Wybrane Zagadnienia Z Zakresu Nauk Biologicznych I Weterynaryjnych

Wybrane zagadnienia z zakresu nauk biologicznych i weterynaryjnych

Redakcja: Kamil Maciąg Alicja Danielewska

Lublin 2019

Wydawnictwo Naukowe TYGIEL składa serdecznie podziękowania dla zespołu Recenzentów za zaangażowanie w dokonane recenzje oraz merytoryczne wskazówki dla Autorów.

Recenzentami niniejszej monografii byli:  prof. dr hab. Łukasz Adaszek  dr hab. Mariola Andrejko  dr hab. inż. Ryszard Tuz  dr Jolanta Artym  dr n. o zdr. Mariola Janiszewska  dr Agnieszka Kuźniar  dr n. med. Łukasz Pilarz  dr Anna Pytlak  dr Małgorzata Telecka

Wszystkie opublikowane rozdziały otrzymały pozytywne recenzje.

Skład i łamanie: Alicja Danielewska Monika Maciąg

Projekt okładki: Marcin Szklarczyk

ISBN 978-83-65932-95-2

Wydawca: Wydawnictwo Naukowe TYGIEL sp. z o.o. ul. Głowackiego 35/341, 20-060 Lublin www.wydawnictwo-tygiel.pl

Spis treści

Karolina Boguszewska, Michał Szewczuk, Bolesław T. Karwowski Naprawa uszkodzeń DNA w mitochondriach poprzez wycinanie zasady  system BER .... 7

Michał Szewczuk, Karolina Boguszewska, Bolesław T. Karwowski Rola OGG1 w przebiegu procesu naprawy DNA przez system BER ...... 19

Magdalena Szatkowska, Renata Krupa Paralogi RAD51 w naprawie pęknięć dwuniciowych DNA na drodze rekombinacji homologicznej ...... 28

Jakub Krzaczyński, Beniamin Grabarek, Barbara Strzałka-Mrozik Zmiany aktywności transkrypcyjnej genu CYP1B1 związanego z sygnalizacją IL-12/23 w hodowli NHDF eksponowanych na adalimumab...... 37

Beata Kuczyńska, Arkadiusz Budziński, Konrad Wiśniewski, Kamila Puppel Zastosowanie badań proteomicznych w hodowli bydła ...... 46

Sylwia Kłys, Anna Czech Produkcja trzody chlewnej jako źródło pierwiastków biogennych w środowisku ...... 54

Anna Wilczyńska, Jerzy Ziętek, Michał Jabłoński, Sylwia Sajdak Analiza cytologiczna rozmazu z hemolimfy Cornu aspersum i Cepaea nemoralis ...... 61

Katarzyna Kruk Wykorzystanie nicieni owadobójczych z rodziny Steinernematidae i Heterorhabditidae w ochronie roślin przed szkodnikami w uprawach pod osłonami ...... 69

Tomasz Kuczyński, Anna Barańska, Piotr Pieckiel Trawianka Perccottus glenii – inwazyjny gatunek w zbiornikach wodnych rezerwatu Mewia Łacha ...... 76

Grzegorz Kania Znaczenie krocionogów (Diplopoda) w ekotoksykologii. Czy Diplopoda są bioindykatorami środowiska? ...... 88

Beata Kuczyńska, Kamila Puppel, Beata Madras-Majewska Fitobiotyki jako alternatywa w prewencji mastitis i wzmocnienia jakości dietetycznej mleka w gospodarstwach eko-certyfikowanych ...... 99

Sylwia Kłys, Anna Czech Białkowe komponenty i dodatki paszowe w żywieniu świń ...... 111

Monika Lik, Dominika Gulda, Przemysław Brodzki Ocena obrazu termografii powierzchniowej rudawki nilowej (Rousettus aegyptiacus) pod wpływem stresu ...... 120

Michał Jabłoński,Paweł Łyp, Jerzy Ziętek, Anna Wilczyńska, Sylwia Sajdak Przypadek przetrwałego przewodu tętniczego ductus arteriosus peristens u królika domowego Oryctolagus cuniculus f. domesticus ...... 130

Jacek Mrowiec, Aleksandra Banasik, Dominika Czyżyk Wiek jałówki podczas pierwszego zacielenia, a jej parametry fizjologiczne i wydajność laktacyjna w okresie po wycieleniu ...... 139

Tomasz Arkadiusz Łabuz Neoichnologia w badaniach obecności i aktywności zwierząt w środowisku na przykładzie wydm ...... 150

Indeks Autorów ...... 159

Karolina Boguszewska1, Michał Szewczuk2, Bolesław T. Karwowski3 Naprawa uszkodzeń DNA w mitochondriach poprzez wycinanie zasady  system BER

1. Wstęp Każda żywa komórka jest w sposób ciągły narażona na działanie wielu czynników, zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych, które oddziałują z jej materiałem genetycznym. Produkty metabolizmu komórkowego, reaktywne formy tlenu, zanieczyszczenia środowiska i żywności, promieniowanie jonizujące oraz chemioterapeutyki – wszystko to może wywoływać uszkodzenia DNA, których skutki na poziomie molekularnym nie są jeszcze w pełni poznane. Uszkodzenia te mogą powodować blokowanie transkrypcji genów lub prowadzić do mutacji. W przypadku gdy uszkodzenie nie zostanie wykryte lub naprawione przez komórkę istnieje prawdopodo- bieństwo utrwalenia go jako mutacji w trakcie kolejnych podziałów komórkowych. Dlatego też systemy naprawcze muszą być w komórce stale aktywne, aby wykrywać i niwelować skutki uszkodzeń, zanim dojdzie do przekazania uszkodzonego genomu następnym pokoleniom. Skuteczność mechanizmów naprawczych zależna jest od wielu czynników m.in. rodzaju komórki i powstałego uszkodzenia. W sytuacji, gdy w genomie znajdzie się zbyt wiele uszkodzeń lub gdy system naprawy DNA nie funkcjonuje efektywnie może dojść m.in. do wejścia komórki na drogę kontrolowanej śmierci (apoptozy) lub do niekontrolowanych podziałów prowadzących do rozwoju nowotworu w organizmie. Mitochondrialne DNA w ostatnich latach budzi szczególne zainteresowania badaczy. Mutacje mogą prowadzić do zaburzenia poprawności i stabilności informacji genetycznej, tym samym mając pośredni wpływ na zdrowie i życie całego organizmu. Przyjmuje się, że w mitochondriach za naprawę większości uszkodzeń odpowiada system BER (ang. base excision repair), który naprawia uszkodzenie poprzez wycięcie pojedynczej zasady lub fragmentu 2-10 nukleotydów. Specyficzne enzymy rozpoznają i usuwają uszkodzone zasady azotowe, po czym w wyniku działania szeregu enzymów wchodzących w skład systemu BER wstawiony zostaje poprawny nukleotyd. DNA mitochondrialny (mtDNA, ang. mitochondrial DNA) jest szczególnie narażony na powstawanie uszkodzeń. Zachodzące w jego pobliżu reakcje łańcucha oddechowego oraz generacja znacznej ilości reaktywnych form tlenu mają wysoki potencjał oksydacyjny. Badanie mechanizmów powstawania i naprawy uszkodzeń DNA jest kluczowe dla pełnego zrozumienia tych procesów oraz opracowania przyszłych terapii. Niniejsza praca przedstawia podstawowe zagadnienia dotyczące DNA i jego uszkodzeń, opisuje system naprawczy BER działający w mitochondriach oraz wybrane choroby związane z mutacjami w mtDNA.

1 [email protected], Pracownia Uszkodzeń Kwasów Nukleinowych, Zakład Bromatologii, Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, www.bromatologia.umed.pl. 2 [email protected], Pracownia Uszkodzeń Kwasów Nukleinowych, Zakład Bromatologii, Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, www.bromatologia.umed.pl. 3 [email protected], Pracownia Uszkodzeń Kwasów Nukleinowych, Zakład Bromatologii, Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, www.bromatologia.umed.pl.

Karolina Boguszewska, Michał Szewczuk, Bolesław T. Karwowski

2. Budowa i funkcje mitochondriów Mitochondria obecne są we wszystkich komórkach eukariotycznych a ich główną rolą jest zaopatrywanie komórki w energię. Z tego powodu stanowią jedne z najważ- niejszych organelli obecnych w komórce. Komórki eukariotyczne posiadają od kilku do kilkunastu tysięcy mitochondriów, które stanowić mogą nawet 12% objętości komórki [1]. Mitochondrium zbudowane jest z (rys. 1):  zewnętrznej błony komórkowej (gładkiej) oddzielającej organellum od cytoplazmy;  wewnętrznej błony komórkowej (pofałdowanej) tworzącej grzebienie mitochondrialne, które zawierają białka odpowiedzialne za proces oddychania komórkowego;  macierzy mitochondrialnej, w której znajduje się m.in. mitochondrialne DNA;  przestrzeni międzybłonowej (perimitochondrialnej) zawierającej m.in. kinazę adenylanową, która zostaje aktywowana w przypadku zbyt małej ilości ATP w komórce;  rybosomów;  ziarnistości. Co ciekawe, mitochondrialne DNA wykazuje podobieństwo do genomu bakteryjnego, co pozwala podejrzewać, że jest to pozostałość po organizmach endosymbio- tycznych. Zgodnie z tzw. teorią endosymbiotyczną zakłada się, że organizmy te zostały włączone do komórek pierwotnych eukariontów i od tej pory funkcjonowały w symbiozie z gospodarzem. Wykazano wiele podobieństw pomiędzy mitochondriami a komórkami prokariotycznymi. Organellum to tworzy się w procesie podobnym do podziału i posiada własne DNA, które występuje w 2-10 kopiach i koduje od kilkunastu do kilkudziesięciu białek. Tak jak u bakterii występuje ono w postaci kulistego nukleoidu. Ponadto, rybosomy kodowane przez mtDNA mają wielkość 70S, co odpowiada komórkom prokariotycznym.

Rysunek 1. Schemat przedstawiający budowę mitochondrium. Na rysunku zaznaczono najważniejsze elementy: błonę zewnętrzną i wewnętrzną wraz z grzebieniami mitochondrialnymi i przestrzenią międzybłonową (perimitochondrialną), macierz mitochondrialną, rybosomy, ziarnistości, położenie DNA oraz kompleksów syntazy ATP stanowiących ostatni etap łańcucha oddechowego, w którym produkowana jest energia w postaci ATP [2]

Naprawa uszkodzeń DNA w mitochondriach poprzez wycinanie zasady – system BER

Główną funkcją mitochondriów jest przeprowadzanie procesów oddychania komórkowego zapewniającego energię w postaci ATP (adenozyno-5’-trifosforan, ang. adenosine-5’-triphosphate) dla całej komórki. Te niewielkie organelle są zaanga- żowane również w inne procesy takie jak sygnalizacja komórkowa, wzrost i śmierć komórkowa i kontrola cyklu komórkowego [3]. Jednakże, w kontekście powstawania uszkodzeń DNA łańcuch oddechowy gra największą rolę. Intensywne procesy oksydacyjne są przyczyną licznych uszkodzeń mitochondrialnego materiału genetycznego, który ze względu na swoje położenie jest na nie szczególnie narażony [4]. Rodzaje i przyczyny uszkodzeń DNA omówione zostały w dalszej części pracy, jednak należy pamiętać, iż ich kumulacja prowadzi do procesów patologicznych, co może być przyczyną starzenia się i śmierci komórki. Dlatego też niezmiernie istotne jest poprawne i wydajne funkcjonowanie systemów naprawczych w mitochondriach, a w szczególności naprawy uszkodzeń oksydacyjnych przez system BER. 3. Mitochondrialny DNA Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA, ang. deoxyrybonucleic acid) stanowi nośnik informacji genetycznej każdego żywego organizmu. DNA zlokalizowane jest głównie w jądrze komórki, które podczas rozmnażania ulega podziałowi. Wraz z nim replikowana jest informacja genetyczna i przekazywana kolejnym pokoleniom. DNA znajduje się również w mitochondriach, gdzie występuje w postaci kolistej cząsteczki (rys. 2). Pojedyncza cząsteczka mitochondrialnego DNA (mtDNA, ang. mitochondrial DNA) u ludzi składa się z 16569 par zasad azotowych. Zawiera ona 37 genów: 13 odpowiedzialnych za kodowanie białek, 22 za transportujący RNA (tRNA, ang. transfer RNA) i 2 za rybosomalne RNA (rRNA, ang. ribosomal RNA) [3]. Białka kodowane przez mtDNA wchodzą w skład kompleksu cytochromu c i b oraz podjednostek dehydrogenazy NADH i kompleksu ATPazy. Stanowią one jedynie część białek łańcucha oddechowego. Pozostałe są kodowane przez nDNA i transportowane z jądra do mitochondriów [5]. Stabilność łańcucha DNA jest uzależniona od poprawnej sekwencji podjednostek nukleozydowych. Ma ona wpływ na wiele procesów zachodzących w komórce, w tym replikację materiału genetycznego, transkrypcję RNA i pośrednio na syntezę białek. Uszkodzenia DNA są częstym zjawiskiem, a ich poziom jest wyższy w mtDNA niż w nDNA [4]. Przyczyn tego zjawiska można doszukiwać się w m.in.:  lokalizacji mtDNA w małej odległości wewnętrznej błony mitochondrialnej, gdzie generowana jest duża ilość reaktywnych form tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species);  braku histonów, które w jądrowym DNA wchodzą w skład chromatyny wraz z białkami niehistonowymi;  braku intronów, co powoduje konieczność każdorazowej ekspresji całego genomu;  niewystarczającej aktywności dysmutazy ponadtlenkowej, która odpowiada za - konwersję nadmiaru anionorodnika ponadtlenkowego (O2 ) do nadtlenku wodoru (H2O2) i tlenu (O2);  mniej efektywnym działaniu systemów naprawczych.

Karolina Boguszewska, Michał Szewczuk, Bolesław T. Karwowski

Rysunek 2. Struktura ludzkiego genomu mitochondrialnego kodującego 13 białek, 22 cząsteczki tRNA oraz 2 cząsteczki rRNA [opracowanie własne]

DNA mitochondrialny jest narażony głównie na uszkodzenia oksydacyjne [6]. W mitochondriach w ciągu każdej minuty powstają 2-3 miliony nadtlenków w przeliczeniu na miligram białka [7]. Dodatkowo, w mtDNA udowodniono działanie jedynie kilku ze znanych systemów naprawczych. Jednym z nich jest system BER, który naprawia uszkodzenia alkilacyjne, oksydacyjne oraz pojedyncze pęknięcia nici DNA [1]. Procesy naprawy bardziej złożonych i większych uszkodzeń DNA nie są jeszcze w pełni poznanie. Inne systemy naprawy genomu mitochondrialnego to [5]:  bezpośrednia rewersja uszkodzeń (DR, ang. direct reverse);  naprawa błędnego sparowania zasad (MMR, ang. mismatch repair);  naprawa pęknięć dwuniciowych przez rekombinację homologiczną (HRR, ang. homology recombination repair);  tolerancja uszkodzeń poprzez syntezę DNA na podstawie uszkodzonej nici (TLS, ang. translesion synthesis). Uszkodzenia mtDNA przyczyniają się do zmniejszenia sprawności energetycznej komórki. Z powodu mniejszej wydolności mitochondriów nastąpić może deficyt energetyczny, co obniża aktywność komórki i utrudnia jej adaptację w warunkach stresowych. Mutacje, delecje i substytucje w mtDNA mogą prowadzić do zmian w kodowanych białkach i tym samym do stanów patologicznych, takich jak nowotwory, choroby neurodegeneracyjne, choroby układu krążenia oraz przyspieszone procesy starzenia się organizmu. 4. Uszkodzenia DNA Zasady azotowe ulegają modyfikacjom w czasie całego życia komórki. Są one częściowo pożądane, gdy wspomagają procesy molekularne zachodzące w komórce. Przykładem takich modyfikacji może być metylacja cytozyny prowadząca do powstania 5-metylocytozyny, która jest jednym z elementów komórkowej kontroli

Naprawa uszkodzeń DNA w mitochondriach poprzez wycinanie zasady – system BER poziomu ekspresji genów. Codziennie DNA podlega uszkodzeniom wywołanym przez liczne czynniki. Szacuje się, że każdego dnia w jednej cząsteczce DNA występuje 102-105 pojedynczych uszkodzeń. Jeśli uszkodzenie pojawi się w obszarze odpowiedzialnym za kodowanie genów kluczowych dla poprawnego funkcjonowania komórki (np. genów supresji nowotworowej) uszkodzenie może być fatalne w skutkach, np. upośledzić funkcje komórki czy prowadzić do transformacji nowotworowej. Uszkodzenia DNA można podzielić na uszkodzenia pojedynczych nukleotydów (np. 8-oksyguanina), uszkodzenia zaburzające strukturę (np. wiązania poprzeczne między nićmi DNA lub w obrębie jednej nici DNA, ang. intrastrand/ interstrand crosslinking) lub szkielet DNA (np. miejsce pozbawione zasady lub pęknięcie obu nici). Przyjmuje się, że najczęściej występujące uszkodzenia związane są z mody- fikacją struktury chemicznej zasad azotowych. Powoduje to zaburzenie i/lub wypa- czenie struktury helisy poprzez obecność dodatkowych wiązań chemicznych lub zawady sterycznej. Jednym z najczęściej występujących uszkodzeń oksydacyjnych jest 7,8-dihydroguanina (1 na 106 cząsteczek deoksyguanozyny) [8]. Do dziś zidentyfikowano ok. 70 różnych rodzajów uszkodzeń DNA, a część z nich przedstawiono na rysunku 3. Najczęściej wymienianymi uszkodzeniami DNA są:  utlenianie zasad azotowych;  pęknięcia pojedynczej nici DNA (np. w wyniku działania ROS);  alkilowanie zasad azotowych;  deaminacja zasad azotowych;  wstawienie błędnej zasady azotowej w trakcie replikacji;  powstawanie dimerów pirymidynowych (np. w wyniku promieniowania UV);  przerwanie obu nici DNA (np. w wyniku promieniowania jonizującego);  powstawanie pochodnych zasad azotowych (np. w wyniku nadtlenku wodoru lub policyklicznych węglowodorów obecnych w dymie i sadzy);  powstawanie poprzecznych wiązań między nićmi DNA (np. w wyniku działania chlorku winylu). Uszkodzenia DNA można podzielić na endogenne lub egzogenne. Pierwsze z nich wywoływane są przez produkty procesów metabolicznych komórki (np. reaktywne formy tlenu, reaktywne formy azotu) lub przez błędy w procesie replikacji. Uszko- dzenia wywołane czynnikami zewnętrznymi mogą być spowodowane np. przez promieniowanie ultrafioletowe, działanie wysokiej temperatury, niektóre toksyny pochodzenia roślinnego, mutageny aromatyczne czy też radio- lub chemioterapię. Promieniowanie jonizujące może prowadzić do powstawania pęknięć obu nici DNA oraz uszkodzeń zespolonych, które są charakterystyczne dla tego czynnika. W wyniku promieniowania ultrafioletowego (UV) mogą powstawać dimery pirymidynowe pomiędzy sąsiadującymi ze sobą cytozyną i tyminą lub dwiema tyminami. Stosowana w chemioterapii cisplatyna jest czynnikiem alkilującym, który jednocześnie może prowadzić do powstawania wiązań pomiędzy nićmi DNA (tzw. crosslinking). Szczególną grupą są wspomniane uszkodzenia zespolone. Są one definiowane przez obecność 2 lub więcej uszkodzeń w obrębie 1-2 skrętów helisy DNA. Jest to charakterystyczny skutek działania promieniowania jonizującego, które jest w stanie

Karolina Boguszewska, Michał Szewczuk, Bolesław T. Karwowski spowodować nawet do 25 tak skumulowanych uszkodzeń [7]. Inną przyczyną pojawienia się uszkodzeń zespolonych może być działanie wybranych chemiotera- peutyków [9]. Przykładami uszkodzeń zespolonych są 5-formylouracyl (modyfikacja tyminy), 7,8-dihydro-8-oksoguanina (modyfikacja guaniny) lub miejsca AP (pozbawione zasady azotowej). Dodatkowo wyróżnia się uszkodzenia tandemowe, które polegają na tworzeniu się wiązań kowalencyjnych pomiędzy sąsiadującymi nukleon- zydami (dimery pirymidynowe) lub tworzeniu się więcej niż 1 modyfikacji w obrębie jednego nukleotydu (5’8-cyklo-2’-deoksypuryny) [10].

Rysunek 3. Przykładowe uszkodzenia DNA [opracowanie własne na podstawie [11]]

Wraz ze wzrostem ilości pojedynczych uszkodzeń skumulowanych na niewielkim fragmencie DNA wzrasta trudność ich naprawy. Poznanie natury i implikacji wynikających z tego rodzaju uszkodzeń jest szczególnie ważne w czasach, gdy promieniowanie znajduje coraz to nowe zastosowania w medycynie [12]. Replikacja DNA zawierającego uszkodzone lub błędnie sparowane nukleozydy może skutkować przekazaniem powstałych mutacji kolejnym pokoleniom w trakcie podziału komórkowego. Aby temu zapobiec komórka posiada wyspecjalizowane systemy naprawy DNA. Wyróżnia się sześć głównych mechanizmów. Bezpośrednia naprawa uszkodzeń zachodzi dzięki działaniu specyficznych enzymów, które nie potrzebują matrycy w postaci komplementarnej nici DNA. Przykładem są fotoliazy, które rozdzielają powstałe dimery pirymidynowe [13], alkilacja zasad azotowych odwracana przez alkilotransferazy oraz pęknięcia pojedynczych nici (bez zmian w końcach nici), które naprawiane są przez bezpośrednie działanie ligaz. Pozostałe procesy naprawcze pociągają za sobą wycięcie uszkodzonego i wstawienie nowego

Naprawa uszkodzeń DNA w mitochondriach poprzez wycinanie zasady – system BER fragmentu łańcucha DNA. System NER (NER, ang. nuclotide excision repair) zdolny jest do usuwania dużych uszkodzeń zaburzających przebieg helisy np. adduktów ksenobiotyk-DNA [14]. Mechanizm naprawy źle sparowanych zasad azotowych (MMR, ang. mismatch repair) koryguje błędy polimerazy powstałe podczas replikacji DNA i na podstawie komplementarnej nici wstawia poprawny nukleozyd [15]. Najpoważniejsze uszkodzenia DNA w postaci pęknięć obu nici DNA są naprawiane poprzez scalenie niehomologicznych końców DNA (NHEJ, ang. non-homologous end joining) lub rekombinację homologiczną (HRR, ang. homology recombination repair). Niniejsza praca skupia się na ostatnim systemie naprawczym – BER (ang. base excision repair). Koryguje on uszkodzenia pojedynczych nukleotydów, poprzez wycięcie uszkodzonej zasady [16]. 5. System BER – naprawa DNA przez wycięcie zasady System naprawczy BER (BER, ang. base excision repair) jest systemem mającym na celu naprawę uszkodzeń DNA poprzez wycinanie pojedynczej zasady (SP-BER, ang. short patch BER) lub dłuższego fragmentu 2-10 nukleotydów (LP-BER, ang. long patch BER). Schemat przebiegu mechanizmu BER przedstawia rysunek 4. Zdolność wycinania pojedynczej zasady azotowej to cecha, która odróżnia system BER od innych, gdzie w celu naprawy DNA następuje usunięcie nukleotydów lub całych ich fragmentów [8]. System BER opiera się na identyfikacji zmodyfikowanego nukleotydu, wycięciu uszkodzonej zasady i wstawieniu poprawnej na podstawie komplementarnej, nieuszkodzonej nici. W procesie bierze udział szereg enzymów. Większość uszkodzeń wpływa na przestrzenne ułożenie helisy DNA, co umożliwia ich wykrycie przez komórkę. Rekrutowane są specyficzne białka naprawcze mające na celu związanie się z uszkodzonym miejscem, aby kolejne elementy naprawcze mogły zadziałać. Kompleksy enzymów składają się z wielu białek różnych typów białek w zależności od rodzaju komórki, rodzaju uszkodzenia, a także fazy cyklu komór- kowego. Glikozylaza DNA odnajduje uszkodzony fragment nici, a następnie rozcina wiązanie β-N-glikozydowe pomiędzy zasadą a deoksyrybozą. W ten sposób powstaje miejsce apurynowe/apirymidynowe (AP, ang. AP site), które jest rozpoznawane przez endonukleazę AP [17]. Istnieje wiele typów glikozylaz, a każdy z nich odpowiada za identyfikację innego rodzaju uszkodzenia. Przykładem może być uracylowa glikozylaza DNA (UDG, ang. uracil DNA glycosylase), która odnajduje i wycina uracyl z jedno- lub dwuniciowej cząsteczki DNA. Wyróżnia się glikozylazy mono- funkcyjne, które przecinają wiązania β-N-glikozydowe oraz glikozylazy dwufunk- cyjne, które dodatkowo mają zdolność usuwania miejsc AP (na drodze β-eliminacji) w wyniku czego powstaje luka wielkości tylko jednego nukleotydu. Endonukleaza AP hydrolizuje wiązanie fosfodiestrowe w kierunku 5’ od miejsca AP, a tym samym rozcina nić DNA. Utworzony w ten sposób wolny koniec 3’-OH pozwala polimerazie DNA i (Pol I) na dobudowanie brakującego nukleotydu. Ostatecznie, nowy fragment łańcucha jest łączony ze starym dzięki działaniu ligazy DNA III [18].

Karolina Boguszewska, Michał Szewczuk, Bolesław T. Karwowski

Rysunek 4. Schemat systemu naprawczego BER (ang. base excision repair). 1) Uszkodzenie DNA. 2) Rozcięcie wiązania N-glikozydowe przez glikozylazę DNA i usunięcie uszkodzonej zasady z łańcucha. 3) Rozpoznanie miejsca AP przez endonuklezę AP i utworzenie wolnego końca 3’-OH. 4) SP-BER: hydroliza wiązania fosfodiestrowego przez liazę i usunięcie deoksyrybozy z łańcucha, LP-BER: dobudowanie nowego fragmentu nukleotydów przez polimerazę i wypchnięcie z łańcucha starego fragmentu. 5) SP-BER: dobudowanie brakującego nukleotydu przez polimerazę, LP-BER: hydroliza wiązanie fosfodiestrowego przez endonukleazę FEN1 – usunięcie starego fragmentu DNA. 6) SP-BER i LP-BER: połączenie nowego fragmentu nici DNA ze starym przez ligazę [opracowanie własne]

W przypadku SP-BER wstawiany jest pojedynczy nukleotyd, zaś w przypadku LP-BER wstawiany jest dłuższy fragment. Zanim nici zostaną zligowane konieczny jest dodatkowy krok – odcięcie fragmentu starej nici przez endonukleazę FEN1. Tym sposobem następuje „wymiana” fragmentu łańcucha DNA na nowy, a uszkodzenie zostaje naprawione. Ciekawym przypadkiem są uszkodzenia zespolone, gdzie 2 lub więcej uszkodzeń występuje w obrębie 1-2 skrętów helisy. Dowiedziono, że obecność skumulowanych w ten sposób uszkodzeń obniża aktywność enzymów systemu BER [19]. Uszkodzenia

Naprawa uszkodzeń DNA w mitochondriach poprzez wycinanie zasady – system BER są naprawiane pojedynczo, głównie przez SP-BER, aby uniknąć ewentualnych błędów podczas wycinania całego fragmentu nukleotydów. Dodatkowo, zależności od rodzaju i wzajemnego położenia uszkodzeń efektywnie naprawiane może być tylko pierwsze z uszkodzeń. System BER ma za zadanie ochronę genomu przed uszkodzeniami. Jednak w trakcie działania tego mechanizmu również mogą pojawić się błędy w wyniku niepoprawnego wstawienia zasady przez polimerazę. Zdarza się to średnio 310-4 razu na parę zasad w trakcie jednej rundy replikacji [8]. Duża część tych mutacji to delecje pojedynczych nukleotydów pojawiające się naprzeciwko pierwotnego uszkodzenia, co stanowi najczęstsze błędy systemu BER. 6. Choroby mitochondrialne Mutacje w DNA mitochondrialnym mają swój udział w rozwoju tzw. chorób mitochondrialnych oraz w przyspieszeniu procesu starzenia, dlatego też są przedmiotem badań od wielu lat [20]. Choroby te związane są głównie z tkankami, które mają wysokie zapotrzebowanie energetyczne – mięśniową i nerwową. Dotyczy to również mutacji białek mitochondrialnych, które kodowane są przez nDNA. Przykładem jest ataksja Friedreicha, która prowadzi do zwyrodnienia mięśnia sercowego i części układu nerwowego. Przyczyną jest mutacja w intronie genu FXN (znajdującym się na chromosomie 9) kodującym białko mitochondrialne – frataksynę, biorącą udział w metabolizmie żelaza. W przypadku wystąpienia mutacji transkrypcja tego genu jest zahamowana, co prowadzi do kumulacji żelaza w mitochondriach i zwiększonego stresu oksydacyjnego. Przyjmuje się, że choroby genetyczne związane z mutacjami w DNA mitochondrialnym występują u 1 na 15 000 osób. Przykładami chorób mitochondrialnych są [21]:  dziedziczna neuropatia nerwu wzrokowego Lebera (LHON, ang. Leber’s hereditary optic neuropathy);  padaczka miokloniczna z nieprawidłowymi czerwonymi włóknami mięśniowymi (MERRF, ang. myoclonic epilepsy with ragged red fibers);  neurogenna miopatia z ataksją i zwyrodnieniem barwnikowym siatkówki (NARP, ang. neurogenetic myopathy, ataxia, retinitis pigmentosa);  zespół Leigha – encefalopatia mitochondrialna z kwasicą mleczanową (SNEM, ang. subacute necrotizing encephalomyelopathy). Pierwsza z chorób wywołana jest tranzycją w jednym z genów mtDNA (ND1, ND4, ND6) a w efekcie następuje inhibicja kompleksu i ATPazy. Mutacja prowadzi do dziedzicznej neuropatii nerwu wzrokowego LHON, która objawia się zanikiem nerwów wzrokowych i zwyrodnienia komórek siatkówki. U podstaw genetycznych zespołu MERRF leży mutacja a do G nukleotydu 8344, która jest przyczyną zahamo- wania transkrypcji genów kodujących enzymy kompleksu łańcucha oddechowego – reduktazy NADH-CoQ i oksydazy cytochromu c. Charakterystyczne objawy MERRF to postępująca padaczka miokloniczna, niskorosłość i zlepki mitochondriów widoczne podczas analizy jako tzw. czerwone poszarpane włókna. Zespół NAPR jest rzadką chorobą mitochondrialną wywołaną przez punktową mutację w genie kodującym 6 podjednostkę mitochondrialnej syntazy ATP. Objawy choroby to m.in. napady drgawek, otępienie, ataksja móżdżkowa, neuropatia czuciowa czy też dysfunkcja pnia mózgu. SNEM może być wywołany mutacjami w nDNA, które wpływają na pracę

Karolina Boguszewska, Michał Szewczuk, Bolesław T. Karwowski mitochondriów. Choroba występuje w wielu postaciach w zależności od genu, który ulegnie mutacji. Mogą to być geny kodujące białka łańcucha oddechowego (ND2, ND6, COX10, ATP6) lub geny kodujące tRNA. Choroba rozwija się gwałtownie i obejmuje układ nerwowy, mięśniowy, a także wątrobę i nerki. NARP i zespół Leigha dotyczą częściowo tej samej mutacji w podjednostce syntazy ATP. Gdy mutacja występuje z częstotliwością < 75% obserwuje się NARP. Gdy ta sama mutacja wys- tępuje w ponad 95% kopiach genu częściej prowadzi do rozwoju zespołu Leigha [5]. Innym zjawiskiem związanym z mtDNA jest proces starzenia się komórki. Podczas każdego podziału komórki następuje skracanie telomerów, za które odpowiedzialny jest enzym telomeraza. Telomery stanowią zakończenia chromosomów i składają się z powtarzającej się, niekodującej sekwencji DNA. Udowodniono, że długość telomerów jest skorelowana z pozostałą liczbą podziałów, których może dokonać każda komórka, zanim wejdzie na drogę apoptozy. Podejrzewa się, że pojawianie się uszkodzeń DNA może przyspieszać proces starzenia się organizmu poprzez zaburzenie funkcjonowania mitochondriów. Mechanizmy naprawcze, które są zaburzone przez odziedziczone mutacje mogą prowadzić do rozwoju stanów patologicznych, a w szczególności zwiększać podatność organizmu na rozwój nowotworu. Dodatkowo, jeśli w trakcie naprawy uszkodzenia DNA pojawi się nowa mutacja w wyniku błędów enzymów naprawczych, to efekt dla genomu może być gorszy niż w przypadku wystąpienia tych samych uszkodzeń pojedynczo. Z drugiej strony, wywoływanie uszkodzeń w genomie komórek nowotworowych jest celem działania chemio- i radioterapii. Kumulacja uszkodzeń prowadzi do śmierci uszkodzonych komórek, co jest w tym przypadku pożądanym efektem [22]. Niestety, w tym samym czasie uszkodzeniom podlegają też zdrowe komórki. W szczególności dotyczy to komórek o podwyższonym stopniu proliferacji, takich jak komórki miesz- ków włosowych i pnia szpiku kostnego. Zostają one uszkodzone w pierwszej kolejności, co objawia się jako charakterystyczny efekt uboczny u pacjentów poddanych terapii, czyli wypadanie włosów i obniżona odporność. W ostatnich latach szczególne zainteresowanie budzi związek BER z pojawianiem się chorób neurodegeneracyjnych. Wykazano, że jedno z białek systemu BER – OGG1 (ang. 8-oxoguanine glycosylase 1), które jest glikozylazą DNA, jest często zmutowane u pacjentów z chorobą Alzheimera, co prowadzi do mniej efektywnej naprawy uszkodzeń i jednocześnie do kumulacji uszkodzeń oksydacyjnych w tkankach mózgu, a w efekcie do rozwoju i postępowania choroby [23]. 7. Podsumowanie Wiedza w zakresie działania systemów naprawczych DNA stale się zwiększa. Chociaż coraz więcej elementów mechanizmu BER jest dobrze opisanych, procesy te kryją w dalszym ciągu wiele tajemnic. Pomimo znajomości struktury prawie wszystkich elementów systemu BER, sposób ich interakcji i działania nie został w pełni poznany. Prowadzonych jest wiele badań mających na celu m.in. opisanie przebiegu zmian konformacyjnych w trakcie działania poszczególnych enzymów. Wiedza ta jest szczególnie ważna w kontekście organizmu jako całości, którego DNA jest chronione przez systemy naprawcze przed wejściem na drogę kancerogenezy, przedwczesnego starzenia się oraz chorób mitochondrialnych.

Naprawa uszkodzeń DNA w mitochondriach poprzez wycinanie zasady – system BER

Literatura 1. Oliński R., Jurgowiak M., Czy w mitochondriach działają skuteczne mechanizmy naprawy DNA?, Postepy Biochemii, 1 (47), 2001, s. 85-92. 2. Ruiz Villarreal M., Mitochondrium – rysunek, online: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Animal_mitochondrion_diagram_en.svg. 3. Herst P., Rowe M., Carson G., Berridge M., Functional mitochondria in health and disease, Frontiers in Endocrinology, 8 (269), 2017, s. 1-16. 4. Sharma P., Sampath H., Mitochondrial DNA Integrity: Role in Health and Disease, Cells, 8 (100), 2019, s. 1-21. 5. Głowacki S., Błasiak J., Mutageneza mitochondrialnego DNA, Postepy Biochemii, 58 (3), 2012, s. 265-272. 6. Alnajjar K., Sweasy J., A new perspective on oxidation of DNA repair proteins and cancer, DNA Repair, 76, 2019, s. 60-69. 7. Karwowski B.T., 5’8-cyklo-deoksyadenozyna. Podwójne uszkodzenie w obrębie pojedynczego nukleozydu/nukleotydu, Wiadomości Chemiczne, 64, 2010, s. 1013-1048. 8. Zharkov D., Base excision DNA repair, Cellular and Molecular Life Science, 65 (10), 2008, s. 1544-1565. 9. Bukowska B., Karwowski B.T., The Clustered DNA Lesions – Types, Pathways of Repair and Relevance to Human Health, Current Medical Chemistry, 25 (23), 2018, s. 2722-2735. 10. Karwowski B.T., Bellon S., O’Neill P., Lomax M., Cadet J., Effects of (5’S)-5’,8-cyclo-2’- deoxyadenosine on the base excision repair of oxidatively generated clustered DNA damage. A biochemical and theoretical study, Organic and Biomolecular Chemistry, 12 (43), 2014, s. 8671-8682. 11. Krokan H., Bjoras M., Base Excision Repair, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 5, 2013, s. 1-17. 12. Lomax M., Folkes L., O’Neill P., Biological consequences of radiation-induced DNA damage: Relevance to radiotherapy, Clinical Oncology, 25 (10), 2013, s. 578-585. 13. Zhang M., Wang L., Zhong D., Photolyase: Dynamics and Mechanisms of Repair of Sun- Induced DNA Damage, Photochemistry and Photobiology, 93 (1), 2017, s. 78-92. 14. Bukowska B., Karwowski B.T., Actual state of knowledge in the field of diseases related with defective nucleotide excision repair, Life Sciences, 195, 2018, s. 6-18. 15. Popławski T., Błasiak J., Naprawa błędnie sparowanych zasad, Postepy Biochemii, 49 (3), 2003, s. 126-135. 16. Zinovkina L., Mechanisms of Mitochondrial DNA Repair in Mammals, Biochemistry, 83 (3), 2018, s. 233-249. 17. Wallace S., Base excision repair: a critical player in many games, DNA Repair, 19, 2014, s. 14-26. 18. Allison L., Podstawy biologii molekularnej, Wydawnictwo Uniwersytetu Warszawskiego, Warszawa, 2009. 19. Lomax M., Cunniffe S., O’Neill P., 8-OxoG retards the activity of the ligase III/XRCC1 complex during the repair of a single-strand break, when present within a clustered DNA damage site, DNA Repair, 3 (3), 2004, s. 289-299. 20. Gredilla R., DNA damage and base excision repair in mitochondria and their role in aging, Journal of Aging Research, 2011, s. 1-9. 21. Tuppen H., Blakely E., Turnbull D., Taylor R., Mitochondrial DNA mutations and human disease, Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics, 1797 (2), 2010, s. 113-128. 22. Hanna B., Helleday T., Cázares-Körner A., Benitez-Buelga C., Visnes T., Grube M., Targeting BER enzymes in cancer therapy, DNA Repair, 71, 2018, s. 118-126.

Karolina Boguszewska, Michał Szewczuk, Bolesław T. Karwowski

23. Abolhassani N., Leon J., Sheng Z., Oka S., Hamasaki H., Iwaki T., Nakabeppu Y., Molecular pathophysiology of impaired glucose metabolism, mitochondrial dysfunction, and oxidative DNA damage in Alzheimer’s disease brain, Mechanisms of Ageing and Development, 161, 2017, s. 95-104.

Naprawa uszkodzeń DNA w mitochondriach – system BER Streszczenie Genom każdego żywego organizmu jest narażony na działanie wielu czynników wewnętrznych i zewnętrznych, m.in. reaktywnych form tlenu oraz promieniowania jonizującego, które indukują uszkodzenia kwasów nukleinowych. Promieniowanie jonizujące wykorzystywane w radioterapii stosuje się, aby celowo uszkadzało DNA komórek nowotworowych, prowadząc do ich śmierci. Jest to pożądany efekt walki z chorobą, jednak w tym samym czasie zniszczeniu podlegają również zdrowe komórki. Charakterystycznym skutkiem działania promieniowania jonizującego są tzw. uszkodzenia zespolone kwasów nukleinowych. Są one definiowane jako obecność 2 lub więcej uszkodzeń w obrębie 1-2 skrętów helisy DNA. Podlegają one procesom naprawczym znaczenie trudniej niż uszkodzenia występujące pojedynczo. Przykładami uszkodzeń zespolonych materiału genetycznego są 5-formylouracyl (modyfikacja tyminy), 7-8-dihydro-8-oksoguanina (modyfikacja guaniny) czy też miejsca apurynowe/ apirymidynowe (pozbawione zasady azotowej). Najlepiej opisanym systemem naprawczym w mitochondriach jest BER (ang. base excision repair). Naprawa DNA następuje na drodze wycięcia pojedynczej zasady lub fragmentu 2-10 nukleotydów w zależności od rodzaju zidentyfikowanego uszkodzenia. Uważa się, że mitochondrialny system BER nakierowany jest na naprawdę pojedynczych uszkodzeń, a w znacznie mniejszym stopniu na naprawę uszkodzeń zespolonych. Akumulacja uszkodzeń w DNA komórki mitochondrialnej może prowadzić do poważnych stanów patologicznych, związanych m.in. z zaburzeniem szybkości naprawy DNA. Mechanizmy naprawcze mtDNA nie są jeszcze w pełni poznane, jednak dysfunkcje w ich obrębie zwiększają szansę utrwalenia się mutacji w genomie, a tym samym wystąpienie choroby. Prowadzenie badań w zakresie systemów naprawczych DNA jest kluczowe dla lepszego zrozumienia ich mechanizmów oraz opracowania przyszłych terapii dla schorzeń powstających w wyniku mutacji w obrębie mtDNA. Niniejszy artykuł przedstawia podstawowe zagadnienia dotyczące uszkodzeń DNA, a także mitochondrialny system naprawczy BER i jego zaburzenia. Słowa kluczowe: uszkodzenia DNA, naprawa DNA, BER, mitochondria

Repair of DNA damage in the mitochondria – BER system Abstract The genome of every living organism is exposed to many internal and external factors, including reactive oxygen species and ionizing radiation, which induce damage to nucleic acids. Ionizing radiation used in radiotherapy is used to damage the DNA of cancer cells on purpose, leading to their death. In this case damage is desired during the figh against the disease, but at the same time healthy cells are also destroyed. Clustered DNA damage of nucleic acids is a very characteristic effect of ionizing radiation. Clustered damage is defined as the presence of 2 or more lesions within 1-2 turns of the DNA helix. They are more difficult to repair than single lesions. Examples of such damage are 5-formyluracil (thymine modification), 7-8-dihydro-8-oxoguanine (guanine modification) or apurin/apirimidine sites (deprived of nitric base). The best described repair system in the mitochondria is BER (base excision repair). DNA repair occurs by cutting out a single base or fragment of 2-10 nucleotides depending on the type of identified damage. It is believed that the mitochondrial BER system is aimed mainly at single lesions. Accumulation of damage in the DNA of the mitochondrial cell may lead to serious pathological conditions related to, e.g. lower rate of DNA repair. The mtDNA repair mechanisms are not yet fully understood, however, its dysfunctions may lead to fixed mutations in the genome, and thus the occurrence of the disease. Research in the field of DNA repair is crucial for a better understanding of its mechanisms and for the development of future therapies. This article focuses on the presentation of basic concepts concerning a damage, of DNA and the mitochondrial BER repair system as well as its disorders. Keywords: DNA damage, DNA repair, BER, mitochondria

Michał Szewczuk1, Karolina Boguszewska2, Bolesław T. Karwowski3

Rola OGG1 w przebiegu procesu naprawy DNA przez system BER

1. Wstęp W obliczu poszerzającego się stanu wiedzy na temat genomu człowieka oraz wpływu szkodliwych czynników zewnętrznych na jego strukturę, podejmowane są próby precyzyjnego określenia mechanizmów odpowiedzialnych za procesy patologiczne w ludzkim organizmie. Jednym z najważniejszych jest powstawanie nowotworów wskutek mutacji w kodzie genetycznym. Za usuwanie mutacji odpowiadają systemy naprawy DNA, w których kluczową rolę odkrywają enzymy z klasy glikozylaz. Jednym z czynników rakotwórczych, na które ludzki organizm jest szczególnie narażony, jest promieniowanie UV. Glikozylaza OGG1, jako element składowy systemu naprawczego BER, odpowiada za usuwanie z nici DNA cząsteczek 8-oksoguaniny, powstających w znacznym stopniu wskutek działania wspomnianego promieniowania. Dlatego też badania nad funkcjonowaniem OGG1 oraz całego systemu BER stanowią obecnie ważny kierunek zainteresowań w dziedzinie genetyki i biologii molekularnej. 2. Struktura i funkcja OGG1 Glikozylaza 8-oksoguaniny (OGG1, ang. 8-oxoguanine glycosylase 1) jest enzymem posiadającym aktywność N-glikozylazy DNA (EC 3.2.2.23) oraz liazy AP (EC 4.2.99.18). U człowieka enzym ten jest kodowany przez gen OGG1 zlokalizo- wany na chromosomie 3 w locus 3p25.3 [1-3]. Wskutek alternatywnego splicingu nici mRNA w obrębie C-końca genu OGG1, możliwe jest stworzenie różnych izoform tego białka. N-koniec wszystkich izoform jest identyczny i zawiera w swojej strukturze specyficzną sekwencję MTS (ang. mitochondrial targeting sequence). Dlatego też typ białka zależy od budowy C-końca, który jest warunkowany rodzajem C-końcowego egzonu w sekwencji kodującej enzym. Białka kodowane przez gen posiadający egzon 7 są oznaczane jako typ 1, natomiast jeżeli w sekwencji występuje egzon 8, to białko jest oznaczane jako typ 2 [4-6]. Dotychczas opisano trzy izoformy typu pierwszego (OGG1-1a, OGG1-1b, OGGi-1c) oraz pięć izoform typu drugiego (OGG1-2a, OGG1- 2b, OGG1-2c, OGG1-2d, OGG1-2e). Wyjątkiem w nomenklaturze pozostaje izoforma OGG1-1b, która posiada jedynie egzony 1-6. Ze wszystkich ośmiu izoform tylko OGG1-1a, znana również jako α-OGG1, występuje wewnątrz jądra komórkowego, pozostałe występują wewnątrz mitochondrium [7]. Odpowiada za to dodatkowa, specyficzna sekwencja NLS (ang. nuclear localisation signal) w strukturze OGG1-1a,

Michał Szewczuk, Karolina Boguszewska, Bolesław T. Karwowski której nie posiada żadna inna izoforma tego enzymu. Dodatkowo, białko OGG1-1a może być transportowane do wnętrza mitochondriów, gdzie pozostaje silnie związane z wewnętrzną błoną mitochondrialną [6, 8]. Udowodniono przy tym również, że najczęściej występującą izoformą OGG1 w mitochondriach jest OGG1-2a [4] (rys. 1). Białko OGG1 bierze udział w usuwaniu z nici DNA pojedynczych uszkodzeń w postaci 7,8-dihydro-8-oksoguaniny (8-oxo-G, ang. 7,8-dihydro-8-oxoguanine) oraz 2,6-diamino-4-hydroksy-5-N-metylformamidopirymidyny (FapyG lub FapyGua, ang. 2,6-diamino-4-hydroxy-5-N-methylformamidopyrimidine) [9]. Oba związki są popular- nymi produktami oddziaływania stresu oksydacyjnego na cząsteczki DNA. Ze względu na fakt, że jednym z głównych elementów stresu oksydacyjnego są powstające w mitochondriach reaktywne formy tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species), priorytetem w badaniach dotyczących naprawy DNA staje się system wycinania zasady (BER, ang. base excision repair). Jest to podstawowy system naprawy mitochondrialnego DNA, a glikozylaza OGG1 stanowi jego kluczowy element.

Rysunek 1 – Lokalizacja poszczególnych izoform OGG1 w komórce. Jako OGG1-X* sumarycznie oznaczono izoformy OGG1-1b, OGG1-1c, OGG1-2b, OGG1-2c, OGG1-2d i OGG1-2e, ponieważ ich dokładna lokalizacja wewnątrz mitochondrium nie jest znana. Ponadto przypuszcza się związek izoformy OGG1-2a z kompleksem i łańcucha oddechowego.

3. System naprawy dna poprzez wycinanie zasady – base excision repair Systemy naprawcze DNA służą utrzymaniu integralności genomu poprzez usuwanie uszkodzeń nukleotydów, zapobieganie powstawaniu kancerogennych mutacji między innymi w protoonkogenach, a także eliminację błędnych dopasowań w parach zasad DNA w procesie replikacji [10]. Spośród wszystkich znanych systemów naprawczych najmniej skomplikowany i najlepiej opisany jest system BER (rys. 2). Celem działania tego systemu jest usunięcie pojedynczej uszkodzonej zasady azotowej z nici DNA i zastąpienie jej nieuszkodzoną. Proces jest inicjowany z udziałem jedno- lub dwufunkcyjnych glikozylaz DNA. Ich zadaniem jest hydroliza wiązania β-N-

Rola OGG1 w przebiegu procesu naprawy DNA przez system BER glikozydowego pomiędzy uszkodzoną zasadą i cukrem (deoksyrybozą) określonego deoksynukleozydu, co powoduje uwolnienie tej zasady z łańcucha. Jest to etap odróżniający system BER od innych systemów naprawczych, w których usunięciu ulega od razu cały nukleotyd lub fragment oligonukleotydowy. Po usunięciu zasady azotowej powstaje miejsce apurynowe/apirymidynowe AP (ang. apurynic/apyrimidinic site). Jest ono wówczas zamknięte dwoma wiązaniami fosfodiestrowymi łączącymi trzy kolejne deoksyrybozy pochodzące z naprawianego nukleozydu oraz dwóch nukleozydów sąsiednich. Enzymem odpowiedzialnym za uzupełnienie miejsca AP o nieuszkodzoną zasadę azotową jest polimeraza DNA. Polimeryzacja polega jednak na dołączaniu całych nukleotydów do istniejącej nici i wymaga wolnego końca 3’ do inicjacji procesu. Istniejące wiązania fosfodiestrowe uniemożliwiają inicjację, dlatego też w kolejnym etapie dochodzi do ich zerwania. Proces zależy od rodzaju organizmu oraz typów i aktywności enzymów biorących w nim udział. AP endonukleaza hydrolizuje wiązanie fosfodiestrowe po stronie 5’ od miejsca AP z wytworzeniem wolnego końca 3’-OH oraz reszty 5’-fosforanowej. AP liaza natomiast katalizuje β-eliminację reszty fosforanowej z wytworzeniem nienasyconego cukru na końcu 3’ oraz reszty 5’-fosforanowej. Dodatkowo, możliwa jest jednoczesna β- i δ-eliminacja, która powoduje usunięcie deoksyrybozy i pozostawienie dwóch reszt fosforanowych przyłączonych do sąsiednich deoksynukleozydów. W tym przypadku 3’-fosforan musi zostać później usunięty, aby stworzyć dostęp do 3’-końca dla polimerazy DNA. Naprawa uszkodzenia może zakończyć się na dwa sposoby. W wersji short patch BER dochodzi do wbudowania pojedynczego nukleotydu w wolne miejsce AP przez polimerazę DNA, po czym ligaza DNA odtwarza wiązanie fosfodiestrowe. W wersji long patch BER polimeraza DNA dobudowuje do wolnego końca 3’-OH łańcuch 2-10 nukleotydów, począwszy od wolnego miejsca AP. Jednocześnie istniejące nieuszko- dzone nukleotydy są wypierane z nici na rzecz powstającego fragmentu. Nowy fragment nici trafia w miejsce starego, a dopiero jego koniec zostaje połączony z resztą helisy przez ligazę DNA. Polimeraza DNA odpowiada również za wypieranie istnie- jących nukleotydów z nici DNA, a zstępujący fragment jest usuwany przez endonuk- leazę FEN1 (ang. flap endonuclease 1). W niektórych przypadkach endonukleaza FEN1 może wycinać nieuszkodzne nukleotydy tworząc przestrzeń dla powstającego nowego fragmentu nici. Mechanizmy zamiany fragmentu oligonukleotydowego na nowy, jak również kryteria wyboru pomiędzy short patch BER i long patch BER nie zostały jeszcze do końca poznane. Sugeruje się, że jednymi z kryteriów są stężenie ATP (ang. adenosine 5’-triphosphate) oraz kofaktorów enzymów w środowisku reakcji, a także struktura szczeliny pozostałej po miejscu AP [9, 11]. Spośród wszystkich zasad azotowych, guanina (G) jest najbardziej podatna na uszkodzenia oksydacyjne ze względu na najniższy potencjał jonizacji. Dlatego też, pomimo istnienia ponad 100 różnych modyfikacji puryn i pirymidyn wywoływanych przez ROS, produkt utleniania guaniny w postaci 8-okso-G występuje szczególnie często i jest najszerzej opisywanym pojedynczym uszkodzeniem DNA [12, 13]. Uszkodzenie to zidentyfikowano w 1984 roku, natomiast pierwsze informacje dotyczące usuwania 8-okso-G z nici DNA pojawiły się w badaniach na komórkach Escherichia coli w 1990 roku [14, 15]. Udowodniono wówczas istnienie enzymu glikozylazy DNA formamidopirymidyny (MutM lub FPG, ang. formamidopyrimidine DNA glycosylase) zdolnej do usuwania uszkodzeń w postaci 8-oksoguaniny, 2,6-

Michał Szewczuk, Karolina Boguszewska, Bolesław T. Karwowski diamino-4-hydroksy-5-formamidopirymidyny (FapyGua) oraz 4,6-diamino-5- formamidopirymidyny (FapyA lub FapyAde) [15]. Podobnie jak OGG1, FPG również posiada podwójną aktywność glikozylazy DNA i liazy AP [10, 16]. Odkrycie OGG1 miało miejsce w 1996 roku. Wówczas wykazano istnienie homologu FPG w komórkach drożdży z gatunku Saccharomyces cerevisiae i oznaczono go jako yOGG1 (ang. yeast OGG1) [17]. Rok później enzym ten zidentyfikowano u człowieka i oznaczono jako hOGG1 (ang. human OGG1) [18]. Włączenie cząsteczek 8-okso-G do wnętrza struktury kwasu nukleinowego może skutkować błędnym dopasowaniem adeniny do 8-okso-G podczas replikacji, co skutkuje mutacjami w postaci transwersji pary zasad G:C do A:T [13, 19]. 4. Rozpoznawanie i naprawa uszkodzeń Badania budowy przestrzennej i molekularnego mechanizmu działania OGG1 u ludzi wykazują istnienie specyficznego motywu helisa-skręt-helisa w strukturze enzymu (HhH, ang. helix hairpin helix), który jest charakterystyczny dla wielofunk- cyjnych N-glikozylaz DNA. Cechą szczególną motywu w tej grupie enzymów jest obecność dwóch aminokwasów biorących udział w katalizie reakcji – lizyny i kwasu asparaginowego, które w przypadku α-OGG1 znajdują się na miejscach odpowiednio 249 i 268 w łańcuchu polipeptydowym (Lys249 i Asp268). Chociaż konkretny mechanizm aktywacji OGG1 nie został dotychczas sprecyzowany, samo wykrywanie uszkodzenia w postaci 8-okso-G przez aktywny enzym polega na jego ciągłym poruszaniu się wzdłuż helisy DNA. Cząsteczka jest jednocześnie zdolna do wykonywania tzw. skoków, czyli przemieszczania się na sąsiadujący fragment helisy DNA w przypadku napotkania przeszkody, na przykład w postaci nukleosomu lub innego białka związanego z DNA. Motyw HhH jest odpowiedzialny za pozycjo- nowanie cząsteczki enzymu po stronie 3’ od miejsca uszkodzenia. Ponadto enzym potrafi rozpoznawać cytozynę (C) umiejscowioną po przeciwległej stronie uszkodzonej guaniny. Za pomogą specyficznych reszt aminokwasowych dochodzi do związania się białka z helisą DNA w taki sposób, że zostaje ona „złamana”, kierując miejsce wystąpienia 8-okso-G do wnętrza cząsteczki enzymu i zmniejszając w ten sposób odległość do miejsca katalitycznego. Reakcja rozpoczyna się od zerwania wiązań wodorowych w parze 8-okso-G:C i obrócenia naprawianego nukleozydu na zewnątrz helisy, do wnętrza kieszeni katalitycznej enzymu. Wówczas następuje hydroliza wiązania β-N-glikozydowego i zasada azotowa zostaje odłączona [20-23]. Wiadomo również, że proces poszukiwania uszkodzenia DNA przez OGG1 jest możliwy tylko przy zachowaniu dobrego dostępu białka do helisy. Naprawa DNA przez system BER wymaga więc rozluźnienia chromatyny i specyficznego przemodelowania helisy DNA. OGG1 nie jest w stanie przyłączyć się do podwójnej nici DNA w warunkach standardowego, ciasnego jej upakowania z udziałem histonów. Dlatego uszkodzenia DNA w obrębie nukleosomów naprawiane są z dużo mniejszą efektywnością niż te występujące na luźnej nici DNA. Istnieją doniesienia wskazujące na związek pomiędzy aktywnością OGG1 i innych elementów systemu BER a procesem potranslacyjnej modyfikacji histonów. Proces ten wprowadza niewielkie zmiany w strukturze histonów, na przykład acetylację i metylację, skutkujące rozluźnieniem chromatyny przed kolejną replikacją lub transkrypcją DNA [8, 21, 24].

Rola OGG1 w przebiegu procesu naprawy DNA przez system BER

Rysunek 2. Schemat systemu naprawczego BER z uwzględnieniem podziału na SP-BER i LP-BER

5. Regulacja aktywności OGG1 Dokładny mechanizm aktywacji OGG1 oraz indukcji odpowiedzi obronnej ze strony systemu BER nie został dotychczas wyjaśniony. Aktualne doniesienia naukowe przedstawiają proces jako złożony i wieloetapowy. Badania in vivo przeprowadzone na szczurach wykazały, że OGG1 hamuje negatywny wpływ stresu oksydacyjnego dzięki działaniu czynnika transkrypcyjnego NRF2 (ang. nuclear factor erythroid 2-related factor 2), który odpowiada za regulację odpowiedzi komórkowej na ten stres. Promotor zarówno szczurzego, jak i ludzkiego genu OGG1 posiada w swojej strukturze miejsce wiązania NRF2, przez co białko to zwiększa ekspresję tego genu i syntezę OGG1 [25]. Wiadomo również, że OGG1 wchodzi w bezpośrednie interakcje z innymi białkami. Białka CUX1 i CUX2, będące mediatorami ekspresji wielu genów w odpowiedzi na

Michał Szewczuk, Karolina Boguszewska, Bolesław T. Karwowski uszkodzenia DNA, zwiększają aktywność OGG1 bez wywierania wpływu na transkrypcję jego genu. Podczas modyfikacji potranslacyjnych OGG1 ulega również acetylacji przez acetylotransferazy histonowe, np. kompleks CBP/p300 (ang. cyclic AMP response element-binding protein), a także deacetylacji przez deacetylazy histonowe. Dochodzi wówczas do regulacji aktywności OGG1 wskutek acetylacji/ deacetylacji Lys338 i Lys341 [26, 27]. Uważa się, że acetylacja enzymu wpływa pozytywnie na utrzymanie odpowiedniego stężenia cząsteczek białka w środowisku reakcji poprzez zmniejszenie jego powinowactwa do miejsca AP, będącego produktem reakcji katalizowanej przez ten enzym. Dzięki temu enzym szybciej „odczepia się” od miejsca reakcji i proces usuwania 8-okso-G z nici DNA przebiega sprawniej. Z drugiej strony acetylacja OGG1 wpływa negatywnie na jego ekspresję. Udowodniono ten fakt w badaniach nad białkiem SIRT3 (ang. NAD-dependent deacetylase sirtuin-3). SIRT3 odpowiada za bezpośrednią deacetylację OGG1, co prowadzi do wzrostu ekspresji i poprawy stabilności OGG1, a także chroni białko przed degradacją ze strony kalpainy – białka będącego proteazą cysteinową zależną od kationów wapnia [28-30]. OGG1 może również ulegać bezpośredniej fosforylacji przez CDK4 (ang. cyclin-dependent kinase 4), co zwiększa aktywność liazy AP tego enzymu [27, 31]. Dodatkowo, zaraz po zakończeniu hydrolizy wiązania glikozydowego, połączenie między OGG1 a miejscem AP jest stabilizowane przez białko XRCC1 (ang. X-ray repair cross- complementing protein 1). Białko to jest jednocześnie kofaktorem ligazy III i stabilizuje ten enzym. Stanowi również podstawowy element kompleksu BER, czyli zespołu białek łączących się z nicią DNA, po utworzeniu miejsca AP, celem zakończenia procesu naprawy. Stabilizacja OGG1 w miejscu AP trwa do momentu pojawienia się w pobliżu uszkodzenia kolejnych enzymów kompleksu BER – endonukleazy i polimerazy. Istnieją doniesienia mówiące o tym, że interakcja pomiędzy OGG1 i XRCC1 jest inicjowana jeszcze przed związaniem się OGG1 z nicią DNA. Wzajemne oddziaływania obydwu białek ze sobą mogą mieć wpływ na ich zdolność do przedostawania się w miejsce wykrycia uszkodzenia DNA [32-34]. 6. Podsumowanie W dobie zwiększonego zainteresowania tematyką pojedynczych i zespolonych uszkodzeń DNA, znaczną uwagę przywiązuje się do mechanizmów działania systemu BER. Chociaż jest to najmniej skomplikowany z dotychczas opisanych systemów naprawy DNA, to jego zakres działania obejmuje usuwanie najbardziej popularnych uszkodzeń. Uszkodzenia oksydacyjne, powstające na przykład jako efekt działania promieniowaniem UV, stanowią przyczynę licznych mutacji ludzkiego genomu i mogą przyczyniać się do rozwoju procesu nowotworzenia w tkankach organizmu. Badania dowodzą, że bardzo ważną rolę w naprawie uszkodzeń DNA przez system BER pełni OGG1 – enzym, którego mechanizmy aktywacji i regulacji nadal stanowią źródło licznych spekulacji. Przewiduje się, że w niedalekiej przyszłości szczegółowe informacje zebrane na temat sposobu działania systemu BER i wzajemnych powiązań pomiędzy jego elementami posłużą jako podstawa w prewencji uszkodzeń DNA oraz w diagnostyce i leczeniu chorób o podłożu genetycznym.

Podziękowania Praca jest wspierana z funduszu dla młodych naukowców Uniwersytetu Medycznego w Łodzi.

Rola OGG1 w przebiegu procesu naprawy DNA przez system BER

Literatura 1. Boiteux S., Radicella J.P., The human OGG1 gene: Structure, functions, and its implication in the process of carcinogenesis, Arch. Biochem. Biophys., vol. 377, no. 1, pp. 1-8, 2000. 2. Gunnarsson C., Bruun C.F., Molecular characterization and clinical features of a patient with an interstitial deletion of 3p25.3-p26.1, Am. J. Med. Genet. Part A, vol. 152 A, no. 12, pp. 3110-3114, 2010. 3. Peltekova I.T., Macdonald A., Armour C.M., Microdeletion on 3p25 in a patient with features of 3p deletion syndrome, Am. J. Med. Genet. Part A, vol. 158 A, no. 10, pp. 2583- 2586, 2012. 4. Ogawa A., Watanabe T., Shoji S., Furihata C., Enzyme Kinetics of an Alternative Splicing Isoform of Mitochondrial 8-Oxoguanine DNA Glycosylase, OGG1-1b, and Compared with the Nuclear OGG1-1a, J. Biochem. Mol. Toxicol., vol. 29, no. 2, pp. 49-56, 2014. 5. Nishioka K. et al., Expression and Differential Intracellular Localization of Two Major Forms of Human 8-Oxoguanine DNA Glycosylase Encoded by Alternatively Spliced OGG1 mRNAs, Mol. Biol. Cell, vol. 10, no. 5, pp. 1637-1652, 1999. 6. Lia D. et al., Mitochondrial maintenance under oxidative stress depends on mitochondrial but not nuclear α isoform of OGG1, J. Cell Sci., no. November, 2018. 7. Furihata C., An active alternative splicing isoform of human mitochondrial 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1), Genes Environ., vol. 37, no. 1, 2015. 8. Komakula S.S.B. et al., The DNA Repair Protein OGG1 Protects Against Obesity by Altering Mitochondrial Energetics in White Adipose Tissue, Sci. Rep., vol. 8, no. 1, pp. 1- 15, 2018. 9. Wang R., Hao W., Pan L., Boldogh I., Ba X., The roles of base excision repair enzyme OGG1 in gene expression, Cell. Mol. Life Sci., vol. 75, no. 20, pp. 3741-3750, 2018. 10. Hirano T., Repair System of 7, 8-Dihydro-8-Oxoguanine as a Defense Line against Carcinogenesis, J. Radiat. Res., vol. 49, no. 4, pp. 329-340, 2008. 11. Zharkov D.O., Base excision DNA repair, Cell. Mol. Life Sci., vol. 65, no. 10, pp. 1544- 1565, 2008. 12. Gruber C.C., Walker G. C., Incomplete base excision repair contributes to cell death from antibiotics and other stresses, DNA Repair (Amst)., vol. 71, no. August, pp. 108-117, 2018. 13. Mirbahai L., Kershaw R.M., Green R.M., Hayden R.E., Meldrum R.A., Hodges N.J., Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells, DNA Repair (Amst)., vol. 9, no. 2, pp. 144-152, 2010. 14. Kasai H., Tanooka H., Nishimura S., Formation of 8-hydroxyguanine residues in DNA by X-irradiation, Japanese J. Cancer Res. GANN, vol. 75, pp. 1037-1039, 1984. 15. Boiteux S., O’Connor T.R., Lederer F., Gouyette A., Laval J., Homogeneous Escherichia coli FPG protein, vol. 265, no. 7, pp. 3916-3922, 1990. 16. Serre L., De Jésus K.P., Boiteux S., Zelwer C., Castaing B., Crystal structure of the Lactococcus lactis formamidopyrimidine-DNA glycosylase bound to an abasic site analogue-containing DNA, EMBO J., vol. 21, no. 12, pp. 2854-2865, 2002. 17. van der Kemp P.A., Thomas D., Barbey R., de Oliveira R., Boiteux S., Cloning and expression in Escherichia coli of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae, which codes for a DNA glycosylase that excises 7,8-dihydro-8-oxoguanine and 2,6-diamino-4- hydroxy-5-N-methylformamidopyrimidine., Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 93, no. 11, pp. 5197-5202, 2002.

Michał Szewczuk, Karolina Boguszewska, Bolesław T. Karwowski

18. Lu R., Nash H.M., Verdine G. L., A mammalian DNA repair enzyme that excises oxidatively damaged guanines maps to a locus frequently lost in lung cancer, Curr. Biol., vol. 7, no. 6, pp. 397-407, 1997. 19. De Souza-Pinto N.C. et al., Repair of 8-oxodeoxyguanosine lesions in mitochondrial DNA depends on the oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) gene and 8-oxoguanine accumulates in the mitochondrial DNA of OGG1-defective mice, Cancer Res., vol. 61, no. 14, pp. 5378-5381, 2001. 20. Boiteux S., Coste F., Castaing B., Repair of 8-oxo-7,8-dihydroguanine in prokaryotic and eukaryotic cells: Properties and biological roles of the Fpg and OGG1 DNA N- glycosylases, Free Radic. Biol. Med., vol. 107, no. September 2016, pp. 179-201, 2017. 21. Amouroux R., Campalans A., Epe B., Radicella J.P., Oxidative stress triggers the preferential assembly of base excision repair complexes on open chromatin regions, Nucleic Acids Res., vol. 38, no. 9, pp. 2878-2890, 2010. 22. Hazra T.K., Das A., Das S., Choudhury S., Kow Y.W., Roy R., Oxidative DNA damage repair in mammalian cells: a new perspective, DNA Repair (Amst)., vol. 6, no. 4, pp. 470- 480, 2007. 23. Ba X. et al., The role of 8-oxoguanine DNA glycosylase-1 in inflammation, Int. J. Mol. Sci., vol. 15, no. 9, pp. 16975-16997, 2014. 24. Boiteux S., Coste F., Castaing B., Repair of 8-oxo-7,8-dihydroguanine in prokaryotic and eukaryotic cells: Properties and biological roles of the Fpg and OGG1 DNA N- glycosylases, Free Radic. Biol. Med., vol. 107, no. September 2016, pp. 179-201, 2017. 25. Singh B., Chatterjee A., Ronghe A.M., Bhat N.K., Bhat H.K., Antioxidant-mediated upregulation of OGG1 via NRF2 induction is associated with inhibition of oxidative DNA damage in estrogen-induced breast cancer, BMC Cancer, vol. 13, pp. 1-9, 2013. 26. Bhakat K.K., Mokkapati S.K., Boldogh I., Hazra T.K., Mitra S., Acetylation of Human 8- Oxoguanine-DNA Glycosylase by p300 and Its Role in 8-Oxoguanine Repair In Vivo, Mol. Cell. Biol., vol. 26, no. 5, pp. 1654-1665, 2006. 27. Ba X., Boldogh I., 8-Oxoguanine DNA glycosylase 1: Beyond repair of the oxidatively modified base lesions, Redox Biol., vol. 14, no. November 2017, pp. 669-678, 2018. 28. Chen L.Y., Wang Y., Terkeltaub R., Liu-Bryan R., Activation of AMPK-SIRT3 signaling is chondroprotective by preserving mitochondrial DNA integrity and function, Osteoarthr. Cartil., vol. 26, no. 11, pp. 1539-1550, 2018. 29. Liu-Bryan R., Wang Y., Terkeltaub R., AMP-activated protein kinase (AMPK) limits mitochondrial DNA damage in human knee OA chondrocytes by upregulation of SIRT3 and the DNA repair enzyme OGG1, Osteoarthr. Cartil., vol. 23, no. 2015, pp. A157-A158, 2015. 30. Cheng Y. et al., Interaction of Sirt3 with OGG1 contributes to repair of mitochondrial DNA and protects from apoptotic cell death under oxidative stress, Cell Death Dis., vol. 4, no. 7, pp. 1-11, 2013. 31. Hu J., Imam S.Z., Hashiguchi K., de Souza-Pinto N.C., Bohr V.A., Phosphorylation of human oxoguanine DNA glycosylase (α-OGG1) modulates its function, Nucleic Acids Res., vol. 33, no. 10, pp. 3271-3282, 2005. 32. Ko H.L., Ren E.C., Functional aspects of PARP1 in DNA repair and transcription, Biomolecules, vol. 2, no. 4, pp. 524-548, 2012. 33. Campalans A., Moritz E., Kortulewski T., Biard D., Epe B., Radicella J.P., Interaction with OGG1 Is Required for Efficient Recruitment of XRCC1 to Base Excision Repair and Maintenance of Genetic Stability after Exposure to Oxidative Stress, Mol. Cell. Biol., vol. 35, no. 9, pp. 1648-1658, 2015. 34. Norjmaa B., Tulgaa K., Saitoh T., Base Excision Repair Pathway and Polymorphisms of XRCC1 Gene Human genetic factor of disease susceptibility View project, no. November, 2016.

Rola OGG1 w przebiegu procesu naprawy DNA przez system BER

Rola OGG1 w przebiegu procesu naprawy DNA przez system BER Streszczenie Glikozylaza 8-oksoguaniny OGG1 (ang. 8-oxoguanine glycosylase 1) jest enzymem odpowiedzialnym za usuwanie 8-oksoguaniny z nici DNA w przebiegu procesu naprawy DNA przez system BER (ang. base excision repair). Będąc białkiem zarówno jądrowym, jak i mitochondrialnym, stanowi przedmiot licznych badań naukowych, mających na celu poznanie szczegółowych mechanizmów usuwania uszkodzeń z ludzkiego genomu w zależności od miejsca działania systemu naprawczego. Ze względu na fakt, że 8- oksoguanina jest najczęściej występującym pojedynczym uszkodzeniem DNA, poznanie sposobu aktywacji i regulacji białka OGG1 jest podstawą do rozwoju nauki pod kątem prewencji, diagnostyki i leczenia chorób o podłożu genetycznym – w tym procesu rozwoju nowotworu. W niniejszym artykule przybliżono zagadnienia dotyczące struktury OGG1, przedstawiono rolę tego enzymu w działaniu systemu BER, a także opisano możliwe ścieżki aktywacji i regulacji tego białka, które do dziś stanowią przedmiot licznych spekulacji. Słowa kluczowe: BER, OGG1, uszkodzenia DNA, naprawa DNA, 8-oksoguanina

The role of OGG1 in the process of DNA damage repair by BER system Abstract 8-oxoguanine glycosylase OGG1 is an enzyme responsible for the removal of 8-oxoguanine from a DNA strand during the process of DNA repair by the BER system. As nuclear and mitochondrial protein, it is the subject of numerous scientific studies aimed at understanding detailed mechanisms of removing damage from the human genome depending on the location of the repair system. Due to the fact that 8-oxoguanine is the most frequently occurring single DNA damage, learning how to activate and regulate the OGG1 protein is the basis for the development of science in terms of prevention, diagnosis and treatment of genetic diseases – including the process of cancer development. This article presents issues related to the structure of OGG1, role of this enzyme in the mechanism of the BER system, and describes the possible pathways of activation and regulation of this protein, which to date are the subject of numerous speculations. Keywords: BER, OGG1, DNA damage, DNA repair, 8-oxoguanine

Magdalena Szatkowska1, Renata Krupa2

Paralogi RAD51 w naprawie pęknięć dwuniciowych DNA na drodze rekombinacji homologicznej

1. Wprowadzenie Dokładna naprawa dwuniciowych pęknięć DNA (DSB) ma kluczowe znaczenie dla zachowania integralności genomu. Istnieją dwie główne ścieżki, które naprawiają DSB, rekombinacja homologiczna (HR) i łączenie końców niehomologicznych (NHEJ) [1, 2]. Proces rekombinacji homologicznej odgrywa istotną rolę w mitotycznych i mejotycznych cyklach komórkowych większości organizmów eu- i prokariotycznych [2]. Naprawa za pośrednictwem naprawy przez rekombinację homologiczną (HRR) używa sekwencji DNA podobnej lub identycznej do sekwencji w miejscu uszkodzenia jako szablonu dla przeprowadzenia dokładnej naprawy [3]. W komórkach eukariotycznych głównym graczem w naprawie HRR jest homolog rekombinazy RecA Escherichia coli, białko Rad51. Białko to rozpoznaje sekwencję homologiczną w nieuszkodzonej siostrzanej chromatydzie lub w chromosomie homologicznym i pośredniczy w wymianie nici pomiędzy dwiema matrycami DNA [4]. Poziom ekspresji rekombinazy Rad51 zmienia się w całym cyklu komórkowym. Najniższa ekspresja występuje w fazie G1 i wzrasta w fazie S osiągając swoje maksi- mum w fazie G2/M [5]. Wzrost poziomu białka Rad51 w późnej fasie S oraz w G2/M cyklu komórkowego koreluje z preferencją naprawy DNA na drodze HRR, gdy siostrzane chromatydy są dostępne dla białek naprawczych [1, 6]. Poszukiwania homologów w prokariontach i eukariontach wskazywały, że większość eubakterii zawiera tylko jeden RecA, a wiele gatunków archeonów posiada trzy homologi RecA/Rad51 (RadA, RadB i SsoRal1), natomiast eukarioty posiadają ich pięć (XRCC2, XRCC3, Rad51B, Rad51C i Rad51D) (rys. 1) [2]. Ludzkie paralogi RAD51 wykazują 20-30% podobieństwa z RAD51 w sekwencji aminokwasowej [7]. Białka te najprawdopodobniej pozytywnie regulują naprawę HRR na różnych jej etapach [7, 8]. Znaczenie prawidłowego funkcjonowania systemu HRR w komórkach widać na przykładach różnych organizmów. Dotychczasowe badania jednoznacznie wskazują, że homologi Rad51 są ważne nie tylko dla stabilności genomu ludzkiego, lecz także dla komórek drożdży oraz niektórych gatunków eubakterii i archeonów [11, 43, 44]. Identyfikacja wszystkich białek mechanizmu HRR może pomóc w opracowaniu skuteczniejszej terapii przeznaczonej do leczenia schorzeń, których występowanie wiąże się z defektami genów kodujących białka HRR.

1 [email protected], Pracownia Genetyki Medycznej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki. 2 [email protected], Pracownia Genetyki Medycznej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki.

Paralogi RAD51 w naprawie pęknięć dwuniciowych DNA na drodze rekombinacji homologicznej

W niniejszym przeglądzie omawiamy dane literaturowe z ostatnich lat opisujące postępy w zrozumieniu, w jaki sposób paralogi Rad51 oddziałują między sobą w organizmach żywych oraz jaka jest ich rola w procesie naprawy HRR.

Rysunek 1. Homologi Rad51/RecA w organizmach żywych (opis w tekście) [opracowanie własne].

2. Mechanizm naprawy DNA przez rekombinację homologiczną (HRR) w komórkach ssaków Naprawa za pośrednictwem systemu HRR jest bezbłędnym mechanizmem naprawy dwuniciowych pęknięć DNA i międzyniciowych wiązań krzyżowych (ICL), które mogą wystąpić podczas cyklu komórkowego lub w wyniku uszkodzenia DNA przez endogenne lub egzogenne czynniki uszkadzające [9, 10]. Nieprawidłowości HRR związane są z wieloma chorobami genetycznymi, w tym z ataksją–teleangiektazją, zespołem Nijmegena, niedokrwistością Fanconiego i zespołem Blooma [11]. Zaburzenia procesu rekombinacji homologicznej w tych chorobach często prowadzą do zwiększonej podatności na raka, co potwierdza istotną rolę szlaku naprawy HRR w utrzymaniu integralności genomu [12]. Przebieg procesu naprawy dwuniciowych pęknięć DNA przedstawiono na rysunku 2. Uszkodzenia w postaci dwuniciowych pęknięć DNA są rozpoznawane przez białka HRR po etapie przebudowy chromatyny. W pierwszej fazie, presynaptycznej, kompleks MRE11–RAD50–NBS1 (MRN) rozpoznaje i wykrywa przerwy dwuniciowe [13]. Kompleks ten aktywuje kinazę ATM, która z kolei inicjuje pełną odpowiedź komórki na uszkodzenie DNA. Natomiast aktywność nukleazy CtIP jest wymagana do resekcji nici DNA w kierunku od 5’→3’ i pozostawienia na końcu 3’ wystających jedno- niciowych końców (3’–ssDNA). Odsłonięty ssDNA jest pokryty białkiem replika- cyjnym a (RPA), którego prokariotycznym odpowiednikiem jest białko SSB [14].

Magdalena Szatkowska, Renata Krupa

Rysunek 2. Schemat naprawy dwuniciowych pęknięć DNA na drodze rekombinacji homologicznej (opis w tekście) [opracowanie własne].

Podczas fazy synaptycznej, Rad51 zastępują białka RPA i dochodzi do formowania się nukleoproteinowego włókna Rad51–ssDNA. Proces ten jest pozytywnie regulo- wany białkami BRCA2, PALB2 oraz najprawdopodobniej paralogami Rad51 [15]. Na tym etapie DNA jest rozciągnięte co zapewnia odpowiednie warunki dla poszukiwania homologii. Taka struktura ułatwia tworzenie fizycznego połączenia między nicią DNA dawcy a nicią DNA biorcy. Rad51 przeprowadza poszukiwanie sekwencji homologicznej i pośredniczy w inwazji jednej z nici DNA na dupleks homologiczny i odsuwa nić komplementarną – powstaje pętla D. W komórkach eukariotycznych białko BRCA2 jest głównym mediatorem ułatwiającym tworzenie filamentów Rad51– ssDNA, aczkolwiek brak aktywności BRCA2 może przyczyniać się do aktywacji alternatywnej drogi do promowania HRR, czyli za pośrednictwem Rad51 poprzez działanie mediatora Rad52 [16]. Utrata zarówno BRCA2, jak i Rad52 wiąże się z wywołaniem syntetycznej letalności, ponieważ dochodzi wówczas do inaktywacji rekombinazy Rad51 (rys. 3) [17].

Paralogi RAD51 w naprawie pęknięć dwuniciowych DNA na drodze rekombinacji homologicznej

W ostatniej fazie HRR nić DNA jest syntetyzowana z użyciem końca 3’–OH jako startera. Na tym etapie białko Rad51 odłącza się od DNA, aby odsłonić 3’–OH niezbędny dla syntezy naprawczej DNA. Ligaza odtwarza dwuniciowe struktury tworząc tzw. połączenia Hollidaya, rozdzielane w ostatnim etapie HRR [18, 19].

Rysunek 3. Schemat prezentujący powstawanie syntetycznej letalności. Wyciszenie ekspresji białek (gruba strzałka w dół) Rad52 i BRCA2 powoduje fenotyp letalny dla komórki, natomiast aktywność chociaż jednego z białek (gruba strzałka w górę) wystarczy dla promowania procesu HRR i przeżycia komórki [opracowanie własne].

3. Kompleksy paralogów Rad51/RecA Ludzkie paralogi Rad51 (hRAD51: XRCC2, XRCC3, RAD51B, RAD51C i RAD51D), podobnie jak drożdżowe odpowiedniki Rad51 (Rad55 i Rad57), mogą promować aktywność rekombinaz Rad51 w procesie HRR [20]. Paralogi Rad51/RecA są białkami, które strukturalnie przypominają rekombinazy Rad51, ponieważ są produktami zdarzeń duplikacji genów Rad51/RecA [21]. Zidentyfikowano kilka kompleksów paralogowych RAD51 w komórkach kręgowców: heterotetramer (BCDX2) RAD51B–RAD51C–RAD51D–XRCC2 i trzy heterodimery: (BC) RAD51B–RAD51C, (DX2) RAD51D–XRCC2 i (CX3) RAD51C–XRCC3 [17, 21]. Wykazano, że kompleksy BC i DX2 wiążą się z jedno- i dwuniciowym DNA oraz mają zdolność do hydrolizy ATP [22]. Każdy z paralogów Rad51 zawiera dwa wysoce konserwatywne motywy wiążące ATP. Regionami o najwyższej homologii są motywy Walker a i Walker B, przypuszczalne domeny wiążące ATP. Motywy te występują kompleksach BC, DX2 i CX2 [23]. Zachowanie ewolucyjne struktury motywów Walkera wśród rodziny paralogów Rad51/RecA odzwierciedla ich funkcjonalne znaczenie w nadawaniu odporności na uszkodzenia DNA i integralność kompleksów paralogowych w komórkach eu- i prokariotycznych [24]. Mutacje motywów Walkera w RAD51C i XRCC3 powodują obniżenie zdolności do naprawiania indukowanych mitomycyną C miedzyniciowych wiązań krzyżowych między łańcuchami DNA [25, 26].

Magdalena Szatkowska, Renata Krupa

W przeciwieństwie do wyżej wymienionych kanonicznych kompleksów paralogowych Rad51, niedawno zidentyfikowano białko SWSAP1, które jest bardzo odmiennym ewolucyjnie paralogiem Rad51 oraz wykazuje najbliższą homologię do sekwencji białek RadA (~ 24%) i RecA, a także zawiera motywy Walkera A i B [27, 28]. Białko to, razem z SWS1, wchodzi w skład kompleksu Shu zaangażowanego w regulację rekombinacji homologicznej promując rekrutację Rad51 we wczesnych mejotycznych procesach rekombinacyjnych w komórkach rozrodczych [29]. Geny drożdżowe kodujące białka Rad55 i Rad57 są bardzo rozbieżne ewolucyjnie względem ludzkich paralogów Rad51, więc ich wzajemne powiązania są trudne do określenia. Badania genetyczne sugerują, że Rad55 i Rad57 są ortologami odpowiednio dla XRCC3 i XRCC2 [2]. Mutacje motywów Walker A/B w białku Rad55 powodują wzrost wrażliwości na promieniowanie jonizujące, jak również przyczyniają się do spadku aktywności rekombinacji mejotycznej [2, 30]. Strukturalny homolog Rad51/RecA znaleziony w archebakteriach nazwano RadA [31]. Sekwencje aminokwasowe RadA są znacznie bardziej podobne do sekwencji eukariotycznych homologów RAD51/Rad51 niż do homologa bakteryjnego RecA. Wstępna charakterystyka pokazuje, że paralogi RadA (SsoRal1 i RadB) znalezione w Sulpholobus solfataricus i Pyrobaculum islandicum są funkcjonalnie podobne do białek z rodziny Rad51/RecA i obecnie uważa się, że odgrywają kluczową rolę w rekombinacji oraz w naprawie DNA w archeonach [32, 33]. 3.1. Kompleksy BCDX2 i CX3 w HRR Aby lepiej zrozumieć rolę paralogów Rad51, starano się ustalić, na jakim etapie szlaku HRR są one wymagane. Badania genetyczne potwierdziły, że pod względem biochemicznym kompleksy BCDX2 i CX3 pełnią odmienne funkcje [27]. Mimo, że specyficzne aktywności kompleksów paralogowych Rad51 nie zostały zdefiniowane in vivo, to wiemy, że w badaniach in vitro tetramer BCDX2 jest odpowiedzialny za lokalizację Rad51 w obrębie uszkodzenia i wykazuje preferencję wiązania się do rozgałęzionych substratów DNA oraz złączy Hollidaya [30], [34]. Inne badania wskazują, że kompleks CX3 pośredniczy w naprawie rekombinacyjnej podczas wymiany nici DNA [17]. Ludzkie komórki jelita grubego z mutacją w genie kodującym białko XRCC3 nie wykazywały defektu w akumulacji białek Rad51 w miejscu uszkodzenia po ekspozycji na promieniowanie jonizujące (IR) [35]. Zmienność składników kompleksu BCDX2 lub CX3 w komórkach ludzkich nie powoduje dostarczania BRCA2 do miejsca uszkodzenia w DNA. Z kolei niedobory białka Rad51D powodują obniżony stopień dostarczania Rad51 do uszkodzonych rejonów w DNA, podczas gdy brak XRCC3 nie powoduje takiego efektu [23]. Sugeruje to, że kompleksy BCDX2 i CX3 działają na różnych etapach szlaku HRR, ponieważ zarówno BRCA2, jak i Rad52 zapewniają możliwość naprawy DNA za pośrednictwem rekombinazy Rad51 w komórkach ssaków poprzez dwa niezależne szlaki naprawcze [17, 36]. Jedoczesna utrata składników w obu kompleksach: BCDX2 (Rad51D lub XRCC2) i CX3 (Rad51C lub XRCC3) nie doprowadza do supresji Rad51, co dodatkowo dowodzi, że to tylko kompleks BCDX2 jest odpowiedzialny za rekrutację i stabilizację Rad51 w miejscu uszkodzonego DNA [37].

Paralogi RAD51 w naprawie pęknięć dwuniciowych DNA na drodze rekombinacji homologicznej

3.2. Drożdżowe paralogi Rad51/RecA Mutacje w genach kodujących białka Rad55 i Rad57 wykazują zwiększoną wrażliwość na zimno oraz są bardziej podatne na uszkodzenia DNA, aczkolwiek nadekspresja Rad51 lub Rad52 hamuje defekt naprawy DNA tych mutantów, zgodnie z założeniem, że Rad55 i Rad57 działają jako dodatkowe białka w rekombinacji homologicznej. Dowiedziono również, że Rad55 oddziałuje z Rad57 i Rad51 zarówno w warunkach in vivo, jak i in vitro [27, 38]. Kompleks składający się z heterodimeru Rad55–Rad57 nie wykazuje aktywności rekombinazy, aczkolwiek mutacja w genie kodującym białko Rad55 w rejonie Walkera a inicjuje zamianę lizyny w alaninę powodując zaburzenia biochemiczne w procesie rekombinacji mejotycznej [39]. W wyniku wywołania podwójnych pęknięć DNA dochodzi do aktywacji odpowiedzi komórki na stres genotoksyczny i kinazy punktu kontrolnego cyklu komór- kowego przeprowadzają fosforylację białka Rad55, która jest niezbędna dla aktywacji rekombinacji homologicznej w komórkach drożdży [40]. 3.3. Paralogi Rad51/RecA w prokariontach W Escherichia coli odnotowano występowanie specyficznej interakcji RecA z fragmentem Klenowa polimerazy DNA I, która zwiększa wierność syntezy DNA. Istnieje wiele dowodów sugerujących, że sprzężenie między rekombinacją a replikacją występuje zarówno u prokariontów, jak i eukariontów [41]. W komórkach archeonów zidentyfikowano dwa paralogi rekombinazy RadA. Pierwszy z nich, SsoRal1, został odkryty w Sulfolobus solfataricus. Badania in vitro wykazały, że jego rola polega na stymulowaniu procesu wymiany nici DNA za pośrednictwem białka RadA poprzez wzmocnienie wiązania RadA z ssDNA [42]. Drugi paralog, RadB występujący tylko u członków typu Euryarchaeota napraw- dopodobniej działa jako mediator w procesie rekombinacji homologicznej oraz odgrywa rolę łącznika zjawiska rekombinacji z replikacją [43]. Wyciszenie ekspresji genu kodującego RadB powoduje zwiększenie podatności na uszkodzenia DNA w Haloferax volcanii [43]. Ponadto, w badaniach in vitro u Pyrococcus furiosus zidentyfikowano wzajemną interrakcje białek RadA i RadB. Dodatkowo RadB indukuje zmianę konformacyjną w białku RadA i tym samym promuje jego polimeryzację na DNA podczas rekombinacji homologicznej [44]. 4. Podsumowanie Występowanie białek o wysokiej homologii do rekombinazy Rad51 stwierdza się w organizmach eu- i prokariotycznych. Zarówno formy skompleksowane, jak i poszczególne paralogi Rad51, pełnią funkcje regulacyjne w naprawie pęknięć dwuniciowych HRR na różnych jej etapach u różnych organizmów żywych. Pomimo że powszechnie uważa się, iż wszystkie kompleksy zawierające paralogi Rad51/RecA promują pośrednie działania w naprawie HRR, to ich dokładny skład, funkcja i zależności pozostają w dużej mierze niewyjaśnione.

Magdalena Szatkowska, Renata Krupa

Literatura 1. Jasin M., Rothstein R., Repair of strand breaks by homologous recombination, Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 5, 2013, a012740. 2. Lin Z., Kong H., Nei M., Ma H., Origins and evolution of the recA/RAD51 gene family: evidence for ancient gene duplication and endosymbiotic gene transfer, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 103, 2006, 10328-10333. 3. González-Barrera S., Cortés-Ledesma, F., Wellinger R. E., Aguilera A. Equal sister chromatid exchange is a major mechanism of double-strand break repair in yeast, Mol. Cell, 11, 2003, 1661-1671. 4. Huang F., Mazina O.M., Zentner I.J., Cocklin S., Mazin A.V., Inhibition of homologous recombination in human cells by targeting RAD51 recombinase, J. Med. Chem., 55, 2012, 3011-3020. 5. Kousholt A.N., Menzel T., Sørensen C.S. Pathways for genome integrity in G2 phase of the cell cycle, Biomolecules, 2, 2012, 579-607. 6. Ahrabi S. i wsp., A role for human homologous recombination factors in suppressing microhomology-mediated end joining, Nucleic Acids Res., 44, 2006, 5743-5757. 7. Thacker J., A surfeit of RAD51-like genes?, Trends Genet. TIG, 15, 1999, 166-168. 8. Thompson L.H., Schild D., The contribution of homologous recombination in preserving genome integrity in mammalian cells, Biochimie, 81, 1999, 87-105. 9. Taleei R., Girard P.M., Nikjoo H., DSB repair model for mammalian cells in early S and G1 phases of the cell cycle: application to damage induced by ionizing radiation of different quality, Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen., 779, 2015, 5-14. 10. Lin Y.F. i wsp., Differential radiosensitivity phenotypes of DNA-PKcs mutations affecting NHEJ and HRR systems following irradiation with gamma-rays or very low fluences of alpha particles, PloS One, 9, 2014, e93579. 11. Suhasini A.N., Brosh R.M., Fanconi anemia and Bloom’s syndrome crosstalk through FANCJ-BLM helicase interaction, Trends Genet. TIG, 28, 2012, 7-13. 12. Tischkowitz M., Easton D.F., Ball J., Hodgson S.V., Mathew C.G., Cancer incidence in relatives of British Fanconi Anaemia patients, BMC Cancer, 8, 2008, 257. 13. Lamarche B.J., Orazio N.I., Weitzman M.D. The MRN complex in double-strand break repair and telomere maintenance, FEBS Lett., 584, 2010, 3682-3695. 14. Maréchal A., Zou L., DNA damage sensing by the ATM and ATR kinases, Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 5, 2013, a012716. 15. Park J.Y. i wsp., Breast cancer-associated missense mutants of the PALB2 WD40 domain, which directly binds RAD51C, RAD51 and BRCA2, disrupt DNA repair, 33, 2014, 4803- 4812. 16. Mahajan S., Raina K., Verma S., Rao B.J., Human RAD52 protein regulates homologous recombination and checkpoint function in BRCA2 deficient cells, Int. J. Biochem. Cell Biol., 107, 2019, 128-139. 17. Chun J., Buechelmaier E.S., Powell S.N., Rad51 paralog complexes BCDX2 and CX3 act at different stages in the BRCA1-BRCA2-dependent homologous recombination pathway, Mol. Cell. Biol., 33, 2013, 387-395. 18. Crickard J.B., Greene E.C., Helicase Mechanisms During Homologous Recombination in Saccharomyces cerevisiae, Annu. Rev. Biophys., 48, 2019. 19. Ceccaldi R. i wsp., Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ- mediated repair, Nature, 518, 2015, 258-262. 20. Cox M.M., A new look at the human Rad51 protein, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 106, 2009, 13147-13148.

Paralogi RAD51 w naprawie pęknięć dwuniciowych DNA na drodze rekombinacji homologicznej

21. Tombline G., Fishel R., Biochemical characterization of the human RAD51 protein. I. ATP hydrolysis, J. Biol. Chem., 277, 2002, 14417-14425. 22. Yokoyama H. i wsp., Preferential binding to branched DNA strands and strand-annealing activity of the human Rad51B, Rad51C, Rad51D and Xrcc2 protein complex, Nucleic Acids Res., 32, 2004, 2556-2565. 23. Wiese C. i wsp., Disparate requirements for the Walker a and B ATPase motifs of human RAD51D in homologous recombination, Nucleic Acids Res., 34, 2006, 2833-2843. 24. Stark J.M., Hu P., Pierce A.J., Moynahan M.E., Ellis N., Jasin M., ATP hydrolysis by mammalian RAD51 has a key role during homology-directed DNA repair, J. Biol. Chem., 277, 2002, 20185-20194. 25. French C.A., Tambini C.E., Thacker J., Identification of functional domains in the RAD51L2 (RAD51C) protein and its requirement for gene conversion, J. Biol. Chem., 278, 2003, 45445-45450. 26. Hanson P.I. Whiteheart S.W., AAA+ proteins: have engine, will work, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6, 2005, 519-529. 27. Gaines W.A. im wsp., Promotion of presynaptic filament assembly by the ensemble of S. cerevisiae Rad51 paralogues with Rad52, Nat. Commun., 6, 2015, 7834. 28. Liu J., Ehmsen K.T., Heyer W.D., Morrical S.W., Presynaptic filament dynamics in homologous recombination and DNA repair, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 46, 2011, 240-270. 29. Liu T., Wan L., Wu Y. Chen J., Huang J., hSWS1·SWSAP1 is an evolutionarily conserved complex required for efficient homologous recombination repair, J. Biol. Chem., 286, 2011, 41758-41766. 30. Shinohara A., Ogawa H., Ogawa T., Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein, Cell, vol. 69, 1992, 457-470. 31. Sandler S.J., Hugenholtz P., Schleper C., DeLong E.F., Pace N.R., Clark A.J. Diversity of radA genes from cultured and uncultured archaea: comparative analysis of putative RadA proteins and their use as a phylogenetic marker, J. Bacteriol., 181, 1999, 907-915. 32. Kil Y.V., Baitin D.M., Masui R., Bonch-Osmolovskaya E.A., Kuramitsu S., Lanzov V.A., Efficient strand transfer by the RadA recombinase from the hyperthermophilic archaeon Desulfurococcus amylolyticus, J. Bacteriol., 182, 2000, 130-134. 33. Kil Y.V., Glazunov E.A., Lanzov V.A., Characteristic thermodependence of the RadA recombinase from the hyperthermophilic archaeon Desulfurococcus amylolyticus, J. Bacteriol., 187, 2005, 2555-2557. 34. Compton S.A., Ozgür S., Griffith J.D., Ring-shaped Rad51 paralog protein complexes bind Holliday junctions and replication forks as visualized by electron microscopy, J. Biol. Chem., 285, 2010, 13349-13356. 35. Sahami-Fard M H., Farashahi Yazd E., Comment on: ‘Association Between the XRCC3 Thr241Met Polymorphism and Risk of Colorectal Cancer: a Meta-Analysis of 5,193 Cases and 6,645 Controls, Asian Pac. J. Cancer Prev. APJCP, 17, 2016, 4803-4804. 36. Feng Z. i wsp., Rad52 inactivation is synthetically lethal with BRCA2 deficiency, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 108, 2011, 686-691. 37. Takata M. i wsp., Chromosome instability and defective recombinational repair in knockout mutants of the five Rad51 paralogs, Mol. Cell. Biol., 21, 2001, 2858-2866. 38. Hays S.L., Firmenich A.A., Berg P., Complex formation in yeast double-strand break repair: participation of Rad51, Rad52, Rad55, and Rad57 proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 92, 1995, 6925-6929. 39. Sharma D. i wsp., Role of the conserved lysine within the Walker a motif of human DMC1, DNA Repair, 12, 2013, 53-62.

Magdalena Szatkowska, Renata Krupa

40. Nagy Z., Kalousi A., Furst A., Koch M., Fischer B., Soutoglou E., Tankyrases Promote Homologous Recombination and Check Point Activation in Response to DSBs, PLoS Genet., 12, 2016, e1005791. 41. Naiman K., Pagès V., Fuchs R.P., A defect in homologous recombination leads to increased translesion synthesis in E. coli, Nucleic Acids Res., 44, 2016, 7691-7699. 42. Graham W.J., Rolfsmeier M.L., Haseltine C.A., An archaeal RadA paralog influences presynaptic filament formation, DNA Repair, 12, 2013, 403-413. 43. Wardell K., Haldenby S., Jones N., Liddell S., Ngo G.H.P., Allers T., RadB acts in homologous recombination in the archaeon Haloferax volcanii, consistent with a role as recombination mediator, DNA Repair, 55, 2017, 7-16. 44. Komori K. i wsp., Both RadA and RadB are involved in homologous recombination in Pyrococcus furiosus, J. Biol. Chem., 275, 2000, 33782-33790.

Paralogi RAD51 w naprawie pęknięć dwuniciowych DNA na drodze rekombinacji homologicznej Dwuniciowe pęknięcia DNA są jednymi z najbardziej szkodliwych uszkodzeń. W celu utrzymania stabilności genomu dwuniciowe pęknięcia DNA mogą być naprawiane za pomocą procesu rekombinacji homologicznej (HRR). Naprawa HRR stanowi dokładny mechanizm naprawczy, który do naprawy wykorzystuje homologiczny szablon DNA. Pierwszym etapem HRR jest tworzenie aktywnego nukleoproteinowego włókna na wyciętym jednoniciowym DNA (ssDNA) i białko RecA/Rad51 odgrywa ważną rolę na tym etapie. Rekombinaza RecA/Rad51 pośredniczy w rekombinacji homologicznej, ponieważ jest wymagana dla inwazji i poszukiwania homologii przez presynaptyczne włókno Rad51-ssDNA. Paralogi RecA/Rad51 są białkami, które strukturalnie przypominają RecA/Rad51 i zostały zidentyfikowane jako białka pomocnicze dla systemu HRR. Niemniej jednak poczyniono niewiele postępów w zrozumieniu funkcji paralogów RecA /Rad51 w naprawie pęknięć dwuniciowych DNA w komórkach eu- i prokariotycznych. Celem niniejszej pracy jest przegląd badań z ostatnich lat dotyczących roli paralogów białka Rad51 w naprawie pęknięć dwuniciowych DNA za pośrednictwem systemu HRR. Słowa kluczowe: paralogi Rad51, rekombinacja homogiczna, HRR

The RAD51 paralogs in DNA double-strand breaks repair by homologous recombination The DNA double-strand breaks (DSBs) are the one of the most toxic lesions and for maintain genome stability, the DSBs can be repaired using homologous recombination. Homologous recombination repair (HRR) represents an accurate repair mechanism using a homologous template for DNA repair. First central HRR step is the formation of an active DNA nucleoprotein filament on the resected single-stranded DNA (ssDNA) and the RecA/Rad51 protein plays a crucial role in this process. The RecA/Rad51 recombinase mediates homologous recombination because it is required for the strand invasion and homology search by the Rad51-ssDNA presynaptic filament. The RecA/Rad51 paralogs structurally resemble RecA/Rad51 recombinase and they have been identified as ancillary proteins in HRR system. Nevertheless, few progression has been made for in understanding the function of the RecA/Rad51 paralogs in DSBs repair in eu- and prokaryotes cells. The aim of this paper is to review a data from recent years indicating the importance of Rad51 paralogs in the repair of a double-stranded DNA breaks by HRR system. Keywords: Rad51 paralogs, homologous recombination, HRR

Jakub Krzaczyński3, Beniamin Grabarek1,2,3, Barbara Strzałka-Mrozik3

Zmiany aktywności transkrypcyjnej genu CYP1B1 związanego z sygnalizacją IL-12/23 w hodowli NHDF eksponowanych na adalimumab

1. Wstęp Łuszczyca to choroba autoimmunologiczna o przewlekłym charakterze zapalnym, z często nawracającymi okresami zaostrzeń objawów. Histologicznie obserwuje się wzmożoną proliferację przede wszystkim keratynocytów, natomiast na poziomie molekularnym nasiloną sekrecję prozapalnych cytokin i adipokin, gdzie najważ- niejszymi są interleukiny (IL) IL-1, IL-2, IL-6, IL-17, IL-12 i IL-23, interferon gamma (IFN-γ), czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α), transformujący czynnik wzrostu β (TGFβ). Zmiany łuszczycowe lokalizują się w obrębie owłosionej skóry głowy oraz w zgięciach łokci i kolan [1, 2, 3]. IL-12 i IL-23 są heterodimerycznymi plejotro- powymi cytokinami, zbudowanymi z 2 podjednostek: p35, p40 (IL-12), p19, p40 (IL-23) [4]. Pełnią one istotną funkcję w patogenezie łuszczycy, gdyż zaangażowane są w różnicowanie natywnych limfocytów T o fenotypie Th0 do subpopulacji Th1 lub Th17. IL-12 poprzez związanie z receptorem IL-12R występującym na powierzchni komórek T CD4+ powoduje ich różnicowanie do fenotypu Th1, charakteryzującego się w głównej mierze zwiększoną sekrecją INF-γ i TNF-α. IL-23 nie uczestniczy w różni- cowaniu natywnych limfocytów T do subpopulacji Th, z powodu braku receptora IL-23R na powierzchni błony komórkowej limfocytów. W różnicowaniu subpopulacji limfocytów Th0 do Th17 uczestniczą łącznie IL-23, IL-6, TGFβ. Tak zróżnicowana populacja limfocytów jest źródłem sekrecji: IL-17, IL-22, IL-6, TGFβ [7]. Zgodnie z zaleceniami Polskiego Towarzystwa Dermatologicznego w leczeniu łuszczycy o nasileniu od umiarkowanego do dużego stosuje się leki anty-cytokinowe. Decyzja o włączeniu terapii biologicznej warunkowana jest brakiem uzyskania adekwatnej, oczekiwanej odpowiedzi na dotychczas stosowane formy farmakoterapii konwencjonalnej (minimum dwie metody) z wykorzystaniem maksymalnych dawek leku [8]. Jedną z rekomendowanych grup leków są inhibitory TNF-α. Adalimumab jest ludzkim przeciwciałem monoklonalnym swoiście wiążącym się z TNF-α, w wyniku czego zahamowane zostają ścieżki sygnalizacyjne indukowane przez wspomnianą cytokinę [5, 6]. Niestety pomimo molekularnie ukierunkowanego leczenia, również w terapii anty-TNF łuszczycy obserwuje się zjawisko lekooporności. Stąd też niezwykle ważnym zagadnieniem jest poszukiwanie nowych, uzupełniających markerów molekularnych detekcji utraty adekwatnej odpowiedzi na leczenie oraz analizowanie sieci wzajemnych powiązań między cytokinami, przyczyniającymi się do nasilania stanu zapalnego [9]. Gen CYP1B1 należy do nadrodziny cytochromu P450 o kluczowej roli

1 Katowice School of Technology, The University of Science and Art. in Katowice Poland. 2 Center od Oncology, M. Skłodowska-Curie Memorial Institute, Cracow Branch, Poland. 3 Departament of Molecular Biology, School of Pharmacy with the Division of Laboratory Medicine in Sosnowiec, Medical University of Silesia in Katowice.

Jakub Krzaczyński, Beniamin Grabarek, Barbara Strzałka-Mrozik w procesie biotransformacji leków. Warto również zauważyć, że jego ekspresji nie odnotowano w prawidłowych tkankach [10], dlatego zagadnieniem niezwykle ważnym dla zapewnienia bezpiecznej i skutecznej anty-cytokinowej farmakoterapii jest analiza wzoru ekspresji CYP1B1. 2. Cel Celem badania było określenie wpływu adalimumabu na zmiany profilu ekspresji CYP1B1 w prawidłowych ludzkich fibroblastach skóry in vitro eksponowanych na adalimaumab oraz ocena możliwości wykorzystania analizowanego genu jako uzupełniającego markera molekularnego w monitorowaniu efektywności terapii anty- TNF. 3. Materiały i metody 3.1. Hodowla komórkowa Materiałem wykorzystywanym do badań była linia komórkowa prawidłowych ludzkich fibroblastów skóry NHDF (CC-2511 Lonza, Basel, Szwajcaria). Komórki hodowano zgodnie z zaleceniami w atmosferze 5% CO2, w 37˚C w inkubatorze Direct Heat CO2 Incubator (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Jako medium hodowlane wykorzystano pożywkę FBM (ang. Fibroblast Basal Medium; Lonza, Basel, Szwajcaria), wzbogaconą o hFGF-B (ludzki czynnik wzrostu fibroblastów, ang. Human Fibroblast Growth Factor-basic), insulinę i gentamycynę (FGMTM Single QuotsTM; Lonza, Basel, Szwajcaria). W eksperymencie wykorzystano komórki NHDF, między 4 a 6 pasażem, przy żywotności ≥ 98%. Cytotoksyczność oceniono za pomocą testu XTT (In Vitro Toxicology Assay Kit, XTT based; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). 3.2. Ekstrakcja całkowitego RNA Do izolacji całkowitego RNA użyto odczynnika TRIzol® (Invitrogen Life Technologies, Kalifornia, USA). Etapy ekstrakcji kwasu rybonukleinowego rozpoczęto od dodania 1000 μl odczynnika TRIZOL do osadu komórkowego, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej przez okres 5 minut. W kolejnym etapie dodano 200 μl schłodzonego chloroformu, zworteksowano przez 15 sekund i inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej. W dalszej kolejności przeprowadzono wirowanie, według następujących parametrów: 15 min, 12000 RPM, temperatura 4oC, co pozwoliło na przeniesienie górnej frakcji zawierającej RNA do nowej probówki. Następnie do supernatantu dodano 500 μl izopropanolu. Po upływie 12-godzinnej inkubacji w temperaturze -20oC próby wirowano (10 min, 12500 RPM, w temperaturze 4oC), a uzyskany supernatant zdekantowano. Osady RNA przemyto dwukrotnie 1000 μl 70% etanolu i wirowano wg następujących parametrów: 6 min, 9000 RPM, w temperaturze 4oC. Następnie osady suszono przez ok. 30 minut pod komorą laminarną aż do całkowitego odparowania etanolu.

Zmiany aktywności transkrypcyjnej genu CYP1B1 związanego z sygnalizacją IL-12/23 w hodowli NHDF eksponowanych na adalimumab

3.3. Jakościowa i ilościowa analiza ekstraktów RNA Oceny jakościowej uzyskanych ekstraktów RNA dokonano z wykorzystaniem elektroforezy agarozowej w 1% żelu, który otrzymano poprzez rozpuszczenie 400 mg agarozy w 40 ml 1x stężonego buforu TBE (Tris-boranowy). Elektroforezę przeprowadzono w aparacie SUBMINI (K. Kucharczyk T.E., Polska), Otrzymane elektrofo- regramy oceniano przy pomocy transiluminatora UV. Z kolei, analizę ilościową przeprowadzono z wykorzystaniem spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia LKB Biochrom Ltd., UK). Wyznaczono stężenie RNA w badanych próbkach oraz współczynnik A260/A280 przy założeniu, że 1OD dla roztworu RNA wynosi 40μg. 3.4. Wyznaczanie transktryptomów techniką ekspresyjnych mikromacierzy oligonukleotydowych Analizę profilu ekspresji genów związanych z sygnalizacją IL-12/23 w hodowli NHDF traktowanych adalimumabem przeprowadzono za pomocą mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A_2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) zgodnie z zaleceniami producenta. W przeprowadzonej analizie można wyróżnić następujące etapy: przygotowanie oraz wyznakowanie próbek kwasu rybonukleinowego, hybrydyzację próbek z sondami występującymi na płytce mikromacierzowej oraz interpretację uzyskanych danych. Uzyskane wyniki analizowano z wykorzystaniem oprogramowania PL-Grid wraz z programem GeneSpring 12.6.1. 4. Analiza wyników W wyniku analizy bazy danych Affymetrix spośród 22283 ID mRNA wystę- pujących na mikromacierzach oligonukleotydowych HGU-133A_2.0 wyselekcjo- nowano 149 ID mRNA związanych ze ścieżkami sygnałowymi IL-12 i IL-23. Porównanie wszystkich analizowanych grup transkryptomów w odniesieniu do grupy kontrolnej i określenie, które z obserwowanych różnic w ekspresji mRNA wykazywały istotność statystyczną możliwe było dzięki przeprowadzeniu testu jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA z poprawką Benjamini-Hochberga. Pozwoliło to wyty- pować 58 ID mRNA, dla których różnice we wzorcach ekspresji były znamienne statystycznie (p < 0,05). W następnym etapie wykonano test wielokrotnych porównań – post-hoc Tukey`a, dzięki któremu wskazano liczbę ID mRNA różnicujący hodowlę eksponowaną na adalimumab przez 2, 8 i 24 godziny w porównaniu do kontroli 2 h vs K = 45 ID mRNA; 8 h vs K = 29 ID mRNA; 24 vs K = 2 ID mRNA. Jednym z genów, dla którego zaobserwowano ponad 2 krotną zamianę ekspresji (FC, ang. Fold Change) był CYP1B1 (tab. 1, rys.1).

Tabela 1. Aktywność transkrypcyjna genu CYP1B1 w zależności od czasu ekspozycji hodowli NHDF na adalimumab FC ID Symbol genu 2h vs C 8h vs C 24h vs C 202435_s_at CYP1B1 +2,405 -1,981 +1,038 202436_s_at CYP1B1 +2,417 -2,205 +1,004 202437_s_at CYP1B1 +2,175 -2,307 -1,035 Źródło: Opracowanie własne

Jakub Krzaczyński, Beniamin Grabarek, Barbara Strzałka-Mrozik

Dwugodzinna ekspozycja fibroblastów skóry z lekiem anty-TNF spowodowała ponad dwukrotny wzrost aktywności transkrypcyjnej (2h vs K; FC = +2.999), jednak w miarę wydłużania czasu inkubacji, po ośmiu godzinach stwierdzono wyciszenie ekspresji CYP1B1 (8h vs K; FC = -2.164) w porównaniu do kontroli. Z kolei, po 24 godzinach aktywność transkrypcyjna analizowanego genu była zbliżona do obserwowanej w hodowli kontrolnej (24 h vs K; FC = +1.026). Statystycznie istotne różnice na podstawie testu post-hoc zaobserwowano dla porównań: 8 h vs 2 h, p = 0,000712; 24 h vs 8 h, p = 0,011034; 24h vs 2h p = 0,029451.

* *

Rysunek 1. Profil ekspresji genu CYP1B1 w hodowli NHDF eksponowanej na działanie adalimumabu przez 2, 8 i 24 h w porównaniu do hodowli kontrolnej [opracowanie własne] *- istotne statystycznie różnice ekspresji CYP1B1 (p < 0,05)

5. Podsumowanie Enzymy cytochromu P450 (CYP) stanowią kluczową grupę enzymów o aktywności oksydoreduktazy, zaangażowanych w proces biotransformacji leków, steroidów, witamin rozpuszczalnych w tłuszczach, i ksenobiotyków [11]. Rodzina CYP1, obejmuje następujących przedstawicieli: CYP1A1, CYP1B1 i CYP1A2, którzy uczestniczą w reakcjach hydroksylacji, m.in. wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych [WWA], prokancerogenów, amin biogennych i estrogenów [12, 13]. Największą aktywność CYP1 odnotowuje się w hormonozależnych nowotworach gruczołu krokowego, jajnika, sutka, jak również w przypadku raka płuc. Cechą charakte- rystyczną CYP1 jest fakt, że w prawidłowych tkankach ich ekspresja jest na poziomie granicy detekcji lub też jej się nie odnotowuje [14-16]. Przesłanką do podjęcia w niniejszej pracy oceny profilu ekspresji CYP1B1 w fibroblastach skóry eksponowanych na adalimumab był fakt, iż ta izoforma CYP1 opisywana jest jako jeden z czynników indukcji transformacji nowotworowej. CYP1B1

Zmiany aktywności transkrypcyjnej genu CYP1B1 związanego z sygnalizacją IL-12/23 w hodowli NHDF eksponowanych na adalimumab zaangażowany jest przede wszystkim w metabolizm estradiolu do estradiolu – 4- hydroksyestradiol (4-OHE2). Katecholowa forma estradiolu przekształcana jest następnie do postaci chinonowej, wchodzącej w interakcję z DNA i tubuliną wrzeciona kariokinetycznego [17]. Dlatego też, CYP1B1 uważany jest za krytyczny enzym zaangażowany w metabolizm hormonów w tkankach śluzówki macicy, sutka, i jajników, a poprzez to wskazywany jest jako biomarker nowotworów hormo- nozależnych [18-20]. Analiza mikromacierzowego wzorca ekspresji CYP1B1wskazuje, że białko kodowane przez ten gen jest związane nie tylko ze szlakami sygnalizacyjnymi metabolizmu hormonów steroidowych, ale również pełni ważną funkcję w kaskadach sygnałowych IL-12/23. Wskazuje to na złożony charakter zmian molekularnych [21] inicjowanych wprowadzeniem adalimumabu do hodowli NHDF. Dolcino i wsp. potwierdzają istnienie takiej złożonej sieci oddziaływań i występowania pętli sprzę- żenia zwrotnego poziomu cytokin podczas terapii anty-TNF [22]. W trakcie prowa- dzonego eksperymentu można zaobserwować różnice w profilu ekspresji analizowanego transkryptu genu. Po blisko 3-krotnym zwiększeniu ekspresji spowodowanym dwugodzinnym okresem inkubacji komórek z lekiem anty-TNF, następuje gwałtowny, dwukrotny spadek aktywności CYP1B1. Jednakże wydłużenie czasu ekspozycji do doby wiąże się z osiągnięciem poziomu ekspresji zbliżonym do hodowli nietraktowanej lekiem. W jednej z poprzednich prac dokona-liśmy oceny wpływu adalimumabu na zmiany poziomu ekspresji genów ścieżek sygnalizacyjnych aktywowanych przez TNF-α [23] oraz związanych z kaskadą JAK/STAT [24]. Biorąc łącznie pod uwagę spostrzeżenia z obydwu prac, nadekspresja CYP1B1 niekoniecznie musi być bezpośrednim efektem działania adalimumabu, ale może być odzwierciedleniem niezneutralizowanego w pełni TNF-α po 2-godzinnej inkubacji komórek z lekiem anty-TNF. Spostrzeżenia te są zbieżne z obserwacjami poczynionymi przez Leijs i wsp., którzy stwierdzili w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej (PBMC), że wyciszeniu ekspresji TNF-α towarzyszy równoległe obniżenie aktywności transkrypcyjnej CYP1B1 [25]. Również Umannová i wsp. zaobserwowali, że TNF-α stymuluje jego ekspresję [26]. W związku z tym, zasadnym wydaje się wniosek, iż zmiana wzoru ekspresji analizowanego genu po 8 godzinach ekspozycji komórek NHDF na działanie adalimumabu w porównaniu do 2-godzinnej inkubacji jest skutkiem inhibicji TNF-α przez wprowadzony lek. Nie należy jednak zapominać, iż potencjalną przyczyną obniżenia poziomu CYP1B1 może być związana z sekwencyjno-specyficzną regulacją ekspresji genów przez cząsteczki mikro RNA (miRNA) [27]. Wskazuje się, że jedną z potencjalnych cząsteczek mających wpływ na profil ekspresji CYP1B1 jest miR-27b [28]. Również nasze poprzednie badania [22, 23] podkreślają kluczową rolę miRNA w zrozumieniu zmian na poziomie mRNA, wskazując na rozważenie włączenia do rutynowego algorytmu diagnostyczno-terapeutycznego oznaczania zmian ekspresji wybranych miRNA [29]. Jednakże dalsze wydłużenie czasu działania adalimumabu na hodowlę fibroblastów skóry spowo- dowało osiągnięcie przez gen CYP1B1 poziomu ekspresji jak w hodowli kontrolnej. Interesujących obserwacji dostarczają badania przeprowadzone przez Alhouayek i wsp. Potwierdzają one plejotropowy charakter działania cytokin, związane z nimi zjawisko redundancji oraz możliwość wykorzystania CYP1B1 jako nie tylko markera

Jakub Krzaczyński, Beniamin Grabarek, Barbara Strzałka-Mrozik molekularnego, ale również obiecującego, atrakcyjnego celu terapeutycznego [30]. Ekspozycja linii komórkowej T84 na IFN-γ, stanowiący podobnie jak TNF-α ważny składnik osi Th0/Th1 [7], skutkowała zaburzeniem ciągłości bariery nabłonkowej, co manifestowało się podwyższoną ekspresją, m.in. CYP1A1, CYP1B1, TNF-α, IL-8. Natomiast zahamowanie ekspresji CYP1B1 i indukowanych przez niego efektów biologicznych powodował przywrócenie integralności bariery nabłonkowej [30]. Tym samym, zaobserwowana przez nas nadekspresja CYP1B1 jest najprawdopodobniej wynikiem inhibicji TNF-α w niewystarczającym stopniu [31], co jednak zmienia się po 8 godzinach od wprowadzenia leku do hodowli. Obserwowane zmiany wzorca aktywności transkrypcyjnej omawianego genu sugerują, iż może stanowić on molekularny wykładnik aktywacji mechanizmów adaptacyjnych przez fibroblasty skóry na wprowadzony ksenobiotyk (lek anty-TNF). Z drugiej strony, powrót ekspresji po 24 godzinach do poziomu kontrolnego pokazuje, iż komórki wykorzystane jako model badawczy w niniejszej pracy dążą do osiągnięcia stanu homeostazy [32]. Wydaje się więc, iż nasze obserwacje stanowią przesłankę do systematycznej podaży adalimumabu, uwzględniając okresy remisji oraz regularnego, dokładnego monitorowania skuteczności terapii anty-TNF. Ponadto, wydaje się, że analiza profilu ekspresji genu CYP1B1 ma uzasadnienie nie tylko w odniesieniu do tkanek nowotworowo zmienionych, ale może stanowić uzupełniający marker monitorowania profilu skuteczności i bezpieczeństwa terapii, co jest zgodne ze stwierdzeniem poczynionym przez Faiq i wsp. [33]. Literatura 1. Monin L., Gaffen S.L., Interleukin 17 family cytokines: signaling mechanisms, biological activities, and therapeutic implications, Cold Spring Harbor perspectives in biology, 10, 2018, a028522. 2. ArrudaI L., YpirangaII S., Martins G.A., Systemic treatment of psoriasis – Part II: Biologic immunomodulator agents, Anais Brasileiros de Dermatologia, 79, 2004, 393- 408. 3. Grabarek B., Zmarzły N., Wojdas E., Bednarczyk M., Plewka A., Interleukiny 12 i 23 (IL- 12 i IL-23) – budowa, charakterystyka, znaczenie biologiczne, Młodzi Naukowcy, Poznań 2017, 51-56. 4. Kofoed K., Skov L., Zachariae C., New Drugs and Treatment Targets in Psoriasis, Acta Dermato-Venereologica, 95, 2014, 133-139. 5. Bartelds G.M., Wijbrandts C.A., Nurmohamed M.T., Clinical response to adalimumab: relationship to anti-adalimumab antibodies and serum adalimumab concentrations in rheumatoid arthritis, BMJ Journals, 66, 2007, 921-925. 6. Mitoma H., Horiuchi T., Tsukamoto H., Ueda N., Molecular mechanisms of action of anti- TNF-α agents–comparison among therapeutic TNF-α antagonists, Cytokine, 101, 2018, 56-63. 7. Jeon C., Sekhon S., Yan D., Monoclonal antibodies inhibiting IL-12, -23, and -17 for the treatment of psoriasis, Human Vaccines Immunotherapeutics, 13, 2017, 2247-2259. 8. Reich A., Szepietowski J., Adamski Z., Chodorowska G., Kaszuba A., Krasowska D., Lesiak A., Maj J., Narbutt J., Osmola-Mańkowska A., Owczarek-Saczonek A., Owczarek W., Placek W., Rudnicka L., Psoriasis. Diagnostic and therapeutic recommendations of

Zmiany aktywności transkrypcyjnej genu CYP1B1 związanego z sygnalizacją IL-12/23 w hodowli NHDF eksponowanych na adalimumab

the Polish Dermatological Society. Part II: Moderate to severe psoriasis, Dermatology Review/Przegląd Dermatologiczny, 105, 2018, 329-357. 9. Wcisło-Dziadecka D., Grabarek B., Brzezińska-Wcisło L., Mazurek U., Drug resistance in anti-TNF therapy of psoriatic arthritis, Dermatology Review/Przegląd Dermatologiczny, 105, 2018, 625-631. 10. Murray G.I., Taylor M.C., McFadyen M.C.E., Tumor-specific Expression of Cytochrome P450 CYP1B1, AACR Publications, 57, 1997, 3026-3031. 11. Guengerich F.P., Waterman M.R., Egli M., Recent structural insights into cytochrome P450 function, Trends in pharmacological sciences, 37, 2016, 625-640. 12. Ohsako S., Aiba T., Miyado M., Fukami M., Ogata T., Hayashi Y., Mizuno K., Kolima Y., Expression of Xenobiotic Biomarkers CYP1 Family in Preputial Tissue of Patients with Hypospadias and Phimosis and Its Association with DNA Methylation Level of SRD5A2 Minimal Promoter, Archives of environmental contamination and toxicology 74, 2018, 240-247. 13. Harlow P.H. ,Perry S.J., Stevens A.J., Flemming A.J., Comparative metabolism of xenobiotic chemicals by cytochrome P450s in the nematode Caenorhabditis elegans, Scientific reports, 8, 2018, 13333. 14. Zhu W., Liu H., Wang X., Lu J., Zhang H., Wang S., Yang W., Associations of CYP1 polymorphisms with risk of prostate cancer: an updated meta-analysis, Bioscience Reports, 2019. 15. Surichan S., Arroo R.R., Ruparelia K., Tsatsakis A.M., Androutsopoulos V.P., Nobiletin bioactivation in MDA-MB-468 breast cancer cells by cytochrome P450 CYP1 enzymes, Food and chemical toxicology, 113, 2018, 228-235. 16. Matakova T., Halasova E., Dzian A., Hruby R., Halasa M., Javorka K., Skerenova M., Associations of CYP1A2 Polymorphisms with the Risk Haplotypes in Lung Cancer in the Slovak Population, Advances in Respiratory Cancerogenesis, 911, 2016, 23-32. 17. Yager J.D., Endogenous estrogens as carcinogens through metabolic activation, Journal of the National Cancer Institute Monographs, 27, 2000, 67-73. 18. Słowikowski B.K., Lianeri M., Jagodziński P.P., Exploring estrogenic activity in lung cancer, Molecular biology reports, 44, 2017, 35-50. 19. Cirillo F., Pellegrino M., Malivindi R., Rago V., Avino S., Muto L., Dolce V., Vivacqua A., Rigiracciolo D.C., De Marco P., Sebastiani A., Abonante S., Nakajima M., Lappano R., Maggiolini M., GPER is involved in the regulation of the estrogen-metabolizing CYP1B1 enzyme in breast cancer, Oncotarget, 8, 2017, 106608-106624. 20. Li C., Long B., Qin X., Li W., Zhou Y., Cytochrome P1B1 (CYP1B1) polymorphisms and cancer risk: a meta-analysis of 52 studies, Toxicology, 327, 2015, 77-86. 21. Kveler K., Starosvetsky E., Ziv-Kenet A., Kalugny Y., Gorelik Y., Shalev-Malul G., Aizenbud-Reshef N., Dubovik T., Briller M., Campbell J., Rieckmann J.C., Asbeh N., Rimar D., Meissner F., Wiser J., Shen-Orr S., Immune-centric network of cytokines and cells in disease context identified by computational mining of PubMed, Nature biotechnology, 36, 2018, 651-659. 22. Dolocino M., Tinazzi E., Pelosi A., Patuzzo G., Moretta F., Lunardi C., Puccetti A., Gene expression analysis before and after treatment with adalimumab in patients with ankylosing spondylitis identifies molecular pathways associated with response to therapy, Genes, 8, 2017, 127. 23. Wcisło-Dziadecka D., Gola J., Grabarek B., Mazurek U., Brzezińska-Wcisło L., Kucharz E., Effect of adalimumab on the expression of genes encoding TNF-α signal paths in skin fibroblasts in vitro, Advances in Dermatology and Allergology/Postȩpy Dermatologii i Alergologii, 35, 2018, 413-422. 24. Grabarek B,, Wcislo-Dziadecka D., Gola J., Kruszniewska-Rajs C., Brzezinska-Wcislo L., Zmarzly N., Mazurek U., Changes in the Expression Profile of JAK/STAT Signaling

Jakub Krzaczyński, Beniamin Grabarek, Barbara Strzałka-Mrozik

Pathway Genes and Mirnas Regulating their Expression Under the Adalimumab Therapy, Current pharmaceutical biotechnology, 19, 2018, 556-565. 25. Leijs M.M., Esser A., Amann P.M., Schettgen T., Heise R., Fietkau K., Gube M., Merk H.F., Kraus T., Baron J.M., Expression of CYP1A1, CYP1B1 and IL-1β in PBMCs and skin samples of PCB exposed individuals, Science of the total environment, 642, 2018, 1429-1438. 26. Umannová L., Machala M., Topinka J., Novákova Z., Milcová A., Kozubik A., Vondracek J., Tumor necrosis factor-α potentiates genotoxic effects of benzo[a]pyrene in rat liver epithelial cells through upregulation of cytochrome P450 1B1 expression, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 640, 2008, 162-169. 27. Grenda A., Budzyński M., Filip A., Biogeneza cząsteczek mikroRNA oraz ich znaczenie w powstawaniu i przebiegu wybranych zaburzeń hematologicznych, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 67, 2013, 174-18. 28. Sanjay S., Girish Ch., Role of miRNA and its potential as a novel diagnostic biomarker in drug-induced liver injury, European journal of clinical pharmacology, 73, 2017, 399-407. 29. Budzyński M., Grenda A., Filip A., Krążące mikrona – nowa klasa biomarkerów diagnostyczno-prognostycznych w przebiegu chorób nowotworowych, Postępy Biologii Komórki, 41, 2014, 173-208. 30. Alhouayek M., Gouveia-Figueira S., Hammarström M.L., Fowler C.J., Involvement of CYP1B1 in interferon γ‐induced alterations of epithelial barrier integrity, British Journal of Pharmacology, 175, 2018, 877-890. 31. Dolocino M., Tinazzi E., Pelosi A., Patuzzo G., Moretta F., Lunardi C., Puccetti A., Gene expression analysis before and after treatment with adalimumab in patients with ankylosing spondylitis identifies molecular pathways associated with response to therapy, Genes, 8, 2017, 127. 32. Defendenti C., Atzeni F., Malandrin S., Ardizzone S., Almasio P.L., Saibeni S., Bezzio C., Bollani S., Salerno R., Declich P., Sarno Z., Bruno S., Talotta., Sarzi-Puttini P., Anti- tumour necrosis factor-α antibodies and B cell homeostasis in human inflammatory bowel diseases, International immunopharmacology, 54, 2018, 329-335. 33. Faiq M.A., Dada R., Sharma R., Saluja D., Dada T., CYP1B1: a unique gene with unique characteristics, Current Drug Metabolism, 15, 2014, 893-914. Zmiany aktywności transkrypcyjnej genu CYP1B1 związanego z sygnalizacją IL- 12/23 w hodowli NHDF eksponowanych na adalimumab Streszczenie Adalimumab jest ludzkim przeciwciałem monoklonalnym anty-TNF. Gen CYP1B, związany z sygnalizacją IL-12/23, należy do nadrodziny enzymów cytochromu P450 i pełni istotną funkcję w procesie biotransformacji leków. Celem badania było określenie wpływu adalimumabu na aktywność transkrypcyjną genu CYP1B1 w hodowli NHDF oraz ocena wykorzystania zmian profilu jego ekspresji jako uzupełniającego markera molekularnego w monitorowaniu efektywności terapii anty-TNF. Hodowlę NHDF eksponowano na adalimumab przez 2, 8, 24h w porównaniu do komórek nietraktowanych lekiem anty-TNF. Zmiany ekspresji genu CYP1B1 wyznaczono z wykorzystaniem mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A_2.0. Spośród 149 ID mRNA związanych z kaskadami IL-12/23, 58 ID mRNA różnicuje hodowlę NHDF eksponowaną na adalimumab od hodowli kontrolnej (p < 0,05). Dla genu CYP1B1 zaobserwowano wzrost aktywności transkrypcyjnej po 2 h i 8 h, natomiast po 24 h wykazano spadek jego ekspresji. Zaobserwowanie ponad 2-krotnego wzrostu aktywności transkrypcyjnej CYP1B1 po 2 i 8 h od wprowadzenia leku do hodowli wskazuje, iż adalimumab wpływa na zmianę profilu ekspresji badanych genów zaangażowanych w metabolizm ksenobiotyków. Obniżenie ekspresji CYP1B1 po 24 h inkubacji sugeruje stopniowy zanik działania adalimumabu. Wydaje się, że ocena zmian wzorca ekspresji CYP1B1 może stanowić nowy, obiecujący marker molekularny analizy potencjału terapeutycznego adalimumabu. Słowa kluczowe: CYP1B1, terapia spersonalizowana, adalimumab, marker molekularny

Zmiany aktywności transkrypcyjnej genu CYP1B1 związanego z sygnalizacją IL-12/23 w hodowli NHDF eksponowanych na adalimumab

Changes in the transcriptional activity of the CYP1B1 gene associated with IL-12/23 signaling in NHDF culture exposed to adalimumab Abstract Adalimumab is a human anti-TNF monoclonal antibody. The CYP1B gene, associated with IL-12/23 signaling, belongs to the cytochrome P450 enzyme superfamily and plays an key role in the biotransformation of medicines. The aim of study was to determine the effect of adalimumab on the transcriptional activity of the CYP1B1 gene in NHDF culture and to assess the use of changes in its expression profile as a complementary molecular marker in monitoring the effectiveness of anti-TNF therapy. The NHDF culture was exposed to adalimumab for 2, 8, 24 hours compared to untreated cells. Changes in CYP1B1 gene expression were determined using oligonucleotide microarray HG-U133A_2.0. Out of the 149 IDs mRNAs associated with the IL-12/23 cascades, 58 differentiates the NHDF culture exposed to adalimumab compared to the control culture (p < 0.05). For the CYP1B1 gene, an increase in transcriptional activity after 2 h and 8 h was observed, however, after 24 h, its expression was reduced. Observation of over 2-fold increase in CYP1B1 transcriptional activity after 2 and 8 hours from the administration the medicine into the culture indicates that adalimumab influences the change in the expression profile of the genes involved in the metabolism of xenobiotics. Decreased CYP1B1 expression after 24 h incubation suggests a gradual disappearance of adalimumab. It seems that the assessment of changes in the CYP1B1 expression pattern may be a new, promising molecular marker for the analysis of the therapeutic potential of adalimumab. Keywords: CYP1B1, personalized therapy, adalimumab, molecular marker

Beata Kuczyńska1, Arkadiusz Budziński, Konrad Wiśniewski, Kamila Puppel

Zastosowanie badań proteomicznych w hodowli bydła

1. Wprowadzenie Rozwój nowoczesnych technik instrumentalnych w laboratoriach naukowo- badawczych związanych z naukami weterynaryjnymi i zootechnicznymi umożliwia nie tylko doskonalenie programów hodowlanych bydła, ale także lepszą diagnostykę różnych schorzeń, w tym i metabolicznych, jak również analizę jakości surowca dla przemysłu rolno-spożywczego w postaci mleka i mięsa, a w dalszym etapie prze- twórstwa dla nas konsumentów. Coraz większe zainteresowanie budzą badania, które pozwalają poprzez oznaczanie różnorodnych markerów monitorować status zdrowotny zwierząt i jakość produktów uzyskiwanych od nich. Jedną z dziedzin naukowych, która umożliwia tak kompleksowe badania jest proteomika. Termin proteomika został po raz pierwszy sformułowany i zastosowany przez Wilkinsa na I-wszej konferencji poświęconej tej dziedzinie w 1994 roku. Podkreślił on wtedy, że nadrzędnym celem badań proteomicznych jest wyodrębnianie białek wytwarzanych przez komórki i narządy, zarówno w stanach fizjologicznych normalnie funkcjonujących organizmów, jak i patologicznych [1]. Proteomika to dział wiedzy uzupełniający genomikę, zajmujący się identyfikacją i charakterystyką białek oraz ich wzajemnych oddziaływań, kodowanych w obrębie genomu danego organizmu. Nie mniej ważne jest znaczenie tych badań w oszacowywaniu wzajemnych zależności, a także poznanie struktur trójwymiarowych komponentów białkowych kodowanych przez genom. Każde badanie proteomiczne można podzielić na 3 etapy. Pierwszy to pozyskanie referencyjnych próbek materiału biologicznego i ich przygotowanie do analiz, drugi to właściwa analiza profilu białkowego badanych prób, natomiast kolejny to interpretacja i analiza otrzymanych i zebranych danych. W badaniach naukowych dotyczących zwierząt im więcej rozpatrujemy determinantów tym uzyskujemy pełniejszy wgląd w zależności dotyczące zmienności ilościowej analizowanych parametrów. W hodowli bydła napotykamy na coraz częstsze występowanie schorzeń związanych z ich produkcyjnością i niestety wpływających na pogorszenie jakości surowca, w zależności od kierunku użytkowania mlecznego bądź mięsnego. Podczas eksperymentów związanych z proteomiką często dochodzi do pojawiania się różnych trudności metodologicznych, które uniemożliwiają postawienie jednoznacznych konkluzji. Istotne w rozwoju tej dziedziny jest w rozwoju tej dziedziny przyjęcie ogólnych norm, np. stosowanie tych samych jednostek pomiaru, czy kryteriów jakościowych, aby wyniki pochodzące z różnych laboratoriów mogłyby być porównywane i odnoszone do siebie wzajemnie. Naukowcy dysponują obszerną gamą technik analitycznych i narzędzi informatycznych, które stosują w analizach specyficznych proteomów. Można do nich zaliczyć: wysokosprawną chromatografię cieczową w odwróconym układzie faz (HPLC-RP), elektroforezę żelową w wymiarze

1 [email protected], Zakład Hodowli Bydła, Wydział Nauk o Zwierzętach Katedra Szczegółowej Hodowli Zwierząt, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie.

Zastosowanie badań proteomicznych w hodowli bydła

2D lub 3D, diagnostyczne molekularne metody służące do powielania interesujących fragmentów DNA np. PCR, spektrofotometrię w podczerwieni z transformatą Fouriera – FTIR oraz narzędzia bioinformatyczne, takie jak: bazy danych białek i bioaktywnych peptydów, które umożliwiają analizę dużej ilości danych o skomplikowanej strukturze. Dosyć często w pracach badawczych stosuje się elektroforezę dwu wymiarową, która umożliwia wykrywanie białek w szerokim zakresie stężeń oraz pozwala na śledzenie między nimi różnic w obrębie badanych proteomów [2]. Wszystkie one są z powo- dzeniem wykorzystywane również w hodowli zwierząt gospodarskich, w tym bydła. 2. Badania proteomiczne w aspekcie diagnozowania schorzeń bydła Metody molekularne oparte na analizie DNA znajdują szerokie zastosowanie w diagnozowaniu wielu chorób bydła – w tym: genetycznych, metabolicznych, pasożytniczych i infekcyjnych. Nie wspominając już o tym, że za pomocą tych metod możemy zbadać pochodzenie zwierząt. Najczęściej stosowaną metodą diagnostyki molekularnej jest obecnie technika PCR (z ang. Polymeraze Chain Reaction), czyli reakcja łańcuchowej polimerazy. Jest to metoda służąca do powielania interesujących nas fragmentów DNA. Technika ta została opracowana w roku 1983 przez amery- kańskiego biochemika – Kary'ego Mullisa, która za to cenne odkrycie 10 lat później otrzymał nagrodę Nobla. Za pomocą techniki PCR możemy w krótkim czasie otrzymać miliardy kopii określonej sekwencji DNA. Następnie możemy określić jej długość i dokładną budowę. 2.1. Markery stresu oksydacyjnego o powinowactwie białkowym u wysokowydajnych krów Stres oksydacyjny jest konsekwencją braku równowagi między oksydantami a biolo- giczną zdolnością do szybkiej detoksyfikacji reaktywnych form tlenu (RFT). Wykazano, że wysoka wydajność mleczna krów ma istotny wpływ na kształtowanie się markerów stresu oksydacyjnego, zarówno w osoczu, jak i w mleku. Zaobserwo- wano, że początek produkcji mleka (wchodzenie w okres laktacji po porodzie) jest jednym z najbardziej newralgicznych momentów. Wtedy to organizm zwierzęcia jest atakowany przez RFT, a przez wyczerpanie układów antyoksydacyjnych nie jest w stanie się skutecznie bronić i utrzymywać homeostazy. Do obrony przed RFT organizm wykorzystuje własny układ enzymatyczny oraz endogenne antyoksydanty m.in.: glutation cysteinę i melatoninę. Antyoksydacyjne mechanizmy obronne w żywym organizmie mogą odbywać się dwutorowo. Jedne przerywają ciąg zaistniałych reakcji rodnikowych, a inne polegają na wychwytywaniu RFT, tworząc stabilną konformację. Zdiagnozowanie stresu oksydacyjnego u krów mlecznych nie jest łatwe. Najbardziej wiarygodnym źródłem są specyficzne biomarkery np. reduktaza glutationowa (Glu-Red) czy dysmutaza ponadtlenkowa (SOD). Istniejący stan wiedzy dowodzi, że Glu-Red i/lub SOD są odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy zredukowanego glutationu, najważniejszego substratu syntezy bioprotein i innych antyoksydantów (witaminy C i A). Kapusta i wsp. [3] wykazali, że najwyższy poziom Glu-Red (64,6 U/L) u krów występuje w pierwszych tygodniach laktacji. Krowy wchodząc w laktację są najbardziej narażone na działanie RTF, a SOD działa jako pierwsza linia obrony

Beata Kuczyńska, Arkadiusz Budziński, Konrad Wiśniewski, Kamila Puppel i ma wpływ na poziom innych antyoksydantów. Przy najniższym stężeniu poniżej 200 U/L, wykazano najwyższy poziom Glu-Red w surowicy bydlęcej. Stres oksydacyjny podwyższa również poziom cholesterolu w mleku, co prowadzi do niekorzystnych zmian wartości odżywczej mleka i produktów mlecznych. Puppel i wsp., [4] wykazali ścisłą korelację między dawką pokarmową a polimorfizmem β-laktoglobuliny na kształtowanie wartości odżywczej mleka krów, ze szczególnym uwzględnieniem profilu lipidowego. 2.2. Markery zapalenia gruczołu mlekowego o białkowym powinowactwie W trakcie trwania stanu zapalnego gruczołu mlekowego, razem ze wzrastającą liczbą komórek somatycznych w mleku wzrasta aktywność niektórych enzymów lub białek. Wzrasta m.in. aktyność N-acetylo-β-D-glukozaminidazy (NAG) z poziomu 3,8U/L dla stanu zdrowej krowy przy LKS na poziomie 200 tys./cm3 do 15,6 U/L w stanach subklinicznego zapalenia. NAG jest enzymem z grupy kwaśnych hydrolaz i jest pochodzenia komórkowego, w mleku krowy poziom aktywności tego enzymu jest praktycznie stały w trakcie standardowej laktacji. Zwiększona sekrecja enzymu do mleka jest wynikiem rozluźnienia błon komórkowych zainfekowanych komórek. W mleku u zdrowej krowy, gdy zawartość komórek somatycznych oscyluje poniżej 200 tys./ml, poziom aktywności enzymu jest niższy niż 4 U/ml mleka. Przy klinicznej postaci mastitis aktywność NAG w mleku przekracza 15 U/ml, a w stanach ostrych przekracza 50 U/ml [5]. Badania aktywności NAG pozwalają na uchwycenie utrzymujących się zaburzeń frakcji nabłonka wydzielniczego już po wyleczeniu mastitis oraz zmian związanych z utajonym zapaleniem, kiedy ocena poziomu komórek nie daje podstaw do rozpoznania podklinicznego stanu zapalnego. Poziom NAG lepiej niż liczba komórek somatycznych oddaje stan zdrowotny gruczołu mlekowego krów, szczególnie na poziomie podklinicznym. Haptoglobina (Hp) jest drugim dość czułym markerem zapalenia gruczołu mlekowego, dlatego zmiana jej stężenia jest wykrywalna dopiero po 24 godz. od uszkodzenia bądź zakażenia tkanek, a maksymalną wartość osiąga po upływie 3 do 5 dni. Powrót do stężenia wyjściowego może trwać nawet do miesiąca. W mleku mastitowym stężenie Hp dochodzi do 55 µg/ml. W osoczu krwi bydlęcej dolna granica oznaczalności to 0,033g/l [6]. 3. Badania proteomiczne w kontekście jakości surowca dla przemysłu mleczarskiego 3.1. Wpływ polimorfizmu białek mleka krowiego na jakość technologiczną surowca Już w latach 50. ubiegłego stulecia zapoczątkowane zostały badania, których celem było oszacowanie wpływu cech osobniczych krów tej samej rasy, tak pod względem składu chemicznego, jak i jakości technologicznej. Wykazano, że jednym z głównych czynników warunkujących te zmiany jest zjawisko dziedzicznego polimorfizmu białek. Polimorfizm białek to zjawisko występowania co najmniej dwóch form strukturalnych tzw. izoform danego białka. Znamy już ponad 30 polimorficznych wariantów mleka krowiego – 19 w obrębie kazein (tj.: 5 alfa S1, 4 alfa S2, 7 beta i 3 kappa kazeiny) oraz 6 beta-laktoglobulin i 3 alfa-laktoalbuminy. Zastosowanie badań proteomicznych

Zastosowanie badań proteomicznych w hodowli bydła w pracach hodowlanych ma na celu ustalenie zależności między obecnością różnych markerów genetycznych a cechami produkcyjnymi. Warianty genetyczne białek wprowadzono jako dodatkowe kryteria selekcyjne. Wiele firm hodowlanych specjalizujących się w inseminacji bydła mlecznego zamieszcza informacje o okreś- lonym genotypie kappa kazeiny (CSN3) i beta laktoglobuliny (LGB) w katalogach bydła mlecznego. W odniesieniu do bydła mlecznego badania koncentrują się wokół zagadnień dotyczących zależności między polimorfizmem białek kazeinowych i serwatkowych mleka, głównie CSN3 i LGB a jego składem chemicznym oraz ważnymi z punktu widzenia przemysłu mleczarskiego właściwościami fizyko- chemicznymi i parametrami przydatności technologicznej. I tak np. niewielkie różnice między poszczególnymi wariantami CSN3 w sekwencji aminokwasowej prowadzą do istotnych zmian zarówno w wielkości, jak i stabilności miceli kazeinowych. Mleko pozyskiwane od krów o genotypie CSN3 BB w porównaniu z krowami o genotypie CSN3 AA, wyróżnia się mniejszą średnicą micelli kazeinowych, lepszą krzepliwością mleka pod wpływem podpuszczki, krótszym czasem koagulacji i większą wytrzy- małością skrzepu kazeinowego, a także wyższym poziomem białka ogólnego i większą jego stabilnością termiczną. Mniejsza średnica micelli kazeinowych decyduje o większym stopniu homogeniczności surowca, co pozwala uzyskiwać bardziej zwięzły skrzep, który zatrzymuje większą ilość substancji stałych mleka, a w konsekwencji przyczynia się do wzrostu wydajności sera. Ponadto istnieje istotna pozytywna korelacja między LGB BB a zawartością sumy białek kazeinowych. Różnice między wariantami genetycznymi LGB B i LGB a pod względem poziomu kazeiny w mleku przekraczają 0,3 pkt procentowego. Różnice między tymi wariantami dotyczą również zawartości tłuszczu i komponentów litofilnych. Selekcja krów mlecznych prowadzona z jednoczesnym uwzględnieniem genotypu wskazuje na najkorzystniejszy układ CSN3BB i LGB BB w odniesieniu do produkcji serowarskiej [7]. 3.2. Badanie zafałszowań mleka Dodatek mleka krowiego do mleka koziego lub owczego jest niechlubnym procederem zafałszowania surowca przeznaczanego m.in. do produkcji serów. Można go wykryć za pomocą elektroforezy, analizy immunologicznej i rozdzielania chroma- tograficznego HPLC oznaczając specyficzne białka mleka. Dostępna wiedza wskazuje na istotne różnice ilościowe w składzie frakcji białkowej między mlekiem kozim, owczym i krowim. Mleko kozie charakteryzuje się pełnym składem aminokwasowym w proporcjach korzystniejszych niż w mleku krowim, co zapewnia lepsze wchłanianie. Więcej jest w mleku kozim aminokwasów egzogennych, czyli takich, których organizm nie może syntetyzować samodzielnie więc muszą być dostarczane w pożywieniu. Wzajemne proporcje tych aminokwasów w białku mleka koziego są bardzo korzystne z punktu widzenia odżywiania dzieci. W porównaniu z mlekiem krowim mleko kozie zawiera znaczne ilości aminokwasu tauryny, który spełnia szczególnie ważną funkcję w prawidłowym rozwoju układu nerwowego niemowląt. Mleko kozie charakteryzuje się również większą zawartością aminokwasów siarkowych tj. metioniny i cystyny. Aminokwasy te są niezbędne dla prawidłowego metabolizmu oraz rozwoju młodego organizmu. Co istotne, białko mleka koziego jest szybciej i łatwiej trawione, a jego aminokwasy w wyższym stopniu przyswajane.

Beata Kuczyńska, Arkadiusz Budziński, Konrad Wiśniewski, Kamila Puppel

Enzymy trawienne obecne w prze-wodzie pokarmowym człowieka łatwiej rozkładają mleko kozie, gdyż powstający w żołądku skrzep tego mleka jest bardziej miękki, drobnoziarnisty i delikatny w swej strukturze. Dlatego osoby mające problemy z przyswajaniem mleka krowiego bardzo często bez najmniejszych problemów trawią białko pochodzące z mleka kóz. Głównym białkiem mleka krowiego, jak i koziego jest kazeina – białko o wysokiej wartości odżywczej zbliżonej do mięsa i znacznie przewyższającej wartość odżywczą nasion roślin strączkowych. Podstawowymi białkami kazeinowymi mleka koziego są β-kazeina, κ-kazeina i αs2-kazeina. Spośród wymienionych frakcji kazeinowych zaznacza się w mleku kóz większy niż w mleku krowim udział β-kazeiny, z wyjątkiem kóz ze słabym wariantem αs1-kazeiny tzw. O, które nie syntetyzują tego alergennego białka [8]. Spośród białek serwatkowych zawartość β-laktoglobuliny jest podobna w mleku obu gatunków zwierząt, natomiast mleko kóz zawiera prawie dwukrotnie więcej α-laktoalbuminy. Analiza proteolizy kazeiny w czasie dojrzewania serów przy zastosowaniu elektroforezy i HPLC pozwala identyfikować sery owcze i kozie produkowane z dodatkiem mleka krowiego [9]. Natomiast zafałszowania mleka polegające na dodatku rozcień- czonego mleka w proszku można szybko wykryć się poprzez określenie stosunku kazeiny CSN do albuminy BSA przy zastosowaniu elektroforezy. 4. Bioaktywne peptydy o właściwościach prozdrowotnych pochodzące z białek mięsa wołowego i mleka 4.1. Endogenne peptydy z białek mięsni szkieletowych Mięso stanowi pożywienie człowieka od najdawniejszych czasów. Już w czasach prehistorycznych podstawę egzystencji ludzi stanowiło mięso zdobywane w trakcie polowań. Około 10-12 tys. lat p.n.e. człowiek postanowił udomowić zwierzęta, w tym bydło, by pozyskiwać z niego mięso i mleko [10]. Mięso charakteryzuje się dużymi wartościami odżywczymi. Jest ważnym źródłem białka, tłuszczu, niezbędnych aminokwasów, minerałów, witamin oraz innych skład- ników odżywczych [11]. Ponadto białka mięsa są endogennym źródłem specyficznych składników bioaktywnych m.in. peptydów, takich jak: karnozyna czy anseryna, które korzystnie oddziaływają na stan zdrowia człowieka [12]. Karnozyna (β-Ala-His) i anseryna (β-Ala-metylo-His) są peptydami endogennymi występującymi w białkach mięśni szkieletowych różnych gatunków zwierząt [13]. W mięśniach bydlęcych pectoralis profundus zindyntyfikowano, że 89% reszt aminokwasowych odpowiada karnozynie, anserynie i glutationowi. Peptydy te wykazują aktywność buforującą oraz antyoksydacyjną. Karnozyna może być aktywatorem enzymów m.in.: kapaliny II, fosforylazy b, czy miofibrylarnej ATP-azy. Odgrywa rolę ochronną przed zmianą barwy mięsa oraz bierze udział w polepszaniu walorów smakowych. Pochodne kwasu glutaminowego powstałe w wyniku hydrolizy białek wołowiny papainą nadają tzw. bulionowy smak potrawom [14]. Zawartość tych peptydów jest tym większa, im mniej chromoprotein występuje w mięsie, tzn. im mięso bielsze, tym więcej zawiera anseryny i karnozyny. Jednymi z pierwszych badaczy, którzy określili poziom tych peptydów w tkankach i wybranych narządach bydła byli Purchas i Busboom [15]. Podają oni, że średnia zawartość karnozyny w mięśniu najdłuższym grzbietu wynosi

Zastosowanie badań proteomicznych w hodowli bydła

432,6 mg/100 g, w półścięgnistym – 452,6 mg/100 g a w trójgłowym ramienia musculus triceps brachii – 299,1 mg/100g. Natomiast w wątrobie stwierdzono, jej zawartość na poziomie 77,5 mg/100 g, a w sercu jedynie 32,6 mg/100 g. Matescu i wsp. [16] wykazali, że płeć bydła rasy Angus nie odgrywa wpływu ani na kształtowanie się poziomu karnozyny, ani anseryny i wynosi u wolców – 370 mg/100 g i jałówek – 367 mg/100 g, a buhajów 366 mg/100 g mięsa dla karnozyny, natomiast dla anseryny poziom jest zbliżony dla wszystkich płci i wynosi średnio 66-67 mg/100 g. Jak podaje Kucińska [17] zawartość tych peptydów w mięśniu półścięgnistym musculus semimembranosus bydła ras mięsnych oscyluje odpowiednio w granicach od 78,2 do 83,6 mg/100g dla anseryny i od 462,5 do 492,4 mg/100 g dla karnozyny. Autorka nie wykazała istotnie statystycznych różnic między próbami mięs pozyskanych od rasy Hereford, Limousine i mieszańców bydła rasy Polskiej Holsztyńsko-Fryzyjskiej z Limousine. Najwyższy poziom anseryny uzyskała w mięsie pozyskanym od rasy Hereford, najmniejszy wystąpił w mięsie rasy Angus Koncentracja karnozyny największa była w mięsie pozyskanym od mieszańców najmniejsza także w mięsie rasy Angus, jak w przypadku karnozyny.

Tabela 1. Wpływ genotypu bydła na kształtowanie się poziomu bioaktywnych di-peptydów w białkach mięsni szkieletowych Dipeptyd Genotyp bydła istotność [mg/100 g] Limousine Hereford Angus PHFxLim Anseryna 78,2 83,6 67,0 81,5 ns Karnozyna 487,2 462,5 366,0 492,4 ns Źródło: Opracowanie własne [Kucińska, 2018]

Z ekstraktów wołowych mięsnia biceps femoris w wyniku hydrolizy przy zastosowaniu termo lizyny i proteinazy A, Jang i Lee [14] wyizolowali kolejny peptyd o sekwencji VLAQYK, który wyróżnia się wysoką aktywnością przeciwnadciś- nieniową krwi. Mleko krów zawiera ponad 20 białek, z których w wyniku hydrolizy enzyma- tycznej uwalniają się peptydy. Wiadomo, że w mleku każde z białek, czy to kazeinowych, czy serwatkowych jest macierzystym źródłem dla wielotysięcznej bazy peptydów, które wykorzystywane są jako komponenty leków, nutraceutyków i kosmetyków ze względu na swoje prozdrowotne właściwości, głównie antybakteryjne [18]. 5. Podsumowanie Badania proteomiczne mają coraz powszechniejsze zastosowanie w hodowli zwierząt gospodarskich, w tym bydła. Są wykorzystywane do genetycznego dosko- nalenia populacji bydła tak użytkowanego w typie mlecznym, jak i mięsnym w celu poprawy wydajności, eksterieru, zdrowia, długowieczności. Najnowsze trendy wskazują na wpływ polimorficznych form białek na skład i parametry technologiczne surowca tj. wołowiny i mleka i interakcję z czynnikami środowiskowymi np. żywieniem.

Beata Kuczyńska, Arkadiusz Budziński, Konrad Wiśniewski, Kamila Puppel

Literatura 1. Płodzich A., Proteomika i jej zastosowanie w wybranych jednostkach chorobowych, J Transf. Med., 2013 6, 2, 48-59. 2. Kossowska B., Dudka I., Gancarz R., Antonowicz-Juchniewicz J. Analiza proteomiczna profili białkowych w niektórych zmianach patofizjologicznych ludzkiego organizmu, Post. Hig. Med. Dośw., 63, 549-563. 3. Kapusta A., Kuczyńska B., Puppel K., Kamaszewski M., The relationship between early stages of lactation and antioxidant capacity of milk and blond plasma of PHF cows, Anim. Sci. Pap. Rep., 2018, 36, 2, 149-158. 4. Puppel K., Kuczyńska B., Nałęcz-Tarwacka T., Gołębiewski M., Sakowski T., Kapusta A., Budziński A., Balcerak M., Effect of supplementation of cows diet with linseed and fish oil and different variants of ß–lactoglobulin on fatty acid composition and antioxidant capacity of milk. J Sci Food Agri, 2016, 96: 2240-2248. 5. Dżugan M., Poziom aktywności N-acetylo-β-D-glukozaminidazy w mleku w stanach patologicznych wymienia, 2002, Przegl. Mlecz 3, 127-129. 6. Brady N., O’Reilly E.L., McComb C., Macrae A.I., Eckersall P.D., An immunoturbidimetric assay for bovine haptaglobulin, Comp. Clin. Path, 2018 doi.org/10.1007/s00580-018-2863-6. 7. Zwierzchowski L., Świtoński M., Genomika bydła i świni, Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, 2009, 194-204. 8. Pastuszko R., Barłowska J., Litwińczuk Z., Alergenność mleka różnych gatunków zwierząt w porównaniu do kobiecego, Post. Hig. Med. Dośw., 2016, 70: 1451-1459. 9. Veloso A.C.A., Teixeira N., Peres A.M., Mendonca A., Ferreira I.M.P.L.V.O., Evaluation of cheese authenticity and proteolysis by HPLC and urea-polyacrylamide gel electrophoresis. Food Chem., 2004, 87, 289-295. 10. Litwińczuk Z., Udomowienie i hodowla zwierząt jako istotny element rozwoju cywilizacji, Przegl. Hod., 2017, 2, 30-32. 11. Biesalski H.K., Meat as a component of a healthy diet- Are there any risks or benefits if meat is avoided in the diet?, Meat Sci, 2005, 70: 509-524. 12. Aihara R., Functional foods. Encyclopedia of meat sciences, Oxford Elsevier, 2004, 492-499. 13. Łukasiewicz M., Puppel K., Balcerak M., Slósarz J., Gołębiewski M., Kuczyńska B., Batorska M., Więcek J., Kunowska-Slósarz M., Popczyk B., Variability of anserine and carnosine concentration In the Wild boar (Sus scrofa scrofa) meat, Anim Sci Pap Rep, 2018, 36, 2: 185-192. 14. Jang A., Lee M., Purification and identification of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from beef hydrolysates, Meat Sci., 2005, 69, 4, 653-666. 15. Purchas R.W., Busboom J., The effect of production system and age on levels of iron, taurine, carnosine, coenzyme q(10), and creatine in beef muscles and liver, Meat Science, 2005, 70: 589-596. 16. Mateescu R.G., Garmyn A.J., O'Neil M.A., Tait R.G., Abuzaid Jr.A., Mayes M.S., Garrick D.J., Van Eenennaam A.L., VanOverbeke D.L., Hilton G.G., Beitz D.C., Reecy J.M. Genetic parameters for carnitine, creatine, creatinine, carnosine, and anserine concentration in longissimus muscle and their association with palatability traits in Angus cattle. J Anim Sci, 2012, 90, 12: 4248-4255. 17. Kucińska K., Wpływ genotypu na kształtowanie się jakości odżywczej i prozdrowotnej mięsa wołowego, Praca magisterska SGGW, 2018, 1-41. 18. Król J., Brodziak A., Białka mleka o właściwościach antybakteryjnych, Probl Hig Epidemiol, 2015, 96 (2): 399-405.

Zastosowanie badań proteomicznych w hodowli bydła

Zastosowanie badań proteomicznych w hodowli bydła Streszczenie Proteomika jest nauką zajmującą się proteomem, czyli komponentami białkowymi kodowanymi przez genom. Po raz pierwszy termin ten został podany i zastosowany przez Wilkinsa 25 lat temu. Każde badanie proteomiczne można podzielić na 3 etapy. Pierwszy to pozyskanie referencyjnych próbek materiału biologicznego i ich przygotowanie do analiz, drugi to właściwa analiza profilu białkowego badanych prób, a trzeci to interpretacja i analiza otrzymanych i zebranych danych. Wyniki badań proteomicznych są szeroko wykorzystywane w wielu aspektach pracy hodowlanej. W pracy opisano wybrane możliwości ich zastosowania np. w aspekcie diagnozowania schorzeń bydła czy oszacowania wpływu polimorfizmu białek na jakość surowca. Słowa klczowe: proteomika, bydło

Application of proteomics in cattle breeding Abstract Proteomics is a branch of scientific research focused on the study of proteome for instance a genome- encoded protein components. The term proteomic was coined and first user by Wilkins 25 years ago. In each proteomic studies were three main phases: 1-collection and preliminary testing of biological material, 2-protein profile analysis and 3-interpretation of results. The results of proteomics research are widely used in many aspects of breeding work. The paper describes selected possibilities of their use, for instance in the aspect of diagnosis of cattle diseases or estimation of the impact of protein polymorphisms on the quality of the raw material. Keywords: proteomic, cattle breeding

Sylwia Kłys1, Anna Czech

Produkcja trzody chlewnej jako źródło pierwiastków biogennych w środowisku

1. Wstęp Produkcja mięsa stanowi jedno z głównych źródeł dochodów sektora rolniczego. Produkt ten jest podstawowym składnikiem diety Polaków a konsumpcja mięsa wieprzowego w roku 2000 stanowiła 59%, w 2010 wynosiła 57,3%, natomiast w 2017 roku spadła do poziomu 51,2%. Dokonując analizy produkcji wieprzowiny na świecie w latach 2001-2017, widoczna jest tendencja wzrostowa na poziomie 1,75%, trend ten także został zaobserwowany w krajach Unii Europejskiej. Inaczej jednak zachowała się rodzima produkcja, która w tym czasie zmniejszała się w tempie 0,7% rocznie. Przyczyną tego zjawisko było rosnące tempo wzrostu importowanego mięsa, które w latach 2001-2008 wynosiło 32% rocznie, a w okresie 2009-2017 stanowiło 3,1% [1]. W celu zaspokojenia potrzeb żywieniowych ludzi nastąpiła intensywnej produkcji zwierzęcej, która nie jest obojętna dla środowiska naturalnego [2]. Konsekwencją produkcji zwierzęcej jest duża emisja zanieczyszczeń gazowych w tym odorów, a zwłaszcza amoniaku [3]. Ogólna emisja tego gazu pochodzącego z sektora rolniczego wynosi ok. 90%, z czego ok.70% pochodzi z budynków, w których prowadzony jest chów zwierząt [4-7]. Za tak wysoką emisję odpowiedziane są sposoby i systemy utrzymania zwierząt, a także sprawność systemu wentylacyjnego znajdującego się w budynkach inwentarskich. Biorąc pod uwagę te czynniki emisja może stanowić 10-20% pierwotnej wartości azotu w odchodach [8]. Kolejnym źródłem tak wysokiej emisji amoniaku jest nieodpowiedni sposób magazynowania i składowania odchodów zwierząt. Jest to uzależnione od wielu czynników, do których należą m.in. sposoby układania oraz formowania pryzm z obornikiem, powierzchnia przechowywania odchodów, szczel- ność zbiornika oraz kanałów odprowadzających gnojowicę do tego zbiornika, a także zawartość „azotu” w diecie zwierząt. Emisja amoniaku z tego źródła stanowi około 2-30% zawartości azotu znajdującego się w odchodach określanej przed procesem magazynowania [9]. Polska, przystępując do Protokołu z Geteborga zobowiązała się do redukcji emisji amoniaku o 1% każdego roku tak by w 2020 emisja wynosiła nie więcej niż 267,3 tys. ton rocznie [8]. Amoniak jest gazem odorowym, który przy stężeniu 10 ppm jest łatwo wyczu- walny. Natomiast, gdy jego stężenie wzrośnie do 100 ppm węch przestaje na niego reagować. Nie niweluje to jednak jego silnych właściwości trujących [10]. Gaz ten charakteryzuje się dużą uciążliwością dla społeczności lokalnej, a także wpływa negatywnie na zdrowie ludzi. Z powodu wysokiej jego emisji, a także ze względu na uciążliwość zapachową hodowcy trzody chlewnej powinny podjąć działania mające na celu ograniczenie emisji tego gazu z każdego wyżej wymienionego źródła [11].

1 Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Katedra Biochemii i Toksykologii.

Produkcja trzody chlewnej jako źródło pierwiastków biogennych w środowisku

2. Wpływ „białka paszowego” na powstanie związków odorowych Podczas układania dawki pokarmowej dla świń należy zwrócić uwagę na odpo- wiednią ilość i stosunek do siebie aminokwasów egzogennych tj. lizyny, metioniny, cystyny, treoniny i tryptofanu. W przypadku świń stosunek ten powinien wynosi 100:32:64:19 [12]. Aminokwasy, które nie zostaną wykorzystane przez organizm m.in. do budowy mięśni zostają wydalane w odchodach, gdzie podczas rozkładu z udziałem bakterii beztlenowych powstają związki zapachowe o nieprzyjemnej woni (odory). Każdy z tych aminokwasów znajdujący się w odchodach jest odpowiedzialny za powstanie innych związków odorowych. Treonina i tryptofan determinują powstanie inoli, statoli i fenoli. Metionina odpowiedzialna jest za obecność w powietrzu siarkowodoru, natomiast cystyna z benzaldehyd, determinują występowanie amoniaku. Z tego powodu nadmiar białka w paszy nie jest wskazany, a straty cennych amino- kwasów w odchodach powodują zmniejszenie opłacalność produkcji z uwagi na koszty, jakie zostają poniesienie w momencie zadawania zwierzętom bogatej w białko paszy [11]. Pasze o niezbilansowanym składzie aminokwasowym są wzbogacane w niektóre aminokwasy egzogenne w postaci krystalicznej. O składzie tych dodatków paszowych decyduje głównie wiek zwierząt, ponieważ zapotrzebowanie jest zróżnicowane [11]. Cho i in. [13] wykazali, że podawanie paszy wzbogacanej w lizynę, treoninę i tryptofan o zawartości białka ogólnego 16% wpływa na redukcję emisji amoniaku o 26% w stosunku do zadawania paszy o zawartości białka ogólnego na poziomie 19,5%. W tych badaniach zaobserwowano również redukcję emisji siarkowodoru o 28,3%, a także merkaptanów o 12,7%. Pociągnęło to jednak za sobą obniżenie efektów produkcyjnych a konkretnie spadek przyrostów masy ciała prosiąt. W przypadku tuczników coraz częściej stosuje się metodę żywienia cztero- fazowego. Dzięki zastosowaniu tej metody można zapewnić zwierzętom odpowiednią ilość białka, jaką są w stanie wykorzystać, a także zredukować ilość azotu, co wpływa na ograniczenie powstawania związków odorowych. Stosowanie mieszanek o mniejszej ilość białka, ale o optymalnym składzie aminokwasowym przynosi najlepsze wyniki w pierwszej fazie tuczu. Zadawana pasza wzbogacona w dodatki amino- kwasów egzogennych zapewnia ich potrzeby żywione, tym samym wpływa na efektywniejszy wzrost tuczu. Należy także pamiętać, aby komponując mieszankę paszową wzbogacić ją o dodatki, które przyczyniają się do lepszej strawność białka. Dzięki temu białko zostanie wykorzystane w organizmie a ilość związków azotowych w odchodach będą znacznie mniejsze. Zmniejszając tym samym powstawanie amoniaku i gazów odorowych [11]. Taką zależność potwierdzili Hayesa i in. [14], którzy wykazali, że stosując u tuczników w ostatniej fazie tuczu pasze o różnej ilości białka tj. 130, 160, 190 i 220 g/kg, najlepsze efekty zarówno produkcyjne, jak i chroniące środowisko można uzyskać przy niższych poziomach białka. Najwyższą ilość związków odporowych odnotowano stosując mieszankę o zwartości białka -1 190 g/kg i wynosiła ona 115,8 oue /1SD. Natomiast stosując mieszankę o zawartości białka na poziomie 160 g/kg odnotowano spadek ilości związków odorowych o 31% -1 (80,03 oue /1SD). Przy najmniejszej zawartości białka w mieszance spadek ten -1 wyniósł 33% (77,64 oue /1SD). Należy jednak zaznaczyć, że przy zastosowaniu mieszanki z ilością białka na poziomie 220 g/kg ilość odorów była niższa niż w przy zastosowaniu mieszanki z 190 g/kg białka, co Hayesa i in. [14] tłumaczą zachowaniem równowagi C:N lub niewystarczającą ilością węglowodanów.

Sylwia Kłys, Anna Czech

3. Wpływ żywienia świń na wykorzystanie pierwiastków biogennych Zbilansowanie mieszanki paszowej ma na celu dostosowanie podawanej paszy do potrzeb zwierząt, co prowadzi do lepszego wykorzystanie składników pokarmowych ograniczając tym samym ich ilość w odchodach. U świń na wykorzystanie składników pokarmowych wpływa głównie wiek zwierząt w przypadku azotu. Wartość ta waha się w przedziale 18% u prosiąt i 47% u warchlaków. Na wykorzystanie azotu w organizmie zwierząt wpływa również faza cyklu rozrodczego, ponieważ lochy w okresie laktacji mają większe zapotrzebowanie na składniki pokarmowe niż w okresie pozalaktacyjnym [15]. W przypadku tuczników można zmniejszyć wydalanie azotu o 30% poprzez wzbogacenie dawki pokarmowej o aminokwasy egzogenne [16]. Dach i Zbytek [17] wykazali, że mieszanka wysokobiałkowa dla świń przyczynia się do wzrostu emisji amoniaku z obornika do środowisk, która wynosiła 5,0 kg t-1 s.m, natomiast przy diecie niskobiałkowej 2,65 kg t-1 s.m. Inaczej przedstawia się przyswajalność innego pierwiastka biogennego, czyli fosforu oraz innych składników mineralnych u zwierząt monogastrycznych. Ograni- czenie ich wykorzystania z pasz roślinnych jest determinowane przez występowanie fosfor w postaci fitynowej, która również łączy chelatowo inne składniki mineralne tworząc fityniany. Taka forma jest trudno dostępna dla zwierząt monogastrycznych. Dlatego mieszanki paszowe, które są dodatkowo wzbogacone w fosfor i inne składniki mineralne są potencjalnym źródłem tych składników w odchodach. Fityniany w przewodzie pokarmowy tworzą kompleks białkow-fitynianowy, który zmniejsza przyswajanie nie tylko składników mineralnych, ale również białka, a tym samym dodatkowo przyczynia się do zwiększenia ilości związków azotowych w odchodach. Z tego powodu mieszanki paszowe dla świń powinny być wzbogacone o enzym fitazę. Fitaza mikrobiologiczna zwiększa przyswajalność fosforu i zmniejsza wydalanie tego biogenu o 25-50%. Enzym fitazy wpływa, także na lepsze wykorzystanie amino- kwasów, cukrów oraz tłuszczów, co zwiększa efektywność produkcji [18, 19]. Badania Czech i Greli [20] wskazują, że dodatek fitazy mikrobiologiczne w ilość 500 UP kg-1 w mieszankach dla loch w okresie laktacji zwiększa strawność białka ogólnego oraz wpływa korzystnie na profil aminokwasów w tkankach. Zależność ta została, także potwierdzona przez Adeol i Sands [21] w badaniach dotyczących loch oraz przez Kemme i in. [22] w badaniach na tucznikach. W związku z powyższym źle zbilansowana mieszanka paszowa pod kątem zawartości białka (główne źródło azotu) oraz fosforu jest źródłem ok. 60-80% tych biogenów w środowisku, co stanowi duże zagrożenie dla całego ekosystemu [2]. 4. System utrzymania zwierząt a ilość biogenów w odchodach W chowie świń zastosowanie ściółki, podłóg rusztowych lub systemu alkierzowego wpływa na behawior zwierząt, ale także na emisję niekorzystnych zanieczyszczeń gazowych w tym amoniaku [23]. Zastosowanie ściółkowego systemu utrzymania zwierząt, w którym obornik zawiera więcej stałej materii organicznej, wyższą temperaturę odpowiadającą za mniej korzystne warunki rozwoju dla mikroorganizmów chorobotwórczych, powoduje mniejszą degradację środowiska naturalnego niż chów bezściółkowy [24, 25]. W magazynowanym oborniku dochodzi do przemian azotu głównie w procesie amonifikacji oraz po zetknięciu z glebą w procesie nitryfikacji

Produkcja trzody chlewnej jako źródło pierwiastków biogennych w środowisku i denitryfikacji. Efektywność tych procesów zależy od czynników fizycznych i chemicznych. Zachodzą one przy współudziale ureazy oraz mikroflory znajdującej się w odchodach zwierząt, co wpływa na jakość nawozową obornika. Szybka faza termofilna przy stosunku C:N (40-50:1) powoduje powstanie wolnodziałających organicznych połączeń pierwiastków biogennych. Niewłaściwy stosunek C:N w odchodach powoduje szybką mineralizację i słabsze zatrzymanie azotu w glebie [25, 26]. Na emisję amoniaku z obornika mają istotny wpływ czynniki fizyczne tj. temperatura, światło, wentylacja i in. Wpływ temperatury na ilość amoniaku potwierdził Krawczyk [31], który wskazał, że emisja amoniaku z obornika była o ponad 75% w wyższych temperaturach w porównaniu do temperatury niższej. Bardziej niekorzystny dla środowiska jest bezściółkowy system utrzymanie zwierząt, w którym wytwarzane są duże ilości gnojowcy [27]. Jest to mieszanina kału, moczu, resztek pokarmu oraz wody stosowanej do utrzymania odpowiedniej higieny urządzeń odprowadzających odchody [27, 16]. Przyjmuje się, że w gnojowicy stosunek kału do moczu wynosi 40:60 [28]. Głównym czynnikiem, który determinuje ilość wytwarzanej gnojowicy jest liczba zwierząt w chlewni. Szacuje się, że jedna świnia wytwarza taka ilość odchodów, która odpowiada 7% jej masy ciała. Stanowi to w przypadku tuczników 1,9 m3/rok, natomiast u loch jest to ok. 4,9 m3/rok. Gnojowica jest nawozem wysoko skoncentrowanym (8-10% s.m.) o bogatym składzie mineral- nym (średnio: azot-0,6%, fosfor -0,2%, potas -0,2%, magnez -0,05%), którego jakość zależny od technologii produkcji, sposobu żywienie, ilości zużytej wody, a także wieku zwierzęta. Należy również wspomnieć, że w skład gnojowicy wchodzą również zanieczyszczenia mikrobiologiczne co nie jest obojętne dla środowiska [29]. Czop [30] wykazała, że ilość pierwiastków biogennych w tym azotu w gnojowicy istotnie zależy od czasu jej przechowywania tzn. im dużej przechowywana jest gnojowica tym ilość azotu jest mniejsza i sięga nawet 60% w ciągu 90 dni. Ilość fosforu po upływie takiego czasu magazynowania również spada nawet do 80% jego zawartości w materiale pierwotnym. Zatem w trakcie magazynowania dochodzi do strat zawar- tości pierwiastków biogennych, co jest związane m.in. z warunkami pogodowymi w tym temperaturowymi. 5. Wpływ amoniaku na środowisko Intensywne utrzymywanie świń ma znaczący wpływ na środowisko naturalnej w tym na jakość wody, gleby, powietrza oraz na biologiczną różnorodność [32]. Emisja amoniaku wpływa głównie na wzrost zakwaszania biosfery. Gaz ten w naj- większych ilościach jest uwalniany z ferm świń i drobiu. W przypadku świń roczna produkcja amoniaku wynosi 5,1 kg/sztukę [33]. Amoniak jest gazem dobrze rozpusz- czanym w parze wodnej i charakteryzuje się silnymi właściwościami utleniającymi. Około 20% azotu pochodzącego z amoniaku opada na powierzchnie gleby. Obserwo- wane jest to szczególnie na obszarze w promieniu 1-2 km od gospodarstw hodowlanych. Na glebach, w których występuje niewielka pojemność buforowa, zbyt duża ilość azotu powoduje ich zakwaszenie. Wpływa to na wzrost rozpuszczalności azotu i jego przemieszczanie. Amoniak wywiera także wpływ na wegetację roślin oraz zaburza proces fotosyntezy i oddychania [34]. W glebie podczas dobrego natlenianie dochodzi do procesu nitryfikacji, natomiast w warunkach o obniżonej dostępności

Sylwia Kłys, Anna Czech tlenu do denitryfikacji [35]. Kolejnym negatywnym skutkiem obecności nadmiaru azotu w środowisku jest eutrofizacja, czyli przeżyźnienie ekosystemów [36]. Do procesu eutrofizacji dochodzi nie tylko z nadmiaru azotu, ale także fosforu. Niewykorzystana ilość tego pierwiastka przez rośliny rozpuszcza się w wodzie do form fosforowych, które z opadami przedostają się do cieków wodnych gdzie stymulują proces eutrofizacji [37]. Zarówno zakwaszenie, jak i eutrofizacja zaburzają ekosystemy oraz powodują degradację środowiska naturalnego [36] 6. Posumowanie Ograniczenia amoniaku do atmosfery powinny zostać zmniejszanie nie tylko z uwagi na zobowiązania prawne, ale przede wszystkim na konsekwencje dla środowiska naturalnego. Obserwowane zakwaszenie oraz eutrofizacja ekosystemu wymusza zastanowienie się społeczność nad bezpośrednimi przyczynami, do których zaliczamy przedostawanie się do ekosystemów pierwiastków biogennych takich jak azot i fosfor. Źródłem tych pierwiastków są odchody zwierząt, które posiadają kilka dróg emisja do środowiska naturalnego między innymi nawożenie gruntów nawozami naturalnym. Zbyt duże ilości w odchodach tych pierwiastków związane są z zadawaniem źle zbilansowanej paszy zwierzętom. Literatura 1. Stańko S., Mikuła A., Zmiany na rynku mięsa wieprzowego w Polsce w latach 2001- 2017, Problems of World Agriculture/Problemy Rolnictwa Światowego, 19 (1827- 2019-3013), 2019, 174-185. 2. Golas Z., Kozera M., Ekologiczne konsekwencje koncentracji produkcji trzody chlewnej, Journal of Agribusiness and Rural Development, 01 (07), 2008, 29-42. 3. Kołodziejczyk T., Jugowar J.L., Piotrkowski M. Emisja odorów z kurników, Problemy Inżynierii Rolniczej, 19, 2011, 135-141. 4. Gay S.W., Knowlton K.F., Ammonia emissions and animal agriculture,Virginia Cooperative Extension. Publication, 2005, 442-110. 5. Mroczek J.R., Redukcja emisji amoniaku pochodzącego z produkcji zwierzęcej jako element ekorozwoju rolnictwa, Zeszyty Naukowe Południowo-Wschodniego Oddziału Polskiego Towarzystwa Inżynierii Ekologicznej i Polskiego Towarzystwa Gleboznawczego, (7), 2006, 63-68. 6. Reidy B., Rhim B., Menzi H., A new Swiss inventory of ammonia emissions from agriculture based on a survey on farm and manure management and farm-specific model calculations, Atmospheric Environment, 42(14), 2008, 3266-3276. 7. Sotiropoulou R.E.P., Tagaris E., Pilinis C., An estimation of the spatial distribution of agricultural ammonia emissions in the Greater Athens Area, Science of the Total Environment, 318(1-3), 2004, 159-169. 8. Marcinkowski T., Emisja gazowych związków azotu z rolnictwa, Woda-Środowisko- Obszary Wiejskie, 10, 2010, 175-189. 9. Pietrzak S., Metoda inwentaryzacji emisji amoniaku ze źródeł rolniczych w Polsce i jej praktyczne zastosowanie,Woda-Środowisko-Obszary Wiejskie, 6, 2006, 319-334. 10. Myczko A., Wymogi prawne w zakresie ochrony środowiska w produkcji trzody chlewnej, [w:] Prowadzenie i rozwój gospodarstw specjalizujących się w produkcji żywca wieprzowego w aspekcie racjonalizacji wykorzystania podstawowych czynników produkcji i zgodnie z wymogami UE. POLnet, ADT Projekt, PIWet, Poznań, 2005, 72-84.

Produkcja trzody chlewnej jako źródło pierwiastków biogennych w środowisku

11. Kunowska-Ślósarz M., Gurdała J., Gołębiewski M., Przysucha T., Metody zmniejszania emisji odorów w budynkach inwentarskich i ich otoczeniu, Wiadomości Zootechniczne, 54(1), 2016, 118-126. 12. Buraczewski S., Żywienie zwierząt i paszoznawstwo, Wydawnictwo PWN, Warszawa 2004, 55. 13. Cho J.H., Chen Y.J., Min B.J., Yoo J.S., Wang Y., Kim I.H., Effects of reducing dietary crude protein on growth performance, odor gas emission from manure and blood urea nitrogen and IGF‐1 concentrations of serum in nursery pigs,Animal Science Journal, 79(4), 2008, 453-459. 14. Hayes E.T., Leek A.B.G., Curran T.P., Dodd V.A., Carton O.T., Beattie V.E., O’Doherty J.V., The influence of diet crude protein level on odour and ammonia emissions from finishing pig houses, Bioresource Technology, 91(3), 2004, 309-315. 15. Smurzyńska A., Dach J., Czekała W., Technologie redukujące emisje uciążliwych gazów powstających podczas chowu zwierząt gospodarskich, Inżynieria Ekologiczna, 47, 2016, 189-198. 16. Potkanski A., Sapek A., Możliwości ograniczania zanieczyszczania wody związkami azotu i fosforu w wyniku zmian sposobu żywienia zwierząt, Postępy Nauk Rolniczych, 44(6), 1997, 83-91. 17. Dach J., Zbytek Z., Wpływ wysokobiałkowego żywienia trzody na wielkość emisji amoniaku z kompostowanego obornika, Journal of Research and Applications in Agricultural Engineering, 53(3), 2008, 48-52. 18. Czech A., Efektywność fitazy w żywieniu zwierząt, Medycyna Weterynaryjna, 63(9), 2007, 1034-1039. 19. Knowlton K.F., Radcliffe J.S., Novak C.L., Emmerson D.A., Animal management to reduce phosphorus losses to the environment, Journal of Animal Science, 82(13), 2004, 173-195. 20. Czech A., Grela E.R., The influence of microbial phytase on the total and ileal digestibility of amino acids and their content in sow carcasses, Roczniki Naukowe Zootechniki, 31(1), 2004, 67-76. 21. Adeola O., Sands J.S., Does supplemental dietary microbial phytase improve amino acid utilization? a perspective that it does not, Journal of Animal Science, 81(14), 2003, 78-85. 22. Kemme P.A., Jongbloed A.W., Mroz Z., Kogut J., Beynen A.C., Digestibility of nutrients in growing – finishing pigs is affected by Aspergillus niger phytase, phytate and lactic acid levels: 1. Apparent ileal digestibility of amino acids. Livestock Production Science, 58(2), 1999, 107-117. 23. Sommer S.G., Søgaard H.T., Møller H.B., Morsing S., Ammonia volatilization from sows on grassland, Atmospheric environment, 35(11), 2001, 2023-2032. 24. Krawczyk W., Walczak J., Potencjał biogenny obornika jako źródło emisji amoniaku i zagrożenia środowiska, Roczniki Naukowe Zootechniki, 37(2), 2010, 187-193. 25. McCrory D.F., Hobbs P.J., Additives to reduce ammonia and odor emissions from livestock wastes, Journal of Environmental Quality, 30(2), 2001, 345-355. 26. Goyal S., Dhull S.K., Kapoor K.K., Chemical and biological changes during composting of different organic wastes and assessment of compost maturity, Bioresource Technology, 96(14), 2005, 1584-1591. 27. Suresh A., Choi H.L., Oh D.I., Moon O.K., Prediction of the nutrients value and biochemical characteristics of swine slurry by measurement of EC – Electrical conductivity, Bioresource Technology, 100(20),2009, 4683-4689. 28. Smurzyńska A., Czekała W., Kupryaniuk K., Cieślik M., Kwiatkowska A., Typy i właściwości gnojowicy oraz możliwości jej zagospodarowania, Problemy Inżynierii Rolniczej, 4(94), 2016, 117-127.

Sylwia Kłys, Anna Czech

29. Marszałek M., Banach M., Kowalski Z., Wpływ gnojowicy na środowisko naturalne- potencjalne zagrożenia, Journal of Ecology and Health, 15, 2011, 66-70. 30. Czop M.,Potencjał biogenny odpadów z hodowli trzody chlewnej, Archiwum Gospodarki Odpadami i Ochrony Środowiska, 13(3), 2011, 53-64. 31. Krawczyk W., Wpływ warunków przechowywania obornika loch na przebieg procesów jego dekompozycji i emisję amoniaku, Wiadomości Zootechniczne 56(2), 2018, 16-22. 32. Szymanska E., Produkcja żywca wieprzowego w zrównoważonym rozwoju rolnictwa, Zagadnienia Ekonomiki Rolnej, 3, 2012, 89-103. 33. Olendrzyński K., Dębski B., Skośkiewicz J., Kargulewicz I., Cieślińska J., Fudała J., Hławiczka S., Cenowski M., Inwentaryzacja emisji do powietrza SO2, NO2, NH3, CO, pyłów, metali ciężkich, NMLZO i TZO w Polsce za rok 2003, Instytut Ochrony Środowiska. Warszawa – Krajowe Centrum Inwentaryzacji Emisji, 2005, 22-23. 34. Vitousek P.M., Howarth R.W., Nitrogen limitation on land and in the sea: how can it occur?, Biogeochemistry, 13(2), 1991, 87-115. 35. Yamulki S., Joscelyne P., Jarvis S.C., Sapek B., Pietrzak S., Effects of soil pH and application of nitrogen fertilisers on emissions of nitrogen oxides from grassland. The Janki experiment. Effects of liming and nitrogen fertilizer application on soil acidity and gaseous nitrogen oxide emissions in grassland systems, 2000, 54-600. 36. Lisowska-Mieszkowska E., Kontrola i ograniczanie emisji amoniaku ze źródeł rolniczych. Działania podejmowane na forum międzynarodowym, Ekonomia i Środowisko, 3 (50), 2014, 108-120. 37. Mroczek J.R., Mięso wieprzowe w zrównoważonej gospodarce żywnościowej, Polish Journal for Sustainable Development, 19, 2015, 83-90.

Produkcja trzody chlewnej jako źródło pierwiastków biogennych w środowisku Streszczenie W chowie trzody chlewnej bardzo ważne jest wykorzystanie mieszanek paszowych o prawidłowo zbilansowanej zawartości składników pokarmowych w tym przede wszystkim białka i fosforu. Źle zbilansowana mieszanka może prowadzić do obniżenia efektywności tuczu czy też do dużych strat związanych z wydalaniem z organizmu, składników niewykorzystanych przez zwierzę, do których należą m.in. pierwiastki biogenne, jakimi są azot i fosfor. Z jednej strony stanowią one wartość nawozową jednak ich nadmiar wpływa negatywnie na środowisko naturalne powodując jego zakwaszenie, a także eutrofizację ekosystemów. Ponadto w procesie magazynowanie odchodów powstają gazy odorowe bardzo uciążliwe dla społeczności lokalnej. Zatem znając przyczyny negatywnych oddziaływań na środowisko należy podjąć działania ograniczające ich wydalanie koncentrując się głównie na odpowiednim bilansowaniu mieszanek paszowych, a także zachowaniu dobrej praktyki rolniczej. Słowa kluczowe: pierwiastki biogenne, azot, fosfor, białko, trzoda chlewna

Swine production as a source of biogenic elements in the environment Abstract In pig farming, it is very important to use compound feed with a properly balanced content of nutrients, primarily protein and phosphorus. It may be a technology that allows you to reduce efficiency and make it more efficient from the body, not used by an animal, to which, among others, nutrients such as nitrogen and phosphorus. On the one hand, ensure this value, but their excess influence on the natural environment, causing its acidification, as well as eutrophication of ecosystems. In addition, odor gases are very burdensome to the community in the process of storing manure. This is knowing the causes of negative environmental impacts, as well as maintaining good agricultural practices. Keywords: biogenic elements, nitrogen, phosphorus, protein, swine

Anna Wilczyńska1, Jerzy Ziętek, Michał Jabłoński, Sylwia Sajdak

Analiza cytologiczna rozmazu z hemolimfy Cornu aspersum i Cepaea nemoralis

1. Wprowadzenie Obecnie duże zainteresowanie budzi wykorzystanie pierwotnych form życia, takich jak bezkręgowce w celach tworzenia innowacyjnych technologii. Biologia tych zwierząt chodź wydaje się już dobrze znana cały czas jednak powstają nowe odkrycia. Postęp technologii badawczej pozwolił na dokładniejsze poznanie ich anatomii, fizjologii, a także odkrycie dokładnego przebiegu niektórych procesów oraz ich funkcji. Mięczaki w tym ślimaki obecnie wykorzystywane są do produkcji żywności. Spożywanie owadów oraz mięczaków w wielu kulturach jest powszechne. Zwierzęta te są dobrym źródłem pożywienia a ich hemolimfa jest wykorzystywana w przemyśle kosmetycznym. W związku, z coraz szerszym wykorzystaniem bezkręgowców należy odpowiednio zadbać o hodowle przemysłowe zwierząt. Badanie krwi u ssaków jest często wykonywane, dostarcza wiele cenny informacji na temat stanu zdrowia zwierzęcia. Opraco- wanie wytycznych dla zdrowych ślimaków, czyli analiza cytologiczna oraz zakres norm biochemicznych hemolimfy umożliwi proste i szybkie określanie stanu hodowli [1]. Istotne nie tylko z punktu widzenia bezpieczeństwa produktów pochodzących od tych zwierzą, ale także oceny ich dobrostanu i zdrowia. 1.1. Taksonomia oraz opis gatunków Brzuchonogi (ślimaki) (Gastopoda) należą do dużej grupy zwierząt nazywanych bezkręgowcami. Wśród nich znajduje się wiele typów zwierząt jednak największe tworzą mięczaki (Molusca) oraz stawonogi (Arthopoda). Do mięczaków należą również Jednopłytkowce (Monoplacophora), Wielopłytkowce (Polyplacophora), Tarczkonogi (Caudofoveata), Bezpłytkowce (Aplacophora), Brzuchonogi (Gastro- poda), Małże (Bivalvia), Łódkonogi (Scaphopoda), Głowonogi (Cephalopoda). Domena: eukarionty Królestwo: zwierzęta Typ: mięczaki Podtyp: muszlowce Gromada: ślimaki (Gastopoda) Podgromada: płucodyszne Rząd: trzonkooczne Nadrodzina: Helicoidea Rodzina: ślimakowate Rodzaj: Cepaea Gatunek: Cepaea nemoralis Rodzaj: Cornu Gatunek: Cornu aspersum

1 Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Katedra Epizotiologi i Klinika Chorób Zakaźnych.

Anna Wilczyńska, Jerzy Ziętek, Michał Jabłoński, Sylwia Sajdak

1.2. Charakterystyka gatunku Cornu apsersum Muller Cornu aspersum Muller jest rozpowszechniony na całym świecie. Zajmuje bardzo zróżnicowane środowisko, tak jak Cepaea nemoralis jest gatunkiem synantropijnym. Można spotkać go na torfowiskach lub glebach leśnych jednakże nie występuje na łąkach. Powszechnie spotykaną odmianą barwną jest muszla żółta, brązowa lub szaro- brązowa o karbowanej powierzchni. Ich wielkość sięga do 30 mm (15-25 mm lub 29-33 mm). Wysokość do 35 mm (15-25 mm lub 32-38 mm) szerokości. Jest gatunkiem jadalnym, z uwagi na łatwość prowadzenia hodowli użytkuje się go od czasów starożytnych. Współcześnie hodowla przebiega w gospodarstwach specjalistycznych zwanych helikulturami. Ślimaki utrzymywane są w systemie zamkniętym (w pomieszczeniach) lub półotwartym (rozród, inkubacja i odchów młodocianych osobników w pomieszczeniach, tucz osobników dorosłych na specjalnie zabezpie- czonych polach). Pozyskuje się od nich mięso, jaja (kawior ślimaczy) i śluz używany w kosmetologii. Z uwagi na potrzebę poznania jego fizjologii, głównie w aspekcie weterynaryjnym bywa coraz częstszym obiektem badań. 1.3. Charakterystyka gatunku Cepaea nemoralis Popularnie występujący ślimak lądowy, dlatego też stanowi dobry obiekt do badań ekologicznych. Gatunek ten spotkany jest w Europie Zachodniej oraz środkowej, a także w Skandynawii, wyspach Brytyjskich oraz półwyspie Iberyjskim i Apenińskim. Nie ma dużych wymagań środowiskowych, znajduje się w lasach liściastych, a także terenach piaszczystych. Wstężyk gajowym jest gatunkiem o dużym polimorfizmie muszli, posiada szeroką odmianę barwną głównie żółty, różowy lub brązowy i prążki do pięciu ciemnych pasm czasami łączonych razem. Szerokość wynosi muszli 17- 20 mm, a średnica 22-25 mm. Jest to gatunek jadalny, choć spożywany jest rzadko. Z uwagi na duże zróżnicowanie kolorystyczne muszli i łatwość hodowli służy niekiedy do badań genetycznych. Jest cennym źródłem pokarmu dla wielu gatunków ptaków, choć bywa także szkodnikiem upraw [2]. 1.4. Hemolimfa Większość mięczaków posiada układ krwionośny otwarty. Charakteryzuje się on sercem składającym się z komory i jednego lub dwóch przedsionków. Hemolimfa stanowi płyn tkankowy wypełniający podobną rolę jak krew u kręgow- ców takie jak dostarczanie tlenu oraz składniki odżywcze, a także zbierając zbędne metabolity przemiany materii oraz neutralizuje substancje toksyczne; u ślimaków dodatkowo spełnia funkcję szkieletu hydrostatycznego. W około 85% składa się z wody; pozostałe składniki to aminokwasy, polipeptydy, białka tłuszcze oraz sole mineralne. Posiada charakterystyczny błękitny kolor, który jest spowodowany zawar- tymi w niej barwników oddechowych: hemocyjaniny, chlorokruiryny lub hemoerytryny. Barwnik oddechowy w przypadku większości mięczaków – hemocyjanina jest rozpuszczony bezpośrednio w osoczu, brak jest specjalnie wytworzonych w tym celu komórek analogicznych do erytrocytów u kręgowców. Elementy morfotyczne znajdujące się w hemolimfie nazywane są hemocytami. Brak do tej pory ich jasnej klasyfikacji i nazewnictwa. Ze względu na jedną z ich funkcji bywają w literaturze nazywane także fagocytami ze względu na typ poruszania się niektórych ich rodzajów

Analiza cytologiczna rozmazu z hemolimfy Cornu aspersum i Cepaea nemoralis amebocytami, jednakże najczęściej są one opisywane, jako wspomniane hemocyty. Wywodzą się z różnych tkanek płaszcza, zatok jam ciała, w przypadku najbardziej złożonych mięczaków także jak głowonogi (Cephalopoda) są wytwarzane w specjal- nym narządzie hematopoetycznym w postaci ciała białego (white body). Oprócz hemocytów krążących w hemolimfie u mięczaków funkcjonują także komórki osiadłe (permanently fixed cells), komórki siateczkowe i komórki nabłonka wyścielającego jelito środkowe i zatoki ciała i spełniają one podobną do hemocytów funkcje, jaką jest udział w procesach odpornościowych, głównie poprzez fagocytozę. Sam proces ma charakter fagocytozy immunologicznej, gdyż bierze w niej udział układ oksydazy polifenolowej i lektyny. Większe obiekty ulegają procesowi nodulacji lub inkapsulacji. Z uwagi na dużą różnorodność typów komórek, wysoką zmienność morfologiczną oraz z dużym podobieństwem poszczególnych rodzajów komórek istnieją duże trudności z dokładną klasyfikacją hemocytów u mięczaków. Jedynym z kryteriów jest funkcja poszczególnych rodzajów komórek. Na pewno można wyróżnić komórki pnia (stern cells), komórki hemostatyczne biorące udział w procesach krzepnięcia (hialinocyty), fagocyty oraz komórki odżywcze (multivitive cells) o dużych rozmiarch. Istnieje możliwość, że poszczególne typy komórek są studiami rozwojowym jednej lub kilku linii hemocytów. W procesach odpornościowych biorą udział fagocyty naczyniowe w niektórych procesach granulocyty z uwagi na ziarnistości w cytoplazmie, a także hialinocyty i komórki osiadłe. Dominujący mechanizmem odpornościowym jest fagocytoza, zaś fagocyty stanowią zdecydowaną większość spośród hemocytów. Ziarnistości fagocytów zawierają aktywne fazy tlenu, kwas azotowy oraz enzymy lizosomowe [6-7]. Jak wspomniano, fagocytoza dotyczy niewielkich obiektów (bakterie, fragmenty tkanek, niektóre pasożyty) i przebiega ona przy współudziale czynników humoralnych (np. aglutyniny). Większe obiekty ulegają inkapsulacji, czyli tworzenia się otoczki z wielu warstw hemocytów ułożonych wokół inkapsulowanego obiektu. Inkapsulacja zaczyna się od migracji hemocytów w kierunku obcego obiektu o średnicy powyżej 15 mm np. pasożyty. Po kilku godzinach obiekt zostaje otoczony warstwą koncentrycznie ułożonych komórek. Po upływie doby pasożyt ginie, a jego martwe tkanki ulegają sfagocytowaniu. W hemocytach tworzących otoczkę stwierdza się wzrost poziomu fosfatazy kwaśnej. Jednak istnieją gatunki pasożytów (niektóre przywry i nicienie), które są w stanie przeżyć inkapsulację [1, 3, 4, 8]. Innym odczynem komórkowym, w którym biorą udział hemocyty jest nodulacja. Poprzez nią dochodzi do agregacji hemocytów wokół obecnej substancji. Jest to odporność organizmu na powstawanie skupisk intensywnej fagocytozy hemocytów wokół skupisk patogenów np. bakterii. Nowo przybyłe hemocyty tworzą skupisko wokół wcześniej zaangażowanych w procesy obronne komórek i patogenów otaczając całość szeroką warstw. Proces występuje w przypadku silnie nasilonych procesów fagocytozy, zabezpieczają organizm przed inwazją niektórych pasożytów i patogenami, a także przed rozpadającymi się fagocytami, których ziarnistości mogłyby oddziaływać niekorzystnie na tkanki organizmu.

Anna Wilczyńska, Jerzy Ziętek, Michał Jabłoński, Sylwia Sajdak

1.5. Komórki typu I i II Komórki i typu są największe spośród widocznych komórek oraz stosunkowo jest ich najwięcej. Jądro jest okrągłe, owalne lub wielokształtne z ziarnistościami. Cytoplazma jest bezbarwna lub słabo wybarwiona mogą znajdować się w niej lekko niebieskie ziarnistości. Wokół jądra widoczna jest warstwa jasna obwódka. Posiadają zdolność do agregacji. Komórki II typu są znacznie mniejsze. Występują w znacznie mniejszej ilości. Jądro ma intensywną barwę niebiesko-fioletowe, a cytoplazma zawiera ziarnistości [5]. 1.6. Pozostałe komórki Blastocyty – największe, jądro bez cytoplazmy lub cienka otoczka zabarwiona Hialinocyty – komórki nieco większe niż blastocyty, o dużym, owalnym jądrze i wyraźnie widocznej, cienkiej warstwie cytoplazmy bawiącej się przy użyciu standardowych metod w sposób jednolity na kolor bladoniebieski [5]. 2. Cel Wykonano rozmazy hemolimfy ślimaka z gatunku Cornu aspersum Muller oraz Ceapaena nemoralis, aby wyróżnić charakterystyczne cechy hemocytów u obu gatunków oraz porównać je. 3. Materiały i metody Hemolimfę pobrano od 3 ślimaków Cornu apsersum Muller i 3 Cepaea nemoralis. Pobranie wykonano metodą, która umożliwia zgromadzenie potrzebnej ilości materiału nie powodując zgonu u zwierzęcia ani trwałego uszczerbku na zdrowiu. Na początek odłupano kawałek skorupki, aby uwidocznić naczynie główne, pobrano bezpośredni o z naczynia igłą 0,45 (26G), około 0,5 ml czystej hemolimfy. Barwienie metodą Pappenheima (wykorzystana w Diff- quick i Hemacolor) jest to połączenie dwóch metod Maya – Grűnwalda – roztwór metanolowy eozyny i błękitu metylenowego, barwiący ziarnistości hemocytów, ale nie ich jądra i Giemsy będącej modyfikacją mieszaniny eozyny i błękitu metylenowego z dodatkiem glicerolu. Dla uroszczenia powstał jeden barwnik nazywany MGG (Maya – Grünwalda – Giemsy) lub barwnikiem Pappenhaima. Z uwagi na łatwość barwienia jest wykorzystywana w tworzeniu niektórych komercyjnych zestawów do barwienia krwi obwodowej ssaków. Wykonanie rozmazu: Duża krople hemolimfy była rozprowadzona na szkiełku podstawowym i za pomocą drugiego szkiełka o oszlifowanych brzegach był sporządzony dość gruby preparat. Z uwagi na inną niż w przypadku krwi ssaków lepkość oraz niewielka ilość hemocytów w hemolimfie (100-600 w 1 mm3) było to konieczne do prawidłowej oceny leukorgamu. Po wysuszeniu barwiono preparat za pomocą komercyjnego zestawu do barwienia Hemacolor. Po delikatny opłukaniu preparatu i jego wysuszeniu oglądano go w powiększeniu 100x w mikroskopie świetlnym przy użyciu olejku immersyjnego. Zwrócono uwagę na wielkość komórek, kształt, zabarwienie cytoplazmy, obecność ziarnistości, rodzaj wybarwienia (kwaśny, zasadowy lub

Analiza cytologiczna rozmazu z hemolimfy Cornu aspersum i Cepaea nemoralis obojętny, a także wielkość i kształt jądra komórkowego. Na podstawie dostępnej literatury określono typy występujących komórek. Porównano także ilość hemocytów znajdującą się w 1 mikrolitrze hemolimfy u obu badanych gatunków. Do tego celu wykonano badanie w komorze Fuchs-Rosenthala. Jest to komora zaliczeniowa służąca do określania ilości komórek w płynach ciała, np.: w płynie mózgowo-rdzeniowym u kręgowców. Posiada wyszlifowaną siatkę składającą się z 16 dużych kwadratów o boku 1 mm każdy, które są dodatkowo podzielone na 16 mniejszych kwadratów o boku 0,25 mm każdy. Głębokość komory wynosi 0,2 mm, zaś pojemność 0,32 mm sześciennego. Ilość komórek po zabarwieniu materiału, w tym wypadku hemolimfy (roztwór fioletu krystalicznego – 1 część, hemolimfa – 10 części) zlicza się pod mikroskopem w powiększeniu 100x-400x nakrywając komorę szkiełkiem podstawowym i nanosząc pod niewspomniany roztwór badanego płynu. Obliczeń dokonuje się poprzez określenie ilości wszystkich zaobserwowanych komórek i dzielą wynik przez 3. Uzyskany wynik to ilości komórek w 1 m3. Do celów hodowli ślimaków w warunkach laboratoryjnych użyto standardowych kuwet do hodowli szczurów laboratoryjnych, wykonanych z przeźroczystego poliestru i przykrywanych metalową kratą (zdj. 1). Ślimaki Cornu aspersum Muller podzielono na dwie grupy po 10 osobników i znajdowały się one w dwóch identycznych pojemnikach o wymiarach, zaś ślimaki Cepea nemoralis zostały umieszczone w liczbie 20 sztuk w jednej kuwecie. Podłoże stanowiło namoczone włókno kokosowe. Jest to standardowe i higieniczne rozwiązanie stosowane w terrariach. Kilkumilimetrowa warstwa tego materiału była zwilżana obficie woda wodociągową. W kuwecie umieszczano płytki, płaski, plastikowy pojemnik niewielkich rozmiarów po napełnieniu wodą służący, jako poidło, podobny pojemnik służący, jako karmnik na pokarmy sypkie (standardowa karma dla ślimaków fermowych o dużej zawartości wapnia) oraz nieco większy pojemnik, do którego podawano zielonki. W pomieszczeniu panowała temperatura 20℃, dzień świetlny trwał 10 godzin na dobę. Raz w tygodniu, w ponie- działek, wymieniano bibułę, myto starannie pojemniki na żywność oraz samą kuwetę, natomiast ślimaki były myte pod bieżącą wodą przez okres około 2-3 minut, celem usunięcia zanieczyszczeń. Następnie kuwetę wykładano świeżą, obficie zwilżona bibułą i umieszczano pojemniki napełnione pokarmem i świeżą wodą wodociągową. Następnie ostrożnie wkładano ślimaki i całość zakrywano metalową kratą. Podczas kolejnych dni tygodnia dwa razy dziennie obficie spryskiwano kuwetę wodą, uzupeł- niano karmę i wodę, podawano umyte warzywa, usuwano większe zanieczyszczenia i ewentualnie martwe zwierzęta. 4. Analiza wyników Hemocyty Cornu apsersum Muller są większe od Cepaea nemoralis. U obu gatunków można wyróżnić wszystkie wcześniej opisywane rodzaje hemocytów tj. I i II typ hemocytów oraz blastocyty i hialinocyty. U ślimaków Cornu apsersum Muller komórki pierwszego typu posiadają jądro okrągłe owalne lub wielkokształtne, kolor od ciemnoróżowego do fioletowego oraz największą zawartość cytoplazmy spośród wszystkich typów komórek. Blastocyty to komórki, u których widoczne jest wyłącznie jadro zajmujące całą komórkę wybar-

Anna Wilczyńska, Jerzy Ziętek, Michał Jabłoński, Sylwia Sajdak wione na ciemnofioletowy kolor. Hialinocyty posiadają podobnie do blastocytów jądro zajmujące większą powierzchnie komórki, ale widoczny jest cienki pas cytoplazmy wokół, który barwi się lekko na niebiesko w barwieniu rozmazu zastosowanym w niniejszym badaniu. Hemocyty drugiego typu są całe różowe.

Rysunek 1. Hemocyty Cornu aspersum: a) Hemocyt i typu; b) po prawej stronie hemocyt II typu, po lewej stronie zdjęcia hialinocyt; c) blastocyt d) hemocyt typu II o nieregularnym jadrze e) hialinocyt

U ślimaków Cornu apsersum Muller widoczne były bardzo duże hemocyty typu I o rozmiarach 20-60 mikrometrów, zaś podobne struktury u Cepaea nemoralis są mniejsze, o średnicy około 10 mikrometrów, oba typy komórek łączy brak wyraźnie wybarwionego jadra komórkowego oraz różowo-czerwonawe zabarwienie. U ślima- ków Cornu apsersum Muller komórki typu i stanowią do 12% obserwowanych komórek, zaś Cepaea nemoralis tylko około 2-3%. Hemocyty typu II stanowiły większość obserwowanych komórek u obu gatunków ślimaków. W przypadku Cornu apsersum Muller było to 75-80%, zaś w przypadku Cepaea nemoralis powyżej 90% ogółu komórek obserwowanych w preparacie. Hialinocyty w obu przypadkach

Analiza cytologiczna rozmazu z hemolimfy Cornu aspersum i Cepaea nemoralis stanowiły 2-3% obserwowanych komórek, zaś blastocyty w przypadku Cornu apsersum Muller stanowiły do 8% procent obserwowanych komórek, zaś w przypadku Cepaea nemoralis do 6%. Warto podkreślić, że w wykonanym dodatkowo badaniu za pomocą komory Fuchs-Rosenthala, polegającym na zliczaniu hemocytów, ilości hemocytów w hemolimfie różniła się u obu gatunków. W przypadku Cornu apsersum Muller wahała się ona od 100 do 400 komórek w mikrolitrze, zaś w przypadku Cornu apsersum Muller wyniosła do 300 do 600 komórek w mikrolitrze.

Rysunek 2. Hemocyty Cepea nemoralis: a) hialinocyt; b) hemocyt typu II z widocznymi ziarnistościami; c) blastocyt i hialinocyt d) hemocyt typu i (u góry) i hemocyty typu II e) konglomerat złożony z hemocytów i typu i II typu

5. Podsumowanie Pobieranie hemolimfy u ślimaków jest stosunkowo łatwe i nie jest to metoda letalna. Uzyskana ilość materiału, z uwagi na dużą objętość hemolimfy w ciele ślimaka, pozwala na wykonanie badań hematologicznych, analogicznych jak w przypadku kręgowców i przy użyciu powszechnie dostępnych metod. Uzyskane wyniki pozwoliły zróżnicować różne typy komórek. W kolejnych pracach autorzy zamierzają prześledzić dynamikę poszczególnych populacji hemocytów w różnych stanach fizjologicznych ślimaków w kontekście ich immunologii i odporności przeciw- zakaźnej, co może okazać się przydatne w naukach podstawowych. Będzie miało też charakter aplikacyjny z uwagi na fakt użytkowania niektórych ślimaków, jako zwierząt jadalnych.

Anna Wilczyńska, Jerzy Ziętek, Michał Jabłoński, Sylwia Sajdak

Literatura 1. Ziętek J., Guz L., Winiarczyk S., Szkucik K., Ziomek M., Wysokowski M., Madany J., Adaszek Ł., Study on establishing normal ranges of chosen biochemical parameters of haemolymph of Cornu aspersum maxima and Cepaea nemoralis gastropods, Pol J Vet Sci., 2018, Sep, 21(3): 445-449. 2. Pengsakul T., Suleiman Y.A., Cheng Z., Morphological and structural characterization of haemocytes of Oncomelania hupensis (Gastropoda: Pomatiopsidae), Italian Journal of Zoology, 2013, 1-9. 3. Neiber MT., Hausdorf B., Molecular phylogeny reveals the polyphyly of the snail genusCepaea (Gastropoda: Helicidae) Mol Phylogenet Evol., 2015, 93:143-9. 4. Adamowicz A., Bolaczek M., Blood cells morphology of the snail Helix aspersa maxima (HELICIDAE), Zoologica Poloniae, 2003, 48/1-4: 93-101. 5. Urbanski A., Czarniewska E., Baraniak E., Rosinski G., Morfologia, aktywność fizjologiczna oraz praktyczne wykorzystanie badań na hemocytach owadów Orphology physiological activity ang application apects researches on insect hemocytes, postępy biologii komórki, 2013, NR 2, 295-306. 6. Ratcliffe N.A., Rowley A.F., Invertabrate Blood Calls, 1981. 7. Eble A.F., Tripp M.R., Enzyme biochemistry of phagosome in oyster leukocytes, Bull. N,Y. Acad. Sci. B 13, 93. 8. Feng S.Y,. Lysozyme-like activities in the hemolimph of Crassoyea virginica, Contamporary Topics in Immunobiol., 4, 225. 9. Ottaviani E., Paemen L.R., Cadet P., Stefano G.B., Evidence for nitric acide production and utilization as a bacterididal agent by intertebrate immunocytes, Eur. J. Pharmacoe Environ Toxicol Phartmacol, 1993, 248, 319.

Analiza cytologiczna rozmazu z hemolimfy Cornu aspersum i Cepaea nemoralis Streszczenie Hemolimfa ślimaków składa się między innymi z komórek odpornościowych nazywanych hemocytami, ich główną rolą jest fagocytoza i enkapsulacja. Podczas analizy cytologicznej rozmazów hemolimfy brane są pod uwagę następujące cechy: wielkości komórek, ich barwliwości oraz kształtu, a także stosunku wielości jądra do ilości cytoplazmy i obecności ziarnistości. Na podstawie powyższych cech wyróżniono dwa główne typy komórek I i II, typ i dzielimy na podtypy a i b. Rozmazy świeżo pobranej hemolimfy były barwione za pomocą komercyjnego zestawu barwników Hemovet (utrwalacz, barwnik kwaśny, barwnik zasadowy). Następnie preparaty były analizowane pod mikroskopem świetlnym w powiększeniu x100. Komórki typu Ia barwiły się na kolor różowy z dużym jądrem i wąskim pasmem cytoplazmy. Typ Ib wybarwił się na niebiesko, a stosunek ilości cytoplazmy do wielkości jądra był zdecydowanie większy. Typ II znacznie większy od typu i zabarwione jednolicie na różowo. Zaobserwowano różnice gatunkowe w wyglądzie komórek pomiędzy Cornu aspersum a Cepaea nemoralis. Słowa kluczowe: Gastopodas, Cornum aspersum, Cepaea nemoralis, hemocyty Cytological analysis of smear from hemolymph Cornu aspersum and Cepaea nemoralis Abstract Hemolymph of snails consists of, among others, immune cells called hemocytes, their main role is phagocytosis and encapsulation. During the cytological analysis of hemolymph smears, the following features are taken into account: cell size, their color and shape, as well as the ratio of nucleus size to cytoplasm and the presence of granulation. On the basis of the above characteristics, two main types of I and II cells are distinguished, type i divided into subtypes a and b. Smears of freshly drawn hemolymph were stained using the commercial Hemovet dye set (fixative, acid dye, alkaline dye). The preparations were then analyzed under a light microscope at x100 magnification. Type Ia cells stained pink with a large nucleus and a narrow band of cytoplasm. Type Ib stained blue and the ratio of the cytoplasm to the size of the nucleus was much larger. Type II much larger than type I, uniformly colored in pink. Species differences in the appearance of cells between Cornu aspersum and Cepaea nemoralis were observed. Słowa kluczowe: Gastopodas, Cornum aspersum, Cepaea nemoralis, hemocytes

Katarzyna Kruk1

Wykorzystanie nicieni owadobójczych z rodziny Steinernematidae i Heterorhabditidae w ochronie roślin przed szkodnikami w uprawach pod osłonami

1. Wstęp Uprawa pod osłonami stanowi jedną z gałęzi produkcji roślinnej, której powierzchnia stale się powiększa. W latach 2011-2017 odnotowano zwiększenie areału o 386 ha dając w efekcie 6372 ha [1, 2]. Dany typ uprawy charakteryzuje się możliwością kontrolowania parametrów środowiskowych np. temperatury i wilgotności podłoża co pozwala na całoroczną uprawę, a w efekcie uzyskanie większych plonów. Warunki panujące pod osłonami sprzyjają rozwojowi agrofagów, których zwalczanie opierało się przede wszystkim na stosowaniu chemicznych środków ochrony roślin, ze względu na ich wysoką skutecz- ność oraz niskie koszty wykonania zabiegu. Jednak w ciągu ostatnich lat dzięki przeprowadzeniu licznych badań wzrosła świadomość ekologiczna społeczeństwa oraz jego wymagania względem produktów spożywczych co doprowadziło do ograniczenia stosowania pestycydów. Jednocześnie prężnie rozwijało się rolnictwo ekologiczne, dzięki czemu na znaczeniu zyskała biologiczna ochrona roślin [3, 4]. Obowiązujące krajowe oraz unijne przepisy prawne kładą nacisk na integrowaną ochronę roślin, która powinna minimalizować stosowanie chemicznych insektycydów na rzecz metod niechemicznych. Jedną z nich jest metoda biologiczna, która polega na wykorzystywaniu żywych organizmów będących naturalnymi wrogami szkodników [5]. 2. Charakterystyka upraw pod osłonami Prowadzenie produkcji roślinnej pod osłonami takimi jak szklarnie czy agro- włóknina umożliwia przyśpieszenie wzrostu i rozwoju siewek oraz uzyskanie większego plonu o lepszej jakości [6]. Ponadto stanowi to ochronę przed niekorzystnymi warunkami środowiskowymi (m.in. przymrozkami i niskimi temperaturami), zachwasz- czeniem oraz uszkodzeniami powodowanymi przez niektóre grupy szkodników. Dzięki temu minimalizuje się użycie pestycydów co wpływa na zmniejszenie zanieczyszczenia środowiska wynikającego z zalegania substancji aktywnych zawartych w chemicznych środkach ochrony roślin [7]. Najczęściej wykorzystywanym materiałem do produkcji osłon jest juka oraz polipropylen, natomiast ze względu na sposób jego wykorzystania osłony można dzielić na płaskie okrycia oraz tunele i szklarnie, które różnią się między sobą rodzajem ochrony, jaki zapewniają [8].

1 [email protected], Katedra Fizjologii Roślin i Biochemii, Wydział Kształtowania Środowiska i Rolnictwa, Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, http://www.zut.edu.pl/zut- pracownicy/aktualnosci/informacje-biezace.html.

Katarzyna Kruk

2.1. Okrycia płaskie Do okrywania roślin wykorzystuje się folię perforowaną lub agrowłókninę (włóknina propylenowa). Tkaniny stosuje się w okresie wczesnowiosennym do przykrycia roślin wcześnie sadzonych lub wysiewanych np. rzodkiewka czy sałata. Celem ich stosowania jest przede wszystkim ochrona siewek przed niskimi temperaturami, uszkodzeniami spowodowanymi gradobiciem lub silnym wiatrem oraz przed żerowaniem niektórych owadów, gryzoni i ptaków. Temperatura utrzymująca się pod okryciem jest wyższa od temperatury na zewnątrz o ok. 8oC co powoduje przyspie- szenie zbioru plonów nawet o 2 tygodnie oraz konieczność zdejmowania okryć po kilku tygodniach, aby nie doprowadzić do przegrzania roślin. Zastosowanie płaskich osłon uniemożliwia prowadzenie zabiegów agrotech- nicznych do momentu ich usunięcia. W przypadku nieodpowiedniego przygotowania gleby istnieje wysokie ryzyko wystąpienia szkodników glebowych, do których zalicza się: pędraki chrząszczy żukowatych, gąsienice rolnic oraz larwy komarnic, które mogą spowodować znaczne straty w uprawie [9, 10]. 2.2. Osłony wysokie Jako osłony wysokie stosuje się tunele foliowe oraz szklarnie. Szklarnie najczęściej wykonywane są ze szkła lub plastikowych płyt. Wpływa to na wytrzymałość ich konstrukcji. Tunele foliowe (niskie oraz wysokie) wykonywane są z metalowych konstrukcji oraz folii polietylenowej, ich budowa wymaga mniejszych nakładów finansowych niż szklarni. Obydwa rodzaje osłon mogą zostać wyposażone w urządzenia docieplające, nawadniające oraz napowietrzające, dzięki czemu z łatwością można sterować panującym w nich mikroklimatem. Zarówno szklarnie, jak i tunele foliowe stanowią ochronę roślin przed uszkodzeniami powodowanymi przez opady atmosferyczne (np. gradobicie), przesuszenie gleby oraz działanie organizmów szkodliwych. Wysokość danych konstrukcji umożliwia prowadzenie zabiegów ochronnych uprawianych w nich roślin. Dodatkowo produkcja może być prowadzona w gruncie, jak i w pojemnikach czy z wykorzystaniem hydroponiki. Wysokie osłony pozwalają na maksymalne wykorzystanie światła oraz ciepła pochodzącego z promieniowania słonecznego, co wpływa na:  uprawę roślin o wysokich wymaganiach cieplnych, również pochodzących z klimatu tropikalnego,  prowadzenie całorocznej uprawy roślin,  zwiększenie ilości, jak i jakości otrzymywanego plonu,  prowadzenie upraw doświadczalnych [4, 9-11]. 3. Charakterystyka nicieni owadobójczych Nicienie owadobójcze są pasożytniczymi organizmami żyjącymi w środowisku glebowym. Najlepiej poznane zostały rodziny Steinernematidae oraz Hetero- rhabditidae, które wykorzystuje się w biologicznej ochronie roślin przed szkodnikami. Do listy ich żywicieli zalicza się ponad 350 gatunków szkodników przynależnych do 13 rzędów, są to m.in. larwy muchówek z rodziny Sciaridae, pędraki chrząszczy z rodziny Scarabaeidae oraz wciornastki z rodziny Tripidae [5, 12, 13].

Wykorzystanie nicieni owadobójczych z rodziny Steinernematidae i Heterorhabditidae w ochronie roślin przed szkodnikami w uprawach pod osłonami

Do tej pory opisano ponad 80 gatunków nicieni należących do rodziny Steiner- nematidae oraz 19 gatunków z rodziny Heterorhabditidae. Najpowszechniej wystę- pującymi przedstawicielami danych rodzin są: Steinernema feltiae oraz Heterho- rhabditis bacteriophora [14-17]. Największą zaletą nicieni entomopatogenicznych jest ich naturalne występowanie w środowisku glebowym na obszarach znajdujących się w dużym zakresie szerokości geograficznych. Spowodowało to wykształcenie się wśród osobników zdolności przetrwania niekorzystnego okresu poprzez przejście stadium przetrwalnikowego w stan uśpienia (fazę spoczynkową lub diapauzę) [16, 18]. Mimo stosunkowo wysokiej odporności na stres środowiskowy występowanie stadiów wolnożyjących uwarun- kowane jest szeregiem czynników ekologicznych. Duży wpływ na przeżywalność i kondycję nicieni ma wilgotność środowiska, w którym występują (niezależnie czy jest to gleba, akwen słono lub słodkowodny czy tkanki żywiciela). Do pozostałych czynników o dużym znaczeniu zalicza się: ekstrema temperaturowe (zarówno dodatnie, jak i ujemne), kwasowość oraz napowietrzenie gleby, liczebność oraz zróżnicowanie gatunkowe organizmów żywicielskich, prowadzone zabiegi agrotechniczne oraz stosowanie pestycydów [19-23]. Jedynym stadium narażonym na niekorzystne warunki środowiska glebowego są osobniki trzeciego stadium rozwojowego będącego zarówno formą przetrwalnikową, jak i infekcyjną. Larwy te charakteryzują się stosunkowo wysoką tolerancją na stres środowiskowy [23]. Larwy infekcyjne odnajdują swoich żywicieli i przenikają do wnętrza ich ciała przez naturalne otwory tj. przetchlinki, otwór gębowy oraz odbytowy. Po przedostaniu się do hemocelu uwalniają z pęcherzyka jelitowego symbiotyczne bakterie, które zaczynają produkować szeroki zakres toksyn i hydrolitycznych egzoenzymów uśmiercających żywiciela w ciągu 48-72 godzin po infekcji [24]. Substancje te odpowiedzialne są również za rozkład wnętrzności ciała żywiciela do substancji pokarmowych łatwo przyswajalnych przez nicienie oraz za zabezpieczenie ich przed innymi mikroorganizmami glebowymi i procesem gnilnym [13, 25]. Cykl rozwojowy jednego pokolenia trwa ok. 7 dni. Po wyczerpaniu zapasów pokarmowych bakterie powtórnie kolonizują jelito larw inwazyjnych nowego pokolenia, które migrują do gleby w poszukiwania nowego żywiciela. Symbioza między tymi organizmami jest nierozerwalna i konieczna do przetrwania obu stron, które nie potrafią funkcjonować samodzielnie [26]. Na drodze danego współżycia bakteria jest chroniona przed konkurencyjnym środowiskiem glebowym i zostaje przetranspor- towana do bogatej w składniki pokarmowe hemolimfy owada. Nicienie czerpią korzyści z potencjału patogenicznego bakterii, który pomaga w zabiciu i konserwacji żywiciela [27]. 3.1. Rodzina Steinernematidae Wśród rodziny Steinernematidae największe znaczenie w biologicznej ochronie roślin mają trzy gatunki: Steinernema carpocapsae, S. feltiae oraz S. kraussei. Są one podstawą bioinsektycydów dostępnych obecnie na rynku. Producenci zalecają je do zwalczania m.in. larw turkucia podjadka (Gryllotalpa gryllotalpa), zimujących larw owocówek (Cydia spp.), larw opuchlaków (Otiorhynchus spp.) oraz typowych

Katarzyna Kruk szkodników szklarniowych tj. ziemiórki (Sciaridae), wciornastki (Tripidae) oraz miniarki (Agromyzyidae) [28, 29]. Według danych literaturowych przedstawiciele tej danej rodziny mają zdolność infekcji szkodników, których nawet część rozwoju związana jest ze środowiskiem glebowym. W przeciwieństwie do innych rodzin, nicienie z rodziny Steinernematidae wykorzystywane są do zwalczania szkodników występujących na powierzchni liści m.in. wciornastków, jednak największą popu- larność zyskały one w ochronie pieczarkarni przed uszkodzeniami powodowanymi przez ziemiórki. Aby uzyskać najwyższą skuteczność należy unikać wystawiania nicieni na działanie promieniowania UV stosując kurtyny świetlne oraz wykorzystując adiuwanty mające cechy nawilżaczy (przy stosowaniu nalistnym) [5, 30, 31]. Nicienie Steinernema spp. stają się aktywne już w 10oC. Infekują swoich żywicieli jedynie przez naturalne otwory (przetchlinki, otwór gębowy oraz odbytowy). Żyją w ścisłej symbiozie z bakteriami z rodzaju Xenorhabdus, jednak powiązanie między gatunkami nicieni i bakterii nie jest na tak restrykcyjne, jak u rodziny Heterothab- ditidae, nawet kilka gatunków nicieni może współżyć z tym samym gatunkiem bakterii [32, 33]. Cechą charakterystyczną nicieni z tej rodziny jest występowanie pokolenia płciowego w wyniku rozmnażania larw infekujących żywiciela. Samice są dużo większe od samców i potrafią złożyć nawet kilka tysięcy jaj [23]. 3.2. Rodzina Heterorhabditidae Nicienie należące do rodziny Heterorhabditidae zalecane są do zwalczania szkod- ników glebowych zarówno w uprawach gruntowych, jak i pojemnikowych. Przedsta- wiciele danej rodziny preferują organizmy żywicielskie znajdujące się w głębszych partiach podłoża co jest związane z dużą aktywnością ruchową osobników, pozwa- lająca im na dotarcie do żywicieli głębiej umiejscowionych, np. larwy opuchlaków (Otiorhynchus), wobec których wykazują największą aktywność owadobójczą [23, 31, 34]. Jako podstawa preparatów biologicznych stosowanych do zwalczania szkodników wykorzystywany jest tylko jeden gatunek nicienia, Heterorhabditis bacteriophora. Mimo szerokiego spektrum owadów będących potencjalnymi żywicielami producenci zalecają stosowanie tego organizmu przeciwko opuchlakom (szczególnie w uprawach truskawki zarówno pod osłonami, jak i w gruncie), poczwarkom niektórych motyli oraz pędrakom niektórych chrząszczy [28, 29, 33, 34]. Larwy danej rodziny są gotowe do penetracji żywicieli, gdy minimalna temperatura w ich otoczeniu wynosi 14oC. Po przekroczeniu tej granicy nicienie odnajdują swoją ofiarą i wnikają do jej wnętrza przez naturalne otwory oraz przez przebitą kutykulę za pomocą zębopodobnego wyrostka znajdującego się w pobliżu otworu gębowego (jest to cecha charakterystyczna rodziny). Przedstawiciele rodziny Heterorhabditidae żyją w bardzo ścisłej symbiozie z bakteriami z rodzaju Photorhabdus. Występuje tu rygorystyczne powiązanie między gatunkiem nicieni i bakterii, jeden gatunek Photorabdus sp, współżyje tylko z jednym gatunkiem Heterorhabditis sp. w przeciwieństwie do gatunków Steinernema spp., nicienie z tej rodziny nie posiadają woreczka bakteryjnego, a związane z nimi symbiotyczne drobnoustroje wypełniają całą długość jelita, ponadto otwór wydalniczy znajduje się poniżej obrączki okołonerwowej [34]. W wyniku rozwoju pokolenia infekującego żywiciela powstaje pokolenie hermafrodytycznych osobników, dopiero w następnym cyklu pojawia się pokolenie płciowe. Żerowanie gatunków Heterorhanditis spp. powoduje charakterystyczne czerwonawe zabarwienie organizmu żywicielskiego [32].

Wykorzystanie nicieni owadobójczych z rodziny Steinernematidae i Heterorhabditidae w ochronie roślin przed szkodnikami w uprawach pod osłonami

4. Wnioski/Podsumowanie Uprawa roślin pod osłonami jest prężnie rozwijającym się działem przemysłu rolniczego oraz ogrodniczego. Warunki utrzymywane w danych produkcjach sprzyjają występowaniu agrofagów, których zwalczanie zostało utrudnione po wprowadzeniu szeregu norm prawnych ograniczających stosowanie chemicznych środków ochrony roślin. Dlatego też znaczenia nabrała biologiczna ochrona roślin, która opiera się na stosowaniu żywych organizmów będących naturalnymi wrogami szkodników. Zalicza się tutaj m.in. nicienie entomopatogeniczne należące do rodziny Steinernematidae i Heterorhabditidae, które mogą infekować ponad 300 gatunków stawonogów. Szeroki zakres żywicieli, stosunkowo wysoka odporność na stres środowiskowy, aktywne poszukiwanie żywiciela oraz bezpieczeństwo stosowania dla kręgowców i środowiska są największymi zaletami tych organizmów. Preparaty oparte na czterech gatunkach nicieni entomopatogennych (Steinernema feltiae, S. carpocapsae, S. kraussei, Heterorhabditis bacteriophora) pozwalają na ograniczenie liczebności szkodników, których chociaż jedno stadium rozwojowe związane jest z glebą. Ponadto zalecane są do zwalczania typowych szkodników szklarniowych co wpływa na popularność ich stosowania w uprawach pod osłonami. Literatura 1. GUS., Wyniki produkcji roślinnej w 2011 r., Zakład Wydawnictw Statystycznych, Warszawa 2012, s. 79. 2. GUS., Wyniki produkcji roślinnej w 2017 r., Zakład Wydawnictw Statystycznych, Warszawa 2018, s. 52-53. 3. Jamiołkowska A., Hetman B., Skwaryło-Bednarz B., Kopacki M., Integrowana ochrona roślin w Polsce i Unii Europejskiej oraz prawne podstawy jej funkcjonowania, Praca przeglądowa, Annales UMCS Agricultura, LXXII(1), 2017, s. 103-111. 4. Jarosz Z., Jak uprawiać pod osłonami, czyli wszystko o uprawie w szklarniach, inspektach i tunelach, Wydawnictwo działkowiec, Warszawa 2006. 5. Kruk K., Dzięgielewska M., Wykorzystanie nicieni owadobójczych w biologicznej ochronie roślin, [w:] Nyćkowiak J., Leśny J. (red.), Badania i Rozwój Młodych Naukowców w Polsce. Nauki Przyrodnicze. Część VIII – Rośliny i ochrona środowiska, Młodzi Naukowcy, Poznań 2018, s. 72-76. 6. Biesiada A., Effect of flat covers and plant density on yielding and quality of kohlrabi, Journal of Elementology, 13 (2), 2008, s. 167-173. 7. Thierfelder C., Rusinamhodzi L., Ngwira R.A., Mupangwa W., Conservation agriculture in Southern Africa: advances in knowledge, Renewable Agriculture & Food Systems, 30 (4), 2015, s. 328-348. 8. Marasovic P., Kopitar D., Overview and perspective of nonwoven agrotextile. Textile & Review Leather, 2 (1), 2019, s. 32-45. 9. Skierkowski J., Uprawa warzyw pod szkłem i folią, Państwowe Wydawictwo Rolnicze i Leśne, Warszawa 1984, s. 53-144. 10. Palamutcu S., Devrent N., Technical textiles for agricultural applications https://iijsr.org/july-2015/#, 28. 03. 2019. 11. Kozłowski J., Buchwald W., Szczyglewska D., Uprawy szklarniowe roślin zielarskich ze szczególnym uwzględnieniem kultur hydroponicznych. Biuletyn Ogrodów Botanicznych, 12, 2003, s. 173-175.

Katarzyna Kruk

12. Lewis E.E., Clarke D.J., Nemaotde parasites and enthomopathogens, [w:] Vega F., Kaya H. K. (red.), Insect pathology, Elsevier, Amsterdam 2012, s. 395-424. 13. Hazir S., Shapiro-Ilan D.I., Hazir C., Leite L.G., Cakman I., Olson D., Multifaceted effects of host plants on Entomopathogenic nematodes, Journal of Inertebrate Pathology, 135, 2016, s. 53-59. 14. http://entnem.ifas.ufl.edu/nguyen/morph/steinsp1.htm, 21.03.2019. 15. http://entnem.ifas.ufl.edu/nguyen/morph/HETEROSP.htm, 21.03.2019. 16. Hominick W.M., Biogeography, [w:] Gaugler R. (red.), Enthomopathogenic nematology, CABI Publishing, Wallingford 2002, s. 115-143. 17. Sturhan D., Liskova M., Occurrence and distributionof enthomopathogenic nematodes in the Slovak Republic. Nematology, 1, 1999, s. 273-277. 18. Barrett J., Anhydrobiotic nematodes, Agricultural Zoology Reviews, 4, 1991, s. 161-176. 19. Wharton D.A., A functional Biology of Nematodes, Croom Helm Publishing, Londyn 1986, s. 190-192. 20. Wharton D.A., Surry M.R., Cold tolerance mechanisms of the infective larvae of the insect parasitic nematode Heterorhabditis zelandica Poinar, Cryo letters, 15, 1994, s. 353-360. 21. Rovesti L., Deseö K.V., Compatibility of chemical pesticides with the Entomopathogenic nematodes, Steinernema carpocapsae Weiser and Steinernema feltiae (Nematoda, Steinerneatidae), Nematologica, 36, s. 237-245. 22. Glazer I., Survival Biology, [w:] Gaugler R. (red.), Enthomopathogenic nematology, CABI Publishing, Wallingford 2002, s. 169-187. 23. Sander H., Pasożyty w służbie człowieka, Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa 1990, s. 24-143. 24. Lacey L.A., Grzywacz D., Shapiro-Ilan D.I., Frutos R., Brownbridge M., Goettel M.S., Insect pathogens as biological controlagents: back to the future, Journal of Invertebrate Pathology, 132, 2015, s. 1-41. 25. Kaya H.K., Gaugler R., Entomopathogenic nematodes, Annual Review of Entomology, 38, 1993, s. 181-206. 26. Helmberger M.S., Shields E.J., Wickings K.G., Ecology of belowground biological control: Entomopathogenic nematode interaction with soil biota, Applies Soil Ecology, 121, 2017, s. 201-213. 27. Forst S., Clarke D., Bacteria-Nematode Symbiosis, [w:] Gaugler R. (red.), Enthomopathogenic nematology, CABI Publishing, Wallingford 2002, s. 57-78. 28. https://www.koppert.pl/produkty-do-zwalczania-szkodnikow/, 29. 03.2018 r. 29. https://royalbrinkman.pl/nowo%C5%9Bci/nicienie-po%C5%BCyteczne/, 29. 03. 2018 r. 30. Shapiro-Ilan D.I., Cottrell T.E., Mizell III R.F., Horton D.L., Efficacy of Steinernema carpocapsae plus fire gel applied as a single spray for control of the lesser peachtree borer, Synanthedon pictipes, Biological Control, 94, 2016, s. 33-36. 31. Lortkipanidze M.A., Gorgadze O.A., Kajaia G.Sh., Gratiashvili N.G., Kuchava M.A., Foraging behawior and virulence of some Entomopathogenic nematodes, Annals of Agrarian Science, 14, 2016, s. 99-103. 32. Akhurst R.J., Boemare N.E., Biology and taxonomy of Xenorhabdus, [w:] Gaugler R., Kaya H. K. (red.), Entomopathogenic Nematodes in Biological Control, CRC Press. Boca Raton 1990, s. 75-90. 33. Guy A., Gaffney M., Kapranas A., Griffin C.T., Conditioning the enthomopathogenic nematodes Steinernema carpocapsae and Heterorhabditis megidis by pr-aplication storage improves efficacy against blacj vine weevil, Otiorhynchus sulcatus (Coleoptera: Curculionidae) at low and moderate temperatures, Biological control, 108, 2017, s. 40-46. 34. Tomalak M., Sosnowska D. (red.), Organizmy pożyteczne w środowisku glebowym, Instytut Ochrony Roślin Państwowy Instytut Badawczy, Poznań 2008, s. 22-27.

Wykorzystanie nicieni owadobójczych z rodziny Steinernematidae i Heterorhabditidae w ochronie roślin przed szkodnikami w uprawach pod osłonami

Wykorzystanie nicieni owadobójczych z rodziny Steinernematidae i Heterorhabditidae w ochronie roślin przed szkodnikami w uprawach pod osłonami Streszczenie Rośliny uprawiane pod osłonami narażone są na uszkodzenia powodowane przez różne grupy agrofagów. Zalicza się do nich szkodniki glebowe (np. drutowce, pędraki, rolnice) oraz typowe fitofagi szklarniowe jak ziemiórki (Sciaridae) i wciornastki (Tripidae). Jedną z metod ich ograniczania jest metoda biologiczna wykorzystująca naturalnych wrogów organizmów szkodliwych np. nicienie. Dotychczas opisano ponad 30 rodzin nicieni patogenicznych w stosunku do bezkręgowcowców, a przede wszystkim szkodliwych owadów. Jednak jako podstawę bioinsektycydów wykorzystuje się gatunki należące do rodziny Steinernematidae i Heterorhabditidae. Są one najlepiej poznane, a obszar ich naturalnego występowania jest najszerszy co wpływa na ich możliwości adaptacyjne, a jednocześnie infekcyjne. Ponadto ich stosowanie nie zagraża środowisku oraz niedocelowym organizmom tj. zwierzęta. Niniejsza praca stanowi przegląd gatunków zalecanych do zwalczania szkodników w uprawach pod osłonami. Słowa kluczowe: nicienie owadobójcze, Steinernematidae, Heterorhabditidae, uprawa pod osłonami.

Use of entomopathogenic nematodes from Steinernematidae and Heterorhabditidae family in plant protection against pests in growing under covers Abstract Plants cultivated under cover are exposed to damage caused by different types of agrophages. We rate different soil pests to this group (e.g. wirewarms, grubs, turnip moth) and typical greenhouse phytophage like dark-winged fungus gnats (Sciaridae) and Tripidae sp. One of the methods of restricting them is by biological method that uses natural enemies of the harmful organism for example nematodes. Untill now over 30 families of pathogenic nematodes were described in relation to invertebrates, primarily harmfull insects. However as a base of bioinsecticides we use species that belong to the Steinernematidae and Heterorhabditidae families. These species are mostly known, and area of their natural occurrence is the widest, which factor into their adaptating and infectious abilities. Moreover applying them does not endanger the environment and nontarget species – animals. This thesis constitute reviev of the species that are instructed to fight pest in crop under cover. Keywords: enthomopathogenic nematodes, Steinernematidae, Heterorhabditidae, growing under cover

Tomasz Kuczyński1, Anna Barańska2, Piotr Pieckiel3

Trawianka Perccottus glenii – inwazyjny gatunek w zbiornikach wodnych rezerwatu Mewia Łacha

1. Wstęp Rozprzestrzenianie się gatunków inwazyjnych spowodowało wiele niekorzystnych zmian w ekosystemach wodnych, przede wszystkim spadek różnorodności biologicznej [5, 6, 9, 15]. Może również wpływać na strukturę i funkcjonowanie rodzimych ekosystemów, zmienić relacje troficzne biocenoz, co niesie za sobą istotne konsekwencje ekologiczne i ekonomiczne. Drapieżnictwo i konkurencja ze strony gatunków inwazyjnych mogą prowadzić do zmian w liczebności rodzimych gatunków (w tym gatunków ryb użytkowych), będących ofiarami lub konkurentami i ostatecznie przyczynić do ich lokalnego wyginięcia [22, 32, 15]. Dlatego ważne jest rozpoznanie zagrożeń ze strony gatunków obcych dla rodzimych gatunków, szczególnie tych będących przedmiotem ochrony. Podczas opracowywania koncepcji ochrony obszaru siedliskowego Natura 2000 „Ostoja w Ujściu Wisły” PLH 220044, w ramach tworzonego w latach 2011-2014 projektu Planu Ochrony, były przeprowadzone badania inwentaryzacyjne. Obszar ten obejmuje między innymi rezerwat Mewia Łacha, położony w obrębie przyujściowego odcinka Przekopu Wisły. Znajdują się tu również kilka estuariowych zbiorników wodnych. Maja one złożoną genezę wynikająca z połączenia zjawisk naturalnych i działalności człowieka. Powstały w rezultacie tworzenia się małych mierzei i odci- nania zatok, tworzących się wskutek sukcesywnego od początku XX wieku przedłu- żania kierownic nurtowych w ujściu wód Przekopu Wisły do Zatoki Gdańskiej. Ten techniczny zabieg, powtarzany cyklicznie od 120 lat, ma na celu rozmywanie tworzącego się w ujściu, z niesionych Wisłą osadów, stożka napływowego. Jednak skutkuje również wylądowaniem obszarów w bezpośrednim sąsiedztwie umocnień i tworzenie nowych seminaturalnych form siedliskowych. Do gatunków obcych inwazyjnych zalicza się między innymi trawiankę Perccottus glenii Dybowski, 1877, która pierwotnie występowała na terenach wschodniej Rosji, północno-wschodnich Chin i północnej części Półwyspu Koreańskiego [3, 23, 25]. Od czasu pojawienia się trawianki we wschodniej i centralnej Europie, ryba ta stała się w tym rejonie jednym z najbardziej inwazyjnych gatunków [7, 27, 28]. W polskich wodach została odnotowana po raz pierwszy w 1993 r. [2]. Podczas prowadzonych w latach 2011-2012 połowów inwentaryzacyjnych, trawinkę stwierdzono we wszystkich badanych jeziorach na terenie rezerwatu Mewia Łacha [19, 20]. Aby ograniczać rozprzestrzenianie się inwazyjnych gatunków obcych, w tym trawianki, w Polsce wprowadzono zakaz wpuszczania złowionych osobników tego gatunku do łowiska, w którym je złowiono, ani do innych wód [29].

1 [email protected], Zakład Ekologii Wód, Instytut Morski w Gdańsku, www.im.gda.pl. 2 [email protected], Zakład Ekologii Wód, Instytut Morski w Gdańsku, www.im.gda.pl. 3 [email protected], Zakład Ekologii Wód, Instytut Morski w Gdańsku, www.im.gda.pl.

Trawianka Perccottus glenii – inwazyjny gatunek w zbiornikach wodnych rezerwatu Mewia Łacha

Celem pracy było określenie składu gatunkowego i struktury dominacji ichtiofauny oraz poznanie diety trawianki w dwóch zbiornikach wodnych – jeziorze Małym i jeziorze Bobrowym, zlokalizowanych w rezerwacie Mewia Łacha położonym w obszarze specjalnej ochrony siedlisk Natura 2000 Ostoja w Ujściu Wisły PLH220044. 2. Metodyka badań Badania inwentaryzacyjne ichtiofauny prowadzono latem 2011 i 2012 roku na dwóch małych jeziorach w rezerwacie Mewia Łacha (rys. 1). Ze względu na awifaunę wodną, będącą celem ochrony rezerwatu Mewia Łacha do połowów wykorzystano narzędzia pułapkowe jak: żaki (o długości boku oczka 11 mm) i pułapki narybkowe (więcierze, w kształcie prostopadłościanu o wymiarach 60x60x100 cm i z tkaniny bezwęzłowej o przekroju oczka ok. 5 mm). Dodatkowo w 2012 roku na jeziorze Małe, zastosowano jednorazowo jedną wielopanelową sieć skrzelową typu NORDIC Coastal warm, o zestawie oczek od 10-60 mm. Żaki oraz pułapki wystawiano na całą dobę w strefie litoralu i kontrolowano, co kilka godzin. Ryby identyfikowano taksono- micznie, zliczano i mierzono długości całkowite (Lt) z dokładnością do 1 mm zaokrąglając w dół.

Rysunek 1. Obszar badań [opracowanie IMwG]

Ryby do analiz pokarmowych zostały złowione za pomocą pułapek narybkowych, w dwóch zbiornikach wodnych: jeziorze Małym i jeziorze Bobrowym. Próby zbierano co miesiąc, od maja do listopada 2014 r. oraz w marcu i kwietniu 2015 r. w okresie od grudnia 2014 r. do lutego 2015 r. nie zebrano materiału do badań, gdyż oba zbiorniki były zamarznięte. Bezpośrednio po złowieniu, osobniki trawianki przeznaczone do analiz laboratoryjnych konserwowano 7% roztworem formaliny. Pozostałe gatunki ryb, stanowiące przyłów, po identyfikacji taksonomicznej były wypuszczane. Do analizy składu pokarmowego, wybierano z każdej próby co najmniej 10 osob- ników o różnej długości. W przypadku złowienia mniejszej liczby ryb, badano całą próbę.

Tomasz Kuczyński, Anna Barańska, Piotr Pieckiel

Po wypreparowaniu przewodu pokarmowego, jego zawartość umieszczano na szalce. Następnie poszczególne składniki segregowano i identyfikowano za pomocą mikroskopu stereoskopowego, do możliwie najniższej jednostki taksonomicznej. Skład pokarmowy został scharakteryzowany za pomocą następujących parametrów [10]: 1) Częstość występowania składnika pokarmowego (%F)

Gdzie: %F – częstość występowania składnika x w analizowanych rybach, fx – liczba ryb zawierająca określoną kategorię pokarmu x w pożywieniu, f – całkowita liczba ryb poddanych analizie. 2) Udział wagowy składnika pokarmowego (%W)

Gdzie: %W – procentowy udział wagowy składnika pokarmowego x w analizowanych rybach, wx – masa danego składnika pokarmu x, w – całkowita masa składników pokarmowych.

Metodą udziału wagowego określono procentowy udział zsumowanej masy każdego składnika w całkowitej masie treści pokarmowej. Natomiast częstość wystę- powania to liczba ryb, z danym składnikiem pokarmu znalezionym w żołądku. 3. Wyniki i dyskusja W trakcie połowów realizowanych w latach 2011-2015 łącznie w obu jeziorach stwierdzono występowanie 19 gatunków ryb, przy czym więcej gatunków (17 gatun- ków) odnotowano w jeziorze Bobrowym. Lecz tylko 7 gatunków było stwierdzonych w obu jeziorach: karas pospolity, słonecznica, lin (tab. 1), oraz chronione: różanka i piskorz, a z gatunków obcych karaś srebrzysty i trawianka. Wyższa liczba gatunków występujących w jeziorze Bobrowym wynika najprawdopodobniej z bezpośredniego sąsiedztwa koryta Przekopu Wisły i cyklicznego połączenia z jego wodami podczas wysokich stanów wód. Potwierdzenie tego jest stwierdzenie w tym jeziorze osobników ryb reofilnych jak boleń i jaź, przy braku takich gatunków w jeziorze Małe.

Tabela 1. Lista gatunków ryb stwierdzonych w badanych jeziorach w latach 2011-2015 Nazwa gatunkowa Jezioro Małe Jezioro Bobrowe Abramis brama leszcz x Abramis sapa sapa x Alburnus alburnus ukleja x Aspius aspius boleń x Carassius carassius karaś pospolity x x

Trawianka Perccottus glenii – inwazyjny gatunek w zbiornikach wodnych rezerwatu Mewia Łacha

Carassius gibelio karaś srebrzysty x x Esox lucius szczupak x Gasterosteus aculeatus ciernik x Leucaspius delineatus słonecznica x x Leuciscus idus jaź x Misgurnus fossilis piskorz x x Perca fluviatilis okoń x Perccottus glenii trawianka x x Pungitius pungitius cierniczek x Rhodeus sericeus różanka x x Scardinius erythrophthalmus wzdręga x Silurus glanis sum europejski x Stizostedion lucioperca sandacz x Tinca tinca lin x x Źródło: Opracowanie własne

W strukturze gatunkowej w obu jeziorach zdecydowanie dominowała trawianka. W połowach realizowanych w trackie badań inwentaryzacyjnych w latach 2011-2012 najliczniej występowała w połowach pułapkami narybkowymi w strefie litoralu, gdzie w obu jeziorach stanowiła 89-90% ogólnej liczby złowionych ryb (tab. 2). W połowach prowadzonych w latach 2014-2015 jej udział w strukturze ilościowej był jeszcze wyższy i wynosił 93-97% (rys. 2-5). Potwierdza to, że gatunek ten jest wysoce inwazyjny i w zbiornikach wodnych, niezamieszkałych przez drapieżniki lub przy ich małolicznej populacji, trawianka szybko staje się dominantem [4, 22]. Natomiast w zdominowanych już przez ten gatunek ekosystemach powoduje spadek zróżnico- wania gatunkowego i liczebności innych gatunków ryb [13, 14, 17].

Tabela 2. Liczebność, udziału procentowy oraz zakresy długości trawianki w połowach inwentaryzacyjnych w latach 2011−2012

Długość max.

Średnia [mm]

Długość min.

Liczba [szt.]

połowie [%]

Udział

[mm] [mm] Stanowisko Narzędzie

żaki 88 71 216 137 51 Jezioro Małe NORDIC 6 62 99 82 7,5 pułapki 465 15 207 63 90 suma 559 15 216 74 73 żak 5 88 125 103 22 Jezioro Bobrowe pułapki 354 16 149 69 89 suma 359 16 149 70 85 Źródło: Opracowanie własne

Tomasz Kuczyński, Anna Barańska, Piotr Pieckiel

Rysunek 2. Struktura ilościowa ichtiofauny w połowach pułapkami narybkowymi na jeziorze Małym w latach 2011-2012 [opracowanie własne]

Rysunek 3. Struktura ilościowa ichtiofauny w połowach pułapkami narybkowymi na jeziorze Małym w latach 2014-2015 [opracowanie własne]

Trawianka Perccottus glenii – inwazyjny gatunek w zbiornikach wodnych rezerwatu Mewia Łacha

Rysunek 4. Struktura ilościowa ichtiofauny w połowach pułapkami narybkowymi na jeziorze Bobrowym w latach 2011-2012 [opracowanie własne]

Rysunek 5. Struktura ilościowa ichtiofauny w połowach pułapkami narybkowymi na jeziorze Bobrowym w latach 2014-2015 [opracowanie własne]

Długości całkowite (Lt) osobników trawianki złowionych w obu zbiornikach w trakcie badań inwentaryzacyjnych, zawierały się w przedziale od 15 do 216 mm (tab. 1) przy średniej długości osobniczej wynoszącej 72 mm. W połowach realizowanych w latach 2014-2015 rozmiar łowionych osobników tego gatunku był podobny (16-200 mm). Są to typowe dla trawianki długości ciała [31] jednak długości maksymalne odbiegają od stwierdzanych w innych rejonach Polski i są znacznie wyższe. Na innych badanych stanowiskach tego gatunku w naszym kraju, długości łowionych

Tomasz Kuczyński, Anna Barańska, Piotr Pieckiel osobników wynosiły: w środkowej Wiśle 1,5-9 cm [30], w Zalewie Włocławskim 6,9-10,5 cm [11], w stawach w okolicy Krakowa 77,7-106,5 mm [24] oraz 30-120 mm w dorzeczu Warty pod Poznaniem [1]. Świadczy to o wyjątkowo korzystnych warunkach dla wzrostu trawianki w małych jeziorach rezerwatu Mewia Łacha. Ze złowionego w latach 2014-2015 materiału analizom składu pokarmowego poddano 392 ryby: 234 z jeziora Małe i 158 z jeziora Bobrowego. Spośród nich 5 osobników miało puste przewody pokarmowe. Skład jakościowy. Dieta trawianki w obu jeziorach była zróżnicowana. Ogólnie zidentyfikowano 50 składników pokarmowych, m.in.: skorupiaki, larwy owadów: muchówek, jętek, ważek, chruścików, chrząszczy; ślimaki oraz ryby (tab. 3). Skład- niki te zostały odnotowane również w diecie trawianki z innych rejonów Polski i Europy [8, 12, 18, 25]. Najczęściej występującym składnikiem pokarmowym ryb w obu jeziorach, były larwy owadów ochotkowatych – Chironomidae. U ryb w jeziorze Małym odnotowano je u 95% osobników, natomiast w Bobrowym u 68% osobników. W badaniach przeprowadzonych w Zbiorniku Włocławskim larwy Chironomidae były drugim co do częstości występowania składnikiem w diecie trawianki [8]. Larwy jętek – Ephemeroptera również były często występującym pokarmem, zidentyfikowano je średnio w 32% badanych przewodów pokarmowych trawianek w obu jeziorach. Częstość występowania pozostałych składników pokarmowych różniła się w zależności od zbiornika. W jeziorze Bobrowym u niemal 60% ryb odnotowano skorupiaki planktonowe: widłonogi i wioślarki, a u 40% ryb małżoraczki – drobne skorupiaki bentosowe, których udział procentowy w biomasie był znikomy (< 1%). W zbiorniku tym ważnym składnikiem diety były ślimaki stwierdzone u 45% ryb, podczas gdy w jeziorze Małym odnotowano je u 7% osobników. Trudno określić przyczynę różnic w diecie trawianek z obu zbiorników, z uwagi na brak jakichkolwiek informacji na temat struktury jakościowo-ilościowej organizmów roślinnych i zwie- rzęcych zasiedlających akweny.

Tabela 3. Częstotliwość występowania głównych składników pokarmowych Jezioro Małe Jezioro Bobrowe Składniki pokarmowe n = 230 n = 157 CRUSTACEA (skorupiaki) skorupiaki Copepoda (widłonogi) 16,64 58,01 planktonowe Cladocera (wioślarki) 21,55 57,74 skorupiaki bentosowe Ostracoda (małżoraczki) 4,43 39,73 Harpacticoida - 0,86 Ispoda (równonogi) Asellidae (ośliczki) 9,40 24,58 INSECTA (owady) Diptera (muchówki) larwy Chironomidae (ochotkowate) 95,80 68,04 Ceratopogonidae 11,60 19,86 (mokrzecowate) Chaoboridae 1,77 0,52 (wodzieniowate)

Trawianka Perccottus glenii – inwazyjny gatunek w zbiornikach wodnych rezerwatu Mewia Łacha

Culicidae (komarowate) 0,72 1,25 Psychodidae (ćmiankowate) 1,36 7,80 Ptychopteridae - 3,65 Stratiomyidae (lwinkowate) 0,28 - Tipuloidea (koziułkowate) 0,40 14,98 Inne 3,64 10,99 poczwarki Chironomidae (ochotkowate) 34,54 5,06 Ceratopogonidae 0,28 0,50 (mokrzecowate) Tipuloidea - 1,25 Inne 1,74 0,52 imago - 0,72 2,44 Coleoptera (chrząszcze) Odonata (ważki) Anisoptera (różnoskrzydłe) 1,37 - larwy Zygoptera (równoskrzydłe) 11,12 0,50 Trichoptera (chruściki) larwy 24,51 7,42 Lepidoptera (motyle) larwy 5,96 6,51 Ephemeroptera (jętki) larwy 29,86 35,36 Heteroptera Gerromorpha (nawodne) 2,25 3,50 (pluskwiaki) Nepomorpha (wodne) 3,12 11,09 MOLUSCA (mięczaki) Gastropoda (ślimaki) 6,97 45,04 PISCES (ryby) Perccottus glenii (trawianka) 1,37 0,71 Ryby niezidentyfikowane 4,76 8,48 Jaja trawianki 2,13 3,29 AMPHIBIA (płazy) Kijanki 1,02 2,86 INNE Rośliny Makroglony 28,50 34,78 Naczyniowe 39,35 26,57 Źródło: Opracowanie własne

Skład ilościowy w jeziorze Małym wśród składników treści pokarmowej trawianek największy udział procentowy w biomasie, odpowiednio 67% i 40%, miały larwy owa- dów z rodziny ochotkowatych (rys. 6). Występują one we wszystkich typach zbiorników słodkowodnych, a w wielu stanowią dominującą grupę makrofauny bezkręgowej. Bardzo licznie występują w osadach dennych, gdzie są w stanie przetrwać niedobór lub okresowy brak tlenu [16]. Larwy pozostałych owadów również wyróżniały się znacznym udziałem w biomasie pokarmu, przede wszystkim larwy ważek różnoskrzydłych (7,5%) i jętek (5,5%). Organizmy te były istotną grupą komponentów diety trawianki badanej na Węgrzech [12]. Ważnym składnikiem diety trawianki w jeziorze Małym były ryby, w tym przedstawiciele tego samego gatunku, których udział biomasy przek- roczył 18%. Badania preferencji pokarmowych trawianki przeprowadzone na Słowacji [18] również wykazały obecność tego gatunku w diecie. Natomiast w składzie diety trawianki ze Zbiornika Włocławskiego stwierdzono ryby m.in. karpiowate, wystę- pujące licznie w zbiorniku [8]. W obecnych badaniach, w większości przypadków, ten

Tomasz Kuczyński, Anna Barańska, Piotr Pieckiel rodzaj składnika pokarmowego był w daleko posuniętym stopniu strawienia, w związ- ku z czym niemożliwe było stwierdzenie czy w treści pokarmowej trawianek były m.in. różanki. Ponadto w obu badanych zbiornikach w Ujściu Wisły w diecie odnotowano jaja trawianki, które stanowiły odpowiednio: 11% i 8% biomasy pokarmu w jeziorach Małym i Bobrowym (rys. 6). Dieta trawianki w jeziorze Bobrowym charakteryzowała się większym zróżnico- waniem składników pokarmowych. Dominowały skorupiaki planktonowe, stanowiące 15% biomasy ogólnej oraz larwy ochotkowatych, stanowiące 12% biomasy (rys. 6). Ważnym pokarmem były również inne organizmy bentosowe m. in. skorupiaki równonogie – ośliczki (16% biomasy) oraz ślimaki (18% biomasy). Grabowska i inni [8] wykazali, że ślimaki stanowiły 14% biomasy składników pokarmowych trawianki ze Zbiornika Włocławskiego. 100% Inne

90% Kijanki Jaja trawianki 80% Ryby 70% Ślimaki

60% Pluskwiaki

50% Larwy pozostałych owadów B (%B) B Imago chrząszczy 40% Larwy chrząszczy 30% Imago muchówek 20% Poczwarki muchówek

10% Larwy innych muchówek 0% Larwy ochotkowatych Jezioro Małe Jezioro Bobrowe

Rysunek 6. Procentowy udział biomasy składników pokarmowych (%B) w diecie trawianki w jeziorach: Małym i Bobrowym w okresie maj 2014 – kwiecień 2015 [opracowanie własne]

Częste i liczne występowanie bezkręgowców, chrząszczy, ważek czy jętek w składzie pokarmowym trawianki może wpłynąć na liczebność oraz obniżenie różnorodności gatunkowej ekosystemów, co zostało potwierdzone w badaniach Reshetnikov’a [25] dotyczących wpływu trawianki na populacje wodnych zwierząt, w tym płazów. Reshetnikov [25] zaobserwował negatywną korelację między obec- nością trawianki, a składem jakościowym i liczebnością bezkręgowców w zbiornikach

Trawianka Perccottus glenii – inwazyjny gatunek w zbiornikach wodnych rezerwatu Mewia Łacha wodnych. W miejscach występowania trawianki rzadko notowano dorosłe chrząszcze i ich larwy, a także larwy ważek czy ślimaki. Bezkręgowce te były liczne w sąsiednich zbiornikach, w których trawianka nie występowała. Podobna sytuacja miała miejsce z kręgowcami – w zbiornikach, w których bytowała trawianka różnorodność gatunkowa ryb i larw płazów była niższa niż w zbiornikach bez trawianki. Obecne badania potwierdziły, że trawianka może odżywiać się kijankami, przez co może spowodować spadek ich liczebności. Ochotkowate czy larwy jętek, będące ważną częścią diety trawianki są również istotnym pokarmem rodzimych gatunków ryb występujących w jeziorach Małym i Bobrowym, m.in. słonecznic Laucaspius delineatus czy karasi pospolitych Carassius carassius [17]. Gatunki te mogą więc konkurować o pokarm z inwazyjną trawianką. 4. Wnioski  trawianka ma wysoką zdolność do dominacji w strukturze gatunkowej dogodnych dla siebie siedlisk,  zróżnicowana dieta trawianki wskazuje na jej nieselektywny charakter odżywiania się, co jest typową cechą gatunków inwazyjnych,  trawianka może przyczyniać się do zmniejszenia liczebności współwystępujących gatunków bezkręgowców, płazów i ryb,  nie można jednoznacznie stwierdzić, że trawianka wywiera wpływ na współ- występujące gatunki ryb, w tym na chronioną różankę Rhodeus sericeus, m.in. wyżerając młodociane osobniki innych gatunków. Literatura 1. Andrzejewski W., Golski J. Mazurkiewicz J., Przybył A., Trawianka Perccottus glenii – nowy, inwazyjny gatunek w ichtiofaunie dorzecza Warty, Chrońmy Przyrodę Ojczystą, 67 (4), 2011, 323-329. 2. Antychowicz J., Perccottus glehni [sic] w naszych wodach, Komunikaty rybackie 2, 1994, 21-22. 3. Berg L.S., Ryby presnykh vod SSSR i sopredel’nykh stran, Tom 3. Moskva-Leningrad 1949. 4. Bogutskaya N.G., Naseka A.M., Perccottus glenii Dybowski, 1877, [w:] Freshwater Fishes of Russia, Zool Institute RAS, 2002 http://www.zin.ru/Animalia/pisces/eng/ taxbase_e/species_e//perccottus/perccottus_glenii_eng.pdf, 2019-05-06. 5. Casal C., Global documentation of fish introductions: the growing crisis and recommendations for action, Biological Invasion, 8, 2006, 3-11. 6. Clavero M., Garcia-Berthou E., Invasive species are a leading cause of animal extinctions, Trends in Ecology and Evolution, 20 (3), 2005, s. 110. 7. Copp G.H., Bianco P.G., Bogutskaya N.G., Erős T., Falka I., Ferreira M.T., Fox M.G., Freyhof J., Gozlan R.E., Grabowska J., Kováč V., Moreno-Amich R., Naseka A.M., Penáz M., Povž M., Przybylski M., Robillard M., Russell I.C., Stakénas S., Šumer S., Vila- Gispert A., Wiesner C., To be, or not to be, a non–native freshwater fish?, Journal of Applied Ichthyology 21, 2005, 242-262. 8. Grabowska J., Grabowski M., Pietraszewski D., Gmur J., Non-selective predator – the versatile diet of Amur sleeper (Preccottus glenii Dybowski, 1877) in the Vistula River (Poland), a newly invader ecosystem, Journal of Applied Ichthyology 25, 2009, 451-459.

Tomasz Kuczyński, Anna Barańska, Piotr Pieckiel

9. Grabowska J., Witkowski A., Kotusz J., Inwazyjne gatunki ryb w naszych wodach – zagrożenie dla rodzimej ichtiofauny, Użytkownik rybacki, nowa rzeczywistość, PZW, 2008, 90-96. 10. Hyslop E.J., Stomach contents analysis – a review of methods and their application, Journal of Fish Biology 17, 1980, 411-429. 11. Kakareko T., Perccottus glenii (Odontobutidae) – nowy gatunek ryby w Zbiorniku Włocławskim na Dolnej Wiśle, Przegląd Zoologiczny 42, 1999, 107-110. 12. Kati S., Mozsár A., Árva D., Cozma N.J., Czeglédi I., Antal L., Nagy S. A., Erős T., Feeding ecology of the invasive Amur sleeper (Perccottus glenii Dybowski, 1877) in Central Europe, International Review of Hydrobiology Volume 100, Issue 3-4, 2015, 116- 128. 13. Kautman J., Perccottus glenii Dybowski, 1877 vo vodach vychodneho Slovenska, Chranene Uzeme Slovenska 40, 1999, 20-22. 14. Kautman J., Tri nove druhy ryb na Slovensku, Biodiverzita Ichtyofauny ČR 3, 2000, 29-36. 15. Khan M.F., Panikkar P., Assessment of impacts of invasive fishes on the food web structure and ecosystem properties of a tropical reservoir in India, Ecological Modelling 220, 2009, 2281-2290. 16. Kołodziejczyk A., Koperski P., Bezkręgowce słodkowodne Polski. Klucz do oznaczania oraz podstawy biologii i ekologii makrofauny, Wydawnictwo Uniwersytetu Warszawskiego, Warszawa 2000, s. 250. 17. Koščo J., Lusk S., Halačka K., Luskova V., The expansion and occurrence of the Amur sleeper (Perccottus glenii) in eastern Slovakia. Folia Zoologica 52, 2003, 329-336. 18. Koščo J., Manko P., Miklisova D., Kosuthova L., Feeding ecology of invasive Perccottus glenii (Preciformes, Odontobutidae) in Slovakia, Czech Journal of Animal Science 53, 2008, 470-486. 19. Kuczyński T., Pieckiel P., Stanowisko trawianki Perccottus glenii w rezerwacie Mewia Łacha. Komunikaty Rybackie, Nr 6, 2011, 31-32. 20. Kuczyński T., Pieckiel P., Kolejne stanowiska trawianki Perccottus glenii w rezerwacie Mewia Łacha, Komunikaty Rybackie, Nr 5, 2012, 43-44. 21. Litvinov A.G., O’Gorman R., Biology of Amur sleeper (Perccottus glenii) in the delta of the Selenga River, Buryatia, Russia, Journal of Great Lakes Research, 22, 1996, 370-378. 22. Lodge D.M., Biological invasions: lessons for ecology, Trends in Ecology and Evolution 8, 1993, 133-137. 23. Nikolski G.W., Fishes of Amur river basin. Results of Amur ichthyological expedition of 1944-1949, Moscow, Russia, 1956, s. 551. 24. Nowak M., Popek W., Epler P., Range expansion of an invasive alien species, Chinese Sleeper, Perccottus glenii Dybowski, 1877 (Teleostei: Odontobutidae) in Vistula River drainage, Acta Ichthyol. Piscat. 38 (1), 2008, 37-40. 25. Reshetnikov A.N., The introduced fish, rotan (Perccottus glenii), depresses population of aquatic animals (macroinvertibrates, amphibians and fish), Hydrobiologia 510, 2003, 83-90. 26. Reshetnikov A.N., The fish Perccottus glenii: history of introduction to western regions of Eurasia, Hydrobiologia 522, 2004, 349-350. 27. Reshetnikov A.N., Ficetola G.F., Potential range of the invasive fish Amur sleeper (Percocottus glenii) in the Holarctic, Biological Invasions 13, 2011, 2967-2980. 28. Reshetnikov A.N., Spatio-temporal dynamics of the expansion of rotan Perccottus glenii from West-Ukrainian centre of distribution and consequences for European freshwater ecosystems, Aquatic Invasions 8(2), 2013, 193-206. 29. Rozporządzenie Ministra Środowiska i Rozwoju Wsi z dnia 17 stycznia 2003 r. zmieniające rozporządzenie w sprawie połowu ryb oraz warunków chowu, hodowli i połowu innych organizmów żyjących w wodzie (Dz.U. 2003 nr 17 poz. 160).

Trawianka Perccottus glenii – inwazyjny gatunek w zbiornikach wodnych rezerwatu Mewia Łacha

30. Terlecki J., Pałka R., Occurrence of Perccottus glenii Dybowski 1877 (Perciformes, Odontobutidae) in the middle stretch of the Vistula river, Poland. Archiwum Rybactwa Polskiego 7, 1999, 141-150. 31. Witkowski A., Trawianka Perccottus glenii Dybowski, 1877, [w:] Głowaciński Z., Okarma H., Pawłowski J., Solarz W. (red.), Gatunki obce w faunie Polski, Wydawnictwo internetowe Instytutu Ochrony Przyrody PAN w Krakowie, 2008, http://www.iop.krakow.pl/gatunkiobce/default7473.html?nazwa=opis&id=105&je=pl, 2019-05-06. 32. Zaret T.M., Paine T.R., Species introduction in a tropical lake, Science 182, 1973, 449-455.

Trawianka Perccottus glenii – inwazyjny gatunek w zbiornikach wodnych rezerwatu Mewia Łacha Streszczenie W 2011 i 2012 r. w dwóch zbiornikach wodnych w rezerwacie Mewia Łacha, położonych w obszarze Natura 2000 Ostoja w Ujściu Wisły przeprowadzono badania inwentaryzacyjne ichtiofauny w ramach opracowania projektu planu ochrony dla tego obszaru. W obu zbiornikach tj. jeziorze Małym i jeziorze Bobrowym, zaobserwowano inwazyjny gatunek obcy – trawiankę Perccottus glenii Dybowski, 1877, która zdecydowanie dominowała w liczebności wśród ichtiofauny (90%). Od czasu pojawienia się tego gatunku we wschodniej i centralnej Europie, w tym w Polsce (1993 r.), ryba ta stała się jednym z najbardziej inwazyjnych gatunków, spośród introdukowanych tu przedstawicieli ichtiofauny. Trawianka została wymieniona w Rozporządzeniu w sprawie połowu ryb oraz warunków chowu, hodowli i połowu innych organizmów żyjących w wodzie (Rozp. MRiRW z dnia 12 listopada 2001 r.) w celu ograniczenia jej rozprzestrzeniania się w wodach otwartych. W latach 2014-2015 w obu jeziorach ponownie wykonano badania ichtiologiczne. Ich celem była próba oceny wpływu trawianki na ekosystem tych zbiorników wodnych na podstawie składu pokarmowego. Podczas drugich w historii tych jezior połowów trawianka była ponownie najliczniejszym gatunkiem ryby, stanowiąc ponad 90% liczebności. Analiza żołądków wykazała, że ta drapieżna ryba może negatywnie wpływać na liczebność bezkręgowców i płazów. W jej diecie zidentyfikowano 50 składników, m.in.: skorupiaki, larwy owadów: muchówek, jętek, ważek, chruścików, chrząszczy; ślimaki oraz ryby. Słowa kluczowe: Trawinaka Perccotus glenii

Chinese sleeper Perccottus glenii – an invasive species in the water reservoirs of the Mewia Łacha nature reserve Abstract In 2011 and 2012, two water reservoirs in the Mewia Łacha reserve, located in the Natura 2000 Ostoja site in Vistula river mouth, were carried out inventory surveys of ichthyofauna as part of the development draft of the protection plan for this area. In both reservoirs, in the Małe Lake and the Bobrowe Lake, an invasive alien species chinese sleeper (Perccottus glenii Dybowski, 1877) was observed, which definitely dominated in the number of ichthyofauna (90%). Since the appearance of this species in eastern and central Europe, including Poland (1993), this fish has become one of the most invasive species among the ichthyofauna representatives introduced here. Chinese sleeper was mentioned in the national regulation on fishing breeding fish and other organisms living in water (Ustawa MRiRW of November 12, 2001) in order to limit its spread. In the years 2014-2015, ichthyological survey were performed again in both lakes. Their aim was an attempt to assess the impact of the digestate on the ecosystem of these water bodies based on the nutrient composition. During the second, in the history of these lakes, fishing Chinese sleeper was once again the most numerous species of fish, representing over 90% of the fish abundance. The analysis of stomachs has shown that this predatory fish can negatively affect the number of invertebrates or amphibians. 50 ingredients were identified in her diet, among others: crustaceans, insect larvae: dipterans, mayflies, dragonflies, caddis flies, beetles; snails and fish. Keywords: Chinese sleeper, alien species, ichthyofauna composition, fish diet

Grzegorz Kania1

Znaczenie krocionogów (Diplopoda) w ekotoksykologii. Czy Diplopoda są bioindykatorami środowiska?

1. Wstęp Krocionogi (Diplopoda) są trzecią gromadą stawonogów po owadach (Insecta) i pajęczakach (Arachnida) pod względem bioróżnorodności i znaczenia w przyrodzie [1-3]. Nazwa Wije (Myriapoda) jest obecnie nietaksonomicznym określeniem zróżni- cowanej grupy stawonogów, do której należą Symphyla (Drobnonogi), Pauropoda (Skąponogi), Diplopoda (Krocionogi = dwuparce) oraz Chilopoda (Pareczniki = jednoparce). Dawniej krocionogi i owady łączono w monofiletyczny podtyp Tracheata (Tchawkowce). Jednakże badania molekularne wykazały bliskie powiązania filogene- tyczne krocionogów ze skorupiakami [4-6]. Krocionogi są starą filogenetycznie grupą wykazaną z okresu Dewonu i Karbonu [7, 8]. Dotychczas opisano ponad 12000 gatunków w 144 rodzinach w 16 rzędach [1, 3, 4, 9]. W Polsce Stojałowska i Staręga [10] i Jędryczkowski [11] opisali 84 gatunki krocio- nogów. Taksonomia numeryczna wykazała 86 gatunków [12], a dalsze badania pot- wierdziły w Polsce 87 gatunków krocionogów, które reprezentują 6 rzędów: Poly- xenida, Glomerida, Polyzoniida, Julida, Polydesmida i Chordeumatida [13, 14]. Jastrzębski [15] znalazł i opisał gatunek Brachyiulus jawlowskii na zalewanych łąkach w dolinie rzeki Bug w ,,Podlaskim Przełomie Bugu” w Polsce. Krocionogi są saprofagami biorącymi udział w dekompozycji szczątków organicznych i w krążeniu pierwiastków w przyrodzie. Aktywność krocionogów obejmuje różne poziomy profilu glebowego, ściółkę, korę żywych i martwych drzew. Niektóre gatunki krocionogów żyją stale pod korą drzew np. Nemasoma varicorne. Natomiast inne np. Polyxenus lagurus, Proteroiulus fuscus i Ommatoiulus sabulosus żyją zarówno pod korą drzew, jak i w ściółce [16-20]. Krocionogi i inni przedstawiciele fauny glebowej powodują mieszanie się organicznych składników gleby z cząstkami mineralnymi co sprzyja porowatości i przewietrzaniu gleby. Krocionogi produkują ogromne ilości odchodów, które są wydalane do gleby. Odchody wzbogacają glebę w łatwiej i szybciej rozkładane związki mineralne [21-23]. Diplopoda wraz z Insecta, Chilopoda, Isopoda i Acari zasiedlają tereny porolne, pozrębowe, hałdy i ugory przyczyniając się do wzbogacenia gleby w pierwiastki, mineralizację i równowagę ekosystemów [24-30]. Kime i Golovatch [20] podali 5 ekomorfologicznych form życia krocionogów: stratobionty, troglobionty, geobionty, ksylobionty oraz epifitobionty. Stratobionty żyjące w ściółce i na jej wierzchniej warstwie dominują u Diplopoda; Troglobionty żyjące w jaskiniach i zasiedlające wejścia do jaskiń troglokseny np. Trachysphaera costata Waga, 1857 (Glomerida), Brachychaeteuma bradeae Brölemann & Brade-Birks, 1917 i Hungarosoma bokori Verhoeff, 1928 [31-34].

1 [email protected], Uniwersytet Medyczny, Katedra i Zakład Biologii i Parazytologii, ul. Radziwił- łowska 11, 20-080 Lublin.

Znaczenie krocionogów (Diplopoda) w ekotoksykologii. Czy Diplopoda są bioindykatorami środowiska?

Geobionty żyjące w głębszych warstwach gleby. Przykładem geobionta jest Geoglomeris subterranea Verhoeff, 1908 (Glomerida), gatunek żyjący w glebie wnikając do 20 cm głębokości i często występuje w jaskiniach [35, 36]. Ksylobionty, czyli gatunki żyjące pod korą drzew obejmujące wszystkie znane formy życia krocionogów np. Polydesmida, Platydesmida, Polyxenida i Glomerida oraz Julida np. Proteroiulus fuscus Am Stein, 1857 [37, 38]. Epifitobionty to gatunki krocionogów wspinające się na rośliny, o bardzo małych rozmiarach ciała np. Apomus Cook, 1911, Catharosoma Silvestri, 1897 (Polydesmida) opisane w bromeliach [39]. Epinannolene exilio Broleman, 1904 (Spirostreptida) jako dendrobiont występujący w lasach Brazylii [20]. Najliczniej zasiedlane przez krocionogi są lasy liściaste i mieszane, gdzie znajdują się martwe pnie, wykroty i grube pokłady ściółki dające najbardziej dogodne warunki dla różnorodności gatunkowej [20, 28, 40]. Krocionogi są epigeiczną makrofauną w umiarkowanym, subtropikalnym i tropikalnym lesie. Najwięcej krocionogów żyje w wilgotnym lesie równikowym [41- 43]. W lasach liściastych najliczniej występują krocionogi i równonogi (Isopoda) oraz larwy i postacie dorosłe owadów m.in. muchó- wek i chrząszczy oraz roztoczy. Krocionogi jako detrytofagi rozkładają ściółkę i zwięk- szają powierzchnię substratu, która jest zasiedlona przez mikroorganizmy [23, 44, 45]. Krocionogi należą do stenobiontów i eurybiontów. Krocionogi np. Ommatoiulus sabulosus Linnaeus, Cylindroiulus caeruleocinctus Wood oraz Chamberlinius hualienensis Wang i Urostreptus atrobrunneus Pierozzi i Fontanetti żyją w ekotonach, agrocenozach i w synantropijnych środowiskach i często wędrują masowo wokół domów mieszkalnych [19, 46-54]. 2. Zastosowanie fauny glebowej do oceny zanieczyszczeń środowiska – bioindykacja Badania bioindykacyjne prowadzą do znalezienia organizmów gromadzących substancje toksyczne, których poziom w ciele osobnika jest podstawą oceny stopnia zanieczyszczenia środowiska. Bioindykatory są gatunkami lub grupami gatunków, które mają zastosowanie w ekosystemach lub laboratoryjnych testach toksyczności w celu określenia jakości środowiska. Bioindykator (organizm wskaźnikowy, biowskaźnik) to organizm służący w bioindykacji do oceny stanu środowiska lub stopnia zanieczyszczenia środowiska, dzięki jego wrażliwości na zanieczyszczenia lub zdolności do ich akumulacji. Wskaźniki biologiczne to gatunki o znanych wymaganiach ekologicznych, małej zmienności genetycznej, dostępne i stenotopowe. Doświadczenia laboratoryjne wykorzystujące organizmy do oceny skutków działania substancji w środowisku nazywamy biotestami. Jakość środowiska ocenia się wykorzystując zarówno rośliny, jak i zwierzęta. Klasycznym przykładem bioindykatora zanieczyszczeń chemicznych powietrza są porosty (Lichenes). Wskaźnikami czystej wody są m.in. niektóre bakterie, sinice i orzęski [55]. Badania bioindykacyjne gleby prowadzi się z zastosowaniem przedstawicieli fauny glebowej m.in. Acarina, Enchytraeidae, Nematoda, Lumbricidae [56, 57], owadów (Insecta: Collembola, Diptera), równonogów (Crustacea: Isopoda, Oniscidea), pareczników (Chilopoda) i krocionogów (Diplopoda) [58]. Krocionogi są bardzo

Grzegorz Kania tolerancyjne na kadm (Cd), ołów (Pb) i cynk (Zn) [59, 60] i są uznawane za wskaźniki zanieczyszczenia środowiska [61]. W obszarze zurbanizowanym zgrupowania mezofauny były liczne i różnorodne w glebach z wysoką zawartością szczątków organicznych i wody oraz niską zawartością metali Cu, Pb i Zn. Najbardziej odporne na środowisko miejskie były Acarina, Enchytraeidae, Collembola i Nematoda. Są to wskaźniki zanieczyszczeń gleb. Diplopoda odgrywają ważną rolę w dynamice ekosystemów lądowych aktywnie uczestnicząc w dekompozycji. Powierzchnia ściółki rozdrobniona przez krocionogi zwiększa się tysiące razy. Krocionogi są składnikiem fauny edaficznej wystawionej na zanieczyszczenia gleby. Zanieczyszczenia metalami ciężkimi mają wpływ na dekom- pozycję oraz obniżenie różnorodności gatunków mikrofauny, mezofauny i makrofauny w ekosystemach lądowych [58, 62]. Niektóre grupy bezkręgowców są stosowane w testach toksyczności. Najczęściej wykorzystuje się dżdżownice np. Eisenia fetida, skoczogonki (Insecta: Collembola) np. Falsomia candida, równonogi (Crustacea, Isopoda, Oniscidea) np. Oniscus asellus i Porcellio scaber oraz krocionogi (Diplopoda) np. Glomeris marginata to gatunki odpowiednie do oceny jakości gleby [63- 66]. Diplopoda rozwijają mechanizmy fizjologiczne, które minimalizują wpływ metali na ich przeżycie. Badania wykazały, że Glomeris marginata znacząco obniżają pobieranie ściółki z Cd, Cu, Pb i Zn. W pokarmie krocionogów jest duża zawartość wapnia. W zanieczyszczonych lasach nie występują gatunki z rzędów Julida i Glo- merida, a występują nieliczne populacje rzędu Polydesmida w porównaniu do niezanieczyszczonych biotopów leśnych [65]. Badania przeprowadzone przez Hopkin i wsp. [65] na Glomeris marginata wykazały, że gatunek ten nie gromadzi ołowiu, pomimo że podłoże zawierało ołów. Natomiast późniejsze analizy wykazały wysoki poziom ołowiu w jelitach Glomeris marginata zebranych ze stanowisk zanieczyszczonych ołowiem [67]. Ponadto Read i Martin [68] znaleźli wysoką zawartość metali u osobników Glomeris marginata z zanieczyszczonych miejsc, a niską zawartość metali w ciele tego gatunku z niezanieczyszczonych stanowisk. Przeżywalność krocionogów była niższa u osobników żyjących w ściółce zanieczyszczonej. Read i wsp. in. [59] odnotowali, że niektóre gatunki Diplopoda mogą występować częściej w glebach zanieczyszczonych metalami ciężkimi. Krocionogi Glomeris hexasticha [69] żyją w różnych biotopach z wysoką zawar- tością metali ciężkich. Natomiast u krocionoga piaskowego Ommatoiulus sabulosus nie wykazano znaczących różnic w zawartości metali ciężkich osobników zebranych z Górnego Śląska i Lublina [70]. Glomeris hexasticha i Ommatoiulus sabulosus nie są wrażliwe na różną zawartość metali ciężkich w glebach i nie są bioindykatorami zmian w środowisku. Akumulacja metali u lądowych saprofagów oparta na analizie pierwiastków w glebie i w ich ciałach jest użyteczna w ekotoksykologicznych testach na Trigoniulus corallinus i Rhinocricus padbergi (Spirobolida). Stężenie ołowiu było oznaczone w gruczołach repugnatorialnych, kutikuli i jelicie zarówno Trigoniulus corallinus, jak i Rhinocricus padbergi. Analizowane osobniki T. corallinus wykazują większą wrażliwość na ołów niż R. padbergi [71].

Znaczenie krocionogów (Diplopoda) w ekotoksykologii. Czy Diplopoda są bioindykatorami środowiska?

Według innych analiz gatunki krocionogów Oxidus gracilis i Chamberlinius hualienensis (Polydesmida) nie są biowskaźnikami stężenia metali i mechanizmów regulacji w glebie [72, 73]. Stężenie metali ciężkich było oznaczone u krocionoga Apfelbekia insculpta endemicznego drapieżnego gatunku żyjącego w jaskiniach w południowej Europie. Analiza wykazała bioakumulacje pierwiastków w kolejności: Pb> Ni> Hg> Cr> Fe> Cd> Mn> Zn> As> Cu. Stężenie Cu, Fe i Ni było wyższe u samic niż u samców Apfelbekia insculpta [74]. Jednakże zanieczyszczenie metalami ciężkimi nie jest dominującym czynnikiem wpływającym na różnorodność gatunków i zagęszczenie populacji równonogów i kro- cionogów. Brak negatywnego wpływu metali ciężkich można wyjaśnić niską akumu- lacją metali w glebie, mechanizmami obronnymi i zróżnicowaniem zawartości podłoża organicznego [75, 76]. Zwiększenie produkcji białek szoku termicznego hsp70 przez organizmy wystawione na stres środowiska (działanie na stabilność wewnątrz- komórkowych białek) jest uniwersalnym markerem stresu. Badania białek hsp70 były przeprowadzone na krocionogu Julus scandinavius wystawionym na różne stężenia metali. Wykazano, że J. scandinavius żyjąc w ściółce zanieczyszczonej z różnym stężeniem kadmu zwiększa ekspresje białka hsp70. Wysoki poziom hsp70 odnotowano u krocionogów narażonych na wysokie stężenia Zn i Cd [77- 79]. Analiza populacji krocionoga Julus scandinavius z terenów bardzo zanieczyszczonych metalami Cd, Pb i Zn wykazała, że średni poziom hsp70 był niski. Populacje tego gatunku krocionoga nie są bardzo wrażliwe na zanieczyszczenia [80]. Krocionóg Polyzonium germanicum jest gatunkiem występującym w biotopach leśnych typu grąd, buczyna i ols w starych pniach oraz torfowiskach [47, 81-83] oraz w podmiejskich obszarach leśnych [49, 51, 84-88]. Polyzonium germanicum jest biowskaźnikiem w stosunku do zmieniających się czynników środowiska bardzo wrażliwym na zanieczyszczenia w glebie i ściółce (Kania obserwacje własne). 2.1. Zastosowanie Diplopoda w celu identyfikacji uszkodzeń komórek i tkanek spowodowanych zanieczyszczeniem środowiska. W ultrastrukturze jelita środkowego niektórych badanych gatunków Diplopoda m.in. Cylindroiulus silvarum, Glomeris marginata, Julus scandinavius, Polydesmus angustus zebranych z terenów zanieczyszczonych Cd, Pb i Zn stwierdzono kondensacje cytoplazmy komórek. Analiza wykazała, że Pb i Cd są przechowywane w jelicie, szczególnie nabłonku jelita środkowego. Natomiast cynk gromadzi się w kutikuli i pobli- skich tkankach [89]. Gatunki takie określa się histopatologicznymi biomarkerami. U krocionogów badanie histopatologiczne jelita środkowego odgrywa ważną rolę w procesie detoksykacji i wydzielaniu ksenobiotyków. Biomarker to każda biologiczna odpowiedź na działanie związku chemicznego na poziomie osobniczym lub niższym, wskazująca na odchylenie od stanu prawidłowego. Zazwyczaj ograniczona do odpowiedzi na poziomie całego organizmu lub niższym. Za biomarkery uważa się pomiary biochemiczne, fizjologiczne, histologiczne, morfologiczne i behawioralne. Najczęściej biomarkery dzieli się na biomarkery narażenia i skutków toksycznych [90, 91, 92, 93].

Grzegorz Kania

3. Krocionogi a radioaktywne pierwiastki (radionuklidy) Awaria w kompleksie energetycznym w Czarnobylu w 1986 roku spowodowała opad promieniotwórczy w większości Europy, szczególnie w Skandynawii i obszarach północnozachodnich. Gromadzenie się radioaktywnego cezu (Cs) u krocionoga Cylindroiulus britannicus po awarii reaktora atomowego przeanalizowała Rantala [94]. Autorka wykazała, że krocionogi zawierały bardzo wysoki poziom radioaktywnego cezu 137 Cs, a ich postacie juwenilne krocionogów były najbardziej skażone [94]. Relatywnie powoli rozkładające się izotopy 137 Cs, 90 Sr wpływają na rośliny i faunę glebową na wiele dekad. Radionuklidy niszczą DNA, zmieniają tkanki i działają toksycznie na integument Diplopoda. Niektóre izotopy radioaktywne np. 131I, 137 Cs, 90Sr wnikają do tkanek wraz z pokarmem. Izotopy radioaktywne działają jako biologiczne równoważniki dla znanych biogennych pierwiastków np. takich jak pary Ca - 90 Sr i K - 137 Cs. Większość radionuklidów wnika w glebę. Z powodu wertykalnej wędrówki radionuklidów w profil gleby fauna żyjąca w głębszych warstwach jest dobrym wskaźnikiem radioaktywności na dłuższy czas. Cez (137 Cs) gromadzi się głównie na powierzchni gleby, podczas gdy stront (90 Sr) wnika w głębsze warstwy gleby. Opad promieniotwórczy ze zniszczonego reaktora spowodował silne skażenie 70% powierzchni Białorusi. Maksimova [95] badała wpływ promieniotwórczego skażenia po awarii reaktora atomowego w Czarnobylu na zgrupowania krocionogów na Białorusi oraz mechanizmy obrony komórkowej. Różnorodność gatunkowa Diplopoda jest niska pod wpływem zwiększającego się skażenia radionuklidami. Śmiertelność była wyższa pośród postaci juwenilnych. Osobniki juwenilne krocionogów były prawie nieobecne w strefie największego skażenia po awarii reaktora. Autorka wykazała, że hemocyty we wczesnych etapach skażenia promieniotwórczego podlegają fagocytozie. Później liczba i funkcja hemocytów ulegają znacznemu zmniejszeniu. Widoczne są morfologiczne zmiany takie jak liza, przemieszczenie jądra komórki, pęcznienie cytoplazmy i wakuolizacja. Cytoplazma staje się homogenna [95]. Zaitsev i wsp. (2014) opisał wpływ promieniowania jonizującego po katastrofie w Czernobylu na faunę glebową Nematoda, Tardigrada, Acari, Collembola, Lumbri- cidae, Isopoda i Diplopoda. Autor wykazał, że postacie dorosłe Diplopoda są bardziej odporne na promieniowanie gamma niż Isopoda [96]. Natomiast jedną z przyczyn niskiej różnorodności gatunkowej lądowych Lumb- ricidae i Diplopoda, w rejonie zlikwidowanych kopalń uranu jest gleba piaszczysta i płytki profil gleby w niektórych miejscach. Stwierdzono bioakumulację cezu Cs, radu Ra, ołowiu Pb i uranu U w tkankach Lumbricidae (sześć gatunków) i Diplopoda: Julida Pachyiulus cattarensis i Megaphyllum hercules. Pośród zebranych osobników Diplopoda przeważają formy dorosłe. Struktura płci wykazała dominację samic nad samcami na każdym etapie badań [97].

Znaczenie krocionogów (Diplopoda) w ekotoksykologii. Czy Diplopoda są bioindykatorami środowiska?

Literatura 1. Brewer M.S, Sierwald P., Bond J.E., Millipede Taxonomy after 250 Years: Classification and Taxonomic Practices in a Mega-Diverse yet Understudied Arthropod Group, PLOS ONE 7(5), 2012, s. 1-12, e37240, doi:10.1371/journal.pone.0037240. 2. Kime R.D., Enghoff H., Atlas of European Millipedes (Class Diplopoda): volume 1, Orders Polyxenida, Glomerida, Platydesmida, Siphonocryptida, Polyzoniida, Callipodida, Polydesmida Sofia-Moscow: Pensoft, 2011, s. 282. 3. Shelley R.M., Taxonomy of extant Diplopoda (Millipedes) in the modern era: perspectives for future advancements and observations on the global diplopod community (Arthropoda: Diplopoda), Zootaxa 1668, 2007, s. 343-362. 4. Sierwald P., Bond J.E. Current status of the Myriapod Class Diplopoda (Millipedes): taxonomic diversity and phylogeny, Annual Review of Entomology 52, 2007. s. 401-420. 5. Wytwer J., Wije (Myriapoda), [w:] Bogdanowicz W., Chudzińska E., Pilipiuk I., Skibińska E. (eds.), Fauna Polski. Wydawnictwo Muzeum i Instytutu Zoologii PAN Warszawa III, 2008, s. 327-328. 6. Shear W.A., Edgecombe G.D., The geological record and phylogeny of the Myriapoda, Arthropod Structure & Development 39, 2010, s.174-190. 7. Hannibal T., Krzemiński W., A palaeosomatid millipede (Archipolypoda: Palaeosomatida) from the Carboniferous (Namurian A) of Silesia, Poland, Polish Journal of Entomology 74, 2005, s. 205-217. 8. Edgecombe G., Diplopoda- Fossils, [w:] Treatise on Zoology-Anatomy, Taxonomy, Biology (Minelli A. ed.), Brill Leiden Boston. The Myriapoda 2, 2015, s. 337- 351. 9. Enghoff H., Golovatch S.I., Short M., Stoev P., Wesener T., Diplopoda- taxonomic overview, [w:] Minelli A. ed. The Myriapoda. Treatise on Zoology-Anatomy, Taxonomy, Biology, Brill, Leiden-Boston 2, 2015, s. 363-453. 10. Stojałowska W., Staręga W., Krocionogi Diplopoda, Katalog Fauny Polski, PWN, Warszawa 1974, s. 71. 11. Jędryczkowski W.B., The distribution and ecology of the millipedes in Poland, Meyer E., Thaler K., Schedl K. eds. Advances in Myriapodology. Proccedings of the 8th International Congress of Myriapodology. Berichte Naturwissenschaftlich-Medizinischen Verein in Innsbruck Suppl. 10, 1992, s. 385-391. 12. Piróg Z., Stojałowska W., Gieryng R., Komputerowa analiza rozmieszczenia Diplopoda w Polsce, oparta na metodzie taksonometrycznej, Annales Universitatis Mariae Curie- Skłodowska Lublin- Polonia. XlV, 1990, s. 1-12. 13. Wytwer J., Krocionogi (Diplopoda), [w:] Bogdanowicz W., Chudzińska E., Pilipiuk I., Skibińska E. (eds.), Fauna Polski. Charakterystyka i wykaz gatunków, Wydawnictwo Muzeum i Instytutu Zoologii PAN Warszawa III, 2008, s. 335-343. 14. Wytwer J., Gromada: Krocionogi (dwuparce) – Diplopoda, [w:] Zoologia Stawonogi Tchawkodyszne. Błaszak Cz. (red.), Wydawnictwo Naukowe PWN, t. 2, Warszawa 2012, s. 29-52. 15. Jastrzębski P., Brachyiulus jawlowskii Lohmander, 1928, a millipede species new to the fauna of Poland (Myriapoda: Diplopoda), Fragmenta Faunistica 55(1), 2012, s. 1-3. 16. Stojałowska W., Krocionogi (Diplopoda) Polski, PWN, Warszawa, 1961, s. 216. 17. Tracz H., Studies on the ecology of Proteroiulus fuscus (Am Stein, 1857) (Diplopoda, Blaniulidae), Acta Zoologica Cracoviensa 21, 1984, s. 519- 576. 18. Kania G., Obserwacje nad morfologią Polyxenus lagurus (Diplopoda: Polyxenidae), Przegląd Zoologiczny 39, 1995, s.101-103. 19. Kania G., Tracz H., Mass occurrence and migration of Ommatoiulus sabulosus (Linnaeus) (Diplopoda, Julida: Julidae) in Poland, Peckiana 4, 2005, s. 57- 66.

Grzegorz Kania

20. Golovatch S.I., Kime R.D., Millipede (Diplopoda) distributions: a review, Soil Organisms 81(3), 2009, s. 565-597. 21. Tajovsky K., Feeding biology of the millipede Glomeris hexasticha (Glomeride, Diplopoda), Berichte nat.-med. Verein Innsbruck suppl.10, 1992, s. 305-311. 22. Gromysz-Kałkowska K., Szubartowska E., Bieńko M., Rola krocionogów w przyrodzie i gospodarce człowieka, Przegląd Zoologiczny 37, 1994, s. 25- 33. 23. David J.F., Diplopoda- Ecology. (Minelli, A. ed. ) Treatise on Zoology-Anatomy, Taxonomy, Biology. Brill, Leiden-Boston. The Myriapoda. Vol. 2, 2015, s. 303-327. 24. Tracz H., The role of Proteroiulus fuscus (Am Stein1857) (Diplopoda) in the circulation of some elements in the fresh pine forest, Annals of Warsaw Agricultural University, Forestry and Wood Technology 36, 1987, s.101-107. 25. Tracz H., Problemy udziału Diplopoda w dekompozycji materii organicznej borów świeżych, Wyd. SGGW, Warszawa 1993, s. 86. 26. Carcamo H.A., Abe T.A., Prescott C.E., Holl F.B., Chanway C.P., Influence of millipede on litter decomposition, N mineralization, and microbial communities in a coastal forest in British Columbia, Canada. Canadian Journal Forest Research 30, 2000, s. 817-826. 27. Dunger W., Voigtlander K., Soil fauna (Lumbricidae, Collembola, Diplopoda and Chilopoda) as indicators of soil eco-subsystem development in post-mining sites of eastern Germany – a review, Soil Organisms 81 (1), 2009, s. 1-52. 28. Stasiov S., Millipede (Diplopoda) communities in mixed oak-hornbeam forest stands- effects of selected site factors, Polish Journal Ecology 57 (4), 2009, s. 785-792. 29. Schreiner A., Decker P., Hannig K., Schwerk A., Millipede and centipede (Myriapoda: Diplopoda, Chilopoda) assemblages in secondary succession: variance and abundance in Western German beech and coniferous forests as compared to fallow ground, Web Ecology 12, 2012, s. 9-17, www.web-ecol.net/12/9/2012/ doi:10.5194/we-12-9-201. 30. Tajovsky K., Millipede succession in abandoned Fields, Fragmenta faunistica 43 Suppl, 2000, s. 361-370. 31. Kania G., Wytwer J., Mock A., Trachysphaera costata (Waga, 1857) – krocionóg odkryty podczas podróży naturalistów do Ojcowa, [w:] Zróżnicowanie i przemiany środowiska przyrodniczo-kulturowego Wyżyny Krakowsko-Częstochowskiej.Ojców Suppl. Tom 3, 2005, s. 81-84. 32. Gruber J., Zür Verbreitung von Trachysphaera costata (Waga, 1857) in Niederosterreich – eine für Osterreichs Fauna neue Diplopoden art (Diplopoda: Glomerida: Doderiidae), Contributions to Natural History 12, 2009, s. 565-583. 33. Rendoš M., Mock A., Miklisova D., Terrestrial isopods and myriapods in a forested scree slope: subterranean biodiversity, depth gradient and annual Dynamics, Journal of Natural History 50 (33-34), 2016, s. 2129-2142, dx.doi.org/10.1080/00222933.2016.1193642. 34. Mock A., Tajovský K., Žurovcová M., Jarošová A., Kocourek P., Gruber J., Angyal D., Spelda J., Hungarosoma bokori Verhoeff, 1928 (Diplopoda: Chordeumatida): new insights into its taxonomy, systematics, molecular genetics, biogeography and ecology. Zootaxa 4178(2), 2016, s. 234-256, doi.org/10.11646/zootaxa.4178.2.4. 35. Gruber J., Geoglomeris subterranea Verhoeff, 1908, neue für Österreichs Fauna (Diplopoda, Glomerida), Anzeiger der Österreichischen Akademie der Wissenschaften, mathematisch-naturwissenschaftliche Klasse 121 (7), 1985, s. 111-116. 36. Tajovsky K., Tuf I. H. An annotated checklist of the millipedes (Diplopoda) recorded in the Czech Republic, Acta Societatis Zoologicae Bohemicae 80, 2016, s. 33-37. 37. Tracz H., Diplopoda, Chilopoda i Isopoda w waloryzacji ekosystemów leśnych Leśnego Kompleksu Promocyjnego ,,Lasy Spalsko-Rogowskie”, Studia i Materiały CEPL w Rogowie R.15 zeszyt 35/2/, 2013, s. 36- 47.

Znaczenie krocionogów (Diplopoda) w ekotoksykologii. Czy Diplopoda są bioindykatorami środowiska?

38. Persson T., Lenoir L., Vegerfors B., Which macroarthropods prefer tree stumps over soil and litter substrates ?, Forest Ecology and Management 290, 2013, s. 30-39. 39. Schubart O., Sobre os Diplopoda dos estados do Parana e Santa Catarina, Arquivos do Museum Paranaense Curitiba 10(3), 1953, s. 1-156. 40. Zuo J., Fonck M., van Hal J., Cornelissen J. H., Berg M.P., Diversity of macro-detritivores in dead wood is influence by tree species, decay stage and environment, Soil Biology & Biochemistry 78, 2014, s. 288-297. 41. Loranger G., Ponge J.F., Lavelle P., Humus forms in two secondary semi-evergreen tropical forests, European Journal Soil Science 54, 2003, s. 17-24. 42. Enghoff H., Diplopoda – geographical distribution. In: Treatise on Zoology-Anatomy, Taxonomy, Biology. (ed. A. Minelli), 2015, The Myriapoda Vol. 2: 329- 336. 43. Alagesan P., Millipedes: Diversity, distribution and ecology. (A. K. Chakravarthy, S. Sridhara eds.) Arthropod Diversity and Conservation in the Tropics and Sub-tropics, 2016, s. 119- 137, DOI 10.1007/978-981-10-1518-2_ 7. 44. Tajovsky K., Santruckova H., Hanel L., Balik V., Lukesova A., Decomposition of faecal pellets of the millipede Glomeris hexasticha (Diplopoda) in forest soil, Pedobiologia 36, 1992, s. 146-158. 45. Alagesan P., Millipedes as host for microbes – a review, International Journal of Microbiological Research 8, 2017, s. 19-24. 46. Voigtländer K., Mass occurrences and swarming behaviour of millipedes (Diplopoda: Julidae) in Eastern Germany, Peckiana 4, 2005, s. 181-187. 47. Voigtländer K., Preferences of common central european millipedes for different biotope types (Myriapoda, Diplopoda) in Saxony-Anhalt (Germany). International Journal of Myriapodology 6, 2011, s. 61-83, Doi: 10.3897/ijm.6.2172. 48. Fontanetti C.S., Calligaris I.B., Souza T.S., A millipede infestation of an urban area of the city of Campinas, Brazil and preliminary toxicity studies of insecticide Bendiocarb to the Urostreptus atrobrunneus Pierozzi and Fontanetti 2006, Arquivos do Instituto Biologico, Sao Paulo, 77(1), 2010, s. 165-166. 49. Kania G., Millipedes (Diplopoda) recorded in the town of Lublin (Poland). Urban Fauna. Studies of animal biology, ecology and conservation in European cities, [w:] P. Indykiewicz, L. Jerzak, Jörg Böhner and Brendan Kavanagh (eds.) UPT Bydgoszcz, 2011, s. 91-99. 50. Kania G., Kłapeć T., Seasonal activity of millipedes (Diplopoda) – their economic and medical significance, Annals of Agriculture and Environmental Medicine 19, 2012, s. 646- 650. 51. Kania G., Czyżowski P., Millipedes [Myriapoda: Diplopoda] in synanthropic sites of Puławy, Kazimierz Dolny and Nałęczów [Poland], Urban Fauna. Animal, Man, and the City- Interactions and Relationships, P. Indykiewicz, J. Böhner (eds.) Bydgoszcz, 2014, s. 55-64. 52. Kania G., Znaczenie gospodarcze krocionogów (Diplopoda), [w:] Nauki rolnicze i przyrodnicze – wybrane zagadnienia, Szala M., Maciąg K. red. Wydawnictwo Naukowe Tygiel, Lublin 2017, s. 103-121. 53. Zimmermann K., Röns: St. Magnus und die Tausendfüβler, Naturmonografie Jagdberggemeinden 2013, s. 371-386. 54. Meyer-Rochow V.B., New observations- with older ones reviewed- on mass migrations in millipedes based on a recent outbreak on Hachijojima (Izu Islands) of the polydesmid diplopod (Chamberlinius hualienensis), Wang 1956): nothing appears to make much sense, Zoological research 36, 2015, s. 119-132.

Grzegorz Kania

55. Abratowska A., Zaniewski P., Wierzbicka M., Ocena bioindykacyjna stanu środowiska, Ekotoksykologia Rośliny, gleby, metale. (Wierzbicka M. ed.) Wyd. Uniw. Warszawskiego, Warszawa 2015, s.124- 135. 56. Tisher S., Lumbricidae communities in soil monitoring sites differently managed and polluted with heavy metals, Polish Journal of Ecology 56, 2008, s. 635-646. 57. Tisher S., Earthworms (Lumbricidae) as a bioindicators: the relationship between in-soil and in-tissue heavy metal kontent, Polish Journal of Ecology 57, 2009, s. 513-523. 58. Santorufo L., Van Gestel Cornelis A. M., Rocco A., Maisto G. Soil invertebrates as bioindicators of urban soil quality, Environmental Pollution 161, 2012, s. 57-63. 59. Read H.J., Martin M.H., Rayner J.M.V., Invertebrates in woodlands polluted by heavy metals. An evaluation using canonical correspondence analysis, Water Air and Soil Pollution 106, 1998, s.17-42. 60. Grelle C., Fabre M.C., Leprete A., Descamps M., Myriapod and isopod communities in soils contaminated by heavy metals in northern France, European Journal Soil Science 51, 2000, s. 425-433. 61. Nogarol L.R., Fontanetti C.S., Acute and subchronic exposure of diplopods to substrate containing sewage mud: tissular responses of the Migut, Micron 41, 2010, s. 239- 246. 62. Heikens A., Peijnenburg W.J.G.M., Hendriks A.J., Bioaccumulation of heavy metals in terrestrial invertebrates, Environmental Pollution 113, 2001, s. 385-393. 63. Hopkin S.P., Martin M.H., Heavy metals in woodlice, Symposia of the Zoological Society of London 53, 1984, s. 143-166. 64. Hopkin S.P., Watson K., Martin M.H., Mould M.L., The assimilation of heavy metals by Lithobius variegates and Glomeris marginata (Chilopoda;Diplopoda), Bijdragen tot de Dierkunde 55, 1985, s. 88-94. 65. Hopkin S.P., Critical concentrations, pathways of detoxification and cellular ecotoxicology of metals in terrestrial arthropods, Functional Ecology 4, 1990, s. 321- 327. 66. Dallinger R., Berger B., Birkel S., Terrestrial isopods: useful biological indicators of urban metal pollution, Oecologia 89, 1992, s. 32-41. 67. Köhler H.R., Storch V., Alberti G., The impact of lead on the assimilation efficiency of laboratory-held Diplopoda (Arthropoda) preconditioned in different environmental situations, Oecologia 90, 1992, s. 113-119. 68. Read H.J., Martin M.H. A study of myriapod communities in woodlands contaminated with heavy metals, [w:] E.J. Brill, Leiden. Proccedings of the 7th International Congress of Myriapodology (Minelli A. ed.), 1990, s. 289-298. 69. Kania G., Lechowski J., Bioaccumulation of some elements in the millipede Glomeris hexasticha (Brandt, 1833) (Diplopda: Glomerida), Journal of Elementology 19, 2014, s. 155-164. 70. Kania G., Elements content in the millipede Ommatoiulus sabulosus (Linnaeus 1758); Arthropoda: Diplopoda, Ochrona środowiska i zasobów naturalnych 43, 2010, s. 17-25. 71. Buch A.C., Silveira- Sisinno C.L., Fernandes- Correira M.E. , Silva-Filho E.V., Food preference and ecotoxicological tests with millipedes in litter contaminated with merkury, Science of the Total Environment 633, 2018, s. 1173-1182. 72. Nakamura K., Taira J., Distribution of elements in the millipede, Oxidus gracilis C. L. Koch (Polydesmida: Paradoxosomatidae) and the relation to environmental habitats, Biometals 18, 2005, s. 651-658. 73. Nakamura K., Taira J., Higa Y., Internal elements of the millipede, Chamberlinius hualienensis Wang (Poydesmida: Paradoxosomatidae), Applied Entomology Zoology 40, 2005, s. 283-288. 74. Vranković J., Borković- Mitić S., Ilić B., Radulović M., Milošević S., Makarov S., Mitić B., Bioaccumulation of metallic trace elements an antioxidant enzyme activities in

Znaczenie krocionogów (Diplopoda) w ekotoksykologii. Czy Diplopoda są bioindykatorami środowiska?

Apfelbekia insculpta (L. Koch, 1867) (Diplopoda: Callipodida) from the cave Hadzi- Prodanova Pecina (Serbia), International Journal of Speleology 46, 2017, s. 99-108. 75. Köhler H.R., Körtje K.H., Alberti G., Content, absorption quantities and intracellular storage sites of heavy metals in Diplopoda (Arthropoda), Biometals 8, 1995, s. 37-46. 76. Hobbelen P.H.F., van den Brink P.J., Hobbelen J.F., van Gesten C.A.M., Effects of heavy metals on the structure and functioning of detritivore communities in a contaminated floodplain area, Soil Biology Biochemistry 38, 2006, s. 1596-1607. 77. Köhler H.R., Triebskorn R., Stocker W., Koetzel P.M., Alberti G., The 70 Kd heat shock protein (hsp70) in soil invertebrates: a possibile tool for monitoring environmental toxicants, Archives Environmental Contaminaton Toxicology 22, 1992, s. 334-338. 78. Zanger M., Köhler H.R., Colour change, a novel biomarker indicating sublethal stress in the millipedeJulus scandinavius Diplopoda), Biomarkers 1, 1996, s. 99-106. 79. Zanger M., Alberti G., Kuhn M., Köhler H.R., The stress 70 protein family in diplopods induction and characterization, Journal Comp. Physiol. B 165, 1996, s. 622-627. 80. Köhler H.R., Localization of metals in cells of saprophagous soil arthropods (Isopoda, Diplopoda, Collembola), Microscopy Res. Tech. 56, 2002, s. 393-401. 81. Jędryczkowski W.B., Krocionogi (Diplopoda) wybranych środowisk Roztocza, Fragmenta faunistica 37, 1994, 109-114. 82. Bogyó D., Korsós Z., Lazányi E., Hegyessy G., Millipedes (Diplopoda) from the Zemplen Mountains, Northeast Hungary, with two julid species new to the Hungarian fauna, Opuscula Zoologica 43(2), 2012, s. 131-145. 83. Kula E., Lazorik M., Relationship between soil type, humus form and makrofauna communities (Myriapoda and Isopoda) in forests of the Moravskoslezske Beskydy mountains, Czech Republic. Acta Zoologica Bulgarica 68, 2016, s. 269-280. 84. Jędryczkowski W.B., Synanthropisation of the Diplopoda fauna of Poland, [w:] Geoffroy J.J., Mauries J.P., Nguyen Duy-Jacquemin M. (eds.) Acta Myriapodologica Mem. Mus. natn. Hist. nat. 169, 1996, s. 209-212. 85. Hauser H., Voigtländer K., Doppelfüßer (Diplopoda) der Sächsischen Schweiz und der Umgebung von Dresden (Deutschland, Sachsen), Berichte der Naturforschenden Gesellschaft der Oberlausitz 16, 2008, s. 143-152. 86. Kocourek P., Mnohonožky (Myriapoda: Diplopoda) Prahy, Natura Pragensis, 21, 2013, s. 3-146. 87. Kocourek P., Mnohonožzky (Myriapoda: Diplopoda) Jizerských hor, Frýdlantské pahorkatiny, Jéstédského hřbetu a Liberecké kotliny (severni Čechy), Sbornik Severoceskeho Muzea, Přirodni Védy, Liberec 32, 2014, s. 123-154. 88. Stojałowska W., Materiały do poznania krocionogów (Diplopoda) Wyżyny Lubelskiej, Folia Societas Scientarum B., Lublin 1967/68, 7/8 : 83-93. 89. Köhler H.R., Alberti G., The effect of heavy metal stress of the intestine of diplopods, Meyer E., Thaler K., Schedl K. eds. Advances in Myriapodology. Proccedings of the 8th International Congress of Myriapodology. Berichte des Naturwissenschaftlich- Medizinischen Vereins in Innsbruck Suppl. 10, 1992, s. 257-267. 90. Fantazzini E.R., Fontanetti C.S., Camargo-Mathias M.I., Midgut of the millipede, Rhinocricus padbergi Verhoeff 1938 (Diplopoda: Spirobolida): histology and histochemistry, Arthropoda Selecta 11, 2002, s. 135-142. 91. Godoy J.A.P., Fontanetti C.S., Diplopods as bioindicators of soils: analysis of midgut of individuals maintained in substract containing sewage sludge, Water Air Soil Pollution 210, 2010, s. 389-398. 92. Souza T.S., Fontanetti C.S., Morphological biomarkers in the Rhinocricus padbergi midgut exposed to contaminated soil, Ecotoxicology and Environmental Safety 74, 2011, s. 10-18. 93. Walker C.H., Hopkin S.P., Sibly R.M., Peakall D.B., 10. Biomarkery [w:] Podstawy ekotoksykologii. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa 2002, s. 203-224.

Grzegorz Kania

94. Rantala M., Intensity of radation in some diplopods and chilopods reared in radioactive kompost, [w:] E.J. Brill, Leiden. Proccedings of the 7th International Congress of Myriapodology (Minelli A. ed.), 1990, s. 271-287. 95. Maksimova S., The effect of radioactive contamination caused by the Chernobyl nuclear accident on Diplopoda communities, Acta Zoologica Lithuania 12, 2002, s. 90-94. 96. Zaitsev A.S., Gongalsky K.B., Nakamori T., Kaneko N., Ionizing radiation effects on soil biota: application of lessons learned from Chernobyl accident for radioecological monitoring, Pedobiologia- Journal of Soil Ecology 57, 2014, s. 5-14. 97. Tsekova R.V., Bogoev V.M., Bioaccumulation of Cs, Ra, Pb and U in tissues of terrestrial invertebrates (Lumbricidae and Julidae) collected from liquidated uranium mine, Natura Montenegrina, Podgorica 9(3), 2010, s. 607-614.

Znaczenie krocionogów (Diplopoda) w ekotoksykologii. Czy Diplopoda są bioindykatorami środowiska ? Streszczenie W świetle literatury i badań własnych stwierdzono różną wrażliwość krocionogów na zanieczyszczenie środowiska. W pracy zebrano informacje o niektórych gatunkach Diplopoda np. Glomeris marginata, Trigoniulus corallinus i Rhinocricus padbergi (Spirobolida) jako biowskaźnikach zanieczyszczonych miejsc. Glomeris hexasticha i Ommatoiulus sabulosus nie są wrażliwe na różną zawartość metali ciężkich w glebach i nie są bioindykatorami zmian w glebie. Według innych analiz gatunki krocionogów Oxidus gracilis i Chamberlinius hualienensis (Polydesmida) nie są biowskaźnikami stężenia metali w glebie. Polyzonium germanicum jest biowskaźnikiem w stosunku do zmieniających się czynników środowiska bardzo wrażliwym na zanieczyszczenia w glebie i w ściółce. Histopatologiczne biomarkery mają zastosowanie u bezkręgowców w celu identyfikacji uszkodzonych komórek i tkanek pod wpływem zanieczyszczenia środowiska. U krocionogów badanie histopatologiczne jelita środkowego odgrywa ważną rolę w procesie detoksykacji i wydzielaniu ksenobiotyków. Wykazano wpływ promieniotwórczego skażenia po awarii reaktora atomowego w Czarnobylu na zgrupowania krocionogów. Różnorodność gatunkowa Diplopoda była niska pod wpływem skażenia radionuklidami w glebie. Większość radionuklidów wnika w glebę. Cez (137 Cs) gromadzi się głównie na powierzchni gleby, podczas gdy stront (90 Sr) wnika w głębsze warstwy gleby. Śmiertelność krocionogów była wyższa pośród postaci juwenilnych. Słowa kluczowe: krocionogi, Diplopoda

Role of millipedes (Diplopoda) in ecotoxicology. Are there millipedes environmental indicators of polluted sites ? Abstract Many papers and own results indicate different sensitivity of millipedes on environmental pollution. In this work , i have collected information on some species of millipedes such as Glomeris marginata, Trigoniulus corallinus, and Rhinocricus padbergi (Spirobolida) are bioindicators of polluted sites. Although, Glomeris hexasticha and Ommatoiulus sabulosus are not sensitive to different content of heavy metals in soil, and are not bioindicators of soil pollution. According to other studies millipedes Oxidus gracilis and Chamberlinius hualienensis (Polydesmida) can not be considered valuable indicators of soil disturbances. Polyzonium germanicum is bioindicator of environmental changes, and very sensitive on soil and litter pollution. Histopathological biomarkers have been applied to invertebrate species or the identification of cell and tissue damage resulting from environmental contamination. In millipedes, the midgut plays an important role in detoxification processes and excretion of xenobiotics. Bioaccumulation of radioactive materials has been evaluated in diplopods. Biodiversity of millipedes were low after migration of radionucleides in soil. Most of radionucleides enter into soil. Radioactive Cs accumulated mostly on uppermost soil layers, whereas 90 Sr enter into deeper soil layers. The accumulation of radioactive caesium 137 Cs, in millipedes were indicated following the Chernobyl nuclear accident of 1986. Levels were higher in younger specimens of diplopods. Juveniles were the most affected age group of millipedes. Keywords: millipedes, Diplopoda

Beata Kuczyńska1, Kamila Puppel1, Beata Madras-Majewska 2

Fitobiotyki jako alternatywa w prewencji mastitis i wzmocnienia jakości dietetycznej mleka w gospodarstwach eko-certyfikowanych

1. Wprowadzenie W gospodarstwach utrzymujących bydło użytkowane mlecznie w warunkach produkcji ekologicznej, czyli eko-certyfikowanych, zabiegi dotyczące zdrowia krów powinny być ukierunkowane przede wszystkim na profilaktykę, w której zabronione jest stosowanie antybiotyków. Zastosowanie ich w czasie jednego roku do leczenia krów powoduje, że muszą być one objęte okresem przestawiania (czyli konwersji, która trwa minimum 6 miesięcy) lub wybrakowane ze stada. Europejskie ustawodawstwo dotyczące chowu ekologicznego zwierząt gospodarskich podaje, że chemicznie syntetyzowane leki alopatyczne np. antybiotyki mogą być stosowane u zwierząt w gospodarstwach certyfikowanych jedynie, gdy nie dysponujemy skutecznie działającym środkiem alternatywnym. W przypadku zachorowań krów ekologiczni producenci stosują w pierwszej kolejności leki weterynaryjne pochodzenia naturalnego. Z dostępnej literatury wiadomo o działaniu alternatywnych leków dla zwierząt np. homeopatycznych czy fitobiotyków, jednakże jest ono wciąż słabo udokumentowane naukowo [2, 18]. Konsekwencją częstego lub niewłaściwego leczenia zwierząt antybiotykami są coraz powszechniej występujące wielooporne szczepy bakterii [9, 12]. Od lat obserwowany jest spadek wrażliwości m.in. pałeczek Salmonella, Escheri- chia coli oraz Campylobacter izolowanych od zwierząt na substancje przeciwbakteryjne. Według danych z raportów Głównego Inspektoratu Sanitarnego w Polsce bakterie te należą do odzwierzęcych czynników odpowiedzialnych za zatrucia pokarmowe występujące u człowieka [10]. Zapalenie wymienia, czyli mastitis obok zaburzeń metabolicznych i rozrodczych zaliczane jest do najpoważniejszych źródeł strat w produkcji mleka. W roli czynników etiologicznych mastitis występuje ponad 150 gatunków drobnoustrojów. Rolę dominującą w wywoływaniu zapaleń mają: Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli oraz wiele innych mikroorganizmów, tj.: Mycobacterium bovis, Aspergillus sp., a także glony i grzyby [7, 13, 16]. W zależności od czynnika etiologicznego, stopnia zmian zazwyczaj leczenie trwa ok. 2 tygodni. U 20-70% krów w stadzie stwierdza się postać mastitis (brak zmian klinicznych i zmian w mleku; wzrasta tylko liczba komórek somatycznych). Wyleczenie tej formy zapalenia wymienia trwa dość długo, od 3 do 6 miesięcy. Decyzja lekarza prowadzącego o podaniu antybiotyków krowom może powodować zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego, będące następstwem bakteriosta- tycznego ich wpływu na mikroflorę przewodu pokarmowego. Szczególnie sytuacja ta dotyczy przeżuwaczy, u których na skutek bakteriostazy mikroflory przedżołądków

1 Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, Wydział Nauk o Zwierzętach, Katedra Szczegó- łowej Hodowli Zwierząt, Zakład Hodowli Bydła, Pracownia Pszczelnictwa.

Beata Kuczyńska, Kamila Puppel, Beata Madras-Majewska może dochodzić także do zaburzeń w syntezie m.in. witamin z grupy B. Jedynie w razie konieczności (ratowania życia lub ulżenia w cierpieniu) zezwala się w tego rodzaju gospodarstwach na leczenie antybiotykami pod ścisłą kontrolą weterynarza. Jednakże redukcja antybiotyków wydaje się być koniecznym krokiem. Dlatego naukowcy szukają alternatywnych substancji, które mogą zastąpić antybiotyki [11, 14- 17]. W systemach produkcji konwencjonalnej najbardziej obiecujące są nanocząstki metaliczne ze względu na ich dobre właściwości antybakteryjne wobec opornych szczepów [7]. W gospodarstwach ekologicznych w takich przypadkach alternatywą dla antybio- tyków są fitobiotyki, które poprzez szerokie spektrum swojego działania (przeciwbakteryjne, przeciwbiegunkowe, przeciwzapalne i przeciwgorączkowe) poprawiają stan zdrowia zwierząt. Szczególną rolę w tej dziedzinie spełniają fitoncydy, wykazujące działanie bakteriostatyczne i bakteriobójcze [3-6]. Znajdują się one m.in. w czosnku czy cebuli – roślinach bardzo bogatych w substancje biologicznie aktywne i dość powszechnie uprawiane w warunkach ekologicznych. Wymienione fitobiotyki swoje dobroczynne działanie zawdzięczają głównie związkom fenolowym – flawonoidom [20]. Jednym z najsilniejszych flawonoidów jest kwercetyna. Jest to składnik wielu roślin leczniczych. Działanie lecznicze kwercetyny nie ogranicza się tylko do zmniejszania stanu zapalnego i obrzęku, ale przede wszystkim hamuje reakcje alergiczne oraz posiada silne właściwości antyoksydacyjne i przeciwbakteryjne. Największe stężenie kwercetyny znajduję się w zewnętrznych łuskach cebuli oraz w bulwach czosnku [1]. W niektórych sytuacjach czosnek może działać sto razy silniej niż antybiotyki, jest on skuteczniejszy niż erytromycyna i ciprofloksacyna. Ekorolnicy stosują napar z łusek cebulowych, który ma właściwości bakteriobójcze, niszcząc także bakterie oporne na działanie antybiotyków. Zapach i właściwości bakteriobójcze cebuli i czosnku wynikają także z zawartości organicznych związków siarki, które są aktywne nawet w bardzo małych stężeniach [19]. Cebula, poza niedoborami witaminy C, może uzupełniać niedobory witamin A, B1, B2, PP, a także wielu mikroelementów, przede wszystkim cynku i selenu, ważnych czynników w odporności przeciwwirusowej oraz przeciwutleniających i immunostymulujących. Ekstrakty z cebuli i czosnku wykazują również działanie anaboliczne, zmniejszając podatność na stres, a także niwelują negatywny wpływ substancji przeciw-odżywczych. Immunostymulacja polega na zmianie reaktywności układu immunologicznego w kierunku nasilenia odporności. Immunostymulacja nie zawsze odbywa się bezpośrednio, a aktywność immunolo- giczna preparatów roślinnych bądź substancji biologicznie czynnych w nich zawartych może się wyrażać różnymi efektami, m.in. wzmożoną aktywnością fagocytarną makrofagów, zwiększeniem liczby pobudzonych limfocytów B i T, wzrostem aktywności lizozymu czy też indukcją syntezy czynnika o działaniu przeciw- wirusowym – interferonu. 2. Opis doświadczenia i materiału Doświadczenia przeprowadzono w 2 gospodarstwach eko-certyfikowanych specjalizujących się w produkcji mleka. Doświadczenia przeprowadzono na krowach rasy polska holsztyńsko-fryzyjska odmiany czarno-białej (po 7 w każdej z 2 grup suplementacyjnych). Wyselekcjonowane ze stada podstawowego krowy znajdowały

100

Fitobiotyki jako alternatywa w prewencji mastitis i wzmocnienia jakości dietetycznej mleka w gospodarstwach eko-certyfikowanych się w zbliżonym przedziale wiekowym (1. i 2. laktacja), charakteryzowały się podobną wydajnością (15,08  3,28 kg/dzień) i wagą (550  50 kg). Eksperymentem były objęte krowy ze zdiagnozowanym subklinicznym stanem mastitis (minimum 7 sztuk w każdym gospodarstwie). Była to minimalna liczba zwierząt do przeprowadzenia tego typu doświadczeń uwzględniająca również wymagania Komisji Etyki, wskazujące na redukowanie liczby zwierząt doświadczalnych. Doświadczenie przeprowadzono w sezonie żywienia letniego, w trakcie którego podstawę żywienia krów stanowiły pasze objętościowe – zielonki z niewielkim dodatkiem pasz treściwych w ilości 500 g. W ramach realizacji pracy wprowadzono dwa różne dodatki: ekstrakt z cebuli [5 g/d/szt.] oraz ekstrakt z czosnku [5 g/d/szt.], które sporządzono na bazie surowców z upraw z objętych badaniami gospodarstw eko-certyfikowanych. Oczyszczone cebule i bulwy czosnków były na 15 minut przed podaniem krowom starannie miażdżone przy użyciu blendera firmy Bosh o mocy 400W. Zielonka pastwiskowa pobierana była przez krowy ad libitum, natomiast pasza treściwa razem z fitobiotykami zadawana indywidualnie każdej krowie do żłoba na pół godziny przed dojem wieczornym. Zadawanie dodatków, jak również ich pobieranie przez krowy było kontrolowane przez właściciela wytypowanego gospodarstwa, jak również przez autorów. Porównanie 2 wyselekcjonowanych dodatków charakteryzujących się podobnym spectrum działania w przeprowadzonych doświadczeniach żywieniowych umożliwiło wybranie dawki suplementacyjnej wpływającej najkorzystniej na jakość cytologiczną i mikrobiologiczną oraz dietetyczną mleka. Do analiz jakości higienicznej surowca będącej wskaźnikiem zdrowotności gruczołu mlekowego łącznie pobrano 126 prób mleka w sposób aseptyczny (2 gospodarstwa x 7 krów x 9 pobrań). Próbkę do analiz stanowiło mleko (25 ml) pozyskane z doju wieczornego w danym dniu, umieszczone w sterylnych plastikowych pojemnikach, zgodnie z poniższym planem doświadczenia. Doświadczenie żywieniowe podzielone zostało na trzy okresy w odniesieniu do jakości higienicznej (cytologicznej i mikrobiologicznej) surowca: 1 pobranie – wartości wyjściowe, 1 dzień doświadczenia, w którym oznaczano liczbę komórek somatycznych (LKS) w celu wybrania krów z subklinicznym stanem zapalenia gruczołu mlekowego 2 pobranie – po 1 tygodniu zadawania fitobiotyków, tzw. okres wstępny 3 pobranie – po 2 tygodniu zadawania fitobiotyków, tzw. okres wstępny 4 pobranie – po 3 tygodniach zadawania fitobiotyków tzw. okres właściwy 5 pobranie – po 4 tygodniach zadawania fitobiotyków tzw. okres właściwy 6 pobranie – po 5 tygodniach zadawania fitobiotyków tzw. okres właściwy 7 pobranie – po 1 tygodniu, gdy zaprzestano podawania fitobiotyków 8 pobranie – po 2 tygodniu, gdy zaprzestano podawania fitobiotyków 9 pobranie – po 3 tygodniu, gdy zaprzestano podawania fitobiotyków Okres wstępny – trwający 2 tygodnie, podczas którego wprowadzana była suplementacja uwzględniono w celu przyzwyczajenia środowiska żwacza do zmiany. Właściwy – trwający 3 tygodnie, podczas którego każdej krowie indywidualnie bezpośrednio do żłoba podawano fitobiotyki zmieszane z paszą treściwą. W trakcie trwania okresu właściwego, na początku każdego tygodnia pobrano próbki mleka nr 4, 5 i 6 (w sumie 3 pobrania). Łączny czas stosowania suplementacji wyniósł 5 tygodni (35 dni), z czego okres wstępny, adaptacyjny – 2 tygodnie i okres właściwy – 3 tygodnie.

101

Beata Kuczyńska, Kamila Puppel, Beata Madras-Majewska

Po-suplementacyjny – trwający 3 tygodnie. Wykonano 3 pobrania po każdym zakończonym tygodniu od zakończenia podawania dodatków, w celu ustalenia zdrowotności gruczołu mlekowego (pobranie nr 7, 8 i 9). Schemat pobierania próbek mleka w doświadczeniu badającym jakość dietetyczną był odmienny: pobranie 1. – początek doświadczenia (pobranie kontrolne); pobranie 4. – po 21 dniach żywienia odpowiednim dodatkiem; pobranie 5. – po 28 dniach żywienia odpowiednim dodatkiem; pobranie 6. – po 35 dniach żywienia odpowiednim dodatkiem. Taki wybór był związany z kosztownością oznaczania witamin lipofilnych i poziomu całkowitego statusu antyoksydacyjnego (TAS) w mleku. 2.1. Metody analityczne Po bezpośrednim dostarczeniu prób do Laboratorium Oceny Mleka Zakładu Hodowli bydła SGGW oznaczano LKS i ogólnej liczby drobnoustrojów (OLD). Liczbę komórek somatycznych oznaczano za pomocą aparatu Somacount 150 firmy Bentley. Jakość mikrobiologiczna mleka to stan ilościowy i jakościowy mikroflory mleka. Prawidłowo żywiona i zdrowa krowa produkuje mleko o bardzo wysokiej, wręcz sterylnej czystości na poziomie od 1 do 10 tys. OLD/cm3. Mikrobiologiczne posiewy mleka wykonano przy użyciu aparatu WASP do automatycznego posiewu spiralnego na płytkach Petriego, a wynik (OLD) odczytano przy wykorzystaniu licznika Countermat wyposażonego w kamerę wideo oraz specjalne oprogramowanie. Do analizy mikrobiologicznej mleka wykorzystano: agar bakteriologiczny, pożywkę chromogenną Uri-color do selekcji E. coli indol (+), bakterii z grupy KESC (Klebsiella i Enterobacteriaceae), Enterococcus, Proteus vulgaris oraz Staphylococcus aureus oraz pożywkę TBX Tryptone Bile X-glucoronide selekcyjno namnażającą do wykrywania E. coli beta glukoronidazowo (+). Następnie w pobranych próbkach mleka oznaczano stężenia witamin lipofilnych: a i E oraz β-karotenu o właściwościach antyoksydacyjnych w mleku przy wykorzystaniu techniki RP-HPLC. Każdą próbkę mleka poddano dodatkowo ocenie organoleptycznej ze szczególnym uwzględnieniem specyficznego zapachu, wykonanej przez 3 niezależnych analityków. W badanych próbkach nie wykazano odmiennego nieprzyjemnego zapachu, wynikłego ze spożywania przez krowy fitobiotyków bogatych w związki siarkowe W pobranych próbkach mleka w pierwszym dniu doświadczenia (pobranie kontrolne) i w okresie właściwym suplementacji oznaczono TAS (total antioxidant status) – za pomocą Testu Randox. Analiza polegała na spektrofotometrycznym pomiarze stopnia zmiany barwy powstałego reaktywnego rodnika ABTS® (2,2'- Azyno-di-[sulfonian 3-etylbenztiazoliny]) w czasie dokładnie ustalonym wg aplikacji firmy Randox. Dodatkowo oznaczono zawartość witamin lipofilnych i β-karotenu przy wykorzystaniu techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) i aparatu Agilent 1100 wyposażonego w kolumnę ZORBAX Eclipse XDB – C8, o średnicy 4,5 mm x 150 mm. Fazę mobilną stanowiła woda podwójnie demineralizowana z systemu Millipore i MeOH (firmy Merck) w proporcji 5:95, przepływ przez kolumnę wynosił 1,0 ml/min przy detekcji UV wynoszącej 280 nm wg metodyki Puppel i wsp. [19].

102

Fitobiotyki jako alternatywa w prewencji mastitis i wzmocnienia jakości dietetycznej mleka w gospodarstwach eko-certyfikowanych

Wyniki doświadczenia poddano analizie statystycznej przy pomocy programu SPSS 25.0. Do obliczeń zastosowano analizę wariancji dla pomiarów powtarzanych. Wyniki średnich wartości z pobrań w dniach 21, 28 i 35 odniesiono do wyników z poziomu wyjściowego. 3. Omówienie i dyskusja wyników 3.1. Wpływ fitobiotyków na jakość cytologiczną surowca Wyniki przedstawione na rysunku 1 i 2 wskazują, że wszystkie krowy ze zdiagnozowanym subklinicznym stanem mastitis zareagowały pozytywnie na zastosowane fitobiotyki w żywieniu.

900 800 700 krowa 1

600 krowa 2

]

3 500 krowa 3

m c

/ 400 . krowa 4 300 [tys krowa 5 200 krowa 6 100 krowa 7 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 liczba komórek somatycznych w mleku mleku w somatycznych komórek liczba kolejne pobrania w trakcie trwania doświadczenia

Rysunek 1. Wpływ stosowania ekstraktu z cebuli na liczbę komórek somatycznych w mleku [tys./cm3] w 9 poszczególnych pobraniach wg schematu doświadczenia

Wszystkie chore krowy zareagowały obniżeniem LKS w mleku poniżej 400 tys./cm3 zarówno w trakcie zadawania dodatku ekstraktu z cebuli, jak i po jego odstawieniu. Wyliczono, że w mleku badanych krów nastąpiło prawie 3-krotne obniżenie LKS z poziomu wyjściowego średnia 644,71 tys./cm3 do 215,71 tys./cm3 po 35 dniach stosowania dodatku ekstraktu z cebuli (tab. 1). Stan zdrowia gruczołu mlekowego utrzymywał się stabilnie do końca doświadczenia pomimo zaniechania suplementacji. W drugim gospodarstwie 5 krów z subklinicznym stanem zapalenia gruczołu mlekowego zareagowało pozytywnie 2-krotnym obniżeniem LKS z 477 tys./cm3 na początku doświadczenia do 218 tys./cm3 po 35 dniach zadawania czosnku (tab. 2). Natomiast po odstawieniu zadawania czosnku u trzech krów zaobserwowano niestety tendencję wzrostową (różnice od 6 do 7 pobrania), po czym LKS ustabilizowała się poniżej 400 tys./cm3. Dane świadczą o wpływie zmiennych osobniczych na odpowiedź krów na zastosowany fitobiotyk w żywieniu.

103

Beata Kuczyńska, Kamila Puppel, Beata Madras-Majewska

800

700

600 krowa1

500 krowa2

] 400 3 krowa3 300 krowa4

[tys./cm 200 krowa5 100 krowa6 0 krowa7 1 2 3 4 5 6 7 8 9

kolejne pobrania w trakcie trwania doświadczenia liczba komórek somatycznych mleku w komórek somatycznych liczba

Rysunek 2. Wpływ stosowania czosnku na liczbę komórek somatycznych w mleku [tys./cm3] w 9 poszczególnych pobraniach wg schematu doświadczenia

3.2. Wpływ fitobiotyków na jakość mikrobiologiczną surowca Wyniki zamieszczone w tabelach 1 i 2 wskazują, że w mleku z gruczołu objętego stanem zapalnym w fazie subklinicznej we wszystkich próbkach mleka wykazano ponad 100 tys./cm3 drobnoustrojów, natomiast po zastosowaniu fitobiotyków zaobserwowano zmniejszenie wartości do kilkudziesięciu tys./cm3. Większą poprawę jakości mikrobiologicznej surowca zaobserwowano po zastosowaniu ekstraktu z czosnku. Wyniki badań bakteriologicznych przedstawione w tabeli 3 wskazują, że z ogółu badanych prób mleka wyizolowano i zidentyfikowano 9 różnych drobnoustrojów: Staphylococcus aureus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Serratia i Citrobacter. Najczęstszymi patogenami wywo- łującymi stan subkliniczny mastitis były bakterie katalazo ujemne Streptococcus, Enterococcus lub Clostridium, które stanowiły 82% zakażeń. Na drugim miejscu plasowały się bakterie Gram-ujemne betaglukoronidazo dodatnie, które stanowiły 55% zakażeń. Gronkowiec złocisty wyizolowano w 18 % przypadków, przy czym nigdy nie stanowił on dominującej flory jako gatunek pojedynczy, lecz wchodził w skład flory mieszanej. We wszystkich próbkach mleka przed doświadczeniem i w jego trakcie wykazano większy udział zakażeń wywołanych przez bakterie katalazo ujemne z rodzajów Streptococcus, Enterococcus lub Clostridium, z tendencją malejącą po zastosowaniu fitobiotyków z 82 do 18%. Dużym problemem okazało się zakażenie wywołane przez E. coli i Klebsiella, co prawdopodobnie było związane z sezonem letnim, w którym prowadzono doświadczenia oraz wysoką temperaturą osiągającą ponad 40°C na zewnątrz.

104

Fitobiotyki jako alternatywa w prewencji mastitis i wzmocnienia jakości dietetycznej mleka w gospodarstwach eko-certyfikowanych

Tabela 1. Wpływ dodatku ekstraktu z cebuli na jakość higieniczną (cytologiczną i mikrobiologiczną) mleka Badane Dni doświadczenia parametry Wartość 21 28 35 wyjściowa średnia – LKS 644,71 433,43 372,86* 215,71** [tys./cm3] SE 61,50 102,62 81,71 57,06 Δ [%] -32,7 -42,2 -66,6 Średnia – OLD 232,00 232,04** 165,17 55,45** [tys./cm3] SE 47,70 100,71 46,04 17,53 Δ [%] 0 -28,8 -76,1 SE – błąd standardowy średniej; Δ [%] różnice w odniesieniu do poziomu wyjściowego [%]; różnice statystyczne między wartościami wyjściowymi a w kolejnych dniach doświadczenia * dla p ≤ 0.01; ** dla p≤0.05

Tabela 2. Wpływ dodatku ekstraktu z czosnku na jakość higieniczną (cytologiczną i mikrobiologiczną) mleka Badane Dni doświadczenia parametry Wartość 21 28 35 wyjściowa średnia –LKS 477,57 418,14 296,57 218,00** [tys./cm3] SE 126,83 222,83 202,89 186,83 Δ [%] -8,25 -37,90 -54,35 średnia – OLD 174,28 132,94 59,57** 41,17** [tys./cm3] SE 15,28 45,49 19,09 10,65 Δ [%] -23,72 -65,82 -76,4 SE – błąd standardowy średniej; Δ [%] różnice w odniesieniu do poziomu wyjściowego [%]; różnice statystyczne między wartościami wyjściowymi a w kolejnych dniach doświadczenia * dla p ≤ 0.01; ** dla p ≤ 0.05

We wcześniejszych badaniach korzystnego oddziaływania ziół (m.in. jeżówki purpurowej) na poprawę stanu zdrowotnego krów w próbkach mleka oprócz E. coli w ponad 50% przypadków, izolowano także gatunki drobnoustrojów z rodzajów Enterobacter oraz Klebsiella w ponad 80% przypadków [6, 9, 11, 19]. We wcześniej- szych badaniach Kuczyńskiej i wsp. [9] bakterie wytwarzające hemolizyny występo- wały w 77,2% wszystkich badanych próbek, z tego α-hemolizę zaobserwowano w 11% przypadków, ß-hemolizę w 55%, a oba typy hemolizy w 27% przypadków. Pozytywna odpowiedź organizmu krów w stosunku do zastosowanego preparatu jeżówki purpurowej prawdopodobnie była efektem obecności bioaktywnych składników: izobutyloamidów, alkiloamidów, polienów, poliacetylenów, polifenoli i licznych pochodnych kwasu kawowego (kwas chlorogenowy, izochlorogenowy, kwas cychorynowy, echinakozyd, werbakozyd), flawonoidów (luteolina, kwercetyna, apigenina), kwasów: cytrynowego, winowego, askorbinowego, a także całej gamy polisacharydów (4-0-metyloglukurono-arabinoksylany, ksyloglukany, arabinoramno- galaktany, arabinogalaktany) oraz ich synergicznego działania. Pomimo licznych wymienionych substancji najważniejsze działanie immunostymulujące jeżówki wynika

105

Beata Kuczyńska, Kamila Puppel, Beata Madras-Majewska z obecności pochodnych kwasu kawowego. Pochodna kwasu kawowego, jak udowodniono, stymuluje aktywność komórek odpornościowych, wykazuje działanie przeciwwirusowe i jest silnym przeciwutleniaczem, hamuje działanie enzymu hialuro- nidazy, które wpływają na zakażenie i stan zapalny. Natomiast polisacharydy stymulują aktywność komórek układu immunologicznego, a także wykazują aktywność przeciw- zapalną. Ziele jeżówki bogate jest w związki takie jak: glikozydy, flawonoidy, olejek eteryczny, poliacetyleny, alkaloidy pirolizydynowe. Inaczej rzecz się ma z ekstraktem korzenia Echinaceae, który bogaty jest w glikozyd fenolowy, kwas chlorogenowy, kwas izo-chlorogenowy, dodatkowo zawiera inulinę (ok. 4-6%), cynarynę, glikopro- teiny, poliacetyleny, alkaloidy pirolizydynowe, związki aminowe i inne [20].

Tabela 3. Udział procentowy próbek mleka, w których zidentyfikowano drobnoustroje na początku i na końcu eksperymentu Identyfikacja Udział % próbek, w których drobnoustrojów wykryto drobnoustroje z rodzaju Właściwości Eksperyment fenotypowe bakterii Stan Po zakończeniu wyjściowy suplementacji – - – 1 dzień 35 dzień Katalazo dodatnie CEB* 18 0 Staphylococcus ogółem CZ* 18,1 0 aureus CEB 82 18 Streptococcus Katalazo ujemne Enterococcus ogółem CZ 82 18 Clostridium Bakterie G(-) CEB 54 14 betaglukoronidazo Escherichia coli (+) CZ 55 15 Klebsiella CEB 42 38 Bakterie z grupy Enterobacter, KESC Serratia, CZ 38 12 Citrobacter CEB 0 0 - Candida albicans CZ 0 0 - *CEB- ekstrakt z cebuli; CZ- ekstrakt z czosnku

Wyniki badań własnych sugerują, że liczne zakażenia w badanym stadzie wywołane były przez bakterie zarówno środowiskowe, jak i patogenne. Przy tak dużym zróżni- cowaniu zakażeń bakteryjnych, subkliniczne przypadki zapalenia wymion u badanych krów ze względu na charakterystyczny ostry przebieg i wysokie temperatury w sierpniu oraz ataki much zdiagnozowano jako colimastitis. Malinowski i Gajewski [13] podają, że do zakażeń w trakcie trwania laktacji u krów dochodzi na początku i pod koniec okresu zasuszenia, natomiast w pierwszych 6 tygodniach laktacji obserwuje się najwięcej przypadków colimastitis. Ostre postacie, jak i przewlekłe i podkliniczne colimastitis występują głównie w okresie letnim, kiedy dodatkowo krowy ulegają wpływom stresu termicznego i są narażone na wzmożone ataki insektów.

106

Fitobiotyki jako alternatywa w prewencji mastitis i wzmocnienia jakości dietetycznej mleka w gospodarstwach eko-certyfikowanych

3.3. Wpływ fitobiotyków na jakość dietetyczną surowca Jakość dietetyczną mleka kształtuje zawartość substancji biologicznie czynnych m.in. antyoksydantów takich jak: witaminy rozpuszczalne w tłuszczu mlekowym: prowitamina witaminy A, czyli β-karotenwitamina A i E. Badania wykazały istotny wpływ zastosowanej suplementacji na kształtowanie się poziomu tych składników oraz całkowitego potencjału antyoksydacyjnego mleka (TAS). W pracy wykazano istotny wpływ dnia doświadczenia na poziom witamin lipofilnych i poziom TAS po zastosowaniu ekstraktu z cebuli. Zawartość witaminy A, E oraz TAS była najwyższa w 35 dniu doświadczenia, natomiast β-karotenu w 21 dniu doświadczenia (tabela 4). Badania wykazały ponad 3-krotny wzrost wartości TAS po 35-dniowym okresie suplementacji ekstraktem z cebuli względem pobrania kontrolnego. Należy podkreślić, że poziom TAS jest sumą antyoksydantów pochodzących z mleka decydującym o jego wartości dietetycznej. Tabela 4. Wpływ stosowania ekstraktu z cebuli na poziom witamin lipofilnych i potencjał antyoksydacyjny mleka w tzw. okresie właściwym doświadczenia Dni parametry β-karoten witamina A witamina E TAS eksperymentu [mg/l] [mg/l] [mg/l] [mmol/L] Poziom średnia 0,377 0,574 0,793 0,693 wyjściowy SE 0,037 0,023 0,032 0,030 21 średnia 0,483 0,674 0,931 1,311 SE 0,075 0,028 0,038 0,184 Δ [%] +128,12 +117,42 +117,40 +189,18 28 średnia 0,397 0,622 0,859 1,259 SE 0,066 0,018 0,025 0,172 Δ [%] +105,30 +108,36 +108,32 +181,67 35 średnia 0,469 0,855** 1,180** 2,221** SE 0,067 0,063 0,087 0,479 Δ [%] +124,40 +148,95 +148,80 +320,49 SE – błąd standardowy średniej; Δ [%] różnice w odniesieniu do poziomu wyjściowego [%]; różnice statystyczne między wartościami wyjściowymi a po 35 dniach suplementacji * dla p ≤ 0.01; ** dla p ≤ 0.05 Tabela 5. Wpływ stosowania ekstraktu z czosnku na poziom witamin lipofilnych i potencjał antyoksydacyjny mleka w tzw. okresie właściwym doświadczenia Dni parametry β-karoten witamina A witamina E TAS eksperymentu [mg/l] [mg/l] [mg/l] [mmol/L] Poziom średnia 0,348 0,545 0,936 0,693 wyjściowy SE 0,041 0,015 0,126 0,030 21 średnia 0,487* 0,616 1,074 1,335** SE 0,047 0,035 0,137 0,175 Δ [%] +139,94 +113,03 +114,74 +192,64 28 średnia 0,362 0,601 1,000 1,180 SE 0,066 0,016 0,140 0,121 Δ [%] +104,02 +110,27 +106,84 +170,27 35 średnia 0,369 0,849** 2,788** 1,965** SE 0,024 0,064 0,098 0,357 Δ [%] +106,03 +155,78 +297,86 +283,55 SE – błąd standardowy średniej; Δ [%] różnice w odniesieniu do poziomu wyjściowego [%]; różnice statystyczne między wartościami wyjściowymi a w kolejnych dniach doświadczenia * dla p ≤ 0.01; ** dla p ≤ 0.05

107

Beata Kuczyńska, Kamila Puppel, Beata Madras-Majewska

Potencjał antyoksydacyjny mleka pozyskanego od krów, u których zastosowano do suplementacji ekstrakt z czosnku uległ znacznemu podwyższeniu (tab. 5). W trakcie doświadczenia wykazano znaczny wzrost poziomu witamin A i E oraz całkowitego poziomu antyoksydacyjnego TAS po 35 dniach dawkowania ekstraktu z czosnku w porównaniu do poziomu wyjściowego, co świadczy o znacznym zwiększeniu poziomu ochrony antyoksydacyjnej. Uzyskanie większego potencjału antyoksydacyjnego mleka po zastosowaniu ekstraktu z czosnku jest bardzo korzystne z punktu widzenia konsumenta i jakości technologicznej mleka [8, 19]. Należy zaznaczyć, że znacznie większy wzrost zawartości wit. E w tłuszczu mlekowym po zastosowaniu ekstraktu z czosnku w porównaniu do ekstraktu z cebuli, może być tłumaczony lepszym wykorzystaniem składników diety w tym przypadku. 4. Podsumowanie Porównanie tych 2 wyselekcjonowanych dodatków w postaci ekstraktu z czosnku i ekstraktu z cebuli charakteryzujących się zbliżonym spectrum działania w przeprowadzonych doświadczeniach żywieniowych potwierdziło słuszność ich wyboru. Fitobiotyki w postaci ekstraktów z cebuli i czosnku zastosowane w profilaktyce i leczeniu stanów zapalnych gruczołu mlekowego krów w gospodarstwach Eko- certyfikowanych pochodziły z produkcji ekologicznej. Dzięki tym niekonwencjonalnym dodatkom w przeprowadzonym doświadczeniu nie tylko podwyższono zdrowotność krów, ale również jakość odżywczą i prozdrowotną mleka. Należy pokreślić, że przy zastosowaniu tych fitobiotyków wykazano, że stan zdrowia gruczołu mlekowego u wszystkich badanych krów był stabilny do końca doświadczenia pomimo zaniechania suplementacji po 3 tygodniach. Uzyskane wyniki stanowią doskonałe uzupełnienie istniejącego stanu wiedzy i potwierdziły skuteczność zastosowanych fitobiotyków w walce z subklinicznym stanem zapalenia gruczołu mlekowego krów w gospodarstwach eko-certyfikowanych specjalizujących się w produkcji mleka. Dodatkowo wyniki badań wskazują, że podwyższenie zawartości w dawce pokarmowej składników o właściwościach antyoksydacyjnych przy wykorzystaniu fitobiotyków może być naturalnym sposobem stymulacji układu immunologicznego krów, umożliwiającym ograniczenie stosowania chemiote- rapeutyków. Duże stężenie bioaktywnych składników z naturalnych suplementacji w istotny sposób może wpływać na zwiększenie właściwości antyoksydacyjnych mleka, co przyczynia się do przywracania homeostazy w obrębie gruczołu mlekowego i wygaszania stanu zapalnego. Podsumowując zastosowane dodatki w postaci ekstraktu z cebuli lub czosnku, do dawki pokarmowej krów, ze zdiagnozowanym subklinicznym zapaleniem gruczołu mlekowego, wpłynęły na obniżenie liczby komórek somatycznych i ogólnej liczby bakterii w mleku oraz na podwyższenie stężenia bioaktywnych składników odpowiedzialnych za immunostymulację głównie składników o właściwościach antyoksydacyjnych. Zaproponowane ilości certyfikowanych fitobiotyków w ilości 5 g ekstraktu z cebuli lub czosnku/sztukę/dobę, pomimo niewielkiej liczebności badanych krów okazały się niezawodne w profilaktyce mastitis w stanie podklinicznym i nie spowodo- wały specyficznego nieprzyjemnego zapachu, natomiast podwyższyły wartość dietetyczną mleka wyrażoną poziomem witamin lipofilnych i całkowitym potencjałem antyoksydacyjnym.

108

Fitobiotyki jako alternatywa w prewencji mastitis i wzmocnienia jakości dietetycznej mleka w gospodarstwach eko-certyfikowanych

Badania zrealizowano w ramach zadania „Badania nad nowatorskimi metodami ograniczania występowania chorób i pasożytów zwierząt gospodarskich w warunkach produkcji ekologicznej” finansowane z dotacji MRiRW zgodnie z umową nr HOR.re.027.6.2017. Literatura: 1. Caribu H.P., Suwarno S.A., Jayanegara A., Effect of garlic extract and organic mineral supplementation on feed intake digestibility and milk yield of lactating dairy cows, Asian Journal of Animal Science, 2016, 10: 213-218. 2. Cheng G., Hao A., Xie S., Wang X., Dai M., Huang L., Yuan Z., Antibiotic alternatives: the substitution of antibiotics in animal husbandry?, Front Microbiology, 2014, doi:10.3389/fmicb.2014.00217. 3. Grela E.R., Klebaniuk R., Kwiecień M., Pietrzak K., Fitobiotyki w produkcji zwierzęcej, Przegląd hodowlany, 2013, 3: 21-24. 4. Grzesiak B., Kołodziej B., Głowacka A., Krukowski H., The Effect of Some Natural Essential Oils Against Bovine Mastitis Caused by Prototheca zopfii Isolates In Vitro, Mycopathologia, 2018, 83(3): 541-550. 5. Gull I., Saeed M., Shaukat H., Aslam S.M., Samra Z.S., Athar A.M., Inhibitory effect of Allium sativum and Zingiber officinale extracts on clinically important drug resistant pathogenic bacteria, Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 2012, doi:10.1186/1476-0711-11-8. 6. Hashemzadeh-Cigari F., Khorvash M., Ghorbani G.R., Kadivar M., Riasi A., Zebeli Q., Effects of supplementation with a phytobiotics-rich herbal mixture on performance, udder health, and metabolic status of Holstein cows with various levels of milk somatic cell counts, Journal of Dairy Science, 2014, 97: 7487-7497. 7. Kalińska A., Gołębiewski M., Wójcik A., Mastitis pathogenes in dairy cattle – a review, World Scientific News, 2017, 89: 22-31. 8. Kapusta A., Kuczyńska B., Puppel K., Relationship between the degree of antioxidant protection and the level of malondialdehyde in high-performance Polish Holstein-Friesian cows in peak lactation, PLOS ONE, 2018, 13 (3): doi 10.1371/journal.pone. 0193512. 9. Kuczyńska B., Serafin W., Puppel K., Próba zastosowania ekstraktu z Echinacea purpurea w zwalczaniu bakterii patogennych wywołujących mastitis u krów. Rozdział w monografii Mikrobiologia oraz metody analityczne w nauce, Wydawnictwo Tygiel, Lublin 2016, 166-176. 10. Krasucka D., Biernacki B., Szumiło J., Burmańczuk A., Monitoring zużycia leków przeciwdrobnoustrojowych u bydła, trzody chlewnej i koni w Polsce w latach 2014-2016 na podstawie Programu Wieloletniego, Życie Weterynaryjne, 92, 2017, 578-581. 11. Kraszewski J., Wawrzyński M., Radecki P., Wpływ dodawania ziół do paszy dla krów na zdrowotność wymion i obraz cytologiczno-mikrobiologiczny mleka, Wiadomości Zootechniczne, 3, 2008, 3-7. 12. Majewski M., Anusz K., Antybiotykooporność czynników zoonotycznych związanych z bezpieczeństwem żywności pochodzenia zwierzęcego, Życie Weterynaryjne, 2018, 93, 2: 118-121. 13. Malinowski E., Gajewski Z., Charakterystyka zapaleń gruczołu mlekowego u krów wywołanych przez odżywnościowe patogeny człowieka, Życie Weterynaryjne 84, 2009, 4: 290- 294. 14. Montironi I.D., Cariddi L.N., Reinoso E.B., Evaluation of the antimicrobial efficacy of Minthostachys verticillata essential oil and limonene against Streptococcus uberis strains isolated from bovine mastitis, Revista Argentina Microbiologia, 2016, 48(3): 210-216. 15. Mussarat S., Amber R., Tariq A., Adnan M., Abdelsalam N.M., Ullah R., Bibi R., Ethnopharmacological Assessment of Medicinal Plants Used against Livestock Infections by the People Living around Indus River, Biomed Research International, 2014, doi.org/10.1155/2014/616858.

109

Beata Kuczyńska, Kamila Puppel, Beata Madras-Majewska

16. Mullen K.A., Lyman R.L., Washburn S.P., Baynes R.E., Anderson K.L., Short communication: Effects of 3 phytoceutical products on elimination of bacteria in experimentally induced Sreptococcus uberis clinical mastitis, Journal of Dairy Science, 2018,101, 10409-13 17. Pasca C., Mărghitas L., Dezmirean D., Bobis O., Bonta V., Chirilă F., Matei I., Fit N., Medicinal Plants Based Products Tested on Pathogens Isolated from Mastitis Milk, 2017: Molecules. doi:10.3390/molecules22091473. 18. Pinedo P., Karreman H., Bothe H., Velez J., Risco C., Efficacy of a botanical preparation for the intramammary treatment of clinical mastitis on an organic dairy farm, Canadian Veterinary Journal, 2013, 54, 479-484. 19. Puppel K., Sakowski T., Kuczyńska B., Grodkowski G., Gołębiewski M., Barszczewski J., Wróbel B., Budziński A., Kapusta A., Balcerak M., Degrees of antioxidant protection: a 2-year study of the bioactive properties of organic milk in Poland, Journal of Food Science, 2017, 82 (2): 523-528. 20. Teleb D.F., El-Saied U.M., Sallam A.A., El-Baz A.M., Hussein A.M. Effect of using Echinacea extract as immune-stimulating additive on milk yield traits, immunity and udder health of Zaraibi Goats, Egyptian Journal of Sheep & Goat Sciences, vol. 4, 2009, 2, 33-53. Fitobiotyki jako alternatywa w prewencji mastitis i wzmocnienia jakości dietetycznej mleka w gospodarstwach eko-certyfikowanych Streszczenie W gospodarstwach eko-certyfikowanych, specjalizujących się w produkcji mleka zabiegi dotyczące zdrowia krów powinny być ukierunkowane przede wszystkim na profilaktykę. Badania przeprowadzono w eko- certyfikowanych gospodarstwach specjalizujących się w produkcji mleka. Badaniami objęto krowy ze zdiagnozowanym stanem subklinicznym mastitis. Do prewencji zastosowano takie fitobiotyki jak: ekstrakt z cebuli i z czosnku, które podawano krowom indywidualnie przez okres 5 tygodni. Dzięki zastosowanemu ekstraktowi z czosnku uzyskano poprawę jakości cytologicznej i mikrobiologicznej mleka odpowiednio o 66,6% oraz 76,1%. Wyniki dla drugiego fitobiotyku były również bardzo dobrze rokujące, uzyskano obniżenie liczby komórek somatycznych o 54,35% i ogólnej liczby drobnoustrojów o 76,4%. Należy pokreślić, że stan zdrowia gruczołu mlekowego u wszystkich badanych krów utrzymywał się stabilnie do końca doświadczenia pomimo zaniechania suplementacji. Badania potwierdziły skuteczność zastosowanych dodatków paszowych w walce z subklinicznym stanem mastitis w warunkach produkcji mleka ekologicznego. Ekstrakty fitobiotyków zastosowanych w prewencji mastitis były sporządzone samodzielnie na bazie surowców z produkcji ekologicznej. Dzięki tym niekonwencjonalnym dodatkom w przeprowadzonych 8-tygodniowych doświadczeniach nie tylko podwyższono zdrowotność krów, ale również jakość dietetyczną mleka, wyrażoną kilkukrotnie zwiększoną zawartością witamin lipofilnych i całkowitego potencjału antyoksydacyjnego mleka. Słowa kluczowe: alternatywne antybiotyki, farmy ograniczne, prewensja mastitis Phytobotics as an alternative in the prevention of mastitis and enhancement of dietetic quality of milk in eco-certified farms Abstract In eco-certified farms specializing in milk production, cow health measures should be directed primarily at prevention. The research was carried out in eco-certified farms specializing in milk production. The study included cows diagnosed with subclinical mastitis. For the prevention such phytobiotics as onion and garlic extract were applied, which were given individually to cows for 5 weeks. Thanks to the garlic extract addition, the cytological and microbiological quality of milk was increased by 66.6% and 76.1%, respectively. The results for the second phytobiotic were also very promising, as the somatic cell count was reduced by 54.35% and the colony forming units by 76.4%. It should be pointed out that the state of health of the mammary gland in all cows tested was stable until the end of the experiment, despite the cessation of the supplementation. The studies confirmed the effectiveness of used feed additives in the fight against subclinical mastitis in the conditions of organic milk production. The extracts of phytobiotics used in mastitis prevention were prepared independently on the basis of raw materials from organic production. Thanks to these unconventional additions in 8-week experiments, not only the health of the cows was improved, but also the quality of the dietary milk as evidenced by the increased content of antioxidants. Keywords: alternative antibiotics, sub-clinical mastitis prevention, organic farm

110

Sylwia Kłys1, Anna Czech

Białkowe komponenty i dodatki paszowe w żywieniu świń

1. Wprowadzenie W ostatnim czasie zanotowano znaczny spadek pogłowia zarówno tuczników, jak i loch. Głównym czynnikiem wpływającym na ten wskaźnik jest wzrost kosztów ich produkcji szacowany na poziomie 41% [1]. W żywieniu zwierząt najważniejszym czynnikiem wpływającym na opłacalność produkcji jest odpowiednia ilość i jakość paszy, która m.in. zaspokaja potrzeby organizmu na składniki pokarmowe, takie jak: białko, w tym aminokwasy egzogenne, tłuszcz, włókno pokarmowe, czy składniki mineralne i witaminy. W celu zapewnienia odpowiedniej ilości i jakości składników pokarmowych na każdym etapie produkcji należy zastosować odpowiednio zbilanso- waną pod kątem zapotrzebowania organizmu mieszankę paszową. Na jakość paszy wpływa nie tylko ilość składników pokarmowych, ale również ich odpowiedni stosunek. Na szczególną uwagę zasługuje dobór (zbilansowanie) tzw. aminokwasów limitujących. Głównym aminokwasem limitującym w żywieniu świń jest lizyna, której w prawidłowo zbilansowanej mieszance paszowej, powinno być ok. 5-5,5% biała ogólnego. Obok lizyny ważnymi aminokwasami w dobrze zbilansowanej mieszanki paszowej są metionina, treonina i tryptofan. Niedobór lizyny może ograniczyć wyko- rzystywanie pozostałych aminokwasów i upośledzić syntezę białka, a więc m.in. tworzenie tkanki mięśniowej. Zakładając zapotrzebowanie na ten aminokwas na poziomie 100 (jednostki wagowe), ilość pozostałych egzogennych aminokwasów wyraża się w procentach zawartości lizyny. Przy układaniu składu mieszanek dla trzody, stosunek lizyny, metioniny, treoniny i tryptofanu powinien wynosić 100:32:64:19 [2]. Skład aminokwasowy zbóż, a więc podstawowych komponentów mieszanek paszowych stosowanych w żywieniu świń, odbiega znacznie od składu białka ciała tuczników i składu mleka loch, dlatego istnieje konieczność wzbogacenia paszy o wysokobiałkowe komponenty paszowe pochodzenia roślinnego oraz zwierzęcego. Takie rozwiązanie prowadzi do uzyskania tzw. białka idealnego, które umożliwia żywienie świń tak, aby dostarczone w paszach białko pokrywało zapotrzebowanie na aminokwasy w proporcjach zbliżonych do składu ciała zwierząt [3]. 2. Zapotrzebowanie na biało poszczególnych grup technologicznych świń Zgodnie z wytycznymi wskazanymi w ,,Zalecenia żywieniowe i wartość pokarmowa pasz dla świń” zapotrzebowanie na białko ogólne świń mieści się w przedziale od 204 g/kg paszy dla prosiąt poniżej 10 kg masy ciała, do 140 g/kg paszy dla tuczników powyżej 90 kg masy ciała (wykres 1). Zapotrzebowanie na aminokwasy egzogenne, w tym lizynę, maleje wraz z wiekiem świń [4].

1 Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Katedra Biochemii i Toksykologii.

111

Sylwia Kłys, Anna Czech

Wykres 1. Zapotrzebowanie na białko ogólne i aminokwasy egzogenne (g/kg paszy) poszczególnych grup technologicznych świń [4]

Nieco inne potrzeby żywieniowe występują u loch, co związane jest z cyklem rozrodczy oraz okresem laktacji, w której organizm lochy poddawany jest podwyż- szonej eksploatacji. W związku z tym zapotrzebowanie na białko i aminokwasy wzrasta zgodnie z produkowaną ilością mleka [5]. 3. Problemy żywieniowe w chowie świń W związku z problemami, z jakimi muszą zmierzyć się producenci świń, uzyskana przez Polskę pozycja na światowym rynku produkcji mięsa wieprzowego jest obecnie niestabilna. Nie tylko z powodu obniżenia eksportu o ponad 10% wynikającego z wprowadzenie przez Rosję embarga na te produkty, ale także z powodu braku wysokobiałkowych komponentów paszowych. Źródłem tej trudność jest wprowadzony w 2001 roku przez Unię Europejską zakaz stosowania mączek mięsno-kostnych, które stanowiły pełnowartościowe źródło białka o bardzo dobrym składzie aminokwasowym [1]. Powstały niedobór białka paszowego wypełniła poekstrakcyjna śruta sojowa, której skład pokrywa w znacznym stopniu zapotrzebowanie świń na aminokwasy egzogenne (w tym przede wszystkim lizynę). Z uwagi na położenie geograficzne uprawa soi w Polsce jest ograniczona, dlatego też jest ona importowana między innymi z Argentyny, Brazylii, Paragwaju i USA [6]. Poekstrakcyjna śruta sojowa jest również importowana do Polski z Krajów UE, w których obowiązuje częściowy ,,Zakaz obrotu, wytwarzania oraz stosowania w żywieniu zwierząt roślin i organizmów genetycznie modyfikowanych’’ [7]. Rośliny GMO są głównie wykorzystywane w produkcji pasz wysokobiałkowych, z czego połowę upraw tego typu stanowi soja. W 2010 roku na

112

Białkowe komponenty i dodatki paszowe w żywieniu świń

łączną ilość wszystkich upraw soi przypadało 82% soi genetycznie modyfikowanej. Według szacunków ilość ta odpowiadała 93-95% międzynarodowego handlu tym produktem [8]. Całkowity zakaz używania roślin GMO w Polsce miał zostać wprowadzony w 2013 roku, jednak ze względów ekonomicznych czas ten został przedłużony do 2024 roku, co wynikało z ustawy z dnia 1 stycznia 2019 roku [9]. Obecnie w Polsce, aż 80% zapotrzebowania na pasze wysokobiałkowe zaspokaja poekstrakcyjna śruta sojowa, która jeszcze nie znalazła swojej alternatywy [10]. Ponadto nasiona soi (GMO), stanowią aż 64% wszystkich stosowanych komponentów białkowych w Europie [11]. 4. Wysokobiałkowe komponenty paszowe oraz białkowe dodatki paszowe Biorąc pod uwagę problemy polskich hodowców świń związane z zapewnieniem odpowiedniego źródła białka rozpoczęto działania mające na celu zwiększenie produkcji oraz wykorzystania krajowych roślin białkowych, takich jak nasiona roślin bobowatych [12]. W latach 2011-2015 mając na uwadze podniesienie poziomu produkcji tych roślin wprowadzono program „Ulepszenie krajowych źródeł białka roślinnego, i ich produkcji, systemu obrotu i wykorzystania w paszach” [13]. Dodatko- we finansowanie upraw znajdujących się w zakresie programu spowodowało zwiększone nimi zainteresowanie. Jednak produkcja tych roślin w dalszym ciągu jest stosunkowo niska. Najistotniejszym problemem w uprawie roślin bobowatych okazała się ich nieprzewidywalna zmienność plonowania i uzyskiwanie bardzo często niskich plonów, a także ich niska odporność na choroby, czego konsekwencją jest bardzo małe zainteresowanie przemysłu paszowego [12]. Jednak, dążąc do wyeliminowania poekstrakcyjnej śruty sojowej, wykorzystuje się je, ale w niewielkim stopniu, w mieszankach dla tuczników. Jest to związane przede wszystkim z ich cennym składem chemicznym tzn. wysoką zawartością białka i interesującym składem aminokwasowym (tab. 1). Biorąc pod uwagę np. zawartość lizyny nasiona roślin bobowatych są jej cenniejszym źródłem niż poekstrakcyjna śruta sojowa. Oprócz problemów z uprawą, również obecność związków antyżywieniowych (kwas fitynowy, skondensowane taniny, lektyny, inhibitory proteazy i α-amylazy) ogranicza zastosowanie roślin bobrowatych szczególnie w żywieniu loch oraz prosiąt. Rozwiązaniem tego problemu są procesy technologiczne takie jak np. obłuskiwanie, które redukuje ilość tanin w nasionach bobiku nawet o 92% [14]. Wg Miczerk i Osek [15] stosowanie takich komponentów w mieszance dla świń rasy puławskiej w miejsce części poekstrakcyjnej śruty sojowej nie wpływa negatywnie na zawartość składników pokarmowych i mineralnych mięsa, a nawet wywiera pozytywny wpływ na profil kwasów tłuszczowych tuszy.

Tabele 1. Zawartość białka ogólnego i aminokwasów egzogennych w białkowych komponentach paszowych (% s.m.) [13] BIAŁKO LIZYNA METIONINA + TREONINA TRYPTOFAN OGÓLNE CYSTYNA Nasiona 23,17 1,39 1,05 1,11 0,30 rzepaku Poekstrakcyjna 38,29 2,26 1,86 1,82 0,46 śruta rzepakowa

113

Sylwia Kłys, Anna Czech

Makuch 31,27 1,85 1,78 1,98 0,46 rzepakowy Nasiona soi 32,10 2,05 0,93 1,28 0,45

Poekstrakcyjna 49,81 3,04 1,63 2,02 0,65 śruta sojowa Bobik 29,47 1,89 0,66 1,10 0,25 Groch 22,86 1,76 0,55 0,91 0,23 Łubin żółty 39,00 5,00 3,00 3,20 0,80 Łubin biały 33,60 5,21 2,50 3,69 0,71 Łubin 31,30 4,60 2,50 3,51 0,79 wąskolistny Na korzyści stosowania roślin bobowatych poddanych obróbce w żywieniu świń wskazują również badania Soństa i wsp. [16], w których zastąpienie poekstrakcyjne śruty sojowej w 7,5% lub 15% nasionami łubinu żółtego (rozdrobnione w śrutowniku bijakowym) nie spowodowało zmian w efektach produkcyjnych, ale przyczyniło się do lepszej mięsności i mniejszego otłuszczenia tuszy. Autorzy wskazali również na korzyści ekonomiczne z tym związane, tzn. koszty związane z żywieniem zwierząt mieszanką z udziałem nasion łubinu zostały zmniejszone o 9,82%, co związane było ze zdecydowanie droższą importową śrutą sojową w stosunku do krajowego łubinu żółtego. Kolejne badania, jakie przeprowadzili Soństa i wsp. [17] z zastosowaniem łubinu wąskolistnego w ilości 5% potwierdziły ich wysoką przydatność w żywieniu świń z uwzględnieniem 3,23% oszczędności kosztów produkcji. Do komponentów paszowych o cennym składzie aminokwasowym, a także znacznej zawartości białka należy powszechnie uprawiany w Polsce rzepak. W żywieniu świń wykorzystywane są jego produkt uboczne powstające podczas produkcji oleju, czyli makuch rzepakowy, a także poekstrakcyjna śruta rzepakowa, która dzięki dużej koncentracji białka może stanowić uzupełnienie mieszanek paszowych dla świń w cenne białko [18]. Składnikiem ograniczającym stosowanie makuchu rzepakowego jest jego niższa wartość pokarmową, na co składa się przede wszystkim niższa zawartość białka, w tym lizyny, większa zawartość włókna pokarmowego i związana z tym niższa wartość energetyczna oraz obecność antyżywieniowych związków jak glukozynolany, taniny, fityniany i inne [19]. Najczęściej wykorzystywane do celów paszowych są nasiona rzepaku ozimego o niższej koncentracji antyżywieniowych glukozynolanów [20]. Należy jednak podkreślić, że nie należy stosować surowych nasion rzepaku, ponieważ są one m.in. bogatym źródłem tłuszczu, włókna, a przede wszystkim składników antyżywieniowych [21]. Skład chemiczny poekstrakcyjnej śruty rzepakowej w tym przede wszystkim zawartość aminokwasów egzogennych nie jest konkurencyjny w porównaniu do powszechnie stosowanej w żywieniu zwierząt monogastrycznych poekstrakcyjnej śruty sojowej (tab. 1). Zawartość białka ogólnego waha się od 23,17% s.m w nasionach rzepaku do 38,29% s.m w poekstrakcyjnej śrucie rzepakowej (tab. 1). Jednak biorąc pod uwagę zawartość aminokwasów egzogennych to, co prawda ilość lizyny w poekstrakcyjnej śrucie rzepakowej jest zdecydowanie mniejsza niż w poekstrak-

114

Białkowe komponenty i dodatki paszowe w żywieniu świń cyjnej śrucie sojowej, ale w przypadku aminokwasów siarkowych zależność jest odwrotna [19]. Stosowanie komponentów rzepakowych zalecane jest przede wszystkim w drugiej połowie tuczu (60-110 kg), co jest związane z większą odpornością tych zwierząt na składniki antyżywieniowe. Brzóska i wsp. [22] wskazują, że stosowanie 15% udziału poekstrakcyjnej śruty rzepakowej w miejsce poekstrakcyjnej śruty sojowej w mieszankach dla tuczników tylko w niewielkim stopniu obniża przyrost masy ciała oraz nie wpływa negatywnie, na jakość tuszy. Dlatego w mieszankach dla tej grupy technologicznej można zminimalizować lub nawet całkiem wyeliminować ilość poekstrakcyjnej śruty sojowej. U młodszych zwierząt oraz loch w okresie ciąży i laktacji zaleca się jednak ograniczenie stosowania tego komponentu paszowego. Spowodowane jest to m.in. z obecnością glukozynolanów, które przedostając się do mleka loch upośle- dzają metabolizm jonowy prosiąt oraz hamują tempo ich wzrostu, a także powiększają gruczoł tarczycy wpływając niekorzystnie na gospodarkę hormonalną [23]. W celu rozwiązania tej sprzeczności pomiędzy stosunkowo wysoką wartością odżywczą i niskim stopniem wykorzystania śruty rzepakowej stosowane są metody ich detoksykacji, ekstrakcji czy separacji. Jedną z takich metod jest poddanie śruty działaniu mikroorganizmów (proces fermentacji), które jako źródło enzymów takich jak: glukozydazy, amylazy, celulazy, chitynazy, fitazy, ksylanazy, esterazy, inwertazy lub lipazy, mogą skutecznie hydrolizować białka rzepaku, a przede wszystkim rozkładać substancje antyżywieniowe [24]. Ponadto fermentacja, wpływając na podział ścian komórkowych zbóż uwalnia i/lub indukuje syntezę różnych związków bioaktywnych, w tym przede wszystkim przeciwutleniaczy [25]. Fermentowane komponenty paszowe w formie płynnej (system żywienia na mokro) wykorzystywane są w żywieniu świń od wielu lat [26, 27, 28, 29], jednak ze względu na trudności, jakie związane są z podawaniem takiej formy paszy dla trzody chlewnej oraz z mnogością gospodarstw hodujących trzodę chlewną w systemie żywienia w oparciu o pasze suche, prowadzone są obecnie badania nad skutecznością stosowania fermentowanej wysuszonej poekstrakcyjnej śruty rzepakowej w żywieniu warchlaków, a także loch w okresie ciąży. Do roślin wysokobiałkowych uprawianych w Polsce należy także lucerna, w której zawartość białka bogatego w aminokwasy egzogenne i semiegzogenne wynosi 170- 220 g/kg s.m. W składzie chemiczny lucerny występują również związki biologicznie czynne, które w niewielkich ilościach wykazują działanie fitobiotyczne, dlatego przypisuje się im rolę antybiotykowych stymulatorów wzrostu. Produktem wytwarzanym na bazie lucerny, który cechuje się pożądanym składem aminokwasowym i właści- wościami modulującymi przemianę materii jest koncentrat białko-ksantofilowy (APC) [30]. W badaniach Greli i Kowalczuk-Vasilev [31], stwierdzono, że dodatek APC miał wpływ na wyższe przyrosty masy ciała, a także lepsze umięśnienie tuszy przy niższym pobraniu pasz. Wysoką stawnością białka na poziomie 75-80% zawierającego cenne aminokwasy na poziomie wyższym niż poekstrakcyjna śruta sojowa jest koncentrat ziemniaczany – PPC (uboczny produkt przemysłu skrobiowego) (wykres 2). Jest on chętnie wykorzystywany w żywieniu młodych zwierząt, ponieważ jego skład chemiczny odpowiada

115

Sylwia Kłys, Anna Czech ich zapotrzebowaniu, jednak z powodu ceny jest on wykorzystywany w niewielkim stopniu. Spirulina (S), czyli białko z alg charakteryzuje się dużą wartością odżywczą białka (wykres 2), zawartością witamin hydrofilnych oraz jodu. W żywieniu świń znalazła ona zastosowanie, jako dodatek w ilości 1-5% w mieszance dla prosiąt oraz loch. Badania wskazują, że ma ona istotny wpływ na wzrost masy ciała prosiąt po urodzeniu [32].

Wykres 2. Zawartość białka ogólnego oraz wybranych aminokwasów w koncentratach białkowych (g/kg) [32]

Koncentrując się na poszukiwaniu nowych źródeł białka, które stanowiłyby alternatywne dla importowanej poekstrakcyjnej śruty sojowej, rozpoczęto nowatorskie badania nad zastosowaniem rzęsy wodnej. Jest ona cennym źródłem białka, ponieważ charakteryzuje się dobrą przyswajalnością aminokwasów w tym lizyny i metioniny oraz dużą ilością treoniny [33]. Głównym zagrożeniem wynikającym z wykorzystania rzęsy wodnej jest obecność metali ciężkich. Standaryzowana strawność białka surowego w koncentracie z rzęsy wodnej wynosi 78,1% i jest ona porównywalna do wartości, jaką charakteryzowały się mączki rybne. Obecnie w Polsce i Holandii prowadzone są badania pilotażowe w celu wykorzystania jej w produkcji zwierzęcej [34]. Interesujące są badania Zawadzkiego [35], wg którego podczas produkcji rzęsy można uzyskać 4-5 razy więcej białka niż z uprawy soi o powierzchni 1 hektara. 5. Podsumowanie Rynek komponentów i dodatków wysokobiałkowych jest w dalszym ciągu otwarty na produkty, które mogą stanowić alternatywę dla importowanej poekstrakcyjnej śrutu sojowej z nasion GMO. Dlatego należy w dalszym ciągu prowadzić badania nad efektywnością – uzdatnieniem polskich roślin, które mogłyby zastąpić „soję GMO” w mieszankach paszowych dla świń. Obecnie wielkie oczekiwania są skierowane w stronę fermentowanej poekstrakcyjnej śruty rzepakowej, której Polska jest dużym producentem.

116

Białkowe komponenty i dodatki paszowe w żywieniu świń

Literatura 1. Hejdysz M., Rutkowski A., Aktualne problemy żywienia zwierząt monogastrycznych- podaż pasz wysokobiałkowych i białkowe bezpieczeństwo kraju, Przegląd Hodowlany, 83, 2015, 17-20. 2. Buraczewski S., Żywienie zwierząt i paszoznawstwo, Wydawnictwo PWN Warszawa, 2004, 55. 3. Dzwonkowski W., Bodyl M.R., Zmiany zapotrzebowania na białko paszowe w kontekście rozwoju produkcji zwierzęcej i sytuacji na światowym rynku surowców wysokobiałkowych, Zeszyty Naukowe Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie. Problemy Rolnictwa Światowego, 2014, 14, 5-15. 4. Grela E.R., Skomiał J., Zalecenia żywieniowe i wartość pokarmowa pasz dla świń. Instytut Fizjologii i Żywienia Zwierząt PAN, Jabłonna 2015, 64-65. 5. Beyga K., Rekiel A., Effect of the backfat thickness of sows in late pregnancy on the composition of colostrum and milk, Archives Animal Breeding, 52(6), 2009, 593-602. 6. Vivian R., Reis A., Kalnay P.A., Vargas L., Ferreira A.C.C., Mariani F., Soybean – Pest Resistance, Weed Management in Soybean – Issues and Practices, Chapter 3, February 13, 2013, 47-84. 7. Dzwonkowski W., Analiza sytuacji na krajowym rynku pasz białkowych w kontekście ewentualnego zakazu stosowania materiałów paszowych GMO, Roczniki Naukowe Stowarzyszenia Ekonomistów Rolnictwa i Agrobiznesu, 18(3), 2016, 47-52. 8. Dzwonkowski W., Hryszko K., Raport o sytuacji na światowym rynku pasz wysokobiałkowych ze szczególnym uwzględnieniem produkcji roślin GMO, IERiGŻ-PIB, Warszawa 2011, 98-101. 9. Król B., Mazur M., Sieradzki Z., Kwiatek K., Aspekty prawne wytwarzania, obrotu i kontroli żywności i pasz genetycznie zmodyfikowanych, Życie Weterynaryjne, 93(08), 2018, 580-584. 10. Alonso R., Orue E., Marzo F., Effects of extrusion and conventional processing methods on protein and antinutritional factor contents in pea seeds, Food Chemistry, 63(4), 1998, 505-512. 11. De Visser C.L.M., Schreuder R., Stoddard F., The EU's dependency on soya bean import for the animal feed industry and potential for EU produced alternatives, Oilseeds Fats Crops Lipids, 21(4), 2014, https://doi.org/10.1051/ocl/2014021. 12. Szostak B., Klikocka H., Glowacka A., Produkcja krajowych surowców wysokobiałkowych na cele paszowe-stan i perspektywy, Przegląd Hodowlany, 85(3), 2017, 19-21. 13. Fiedorowicz E., Sobotka W., Poekstrakcyjna śruta sojowa a alternatywne źródła białka roślinnego dla trzody chlewnej, Przegląd Hodowlany, 81(4), 2013, 14-17 14. Alonso R., Aguirre A., Marzo F., Effects of extrusion and traditional processing methods on antinutrients and in vitro digestibility of protein and starch in faba and kidney beans, Food chemistry, 68(2), 2000, 159-165. 1. Milczarek A., Osek M., Jakość mięsa świń rasy puławskiej żywionych mieszanką z udziałem bobiku niskotaninowego, Żywność: Nauka-Technologia-Jakość, 1(104), 2016, 57-67.

117

Sylwia Kłys, Anna Czech

2. Sonta, M., Rekiel A., Wiecek J., Efektywność tuczu świń mieszankami z udziałem łubinu żółtego (Lupinus luteus), Roczniki Naukowe Polskiego Towarzystwa Zootechnicznego, 12(2), 2016, 9-18. 3. Sonta M., Rekiel A., Wiecek J., Efektywność stosowania mieszanek z udziałem łubinu wąskolistnego w żywieniu rosnących świń, Roczniki Naukowe Polskiego Towarzystwa Zootechnicznego, 11(1), 2015, 35-46 4. Dewulf J., Vanlangenhove H., Vab De Velbe B., Exergy-based efficiency and renewability assessment of biofuel production, Environmental Science&Technology, 39, 2005, 3878- 3882. 5. Schőne F., Leiterer M., Hartung H., Jahreis G., Tischendorf F,. Rapeseed glucosinolates and iodine in sows affect the milk iodine concentration and the iodine status of piglets, British Journal of Nutrition, 85, 2001, 659-670. 6. Schőne F., Rudolph B., Kirchheimu U., Knapp G., Counteracting the negative effects of rapeseed and rapeseed press cake in pig diets, British Journal of Nutrition 78, 1997, 947- 962. 7. Pastuszewska B., Raj S., Śruta rzepakowa jako pasza białkowa i energetyczna- ograniczenia i perspektywy, Rośliny Oleiste-Oilseed Crops, 24(2), 2003, 525-536. 8. Brzóska F., Śliwiński B., Michalik-Rutkowska O., Pasze rzepakowe – wykorzystanie w żywieniu zwierząt oraz bioenergetyce, Cz. 2. Wiadomości Zootechniczne, 48(2), 2010, 19-29. 9. Xu F.Z., Li L.M., Xu J.P., Qian K., Zhang Z.D., Liang Z.Y., Effects of fermented rapeseed meal on growth performance and serum parameters in ducks, Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 24(5), 2011, 678-684. 10. Couto S.R., Sanromán M.A., Application of solid-state fermentation to food industry-A review, Journal of Food Engineering, 76, 2006, 291-302. 11. He R., Ju X., Yuan J., Wang L., Girgih A.T., Aluko R.E., Antioxidant activities of rapeseed peptides produced by solid state fermentation, Food Research International, 49, 2012, 432-438. 12. Scholten R.H., van der Peet-Schwering C.M., den Hartog L.A., Balk M., Schrama J.W., Verstegen M.W., Fermented wheat in liquid diets: Effects on gastrointestinal characteristics in weanling piglets, Journal of Animal Science, 80, 2002, 1179-1186. 13. Canibe N., Virtanen E., Jensen B.B., Microbial and nutritional characteristics of pig liquid feed during fermentation, Animal Feed Science And Technology, 134(1), 2007, 108-123. 14. Song Y.S., Pérez V.G., Pettigrew J.E., Martinez-Villaluenga C., Gonzalez de Mejia E., Fermentation of soybean meal and its inclusion in diets for newly weaned pigs reduced diarrhea and measures of immunoreactivity in the plasma, Animal Feed Science and Technology, 159, 2010, 41-49 15. Canibe N., Jensen B.B., Fermented liquid feed – microbial and nutritional aspects and impact on enteric diseases in pigs, Animal Feed Science and Technology, 173, 2012, 17- 40. 16. Gaweł E., Grzelak M., Koncentrat białkowo-ksantofilowy z lucerny w żywieniu zwierząt, Journal of Research and Applications in Agricultural Engineering, 58(3), 2013, 137-142

118

Białkowe komponenty i dodatki paszowe w żywieniu świń

17. Grela E.R., Kowalczuk-Vasilev E., Skład chemiczny, wartość pokarmowa i przydatność produktów z lucerny w żywieniu ludzi i zwierząt, Lucerna w żywieniu ludzi i zwierząt. Nowe możliwości zastosowania ekstraktu z liści lucerny, Studia Regionalne i Lokalne Polski Południowo-Wschodniej, 6, 2010, 13-25. 18. Grela E.R., Roślinne koncentraty białkowe w żywieniu zwierząt, Wiadomości Zootechniczne, 54(1), 2016, 99-106. 19. Goopy J.P., Murray P.J., A review on the role of duckweed in nutrient reclamation and as a source of animal feed, Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 16 (2), 2003, 297-305. 20. Sońta M., Rekiel A., Rzęsa jako potencjalne źródło białka dla świń., Przegląd Hodowlany, 86(4), 2018, 6-8. 21. Zawadzki K., Możliwości wykorzystania naturalnych surowców wysokobiałkowych (rzęsy wodnej i much) do celów paszowych, Przegląd Zbożowo-Młynarski, 60(1), 2016, 53.

Białkowe komponenty i dodatki paszowe w żywieniu świń Streszczenie Wśród czynników żywieniowych podstawowe znaczenie dla optymalizacji przyrostów masy ciała i efektywności rozrodu świń, ma odpowiedni poziom białka w tym poszczególnych aminokwasów w mieszankach paszowych. Organizm zwierzęcy ma możliwość wytworzenia tylko niektórych aminokwasów białkowych, tzw. endogennych, nie posiada jednak zdolności do syntezy innych aminokwasów budujących białko – zwanych aminokwasami egzogennymi. Jedynym ich źródłem jest białko dostarczane zwierzęciu w paszy. W związku z zakazem stosowania w kraju mączek pochodzenia zwierzęcego obowiązującym od 1 listopada 2003, które w dużym stopniu zaspakajały potrzeby zwierząt na aminokwasy egzogenne, cały czas poszukuje się naturalnych i bezpiecznych substratów do produkcji pasz mogących zapewnić odpowiednie zapotrzebowani na te składniki. Najczęściej stosowane do tej pory śruty z roślin bobowatych, szczególnie z soi, znajdują wśród hodowców coraz mniejszą grupę odbiorców z uwagi na ograniczenia prawne (zakaz stosowania roślin modyfikowanych genetycznie), jak również ekonomicznych. Najczęstszym „zamiennikiem” jest poekstrakcyjna śruta rzepakowa, a także nasiona roślin strączkowych. Źródłem cennego białka są również komponenty pochodzenia zwierzęcego, spośród których największe znaczenie mają: mączka rybna, mączka z krwi czy suszona plazma krwi, nie są one jednak często wykorzystywane. Ponadto źródłem aminokwasów egzogennych są także stosowane w małych ilościach drożdże paszowe znajdujące się w mieszaninach pasz. Słowa kluczowe: Białkowe komponenty, żywienie świń

119

Monika Lik1, Dominika Gulda2, Przemysław Brodzki3

Ocena obrazu termografii powierzchniowej rudawki nilowej (Rousettus aegyptiacus) pod wpływem stresu

1. Wstęp Termografia z zastosowaniem specjalistycznych kamer stanowi obecnie jedną z najlepszych metod obrazowania rozkładu temperatury powierzchniowej zwierząt. Działanie kamer termowizyjnych oparte jest na odczytywaniu i rejestrowaniu promieniowania podczerwonego emitowanego przez ciało. Samo obrazowanie nie powoduje stresu u zwierząt, gdyż prowadzi się je z pewnej odległości, jest całkowicie nieinwa- zyjne i bezbolesne a wyniki uzyskuje się natychmiast [1]. Obrazowanie termiki powierzchniowej umożliwia zlokalizowanie miejsc o pod- wyższonej i obniżonej emisji termicznej – obszarów patologicznie zmienionych oraz wykrycie asymetrii termicznej w obrębie ciała zwierzęcia. Kamery termowizyjne można także wykorzystywać przy określaniu stopnia zestresowania zwierząt, wyrażającego się podniesieniem ciepłoty ciała oraz prędkością regeneracji po stresie – powrót do temperatury normatywnej dla gatunku [1]. Jako podmiot przeprowadzonych badań wybrano rudawkę nilową (rudawca nilowego, Rousettus aegyptiacus) utrzymywaną w chowie zamkniętym w bydgoskim Ogrodzie Zoologicznym (rys. 1). Gatunek ten należy do podrzędu Megachiro-ptera, rodziny rudawkowatych. Rudawka żyje w wilgotnych biomach tropikalnych lub subtropikalnych, ale ma szeroką tolerancję siedliskową o ile środowisko zapewnia odpowiednią bazę żerową, głównie w postaci miękkich owoców (np. morwa, figa, jabłka), niekiedy liści oraz latających owadów [2]. Często spotykana jest w sadach, gdzie uznaje się ją za szkodnika [3]. W związku z tym, że rudawka nilowa prowadzi nocny tryb życia ma duże oczy przystosowane do widzenia w nocy [4]. Żeruje głównie po zmierzchu, a do swoich kryjówek wraca przed wschodem słońca. Ze względu na nocne żerowanie rodzaj Rousettus potrafi posługiwać się echolokacją, przy czym dźwięki umożliwiające orientację w przestrzeni wytwarzane są przy pomocy języka przez tzw. mlaskanie [5, 2]. Pojedyncze mlaśnięcie językiem rudawki nilowej trwa ok. 0,6-1 ms, o częstotli- wości 12-70 kH [6]. Podczas sezonu rozrodczego samce i samice tworzą oddzielne kolonie odpowiednio – kawalerów i macierzyńskie. Po ciąży trwającej ok. 4 m-cy samice zwykle rodzą jedno młode, rzadziej bliźnięta, które pozostają z matką do ukończenia 9 m-cy [4]. Nietoperze należące do tej rodziny w porównaniu z gatunkami krajowymi (reprezentującymi podrząd Microchiroptera) są stosunkowo duże – rozpiętość skrzydeł rudawki nilowej wynosi około 60 cm a długość ciała do 20 cm i przy masie 80-170

1 [email protected], Katedra Biologii i Środowiska Zwierząt, Wydział Hodowli i Biologii Zwierząt, Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy w Bydgoszczy 2 [email protected], Rada Naukowo-Dydaktyczna Ogrodu Zoologicznego w Bydgoszczy, Ogród Zoologiczny, Leśny Park Kultury i Wypoczynku „Myślęcinek” sp. z. o.o. 3 Ogród Zoologiczny, Leśny Park Kultury i Wypoczynku „Myślęcinek” sp. z.o.o.

120

Ocena obrazu termografii powierzchniowej rudawki nilowej (Rousettus aegyptiacus) pod wpływem stresu gramów, przy czym samce są większe od samic [4, 7]. Ubarwienie obu płci jest podobne – od ciemnobrązowego do szarego, z jaśniejszą stroną brzuszną i ciemniej- szym grzbietem. Błony skrzydeł są ciemnobrązowe i porośnięte sierścią do połowy przedramienia. Spośród palców skrzydeł tylko pierwszy i drugi palec zaopatrzone są w pazury, zaś tylne kończyny mają po 5 palców każdy zakończony pazurem (rys. 1).

Rysunek 1. Odpoczywające samice rudawki nilowej [fot: Tamara Samsonowicz]

Lot nietoperzy charakteryzuje bardzo duża zwrotność dzięki możliwości zmniejszenia powierzchni patagium (złożenie częściowe skrzydeł powoduje wybrzuszenie patagium) do 70% maksymalnej powierzchni, co wpływa na zmniejszenie prędkości, ale ułatwia skręty [8]. Rudawki posiadają zdolność poruszania naprzemiennego skrzydłami, czego ptaki nie potrafią. Gatunki owocożerne zwykle latają wolniej niż owadożerne, a ich skrzydła są stosunkowo szerokie i raczej krótkie. Skrzydła nietoperzy służą także do termoregulacji. Podczas lotu 80% energii uwalnia się jako ciepło [9], które wypromieniowują skrzydła zapobiegając hipertermii. Równowaga między termogenezą a utratą ciepła jest szczególnie ważna dla nietoperzy latających przez dłuższy czas lub zasiedlających strefy tropikalne i subtropikalne [9]. W warunkach naturalnych rudawki nilowe zasiedlają tereny między Afryką subsaharyjską a Afryką północną, środkowy wschód oraz Azję południowo-wschodnią [10]. Nietoperze mają szybkie tempo metabolizmu, gdyż wydatek energetyczny na mało wydajny lot, szybkie zwroty (szczególnie nietoperze owadożerne) powoduje wyższe zapotrzebowanie energetyczne, celem utrzymania funkcji życiowych, w tym stałej temperatury ciała. Taki typ przemiany materii znajduje także odzwierciedlenie w rozkładzie temperatury powierzchniowej. Zwierzęta różnie reagują na warunki stresowe, wywoływane przez czynniki zwane stresorami, przy czym szczególnie wrażliwe na stresory wydają się gatunki stadne takie, jak rudawka nilowa. Silny stres ma miejsce wówczas, gdy organizm traci poczucie kontroli, a zwierzę nie może przy pomocy własnej aktywności uniknąć

121

Monika Lik, Dominika Gulda, Przemysław Brodzki stresora [11]. Taka sytuacja miała miejsce, gdy nietoperze odławiano po kolei (odłączając od stada) oraz unieruchamiając chwytem podczas dokonywania pomiarów. W reakcji na czynnik stersowy pojawia się tzw. ogólny zespół przystosowawczy (general adaptation syndrome – GAS) składający się z trzech faz alarmowej, przystosowania i wyczerpania. W organizmie zwierzęcia włączone zostają reakcje fizjologiczne, takie jak: wyrzut glikokortykosteroidów z kory nadnerczy (faza alarmowa), uwolnienie glukozy z gliko- genu wątroby, wzrost ciśnienia krwi oraz częstotliwości uderzeń serca czy zmiana ciepłoty ciała [11]. Broniący się przed stresem organizm zużywa zasoby energetyczne, co prowadzi do ich wyczerpania. Przy określaniu wpływu stersu na organizm należy uwzgędnić czas działania stresora, gdyż długo działający czynnik stresowy może doprowadzić do zmian patologicznych w obrębie narządów wewnętrznych oraz do zaburzeń behawioralnych. Stres, któremu poddano rudawkę nilową ze względu na zachowanie dobrostanu poczas badań był krótkotrwały. Dużą rolę w sposobie odpowiedzi na stres, odgrywaja także indywi- dualne predyspozycje zwierzęcia, gatunek, wiek czy płeć, która stanowiła jeden z czynników służących porównaniu reakcji na stres samców i samic rudawki nilowej. Celem niniejszej pracy była ocena termiki powierzchniowej rudawki nilowej w warunkach wywoływanego stresu. 2. Materiał i metody Badaniami objęto stado 41 dorosłych osobników rudawki nilowej, w tym 8 samców i 33 samic. Zwierzęta utrzymywane są w bydgoskim ogrodzie zoologicznym, w dwóch wolierach, z podziałem na płeć. Elementy wyposażenia w obu wolierach są podobne. Podstawowe składniki każdej z ekspozycji stanowiły: półki osiatkowane umożliwiające podwieszanie się zwierząt, liny, kuwety z pokarmem (owoce m.in. banany, jabłka, kiwi, cytrusy), kuweta z wodą. Jako ściółkę wykorzystano trociny oraz korę drzew iglastych. Pielęgniarz w ciagu dnia dwukrotnie narusza strefę stada, sprzątając i zadając pokarm, wtedy nieliczne zwierzęta przyzwyczajone do takiego cyklu technologicznego w zoo nieznacznie się podnoszą, rozpoczynając lot. Jako nietypowe naruszenie strefy bezpieczeństwa stada wprowadzono dodatkowy element pomiaru – kolejne wejście w ciągu dnia celem rejestracji termiki powierzchniowej z użyciem kamery termowizyjnej, której współczynnik emisji wynosi 98% (rys. 2). Po uzyskaniu 30 termogramów dla stad obu płci (po 15 dla samców i samic), zastosowano presję behawioralną – silny bodziec stresowy, którym w przypadku doświadczenia było odławianie zwierząt i wykonywanie pomiarów morfometrycznych. Nietoperze odławiano bezpośrednio chwytem w ochronnej rękawicy. Do oceny masy zwierząt użyto wagi o dokładności 0,2 g, a nietoperze ważono w lnianym woreczku, którego ciężar odliczono. Pomiarów morfometrycznych dokonano elektroniczną suwmiarką z dokładnością 0,1 mm, przy czym w niniejszych badania odwołano się tylko szerokości ciała – za szerokość ciała przyjęto odległość między stawami barkowymi rudawki.

122

Ocena obrazu termografii powierzchniowej rudawki nilowej (Rousettus aegyptiacus) pod wpływem stresu

Rysunek 2. Przykładowy termogram błony skrzydłowej (patagium) rudawki nilowej [źródło własne]

Przed wypuszczeniem nietoperzy z powrotem do woliery dokonywano pomiaru temperatury powierzchniowej na poziomie klatki piersiowej, z użyciem laserowego pirometru strzałowego (z dokładnością do 0,1℃) wykonując trzy strzały pirometrem i wyznaczając z nich średnią. Kolejnego pomiaru termiki powierzchniowej dokonano po 20-minutowym odpoczynku nietoperzy, bez odłowu i stresowania zwierząt, wykonując kolejne termogramy (po 15 dla obu stad). Wyznaczono równanie regresji liniowej oraz R-kwadrat dla rozkładu termiki powierzchniowej samców i samic rudawki nilowej podczas stresu i opoczynku. Szerokość ciała i masę wyznaczono ze względu na ewentualne zróżnicowanie płci oraz weryfikując założenie, że osobniki większe mają większą bezwładność cieplną, jak również duże wychylenia amplitudy termicznej w warunkach stresu, w porównaniu z temperaturą normatywną dla gatunku. 3. Omówienie wyników Porównując masę ciała badanych osobników zauważono różnice między samcami i samicami na korzyść samców (wykres 1), podobnie jak we wcześniejszych badaniach przeprowadzonych na rudawkach [12]. Średnia masa ciała rudawki nilowej mieściła się w górnym zakresie normy podawanej dla gatunku [4, 12], przy rozpiętości ciężaru ciała od wartości minimalnej 70 gramów do maksymalnej wynoszącej 220 gramów u największego samca. Spośród samic największy osobnik uzyskał ciężar 210 gramów, zaś najmniejsze 70 gramów (dwa osobniki). Najwięcej samic osiągnęło masę 130-160 gramów (14 okazów) (wykres 1). Najmniejszy samiec ważył 140 g, zaś pozostałe od 160 do 220 gramów (wykres 1).

123

Monika Lik, Dominika Gulda, Przemysław Brodzki

Wykres 1. Masa ciała (g) badanych osobników rudawki nilowej z podziałem na płeć [opracowanie własne]

Pozostałe pomiary morfometryczne, czyli szerokość ciała były adekwatne do masy ciała rudawki nilowej. Samice miały węższe ciała niż samce – rozpiętość uzyskanych wyników mieściła się w przedziale od 36,4 mm do 57,2 mm, zaś u samców oscylowała między wartościami 45,5 mm do 60,4 mm (wykres 2). Dla większości samic rozstaw między stawami barkowymi nie przekraczał 50 mm, zaś samców wynosił powyżej 50 mm (wykres 2).

Wykres 2. Szerokość ciała (mm) badanych osobników rudawki nilowej z podziałem na płeć [opracowanie własne]

124

Ocena obrazu termografii powierzchniowej rudawki nilowej (Rousettus aegyptiacus) pod wpływem stresu

Wykres 3. Spoczynkowa temperatura powierzchniowa (℃) badanych osobników rudawki nilowej z podziałem na płeć [opracowanie własne]

Na wykresie 3 podano temperatury spoczynkowe dla stada samców i samic zarejestrowane kamerą termowizyjną, przy czym podane numery określają ilość wykonanych termogramów dla każdego ze stad. Temperatura powierzchniowa uzyskana przez samice była w większości przypadków (poza termogramem 1 i 13) niższa od temperatury samców, niekiedy tylko nieznacznie o 0,1℃, a w skrajnych przypadkach aż o 1,7℃ (wykres 3). Dla obu stad równanie regresji liniowej miało charakter ujemny a więc stada dążyły do obniżenia temperatury w granicach zakresów normatywnych (zwierzę stałocieplne, oszczędzanie metaboliczne). W przypadku samic trafność twierdzenia obejmowała 65% przypadków, a dla samców 13% (tab. 1).

Wykres 4. Temperatura powierzchniowa (℃) badanych osobników rudawki nilowej z podziałem na płeć w warunkach stresu [opracowanie własne]

125

Monika Lik, Dominika Gulda, Przemysław Brodzki

W przypadku dużego stresu, jakim niewątpliwe jest odłów osobników i dokony- wanie pomiarów morfometrycznych temperatura u obu płci wzrasta. Samce stresują się silniej niż samice, ponosząc znaczne koszty energetyczne takiego stanu fizjologicznego – u niektórych w wyniku silnego pobudzenia nastąpiła erekcja. Temperatura samców osiągała wartości około 38-39℃ sięgając maksymalnie 40,1℃ (wykres 4). U jednej i drugiej płci zaobserwowano skokowy wzrost wartości pirometrii powierzchniowej, wyznaczonej dla każdego osobnika, ale w przypadku samic organizm dążył do natychmiastowego obniżenia temperatury (tendencja spadkowa, dotycząca 6% stada), a u samców pojawiło się silne pobudzenie ze wzrostem temperatury do granicznych wartości normatywnych i trendzie dodatnim obejmującym 13% (wartość R2) przypadków (tab. 1).

Wykres 4. Temperatura powierzchniowa (℃) badanych osobników rudawki nilowej z podziałem na płeć w warunkach stresu [opracowanie własne]

Po ustaniu czynnika stresowego i 20-minutowym odpoczynku temperatura spadła u obu płci, przy czym można zauważyć, że u samców znacznie się obniżyła, nawet poniżej temperatury spoczynkowej. Samce stresują się bardziej niż samice, ponosząc bardzo duży wydatek energetyczny, odbierając schwytanie jako atak na siebie, dlatego też niektóre osobniki po wypuszczeniu upadały na ziemię i przez jakiś czas z niej się nie podnosiły, odpoczywając i przejawiając wzmożoną wymianę gazową, z dyna- miczną pracą klatki piersiowej. Samice mają sprawniej działający mechanizm termoregulacji, szybciej kumulują ciepło i odpowiednio nim gospodarują. Dla obu płci wykazano trend ujemny, przy czym spadek skokowy wartości termicznej był niższy u samców tzw. wolniej wracają do temperatury sprzed działania czynnika stresowego (tab. 1). Termoregulację u nietoperzy wspomagają skrzydła – powierzchnia patagium się nie zgrzewa, a jej temperatura na termogramach była o jeden stopień wyższa od temperatury otoczenia. Podczas lotu membrana skrzydłowa zmienia swój kształt, dzięki czemu możliwa jest zarówno absorpcja ciepła ze środowiska, jak i rozpraszanie

126

Ocena obrazu termografii powierzchniowej rudawki nilowej (Rousettus aegyptiacus) pod wpływem stresu jego nadmiaru. Napięta błona skrzydłowa absorbuje mniej ciepła niż błona rozluźniona. Nietoperze nie mają gruczołów potowych na skrzydłach, obniżają temperaturę liżąc powłoki ciała [13] i usuwając ciepło przez drogi oddechowe (chłodzenie wyparne) [14, 15].

Tabela 1. Równanie regresji liniowej oraz R-kwadrat obliczone dla rozkładu termiki powierzchniowej samców i samic rudawki nilowej podczas stresu i opoczynku Płeć Równanie regresji liniowej R – kwadrat przed działaniem czynnika stresowego samice y = -0,0982x + 36,646 R² = 0,6594 samce y = -0,0654x + 36,963 R² = 0,1755 w warunkach stresu samice y = -0,0488x + 37,836 R² = 0,0630 samce y = 0,1429x + 38,382 R² = 0,1393 po 20 min odpoczynku samice y = -0,1511x + 36,902 R² = 0,4696 samce y = -0,1189x + 36,538 R² = 0,3531 Źródło: Opracowanie własne

4. Wnioski Prowadzone badania wymagają zwielokrotnienia doświadczenia, celem uzyskania większej ilości prób (termogramów), przede wszystkim ze względu na nierówną liczebność grup (samców w niniejszych badaniach było 4 krotnie mniej niż samic), jednakże mogą stanowić przyczynek do dalszych badań dotyczących zmian temperatury powierzchniowej zwierząt w warunkach stresowych. Większy wydatek energetyczny w warunkach dyskomfortu behawioralnego ponoszą samce, których termika powierzchniowa w okresie tzw. wypoczynku spada poniżej normatywnej dla gatunku, wskazując na wyczerpanie. Warto powtórzyć niniejsze badania w reakcji na stres umiarkowany, gdyż chwyt wykonywany przez człowieka jest przez zwierzęta odczytywany jako atak drapieżnika, co wyraża się skokowym wzrostem temperatury. Nieznaczna presja behawioralna (niewielki czynnik stresowy) jest łatwa do obserwacji, gdyż wynika np. z cyklu technologicznego ogrodu zoologicznego tzn. prac porządkowych oraz podawania karmy i wody, co stanowi już przedmiot zainteresowań autorów i wymaga tylko opracowania. Literatura 1. Godyń D., Zastosowanie kamery termograficznej w ocenie termograficznej zwierząt gospodarskich, Wiadomości zootechniczne, Vol. 4, 2013, 91-95. 2. Korine C., Izhaki I., Arad Z., Is the Egyptian fruit-bat Rousettus aegyptiacus a pest in Israel? An analysis of the bat's diet and implications for its conservation, Biological Conservation, Vol. 88(3), 1999, 301-306.

127

Monika Lik, Dominika Gulda, Przemysław Brodzki

3. Albayrak I., Asan N., Yorulmaz T., The Natural History of the Egyptian Fruit Bat, Rousettus aegyptiacus, in Turkey (Mammalia: Chiroptera), Turkish Journal of Zoology Vol. 32, 2008, 11-18. 4. Kwiecinski G.G., Griffiths T.A., Rousettus egyptiacus, Mammalian Species, Vol. 611, 1999, 1-9. 5. Holland R., Waters D., Rayner J., Echolocation Signal Structure in the Megachiropteran Bat Rousettus aegyptiacus Geoffrey 1810, The Journal of Experimental Biology,Vol. 207 2004, 4361-4369. 6. von Herbert H., Echoortungsverhalten des Flughundes Rousettus aegyptiacus (Megachiroptera), Zeitschrift für Säugetierkunde, Vol.50, 1985, 141-152. 7. Barclay R.M.R., Jacobs D.S., Harding C.T., McKechnie A.E., Steward S., McCulloch D., Markotter W., Poweska J., Brigham R., M., Termoregulation by captive and free ranging Egyptian rousette bats (Rousettus aegyptiacua) in South Africa, Journal of Mammalogy,Vol. 98 (2), 2017, 572-578. 8. Pennycuick D.J., Gilgding flight of the Dog-Faced bat Rousettus aegyptiacus observed in a wind tunnel, Journal of Experimental Biology, Vol. 55, 1971, 833-845. 9. Reichard J.D., Fellows S.R., Frank A.J., Kunz T.H., Termoregulation during Flight: Body Temperature and Sensible Heat Transfer in Free-Ranging Brazilian Free-Tailed Bats (Tadarida brasiliensis), Physiologycal and Biochemical Zoology, 2010, Vol.83(6), 885- 897. 10. Benda P., Vallo P., Hulva P., Horáček I., The Egyptian fruit bat Rousettus aegyptiacus (Chiroptera: Pteropodidae) in the Palaearctic: geographical variation and taxonomic status, Biologia, Vol. 67(6), 2012, 1230-1244. 11. Kaleta T., Stres i zachowanie się zwierząt dzikich – badania i interpretacje, Życie weterynaryjne, Vol. 84(1), 2009, 21-26. 12. Lik M., Samsonowicz T., Zielińska E., Morphometrics in movement biomechanics of Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus), National Scientific Conference, Novel Trends of Polish Science 2018”, Promovendi, Zakopane 2018. 13. Crowley G., Hall L., Histological observations on the wing of the grey-headed flying-fox (Pteropus-poliocephalus) (Chiroptera, Pteropodidae), Aust. J. Zool. Vol. 42, 1994, 215- 231. 14. Carpenter R.E., Flight Physiology of Flying Foxes, Pteropus Poliocephalus, Journal of Experimental Biology, Vol. 114, 1985, 619-467. 15. Lindhe-Norberg U.M., Brooke A.P., Trewhella W.J., Soaring and non-soaring bats of the family pteropodidae (flying foxes, Pteropus spp.): wing morphology and flight performance, J Exp Biol., Vol. 203(Pt 3), 2000, 651-664.

Ocena obrazu termografii powierzchniowej rudawki nilowej (Rousettus aegyptiacus) pod wpływem stresu Streszczenie Celem badań była ocena rozkładu termiki powierzchniowej stada rudawki nilowej, w warunkach wywołanego stresu. Nietoperze były utrzymywane w stadzie 41 osobników, w chowie zamkniętym w Ogrodzie Zoologicznym w Bydgoszczy. Stresorem dla rudawek był ich odłów i kontakt z badaczem, kiedy dokonywano pomiarów morfometrycznych. Termikę powierzchniową z użyciem kamery termowizyjnej badano przed zastosowaniem czynnika stresującego oraz po odłowie, wypuszczeniu zwierząt do wolier i ich 20-minutowym odpoczynku. Temperaturę podczas stresu określano przy pomocy pirometru strzałowego. W przypadku czynnika stresowego zaobserwowano znaczne przekroczenie wartości normatywnych. Jednakże po odpoczynku temperatura osiągnęła wartości zbliżone do wyjściowych, szybciej u samic zaś u samców wolniej.

128

Ocena obrazu termografii powierzchniowej rudawki nilowej (Rousettus aegyptiacus) pod wpływem stresu

Stres stanowi stan wysoce energochłonny, zatem zwierzęta potrzebują czas na regenerację organizmu (niektóre osobniki, szczególnie samce spadały na podłoże, gdzie przez parę minut odpoczywały) i wyrównanie temperatury ciała, po tak znacznym wydatku energetycznym. Co ciekawe w obrazie termowizyjnym większa część powierzchni membrany skrzydłowej (patagium) miała temperaturę tylko o 1-2 stopnie C wyższą od temperatury otoczenia i nie zmieniała się pod wpływem działania stresu. Słowa kluczowe: stres, termografia powierzchniowa, rudawka nilowa

Evaluation of the surface thermography of the Egyptian rousette (Rousettus aegyptiacus) under stress Abstract The aim of the study was to evaluate the distribution of surface thermics of the Egyptian fruit bat (Egyptian roussete), under conditions of stress. Bats were kept in a herd of 41 individuals, closed in the Zoological Garden in Bydgoszcz. The stressor for the redheads was their catch and contact with the researcher when morphometric measurements were made. Surface thermography with the use of a thermal imaging camera was tested before applying a stressful factor and after fishing, releasing the animals to the aviary and their 20 min rest. In the case of a stress factor, a significant excess of normative values has been observed. However, after a rest the temperature reached values similar to the starting ones, faster in the females and in the males slower. Stress is a highly energy-consuming condition, so animals need time to regenerate the body (some individuals, especially males, fell to the ground, where they rested for a few minutes) and body temperature equilibrium, after such a significant energy expenditure. Interestingly, in the thermovision image the major part of the surface of the wing diaphragm (patagium) had a temperature of only 1-2 degrees C0 higher than the ambient temperature and did not change under the influence of stress. Keywords: stress, surface thermography, Egyptian fruit bat

129

Michał Jabłoński1, Paweł Łyp2, Jerzy Ziętek3, Anna Wilczyńska4, Sylwia Sajdak5

Przypadek przetrwałego przewodu tętniczego ductus arteriosus peristens u królika domowego Oryctolagus cuniculus f. domesticus

1. Wstęp Przewód tętniczy, przewód Botalla (ductus arteriosus) – to struktura płodowa, łącząca pień płucny z aortą, tylnie w stosunku do ujścia pnia ramienno – głowowego oraz lewej tętnicy podobojczykowej. Umożliwia przepływ krwi z ominięciem krążenia płucnego. W krążeniu płodowym z żyły pępowinowej utlenowana krew uchodzi do żyły głównej dolnej, a następnie kierowana jest do prawego przedsionka. W tym miejscu dochodzi do podziału na dwa strumienie większy kierowany do lewego przedsionka przez otwór owalny i mniejszy uchodzący do prawej komory, a następnie do pnia płucnego. Niemal cała krew omija krążenia płucne bowiem, aż 90-95% krwi uchodzi do przewodu tętniczego. W takich przypadkach utlenowana krew dociera do głowy i szyi, natomiast tylne partie ciała otrzymują krew ubogą w tlen. Przepływ prawo i lewo stronny możliwy jest dzięki wysokiemu oporowi płucnego w stosunku do niskiego oporu systemowego. Przewód tętniczy odznacza się odmienną budową w stosunku do łączących naczyń, czyli pnia płucnego i aorty. Może proliferować i włóknieć, tworząc mięśniówkę gładką o ułożeniu spiralnym. Posiada grubą warstwę mukopolisacharydów, a długość i szero- kość całego przewodu jest zmienna. U psów jest on zazwyczaj szeroki i krótki [1-4]. Po urodzeniu w momencie pierwszych oddechów dochodzi do przełomu hemodyna- micznego i rozpoczęcia pracy płuc. Następuje spadek płucnego oporu naczyniowego, dochodzi do odwrócenia kierunku przepływu z pnia płucnego do aorty, spadku stężenia prostaglandyn oraz zmiany stężenia gazów we krwi. Na skutek spadku PGs E1 i E2 dochodzi do obkurczenia ściany naczynia. Z kolei wzrost stężenia parcjalnego tlenu powoduje blokadę kanału potasowego umożliwiając napływ jonów wapnia i wywołanie skurczu. W miejscu zmniejszonego przepływu dochodzi do lokalnej martwicy i proliferacji na skutek wydzielonych czynników wzrostu. Wyżej przyto- czony fizjologiczny mechanizm powoduje zamknięcie przewodu Botalla w ciągu

1 [email protected], Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakaźnych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie. 2 [email protected], Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakaźnych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie. 3 [email protected], Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakaźnych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie. 4 ania.osinska@eyosys, Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakaźnych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie. 5 [email protected], Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakaźnych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie.

130

Przypadek przetrwałego przewodu tętniczego ductus arteriosus peristens u królika domowego Oryctolagus cuniculus f. domesticus kilkudziesięciu pierwszych godzin, a następnie jego powolne zarastanie i powstanie więzadła tętniczego (ligamentum arteriosum). Jeżeli ten proces nie nastąpi to wada ta nazywana jest przetrwałym przewodem tętniczym lub też otwartym przewodem Botalla (PDA – Patent Ductus Arteriosus) [1-7]. 1.1. Predyspozycje rasowe i częstotliwość występowania PDA to jedna z najczęściej występujących wad wrodzonych u psów. Do jej rozwoju może dochodzić na skutek przyjmowania leków, a także przez przekazywanie genów z rodziców na miot. U wcześniaków przewód tętniczy jest zazwyczaj drożny i dochodzić może do jego spontanicznego zamknięcia. U szczeniaków donoszonych do końca ciąży, przewód wykazuję większą wrażliwość na tlen, ale mniejszą wrażliwość na prostaglandyny w porównaniu do szczeniaków – wcześniaków. Autorzy zgodnie stwierdzają, że przetrwały przewód tętniczy występuje dwa razy częściej u samic w porównaniu do samców. W przypadku królików domowych nie istnieją żadne dany statystyczne w oparciu o które możliwe byłoby określenie częstotliwości występo- wania tej wady. Doniesienia kardiologów weterynaryjnych skłaniają, by sądzić o marginalnym występowaniu PDA w populacji królików. Do ras predysponowanych do rozwoju omawianego zaburzenia wśród psów zaliczamy: owczarki niemiecki, polskie owczarki nizinne, maltańczyki, pudle, labrador retriever, sznaucery miniaturowe, chihuahua, yorkshire teriery. W przypadku królików ze względu na niewielką liczbę doniesień naukowych nie można wytypować ras obarczonych zwiększonym ryzykiem wystąpienia tej wady [8, 9]. 1.2. Klasyfikacja i powikłania Istnieje 4-stopniowy podział otwartego przewodu Botalla: a) utajony b) małego stopnia c) umiarkowany d) duży. W przecieku małego stopnia i umiarkowanym dochodzi do poszerzenia prawego przedsionka i prawej komory z nadciśnieniem płucnym. Natomiast w dużym przecieku dochodzi do nieodwracalnych zmian tętnic i żył płucnych, a także do przecieku prawo- lewego. Konsekwencją czego jest rozwój zastoinowej niewydolności serca. Częstym powikłaniem przecieku jest zapalenie wsierdzia – endocarditis. Rzadziej występujące są tętniakowate poszerzenia tętnicy płucnej, a także zator płucny lub obwodowy [1]. 1.3. Zaburzenia hemodynamiczne Na skutek drożności przewodu tętniczego po urodzeniu dochodzi do zaburzeń krążeniowo-oddechowych z hipoperfuzją obwodową. Co powoduje zwiększony przepływ płucny ze spadkiem przepływu obwodowego. Nasilenie wyżej wymienionych zmian zależne jest od oporu naczyniowego, szerokości i długości przetrwałego przewodu oraz wielkości przepływu. W przypadku przetrwałego przewodu tętniczego dochodzi do przecieku lewo- prawego, który polega na wstecznym przepływie krwi przez przewód z aorty do tętnicy płucnej. W zależności od długości i szerokości tej tętnicy dochodzić może do ucieczki nawet 70% krwi pompowanej do krążenia systemowego. Co skutkuje znaczącym zmniejszeniem rzutu serca, spadku perfuzji narządów, a także obniżeniem ciśnienia w aorcie. Dochodzi do zwiększonego przepływu płucnego z zaburzeniem oddychania oraz obciążeniem objętościowym prawego przedsionka i prawej komory. Powięk-

131

Michał Jabłoński, Paweł Łyp, Jerzy Ziętek, Anna Wilczyńska, Sylwia Sajdak szenie przedsionka powoduję ucisk na lewe oskrzele co objawia się okresowym kaszlem i dusznością. Z kolei niewydolność lewo przedsionkowa powoduje gromadzenie się płynu na terenie płuc i oskrzeli co utrudnia oddychanie i wywołuje kaszel. Niedojrzała mięśniówka serca nie jest w stanie podjąć odpowiedniej reakcji na występujące przeciążenie objętościowe i zwiększenie rzutu serca. Skutkuje to dalszym rozwojem niewydolności serca. W tętnicy płucnej w wyniku zmniejszenia oporu naczyniowego płucnego dochodzi do zwiększonego przepływu przez przewód tętniczy, a w konsekwencji również przez krążenie płucne. Pogłębia to zaburzenia oddychania i zastoinową niewydolność serca [1, 7]. 2. Obraz kliniczny Objawy kliniczne w przypadku psów i kotów są wyraźniejsze w porównaniu do królików. Sposób utrzymywania tych zwierząt w klatkach nie sprzyja ich obserwacji. Ze względu na niewielki ruch tych zwierząt w warunkach domowych nie łatwo jest zauważyć na przykład duszność powysiłkową lub łatwe męczenie się. Do charak- terystycznych objawów przy przepływie lewo prawym u psów należą kaszel, płytki oddech, któremu czasami towarzyszy obrzęk płuc. W osi ponad 50 na minutę, przez co objaw ten może być niezauważony przez właściciela. Dodatkowo serce królika posiada odmienną budowę w porównaniu z innymi ssakami, w śródpiersiu znajduje się tkanka tłuszczowa co utrudnia rozpoznanie powiększonego serca, tętnica płucna ma zdecydowanie grubszą warstwę mięśniową aniżeli u psów i kotów. Przetrwały przewód tętniczy często nie manifestuje się objawami klinicznymi co utrudnia jego diagnostykę. Zwierzęta najczęściej trafiają do lekarza weterynarii w momencie, gdy pojawiają się już istotnie zauważalne objawy kliniczne obserwowane przez właściciela. Dla praktyka zajmującego się na co dzień wyłącznie psami i kotami, zdiagnozowanie wad serca u królika jest dosyć trudne. Częstotliwość tętna u królików wynosi około 120-150 fizjologicznie. Dla porównania wartości te u psów są niższe i wynoszą 60-120. Jednym z elementów podstawowego badania klinicznego przed szczepieniem przeciw myksomatozie i wirusowej krwotocznej chorobie królików jest między innymi osłuchiwanie zwierzęcia. Gdy mamy do czynienia z PDA charakterystycznym objawem choroby jest szmer maszynowy. Jest on ciągły, słyszalny najlepiej wysoko u podstawy serca po lewej stronie lub w okolicy pachowej. W okolicy przedsercowej wyczuwalne są drżenia, uderzenia koniuszkowe po lewej stronie są przemieszczone doogonowo i dobrze słyszalne. Do innych objawów klinicznych zaliczamy: zasinienie języka, fioletowo-niebies- kawa barwa widocznych błon śluzowych, czas włośniczkowy powyżej 2s, apatia, brak apetytu, długi odpoczynek po wysiłku. Dodatkowo przy niewydolności serca zdecydowanie częściej dochodzi do powtarzających się infekcji dolnych dróg oddechowych. W postaci bezobjawowej, gdy brak objawów patognomicznych wskazujących na problemy kardiologiczne często dochodzi do stopniowego spadku wagi bez uchwytnej przyczyny [2, 3, 5, 6, 13].

132

Przypadek przetrwałego przewodu tętniczego ductus arteriosus peristens u królika domowego Oryctolagus cuniculus f. domesticus

3. Diagnostyka Obecnie metody diagnostyczne w medycynie weterynaryjnej są na podobnym poziomie medycyny ludzkiej. Problem stanowi natomiast koszt badania, a także dostępność sprzętu wysokiej klasy w mniejszych miastach Polski. Do badań dodatkowych przydatnych w rozpoznawaniu chorób serca zaliczamy: RTG, echo serca, EKG, tomografię komputerową, rezonans magnetyczny, echokardiografię przezprze- łykową, cewnikowanie serca z badaniem angiograficznym. 3.1. Badanie rentgenowskie Jednym z podstawowych badań wykorzystywanych w rozpoznawaniu przetrwałego przewodu tętniczego jest RTG. U pacjentów z tym zaburzeniem pozwala ono wykazać: powiększenie lewego przedsionka, lewej komory, przy dobrze wykonanych zdjęciach RTG uwidocznić można nadmierne wypełnienie naczyń płucnych i poszerzenie aorty zstępującej. Z kolei przy odwróconym PDA widoczne na zdjęciu RTG jest powięk- szenie obu komór, poszerzenie tętnic płatowych płuc z poszerzeniem odcinkowym tętnicy płucnej. Obecnie większość gabinetów i klinik weterynaryjnych posiada pracownię radiologiczną. Niestety przy PDA zmiany na zdjęciu rentgenowskim mogą być niewielkie lub wręcz niezauważalne. Na zdjęciu RTG przede wszystkim zau- ważalna jest powiększona sylwetka serca, która u królika nie powinna wynosić więcej niż trzy przestrzenie międzyżebrowe. Dodatkowo zdjęcie RTG pozwala skutecznie wykryć przewlekły zespół płucno-sercowy [2, 3]. 3.2. Badanie elektrokardiograficzne Kolejnym z podstawowych badań jest badanie elektrokardiograficzne. Jest on profilaktycznie wykonywane przed zabiegiem chirurgicznym przez lekarza weterynarii. Umożliwia ona rejestrację czynności elektrycznej serca na podstawie różnicy poten- cjałów pomiędzy elektrodami. Zapis ten jest w formie krzywej elektrokardiograficznej na papierze bądź na ekranie monitora. Oceniamy na nim załamki P, które powstają w trakcie skurczu przedsionków i pompowania krwi do komór serca, zespół QRS – przedstawiający skurcz komór serca wypełnionych krwią, a także odcinki – stanowiące okres między fazami pracy serca, kiedy w sercu dochodzi do pobudzenia. Niestety EKG nie jest urządzeniem niezawodnym, możliwy jest prawidłowy zapis przy współistniejącej chorobie serca. Przy przetrwałym przewodzie tętniczym zapis może być prawidłowy przy małym przecieku. Natomiast w przecieku umiarkowanym pojawiać się mogą się cechy zaburzeń rytmu w postaci wysokich załamków R i głębokiego załamka Q w odprowadzeniach przedsercowych. Powikłaniem PDA dobrze widocznym w zapisie EKG może być migotanie przedsionków [2, 3]. 3.3. Angiografia przez cewnikowanie Rzadziej wykonywanym badaniem przy otwartym przewodzie Botalla jest angiografia z cewnikowaniem serca, w którym to przeprowadza się cewnik z pnia płucnego do aorty. Uwidocznienie przewodu dokonuję się przez podanie środka kontrastowego do łuku aorty. Bardzo rzadko wykonywanym badaniem w Polsce jest badanie metodą wewnątrz- naczyniowej ultrasonografii. Za jej pomocą możemy ocenić strukturę, funkcję światła

133

Michał Jabłoński, Paweł Łyp, Jerzy Ziętek, Anna Wilczyńska, Sylwia Sajdak naczynia, lokalizację, rozwój, skład, długość i stopień zwężenia. Innym badaniem wewnątrznaczyniowym jest tomografia koherentna umożliwiająca pomiar światła naczynia i grubości ściany naczynia [5, 6]. 3.4. Tomografia komputerowa i rezonans magnetyczny Często wykonywanymi w diagnostyce wad wrodzonych są tomografia komputerowa i rezonans magnetyczny. Obecnie w Polsce jest dostępnych tylko kilka pracowni z rezonansem magnetycznym, ale ich liczba stale się powiększa. Z kolei badanie tomograficzne jest już szeroko rozpowszechnione i stanowi alternatywę dla badania RTG, którą coraz więcej lecznic wykorzystuje. Badania te pozwalają na dokładne poznanie anatomii przewodu oraz dokładnie zobrazowanie zmian strukturalnych poprzez zobrazowanie przekrojów badanego obiektu w projekcji obrazów przekrojowych 2D i przestrzennych 3D. Umożliwia to wykrycie poszerzeń przewodu tętniczego i jego zwapnień w ścianie co stanowi podstawę do wyboru metody operacji PDA [2, 3, 5, 6]. 3.5. Echokardiografia Najbardziej diagnostycznym badaniem w przypadku przetrwałego przewodu tętniczego jest USG serca zwane też badaniem echokardiograficznym. Jest to technika umożliwiająca ocenię struktur anatomicznych serca – grubość ścian, wielkość jam serca. Pozwala także ocenić kurczliwość serca, ruch zastawek ze stopniem ich zwężenia lub niedomykalnością, przecieki wewnątrzsercowe. Dzięki technice dopplerowskiej pozwalającej na ocenę prędkości przepływu krwi w przedsionkach, komorach, aorcie, żyłach i tętnicach płucnych. Echo serca jest doskonałym badaniem pozwalającym na wykrycie krwi lub innego płynu w worku osierdziowym, a także płynu w obrzęku płuc przy niewydolności lewokomorowej lub też na innym tle [2, 3, 5, 6]. Badanie to wykonuje się najczęściej w pozycji bocznej, w IV-VI przestrzeni międzyżebrowej. Odstępstwem od badania w pozycji leżącej może być ciężki stan kliniczny na przykład obrzęk płuc. Jest to badanie bezbolesne, nienarażające zwierzę i właściciela na niekorzystne działanie jak na przykład promienie rentgenowskie przy badaniu RTG. 3.5.1. Rodzaje sond USG i parametry echokardiograficzne W badaniu tym zazwyczaj wykorzystuje się częstotliwość ultradźwięków miedzy 1 a 12 MHz. Powstający obraz jest odbiciem fali ultradźwiękowej badanych struktur. Przy badaniu USG drobnych ssaków wykorzystuje się sondy: microconvex, liniową, sektorową. Najlepszą w przypadku wad wrodzonych serca – jest sonda sektorowa, która posiada niewielką powierzchnię i umożliwia ocenę przez klatkę piersiową serca i naczyń krwionośnych. Badania echa serca przez klatkę piersiową dzielą się na: jednowymiarowe – pozwalają uzyskać przekrój serca w jednej płaszczyźnie, dwuwy- miarowe 2D – umożliwiające pomiar powierzchni i objętości oraz frakcji wyrzutowej, trójwymiarowe – umożliwiające ocenę serca w obrazie przestrzennym. Parametrami służącymi ocenie wymiarów struktur serca i naczyń są: przepływy i napływy maksymalne, grubość ścian, frakcja wyrzutowa, wymiary końcoworozkurczowe i końcowoskurczowe [2, 3].

134

Przypadek przetrwałego przewodu tętniczego ductus arteriosus peristens u królika domowego Oryctolagus cuniculus f. domesticus

4. Przetrwały przewód tętniczy – leczenie 4.1. Torakotomia W leczeniu przetrwałego przewodu tętniczego nie wykorzystuje się metod farmako- logicznych jak w przypadku ludzi ze względu na brak jej skuteczności, wykorzystuje się natomiast dwie metody chirurgiczne. Pierwsza z nich w przypadku psów i kotów polega na otwarciu klatki piersiowej tzw. torakotomii w IV przestrzeni między- żebrowej. Operacja polega na przecięciu tkanki podskórnej, mięśni skórnych, mięśnia najszerszego grzbietu, nerwu piersiowo bocznego, mięśnia pochyłego wraz z mięśniem zębatym. Po przecięciu mięśni międzyżebrowych zewnętrznych i wewnętrznych oraz opłucnej ściennej dochodzi do wniknięcia powietrza do jamy piersiowej. Następnie za pomocą retraktoru rozchyla się żebra. Przetrwały przewód tętniczy identyfikujemy pomiędzy łukiem aorty i pniem płucnym. Na przewód nakłada się przewiązkę po stronie aorty i drugą po stronie pnia płucnego, cięcia dokonuje się między nimi. Metoda ta jest silnie inwazyjna a cała operacja obarczona jest bardzo dużym ryzykiem wystąpienia powikłań [1, 5-7,10-13]. 4.2. Embolizacja otwartego przewodu Botalla Inna metodą stosowaną u psów to cewnikowanie tętnicy udowej i przeprowadzenie aortografii z podaniem środka kontrastującego, by uwidocznić PDA. Robi się go, by sklasyfikować przewód pod względem wielkości i dobrać odpowiednią zatyczkę, która zapewni stałą embolizację przewodu. Gdy pacjent ma zbyt małe naczynie zamiast z dostępu tętnicy udowej dokonuje się go z żyły szyjnej zewnętrznej. Zabieg polega na wprowadzeniu cewnika do PDA następnie jego rozprężeniu i umieszczeniu dalszego dysku w ampule przewodu, a bliższego w pniu tętnicy płucnej. Potwierdzenie stałej embolizacji jest badanie angiograficzne z badaniem echokardiograficznym [5, 6, 10- 12]. 5. Opis przypadku Pacjent, którego dotyczy ta monografia to królik domowy o masie około 1,5 kg masy ciała w wieku około 4 lat, który zgłosił się do Oddziału Drobnych Ssaków dnia 14 grudnia 2018 r. Właściciele zgłosili się z nim na badanie okresowe celem szcze- pienia przeciwko chorobom zakaźnym takim jak myksomatoza i wirusowa krwotoczna choroba królików (pomór królików). W wywiadzie ustalono wystąpienie objawów klinicznych o niskim nasileniu takich jak: duszność spoczynkowa i wysiłkowa, niechęć do ruchu, okresowa apatia, długo- trwały odpoczynek po aktywności wysiłkowej, sina barwa błon śluzowych. W badaniu klinicznym osłuchowo stwierdzono arytmie, której towarzyszył charakterystyczny szmer skurczowo rozkurczowy tzw. maszynowy. 5.1. Wyniki badanie echokardiograficznego Badaniem echo serca stwierdzono przeciążenie objętościowe lewej komory i przerost objętościowy lewego przedsionka. Badanie w projekcji przymostkowej w osi krótkiej na tętnicę płucną uwidoczniło obecność przewodu Botalla o wielkości 2 x 3 mm, od strony aorty szersze, a węższe od strony tętnicy płucnej. Badanie dopplerowskie wyka- zało obecność znacznych turbulencji w przepływie krwi przez tętnicę płucną z pręd-

135

Michał Jabłoński, Paweł Łyp, Jerzy Ziętek, Anna Wilczyńska, Sylwia Sajdak kością przepływu 2.0 m/s. Nie stwierdzono odwróconego kierunku przepływu. Dodatkowo dokonano pomiaru: RVEDd – wymiar końcoworozkurczowy prawej komory 2.7 mm IVSd – grubość przegrody międzykomorowej w rozkurczu 1.6 mm LVEDd – wymiar końcoworozkurczowy lewej komory 8.3 mm PWd – grubość tylnej ściany serca w rozkurczu 2.0 mm IVSs – grubość przegrody międzykomorowej w skurczu 2.2 mm LVESd – wymiar końcowoskurczowy lewej komory 6.1 mm PWs – grubość tylnej ściany serca w skurczu 2.1 mm EF – Frakcja wyrzutu 57% FS – Frakcja skurczowa

136

Przypadek przetrwałego przewodu tętniczego ductus arteriosus peristens u królika domowego Oryctolagus cuniculus f. domesticus

5.2. Postępowanie z pacjentem Ze względu na niewielką masę ciała królika cewnikowanie żył byłoby niemożliwe. Dodatkowo dostępne zatyczki są zbyt duże, by zamknąć przewód w tym konkretnym przypadku. Jedyną metodą pozostaje torakotomia, która byłaby zabiegiem bardzo trudnym nawet dla bardzo doświadczonego lekarza weterynarii – chirurga. Ze względu na niewielkie rozmiary zwierzęcia lekarz prowadzący podjął decyzję o rozważeniu w najbliższej przyszłości operacji. Pacjent obecnie jest stale monitorowany, a ośrodek, który podejmie się operacji jest poszukiwany. Literatura 1. Jędrzejek M., Sarbinowska J., Wiślińska K., Błaż W., Przetrwały przewód tętniczy – zagadnienia nie tylko dla pediatrów, Pediatria i Medycyna Rodzinna, 2014, 10, 291-305. 2. Larry P. Tilley, Francis W. K. Smith, Mark Oyama, Meg M. Sleeper, red. wyd. pol. Garncarz M., Niziołek R., Kardiologia psów i kotów, Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2011, wyd.1. 3. Noszczyk-Nowak A., Kardiologia psów i kotów w praktyce, Elamed, Katowice 2017, wyd. 1. 4. Yajima G., Masugi Y., Suzuki T, Ooami H., Ito S., An adult case of primiary pulmonary hypertension; as compared with an adult case of patent ductus botalli and experimental vasopressin pulmonary thromboarteriopathy of the rabbit, Acta Pathol Jpn, 1963. 5. Kurski B., Krawczyk A., Mikow M., Wieloletni przetrwały przewód tętniczy Botalla, Elwet, 2/2013 r., 42-46. 6. Garncarz M., Przetrwały przewód tętniczy Botalla, Magazyn Weterynaryjny, 12/2008 r. 7. Fan F.L., Zhu S., Chen L.H., Zou Y.L., Fan L.H., Kang J.H., Ma A.Q., Guan Y.F., Role of prostaglandin E and its receptors in the proces of ductus arteriosus maturation and functional closure in the rabbit, Clin Exp Pharmacol Physiol, 2010. 8. Mitchell M.A., Tully Jr T.N., Zwierzęta egzotyczne, wyd. i polskie, red. T.Piasecki 2010 Wrocław. 9. Kraszewska K., Kiedy twojemu szczeniaczkowi wydaje się, że jeszcze nie potrzebuje płuc czyli o?, http://vetcardia.pl/kardiologia/twojemu-szczeniaczkowi-wydaje-sie-ze-jeszcze- potrzebuje-pluc-czyli-o/, 2017.

137

Michał Jabłoński, Paweł Łyp, Jerzy Ziętek, Anna Wilczyńska, Sylwia Sajdak

10. Janiszewski A., Pasławska U., Noszczyk-Nowak A., Cepiel A., Pasławski R., Embolizacja przetrwałego przewodu tętniczego u psów małych ras, Magazyn Weterynaryjny, 16.03.2018. 11. Piszczyński M., Wojtalik M., Gadzinowski J., Kornacka M.K., Siwińska A., Sharma G.K., Henschke J., Wodziński A., Westerski P., Bartkowski R., Mrówczyński R., Mroziński B., Wyniki leczenia chirurgicznego przetrwałego przewodu tętniczego Botalla u noworodków z masą ciała poniżej 1500 g, Kliniczna Perinatologia i Ginekologia 1999, (Supl.) 1999, 92. 12. Heymann M.A., Rudolph A.M., Silverman N.H., Closure of the ductus arteriosus in premature infants by inhibition of prostaglandin synthesis, N. Engl. J. Med. 1976, 295, 530. 13. Miller S.J., Thomas W.P., Coil embolization of patent ductus arteriosus via the carotid artery in seven dogs. Journal of Veterinary Cardiology, 2009, 11, 129-136.

Przypadek przetrwałego przewodu tętniczego ductus arteriosus peristens u królika domowego Oryctolagus cuniculus f. domesticus Streszczenie Przetrwały przewód tętniczy to wrodzona choroba serca, w przebiegu której nie dochodzi do zaniku połączenia pomiędzy tętnicą płucną a aortą. Stanowi ona w życiu płodowym strukturę, dzięki której krew wypływająca z prawej komory omija krążenie płucne i łączy się z aortą zstępującą. Fizjologicznie w ciągu kilkudziesięciu godzin po porodzie światło tego przewodu ulega obkurczeniu na skutek wzrostu ciśnienia parcjalnego tlenu we krwi, a także w wyniku zmniejszenia stężenia prostaglandyn. Następnie ulega ono zarośnięciu i przekształceniu w więzadło tętnicze. Przetrwały przewód tętniczy Botalla to jedna z najczęściej występujących wad wrodzonych serca u psów. Do niedawna w wielu przypadkach wada ta prowadziła do śmierci zwierzęcia, jednak w ostatnich latach na skutek rozwoju nowoczesnych metod diagnostycznych takich jak USG, TK, MRI, a także torakochirurgii możliwe jest skuteczne leczenie tej wady. Coraz częściej diagnozuje się przetrwały przewód tętniczy u królików. Wynika to ze znacznego wzrostu zainteresowani królikami jako zwierzętami domowymi, wzrostu świadomości właścicieli, a także dostępności specjalistycznych technik obrazowania. Pomimo tego liczba doniesień wciąż jest niewielka. Słowa kluczowe: kardiologia, królik, przetrwały, przewód, tętniczy

The case of patent ductus arteriosus peristens ductus arteriosus in the domestic rabbit Oryctolagus cuniculus f. domesticus The persistent arterial duct is an congenital heart disease in which the connection between the pulmonary artery and the aorta does not disappear. It is a structure in the fetal life thanks to which the blood flowing from the right ventricle bypasses the pulmonary circulation and connects with the aorta descending. Physiologically within tens of hours after birth, the light of this tube is shrinking due to the increase of the partial pressure of oxygen in the blood, as well as a result of a decrease in the concentration of prostaglandins. Then it becomes overgrown and transformed into arterial ligament. The persistent ductus Botall is one of the most common congenital heart`s defect in dogs. Until recently, in many cases the defect led to the death of the animal, however, in recent years, due to the development of modern diagnostic methods such as ultrasound, CT, MRI, as well as thoracic surgery, it is possible to effectively treat this defect. The persistent ductus arteriosis in rabbits is diagnosed more and more often. This is due to a significant increase of interest in rabbits as pets, an increase of owners' awareness, as well as the availability of specialized imaging techniques. Despite this, the number of reports is still small. Keywords: cardiology, rabbit, patent, ductus, arteriosus

138

Jacek Mrowiec, Aleksandra Banasik1, Dominika Czyżyk

Wiek jałówki podczas pierwszego zacielenia, a jej parametry fizjologiczne i wydajność laktacyjna w okresie po wycieleniu

1. Wstęp Istnieje kilka wskaźników mówiących o dobrej reprodukcji w stadzie krów mlecznych. Do najważniejszych z nich należą: okres międzyciążowy, zapładnialność, indeks ciąży oraz indeks inseminacji. Indeks inseminacji mówi o ilości kryć wykonanych w stadzie w przeliczeniu na sztukę w skali roku. Im więcej zabiegów insemina- cyjnych, tym koszty związane z rozrodem są wyższe. Indeks ten jest wyliczany zarówno u krów, które zaszły w ciążę, a także u tych, które jeszcze się nie zacieliły [1-3]. Jednym ze sposobów zwiększenia wydajności krów jest ujednolicenie wieku zapładnianych jałówek, co jest bardzo istotne ze względów ekonomiczno-hodowlanych. W związku z tym ważnym elementem współczesnej hodowli stała się optymalizacja wieku inseminowanych zwierząt. Kluczową rolę w inseminacji pełni zarówno osiągnięcie dojrzałości płciowej, jak i dojrzałości hodowlanej. Początek dojrzałości płciowej charakteryzuje się pojawieniem się pierwszych owulacji. Ten punkt czasowy nie jest cechą specyficzną wyłącznie dla rasy, ale jest również, jak wykazały badania, szczególnie zależne od osiągnięcia określonej masy ciała w obrębie rasy. Ponadto, wpływ utrzymania tych zwierząt (światło, ruch, klimat) również odgrywa pewną rolę [4]. Dojrzałość hodowlana (maturitas) jest to wiek właściwy osobniczo i rasowo, kiedy dane zwierzę osiąga rozwój somatyczny (cielesny) i staje się przydatne do rozrodu w aspekcie wymogów hodowlanych. Dojrzałość płciowa u bydła (determinowana wystąpieniem pierwszej rui) występuje generalnie pomiędzy 7 a 18 miesiącem życia, kiedy jałówki mleczne osiągają 35% wagi dorosłej samicy w danej rasie, a jałówki mięsne 40% [1, 5, 6]. Oczywistym faktem jest unikanie krycia zbyt młodych zwierząt, ze względu na następujące czynniki: niedostateczny rozwój somatyczny, który może sprawiać trud- ności przy porodzie, niepełny rozwój gruczołu mlekowego, czy też nie zadowalającą kondycję zwierzęcia, co może powodować straty rzędu 10-12% w życiowej wydajności w prowadzonych badaniach dotyczących tego aspektu. Wiek osiągnięcia dojrzałości płciowej zależy od rasy – bydło mięsne dojrzewa później o 3-5 miesięcy w porównaniu do ras typowo mlecznych. Jednak różne informacje na temat wieku zwierząt na początku okresu dojrzewania nie opierają się całkowicie na różnicach w chowie. Są one również uzależnione od tego, że pierwsze owulacje w ponad 70% przypadków nie są związane z objawami rui zewnętrznej. Ograniczone rozpoznawanie rui z widocznych zewnętrznie objawów u krów, które osiągnęły dojrzałość płciową, wykrywane są później w detekcji rui przy wykorzystaniu buhaja, monitorowania funkcji jajników przez badanie ginekologiczne uzupełnione badaniem ultrasonograficznym narządu

1 [email protected], Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu.

139

Jacek Mrowiec, Aleksandra Banasik, Dominika Czyżyk rodnego lub oznaczaniem poziomu progesteronu. Takie różnice metodologiczne mogą łatwo prowadzić do różnic 1-2 miesięcy, w oparciu o wartości średnie. Oprócz wpływu rasy i intensywności chowu na rozpoczęcie dojrzałości płciowej istnieje znaczna indywidualna zmienność która, jest uwarunkowana genetycznie. Po osiągnięciu dojrzałości płciowej bydło wymaga dalszego rozwoju somatycznego, zanim zostanie wykorzystane do hodowli. Zbyt wczesne krycie niesie ze sobą wiele zagrożeń, które później będą rzutowały na przyszłą produkcyjność sztuki. Ciąża spowalnia wzrost somatyczny organizmu, przez co jałówki niedojrzałe somatycznie będą miały niższe parametry zootechniczne (masa ciała, wysokość w krzyżu, obwód klatki piersiowej) w porównaniu do sztuk dojrzałych i będzie to skutkowało obniżeniem wydajności. Poród u sztuk niedojrzałych somatycznie wiąże się ze znacznym ryzykiem wystąpienia ciężkiego porodu i urazów powstałych w trakcie jego przebiegu spowodowanych wystąpieniem dysproporcji płodowo-matczynych w jego trakcie. Czas pierwszego zacielenia powinien być zależny od masy ciała i wysokości w krzyżu niż od wieku [4]. Prawidłowo dobrany wiek pierwszego krycia znacznie skraca okres bezprodukcyjny i wpływa na poziom brakowania krów w stadzie. W przeciwieństwie do zbyt wczesnego krycia, nadmierne opóźnienie wieku pokrycia [7] powoduje: przedłużenie okresu odchowu, opóźnienie oceny i selekcji, zwiększenie odstępu pomiędzy pokoleniami, zmniejszenie przyrostu masy ciała w przeliczeniu na jedno stanowisko w jałowniku, zwiększenie kosztów wychowu i reprodukcji. Natomiast jeżeli chodzi o dojrzałość hodowlaną, to jest ona wypadkową wielu czynników związa-nych z rasą, odchowem zwierzęcia, uzyskaną masą ciała i kalibrem, jak również wpływami środowiskowymi warunkującymi rozwój osobniczy. Można powiedzieć, że jest połączeniem dojrzałości rozpłodowej i czynnika hodowlanego realizowanego w danym gospodarstwie [8]. W naszej pracy skupiłyśmy się na ocenie właściwego wieku do zapłodnienia jałowic rasy Holsztyńsko Fryzyjskiej (HF). Badania prowadzone były na jałówkach skutecznie pokrytych w wieku 12, 13, 14, 15, 16 miesięcy i polegały na określeniu wybranych parametrów fizjologicznych, wskaźników płodności oraz wydajności mlecznej i składzie mleka. Grupę kontrolną stanowiły jałówki pokryte w 13 i 14 miesiącu natomiast grupę doświadczalną jałówki kryte w wieku 12,15 oraz 16 miesięcy. Dla jałówek rasy Holsztyńsko Fryzyjskiej za optymalny przyjmuje się okres, w którym zwierzęta uzyskują masę ciała ok. 350-380 kg i wysokość w krzyżu ok. 125 cm. Przyjmuje się, że przed samym wycieleniem jałówki powinny uzyskać masę ciała w przedziale 580-600 kg, przy wysokości w kłębie 135-140 cm i kondycji 3,40-3,50 BCS [8]. 2. Materiały i metody 2.1. Metoda i opis stada Analizę przeprowadzono na grupie krów należących do stada rasy Holsztyńsko Fryzyjskiej liczącego około 970 krów dojnych oraz około 800 młodzieży. W systemie utrzymania przeważają obory wolnostanowiskowe i z tego rodzaju obór będą pocho- dziły krowy badane przez nas. Udój krów odbywa się trzy razy dziennie. Hale udojowe wykorzystywane w tej oborze to hale udojowe typu „tandem” oraz „bok w bok”. Badane jałówki kryte są metodą inseminacji. Jałówki w wieku do krycia karmione są

140

Wiek jałówki podczas pierwszego zacielenia, a jej parametry fizjologiczne i wydajność laktacyjna w okresie po wycieleniu

TMR (total mixed ration- system pełnoporcjowego żywienia krów mlecznych) o łącznej masie 19,5. W skład paszy wchodzą m.in. kreda pastewna, śruta rzepakowa, kiszonki (z kukurydzy, trawy), siano, śruta zbożowa. 2.2. Opis metody statystycznej Do oceny różnic między średnimi wartościami parametrów: indeks inseminacji, % tłuszczu,% białka, % suchej masy, ilości mleka, czasu trwania laktacji, ilorazu ilości mleka i ilości dni laktacji między grupami: 12, 13, 14, 15 oraz 16-miesięcy (z wyjątkiem indeksu inseminacji odrębnie dla laktacji pierwszej i drugiej) zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA). W przypadku odrzuceniu hipotezy o równości wszystkich średnich wykonano testy post-hoc wielokrotnych porównań parami metodą „uczciwie istotnej różnicy” (Honestly Significant Difference – HSD) Tukey’a. Wnioskowanie prowadzono na poziomie istotności 5% przy użyciu oprogramowania Statistica 12 firmy StatSoft, Inc. 3. Wyniki 3.1. Indeks inseminacji: Podczas analizowania wyników indeksu inseminacji (Ryc.1) wykazano różnice między średnimi. Istotną statystycznie różnicę między grupami 12 vs 16 miesięcy , 13 vs 16 miesięcy 14 vs 16 miesięcy i 15 vs 16 miesięcy oraz brak istotnych statystycznie różnic między grupami 12 vs 13 miesięcy, 12 vs 14 miesięcy, 12 vs 15 miesięcy, 13 vs 14 miesięcy, 13 vs 15 miesięcy i 14 vs 15 miesięcy.

Rycina 1

3.2. Iloraz ilości mleka i czasu trwania laktacji Podczas analizowania wyników ilorazu ilości mleka i czasu trwania pierwszej laktacji (ryc. 2) wykazano różnice między średnimi. Istotną statystycznie różnicę między grupami 12 vs 14 miesięcy, 12 vs 15 miesięcy i 13 vs 14 miesięcy oraz brak istotnych statystycznie różnic między grupami 12 vs 13 miesięcy, 12 vs 16 miesięcy,

141

Jacek Mrowiec, Aleksandra Banasik, Dominika Czyżyk

13 vs 15 miesięcy, 13 vs 16 miesięcy, 14 vs 15 miesięcy) i 14 vs 16 miesięcy i 15 vs 16 miesięcy. Podczas analizowania wyników ilorazu ilości mleka i czasu trwania drugiej laktacji (ryc. 3) wykazano różnice między średnimi. Istotną statystycznie różnicę między grupami 15 vs 16 miesięcy oraz brak istotnych statystycznie różnic między grupami 12 vs 13 miesięcy ,12 vs 14 miesięcy, 12 vs 15 miesięcy, 12 vs 16 miesięcy, 13 vs 14 miesięcy, 13 vs 15 miesięcy, 13 vs 16 miesięcy, 14 vs 15 miesięcy i 14 vs 16 miesięcy.

Rycina 2

Rycina 3

142

Wiek jałówki podczas pierwszego zacielenia, a jej parametry fizjologiczne i wydajność laktacyjna w okresie po wycieleniu

3.3. Procentowa zawartości suchej masy w mleku Podczas analizowania procentowej zawartości suchej masy w mleku podczas trwania pierwszej laktacji (ryc. 4) wykazano brak istotnych statystycznie różnic między średnimi. Również analiza procentowej zawartości suchej masy w mleku podczas trwania drugiej laktacji (ryc. 5) wykazała brak istotnie statystycznych różnic między średnimi.

Rycina 4

Rycina 5

143

Jacek Mrowiec, Aleksandra Banasik, Dominika Czyżyk

3.4. Procentowa zawartość białka w mleku Podczas analizowania procentowej zawartości białka w mleku podczas trwania pierwszej laktacji (ryc. 6) wykazano brak istotnych statystycznie różnic między średnimi Również analiza procentowej zawartości białka w mleku podczas trwania drugiej laktacji (ryc. 7) wykazała brak istotnych statystycznie różnic między średnimi.

Rycina 6

Rycina 7

144

Wiek jałówki podczas pierwszego zacielenia, a jej parametry fizjologiczne i wydajność laktacyjna w okresie po wycieleniu

3.5. Procentowa zawartość tłuszczu w mleku Podczas analizowania procentowej zawartości tłuszczu w mleku podczas trwania pierwszej laktacji (ryc. 8) wykazano brak istotnych statystycznie różnic między średnimi. Również analiza procentowej zawartości tłuszczu w mleku podczas trwania drugiej laktacji (ryc. 9) wykazała brak istotnych statystycznie różnic między średnimi.

Rycina 8

Rycina 9

145

Jacek Mrowiec, Aleksandra Banasik, Dominika Czyżyk

4. Dyskusja Niniejsza praca przedstawia analizę różnic pomiędzy poszczególnymi parametrami (wydajność laktacyjna, indeks inseminacji, procentowa zawartość suchej masy, białka i tłuszczu w mleku, iloraz ilości mleka i czasu trwania laktacji) w zależności od wieku jałówki podczas pierwszego zacielenia. Ma to na celu optymalizację wieku inseminowanych zwierząt, bez której współczesna hodowla bydła mlecznego nie mogłaby osiągnąć maksymalnych wyników, przy zachowaniu dobrostanu bydła mlecznego. W przypadku analizy indeksu inseminacji nie wykazano istotnych statystycznie różnic pomiędzy 12 vs 13, 12 vs 14, 12 vs 15, 13 vs 14, 13 vs 15, 14 vs 15, natomiast wykazano istotne statystycznie różnice między grupami 12 vs 15,13 vs 16, 14 vs 16, 15 vs 16. W praktyce weterynaryjnej przyjmuje się, u jałówek, że indeks inseminacji powinien dążyć do wartości równej 1. W przypadku jałówek zacielonych w wieku 16 miesięcy średni indeks inseminacji wyniósł 2,5, co uznaje się za niekorzystny rezultat. Jest to niewątpliwie strata finansowa dla hodowcy, który musi przeznaczyć dodatkowe środki na utrzymanie jałówek, ich żywienie oraz na zakup kolejnych porcji nasienia i obsługę inseminacyjną oraz weterynaryjną. Do strat można także zaliczyć nadmierne otłuszczenie się jałówek z powodu dłuższego okresu przebywania na paszy bogatszej energetycznie, jałówki cielne przechodzą na uboższą dawkę żywieniową w celu redukcji ryzyka nadmiernego otłuszczenia. Dlatego wskazane jest podjęcie próby inseminacji wcześniej, uwzględniając wszystkie niezbędne parametry zootechniczne w celu obniżenia średniego wieku pierwszego krycia do poziomu nieprzekraczającego 16 miesięcy w stadzie. Iloraz ilości mleka a długości trwania laktacji ma na celu pokazanie, ile krowa produkowała średnio mleka w ciągu jednego dnia. Jest to parametr niezbędny do oceny wydajności mlecznej krów. W przypadku jego analizy wyniki znacząco różnią się pomiędzy pierwszą a drugą laktacją. Krowy zacielone w dwunastym oraz trzynastym miesiącu życia wyprodukowały znacznie większą ilość mleka w drugiej laktacji. Jednak okres przebywania sztuki w stadzie w tej grupie wiekowej okazał się bardzo krótki w porównaniu z jałówkami starszymi w momencie pierwszego krycia. Zapisy danych z fermy wykazały, że trzy czwarte jałówek z tej grupy wiekowej zostało wybrakowane do końca drugiej laktacji. Wśród przyczyn brakowania dominowały schorzenia gruczołu mlekowego, układu oddechowego oraz skutki ciężkich porodów. Na podstawie tych informacji można stwierdzić, że zbyt niski wiek w momencie krycia zahamował rozwój somatyczny tych sztuk, zwiększając przy okazji ryzyko powikłań w okresie okołoporodowym oraz ograniczył możliwości ich metabolizmu z powodu mniejszej pojemności przewodu pokarmowego przy zachowanym potencjale genetycznym i produkcyjnym. Większe ryzyko niedoborów energetycznych z tego powodu, przy bardzo wysokiej wydajności doprowadziło do nadmiernego obciążenia organizmu, w tym jego naturalnych mechanizmów obronnych. Dlatego też, w praktyce hodowlanej i weterynaryjnej krycie sztuk niedojrzałych somatycznie jest niewskazane ze względu na późniejsze powikłania, a nawet zalecane jest przerywanie ciąży u sztuk niedojrzałych, zjawisko to ma najczęściej miejsce w przypadku obecności buhaja w danej grupie i przy kryciu haremowym. Podjęcie decyzji o ich inseminacji wiąże się z osiągnięciem przez nie odpowiedniej wagi i wyrostowości (omówionej we wstępie). Należy pamiętać, że osiągnięcie odpowiedniej wagi, nie zawsze koreluje z dojrzałością

146

Wiek jałówki podczas pierwszego zacielenia, a jej parametry fizjologiczne i wydajność laktacyjna w okresie po wycieleniu somatyczną samic. Wyraźną tendencję spadkową zaobserwowano w drugiej laktacji krów zacielonych w 16 miesiącu. Największą produkcyjnością zarówno podczas pierwszej, jak i drugiej laktacji cechowały się samice zacielone w piętnastym miesiącu. Badania Ettema i Santos wykazały, że jałówki, które cieliły się w wieku ≤ 700 dni, wytwarzały mniej mleka niż te, które później się wycielały, przy czym największymi producentami były te, które wycielały się w wieku ≥ 751 dni [9]. W naszych badaniach krowy, które zostały zainseminowane w 15 miesiącu życia wyprodukowały największą ilość mleka zarówno w pierwszej, jak i drugiej laktacji co zgodne jest z wynikami pracy Ettema i Santos. Natomiast u krów zacielonych w 16 miesiącu życia produkcja mleka była znacznie niższa, w odróżnieniu od badań przeprowadzonych przez Ettema i Santos. W związku z tym, przeprowadzone przez nas badania częściowo pokrywają się z tymi, przedstawionymi w 2004 roku. Kolejnym badanym parametrem jest jakość mleka. Do składu oceny jakości mleka zaliczamy zawartość procentową suchej masy, tłuszczu, a także białka [10]. Mimo braku istotnych statystycznie różnic między średnimi, można zaobserwować łagodniejszy przebieg wykresu w drugiej laktacji. Różnice są tak subtelne w zawartości tych związków w mleku, że można stwierdzić, iż wiek pierwszego zacielenia jałówki nie ma żadnego wpływu na jakość produkowanego mleka. Ponadto mleko produkowane przez badane krowy odpowiadało normom dla mleka krowiego opublikowanego przez MIR Kraków (tab.1) [11].

Tabela 1. Podstawowy skład mleka w procentach Mleko Sucha masa Laktoza Białko ogółem Kazeina Tłuszcz Popiół Kobiece 10,5-13 7,0-8,8 2,0-2,3 1,0-1,2 0,5-4,0 0,2-0,3 Krowie 10,8-15,0 3,6-5,3 2,5-4,2 2,0-3,2 2,7-5,5 0,6-0,8 Owcze 15,0-21,0 4,5-5,8 5,0-7,5 4,0-6,0 5,0-9,0 0,7-1,2 Kozie 10,5-14,5 4,4-4,8 3,5-4,5 2,5-3,5 2,5-5,0 0,8-1,0 Bawole 14,0-19,0 3,5-5,0 2,5-4,0 2,0-3,0 7,0-9,0 06,-0,9 Źródło: MIR Kraków

5. Wnioski Po przeanalizowaniu wyników pracy stwierdzono wpływ wieku jałówek na skuteczność pierwszej inseminacji. Optymalny wiek zacielenia jałówki przypada na trzynasty oraz czternasty miesiąc życia, co znajduje swoje potwierdzenie w literaturze. Jałówki pokryte w szesnastym miesiącu życia wykazywały bardzo wysoki indeks inseminacji, co niesie za sobą duże straty dla hodowcy. Są one związane głównie z dodatkowymi kosztami utrzymania i obsługi inseminacyjnej oraz weterynaryjnej. Z uwagi na ten aspekt, nie powinny one stanowić pożądanej grupy wiekowej do krycia. Ponadto wykazano wpływ wieku pierwszej inseminacji na laktacje. Krowy zacielone w dwunastym oraz trzynastym miesiącu życia wyprodukowały znacznie większą ilość mleka w drugiej laktacji, jednak ich znakomite średnie wydajności zostały okupione stratami metabolicznymi i zdrowotnymi, przez co ich okres użytkowania w stadzie uległ drastycznemu skróceniu. Wyniki produkcyjne w drugiej laktacji uległy wyrów- naniu porównując wyniki poszczególnych grup wiekowych. Podczas drugiej laktacji

147

Jacek Mrowiec, Aleksandra Banasik, Dominika Czyżyk doszło do wyrównania ilości produkowanego dziennie mleka pomiędzy poszcze- gólnymi grupami krów. Ważnym wnioskiem płynącym z pracy jest to, że pomimo zadowalających wyników odnośnie rozrodu i parametrów laktacyjnych wczesny wiek negatywnie odbija się na dobrostanie zwierząt i ich długowieczności. Zaobserwowano, że trzy czwarte jałówek pokrytych w 12 miesiącu życia zostało wybrakowanych z powodu wystąpienia chorób uniemożliwiających dalsze ekonomiczne uzasadnione użytkowanie. Najprawdopodobniej z powodu niedojrzałości somatycznej w momencie krycia, którego skutki odbijały się negatywnie na ich zdrowotności. Należy podkreślić, że wyniki badań wykazały, że zbyt wczesne oraz nazbyt późny czas krycia jałówek nie przynosi wymiernych korzyści w praktyce hodowlanej. Literatura 1. Twardoń J., Wykład. Fizjologia i specyfika rozrodu bydła, Katedra Rozrodu Zwierząt, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, 2015. 2. Kaszyński A., Zacielanie jałówek, 2017, strona internetowa: http://www.rotr.pl/fileadmin/doc/zacielanie_jalowek.pdf. 3. Chmielewski Ł., Ocena płodności w stadzie,2015, strona internetowa: http://www.farmer.pl/produkcja-zwierzeca/bydlo-i-mleko/ocena-plodnosci-w stadzie,60423.html. 4. Grunert E., Berchtold M., Fertilitätsstӧrungen beim weiblichen Rind. Parley, 1999, 1: 13-15. 5. Bailey T., Currin J., Milk production evaluation in first lactation heifers. Virginia Cooperative Extension, Dairy Science Publication, 2009, Doc. No. 404-285. 6. Bayram B., Yanar M., Akbulut O., The effect of average daily gain and age at first calving on reproductive and milk production traits of Brown swiss and Holstein Friesian cattle, Bulgarian J. Agric. Sci., 2009, 15(5): 453462. 7. Boryczko Z. i in., Wczesne rozpoznawanie ciąży u bydła jako element sterowania rozrodem, Życie weterynaryjne, 2010, strona internetowa: https://www.vetpol.org.pl/dmdocuments/ZW%202010_11%20%2004.pdf. 8. Micek P., Jałówka dobrze odchowana, Dwumiesięcznik „Trouw i MY”, 2009. 9. Ettema JF i in., Impact of age at calving on lactation, reproduction, health, and income in first parity Holsteins on commercial farms, 2004, strona internetowa: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/m/pubmed/15328299/?fbclid=IwAR1p5jyA5a3X- ZxfyVvJSWERJltHNTa4QfnNltUP79fPP3sjLvXOvQSEdKs. 10. Fuertes J.A. i in., Parameters of test day milk yield and milk components for dairy ewes, 1998, strona internetowa: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9621232?fbclid=IwAR3YuUkmmPWDhOt_hqiUk CXHS4q57T2xx0TZfnuYSAmUdE75BMCllrupq_0. 11. https://mir.krakow.pl/resources/articles/8281/Wartosc%20odzywcza_mleko_i_przetwory_ mleczne.pdf?fbclid=IwAR1m775MkRWdwccOJoVF8gqQ6b_WByLMz2OIk8JiHKPawJ X_GXctI4vhdpA.

Wiek jałówki podczas pierwszego zacielenia, a jej parametry fizjologiczne i wydajność laktacyjna w okresie po wycieleniu Streszczenie Jednym ze sposobów zwiększenia wydajności krów jest ujednolicenie wieku pokrycia jałówek, co jest bardzo istotne ze względów ekonomiczno-hodowlanych. W związku z tym ważnym elementem współ- czesnej hodowli stała się optymalizacja wieku inseminowanych zwierząt. W naszej pracy skupiłyśmy się na ocenie właściwego wieku do zapłodnienia jałówek rasy PHF. Badania prowadzone zostały na jałówkach zacielonych w wieku 12, 13, 14, 15, 16 miesięcy i polegały na określeniu wybranych

148

Wiek jałówki podczas pierwszego zacielenia, a jej parametry fizjologiczne i wydajność laktacyjna w okresie po wycieleniu parametrów fizjologicznych, wskaźników płodności (tj.: długość ciąży, okres międzyciążowy, ilość inseminacji, CR, występowanie chorób) oraz wydajności mlecznej po porodzie. Analizę przeprowadzono na grupie krów należących do stada PHF liczącego 970 krów dojnych oraz 800 sztuk młodzieży. W systemie utrzymania dominuje system utrzymania wolnostanowiskowy i na takim materiale prowadzone były badania Hale udojowe wykorzystywane w tej oborze to hale udojowe typu „tandem” oraz „bok w bok”, udój jest prowadzony trzykrotnie. Badane jałówki kryte były poprzez zabieg inseminacji. Jałówki w kryciu karmione są TMR o łącznej masie 19,5. W skład paszy wchodzą m.in. węglan wapnia w postaci kredy pastewnej, śruta rzepakowa, kiszonki (z kukurydzy, traw), siano, śruta poekstrakcyjna rzepakowa. Jako optymalny miesiąc krycia i dotąd najczęściej stosowany zakładamy 13,14 miesiąc życia jałówki (grupa kontrolna). Grupę badawczą stanowić będą jałówki kryte w wieku 12, 15 oraz 16 miesięcy. Słowa kluczowe: bydło mleczne, jałówki, inseminacja, wydajność mleczna, parametry mleka

Influence of heifers first service to selected physiological and productivity parameters Abstract One of the ways to increase cow productivity is to unify the age of fertilized heifers, which is very important for economic and breeding reasons. Therefore, an important element of contemporary breeding is the fact that the animals impregnated through insemination are of the same age. This work focuses on evaluation of the appropriate age to first service the heifers of the PHF breed. The research is conducted on 12, 13, 14, 15, 16 month old heifers and involves the determination of selected physiological parameters, fertility indicators (ie: length of pregnancy, gestation interval, conception rate, occurrence of diseases) and milk yield after delivery. The analysis is carried out on a group of cows in the PHF herd, this group consists of about 970 dairy cows and about 800 young stock and heifers. The housing system is dominated by cubical system and on this group the study was performed. The milking parlors used in those barn are „tandem” and „parallel” type and milking is performed 3 times a day. Heifers enrolled to this study were breeded by artificial insemination. Heifers in breed were fed by TMR with a total mass of 19.5. The feed includes, among others, calcium carbonate, post extraction rape meal, silage (from corn, grass), hay. As the optimal and most common month of first service we assume a, 13-month, 14-month old and this is our control group. The study group consists heifers breeded at 12, 15 and 16 months of age. Keywords: dairy cattle, heifers, insemination, milk yield, milk parameters

149

Tomasz Arkadiusz Łabuz1

Neoichnologia w badaniach obecności i aktywności zwierząt w środowisku na przykładzie wydm

1. Wprowadzenie Współcześnie, wraz z zanikaniem siedlisk zwierząt, istotne jest rozpoznanie miejsc ich bytowania, a nawet koncentracji osobników. Zmiany klimatyczne powodują wędrówki zwierząt na nowe tereny. Z tego powodu adaptują się do nowych warunków środowiskowych, m.in. żerowanie w miastach czy podchodzenie do siedzib. Zwierzęta wywołują różnorodne zmiany w środowisku przyrodniczym, na podstawie których można określić ich zachowania i miejsca bytowania. Oddziaływanie zwierząt na poszczególne elementy środowiska może być istotnym czynnikiem jego przemian [1]. Rozwój gospodarczy obejmuje nowe obszary, zajmowane do tej pory przez dziko żyjące zwierzęta. Sytuacje takie mają miejsce przede wszystkim wraz z rozwojem turystyki, która wkracza na naturalne obszary oraz docelowo kieruje ruch turystyczny do miejsc cennych przyrodniczo. Wpływa to niekorzystnie na środowisko zwierząt powodując ich płoszenie i defragmentację siedlisk. Powoduje również konflikty wynikające ze wzajemnej i często przypadkowej styczności ludzi ze zwierzętami. Z powodu rozwoju turystyki nadmorskiej, w tym: zabudowy wzdłuż brzegu, wzrostu długości odcinków ochranianych hydrotechnicznie, większej mobilności turystów i tym samym eksploracji środowiska na dotychczas naturalnych terenach, zmniejsza się powierzchnia dla żyjących tam gatunków zwierząt. Ponadto rośnie liczba kontaktów i konfliktów pomiędzy zwierzętami a turystami. Zdarza się, że na plażę podczas sezonu turystycznego wychodzą dziki, a w nadmorskich lasach przebywają sarny, stanowiące zagrożenie dla kierowców. W wielu miejscowościach dziki stały się problemem, ze względu na żerowanie na promenadach i ulicach miejskich, m.in. w Świnoujściu i Krynicy Morskiej. Brak wiedzy o zachowaniach zwierząt utrudnia ocenę skali problemu i ogranicza możliwości przeciwdziałania. Coraz częstsze kontakty ludzi i zwierząt w środowisku powodują konflikty. Celem pracy jest omówienie problematyki badawczej neoichnologii i prezentacja wyników obserwacji własnych wpływu zwierząt na środowisko wydm na przykładzie polskiego wybrzeża, w tym określenie bytujących gatunków. 2. Badania wpływu zwierząt na środowisko Przez lata znaczenie zwierząt w przekształcaniu środowiska było pomijane w badaniach naukowych [1]. Organizmy żywe, które bytują w danym środowisku wpływają na jego komponenty, w tym szatę roślinną i podłoże. Pierwszą pracą, w której przedstawiono wpływ robaków piaskowych na mieszanie warstw osadu oraz wzbogacanie gleby, zostały przedstawione w pracy Darwina z 1881 r. „The formation of vegetable mould, through the action of worms, with observations on their habits”

1 [email protected], Pracownia Morfologii i Ochrony Wybrzeża, Wydział Nauk o Ziemi, Uniwersytet Szczeciński.

150

Neoichnologia w badaniach obecności i aktywności zwierząt w środowisku na przykładzie wydm

[1]. Rola ptaków w analizach geograficznych została doceniona późno [2], a zwierzęta jako czynnik sprawczy w geomorfologii były uważane za osobliwości [1]. Na początku XXI w. powstały pierwsze prace analizujące zachowania zwierząt w różnych środowiskach przyrodniczych. W tym morskich bezkręgowców, takich jak małże i robaki piaskowe [3, 4]. Na lądzie, przede wszystkim dużych ssaków, jak hipopotamy w środowisku mokradeł [5] i niedźwiedzie w górach [6], gadów i ssaków w obszarach suchych [7, 8], drobnych ssaków [9] i bezkręgowych skorupiaków wodach [4]. Na podstawie dotychczas powstałych badań zwierzęta należy uznać za jeden z czynników przekształcania środowiska [10]. Wpływ organizmów na ukształtowanie terenu nadal nie został odkryty [11]. We współczesnych badaniach geograficznych środowisk przyrodniczych dużą rolę odgrywają łączone metody różnych dyscyplin oraz nowoczesne technologie. Obec- nością zwierząt i ich wpływem na środowisko zajmują się ichnologia, neoichnologia i zoo-geomorfologia, która jest częścią bio-geomorfologii. Ichnologia (ichnology), to metoda studiowania kopalnych śladów zwierząt, zapisanych w skamieniałych osadach z różnych epok. Z tego powodu często też nazywana jest paleoichnologią [1]. Od lat wykorzystuje się ją w celu identyfikacji środowisk życia danych gatunków w przeszłości i ich rozpoznawania. W osadach zapisane są ślady i szlaki przejść zwierząt, nory i jamy z miejsc bytowania oraz bruzdy i materiał kałowy pochodzące z różnych form żerowania. Na tej podstawie można prześledzić miejsca ich bytowania, ale i określić warunki paleogeograficzne, m.in. zmian klimatu czy szaty roślinnej i siedlisk. Neoichnologia (neoichnology), to metoda pozyskiwania danych o współczesnej obecności zwierząt i ich wpływie na środowisko [1]. Zajmuje się interpretacją i rodzajami śladów pozostawianych przez zwierzęta, w tym polegających na przekształcaniu krajobrazu, podłoża, form terenu i roślinności. Badania polegają na rejestrowaniu skutków przemian środowiska wywoływanych przez różne grupy organizmów. W związku z tym, że najwięcej śladów pozostaje w podłożu, czyli przekształcane jest ukształtowanie terenu, wyodrębniono osobną dyscyplinę zwaną zoogeomofrologią [1]. Zajmuje się ona badaniem wpływu zwierząt na ukształtowanie terenu, ponieważ tak jak i inne czynniki, powodują one niszczenie form terenu, transport osadu (oraz nasion), a nawet tworzą nowe formy, w tym tak duże jak zapory bobrów oraz rafa koralowa. Celem badań jest określenie wielkości form, czasu i celu ich powstania oraz określenie, jakie organizmu za nie odpowiadają. Zoogeomorfologia, w zawiązku z adaptacją zwierząt do zmieniających się warunków klimatu, staje się jedną z metod analizy skutków współczesnych przemian środowiska przyrodniczego [12]. W celu obserwacji zachowań i przemieszczania się zwierząt, zwłaszcza tych, które unikają człowieka można korzystać ze zdalnych technik obserwacji za pomocą kamer i nadajników GPS. Badania takie są kosztochłonne, a kamery nie dają gwarancji rejestracji zwierząt. Dobrym rozwiązaniem jest śledzenie ich tropów oraz innych śladów, pozostawianych przez nie w środowisku. Odbywający się na przykład monitoring ptaków, jest zazwyczaj ustalany w okresie przelotu czy żerowania poszczególnych gatunków. Tropy pozostawione w miękkim podłożu piaszczystym lub mulistym oraz na śniegu są dowodem na obecność danych gatunków w różnych porach

151

Tomasz Arkadiusz Łabuz roku czy nawet dnia. Pozwalają więc stwierdzić, w jakich okresach i w jakich siedliskach bytują zwierzęta. Różne ślady pozostawiane przez nie mogą potwierdzić trwałą obecność lub tylko migracje pomiędzy siedliskami. Ponadto zróżnicowanie śladów od tropów przez ślady żerowania czy gniazdowania, pozwala oceniać zachowania, przystosowanie czy nawyki danych gatunków. 3. Neoichnologia – współczesne ślady zwierząt w środowisku Zwierzęta można uważać za „inżynierów” przekształcających środowisko w różnym stopniu [1, 10]. Obserwacja pozostawianych śladów przez kręgowce umożliwia lokalizowanie ich siedlisk życia oraz wędrówek pomiędzy środowiskami. Podłoże, w którym zwierzęta pozostawiają ślady, to najczęściej luźny materiał, który utrwala zachowania i ich wędrówki. Jest to najczęściej podłoże muliste brzegów jezior, litoralu morskiego i jeziornego, plaż, wydm nadmorskich i tych na pustyniach, ale także stref pływów [3,4,7,8]. Ślady spotkać można na użytkowanych przez człowieka obszarach rolniczych, w okresach nieużytkowania gleby. Rzadziej ślady mogą zachować się w luźnych popiołach wulkanicznych oraz materiale osuwisk i luźniej zwietrzelinie skalnej. Wraz z upływem czasu mogą się utrwalać w osadach w wyniku lityfikacji, scalania osadu w skałę lub sedymentacji, odkładania kolejnych warstw osadu. Ślady pozostawiane przez zwierzęta to najczęściej zagłębienia w terenie, czyli powstałe wyniku erozji, poprzez wkopywanie się w podłoże, wydeptywanie, rycie [7, 11]. Główną, łatwo dostrzegalną, częścią śladów są tropy pozostawiane przez duże zwierzęta: ssaki, gady i ptaki. Ponadto są to szkodzenia roślinności po legowisku, gniazdowaniu lub żerowaniu, kał i ślady rycia w warstwie podłoża. Dużą część śladów znacznie mniejszych, ale nie mniej licznych pozostawiają małe zwierzęta, zwłaszcza w osadach litoralnych i plaży. Są to bezkręgowce i stawonogi, w tym skorupiaki, bytujące przy dnie, w strefie pływów lub w litoralu morskim i jeziornym [3]. Na luźnym podłożu piaszczystym pozostają także ślady pajęczaków i licznych owadów. Również w pionowych ścianach miękkich skał osadowych mogą pozostać nory gniazdujących ptaków, małych saków i owadów. Przykładem w Polsce są gniazda jaskółek brzegowych w gliniastym klifie w rejonie Trzęsacza. Mniejszą część stanowią ślady będące formą akumulacyjną, to znaczy zbudowane przez zwierzęta kopce lub nagromadzony osad, np. po wykopaniu i usunięciu z nory. Większe zwierzęta, które kopią nory, usuwając duże ilości osadu tworzą duże formy terenu [5, 6, 8, 9]. Największe konstrukcje, nieproporcjonalne do swoich rozmiarów budują bobry, termity i mrówki. Największą konstrukcją zwierząt jest rafa koralowa. Ślady współczesnego bytowania zwierząt znajdziemy również w litej skale wapiennej, która może być przez nie żłobiona za pomocą mięśni w celu pozyskania wapienia, tak jak niszczone są klifowe skały przez niektóre gatunki małży. Zwierzęta morskie mogą również rozpuszczać skałę wytwarzanym kwasem, tak jak robią duże, bezmuszlowe małże (Tridacna crocea), żyjące na rafie koralowej. W osadzie luźnym organizmy małe pozostawiają wiele śladów, pochodzących z rycia kanałów i przerabiania materii. Małż nożeniec (Ensis arcuatus) zostawia wąskie i podłużne korytarze w piasku, który jest przez niego filtrowany w poszukiwaniu pożywienia. Kanaliki oraz kupki przetrawionego piasku pozostawiają żyjące w pasie pływów robaki piaskowe. Najwięcej śladów zwierzęta pozostawiają

152

Neoichnologia w badaniach obecności i aktywności zwierząt w środowisku na przykładzie wydm w nieskonsolidowanym osadzie, z tego powodu obserwacje prowadzone na wydmach i plażach dają najszersze spektrum zachowań zwierząt i wytworzonych przez nie form. 4. Cel badań Celem podjętych obserwacji było poznanie, jakie gatunki zwierząt przebywają na wydmach, w których strefach i o jakiej porze dnia oraz roku. Prace prowadzono podczas wykonywanych badań środowiskowych na całym polskim wybrzeżu w okresie ostatnich 15 lat, w tym w projekcie FoMoBi [13]. Prace terenowe na wszystkich mierzejach realizowano każdej wiosny i jesieni od 2003 r. Metody pracy polegały na rozpoznaniu tropów, przejściu wzdłuż nich, wykonanie dokumentacji fotograficznej, pomiary wielkości form utworzonych form terenu. Ponadto rejestrowano ślady żerowania na trawach, pozostawione odchody i inne rozpoznane ślady. Na podstawie zebranej bazy danych możliwe było ustalenie rodzaju gatunków, określenie ich zachowań pasie wydm i plaży oraz wyznaczenie miejsc, w których ślady te powtarzały się. To pozwoliło na określenie stref bytowania i odcinków brzegu, na których występują dane gatunki oraz ich wpływu na środo- wisko. Na tej podstawie próbowano poznać zachowania i przystosowania zwierząt do życia w warunkach skrajnych oraz bioróżnorodność siedlisk [13]. Badania takie były łatwe do realizacji w środowisku nadmorskim, gdzie na luźnym podłożu widoczne są liczne tropy zwierząt. W okresie jesienno-zimowym, na pustej o tej porze roku plaży można było częściej znaleźć ślady zwierząt, które latem unikają spotkań z plażo- wiczami. 5. Wyniki obserwacji Główne rodzaje śladów rozpoznanych na plażach i wydmach nadmorskich to tropy zwierząt, ich odchody, utworzone formy terenu i uszkodzenia roślinności. Zebrane w trakcie prac terenowych dane podzielono na ślady kręgowców dużych, w tym ptaków i ssaków, mniejszych jak gady i płazy oraz licznej grupy bezkręgowców. Podział wynikał ze skali wpływu poszczególnych grup zwierząt na środowisko z powodu rozmiarów pozostawionych śladów. Oczywistym jest fakt, że jeden trop dzika pozostawia wielokrotnie bardziej zmienioną morfologię podłoża, niż jaszczurka zwinka czy larwa mrówkolwa. Z tego powodu zaobserwowane ślady można było zaklasyfikować do form mikro, od milimetrów do 1 cm, mezo, do kilku centymetrów i makro o wymiarach powyżej dziesiątek centymetrów. Na plażach i wydmach zwierzęta wpływają na tworzenie i przebudowę gleby, przekształcenia form terenu i budowę nowych form, najczęściej wklęsłych, erozyjnych. Ślady zwierząt zarejestrowane w podłożu wydm pogrupowano ze względu na cel aktywności:  zakopywanie w celu ochrony w podłożu;  kopanie i przekopywanie w poszukiwaniu pożywienia;  kopanie, wygrzebywanie nor i gniazd i legowisk;  spulchnianie i mieszanie osadu z powodu: deptania, zabawy, walki i tarzania się. Na piasku najczęściej znajdowano tropy, pozostałe po wędrówkach zwierząt pomiędzy lasem a linią wody. Woda wyrzucająca na brzeg kidzinę, materię orga- niczną, roślinną i mniejsze zwierzęta morskie, pozwala żerować różnym gatunkom zwierząt. Liczne są zagłębienia podłużne i owalne po żerowaniu w podłożu. Plaża

153

Tomasz Arkadiusz Łabuz i wydma pokryta roślinami są miejscem schronienia i życia wielu małych bez- kręgowców, które również są pokarmem zwierząt większych. Trawy na wydmach mogą być jedynym źródłem pożywienia podczas śnieżnej zimy dla zwierząt żyjących na łące lub w lesie. W okresie jesienno-zimowym bardzo często spotykano miejsca zgryzania traw i pozostawionych odchodów przez zające i sarny. Czasem na plaży znajdowano ślady po walkach i zabawie, np. wilków czy mew. Innym typem śladów bytowania zwierząt było odnalezione futro zrzucone w trakcie linienia lub pióra. Na wydmie znajdowano miejsca po legowisku zwierząt większych, gdzie trawa była połamana, a w luźnym podłożu występowały charakterystyczne owalne zagłębienia. Często na wydmach spotykane były kości zwierząt. Rzadziej znajdowano zwierzęta martwe, które padły z różnych przyczyn lub utonęły w morzu. Również po owadach znajdowano pozostałe pancerzyki zmieszane z nasionami i osadem. Wszystkie te ślady mają jednak znaczenie dla rozpoznania bioróżnorodności i aktywności poszczególnych grup zwierząt. 5.1. Ślady dużych kręgowców Na odkrytym podłożu rzadko porośniętych wydm przednich, na plaży oraz na mulistym podłożu strefy litoralnej jezior występują liczne ślady wędrówek zwierząt szukających wody i pożywienia. Obok śladów w podłożu zwierzęta pozostawiają ślady na pniach drzew, obgryzione trawy oraz dowody pozostawianego kału. W pasie ustabilizowanych, porośniętych wydm jedynymi śladami są obgryzione liście i ewentualnie kał. Trawa najczęściej jest zgryzana przez sarny oraz zające i króliki w okresie jesienno-zimowym, gdy są to jedyne trawy niezasypane śniegiem i nieuschnięte zupełnie. Ponadto zwierzęta wychodzą w kierunku linii wody, przeszukując strefę napływu fal, gdzie woda wyrzuca szczątki roślinne. Z tego powodu są możliwe utopienia zwierząt, pod którymi na przykład załamał sie lód. Podczas gwałtownych i silnych spiętrzeń sztormowych, gdy woda sięga na ląd do 3,5 m n.p.m., zwierzęta topią się. Z tego powodu znaleziono na plaży osobniki martwe, m.in. dziki, borsuki i krety. Najwięcej śladów na plaży pozostawiają dziki, które w okresie jesieni oraz zimy, w tym także po sztormach potrafią przeorać całą plażę w poszukiwaniu pożywienia w piasku. Zdarza się, że dziki ryją również na wydmie, co doprowadza do uszkodzeń traw i rozwoju niewielkich rynien deflacyjnych. Z nadejściem wiosny i wzrostem glonów oraz nowych traw miejsca te stabilizują się. Rzadko, i to tylko na plaży w Słowińskim Parku Narodowym oraz na Mierzei Kurońskiej na Litwie obserwowano ślady kopyt łosia. Łosie żerujące w nadmorskim lesie obserwowano na Łotwie. Ponadto na plaży spotykano ślady wędrówki w kierunku wody i z powrotem do lasu bobrów, borsuków i kun. Raz zdarzyło się rozpoznać tropy wilków. Odróżnienie było możliwe, ponieważ na świeżym śniegu, pozostawione ślady na plaży i dalej na odkrytych wydmach, znajdowały się w środkowej, odległej części Słowińskiego Parku Narodowego, w okresie zimy (np. styczeń 2019). W pobliżu nie było śladów ludzi ani psów. Nory, to obok tropów najczęściej widoczne, choć często ukryte przed wzrokiem ślady bytowania zwierząt. Nory kręgowców, od gryzoni przez lisy i borsuki mogą mieć średnicę od kilku centymetrów do ponad 0,5 m. Objętość osadu, jaki przy norze jest usypywany może sięgać do 0,5 m3. Głębokość nory trudno określić, jednak drugie lub

154

Neoichnologia w badaniach obecności i aktywności zwierząt w środowisku na przykładzie wydm trzecie wyjście znajduje się często o 3-4 m od pierwszego. Nory usytuowane są najczęściej w stokach wydm, zarówno nasłonecznionych, eksponowanych na południe, jak i tych eksponowanych na północ. Budowane są tylko w utrwalonych wydmach oraz w pionowych podcięciach piaszczystych klifów. Zwierzęta mogą kopać nory także w bardziej skonsolidowanej skale, np. nory królików w osadach gipsowych w suchych warunkach pustyni australijskiej [9].

Rysunek 1. Ślady świadczące o obecności zwierząt w środowisku. A – obok śladów człowieka (a) i pas (b), tropy sieweczki obrożnej (c). B – ślady rycia dzików na plaży [fot: T.A. Łabuz]

W okresie jesienno-zimowym na wydmie przedniej oraz plaży najczęściej spotyka się ślady dzików, saren oraz zajęcy (rys. 1). Zwierzęta te poszukują pożywienia w środowisku, które w tym czasie nie jest zupełnie zamarznięte lub zasypane śniegiem. 5.2. Ślady małych kręgowców Do tej grupy zaliczono ślady obecności ptaków, gadów, płazów i najmniejszych gryzoni, takich jak myszy. Wymiary ich tropów sięgają szerokości 2-5 cm. Tropy niewielkich gryzoni najczęściej można znaleźć na wydmie i plaży, gdzie w czasie nocy żerują pośród traw. Na wydmach ustabilizowanych zlokalizowane są ich norki, małe do 10 cm średnic zagłębienia, dobrze zamaskowane wśród traw. Ponadto występują formy wypukłe w postaci kopców kretów. Największe wśród ptaków alki czy łabędzie pozostawiają ślady do 10-12 cm szerokości. Wśród ptaków wydzielono ślady odpoczywających na plaży lub wałach brzegowych i mieliznach mew oraz łabędzi oraz ślady żerowania małych ptaków z rodziny brodźców i siewkowców. Na plaży najczęstszymi śladami są miejsca wydeptane przez stada mew, łabędzie lub gołębie. Mniej widoczne są ślady gawronów, malutkich świergotków polnych i sieweczek obrożnych. Dużą rzadkością są ślady pozostawione przez żerującego orła. Śladami po obecności i żerowaniu ptaków w strefie brzegowej są zarówno ich szkielety oraz odchody, jak i ślady tropów. Śladami po odpoczynku są często wygrzebane, niewielkie, zagłębienia o średnicy nieprzekraczającej 20-30 cm. Zdarza się, że również i ptaki wykopują spod piasku pokarm. Ślady takie, to jamki o głębokości 10 cm i szerokości 5 cm oraz pozostawione tropy, najczęściej mew. Przy linii wody żerujące np. krwawodzioby, kszyki i biegusy, pozostawiają wąskie dziurki w piasku, które po chwili są zalewane przez napływ wody. Czasami jednak pozostają dłużej, po opadnięciu poziomu morza. Duży wpływ na środowisko mają kormorany, które w miejscach gniazdowania niszczą odchodami podszyt i las, zmieniając krajobraz nadmorski, np. w Rezerwacie Katy Rybackie na Mierzei Wiślanej.

155

Tomasz Arkadiusz Łabuz

Tropy pozostawione przez małe ptaki są często jedyną oznaką ich obecności w danym miejscu (rys. 1), [14]. Jednym z unikatowych takich ptaków jest sieweczka obrożna (Charadious haticulata), ptak, który w okresie wiosny gniazduje na górnej plaży pośród traw i otoczaków, maskując swe gniazdo w pasie śmieci i szczątków organicznych, pozostawionych przez zimowe spiętrzenia sztormowe. Na polskim wybrzeżu w latach 2010-2014 w projekcie FoMoBi ustalono tylko kilka miejsc, w których siewki gniazdują [13].

Rysunek 2. Występowanie gniazd siewki obrożnej na polskim wybrzeżu w latach 2010-2018 [badania i opracowanie własne]

Badania rozmieszczenia gniazd siewek pozwalają określić ich liczebność (rys. 2), [15]. W Polsce obserwacje tych ptaków wykonywane są przez organizację Kuling przy ujściu Wisły oraz podczas liczeń corocznych , m.in. na mierzei jeziora Bukowo. Wśród gadów i płazów najczęściej spotykane na wydmach są dwa gatunki jaszczurek oraz padalec (Anguis fragilis, beznoga jaszczurka. Zdarzają się węże, przede wszystkim zaskrońce (Natrix natrix) i czasem żmije zygzakowate (Vipera berus). Jaszczurka zwinka (Lacerta agilis) przebywa na nie porośniętych zupełnie wydmach przednich. Jej ślady można spotkać także na plaży górnej, zwłaszcza przy kępach roślin, gdzie żeruje, polując na drobne owady ukryte w trawach. Jaszczurka żyworodna (Zootoca vivipara) przebywa na ustabilizowanych i gęsto porośniętych wydmach, w murawie napiaskowej. Padalce i węże wychodzą często na odkryte powierzchnie piaszczyste, w tym na samą plażę. Jaszczurki, węże i padalce pozosta- wiają charakterystyczne, łatwe do rozpoznania na piasku ślady przemieszczania. Ponadto jaszczurki tworzą trapezowate norki o średnicy do 5 cm. Na podstawie rozpoznania śladów można określać miejsca ich obecności i zasięg bytowania. Wiedza o obecności, tych rzadkich, będących pod ochroną zwierząt jest bezcenna. 5.3. Ślady bezkręgowców Wśród owadów ślady wędrówki na piasku pozostawiają tylko organizmy duże i ciężkie, w tym pajęczaki oraz żuki. Pająki, w tym wymyk szarawy (Arctosa cinerea), który ma 2-5 cm średnicy, żyje na luźnym piasku. Pozostawia kropkowane tropy, a także buduje 1 cm szerokości pionowe norki o głębokości do 20-25 cm, w których przebywa i zimuje. Na wydmach agresywnie poluje na małe owady, przemierzając luźny piasek wydm na dużych odległościach. Ślady jednego osobnika mogą rozcho-

156

Neoichnologia w badaniach obecności i aktywności zwierząt w środowisku na przykładzie wydm dzić się w promieniu 5-8 m od norki. Gatunek ten zasięgiem obejmuje wydmy ruchome. Jego ubarwienie przypomina jasne i ciemne ziarna piasku, stąd jest często trudno zauważalny na plaży. Jego kuzyn, wilkosz kowal (Alopecosa fabrilis), przebywa na wydmach stabilnych. Śladem jego bytowania jest pajęczyna uformowana w kształt okrągłego gniazda. Oba gatunki są spokrewnione z tarantulą. Larwa mrów- kolwa pospolitego (Myrmeleon formicarius) żyje na nasłonecznionych i utrwalonych murawą napiaskową wydmach. Jest zasypana w luźnym piasku, na dnie zagłębienia o szerokości 1-3 cm i głębokości 2-5 cm. Zagłębienie jest dobrze widoczne w powierzchni piaszczystej. Jest pułapką dla drobnych owadów, które wpadając w luźny osad są powoli zsuwane do dna, gdzie czeka na nie mrówkolew. Pszczoły obrostki (Dasypoda sp.) na wydmie ustabilizowanej z mniej sypkim piaskiem, najczęściej związanym przez glony, budują 0,5 cm szerokości norki, w których składają jaja. Przed nimi usypują niewielkie kopczyki z piasku, wybieranego z głębi nory. Niewielkie, ale liczne zagłębienia w piasku związanym przez glony powstają w miejscach przebywania mrówek. Nie budują one kopczyków, a sieć podziemnych korytarzy. Owady lżejsze, w tym częsty na wydmach trzyszcz piaskowy, nie pozostawiają tropów. Innymi dowodami obecności owadów w danym miejscu są ich szczątki, kawałki pancerzy, fragmenty Ślady owadów na wydmach są mało istotne z punktu widzenia przekształcania podłoża, ale ważne dla potrzeb rozpoznania ich obecności. 6. Podsumowanie Badania przeprowadzone w środowisku wydmowym pokazały skalę użytkowania i rodzaju przekształceń przez różne, wydzielone grupy zwierząt. Najczęściej spotykanym śladami zwierząt na wybrzeżu wydmowym są pozostawione tropy, zmiany podłoża oraz uszkodzenia roślinności. Wyróżniono tworzone formy terenu o różnej wielkości oraz pochodzące z różnych zachowań zwierząt. Głównym obser- wowanym po śladach zachowaniem zwierząt było przemieszczanie w poszukiwaniu pokarmu i ślady żerowania na plaży lub na wydmie. Ustalono strefy i czas bytowania oraz miejsca gniazdowania zagrożonych gatunków ptaków i gadów. Informacje te są ważne z powodu potrzeby określenia miejsc występowania danych gatunków zwierząt i przewidywania potencjalnych spotkań z wypoczywającymi turystami. Częstotliwość obserwowanych śladów pozwala szacować: liczebność, oznaczać miejsca bytności i tym samym określać bioróżnorodność siedlisk. Zwierzęta są ważnym czynnikiem naturalnych przekształceń środowiska, w tym ukształtowania terenu. Literatura 1. Butler D.R., Zoogeomorphology: Animals as Geomorphic Agents, Cambridge University Press, 1 edition 1995. 2. Collias N.E., The evolution of nests and nest-building in birds, American Zoologist 4(2), 1964, 175-190. 3. Dernie K.M., Kaiser M.J., Richardson E.A., Warwick R.M., Recovery of soft sediment communities and habitats following physical disturbance, Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 285/6, 2003, 285-286. 4. Strayer D.L., Malcom H.M., Shell decay rates of native and alien freshwater bivalves and implications for habitat engineering, Freshwater Biology 52, 2007, 1611-1617. 5. Deocampo D.M., Sedimentary structures generated by Hippopotamus amphibious in a lake-margin wetland, Ngorongoro Crater, Tanzania, Palaios 17, 2002, 212-217.

157

Tomasz Arkadiusz Łabuz

6. Tardiff S.E., Stanford J.A., Grizzly bear digging: effects on subalpine meadow plants in relation to mineral nitrogen availability, Ecology 79, 1998, 2219-2228. 7. Shachak M., Jones C.G., Brand S., The role of animals in an arid ecosystem: snails and isopods as controllers of soil formation, erosion and desalinization, Advances of Geoecology 28, 1995, 37-50. 8. Whitford W.G., Kay F.R., Biopedturbation by mammals in deserts: a review, Journal of Arid Environments 41, 1999, 203-230. 9. Pickard J., Tunnel erosion initiated by feral rabbits in gypsum, semi-arid New South Wales, Australia, Zeitschrift fur Geomorphologie 43(2), 1999, 155-166. 10. Jones C.G., Ecosystem engineers and geomorphological signatures in landscapes, Geomorphology 157/8, 2012, 75-87. 11. Dietrich W.E., Perron J.T., The search for a topographic signature of life, Nature 439, 2006, 411-418. 12. Butler D.R., Anzah F., Goff P.D.,Villa J., Zoogeomorphology and Resilience Theory, Geomorphology 305, 2018, 154-162. 13. Łabuz T.A., Wochna-Bartnik S., Osóch P., Sławińska J., Projekt badawczy FoMoBi i jego znaczenie w rozpoznaniu współczesnej dynamiki i różnorodności biologicznej wydm przednich polskiego wybrzeża, [w:] Florek W. (red.), Geologia i Geomorfologia Pobrzeża i południowego Bałtyku, t. 10, PAP Słupsk, 2013, 81-98. 14. Łabuz T.A., Symbol dzikich plaż i wydm wśród ptaków – Siewka obrożna, Ekonatura, Ogólnopolski Miesięcznik Ekologiczny, 7(176), 2018, 11-14. 15. Colwell M.A., Meyer J.J., Hardy M.A., McAllister S.E., Transou A.N., Levalley R.R., Dinsmore S.J., Western Snowy Plovers Charadrius alexandrinus nivosus, select nesting substrates that enhance egg crypsis and improve nest survival, Ibis 153(2), 2011, 303-311. Neoichnologia w badaniach obecności i aktywności zwierząt w środowisku na przykładzie wydm Streszczenie W pracy przeanalizowano problemy badawcze neoichnologii, badającej ślady zachowań zwierząt w różnych środowiskach. Na podstawie własnych obserwacji, prowadzonych podczas badań terenowych wydm nadmorskich, określono grupy zwierząt i ich ślady zarejestrowane na podłożu piaszczystym. Na tej podstawie ustalono rodzaje aktywności zwierząt oraz miejsca ich bytowania. Ponadto przedstawiono wpływ różnych grup zwierząt na morfologię podłoża, w tym tworzone nowe formy terenu. Wydzielono ślady dużych i małych kręgowców oraz bezkręgowców. Na podstawie omówionych śladów można wnioskować o zwyczajach i miejscach bytowania zwierząt. Można określać bióżnorodność gatunkową, zwłaszcza w związku zaborem siedlisk wydmowych pod działalność turystyczną. Wyniki stanowią też element edukacji środowiskowej Słowa kluczowe: neoichnologia, wpływ na środowisko, ślady zwierząt, polskie wybrzeże Neoichnology in studies of the animals presence and activity in the environment, the example of dunes Abstract This paper has been analyzed the research problems of neoichnology, studying traces of animal behavior in various environments. During own field studies on coastal dunes, groups of animals and their behavior on the sandy substrate were determined. The types of activity and their traces were determined. In addition, the influence of different animal groups on the morphology and the creation of new terrain forms was presented. The traces of large and small vertebrates and invertebrates were distinguished. On the basis of the traces can be concluded animal behavior and selected habits. It can be specified species biodiversity, especially in relation to increasing tourist activity in dune habitats. Obtained data can be used for environmental education. Keywords: neoichnology, influence in environment, animal traces, polish coast

158

Indeks Autorów

Banasik A...... 139 Kuczyńska B...... 46, 99

Barańska A...... 76 Kuczyński T...... 76

Boguszewska K...... 7, 19 Lik M...... 120

Brodzki P...... 120 Łabuz T. A...... 150

Budziński A...... 46 Łyp P...... 130

Czech A...... 54, 111 Madras-Majewska B...... 99

Czyżyk D...... 139 Mrowiec J...... 139

Grabarek B...... 37 Pieckiel P...... 76

Gulda D...... 120 Puppel K...... 46, 99

Jabłoński M...... 61, 130 Sajdak S...... 61, 130

Kania G...... 88 Strzałka-Mrozik B...... 37

Karwowski B. T...... 19 Szatkowska M...... 28

Karwowski B.T...... 7 Szewczuk M...... 7, 19

Kłys S...... 54, 111 Wilczyńska A...... 61, 130

Kruk K...... 69 Wiśniewski K...... 46

Krupa R...... 28 Ziętek J...... 61, 130

Krzaczyński J...... 37

159