اندام زایی مستقیم از ریزنمونههای بخشهای رویشی L. Gerbera Jamesonii رقم
Total Page:16
File Type:pdf, Size:1020Kb
گل و گیاهان زینتی )1399(، 5 )1(: 1 - 12 مقاله پژوهشی Nilo Gerbera jamesonii L. اندام زایی مستقیم از ریزنمونههای بخشهای رویشی رقم *2 *1 1 مهدی ایزدی ، نیما احمدی ، پژمان آزادی 1. گروه علوم باغبانی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس، تهران 2. بخش مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی، پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج [email protected] تاریخ دریافت: 20/8/98، تاریخ پذیرش: 1400/2/13 چکیده برای موفقیت استفاده از فنون انتقال ژن، دستیابی به روش کارآمد باززایی ضروری است. در این پژوهش در آزمایش نخست، اندام زایی مستقیم ژربرا از ریزنمونههای برگ کامل، دمبرگ، دمبرگ خراشدار و ﻻیه یاخته ای نازک )Thin Cell ،TCL Layer( و ترکیب تنظیم کننده رشد BAP )0، 1، 2 و 3 میلی گرم در لیتر(، TDZ ) 0، 1/0، 5/0، 8/0 و 1 میلی گرم در لیتر( و IAA با غلظت 1/0 میلی گرم در لیتر در دو حالت نوری )تاریکی به مدت یک ماه و 16 ساعت روشنایی/8 ساعت تاریکی( مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین در آزمایش دوم، باززایی سه برش اول ریزنمونه ﻻیه یاختهای نازک از انتهای دمبرگ متصل به گیاه در ترکیب هورمونی BAP )0، 1 و 2 میلی گرم در لیتر(، TDZ ) 0 و 5/0 میلی گرم در لیتر( و IAA )0، 1/0 و 3/0 میلی گرم در لیتر( مورد ارزیابی قرار گرفت. در تمام آزمایش ها، محیط کشت MS استفاده شد. نتیجهها نشان داد که بهترین محیط باززایی برای ریزنمونههای برگ کامل )2/33% باززایی، 66/3 شاخه(، دمبرگ ) 66/86% باززایی، 33/33 شاخه(، دمبرگ خراش دار )2/53% باززایی، 33/10 شاخه( محیط دارای 2 میلی گرم در لیتر BAP در روشنایی و برای ریزنمونه TCL Downloaded from flowerjournal.ir at 16:56 +0330 on Tuesday September 28th 2021 )6/46% باززایی، 29 شاخه(، 2 میلی گرم در لیتر BAP به همراه 5/0 میلی گرم در لیتر TDZ در تاریکی میباشد. در آزمایش دوم نیز بیشترین میزان اندام زایی در ریزنمونههای TCL از برش اول و در محیط کشت دارای 2 میلی گرم در لیتر BAP، 0/5 میلی گرم در لیتر TDZ و 1/0 میلی گرم در لیتر IAA )20% باززایی، 66/18 شاخه( به دست آمد. واژههای کلیدی: اندام زایی، باززایی، تنظیم کنندههای رشد گیاهی، ﻻیه یاخته ای نازک. مقدمه ژربرا یکی از مهم ترین گلهای بریدنی به شمار میرود به طوری که در فهرست 10 گل بریدنی پر فروش جهان قرار دارد )Azadi et al., 2016(. جنس Gerbera از نظر گیاهشناسی در تیره Asteraceae است که گیاهی دوگان، علفی، چند ساله، حساس به سرما و دارای حالت رشد بیساگ1 میباشد. این گیاه بومی نواحی گرمسیری آمریکای جنوبی، آفریقا و آسیا میباشد ولی امروزه با کمک تجهیزات گلخانهای در دامنه گستردهای از اقلیمها کشت میشود )Sheela, 2006(. ژربرا با Rosette -1 گل و گیاهان زینتی )1399(، 5 )1(: 12-1 روشهایی مانند کشت دانه و تقسیم بوته افزایش می یابد، اما روش افزایش ریزافزایی آن از نظر تجاری مورد توجه قرار گرفته است. روش ریزافزایی افزون بر افزایش گیاه، برای باززایی یاخته پس از انتقال ژن به گیاه نیز به کار میرود ) ,Teeri 2006(. افزون بر این، روشهای گوناگون ریزافزایی در نگهداری ذخیره های ژنتیکی )Meyer et al., 1988(، بررسی زیست ساخت متابولیتهای ثانویه )Chakrabarty et al. 2008; Elomaa et al., 2003(، انگیزش خودچارگانی و نیمگانی ) Elomaa et al., 1993; Korbin et al., 2001; Nowak et al., 1997( به کار گرفته میشود. با توجه به نیاز روز افزون به افزایش صفات برتر رقمهای بازارپسند بدون تغییرهای ژنتیکی ناخواسته در ویژگیهای ارزشمند آن ها، امروزه از روشهای زیست فناوری برای انتقال ژن و ایجاد ویژگیهای دلخواه استفاده میشود )Jauhar, 2006(. به هر حال موفقیت انتقال ژن نیاز به استقرار سیستم مناسبی برای باززایی از ریزنمونههای مختلف دارد. ریزافزایی ژربرا نخستین بار در سال 1974 با استفاده از ریزنمونه نوک شاخه )Murashige et al., 1974( و پس از آن در سال 1985 انجام شد )Huang and Chu, 1985(. برای باززایی درون شیشهای گل ژربرا از باززایی غیرمستقیم نیز استفاده شده است )Cardosa et al., 2013(. باززایی غیرمستقیم نیازمند تولید پینه و سپس انگیزش پینه به تولید گیاهان کامل است که این کار ممکن است باعث بی ثباتی ژنتیکی و افزایش گوناگونی بدن- همگروهی در گیاهان تولید شده شود )Bhatia et al., 2009(. در این پژوهش تﻻش شد تا با کاربرد ترکیب تنظیم کنندههای رشد اکسینی و سایتوکینینی روش کار مناسبی برای باززایی به ویژه باززایی مستقیم به دست آید. همچنین از آنجا که نسبت ترکیبهای تنظیم کننده رشد با غلظت مناسب آن ها تعیین کننده مسیر رشد به سوی باززایی و یا پینهزایی از ریزنمونههای تهیه شده از قسمتهای مختلف گیاه ژربرا میباشد، با استفاده از روشهای ریزافزایی و همچنین مقایسه محیطهای مناسب برای باززایی هر ریزنمونه، ترکیب مناسب تنظیم کننده رشد مورد بررسی قرار گرفت. دستور کار به دست آمده می تواند در بررسی های بهنژادی درون شیشهای و انتقال ژن به این گیاه مورد استفاده قرار گیرد. مواد و روشها پرآوری و افزایش نمونه گیاهی از گیاهان استقرار یافته درون شیشهای ژربرا1 رقم Nilo به دست آمد. محیط کشت پایه برای پرآوری گیاهان Downloaded from flowerjournal.ir at 16:56 +0330 on Tuesday September 28th 2021 درون شیشهای شامل نمکها و ویتامینهای محیط MS به همراه 30 گرم در لیتر سوکروز، 7 گرم در لیتر آگار و تنظیم کننده رشد گیاهی 5/0 میلی گرم در لیتر BAP بود. نمونهها در اتاق رشد با شرایط نور فلوئورسنت سرد با رژیم نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، دمای 1±23 درجه سلسیوس و رطوبت نسبی 5±35% قرار گرفتند. برای پرآوری، زیرکشتها هر یک ماه یک بار انجام شد. باززایی ریزنمونهها از گیاهان پرآوری شده 1 تا 2 ماهه تهیه شدند. ریزنمونه برگ کامل، با جدا کردن برگ از محل اتصال دمبرگ به گیاه مادری به دست آمد و ریزنمونه دمبرگ نیز مانند برگ کامل تهیه شد با این تفاوت که پهنک آن حذف شد. نمونه دمبرگ خراش دار نیز با ایجاد خراشهای سطحی در ریزنمونه دمبرگ تهیه شد. تهیه ریزنمونه TCL نیز به کمک چاقو و برشهای Gerbera jamesonii L. -1 2 گل و گیاهان زینتی )1399(، 5 )1(: 12-1 عرضی و نازک با ضخامتی حدود 5/0 میلی متر در قسمت اتصال دمبرگ به گیاه مادری انجام شد، که از هر دمبرگ حداکثر 4 ریزنمونه TCL گرفته شد. محیط کشت پایه برای باززایی، مشابه محیط به کار رفته برای پرآوری بود. تنها تفاوت محیطهای باززایی و پرآوری در ترکیب و میزان تنظیم کنندههای رشد به شرح زیر بود: آزمایش 1: مقایسه باززایی و پینهزایی ریزنمونههای مختلف در ترکیب تنظیم کنندههای رشد گیاهی BAP و TDZ با غلظتهای مختلف در این آزمایش از 4 نوع ریزنمونه برگ کامل، دمبرگ، دمبرگ خراش دار و TCL استفاده شد. تنظیم کنندههای رشد گیاهی به کار رفته در محیط کشت نیز شامل BAP در غلظتهای 0، 1، 2 و 3 میلی گرم در لیتر، TDZ نیز در غلظتهای 0، 0/1، 5/0، 8/0 و 1 میلی گرم در لیتر و IAA هم تنها در غلظت 1/0 میلی گرم در لیتر بود. هر تیمار دارای 3 تکرار و هر تکرار شامل 5 ریزنمونه از برگ کامل، دمبرگ، دمبرگ خراش دار و 10 ریزنمونه از TCL بود. برای تمام تیمارها دو حالت روشنایی )16 ساعت نور/8 ساعت تاریکی( و تاریکی به مدت یک ماه در نظر گرفته شد. آزمایش 2: مقایسه باززایی سه برش اول ریزنمونه TCL در ترکیب با سه تنظیم کننده رشد گیاهی TDZ ،BAP و IAA در این آزمایش از سه برش اول ریزنمونه TCL از انتهای دمبرگ متصل به گیاه مادری استفاده شد، که برشهای اول، دوم و سوم به صورت جداگانه در محیط کشت قرار داده شدند. همچنین تنظیم کنندههای رشد به کار رفته شامل BAP در غلظتهای 0، 1 و 2 میلی گرم در لیتر، TDZ در غلظتهای 0 و 5/0 میلی گرم در لیتر و IAA نیز در غلظتهای 0، 1/0 و 3/0 میلی گرم در لیتر بودند. در این آزمایش نیز هر تیمار دارای 3 تکرار و هر تکرار دارای 10 ریزنمونه بود. شرایط نوری نیز در این آزمایش برای تمام تیمارها تاریکی به مدت دو هفته در ابتدای کشت بود و سپس شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی به کار رفت. شرایط اتاق رشد ± نمونهها در اتاق رشد با دمای 1 23 درجه سلسیوس و رطوبت نسبی بین 30 تا 40% قرار گرفتند. Downloaded from flowerjournal.ir at 16:56 +0330 on Tuesday September 28th 2021 ویژگی های مورد ارزیابی در این پژوهش ویژگیهایی مانند میانگین درصد ریزنمونههای باززایی کرده و شمار شاخه به دست آمده در هر تیمار و تکرار مورد ارزیابی قرار گرفت. افزون بر این در ریزنمونههایی که پینه تولید کردند، درصد پینهزایی و درجه پینهزایی )دامنه درجه بندی پینهزایی از 0 تا 3 در نظر گرفته شد( مورد بررسی قرار گرفت. واکاوی آماری این پژوهش در قالب طرح به طور کامل تصادفی انجام شد. برای واکاوی آماری دادهها از نرم افزار SAS نسخه 1/9 بهره گیری و مقایسه میانگینها در سطح احتمال 1% با آزمون LSD انجام شد. نتایج و بحث آزمایش 1: مقایسه باززایی ریزنمونههای مختلف در ترکیب دو تنظیم کننده رشد گیاهی BAP و TDZ در غلظتهای مختلف 3 گل و گیاهان زینتی )1399(، 5 )1(: 12-1 در این دسته از آزمایشها نوع و غلظت تنظیم کنندههای رشد گیاهی به کار رفته باززایی شاخه را در تمامی 4 نوع ریزنمونه مورد پژوهش به میزان قابل توجهی زیر اثر قرار داد. ریزنمونهها آغازههای جوانه شاخه را پس از 2 تا 3 هفته از کشت در محیطهای دارای غلظتهای مختلف TDZ ،BA و 1/0 میلی گرم در لیتر IAA تشکیل دادند )شکل 1( و رشد شاخههای باززایی کرده پس از 6 هفته کامل شد )شکل 2(. بیشترین درصد باززایی و میانگین شمار شاخه به ترتیب از ریزنمونههای دمبرگ )66/86%، 33/33 شاخه(، دمبرگ خراش دار )33/53%، 33/10 شاخه( و برگ کامل )%33/2، 3/66 شاخه( از تیمار 2 میلی گرم در لیتر BAP در روشنایی به دست آمد که این نتیجهها همسو با یافتههای سایر پژوهشگران )Chung et al., 2016; Shabanpour et al., 2011( بود.