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ANNÉE 2014

THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1 sous le sceau de l’Université Européenne de Bretagne

pour le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1 Mention : Biologie et Sciences de la Santé École doctorale Vie-Agro-Santé

présentée par Camille Savary Préparée à l’unité de recherche INSERM UMR 991 Foie, Métabolismes et Cancer (Pharmacie)

Thèse soutenue à Rennes le 2 Juillet 2014 devant le jury composé de : Étude de la toxicité Pr François SICHEL Professeur des Universités chronique et du Université de Caen / rapporteur Dr Martine AGGERBECK potentiel cancérogène Chargé de recherche Paris Descartes, INSERM UMR-S 1124 / rapporteur de contaminants de Dr Brigitte LE MAGUERESSE Directeur de recherche l’environnement Université de Lyon, INSERM U1060 / examinateur Pr Lydie SPARFEL-BELIVET séparément et en Professeur des Universités Université de Rennes, IRSET / examinateur mélange sur les Pr André GUILLOUZO Professeur des Universités Université de Rennes 1, Inserm UMR 991 / directeur cellules HepaRG de thèse Dr Marie-Anne ROBIN Directeur de recherche Université de Rennes 1, Inserm UMR 991 / co- directeur de thèse

Table des matières Index des Figures ...... 5 Index des tableaux ...... 7 Principales abréviations ...... 8 Introduction générale ...... 13 I. Le foie, ses fonctions et les modèles d’études in vitro ...... 13 A. Le foie ...... 13 1. Les cellules hépatiques ...... 13 2. Le foie et ses principales fonctions ...... 14 3. Les fonctions de détoxication du foie ...... 16 B. Les modèles cellulaires hépatiques in vitro ...... 30 1. Les différents modèles hépatiques in vitro ...... 30 2. Le cas particulier de la lignée HepaRG ...... 31 II. Les pesticides ...... 35 A. Avant-propos ...... 35 B. Les pesticides ...... 36 1. Les organophosphorés (OP) ...... 36 2. Les organochlorés (OC) ...... 37 C. Dispersion et devenir des pesticides dans l’environnement ...... 39 1. Dispersion dans l’air, pollution atmosphérique ...... 39 2. Pollution des milieux aquatiques ...... 40 3. Migration et dégradation des pesticides dans les sols ...... 40 D. Les risques pour la santé humaine ...... 41 1. Expositions ...... 41 2. Principaux effets des pesticides sur la santé humaine ...... 42 3. Mécanismes moléculaires liant pathologies chroniques et exposition aux pesticides ...... 47 E. Pesticides et la problématique des mélanges ...... 51 1. La reconnaissance des risques liés aux mélanges de pesticides ...... 51 2. L’approche expérimentale des effets de mélanges ...... 53 III. Cancérogenèse chimique ...... 57 A. Généralité sur la transformation des cellules cancéreuses ...... 57 1. Étapes de la cancérogénèse ...... 57

2. Propriétés des cellules tumorales ...... 58 B. Cancérogenèse chimique ...... 66 1. Les atteintes de l’ADN ...... 66 2. Mécanismes de réparation de l’ADN ...... 67 3. Les mécanismes épigénétiques ...... 68 4. Le stress oxydant et inflammation ...... 69 C. Classification du risque carcinogène des composés chimiques ...... 70 1. UE ...... 70 2. CIRC ...... 71 D. Les modèles utilisés pour la cancérogenèse chimique ...... 72 1. Les tests de génotoxicité ...... 72 2. Les tests in vitro de transformation cellulaire ...... 73 3. Les tests de cancérogenèse sur les rongeurs ...... 74 4. Études de cancérogenèse chimique à long terme in vitro ...... 75 5. Recherche de biomarqueurs par les approches « omiques » ...... 77 Objectifs de la thèse ...... 79 Chapitre 1 : Cellules HepaRG : évaluation fonctionnelle à confluence et stabilité au cours du temps ...... 81 I. Evaluation de la stabilité des cellules HepaRG : étude transcriptomique ...... 81 A. Article ...... 81 B. Résultats complémentaires : activités des CYPs dans les conditions de culture utilisées ...... 83 II. Biocinétique de 4 médicaments après traitement unique ou répété dans les cellules HepaRG ...... 84 A. Médicaments étudiés ...... 84 1. Ciclosporine (CsA) ...... 84 2. Chlorpromazine ...... 85 3. Amiodarone ...... 86 4. Ibuprofène (IBU) ...... 86 B. Matériel et méthodes ...... 88 1. Le protocole expérimental ...... 88 2. Exposition aux médicaments ...... 89 3. La mesure analytique des produits et métabolites...... 90 C. Résultats ...... 91 1. Ciclosporine ...... 91

2. Chlorpromazine ...... 93 3. Amiodarone ...... 94 4. Ibuprofène ...... 96 D. Discussion ...... 97 E. Conclusion ...... 99 Chapitre 2 : Effets des pesticides individuellement ou en mélange sur les cellules HepaRG après exposition aigüe ou répétée ...... 101 I. Impact de l’isomalathion sur la cytotoxicité du malathion dans les cellules HepaRG 101 A. Résumé de l’étude ...... 101 B. Publication ...... 102 II. Etude des effets de l’endosulfan et du methoxychlore individuellement ou en mélange après un traitement aigu ou répété...... 103 A. Résumé de l’étude ...... 103 B. Etude de la cytotoxicité ...... 104 1. Viabilité cellulaire ...... 104 2. Stress oxydant ...... 106 3. Modifications morphologiques ...... 107 4. Discussion ...... 108 C. Interactions de l'endosulfan et méthoxychlore impliquant le CYP3A4 et CYP2B6 dans les cellules HepaRG humaines ...... 110 Chapitre 3 : Etude du potentiel cancérogène de l’AFB1 et du PhIP à l’aide du modèle cellulaire HepaRG ...... 111 I. Introduction ...... 111 A. Caractéristiques de la lignée HepaRG importantes pour notre étude ...... 112 B. Les agents génotoxiques étudiés ...... 114 1. L’aflatoxine B1 ...... 114 2. Le PhIP ...... 115 II. Matériels et méthodes ...... 116 A. Produits testés ...... 116 B. Culture des cellules HepaRG ...... 117 C. Microscopie optique ...... 118 D. Cinétique de prolifération ...... 118 E. Culture sur agar mou (Soft agar assay) ...... 118 F. Test de la cicatrice (Wound healing) ...... 118 G. Analyse du transcriptome ...... 119

1. Isolement des ARNs...... 119 2. Hybridations des biopuces ...... 119 III. Résultats ...... 120 A. Changements morphologiques ...... 120 B. Étude de la croissance cellulaire ...... 121 C. Evaluation des propriétés invasives et migratoires ...... 123 D. Analyse transcriptomique ...... 125 1. Evolution des cultures contrôles ...... 125 2. Effets de l’AFB1 et du PhIP sur l’expression génique ...... 127 IV. Discussion ...... 134 Discussion générale & Perspectives ...... 143 Références Bibliographiques ...... 147 Publications supplémentaires ...... 167 I. En révision ...... 167 II. Prochainement soumis ...... 169

Index des Figures

Figure 1 : Les fonctions hépatiques ...... 15 Figure 2 : Schéma représentant la biotransformation des xénobiotiques...... 17 Figure 3 : Répartition des CYP dans le foie humain (Guengerich, 2003)...... 19 Figure 4 : Voie de transduction du récepteur AhR ...... 20 Figure 5 : Voie de transduction du récepteur CAR ...... 21 Figure 6 : Voie de transduction du récepteur PXR ...... 21 Figure 7 : Voies principales de toxicité liées à la biotransformation chez l'homme...... 23 Figure 8 : Peroxydation lipidique ...... 25 Figure 9 : Contribution (en %) de chaque CYP dans les voies majeures du métabolisme des médicaments (sur la base ici de 248 molécules) et leurs facteurs de variabilité ...... 27 Figure 10 : Evolution des cellules HepaRG après repiquage à faible densité...... 32 Figure 11 : Représentations du caryotype des cellules HepaRG. Les flèches rouges indiquent les anomalies (Gripon et al., 2002)...... 32 Figure 12 : Schéma du devenir des pesticides dans l'environnement ...... 39 Figure 13 : Répartition des pesticides dans les sols ...... 41 Figure 14 : Principales voies métaboliques du malathion et de son produit de dégradation, l’isomalathion...... 50 Figure 15 : Métabolisme hépatique possible de l’endosulfan (A) et du méthoxychlore (B) ...... 51 Figure 16 : Etapes de la cancérogenèse chimique d’après Oliveira et al, 2007...... 58 Figure 17 : Caractéristiques des cellules malignes d’après Hanahan and Weinberg (2011)...... 59 Figure 18 : Différentes voies de signalisation impliquées dans la TEM et l’invasion des cellules cancéreuses (Gavert and Ben-Ze'ev, 2008)...... 63 Figure 19 : Lésions de l’ADN et systèmes de réparation ...... 67 Figure 20 : Mécanismes épigénétiques d’après Hou et al. (2012)...... 69 Figure 21 : Formules chimiques des agonistes PPARs étudiés ...... 81 Figure 22 : Activité des CYP2D6, 2C9, 1A2, 2B6 et 3A4 mesurées dans des cellules HepaRG différenciées après 1, 3 et 14 jours à confluence...... 83 Figure 23 : Biocinétique de la CsA dans les cellules HepaRG pendant 24 h après le 1er traitement (J0) et après 14 additions, lors de la dernière exposition (J13) ...... 91 Figure 24 : Biocinétique de la CPZ dans les cellules HepaRG pendant 24 h après une (J0) et 14 additions (J13) ...... 93

Figure 25 : Biocinétique de l’amiodarone (AMI) et de l’apparition de son métabolite MDEA pendant 24 h après le 1er traitement (J0) et après 14 additions, lors de la dernière exposition (J13)...... 95 Figure 26 : Biocinétique de l’ibuprofène dans les cellules HepaRG pendant 24 h après le premier traitement (J0) et 14 additions, lors de la dernière exposition (J13) ...... 96 Figure 27 : Activité du CYP3A4 après un traitement dose et temps dépendant de CsA...... 97 Figure 28 : Effet cytotoxique de l’END, du MXC et de leur mélange [E + M] dans les cellules HepaRG (A, B, C), les hépatocytes humains (D) et les cellules HepG2 (E) après 24 h ou 14 jours (cellules HepaRG)...... 106 Figure 29 : Stress oxydant induit par END, MXC et leur mélange [E + M] dans les cellules HepaRG (A, B, C) et des hépatocytes humains (D)...... 107 Figure 30 : Examen en microscopie optique ou électronique des cellules HepaRG non traitées (A) ou traitées avec le méthoxychlore (MXC) ...... 108 Figure 31 : Schématisation du comportement de la lignée HepaRG au cours du temps et des repiquages : d’après la Thèse de Kélig Pernelle (2011) ...... 113 Figure 32 : Métabolisme de l’AFB1 (Kensler et al., 2003)...... 115 Figure 33 : Principales voies métaboliques du PhIP d’après Dumont et al., 2010b...... 116 Figure 34 : Protocole expérimental de culture et traitement des cellules HepaRG ...... 117 Figure 35 : Morphologie des cellules HepaRG après 3 ou 13 expositions de 3 jours consécutifs chacune à 0,05 µM d’AFB1 ou 50 µM de PhIP ou maintenues sans traitement (contrôle)...... 120 Figure 36 : Croissance des cellules HepaRG sur 96 h ...... 121 Figure 37 : Impact d’une exposition répétée (chronique) à l’AFB1 et au PhIP sur la migration cellulaire mesurée grâce au test de la cicatrisation...... 122 Figure 38 : Morphologie des cellules au cœur de la griffure lors du test de la cicatrisation ...... 122 Figure 39 : Photographies des colonies formées par les cellules HepG2 et HepaRG à passages 30 (CTR, AFB1 et PhIP) après 3 semaines dans de l’agarose mou...... 124 Figure 40 : Représentation d’après le logiciel en ligne STRING®, des relations entre les gènes les plus réprimés dans les contrôles des passages 29-30 versus 13-14...... 126 Figure 41 : Relation entre les gènes les plus surexprimés entre les contrôles des passages 29- 30 versus 13-14...... 127 Figure 42 : Analyse du transcriptome ...... 129 Figure 43 : Fonctions moléculaires obtenues par le logiciel IPA® et nombres de gènes dérégulés rattachés à ces fonctions...... 131

Figure 44 : Voies d’intérêt dérégulées : néoplasie cellulaire (A), invasion des cellules tumorales (B), prolifération des cellules cancéreuses (C) et métastases (D) prédites pour être augmentées en fonction des gènes dérégulés par l’AFB1 selon IPA®...... 132 Figure 45 : Voies d’intérêt dérégulées, néoplasie cellulaire (A) et métastases (B) prédites pour être augmentées en fonction des gènes dérégulés par le PhIP selon IPA®...... 133 Figure 46 : Voie de signalisation de la TEM d'après IPA® ...... 135 Figure 47 : Mesure de la durée du cycle cellulaire (données préliminaires) ...... 137 Figure 48 : Analyses préliminaires des caryotypes des cellules transformées par l'AFB1 et le PhIP à passage 30 par rapport aux cellules contrôles...... 140

Index des tableaux

Tableau 1 : Classification des CYP450 humains en fonction des substrats (Guengerich, 2006) 18 Tableau 2 : Classification des substances chimiques par l'UE ...... 71 Tableau 3 : Classification par le CIRC ...... 71 Tableau 4 : Principaux tests de génotoxicité ...... 73 Tableau 5 : Principales étude de cancérogenèse in vitro ...... 76 Tableau 6 : Concentrations d’exposition et temps d’arrêt ...... 89 Tableau 7 : Laboratoires ayant réalisé les dosages analytiques des 4 médicaments et méthodes associées...... 90

Principales abréviations

AASQA : Association agréée de la surveillance de la qualité de l’air Ac-DEVD-AMC : 7-Amino-4-methylcoumarin, N-acetyl-L-aspartyl-Lglutamyl-L-valyl-l-aspartic acid amide ACROPOLIS : Aggregate and Cumulative Risk of Pesticides: an on-line integrated Strategy ADH : alcool déshydrogénase AFB1: Aflatoxine B1 AhR : Aryl hydrocarbone Receptor AIP : AhR interacting protein ALDB : aldolase B ALDH : alcool déshydrogénase AR : récepteur aux androgènes ARNT: AhR nuclear translocator BMP : bone morphogenetic protein BRCA: Breast Cancer 1 BSA : Bovine Serum Albumine BTG2 : B-cell translocation gene 2 CAR : Constitutive Androstane Receptor CEMAGREF : Centre national du machinisme agricole du génie rural, des eaux et des forêts c-FOS : FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog CHAPS : 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate CIRC : Centre International de Recherche contre le Cancer COX : cyclo-oxygénase CYP : Cytochrome P450 DCFDA : Dichlorofluorescein diacetate DDD : 1,1-dichloro-2,2-bis 4-(chlorophényl)éthane DDE : 1,1-bis 4-(chlorophényl)-2,2-dichloroéthane DDT : Dichlorodiphényltrichloroéthane DGCCRF : Direction générale de la concurrence, de la consommation et de la répression des fraudes DMEM : Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium DMSO : Diméthylsulfoxyde EBV : virus d'Epstein-Barr EDTA : Acide éthylène-diamine-tétra-acétique EFSA : Autorité européenne de sécurité des aliments EGF : facteurs de croissance EGTA : Acide ethylene-glycol-tétraacétique EHS : cellules embryonnaires d’hamster syrien END : Endosulfan EPA : Environmental Protection Agency ER : récepteur aux oestrogènes ERO : espèces réactives de l’oxygène GABA : acide γ-aminobutyrique GAG : glycosaminoglycane GST : Glutathion S-Transférase H2DCFDA : 2’-7’-dichlorofluorosceine diacétate HCH : hexachlorocyclohexane HEPES : 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HIOEC : cellules épithéliales buccales humaines immortalisées

HPCL : Chromatographie en Phase Liquide à haute Performance HPLC : high performance liquid chromatography HPRT : hypoxanthine phosphorybosyl transférase HSP90 : heat shock protein HTERT : Telomerase reverse transcriptase HTLV-1 : virus humain T-leucémie / lymphome 1 INRA : Institut National de Recherches Agronomiques IPs : cellules souches pluripotentes induites ITGB4 : Integrin, beta 4 LNH : Lymphome non Hodgkinien MAPK : Mitogen-activated protein kinase MDR : Multi Drug Resistance MEC : matrice extra-cellulaire mEH : Epoxyde Hydrolase microsomale MMS : Méthyl méthane sulfonate MRP : Multi Drug Resistance associated protein MTT : 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide MXC : Méthoxychlore NAPQI : N-acetyl-p-benzo-quinone NAT : N-acétyl-transférases NOAEL : No observable Adverse Effect Level NRF2 : NF-E2-related factor 2 OC : organochloré OCDE : Organisation de coopération et de développement économique OCT3/4 : octamer-binding transcription factor 4 OMS : Organisation Mondiale de la Santé ONU : organisations des nations unies OP : organosphosphoré PBRE : élément de réponse au phénobarbital PBS : Phosphate-Buffered Saline PCB : Polychlorobiphényle PhIP : 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine PIPES : 2-[4-(2-sulfoethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid PMSF : Phenylméthanesulfonyl fluoride POP : Polluant Organique Persistants PPAR : peroxysome proliferator activated PXR : Pregnane X Receptor RN : Rouge Neutre RTK : receptor tyrosine kinase RT-qPCR : Real Time quantitative polymerase chain reaction SNC : Système Nerveux Central SOD : superoxydes dismutases SVF : sérum de veau fœtal TEM : transition épithélio-mésenchymateuse TGF : transforming growth factor TK : thymidine kinase UGT: UDP-glucuronyl-transférase VEFGC : vascular endothelial growth factor C VEGF : facteur vasculaire de croissance endothélial A XRE : Xenobiotic Responsive Element ZEB : zinc-finger E-box-binding homeobox factor

Avant-propos

De nombreux composés chimiques (ou xénobiotiques) sont présents dans l’environnement et l’alimentation et de plus en plus de données existent indiquant qu’ils représentent un risque pour la santé humaine. L’homme est en effet le plus souvent exposé tout au long de sa vie à de nombreux contaminants, généralement à faibles doses et en mélanges. Il devient donc urgent de mieux les identifier et d’établir dans quelles conditions (doses, mélanges…) et par quels mécanismes ils peuvent exercer leurs effets délétères. Cependant, se pose la question du choix des approches expérimentales pour de telles études, d’autant qu’il est bien établi qu’il existe des différences de réponse entre l’homme et l’animal.

Quelle que soit la voie d’exposition (respiratoire, digestive ou cutanée), de par son rôle majeur dans la biotransformation des xénobiotiques, le foie est considéré comme un organe cible pour de nombreuses classes de produits chimiques potentiellement cytotoxiques et/ou génotoxiques. Le choix de modèles cellulaires hépatiques humains pour l’étude de tels composés apparait donc pertinent. Toutefois, l’induction de lésions hépatiques, notamment celles conduisant au développement de cancers, peut nécessiter des temps d’exposition prolongés dont la compatibilité avec des approches in vitro peut susciter des interrogations.

Des études récentes ont montré que la lignée cellulaire hépatique humaine HepaRG, isolée au laboratoire à partir d’un cholangio-hépatocarcinome, possède des propriétés proches de celles des hépatocytes humains primaires et peut être maintenue fonctionnellement relativement stable à confluence pendant plusieurs semaines. Aussi, nous avons retenu cette lignée pour évaluer la toxicité chronique et/ou le pouvoir cancérogène de pesticides et de composés génotoxiques présents dans l’environnement.

Introduction générale

I. Le foie, ses fonctions et les modèles d’études in vitro

A. Le foie

Le foie est situé dans la partie supérieure droite de la cavité abdominale, en dessous du diaphragme, au-dessus de l'estomac, du rein droit et des intestins. Cet organe rouge-brun sombre pèse environ 1,3 kg à l’âge adulte. Cette glande volumineuse est formée de deux lobes bien individualisés : lobes droit et gauche. Chaque lobe hépatique est subdivisé en segments hépatiques délimités par des cloisons fibreuses qui vont diviser progressivement le foie en segments plus petits.

Il s’agit d’un organe très complexe formé de types cellulaires variés permettant ainsi de répondre à de nombreuses fonctions.

1. Les cellules hépatiques

Les hépatocytes

Les fonctions du foie sont principalement assurées par les hépatocytes qui représentent environ 80% de la population cellulaire totale. Ce sont des cellules polyédriques (ou polygonales) organisées en travées lamellaires séparées les unes des autres par les capillaires sinusoïdaux. Les hépatocytes sont polarisés par le pôle sinusoïdal (ou basal) et le pôle canaliculaire (ou apical). L’hépatocyte est une cellule volumineuse de 18-24 µm de diamètre comportant un ou deux noyaux. Le cytoplasme contient de nombreuses mitochondries, un réticulum endoplasmique granuleux et lisse ainsi qu’un appareil de Golgi abondants, nécessaires à ses activités de synthèse et de sécrétion.

Les cellules non parenchymateuses

» Les cellules épithéliales biliaires ou cholangiocytes

Les cellules biliaires ou cholangiocytes composent l’épithélium qui tapisse les canaux biliaires et qui permettent le transport de la bile produit par les hépatocytes de manière continue vers la vésicule biliaire puis le tractus intestinal. La bile est à la fois un suc digestif

(émulsification des graisses et vitamines liposolubles) et une voie d’excrétion pour le foie (protéines hépatiques, cholestérol, stéroïdes). Les cellules biliaires sont activement impliquées dans la synthèse, le transport et la modification de la bile.

» Les cellules sinusoïdales

Les cellules sinusoïdales sont des cellules endothéliales qui bordent la paroi des vaisseaux sanguins (capillaire sinusoïdal). Les échanges de nutriments et macromolécules entre le secteur sanguin et les hépatocytes sont favorisés par la présence de fenestrations (pores de 0,1 à 1 µm) mais aussi par le fait que les cellules endothéliales du foie ne reposent pas sur la membrane basale.

» Les cellules de Kupffer

Les cellules de Kupffer sont des macrophages résidents par opposition aux macrophages circulants qui sont transportés entre les différents organes. Elles ont des attaches avec les cellules endothéliales et restent dans le sinusoïde. Impliquées dans la phagocytose de particules étrangères et d'agents biologiques, elles participent également à l’élimination d’endotoxines et de diverses substances nocives provenant du sang portal. Elles jouent aussi un rôle dans l’immunité adaptative.

» Les cellules étoilées

Les cellules étoilées, précédemment appelées cellules de Ito stockent la vitamine A et ont une fonction physiopathologique. Sites majeurs de synthèse de la matrice extracellulaire hépatique, quand elles sont activées par un processus inflammatoire, elles se transforment en myofibroblastes et jouent ainsi un rôle important dans la fibrose hépatique. Ces cellules sont présentes dans l’espace de Disse, espace compris entre les cellules sinusoïdales et les cellules hépatiques.

2. Le foie et ses principales fonctions

Le foie est le siège de nombreuses fonctions métaboliques, immunologiques et endocrines. Il reçoit le sang oxygéné du cœur via la veine porte et du sang désoxygéné de l'intestin via l’artère hépatique. Le sang circule à-travers un réseau de capillaires discontinus perméables appelés les sinusoïdes pour atteindre les veines centro-lobulaires.

Figure 1 : Les fonctions hépatiques

Il joue un rôle essentiel dans de nombreuses fonctions vitales (Figure 1) :

- Une fonction glycogénique régulant le taux de glucose sanguin, en stockant le glucose sous forme de glycogène. - La synthèse de la majorité des protéines plasmatiques (sérum-albumine, fibrogène, complexe prothrombinique), à l’exception des immunoglobulines. - La synthèse et la dégradation des lipides et des lipoprotéines (LDL, VLDL, HDL, cholestérol). - Une fonction d’uréogénèse (élimination, sous forme d’urée, de substances produites par la dégradation des acides aminés). - Une fonction de détoxification de composés exogènes (xénobiotiques) et endogènes.

Il a également une fonction exocrine avec la sécrétion biliaire ; il produit un litre de bile par jour et la sécrète, via les canalicules biliaires, dans les canaux biliaires vers le duodénum

3. Les fonctions de détoxication du foie

Rappels généraux

L’organisme est sans cesse exposé à des composés exogènes indésirables qu’il doit éliminer. Ceux-ci incluent des polluants, des toxines naturelles et des médicaments. Un xénobiotique hydrophile peut être rapidement éliminé par des mécanismes de transport membranaire. En revanche, s’il est hydrophobe, il doit être métabolisé et rendu hydrophile pour être éliminé. Chez les mammifères, le siège majeur de la biotransformation des xénobiotiques est le foie, et celle-ci s’opère essentiellement au niveau des hépatocytes. Les processus de biotransformation incluent habituellement plusieurs phases (Figure 2):

− La phase I (ou phase de fonctionnalisation) correspond principalement à des réactions d’oxydation mais aussi à des réactions de réduction et d’hydrolyse, catalysés par les cytochromes P450 (CYPs). − La phase II (ou phase de conjugaison) est assurée par les enzymes dites de phase II qui catalysent le transfert d’un ligand endogène sur le métabolite de phase I. Ces enzymes comprennent les glutathion-S-transférases (GSTs), les UDP-glucuronyl-transférases (UGTs), les sulfotransférases, les N-acétyl transférases, les époxydes hydrolases, les méthyl transférases et les acyl-CoA transférases (conjugaison à des acides aminés). − La phase III correspond à l’excrétion des conjugués hors de la cellule. Ce processus est assuré par des transporteurs membranaires actifs tels que la P-glycoprotéine (P-gp / ABCB1) et les multi drug resistance related proteins (MRP).

Figure 2 : Schéma représentant la biotransformation des xénobiotiques dans un hépatocyte. (R : Xénobiotique, ERO : Espèce réactives de l’oxygène)

Le rôle majeur des cytochromes P450 dans la biotransformation des xénobiotiques

Les CYPs sont des complexes moléculaires dérivés d’un gène ancestral commun remontant à 1,5 milliard d’années. Ils sont identifiés comme étant des hémoprotéines (une apoprotéine de 45 à 60 kDa contenant un groupe prosthétique, l’hème). Les CYPs doivent leur nom au fait qu’une fois réduits, ils peuvent lier le monoxyde de carbone et présenter un pic d’absorption caractéristique à 450 nm (Omura and Sato, 1964). Dans les années 1960, les études de métabolisme (Klingenberg, 1958; Omura and Sato, 1962) ont permis de caractériser leur fonction d’oxydation et leur rôle dans le métabolisme des xénobiotiques.

Les CYPs sont considérés comme les biocatalyseurs les plus polyvalents. En effet, plus de 90% des réactions d’oxydation sont catalysées par les CYPs. Ils interviennent dans la détoxication de la cellule en métabolisant de nombreux xénobiotiques (polluants, médicaments…) permettant le plus souvent leurs élimination mais parfois aussi une activation métabolique.

La réaction catalysée par un CYP s’écrit de la façon suivante (où R représente un substrat):

Les principales réactions catalysées par les CYPs sont

des réactions d’hydroxylation (RCH í RCOH),

des réactions de N-oxydation (R1-NH-R2 í R1-NOH-R2)

des réactions de S-oxydation (R1-S-R2 í R1-SO-R2)

des réactions de N- et O-déalkylation

Outre leur implication dans le métabolisme des substances exogènes, les CYPs ont également un important rôle dans le métabolisme des substances endogènes. Ils interviennent dans la biosynthèse et le catabolisme des hormones stéroïdes, des acides biliaires et de la vitamine D3.

» Multiplicité et nomenclature des CYPs

Les CYPs constituent une superfamille d’enzymes comportant des familles, des sous-familles et des isoformes. Le génome humain code 57 protéines CYPs pouvant être classés en fonction du type de substrat (Tableau 1).

Tableau 1 : Classification des CYP450 humains en fonction des substrats (Guengerich, 2006)

Chez l’Homme, il existe au moins 18 familles de CYP (Wang and Chou, 2010). La nomenclature actuelle utilise le terme CYP pour désigner le cytochrome P450 et celui-ci en italique lorsque cela fait référence au gène. Les CYPs sont classés en fonction de leur degré de similitude dans leur séquence en acides aminés (http://drnelson.uthsc.edu/cytochromeP450.html). Les familles sont désignées par un nombre arabe (CYP 1, 2, 3), les sous-familles par une lettre (A, B, etc.)

18 et les isoformes par un autre nombre arabe. Les cytochromes d’une même famille présentent plus de 40% d’identité dans leur séquence, tandis que les membres d’une même sous-famille présentent plus de 55% d’homologie entre eux.

Seules les familles 1, 2, 3 et 4 sont impliquées dans le métabolisme des xénobiotiques. Une quinzaine de CYP métabolise les xénobiotiques mais seulement six d’entre eux sont impliqués dans la quasi-totalité du métabolisme des médicaments ; il s’agit du CYP3A4 (50%), du CYP2D6 (30%), du CYP2C9 (>10%), du CYP2C19, du CYP1A2 et du CYP2E1. Le pourcentage de xénobiotiques métabolisés n’est pas corrélé à la quantité relative de protéines, notamment pour le CYP2D6 (30% versus 2%). La répartition des CYPs dans le foie est représentée dans la Figure 3. Un même xénobiotique est capable d’être métabolisé par deux ou plusieurs isoenzymes.

Figure 3 : Répartition des CYP dans le foie humain (Guengerich, 2003).

Certains composés chimiques, qu’ils soient substrats préférentiels de CYP ou non métabolisés, peuvent être inducteurs ou inhibiteurs de CYP et/ou d’autres enzymes. Les mécanismes impliqués seront décrits ultérieurement.

» Localisation

Chez l’Homme, les CYPs sont retrouvés dans presque tous les tissus sauf le muscle, les os et les globules rouges. Les CYPs métabolisant les xénobiotiques sont principalement localisés au niveau du foie et surtout retrouvés dans le réticulum endoplasmique lisse (microsomes) des hépatocytes. Les CYPs sont également exprimés dans d’autres tissus tels que les reins (cellules tubulaires proximales), l’intestin (entérocytes), les poumons (cellules de Clara et pneumocytes de type II), la peau et le cerveau (Krishna and Klotz, 1994).

» Régulation

La plupart des CYPs et autres enzymes intervenant dans la biotransformation des xénobiotiques peuvent être induits ou réprimés par différents xénobiotiques. Ceci est souvent la cause d’effets secondaires des médicaments.

L’induction est le plus souvent de nature transcriptionnelle et implique des récepteurs nucléaires. Les principaux récepteurs concernés sont l’aryl hydrocarbon receptor (AhR), le constitutive androstane receptor (CAR), le pregnane X receptor (PXR) et les récepteurs activés des proliférateurs de peroxysomes : peroxisome proliferator activated receptors (PPAR) (Tien and Negishi, 2006).

Le récepteur AhR est présent dans le cytoplasme sous forme d’un complexe comprenant plusieurs protéines : Heat Shock protein HSP90, AhR interacting protein (AIP) et p23. Lorsqu’il est activé par un ligand (dioxines, benzo(a)pyrène, etc.), il rentre dans le noyau où il s’hétérodimérise avec la protéine AhR nuclear translocator (ARNT) (Figure 4). Cet hétérodimère reconnaît la séquence nucléotidique Xenobiotic Responsive Element (XRE) dans les promoteurs de nombreux gènes cibles tels que les CYP1A mais aussi AhRR (Aryl-Hydrocarbon Receptor Repressor) qui code une protéine répressive AhRR capable de former un leurre pour ARNT en s’y liant et empêchant ainsi la fixation de AhR (Hahn et al., 2009)

Figure 4 : Voie de transduction du récepteur AhR

Le CAR est un récepteur nucléaire orphelin qui possède deux catégories de ligands : des composés exogènes de type phénobarbital et des composés endogènes dérivés de la testostérone (androstanol et androsténol) qui l’activent et favorisent son déplacement vers le noyau. Ce transfert nécessite des processus de phosphorylation/déphosphorylation. Dans le noyau, CAR s’hétérodimérise avec le récepteur des rétinoïdes (RXR) avant de se lier à l’élément

20 de réponse au phénobarbital (PBRE) (Figure 5). Il peut aussi se lier à l’élément de réponse DR4 et au xenobiotic response enhancer module (XRME). L’activation de CAR est associée à une induction de certains CYP dont les CYP2B6, CYP2C9 et CYP2C19 (Chai et al., 2013).

Figure 5 : Voie de transduction du récepteur CAR

Le PXR est activé par de nombreux composés exogènes (rifampicine, phénobarbital, nifédipine, clotrimazole, hyperforine, etc.) et endogènes (stéroïdes). Tout comme CAR, il s’hétérodimérise avec RXR et transactive plusieurs éléments de réponse : ER6 (everted repeats), DR3 (direct repeats), PBRE et XRE (Figure 6). Il induit les CYP3A mais intervient également dans l’induction d’autres CYPs (2B6, 2C9, etc.) et d’autres gènes tels que MDR1 (Chai et al., 2013). En revanche, ce récepteur régule négativement le CYP7A impliqué dans la synthèse de l’acide lithocholique. PXR est exprimé principalement dans le foie, l’intestin et le colon.

Figure 6 : Voie de transduction du récepteur PXR

CAR et PXR agissent de manière coordonnée dans l’élimination de nombreuses molécules lipophiles de structure et d’origine diverses. Ils sont à l’origine d’interactions médicamenteuses indésirables et de résistances à des thérapies (Wang et al., 2012). Leur activation prolongée semble être à l’origine de perturbations endocriniennes (Kretschmer and Baldwin, 2005). Par exemple, le traitement de femmes enceintes avec du phénobarbital et de la phénytoïne, un agoniste de CAR, entraîne un risque plus élevé d’anomalies du développement, de cryptorchidies et de malformations génitales chez les garçons (Dessens et al., 2001).

Les PPARs appartiennent à la superfamille des récepteurs nucléaires hormonaux (Issemann and Green, 1990). Il en existe trois membres : α, β/δ et γ (Michalik et al., 2006) ; α et γ sont principalement activés par des ligands exogènes. PPAR α a été le premier découvert. Il a pour rôle majeur la régulation de l’homéostasie énergétique ; en particulier il active le catabolisme des acides gras, stimule la gluconéogenèse et la synthèse des corps cétoniques. En outre, il possède des propriétés anti-inflammatoires. Il est activé par certains fibrates utilisés dans le traitement des hypercholestérolémies et hypertriglycéridémies (fénofibrate).

Il existe aussi des mécanismes de régulations post-transcriptionnelles comme une stabilisation des ARNm ou de la protéine ou encore des modifications post-traductionnelles (phosphorylations). Les micro-ARN peuvent également contrôler la régulation post- transcriptionnelle des ARNm des CYPs en réprimant la traduction ou en facilitant la dégradation du transcrit (Singh et al., 2011). Les CYPs peuvent être aussi inhibés par des substrats suicides.

Ces régulations contribuent aux interactions entre composés et peuvent être à l’origine d’interactions médicamenteuses lors de l’administration concomitante de substances métabolisées par la même voie métabolique. D’autres mécanismes de toxicité peuvent être le résultat de la biotransformation.

Bioactivation des xénobiotiques en métabolites réactifs

Paradoxalement, les mécanismes liés à la détoxication peuvent parfois conduire à l’apparition d’effets délétères. En effet, l’organisme peut former par bioactivation des métabolites réactifs, composés plus toxiques que les composés initiaux (Figure 7).

Figure 7 : Voies principales de toxicité liées à la biotransformation chez l'homme. La phase initiale de toxicité est la formation de métabolites réactifs et/ou d’ERO. Si les systèmes de protection sont altérés ou dépassés ( ), des effets toxiques seront initiés. S’il en est de même pour les systèmes de réparation, des dommages cellulaires seront inévitables.

» Bioactivation

Lors de réactions de biotransformation dans l’organisme, des xénobiotiques peuvent être activés en métabolites réactifs. Les métabolites réactifs électrophiles sont surtout formés par oxydation (quinone-imine, époxydes) ; des réactions de réduction peuvent aussi conduire à la formation d’espèces chimiques toxiques (radical libre).

‹ Formation de radicaux libres

Au cours du métabolisme réductif de certains xénobiotiques (nitrobenzène, aniline, dérivés quinoniques, paraquat…) se forment des structures intermédiaires radicalaires réactives en raison de la présence d’un électron célibataire. Par exemple, le tétrachlorure de carbone (CCl4) forme le radical trichlorométhyle (CCl3°), source de peroxydation lipidique et de liaison covalente aux protéines et aux lipides insaturés (Weber et al., 2003). Ces réactions initiales sont suivies d’une série de phénomènes toxiques au niveau cellulaire.

‹ Formation de métabolites électrophiles

Certains composés sont oxydés en métabolites dits électrophiles c'est-à-dire déficients en électron et affins de molécules nucléophiles telles que les protéines et les acides nucléiques. Par exemple, les CYPs peuvent induire la conversion de nombreux composés aromatiques en époxydes (Guengerich, 2003). L’aflatoxine B1, le benzène, le benzo[a]pyrène, le furosémide, les polychlorobiphényles, le trichloréthylène, le chlorure de vinyle sont époxydés, principalement dans le foie, et les métabolites ainsi formés se lient de façon covalente aux macromolécules tissulaires, provoquant des nécroses ou des cancers (Yang et al., 1988; Lash et al., 2000; Guengerich, 2002).

Les quinone-imines sont d’autres métabolites électrophiles. Un exemple très connu est la formation de quinone-imine lors du métabolisme du paracétamol. En effet, si la dose est supérieure à la dose thérapeutique, le métabolisme ainsi que les mécanismes de protection seront dépassés et il y aura formation par le CYP2E1 de N-acétyl-p-benzo-quinone imine (NAPQI) hautement toxique pour la cellule hépatique (Gonzalez, 2007).

‹ Production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) Lors des réactions de phase I et plus particulièrement celles catalysées par les CYP, de nombreuses ERO peuvent être produites au cours du cycle d’oxydation. Par exemple, l’oxygène devant être utilisé par un CYP pour être fixé au xénobiotique donnera du peroxyde d’hydrogène au lieu de la molécule d’eau normalement formée :

D’autres CYPs, tels que le CYP2E1, formeront automatiquement des ERO au cours du métabolisme. Les ERO sont en majorité prises en charge par les systèmes antioxydants de la cellule. Toutefois, dans le cas d’un débordement de ces processus, le stress oxydant généré peut conduire à de nombreuses altérations par liaison des ERO aux macromolécules cellulaires telles que les protéines, les lipides ou encore l’ADN. Ces réactions sont donc susceptibles d’influer sur le devenir de la cellule en induisant des phénomènes de prolifération/survie cellulaire (promotion tumorale), ou de mort cellulaire soit par apoptose soit par nécrose. L’implication des ERO dans la progression tumorale sera abordée en 3ème partie d’introduction.

» Toxicité

‹ Fixation des métabolites réactifs sur les macromolécules Les métabolites réactifs vont réagir avec différents constituants de l’organisme et conduire à des altérations (Figure 7). Le métabolite réactif électrophile peut se fixer par une liaison covalente irréversible : (1) sur l’ADN : l’alkylation d’une base purique ou pyrimidique (fixation sur NH2, -N=, l’oxygène), si elle n’est pas réparée rapidement avant la division cellulaire, peut conduire à une mutation et à un cancer ; (2) sur les groupements nucléophiles des protéines : SH

(cystéine), NH2 (lysine ou arginine), S (méthionine), et NH (histidine) : cette fixation covalente a comme conséquence l’inactivation d’enzymes, de transporteurs ou de protéines régulatrices.

Le radical libre, très réactif, peut se lier de façon irréversible aux macromolécules hépatiques (protéines, lipides insaturés). Il peut également arracher un atome d’hydrogène d’un acide gras poly-insaturé. Après remaniement de la position d’une double liaison de l’acide gras, le radical lipidique réagit avec l’oxygène pour former un radical peroxyde qui, à son tour, réagira avec un autre acide gras polyinsaturé pour former un hydroperoxyde et un nouveau radical lipidique. Ce phénomène se propage et constitue la peroxydation lipidique (Figure 8) à l’origine de la destruction des membranes biologiques (réaction retrouvée dans l’intoxication aiguë par le tétrachlorure de carbone au niveau hépatique et rénal). Parallèlement, les lipides insaturés se scindent en petits fragments dialdéhydiques, qui peuvent se fixer sur des protéines.

Figure 8 : Peroxydation lipidique

‹ Phénomènes immunoallergiques

La fixation de métabolites réactifs sur des protéines modifie le soi de l’individu, entraînant chez un petit nombre de sujets une réaction immunitaire. Celle-ci peut être dirigée contre le soi modifié (induction d’une hépatite immunoallergique par l’halothane, un anesthésique), ou bien contre le soi non modifié (hépatites autoimmunes associées à la présence d’autoanticorps, anticorps anti-microsomes du foie et du rein [liver-kidney-microsomes] : anti-LM, anti-LKM2, anti-

LKM1, après prise de médicaments) (Beaune et al., 1987).

‹ Autres voies Certains métabolites réactifs ne sont pas produits au niveau hépatique et vont induire des dommages où ils sont formés. Par exemple, les N-glucuronides des N-hydroxylamines, initialement formées dans le foie, vont migrer vers l’urine, où ils sont hydrolysés (en raison du pH acide) en N-hydroxylamines cancérogènes. C’est ainsi que la N-naphtylamine et le 4-amino- biphényle provoquent des cancers de la vessie (Zenser et al., 1998).

Mécanismes de protection

L’inactivation du CYP autolimite la formation de métabolite réactif. Une fois dans la poche hydrophobe du CYP, le métabolite réactif instable va détruire l’enzyme qui l’a formé (alkylation d’un azote de l’hème, complexe stable avec le fer de l’hème, fixation irréversible sur un groupe nucléophile de l’apoprotéine). Certains métabolites se transforment directement en métabolites stables. Par exemple, les époxydes hydrolases réarrangent un époxyde en phénol.

Certains métabolites réactifs vont être conjugués au glutathion par des enzymes cytosoliques ou mitochondriales, les glutathion-transférases et de ce fait être inactivés. Le glutathion maintient ainsi les groupements SH des protéines à l’état réduit, ces groupements étant nécessaires aux ATPases thiol dépendantes. Cette conjugaison consomme beaucoup de glutathion, ce qui peut entrainer une forte diminution de sa concentration. La neutralisation des radicaux libres formés par les xénobiotiques s’effectue par des enzymes : superoxydes dismutases (SOD), catalases, glutathions peroxydases…D’autres systèmes non enzymatiques peuvent s’opposer aux espèces radicalaires en les piégeant et en interrompant la chaîne de propagation des réactions radicalaires (ex : vitamine A, C, E).

Les lésions de l’ADN, au niveau des bases puriques et pyrimidiques, peuvent être réparées avant l’apparition d’une mutation somatique qui peut conduire au long terme au cancer. Ces mécanismes de protection expliquent que seule une petite partie des métabolites réactifs va

26 conduire à des altérations moléculaires. En général, le métabolite étant très instable va réagir à l’endroit même où il est formé. Il s’agit donc de la région centrolobulaire du foie où les CYPs sont en plus grande quantité.

Mécanismes aggravant la toxicité

Outre les différents mécanismes décrits ci-dessus, des facteurs physiologiques, physiopathologiques et génétiques peuvent également influencer le métabolisme et ainsi avoir des conséquences sur la toxicité de chaque molécule. La Figure 9 représente l’implication de chaque CYP dans le métabolisme et les facteurs de variabilité liés à leur activité enzymatique pour les médicaments. On peut cependant imaginer que ces facteurs influencent le métabolisme des xénobiotiques en général.

Figure 9 : Contribution (en %) de chaque CYP dans les voies majeures du métabolisme des médicaments (sur la base ici de 248 molécules) et leurs facteurs de variabilité : Les plus important facteurs de variabilité sont indiqués en gras, les possibles entre parenthèses. Les influences sont marquées ainsi : (↑) augmente l’activité, (↓) diminue l’activité. (Zanger and Schwab, 2013)

» Rôle des facteurs génétiques

Des polymorphismes génétiques ont été décrits pour de nombreuses enzymes de biotransformation. Dans ce cas, un déficit enzymatique plus ou moins important peut conduire à une diminution des capacités de biotransformation. Ceci est favorable lorsque le métabolite est plus toxique que le produit initial et défavorable dans le cas contraire. Les principaux polymorphismes génétiques concernent les CYPs (CYP2C9, 2C19, 2D6, 3A5, …), les N-acétyl- transférases (NAT2) et les GST (GSTM1, GSTT1,…) (Martiny and Miteva, 2013; Yiannakopoulou, 2013)

» Facteurs physiologiques de l’individu

Des facteurs physiologiques propres à chaque individu lors de l’exposition aux xénobiotiques peuvent influencer la toxicité de celui-ci. Par exemple si l’individu présente une pathologie hépatique (cirrhose, hépatite virale….), son foie risque de ne pas être totalement fonctionnel avec pour conséquence une diminution du métabolisme. D’autres états pathologiques peuvent influencer le métabolisme et donc la toxicité. Par exemple, lors de la prise de paracétamol aux concentrations thérapeutiques, un état de jeûne et une dénutrition semblent jouer un rôle dans l’hépatotoxicité. Ceci s’expliquerait par la diminution du taux de glutathion hépatique et l’augmentation du CYP2E1 imputables à la dénutrition (Vaubourdolle, 2007). Les situations inflammatoires et infectieuses sont également associées à une réduction du métabolisme oxydatif des médicaments.

» Induction/inhibition enzymatique

L’induction peut avoir diverses conséquences ; il en résulte une accélération du métabolisme des xénobiotiques qui pourra se traduire par :

- Une diminution de l’effet si les métabolites sont inactifs, c’est-à-dire une diminution de l'activité pharmacologique pour une même dose administrée. - Une augmentation de l’effet si les métabolites sont actifs. - Une augmentation de la toxicité si les métabolites sont réactifs.

Les inducteurs connus comprennent plus d'une centaine de molécules, incluant essentiellement la plupart des insecticides et pesticides, l'alcool, mais aussi de nombreux médicaments. Ainsi, la plupart des barbituriques, sédatifs et hypnotiques, sont inducteurs de CYP (le plus puissant et le plus polyvalent étant le phénobarbital) (Zhang et al., 2010).

De la même façon, les inhibiteurs métaboliques peuvent avoir des conséquences importantes à la fois sur la toxicité ou sur l’action pharmacologique. L’exemple le plus connu est l’inhibition de certains CYPs par le jus de pamplemousse qu’il est déconseillé de boire lors de prises de nombreux médicaments (Girennavar et al., 2007; Bailey et al., 2013). Tel est le cas lors de la prise d’atorvastatine connue sous le nom de Tahor, pour le traitement de l’hypercholestérolémie (Ando et al., 2005).

» Interaction métabolique

Les mécanismes d’inductions/inhibitions décrits ci-dessus peuvent être à l’origine d’interactions métaboliques en cas de co-exposition à plusieurs xénobiotiques. En effet, si un xénobiotique induit une enzyme impliquée dans le métabolisme d’un autre, le métabolisme de celui-ci sera modifié. S’il se transforme en métabolite réactif, la toxicité sera donc augmentée. C’est le cas de la co-exposition de l’alcool et du paracétamol. En effet, l’alcool en induisant le CYP2E1 augmentera la formation de NAPQI, métabolite toxique. A l’inverse, le jus de pamplemousse inhibant le CYP3A4, influence la toxicité d’un xénobiotique métabolisé par celui-ci. Ces mécanismes sont impliqués dans les interactions médicamenteuses et sont à prendre en compte lors d’une polymédication.

Si des xénobiotiques empruntent la même voie métabolique, il y aura compétition pour le même site de liaison enzymatique. Il en résulte une diminution du métabolisme de la substance qui a la plus faible affinité pour ce site. Si la voie métabolique affectée représente la principale voie d’élimination, les concentrations plasmatiques de la molécule mère sont augmentées. Ceci peut se traduire par des effets toxiques prolongés. Dans plusieurs cas, d’autres voies métaboliques alternatives peuvent se mettre en place, ce qui n’est pas toujours bénéfique.

Ces différents mécanismes de toxicité des xénobiotiques permettent d’expliquer les effets délétères qu’ils peuvent induire dans l’organisme. Bien évidemment la toxicité d’un xénobiotique dépend de la substance elle-même, de sa concentration et de l’organe cible. Comme nous venons de le préciser, l’induction enzymatique et les interactions métaboliques peuvent jouer un rôle aussi important dans la toxicité. Cependant, les effets des mélanges de produits chimiques sont très peu étudiés.

B. Les modèles cellulaires hépatiques in vitro

1. Les différents modèles hépatiques in vitro

Les hépatocytes sont responsables de la majorité des fonctions hépatiques comme notamment la biotransformation des xénobiotiques. Il est établi que cette fonction détermine la pharmacocinétique et le potentiel toxique des produits chimiques. Il apparait logique que la majorité des études in vitro soient basées sur les hépatocytes. De nombreux investissements sont faits pour les tests in vitro avec toujours le souci de l’extrapolation des résultats à la toxicologie humaine. En effet, bien que les hépatocytes de rongeurs en culture primaire soient largement utilisés, la variabilité inter-espèce en fait un modèle non adapté pour l’étude du métabolisme et de la toxicité des xénobiotiques. Les modèles humains sont de ce fait largement plus en adéquation avec l’extrapolation des résultats in vitro-in vivo.

Aujourd’hui, de nombreux systèmes in vitro dérivés du foie sont disponibles, allant de fractions subcellulaires d'hépatocytes aux foies perfusés isolés. Les hépatocytes humains en culture primaire et les lignées cellulaires dérivées d'hépatomes sont des outils les plus largement utilisés pour les études in vitro sur le foie. Les hépatocytes en culture primaire représentent a priori, le modèle cellulaire hépatique le plus proche de la situation in vivo. Fraichement isolés, les hépatocytes conservent leur structure particulière et expriment transitoirement in vitro la plupart des fonctions spécifiques du foie. Cependant, des altérations fonctionnelles et phénotypiques sont rapidement observées. De plus, leur disponibilité et leur survie sont limitées (Guillouzo, 1998; Brandon et al., 2003). Actuellement, la cryoconservation est la seule méthode disponible à long terme pour le stockage d'hépatocytes humains primaires.

De nombreuses conditions expérimentales ont été proposées afin d’améliorer leur survie et le maintien des fonctions des hépatocytes en culture primaire (Guguen-Guillouzo and Guillouzo, 1983) : 1) l'utilisation de facteurs solubles dans le milieu favorisant la différentiation (Guguen- Guilouzo, 2002; Jasmund et al., 2007) ; 2) la co-culture avec des cellules épithéliales ou mésenchymateuses ou des lignées de cellules (Guguen-Guillouzo et al., 1983; Hiramatsu et al., 2005; Khetani et al., 2009; Kostadinova et al., 2013) ; 3) l'utilisation de diverses matrices extracellulaires (MEC), telles que le collagène, le matrigel ™ (mélange de laminine et de collagène IV) et l'alginate (De Bruyn et al., 2013; Kostadinova et al., 2013). Malgré des améliorations, les fonctions spécifiques du foie diminuent dans le temps sans parvenir à se stabiliser. Par ailleurs, les hépatocytes humains présentent l’inconvénient d’une importante variabilité interindividuelle (Brandon et al., 2003).

Les lignées de cellules hépatiques offrent un certain nombre d'avantages, parmi lesquels une offre illimitée de cellules (Castell et al., 2006). Cependant, ces lignées, y compris la lignée humaine HepG2, la plus couramment utilisée, ont perdu un part importante des fonctions hépatiques, en particulier l'expression des enzymes de phase I et des transporteurs de médicaments (Castell et al., 2006; Westerink and Schoonen, 2007).

Plus récemment, certains laboratoires ont établi de nouveaux modèles in vitro constitués d'hépatocytes dérivés de cellules souches / progénitrices. Celles-ci peuvent provenir d’embryons ou être d'origine adulte et peuvent être obtenues par différents protocoles d'isolement et de différenciation (Snykers et al., 2006; Snykers et al., 2009; Guguen-Guillouzo et al., 2010; De Kock et al., 2012). Les cellules souches pluripotentes induites (iPS) constituent une catégorie particulière car elles sont obtenues par reprogrammation génétique de cellules somatiques (Greenhough et al., 2010). Les hépatocytes dérivés de cellules souches pourraient devenir un outil de premier plan pour les tests de sécurité préclinique. Toutefois, leurs activités fonctionnelles restent, pour le moment, bien inférieures à celles mesurées dans le foie et les hépatocytes en culture primaire (Snykers et al., 2009).

2. Le cas particulier de la lignée HepaRG

Une lignée, la lignée HepaRG, se distingue cependant de toutes les autres lignées par sa capacité à exprimer des fonctions hépatiques différenciées et représente une alternative aux hépatocytes humains en culture primaire.

Description de la lignée

La lignée HepaRG a été isolée à partir d’un cholangio-hépatocarcinome d’une patiente souffrant également d’une infection chronique par virus de l’hépatite C (Gripon et al., 2002). Les cellules sont capables de se (de)différencier et de se transdifférencier (Cerec et al., 2007). En effet, lorsqu’elles sont ensemencées à faible densité (2,6.104 cellules/cm²), elles ont une forte capacité d’auto-renouvellement, présentent une morphologie cellulaire allongée et indifférenciée et expriment des marqueurs de progéniteurs hépatiques bipotents. Au cours de leur prolifération, elles prennent progressivement une forme caractéristique de cellules épithéliales granuleuses entourées de cellules épithéliales plus étalées et claires. L’ajout de 2% de diméthylsulfoxyde (DMSO) 15 jours après l’ensemencement, c’est-à-dire lorsqu’elles sont confluentes, potentialise leur différenciation en deux types cellulaires bien distincts : des cellules

31 hépatiques ressemblant à des hépatocytes humains matures en culture primaire et des cellules de type biliaire. Environ 50 à 55% des cellules sont des hépatocytes (Figure 10).

Figure 10 : Evolution des cellules HepaRG après repiquage à faible densité (J0). Au 14ème jour, les cellules sont confluentes puis après l’ajout de 2 % de DMSO jusqu’au 30ème jour, les cellules HepaRG se différencient en deux types cellulaires : les hépatocytes et les cellules biliaires.

Caractère « subnormal » de la lignée

La lignée HepaRG présente un caractère transformé modéré comparativement à des lignées d’hépatome comme HepG2 ou HuH7. L’analyse du profil d’expression de l’ensemble du génome a révélé que les transcrits des cellules HepaRG sont à des niveaux bien plus proches de ceux des hépatocytes humains primaires et des tissus hépatiques humains comparés à ceux d'autres lignées telles que HepG2 (Hart et al., 2010).

Les cellules HepaRG ont un caryotype subnormal avec une translocation 12-22 et une trisomie du chromosome 7 (Figure 11).

Figure 11 : Représentations du caryotype des cellules HepaRG. Les flèches rouges indiquent les anomalies (Gripon et al., 2002).

Les cellules HepaRG peuvent repeupler le foie des souris transgéniques uPA/SCID quand elles sont injectées dans la rate et forment des travées d’hépatocytes différenciés (Cerec et al., 2007). Lorsqu’elles sont injectées chez des souris uPA/SCID, elles ne forment pas de tumeur, ce qui indique qu’elles ne possèdent les propriétés des cellules cancéreuses. Du reste, un processus de vieillissement a été observé dans les cellules HepaRG maintenues à confluence, caractérisé par une augmentation de l’activité de la β-galactosidase (Pernelle et al., 2011)

Stabilité fonctionnelle de la lignée HepaRG

Des expériences réalisées au laboratoire ont démontré la capacité des cellules HepaRG à conserver leurs caractéristiques morphologiques pendant au moins le mois qui suit l’acquisition de leur différenciation (Josse et al., 2008). Elles conservent également la capacité à assurer le métabolisme oxydatif des xénobiotiques (Aninat et al., 2006; Kanebratt and Andersson, 2008a) et la synthèse de glycogène. Elles expriment les transporteurs fonctionnels responsables de l’efflux et de l’influx des toxiques, permettant ainsi à l’utilisateur de tester simultanément l’effet d’une drogue et de ses métabolites.

L’expression de gènes caractéristiques d’hépatocytes différenciés (aldolase B, CYP3A4), impliqués dans le métabolisme et le transport de xénobiotiques (CYP3A4, CYP1A2, CYP2E1, CYP2B6, GSTA1/2, mEH, UGT1A1) ou codant des facteurs nucléaires (CAR, PXR), reste relativement stable pendant au moins 4 semaines après la différenciation des cellules HepaRG. De même les activités enzymatiques correspondantes des CYPs sont maintenues et restent inductibles par des inducteurs modèles, notamment la rifampicine, l’oméprazole et le 3- méthylcholanthrène (Kanebratt and Andersson, 2008b; Antherieu et al., 2010; Gerets et al., 2012).

La pertinence du modèle des cellules HepaRG pour les études de toxicité hépatique in vitro par rapport aux modèles cellulaires classiquement utilisés a été également évaluée, de même que son intérêt pour des études de toxicité chronique (Dumont et al., 2010a; McGill et al., 2011; Andersson et al., 2012; Josse et al., 2012).

Aujourd’hui, la plupart des laboratoires des principales firmes pharmaceutiques utilisent la lignée HepaRG comme substitut des hépatocytes primaires pour des études prédictives de cinétique et d’interactions médicamenteuses (McGinnity et al., 2009).

Etudes de génotoxicité

En utilisant un composé hépatotoxique de référence, l’aflatoxine B1 (AfB1), il a été montré que les cellules HepaRG différenciées sont aussi sensibles que les hépatocytes primaires tandis que la viabilité des cellules HepG2 ne semble pas altérée (Josse et al., 2012). De plus, une toxicité dépendante du temps et de la dose a été observée lors d’un traitement de 14 jours par ce composé. Enfin, la faisabilité des études de génotoxicité dans le modèle HepaRG a été évaluée par le test des comètes et le test du micronoyau (Le Hegarat et al., 2010; Josse et al., 2012). Les résultats montrent un effet génotoxique dose-dépendant dès la concentration de 1µM d’AfB1 dans les cellules différenciées (Josse et al., 2008). Par ailleurs, la cyclindrospermopsine, une cyanotoxine impliquée dans l’initiation de tumeurs chez la souris, a induit des micronoyaux dans ce modèle cellulaire avec l’implication indiscutée du CYP3A4 dans cette génotoxicité (Bazin et al., 2010).

II. Les pesticides

A. Avant-propos

Parmi les contaminants environnementaux, les pesticides qui incluent herbicides, fongicides et insecticides, font l’objet d’une attention particulière. En effet, ils sont responsables de sérieux problèmes environnementaux en raison de leur large utilisation, leur persistance et leur bioaccumulation le long de la chaîne trophique. De plus, plusieurs études ont montré leur implication dans la survenue de diverses pathologies, y compris cancéreuses, ce qui explique l’interdiction d’usage d’un certain nombre d’entre eux.

Chaque année, la France utilise plus de 65 000 tonnes de produits phytosanitaires ce qui la place au 1er rang européen de consommation de matières actives selon le ministère de l’agriculture. Cependant, si l’on rapporte cette consommation à l’hectare cultivé, la France se situe près de la moyenne européenne (4,4 versus 3,9 kg/ha cultivé). Une expertise scientifique collective conduite par l’INRA et le CEMAGREF a montré que 80% des stations de mesure en eau superficielle et 57 % en eau souterraine sont contaminées par des pesticides. Elle a aussi révélé la rémanence de certains pesticides interdits depuis plus de 10 ans. De plus, les diverses études épidémiologiques révélant des effets potentiels des pesticides sur la santé humaine ont amené le gouvernement à mettre en place le Plan Interministériel de réduction des risques liés aux pesticides en 2006 pour une période de trois ans et à mettre en place le plan Ecophyto qui vise à diviser la quantité de pesticides utilisée par 2 d’ici 2018. Ces dernières études ont, en effet, montré que les personnes exposées aux pesticides ont plus de risques que d’autres, de développer de nombreuses maladies : cancer, malformations congénitales, problèmes d’infertilité, problèmes neurologiques ou encore système immunitaire affaibli. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), ces produits seraient responsables de quelques trois millions d’empoisonnement de personnes chaque année dans le monde, provoquant maladies chroniques et décès. Ces produits phytosanitaires posent donc un véritable problème de santé publique, non seulement pour les utilisateurs qui sont les plus exposés, mais aussi pour la population générale.

Les principaux pesticides sont des produits phytopharmaceutiques majoritairement utilisés dans le milieu agricole. Entre les substances passées et celles encore utilisées, il existe plus d’un millier de substances actives ayant des caractéristiques très variées. Les pesticides peuvent

être classés en fonction de leurs cibles (insectes, mauvaises herbes, champignons) mais également selon leur structure chimique.

B. Les pesticides

Il existe de nombreuses classes de pesticides mais ne seront développés ici que les organophosphorés (OP) et les organochlorés (OC) classes auxquelles appartiennent les pesticides étudiés dans mon travail de thèse. Pour cette même raison, une attention particulière sera portée au malathion, à l’endosulfan et au méthoxychlore.

1. Les organophosphorés (OP)

Les insecticides OP, issus de la recherche d’armes chimiques dans les années 30, ont été commercialisés à partir de 1942 avec le TEPP (tétra-éthylpyrophosphate), très toxique et rapidement abandonné, puis avec le parathion, en 1944. Les OP sont des insecticides qui ont en commun leur mode d’action sur le système nerveux des ravageurs. De formule générale (R1O, R2O)-PO(S)-O(S)-X, ils ont peu à peu remplacé les OC, trop persistants. En effet, bien que ces pesticides aient en général une toxicité aiguë plus élevée que les OC, ils se dégradent beaucoup plus rapidement. Les OP ont de multiples usages et plus de 40 composés sont commercialisés en France dans de nombreuses formulations à usage agricole et domestique. Ils peuvent être classés en trois groupes, selon la nature du groupe X : les aliphatiques (le malathion), les aromatiques (le parathion) et les hétérocycliques (la phosalone), ou selon la présence d’atomes de soufre : les organophosphorés (le dichlorvos), les thio-organophosphorés (le diazinon) et les dithio-organophosphorés (le malathion). Les aromatiques et les dérivés soufrés sont les plus persistants bien que la plupart soient hydrolysés rapidement et donc peu rémanents. Ils ne s’accumulent pas non plus dans les organismes vivants. Ils sont en général peu volatils, sauf le chlorpyriphos, le dichlorvos et le fenthion, et très lipophiles. Ils agissent par contact et par ingestion, parfois également par inhalation, sur une grande variété d’insectes et de vers. Certains ont une diffusion systémique dans la plante ou l’animal.

Le malathion est interdit en Europe depuis 2008 mais continue d’être produit notamment en Chine. Il était et reste utilisé dans certains pays en agriculture contre les insectes mais également dans la lutte anti-vectorielle contre la malaria. Il a également été utilisé pour traiter la gale et les poux chez l’homme. Sa principale action toxique passe par l’inhibition de l’acétylcholinestérase, entraînant l’interruption de la neurotransmission dans les systèmes

36 nerveux parasympathiques et sympathiques, ainsi qu’un blocage du système nerveux central. Lors du stockage, le malathion peut se dégrader naturellement en isomalathion.

2. Les organochlorés (OC)

Les OC sont des composés organiques, obtenus par la chloration de différents hydrocarbures insaturés. De poids moléculaire élevé (de 266 à 406g/mol), ces substances possèdent 3 à 9 substitutions par des atomes de chlore, responsables d’une stabilité chimique très élevée. Leur fort coefficient de sorption au carbone organique (Koc) leur confère une excellente affinité pour les sols riches en matières organiques. Ainsi, ces substances ont tendance à persister longtemps dans les sols, milieu d’accumulation privilégié et donc source potentielle d’exposition. Les OC se caractérisent par une faible solubilité dans l’eau, mais une solubilité élevée dans les solvants organiques ; ils sont très résistants à la dégradation biologique, chimique et photolytique. Leur faible pression de vapeur est responsable d’une faible volatilité et participe donc de façon négligeable à la contamination de l’air à moins qu’ils soient adsorbés aux particules atmosphériques. Les OC ont un fort pouvoir bioaccumulatif et une lipophilie importante de par un logarithmique du coefficient de répartition octanol/eau (LogKow) supérieur à 3,5. Ils ont donc tendance à s’accumuler dans les tissus riches en graisses des organismes vivants (tissus adipeux, foie, système nerveux central) et à contaminer la chaine alimentaire.

Les OC sont des insecticides de contact. Ce sont des toxiques neurotropes qui altèrent le fonctionnement des canaux sodium indispensables à la transmission de l'influx nerveux. Leur spectre d'action est large.

Le DTT est le chef de file de ces insecticides. D’autres ont progressivement suivi sa mise sur le marché : le lindane en 1946, l’aldrine et la dieldrine en 1949, l’endrine et l’heptachlore en 1952 et l’endosulfan en 1960. Le méthoxychlore arriva vers les années 70, après le déclin du DDT dont il est l’analogue.

La majorité des OC sont considérés comme des polluants organiques persistants (POP). Le DDT, l’endrine, l’aldrine, le dieldrine le chlordane et l’heptachlore font ainsi partie des douze premiers produits chimiques classés comme POP d’après la convention de Stockholm datant du 22 mai 2001. Ce traité international a permis de restreindre puis d’en éliminer totalement la production, l’utilisation, l’écoulement et le stockage.

Les POP sont caractérisés par quatre propriétés :

- ils sont extrêmement toxiques

- ils persistent pendant des années, voire des décennies avant de se décomposer en substances moins dangereuses

- ils s’évaporent et se déplacent sur de longues distances dans l’eau et dans l’air

- ils s’accumulent dans les tissus graisseux.

Depuis l’heptachlore α, β et le lindane ont rejoint cette liste initiale et, en juillet 2007, le Conseil de l’Union Européenne a formulé une proposition d’inscription de l’endosulfan en vue d’une suppression globale.

Le méthoxychlore est moins persistant que son analogue, le DDT, car dans l’environnement sa demi-vie est de 120 jours (pouvant aller jusqu’à 30 ans pour le DTT). Le méthoxychlore est utilisé en agriculture (fruits, légumes, fourrages, forêts), sur les plantes ornementales et comme parasiticide sur le bétail laitier. Aux États-Unis, il a été interdit en octobre 2002 par l’EPA (Environmental Protection Agency) car son innocuité sur la santé humaine n’avait pas été démontrée.

L’endosulfan est un insecticide et acaricide par contact et ingestion utilisé sur les cultures légumières, les arbres fruitiers, les cultures céréalières, le coton, le thé ou encore le tabac. La spécialité commerciale est un mélange de deux stéréo-isomères contenant 70 % d’α et 30 % de β-endosulfan. L’endosulfan et ses produits de dégradation sont persistants dans l'environnement avec une demi-vie allant de 9 mois à 6 ans (Jayashree and Vasudevan, 2007). De ce fait, il appartient aux substances prioritaires de la Directive Cadre sur l’Eau (DCE) et notamment pour ses effets toxiques importants sur la faune aquatique. En effet, cette substance a été retrouvée dans les lacs d’Europe (Carrera et al., 2002), en Arctique dans l’eau, la glace, l’air mais aussi dans les sédiments, le sol et les plantes (http://www.cdpr.ca.gov/docs/emon/pubs/tac/tacpdfs/ endosulfan/enviro_fate3.pdf). Il n’a pas pour autant été interdit dans tous les pays. En Europe, il s’agit du dernier organochloré ayant été retiré du marché (2008). En 2010, le journal Le Monde faisait état d’une forte consommation actuelle au Brésil. Par ailleurs lors d’une dernière réunion en octobre 2010, des experts de l'ONU ont recommandé aux gouvernements d'interdire ce pesticide, à ce jour encore très utilisé, en raison de l'impact qu'il peut avoir sur le système nerveux humain, comme sur la faune sauvage.

C. Dispersion et devenir des pesticides dans l’environnement

Les pesticides peuvent se propager dans l’environnement, contaminant différentes matrices : atmosphère, milieux aquatiques et sol. La pollution peut être liée à la production, au stockage des produits chimiques concernés, à leur application et au processus de transport naturel des polluants : volatilisation, infiltration (Figure 12).

Figure 12 : Schéma du devenir des pesticides dans l'environnement

1. Dispersion dans l’air, pollution atmosphérique

La présence des pesticides dans l’air est due aux émissions des entreprises chimiques de production de pesticides (Bailey, 2001; Barber et al., 2005), au traitement des cultures agricoles et des plantations d’arbres (Chevreuil et al., 1996). Les plus grandes concentrations de pesticides passent dans l’atmosphère après les épandages aériens. Le DDT et le lindane sont appliqués sous forme d’aérosols. Ils se retrouvent donc sous cette forme dans l’atmosphère mais aussi adsorbés aux particules de l’air. Ainsi, le DDT a été retrouvé à des milliers de kilomètres de distance de l’épandage comme par exemple en Antarctique où il a été mesuré dans les œufs de manchots et dans certains poissons (Corsolini et al., 2011). Après avoir été acheminés dans les océans, les pesticides peuvent se redistribuer dans l’air par vaporisation. Celle-ci dépend de la variation de la température atmosphérique et du vent. Dès la pénétration dans l’air, les pesticides peuvent se dégrader, se redistribuer, se transporter et se retrouver sous forme de précipitations sur le sol ou dans les eaux de surface. D’après les mesures effectuées en France par l’AASQA (Association agréée de la surveillance de la qualité de l’air), une quantité non négligeable de pesticides dans l’air extérieur toute l’année avec des pics d’exposition lors d’activités d’épandage agricole. Des pesticides interdits en France depuis de

39 nombreuses années ont été retrouvés comme le lindane et l’endosulfan. Il est à noter qu’une étude de 2006 menée par Bouvier et ses collaborateurs sur 130 logements franciliens, fait état d’une contamination de l’air intérieur pour la plupart d’entre eux (Bouvier et al., 2006).

2. Pollution des milieux aquatiques

Des études ont montré que les pesticides peuvent contaminer les systèmes aquatiques à travers l’interface air-eau. Ces micro-polluants contaminent tout d’abord les eaux continentales par transfert à partir des sources (champs cultivés, canaux de drainages), ils sont ensuite acheminés vers les océans. Les pesticides sont en général plutôt solubles et se retrouvent plus facilement dans les cours d’eau. Ainsi en 2011, des pesticides sont quantifiés dans 91 % des points suivis dans les cours d’eau et 70 % des points en eaux souterraines (www.eaufrance.fr). Certaines substances se fixent sur les sédiments. Les 15 pesticides les plus quantifiés dans les sédiments des cours d’eau en 2011 sont en majorité des insecticides ou leurs dérivés alors que la grande majorité sont interdits depuis certaines années comme l’endosulfan, le DDT et ses métabolites.

La rétention des pesticides et particulièrement des OC dans l’eau et les sédiments donne lieu à une contamination à long terme des milieux aquatiques et notamment des espèces animales et végétales qui vivent dans les eaux (Binelli and Provini, 2003; Binelli et al., 2004; Pazou et al., 2006). Les OC peuvent s’accumuler dans les organismes aquatiques directement à partir de l’eau, les sédiments et les nutriments aquatiques contaminés (Mackay and Fraser, 2000). La bioaccumulation à partir de l’eau est liée au processus de respiration (l’eau qui passe à travers les branchies) et à partir des sédiments à l’ingestion de différentes particules en suspension dans l’eau (particules contaminées) et de plantes aquatiques contaminées (adsorption des OC dans les plantes consommées par les poissons). De nature lipophile, ils s’accumulent dans les organes et la chair des poissons puis tout au long de la chaine trophique. Il s’agit de la bioamplification pouvant avoir un effet néfaste sur la santé humaine, l’homme étant le dernier maillon de cette chaine (Perugini et al., 2004; Cheung et al., 2007; Chopra et al., 2011).

3. Migration et dégradation des pesticides dans les sols

Les pesticides peuvent arriver sur la surface du sol à la suite d’un traitement aérien des cultures, à partir des suspensions, des poudres ou encore directement dans le sol par le biais de semences traitées. Il existe également des machines spéciales qui permettent l’incorporation directe de pesticides dans le sol.

Une fois les pesticides arrivés dans le sol, plusieurs processus peuvent intervenir (Figure 13) :

- la volatilisation dans l’atmosphère - l’adsorption et fixation dans la matrice solide - le transport : migration dans la profondeur du sol, migration horizontale, en bassin versant, écoulement vers la nappe phréatique - la biodégradation, photo-dégradation : transformation en produits secondaires et décomposition chimique.

Figure 13 : Répartition des pesticides dans les sols

Plusieurs paramètres peuvent influencer la migration, la persistance et la dégradation des pesticides dans les sols : la température (photodégradation), le pH du sol, l’humidité du sol, le taux de carbone organique, la lumière, le régime hydrique, la composition granulométrique, la profondeur des labours des sols, le relief du terrain, l’abondance de la flore et la faune etc. (Hitch and Day, 1992; Parween et al., 2014)

D. Les risques pour la santé humaine

1. Expositions

A partir de la multiplicité des sources de contamination (aliments, air, eau, sol), l’exposition aux pesticides peut se produire à la fois par ingestion, inhalation ou absorption cutanée. Les voies prépondérantes varient selon qu’elles touchent les milieux professionnels ou la population générale. Le degré d’exposition aux pesticides varie selon la durée, l’intensité et la fréquence de

41 contact. De nombreux facteurs entrent en jeu, notamment la concentration de produit dans le milieu et ses propriétés physico-chimiques, ainsi que les activités des individus exposés. La voie cutanée prévaut pour les pesticides en milieu professionnel agricole tant qu’il ne s’agit pas d’une poudre où la voie majoritaire d’exposition sera respiratoire. Quant à la population générale, selon l’OMS, la voie orale est la plus importante prenant en compte l’ingestion d’aliments (fruits et légumes, viandes, produits de la mer) et d’eau contaminés par les résidus de pesticides. Les évaluations de risque attribuent 90% de l’exposition à l’alimentation contre 10% à l’eau.

En France, le programme de surveillance et contrôle des résidus de pesticides dans les produits d'origine végétale réalisé par la DGCCRF en 2011 a conduit à l’analyse de plus de 3000 échantillons de fruits et légumes dont plus de 40 % contenait de résidus.

2. Principaux effets des pesticides sur la santé humaine

Les pesticides sont par définition des produits induisant la mort des organismes cibles. De par leur mécanisme d’action et leurs effets non souhaités, ils peuvent engendrer des effets néfastes pour les organismes non ciblés, comme l’espèce humaine. Les symptômes d’une exposition aiguë aux pesticides ont été décrits à la suite d’accidents, d’empoisonnements ou de suicides (Moses and Peter, 2010; Cavari et al., 2013; Chaou et al., 2013). Dans une moindre mesure, des cas d’allergies, d’effets dermatologiques et respiratoires ont été rapportés par les utilisateurs dans le milieu professionnel.

Cependant, les principaux effets des pesticides sur la santé humaine proviennent d’une exposition chronique à de faibles doses. Beaucoup d’études ont été menées, principalement dans des populations professionnelles et plus récemment dans la population générale. Ainsi, les principaux effets chroniques relevés sont les troubles des systèmes nerveux central et immunitaire, les effets perturbateurs endocriniens et les cancers. L’association entre ces pathologies et l’exposition aux pesticides provient en général de données épidémiologiques, et pour plusieurs raisons, il est difficile parfois d’arriver à des conclusions définitives. Cependant, les méta-analyses permettent d’apporter les présomptions d’un lien entre exposition aux pesticides et pathologies. En voici, une liste non exhaustive.

Neurotoxicité

Pour certains pesticides, la neurotoxicité est le mécanisme même de leur mode d’action. Aussi, les effets aigus survenant aux doses importantes chez les utilisateurs (surtout les agriculteurs) sont maintenant assez bien documentés notamment en raison des intoxications accidentelles

(ou volontaires). Cependant, les effets chroniques sont différents puisque de nombreuses études relatent l’implication des pesticides dans des pathologies neuro-dégénératives telle que la maladie de Parkinson (Franco et al., 2010; Baltazar et al., 2014). Cette pathologie résulte de la dégénérescence progressive de neurones dopaminergiques de la substance noire. Le stress oxydatif, l'apoptose, la dysfonction mitochondriale, l'inflammation et la déficience des voies de dégradation de protéines sont suspectés d’être à l’origine de cette dégénérescence (Bove and Perier, 2012).Trois récentes méta-analyses regroupent des études ayant été menées sur une population professionnelle ou non et relatent un lien plus étroit avec les herbicides tels que le paraquat et les insecticides OC (van der Mark et al., 2012; Van Maele-Fabry et al., 2012; Pezzoli and Cereda, 2013). Le stress oxydant et l’induction d’ERO seraient le lien entre paraquat et la maladie de Parkinson (Franco et al., 2010).

La survenue de la maladie d’Alzheimer a également était étudiée dans le cadre d’exposition aux pesticides (Zaganas et al., 2013). Néanmoins, les mécanismes d’action sont difficiles à établir. Bien que des facteurs génétiques soient un facteur prépondérant dans la survenue de cette pathologie, des expositions professionnelles seraient également un des facteurs de risque (Jiang et al., 2013). Parmi d’autres effets sur le système nerveux, les troubles cognitifs seraient principalement en lien à une exposition professionnelle aux OP et d’autant plus à la suite d’une intoxication aiguë (Ross et al., 2013). D’autres études ont recherché un lien entre exposition professionnelle et l’apparition de sclérose latérale amyotrophique, mais les résultats étaient peu concluants (Johnson and Atchison, 2009).

Effets cancérigènes

Les premières recherches sur le rôle des pesticides dans l’induction de cancers sont basées sur le constat de différences de mortalité entre les fermiers et les autres catégories socio- professionnelles pour certaines pathologies cancéreuses. Il s’agit des cancers des tissus hématopoïétiques (leucémies, myélomes, lymphomes) et conjonctifs, des lèvres, de l’estomac, de la peau et du cerveau (Baldi et al., 1998). D’autres cancers sont concernés, y compris ceux qui se développent dans les organes dont la physiologie est fortement régulée par les hormones sexuelles (sein, prostate, endomètre, testicule, etc.…).

» Cancer de la prostate

Au niveau mondial, le cancer de la prostate est le 2ème cancer le plus fréquent chez l’homme après celui du poumon. Il existe une disparité au niveau géographique puisque l’incidence est

43 plus élevée en Amérique et en Europe de l’Ouest et du Nord ainsi que dans les populations originaires de l’Afrique Subsaharienne résidant dans les pays développés. En France, le cancer de la prostate se situe au 1er rang des cancers incidents chez l’homme et représente la 3ème cause de décès par tumeurs chez l’homme. Ainsi, 71 220 cas incidents et 8 685 décès par cancer de la prostate ont été estimés pour 2011 en France selon la Haute Autorité de Santé. En 2008, l’expertise collective réalisé par l’Inserm, concernant les facteurs de risque de développer ce cancer indique une origine multifactorielle, en lien essentiellement avec l’âge, l’ethnie et l’alimentation. Cependant, l’exposition professionnelle aux pesticides n’est pas à exclure. D’après la cohorte Américaine Agricultural Health Study citée précédemment, il y aurait présomption d’un lien important entre l’exposition aux pesticides et cancer de la prostate (Weichenthal et al., 2010). En France, le programme de recherche KARUPROSTATE vise à identifier et caractériser des déterminants génétiques et environnementaux de survenue et d'évolution du cancer de la prostate aux Antilles. Cette étude cas-témoin relate d’une augmentation significative du risque de cancer de la prostate avec l'augmentation de la concentration plasmatique de chlordécone (Multigner et al., 2010). Les propriétés oestrogéniques (agonistes vis-à-vis du récepteur des œstrogènes ERα et antagoniste vis-à-vis de l’ERβ) de ce pesticides seraient à l’origine de cette association (Rochefort and Balaguer, 2010).

» Lymphome non Hodgkinien (LNH)

Le LNH correspond à une prolifération maligne initialement extra-médullaire des cellules lymphoïdes (B et T). Ces dernières ayant des fonctions très variées et par leur présence ubiquitaire, différents organes peuvent être atteints avec des signes cliniques très hétérogènes. Même si l’étiologie du LNH n’est pas encore bien connue, un certain nombre de facteurs de risques ont été établis comme certaines infections et affaiblissement du système immunitaire. En effet, il existerait un lien de causalité entre les agents infectieux en particulier ceux du type de virus humain T-leucémie / lymphome 1 (HTLV-1), virus d'Epstein-Barr (EBV), et Helicobacter pylori infections (Muller et al., 2005). L'exposition à des agents environnementaux et les risques professionnels ont été étudiés et ont fait l’objet de nombreuses études surtout dans le secteur agricole. En 2007, une méta-analyse de 13 études cas-contrôles établit un lien particulier entre l’exposition aux pesticides dans le secteur professionnel agricole et la survenue de LNH (Merhi et al., 2007). Les résultats issus de la cohorte américaine Agricultural Health Study menée dans les états de l’Iowa et de la Caroline du Nord sur plus de 57000 applicateurs de pesticides (employés de pépinière, fermiers, employés d'entreprises de lutte antiparasitaire…) révèlent une

44 association entre le lindane et le LNH alors que l’association avec d’autres pesticides comme le DTT, l’atrazine et le malathion n’a pas été démontrée (Weichenthal et al., 2010). Néanmoins, le malathion lorsqu’il serait utilisé conjointement avec le carbaryl ou l’acide 2,4-dichlorophénoxy acétique augmenterait significativement le risque de LNH (McDuffie et al., 2001; Hohenadel et al., 2011).

» Myélome multiple

Le myélome multiple est caractérisé par la prolifération maligne dans la moelle osseuse de plasmocytes anormaux. D’après la cohorte américaine Agricultural Health Study, les applicateurs de perméthrine dans les plus hautes catégories d'exposition ont une incidence accrue de myélome multiple par rapport à des applicateurs non exposés (Rusiecki et al., 2009). Une étude cas-contrôle menée en Europe conclue également à une association entre le myélome multiple et les métiers de la ferme ou une exposition aux pesticides supérieurs à 10 ans (Perrotta et al., 2012). Une année plus tard, une méta-analyse de 5 études cas-contrôles internationales rediscute ces résultats et conclue difficilement quant à cette association (Perrotta et al., 2013).

» Leucémies

Les leucémies sont des proliférations malignes dans le sang, la moelle et éventuellement d’autres organes, de précurseurs des cellules sanguines bloqués à un stade précoce de leur maturation. Les leucémies peuvent se distinguer selon leur évolution (aiguë ou chronique) et selon l’origine lymphoïde ou myéloïde des cellules néoplasiques. Le risque de leucémie attribuable à des facteurs professionnels a été estimé à 10% aux Etats-Unis et à 5-10% en Europe. Une relation de cause à effet avec la leucémie n’a été démontrée que pour 2 agents: le benzène et les rayonnements ionisants. D’autres expositions professionnelles sont suspectées, notamment celle à des hydrocarbures aromatiques et solvants organiques, des champs électromagnétiques, des agents infectieux, des pesticides et autres produits chimiques (Descatha et al., 2005). Malgré la forte significativité de l’association entre l’exposition professionnelle aux pesticides et l’augmentation des leucémies myéloïdes (risque relatif ; RR entre 6,32 et 6,99), obtenue par Van Maele-Fabry et al. dans deux larges méta-analyses, les auteurs soulignent l’insuffisance de données ne permettant pas de conclure quant au pesticide ou à la famille de pesticides responsable de l’effet (Van Maele-Fabry et al., 2007; Van Maele- Fabry et al., 2008). Par ailleurs, la cohorte prospective AHS n’indique pas de différence

45 significative entre l’incidence des leucémies observées chez les professionnels dans le secteur agricole (Alavanja et al., 2005).

Maladies et troubles du développement de l’enfant

» Leucémies

Bien que chez l’adulte le lien de causalité entre leucémie et exposition aux pesticides soit discuté, celui chez l’enfant est avéré selon plusieurs méta-analyses (Turner et al., 2011; Vinson et al., 2011). En effet, que ce soit une exposition professionnelle maternelle pendant la grossesse ou résidentielle pendant la grossesse ou l’enfance, il existe un risque de développement de leucémies chez l’enfant. Des chercheurs ont émis l'hypothèse que les mécanismes potentiels de pesticides dans la survenue de la leucémie infantile peuvent inclure l'exposition pré-conceptionnelle provoquant des mutations des cellules germinales des parents ou des effets épigénétiques comme l'exposition transplacentaire provoquant des mutations de cellules somatiques dans l'embryon / fœtus ou des altérations de la fonction hormonale ou immunologique (Daniels et al., 1997).

» Malformations et troubles du développement de l’enfant

La présence de pesticides dans les urines et dans le plasma des femmes enceintes puis dans le lait maternel implique une exposition non négligeable lors la période prénatale et postnatale. L’étude PELAGIE menée de 2002 à 2006 en Bretagne sur plus de 3400 femmes enceintes a permis de mettre en évidence la présence d’atrazine dans les urines dans 5,5 % des cas et de 2 de ces métabolites dans 20 et 40 %. Celle-ci était liée à une diminution du poids de naissance et du périmètre crânien (Chevrier et al., 2011). En revanche, un immense travail publié en 2013 reprend toutes les études d’épidémiologie et sur animaux et conclue au manque de causalité concernant l’exposition aux pesticides et troubles neuro-développementaux chez l’enfant hormis quelques pesticides isolés (Burns et al., 2013). Une exposition professionnelle aux pesticides en général pendant la grossesse serait responsable d’un taux plus important de malformations de type hypospadias (Rocheleau et al., 2009).

3. Mécanismes moléculaires liant pathologies chroniques et exposition aux pesticides

Il est parfois difficile de faire le lien entre les pathologies chroniques décrites-ci-dessus et l’exposition aux pesticides. Certains mécanismes moléculaires permettent de mieux comprendre les facteurs intervenant dans l‘apparition de ces maladies.

Dommage génétiques

Les dommages à l’ADN sont associés à la phase d’initiation de la cancérogène. Dans le cas des pesticides, leurs effets génotoxiques peuvent être entre autres (production de ROS) responsables de la cancérogenèse. Plusieurs pesticides présentent des propriétés génotoxiques qui sont associées aux produits eux-mêmes ou à leurs métabolites formés par les CYPs. Plusieurs marqueurs de génotoxicité ont été déterminés dans des populations exposées à différents types de pesticides (Lebailly et al., 1998; Gomez-Arroyo et al., 2000; Costa et al., 2011). Pourtant, hormis l’arsenic classé cancérogène pour l’homme, la plupart des pesticides sont classés cancérogènes probables (captafol, manèbe) voire inclassables quant à leur cancérogénicité. Tel est le cas du malathion, de l’endosulfan et du méthoxychlore.

En effet, l’Agricultural Health Study menée de 1993 à 1997 sur 19717 applicateurs de malathion n’a pas conclu quant à l’implication de ce pesticide dans l’apparition de cancer (Bonner et al., 2007). Cependant, plusieurs études in vivo et in vitro indiquent que le malathion serait génotoxique (Rupa et al., 1991; Moore et al., 2010; Ojha and Srivastava, 2014). Le méthoxychlore induit une mutagénicité positive dans le test des cellules du lymphome de souris (Oberly et al., 1993) et serait cancérigène pour le foie de souris C3H et BALB/c et de rats Osborne-Mendel selon Reuber (1980). L’endosulfan et ses métabolites induisent des dommages à l’ADN, des mutations (Bajpayee et al., 2006) et notamment des adduits à l’ADN (Dubois et al., 1996) . Il a également été montré que l’endosulfan induisait des micronoyaux et des échanges de chromatides sœurs dans des cellules HepG2 (Lu et al., 2000; Hashizume et al., 2010). Ses effets génotoxiques seraient en partie liés à ses métabolites formés par le CYP3A4 (Dubois et al., 1996; Hashizume et al., 2010) .

Modifications épigénétiques

Plusieurs mécanismes épigénétiques tels que la méthylation de l'ADN, les modifications des histones et l'expression de microARNs peuvent être induits par des facteurs environnementaux.

Des études in vivo suggèrent que ces modifications épigénétiques peuvent être impliquées dans les effets des pesticides sur la santé humaine (Collotta et al., 2013). Les altérations héréditaires de méthylation de l'ADN dans la lignée germinale mâle ainsi que les dysfonctionnements testiculaires et ovariens ont été rapportés après une exposition à certains pesticides comme la vinclozoline (fongicide) et le méthoxychlore (Anway and Skinner, 2008; Zama and Uzumcu, 2009; Guerrero-Bosagna et al., 2010). L’association entre l’exposition à de faibles doses de POP dont les OC et l’hypométhylation de l'ADN a été rapportée chez des personnes dont le sang contenait ces substances (Kim et al., 2010). L’altération de l’expression de microARNs représenterait une signature de la tumorogénicité de certains fongicides comme le propiconazole dans le foie de souris (Ross et al., 2010).

Ces modifications épigénétiques en lien avec les pesticides peuvent intervenir dans l’apparition des cancers mais sont également impliquées dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (Baltazar et al., 2014).

Stress oxydant

De nombreux pesticides sont à l’origine d’un stress oxydant (Karami-Mohajeri and Abdollahi, 2011). C’est par exemple le cas des OP comme l’indiquent Soltaninejad and Abdollahi (2009) dans une revue regroupant 127 études dont 15 cliniques qui sont réalisées pour la plupart par des dosages sanguins. La présence de peroxydation des lipides membranaires, les diminutions des niveaux d’antioxydant et des protéines thiols ainsi que des dommages morphologiques et biochimiques sont les principales preuves de l’implication des OP dans le stress oxydant. De façon générale, le stress oxydant induit par les pesticides est impliqué dans l’apparition des cancers et des maladies neuro-dégénératives comme la maladie de Parkinson (Mena et al., 2009; Sharma et al., 2010)

Perturbations endocriniennes

Un total de 101 pesticides a été répertorié comme perturbateurs endocriniens possibles ou probables par le Pesticide Action network UK (PAN, 2009) http://www.pan- europe.info/Campaigns/pesticides/documents/cut_off/list%20of%20lists.pdf. Certains pesticides ou leurs métabolites vont pouvoir se fixer sur les ER, les AR et le récepteur aux hormones thyroïdiennes (Du et al., 2010). Les pesticides perturbateurs endocriniens peuvent mimer les fonctions oestrogéniques, se fixer sur les récepteurs appariés et induire l’expression de gènes sensibles aux œstrogènes. C’est le cas du méthoxychlore qui possède une activité

œstrogénique en partie liée à ses métabolites phénoliques. En effet, chez le rat et la souris, il induit une atrésie folliculaire, une diminution du taux d’ovulation et une diminution de l’implantation de l’embryon (Tiemann, 2008). Chez le rat mâle, le méthoxychlore réduit le poids des testicules, de la prostate et des vésicules séminales et provoque des troubles de la spermatogénèse (Okazaki et al., 2001).

Métabolisme et toxicité (hépatique)

De nombreuses études ont montré le rôle important des CYPs dans le métabolisme des pesticides ainsi que la fréquente induction ou inhibition de ces enzymes par ces composés. Ainsi, les OCs sont reconnus comme étant des inducteurs enzymatiques, ce qui accroît leur propre métabolisme (Schuetz, 2001). Cependant, ces effets inducteurs ou inhibiteurs ont principalement été montrés chez l’animal. Ce métabolisme surtout au niveau du foie peut donc conduire à la formation de métabolites toxiques et par conséquent à la survenue de dommages cellulaires et/ou génétiques. Par exemple l’hexa-chlorobenzène agirait sur le foie en modifiant l’activité de certains enzymes hépatiques à l’origine de l’apparition de porphyrie (Sunyer et al., 2008).

Nous évoquerons ici uniquement le métabolisme des molécules que nous avons étudiées : le malathion et son produit de dégradation, l’isomalathion, le méthoxychlore et l’endosulfan.

Concernant le malathion, il est métabolisé au niveau hépatique par les CYPs en malaoxon, métabolite actif. Le malathion et le malaoxon peuvent ensuite être rapidement hydrolysés par les carboxylestérases. Le malathion peut interagir avec son produit de dégradation, l’isomalathion et ainsi engendrer une toxicité plus importante (Maroni et al., 2000). La Figure 14 représente le métabolisme et les interactions possibles.

Figure 14 : Principales voies métaboliques du malathion et de son produit de dégradation, l’isomalathion. Sont également représentées dans ce schéma, les interactions probables entre des deux produits via les carboxylestérases (CE).

Le méthoxychlore et l’endosulfan sont tous deux métabolisés par des CYPs en particulier, les CYP3A4 et 2B6 (Blizard et al., 2001; Hu and Kupfer, 2002; Casabar et al., 2006; Lee et al., 2006) (Figure 15). La cytotoxicité de l'endosulfan et du méthoxychlore a été associée, au moins en partie, à leurs métabolites comme l’endosulfan-sulfate pour le premier et les dérivés déméthylés pour le second (Miller et al., 2006; Key et al., 2010).

A B

Figure 15 : Métabolisme hépatique possible de l’endosulfan (A) et du méthoxychlore (B).

E. Pesticides et la problématique des mélanges

De façon générale, les liens entre l’apparition des pathologies citées ci-dessus et l’exposition aux pesticides sont difficiles à déterminer car il s’agit la plupart du temps d’une relation multifactorielle. De plus, lorsqu’un lien est établi, l’imputabilité à un ou plusieurs pesticides reste très difficile à préciser.

1. La reconnaissance des risques liés aux mélanges de pesticides

En 2010, l'Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) reconnaît que les résidus de pesticides ont été détectés dans 46,7% des 67 887 échantillons d'aliments analysés à travers l'Union européenne. Des résidus d'au moins deux pesticides ont été trouvés dans 26,7% des échantillons analysés, parmi lesquels un tiers contenait plus de 4 résidus de pesticides. Cependant, la procédure d’homologation des produits phytosanitaires est basée sur des études de toxicologie individuelles de la substance active. Il est donc admis que le mélange de pesticides aux doses inférieures à leur NOAEL (No observable Adverse Effect Level) n’a pas d’effet néfaste. Toutefois, le règlement (CE) n ° 396/2005 reconnaît que les consommateurs sont exposés à de multiples résidus présents dans les aliments consommés avec un repas, au cours d'une journée ou sur une période plus longue qui peut conduire à des effets cumulatifs sur la santé humaine.

Le règlement européen (CE n° 396/2005) a permis d’harmoniser toutes les limites maximales de résidu pour toutes les denrées alimentaires dans tous les états membres. Dans ce même texte apparait la notion d’effets cumulatifs et synergiques des résidus de pesticides et l’importance d’établir une méthodologie permettant de tenir compte de ces effets. C’est ainsi que l’EFSA s’est intéressée à cette question et que l’Europe a permis le financement du projet ACROPOLIS chargé des outils pour répondre à cette réglementation.

Dès 2008, l'EFSA en lien avec la Commission Européenne a demandé au groupe d'experts sur les produits phytosanitaires et leurs résidus (groupe PPR) de donner un avis scientifique sur la pertinence de l'évaluation des risques cumulatifs des résidus de pesticides dans les aliments.

Le PPR a donc conclu que :

- Le concept de l'addition des doses devrait être utilisé comme moyen d'évaluer la toxicité combinée de mélanges de substances agissant selon des modes d'action dissemblables. Le concept d'addition des doses implique que chaque substance chimique, quelle que soit sa concentration, contribue à la toxicité globale du mélange.

- Dans la pratique d'évaluation des risques, les substances causant le même effet indésirable sur le même organe ou système organique devraient être regroupées dans des groupes d'évaluation cumulatifs.

Dans le cadre du projet ACROPOLIS (Aggregate and Cumulative Risk of Pesticides: an on-line integrated Strategy) une méthodologie est développée pour s'assurer que les aspects manquants dans l'évaluation des risques des pesticides peuvent être abordés dans la future gestion du risque. Après analyse des approches pessimistes et optimistes, l’une surestimant le risque et l’autre sous-estimant l’exposition réelle, ACROPOLIS a mis en place un outil informatique se basant sur une approche intermédiaire qui se veut « réaliste » quant à l’exposition aux résidus. Le cadre de l'évaluation probabiliste de l'exposition a été fixé dans les lignes directrices de l'EFSA. Outre les aspects pratiques pour obtenir des données externes et les questions ouvertes concernant le management des risques, le modèle cumulatif ACROPOLIS est bien reçu en Europe et de nombreux Etats membres ainsi que les parties prenantes (Direction générale de la santé et des consommateurs (DGSanco) l'utilisent par l’intermédiaire d’internet. L’exposition cumulative combine les sources alimentaires et non alimentaires comme par exemples l’activité professionnelle agricole, l'utilisation de produits amateurs ou consommateurs, ou des expositions accidentelles subies par les résidents ou des

52 passants qui sont toutes des personnes également exposées aux pesticides par la consommation. Le logiciel permet de prendre en compte le cadre d’exposition, ainsi plusieurs scenarios d’exposition ont été testés afin de le valider. A ce jour d’autres tests sont à réaliser.

ACROPOLIS avait également comme projet la mise en place de nouveaux essais toxicologiques pour déterminer les effets synergiques possibles. Ainsi, cela a donné lieu à deux systèmes de tests in vitro et deux modèles PB-PK

2. L’approche expérimentale des effets de mélanges

Des mélanges de pesticides peuvent induire des interactions entre les produits eux-mêmes, des interactions toxico-cinétiques et toxico-dynamiques. Pour pouvoir interpréter ces interactions, il est nécessaire d'avoir une bonne compréhension de la réactivité chimique, la toxico-cinétique (y compris les voies métaboliques) et les mécanismes d'action de chaque composé (IGHRC, 2009).

L'exposition à plusieurs pesticides peut en effet provoquer des modifications de la toxico- cinétique de composés individuels, modifiant ainsi la toxicité prédite. Les interactions toxico- cinétiques correspondent à une modification de l'absorption, de la distribution, du métabolisme ou de l'élimination (Reffstrup et al., 2010) , qui peut se produire à toutes les doses.

Il existe deux grands principes décrivant comment les pesticides individuels dans un mélange s'influencent mutuellement : la notion d'additivité et de l'interaction. L’additivité résulte du concept d’addition des doses ou de l’action indépendante, qui supposent que les produits chimiques agissent par les mêmes ou différents modes d'action, respectivement (Silins and Hogberg, 2011). Dans ce cas, également appelé " non- interaction ", la toxicité d'un mélange correspond aux effets attendus, ce qui se produit lorsque les constituants du mélange agissent sans augmenter ou diminuer les effets. En revanche, l'interaction se produit lorsque les effets de mélange observés s'écartent de ce qui était attendu. Dans ce cas, un ou plusieurs pesticides peuvent avoir interagi avec l'autre, par exemple, en facilitant ou en diminuant leur consommation, le transport, le métabolisme ou l'excrétion. Il s’agira de synergie (effet de mélange plus important que celui attendu) ou d’antagonisme (Kortenkamp, 2007). Les effets toxicologiques combinés de deux ou plusieurs pesticides peuvent donc prendre une ou trois formes : indépendance, addition ou interaction.

Le métabolisme des pesticides peut être important. En effet, non seulement les pesticides mais aussi et sans doute surtout leurs métabolites peuvent influencer l’expression ou l’activité des

53 enzymes du métabolisme ou celle des transporteurs comme nous avons pu le voir dans la 1ère partie d’introduction. Cette complexité justifie d’utiliser largement des modèles in vitro afin de mieux prédire et comprendre les interactions et la toxicité qui en découle.

Cependant le choix des conditions expérimentales est source de débat : faut-il tester des mélanges simples ou complexes en considérant des concentrations de pesticides normalement trouvées dans l’environnement ?

Deux études ANR récentes, l’une in vitro et l’autre in vivo ont montré la difficulté de prédire les effets toxiques des mélanges lorsqu’on se base sur ceux de chacun en analysant de nombreuses combinaisons de pesticides (3 à 7 pesticides par combinaison) pouvant être trouvées dans l’alimentation (Graillot et al., 2012; Crepet et al., 2013). Dans l’étude in vitro, bien que plusieurs différents types cellulaires aient été étudiés, des interactions limitées ont été observées uniquement avec des cellules hépatiques (Crepet et al., 2013) ; Dans l’étude in vivo, des analyses métabolomiques après exposition de souris ont suggéré que l'exposition à plusieurs pesticides entraine des interférences au niveau des différentes voies métaboliques conduisant à des effets induits par les molécules individuellement (Demur et al., 2013). Cependant, les études ont surtout porté sur la recherche d’effets de mélanges simples, le plus souvent binaires.

Les OP, de par leur métabolisme, sont responsables de nombreuses interactions. De façon générale, ils sont métabolisés en premier lieu par les CYPs en métabolites réactifs (OP-oxon) responsables de la toxicité de ces pesticides. Par la suite ces métabolites sont pris en charge par des estérases mais la plupart du temps, lors de cette hydrolyse, les estérases sont inhibées.

Par exemple l’isomalathion, contaminant du malathion inhibe la carboxyl-estérase, empêchant ainsi la dégradation de son métabolite réactif, le malaoxon, induisant ainsi une toxicité plus importante (Maroni et al., 2000)

A titre d’exemples on peut citer : le chlorpyrifos qui augmente la toxicité de deux pyrethrinoïdes en inhibant les carboxylesterases via leurs métabolites OP-oxons et ainsi en inhibant leur élimination. Le chlorpyrifos-oxon empêche également l’hydrolyse de la permethrine et donc son élimination, potentialisant son effet toxique (Choi et al., 2004; Hodgson and Rose, 2007).

D’autre OP thiolés comme le malathion, le chlorpyrifos, le diazinon, connus pour inhiber l’activité des CYPs de manière irréversible empêchent ainsi la détoxication du carbaryl via les CYPs. La

54 seule voie possible d’élimination est celle des CEs elles-mêmes inhibées ensuite par les métabolites, les OP-oxons (Tang et al., 2002; Hodgson and Rose, 2007).

Les métabolites OP-oxons inhibent l’activité acétyle-choline-esterase, enzymes clés dans la rupture de la neurotransmission par l’acétylcholine. L’atrazine, en augmentant l’activité des CYPs, augmente la formation des OP-oxons, ce qui empêche l'hydrolyse physiologique de l'acétylcholine en choline et en acide acétique

De plus, certains perturbateurs endocriniens peuvent avoir des effets significatifs en présence de combinaisons de pesticides même à des doses bien inférieures à leur NOAEL et ce, quel que soit leur mode d’action (Kortenkamp, 2007).

III. Cancérogenèse chimique

Tandis que la mortalité des maladies infectieuses et cardiaques diminue, celle liée aux cancers pourrait passer de 12,7 à 21 millions de nouveaux cas / an entre 2008 et 2030 au niveau mondial (Ferlay et al., 2010). Si différents facteurs génétiques, viraux et immunitaires jouent un rôle dans l’étiologie des cancers, l’exposition à des produits chimiques sous forme de produits agricoles, industriels et pharmaceutiques, additifs alimentaires et polluants naturels ou environnementaux est un facteur prépondérant. Une majorité de ces produits sont génotoxiques et les lésions de l’ADN qui sont induites sont à l’origine du processus de cancérogenèse. Cependant de plus en plus de composés chimiques se révèlent cancérogènes sans être génotoxiques; en induisant des modifications épigénétiques L'évaluation des risques liés à ces produits demeure importante aujourd'hui plus que jamais.

Le développement d’un cancer est un processus multi-étapes complexe impliquant divers changements génétiques et cellulaires. La progression tumorale, et notamment le processus métastatique jouent un rôle majeur dans la survie des patients.

A. Généralité sur la transformation des cellules cancéreuses

1. Étapes de la cancérogénèse

L’acquisition progressive de propriétés cancéreuses repose sur trois étapes clés : l’initiation, la promotion et la progression (Foulds, 1954; Oliveira et al., 2007).

L’initiation résulte de l’interaction de cellules avec un agent carcinogène conduisant ainsi à un changement génétique irréversible. La deuxième étape appelée promotion est considérée comme étant un processus réversible facilitant l’expression du phénotype initié par les altérations moléculaires. Il en résulte l’émergence de clones cellulaires transformés conduisant à des dommages tissulaires. La troisième étape, ou progression, correspond à la formation de lésions néoplasiques conduisant à la tumeur (Figure 16). Ces trois étapes ont été décrites depuis de nombreuses années et restent le paradigme de la carcinogénèse. Par la suite, une tumeur peut disséminer dans d’autres tissus et donner naissance à des métastases.

Figure 16 : Etapes de la cancérogenèse chimique d’après Oliveira et al, 2007. Des cellules normales en contact avec un produit chimique cancérogène qui peut induire des dommages et engendrer la 1ère étape d’initiation. Si les dommages ne sont pas réparés et que la cellule échappe à l’apoptose, et prolifère, la promotion de la tumeur est alors engagée ; les cellules sont transformées. Une prolifération intensive définit une phase de progression qui conduit à la formation d’une tumeur.

2. Propriétés des cellules tumorales

Les propriétés (caractéristiques) des cellules néoplasiques reposent sur des modifications essentielles de la physiologie cellulaire, très bien décrites par Hanahan and Weinberg en 2000 puis en 2011 (Figure 17). Elles ne sont ni isolées des unes des autres, ni des évènements successifs. Elles peuvent interagir par des voies de signalisation, différentes molécules et mécanismes moléculaires. Cependant, ceci a été remis en question car le plus souvent l’environnement de la tumeur qui pourtant joue un rôle important dans les 3 étapes de la cancérogenèse n’est pas pris en compte. Les différentes propriétés des cellules tumorales sont présentées dans la Figure 17 et détaillées ci-dessous.

Figure 17 : Caractéristiques des cellules malignes d’après Hanahan and Weinberg (2011).

Indépendance vis-à-vis des signaux de prolifération

Les tissus normaux contrôlent la production et la libération des signaux de prolifération à travers le cycle de croissance et la division cellulaire assurant ainsi une homéostasie du nombre de cellules et le maintien de l'architecture tissulaire et de leur fonction. Ainsi une cellule normale nécessite des signaux mitogèniques de croissance pour se diviser. Ces signaux sont transmis à la cellule via des facteurs de croissances interagissant avec des récepteurs transmembranaires de type récepteur tyrosine kinase (Liang et al., 2013). Les cellules cancéreuses deviennent indépendantes vis-à-vis de cette signalisation proliférative. Elles produisent elles-mêmes des facteurs de croissance entrainant une réponse par l'intermédiaire d’une augmentation de l'expression de récepteurs apparentés, ce qui induit une stimulation de la prolifération autocrine. La voie de signalisation via les récepteurs peut être dérégulée par l’augmentation du nombre de récepteurs à la surface des cellules cancéreuses rendant celles-ci hyper-sensibles aux facteurs de croissance normalement limités. Elle peut être également activée par des altérations structurelles des récepteurs facilitant les interactions ligand-récepteurs (Evans et al., 2004a)

Insensibilité aux signaux antiprolifératifs

Dans les tissus normaux, de nombreux signaux antiprolifératifs conduisent au maintien de l’homéostasie et de la quiescence cellulaire. Les facteurs solubles inhibiteurs de croissance et

59 de prolifération sont régulés négativement dans les cellules tumorales et la plupart du temps, via la perte de fonction des gènes suppresseurs de tumeur. Les plus connus sont les gènes codant les protéines du rétinoblastome pRB et p53 qui sont impliquées dans la décision cellulaire à se diriger vers la prolifération ou à l’inverse vers la sénescence ou l’apoptose. La protéine p53 permet d’arrêter le cycle cellulaire en cas de dommage à l’ADN. La protéine pRB quant à elle va en fonction de sa phosphorylation induire ou stopper la croissance et la division cellulaire (Burkhart and Sage, 2008). La mutation de gènes suppresseurs de tumeur confère à la cellule cancéreuse la capacité d’échapper aux signaux antiprolifératifs. Ces cellules perdent ainsi l’inhibition de contact.

Résistance à l’apoptose

L’apoptose est un mécanisme de mort cellulaire programmé évitant à l’organisme d’accumuler des erreurs et ainsi de développer des pathologies telles que le cancer ou les maladies neuro- dégénératives (Sankari et al., 2012). Le programme de mort cellulaire est présent sous une forme latente dans tous les types cellulaires et peut être activé en réponse à la détection d’anomalies telles que les dommages à l’ADN, le déséquilibre de signalisation provoqué par l'action d’un oncogène, une insuffisance en facteurs de survie ou encore en cas d’hypoxie (Wilson et al., 2001). Plusieurs voies apoptotiques sont décrites impliquant ou non les mitochondries qui jouent un rôle central dans le processus apoptotique. La cellule se dirigera vers l’apoptose en fonction de la balance entre les facteurs anti-apoptotiques (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl- W) et pro-apoptotiques (Bax, Bak, Bid, Bim), tout en agissant en partie sous la gouvernance des signaux de mort mitochondriaux à travers la libération du cytochrome c.

La protéine suppresseur de tumeur p53 peut induire l’apoptose par l’induction de facteurs pro- apoptotiques en réponse aux dommages à l’ADN. Les cellules cancéreuses acquièrent une résistance à l’apoptose par la perte de cette fonction liée à une mutation du gène TP53. La voie PI3 kinase-AKT/PKB qui transmet des signaux anti-apoptotiques peut être également impliquée dans l’échappement à l’apoptose dans certaines tumeurs.

Prolifération illimitée (perte de la sénescence)

La sénescence est une réponse au stress bloquant la prolifération cellulaire. Considérée comme une barrière de l’expansion néoplasique, elle peut être induite par des anomalies variées associées à la prolifération incluant un haut niveau de signaux oncogéniques et un raccourcissement des télomères.

En effet, les cellules sénescentes sont incapables de proliférer, ce qui représente un frein à la progression tumorale. Une catégorie de suppresseurs de tumeurs (par exemple, p53, INK4A et ARF) sont activés par les signaux de stress, ce qui entraîne la sénescence. Leur perte ou l'inactivation est associée à une altération de la sénescence, déclenchant ainsi la progression tumorale (Collado and Serrano, 2010). Parfois, les tumeurs malignes peuvent être contraintes à la sénescence si les voies oncogéniques sont altérées ou si les voies suppressives de tumeurs sont restaurées (Wu et al., 2007)

Dans une cellule normale, le nombre de divisions cellulaires est limité en raison de la présence des télomères qui raccourcissent à chaque division. Devenu trop court au bout d’un certain nombre de divisions, les cellules rentreront en senescence. Les cellules cancéreuses restaurent à chaque division leurs fragments d’ADN télomériques détruits grâce à la télomérase permettant ainsi l’immortalité de ces cellules.

Capacité d’angiogenèse

Les tumeurs, comme tous les tissus, ont besoin de nutriments, d'oxygène et d’évacuer les déchets métaboliques et le dioxyde de carbone. Pour ce faire, le processus d’angiogenèse permet un nouveau système de vascularisation associé à la tumeur. Ce processus est normalement induit lors d’événements physiologiques mais au cours de la progression tumorale, l’angiogenèse est presque toujours activée provoquant une vascularisation qui aide à maintenir l'expansion des tumeurs néoplasiques (Hanahan and Folkman, 1996). Celle-ci est régie par des facteurs compensateurs qui induisent ou s'opposent à l'angiogenèse (Baeriswyl and Christofori, 2009). Par exemple, un inducteur et un inhibiteur de l'angiogenèse sont respectivement le facteur vasculaire de croissance endothélial A (VEGF-A) et la thrombospondine -1 (TSP-1).

Le gène codant le ligand VEGF-A est impliqué dans l’organisation de la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins. Ce VEGF interagit avec les récepteurs tyrosine kinases (VEGFR-1-3) et l'expression du gène VEGF peut être induite dans la situation d’hypoxie et lors de l’activation d’une voie de signalisation oncogénique (Ferrara, 2010). La tumeur est ainsi irriguée et peut se multiplier. L’angiogenèse tumorale n’est pas nécessairement une caractéristique de tumeur invasive mais peut être un événement précoce de la tumorogènèse (Raica et al., 2009).

Capacité d’invasion et de diffusion métastatique

La présence de métastases dans les organes vitaux est signe de mauvais pronostic car elle est responsable de 90 % des décès des patients atteints de cancer. En effet, le caractère invasif

61 des cellules tumorales reflète un stade avancé du cancer et son apparition peut être variable en fonction de l’organe atteint en premier lieu et du patient. Talmadge et Filder ont décrit en 2010 cette « cascade métastasique » en plusieurs étapes. Les changements biologiques commencent par une invasion locale des cellules dans le sang et des vaisseaux lymphatiques suivis par l'évasion des cellules cancéreuses à partir de la lumière de ces vaisseaux dans le parenchyme des tissus éloignés (extravasation), puis par la formation de petits nodules de cellules cancéreuses (les micrométastases), et enfin la croissance des micrométastases en tumeurs macroscopiques ; cette dernière étape étant appelée ''colonisation'' (Talmadge and Fidler, 2010).

La transformation métastasique est un phénomène complexe qui nécessite, entre autres, des changements morphologiques cellulaires étroitement liés à la matrice extra-cellulaire (MEC). Ce processus entraine une perte des propriétés épithéliales, comme l'adhérence cellule-cellule et la polarité baso-apicale, et un gain de propriétés mésenchymateuses. Ce changement de phénotype rapide et provisoire correspond à la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) impliquée dans les processus physiologiques et pathologiques tels que l’embryogenèse, la cicatrisation, la fibrose et le cancer (Nieto and Cano, 2012). Principales protéines de l’adhérence intercellulaire, les cadhérines sont des glycoprotéines transmembranaires qui jouent un rôle important dans cette transformation cellulaire. Ainsi, la perte d’expression de l’E-cadhérine est définie comme un événement précoce de la TEM. Celle-ci est régie par l’induction de facteurs de transcription embryonnaires tels que Twist 1, impliqué dans l’induction de l’expression de la N-cadhérine. De nombreux autres facteurs de transcription sont impliqués dans la TEM. Nous pouvons citer la famille Snail et les protéines ZEB1 et ZEB2, membres de la famille zinc-finger E-box-binding homeobox factor (ZEB) (Barrallo-Gimeno and Nieto, 2005; Chu et al., 2013). Il existe également des modifications épigénétiques qui peuvent modifier l’expression du gène codant la E-cadhérine (CDH1) (Prasad et al., 2008). Que ce soit au cours de l’embryogenèse ou de la progression tumorale, plusieurs voies de signalisation, incluant les voies receptor tyrosine kinase RTK, transforming growth factor TGF-β, Notch, Wnt, TGF-α, et les voies BMP, sont impliquées dans la TEM et représentées pour certaines dans la Figure 16 (Gavert and Ben- Ze'ev, 2008; Wang et al., 2013)

Figure 18 : Différentes voies de signalisation impliquées dans la TEM et l’invasion des cellules cancéreuses (Gavert and Ben-Ze'ev, 2008). Les voies de signalisation RTK, Wnt, TGF-b, NF-kB peuvent induire la TEM et les cancers invasifs par l'activation d'un groupe majeur de régulateurs de transcription comme les familles Snail, Slug, Twist et ZEB1, qui inhibent la transcription de l’E- cadhérine et contribuent à la destruction des jonctions entre cellules épithéliales et permettent ainsi la transition des cellules épithéliales en un phénotype plus instable et plus invasif.

En ce qui concerne le lien entre polluants environnementaux et migration cellulaire, l’implication d’un autre facteur de transcription tel que AhR régulant des gènes comme HEF-1 a été montrée suite à l’exposition de lignées cellulaires telles que HepG2 à la dioxine (Barouki and Coumoul, 2010).

Autres caractéristiques

» Dérégulation du métabolisme énergétique cellulaire

Le métabolisme spécifique de la cellule cancéreuse a été décrit par Otto Warburg en 1923 (Warburg et al., 1927). En effet, de par leur capacité à proliférer, les cellules cancéreuses doivent réajuster leur métabolisme énergétique dans le but de pouvoir croître et se diviser. Ainsi, au lieu de prendre leur énergie via la respiration cellulaire, elles l'obtiennent en dégradant du glucose de façon anaérobie. Cet effet « Warburg » a pour conséquence une consommation accrue de glucose par les tumeurs, propriété qui permet aujourd'hui de les visualiser en imagerie médicale, par tomographie à émission de positons (PET-scan) (Bensinger and Christofk, 2012). Longtemps mis de côté, cet effet est depuis quelques années réétudié, notamment pour mettre en place de nouvelles thérapies (Razungles et al., 2013; Masoudi-Nejad and Asgari, 2014).

» Echappement au contrôle immunitaire

La surveillance immunitaire cellulaire est un processus essentiel qui empêche la formation d'une tumeur de façon proactive dans le corps humain. Cependant, les cellules cancéreuse arrivent à échapper au contrôle du système immunitaire et ce en 3 étapes : élimination, équilibre et échappement. Le système immunitaire reconnaît et élimine les cellules cancéreuses. Ensuite vient l’équilibre où les cellules cancéreuses ne sont plus éliminées mais deviennent contrôlées par le système immunitaire. Enfin, les cellules tumorales non sensibles à la destruction immunitaire progressent vers la phase d'échappement (Teng et al., 2008).

» L’inflammation

L'inflammation chronique est associée à un risque élevé de cancer. Au niveau moléculaire, les aldéhydes et les radicaux libres, produits au cours de l'inflammation chronique, peuvent induire des mutations de gènes cibles et des modifications post-traductionnelles de protéines. D'autres produits de l'inflammation, comme les cytokines, les facteurs de croissance, ou des facteurs de transcription tels que le NFκB, contrôlent l'expression des gènes suppresseurs de tumeur, d’oncogènes et des enzymes inflammatoires clés tels que l'oxyde nitrique synthase et la cyclo- oxygénase 2 (COX-2). Ces enzymes à leur tour influencent directement la production d’ERO et le niveau des dérivés d’acides gras. Ainsi, l'inflammation chronique engendre les dommages à l'ADN, la synthèse de l'ADN, la prolifération cellulaire, l'interruption des voies de réparation d'ADN, l'inhibition de l'apoptose, et induit la promotion de l'angiogenèse et de l'invasion (Mantovani et al., 2008; Valavanidis et al., 2013).

Instabilité génétique

Les caractéristiques des cellules cancéreuses, que nous venons de décrire, reposent sur l’altération du génome en raison d’une grande instabilité génétique.

Certains facteurs génétiques héréditaires sont à l’origine de cancers. La présence de mutations dans les gènes de réparation de l’ADN, BRCA1 et BRCA2, conduit à une instabilité génomique responsable des cancers du sein. Dans ce cas, l’instabilité précède l’acquisition des autres caractéristiques des cellules cancéreuses.

En revanche, dans les cancers sporadiques, les études de séquençage à haut débit suggèrent que les gènes « gardiens du génome » ne sont pas souvent inactivés dans les étapes précoces du développement des cancers. Au contraire, la première caractéristique acquise dans les

64 cancers sporadiques pourrait être l’activation de facteurs de croissance en raison de mutations dans des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeur. La contrainte à la réplication de l'ADN qui est associée à l'activation d'oncogènes peut alors conduire à une instabilité génomique et la sélection de mutations de TP53, qui se traduit dans les cellules par un contournement de la mort cellulaire et de la sénescence. Dans tous les cas, le phénomène initial repose sur l’instabilité génomique de gènes impliqués dans la progression tumorale : les gènes suppresseurs de tumeur, les oncogènes et les gènes impliqués dans la réparation de l’ADN.

‹ Les oncogènes Un oncogène est par définition, un gène susceptible de devenir par modification qualitative ou quantitative un gène impliqué dans la transformation d’une cellule normale en cellule cancéreuse. Il en existe plusieurs familles, pour certaines déjà citées, et classées en fonction des protéines qu’elles codent : les facteurs de croissance (EGF), les récepteurs transmembranaires de facteurs de croissance (récepteur à l’EGF), les tyrosine-kinases membranaires, les G-protéines (famille ras), et les protéines à activité nucléaire (fos, jun, c- myc).

‹ Les gènes suppresseurs de tumeur

Les propriétés des gènes suppresseurs de tumeur ne peuvent être en théorie démontrées que lorsque la réintroduction du gène sauvage dans les cellules cancéreuses conduit à une réversion vers un phénotype « normal ». Ainsi, la plupart des gènes que l’on appelle communément gênes suppresseurs de tumeur, sont en réalité des anti-oncogènes dont la perte d’expression normale favorise l’oncogenèse. Les gènes TP53 et RB précédemment cités sont les gènes suppresseurs de tumeur les plus étudiés mais il en existe bien d’autres. Ils sont impliquées dans la progression ou l’arrêt du cycle cellulaire, la surveillance et le maintien de l’intégrité du génome, la protéolyse, l’apoptose, les contacts intercellulaires, la différenciation cellulaire, le modelage de la chromatine, la transcription, la transduction du signal et bien d’autres fonctions (Bignon and Urhammer, 2005).

‹ Les gènes impliqués dans la réparation de l’ADN Les mécanismes de réparation de l’ADN qui sont abordés brièvement plus loin, peuvent également être altérés par différents mécanismes et ainsi jouer un rôle dans l’oncogenèse.

B. Cancérogenèse chimique

L’acquisition de propriétés tumorales à la suite d’expositions à certains composés chimiques fait intervenir plusieurs mécanismes. Ceux-ci seront différents dès lors qu’il s’agit d’un produit génotoxique ou non. Les produits génotoxiques agissent sans concentration seuil alors que les produits non génotoxiques nécessitent généralement une exposition à long terme, souvent à des doses élevées (existence d’un seuil sans effet) (Osimitz et al., 2013). Les produits génotoxiques impliquent des lésions directes de l’ADN et les mécanismes des molécules non génotoxiques comprend des modifications épigénétiques, des réactions inflammatoires, la génération de stress oxydants et des perturbations endocriniennes. Cette distinction d’atteinte directe de l’ADN ou non n’est pas si évidente. La production d’ERO par exemple lors du métabolisme des xénobiotiques non génotoxiques peut avoir des conséquences génotoxiques indirectes. D’ailleurs, comme introduit en première partie d’introduction, il est à noter que certaines molécules deviennent seulement génotoxiques à la suite du métabolisme par la formation de métabolites électrophiles.

Si plusieurs enzymes peuvent médier la formation de métabolites potentiellement cancérogènes à partir de composés chimiques, les CYPS sont impliqués pour les 2/3 (Rendic and Guengerich, 2012). Par ailleurs, il faut souligner que les molécules génotoxiques seraient initiatrices de tumeur tandis que les molécules non génotoxiques favoriseraient surtout la promotion.

1. Les atteintes de l’ADN

Les lésions de l’ADN induites par les polluants environnementaux sont variées.

L’oxydation de bases se fait par la fixation du radical OH avec les bases puriques ou pyrimidiques. La plus connue est la transformation de la guanine en 8-oxo-7,8- dihydroxyguanosine, marqueur ubiquitaire du stress oxydant (Loft et al., 2008) La lésion du désoxyribose implique que le radical 0H° puisse arracher un atome d’hydrogène à chacun des 5 atomes de carbone du désoxyribose (Evans et al., 2004b) conduisant à des produits de dégradation (sucres modifiés) ou une cassure de la chaîne d’ADN ou une perte d’une base. Les adduits à l’ADN résultent d’une interaction entre un brin d’ADN nucléophile et un produit chimique qui serait électrophile. Il existe trois types d’adduits : d’alkylation, d’oxydation et des adduits volumineux. La formation de sites apyrimidiques ou apuriques intervient à la suite d’une hydrolyse par l’acide nitreux (Wilson and Barsky, 2001). Les cassures simples ou doubles brin résultent d’une rupture de la chaîne sucre-phosphate de l’ADN. L’intercalation

66 de grosses molécules comme l’actinomycine D peut provoquer un décalage du cadre de lecture lors de la transcription. Les pontages ADN-ADN proviennent d’une liaison covalente entre bases puriques et pyrimidines (inter-brins) ou entre deux bases de la même famille (intra-brins).

Les mutations géniques se caractérisent par des substitutions de paires de base, des décalages dans le cadre de lecture, des délétions, des duplications ou des insertions dans le génome. Il en découle la disparition ou l’altération de la fonction du gène muté.

Les mutations chromosomiques résultent des cassures de la double hélice d’ADN avec perte de chromosomes, des aberrations structurales, des réarrangements et des translocations chromosomiques.

2. Mécanismes de réparation de l’ADN

Les principaux systèmes de réparation, représenté Figure 19, sont la réparation par excision de base (BER), par excision de nucléotide (NER), par recombinaison homologue (HRR) et non homologue (NHEJ) et la réparation des mésappariements (MMR) (Casorelli et al., 2012).

Si les dommages à l’ADN sont trop importants, la cellule peut décider de se diriger vers l’apoptose. Par ailleurs, si les systèmes de réparation sont défaillants ou dépassés, il en résulte des altérations de l’ADN.

Figure 19 : Lésions de l’ADN et systèmes de réparation

3. Les mécanismes épigénétiques

La cancérogenèse chimique a longtemps été associée à la génotoxicité. Aujourd’hui il est établi que les modifications épigénétiques jouent un rôle clé dans la cancérogenèse chimique (Koturbash et al., 2011; Hou et al., 2012).

L’épigénétique correspond aux mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de l’expression des gènes sans altérer la séquence primaire de l’ADN. Transmissible, l’épigénétique joue un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques. Les trois mécanismes impliqués sont la méthylation de l’ADN, la modification des histones et le remodelage de la chromatine permettant ainsi l’organisation de celle-ci et la modification de l’expression des gènes codants et non codants (Figure 20). La méthylation peut être altérée de deux manières dans l‘étiologie du cancer et se traduire par une hypométhylation ou une hyperméthylation de la région promotrice de l’ADN. Les conséquences cellulaires potentielles de la perte globale de la méthylation de l’ADN sont diverses. Elles peuvent conduire à une instabilité chromosomique, des mutations génétiques et une activation de gènes liés au cancer. L’inactivation des gènes suppresseurs de tumeur résulte de la perte de la transcription par l’hyperméthylation de l’ADN. De cette même façon, le système de réparation de l’ADN peut être inactivé. L’acétylation et la méthylation des résidus de lysine sur l’amine terminal de l’histone 3 et 4 sont les modifications des histones les plus courantes induites pas les produits chimiques environnementaux (Hou et al., 2012). Les microARNs jouent un rôle clé dans la modification de la structure de la chromatine et participent au maintien de la stabilité du génome. Ils peuvent réguler divers processus physiologiques et pathologiques, tels que la croissance cellulaire, la différenciation, la prolifération, l'apoptose et le métabolisme (Backes et al., 2010).

Figure 20 : Mécanismes épigénétiques d’après Hou et al. (2012). Régulation transcriptionnelle au niveau épigénétique. Les mécanismes épigénétiques comme la méthylation de l'ADN, les modifications des histones et les microARNs régulent le compactage de la chromatine et l'expression des gènes. La méthylation de l'ADN sur des sites CpG supprime généralement l'expression des gènes. Les histones sont des protéines globulaires qui subissent des modifications post-traductionnnelles, telles que l'acéthylation, la méthylation et la phosphorylation, influençant ainsi la structure de la chromatine et l'expression des gènes. Les gènes actifs sont habituellement caractérisés par une faible méthylation de l'ADN et une configuration de la chromatine hautement acétylée qui permet l'accès aux facteurs de transcription. Les microARNs sont une série de petits ARN non-codant qui régulent négativement l'expression de gènes cibles au niveau post-traductionnel en se liant à des régions 3’ non traduite de l'ARNm cibles.

4. Le stress oxydant et inflammation

Stress oxydant et cancer vont de pair et de nombreuses publications traitent de ce sujet que ce soit via le métabolisme des xénobiotiques, une induction directe par certains polluants ou les propriétés intrinsèques des cellules cancéreuses.

La formation d’ERO lors du métabolisme des xénobiotiques a déjà été abordée en première partie d’introduction. De plus, certaines molécules capables d’induire les CYPs, peuvent

69 provoquer un stress du réticulum endoplasmique. Par ailleurs, la toxicité de nombreuses molécules implique non seulement la formation d’un stress oxydant mais également l’induction de cytokines et d’une réaction inflammatoire. Ainsi, la pollution atmosphérique (particules fines, fibres, fumée de cigarette, air urbain) serait responsable d’un stress oxydant à l’initiation de la synthèse de médiateurs de l’inflammation, elle-même initiatrice des mécanismes de cancérogenèse (Valavanidis et al., 2013).

Par ailleurs, en comparaison à une cellule « normale », la cellule cancéreuse possède elle- même un état général de stress exigé pour maintenir son état. Une récente revue synthétise l’implication du stress oxydant dans la cancérogenèse, à savoir l’atteinte de l’ADN, la prolifération cellulaire, le métabolisme énergétique, l’angiogenèse, l’implication du facteur nucléaire NrF2 (NF-E2-related factor 2), l’inflammation et les métastases (Sosa et al., 2013).

C. Classification du risque carcinogène des composés chimiques

Le degré de cancérogénicité de chaque molécule est difficile à établir, car parfois il s’agit d’un ensemble d’expositions qui conduit au cancer. Cependant, l’Union Européenne et le Centre International de Recherche contre le Cancer (CIRC) ont chacun établi une classification.

1. UE

Le classement établi par l’UE a une valeur réglementaire. Il implique un étiquetage de chaque substance ou mélange chimique. Actuellement, deux systèmes sont en place : celui faisant référence à l’actuelle législation communautaire et le nouveau, dit système CLP (Classification, Labelling and Packaging of substances and mixtures) mis en place depuis 2009 et visant à remplacer le premier d’ici 2015. A cette date, les mélanges de substances devront également être classés avec le système CLP décrit dans le tableau ci-dessous.

Tableau 2 : Classification des substances chimiques par l'UE

Système classique Nouveau système CLP Nombre d’agents

Catégorie 1 C1 : Catégorie 1A : 239 substances que l'on sait être cancérogènes pour l'homme. On dispose de suffisamment d'éléments pour établir l'existence d'une relation de cause à effet entre l'exposition de l'homme à de telles substances et l'apparition d'un cancer.

Catégorie 2 C2 : Catégorie 1B : 668

substances devant être assimilées à des substances cancérogènes pour l'homme. On dispose de suffisamment d'éléments pour justifier une forte présomption que l'exposition de l'homme à de telles substances peut provoquer un cancer.

Catégorie 3 C3 : Catégorie 2 : substances préoccupantes pour l'homme en raison d'effets cancérogènes possibles mais pour 176 lesquelles les informations disponibles ne permettent pas une évaluation satisfaisante (preuves insuffisantes). Il existe des informations issues d'études adéquates sur les animaux mais elles sont insuffisantes pour classer la substance dans la catégorie 2 (ou 1B selon CLP).

2. CIRC

Le CIRC, agence de l’OMS, établit un classement qui n’a pas de caractère réglementaire mais qui permet la classification des agents (chimiques, biologiques ou physiques), des situations d'exposition, de certains procédés industriels ou des circonstances d'exposition de la vie courante (Tableau 3). Celle-ci est établie par des commissions d'experts internationaux en cancérogenèse (http://monographs.iarc.fr/FR/Classification/).

Tableau 3 : Classification par le CIRC

Classification Nombre d’agents

Groupe 1 l'agent (ou le mélange) est cancérogène pour l'homme 113

Groupe 2A l'agent (ou le mélange) est probablement cancérogène pour l'homme 66

Groupe 2B l'agent (ou le mélange) est un cancérogène possible pour l'homme 285

Groupe 3 l'agent (ou le mélange) ne peut être classé du point de vue de sa 505 cancérogénicité pour l'homme

Groupe 4 l'agent (ou le mélange) est probablement non cancérogène pour l'homme. Ce 1 groupe ne contient qu'une seule substance

Il existe des disparités entre ces deux classifications. La 1ere possède un caractère réglementaire, figure dans le code du travail et implique l’étiquetage des substances chimiques. Tandis que la classification du CIRC permet de classé certaines situations d’exposition comme le tabagisme passif mais aussi les agents biologiques comme Helicobacter pylori. en classe I. De façon surprenante, la dioxine est également classée que par le CIRC dans cette classe. Un autre exemple de différence est reporté sur la classification du formaldéhyde, classé dans le groupe 1 par le CIRC et seulement dans la catégorie 2 par l’UE.

De façon générale, les classifications qu’elles soient établies par l’UE ou le CIRC reposent sur la littérature, l’épidémiologie et sur les tests de génotoxicité et sur les études de cancérogénèse sur animaux.

D. Les modèles utilisés pour la cancérogenèse chimique

1. Les tests de génotoxicité

Au moins deux tests in vitro, l'un bactérien et l'autre sur cellules de mammifères, sont nécessaires pour considérer une substance génotoxique.

Lorsque les produits sont destinés à une exposition humaine certaine (additif alimentaire, produit pharmaceutique), deux/trois tests in vitro et un in vivo sont obligatoires (Muller et al 1999).

1 : Un test pour l'induction de mutations génétiques dans les bactéries.

2 : Un test pour l'induction de mutations génétiques dans des cellules de mammifères notamment la recherche d’une mutation de la thymidine kinase (TK) dans les cellules d’un lymphome de souris ou celle de l’hypoxanthine phosphorybosyl transférase (HPRT) dans des cellules de hamster chinois.

3 : Un test pour l'induction d'aberrations chromosomiques dans des cellules de mammifères.

Pour répondre à ces exigences, il existe de nombreux tests de génotoxicité répondant à différentes lésions génotoxiques (Tableau 4).

Tableau 4 : Principaux tests de génotoxicité

(TK : thymidine kinase, HPRT : hypoxanthine phosphorybosyl transferase)

- Post-marquage au 32P - Echange de chromatides sœurs Lésions primaires - Synthèse non programmée d’ADN - Test des comètes

- Test d’Ames Mutations géniques - Test TK et HPRT

Mutation chromosomiques - Analyse des métaphases - Test du micronoyau (clastogènes et aneugène) - γH2Ax

Rapides, ces tests de génotoxicité révèlent facilement la capacité d’un produit chimique à générer des dommages à l’ADN. La plupart des composés mutagènes in vitro sont cancérogènes in vivo (Oliveira et al., 2007). D’autres molécules comme le benzène, l’uréthane et la procarbazine nécessitent une bioactivation par les CYPs qui n’est pas suffisamment reproduite par l’utilisation des fractions S9 de foie de rat comme additif métabolique aux lignées cellulaires (Muller et al., 1999).

2. Les tests in vitro de transformation cellulaire

Ce test est proposé en vue de remplacer les essais de cancérogenèse à long terme chez les rongeurs. Il rentre dans le cadre du concept mondial des trois R, c’est-à-dire, remplacement, réduction et raffinement, qui vise à réduire le nombre d’animaux utilisés en expérimentation animale. Les tests sur cellules embryonnaires d’hamster syrien (EHS) et de souris Babl/c et C3H/10T1/2 sont les plus couramment utilisés. L’utilisation des cellules EHS permettrait de déceler la cancérogenèse à un stade précoce, tandis que les essais sur cellules murines (Balb/c et C3H10) permettraient de déceler des changements tardifs. L’essai sur la lignée cellulaire murine C3H/10T1/2 ne sera pas abordé en raison des résultats non concluants (Vasseur and Lasne, 2012)

Test de transformation sur cellules EHS

Décrit par Berwald et Sachs en 1963, le test EHS est un système in vitro qui peut être utilisé pour tester le potentiel cancérogène d’agents biologiques, physiques et chimiques (Berwald and

Sachs, 1963). Par la suite des variations surtout relatives au pH ont permis d’améliorer sa spécificité et sa sensibilité (Maire et al., 2012). Ce test présente de nombreux avantages : les cellules seraient métaboliquement compétentes, génétiquement stables et les transformations spontanées sont rares. Il détecte à la fois les cancérogènes génotoxiques et non génotoxiques (Ahmadzai et al., 2012) .

La transformation des cellules EHS comprendrait les différentes étapes de la cancérogenèse chimique, à savoir la transformation morphologique, l'immortalité, et la progression maligne (Isfort and LeBoeuf, 1995). Le protocole reste court puis que le traitement dure 7 jours après la préparation de cultures de 3 jours (Maire et al., 2012). Bien qu’il devrait prochainement faire l’objet d’une directive de l’OCDE (Vasseur and Lasne, 2012), ce test présente certains inconvénients : il est d’origine animale; la biotransformation n’a pas clairement été démontrée (Farmer, 2002) et les critères d’évaluation peuvent parfois être subjectifs (Ahmadzai et al., 2012).

Test sur les cellules BALB/c 3T3

Le protocole de base de l’essai sur les cellules murines BALB/c 3T3 a été développé en 1973 (Kakunaga, 1973) puis repris par un groupe de travail du CIRC (IARC/NCI/EPA, 1985). Vingt- quatre heures après ensemencement, les cellules sont exposées pendant 48 à 72 h au produit. Par la suite, le milieu est renouvelé en absence de produit au cours des 5 semaines suivantes. Le résultat repose sur l’observation morphologique de foyers transformés : couches multiples denses de cellules, orientation des cellules, inhibition de contact, monocouche inhibée et la prépondérance de cellules en forme de fuseau sont ainsi les critères relevés. Malgré les critères subjectifs d’observation, la reproductibilité de ce test a été validée dans plusieurs laboratoires (Tanaka et al., 2012). C’est pourquoi des groupes d’experts de l’OCDE le recommanderaient pour en établir une ligne directrice (Vasseur and Lasne, 2012).

3. Les tests de cancérogenèse sur les rongeurs

Les tests de toxicité chronique et de cancérogenèse sont conduits sur deux espèces de mammifères, le rat et la souris. Ces tests font partie de la Ligne directrice 453 de l’OCDE adoptée initialement en 1981 et revisité en 2009. Chaque groupe pour des doses différentes sera composé de 50 animaux minimum et de chaque sexe. L’exposition sera relative à l’exposition humaine à savoir par voie orale, cutanée ou inhalation et ce pendant 2 ans (http://www.oecd-ilibrary.org).

Ces tests ont l’avantage de pourvoir détecter les produits cancérogènes à la fois génotoxiques ou non et de bénéficier des interactions complexes au niveau d’un organisme entier. Cependant, les tests chez les rongeurs sont fastidieux et coûteux, et exigent le sacrifice d'un grand nombre d'animaux (Benigni et al., 2013). La dose habituellement administrée (MDT : Maximum Tolerated Dose) est largement supérieure à la dose d’exposition humaine et peut manquer de relevance quant aux résultats (Osimitz et al., 2013). Par ailleurs le nombre de tumeurs spontanées chez la souris n’est pas négligeable et certaines tumeurs apparaissant chez le rongeur ne sont pas systématiquement transposables à l’homme. Comme nous avons pu le voir, les CYPs jouent un rôle important dans la bio-activation de certaines molécules. La différence inter-espèce dans ce cas n’est pas négligeable et a pour conséquence des faux positifs ou de faux négatifs.

4. Études de cancérogenèse chimique à long terme in vitro

Il existe très peu d’études d’induction de cancérogenèse chimique in vitro qui reposent sur des traitements chroniques car cela implique le maintien des cellules pendant plusieurs semaines et sur plusieurs passages et que celles-ci ne soient pas initialement transformées. Quelques équipes de recherche ont néanmoins abordé le sujet soit à la suite de traitements avec des génotoxiques avérés, comme le benzo[a]pyrène (Zhong et al., 2008), ou non tel que l’aluminium (Sappino et al., 2012) ou le bisphénol A (BPA) (Fernandez and Russo, 2010; Tarapore et al., 2014) ou encore avec des mélanges tels que l’extrait de fumée de cigarette (CSE) (Di Cello et al., 2013).

Tableau 5 : Principales étude de cancérogenèse in vitro

Augmentation Injection Produits Modèles Durée de Croissance de la Migration souris chimiques cellulaires l'exposition sur agar prolifération Nude

chambres Zhong et al. jusqu'à 100 après 56 de Boyden B[a]P HIOEC x 2008 passages passages (après 56 passages)

Sappino et 7 jours à 20 Aluminium MCF-10 x al. 2012 passages

Fernandez 14 jours en Chambres and Russo BPA MCF-10 x continu de Boyden 2010 seulement lignées Tarapore et jusqu'à 10 pour les BPA épithéliales al. 2014 passages lignées déjà de prostate transformées

Di Cello et de 20 à 72 CSE MCF-10 x transwell x al. 2013 semaines

Les conditions de traitements dans ces différentes études sont très différentes. Par exemple, la durée de traitement est de 14 jours en continu pour le BPA sur les cellules mammaires MCF10 initialement non transformées (Fernandez and Russo, 2010) ou sur 10 passages sur différentes lignées épithéliales de prostate (Tarapore et al., 2014) et jusqu’à des expositions sur plus de 100 passages au B(a)P sur des cellules épithéliales buccales humaines immortalisées (HIOEC).

L’aluminium et le CSE ont induit des modifications morphologiques de la lignée MCF10 tandis que le B(a)P, quant à lui, a induit une inhibition de contact visible entre les cellules HIOEC. Plusieurs caractères de transformation ont été analysés dans chacune de ces études, notamment la croissance sans support évaluée sur agar et la migration cellulaire étudiée soit en chambre de Boyden ou sur « transwell ». Les cellules MCF10 après des traitements sur 20 à 72 semaines au CSE ou dès 10 passages à l’aluminium ont montré un nombre significatif de colonies sur agar par rapport aux cellules jamais exposées. Les cellules épithéliales de prostate ont proliféré sur agar après un traitement long de BsA seulement lorsque les lignées étaient initialement transformées (Tarapore et al., 2014). Les cellules HIOEC traitées pendant plus de 56 passages, quant à elles, prolifèrent plus rapidement et migrent plus facilement à travers les

76 chambres de Boyden (Zhong et al., 2008). Cependant, cette dernière étude a été conduite sans comparaison avec cellules non traitées au même passage. Il est donc difficile d’incriminer ces nouvelles propriétés au B(a)P seul, étant donné l’instabilité génétique des lignées au cours du temps et qui plus est, après 56 à 96 passages. Certains se sont intéressés à l’expression protéique de p53 et l’ont trouvée soit augmentée à la suite de traitement à l’aluminium soit diminuée par le B(a)P. Certaines de ces études se sont conclues par des injections des cellules transformées chez des souris « Nude » afin d’observer l’apparition de nodules (CSE et B(a)P) tandis que d’autres ont observé des modifications épigénétiques par l’étude des méthylations de l’ADN (avec le BPA) (Fernandez and Russo, 2010).

Ces études apportent la preuve du concept qu’il est possible de transformer des lignées cellulaires immortalisées mais non cancéreuses. Il convient de noter qu’aucune étude sur la transformation néoplasique d’hépatocytes humains n’a été rapportée dans un modèle in vitro (Shiraha et al., 2013).

5. Recherche de biomarqueurs par les approches « omiques »

Grace à l’application de nouvelles technologies rassemblées sous le terme de « omiques » (transcriptomique, protéomique, métabolomique, épigénomique…), il maintenant possible d’établir des signatures d’exposition, d’effets précoces ou tardifs liés aux molécules cancérogènes. La recherche de biomarqueurs permettant une prédiction précoce des effets génotoxiques ou non génotoxiques seraient une alternative aux essais de 2 ans sur les rongeurs et permettrait aussi de mettre en évidence des gènes impliqués dans la carcinogénèse chimique.

Objectifs de la thèse

L’objectif général de notre projet était d’évaluer la toxicité de polluants environnementaux, à faible doses, à long terme et en mélange. Plus précisément il s’est agi de de déterminer s’il est possible d’évaluer les mécanismes impliqués dans la toxicité et/ou la cancérogénèse induites par ces molécules chimiques à long terme en utilisant des cultures de cellules hépatiques humaines. La lignée HepaRG qui exprime des fonctions proches des hépatocytes primaires en culture, représentait donc à priori un modèle cellulaire pertinent pour de telles études. Afin de répondre à ces objectifs mon travail de thèse s’est décliné en 3 parties :

(i) Tout d’abord, dans la mesure où nous souhaitions réaliser des études in vitro à long terme, il paraissait indispensable de compléter et confirmer les études relatives à la stabilité des cellules HepaRG différenciées au cours du temps à confluence. Aussi, une étude transcriptomique et une étude biocinétique de 4 molécules chimiques ont été effectuées sur une durée de 14 jours

(ii) Dans une seconde partie nous avons évalué l’influence de traitements aigus et répétés sur 14 jours de pesticides individuellement et en mélange binaire sur leur toxicité et avons recherché d’éventuelles interactions lorsqu’ils sont utilisés en mélange

(iii) Enfin, nous avons recherché si des contaminants génotoxiques après bioactivation pouvaient induire des propriétés caractéristiques d’une transformation cellulaire dans les cellules HepaRG après exposition à chaque passage.

Chapitre 1

Cellules HepaRG : évaluation fonctionnelle à confluence et stabilité au cours du temps

Si plusieurs études ont déjà montré que les cellules HepaRG conservent des fonctions différenciées à confluence pendant plusieurs semaines il nous est apparu important de compléter ces données par une analyse du transcriptome et de cinétiques de disparition des produits chimiques au cours du temps à confluence.

Cette étude s’est inscrite dans le cadre du projet européen Predict-IV qui avait pour but de développer des stratégies pour améliorer l'évaluation de l'innocuité des médicaments aux stades précoces de leur développement.

I. Evaluation de la stabilité des cellules HepaRG : étude transcriptomique

A. Article

L’analyse transcriptomique a permis d’évaluer la stabilité des cellules HepaRG à confluence sur une période de 14 jours ainsi que l’impact de trois médicaments agonistes PPARs : le fenofibrate, la troglitatozone et la rosiglitazone (Figure 21). Ce choix repose sur la connaissance de la pharmaco-toxicocinétique de ces molécules, notamment à 24 h.

Figure 21 : Formules chimiques des agonistes PPARs étudiés

Ces résultats font l’objet d’une publication qui sera prochainement soumise dans Toxicology In Vitro.

Camille C. Savary, Xiaoqi Jiang, Marc Aubry, Anette Kopp-Schneider, Philip Hewitt, André Guillouzo

Transcriptomic analysis of untreated and drug-treated differentiated

HepaRG cells over a 2-week period

Camille C. Savary1, 2, Xiaoqi Jiang3, Marc Aubry2,4, Rozenn Jossé1, 2, Annette Kopp-

Schneider3, Philip Hewitt5, André Guillouzo1,2,a.

1 Inserm U991, Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Rennes, France

2 Université de Rennes 1, France

3 Department of Biostatistics, German Cancer Research Center (DKFZ), Heidelberg,

Germany

4 CNRS UMR 6061 Genetic and Development, Rennes

5 Non-Clinical Safety, Merck Serono, Merck KGaA, Darmstadt, Germany.

Corresponding author:

Camille Savary

2 av Pr Léon Bernard, 35043 Rennes Cedex

[email protected]

Abstract

Previous works have shown that differentiated HepaRG cells can exhibit drug metabolism activities close to those of primary human hepatocytes for several weeks at confluence. The present study was designed to evaluate their long-term functional stability and their response to repeated daily drug treatments over a 14-day period, using a transcriptomics approach.

Our data show that less than 1% of the expressed genes were markedly deregulated over this period and mainly included down-regulation of genes related to the cell cycle during the two weeks and overexpression of genes involved in xenobiotic and lipid metabolism from 3 days. After daily treatment with the three PPAR agonists, fenofibrate, troglitazone and rosiglitazone qualitative and/or quantitative changes in gene profiling were observed depending on the compound and duration of treatment. The highest increase in the number of deregulated genes as a function of drug treatment was seen with rosiglitazone. The most up-regulated genes common across the three compounds were mainly related to lipid and xenobiotic metabolisms. All the data support the conclusion that human HepaRG cells have unique functional stability at confluence and that they are suitable for investigations on chronic effects of drugs and other chemicals.

Key words: HepaRG cells, Transcriptomics, PPAR agonists, Repeated treatments,

Time-dependent changes, gene profiling

Abbreviations:

CYP, cytochrome P450; DMSO, dimethyl sulfoxide ; FBS, fetal bovine serum; LFC, log2 fold change; PPAR, peroxisome proliferator-activated receptor.

Introduction

The liver is the most complex and metabolically active organ in the human body; it performs hundreds of essential functions but is also affected by multiple diseases. The marked hepatic functional differences existing between human and laboratory animals have led to a growing interest for in vitro human liver cell preparations for investigations on normal and diseased human liver (Guguen-Guillouzo and Guillouzo, 2010). Primary hepatocytes are the closest model to the liver in vivo (Guillouzo, 1998). However, they exhibit large inter-donor variability, as evidenced by analysis of basal and chemical-altered gene expression profiles in hepatocyte populations from multiple donors using transcriptomic approaches (Rogue et al.,

2012). Indeed, it appears that, whatever the test chemical, only a very small set of responsive genes is reproducibly altered among hepatocytes from multiple individual donors

(Goyak et al., 2008; Rogue et al., 2012).

Liver cell lines are potential alternatives to primary hepatocytes. However, many studies have emphasized the poor resemblance between primary normal hepatocytes and liver cell lines, including their transcriptome (Boess et al., 2003; Hart et al., 2010; Jennen et al., 2010;

Olsavsky et al., 2007). Nevertheless, there is presently one exception represented by the

HepaRG cell line that can differentiate from a bipotent progenitor state to attain features of normal adult hepatocytes in primary culture without losing the indefinite growth property of immortalized cell lines (Cerec et al., 2007; Guillouzo et al., 2007).

HepaRG cells have been shown to be a suitable in vitro cell model for studies on viral B infection and replication (Gripon et al., 2002) and xenobiotic metabolism and toxicity (Aninat et al., 2006; Antherieu et al., 2010; Antherieu et al., 2012). Recent studies have confirmed their resemblance to primary human hepatocytes by comparing their gene expression profiles either at the basal level or after chemical treatment using whole genome arrays,

suggesting that HepaRG cells could be representative of primary human hepatocyte populations (Lambert et al., 2009).

Contrary to other liver cell lines which continue to grow and consequently do not remain functionally stable, HepaRG cells cease to proliferate at confluence. Moreover, they do not form tumors in nude mice (Cerec et al., 2007). Importantly, HepaRG cells maintain their xenobiotic metabolism capacity, including their responsiveness to prototypical inducers, for several weeks at confluence (Antherieu et al., 2010; Josse et al., 2008). However, their global long-term stability at the transcriptome level has not been evaluated yet.

Within the 5-year EU framework PREDICT-IV, we performed a detailed comparative analysis of the transcriptome of HepaRG cells after 1, 3 and 14 days in basal and drug-treated conditions using Illumina microarrays. Three PPARs agonists, fenofibrate, troglitazone and rosiglitazone were used to evaluate drug-induced gene profiling changes related to repeated treatments. Our data show high reproducibility between different experiments, deregulation of few genes with time at confluence and some qualitative and quantitative changes in gene profiling depending on the PPAR agonist and the duration of treatment.

Material and methods

Reagents

Williams’ E medium was supplied by Eurobio (Les Ulis, France) and fetal bovine serum

(FBS) was from HyClone® (Thermo Fischer Scientific, Illkrich, France). Troglitazone and rosiglitazone were purchased from Calbiochem. Fenofibrate were from Sigma Aldrich (St.

Quentin Fallavier, France). All other chemicals were of the highest quality available.

HepaRG cell cultures

In the present study, HepaRG cells were first seeded at a density of 2.6 x 104 cells/cm2 in 6- well dishes in growth medium composed of Williams’ E medium supplemented with 10%

FBS, 2 mM glutamine, 100 units/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5x10-5 M hydrocortisone hemisuccinate. After two weeks of culture, they were shifted to the same culture medium supplemented with 2% dimethyl sulfoxide (DMSO) for two further weeks in order to reach maximum differentiation. At that time, differentiated HepaRG cell cultures were composed of both mature hepatocytes and primitive biliary epithelial cells (about 50% of each type) (Cerec et al., 2007). The cells were issued from the same cryopreserved cell stock (passage 10) and used at passage 12.

Drug treatments

Two days before treatment, differentiated HepaRG cells were shifted to a medium containing

2% serum and 1% DMSO. In this medium CYP activities are still maintained at sufficient levels and protein binding of test drugs is usually limited. This medium was renewed daily.

Cultures were treated with the PPAR alpha agonist fenofibrate, the two PPAR gamma agonists troglitazone and rosiglitazone or the vehicule (DMSO) every day for up to 14 days

(Fig 1). In preliminary experiments their cytotoxicity was assayed using the MTT test to select appropriate drug concentrations. A 10% toxic concentration (TC10) was determined for each drug after 14-day repeated exposure and was used for all experiments, i.e. 30, 70 and 100

µM for troglitazone, rosiglitazone and fenofibrate respectively.

RNA isolation.

HepaRG cells were used after 1, 3 and 14 days for transcriptomic analysis. Briefly, they were washed with phosphate buffered saline (PBS) 1X and harvested in lysis buffer (RLT buffer and β-mercaptoethanol). Total RNA was isolated using the RNeasy mini Kit (Qiagen, Venlo,

Netherlands). RNA quantity and purity were assessed with a Nanodrop ND-1000 5

spectrophotometer (Nyxor Biotech, Paris, France) and RNA integrity was checked on a

Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany).

Microarray hybridizations.

Gene expression analysis was performed using Illumina ® HT 12 v3 BeadChip arrays

(Illumina Inc.) allowing the analysis of ~48,000 transcripts. Synthesis of biotin-labelled cRNA was performed in an automated procedure using a Theonyx Liquid Performer (Aviso GmbH,) and MessageAmp™ II aRNA amplification Kit (Ambion) with several modifications (Zidek et al., 2007). Instead of column cleanup, the bead-based Agencourt® RNAclean™ system

(Beckman Coulter) was applied to purify cDNA and cRNA. cRNA quantity was measured spectrophotometrically (NanoDrop®) and the 2100 Agilent Bio-Analyzer was used for quality assessment. Amplified biotinylated cRNA (750 ng) was hybridized onto the Illumina®

BeadChip in a Hybridization Cartridge under humidified conditions for 20 h at 58 °C. The chips were then washed, stained for 10 min with 1 µg/ml streptavidin-conjugated Cy3

(Amersham Biosciences), and finally dried by centrifugation. Fluorescence detection was carried out by confocal laser scanning with the Illumina® BeadArray Reader (Illumina Inc) at

532 nm and 0.8 µm resolution. Illumina® BeadStudio Software was used for condensing raw data and further to ensure array quality based on different control bead parameters as described in a previous study (Boehme et al., 2009).

Data processing and statistical analysis

Differences in gene expression measurements between corresponding time-matched vehicle controls and drug treatment conditions were summarized for each feature as log2 fold change (LFC) value and associated p-value computed by application of the moderated

(unpaired) t-test (Smyth, 2004). The Benjamini-Hochberg multiple testing procedure

(Benjamini and Hochberg, 1995) was applied to correct p-values for multiple testing of features. The R package ‘limma’ (Smyth, 2005) was used for calculation. Differentially 6

expressed genes were selected with the adjusted p-value of 0.01 and LFC cutoff of 0.58 (fold change cutoff of 1.5). Genes with a LFC value larger than 0.58 were regarded as up- regulated while genes with a LFC value smaller than -0.58 were regarded as down- regulated. For each time point, pathway hypotheses were generated using the Ingenuity

Pathway Analysis® v.7.0 software (IPA, Ingenuity System, CA). The names of all deregulated genes identified in the present study are given in the Supplemental Table 1.

Results

Inter-assays correlation coefficients

A total of 48,000 probes, corresponding to 25,000 annotated genes, were present on each array. Seven independent experiments, each containing 2 to 8 technical duplicates, were performed over a 3-year period using cells derived from the same frozen cell stock at passage 12. Transcriptomes of differentiated cells maintained for 1, 3 and 14 days at confluence were analyzed. Correlation coefficients were high, ranging from 0.98 to 0.99 for technical and biological replicates (data not shown). Using an arbitrary cut-off of 6 (on log2 data), the number of expressed genes varied between 12,791 and 13,536 and the lowest consistency did not fall below 88 % (Fig. 2A, B).

Venn diagrams were drawn on the common expressed genes in all experiments; at the 3 time points the number of expressed genes was very close representing 13,026, 13,027 and

13,040 with 12,536 in common after 1, 3 and 14 days respectively (Fig. 2C). Hierarchical clustering showed that day 3 was closer to day 14 than to day 1 (Fig. 2C). Accordingly, principal component analysis did not allow to separate the 3 time points (Fig 2D).

Differential gene expression with time at confluence

Differentially expressed genes of all the control samples are displayed in Figure 3. The total number of deregulated genes was 106; among them 54 were different between day 1 and day 3; 71 between day 1 and day 14 (34% up-regulated and 66% down-regulated) and 36 between day 3 and day 14 (Fig. 3A). Taking into account only modulated genes, hierarchical clustering showed that day 1 was closer to day 3 than to day 14 (Fig. 3B).

Three major functional pathways differed as a function of culture time, i.e. cell cycle, lipid metabolism and xenobiotic metabolism; between days 1 and 3 most deregulated genes, were down-regulated while between days 3 and 14 a set of up-regulated genes was identified in addition (Fig. 3C). Taking day 1 as a reference, most genes involved in cell cycle were down-regulated after 3 or 14 days (Fig. 3C; Supplemental Fig. 1A) while many of the up-regulated genes after 14 days were involved in lipid and xenobiotic metabolisms (Fig. 3C;

Supplemental Fig. 1B). Up-regulated genes related to lipid metabolism included THRSP,

APO2, 4 and 5, HSD17B13, CYP4A11 and those related to xenobiotic metabolism CYP2A6,

2C18, 2C19, 3A4. Among other up-regulated genes were genes related to inflammation and stress (CRP, TMPRSS6, CD3D, INHBE), innate immunity (SKAP1, LEAP2) and transport

(OSTalpha, SLC28A1, SLC7A9). The highest up- and down-regulated genes were THRSP

(1.67 LFC corresponding to 3.2-fold change) and CDC20 (-1 LFC corresponding to 0.5-fold change) respectively.

Influence of PPAR agonists on gene expression as a function of treatment duration

In order to take into account time-related changes in gene expression profiles in untreated cultures changes in gene transcripts induced by the three PPAR agonists after 1, 3 and 14 days of treatment were estimated by comparison with corresponding controls. Total and specific modulated genes are shown in Venn diagrams (Fig 4A). Thus, when considering the three time points a total of 99, 224 and 153 different genes with 20 genes in common was 8

modulated by fenofibrate, rosiglitazone and troglitazone (Fig. 4A), representing 47, 39 and

15 commonly deregulated genes after 1, 3 and 14 days of treatment to the three PPAR agonists respectively (Fig. 4C). Noticeably, more commonly deregulated genes were observed between the two PPARγ agonists troglitazone and rosiglitazone (44) than between these two PPARγ agonists and the PPARα agonist fenofibrate, representing 19 and 7 genes with troglitazone and rosiglitazone respectively (Fig. 4A). The number of up- and down- regulated genes was variable for each drug at the different time points (Fig. 4B,

Supplemental Table 2). The total number was higher on day 14 than on days 1-3 for fenofibrate and especially rosiglitazone (Fig. 4B, Supplemental Table 2).

Using the Ingenuity Pathway Analysis® software we found that the major “top networks” included lipid metabolism for the three compounds and in addition, drug metabolism for rosiglitazone and fenofibrate. The top “tox lists” included fatty acid metabolism, xenobiotic metabolism signaling, PXR/RXR activation at the three time points and in addition, LPS/IL1 mediated inhibition of RXR function at day 14 for rosiglitazone, FXR//RXR et PXR/RXR activation, LPS/IL1 mediated inhibition of RXR function at the three time points for troglitazone; fatty acid metabolism, PXR/RXR activation, LPS/IL1 mediated inhibition of RXR function, at the three time points for fenofibrate. Analysis of gene profiles changes induced by the three PPARs also showed that a number of modulated genes were related to lipid and xenobiotic metabolisms (Fig. 5).

Most deregulated genes by 100µM fenofibrate were up-regulated; they included genes involved in mitochondrial fatty acid oxidation and ketogenesis (CPT1A, HADHB, HADHB), peroxisomal β oxidation (ACOX1, PEX11A), microsomal ω oxidation (CYP4A11), fatty acid binding and activation (FABP4), regulation of lipoprotein lipase (ANGPTL4), associated with lipid droplets (PLINs) and transcriptional factors (KLF10, KLF11) as well as with glucose/glycerol metabolism (PDK4). Down-regulated genes were only 13, 17 and 20 after 1,

3 and 14 days of treatment; they included ADH4, GMNT and THRSP. Noteworthy, the number of deregulated genes increased only slightly between days 3 and 14 (81 versus 88); the main deregulated genes were found at the 3 time points and showed only limited variation, with the exception of THRSP which became repressed at day 3 and much more on day 14 (FLC: -2.6 versus -1.7).

The percentage of down-regulated genes with 70µM rosiglitazone and 30µM troglitazone was much higher than with fenofibrate, whatever the duration of treatment.

Various genes related to lipid metabolism including ANGPTL4, PLINs, PEX11A, DHRS9 and/or to xenobiotic metabolism (CYP3A4, UGT1A1) were also up-regulated with rosiglitazone including at day 14 and with troglitazone after 1-3 days of treatment. However, some major qualitative and quantitative differences were observed between the two glitazones. CYP1A1, CYP1B1 and CPT1 were up-regulated only by rosiglitazone, and CD36 only by troglitazone. GNMT and THRSP were down-regulated only by the latter. Several genes were down-regulated (PKLR, G6PC, ADH4) by the two glitazones. Noticeably; 15 out of the 16 genes found to be up-regulated by troglitazone at day 14; were already up- regulated after 1 and/or 3 days. FABP4, the most overexpressed gene with fenofibrate was also the most overexpressed gene with troglitazone at the three time points as well as with rosiglitazone at 14 days, change being detected only at a p value >0.01 at days 1 and 3 with the latter (Fig. 5, supplemental table 2).

Discussion

Although several studies have already dealt with transcriptomic analysis of HepaRG cells, either in the absence or after treatment with various drugs, all have been limited to a period not exceeding a few days (Hart et al., 2010; Lambert et al., 2009; Rogue et al., 2012). The present study showed that only few genes were deregulated in differentiated HepaRG cells for 2 weeks at confluence and that both qualitative and quantitative changes in gene 10

expression were observed between the three PPAR agonists and for each of them, as a function of treatment duration.

The use of 1% DMSO and 2% serum was a compromise allowing daily drug treatments, long-term maintenance of sufficient activity levels of the CYPs, which are known to be sensitive to DMSO. The presence of 2% serum corresponding to 0.8-0.9 mg/mL albumin can result in binding of drugs to proteins (Kramer et al., 2012). However, biokinetics analysis of several drugs has shown only limited delay, if any, in their metabolism as observed with chlorpromazine (Broaders et al., 2014).

As found with Agilent microarrays (Rogue et al., 2012), the total number of expressed genes was very close from one experiment to another, using Illumina microarrays. The number of commonly expressed genes identified with the latter was slightly higher, i.e.12,536, n=7 versus 11,691, n=2; this could be explained by the presence of genes encoding miRNA and

LOC on Illumina arrays and/or the choice of different cut-off signals. Some probes can also be absent in either microarray, as for example UGT1A1 that was not found in the Agilent microarrays (Rogue et al., 2012).

The total number of deregulated genes with time in culture was very limited. Indeed, only 106 genes were found to be deregulated after 3 or 14 days, representing less than 1% of the total number of expressed genes. Such limited changes based on 7 independent experiments over a 3-year period bring further support to the high functional stability of the HepaRG cell line at confluence and to the strong inter-assay reproducibility of the data obtained with this cell line.

Importantly, most deregulated genes between days 1 and 3 were repressed and related to the cell cycle; they remained down-regulated thereafter. This could be explained by the absence of marked cell proliferation when the cells are differentiated and maintained at confluence. By contrast, most other deregulated genes between days 3 and 14 were 11

overexpressed and related to xenobiotic and lipid metabolisms in agreement with previous observations showing increase activity of several CYPs with time at confluence; e.g.

CYP3A4, CYP2C9 and CYP1A2 (Antherieu et al., 2010; Josse et al., 2008). This increase could be related to the presence of DMSO that is known to induce several major CYPs at high concentrations (Aninat et al., 2006).

Up to now, only short-term studies on drug-induced changes in gene profiling have been performed with HepaRG cells. In the current work we used three PPAR agonists, fenofibrate troglitazone and rosiglitazone, to evaluate the influence of repeated daily treatments. Since these compounds have already been investigated by the transcriptomics approach in

HepaRG cells and/ or primary human hepatocytes over a short period of time

(Rakhshandehroo et al., 2009) the results were used as references in the present study.

Although different experimental conditions (medium composition, different microarrays) were employed here, the major target metabolic pathways and many deregulated genes were similar to those identified in previous reports with the same PPAR agonists. After daily treatments for 14 days lipid and drug metabolisms remained the two main deregulated pathways, as previously observed after a short term exposure (Rogue et al., 2011). However, both qualitative and quantitative changes in gene profiling were associated with repeated treatments. Thus, the number of deregulated genes was marked increased with fenofibrate and especially rosiglitazone, and amplification of up- or down-regulation of some genes was seen with each of the three PPAR agonists after a 2-week daily treatment.

Many PPARα target genes were found to be deregulated by fenofibrate. They included many genes related to lipid metabolism as well as other genes such as vinn-2 that is linked to inflammation and oxidative stress. Plasma vanin activity levels have been found to be increased significantly by fenofibrate in human subjects with type 2 diabetes (van Diepen et al., 2014). Recently, a map of the PPARα transcription regulatory network has been

designed for primary human hepatocytes (McMullen et al., 2014). Noticeably many major

PPARα target genes were similarly found to be deregulated in HepaRG cells, such as

ACOX1, CPT1A, ANGPTL4, HMGC2, PLIN2 and SLC25A20. Our data are also in line with those reported in human hepatocytes treated with the PPARα agonist Wy14643

(Rakhshandehroo et al., 2009).

Treatments were glitazones also showed changes in gene profiling dependent on the compound and the duration of treatment. Thus, the high responsiveness of the CYP1 family to rosiglitazone after a short exposure (Rogue et al., 2011) was confirmed and shown to be maintained with repeated treatments. Noteworthy, as with fenofibrate, FAPB4 was the highest up-regulated gene observed with troglitazone at the three time points, while it was not modulated with rosiglitazone at days 1 and 3 (at a pv <0.01). However it also became the most deregulated gene with this compound at day 14. Similarly THRSP was the most or nearly the most repressed gene with fenofibrate and troglitazone while it was not modulated by rosiglitazone, except at 14 days. In addition, various qualitative and quantitative differences in gene expression levels were observed between the two glitazones in agreement with their quite different hepatotoxic potential. Interestingly, several genes previously reported to be modulated by the two glitazones in both primary human hepatocytes and HepaRG cells after a 24h treatment (Rogue et al., 2011) were also found to be altered in the present study, e.g. ANGPTL4, CD36, PLIN4 and POR. Surprisingly, the number of modulated genes by troglitazone was much lower after 14 days than 1-3 days (47 versus 87-102); however, 15 out the 16 up-regulated genes were also found to be overexpressed after 1-3 days. Comparison of several concentrations of the compound and some qPCR analyses that are usually more sensitive than microarrays, should allow to better understand in vitro long-term effects.

Time-dependent quantitative changes were usually modest; those of FABP4 appearing as the most prominent: indeed, its overexpression was markedly higher at day 3 and/ day 14 compared to day 1 with fenofibrate and troglitazone and its LFC reached 4.5 at day 14 versus no change at days 1-3 with rosiglitazone.

Another interesting observation was that many PPARα target genes, e.g. VNN1 and

UGT1A1 (Senekeo-Effenberger et al., 2007), were also modulated by PPARγ agonists,

In summary, our results show that changes in gene expression profiles in differentiated

HepaRG cells are limited over a 2 weeks period and that daily treatments with PPAR agonists lead to some qualitative and quantitative changes related to the agonist and the duration of treatment

Acknowledgments

This work was primarily supported by the European Union’s Seventh Framework Programme

(FP7/2007-2013), project Predict-IV, grant agreement 202222. We are grateful to Mrs

Claudia Klement for microarrays preparation.

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Figure legends

Figure 1: Schematic representation of the experimental design. Differentiated HepaRG cells were prepared as previously described (Cerec et al., 2007): after seeding at low density, they were allowed to proliferate and at confluence were shifted to a medium containing FBS and 2% DMSO for 2 weeks. At that time, the medium was changed with medium containing 2% FBS and 1% DMSO for daily exposure. After 2 days, experiments started: cells were exposed to PPAR agonists daily for 14 days. mRNAs were prepared after

1, 3 and 14 days.

Figure 2: Expressed genes in different experiments after 1, 3 and 14 days. Numbers of expressed genes in different experiments (A); Percentage of commonly expressed genes between experiments (B); Hierarchical clustering and Venn diagrams of expressed genes as a function of time at confluence taking into account all experiments (C); Principal component analysis representing all experiments (D).

Figure 3: Effects of culture time on gene expression in HepaRG cells. Number of differentially expressed genes between 1, 3 and 14 days (A). Heat map taking into account modulated genes (FC≥1.5, ≤-1.5 with pv≤0.01) (B). Heat map taking first day as a reference of modulated genes involved in cell cycle, lipid and drug metabolisms (C).

Figure 4: Effects of PPAR agonist exposure on HepaRG transcriptome after 1, 3 and 14 days. Venn diagrams depicting the differentially expressed genes between drugs; three days are grouped (A); Number of up and down-deregulated genes by each drug (B); Venn diagrams depicting the differentially expressed genes between 1, 3 and 14 days of exposure to fenofibrate, rosiglitazone and troglitazone (C).

Figure 5: Top networks affected as a function of time by PPAR agonists. These networks were identified by Ingenuity Pathway Analysis® software. The actual values (log 2

fold change) are shown as a heatmap, where red represents increased and green decreased expression respectively. Modulated genes, LFC>0.58 or <-0.58, pv<0.01 at least for 1 condition (days of treatment).

Figure 1

Start

D0 Proliferation Differentiation D28 D0 D1 D3 D14

10% FCS D 30 Daily treatment D14 2% DMSO

2% FCS 1% DMSO Figure 2

A C Ç

5 Day 1 5 5 Day 3

Day 14

B D1 1 100 94 94 91 93 92 92 2 96 100 95 92 95 93 94 3 93 92 100 92 93 93 94 4 95 94 96 100 96 97 96 5 95 94 96 93 100 95 96 6 91 90 93 92 93 100 94 7 93 92 95 92 94 96 100 D

D3 1 100 93 94 89 92 92 92 2 96 100 95 91 94 93 94 3 93 92 100 91 93 94 94 4 93 92 95 100 94 95 94 5 94 93 96 91 100 96 96 6 91 89 93 89 93 100 94 7 92 91 94 90 94 95 100

D14 1 100 93 96 90 95 94 94 2 95 100 97 90 95 93 94 3 94 93 100 88 94 92 93 4 94 91 93 100 93 95 93 5 96 95 97 91 100 95 96 6 92 90 92 90 92 100 94 7 94 92 94 90 94 95 100 Figure 3

ABD1 vs D1 vs D3 vs D1+D3 Day 1 D3 D14 D14 +D14 Day 3 54 71 36 106 Day 14

Lipid metabolism (22 genes)

Cell cycle (40 genes)

Xenobiotic metabolism (7 genes) Figure 4

C w Ç

Üt 5híb Üt 5híb Üt 5híb

C Fenofibrate Rosiglitazone Troglitazone Figure 5 Figure

Lipid metabolism

Cholesterol / bile Amino acid transport and Inflammation / ROS metabolism metabolism

Xenobiotique Carbohydrate metabolism metabolism Supplemental Figure 1 Day 1 vs day 3 Day 1 vs Day 14

A Cell cycle

B Lipid and xenobiotic metabolism

Supplemental Figure 1: Top networks affected as a function of time at confluence. These networks were identified by Ingenuity Pathway Analysis, and involved cell cycle (A), lipid and drug metabolisms (B). The intensity of the node color indicates the degree of up (red) or down (green) regulation in gene expression. Supplemental Tabl 1 : List of deregulated genes in HepaRG cells untreated and treated with fenofibrate, rosiglitazone and troglitazone: symbols and names Symbol Name Symbol Name AADAC arylacetamide deacetylase (esterase) CA12 carbonic anhydrase XII AASS aminoadipate-semialdehyde synthase CA5A carbonic anhydrase VA, mitochondrial ABAT 4-aminobutyrate aminotransferase CALML4 calmodulin-like 4 ABCA8 ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 8 CAPN5 calpain 5 ABCC2 ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 2 CBS cystathionine-beta-synthase ABCC6 ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 6 CCL13 chemokine (C-C motif) ligand 13 ABCC6P1 ATP-binding cassette, sub-family C, member 6 pseudogene 1 CCNA2 cyclin A2 ABI3BP ABI family, member 3 (NESH) binding protein CCNB1 cyclin B1 ABP1 amiloride binding protein 1 (amine oxidase (copper-containing)) CCNF cyclin F ACAA2 acetyl-CoA acyltransferase 2 CCT2 chaperonin containing TCP1, subunit 2 (beta) ACADM acyl-CoA dehydrogenase, C-4 to C-12 straight chain CD14 CD14 molecule ACLY ATP citrate lyase CD36 CD36 molecule (thrombospondin receptor) ACOX1 acyl-CoA oxidase 1, palmitoyl CD3D CD3d molecule, delta (CD3-TCR complex) ACSM5 acyl-CoA synthetase medium-chain family member 5 CD70 CD70 molecule ACSS2 acyl-CoA synthetase short-chain family member 2 CDC2 Cyclin-Dependent Kinase 1 ACY1 aminoacylase 1 CDC20 cell division cycle 20 homolog (S. cerevisiae) ADAM23 ADAM metallopeptidase domain 23 CDC20B cell division cycle 20 homolog B (S. cerevisiae) ADH1B alcohol dehydrogenase 1B (class I), beta polypeptide CDC25C cell division cycle 25 homolog C (S. pombe) ADH1C alcohol dehydrogenase 1C (class I), gamma polypeptide CDCA3 Cell Division Cycle Associated 3 ADH4 alcohol dehydrogenase 4 (class II), pi polypeptide CDCA5 Cell Division Cycle Associated 5 ADH6 alcohol dehydrogenase 6 (class V) CDCA8 Cell Division Cycle Associated 8 ADSSL1 adenylosuccinate synthase like 1 CDK20 cyclin-dependent kinase 20 AFM afamin CDKN3 cyclin-dependent kinase inhibitor 3 AGMO alkylglycerol monooxygenase CENPA centromere protein A AGXT2 alanine--glyoxylate aminotransferase 2 CENPF centromere protein F, 350/400kDa (mitosin) AKAP12 A kinase (PRKA) anchor protein 12 CEP55 centrosomal protein 55kDa AKR1B10 aldo-keto reductase family 1, member B10 (aldose reductase) CFB complement factor B AKR1B15 aldo-keto reductase family 1, member B15 CFH complement factor H AKR1D1 aldo-keto reductase family 1, member D1 (delta 4-3-ketosteroid-5-beta-reductase) CGN cingulin ALAS1 aminolevulinate, delta-, synthase 1 CIDEB cell death-inducing DFFA-like effector b ALDH3A2 aldehyde dehydrogenase 3 family, member A2 CIDEC cell death-inducing DFFA-like effector c ALDH8A1 aldehyde dehydrogenase 8 family, member A1 CKAP2L cytoskeleton associated protein 2-like ALDOB aldolase B, fructose-bisphosphate CKS2 CDC28 protein kinase regulatory subunit 2 ALPK2 alpha-kinase 2 CLRN3 clarin 3 ALPL alkaline phosphatase, liver/bone/kidney COL8A1 collagen, type VIII, alpha 1 ANG angiogenin, ribonuclease, RNase A family, 5 COX6A2 cytochrome c oxidase subunit VIa polypeptide 2 ANGPTL4 Angiopoietin-like 4 CP ceruloplasmin (ferroxidase) ANLN anillin, actin binding protein CPN1 carboxypeptidase N, polypeptide 1 ANXA10 annexin A10 CPS1 carbamoyl-phosphate synthase 1, mitochondrial APCS amyloid P component, serum CPT1A carnitine palmitoyltransferase 1A (liver) APOA2 apolipoprotein A-II CPT2 carnitine palmitoyltransferase 2 APOA4 apolipoprotein A-IV CREB3L3 cAMP responsive element binding protein 3-like 3 APOA5 apolipoprotein A-V CRP C-reactive protein, pentraxin-related AQP12A/AQP12B Aquaporin 12A/B CTGF connective tissue growth factor AQP9 aquaporin 9 CTH cystathionase (cystathionine gamma-lyase) ARG1 arginase, liver CYBASC3 cytochrome b561 family, member A3 ASGR2 asialoglycoprotein receptor 2 CYP1A1 cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1 ASPA aspartoacylase CYP1A2 cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 2 ASPDH aspartate dehydrogenase domain containing CYP1B1 cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1 ASPM asp (abnormal spindle) homolog, microcephaly associated (Drosophila) CYP2A6 cytochrome P450, family 2, subfamily A, polypeptide 6 ATF3 activating transcription factor 3 CYP2A7 cytochrome P450, family 2, subfamily A, polypeptide 7 ATP2B4 ATPase, Ca++ transporting, plasma membrane 4 CYP2B7P1 cytochrome P450, family 2, subfamily B, polypeptide 7 pseudogene 1 AURKA aurora kinase A CYP2C18 cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 18 AURKB aurora kinase B CYP2C19 cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 19 B4GALNT1 beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 1 CYP2C8 cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 8 BBOX1 butyrobetaine (), 2-oxoglutarate dioxygenase (-butyrobetaine hydroxylase) 1 CYP3A4 cytochrome P450, family 3, subfamily A, polypeptide 4 BCHE butyrylcholinesterase CYP3A43 cytochrome P450, family 3, subfamily A, polypeptide 43 BHLHB2 Class E basic helix-loop-helix protein 40 CYP4A11 cytochrome P450, family 4, subfamily A, polypeptide 11 BIRC5 baculoviral IAP repeat containing 5 CYP4A22 cytochrome P450, family 4, subfamily A, polypeptide 22 BMF Bcl2 modifying factor CYP4F2 cytochrome P450, family 4, subfamily F, polypeptide 2 BRSK1 BR serine/threonine kinase 1 CYP4X1 cytochrome P450, family 4, subfamily X, polypeptide 1 BTBD16 BTB (POZ) domain containing 16 CYP7A1 cytochrome P450, family 7, subfamily A, polypeptide 1 BTG1 B-cell translocation gene 1, anti-proliferative CYP8B1 cytochrome P450, family 8, subfamily B, polypeptide 1 BUB1 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog (yeast) CYR61 cysteine-rich, angiogenic inducer, 61 C10orf54 chromosome 10 open reading frame 54 DAK dihydroxyacetone kinase 2 homolog (S. cerevisiae) C10orf65 chromosome 10 open reading frame 65 DAO D-amino-acid oxidase C11orf24 chromosome 11 open reading frame 24 DCXR dicarbonyl/L-xylulose reductase C13orf15 chromosome 13 open reading frame 15 DDT D-dopachrome tautomerase C19orf12 chromosome 19 open reading frame 12 DDTL D-dopachrome tautomerase-like C3 complement component 3 DEFB1 defensin, beta 1 C4orf32 chromosome 4 open reading frame 32 DEPDC1 DEP domain containing 1 C6orf173 chromosome 6 open reading frame 173 DHRS9 dehydrogenase/reductase (SDR family) member 9 C7orf52 chromosome 7 open reading frame 52 DLGAP5 discs, large (Drosophila) homolog-associated protein 5 C8A complement component 8, alpha polypeptide DMGDH dimethylglycine dehydrogenase C8B complement component 8, beta polypeptide DNMT3L DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3-like C8G complement component 8, gamma polypeptide DPYS dihydropyrimidinase Symbol Name Symbol Name ECT2 epithelial cell transforming sequence 2 oncogene IARS isoleucyl-tRNA synthetase EGR1 early growth response 1 IGFBP1 insulin-like growth factor binding protein 1 ELOVL6 ELOVL fatty acid elongase 6 IGFBP2 insulin-like growth factor binding protein 2, 36kDa ENPP2 ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2 IL1R2 interleukin 1 receptor, type II ENTPD8 ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 8 IL22RA1 interleukin 22 receptor, alpha 1 ERP27 endoplasmic reticulum protein 27 IL8 interleukin 8 ESPN espin INHBE inhibin, beta E ESRRG estrogen-related receptor gamma INSIG1 insulin induced gene 1 ETFA electron-transfer-flavoprotein, alpha polypeptide IRAK2 interleukin-1 receptor-associated kinase 2 ETFDH electron-transferring-flavoprotein dehydrogenase IRF7 interferon regulatory factor 7 ETNK2 ethanolamine kinase 2 ISCA1 iron-sulfur cluster assembly 1 homolog (S. cerevisiae) F10 coagulation factor X ISG20 interferon stimulated exonuclease gene 20kDa F12 coagulation factor XII (Hageman factor) ITGA3 integrin, alpha 3 (antigen CD49C, alpha 3 subunit of VLA-3 receptor) F7 coagulation factor VII (serum prothrombin conversion accelerator) IYD iodotyrosine deiodinase FABP4 fatty acid binding protein 4, adipocyte KCNK13 potassium channel, subfamily K, member 13 FAH fumarylacetoacetate hydrolase (fumarylacetoacetase) KIAA1881 KIAA1881 FAM102A family with sequence similarity 102, member A KIF11 kinesin family member 11 FAM111A family with sequence similarity 111, member A KIF14 kinesin family member 14 FAM222A family with sequence similarity 222, member A KIF20A kinesin family member 20A FAM72D family with sequence similarity 72, member D KIF4A kinesin family member 4A FAM83D family with sequence similarity 83, member D KIFC1 kinesin family member C1 FETUB fetuin B KLF10 Kruppel-like factor 10 FGFR3 fibroblast growth factor receptor 3 KLF11 Kruppel-like factor 11 FLJ20021 uncharacterized LOC90024 KLKB1 kallikrein B, plasma (Fletcher factor) 1 FMO5 flavin containing monooxygenase 5 KMO kynurenine 3-monooxygenase (kynurenine 3-hydroxylase) FNDC5 fibronectin type III domain containing 5 LAMA4 laminin, alpha 4 FSTL1 follistatin-like 1 LBH limb bud and heart development homolog (mouse) FUOM fucose mutarotase LDHB lactate dehydrogenase B FXYD5 FXYD domain containing ion transport regulator 5 LDLR low density lipoprotein receptor FYN FYN oncogene related to SRC, FGR, YES LEAP2 liver expressed antimicrobial peptide 2 G0S2 G0/G1switch 2 LINGO4 leucine rich repeat and Ig domain containing 4 G6PC glucose-6-phosphatase, catalytic subunit LIPG lipase, endothelial GALT galactose-1-phosphate uridylyltransferase LOC100132673 uncharacterized LOC100132673 GAR1 GAR1 ribonucleoprotein homolog (yeast) LOC100133920 uncharacterized LOC100133920 GBA3 glucosidase, beta, acid 3 (cytosolic) LOC55908 uncharacterized LOC55908 GCAT glycine C-acetyltransferase LOC645313 uncharacterized LOC645313 GCGR glucagon receptor LPCAT3 lysophosphatidylcholine acyltransferase 3 GCHFR GTP cyclohydrolase I feedback regulator LPIN1 lipin 1 GCLM glutamate-cysteine ligase, modifier subunit LRRC31 leucine rich repeat containing 31 GDF15 growth differentiation factor 15 LRRC8A leucine rich repeat containing 8 family, member A GGT5 gamma-glutamyltransferase 5 LSS lanosterol synthase (2,3-oxidosqualene-lanosterol cyclase) GK glycerol kinase LY96 lymphocyte antigen 96 GNL3 guanine nucleotide binding protein-like 3 (nucleolar) LYRM1 LYR motif containing 1 GNMT glycine N-methyltransferase MAD2L1 MAD2 mitotic arrest deficient-like 1 (yeast) GPAM glycerol-3-phosphate acyltransferase, mitochondrial MAPRE3 microtubule-associated protein, RP/EB family, member 3 GPER1 G protein-coupled estrogen receptor 1 MASP2 mannan-binding lectin serine peptidase 2 GPR56 G protein-coupled receptor 56 MATN2 matrilin 2 GPT glutamic-pyruvate transaminase (alanine aminotransferase) MBL2 mannose-binding lectin (protein C) 2, soluble GPX2 glutathione peroxidase 2 (gastrointestinal) MCF2 MCF.2 cell line derived transforming sequence GRM3 glutamate receptor, metabotropic 3 MELK maternal embryonic leucine zipper kinase GSTT2/GSTT2B glutathione S-transferase theta 2B (gene/pseudogene) MERTK c-mer proto-oncogene tyrosine kinase GYPC glycophorin C (Gerbich blood group) MFSD2 major facilitator superfamily domain containing 2A hydroxyacyl-CoA dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA thiolase/enoyl-CoA hydratase (trifunctional protein), HADHA MFSD2A major facilitator superfamily domain containing 2A alpha subunit hydroxyacyl-CoA dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA thiolase/enoyl-CoA hydratase (trifunctional protein), HADHB MGP matrix Gla protein beta subunit HAGH hydroxyacylglutathione hydrolase MGST3 microsomal glutathione S-transferase 3 HFE2 hemochromatosis type 2 MID1IP1 MID1 interacting protein 1 HIST1H2BJ histone cluster 1, H2bj MIR1974 microRNA 1974 HIST1H2BJ/HIST1H2Bhistone cluster 1, H2bj / H2bk MLKL mixed lineage kinase domain-like HIST2H2BE histone cluster 2, H2be MMD monocyte to macrophage differentiation-associated HJURP Holliday junction recognition protein MOGAT3 monoacylglycerol O-acyltransferase 3 HLA-DRA major histocompatibility complex, class II, DR alpha MS4A10 membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 10 HMGB2 high mobility group box 2 MST1 macrophage stimulating 1 (hepatocyte growth factor-like) HMGCS1 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 1 (soluble) MTMR11 myotubularin related protein 11 HMGCS2 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2 (mitochondrial) MTSS1 metastasis suppressor 1 HMMR hyaluronan-mediated motility receptor (RHAMM) MUC13 mucin 13, cell surface associated HOGA1 4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase 1 MVK mevalonate kinase HPN hepsin MXD3 MAX dimerization protein 3 HPX hemopexin MYLK myosin light chain kinase HRG histidine-rich glycoprotein N4BP2L1 NEDD4 binding protein 2-like 1 HSD11B1 hydroxysteroid (11-beta) dehydrogenase 1 NCAPG non-SMC condensin I complex, subunit G HSD17B13 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 13 NDC80 NDC80 kinetochore complex component homolog (S. cerevisiae) HSD17B4 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 4 NDUFAF2 NADH dehydrogenase (ubiquinone) complex I, assembly factor 2 HSD17B6 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 6 homolog (mouse) NEK2 NIMA (never in mitosis gene a)-related kinase 2 HTR3A 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 3A, ionotropic NOX4 NADPH oxidase 4 IARS isoleucyl-tRNA synthetase NRP1 neuropilin 1 HTR3A 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 3A, ionotropic NT5E 5'-nucleotidase, ecto (CD73) Symbol Name Symbol Name NUSAP1 nucleolar and spindle associated protein 1 SKAP1 src kinase associated phosphoprotein 1 OASL 2'-5'-oligoadenylate synthetase-like SLC10A1 solute carrier family 10 (sodium/bile acid cotransporter family), member 1 OSTalpha organic solute transporter alpha SLC16A13 solute carrier family 16, member 13 (monocarboxylic acid transporter 13) OTC ornithine carbamoyltransferase SLC17A4 solute carrier family 17 (sodium phosphate), member 4 PANK1 pantothenate kinase 1 SLC22A1 solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 1 PBK PDZ binding kinase SLC22A10 solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 10 PCDH7 protocadherin 7 SLC22A11 solute carrier family 22 (organic anion/urate transporter), member 11 PCK1 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (soluble) SLC22A18AS solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 18 antisense PCK2 phosphoenolpyruvate carboxykinase 2 (mitochondrial) SLC22A5 solute carrier family 22 (organic cation/carnitine transporter), member 5 PCSK6 proprotein convertase subtilisin/kexin type 6 SLC22A7 solute carrier family 22 (organic anion transporter), member 7 PCSK9 proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 SLC22A9 solute carrier family 22 (organic anion transporter), member 9 PDK4 pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4 SLC25A20 solute carrier family 25 (carnitine/acylcarnitine translocase), member 20 PDZK1IP1 PDZK1 interacting protein 1 SLC25A26 solute carrier family 25 (S-adenosylmethionine carrier), member 26 PEG10 paternally expressed 10 SLC25A30 solute carrier family 25, member 30 PEMT phosphatidylethanolamine N-methyltransferase SLC25A34 solute carrier family 25, member 34 PEX11A peroxisomal biogenesis factor 11 alpha SLC27A2 solute carrier family 27 (fatty acid transporter), member 2 PFKFB1 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 1 SLC28A1 solute carrier family 28 (sodium-coupled nucleoside transporter), member 1 PHGDH phosphoglycerate dehydrogenase SLC29A4 solute carrier family 29 (nucleoside transporters), member 4 PHLDB2 pleckstrin homology-like domain, family B, member 2 SLC37A4 solute carrier family 37 (glucose-6-phosphate transporter), member 4 PI3 peptidase inhibitor 3, skin-derived SLC38A3 solute carrier family 38, member 3 PI4K2B phosphatidylinositol 4-kinase type 2 beta SLC51A solute carrier family 51, alpha subunit PKIB protein kinase (cAMP-dependent, catalytic) inhibitor beta SLC51B solute carrier family 51, beta subunit PKLR pyruvate kinase, liver and RBC SLC6A1 solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, GABA), member 1 solute carrier family 7 (glycoprotein-associated amino acid transporter light chain, bo,+ PLA1A phospholipase A1 member A SLC7A9 system), member 9 PLA2G12B phospholipase A2, group XIIB SLCO2A1 solute carrier organic anion transporter family, member 2A1 PLCXD1 phosphatidylinositol-specific phospholipase C, X domain containing 1 SOHLH2 spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix 2 PLCXD3 phosphatidylinositol-specific phospholipase C, X domain containing 3 SOX13 SRY (sex determining region Y)-box 13 PLG plasminogen SOX4 SRY (sex determining region Y)-box 4 PLIN perilipin SPARCL1 SPARC-like 1 (hevin) PLIN1 perilipin 1 SPC24 SPC24, NDC80 kinetochore complex component, homolog (S. cerevisiae) PLIN2 perilipin 2 SPINK1 serine peptidase inhibitor, Kazal type 1 PLIN4 perilipin 4 SPNS2 spinster homolog 2 (Drosophila) POLR1E polymerase (RNA) I polypeptide E, 53kDa SPP1 secreted phosphoprotein 1 PON1 paraoxonase 1 SPP2 secreted phosphoprotein 2, 24kDa POR P450 (cytochrome) oxidoreductase SQLE squalene epoxidase PPAP2A phosphatidic acid phosphatase type 2A SRPX sushi-repeat containing protein, X-linked PPIL6 peptidylprolyl isomerase (cyclophilin)-like 6 SRPX2 sushi-repeat containing protein, X-linked 2 PPP1R1A protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A SRXN1 sulfiredoxin 1 PPP1R3C protein phosphatase 1, regulatory subunit 3C ST6GAL1 ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 1 PRC1 protein regulator of cytokinesis 1 STC1 stanniocalcin 1 PRG4 proteoglycan 4 STK32A serine/threonine kinase 32A PROC protein C (inactivator of coagulation factors Va and VIIIa) STX3 syntaxin 3 PRODH proline dehydrogenase (oxidase) 1 SYT7 synaptotagmin VII PROZ protein Z, vitamin K-dependent plasma glycoprotein TACC3 transforming, acidic coiled-coil containing protein 3 PTPRE protein tyrosine phosphatase, receptor type, E TDO2 tryptophan 2,3-dioxygenase PTPRQ protein tyrosine phosphatase, receptor type, Q TGFBR2 transforming growth factor, beta receptor II (70/80kDa) PTTG1 pituitary tumor-transforming 1 THRSP thyroid hormone responsive PTTG3P pituitary tumor-transforming 3, pseudogene TM6SF2 transmembrane 6 superfamily member 2 RACGAP1 Rac GTPase activating protein 1 TMEM171 transmembrane protein 171 RAP1GAP RAP1 GTPase activating protein TMEM41A transmembrane protein 41A RASD1 RAS, dexamethasone-induced 1 TMEM86B transmembrane protein 86B RASD2 RASD family, member 2 TMPRSS6 transmembrane protease, serine 6 RDH5 retinol dehydrogenase 5 (11-cis/9-cis) TMSB15A thymosin beta 15a RIMS2 regulating synaptic membrane exocytosis 2 TNFRSF11B tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11b RINL Ras and Rab interactor-like TNFRSF21 tumor necrosis factor receptor superfamily, member 21 RNASE4 ribonuclease, RNase A family, 4 TOP2A topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa RNF125 ring finger protein 125, E3 ubiquitin protein ligase TP53INP2 tumor protein p53 inducible nuclear protein 2 RORA RAR-related orphan receptor A TPR translocated promoter region, nuclear basket protein RP11-381O7.3 uncharacterized LOC286297 TPX2 TPX2, microtubule-associated, homolog (Xenopus laevis) RP4-639F20.1 hCG2028352-like TRIB3 tribbles homolog 3 (Drosophila) RPL15 ribosomal protein L15 TRIM24 tripartite motif containing 24 RRM2 ribonucleotide reductase M2 TRIM38 tripartite motif containing 38 SAA4 serum amyloid A4, constitutive TRPM8 transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 8 SC5D SC5D TTK TTK protein kinase SCP2 sterol carrier protein 2 TUBB2A tubulin, beta 2A class IIa SDCBP2 syndecan binding protein (syntenin) 2 TXNIP thioredoxin interacting protein SERINC2 serine incorporator 2 UGT1A1 UDP glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide A1 SERPINA4 serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 4 UGT1A3 UDP glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide A3 SERPINE1 serpin peptidase inhibitor, clade E (nexin, plasminogen activator inhibitor type 1), member 1 UPB1 ureidopropionase, beta SERPINF1 serpin peptidase inhibitor, clade F (alpha-2 antiplasmin, pigment epithelium derived factor), member 1 VNN1 vanin 1 SERPINF2 serpin peptidase inhibitor, clade F (alpha-2 antiplasmin, pigment epithelium derived factor), member 2 VPS37D vacuolar protein sorting 37 homolog D (S. cerevisiae) SGK2 serum/glucocorticoid regulated kinase 2 WDR12 WD repeat domain 12 SH3BGRL2 SH3 domain binding glutamic acid-rich protein like 2 WDR72 WD repeat domain 72 SHD Src homology 2 domain containing transforming protein D ZNF385D zinc finger protein 385D Supplemental Table 2: Quantitative gene expression variations in HepaRG cells in response to PPAR agonists as a function of treatment duration (LFC ≤ -0.58, ≥ 0.58 : pv ≤ 0.01) Fenofibrate Rosiglitazone Troglitazone D1 D3 D14 D1 D3 D14 D1 D3 D14 FABP4 2.836 FABP4 3.7 FABP4 3.212 CYP1A1 3.962 CYP1A1 2.996 FABP4 4.582 FABP4 2.994 FABP4 4.468 FABP4 4.14 PLIN2 2.271 PDK4 2.422 PLIN4 2.055 CYP1B1 2.88 CYP1A2 2.632 CYP1A1 2.781 KIAA1881 1.764 DHRS9 2.126 KIAA1881 1.60 ANGPTL4 2.256 ANGPTL4 2.254 VNN1 2.05 CYP1A2 2.407 CYP1B1 2.076 DHRS9 2.741 CA12 1.578 KIAA1881 2.057 CYP2C19 1.57 PDK4 2.124 PLIN2 2.181 ANGPTL4 2.007 DHRS9 2.17 UGT1A1 1.835 PLIN4 2.252 SPP1 1.114 SPP1 1.792 SPP1 1.47 PLIN4 2.033 PLIN4 2.035 UGT1A1 1.936 PLIN2 1.911 RAP1GAP 1.305 CYP1A2 1.97 CYP3A4 1.091 APOA2 1.748 UGT1A1 1.41 CREB3L3 1.625 OASL 1.807 PLIN2 1.865 RAP1GAP 1.752 PDK4 1.301 GPR56 1.939 SGK2 1.071 CYP3A4 1.387 GPX2 1.18 OASL 1.457 HSD11B1 1.657 PDK4 1.746 GDF15 1.714 UGT1A3 1.236 CD36 1.892 FXYD5 1.027 UGT1A1 1.222 CD36 0.86 VNN1 1.326 UGT1A1 1.643 OASL 1.695 PLIN4 1.679 CYP3A4 1.154 UGT1A1 1.875 GPX2 0.989 CYP2C19 1.216 AKR1B15 0.85 KLF11 1.249 CYP4A11 1.568 HADHB 1.634 ANGPTL4 1.522 SLCO2A1 0.912 CYP1B1 1.695 PLIN2 0.931 LAMA4 1.118 MBL2 0.69 TXNIP 1.236 VNN1 1.537 CREB3L3 1.614 UGT1A1 1.481 PTPRE 0.873 SPINK1 1.675 UGT1A1 0.916 GPX2 1.069 VNN1 0.68 ATP2B4 1.161 HADHB 1.527 HSD11B1 1.512 PDK4 1.411 CPT1A 0.774 ANGPTL4 1.538 CIDEC 0.854 AKR1B15 1.067 LAMA4 0.66 UGT1A1 1.125 TXNIP 1.525 ACAA2 1.393 SERINC2 1.235 ATP2B4 0.759 HADHB 1.45 SRPX 0.847 CA12 0.975 HSD11B1 0.65 PEX11A 1.066 CYP4A22 1.48 AADAC 1.327 CYP3A4 1.197 ALAS1 0.747 LAMA4 1.361 CD14 0.833 B4GALNT1 0.93 GRM3 0.64 CPT1A 1.039 ACAA2 1.23 GALT 1.324 SRPX 1.167 GCLM 0.735 PDK4 1.355 POR 0.826 RAP1GAP 0.919 LY96 0.61 AADAC 0.995 PEX11A 1.186 CYP4A22 1.306 GCLM 1.163 PEX11A 0.713 RAP1GAP 1.349 OASL 0.735 CYP2C8 0.902 AADAC 0.61 C4orf32 0.993 C4orf32 1.165 CYP4A11 1.281 ATP2B4 1.157 AADAC 0.71 PTPRE 1.259 MGST3 0.726 CYP3A43 0.869 B4GALNT1 0.61 HADHB 0.971 KLF11 1.152 SLC25A34 1.247 SLCO2A1 1.119 PLIN1 0.695 RASD2 1.235 LAMA4 0.712 STK32A 0.813 SERPINA4 -0.62 PLIN1 0.952 IRF7 1.148 KLF11 1.224 POR 1.058 SLC25A30 0.622 RPL15 1.209 ANGPTL4 0.697 IRF7 0.81 LSS -0.62 POR 0.945 CYP4X1 1.142 HADHA 1.175 HTR3A 1.043 PPAP2A 0.586 ATP2B4 1.173 NRP1 0.679 PKIB 0.795 SLC6A1 -0.64 SLC27A2 0.941 BMF 1.136 IRF7 1.156 UGT1A3 0.993(includes others) -0.597 SLC25A26 1.119 VNN1 0.66 CD36 0.772 OTC -0.65 SLC25A20 0.929 CREB3L3 1.122 CPT1A 1.144 PLIN1 0.954 CFB -0.599 FXYD5 1.104 SRPX2 0.629 ASPA 0.765 INHBE -0.65 IRF7 0.907 CPT1A 1.106 PLA1A 1.107 SLC51B 0.936 NT5E -0.637 SRPX 1.076 B4GALNT1 0.608 SRPX 0.759 SERPINF1 -0.69 LRRC31 0.864 AADAC 1.062 PLIN1 1.091 PEX11A 0.933 DAK -0.641 PLIN2 1.071 PKIB 0.598 TXNIP 0.747 RASD1 -0.69 CYP4X1 0.856 PLA1A 1.057 LRRC31 1.07 SLC27A2 0.923 SOX13 -0.641 CPT1A 1.067 MUC13 0.592 MGST3 0.742 SLC10A1 -0.70 BMF 0.834 POR 0.995 ALPK2 1.052 ALAS1 0.9 2BJ/HIST1H2BK -0.642 PEX11A 1.024 HSD17B6 -0.584 CIDEC 0.722 ACLY -0.71 CPT2 0.787 SLC25A20 0.982 PEMT 1.025 IARS 0.887QP12A/AQP12B -0.683 UGT1A3 1.001 ELOVL6 -0.588 PEMT 0.713 FMO5 -0.72 HADHA 0.783 PEMT 0.964 SLC27A2 0.993 ABCC2 0.885 TM6SF2 -0.697 MBL2 0.991 SERPINF2 -0.592 SGK2 0.713 SLC38A3 -0.73 HMGCS2 0.745 CCL13 0.952 RP11-381O7.3 0.933 CPT1A 0.876 TP53INP2 -0.801 SERINC2 0.882 MGP -0.599 LY96 0.692 ADH4 -0.74 SLC16A13 0.733 LRRC31 0.952 TXNIP 0.925 SLC25A30 0.861 ALDH8A1 -0.817 FSTL1 0.875 CYBASC3 -0.601 RINL 0.689 AQP9 -0.74 SLC25A34 0.73 PLIN1 0.934 CYP4X1 0.909 PTPRE 0.839 CGN -0.819 GDF15 0.823 LSS -0.601 HSD11B1 0.669 MFSD2 -0.74 GALT 0.728 GALT 0.93 HMGCS2 0.899 LAMA4 0.829 TMEM86B -0.825 SLCO2A1 0.812 PHLDB2 -0.604 MBL2 0.667 G0S2 -0.76 CD14 0.727 LDHB 0.897 C4orf32 0.889 MLKL 0.808 TUBB2A -0.858 PLIN1 0.791 ANXA10 -0.607 POR 0.658 PCSK6 -0.78 C19orf12 0.726 HADHA 0.887 CCL13 0.876 SRXN1 0.793 ABCC6 -0.865 TNFRSF21 0.785 ANG -0.615 SLC22A11 0.654 BHLHB2 -0.80 ACAA2 0.724 CPT2 0.882 CD36 0.859 MBL2 0.784 GBA3 -0.866 SLC27A2 0.771 SPARCL1 -0.615 AADAC 0.651 TRIB3 -0.84 HSD11B1 0.721 GRM3 0.871 ACADM 0.825 TRPM8 0.772 PPP1R1A -0.892 SLC29A4 0.754 CALML4 -0.616 LDHB 0.649 MS4A10 -0.85 CYP4A22 0.714 ATP2B4 0.869 BMF 0.82 GYPC 0.734 RDH5 -0.893 GCLM 0.751 UPB1 -0.628 FXYD5 0.632 CYP2A7 -0.85 LPCAT3 0.693 SLC27A2 0.868 GK 0.82 SOHLH2 0.725 SPARCL1 -0.894 AADAC 0.742 DMGDH -0.629 CYP2B7P1 0.627 DAK -0.87 GRM3 0.68 ACADM 0.84 SH3BGRL2 0.802 CD70 0.71 ASPDH -0.908 CD70 0.736 CYR61 -0.638 ADAM23 0.617 C7orf52 -0.88 SH3BGRL2 0.67 HMGCS2 0.823 PANK1 0.801 MAPRE3 0.709 ERP27 -0.931 FLJ20021 0.697 PCK2 -0.659 CPT1A 0.615 ACSS2 -0.91 KCNK13 0.669 RP11-381O7.3 0.807 ETFDH 0.795 GNL3 0.686 CYP4F2 -0.933 GYPC 0.694 LPIN1 -0.66 ITGA3 0.606 SPP2 -1.09 ETFDH 0.664 FAM222A 0.805 GRM3 0.793 CCT2 0.685 F10 -0.933 ALAS1 0.687 ABCC6 -0.691 NRP1 0.602 ADH1C -1.09 MMD 0.663 ALPK2 0.784 LDHB 0.788 RASD2 0.682 DCXR -1.009 SOX4 0.656 GPAM -0.696 TRIM38 0.602 SYT7 -1.17 IRAK2 0.659 C19orf12 0.773 SLC25A20 0.761 TMEM171 0.674 HLA-DRA -1.014 VNN1 0.615 ABCC6P1 -0.708 AKR1B10 0.599 PKLR -1.20 ACADM 0.623 SLC25A34 0.763 POR 0.754 POLR1E 0.668 CPN1 -1.049 ALDH3A2 0.608 SLC17A4 -0.721 PLIN 0.597 HSD17B13 -1.34 OR7E14P 0.62 ETFDH 0.758 KLF10 0.727 STX3 0.665 AGXT2 -1.054 SLC22A5 0.602 DNMT3L -0.726 OASL 0.587 DEFB1 -1.37 LDHB 0.603 CYP2C8 0.732 PEX11A 0.702 FSTL1 0.65 IGFBP2 -1.093 MLKL 0.598 ALDOB -0.739 ERP27 -0.586 G6PC -1.39 KLF10 0.595 SLC16A13 0.732 LBH 0.696 AADAC 0.641 CDC20B -1.107 PPAP2A 0.582 CIDEB -0.745 C8G -0.59 THRSP -2.13 ACOX1 0.582 PANK1 0.73 ETFA 0.693 FAM102A 0.607 ABAT -1.205QP12A/AQP12B -0.598 PEG10 -0.759 TGFBR2 -0.591 ACSS2 -0.599 FAH 0.715 N4BP2L1 0.689 FXYD5 0.605 SLC22A7 -1.21 MOGAT3 -0.611 DPYS -0.771 AKAP12 -0.593 HOGA1 -0.691 PKIB 0.694 PCK1 0.687 WDR12 0.601 C8G -1.279 SLC22A9 -0.62 GBA3 -0.777 MCF2 -0.595 TMEM120A -0.691 LBH 0.691 PKIB 0.669 SLC22A5 0.596 AFM -1.337 BRSK1 -0.655 OTC -0.783 HPX -0.597 ETNK2 -0.706 CD14 0.671 CYP2C19 0.661 RINL 0.594 GPT -1.367 SOX13 -0.656 C10orf65 -0.794 CIDEB -0.615 ADH1C -0.741 SH3BGRL2 0.662 ZNF385D 0.656 ISCA1 0.593 C8A -1.41GSTT2/GSTT2B -0.657 COL8A1 -0.798 SERPINF2 -0.62 AGXT2 -0.751 CYP2C19 0.658 ATP2B4 0.638 PPIL6 0.59 INHBE -1.447 PI4K2B -0.668 CTGF -0.801 EGR1 -0.621 SLC10A1 -0.794 TNFRSF21 0.658 MERTK 0.636 GAR1 0.586 C8B -1.507 C11orf24 -0.671 SLC22A10 -0.803 SERPINA4 -0.637 FMO5 -0.839 LPCAT3 0.657 FAM222A 0.63 NDUFAF2 0.583 STC1 -1.525 PLA2G12B -0.688 SQLE -0.805 SPARCL1 -0.639 ALPL -0.841 SPNS2 0.634 TDO2 0.628 ESRRG -0.581 PKLR -1.585 COX6A2 -0.694 ERP27 -0.809 C8A -0.647 ADH4 -0.943 KLF10 0.628 TRIM24 0.624 CLRN3 -0.583 OTC -1.722 TMEM41A -0.702 ETNK2 -0.815 ALDOB -0.648 CYR61 -1.022 LYRM1 0.616 LYRM1 0.623GSTT2/GSTT2B -0.585 ALDOB -1.786 CGN -0.716 MVK -0.829 BHLHB2 -0.649 PRODH -1.029 CDK20 0.61 ACOX1 0.621 CAPN5 -0.591 G6PC -2.061 ACY1 -0.722 CYP4F2 -0.84 KLKB1 -0.649 GNMT -1.414 MMD 0.607 SGK2 0.621 CBS -0.595 CPS1 -2.115 CBS -0.724 AQP9 -0.854 C3 -0.657 KCNK13 0.603 LPCAT3 0.618 SERPINA4 -0.598 SPP2 -2.128 RORA -0.73 LDLR -0.863 CPN1 -0.666 Fenofibrate Rosiglitazone Troglitazone D1 D3 D14 D1 D3 D14 D1 D3 D14 ACOX1 0.597 SPNS2 0.61 MID1IP1 -0.603 ADH4 -2.336 KMO -0.735 AGXT2 -0.872 SLC22A10 -0.69 LAMA4 0.589LOC100133920 0.603 MATN2 -0.605 MID1IP1 -0.741 SLC22A1 -0.887 CALML4 -0.692 HOGA1 -0.643 TNFRSF21 0.599(includes others) -0.618 MTSS1 -0.751 TRIB3 -0.9 PI3 -0.707 MYLK -0.644 IRAK2 0.593 TP53INP2 -0.62 CYP2C18 -0.761 PCSK9 -0.907 SERPINF1 -0.722 ENPP2 -0.691 FAH 0.592 FGFR3 -0.632 PLCXD1 -0.761 SYT7 -0.921 CDC20B -0.726 TNFRSF11B -0.716 HSD17B4 0.587 SLC22A9 -0.634 FYN -0.772 G6PC -0.923 FMO5 -0.73 PTPRQ -0.75 GCAT -0.608 FAM111A -0.639 MTMR11 -0.772 ACSS2 -0.933 ANG -0.731 ETNK2 -0.813 AQP9 -0.625 IYD -0.641 ENTPD8 -0.776 FMO5 -0.94 CYR61 -0.755 FMO5 -0.827 ALPL -0.626 SHD -0.645 DDT -0.78 TNFRSF11B -0.967 ANXA10 -0.789 ALPL -0.858 AGXT2 -0.665 BTG1 -0.655 BTBD16 -0.788 HMGCS1 -1.012 SYT7 -0.789 C10orf54 -0.899 PLCXD3 -0.735 AGMO -0.657 SLC37A4 -0.796 PKLR -1.019 C8B -0.803 SLC10A1 -0.975 MYLK -0.777 VPS37D -0.659 TMEM86B -0.809 STC1 -1.019 IL1R2 -0.804 ABI3BP -1.028 MS4A10 -0.801 TM6SF2 -0.691 SERPINA4 -0.814 SLC38A3 -1.043 SLC10A1 -0.828 PRODH -1.029 INSIG1 -0.842BJ/HIST1H2BK -0.697 ABCA8 -0.82 SLC10A1 -1.056 ATF3 -0.829 MFSD2A -1.032 ABI3BP -0.851 GCHFR -0.701 MASP2 -0.833 INSIG1 -1.092 GGT5 -0.832 CYR61 -1.114 C10orf54 -0.873 BCHE -0.71 GCHFR -0.838 PRODH -1.113 PRODH -0.846 ADH4 -1.243 ETNK2 -0.93 MS4A10 -0.729 PROC -0.841 THRSP -1.144 IGFBP2 -0.865 GNMT -1.448 PRODH -0.941 MTSS1 -0.731 LRRC8A -0.847 RNASE4 -1.305 MFSD2 -0.895 THRSP -1.701 FMO5 -0.974 PLA2G12B -0.739 RP4-639F20.1 -0.85 ADH1B -1.333 OTC -0.901 G6PC -0.999 CGN -0.741 IYD -0.853 C13orf15 -1.375 PCSK6 -0.902 ADH4 -1.039 TUBB2A -0.742 MATN2 -0.855 ADH4 -1.433 GNMT -0.908 PKLR -1.043 KMO -0.753 NOX4 -0.878 GNMT -1.541 APCS -0.941 SLC10A1 -1.254 SOX13 -0.795 ST6GAL1 -0.883 PDZK1IP1 -0.944 GNMT -1.562 PPP1R1A -0.8 HLA-DRA -0.889 IGFBP1 -0.977 ADH1C -1.634 ABCC6 -0.804 CALML4 -0.896 HRG -0.982 THRSP -2.571 TPR -0.806 RNF125 -0.904 MGP -0.989 CPN1 -0.808 ABCC6 -0.922 PKLR -1.004 LIPG -0.809 HPN -0.925 SLC22A1 -1.064 PPP1R3C -0.822 CFB -0.927 TNFRSF11B -1.085 ALDH8A1 -0.823 PROZ -0.93 COL8A1 -1.087 DPYS -0.832 RIMS2 -0.961 IL8 -1.116 HAGH -0.843 CFH -0.97 ADH4 -1.139 GPT -0.849 PCK2 -0.977 THRSP -1.183 ST6GAL1 -0.851 SLC51A -0.982 RNASE4 -1.245 RDH5 -0.852 DPYS -0.995 SAA4 -1.248 ESPN -0.876 HAGH -0.997 C13orf15 -1.436 ABCC6P1 -0.879 ESPN -1 G6PC -1.463 SLC37A4 -0.879 ABCC6P1 -1.007 INHBE -1.503 SLC22A10 -0.885 ASGR2 -1.011 STC1 -1.602 GBA3 -0.907 SLC22A18AS -1.012 SPP2 -1.708 TMEM86B -0.914 TUBB2A -1.025 CDC20B -0.921 LEAP2 -1.027 CALML4 -0.954 NT5E -1.028 FYN -0.959 CTH -1.039 SC5D -0.992 FUOM -1.04 SLC38A3 -0.996 LIPG -1.052 GPER1 -1.01 F10 -1.061 ERP27 -1.017 SC5D -1.075 CYP4F2 -1.037 SHD -1.076 SLC22A7 -1.042 IL22RA1 -1.079 SYT7 -1.07 ISG20 -1.08 PLCXD1 -1.096 PPP1R1A -1.108 PON1 -1.115 DDTL -1.118 HFE2 -1.127 SKAP1 -1.127 ETNK2 -1.145 ALDH8A1 -1.129 CIDEB -1.172 CAPN5 -1.129 ANXA10 -1.192 CYP7A1 -1.132 WDR72 -1.213 PON1 -1.136 KLKB1 -1.239 PPP1R3C -1.167 FMO5 -1.269 SERPINF1 -1.177 CYP7A1 -1.27 INSIG1 -1.202 AGXT2 -1.31 CDC20B -1.203 Fenofibrate Rosiglitazone Troglitazone D1 D3 D14 D1 D3 D14 D1 D3 D14 SPARCL1 -1.345 TP53INP2 -1.205 AFM -1.395 PFKFB1 -1.206 AASS -1.412 PCSK6 -1.209 ADH6 -1.422 DAO -1.21 PKLR -1.458 STC1 -1.221 CTGF -1.516 IGFBP2 -1.228 ABAT -1.523 TPR -1.237 STC1 -1.674 CA5A -1.24 G6PC -2.039 PRG4 -1.277 ADH4 -2.077 DAK -1.282 TMPRSS6 -1.282 AASS -1.288 DCXR -1.323 ADH6 -1.327 MS4A10 -1.331 CPN1 -1.333 TRIB3 -1.34 ERP27 -1.355 INHBE -1.394 ANXA10 -1.415 SLC22A10 -1.419 TM6SF2 -1.433 MFSD2A -1.451 F7 -1.459 SLC38A3 -1.47 KLKB1 -1.503 GBA3 -1.516 ACSM5 -1.517 ASPDH -1.541 C8A -1.55 CYP4F2 -1.574 LINGO4 -1.578 SCP2 -1.588 C8B -1.598 F12 -1.62 SPARCL1 -1.66 APOA4 -1.725 SLC28A1 -1.765 ETNK2 -1.772 GPT -1.773 AGXT2 -1.777 FMO5 -1.807 HFE2 -1.837 ABAT -1.877 C8G -1.968 SLC22A7 -2.024 G0S2 -2.052 CIDEB -2.096 CYP2A6 -2.115 ALPL -2.118 SYT7 -2.171 CPS1 -2.189 OTC -2.516 SLC22A1 -2.778 CYP2A7 -2.78 SPP2 -2.848 ALDOB -3.309 ARG1 -3.464 PKLR -3.556 G6PC -3.573 THRSP -3.679 ADH4 -3.846

Chapitre 2

Effets des pesticides individuellement ou en mélange sur les cellules HepaRG après exposition aigüe ou répétée

L'impact sanitaire de l'exposition humaine à de faibles doses de mélanges de pesticides est très préoccupant. Les interactions entre plusieurs types de pesticides peuvent entraîner des réponses multiples en fonction de leur impact sur les enzymes du métabolisme des xénobiotiques, leur toxico-cinétique, et leurs cibles moléculaires et cellulaires. Il est donc indispensable d’étudier les effets toxiques des produits chimiques en mélange afin de comprendre leurs interactions dans les systèmes vivants et d’évaluer leurs risques potentiels au long cours. Deux études ont été réalisées sur cette importante question. La première porte sur la toxicité et la génotoxicité individuelle et en mélange de l’isomalathion et de son produit de dégradation l’isomalathion. La seconde étudie la toxicité de deux pesticides organochlorés, le méthoxychlore et l’endosulfan individuellement et en mélange après une exposition aiguë et répétée mais aussi l’impact sur les CYPs impliqués dans leur propre métabolisme.

I. Impact de l’isomalathion sur la cytotoxicité du malathion dans les cellules HepaRG.

A. Résumé de l’étude

L’isomalathion est une impureté majeure du malathion, insecticide largement utilisé, mais dont l’hépatotoxicité reste mal connue. Dans cette étude, la cytotoxicité et la génotoxicité du malathion et de l’isomalathion individuellement ou en mélange, ont été évaluées en utilisant la lignée cellulaire HepaRG métaboliquement compétente. L’isomalathion réduit la viabilité des cellules dès la concentration de 100 µM après une exposition de 24 h. Il induit de manière significative l'activité de la caspase-3 de façon dose dépendante à partir de 5 µM. A l’inverse, à des concentrations aussi élevées que 500 µM, le malathion affecte ni la viabilité cellulaire ni l’activité caspase-3. Par ailleurs, la co-exposition des deux composés a entraîné une diminution de la toxicité de l'isomalathion. En revanche, le malathion et isomalathion séparément ou en mélange induisent la formation de micronoyaux à de faibles concentrations et leur effets génotoxiques sont additifs lorsqu'ils sont en mélange à 25 µM. Individuellement ou en mélange l’activité de l’isomalathion inhibe directement les carboxylestérases qui sont impliquées dans la détoxication du malathion. Par ailleurs, les ARNm des CYP2B6 et CYP3A4, CYPs responsables

101 du métabolisme du malathion ont été fortement induits par le mélange tandis que l’isomalathion seul diminue modérément le CYP1A2 et augmente le CYP2B6. Cependant, l’activité et le niveau protéique de ces CYPs n'ont pas été modifiés. Au total, nos résultats montrent que l'isomalathion est beaucoup plus cytotoxique que le malathion alors que les deux composés ont des effets génotoxiques comparables dans les hépatocytes HepaRG à de faibles concentrations ; ils montrent également l’importance d’évaluer les risques sanitaires des pesticides et leurs interactions avec leurs impuretés.

B. Publication

Ces résultats sont publiés dans : Rozenn Josse, Ahmad Sharanek, Camille C. Savary, Andre Guillouzo. 2014. Impact of isomalathion on malathion cytotoxicity and genotoxicity in human HepaRG cells. Chemico- Biological Interactions. 209 : 68–76.

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Chemico-Biological Interactions 209 (2014) 68–76

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Chemico-Biological Interactions

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Impact of isomalathion on malathion cytotoxicity and genotoxicity in human HepaRG cells ⇑ Rozenn Josse 1, Ahmad Sharanek 1, Camille C. Savary, Andre Guillouzo

INSERM, UMR991, Liver Metabolisms and Cancer, Faculty of Pharmacy, Rennes, France University of Rennes1, Rennes, France article info a b s t r a c t

Article history: Isomalathion is a major impurity of technical grade malathion, one of the most abundantly applied insec- Received 2 August 2013 ticides; however little is known about its hepatotoxicity. In the present study, cytotoxicity and genotox- Received in revised form 20 November 2013 icity of malathion and isomalathion either individually or in combination, were assessed using the Accepted 4 December 2013 metabolically competent human liver HepaRG cell line. Isomalathion reduced cell viability starting at a Available online 12 December 2013 100 lM concentration after a 24 h exposure. It also signiﬁcantly induced caspase-3 activity in a dose- dependent manner starting at 5 lM. On the contrary, even at concentrations as high as 500 lM malathion Keywords: affected neither cell viability nor caspase-3 activity. Moreover, co-exposure of both compounds resulted Pesticides in decreased toxicity of isomalathion. By contrast, malathion and isomalathion either separately or in Mixture Low doses combination, slightly induced micronuclei formation at low concentrations and had additive genotoxic Human hepatocytes effects when combined at 25 lM. Individually or combined isomalathion directly inhibited activity of Micronucleus assay carboxyesterases which are involved in detoxication of malathion. In addition, transcripts of CYP2B6 and CYP3A4, two CYPs responsible for malathion phase I metabolism, were strongly induced by the mixture while isomalathion alone only moderately decreased CYP1A2 and increased CYP2B6 transcripts. However, these CYPs were not altered at the protein or activity levels. Taken altogether, our results showed that isomalathion was much more cytotoxic than malathion while both compounds had comparable genotoxic effects in HepaRG hepatocytes at low concentrations and brought further support to the importance of considering impurities and interactions during evaluation of health risks of pesticides. Ó 2013 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

1. Introduction extent, CYP2B6 at low malathion concentrations (<50 lM), whereas at high levels the role of CYP3A4 becomes relevant [4]. Extensive use of pesticides has caused both environmental and Alterations or individual variations in both CYP and CE activities public health concerns. Because of its low mammalian toxicity and could result in increased malaoxon formation, enhancing mala- high selectivity toward insects [1], malathion has become one of thion toxicity. Technical grade malathion (90–95%) contains sev- the most commonly used organophosphate insecticides for both eral impurities, such as isomalathion and various trimethyl domestic and commercial agricultural purposes; it has been em- phosphorothioate esters, formed during production and/or storage, ployed in malaria eradication programs in Africa and Central that can potentiate malathion-induced toxicity up to 10-fold [5,6]. America and in wide-scale pest-control in the United States. Expo- The presence of isomalathion, a toxic degradation product, in com- sure of workers who applied the insecticide or harvested the crops mercial formulations was implicated in the 1976 epidemic mala- was estimated to be 1–3 mg/kg/day and 1–270 lg/kg/day, respec- thion poisoning of 2800 spraymen (including ﬁve deaths) among tively which might give rise to a range of plasma concentrations 7500 ﬁeld workers, during the Pakistan malaria control program. between 0.03 and 80 lM [2]. Its rapid degradation by carboxyles- The greatest toxicity was observed with the formulation contain- terases (CEs) competes with the cytochrome P450 (CYP)-catalyzed ing the highest level of isomalathion [7]. Isomalathion has been formation of the toxic metabolite, malaoxon [3]. In human liver, found to inhibit CEs in a non-competitive manner, shifting the malaoxon formation is mainly catalyzed by CYP1A2 and, to a lesser metabolic pathway toward the bioactivation reaction [8–10]. How- ever, little is known about isomalathion toxicity. Malathion has been found to be genotoxic in several in vivo and ⇑ Corresponding author. Address: INSERM, U991, Faculté de Pharmacie, Univer- in vitro studies. However, data were usually obtained with the sité de Rennes 1, 2 Avenue L. Bernard, 35043 Rennes Cedex, France. Tel.: +33 02 23 technical grade and high doses of the compound [11,12]. No in- 23 47 91; fax: +33 02 23 23 53 85. crease in the frequency of micronucleated cells and no inhibition E-mail address: [email protected] (A. Guillouzo). 1 These authors contributed equally to this work. of proliferation in lymphocyte cultures from two cohorts of

0009-2797/$ - see front matter Ó 2013 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.cbi.2013.12.002 R. Josse et al. / Chemico-Biological Interactions 209 (2014) 68–76 69 applicators intermittently exposed to relatively low doses of mala- 2.3. Preparation of microsomal fractions thion were observed [13]. On occupational settings, pesticide applicators exposed to technical grade malathion and other insec- Human liver tissue samples were homogenized in 50 mM Tris– ticides were reported to exhibit higher levels of chromosome aber- HCl buffer (pH 7.4) containing 0.25 M sucrose and 1 mM EDTA. rations and sister chromatid exchanges [14]. Weak or negative Microsomal fractions were the sediment and supernatant, respec- results have been reported with pure-grade malathion [15]. tively, from the last of three successive centrifugations at 4 °C Noticeably, most genotoxic studies have been performed in the ab- (3000g, 10 min; 8000g, 20 min; and 30,000g, 60 min). sence of a bioactivation system. In the present study, mixtures containing both malathion and 2.4. Cell viability its major impurity, isomalathion, were used to better understand their toxic and genotoxic effects in the metabolically competent Cytotoxicity of malathion and isomalathion, was evaluated by human liver HepaRG cell line [16]. Since in vivo hepatic concentra- the MTT spectrometry assay [17]. Briefly, after treatment, medium tions are usually higher than circulating ones, malathion concen- was removed and serum-free medium containing MTT (0.5 mg/ml) trations around 50 lM could be easily achieved in exposed was added to each well and incubated for 2 h at 37 °C. After re- individuals, and therefore, a 50 lM maximal concentration was moval of the incubation solution, water-insoluble formazan was used in vitro to be representative of the in vivo situation. Moreover, dissolved in DMSO and absorbance was measured at 550 nm. Data the presence of isomalathion levels as high as 0.2% is documented were expressed as the mean of three independent experiments. in actual commercial formulations, and it is known that additional amounts can be formed during storage [6]. This study showed for 2.5. Caspase-3 activity the first time, the potent toxic and genotoxic effects of isomalathion in an in vitro metabolically competent cell model and high- After treatment with pesticides, differentiated HepaRG cells lighted the necessity to take into consideration the impurities were harvested and stored as pellets at À80 °C. After cell lysis, present in technical pesticide grade. 40 lg of protein was incubated with 80 lM Ac-DEVD-AMC in caspase-3 activity buffer (20 mM PIPES pH 7.2, 100 mM NaCl, 10 mM dithiotreitol, 1 mM EDTA, 0.1% CHAPS and 10% sucrose) at 37 °C for 2. Materials and methods 1 h. Caspase 3-mediated cleavage of Ac-DEVD-AMC peptide was continuously measured by spectrofluorimetry using excitation/ 2.1. Chemicals emission wavelengths of 380/440 nm [20].

Malathion, isomalathion, methylthiazoletetrazolium (MTT), 6b- 2.6. Evaluation of oxidative stress hydroxytestosterone, 16b-hydroxytestosterone and p-nitrophenyl acetate (PNPA) were purchased from Sigma (St. Quentin Fallavier, Cells were incubated for 2 h at 37 °C with 5 lM H2DCFDA; then 0 0 France). 2 ,7 -dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA) was from they were washed with cold phosphate buffered saline (PBS), and Invitrogen-Molecular Probe (Cergy-Pontoise, France). scraped in a solution containing an equal volume of potassium buffer (10 mM, pH 7.4) and methanol (v/v), supplemented with 0.1% Triton X-100. Fluorescence intensity of cell extracts was deter- 2.2. Cell cultures mined by spectrofluorimetry using excitation/emission wavelengths of 498/520 nm. HepaRG cells are derived from a human cholangiohepatocarci- noma; they are untransformed cells and were used before passage 2.7. Real time – quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) 18. Briefly, they were seeded at a density of 2.6 Â 104 cells/cm2 as analysis described previously [17,18]. They were first incubated in the Wil- liams’ E medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), Total RNA was extracted from HepaRG cells with the SV total 100 units/ml penicillin, 100 lg/ml streptomycin, 5 lg/ml insulin, RNA isolation system (Promega, Madison, WI). Five hundred nano- 2 mM glutamine, and 5 Â 10À7 M hydrocortisone hemisuccinate grams of total RNA were reversed–transcribed into cDNA using the for 2 weeks. Then, HepaRG cells were shifted to the same medium high-capacity cDNA archive kit (Applied Biosystems, Foster City, supplemented with 2% dimethylsulfoxide (DMSO) for two further CA). RT-qPCR was performed by the fluorescent dye SYBR green weeks in order to obtain confluent differentiated cultures with methodology using the SYBR green PCR master mix and the ABI maximum functional activities. At this time, these cultures con- Prism 7000 (Applied Biosystems). Primers pairs for each transcript tained hepatocyte-like and progenitors/primitive biliary-like cells are described in Table 1. Amplification curves were read with the at around 50% each [19]. The medium was renewed every 2 or ABI Prism 7000 SDS Software using the comparative cycle thresh- 3 days. During treatment, the cells were exposed to the compounds old method and the relative quantification of the steady-state in a medium supplemented by 2% FCS and 1% DMSO. mRNA levels was normalized against 18S RNA.

Table 1 List of primer sequences used in RT-qPCR.

Gene Name Forward primer Reverse primer CE1 Carboxylesterase 1 AGGTCCTGGGGAAGTATGCC TGCATCTTGGGAGCACATAGG CE2 Carboxylesterase 2 GGAGTGGTGTGAGAGATGCG CAGGTTAGAGCCCTCACGG CYP1A2 Cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 2 TGGAGACCTTCCGACACTCCT CGTTGTGTCCTTTGTTGTGC CYP2B6 Cytochrome P450, family 2, subfamily B, polypeptide 6 TTCCTACTGCTTCCGTCTATCAAA GTGCAGATTCCCACAGCTCA CYP3A4 Cytochrome P450, family 3, subfamily A, polypeptide 4 CTTCATCCAATGGACTGCATA TCCCAAGTATAACAGCACTCTACACAGAC HO1 Hemeoxygenase 1 ACTTTCAGAAGGGCCAGGT TTGTTGCGCTCAATCTCCT MnSOD Manganese superoxide dismutase GGGTTGGCTTGGTTTCAATA CTGATTTGGACAAGCAGCAA Nrf2 NF-E2-related factor 2 TCAGCATGCTACGTGATGAAG TTTGCTGCAGGGAGTATTCA 70 R. Josse et al. / Chemico-Biological Interactions 209 (2014) 68–76

2.8. Micronucleus assay were as follows: area less than one-third the main nucleus area, no overlap with the nucleus (distinct borders) and same aspect as the Genotoxic effects of malathion and isomalathion either individ- chromatin. Cells containing two to five and more than five micro- ually or combined, were evaluated by the micronucleus assay as nuclei were scored as multi-micronucleated and apoptotic cells, previously described [21]. Briefly, after 24 h of treatment with pes- respectively. Cytotoxicity was also evaluated by calculation of rel- ticides, followed by a 72 h epidermal growth factor (EGF) stimula- ative population doubling (RPD) as follows: RPD = 100 Â number tion corresponding to the recovery time, HepaRG cells were fixed of population doublings in treated cultures/number of population for 10 min in 4% paraformaldehyde at 4 °C and then permeabilized doublings in control cultures; where population doubling = [log for 45 min in 1X phosphate–buffered saline containing 10% donkey (post-treatment cell number)/initial cell number)]/log2. serum and 0.1% saponin. F-actin, a cytoskeletal component, was labelled with 1/400 phalloidin conjugated to sulforhodamine for 2.9. Determination of xenobiotic-metabolizing enzyme activities 20 min and nuclei were stained with 1/5000 Hoechst for 5 min. Images were taken with an upright microscope (Axioimager M1) For the determination of the effects of pesticides on CYP3A4-, and were a mosaic of six pictures per condition. All experiments CYP2B6- and CYP1A2-related activities HepaRG cells were incu- were performed in triplicate. Mono-micronucleated, multi-micro- bated with 200 lM testosterone for 2 h for CYP3A4 and CYP2B6 nucleated, apoptotic and mitotic cells were scored manually and analysis or with 200 lM phenacetin for 20 h for measurement of blindly with image tool software from micrographs obtained with CYP1A2 activity in phenol red-free medium deprived of both FCS a Axioimager microscope. Criteria used for identifying micronuclei and DMSO. Rifampicin at 50 lM and 3-methylcholanthrene at

A 120

100

80 * 60 * *

Cell survival (%) survival Cell 40 *

20 Malathion Isomalathion Mixture 0 0 100 200 300 400 500 Concentraon (µM)

UNT M, 200 μM

IM, 200 μM M + IM, 200 μM

Fig. 1. Cytotoxic effects of malathion (M), isomalathion (IM) and their mixture (M + IM) in HepaRG cells. (A) Cells were exposed to 200 mM M, IM or the mixture (M + IM) for 24 h. Cytotoxicity was assayed using the MTT assay. Results are expressed as % of the value found in control cells arbitrarily set at 100%. Data are means ± SD of three independent experiments. (B) Morphological changes after exposure of HepaRG cells to 0.2% DMSO (UNT), M, IM or their mixture (M + IM) for 24 h. R. Josse et al. / Chemico-Biological Interactions 209 (2014) 68–76 71

5 lM were used as positive controls and added to the cell cultures the mixture incubated without cells or without microsomes was for 48 h before incubation with the specific substrates. Culture substracted from that measured in the cells or microsomes respec- media were then collected and centrifuged for 2 min at tively to correct the activity level. Data are expressed relative to 10,000 rpm; 50 ll of sample was injected in the high-performance absorbance found in untreated cells arbitrarily set at 1. liquid chromatography system for quantification of the specific metabolites, 6b- and 16b-hydroxytestosterone and acetaminophen 2.10. Western blot analysis generated by CYP3A4, CYP2B6 and CYP1A2 respectively, resulting from 6b- and 16b-hydroxylation of testosterone and phenacetin HepaRG cells were treated for 48 h with malathion and isomal- deethylation activities, respectively. A nucleosil C18 column athion either individually or with various combinations, then they (150 Â 4.6 mm, 5 lm) was used for chromatographic separation were scrapped with CytoBuster Protein Extraction Reagent (Nova- of testosterone metabolites at 254 nm. The mobile phase consisted gen, USA) supplemented with 1X complete protease inhibitors and of two solvents, A (0.1% acetic acid) and B (acetonitrile), with the 1X Phosphatase Inhibitor (Roche, Mannheim, Germany). Twenty following gradient: 0 min, 20% B; and 20 min, 33% B. Chromato- micrograms of protein were separated by electrophoresis on 4– graphic separation of phenacetin metabolites was carried out with 12% gradient Bis–Tris gels (Invitrogen), transferred to Hybond an Interchrom C18 column (250 Â 4.0 mm, 5 lm) at 250 nm. The ECL nitrocellulose membranes (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, mobile phase consisted of two solvents, A (2 mM ammonium ace- Buckinghamshire, UK) and immunoblotted with antibodies against tate, pH 2.6) and B (acetonitrile) with a linear gradient (20 min, 3% CYP3A4 or CYP2B6 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) B). The high-performance liquid chromatography apparatus con- and heat shock cognate protein 70 (HSC70) (Tebu-bio, Le Perray en sisted of an Agilent 1100 Series high-performance liquid chromato- Yvelines, France). Blots were then incubated with appropriate sec- graph equipped with an autosampler and Agilent 1100 Series ondary antibodies, and protein bands were revealed by enhanced fluorescence and UV detectors (Agilent Technologies, Palo Alto, chemiluminescence in a Chemi-smart imager (Thermo Fisher Sci- CA). A computer running Agilent 1100 software (ChemStation) entific, Ilkirch, France). HSC70 was used to normalize protein load- was used to integrate and calculate the separated peak area and ings, and quantification was performed with BIO-1D software to plot metabolite patterns. Metabolites were identified by com- (Vilber Lourmat, Marne la Vallée, France). parison of retention times, and quantifications were estimated from calibration. 2.11. Statistical analysis Carboxylesterase activity was determined by measuring hydrolysis of PNPA, an esterase substrate, to p-nitrophenol in HepaRG The Mann–Whitney U test was applied to compare data be- cells and for comparison in human liver microsomes as previously tween treated cells and corresponding control cultures. For the described [22]. One, 4, 24 and 48 h after pesticide treatment, He- micronucleus assay, a chi-square one-tailed test associated with paRG cells were incubated with 5 mM PNPA in phenol red-free a Yates correction was performed. Data were considered signifi- medium deprived of both FCS and DMSO during 15 min. In micro- cantly different when p < 0.05. somes, after a 2-min preincubation at 37 °C with either pesticides or DMSO (vehicle) the reaction was initiated by addition of PNPA 3. Results 1 mM (final concentration) to 200 ll solution containing 100 mM K HPO buffer, pH 7.4, containing 5 mM MgCl and 20 g of micro- 2 4 2 l 3.1. Cytotoxicity of malathion and isomalathion individually and in somal proteins in 96 multi-well plates as final concentrations. combination Hydrolysis of PNPA to p-nitrophenol was determined spectrophotometrically by measuring increase in absorbance determined First, cytotoxicity induced by malathion (M), isomalathion (IM) at 405 nm, after a 15 min exposure. Because p-nitrophenol exists and an equimolar mixture (M + IM) was assessed in HepaRG cells as a contaminant in commercially available PNPA, its content in after a 24 h exposure to varying concentrations up to 500 lM using

Fig. 2. Pro-apoptotic effects of malathion (M), isomalathion (IM) and their mixture (M + IM) in HepaRG cells. Cells were exposed to 0.2% DMSO (UNT), M, IM, the mixture (M + IM) or 2 lM staurosporine (positive control of apoptosis induction) for 24 h. Apoptosis was assayed by measuring caspase-3 activation. Results are expressed as % of the value found in control cells arbitrarily set at 100%. Data are means ± SD of three independent experiments. ⁄p < 0.05 Compared to untreated cells. 72 R. Josse et al. / Chemico-Biological Interactions 209 (2014) 68–76 the MTT assay. Similar results were obtained with the ATP assay served but no effect was noticed on Nrf2 and MnSOD level (not shown). Malathion did not affect cell viability contrary to iso- expression after a 24 h exposure to either malathion or isomalathi- malathion which reduced cell viability at 100 lM(Fig. 1A). A de- on (Fig. 3B). crease in cell viability occurred with the (M + IM) mixture from 200 lM. Importantly, as evidenced by light microscopic examina- 3.2. Genotoxicity of malathion and isomalathion individually and in tion, morphological alterations of HepaRG cells were restricted to combination hepatocyte-like cells (Fig. 1B). No change in cell viability was observed in HepG2 cells using the same range of concentrations (data In order to evaluate malathion and isomalathion genotoxic ef- not shown). fects, the micronucleus assay was performed in HepaRG cells as Cytotoxic effects of isomalathion were confirmed by measuring previously described [21]. Two positive controls were used: caspase-3 activity. Isomalathion significantly induced caspase-3 MMS, a classical DNA damaging agent and AFB1, a metabolism- activity in a dose-dependent manner at concentrations that did requiring genotoxic compound (Table 2). At the tested concentra- not affect cell viability (Fig. 2). A slight production of ROS was ob- tions, none of the compounds alone or in combination induced tox- served after treatment with 50 lM isomalathion and the equimo- icity as shown by the calculation of the RPD. Both malathion and lar (M 25 + IM 25) mixture (Fig. 3A). In order to evaluate isomalathion slightly increased the number of mono-micronucle- modulation of the antioxidant system in response to the com- ated cells compared to untreated cells but this number did not vary pounds, mRNA expression levels of the transcription factor Nrf2, with concentrations up to 25 lM and no variation was observed in hemeoxygenase 1 (HO-1) and superoxide dismutase (MnSOD) the number of multi-micronucleated or apoptotic cells. Similarly, were measured. In parallel to the oxidative stress induced by iso- the number of mono-micronucleated cells induced by the malathion, a two-fold increase of HO-1 mRNA expression was ob- (M + IM) mixture was not significantly different from that induced

Fig. 3. Oxidative stress induced by malathion (M), isomalathion (IM) and their mixture (M + IM) in HepaRG cells. (A) Oxidative stress was assessed by ROS formation. Cells were exposed to 0.2% DMSO (UNT), M, IM or the mixture (M + IM) and 100 mM H2O2 (positive control) for 24 h. Data are means ± SD of three independent experiments. ⁄p < 0.05 vs. control cells. (B) Nrf2, HO-1 and MnSOD mRNA levels were estimated by RT-qPCR. Data were expressed relative to mRNA levels found in untreated cells arbitrarily set at 1. R. Josse et al. / Chemico-Biological Interactions 209 (2014) 68–76 73

Table 2 Numbers of mono-micro-nucleated, multi-micronucleated, apoptotic and metaphasic cells induced by malathion (M) and isomalathion (IM) separately or in combination (M + IM) in HepaRG cells after a 24 h exposure.

Compound (lM) Mono-micro-nucleated Multi-micro-nucleated Apoptotic Metaphasic RPD (%) UNT 7 ± 1 0.7 ± 1.2 1.7 ± 0.6 19.7 ± 5.7 100 AFB1 0.5 49 ± 2.6⁄⁄⁄ 11 ± 2.6 10 ± 4 28 ± 5.3 88.2 MMS 270 50 ± 4.4⁄⁄⁄ 9.3 ± 2.5 5.3 ± 2.1 33.7 ± 8.3 95.4 Malathion 10 17.7 ± 3.1⁄ 1 ± 0 2 ± 1 24 ± 6.2 99.7 25 17.3 ± 3.2⁄ 2.7 ± 2.1 3 ± 2.6 22.7 ± 4.5 100.2 50 21 ± 4.6⁄⁄ 0.7 ± 0.6 3.7 ± 1.2 22.7 ± 6.7 100.2 Isomalathion 0.05 13.7 ± 5.5 1.7 ± 1.5 2.7 ± 1.5 21.7 ± 3.1 99.6 5 11.3 ± 2.1 1 ± 1 1.3 ± 0.6 18.7 ± 1.2 100.6 10 16 ± 1.7 1 ± 1 1 ± 0 20.7 ± 7 99.8 25 17.7 ± 5.5⁄ 2.3 ± 2.5 2.3 ± 1.2 22.7 ± 6.4 99.7 50 26.7 ± 2.3⁄⁄⁄ 2 ± 1.0 1.3 ± 0.6 23.7 ± 5.7 100.5 Mixture M 25 + IM 0.05 15.3 ± 2.1 1 ± 1 2.3 ± 0.6 19.3 ± 3.8 99.6 M 25 + IM 5 15.7 ± 2.3 0.7 ± 0.6 2.7 ± 2.1 21.7 ± 5.7 99.5 M 10 + IM 10 18.7 ± 4⁄ 2 ± 1 3.3 ± 2.1 23 ± 7.8 99.6 M 25 + IM 25 27 ± 8.9⁄⁄⁄ 1.7 ± 0.6 2 ± 2 23.3 ± 4 100.3

Results are expressed as mean number per 1000 cells ± SD of three independent cultures. Chi-square test associated with a Yates correction: ⁄p < 0.05; ⁄⁄p < 0.01; ⁄⁄⁄p < 0.001 from untreated (UNT) cells. AFB1 (aflatoxin B1) and MMS (methyl methanesulfonate) were used as positive controls. RPD (relative population doubling) has been calculated. by either malathion or isomalathion, except for the equimolar (M [16]. Up to now, most of the literature concerns malathion toxicity 25 + IM 25) mixture which had additive effects compared to either and only few studies have been performed on human liver cells. compound at 25 lM. We found that malathion alone was much less cytotoxic than isomalathion and exerted cytotoxic effects at similar concentrations 3.3. Effect of malathion and isomalathion on their metabolic-required as in primary human hepatocytes [24]. It was also previously re- enzymes ported to significantly decrease cell viability in HepG2 cells after a 48 h exposure only at very high concentrations close to the insol- To better understand malathion and isomalathion effects in He- ubility, i.e. at 18 mM [25]. In agreement, we observed that mala- paRG cells, we analyzed gene expression and activities of the main thion and isomalathion did not cause any cell loss in HepG2 cells CYPs as well as the two detoxifying enzymes CE1 and CE2 (Figs. 4 when using the same range of concentrations as those used for He- and 5). Malathion alone did not modify expression of any of the paRG cells. These results support our previous data showing that main CYPs while isomalathion decreased CYP1A2 mRNA and in- HepaRG cells are much more sensitive to compounds requiring li- creased CYP2B6 mRNA. All the mixture ratios except the (M ver metabolism to exert their toxic effects than HepG2 cells that 25 + IM 0.05) ratio, strongly induced CYP2B6 and CYP3A4 expres- did not express most of the major cytochromes P450 [21,26]. sion (Fig. 4A). Despite a change in CYP expression levels caused Malathion concentrations used in the present study were rele- by isomalathion alone or in mixture, CYP activities and protein lev- vant to an human in vivo exposure [2]. Indeed, malathion concen- els were not altered (Fig. 4B–D). Nevertheless, neither alone nor in trations 650 lM could be very likely present in the blood of mixture did malathion or isomalathion modify the transcript levels exposed individuals. Even higher concentrations can be reached of the two CEs (CE1 and CE2) (Fig. 5A) except IM at 50 lM which in the liver, where most of malathion bioactivation takes place slightly down-regulated CE1 and CE2. However, isomalathion [27,28]. For agricultural workers, exposure to malathion was esti- was found to strongly inhibit CEs activity in HepaRG cells. As early mated to be 1–270 lg/kg/day [2], which may give rise to plasma as 1 h of pesticide treatment, this non-competitive inhibition was concentrations up to 80 lM, considering an almost complete nearly complete with 5 lM isomalathion and persisted after 48 h absorption. It has been reported that malathion induced complex (Fig. 5B–C). Malathion alone had no any modulatory effect on structural chromosomal aberrations in whole human blood cells CEs activity even at high concentration. In agreement, all the mix- in the presence of S9 mix [29]. In a review, Flessel et al. [11] con- ture ratios had the same inhibitory effect as isomalathion alone. cluded that technical grade malathion and malaoxon caused an in- Similar results were obtained with human liver microsomes crease in sister chromatid exchange frequency, indicating that this (Fig. 5D). pesticide, its impurities or metabolites, can affect DNA. Moreover, Noticeably, transcripts of other genes related to drug metabo- human lymphocytes exposed to malaoxon and isomalathion lism (UGT1A1, MRP2), the p53 pathway (p21, FDXR, BTG2) or pre- showed a positive comet assay from 25 and 75 lM, respectively. viously found to be deregulated by genotoxic compounds (FHIT, DNA damage induced by isomalathion was efficiently and quickly BCAS3, SMYD3) [23], were also measured; none of them was found repaired as soon as 15 min while malaoxon induced more persis- to be significantly deregulated after exposure to malathion and iso- tent DNA damage [15] but these data were obtained in the absence malathion individually or in combination (not shown). of a bioactivation system. To our knowledge, no report is available in the literature regarding the level of cytotoxicity and DNA dam- 4. Discussion age when human liver cells are exposed to a combination of both compounds. According to the degree of contamination of technical In the present study, we investigated the effects of malathion malathion by isomalathion, different toxic effects could be ex- and its impurity, isomalathion, individually or in combination, in pected. In the metabolically competent HepaRG liver cell model, HepaRG cells, an in vitro metabolically competent liver cell model malathion and isomalathion were able to slightly increase micro- 74 R. Josse et al. / Chemico-Biological Interactions 209 (2014) 68–76

A B 16 5 * CYP1A2 * * CYP2B6 CYP3A4 12 CYP2B6 ** * CYP3A4 4 8 * *

4 3 * 4 2 * mRNAfoldchange 2 1 CYP1A2 * * CYP2B6 0 CYPsacvies (Foldinducon) 0 CYP3A4 UNT IM 5 IM IM 5 IM M 10M 25M M 10 M 25 M 50 M IM 10 IM IM 25 IM IM 10 IM 25 IM 50 IM RIF 25 RIF IM 0.05IM IM 0.05 IM M 25 + IM 5 25 M M 25 + 25 IMM 5 M 10 + IM 10 10 M M 25 + IM 25 25 M M 10 + 10M IM 10 M 25 + 25M IM 25 M 25 + IM 0.05 25 M M 25 + 25 IMM 0.05

Malathion (µM) Isomalathion (µM) Mixture (µM) Malathion (µM) Isomalathion (µM) Mixture (µM) C D )noitcu 5 * M 25 M 25 UNT M 25 IM 25 IM 5 d 4 + IM 25 + IM 5 nidloF(ytivitca 3 CYP2B6

2 CYP3A4 1 HSC70

2A1PYC 0 I 5 I I 10 I 25 I UNT M 10M M 25M I 0.05I 3MC 0.53MC M 25 +5 25M I M +1010M I +2525M I M +250.05M I Malathion(µM) Isomalathion(µM) Mixture (µM)

Fig. 4. Effect of malathion (M), isomalathion (IM) and their mixture (M + IM) on expression and activities of CYPs involved in malathion metabolism. (A) CYP mRNAs were analyzed by RT-qPCR. HepaRG cells were exposed to 0.2% DMSO (UNT) or incubated with different concentrations of M, IM, or their mixture (M + IM) for 24 h. Results are expressed as fold of the value found in untreated cells arbitrarily set at 1. Data are means ± SD of three independent experiments. ⁄p < 0.05 Compared to untreated cells. Activity of CYP3A4, CYP2B6 (B) and CYP1A2 (C) and protein levels (D) after treatment of HepaRG cells with malathion (M), isomalathion (IM) and their mixture (M + IM). (B– C) Cells were exposed to 0.2% DMSO (UNT), M, IM, the mixture (M + IM) or positive controls [25 lM rifampicin (RIF) or 5 lM 3-methylcholanthrene (3MC)] for 48 h. CYP activities were determined directly into the cells as pmoles/min/mg protein. Data are expressed as fold induction of the value found in untreated cells arbitrarily set at 1; they are means ± SD of three independent experiments. ⁄p < 0.05 Compared to untreated cells. (D) Western blotting of CYP3A4 and CYP2B6 proteins after a 48 h exposure. nuclei at a concentration as low as 10 lM or less but no further in- [4], CYP1A2 > CYP2B6 > CYP3A4 play a pivotal role in malaoxon crease was evidenced with concentrations up to 25 lM and, in production while CE, mainly CE1 in liver, also detoxifies malathion. combination they showed a limited additive effect only at the equi- However, as previously reported [9] we found that isomalathion molar concentration of 25 lM. An in vivo study has also shown that inhibited CEs in human microsomes and similarly in HepaRG cells three common organosphosphate pesticides, i.e. malathion, chlor- in a non-competitive manner, suggesting that malathion in the pyrifos and methyl parathion, given in mixture to rats were not presence of isomalathion, might shift its metabolic pathway to- able to potentiate the toxicity of each other [30]. ward a bioactivation reaction and be more toxic [10]. Noticeably, In our study, the interaction between malathion and isomala- even at high concentration malathion did not alter CEs activity. thion was shown to be dependent on the endpoint measured and In addition, while malathion and isomalathion combination did their concentration. Noticeably, malathion antagonized cytotoxic not change CYP1A2 expression, it strongly induced expression of and apoptotic effects of isomalathion. A concentration-dependent CYP2B6 and CYP3A4 without any induction of corresponding pro- induction of caspase-3 activity by isomalathion was evidenced at tein or activity levels. In agreement, in a recent study using the He- concentrations that did not alter cell viability. To our knowledge, paRG cell line but in different treatment conditions, malathion was these results represent the first demonstration that isomalathion found to activate the nuclear receptor constitutive androstane is directly hepatotoxic. No synergistic toxic effects between mala- receptor (CAR) and some of its target genes, including CYP2B6 thion and isomalathion were observed, suggesting occurrence of a and CYP3A4, without induction of their corresponding activities more complex balance between the bioactivation and detoxica- [31]. Using bupropion as another specific CYP2B6 substrate, the tion/DNA repair pathways in a metabolically competent system same lack of induction was observed after malathion exposure such as the HepaRG cell line. In order to better understand the (data not shown). Presently, such differences between transcripts underlying toxic mechanisms, we focused on the effects of mala- and protein activities response remain unclear and require further thion and isomalathion on the phase I metabolism enzymes. For- investigation. mation of metabolites could be at least partially responsible for In conclusion, our findings show that although chemically sim- genotoxicity of the compounds in HepaRG cells as shown by using ilar, malathion and its impurity isomalathion, either individually or the micronucleus assay. As previously described by Buratti et al. in combination, might exert different toxic effects in the metabol- R. Josse et al. / Chemico-Biological Interactions 209 (2014) 68–76 75

A B 1.51,5 3 HepaRG cells – 24 h HepaRG cells – 1 h CES1CE 1 2 CES2CE 2 11,0 * * * * * * * * 1 * 0.50,5 mRNA fold change fold mRNA 0 0,00 CE acvity CE (Fold inducon) IM 5 IM M 25 M M 10 M 50 M IM 5 IM IM 25 IM 50 IM IM 10 IM M 25 M M 10 M 50 M IM 25 IM IM 50 IM IM 10 IM IM 0.05 IM IM 0.05 IM M 25 + IM 5 25 M M 25 + 5 IM 25 M M 10 + IM 10 10 M M 25 + IM 25 25 M M 10 + 10 IM 10 M 25 + IM 25 M M 25 + IM 0.05 25 M M 25 + 0.05 IM 25 M

Malathion (µM) Isomalathion (µM) Mixture (µM) Malathion (µM) Isomalathion (µM) Mixture (µM) C D

1.51,5 HepaRG cells – 48 h 1.21,2 Microsomes

11,0 inducon) inducon) * * * 0,6 * 0.6 * * * * * 0.50,5 * * *

0,0 00 0 acvity (Fold CE CE CE acvity CE (Fold IM 5 IM M25 M50 IM 5 IM M 10 M 25 M 50 M IM 10 IM IM 25 IM 50 IM IM 10 IM 50 IM IM 25 IM IM 0.05 IM IM 0.05 IM M 25 + 5 IM 25 M M 10 +10 IM 10 M M 25 + 25 IM 25 M M 25 + IM 25 25 + IM 25 M M 50 + 50 IM 50 M M 25 + IM 0.05 + IM 25 M M 25 + IM 0.05 0.05 + IM 25 M Malathion (µM) Isomalathion (µM) Mixture (µM) Malathion (µM) Isomalathion (µM) Mixture (µM)

Fig. 5. Effect of malathion (M), isomalathion (IM) and their mixture (M + IM) on expression and activities of CEs involved in malathion metabolism. (A) CE mRNAs were analyzed by RT-qPCR. HepaRG cells were exposed to 0.2% DMSO (UNT) or incubated with different concentrations of M, IM, or their mixture (M + IM) for 24 h. Results are expressed as fold of the value found in untreated cells arbitrarily set at 1. Data are means ± SD of three independent experiments. ⁄p < 0.05 Compared to untreated cells. CE activities in HepaRG cells after 1 (B) and 48 h (C) and in human liver microsomes (D) after treatment with malathion (M), isomalathion (IM) and their mixture (M + IM). Data are expressed as fold induction of the value found in untreated cells arbitrarily set at 1; they are means ± SD of three independent experiments. ⁄p < 0.05 Compared to untreated cells. ically competent HepaRG cells. We clearly evidence that isomala- [2] R.I. Krieger, T.M. Dinoff, Malathion deposition, metabolite clearance, and thion by itself induced caspase-3 activation and can be a DNA- cholinesterase status of date dusters and harvesters in California, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 38 (4) (2000) 546–553. damaging agent. The combination of malathion with isomalathion [3] L.G. Sultatos, Mammalian toxicology of organophosphorus pesticides, J. had additive effects on genotoxicity. However, isomalathion-in- Toxicol. Environ. Health 43 (3) (1994) 271–289. duced apoptosis was abolished by a co-exposure with malathion. [4] F.M. Buratti, A. D’Aniello, M.T. Volpe, A. Meneguz, E. Testai, Malathion bioactivation in the human liver: the contribution of different cytochrome This study highlights the importance of considering possible impu- p450 isoforms, Drug Metab. Dispos. 33 (3) (2005) 295–302. rities and interactions during evaluation of health risks of [5] G. Pellegrini, R. Santi, Potentiation of toxicity of organophosphorus compounds pesticides. containing carboxylic ester functions toward warm-blooded animals by some organophosphorus impurities, J. Agric. Food Chem. 20 (5) (1972) 944–950. [6] W.N. Aldridge, J.W. Miles, D.L. Mount, R.D. Verschoyle, The toxicological Funding properties of impurities in malathion, Arch. Toxicol. 42 (2) (1979) 95–106. [7] E.L. Baker Jr., M. Warren, M. Zack, R.D. Dobbin, J.W. Miles, S. Miller, L. Alderman, W.R. Teeters, Epidemic malathion poisoning in Pakistan malaria This work was supported by grants from the Ligue 35 contre le workers, Lancet 1 (8054) (1978) 31–34. Cancer and ANR (contract NISTEC 09-CESA-003-002). [8] R.E. Talcott, H. Denk, N.M. Mallipudi, Malathion carboxylesterase activity in human liver and its inactivation by isomalathion, Toxicol. Appl. Pharmacol. 49 (2) (1979) 373–376. Conflict of interest statement [9] F.M. Buratti, E. Testai, Malathion detoxification by human hepatic carboxylesterases and its inhibition by isomalathion and other pesticides, J. Biochem. Mol. Toxicol. 19 (6) (2005) 406–414. None. [10] A.F. Hernandez, T. Parron, A.M. Tsatsakis, M. Requena, R. Alarcon, O. Lopez- Guarnido, Toxic effects of pesticide mixtures at a molecular level: their relevance to human health, Toxicology 307 (2013) 136–145. References [11] P. Flessel, P.J. Quintana, K. Hooper, Genetic toxicity of malathion: a review, Environ. Mol. Mutagen 22 (1) (1993) 7–17. [1] R.D. Wauchope, T.M. Buttler, A.G. Hornsby, P.W. Augustijn-Beckers, J.P. Burt, [12] J.M. Pluth, J.A. Nicklas, J.P. O’Neill, R.J. Albertini, Increased frequency of specific The SCS/ARS/CES pesticide properties database for environmental decision- genomic deletions resulting from in vitro malathion exposure, Cancer Res. 56 making, Rev. Environ. Contam. Toxicol. 123 (1992) 1–155. (10) (1996) 2393–2399. 76 R. Josse et al. / Chemico-Biological Interactions 209 (2014) 68–76

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A. Résumé de l’étude

Les êtres humains sont habituellement exposés simultanément à plusieurs pesticides ; par conséquent, les actions combinées entre les pesticides eux-mêmes ou entre les pesticides et d’autres produits chimiques doivent être pris en compte dans l'évaluation des risques. Parmi les nombreux pesticides connus pour provoquer divers effets néfastes chez l'homme plusieurs sont des activateurs de CAR et/ou PXR, deux récepteurs nucléaires majeurs qui sont également activés par de nombreux autres substrats. Dans ce travail, nous avons cherché des interactions possibles entre les deux pesticides organochlorés, l'endosulfan et le méthoxychlore, qui sont à la fois activateurs de CAR et PXR et dont les mécanismes d'action reste mal compris chez l'Homme. Leurs effets, que ce soit individuellement ou en mélange, ont été analysés sur la viabilité des cellules ainsi que sur les CYP3A4 et CYP2B6, deux CYPs majeurs impliqués dans leur métabolisme, dans les cellules HepaRG et les hépatocytes humains primaires après un traitement unique ou répété. L’endosulfan s'est révélé être le composé le plus cytotoxique. Le méthoxychlore a provoqué une accumulation massive transitoire d’autophagosomes intracytoplasmiques. En mélange, ils exercent des effets cytotoxiques synergiques après 24h ou 2 semaines d’exposition répétée. Quelle que soit la durée du traitement les deux composés ont induit les niveaux d'ARNm des CYP3A4 et 2B6 mais exercé une action différente sur l’activité correpondante. L'endosulfan a exercé une inhibition directe sur l'activité du CYP3A4 tandis que le méthoxychlore l’augmente. L’activité du mélange résulte d’une addition. A l’inverse l’endosulfan et le méthoxychlore augmentent l’activité du CYP2B6 mais pas en mélange ce qui montre une inhibition entre les deux composés. De plus, leur interaction avec des substrats endogènes a également été démontrée. Au total, nos données appuient la conclusion que l'endosulfan et méthoxychlore peuvent interagir entre eux et avec d'autres substrats dans les hépatocytes humains.

103

B. Etude de la cytotoxicité

1. Viabilité cellulaire

Tout d'abord, la viabilité cellulaire des cellules HepaRG a été estimée après une exposition de 24 h et comparée à celles observées sur des hépatocytes humains en culture primaire et des cellules HepG2. Les traitements à l'endosulfan et au méthoxychlore ont été réalisés individuellement ou en mélange, à des concentrations variant de 50 à 500 µM.

La cytotoxicité induite par l’endosulfan est importante et atteint 100% à 200 µM (IC50 = 123 µM) dans les cellules HepaRG avec un milieu de culture sans sérum et contenant 1% de DMSO (Figure 28 A). Le méthoxychlore était moins cytotoxique : aucun effet n'a été observé à 100 µM et 45% des cellules étaient encore viables en présence de 200 µM (IC50 = 189 µm). Le mélange équimolaire est plus cytotoxique que les différents pesticides, avec une perte de la viabilité cellulaire de 100% en présence de 150 µM (IC50 = 77 µM).

Des hépatocytes primaires humains provenant de trois donneurs ont été également exposés aux pesticides individuellement ou en mélange en utilisant un milieu identique à celui des cellules HepaRG. Les valeurs de cytotoxicité sont comparables à celles obtenues sur les cellules HepaRG pour l’endosulfan et le mélange (IC50 = 108 µM et 71 µM, respectivement) (Figure 28 A, B). En revanche, les hépatocytes humains semblaient légèrement plus sensible que les cellules HepaRG au méthoxychlore seulement à 100 µM. En outre, deux populations d'hépatocytes isolées à partir de foie stéatosique ont été analysés et se sont révélées beaucoup moins sensibles aux pesticides avec seulement une perte de cellules de 20% en présence de 500 µM d'endosulfan ou de méthoxychlore (données non présentées). Pour confirmer un lien avec la stéatose, un prétraitement de 500 µM d’acide oléique pendant 24 h des cellules HepaRG a permis d’obtenir des cellules HepaRG stéatosiques (Antherieu et al., 2011). Comme prévu, ces cellules ont été moins sensibles aux pesticides que leurs homologues non stéatosiques. Les IC 50 étaient de 151 µM contre 123 µM après un traitement à l'endosulfan et n’a pas pu être atteinte avec le méthoxychlore, même avec une concentration de 500 µM (Figure 28 C).

Les cellules HepG2 non métaboliquement compétentes ont été beaucoup moins sensibles que les cellules HepaRG et les hépatocytes (Figure 28 D). L'endosulfan a également été le composé le plus cytotoxique mais environ 30 % de cellules étaient encore viables en présence de 500 µM

104

(IC50 = 406 µM) tandis que 60 % l’étaient avec le méthoxychlore à la même concentration. Un effet additif a été observé avec le mélange (IC50 = 252 µM).

Le milieu contenant 10 % de sérum et 2 % de DMSO favorise le maintien des différentes fonctions d'hépatocytes matures, y compris les activités du CYP3A4 et CYP2B6. Les cellules ont été cultivées dans ce milieu et exposées tous les 2-3 jours à des concentrations de pesticides variant de 10 à 100 µM. Après 24 h dans ces conditions, les cellules ont été moins sensibles à l'endosulfan et au mélange en comparaison du milieu sans sérum et contenant 1% de DMSO (Figure 28 E). Les valeurs d’IC50 sont de 168 µM et 108 µM pour l'endosulfan et le mélange équimolaire respectivement. La cytotoxicité liée au méthoxychlore a été similaire dans les deux milieux. Par rapport aux IC50 calculées après un traitement unique, des valeurs plus faibles ont été obtenues au bout de 14 jours (Figure 28 F).

105

Figure 28 : Effet cytotoxique de l’END, du MXC et de leur mélange [E + M] dans les cellules HepaRG (A, B, C), les hépatocytes humains (D) et les cellules HepG2 (E) après 24 h ou 14 jours (cellules HepaRG (F)). Des conditions de milieu différentes ont été testées sur les cellules HepaRG: un milieu à 0% de SVF et 1% de DMSO (A) et un milieu avec 10% de sérum et 2% de DMSO (B). Des cellules HepaRG ont également subi un prétraitement à l'acide oléique (500 µM) induisant des lipides (C) avant traitement avec les pesticides. La cytotoxicité a été analysée en utilisant le test MTT. Les résultats sont exprimés en % de la valeur obtenue dans les cellules témoins arbitrairement fixé à 100%. Les données sont des moyennes ± SEM d’au moins trois expériences indépendantes.

2. Stress oxydant

Afin de déterminer si l'exposition aux pesticides induit un stress oxydant, l'analyse de la production d’ERO et de l'expression de l’hème-oxygénase 1 (HO-1), gène lié au stress oxydatif, a été réalisée. Après 6h d'exposition à l'endosulfan et le mélange, une augmentation de près de 2 fois de la production d’ERO (Figure 29 A) déterminée par le test DCFDA, a été mis en évidence avec une surexpression de l’HO-1 (Figure 29 B). Après 24 h, une augmentation similaire de l’expression d’HO-1 a été observée et jugée comparable à celle mesurée dans les hépatocytes humains en culture primaires (Figure 29 C et D).Toutefois, lorsque ces dernières

106 ont été exposées au mélange, les valeurs étaient 2 fois plus élevées. Le méthoxychlore seul n'a eu aucun effet, même après 20 µm d’exposition, la plus forte concentration testée.

Figure 29 : Stress oxydant induit par END, MXC et leur mélange [E + M] dans les cellules HepaRG (A, B, C) et des hépatocytes humains (D).

Le stress oxydant a été évalué par DCFDA après exposition des cellules par les pesticides pendant 6 h et 50 mM de H2O2 pour 1h (contrôle positif). Les niveaux d'ARNm de HO-1 ont été estimés par RT-qPCR sur HepaRG après 6h (B), 24 h (C) et sur des hépatocytes humains après 24 heures. Les données ont été exprimées par rapport au taux d'ARNm présents dans les cellules non traitées arbitrairement fixée à 1. Les données sont des moyennes (± écart-type) de trois expériences indépendantes. * p <0,05 vs contrôle.

3. Modifications morphologiques

Les cellules HepaRG ont été examinées au microscope à contraste de phase après 24 h de traitement avec des concentrations variables d'endosulfan et/ou de méthoxychlore de 10 à 500 µM. L'endosulfan altère les hépatocytes avant les cellules épithéliales de types biliaires. Comme le montre la Figure 30 B, les hépatocytes et plus particulièrement les cellules biliaires exposées à 50 µM de méthoxychlore présentaient de nombreuses vésicules réfringentes. Ces vésicules

107 ne sont pas colorées avec le rouge d'huile (Figure 30 C), mais intègre rapidement et fortement le rouge neutre, colorant cationique qui pénètre facilement dans les membranes cellulaires par diffusion non ionique et s'accumule dans les lysosomes (Figure 30 D). Pour caractériser davantage la nature de ces structures intra-cytoplasmiques, les cellules HepaRG ont été examinées au microscope électronique à la suite d’une exposition au méthoxychlore. L'altération morphologique la plus importante était la présence de nombreuses vésicules membranaires, typiques des autophagosomes, contenant des éléments cytoplasmiques séquestrés (Figure 30 F, G). Ces vésicules ont également été observées dans les cellules exposées au mélange; ce phénomène était réversible, car les vésicules disparaissent après une incubation de 24 h en l'absence de méthoxychlore (données non présentées). Après un traitement de 14 jours, ces vésicules disparaissent également.

Figure 30 : Examen en microscopie optique ou électronique des cellules HepaRG non traitées (A) ou traitées avec le méthoxychlore (MXC). Une accumulation intracellulaire de vésicules est visible après une incubation de 24 h avec 25 uM MXC (B). A la fin du traitement avec les pesticides, les cellules ont été incubées avec de l'huile rouge (C) ou le rouge neutre (D). Examen au microscope électronique des cellules non traitées (E) ou exposées à MXC pendant 24 h (F, G).

4. Discussion

L'endosulfan et méthoxychlore sont deux pesticides organochlorés dont la toxicité a été associée au moins en partie, à leurs métabolites, y compris l’endosulfan-sulfate pour le premier et les dérivés déméthylés pour le dernier (Miller et al., 2006; Key et al., 2010). Les CYP3A4 et CYP2B6 sont deux CYPs majeurs dans leur métabolisme. Nos résultats montrent que les cellules métaboliquement compétentes HepaRG et les hépatocytes humains en culture primaire

108 sont plus sensibles que les cellules HepG2 à ces deux composés; de plus ils ont mis en évidence une sensibilité plus élevée après un traitement répété. La sensibilité des cellules HepaRG pour l'endosulfan était dépendante de la composition du milieu de culture. La cytotoxicité inférieure de l'endosulfan dans un milieu contenant 10% de sérum et 2 % de DMSO pourrait s'expliquer par sa liaison aux protéines sériques et / ou par les effets protecteurs du DMSO. En effet, il a été rapporté que la cytotoxicité des composés organochlorés diminuait avec l'augmentation du pourcentage d'albumine dans le milieu d’une culture de cellules Balb/c 3T3 (Gulden et al., 2002) et que le DMSO a des propriétés anti-apoptotiques et est un capteur d’ERO (Gilot et al., 2002). En accord avec des études précédentes (Bebe and Panemangalore, 2003; Rouimi et al., 2012), l'endosulfan provoque à de faibles doses un stress oxydant et modifie l'activité des enzymes anti-oxydantes dans les cellules HepaRG même en présence de DMSO. En revanche, le méthoxychlore qui n'a pas induit de stress oxydant était également cytotoxique en présence ou en absence de sérum et de 1 ou 2 % de DMSO.

En outre, de façon intéressante, l'endosulfan et surtout le méthoxychlore étaient moins toxiques dans des cellules stéatosiques que dans les cellules non stéatosiques comme observé avec les deux lots d’hépatocytes humains et les cellules HepaRG, ce qui suggère qu'en raison de leur caractère lipophile, ces pesticides se lient aux lipides intracellulaires. La diminution de la cytotoxicité plus élevée du méthoxychlore pourrait s'expliquer par sa lipophilie plus importante par rapport à l'endosulfan ; leurs coefficients de partage n–octanol/eau étant de l'ordre de 4,91 et 3,57 respectivement. En effet, il a été rapporté que les pesticides et leurs résidus lipophiles s'accumulent dans les tissus adipeux (Botella et al., 2004) et peuvent être libérés lors de régimes (Kim et al., 2011).

Dans l'ensemble, le méthoxychlore s'est révélé moins toxique que l'endosulfan. Une toxicité plus faible par rapport à l’endosulfan a également été rapportée dans des cellules HepG2 après une exposition de 24 h (Dehn et al., 2004). Cependant, il provoque spécifiquement l'accumulation rapide de nombreuses vésicules intra-cytoplasmiques qui, après coloration au rouge neutre, colorant lysosomal, et observation en microscopie électronique, est apparu être des autophagosomes typiques. Ces organites intracellulaires ont également été identifiés dans les hépatocytes de rats traités avec le lindane, un autre pesticide organochloré (Zucchini-Pascal et al., 2009). L’autophagie est considérée comme un mécanisme de survie cellulaire (Das et al., 2012) ; la formation de vacuoles dans les cellules HepaRG traités avec le méthoxychlore pourrait donc représenter un mécanisme de défense transitoire. En effet, ces autophagosomes disparaissent rapidement après l'arrêt du traitement et au cours du temps.

109

C. Interactions de l'endosulfan et méthoxychlore impliquant le CYP3A4 et CYP2B6 dans les cellules HepaRG humaines

Ces résultats font l’objet d’une publication actuellement en révision dans « Drug, Metabolism and Disposition » :

Interactions of endosulfan and methoxychlor involving CYP3A4 and CYP2B6 in human HepaRG cells.

Camille C. Savary, Rozenn Jossé, Arnaud Bruyère, Fabrice Guillet, Marie-Anne Robin and André Guillouzo.

110

1521-009X/42/8/1235–1240$25.00 http://dx.doi.org/10.1124/dmd.114.057786 DRUG METABOLISM AND DISPOSITION Drug Metab Dispos 42:1235–1240, August 2014 Copyright ª 2014 by The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics Short Communication

Interactions of Endosulfan and Methoxychlor Involving CYP3A4 and CYP2B6 in Human HepaRG Cells s

Received February 28, 2014; accepted May 15, 2014

ABSTRACT Humans are usually exposed to several pesticides simultaneously; duration of treatment, both compounds increased CYP3A4 and consequently, combined actions between pesticides themselves or CYP2B6 mRNA levels while differently affecting their corresponding between pesticides and other chemicals need to be addressed in the activities. Endosulfan exerted a direct reversible inhibition of CYP3A4 risk assessment. Many pesticides are efficient activators of pregnane activity that was confirmed in human liver microsomes. By contrast, X receptor (PXR) and/or constitutive androstane receptor (CAR), two methoxychlor induced this activity. The effects of the mixture on major nuclear receptors that are also activated by other substrates. CYP3A4 activity were equal to the sum of those of each individual In the present work, we searched for interactions between en- compound, suggesting an additive effect of each pesticide. Despite dosulfan and methoxychlor, two organochlorine pesticides whose CYP2B6 activity being unchanged and increased with endosulfan major routes of metabolism involve CAR- and PXR-regulated and methoxychlor, respectively, no change was observed with their CYP3A4 and CYP2B6, and whose mechanisms of action in humans mixture, supporting an antagonistic effect. Altogether, our data remain poorly understood. For this purpose, HepaRG cells were suggest that CAR and PXR activators endosulfan and methoxychlor treated with both pesticides separately or in mixture for 24 hours or can interact together and with other exogenous substrates in human 2 weeks at concentrations relevant to human exposure levels. In hepatocytes. Their effects on CYP3A4 and CYP2B6 activities could combination they exerted synergistic cytotoxic effects. Whatever the have important consequences if extrapolated to the in vivo situation.

Introduction involve cytochrome P450s CYP3A4 and CYP2B6, which are known Pesticides are major and ubiquitous contaminants of the human to be regulated by the two nuclear receptors (Blizard et al., 2001; environment. The human population is usually exposed to low doses Casabar et al., 2006). of several pesticides simultaneously via food and, to some extent, via Both pesticides are classified as endocrine disrupters. Endosulfan inhalation and cutaneous contact. These compounds can be substrates, has been reported to affect a variety of organ systems and physiologic inhibitors, and inducers of hepatic enzymes and also causative agents functions (Moon and Chun, 2009). Animal studies have shown its of various toxic effects. Interactions between pesticides themselves or toxicity to the liver, kidney, blood, immune, reproductive, and nervous between pesticides and other chemicals are known to occur, frequently systems (Choudhary and Joshi, 2003; Singh et al., 2008; Briz et al., through the generation of reactive intermediates that may exert their 2011). Methoxychlor induces follicular atresia, reduces ovulation rate, effects in the liver itself or in other tissues. Therefore, combined and decreases embryo implantation in rats and mice (Tiemann, 2008). actions of pesticides need to be addressed in the risk assessment It also reduces the weight of testes, prostate, and seminal vesicles and (Reffstrup et al., 2010; Lokke et al., 2013). Indeed, if the effects of causes disorders of spermatogenesis in male rats (Okazaki et al., mixtures are often equal to the arithmetic sum of the effects of each 2001). However, mechanisms of action of endosulfan and methoxy- component, in certain cases the observed toxicity may deviate chlor in humans remain poorly understood. Studies using primary significantly from expected additivity, indicating synergistic or human hepatocytes have shown that endosulfan caused an oxidative antagonistic effects (Kortenkamp et al., 2009). In the present work, stress and that both endosulfan and methoxychlor enhanced transcrip- we studied whether the two organochlorine pesticides endosulfan tion of CYP3A4 and CYP2B6 genes, but effects on their corresponding and methoxychlor could interact. In common with numerous other enzyme activities remained unclear (Dehn et al., 2005; Casabar et al., chemicals and endogenous substrates, endosulfan and methoxychlor 2010; Kublbeck et al., 2011; Rouimi et al., 2012). are activators of two major nuclear receptors, pregnane X receptor In this study, we showed that endosulfan and methoxychlor (PXR) and/or constitutive androstane receptor (CAR) (Casabar et al., upregulated CYP3A4 and CYP2B6 transcripts but differently affected 2010; Kublbeck et al., 2011), and their major routes of metabolism their corresponding activities in the metabolically competent human HepaRG cells after either single or 2-week repeated treatment.

Materials and Methods This work was supported by grants from the Agence Nationale de la Recherche (ANR) [contract NISTEC 09-CESA-003-002] and the Ligue 35 Contre le Cancer. Chemicals. Endosulfan (68.3% a-endosulfan, 30.9% b-endosulfan) was dx.doi.org/10.1124/dmd.114.057786. purchased from ChemService (West Chester, PA). Methoxychlor (PESTANAL, s This article has supplemental material available at dmd.aspetjournals.org. analytical standard), dimethyl sulfoxide (DMSO), testosterone, 6b-hydroxytestosterone,

ABBREVIATIONS: CAR, constitutive androstane receptor; DMSO, dimethyl sulfoxide; FCS, fetal calf serum; P450, cytochrome P450; PCR, polymerase chain reaction; PXR, pregnane X receptor.

1235 1236 Savary et al. nifedipine, oxidized nifedipine, midazolam, bupropion, and ketoconazole arbitrarily set at 1. Each 24-well plate contained around 0.4 Â 105 cells were from Sigma-Aldrich (St. Quentin Fallavier, France). 1-Hydroxymidazolam, corresponding to 250 mg of protein. 1-hydroxymidazolam-13C3, hydroxybupropion, and hydroxybupropion-D6 were Statistical Analysis. Data are presented as mean 6 S.E.M. Significant supplied from LGC Standards (Molsheim, France). All other chemicals were of differences were evaluated using the Mann-Whitney U test. *P , 0.05 was the highest quality available. considered statistically significant. To evaluate whether the effects caused by the Cell Cultures and Pesticide Treatments. HepaRG cells were cultured at mixture of endosulfan and methoxychlor were additive, more than additive, or a density of 2.6 Â 104 cells/cm2 in 12- or 24-well plates as described previously less than additive, it was possible to calculate the expected effect of the mixture (Gripon et al., 2002; Aninat et al., 2006). They were first incubated in under the hypothesis of simple additivity response. The expected value was the Williams’ E medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), 100 IU/ml sum of the effects observed for each individual compound (Dumont et al., 2010). penicillin, 100 mg/ml streptomycin, 5 mg/ml insulin, 2 mM glutamine, and The Mann-Whitney U test was then used to test whether any observed response 5 Â 1025 M hydrocortisone hemisuccinate for 2 weeks. Maximal liver- was significantly different from the expected response. Effects stronger than specific activities were attained after 2 additional weeks in the same medium expected were designated as resulting from synergism, whereas effects smaller with 2% DMSO added. The culture medium was renewed every 2 or 3 days. than expected were designated as resulting from antagonism. For analysis of At that time HepaRG cells were used for pesticide treatments. cytotoxicity values, the CATAM mixture model (http://service004.hpc.ncsu.edu/ HepG2 cells were used for cytotoxicity comparison with HepaRG cells. Briefly, toxicology/faculty/leblanc/web1/) was also used. they were seeded at a density of 100,000 cells/cm2 in 24-well plates. The growth medium was composed of minimum essential medium, nonessential amino acids, 100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin, and supplemented with 10% Results and Discussion FCS. The cells were used at the time they reached confluence. Endosulfan and methoxychlor were dissolved in DMSO; both control and Cytotoxicity of Endosulfan, Methoxychlor, and the Mixture. treated cultures received the same final concentration of vehicle. The binary Preliminary studies were performed to estimate viability of HepaRG mixture was designed as [E+M]. Thus, 20 mM [E+M] was composed of 20 mM cells after a 24-hour exposure to endosulfan and methoxychlor of each pesticide. For mRNA and activity measurements HepaRG cells were individually and in mixture; varying concentrations from 5 up to 500 treated in a serum-free medium containing only 0.1% DMSO for 24 or 48 mM were tested (Fig. 1A). Endosulfan cytotoxicity sharply increased hours. from 100 mM to reach a 100% loss of cell viability at 200 mM (IC50 = Preparation of Microsomal and Cytosolic Fractions. Human liver tissue 123 mM) in HepaRG cells. Methoxychlor was significantly less samples and HepaRG cells were homogenized in 50 mM Tris-HCl buffer (pH cytotoxic than endosulfan: indeed, no effect was observed at 100 mM 7.4) containing 0.25 M sucrose and 1 mM EDTA. Microsomal and cytosolic and 45% cells were still viable in the presence of 200 mM (IC = 189 fractions were the sediment and supernatant, respectively, from the last of three 50 successive centrifugations at 4°C (3000g, 10 minutes; 8000g, 20 minutes; and mM). The equimolar mixture was significantly more cytotoxic than 30,000g, 60 minutes). individual pesticides at 100 mM and a 100% loss of cell viability was Cytotoxicity Assay. Cytotoxicity of pesticides was evaluated by the observed in the presence of 150 mM (IC50 = 77 mM). When HepaRG methylthiazoletetrazolium colorimetric assay (Aninat et al., 2006). cells were treated every 2–3 days for 14 days with varying pesticide Isolation of RNA and Real-Time Polymerase Chain Reaction Analysis. concentrations from 1 up to 100 mM, cytotoxicity was exacerbated (Fig. For the determination of cytochrome P450 mRNA levels, HepaRG cells were 1B). IC50 fell to 72 mM and 38 mM for endosulfan and the mixture, treated for 24 hours or 14 days with the pesticides. Total RNA was extracted respectively, and a 40% cell loss was observed with 100 mM 6 from 10 cells with the SV Total RNA Isolation System (Promega, Madison, methoxychlor. Increased cytotoxicity after repeated treatment with the WI), which directly included a DNase treatment step. RNAs were reverse- two pesticides could be explained by continuous generation of toxic transcribed into cDNA using a High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied metabolites. Indeed, endosulfan and methoxychlor cytotoxicity has been Biosystems, Foster City, CA). Real-time polymerase chain reaction for all genes was performed by the fluorescent dye SYBR Green methodology using associated, at least in part, with their metabolites, including endosulfan the SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) and the ABI Prism sulfate for the former and demethylated derivatives for the latter (Miller 7000 (Applied Biosystems). The primer forward and the primer reverse et al., 2006; Key et al., 2010). As previously reported (Josse et al., used for CYP3A4, CYP2B6, and 18S were the following: CYP3A4, forward 2008), major P450 activities were well maintained in differentiated 59-CTTCATCCAATGGACTAGCATAAAT-39 and reverse 59-TCCCAAG- HepaRG cells over a 2-week period. Noticeably as expected, HepG2 TATAACACTCTACACAGACAA-39; CYP2B6, forward 59-TTCCTAC- cells that did not express major P450s were much less sensitive to the 9 9 9 TGCTTCCGTCTATCAAA-3 and reverse 5 -GTGCAATCCCACAGCTCA-3 ; and two pesticides and their mixture (IC50 = 406 mM, less than 500 mM, control 18S, forward 59- CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-39 and reverse 59- and 250 mM for endosulfan, methoxychlor, and the mixture, respectively, 9 TTGGCAAATGCTTTCGCTC-3 . after a 24 hours treatment (Fig. 1C). A synergistic cytotoxic effect was The amplification curves were read with the ABI Prism 7000 SDS software observed in HepaRG cells, while it was only additive in HepG2 cells after using the comparative cycle threshold method. The relative quantification of exposure to each pesticide at 100 mM in mixture (Fig. 1D). the steady-state mRNA levels was calculated after normalization against 18S RNA. Furthermore, a dissociation curve was performed after the PCR to verify Based on these cytotoxicity data, noncytotoxic concentrations of the the specificity of the amplification. Results were expressed as a fold change of two pesticides ranging from 1 to 20 mM were used for measuring mRNA levels measured in controls arbitrarily set at 1. P450 transcripts and activities in HepaRG cells; these concentrations Determination of P450 Activities. For the determination of P450-related were similar to those used in other in vitro studies (Casabar et al., activities, HepaRG cells were cultured in 24-well plates and treated for 48 2010; Craig et al., 2013) and relevant to human exposure levels hours with pesticides and then incubated with specific substrates for each P450 (Botella et al., 2004; Carreno et al., 2007). Noticeably, endosulfan and in phenol red–free medium deprived of FCS and DMSO for 2 hours. Several its metabolites have been found to be concentrated as much as ten substrates of CYP3A4 were used. Cultures were incubated with either of three times in liver than in blood (Nath et al., 1978). substrates of CYP3A4, 200 mM testosterone, 200 mM nifedipine, or 50 mM Effects on CYP3A4 and CYP2B6 after Single Exposure. midazolam, or with 100 mM bupropion, a specific substrate of CYP2B6. CYP3A4 and CYP2B6 are both implicated in metabolism of Oxidized nifedipine was quantitated by high-performance liquid chromatography (HPLC)-UV. 6b-hydroxytestosterone, hydroxymidazolam and its internal endosulfan and methoxychlor (Blizard et al., 2001; Casabar et al., standard and hydroxybupropion and its internal standard were directly 2006). We evaluated whether endosulfan, methoxychlor and their measured in the culture medium by HPLC–tandem mass spectrometry (MS/ mixture could modulate their expression and/or activity after single MS) (Galetin et al., 2003). P450 activities were determined as pmol/mg protein and repeated exposure. After a single 24-hour exposure, a concentra- per minute and are reported as a fold change of activity measured in controls tion-dependent increase in CYP3A4 mRNA levels was observed in Differential P450s Modulation by Pesticides 1237

Fig. 1. Cytotoxic effects of endosulfan (END), methoxychlor (MXC), and their mixture [E+M] in HepaRG cells after 24 hours (A) and 14 days (B) of treatment, and for comparison in HepG2 cells (C) after 24 hours. (D) Expected versus observed cytotoxic effects based on the CATAM mixture model (http://service004.hpc.ncsu.edu/ toxicology/faculty/leblanc/web1/); in parentheses, values obtained by using the method of Dumont et al., 2010, as described in Materials and Methods. “100 mM [E+M]” means that the mixture contained a 100-mM concentration of each pesticide. Cytotoxicity was assayed using the methylthiazoletetrazolium test. Results are expressed as % of the value found in control cells, arbitrarily set at 100%. Data are means 6 S.E.M. of three independent experiments.

HepaRG cells treated with endosulfan, methoxychlor, and their mixture, the same active site as testosterone (Galetin et al., 2003) did not reaching respectively 7.7-, 9.9-, and 22.4-fold at 20 mM (Fig. 2A). Both interact with methoxychlor and therefore could be considered as more pesticides also induced CYP2B6 mRNA expression in a concentration- appropriate substrates than testosterone to evaluate the effects of this dependent manner (Fig. 2B). These data are in agreement with previous pesticide on CYP3A4 activity. studies (Coumoul et al., 2002; Lemaire et al., 2005; Casabar et al., 2010; To confirm a direct inhibition of CYP3A4 activity by endosulfan, Rouimi et al., 2012). microsomes prepared from human liver samples and HepaRG cells Activity of both P450s was measured after a 48-hour exposure. were incubated with this pesticide at 20 mM for 20 minutes. A 28% Despite an induction at the transcript level, endosulfan showed a and 60% inhibition of 6b-hydroxytestosterone formation was ob- strong concentration-dependent inhibition of CYP3A4 activity in served with microsomes from human liver and HepaRG cells, HepaRG cells, as shown by quantification of 6b-hydroxytestosterone, respectively (Fig. 2F). This inhibition was not NADPH-dependent, the metabolite of testosterone formed by CYP3A4 (Fig. 2C). Indeed, suggesting a non–mechanism-based inhibition. These results provide 5, 10, and 20 mM endosulfan inhibited 45, 60, and 75% of CYP3A4 the first demonstration of a direct inhibitory effect of endosulfan on activity, respectively. This decrease of CYP3A4 activity observed by CYP3A4 activity in human hepatocytes. Surprisingly, previous studies determination of 6b-hydroxytestosterone formation was confirmed by have only analyzed mRNA and protein levels in endosulfan-treated measurement of hydroxymidazolam and oxidized nifedipine, two human hepatocytes (Dehn et al., 2005; Casabar et al., 2010; Rouimi metabolites specifically formed by CYP3A4 from midazolam and et al., 2012). A lack of direct correlation has been reported between nifedipine, respectively (Fig. 2, D and E). transcripts and enzyme activity levels for other pesticides, especially On the other hand, methoxychlor induced CYP3A4 activity except organophosphate insecticides that are likewise CAR and PXR activators when testosterone was used as a substrate (Fig. 2, C–E). The most (Abass et al., 2012). probable explanation is competitive inhibition of 6b-testosterone Both endosulfan and methoxychlor increased CYP2B6 activity as hydroxylation by methoxychlor and its metabolites, as previously shown by quantification of hydroxybupropion formation (Fig. 2G). reported by Li et al. (1993). However, a reduced cooperativity in the Although expected, to our knowledge an induction of CYP2B6 binding of testosterone molecules to its binding site has been observed activity by these two CAR activators had never been reported in human in the presence of some other substrates (Galetin et al., 2003) and hepatocytes. consequently cannot be excluded with methoxychlor. Noticeably, the Effects on CYP3A4 and CYP2B6 after Repeated Exposure. two other substrates, nifedipine and midazolam, which do not bind to P450 transcripts and activities were also measured in HepaRG cells 1238 Savary et al.

Fig. 2. Effects of endosulfan, methoxychlor, and their mixture [E+M] on P450 mRNAs and/or activities in HepaRG cells and microsomes. HepaRG cells were exposed to the vehicle (0.1% DMSO) (CTR), endosulfan, methoxychlor, and their mixture [E+M] for 24 or 48 hours. CYP3A4 and CYP2B6 mRNAs (A and B) and activity (C–G) were measured 24 and 48 hours after the last treatment, respectively. CYP3A4 activity was estimated by determination of 6b-hydroxytestosterone (C), hydroxymidazolam (D), and oxidized nifedipine (E). CYP2B6 activity was estimated by determination of hydroxybupropion (G). Microsomes were prepared from human liver and HepaRG cells, then preincubated with 20 mM endosulfan (END) or 0.5 mM ketoconazole (KETO), used as a reference inhibitor, for 20 minutes with or without NADPH before incubation with testosterone (F). All results are expressed as fold changes compared with corresponding controls. Data are means 6 S.E.M of at least three independent experiments. *P , 0.05 compared with control cells.

after 2-week repeated treatments with the two pesticides individually activity with the mixture represented the sum of a decrease with and in mixture. As shown in Fig. 3, A and B, an increase of CYP3A4 endosulfan and an increase with methoxychlor. As an example, after and CYP2B6 transcripts was observed after treatment with 5 and 10 mM single exposure at 20 mM, endosulfan decreased CYP3A4 activity by endosulfan, methoxychlor, and their mixture. 0.65-fold while methoxychlor increased it by 2.85-fold. No significant After 14-day repeated treatments, CYP3A4 activity dropped by 60 difference was found between observed (1.77 6 0.25-fold) and and 70% of control values in response to 5 and 10 mM endosulfan, theoretical additive (2.55 6 0.2-fold) effects (Supplemental Table 1). respectively, while it was increased with 10 mM methoxychlor (Fig. For CYP2B6, our results showed additive effects only for the 3C). CYP2B6 activity was unchanged with endosulfan and induced by lowest concentrations (5 mM after single and 1 mM after repeat methoxychlor (Fig. 3D). Therefore, it might be concluded that the exposure). However, with 10–20 mM and 5–10 mM [E+M] mixture effects of endosulfan and methoxychlor on transcripts and activity of after single and repeat exposure, respectively, this activity was CYP3A4 and CYP2B6 were comparable after single or 2-week repeat significantly lower than expected (Figs. 2G and 3D). For instance, 20 mM treatments of HepaRG cells exposed to the same pesticide concen- endosulfan and 20 mM methoxychlor increased CYP2B6 activity trations (Figs. 2 and 3). (1.3- and 1.7-fold, respectively). Although a 2-fold augmentation Effects of the Mixture on CYP3A4 and CYP2B6 after Single was expected, no effect was observed with the mixture (1.1-fold) and Repeated Exposure. Changes in CYP3A4 and CYP2B6 supporting an interaction (antagonism) between the two pesticides activities after exposure to an equimolar mixture of endosulfan and on this P450 activity (Supplemental Table 1). methoxychlor should correspond to the addition of changes measured Although contaminants are recognized as usually having much less with each compound separately, if no interaction occurred. affinity to P450s than pharmaceuticals, our data clearly showed that For CYP3A4, additive effects were observed whatever the con- both endosulfan and methoxychlor affected P450 activities in HepaRG centration and the duration of the treatment (Figs. 2E and 3C). Total cells at concentrations relevant to human exposure levels. Differential P450s Modulation by Pesticides 1239

Fig. 3. Effects of endosulfan, methoxychlor, and their mixture [E+M] on CYP3A4 and CYP2B6 mRNAs (A and B) and activities (C and D) after repeat treatment. HepaRG cells were exposed to the vehicle (0.1% DMSO) (CTR), endosulfan, methoxychlor, and their mixture [E+M] for 14 days. CYP3A4 activity was estimated by determination of oxidized nifedipine (C). CYP2B6 activity was estimated by determination of hydroxybupropion (D). Data are means 6 S.E.M of three independent experiments. *P , 0.05 compared with control cells.

In summary, results obtained with the metabolically competent Conducted experiments: Savary. human HepaRG cells exposed to single or repeated doses of endosulfan Contributed new reagents or analytic tools: Guillet, Bruyère. and methoxychlor, individually or in mixture, provide the first Performed data analysis: Savary, Guillet. demonstration that these two pesticides can exert opposite effects on Wrote or contributed to the writing of the manuscript: Savary, Jossé, Robin, CYP3A4 and CYP2B6 activities. The results further support the occurrence Guillouzo. of metabolic interactions between environmental contaminants themselves References and between environmental contaminants and other chemicals, including drugs and endogenous compounds, especially agonists of the Abass K, Lämsä V, Reponen P, Küblbeck J, Honkakoski P, Mattila S, Pelkonen O, and Hakkola J (2012) Characterization of human cytochrome P450 induction by pesticides. Toxicology 294: same nuclear receptors. Such effects on main xenobiotic metabolizing 17–26. enzyme activities could have important consequences if extrapolated to Aninat C, Piton A, Glaise D, Le Charpentier T, Langouët S, Morel F, Guguen-Guillouzo C, and Guillouzo A (2006) Expression of cytochromes P450, conjugating enzymes and nuclear the in vivo situation. receptors in human hepatoma HepaRG cells. Drug Metab Dispos 34:75–83. Blizard D, Sueyoshi T, Negishi M, Dehal SS, and Kupfer D (2001) Mechanism of induction of cytochrome p450 enzymes by the proestrogenic endocrine disruptor pesticide-methoxychlor: Acknowledgments interactions of methoxychlor metabolites with the constitutive androstane receptor system. The authors thank Ahmad Sharanek and Drs. Caroline Aninat, Eva Drug Metab Dispos 29:781–785. Botella B, Crespo J, Rivas A, Cerrillo I, Olea-Serrano MF, and Olea N (2004) Exposure of Klimcakova, and Caroline Moreau for helpful comments. women to organochlorine pesticides in Southern Spain. Environ Res 96:34–40. Briz V, Molina-Molina JM, Sánchez-Redondo S, Fernández MF, Grimalt JO, Olea N, Rodríguez- Inserm U991, Faculté des Sciences CAMILLE C. SAVARY Farré E, and Suñol C (2011) Differential estrogenic effects of the persistent organochlorine Pharmaceutiques et Biologiques de ROZENN JOSSÉ pesticides dieldrin, endosulfan, and lindane in primary neuronal cultures. Toxicol Sci 120: 413–427. Rennes (C.C.S., R.J., M.-A.R., A.G.), ARNAUD BRUYÈRE Carreño J, Rivas A, Granada A, Jose Lopez-Espinosa M, Mariscal M, Olea N, and Olea-Serrano F Université de Rennes 1, Rennes, FABRICE GUILLET (2007) Exposure of young men to organochlorine pesticides in Southern Spain. Environ Res 103:55–61. France; and Xenoblis, Saint-Gregoire, MARIE-ANNE ROBIN Casabar RC, Wallace AD, Hodgson E, and Rose RL (2006) Metabolism of endosulfan-alpha by France (A.B., F.G.) ANDRÉ GUILLOUZO human liver microsomes and its utility as a simultaneous in vitro probe for CYP2B6 and CYP3A4. Drug Metab Dispos 34:1779–1785. Casabar RC, Das PC, Dekrey GK, Gardiner CS, Cao Y, Rose RL, and Wallace AD (2010) Endosulfan induces CYP2B6 and CYP3A4 by activating the pregnane X receptor. Toxicol Appl Pharmacol 245:335–343. Authorship Contributions Choudhary N and Joshi SC (2003) Reproductive toxicity of endosulfan in male albino rats. Bull Participated in research design: Savary, Jossé, Guillouzo. Environ Contam Toxicol 70:285–289. 1240 Savary et al.

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I. Introduction

En France, les cancers ont progressé, entre 1980 et 2005, de 93% chez l’homme et de 84% chez la femme. De nombreux contaminants de l’environnement et de l’alimentation ont été mis en cause sur la base d'études épidémiologiques mais la corrélation directe entre les deux reste difficile à établir. L’exposition humaine à ces contaminants reconnus comme cancérigènes chez l’animal est inévitable en raison de leur présence dans l’air, l’eau et les aliments. Il faut en outre rappeler que l'Homme est exposé le plus souvent à des mélanges de produits chimiques à faibles doses pendant une longue période de sa vie et que les effets mutagènes/cancérigènes peuvent résulter d'interactions entre ces produits, souvent suite à leur transformation métabolique intracellulaire, notamment au niveau du foie.

La cancérogénèse chimique est un processus multi-étapes impliquant diverses altérations génétiques et épigénétiques. Aussi, les produits cancérogènes sont communément classés en composés génotoxiques et non génotoxiques. Il existe des tests in vitro et in vivo validés pour tester la génotoxicité de ces produits mais leur spécificité reste insuffisante. Pour les composés non génotoxiques, le test de cancérogénèse de 2 ans chez le rongeur, long et coûteux, reste le test recommandé par les agences d’enregistrement. Mais, l’évaluation du risque implique que les effets observés chez l’animal puissent être extrapolés à l’Homme, ce qui est loin d’être le cas.

Il n’existe dans la littérature que peu d’études ayant eu pour but d’obtenir une cancérisation des cellules humaines soumises in vitro à une exposition prolongée à des contaminants chimiques et à notre connaissance aucune n’a porté sur des cellules hépatiques humaines (Shiraha et al., 2013). Ces études ont apporté la preuve du concept qu’il est possible de transformer des lignées cellulaires immortalisées mais non cancéreuses par expositions à des contaminants tels que le B[a]P, le BPA ou la fumée de cigarette. Ces études ont porté sur la prolifération, la croissance sur agar et la vérification du potentiel cancérogène par injection des cellules transformées dans les souris nude.

111

Aussi, l’objectif notre 3ème partie a été d’étudier le potentiel cancérigène de deux contaminants chimiques nécessitant une bioactivation dans des cellules humaines hépatiques ayant une capacité de biotransformation et soumises à une exposition prolongée. Nous avons donc choisi d’utiliser les cellules HepaRG et de les traiter de manière répétée pendant plusieurs passages par deux contaminants génotoxiques, l’AFB1 et le PhIP, une amine hétérocyclique aromatique, qui, tous deux, nécessitent une métabolisation pour exercer leurs effets toxiques.

A. Caractéristiques de la lignée HepaRG importantes pour notre étude

Les cellules HepaRG ont, à priori des avantages uniques pour une telle étude. En effet, elles ont des propriétés proches des hépatocytes adultes tout en passant par un stade de cellules souches /progénitrices et étant capables de proliférer pendant plusieurs passages. Elles présentent un caryotype légèrement modifié caractérisé par une trisomie du chromosome 7 et une translocation entre les chromosomes 22 et 12 (Gripon et al. 2002). La comparaison des profils d’expression des gènes de chaque chromosome des cellules HepaRG différenciées et d’hépatocytes humains en cultures primaires a révélé que seule l’anomalie sur le chromosome 7 serait responsable d’une différence d’expression génique ; en effet celle-ci serait plus importante pour les gènes portés par ce chromosome (dû au nombre de copies plus élevé) (Hart et al., 2010).

De plus, l’intégrité des voies Wnt/β-caténine et GSK3, responsables du contrôle du cycle cellulaire, ainsi que celle des facteurs P53 et Rb, deux éléments ayant un rôle déterminant dans la régulation du cycle cellulaire, ne sont pas altérées.

Enfin, la lignée HepaRG est une lignée de cellules non transformées, contrairement à la lignée HepG2. En effet, ces cellules n’ont pas perdu leur inhibition de contact contrairement aux cellules cancéreuses classiques ni leur dépendance vis-à-vis de l'ancrage à un support solide (absence de croissance sur agar mou). Elles n’ont également pas de capacité invasive. Inoculées à des souris nude, elles n’induisent pas de tumeur, mais simplement un nodule sous cutané (Cerec et al., 2007).

Lorsque les cellules HepaRG sont cultivées selon le protocole standard, les progéniteurs donneront deux types de populations cellulaires: des hépatocytes et des cellules indifférenciées de type biliaire (Cerec et al., 2007; Josse et al., 2008). L’ajout de 2 % de DMSO à 15 jours de culture potentialise la différentiation des hépatocytes et peut avoir, à plus long terme, une influence sur le vieillissement des cellules dès 60 jours de culture (Pernelle et al., 2011). La

112 lignée présente les caractères d’immortalité avec une capacité de division illimitée. En revanche, sa capacité bipotente ainsi que sa capacité de transdifférenciation semblent s‘estomper après un certain nombre de passages. Effectivement, cette propriété qui donne un caractère unique aux cellules HepaRG correspond à une phase précise, évolutive, limitée dans le temps puisqu’après 20 passages, les cellules entrent en période de crise aboutissant à la disparition de la capacité bipotente des progéniteurs et au développement d’une culture avec un seul type cellulaire, toutefois encore morphologiquement proche des hépatocytes (Figure 31).

Figure 31 : Schématisation du comportement de la lignée HepaRG au cours du temps et des repiquages : d’après la Thèse de Kélig Pernelle (2011) . Les progéniteurs hépatiques prolifèrent, se différencient en deux types cellulaires puis effectuent une maturation et finalement entrent en processus de sénescence. En parallèle, les cellules différenciées HepaRG ont la capacité de réversion lorsqu’elles sont ensemencées à faible densité, ce qui est un caractère d’immortalisation dans la mesure où le processus peut être réitéré plusieurs fois et sans intervention de modification génétique. Au-delà du passage 20, ces cellules n’ont plus la capacité de se différencier en deux types cellulaires.

113

B. Les agents génotoxiques étudiés

1. L’aflatoxine B1

Les aflatoxines sont des mycotoxines produites par deux espèces d’Aspergillus, l’Aspergillus flavus et l’Aspergillus parasiticus, champignons que l’on trouve surtout dans les régions chaudes et humides. Elles sont produites sur une large variété de denrées alimentaires avant, pendant et après la récolte. Elles affectent de nombreux produits agricoles dont les céréales, les fruits secs, les noix, les grains de café, les raisins et graines oléagineuses. La contamination fongique des plantes et la synthèse de toxines dépendent d’un certain nombre de conditions environnementales : état sanitaire de la plante précédant une récolte, conditions météorologiques, techniques de récolte, délais et conditions hydro-thermiques avant la stabilisation pour une bonne conservation.

Différents types d’aflatoxines sont produits dans la nature. L’aflatoxine B1 (AFB1) est la plus fréquente dans les aliments et celle qui possède les propriétés génotoxiques et carcinogènes les plus puissantes. L’AFB1 est reconnue comme l'un des plus puissants hépato-carcinogènes chez l'Homme et de nombreuses espèces animales. Sa génotoxicité nécessite l'activation par les CYP3A4 et 1A2 et la formation de l'AFB1-8 ,9-époxyde (Gallagher et al., 1996; Kensler et al., 2003) (Figure 32). Ce dernier a une affinité pour la guanine en position N7 de l’ADN provoquant ainsi la formation d’adduits qui peuvent être à l’origine de mutations, comme celle largement documentée sur le codon 249 du gène TP53 (Stern et al., 2001; Shirabe et al., 2011). La corrélation entre l’absorption d’AFB1 par les aliments et cette mutation a permis de considérer cette dernière comme un des biomarqueurs d’exposition à l’AFB1.

114

Figure 32 : Métabolisme de l’AFB1 (Kensler et al., 2003).

L’AFB1 est classée comme carcinogène de groupe 1 par le CIRC. L’Union européenne (UE) a introduit des mesures afin de réduire la présence des aflatoxines dans différents aliments. Les taux maximum d’aflatoxines sont fixés dans le règlement (CE) n°1881/2006 de la Commission : il est actuellement de 4 µg/kg en aflatoxines totales. Les produits dépassant les taux maximum ne peuvent pas être mis sur le marché dans l’UE.

2. Le PhIP

Le PhIP (2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine), produit lors de la combustion des aliments d’origine animale, est l’une des amines aromatiques les plus retrouvées. Il s’agit du produit de la réaction d’un acide aminé, la phénylalanine, et de la créatinine (substance azotée non protéique caractéristique du muscle). La fumée de cigarette est une autre source majeure de PhIP (Pfeifer et al., 2002). La quantité réelle à laquelle nous sommes exposés est difficile à

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évaluer étant donné les diverses sources d’exposition. Il est classé 2B par le CIRC du fait qu’il entraine des mutations dans la plupart des systèmes testés. Par ailleurs, des études épidémiologiques ont démontré une corrélation entre la consommation de viande grillée et l’apparition de cancer comme celui de la prostate, de l’estomac ou encore le cancer colorectal. Le PhIP subit une activation métabolique via une N-oxydation par le CYP1A2 hépatique. De plus, ce métabolite oxydatif primaire peut être converti en une variété de métabolites de phase II, y compris les glucuronides, des esters de sulfate, et des produits acétylés, certaines espèces étant connues pour être génotoxiques (Buonarati and Felton, 1990) (Figure 33).

Figure 33 : Principales voies métaboliques du PhIP d’après Dumont et al., 2010b. HAA: heterocyclic aromatic amines; IQx-8-COOH: 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoxaline-8-carboxylic acid; NAT: N- acetyltransferase; UGT: UDP-glucuronosyltransferase.

II. Matériels et méthodes

A. Produits testés

L’aflatoxine B1 a été fournie par Sigma Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France) et le PhIP par Toronto Research Chemicals (North York, Canada).

116

B. Culture des cellules HepaRG

Les cellules HepaRG sont ensemencées à la densité de 650 000 cellules par flasque de 25 cm2 de façon à atteindre la confluence en 15 jours dans un milieu de culture précédemment décrit contenant 10% de sérum et sans DMSO. Le milieu de culture est renouvelé tous les deux / trois jours. Les 18ème, 19ème et 20ème jours, elles sont traitées avec 0,05µM d’aflatoxine ou 50µM de PhIP, doses non cytotoxiques. Ces deux composés sont dilués dans le DMSO. Au 21ème jour, les cellules sont décollées avec la trypsine/EDTA et sont ensuite ensemencées dans des flasques afin de recommencer ce cycle de culture à la densité de 650 000 cellules. Le protocole expérimental est représenté Figure 34. Ce protocole a été retenu car déjà à ce stade les cellules ont une certaine activité de biotransformation tout en ne perdant pas une petite partie de leur capacité de prolifération.

Figure 34 : Protocole expérimental de culture et traitement des cellules HepaRG

Les expositions à l’AFB1 et au PhIP des cellules HepaRG ont été réalisées à chaque passage à partir du passage 13 jusqu’au passage 33.

Des cellules HepG2 (ATCC-LGC, Molsheim, France) ont été utilisées comme contrôle pour certaines expériences. Ces dernières sont entretenues dans du milieu DMEM contenant 4,5 g

117 de glucose, additionné de 10% de SVF, de 5% d’acides aminés non essentiels ainsi que de la pénicilline (100U/ml) et de la streptomycine (0,1µG/ml), à 37°C dans une atmosphère saturée à

5% de CO2.

C. Microscopie optique

Les observations morphologiques sont réalisées à l’aide du microscope Axiovert 200M inversé et l’acquisition des images est faite à l’aide du logiciel AxioVison®.

D. Cinétique de prolifération

Après ensemencement à une densité de 100 000 cellules par puits dans une plaque 24 puits, les différentes cellules ont été comptées 24 et 48 h après décollement à la trypsine afin de déterminer la vitesse de croissance des cellules ayant été exposées à l’AFB1 et au PhIP par rapport à des cellules n’y ayant jamais été exposées.

E. Culture sur agar mou (Soft agar assay)

Cette technique permet l’étude de la capacité de croissance sans support des cellules, c'est-à- dire la perte de la dépendance vis-à-vis de l'ancrage à un support solide.

Chaque puits est constitué de deux couches : une couche inférieure à 0,8 % d’agar sans cellules et une couche supérieure à 0,4 % d’agar contenant 75 000 cellules. Les boites sont ensuite placées à 37°C et à 5% de CO2 pendant 3 semaines et observées régulièrement au microscope à contraste de phase. Les colonies sont colorées avec 0,005% de Crystal violet le dernier jour.

F. Test de la cicatrice (Wound healing)

Pour analyser leur capacité d’envahissement, les cellules ont été cultivées dans des plaques de 96 puits à 10 000 cellules par puits jusqu’à obtention d’un tapis cellulaire confluant (après 4 jours). La cicatrice a été effectuée dans la monocouche de cellules avec un cône de pipette. La migration cellulaire a été observée immédiatement après (temps 0) puis une vidéo en contraste de phase a été réalisée à intervalle de temps de 6h avec un objectif 10x sur un microscope inversé Carl Zeiss (AxioVert 200M). Celui-ci est équipé d’un contrôleur de température et de

CO2 et d’une caméra Zeiss AxioCam MR digital. La quantification de la migration cellulaire est permise grâce au logiciel d’analyse d’image Simple PCI, qui mesure la surface de la cicatrice au cours du temps. Cette analyse a été réalisée sur la plateforme ImPACcell® de Rennes.

118

G. Analyse du transcriptome

1. Isolement des ARNs.

A la suite des expositions de 3 jours aux produits chimiques, les cellules HepaRG sont décollées et ensemencées dans une plaque 6 puits et sont récoltées 15 jours plus tard dans un tampon de lyse (tampon RLT et β-Mercaptoéthanol). L'ARN total a été isolé en utilisant un kit RNeasy Micro (QIAGEN, Venlo, Pays-Bas). La quantité d'ARN et sa pureté ont été évaluées avec un spectrophotomètre NanoDrop ND -1000 (Nyxor Biotech, Paris, France), et l'intégrité de l'ARN a été vérifiée sur un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Massy, France).

2. Hybridations des biopuces

Cinq cents nanogrammes d'ARN total de chaque échantillon de culture cellulaire ont été séparément reverse-transcrits en ADNc double brin par le virus de la leucémie murine de Moloney transcriptase inverse et amplifiés pendant 2h à 40°C en utilisant un kit rapide Amplification Labeling (Agilent Technologies). Les ADNc ont ensuite été transcrits en ARNc antisens et marqués avec un colorant fluorescent CTP-Cy3 pendant 2h à 40°C suivant le protocole du fabricant. Les cyanines marqués des ARNc ont été purifiés en utilisant un kit RNeasy Mini (QIAGEN). Les ARNc ont été hybridés sur 2 puces 66K du génome humain (Agilent Technologies) selon les protocoles standards Agilent. Tous les échantillons ont été hybridés simultanément. L’analyse des données a été réalisée avec le logiciel Rosetta Resolver (version 7.0 ; Solutions Ceiba, Cambridge, MA ) pour la gestion de base de données, le contrôle qualité et l'analyse. L’hybridation a eu lieu dans le service transcriptomique des laboratoires Servier (Dr Catherine Spire).

Les données de puces à ADN ont été analysées en utilisant le logiciel Genespring GX11.5 (Agilent Technologies, Santa 2 YL Wong et al. © 2014 Wiley Publishing Asie Pty Ltd Asie-Pac J Clin Oncol 2014 Clara, CA, USA). Les intensités de fluorescence ont été transformées en log, normalisées et préfiltrées pour supprimer les données de faible qualité. Le contrôle qualité des données a été évalué en utilisant l'analyse des composantes. Une liste de gènes significatifs a été identifiée avec une expression relative supérieure à 2 ou inférieure à -2. Le logiciel Ingenuity® et String® (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) ont été utilisés pour identifier les relations pertinentes, les interactions et les voies de signalisation.

119

III. Résultats

A. Changements morphologiques

La morphologie des cellules a été observée régulièrement afin de déterminer si des modifications apparaissaient suite aux traitements répétés à de faibles doses d’AFB1 ou de PhIP. Au cours des différents passages et traitements successifs, elles acquièrent une morphologie différente. En effet, autour du passage 28, il apparait un nouveau type cellulaire de forme allongée « fusiforme » dans les cultures exposées à l’AFB1. Quant aux cellules traitées par le PhIP, elles apparaissent au même passage, pour une très grande majorité, plus arrondies, plus étalées et plus larges que les cellules contrôles correspondantes (Figure 35). En effet, les cellules contrôles d’un même passage apparaissent de plus petite taille et forment un tapis de cellules épithéliales plutôt homogène comparativement aux cellules d’un passage plus précoce où les deux types cellulaires caractéristiques de la lignée HepaRG peuvent être distingués.

Ces observations morphologiques constituent un premier argument en faveur de l’acquisition de propriétés nouvelles par les cellules HepaRG associées à un traitement prolongé avec des cancérogènes génotoxiques.

Contrôle AFB1 PhIP

Cellules traitées 3 fois - Aucune évolution

Cellules traitées 13 fois - Changements morphologiques

Figure 35 : Morphologie des cellules HepaRG après 3 ou 13 expositions de 3 jours consécutifs chacune à 0,05 µM d’AFB1 ou 50 µM de PhIP ou maintenues sans traitement (contrôle). Chaque exposition de 3 jours correspond à un passage.

120

B. Étude de la croissance cellulaire

Une des caractéristiques des cellules cancéreuses est leur capacité à proliférer. Un comptage cellulaire après ensemencement a été réalisé sur 96 h et les résultats sont représentés Figure 36. Des comptages cellulaires ont été réalisés aux passages 14-15 et 30-33. Ils montrent qu’aux passages 30-33 les cellules exposées à l’AFB1 ou au PhIP présentent une cinétique de croissance statistiquement différente à partir de 72 heures après ensemencement pour les cellules exposées au PhIP et 96 heures après ensemencement pour les cellules exposées à l’AFB1. En effet, après 4 jours le nombre de cellules est notablement supérieur à celui des cellules contrôles aux passages équivalents. Aucun effet n’est observé après une ou deux expositions (passages 14-15). La cinétique de prolifération des cellules contrôles est comparable quel que soit le nombre de passages (Figure 36 A, B).

Figure 36 : Croissance des cellules HepaRG sur 96 h : A, cellules HepaRG aux passages 14-15 (R14-15) ayant subi une ou deux expositions à l’AFB1 et au PhIP; B, cellules HepaRG aux passages 30-33 (R30- 33). Les résultats représentent les moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes.*p<0,05 significativement différent des cellules contrôles (CTR).

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120,0 Figure 37 : Impact d’une exposition répétée 100,0 (chronique) à l’AFB1 et au CTR PhIP sur la migration R29 cellulaire mesurée grâce au 80,0 test de la cicatrisation. Dès AFB1 R29 30 heures, les cellules 60,0 HepaRG ayant été exposées pendant 3 jours, à PhIP 40,0 R29 chaque passage et ce sur 12 passages aux 2 produits

Pourcentagedecomblement (%) chimiques, migrent et 20,0 CTR R14 comblent plus rapidement la griffure par rapport à des 0,0 cellules n’ayant jamais été 0 20 40 60 80 100 exposées Temps (heures)

Figure 38 : Morphologie des cellules au cœur de la griffure lors du test de la cicatrisation (haut : 96 h après la griffure (fin du test de cicatrisation) ; bas : fixation et coloration hématoxyline-éosine, 72 h après la griffure).

122

C. Evaluation des propriétés invasives et migratoires

Le test de cicatrisation permet de mettre en évidence des capacités de migration et/ou de croissance cellulaire, caractéristiques de l’acquisition de propriétés tumorales. La Figure 37 montre une augmentation de la migration des cellules exposées de façon chronique à l’AFB1 ou au PhIP selon notre protocole par rapport aux cellules contrôles du même passage ou d’une culture au passage 14. En effet, après 96 heures, la griffure est comblée à 100% dans les cultures ayant été exposées alors que le comblement de la griffure des cultures contrôles du même passage (R29) ou d’un passage plus précoce (R14) n’est que de 80%. Que ce soit dans les cellules contrôles ou celles exposées à l’AFB1 ou au PhIP, la morphologie au centre de la griffure est différente; en effet, ces dernières adoptent une forme effilée pour les cellules ayant été exposées à l’AFB1 contrairement aux cellules exposées au PhIP qui, elles, sont plus rondes et larges (Figure 38).

Pour explorer l’hypothèse d’acquisition d’indépendance vis-à-vis du support, les cellules exposées 3 jours aux produit génotoxiques pendant près de 15 passages ont étés mises en culture dans de l’agar mou. Le témoin positif utilisé pour cette expérience est la lignée transformée HepG2 issue d’un hépatocarcinome. Les cellules HepaRG à un passage précoce ne forment pas de colonie sur agar, et sont utilisées comme témoin négatif. Après 15 jours de culture, la présence de nombreuses colonies de grande taille est constatée avec les cellules HepG2. Les cellules CTR à passage 30 forment également des colonies mais elles sont moins nombreuses et de petite taille comparées qu’à celles de cellules exposées au PhIP ou à l’AFB1. Les colonies de cellules exposées au PhIP atteignent des tailles supérieures à celles obtenues avec des cellules exposées à l’AFB1 (Figure 39).

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Figure 39 : Photographies des colonies formées par les cellules HepG2 et HepaRG à passages 30 (CTR, AFB1 et PhIP) après 3 semaines dans de l’agarose mou (microscope optique x 200).

124

D. Analyse transcriptomique

1. Evolution des cultures contrôles

Compte-tenu de l’évolution des cellules, en particulier à partir du 20ème passage, une analyse transcriptomique des cultures contrôles était nécessaire. Le nombre de gènes modulés entre les passages 13-14 et 29-30 avec un fold-change supérieur ou inférieur à 5 est de 584. De nombreux gènes sous-exprimés sont liés ou correspondent aux gènes spécifiques du métabolisme hépatique, que ce soit le métabolisme des xénobiotiques (CYPs, UGT,…) ou les métabolismes glucidique, lipidique ou protéique (aldolase B, apolipoprotéines, …) (Figure 40). Par ailleurs certains gènes comme OCT3/4 et HTERT, marqueurs de cellules souches sont augmentés au cours du temps. En revanche le gène codant l’E-cadhérine est diminué.

De façon générale, les changements entre les passages 13-14 et 20-21 vont dans le sens de l’évolution vers les passages 29-30.

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Figure 40 : Représentation d’après le logiciel en ligne STRING®, des relations entre les gènes les plus réprimés dans les contrôles des passages 29-30 versus 13-14. En rouge les gènes impliqués dans la fonction biologique majeure d’après gene ontology : single organism metabolic process.

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Les gènes les plus surexprimés n’ont en revanche pas de lien apparent, ni de fonction commune majeure (Figure 41). Certaines kératines (KRT) constituant le cytosquelette des cellules épithéliales sont nettement augmentées.

Figure 41 : Relation entre les gènes les plus surexprimés entre les contrôles des passages 29-30 versus 13-14.

2. Effets de l’AFB1 et du PhIP sur l’expression génique

Comme nous l’avons vu, si la morphologie des cellules HepaRG contrôles évolue au cours du temps et des passages successifs celle des cellules exposées au PhIP et à l’AFB1 après un même nombre de passages révèle des changements différents et l’acquisition de propriétés spécifiques.

Les analyses transcriptomiques confirment cette évolution différente des cultures contrôles et des cultures traitées. La Figure 42A indique le nombre de gènes dérégulés à la suite d’un ou deux traitements (R13-14) à l’AFB1 et au PhIP, 4-5 traitements (R20) à l’AFB1 ou environ 15 traitements avec les deux molécules (R29-30) par comparaison avec les contrôles correspondants. Les premières expositions ne permettent pas une distinction en fonction des traitements ; en effet le regroupement hiérarchique présenté Figure 42 B sépare les passages 13 et 14 d’une part et 20 et 21 d’autre part. En revanche, les cellules exposées 14 ou 15 fois

127 sur plusieurs passages se regroupent en fonction du traitement tel des dupliquats. Cela confirme l’acquisition de propriétés distinctes de celles de cellules contrôles et les cellules exposées au PhIP ou à l’AFB1. Cependant, les passages tardifs, quelle que soit la condition (traitement ou non), se regroupent et se distinguent des passages plus précoces confirmant ainsi l’évolution de la lignée au cours des repiquages.

Les cellules exposées sur 1 ou 2 passages à l’AFB1 ne présentent pas de différence notable (4 gènes dérégulés). Il en est de même aux passages 20-21 correspondant à 4-5 expositions (22 gènes). En revanche, 224 gènes sont dérégulés par rapport au contrôle au même passage à la suite des premiers traitements au PhIP. Sur ces 224 gènes, 181 sont réprimés. Il s’agit pour la plupart de gènes spécifiques des hépatocytes différenciés comme par exemple l’ALDB (aldolase B : -3.44), le CYP3A4 (-4.33), l’ALDH (aldéhyde déshydrogénase : -3.77) ou encore l’APOA2 (apolipoprotéine A-II : -4.64). En effet, les cellules ont été ensemencées à la suite de l’exposition de 3 jours aux molécules génotoxiques et les ARN récupérés 15 jours après pour l’analyse du transcriptome. Un retard de prolifération a été observé entraînant une confluence plus tardive et donc finalement un retard de différenciation qui pourrait expliquer au moins en partie les différences entre les cellules contrôles et les cellules exposées seulement une ou deux fois au PhIP. Par ailleurs d’autres gènes sont surexprimés comme le DDIT3 (DNA-Damage-Inducible Transcript : 4.22) et IFRD1 (Interferon-Related Developmental Regulator 1 : 3). Le 1er est un facteur de transcription qui joue un rôle essentiel dans le stress cellulaire et induit l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose en réponse au stress du reticulum endoplasmique (RE). Le second peut fonctionner comme un co-activateur ou répresseur transcriptionnel qui contrôle la croissance et la différentiation des cellules spécifiques durant le développement de l’embryogenèse et la régénération des tissues.

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Figure 42 : Analyse du transcriptome : A, nombre de gènes dérégulés en fonction des conditions expérimentales (traitements/passages) FC > 2 ou < -2 ; B, regroupement hiérarchique de l’analyse transcriptomique (toutes les conditions incluant les duplicatats sont représentées) ; C, diagramme de Venn représentant les gènes dérégulés communs aux passages 29-30 après exposition au PhIP et à l’AFB1 (FC >2 ou <2) ; D, Liste de gènes et les expressions relatives (FC) correspondants, les plus surexprimés et dérégulés par l’AFB1 et le PhIP aux passages 29-30.

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Après une quinzaine d’expositions 586 et 641 gènes sont modulés par l’AFB1 et le PhIP, respectivement; 359 sont communs aux 2 génotoxiques. L’analyse des fonctions cellulaires et moléculaires, utilisant IPA® identifie les gènes impliqués dans les mouvements cellulaires quelle que soit l’analyse (AFB1 et PhIP UP/DOWN, séparément ou liste de gènes communs)(Figure 43

Figure 43 A, B, C, D). La signalisation et l’interaction cellule-cellule, la prolifération et la croissance cellulaire, le métabolisme lipidique ainsi que la mort et la survie cellulaire sont les autres principales fonctions dans lesquelles les gènes dérégulés sont impliqués. Peu de gènes réprimés sont impliqués dans les principales fonctions moléculaires et cellulaires que sont le métabolisme des médicaments, la synthèse protéique, le cycle cellulaire, les mouvements cellulaires, la réplication, la recombinaison et la réparation de l’ADN.

Les gènes dérégulés par l’AFB1 et le PhIP aux passages 29-30 sont impliqués dans la néoplasie cellulaire et les métastases (Figure 44 A, D et Figure 45 A, B). S’ajoute à cela l’invasion des cellules tumorales et la prolifération des cellules cancéreuses pour les cellules exposées à l’AFB1 (Figure 44 B, C).

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Figure 43 : Fonctions moléculaires obtenues par le logiciel IPA® et nombres de gènes dérégulés rattachés à ces fonctions. A, liste de gènes à la fois « up et down » régulés par l’AFB1 et le PhIP aux passages 29-30 ; B, liste de gènes communs aux deux conditions de traitement ; C, liste de gènes surexprimés; D, liste de gènes réprimés (FC >2, < -2).

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A B C

Figure 44 : Voies d’intérêt dérégulées : néoplasie cellulaire (A), invasion des cellules tumorales (B),

prolifération des cellules cancéreuses (C) et

métastases (D) prédites pour être augmentées en fonction des gènes dérégulés par l’AFB1 selon IPA®. Les liens entre ces fonctions et les gènes sont expliqués dans la légende ; les couleurs rouge

(up) et verte (down) sont de différentes nuances en

fonction du degré de l’expression relative par rapport au contrôle.

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A B

Figure 45 : Voies d’intérêt dérégulées, néoplasie cellulaire (A) et métastases (B) prédites pour être augmentées en fonction des gènes dérégulés par le PhIP selon IPA®. Les liens entre ces fonctions et les

gènes sont expliqués dans la légende ; les couleurs rouge (up) et verte (down) sont de différentes nuances en fonction du degré de l’expression relative.

Lorsqu’on s’intéresse de plus près à cette analyse transcriptomique, quelques gènes paraissent particulièrement intéressants. La décorine (DCN) est fortement surexprimée par rapport au contrôle du même passage (AFB1 : x468 ; PhIP : x76). Cependant elle s’effondre au cours du temps c’est-à-dire entre le passage 13-14 et 29-30 (x -130). La décorine est donc néanmoins augmentée par l’AFB1 par rapport au passage jeune et très largement par rapport aux contrôles aux passages tardifs.

De la même façon le gène VEFGC (vascular endothelial growth factor C) diminue mais faiblement au cours du temps et est largement surexprimé à la suite des expositions successives à l’AFB1 (x18.53) et au PhIP (x22).

Certains gènes stables au cours du temps dans les contrôles sont augmentés avec l’AFB1 et le PHIP. C’est le cas de F2R (facteur de coagulation II (thrombine), AFB1 : x4.49, PhIP : x2.78), d’ITGB4 (intégrine β-4, AFB1 : x2.2, PhIP : 2x.61) et de l’oncogène FOS (FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog, AFB1 : 3x.36, PhIP : x2.63).

133

IV. Discussion

Cette première étude sur les effets à long-terme de deux composés génotoxiques de référence sur les cellules hépatiques humaines HepaRG a permis de montrer que ces cellules peuvent acquérir des propriétés de cellules transformées mais aussi de préciser leur évolution au-delà du 20ème passage, considéré comme étape-clé dans l’apparition de diverses modifications phénotypiques. Dans ce travail, le protocole de culture cellulaire « classique » a été modifié pour obtenir le meilleur compromis entre différentiation, temps et capacité proliférative puisque les cellules sont maintenues 3 semaines sans ajout de DMSO avec une exposition aux deux composés génotoxiques les 3 derniers jours. En effet, il est bien établi que l’ajout du DMSO augmente la différentiation mais aussi engage les cellules vers un processus de vieillissement engendrant ainsi la perte de capacité des cellules à proliférer. Progressivement autour du 20ème passage, une réduction du nombre de cellules « granulaires », capables de se différencier en hépatocytes a été constatée. L’analyse transcriptomique a révélé une perte d’expression de gènes caractéristiques des cellules hépatiques (ALDOB, CYP3A4, APOC3) et une surexpression de gènes tels que BGT2, OCT3/4 et HTERT qui pourrait traduire une perte de différenciation et la présence d’un plus grand nombre de cellules pluripotentes à caractère souches ou de progéniteurs. La présence de cellules de plus petites tailles avec un ratio noyau/cytoplasme élevé soutient cette hypothèse (Ratajczak et al., 2012). Une forte diminution de l’expression de l’E-cadhérine est également observée. Selon Pan et al. (2007), cette expression diminuée peut refléter un état de vieillissement des cellules souches. Des études complémentaires plus approfondies sont nécessaires pour comprendre l'évolution intrinsèque de la lignée. Néanmoins nos observations indiquent bien la nécessité de prendre en compte cette évolution dans l’analyse des altérations observées après des expositions prolongées à des produits chimiques sur plusieurs passages. Cela n’a pas été le cas pour une étude similaire sur des cellules épithéliales buccales immortalisées exposées à du B(a)P et repiquées sur plus de 100 passages, la comparaison ayant été limitée aux cellules initiales non exposées (Zhong et al., 2008).

Dans notre étude, nous avons exposé les cellules HepaRG à des doses non cytotoxiques d’AFB1 et de PhIP. Tous deux nécessitent une activation métabolique pour exercer leur effets génotoxiques mais les CYP impliqués sont différents : CYP3A4 pour l’AFB1 et CYP1A1/1A2 pour le PhIP (Josse et al., 2008; Dumont et al., 2010b). De plus, alors que le premier est un hépatocancérogène avéré, le second est seulement un cancérogène possible pour l'homme. Si la dose de 0,05 µM d’AFB1 est, elle, non génotoxique après une seule exposition (Le Hegarat et

134 al., 2010; Josse et al., 2012; Le Hegarat et al., 2014), 50 µM de PhIP induit des dommages à l’ADN (Dumont et al., 2010b; Le Hegarat et al., 2010). Alors que la dose d’AFB1 peut représenter une réelle dose d’exposition humaine (Aydin et al., 2013), la concentration de PhIP (50 µM ≈ 10 mg/g) est supérieure puisque l’exposition via la nourriture varie de quelques ng/g à quelques centaines de ng/g pour une portion de poulet bien grillé (Felton et al., 1997). Cependant, selon les habitudes alimentaires et les techniques de cuisson, la quantité quotidienne d’amine aromatique hétérocyclique ingérée peut beaucoup varier d’un individu à l’autre (Keating and Bogen, 2001).

La morphologie des cellules semblent avoir évolué différemment au cours des expositions successives à ces composées. Les cultures exposées à l’AFB1 présentent des zones assez étendues de cellules de forme allongée, ce qui soulève quelques questions : est-ce l’apparition d’une nouvelle population cellulaire ou bien le signe d’une adaptation morphologique d’une seule population face à l’agression toxique ? Le test de la griffure apporte un élément de réponse à ces questions. En effet, lors du recouvrement du tapis cellulaire griffé, ce sont toutes les cellules aux deux extrémités de la griffure qui adoptent cette forme allongée afin de combler plus rapidement la griffure et pas seulement celles ayant déjà cette morphologie. Cette forme effilée laisse suggérer une adaptation particulière des cellules face à l’exposition : le développement d’une architecture mésenchymateuse par un processus de transition épithélio- mésenchymateuse (TEM). Certaines observations permettent déjà d’appuyer cette idée, tels que l’augmentation pour les 2 toxiques, de l’expression relative de TWIST2, FN1 (fibronectine 1) et POSTN (Periostin, Osteoblast Specific Factor), et la diminution de IL1B, gènes impliqués dans la TEM (Figure 46).

Figure 46 : Voie de signalisation de la TEM d'après IPA® : TWIST2, FN1 et POSTN sont surexprimés tandis que IL1B est réprimé. Les flèches oranges représentent une activation ; les flèches bleues, une inhibition.

135

Cependant, ces modulations sont présentes avec les deux génotoxiques alors que les cellules exposées au PhIP ne présentent pas cette morphologie allongée. Par ailleurs, il est à noter qu’excepté le gène POSTN, les autres gènes indiqués ci-dessus sont réprimés au cours du temps dans les contrôles. Ces résultats sont donc à prendre avec précaution et nécessitent plus d’exploration. De même, pour les cellules HepaRG exposées chroniquement aux toxiques, l’expression de l’E-cadhérine, normalement diminuée dans la TEM, est certes diminuée par rapport aux cellules contrôles R14 mais reste supérieure par rapport aux cellules contrôles du même passage (R30). Cette diminution d’ARN est cependant transitoire dans la TEM (Wang et al., 2013) .

La morphologie acquise par les cellules exposées chroniquement au PhIP ressemble étrangement aux cellules d’un passage précoce. En effet, par rapport aux cellules contrôles et même celles exposées à l’AFB1, ces cellules ont moins perdu l’expression d’APOC3 et d’ALDOB. En présence de DMSO, ces cellules sont capables de se différentier et de résister face à l’exposition de ces produits chimiques contrairement aux cellules contrôles du même passage (résultats non montrés). Comme des cellules de passage 14-15, ces cellules auraient la capacité de survivre face au DMSO et de potentialiser la différentiation cellulaire. S’agirait-il d’un mécanisme de défense acquis au fur et à mesure des expositions au PhIP ou la sélection d’une population cellulaire résistante ?

Bien que les cellules exposées chroniquement à l’AFB1 et au PhIP soient de morphologies différentes, les cellules acquièrent des propriétés transformées identiques. L’exposition chronique des cellules HepaRG à l’AFB1 et au PhIP, leur ont permis d’acquérir une capacité de croissance cellulaire plus élevée. Une mesure préliminaire du cycle cellulaire en cytomètre en flux permet d’avancer l’hypothèse d’un cycle plus court surtout pour les cellules exposées au PhIP (Figure 47), ce qui confirmerait une croissance plus élevée pour ces cellules.

136

Figure 47 : Mesure de la durée du cycle cellulaire (données préliminaires)

L’analyse de l’expression génique confirme cette observation. En effet, l’expression relative de gènes tels que C-MYC ou C-MET, impliqués dans la prolifération cellulaire, est augmentée en comparaison à celle des témoins au passage équivalent alors que l’expression de BTG2, gène régulant négativement le cycle cellulaire en réponse à des dommages à l’ADN et à d’autres stress (Ficazzola et al., 2001), est significativement diminuée. La diminution de BTG2, 15 jours après réensemencement (et donc 15 jours après exposition) pourrait refléter une activité du cycle cellulaire non ralentie malgré l’augmentation des dommages à l’ADN.

Par ailleurs, l’AFB1 est connu pour induire une mutation sur le codon 249 du gène suppresseur de tumeur TP53. D’ailleurs celle-ci est très fortement corrélée aux tumeurs hépatiques dans les pays où l’exposition à l’AFB1 est importante (Coursaget et al., 1993; Gouas et al., 2009; Shirabe et al., 2011). Une exposition unique d’AFB1 provoque une accumulation dose dépendante du nombre de cellules en phase S en vue des réparations et ceci est fonction de l’expression de TP53. Dans notre étude, il est probable que l’AFB1 ait induit une mutation de TP53 abrogeant ses fonctions de gène suppresseur de tumeur ce qui permettrait aux cellules de passer les points de contrôle du cycle cellulaire, de proliférer plus rapidement et d’accumuler les erreurs (Kew, 2013). Il serait donc intéressant de rechercher les mutations de TP53 par séquençage.

Dans l’expérience du wound healing, nous observons un comblement plus rapide de la griffure pour les cellules exposées chroniquement par comparaison aux cellules contrôles du même passage ou d’un passage précoce. La question est de savoir si cette différence s’explique par une capacité de croissance plus élevée, ou par une capacité migratoire acquise par les

137 expositions répétées aux génotoxiques. Si les cellules exposées au PhIP ont la capacité de proliférer plus vite que celles exposées à l’AFB1, elles ont toutes deux le même pouvoir de combler la cicatrice. Serait-ce une capacité à migrer plus vite qui compenserait celle à proliférer moins rapidement ? Une hypothèse pour expliquer le comblement aussi rapide est celle de la TEM, un évènement majeur dans la migration cellulaire dont nous avons déjà évoqué les modifications (Gos et al., 2009). En effet la morphologie au centre n’est pas sans nous rappeler ce phénomène. Une expérience d’immunomarquage à la vimentine, protéine des filaments intermédiaires présente dans la plupart des cellules d'origine mésenchymateuse et à l’E- cadhérine, molécule d'adhérence cellule-cellule présente dans la très grande majorité des cellules épithéliales, pourrait être envisagée pour valider cette hypothèse.

Par ailleurs, dans les deux cas, le gène VEGFC est surexprimé. La protéine associée est active dans l'angiogenèse et la croissance des cellules endothéliales. La surexpression de l’ARNm est souvent associé au cancer de mauvais pronostic car en lien avec les métastases (Xiang et al., 2009; Zhuang et al., 2013).

La décorine, très fortement surexprimée par l’AFB1 et le PhIP, est également liée à la migration des cellules cancéreuses et l'angiogenèse. Cette protéine est un élément de la matrice extracellulaire (ECM), membre de la famille des petits protéoglycanes riches en leucine (SLRP). La protéine est constituée de 3 oligosaccharides et d’une chaine glycosaminoglycane (GAG) de type CS/DS (chondroïtine sulphate/dermatane sulphate). Il existe plusieurs sites de liaison entre le collagène et la décorine induisant différents effets sur l’organisation des fibres (Orgel et al., 2009). De manière intéressante, la décorine est impliquée dans le cancer mais de façon contradictoire. Alors que de nombreuses études lui confèrent des propriétés anti-cancéreuses en prévenant la croissance des cellules tumorales et des métastases et en diminuant les facteurs pro-angiogéniques, d’autres font part de ses capacités pro-tumorigènes (Bi and Yang, 2013; Sofeu Feugaing et al., 2013). Ces 2 propriétés antagonistes de la décorine pourraient dépendre d’une modification de la structure chimique de ce protéoglycane. En effet, la décorine associée aux tumeurs s'est révélée contenir des quantités importantes de séquences de DS par rapport au CS (Skandalis et al., 2006). La décorine affecte l’angiogenèse par induction de la prolifération des cellules endothéliales et l'activation de voies intracellulaires. L'induction de l'expression de la décorine dans des cellules endothéliales angiogéniques favorise un phénotype mobile dans un environnement riche en collagène I en activant l'IGF-IR (insulin-like growth factor-I receptor) et en influençant l’activité de l'intégrine α2β1 (Fiedler et al., 2008). En revanche, dans divers cancers, la décorine peut agir comme agent anti-métastatique, prévenant

138 la migration, la mobilité et l’invasion des cellules cancéreuse (Shintani et al., 2008; Buraschi et al., 2010; Bi et al., 2012)

La plupart de ces études sont basées sur le taux protéique et non sur l’ARNm. Il serait important de vérifier par western blot la quantité de protéine dans les cellules transformées par l’AFB1 et le PhIP par rapport au contrôle du même passage voire d’un passage précoce avant de conclure quant à l’impact de ce fort taux d’ARNm. Néanmoins, une étude a fait le lien entre un fort taux d’expression de l’ARNm lors d’un stade précoce de leucémies lymphoïdes chroniques à l’inverse des stades avancés qui présentaient un niveau très faible (Campo et al., 2006). Dans notre étude, le fort taux de transcrits de la décorine pourrait être en lien avec un stade précoce de transformation.

Par ailleurs d’autres gènes sont impliqués dans la cancérogenèse. Le gène F2R code le récepteur du facteur de coagulation II (thrombine), récepteur couplé aux protéines G, qui lorsqu’il est surexprimé, est impliqué dans le caractère métastatique de certains cancers comme ceux du sein, de la prostate et les mélanomes (Shi et al., 2004; Salah et al., 2007; Hernandez et al., 2009). La protéine TWIST associée à l’EMT est impliquée dans sa régulation (Feng et al., 2009). L’ITGB4 contribue à la progression du cancer en stimulant la transcription et la translation de gènes relatifs au cancer comme VEGF en activant la voie de signalisation mTOR La protéine ITGB4 est retrouvée dans le sérum de patients atteints de carcinome hépatocellulaire (Uemura et al., 2003). La protéine c-FOS est un facteur de transcription nucléaire et forme avec c-JUN, le complexe transcriptionnel AP-1. Il a été rapporté qu’une autre mycotoxine, l’ochratoxin A induisait une proliferation cellulaire et la promotion de tumeur cutané chez les souris en activant AP-1 (Kumar et al., 2013)

Ces dérégulations géniques qu’elles soient importantes (DCN) ou non (FOS, ITGB4 etc….) peuvent être associées à une atteinte du caryotype. Des études préliminaires réalisées en partenariat avec le Dr Florian Cabillic (Laboratoire de Cytogénétique et Biologie Cellulaire) suggèrent l’apparition d’une monosomie du chromosome 15 dans les cellules transformées par le PhIP et une duplication sur un des chromosomes 8 dans les cellules transformées par l’AFB1. Aucune différence n’a été observée dans les cellules contrôles au passage 30.

139

Figure 48 : Analyses préliminaires des caryotypes des cellules transformées par l'AFB1 et le PhIP à passage 30 par rapport aux cellules contrôles où les anomalies présentes sur les cellules HepaRG au passage 14 sont retrouvées.

Une banque d’ARNm a été récoltée au fur et à mesure des passages et des expositions, ce qui pourra permettre de prendre en compte les étapes de la cancérogenèse. Le taux de protéines associés pourra également être évalué pour voir la correspondance avec les ARNm.

Le test de croissance sur agar a permis de mettre en évidence la capacité des cellules transformées par les deux produits chimiques à croître sans support. Un comptage préliminaire indique la formation de plus grandes colonies par les cellules exposées chroniquement au PhIP et un plus grand nombre de colonies par celles exposées à l’AFB1. Enfin, il serait pertinent de vérifier le potentiel tumoral des cellules traitées par injection chez des souris immunodéprimées. En effet il a déjà été rapporté la capacité de cellules à croître sur agar mou à former des tumeurs solides sous-cutanés dans des souris nude (Liu et al., 2008; Wang et al., 2008; Zhong et al., 2008)

Au total, cette approche originale d’exposition à de faibles doses de génotoxiques de la lignée HepaRG après des traitements répétés sur une quinzaine de passages est en faveur de l’acquisition de propriétés tumorales par ces cellules, comme le montrent les altérations morphologiques, la croissance cellulaire, la croissance sur agar, les résultats du test de wound healing et la dérégulation de certains gènes associés au cancer. Des études supplémentaires sont nécessaires afin d’identifier d’éventuels biomarqueurs de cancérogenèse et d’établir les étapes de transformation à la suite d’expositions à des contaminants environnementaux.

140

Discussion générale & Perspectives

La toxicité des xénobiotiques et particulièrement celle des contaminants de l’environnement constitute un problème majeur de santé publique. La prise en compte récemment de la toxicité chronique des faibles doses et des mélanges implique de nouveaux moyens pour évaluer ces risques. Les limites de l’expérimentation animale conduisent à rechercher des approches in vitro reposant sur des modèles cellulaires humains représentatifs des cellules in vivo dont elles dérivent. S’agissant des hépatocytes il est nécessaire de disposer de modèles métaboliquement compétents et stables afin de pouvoir évaluer les effets d’expositions répétées prolongées. Les hépatocytes humains en culture primaire ne répondant que partiellement à un tel besoin car ils ne sont pas métaboliquement stables, ont une durée de vie limitée et ne prolifèrent pas. De plus, les différences fonctionnelles inter-individuelles sont exagérées du fait de leur origine (obtention à partir de foies pathologiques) et des conditions de prélèvement et de conservation de la pièce chirurgicale avant sa dissociation. Les cellules HepaRG établies depuis quelques années au laboratoire et aujourd’hui largement utilisées au niveau international permettent de lever ces réserves. Quelques études ont montré qu’elles peuvent représenter un modèle pertinent pour évaluer la toxicité aiguë et chronique de contaminants de l’environnement individuellement et/ou en mélange, par exemple des amines hétérocycliques aromatiques (Dumont et al., 2010b). Dans une première partie de nos travaux, nous avons étendu et confirmé les données concernant la stabilité des cellules HepaRG différenciées à confluence, qui reposaient principalement sur l’analyse des enzymes de biotransformation et leur réponse à des inducteurs et des inhibiteurs de référence. Une analyse du transcriptome au cours des 14 jours suivant la différenciation de cellules, a montré une grande stabilité de l’expression des gènes ; une surexpression limitée étant seulement observée pour certains gènes codant des enzymes de biotransformation ou liées au métabolisme lipidique, ce qui reflète un vieillissement cellulaire en accord avec une étude précédente ayant mis en évidence une augmentation de l’activé de la « senescent beta galactosidase » au cours du temps à confluence (Pernelle et al., 2011). Ce maintien de la capacité fonctionnelle des cellules HepaRG à confluence a été confirmé par l’analyse transcriptomique et la réponse à des traitements répétés à trois agonistes des PPARs.

L’association de pathologies cancéreuses ou non à des contaminants de l’environnement repose principalement sur des études épidémiologiques. Les études in vitro réalisées jusqu’ici, ont surtout porté sur des expositions brèves à des concentrations relativement élevées de

141 composés. Elles ont apporté des informations importantes sur leurs effets majeurs et parfois sur leur mécanisme d’action. Dans une seconde partie, nous avons recherché si des expositions répétées à de faibles doses individuellement ou en mélange, pouvaient permettre de détecter des effets qui ne pouvaient l’être après des expositions aiguës. L’étude de deux pesticides organochlorés, l’endosulfan et le méthoxychlore, a permis de montrer que leur cytotoxicité augmente avec le temps d’exposition et qu’un effet synergique est obtenu avec le mélange binaire. Des données originales ont également été acquises par l’analyse de deux CYPs majeurs impliqués dans leur métabolisme, les CYP3A4 et 2B6. En effet, il a tout d’abord été démontré que l’endosulfan augmente le taux d’ARNm du CYP3A4 alors qu’il inhibe de manière directe l’activité correspondante. D’autre part, alors qu’en mélange les deux pesticides exercent un effet additif sur l’activité du CYP3A4, leurs effets sur celle du CYP2B6 résultent d’un antagonisme. Ces effets sont conservés après 14 jours de traitements répétés. Ainsi des interactions peuvent intervenir et engendrer des effets toxiques non prévisibles. Alors qu’il semble admis que la toxicité d’un mélange représente la somme des effets individuels (IGHRC, 2009) ces résultats prouvent que des interactions peuvent survenir entre des pesticides ainsi qu’entre d’autres contaminants comme précédemment montré avec deux amines aromatiques hétérocycliques, PhiP et MeIQX (Dumont et al., 2010b). Dans la mesure où les deux pesticides étudiés sont des activateurs des facteurs nucléaires PXR et CAR qui régulent les CYP3A4 et 2B6 ainsi que bien d’autres gènes et que d’autre part ces facteurs sont modulés par de nombreux autres substrats exogènes et endogènes, on peut conclure que ces pesticides peuvent altérer la réponse à de nombreux autres substrats en réduisant leur métabolisme. Selon que ces substrats sont directement toxiques ou après biotransformation, leurs toxicité/effets seront différents. Ces résultats constituent un solide argument pour la poursuite de telles études dans la mesure où des mélanges simples peuvent éclairer sur les mécanismes d’action et les effets de chaque pesticide et sur leurs interactions potentielles. Néanmoins, il convient de souligner qu’il n’est pas possible de mimer de manière satisfaisante la situation d’exposition in vivo dans la mesure où celle-ci correspond à une exposition concomitante à de nombreux contaminants (parfois plusieurs dizaines) et que la composition ainsi que les quantités relatives peuvent grandement évoluer au cours du temps. Des tests de screening à haut débit pourraient faciliter l’évaluation de mélanges complexes de contaminants.

L’induction d’un cancer est un processus multi-étapes sur une durée qui peut être de quelques dizaines d’années in vivo. L’évaluation du pouvoir cancérogène d’un composé chimique pose donc beaucoup de difficultés. Ainsi, de nombreux pesticides ne sont pas classés comme

142 cancérogènes dans la classification du CIRC. C’est le cas pour l’endosulfan et le méthoxychlore alors que ceux-ci sont connus pour être génotoxiques (Reuber, 1980; Oberly et al., 1993; Bajpayee et al., 2006; Hashizume et al., 2010). Il est vraisemblable que beaucoup de contaminants agissent par l’induction de modifications épigénétiques (Hou et al., 2012). De par ses caractéristiques uniques, la lignée HepaRG pourrait constituer un modèle cellulaire approprié pour évaluer le potentiel cancérogène des contaminants de l’environnement car une exposition chronique sur plusieurs passages peut être envisagée. Dans une troisième partie, nous avons testé la faisabilité d’une telle étude avec deux composés génotoxiques de référence, l’AFB1 et le PhIP en retenant un protocole répondant au meilleur compromis entre capacité proliférative et différenciation. Nos résultats montrent que l’exposition des cellules HepaRG à l’AFB1 et au PhIP sur plusieurs passages a induit l’apparition de propriétés de cellules transformées après environ 10 expositions successives soit un temps de 30 semaines, notamment des modifications morphologiques, une capacité de migration et de croissance sur agar. L’analyse transcriptomique a permis de mettre en évidence des gènes d’intérêt, mais de plus amples analyses doivent être menées avant de déterminer la robustesse de ceux-ci en tant qu’éventuels biomarqueurs de transformation. Le projet Européen récent « Carcinogenomics » avait pour objectif de découvrir de tels biomarqueurs après exposition pendant 15 jours de différents types cellulaires à des cancérogènes génotoxiques ou non. Il n’a pas réellement abouti. L’exposition pendant une période trop courte peut sans doute expliquer le manque de résultats concluants. Notre étude ne constitue qu’une première étape, certes encourageante mais des travaux complémentaires sont nécessaires pour déterminer si nos cellules ont acquis une mutation de TP53 et si l’injection sous-cutanée des cellules transformées par l’AFB1 et le PhIP dans les souris nude conduira à la formation de tumeurs. La question de la reproductibilité des résultats est également une question primordiale. Une deuxième expérience indépendante en cours d’achèvement confirme largement les résultats de la première. Au vu de l’ensemble des résultats, nous pouvons conclure que le modèle des cellules HepaRG apparait pertinent pour des études de cancérogénèse. L’évaluation du potentiel cancérogène de contaminants non génotoxiques peut également être envisagé dans le but d’observer l’apparition d’altérations épigénétiques et d’en évaluer les conséquences. Des modifications du protocole expérimental pourront bien entendu être réalisées mais la comparaison avec des cellules non traitées aux mêmes passages devra être la règle, compte-tenu de leur évolution propre; une comparaison jusqu’ici habituellement négligée par d’autres auteurs ayant utilisé des lignées de cellules non hépatiques.

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Publications supplémentaires

I. En révision

Different dose-dependent mechanisms are involved in early cyclosporine A- induced cholestatic effects in HepaRG cells Ahmad Sharanek*,§, Pamela Bachour-El Azzi*,§, Houssein Al-Attrache*,§, Camille C. Savary*,§, Christiane Guguen-Guillouzo*,§ and André Guillouzo*,§

Mechanisms involved in drug-induced cholestasis in humans remain poorly understood. Although cyclosporine A (CsA) and tacrolimus (FK506) share similar immunosuppressive properties, only CsA is known to cause dose-dependent cholestasis. Here, we have investigated the mechanisms implicated in early cholestatic effects of CsA using the differentiated human HepaRG cell line. Inhibition of efflux and uptake of taurocholate was evidenced as early as 15 minutes and 1 hour respectively after addition of 10 µM CsA; it peaked at around 2 hours and was reversible. These early effects were associated with generation of oxidative stress and deregulation of cPKC pathway. At higher CsA concentrations (≥50 µM) alterations of efflux and uptake activities were enhanced and became irreversible, pericanalicular F-actin microfilaments were disorganized and bile canaliculi were constricted. These changes were associated with induction of endoplasmic reticulum stress that preceded generation of oxidative stress. Accordingly, genes encoding hepatobiliary transporters and bile acid synthesis enzymes were differently deregulated depending on CsA concentration. By contrast, FK506 induced limited effects only at 25-50 µM and did not alter bile canaliculi. Our data demonstrate involvement of different concentration-dependent mechanisms in CsA- induced cholestasis and point out a critical role of endoplasmic reticulum stress in the occurrence of the major cholestatic features.

Impact of inflammation on chlorpromazine-induced cytotoxicity and cholestatic features in HepaRG cells.

Pamela Bachour-El Azzi*, Ahmad Sharanek*, Ziad Abdel-Razzak, Sebastien Antherieu+, Houssein Al-Attrache, Camille C. Savary, Sylvie Lepage, Isabelle Morel, Gilles Labbe, Christiane Guguen-Guillouzo and Andre Guillouzo. Several factors are thought to be implicated in the occurrence of idiosyncratic adverse drug reactions. The present work aimed to question as to whether inflammation is a determinant factor in hepatic lesions induced by chlorpromazine (CPZ) using the human HepaRG cell line. An inflammation state was induced by a 24 hours exposure to pro- inflammatory cytokines IL-6 and IL-1β; then the cells were treated with CPZ and/or cytokine for 24 hours or daily for 5 days. The inflammatory response was attested by induction of C-reactive protein and IL-8 transcripts and proteins as well as inhibition of CPZ metabolism and expression of CYP3A4 and CYP1A2 mRNA, two major CYPs involved in its metabolism. After 5 days, co-treatment with either cytokine or CPZ

165 moderately increased cytotoxicity and transcripts of oxidative stress-related genes compared to CPZ or cytokines alone, while inhibition of taurocholic acid efflux and pericanalicular F-actin distribution were not affected. However, down-regulation of mRNA and activity of NTCP, a key transporter involved in bile acids uptake, and deregulation of several other transporters were amplified by co-treatment. Altogether our results show that an inflammation state induced by pro-inflammatory cytokines pretreatment, aggravated to a certain extent, cytotoxicity and some cholestatic features induced by the idiosyncratic drug CPZ in HepaRG cells. Inhibition of CYP activities and NTCP, which is also involved in hepatitis B and D virus entry, could have important consequences if extrapolated to the in vivo situation.

Biokinetics of chlorpromazine in primary rat and human hepatocytes and human HepaRG cells after repeated exposure

Jessica J.W. Broeders1a *, Céline Parmentier2*, Germaine L. Truisi3,5*, Rozenn Jossé4*, Eliane Alexandre2, Camille C.Savary4, Philip G. Hewitt3, Stefan O. Mueller3,5, André Guillouzo4, Lysiane Richert2, Jan C.H. van Eijkeren6, Joop L.M. Hermens1, Bas J. Blaauboer1

Since drug induced liver injury is difficult to predict in animal models, more representative tests are needed to better evaluate these effects in humans. Existing in vitro systems hold great potential to detect hepatotoxicity of pharmaceuticals. In this study, the in vitro biokinetics of the model hepatotoxicant chlorpromazine (CPZ) were evaluated in three different liver cell systems after repeated exposure in order to incorporate repeated-dose testing into an in vitro assay. Primary rat and human hepatocytes, cultured in sandwich configuration and the human HepaRG cell line were treated daily with CPZ for 14 days. Samples were taken from medium, cells and well plastic at specific time points after the first and last exposure. The samples were analysed by HPLC-UV. Based on cytotoxicity assays, the three models were tested at 1- 2 µM CPZ, while the primary rat hepatocytes and the HepaRG cell line were in addition exposed to a higher concentration of 15-20 µM. Overall, the mass balance of CPZ decreased in the course of 24 h, indicating the metabolism of the compound within the cells. The largest decrease in parent compound was seen in the primary cultures; in the HepaRG cell cultures the mass balance only decreased to 50%. CPZ accumulated in the cells during the 14-day repeated exposure. At the 15-20 µM CPZ concentrations, formation of lamellar bodies, typical of phospholipidosis was observed. Possible explanations for the accumulation of CPZ are a decrease in metabolism over time, inhibition of efflux transporters or binding to phospholipids. The biokinetics of CPZ differed between the three liver cell models and were influenced by specific cell properties as well as culture conditions. These results support the conclusion that in vitro biokinetics data are necessary to better interpret chemical-induced cytotoxicity data.

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II. Prochainement soumis

G.L. Truisi *, G. Pomponio *, C. Parmentier *, C.C. Savary*,R. Josse , E. Di Consiglio, F. Bois, B. Lauer, P.G Hewitt, S. O Mueller, L. Richert, A. Guillouzo, E. Testai. Implementation of biokinetics after repeated ibuprofen exposure in rat and human in vitro systems. (*co-premiers auteurs)

P.Bellwon*, C. Parmentier*, C.C. Savary*, T. Schmidt*, G. L Truisi*, F. Bois, W. Dekant, A. Guillouzo, P.G. Hewitt, S.O. Mueller, L.Richert, E. Testai. Toxicokinetics of ciclosporin A in hepatic cell systems and their potential to reflect the in vivo situation. (*co-premiers auteurs)

G.Pomponio*, C.C. Savary*, C. Parmentier*, A. Guillouzo,F. Bois,L. Richert, E. Di Consiglio, and E. Testai. In vitro modelling of amiodarone biokinetics in two different hepatic models of human origin. (*co-premiers auteurs)

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Etude de la toxicité chronique et du potentiel cancérogène de contaminants de l’environnement séparément et en mélange sur les cellules hépatiques humaines HepaRG

L’Homme est exposé tout au long de sa vie à de nombreux contaminants présents dans l’environnement et l’alimentation généralement à faibles doses et en mélanges. L’évaluation des risques pose problème dans la mesure où il est bien établi qu’il existe des différences de réponse entre l’homme et l’animal. Quelle que soit la voie d’exposition, de par son rôle majeur dans la biotransformation des xénobiotiques, le foie est considéré comme un organe cible pour de nombreuses classes de produits chimiques potentiellement cytotoxiques, génotoxiques voire cancérogènes. Nous avons utilisé la lignée de cellules hépatiques humaines HepaRG non transformées pour évaluer la toxicité chronique et/ou le pouvoir cancérogène de pesticides et de composés génotoxiques présents dans l’environnement. Cette lignée est la seule connue pour avoir conservé des propriétés proches des hépatocytes humains en culture primaire. Dans une première partie nous avons confirmé le maintien de ses capacités fonctionnelles à confluence par l’analyse du transcriptome et de la biocinétique de 4 médicaments, après traitements quotidiens pendant 14 jours. Nous avons ensuite recherché les effets de mélanges de pesticides après des expositions aiguës et répétées. Nous avons ainsi montré que : 1. l’isomalathion, une impureté majeure du malathion, joue un rôle prépondérant sur la toxicité hépatique de ce dernier et qu’il inhibe la carboxylesterase impliquée dans le métabolisme des deux composés; 2. l’endosulfan et le méthoxychlore, deux organochlorés métabolisés par les CYP3A4 et 2B6, agissent de manière synergique sur leur cytotoxicité après une exposition unique ou répétée. De plus, alors que l'activité du CYP3A4 est inhibée de manière réversible par l’endosulfan, le méthoxychlore l’augmente. En revanche, l’activité du CYP2B6 est induite par les deux pesticides. Lorsqu’ils sont en mélange équimolaire un effet additif ou antagoniste est observé sur l'activité du CYP3A4 et du CYP2B6 respectivement quelle que soit la durée de l’exposition. Enfin, dans une troisième partie, nous avons exposé des cellules HepaRG pendant une quinzaine de passages à de faibles doses de deux contaminants génotoxiques nécessitant une bioactivation, l’aflatoxine B1 et une amine aromatique hétérocyclique, le PhiP, et démontré l’acquisition de propriétés de cellules transformées (par exemple croissance sur agar, migration dans le test de griffure et surexpression de gènes associés au cancer). Au total, nos résultats démontrent tout l’intérêt que représente la lignée hépatique humaine HepaRG métaboliquement compétentes pour l’étude de la toxicité chronique et/ou le potentiel cancérogène des contaminants de l’environnement. Ils ont permis de mettre en évidence d’interactions entre des pesticides en mélanges binaires et pour la première fois d’analyser le potentiel cancérogène de contaminants génotoxiques dans une lignée hépatique humaine.

Mots-clés : contaminants de l’environnement, toxicité chronique, mélanges, cancérogenèse, cellules HepaRG

Study of chronic toxicity and carcinogenic potential of environmental contaminants separately and in mixture in human hepatic HepaRG cells

Humans are exposed throughout their life to many environmental and food contaminants, usually at low doses and in mixtures. Risk assessment remains questionable as it is well established that there are differences in the response to chemicals between humans and animals. Regardless of the route of exposure, due to its major role in xenobiotic biotransformation, the liver is considered as a target organ for many classes of chemicals potentially cytotoxic, genotoxic or carcinogenic. We used the HepaRG cell line to evaluate chronic toxicity and/or carcinogenicity of pesticides and genotoxic compounds. This cell line is the only one known to exhibit properties similar to those of human hepatocytes in primary culture. In the first part we confirmed the maintenance of functional capacities of these cells at confluence by transcriptomic and biokinetic analysis of several drugs after a 14-day treatment. We then investigated the effects of mixtures of pesticides after acute and repeated exposures. We showed that : 1. Isomalathion, a major impurity of malathion, played a leading role on liver toxicity and inhibited carboxylesterase that is involved in the metabolism of these two compounds; 2. Endosulfan and methoxychlor, two organochlorines, metabolized by CYP3A4 and CYP2B6, acted synergistically on their cytotoxicity after single or repeated exposure. Moreover, whereas activity of CYP3A4 was reversibly inhibited by endosulfan and increased by methoxychlor. By contrast, CYP2B6 activity was induced by these two pesticides while in equimolar mixtures, they caused additive or antagonistic effects on CYP3A4 and CYP2B6 activities respectively, regardless of the duration of exposure. Finally, in the third part, we exposed HepaRG cells for up to 15 passages to low doses of two genotoxic contaminants which required bioactivation, aflatoxin B1 and heterocyclic aromatic amine, PhIP, and demonstrated the appearance of properties of transformed cells (e.g. growth on agar, cell migration in the wound healing test and overexpression of a number of genes associated with cancer). Altogether, our results demonstrate the great potential interest that represents the metabolically competent human liver cell line HepaRG for the study of chronic toxicity and/or carcinogenic potential of environmental contaminants. They highlight possible interactions between pesticides in binary mixtures and for the first time, demonstrate that the carcinogenic potential of genotoxic contaminants can be analyzed in an human hepatic cell line.

Key words: environmental contaminants, chronic toxicity, chemical mixture, carcinogenesis, HepaRG cells