussi être impliquée dans l’activation de mTORC1 par les acides aminés (139, 140), mais a été montré pour ne pas influencer la croissance in vivo (141).

Malgré les avancées scientifiques importantes dans la compréhension de l’activation de mTORC1 par les acides aminés, il reste beaucoup de travail pour comprendre comment toutes ces protéines interagissent entre elles face à différents stress et conditions physiologiques comme le jeûne vs l’excès de nutriments. D’autre part, mTORC1 ne se retrouve pas seulement au niveau des lysosomes et son implication dans la transmission des signaux provenant de différents types d’acides aminés peut varier selon sa proximité à un compartiment spécifique. En effet, mTORC1 se retrouve également sur le Golgi, la mitochondrie, le noyau, les granules de stress et dans le cytoplasme (142). Par exemple, l’activation de mTORC1 au niveau du Golgi semble plus importante pour contrôler 4E-BP1 que S6K1 et cette population de mTORC1 est insensible à la rapamycine (143).

L’activation de mTORC1 au niveau des lysosomes requiert non seulement des acides aminés mais également Rheb-GTP qui est normalement régulé par le complexe TSC et inhibé par l’insuline (123, 140). En fait, les acides aminés stimulent la localisation de mTORC1 à la surface des lysosomes via les Rag mais ils ne peuvent activer directement mTORC1. Ces données suggèrent donc qu’un certain niveau d’acides aminés est nécessaire ainsi qu’un contrôle de TSC régulé par les besoins énergétiques et les facteurs de croissance tel l’insuline. Même si Rheb-GTP est nécessaire à l’activation de mTORC1, on ne peut en dire autant de son activateur TSC2 puisque l’activation de mTORC1 par les acides aminés est toujours présente dans les cellules MEF (mouse embryonic fibroblast) déficientes pour TSC2 (144). Par conséquent, l’activation de mTORC1 peut se faire de manière indépendante à la voie PI3K-Akt-TSC stimulé par l’insuline. Malgré tout, TSC2 est un

27 régulateur important de mTORC1 puisqu’il est un élément central dans l’intégration de différents signaux du statut énergétique.

Figure 12 : Les effets en aval de mTORC1. (Adapté de (96))

1.4.1.4 Les effets en aval de mTORC1

La voie mTORC1 régule plusieurs fonctions physiologiques anaboliques (Figure 12) à commencer par la synthèse protéique. Afin de bien réguler la croissance et la prolifération cellulaire, un niveau de synthèse protéique adéquat est nécessaire. mTORC1 et ses substrats contrôlent l’initiation et l’élongation lors de la traduction protéique. La traduction des protéines est le processus par lequel les chaines d’ARN messager sont traduites en chaines polypeptidiques qui formeront après maturation, des protéines. L’initiation de la traduction est induite par mTORC1 via l’inhibition de 4EBP1 ce qui active eIF4E (eukaryotic translation initiation factor 4E). eIF4E actif recrute d’autres protéines telles eIF4G et eIF4A afin de permettre la formation du complexe eIF4F qui se lie à la structure Cap en 5’ de l’ARNm. L’ARNm traduit et initié par mTORC1/4E-BP1/eIF4E sont presque tous des ARNm contenant une partie terminale oligopyrimidine (TOP) ou TOP-like motif downstream of the 5’ m7Gppp cap structure (145, 146). Cette structure se trouve à l’extrémité 5’ de l’ARNm codant pour toutes les protéines ribosomales, facteurs d’élongation, certains facteurs d’initiation et cofacteurs de la traduction protéique (147). mTORC1 régule la synthèse protéique également via S6K1 qui favorise le recrutement de ribosomes (40S), l’épissage et le transfert de codon durant l’élongation de la traduction assurant ainsi une bonne efficacité lors la synthèse des protéines (148). Pour ce faire, S6K1

28 régule positivement eIF3 du complexe eIF4F, eIF4A, eEF2 (eukaryotic elongation factor 2) et la protéine ribosomale S6.

L’un des rôles importants de mTORC1 est le contrôle de l’autophagie, un système de recyclage intracellulaire, qui est régulé en fonction des besoins énergétiques cellulaires. L’autophagie est le processus par lequel des composantes complexes comme des protéines seront dégradées afin de fournir des acides aminés à la cellule. De plus, l’autophagie débute avec la formation d’un autophagosome qui est composé d’une double membrane lipidique qui peut engouffrer des protéines, des gouttelettes lipidiques et des organelles telles que les mitochondries et des fragments du réticulum endoplasmique. S’ensuit également une fusion avec des lysosomes afin de dégrader ces composantes intracellulaires et ainsi rendre disponibles de nouveaux nutriments. Par ailleurs, il existe également des types d’autophagie plus sélectifs, par exemple la dégradation sélective des mitochondries (mitophagie) (149) ou encore la dégradation des gouttelettes lipidiques (lipophagie) (150). mTORC1 est un puissant inhibiteur de l’initiation de l’autophagie en phosphorylant ULK1 (Figure 13) (la unc51-like kinase ou ATG1; Autophagy-related) (111, 151-154). mTORC1 peut aussi réguler la stabilité et l’activité de ULK1 en phosphorylant AMBRA1 (autophagy/beclin 1 regulator 1) (155). Un autre complexe de protéines importantes pour l’initiation de l’autophagie est VPS34, une PI3K de classe III, dont l’activité est cruciale pour l’autophagie. mTORC1 régule VPS34 de deux façons soit en inhibant directement un membre du complexe ATGL14L ou encore via l’inhibition du complexe ULK1 qui régule positivement le complexe VPS34 (156, 157). En plus d’agir directement sur les composantes de l’initiation de l’autophagie, mTORC1 régule également la biogenèse des lysosomes en inhibant la transcription de TFEB (transcription factor EB), un régulateur clé des lysosomes et de l’autophagie (158, 159). Chez l’humain ou dans différents modèles d’obésité et de diabète de type 2, l’autophagie est diminuée dans différents tissus, dont le cœur (160-162), les cellules β du pancréas (163, 164), le tissu adipeux (165-167), le muscle squelettique (168) et le foie (169, 170).

Figure 13 : Régulation de l’initiation de l’autophagie par mTORC1 L’activation de mTORC1 par les nutriments et les facteurs de croissance mènent à l’inhibition de l’autophagie par la phosphorylation de multiples ATG (autophagy-related proteins) telles que ULK1, ATG13, AMBRA1 et ATG14L qui stimulent l’initiation de l’autophagie et la formation de l’autophagosome. mTORC1 phosphoryle et prévient la localisation nucléaire du facteur de transcription TFEB, un régulateur central de l’expression de gènes régulant les lysosomes et l’autophagie. (Adapté de (171))

Le jeûne et l’absence de nutriments sont l’un des plus puissants inducteurs de l’autophagie qui est en partie expliquée par l’inhibition de mTORC1 (118, 152, 154, 172, 173). Ces effets peuvent être en majeure partie reproduits par l’utilisation aigüe de la rapamycine (171). L’AMPK est aussi un régulateur important de l’autophagie en inhibant mTORC1 ou directement en phosphorylant les Ser317/Ser777 de ULK1 (108, 110-114, 156, 172, 174).

La lipogenèse, le processus qui utilise l’acétyl-CoA pour former des acides gras et le glycérol pour synthétiser des triglycérides, est aussi régulé par mTORC1. Comme mentionné précédemment, mTORC1 est activé en présence de nutriments afin d’activer des processus anaboliques. Il est maintenant clair que mTORC1 joue un rôle important dans la lipogenèse en régulant l’expression de plusieurs gènes lipogéniques (175). Les facteurs de transcription SREBPs (sterol regulatory element-binding proteins) sont d’importants régulateurs de l’expression de gènes impliqués dans le métabolisme lipidique. Parmi cette

30 famille, on retrouve deux gènes : les isoformes SREBP1a, SREBP1c et SREBP2. SREBP1 est un régulateur clé de la synthèse des acides gras stimulée par l’insuline alors que SREBP2 est impliqué dans la synthèse du cholestérol (176). Les SREBPs résident à la membrane du réticulum endoplasmique (ER) sous une forme précurseure inactive. En réponse à l’insuline ou des niveaux bas de stérols, les SREBPs sont clivés en leurs formes matures (mSREBPs). Par la suite, mSREBP peut transférer au noyau afin d’activer l’expression de certains gènes impliqués dans le métabolisme lipidique. SREBP1 augmente l’expression de l’ACL (ATP citrate lyase), l’ACC (acetyl-CoA carboxylase) et la FASN (fatty acid synthase) afin de réguler la lipogenèse alors que SREBP2 augmente l’expression de LDLr (low-density lipoprotein receptor), HMG-CoA synthase (3-hydroxymethyl-3- glutaryl-(HMG-)CoA-synthase), et HMG-CoA-reductase afin de réguler la synthèse de cholestérol (176, 177). mTORC1 régule positivement SREBP à plusieurs niveaux incluant la maturation, le transport et la transcription (178). Une première étude en 2008, a montré que la rapamycine inhibe l’action d’Akt sur l’accumulation nucléaire de mSREBP dans des cellules épithéliales (179). Cette même étude a également montré que l’ablation de raptor mais pas de rictor bloquait la maturation de SREBP suggérant que cet effet était principalement induit par mTORC1 (179). À l’inverse, la délétion aigüe de TSC1/2 qui induit une suractivation de mTORC1 est associée avec une plus grande présence de mSREBP au noyau ainsi qu’une augmentation de la lipogenèse de novo (180). Cependant, une suractivation prolongée de mTORC1 empêche Akt d’activer SREBP via l’activation des boucles de rétro-inhibition négative sur la voie PI3K/Akt (45). Ces résultats suggèrent que Akt induit ces effets sur SREBP via une voie dépendante et indépendante de mTORC1. mTORC1 régule la lipogenèse, mais qu’en est-il de son rôle dans l’oxydation des substrats énergétiques? Bien que mTORC1 soit caractérisé comme une kinase activant les voies anaboliques et inhibant les voies cataboliques, mTORC1 semble réguler positivement l’oxydation. Dans des conditions normales, mTORC1 régule également l’expression de PGC-1α (PPAR-γ coactivator-1α), un régulateur de l’expression de gènes impliqués dans la biogenèse mitochondriale ainsi que l’oxydation des substrats énergétiques (181-184). La délétion génétique de l’activité de mTORC1 au niveau du cœur et des muscles squelettiques montre une diminution du nombre de mitochondries et des gènes oxydatifs

(185-187). Même si l’oxydation des substrats énergétiques ne cadre pas, à première vue, avec les rôles anaboliques de mTORC1, il se pourrait que cette fonction de mTORC1 permette de maintenir un niveau d’ATP adéquat et nécessaire pour le stockage des substrats énergétiques. Cependant, dans des conditions de suractivation de mTORC1, les fonctions mitochondriales et oxydatives pourraient être plutôt diminuées, tel qu’observé dans l’obésité et le diabète de type 2, deux pathologies où la voie mTORC1 est suractivée (96).

1.4.2 mTORC2 mTORC2 est un complexe de protéines qui est différent de mTORC1 de par certaines protéines qui le composent telles Sin1, Rictor et Protor 1/2. De plus, contrairement à mTORC1, mTORC2 n’est pas sensible aux nutriments ou aux différentes conditions énergétiques. mTORC2 a tout d’abord été montré pour activer Akt suite à l’activation du récepteur à l’insuline en augmentant sa phosphorylation sur la Thr450, Ser473 et la Ser477/479 (29, 188, 189). De par son rôle d’activateur d’Akt, mTORC2 participe à la prolifération, la croissance et la survie cellulaire ainsi qu’au métabolisme du glucose et à la lipogenèse (190-193). mTORC2 phosphoryle aussi la SGK1 (serum- and glucocorticoid- induced protein kinase 1) afin de réguler plusieurs canaux ioniques et transporteurs (194) ainsi que plusieurs membres de la famille des PKC (protein kinase C) afin de réguler des protéines du cytosquelette (188, 195-197). Récemment, mTORC2 a aussi été montré pour phosphoryler et inactiver MST1, un membre de la signalisation Hippo afin de protéger les fonctions cardiaques (198).

Cependant, la régulation de l’activation de mTORC2 est loin d’être éclaircie. En effet, l’activation de mTORC2 par la voie PI3K a clairement été montrée, mais le mécanisme exact d’activation de mTORC2 reste encore inconnu. La GTPase Rac1 a été montrée pour jouer un rôle comme médiateur de l’activation de mTORC2 en aval de PI3K. Akt a été suggéré également pour être une kinase en amont de mTORC2 en phosphorylant mSIN1 sur la Thr86 (199). Par contre, le rôle de ce site de phosphorylation n’est pas clair et pourrait même réguler négativement mTORC2 (57). D’autres ont suggéré que PIP3 produit par la PI3K enlèverait l’inhibition de mSIN1 sur mTORC2 (200).

Un autre aspect important dans l’activation des différentes molécules signalétiques est leurs localisations. Jusqu’à récemment la localisation de mTORC2 n’était pas connue. De récentes études montrent cependant que le site principal de localisation de mTORC2 est le réticulum endoplasmique (ER) (201). Beltz et collègues ont montré également que mTORC2 se localisait plus précisément au niveau des MAMs (mitochondria-associated membrane) qui sont des points de contact entre les membranes des mitochondries et du ER (202). Le rôle exact de mTORC2 à cet endroit est encore obscur, mais Akt a été montré pour également se retrouver au niveau du ER et des MAMs et ensemble, ils semblent réguler le métabolisme lipidique, calcique ainsi que la physiologie mitochondriale en réponse à l’insuline (201-203).

1.5 S6K

La famille S6K (p70 ribosomal S6 kinase) est composée de deux gènes distincts soit S6K1 et S6K2 qui sont membres de la famille des AGC kinases tout comme PKA, PKG, PKC, Akt et RSK. À la fois S6K1 et S6K2 possèdent deux isoformes protéiques causées par la présence de deux codons de départ alternatif ATG (Figure 14) (204). Il y a la S6Kα1 (p85 ribosomal S6 kinase) de 85 kDa et la S6Kα2 (p70 ribosomal S6 kinase) de 70 kDA qui est la forme majeure de S6K. De plus, la forme plus grosse de S6K1 de 85 kDa possède un domaine nuclear localization sequence (NLS) suggérant que cette isoforme peut se déplacer entre le cytosol et le noyau. Par ailleurs, S6K1 possède aussi un isoforme de 31 kDa, mais qui ne contient pas de domaine kinase. En ce qui concerne S6K2, il possède un isoforme à 54 kDa (S6Kβ2) et une autre à 56 kDa (S6K2β1). La forme plus courte contient déjà un NLS en C-terminal alors que la forme plus longue en contient une autre en N- terminale ce qui suggère un rôle important de S6K2 au niveau du noyau. Dans le cas de S6K1, sa localisation au noyau est dépendante de sa phosphorylation par mTORC1 sur la Thr389, mais pas de son activité kinase (205, 206). Une étude a également montré que S6K1 peut se retrouver à la surface de la mitochondrie (207).

Figure 14 : Structure de S6Ks. Les isoformes de S6K1 comprennent p70-, p85- et p31-S6K1. Différents sites de départ sur l’ARNm permettent d’obtenir les isoformes p85 et p31 (à noter que la forme p31 n’a presque pas de domaine kinase). Les isoformes de S6K2 incluent p54- et p56-S6K2 et un site de départ différent permet d’obtenir l’isoforme p56-S6K2. Les domaines signal de localisation nucléaire (NLS) se retrouvent dans la partie N-terminale de p85-S6K1 et p56-S6K2, alors que S6K2 contient aussi un domaine NLS dans la partie C-terminale. Les formes de S6Ks contiennent un domaine N-terminal acide (NTD), un domaine kinase (KD), une région de liaison et un domaine C-terminal acide (CTD). Le NTD contient le TOS motif qui permet à S6Ks de lier mTORC1. mTORC1 phosphoryle le site HM (Thr389) dans la région de liaison et PDK1 phosphoryle le T- loop qui inclut le site TM (Ser371). (Adapté de (36))

Au repos, la partie C-terminale de S6K1 est repliée sur la partie N-terminale, empêchant le domaine kinase de lier ses substrats. L’activation de S6K1 commence par la phosphorylation des résidus Ser411, Ser418, Ser421 et Ser424 dans la partie C-terminale de la protéine par des signaux mitogéniques (208, 209). Ces phosphorylations ouvrent la partie interne de la protéine exposant la Thr389 qui peut être phosphorylée par mTORC1 (210- 212), suivi par la phosphorylation de la T229 et l’activation de S6K1. La plupart des études ont porté jusqu’à maintenant majoritairement sur S6K1 dû à leur forte homologie de leur domaine kinase (~84%) (213), laissant S6K2 négligé (214). Cependant la régulation de S6K2 est similaire à S6K1 puisque 7 des 8 sites de phosphorylation de S6K1 sont conservés sur S6K2 (215-217).

S6K régule plusieurs fonctions métaboliques, dont la synthèse protéique. Ainsi, le principal substrat de S6K est la protéine ribosomale S6, un membre de la sous-unité ribosomale 40S. De plus, les deux kinases, S6K1 et S6K2, sont nécessaires à la phosphorylation complète de S6, mais S6K2 semble être la principale kinase phosphorylant S6 (218). Par ailleurs, l’activation de S6 est essentielle à la synthèse protéique et au cycle cellulaire en régulant la traduction protéique (219, 220). Parmi les autres substrats de S6K1, on retrouve la protéine PDCD4 (pro-200 grammed cell death protein 4) (221), eIF4B (eukaryotic translation initiation 201 factor 4B) (222, 223), eEF2K (eukaryotic elongation factor-2 kinase) (224), SKAR (S6K1 Aly/REF-like target) (225), et CCTβ (chaperonin containing TCP-1 (t- complex protein 1)) (226). Ainsi, la phosphorylation de ces substrats par S6K1 stimule la synthèse protéique.

Plusieurs études montrent également que S6K régule la prolifération cellulaire puisqu’une diminution aigüe de l’expression de S6K1 induite à l’aide d’un inhibiteur d’ARN (RNAi) diminue l’entrée en phase G1-S. De plus, une forme de S6K résistante à la rapamycine empêche la rapamycine de bloquer l’entrée en phase G1-S du cycle cellulaire (227, 228). Inversement, la surexpression de S6K1 et S6K2 confère une augmentation au niveau de la prolifération cellulaire (228-230). Cependant, les cellules MEF déficientes pour S6K1 et S6K2 n’ont pas de défaut de prolifération comparativement aux cellules contrôles suggérant qu’il y a potentiellement des mécanismes compensatoires (227, 231).

S6K1 et S6K2 jouent un rôle important dans le métabolisme en interagissant avec des facteurs de transcription afin de réguler l’expression de gènes. Entre autres, S6K1 a été montré pour interagir avec le récepteur à l’estrogène alpha (ERα) (232) et CREM (cAMP responsive element modulator) afin d’induire la prolifération cellulaire (233). S6K1 joue un rôle important également dans l’activité de SREBP1c et la lipogenèse induite par l’insuline (234, 235). En effet, S6K1 participe au clivage de la SREBP1c et la translocation de la forme mature au noyau (236). De son côté, S6K2 a été montré pour interagir avec YY1 (Yin Yang 1) qui contrôle l’expression de gènes liés à la transcription, à la prolifération cellulaire et l’apoptose (237). Cette interaction est également inhibée par la rapamycine, montrant ainsi l’implication de mTORC1. S6K2 a aussi été montré pour interagir avec PPARα

(peroxysome proliferator-activated receptor alpha) et son co-répresseur NCOR1 (nuclear receptor corepressor 1) afin d’inhiber la cétogenèse (238).

1.6 mTORC1/S6K1 : une voie clé du métabolisme !

La capacité de mTORC1 à détecter les nutriments, d’intégrer différents signaux environnementaux et à activer différentes voies de signalisation en réponse à ces signaux font de la voie mTORC1 un régulateur central du métabolisme. De plus, mTORC1/S6K1 régule le métabolisme de différentes façons selon les tissus; le foie, le muscle squelettique, le tissu adipeux et le cerveau seront discutés dans cette section.

1.6.1 mTORC1 et le métabolisme énergétique

Il existe plusieurs façons de réguler l’activation de la voie mTORC1. En effet, l’insuline et les acides aminés sont de puissants activateurs de la voie mTORC1 alors que la rapamycine utilisée de manière aigüe est un inhibiteur très puissant de cette même voie. Cependant, il existe également différents modèles génétiques d’activation ou d’inactivation de la voie mTORC1. Parmi eux, la délétion des protéines TSC1 et TSC2, des inhibiteurs de la voie mTORC1, entraine une suractivation de cette voie. À l’inverse, la délétion spécifique de certaines composantes des complexes tels que raptor (mTORC1) et rictor (mTORC2) permet d’inactiver ces kinases. Ces différents outils ont été utilisés par plusieurs groupes afin de montrer le rôle métabolique de mTORC1/2. De plus, une partie des effets associés à ces modèles sont dépendants de S6K.

Les maladies métaboliques telles l’obésité sont composées, entre autres, d’un dérèglement du métabolisme des différents substrats énergétiques. Au niveau du foie, l’utilisation de souris déficientes pour TSC1 (suractivation de mTORC1) ou raptor (inactivation de mTORC1) spécifiquement dans le foie a montré que mTORC1 inhibe la cétogenèse induite par le jeûne (239). La cétogenèse est le processus par lequel les cétones sont produites à partir de triglycérides lorsqu’il y a peu de glucose disponible dans les cellules comme lors d’un jeûne. La production de cétones a pour objectif d’approvisionner les tissus en énergie 36 afin de compenser le manque de glucose. Les cétones sont également diminués chez les patients obèses (240, 241) et au cours du vieillissement (239). Les auteurs ont également montré que ces résultats étaient causés par l’inhibition de PPARα par mTORC1. Ainsi, mTORC1, qui est également activé en présence de nutriments, inhibe l’oxydation des lipides. Ainsi, mTORC1 est un important contributeur de la diminution des corps cétoniques et un inhibiteur de l’oxydation des lipides après un repas. Dans les souris déficientes sélectivement pour raptor dans le foie, une diète riche en gras et en sucre révèle que mTORC1 hépatique participe à la prise de poids ainsi qu’au développement de la stéatose hépatique (242). Par ailleurs, une étude récente illustre un nouveau concept complexifiant la compréhension du rôle de mTORC1 hépatique sur la stéatose hépatique. En effet, cette étude a montré qu’alors que l’activité de mTORC1 augmente avec l’âge et l’obésité, la proportion de la protéine Raptor (composante de mTORC1) « libre » (dissociée du complexe) diminue. Ce raptor libre participerait à la diminution de le la stéatose hépatique en favorisant l’inhibition d’Akt qui, lui, favorise la lipogenèse (243). Cependant, notre compréhension du rôle des différentes composantes de mTORC1 lorsqu’ils sont libres est loin d’être éclaircie. D’autant plus que mTORC1 participe également à plusieurs boucles de rétro-inhibition négative régulant Akt ce qui peut entrainer certains phénomènes compensatoires.

Le muscle est un organe important et nécessite une régulation fine puisqu’il est très dynamique. mTORC1 est une kinase essentielle au développement et à la réparation musculaire puisque les souris déficientes pour Raptor dans le muscle ont une atrophie musculaire, une diminution de la capacité oxydative et une augmentation des dépôts de glycogène qui ensemble participent au développement de la dystrophie musculaire (185). mTORC1 assure également un bon couplage excitation-contraction dans le muscle squelettique en régulant entre autres les niveaux de calcium (244). Paradoxalement, une suractivation de mTORC1 par la délétion de TSC1 spécifiquement dans le muscle squelettique de souris induit également une dysfonction musculaire qui est causée par une inhibition de l’autophagie nécessaire à l’homéostasie musculaire (245). Une étude a récemment comparé le rôle métabolique entre la délétion de Raptor (RAmKO, inactivation de mTORC1 dans le muscle) et la délétion de TSC1 (TSCmKO, activation de mTORC1)

37 spécifiquement dans le muscle (246). Les deux modèles sont caractérisés par une diminution du gain de poids et de la masse maigre. Par contre, les souris RAmKO sont résistantes à l’insuline, mais glucose tolérante alors que les souris TSCmKO sont sensibles à l’insuline, mais glucoses intolérantes à l’âge de 10 semaines. Lorsqu’elles sont exposées à une diète riche en gras, les deux modèles sont résistants à l’obésité et à la stéatose hépatique, mais développent tous deux une résistance à l’insuline à long terme (246). Les données de cages métaboliques indiquent aussi que sous une diète riche en gras, les souris TSCmKO mangent plus et dépensent plus d’énergie sans changement de leur quotient respiratoire alors que les souris RAmKO ont une diminution de leurs dépenses énergétiques ainsi que de leur quotient respiratoire indiquant leur préférence pour l’utilisation des lipides (246). Cette étude suggère que l’activation musculaire de mTORC1 est nécessaire afin d’induire les gènes liés à l’oxydation des lipides et du glucose, mais induit une résistance à l’insuline. Cependant, à la fois une suractivation et une perte de l’activité de mTORC1 dans le muscle induisent une myopathie associée à une perte de masse grasse et une résistance à l’insuline chez les souris âgées de plus de 20 semaines (246). La complexité des phénotypes observés par la suractivation et la perte de l’activité de mTORC1 dans le muscle squelettique montre à quel point mTORC1 est essentiel pour le développement des tissus, mais également dans l’homéostasie des voies métaboliques en réponse à différents stress métaboliques tel l’excès de nutriments. Ainsi, inhiber complètement mTORC1 ne serait peut-être pas une stratégie efficace pour traiter l’obésité et le diabète de type 2.

Au niveau du tissu adipeux, mTORC1 est essentiel à l’adipogenèse et aux fonctions adipocytaires. Un modèle déficient pour Raptor sélectivement dans le tissu adipeux sous le contrôle du promoteur Adiponectine-Cre induit une lipodystrophie et une résistance à l’insuline ainsi qu’une importante augmentation de la masse du foie causé par une stéatose hépatique (247). Cette stéatose hépatique est probablement causée par le fait que ces souris sont lipodystrophiques et ne peuvent stocker les lipides dans le tissu adipeux favorisant ainsi une lipotoxicité. Comme montré également dans un autre modèle déficient pour Raptor dans le tissu adipeux, mais moins spécifique par l’utilisation du promoteur AP2- Cre, ces souris sont plus petites et sont résistantes à une diète induisant l’obésité (247, 248). Les effets de mTORC1 sur l’adipogenèse sont induits par 4E-BP1, Lipin1 et S6K1 qui

38 ensemble régulent l’activité de PPARγ, CCAAT/enhancer-binding proteins (C/EBPs) et SREBPs afin d’augmenter l’expression des gènes lipogéniques et de différenciation adipocytaire (249-251). De récentes études ont montré que le tissu adipeux blanc a la capacité de devenir avec un phénotype de tissu adipeux brun et donc plus oxydatif, un phénomène appelé le « beiging » (252). L’utilisation d’un modèle de souris déficient pour TSC spécifiquement dans le tissu adipeux (suractivation de mTORC1) a permis de montrer que mTORC1 stimule le tissu adipeux brun à devenir comme un tissu adipeux blanc (253). À l’inverse, la rapamycine peut également empêcher un agoniste β3-adrénergique et le froid de stimuler le tissu adipeux blanc à devenir avec un phénotype de tissu adipeux brun (254). Dans la même lignée que cette dernière étude, l’activation β3-adrénergique a été montrée pour stimuler PKA ce qui augmente l’activation de mTORC1 et l’expression de UCP-1 (uncoupling protein) (255). Ces résultats suggèrent que l’activation classique de mTORC1 par les nutriments ou l’insuline favoriserait un phénotype de tissu adipeux blanc pour le stockage alors qu’une stimulation adrénergique favoriserait l’action de mTORC1 sur l’oxydation des lipides. Cependant, d’autres études seront nécessaires afin d’éclaircir comment mTORC1 régule des processus différents selon le mécanisme d’activation. mTORC1/S6K1 joue également un rôle très important dans l’hypothalamus en régulant la prise alimentaire (256). mTORC1/S6K1 est activé par la prise alimentaire dans les neurones AGRP (agoupi-related peptide hormone) / NPY (neuropeptide Y) et POMC (proopiomelanocortin) par l’insuline, la leptine et la ghréline (257). En effet, la prise alimentaire active mTORC1/S6K1 ce qui inhibe l’expression de AGRP/NPY (orexigénique) et augmente l’expression de POMC (anorexigénique) dans l’hypothalamus médio-basal (MBH). Cependant, malgré que l’obésité induit une suractivation de la voie mTORC1/S6K1 au niveau périphérique, l’activation de la voie mTORC1/S6K1 par les nutriments, la leptine ou l’insuline est plutôt diminuée au niveau central contribuant ainsi au développement de l’hyperphagie et la prise de poids (256)(258, 259). Ces résultats contrastent avec l’activation chronique de mTORC1/S6K1 en périphérie qui est plutôt suractivée. Il est donc possible qu’il y ait des mécanismes distincts de régulation de cette voie entre l’hypothalamus et les tissus périphériques. Récemment, Caron A et collègues (260) ont montré que la surexpression de Deptor dans le MBH de souris, un inhibiteur

39 endogène de mTOR et membre de mTORC1, les rendaient résistantes à l’obésité induite par une diète riche en gras, améliorait la tolérance au glucose et diminuait la stéatose hépatique qui était associée à une diminution de la prise alimentaire. Ces résultats ne semblent pas être expliqués par un rôle de Deptor dans les neurones POMC puisque la surexpression de Deptor spécifiquement dans les neurones exprimant POMC ne récapitule pas les effets de la surexpression de Deptor dans le MBH suggérant que d’autres populations de neurones sont impliquées dans les effets métaboliques induits par Deptor (261).

Par ailleurs, certaines études ont également montré que mTORC2 et mTORC1 peuvent être régulés directement par les lipides. L’activité de mTORC2 dans les hépatocytes est inhibée par la surexpression de Gpat1 (glycérol-3-phosphate acyltransferase-1). D’autres études similaires ont montré que mTORC2 et mTORC1 peuvent être inhibés ou activés par différentes espèces de lipides tels l’acide phosphatidique, mais la compréhension de la régulation directe de mTORC1/2 par différentes espèces de lipides reste encore à être étudiée (262, 263). Récemment, un groupe a suggéré que les lipides produits de la lipolyse inhiberaient à la fois mTORC1 et mTORC2 afin d’inhiber le captage de glucose dans les adipocytes (264). Ces résultats sont intéressants puisqu’ils pourraient expliquer comment les lipides produits pour la β-oxydation inhibent l’entrée de glucose. Cependant, ils n’ont pas identifié précisément les lipides impliqués dans ce processus. D’autre ont montré que le PA (phosphatidic acid) pourrait jouer un rôle en inhibant et en activant mTOR en fonction du type de lipide. En effet, le PA contenant deux acides gras saturés inhibe mTORC2 (265), alors que le PA contenant un acide gras saturé et un acide gras insaturé activerait mTORC1 et mTORC2, car le PA serait nécessaire à la stabilité des deux complexes (262, 266). De plus, une étude récente a montré que le PA produit par la phospholipase D déplaçait Deptor et activait par ce mécanisme mTORC1 (267). Ainsi les niveaux de PA pourraient être un indicateur des besoins cellulaires en lipides notamment des membranes lipidiques afin de réguler l’équilibre entre le stockage et les besoins en lipides (263). Il serait intéressant de déterminer si le PA joue un rôle important dans la suractivation de mTORC1/S6K1 dans l’obésité.

1.6.2 Le rôle de S6K dans le métabolisme énergétique

Plusieurs des effets métaboliques de mTORC1 sont également reproduits par son substrat S6K. Les différents modèles génétiques utilisés durant les 10 dernières années ont grandement aidé à déchiffrer le rôle métabolique de S6K1 et S6K2. En effet, les souris déficientes pour S6K1 sont plus petites alors que les souris S6K2 sont plus grosses que les souris contrôles (218). Cependant, les souris déficientes pour les deux isoformes sont plus petites et décèdent autour de la naissance révélant leur importance dans le développement (218). À noter que ces modèles sont à risque de développer des mécanismes compensatoires pouvant expliquer une partie des phénotypes observés puisqu’ils partagent la plupart de leurs substrats entre eux et avec d’autres kinases.

De manière très intéressante, ces modèles de souris présentent également des phénotypes métaboliques modifiés par la perte de ces kinases. Tout comme mTORC1, l’activité des S6Ks sont augmentés par l’exposition à des nutriments, l’inflammation et dans plusieurs pathologies telles que l’obésité, la résistance à l’insuline et le diabète de type 2 (268). En effet, les souris déficientes pour S6K1 sont résistantes à l’obésité induite par une diète riche en gras à cause de l’augmentation de la lipolyse et de la dépense énergétique (269). De plus, ces souris sont plus sensibles à l’insuline suggérant une amélioration des boucles de rétrocontrôle négatives sur la voie PI3K/Akt (section 1.3.1). Cet effet est probablement causé par la diminution des boucles de rétrocontrôle négatives sur la phosphorylation d’IRS-1 et mTORC2 augmentant ainsi l’action de l’insuline (49, 53-55, 59, 269, 270).

Puisque S6K1 semblent jouer un rôle important dans l’obésité et la résistance à l’insuline, plusieurs groupes ont essayé d’inhiber l’activité de S6K1 en utilisant des modèles génétiques. Une étude a utilisé des rats Sprague-Dawley ayant reçu deux injections d’oligonucléotides anti-sens contre S6K1 par semaine pendant 4 semaines afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de diminuer l’expression de S6K1 (271). Dans cette étude, une réduction de 80% de l’expression de S6K1 diminuait le gain de poids durant les 4 semaines et augmentait la sensibilité à l’insuline (271). Une autre étude a également évalué le potentiel thérapeutique d’inhiber S6K1 et S6K2, mais spécifiquement au niveau du foie. Le groupe de Dr. Olefsky a utilisé des lentivirus (LV) qui exprimaient des shARN contre S6K1 et S6K2 (236). À l’aide de cette technologie, ils ont montré que la réduction de

41 l’expression de S6K1/2 améliorait la sensibilité à l’insuline systémique et la tolérance au glucose chez des souris sous diète riche en gras (HF) sans changer la prise alimentaire ou le poids des souris. Ces résultats étaient également associés à une réduction de la production hépatique de glucose et une diminution de la stéatose hépatique causée par une réduction de l’expression de SREBP1c (236). De plus, la signalisation de l’insuline au niveau de la phosphorylation d’Akt et de FOXO était améliorée en condition postprandiale dans le foie et le tissu adipeux. Ces résultats indiquent qu’une diminution de l’expression de S6K1 et S6K2 uniquement dans le foie est suffisante pour renverser les effets délétères associés à l’obésité. Par ailleurs, même sans acides aminés, S6K est fortement activé par les lipides et les effets bénéfiques observés par l’absence de S6K1 et S6K2 semblent être présents seulement lorsque les souris sont soumises à une diète contenant des lipides suggérant un rôle important de S6K comme médiateurs des effets délétères des lipides (272).

Au niveau musculaire, une élégante étude a montré que l’absence de S6K1 dans le muscle squelettique est associée avec une augmentation de l’activité de l’AMPK qui est une kinase importante dans le contrôle de l’homéostasie énergétique (273). En fait, l’absence de S6K1 augmente la quantité d’adénosine monophosphate (AMP) alors que les niveaux d’ATP ne changent pas dans le muscle squelettique causant ainsi un ratio élevé AMP/ATP ce qui active l’AMPK. Cette étude a également permis de déterminer que les muscles déficients pour S6K1 consommaient préférablement les lipides au glucose (273). De plus, la leptine diminue la prise alimentaire en inhibant l’AMPK via l’activation de S6K1 qui phosphoryle la Ser491 de l’AMPK. Ces résultats suggèrent donc une régulation directe de l’activité de l’AMPK par S6K1 (274).

Dans le tissu adipeux viscéral humain de patients obèses, l’expression de S6K1 est augmentée et est associée positivement avec la résistance à l’insuline (275). Les niveaux d’expression de S6K1 corrèlent également avec plusieurs marqueurs inflammatoires tels que TNF-α (Tumour necrosis factor -alpha). Toujours au niveau des adipocytes, S6K1 est également important pour l’initiation des cellules souches à se différencier en adipocytes (249). De plus, S6K1 est nécessaire également à la transcription de gènes précurseurs impliqués dans les premières étapes de l’adipogenèse (249). Ces résultats expliquent en partie pourquoi les souris déficientes pour S6K1 sont résistantes à une diète induisant l’obésité (269).

S6K1 est une kinase centrale dans la résistance à l’insuline et elle participe à l’action de plusieurs signaux, dont les lipides. S6K1 est connu pour induire la lipogenèse et ainsi le stockage des lipides (section 1.5), mais S6K1 peut aussi induire, en partie, la résistance à l’insuline causée par certaines espèces de lipides. Parmi ces espèces, on retrouve les céramides et le palmitate qui sont largement connus pour participer à la résistance à l’insuline et diminuer l’activité de la signalisation de l’insuline (276, 277). Les céramides ont été montrés pour induire la résistance à l’insuline via trois mécanismes, soit l’activation de PKCζ (278), l’activation de la phosphatase PP2A (279) et l’activation de la voie RHEB/mTORC1/S6K1 qui bloque la signalisation de l’insuline au niveau des protéines IRS et Akt (280). Le palmitate a été montré aussi pour activer mTORC1/S6K1 et diminuer la signalisation de l’insuline dans les hépatocytes (281). Cependant, les mécanismes exacts par lesquels ces lipides activent la voie mTORC1/S6K sont encore inconnus.

Malgré le peu d’études ayant évalué le rôle de S6K2 dans le métabolisme énergétique, S6K2 est important pour réprimer l’activité de PPARα (peroxysome-proliferator-activated receptor alpha) en s’associant avec son co-répresseur NCOR1 (nuclear receptor corepressor 1) au niveau du foie (238). Un des rôles importants de PPARα est le contrôle de la cétogenèse. Les souris déficientes pour S6K2 montrent une augmentation de l’activité de PPARα et de la production de corps cétoniques (238). De plus, les souris obèses (ob/ob) montrent une augmentation de l’activité de S6K2 et une plus grande association entre S6K2 et NCOR1 qui est associée à une diminution de la production de corps cétoniques (238). Ainsi, la diminution de la production de corps cétoniques après un repas induite par l’activation de mTORC1 est probablement stimulée par S6K2 (239). En résumé, S6K1 et S6K2 représentent des cibles thérapeutiques potentielles afin d’améliorer le métabolisme énergétique dans les maladies métaboliques telles que l’obésité et le diabète de type 2.

1.7 p90 ribosomal S6 kinase (RSK)

La p90 ribosomal S6 kinase (RSK) est une kinase de la même famille que les S6Ks, c’est-à- dire les AGC kinases et se retrouve sous 4 isoformes (RSK1-4). Tout comme les S6Ks, RSK a été découverte pour sa capacité à phosphoryler S6 (282, 283). Cependant, S6K1 et S6K2 sont les kinases prédominantes phosphorylant la protéine ribosomale S6 (284, 285). Alors que RSKs phosphoryle S6 uniquement sur les Ser235/36, S6K1/2 phosphoryle S6 sur

43 les Ser235, Ser236, Ser240, et Ser244 (286). Plus précisément, RSK 1 et 2 ont été montré pour phosphoryler S6 en réponse à des agonistes qui activent la voie MAPK (mitogen- activated protein kinase) telle l’insuline (286, 287). Les kinases ERK1/2 (extracellular signal–regulated kinase), qui font partie de la voie MAPK, activent les RSKs et sont impliquées dans plusieurs processus clés tels que la prolifération cellulaire, la différentiation, la survie, la migration et le métabolisme (Figure 15).

Figure 15 : L’activation de RSK et ses fonctions. La liaison des facteurs de croissance aux récepteurs tyrosine kinase induit l’activation de Ras qui active à son tour les Ser/Thr kinases de la famille Raf. Une fois activé, Raf stimule l’activation de la voie MAPK en phosphorylant directement MEK1/2 qui active ERK1/2. Les kinases RSK sont phosphorylées directement par ERK1/2 et PDK1 permettant son activation. RSK, activé, phosphoryle différents substrats cytosoliques et transloque au noyau afin de phosphoryler des facteurs de transcription qui régulent la croissance, la survie et la prolifération cellulaire ainsi que la progression du cycle cellulaire. Alors que PD184352, U0126 et PD98059 sont des inhibiteurs sélectifs pour MEK, BI-D1870, SL0101 et FMK inhibent la famille RSK. Grb2, growth-factor-receptor-bound protein 2; NF1, neurofibromin. (Adapté de (288))

Les isoformes RSK1-4 se ressemblent beaucoup puisqu’ils partagent 73-80% d’homologie et sont principalement différents dans les parties N- et C-terminales. De plus, le domaine

NTKD possède 57% d’homologie avec S6K1. La particularité de RSK est la présence de deux domaines kinases sur chacune des extrémités (N-terminale et C-terminale) pouvant phosphoryler des substrats sur la même protéine. En effet, la NTKD (N-terminal kinase domain) fait partie de la famille des AGC kinases tout comme Akt, S6K1/2, SGK et autres, alors que le CTKD (C-terminal kinase domain) appartient à la famille des Ca2+ /calmodulin-dependent protein kinases (CAMK) (289, 290). Cependant, l’unique fonction du domaine CTKD caractérisé jusqu’à maintenant est l’autophosphorylation du domaine NTKD alors que le domaine NTKD est responsable de la phosphorylation des différents substrats de RSK (289, 291, 292). RSK possède aussi un site d’amarrage KIM (kinase interaction motif) sur lequel ERK1/2 peut interagir directement avec RSK afin de l’activer (293, 294).

RSK contient 4 sites de phosphorylation (Ser321, Ser363, Ser380 et Thr573 chez l’humain) essentielle à l’activation de RSK et qui sont phosphorylés par des signaux mitogéniques (qui activent la prolifération et la croissance cellulaire) (295). L’activation de RSK se fait en plusieurs étapes. Tout d’abord, suite à des signaux mitogéniques, ERK1/2 se lie au domaine KIM de RSK et phosphoryle la boucle d’activation de la CTKD sur la Thr573. ERK1/2 phosphoryle également la Ser363 dans la région de liaison entre le CTKD et le NTKD. La phosphorylation de la Thr573 stimule l’autophosphorylation de la Ser380 par le CTKD dans la région de liaison (292, 294). La phosphorylation de la Ser380 crée ainsi un site d’amarrage pour PDK1 qui à son tour peut phosphoryler la Ser221 dans la boucle de NTKD (296, 297). Ensuite, lorsque PDK1 se dissocie de RSK, la Ser380 peut lier un site de liaison phosphate et permettre la stabilisation du NTKD dans sa forme active. Cette conformation permet ainsi l’activation complète de RSK et sa dissociation de ERK1/2 qui peut, par la suite, transloquer dans le cytosol ou le noyau afin de phosphoryler ses substrats.

L’expression des isoformes de RSK1-3 est ubiquitaire alors que RSK4 est peu exprimée à la fois à l’état embryonnaire et chez l’adulte (298). Par contre, des analyses disponibles de BioGPS provenant de puce à ADN d’Affymetrix indiquent qu’il y a des variations de l’expression des isoformes en fonction des tissus (288, 299). En effet, d’autres études ont confirmé que l’ARNm de RSK1 est plus abondant dans les poumons, les reins et le

45 pancréas alors que RSK2 et RSK3 sont plus abondants dans le muscle squelettique, le cœur et le pancréas (300, 301). Des analyses par Northern Blot montrent que RSK4 est faiblement exprimé dans le cerveau, le cœur, le cervelet et le muscle squelettique, mais elle n’est pas détectable dans le foie, les poumons, le pancréas et le tissu adipeux (302).

Les fonctions les plus connues de RSK incluent la signalisation nucléaire, la prolifération cellulaire, la croissance cellulaire, la synthèse protéique, la migration et la survie cellulaire. La plupart des études n’ont pas discriminé les effets de RSK pour chaque isoforme donc il se peut que des effets de RSK soient partagés par toutes ou quelques isoformes, ou encore unique à un isoforme en particulier. De plus, le site consensuel de phosphorylation de RSK est semblable aux autres kinases AGC telles que Akt et S6K1, suggérant qu’ils puissent partager plusieurs substrats communs. En effet, RSK phosphoryle plusieurs cibles d’Akt dont Akt substrate of 160 kDa (AS160), tuberous sclerosis complex 2 (TSC2), Bcl-2/Bcl- xL-antagonist (Bad), glycogen synthase kinase-3 (GSK3) et cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (p27kip1) et de S6K1 dont eukaryotic elongation factor-2 kinase (eEF2K), rpS6, GSK3 and eIF4B (288). Ainsi l’inhibition de ces kinases risque potentiellement d’induire des voies compensatoires.

Très peu d’études ont évalué le rôle de RSK sur le métabolisme du glucose et des lipides. La majorité des études portant sur RSK ont étudié son rôle dans le cancer, la prolifération et la survie cellulaire. Les données montrant un rôle potentiel de RSK dans le métabolisme proviennent surtout des souris déficientes pour RSK2 (RSK2 KO). En 2001, le groupe du Dr. L.J. Goodyear a montré que ces souris étaient plus petites et plus courtes, et présentaient une diminution de leurs aptitudes d’apprentissage et de coordination en comparaison aux souris WT (303). Malgré cela, ils ont également observé que Akt était fortement activé par l’insuline dans le muscle squelettique de ces souris. Cependant, le mécanisme derrière cette augmentation n’a pas encore été élucidé. Ils ont également observé une augmentation soutenue de l’activation de ERK après stimulation avec l’insuline dans le muscle des souris RSK2 KO suggérant ainsi que RSK exercerait un contrôle négatif en amont de ERK (303). Le même groupe a, par la suite, évalué le métabolisme de ces souris dans une autre étude. Les souris RSK2 KO sont

46 lypodystrophiques et caractérisées par une diminution de la masse adipeuse, une stéatose hépatique et une résistance à l’insuline (304). De plus, ces souris sont résistantes à l’obésité induite par une diète riche en gras montrant ainsi l’incapacité du tissu adipeux à s’expandre et entreposer des lipides (304). Ces résultats suggèrent également un rôle de RSK2 dans la physiologie, le développement et les fonctions du tissu adipeux.

Certains substrats de RSK sont aussi bien connus pour réguler le métabolisme énergétique. À commencer par mTORC1 puisque RSK phosphoryle TSC2 sur la Ser1798 inhibant ainsi son activité ce qui active mTORC1 (305-307). De plus, RSK phosphoryle positivement Raptor, une composante essentielle de mTORC1 (308). Ainsi, RSK fait un pont entre la voie MAPK et la voie mTORC1 afin de contrôler la croissance cellulaire et la synthèse protéique. Parallèlement, RSK régule également la synthèse protéique en phosphorylant directement S6 indépendamment de mTORC1 (282, 283, 286). Cependant, l’impact de RSK sur les rôles métaboliques de mTORC1 n’a pas été encore exploré. RSK a été montré pour aussi inhiber GSK3β en phosphorylant la Ser9 afin de réguler l’initiation de la traduction d’ARNm (309). L’inhibition de GSK3β par RSK enlève l’inhibition de GSK3β sur le facteur d’initiation de la traduction protéique eIF2B (310). Un autre rôle important de GSK3β est la régulation de la synthèse de glycogène. Cependant, RSK2 ne semble pas être requis pour activer la glycogène synthase par l’insuline. Par ailleurs, RSK, tout comme ERK, est capable de phosphoryler LKB1 sur des sites qui bloquent son interaction avec l’AMPK et l’inhibe (311). Ce mécanisme est un autre moyen d’activer mTORC1 et la prolifération cellulaire puisque l’AMPK est un inhibiteur de cette voie. Cependant, encore une fois aucune étude n’a étudié le rôle de RSK sur les effets métaboliques induit par l’AMPK qui est un régulateur central dans le métabolisme énergétique.

Une autre cible intéressante de RSK est AS160, une protéine impliquée dans la translocation de Glut4 à la membrane plasmique, qui est phosphorylée sur plusieurs sites par RSK (312). Malgré que certains de ces sites soient connus pour stimuler la translocation de Glut4 à la membrane plasmique, l’inhibition de RSK n’empêche pas la translocation de Glut4 à la membrane dans les 3T3-L1 stimulées à l’insuline. Par contre, l’inhibition de RSK par les inhibiteurs BI-D1870 et SL0101 diminue le captage de glucose stimulé par

47 l’insuline dans ces cellules, suggérant que RSK participe à l’entrée de glucose induite par l’insuline (313).

Par ailleurs, des différentes isoformes de RSKs sont exprimées dans le pancréas et pourraient jouer un rôle important dans les différentes fonctions de cet organe. En effet, la voie des MAPK est sensible au glucose, au GLP-1 (glucagon like peptide-1) (314) et au GIP (glucose-dependent insulinotropic polypeptide) (315) qui sont connus pour augmenter la sécrétion d’insuline. Certaines études ont montré que GLP-1 et GIP augmentaient l’activation des MAPK et également de RSK (315, 316). De façon intéressante, RSK2 a été montré pour s’associer directement au promoteur du gène de l’insuline dans les cellules β du pancréas (316). De plus, de fortes concentrations de glucose activent la voie des MAPK et RSK dans les cellules épithéliales de rein (MDCK) suggérant que RSK pourrait jouer un rôle dans la transmission de signaux provenant du glucose (317).

1.8 La mitochondrie

La mitochondrie est la principale source de production d’énergie. Cette organelle utilise différents substrats énergétiques comme le glucose et les lipides afin de produire de l’énergie suffisante pour les différentes fonctions cellulaires en fonction des besoins. Pour ce faire, la mitochondrie utilise une série de réactions d’oxydoréduction régulées par les complexes de la chaine respiratoire oxydative mitochondriale et qui nécessite la consommation d’oxygène. Ainsi, la mitochondrie joue un rôle primordial dans l’homéostasie énergétique et les maladies métaboliques. Ces aspects seront traités plus en détails dans les sections subséquentes.

1.8.1 La structure de la mitochondrie

L’une des particularités importantes de la mitochondrie est qu’elle possède son propre ADN. L’origine des mitochondries dans les cellules eucaryotes modernes provient, selon la communauté scientifique, de l’engouffrement d’une α-Protobacterium contenant des mitochondries dans des cellules précurseures il y a de cela 2 millions d’années (318). Par la suite, ces mitochondries provenant de procaryotes ont évolué et une grande partie du

48 matériel génétique mitochondrial a été perdu ou transféré au noyau (319). Ainsi, seulement une petite partie de cet ADN (16 kilobases) réside dans la matrice mitochondriale, mais en plusieurs copies et codent pour plusieurs protéines mitochondriales importantes (Figure 16).

La mitochondrie est composée d’une double membrane (membrane externe et interne) avec un espace intermembranaire et une matrice (entourée par la membrane interne et qui compose l’intérieur de la mitochondrie) (Figure 16). La membrane externe est poreuse et perméable aux ions et petites molécules non chargées. Toute autre molécule plus grosse doit utiliser des translocases pour traverser la membrane externe. La membrane interne est non perméable aux ions et autres petites molécules ce qui nécessite l’utilisation de protéines de transport qui sont sélectives pour certains ions et molécules. Ainsi, la sélectivité des ions de cette membrane crée un potentiel de membrane d’environ 180 mV au niveau de la membrane interne mitochondriale. Elle forme également des invaginations, appelées cristae, qui vont plus ou moins profondément à l’intérieur de la mitochondrie. Les cristae sont aussi les sites où les substrats énergétiques sont convertis en énergie. De plus, il y a un gradient de protons (H+) entre l’espace intermembranaire (pH 7.2–7.4) et la matrice (pH 7.9–8) qui stimule la production d’ATP par l’ATP synthase à la membrane des cristae (voir section 1.7.2). Par ailleurs, la matrice est le site de réplication et de la transcription de l’ADN mitochondrial ainsi que de la traduction protéique. L’ADN mitochondrial est compacté en supramolécule sphérique appelée nucléoïde par le facteur de transcription mitochondriale A (TFAM). Les ribosomes mitochondriaux sont attachés à la membrane interne et traduisent uniquement l’ARNm codant pour des protéines s’intégrant à la membrane interne. De plus, l’ADN mitochondrial humain code pour 13 protéines qui sont d’importants membres des différents complexes mitochondriaux (I-IV) ainsi que l’ATP synthase et qui sont intégrées à la membrane interne des mitochondries.

Figure 16. La structure de la mitochondrie. La mitochondrie comprend une membrane externe séparant la mitochondrie du cytoplasme. Elle enveloppe une membrane interne qui sépare l’espace intermembranaire de la matrice. La membrane interne forme également des cristae qui sont des structures qui s’insèrent plus ou moins profondément dans la matrice mitochondriale. Les cristae sont également le site où se produit la conversion de l’énergie. De plus, il y a un gradient de protons entre l’espace intermembranaire (pH 7.2-7.4) et la matrice (pH 7.9-8) qui stimule la production d’ATP par l’ATP synthase à la membrane des cristae. (Adapté de (320))

1.8.2 La chaine respiratoire oxydative

La matrice est également le lieu où les différentes réactions du cycle de Krebs surviennent. Le cycle de Krebs est l’étape qui suit le métabolisme du glucose, des lipides et des acides aminés afin de produire des molécules à haut potentiel de transfert d’électrons qui pourront être utilisées par la chaine de phosphorylation oxydative mitochondriale pour produire de l’ATP (Figure 17). Ces molécules sont la NADH (nicotinamide adénine dinucléotide),

FADH2 (flavine adénine dinucléotide) et l’ubiquinone (Coenzyme Q10). Ces électrons permettent de produire un gradient de protons, plus nombreux dans l’espace intermembranaire que dans la matrice (Figure 17). Ce gradient de protons est maintenu par trois complexes de protéines de la chaine de respiration oxydative soient les complexes I (NADH/ubiquinone oxidoreductase), III (cytochrome c reductase) et IV (cytochrome c oxidase). Le complexe I transfère les électrons à partir du NADH vers la chaine de respiration oxydative en passant par l’ubiquinone. L’énergie obtenue de ce transfert permet

50 le transport de 4 protons à travers la membrane interne. Le complexe III prend un électron de l’ubiquinol et le transfère au cytochrome c pompant au passage un proton. Finalement, le complexe IV transfère un électron du cytochrome c à une molécule d’oxygène et contribue au gradient en transportant 4 protons par molécule d’oxygène consommée afin de produire une molécule d’eau. Le complexe II (succinate dehydrogenase) transfert les électrons du

FADH2 à partir du succinate directement à l’ubiquinol et sera transféré au complexe III puis au complexe IV. Ensuite, le gradient de protons alimente le complexe V (ATP synthase) qui est une turbine rotative qui catalyse la formation d’ATP (Figure 17).

Figure 17 : Chaine de respiration oxydative mitochondriale. Le complexe I (NADH/ubiquinone oxidoreductase), coenzyme Q10 (ubiquinone), complexe II (succinate dehydrogenase), complexe III (cytochrome c reductase), complexe IV (cytochrome c oxidase) et l’ATP synthase mitochondriale (aussi connu comme le complexe V) fonctionnent ensemble afin de produire un gradient de protons en utilisant les électrons du NADH et FADH2. L’ATP synthase convertit ensuite l’ADP en ATP en utilisant l’énergie du gradient de protons. (Adapté de MyCancerGenome.org)

1.8.3 La production d’énergie par la mitochondrie

L’adénosine triphosphate (ATP) est la principale source d’énergie alimentant tout l’organisme. La consommation d’énergie utilisée pour la plupart des activités métaboliques de nos cellules est principalement fournie par la phosphorylation oxydative mitochondriale qui est plus efficace à produire de l’ATP que la glycolyse. En plus de ces fonctions énergétiques, la mitochondrie génère plusieurs intermédiaires pour la biosynthèse des dérivés réactifs de l’oxygène qui servent comme second messager pour induire différents

51 signaux afin de réguler le métabolisme. Les altérations des fonctions, du dynamisme et de la biogenèse mitochondriaux sont associées avec plusieurs désordres métaboliques tels le vieillissement, le cancer, les maladies neurodégénératives, les dysfonctions cardiaques, le diabète et l’obésité (321). Par ailleurs, la mitochondrie est un lieu où plusieurs molécules signalétiques convergent ou encore qui initie plusieurs signaux afin de communiquer le statut énergétique ou les dysfonctions mitochondriales à la cellule (voir section 1.8.4.) (322, 323).

Les deux sources principales de substrats énergétiques sont le glucose et les lipides. Les acides aminés participent également à la production d’énergie, mais après désamination, ils sont utilisés comme les glucides. À la fois l’entrée cellulaire de glucose et des lipides se fait en partie par diffusion passive selon les tissus ou en stimulant leurs entrées via des transporteurs qui répondent à différents stimuli comme l’insuline. Le métabolisme du glucose commence dès son entrée via une série de réactions enzymatiques formant la voie de la glycolyse qui consiste en la conversion du glucose en acetyl-CoA (Figure 18). La glycolyse est régulée par plusieurs facteurs, dont le système redox cytosolique (l’équilibre entre toutes les réactions d’oxydoréduction du cytosol) et les niveaux de phosphates. La glycolyse est activée lorsque le compartiment cytosolique est oxydé et lorsqu’il y a une réduction des niveaux de phosphates, c’est-à-dire une réduction d’ATP. Cet effet est en partie causé par l’activation allostérique de la pyruvate kinase par l’ADP ce qui résulte en une augmentation du flux glycolytique (324). Un autre fait intéressant est la présence de l’enzyme de la glycolyse hexokinase, qui est la première enzyme de la glycolyse convertissant le glucose en glucose-6-phosphate, à la membrane externe des mitochondries. Elle participe à produire de l’énergie de façon efficace entre la glycolyse et la phosphorylation oxydative, mais également à protéger la mitochondrie de par son action antioxydante et anti-apoptotique (325).

À la fois le glucose et les lipides vont former de l’acetyl-CoA qui entre dans le cycle de Krebs pour produire des molécules à haut potentiel de transfert d’électrons. Cependant, il est intéressant de noter que le glucose produit plus de NADH grâce à la glycolyse ce qui résulte en un ratio de NADH/FADH plus élevé que via l’oxydation des lipides. Ainsi les molécules de glucose utilisent le complexe I alors que les lipides utilisent plutôt le complexe II ce qui occasionne une compétition pour l’ubiquinone comme accepteur

52 d’électrons. Un haut ratio de FADH/NADH favorise le transfert d’électrons du complexe II vers l’ubiquinone et diminue l’oxydation du NADH au niveau du complexe I provoquant ainsi la production de produits réactifs oxygénés similaire à l’inhibition du complexe I. Malgré que les lipides produisent plus d’ATP par mole que le glucose (exemple : l’oxydation d’une molécule d’acide palmitique produit 106 moles d’ATP alors qu’une molécule de glucose environ 32 moles d’ATP), la force motrice engendrée par le transport de protons provenant d’une molécule de NADH est plus importante que le FADH2. En effet, le NADH produit 2.5 moles d’ATP alors que le FADH2 en produit 1.5 mole. Ainsi, pour une même quantité d’ATP, une molécule d’acide palmitique consomme environ 15% plus d’oxygène (23 moles) que le glucose (20 moles) (326), indiquant ainsi que les lipides sont le substrat de choix lorsque la cellule est bien approvisionnée en oxygène, mais en condition hypoxique le glucose est préférable (327).

Figure 18 : Le métabolisme énergétique. (A) Une fois que le glucose entre dans la cellule, une série de réactions enzymatiques formant la glycolyse convertit le glucose en pyruvate. Cette réaction forme au passage deux molécules d’ATP. À ce moment, le pyruvate peut être converti à son tour en lactate ou encore transporté dans la mitochondrie pour être converti en acetyl-CoA. (B) Puis, l’acetyl-CoA peut être utilisé par le cycle de Krebs afin de produire du NADH et du FADH2 qui seront utilisés pour former le gradient de protons nécessaire à la production d’ATP par la chaine respiratoire oxydative mitochondriale. (Adapté de MyCancerGenome.org)

1.8.4 Mécanisme de régulations des fonctions mitochondriales

1.8.4.1 La transcription

Il existe plusieurs façons de réguler les fonctions mitochondriales à commencer par la biogenèse mitochondriale au niveau de la transcription (Figure 19). La famille des PPARs est constituée de récepteurs nucléaires qui se lient directement aux lipides. Cette famille est composée de PPAR α, β (appelé aussi δ) et γ. Chacun d’entre eux a des ligands spécifiques et active des voies de transcription régulant le métabolisme des lipides (328). Par exemple, PPARα stimule l’oxydation des lipides en induisant l’expression d’enzymes oxydant les lipides dans les mitochondries et les peroxysomes (329). PPARβ/δ augmente aussi l’oxydation des lipides dans le muscle et le tissu adipeux (330). À l’inverse, PPARγ contrôle l’expression de gènes impliqués dans la lipogenèse et le stockage des lipides, notamment dans le tissu adipeux (330).

Un autre membre de cette famille est le PGC-1α (peroxysome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha) et ses cofacteurs qui sont des régulateurs clés de la biogenèse mitochondriale. Plusieurs molécules signalétiques affectent leurs activités, dont les ratios de NAD+/NADH et AMP/ATP, via l’activation des sirtuins (voir section 1.8.4.3) et de l’AMPK respectivement, vont influencer l’activation de PGC-1α et ses cofacteurs (331, 332). À la fois le NAD+ et l’ATP sont des indicateurs du statut métabolique et dont l’abondance dépend des niveaux de substrats énergétiques disponibles. Ainsi, le statut métabolique peut augmenter ou diminuer la quantité de mitochondries en fonction des besoins énergétiques (333). mTORC1, qui est inhibé par l’AMPK, est aussi connu pour influencer l’activité de PGC-1α. Dans le muscle squelettique, l’inhibition de mTORC1 diminue l’expression de PGC-1α, du récepteur à l’estrogène (ER) et du NRF (nuclear respiratory factor) ce qui entraine une diminution de l’expression des gènes mitochondriaux et par conséquent, de l’activité mitochondriale (181). De plus, le facteur de transcription YY1 (Yin Yang 1) a été montré pour être un partenaire d’interaction de PGC- 1α et mTORC1, essentiels à leur action sur la transcription des gènes mitochondriaux et leurs capacités oxydatives (181). Par ailleurs, mTORC1 régule aussi l’expression sélective de TFAM, des composantes du complexe I et V de la mitochondrie (334). Cette régulation serait induit positivement par eIF4E qui est inhibé par 4E-BP1, lui-même inhibé par

54 mTORC1. Ainsi, l’inhibition de mTORC1 entraine une diminution de la production d’ATP, une diminution des fonctions mitochondriales et une diminution de la glycolyse en modulant la transcription des gènes mitochondriaux (334) (Figure 19).

Figure 19 : Régulation du métabolisme mitochondrial par mTOR. mTOR coordonne, entre autres, la synthèse protéique, la biogenèse mitochondriale et l’autophagie afin de concentrer l’énergie à la croissance cellulaire et la prolifération. mTORC1 stimule les fonctions et la biogenèse mitochondriale en régulant PGC-1α et YY1, les ribosomes mitochondriaux et également à travers son substrat 4E-BP1 qui contrôle la traduction protéique de l’ARNm mitochondrial tel que TFAM et les complexes I et V. Malgré que S6K soit également un substrat de mTORC1 régulant la traduction protéique, ces effets semblent être médiés seulement par 4E-BP1. (Adapté de (335))

1.8.4.2 Modifications post-traductionelles

Parmi les modifications post-traductionelles possibles, l’acétylation de différentes protéines mitochondriales a récemment émergé comme étant un mécanisme important régulant les fonctions mitochondriales en fonction du statut énergétique. Plusieurs protéines mitochondriales peuvent être acétylées et parfois sur plusieurs résidus. Ces niveaux d’acétylations peuvent être également diminués, ou renversés, et ainsi réguler les fonctions mitochondriales incluant la phosphorylation oxydative, le métabolisme des dérivés de

55 produits oxygénés et le métabolisme des lipides. Les niveaux d’acétylations sont, entres autres, régulés par une famille de NAD+-dependent protein deacetylase nommée sirtuins dont 7 isoformes sont présentes chez la souris et l’humain. Les sirtuins utilisent le NAD+ comme cofacteur et ainsi sont sensibles aux niveaux énergétiques des ratios NAD+/NADH en plus des niveaux d’acetyl-CoA. La restriction calorique a été montrée pour augmenter les niveaux de NAD+ qui active la protéine mitochondriale SIRT3 et induit la désacétylation du NDUFA9 (mitochondrial complex I protein), de SOD2 (superoxide dismutase 2) et de LCAD (fatty acid oxydation enzyme) favorisant ainsi une meilleure efficacité des fonctions mitochondriales (Figure 20) (336-338). SIRT3 a aussi été montré pour participer à la fusion mitochondriale suite à la restriction calorique (339). La restriction calorique induit aussi une augmentation du ratio AMP/ATP ce qui active l’AMPK et qui active à son tour SIRT1 (340). SIRT1 peut alors désacétyler les protéines FOXO et PGC-1α afin d’augmenter la biogenèse mitochondriale et l’oxydation des lipides (333, 341) (Figure 20).

Figure 20 : Modifications post-traductionelles régulant les fonctions mitochondriales. Lorsque les nutriments sont limités, les niveaux d’AMPc augmentent,ce qui active la protéine kinase A. Ensuite, PKA phosphoryle et inactive Drp1 bloquant ainsi la fission mitochondriale. Cela a pour effet d’induire une élongation des mitochondries et la production d’ATP. La diminution des niveaux de nutriments augmente aussi les niveaux de NAD+ activant ainsi SIRT3 qui peut désacétyler le complexe I mitochondrial (NDUFA9), la superoxide dismutase (SOD2) et l’enzyme oxydative des lipides (LCAD). Parallèlement, l’absence de nutriments (niveaux bas d’AMP/ATP) induit l’activation d’AMPK qui phosphoryle FOXO et PGC-1α ce qui facilite leurs désacétylations par SIRT1 dont l’activité est augmentée par l’augmentation des niveaux de NAD+. FOXO et PGC- α phosphorylé par AMPK et désacétylé est complètement fonctionnel et

56 peut ainsi réguler la biogenèse mitochondriale. Ensemble, ces différents mécanismes permettent de fournir de l’énergie de façon efficace à la cellule afin de faire face au manque de nutriments. (Adapté de (342))

1.8.4.3 Le dynamisme mitochondrial

La mitochondrie n’est pas seulement une organelle statique ayant une morphologie unique. En vérité, cette organelle est très dynamique et la population mitochondriale chez les mammifères est très hétérogène en fonction des différents signaux environnementaux. Cette hétérogénéité s’explique par une architecture particulière régulée par l’équilibre entre la fusion et la fission de la mitochondrie. La fusion consiste en l’intégration de deux mitochondries afin de ne former qu’une seule entité et qui peut former, par ce processus, un réseau de mitochondries. Alors que la fission est le clivage d’une partie d’une mitochondrie pour former deux entités distinctes. La fusion est un processus à deux étapes qui nécessite la fusion d’une protéine de la membrane externe et de la membrane interne de la mitochondrie. Trois protéines sont impliquées dans ce phénomène soient la Mfn1 et Mfn2 (mitofusins-1 et -2) pour la fusion de la membrane externe ainsi que la IMM-located optic atrophy 1 (Opa1) pour la fusion de la membrane interne. À l’opposé, la fission s’effectue grâce à la Drp1 (dynamin-related protein) et à l’aide de protéines adaptatrices localisées à la membrane externe soit Mff, Mid49-51 et Fis1. La fusion et la fission s’autorégulent entre elles afin de se contrebalancer en fonction des besoins énergétiques (343). La fusion, activée entre autres par le jeûne, entraine une architecture mitochondriale tubulaire associée à une plus grande efficacité bioénergétique afin de maintenir les niveaux d’énergie alors que la fission, activée entre autres par l’excès de nutriments, induit une fragmentation des mitochondries plutôt associée à une diminution de l’efficacité énergétique des mitochondries qui favorise le stockage des nutriments (Figure 21).

Figure 21 : Le dynamisme mitochondrial et l’homéostasie énergétique L’homéostasie métabolique des cellules est contrôlée par la balance entre l’apport de nutriments et la demande cellulaire. Des perturbations dans l’apport d’énergie induisent des mécanismes d’adaptation afin de rééquilibrer la balance énergétique. En effet, une surcharge de nutriments est suivie d’une fragmentation du réseau mitochondrial qui mène à une diminution de l’efficacité bioénergétique afin de faciliter l’entreposage des nutriments et d’éviter la perte d’énergie. À l’inverse, une absence de nutriments induit une élongation du réseau mitochondrial afin d’augmenter l’efficacité bioénergétique et de fournir l’énergie nécessaire à la cellule. (Adapté de (344))

Un autre facteur important contribuant au dynamisme mitochondrial est l’autophagie mitochondriale (mitophagie) (Figure 22). L’autophagie est un mécanisme d’auto-digestion pouvant dégrader les protéines cytosoliques ou encore des organelles. L’autophagie sélective des mitochondries a été suggérée afin d’éliminer les mitochondries dysfonctionnelles qui produisent des niveaux élevés de dérivés de produits oxygénés. C’est un processus complexe qui nécessite tout d’abord la fragmentation (fission) de la mitochondrie afin d’être adéquatement identifiée et puis éliminée par l’autophagolysosome

(345). Par ailleurs, Rheb et l’AMPK ont récemment été identifiés comme des régulateurs de la mitophagie (115, 346, 347) (Figure 22).

Figure 22 : La mitophagie. Le dynamisme mitochondrial implique plusieurs cycles répétitifs de fusion et fission. La fusion mitochondriale est régulée par MFN1/2 (les deux protéines sont requises pour la fusion de la membrane externe) et par Opa1 (est requise pour la fusion de la membrane interne). La fission mitochondriale est régulée par Drp1, Mff et la Fis1. Lorsqu’une partie d’une mitochondrie devient dépolarisée, elle est ciblée pour être dégradée. La partie défectueuse accumule la protéine PINK1 à la surface de la mitochondrie qui recrute à son tour Parkin. Cette dernière, Parkin, induit l’ubiquitylation de la membrane externe ce qui initie le recrutement de l’autophagosome dont le contenu est dégradé après fusion avec un lysosome. (Adapté de (342))

1.8.4.4 La mitochondrie et le réticulum endoplasmique (ER)

La mitochondrie interagit à plusieurs niveaux avec la cellule afin de répondre adéquatement aux différents signaux externes. L’une des façons dont la mitochondrie communique avec la cellule est par l’interaction avec d’autres organelles. L’interaction qui a été la plus

étudiée est l’interaction directe entre le réticulum endoplasmique et la mitochondrie. Les premiers travaux montrant l’interaction entre ces deux organelles ont mené au développement du terme MAMs, pour Mitochondria-associated ER membranes (348). Les MAMs permettent de réguler plusieurs fonctions physiologiques de chacune d’entre elles, dont l’entrée de calcium (349) et de lipides (350) dans la mitochondrie ainsi que la mort cellulaire et la survie (351). La communication entre ces deux organelles se fait par leurs proximités causées par des structures spécifiques qui peuvent être stables ou transitoires. Une de ces structures est appelée ERMES (ER–mitochondria encounter structure) qui a été découverte dans les levures (Saccharomyces cerevisiae). Le complexe ERMES a été montré pour être impliqué dans le transfert de calcium du ER vers la mitochondrie, l’échange de phospholipides, l’importation de protéines et le maintien du matériel génétique mitochondrial (352-354). Pour le moment, aucun homologue de ces protéines formant le complexe ERMES n’a été découvert dans les cellules de mammifères. Cependant, plusieurs protéines composant les MAMs ont été identifiées (Figure 23). À commencer par Mfn-2, une protéine importante pour la fusion mitochondriale, qui est nécessaire à la formation des MAMs. La délétion de Mfn-2 réduit le nombre d’interactions entre le ER et la mitochondrie (355). Chez les mammifères, le transfert de Ca2+ du ER aux mitochondries est facilité par la chaperonne cytosolique GRP75 (glucose protein-related 75) qui forme un complexe avec un canal de relâche Ca2+ du réticulum endoplasmique soit l’IP3R (inositol-1,4,5-triphosphate receptor) et le canal anionique voltage-dépendent mitochondrial (VDAC) à la membrane externe mitochondriale (356). L’interaction entre ces protéines crée la proximité nécessaire pour l’échange de Ca2+ (349). Une fois que les ions Ca2+ ont passé la membrane externe mitochondriale, ils peuvent entrer dans la matrice via le canal MCU (mitochondrial Ca2+ uniporter). Les MAMs sont aussi enrichies en protéines qui permettent la synthèse et le transport des phospholipides et glycosphyngolipides (357).

Figure 23 : Composition des MAMs. L’étroite interaction entre le réticulum endoplasmique (ER) et la mitochondrie est essentielle pour le transfert de calcium rapide et soutenu à l’intérieur de la mitochondrie. Les VDACs (voltage-dependent anion channels), localisés à la membrane externe mitochondriale (OMM), sont responsables du transfert rapide du Ca2+ du ER vers la mitochondrie. À ces endroits, des microdomaines de transfert de Ca2+ se mettent en place afin de faciliter le transfert dans la matrice mitochondriale. L’accumulation de Ca2+ dans la matrice est possible grâce à MCU (mitochondrial Ca2+ uniporter). Plusieurs protéines régulatrices et chaperons contrôlent la formation des jonctions ER-mitochondrie. MFN2 (Mitofusin 2) est impliqué dans la fusion des mitochondries et dans les contacts ER-mitochondrie en interagissant avec MFN2 ou MFN1. Des protéines chaperones, tels que calreticulin et calnexin, régulent le Ca2+ du ER et la stabilité des protéines signalétiques. Par exemple, le récepteur sigma 1 stabilise inositol-1,4,5-trisphosphate (Ins(1,4,5) P3) receptors 2+ 2+ (Ins(1,4,5)P3Rs) lorsque les dépôts de Ca sont diminués afin d’assurer un flux de Ca du ER vers la mitochondrie. D’autres protéines comme GRP75 (75 kDa glucose-regulated protein) assurent une interaction 2+ efficace entre Ins(1,4,5)P3Rs et VDACs afin de faciliter le captage de Ca mitochondrial ou encore PML (promyelocytic leukaemia) qui permet le transfert de calcium. Parmi ces protéines, on retrouve également FACL (long-chain fatty-acid CoA ligases) dans les MAMs qui est impliqué dans le métabolisme des lipides. (Adapté de (358))

Le transfert de Ca2+ a un impact très important sur la fonction mitochondriale, car il est essentiel au fonctionnement de la mitochondrie. Le Ca2+ peut directement activer les enzymes cataboliques PDC (pyruvate dehydrogenase complex), isocitrate déhydrogénase et α-ketoglutarate déhydrogénase (359). De plus, le Ca2+ peut stimuler directement l’ATP + synthase (359). À l’opposé, une surexposition de la mitochondrie au Ca2 induit l’apoptose

61 en activant la mPTP (mitochondrial permeability transition pore) qui résulte en une dissipation du potentiel de membrane mitochondrial, un changement de la structure des mitochondries et la relâche de facteurs proapoptotiques tels le cytochrome c induisant l’apoptose (360, 361). Une autre fonction très intéressante des MAMs est que c’est un endroit où plusieurs molécules de signalisation sont localisées, dont quelques-unes sont impliquées dans la signalisation de l’insuline. Akt se retrouve au niveau des contacts ER-mitochondrie où il phosphoryle IP3R réduisant ainsi les flux de calcium vers la mitochondrie afin de prévenir l’apoptose (Figure 24) (362). De plus, mTORC2 lié à Akt se situe également au niveau des MAMs afin de stabiliser ces structures, inhiber les influx de calcium vers la mitochondrie et phosphoryler l’hexokinase II (HK2) mitochondriale (202). Au niveau mitochondrial, l’hexokinase assure un couplage efficace entre la glycolyse et la phosphorylation oxydative mitochondriale en augmentant le recyclage de l’ADP produit par l’hexokinase par la mitochondrie (325, 363).

Figure 24 : Régulation des MAMs par mTORC2/Akt. mTORC2 est localisé au niveau des contacts ER-mitochondrie (MAMs). À cet endroit, mTORC2 active Akt et phosphoryle IP3R, HK2 et PACS2 (Phosphofurin acidic cluster sorting protein 2). Ainsi, Akt inhibe le transfert de calcium, active la glycolyse et assure un couplage efficace avec la phosphorylation oxydative, et augmente l’intégrité des MAMs. Cependant, le rôle physiologique de ces kinases à cet endroit n’est pas encore éclairci. (Adapté de (202))

1.8.4.5 La mitochondrie et les dérivés réactifs de l’oxygène (ROS)

Figure 25: Oxydation de l’oxygène par la chaine respiratoire oxydative mitochondriale. La production d’un dérivé oxygéné par l’addition d’un seul électron (e-). (Adapté de (364))

La mitochondrie est le site principal de production des ROS. Cette production varie en fonction des stress sur la chaine de transport d’électrons. Les ROS sont issus d’une fuite d’électrons à travers la chaine de transport d’électrons. En effet, les électrons passent à travers une série de protéines, chacune ayant un potentiel de réduction plus important que la protéine précédente pour finalement réduire 4 électrons afin de convertir l’O2 en H2O (Figure 25). Cependant, il arrive que cette réduction soit incomplète ou même prématurée générant les ROS. Les ROS sont des dérivés de l’O2 et sont composés de radicaux - - oxygénés tels que le superoxide (O2 ) et l’hydroxyle (HO ) et des molécules non radicales telles que le peroxyde d’hydrogène (H2O2). À noter que jusqu’à 2% de l’oxygène consommé peut être dérivé en ROS en condition basale au niveau des complexes I et III de la mitochondrie (365). Hormis les changements de flux énergétiques vers la mitochondrie, plusieurs stress peuvent augmenter les niveaux de ROS tels que la radiation, l’infection de pathogènes, l’exposition à des xénobiotiques, la chaleur, les herbicides/insecticides, les toxines environnementales et la lumière ultraviolette (366). Des niveaux élevés de ROS peuvent induire plusieurs dommages cellulaires au niveau de l’ADN, des lipides et des protéines. L’ADN mitochondrial est particulièrement à risque d’être endommagé de par sa proximité avec les niveaux élevés de ROS mitochondriaux et qui est également dépourvu de système de réparation comparativement à l’ADN nucléaire (Figure 26). Ces changements causés par les ROS peuvent profondément changer la fonction de protéines, l’expression de gènes régulant le métabolisme et la survie cellulaire. Ces dommages ont été

63 montrés pour être impliqués dans plusieurs pathologies telles que l’obésité, le diabète de type 2, la résistance à l’insuline (367), les maladies cardiovasculaires (368), les cancers (369) et les maladies neurodégénératives (370). De plus, la production de ROS est associée avec le vieillissement (366).

Figure 26 : Rôle des ROS dans le développement des dysfonctions mitochondriales et métaboliques. Il existe plusieurs sources de dommages (éclairs oranges, a-d) causant une dysfonction mitochondriale. (a) Le surplus de nutriments induit l’accumulation de lipides intermédiaires qui surcharge et hyperpolarise la mitochondrie. L’oxydation incomplète des lipides par le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA, cycle de Krebs) et la chaine respiratoire oxydative (OXPHOS) induit une augmentation des produits dérivés oxygénés (ROS) qui induit un stress oxydatif. Ces intermédiaires peuvent aussi activer des kinases sensibles au stress telles que protéine kinase C, PKC; c-Jun N-terminal kinase, JNK; and IκB kinase, IKK qui phosphorylent négativement IRSs favorisant ainsi le développement de la résistance à l’insuline. (b) Les ROS produits en excès vont endommager l’ADN mitochondrial ainsi qu’endommager les protéines mitochondriales qui sont essentielles au système OXPHOS et au dynamisme mitochondrial. (c) Une dysfonction du dynamisme mitochondriale et une diminution de la mitophagie entrainent l’accumulation de mitochondries dysfonctionnelles. (d) Afin de compenser la demande en surplus d’énergie ou la dysfonction mitochondriale, la cellule peut augmenter la biogenèse mitochondriale en contrôlant l’activité de PGC1α. Cependant, un stress comme la production de ROS peut diminuer la capacité de ce mécanisme à compenser les mitochondries défectueuses. Par ailleurs, la résistance à l’insuline contribue au développement d’un cycle vicieux en diminuant la biogenèse et en inhibant l’activité du cycle de Krebs et de l’OXPHOS. (Adapté de (371))

Malgré leurs effets néfastes, lorsque produits à de fortes concentrations et chroniquement, les ROS sont aussi des molécules signalétiques essentielles à la physiologie cellulaire (Figure 27) (372-374). En effet, plusieurs stimuli physiologiques induisent la production de ROS tels que l’exercice dans le muscle squelettique (375) et le jeûne prolongé (376). Complexifiant encore plus la théorie du vieillissement qui serait en partie causé par l’augmentation de la production de ROS avec l’âge, la plupart des études ayant utilisé des antioxydants n’ont pas eu d’effets ou ont même diminué la longévité dans différents modèles (377). Par ailleurs, la majorité des études cliniques visant à étudier l’efficacité des antioxydants sur diverses pathologies n’ont pas fonctionné (378). Ces résultats peuvent être en partie expliqués par la réponse physiologique induite par la production faible à modérée de ROS. Plusieurs études ont confirmé la nécessité des ROS afin d’induire l’autophagie en réponse à plusieurs stimuli tels que le jeûne prolongé (374, 379-381) et l’exercice (382). L’un des rôles de l’autophagie est d’éliminer les mitochondries qui produisent de fortes quantités de ROS afin de prévenir les dommages qu’ils pourraient engendrer via la mitophagie. Mécanistiquement, les ROS peuvent être détectés par plusieurs protéines/mécanismes, dont la ATM (Ataxia telangiectasia mutated) et les niveaux de glutathion. En effet, l’ATM cytosolique est activé par les ROS ce qui active l’AMPK et ainsi inhibe mTORC1 afin d’activer l’autophagie (174, 383-386). D’autre part, les niveaux de ROS affectent différents systèmes antioxydants endogènes tels que les glutathion - peroxidases qui diminuent les niveaux de O2 et H2O2 par l’utilisation de gluthation (GSH). Lorsque les niveaux de ROS cytosolique augmentent, certaines modifications posttraductionnelles peuvent survenir sur des protéines par la S-gluthationylation qui consiste en la formation d’un pont disulfure entre un groupe S-H d’une protéine et le gluthation en présence de H2O2. La gluthationylation peut changer l’activité de protéines telles l’AMPK (387) et activer l’autophagie (388). Ainsi, les ROS sont des molécules signalétiques importantes qui peuvent réguler l’homéostasie mitochondriale en activant la mitophagie notamment via l’activation de l’AMPK et en inhibant mTORC1 dans le but d’éliminer les mitochondries dysfonctionnelles.

Figure 27: Rôle des ROS comme molécules de signalisation dans le contrôle de l’autophagie lors du jeûne. Superoxide (O2⨪) et H2O2 sont les deux formes de ROS principalement produites par la mitochondrie durant le jeûne. Ils régulent positivement l’autophagie par au moins trois différents mécanismes incluant (a) la S- glutahionylation des résidus cystéines (SH → S-SG) localisés dans les sous-unités α et β d’AMPK, (b) l’oxydation de la Cys81 (SH → Sox) de la protéine Atg4 qui inactive la délipidation de LC-3 favorisant ainsi l’accumulation de la forme LC3-II pro-autophagique, (c) l’altération du statut redox (exemple : diminution des niveaux du ratio GSH/GSSG augmentant l’oxydation des groupements thiols, Sox) qui est facitilitée par la relâche de gluathion réduit (GSH) dans le milieu extracellulaire par la protéine de résistance aux médicaments (MRP1). Parallèlement, le stress oxydatif peut aussi activer l’ubiquitination de

66 p62/Sequestosome 1 qui interagit avec Keap1 (Kelch-like ECH- associated protein 1), un membre du complexe Cul3 ubiquitin E3 ligase, afin d’être dégradé par l’autophagie ce qui induit son détachement de la protéine Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2). Ainsi Nrf2 n’est plus dégradé par le système ubiquitin-3 proteasome et transloque au noyau afin d’activer la transcription de gènes anti-oxydants en se liant sur le AREs (antioxidants-responsive elements). (Adapté de (374))

1.8.5 La mitochondrie et son rôle dans les maladies métaboliques.

La mitochondrie est au centre de plusieurs maladies métaboliques telles que l’obésité et le diabète de type 2 (389). Même s’il est bien connu que ces maladies puissent être améliorées ou prévenues par l’activité physique régulière et de saines habitudes alimentaires, la compliance des patients à ces recommandations est mauvaise et ces maladies continuent d’augmenter de façon épidémique. Un des effets bénéfiques de l’activité physique et d’une bonne alimentation est l’augmentation ou la préservation des fonctions mitochondriales. Ainsi le développement de stratégies pharmacologiques afin d’améliorer ces fonctions est de plus en plus envisagé afin de traiter ces maladies (390). De façon intéressante, les fonctions mitochondriales et l’oxydation des lipides s’adaptent dans les phases initiales d’exposition à une diète riche en gras qui augmente les flux de lipides (jusqu’à 1 mois) (391, 392). Cependant, une exposition prolongée aux lipides altère les fonctions mitochondriales et les mécanismes exacts impliqués dans cette transition sont encore inconnus, mais il est clair que cette dysfonction contribue à l’augmentation des dépôts ectopiques de lipides ainsi qu’au développement de la résistance à l’insuline. Toutefois, le débat demeure toujours à savoir si les dysfonctions mitochondriales sont une cause ou une conséquence de la résistance à l’insuline chez l’humain (393, 394).

Une des particularités des maladies métaboliques est l’incapacité de faire la transition entre les substrats énergétiques en fonction des besoins, appelée l’inflexibilité métabolique (395). En effet, lors du jeûne les lipides sont les substrats utilisés alors qu’en condition postprandiale, l’utilisation des substrats passe vers le métabolisme du glucose qui est notamment stimulé par l’insuline (396). Le stockage et l’utilisation efficace des nutriments après un repas sont des caractéristiques de gens en santé alors que l’inflexibilité métabolique caractérise les gens souffrant d’obésité, de diabète de type 2 et de résistance à l’insuline (395, 397). Dans des modèles d’obésité, la dysfonction mitochondriale est

67 associée avec une augmentation des gouttelettes lipidiques dans le muscle squelettique et l’accumulation ectopique de lipides (333, 393, 397, 398). De plus, ces lipides peuvent interférer avec la signalisation de l’insuline et contribuer directement à la résistance à l’insuline (399-401). Cette accumulation de lipides est aussi associée avec une diminution des capacités oxydatives mitochondriales et de l’expression des gènes mitochondriaux (182, 402). De manière intéressante, il y a une corrélation directe entre la diminution des fonctions mitochondriales et l’augmentation de la résistance à l’insuline avec l’âge suggérant encore une fois un lien entre ces deux phénomènes (403).

Les MAMs sont également impliquées dans la résistance à l’insuline puisque l’exposition chronique à des lipides augmente les MAMs. En effet, l’obésité et l’exposition aux lipides contribueraient au développement de dysfonctions mitochondriales en augmentant les flux de Ca2+ vers la mitochondrie (404 {Egnatchik, 2014 #1351}. Cependant d’autres études viennent contredire le rôle du calcium mitochondrial dans la signalisation de l’insuline proposé par ces études. Récemment, le blocage de l’entrée de calcium dans la mitochondrie a été montré pour diminuer la translocation de Glut4 à la membrane induite par l’insuline dans les cellules du muscle squelettique et les cardiomyocytes (405, 406). Ces résultats + suggèrent donc que le Ca2 mitochondrial joue un rôle sur la capacité de l’insuline à stimuler le captage de glucose. De plus, en déplétant certaines composantes des MAMs diminuant ainsi leur nombre, Tubbs et collègues (407) ont montré que les MAMs étaient essentielles à la signalisation de l’insuline dans les hépatocytes alors que la surexpression de ces composantes diminuait l’activation de la cascade de signalisation de l’insuline. Ils ont également montré que des lipides qui induisent une résistance à l’insuline diminuaient aussi les MAMs. Ces perturbations étaient aussi présentes dans des modèles animaux génétiquement modifiés et nutritionnels d’obésité. À l’inverse, restaurer la sensibilité à l’insuline dans ces modèles par l’utilisation d’agents pharmacologiques comme la roziglitazone restaure le nombre de MAMs. Ainsi, le rôle des MAMs dans la signalisation de l’insuline, les dysfonctions mitochondriales et l’obésité reste encore à éclaircir. D’autres études seront nécessaires afin d’évaluer le rôle des MAMs dans l’établissement des niveaux de calcium mitochondriaux régulés par la signalisation de l’insuline en condition normale vs en situation de résistance à l’insuline.

Par ailleurs, une surcharge en lipides induit des changements rapides et transitoires dans l’architecture mitochondriale (Figure 28). Les rats obèses Zucker et les humains obèses ont une diminution de l’expression de Mfn2 (protéine de fusion mitohondriale) dans leurs muscles squelettiques qui est associée à une diminution du réseau et de la taille des mitochondries (408). La délétion de Mfn2 dans les myocytes réduit aussi la consommation d’oxygène, l’oxydation du glucose, l’incorporation du glucose en glycogène ainsi que l’oxydation du pyruvate et du palmitate dans les myotubes (408, 409). De plus, les souris génétiquement obèses ou induites par une diète ont une augmentation de la fragmentation mitochondriale et de l’expression des protéines de fission Drp1 et Fis1 dans le muscle squelettique (410). Cette augmentation de la fission mitochondriale est reproduite par le palmitate dans des cellules musculaires suggérant un rôle important des lipides dans l’induction de la fission (410). L’inhibition de la fission mitochondriale dans ces modèles améliore la signalisation de l’insuline dans le muscle squelettique et la sensibilité à l’insuline in vivo (410). De plus, les lipides peuvent stimuler la noradrénaline à induire la fission mitochondriale dans le tissu adipeux brun afin d’augmenter sa capacité de découplage in vivo et ex vivo (389, 411). Ainsi, l’induction de la fission mitochondriale par les lipides est peut-être un moyen cellulaire d’éviter le dépôt trop important de lipides dans la cellule en augmentant leur oxydation via le découplage, mais chroniquement, les lipides induisent une fragmentation mitochondriale importante favorisant ainsi la dysfonction mitochondriale et la résistance à l’insuline.

Afin de maintenir les fonctions mitochondriales, la cellule peut éliminer les mitochondries dysfonctionnelles par la mitophagie. ULK1 qui est une cible d’AMPK et de mTORC1 est nécessaire à l’initiation de l’autophagie (111). L’activité de ULK1 dépend de l’équilibre entre AMPK et mTORC1 qui régulent, respectivement, son activité positivement et négativement. Ainsi, AMPK et mTORC1 régulent la mitophagie en régulant l’initiation de la formation des autophagosomes via ULK1 (115, 346, 412). Récemment, l’AMPK a aussi été montré pour être nécessaire à l’induction de la fission mitochondriale, une étape requise pour la mitophagie, en régulant la protéine MFF (413). Cependant, mTORC1 est suractivé dans l’obésité et le diabète de type 2 favorisant ainsi l’inhibition de l’autophagie et de la mitophagie.

Figure 28 : L’homéostasie de la morphologie mitochondriale. (A) La mitochondrie possède un cycle de vie qui est dépendant de son environnement. Ce cycle est caractérisé par une série de fusions et fissions mitochondriales. La fusion génère un réseau dans lequel les composantes de deux mitochondries se mélangent et se réorganisent. La fission qui survient dans les minutes suivantes sépare la mitochondrie en deux mitochondries filles avec deux potentiels de membrane différents (vert). La mitochondrie fille qui a un potentiel de membrane élevé sera la première à retourner dans le cycle de fusion et fission alors que l’autre avec un potentiel de membrane dépolarisé restera seule jusqu’à ce que son potentiel de membrane retourne à la normale. Si son potentiel de membrane reste dépolarisé, la mitochondrie perdra sa capacité à fusionner et entrera dans le processus pré-autophagique (mitophagie). Dans un délai de 1-3h, ces mitochondries sont éliminées par autophagie. (B) Des changements dans la disponibilité des nutriments et de la demande en énergie peuvent entrainer des changements dans ce cycle de vie des mitochondries et étendre la durée des mitochondries à l’état allongé (post-fusion) ou fragmenté (post-fission). L’élongation mitochondriale est le résultat d’une augmentation de la fusion ou de la diminution de la fission. Cet état est bien souvent le résultat d’une demande importante en énergie (jeûne prolongé, stress aigus et la sénescence). Des mitochondries qui restent fragmentées sont le résultat d’une diminution de la fusion et d’une

70 augmentation de la fission. Cet état est associé à une diminution de l’efficacité bioénergétique (augmentation du découplage de la respiration oxydative mitochondriale). Ainsi, puisque l’adaptation bioénergétique à un apport d’énergie élevé induit un arrêt du cycle de vie mitochondriale, une exposition élevée et chronique de nutriments diminue le contrôle de « qualité » des mitochondries par la mitophagie ce qui favorise une dysfonction mitochondriale. (Adapté de (389))

II-Problématique et objectifs du projet de recherche

L’obésité et le diabète de type 2 sont des pathologies métaboliques complexes qui ont pris des proportions épidémiques. Jusqu’à maintenant, aucun traitement pharmacologique contre l’obésité même en association à une intervention intensive de changements d’habitudes de vie n’a montré une perte de poids significative de plus de 10 % (414, 415). Cependant, une diminution du poids initial de 5-10% est suffisante pour retarder l’apparition de diabète de type 2 et réduire les risques d’évènements cardiovasculaires (415, 416). Cette diminution du risque cardiovasculaire peut être même plus importante si la perte de poids est plus grande (417). Malgré ces données provenant d’études cliniques, ces résultats sont difficilement obtenus dans la pratique médicale et le maintien des pertes de poids est très difficile (418, 419). En ce qui a trait au diabète de type 2, les traitements pharmacologiques actuels ont pour objectif de contrôler le diabète et de ralentir sa progression. Cependant, d’autres options thérapeutiques sont nécessaires afin d’augmenter l’efficacité des traitements actuels puisque la gestion des patients avec le diabète de type 2 est très complexe due aux multiples facteurs (gènes, environnements) qui influencent la résistance à l’insuline et les dysfonctions des cellules β du pancréas (420). Cette maladie nécessite donc des thérapies parfois multiples qui sont souvent associées à des effets secondaires importants complexifiant ainsi le traitement du diabète de type 2 (421, 422).

Ainsi d’autres thérapies pharmacologiques sont nécessaires afin d’obtenir une perte de poids plus importante et/ou diminuer les complications associées à l’obésité tels la résistance à l’insuline et le diabète de type 2. Une particularité intéressante de la voie mTORC1/S6K1 dans l’obésité et le diabète de type 2 est que cette voie est suractivée dans la plupart des tissus régulant l’homéostasie énergétique (55, 67, 96, 269). D’autres études ont également montré un rôle important de cette voie dans la dérégulation des fonctions cardiaques (423), des fonctions vasculaires (424) et des macrophages (425) dans l’obésité. Basé sur ces résultats, il a été suggéré que l’inhibition sélective de la voie mTORC1 puisse être un moyen efficace de contrecarrer la résistance à l’insuline induite par l’excès de nutriments ou l'obésité. En effet, une inhibition aigüe de mTORC1 augmente la signalisation de l’insuline, le captage de glucose musculaire, diminue la gluconéogenèse

72 hépatique et l’hyperlipidémie (70, 426). Cependant, malgré l’augmentation ou le maintien de l’activité d’IRS-1/PI3K suite à l’inhibition chronique de mTORC1/S6K1 par la rapamycine, l’activité d’Akt est diminuée. Conséquemment, cela cause chez l'animal et l’humain une résistance à l’insuline, une intolérance au glucose et une hyperlipidémie associée à des perturbations majeures dans les voies de transcription régulant la gluconéogenèse hépatique, le métabolisme des lipides dans le tissu adipeux et la sensibilité à l’insuline musculaire (427-431). Ces effets peuvent être partiellement expliqués par l’inhibition de mTORC2, un complexe essentiel à la phosphorylation sur la Ser473 d’Akt, par un traitement chronique à la rapamycine (432, 433). De plus, ces effets sont également retrouvés chez les patients traités chroniquement avec la rapamycine pour son effet immunosuppresseur afin de faciliter certaines transplantations d’organes (434). Une autre raison pouvant expliquer ces effets métaboliques néfastes associés à l’utilisation chronique de la rapamycine est le rôle important de mTORC1 dans la biogenèse mitochondriale (181) et l’autophagie (435) qui sont toutes deux diminuées avec un traitement chronique à la rapamycine. Ainsi, ces résultats illustrent la nature complexe des fonctions métaboliques de mTORC1. En effet, mTORC1 exerce un contrôle précis sur la signalisation de l’insuline, mais il joue également un rôle physiologique essentiel dans l’homéostasie du glucose et des lipides via la régulation de gènes de transcription clé, dans les tissus cibles de l’insuline. Une approche qui cible plutôt les substrats en aval de mTORC1 ou des régulateurs de mTORC1 ou encore d’autres kinases régulant les mêmes substrats que mTORC1 entrainerait peut-être moins d’effets secondaires que son inhibition complète.

2.1 L’inhibition pharmacologique de S6K1 et la signalisation de l’insuline

L’une des protéines importantes en aval de mTORC1 est la kinase S6K qui contribue à une partie des effets délétères causés par mTORC1 dans les pathologies métaboliques. Jusqu’à maintenant, les études évaluant le potentiel thérapeutique de l’inhibition de S6K1 ont utilisé uniquement des méthodes d’invalidation du gène (voir section 1.6.2). En 2010, un inhibiteur sélectif pour l’isoforme S6K1, le PF-4708671, a été caractérisé avec une constante d’inhibition (Ki) de 20 nM et une concentration d’efficacité (IC50) de 160 nM. Nous avons donc émis l’hypothèse que S6K1 est un régulateur distinct du métabolisme et

73 que son inhibition prolongée améliorera la sensibilité à l’insuline et le métabolisme énergétique sans entraîner les effets délétères d’une inhibition chronique de mTORC1.

Figure 29: Structure de l’inhibiteur PF-4708671

L’objectif principal de ce projet était d’étudier les effets chroniques d’une inhibition pharmacologique de S6K1 dans la régulation du métabolisme du glucose et des lipides comparativement à la rapamycine (Chapitre I). Ainsi, nous avons tout d’abord vérifié l’impact du PF-4708671 sur la signalisation de l’insuline dans les cellules musculaires et les hépatocytes. Ensuite, nous avons déterminé si l’inhibition de S6K1 influençait le captage de glucose musculaire et la production hépatique de glucose. Puis, nous avons évalué si PF-4708671 pourrait devenir un traitement potentiel afin d’améliorer le métabolisme du glucose chez des souris obèses. Finalement, nous avons cherché à déterminer les mécanismes additionnels derrière les changements métaboliques induits par le PF-4708671 qui sont indépendants d’une amélioration de la sensibilité à l’insuline (Chapitre II). 2.2 L’inhibition de RSK et la signalisation de l’insuline

La voie mTORC1/S6K1 est activée par l’insuline et l’excès de nutriments comme les acides aminés (AA), menant ainsi à l’inhibition de la voie PI3K/AKT par la phosphorylation inhibitrice d’IRS1 dont la sérine 1101 (55, 67-70, 426). En effet, la voie mTORC1/S6K1 induit un retard de la migration de la protéine IRS1 (indicateur de modifications posttraductionnelles) induite par l’insuline seulement lorsqu’il y a deux fois plus d’AA puisque la rapamycine bloque l’effet de l’insuline. Cependant, d’autres kinases

74 peuvent entrainer des modifications posttraductionnelles induites par l’insuline sur IRS1 (Figure 30). En effet, l’insuline peut également retarder la migration de la protéine IRS-1 même lorsque la voie mTORC1 ne peut pas être activée (en absence d’acide aminé) (Figure 30). En effet, l’insuline retarde la migration de la protéine IRS-1 même en absence d’acide aminé et même lorsque la voie mTORC1/S6K1 est inhibé avec la rapamycine. Par conséquent, l’une de ces kinases pourrait être RSK qui est stimulé par l’insuline dans ces même conditions (phospho-S221) puisqu’elle partage 57% d’homologie de son domaine kinase avec S6K1.

Modifié Native

Figure 30 : Modifications post-traductionnelle d’IRS1 en réponse aux acides aminés et à l’insuline Des myotubes L6 différenciés ont été incubés avec des concentrations constantes d’acides aminés (0X, 1X, 2X AA) durant 60 min. La rapamycine (25 nM) ou le véhicule (DMSO) a été ajouté durant 60 min. L’insuline (100 nM) a été ajoutée durant les 45 dernières minutes. Puis, les cellules ont été lysées, préparées pour un SDS-PAGE et un immunobuvardage de type Western blot en utilisant un anticorps anti-IRS-1 polyclonal, un anti-phospho-S6K1 T389 ou anti-phospho-RSK S221. La tubuline a été utilisée comme contrôle. Au niveau d’IRS-1, un retard de migration de la protéine sur un gel d’électrophorèse en conditions dénaturantes indique plusieurs modifications post-traductionelles de la protéine induisant un poids moléculaire plus grand que la forme native.

Nous avons donc émis l’hypothèse que RSK pourrait phosphoryler IRS1 afin de réguler la signalisation de l’insuline et ainsi contribuer au développement de la résistance à l’insuline (Chapitre III). L’objectif de ce projet était dans un premier temps de démontrer si RSK interagissait directement avec IRS1 et s’il pouvait phosphoryler IRS1. Deuxièmement de montrer si l’inhibition de RSK pouvait améliorer la signalisation de l’insuline et troisièmement si l’inhibition de RSK avait un impact sur la production de glucose hépatique et le transport du glucose musculaire en culture.

Chapitre I

Avant-propos

L’objectif du projet de recherche était de vérifier l’hypothèse selon laquelle l’inhibition pharmacologique de S6K1 allait améliorer la signalisation de l’insuline, sa fonction et le métabolisme du glucose dans un modèle animal d’obésité. Je suis l’auteur principal de cette étude qui a été publiée dans le journal Diabetologia.

La conceptualisation générale du projet a été effectuée par Dr André Marette et moi. Les études cellulaires ont toutes été effectuées par moi sauf les extractions nucléaires afin de déterminer les niveaux d’expression des facteurs de transcriptions qui a été faite par Kesrtin Belleman. Toutes les études chez les animaux ont été faites par moi avec l’aide de Philippe St-Pierre. J’ai effectué tous les immunobuvardages de type western. J’ai procédé à l’analyse statistique, réalisée et assemblé les figures. Le manuscrit a initialement été écrit par moi, supplémenté par Kerstin Belleman et Philippe St-Pierre et finalement, corrigé et amélioré par Dr André Marette. Avec l’appui du Dr André Marette, j’ai été en charge de la soumission de l’article et la communication avec les arbitres et l’éditeur du journal.

Article

Pharmacological inhibition of S6K1 increases glucose metabolism and

Akt signalling in vitro and in diet-induced obese mice

Michael Shum, Kerstin Bellmann, Philippe St-Pierre, André Marette

Department of Medicine, Quebec Heart and Lung Institute, Hôpital Laval, Pavillon

Marguerite d'Youville, Room Y4308, 2705 Chemin Ste-Foy, Québec, Canada G1V 4G5

Corresponding author: André Marette, Department of Medicine, Quebec Heart and Lung

Institute, Hôpital Laval, Pavillon Marguerite d'Youville, Room Y4308, 2705 Chemin Ste-

Foy, Québec, Canada G1V 4G5

Email: [email protected]

Received: 18 June 2015 / Accepted: 13 November 2015

Diabetologia. 2016 Mar;59(3):592-603

Résumé

La voie mTORC/S6K1 est suractivée dans l’obésité menant ainsi à une inhibition de la voie PI3K/Akt et une induction de la résistance à l’insuline. Ainsi, nous avons utilisé dans cette étude un inhibiteur sélectif de S6K1, PF-4708671, afin de déterminer si l’inhibition de S6K1 pouvait améliorer l’homéostasie du glucose et la résistance à l’insuline. Nous avons utilisé des cellules musculaires L6 et hépatiques FAO afin d’explorer les effets métaboliques de l’inhibition de S6K1 sur le transport de glucose musculaire, la production hépatique de glucose et la signalisation de l’insuline. Nous avons également traité des souris soumises à une diète riche en gras avec le PF-4708671 pendant 1 semaine pour évaluer l’effet de l’inhibition de S6K1 sur le métabolisme du glucose in vivo. Nous avons observé que l’inhibiteur de S6K1 induisait une augmentation du transport du glucose, une diminution de la production de glucose hépatique dans les cellules L6 et les FAO ainsi qu’une amélioration de la tolérance au glucose chez des souris obèses. Ainsi, nous proposons que l’inhibition de S6K1 soit une stratégie thérapeutique intéressante pour traiter l’intolérance au glucose chez les individus obèses.

Abstract

Aims/hypothesis The mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1)/p70 ribosomal S6 kinase (S6K)1 pathway is overactivated in obesity, leading to inhibition of phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt signalling and insulin resistance. However, chronic mTORC1 inhibition by rapamycin impairs glucose homeostasis because of robust induction of liver gluconeogenesis. Here, we compared the effect of rapamycin with that of the selective S6K1 inhibitor, PF-4708671, on glucose metabolism in vitro and in vivo. Methods We used L6 myocytes and FAO hepatocytes to explore the effect of PF-4708671 on the regulation of glucose uptake, glucose production and insulin signalling. We also treated high-fat (HF)-fed obese mice for 7 days with PF-4708671 in comparison with rapamycin to assess glucose tolerance, insulin resistance and insulin signalling in vivo. Results Chronic rapamycin treatment induced insulin resistance and impaired glucose metabolism in hepatic and muscle cells. Conversely, chronic S6K1 inhibition with PF- 4708671 reduced glucose production in hepatocytes and enhanced glucose uptake in myocytes. Whereas rapamycin treatment inhibited Akt phosphorylation, PF-4708671 increased Akt phosphorylation in both cell lines. These opposite effects of the mTORC1 and S6K1 inhibitors were also observed in vivo. Indeed, while rapamycin treatment induced glucose intolerance and failed to improve Akt phosphorylation in liver and muscle of HF-fed mice, PF-4708671 treatment improved glucose tolerance and increased Akt phosphorylation in metabolic tissues of these obese mice. Conclusions/interpretation Chronic S6K1 inhibition by PF-4708671 improves glucose homeostasis in obese mice through enhanced Akt activation in liver and muscle. Our results suggest that specific S6K1 blockade is a valid pharmacological approach to improve glucose disposal in obese diabetic individuals. Keywords: Akt, Glucose tolerance, Glucose uptake, Hepatic glucose production, Insulin resistance, mTORC1, PF-4708671, Rapamycin, S6K1, Type 2 diabetes

Abbreviations: AMPK AMP kinase CREB cAMP response element-binding protein FOXO Forkhead box O G6Pase Glucose-6-phosphatase GTT Glucose tolerance test HF High fat HFD High-fat diet HNF4α Hepatocyte nuclear factor 4α KO Knockout MSK1 Mitogen and stress activated kinase 1 mTORC 1/2 Mammalian target of rapamycin complex 1/2 PGC1α Peroxisome proliferator-activated receptor γ, coactivator 1 α PI3K Phosphoinositide 3-kinase PTT Pyruvate tolerance test RSK p90 ribosomal S6 kinase S6K p70 ribosomal S6 kinase TG Triacylglycerol

Introduction

Insulin is an essential hormone that regulates many physiological pathways such as cellular growth, proliferation, glucose and lipid homeostasis. Impaired insulin action has been shown to play major roles in metabolic diseases, such as obesity and type 2 diabetes. Several Ser/Thr kinases have been found to phosphorylate multiple Ser residues in IRS-1 in response to growth factors, nutrient excess or inflammatory stimuli, which inhibit insulin signalling and contribute to insulin resistance. These include the mammalian target of rapamycin (mTOR) and p70 ribosomal S6 kinase (S6K) as well as c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) and inhibitor of nuclear factor-B (IKK) [1, 2]. Both ribosomal S6 kinases—p70 ribosomal S6 kinase (S6K) and p90 ribosomal S6 kinase (RSK)—are well recognised key insulin signalling proteins [3, 4]. The two S6K isoforms, S6K1 and S6K2, were originally thought to be redundant proteins due to their

80 high homology. However, recent studies suggest distinct roles for each isoform (reviewed in [5]). Indeed, S6K1 participates in insulin-mediated cell growth but—like mTORC1— also operates negative feedback loops at various levels of regulation. For example, several studies have shown that both mTORC1 and/or S6K1 phosphorylate specific serine residues on IRS proteins [6, 7]. Moreover, some of these IRS-1 sites, notably Ser 1101 and Ser 636, were differentially regulated by mTOR and S6K1 [8, 9]. We have further reported that Ser 1101 is an important target of S6K1 and that this site is hyperphosphorylated in animal models of obesity and upon nutrient excess in humans [10]. Recently, Liu et al [11] reported that S6K1 can also disrupt mTORC2 by phosphorylating Sin1 on both T86 and T398 residues. All these negative feedback control mechanisms reveal the importance of S6K1 in the regulation of insulin’s pleiotropic actions. The metabolic functions of S6K1 were also demonstrated using genetic models. Indeed, S6K1 knockout (KO) mice are resistant to high-fat (HF)-diet-induced obesity, and showed improvement of glucose tolerance and insulin signalling [12]. However, S6K1 KO mice on standard low-fat diet are also hypoinsulinaemic, glucose intolerant and have reduced beta cell mass due to a lesion in glucose sensing or insulin production [13]. Younis et al [14] further observed an improvement in glucose tolerance using antisense oligonucleotides against S6K1 in mice for 4 weeks; however, this was associated with a decrease in body weight and food intake. Interestingly, adeno-associated virus (AAV)- mediated hepatic S6K1/2 depletion was recently shown to improve systemic insulin resistance, hepatic gluconeogenesis and hepatic steatosis [15]. These studies suggest that S6K1 inhibition may be an interesting therapeutic option to alleviate obesity-linked insulin resistance and type 2 diabetes. Acute pharmacological inhibition of the mTORC1/S6K1 pathway with rapamycin increases insulin signalling and glucose metabolism in vitro and in animal models of insulin resistance [10, 16-18]. However, chronic rapamycin treatment causes diabetes-like symptoms due to alterations in hepatic gluconeogenic genes and lipid storage in fat [9, 19, 20]. However, no studies have yet evaluated the effect of specifically inhibiting S6K1 on cellular insulin signalling, glucose metabolism and whole-body glucose homeostasis. Recently, the selective S6K1 inhibitor PF-4708671 has been characterised [21], allowing us to test the effect of pharmacological inhibition of S6K1 on glucose metabolism for the first

81 time. Here, we observed that PF-4708671 reduced hepatic glucose production and stimulated muscle glucose uptake in vitro, in association with increased Akt phosphorylation in both hepatocytes and myocytes. Moreover, PF-4708671 improved glucose tolerance in HF-fed obese mice by restoring Akt S473 phosphorylation in metabolic tissues, suggesting that S6K1 inhibition may represent a valid approach to improve glucose control in obese individuals with type 2 diabetes.

Methods

Reagents and antibodies Reagents and antibodies are included in Electronic Supplementary Material (ESM) Methods. Cell culture L6 myoblasts were grown in α-MEM (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) supplemented with 10% (vol.vol./vol) FBS and differentiated into myotubes in α-MEM with 2% (vol./vol.) FBS as previously described [22]. L6 cells were serum-deprived for 5 h prior to the experiments, and 100 nmol/l of insulin was used to stimulate the cells during the last 5 min of deprivation. FAO hepatocytes were maintained in RPMI media (Invitrogen), serum-deprived overnight and stimulated with the indicated concentration of insulin. Vehicle (dimethyl sulfoxide, DMSO 0.02 % (vol./vol.)) or rapamycin (25 nmol/l) or PF-4708671 (10 µmol/l) were used since p70 S6 kinase is fully inhibited at this dose [21]. Only mycoplasma free cells were used.

Western analyses Western blots were performed as described [19]. Briefly, equal amounts of proteins were separated by SDS-PAGE (7.5% (wt/vol.)) and transferred onto nitrocellulose membrane. Membranes were blocked in 5% (wt/vol.) fish gelatin diluted in Tris pH 7.4 + 0.1% (vol./vol.) Tween (TBS-T) and incubated overnight at 4°C with the respective antibodies diluted in 1% (wt/vol.) fish gelatin in TBS-T. Immunoprecipitations were performed as described with minor modification [19]. Total cells lysates (500 µg) were pre-cleared with protein A/G sepharose (Santa Cruz Biotechnology, Paso Robles, CA, USA) and immunoprecipitated with the appropriate antibodies coupled to protein A/G sepharose.

Glucose uptake Glucose (2-DG) uptake was performed as previously described [22] (see ESM Methods).

Glucose production Glucose production was evaluated in FAO hepatocytes as described previously [23] (see ESM Methods).

Animal studies Animal handling and treatment were approved by the Animal Care and Handling Committee of Laval University. Male C57Bl/6 mice (6 weeks old) were purchased from Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canada) and housed individually in cages in a room kept at 23 ± 1°C with a 12 h light/12 h dark cycle. Mice were randomly distributed among groups but match for body weight at the beginning of the studies. Glucose and pyruvate tolerance test were done blinded. Male C57Bl/6 mice (6 weeks old) were fed high-fat diet (HFD, 60 % Kcal from fat, Research Diets, D12492 (New Brunswick, NJ, USA)) for 12 weeks before being randomly assigned to three groups: (1) control (HF) receiving vehicle (8% EtOH (vol./vol.), 0.2% (wt/vol.) carboxymethylcellulose sterile); (2) treated with PF-4708671 (35 mg kg-1 day-1, i.p.); or (3) treated with rapamycin (2 mg kg-1 day-1, i.p.) for 7 days while being kept on the same HFD (ESM Methods). i.p. glucose and pyruvate tolerance tests After 12 weeks of HFD feeding, mice were fasted for 6 h and injected i.p. with glucose (1 g/kg) diluted in saline, 0.9% (wt/vol.). For the pyruvate tolerance test (PTT), mice were fasted for 6 h and injected i.p. with pyruvate (2 g/kg; Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) diluted in saline, 0.9% (wt/vol.).

Plasma/tissue determinations Blood glucose levels were measured by a One Touch Mini Ultra Glucometer (LifeScan, CA, USA). Plasma insulin was determined by radioimmunoassay (Linco Research, St Charles, MO, USA). Triacylglycerol (TG) levels in plasma and liver were measured by enzymatic methods according to the manufacturers’ instructions (Randox Lab kit, WV, USA). Total lipid was isolated from 0.1 g frozen liver using chloroform–methanol extraction [24]. Hepatic TG content was enzymatically

83 determined from reconstituted lipid extract. Liver glycogen was determined using the phenolsulphuric acid reaction [25].

Nuclear extracts Liver nuclear extracts were prepared as previously described [19] and subjected to immunoblotting as described above.

RNA extraction and quantitative PCR analysis RNA extraction and quantitative PCR analysis were performed as described previously [19] (see ESM Methods).

Quantification and statistical analyses One- and two-way ANOVA with Newman–Keuls post hoc was performed with Sigma Plot version 12 (Systat Software, San Jose, CA, USA); p values were considered significant if they were <0.05. SEMs are represented in the graphs. The criterion for exclusion of animals was a >20% deviation from the mean weight of the other animals of the same group. The criterion for the exclusion of any data point was a distance > ±2.5 × SD from the mean of the other data from the same group.

Results

S6K1 inhibition decreases S6 phosphorylation and increases Akt phosphorylation in hepatocytes As the main target of S6K1, ribosomal S6 protein phosphorylation was first measured after treatment with PF-4708671 in hepatocytes. Both basal and insulin-stimulated S6 phosphorylation on S235/6 were rapidly inhibited by PF-4708671, and the inhibitory effect was maintained for up to 24 h in insulin-treated cells (Fig. 1). Moreover, S6K1 Thr389 phosphorylation increased after PF-4708671 treatment, a finding that is in line with previous reports, and that was suggested to involve some feedback pathways by which S6K1 might regulate its own phosphorylation by mTORC1 [21, 26]. As previously shown using genetic tools in cells [10], pharmacological S6K1 inhibition by PF-4708671 reduced insulin-stimulated IRS1 S1101 phosphorylation. PF-4708671 treatment increased insulin- induced Akt phosphorylation from 5 h and this effect was sustained for up to 24 h (Fig. 1b,c). We also rule out that PF-4708671 might inhibit mitogen and stress activated kinase 1 (MSK1) since this inhibitor did not inhibit Thr581 MSK1 and Ser133 cAMP response 84 element-binding protein (CREB) induced by phorbol myristate acetate (PMA) in hepatocytes (ESM Fig. 1), in line with previous work by Pearce et al [21].

S6K1 inhibition decreases glucose production in hepatic cells To evaluate the role of S6K1 in liver glucose metabolism, we measured basal and insulin-suppressed glucose production in FAO hepatic cells. PF-4708671 treatment for 5 h decreased basal glucose production, which was further reduced with increasing concentrations of insulin (Fig. 2a). We previously reported that chronic rapamycin treatment increased hepatic glucose production in rats and FAO cells [19]. We thus compared the effect of chronic PF-4708671 treatment with that of rapamycin by treating FAO cells for 72 h with either drug before measuring glucose production. As illustrated in Fig. 2b, chronic S6K1 inhibition reduced basal glucose production while chronic rapamycin treatment increased it. When corrected for differences in basal rates of glucose production, the results revealed that rapamycin treatment reduced the suppressing effect of insulin while insulin action on glucose production remained unaffected by S6K1 inhibition (Fig. 2c,d). Nuclear extractions of proteins involved in gluconeogenic enzyme expression revealed that hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α), forkhead box O (FOXO) and CREB were decreased after 72 h inhibition of S6K1 while chronic rapamycin treatment increased the levels of these proteins compared with vehicle (Fig. 2e). However, peroxisome proliferator-activated receptor γ, coactivator 1α (PGC1α) expression in the nucleus was not affected by the treatments. In line with these results, FAO cells treated with PF-4708671 showed reduced mRNA expression of the gluconeogenic enzymes PEPCK (also known as Pck1) and G6Pase (also known as G6pc) (Fig. 2f). Chronic rapamycin treatment increased G6Pase protein content but PF-4708671 failed to affect glucose-6-phosphate (G6Pase) and PEPCK protein levels (Fig. 2g). As expected, both acute and chronic PF-4708671 treatment reduced insulin- mediated S6 phosphorylation (Fig. 2h). On the other hand, chronic rapamycin treatment completely reduced both basal and insulin-stimulated S6 phosphorylation, even below the level of vehicle-treated control cells. Interestingly, acute and chronic inhibition of S6K1 increased insulin-induced Akt phosphorylation while this was fully abrogated in cells chronically exposed to rapamycin (Fig. 2h). Whereas rapamycin treatment increased basal

Akt T308 phosphorylation, insulin-induced Akt S473 phosphorylation was disrupted by the inhibitor.

S6K1 inhibition increases glucose uptake in L6 myocytes We next determined whether S6K1 inhibition improves glucose uptake using L6 myocytes. PF-4708671 markedly increased basal glucose uptake after 5 h and this effect persisted up to 48 h compared with vehicle-treated cells (Fig. 3a). Insulin did not further increase the effect of the S6K1 inhibitor on glucose uptake. Conversely, 48 h rapamycin treatment significantly reduced basal and insulin-mediated glucose uptake in these muscle cells. The stimulatory effect of PF-4708671 on glucose uptake was fully abolished by Akt inhibition using the Akt inhibitor, Viii (Fig. 3b). As in hepatocytes, PF-4708671 reduced insulin-induced S6 phosphorylation while chronic rapamycin treatment fully abrogated this response in L6 muscle cells (Fig. 3c). After 48 h treatment, S6K1 inhibition increased Akt phosphorylation. However, rapamycin was found to decrease Akt S473 while increasing both basal and insulin-mediated Akt T308 phosphorylation (Fig. 3c). Recently, PF-4708671 was reported to enhance AMP kinase (AMPK) phosphorylation in mouse embryonic fibroblasts lacking S6K [27]. However, AMPK Thr172 phosphorylation was not increased after 5 h and 72 h treatment of L6 myocytes with the S6K1 inhibitor (Fig. 3d). Collectively, these results demonstrate that glucose metabolism is increased after PF-4708671 exposure in both muscle and hepatic cells.

In vivo treatment with PF-4708671 improves glucose homeostasis in obese mice To evaluate the therapeutic potential of PF-4708671 in vivo, we treated HFD-fed obese mice with PF-4708671 for 1 week and compared its effect with that of rapamycin. As expected, the HFD induced body weight gain, adiposity, hyperglycaemia and hyperinsulinemia as compared with mice fed the chow diet (Table 1). While PF-4708671 did not affect body weight or adiposity, rapamycin treatment was found to significantly reduce body weight, which was partly related to decreased inguinal adipose tissue weight. Interestingly, only 1 week of PF-4708671 treatment was found to improve fasting glucose whereas rapamycin further increased fasting hyperglycaemia in obese mice. In addition to fasting glucose,

86 rapamycin treatment was also found to increase fasting insulinaemia as previously reported in various rodent models [19, 20, 28, 29]. To determine the impact of S6K1 inhibition on glucose homeostasis, we next performed a glucose tolerance test (GTT). The HFD induced glucose intolerance, which was partially reversed by S6K1 inhibition but further exacerbated by rapamycin treatment (Fig. 4a,b). The improvement of glucose tolerance by S6K1 inhibition was independent of changes in plasma insulin levels while rapamycin increased the insulin response during the GTT (Fig. 4c). HF feeding also increased liver TG but decreased liver glycogen content (Fig. 4d,e). PF-4708671 tended to decrease slightly liver TG and glycogen content compared with the HF group while rapamycin tended to increase them leading to a statistically significant difference between the drugs.

Chronic PF-4708671 and rapamycin effect on gluconeogenesis in vivo The rapamycin- induced deterioration of glucose tolerance was also associated with increased gluconeogenesis as measured by a PTT, which was not affected by PF-4798671 treatment (Fig. 5a). Accordingly, PF-4798671-treated mice expressed a similar level of nuclear PGC1α, HNF4α and CREB compared with HF-fed control mice (Fig. 5b). As expected from the increased hepatic gluconeogenesis in the rapamycin-treated mice, we found higher nuclear expression of CREB and HNF4α in the liver of these animals. HF-fed mice treated with the S6K1 inhibitor expressed similar mRNA levels of gluconeogenic enzymes compared with vehicle-treated HF-fed controls while G6Pase mRNA levels were increased in liver of rapamycin-treated mice (Fig. 5c).

Chronic PF-4708671 improved Akt S473 phosphorylation in HF-fed mice tissues To further explore the mechanisms underlying the metabolic phenotype of PF-4708671-treated mice, we next analysed Akt phosphorylation in liver, muscle and adipose tissues. In liver, the HFD induced a decrease in insulin-stimulated Akt S473 phosphorylation in all tissues, which was fully restored by PF-4708671 in liver and muscle, but only partially improved in adipose tissue. In contrast, rapamycin treatment only partially restored Akt S473 phosphorylation in liver but not in muscle and adipose tissues (Fig. 6a–c). The effect of the drug on Akt Thr308 phosphorylation was less clear. Whereas both PF-4708671 and

87 rapamycin treatments tended to improve insulin-induced Thr308 phosphorylation in liver and muscle (Fig. 6a,b), only rapamycin was found to improve the phosphorylation of this site in adipose tissue of obese mice (Fig. 6c). Both PF-4708671 and rapamycin were found to blunt the HFD-induced increased S1101 phosphorylation of IRS-1 in liver and adipose tissue (ESM Fig. 2). IRS-1 phosphorylation on S1101 could not be detected in muscle (data not shown). To determine whether the tissue-specific effects of PF-4708671 on Akt phosphorylation may be related to differential inhibition of S6K1 in liver, muscle and adipose tissue, we further evaluated the phosphorylation state of S6 in those tissues. Unexpectedly, PF-4708671 did not inhibit S6 phosphorylation, which was, however, completely inhibited by rapamycin under both basal and insulin-stimulated conditions (Fig. 7a–c). On the other hand, treatment with PF-4708671, but not rapamycin, caused a marked increase in S6K1 phosphorylation, at least in liver and adipose tissue (Fig. 7a–c). This is consistent with the inhibition of S6K1 by PF-4708671, as seen in vitro (Fig. 1) and previous reports [21, 26], suggesting that other kinases might phosphorylate ribosomal S6 proteins in those tissues in vivo.

Discussion

The mTORC1/S6K pathway regulates many essential processes such as growth, proliferation, protein synthesis and lipogenesis. In addition, several studies have emphasised the role of mTORC1/S6K1 in metabolism since this pathway senses nutrients and energy (ATP) but also regulates insulin signalling at various levels. Acute treatment (<2 h) with the mTORC1 inhibitor, rapamycin, improves the metabolic actions of insulin through disrupting the negative feedback loop towards phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt signalling in both cellular and animal models [10, 16-18]. However, when administered chronically (>24 h) rapamycin also has important adverse metabolic effects in rodent models and in humans, causing hyperlipidaemia, hyperglycaemia and hyperinsulinaemia [9, 19, 30, 31]. In the present study, we show that chronic S6K1 inhibition does not reproduce the adverse effects observed after chronic rapamycin treatment. In vitro studies using hepatic and muscle cells revealed that S6K1 inhibition with PF-4708671 reduced hepatic glucose

88 production and increased muscle glucose uptake, and these effects were seen even in the absence of insulin stimulation. In both cell types we found that, in contrast to rapamycin treatment, PF-4708671 increased insulin-induced Akt phosphorylation. The therapeutic relevance of these cellular findings was further demonstrated in HF-fed mice, in which chronic treatment with PF-4708671 for 7 days was found to improve glucose tolerance, while chronic rapamycin exacerbated glucose intolerance in these obese animals. This improvement in glucose homeostasis after S6K1 inhibition was associated with a restoration of Akt phosphorylation in liver, muscle and adipose tissues. Although PF- 4708671 did not inhibit MSK1 (ESM Fig. 1) or RSK1 [23] in muscle and hepatic cells, we cannot completely exclude that part of its beneficial effects on glucose homeostasis in vivo is explained by partial inhibition of these enzymes. However, our finding that pharmacological inhibition of S6K1 improves glucose metabolism is in line with previous studies using genetic models of S6K1 deficiency. Um et al [12] first showed that S6K1–/– mice are protected against diet-induced obesity and insulin resistance, and this was associated with increased Akt S473 phosphorylation in insulin target tissues. More recent studies have also shown that antisense oligonucleotides against S6K1 in rats or liver- specific downregulation of S6K1/2 using a lentiviral approach in the liver of HF-fed mice improved glucose tolerance and insulin sensitivity, which was associated with increased Akt S473 phosphorylation in the liver and adipose tissue in the latter study [14, 15]. Our results show that S6K1 inhibition represents a more suitable target to improve glucose homeostasis as compared with abrogating the mTORC1/S6K1 pathway with rapamycin, which has been reported to impair glucose and lipid metabolism after chronic in vivo exposure [9, 19, 29]. The adverse effects of chronic rapamycin treatment are partly due to off-target effects on mTORC2 [29, 32, 33], which impairs Akt S473 phosphorylation and activity [34, 35], but these side effects were not observed with selective S6K1 inhibition in the present study. In contrast, we found that PF-4708671 increased Akt S473 phosphorylation, which was associated with blunted inhibitory S1101 phosphorylation on IRS1 in vitro and in vivo. However, S6K1 is also involved in a negative feedback loop towards mTORC2/Akt signalling, which has been recently linked to inhibitory phosphorylation of the mTORC2 subunit Sin1 on Thr86 and Thr398 by S6K1 [11, 34, 36]. Indeed, Sin1 phosphorylation by S6K1 inhibits the ability of mTORC2 to phosphorylate

Akt at S473. This may explain the preferential effect of PF-4708671 on Akt S473 and not Akt T308 as revealed by immunoblot analysis of Akt phosphorylation sites in FAO cells and insulin target tissues of HF-fed obese mice. In line with these results, PF-4708671 has been also shown to be cardioprotective against myocardial infarction in mice by increasing Akt phosphorylation [37]. Thus, increased Akt activity likely plays a major role in the beneficial metabolic outcomes of S6K1 inhibition by PF-4708671. Our studies in hepatic and muscle cells further suggest that PF-4708671 increases glucose metabolism independently from insulin action. Indeed, we observed that glucose production by hepatocytes is reduced after acute and chronic treatment with PF-4708671, whereas insulin-mediated suppression was not further enhanced by S6K1 inhibition. Similarly, PF-4708671 robustly increased basal glucose uptake in L6 myocytes and insulin did not further increase the stimulatory effect of PF-4708671 on this process. This insulin- independent effect of the S6K1 inhibitor is consistent with the finding that S6K-mediated Sin1 phosphorylation negatively regulates mTORC2 independently from insulin signalling [11]. S6K1 inhibition in hepatic cells was associated with increased Akt S473 phosphorylation and lower mRNA expression of PEPCK and G6Pase gluconeogenic enzymes as well as a reduction in CREB, FOXO and HFN4α nuclear levels. However, PF- 4708671 failed to significantly reduce PEPCK or G6Pase protein expression despite lower mRNA expression of these enzymes. It is possible that G6Pase and PEPCK proteins are only reduced in specific cellular compartments [38-40]. Indeed, we have used a PEPCK1- specific antibody that recognises the cytosolic isoform, whereas PEPCK2 is predominantly a mitochondrial form. Moreover, other important enzymes for gluconeogenic flux such as pyruvate carboxylase and fructose 1,6-bisphosphatase, which are regulated by CREB, HNF4α and FOXO, might also be affected by PF-4708671. In addition, previous studies have showed that hepatic gluconeogenesis can be regulated independently from the expression of these enzymes. Indeed, changes in gluconeogenic flux have been previously described in humans without changes in PEPCK1/2 or G6Pase protein/mRNA expression [41]. Moreover, Foretz et al [42] showed that metformin decreases hepatic glucose production via a transcription-independent process, through changes in hepatic energy state, which were also independent from AMPK activation. The detailed molecular mechanisms

90 underlying the suppressive effect of PF-4708671 on hepatic glucose production still need to be fully elucidated. Whereas PF-4708671 treatment was found to improve glucose tolerance in HF-fed obese mice, the drug failed to improve gluconeogenesis, as measured during the PTT and by determination of the gluconeogenic programme. Nevertheless, other observations suggest that liver insulin sensitivity was improved in PF-4708671 treated obese mice, especially when compared with mice chronically exposed to rapamycin. Indeed, liver Akt S473 phosphorylation was normalised in these mice and liver glycogen content was improved, while hepatic TG levels were decreased in these animals when compared with rapamycin-treated obese mice. Although gluconeogenesis is unaffected, one potential mechanism underlying this hepatic phenotype of PF-4708671 treated obese mice may involve a compensatory increase in S6K2 activity. Previous studies have shown that S6K2 can compensate for the loss of S6K1 (also known as Rps6kb1) in S6K1 KO mice and that S6K2 is the major kinase phosphorylating ribosomal S6 proteins [43, 44]. In mice with partial genetic deletion of both S6K1 and S6K2 (also known as Rps6kb2) in the liver, suppression of hepatic glucose production by insulin was increased [15], suggesting that S6K2 might also play a role in gluconeogenesis. Indeed, S6K2-deficient mice are more insulin sensitive than wild-type mice exposed to HFD [45] especially given that S6K2 also interacts with Yin Yang 1 [46], a transcriptional factor that promotes hepatic gluconeogenesis [47]. In addition, based on the study of Kim et al [48], S6K2 is more activated in liver of ob/ob mice suggesting that S6K2 might also be more active in our HF- diet-induced obesity model. The potential role of compensatory mechanisms after chronic inhibition of S6K1 by PF-4708671 warrants further investigation in future studies. Current pharmacological treatments fail to achieve optimal glycaemic control and it is therefore critical to develop new therapeutic options for patients with type 2 diabetes. In this study, we provide evidence that the specific S6K1 inhibitor PF-4708671 decreased hepatic glucose production and muscle glucose uptake in vitro, and improved glucose tolerance in vivo, which may be of clinical relevance for type 2 diabetes treatment. Indeed, unlike mTORC1/S6K1 inhibition by rapamycin which has adverse metabolic effects when chronically given in vivo selective S6K1 inhibition clearly improved glucose tolerance and insulin signalling in metabolic tissues, as revealed by improvement of Akt phosphorylation

91 in HF-fed obese mice. Our results thus suggest that pharmacological inhibition of S6K1 is a valid therapeutic approach for treatment of obesity-linked type 2 diabetes.

Acknowledgements The authors acknowledge V. Dumais, C. Dallaire and C. Dion for their technical help at Cardiology Axis of the Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de Québec (CRIUCPQ), Hôpital Laval, Québec, Canada.

Funding This work was funded by a grant from Canadian Institutes of Health Research (CIHR) to AM (FRN- 57878); MS was supported by a PhD studentship from Fond de recherche du Québec en santé (FRQS). AM holds a CIHR/Pfizer research Chair on the pathogenesis of insulin resistance and cardiovascular diseases.

Duality of interest The authors declare that there is no duality of interest associated with this manuscript.

Contribution statement All authors were responsible for the conception and design of the study, for the analysis and interpretation of data, and for writing and editing the manuscript, and thus all contributed to its intellectual content. All authors gave final approval of the version to be published. AM is the guarantor of this work and, as such, had full access to all the data in the study and takes responsibility for the integrity of the data and the accuracy of the data analysis.

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Table 1 Effect of 7-day PF-4708671 and rapamycin treatment on weight, food intake and metabolic variables of treated mice

Metabolic variable Standard diet HFD

Vehicle Vehicle PF Rapa

Body weight (g) 28.78±0.33a 39.21±1.23b 38.75±0.74b,c 35.51±0.90c

Energy intake 45.63±1.08 45.93±1.51 41.49±0.96 44.34±1.51 (kJ/day) Fasting glucose 8.80±0.26a 10.46±0.54b 9.18±0.26a 12.83±0.45c (mmol/l) Fasting insulin 103.26±10.33a 368.29±34.42b 411.32±41.30b 619.56±58.51c (pmol/l) TG (mmol/l) 0.50±0.06a 0.56±0.04a,b 0.45±0.05a,b 0.60±0.04b

Liver (g) 1.30±0,03 1.18±0,08 1.20±0,03 1.15±0,04

Pancreas (g) 0.22±0.02 0.19±0.02 0.22±0.02 0.19±0.01

Gastrocnemius (g) 0.33±0.01 0.32±0.01 0.32±0.01 0.33±0.01

Heart (g) 0.15±0.01a 0.13±0.01a,b 0.13±0.01a,b 0.12±0.01b

Inguinal WAT (g) 0.24±0.02a 1.22±0.15b,c 1.47±0.13b 0.99±0.10c

Ret WAT (g) 0.11±0.02a 0.73±0.05b 0.68±0.04b 0.62±0.54b

Epididymal WAT (g) 0.42±0.03a 2.11±0.10b 2.10±0.09b 1.90±0.09b

BAT (g) 0.09±0.01 0.12±0.01 0.12±0.01 0.10±0.01

Fat mass (%) 2.41±0.06a 11.99±1.47b 11.05±0.78b 11.83±0.93b Lean mass (g) 22.64±0.55 22.34±0.73 22.81±0.51 21.16±0.33 Data are means ± SE (n =7–10 control and HFD group; n=8–14 for PF-4708671 and rapamycin group)

Means not sharing a common superscript are significantly different from each other, p<0.05

BAT, brown adipose tissue; PF, PF-4708671; Rapa, rapamycin; Ret, retroperitoneal; WAT, white adipose tissue

Figure legends

Figure. 1 Time-dependent S6K1 inhibition by PF-4708671. Insulin signalling analysis after time-dependant S6K1 inhibition by PF-4708671. (a, b) FAO cells were treated with 10 µmol/l PF-4708671 for the indicated times followed by 5 min insulin treatement (100 nmol/l). These blots are representative of at least three separate experiments. (c) Quantification of basal (white bars) and insulin-stimulating (black bars) phospho-Akt are shown; n=5. *p<0.05, vehicle vs PF-4708671 treated cells

Figure. 2 S6K1 inhibition decreased glucose production and increased Akt phosphorylation in hepatocytes. Glucose production was evaluated in FAO cells as described in Methods. Cells were treated with vehicle (black circles) or with 10 μmol/l PF-4708671 (black squares) for 5 h (a, c) or 72 h (b, d) and compared with cells treated with 25 nmol/l rapamycin (black triangles) for 72 h; n=3–5; †p<0.05 for rapamycin- vs vehicle- and PF-4708671-treated cells; *p<0.05, ***p<0.001 PF-4708671 vs vehicle. (e) Representative blots and quantification of CREB (white bars), HNF4α (grey bars), PGC1α (black bars), FOXO (hatched bars) and histone H3 of nuclear extracts from FAO cells treated with 10 µmol/l PF-4708671 or 25 nmol/l rapamycin. †p<0.05 vs vehicle (Veh) from the same treatment group. (f) mRNA levels of G6pase (white bars) and Pepck (black bars) were assessed by semi-quantitative RT-PCR in FAO cells treated with PF-4708671 or insulin (100 nmol/l, 24 h). The graphs depict mRNA expression in FAO cells of target genes corrected for the expression of 36B4 (also known as Rplp0) as a control gene, n=3, *p<0.05 vs vehicle. (g) Protein levels of G6Pase (white bars) and PEPCK (black bars) were measured in FAO cells treated with PF-4708671, rapamycin or insulin (100 nmol/l, 24 h), n=3, *p<0.05 vs vehicle. (h) Phospho-S6 235/36 and Akt phosphorylation levels were measured in FAO cells treated with 10 µmol/l PF- 4708671 or 25 nmol/l rapamycin and basal (white bars) or 5 min insulin-stimulated cells (black bars) (100 nmol/l) were analysed. ‡p<0.05 vs insulin- and PF-insulin-treated groups, *p<0.05, †p<0.05 vs vehicle treated cells,, as indicated. I, insulin; PF, PF-4708671; R, rapamycin; Veh, vehicle

Figure. 3 S6K1 inhibition increased glucose uptake and increased Akt phosphorylation in L6 myotubes. (a) Glucose (2-DG) uptake was evaluated in L6 cells treated with vehicle (white bars) or 10 µmol/l PF-4708671 (5 h, grey bars; 48 h, black bars) or 25 nmol/l rapamycin for 48 h (hatched bars) as described in the Methods. Results are presented as fold over basal conditions and are the means ± SEM of three independent experiments. †p<0.05 for insulin vs basal conditions (white bars). (b) Cells were used as in (a) with or without Akt inhibitor- Viii (Akt I; 10 µmol/l) for the last hour. (c) Phospho-S6 235/36 and Akt phosphorylation

levels were measured in L6 cells treated with 10 µmol/l PF-4708671 or 25 nmol/l rapamycin and basal (white bars) or 5 min insulin-stimulated cells (black bars) (100 nmol/l) were analysed, n=4–5. ‡p<0.05 vs insulin- and PF-insulin-treated groups (black bars), †p<0.05 vs vehicle treated cells (d) Phospho-Thr172 AMPK and phospho-S6 235/36 levels were measured in L6 cells pre-treated with 10 µmol/l PF-4708671 or vehicle (DMSO 0.02 %) and basal (white bars) or 5 min insulin-stimulated cells (black bars) (100 nmol/l) were analysed, n=3. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, as indicated. AMPK, AMP kinase; PF, PF- 4708671; R/Rapa, rapamycin; Veh, vehicle

Figure. 4 S6K1 inhibition improved glucose tolerance while rapamycin exacerbated glucose intolerance in HF-fed mice. Mice were treated with PF-4708671 and rapamycin as described in the Methods and fasted for 6 h before i.p. GTTs. (a) Plasma glucose, (b) AUC of plasma glucose and (c) insulin levels were measured during a GTT. Chow-fed mice (white circles and white bars), and HF-fed mice treated with vehicle (black squares and grey bars), PF-4708671 (white squares and black bars) and rapamycin (white triangles and hatched bars), n=6–8 for each group. (d) Liver TG and (e) liver glycogen content were measured as described in the Methods. n=6–8 for each group. *p<0.05, ***p<0.001. PF, PF-4708671; Rapa, rapamycin; Veh, vehicle

Figure. 5 PF-4708671 did not reproduce the deleterious effect of chronic rapamycin on hepatic gluconeogenesis. (a) Plasma glucose levels were measured during an i.p. PTT. n=6–8 for each group. Chow- fed mice (white circles), HF-fed mice (black squares), HF-fed mice treated with PF- 4708671 (white squares) and HF-fed mice treated with rapamycin (white triangles). (b) mRNA levels of G6pase (white bars) and Pepck (black bars) were assessed by semi- quantitative RT-PCR; n=6–8. (c) Representative blots and densitometric analysis of normalisation of total protein/SP1 protein of PGC1α (black bars), HNF4α (grey bars), CREB (white bars) and SP1 proteins in nuclear extracts prepared from liver samples. n=3– 4 for each group. *p<0.05, ***p<0.001, HF group treated with vehicle vs PF-4708671 and rapamycin-treated cells. PF, PF-4708671; Rapa, rapamycin; Veh, vehicle

Figure. 6 S6K1 inhibition increased Akt phosphorylation. Chow-fed mice (white bars), HF-fed mice treated with vehicle (grey bars), HF-fed mice treated with PF-4708671 (black bars) and HF-fed mice treated with rapamycin (hatched bars) were fasted for 6 h before saline or insulin (3.8 U/kg caudal, 5 min) vein injection and tissues were analysed for Akt phosphorylation. Liver (a), gastronecmius muscle (b) and epididymal white adipose tissue (c) were lysed and equal amounts of proteins were separated on SDS-PAGE and processed for western blot analyses using the indicated antibodies. n=5–8 for each group.*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. eWAT, epididymal white adipose tissue; PF, PF-4708671; Rapa, rapamycin; Veh, vehicle

Figure. 7 S6K1 inhibition did not decrease S6 phosphorylation in HF-fed obese mice. Chow-fed mice (white bars), and HF-fed mice treated with vehicle (grey bars), PF-4708671 (black bars) and rapamycin (hatched bars) were fasted for 6 h before saline or insulin (3.8 U/kg caudal, 5 min) vein injection and tissues were analysed for S6 and S6K1 phosphorylation. Liver (a), gastronecmius muscle (b) and epididymal white adipose tissue (c) were lysed and equal amounts of proteins were separated on SDS-PAGE and processed for western blot analyses using the indicated antibodies. n=5–8 for each group.*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. eWAT, epididymal white adipose tissue; PF, PF-4708671; Rapa, rapamycin; Veh, vehicle

ESM Figure 1: MSK and CREB phosphorylation are not inhibited by PF-4708671 MSK Thr581, CREB Ser133 and S6 Ser235/36 phosphorylation was measured in FAO cells pre-treated with vehicle (Veh) or 10 μM PF-4708671 (PF) for 5h and 72h and stimulated with Phorbol 12 myristate 13-acetate (PMA, 200 ng/ml, 30 min) to induce MSK and CREB phosphorylation.

ESM Figure 2: IRS1 S1101 phosphorylation is inhibited by S6K1 inhibition IRS1 S1101 phosphorylation was measured in mice treated with vehicle (Veh), PF- 4708671 (PF) or rapamycin (Rapa) and fasted for 6 h before saline or insulin (3.8 U/kg, 5 min) caudal vein injection. Liver and epididymal white adipose tissue were lysed and equal amounts of proteins were separated on SDS-PAGE and processed for western blot analyses using the indicated antibodies. n =5-8 for each group.

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ESM Methods

Reagents and antibodies. DMSO, Akt Viii inhibitor and fish gelatin were from Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA). Rapamycin was from Biomol, (Plymouth- Meeting, PA, USA). PF-4708671 was from Symansis (Timaru, NZ). Insulin was from Eli Lilly (Toronto, ON, Canada). The anti-IRS1, anti-PGC1α, anti-HNF4α, anti-S6K2, anti-G6Pase and anti- PEPCK antibodies were from Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz Biotechnology, Paso Robles, CA, USA). The anti-phospho-IRS-1 Ser 1101 and Ser 636/9; the anti- phospho-S6K1 Thr 389, phospho-S6 Ser 235/36, phospho-MSK1 Thr581, MSK1, phospho- Ser133 CREB, S6, CREB, Foxo, eEF2, phospho-Thr172 AMPK, AMPK and the phospho- Akt Ser 473, Thr 308 were from Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, USA). The anti-actin was from Millipore (St. Louis, MO, USA). Antibodies from Cell Signaling Technology, were used at 1:1,000 dilution. Santa Cruz Biotechnology Inc. antibody was used at 1:500 dilution. -actin antibody was used at 1:10,000 dilution.

Glucose uptake. L6 cells were serum-deprived during 5 h prior to the experiments, and 100 nmol/l of insulin was used to stimulate the cells during the last hour of deprivation. L6 cells were incubated for 8 min in HEPES-buffered saline containing 10 μmol/l unlabeled 2- DG and 10 μmol/l D-2-deoxy-[3H] glucose (0.5 μCi/ml). The reaction was terminated by washing three times with ice-cold 0.9% NaCl (wt/vol). Cell-associated radioactivity was determined by lysing the cells with 0.05 N NaOH, followed by liquid scintillation counting and normalization to protein concentration.

Glucose production. FAO cells were incubated 16 h in serum-free medium, with or without the indicated concentration of insulin, PF-4708671 (10 μmol/l) or rapamycin (25 nmol/l). The cells were washed three times with PBS and incubated with phenol- and glucose-free DMEM medium supplemented with 20 mmol/l sodium L-lactate and 2 mMmol/lsodium pyruvate for 5 h with or without the indicated concentration of insulin, PF-4708671 (10 μmol/l) or rapamycin (25 nmol/l). Cell supernatants were collected and

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glucose concentration was measured with the Amplex-Red Glucose assay kit (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) according to the manufacturer’s instructions. Cells were lysed with 50 mmol/l NaOH and protein concentration was determined using a BCA protein assay kit for normalization.

Animal studies. Animal handling and treatment were approved by the Animal Care and Handling Committee of Laval University. 6 weeks old male C57Bl/6 mice were purchased from Charles River Laboratories (St. Constant, QC, Canada) and housed individually in cages in a room kept at 23 ± 1°C with a 12-h light/12-h dark cycle. After 1-week adaptation, mice were matched by weight and put on standard diet (Chow) or on a high fat diet (HFD, 60% energy from fat, Research Diets, D12492) for 12 weeks. HFD-fed mice were then randomly assigned to three groups: control (HF) receiving vehicle (8% (vol/vol) EtOH, 0.2% (wt/vol) carboxymethylcellulose sterile), treated with PF-4708671 (35 mg kg- 1 day-1, i.p.) or treated with rapamycin (2 mg kg-1 day-1, i.p.) for 7 days while being kept on the same HFD. After the treatments, mice were fasted for 6 h and euthanized 5 min after tail-vein injection of either saline or insulin (3.8 U/kg body weight). Tissues and blood were rapidly harvested and frozen in liquid nitrogen. Dual X-ray absorptiometry (Piximus; Lunar, Madison, WI) was used to measure total fat and lean masses as well as bone mineral content in mice anesthetized with isoflurane.

RNA extraction and quantitative PCR analysis. The primer sequence used for evaluating PEPCK and G6Pase expression in FAO cells: (PEPCK; 5’- TGGGTGATGACATTGCCTGG-3’), (G6Pase; 5’-CGACTCGCTACCTCCAA GTG-3’). Data are expressed as the ratio between the expression of the target gene and the housekeeping gene 36B4 (also known as ARBP). Mouse liver (PEPCK; Mm01247058_m1), (G6Pase; Mm00839363_m1) and gene expression were evaluated with primer/probes and Taqman gene expression master mix from Life Technologies.

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Chapitre II

Avant-propos

L’objectif du projet de recherche était de vérifier l’hypothèse selon laquelle l’inhibition pharmacologique de S6K1 entraine des effets métaboliques indépendamment de l’amélioration de la signalisation à l’insuline. Je suis l’auteur principal de cette étude qui est en préparation pour publication prochaine.

La conceptualisation générale du projet a été effectuée par moi et Dr. André Marette. Les mesures de captage de glucose dans les cellules L6 et de production de glucose dans les cellules FAO ont été faites par moi. Les expériences d’immunobuvardage ont été effectuées par moi et Vicky Bellemare. Les études d’analyses de fonctions mitochondriales ont été effectuées par moi. Les mesures de captage de glucose dans les cellules déficientes pour AMPK ont été effectuées par moi. J’ai procédé à l’analyse statistique, réalisée et assemblé les figures. Le manuscrit a initialement été écrit par moi, supplémenté par Kerstin Belleman et finalement, corrigé et amélioré par Dr André Marette.

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Article

Le PF-4708671 régule l’homéostasie énergétique cellulaire en agissant sur l’inhibition de S6K1 et le complexe 1 mitochondrial.

PF-4708671 regulates energy homeostasis by acting on both S6K1 inhibition and mitochondrial complex 1.

Michael Shum, Vicky Bellemare, Kerstin Bellmann, André Marette

Department of Medicine, Quebec Heart and Lung Institute, Hôpital Laval, Pavillon

Marguerite d'Youville, Room Y4308, 2705 Chemin Ste-Foy, Québec, Canada G1V 4G5

Corresponding author: André Marette, Department of Medicine, Quebec Heart and Lung

Institute, Hôpital Laval, Pavillon Marguerite d'Youville, Room Y4308, 2705 Chemin Ste-

Foy, Québec, Canada G1V 4G5

Email: [email protected]

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Résumé

L’inhibition de S6K1 améliore la signalisation de l’insuline, le métabolisme du glucose et la tolérance au glucose. Malgré qu’une importante partie de ces effets soient associée à une meilleure action de l’insuline, l’inhibition de S6K1 par le PF-4708671 peut réguler le métabolisme du glucose indépendamment de l’insuline. En effet, nous avons observé que le PF-4708671 augmentait le captage de glucose et diminuait la production hépatique de glucose indépendamment de l’insuline. Afin d’élucider les mécanismes causant ces effets nous avons évalué la régulation du métabolisme énergétique par l’inhibiteur de S6K1 dans les cellules musculaires L6 et hépatiques FAO. Le PF-4708671 induit une augmentation de l’activité d’AMPK et inhibe l’activité du complexe I mitochondrial de manière aigüe. Malgré l’inhibition du complexe I mitochondrial, les niveaux d’ATP musculaire ne changent pas suite au traitement chronique avec le PF-4708671. De plus, l’utilisation de cellules AMPK KO ont montré que l’induction du transport du glucose par le PF-4708671 n’est pas dépendant de l’AMPK. En conclusion, l’utilisation du PF-4708671 induit rapidement une activation d’AMPK, l’inhibition du complexe I mitochondrial, stimule le captage de glucose et inhibe la production hépatique de glucose indépendamment de l’insuline.

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Introduction

The mechanistic target of rapamycin (mTOR) complex 1 (mTORC1) and its downstream effector p70 ribosomal S6 kinase (S6K1) are important modulators of energy homeostasis (1,2). This pathway regulates cell proliferation, growth and protein synthesis, which are tightly regulated depending on substrate availability (3). Thus, mTORC1 also acts as an energy sensor by sensing amino acids, lipids and energy status. In addition, mTORC1/S6K1 pathway triggers a negative feedback loop towards the PI3K/Akt pathway to terminate its activation after insulin or growth factor stimulation (4-7). However, this negative feedback loop is overactivated in nutrient satiation diseases such as obesity contributing to the development of insulin resistance and potentially leading to type 2 diabetes (7-9). Selective pharmacological inhibition of mTORC1 by rapamycin have failed to improve insulin resistance and energy homeostasis since this compound can also inhibit mTORC2, an important mediator of Akt Ser473 phosphorylation thus inducing a diabetes- like syndrome (10). However, some of these adverse effects induced by chronic rapamycin are mTORC2 independent (11). Therefore, targeting downstream effectors of mTORC1 such as S6K1 might be a more promising way to improve the metabolic syndrome.

We have recently shown that pharmacological inhibition of S6K1 using PF-4708671 improved glucose tolerance in mice fed high-fat diet by restoring insulin induced Akt phosphorylation (12). Furthermore, in vitro studies using L6 myocytes and FAO hepatoma cells revealed the ability of PF-4708671 to increase basal muscle glucose uptake and to decrease basal hepatic glucose production (12). These results were obtained in the absence of insulin stimulation suggesting a potential role of this compound to modulate energy homeostasis independently from the amelioration of insulin signalling. Previously, several studies have shown a role of S6K to regulate AMPK (5’ adenosine monophosphate activated protein kinase). Indeed, S6K has been shown to phosphorylate AMPK on Ser 491 in neurons, inhibiting its activity (13). In addition, selective S6K1/2 deletion in muscle is associated with an increase in AMPK activity due to higher AMP/ATP ratio (14) suggesting that S6K participates in the inhibition of AMPK by either direct and/or indirect mechanisms.

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AMPK is an important regulator of energy homeostasis by sensing the energy level from AMP/ATP levels thus activating catabolic processes to provide energy to the cells. A high AMP/ATP ratio increases AMPK phosphorylation on Thr172 which enhances AMPK activity. AMPK activation induces glucose uptake, fatty acid oxidation, autophagy and inhibit cell growth and protein synthesis. Independently of insulin, AMPK is well known to regulate glucose uptake in muscle by phosphorylating TBCB1D (AS160) (15-17) and by regulating hepatic glucose production (18-20). However, the mechanisms behind the increase in AMPK activation by S6K1 deficiency is still unclear.

Herein, we use the S6K1 inhibitor, PF-4708671, in order to determine the mechanisms by which S6K1 inhibition regulates energy homeostasis. PF-4708671 induced basal glucose uptake in muscle cells and decreased basal glucose production in hepatocytes. In these cell types, we observed that PF-4708671 increased dose-dependently both AMPK Thr172 and AMPK Ser491 phosphorylation. However, PF-4708671 also increased ACC Ser79 phosphorylation suggesting an increase in AMPK activity. In addition, acute treatment with PF-4708671 reduced mitochondrial complex I activity and mitochondrial spare respiratory capacity. Despite an increase in AMPK activity by PF-4708671, the induction of basal glucose uptake by PF-478671 was similar between muscle AMPK deficient and WT cells. These results show that PF-4708671 inhibits S6K1 and acute exposure to PF also inhibits mitochondrial complex I activity leading to AMPK activation.

Methods

Reagents and antibodies. DMSO was from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). PF- 4708671 was from Symansis (Timaru, NZ). Insulin was from Eli Lilly (Toronto, ON, Canada). The phospho-S6 Ser 240/44, S6, phospho-Thr172 AMPK, phospho-Ser491 AMPK, phospho-ACC Ser79, ACC were from Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, USA). The anti-actin was from Millipore (St. Louis, MO, USA). Antibodies from Cell

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Signaling Technology, were used at 1:1,000 dilution. -actin antibody was used at 1:10,000 dilution.

Cell culture L6 myoblasts were grown in α-MEM (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) supplemented with 10% (vol./vol.) BGS and were differentiated into myotubes in α-MEM with 2% (vol./vol.) FBS as previously described (21). Wild-type (WT) and α1-/-/α2-/- AMPK double knock-out (KO) primary muscle cells were grown as reported previously (22). L6, WT and AMPK KO cells were serum-deprived for 5 h prior to the experiments, and 100 nmol/l of insulin was used to stimulate the cells during the last 5 min of deprivation. FAO rat hepatocytes were maintained in RPMI media (Invitrogen), serum- deprived overnight and stimulated with the indicated concentrations of insulin. Vehicle (dimethyl sulfoxide, DMSO 0.02% [vol./vol.]) or PF-4708671 was used at the indicated dose.

Western analyses Western blots were performed as described (11). Briefly, equal amounts of proteins were separated by SDS-PAGE (7.5% [wt/vol.]) and transferred onto nitrocellulose membranes. Membranes were blocked in 5% (wt/vol.) milk and incubated overnight at 4°C with the respective antibodies diluted in 1% (wt/vol.) fish gelatin in TBS- T.

Glucose uptake. L6 cells were serum-deprived during 5 h prior to the experiments, and 100 nmol/l of insulin was used to stimulate the cells during the last hour of deprivation. L6 cells were incubated for 8 min in HEPES-buffered saline containing 10 µmol/l unlabeled 2- DG and 10 µmol/l D-2-deoxy-[3H] glucose (0.5 µCi/ml). The reaction was terminated by washing three times with ice-cold 0.9% NaCl (wt/vol). Cell-associated radioactivity was determined by lysing the cells with 0.05 N NaOH, followed by liquid scintillation counting and normalization to protein concentration.

Glucose production. FAO cells were incubated 16 h in serum-free medium, with or without the indicated concentration of insulin, PF-4708671 (10 µmol/l) or rapamycin (25 nmol/l). The cells were washed three times with PBS and incubated with phenol- and glucose-free DMEM medium supplemented with 20 mmol/l sodium L-lactate and 2 mmol/l

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sodium pyruvate for 5 h with or without the indicated concentration of insulin, PF-4708671 (10 µmol/l) or rapamycin (25 nmol/l). Cell supernatants were collected and glucose concentration was measured with the Amplex-Red Glucose assay kit (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) according to the manufacturer’s instructions. Cells were lysed with 50 mmol/l NaOH and protein concentration was determined using a BCA protein assay kit for normalization.

XF metabolic assay Baseline oxygen consumption rate (OCR) measurements were made using the Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer. For mitochondrial metabolic parameters, we used successively oligomycin 1 µM, FCCP 2 µM, rotenone/antimycin 1 µM. 25 mM glucose was injected to cells in DMEM containing 2.5 mM glucose after baseline rate measurement. For determination of complex I and complex II activity, cells were pre- incubated and baseline rates were determined in KHB buffer free of any substrate but containing 4 mM ADP. Pyruvate/malate or succinate were injected at increasing doses sequentially into each well and test measurements were made at the indicated time points. The responses were expressed as percentage increase of OCR or ECAR relative to baseline rate.

Quantification and statistical analyses. One- and two-way ANOVA with Newman–Keuls post hoc was performed with Sigma Plot version 12 (Systat Software, San Jose, CA, USA); p values were considered significant if they were <0.05. SEMs are represented in the graphs. The criterion for the exclusion of any data point was a distance > ±2.5 ×SD from the mean of the other data from the same group.

Results

Muscle glucose uptake and liver glucose production are central regulators of glucose metabolism for the maintenance of energy homeostasis. To assess the effect of S6K1 inhibition on basal glucose transport, differentiated L6 myotubes were treated with PF- 4708671 (PF). PF treated cells for 1 h displayed higher glucose uptake compared to control

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cells treated with vehicle and similar to insulin treated cells (Fig. 1A). However, glucose uptake was even more increased in cells treated with PF for 5 h and 24 h than in insulin treated cells. In addition, basal hepatic glucose production in FAO hepatoma cells was reduced after 5 h and 72 h exposure to PF as well as with insulin (Fig. 1B).

As a central sensor of energy status, AMPK activation by S6K1 inhibition was evaluated since previous studies showed a potential link between S6K and AMPK (13,14). In fig. 2A, we performed a dose-response (1 to 10 µM PF) in L6 myotubes and FAO hepatocytes. AMPK phosphorylation on Thr172 (activation site) and Ser491 (inhibitory site) increased dose-dependently as well as the phosphorylation of its substrate ACC on Ser79. These effects were also associated with a dose-dependent inhibition of S6 phosphorylation on Ser 240/44. In order to assess the time-dependent activation of AMPK, we did a time-course treatment with 10 µM PF (Fig. 2B). Surprisingly, AMPK Thr172 and ACC Ser79 phosphorylation were already increased 5 min after PF treatment and peaked around 30 min while S6 phosphorylation was reduced only from 15-30 min after PF treatment in L6 cells and at 15 min in FAO cells. In addition, AMPK phosphorylation on AMPK Ser491 also increased with time reaching a maximal phosphorylation between 45-90 min after PF treatment. The data are consistent with a rapid but transient activation of AMPK (increased Thr172 phosphorylation) followed by inhibition of its activity (increased Ser491 phosphorylation). Interestingly, both AMPK Thr172 and ACC Ser79 phosphorylation decrased after AMPK Ser491 phosphorylation.

AMPK detects the cellular energy status by sensing the AMP/ATP ratio in order to activate catabolic pathways. One known mechanism that increases the AMP/ATP ratio and induces AMPK activation is the inhibition of mitochondrial complex I. Using the Seahorse XF 24 apparatus, we examined oxygen consumption in L6 myotubes acutely treated (directly injected in the assay) or pre-treated for 5 h, 24 h and 48 h with PF (10 µM). No differences in oxygen consumption were observed on the different mitochondrial parameters in pre- treated cells (Fig. 3A-B). However, despite normal basal oxygen consumption, L6 cells acutely treated with PF showed a decrease in maximal respiratory capacity of mitochondria induced by FCCP (Fig. 3A-B). We then assessed whether this decrease in maximal

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respiratory capacity is due to a decrease in mitochondrial complexes I and/or II activity. L6 myotubes were permeabilized to allow ADP, pyruvate (Pyr), malate (Mal) and succinate (Succ) to pass through the plasma membrane and to reach mitochondria. Next, L6 cells were treated with different concentrations of PF acutely (just before the assay) and were added in the Seahorse XF 24 apparatus. Pyr/Mal in the presence of ADP increased mitochondrial complex I activity but this was reduced dose dependently in the presence of PF (Fig. 3C-D). Mitochondrial complex II activity was measured by adding first rotenone, a complex I inhibitor, and then Succ. No significant differences were observed on mitochondrial complex II activity with PF (Fig. 3C-D). In normal conditions, 2h PF treatment did not change cellular ATP level (Fig. 3E). Similar results were also obtained in FAO cells. Indeed, only acute PF decreased maximal respiratory capacity (Fig. 4A) and reduced mitochondrial complex I activity in FAO cells (Fig. 4B-C).

Since AMPK can regulate glucose uptake, we determined whether the induction of basal glucose uptake by PF was AMPK-dependent. We used differentiated primary muscle cells from mice lacking both AMPKα1 and AMPKα2 catalytic subunits (AMPK KO cells) and from their WT littermates. Under basal conditions, both WT and AMPK KO muscle cells treated with PF for 5 and 48 h showed increased glucose uptake, compared to vehicle treated cells (Fig. 5A). Similar results were obtained in cells pre-treated with PF for 5 and 48 h before insulin stimulation. Interestingly, no differences were observed between WT and AMPK KO muscle cells (Fig. 5A). After 5 and 48 h treatment with PF, AMPK phosphorylation on Thr172 and ACC phosphorylation on Ser79 were increased in differentiated WT myocytes but not in AMPK KO cells (Fig. 5B). In both WT and AMPK KO cells, PF decreased S6 phosphorylation.

Discussion

Overactivity of the mTORC1/S6K1 pathway is highly correlated to metabolic diseases and is a hallmark of insulin resistance and obesity (7-9,23,24). However, chronic use of rapamycin to inhibit mTORC1 induces a diabetes-like syndrome caused by either mTORC2 inhibition or other mechanisms (11,25-30). Complete and chronic mTORC1 inhibition might not be a suitable strategy to improve energy homeostasis since the mTORC1

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pathway is important for regulating essential physiologic processes such as growth, protein synthesis, energy homeostasis and autophagy in response to daily nutrient intake (31-33). Thus, inhibiting downstream effectors of the mTORC1 pathway might be an interesting alternative therapeutic strategy to improve energy homeostasis and to overcome the adverse effects associated with chronic mTORC1 inhibition.

We recently reported in a previous study that pharmacological inhibition of S6K1 for only one week with PF improves glucose tolerance in high-fat fed obese mice and increased insulin-induced Akt phosphorylation in liver, muscle and white adipose tissue (12). In vitro, the increase in insulin-dependent Akt phosphorylation induced by PF was associated with enhanced glucose uptake in L6 myocytes and decreased glucose production in hepatocytes (12). Interestingly, we also observed an increase in basal glucose uptake in myocytes and a decrease in basal glucose production in hepatocytes induced by PF suggesting a potential insulin-independent role of S6K1 in the regulation of energy homeostasis. Here we indeed show that independently of insulin, acute as well as chronic inhibition of S6K1 by PF increased basal glucose uptake in L6 myotubes and reduced basal glucose production by FAO hepatocytes. These results are supported by other studies showing that C2C12 cells transfected with siRNA targeting S6K1 also displayed higher basal glucose uptake (34). In our study, we have shown that the phosphorylation of AMPK and its downstream effector ACC are increased in both L6 myotubes and FAO hepatocytes stimulated with PF. This increase in AMPK activation was associated with inhibition of mitochondrial complex I after acute PF treatment. However, while AMPK is an important regulator of energy homeostasis, additional studies using AMPK KO muscle cells showed that AMPK activation cannot account for the increase in glucose uptake in muscle cells induced by PF.

PF has been suggested to activate AMPK by inhibiting mitochondrial complex I of the respiratory chain independently of S6K1 in mouse embryonic fibroblast (MEF) isolated from double S6K1/2 KO mice compared to MEF from WT mice (35). We also observed that PF inhibited mitochondrial complex I activity in muscle cells and hepatocytes suggesting a potential role of PF to modulate mitochondrial function in these tissues. However, PF decreased only the mitochondrial spare capacity acutely without significant

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changes in basal oxygen consumption while longer treatment with PF did not change the mitochondrial spare capacity. In basal conditions, many cells require only part of their total bioenergetic capacity. The difference between ATP produced by oxidative phosphorylation in the basal state compared to that generated at maximal activity is called “spare respiratory capacity”. Under specific conditions a tissue can require a sudden amount of additional cellular energy in response to stress or increased workload. If the spare respiratory capacity of the cells is not sufficient to provide the required amount of ATP, the cells might go into senescence or cell death (36). However, this effect is only transiently observed after acute PF treatment and seems to be compensated later or lost since this effect is absent after 5 , 24 and 48 h treatment.

The effects of PF observed in this study are similar to those induced by metformin, one of the most prescribed antidiabetic drugs to manage glucose homeostasis in humans. Metformin is known as well to inhibit mitochondrial complex I, leading to higher AMP/ATP ratio and AMPK activation (37,38). In addition, metformin also increases basal glucose uptake by inducing aerobic glycolysis in order to maintain ATP levels (39). As observed here with PF, the increase in glucose uptake in muscle cells induced by metformin is also independent of AMPK (40). Thus, it is possible that PF induces glucose uptake by increasing aerobic glycolysis to maintain normal ATP levels as seen herein in L6 muscle cells. Hepatic glucose production inhibited by metformin is also independent of AMPK and it is rather mediated by mitochondrial glycerol-phosphate dehydrogenase inhibition induced by metformin (41,42). More studies will be needed to determine whether PF reduces mitochondrial glycerol-phosphate dehydrogenase activity in hepatocytes.

Despite the fact that PF directly inhibited mitochondrial complex I, it might as well increase AMPK activation by inhibiting S6K1 since many studies support a role of S6K1 in regulating AMPK activity (13,14). Dagon et al. have shown that leptin inhibits food intake by activating S6K1 leading to Ser491 phosphorylation of AMPK which inhibits its activity in neurons (13). Furthermore, they showed that AMPK inhibition was essential for leptin to mediate its effect on food intake and this effect was dependent on S6K phosphorylating Ser491 of AMPK. In addition, they showed that S6K1 directly interacted with the catalytic

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subunit of AMPKα2 to increase phosphorylation of AMPK on Ser491 and hinder AMPK Thr172 phosphorylation, which is essential for AMPK activity. In our study, we observed a rapid increase in Thr172 phosphorylation followed by an increase in Ser491 phosphorylation on AMPK by PF treatment. Although it has been reported that Ser491 can regulate negatively AMPK activity independently of Thr172 phosphorylation (13), we observed instead an increase in ACC phosphorylation on Ser79, a well-known substrate of active AMPK, suggesting that AMPK is rather active than inactive. However, the time- course experiment after PF treatment reveals that AMPK is activated rapidly (Thr172 phosphorylation), but transiently, since this phosphorylation is reduced after AMPK Ser491 phosphorylation. Similarly, AICAR, an AMPK activator, induced dose-dependently AMPK Ser491 phosphorylation and Thr179 phosphorylation as well as AMPK activity (43). The fact that both phosphorylation sites are increased, but phosphorylation of Ser491 is slightly delayed in time compared to Thr172, might suggest that Ser491 is induced to terminate AMPK activation which is associated also with a decrease in ACC Ser79 phosphorylation (from 60 min to 24h, Figure 2B). In addition, this phosphorylation site might also be phosphorylated by other kinases such as PDK1 (44), Akt (45), Erk1/2 (46), IKKβ (47) and PKA (48,49), which have all been described to phosphorylate this site. Another potential kinase, but not yet assessed is S6K2. In regards to Akt, we have already shown that S6K1 inhibition by PF increases Akt activation (12) and other studies have reported that S6K2 expression is upregulated in absence of S6K1 (50) which could increase Ser491 phosphorylation on AMPK.

Although phosphorylation on AMPK Ser491 is rather increased than inhibited by PF, other unknown mechanisms may underlie AMPK activation, such as changes in energy status. Interestingly, S6K1/2 deficient skeletal muscle cells have normal ATP levels but higher AMP concentrations leading to a higher AMP/ATP ratio, and it was shown that ATP levels were maintained by the creatine kinase reaction in S6K1/2 deficient muscles (14). Similarly, S6K1 inhibition by PF did not change ATP levels in L6 myotubes in our study. Lack of muscle S6K1/2 is correlated with muscle atrophy, insulin hypersensitivity and metabolic adaptations (14). In addition, these changes are mainly attributed to S6K1 rather than S6K2 deficiency (14).

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Another interesting phenotype observed in S6K1/2 deficient muscle is the switch from glucose to fatty acids as the primary energy source leading to higher glycogen content and lower lipid content in muscle compared to WT cells. In addition, this result was associated with higher mitochondrial mass, content and activity suggesting an increase in energy expenditure (14). These results are supported by the higher energy expenditure and the resistance to obesity induced by a high-fat diet observed in whole-body S6K1 -/- mice (9). Mechanistically, these effects might be due to increased fatty acid oxidation observed in whole-body S6K1 -/- mice (9) or in cells treated with siRNA targeting S6K1 (51). Along the same lines, one of the most well-known substrates of AMPK is ACC which regulates lipid metabolism. Indeed, AMPK triggers ACC inhibition by phosphorylating ACC on Ser79. ACC is important to catalyse the synthesis of malonyl-CoA, which is the initial step of lipogenesis and fatty acid elongation but also exerts an inhibition on carnitine palmitoyl- transferase (CPT-1), an enzyme that allows fatty acids to cross the mitochondrial membrane for β-oxidation. As observed in the present study, PF increased ACC Ser79 phosphorylation. Consequently, PF might also regulate lipid oxidation but this hypothesis remains to be tested.

In conclusion, PF was characterized as a selective S6K1 inhibitor, but our study and others suggest that this pharmacological inhibition acutely reduces mitochondrial complex I activity as well. This inhibition led to a rapid, but transient induction, of AMPK activation and ACC inhibition, followed by S6K1 inhibition within the first 30 min in muscle cells and hepatocytes. However, muscle glucose uptake induced by PF is not AMPK dependent suggesting that other mechanisms are involved in this effect. Thus, PF inhibits both S6K1 and acutely mitochondrial complex I activity. These results suggest that PF might reproduce many beneficial effects mediated by metformin in addition to those associated with S6K1 inhibition such as the direct inhibition of insulin signalling through the negative feedback loop, making this drug an even more interesting thereapeutic compound to alleviate type 2 diabetes.

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References

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Legends to figures

Figure 1: PF-4708671 induced basal muscle glucose uptake and decreased basal hepatocyte glucose production. (A) Glucose uptake was evaluated in L6 cells as described in materials. Cells were treated with 10 μM PF-4708671 for the indicated times with or without insulin (100 nM, 45 min). After 7 days of differentiation, 2-deoxyglucose uptake was evaluated by incubating cells with [3H]-2-D-deoxyglucose for 8 min. Myocytes were then lysed and protein concentrations were evaluated to normalize radioactive counts. Results are presented in fold over basal conditions and are the mean +/- SEM of at least 4 independent experiments. (B) Glucose production in FAO hepatoma cells were measured after 5 and 72 h treatement with PF-4708671 or after insulin treatment (100 nM, 30 min). Results are presented in µg of glucose per µg of protein. Shown are the mean +/- SEM of at least 4 independent experiments. *p<0.05, ***p<0.001 vs vehicle treated cells, as indicated. PF, PF-4708671.

Figure 2: PF-4708671 rapidly increased AMPK phosphorylation before inhibiting S6K1 in normal conditions. (A) L6 differentiated myocytes and FAO hepatoma cells were treated with the indicated concentrations of PF-4708671 for 2 hours in presence of serum. Cells were then harvested, processed for SDS-PAGE and western blot using the indicated antibodies. (B) L6 differentiated myocytes and FAO hepatoma cells were treated for the indicated time with 10 M PF-4708671 in presence of serum. Actin levels are presented as loading control. PF, PF-4708671.

Figure 3: PF-4708671 decreased mitochondrial spare respiratory capacity and inhibited acutely mitochondrial complex I activity in muscle cells. (A) L6 cells were seeded at 20,000 cells per well in 24-well XF plates and incubated for 24 hours with 10% bovine growth serum in MEM at 37ºC/5% CO2 incubator. For differentiation, growth media was replaced with differentiation media (2% BGS in MEM). Well differentiated myocytes were used at day 7 for all assays. Cells were pretreated with 10 μM PF-4708671 for the indicated times or directly added (acute) in the plate by using a port from the seahorse cartridge followed by a Mitostress protocol. (B) Mitochondrial parameters were assessed with the Mitostress protocol. (C) On the day of experiment, cells were washed 2 times with MAS buffer containing 4mM ADP and treated with the indicated PF-4708671 concentrations before cell permeabilization with XF plasma membrane permeabilizer (1 nM) from Seahorse Bioscience. Then the plate was inserted into the XF 24-well apparatus. Mitochondrial complex I and II activity were assessed by adding successively Pyruvate/Malate (Pyr/Mal; 10mM/1mM), Rotenone (Rot; 1 uM), Succinate (10 mM) and Antimycin A (AA; 1 uM). (D) OCR differences between Pyruvate/Malate and basal for mitochondrial complex I activity and between Succinate and Rotenone for

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mitochondrial complex II activity. (E) Cellular ATP levels were measured in a 6-well plate after 2 h treatment with PF (5 µM and 10 µM). *p<0.05, vs vehicle treated cells, as indicated. PF, PF-4708671.

Figure 4: PF-4708671 decreased mitochondrial spare respiratory capacity and acutely inhibited mitochondrial complex I activity in hepatocytes. (A) FAO cells were seeded at 80,000 cells per well in 24-well XF plates and incubated for 24 hours with 10% bovine growth serum in RPMI at 37ºC/5% CO2. Cells were pretreated with 10 μM PF-4708671 for the indicated times or directly added (acute) in the plate by using a port from the seahorse cartridge followed by a Mitostress protocol. (B) On the day of the experiment, cells were washed 2 times with MAS buffer containing 4 mM ADP and treated with the indicated PF-4708671 concentrations before cell permeabilization with XF plasma membrane permeabilizer (1 nM) from Seahorse Bioscience. Then the plate was inserted into the XF 24-well apparatus. Mitochondrial complex I and II activity were assessed by adding successively Pyruvate/Malate (Pyr/Mal; 10mM/1mM), Rotenone (Rot; 1 uM), Succinate (10 mM) and Antimycin A (AA; 1 uM). (C) OCR differences between Pyruvate/Malate and basal for mitochondrial complex I activity and between Succinate and Rotenone for mitochondrial complex II activity. PF, PF-4708671.

Figure 5: PF-4708671 did not increase glucose uptake by activating AMPK (A) Glucose uptake was assessed in wild type and α1 (-/-) and α2 (-/-) primary muscle cells in absence or presence of insulin (100 nM, 45 min) and/or PF-4708671 (10 µM, 5 or 48 h). *p<0.05, vs vehicle treated cells, # p < 0.05 between PF treated cells with insulin vs insulin alone (B) Wild type and α1 (-/-) and α2 (-/-) primary muscle cells were cultured in the absence or presence of PF-4708671 (10 M) for the indicated times followed by cell lysis and immunoblotting using the indicated antibodies. PF, PF-4708671.

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Chapitre III

Avant-propos

L’objectif du projet de recherche était de vérifier l’hypothèse selon laquelle RSK pourrait phosphoryler la Ser1101 d’IRS afin de réguler la signalisation à l’insuline et le métabolisme du glucose. Je suis co-premier auteur de cette étude avec le Dr. Nicolas Smadja-Lamère qui est publiée dans J. Biochem. Chem.

La conceptualisation générale du projet a été effectuée par Dr. Nicolas Smadja-Lamère et Dr. André Marette. Les mesures de captage de glucose dans les cellules L6 et de production de glucose dans les cellules FAO ont été faites par Dr. Smadja-Lamère. L’analyse computationnelle et l’essai kinase de RSK sur IRS-1 a été effectué par Dr. Smadja-Lamère. Les immunobuvardages de type western ainsi que les études à l’aide du BI-D1870 et du DN-RSK1 ont été faits par moi et Dr. Smadja-lamère. L’essai kinase de RSK activé par l’insuline sur la protéine S6 a été faite par moi. Dr. Smadja-Lamère et moi avons procédé à l’analyse statistique, réalisée et assemblé les figures. Le manuscrit a initialement été écrit par Dr. Smadja-Lamère et moi, supplémenté par Dr. Déléris et Dr. Roux et pour être finalement, corrigé et amélioré par Dr André Marette. Avec l’appui du Dr André Marette, j’ai été responsable de la soumission de l’article, des révisions et de la communication avec les arbitres et l’éditeur du journal.

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Insulin activates RSK (p90 ribosomal S6 kinase) to trigger a new negative feedback loop that regulates insulin signalling for glucose metabolism

Nicolas Smadja-Lamère1ǂ, Michael Shum1ǂ, Paul Déléris2, Philippe P. Roux2,3, Jun-Ichi Abe4 & André Marette1*

1Quebec Heart and Lung Institute, Laval University, 2705 Chemin Ste-Foy Ste-Foy (Quebec) G1V4G5, CANADA 2Institute for Research in Immunology and Cancer (IRIC), Université de Montréal, Montreal, Quebec H3C 3J7, CANADA 3Department of Pathology and Cell Biology, Faculty of Medicine, Université de Montréal, Montreal, Quebec, H3C 3J7, CANADA 4University of Rochester medical center, ACVRI, 211 Bailey Rd, NY, 14642 USA

ǂ both authors contributed equally to this work.

Running title: RSK modulates glucose metabolism

To whom correspondence should be addressed: Dr André Marette, Department of Medicine, Faculty of Medicine, Quebec Heart and Lung Institute, Hôpital Laval, Pavillon Marguerite d'Youville, Room Y4308, 2705 Chemin Ste-Foy, Québec, CANADA, G1V 4G5,Tel: (418) 656-8711 x 3781, Fax: (418) 656-4749, [email protected]

J Biol Chem. 2013 Oct 25;288(43):31165-76.

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Keywords: RSK, IRS-1, insulin resistance, serine phosphorylation, glucose uptake, glucose production

Background: RSK is a downstream effector of the Ras/ERK pathway and shares high homology with S6K. Result: RSK1 inhibition improved insulin signalling and insulin action on glucose metabolism in myotubes and hepatocytes by preventing IRS-1 Ser1101 phosphorylation. Conclusion: RSK1 promotes insulin resistance by phosphorylating IRS-1 Ser1101. Significance: RSK1 might be a new mediator of insulin resistance in hyperinsulinemia or diabetic states.

Résumé

Nous avons précédemment montré que la voie mTORC/S6K1 est activée par l’insuline et l’excès de nutriments (acide aminés, AA) induisant ainsi une inhibition de la voir PI3K/Akt par la phosphorylation inhibitrice des résidus sérines d’IRS-1, notamment la sérine 1101. Cependant, même en absence d’AA, l’insuline peut toujours stimuler la phosphorylation de la sérine 1101 d’IRS-1 par d’autres kinases qui restent encore à caractériser. Nous avons découvert RSK comme une nouvelle kinase pouvant phosphoryler la sérine 1101 d’IRS-1. RSK phosphoryle directement IRS-1 sur la sérine 1101 réduisant ainsi l’activation de la voie PI3K/Akt par l’insuline. L’utilisation d’un dominant négatif pour RSK1 (DN-RSK1) a permis de montrer que l’inhibition de RSK1 améliore l’action de l’insuline sur la phosphorylation d’Akt, le transport du glucose dans des cellules musculaire et l’inhibition de la production hépatique de glucose. De plus, le DN-RSK1 a restauré la sensibilité à l’insuline du transport de glucose dans des cellules musculaires exposées à de fortes concentrations d’insuline et de glucose. Ces résultats montrent que RSK est un nouveau régulateur de la signalisation de l’insuline et est un médiateur potentiel de la résistance à l’insuline.

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Abstract

We previously demonstrated that the mTORC1/S6K1 pathway is activated by insulin and nutrient overload (e.g. amino acids [AA]), which leads to the inhibition of the PI3K/Akt pathway via the inhibitory serine phosphorylation of IRS-1, notably on serine 1101 (Ser1101). However, even in the absence of AA, insulin can still promote IRS-1 Ser1101 phosphorylation by other kinases that remain to be fully characterized. Here, we describe a new negative regulator of IRS-1, the p90 ribosomal S6 kinase (RSK). Computational analyses revealed that Ser1101 within IRS-1 falls into the consensus motif of RSK. Moreover, recombinant RSK phosphorylated IRS-1 C- terminal fragment on Ser1101 which was prevented by mutations of this site or when a kinase-inactive mutant of RSK was used. Using antibodies directed toward the phosphorylation sites located in the activation segment of RSK (S221 or S380), we found that insulin activates RSK in L6 myocytes in the absence of AA overload. Inhibition of RSK using either the pharmacological inhibitor BI-D1870 or after adenoviral expression of a dominant negative RSK1 mutant (RSK1-DN) showed that RSK selectively phosphorylates IRS-1 on Ser1101. Accordingly, expression of the RSK1-DN mutant in L6 myocytes and FAO hepatic cells improved insulin action on glucose uptake and glucose production, respectively. Furthermore, RSK1 inhibition prevented insulin resistance in L6 myocytes chronically exposed to high glucose and high insulin. These results show that RSK is a novel regulator of insulin signalling and glucose metabolism and a potential mediator of insulin resistance, notably through the negative phosphorylation of IRS-1 on Ser1101. The insulin receptor substrate-1 (IRS-1) has been recognized as an insulin signaling nexus and, as such, a master regulator of insulin sensitivity as it integrates signals from many signaling pathways. On one hand, activation of the insulin receptor will phosphorylate IRS-1 on tyrosine (Tyr) residues, promoting the metabolic effects of insulin, mostly through the activation of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt pathway. On the other hand, IRS-1 can be phosphorylated on serine residues (Ser) to uncouple PI3K from IRS-1, which downregulates insulin signaling through the PI3K/AKT pathway (1,2). Several Ser/Thr kinases have been found to phosphorylate multiple Ser residues in IRS-1 in response to growth factors or inflammatory stimuli. These include the mammalian target of

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rapamycin (mTOR) and the p70 S6 kinase (S6K1) as well as the c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) and the inhibitor of nuclear factor- B (IKK) (reviewed in (2,3)). We first showed that prolonged insulin stimulation combined with nutrient overload, such as an excess of amino acids (AA), promotes serine phosphorylation of IRS-1 through chronic activation of the rapamycin-sensitive mTOR complex 1-S6K1 (mTORC1/S6K1) (4). Subsequent studies revealed that mTORC1 and/or S6K1 phosphorylate specific serine residues on IRS proteins (rodent/human) such as Ser265/270 (5), Ser302/307 (6), Ser307/312 (7), Ser632/636 (8) and Ser1097/1101 (9). Moreover, some of these IRS-1 sites, notably Ser1101 and Ser636, were differentially regulated by mTOR and S6K1 (10,11). We have further reported that Ser1101 was an important target of S6K1 and that S6K1 overactivation contributes to Ser1101 hyperphosphorylation in liver and muscle of several animal models of obesity as well as human muscle during nutrient excess (9). However, we have previously noted that rapamycin-insensitive kinases are also involved in the insulin-dependent serine phosphorylation of IRS-1 in the absence of nutrient overload (4). The identity of potential serine kinase(s) and whether Ser1101 could be one of their potential targets is still unknown.

The p90 ribosomal S6 kinase (RSK) constitutes a family of 4 members that are activated by the ERK-MAP kinase pathway, where RSK1-3 are the most abundant and are ubiquitously expressed, whereas RSK4 is weakly expressed in few tissues (12,13). The structure of RSK is comprised of two kinase domains at the N- and C-terminal kinase domains (NTKD and CTKD respectively), interspaced by a linker region (14,15). RSK is activated through a complex process in which ERK first phosphorylates both threonine 573 (Thr) of the CTKD and Thr359/Ser363 in the linker region. The CKTD then autophosphorylates Ser380 in the linker region to promote recruitment of phosphoinositide- dependent kinase-1 (PDK1) which in turn phosphorylates Ser221 of the NTKD which then becomes capable of phosphorylating its substrates (16). The biological role of RSK, based on the identity of its known substrates, is mostly ascribed to regulation of development, cell motility and survival, as well as cell proliferation and growth (16-18). RSK promotes cell growth by directly regulating protein synthesis (19) or via its ability to modulate the mTORC1 pathway (17,20,21). Moreover, the NTKD is similar to S6K1 with 57% amino

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acid identity, suggesting that RSK could potentially phosphorylate similar substrates (13). However, whether RSK may be implicated in the regulation of insulin sensitivity and glucose homeostasis remains unexplored.

Here, we describe a new negative feedback loop whereby insulin activates RSK, which promotes IRS-1 phosphorylation on S1101, independently of the mTOR/S6K1 pathway, which in turn restricts insulin signaling and glucose metabolism in skeletal muscle and hepatic cells.

Methods

Reagents and antibodies. DMSO, fish gelatin and Rapamycin were from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). BI-D1870 was from the MSI/WTB complex at the University of Dundee, UK. PF-4708671 was from Symansis (Timaru, NZ). The insulin was from Eli Lilly (Toronto, ON, Canada). The anti-IRS1, anti-G6Pase, anti-PGC1α and anti-RSK antibodies were from Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). The anti-phospho-RSK S221 and S380 were from Abcam (Cambridge, MA). The anti-phospho-IRS-1 Ser1101 and S636/9; the anti-phospho-S6K1 T389, the anti-phospho-GSK3 S21/9, the anti-GSK3 the anti-phospho-Foxo S256, the anti-Foxo, the anti-phospho-mtor S2448 and the anti-AKT S473 were from Cell Signaling Technologies (Danvers, MA). The anti-Tubulin was from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). The p85 antibody was from Millipore (San Francisco, CA). The anti-PEPCK was from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). The RSK1 dominant negative (RSK1-DN) and LacZ adenoviruses were already described (22).

Cell culture. L6 myoblasts were grown in α-MEM (Invitrogen) supplemented with 10% FBS and differentiated into myotubes in α-MEM with 2% FBS as previously described (Bedard, Marette 1997). HepG2 cells were grown in DMEM (Invitrogen). L6 and HepG2 cells were serum-deprived during 4 h prior the experiment and 100 nM of insulin was used to stimulate the cells during the last hour of deprivation. FAO hepatocytes were maintained in RPMI media (Invitrogen). FAO cells were serum-deprived overnight and stimulated with the indicated concentration of insulin.

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Western Analyses. Western blots were performed as described (23). Briefly, equal amount of proteins were separated by SDS-PAGE (9%) and transferred onto nitrocellulose membrane. Membranes were blocked in 5% fish gelatin diluted in PBS pH 7.4 + 0.1% tween (PBS-T) and incubated overnight with the respective antibodies diluted in 1% fish gelatin in PBS-T. Immunoprecipitations were performed as described with minor modifications (24). Total cells lysates (500 µg) were pre-cleared with protein A sepharose and immunoprecipitated with the according antibodies coupled to protein A sepharose.

2-deoxyglucose (2-DG). 2-DG uptake procedures were used as previously described (25). In brief, cells were incubated for 8 min in HEPES-buffered saline containing 10 µM unlabeled 2-DG and 10 µM D-2-deoxy-[3H]glucose (0.5 µCi/ml). The reaction was terminated by washing three times with ice-cold 0.9% NaCl (w/v). Cell-associated radioactivity was determined by lysing the cells with 0.05 N NaOH, followed by liquid scintillation counting and normalized to the protein concentration.

Protein phosphotransferase assays. Transfected HA-tagged wt or kinase inactive (kd) RSK1 (K112/464R) was immunoprecipitated from cells starved overnight and treated with DMSO or PMA (100 ng/ml) for 30 minutes, as previously described (PMID: 23401857). Immunoprecipitates were washed three times in lysis buffer and twice in kinase buffer (25 mM Tris-HCl pH7.4, 10 mM MgCl2, 5 mM β-glycerophosphate). Kinase assays were performed with bacterially-purified GST- and GST-IRS-1 (wt or Ser1101A (SA)) fusion proteins as substrates, under linear assay conditions. Assays were performed for 10 min at 30°C in kinase buffer and all samples were subjected to SDS-PAGE followed by immunoblotting with IRS-1 phosphospecific antibodies. A similar procedure was used for RSK1 phosphotranferase assay. Cells were deprived in serum during 4 h and treated with 100 nM of insulin for the last 45 min prior cell lysis Saturating amount of antibody selective for the RSK1 isoform was incubated overnight with 500 µg of proteins. Immunoprecipitated RSK1 was incubated in a tube with GST-S6 in kinase buffer supplemented with 100 µM ATP and with or without RSK inhibitor (BI-D1870) 10 µM, S6K inhibitor (PF-4708671) 10 µM or PMA (50 ng/ml) for 10 min at 30°C. Inhibitors were

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added after the immunoprecipitation. All samples were subjected to SDS-PAGE followed by immunoblotting with anti-phospho-S6 S235/236 antibody.

Glucose production. FAO cells were incubated 16 h in serum-free medium, with or without insulin (100 nM). The cells were washed three times with PBS and incubated with phenol- and glucose-free DMEM medium supplemented with 20 mM sodium L-lactate and 2 mM sodium pyruvate for 5 h with or without insulin. Cell supernatants were collected and glucose concentration was measured with the Amplex-Red Glucose assay kit accordingly to the manufacturer’s instructions (Invitrogen). Cells were lysed with 50 mM NaOH and protein concentration was determined using a BCA protein assay kit to normalize glucose production.

Quantification and Statistical analyses. Western blot were quantified with the Quantity One software version 4.6.9 (BioRad). One- and two-way ANOVA with Boneferonni or Tuckey post hoc and t-tests were performed with GraphPad Prism version 5.0a for Mac (GraphPad Software).

Results

A rapamycin-insensitive kinase phosphorylates IRS-1 at normal AA concentrations As previously shown (4), insulin stimulates the phosphorylation of IRS-1, mainly through a rapamycin-sensitive kinase in conditions of nutrient overload, such as an excess of amino acids (AA; see the IRS-1 molecular shift prevented by rapamycin in 2X AA conditions, Figure 1A). However, at low to normal amino acid concentrations (0X-1X AA), rapamycin only had minor effects on the insulin-induced higher molecular shift of IRS-1 suggesting that mTORC1/S6K1 are not responsible for the mobility shift. These results also indicate that other kinase(s) might phosphorylate IRS-1 in the absence of AA overload (see 0X-1X AA conditions, Figure 1A). Along the same line, the phosphorylation of RSK is not affected by different amino acid concentrations nor rapamycin (Figure 1A).

RSK1 phosphorylates IRS-1on Ser1101

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Upon analysis of the amino acid sequence of IRS-1, we noted that the peptidic environment around Ser1101 is conserved throughout evolution and corresponds to the type 1 motif of phosphorylation present in many RSK substrates (RXRXX-pS/T-XXX see figure legend for details; Figure 1B-1C). We then searched within the human IRS-1 sequence for the presence of this consensus motif and found 5 putative serine residues of IRS-1 present in the RSK phosphorylation motif (Figure 1D).

These analyses suggest that RSK might represent a new kinase that phosphorylates IRS-1 upon insulin treatment. Therefore, we used the predicted phosphorylation of Ser1101 as a marker to validate the capacity of RSK to phosphorylate IRS-1 (see Figure 1D). A non-radioactive kinase assay that relies on an antibody that specifically detects the phosphorylation of IRS-1 Ser1101 was designed to assess the capacity of RSK to phosphorylate this serine residue in vitro (26). Recombinant wild-type or a Ser1101Ala mutated C-terminal region of IRS-1 fused to a GST tag (C-ter IRS-1 wt and SA respectively) were used as substrates (Figure 1E) (9). HA-RSK1 kinase was immunoprecipitated from HEK293 cells that were stimulated or not with Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA), a classical RSK activator (27). In basal conditions, no phosphorylation of the C-ter IRS-1 proteins was detected. However, in cells stimulated with PMA, the immunoprecipitated HA-RSK1 was able to phosphorylate the wt C-ter IRS- 1 protein (Figure 1E). This signal was specific as no phosphorylation could be detected when the C-ter IRS-1 SA mutant was used as a substrate. Moreover, the phosphorylation of the Ser1101 residue appears to rely on an active RSK1 kinase per se, as a kinase dead (KD) mutant of HA-RSK1 could not phosphorylate Ser1101 residue in the C-ter IRS-1 proteins, even in PMA-stimulated cells. These data indicate that RSK1 phosphorylates IRS-1 in vitro and that phosphorylation of Ser1101 is achieved through a direct interaction between RSK1 and IRS-1.

Next, we sought to determine if RSK could also phosphorylate IRS-1 Ser1101 in more typical insulin targeted cells. L6 (rat myocytes) and HepG2 (human hepatocytes) cell lines were serum-starved during 4 h and treated with 100 nM insulin. The activation of RSK was then assessed by western blotting using antibodies directed against the phospho-

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Ser221 or the phospho-Ser380 residues of RSK, the last steps in the mechanism leading to the activation of RSK (16). We found that RSK is activated by insulin in a time-dependent manner in L6 myocytes (Figure 2A) and in HepG2 hepatic cells (Figure 2B). Moreover, RSK was activated by insulin with a kinetic similar to that of mTOR and S6K1, as revealed by phosphorylation of S6 protein in muscle cells (Figure 2A) or mTOR and S6K1 proteins in hepatic cells (Figure 2B).

We also determined that the RSK1 isoform is activated by insulin in L6 myocytes (Figure 2C/D). A non-radioactive kinase assay was performed to assess RSK's ability to phosphorylate Ser235/6 residue of a recombinant GST-S6 in vitro after insulin treatment. Again, RSK1 activity was increased by insulin since insulin increased Ser235/236 phosphorylation of RSK1 and this activity was inhibited by a RSK inhibitor (BI-D1870). We also confirmed that S6K, a protein with an amino acid sequence similar to RSK, was not co-immunoprecipitated since a S6K1 inhibitor (PF-4708671) did not interfere with the phosphorylation of GST-S6 protein. These results show that RSK1 is activated in response to insulin stimulation in L6 myocytes which is in agreement with a previous study showing that RSK could be activated by insulin in the epithroclearis muscle of rats (28).

RSK phosphorylates IRS-1 Ser1101 independently from mTORC1/S6K1 To distinguish the role of RSK and mTOR in the phosphorylation of Ser1101 and Ser636/9, we also treated L6 cells during the last hour of deprivation with BI-D1870, a pharmacological inhibitor of RSK (29), or the mTORC1 inhibitor, rapamycin. We used 10 µM of BI-D1870 since this dose was required to inhibit RSK Ser221 phosphorylation as well as phosphorylation of the RSK substrate S6 (Figure 3A). It is also the dose required to reduce phosphorylation of IRS-1 on Ser1101 by RSK (Figure 3A). In vehicle-treated L6 cells (DMSO), stimulation with insulin significantly increased the phosphorylation of both Ser1101 and Ser636/9 (Figure 3B). However, treatment with BI-D1870 selectively and significantly inhibited the phosphorylation of Ser1101 without blocking the phosphorylation of Ser636/9 residues (Figure 3B). These results are in agreement with our bioinformatics analyses which did not predict Ser636/9 phosphorylation by RSK (see Figure 1D). On the other hand, rapamycin treatment significantly blunted only the

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phosphorylation of IRS-1 Ser636/9 residues in insulin-treated L6 cells under normal amino acid conditions as we previously observed (4)(Figure 3B, lower panel).

The finding that rapamycin treatment failed to reduce the insulin-induced Ser1101 phosphorylation of IRS-1 in L6 myocytes not exposed to nutrient stress (i.e. incubated with normal AA concentrations) suggests that the mTORC1/S6K1 pathway is not acting downstream of RSK to phosphorylate this site. However, previous studies have implicated RSK in the activation of the mTORC1/S6K1 pathway by inhibiting the tuberous sclerosis complex (TSC) (20,30). Thus promoting indirectly the activation of mTORC1 and/or via the phosphorylation of the mTORC1-scaffold protein Raptor, which then stimulates the association and activation of S6K1 (20,21). Therefore, to determine that the BI-D1870- mediated RSK inhibition did not interfere with the capacity of the mTORC1/S6K1 pathway to phosphorylate IRS-1 on Ser1101 in response to insulin, we monitored the activation state of S6K1 using a phosphospecific antibody directed against Thr389 of S6K1. As predicted, insulin stimulation significantly increased phosphorylation of Thr389 S6K1 in cells treated with vehicle (DMSO), whereas a 1h treatment with rapamycin strongly blunted the insulin- induced activation of S6K1 (Figure 3C). However, S6K1 Thr389 phosphorylation was not significantly decreased in BI-D1870-incubated cells (Figure 3C). Therefore, our results do not support a role for the mTORC1/S6K1 pathway in the phosphorylation of IRS-1 Ser1101 by RSK.

Since 10 µM BI-D1870 decreased Ser1101 phosphorylation of IRS-1 (Figures 3A, B), we next tested its impact on downstream insulin signaling in muscle cells, using Akt Ser473 phosphorylation as a molecular readout. BI-D1870 treatment did not result in the expected increase in Akt phosphorylation despite the drug effect to blunt inhibitory IRS-1 phosphorylation on Ser1101 (Figure 3D). However, it has been previously reported that BI- D1870 partially inhibits insulin action through inhibition of Akt phosphorylation in 3T3-L1 cells suggesting some off-target action of this inhibitor when used at 10 µM (31). We thus moved toward a genetic approach to inhibit RSK activity, using a dominant negative mutant of RSK1 (RSK1-DN) that was expressed in L6 myocytes using an adenoviral vector (22). As expected, in LacZ-expressing control cells, insulin significantly stimulated the

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phosphorylation of Ser1101 (Figure 4A, black bars), whereas in RSK1-DN-expressing cells, insulin could not increase the phosphorylation levels of this residue (Figure 4A, white bars). However, in similar conditions, Ser636/9 IRS-1 remained phosphorylated by insulin (Figure 4A).

Inhibition of RSK activity improves the metabolic effects of insulin We have previously shown that IRS-1 phosphorylation on Ser1101 contributes to the inhibition of insulin signaling at the level of PI3K/Akt (9). Thus we evaluated the association of the p85 subunit of PI3K to IRS-1 in muscle cells expressing either RSK1-DN or LacZ. Saturating amounts of antibody were used to immunoprecipitate IRS-1 followed by western blot analysis. The data show that insulin stimulation increased the association of p85 with IRS-1 in control cells (LacZ, basal vs insulin; Figure 4B) and this response is further increased in myocytes expressing RSK1-DN. Moreover, RSK1-DN expression was found to improve insulin-induced Akt phosphorylation which was statistically significant for Ser473 but not for Thr308 site, as compared to LacZ-infected controls (Figure 4C).

We next assessed whether the up-regulation of insulin signaling to PI3K/Akt by expression of RSK1-DN have a functional impact on muscle glucose metabolism by measuring insulin-mediated [3H]-2-deoxy-d-glucose uptake in L6 myocytes. Three days prior to experimentation, L6 myocytes in differentiation media were infected with adenoviruses encoding either RSK1-DN or LacZ as a control. Cells were then serum- starved during 4 h and treated with 100 nM of insulin during the last 45 min, and glucose uptake was measured (25). As shown in Figure 4D, insulin induced a 1.7 fold increase in glucose uptake, which was further increased to 2.5 fold by the expression of the RSK1-DN construct compared to basal cells expressing LacZ. These results are consistent with the hypothesis that RSK activity is inhibitory to insulin's metabolic action in skeletal muscle.

To determine whether RSK also controls insulin action in liver, we then evaluated whether RSK inhibition enhances insulin-mediated suppression of gluconeogenesis in FAO hepatic cells. Three days after infection with either the LacZ or RSK1-DN adenoviruses, hepatic cells were serum-deprived and then stimulated with the indicated concentrations of

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insulin for 16 h followed by incubation in a medium containing lactate and pyruvate as the sole source of carbon and increasing insulin concentrations. The glucose produced from these gluconeogenic substrates was then determined. In control LacZ-expressing cells, we observed a dose-dependent inhibition of glucose production by insulin (Figure 5A). However, in FAO cells expressing the RSK1-DN construct, the suppressive action of insulin on glucose production was significantly potentiated at several doses, indicating an improvement of hepatic insulin sensitivity upon RSK inhibition.

To examine whether improvement of insulin action in hepatic cells expressing RSK1-DN was linked to increased insulin signaling, we next measured the association of the p85 subunit of PI3K with IRS-1. As depicted in (Figure 5B), insulin stimulation increased the amount of p85 subunit in IRS-1 immunoprecipitates from control cells (lacZ, basal vs insulin). In cells infected with RSK1-DN, we found that the association of p85 with IRS-1 was further increased upon insulin stimulation as compared to LacZ-expressing controls, suggesting that RSK1 inhibition improves insulin signaling to PI3K. The expression of either IRS-1 or p85 PI3K were not affected by expression of RSK1-DN (lower panel, TLC fractions). This improvement was also associated with an increase in insulin-induced pAkt on both S473 and T308. Moreover, RSK1 down-regulation increased phosphorylation of FoxO1 S256 and GSK3 S21/9, two important targets of Akt, in both the basal and insulin stimulated state (Figure 5C). We also measured the expression of gluconeogenic enzymes phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) and glucose-6- phosphatase (G6Pase) as well as a co-activator of Foxo1, PPARγ coactivator-1α (PGC1α). These results show that only G6Pase is decreased in RSK1-DN infected cells while PEPCK and PGC1α expression levels are similar between experimental conditions (Figure 5D). These data indicate that, as observed in muscle cells, RSK1 restricts the metabolic effects of insulin in hepatic cells through the regulation of insulin signaling and by modulating G6Pase expression.

These results prompted us to evaluate the implication of RSK1 in the context of insulin resistance. Previously, Huang et al. reported that a sustained exposure of 24 h to a glucose/insulin-enriched medium (High G/I) significantly decreased insulin-induced

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glucose uptake in L6 myocytes by downregulating the IRS-1/PI3K signaling pathway (Figure 6A) (32). We took advantage of this experimental paradigm to promote insulin resistance in L6 myocytes and test whether this could be prevented by RSK inhibition. As expected, incubation with the High G/I medium strongly interfered with the capacity of insulin to stimulate glucose uptake in control cells expressing LacZ (Figure 6B). However, we found that RSK1-DN expression induced a significant 1.6 fold improvement of glucose uptake, consistent with a role for RSK in the promotion of insulin resistance in myocytes exposed to High G/I medium. We observed also that even with High G/I medium RSK1- DN was able to reduce IRS-1 phosphorylation on S1101 in both basal and insulin conditions (Figure 6C). This was linked to improved insulin signaling as revealed by enhanced Akt phosphorylation on both Ser473 and Thr308 residues upon insulin stimulation of RSK1-DN expressing cells as compared to LacZ-infected controls (Figure 6C-D). These data suggest that RSK1 plays a role in the development of muscle insulin resistance following prolonged hyperinsulinemia and hyperglycemia, as commonly observed in insulin-resistant and glucose-intolerant subjects.

Discussion

Insulin resistance is a hallmark of obesity-linked type 2 diabetes. The mechanisms leading to insulin resistance are currently viewed as an intricate network of molecular steps where signaling proteins like IRS-1 integrate signals provided by inflammation and nutrient-sensing pathways to generate a pathophysiologic response. For example, dysregulation of mTORC1/S6K1 signaling caused by hyperinsulinemia and nutrient overload in obese animals has been shown to increase IRS-1 serine phosphorylation and to downregulate the IRS-1/PI3K/Akt signaling axis, which, in turn, interferes with the metabolic actions of insulin in skeletal muscle and liver (9,33). However, this pathway appears to be dominant mostly in the context of nutrient excess, particularly when branched chain AA concentration is increased (4,9,34-36). It is still to be determined if IRS-1 may be phosphorylated by other kinase(s) in the context of normal nutrient levels. As shown in this paper, IRS-1 can also be serine phosphorylated by prolonged insulin exposure, independently from nutrient status and mTORC1/S6K1 activation, and we thus decided to

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explore the role of other Ser/Thr kinases in the regulation of IRS-1 signaling and their impact on glucose metabolism.

Herein we describe a new mechanism of regulation of insulin signaling through phosphorylation of the IRS-1 scaffold protein by the Ser/Thr kinase RSK. Indeed, we found that RSK is a novel mediator of IRS-1 serine phosphorylation, leading to inhibition of insulin's metabolic actions in muscle and liver cells. Since we have previously shown that Ser1101 in IRS-1 is a key site of negative regulation of insulin signaling for glucose metabolism (9) and that this site falls into the consensus motif of RSK, we explored the ability of this Ser/Thr kinase to phosphorylate this site in various cell types. We found that RSK can phosphorylate Ser1101 of IRS-1 in HEK293 cells but not when a mutant IRS-1 SA mutant was transfected in these cells. We further showed that insulin increases RSK phosphorylation and activates RSK1 kinase in typical insulin target cells and that IRS-1 Ser1101 was phosphorylated in these conditions. Using both a RSK inhibitor and a RSK1- DN mutant, we confirmed that RSK activation by insulin phosphorylates Ser1101. We have further shown that RSK-induced IRS-1 Ser1101 phosphorylation does not rely on nutrient excess and, accordingly, is independent of the mTORC1/S6K1 pathway. Insulin-induced RSK activation is therefore a novel autologous mechanism by which the hormone's metabolic actions can be regulated through a negative feedback loop at the level of IRS-1, leading to attenuation of PI3K/Akt signaling. Our data further show that expression of the RSK1-DN mutant in muscle and hepatic cells increased insulin-stimulated glucose uptake and augmented the hormone's sensitivity for suppression of glucose production, respectively. Both effects were linked to an increased association of the PI3K p85 subunit to IRS-1 suggesting that insulin signaling was improved through reduced inhibitory Ser1101 phosphorylation of IRS-1. As expected, this translates into an increased phosphorylation of Akt in both muscle and hepatic cells. Moreover, phosphorylation of Foxo1 and GSK3, two important targets of Akt controlling glucose metabolism, were increased in FAO cells. Since glucose production was reduced in RSK1-DN infected cells we measured the expression of gluconeogenic enzymes. Interestingly, only G6Pase protein expression was decreased by the RSK1-DN while PEPCK expression was similar between LacZ and infected cells. Foxo1 has been reported to induce higher activation of G6Pase

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than that of PEPCK and this could be due to the presence of only one insulin response sequence for Foxo1 in the latter gene in comparison to three insulin response sequences in the G6Pase promoter (37-39). Additionally, overexpression of Foxo1 increases the expression of the catalytic subunit of G6Pase in response to cAMP and dexamethasone, and not the expression of PEPCK (40). However, more studies are needed to understand the role of RSK on hepatic gluconeogenic enzyme expression, specifically regarding insulin regulation of gluconeogenic enzyme expression and function in insulin-resistant conditions.

RSK is a downstream effector of the ERK/MAP kinase pathway and previous studies have shown a potential role for ERK in mediating IRS-1 serine phosphorylation in both inflammatory and nutrient stress conditions. Indeed, ERK has been reported to phosphorylate IRS-1 on Ser612 and Ser632 and this was proposed to modulate the association of the p85 subunit of PI3K to IRS-1 (3). Furthermore, elevated Ser636 phosphorylation of IRS-1 (corresponding to the Ser632 in rodents) has been correlated to higher ERK activity in primary cultures of skeletal muscles from type 2 diabetic patients (41). Interestingly, cross-breeding ERK1-/- mice with genetically obese ob/ob mice was found to improve their insulin sensitivity in association with improved Akt phosphorylation suggesting that the ERK pathway is implicated in obesity-linked insulin resistance (42). However, it remains to be clarified if ERK itself is the principal mediator of inhibitory serine IRS-1 phosphorylation in these in vitro and in vivo studies, or if downstream kinases such as RSK could be also involved. Indeed, although ERK phosphorylates Ser636 (43), it is not expected to phosphorylate Ser1101 since this site is not followed by a proline and ERK is a proline-directed kinase. On the other hand, we have demonstrated that Ser636 is not a target of RSK since its inhibition did not affect insulin-mediated Ser636 phosphorylation in muscle cells. Taken together, these results suggest that ERK-mediated Ser636 phosphorylation is independent of RSK but that RSK could be a downstream mediator of Ser1101 phosphorylation upon activation of the ERK/MAP kinase pathway. More studies will be needed to determine whether the other 4 Ser residues within IRS-1 (Figure 1D), that were also identified as potential RSK target sites by our bioinformatic analysis, are also phosphorylated by RSK in vivo and whether they can alter PI3K/Akt signaling and glucose metabolism.

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Our finding that RSK-mediated autologous inhibition of insulin signaling is likely involved in the physiological regulation of insulin's metabolic actions does not exclude that it may also be implicated in the development of insulin resistance. Indeed, we found that interfering with RSK1 activity not only potentiated the physiological response to insulin but also improved insulin sensitivity in a well-known model of insulin resistance induced by chronic exposure to high glucose high insulin in L6 myocytes. These data are consistent with the hypothesis that RSK promotes insulin resistance through increasing IRS-1 Ser1101 phosphorylation thereby attenuating the activation of PI3K/Akt signaling, a negative feedback mechanism that is shared by S6K1 to promote insulin resistance upon nutrient excess (9).

Whereas our results suggest a new role for the RSK pathway in the control of insulin's metabolic actions, our conclusions are limited to the RSK1 isoform and we cannot exclude a role of other RSK isoforms, as the approaches used to interfere with RSK activity (e.g. pharmacological inhibition BI-D1870 and expression of the RSK1-DN mutant) cannot discriminate the potential roles of other RSK isoforms. Indeed, exploration of the BioGPS database revealed that RSK1, RSK2 and RSK3 are expressed in skeletal muscle while RSK1 is the main isoform expressed in liver from both human and mice (13). With regards to RSK2, Chang PY et al. (44) previously reported that its activity is decreased in muscles of obese and insulin-resistant mice. This was measured after a single time point (15 min) following in vivo insulin injection. Moreover, ERK1/2 activation was also reduced in the same animals, which is in contrast with others studies that reported increased ERK1/2 MAPK activity in obese animals (45-47) and with the observation that ERK1-/- mice are more insulin sensitive and protected from high-fat diet induced obesity (48). The conclusions of the present study may seem at odds with a previous study reporting that RSK2-/- mice develop insulin resistance and are glucose intolerant (49). However, these mice are also lipodystrophic, which likely explains their secondary insulin resistance through lipotoxicity. It should also be noted that despite their lower body weight and whole-body insulin resistance, RSK2-/- mice actually showed enhanced insulin-stimulated Akt phosphorylation in skeletal muscle which supports a negative role for this RSK isoform

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in the control of insulin's metabolic signaling (50). Further analysis of the role of both RSK1 and RSK2 isoforms in the regulation of insulin action and glucose metabolism in muscle and liver is therefore warranted. Selective deletion of individual RSK isoforms in those tissues will likely be needed to confirm their specific metabolic functions in vivo as well as their role in the development of insulin resistance in obese and hyperinsulinemic states.

Taken together, our results demonstrate that RSK is involved in the negative regulation of IRS-1 through its ability to directly phosphorylate Ser1101, independently from nutrient excess and from mTORC1/S6K1 activation. Using a RSK1-DN mutant further allowed us to demonstrate a functional role for RSK1 as a negative regulator of glucose metabolism in muscle and liver cells, through IRS-1 Ser1101 phosphorylation and inhibition of PI3K/Akt signaling. Our findings that RSK1 mediates insulin resistance in HG/HI treated muscle cells further suggest that RSK is a new potential target for the treatment of insulin resistance, at least in vitro. Future studies in animal models lacking individual RSK isoforms in key metabolic tissues will be needed to fully understand the role of each member of this family of Ser/Thr kinases in the regulation of insulin.

Acknowledgements The authors thank Dr. Kerstin Bellmann and Dr. Patricia Mitchell for their critical evaluation of the manuscript. This work was funded by a grant from Canadian Institutes of Health Research (CIHR) to A. M. (FRN- 57878); N. S-L was supported by a postdoctoral scholarship from the Obesity training program funded by CIHR. Part of this study was also supported by grants from the CIHR and the National Science and Engineering Research Council (NSERC). A. M. holds a CIHR/Pfizer research Chair on the pathogenesis of insulin resistance and cardiovascular diseases and P.P.R. also holds a Canada Research Chair in Signal Transduction and Proteomics.

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Legends to Figures

Figure 1. The IRS-1 scaffold protein presents putative residues that could be phosphorylated by the RSK kinase. (A) Differentiated L6 myotubes were incubated in increasing concentrations of amino acids (0X, 1X, 2X AA) during 60 min. Rapamycin was added to a final concentration of 25 nM during 60 min or, alternatively, equivalent volume of DMSO (vehicle). Insulin was added for the last 45 min at a final concentration of 100 nM. Cells were then harvested, processed for SDS-PAGE and western blot using the anti-IRS-1 polyclonal antibody, anti-phospho- S6K1 T389 or anti-phospho-RSK S221. Tubulin levels are presented as loading control. (B) WebLogo frequency plot of the target sequences in known RSK substrates, and the evolutionary conservation around IRS-1 Ser1101. Bt, Bos taurus; Dr, Danio rerio; Hs, Homo sapiens; Mm, Mus musculus; Xt, Xenopus tropicalis. (C) Phosphorylation site alignment of a selection of known RSK substrates (human sequences). (D) Human IRS-1 sequence was probed for the presence of RSK consensus sequence of phosphorylation (RXRXXS/T) using ExPaSy tools (see Material and Methods for details). Putative serines phosphorylated by RSK are underlined with a solid line and highlighted in bold. The Ser1101 residue is highlighted by a red line whereas the residues Ser636/9 that are phosphorylated downstream of the mTOR pathway and not recognized by RSK are evidenced by a dashed line. (E) HEK293 cells were transfected with the indicated constructs. After 24 h, cells were serum starved for 18 h and stimulated with or without PMA (50 ng/ml). Cells were lysed and HA-RSK1 was immunoprecipitated from 200 µg of clarified lysate. Beads were washed and incubated with 100 ng of wt or Ser1101A (SA) mutant GST-IRS-1 C-ter in RSK kinase buffer supplemented with 200 µM ATP for 10 min at 30°C. Proteins were then separated by SDS-PAGE and analyzed by western blotting with the indicated antibodies. The relative amount of GST-IRS-1 C-terminal proteins used in kinase assays was controlled by loading 1 µg of each protein on SDS-PAGE followed by Coomassie staining.

Figure 2. RSK1 is activated in insulin-targeted cell lines (A) L6 myotubes and (B) HepG2 cells were incubated with 100 nM insulin during the indicated time. Following stimulation, cells were harvested, processed for SDS-PAGE and western blot with the indicated antibodies. Tubulin levels are presented as loading control. Equal volumes of DMSO (vehicle) were added as control. (n=3) C) L6 cells were deprived in serum and treated with 100 nM of insulin for the last 45 min. Following cell lysis, saturating amount of antibody selective for the RSK1 isoform was incubated overnight with 500 µg of protein from cell lysates. Then a non-radioactive kinase assay was performed. Briefly, immunoprecipitated RSK1 was incubated with GST-S6 and with or without RSK inhibitor (BI-D1870) 10 µM or S6K inhibitor (PF-4708671) 10 µM in a tube with kinase buffer supplemented with 100 M ATP for 10 min at 30°C. SDS-PAGE and anti-phospho S6 S235/236 was used to assess the level of RSK activity. n-a: no antibody, TCL: total cell

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lysate D) Graphs shows the mean +/- SEM of densitometry analyses of the western blot (n=4). * p<0.05 A.U., arbitrary units.

Figure 3. Insulin stimulation of L6 myocytes promotes the RSK1-dependent phosphorylation of Ser1101 of IRS-1 (A) L6 myotubes were incubated with the RSK inhibitor BI-D1870 or Rapamycin at a final concentration of 10 µM and 25 nM respectively, during 60 min. In control conditions, equal volume of DMSO (vehicle) was added. Cells were deprived in serum and treated with 100 nM of insulin for the last 45 min prior cell lysis. Equal amounts of proteins were separated on SDS-PAGE and processed for western blot analyses using the indicated antibodies. Actin and tubulin levels were used as loading controls. (n5). (B) L6 cells were treated and processed for western blot analyses as in A) using the indicated antibodies. Tubulin levels are shown as loading controls. (n=7). (C) L6 myocytes were infected with an adenovirus encoding a dominant negative RSK1 mutant (RSK1-DN) or the control LacZ gene after 4 days of differentiation. After 7 days of differentiation cells were processed for western blot analyses as in A). Graph shows the mean +/- SEM of densitometry analyses of the western blot normalized for the loading controls (n=6). ***, p<0.001; *, p<0.05 A.U., arbitrary units.

Figure 4. Inhibition of RSK1 activity improves insulin sensitivity in L6 cells (A) L6 myocytes were infected with an adenovirus encoding a dominant negative RSK1 mutant (RSK1-DN) or the control LacZ gene at the day 4 of differentiation. After 7 days of differentiation, 2-deoxyglucose uptake was evaluated by incubating cells with [3H] 2- deoxyglucose for 8 min. Myocytes were then lysed and protein concentrations were evaluated to normalize radioactive counts. Results are presented in fold over basal-LacZ conditions and are the mean +/- SEM of 3 independent experiments. A.U., arbitrary units. (B) On the day of the experiment, L6 cells were serum-deprived during 4 h and treated with 100 nM of insulin during the last 45 min. Cells were then harvested and equal amount of total cell lysate was subjected to immunoprecipitation with an anti-IRS-1 antibody. As a control, irrelevant IgG was used. Western blot analyses using the indicated antibodies were performed. Total cell lysates (TCL) are shown to control the relative expression of each protein. The expression of either IRS-1 or p85 PI3K were not affected by expression of RSK1-DN (lower panel, TLC fractions). Equal amount of irrelevant IgG were used as a control and, as expected, IRS-1 was not immunoprecipitated under these conditions nor could we detect p85 in western blot analyses. (C) Western blot of pAkt S473 and T308. Actin levels were used as loading controls. Graph shows the mean +/- SEM of densitometry analyses of pAkt S473 and T308 (n=6). *, p<0.05, A.U., arbitrary units.

Figure 5. Inhibition of RSK1 activity improves insulin sensitivity in hepatocytes (A) FAO hepatocytes were infected with an adenovirus encoding a dominant negative RSK1 mutant (RSK1-DN) or the control LacZ gene during 72h and processed for the determination of glucose production (see material and methods for details). Results are

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presented in folds over basal (LacZ) and are the mean +/- SEM of 6 independent experiments. *, p<0.05; A.U., arbitrary units. (B) FAO hepatocytes were infected as indicated. Cells were serum deprived during 16 h and treated with 100 nM of insulin during the last 45 min. Immunoprecipitation of IRS-1 was performed as in figure 4B. (C) Equal amounts of proteins were separated on SDS-PAGE and processed for western blot analyses using the indicated antibodies to assess insulin signalling and (D) gluconeogenic enzyme expression. Tubulin levels were used as loading controls. These blots are representative of at least three separate experiments.

Figure 6. RSK1-DN improves insulin sensitivity in pathological conditions in L6 cells (A) Time line describing the differentiation of the L6 cells and the treatments performed. (B) 2-deoxyglucose uptake in L6 myocytes was performed as in Figure 4 A), however, the cells were incubated with a medium containing 25 mM of glucose and 100 nM of insulin 24 h prior to the experiment to promote insulin resistance. Results are presented in fold over basal-LacZ conditions and are the mean +/- SEM of 6 independent experiments. A.U., arbitrary units. (C) L6 myocytes were infected with an adenovirus encoding a dominant negative RSK1 mutant (RSK1-DN) or the control LacZ gene at the day 4 of differentiation. After 7 days of differentiation L6 myotubes were serum-starved for 4 h and stimulated with 100 nM of insulin for the last 45 min prior cell lysis. In control conditions, equal volume of DMSO (vehicle) was added. Equal amounts of proteins were separated on SDS-PAGE and processed for western blot analyses using the indicated antibodies. (D) Western blot of pAkt S473 and T308 in HG/I conditions. Actin levels were used as loading controls. Graph shows the mean +/- SEM of densitometry analyses of pAkt S473 and T308 normalized for the loading controls and Akt (n=6). **, p<0.01; *, p<0.05, N.S., not significant difference. A.U., arbitrary units.

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IV-Discussion générale

Notre laboratoire a montré au cours des 15 dernières années l’importance de la voie mTORC1/S6K1 dans la régulation de la signalisation de l’insuline en réponse à des nutriments et dans la physiopathologie de l’obésité et du diabète de type 2. Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse avaient pour objectif d’évaluer l’impact de l’inhibition de S6K1 et RSK sur la signalisation de l’insuline. Puis, d’explorer l’impact métabolique et les mécanismes moléculaires engendrés par l’inhibition de ces kinases dans l’optique de déterminer si l’inhibition de ces kinases pourrait être de bons mécanismes thérapeutiques afin d’améliorer la résistance à l’insuline. Les résultats présentés dans cette thèse sont les premiers à montrer les effets de l’inhibition pharmacologique de S6K1 à l’aide du PF- 4608671 sur le métabolisme du glucose et la signalisation de l’insuline. De plus, nous sommes les premiers à montrer l’importance de RSK dans le rétrocontrôle négatif de la signalisation de l’insuline sur IRS-1 induit par l’insuline.

S6K1 régule Akt principalement en régulant la Ser473 d’Akt.

L’inhibiteur de mTORC1, la rapamycine, a été très utilisé pour montrer l’importance de cette kinase dans la croissance, la prolifération, la synthèse protéique et l’autophagie (436). Plusieurs groupes ont également utilisé cet inhibiteur pour montrer le rôle de mTORC1 dans la régulation de la signalisation de l’insuline et le métabolisme énergétique (136). Cependant, l’utilisation chronique de cet inhibiteur crée plusieurs effets secondaires tels l’hyperinsulinémie, l’intolérance au glucose, une résistance à l’insuline et une hypertriglycéridémie (136). Notre stratégie d’utiliser un inhibiteur sélectif pour S6K1 qui est une kinase en aval de mTORC1, soit le PF-4708671, n’a pas reproduit ces effets in vitro ou in vivo. Au contraire, le PF-4708671 aigu et chronique augmente la phosphorylation d’Akt sur la Thr308 et la Ser473 induite par l’insuline comparativement à la rapamycine chronique qui diminue la phosphorylation d’Akt Ser473. Ces résultats suggèrent que le PF- 4708671 représenterait une bonne stratégie thérapeutique afin de traiter la résistance à l’insuline associée à l’obésité (Chapitre I).

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Nous avons également remarqué que le PF-4708671 agissait de manière plus importante sur la Ser473 que la Thr308 comparativement à la rapamycine. En effet, dans un modèle de souris obèse nourri avec une diète riche en gras, le PF-4708671 n’augmente par la phosphorylation de la Thr308 alors que la rapamycine chronique restaure l’action de l’insuline sur la phosphorylation de la Thr308 dans le tissu adipeux. Ces résultats suggèrent que bien que S6K1 est un médiateur important de la boucle de rétrocontrôle négatif de la signalisation de l’insuline sur IRS-1, S6K1 exercerait peut-être un rétrocontrôle négatif plus important sur mTORC2 qui phosphoryle Akt sur la Ser473.

En effet, S6K1 a été montré pour réguler négativement l’activité de mTORC2 qui phosphoryle la Ser473 d’Akt en phosphorylant Rictor et Sin1 (57, 58, 437). Parmi les raisons possibles pour expliquer cette différence entre inhiber mTORC1 et S6K1 est que mTORC1 inhibe IRS-1 non seulement par S6K1, mais aussi via GRB10 ou encore directement (50). Ainsi, mTORC1 régule la boucle de rétro-inhibition négative sur la voie PI3K/PDK1/AktThr308 par plusieurs mécanismes. De plus, dans ce modèle, la diète riche en gras et l’obésité peuvent induire d’autres kinases qui pourraient compenser l’action de l’inhibition de S6K1 sur IRS-1 tel qu’une augmentation de l’activité de RSKs et de PKCs qui phosphorylent les mêmes sites sur IRS-1. Ainsi, cette compensation limiterait l’impact de l’inhibition de S6K1 sur IRS-1 et la voie PI3K, responsable de la phosphorylation de la Thr308 d’Akt dans ce modèle.

De plus, il a été montré que la phosphorylation d’Akt sur la Thr308 augmente l’activité d’Akt de 100 fois, mais que l’activité maximale d’Akt nécessite la phosphorylation de la Ser473 (30). Cependant, plusieurs études suggèrent que la phosphorylation de la Ser473 ne régule pas nécessairement l’activité d’Akt, mais plutôt sa spécificité pour ses substrats (438-440). En effet, la Thr308 serait nécessaire à la phosphorylation de GSK3β et TSC2 par Akt alors que la Ser473 serait plutôt nécessaire pour la phosphorylation de FOXO et AS160 par Akt qui régulent la lipogenèse, le captage de glucose et la gluconéogenèse (191, 192, 438, 439, 441). Ces études expliquent en partie pourquoi même si la rapamycine chronique augmente la phosphorylation de la Thr308, l’inhibition qu’elle exerce sur la phosphorylation de la Ser473 entraine une dérégulation du métabolisme du glucose. De

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manière intéressante, les effets majeurs du PF-4708671 que nous avons observés étaient sur le captage de glucose, la gluconéogenèse hépatique in vitro et associée à une augmentation de la phosphorylation de la Ser473 d’Akt.

S6K1 régule Akt, mais où ?

Par ailleurs, il y a d’autres facteurs qui peuvent influencer la spécificité des substrats activés par Akt. En effet, un de ces mécanismes est la localisation d’Akt. Suite à la stimulation du récepteur à l’insuline, la voie PI3K est activée ce qui augmente le recrutement d’Akt à la membrane plasmique et permet la phosphorylation de la Thr308 d’Akt par la PDK1. Ce qui est moins clair est le lieu où la phosphorylation de la Ser473 d’Akt par mTORC2 se fait. mTORC2 a été montré pour être localisé à la membrane plasmique au niveau des radeaux lipidiques, mais seulement une petite partie se retrouve à cet endroit (201, 442, 443). mTORC2 se localise également à la membrane du réticulum endoplasmique, plus spécifiquement au niveau des contacts MAM « mitochondrial- associated endoplasmic reticulum membranes » de la mitochondrie-réticulum endoplasmique (202). De façon intéressante, l’insuline et la réexposition à des nutriments après un jeûne chez des souris (fasting-refeeding) stimulent la translocation de mTORC2 et Akt vers les MAMs (202). Cette translocation permet à mTORC2 de phosphoryler Akt et de réguler certaines fonctions mitochondriales ainsi que la glycolyse en activant l’hexokinase II mitochondriale. La localisation de l’hexokinase II à la mitochondrie permet de coupler, à proximité, la glycolyse à l’oxydation du pyruvate, mais aussi de permettre le recyclage rapide de l’ADP vers la mitochondrie (Figure 31). De plus, S6K1 et AMPK se retrouvent également au niveau de la mitochondrie (207, 413). Alors que l’AMPK a été montré pour être impliqué dans l’autophagie, plus particulièrement la mitophagie, le rôle de S6K au niveau mitochondrial reste encore à déterminer. Cependant, puisque S6K interagit directement avec mTORC2 et AMPK, il se pourrait que S6K régule les fonctions mitochondriales par l’entremise de ces kinases.

Peu d’études ont en effet regardé la localisation cytoplasmique de S6K sur les différentes organelles. Les seules études ayant regardé la localisation de S6K se sont attardées à sa

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présence cytoplasmique ou nucléaire. Cependant, il est logique de penser que S6K se retrouve au niveau des mêmes compartiments cytosoliques que ses activateurs et ses substrats. Ainsi, il serait intéressant de déterminer le rôle de S6K en réponse à différents stimuli au niveau des lysosomes où mTORC1 est activé et également au niveau du réticulum endoplasmique et la mitochondrie où mTORC1, mTORC2, Akt et AMPK se trouvent aussi.

Le PF-4708671 améliore l’action de l’insuline et le métabolisme du glucose.

Dans notre première étude (chapitre I), nous avons évalué si l’inhibition pharmacologique de S6K1 améliorait la tolérance au glucose chez des souris obèses nourries avec une diète riche en gras. Une semaine seulement d’injection intrapéritonéale à raison d’une fois par jour fut suffisant pour améliorer la tolérance au glucose, l’hyperglycémie, l’hyperinsulinémie et la stéatose hépatique sans changer le poids des souris. Un des mécanismes expliquant ces résultats est une amélioration de la résistance à l’insuline notamment via la restauration de la capacité de l’insuline à stimuler la phosphorylation d’Akt. Ces résultats concordent également avec les études utilisant différents modèles génétiques afin d’inhiber S6K1 (236, 269). D’autres mécanismes peuvent cependant être impliqués dans ces effets du PF-4708671 puisque nos études cellulaires ont montré une activation importante de l’AMPK et une inhibition d’ACC (Chapitre II). ACC est impliqué dans la lipogenèse de novo et l’inhibition du transport des lipides dans la mitochondrie. Ainsi, le PF-4708671 inhibe ACC via l’activation de l’AMPK et pourrait augmenter l’oxydation des lipides ce qui contribuerait à diminuer la stéatose hépatique, améliorer la résistance à l’insuline et diminuer l’obésité tel qu’observé dans les souris déficientes pour S6K1. Par ailleurs, S6K a été montré pour induire SREBP-1c et ainsi contribuer à la stéatose hépatique. Nous ne l’avons pas vérifié dans notre étude, mais la tendance d’une diminution de la stéatose hépatique dans les souris traitées avec le PF-4708671 comparativement au groupe traité avec le véhicule pourrait aussi être causée par une diminution de l’activité transcriptionnelle de SREBP-1c.

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Malgré que nous ayons observé une diminution de la production hépatique de glucose dans les cellules hépatiques FAO, le PF-4708671 n’a pas reproduit ces effets chez des souris obèses soumises à une diète riche en gras. Pourtant, le PF-4708671 a entrainé la restauration de la sensibilité à l’insuline hépatique au niveau d’Akt. La principale différence entre les deux modèles (in vitro vs in vivo) est la diète c’est-à-dire une exposition chronique à des niveaux élevés de lipides activant ainsi plusieurs protéines qui n’a pas été reproduite dans nos études cellulaires. Dans ce contexte, il est possible que d’autres mécanismes induits par la diète empêchent l’inhibition de S6K1 d’inhiber la production hépatique de glucose. Nous avons montré que le PF-4708671 augmentait la phosphorylation d’Akt dans les hépatocytes, mais même si Akt est un régulateur important de la gluconéogenèse hépatique via la régulation de FoxO, ils ne sont pas essentiels puisque la délétion d’Akt et FoxO sélectivement dans le foie de souris n’empêche pas la régulation de la production hépatique de glucose par l’insuline (44, 444). Par contre, la gluconéogenèse hépatique peut aussi être régulée par la disponibilité des substrats gluconéogéniques, plusieurs facteurs de transcription et également via certains axes entre tissus tels que l’axe cerveau-foie, intestin-foie qui peuvent aussi réguler la production hépatique de glucose dans l’obésité (445).

Une autre raison pouvant expliquer ces différences est la pharmacocinétique de cette molécule. En effet, il n’y a aucune étude jusqu’à présent qui a étudié le métabolisme et la distribution du PF-4708671 chez l’animal. Le foie étant un organe qui métabolise plusieurs molécules, il se pourrait que ce soit le site de dégradation et d’élimination du PF-4708671 ce qui diminuerait ses effets hépatiques. De plus, pour des raisons monétaires, nous n’avons pas pu tester plusieurs doses et plusieurs temps de traitement qui auraient pu révéler des effets plus importants du PF-4708671. Cependant, nous avons testé une dose 10 fois moindre (3.5 mg/kg/j) que celle utilisée dans notre publication (Chapitre I) ainsi qu’une et deux semaines de traitement. Lors de ces essais préliminaires, la dose la plus faible même à deux semaines de traitement n’améliorait pas de façon significative la tolérance au glucose chez des souris obèses. Par contre, deux semaines de traitements avec le PF-4708671 à la même dose que nous avons utilisée dans notre étude soit 35 mg/kg/j (Chapitre I) amélioraient de façon plus importante la tolérance au glucose, mais aussi diminuait la prise

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de poids et la prise alimentaire. Ces résultats suggèrent donc un potentiel rôle de l’inhibiteur de S6K1 dans la prise alimentaire lorsqu’il est utilisé à plus long terme. Ces résultats sont surprenants puisque S6K1 ne semble pas jouer un rôle majeur sur la prise alimentaire au niveau central (446). Malgré cela, il serait intéressant de déterminer l’impact du PF-4708671 sur la prise alimentaire et la dépense énergétique à plus long terme.

Le PF-4708671 et l’inhibition du complexe I mitochondrial.

Le PF-4708671 semble aussi inhiber à court terme l’activité du complexe I mitochondrial indépendamment de S6K1 (447). Dans cette étude, les auteurs ont montré que le PF- 4708671 inhibait l’activité du complexe I mitochondrial dans des cellules MEF déficientes pour S6K1 et S6K2. De plus, cet effet est associé à une augmentation de la phosphorylation de la Thr172 d’AMPK et d’ACC sur la Ser79. Curieusement, même si les deux kinases responsables de la phosphorylation de S6 sur la Ser240/244 sont absentes dans ces cellules, les auteurs détectent toujours une phosphorylation importante de ce site. Malgré cela, nous avons confirmé ces résultats dans des cellules musculaires et hépatiques (Chapitre II). Dans ces cellules, nous n’avons pas observé de diminution de la consommation d’oxygène mitochondriale basale contrairement à Vainer et collègues, mais plutôt une diminution de la capacité respiratoire de réserve qui est nécessaire afin de répondre à une demande énergétique plus importante. Cependant, cet effet semble être seulement à court terme puisque 5h, 24h et 48h de traitement n’inhibe pas la capacité respiratoire de réserve, mais inhibe toujours S6K1. De plus, l’augmentation de la phosphorylation d’AMPK Thr172 et d’ACC Ser79 est aussi présente à 5 et 48h. Ces résultats suggèrent qu’il y a probablement un mécanisme induit soit par le PF-4708671 ou encore induit de manière endogène afin de compenser la diminution de l’activité du complexe I mitochondrial sur la chaine respiratoire. Cette hypothèse concorde aussi avec l’absence de diminution des niveaux d’ATP dans les cellules musculaires. Par contre, il se pourrait que le PF-4708671 augmente les niveaux d’AMP augmentant de la même manière le ratio AMP/ATP afin d’activer l’AMPK. Malgré l’augmentation de l’activité de l’AMPK induite par le PF-4708671, l’AMPK n’est pas nécessaire pour que le PF-4708671 augmente le transport du glucose dans les cellules musculaires (Chapitre II). Cet effet pourrait donc être induit par

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l’inhibition de S6K1 comme montré précédemment à l’aide de siRNA contre S6K1 (448) qui augmente la phosphorylation d’Akt ou encore via l’inhibition du complexe I mitochondrial. En effet, plusieurs groupes ont montré que les inhibiteurs du complexe I mitochondrial tels que la roténone et la metformine augmentaient le transport de glucose afin de compenser la diminution des niveaux d’ATP (449, 450). Cependant, la metformine est connue pour augmenter l’oxydation des lipides contribuant à la production d’ATP, un effet qui n’est pas reproduit par la roténone (451). Ces différences peuvent être expliquées en partie par une affinité moins élevée de la metformine (~20 mM) (452) pour le complexe I mitochondrial que la roténone (8-20 nM) (453) et par la possibilité qu’elles inhibent le complexe I mitochondrial par des mécanismes différents. Ainsi, d’autres études seront nécessaires afin de déterminer le potentiel d’inhibition du complexe I mitochondrial par le PF-4708671 en comparaison avec ces inhibiteurs.

Le PF-4708671 et la metformine.

La metformine est le médicament anti-diabétique le plus prescrit en raison de son action sur la réduction de l’hyperglycémie. Malgré que la metformine inhibe le complexe I mitochondrial et active AMPK dans la plupart des tissus, physiologiquement et cliniquement, son principal mécanisme d’action est la diminution de la production hépatique de glucose et légèrement une amélioration de la clairance du glucose dans les tissus périphériques (454). Nos données montrent que le PF-4708671 augmente le captage de glucose musculaire et inhibe la production hépatique de glucose de manière très importante in vitro. Cependant, nos études animales montrent que la production de glucose hépatique n’est pas diminuée après une semaine de traitement à la dose utilisée. Ces données suggèrent donc que le principal mécanisme d’action du PF-4708671 sur le métabolisme du glucose est une amélioration de la clairance du glucose dans les tissus périphériques puisque la tolérance au glucose est augmentée, mais les niveaux d’insuline ne changent pas lors d’un test de tolérance au glucose. Une combinaison de la metformine avec le PF-4708671 serait une stratégie thérapeutique très intéressante à tester dans un modèle animal obèse afin de déterminer s’ils peuvent agir de façon additive ou même synergique sur la gestion du glucose et la résistance à l’insuline.

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Par ailleurs, la metformine est connue pour activer l’AMPK de manière indirecte en inhibant le complexe I mitochondrial augmentant ainsi le ratio AMP/ATP (450). Par conséquent, le PF-4708671 pourrait également utiliser ce mécanisme pour activer l’AMPK. Cependant, l’augmentation du ratio AMP/ATP n’est peut-être par le seul mécanisme par lequel la metformine peut activer l’AMPK. En effet, plusieurs études montrent que la metformine augmente la production de ROS et des RNS (reactive nitrogen species) participant à ses effets bénéfiques tels l’augmentation du métabolisme énergétique et l’augmentation de la longévité (455-457) alors que d’autres ont montré que la metformine inhibait la production de ROS induite par l’inhibition du complexe I mitochondrial (458, 459). Ces différences peuvent être expliquées par les conditions et les modèles utilisés puisqu’il est possible que la metformine induise une augmentation de la production de ROS et ensuite une réponse antioxydante (456). Certaines études ont même montré que l’activation de l’AMPK par la metformine est dépendante des ROS ou des RNS (460, 461). Même si les mécanismes exacts par lesquels la metformine inhibe le complexe I mitochondrial et induit l’activation de l’AMPK ne sont toujours pas résolus à ce jour, il est clair que la metformine induit des signaux provenant de la mitochondrie qui peuvent influencer des molécules signalétiques telles l’AMPK afin de balancer les effets mitochondriaux induits par la metformine. Ainsi puisqu’il y a des similitudes entre les effets induits par la metformine et le PF-4708671, il se pourrait qu’ils partagent des mécanismes similaires en amplifiant les signaux mitochondriaux en réponse aux différents stress, appelés mitohormèse, afin de réguler le métabolisme énergétique (374, 457). D’autres parts, l’activation de l’AMPK entraîne la phosphorylation et une inhibition des protéines ACC1 et ACC2, qui sont responsables des effets bénéfiques de la metformine sur l’oxidation des lipides (464). Il serait également intéressant de regarder le rôle du PF sur l’oxidation des lipides puisque la phosphorylation d’ACC est augmentée par le PF.

La régulation de l’AMPK par S6K1.

S6K1 a été montré pour réguler l’AMPK directement en phosphorylant la Ser491 d’AMPKα2 dans les neurones (274). Cependant, cette régulation de l’AMPK par S6K1 a récemment été remise en question puisque ce site semble être auto-phosphorylé par

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l’AMPK elle-même suite à la phosphorylation de la Ser485 d’AMPKα1 par Akt (462). Dans notre étude (chapitre II), nous avons montré que les sites de phosphorylation Ser485/491 augmentent avec l’inhibiteur de S6K1 suggérant que d’autres kinases pourraient phosphoryler ces sites tel Akt dont l’activité est augmentée par l’inhibition de S6K1 (chapitre I). Malgré que ces sites de phosphorylations soient augmentés, le PF- 4708671 augmente aussi la phosphorylation de la Thr172 d’AMPK qui est nécessaire à son activation. De plus, le PF-4708671 stimule la phosphorylation d’ACC sur la Ser79, un substrat important d’AMPK, indiquant que l’AMPK est plutôt actif, et ce même si les sites inhibiteurs Ser485/491 sont phosphorylés. Ainsi, il se pourrait que le PF-4708671 induise rapidement l’activation de l’AMPK puis l’augmentation de l’activité d’Akt vient terminer cette activation puisque la phosphorylation de la Thr172 augmente rapidement puis diminue. Cette diminution semble corréler également avec l’augmentation de la phosphorylation des sites Ser485/Ser491.

L’autre mécanisme par lequel S6K1 peut réguler l’activation de l’AMPK est par la régulation du statut énergétique. L’AMPK est activé notamment en présence de niveaux élevés d’AMP et des niveaux faibles d’ATP qui reflètent une demande en énergie afin de combler les faibles niveaux d’ATP. Les souris déficientes pour S6K dans les muscles squelettiques ont une augmentation des niveaux d’AMP, mais les niveaux d’ATP sont similiaires aux souris wild-type qui sont maintenus par la créatine kinase (273). De façon intéressante, S6K1 a récemment été montré pour augmenter l’expression de la créatine kinase qui maintient les niveaux d’ATP dans les vers C. Elegans stimulant la longévité suite à l’ablation de S6K1 (463). Cependant, le groupe du Dr. Mario Pende a montré également que dans des cellules où la créatine kinase est moins présente comme les hépatocytes, l’absence de S6K1 induit une diminution des niveaux d’ATP (273). Afin de déterminer d’où pouvaient provenir ces changements de nucléotides adénines, les auteurs ont mesuré l’activité mitochondriale dans les muscles des souris déficientes pour S6K. En présence de glutamate et malate qui approvisionnent le complexe I mitochondrial, la consommation d’oxygène basale et maximale augmente dans les fibres musculaires provenant des souris déficientes pour S6K (273). Ces résultats contrastent avec ceux induits par le PF-4708671 puisque cet inhibiteur induit plutôt une réduction de la capacité

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respiratoire de réserve de manière aigüe qui est associée à une inhibition directe du complexe I mitochondrial. Cependant, cette inhibition ne semble pas perdurer à long terme.

Ces résultats induits par l’absence de S6K dans les muscles squelettiques suggèrent une augmentation de la dépense énergétique qui est également associée avec une augmentation de l’oxydation des lipides, mais une augmentation des réserves de glycogène musculaire (273). Ainsi, l’absence de S6K semble favoriser l’oxydation des lipides plutôt que celle du glucose. Il est donc possible que l’inhibiteur de S6K1 reproduise ces effets puisque nous observons une augmentation de la phosphorylation d’ACC qui est connue pour être associée à une augmentation de l’oxydation des lipides (464, 465).

Des expériences supplémentaires seront nécessaires dans les cellules déficientes pour S6K1 afin de bien distinguer les effets associés à l’inhibition de S6K1, de ceux associés à l’inhibition directe du complexe I mitochondrial par le PF-4708671. D’autant plus que plusieurs de nos résultats en utilisant le PF-4708671 sont similaires à ceux observés chez les souris déficientes pour S6K sélectivement dans le muscle squelettique (273). Des expériences semblables seront également à faire dans des hépatocytes déficients pour S6K1. De plus, il serait intéressant d’évaluer aussi l’impact du PF-4708671 sur la glycérophosphate déhydrogénase mitochondriale puisque cette enzyme est la principale cible de la metformine permettant de réduire la production hépatique de glucose (466). Ces expériences pourront ainsi confirmer si certains effets du PF-4708671 sont indépendants de l’inhibition de S6K1 ou potentiellement révéler un nouveau rôle de S6K1 dans la régulation de l’homéostasie énergétique mitochondriale.

S6K1 et l’autophagie.

Récemment, l’inhibiteur de S6K1, PF-4708671, a été montré pour induire l’autophagie afin de promouvoir la survie cellulaire (467). Cette étude a montré que l’inhibition de S6K1 induit la dégradation du facteur nucléaire Keap1 ((Nrf2)-Kelch-like ECH associated protein 1). Keap1 régule négativement le Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2) qui est responsable de la réponse protectrice contre les dérivés réactifs de l’oxygène (ROS) en

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induisant la transcription de gènes antioxydants NQO-1 (NAD(P)H:quinone oxydoreductase), HO-1 (heme oxygenase-1), et GSTA1 (glutathione S-transferase A1). Les auteurs ont montré que la dégradation de Keap1 induisant l’activation de Nrf2 était dépendante du recrutement de la protéine p62 et de l’induction de l’autophagie par le PF- 4708671 (467). De plus, le recrutement de la protéine p62 était stimulé par la production de ROS induit par le PF-4708671. Ces données très intéressantes suggèrent que S6K1 joue un rôle dans l’autophagie et la production de ROS mitochondriale (467). Par ailleurs, l’un des régulateurs importants de l’autophagie et de la mitophagie est l’AMPK. Dans notre étude (chapitre II), nous avons montré que l’AMPK est induit rapidement par le PF-4708671. Ainsi, l’induction de l’AMPK par le PF-4708671 pourrait participer au maintien de l’homéostasie énergétique en régulant l’autophagie et la mitophagie. D’autres études suggèrent aussi que S6K1 participerait au flux d’autophagie, mais de futures études seront nécessaires afin de bien évaluer le rôle de S6K1 dans l’autophagie (468, 469).

RSK, un nouveau régulateur de la signalisation de l’insuline

La résistance à l’insuline peut être améliorée à plusieurs niveaux. De la même façon que S6K1, nous avons montré que RSK peut aussi phosphoryler la Ser1101 d’IRS1 et que son inhibition améliorait l’action de l’insuline sur Akt. En utilisant une protéine recombinante RSK1 et le dominant-négatif (DN) pour RSK1, nous avons montré que l’isoforme RSK1 est impliquée dans cette phosphorylation sur IRS1, mais nous n’avons pas montré le rôle des autres isoformes dans ce mécanisme d’inhibition de la voie PI3K/Akt. RSK est un substrat en aval de ERK1/2 et est ainsi un important signal entre la voie des MAPK et la voie PI3K. Dans l’obésité, malgré la résistance à l’insuline, ERK1/2 sont suractivés dans le tissu adipeux (470) et le foie (471, 472). L’utilisation de forme active et inactive de MEK, qui est un activateur de ERK1/2, a permis de montrer que la suractivation de ERK entraine une résistance à l’insuline hépatique (473). De plus, contrairement à la voie PI3K qui est diminuée dans l’obésité et le diabète, la voie ERK1/2 est toujours sensible à l’insuline, du moins, dans des souris obèses et dans le muscle des patients obèses ou diabétiques type 2 (1, 474). ERK1/2 peuvent entrainer cette résistance à l’insuline en phosphorylant directement les résidus Serine d’IRS-1 comme le fait S6K (475-478). Par contre, nous

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avons montré que RSK peut aussi causer et/ou amplifier cet effet de ERK1/2 en phosphorylant la Ser1101 d’IRS1 (Chapitre III). Ainsi, RSK pourrait participer aux effets néfastes sur la signalisation de l’insuline induits par ERK1/2.

Contrairement à la voie mTORC1/S6K1 qui peut phosphoryler la Ser1101 d’IRS1 en présence d’excès d’acides aminés (55, 70), RSK est connu jusqu’à maintenant pour être activé majoritairement par les facteurs de croissance et l’insuline. Le fait que l’insuline soit encore en mesure d’activer la voie de signalisation ERK1/2 même en situation de résistance à l’insuline (diminution de l’activité de la voie PI3K) et que celle-ci soit suractivée dans l’obésité est très intéressant puisque ces résultats suggèrent que l’hyperinsulinémie pourrait participer au développement de la résistance à l’insuline en suractivant la voie ERK-RSK (Figure 31). D’autres études seront nécessaires afin de discriminer les rôles respectifs de ERK et de RSK sur la résistance à l’insuline causé par l’hyperinsulinémie.

Par ailleurs, les souris ERK1 sélectivement déficientes dans les tissus adipeux sont résistantes à l’obésité induite par une diète riche en gras (470, 479). Ces résultats sont similaires aux souris complètement déficientes pour RSK2 qui sont résistantes à l’obésité également (304). Cependant ce modèle de souris, RSK2 KO, est associé à une résistance à l’insuline sous diète riche en gras probablement causée par la lipodystrophie et au syndrome Coffin-Lowry. Ainsi un modèle où RSK2 est absent sélectivement dans le tissu adipeux et induit à l’âge adulte serait nécessaire pour explorer les différents mécanismes impliqués dans cette résistance à l’obésité et l’adipogenèse.

Nous avons montré dans notre étude (chapitre III) que RSK1 joue aussi un rôle dans le captage de glucose musculaire induit par l’insuline. Ces effets étaient associés à une augmentation de la phosphorylation d’Akt induite par l’insuline. De plus, en conditions d’hyperglycémie et d’hyperinsulinémie, le DN-RSK1 a restauré la capacité de l’insuline à stimuler le captage de glucose dans les cellules musculaires. D’autre part, nous avons aussi observé une augmentation de l’action de l’insuline sur la production hépatique de glucose. Ces résultats suggèrent donc qu’inhiber RSK pourrait améliorer la résistance à l’insuline musculaire et le métabolisme du glucose (Figure 31). Ainsi notre étude a montré un rôle

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important de RSK, notamment RSK1, dans la sensibilité à l’insuline, mais certaines études ont montré aussi un rôle de RSK dans le métabolisme indépendamment de l’insuline. En effet, RSK semble être très important pour le métabolisme du glycogène puisqu’il stimule la synthèse de glycogène musculaire en inhibant GSK3β permettant ainsi l’activation de la GS (glycogen synthase) (309). Au niveau hépatique, RSK peut aussi augmenter les niveaux de glycogène indépendamment de l’insuline en réponse au FGF15/19 (480). Récemment, une étude a également montré un rôle de RSK dans l’inflammation et le développement de la fibrose hépatique (481). Ensemble, ces résultats suggèrent que RSK pourrait jouer un rôle dans le métabolisme énergétique indépendamment de l’insuline.

Afin de déterminer le rôle de RSK dans le métabolisme énergétique et les pathologies métaboliques, le développement de nouveaux outils génétiques et d’inhibiteurs pharmacologiques sélectifs est nécessaire afin d’identifier les effets de chacune des isoformes de RSKs. En effet, notre étude a permis seulement de déterminer les effets de RSK1, mais il est possible que les autres isoformes de RSKs puissent aussi être impliquées dans la boucle de rétro-inhibition de la signalisation de l’insuline. En effet, l’étude de l’inhibition de RSK1-4 dans des modèles de souris conditionnelles nourries avec une diète riche en gras serait nécessaire afin de bien évaluer l’impact thérapeutique d’inhiber RSK dans le syndrome métabolique. Entre-temps, l’utilisation des inhibiteurs pharmacologiques pour toutes les isoformes de RSK soit le BI-D1870, SL0101 et FMK pourrait nous permettre d’évaluer le potentiel thérapeutique d’inhiber RSK pour traiter la résistance à l’insuline.

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Figure. 31 La signalisation de l’insuline dans l’obésité suite à l’inhibition de S6K1 et RSK. (A) L’activation du récepteur à l’insuline stimule la voie PI3K/Akt (bleu) et MAPK (verte). La voie MAPK régule la prolifération cellulaire alors la voie PI3K/Akt régule la synthèse protéique, la lipogenèse, l’autophagie, le glycogène et le captage de glucose. (B) Suite à l’activation de ces voies, plusieurs kinases exercent une boucle de rétro-inhibition sur la voie PI3K/Akt en inhibant IRS et Akt dont ERK1/2, RSK, mTOR, S6K1. (C) Dans l’obésité, l’exposition chronique à des concentrations élevées de nutriments suractive la voie mTORC1/S6K1 qui participe au développement de la résistance à l’insuline en augmentant l’inhibition de la voie PI3K/Akt. De plus, l’hyperinsulinémie observée dans l’obésité pourrait participer à la suractivation de la voie ERK-RSK et favoriser le maintien de la résistance à l’insuline. Ainsi, la suractivation de la voie mTORC1/S6K1 et RSK diminue le captage de glucose et augmente la production de glucose hépatique. (D) L’utilisation d’un dominant-négatif pour RSK1 a permis de montrer que l’inhibition de RSK1 améliore la signalisation de l’insuline et augmente l’activation de la voie PI3K/Akt. Parallèlement, l’inhibition de S6K1 par le PF-4708671 améliore également la signalisation de l’insuline en augmentant la phosphorylation d’Akt et augmente l’action de l’insuline. Par ailleurs, le PF-4708671 induit l’activation rapide de l’AMPK par un mécanisme qui est encore inconnu (?). De plus, l’action du PF-470671 pourrait nous permettre de révéler de nouveaux mécanismes intrinsèques à la molécule tels que l’inhibition du complexe I mitochondrial ou encore de nouveaux rôles mitochondriaux de S6K1 (?)

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VI-Conclusion

Les travaux présentés dans cette thèse montrent que l’inhibition de S6K1 pourrait représenter une alternative à l’inhibition de mTORC1 qui induit plusieurs effets métaboliques indésirables puisque mTORC1 régule d’importants processus physiologiques en réponse aux nutriments et aux facteurs de croissance. L’utilisation du PF-4708671 pour inhiber S6K1 augmente la phosphorylation d’Akt, le captage de glucose musculaire, diminue la production hépatique de glucose dans des modèles cellulaires et augmente la tolérance au glucose dans un modèle d’obésité. De plus, le fait que le PF-4708671 inhibe S6K1 et le complexe I mitochondrial suggèrent que le PF-4708671 pourrait aussi reproduire plusieurs effets bénéfiques de la metformine.

Finalement, nous avons identifié RSK comme un nouveau régulateur de la signalisation de l’insuline et de ses effets métaboliques. Nos résultats montrent que l’inhibition de RSK augmente les effets de l’insuline sur la phosphophorylation d’Akt, le captage de glucose et la production hépatique de glucose. Ainsi, RSK représente un moyen de réguler la voie PI3K/Akt par l’insuline et pourrait être impliqué dans le développement de la résistance à l’insuline par l’hyperinsulimémie puisque la voie activant RSK est intacte dans l’obésité. Ensemble, ces travaux montrent donc que S6K1 et RSK sont des cibles thérapeutiques potentielles afin d’améliorer le métabolisme énergétique et la résistance à l’insuline.

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