UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

CÂMPUS DE BOTUCATU

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

ESTRUTURA FLORAL DE REPRESENTANTES DA TRIBO

CRANICHIDEAE (: )

SÉRGIO AKIRA ADACHI

PROFª. DRª. MARIA DAS GRAÇAS SAJO ORIENTADORA

PROF. DR. FÁBIO DE BARROS COORIENTADOR

Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas

(Botânica), AC: Morfologia e Diversidade

Vegetal

BOTUCATU - SP - 2015 -

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSANGELA APARECIDA LOBO-CRB 8/7500 Adachi, Sérgio Akira. Estrutura floral de representantes da tribo (Orchidoideae: Orchidaceae) / Sérgio Akira Adachi. - Botucatu, 2015

Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências de Botucatu. Orientadora: Maria das Graças Sajo Coorientador: Fábio de Barros Capes: 20302037

1. Orquídea. 2. Flores – Morfologia. 3. Flores – Anatomia. 4. Polinização. 5. Botânica - Morfologia

Palavras-chave: Cranichidinae; Goodyerinae; Morfologia Floral; Orchidaceae; Spiranthinae.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP – Botucatu), seu corpo docente e técnico-administrativo, por permitirem a realização deste trabalho.

Aos docentes e técnicos-admininstrativos do departamento de Botânica pela agradável convivência e pela ajuda em diversos momentos.

Ao Centro de Microscopia Eletrônica da UNESP – Botucatu, seus supervisores e equipe técnica pelo auxílio no preparo e processamento de amostras.

À Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), seu corpo docente, técnico- administrativo e discente, que permitiram e auxiliaram no desenvolvimento de parte deste trabalho.

À FAPESP e à CAPES, pelas bolsas de doutorado regular e doutorado sanduíche (PDSE) concedidas, sem as quais este trabalho não poderia ter sido desenvolvido.

À Dra. Maria das Graças Sajo, pela orientação, pela confiança, pelos ensinamentos, pela amizade e por manter meu foco ao longo do desenvolvimento deste trabalho.

Ao Dr. Fábio de Barros pela continuidade na orientação desde o mestrado, pelos ensinamentos, pela confiança e amizade.

Aos pesquisadores da UNAM Dr. Gerardo Adolfo Salazar Chávez, Dra. Lidia Irene Cabrera Martínez e Dra. Teresa Terrazas da UNAM, por me receberem em seus laboratórios durante o estágio sanduíche, em especial ao Dr. Salazar por sua dedicada supervisão e ensinamentos.

À Dra. Sílvia Rodrigues Machado, pela orientação durante o mestrado e pela amizade e ensinamentos compartilhados até hoje.

À Dra. Elza Maria Guimarães Santos pela amizade e ensinamentos compartilhados.

Aos amigos e colegas de pós-graduação, de departamento e de laboratório por todas as trocas de conhecimentos e pela alegria em todos os momentos.

III

Aos amigos da UNAM (Ana, Caro, Clau, Gabi, Miguel, Rosa e Sylvia) por dividirem seus conhecimentos sobre as orquídeas, por me ensinarem sobre a cultura mexicana e pela grande amizade.

Aos amigos Fábio, Felipe e Luís pela convivência e amizade ao longo da pós-graduação.

À Camila pelo imenso apoio nesta fase final da tese e pela alegria e felicidade compartilhadas.

Aos amigos de longa data André, César, Emerson, Fernanda, Karina, Pedro, Thiago e Vivian por fazerem parte da família que ganhei em Botucatu e por todos os momentos que vivemos.

As minhas irmãs e irmãos que chegaram por convergência de caminhos, Clívia, Danilo, Yve e Yvan, por todo o carinho, amizade, momentos de alegria, conselhos e broncas.

A minha família por tudo o que aprendi ao longo da vida, em especial a meus pais, que sempre acreditaram, apoiaram e nunca mediram esforços para me ajudarem a realizar meus sonhos.

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“I learned that orchis do not always have the decency to behave as botanists say they should.” Robert L. Dressler

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SUMÁRIO

RESUMO – ...... 8

ABSTRACT – ...... 10

INTRODUÇÃO GERAL ...... 12

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 14

CAPÍTULO I: CARACTERÍSTICAS ANATÔMICAS FLORAIS RELACIONADAS À POLINIZAÇÃO EM CRANICHIDINAE, GOODYERINAE E SPIRANTHINAE (CRANICHIDEAE: ORCHIDOIDEAE: ORCHIDACEAE)...... 20

RESUMO ...... 21

INTRODUÇÃO ...... 22

MATERIAL E MÉTODOS ...... 24

RESULTADOS ...... 25

DISCUSSÃO ...... 30

CONCLUSÕES ...... 34

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 35

TABELAS E FIGURAS ...... 40

CAPÍTULO II: MICROMORFOLOGIA DA COLUNA E DO LABELO DE s.l. (SPIRANTHINAE, ORCHIDACEAE) ...... 59

RESUMO ...... 60

INTRODUÇÃO ...... 61

MATERIAL E MÉTODOS ...... 63

RESULTADOS ...... 63

DISCUSSÃO ...... 65

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 69

TABELAS E FIGURAS ...... 73 VI

CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 82

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 84

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ADACHI, S. A. ESTRUTURA FLORAL DE REPRESENTANTES DA TRIBO CRANICHIDEAE (ORCHIDOIDEAE: ORCHIDACEAE) 2015. 95P. TESE (DOUTORADO) – INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA, BOTUCATU.

RESUMO - Orchidaceae é uma das maiores famílias de angiospermas; possui distribuição cosmopolita e encontra-se bem representada no território brasileiro, aparecendo em todos os tipos de formação vegetal. É facilmente reconhecível pela presença de flores zigomorfas, caracterizadas principalmente pela presença de uma pétala modificada e pela fusão parcial do androceu com o gineceu levando à formação de estruturas particulares nesses verticilos. A família encontra-se subdividida em cinco subfamilías e, dentro da subfamília Orchidoideae Endl., a tribo Cranichideae abrange cerca de 100 gêneros e 1.800 espécies predominantemente terrícolas, sendo subdividida em oito subtribos: Chloraeinae, Cranichidinae, Galleotiellinae, Goodyerinae, Manniellinae, Pterostylidinae, Discyphinae e Spiranthinae. As espécies desta tribo geralmente apresentam flores tubulares e modificações particulares, porém carecem de caracteres morfológicos “chave” para sua identificação. Considerando a escassez de estudos sobre características florais e sua relação com a polinização na tribo Cranichideae, o objetivo deste trabalho foi analisar a micromorfologia e a anatomia floral de espécies pertencentes às subtribos Cranichidinae, Goodyerinae e Spiranthinae, com ênfase em estruturas relacionadas ao processo de polinização (labelo, nectário, viscídio e polínia), visando uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nesse processo. Além disso, considerando a controversa circunscrição do gênero Cyclopogon, foi analisada a micromorfologia do labelo e da coluna de representantes do gênero incluídos em Cyclopogon s.l. (Cyclopogon, Cocleorchis, Warscaea, Stigmatosema e Beadlea) em busca de caracteres que auxiliem na interpretação sobre a atual subdivisão do gênero. As espécies analisadas possuem ovário unilocular com placentação parietal, com ou sem a presença de tricomas; labelo com epiderme composta por células papiliformes cônicas ou em forma de domo, e presença de estruturas consideradas nectários com células parenquimáticas apresentando grande quantidade de grãos de amido; as polínias são farináceas ou sécteis. Viscídio com superfície dorsal adesiva está presente somente em espécies da subtribo Spiranthinae pertencentes à aliança Pelexia, sendo que as outras subtribos, e demais espécies de Spiranthinae, apresentaram viscídio com face adesiva na superfície ventral. A presença de tégula nas espécies de Goodyerinae aqui estudadas, incluindo Zeuxine strateumatica, anteriormente caracterizada como não possuindo esta estrutura, contribui para a inclusão de mais um 8 provável caráter diagnóstico para a subtribo; já a presença de um hâmulo rudimentar em C. apricus, S. fasciculata e S. elatum (Spiranthinae) pode explicar a origem da posição dorsal do viscídio. Por ser um grupo numeroso no qual as flores apresentam estruturas diversificadas e adaptadas a diferentes grupos de polinizadores, a morfologia estrutural do labelo, viscídio, anteras e polínias é, em geral, a mesma encontrada na família, indicando a presença de possíveis homologias e homoplasias resultantes da pressão exercida pelos polinizadores. Quanto às características das espécies de Cyclopogon s.l., observa-se que, apesar das flores analisadas possuírem pétalas e sépalas com morfologia semelhante, algumas características estruturais do labelo e do ápice do rostelo são particulares de determinadas espécies. Com relação ao ápice do rostelo, observa-se uma morfologia variada após a remoção do polinário nas flores estudadas, entretanto, tal variação não parece estar relacionada a diferenças funcionais, já que o mesmo mecanismo de polinização, executado por abelhas da família Halictidae, é descrito para espécies típicas de Cyclopogon e também para espécies associadas a Warscaea e Beadlea.

Palavras-chave: Cranichidinae, Cyclopogon, Goodyerinae, morfologia floral, Spiranthinae.

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ADACHI, S. A. 2015. FLORAL STRUCTURE OF MEMBERS OF CRANICHIDEAE TRIBE (ORCHIDOIDEAE: ORCHIDACEAE) 2015. 95P. (PhD. THESIS) INSTITUTE OF BIOSCIENCES, SÃO PAULO STATE UNIVERSITY – UNESP, BOTUCATU.

ABSTRACT - Orchidaceae, one of the largest angiosperms families, has a worldwide distribution and is well represented in Brazil, growing in all types of vegetation. It is easily recognizable by the presence of zygomorphic flowers, characterized mainly by the presence of a modified petal and partial fusion of the androecium with ginoecium leading to the formation of particular structures in these whorls. The family is composed by five subfamilies and within the subfamily Orchidoideae Endl., the tribe Cranichideae includes about 100 genera and 1,800 species predominantly terrestrial, being subdivided into eight sub-tribes: Chloraeinae, Cranichidinae, Galleotiellinae, Goodyerinae, Manniellinae, Pterostylidinae, Discyphinae, and Spiranthinae. The species of this tribe usually have tubular flowers and particular changes, but lack morphological "key" characteristics that allows their recognition. Considering the lack of studies on floral characteristics and its relationship with pollination in tribe Cranichideae, the objective of this study was to analyze the morphology and anatomy of floral species of the sub-tribes Cranichidinae, Goodyerinae and Spiranthinae, with emphasis on structures related to the pollination process (lip, nectary, viscidium and pollinia), to better understand the mechanisms involved in this process. Moreover, considering the controversial circunscription of the genus Cyclopogon, the micromorphology of the lip and column were analyzed for representatives included in Cyclopogon s.l. (Cyclopogon, Cocleorchis, Warscaea, Stigmatosema, and Beadlea), looking for characters that aid in the interpretation of the current division of the genus. The analyzed species have unilocular ovary with parietal placentation, with or without the presence of trichomes; lip epidermis consisting of conical or domed papilliform cells, and the presence of structures considered nectaries with parenchyma cells presenting large amount of starch grains; the pollinia are mealy or sectile. Viscidium with adhesive dorsal surface is present only in the subtribe Spiranthinae in species belonging to the Pelexia alliance, whereas the other subtribes, and remaining species of Spiranthinae, have an adhesive ventral surface. The presence of tegula in the studied species of Goodyerinae, including Zeuxine strateumatica, characterized before by not having this structure, contributes to the inclusion of another probable diagnostic character for the subtribe, and the presence of a rudimentary hamulus in C. apricus, S. fasciculata and S. elatum (Spiranthinae) can explain the origin of dorsal viscidium position. Being a large group

10 in wich the flowers have diverse structures adapted to different groups of pollinators, the structural morphology of the lip, viscidium, anther, and pollinia is usually the same found in the family, indicating the presence of possible homologies and homoplasies resulting from pollinator pressure. Regarding the characteristics of the species Cyclopogon s.l., despite analyzed flowers presented petals and sepals with similar morphology, some structural features of the lip and apex of the rostellum are particular to certain species. With respect to the rostellum apex, there is a diverse morphology after pollinarium removal on the studied flowers, however, such variation does not appear to be related to functional differences, since the same mechanism of pollination, performed by Halictidae bees, is described for typical Cyclopogon species and for species associated to Warscaea and Beadlea.

Key words: Cranichidinae, Cyclopogon, Goodyerinae, floral morphology, Spiranthinae.

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INTRODUÇÃO GERAL

A mais recente atualização da classificação da família Orchidacae apresenta a tribo Cranichideae composta por cerca de 100 gêneros e 1.800 espécies, distribuídas em oito subtribos: Chloraeinae, Cranichidinae, Galleotiellinae, Goodyerinae, Manniellinae, Pterostylidinae, Discyphinae e Spiranthinae (Chase et al. 2015). No Brasil esta tribo encontra- se representada pelas subtribos Cranichidinae, Goodyerinae, Discyphinae e Spiranthinae (Pridgeon et al. 2003, Barros et al. 2010, Salazar et al. 2014). Cranichideae é constituída por plantas pequenas com raízes suculentas, fasciculadas ou dispersas ao longo de um rizoma; folhas em roseta e flores predominantemente de formato tubular com viscídio terminal e polínias farináceas ou sécteis (Salazar et al. 2003). Estas características, também ocorrem em outros grupos da família, por este motivo, a tribo não apresenta caracteres morfológicos “chave” que permitam a sua identificação. A subtribo Cranichidinae apresenta como características principais a presença de coluna pontiaguda, algumas vezes unida ao labelo ou às pétalas, e polínias frágeis e clavadas; Goodyerinae usualmente apresenta rizoma herbáceo, coluna curva e polínias sécteis com viscídio mais ou menos evidente; em Spiranthinae, as margens do labelo unem-se com a base da coluna formando um nectário profundo, e as polínias são macias e granulosas (Dressler 1993, Pridgeon et al. 2003). Um dos problemas relacionados com a taxonomia da subtribo Cranichidinae é a definição das subtribos Cranichidinae e/ou Prescottiinae. Os gêneros Aa Rchb.f., Altensteinia Kunth, Gomphichis Lindl., Myrosmodes Rchb.f., Porphyrostachys Rchb.f., Prescottia Lindl. ex Hook. e Stenoptera C.Presl. foram segregados por Dressler (1993) em Prescottiinae que, segundo o autor, difere de Cranichidinae pelo tipo de velame, estrutura das polínias, formato do rostelo e ausência de viscídio com hâmulo (Rasmussen 1982). Entretanto as características que separam Prescottiinae de Cranichidinae são compartilhadas por representantes de outras subtribos, como as Spiranthinae, e, provavelmente, representam simplesiomorfias para o grupo (Salazar et al. 2003). Além disso, dentro da tribo Cranichideae, somente Cranichidinae e Prescottiinae apresentam flores não ressupinadas, razão pela qual formavam um único grupo na classificação de Dressler (1981). O estudo de Chase et al. (2003) alterou a posição taxonômica de Prescottiinae incluindo seus representantes dentro da subtribo Cranichidinae, concordando, deste modo, com a proposta de Dressler (1981). Estudos filogenéticos (Salazar et al. 2003, 2009, Álvarez- Molina & Cameron 2009) concluíram que a subtribo Prescottiinae

12 não é monofilética e apresenta duas linhagens evolutivas distintas, sendo necessária uma reclassificação para a mesma. Dentro da subtribo Goodyerinae são necessários mais estudos e a monofilia de diversos gêneros como atualmente circunscritos é considerada improvável (Chase et al. 2015). A subtribo Spiranthinae, encontra-se dividida em quatro clados principais: Stenorrynchos, Pelexia, Eurystyles/Lankesterella e Spiranthes (Salazar et al. 2003). Os autores confirmaram a monofilia da subtribo e destacaram a necessidade de reexaminar os caracteres morfológicos das espécies, especialmente os atributos relacionados ao rostelo e viscídio, para uma melhor classificação das mesmas. É tradicionalmente reconhecido que a variação morfológica observada nas flores das orquídeas encontra-se intimamente associada aos processos de polinização (Barros 1990, Dressler & Chase 1995, Maad & Nilsson 2004). Entretanto, estudos recentes têm demonstrado que outros aspectos, como polinização por engodo e hibridização, também atuaram na diversificação do grupo (Cozzolino & Widmer 2005, Peakall 2010), reforçando a necessidade de se conhecerem aspectos morfológicos particulares, encontrados em determinados representantes. Considerando as variações observadas no rostelo, anteras e polínias das Orchidoideae, o presente trabalho pretende analisar a morfologia e a anatomia floral, em espécies das tribos Cranichideae (subtribos Spiranthinae, Goodyerinae e Cranichidinae), com os objetivos de: a. Atualizar os conhecimentos disponíveis sobre a família, apresentando novas observações sobre seus órgãos reprodutivos. b. Descrever e interpretar a organização das estruturas diretamente relacionadas à polinização (nectário, labelo, viscídio, antera e polínias), visando entender os mecanismos envolvidos nesse processo, nas diferentes espécies. c. Analisar a micromorfologia do labelo e da coluna de representantes de Cyclopogon s.l., buscando-se obter um melhor entendimento das características que suportam a aliança Pelexia e definem a circunscrição atual do gênero.

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REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Orchidaceae, uma das maiores e mais diversificadas famílias das Angiospermas, abriga cerca de 800 gêneros e 25.000 espécies (Chase et al. 2003). Atualmente são reconhecidos 736 gêneros e, anualmente, são descritos uma média de 13 novos gêneros para a família, porém a maioria é constituída por espécies segregadas de outros gêneros e não baseada na descoberta de novos táxons (Chase et al. 2015). Encontra-se representada no Brasil por mais de 2.000 espécies, distribuídas em 235 gêneros (Barros et al. 2010). Seus representantes possuem hábito predominantemente epifítico, embora também possam ser encontrados representantes terrícolas, rupícolas e saprofíticos (mico-hetrotróficos) (Dressler 1993). Apresenta distribuição cosmopolita, mas possui maior número de representantes em ambientes tropicais e subtropicais (Dressler 1981). Por possuírem estruturas vegetativas particulares (ramos caulinares transformados em pseudobulbos, folhas de morfologia e consistência variadas e raízes portadoras de velame) e apresentarem crescimento monopodial e simpodial, as orquídeas ocuparam diferentes ambientes (Hoehne 1949), estando presentes em todos os ecossistemas brasileiros. Devido à escassez de registros fósseis precisos (Conran et al. 2009), a provável origem da família é atribuída ao período Cretáceo superior (76-84 m.a.), com base no fóssil de uma espécie de abelha extinta (Meliorchis caribea) portando polínias aderidas ao escutelo. Seu centro de origem é o continente Africano e tanto a radiação como a diversificação, de suas espécies, ocorreram após o período de extinções do Cretáceo-Terciário (Ramirez et al. 2007). As Orchidaceae pertencem à ordem (Chase et al. 2000) e formam um grupo irmão dos demais representantes do clado (Chase et al. 2006; Givnish et al. 2006; Graham et al. 2006) embora seu relacionamento intra-familiar ainda esteja sendo investigado (Dressler 1981, 1993; Whitten et al. 2000; Kores et al. 2000, 2001; Salazar et al. 2003, Chase et al. 2003, Chase et al. 2015). Apesar de alguns trabalhos reconhecerem apenas três subfamílias de orquídeas, com base no número e grau de fusão das anteras ao gineceu (e.g. Dahlgren et al. 1985), os resultados moleculares sumarizados em Chase et al. (2003) mostram que elas compreendem um grande grupo, dividido em cinco subfamílias: Apostasioideae, Vanilloideae, Cypripidioideae, Orchidoideae e Epidendroideae, indicando que a redução de três para uma única antera fértil ocorreu pelo menos duas vezes, durante a história evolutiva do grupo (Chase et al. 2003).

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Representa um grupo facilmente reconhecível por possuir flores fortemente zigomorfas, nas quais androceu e gineceu encontram-se, parcialmente, fundidos formando o ginostêmio ou coluna (Dressler 1993). Tal zigormorfia também é decorrente da presença de estaminódios, e/ou da supressão completa do estame abaxial, e de uma pétala mediana modificada, o labelo, geralmente acompanhado por estruturas diversas, como nectários em forma de esporões cilíndricos. Também a ressupinação do ovário e/ou do pedicelo, observada na maioria das espécies, contribui para o aspecto altamente modificado das flores da família (Box et al. 2008) que, em geral, possuem apenas uma antera funcional transportando grãos de pólen aglutinados em polínias. Na coluna, o estigma, geralmente côncavo, encontra-se separado da antera funcional por uma estrutura mais ou menos membranácea, o rostelo, que nada mais é do que um lobo do estigma modificado, cuja função principal é impedir a autofecundação (Szlachetko & Rutkowski 2000). O ovário é ínfero e o fruto, uma cápsula, abre-se através de fendas laterais liberando numerosas e diminutas sementes (Barros 1990; Dressler & Chase 1995; Pinheiro et al. 2004; Ruschi 1997; Souza & Lorenzi 2005). A complexa organização da coluna (ginostêmio) determinou a utilização de termos particulares, para definir as estruturas de transferência do pólen (Rasmussen, 1982), especialmente para as espécies que possuem polinários mais complexos. Por exemplo, viscídio se refere à estrutura, derivada do rostelo, responsável pela adesão das polínias ao polinizador em grande parte das espécies (Rasmussen 1982); estipe, também derivado do rostelo, representa o eixo que sustenta as polínias; já as caudículas são originadas dentro da antera e não são formadas por tecido vegetal, mas apenas pela mesma substância que une os grãos de pólen. As polínias podem possuir apenas caudículas, ou formar polinários compostos de polínias + viscídio ou polínias + estipe + viscídio. Os estipes são chamados tégulas, quando originados de uma modificação da epiderme do rostelo, ou hâmulo, quando provêm do ápice recurvado do rostelo (Rasmussen 1982). Apesar da diversidade fenotípica, encontrada nos órgãos florais desses representantes e da terminologia incomum associada a esses órgãos (Rudall & Bateman 2002), o arranjo básico de suas peças é típico das flores das monocotiledôneas e as peculiaridades de suas partes encontram-se associadas, principalmente, aos recursos produzidos para atrair diferentes polinizadores, especialmente néctar, óleos, fragrâncias e pseudopólen (Dressler 1993). Também a variação morfológica observada nas flores das orquídeas encontra-se intimamente associada aos processos de polinização (Barros 1990; Dressler & Chase 1995; Maad & Nilsson 2004). Entretanto, estudos recentes têm demonstrado que outros aspectos, como

15 polinização por engodo e hibridização, também atuaram na diversificação do grupo (Cozzolino & Widmer 2005; Peakall 2010), reforçando a necessidade de se conhecerem aspectos morfológicos particulares, encontrados em determinados representantes. Apesar de ser um grupo extenso e diversificado e de possuir flores com adaptações morfológicas específicas, poucos são os trabalhos que abordam o desenvolvimento floral em Orchidaceae (Kocyan & Endress 2001; Kurzweil 1987a,b, 1993, 1998, 2000; Kurzweil & Kocyan 2002; Johansen & Frederiksen 2002; Luo & Chen 2000; Kurzweil et al. 2005; Bateman et al. 2006; Box et al. 2008). As demais pesquisas tratam, em geral, de aspectos florais específicos, como pólen (Schill & Pfeiffer 1977; Newton e Williams 1978; Pacini & Hesse 2002), morfologia do polinário (Johnson & Edwards 2000), das polínias (Freudenstein & Rasmussen 1997), da coluna (Szlachetko & Rutkowski 2000) ou descrevem a embriologia (Wirth & Withner 1959, Yeung 2005) de determinados representantes. Dentro da família, o perianto apresenta um padrão de desenvolvimento inicial, em geral, similar (Kurzweil 1987a, b, 1993, 1998, 2000; Kurzweil et al. 2005; Luo & Chen 2000) e as diferenças observadas nesses verticilos somente se estabelecem nas etapas finais da ontogênese dos diferentes representantes (Pabón-Mora & González 2008). Estudos interpretando a possível homologia do labelo e mostrando suas variações estruturais são escassos, podendo ser ressaltados os trabalhos de Swamy (1948), Vermeulen (1959 e 1966), Pabón-Mora & González (2008) e Rudall et al. (2013). Além disso, a existência de poucos trabalhos, relacionando polinização e morfologia floral torna difícil entender a biologia das espécies e o papel funcional das estruturas reprodutivas (Figueroa et al. 2012). O ginostêmio, resultante da fusão parcial androceu-gineceu, pode apresentar modificações como a observada em algumas Orchidoideae nas quais as duas aurículas (estruturas localizadas lateralmente à antera fértil) são interpretadas como estames adaxiais estéreis (estaminódios) (Kurzweil, 1987 a,b). Dentre os três carpelos que também compõem o ginostêmio, o mediano forma o rostelo, estrutura mais ou menos membranácea que separa a antera do estigma, e os laterais formam a superfície receptiva do estigma (Kurzweil, 1987 a). Já a estrutura dos nectários é analisada junto com a dinâmica de produção do néctar (Stpiczynska & Matusiewicz 2001; Figueiredo & Pais 1992) e sua reabsorção (Stpizynska 2003; Stpizynska et al. 2003), não existindo pesquisas que relacionem a presença dessas estruturas a grupos taxonômicos específicos. A subfamília Orchidoideae, com mais de três mil espécies predominantemente terrícolas, ocorre em todos os continentes, exceto a Antártica (Dressler 1993; Pridgeon et al.

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2001, 2003), e seus representantes apresetam inflorescências terminais, com flores pouco vistosas nas espécies neotropicais. Apresentam um único estame que transporta apenas uma antera fértil e erecta, com polínias farináceas (tétrades agrupadas por elastoviscina em estrutura uniforme) ou sécteis (tétrades agrupadas por elastoviscina subdivididas em pequenos pacotes denominados mássulas). Em Orchidoideae, até o presente momento, nenhum estudo conseguiu resolver a relação das quatro tribos reconhecidas (Orchideae, Codonorchideae, Diurideae e Cranichideae), sendo que inúmeras mudanças no nível genérico dentro da subfamília são resultados dos estudos filogenéticos em andamento (Chase et al. 2015). A tribo Cranichideae compreende cerca de 100 gêneros e 1.800 espécies, distribuídas em oito subtribos: Chloraeinae, Cranichidinae, Galleotiellinae, Goodyerinae, Manniellinae, Pterostylidinae, Discyphinae e Spiranthinae (Chase et al. 2015). No Brasil, esta tribo encontra-se representada pelas subtribos Cranichidinae, Goodyerinae, Discyphinae e Spiranthinae (Pridgeon et al. 2003, Barros et al. 2010, Salazar et al. 2014). Não foram reconhecidas, até o presente momento, sinapomorfias morfológicas para todas as subtribos de Cranichideae, porém algumas características permitem separá-las umas das outras: em Cranichidinae a coluna é pontiaguda e, algumas vezes, unida com o labelo ou com as pétalas, e as polínias são frágeis e clavadas; Goodyerinae usualmente tem um rizoma herbáceo, coluna curva e polínias sécteis com viscídio mais ou menos evidente; em Spiranthinae, as margens do labelo unem-se com a base da coluna formando um nectário profundo, e as polínias são macias e granulosas (Dressler1993; Pridgeon et al. 2003). Um dos problemas relacionados com a taxonomia da subtribo Cranichidinae é a definição das subtribos Cranichidinae e/ou Prescottiinae. Em 1993, Dressler segregou os gêneros Aa Rchb.f., Altensteinia Kunth, Gomphichis Lindl., Myrosmodes Rchb.f., Porphyrostachys Rchb.f., Prescottia Lindl. ex Hook. e Stenoptera C.Presl em Prescottiinae que, segundo o autor, difere de Cranichidinae pelo tipo de velame, pela estrutura das polínias, pelo formato do rostelo e ausência de viscídio com hâmulo (Rasmussen 1982). Entretanto as características que separam Prescottiinae de Cranichidinae são compartilhadas por representantes de outras subtribos, como as Spiranthinae, e, provavelmente, representam simplesiomorfias para o grupo (Salazar et al. 2003). Além disso, dentro da tribo Cranichideae, somente Cranichidinae e Prescottiinae apresentam flores não ressupinadas, razão pela qual formavam um único grupo na classificação anterior de Dressler (1981). Estudos filogenéticos (Salazar et al. 2003, 2009; Álvarez- Molina & Cameron 2009) concluíram que a subtribo Prescottiinae não é monofilética e apresenta duas linhagens evolutivas distintas, sendo

17 necessária uma reclassificação para a mesma, assim como para a subtribo Spiranthinae. O estudo de Chase et al. (2003) alterou a posição taxonômica de Prescottiinae incluindo seus representantes dentro da subtribo Cranichidinae, concordando, deste modo, com a proposta de Dressler (1981). A situação em Goodyerinae ainda requer uma quantidade maior de estudos e a monofiletismo de diversos gêneros como atualmente circunscritos é considerado improvável (Chase et al. 2015). Discyphinae recentemente proposta (Salazar et al. 2014) foi criada para incluir uma única espécie antes descrita como Spiranthes scopulariae pertencente anteriormente a subtribo Spiranthinae, porém com diversas peculiaridades em sua morfologia vegetativa e floral. Em relação à subtribo Spiranthinae, o estudo filogenético realizado por Salazar et al. (2003), dividiu o grupo em quatro clados principais: clado Stenorrynchos, clado Pelexia, clado Eurystyles/Lankesterella e clado Spiranthes. Os autores confirmaram a monofilia da subtribo e destacaram a necessidade de reexaminar os caracteres morfológicos das espécies, especialmente os atributos relacionados ao rostelo e viscídio, para uma melhor classificação das mesmas.

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De acordo com as normas para apresentação de Teses e Dissertações do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Botânica) do IBB - UNESP, os capítulos desta tese deverão ser apresentados em forma de artigos seguindo as normas da revista selecionada para publicação.

Desta forma, o capítulo 1 está redigido segundo as normas da revista Botanical Journal of the Linnean Society e o capítulo 2 segundo a revista Phytotaxa.

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CAPÍTULO 1

(A ser submetido ao periódico Botanical Journal of the Linnean Society)

CARACTERÍSTICAS ANATÔMICAS FLORAIS RELACIONADAS À POLINIZAÇÃO EM CRANICHIDINAE, GOODYERINAE E SPIRANTHINAE (CRANICHIDEAE: ORCHIDOIDEAE: ORCHIDACEAE)

SÉRGIO AKIRA ADACHI*, FÁBIO DE BARROS E MARIA DAS GRAÇAS SAJO

1Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista – UNESP, Distrito de Rubião Júnior s/nº, Caixa Postal 510, CEP: 18618-970, Botucatu-SP, Brasil; E-mail: [email protected] 2 Seção do Orquidário, Instituto de Botânica, Av. Miguel Stéfano 3687, Água Funda, CEP 04301-902, São Paulo-SP, Brasil. 3Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista – UNESP, Avenida 24A, 1515 Bela Vista, CEP 13506-900, Rio Claro-SP, Brasil.

*Autor para correspondência: [email protected]

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RESUMO

A tribo Cranichideae compreende cerca de 100 gêneros e 1.200 espécies, sendo representada no Brasil pelas subtribos Cranichidinae, Goodyerinae, Discyphinae e Spiranthinae. Até o momento, não são reconhecidas sinapomorfias morfológicas para todas as subtribos, embora alguns caracteres possam identificá-las. Os objetivos deste trabalho foram analisar a morfologia e a anatomia floral de representantes da tribo Cranichideae (subtribos Spiranthinae, Goodyerinae e Cranichidinae), visando atualizar os conhecimentos disponíveis sobre a família, apresentar novas observações sobre seus órgãos reprodutivos e descrever e interpretar a organização das estruturas diretamente relacionadas à polinização (nectário, labelo, viscídio e polínias). A ressupinação das flores, decorrente da torção de 180º no ovário, de Cranichidinae é o caráter principal para separar essa subtribo das demais. A presença de tégula nas espécies de Goodyerinae, incluindo Zeuxine strateumatica, antes caracterizada como não possuindo tégula, contribui para a inclusão de mais um caráter diagnóstico para a subtribo. Em representantes da aliança Pelexia (Spiranthinae), a presença de uma estrutura semelhante a um hâmulo rudimentar pode explicar a origem da posição dorsal do viscídio. A morfologia estrutural do labelo, do viscídio, das anteras e das polínias é, em geral, a mesma encontrada na família, indicando a presença de possíveis homologias e homoplasias resultantes da pressão exercida pelos polinizadores.

PALAVRAS-CHAVE ADICIONAIS: hâmulo, morfologia floral, viscídio, tégula

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INTRODUÇÃO

Orchidoideae, com mais de três mil espécies predominantemente terrícolas, ocorre em todos os continentes, exceto pela Antártica (Dressler, 1993; Pridgeon et al., 2001, 2003). Seus representantes possuem inflorescências terminais com flores pouco vistosas e portando um único estame que transporta apenas uma antera fértil e ereta, com polínias farináceas (tétrades agrupadas por elastoviscina em estrutura uniforme) ou sécteis (tétrades agrupadas por elastoviscina subdivididas em pequenos pacotes denominados mássulas). A subfamília abrange dois subclados: um formado pelas tribos Orchideae e Codonorchideae e outro, por Cranichideae e Diurideae (Chase et al., 2015). Nesse grupo, é comum a presença de variações florais (Kurzweil et al., 2005; Box et al., 2008; Luo & Chien, 2000) que, em muitos casos, não estão bem investigadas. Na tribo Cranichideae, por exemplo, o rostelo, a antera e as polínias dispõem-se paralelamente ao eixo da coluna (geralmente perpendiculares nas demais Orchidaceae) enquanto que em Orchideae, o rostelo é espessado, a antera é fixa e as polínias são sécteis (rostelo membranáceo, antera caduca e polínias consistentes nas demais Orchidaceae). A tribo Cranichideae compreende cerca de 100 gêneros e 1.800 espécies, distribuídas em oito subtribos: Chloraeinae, Cranichidinae, Galleotiellinae, Goodyerinae, Manniellinae, Pterostylidinae, Discyphinae e Spiranthinae (Chase et al., 2015) sendo que no Brasil encontra-se representada pelas subtribos Cranichidinae, Goodyerinae, Discyphinae e Spiranthinae (Pridgeon et al., 200; Barros et al., 2010; Salazar et al., 2014). Não foram reconhecidas, até o momento, sinapomorfias morfológicas para todas as subtribos de Cranichideae, embora alguns caracteres possam identificá-las. Por exemplo, em Cranichidinae a coluna é pontiaguda, e, algumas vezes, unida com o labelo ou com as pétalas, e as polínias são frágeis e clavadas; Goodyerinae geralmente apresenta rizoma herbáceo, coluna curva e polínias sécteis com viscídio mais ou menos evidente; em Spiranthinae, as margens do labelo unem-se com a base da coluna formando um nectário profundo, e as polínias são macias e granulosas (Dressler, 1993; Pridgeon et al., 2003). Um dos problemas relacionados à taxonomia de Cranichideae é a subdivisão ou não da subtribo Cranichidinae em Cranichidinae e Prescottiinae, conforme proposto por alguns autores (Dressler, 1990, 1993; Szlachetko, 1995; Álvarez-Molina & Cameron, 2009). Nos dois grupos, as flores não são ressupinadas ao contrário dos demais representantes da tribo e, por essa razão, eles são considerados um único táxon na classificação de Dressler (1981).

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Alguns gêneros (Aa, Altensteinia, Gomphichis, Myrosmodes, Porphyrostachys, Prescottia e Stenoptera) foram segregados de Cranichidinae (Dressler, 1993) e posicionados em Prescottiinae (Dressler, 1990, 1993) por serem diferentes no tipo de velame, na estrutura das polínias e no formato do rostelo. Entretanto, determinadas características usadas na separação das Prescottiinae de Cranichidinae aparecem em representantes das subtribos Galeottiellinae, Manniellinae e Spiranthinae e, provavelmente, constituem simplesiomorfias para o ‘núcleo spiranthides’ sensu Salazar et al. (2003) e Chase (2003). Estudos moleculares de Salazar et al. (2003, 2009) e de Álvarez- Molina & Cameron (2009), usando DNA ribossômico (ITS) e plastidial (rbcL, matK-trnK, trnL-trnF), mostram duas linhagens dentro de Prescottiinae indicando a necessidade de se proceder a uma reclassificação para o grupo, embora Chase et al. (2003) reconheçam Prescottiinae como incluída em Cranichidinae, concordando com a concepção originalmente proposta por Dressler (1981). Já a subtribo Spiranthinae aparece, na análise de Salazar et al. (2003), como um grupo monofilético que inclui quatro clados: Stenorrynchos, Pelexia, Eurystyles/Lankesterella e Spiranthes. Nesse estudo, os autores apontam para a necessidade de um reexame na morfologia floral do grupo, especialmente do rostelo e viscídio, para um melhor entendimento da posição taxonômica de seus representantes. Discyphinae, recentemente proposta por Salazar et al. (2014), abriga apenas Discyphus scopulariae (ex Spiranthes scopulariae, originalmente posicionada em Spiranthinae), segregada pela ocorrência de uma folha séssil envolvendo a inflorescência (ausente em Spiranthinae), por apresentar pétalas não adnatas à sépala dorsal (adnatas em Spiranthinae), por possuir as margens do labelo livres da coluna (unidas em Spiranthinae) e duas áreas estigmáticas em forma de cúpula (uma única área estigmática em Spiranthinae). Goodyerinae, por sua vez, ainda necessita estudos mais detalhados já que a monofilia de determinados gêneros, aceitos atualmente, é considerada questionável (Chase et al., 2015). A morfologia do labelo, rostelo, anteras e polínias varia nas Orchidoideae, ocorrendo labelos invaginados formando um cálcar (Bell et al., 2009), rostelos portadores de viscídios abrigados em bursículas (Kurzweil, 1987; Box et al., 2008; Rudall et al., 2013) ou com hâmulo e tégula (Rasmussen, 1982) e a eventual presença de estruturas estéreis no ápice da coluna, denominadas aurículas e interpretadas como estaminódios. Dessa forma, no presente trabalho são analisadas a morfologia e a anatomia floral de representantes das tribos Cranichideae (subtribos Spiranthinae, Goodyerinae e Cranichidinae),

23 visando atualizar os conhecimentos disponíveis sobre a família, apresentar novas observações sobre seus órgãos reprodutivos e descrever e interpretar a organização das estruturas diretamente relacionadas à polinização (nectário, labelo, viscídio e polínias), a fim de se entender os mecanismos envolvidos nesse processo, nas diferentes espécies.

MATERIAL E MÉTODOS

O material foi coletado em seu ambiente natural, nos seguintes tipos de formação vegetal: floresta estacional semidecidual (localizada em Botucatu e Gália - SP), cerrado (localizado em Pratânia e Itirapina - SP) e em floresta ombrófila densa e campos de altitude (localizadas nos Estados de São Paulo, Minas Gerais e Espírito Santo). Os exemplares coletados foram herborizados e posteriormente identificados e incluídos no Herbário “Irina Delanova Gemtchujnicov” (BOTU), onde se encontram depositados com os números de registro (Tabela 1). Quando estéril, o material foi transferido para a o Orquidário do Jardim Botânico do IBB – UNESP – Botucatu onde permaneceu em cultivo até o período de florescimento. O material foi fixado em FAA 50 (Johansen, 1940) e conservado em álcool 50% (v/v). Para as análises em microscópio eletrônico de varredura (MEV) flores foram cuidadosamente dissecadas e as peças desidratadas em série etílica (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) e no dessecador de ponto crítico. Em seguida, as amostras foram colocadas em suporte de alumínio, metalizadas com ouro (10nm) e observadas em microscópio eletrônico de varredura Quanta 200 (Fei Company, FEI, Gräfelfing, Germany) a 5KV. Os aspectos morfológicos mais relevantes foram registrados usando o mesmo equipamento. Para o estudo anatômico de cada espécie, flores foram desidratadas em série alcóolica crescente embebidas em Histoclear® e incluídas em Paraplast® ou em Historesina (Leica). As flores foram seccionadas em micrótomo rotativo semiautomático (6-10 µm de espessura) e os cortes corados com solução de Azul de Astra e Safranina (Bukatsch, 1972) ou Azul de Toluidina (Johansen, 1940). Após a coloração, as lâminas foram montadas em resina sintética Entelan® e os aspectos mais significativos foram registrados em microscópio de luz Olympus BX 41 equipado com câmera fotográfica digital Olympus C7070. Cristais de oxalato de cálcio foram identificados com ácido clorídrico a 10% (Johansen, 1940), lignina com floroglucinol acidificado (Sass, 1951), amido com Lugol (Johansen, 1940) e substâncias lipídicas com Sudan IV (Johansen, 1940).

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RESULTADOS

SUBTRIBO CRANICHIDINAE Em Baskervilla paranaensis (Kraenzl.) Schltr., Cranichis glabricaulis Hoehne e Prescottia stachyodes (Sw.) Lindl., as flores não são ressupinadas, possuem labelo côncavo, antera dorsal ereta com quatro polínias e viscídio terminal. O ovário é unilocular e os numerosos óvulos encontram-se fixados à sua parede em três placentas bifurcadas (Figs.1A–C). É revestido externamente por epiderme unisseriada de células isodiamétricas, sendo que em C. glabricaulis ocorrem tricomas glandulares nesse tecido (Fig.1D). A epiderme interna do ovário, também unisseriada, é composta por células retangulares de tamanho menor do que as da epiderme externa. O mesofilo, com cinco camadas em B. paranaensis, duas a três camadas em C. glabricaulis e quatro a seis em P. stachyodes, é irrigado por seis feixes vasculares, sendo três dorsais e três ventrais; idioblastos contendo ráfides aparecem nessa região (Figs. 1A–C). Nas sépalas, as células da epiderme são retangulares a papilosas, nas duas superfícies, sendo que em B. paranaensis e C. glabricaulis as da face adaxial são de tamanho menor (Figs.1E–G) e em P. stachyodes de tamanho maior. O mesofilo é formado por uma única camada de células parenquimáticas isodiamétricas, em B. paranaensis e P. stachyodes, e por duas a três camadas em C. glabricaulis. Idioblastos contendo ráfides foram observados nas sépalas de B. paranaensis e P. stachyodes. Apenas um feixe vascular irriga cada sépala (Figs. 1E–G). As pétalas são revestidas por epiderme de células isodiamétricas a retangulares. Em C. glabricaulis as células são papilosas e em B. paranaensis e P. stachyodes, as da face adaxial apresentam tamanho menor. O mesofilo é formado por uma a três camadas de células parenquimáticas e cada pétala é irrigada por um único feixe vascular (Figs. 1E–G). O labelo, nas três espécies, é revestido por células retangulares, isodiamétricas e papilosas (Figs. 2A–H) e preenchido por duas a três camadas de células parenquimáticas. Em B. paranaenses, o labelo é percorrido por apenas um feixe vascular, em C. glabricaulis por três e em P. stachyodes por sete. Em P. stachyodes aparecem duas estruturas de aspecto secretor, na base do labelo, provavelmente associadas à produção de néctar (Fig. 2G). Elas são revestidas por uma epiderme unisseriada de células isodiamétricas a papiliformes e preenchidas por cinco camadas de células parenquimáticas, muitas delas portadoras de grãos de amido e de ráfides (Fig. 2H).

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As anteras são irrigadas por um feixe vascular e apresentam duas tecas com epiderme de células retangulares, em corte transversal. O endotécio apresenta espessamento parietal em faixas organizadas de forma circular (Figs. 1F e G – detalhes). Em B. paranaensis as faixas são mais largas e se dispõem em arranjo difuso IVc (Fig.1 E – detalhe). Nas três espécies desta subtribo ocorrem quatro polínias, que são farináceas em (Figs. 1E–G). O rostelo de B. paranaensis e P. stachyodes é revestido por epiderme de células retangulares, isodiamétricas e papiliformes. O de C. glabricaulis, por epiderme de células aparentemente secretoras e alongadas anticlinalmente, em corte transversal. O viscídio ocupa posição apical (Figs. 3A–F) e é formado, aparentemente, pela curvatura do ápice do rostelo. Em B. paranaensis e C. glabricaulis, ele possui um hâmulo cônico (Figs. 3B, 3D) e em P. stachyodes, é formado por células alongadas anticlinalmente e portadoras de paredes espessadas, em corte transversal (Fig. 3F).

SUBTRIBO GOODYERINAE Aspidogyne kuczynskii (Porsch) Garay, Microchilus arietinus (Rchb. f. & Warm.) Ormerod e Zeuxine strateumatica (L.) Schltr. possuem flores são ressupinadas, com labelo côncavo, antera dorsal ereta com quatro polínias sécteis, viscídio terminal com tégula e estigma ventral. Como em Cranichidinae, o ovário é unilocular e os numerosos óvulos encontram-se presos à sua parede, em três placentas distintas e bifurcadas (Figs. 4A, D, G). A epiderme externa do ovário é unisseriada e formada por células isodiamétricas. Em A. kuczynskii e M. arietinus aparecem tricomas glandulares nesse tecido e em Z. strateumatica apenas estômatos (Figs. 4B, E e H). A epiderme interna do ovário, também unisseriada, é composta por células retangulares a isodiamétricas de tamanho menor que as da epiderme externa. O mesofilo, com duas a quatro camadas em A. kuczynskii, quatro a cinco em M. arietinus e quatro camadas em Z. strateumatica, é formado por células parenquimáticas isodiamétricas. Idioblastos contendo ráfides são comuns nessa região e em A. kuczynskii também aparecem grãos de amido (Fig. 4A). Seis feixes vasculares irrigam o ovário, sendo três dorsais e três ventrais (Figs. 4A, D, G). As sépalas são revestidas por epiderme de células isodiamétricas e papilosas, sendo que as da face adaxial são menores do que as da abaxial. O mesofilo apresenta uma a duas camadas de células parenquimáticas isodiamétricas com idioblastos contendo ráfides. Em M.

26 arietinus e Z. strateumatica as sépalas são irrigadas por apenas um feixe vascular, mas em A. kuczynskii aparecem três feixes na sépala dorsal (Figs. 4C, F e I; 6C, F e I). A epiderme que reveste as pétalas é formada por células isodiamétricas, que são papilosas em A. kuczynskii e retangulares a isodiamétricas, em M. arietinus e Z. strateumatica. O mesofilo das pétalas é constituído por uma a duas camadas de células parenquimáticas e cada pétala é irrigada por um único feixe vascular (Figs. 4C, F e I; 6C, F e I). No labelo de A. kuczynskii e Z. strateumatica, as células da epiderme são retangulares a isodiamétricas e papilosas na face adaxial (Figs. 5A–E, J–L). Em M. arietinus, o labelo é revestido por células papilosas nas duas superfícies (Figs. 5F–H). O mesofilo, com duas a quatro camadas em A. kuczynskii, cinco a seis em Z. strateumatica e cinco a sete em M. arietinus, é formado por células parenquimáticas, sendo comum a presença de idioblastos contento ráfides, nessa região. Três feixes vasculares irrigam o labelo de A. kuczynskii e de Z. strateumatica e sete feixes vasculares percorrem o de M. arietinus. Em A. kuczynskii e M. arietinus, aparece uma extensão longa e tubular em forma de cálcar, na base do labelo. Essa região é revestida internamente por uma epiderme de células isodiamétricas e papiliformes e preenchida por duas-três (A. kuczynskii) e quatro-cinco camadas (M. arietinus) de células parenquimáticas isodiamétricas, com grande quantidade de grãos de amido (Figs. 5E e I). Em Z. strateumatica, aparecem duas porções infladas na região lateral do labelo, que são revestidas por células isodiamétricas e preenchidas por três camadas de células parenquimáticas portadoras de grãos de amido (Figs. 5K e L). Tanto o cálcar como as porções infladas do labelo, das três espécies, devem atuar na produção e acúmulo de néctar (Figs. 4C e F). As anteras são irrigadas por um feixe vascular e apresentam duas tecas com epiderme de células retangulares, em corte transversal (Figs. 6C, F e I). O endotécio apresenta espessamento anelado, em A. kuczynskii, (Fig. 6C – detalhe), formando faixas de arranjo difuso, em M. arietinus (Fig. 6F – detalhe), e faixas compactamente arranjadas em Z. strateumatica (Fig. 6I – detalhe). Nas espécies desta subtribo, ocorrem quatro polínias sécteis (Figs. 6C, F e I). O rostelo é laminar e revestido por epiderme de células isodiamétricas e papiliformes. Internamente, ele é preenchido por uma a duas camadas de células parenquimáticas em A. kuczynskii e M. arietinus e por quatro camadas em Z. strateumatica (Figs. 6B, E e H). Em A. kuczynskii, o viscídio é triangular, em corte transversal. Ele é recoberto por epiderme de células retangulares e possui no seu interior quatro a cinco camadas de células

27 parenquimáticas (Fig. 6B – detalhe). Em M. arietinus, o viscídio é arredondado as células de sua epiderme são isodiamétricas e papiliformes e aparecem quatro camadas de células parenquimáticas internamente (Fig. 6E). Em Z. strateumatica o viscídio é ovalado, revestido por epiderme de células retangulares e preenchido por seis camadas de células parenquimáticas (Fig. 6H). Nas três espécies observa-se uma tégula, que em A. kuczynskii é formada por células frouxamente arranjadas e recobertas por cutícula espessa (Fig. 6B), em M. arietinus apresenta duas camadas de células revestidas por cutícula espessa (Fig. 6E) e em Z. strateumatica ela não possui organização celular se assemelhando a uma cutícula destacada (Fig. 6H – detalhe).

SUBTRIBO SPIRANTHINAE As flores de Cyclopogon apricus (Lindl.) Schltr., Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay, Sarcoglottis fasciculata (Vell.) Schltr. e Sauroglossum elatum Lindl. são ressupinadas e tomentosas. Possuem sépala dorsal livre, sépalas laterais infladas na base e levemente concrescidas com o ginoestêmio formando, junto com o labelo, um reservatório de néctar, cujo tamanho varia com a espécie. O labelo apresenta, na porção marginal de sua base, dilatações mais ou menos retrorsas que podem assumir a forma de cone e que aqui são interpretadas como possíveis nectários. A antera dorsal é ereta e transporta quatro polínias farináceas. O estigma é ventral e possui uma ampla superfície receptiva. O ovário é unilocular e possui inúmeros óvulos presos em três placentas parietais e bifurcadas (Figs.7A, D, G, J). É revestido externamente por uma epiderme unisseriada de células isodiamétricas, sendo comum a presença de tricomas nesse tecido (Figs.7B, E, H, K). Em S. elatum também ocorrem células papilosas na epiderme externa do ovário (Fig 7K). A epiderme interna do ovário, também unisseriada, é composta por células retangulares de tamanho menor do que as da epiderme externa. O mesofilo é formado por células parenquimáticas isodiamétricas e possui quatro a seis camadas em C. apricus, M. cuspidata e S. elatum e seis a oito em S. fasciculata. Seis feixes vasculares, sendo três dorsais e três ventrais irrigam o ovário. Idioblastos contendo ráfides são comuns no mesofilo do ovário (Figs. 7A, D, G, J) e, em M. cuspidata, também aparecem grãos de amido, nessa região (Fig. 7D) As sépalas, revestidas por epiderme de células retangulares a isodiamétricas e papilosas, possuem um mesofilo de células parenquimáticas isodiamétricas, formado por uma a duas camadas em C. apricus e M. cuspidata, quatro a cinco em S. fasciculata e três a cinco

28 em S. elatum. Idioblastos contendo ráfides são frequentes no mesofilo das sépalas. Em C. apricus e S. elatum, cada sépala é irrigada por apenas um feixe vascular; em M. cuspidata aparecem três feixes e em S. fasciculata quatro (Figs. 9C, F, I, L). Nas pétalas a epiderme é composta por células retangulares a isodiamétricas, recobrindo as duas faces. No mesofilo, formado por células parenquimáticas, aparecem uma a duas camadas em C. apricus e M. cuspidata, três em S. fasciculata e duas a quatro em S. elatum. Cada pétala é irrigada por um feixe vascular em C. apricus e S. elatum, por dois em M. cuspidata e por quatro em S. fasciculata (Figs. 9C, F, I, L). O labelo, recoberto por epiderme de células papilosas de tamanhos variados (curtas, médias e longas; Figs. 8A, B, D, E, G–I, K, L e M), apresenta células globosas ou papilas (Figs. 8A, E e K), em C. apricus, M. cuspidata e S. elatum, e células retangulares a isodiamétricas, que conferem um aspecto de superfície lisa em S. fasciculata (Figs. 8I), na face adaxial. Na região mediana, a face adaxial do labelo é revestida por papilas médias a longas, em todas as espécies (Figs. 8A, D, H, K), que continuam até a base da estrutura e nas dilatações de suas margens. Na face abaxial, o ápice do labelo é revestido por células epidérmicas retangulares a isodiamétricas, sendo que em C. apricus, M. cuspidata e S. elatum também se observam células globosas, nessa porção (Fig. 8M). A região mediana apresenta tricomas glandulares em M. cuspidata e é revestida pelos mesmos tipos celulares do ápice, nas demais espécies. Na base do labelo aparecem papilas curtas, em S. elatum, e de vários tamanhos, em M. cuspidata e S. fasciculata. O mesofilo, formado por células parenquimáticas e idioblastos contento ráfides, possui quatro a cinco camadas em C. apricus e M. cuspidata, três a cinco em S. fasciculata e sete a dez em S. elatum. Cinco feixes vasculares irrigam o labelo de C. apricus, sete vascularizam o de M. cuspidata e S. elatum e 13 o de S. fasciculata (Figs. 8C, F, J e N). Dilatações ou prolongamentos retrorsos em forma de cone, aqui interpretadas como nectários, aparecem nas margens da porção basal do labelo (Figs. 8A, B, D, G, K e L). A superfície das dilatações é revestida por epiderme de células retangulares na face adaxial, enquanto a face abaxial é revestida por papilas longas, em C. apricus (Figs. 8A–C), por células retangulares e isodiamétricas, em M. cuspidata e S. fasciculata (Figs. 8D, F, G e J), e por papilas curtas a intermediárias, em S. elatum (Figs. 8L e N). Internamente, as dilatações ou prolongamentos são preenchidos por células parenquimáticas isodiamétricas com grande quantidade de grãos de amido (Figs. 8C, F, J e N). As anteras são irrigadas por um feixe vascular e possuem duas tecas revestidas por epiderme de células retangulares, em corte transversal. O espessamento do endotécio é em

29 faixas densamente arranjadas, em C. apricus (Fig. 9C – detalhe), é anelado, em M. cuspidata e S. fasciculata (Fig. 9F – detalhe, I – detalhe), e em faixas de arranjo aberto, em S. elatum (Fig. 9L – detalhe). Ocorrem quatro polínias farináceas (Figs. 9C, F, I e L). O rostelo, laminar e recoberto por epiderme de células isodiamétricas ou papiliformes, possui internamente uma a cinco camadas de células parenquimáticas, em C. apricus (Fig. 9C), e duas camadas nas demais espécies (Figs. 9F, I e L). O viscídio, em corte transversal, é triangular em C. apricus e S. elatum, retangular em S. fasciculata e circular em M. cuspidata. Ele é recoberto por epiderme de células retangulares a isodiamétricas e preenchido por quatro a cinco camadas de células parenquimáticas alongadas anticlinalmente (Figs. 9B, H e K). Aparentemente, os viscídios são formados pela curvatura do ápice do rostelo apresentando em seu prolongamento uma estrutura semelhante a um hâmulo rudimentar (Figs. 9A, B, G, H, J e K). Em M. cuspidata, o viscídio é alongado e possui superfície ventral adesiva (Figs. 9D e E).

DISCUSSÃO

Muitos dos aspectos florais aqui descritos, como a posição do órgão no eixo da inflorescência, os tipos celulares que compõe a epiderme das sépalas e pétalas, as características do viscídio e a presença de nectários na base do labelo encontram-se relacionados aos mecanismos de polinização, já que a pressão exercida pelo agente aparenta ser o fator principal que dirige o processo evolutivo, nas flores das orquídeas (Johnson & Steiner, 1997; Cozzolino et al., 2001). Tipos celulares particulares como as papilas, encontradas no tecido epidérmico das diferentes peças (sépalas, pétalas ou labelo), podem auxiliar na atração de polinizadores, pois concentram os raios luminosos ampliando o contraste de cores e conferindo à superfície um aspecto reluzente (Kay et al., 1981). Este efeito visual vem do fato dessas células agirem como lentes, focando a luz em vacúolos preenchidos por antocianinas e, desta forma, aumentando o contraste. Ao mesmo tempo, as células papilosas dispersam mais homogeneamente a luz refletida pelo mesofilo, promovendo uma textura mais brilhante ou aveludada na superfície (Vogelmann, 1996). Em diversas espécies de Ophrys, a presença de células cônicas e de tricomas, na epiderme, junto com a grande quantidade de grãos de amido, no parênquima, parece ser responsável pela reflexão luminosa que interfere nas cores das peças florais (Bradshaw et al., 2010). Associado à morfologia externa das flores a presença de

30 grande quantidade de cristais, presentes nas células do mesofilo de sépalas e pétalas, pode estar relacionada a um aumento da reflexão dos raios UV pelas flores das espécies estudadas. Estes cristais são muito comuns em folhas e além de atuarem como substância deterrente ao ataque de herbívoros, podem também estar relacionados à captação e reflexão da luz (Franceschi, 2001). Drusas de um tipo especial, identificadas em espécies do gênero Anacheilium (= Prosthechea), são fluorescentes quando submetidas à luz ultravioleta e provavelmente colaboram para tornar a flor muito mais visível aos insetos polinizadores, os quais enxergam no espectro do ultravioleta (Pabst et al., 1980). O mento (formado pela fusão do pé da coluna, base do labelo e sépalas laterais), encontrado nas flores de Baskervilla paranaenses e Prescottia stachyodes (Cranichidinae); Zeuxine strateumatica (Goodyerinae); Cyclopogon apricus, Sauroglossum elatum e Mesadenella cuspidata (Spiranthinae), forma uma região acumuladora de néctar e se encontra associado a projeções da base do labelo que constituem, provavelmente, nectários. Estas projeções marginais foram descritas por Galetto et al. (1997) para exemplares da subtribo Spiranthinae, sendo caracterizadas pela presença de epiderme secretora, precedida por células parenquimáticas com grãos de amido na face adaxial e epiderme com células papilosas na face abaxial, são muito semelhantes ao observado neste estudo. Essas estruturas devem oferecer atrativos aos polinizadores, embora pouca informação encontre-se disponível sobre a sua organização e localização (Galetto et al., 1997). Já o cálcar (prolongamento tubular da base do labelo), presente na forma livre em Aspidogyne kuczynskii e Microchilus arietinus (Goodyerinae) e o mento não pronunciado em Sarcoglottis fasciculata (Spiranthinae), é revestido por epiderme de células retangulares e papilosas e tem seu interior preenchido por células parenquimáticas com grande quantidade de amido, podendo constituir uma estrutura nectarífera. Em Zeuxine strateumatica (Goodyerinae), na qual não se observa cálcar, a morfologia celular da câmara, formada pela base do labelo e da coluna, é idêntica à observada para o cálcar das espécies anteriores. A presença de papilas e tricomas amplia a área da superfície secretora de néctar, situação que também tem sido reportada em diversas outras espécies de Orchidaceae (Stpczynska et al., 1997; Stpczynska & Matusiewicz, 2001; Teixeira et al., 2004; Stpczynska et al., 2005; Melo et al., 2010). Nas anteras, as células do endotécio apresentam espessamento, predominantemente dos tipos III e IV de Freudenstein (1991) caracterizados, respectivamente, por faixas anticlinais arranjadas em círculo ou sem organização aparente. O tipo I é considerado

31 plesiomórfico por ser encontrado em clados e em gêneros basais, como Apostasia e Neuwiedia, enquanto que os tipos III e IV são derivados (Freudenstein, 1991). Os subtipos do tipo III aparecem na subfamília Orchidoideae, mas sua distribuição não coincide com a circunscrição das tribos e subtribos: o tipo IIIa (barras anticlinais alongadas e agrupadas de forma congesta) aparece em Prescottia (Cranichidinae), Zeuxine (Goodyerinae) e Cyclopogon (Spiranthinae); o tipo IIIb (barras anticlinais de comprimento variado e agrupadas de forma laxa) encontra-se presente em Microchilus (Goodyerinae) e Sauroglossum (Spiranthinae) e tipo IVc (barras distintas comumente curtas e espessadas) ocorre apenas em Baskervilla e Cranichis (Cranichidinae), embora também seja descrito para representantes de outras subtribos (Freudenstein, 1991). Essa distribuição sugere uma evolução paralela dos tipos de espessamento do endotécio, ou uma ausência de monofilia nas subtribos. Conforme comentado por Freudenstein (1991), uma amostragem adicional nos representantes das subfamílias seria de grande importância para um melhor entendimento da distribuição desse caráter. Quanto às polínias, nas espécies das tribos Cranichidinae e Spiranthinae elas são farináceas, caráter considerado plesiomórfico dentro do grupo (Álvarez-Molina & Cameron, 2003). Já polínias sécteis (subdivididas em pequenos pacotes) são características da sutribo Goodyerinae, embora também apareçam em outros representantes. Polínias farináceas e sécteis podem ter partes delas fixadas nos estigmas de diferentes flores, enquanto os polinizadores as visitam. No caso de polínias compactas (ausentes nos grupos aqui estudados) um único polinário, ou pelo menos uma única polínia, é depositado, por inteiro, em um único estigma (Pacini & Hesse, 2002). Há ainda a suposição de que a diversidade estrutural dos polinários pode resultar das interações entre flores e polinizadores (Cozzolino et al., 2001). A presença de polínias sécteis em A. kucyzinskii, M. arietinus, Z. strateumatica (Goodyerianae) pode representar uma adaptação biológica já que os pequenos grupos de pólen, ao se fragmentarem, não são depositados em uma única flor. Dessa forma, muitas flores podem ser polinizadas à partir de um único polinário (Freudenstein & Rasmussen, 1997). Outro fato importante, relacionado às polínias sécteis, é que insetos carregando polínias provenientes de plantas diferentes podem depositar grupos de mássulas no estigma de uma mesma flor, aumentando a possibilidade de múltiplos genótipos contribuírem para a fecundação dos óvulos (Freudenstein & Rasmussen, 1997). Caracteres morfológicos do estipe e do viscídio encontram-se diretamente relacionados com as funções do polinário (Dressler, 1993). O estipe, haste que sustenta as

32 polínias, interfere na eficiência da polinização uma vez que seu tamanho facilita ou não o depósito das polínias no estigma. O viscídio auxilia no transporte das polínias, de uma flor para outra via polinizador, atuando no mecanismo de adesão às diferentes partes do agente polinizador (Hidayat et al., 2006). A presença de hâmulo (tipo especial de estipe), na maioria das espécies de Cranichidinae, e sua ausência em Spiranthinae e Goodyerinae (Álvarez-Molina & Cameron, 2009) é um assunto controverso. Segundo Salazar et al. (2003), a presença de hâmulo no gênero Gomphichis e em representantes da nova subtribo Prescottiinae, derivada de Cranichidinae, representa uma sinapomorfia que interliga os representantes andinos de Prescottiinae ao restante de Cranichidinae. Por outro lado, Álvarez-Molina & Cameron (2009), analisando mais de 2000 espécimes de Gomphichis e cerca de 2500 espécimes de outros gêneros de Prescottiinae, afirmam que apenas Cranichidinae apresenta hâmulo. Em nossos resultados, uma estrutura semelhante ao hâmulo descrito por Rasmussen (1982) aparece em Cyclopogon apricus e Sauroglossum elatum, da subtribo Spiranthinae, estando, no entanto, ausente em C. glabricaulis, da subtribo Cranichidinae. A presença de hâmulo também é referida para Spiranthes, da subtribo Spiranthinae (Rasmussen, 1982), indicando a necessidade de estudos detalhados que determinem a natureza estrutural desse caráter, especialmente por ele ser usado para agrupar táxons distintos (ver Salazar et al. 2003, 2009; Álvarez-Molina & Cameron, 2009). A ressupinação, decorrente da torção de 180º no ovário, que ocorre nas flores de Cranichidinae é o caráter principal para separar essa subtribo das demais que compõem a tribo Cranichideae (Salazar et al., 2009). Segundo os resultados moleculares de Álvarez-Molina & Cameron (2009), as flores não ressupinadas evoluíram mais de uma vez a partir da condição ancestral ressupinada, sendo encontradas em Prescottia e nas demais Cranichidinae. Para Spiranthinae, a ressupinação floral é interpretada como uma reversão ao caráter ancestral (Dressler, 1993; Álvarez-Molina & Cameron, 2009). Microchilus arietinus (Goodyerinae), P. stachyodes (Cranichidinae) e S. elatum (Spiranthinae) são espécies que apresentam protandria, com a região estigmática tornando-se exposta somente após a retirada do polinário (Singer & Sazima, 2001a, b, 2002). Este aspecto é significativo por favorecer a polinização cruzada, embora protandria não tenha sido reportada para outros membros de Goodyerinae e Cranichidinae (ver Singer & Sazima, 2001). As duas espécies de Aspidogyne (Goodyerinae) estudadas por Singer & Sazima (2001) não apresentam protandria que, aparentemente, foi “substituída” pela presença de um viscídio com

33 superfície dorsal adesiva e por um comportamento “trapliner” do polinizador (deslocamento em linha de captura). Viscídios com superfície dorsal adesiva aparecem em Spiranthinae, na “aliança Pelexia”, formada pelos gêneros neotropicais Cyclopogon, Pelexia e Sarcoglottis (Singer & Sazima, 1999). Nestes, os viscídios têm forma de cunha e apresentam uma membrana túrgida envolvendo a substância adesiva produzida pelo rostelo. Quando dorsalmente pressionada pelo labrum das abelhas, essa membrana se rompe, liberando a substância adesiva que fixa o polinário ao polinizador (Singer & Sazima, 1999). Esse tipo de viscídio promove a adesão do polinário à superfície ventral do labrum do polinizador que, por ser flexível e se dobrar quando o inseto está em voo, faz com que o polinário fique protegido embaixo da cabeça do inseto. Esses aspectos encontram-se relacionados à escassez de polinizadores ou a polinizadores com hábito “trapliner” (Singer & Sazima, 2001). Com exceção de A. kuczynskii, C. apricus e S. fasciculata, com viscídios dorsais, as flores das espécies aqui estudadas apresentam uma região ventral diferenciada, que corresponde a um viscídio. Diversos autores consideram importante a variação desta estrutura, derivada do rostelo, já que existe uma relação direta entre a forma, a posição do viscídio, a morfologia do polinizador e o local em que o viscídio adere (Singer, 2002; Benitez-Vieyra et al., 2006).

CONCLUSÕES

Embora as flores de diferentes táxons da tribo Cranichideae tenham sido aqui analisadas, ainda persiste uma lacuna no conhecimento sobre o papel desempenhado por cada estrutura no mecanismo de polinização, tanto relacionado à oferta de recursos para atração do agente como ao mecanismo relacionado à adesão do polinário ao seu corpo. Por essa razão, mais estudos investigando a morfo-anatomia e o desenvolvimento estrutural das flores junto com observações sobre a biologia floral das espécies são necessários para o entendimento do papel funcional desempenhado pelas estruturas florais. O relato da presença de uma tégula nas espécies de Goodyerinae aqui analisadas, incluindo Zeuxine strateumatica antes caracterizada por Rasmussen (1982) como não possuindo tégula, contribui para a inclusão de mais um caráter diagnóstico para a subtribo. A presença de um hâmulo rudimentar em C. apricus, S. fasciculata e S. elatum (Spiranthinae) pode explicar a origem da posição dorsal do viscídio, nessa subtribo; provavelmente esse hâmulo rudimentar, se origina a partir da curvatura do ápice do rostelo provocando o

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deslocamento da superfície adesiva do viscídio, anteriormente ventral, aspecto relacionado ao tipo de comportamento e morfologia do polinizador. Por ser um grupo numeroso no qual as flores apresentam estruturas diversificadas e adaptadas a diferentes grupos de polinizadores, a morfologia estrutural do labelo, do viscídio, das anteras e das polínias é, em geral, a mesma encontrada na família, indicando a presença de possíveis homologias e homoplasias resultantes da pressão exercida pelos polinizadores (Chase & Palmer, 1997; Hapeman & Inoue, 1997; Rudall et al., 2013).

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de doutorado concedida (Processo 2011/21150-5) a S.A.A e à equipe técnica do Centro de Microscopia Eletrônica da UNESP de Botucatu (CME).

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Tabela 1: Espécies de Orchidaceae que compõem o presente estudo. BOTU= número do voucher depositado no herbário “Irina Delanova Gemtchujnicov”; IBB/BOT= número do exemplar incluído na coleção de plantas vivas do Departamento de Botânica do Instituto de Biociências da UNESP - Botucatu:

Tribo Subtribo Espécie Voucher ou nº Coleção ex situ Cranichideae Cranichidinae Baskervilla paranaensis BOTU 028366 (Kraenzl.) Schltr. Cranichis glabricaulis Hoehne IBB/BOT 0647 Prescottia stachyodes (Sw.) BOTU 028429 Lindl. Goodyerinae Aspidogyne kuczynskii IBB/BOT 0472 (Porsch) Garay Microchilus arietinus (Rchb. f. BOTU 028404 & Warm.) Ormerod Zeuxine strateumatica (L.) BOTU 028456 Schltr. Spiranthinae Cyclopogon apricus (Lindl.) BOTU 028450 Schltr. Sauroglossum elatum Lindl. BOTU 028431 Mesadenella cuspidata IBB/BOT 0470 (Lindl.) Garay Sarcoglottis fasciculata (Vell.) IBB/BOT 0753 Schltr.

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Figura 1. Detalhes de flores de Cranichidinae em microscopia de luz (A-C, D-detalhe e E-G) e eletrônica de varredura (D). A-C. Cortes transversais do ovário. A. Baskervilla paranaenses. B. Cranichis glabricaulis; C. Prescottia stachyodes. D. Tricomas presentes na epiderme externa do ovário de Cranichis glabricaulis (no detalhe, em corte transversal). E-G. Flor em corte transversal. E. Baskervilla paranaensis (no detalhe, parede da antera mostrando o espessamento do endotécio). F. Cranichis glabricaulis (no detalhe, parede da antera mostrando o espessamento do endotécio). G. Prescottia stachyodes (no detalhe, parede da antera mostrando o espessamento do endotécio). An= antera, Es=estigma, Fd=Feixe vascular dorsal; Fv=feixe vascular ventral; Id=idioblasto, La=labelo, Po=polínias, Pt=pétala, Ro=rostelo, Sl=sépala lateral, Sd=sépala dorsal. Escalas: A-D=150 µm; G, H= 500 µm; detalhes em D-G=50µm.

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Figura 2. Labelo de flores de Cranichidinae em microscopia de luz (C, E, H) e eletrônica de varredura (A-B, D, F, G). A. Baskervilla paranaensis; B. Baskervilla paranaenses; note as papilas e tricomas na base da estrutura. C. Baskervilla paranaenses, em corte transversal. D. Cranichis glabricaulis; E. Cranichis glabricaulis, corte transversal na região de aspecto secretor. F. Face adaxial de Cranichis glabricaulis, com células globosas. G-H. Prescottia stachyodes. G. Aspecto geral. H. corte transversal na região de aspecto secretor; notar idioblastos contendo ráfides e grãos de amido nas células parenquimáticas. Escalas: A=1mm; D, G=500µm; B=250µm; E=150µm; C, F, H=50µm.

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Figura 3. Porção apical da coluna de flores de Cranichidinae em microscopia de luz (B, D, F) e eletrônica de varredura (A, C, E). A. Baskervilla paranaenses. B. Baskervilla paranaenses, em corte transversal, mostrando a estrutura do hâmulo. C-D. Cranichis glabricaulis, mostrando o aspecto geral (C) e a estrutura do viscídio, em corte longitudinal. E-H. Prescottia stachyodes, mostrando o aspecto geral (E) e a estrutura do viscídio (H), em corte transversal. An=antera, Es=estigma, Ha=hâmulo, Po=polínias, Rf=ráfides, Ro=rostelo, Zr=zona de ruptura. Escalas: A, C, E=250µm; B, D=150 µm; F=100 µm.

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Figura 4. Detalhes de flores de Goodyerinae em microscopia de luz (A, C, D, F, G, I) e eletrônica de varredura (B, E, H). A-C. Aspidogyne kuczynskii, mostrando o ovário em corte transversal (A), tricomas presentes na epiderme externa do ovário (B) e flor em corte longitudinal (C). D-F. Microchilus arietinus, mostrando o ovário em corte transversal (D), tricomas da superfície externa do ovário (E) e flor em corte longitudinal (F). G-I. Zeuxine strateumatica, mostrando o ovário em corte transversal (G), estômato encontrado na superfície externa do ovário (H) e flor em corte longitudinal. Ca=cálcar; Co=coluna; Fd=Feixe vascular dorsal; Fv=feixe vascular ventral; La=labelo; Po=polínias; Sd=sépala dorsal; Tr=tricoma; Vi=viscídio. Escalas: A, D=150 µm; B=200µm; C, F, I=2mm; E=250µm; G=500 µm; H=25µm.

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Figura 5. Labelo de flores de Goodyerinae em microscopia eletrônica de varredura (A-D, F- H, J, K) e em microscopia de luz (E, I, L). A-E. Aspidogyne kuczynskii, mostrando o aspecto geral (A), as papilas encontradas no cálcar (B), a região mediana (C), e o nectário localizado no cálcar, em corte transversal (E). F-I. Microchilus arietinus, mostrando o aspecto geral (F), a face adaxial (G), a face abaxial (H) e a região do nectário encontrado no cálcar (I). J-L. Zeuxine strateumatica, mostrando o aspecto geral (J), o nectário na região basal (K) e o corte transversal do nectário (L). La=labelo, Sl=sépala lateral, *=Nectário. Escalas: A= 2,5mm; B,G=100µm; C, D=25µm; E=150 µm; F, J=1mm; H=250µm; I=50µm; K, L=500µm.

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Figura 6. Detalhes da coluna de flores de Goodyerinae em microscopia eletrônica de varredura (A, D, G) e em microscopia de luz (B, C, E, F, H, I). A-C Aspidogyne kuczynskii, mostrando o aspecto geral (A) o ápice em corte longitudinal (B) e em corte transversal (C); o detalhe em B mostra o viscídio e a tégula, em corte transversal, e em C, a parede da antera, em corte transversal. D-F. Microchilus arietinus, mostrando o aspecto geral do ápice da coluna (D) e a mesma região em corte transversal (E-F), com a tégula em E; o detalhe em F mostra a parede da antera em corte transversal. G-I. Zeuxine strateumatica, mostrando o aspecto geral do ápice da coluna (G), a mesma região em corte transversal (H) e o nectário em corte transversal (I); o detalhe em H mostra a tégula originada do desprendimento da cutícula e em I a parede da antera. An=antera, Es=estigma, La=labelo, Po=polínias, Ro=rostelo, Sl=sépala lateral, Te=tégula. Escalas: A, D=1mm, B, E, H=100 µm; C, F=150 µm; G=250µm; I=500 µm. O detalhe em B=150 µm, em C, F, H, I=50 µm.

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Figura 7. Detalhes de flores de Spiranthinae em microscopia de luz (A, C-D, F, G, I-J) e eletrônica de varredura (B, E, H, K). A-C. Cyclopogon apricus, mostrando o ovário em corte transversal (A), os tricomas da superfície externa do ovário (B) e o corte longitudinal da flor (C). D-F. Mesadenella cuspidata, mostrando o ovário em corte transversal (D), os tricomas da superfície externa do ovário (E) e o corte longitudinal da flor (F). G-I. Sarcoglottis fasciculata, mostrando o ovário em corte transversal (G), os tricomas da superfície externa do ovário (H) e o corte longitudinal da flor (I). J-L. Sauroglossum elatum, mostrando os tricomas da superfície externa do ovário (J, K) e o corte longitudinal da flor (L). Es=estigma, Fd=Feixe vascular dorsal; Fv=feixe vascular ventral; Id=idioblasto; La=labelo; Me=mento; Po=polínias; Sd=sépala dorsal; Sl=sépala lateral; Tr=Tricoma, Vi=viscídio, *=nectário. Escalas: A, D, G, H, J=500µm; B=100µm; C, L, I=2mm; E, K=250µm.

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Figura 8: Labelo de flores de Spiranthinae, em microscopia eletrônica de varredura (A-B, D, E, G-I, K-M) e em microscopia de luz (C, F, J, N). A-C. Cyclopogon apricus, mostrando o aspecto geral da estrutura (A), o nectário nas margens da base do labelo (B) e em corte transversal (C). D-F. Mesadenella cuspidata, mostrando os nectários basais (D), o ápice (E) e os nectários em corte transversal (F). G-I. Sarcoglottis fasciculata, mostrando os nectários basais (G), a região central do labelo com papilas de tamanhos variáveis (H), a região apical do labelo (I) e os nectários do cálcar em corte transversal (J). K-N. Sauroglossum elatum, mostrando o aspecto geral (K), os nectários marginais na base (L), a face abaxial com prováveis osmóforos (M), o nectário em corte transversal (N). La=labelo, Sl=sépala lateral, *=Nectário. Escalas: A, H, K=1mm; B, L, M=250µm; C, F=150µm; D, E, G, J=500µm; I=2.5mm; N=100 µm.

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Figura 9: Detalhe de colunas das flores de Spiranthinae em microscopia eletrônica de varredura (A, D, G, J) e em microscopia de luz (B, C, E, F, H, I, K, L). A-C. Cyclopogon apricus, mostrando o aspecto geral do ápice (A), o corte longitudinal dessa mesma região onde se nota um viscídio com hâmulo (B); o detalhe em B mostra o viscídio em corte transversal e o corte transversal desse ápice (C); o detalhe em C mostra a parede da antera. D- F. Mesadenella cuspidata, mostrando o aspecto geral do ápice (D), o corte longitudinal (E) e transversal (F), dessa mesma região; o detalhe em F mostra a parede da antera. G-I. Sarcoglottis fasciculata, mostrando o aspecto geral do ápice (G), essa região em corte longitudinal (H), com viscídio em cunha, e em corte transversal (I); o detalhe em I mostra a parede da antera. J-L. Sauroglossum elatum, mostrando o aspecto geral do ápice (J), essa mesma região em corte longitudinal, mostrando um viscídio apical (K) e em corte transversal (L); no detalhe em L, a parede da antera. An=antera, Es=estigma, Ha=hâmulo, La=labelo, Po=polínias, Pt=Pétala, Ro=rostelo, Sd=sépala dorsal, Sl=sépala lateral, Vi=viscídio. Escalas: A, E, F=500µm; B, C, H, K, L=150 µm; D, G, J=1mm; I=2mm. Os detalhes em B=150µm, em C, F, I, L=50µm, em G=250µm.

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CAPÍTULO 2

(A ser submetido ao periódico Phytotaxa)

Micromorfologia da coluna e do labelo de Cyclopogon s.l. (Spiranthinae, Orchidaceae)

SÉRGIO AKIRA ADACHI1, FÁBIO DE BARROS2, MARIA DAS GRAÇAS SAJO3 & GERARDO ADOLFO SALAZAR4

1Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista – UNESP, Distrito de Rubião Júnior s/nº, Caixa Postal 510, CEP: 18618-970, Botucatu-SP, Brasil; E-mail: [email protected] 2 Seção do Orquidário, Instituto de Botânica, Av. Miguel Stéfano 3687, Água Funda, CEP 04301-902, São Paulo-SP, Brasil. 3Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista – UNESP, Avenida 24A, 1515 Bela Vista, CEP 13506-900, Rio Claro-SP, Brasil. 4Departamento de Botánica, Intituto de Biologia, Universidad Nacional Autónoma de México, Apartado Postal 70-367 México, Distrito Federal, México.

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Resumo

O gênero Cyclopogon encontra-se incluído no clado Pelexia e compreende aproximadamente 75 espécies de hábito terrícola, cujo principal centro de diversidade encontra-se no Brasil, Equador e Peru. Seus representantes compartilham diversos caracteres vegetativos e reprodutivos, mas apresentam variações na estrutura do rostelo e, em menor extensão, na forma do labelo e no grau de fusão das sépalas que, muitas vezes, originam um tubo. Considerando a controversa circunscrição de Cyclopogon, o presente trabalho analisou a micromorfologia do labelo e da coluna de representantes do gênero incluídos em Cyclopogon, sensu Presl, Cocleorchis Szlachetko, Warscaea Szlachetko, Stigmatosema Garay e Beadlea Small, apontando semelhanças/diferenças entre as flores dos gêneros segregados de Cyclopogon s.l. Apesar das flores analisadas possuírem pétalas e sépalas com morfologia semelhante, algumas características estruturais do labelo, como presença de papilas e tricomas, e do ápice do rostelo são particulares de determinadas espécies. Com relação ao ápice do rostelo, observa-se uma morfologia variada após a remoção do polinário nas flores estudadas, com espécies apresentando rostelo laminar, em forma de bolsa, curvado para cima ou com as margens fletidas, entretanto, tal variação não parece estar relacionada a diferenças funcionais, já que o mesmo mecanismo de polinização, executado por abelhas da família Halictidae, é descrito para espécies típicas de Cyclopogon e para espécies associadas à Warscaea e Beadlea. Uma abordagem mais conservativa preservando a monofilia do grupo Cyclopogon s.l. é sugerida até que novos estudos sejam realizados.

Palavras-chave: Beadlea, Cocleorchis, Halictidae, Stigmatosema, Warscaea.

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Introdução

A subtribo Spiranthinae, incluída na tribo Cranichideae (Salazar et al. 2003, 2009) e na subfamília Orchidoideae, abriga representantes de hábito terrícola, exceto pelos gêneros Eurystyles e Lankesterella. Abrange 40 gêneros e cerca de 450 espécies de distribuição predominantemente neotropical (Salazar 2003). A circunscrição da subtribo é um assunto controverso, tendo sido propostas diversas classificações, com base especialmente nos caracteres morfológicos da flor, que deram origem, muitas vezes, a delimitações genéricas contraditórias (Schlechter 1920; Balogh 1982; Garay 1982; Burns-Balogh 1986; Szlachetko 1995; Salazar et al. 2003, 2011). Schlechter (1920) reconhece 24 gêneros para Spiranthinae, enquanto outras duas revisões (Balogh 1982; Garay 1982), apontam, respectivamente, 16 e 44 gêneros para a subtribo. Garay (1982) não reconhece subdivisões dentro de Spiranthinae, enquanto Balogh (1982) identifica quatro alianças (Brachystele, Pelexia, Spiranthes e Stenorrhynchos) com 11 gêneros; os outros cinco gêneros reconhecidos pela autora, são interpretados por ela como remanescentes de outras linhagens evolutivas, não se enquadrando, portanto, em nenhuma das alianças (Salazar 2003). Szlachetko (1995) divide Spiranthinae em três subtribos (Cyclopogoninae, Spiranthinae e Stenorrhynchidinae), com base nas diferenças observadas na estrutura do rostelo e do viscídio, mas a análise molecular de Salazar et al. (2003) identifica, para o grupo, três grandes clados (Stenorrhynchos, Pelexia e Spiranthes), com o gênero Eurystyles isolado dentro de Spiranthinae, que em uma análise posterior foi agrupado ao gênero Lankesterella, formando o clado Eurystyles/Lankesterella (Salazar & Dressler 2011). Cyclopogon encontra-se incluído no clado Pelexia e, como os demais representantes do grupo, apresenta o rostelo (estrutura presente no ápice do ginostêmio, originado a partir do terceiro lobo estigmático e que sustenta o polinário) laminar, longo e largo com uma porção viscidial no ápice (Burns-Balogh & Robinson 1983). Em Pelexia, após a remoção do polinário, o rostelo tem a forma truncada no ápice devido à inflexão transversal do viscidio, que é revestido por uma fina membrana que se rompe antes que a massa polínica se prenda ao polinizador (Balogh 1982; Burns-Balogh & Robinson 1983; Dressler 1993). O gênero Cyclopogon compreende aproximadamente 75 espécies de hábito terrícola, raramente epifítico, cujo principal centro de diversidade encontra-se no Brasil, Equador e Peru (Correa 1955; Felix & Guerra 2005). Seus representantes compartilham diversos

61 caracteres vegetativos e reprodutivos, mas apresentam variações na estrutura do rostelo e, em menor extensão, na forma do labelo e no grau de fusão das sépalas que, muitas vezes, originam um tubo (Salazar 2003). Segundo Garay (1978, 1982) somente tubos sepálicos longos, como os de Cyclopogon ovalifolius, caracterizam o gênero e representantes com tubos curtos devem ser incluídos em Beadlea, mas essa não tem sido uma posição muito aceita, pois esse caráter varia até dentro de uma mesma espécie (Salazar 2003). Szlachetko (1994) segregou dois gêneros a partir de Cyclopogon s.l.: Cocleorchis com rostelo amplo, de margens fletidas e ápice tridentado após a remoção do polinário, e Warscaea, com rostelo suculento e desenvolvido e viscídio conspícuo formado pelos tecidos que recobrem a superfície inferior do rostelo e pelos seus lobos laterais. Apesar de Szlachetko (1994) descrever o viscídio de Warscaea como ventral, um estudo mais minucioso mostrou que, como nas demais espécies de Cyclopogon, ele é apical e possui superfície dorsal adesiva (Salazar 2003). Além disso, embora a forma do ápice do rostelo de Warscaea seja diferente, não se observam diferenças funcionais nos mecanismos de polinização observados entre flores típicas de Cyclopogon, como em C. congestus (Singer & Sazima 1999), e aquelas encontradas em espécies transferidas por Szlachetko para Warscaea, como C. diversifolius (Singer & Coccuci 1999). As duas espécies de Cyclopogon que possuem o ápice do rostelo subquadrado (Salazar 2003) foram transferidas para Stigmatosema por Garay (1982). Entretanto, o exame do material fresco destas espécies mostrou que o ápice do rostelo é curvado para cima e recobre parcialmente as laterais das polínias. Uma vez que outros representantes exibem ápice do rostelo com a mesma morfologia, Szlachetko (1995) incluiu mais espécies em Stigmatosema, embora os demais caracteres que delimitem esse gênero coincidam com os observados para Cyclopogon (Salazar 2003). Considerando a controversa circunscrição de Cyclopogon, o presente trabalho analisa a micromorfologia do labelo e da coluna de representantes do gênero incluídos em Cyclopogon, sensu Presl (1827), em Cocleorchis Szlachetko (1994) em Warscaea Szlachetko (1994), em Stigmatosema Garay (1982) e em Beadlea Small (1903). Essa análise pretende apontar semelhanças/diferenças entre as flores dos gêneros segregados de Cyclopogon s.l. para se obter um melhor entendimento das características que suportam a aliança Pelexia e definem a circunscrição atual do gênero.

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Material e Métodos

Parte do material foi coletado em seu ambiente natural, em floresta estacional semidecidual e matas de brejo, no município de Botucatu (22°52’52”S 48°29’32”O), e em floresta estacional semidecidual, no município de Pardinho (23°04’44”S 48º21’12”O) e parte é proveniente da coleção de material fixado do Professor Gerardo Salazar. O material coletado em seu ambiente natural foi, em parte, fixado em FAA 50 (Johansen, 1940) e conservado em álcool 50% e, em parte, herborizado e incluído no Herbário “Irina Delanova Gemtchujnicov” (BOTU). O material examinado encontra-se especificado na tabela 1. Para a análise do labelo e coluna, flores em diferentes estágios de desenvolvimento foram cuidadosamente dissecadas e as peças desidratadas em série etílica (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) e no dessecador de ponto crítico. Em seguida, as amostras foram colocadas em suporte de alumínio, metalizadas com ouro e observadas em microscópio eletrônico de varredura Hitachi S-2460N a 5KV. Os aspectos morfológicos mais relevantes foram registrados usando o mesmo equipamento.

Resultados

As espécies aqui estudadas são preferencialmente terrícolas, embora também ocorram representantes de hábito rupícola ou epifítico. Determinadas espécies podem apresentar mais de um hábito de crescimento, como Cyclopogon congestus, cujos representantes são predominantemente terrícolas ou epifíticos, mas podem também ser encontrados sobre afloramentos rochosos, no interior de matas. Todas elas são de porte herbáceo, acaules e possuem raízes fasciculadas, cilíndricas e pilosas (Fig. 1A). Suas folhas, em geral, formam uma roseta basal, e possuem um pecíolo estreito e uma lâmina oblongo-lanceolada, de margens inteiras e de consistência membranácea ou coriácea; apresentam coloração verde, escura ou clara, em geral combinada com tons de marrom, vinho ou rosado, e ocasionalmente com faixas ou estrias finas verde- claras, brancas, verde-escuras ou acinzentadas (Figs. 1A, D). As inflorescências são glabras ou tomentosas e transportam muitas ou poucas flores, de disposição espiralada e com brácteas lanceoladas basais (Figs. 1B, E, G, J). As flores, pendentes e mais raramente horizontais, exalem uma fragrância adocicada e secretam néctar. As sépalas e pétalas variam de verde- claro a verde-escuro misturado, algumas vezes, com tons de castanho ou ferrugíneo (Figs. 1C,

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F, I, L). O labelo é branco e possui marcas esverdeadas, castanhas ou avermelhadas (Figs. 1C, F, I, L). As sépalas são tomentosas, principalmente próximo à base, sendo que a dorsal é côncava, lanceolada e livre, embora em alguns casos elas sejam aderidas à base das sépalas laterais, formando uma câmara nectarífera justaposta ou tenuamente adnata à base do labelo. As pétalas são lanceoladas, glabras e justapostas à sépala dorsal e o labelo é adnato ou justaposto às sépalas dorsais. O labelo possui um ápice (epiquílio) flabelado ou trilobado, revestido por papilas ou tricomas, um ístmo recoberto por células epidérmicas comuns, papilas ou tricomas e uma base (hipoquílio) com duas aurículas marginais, arredondadas ou cônicas e curvadas para o interior do labelo, associadas à produção de néctar (Figs. 3A-H). A coluna é ereta e tomentosa, na região anterior ao estigma (Figs. 2A–F), e apresenta um curto prolongamento basal (pé da coluna) ao qual se prende o labelo. A antera, côncava, possui um prolongamento apical membranáceo e o polinário é formado por duas polínias arredondadas amarelo-claras. O viscídio, de coloração acinzentada (Figs. 2A, B e F), possui a forma de disco ou cunha (deltoide) e superfície dorsal adesiva. O rostelo é carnoso, linear ou levemente curvo, e sua forma varia de oblongo a sub-quadrangular com ápice bilobado e curvado (Figs. 2A–F). O ovário é tomentoso (Figs. 1A–L). Comparando o ginostêmio dos táxons aqui analisados, nota-se que o rostelo é reto a levemente curvado e não possui estruturas diferenciadas em suas margens, tanto em alguns Cyclopogon mantidas no gênero (C. congestus, C. elatus e C. luteoalbus) como naquela transferida para Beadlea (C. variegatus). Em Cyclopogon sarcoglottidis, associada ao gênero Cocleorchis, o ápice do rostelo possui margens achatadas lateralmente e levemente curvadas para baixo, aspecto mais evidente após a retirada do polinário (Fig. 2D). Os Cyclopogon transferidos para Stigmatosema (C. inaequilaterus e C. polyaden) possuem rostelo com ápice curvado para cima, em direção à antera, recobrindo parcialmente as polínias e o viscídio (Fig. 2E) e naqueles incluídos em Warscaea (Cyclopogon apricus e C. diversifolius) o rostelo possui o aspecto de uma bolsa (Fig. 2F). Em todas as espécies, o viscídio é deltoide, em vista lateral, e possui a superfície dorsal adesiva, recoberta por membrana que se rompe em contato com o polinizador, liberando uma substância que fixa o polinário ao corpo do agente. As polínias encontram-se fixadas na base do viscídio (Figs. 2A, B e F). Também em todas as espécies, o ginostêmio é recoberto por uma cutícula estriadas observando-se, na epiderme, inúmeras papilas, mais curtas na base da estrutura e mais longas em direção ao estigma (Figs. 2A–F).

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A morfologia e a estrutura do labelo são bastante uniformes nos táxons estudados, observando-se em todos eles células epidérmicas retangulares ou papilosas e dilatações marginais, na sua porção basal (Figs. 3A–H, pontas de seta). Na região apical do labelo (epiquílio) a epiderme é formada por células globosas e/ou papiliformes curtas (Figs. 3A–F, setas) e revestida por cutícula estriada . Nos Cyclopogon transferidos para Warscaea (Cyclopogon apricus e C. diversifolius), observam-se tricomas na porção central do epiquílio (Figs. 3G–H, Tr), enquanto nas demais espécies essa mesma região é revestida por células epidérmicas comuns ou por células globosas e papilas curtas. Na região basal do labelo (hipoquílio), notam-se células epidérmicas comuns e/ou células papiliformes curtas, em todos os representantes. Em algumas espécies mantidas em Cyclopogon sensu stricto (C. congestus, C. elatus, C. luteoalbus), em C. polyaden (transferida para Stigmatosema) e em C. variegatus (incluída em Beadlea), o labelo possui duas projeções cônicas nas margens do hipoquílio, denominadas aurículas (Figs. 3A, D, F, pontas de seta), que são mais reduzidas em C. luteoalbus (Fig. 3B, ponta de seta). Essas projeções são revestidas por células epidérmicas retangulares ou isodiamétricas, em todas as espécies (Fig. 3). Tais estruturas também estão presentes nos Cyclopogon transferidos para Warscaea (C. apricus, C. diversifolius) em C. sarcoglottidis (incluído em Cocleorchis) e em C. inaequilaterus (incluído em Stigmatosema; Figs. 3C, E, G e H, pontas de seta), nestas espécies, porém, não formam aurículas propriamente ditas, mas são digitiformes. Na face abaxial, as margens do labelo são recobertas por papilas, exceto em C. luteoalbus e C. sarcoglottidis com células isodiamétricas (Fig. 4A–D). Nessa mesma face, observam-se células globosas na porção mediana dos labelos de espécies mantidas em Cyclopogon (C. congestus, C. elatus) e das transferidas para Warscaea (C. diversifolius), para Stigmatosema (C. polyaden) e para Beadlea (C. variegatus; Figs. 4 E–H).

Discussão

Em orquídeas, as características morfológicas florais relacionadas aos agentes polinizadores têm sido consideradas como o principal fator que explica a diversidade e a evolução desses órgãos (Darwin 1877). As características compartilhadas pelas espécies de Cyclopogon s.l., como coloração clara das flores, labelo atuando parcialmente como plataforma de pouso, néctar em pequena quantidade de aspecto viscoso e emissão de fragrância, aparentemente,

65 confirmam a síndrome de polinização melitófila (Pijl & Dodson 1966; Dressler 1981; Singer & Cocucci 1997). Apesar das flores analisadas possuírem pétalas e sépalas com morfologia semelhante, algumas características estruturais do labelo e do ápice do rostelo são particulares de determinadas espécies. Morfologicamente, a região apical do labelo é dilatada e, provavelmente, funciona como plataforma de pouso para os polinizadores, à semelhança do descrito por Singer & Coccuci (1999) para C. diversifolius. Abaixo dessa região, observa-se uma porção estreita (ístmo), e, na base do labelo, encontram-se duas estruturas laterais, de forma dilatada ou cônica (aurículas), provavelmente associadas à produção de néctar, em todas as espécies. Nos representantes associados ao gênero Beadlea Small (1903) (C. variegatus) e naqueles incluídos em Cocleorchis Szlachetko (1994) (C. sarcoglottidis) e Stigmatosema Garay (1982) (C. inaequilaterus e C. polyaden), o labelo é revestido por células epidérmicas comuns ou por papilas curtas a arredondadas, nas duas faces. A ocorrência de papilas na superfície adaxial dessa estrutura, pode auxiliar na atração de polinizadores, pois elas concentram os raios luminosos, conferindo um aspecto reluzente (Kay et al. 1981). Nos táxons associados ao gênero Warscaea (C. apricus e C. diversifolius; Szlachetko 1994), aparecem tricomas longos na porção central do ápice do labelo. Em Ophrys, também pertencente à família Orchidaceae, a presença de tricomas epidérmicos, associados a células cônicas e à ocorrência de grãos de amido no parênquima, parece ser responsável pela reflexão luminosa e pelas cores encontradas nas peças florais (Bradshaw et al. 2010). Nas espécies mantidas em Cyclopogon s.s. (C. congestus, C. luteoalbus) e em algumas associadas a Warscaea (C. diversifolius), Stigmatosema (C. polyaden) e Beadlea (C. variegatus) aparecem, na face abaxial do labelo, estruturas semelhantes aos tricomas globulares de Cyclopogon elatus (Wiemer et al. 2009), espécie também mantida em Cyclopogon. Nesses tricomas, as células secretoras são globosas e encontram-se associadas a células parenquimáticas subepidérmicas. A localização (face abaxial do labelo) e organização incomuns (tricomas globulares associados a células parenquimáticas subepidérmicas) dessas estruturas, são raros em Orchidaceae (Wiemer et al. 2009). Na família, a face secretora do labelo é, em geral, a adaxial e o tecido secretor formado por células epidérmicas uniformes com ou sem a participação de células parenquimáticas subepidérmicas (Stern et al. 1986, Stpizaynska 2001). Este caráter talvez represente uma plesiomorifa para o grupo e se encontre associado à polinização melitófila (Borba et al. 2014).

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Com relação ao ápice do rostelo, observa-se, nas flores das espécies estudadas, uma morfologia variada após a remoção do polinário. Nos táxons considerados típicos de Cyclopogon (C. congestus, C. elatus, C. luteoalbus), o ápice da coluna é oblongo e truncado e no associado a Cocleorchis (C. sarcoglottidis), o ápice é amplo e possui as margens refletidas. Nas espécies incluídas em Stigmatosema (C. inaequilaterus e C. polyaden) existem duas expansões laterais curvadas para cima, recobrindo parte do polinário e do viscídio, e naquelas associadas a Warscaea (C. apricus e C. diversifolius) o ápice tem a forma de uma “bolsa”. Entretanto, tal variação não parece estar relacionada a diferenças funcionais, já que o mesmo mecanismo de polinização, executado por abelhas da família Halictidae, é descrito para espécies típicas de Cyclopogon (Cyclopogon congestus; Singer & Sazima 1999 e C. elatus; Benitez-Vieyra et al. 2006) e para espécies associadas a Warscaea (C. diversifolius; Singer & Coccuci 1999) e a Beadlea, (C. dutraei; Galetto et al. 1997). Em Cotylolabium lutzii, espécie irmã da subtribo Spiranthinae, o rostelo longo- acuminado, após a remoção do polinário, é interpretado como característico de espécies polinizadas por beija-flor (Salazar 2011) e pode representar uma plesiomorfia para a subtribo, como sugerem os resultados de Borba et al. (2014). Dessa forma, rostelo com ápice oblongo a subquadrangular, como o de Cyclopogon e de outros gêneros de Spiranthinae, representaria uma condição derivada. Em Cotylolabium lutzii também foram observadas estruturas glandulares (Borba et al. 2014), semelhantes às encontradas na face abaxial de C. congestus, C. diversifolius, C. elatus, C. luteoalbus, C. polyaden e C. variegatus. Novamente aqui, a presença desses tricomas num grupo basal e irmão de Cyclopogon, pode indicar que esse caráter represente uma plesiomorfia para o grupo. O viscídio, estrutura que ocupa, junto com o rostelo, a porção apical da coluna, nos gêneros da aliança Pelexia, à qual pertence Cyclopogon, tem a forma de cunha, sendo achatado dorsi-ventralmente (muitas vezes com forma côncava ou convexa) e desenvolvido na base e nas porções laterais da região posterior. Apresenta margem apical delgada, com as polínias inseridas em posição basal ou sobre as margens laterais (Greenwood 1982). Embora esse tipo de viscídio tenha sido descrito como não possuindo uma superfície adesiva (Greenwood 1982), diversos estudos (Balogh 1982; Burns-Balogh & Robinson 1983; Dressler 1993; Singer & Cocucci 1999; Singer & Sazima 1999) mostram que ele possui superfície adesiva ventral, a qual é recoberta por fina membrana que se rompe quando pressionada pelo labrum das abelhas, liberando uma substância adesiva que fixa o polinário ao polinizador.

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Esse tipo de viscídio tem sido considerado uma sinapormorfia da aliança Pelexia, caracterizando esse grupo dentro de Spiranthinae (Balogh 1982; Burns-Balogh & Robinson 1983; Dressler 1993). Segundo Singer & Cocucci (1999), essas características do viscídio junto com flores claras, ressupinadas, de perfume leve, com tubo reto e polinários que aderem ao labrum das abelhas quando pressionados, são aspectos relacionados à polinização por abelhas da família Halictidae. Para Singer & Sazima (1999), a maioria das espécies não autógamas de Cyclopogon pode ser polinizada por estas abelhas. Segundo Salazar et al. (2003), caracteres florais homoplásicos que refletem adaptações ao mesmo grupo de polinizadores são comuns em orquídeas distantemente relacionadas. Entretanto, para os táxons aqui estudados, as semelhanças observadas representam mais sinapomorfias do que homoplasias, devido à sua proximidade filogenética. Embora os gêneros Beadlea, Stigmatosema e Warscaea possivelmente representem grupos monofiléticos, é provável que sejam ramos morfologicamente homogêneos e derivados de Cyclopogon s.l., cuja elevação de status taxonômico tornaria esse último um grupo parafilético (Salazar et al. 2003). Estudos filogenéticos com Spiranthinae, usando sequências de DNA (Salazar et al., em preparação), evidenciam que as relações dentro do grupo são mais complexas do que a morfologia floral pode indicar (Salazar 2003). A semelhança dos caracteres florais aqui observada, como na forma, revestimento e especializações do labelo e na morfologia da coluna, associada ao mesmo grupo de polinizadores e mecanismos de polinização, não justifica a divisão de Cyclopogon s.l. em diferentes gêneros, sugerindo uma abordagem mais conservativa que preserve a sua monofilia, pelo menos até que sejam realizados estudos reunindo informações sobre a biologia floral, a morfologia floral e os dados moleculares, para que melhor se compreenda a presença/ausência de relações que justifiquem a segregação dos grupos. Os resultados morfológicos aqui apresentados estão atualmente sendo complementados com os estudos moleculares do doutor Gerardo Salazar com o emprego de sequências de DNA ribossômico (ITS) e plastidial (rbcL, matK-trnK, trnL-trnF). Espera-se que ao fim, a união destes dados possam dar melhor suporte para uma definição mais precisa a respeito da circunscrição do gênero.

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Agradecimentos

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de doutorado concedida (Processo 2011/21150-5) a S.A.A e à equipe técnica do Centro de Microscopia Eletrônica da UNESP de Botucatu (CME) e do Centro de Microscopia Eletrônica da Universidade Autônoma do México (UNAM) pelo processamento das amostras para MEV.

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Tabela 1: Lista das espécies utilizadas no estudo com respectivas informações de vouchers.

Gênero atribuído Espécie Voucher ou nº Coleção ex situ

Cyclopogon congestus (Vell.) BOTU 025771 Hoehne

Cyclopogon sensu Presl Cyclopogon elatus (Sw.) IBB/BOT 0657 (1827) Schltr.

Cyclopogon luteoalbus GAS 7500 (A.Rich. & Galeotti) Schltr.

Cocleorchis sensu Szlachetko Cyclopogon sarcogottidis GAS 7793 (1994) Szlach.

Cyclopogon inaequilaterus GAS 7867

Stigmatosema sensu Garay (Poepp. & Endl.) Schltr.

(1982) Cyclopogon polyaden (Vell.) IBB/BOT 0679 Garay

Cyclopogon apricus (Lindl.) BOTU 028450 Warscaea sensu Szlachetko Schltr. (1994) Cyclopogon diversifolius GAS 7872

(Cogn.) Schltr.

Beadlea Small, sensu Garay Cyclopogon variegatus IBB/BOT 0647 (1982) Barb.Rodr.

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Figura 1. Flores de Cyclopogon s.l.: A–C. Cyclopogon (Warscaea) apricus, mostrando aspecto geral (A), a inflorescência (B) e a flor (C). D–F. Cyclopogon (Cyclopogon) elatus, mostrando o aspecto geral (D), a inflorescência (E) e a flor em vista frontal (F). G–I. Cyclopogon (Stigmatosema) polyaden, mostrando o aspecto geral da inflorescência (G), um detalhe da inflorescência (H) e o detalhe da flor em vista frontal (I). J–L. Cyclopogon (Beadlea) variegatus, mostrando o aspecto geral da inflorescência (J) e detalhes da flor, em vista lateral (K) e frontal (L). Barras de escala: A, D, G, J – 1 cm; B, E, H, K – 5mm; C, F, I, L – 2mm.

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Figura 2. Fotomicrografia do ginostêmio (coluna) de Cyclopogon s.l.: A. Cyclopogon (Beadlea) variegatus, mostrando a presença de viscídio e polínias. B. C. (Cyclopogon) elatus, mostrando a presença de viscídio e polínias. C. C. (Cyclopogon) luteoalbus; note o ápice do rostelo truncado após a remoção do polinário. D. C. sarcoglottidis, mostrando o ápice do rostelo com as margens dobradas para baixo. E. C. (Stigmatosema) inaequilaterus, com as margens do ápice do rostelo dobradas para cima. F. C. (Warscaea) apricus, mostrando o ápice da coluna com rostelo em forma de “bolsa” e a presença de viscídio e polínias. An=antera; Po=polínia; Ro=rostelo; *=viscídio. Barras de escala = 500µm.

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Figura 3. Fotomicrografias do labelo de Cyclopogon s.l. (face adaxial). A. Cyclopogon (Beadlea) variegatus. B. C. (Cyclopogon) luteoalbus. C. C. (Cyclopogon) sarcoglottidis. D. C. (Cyclopogon) congestus. E. C. (Stigmatosema) inaequilaterus. F. C. (Stigmatosema) polyaden. G. C. (Warscaea) apricus. H. C. (Warscaea) diversifolius. Pontas de setas=aurículas; setas=margens do labelo com células papiliformes; Tr=tricomas. Barras de escala = 1mm.

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Figura 4. Fotomicrografias da face abaxial do labelo de Cyclopogon s.l.: A–D. Região marginal do hipoquílio; E–H. Região mediana com presença de prováveis osmóforos. A – Cyclopogon apricus; B – C. polyaden; C – C. sarcoglottidis; D – C. luteoalbus; E – C. variegatus; F – C. elatus; G – C. polyaden; H - C. diversifolius. Barras de escala: A-D - 100µm; E, F - 250µm; D - 200µm.

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CONSIDERAÇÕES FINAIS

Sabe-se que em Orchidaceae, as características morfológicas florais relacionadas aos agentes polinizadores têm sido consideradas como o principal fator que explica a diversidade e a evolução desses órgãos. Os trabalhos existentes tratam, em geral, de aspectos florais específicos, como pólen, morfologia do polinário e da coluna de determinados representantes e a escassez de informações relacionando polinização e morfologia floral torna difícil entender a biologia das espécies, o papel funcional das estruturas reprodutivas e, inclusive a delimitação dos diversos grupos. A presença de tégula nas espécies de Goodyerinae incluindo Zeuxine strateumatica antes caracterizada como não possuindo esta estrutura, ressalta a importância de estudos abrangendo uma maior quantidade de espécies para realmente comprovar a possibilidade da inclusão de mais um caráter diagnóstico para a subtribo. Neste trabalho também foi identificada a presença de uma estrutura semelhante a um hâmulo rudimentar nas espécies C. apricus, S. fasciculata e S. elatum (Spiranthinae), o que pode explicar a origem da posição dorsal do viscídio, um aspecto relacionado ao tipo de comportamento e morfologia do polinizador. Em Cyclopogon, apesar das flores analisadas possuírem morfologia semelhante, algumas características estruturais do labelo e do ápice do rostelo são particulares de determinadas espécies. Nas margens da base do labelo, encontram-se duas estruturas dilatadas ou cônicas (aurículas), provavelmente associadas à produção de néctar, em todas as espécies. Com relação ao ápice do rostelo, observa-se uma morfologia variada nas espécies após a remoção do polinário. Entretanto, tal variação não parece estar relacionada a diferenças funcionais, uma vez que o mesmo mecanismo de polinização é descrito por diferentes autores para diversas espécies do gênero. As semelhanças observadas provavelmente representam sinapomorfias e por este motivo manutenção das espécies em Cyclopogon s.l. é recomendada até que sejam realizados mais estudos reunindo informações sobre biologia e morfologia floral a dados moleculares. Embora as flores de diferentes táxons da tribo Cranichideae tenham sido analisadas, uma lacuna no conhecimento sobre o papel desempenhado por cada estrutura no mecanismo de polinização ainda persiste. Por essa razão, são necessários mais estudos investigando a morfo-anatomia e o desenvolvimento estrutural das flores somado as observações sobre a

82 biologia floral das espécies para o entendimento do papel funcional desempenhado pelas estruturas florais.

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