RZECZPOSPOLITA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 3027208 POLSKA

(13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (51) Int.Cl. 30.07.2014 14750331.2 A61K 39/395 (2006.01) G01N 33/50 (2006.01)

(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 24.06.2020 Europejski Biuletyn Patentowy 2020/26 Urząd Patentowy EP 3027208 B1 Rzeczypospolitej Polskiej

(54) Tytuł wynalazku: DIAGNOZA I TERAPIA NOWOTWORU Z UDZIAŁEM NOWOTWOROWYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH

(30) Pierwszeństwo: 31.07.2013 WO PCT/EP2013/002272

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

08.06.2016 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2016/23

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

02.11.2020 Wiadomości Urzędu Patentowego 2020/17

(73) Uprawniony z patentu:

BioNTech SE, Mainz, DE Astellas Pharma Inc., Tokyo, JP TRON - Translationale Onkologie an der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg- Universität Mainz gemeinnützige GmbH, Mainz, DE

(72) Twórca(y) wynalazku:

UGUR SAHIN, Mainz, DE ÖZLEM TÜRECI, Mainz, DE KORDEN WALTER, Saulheim, DE MEIKE WAGNER, Mainz, DE

MARIA KREUZBERG, Aachen, DE SABINE HÄCKER, Mainz, DE T3 STEFAN JACOBS, Mainz, DE

(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Dariusz Mielcarski 3027208 KANCELARIA PATENTOWA LION & LION ul. M. Karłowicza 24/1 80-275 Gdańsk

PL/EP

Uwaga:

W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

LL-20/870 EP 3 027 208 B1

Opis

[0001] Konwencjonalne terapie przeciwnowotworowe próbowały głównie selektywnie wykrywać i eliminować komórki nowotworowe, które w dużej mierze szybko rosną (tj. komórki tworzące guz nowotworowy) i wywierać swoje toksyczne działanie na komórki nowotworowe głównie poprzez zakłócanie mechanizmów komórkowych zaangażowanych we wzrost komórek i replikację DNA. Ponadto standardowe schematy onkologiczne zostały w dużej mierze zaprojektowane w celu podawania najwyższej dawki napromieniania lub środka chemioterapeutycznego bez nadmiernej toksyczności, tj. często określanej jako „maksymalna dawka tolerowana” (MTD). [0002] Protokoły chemioterapii często obejmują także podawanie kombinacji środków chemioterapeutycznych w celu zwiększenia skuteczności leczenia. Pomimo dostępności wielu różnych środków chemioterapeutycznych, terapie te mają wiele wad. Na przykład środki chemioterapeutyczne powodują znaczące i często niebezpieczne skutki uboczne z powodu nieswoistych działań ubocznych na szybko rosnące komórki, normalne lub złośliwe. [0003] Inne rodzaje terapii przeciwnowotworowych obejmują chirurgię, terapię hormonalną, immunoterapię, terapię epigenetyczną, terapię przeciw angiogenezie, terapię celowaną i radioterapię w celu wyeliminowania komórek nowotworowych u pacjenta. [0004] Jednak wszystkie konwencjonalne podejścia do leczenia nowotworu mają znaczące wady dla pacjenta, w tym brak skuteczności (w szczególności pod względem wyników długoterminowych) i toksyczności. W związku z tym potrzebne są nowe terapie leczenia pacjentów z nowotworem. [0005] Istnieje coraz więcej dowodów na to, że w guzie istnieje subpopulacja komórek nowotworowych, które zachowują właściwości podobne do macierzystych. Ta subpopulacja nazywana jest rakowymi komórkami macierzystymi (CSC). Rakowe komórki macierzyste mają podobne właściwości w porównaniu do normalnych komórek macierzystych, mają zdolność do samoodnawiania i tworzenia wszystkich heterogenicznych typów komórek nowotworowych. Potężnym testem do analizy podobnych do CSC właściwości komórek nowotworowych jest test tworzenia kolonii. Za pomocą tego testu można łatwo zbadać zdolność do samoodnawiania i siłę tworzenia się nowotworów pojedynczych komórek nowotworowych. [0006] Uważa się, że rakowe komórki macierzyste są zdolne do zapoczątkowania tworzenia się nowotworu, utrzymania wzrostu nowotworu i prawdopodobnie do rozprzestrzenienia się nowotworu do odległych miejsc narządów w ciele. Rakowe komórki macierzyste obejmują unikalną subpopulację nowotworu, która w porównaniu z pozostałymi komórkami nowotworu (tj. masą nowotworu), jest bardziej rakotwórcza, stosunkowo wolniej rosnąca lub spoczynkowa, a często stosunkowo bardziej chemoodporna niż masa nowotworu. Ponieważ konwencjonalne terapie przeciwnowotworowe są ukierunkowane na szybko namnażające się komórki (tj. komórki tworzące masę nowotworu), uważa się, że terapie te są stosunkowo nieskuteczne w celowaniu i uszkadzaniu rakowych komórek macierzystych. Rakowe komórki macierzyste mogą wyrażać inne cechy, które czynią je względnie chemoodpornymi, takie jak oporność na wiele leków i szlaki antyapoptotyczne. Brak odpowiedniego ukierunkowania i wyeliminowania rakowych komórek macierzystych stanowiłby kluczowy powód niepowodzenia standardowych schematów leczenia onkologicznego w celu zapewnienia długoterminowych korzyści u wielu pacjentów z nowotworem. Tak więc rakowe komórki macierzyste mogą być nie tylko głównym powodem nawrotu nowotworu po leczeniu i nieskuteczności leków, ale także głównym powodem przerzutów nowotworów złośliwych. Tak więc jedną z możliwości leczenia nowotworów jest wyeliminowanie rakowych komórek macierzystych. [0007] Klaudyny są integralnymi białkami błony znajdującymi się w obrębie ścisłych połączeń nabłonka i śródbłonka. Przewiduje się, że klaudyny mają cztery segmenty

2 transbłonowe z dwoma pętlami zewnątrzkomórkowymi i końcami N i C znajdującymi się w cytoplazmie. Rodzina klaudyn (CLDN) w transbłonowych białkach odgrywa istotną rolę w utrzymaniu ścisłych połączeń nabłonka i śródbłonka oraz może także odgrywać rolę w utrzymaniu cytoszkieletu i w sygnalizowaniu komórkowym. CLDN6 ulega ekspresji w szeregu różnych ludzkich komórek nowotworowych, podczas gdy ekspresja w normalnych tkankach jest ograniczona do łożyska. [0008] Tutaj prezentujemy dane wykazujące, że ekspresja CLDN6 jest regulowana w górę podczas generowania komórek pluripotencjalnych. Ponadto CLDN6 jest silnie powiązany ze znanymi markerami rakowych komórek macierzystych, a komórki nowotworu dodatniego CLDN6 wykazują zwiększone tworzenie kolonii. Wykazano również, że terapia przy użyciu przeciwciał swoistych dla CLDN6 może przezwyciężyć oporność chemoterapeutyczną nowotworów, takich jak nowotwór jajnika, a połączenie chemioterapii i terapii przeciwciałem CLDN6 ma niezwykły efekt synergistyczny. [0009] Przedstawione tutaj wyniki wskazują, że CLDN6 jest nowym markerem rakowych komórek macierzystych i że rakowe komórki macierzyste mogą być ukierunkowane do celów diagnostycznych i terapeutycznych poprzez celowanie w CLDN6. WO2011/057788 A1 opisuje cele terapeutyczne poprzez celowanie w CLDN6.

PODSUMOWANIE WYNALAZKU

[0010] W jednym aspekcie niniejsze ujawnienie dotyczy sposobu określania rakowych komórek macierzystych obejmującego wykrywanie komórek eksprymujących CLDN6. [0011] W jednym przykładzie obecność komórek eksprymujących CLDN6 wskazuje na obecność rakowych komórek macierzystych i/lub ilość komórek eksprymujących CLDN6 koreluje z ilością rakowych komórek macierzystych. W jednym przykładzie komórki eksprymujące CLDN6 są wykrywane w próbce uzyskanej od pacjenta z nowotworem, na przykład przed, podczas i/lub po leczeniu nowotworu. W jednym przykładzie sposób obejmuje ilościowe i/lub jakościowe określenie komórek eksprymujących CLDN6. W jednym przykładzie sposób obejmuje porównanie liczby komórek eksprymujących CLDN6 z ilością komórek eksprymujących CLDN6 w próbce referencyjnej lub z góry określonym zakresie referencyjnym. Próbką referencyjną może być próbka od pacjenta, u którego nie zdiagnozowano nowotwór. Z góry określony zakres odniesienia może opierać się na populacji pacjentów, u których nie zdiagnozowano nowotwór. W jednym przykładzie sposób obejmuje monitorowanie ilości rakowych komórek macierzystych u pacjenta z nowotworem, przy czym monitorowanie ilości rakowych komórek macierzystych u pacjenta z nowotworem korzystnie obejmuje porównanie ilości rakowych komórek macierzystych w próbce otrzymanej od pacjenta z nowotworem z ilością rakowych komórek macierzystych w próbce uzyskanej wcześniej od pacjenta z nowotworem. W jednym przykładzie próbka uzyskana od pacjenta z nowotworem jest próbką pobraną od pacjenta z nowotworem podczas lub po podaniu terapii przeciwnowotworowej. [0012] W kolejnym aspekcie niniejsze ujawnienie dotyczy sposobu monitorowania skuteczności terapii przeciwnowotworowej u pacjenta z nowotworem, obejmującego: (i) określenie ilości rakowych komórek macierzystych w próbce uzyskanej od pacjenta z nowotworem podczas lub po podaniu terapii przeciwnowotworowej; oraz (ii) porównanie ilości rakowych komórek macierzystych w próbce uzyskanej od pacjenta z nowotworem z ilością rakowych komórek macierzystych w próbce uzyskanej wcześniej od pacjenta z nowotworem, przy czym określenie ilości rakowych komórek macierzystych w próbce uzyskanej od pacjenta z nowotworem i/lub określenie ilości rakowych komórek macierzystych w próbce uzyskanej wcześniej od pacjenta z nowotworem obejmuje określenie liczby komórek eksprymujących CLDN6.

3 [0013] W jednym przykładzie próbka uzyskana wcześniej od pacjenta z nowotworem jest próbką pobraną od pacjenta z nowotworem przed, podczas lub po podaniu terapii przeciwnowotworowej. [0014] W jednym przykładzie sposobu wszystkich aspektów, stabilizacja lub zmniejszenie liczby rakowych komórek macierzystych wskazuje, że terapia przeciwnowotworowa jest skuteczna. W jednym przykładzie sposobu wzrost liczby rakowych komórek macierzystych wskazuje, że terapia przeciwnowotworowa jest nieskuteczna. W jednym przykładzie sposobu terapia przeciwnowotworowa jest terapią przeciwnowotworową skierowaną przeciwko rakowym komórkom macierzystym. W jednym przykładzie próbką uzyskaną od pacjenta z nowotworem jest płyn biologiczny lub biopsja nowotworu. W jednym przykładzie próbkę poddano jednemu lub większej liczbie etapów obróbki wstępnej. W jednym przykładzie wykrywa się komórki eksprymujące CLDN6 lub ich ilość określa się przez wykrycie lub określenie ilości białka CLDN6 i/lub mRNA CLDN6. W jednym przykładzie wykrywane są komórki eksprymujące CLDN6 lub ich ilość jest określana za pomocą testu immunologicznego, przy czym test immunologiczny jest korzystnie wybrany z grupy składającej się z western blot, immunohistochemii, testów radioimmunologicznych, ELISA (test immunoenzymatyczny połączony z enzymem), testów immunologicznych typu „sandwich”, testów immunoprecypitacyjnych, reakcji wytrącania, reakcji precypitacji z dyfuzją żelową, testów immunodyfuzji, testów aglutynacji, testów wiązania dopełniacza, testów immunoradiometrycznych, testów immunofluorescencyjnych, immunofluorescencji, testów immunologicznych białka A, cytometrii przepływowej i analizy FACS. W jednym przykładzie wykrywane są komórki eksprymujące CLDN6 lub ich ilość jest określana za pomocą przeciwciała mającego zdolność wiązania z CLDN6. W jednym przykładzie komórki eksprymujące CLDN6 są komórkami nowotworowymi eksprymującymi CLDN6 i/lub są komórkami obecnymi w miejscu nowotworu. [0015] Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciała mającego zdolność wiązania z CLDN6 do zastosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania nowotworowi obejmującego hamowanie i/lub eliminację rakowych komórek macierzystych przez podawanie przeciwciała mającego zdolność wiązania z CLDN6 pacjentowi z nowotworem i poprzez podawanie chemioterapii, przy czym przeciwciało i chemioterapia są podawane w synergistycznie skutecznych ilościach, przy czym przeciwciało jest zdolne do pośredniczenia w zabijaniu komórek eksprymujących CLDN6 przez ADCC i/lub CDC i zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego (VH) zawierający sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 5 i region zmienny łańcucha lekkiego (VL) zawierający sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 4, i przy czym chemioterapia obejmuje środek wybrany z grupy obejmującej karboplatynę, gemcytabinę, paklitaksel i cisplatynę. [0016] W jednym przykładzie wykonania nowotwór zawiera rakowe komórki macierzyste eksprymujące CLDN6. W jednym przykładzie wykonania podawanie przeciwciała mającego zdolność wiązania z CLDN6 powoduje hamowanie lub eliminację rakowych komórek macierzystych eksprymujących CLDN6. W jednym przykładzie wykonania podawanie przeciwciała mającego zdolność wiązania z CLDN6 nasila przeciwnowotworowe działanie chemioterapii, przy czym wzmocnienie przeciwnowotworowego działania chemioterapii korzystnie obejmuje wydłużenie życia pacjenta z nowotworem poddawanego chemioterapii. [0017] W jednym przykładzie wykonania sposobu zgodnego z wszystkimi aspektami wynalazku eliminacja rakowych komórek macierzystych powoduje wyleczenie nowotworu. W jednym przykładzie wykonania sposobu zgodnego z wszystkimi aspektami wynalazku, przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 i chemioterapię podaje się w synergistycznie skutecznych ilościach. W jednym przykładzie wykonania sposobu zgodnego z wszystkimi aspektami wynalazku chemioterapię podaje się w dawce, która jest mniejsza niż maksymalna dawka tolerowana. W jednym przykładzie wykonania sposobu zgodnego z wszystkimi aspektami wynalazku chemioterapia obejmuje podawanie środka wybranego z grupy obejmującej taksany, związki platyny, analogi nukleozydów, analogi kamptotecyny,

4 antracykliny, ich proleki, ich sole i ich kombinacje. W jednym przykładzie wykonania sposobu zgodnego z wszystkimi aspektami wynalazku chemioterapia obejmuje podawanie środka wybranego z grupy obejmującej paklitaksel, cisplatynę, karboplatynę, ich proleki, ich sole i ich kombinacje. W jednym przykładzie wykonania sposobu zgodnego z wszystkimi aspektami wynalazku, rakowe komórki macierzyste znajdują się w miejscu nowotworu pacjenta z nowotworem. W jednym przykładzie wykonania sposobu zgodnego z wszystkimi aspektami wynalazku nowotwór jest oporny na chemioterapię, w szczególności jeśli jest podawany w monoterapii. W jednym przykładzie wykonania sposobu zgodnego z wszystkimi aspektami wynalazku, przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 ma działanie hamujące i/lub cytotoksyczne na rakowe komórki macierzyste, przy czym przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 wywiera działanie hamujące i/lub działanie cytotoksyczne na rakowe komórki macierzyste, korzystnie poprzez pośredniczenie w jednej lub więcej lizach zależnych od dopełniacza (CDC), lizach zależnych od przeciwciał zależnych od cytotoksyczności komórkowej (ADCC), indukcji apoptozy i hamowaniu proliferacji. W jednym przykładzie wykonania sposobu zgodnego z wszystkimi aspektami wynalazku, przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 jest sprzężone z ugrupowaniem terapeutycznym i może być koniugatem przeciwciało-lek, jak tu opisano. W jednym przykładzie wykonania, ugrupowaniem terapeutycznym jest środek cytotoksyczny, środek chemoterapeutyczny lub radionuklid. W jednym przykładzie wykonania ugrupowanie terapeutyczne działa na wolno rosnące komórki. W jednym przykładzie wykonania sposobu we wszystkich aspektach wynalazku, przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 wiąże się z pierwszą pętlą zewnątrzkomórkową CLDN6. W jednym przykładzie wykonania sposobu zgodnego z wszystkimi aspektami wynalazku, przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego (VH) zawierający sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 5 lub jej fragment i region zmienny łańcucha lekkiego (VL) zawierający sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 4 lub jej fragment. [0018] Ujawniono sposób leczenia lub zapobiegania nowotworowi, obejmujący podawanie koniugatu przeciwciało-lek zawierającego przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 kowalencyjnie przyłączonego przez łącznik do co najmniej jednego ugrupowania leku toksynowego do pacjenta z nowotworem. [0019] W jednym przykładzie ugrupowanie leku toksyny jest przepuszczalne dla błony komórkowej. W jednym przykładzie co najmniej jedno z ugrupowań leku toksyn działa na wolno rosnące komórki. W jednym przykładzie ugrupowaniem leku toksyny jest majtanzynoid lub aurystatyna. W jednym przykładzie majtanzynoid jest wybrany z grupy składającej się z DM1 i DM4. W jednym przykładzie, aurystatyna jest wybrana z grupy składającej się z monometylo-aurystatyny E (MMAE) i monometylo-aurystatyny F (MMAF). W jednym przykładzie łącznik jest łącznikiem ciętym, korzystnie łącznikiem ciętym katepsyną. W jednym przykładzie przeciwciało jest przyłączone do łącznika poprzez tiol cysteinowy przeciwciała. [0020] W jednym przykładzie nowotwór obejmuje rakowe komórki macierzyste eksprymujące CLDN6. W jednym przykładzie podawanie koniugatu przeciwciało-lek powoduje hamowanie lub eliminację rakowych komórek macierzystych eksprymujących CLDN6. W jednym przykładzie eliminacja rakowych komórek macierzystych powoduje wyleczenie nowotworu. W jednym przykładzie rakowe komórki macierzyste znajdują się w miejscu nowotworu pacjenta z nowotworem. W jednym przykładzie koniugat przeciwciało- lek ma działanie hamujące i/lub cytotoksyczne na rakowe komórki macierzyste, przy czym koniugat przeciwciało-lek wywiera działanie hamujące i/lub cytotoksyczne na rakowe komórki macierzyste, korzystnie poprzez indukcję apoptozy i/lub hamowanie proliferacji. [0021] W jednym przykładzie sposób obejmuje ponadto podawanie chemioterapii i/lub radioterapii. W jednym przykładzie podawanie koniugatu przeciwciało-lek poprawia przeciwnowotworowe działanie chemioterapii i/lub radioterapii, przy czym wzmocnienie

5 przeciwnowotworowego działania chemioterapii i/lub radioterapii korzystnie obejmuje wydłużenie życia pacjenta z nowotworem poddawanego chemioterapii i/lub radioterapii. [0022] W jednym przykładzie koniugat przeciwciało-lek i chemioterapia są podawane w synergistycznie skutecznych ilościach. W jednym przykładzie chemioterapię podaje się w dawce niższej niż maksymalna dawka tolerowana. W jednym przykładzie chemioterapia obejmuje podawanie środka wybranego z grupy składającej się z taksanów, związków platyny, analogów nukleozydów, analogów kamptotecyny, antracyklin, ich proleków, ich soli i ich kombinacji. W jednym przykładzie chemioterapia obejmuje podawanie środka wybranego z grupy składającej się z paklitakselu, cisplatyny, karboplatyny, jej proleków, ich soli i ich kombinacji. W jednym przykładzie nowotwór jest oporny na chemioterapię, zwłaszcza jeśli jest podawany w monoterapii. [0023] W jednym przykładzie przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6, w szczególności gdy jest obecne w koniugacie przeciwciało-lek, ma powinowactwo i/lub swoistość wobec CLDN6 odpowiednie do umożliwienia endocytozy przeciwciała i/lub koniugatu lek-przeciwciało. W jednym przykładzie przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 w koniugacie przeciwciało-lek wiąże się z pierwszą pętlą zewnątrzkomórkową CLDN6. W jednym przykładzie przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 w koniugacie przeciwciało-lek zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego (VH) zawierający sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 5 lub jego fragment i region zmienny łańcucha lekkiego (VL) zawierający sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 4 lub jej fragment. [0024] W jednym przykładzie CLDN6 ma sekwencję aminokwasową zgodną z SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2. W jednym przykładzie nowotwór obejmuje nowotwór pierwotny, nowotwór zaawansowany, nowotwór z przerzutami, nowotwór nawrotowy lub ich kombinacje. [0025] Ujawniono sposób leczenia lub zapobiegania nowotworowi obejmujący: (i) określenie rakowych komórek macierzystych u pacjenta z nowotworem i (ii) podawanie pacjentowi z nowotworem terapii przeciwnowotworowej skierowanej przeciwko rakowym komórkom macierzystym. W jednym przykładzie terapia przeciwnowotworowa skierowana przeciwko rakowym komórkom macierzystym obejmuje wykonanie sposobu leczenia lub zapobiegania nowotworowi zgodnemu z wynalazkiem. [0026] Ujawniono sposób zapobiegania chemooporności nowotworu, nawrotom nowotworu lub przerzutom nowotworu, w szczególności podczas lub po leczeniu nowotworu, obejmujący leczenie nowotworu, jak zastrzeżono. [0027] Ujawniono preparat medyczny do leczenia lub zapobiegania nowotworowi, zawierający (i) przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 i (ii) środek chemioterapeutyczny. Przeciwciało posiadające zdolność wiązania się z CLDN6 i środkiem chemioterapeutycznym może być obecne w preparacie medycznym w mieszaninie lub być oddzielone od siebie. Preparat medyczny może być obecny w postaci zestawu zawierającego pierwszy pojemnik zawierający przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 i drugi pojemnik zawierający środek chemoterapeutyczny. Preparat medyczny może ponadto zawierać drukowane instrukcje stosowania preparatu do leczenia lub zapobiegania nowotworowi. Różne przykłady preparatu medycznego, a w szczególności przeciwciała mającego zdolność wiązania się z CLDN6 i środkiem chemioterapeutycznym są takie, jak tu opisano. [0028] Ujawniono preparat medyczny zawierający (i) przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 i (ii) paklitaksel. Przeciwciało posiadające zdolność wiązania się z CLDN6 i paklitakselem może być obecne w preparacie medycznym w mieszaninie lub być oddzielone od siebie. Preparat medyczny może służyć do leczenia lub zapobiegania nowotworowi, na przykład nowotworowi jajnika. Preparat medyczny może być obecny w postaci zestawu zawierającego pierwszy pojemnik zawierający przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 i drugi pojemnik zawierający paklitaksel. Preparat medyczny może

6 ponadto zawierać drukowane instrukcje stosowania preparatu do leczenia lub profilaktyki nowotworu, takiego jak nowotwór jajnika. Różne wykonania preparatu medycznego, a w szczególności przeciwciała mającego zdolność wiązania z CLDN6 są takie, jak opisano w niniejszym dokumencie. [0029] Ujawniono koniugat przeciwciało-lek zawierający przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 kowalencyjnie przyłączone przez łącznik do co najmniej jednego ugrupowania leku toksyny. [0030] W jednym przykładzie ugrupowanie leku toksyny jest przepuszczalne dla błony komórkowej. W jednym przykładzie wykonania co najmniej jedno z ugrupowań leku toksyny działa na wolno rosnące komórki. W jednym przykładzie ugrupowaniem leku toksyny jest majtanzynoid lub aurystatyna. W jednym przykładzie majtanzynoid jest wybrany z grupy składającej się z DM1 i DM4. W jednym przykładzie, aurystatyna jest wybrana z grupy składającej się z monometylo-aurystatyny E (MMAE) i monometylo-aurystatyny F (MMAF). W jednym przykładzie łącznik jest łącznikiem ciętym, korzystnie łącznikiem ciętym katepsyną. W jednym przykładzie przeciwciało jest przyłączone do łącznika poprzez tiol cysteinowy przeciwciała. [0031] W jednym przykładzie przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6, w szczególności gdy jest obecne w koniugacie przeciwciało-lek, ma powinowactwo i/lub swoistość wobec CLDN6 odpowiednie do umożliwienia endocytozy przeciwciała i/lub koniugatu lek-przeciwciało. W jednym przykładzie przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 w koniugacie przeciwciało-lek wiąże się z pierwszą pętlą zewnątrzkomórkową CLDN6. W jednym przykładzie przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 w koniugacie przeciwciało-lek zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego (VH) zawierający sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 5 lub jego fragment i region zmienny łańcucha lekkiego (VL) zawierający sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 4 lub jej fragment. [0032] Ujawniono preparat farmaceutyczny zawierający koniugat przeciwciało-lek i farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik, nośnik lub zaróbkę. [0033] Ujawniono preparat medyczny zawierający koniugat przeciwciało-lek i środek chemioterapeutyczny. Korzystnie preparat medyczny służy do leczenia lub zapobiegania nowotworowi. Koniugat przeciwciało-lek i środek chemioterapeutyczny mogą być obecne w preparacie medycznym w mieszaninie lub oddzielnie. Preparat medyczny może być obecny w postaci zestawu zawierającego pierwszy pojemnik zawierający koniugat przeciwciało-lek i drugi pojemnik zawierający środek chemoterapeutyczny. Preparat medyczny może ponadto zawierać drukowane instrukcje stosowania preparatu do leczenia lub zapobiegania nowotworowi. Różne przykłady preparatu medycznego, a w szczególności przeciwciała mającego zdolność wiązania się z CLDN6 i środkiem chemioterapeutycznym są takie, jak tu opisano. [0034] Ujawniono preparat medyczny zawierający koniugat przeciwciało-lek zgodny z wynalazkiem i paklitaksel. Koniugat przeciwciało-lek i paklitaksel mogą być obecne w preparacie medycznym w mieszaninie lub oddzielnie. Preparat medyczny może służyć do leczenia lub zapobiegania nowotworowi, na przykład nowotworowi jajnika. Preparat medyczny może być obecny w postaci zestawu zawierającego pierwszy pojemnik zawierający koniugat przeciwciało-lek i drugi pojemnik zawierający paklitaksel. Preparat medyczny może ponadto zawierać drukowane instrukcje stosowania preparatu do leczenia lub profilaktyki nowotworu, takiego jak nowotwór jajnika. Różne przykłady preparatu medycznego, a w szczególności koniugatu przeciwciało-lek są takie, jak tu opisano. [0035] Ujawniono środki i kompozycje tu opisane, takie jak koniugat przeciwciało-lek, przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 i/lub środek chemoterapeutyczny do zastosowania w opisanych tu sposobach. Na przykład, niniejsze ujawnienie zapewnia także koniugat przeciwciało-lek lub przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 do podawania w połączeniu ze środkiem chemioterapeutycznym, takim jak paklitaksel.

7 [0036] W jednym przykładzie przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym lub humanizowanym lub fragmentem przeciwciała. W jednym przykładzie przeciwciało pośredniczy w zabijaniu komórek, gdy jest związane z komórkowym CLDN6, w szczególności z CLDN6 eksprymowanym przez komórki na ich powierzchni komórkowej, przy czym komórkami są korzystnie rakowe komórki macierzyste, takie jak rakowe komórki macierzyste opisanych tutaj nowotworów. [0037] Nowotwór jest korzystnie wybrany z grupy składającej się z nowotworu jajnika, w szczególności gruczolakoraka jajnika i potworniaka jajnika, nowotworu płuc, w tym drobnokomórkowego nowotworu płuc (SCLC) i niedrobnokomórkowego nowotworu płuca(NSCLC), w szczególności płaskonabłonkowego nowotworu płuc i gruczolakoraka, nowotworu wielkokomórkowego (LCC), nowotworu żołądka, nowotworu piersi, nowotworu wątroby, nowotworu trzustki, nowotworu skóry, w szczególności nowotworu podstawnokomórkowego i nowotworu płaskonabłonkowego, czerniaka złośliwego, nowotworu głowy i szyi, w szczególności złośliwego gruczolaka opłucnowego, mięsaka, w szczególności mięsaka maziówki i mięsaka, nowotworu dróg żółciowych, nowotworu pęcherza moczowego, w szczególności nowotworu komórek przejściowych i nowotworu brodawkowatego, nowotworu nerki, w szczególności nowotworu nerki, w tym nowotworu jasnokomórkowego i nowotworu brodawek nerkowych, nowotworu okrężnicy, nowotworu jelita cienkiego, w tym nowotworu jelita krętego, w szczególności gruczolakoraka jelita cienkiego i gruczolakoraka jelita krętego, naczyniaka kosmówki, nowotworu szyjki macicy, nowotworu jądra, w szczególności nasieniaka jądra, potworniaka jądra i nowotworu germinalnego jądra, nowotworu macicy, nowotworu germinalnego, takiego jak potworniak lub nowotwór germinalny, w szczególności nowotworu germinalnego jądra i jajnika oraz ich postaci przerzutowych. [0038] Zgodnie z wynalazkiem, komórki nowotworowe i/lub rakowe komórki macierzyste eksprymujące CLDN6 korzystnie są komórkami opisanego tutaj nowotworu. [0039] W jednym przykładzie wykonania opisany tu nowotwór jest dodatni pod względem CLDN6. W jednym przykładzie wykonania opisane tutaj komórki nowotworowe nowotworu są dodatnie pod względem CLDN6. W jednym przykładzie wykonania opisane tu komórki nowotworowe eksprymują CLDN6 na powierzchni komórki. [0040] W jednym przykładzie wykonania opisany tu nowotwór obejmuje nowotwór pierwotny, nowotwór zaawansowany, nowotwór z przerzutami, nowotwór nawracający lub ich kombinacji, takich jak połączenie nowotworu pierwotnego i nowotworu z przerzutami. W jednym przykładzie wykonania nowotwór jest częściowo lub całkowicie oporny na chemioterapię, taką jak monoterapia paklitakselem. W jednym przykładzie wykonania nowotworem jest nowotwór jajnika, w szczególności nowotwór jajnika częściowo lub całkowicie oporny na chemioterapię, taką jak monoterapia paklitakselem. [0041] Inne cechy i zalety niniejszego wynalazku będą oczywiste po zapoznaniu się z następującym szczegółowym opisem i zastrzeżeniami patentowymi.

KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW

[0042]

Figura 1: mRNA CLDN6 ulega ekspresji w ludzkich komórkach iPS. Ludzkie fibroblasty napletka (HFF) transfekowano przy użyciu Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) albo bez RNA (bez kontroli RNA) lub z koktajlem przeprogramowywania (unmod. OSKMNL + EBK + miR-mix) i komórki zebrano w dniu 5, 12 i 19 po traktowaniu. RNA ekstrahowano, transkrybowano do cDNA, a następnie analizowano sposobem ilościowej RT-PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu systemu i oprogramowania do wykrywania sekwencji ABI PRISM 7300 (Applied Biosystems with QuantiTect SYBR green Kit (Qiagen)). Pokazano krotną indukcję ekspresji CLDN6

8 komórek traktowanych koktajlem przeprogramowywania (czarne słupki) w stosunku do komórek HFF od 1 dnia traktowania (szare słupki).Ekspresja mRNA CLDN6 została znormalizowana do ekspresji mRNA genu domowego HPRT1. OSKMNL = czynniki transkrypcyjne OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG i LIN28, EBK = białka ucieczkowe IFN E3, K3 i B18R, miR-mix = miRNA-302a/b/c/d i 367.

Figura 2: CLDN6 ulega ekspresji na powierzchni ludzkich komórek iPS. Komórki HFF transfekowano bez RNA (bez kontroli RNA) lub z koktajlem przeprogramowywania (unmod. OSKMNL + EBK + miR-mix) i komórki zebrano w dniu 5 (A), 12 (B) i 19 (C) po traktowaniu. Komórki wybarwiono 1 µg/ml swoistego wobec CLDN6 przeciwciała IMAB027-AF647 i SSEA-4-V450 (2,5 µl na test, zakupiony od BD) przez 30 minut w temperaturze 4°C, a ekspresję powierzchniową analizowano sposobem cytometrii przepływowej. Eksperyment przeprowadzono w dwóch egzemplarzach i pokazano reprezentatywne wykresy punktowe. OSKMNL = czynniki transkrypcyjne OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG i LIN28, EBK = białka ucieczkowe IFN E3, K3 i B18R, miR-mix = miRNA-302a/b/c/d i 367.

Figura 3: Ekspresja powierzchniowa CLDN6 w liniach komórek nowotworu jajnika. W celu przeanalizowania ekspresji CLDN6, komórki 1E6 wybarwiono 1 µg/ml IMAB027-AF647 przez 30 minut w 4°C, a ekspresję powierzchniową analizowano sposobem cytometrii przepływowej. W (A) pokazano komórki COV318. Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach i przedstawiono jeden reprezentatywny wykres punktowy. W (B) pokazano komórki PA-1 stabilnie transfekowane albo wektorem kontrolnym (PA-1 76) lub wektorem eksprymującym shRNA przeciwko CLDN6 (klony PA-1 50 i PA-1 54). Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach i przedstawiono jeden reprezentatywny wykres punktowy. shRNA = mały RNA o strukturze spinki do włosów

Figura 4: CLDN6 jest ważny dla tworzenia kolonii komórek nowotworu jajnika. W celu przeanalizowania zachowania klonogenicznego, komórki COV318, PA-1 50 i PA-1 54 wybarwiono 1 µg/ml IMAB027-AF647 przez 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie 700 (COV318) lub 500 (PA-1 50/54 ) Komórki CLDN6-dodatnie lub CLDN6- ujemne posortowano na 6-studzienkowe płytki. Komórki pozostawiono do utworzenia kolonii przez 14 dni, a następnie barwiono 0,5% fioletem krystalicznym przez 20 minut. (A) Pokazano reprezentatywne zdjęcie dla każdej linii komórkowej. (B) Ocenę ilościową kolonii przeprowadzono ręcznie zliczając. Pokazano średnią i odchylenie standardowe z trzech niezależnych eksperymentów.

Figura 5: CLDN6 ulega koekspresji z markerami CSC CD24, CD90 i CD44 w linii komórkowej nowotworu jajnika COV318. Komórki 1E6 COV318 barwiono przez 30 minut w 4°C przeciwciałami przeciw różnym markerom powierzchniowym zgodnie z panelem FACS pokazanym w Tabeli 1, a ekspresję markera CSC analizowano sposobem cytometrii przepływowej. Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach. W (A) pokazano reprezentatywne wykresy punktowe kolokalizacji CLDN6 z różnymi ustalonymi markerami CSC. W (B) odsetki kolokacji komórek dodatnich CD44, CD24, CD90 i CLDN6 obliczono przy użyciu różnych strategii bramkowania wskazanych na osi X schematu. Pokazane są średnie wartości z trzech powtórzeń i odchylenie standardowe.

Figura 6: Wzbogacenie komórek eksprymujących CLDN6 prowadzi do akumulacji ustalonych markerów CSC.

9 Komórki COV318 wybarwiono 0,5 µg/ml IMAB027 i wtórne kozie sprzężone z APC drugorzędowe przeciwciało przeciw ludzkiej IgG (1: 300), a frakcje dodatnie i ujemne pod względem CLDN6 wyizolowano następnie przez sortowanie FACS. Komórki obu frakcji namnażano przez 10 dni. Komórki 1E6 każdej frakcji barwiono przez 30 minut w temperaturze 4°C przeciwciałami przeciwko różnym markerom powierzchniowym zgodnie z panelem FACS pokazanym w Tabeli 1. Eksperyment przeprowadzono w trzech powtórzeniach. W (A) pokazano reprezentatywne wykresy punktowe poziomów ekspresji różnych markerów CSC we frakcji dodatniej CLDN6 i ujemnej CLDN6, a także ich wspólnej lokalizacji z CLDN6. W (B) odsetki poziomów ekspresji markera CSC pokazano jako wykres, a współczynniki wzbogacenia (krotność ekspresji) dla odpowiednich markerów CD44, CD90 i CD24 obliczono przez porównanie odsetków komórek pozytywnych we frakcji dodatniej pod względem CLDN6 i ujemnej pod względem CLDN6.

Figura 7: Linie komórkowe o wysokiej ekspresji CLDN6 pokazują wzbogacenie markerów CSC w porównaniu do komórek o niskiej ekspresji CLDN6. Komórki 1E6 linii komórek nowotworu jajnika o wysokiej ekspresji CLDN6 OV90 (A) i PA-1 (B) lub linie komórkowe nowotworu jąder NEC-8 (C) i NEC-14 (D) wybarwiano przez 30 min w 4°C z przeciwciałami przeciw różnym markerom powierzchniowym zgodnie z panelem FACS pokazanym w Tabeli 1, a ekspresję markera CSC analizowano sposobem cytometrii przepływowej. Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach i pokazano reprezentatywne wykresy punktowe.

Figura 8: Działanie przeciwnowotworowe IMAB027 w połączeniu z paklitakselem we wczesnym modelu ksenotransplantowanego nowotworu. Podskórne ludzkie ksenotransplantowane nowotwory ES-2 z ludzką CLDN6 eksprymującą się ektopowo leczono paklitakselem w dawce 15 mg/kg w dniu 3, 10 i 17 po przeszczepie przez iniekcje dootrzewnowe. Leczenie podtrzymujące przeciwciało rozpoczęto 4 dnia od trzech iniekcji IMAB027 35 mg/kg na tydzień (naprzemiennie dożylnie/dootrzewnowo/dootrzewnowo). (A) Średnia kinetyka wzrostu nowotworu (± SEM) po leczeniu IMAB027 (biały kwadrat), paklitaksel (szary okrąg), IMAB027 w połączeniu z paklitakselem (czarny kwadrat) lub kontrola nośnika (białe koło). Strzałka wskazuje czas rozpoczęcia terapii. (B) Krzywe przeżycia leczonych myszy. Wielkość grupy: n = 12.

Figura 9: Działanie przeciwnowotworowe IMAB027 w połączeniu z cisplatyną w zaawansowanym modelu ksenotransplantowanego nowotworu. Podskórne ludzkie ksenotransplantowane nowotwory NEC14 hodowano do mediany wielkości ∼100 mm3 przed rozpoczęciem leczenia. Myszy traktowano 1 mg/kg cisplatyny przez iniekcje dootrzewnowe codziennie od 6 do 10 dnia po wszczepieniu oraz trzema iniekcjami IMAB027 35 mg/kg na tydzień (naprzemiennie dożylnie/dootrzewnowo/dootrzewnowo), rozpoczynając od dnia 6 jako leczenie podtrzymujące. (A) Średnia kinetyka wzrostu nowotworu (± SEM) po leczeniu IMAB027 (pełny okrąg), cisplatyną (otwarty kwadrat), IMAB027 w połączeniu z cisplatyną (pełny kwadrat) lub kontrolą nośnika (otwarte koło). Strzałka wskazuje czas rozpoczęcia terapii. (B) Indywidualna wielkość nowotworu u myszy w dniu 24 po przeszczepie (średnia z ± odchyleniem standardowym). (C) Krzywe przeżycia leczonych myszy. Wielkość grupy: n = 19. Wartości p: *, p <0,05; **, p <0,01 i ***, p <0,001.

Figura 10: Działanie przeciwnowotworowe IMAB027 w połączeniu z karboplatyną w zaawansowanym modelu ksenotransplantowanego nowotworu.

10 Zaawansowane ludzkie ksenotransplantowane nowotwory NEC 14 leczono samym IMAB027 lub w kombinacji z lekiem cytostatycznym, jak opisano na Figurze 9. Zamiast cisplatyny myszy leczono 30 mg/kg karboplatyny w dniach 6, 13 i 20 w bolusie iniekcje dootrzewnowe. (A) Średnia kinetyka wzrostu nowotworu (± SEM) po leczeniu IMAB027 (pełny okrąg), karboplatyną (otwarty kwadrat), IMAB027 w połączeniu z karboplatyną (pełny kwadrat) lub kontrolą nośnika (otwarte koło). Strzałka wskazuje czas rozpoczęcia terapii. (B) Indywidualna wielkość nowotworu u myszy w dniu 24 po przeszczepie (średnia z ± odchyleniem standardowym). (C) Krzywe przeżycia leczonych myszy. Wielkość grupy: n = 19. Wartości p: *, p <0,05; **, p <0,01 i ***, p <0,001.

Figura 11: CLDN6 jest ważny dla sfer tworzących zachowanie komórek nowotworu jajnika. W celu przeanalizowania wpływu CLDN6 na tworzenie sfery, komórki COV318 dodatnie i ujemne CLDN6 izolowano przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją po barwieniu 0,5 µg/ml IMAB027. Komórki COV318 dodatnie i ujemne CLDN6 CLV618 hodowano na płytkach o bardzo niskiej przyczepności w warunkach formowania kuli (pożywka DMEM/F12 bez surowicy zawierająca 0,4% albuminy surowicy bydlęcej, 20 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów, 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu i 5 µg/ml insuliny). (A) Reprezentatywne zdjęcia sfer pierwszej generacji komórek CLDN6 dodatnich (CLDN6 +) i ujemnych CLDN6 (CLDN6-) COV318 w dniu 3, 8 i 19 po posortowaniu. (B) Reprezentatywne zdjęcia sfer drugiej generacji uzyskane z pojedynczych komórek sfer pierwszej generacji CLDN6 + z (A) w dniu 22 po posortowaniu.

Figura 12: Wzbogacenie komórek dodatnich pod względem CLDN6 po traktowaniu pochodnymi platyny. Komórki COV318 traktowano 500 ng/ml cisplatyny lub 2000 ng/ml karboplatyny przez 4 dni. Po traktowaniu komórki hodowano przy braku leków cytostatycznych odpowiednio przez dodatkowe 3 dni (białe słupki) i 6 dni (czarne słupki). Ekspresję CLDN6 analizowano za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu swoistego dla CLDN6 przeciwciała IMAB027 i przeciwciała kontrolnego izotypowego. Ekspresję traktowanych komórek COV318 pokazano w odniesieniu do nieleczonych komórek. Do oceny wartości kontroli izotypowej odjęto od barwienia CLDN6.

Figura 13: Wzbogacanie komórek dodatnich pod względem CLDN6 po wszczepieniu dootrzewnowym. Komórki COV318 wstrzykiwano dootrzewnowo bezgrasiczym nagim myszom. Myszy, które rozwinęły wodobrzusze, uśmiercano, a zarówno wodobrzusze, jak i nowotwory lite zebrano w celu dalszej charakterystyki. Izolowane komórki analizowano pod kątem ekspresji CLDN6 natychmiast po przygotowaniu i po utrzymaniu w hodowli przez kilka pasaży. (A) Analiza cytometrii przepływowej ekspresji CLDN6 na rodzicielskich komórkach COV318 przy użyciu swoistego dla CLDN6 przeciwciała IMAB027 i kontroli izotypowej. (B) Ekspresja CLDN6 na komórkach pochodzących z wodobrzusza i nowotworów litych z jajnika, wątroby, żołądka, trzustki i przepony w różnych punktach czasowych po izolacji (*: wodobrzusze w dniach 5 i 35; **: nowotwory lite w dniach 12 i 29) . Intensywność fluorescencji jest wyświetlana na osi X. Liczba zdarzeń wyświetlanych na osi Y jest skalowana jako procent maksymalnej liczby zdarzeń.

Figura 14: CLDN6 koreluje z markerami rakowych komórek macierzystych jajnika w pierwotnych próbach nowotworów. 42 próbki nowotworu jajnika przeanalizowano pod kątem poziomów ekspresji mRNA CLDN6 i różnych opisanych markerów rakowych komórek macierzystych jajnika sposobem qRT-PCR przy użyciu systemu wykrywania i oprogramowania Fluidigm. Przeprowadzono analizę korelacji Spearmana w celu przeanalizowania korelacji CLDN6

11 z markerami swoistymi dla rakowych komórek macierzystych. W (A) przedstawiono wykresy punktowe znaczących korelacji (wartości P ≤ 0,05). W (B) pokazano podsumowanie wszystkich korelacji.

Figura 15: ADCC za pośrednictwem IMAB027 po leczeniu karboplatyną i paklitakselem. Aktywność ADCC IMAB027 w połączeniu z chemioterapią analizowano przy użyciu komórek docelowych COV362 (Luc). Dlatego komórki traktowano przez 4 dni karboplatyną, gemcytabiną, paklitakselem, doksorubicyną lub topotekanem we wskazanych stężeniach. Po leczeniu komórki hodowano przez 3 (A-D) i 10 dni (E-J), odpowiednio, przy braku leków cytostatycznych. Komórki kontrolne hodowano bez cytostatyków. (A, C, E, G, I) Eksperymenty ADCC przeprowadzono z IMAB027 (czarne linie) lub przeciwciałem kontrolnym izotypowym (szare linie) przy użyciu PBMC od zdrowych dawców przy efektorze (PBMC) do stosunku komórek docelowych wynoszącego -40: 1 . Punkty danych (n = 4 powtórzenia) są przedstawione jako średnia ± SD. (B, D, F, H, J) Ekspresję CLDN6 analizowano za pomocą cytometrii przepływowej z zastosowaniem IMAB027. Czarne kropkowane linie pokazują ekspresję CLDN6 w nieleczonych komórkach, wypełnione na szaro histogramy reprezentują ekspresję CLDN6 po leczeniu.

Figura 16: Działanie przeciwnowotworowe IMAB027 w połączeniu z leczeniem PEB w bardzo zaawansowanym modelu ksenotransplantowanych nowotworów. Podskórne ludzkie ksenotransplantowane nowotwory NEC14 hodowano u myszy Nude do bardzo zaawansowanego stadium. Leczenie nowotworów PEB (cisplatyną, etopozydem i bleomycyną) i IMAB027 rozpoczęło się w dniu 13. Myszy otrzymujące schemat PEB traktowano 1 mg/kg cisplatyny i 5 mg/kg etopozydu w dniu 13, 14, 15, 16 i 17 oraz 10 mg/kg bleomycyny w dniu 13, 17 i 21 przez iniekcje dootrzewnowe. Przeciwciało IMAB027 podawano trzy razy w tygodniu przez naprzemienne podawanie iniekcje dożylne/dootrzewnowe/dootrzewnowe 35 mg/kg od dnia 13 do 101 po przeszczepie. Grupy kontrolne z nośnikiem otrzymały 0,9% roztwór NaCl i bufor substancji leczniczej. Myszy monitorowano łącznie przez 220 dni. (A), (B) Średnia kinetyka wzrostu nowotworu (± SEM) nieleczonych myszy i myszy leczonych IMAB027, PEB lub PEB w połączeniu z IMAB027. Strzałka wskazuje czas rozpoczęcia terapii (test wielokrotnego porównania Dunna: ***, p <0,001). (C) Krzywe przeżycia nieleczonych myszy i myszy traktowanych IMAB027, PEB lub PEB w połączeniu z IMAB027 (test Mantela-Coxa: *, p <0,05; **, p <0,01). Wielkość grupy: n = 14.

Figura 17: Względne powinowactwo wiązania i cytotoksyczność IMAB 027, IMAB 027-DM1 i IMAB 027-vcMMAE.

(A) Wiązanie IMAB027, IMAB027-DM1 i IMAB027-vcMMAE zmierzono za pomocą analiz cytometrii przepływowej na komórkach OV90 eksprymujących endogennie CLDN6. (B) Krzywe dawka-odpowiedź dla IMAB027-DM1 i IMAB027-vcMMAE, w których pośredniczy zmniejszenie żywotności komórek OV90. Komórki nowotworowe inkubowano przez 72 godziny z IMAB027-DM1 lub IMAB027-vcMMAE. Zmniejszenie żywotności komórek zmierzono za pomocą testu żywotności opartego na XTT. Punkty danych (n = 3 powtórzenia) są przedstawione jako średnia ± SD. MFI: średnia intensywność fluorescencji.

Figura 18: Działanie przeciwnowotworowe koniugatów IMAB027-DM1 na zaawansowane ksenotransplantowane nowotwory. Nagie myszy z ustalonymi podskórnymi ksenotransplantowanymi nowotworami ludzkimi OV90 leczono 10 dni po przeszczepie dożylnymi wstrzyknięciami pojedynczej dawki

12 1,78, 5,33 lub 16 mg/kg IMAB027-DM1 lub kontroli nośnika. Wielkość nowotworów podskórnych mierzono dwa razy w tygodniu (średnia + SEM). Wielkość grupy: n = 5, *: p <0,05, **: p <0,01.

Figura 19: Ustalanie zakresu dawek koniugatów IMAB027-DM1 i IMAB027- vcMMAE w zaawansowanych ksenotransplantowanych nowotworach OV90. Nagie myszy z ustalonymi podskórnymi ksenotransplantowanymi nowotworami ludzkimi OV90 leczono 10 dni po przeszczepie dożylnym wstrzyknięciem pojedynczej dawki IMAB027-DM1, IMAB027-vcMMAE, nośnikiem lub zastrzykami wielokrotnej dawki IMAB027. (A) Wzrost nowotworu myszy leczonych 1,33, 2,67 lub 5,33 mg/kg IMAB027-DM1 dożylnio (u góry) lub 4, 8 lub 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE dożylnio (na dole) w porównaniu do kontroli z nośnika i IMAB027 (35 mg/kg, tygodniowo dożylnio/dootrzewnowo/dootrzewnowo). Wielkość nowotworów podskórnych mierzono dwa razy w tygodniu (średnia + SEM). (B) Krzywe przeżycia Kaplana-Meiera dla myszy leczonych nośnikiem lub 4, 8 lub 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE. Myszy uśmiercano, gdy nowotwory osiągnęły objętość 1400 mm3 lub jeśli nowotwory stały się wrzodziejące. Wielkość grupy: n = 10, *: p <0,05, **: p <0,01, ***: p <0,001.

Figura 20: Ustalenie zakresu dawki koniugatów IMAB027-vcMMAE w zaawansowanych ksenotransplantowanych nowotworach PA-1. Nagie myszy z ustalonymi podskórnymi ksenotransplantowanymi nowotworami ludzkimi PA-1 leczono 15 dni po przeszczepie dożylną iniekcją pojedynczej dawki IMAB027- vcMMAE, kontrolą nośnika lub zastrzykami wielokrotnej dawki IMAB027. (A) Średni wzrost nowotworu (± SEM) i (B) Krzywe przeżycia Kaplana-Meiera u myszy traktowanych kontrolnym nośnikiem, IMAB027 (35 mg/kg, tygodniowo iv/ip/ip) lub 4, 8 lub 16 mg/kg IMAB027 -vcMMAE. Myszy uśmiercano, gdy nowotwory osiągnęły objętość 1400 mm3 lub jeśli nowotwory stały się wrzodziejące. Wielkość grupy: n = 8, *: p <0,05, **: p <0,01. (C) Reprezentatywne barwienie immunohistochemiczne przeciwko CLDN6 w przekrojach przeszczepu heterogenicznego PA-1 w różnych punktach czasowych po wszczepieniu.

Figura 21: Działanie przeciwnowotworowe IMAB027-vcMMAE na zaawansowane ksenotransplantowane nowotwory MKN74. Nagie myszy z ustalonymi podskórnymi ksenotransplantowanymi nowotworami ludzkimi MKN74 leczono 7 dni po przeszczepie dożylnym wstrzyknięciem 16 mg/kg IMAB027- vcMMAE lub kontrolą podłoża. (A) Średni wzrost nowotworu (± SEM) i (B) Krzywe przeżycia Kaplana-Meiera u myszy traktowanych kontrolnym nośnikiem lub IMAB027- vcMMAE. Myszy uśmiercano, gdy nowotwory osiągnęły objętość 1400 mm3 lub jeśli nowotwory stały się wrzodziejące. Wielkość grupy: n = 10. (C) Analiza cytometrii przepływowej ekspresji CLDN6 na komórkach nowotworowych MKN74 przed wszczepieniem i reprezentatywnym barwieniu immunohistochemicznym nieleczonego ksenotransplantowanego nowotworu MKN74 w dniu 31 po wszczepieniu. **: p <0,01, ***: p <0,001.

Figura 22: Przeciwnowotworowe działanie IMAB027-DM1 i IMAB027-vcMMAE na zaawansowane śródotrzewnowe przerzutowe nowotwory jajnika u ludzi. Myszom Nude wszczepiono dootrzewnowo ludzką linię komórkową nowotworu jajnika PA-1 (Luc) ektopowo eksprymującą lucyferazę. Po utworzeniu się śródotrzewnowych przerzutowych ksenoprzeszczepów nowotworów zwierzęta traktowano 16 mg/kg IMAB027-DM1, IMAB027-vcMMAE lub kontrolą nośnika przez iniekcję dootrzewnową w dniu 14 po przeszczepie. Wzrost przerzutów określono po podaniu lucyferyny na podstawie aktywności luminescencji, stosując system obrazowania luminy IVIS. (A)

13 Ocena ilościowa przerzutów u myszy leczonych IMAB027-DM1, IMAB027-vcMMAE lub nośnikiem. (B) Obrazy luminescencji in vivo myszy Nude w dniu 28 po przeszczepie. Wielkość grupy: n = 8 (nośnik) lub n = 9 (IMAB027-DM1, IMAB027-vcMMAE), **: p <0,01, ****: p <0,0001.

Figura 23: Endocytoza przeciwciał związanych z CLDN6 przez ludzkie komórki raka. Endocytozę przeciwciał IMAB027, chimAB5F2D2 lub kontrolnych izotypów związanych z CLDN6 określono za pomocą testu opartego na cytotoksyczności, który zależy od współ internalizacji przeciwciał związanych z celem i sprzężonego z parapiną fragmentu anty-ludzkiej IgG Fab (FabZap). Ludzkie komórki nowotworu PA-1, OV90 lub NEC 14 inkubowano przez 72 godziny z IMAB027, chimAB5F2D2 lub przeciwciałem kontrolnym izotypowym i przeciwludzkim FabZap. (A) Krzywe dawka- odpowiedź dla IMAB027/FabZap i chimAB5F2D2/FabZap zmniejszają żywotność komórek PA-1, OV90 i NEC14, odpowiednio. Punkty danych (n = 3 powtórzenia) są przedstawione jako średnia ± SD. (B) Porównanie znormalizowanego EC50 IMAB027 (rel EC50) i maksimum (rel maksimum) wiązania cytometrii przepływowej i endocytozy.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

[0043] Chociaż niniejszy wynalazek jest szczegółowo opisany poniżej, rozumiane jest, że wynalazek ten nie ogranicza się do konkretnych metodologii, protokołów i odczynników opisanych w niniejszym dokumencie, ponieważ te mogą być różne. Należy również rozumieć, że terminologia użyta w niniejszym dokumencie ma na celu opisanie tylko poszczególnych przykładów wykonania, i nie ma na celu ograniczania zakresu niniejszego wynalazku, który będzie ograniczony tylko przez załączone zastrzeżenia patentowe. O ile nie zostało to zdefiniowane inaczej, wszystkie stosowane tu terminy techniczne i naukowe mają takie samo znaczenie jak powszechnie rozumiane przez przeciętnego znawcę w tej dziedzinie. [0044] Poniżej opisane zostaną elementy niniejszego wynalazku. [0045] Korzystnie, terminy tu stosowane są zdefiniowane jak opisano w „A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel i H. Kölbl, red., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Bazylea, Szwajcaria, (1995). [0046] W praktyce niniejszego wynalazku będą wykorzystywane, o ile nie zostało to wskazane inaczej, konwencjonalne sposoby chemii, biochemii, biologii komórkowej, immunologii i techniki rekombinacji DNA, które są wyjaśnione w literaturze w dziedzinie (np. np., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 wydanie, J. Sambrook i wsp. wyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989). [0047] W całym opisie i poniższych zastrzeżeniach patentowych, o ile kontekst nie wymaga inaczej, słowo „zawierać” i odmiany takie jak „zawiera” i „zawierający”, będą rozumiane jako sugerujące włączenie określonego członu, liczby całkowitej lub etapu lub grupy członów, liczb całkowitych lub etapów, ale nie wykluczając żadnego innego członu, liczby całkowitej lub etapu lub grupy członów, liczb całkowitych lub etapów, chociaż w niektórych przykładach wykonania, taki człon, liczba całkowita lub etap lub grupa członów, liczb całkowitych lub etapów może zostać wykluczona, tj. przedmiot polega na włączeniu określonego członu, liczby całkowitej lub etapu lub grupy członów, liczb całkowitych lub etapów. Określenia „ten” i „ta” oraz „to” i podobne odniesienie stosowane w kontekście opisu wynalazku (zwłaszcza w kontekście zastrzeżeń patentowych) powinny być rozumiane jako zawierające zarówno liczbę pojedynczą, jak i mnogą, o ile nie zostało to wskazane inaczej lub jest to wyraźnie sprzeczne z kontekstem. Podawanie tutaj zakresów wartości ma jedynie służyć jako skrócony sposób odniesienia indywidualnie do każdej oddzielnej wartości mieszczącej się w zakresie. O ile nie zostało to wskazane tutaj inaczej, każda indywidualna wartość jest włączona do specyfikacji tak, jakby była tu indywidualnie przytoczona.

14 Wszystkie opisane tu sposoby mogą zostać przeprowadzone w dowolnej odpowiedniej kolejności, o ile nie zostało zaznaczone to inaczej lub w inny sposób jest to wyraźnie sprzeczne z kontekstem. Zastosowanie dowolnego i wszystkich przykładów lub przykładowego języka (np. „taki jak”) tu zastosowanego, ma na celu jedynie lepsze zilustrowanie wynalazku i nie stanowi ograniczenia zakresu wynalazku zastrzeganego inaczej. Żadne określenie w opisie nie powinno być interpretowane jako wskazujące dowolny niezastrzegany element istotny dla praktycznej realizacji wynalazku. [0048] W całym tekście niniejszej specyfikacji znajdują się odwołania do wielu dokumentów [0049] Klaudyny są rodziną białek, które są najważniejszymi elementami ścisłych połączeń, gdzie ustanawiają parakomórkową barierę, która kontroluje przepływ cząsteczek w przestrzeni wewnątrzkomórkowej pomiędzy komórkami nabłonka. Klaudyny są transbłonowymi białkami rozciągniętymi na błonie czterokrotnie z N-terminalowym i C- terminalowym miejscem wiązania, przy czym oba są zlokalizowane w cytoplazmie. Pierwsza pętla zewnątrzkomórkowa, nazwana EC1 lub ECL1, składa się średnio z 53 kwasów aminowych, a druga pętla zewnątrzkomórkowa, nazwana EC2 lub ECL2, składa się z około 24 kwasów aminowych. Białka powierzchni komórki z rodziny klaudyn, takie jak CLDN6, są wyrażone w nowotworuch nowotworowych różnego pochodzenia i w szczególności nadają się w roli docelowych struktur w połączeniu z immunoterapią przeciw nowotworowi opartą na przeciwciałach z racji na ich selektywną ekspresję (brak ekspresji w zdrowej tkance znaczącej dla toksyczności) i lokalizację w stosunku do błony komórkowej. [0050] CLDN6 zidentyfikowano jako różnicowo eksprymowany w tkankach nowotworowych, przy czym jedyną prawidłową tkanką eksprymującą CLDN6 jest łożysko, w którym małe ilości CLDN6 są wykrywane na poziomie RNA. Stwierdzono, że CLDN6 ulega ekspresji, na przykład w raku jajnika, raku płuc, raku żołądka, raku sutka, raku wątroby, raku trzustki, raku skóry, czerniakach, raku szyi, mięsakach, raku dróg żółciowych, raku nerki i nowotwór pęcherza moczowego. [0051] W różnych przykładach wykonania wynalazku choroby nowotworowe związane z ekspresją CLDN6 obejmują nowotworu jajnika, w szczególności gruczolakoraka jajnika i potworniaka nowotworu jajnika, nowotworu płuc, w tym drobnokomórkowego nowotworu płuca (SCLC) i niedrobnokomórkowego nowotworu płuca (NSCLC), w szczególności płaskonabłonkowego nowotwór płuc i gruczolakorak płuc, nowotwór żołądka, nowotwór piersi, nowotwór wątroby, nowotwór trzustki, nowotwór skóry, w szczególności nowotwór podstawnokomórkowy i nowotwór płaskonabłonkowy, czerniak złośliwy, nowotwór głowy i szyi, w szczególności złośliwy gruczolak szyjki macicy, mięsak, w szczególności błona maziowa mięsak i nowotwór mięsaka, nowotwór dróg żółciowych, nowotwór pęcherza moczowego, w szczególności nowotwór komórek przejściowych i nowotwór brodawkowaty, nowotwór nerki, w szczególności nowotwór komórek nerkowych, w tym nowotwór jasnokomórkowy komórek nerkowych i nowotwór brodawek nerkowych, nowotwór okrężnicy, nowotwór jelita cienkiego, w tym nowotworu jelita krętego, w szczególności gruczolakoraka jelita cienkiego i gruczolakoraka jelita grubego e jelito kręte, nowotwór germinalny jądra, nowotwór kosmówki łożyska, nowotwór szyjki macicy, nowotwór jąder, w szczególności nasieniak jąder, potworniak i germinalny nowotwór jądra, nowotwór macicy, nowotwory germinalne, takie jak potworniak lub nowotwór germinalny, w szczególności nowotwory germinalne jądra i ich przerzutowe postacie. W jednym przykładzie wykonania choroba nowotworowa skojarzona z ekspresją CLDN6 jest wybrana z grupy składającej się z: nowotworu jajnika, nowotworu płuca, metastatycznego nowotworu jajnika i metastatycznego nowotworu płuca. Korzystnie, nowotwór jajnika jest nowotworem złośliwym lub gruczolakonowotworem. Korzystnie, nowotwór płuca jest nowotworem złośliwym lub gruczolakonowotworem i korzystnie jest nowotworem oskrzeli, takim jak nowotwór złośliwy oskrzeli lub gruczolakorak oskrzeli. [0052] Termin „CLDN”, jak użyty w niniejszym dokumencie, oznacza klaudynę i zawiera CLDN6. Korzystnie, klaudyna jest ludzką klaudyną.

15 [0053] Termin „CLDN6” korzystnie odnosi się do ludzkiej CLDN6 i, w szczególności, do białka zawierającego, korzystnie składającego się z sekwencji aminokwasowej z SEKW O NR IDENT: 1 lub SEKW O NR IDENT: 2 z wykazu sekwencji lub wariantu wspomnianej sekwencji aminokwasowej. Pierwsza pętla zewnątrzkomórkowa CLDN6 korzystnie zawiera kwasy aminowe 28 do 80, korzystniej kwasy aminowe 28 do 76 z sekwencji aminokwasowej pokazanej w SEKW O NR IDENT: 1 lub sekwencji aminokwasowej pokazanej w SEKW O NR IDENT: 2. Druga pętla zewnątrzkomórkowa pętla CLDN6 korzystnie zawiera kwasy aminowe 138 do 160, korzystnie kwasy aminowe 141 do 159, korzystniej kwasy aminowe 145 do 157 z sekwencji aminokwasowej pokazanej w SEKW O NR IDENT: 1 lub sekwencji aminokwasowej pokazanej w SEKW O NR IDENT: 2. Wspomniane pierwsze i drugie pętle zewnątrzkomórkowe korzystnie tworzą pozakomórkową porcję CLDN6. [0054] Termin „wariant”, zgodnie z wynalazkiem, nawiązuje w szczególności do mutantów, wariantów splicingowych, konformacji, postaci izomorficznych, wariantów allelicznych, wariantów gatunkowych i homologów gatunkowych, w szczególności tych, które występują naturalnie. Wariant alleliczny dotyczy zmiany w normalnej sekwencji genu, której znaczenie jest często niejasne. Kompletne sekwencjonowanie genu często identyfikuje liczne warianty alleliczne danego genu. Homolog gatunkowy jest kwasem nukleinowym lub sekwencją aminokwasową z gatunkiem źródłowym różniącym się od tego z danego kwasu nukleinowego lub sekwencji aminokwasowej. Termin „wariant” będzie obejmował wszelkie posttranslacyjnie zmodyfikowane warianty i warianty konformacji. [0055] Zgodnie z wynalazkiem, termin „rak claudin dodatni” lub podobny termin oznacza nowotworu obejmującego komórki nowotworowe eksprymujące claudynę, korzystnie na powierzchni tych komórek nowotworowych. CLDN6 jest wyrażona na powierzchni komórek, jeżeli jest zlokalizowana na powierzchni wspomnianych komórek i jest dostępna dla wiązań z przeciwciałami swoistymi dla CLDN6 dodanymi do komórek [0056] „Powierzchnia komórki” jest stosowana zgodnie z jej normalnym znaczeniem w dziedzinie, a zatem obejmuje zewnętrzną część komórki, która jest dostępna do wiązania przez białka i inne cząsteczki. Na przykład białko transbłonowe zawierające jedną lub więcej części zewnątrzkomórkowych uważa się za ulegające ekspresji na powierzchni komórki. [0057] Termin „część zewnątrzkomórkowa” w kontekście niniejszego wynalazku odnosi się do części cząsteczki, takiej jak białko, która jest zwrócona w stronę przestrzeni zewnątrzkomórkowej komórki i najlepiej jest dostępna z zewnątrz tej komórki, np. Przez wiązanie antygenu cząsteczki, takie jak przeciwciała znajdujące się poza komórką. Korzystnie, termin nawiązuje do jednej albo wielu pętli lub domen zewnątrzkomórkowych lub ich fragmentu. [0058] Terminy „część” lub „fragment” są tu stosowane zamiennie i odnoszą się do elementu ciągłego. Na przykład, część struktury, takiej jak sekwencja aminokwasowa lub białko, nawiązuje do ciągłego elementu wspomnianej struktury. Porcja, część lub fragment struktury korzystnie zawiera jedną albo wiele właściwości funkcjonalnych wspomnianej struktury. Na przykład część, część lub fragment epitopu lub peptydu jest korzystnie immunologicznie równoważny epitopowi lub peptydowi, z którego pochodzi. Część lub fragment sekwencji białka korzystnie zawiera sekwencję co najmniej 6, w szczególności co najmniej 8, co najmniej 10, co najmniej 12, co najmniej 15, co najmniej 20, co najmniej 30, co najmniej 50 lub co najmniej 100 kolejnych aminokwasów sekwencji białka. [0059] Zgodnie z wynalazkiem, CLDN6 nie jest zasadniczo wyrażona w komórce, jeżeli poziom ekspresji jest niższy w stosunku do ekspresji w komórkach łożyska lub tkankach łożyska. Korzystnie, poziom ekspresji jest niższy niż 10%, korzystnie niższy niż 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% lub 0,05% ekspresji w komórkach łożyska lub tkankach łożyska lub nawet niższy. Korzystnie, CLDN6 nie jest zasadniczo wyrażona w komórce, jeżeli poziom ekspresji przekracza poziom ekspresji w tkance nienowotworowej innej niż łożysko nie więcej jak dwukrotnie, korzystnie 1,5 raza i korzystnie nie przekracza poziomu ekspresji we wspomnianej tkance nienowotworowej. Korzystnie, CLDN6 nie jest zasadniczo wyrażona w

16 komórce, jeżeli poziom ekspresji jest poniżej granicy wykrycia i/lub jeżeli poziom ekspresji jest zbyt niski, żeby umożliwić wiązanie przeciwciałom swoistym dla CLDN6 dodanym do komórek. [0060] Zgodnie z wynalazkiem, CLDN6 jest wyrażona w komórce, jeżeli poziom ekspresji przekracza poziom ekspresji w tkance nienowotworowej innej niż łożysko korzystnie więcej jak 2 razy, korzystnie 10 razy, 100 razy, 1 000 razy lub 10 000 razy. Korzystnie, CLDN6 jest wyrażona w komórce, jeżeli poziom ekspresji jest powyżej granicy wykrycia i/lub jeżeli poziom ekspresji jest wystarczająco wysoki, żeby umożliwić wiązanie przeciwciałom swoistym dla CLDN6 dodanym do komórek. Korzystnie, CLDN6 wyrażona w komórce jest wyrażona lub wyeksponowana na powierzchni wspomnianej komórki. [0061] Stwierdzono, że ekspresja CLDN6 jest wykrywalna tylko w łożysku jako mRNA, podczas gdy żadne białko nie jest w ogóle wykrywalne. Tak więc stwierdzenia przedstawione w odniesieniu do ekspresji CLDN6 w łożysku korzystnie odnoszą się do ekspresji mRNA. [0062] Zgodnie z wynalazkiem, termin „choroba” odnosi się do dowolnego stanu patologicznego, w tym raka, w szczególności opisanych tu form raka. Każde nawiązanie w niniejszym dokumencie do nowotworu lub poszczególnych form nowotworu zawiera także jego postacie metastatyczne. W korzystnym przykładzie wykonania choroba, która ma być leczona zgodnie z niniejszym zgłoszeniem, obejmuje komórki eksprymujące CLDN6, w szczególności nowotworowe komórki macierzyste eksprymujące CLDN6. [0063] „Choroby związane z komórkami eksprymującymi CLDN6” lub podobnymi wyrażeniami oznaczają zgodnie z wynalazkiem, że CLDN6 ulega ekspresji w komórkach chorej tkanki lub narządu. W jednym przykładzie wykonania ekspresja CLDN6 w komórkach chorej tkanki lub chorego organu jest zwiększona w stosunku do stanu w zdrowej tkance lub zdrowym organie. Wzrost nawiązuje do wzrostu o co najmniej 10%, w szczególności co najmniej 20%, co najmniej 50%, co najmniej 100%, co najmniej 200%, co najmniej 500%, co najmniej 1 000%, co najmniej 10 000% lub więcej. W jednym przykładzie wykonania ekspresja występuje tylko w chorej tkance, podczas gdy ekspresja w odpowiedniej zdrowej tkance jest tłumiona. Zgodnie z wynalazkiem choroby związane z komórkami eksprymującymi CLDN6 obejmują choroby nowotworowe. Ponadto, zgodnie z wynalazkiem, choroby nowotworowe korzystnie są tymi, w których komórki nowotworowe eksprymują CLDN6. [0064] Stosowane tutaj określenie „choroba nowotworowa” lub „rak” obejmuje chorobę charakteryzującą się nieprawidłowo regulowanym wzrostem komórkowym, proliferacją, różnicowaniem, adhezją i/lub migracją. Przez „komórkę nowotworową” rozumie się nieprawidłową komórkę, która rośnie w wyniku szybkiej, niekontrolowanej proliferacji komórkowej i nadal rośnie po ustaniu bodźców, które zapoczątkowały nowy wzrost. Korzystnie „choroba nowotworowa” charakteryzuje się komórkami eksprymującymi CLDN6, w szczególności nowotworowymi komórkami macierzystymi eksprymującymi CLDN6. [0065] Określenie „rak” zgodnie z wynalazkiem zawiera białaczki, nasieniaki, czerniaki, potworniaki, chłoniaki, nerwiaki niedojrzałe, glejaki, nowotwór odbytnicy, nowotwór śluzówki macicy, nowotwór nerki, nowotwór nadnerczy, nowotwór tarczycy, nowotwór krwi, nowotwór skóry, nowotwór mózgu, nowotwór szyjki macicy, nowotwór jelit, nowotwór wątroby, nowotwór jelita grubego, nowotwór żołądka, nowotwór jelita, nowotwór głowy i szyi, nowotwór przewodu pokarmowego, nowotwór węzłów chłonnych, nowotwór przełyku, nowotwór jelita grubego, nowotwór trzustki, nowotwór ucha, nosa i gardła (ENT), nowotwór piersi, nowotwór prostaty, nowotwór macicy, nowotwór jajnika i nowotwór płuc oraz ich przerzuty. Przykładami są raki płuc, raki sutka, raki gruczołu krokowego, raki okrężnicy, raki komórek nerkowych, raki szyjki macicy lub przerzuty typów nowotworu lub nowotworów nowotworowych opisanych powyżej. Termin nowotwór zgodnie z wynalazkiem zawiera także postacie metastatyczne nowotworu.

17 [0066] Zgodnie z wynalazkiem, „rak” jest złośliwym nowotworem pochodzącym od komórek nabłonkowych. Ta grupa reprezentuje najpowszechniejsze nowotwory, włączając powszechne formy nowotworu piersi, prostaty, płuca i jelita. [0067] „Gruczolakorak” jest nowotworem, który wywodzi się z tkanki gruczołowej. Taka tkanka jest także częścią większej kategorii tkankowej znanej jako tkanka nabłonkowa. Tkanka nabłonkowa zawiera skórę, gruczoły i różnorodność innych tkanek, które wyściełają jamy i organy w ciele. Nabłonek ma embriologiczne pochodzenie z ektodermy, endodermy i mezodermy. W celu skasyfikowania komórek jako gruczolakorak niekoniecznie muszą one być częścią gruczołu, o ile mają właściwości wydzielnicze. Ta forma nowotworu może występować u kilku wyższych ssaków, włączając człowieka. Dobrze zróżnicowane gruczolakoraki zwykle przypominają tkankę gruczołową, z której pochodzą, podczas gdy słabo zróżnicowane mogę nie przypominać. Przez barwienie komórek z biopsji patolog określi, czy guz nowotworowy jest gruczolakonowotworem czy innym typem raka. Gruczolakoraki mogą powstać w wielu tkankach ciała z powodu wszechobecności gruczołów w ciele. Podczas gdy gruczoł może nie wydzielać tej samej substancji, o ile komórka ma funkcję zewnątrz-wydzielniczą, uznaje się, że jest gruczołowa, a jej złośliwa forma jest zatem nazwana gruczolakonowotworem. Złośliwe gruczolakoraki atakują inne tkanki i często dają przerzuty, o ile mają na to wystarczająco dużo czasu. Gruczolakorak jajnika jest najpowszechniejszym typem złośliwego nowotworu jajnika. Zawiera surowiczego i śluzowego gruczolakoraka, jasnokomórkowego gruczolakoraka i gruczolakoraka endometrium. [0068] Termin „przerzuty” ma odnosić się do rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych z ich pierwotnego miejsca do innej części ciała. Tworzenie przerzutów jest bardzo złożonym procesem i zależy od oddzielenia złośliwych komórek od pierwotnego nowotworu nowotworowego, inwazji macierzy zewnątrzkomórkowej, penetracji śródbłonkowych błon podstawnych do wnętrza jamy ciała i naczyń, a następnie po przetransportowaniu ich przez krew, infiltracji narządów docelowych. Wreszcie, wzrost nowego nowotworu nowotworowego w miejscu docelowym zależy od angiogenezy. Przerzuty nowotworu nowotworowego często występują nawet po usunięciu pierwotnego nowotworu nowotworowego, ponieważ komórki nowotworu nowotworowego lub składniki mogą pozostać i rozwijać potencjał przerzutowy. W jednym przykładzie wykonania termin „przerzuty”, zgodnie z wynalazkiem, dotyczy „dalekich przerzutów”, które dotyczą przerzutów, które są daleko od pierwotnego nowotworu nowotworowego i regionalnego układu węzłów chłonnych. W jednym przykładzie wykonania termin „przerzuty”, zgodnie z wynalazkiem, dotyczy przerzutów na węzły chłonne. [0069] Nowotwór oporny na leczenie to nowotwór złośliwy, w przypadku którego określone leczenie jest nieskuteczne, który początkowo nie reaguje na leczenie lub z czasem przestaje odpowiadać. Terminy „oporny”, „niereagujący” lub „odporny” są tu stosowane zamiennie. [0070] Stosowane tu określenie „nowotworowa komórka macierzysta” odnosi się do komórki, która może być progenitorem wysoce proliferacyjnej komórki nowotworowej. Nowotworowa komórka macierzysta ma zdolność do ponownego wzrostu nowotworu, o czym świadczy jej zdolność do tworzenia nowotworów u myszy z obniżoną odpornością. Nowotworowe komórki macierzyste również zwykle powoli rosną w stosunku do masy nowotworu, tj. nowotworowe komórki macierzyste są na ogół spoczynkowe. W niektórych przykładach wykonania, ale nie wszystkie, nowotworowa komórka macierzysta może stanowić tylko część, taką jak około 0,1 do 10% nowotworu. Nowotworowe komórki macierzyste mogą mieć jedną lub więcej lub wszystkie z następujących cech lub właściwości: (i) mogą wykazywać zdolność do zainicjowania nowotworu i/lub do podtrzymania wzrostu nowotworu, (ii) mogą być ogólnie relatywnie mniej zmutowane niż większość guz (np. z powodu wolniejszego wzrostu, a tym samym mniej błędów zależnych od replikacji DNA, ulepszonej naprawy DNA i/lub zmian epigenetycznych/niemutagennych przyczyniających się do ich złośliwości), (iii) mogą mieć wiele cech (a) normalnej komórki macierzystej (np.

18 podobny antygen powierzchniowy komórki i/lub profil ekspresji wewnątrzkomórkowej, programy samoodnawiania, oporność na wiele leków, niedojrzały fenotyp itp., charakterystyczny dla normalnych komórek macierzystych) i mogą pochodzić z (a) normalnej komórki (komórek) macierzystej, (iv) mogą być źródłem przerzutów, (v) mogą być wolno rosnące lub spoczynkowe, (vi) mogą być rakotwórcze (np. jak określono w eksperymentach implantacji NOD/SCID), (vii) mogą być względnie oporne na tradycyjne terapie (tj. chemoodporne) i (viii) mogą obejmować subpopulację guz (np. w stosunku do masy nowotworu). [0071] Określenie „leczyć” oznacza podawanie pacjentowi leczenia, takiego jak związek lub kompozycja lub połączenie związków lub kompozycji, w celu zapobiegania lub eliminacji choroby, w tym zmniejszenia wielkości nowotworu lub liczby nowotworów u pacjenta, zatrzymanie lub spowolnienie choroby u osobnika, zahamowanie lub spowolnienie rozwoju nowej choroby u osobnika, zmniejszenie częstotliwości lub nasilenia objawów i/lub nawrotów u osobnika, który obecnie ma lub który wcześniej miał chorobę i/lub przedłużenie, tj. wydłużenie lub wydłużenie długości życia osobnika. W szczególności, określenie „leczenie choroby” zawiera wyleczenie, skrócenie czasu trwania, polepszenie, zapobieganie, spowolnienie lub zahamowanie postępu lub pogorszenia, lub zapobieganie lub opóźnianie wystąpienia choroby lub jej objawów. [0072] W kontekście niniejszego wynalazku, pojęcia takie jak „chronić” lub „zapobiegać” odnoszą się do zapobiegania lub leczenia lub zarówno wystąpienia i/lub rozprzestrzeniania się choroby u osobnika, a w szczególności, minimalizowania szansy, że u osobnika rozwinie się choroba, lub opóźnienia rozwoju choroby. Na przykład, osobnik zagrożona nowotworem byłby kandydatem do terapii w celu zapobiegania nowotworowi. [0073] Termin „będący zagrożonym” znaczy, że osobnik, który został zidentyfikowany jako mający większą niż normalnie szansę rozwoju choroby, w szczególności raka, w porównaniu z ogółem populacji. Dodatkowo, osobnik, który miał lub który w danej chwili ma chorobę, w szczególności nowotwór, jest osobnikiem, który ma zwiększone ryzyko rozwoju choroby, a tym samym u osobnika może dalej rozwijać się choroba. Osobnicy, którzy w danej chwili mają lub mieli nowotwór także mają zwiększone ryzyko przerzutów nowotworu. [0074] Termin „pacjent” oznacza zgodnie z wynalazkiem osobnika do leczenia, w szczególności chorego, w tym ludzi, ssaki naczelne lub inne zwierzęta, w szczególności ssaki, takie jak krowy, konie, świnie, owce, kozy, psy, koty lub gryzonie, takie jak myszy i szczury. W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania pacjentem jest człowiek. [0075] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie termin „kombinacja” w kontekście podawania terapii odnosi się do zastosowania więcej niż jednego środka terapeutycznego lub terapeutycznego. Zastosowanie terminu „w połączeniu” nie ogranicza kolejności, w jakiej pacjentowi podaje się terapie lub środki terapeutyczne. Środek terapeutyczny lub terapeutyczny można podawać przed, jednocześnie z lub po podaniu drugiej terapii lub środka terapeutycznego osobnikowi. Korzystnie, terapie lub środki terapeutyczne podaje się osobnikowi w sekwencji, ilości i/lub w odstępie czasu, tak by terapie lub środki terapeutyczne mogły działać razem. W szczególnym przykładzie wykonania, terapie lub środki terapeutyczne są podawane osobnikowi w sekwencji, ilości i/lub w odstępie czasu, tak by zapewniały zwiększoną korzyść, niż gdyby były podawane inaczej, w szczególności niezależnie od siebie. Korzystnie, zwiększona korzyść jest efektem synergistycznym. [0076] „Komórka docelowa” oznacza dowolną niepożądaną komórkę, taką jak komórka nowotworowa, w szczególności rakowa komórka macierzysta. W korzystnych przykładach wykonania komórka docelowa eksprymuje CLDN6. [0077] Zgodnie z wynalazkiem, termin „chemioterapia” dotyczy leczenia jednym lub większą liczbą środków chemioterapeutycznych lub kombinacji środków chemioterapeutycznych, takich jak środki cytostatyczne lub środki cytotoksyczne. Środki

19 chemioterapeutyczne zgodne z wynalazkiem obejmują związki cytostatyczne i związki cytotoksyczne. [0078] Zgodnie z wynalazkiem, termin „środek chemoterapeutyczny” obejmuje taksany, takie jak paklitaksel i docetaksel oraz związki platyny, takie jak cisplatyna i karboplatyna, oraz ich kombinacje. Korzystne kombinacje, w szczególności do leczenia nowotworu jajnika, mogą obejmować kombinację taksanu i związku platyny, taką jak kombinacja paklitakselu i karboplatyny. Dalsze korzystne kombinacje, w szczególności do leczenia nowotworu jajnika, w szczególności nowotworów germinalnych jajników i/lub do leczenia nowotworów germinalnych, w szczególności nowotworów germinalnych jajnika i jąder, mogą obejmować połączenie związku platyny, takiego jak cisplatyna z etopozydem i/lub bleomycyną. Zgodnie z wynalazkiem, odniesienie do środka chemioterapeutycznego obejmuje dowolny prolek, taki jak ester, sól lub pochodna, jak koniugat wspomnianego środka. Przykładami są koniugaty wspomnianego środka z substancją nośnikową, np. paklitaksel związany z białkiem, taki jak paklitaksel związany z albuminą. Korzystnie sole wspomnianego środka są farmaceutycznie dopuszczalne. [0079] Taksany to klasa związków diterpenowych, które zostały najpierw pozyskane ze źródeł naturalnych, takich jak rośliny z rodzaju Taxus, ale niektóre z nich zostały zsyntetyzowane sztucznie. Głównym mechanizmem działania klasy leków taksanowych jest zakłócenie funkcji mikrotubul, hamując w ten sposób proces podziału komórek. Taksany obejmują docetaksel (Taxotere) i paklitaksel (Taxol). [0080] Termin „docetaksel” odnosi się do związku o następującym wzorze:

[0081] W szczególności, termin „docetaksel” odnosi się do związku 1,7β,10β-trihydroksy-9- okso-5β,20-epoksytaks-11-eno-2α, 4,13α-triyl 4-octan 2-benzoesan 13-{(2R, 3S)-3-[(tert- butoksykarbonylo)-amino]-2-hydroksy-3-fenylopropanianu}. [0082] Zgodnie z wynalazkiem termin „paklitaksel” odnosi się do związku o następującym wzorze:

[0083] W szczególności termin „paklitaksel” odnosi się do związku benzoesan (2α,4α,5β,7β,10β,13α)-4,10-bis-(acetyloksy)-13-{[(2R, 3S)-3-(benzoiloamino)-2-hydroksy-3- fenylopropanoilo]oksy-1,7-dihydroksy-9-okso-5,20-epoksytaks-11-en-2-ylu.

20 [0084] Termin „związek platyny” odnosi się do związków zawierających platynę w swojej strukturze, takich jak kompleksy platyny, i obejmuje związki takie jak cisplatyna, karboplatyna i oksaliplatyna. [0085] Termin „cisplatyna” lub „cisplatyna” odnosi się do związku cis- diamminedichloroplatyny (II) (CDDP) o następującym wzorze:

[0086] Termin „karboplatyna” odnosi się do związku cis-diaminy (1,1- cyklobutanodikarboksyloato)platyny(II) o następującym wzorze:

[0087] Termin „oksaliplatyna” odnosi się do związku, który jest związkiem platyny, który jest kompleksowany z ligandem nośnikowym diaminocykloheksanu o następującym wzorze:

[0088] W szczególności termin „oksaliplatyna” odnosi się do związku [(1R, 2R)- cykloheksano-1,2-diaminy](etanodioato-O,O’)platyny(II). Oksaliplatyna do wstrzykiwań jest również sprzedawana pod nazwą handlową Eloxatine. [0089] Dalsze środki chemioterapeutyczne, które są przewidziane do stosowania w niniejszym wynalazku - same lub w połączeniu z innymi środkami chemoterapeutycznymi, takimi jak taksany lub związki platyny - obejmują, ale nie wyłącznie, analogi nukleozydów, analogi kamptotecyny i antracykliny. [0090] Termin „analog nukleozydu” odnosi się do analogu strukturalnego nukleozydu, kategorii obejmującej zarówno analogi purynowe, jak i analogi pirymidynowe. [0091] Termin „gemcytabina” jest związkiem, który jest nukleozydowym analogiem o następującym wzorze:

21

[0092] W szczególności termin odnosi się do związku 4-amino-1-(2-deoksy-2,2-difluoro-β- D-erytropentofuranozylo)pirymidyn-2(1H)-on lub 4-amino-1-[(2R,4R,5R)-3,3-difluoro-4- hydroksy-5-(hydroksymetylo)oksolan-2-ylo]-1,2-dihydropirymidyn-2-on. [0093] Termin „analog nukleozydu” obejmuje pochodne fluoropirymidyny, takie jak fluorouracyl i ich proleki. Termin „fluorouracyl” lub „5-fluorouracyl” (5-FU lub f5U) (sprzedawany pod markami Adrucil, Carac, Efudix, Efudex i Fluoroplex) jest związkiem, który jest pirymidynowym analogiem o następującym wzorze:

[0094] W szczególności termin dotyczy związku 5-fluoro-1H-pirymidyno-2,4-dionu. [0095] Termin „kapecytabina” (Xeloda, Roche) odnosi się do środka chemioterapeutycznego, który jest prolekiem przekształcanym w 5-FU w tkankach. Kapecytabina, którą można podawać doustnie, ma następujący wzór:

[0096] W szczególności termin odnosi się do związku karbaminianu [1-(3,4-dihydroksy-5- metylotetrahydrofuran-2-ylo)-5-fluoro-2-okso-1H-pirymidyn-4-ylo]pentylu. [0097] Termin „kwas folinowy” lub „leukoworyna” odnosi się do związku przydatnego w synergistycznym połączeniu ze środkiem chemioterapeutycznym 5-fluorouracylem. Tak więc, jeśli w niniejszym dokumencie jest mowa o podawaniu 5-fluorouracylu lub jego proleku, wspomniane podawanie w jednym przykładzie wykonania może obejmować podawanie w połączeniu z kwasem folinowym. Kwas foliowy ma następujący wzór:

22

[0098] W szczególności termin dotyczy związku kwasu (2S)-2-{[4-[(2-amino-5-formylo-4- okso-5,6,7,8-tetrahydro-1H-pterydyn-6- ylo)metyloamino]benzoilo]amino}pentanodiowego. [0099] Termin „analog kamptotecyny” odnosi się do pochodnych związku kamptotecyny (CPT; (S)-4-etylo-4-hydroksy-1H-pirrano[3’,4’: 6,7]indolizino[1,2-b]chinolino-3,14- (4H,12H)-dion). Korzystnie termin „analog kamptotecyny” odnosi się do związków o następującej strukturze:

[0100] Korzystnymi analogami kamptotecyny są inhibitory enzymu DNA topoizomerazy I (topo I). Korzystnymi analogami kamptotecyny zgodnymi z wynalazkiem są irynotekan i topotekan. [0101] Irynotekan jest lekiem zapobiegającym odwijaniu się DNA przez hamowanie topoizomerazy I. Pod względem chemicznym jest półsyntetycznym analogiem naturalnej alkaloidowej kamptotecyny o następującym wzorze:

[0102] W szczególności termin „irynotekan” odnosi się do związku (S)-4,11-dietylo- 3,4,12,14-tetrahydro-4-hydroksy-3,14-diokso-H-pirano[3’,4’: 6,7]-indolizino[1,2-b]chinolin- 9-ylo-[1,4’-bipiperydyno]-1’-karboksylan. [0103] Topotekan jest inhibitorem topoizomerazy o wzorze:

[0104] W szczególności termin „topotekan” odnosi się do związku monochlorowodorku (S)- 10-[(dimetyloamino)metylo]-4-etylo-4,9-dihydroksy-1H-pirano [3’,4’: 6,7]indolizino[1,2- b]chinolino-3,14(4H,12H)-dionu. [0105] Antracykliny to klasa leków powszechnie stosowanych w chemioterapii raka, które są również antybiotykami. Strukturalnie wszystkie antracykliny mają wspólną cztero-

23 pierścieniową strukturę 7,8,9,10-tetrahydrotetraceno-5,12-chinon i zwykle wymagają glikozylacji w określonych miejscach. [0106] Antracykliny korzystnie wywołują jeden lub więcej z następujących mechanizmów działania: 1. Hamowanie syntezy DNA i RNA przez interkalację między parami zasad nici DNA/RNA, zapobiegając w ten sposób replikacji szybko rosnących komórek nowotworowych. 2. Hamowanie enzymu topoizomerazy II, zapobieganie relaksacji superskręconego DNA, a tym samym blokowanie transkrypcji i replikacji DNA. 3. Tworzenie wolnych rodników tlenowych za pośrednictwem żelaza, które uszkadzają DNA i błony komórkowe. [0107] Termin „antracyklina” korzystnie odnosi się do środka, korzystnie środka przeciwnowotworowego do indukowania apoptozy, korzystnie przez hamowanie ponownego wiązania DNA w topoizomerazy II. [0108] Przykłady antracyklin i analogi antracyklinowe obejmują, ale nie są do nich ograniczone, daunorubicynę (daunomycyna), doksorubicynę (adriamycyna), epirubicynę, idarubicynę, rodomycynę, pirarubicynę, walrubicynę, 14-walerianian N-trifluoro-acetyl doksorubicyny, aklacynomycynę, morfolinodoksorubicynę (morfolino-DOX), cyjanomorfolino-doksorubicynę (cyjano-morfolino-DOX), 2-pirolino-doksorubicynę (2- PDOX), 5-iminodaunomycynę, mitoksantron i aklacynomycynę A (aklarubicyna). Mitoksantron jest członkiem klasy związków antracendionowych, które są analogami antracyklin, które nie zawierają ugrupowania cukrowego antracyklin, ale zachowują płaską policykliczną aromatyczną strukturę pierścieniową, która umożliwia interkalację do DNA. [0109] Szczególnie rozważana jako antracyklina w kontekście niniejszego wynalazku jest epirubicyna. Epirubicyna jest lekiem antracyklinowym o następującym wzorze:

i jest sprzedawany pod nazwą handlową Ellence w Stanach Zjednoczonych, a Pharmorubicin lub Epirubicin Ebewe gdzie indziej. W szczególności termin „epirubicyna” odnosi się do związku (8R,10S)-10-[(2S,4S,5R,6S)-4-amino-5-hydroksy-6-metylo-oksan-2-ylo]oksy-6,11- dihydroksy-8-(2-hydroksyacetylo)-1-metoksy-8-metylo-9,10-dihydro-7H-tetracen-5,12-dion. Epirubicyna jest preferowana w stosunku do doksorubicyny, najpopularniejszej antracykliny, w niektórych schematach chemioterapii, ponieważ wydaje się, że powoduje mniej skutków ubocznych. [0110] Termin „etopozyd” odnosi się do półsyntetycznej pochodnej podofilotoksyny, która wykazuje aktywność przeciwnowotworową. Etopozyd hamuje syntezę DNA, tworząc kompleks z topoizomerazą II i DNA. Kompleks ten indukuje przerwy w dwuniciowym DNA i zapobiega naprawie przez wiązanie topoizomerazy II. Skumulowane przerwy w DNA zapobiegają wejściu w mitotyczną fazę podziału komórki i prowadzą do śmierci komórki. Etopozyd ma następujący wzór:

24

[0111] W szczególności termin dotyczy związku 4’-demetylo-epipodofilotoksyny 9-[4,6-O- (R)-etylideno-beta-D-glukopiranozydu], 4’-(diwodorofosforanu). [0112] Termin „bleomycyna” odnosi się do antybiotyku glikopeptydowego wytwarzanego przez bakterię Streptomyces verticillus. Gdy jest stosowany jako środek przeciwnowotworowy, działa powodując przerwy w DNA. Bleomycyna korzystnie zawiera związek o następującym wzorze:

[0113] Jeśli zgodnie z wynalazkiem chemioterapię podaje się w połączeniu z przeciwciałem mającym zdolność wiązania z CLDN6 (który może być obecny w koniugacie z co najmniej jednym ugrupowaniem leku toksyny, tj. jako koniugat przeciwciało-lek), korzystne jest, by chemioterapię podawało się przed i/lub jednocześnie z podawaniem przeciwciała (w postaci mieszaniny lub osobnych kompozycji). Korzystnie podawanie chemioterapii rozpoczyna się przed podaniem przeciwciała. Korzystnie chemioterapia zwiększa ekspresję CLDN6 w komórkach nowotworowych, takich jak rakowe komórki macierzyste, i jest rozpoczynana lub podawana przed podaniem przeciwciała, tak że aktywność przeciwnowotworowa przeciwciała jest zwiększona. Korzystnie podawanie chemioterapii rozpoczyna się co najmniej 2, co najmniej 4, co najmniej 6, co najmniej 8, co najmniej 10, co najmniej 12 lub co najmniej 14 dni przed pierwszym podaniem przeciwciała. Podawanie chemioterapii może być kontynuowane podczas podawania przeciwciała lub może być przerwane przed lub podczas podawania przeciwciała, takie jak 1 do 3, 1 do 7, 1 do 10 lub 1 do 14 dni przed podaniem przeciwciała. Korzystnie środek chemoterapeutyczny zawiera taksan, taki jak paklitaksel lub docetaksel i/lub związek platyny, taki jak cisplatyna lub karboplatyna. [0114] Termin „antygen” odnosi się do środka takiego jak białko lub peptyd zawierający epitop, na który skierowana jest odpowiedź immunologiczna i/lub ma być skierowana. W korzystnym przykładzie wykonania antygen jest antygenem związanym z nowotworem, takim jak CLDN6, tj. składnikiem komórek rakowych, które mogą pochodzić z cytoplazmy, powierzchni komórki i jądra komórki, w szczególności tymi antygenami, które są produkowane, korzystnie w dużej liczbie, wewnątrzkomórkowo lub jako antygeny powierzchniowe na komórkach rakowych.

25 [0115] W kontekście niniejszego wynalazku, termin „antygen związany z nowotworem” lub „antygen nowotworowy” korzystnie dotyczy białek, które są w normalnych warunkach swoiście eksprymowane w ograniczonej liczbie tkanek i/lub narządów lub w określonych stadiach rozwojowych i są eksprymowane lub nieprawidłowo eksprymowane w jednej lub większej liczbie tkanek nowotworowych lub nowotworowych. W kontekście niniejszego wynalazku antygen skojarzony z nowotworem nowotworowym jest korzystnie skojarzony z powierzchnią komórkową komórki nowotworowej i korzystnie nie jest lub jest tylko rzadko wyrażony w zdrowych tkankach. [0116] Termin „epitop” odnosi się do determinanty antygenowej w cząsteczce, tj. do części w cząsteczce, która jest rozpoznawana przez układ odpornościowy, na przykład, która jest rozpoznawana przez przeciwciało. Na przykład epitopy są pojedynczymi, trójwymiarowymi miejscami na antygenie, które są rozpoznawane przez układ odpornościowy. Epitopy zazwyczaj składają się z chemicznie aktywnych grup powierzchniowych cząsteczek, takich jak aminokwasy lub łańcuchy boczne cukru i zwykle mają swoiste trójwymiarowe cechy strukturalne, a także swoiste cechy ładunku. Epitopy konformacyjne i niekonformacyjne wyróżniają się tym, że wiązanie z tym pierwszym, ale nie drugim, jest tracone w obecności denaturujących rozpuszczalników. Epitop białka, takiego jak CLDN6, korzystnie zawiera ciągłą lub nieciągłą część tego białka i ma korzystnie od 5 do 100, korzystnie od 5 do 50, korzystniej od 8 do 30, najkorzystniej od 10 do 25 aminokwasów długości; na przykład, epitop może mieć korzystnie długość 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 lub 25 aminokwasów. [0117] Termin „przeciwciało” obejmuje glikoproteinę zawierającą co najmniej dwa łańcuchy ciężkie (H) i dwa łańcuchy lekkie (L) wzajemnie połączone wiązaniami disiarczkowymi i dowolną cząsteczkę zawierającą część wiążącą antygen takiej glikoproteiny. Termin „przeciwciało” obejmuje przeciwciała monoklonalne, przeciwciała rekombinowane, przeciwciała ludzkie, przeciwciała humanizowane, przeciwciała chimeryczne, fragmenty lub pochodne przeciwciał, w tym między innymi przeciwciała jednołańcuchowe, np. ScFv i fragmenty przeciwciał wiążących antygen, takie jak fragmenty Fab i Fab, a także obejmuje wszystkie rekombinowane formy przeciwciał, np. przeciwciała eksprymowane w prokariotach, nieglikozylowane przeciwciała oraz dowolne fragmenty i pochodne przeciwciał wiążące antygen, jak tu opisano. Każdy łańcuch ciężki zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego (w niniejszym dokumencie skrócony w opisie do VH) i region stały łańcucha ciężkiego. Każdy łańcuch lekki zawiera region zmienny łańcucha lekkiego (w niniejszym dokumencie skrócony w opisie do VL) i region stały łańcucha lekkiego. Regiony VH i VL mogą być dalej podzielone na regiony hiperzmienności, nazwane regionami determinującymi komplementarność (CDR), poprzedzielanymi regionami, które są lepiej zachowane, nazwanymi regionami ramowymi (FR). Każdy VH i VL składa się z trzech CDR i czterech FR usytuowanych od końca aminowego do końca karboksydowego w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich zawierają domenę wiążącą, która wchodzi w interakcję z antygenem. Regiony stałe przeciwciał mogą pośredniczyć w wiązaniu immunoglobulin z tkankami gospodarza lub czynnikami, włączając różne komórki układu immunologicznego (np. komórki efektorowe) i pierwszy element (Clq) klasycznego układu uzupełnień. [0199] Termin „przeciwciało monoklonalne”, jak użyto w niniejszym dokumencie, nawiązuje do preparatu cząsteczek przeciwciał z pojedynczej kompozycji cząsteczek. Przeciwciało monoklonalne wykazuje jednowiązaniową swoistość i powinowactwo. W jednym przykładzie wykonania przeciwciała monoklonalne są produkowane przez komórkę hybrydoma, która zawiera komórkę B uzyskaną od zwierzęcia, np. myszy, złączoną z unieśmiertelnioną komórką. [0119] Termin „przeciwciało rekombinowane”, jak użyto w niniejszym dokumencie, zawiera wszystkie przeciwciała, które są przygotowane, wyrażone, stworzone lub wyodrębnione z użyciem środków rekombinacyjnych, takie jak (a) przeciwciała

26 wyodrębnione od zwierzęcia (np, myszy), które są transgeniczne lub transchromosomalne w odniesieniu do genów immunoglobulin lub komórki hybrydoma przygotowanych z nich, (b) przeciwciała wyodrębnione z komórki gospodarza przekształconej do wyrażenia przeciwciała, np, z transfektomy, (c) przeciwciała wyodrębnione z rekombinowanej, kombinatoryjnej biblioteki przeciwciał oraz (d) przeciwciała przygotowane, wyrażone, stworzone lub wyodrębnione przez inne środki, które obejmują splatanie sekwencji genów immunoglobulin z innymi sekwencjami DNA. [0120] Termin „ludzkie przeciwciało”, jak użyto w niniejszym dokumencie, ma na celu uwzględnienie przeciwciał mających regiony zmienne i stałe pochodzące z ludzkiej germinalnej sekwencji immunoglobulin. Ludzkie przeciwciała mogą zawierać reszty kwasów aminowych niezakodowanych przez ludzkie germinalne sekwencje immunoglobulin (np. mutacje wprowadzone przez losową lub swoistą dla miejsca mutagenezę in vitro lub przez somatyczną mutację in vivo). [0121] Termin „humanizowane przeciwciała” nawiązuje do cząsteczki mającej miejsce wiązania antygenu, która jest zasadniczo pozyskana z immunoglobulin od gatunków nieludzkich, przy czym pozostająca struktura immunoglobulinowa cząsteczki opiera się na strukturze i/lub sekwencji ludzkiej immunoglobuliny. Miejsce wiązania antygenu zawiera albo kompletne zmienne domeny połączone z domenami stałymi, albo tylko regiony determinujące komplementarność (CDR) przeszczepione na właściwe regiony ramowe w zmiennych domenach. Miejsca wiązania antygenu mogą być typu dzikiego lub zmodyfikowane przez jedno albo wiele podstawień kwasu aminowego, np. zmodyfikowane tak, by bardziej przypominały ludzkie immunoglobuliny. Niektóre formy humanizowanych przeciwciał zachowują wszystkie sekwencje CDR (na przykład humanizowane mysie przeciwciała zawiera wszystkie sześć CDR z mysiego przeciwciała). Inne formy mają jeden albo wiele CDR, które są zmienione w stosunku do oryginalnego przeciwciała. [0122] Termin „przeciwciało chimeryczne” nawiązuje do tych przeciwciał, w których jedna porcja każdej sekwencji aminokwasowej łańcucha ciężkiego i lekkiego jest homologiczna z odpowiadającą jej sekwencją w przeciwciałach pochodzących z konkretnego gatunku lub należących do konkretnej klasy, podczas gdy pozostały segment łańcucha jest homologiczny z odpowiadającymi mu sekwencjami w drugim. Zazwyczaj region zmienny zarówno lekkiego i ciężkiego łańcucha imituje regiony zmienne przeciwciał pochodzących z jednego gatunku ssaków, podczas gdy stałe porcje są homologiczne z sekwencjami przeciwciał pochodzących od innego. Jedną wyraźną zaletą takich chimerycznych form jest to, że region zmienny może być dowolnie pozyskany z obecnie znanych źródeł wykorzystujących gotowe komórki B lub hybrydoma z nieludzkich organizmów gospodarza w kombinacji z regionami stałymi pozyskanymi na przykład z preparatów ludzkich komórek. Podczas gdy zaletą regionu zmiennego jest łatwość przygotowania, a jego swoistość nie jest zmieniona przez źródło, region stały będący ludzkim regionem, jest mniej zdolny do wywołania reakcji immunologicznej u badanego ludzkiego podmiotu, kiedy przeciwciała są wstrzyknięte niż gdyby region stały pochodził z nieludzkiego źródła. Jednakże definicja nie ogranicza się do tego konkretnego przykładu. [0123] Przeciwciała mogą pochodzić od różnych gatunków, między innymi od: myszy, szczura, świnki morskiej i człowieka. [0124] Przeciwciała tu opisane obejmują przeciwciała IgA, takie jak IgA1 lub IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM i IgD. W różnych przykładach wykonania przeciwciało jest przeciwciałem IgG1, konkretniej IgG1, kappa lub IgG1, izotyp lambda (tj. IgG1, κ, λ), przeciwciałem IgG2a (np. IgG2a, κ, λ), przeciwciałem IgG2b (np. IgG2b, κ, λ), przeciwciałem IgG3 (np. IgG3, κ, λ) lub przeciwciałem IgG4 (np. IgG4, κ, λ). [0125] Stosowane tu określenie „przeciwciało heterologiczne” definiuje się w odniesieniu do organizmu transgenicznego wytwarzającego takie przeciwciało. Termin ten odnosi się do przeciwciała mającego sekwencję aminokwasową lub kodującą sekwencję kwasu

27 nukleinowego odpowiadającą tej występującej w organizmie nie składającym się z organizmu transgenicznego i zasadniczo pochodzącej z gatunku innego niż organizm transgeniczny. [0126] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie „przeciwciało heterohybrydowe” odnosi się do przeciwciała mającego łańcuchy lekkie i ciężkie różnego pochodzenia. Na przykład, przeciwciało mające ludzki łańcuch ciężki związany z mysim łańcuchem lekkim jest przeciwciałem heterohybrydowym. [0127] Przeciwciała opisane w niniejszym dokumencie korzystnie są wyodrębnione. „Wyodrębnione przeciwciało”, jak użyto w niniejszym dokumencie, ma na celu nawiązanie do przeciwciała, które jest zasadniczo pozbawione innych przeciwciał mających różne antygenowe swoistości (np. wyodrębnione przeciwciało, które w szczególności wiąże się z CLDN6 jest zasadniczo pozbawione przeciwciał, które w szczególności wiążą antygeny inne niż CLDN6). Wyodrębnione przeciwciało, które w szczególności wiąże się z epitopem, postacią izomorficzną lub wariantem ludzkiej CLDN6 może, jednakże, mieć reaktywność krzyżową z innymi powiązanymi antygenami, np. od innych gatunków (np. homologi gatunkowe CLDN6). Co więcej, wyodrębnione przeciwciało może być zasadniczo pozbawione innego materiału komórkowego i/lub chemikaliów. Kombinacja „izolowanych” przeciwciał monoklonalnych dotyczy przeciwciał o różnych swoistościach i łączonych w dobrze zdefiniowaną kompozycję lub mieszaninę. [0128] Terminy „porcja wiążąca antygen” przeciwciała (lub po prostu „porcja wiążąca") lub „fragment wiążący antygen” przeciwciała (lub po prostu „fragment wiążący") lub podobne terminy nawiązują do jednego albo wielu fragmentów przeciwciała, które zatrzymują w szczególności zdolność do wiązania z antygenem. Wykazano, że funkcja wiązania antygenu przez przeciwciało może być zrealizowana przez fragmenty pełnego przeciwciała. Przykłady wiążących fragmentów ujętych przez termin „porcja wiążąca antygen” w przeciwciele zawierają (i) fragmenty Fab, pojedyncze fragmenty składające się z domen VL, VH, CL i CH; (ii) fragmenty F(ab’)2, podwójne fragmenty zawierające dwa fragmenty Fab połączone przez mostek dwusiarczkowy na regionie zawiasu; (iii) fragmenty Fd składające się z domen VH i CH; (iv) fragmenty Fv składające się z domen VL i VH w pojedynczym ramieniu przeciwciała, (v) fragmenty dAb (Ward i inni, (1989) Nature 341: 544-546), które składają się z domeny VH; (vi) wyodrębnione regiony determinujące komplementarność (CDR) oraz (vii) kombinację dwóch lub więcej wyodrębnionych CDR, które mogą być opcjonalnie połączone syntetycznym łącznikiem. Ponadto, chociaż dwie domeny fragmentu Fv, VL i VH, są kodowane przez indywidualne geny, to mogą one być połączone wykorzystując sposób rekombinowania, przez syntetyczny łącznik, który umożliwia im stworzenie pojedynczego łańcucha białkowego, w którym regiony VL i VH są sparowane do utworzenia pojedynczej cząsteczki (znanej jako jednołańcuchowe Fv (scFv), patrz np. Bird i inni (1988) Science 242: 423-426; oraz Huston i inni (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Takie jednołańcuchowe przeciwciała mają także być objęte terminem „fragment wiążący antygen” przeciwciała. Kolejny przykład immunoglobulinowych białek fuzyjnych z domeną wiążącą obejmuje (i) polipeptyd domeny wiążącej, który jest złączony z immunoglobulinowym regionem zawiasowym polipeptydu, (ii) region stały łańcucha ciężkiego CH2 immunoglobulin złączony z regionem zawiasowym oraz (iii) region stały łańcucha ciężkiego CH3 immunoglobulin złączony z regionem stałym CH2. Polipeptyd domeny wiążącej może być regionem zmiennym łańcucha ciężkiego lub regionem zmiennym łańcucha lekkiego. Immunoglobulinowe białka fuzyjne z domeną wiążącą są ponadto ujawnione w US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Te fragmenty przeciwciał są uzyskane z wykorzystaniem konwencjonalnych technik znanych znawcom w dziedzinie techniki, a fragmenty są przesiewane pod kątem użyteczności w ten sam sposób, co nienaruszone przeciwciała. [0129] Termin „domena wiążąca” w odniesieniu do niniejszego wynalazku charakteryzuje się strukturą, np. przeciwciała, które wiąże się z/wchodzi w interakcje z daną docelową strukturą/docelowym antygenem/docelowym epitopem. Zatem, domena wiążąca, zgodnie z wynalazkiem, oznacza „miejsce interakcji z antygenem”.

28 [0130] Wszystkie przeciwciała i pochodne przeciwciał, takie jak fragmenty przeciwciał, jak opisano w niniejszym dokumencie, na potrzeby wynalazku są objęte terminem „przeciwciało”. Termin „pochodne przeciwciała” odnosi się do dowolnej zmodyfikowanej postaci przeciwciała, np. koniugatu przeciwciała i innego środka lub przeciwciała lub fragmentu przeciwciała. [0131] Naturalnie występujące przeciwciała są zasadniczo monoswoiste, tj. Wiążą się z pojedynczym antygenem. Ujawniono przeciwciała wiążące się z komórką docelową (poprzez angażowanie CLDN6) i drugą jednostkę, taką jak komórka cytotoksyczna (np. Poprzez angażowanie receptora CD3). Przeciwciała zgodne z niniejszym wynalazkiem mogą być biswoiste lub wieloswoiste, takie jak triswoiste, tetraswoiste i tak dalej. [0132] Termin „cząsteczka biswoista” ma obejmować środek, który ma dwie różne swoistości wiązania. Na przykład, cząsteczka może wiązać się z (a) antygenem powierzchniowym komórki lub oddziaływać z (a) receptorem, takim jak receptor Fc na powierzchni komórki efektorowej. Termin „cząsteczka wieloswoista” ma obejmować środek, który ma więcej niż dwie różne swoistości wiązania. Na przykład, cząsteczka może wiązać się z (a) antygenem powierzchniowym komórki, (b) receptor taki jak receptor Fc na powierzchni komórki efektorowej i (c) co najmniej jeden inny składnik. Odpowiednio, termin „przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6” obejmuje, ale nie wyłącznie, biswoiste, triswoiste, tetraswoiste i inne wieloswoiste cząsteczki, które są skierowane na CLDN6 i do innych celów, takich jak receptory Fc na komórkach efektorowych. Określenie „przeciwciała biswoiste” obejmuje także diaciała. Diaciała to dwuwartościowe, biswoiste przeciwciała, w których domeny VH i VL ulegają ekspresji na pojedynczym łańcuchu polipeptydowym, ale za pomocą łącznika, który jest zbyt krótki w celu umożliwienia parowania między dwiema domenami tego samego łańcucha, zmuszając w ten sposób domeny do parowania z komplementarnymi domenami innego łańcucha i tworzenia dwóch miejsc wiążących antygen (patrz np. Holliger, P. i in. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444–6448; Poljak, R. J. i in. (1994) Structure 2: 1121-1123). [0133] „Przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6” korzystnie jest zdolne do wywoływania immunologicznych funkcji efektorowych, jak tu opisano. Korzystnie, wspomniane funkcje efektorowe odpornościowe są skierowane przeciwko komórkom, takim jak rakowe komórki macierzyste niosące związany z nowotworem antygen CLDN6 na swojej powierzchni. [0134] Termin „funkcje efektorowe układu odpornościowego” obejmuje wszelkie funkcje, w których pośredniczą składniki układu odpornościowego, które skutkują np. zahamowaniem wzrostu nowotworu i/lub zahamowaniem rozwoju nowotworu, w tym zahamowaniem rozprzestrzeniania się nowotworu i przerzutów. Korzystnie, efektorowe funkcje immunologiczne powodują zabijanie komórek nowotworowych, w szczególności rakowych komórek macierzystych. Takie funkcje obejmują cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC), cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC), fagocytozę komórkową zależną od przeciwciał (ADCP), indukcję apoptozy w komórkach niosących antygen związany z nowotworem, cytolizę komórek niosących antygen związany z nowotworem i/lub hamowanie proliferacji komórek przenoszących antygen związany z nowotworem. Środki wiążące mogą również wywierać efekt po prostu przez wiązanie z antygenami związanymi z nowotworem na powierzchni komórki nowotworowej. Na przykład, przeciwciała mogą blokować funkcję antygenu związanego z nowotworem lub indukować apoptozę przez samo wiązanie z antygenem związanym z nowotworem na powierzchni komórki nowotworowej. [0135] Przeciwciało może być skoniugowane z ugrupowaniem lub środkiem terapeutycznym, takim jak ugrupowanie leku toksyny, w szczególności cytotoksyny, leku (np. immunosupresyjnego) lub radioizotopu. Cytotoksyna lub środek cytotoksyczny obejmuje dowolny środek, który jest szkodliwy i, w szczególności, zabija komórki. Przykłady obejmują taksol, cytochalasynę B, gramicydynę D, bromek etydyny, emetynę, mitomycynę, etopozyd,

29 tenopozyd, winkrystynę, winblastynę, kolchicynę, doksorubicynę, daunorubicynę, dihydroksyantracynę, dion, mitoksantron, mitramycynę, aktynomycynę D, amanitynę, 1- dehydrotestosteron, glukokortykoidy, prokainę, tetrakainę, lidokainę, propranolol i puromycynę oraz ich analogi lub homologi. Odpowiednie środki terapeutyczne do wytwarzania koniugatów przeciwciał obejmują, ale nie wyłącznie, antymetabolity (np. metotreksat, 6-merkaptopuryna, 6-tioguanina, cytarabina, fludarabina, 5-fluorouracyl, dakarbazyna), środki alkilujące (np. mechloretamina, tioepachlorambucyl, melfalan, karmustyna (BSNU) i lomustyna (CCNU), cyklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocyna, mitomycyna C i cis-diaminadichloroplatyna (II) (DDP) cisplatyna), antracykliny (np. daunorubicyna (dawniej daunomycyna) i doksorubicyna), antybiotyki (np. daktynomycyna (dawniej aktynomycyna), bleomycyna, mitramycyna i antramycyna (AMC)), środki antymitotyczne (np. winkrystyna i winblastyna). W korzystnym przykładzie środkiem terapeutycznym jest środek cytotoksyczny lub środek radiotoksyczny. W innym przykładzie środkiem terapeutycznym jest środek immunosupresyjny. W jeszcze innym przykładzie środkiem terapeutycznym jest GM-CSF. W korzystnym przykładzie środkiem terapeutycznym jest doksorubicyna, cisplatyna, bleomycyna, siarczan, karmustyna, chlorambucil, cyklofosfamid lub rycyna A. Szczególnie korzystne ugrupowania leku toksyny to związki hamujące tworzenie mikrotubul i mające działanie antyproliferacyjne i/lub cytotoksyczne. [0136] Szczególnie korzystne jest przeciwciało skoniugowane z ugrupowaniem lub środkiem terapeutycznym, takim jak cytotoksyna, działającym na wolno rosnące lub nieaktywne komórki, takie jak rakowe komórki macierzyste. Takie ugrupowania terapeutyczne obejmują ugrupowania terapeutyczne działające na mRNA i/lub syntezę białek. Znanych jest kilka inhibitorów transkrypcji. Na przykład, aktynomycyna D, która jest zarówno inhibitorem transkrypcji, jak i środkiem uszkadzającym DNA, interkaluje wewnątrz DNA i w ten sposób hamuje etap inicjacji transkrypcji. Flawopiridol jest ukierunkowany na wydłużenie transkrypcji. α-Amanityna wiąże się bezpośrednio do polimerazy RNA II, co prowadzi do zahamowania obu etapów inicjacji i wydłużania. [0137] Przeciwciała można również sprzęgać z radioizotopem, np. Jodem-131, itrem-90 lub indem-111, w celu wytworzenia cytotoksycznych radiofarmaceutyków. [0138] Koniugaty przeciwciał można stosować do modyfikowania danej odpowiedzi biologicznej, a ugrupowania leku nie należy interpretować jako ograniczonego do klasycznych chemicznych środków terapeutycznych. Na przykład, ugrupowanie leku może być peptydem, białkiem lub polipeptydem o pożądanej aktywności biologicznej. Takie białka mogą obejmować, na przykład, enzymatycznie aktywną toksynę lub jej aktywny fragment, taki jak abryna, rycyna A, egzotoksyna pseudomonas lub toksyna błonicza; białko, takie jak czynnik martwicy nowotworów lub interferon-γ; lub modyfikatory odpowiedzi biologicznej, takie jak na przykład limfokiny, interleukina-1 („IL-1”), interleukina-2 („IL-2”), interleukina- 6 („IL-6”), czynnik stymulujący kolonie makrofagów granulocytów („GM-CSF”), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów („G-CSF”) lub inne czynniki wzrostu. Dalszymi korzystnymi ugrupowaniami leku zgodnego z wynalazkiem są kurkumina, salinomycyna i sulforafan. [0139] Techniki sprzęgania takiego ugrupowania terapeutycznego z przeciwciałami są dobrze znane, patrz np. Arnon i wsp., „Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In Cancer Therapy”, w Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld i in. (red.), str. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom i in., „Antibodies For Drug Delivery”, w Controlled Drug Delivery (wyd. 2), Robinson i in. (red.), str. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, „Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, w Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera i in. (red.), str. 475-506 (1985); „Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, w Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin i in. (red.), str. 303-16 (Academic Press 1985) i Thorpe i in., „The

30 Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982). [0140] W jednym korzystnym przykładzie przeciwciało jest skoniugowane z jedną lub większą liczbą cząsteczek majtanzynoidu. [0141] Majtanzynoidy są silnymi związkami celowanymi w mikrotubule, które hamują proliferację komórek przy mitozie. Majtanzynoidy są pochodnymi majtanzyny, która jest 19- członową strukturą ansa makrolidową przyłączoną do chlorowanego pierścienia benzenowego. Majtanzyna ma następujący wzór:

[0142] Odkryto, że niektóre drobnoustroje wytwarzają również majtanzynoidy, takie jak majtanzynol i estry majtanzynolu C-3 (patent USA nr 4,151,042). Syntetyczny majtanzynol i analogi majtanzynolu opisano, na przykład, w patencie USA Nr 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,362,663; i 4,371,533, oraz Kawai i in. (1984) Chem. Pharm. Bull. 3441-3451. [0143] Majtanzynoidy są dobrze znane w dziedzinie i można je syntetyzować znanymi technikami lub izolować ze źródeł naturalnych. Szczególnie korzystnymi majtanzynoidami zgodnymi z wynalazkiem są zawierające tiol pochodne majtanzyny, takie jak DM1 i DM4. Takie pochodne majtanzyny zawierające tiol obejmują związki, w których grupa metylowa związana z grupą karbonylową jest zastąpiona grupą zawierającą wolną grupę sulfhydrylową, taką jak grupa -R-SH, gdzie R oznacza grupę alkilenową lub inną grupę atomów zawierających węgiel. [0144] DM1, znany również jako mertansyna, jest majtanzynoidem o następującym wzorze:

[0145] W szczególności, termin „mertansyna” lub „DM1” odnosi się do związku N2’- deacetylo-N2’-(3-merkapto-1-oksopropylo)-majtanzyna. [0146] DM4” odnosi się do związku N2’-deacetylo-N2’-(4-metylo-4-merkapto-1- oksopentylo)-majtanzyny.

31 [0147] Koniugaty przeciwciało anty-CLDN6-majtanzynoid wytwarza się przez chemiczne połączenie przeciwciała anty-CLDN6 z cząsteczką majtanzynoidu bez znacznego zmniejszenia aktywności biologicznej przeciwciała lub cząsteczki majtanzynoidu. Średnio 3-4 cząsteczki majtanzynoidu mogą być skoniugowane z cząsteczką przeciwciała, chociaż oczekuje się, że nawet jedna cząsteczka toksyny/przeciwciała zwiększy cytotoksyczność w porównaniu z użyciem nagiego przeciwciała. [0148] Pod tym względem termin „przeciwciało kowalencyjnie przyłączone do co najmniej jednego ugrupowania leku toksyny” obejmuje sytuacje, w których jedna lub więcej cząsteczek tego samego leku jest kowalencyjnie przyłączonych do cząsteczki przeciwciała, a także gdy różne leki są kowalencyjnie przyłączone do cząsteczki przeciwciała. W tej ostatniej sytuacji jedna lub więcej cząsteczek każdego z różnych leków może być przyłączonych do cząsteczki przeciwciała lub ich kombinacji (np. jedna cząsteczka jednego leku jest przyłączona, podczas gdy kilka cząsteczek innego leku jest przyłączonych). [0149] W niektórych przykładach przeciwciało jest skoniugowane z dolastatynami lub dolostatynowymi analogami peptydowymi i pochodnymi, aurystatynami (patenty USA nr 5,6355,483; 5 780 588, włączone tutaj przez odniesienie). aurystatyny są syntetycznymi analogami dolostatyny 10, naturalnego produktu pochodzącego z mięczaka morskiego, Dolabela auricularia. Podobnie jak majtanzynoidy, aurystatyny są substancjami zaburzającymi mikrotubule. Ugrupowanie dolastatyny lub aurystatyny może być przyłączone do przeciwciała przez koniec N (amino) lub koniec C (karboksy) peptydowego ugrupowania leku. [0150] Przykłady wykonania aurystatyny obejmują ugrupowania monometylourystatyny, takie jak MMAE i MMAF, które korzystnie są połączone na końcu N. [0151] MMAE, znany również jako monometylo aurystatyna E, ma następujący wzór:

[0152] W szczególności termin „MMAE” odnosi się do związku (S)-N-((3R,4S,SS)-1-((S)- 2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hydroksy-1-fenylopropan-2-ylo)amino)-1-metoksy-2-metylo-3- oksopropylo)pirolidyn-1-ylo)-3-metoksy-5-metylo-1-oksoheptan-4-ylo)-N,3-dimetylo-2-((S)- 3-metylo-2-(metyloamino)butanamido)butanamid. MMAE to tak naprawdę desmetylo- aurystatyna E, tj. N-końcowa grupa aminowa ma tylko jeden podstawnik metylowy zamiast dwóch jak w samej aurystatynie E. [0153] Szczególnie korzystne są koniugaty przeciwciało-aurystatyna, takie jak koniugaty przeciwciało-vcMMAE. Zgodnie z wynalazkiem, termin „przeciwciało-vcAurystatyna” lub „vcMMAE” odnosi się do koniugatu przeciwciało-lek (ADC) zawierającego aurystatynę, taką jak MMAE, połączoną przez lizosomalnie rozszczepialny dipeptyd, walinę-cytrulinę (vc), z przeciwciałem. MMAF, znany również jako monometylo aurystatyna F, dotyczy związku kwasu (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-dimetylo-2-((S)-3-metylo-2- (metyloamino)butanamido)butanamido)-3-metoksy-5-metyloheptanoilo)pirolidyn-2-ylo)-3- metoksy-2-metylopropanamido)-3-fenylopropanowego. [0154] Istnieje wiele grup łączących znanych w dziedzinie do tworzenia koniugatów przeciwciało-lek. [0155] W jednym przykładzie przeciwciało jest połączone z lekiem poprzez dwufunkcyjny odczynnik sieciujący. W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie „dwufunkcyjny

32 odczynnik sieciujący” odnosi się do odczynnika, który ma dwie reaktywne grupy, z których jedna jest zdolna do reakcji z przeciwciałem, podczas gdy druga jest zdolna do reakcji z lekiem w celu połączenia przeciwciała z lekiem, a tym samym tworząc koniugat. W połączeniu z wynalazkiem można zastosować dowolny odpowiedni dwufunkcyjny odczynnik sieciujący, o ile odczynnik łączący zapewnia zatrzymanie leku, np. cytotoksyczność i właściwości celowania przeciwciała. Korzystnie, cząsteczka łącząca łączy lek z przeciwciałem za pomocą wiązań chemicznych, tak że lek i przeciwciało są chemicznie sprzężone (np. kowalencyjnie związane) ze sobą. [0156] W jednym przykładzie dwufunkcyjny odczynnik sieciujący zawiera nierozszczepialne łączniki. Nieodcinalny łącznik to dowolna grupa chemiczna, która jest zdolna do połączenia leku, takiego jak majtanzynoid, z przeciwciałem w stabilny, kowalencyjny sposób. Korzystnie, nierozszczepialny łącznik nie jest rozszczepialny w warunkach fizjologicznych, w szczególności wewnątrz komórki. Zatem nierozszczepialne łączniki są zasadniczo oporne na cięcie indukowane kwasem, cięcie indukowane światłem, cięcie indukowane peptydazą, cięcie indukowane esterazą i cięcie wiązania disiarczkowego, w warunkach, w których lek lub przeciwciało pozostaje aktywne. Odpowiednie odczynniki sieciujące, które tworzą nierozszczepialne łączniki między lekiem a przeciwciałem są dobrze znane w dziedzinie. W jednym przykładzie lek jest połączony z przeciwciałem poprzez wiązanie tioeterowe. Przykłady nierozszczepialnych łączników obejmują łączniki zawierające ugrupowanie oparte na maleimido- lub haloacetylu do reakcji z lekiem, takim jak grupa sulfhydrylowa majtanzynoidu. Takie dwufunkcyjne środki sieciujące są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują między innymi 4-(maleimidometylo)cykloheksanokarboksylan N- sukcynimidylu (SMCC) i N-sukcynoimidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1- karboksy-(6-amidokapronian), który jest „długim łańcuchem” analogiem SMCC (LC-SMCC). Korzystnie dwufunkcyjnym odczynnikiem sieciującym jest SMCC. Stosując taki łącznik, lek taki jak mertansyna można połączyć za pomocą kwasu 4-(3-merkapto-2,5-diokso-1- pirolidynylometylo)-cykloheksanokarboksylowego z grupami aminowymi, takimi jak wolne grupy NH2 reszt lizyny przeciwciała. Każda cząsteczka koniugatu przeciwciało-lek może zawierać pojedynczą cząsteczkę przeciwciała związaną z kilkoma cząsteczkami mertansyny. [0157] W jednym szczególnie korzystnym przykładzie odczynnikiem łączącym jest rozszczepialny łącznik. Korzystnie rozszczepialny łącznik jest rozszczepialny w warunkach fizjologicznych, w szczególności wewnątrz komórki. Przykłady odpowiednich rozszczepialnych łączników obejmują łączniki disiarczkowe, łączniki labilne kwasowo, łączniki fotolabilne, łączniki labilne peptydazowo i łączniki labilne esterazowo. Łączniki zawierające dwusiarczek są łącznikami rozszczepialnymi poprzez wymianę dwusiarczkową, co może zachodzić w warunkach fizjologicznych. Łączniki nietrwałe w kwasach to łączniki rozszczepialne przy kwasowym pH. Na przykład niektóre przedziały wewnątrzkomórkowe, takie jak endosomy i lizosomy, mają kwaśne pH (pH 4–5) i zapewniają warunki odpowiednie do rozszczepiania labilnych kwasowo łączników. Łączniki fotolabilne są przydatne na powierzchni ciała oraz w wielu jamach ciała dostępnych dla światła. Ponadto światło podczerwone może przenikać do tkanek. Łączniki labilne peptydazowo można zastosować do cięcia niektórych peptydów wewnątrz lub na zewnątrz komórek. W jednym przykładzie rozszczepialny łącznik jest cięty w łagodnych warunkach, tj. warunkach w komórce, w których nie ma to wpływu na aktywność środka cytotoksycznego. [0158] W jednym szczególnie korzystnym przykładzie łącznik jest łącznikiem zawierającym dipeptyd walinę (Val) - cytrulinę (Cit) (vc) lub składający się z niej, który jest cięty przez katepsynę w komórkach nowotworowych. [0159] Zgodnie z wynalazkiem, termin „terapia przeciwnowotworowa skierowana przeciwko rakowym komórkom macierzystym” dotyczy dowolnej terapii, która może być zastosowana do celowania i korzystnie zabijania i/lub upośledzania proliferacji lub żywotności rakowych komórek macierzystych. Taka terapia obejmuje i) przeciwciała, fragmenty przeciwciał i białka, które są albo nagie, albo skoniugowane z ugrupowaniem

33 terapeutycznym, które są ukierunkowane na określone cele powierzchni komórek rakowych komórek macierzystych, na przykład CLDN6 (np. przeciwciała lub koniugaty przeciwciał mające zdolność wiązania z CLDN6 jak opisano powyżej) lub ii) małe cząsteczki, które upośledzają proliferację lub żywotność rakowej komórki macierzystej. W konkretnym przykładzie wykonania środek wiąże się z antygenem, który ulega ekspresji na wyższym poziomie na rakowych komórkach macierzystych niż na normalnych komórkach macierzystych. W konkretnym przykładzie wykonania środek wiąże się swoiście z antygenem rakowych komórek macierzystych. [0160] Termin „wiązanie” zgodnie z niniejszym wynalazkiem korzystnie dotyczy swoistego wiązania. [0161] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem przeciwciało jest zdolne do wiązania z ustalonym celem, jeżeli ma istotne powinowactwo ze wspomnianym ustalonym celem i wiąże się ze wspomnianym ustalonym celem w standardowych próbach. „Powinowactwo” lub „powinowactwo wiązania” jest często mierzone przez równowagę stałej dysocjacji (KD). Korzystnie, termin „istotne powinowactwo” nawiązuje do wiązania z ustalonym celem ze -5 -6 -7 -8 stałą dysocjacji (KD) wynoszącą 10 M lub mniej, 10 M lub mniej, 10 M lub mniej, 10 M lub mniej, 10-9 M lub mniej, 10-10 M lub mniej, 10-11 M lub mniej albo 10-12 M lub mniej. [0162] Przeciwciało nie jest (zasadniczo) zdolne do wiązania się z celem, jeżeli nie ma istotnego powinowactwa ze wspomnianym celem i nie wiąże się w sposób istotny, w szczególności nie wiąże się w sposób wykrywalny, ze wspomnianym celem w standardowych próbach. Korzystnie, przeciwciało nie wiąże się w sposób wykrywalny ze wspomnianym celem, jeżeli występuje w stężeniu do 2, korzystnie 10, korzystniej 20, w szczególności 50 lub 100 μg/ml lub wyższym. Korzystnie, przeciwciało nie ma znaczącego powinowactwa do celu, 3 jeśli wiąże się z tym celem za pomocą KD, który jest co najmniej 10-krotnie, 100-krotnie, 10 - 4 5 6 krotnie, 10 -krotnie, 10 -krotnie, lub 10 -krotnie wyższy niż KD dla wiązania z określonym z góry celem, z którym przeciwciało jest zdolne do wiązania. Na przykład, jeśli KD dla wiązania przeciwciała z celem, z którym przeciwciało jest zdolne do wiązania wynosi 10-7 M, KD dla wiązania z celem, dla którego przeciwciało nie ma znaczącego powinowactwa, wynosi co najmniej 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M lub 10-1 M. [0163] Przeciwciało jest swoiste dla określonego z góry celu, jeśli jest zdolne do wiązania się z tym z góry określonym celem, podczas gdy nie jest zdolne do wiązania się z innymi celami, tj. nie ma znaczącego powinowactwa do innych celów i nie wiąże się znacząco z innymi celami w standardowych testach. Zgodnie z wynalazkiem przeciwciało jest swoiste dla CLDN6, jeśli jest zdolne do wiązania się z CLDN6, ale nie jest (zasadniczo) zdolne do wiązania się z innymi celami. Korzystnie, przeciwciało jest swoiste dla CLDN6, jeżeli powinowactwo dla i wiązanie z takimi innymi celami nie przewyższa istotnie powinowactwa dla lub wiązania z białkami niezwiązanymi z CLDN6, takimi jak surowicza albumina wołowa (BSA), kazeina, surowicza albumina ludzka (HSA) lub nieklaudynowe białka transbłonowe, takie jak cząsteczki MHC lub receptor transferryny, lub inny podany polipeptyd. Korzystnie, przeciwciało jest swoiste dla określonego z góry celu, jeśli wiąże się z tym celem za pomocą 3 4 5 KD który jest co najmniej 10-krotnie, 100-krotnie, 10 -krotnie, 10 -krotnie, 10 -krotnie, lub 6 10 -krotnie niższy niż KD dla wiązań z celem, dla którego nie jest swoiste. Na przykład, jeżeli -7 KD dla wiązania przeciwciała z celem, dla którego jest swoisty jest 10 M, to KD dla wiązań z celem dla którego nie jest swoisty byłoby co najmniej 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M lub 10-1 M. [0164] Wiązanie przeciwciała z celem może być określone eksperymentalnie wykorzystując każdy stosowny sposób; patrz, na przykład Berzofsky i inni, „Antibody-Antigen Interactions” In Fundamental Immunology, Paul, W. E., red., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992) i sposoby opisane w niniejszym dokumencie. Powinowactwa mogą być łatwo określone przy zastosowaniu konwencjonalnych technik, takich jak dializa równowagowa; stosując narzędzie BIAcore 2000, stosując ogólne procedury podane przez producenta, w metodach

34 radioimmunologicznych wykorzystujących oznakowany antygen docelowy; lub innym sposobem wiadomym dla znawcy. Dane na temat powinowactwa mogą być zanalizowane, na przykład, sposobem zaproponowanym w Scatchard i inni, Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). Wyniki pomiaru powinowactwa poszczególnej interakcji między przeciwciałem i antygenem mogą się różnić, jeżeli pomiar jest dokonywany w różnych warunkach, np. stężenie soli, pH. Zatem pomiary powinowactwa i innych parametrów wiązania antygenów, np. KD, IC50, korzystnie są dokonywane ze standaryzowanymi roztworami przeciwciała i antygenu i standaryzowanym buforem. [0165] Stosowane tu określenie „izotyp” odnosi się do klasy przeciwciał (np. IgM lub IgG1), która jest kodowana przez geny regionu stałego łańcucha ciężkiego. [0166] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie „przełączanie izotypów” odnosi się do zjawiska, w którym klasa lub izotyp przeciwciała zmienia się z jednej klasy Ig na jedną z pozostałych klas Ig. [0167] Termin „występujący naturalnie” w znaczeniu stosowanym w odniesieniu do przedmiotu odnosi się do faktu, że obiekt może być znaleziony w naturze. Na przykład naturalnie występuje polipeptyd lub sekwencja polinukleotydowa obecna w organizmie (w tym wirusy), którą można izolować ze źródła w naturze i która nie została celowo zmodyfikowana przez człowieka w laboratorium. [0168] Termin „rearanżowany” w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie odnosi się do konfiguracji locus łańcucha ciężkiego lub lekkiego immunoglobuliny, w której segment V jest umieszczony bezpośrednio przylegle do segmentu D-J lub J w konformacji kodującej zasadniczo odpowiednio pełną domenę VH lub VL. Zmienione umiejscowienie genu immunoglobuliny (przeciwciała) można zidentyfikować przez porównanie z DNA linii płciowej; rearanżowane miejsce będzie miało co najmniej jeden rekombinowany element homologii heptamer/nonamer. [0169] Określenie „nierearanżowana” lub „konfiguracja linii germinalnej” stosowane tutaj w odniesieniu do segmentu V odnosi się do konfiguracji, w której segment V nie jest rekombinowany w celu bezpośredniego przylegania do segmentu D lub J. [0170] Korzystnie, wiązanie przeciwciała mającego zdolność wiązania z CLDN6 z komórkami eksprymującymi CLDN6 indukuje lub pośredniczy w zabijaniu komórek eksprymujących CLDN6. Komórki eksprymujące CLDN6 są korzystnie rakowymi komórkami macierzystymi i są w szczególności komórkami opisanych tu chorób nowotworowych, takich jak rakowe komórki macierzyste nowotworu jajnika. Korzystnie, przeciwciało indukuje lub pośredniczy w zabijaniu komórek przez indukowanie jednej lub więcej lizy zależnej od dopełniacza (CDC), lizy zależnej od przeciwciał pośredniczonej przez cytotoksyczność komórkową (ADCC), apoptozy i hamowania proliferacji komórek eksprymujących CLDN6. Korzystnie, lizowanie komórek za pośrednictwem ADCC zachodzi w obecności komórek efektorowych, które w szczególnych przykładach wykonania są wybrane z grupy obejmującej monocyty, komórki jednojądrzaste, komórki NK i PMN. Hamowanie proliferacji komórek można zmierzyć in vitro przez określenie proliferacji komórek w teście z użyciem bromodeoksyurydyny (5-bromo-2-deoksyurydyny, BrdU). BrdU jest syntetycznym nukleozydem, który jest analogiem tymidyny i może być włączony do nowo zsyntetyzowanego DNA replikujących się komórek (podczas fazy S cyklu komórkowego), zastępując tymidynę podczas replikacji DNA. Wykrywanie włączonej substancji chemicznej przy użyciu, na przykład, przeciwciał swoistych dla BrdU wskazuje komórki, które aktywnie replikowały swoje DNA. [0171] W korzystnych przykładach wykonania opisane tu przeciwciała można scharakteryzować jedną lub większą liczbą następujących właściwości:

a) swoistość dla CLDN6; b) powinowactwo wiązania do CLDN6 około 100 nM lub mniej, korzystnie około 5-10 nM lub mniej, a korzystniej około 1-10 nM lub mniej,

35 c) zdolność do indukowania lub pośredniczenia w CDC na komórkach dodatnich pod względem CLDN6; d) zdolność do indukowania lub pośredniczenia w ADCC na komórkach dodatnich pod względem CLDN6; e) zdolność do hamowania wzrostu komórek dodatnich CLDN6; f) zdolność do indukowania apoptozy komórek dodatnich pod względem CLDN6.

[0172] W jednym przykładzie wykonania przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 ma zdolność wiązania z epitopem obecnym w CLDN6, korzystnie epitopem znajdującym się w domenach zewnątrzkomórkowych CLDN6, w szczególności w pierwszej pętli zewnątrzkomórkowej, korzystnie w pozycjach aminokwasowych 28 do 76 CLDN6 lub drugiej pętli zewnątrzkomórkowej, korzystnie pozycjach aminokwasowych 141 do 159 CLDN6. W szczególnych przykładach wykonania, przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 wiąże się z epitopem na CLDN6, który nie jest obecny na CLDN9. Korzystnie, przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 wiąże się z epitopem na CLDN6, który nie jest obecny na CLDN4 i/lub CLDN3. Najkorzystniej, przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 wiąże się z epitopem na CLDN6, który nie jest obecny na białku CLDN innym niż CLDN6. [0173] Przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 korzystnie wiąże się z CLDN6, ale nie z CLDN9 i korzystnie nie wiąże się z CLDN4 i/lub CLDN3. Korzystnie, przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 jest swoiste dla CLDN6. Korzystnie, przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 wiąże się z CLDN6 ulegającym ekspresji na powierzchni komórki. W szczególnie korzystnych przykładach wykonania przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 wiąże się z natywnymi epitopami CLDN6 obecnymi na powierzchni żywych komórek. [0174] W korzystnym przykładzie przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego (VH) zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 i jej fragment. [0175] W korzystnym przykładzie przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 zawiera region zmienny łańcucha lekkiego (VL) zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 11, 12, i jego fragment. [0176] W niektórych korzystnych przykładach przeciwciało o zdolności wiązania z CLDN6 zawiera kombinację regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (VH) i regionu zmiennego łańcucha lekkiego (VL) wybranych z następujących możliwości (i) do (vii):

(i) VH zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 3 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 4 lub jej fragment, (ii) VH zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 5 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 6 lub jej fragment, (iii) VH zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 7 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 8 lub jej fragment, (iv) VH zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 9 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 10 lub jej fragment, (v) VH zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 5 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 4 lub jej fragment,

36 (vi) VH zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 5 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 11 lub jej fragment, (vii) VH zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 5 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 12 lub jej fragment,

[0177] W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 zawiera następującą kombinację regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (VH) i regionu zmiennego łańcucha lekkiego (VL): VH zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 5 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 4 lub jej fragment. [0178] Termin „fragment” nawiązuje w szczególności do jednego albo wielu regionów determinujących komplementarność (CDR), korzystnie co najmniej regionu zmiennego CDR3, regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (VH) i/lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego (VL). W jednym przykładzie wykonania wspomniany jeden albo wiele regionów determinujących komplementarność (CDR) jest wybranych z zestawu regionów determinujących komplementarność CDR1, CDR2 i CDR3. W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania termin „fragment” nawiązuje do regionów determinujących komplementarność CDR1, CDR2 i CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (VH) i/lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego (VL). [0179] W jednym przykładzie wykonania przeciwciało zawierające jeden lub więcej CDR, zestaw CDR lub kombinację zestawów CDR, jak tu opisano, zawiera wspomniane CDR wraz z ich pośrednimi regionami zrębowymi. Korzystnie, porcja będzie także zawierać co najmniej około 50% albo jednego z, albo obu regionów ramowych: pierwszego i czwartego, przy czym te 50% to 50% C-terminala z pierwszego regionu ramowego i 50% N-terminala z czwartego regionu ramowego. Konstrukcja przeciwciał wytworzonych przez techniki rekombinowanego DNA może skutkować wprowadzeniem reszt N- i C-terminalowych do regionów zmiennych kodowanych przez łączniki wprowadzone do ułatwienia klonowania lub innych etapów manipulowania, włącznie z wprowadzeniem łączników do połączenia regionów zmiennych zgodnych z wynalazkiem z dalszymi sekwencjami białek, włączając łańcuchy ciężkie immunoglobulin, inne zmienne domeny (na przykład w produkcji ciał z dwoma miejscami wiążącymi) lub oznakowania białek. [0180] W jednym przykładzie wykonania wynalazku przeciwciało zawierające jeden albo wiele CDR, zestaw CDR lub kombinację zestawów CDR, jak opisano w niniejszym dokumencie, zawiera wspomniane CDR w strukturze ludzkich przeciwciał. [0181] Odniesienie w niniejszym dokumencie do przeciwciała zawierającego w odniesieniu do jego łańcucha ciężkiego określony łańcuch lub określony region lub sekwencję, korzystnie dotyczy sytuacji, w której wszystkie łańcuchy ciężkie tego przeciwciała zawierają ten konkretny łańcuch, region lub sekwencję. Dotyczy to odpowiednio łańcucha lekkiego przeciwciała. [0182] Należy rozumieć, że opisane tu przeciwciała można dostarczyć pacjentowi przez podanie kwasu nukleinowego, takiego jak RNA kodujący przeciwciało i/lub przez podanie komórki gospodarza zawierającej kwas nukleinowy, taki jak RNA kodujący przeciwciało. Zatem kwas nukleinowy kodujący przeciwciało po podaniu pacjentowi może być obecny w postaci nagiej lub w odpowiednim nośniku do dostarczania, takim jak liposomy lub cząstki wirusowe, lub w komórce gospodarza. Dostarczony kwas nukleinowy może wytwarzać przeciwciało przez dłuższy czas w przedłużony sposób, łagodząc niestabilność przynajmniej częściowo obserwowaną dla przeciwciał terapeutycznych. Kwasy nukleinowe dostarczane pacjentowi można wytwarzać sposobami rekombinacji. Jeżeli kwas nukleinowy jest podany pacjentowi, a nie występuje w komórce gospodarza, jest korzystnie przejęty przez komórki

37 pacjenta do wyrażenia przeciwciała zakodowanego przez kwas nukleinowy. Jeżeli kwas nukleinowy jest podany pacjentowi i występuje w komórce gospodarza, jest on korzystnie wyrażony przez komórkę gospodarza u pacjenta w celu wyprodukowania przeciwciała kodowanego przez kwas nukleinowy. [0183] Termin „kwas nukleinowy”, jak użyto w niniejszym dokumencie, ma na celu objęcie DNA i RNA, takich jak genomiczne DNA, cDNA mRNA, rekombinacyjnie wyprodukowane i chemicznie syntetyzowane cząsteczki. Kwas nukleinowy może być jednoniciowy lub dwuniciowy. RNA zawiera transkrybowane in vitro RNA (IVT RNA) lub syntetyczne RNA. [0184] Kwasy nukleinowe mogą być zawarte w wektorze. Termin „wektor”, jak użyto w niniejszym dokumencie, zawiera wszelkie wektory wiadome dla znawcy, włączając wektory plazmidów, wektory kosmidów, wektory fagów, takich jak fag lambda, wektory wirusów, takie jak wektory adenowirusów lub bakulowirusów lub wektory sztucznych chromosomów, takich jak bakteryjnych sztucznych chromosomów (BAC), drożdżowych sztucznych chromosomów (YAC) lub sztucznych chromosomów PI (PAC). Wspomniane wektory zawierają wektory ekspresji, jak również wektory klonowania. Wektory ekspresji zawierają wektory plazmidów, jak również wektory wirusów i na ogół zawierają pożądaną sekwencję kodującą i właściwe sekwencje DNA niezbędne do ekspresji operacyjnie złączonej sekwencji kodującej w danym organizmie gospodarza (np. bakterie, drożdże, rośliny, insekty lub ssaki) lub w układach ekspresji in vitro. Wektory klonowania są na ogół użyte do modyfikowania i amplifikowania pewnego pożądanego fragmentu DNA i mogą nie mieć sekwencji funkcjonalnych niezbędnych do ekspresji pożądanych fragmentów DNA. [0185] W kontekście niniejszego wynalazku, termin „RNA” dotyczy cząsteczki, która zawiera resztę rybonukleotydową i korzystnie całkowicie lub zasadniczo składa się z reszt rybonukleotydowych. „Rybonukleotyd” dotyczy nukleotydów z grupą hydroksylową na 2’ miejscu wiązania grupy β-D-rybofuranozydu. Termin zawiera dwuniciowe RNA, jednoniciowe RNA, wyodrębnione RNA, takie jak częściowo oczyszczone RNA, zasadniczo czyste RNA, syntetyczne RNA, rekombinacyjnie wyprodukowane RNA, jak również zmodyfikowane RNA, które różnią się od naturalnie występującego RNA przez dodanie, usunięcie, podstawienie i/lub zmianę jednego albo wielu nukleotydów. Takie zmiany mogą zawierać dodanie materiału nienukleotydowego, tak jak do końca(ów) RNA lub wewnętrznie, na przykład na jednym albo wielu nukleotydach w RNA. Nukleotydy w cząsteczkach RNA mogą także zawierać niestandardowe nukleotydy, takie jak nukleotydy nie występujące naturalnie lub chemicznie syntezowane nukleotydy lub deoksynukleotydy. Te zmienione RNA mogą być nazywane analogami lub analogami naturalnie występujących RNA. [0186 ]Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, termin „RNA” zawiera i korzystnie odnosi się do „mRNA”, co oznacza „informacyjny RNA” i odnosi się do „transkryptu”, który może być wyprodukowany z użyciem DNA jako macierzy i koduje peptyd lub białko. mRNA typowo zawiera region 5’ nieulegający translacji (5’-UTR), region kodujący białko lub peptyd i region 3’ nieulegający translacji (3’-UTR). mRNA ma ograniczony czas trwania w komórkach i in vitro. Korzystnie, mRNA jest produkowane przez transkrypcję in vitro z użyciem macierzy DNA. W jednym przykładzie RNA otrzymuje się przez transkrypcję in vitro lub syntezę chemiczną. Metodologia transkrypcji in vitro jest wiadoma dla znawcy. Na przykład, komercyjnie dostępnych jest wiele zestawów do transkrypcji in vitro. [0187] W jednym przykładzie RNA jest samo-replikującym się RNA, takim jak jednoniciowy samo-replikujący się RNA. W jednym przykładzie wykonania samo-replikujący RNA jest jednoniciowym RNA z dodatnim sensem. W jednym przykładzie samo-replikujący RNA jest wirusowym RNA lub RNA pochodzącym od wirusowego RNA. W jednym przykładzie samo-replikujący RNA jest alfa-wirusowym genomowym RNA lub pochodzi od alfa-wirusowego genomicznego RNA. W jednym przykładzie samo-replikujący RNA jest wektorem ekspresji genu wirusa. W jednym przykładzie wirus jest wirusem lasu Semliki. W jednym przykładzie samo-replikujący RNA zawiera jeden albo wiele transgenów co najmniej jednego ze wspomnianych transgenów kodujących przeciwciało opisane w niniejszym

38 dokumencie. W jednym przykładzie, jeżeli RNA jest wirusowym RNA lub pochodzi od wirusowego RNA, transgeny mogą częściowo lub całkowicie zastąpić sekwencje wirusowe, takie jak sekwencje wirusowe kodujące białka strukturalne. W jednym przykładzie samo- replikujący RNA jest RNA transkrybowanym in vitro. [0188] Genom alfawirusów to jednoniciowy RNA o dodatnim znaczeniu (ssRNA(+)), który koduje dwie otwarte ramki odczytu (ORF) dla dużych poliprotein. ORF na końcu 5’ genomu koduje białka niestrukturalne od nSP1 do nSP4 (nsP1-4), które są translowane i przetwarzane na zależną od RNA polimerazę RNA (replikazę); ORF na końcu 3’ koduje białka strukturalne - kapsyd i glikoproteiny. Obie ORF są oddzielone przez tak zwany promotor subgenomowy (SGP), który reguluje transkrypcję strukturalnej ORF. W przypadku wykorzystania jako wektory genowe białka strukturalne stojące za SGP są zwykle zastępowane przez transgeny. W celu upakowania takich wektorów w cząsteczki wirusa, białka strukturalne są zwykle eksprymowane w trans z konstruktów pomocniczych. Alfawirusy replikują się w cytoplazmie zainfekowanych komórek wyłącznie na poziomie RNA. Po zakażeniu genom ssRNA(+) działa jako mRNA dla translacji prekursora wielobiałkowego nsP1234, który we wczesnych stadiach cyklu życia wirusa jest autoproteolitycznie przetwarzany na fragmenty nsP123 i nsP4. Fragmenty nsP123 i nsP4 tworzą kompleks replikazy nici (-), który transkrybuje (-) nici RNA z matrycy genomowego RNA. Na późniejszych etapach poliproteina nsP1234 jest całkowicie rozszczepiana na pojedyncze białka, które łączą się z kompleksem replikazy nici (+), która syntetyzuje nowe genomy (+), jak również subgenomowe transkrypty, które kodują białka strukturalne lub transgeny. Subgenomowy RNA, a także nowy genomowy RNA jest zakryty i poliadenylowany, a zatem rozpoznawany jako mRNA po zakażeniu komórek docelowych. Tylko nowy genomowy RNA zawiera sygnał pakowania, który zapewnia wyłączne upakowanie genomowego RNA w rozwijających się wirionach. Atrakcyjność replikonów alfawirusowych dla wektorologii opiera się na pozytywnej orientacji genomu RNA z pułapką i poliadenylowanego. Translatowalny replikon RNA można łatwo zsyntetyzować in vitro, dzięki czemu można osiągnąć ograniczenie z analogiem cap dodanym do reakcji transkrypcji in vitro, a ogony poli-A można zakodować jako ścieżki poli-T na matrycach plazmidowych. Replikony transkrybowane in vitro (IVT) są transfekowane konwencjonalnymi technikami transfekcji i nawet małe ilości wyjściowego RNA IVT są szybko mnożone. W ciągu kilku godzin po przeniesieniu transgeny umieszczone poniżej SGP są transkrybowane na bardzo wysoką liczbę kopii wynoszącą około 40 000 do 200 000 kopii subgenomowego RNA na komórkę, dlatego nie jest zaskakujące, że rekombinowane białka są silnie eksprymowane. W zależności od konkretnego celu replikony IVT mogą być transfekowane bezpośrednio do komórek docelowych lub pakowane do cząstek alfawirusowych za pomocą wektorów pomocniczych, które zapewniają geny strukturalne w trans. Przeniesienie do skóry lub mięśni prowadzi do wysokiej i trwałej ekspresji lokalnej, której towarzyszy silna indukcja humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej [0189] W celu zwiększenia ekspresji i/lub stabilności RNA, można go zmodyfikować, najlepiej bez zmiany sekwencji eksprymowanego peptydu lub białka. [0190] Termin „modyfikacja” w kontekście RNA obejmuje dowolną modyfikację RNA, która nie występuje naturalnie we wspomnianym RNA. [0191] Zastosowany RNA nie ma nielimitowanych 5’-trifosforanów. Usunięcie takich nieograniczonych 5’-trójfosforanów może być osiągnięte przez potraktowanie RNA fosfatazą. [0192] RNA może mieć zmodyfikowane naturalnie występujące lub syntetyczne rybonukleotydy w celu zwiększenia jego stabilności i/lub zmniejszenia cytotoksyczności. Na przykład, w jednym przykładzie wykonania, w RNA zastosowanym zgodnie z wynalazkiem 5-metylocytydyna jest częściowo lub całkowicie podstawiona, korzystnie całkowicie, przez cytydynę. Alternatywnie lub dodatkowo, w jednym przykładzie wykonania, w RNA zastosowanym zgodnie z wynalazkiem pseudourydyna jest częściowo lub całkowicie podstawiona, korzystnie całkowicie, przez urydynę.

39 [0193] Termin „modyfikacja” dotyczy zapewnienia RNA z 5’-czapeczką lub analogiem 5’- czapeczki. Termin „5’-czapeczka” nawiązuje do struktury czapeczki występującej na 5’- miejscu wiązania w cząsteczce mRNA i na ogół składa się z nukleotydu guanozyny połączonego z mRNA przez niezwykłe łączenie 5’ do 5’-trójfosforanu. W jednym przykładzie, ta guanozyna jest metylowana na 7 pozycji. Termin „konwencjonalna 5’- czapeczka” nawiązuje do naturalnie występującej 5’-czapeczki RNA, korzystnie do czapeczki 7-metyloguanozyny (m7G). Termin „5’-czapeczka” zawiera analog 5’-czapeczki, który przypomina strukturę czapeczki RNA i jest zmodyfikowany do stabilizowania RNA, o ile jest do niego dołączony, korzystnie in vivo i/lub w komórce. [0194] Zapewnienie RNA z 5’-czapeczką lub analogiem 5’-czapeczki może być osiągnięte przez transkrypcję in vitro macierzy DNA w obecności wspomnianej 5’-czapeczki lub analogu 5’-czapeczki, przy czym wspomniana 5’-czapeczka jest ko-transkrypcjonalnie włączona do wytworzonej nici RNA lub RNA może być wytworzony, na przykład, przez transkrypcję in vitro, a 5’-czapeczka może być dołączona do RNA po-transkrypcjonalnie używającego enzymów blokujących, na przykład enzymów blokujących wirus krowianki. [0195] RNA może zawierać dalsze modyfikacje. Na przykład, dalsza modyfikacja RNA zastosowanego w niniejszym wynalazku może być rozbudowaniem lub obcięciem naturalnie występującego ogona poli(A) lub zmianą regionu 5’- lub 3’- nieulegającego translacji (UTR), tak jak wprowadzenie UTR, który nie jest związany z regionem kodującym wspomniany RNA, na przykład wprowadzenie jednej albo wielu, korzystnie dwóch kopii 3’-UTR pochodzącego z genu globiny, takiej jak globina alfa2, globina alfa1, globina beta, korzystnie globina beta, korzystniej ludzkiej globina beta. [0196] Zatem w celu zwiększenia stabilności i/lub ekspresji RNA może on być zmodyfikowany tak, żeby występował w sprzęgnięciu z sekwencją poli-A, korzystnie mającą długość 10 do 500, korzystniej 30 do 300, nawet korzystniej 65 do 200 i szczególnie 100 do 150 reszt adenozynowych. W szczególnie korzystnym przykładzie, sekwencja poli-A ma długość około 120 reszt adenozynowych. Dodatkowo, włączenie dwóch lub więcej regionów 3’-nieulegających translacji (UTR) do regionu 3’-nieulegającego translacji w cząsteczce RNA może zwiększyć wydajność translacji. W jednym szczególnym przykładzie wykonania 3’- UTR pochodzi z genu ludzkiej β-globiny. [0197] Korzystnie, RNA, jeśli jest dostarczany do, tj. transfekowany, do komórki, w szczególności komórki obecnej in vivo, wyraża białko lub peptyd, który koduje. [0198] Termin „transfekcja” dotyczy wprowadzenia kwasów nukleinowych, w szczególności RNA, do komórki. Na potrzeby niniejszego wynalazku termin „transfekcja” zawiera także wprowadzenie kwasu nukleinowego do komórki lub absorpcję kwasu nukleinowego przez taką komórkę, przy czym komórka może być obecna u badanego podmiotu, np. pacjenta. Zatem, komórka do transfekcji kwasu nukleinowego opisanej w niniejszym dokumencie może być obecna in vitro lub in vivo, np. komórka może tworzyć część organu, tkanki i/lub organizmu pacjenta. Transfekcja może być przejściowa lub stabilna. W pewnych zastosowaniach transfekcji, wystarczy jeżeli transfektowany materiał genetyczny jest tylko przejściowo wyrażony. Skoro kwas nukleinowy wprowadzony w sposobie transfekcji zwykle nie jest włączony do genomu jądrowego, obcy kwas nukleinowy będzie rozcieńczony przez mitozę lub zdegradowany. Komórki umożliwiające episomalną amplifikację kwasów nukleinowych znacząco redukują stopień rozcieńczenia. Jeżeli to pożądane, by transfektowany kwas nukleinowy właściwie pozostał w genomie komórki i jej komórkach potomnych, musi zajść stała transfekcja. RNA może być transfektowany do komórek w celu przejściowego eksprymowania kodowanego przez siebie białka. [0199] Termin „stabilność” RNA dotyczy „czasu połowicznego rozpadu” RNA. „Czas połowicznego rozpadu” dotyczy czasu, który jest potrzebny do usunięcia połowy aktywności, ilości lub liczby cząsteczek. W kontekście niniejszego wynalazku, czas połowicznego rozpadu RNA wskazuje na stabilność wspomnianego RNA. Czas połowicznego rozpadu RNA

40 może mieć wpływ na „długość czasu ekspresji” RNA. Można się spodziewać, że RNA mający długi czas połowicznego rozpadu będzie eksprymowany przez dłuższy okres. [0200] W kontekście niniejszego wynalazku termin „transkrypcja” dotyczy sposobu, przy czym kod genetyczny w sekwencji DNA jest transkrybowany do RNA. Następnie, RNA może ulegać translacji do białka. Termin „transkrypcja” zawiera „transkrypcję in vitro”, przy czym termin „transkrypcja in vitro” dotyczy sposobu, w którym RNA, w szczególności mRNA, jest syntezowany in vitro w układzie bezkomórkowym, korzystnie wykorzystującym odpowiednie wyciągi z komórek. Korzystnie, wektory klonowania są przyłożone do wytworzenia transkryptów. Te wektory do klonowania są ogólnie oznaczone jako wektory transkrypcyjne i są objęte terminem „wektor”. [0201] Termin „translacja” dotyczy sposobu w rybosomach komórki, w którym nić messegner RNA kieruje zbiór sekwencji kwasów aminowych do tworzenia peptydu lub białka. [0202] Termin „ekspresja” stosuje się w jego najbardziej ogólnym znaczeniu i zawiera wytwarzanie RNA i/lub peptydów lub białka, np. przez transkrypcję i/lub translację. W odniesieniu do RNA termin „ekspresja” lub „translacja” dotyczy w szczególności wytwarzania peptydów lub białek. Zawiera również częściową ekspresję kwasów nukleinowych. Co więcej, ekspresja może być przejściowa lub stabilna. Termin ekspresja zawiera także „nietypową ekspresję” lub „nieprawidłową ekspresję”. [0203] „Nietypowa ekspresja” lub „nieprawidłowa ekspresja” oznacza, że ekspresja jest zmieniona, korzystnie zwiększona, w stosunku do referencji, np. stan u badanego osobnika bez choroby związanej z nietypową lub nieprawidłową ekspresją pewnego białka, np. antygenu guza nowotworowego. Zwiększenie ekspresji nawiązuje do wzrostu o co najmniej 10%, w szczególności co najmniej 20%, co najmniej 50% lub co najmniej 100% lub więcej. W jednym przykładzie, ekspresja występuje tylko w tkance zaatakowanej przez chorobę, podczas gdy ekspresja w tkance zdrowej jest stłumiona. [0204] Termin „w szczególności eksprymowany” oznacza, że białko zasadniczo ulega ekspresji tylko w określonej tkance lub narządzie. Na przykład antygen nowotworowy eksprymowany w szczególności w łożysku oznacza, że to białko jest głównie eksprymowane w łożysku i nie ulega ekspresji w innych tkankach lub nie ulega ekspresji w znacznym stopniu w innych typach tkanek lub narządów. Zatem białko, które ulega ekspresji wyłącznie w komórkach łożyska i, w znacznie mniejszym stopniu, w dowolnej innej tkance, jest swoiście eksprymowane w komórkach łożyska. W niektórych przykładach wykonania, antygen guza nowotworowego może być także w szczególności eksprymowany w normalnych warunkach w więcej jak jednym typie tkanki lub organu, tak jak w 2 lub 3 typach tkanek lub organów, ale korzystnie w nie więcej jak 3 różnych typach tkanek lub organów. W tym przypadku, antygen nowotworu nowotworowego jest zatem w szczególności eksprymowany w tych organach. [0205] Termin „kodujący RNA” oznacza, że RNA, jeśli jest obecny w odpowiednim środowisku, najlepiej w komórce, może ulegać ekspresji w celu wytworzenia kodowanego białka lub peptydu. [0206] Pewne aspekty polegają na adoptywnym transferze komórek gospodarza, które są transfektowane in vitro z kwasem nukleinowym, takim jak RNA kodujący przeciwciało opisane w niniejszym dokumencie, i przeniesione do biorców, takich jak pacjenci, korzystnie po ekspansji ex vivo z niskiej częstotliwości prekursora do klinicznie istotnej liczebności. Komórki gospodarza użyte w leczeniu mogą być autologiczne, allogeniczne lub syngeniczne do leczenia biorcy. [0207] Termin „autologiczny” jest użyty do opisywania wszystkiego, co pochodzi od tego samego osobnika. Na przykład, „przeszczep autologiczny” nawiązuje do przeszczepu tkanki lub organów pochodzących od tego samego osobnika. Takie procedury są korzystne, ponieważ pokonują immunologiczne bariery, które w przeciwnym razie skutkują odrzuceniem.

41 [0208] Termin „allogeniczny” jest użyty do opisywania wszystkiego, co pochodzi od różnych osobników tego samego gatunku. O dwóch lub więcej osobnikach mówi się, że są allogeniczni ze sobą, kiedy geny w jednym albo wielu loci nie są identyczne. [0209] Termin „syngeniczny” jest używany do opisywania wszystkiego, co pochodzi od osobników lub tkanek mających identyczne genotypy, tj. bliźnięta jednojajowe lub zwierzęta tej samej linii wsobnej lub ich tkanki. [0210] Termin „heterologiczny” jest zastosowany do opisania czegoś składającego się z wielu różnych elementów. Na przykład, przeniesienie szpiku kostnego od jednego osobnika do drugiego osobnika stanowi przeszczep heterologiczny. Gen heterologiczny jest genem pochodzącym ze źródła innego niż osobnik. [0129] Termin „peptyd” zawiera oligo-i polipeptydy i nawiązuje do substancji zawierających dwa lub więcej, korzystnie 3 lub więcej, korzystnie 4 lub więcej, korzystnie 6 lub więcej, korzystnie 8 lub więcej, korzystnie 9 lub więcej, korzystnie 10 lub więcej, korzystnie 13 lub więcej, korzystnie 16 lub więcej, korzystnie 21 lub więcej i nie więcej jak korzystnie 8, 10, 20, 30, 40 lub 50, w szczególności 100 kwasów aminowych złączonych kowalentnie przez wiązania peptydowe. Termin „białko” nawiązuje do dużych peptydów, korzystnie peptydów z więcej jak 100 resztami kwasów aminowych, ale na ogół terminy „peptydy” i „białka” są synonimami i są użyte zamiennie w niniejszym dokumencie. [0212] Wiedza przekazana w niniejszym dokumencie odnośnie do swoistych sekwencji aminokwasowych, np. tych pokazanych w wykazie sekwencji, ma być rozumiana tak, żeby także dotyczyła wariantów wspomnianych swoistych sekwencji skutkujących sekwencjami, które są funkcjonalnie ekwiwalentne ze wspomnianymi swoistymi sekwencjami, np. sekwencjami aminokwasowymi wykazujących właściwości identyczne lub podobne do tych ze swoistych sekwencji aminokwasowych. Jedną ważną właściwością jest zachowanie wiązania przeciwciała z jego celem lub utrzymanie funkcji efektorowych przeciwciała. Korzystnie sekwencja, która jest wariantem w stosunku do konkretnej sekwencji, gdy zastępuje swoistą sekwencję w przeciwciele, zachowuje wiązanie tego przeciwciała z CLDN6 i korzystnie funkcje tego przeciwciała, jak tu opisano, np.liza za pośrednictwem CDC lub liza za pośrednictwem ADCC. [0213] Na przykład, sekwencje przedstawione w wykazie sekwencji mogą być modyfikowane w celu usunięcia jednej albo wielu, korzystnie wszystkich wolnych reszt cysteinowych, w szczególności przez zastąpienie reszt cysteinowych przez kwasy aminowe inne niż cysteina, korzystnie seryna, alanina, treonina, glicyna, tyrozyna, leucyna lub metionina, najkorzystniej alanina lub seryna. [0214] Specjaliści w tej dziedzinie docenią, że w szczególności sekwencje CDR, regionów hiperzmiennych i zmiennych można modyfikować bez utraty zdolności wiązania CLDN6. [0215] Na przykład, regiony CDR będą albo identycznie albo wysoce homologiczne z regionami przeciwciał wyszczególnionymi w niniejszym dokumencie. Uznaje się, że termin „wysoce homologiczne” oznacza, że w CDR mogą być zrobione od 1 do 5, korzystnie od 1 do 4, tak jak 1 do 3 lub 1 do 2 podstawienia. Dodatkowo, regiony hiperzmienne i zmienne mogą być zmodyfikowane tak, żeby pokazywały zasadniczą homologię z regionami przeciwciał w szczególności ujawnionymi w niniejszym dokumencie. [0216] Na potrzeby niniejszego ujawnienia „warianty” sekwencji aminokwasowych zawierają warianty z wprowadzonymi kwasami aminowymi, warianty z dodanymi kwasami aminowymi, warianty z usuniętymi kwasami aminowymi i/lub warianty z podstawionymi kwasami aminowymi. Warianty z usuniętymi kwasami aminowymi, które zawierają usunięcie końca N-terminalowego i/lub C-terminalowego z białka są także nazwane wariantami z obciętym N-terminalem i/lub C-terminalem. [0217] Warianty z wprowadzonymi kwasami aminowymi zawierają wprowadzenia pojedynczego lub dwóch lub więcej kwasów aminowych w danej sekwencji aminokwasowej. W przypadku wariantów sekwencji aminokwasowych mających wprowadzenia, jedna albo wiele reszt kwasów aminowych jest wprowadzona w dane miejsce w sekwencji

42 aminokwasowej, chociaż możliwe jest także losowe wprowadzenie z odpowiednim przesiewem produktu końcowego. [0218] Warianty z dodanymi kwasami aminowymi zawierają fuzje amino-terminala i/lub karboksy-terminala z jednego albo wielu kwasów aminowych, tak jak 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 lub więcej kwasów aminowych. [0219] Warianty z usuniętymi kwasami aminowymi charakteryzują się usunięciem jednego albo wielu kwasów z sekwencji, tak jak usunięciem 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 lub więcej kwasów aminowych. Usunięcia mogą być na każdym miejscu występowania w białku. [0220] Warianty z podstawionymi kwasami aminowymi charakteryzują się co najmniej jedną usuniętą resztą w sekwencji i inną resztą wprowadzoną na jej miejsce. Preferowane są modyfikacje na miejscach występowania w sekwencji aminokwasowej, które nie są zachowane między białkami homologicznymi lub peptydami i/lub zastąpienia kwasów aminowych innymi mającymi podobne właściwości. Korzystnie, zmiany kwasów aminowych w wariantach białek są zmianami zachowawczymi, tj. podstawieniami podobnie naładowanych lub nienaładowanych kwasów aminowych. Zachowawcza zmiana kwasów aminowych obejmuje podstawienie jednej z rodzin kwasów aminowych, które są powiązane w ich bocznych łańcuchach. Naturalnie występujące kwasy aminowe są na ogół podzielone na cztery rodziny: kwasowe (asparaginian, glutaminian), podstawowe (lizyna, arginina, histydyna), niepolarne (alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan) i nienaładowane polarne (glicyna, asparagina, glutamina, cysteina, seryna, treonina, tyrozyna) kwasy aminowe. Fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna są czasem klasyfikowane łącznie jako aromatyczne kwasy aminowe. [0221] Korzystnie stopień podobieństwa, korzystnie identyczność danej sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową, która jest wariantem wspomnianej danej sekwencji aminokwasowej będzie wynosiła co najmniej około 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99%. Stopień podobieństwa lub identyczność jest nadawana korzystnie dla regionu kwasów aminowych, który ma długość stanowiącą co najmniej około 10%, co najmniej około 20%, co najmniej około 30%, co najmniej około 40%, co najmniej około 50%, co najmniej około 60%, co najmniej około 70%, co najmniej około 80%, co najmniej około 90% lub około 100% całej długości referencyjnej sekwencji aminokwasowej. Na przykład, jeżeli referencyjna sekwencja aminokwasowa składa się z 200 kwasów aminowych, stopień podobieństwa lub identyczność jest nadawana korzystnie dla co najmniej około 20, co najmniej około 40, co najmniej około 60, co najmniej około 80, co najmniej około 100, co najmniej około 120, co najmniej około 140, co najmniej około 160, co najmniej około 180 lub około 200 kwasów aminowych, korzystnie ciągłych kwasów aminowych. W korzystnych przykładach wykonania stopień podobieństwa lub identyczność jest nadana dla całej długości referencyjnej sekwencji aminokwasowej. Dopasowanie pomagające określić podobieństwo sekwencji, korzystnie identyczność sekwencji, może być zrealizowane za pomocą narzędzi znanych w dziedzinie techniki, korzystnie za pomocą najlepszego dopasowania sekwencji, na przykład używając Align, używając standardowych ustawień, korzystnie EMBOSS:: needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5. [0222] „Podobieństwo sekwencji” wskazuje na odsetek kwasów aminowych, które albo są identyczne, albo reprezentują zachowawcze podstawienia kwasów aminowych. „Identyczność sekwencji” w odniesieniu do dwóch sekwencji aminokwasowych wskazuje na odsetek kwasów aminowych, które są identyczne w dwóch sekwencjach. [0223] Termin „odsetek identyczności” jest użyty w znaczeniu wskazującym na odsetek reszt kwasów aminowych, które są identyczne w dwóch sekwencjach do porównania, uzyskanych po najlepszym dopasowaniu, przy czym ten odsetek jest wskaźnikiem czysto statystycznym i różnice między dwoma sekwencjami są losowe i na ich całej długości. Porównania sekwencji uwzględniające dwie sekwencje aminokwasowe są tradycyjnie przeprowadzane przez porównywanie tych sekwencji po ich optymalnym dopasowaniu, przy

43 czym wspomniane porównanie jest przeprowadzone według segmentów lub według „okna porównania” w celu zidentyfikowania i porównania lokalnych regionów podobieństwa sekwencji. Optymalne dopasowanie sekwencji do porównania może być także przeprowadzone, oprócz technik manualnych, za pomocą lokalnego algorytmu homologii Smitha-Watermana, 1981, Ads App. Math. 2, 482, za pomocą lokalnego algorytmu homologii Neddlemana-Wunscha, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, za pomocą sposobu Pearsona-Lipmana na szukanie podobieństw, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444 lub za pomocą programów komputerowych wykorzystujących te algorytmy (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA w pakiecie oprogramowania Wisconsin Genetics Software, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.). [0224] Odsetek identyczności jest obliczany przez określenie liczby identycznych miejsc występowania w dwóch porównywanych sekwencjach, dzieląc tę liczbę przez liczbę porównywanych miejsc występowania i mnożąc otrzymany wynik przez 100 w celu uzyskania odsetka identyczności tych dwóch sekwencji. [0225] Termin „komórka” lub „komórka gospodarza” korzystnie dotyczy nienaruszonej komórki, tj. komórki z nienaruszoną błoną, która nie uwolniła swoich normalnych wewnątrzkomórkowych elementów, takich jak enzymy, organelle lub materiał genetyczny. Nienaruszona komórka korzystnie jest komórką zdolną do życia, tj. żywą komórką zdolną do wykonywania swoich normalnych funkcji metabolicznych. Korzystnie, wspomniany termin odnosi się, zgodnie z wynalazkiem, do dowolnej komórki, która może być transfektowana egzogennym kwasem nukleinowym. Korzystnie, komórka po transfektacji egzogennym kwasem nukleinowym i przeniesieniu do biorcy może wyrażać kwas nukleinowy u biorcy. Termin „komórka” zawiera komórki bakteryjne; innymi przydatnymi komórkami są komórki drożdży, komórki grzybów lub komórki ssaków. Stosowne komórki bakteryjne zawierają komórki z gram-ujemnych szczepów bakteryjnych, takich jak szczepy Escherichia coli, Proteus i Pseudomonas oraz gram-dodatnich szczepów baterii, takie jak szczepy Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus i Lactococcus. Stosowne komórki grzybów zawierają komórki z gatunków Trichoderma, Neurospora i Aspergillus. Stosowne komórki drożdży zawierają komórki z gatunków Saccharomyces (na przykład Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (na przykład Schizo saccharomyces pombe), Pichia (na przykład Pichia pastoris i Pichia methanolicd) i Hansenula. Stosowne komórki ssaków zawierają na przykład komórki CHO, komórki BHK, komórki HeLa, komórki COS, 293 HEK i podobne. Jednakże zastosowane mogą być również komórki płazów, komórki insektów, komórki roślinne i inne komórki używane w dziedzinie techniki do eksprymowania heterologicznych białek. Komórki ssaków są szczególnie korzystne dla adoptywnego transferu, takie jak komórki od ludzi, myszy, chomików, świń, kóz i naczelnych. Komórki mogą pochodzić z dużej liczby typów tkanek i zawierać główne komórki i linie komórkowe, takie jak komórki układu odpornościowego, w szczególności komórki prezentujące antygen, takie jak komórki dendrytyczne i komórki T, komórki macierzyste, takie jak komórki krwiotwórcze i mezenchymalne komórki macierzyste oraz inne typy komórek. Komórka prezentująca antygen jest komórką, która prezentuje antygen na tle głównego układu zgodności tkankowej na swojej powierzchni. Komórki T mogą rozpoznawać ten układ wykorzystując swój receptor komórek T (TCR). [0226] Termin „zwierzę transgeniczne” odnosi się do zwierzęcia mającego genom zawierający jeden lub więcej transgenów, korzystnie transgenów łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego, lub transchromosomów (zintegrowanych lub niezintegrowanych z naturalnym genomowym DNA zwierzęcia) i który najlepiej jest zdolny do eksprymowania transgenów. Na przykład transgeniczna mysz może mieć ludzki transgen łańcucha lekkiego i ludzki transgen łańcucha ciężkiego lub transchromosom ludzkiego łańcucha ciężkiego, tak że mysz wytwarza ludzkie przeciwciała anty-CLDN6 po immunizacji antygenem CLDN6 i/lub komórkami eksprymującymi CLDN6. Transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego można zintegrować z chromosomalnym DNA myszy, jak ma to miejsce w przypadku myszy

44 transgenicznych, np. myszy HuMAb, takich jak myszy HCo7 lub HCol2, lub transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego można utrzymać pozachromosomalnie, podobnie jak przypadek myszy transchromosomalnych (np. KM), jak opisano w WO 02/43478. Takie transgeniczne i transchromosomalne myszy mogą być zdolne do wytwarzania wielu izotypów ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko CLDN6 (np. IgG, IgA i/lub IgE) poprzez poddanie rekombinacji V-D-J i zamianie izotypów. [0227] „Redukować” ,"zmniejszenie” lub „hamowanie” w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie oznacza ogólny spadek lub zdolność do spowodowania ogólnego spadku, korzystnie o 5% lub więcej, 10% lub więcej, 20% lub więcej, korzystniej o 50% lub więcej , a najkorzystniej 75% lub więcej, na poziomie, np. na poziomie ekspresji lub na poziomie proliferacji komórek. [0228] Terminy, takie jak „wzrosnąć” lub „wzmocnić” korzystnie dotyczą wzrostu lub wzmocnienia o około co najmniej 10%, korzystnie co najmniej 20%, korzystnie co najmniej 30%, korzystniej co najmniej 40%, korzystniej co najmniej 50%, jeszcze korzystniej co najmniej 80% i najkorzystniej co najmniej 100%, co najmniej 200%, co najmniej 500%, co najmniej 1 000%, co najmniej 10 000% lub nawet więcej. [0229] Chociaż poniżej przedstawiono rozważania dotyczące mechanizmu leżącego u podstaw skuteczności terapeutycznej przeciwciał, nie należy go uważać za ograniczające wynalazek w jakikolwiek sposób. [0230] Opisane tu przeciwciała najlepiej oddziałują ze składnikami układu odpornościowego, najlepiej poprzez ADCC lub CDC. Opisane tu przeciwciała można również stosować do celowania w ładunki (np. radioizotopy, leki lub toksyny) w celu bezpośredniego zabijania komórek nowotworowych lub można je stosować synergistycznie z tradycyjnymi środkami chemioterapeutycznymi, atakując nowotwory poprzez uzupełniające się mechanizmy działania, które mogą obejmować przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne, które mogą być zagrożone z powodu cytotoksycznych skutków ubocznych chemioterapeutyka na limfocyty T. Jednak opisane tu przeciwciała mogą również wywierać efekt po prostu przez wiązanie do CLDN6 na powierzchni komórki, a więc np. blokując proliferację komórek.

Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał

[0231] ADCC opisuje zdolność zabijania komórek efektorowych, jak tu opisano, w szczególności limfocytów, co korzystnie wymaga, by komórka docelowa była znakowana przeciwciałem. [0232] ADCC korzystnie występuje, gdy przeciwciała wiążą się z antygenami na komórkach nowotworowych, a domeny Fc przeciwciała sprzęgają receptory Fc (FcR) na powierzchni komórek efektorowych układu odpornościowego. Zidentyfikowano kilka rodzin receptorów Fc, a określone populacje komórek charakterystycznie eksprymują określone receptory Fc. ADCC można postrzegać jako mechanizm bezpośredniego indukowania zmiennego stopnia natychmiastowego zniszczenia nowotworu, który prowadzi do prezentacji antygenu i indukcji ukierunkowanych na nowotwór odpowiedzi komórek T. Korzystnie indukcja ADCC in vivo prowadzi do ukierunkowanych na nowotwór odpowiedzi komórek T i odpowiedzi przeciwciał pochodzących od gospodarza.

Cytotoksyczność zależna od dopełniacza

[0233] CDC to kolejny sposób zabijania komórek, którą mogą kierować przeciwciała. IgM jest najskuteczniejszym izotypem do aktywacji dopełniacza. IgG1 i IgG3 są również bardzo skuteczne w kierowaniu CDC poprzez klasyczny szlak aktywacji dopełniacza. Korzystnie, w tej kaskadzie, tworzenie kompleksów antygen-przeciwciało powoduje odblokowywanie wielu miejsc wiązania Clq w bliskiej odległości od domen CH2 uczestniczących cząsteczek

45 przeciwciał, takich jak cząsteczki IgG (Clq jest jednym z trzech podskładników dopełniacza C1). Korzystnie te nie odblokowane miejsca wiązania C1q przekształcają uprzednio oddziaływanie C1q-IgG o niskim powinowactwie w jedno o wysokiej awidności, co wyzwala kaskadę zdarzeń obejmującą szereg innych białek dopełniacza i prowadzi do proteolitycznego uwalniania środków efaktycznych/aktywujących komórki efektorowe C3a i C5a. Korzystnie kaskada dopełniacza kończy się utworzeniem kompleksu ataku błonowego, który tworzy pory w błonie komórkowej, które ułatwiają swobodny przepływ wody i substancji rozpuszczonych do i z komórki. [0234] Opisane tu przeciwciała mogą być produkowane różnymi technikami, włączając konwencjonalną metodologię przeciwciał monoklonalnych, np. standardową technikę hybrydyzacji komórek somatycznych Kohlera i Milsteina, Nature 256: 495 (1975). Chociaż procedury hybrydyzacji komórek somatycznych są korzystne, z reguły inne techniki produkcji przeciwciał monoklonalnych mogą być zastosowane, np. wirusowa lub onkogeniczna transformacja limfocytów B lub techniki przedstawiania fagów wykorzystujące biblioteki genów przeciwciał. [0235] Korzystnym układem zwierzęcym do przygotowania komórek hybrydoma, które wydziela monoklonalne przeciwciała jest układ mysi. Produkcja komórek hybrydoma u mysz jest bardzo dobrze rozwiniętą procedurą. W dziedzinie techniki znane są protokoły immunizacyjne i techniki izolacji uodpornionych splenocytów do fuzji. Znani są także partnerzy fuzyjni (np. mysie komórki szpiczaka) i procedury fuzji. [0236] Inne korzystne układy zwierzęce do przygotowania komórek hybrydoma, które wydzielają monoklonalne przeciwciała to układ szczurzy i króliczy (np. opisany w Spieker- Polet i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), patrz także Rossi i inni, Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)). [0237] W jeszcze innym korzystnym przykładzie ludzkie przeciwciała monoklonalne można wytwarzać za pomocą myszy transgenicznych lub transchromosomalnych niosących części ludzkiego układu odpornościowego, a nie mysiego. Te transgeniczne i transchromosomowe myszy obejmują myszy znane odpowiednio jako myszy HuMAb i myszy KM, i są tutaj łącznie określane jako „myszy transgeniczne”. Wytwarzanie ludzkich przeciwciał w takich transgenicznych myszach można przeprowadzić jak opisano szczegółowo dla CD20 w WO2004 035607 [0238] Jeszcze inną strategią generowania przeciwciał monoklonalnych jest bezpośrednia izolacja genów kodujących przeciwciała z limfocytów wytwarzających przeciwciała o określonej swoistości, np. patrz Babcock i in., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. W celu uzyskania szczegółowych informacji na temat inżynierii rekombinowanych przeciwciał, patrz również Welschof i Kraus, Rekombinowane przeciwciała dla terapii przeciwnowotworowej ISBN-0-89603-918-8 i Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1. [0239] W celu wytworzenia przeciwciał myszy mogą być uodpornione peptydami sprzęgniętymi z nośnikiem pochodzącymi z sekwencji antygenów, tj. sekwencji, względem której mają być ukierunkowane przeciwciała, wzbogacony preparat rekombinacyjnie wyrażonego antygenu lub jego fragmentu i/lub komórkami eksprymującymi antygen, jak opisano. Alternatywnie, myszy mogą być uodpornione DNA kodującym antygen lub jego fragmentami. W przypadku, gdy immunizacje z wykorzystaniem oczyszczonego lub wzbogaconego preparatu antygenu nie dają przeciwciał, myszy mogą być także uodporniane komórkami eksprymującymi antygen, np. liniami komórek, dla wsparcia reakcji immunologicznych. [0240] Reakcje immunologiczne mogą być monitorowane w trakcie przebiegu protokołu immunizacyjnego, gdzie próbki osocza i surowicy są uzyskane z nakłuć w żyłę w ogonie lub oczodół. Do fuzji użyte mogą być myszy z wystarczającymi mianami immunoglobulin. Myszy mogą być wzmocnione dootrzewnie lub dożylnie komórkami eksprymującymi

46 antygen 3 dni przed ofiarą i usunięciem śledziony w celu zwiększenia stopnia wydzielania swoistych przeciwciał przez komórki hybrydoma. [0241] W celu wytworzenia komórek hybrydoma produkujących przeciwciała monoklonalne, splenocyty i komórki z węzłów chłonnych od uodpornionych mysz mogą być wyodrębnione i połączone z właściwą unieśmiertelnioną linią komórek, taką jak linia komórek mysiego szpiczaka. Powstałe komórki hybrydoma mogą potem być poddane przesiewowi pod kątem produkcji przeciwciał antygenowych. Indywidualne studzienki mogą potem być poddane przesiewowi za pomocą testu ELISA pod kątem komórek hybrydoma wydzielających przeciwciała. Dzięki immunofluorescencji i analizie FACS wykorzystującej komórki eksprymujące antygen zidentyfikowane mogą być przeciwciała ze swoistością dla danego antygenu. Komórki hybrydoma wydzielające przeciwciała mogą być poddane procesowi ponownego pokrycia, przesiewu i, jeżeli wciąż są pozytywne w stosunku do przeciwciał monoklonalnych, mogą być subklonowane przez limitowane rozcieńczenie. Stabilne subklony mogą potem być hodowane in vitro w celu wytworzenia przeciwciała w tkance pożywki hodowlanej do charakteryzacji. [0242] Przeciwciała można również wytwarzać w transfektomie komórki gospodarza, stosując na przykład kombinację technik rekombinacji DNA i sposobów transfekcji genów, które są dobrze znane w dziedzinie (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202). [0243] Na przykład, gen (geny) zainteresowania, np. geny przeciwciała, można ligować z wektorem ekspresyjnym, takim jak eukariotyczny plazmid ekspresyjny, taki jak stosowany w systemie ekspresji genu GS ujawnionym w WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338 841 lub inne układy ekspresyjne dobrze znane w dziedzinie. Oczyszczony plazmid ze sklonowanymi genami przeciwciał można wprowadzić do eukariotycznych komórek gospodarza, takich jak komórki CHO, komórki NS/0, komórki HEK293T lub komórki HEK293 lub alternatywnie inne komórki eukariotyczne, takie jak komórki pochodzące z roślin, komórki grzybowe lub drożdżowe. Sposobem zastosowanym do wprowadzenia tych genów mogą być sposoby opisane w dziedzinie, takie jak elektroporacja, lipofektyna, lipofektamina lub inne. Po wprowadzeniu tych genów przeciwciał do komórek gospodarza, komórki eksprymujące przeciwciało można zidentyfikować i wybrać. Komórki te reprezentują transfektomy, które można następnie amplifikować pod kątem poziomu ekspresji i zwiększać w celu uzyskania przeciwciał. Rekombinowane przeciwciała można izolować i oczyszczać z tych supernatantów hodowli i/lub komórek. [0244] Alternatywnie, sklonowane geny przeciwciał można wyrażać w innych systemach ekspresyjnych, w tym w komórkach prokariotycznych, takich jak mikroorganizmy, np. E coli. Ponadto przeciwciała można wytwarzać u transgenicznych zwierząt innych niż ludzie, na przykład w mleku od owiec i królików lub w jajach od kur lub w roślinach transgenicznych; patrz np. Verma, R., i in. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, i in. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; i Fischer, R., i in. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.

Chimeryzacja

[0245] Przeciwciała mysie są wysoce immunogenne u ludzi, gdy są powtarzane, co prowadzi do zmniejszenia efektu terapeutycznego. W głównej immunogenności pośredniczą regiony stałe łańcucha ciężkiego. Immunogenność mysich przeciwciał u ludzi można zmniejszyć lub całkowicie uniknąć, jeśli odpowiednie przeciwciała są chimeryzowane lub humanizowane. Przeciwciała chimeryczne są przeciwciałami, których różne części pochodzą od różnych gatunków zwierząt, takich jak te mające region zmienny pochodzący od mysiego przeciwciała i region stały ludzkiej immunoglobuliny. Chimeryzację przeciwciał osiąga się poprzez połączenie regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego mysiego przeciwciała z regionem stałym ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego (np. jak opisano w Kraus i in., w Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). W korzystnym przykładzie przeciwciała chimeryczne są generowane przez połączenie

47 ludzkiego regionu stałego łańcucha lekkiego kappa z mysim regionem zmiennym łańcucha lekkiego. W również korzystnym przykładzie wykonania chimeryczne przeciwciała można wytwarzać przez połączenie ludzkiego regionu stałego łańcucha lekkiego lambda z mysim regionem zmiennym łańcucha lekkiego. Korzystnymi regionami stałymi łańcucha ciężkiego do wytwarzania przeciwciał chimerycznych są IgG1, IgG3 i IgG4. Innymi korzystnymi regionami stałymi łańcucha ciężkiego do wytwarzania chimerycznych przeciwciał są IgG2, IgA, IgD i IgM.

Humanizacja

[0246] Przeciwciała oddziałują z docelowymi antygenami głównie poprzez reszty aminokwasowe znajdujące się w sześciu regionach determinujących komplementarność łańcucha ciężkiego i lekkiego (CDR). Z tego powodu sekwencje aminokwasowe w obrębie CDR są bardziej zróżnicowane między poszczególnymi przeciwciałami niż sekwencje poza CDR. Ponieważ sekwencje CDR są odpowiedzialne za większość interakcji przeciwciało- antygen, możliwe jest eksprymowanie rekombinowanych przeciwciał, które naśladują właściwości swoistych naturalnie występujących przeciwciał poprzez konstruowanie wektorów ekspresyjnych, które obejmują sekwencje CDR ze swoistego naturalnie występującego przeciwciała przeszczepionego na sekwencje zrębowe z innego przeciwciała o różnych właściwościach (patrz np. Riechmann, L. i in. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. i in. (1986) Nature 321: 522-525; i Queen, C. i in. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Takie sekwencje zrębowe można uzyskać z publicznych baz danych DNA, które zawierają sekwencje genów przeciwciał linii germinalnej. Te sekwencje linii germinalnej będą się różnić od sekwencji genów dojrzałych przeciwciał, ponieważ nie będą zawierać całkowicie złożonych genów zmiennych, które powstają w wyniku połączenia V (D) J podczas dojrzewania komórek B. Sekwencje genów linii germinalnej będą również różnić się od sekwencji drugiego repertuaru przeciwciała o wysokim powinowactwie u poszczególnych równomiernie w całym regionie zmiennym. [0247] Zdolność przeciwciał do wiązania antygenu można określić przy użyciu standardowych testów wiązania (np. ELISA, Western Blot, immunofluorescencji i analizy cytometrii przepływowej). [0248] W celu oczyszczenia przeciwciał wybrane hybrydomy można hodować w dwulitrowych kolbach z mieszadłem w celu oczyszczenia przeciwciał monoklonalnych. Alternatywnie, przeciwciała można wytwarzać w bioreaktorach opartych na dializie. Supernatanty można filtrować i, w razie potrzeby, zatężyć przed chromatografią powinowactwa z białkiem G-sefarozą lub białkiem A-sefarozą. Eluowane IgG można sprawdzić za pomocą elektroforezy żelowej i wysokosprawnej chromatografii cieczowej w celu zapewnienia czystości. Roztwór buforowy można wymienić na PBS, a stężenie można określić za pomocą OD280, stosując współczynnik ekstynkcji 1,43. Przeciwciała monoklonalne można podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -80°C. [0249] W celu ustalenia, czy wybrane przeciwciała monoklonalne wiążą się z unikalnymi epitopami, można zastosować mutagenezę ukierunkowaną na miejsce lub ukierunkowaną na wiele miejsc. [0250] W celu określenia izotypu przeciwciał, można wykonać izotypowe testy ELISA z różnymi komercyjnymi zestawami (np. Zymed, Roche Diagnostics). Studzienki płytek do mikromianowania mogą być pokryte anty-mysią Ig. Po zablokowaniu płytki poddaje się reakcji z przeciwciałami monoklonalnymi lub oczyszczonymi kontrolami izotypowymi w temperaturze otoczenia przez dwie godziny. Studzienki można następnie poddać reakcji z mysimi IgG1, IgG2a, IgG2b lub IgG3, IgA lub mysimi sondami skoniugowanymi z peroksydazą. Po umyciu płytki można wywoływać substratem ABTS (1 mg/ml) i analizować przy OD 405–650. Alternatywnie można zastosować zestaw do izotypowania przeciwciał monoklonalnych myszy IsoStrip (Roche, nr kat. 1493027) zgodnie z opisem producenta.

48 [0251] W celu wykazania obecności przeciwciał w surowicach immunizowanych myszy lub wiązania przeciwciał monoklonalnych z żywymi komórkami eksprymującymi antygen, można zastosować cytometrię przepływową. Linie komórkowe eksprymujące naturalnie lub po transfekcji antygen i kontrole negatywne pozbawione ekspresji antygenu (hodowane w standardowych warunkach wzrostu) można mieszać z różnymi stężeniami przeciwciał monoklonalnych w supernatantach hybrydomy lub w PBS zawierającym 1% FBS i można inkubować w 4°C przez 30 minut. Po przemyciu przeciwciało anty IgG znakowane APC lub Alexa647 może wiązać się z przeciwciałem monoklonalnym związanym z antygenem w takich samych warunkach, jak barwienie pierwszorzędowym przeciwciałem. Próbki można analizować za pomocą cytometrii przepływowej za pomocą przyrządu FACS, stosując właściwości światła i rozproszenia bocznego do bramkowania pojedynczych żywych komórek. W celu odróżnienia przeciwciał monoklonalnych swoistych wobec antygenu od nieswoistych środków wiążących w jednym pomiarze można zastosować sposób kotransfekcji. Komórki przejściowo transfekowane plazmidami kodującymi antygen i marker fluorescencyjny można zabarwić jak opisano powyżej. Transfekowane komórki można wykryć w innym kanale fluorescencyjnym niż komórki zabarwione przeciwciałem. Ponieważ większość transfekowanych komórek eksprymuje oba transgeny, przeciwciała monoklonalne swoiste wobec antygenu wiążą się preferencyjnie z komórkami eksprymującymi marker fluorescencyjny, podczas gdy przeciwciała nieswoiste wiążą się w porównywalnym stosunku do komórek nietransfekowanych. Oprócz lub zamiast testu cytometrii przepływowej można zastosować alternatywny test z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki mogą być barwione dokładnie tak, jak opisano powyżej i badane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. [0252] W celu wykazania obecności przeciwciał w surowicach immunizowanych myszy lub wiązania przeciwciał monoklonalnych z żywymi komórkami eksprymującymi antygen, można zastosować analizę mikroskopową immunofluorescencyjną. Na przykład linie komórkowe eksprymujące spontanicznie lub po transfekcji antygen i kontrole negatywne pozbawione ekspresji antygenu hoduje się na szkiełkach komorowych w standardowych warunkach wzrostu w pożywce DMEM/F12, uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 2 mM L-glutaminą, 100 IU/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Komórki można następnie utrwalić metanolem lub paraformaldehydem lub pozostawić jako nietraktowane. Komórki można następnie poddać reakcji z przeciwciałami monoklonalnymi przeciw antygenowi przez 30 min. w 25°C. Po przemyciu komórki można poddać reakcji z drugorzędowym przeciwciałem przeciw mysim IgG znakowanym Alexa555 (sondy molekularne) w tych samych warunkach. Komórki można następnie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. [0253] Ekstrakty komórkowe z komórek eksprymujących antygen i odpowiednie kontrole ujemne można przygotować i poddać elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS). Po elektroforezie oddzielone antygeny zostaną przeniesione na błony nitrocelulozowe, zablokowane i sondowane testowanymi przeciwciałami monoklonalnymi. Wiązanie IgG można wykryć za pomocą antymysiej peroksydazy IgG i wywołać z substratem ECL. [0254] Przeciwciała można dalej badać pod kątem reaktywności z antygenem sposobem immunohistochemiczną w sposób dobrze znany specjaliście, np. z zastosowaniem utrwalonych kriosekcji paraformaldehydu lub acetonu lub skrawków zatopionych w parafinie utrwalonych paraformaldehydem z tkanek nienowotworowych lub próbek tkanek nowotworowych uzyskanych od pacjentów podczas rutynowych zabiegów chirurgicznych lub od myszy niosących ksenotransplantowane nowotwory zaszczepione liniami komórkowymi eksprymującymi się spontanicznie lub po transfekcji antygenem. W celu barwienia immunologicznego przeciwciała reaktywne na antygen można inkubować, a następnie skoniugowane z kozim przeciwciałem przeciwko mysim lub kozim przeciwciałem przeciw kozim sprzężonym z peroksydazą chrzanową (DAKO) zgodnie z instrukcjami producenta.

49 [0255] Przeciwciała można badać pod kątem ich zdolności do pośredniczenia w fagocytozie i zabijaniu komórek eksprymujących CLDN6. Testowanie aktywności przeciwciał monoklonalnych in vitro zapewni wstępne badanie przesiewowe przed testowaniem modeli in vivo.

Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC)

[0256] W skrócie, komórki polimorfojądrowe (PMN), komórki NK, monocyty, komórki jednojądrzaste lub inne komórki efektorowe od zdrowych dawców można oczyścić przez wirowanie w gęstości Ficoll Hypaque, a następnie lizę zanieczyszczających erytrocytów. Umyte komórki efektorowe można zawiesić w RPMI uzupełnionej 10% inaktywowaną ciepłem płodową surowicą cielęcą lub, alternatywnie, 5% inaktywowanej termicznie ludzkiej surowicy i zmieszać z komórkami docelowymi znakowanymi 51Cr eksprymującymi CLDN6, w różnych stosunkach komórek efektorowych do komórek docelowych. Alternatywnie, komórki docelowe mogą być znakowane ligandem wzmacniającym fluorescencję (BATDA). Wysoko fluorescencyjny chelat Europu z ligandem wzmacniającym, który jest uwalniany z martwych komórek, można zmierzyć za pomocą fluorometru. Inna alternatywna technika może wykorzystywać transfekcję komórek docelowych lucyferazą. Dodana żółta lucyferaza może być następnie utleniona tylko przez żywe komórki. Oczyszczone IgG anty-CLDN6 można następnie dodawać w różnych stężeniach. Nieistotna ludzka IgG może być stosowana jako kontrola negatywna. Testy można przeprowadzać przez 4 do 20 godzin w 37°C, w zależności od zastosowanego typu komórki efektorowej. Próbki można badać pod kątem cytolizy przez pomiar uwalniania 51Cr lub obecności chelatu EuTDA w supernatancie hodowli. Alternatywnie, luminescencja wynikająca z utleniania żółtej lucyferazy może być miarą żywotnych komórek. [0257] Przeciwciała monoklonalne anty-CLDN6 można również badać w różnych kombinacjach w celu ustalenia, czy cytoliza jest wzmocniona wieloma przeciwciałami monoklonalnymi.

Cytotoksyczność zależna od dopełniacza (CDC)

[0258] Przeciwciała monoklonalne anty-CLDN6 można badać pod kątem ich zdolności do pośredniczenia w CDC przy użyciu różnych znanych technik. Na przykład surowicę dopełniacza można uzyskać z krwi w sposób znany specjaliście. W celu określenia aktywności CDC mAb, można zastosować różne sposoby. Uwolnienie 51Cr można na przykład zmierzyć lub można ocenić podwyższoną przepuszczalność błony za pomocą testu wykluczenia z jodku propidyny (PI). W skrócie, komórki docelowe można myć i 5 x 105/ml można inkubować z różnymi stężeniami mAb przez 10-30 min. w temperaturze pokojowej lub w 37°C. Następnie można dodać surowicę lub osocze do końcowego stężenia 20% (obj./obj.) I komórki inkubować w 37°C przez 20-30 minut. Wszystkie komórki z każdej próbki można dodać do roztworu PI w probówce FACS. Mieszaninę można następnie natychmiast analizować za pomocą analizy cytometrii przepływowej przy użyciu FACSArray. [0259] W alternatywnym teście indukcję CDC można określić na przylegających komórkach. W jednym przykładzie wykonania tego testu, komórki wysiewa się 24 godziny przed testem o gęstości 3 x 104/studzienkę w płaskodennych płytkach do mikromianowania do hodowli tkankowych. Pożywkę wzrostową następnego dnia usuwa się, a komórki inkubuje się w trzech powtórzeniach z przeciwciałami. Komórki kontrolne inkubuje się z pożywką wzrostową lub pożywką wzrostową zawierającą 0,2% saponiny w celu określenia odpowiednio lizy tła i lizy maksymalnej. Po inkubacji przez 20 min. w temperaturze pokojowej supernatant usuwa się i do komórek dodaje się 20% (obj./obj.) ludzkiego osocza lub surowicy w DMEM (wstępnie ogrzanym do 37°C) i inkubuje przez kolejne 20 min. w

50 37°C. Wszystkie komórki z każdej próbki dodaje się do roztworu jodku propidyny (10 µg/ml). Następnie supernatanty zastępuje się PBS zawierającym 2,5 µg/ml bromku etydyny i mierzy się emisję fluorescencji przy wzbudzeniu przy 520 nm przy 600 nm przy użyciu Tecan Safire. Procent swoistej lizy oblicza się w następujący sposób: % swoistej lizy = (fluorescencja próbki - fluorescencja tła)/(fluorescencyjna maksymalna liza - fluorescencyjne tło) x 100.

Indukcja apoptozy i hamowanie proliferacji komórek przez przeciwciała monoklonalne

[0260] W celu przetestowania zdolności do inicjowania apoptozy, monoklonalne przeciwciała anty-CLDN6 można na przykład inkubować z komórkami nowotworowymi dodatnimi CLDN6 lub komórkami nowotworowymi transfekowanymi CLDN6 w 37°C przez około 20 godzin. Komórki można zebrać, przemyć w buforze wiążącym aneksynę V (BD biosciences) i inkubować z aneksyną V sprzężoną z FITC lub APC (BD biosciences) przez 15 min. w ciemności. Wszystkie komórki z każdej próbki można dodać do roztworu PI (10 µg/ml w PBS) w probówce FACS i natychmiast ocenić za pomocą cytometrii przepływowej (jak wyżej). Alternatywnie, ogólne hamowanie proliferacji komórek przez przeciwciała monoklonalne można wykryć za pomocą dostępnych w handlu zestawów. Zestaw do proliferacji komórek DELFIA (Perkin-Elmer, nr kat. AD0200) jest nieizotopowym testem immunologicznym opartym na pomiarze wbudowania 5-bromo-2’-dezoksyurydyny (BrdU) podczas syntezy DNA proliferujących komórek w mikropłytkach. Wbudowane BrdU wykrywa się za pomocą przeciwciała monoklonalnego znakowanego europem. W celu umożliwienia wykrycia przeciwciał, komórki są utrwalane, a DNA denaturowane za pomocą roztworu Fix. Niezwiązane przeciwciało jest wypłukiwane i dodawany jest induktor DELFIA w celu dysocjacji jonów europu ze znakowanego przeciwciała na roztwór, gdzie tworzą one wysoce fluorescencyjne chelaty ze składnikami induktora DELFIA. Zmierzona fluorescencja - z wykorzystaniem fluorometrii z rozdzielczością czasową w detekcji - jest proporcjonalna do syntezy DNA w komórce każdej studzienki.

Badania przedkliniczne

[0261] Opisane tutaj środki wiążące można również testować w modelu in vivo (np. u myszy z niedoborem odporności, mających ksenotransplantowane nowotwory zaszczepione liniami komórkowymi eksprymującymi CLDN6 w celu określenia ich skuteczności w kontrolowaniu wzrostu komórek nowotworowych eksprymujących CLDN. [0262] Badania in vivo po ksenotransplantacji komórek nowotworowych wykazujących ekspresję CLDN6 u myszy z obniżoną odpornością lub innych zwierząt można przeprowadzić przy użyciu opisanych tu przeciwciał. Przeciwciała można podawać myszom wolnym od nowotworu, a następnie wstrzykiwać komórki nowotworowe w celu zmierzenia działania przeciwciał w celu zapobiegniecia tworzenia się nowotworów lub objawów związanych z nowotworem. Przeciwciała można podawać myszom z nowotworem w celu określenia skuteczności terapeutycznej odpowiednich przeciwciał w celu zmniejszenia wzrostu nowotworu, przerzutów lub objawów związanych z nowotworem. Podawanie przeciwciał można łączyć z podawaniem innych substancji, takich jak leki cystostatyczne, inhibitory czynnika wzrostu, blokery cyklu komórkowego, inhibitory angiogenezy lub inne przeciwciała w celu określenia synergistycznej skuteczności i potencjalnej toksyczności kombinacji. W celu przeanalizowania toksycznych działań niepożądanych za pośrednictwem przeciwciał, zwierzęta można zaszczepić przeciwciałami lub odczynnikami kontrolnymi i dokładnie zbadać pod kątem objawów prawdopodobnie związanych z terapią przeciwciałem CLDN6. Możliwe skutki uboczne stosowania in vivo przeciwciał CLDN6 obejmują w szczególności toksyczność w tkankach eksprymujących CLDN6, w tym łożysku. Przeciwciała rozpoznające CLDN6 u ludzi i innych gatunków, np. myszy, są szczególnie przydatne do przewidywania

51 potencjalnych skutków ubocznych, w których pośredniczy zastosowanie monoklonalnych przeciwciał CLDN6 u ludzi. [0263] Mapowanie epitopów rozpoznawanych przez przeciwciała można przeprowadzić jak opisano szczegółowo w „Protokołach mapowania epitopów (Methods in Molecular Biology) autorstwa Glenna E. Morrisa ISBN-089603-375-9 oraz w „Epitope Mapping: A Practical Approach” Practical Approach Series, 248 autorstwa Olwyn MR Westwood, Frank C. Hay. [0264] Związki i środki opisane w niniejszym dokumencie mogą być podane w formie dowolnej stosownej farmaceutycznej kompozycji. [0265] Farmaceutyczne kompozycje z wynalazku są korzystnie sterylne i zawierają skuteczną ilość przeciwciał opisanych w niniejszym dokumencie i opcjonalnie kolejnych środków, jak omówiono w niniejszym dokumencie, do wytworzenia pożądanej reakcji lub pożądanego efektu. [0266] Farmaceutyczne kompozycje są zwykle zapewnione w postaci ujednoliconej dawki i mogą być przygotowane w sposób znany jako taki. Farmaceutyczna kompozycja może np. być w formie roztworu lub zawiesiny. [0267] Farmaceutyczna kompozycja może zawierać sole, substancje buforowe, konserwanty, nośniki, rozpuszczalniki i/lub wypełniacze, z których wszystkie są korzystnie farmaceutycznie dopuszczalne. Termin „farmaceutycznie dopuszczalny” nawiązuje do nietoksyczność materiału, który nie reaguje na działanie aktywnego składnika farmaceutycznej kompozycji. [0268] Sole, które nie są farmaceutycznie dopuszczalne mogą być użyte do przygotowania farmaceutycznie dopuszczalnych soli i są włączone do wynalazku. Farmaceutycznie dopuszczalne sole tego rodzaju zawierają bez ograniczeń te przygotowane z następujących kwasów: chlorowodorowego, bromowodorowego, siarkowego, azotowego, fosforowego, maleinowego, octowego, salicylowego, cytrynowego, mrówkowego, malonowego, bursztynowego i podobnych. Farmaceutycznie dopuszczalne sole mogą także być przygotowane z soli litowców lub soli berylowców, takich jak sole sodowe, sole potasowe lub sole wapniowe. [0269] Stosowne substancje buforowe do użytku w farmaceutycznych kompozycjach zawierają kwas octowy w soli, kwas cytrynowy w soli, kwas borowy w soli i kwas fosforowy w soli. [0270] Stosowne konserwanty do użytku w farmaceutycznych kompozycjach zawierają chlorki benzalkoniowe, chlorobutanol, paraben i timerosal. [0271] Preparat, który może być wstrzykiwany, może zawierać farmaceutycznie dopuszczalny wypełniacz, taki jak mleczan Ringera. [0272] Termin „nośnik” nawiązuje do organicznego lub nieorganicznego składnika, o charakterze naturalnym lub syntetycznym, w którym aktywny składnik jest połączony w celu ułatwienia, wzmocnienia lub umożliwienia aplikacji. [0273] Zgodnie z wynalazkiem, termin „nośnik” zawiera także jeden albo wiele kompatybilnych stałych lub płynnych wypełniaczy, rozpuszczalników lub substancji stanowiących obudowę, które są stosowne do podania pacjentowi. [0274] Możliwe substancje nośnikowe do podawania pozajelitowego to np. sterylna woda, Ringer, mleczan Ringera, sterylny roztwór chlorku sodu, polialkilenoglikole, uwodornione naftaleny i, w szczególności, biozgodne polimery laktydów, kopolimery laktydów/glikoli lub kopolimery polioksyetylenu/polioksypropylenu. [0275] Termin „wypełniacz”, gdy jest użyty w niniejszym dokumencie ma na celu wskazanie wszystkich substancji, które mogą być obecne w farmaceutycznych kompozycjach i które nie są aktywnymi składnikami, tak jak np. nośniki, substancje wiążące, lubrykanty, zagęstniki, środki aktywne powierzchniowo, konserwanty, emulgatory, bufory, środki smakowe lub barwniki. [0276] Środki i kompozycje opisane w niniejszym dokumencie mogą być podane dowolną konwencjonalną drogą, taką jak pozajelitowe podanie, włączając wstrzyknięcie lub infuzję.

52 Podanie jest korzystnie pozajelitowe, np. dożylnie, dotętniczo, podskórnie, doskórnie lub domięśniowo. [0277] Kompozycje stosowne do podania pozajelitowego zwykle zawierają sterylny wodny lub niewodny preparat aktywnego związku, który jest korzystnie izotoniczny z krwią biorcy. Przykłady zgodnych nośników i rozpuszczalników to roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Dodatkowo, zwykle sterylne, ustalone oleje są stosowane jako roztwór lub zawiesina. [0278] Środki i kompozycje opisane w niniejszym dokumencie są podawane w skutecznych ilościach. „Skuteczna ilość” nawiązuje do ilości, która daje pożądaną reakcję lub pożądany efekt indywidualnie lub razem z innymi dawkami. W przypadku leczenia konkretnej choroby lub konkretnego stanu, pożądana reakcja korzystnie dotyczy zahamowania przebiegu choroby. To zawiera zwolnienie progresji choroby i, w szczególności, przerwanie lub cofnięcie progresji choroby. Pożądana reakcja w leczeniu choroby lub stanu może być także opóźnieniem początku lub zapobiegnięciem wystąpienia wspomnianej choroby lub wspomnianego stanu. In particular, the term "effective amount” refers to the amount of a therapy that is sufficient to result in the prevention of the development, recurrence, or onset of cancer and one or more symptoms thereof, reduce the severity, the duration of cancer, ameliorate one or more symptoms of cancer, prevent the advancement of cancer, cause regression of cancer, and/or prevent cancer metastases. W przykładzie wykonania wynalazku ilość terapii jest skuteczna do osiągnięcia stabilizacji, zmniejszenia lub eliminacji populacji rakowych komórek macierzystych i/lub eradykacji, usunięcia lub kontroli nowotworu pierwotnego, nowotworu z przerzutami i/lub nowotworu nawracającego. [0279] Skuteczna ilość środka lub kompozycji opisanych w niniejszym dokumencie będzie zależała od stanu, który ma być leczony, ciężkości choroby, indywidualnych parametrów pacjenta, włączając wiek, stan fizjologiczny, wzrost i wagę, długości leczenia, typu terapii towarzyszącej (o ile taka istnieje), konkretnej drogi podania i podobnych czynników. Odpowiednio, dawki podawanych środków opisanych w niniejszym dokumencie mogą zależeć od różnych takich parametrów. W przypadku, gdy reakcja u pacjenta jest niewystarczająca przy początkowej dawce, zastosowane mogą być większe dawki (lub skutecznie większe dawki osiągnięte przez inną, bardziej miejscową drogę podania). [0280] Opisane tu środki i kompozycje można podawać pacjentom w celu leczenia lub zapobiegania chorobie nowotworowej, np. chorobie nowotworowej, takiej jak tu opisana, charakteryzującej się obecnością rakowych komórek macierzystych eksprymujących CLDN6. [0281] Środki i kompozycje przedstawione w niniejszym dokumencie mogą być zastosowane indywidualnie lub w kombinacji z konwencjonalnymi schematami leczenia, takimi jak operacja, naświetlanie, chemioterapia i/lub przeszczep szpiku kostnego (autologiczny, syngeniczny, allogeniczny lub niespokrewniony). [0282] Leczenie nowotworu stanowi dziedzinę, w której strategie kombinacji są szczególnie pożądane, ponieważ często połączone działanie dwóch, trzech, czterech lub nawet więcej leków/terapii przeciwnowotworowych generuje efekty synergistyczne, które są znacznie silniejsze niż wpływ podejścia monoterapeutycznego. Zatem w innym przykładzie wykonania niniejszego wynalazku leczenie nowotworu można skutecznie łączyć z różnymi innymi lekami. Wśród nich są np. kombinacje z konwencjonalnymi terapiami nowotworowymi, strategiami wielu epitopów, dodatkową immunoterapią i sposobami leczenia ukierunkowanymi na angiogenezę lub apoptozę (do przeglądu patrz np. Andersen i wsp. 2008: Cancer treatment: the combination of vaccination with other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy, 57(11): 1735-1743). Kolejne podawanie różnych środków może hamować wzrost komórek nowotworowych w różnych punktach kontrolnych, podczas gdy inne środki mogą np. hamować neoangiogenezę, przeżycie komórek złośliwych lub przerzutów, potencjalnie przekształcając nowotwór w chorobę przewlekłą. Poniższa lista zawiera kilka nieograniczających przykładów leków i terapii przeciwnowotworowych, które można stosować w połączeniu z niniejszym wynalazkiem:

53

1. Chemoterapia

[0283] Chemioterapia to standard opieki dla wielu rodzajów nowotworów. Tradycyjne środki chemioterapeutyczne działają poprzez zabijanie komórek, które szybko się dzielą, co jest jedną z głównych właściwości większości komórek nowotworowych. Zatem połączenie z konwencjonalnymi lekami chemioterapeutycznymi, takimi jak np. środki alkilujące, antymetabolity, antracykliny, alkaloidy roślinne, inhibitory topoizomerazy i inne środki przeciwnowotworowe, które wpływają na podział komórek lub syntezę DNA, może znacząco poprawić efekty terapeutyczne niniejszego wynalazku przez oczyszczenie komórek supresorowych, ponowne uruchomienie układu odpornościowego, nadanie komórkom nowotworów nowotworowych większej podatności na zabijanie za pośrednictwem układu odpornościowego lub dodatkową aktywację komórek układu odpornościowego. W wielu badaniach wykazano synergistyczne działanie przeciwnowotworowe leków immunoterapeutycznych opartych na chemioterapii i szczepieniach (patrz np. Quoix i wsp. 2011: Therapeutic vaccination with TG4010 and first-line chemotherapy in advanced non- small-cell lung cancer: a controlled phase 2B trial. Lancet Oncol. 12(12): 1125-33.; patrz również Liseth i wsp. 2010: Combination of intensive chemotherapy and anticancer vaccines in the treatment of human malignancies: the hematological experience. J Biomed Biotechnol. 2010: 6920979; patrz również Hirooka i wsp. 2009: A combination therapy of gemcytabina with immunotherapy for patients with inoperable locally advanced pancreatic cancer. Pancreas 38(3): e69-74). Dostępne są setki leków chemioterapeutycznych, które zasadniczo nadają się do terapii skojarzonych. Niektóre (nieograniczające) przykłady leków chemioterapeutycznych, które można łączyć z niniejszym wynalazkiem, to karbo-platyna (Paraplatin), cisplatyna (Platinol, Platinol-AQ), cyklofosfamid (Cytoxan, Neosar), docetaksel (Taxotere), doksorubicyna (Adriamycyna), erlotynib (Tarceva), etopozyd (VePesid), fluorouracyl (5-FU), gemcytabina (Gemzar), mesylan imatinibu (Gleevec), irynotekan (Camptosar), metotreksat (Folex, Mexate, Amethopterin), paklitaksel (Taxol, Abraxane), sorafenib (Nexavar), sunitynib (Sutent), topotekan (Hycamtin), winkrystyna (Oncovin, Vincasar PFS) i winblastyna (Velban).

2. Chirurgia

[0284] Operacja nowotworu - operacja usunięcia nowotworu nowotworowego - pozostaje podstawą leczenia nowotworu. Chirurgia może być łączona z innymi sposobami leczenia nowotworu w celu usunięcia wszelkich pozostałych komórek nowotworów nowotworowych. Połączenie sposobów chirurgicznych z późniejszym leczeniem immunoterapeutycznym jest obiecującym podejściem, które zostało zademonstrowane niezliczoną ilość razy.

3. Radioterapia

[0285] Radioterapia pozostaje ważnym składnikiem leczenia nowotworów u około 50% wszystkich chorych na nowotwór otrzymujących radioterapię w trakcie choroby. Głównym celem radioterapii jest pozbawienie komórek nowotworowych potencjału ich namnażania (podziału komórek). Rodzaje promieniowania stosowane do leczenia nowotworu to promieniowanie fotonów (promieniowanie rentgenowskie i promieniowanie gamma) oraz promieniowanie cząstek (wiązki elektronów, protonów i neutronów). Istnieją dwa sposoby dostarczania promieniowania do lokalizacji nowotworu. Promieniowanie wiązki zewnętrznej jest dostarczane z zewnątrz ciała, poprzez kierowanie promienii wysokoenergetycznych (fotonów, protonów lub promieniowania cząstek) do lokalizacji nowotworu. Promieniowanie wewnętrzne lub brachyterapia są dostarczane z wnętrza ciała przez źródła radioaktywne, zamknięte w cewnikach lub osłonach bezpośrednio w miejscu nowotworu. Techniki terapii

54 radiacyjnej, które można stosować w połączeniu z niniejszym wynalazkiem, to np. frakcjonowanie (radioterapia dostarczana w systemie frakcjonowanym, np. dzienne frakcje od 1,5 do 3 Gy podawane przez kilka tygodni), radioterapia konformalna 3D (3DCRT; dostarczanie promieniowania do całkowitej objętości nowotworu), radioterapia z modulacją intensywności (IMRT; sterowana komputerowo modulacja intensywności wielu wiązek promieniowania), radioterapia sterowana obrazem (IGRT; technika zawierająca obrazowanie przed radioterapią, która umożliwia korekcję), oraz radioterapia stereotaktyczna (SRBT, zapewnia bardzo wysokie indywidualne dawki promieniowania tylko przez kilka frakcji leczenia). W przeglądzie radioterapii patrz Baskar i wsp. 2012: Cancer and radiation therapy: current advances and future directions. Int. J Med Sci. 9(3): 193-199.

4. Przeciwciała

[0286] Przeciwciała (korzystnie przeciwciała monoklonalne) osiągają swój efekt terapeutyczny przeciwko komórkom nowotworowym poprzez różne mechanizmy. Mogą mieć bezpośredni wpływ na wytwarzanie apoptozy lub zaprogramowanej śmierci komórki. Mogą blokować komponenty szlaków przekazywania sygnału, takie jak np. receptory czynników wzrostu, skutecznie zatrzymujące proliferację komórek nowotworowych. W komórkach, które eksprymują przeciwciała monoklonalne, mogą powodować powstawanie przeciwciał antyidiotypowych. Efekty pośrednie zawierają rekrutację komórek, które mają cytotoksyczność, takich jak monocyty i makrofagi. Ten typ zabijania komórek za pośrednictwem przeciwciał nazywany jest cytotoksycznością komórkową zależną od przeciwciał (ADCC). Przeciwciała wiążą również dopełniacz, prowadząc do bezpośredniej toksyczności komórkowej, znanej jako cytotoksyczność zależna od dopełniacza (CDC). Połączenie sposobów chirurgicznych z lekami lub sposobami immunoterapeutycznymi jest skutecznym podejściem, jak np. zademonstrowane w Gadri i wsp. 2009: Synergistic effect of dendritic cell vaccination and anti-CD20 antibody treatment in the therapy of murine lymphoma. J Immunother. 32(4): 333-40. Poniższa lista zawiera kilka nieograniczających przykładów przeciwciał przeciwnowotworowych i potencjalnych docelowych przeciwciał (w nawiasach), które mogą być stosowane w połączeniu z niniejszym wynalazkiem: Abagovomab (CA-125), Abciximab (CD41), Adekatumumab (EpCAM), Afutuzumab (CD20), Alacizumab pegol (VEGFR2), Altumomab pentetate (CEA), Amatuximab (MORAb- 009), Anatumomab mafenatox (TAG-72), Apolizumab (HLA-DR), Arcitumomab (CEA), Bavituximab (fosfatydyloseryna), Bectumomab (CD22), Belimumab (BAFF), Bevacizumab (VEGF-A), Biwatuzumab mertansine (CD44 v6), Blinatumomab (CD19), Brentuximab vedotin (CD30 TNFRSF8), Cantuzumab mertansin (mucyna CanAg), Cantuzumab ravtansine (MUC1), Capromab pendetide (komórki raka gruczołu krokowego), Carlumab (CNTO888), Catumaxomab (EpCAM, CD3), Cetuksymab (EGFR), Citatuzumab bogatox (EpCAM), Cixutumumab (receptor IGF-1), Claudiximab (Klaudyna), Clivatuzumab tetraxetan (MUC1), Conatumumab (TRAIL-R2), Dacetuzumab (CD40), Dalotuzumab (receptor insulinopodobnego czynnika wzrostu I), Denosumab (R ANKL), Detumomab (komórka B- chłoniaka), Drozitumab (DR5), Ecromeximab (GD3 gangliozyd), Edrecolomab (EpCAM), Elotuzumab (SLAMF7), Enavatuzumab (PDL192), Ensituximab (NPC-1C), Epratuzumab (CD22), Ertumaxomab (HER2/neu, CD3), Etaracizumab (integryna αvβ3), Farletuzumab (receptor folanowy 1), FBTA05 (CD20), Ficlatuzumab (SCH 900105), Figitumumab (receptor IGF-1), Flanvotumab (glikoproteina 75), Fresolimumab (TGF-β), Galiximab (CD80), Ganitumab (IGF-I), Gemtuzumab ozogamicyna (CD33), Gevokizumab (IL-1β), Girentuximab (anhydraza węglanowa 9 (CA-IX)), Glembatumumab vedotin (GPNMB), Ibritumomab tiuxetan (CD20), Icrucumab (VEGFR-1), Igovoma (CA-125), indatuximab ravtansine (SDC1), Intetumumab (CD51), Inotuzumab ozogamicyna (CD22), Ipilimumab (CD152), Iratumumab (CD30), Labetuzumab (CEA), Lexatumumab (TRAIL-R2), Libivirumab (antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B), Lintuzumab

55 (CD33), Lorvotuzumab mertansyna (CD56), Lucatumumab (CD40), Lumiliximab (CD23), Mapatumumab (TRAIL-R1), Matuzumab (EGFR), Mepolizumab (IL-5), Milatuzumab (CD74), Mitumomab (gangliozyd GD3), Mogamulizumab (CCR4), Moxetumomab pasudotox (CD22), Nacolomab tafenatox (antygen C242), Naptumomab estafenatox (5T4), Namatumab (RON), Necitumumab (EGFR), Nimotuzumab (EGFR), Niwolumab (IgG4), Ofatumumab (CD20), Olaratumab (PDGF-R α), Onartuzumab (kinaza receptora ludzkiego czynnika rozpraszającego), Oportuzumab monatox (EpCAM), Oregovomab (CA-125), Oxelumab (OX- 40), Panitumumab (EGFR), Patritumab (HER3), Pemtumoma (MUC1), Pertuzuma (HER2/neu), Pintumomab (antygen gruczolakoraka), Pritumumab (wimentyna), Racotumomab (kwas N-glikolylneuraminowy), Radretumab (domena dodatkowa fibronektyny-B), Rafiwirumab (glikoproteina wirusa wścieklizny), Ramukirumab (VEGFR2), Rilotumumab (HGF), Rituximab (CD20), Robatumumab (receptor IGF-1), Samalizumab (CD200), Sibrotuzumab (FAP), Siltuximab (IL-6), Tabalumab (BAFF), Tacatuzumab tetraxetan (alfa-fetoproteina), Taplitumomab paptox (CD19), Tenatumomab (tenascyna C), Teprotumumab (CD221), Ticilimumab (CTLA-4), Tigatuzumab (TRAIL-R2), TNX-650 (IL- 13), Tositumomab (CD20), Trastuzumab (HER2/neu), TRBS07 (GD2), Tremelimumab (CTLA-4), Tucotuzumab celmoleukina (EpCAM), Ublituximab (MS4A1), Urelumab (4 - 1BB), Volociximab (integryna α5β1), Votumumab (antygen guza nowotworowego CTAA16.88), Zalutumumab (EGFR), Zanolimumab (CD4).

5. Cytokiny, chemokiny, cząsteczki kostymulacyjne, białka fuzyjne

[0287] Łączne stosowanie kompozycji farmaceutycznych kodujących antygen z cytokinami, chemokinami, cząsteczkami kostymulującymi i/lub ich białkami fuzyjnymi w celu wywołania korzystnej modulacji immunologicznej lub działania hamującego guz nowotworowy jest kolejnym przykładem. W celu zwiększenia przenikania komórek odpornościowych do nowotworu nowotworowego i ułatwienia ruchu komórek prezentujących antygen do węzłów chłonnych drenujących guz nowotworowy, można zastosować różne chemokiny ze strukturami C, CC, CXC i CX3C. Niektóre z najbardziej obiecujących chemokin to np. CCR7 i jego ligandy CCL19 i CCL21, ponadto CCL2, CCL3, CCL5 i CCL16. Innymi przykładami są CXCR4, CXCR7 i CXCL12. Ponadto przydatne są cząsteczki kostymulacyjne lub regulatorowe, takie jak np. ligandy B7 (B7.1 i B7.2). Użyteczne są także inne cytokiny, takie jak np. interleukiny w szczególności (np. IL-1 do IL17), interferony (np. IFNalfa1 do IFNalfa8, IFNalfa10, IFNalfa13, IFNalfa14, IFNalfa16, IFNalfa17, IFNalfa21, IFNbetal, IFNW, IFNE1 i IFNK), czynniki krwiotwórcze, TGF (np. TGF-α, TGF -β i inni członkowie rodziny TGF), ostatecznie członkowie rodziny receptorów czynnika martwicy nowotworów nowotworowych i ich ligandów, jak również innych cząsteczek stymulujących, zawierających, ale nie ograniczonych do 41BB, 41BB-L, CD137, CD137L, CTLA-4GITR, GITRL, Fas, Fas-L, TNFR1, TRAIL-R1, TRAIL-R2, p75NGF-R, DR6, LT.beta.R, RANK, EDAR1, XEDAR, Fn114, Troy/Trade, TAJ, TNFRII, HVEM, CD27, CD30, CD40, 4-1BB, OX40, GITR, GITRL, TACI, BAFF-R, BCMA, RELT i CD95 (Fas/APO-1), indukowane przez glukokortykoidy białko związane z TNFR, pośredniczące w receptorze TNF związane z apoptozą białko (TRAMP) i receptor śmierci-6 (DR6). Szczególnie CD40/CD40L i OX40/OX40L są ważnymi celami w immunoterapii skojarzonej ze względu na ich bezpośredni wpływ na przeżycie i proliferację komórek T. Dla przeglądu patrz Lechner i wsp. 2011: Chemokines, costimulatory molecules and fusion proteins for the immunotherapy of solid tumors. Immunoterapia 3 (11), 1317-1340.

6. Leczenie bakteryjne

[0288] Naukowcy wykorzystują bakterie beztlenowe, takie jak Clostridium novyi, w celu konsumowania tlenu z wnętrza nowotworów nowotworowych. Te powinny następnie umrzeć,

56 gdy wejdą w kontakt z natlenionymi stronami nowotworu, co oznacza, że będą nieszkodliwe dla reszty ciała. Inną strategią jest stosowanie bakterii beztlenowych, które zostały transformowane enzymem, który może przekształcić nietoksyczny prolek w toksyczny lek. Wraz z proliferacją bakterii w martwiczych i niedotlenionych obszarach nowotworu, enzym ulega ekspresji wyłącznie w guzie. Zatem stosowany ogólnoustrojowo prolek jest metabolizowany do toksycznego leku tylko w guzie. Wykazano, że jest skuteczny w przypadku niepatogennych beztlenowych bakterii Clostridium sporogenes.

7. Inhibitory kinazy

[0289] Inna duża grupa potencjalnych celów dla uzupełniającej terapii przeciwnowotworowej zawiera inhibitory kinazy, ponieważ wzrost i przeżycie komórek nowotworowych jest ściśle powiązane z deregulacją aktywności kinazy. W celu przywrócenia normalnej aktywności kinazy i tym samym zmniejszenia wzrostu nowotworu nowotworowego stosowany jest szeroki zakres inhibitorów. Grupa ukierunkowanych kinaz zawiera receptorowe kinazy tyrozynowe, np. BCR-ABL, B-Raf, EGFR, HER-2/ErbB2, IGF- IR, PDGFR-α, PDGFR-β, c-Kit, Flt-4, Flt3, FGFR1, FGFR3, FGFR4, CSF1R, c-Met, RON, c-Ret, ALK, cytoplazmatyczne kinazy tyrozynowe, np. c-SRC, c-YES, Abl, JAK-2, kinazy serynowo/treoninowe np. ATM, Aurora A i B, CDK, mTOR, PKCi, PLK, b-Raf, S6K, STK11/LKB1 i kinazy lipidowe np. PI3K, SKI. Małocząsteczkowe inhibitory kinazy to np. PHA-739358, Nilotynib, Dasatinib i PD166326, NSC 743411, Lapatinib (GW-572016), Canertinib (CI-1033), Semaksynib (SU5416), Vatalanib (PTK787/ZK222584), Sutent (SU11248), Sorafenib (BAY 43-9006) i Leflunomid (SU101). W celu uzyskania więcej informacji, zobacz np. Zhang i wsp. 2009: Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nature Reviews Cancer 9, 28-39.

8. Receptory Toll-podobne

[0290] Członkowie rodziny receptorów Toll-podobnych (TLR) są ważnym ogniwem między wrodzoną i adaptacyjną odpornością, a wpływ wielu adiuwantów zależy od aktywacji TLR. Duża liczba ustalonych szczepionek przeciwko nowotworom zawiera ligandy dla receptorów TLR w celu zwiększenia odpowiedzi na szczepionki. Oprócz TLR2, TLR3, TLR4, szczególnie TLR7 i TLR 8, zostały przebadane pod kątem terapii przeciwnowotworowej w sposobach pasywnej immunoterapii. Blisko spokrewnione TLR7 i TLR8 przyczyniają się do odpowiedzi przeciwnowotworowych poprzez oddziaływanie na komórki odpornościowe, komórki nowotworu nowotworowego i mikrośrodowisko nowotworu nowotworowego i mogą być aktywowane przez struktury analogów nukleozydów. Wszystkie TLR zastosowano jako samodzielne środki immunoterapeutyczne lub adiuwanty do szczepionek przeciwnowotworowych i można je synergistycznie łączyć z preparatami i sposobami zgodnymi z niniejszym ujawnieniem. W celu uzyskania więcej informacji, zobacz van Duin i wsp. 2005: Triggering TLR signaling in vaccination. Trends in Immunology, 27 (1): 49–55.

9. Inhibitory angiogenezy

[0291] Oprócz terapii ukierunkowanych na receptory immunomodulujące, na które wpływają mechanizmy ucieczki, w których pośredniczy guz nowotworowy i supresja immunologiczna, istnieją terapie ukierunkowane na środowisko nowotworu nowotworowego. Inhibitory angiogenezy zapobiegają rozległemu wzrostowi naczyń krwionośnych (angiogeneza), których nowotwory nowotworowe wymagają do przeżycia. Angiogenezę promowaną przez komórki nowotworu nowotworowego w celu zaspokojenia ich rosnącego zapotrzebowania na składniki odżywcze i tlen, na przykład, można zablokować przez

57 celowanie w różne cząsteczki. Nieograniczającymi przykładami cząsteczek pośredniczących w angiogenezie lub inhibitorów angiogenezy, które można łączyć z niniejszym wynalazkiem, są rozpuszczalne VEGF (izoformy VEGF VEGF121 i VEGF165, receptory VEGFR1, VEGFR2 i ko-receptory Neuropilina-1 i Neuropilina-2) 1 i NRP-1, angiopoetyna 2, TSP-1 i TSP-2, angiostatyna i pokrewne cząsteczki, endostatyna, wazostatyna, kalretikulina, czynnik płytkowy-4, TIMP i CDAI, met-1 i met-2, IFN-α, -β i -γ, CXCL10, IL-4, -12 i -18, protrombina (domena kringle-2), fragment antytrombiny III, prolaktyna, VEGI, SPARC, osteopontyna, maspina, kanstatyna, białko związane z proliferiną, restyna i leki takie jak np. bewacyzumab, itrakonazol, karboksyamidotriazol, TNP-470, CM101, IFN-α, czynnik płytkowy-4, suramina, SU5416, trombospondyna, antagoniści VEGFR, steroidy angiostatyczne + heparyna, czynnik hamujący angiogenezę pochodzący z chrząstki, inhibitory metaloproteinazy macierzy, 2-metoksyestradiol, tekogalan, tetratiomolibdenian, talidomid, trombospondyna, inhibitory Vβ3 prolaktyny, linomid, taschinimod. Przegląd znajduje się w Schoenfeld i Dranoff 2011: Anti-angiogenesis immunotherapy. Hum Vaccin. (9):976-81.

10. Leki małocząsteczkowe do terapii celowanej

[0292] Leki małocząsteczkowe do terapii celowanej są na ogół inhibitorami domen enzymatycznych na zmutowanych, nadeksprymowanych lub w inny sposób krytycznych białkach w komórce nowotworowej. Znaczącymi i nieograniczającymi przykładami są inhibitory kinazy tyrozynowej imatinib (Gleevec/Glivec) i gefitynib (Iressa). Zastosowanie małych cząsteczek, np. jabłczan sunitynibu i/lub tosylan sorafenibu, ukierunkowanych na niektóre kinazy w połączeniu ze szczepionkami do leczenia nowotworu są również opisane w poprzednim zgłoszeniu patentowym USA nr 12/055,151 opublikowanym jako US2009/0004213, obecnie patent USA nr 9,308,244.

11. Szczepionki oparte na wirusach

[0293] Istnieje wiele szczepionek przeciwnowotworowych opartych na wirusach dostępnych lub będących w opracowaniu, które mogą być stosowane w połączonym podejściu terapeutycznym wraz z opisanymi tu preparatami zgodnymi z niniejszym ujawnieniem. [0294] Jedną z zalet stosowania takich wektorów wirusowych jest ich wewnętrzna zdolność do inicjowania odpowiedzi immunologicznych, z reakcjami zapalnymi występującymi w wyniku infekcji wirusowej, tworząc sygnał zagrożenia niezbędny do aktywacji immunologicznej. Idealny wektor wirusowy powinien być bezpieczny i nie powinien wprowadzać odpowiedzi immunologicznej przeciw wektorowi, w celu umożliwienia wzmocnienia odpowiedzi swoistych wobec nowotworu. Rekombinowane wirusy, takie jak wirusy krowianki, wirusy opryszczki pospolitej, adenowirusy, wirusy związane z adenowirusami, retrowirusy i wirusy ospy ptasiej stosowano w zwierzęcych modelach nowotworów i na podstawie ich obiecujących wyników rozpoczęto badania kliniczne u ludzi. Szczególnie ważne szczepionki oparte na wirusach są cząstkami wirusopodobnymi (VLP), małymi cząstkami, które zawierają pewne białka z zewnętrznej powłoki wirusa. Cząsteczki wirusopodobne nie zawierają żadnego materiału genetycznego z wirusa i nie mogą wywołać infekcji, ale mogą zostać skonstruowane w celu przedstawienia antygenów nowotworu nowotworowego na ich powłoce. VLP mogą pochodzić z różnych wirusów, takich jak np. wirus zapalenia wątroby typu B lub inne rodziny wirusów, w tym Parvoviridae (np. wirus związany z adenowirusem), Retroviridae (np. HIV) i Flaviviridae (np. wirus zapalenia wątroby typu C). Ogólny przegląd można znaleźć w Sorensen and Thompsen 2007: Virus- based immunotherapy of cancer: what do we know and where are we going? APMIS 115(11):1177-93; cząsteczki wirusopodobne przeciwko nowotworowi są poddane przeglądowi Buonaguro i wsp. 2011: Developments in virus-like particle-based vaccines for infectious diseases and cancer. Expert Rev Vaccines 10 (11): 1569-83; oraz w Guillen i in.

58 2010: Cząsteczki wirusopodobne jako antygeny szczepionkowe i adiuwanty: zastosowanie w chorobach przewlekłych, immunoterapii nowotworów i strategiach zapobiegania chorobom zakaźnym. Procedia in Vaccinology 2 (2), 128-133.

12. Strategie wielu epitopów

[0295] Zastosowanie wielu epitopów daje obiecujące wyniki do szczepień. Technologie szybkiego sekwencjonowania w połączeniu z inteligentnymi systemami algorytmów pozwalają na wykorzystanie mutacji nowotworu nowotworowego i mogą dostarczać wiele epitopów dla zindywidualizowanych szczepionek, które można łączyć z niniejszym wynalazkiem. W celu uzyskania więcej informacji, patrz 2007: Vaccination of metastatic colorectal cancer patients with matured dendritic cells loaded with multiple major histocompatibility complex class I peptides. J Immunother 30: 762-772; dalej Castle i wsp. 2012: Exploiting the mutanome for tumorvaccination. Cancer Res 72 (5):1081-91.

13. Adoptywny transfer komórek T

[0296] Na przykład, połączenie szczepienia antygenem guza nowotworowego i transferu komórek T opisano w: Rapoport i wsp. 2011: Combination immunotherapy using adoptive T- cell transfer and tumor antigen vaccination on the basis of hTERT and survivin after ASCT for myeloma. Blood 117(3):788-97.

14. Terapie celowane oparte na peptydach

[0297] Peptydy mogą wiązać się z receptorami na powierzchni komórki lub wpływać na macierz zewnątrzkomórkową otaczającą guz nowotworowy. Radionuklidy, które są przyłączone do tych peptydów (np. RGD) ostatecznie zabijają komórkę nowotworową, jeśli nuklid rozpada się w pobliżu komórki. Szczególnie oligo- lub multimery tych motywów wiążących są bardzo interesujące, ponieważ może to prowadzić do zwiększonej swoistości nowotworu nowotworowego i awidności. Dla nieograniczających przykładów patrz Yamada 2011: Peptide-based cancer vaccine therapy for prostate cancer, bladder cancer, and malignant glioma. Nihon Rinsho 69(9): 1657-61.

15. Inne terapie

[0298] Istnieje wiele innych terapii przeciwnowotworowych, które mogą być łączone z preparatami w celu wytworzenia efektów synergistycznych. Nieograniczającymi przykładami są zabiegi ukierunkowane na apoptozę, hipertermię, terapię hormonalną, terapię telomerazą, terapię wzmacnianiem insuliny, terapię genową i terapię fotodynamiczną. [0299] Różne sposoby znane w tej dziedzinie mogą być stosowane do wykrywania i/lub określania ilości komórek eksprymujących CLDN6. [0300] Na przykład można zastosować test immunologiczny do wykrywania ekspresji białka CLDN6 w komórkach lub na powierzchni komórki. Zgodnie z niniejszym ujawnieniem, testy immunologiczne obejmują, ale nie wyłącznie, western blot, immunohistochemię, testy radioimmunologiczne, ELISA (test immunoenzymatyczny), testy immunologiczne typu „sandwich”, testy immunoprecypitacyjne, reakcje precypitacji, reakcje precypitacji sposobem dyfuzji żelowej, testy immunodyfuzji, testy aglutynacji, testy wiązania dopełniacza, testy immunoradiometryczne, fluorescencyjne testy immunologiczne, immunofluorescencję, testy immunologiczne białka A, cytometrię przepływową lub analizę FACS. [0301] W jednym przykładzie komórki są związane z jednym lub więcej znakowanymi przeciwciałami mającymi zdolność wiązania z CLDN6 przed wykryciem i/lub ustaleniem ilości.

59 [0302] Alternatywnie można wykryć ekspresję mRNA CLDN6 lub można określić ilość mRNA CLDN6 w celu wykrycia i/lub określenia ilości komórek eksprymujących CLDN6. [0303] W niektórych przykładach próbka uzyskana od pacjenta do wykrywania i/lub określania ilości komórek eksprymujących CLDN6 jest płynem biologicznym, który obejmuje, ale nie wyłącznie, krew, szpik kostny, surowicę, mocz lub płyn śródmiąższowy. W innych przykładach próbką od pacjenta jest próbka tkanki (np. biopsja od pacjenta z lub podejrzewanym o obecność tkanki nowotworowej). Najkorzystniej próbka jest biopsją nowotworu. [0304] Próbka może być próbką biologiczną, która została poddana jednemu lub większej liczbie etapów obróbki wstępnej przed wykryciem i/lub ustaleniem ilości komórek eksprymujących CLDN6. W pewnym przykładzie płyn biologiczny poddaje się wstępnej obróbce przez wirowanie, filtrację, wytrącanie, dializę lub chromatografię lub przez kombinację takich etapów obróbki wstępnej. W innych przykładach próbkę tkanki poddaje się wstępnej obróbce przez zamrażanie, utrwalanie chemiczne, zatapianie parafiny, odwodnienie, permeablizację lub homogenizację, a następnie wirowanie, filtrację, wytrącanie, dializę lub chromatografię, lub przez połączenie takich etapów obróbki wstępnej. [0305] Ilość rakowych komórek macierzystych w próbce może być wyrażona jako procent np. ogólnej liczby komórek lub ogólnej liczby komórek nowotworowych w próbce lub wyrażona ilościowo w stosunku do powierzchni (np. komórek na pole), objętości (np. komórek na ml) lub masy (np. komórki na ml). [0306] Ilość rakowych komórek macierzystych w badanej próbce można porównać z ilością rakowych komórek macierzystych w próbce (próbkach) referencyjnej. W jednym przykładzie próbka referencyjna jest próbką uzyskaną od pacjenta poddawanego terapii we wcześniejszym punkcie czasowym (np. przed otrzymaniem terapii jako wyjściowej próbki referencyjnej lub we wcześniejszym punkcie czasowym podczas przyjmowania terapii). W tym przykładzie terapia korzystnie powoduje zmniejszenie liczby rakowych komórek macierzystych w próbce testowej w porównaniu z próbką referencyjną. W innym przykładzie próbka referencyjna jest pobierana od zdrowego pacjenta, który nie ma wykrywalnego raka, lub od pacjenta, który jest w remisji z powodu tego samego rodzaju raka. W tym przykładzie terapia korzystnie powoduje, że próbka testowa ma taką samą ilość rakowych komórek macierzystych lub mniej niż ilość rakowych komórek macierzystych niż wykryta w próbce referencyjnej. W konkretnym przykładzie stabilizacja lub zmniejszenie liczby rakowych komórek macierzystych w stosunku do wcześniejszej (wcześniej wykrytej) ilości rakowych komórek macierzystych określonych dla osobnika wskazuje na poprawę rokowania u pacjenta lub pozytywną odpowiedź na terapię, podczas gdy wzrost w stosunku do wcześniejszej ilości rakowych komórek macierzystych wskazuje na to samo lub gorsze rokowanie i/lub brak odpowiedzi na terapię. [0307] W niektórych przykładach kombinacja markerów powierzchni komórki, np. CLDN6 w połączeniu z innymi markerami typowymi dla rakowych komórek macierzystych jest wykorzystywany w celu określenia ilości rakowych komórek macierzystych w próbce. [0308] Ujawniono zestaw zawierający jeden lub więcej pojemników wypełnionych odczynnikami do wykrywania, określania ilości lub monitorowania komórek eksprymujących CLDN6. W jednym przykładzie zestaw opcjonalnie zawiera instrukcje dotyczące stosowania odczynników do określania rakowych komórek macierzystych lub monitorowania skuteczności terapii przeciwnowotworowej przez wykrywanie i/lub określanie ilości komórek eksprymujących CLDN6, w szczególności do stosowania odczynników w sposobie zgodnym z wynalazkiem. W jednym przykładzie zestaw zawiera środek, który swoiście wiąże się z białkiem CLDN6 lub mRNA CLDN6. W niektórych przykładach środkiem jest przeciwciało lub fragment przeciwciała. W innych przykładach środkiem jest kwas nukleinowy. Zestawy do wykrywania kwasu nukleinowego ogólnie zawierają (ale nie wyłącznie) sondy swoiste dla mRNA CLDN6. W przypadku ilościowej PCR zestawy ogólnie zawierają wstępnie wybrane startery swoiste dla sekwencji kwasu nukleinowego CLDN6. Zestawy do ilościowej PCR

60 mogą również zawierać enzymy odpowiednie do amplifikacji kwasów nukleinowych (np. polimerazy, takie jak Taq) oraz deoksynukleotydy i bufory potrzebne do mieszaniny reakcyjnej do amplifikacji. Ilościowe zestawy PCR mogą również zawierać sondy swoiste dla sekwencji kwasu nukleinowego CLDN6. W niektórych przykładach zestawy do ilościowej PCR zawierają również składniki odpowiednie do odwrotnej transkrypcji RNA, w tym enzymy (np. odwrotne transkryptazy) i startery do odwrotnej transkrypcji wraz z dezoksynukleotydami i buforami potrzebnymi do reakcji odwrotnej transkrypcji. [0309] W niektórych przykładach środek jest wykrywalnie znakowany. Ponadto zestawy mogą zawierać instrukcje wykonywania testu oraz sposoby interpretacji i analizy danych wynikających z wykonania testu. [0310] Na podstawie uzyskanych wyników (tj. czy obecne są rakowe komórki macierzyste lub czy ilość rakowych komórek macierzystych ustabilizowała się, czy zmniejszyła), lekarz może wybrać konkretną terapię przeciwnowotworową, np. terapia przeciwnowotworowa skierowana przeciwko rakowym komórkom macierzystym lub może kontynuować terapię. Alternatywnie, w oparciu o wynik, że rakowe komórki macierzyste nie są obecne lub ilość rakowych komórek macierzystych wzrosła, lekarz może zdecydować o zastosowaniu terapii przeciwnowotworowej skierowanej przeciwko rakowym komórkom macierzystym lub kontynuować, zmienić lub zatrzymać terapię. [0311] Jeśli okaże się, że zmniejszenie populacji rakowych komórek macierzystych jest niewystarczające po porównaniu populacji rakowych komórek macierzystych w próbce uzyskanej od pacjenta poddawanego terapii przeciwnowotworowej z próbką od pacjenta pobraną wcześniej od pacjenta, wówczas lekarz ma liczba opcji dostosowania terapii. Na przykład lekarz może zwiększyć dawkę terapii przeciwnowotworowej, częstotliwość podawania, czas podawania lub dowolną ich kombinację. W konkretnym przykładzie, po ustaleniu, pacjentowi można podać dodatkową terapię przeciwnowotworową zamiast pierwszej terapii lub w połączeniu z pierwszą terapią. [0312] W innych niektórych przykładach, jeśli zmniejszenie populacji rakowych komórek macierzystych zostanie uznane za dopuszczalne po porównaniu populacji rakowych komórek macierzystych w próbce uzyskanej od pacjenta poddanego terapii przeciwnowotworowej z próbką od pacjenta pobraną wcześniej od pacjenta, wówczas lekarz może zdecydować o niedostosowaniu terapii przeciwnowotworowej. Na przykład lekarz może nie zwiększać dawki terapii przeciwnowotworowej, częstotliwości podawania, czasu podawania lub dowolnej ich kombinacji. Ponadto lekarz może zdecydować o dodaniu dodatkowych terapii lub połączeniu terapii. [0313] Niniejszy wynalazek jest dalej zilustrowany następującymi przykładami, które nie powinny być interpretowane jako ograniczające zakres wynalazku.

PRZYKŁADY

Przykład 1: CLDN6 ulega ekspresji na powierzchni indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

[0314] W celu przeanalizowania, czy CLDN6 ulega ekspresji w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSC), ekspresję CLDN6 w transkrypcie analizowano w noworodkowym HFF (ludzkie fibroblasty napletka, System Bioscience) w kilku punktach czasowych leczenia koktajlem przeprogramowującym (niemodyfikowany OSKMNL + EBK + miR-mix; składający się z RNA transkrybowanego (IVT) OSKMNL = czynniki transkrypcyjne OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG i LIN28, IVT-RNA z EBK = białka ucieczkowe IFN E3, K3 i B18R oraz mieszanka miRNA składająca się z miR-302a/b/c/d i 367; zgodnie z protokołem opisanym w PCT/EP2012/04673 lub pozornie transfekowanymi HFF (bez kontroli RNA) przez ilościową RT-PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) z wykorzystaniem systemu i oprogramowania ABI PRISM do

61 wykrywania sekwencji 7300 (Applied Biosystems z zestawem QuantiTect SYBR green Kit (Qiagen)). Komórki hodowano w pożywce bez surowicy Nutristem (Stemgent, Cambridge (MA)) uzupełnionej 10 ng/ml bFGF i 0,5 µM tiazowiwiny. Koktajl przeprogramowujący transfekowano przy użyciu Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) w dniu 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10 i 11 eksperymentu. Jako kontrolę komórki traktowano tylko Lipofectamine RNAiMAX (bez kontroli RNA). Wykryliśmy wyraźną prawie 6000-krotną regulację w górę CLDN6 w porównaniu z nietraktowanym HFF w dniu 19 leczenia, a w dniu 12 leczenia zaobserwowaliśmy około 2000-krotną regulację w górę CLDN6 (Figura 1). Zatem CLDN6 ulega ekspresji w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSC). [0315] Cytometrię przepływową zastosowano do zbadania, czy CLDN6 jest również eksprymowany na powierzchni iPSC. Ponieważ iPSC są hodowane na komórkach odżywczych HFF, połączyliśmy analizę z barwieniem SSEA-4, dobrze akceptowanego markera komórek macierzystych w celu zapewnienia, że iPSC są swoiście wykrywane. W tym celu komórki HFF traktowane koktajlem przeprogramowującym lub próbnym contril (bez RNA) zebrano w dniu 5, 12 i 19 leczenia i wybarwiono 1 µg/ml swoistego wobec CLDN6 IMAB027-AF647 i 2 µl przeciwciała SSEA-4 przez 30 minut w 4°C i ekspresję powierzchniową analizowano sposobem cytometrii przepływowej. Włączyliśmy również barwnik Viability Dye 7-AAD do naszego protokołu barwienia w celu wykluczenia martwych komórek z naszych analiz. Eksperyment przeprowadzono w dwóch powtórzeniach i zarejestrowano 50 000 zdarzeń z każdej próbki za pomocą cytometru przepływowego BD Canto II. Analizę zarejestrowanych komórek przeprowadzono za pomocą oprogramowania FlowJo i pokazano reprezentatywne wykresy punktowe (Figura 2). [0316] W dniu 5 CLDN6 nie jest wykrywalny na powierzchni HFF nie jest traktowany koktajlem przeprogramowującym. Nieoczekiwanie okazuje się, że SSEA-4 ma być eksprymowany przy 15% HFF, niezależnie od tego, czy zostanie poddany obróbce koktajlem przeprogramowującym, czy nie. Można to wytłumaczyć faktem, że zastosowane HFF to fibroblasty noworodkowe i możliwe jest, że komórki te zachowują pewną pozytywność względem SSEA-4. W 12 dniu leczenia około 63% leczonych HFF jest dodatnich pod względem SSEA-4 i obserwujemy podwójnie dodatnią frakcję CLDN6-SSEA-4 wynoszącą około 15%. W 19 dniu leczenia 15% leczonych HFF jest dodatnich pod względem CLDN6 i SSEA-4, co stanowi wyraźną subpopulację. Zakłada się, że subpopulacja dodatnia CLDN6- SSEA-4 oznacza tylko iPSC, natomiast subpopulacja ujemna CLDN6-SSEA-4 jest uważana za komórki zasilające HFF lub nie przeprogramowane, a pojedyncze komórki dodatnie SSEA-4 reprezentują komórki znajdujące się na początku przeprogramowania. [0317] Ponieważ stwierdzamy, że 15% komórek HFF jest dodatnich dla SSEA-4, ale nie dla CLDN6, zakłada się, że CLDN6 reprezentuje bardziej swoisty marker dla ludzkiego iPSC niż SSEA-4. SSEA-4 jest również eksprymowany w noworodkowym HFF, podczas gdy CLDN6 wydaje się być swoiście eksprymowany tylko w całkowicie przeprogramowanych komórkach HFF, które reprezentują frakcję iPSC. [0318] Zatem CLDN6 jest swoiście eksprymowany na powierzchni ludzkiego iPSC.

Przykład 2: CLDN6 jest ważny dla tworzenia kolonii komórek nowotworu jajnika

[0319] Potężnym testem do analizy podobnych do CSC właściwości komórek nowotworowych jest test tworzenia kolonii. Za pomocą tego testu można łatwo zbadać zdolność do samoodnawiania i siłę tworzenia się nowotworów w pojedynczych komórkach nowotworowych. W celu przeanalizowania, czy CLDN6 odgrywa rolę w powstawaniu nowotworów, wybraliśmy z jednej strony COV318, linię komórek nowotworowych jajnika, która pokazuje tylko subpopulację komórek dodatnich pod względem CLDN6, a z drugiej strony PA-1, jednorodnie eksprymującą CLDN6 linię komórkową, niosący stabilny

62 lentiwirusowy RNA o strukturze spinki do włosów (shRNA) powalający CLDN6 (klony PA- 1 50, PA-1 54); por. Figura 3. [0320] Komórki wybarwiono pod kątem CLDN6 1 µg/ml IMAB027-AF647 przez 30 minut w 4°C, a następnie posortowano za pomocą FACS (sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjnie) przy użyciu sortera komórek BD FACSAria pod względem ich ekspresji CLDN6. 500 (PA-1 50, PA-1 54) lub 700 (COV318) komórek subpopulacji dodatniej lub ujemnej pod względem CLDN6 posortowano bezpośrednio do studzienek 6-studzienkowej płytki i pozostawiono do wzrostu przez okres do 14 dni, aż do uzyskania wystarczającej ilości powstałych kolonii. Dwa razy w tygodniu podłoże hodowlane zmieniano. Kolonie zabarwiono i utrwalono 0,5% fioletem krystalicznym w 10% etanolu przez 20 minut, przemyto trzykrotnie wodą destylowaną i pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu. Zdjęcia zostały zrobione, a kolonie zliczone ręcznie. Co najmniej 50 komórek uznano za kolonie. Na Figurze 4 pokazano reprezentatywne testy tworzenia kolonii linii komórek CO-3118 i CLDN6 PA-1 50 i 54. [0321] Co ciekawe, komórki ujemne pod względem CLDN6 wykazują znacznie niższe tworzenie kolonii w porównaniu z komórkami dodatnimi pod względem CLDN6 w obu liniach komórkowych. Na podstawie tych wyników wnioskujemy, że CLDN6 odgrywa ważną rolę w zdolności tworzenia kolonii, która jest istotną cechą rakowych komórek macierzystych.

Przykład 3: CLDN6 ulega koekspresji z markerami CSC CD24, CD90 i CD44 w linii komórkowej nowotworu jajnika

[0322] Zastosowanie swoistych profili ekspresji markera powierzchniowego jest powszechną strategią identyfikacji i izolacji CSC od nowotworów litych i linii komórkowych. Markery powierzchniowe stosowane w literaturze do izolacji CSC z nowotworu jajnika obejmują CD44, CD24, CD90, CD34, CD117 i CD133. W celu przeanalizowania, czy możemy zidentyfikować subpopulacje CSC w liniach komórek nowotworu jajnika, które zawierają małą subpopulację komórek dodatnich CLDN6, utworzyliśmy panel FACS zawierający przeciwciała przeciwko tym markerom powierzchniowym (Tabela 1). Ponadto włączyliśmy również przeciwciało do wykrywania CLDN6 w panelu w celu zbadania procentu kolokacji CLDN6 z dobrze ustalonymi markerami CSC, oceniając w ten sposób potencjał CLDN6 jako markera dla CSC. W tym celu komórki 1E6 linii komórkowej COV318 barwiono przez 30 minut w 4°C wskazanymi ilościami przeciwciał (patrz Tabela 1), a następnie komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem ich profilu ekspresji markera powierzchniowego. W naszym protokole barwienia uwzględniliśmy również barwnik żywotności eFluor®506 w celu wykluczenia martwych komórek z naszych analiz. Eksperyment przeprowadzono w trzech powtórzeniach i zarejestrowano 50 000 zdarzeń z każdej próbki za pomocą cytometru przepływowego BD Canto II. Analizę zarejestrowanych komórek przeprowadzono za pomocą oprogramowania FlowJo.

Tabela 1: Panel FACS CSC. Pokazano panel FACS zastosowany do analizy markera CSC i ekspresji CLDN6 w liniach komórek nowotworu jajnika. Podano ilości przeciwciał zastosowanych do odpowiednich markerów i sprzężonych fluorochromów. Marker Ilość przeciwciała/Test Fluorochrom przeciwciała Powierzchniowy CD44 test 5 µl/100 µl FITC CD133/1 test 2 µl/100 µl PE CD90 test 2,5 µl/100 µl PerCP-Cy™5.5 Test 1 µg/100 µl Biotyny CD117 APC-Cy7 Test 0,05 µg/100 µl SA CD34 test 5 µl/100 µl Brilliant Violet™ 421 CD24 test 2 µl/100 µl PE-Cy7

63 Marker Ilość przeciwciała/Test Fluorochrom przeciwciała Powierzchniowy CLDN6 test 2,5 µl/100 µl Alexa Fluor® 647 Utrwalalny barwnik żywotności żywe/martwe 0,2 µl/200 µl PBS eFluor®506

[0323] Analizy FACS ujawniły, że komórki COV318 eksprymują podpopulacje markera CSC CD44, CD90 i CD24 oraz że CLDN6 kolokuje się co najmniej częściowo ze wszystkimi trzema markerami (Figura 5A). Następnie zastosowaliśmy różne strategie bramkowania w celu obliczenia odsetek kolokacji wszystkich czterech markerów. Najpierw obliczyliśmy odsetek komórek CD44, CD24, CD90 i CLDN6 dodatnich w całej populacji żywych komórek. Stwierdziliśmy, że 0,18% żywych komórek jest dodatnich dla wszystkich czterech markerów. Następnie obliczyliśmy odsetek komórek CD44, CD24 i CD90 dodatnich w populacji żywych komórek, co może reprezentować frakcję CSC. Stwierdziliśmy, że 0,23% komórek jest dodatnich dla wszystkich trzech markerów, gdy zestawimy je z całą populacją żywych komórek, podczas gdy w odniesieniu do subpopulacji dodatniej pod względem CLDN6 stwierdziliśmy, że ułamek 20,1% komórek jest potrójnie pozytywny wskazując 87- krotne stężenie trzech markerów w subfrakcji CLDN6-dodatniej. W ostatnim etapie obliczyliśmy następnie odsetek dodatnich komórek CLDN6 z jednej strony w całej populacji żywych komórek, az drugiej strony w dodatniej subpopulacji CD44/CD24/CD90. Stwierdziliśmy stężenie komórek eksprymujących CLDN6 od 0,91% w całej populacji komórek do 66,87% we frakcji CSC, co wskazuje na 74-krotny wzrost (Figura 5B). [0324] Razem dane te pokazują, że CLDN6 jest gromadzony we frakcji CSC i odwrotnie, markery CSC są wzbogacone w subpopulacji dodatniej pod względem CLDN6. Te ustalenia wskazują, że CLDN6 jest markerem dla CSC.

Przykład 4: Wzbogacenie komórek eksprymujących CLDN6 prowadzi do akumulacji ustalonych markerów CSC CD44, CD24 i CD90

[0325] Wykazano, że izolowane frakcje CSC z linii komórkowych i nowotworów są często wzbogacane dla markerów CSC, takich jak CD44 i CD24. W celu przeanalizowania potencjału CLDN6 jako nowego markera dla CSC, zbadaliśmy, czy izolacja komórkowa frakcji dodatnich CLDN6 z komórek masy prowadzi do akumulacji ustalonych markerów jajnikowych CSC. [0326] W tym celu komórki COV318 barwiono 0,5 µg/ml IMAB027 przez 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie inkubowano z kozim drugorzędowym przeciwciałem przeciw ludzkim IgG (1: 300) przez 10 minut w temperaturze 4°C, a następnie frakcje komórkowe CLDN6-dodatnie i CLDN6-ujemne izolowano z komórek COV318 przez sortowanie FACS przy użyciu sortera komórek BD FACSAria. Wybrane komórki następnie namnażano przez 10 dni w standardowych warunkach wzrostu. Komórki 1E6 obu subpopulacji wybarwiono pod kątem markerów CSC CD44, CD24, CD90, CD34, CD117 i CD133 przez 30 minut w temperaturze 4°C (szczegóły patrz Tabela 1) i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem ich profilu ekspresji markera powierzchniowego. Z każdej próbki zarejestrowano 50 000 zdarzeń za pomocą cytometru przepływowego BD Canto II, a analizę zarejestrowanych komórek przeprowadzono za pomocą oprogramowania FlowJo. [0327] Analizy FACS wykazały, że około 50% komórek posortowanej frakcji pospolitej CLDN6 jest nadal dodatnich pod względem CLDN6 po hodowli w standardowych warunkach przez 10 dni, podczas gdy posortowane komórki ujemne pod względem CLDN6 są całkowicie negatywne pod względem CLDN6. Co ważne, stwierdziliśmy, że frakcja dodatnia pod względem CLDN6 wykazała akumulację markerów CSC CD44, CD24 i CD90 w porównaniu z frakcją komórkową ujemną pod względem CLDN6 komórek COV318. Reprezentatywne wykresy punktowe różnych próbek pokazano na Figurze 6A. Dalsze

64 oznaczanie ilościowe poziomów ekspresji tych markerów ujawniło 99-krotne wzbogacenie CD44, 8-krotne wzbogacenie CD90 i 33-krotne wzbogacenie CD24, gdy porównano subpopulacje dodatnie i CLDN6-ujemne (Figura 6B). [0328] Te ustalenia pokazują, że CLDN6 może być stosowany jako marker selekcyjny do oddzielania frakcji CSC od masowych linii komórkowych, co wskazuje, że CLDN6 jest nowym markerem CSC.

Przykład 5: Linie komórkowe o wysokiej ekspresji CLDN6 wykazują wzbogacenie markerów CSC w porównaniu do komórek o niskiej ekspresji CLDN6

[0329] Wykazano, że CLDN6 wykazuje wysoką ekspresję w nowotworuch germinalnych, gruczolakorakach jajników i niektórych nowotworach o pierwotnym fenotypie. W przypadku, gdy CLDN6 jest markerem CSC, spodziewalibyśmy się akumulacji komórek o charakterystyce podobnej do CSC w takich liniach komórkowych lub nowotworach, a zatem akumulacji komórek dodatnich pod względem markera CSC. [0330] Badaliśmy cztery linie komórkowe o wysokiej ekspresji CLDN6, linie komórkowe raka jajnika OV90 i PA-1 oraz linie komórkowe raka jąder NEC-8 i NEC-14, pod kątem poziomów ekspresji ustalonych markerów CSC. W tym celu wybarwiono komórki 1E6 każdej linii komórkowej pod kątem markerów powierzchniowych CD44, CD24, CD90, CD34, CD117 i CD133, a także CLDN6 przez 30 minut w temperaturze 4°C (szczegóły - patrz Tabela 1), a komórki następnie analizowane za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem ich profili ekspresji. Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach i zarejestrowano 50 000 zdarzeń z każdej próbki za pomocą cytometru przepływowego BD Canto II, a analizę zarejestrowanych komórek przeprowadzono za pomocą oprogramowania FlowJo. Martwe komórki wyłączono z analizy przez wybarwienie komórek żywym barwnikiem eFluor®506. Reprezentatywne wykresy punktowe z każdej próbki pokazano na Figurze 7. [0331] Analizy FACS wykazały, że wszystkie badane linie komórkowe są w około 95% pozytywne pod względem CLDN6. Zgodnie z oczekiwaniami, te linie komórkowe o wysokiej ekspresji CLDN6 wykazują oprócz CLDN6 także akumulację ustalonych markerów CSC, przy czym komórki OV90 wykazują wysoką ekspresję CD44, CD133, CD24 i CD117, komórki PA-1 wykazujące wysoką ekspresję CD44, CD133, CD90 i Komórki CD117 i NEC- 8 i NEC-14 wykazują podwyższone poziomy ekspresji markerów CD133, CD90, CD24 i CD117. [0332] Te odkrycia wskazują, że linie komórkowe o wysokiej ekspresji CLDN6 są wzbogacone dla komórek podobnych do CSC i dodatkowo potwierdzają, że CLDN6 jest markerem CSC.

Przykład 6: Leczenie zaawansowanych ludzkich ksenotransplantowanych nowotworów kombinacją przeciwciała CLDN6 i leków chemioterapeutycznych hamuje wzrost komórek nowotworowych i przedłuża przeżycie w sposób synergistyczny

[0333] Hsd: Atymicznym myszom Nude-Foxn1nu wszczepiono ludzkie linie nowotworowe. Po ustaleniu nowotworów myszy z nowotworem zgrupowano i otrzymano swoiste dla CLDN6 przeciwciało monoklonalne (IMAB027), lek chemioterapeutyczny lub kombinację obu. Grupa kontrolna otrzymała bufor na przeciwciała (kontrola nośnika). [0334] Konkretnie, w celu leczenia ksenotransplantacji ludzkich nowotworów ES-2 (CLDN6), linię komórkową ludzkiego raka jajnika ES-2 stabilnie transfekowaną ludzkim CLDN6 hodowano na podłożu Minimum Essential Media (Life Technologies) zawierającym 1 x nieistotny roztwór aminokwasów (Life Technologie), 700 µg/ml G418 (Life Technologies) i 10% FCS (Life Technologies) w 37°C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2. W celu wszczepienia 6-tygodniowe samice Hsd: bezgrasowe myszy Nude-Foxn1nu

65 podskórnie zaszczepiono 5 x 106 komórek ES-2 (CLDN6) w 200 µl PBS w bok. W dniu 3 po podskórnym zaszczepieniu nowotworu myszy traktowano kontrolną solą fizjologiczną, przeciwciałem lub monoterapią lekiem chemioterapeutycznym i grupami terapii skojarzonej przeciwciało/lek cytostatyczny (n = 12 na grupę). Paklitaksel 15 mg/kg lub kontrolę soli fizjologicznej podano w dniu 3, 10 i 17 po wszczepieniu. Leczenie podtrzymujące przeciwciało rozpoczęto w dniu 4 trzy razy w tygodniu w dawce 35 mg/kg IMAB027 lub kontrolnego nośnika (bufor IMAB027) w bolusie (naprzemiennie dożylnio/dootrzewnowo/dootrzewnowo). Obciążenie nowotworu i zdrowie zwierząt monitorowano dwa razy w tygodniu. Myszy uśmiercano, gdy nowotwór osiągnął objętość maksymalnie do 1400 mm3 lub gdy nowotwór stał się wrzodowy. Hamowanie wzrostu nowotworu analizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa i testu wielokrotnego porównania post-hoc Dunna. [0335] W celu leczenia zaawansowanych ksenotransplantowanych nowotworów ludzkiej linii NEC14 ludzkiej komórki germinalnej linii komórek germinalnych hodowano zgodnie z instrukcjami dostawcy w pożywce RPMI 1640 GlutaMAX™ (Life Technologies) zawierającej 10% FCS (Life Technologies) w 37°C w nawilżany inkubator z 5% CO2. W celu wszczepienia 6-8-tygodniowe samice Hsd: bezgrasowe myszy Nude-Foxn1nu zaszczepiono podskórnie 2 x 107 komórkami NEC14 w 200 µl PBS w bok. W badaniu zaawansowanego leczenia nowotwory wyhodowano do objętości między 50 a 150 mm3, a myszy grupowano w grupach kontrolnych, monoterapii przeciwciałem lub lekiem cytostatycznym i grupami terapii skojarzonej przeciwciało/lek cytostatyczny (n = 19 na grupę) przed leczeniem. 6 dni po wszczepieniu, leki same lub w kombinacji lub kontrolę nośnika (sól fizjologiczną) podano w następujący sposób: 1 mg/kg bolusu cisplatyny ip zastrzyki w dniu 6, 7, 8, 9 i 10; 30 mg/kg karboplatyny w bolusie iniekcje dootrzewnowe w dniu 6, 13 i 20 oraz leczenie podtrzymujące przeciwciałem trzy razy w tygodniu 35 mg/kg IMAB027 lub kontrolne podłoże (bufor IMAB027) w bolusie (naprzemiennie dożylnio/dootrzewnowo/dootrzewnowo). Obciążenie nowotworu monitorowano dwa razy w tygodniu. Myszy uśmiercano, gdy nowotwór osiągnął objętość maksymalnie do 1400 mm3 lub gdy nowotwór stał się wrzodowy. Hamowanie wzrostu nowotworu analizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa i testu wielokrotnego porównania post-hoc Dunna. [0336] W porównaniu z grupą kontrolną, leczenie ksenotransplantowanych ludzkich nowotworów ES-2 (CLDN6) z ektopową ekspresją ludzkiego CLDN6 za pomocą paklitakselu nie jest skuteczne i nie wykazuje działania przeciwnowotworowego. Przeciwnie, IMAB027 hamuje wzrost nowotworu i przedłuża przeżycie u myszy. Leczenie kombinacją IMAB027 i paklitakselu synergistycznie hamuje wzrost nowotworu (Figura 8). [0337] Co więcej, zarówno cisplatyna, jak i IMAB027 jako pojedyncze środki są w stanie znacznie znacząco zmniejszyć wzrost nowotworu u zwierząt z nowotworem NEC14. Jednak po początkowym zahamowaniu wzrostu nowotworu zaobserwowaliśmy nawracający wzrost nowotworu u większości zwierząt. W terapii skojarzonej cisplatyna i IMAB027 działają synergistycznie i nie tylko hamują wzrost nowotworu, ale wywołują całkowitą remisję nowotworu NEC14. Dane dotyczące przeżycia najbardziej imponująco pokazują skuteczność terapeutyczną IMAB027 w połączeniu z cisplatyną. W porównaniu z podejściami do pojedynczego środka prawie wszystkie myszy leczone IMAB027 razem z cisplatyną nadal żyły 90 dni po wszczepieniu nowotworu (Figura 9). [0338] W zaawansowanym leczeniu myszy z ksenotransplantacjami nowotworów NEC14, inne pochodne platyny, takie jak karboplatyna, wykazują jedynie bardzo ograniczoną skuteczność przeciwnowotworową. Połączenie karboplatyny z IMAB027 powoduje jednak synergistyczne działanie hamujące rozwój nowotworu z wysoce skutecznym hamowaniem wzrostu nowotworu i przedłużeniem przeżycia (Figura 10). [0339] Zatem połączenie przeciwciała swoistego dla CLDN6 z lekami chemioterapeutycznymi zwiększa hamowanie wzrostu nowotworu i przedłuża przeżycie pędu wszczepionego z ludzkimi komórkami nowotworowymi. Połączenie przeciwciała z lekami

66 chemioterapeutycznymi daje efekt synergistyczny w odniesieniu do hamowania wzrostu komórek nowotworowych i przedłużenia przeżycia.

Przykład 7: CLDN6 jest markerem CSC

Przykład 7.1: CLDN6 jest ważny dla sfer tworzących zachowanie komórek nowotworu jajnika

[0340] Innym silnym testem do analizy właściwości podobnych do CSC komórek nowotworowych jest test tworzenia kulek. Za pomocą tego testu można łatwo zbadać zdolność komórek do wzrostu niezależnego od zakotwiczenia, co jest typową cechą CSC. W celu przeanalizowania, czy CLDN6 odgrywa rolę w niezależnym od zakotwiczenia wzroście komórek nowotworowych, wybraliśmy komórki COV318, linię komórek nowotworowych jajnika, która zawiera tylko subpopulację komórek dodatnich CLDN6. Komórki COV318 posortowano pod względem ich ekspresji CLDN6, a populacje komórek dodatnich i ujemnych CLDN6 pozostawiono do utworzenia kulek przez 21 dni w warunkach swoistych dla komórek macierzystych. Testy tworzenia kulek ujawniły, że komórki COV318 dodatnie pod względem CLDN6 wykazują zdolność do tworzenia kulek, gdy są hodowane w warunkach swoistych dla komórek macierzystych, podczas gdy komórki ujemne pod względem CLDN6 prawie całkowicie umierają (Figura 11A). Te ustalenia wskazują, że frakcja dodatnia CLDN6 reprezentuje populację wzbogaconą w komórki macierzyste, która wykazuje zdolność do wzrostu niezależnego od zakotwiczenia. [0341] W celu zdefiniowania zdolności komórek COV318 dodatnich pod względem CLDN6 do przejścia przez liczne cykle podziału komórek przy zachowaniu ich niezróżnicowanego stanu, przeanalizowaliśmy zdolność kulek do wytwarzania kulek drugiej generacji. W tym celu sfery pierwszej generacji komórek COV318 dodatnich pod względem CLDN6 (dzień 22 po posianiu) rozdzielono na pojedyncze komórki, a następnie ponownie posiano. 23 dni po ponownym nałożeniu mogliśmy wyraźnie zaobserwować, że utworzyła się druga generacja kulek i te nowo utworzone kulki były morfologicznie bardziej regularne niż kulki pierwszej generacji (Figura 11B). Te obserwacje dalej potwierdzają, że frakcja dodatnia CLDN6 komórek COV318 reprezentuje frakcję komórek macierzystych tej linii komórkowej. [0342] Podsumowując, wyniki te wyraźnie pokazują, że CLDN6 odgrywa uderzającą rolę w niezależnym od zakotwiczenia wzroście komórek nowotworu jajnika, co jest istotną cechą rakowych komórek macierzystych.

Przykład 7.2: Wzbogacanie komórek COV318-dodatnich pod względem CLDN6 po leczeniu lekami chemioterapeutycznymi in vitro

[0343] Linia komórkowa nowotworu jajnika COV318 wykazuje heterogeniczną ekspresję CLDN6 i bardzo mała subpopulacja komórek (∼ 0,3 - 0,5%) eksprymuje CLDN6. Traktowanie komórek COV318 pochodnymi platyny in vitro generuje w każdym przypadku resztkową populację komórek z wyższym odsetkiem (> 2%) komórek dodatnich CLDN6 (Figura 12). Swoista akumulacja komórek dodatnich CLDN6 po leczeniu wskazuje, że komórki te mogą mieć selektywne przeżycie lub przewagę wzrostu podczas chemioterapii. Odporność na konwencjonalną chemioterapię jest cechą CSC.

Przykład 7.3: Wzbogacanie komórek COV318-dodatnich pod względem CLDN6 in vivo

[0344] W poprzednich badaniach stwierdziliśmy, że komórki COV318 wstrzyknięte podskórnie w bok bezgrasich myszy Nude są słabo rakotwórcze. Przeciwnie, u myszy, które otrzymały komórki COV318 przez wstrzyknięcie dootrzewnowe, rozwinęły się złośliwe wodobrzusze i nowotwory otrzewnej w ciągu ponad 100 dni. W przeciwieństwie do

67 macierzystych komórek COV318 (Figura 13A), większość komórek izolowanych z wodobrzusza i nowotworów była pozytywna pod względem CLDN6 (Figura 13B, górny panel). Komórki COV318 ponownie tracą ekspresję CLDN6 in vitro po hodowli w standardowych warunkach (Figura 13B, dolny panel). Oznacza to, że komórki COV318 dodatnie pod względem CLDN6 wykazują większą zdolność tworzenia nowotworów, co sugeruje, że mała subpopulacja dodatnia pod względem CLDN6 zawiera CSC.

Przykład 7.4: CLDN6 koreluje z markerami rakowych komórek macierzystych jajnika w pierwotnych próbkach nowotworów

[0345] Ponieważ nasze poprzednie wyniki wykazały, że CLDN6 kolokalizuje się z niektórymi markerami CSC w liniach komórek nowotworu jajnika, zapytaliśmy następnie, czy ekspresja CLDN6 również koreluje z markerami CSC w pierwotnych próbkach nowotworów od pacjentów z nowotworem jajnika. [0346] W tym celu ekspresja mRNA CLDN6 i wybranych markerów opisanych w literaturze jako swoistych dla rakowych komórek macierzystych w raku jajnika (CTCFL, LIN28B, CD24, GNL3, EpCAM, CD44, ABCG2, ALDH1A1, AMACR, ATXN1, BMI1, BMP4, CD34 , CD117, Myd88, Nanog, Notch 1, Pou5F1, CD133, Snail, Sox 2) analizowano w 42 próbkach ludzkiego nowotworu jajnika sposobem qRT-PCR. Kolejną analizę korelacji CLDN6 z tymi markerami przeprowadzono za pomocą r Spearmana. Wykresy punktowe z istotnych korelacji, a także podsumowanie wszystkich korelacji pokazano na Figurze 14. [0347] Stwierdzono dodatnią korelację dla CLDN6 z CTCFL, LIN28B, CD24, GNL3 i EPCAM, podczas gdy stwierdzono, że CD44 koreluje ujemnie z CLDN6 w analizowanych próbkach nowotworu jajnika (Figura 14A). W przypadku wszystkich innych badanych markerów nie zaobserwowano istotnej korelacji (Figura 14B). [0348] Te ustalenia dodatkowo potwierdzają, że CLDN6 jest markerem CSC.

Przykład 8: Aktywność przeciwnowotworowa przeciwciał anty-CLDN6 jest wzmocniona przez połączenie z lekami chemioterapeutycznymi

Przykład 8.1: Wpływ środków chemioterapeutycznych na ADCC za pośrednictwem IMAB027

[0349] Wpływ środków chemioterapeutycznych na ADCC za pośrednictwem IMAB027 analizowano komórkami COV362 (Luc), które wstępnie traktowano odpowiednio karboplatyną, gemcytabiną, paklitakselem, doksorubicyną i topotekanem. Wstępne traktowanie komórek docelowych powoduje zwiększenie poziomu białka CLDN6 na powierzchni komórki, jak pokazano za pomocą cytometrii przepływowej (Figura 15B, D, F, H i J). W porównaniu z nieleczonymi komórkami docelowymi, maksymalna liza komórek traktowanych chemoterapeutykami jest zwiększona do 3-krotnie (Figura 15A, C, F, G i I). Podsumowując, działanie przeciwnowotworowe IMAB027 można wzmocnić w połączeniu z lekami chemioterapeutycznymi.

Przykład 8.2: Połączenie wielo chemioterapii PEB (cisplatyna, etopozyd i bleomycyna) z IMAB027 bardzo skutecznie zwiększa hamowanie wzrostu nowotworu i wydłuża przeżycie myszy z ludzką linią nowotworową NEC14

[0350] Hsd: Atymicznym myszom Nude-Foxn1nu wszczepiono podskórnie linią komórek nowotworowych ludzkich komórek germinalnych NEC14. Myszy z bardzo zaawansowanymi nowotworami randomizowano i leczono przeciwciałem IMAB027, PEB z wieloma chemioterapiami (cisplatyną, etopozydem i bleomycyną) lub kombinacją IMAB027 i PEB.

68 [0351] W porównaniu do myszy nieleczonych i leczonych IMAB027, wielochemia chemioterapii bardzo znacząco zmniejsza wzrost nowotworu (Figura 16A). Jednak po tym, jak nowotwory początkowo zareagowały na leczenie PEB, zaczęły rosnąć u większości zwierząt w 30 dniu. Trwałe zahamowanie wzrostu nowotworu osiągnięto tylko w połączeniu, w którym PEB i IMAB027 działają razem synergistycznie (Figura 16B). Nieleczone myszy wykazywały medianę przeżycia wynoszącą 30 dni, podczas gdy medianę przeżycia wynoszącą 34 i 97 dni obserwowano u myszy leczonych odpowiednio IMAB027 i PEB. W grupie leczonej PEB, 3/14 (21%) myszy wykazało całkowitą remisję nowotworu, a 1/14 (7%) myszy miało resztkową masę nowotworu ~ 30 mm3 na koniec badania. Nieoczekiwanie całkowitą regresję nowotworu zaobserwowano u 12/14 (86%) myszy leczonych PEB w połączeniu z IMAB027. 11 myszy wyleczono bez nawrotu przez ponad 6 miesięcy, a jedną mysz wolną od nowotworu uśmiercano w 93 dniu z powodu złych ogólnych warunków zdrowotnych (Figura 16C). Badanie wykazało, że zwierzęta z bardzo zaawansowanymi ludzkimi nowotworami jąder NEC14, które otrzymały PEB w połączeniu z IMAB027, miały znacznie dłuższe przeżycie i znacznie wyższy odsetek odpowiedzi w porównaniu ze zwierzętami leczonymi samą chemioterapią.

Przykład 9: Koniugaty przeciwciało anty-CLDN6-lek są wysoce skuteczne w leczeniu nowotworów wykazujących ekspresję CLDN6

Przykład 9.1: Aktywność wiążąca i przeciwnowotworowa sprzężonego z toksyną IMAB027 in vitro

[0352] Względne powinowactwa wiązania koniugatów IMAB027-lek IMAB027-DM1 i IMAB027-vcMMAE badano na linii komórkowej nowotworu jajnika OV90 za pomocą cytometrii przepływowej. W eksperymencie wiązania nasycenia wykreślono stężenie przeciwciał względem mediany intensywności fluorescencji (MFI) i EC50 (stężenie przeciwciała, które wiąże się z połową miejsc wiązania w równowadze), a maksymalne wiązanie obliczono sposobem regresji nieliniowej. W porównaniu do niesprzężonego IMAB027, oba koniugaty IMAB027-lek wykazywały podobne niskie wartości EC50, a nasycenie wiązania osiągnięto przy niskich stężeniach (Figura 17A). Aktywności cytotoksyczne koniugatów IMAB027-lek określono za pomocą komórek OV90, stosując test proliferacji XTT. Krzywe dawka-odpowiedź pokazują podobne hamowanie wzrostu komórek nowotworowych dla IMAB027-DM1 i IMAB027-vcMMAE in vitro (Figura 17B). Podsumowując, IMAB027 skoniugowany z DM1 lub vcMMAE wiąże się z podobnym względnym powinowactwem do komórek docelowych dodatnich pod względem CLDN6, bardzo skutecznie indukując zabijanie komórek nowotworowych.

Przykład 9.2: Leczenie zaawansowanych ksenotransplantowanych ludzkich nowotworów sprzężonym z toksyną przeciwciałem anty-CLDN6 IMAB027 hamuje wzrost komórek nowotworowych, przedłuża przeżycie i pośredniczy w całkowitej regresji nowotworu

[0353] Przeciwnowotworową aktywność swoistego wobec CLDN6 przeciwciała IMAB027 skoniugowanego z lekiem cytotoksycznym badano na myszach, u których wprowadzono linie komórkowe ludzkiego raka CLDN6-dodatnie. W tym ukierunkowanym podejściu IMAB027 został przyłączony do majtanzynoidu DM1 lub aurystatyny E (MMAE), a wzrost nowotworu monitorowano u bezgrasowych myszy Nude-Foxn1nu z zaawansowanymi ksenotransplantacjami nowotworów.

Leczenie zaawansowanego modelu podskórnej ksenotransplantacji ludzkiego nowotworu jajnika OV90:

69

[0354] Przeciwnowotworowe działanie sprzężonego z toksyną IMAB027 badano na myszach z zaawansowanymi ksenotransplantacjami nowotworów ludzkich z jednorodną ekspresją CLDN6. Leczenie rozpoczęto 10 dnia po wszczepieniu komórek nowotworowych. Po iniekcji dożylnej jednego bolusa, IMAB027-DM1 i IMAB027-vcMMAE silnie hamowały wzrost ksenotransplantowanych komórek nowotworu jajnika OV90 jednorodnie eksprymujących CLDN6 (Figura 18 i 19A). Co ważniejsze, jednorazowe podanie 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE spowodowało całkowitą remisję nowotworu u 60% leczonych myszy (Figura 19B).

Leczenie zaawansowanego modelu podskórnej ksenotransplantacji ludzkiego nowotworu jajnika PA-1:

[0355] Działanie przeciwnowotworowe sprzężonego z toksyną IMAB027 badano również w modelu ksenotransplantacji zaawansowanego nowotworu z heterogeniczną ekspresją CLDN6. Po wszczepieniu podskórnej ksenotransplantacje nowotworu PA-1 tracą ekspresję CLDN6 po pewnym czasie (Figura 20C). Leczenie rozpoczęto w dniu 15. W tym czasie ksenotransplantacje nowotworu PA-1 zaczynają tracić ekspresję CLDN6. Zwierzęta otrzymały 4, 8 lub 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE przez pojedynczą iniekcję dożylną bolusa. Kontrolne zwierzęta otrzymały zamiast tego niesprzężony IMAB027 lub bufor kontrolny nośnika. [0356] Leczenie IMAB027-vcMMAE bardzo znacząco hamowało wzrost ksenotransplantowanego nowotworu PA-1 i przedłużało przeżycie myszy z nowotworem, podczas gdy IMAB027 lub IMAB027-DM1 (danych nie pokazano) nie wpływały na wzrost nowotworu PA-1 (Figura 20A i B). [0357] Obniżony poziom dodatnich komórek nowotworowych CLDN6 w masie nowotworu jest prawdopodobnie odpowiedzialny za słabą aktywność przeciwnowotworową IMAB027 i IMAB027-DM1 w tym modelu nowotworu in vivo. IMAB027-DM1 jest sprzężony poprzez nierozszczepialny łącznik z nieprzepuszczalną dla błony toksyną DM1. Przeciwnie, IMAB027-vcMMAE jest sprzężony z przepuszczalną przez błonę komórkową toksyną MMAE za pośrednictwem łącznika ciętego przez katepsynę. Uwalnianie przepuszczalnych przez błonę form MMAE po obróbce komórkowej ułatwia zabijanie komórek nowotworowych pozbawionych określonego epitopu (efekt obserwatora). Dlatego leczenie IMAB027-vcMMAE jest wysoce skuteczne w zwalczaniu nowotworów PA-1 zawierających zarówno komórki CLDN6 dodatnie, jak i CLDN6 ujemne. [0358] Podsumowując, IMAB027-vcMMAE jest bardzo skuteczny w zabijaniu ksenotransplantowanych ludzkich nowotworów z heterogenną ekspresją CLDN6 poprzez zabijanie komórek pobocznych aktywowanych przez komórki docelowe.

Leczenie zaawansowanego modelu podskórnej ksenotransplantacji ludzkiego nowotworu MKN74:

[0359] W przeciwieństwie do ksenoprzeszczepów nowotworów PA-1, które tracą ekspresję CLDN6 w nowotworuch zaawansowanych, ksenoprzeszczepy nowotworów MKN74 zyskują ekspresję CLDN6. Jak pokazano za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu swoistego dla CLDN6 przeciwciała IMAB027 <0,3% komórek linii komórkowej nowotworu żołądka MKN74 jest dodatnich pod względem CLDN6 in vitro. Co ciekawe, znaczna liczba komórek nowotworowych wykazuje ekspresję CLDN6 po wszczepieniu podskórnym u bezgrasowych myszy Nude (Figura 21C). Leczenie ustalonych ksenoprzeszczepów nowotworów MKN74 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE spowodowało wysoce znaczące zahamowanie wzrostu nowotworu i przedłużenie przeżycia (Figura 21A i B).

70 [0360] Zahamowanie wzrostu nowotworu obserwowane w przypadku IMAB027-vcMMAE może być spowodowane przez aktywowane przez komórki docelowe zabijanie komórek znajdujących się w pobliżu.

Leczenie zaawansowanego modelu śródotrzewnowego ksenoprzeszczepu ludzkiego nowotworu jajnika PA-1:

[0361] Oprócz leczenia s.c. ksenotransplantowanych nowotworów, skoniugowane z toksyną przeciwciała IMAB027 badano również pod kątem ich działania przeciwnowotworowego w śródotrzewnowym modelu ksenotransplantacji nowotworu z wykorzystaniem komórek PA-1 ektopowo eksprymujących lucyferazę do monitorowania in vivo (Figura 22). Myszy otrzymały 16 mg/kg IMAB027-DM1 lub 16 mg/kg IMAB027-vcMMAE przez pojedynczą iniekcję dożylną bolusa w dniu 14 po wszczepieniu komórek nowotworowych. [0362] Pomiar intensywności bioluminescencji in vivo ujawnił zahamowanie wzrostu przerzutów nowotworu PA-1 do otrzewnej po leczeniu IMAB027-DM1. Ponadto, IMAB027- vcMMAE wykazał znacznie wyższy efekt przeciwnowotworowy niż IMAB027-DM1 lub nośnik z całkowitą regresją nowotworów otrzewnowych u 100% zwierząt (Figura 22). [0363] Podsumowując, IMAB027-vcMMAE i IMAB027-DM1 są bardzo skuteczne bez wykazywania toksycznych skutków ubocznych w zakresie stężeń testowanych in vivo. IMAB027-DM1 znacząco hamował wzrost nowotworów podskórnych ksenotransplantowanych nowotworów i zmniejszał wzrost nowotworów otrzewnowych ksenotransplantowanych nowotworów. IMAB027-vcMMAE silnie hamował wzrost nowotworu i przedłużał przeżycie zwierząt z podskórnymi lub otrzewnowymi ksenotransplantowanymi nowotworami ludzkimi z jednorodną lub nawet heterogeniczną ekspresją CLDN6. Co najbardziej imponujące, duża część zwierząt z nowotworem została wyleczona po leczeniu przeciwciałem skoniugowanym z MMAE. Znakomita aktywność przeciwnowotworowa IMAB027-vcMMAE, szczególnie obserwowana u zwierząt, których nowotwory wykazywały heterogeniczną ekspresję CLDN6, pokazuje, że koniugaty IMAB027-vcMMAE są odpowiednie do leczenia nowotworów o niskim odsetku dodatniej CLDN6.

Przykład 9.3: Endocytoza przeciwciał swoistych wobec CLDN6 zależy od ich powinowactwa i epitopu wiążącego CLDN6

[0364] Skuteczność cytotoksyczna przeciwciał skoniugowanych z toksynami ściśle zależy od ich zależnego od celu potencjału internalizacji. Zatem wytwarzanie przeciwciał o wysokim wskaźniku endocytozy jest niezbędnym kluczowym czynnikiem w rozwoju przeciwciał skoniugowanych z toksyną. [0365] Skuteczność endocytozy zbadano in vitro, inkubując endogennie ludzkie komórki raka eksprymujące CLDN6 wraz z reaktywnymi CLDN6 monoklonalnymi chimerycznymi przeciwciałami i przeciwludzkimi fragmentami Fab, które są sprzężone z toksyną saporyną. Internalizacja kompleksów przeciwciało/Fab-saporyna związana z CLDN6 powoduje swoiste zabijanie komórek i może być zmierzona za pomocą testu żywotności komórek. Badania przesiewowe różnych przeciwciał reaktywnych wobec CLDN6 pokazują, że endocytoza zależy nie tylko od powinowactwa wiązania przeciwciała, ale także od epitopu antygenowego. Obserwujemy, że wiązanie swoistych dla CLDN6 przeciwciał z epitopem w pierwszej pętli zewnątrzkomórkowej CLDN6 wspiera endocytozę w ludzkich komórkach raka OV-90 i PA-1. Warto zauważyć, że reaktywne wobec CLDN6 przeciwciało 5F2D2, które wiąże się z podobnym do wyższego powinowactwa, ale z innym epitopem, wykazuje niższy potencjał cytotoksyczny w tym teście (Figura 23).

Przykład 10: Materiały i sposoby zastosowane w powyższych przykładach od 7 do 9

71

Hodowla Komórkowa:

[0366] Komórki COV362 (Luc) i PA-1 (Luc) stabilnie eksprymujące luminescencyjny gen reporterowy zostały wygenerowane przez stabilną transfekcję linii komórkowych COV362 (ECACC, 07071910) i PA-1 (ATCC, CRL-1572) odpowiednio lucyferazą świetlika. [0367] Komórki NEC14 (JCRB, 0162) i MKN74 (JCRB, 0255) hodowano w pożywce RPMI1640 (Gibco, 61870-010) uzupełnionej 10% FCS inaktywowanej cieplnie (Gibco, 10270-106). Komórki COV318 (ECACC, 07071903) i COV362 (Luc) hodowano w DMEM (Gibco, 41965-039) zawierającym 2 mM GlutaMAX (Gibco, 35050-038) i 10% FCS naktywowanego ciepłem. Komórki PA-1 i PA-1 (Luc) hodowano w MEM (Gibco, 31095- 029) uzupełnionej 1,5 g/l wodorowęglanu sodu (Invitrogen, 25080), 1 mM pirogronianu sodu (Invitrogen, 11360), 1% nie- niezbędne aminokwasy (Gibco, 11140-035) i 10% FCS inaktywowany cieplnie. Komórki OV90 (ATCC, CRL-11732) hodowano w mieszaninie 1: 1 MCB105 (Sigma, M6395) i pożywce 199 (Sigma, M4530) uzupełnionej 1,5 g/l wodorowęglanu sodu i 15% FCS inaktywowanej cieplnie. Komórki hodowano w 37°C i 5% CO2.

Oznaczanie ekspresji CLDN6 za pomocą cytometrii przepływowej:

[0368] Komórki zebrano 0,05% trypsyną/EDTA (Gibco, 25300-054), przemyto buforem FACS (PBS zawierającym 2% FCS (Gibco, 10270-106) i 0,1% azydku sodu (Applichem, A1430) i ponownie zawieszono w buforze FACS w stężenie 2 x 106 komórek/ml. 100 µl zawiesiny komórek inkubowano z przeciwciałem anty-CLDN6 IMAB027 lub kontrolnym izotypem ludzkiego przeciwciała IgG1 (Sigma, I5154) w stężeniu 2,5 µg/ml przez 30 minut w 4°C. Komórki przemywano trzykrotnie buforem FACS i inkubowano ze sprzężonym z APC fragmentem F(ab’)2 koziej-antyludzkiej IgG (Jackson ImmunoResearch, 109-136-170) rozcieńczonym 1: 200 w buforze FACS przez 30 minut w temperaturze 4°C. Komórki przemyto dwukrotnie i ponownie zawieszono w buforze FACS. Wiązanie analizowano za pomocą cytometrii przepływowej z zastosowaniem BD FACSArray (BD Biosciences) i oprogramowania FlowJo (Tree Star Inc.). Żywy/martwy barwnik jodek propidyny (Sigma, P4864) zastosowano do wykluczenia martwych komórek z analizy.

Traktowanie komórek COV318 pochodnymi platyny:

[0369] Komórki COV318 (1,2 x 106 komórek na 100 mm szalki do hodowli komórek) hodowano w standardowych warunkach. Po 24 godzinach komórki traktowano 0,5 µg/ml cisplatyny lub 2 µg/ml karboplatyny i inkubowano przez 96 godzin. Pożywkę zmieniono i traktowane komórki hodowano w standardowych warunkach wzrostu. Po 3 i 6 dniach komórki analizowano pod kątem ekspresji CLDN6 za pomocą cytometrii przepływowej.

Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC) po leczeniu środkami cytostatycznymi:

[0370] Linię komórkową ludzkiego raka jajnika COV362 stabilnie transfekowaną lucyferazą jako reporter zastosowano do określenia wpływu karboplatyny i paklitakselu na ADCC za pośrednictwem IMAB027. Komórki COV362 (Luc) (3 x 106 komórek na 150 mm szalki do hodowli komórek) hodowano w standardowych warunkach. Po 24 godzinach komórki traktowano 5 ng/ml paklitakselu, 20 µg/ml karboplatyny, 25 ng/ml gemcytabiny, 20 ng/ml doksorubicyny lub 7,5 ng/ml topotekanu i inkubowano przez 4 dni. Pożywkę zmieniono i traktowane komórki hodowano w standardowych warunkach wzrostu przez

72 kolejne 3 dni w przypadku karboplatyny i gemcytabiny lub przez 10 dni w przypadku paklitakselu, doksorubicyny lub topotekanu. [0371] Komórki zebrano za pomocą 0,05% trypsyny/EDTA (Gibco, 25300-054) i doprowadzono do stężenia 2 x 105 komórek/ml w DMEM zawierającym 2 mM glutaminy (Gibco, 25030-081) i 20 mM HEPES (Gibco, 15630 -056). 1 x 104 komórek na studzienkę zaszczepiono na białej 96-studzienkowej płytce PP i inkubowano przez ∼godzin w 37°C i 5% CO2. [0372] PBMC (komórki jednojądrzaste krwi obwodowej) izolowano z próbek krwi ludzkiej dawcy przez wirowanie w gradiencie gęstości przy użyciu Ficoll Hypaque (GE Healthcare, 17144003). Wyizolowano interfazę zawierającą PBMC i komórki przemyto trzy razy PBS zawierającym 2 mM EDTA. PBMC zawieszono ponownie w pożywce X-Vivo 15 (Lonza, 7 BE04-418Q) w stężeniu 1,6 x 10 komórek/ml i przechowywano w 37°C i 5% CO2 aż do oznaczenia. [0373] Do komórek dodano 25 µl IMAB027 i przeciwciało kontrolne izotypowe we wskazanych stężeniach. Następnie dodano 25 µl zawiesiny PBMC i komórki inkubowano przez 24 godziny w 37°C i 5% CO2. [0374] Po dodaniu 10 µl 8% Triton X-100 (Sigma, T8787) w PBS do całkowitej kontroli lizy i 10 µl PBS do maksymalnie żywych kontroli komórek i próbek, 50 µl mieszanki lucyferiny (3,84 mg/ml D-lucyferiny ( Sigma Aldrich, 50227) i 160 mM HEPES w ddH20)) i komórki inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Bioluminescencję zmierzono za pomocą luminometru (Infinite M200, TECAN). Wyniki podano jako zintegrowane cyfrowe względne jednostki światła. [0375] Swoistą lizę oblicza się jako:

(próbka - całkowita liza) swoista liza [%] = 100 - [ (maksymalna żywotność x 100 ] komórek - całkowita liza)

maks. żywotne komórki: 10 µl PBS, bez przeciwciała całkowita liza: 10 µl 8% Triton X-100 w PBS, bez przeciwciała

Dootrzewnowe wszczepienie komórek COV318 u bezgrasowych myszy Nude:

[0376] Rakotwórczość in vivo ludzkiej linii komórkowej nowotworu jajnika COV318 i akumulację komórek dodatnich CLDN6 badano na myszach. Tym samym, 2 x 107komórek COV318 ponownie zawieszonych w PBS wstrzyknięto dootrzewnowo 6-8-tygodniowym samicom myszy Hsd: bezgrasiczym Nude-Foxn1nu. Myszy monitorowano codziennie. Gdy objawy zagrażające życiu wyraźnie się ujawniły, zwierzę uśmiercano. Komórki nowotworu i puchliny brzusznej izolowano i hodowano do dalszej analizy. Guzy rozdzielono mechanicznie, przepuszczono przez siatkę i przemyto podłożem DMEM (Gibco, 41965-039). W celu otrzymania zawiesiny pojedynczych komórek, komórki nowotworowe traktowano akutazą (Life Technologies, A11105-01) przez 30 minut w 37°C, przepuszczono przez 40 µm sitko komórkowe i przemyto podłożem DMEM. Zebrano wodobrzusze i usunięto zanieczyszczające krwinki czerwone, stosując bufor do lizy ACK (chlorek amonu-potas) (Invitrogen, A10492-01). Komórki nowotworowe i wodobrzusza hodowano w standardowych warunkach przy użyciu standardowej pożywki COV318 uzupełnionej penicyliną/streptomycyną (Gibco, 15140). Komórki badano pod kątem ekspresji CLDN6 sposobem cytometrii przepływowej.

Leczenie bardzo zaawansowanych ksenotransplantowanych nowotworów ludzkich NEC14:

73 [0377] W celu wszczepienia 6-8-tygodniowe samicom Hsd: bezgrasowych myszy Nude- Foxn1nu zaszczepiono podskórnie 2 x 107komórki NEC14 w 200 µl PBS w bok. W bardzo zaawansowanym badaniu dotyczącym leczenia nowotwory hodowano przez 13 dni do objętości maksymalnie 170 mm3, a myszy grupowano w grupie kontrolnej, IMAB027, PEB (cisplatyna, etopozyd, bleomycyna) i IMAB027/PEB (n = 14 na grupę) przed leczeniem. [0378] 13 dni po wszczepieniu leki podawano w następujący sposób: 1 mg/kg bolus cisplatyny, iniekcje dootrzewnowe w dniu 13, 14, 15, 16 i 17; 5 mg/kg etopozydu w bolusie iniekcje dootrzewnowe w dniu 13, 14, 15, 16 i 17; 10 mg/kg bolomycyny, iniekcje dootrzewnowe w dniu 13, 17 i 21. IMAB027 zastosowano trzy razy w tygodniu od dnia 13 do dnia 101 w bolusie naprzemiennie iniekcję dożylną./dootrzewnową/dootrzewnową 35 mg/kg IMAB027. Jako kontrole nośnika myszy otrzymały bufor substancji leczniczej zamiast przeciwciała lub 0,9% roztwór NaCl zamiast PEB. [0379] Obciążenie nowotworem i zdrowie zwierząt monitorowano dwa razy w tygodniu. Myszy uśmiercano, gdy nowotwórosiągnął objętość 1400 mm3 lub gdy nowotwór stał się wrzodowy. Hamowanie wzrostu nowotworu analizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa i testu wielokrotnego porównania post-hoc Dunna.

Test Formowania Kulek:

[0380] W celu utworzenia kulek, komórki COV318 wybarwiono pod kątem CLDN6 0,5 µg/ml IMAB027 przez 30 minut w 4°C, a następnie inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem koziej anty-ludzkiej IgG (1: 300) przez 10 minut w 4°C i komórki zostały następnie posortowane pod względem ich ekspresji CLDN6 przy użyciu sortera komórek BD FACSAria. 1 x 106 komórek sortowanych dodatnio lub ujemnie względem CLDN6 posiano następnie do studzienek 6-studzienkowej płytki Ultra Low Attachment Plate (Corning) w wolnej od surowicy pożywce DMEM/F12 zawierającej 0,4% albuminy surowicy bydlęcej, 20 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów, 10 ng/ml czynnika wzrostu naskórka i 5 μg/ml insuliny i komórek pozostawiono do utworzenia kulek przez 21 dni w tych swoistych dla komórek macierzystych warunkach. Pożywkę wymieniano co drugi dzień bez zakłócania kulek, a reprezentatywne zdjęcia były regularnie robione. [0381] W celu wytworzenia kulek drugiej generacji, kule pierwszej generacji komórek COV318 dodatnich pod względem CLDN6 (dzień 22 po posianiu) zostały zdysocjowane do pojedynczych komórek, a następnie ponownie umieszczone w studzienkach 6- studzienkowych płytek Ultra Low Attachment Plates. Ponownie, pożywkę wymieniano co drugi dzień bez zakłócania utworzonych sfer i regularnie robiono reprezentatywne zdjęcia.

Ilościowa analiza RT-PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu systemu Bio Mark™ HD (Fluidigm):

[0382] 42 próbki ludzkiego nowotworu jajnika analizowano sposobem qRT-PCR za pomocą testów ekspresji genu TaqMan® (technologie życia) dla wybranych czynników swoistych dla rakowych komórek macierzystych jajnika (CTCFL, LIN28B, CD24, GNL3, EpCAM, CD44, ABCG2, ALDH1A1, AMACR, ATXN1, BMI1, BMP4, CD34, CD117, Myd88, Nanog, Notch 1, Pou5F1, CD133, Snail, Sox 2) przy użyciu systemu Bio Mark™ HD (Fluidigm). Izolację RNA z próbek nowotworu jajnika przeprowadzono za pomocą RNeasy Mini Kit (Qiagen), a cDNA zsyntetyzowano za pomocą PrimeScript RT Reagent Kit (Takara Bio Inc.) zgodnie z instrukcjami odpowiedniego producenta. Próbki przygotowano i analizowano zgodnie z Fluidigm® Advanced Development Protocol 28 - szybka analiza ekspresji genów przy użyciu TaqMan® GE Assays rev A2. Ładowanie na 96.96 Gene Expression Dynamic Array IFCs została wykonana przez IFC Controller HX. Układy matryc analizowano za pomocą systemu Fluidigm BioMark™ HD. TaqMan PreAmp MasterMix został zakupiony w Applied Biosystems. Zestawy danych oceniono zgodnie z sposobem ΔΔCt. Analizę korelacji

74 CLDN6 z wybranymi markerami rakowych komórek macierzystych jajnika przeprowadzono za pomocą r Spearmana. Istotność wartości korelacji oceniono za pomocą testu współczynników korelacji. Wartości p skorygowano w testach wielokrotnych przy użyciu sposobu Benjaminiego i Hochberga, a skorygowane wartości p ≤ 0,05 uznano za znaczące.

Koniugacja toksyny przeciwciała CLDN6

[0383] Koniugacje toksyn przeciwciał monoklonalnych przeprowadzono w Piramal Healthcare (Grangemouth, Wielka Brytania). [0384] W celu sprzęgania DM1, nagie przeciwciała modyfikowano za pomocą SMCC (6x molarność) reagującego z wolnymi resztami NH2 grup lizyny przez inkubację w PBS (pH 7,2) przez 1 godzinę w RT. Następnie zmodyfikowane przeciwciała dializowano do 35 mM buforu cytrynianowego (pH 5,0) i określono stosunek łącznika do przeciwciała za pomocą odwróconego testu Ellmana. DM1 (6x molarność) sprzężono poprzez grupę sulfhydrylową z ugrupowaniem maleimidowym łącznika SMCC przez inkubację przez 17 godzin w RT. Sprzężone przeciwciała dializowano do buforu formulacji (20 mM His, 85 mg/ml sacharozy, pH 5,8) i przechowywano w -80°C. Stosunek przeciwciał leku analizowano za pomocą spektrometrii UV, zawartość monomeru sposobem SEC-HPLC, a zawartość wolnego leku sposobem RP-HPLC. [0385] Do koniugacji MMAE, nagie przeciwciała dializowano do PBS (pH 7,2) i modyfikowano przez tiolowanie wolnych grup NH2 reszt lizyny z użyciem odczynnika Trauta (2-iminotiolan) (20-krotność molarna) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie tiolowane przeciwciała dializowano do 35 mM buforu cytrynianowego (pH 5,5) i określano stosunek łącznika do przeciwciała za pomocą odwróconego testu Ellmana. vcMMAE (molowość 6x) skoniugowano poprzez walinę z ciętego katepsyną łącznika z grupą sulfhydrylową tiolowanych przeciwciał przez inkubację przez 15 godzin w RT. Sprzężone przeciwciała dializowano do buforu formulacji (20 mM His, 85 mg/ml sacharozy, pH 5,8) i przechowywano w temperaturze - 80°C. Stosunek przeciwciał leku analizowano za pomocą spektrometrii UV, zawartość monomeru sposobem SEC-HPLC, a zawartość wolnego leku sposobem RP-HPLC.

Oznaczanie względnych powinowactwa wiązania sposobem cytometrii przepływowej:

[0386] Komórki zebrano za pomocą 0,05% trypsyny/EDTA (Gibco, 25300-054), przemyto buforem FACS (PBS zawierający 2% FCS (Gibco, 10270-106) i 0,1% azydku sodu (Applichem, A1430)) i ponownie zawieszono w buforze FACS w stężeniu 2 x 106 komórek/ml. 100 µl zawiesiny komórek inkubowano przez 30 minut w 4°C z IMAB027, IMAB027-DM1 lub IMAB027-vcMMAE (serie miareczkowania od 0,1 ng/ml do 20 µg/ml). Komórki następnie przemyto trzykrotnie buforem FACS i inkubowano przez 30 min w 4°C z anty-ludzką IgG (Jackson ImmunoResearch, 109-136-170) rozcieńczonym 1: 200 w buforze FACS. Następnie komórki przemyto dwukrotnie i ponownie zawieszono w 100 µl buforu FACS. Wiązanie analizowano za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu BD FACSArray (BD Biosciences) i oprogramowania FlowJo (Tree Star Inc.).

Test żywotności ze skoniugowanym z toksyną IMAB027:

[0387] Wpływ IMAB027-DM1 i IMAB027-vcMMAE na żywotność ludzkich linii komórek nowotworowych określono in vitro przy użyciu testu kolorymetrycznego, który wykrywa aktywność metaboliczną komórek (Cell Proliferation Kit XTT z AppliChem). [0388] Komórki OV90 zebrano za pomocą 0,05% trypsyny/EDTA (Gibco, 25300-054) i 2500 komórek zaszczepiono w 50 µl pożywki wzrostowej w 96-studzienkowej hodowli. Po 24 godzinach dodano serie stężeń IMAB027 skoniugowanego z DM1 i MMAE lub

75 przeciwciało kontrolne izotypowe rozcieńczone w 50 µl pożywki. Komórki hodowano przez 3 do 7 dni, aż nieleczone komórki osiągnęły konfluencję ~ 80%. Żywotność komórek analizowano przy użyciu AppliChem Cell Proliferation Kit II (AppliChem, A8088-1000) zgodnie z instrukcjami producenta. Po 3-5 godzinach inkubacji z odczynnikiem XTT 100 µl supernatantów komórkowych przeniesiono na nową 96-studzienkową płytkę testową i absorbancję zmierzono przy 480 nm (referencyjna 630 nm) za pomocą spektrofotometru (Tecan). Żywotność obliczono za pomocą następującego równania:

(próbka - puste) zmniejszenie żywotności [%] = 100 - [ (maks. żywotne komórki - * 100 ] puste)

puste: pożywka i XTT bez komórek max. żywotne komórki: komórki, pożywka i XTT

[0389] Wartości EC50 określono za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 6 za pomocą regresji nieliniowej.

Leczenie zaawansowanych podskórnych ksenotransplantowanych nowotworów OV90:

[0390] Ludzką linię komórkową nowotworu jajnika OV90 hodowano w standardowych warunkach. W celu wszczepienia 6-8 tygodniowym samicom Hsd: bezgrasowych myszy Nude-Foxn1nu zaszczepiono podskórnie 1 x 107 komórek OV90 w 200 µl PBS w bok. W badaniu zaawansowanego leczenia nowotwory hodowano przez 10 dni, a myszy z ustalonymi nowotworumi o objętości 50-150 mm3 losowo przydzielono do grup nośnika i przeciwciał (n = 10) przed leczeniem. Objętość nowotworu (TV = (długość x szerokość2)/2) monitorowano co dwa tygodnie. TV wyraża się w mm3, co pozwala na tworzenie krzywych wzrostu nowotworu w czasie. [0391] W badaniu ustalania zakresu początkowej dawki zwierzętom wstrzykiwano raz dożylnie. z nośnikiem, IMAB027-DM1 (1,78 mg/kg, 5,33 mg/kg lub 16 mg/kg) i wycięto w 35 dniu po wszczepieniu. W drugim badaniu ustalającym zakres dawek zwierzętom wstrzykiwano raz dożylnie. z nośnikiem, IMAB 027-vcMMAE (4 mg/kg, 8 mg/kg lub 16 mg/kg) lub IMAB 027-DM1 (1,33 mg/kg, 2,67 mg/kg lub 5,33 mg/kg). IMAB027 zastosowano trzy razy w tygodniu w bolusie naprzemiennie iniekcje dożylne./dootrzewnowe/dootrzewnowe 35 mg/kg IMAB027. Myszy uśmiercano, gdy nowotwory osiągnęły objętość większą niż 1400 mm3 lub uległy owrzodzeniu. Hamowanie wzrostu nowotworu analizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa i testu wielokrotnego porównania post-hoc Dunna. Przeżycie analizowano za pomocą testu Mantel Cox.

Leczenie zaawansowanych podskórnych ksenotransplantowanych nowotworów PA-1 i immunhistochemia skrawków nowotworów:

[0392] Ludzką linię komórkową nowotworu jajnika PA-1 hodowano w standardowych warunkach. W celu wszczepienia 6-8 tygodniowym samicom Hsd: bezgrasowych myszy Nude-Foxn1nu zaszczepiono podskórnie 1 x 107 komórek PA-1 w 200 µl PBS w bok. W badaniu zaawansowanego leczenia nowotwory hodowano przez 15 dni, a myszy z ustalonymi nowotworumi o objętości 40 - 120 mm3 losowo przydzielono do grupy nośnika i przeciwciał (n = 10) przed leczeniem. Objętość nowotworu (TV = (długość x szerokość2)/2) monitorowano co dwa tygodnie. TV wyraża się w mm3, co pozwala na tworzenie krzywych wzrostu nowotworu w czasie.

76 [0393] Zwierzętom wstrzyknięto raz dożylnie nośnik, IMAB027-vcMMAE (4 mg/kg, 8 mg/kg lub 16 mg/kg) lub IMAB027-DM1 (4 mg/kg, 8 mg/kg lub 16 mg/kg). IMAB027 zastosowano trzy razy w tygodniu w bolusie naprzemiennie iniekcje dożylne./dootrzewnowe/dootrzewnowe 35 mg/kg IMAB027. Myszy uśmiercano, gdy nowotwory osiągnęły objętość większą niż 1400 mm3 lub uległy owrzodzeniu. Hamowanie wzrostu nowotworu analizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa i testu wielokrotnego porównania post-hoc Dunna. Przeżycie analizowano za pomocą testu Mantel Cox. [0394] W celu przeanalizowania ekspresji CLDN6 podczas ustalania i progresji nowotworów, nowotwory PA-1 nieleczonych myszy wycięto odpowiednio w dniach 7, 14 i 56, utrwalono w formalinie i zatopiono w parafinie. Z każdej próbki bloku FFPE (zatopiony w formalinie zatopiony w parafinie) przygotowano skrawki tkanki o grubości 4 µm, zamocowane na samoprzylepnych szkiełkach (SuperFrost Ultra Plus, Thermo Fisher Scientific) i spiekano przez 60 minut w 60°C. Przed barwieniem skrawki tkanek FFPE deparafinizowano. Skrawki gotowano w 10 mM kwasie cytrynowym uzupełnionym 0,05% Tween-20 (pH 6,0) w 120°C przez 10 min. Endogenne peroksydazy zatrzymano przez inkubację w 0,3% H2O2 w PBS przez 15 minut. Po przemyciu PBS, nieswoiste miejsca wiązania przeciwciał blokowano przez 30 minut buforem blokującym (10% koziej surowicy w PBS) w RT, a następnie inkubowano przez noc z 0,2 µg/ml pierwotnego króliczego przeciwciała anty-Klaudyny-6 (IBL- America, 18865) rozcieńczonego w buforze blokującym. Próbki następnie przemyto 3 razy PBS i inkubowano z odpowiednim drugorzędowym, gotowym do użycia przeciwciałem (Power Vision HRP kozie anty-królicze; Immunologic) przez 30 min w RT. Wizualizację prowadzono przez 4:30 min stosując roztwór substrat- chromogen (VectorRed; Vector Laboratories). Po barwieniu hematoksyliną, odwodnieniu i zamocowaniu skrawki analizowano za pomocą mikroskopu Leica DM2000.

Leczenie zaawansowanych podskórnych ksenotransplantowanych nowotworów MKN74 i immunohistochemia skrawków nowotworów:

[0395] Ludzką linię komórkową nowotworu żołądka MKN74 hodowano w standardowych warunkach. W celu wszczepienia 6-8 tygodniowym samicom Hsd: bezgrasowych myszy Nude-Foxn1nu zaszczepiono podskórnie 1 x 107 komórek MKN74 w 200 µl PBS w bok. W badaniu zaawansowanego leczenia nowotwory hodowano przez 7 dni, a myszy z ustalonymi nowotworumi o objętości 200 ± 30 mm3 losowo przydzielono do grup nośnika i przeciwciał (n = 10) przed leczeniem. Objętość nowotworu (TV = (długość x szerokość2)/2) monitorowano co dwa tygodnie. TV wyraża się w mm3, co pozwala na tworzenie krzywych wzrostu nowotworu w czasie. [0396] Zwierzęta otrzymały bufor kontrolny z nośnikiem lub 16 mg/kg IMAB027- vcMMAE w dniu 8 przez pojedynczą iniekcję dożylnąbolusa. Myszy uśmiercano, gdy nowotwory osiągnęły objętość większą niż 1400 mm3 lub uległy owrzodzeniu. Hamowanie wzrostu nowotworu analizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa i testu wielokrotnego porównania post-hoc Dunna. Hamowanie wzrostu nowotworu analizowano za pomocą testu Manna-Whitneya i testu wielokrotnego porównania post-hoc Dunna. Przeżycie analizowano za pomocą testu Mantel Cox. [0397] Ekspresję docelową CLDN6 na komórkach MKN74 analizowano za pomocą cytometrii przepływowej i histochemii wstępnego wszczepienia na nieleczonych ksenotransplantacjach MKN74 wyciętych w dniu 31. [0398] Do immunohistochemii przygotowano skrawki tkanek o grubości 3 µm, zamontowano na szkiełkach i suszono powietrzem 90 minut w RT. Wszystkie skrawki tkanek utrwalono na 10 minut w acetonie w -20°C i przemyto przez 5 minut w PBS. Endogenne peroksydazy zatrzymano przez 15 minut inkubacji z 0,03% nadtlenkiem wodoru (Dakocytomation EnVision System, K4011). Po przemyciu PBS, nieswoiste miejsca wiązania przeciwciał blokowano przez 30 minut buforem blokującym (10% koziej surowicy w PBS) w

77 RT, a następnie inkubowano przez 60 minut z 5 µg/ml IMAB027-FITC w RT. Próbki następnie przemyto 3 razy PBS i inkubowano z odpowiednim drugorzędowym, gotowym do użycia przeciwciałem (Bright Vision poli-HRP anty-królicza IgG, Immunologic, DPVR- 110HRP) przez 30 min w RT. Wizualizację prowadzono przez 2:30 min stosując roztwór substrat-chromogen (VectorRed; Vector Laboratories). Po barwieniu hematoksyliną, odwodnieniu i zamocowaniu skrawki analizowano za pomocą mikroskopu Leica DM2000.

Leczenie zaawansowanych śródotrzewnowych ksenotransplantowanych nowotworów PA-1 (Luc):

[0399] Ludzką linię komórkową nowotworu jajnika PA-1 (Luc) stabilnie eksprymującą lucyferazę świetlika jako luminescencyjny gen reporterowy zastosowano jako model ksenotransplantacji nowotworu śródotrzewnowego do badania przeciwnowotworowej aktywności skoniugowanych z toksyną przeciwciał IMAB027 in vivo. Poprzednie doświadczenia wszczepienia ujawniły, że dootrzewnowe zaszczepienie komórek PA-1 (Luc) spowodowało śródotrzewnowe guzki nowotworu. [0400] 1 x 107 komórek PA-1 (Luc) ponownie zawieszonych w PBS wstrzyknięto dootrzewnowo samicy Hsd: bezgrasiczej Nude-Foxn1nu. Obrazowanie bioluminescencyjne rozpoczęto w dniu 14 po zaszczepieniu komórek nowotworowych, a następnie co tydzień aż do zakończenia badania. D-lucyferynę (PerkinElmer, 122796) rozpuszczono w jałowej wodzie i wstrzyknięto dootrzewnowo (150 mg/kg, objętości zastrzyku 200 µl) 5 minut przed obrazowaniem za pomocą IVIS Lumina Imaging System (Advanced Molecular Vision). Myszy znieczulono izofluoranem i umieszczono w ciemnej komorze IVIS Lumina, a emitowane fotony określono ilościowo na czas integracji 1 min. Intensywność światła przechodzącego pochodzącego z komórek PA-1 eksprymujących lucyferazę w zwierzęciu była reprezentowana jako obraz pseudokolorowy, gdzie niebieski daje najmniej intensywny, a czerwony najbardziej intensywny sygnał bioluminescencyjny. Obrazy fotograficzne myszy w skali szarości uzyskano również przy oświetleniu LED przy słabym świetle. Obrazy zostały nałożone za pomocą oprogramowania Living Image (Xenogen). Porównywalne ustawienia oświetlenia zastosowano dla wszystkich zdjęć. W celu określenia ilościowego bioluminescencji, określono obszary zainteresowania (ROI) i zmierzono całkowity strumień odpowiedniego ROI za pomocą jednostki fotonów/s (p/s). Wartość bioluminescencji tła uzyskaną z regionu nie emitującego sygnału u zwierzęcia odjęto od odpowiedniej wartości bioluminescencji dla każdego zwierzęcia. [0401] W dniu 14 myszy randomizowano i leczono przez dootrzewnowe podanie odpowiednio 16 mg/kg IMAB027-DM1 lub IMAB027-vcMMAE. Zwierzęta kontrolne otrzymały bufor nośnika. Wzrost nowotworu monitorowano co tydzień za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego z widoków brzusznych, a następnie analizy całkowitego strumienia (fotonów/sek) w obszarach zainteresowania obejmujących brzuch myszy.

Endocytoza:

[0402] Endocytozę przeciwciała związanego z CLDN6 określono za pomocą testu endocytozy opartego na cytotoksyczności, który polega na współ-internalizacji docelowego przeciwciała związanego i sprzężonego z saperyną fragmentu Fab przeciw IgG (ludzkie Fab- ZAP, Advanced Targeting Systems, IT-51) ). Saporyna jest białkiem inaktywującym rybosomy, które po internalizacji hamuje biosyntezę białka, a zatem powoduje śmierć komórki. [0403] Komórki PA-1 zebrano za pomocą 0,05% trypsyny/EDTA (Gibco, 25300-054) i 2,5 x 103 komórek/studzienkę zaszczepiono w 50 µl pożywki wzrostowej na 96-studzienkowej płytce hodowlanej. Po 24 godzinach dodano Fab-ZAP, a następnie IMAB027 lub przeciwciało kontrolne izotypowe w objętości 25 µl. Przeciwciała CLDN6 podawano w serii

78 rozcieńczeń 6- lub 8-stopniowych, przy jednoczesnym zastosowaniu stałych stężeń Fab-ZAP (stosunek Fab-ZAP:Przeciwciało 3: 1 do 6561: 1). Komórki hodowano przez dodatkowe 72 godziny w inkubatorze z nawilżonym CO2 w 37°C. Następnie żywotność komórek analizowano za pomocą zestawu Cell Proliferation Kit II z AppliChem (AppliChem, A8088- 1000) zgodnie z instrukcjami producenta. Absorbancję zmierzono za pomocą spektrofotometru (Tecan) przy 480 nm (referencyjna 630 nm).

LISTA SEKWENCJI

[0404]

<110> BioNTech AG i in.

<120> DIAGNOZA I TERAPIA NOWOTWORU Z UDZIAŁEM NOWOTWOROWYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH

<130> 342-79 PCT

<150> PCT/EP2013/002272 <151> 2013-07-31

<160> 12

<170> Patent w wersji 3.5

<210> 1 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

79

<210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 2

80

<210> 3 <211> 117 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

<220> <223> Fragment przeciwciała

81

<400> 3

<210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

<220> <223> Fragment przeciwciała

<400> 4

82

<210> 5 <211> 117 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

<220> <223> Fragment przeciwciała

<400> 5

83

<210> 6 <211> 106 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

<220> <223> Fragment przeciwciała

<400> 6

<210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

<220> <223> Fragment przeciwciała

<400> 7

84

<210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

<220> <223> Fragment przeciwciała

<400> 8

100 105

85 <210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

<220> <223> Fragment przeciwciała

<400> 9

<210> 10 <211> 106 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

<220> <223> Fragment przeciwciała

<400> 10

86

<210> 11 <211> 106 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

<220> <223> Fragment przeciwciała

<400> 11

<210> 12 <211> 106 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

<220> <223> Fragment przeciwciała <400> 12

87

Zastrzeżenia patentowe

1. Przeciwciało mające zdolność wiązania z Klaudyną 6 (CLDN6) do zastosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania rakowi obejmującym hamowanie i/lub eliminację rakowych komórek macierzystych przez podawanie przeciwciała mającego zdolność wiązania z CLDN6 pacjentowi z rakiem i poprzez podawanie chemioterapii, przy czym to przeciwciało i tę chemioterapię podaje się w synergistycznie skutecznych ilościach, przy czym to przeciwciało jest zdolne do pośredniczenia w zabijaniu komórek wyrażających CLDN6 przez ADCC i/lub CDC i zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego (VH) zawierający sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 5 i region zmienny łańcucha lekkiego (VL) zawierający sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEQ ID NO: 4 i przy czym ta chemioterapia obejmuje środek wybrany z grupy składającej się z karboplatyny, gemcytabiny, paklitakselu i cisplatyny. 2. Przeciwciało do zastosowania według zastrzeżenia 1, przy czym wspomniany sposób obejmuje radioterapię. 3. Przeciwciało do zastosowania według zastrzeżenia 1 albo 2, przy czym chemioterapia jest podawana w dawce, która jest niższa niż maksymalna dawka tolerowana. 4. Przeciwciało do zastosowania według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, przy czym chemioterapia obejmuje podawanie środka wybranego z grupy składającej się z taksanów, związków platyny, analogów nukleozydów, analogów kamptotecyny, antracyklin, ich proleków, ich soli i ich kombinacji, w szczególności środka wybranego z grupy składającej się z paklitakselu, cisplatyny, karboplatyny, ich proleków, ich soli i ich kombinacji. 5. Przeciwciało do zastosowania według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 4, przy czym to przeciwciało mające zdolność wiązania z CLDN6 wiąże się z pierwszą pętlą zewnątrzkomórkową CLDN6.

Uprawnieni: Biontech SE; Astellas Pharma Inc.; TRON - Translationale Onkologie an der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz gemeinnützige GmbH. Pełnomocnik: mgr inż. Dariusz Mielcarski, Rzecznik patentowy.

88

dzień 19 dzień

mix

-

dzień 12 dzień

dzień 5 dzień

Ekspresja CLDN6 w komórkach Ekspresja iPS

brak kontroli RNA kontroli brak + miR EBK niezmod. OSKMNL+

krotność indukcji vs. brak RNA

Figura 1 Figura

89

26

0, 1,21 0,65

14,67

wybarwiony

9,32 89,21 3,62 81,04

Dzień 19 Dzień

0,14 0,67 0,08 0,10

niewybarwiony

0,05 99,14 0,03 99,80

0,01 0,16 0,04

15,17

wybarwiony

5,08 94,75 63,46 21,32

Dzień 12 Dzień 0,00 0,14 0,00 0,01

0,00

niewybarwiony

99,85 0,00 99,99

0,05 0,09 0,15 0,27

wybarwiony

14,93 84,94 15,82 83,77

Dzień 5 Dzień

0,00 0,01 0,00 0,01

niewybarwiony

0,00 99,99 0,00 99,99

CLDN6

SSEA-4

ujący

RNA

Koktajl Koktajl

Brak kontroli Brak

przeprogramow

Figura 2 Figura

90

1 76 1 50 1 54 1

- - -

PA PA PA

soki

soki

soki

IMAB027

0,0/0,6/99,4

0,4/13,0/86,6 0,4/13,0/86,6

Niski/Średni/Wy

Niski/Średni/Wy

Niski/Średni/Wy

y

soki

soki

soki

99,9/0,0/0,0 99,9/0,0/0,0

100,0/0,0/0,0

niewybarwion

Niski/Średni/Wy

Niski/Średni/Wy

Niski/Średni/Wy

CLDN6

50 K 50 K 50 K

250 K 250 K 150 K 250 K 150 K 250 K 150 SSC

B

COV318

0,0

3,17

IMAB027

0,0 96,8

0,0 0,3

0,0 99,7

niewybarwiony

CLDN6

50 K

250 K 250 K 150 SSC

A Figura 3 Figura

91

A

PA-1 50 COV318 CLDN6+ CLDN6+

PA-1 50 COV318 CLDN6- CLDN6-

PA-1 54 CLDN6+

PA-1 54 CLDN6-

Test Tworzenia Kolonii B

CLDN6 dodatni

CLDN6 ujemny

liczba liczba kolonii

PA-1 50 PA-1 54 COV318

Figura 4 Figura

92

CLDN6+ CD24+

0,01 0,94

0,02 0,13

0,68 1,43

Panel

-

CSC

0,69 98,4

0,82 99,0

0,31 97,6

,05

0,00 0,02

0,00 0,00

0,02 0

CD24 CD34

CD133/1

0,04 99,9

0,18 99,8

0,07 99,9

niewybarwiony CLDN6 CLDN6 CLDN6

CLDN6+ CD44+

CLDN6+ CD90+

0,2

0,28 0,42

0,75 10,6

0,94

Panel

-

CSC

0,56 98,7

0,36 88,2

1,1 97,9

0,03 0,23

CD44

ny 0,00 0,00

0,00 0,00

CD90

CD117

0,06 99,7

0,25 99,7

0,25 99,7

niewybarwio CLDN6 CLDN6 CLDN6

A

Figura 5 Figura

93

66,87

CD24+ CD90+

subpopulacji CD44+ subpopulacji CD44+

CLDN6+ komórki w

czynnik 74x =

0,91

żywej żywej populacji

CLDN6+ komórki w

lokalizacji

-

20,10

CLDN6+

CD44+ CD90+ CD24+

komórki w subpopulacji

+

Odsetki współ

czynnik 87x =

-

0,23

V318

populacji

CO

komórki w żywej

CD44+ CD90 CD24+

0,18

żywej żywej populacji

CLDN6+ komórki w

CD44+ CD90+ CD24+

% komórek

B

Figura 5 Figura

94

0,00 0,00 0,00 0,21

0,00 0,04 0,13 0,23

CD34

CD34

0,01 99,98 0,02 99,77

0,01 99,95 51,53 48,11

0,00 0,00

0,01 2,77

0,00 0,00

54,11 38,45

CD24

CD24

2

0,0 99,98 0,03 97,19

0,01 99,99 0,73 6,70

0,00 0,00

0,01

0,00 0,00

11,21

52,55 40,01

CD90

CD90

0,01 99,98 0,01 88,77

0,01 99,99 0,76 6,68

0,01 0,07

0,00 1,07

0,00 0,05 0,17 0,10

CD133

CD133

0,01 99,92 0,02 98,92

0,01 99,94 51,48 48,24

0,00 0,08

0,01 0,15

0,00 0,05 4,20

11,58

CD44

CD44

0,01 99,83

0,01 99,90

0,01 99,95 40,08 44,14

0,01 0,00

0,00 1,72

0,00 0,00 1,28 0,72

frakcja ujemna dla CLDN6 frakcja dodatnia dla CLDN6

CD117

CD117

- -

0,01 98,27

0,01 99,99

0,00 99,99 48,81 49,20

318

niewybarwiony wybarwiony niewybarwiony wybarwiony

COV318 COV

CLDN6 CLDN6

A

Figura 6 Figura

95

0,21 0,36

CD34

2,78

92,60

CD24

czynnik: 33x czynnik:

11,21 92,60

CD90

czynnik: 8x czynnik:

lokalizacji

-

1,07 0,28

CD133

Odsetki współ

-

0,16

15,80

CD44

czynnik: 99x czynnik:

COV318

-

1,72 2,00

CLDN6 CLDN6+

CD117

-

CLDN6

CLDN6+

B

Figura 6 Figura

96

1,17 1,98

0,87 0,02

95,30 97,80

Panel

-

CSC

2,58 0,93 0,09

0,12 95,90 2,21

D133/1

0,11 0,48 0,01

0,06 0,10 0,63

C

CD24

CLDN6

niewybarwiony

0,11 99,30 0,22

99,7 0,08 99,20

CLDN6 CLDN6 CLDN6

2,18 1,74 0,05

1,34

97,70

95,20

Panel

-

CSC

0,07 0,06 95,20

2,05 2,41 1,00

CD44

0,04 0,13

0,08 0,21

CD90

0,02 0,04

CD117

9,80

niewybarwiony

0,14 99,70 0,10

99,60 0,17 9

CLDN6 CLDN6 CLDN6

A

Figura 7 Figura

97

0,00

0,56

2,58 0,00

0,00

95,00

Panel

-

CSC

4,97 0,02 99,40

0,01

97,40 0,02

0,00 0,46

0,00

0,00 0,00

0,15

CD133/1

CD24 CD34

niewybarwiony

0,01 99,50 0,01

99,60

0,02 100,00

CLDN6 CLDN6 CLDN6

0,01

0,02

0,01

99,40

97,20

100,00

Panel

-

CSC

0,54 0,00 2,76

0,03 0,00 0,01

0,00 0,05

CD44 0,01

0,00 0,06

CD90 0,17

CD117

niewybarwiony

0,01

0,01 99,90

0,01 99,90 99,80

CLDN6 CLDN6 CLDN6

B

Figura 7 Figura

98

6,23

2,94

93,5 6,34

0,05

93,30

Panel

-

CSC

90,60

0,36 0,16

0,07 0,04 6,38

0,03 1,03

CD34

0,03

0,00 0,04

CD133/1

0,56

CD24

niewybarwiony

0,03 98,90 0,03

99,40

0,05 99,9

CLDN6 CLDN6 CLDN6

1,99 0,06 3,55

5,67

62,30

91,40

Panel

-

CSC

91,6 6,32

31,20 2,88 2,23

0,71

0,00 0,82

CD44 0,00

0,02 0,20

CD90 0,13

CD117

niewybarwiony

0,04

0,04 99,10

0,03 99,80 99,80

CLDN6 CLDN6 CLDN6

C

Figura 7 Figura

99

2,47

0,18

2,89

0,07

91,90

96,60

Panel

-

CSC

96,70

5,04 0,63

0,27 0,21 3,03

0,07 0,35

CD34

0,20

0,00 0,04

CD133/1

0,16

CD24

niewybarwiony

0,05 99,50 0,12 99,8 0,10

99,70

CLDN6 CLDN6 CLDN6

8,49 0,33 2,79

1,72

95,80

85,00

Panel

-

CSC

88,62 2,56

1,14 0,30 12,10

1,15

CD44

CD90

0,03 0,36

CD117

0,04

0,06 0,14

0,28

70

0,12

0,04 99,57

0,06 99,

niewybarwiony

99,60

CLDN6 CLDN6 CLDN6

D

Figura 7 Figura

100

Nośnik IMAB027 Paklitaksel Paklitaksel + IMAB027

Dni [d]

Przeżywalność [%]

(B)

Dni [d]

Objętość nowotworu [mm3]

(A)

Figura 8 Figura

101

IMAB027 + Cisplatyna

Cisplatyna

ns

IMAB027

Nośnik

Objętość nowotworu [mm3]

(B)

Nośnik IMAB027 Cisplatyna IMAB027 + Cisplatyna

Nośnik IMAB027 Cisplatyna IMAB027 + Cisplatyna

Dni [d]Dni

Dni [d]Dni

Przeżywalność [%] Objętość nowotworu [mm3]

(A) (C) Figura 9 Figura

102

IMAB027 + Karboplatyna

Karboplatyna

IMAB027

Nośnik

Objętość nowotworu [mm3]

(B)

IMAB027 + Karboplatyna

Nośnik IMAB027 Karboplatyna

IMAB027 + Karboplatyna

Nośnik IMAB027 Karboplatyna

Dni [d]Dni

[d]

Dni

Przeżywalność [%] Objętość nowotworu [mm3]

(A) (C) Figura 10 Figura

103

-

-

COV318 CLDN6+ COV318 CLDN6

COV318 CLDN6+ COV318 CLDN6

19

-

Day

Dzień 23

7

-

8

-

Day

Dzień

3

-

2

-

Day

Dzień

(A) (B)

Figura 11 Figura

104

3 days 3 days 6

Karboplatyna [2,000 ng/ml]

Cisplatyna [500 ng/ml]

Brak leczenia

Względna ekspresja CLDN6 [%]

igura 12 F

105

Dzień 5*,12** Dzień 35*, 29**

Przepona

Wątroba

Trzustka

CLDN6 CLDN6

Żołądek

Jajnik

CLDN6

Rodzicielski

Kontrola

Wodobrzusze

Liczba Liczba Liczba

(A) (B) Figura 13 Figura

106

06

-

41744

wartość p 1,39E 0,0002 0,00441744 0,004 0,0132867 wartość p 0,00638357 wartość p 0,477832 0,499984 0,972292 0,615194 0,235788 0,763766 0,615194 0,877142 0,818222 0.712542 0,189975 0,615194 0.606964 0,982996 0,335274

0,5135 0,1924 0,1792 0,0826 0,1255 0,0667 0,0978 0,1236 0,133

spearman r spearman 0,7801 0,8326 0,5354 0,531 0,4738 r spearman - r spearman - - 0,0101 0,1244 0,2806 - - 0,0511 - - 0,3172 - - 0,0058 0,2472

brak korelacji

korelacja ujemna korelacja

korelacja dodatnia korelacja

znacznik CTCFL LIN28B CD24 GNL3 EPCAM znacznik CD44 znacznik ABCG2 ALDH1A1 AMACR ATXN1 BMI1 BMP4 CD34 CD117 MYD88 NANOG NOTCH1 POU5F1 CD133 SNAI1 SOX2

(B)

.5135/p= 0,00638 .5135/p=

0

-

CLDN6 [ddCT]

CLDN6 [ddCT]

CLDN6 [ddCT]

Spearman = 0.6326/p= 0.00024 Spearman0.6326/p= =

Spearman = 0.531/p= 0,00442 Spearman0.531/p= =

Spearman = Spearman =

LIN28B [ddCT] 14,0 13,5 13,0 12,5 12,0 GNL3 [ddCT] CD44 [ddCT]

06

-

6 [ddCT]

CLDN

CLDN6 [ddCT]

CLDN6 [ddCT]

Spearman = 0.5354/P= 0,00442 Spearman0.5354/P= =

Spearman = 0.4738/p= 0,0133 Spearman0.4738/p= =

Spearman = 0.7801/p= 1,39257 e 1,39257 Spearman0.7801/p= =

CTCFL [ddCT] CD24 [ddCT] EpCAM [ddCT]

(A) Figura 14 Figura

107

nieleczony IMAB027 nieleczony ng/ml] [20,000 + Karboplatyna IMAB027 nieleczony Izotyp ng/ml] [20,000 Karboplatyna + Izotyp

Dawca 2 Dawca

Stężenie [ng/ml]Stężenie

ng/ml]

CLDN6 Swoista liza [%]

+ Karboplatyna [20,000

Liczba

Dawca 1 Dawca

leczenia

Stężenie [ng/ml]Stężenie

CLDN8

Brak

Swoista liza [%] Liczba

(A) (B) Figura 15 Figura

108

Izotyp + gemcytabina [25ng/ml]

Izotyp nieleczony

nieleczony IMAB027 IMAB027 gemcytabina + [25ng/ml]

Dawca 4 Dawca

Stężenie [ng/ml]Stężenie

CLDN6 Swoista liza [%]

+ gemcytabina [25 ng/ml] Liczba

Dawca 3 Dawca

żenie [ng/ml]żenie

Stę

CLDN6

Brak leczenia

Liczba Swoista liza [%]

(C) (D) Figura 15 Figura

109

ksel [5ng/ml]

nieleczony IMAB027 IMAB027 Paklita + Izotyp nieleczony Izotyp + Paklitaksel [5ng/ml]

Dawca 6 Dawca

Stężenie [ng/ml]Stężenie

CLDN6 Swoista liza [%]

+ Paklitaksel [5 ng/ml]

Liczba

Dawca 5 Dawca

Stężenie [ng/ml]Stężenie

CLDN6

Brak leczenia

Swoista liza [%] Liczba

(E) (F) Figura 15 Figura

110

20ng/ml]

nieleczony IMAB027 IMAB027 doksorubicyna + [20ng/ml] Izotyp nieleczony Izotyp + doksorubicyna [

Dawca 8 Dawca

Stężenie [ng/ml]Stężenie

Swoista liza [%] CLDN6

+ doksorubicyna [20 ng/ml] Liczba

Dawca 7 Dawca

Stężenie [ng/ml]Stężenie

CLDN6

Brak leczenia

Swoista liza [%] Liczba

(G) (H) Figura 15 Figura

111

kan [7,5ng/ml]

nieleczony IMAB027 IMAB027 topote + Izotyp nieleczony Izotyp + topotekan [7,5ng/ml]

Dawca 8 Dawca

Stężenie [ng/ml]Stężenie

Swoista liza [%] CLDN6

+ topotekan [7.5 ng/ml] Liczba

Dawca 7 Dawca

Stężenie [ng/ml]Stężenie

CLDN6

Brak leczenia

Swoista liza [%] Liczba

(I) (J) Figura 15 Figura

112

Dni [d] Dni

3 Objętość nowotworu [mm ]

Nośnik IMAB027 + PEB Nośnik + PEB IMAB027

(B)

Dni [d] Dni

Dni [d] Dni

Objętość nowotworu [mm3] Przeżywalność [%]

(C)

(A)

Figura 16 Figura

113

Stężenie [ng/ml]Stężenie

DM1 vcMMAE

- -

IMAB027 IMAB027

Zmniejszenie Żywotności [%]

(B)

Stężenie [ng/ml]Stężenie

DM1 vcMMAE

- -

1

0,

IMAB027 IMAB027 IMAB027

0,01

MFI

(A)

Figura 17 Figura

114

Dni [d]

DM1 1,78mg/kg DM1 5,33mg/kg DM1 16mg/kg

- - -

dożylnnie

Nośnik IMAB027 IMAB027 IMAB027

Objętość nowotworu [mm3]

Figura 18 Figura

115

DM1 DM1 DM1

- - -

vcMMAE

-

vcMMAE vcMMAE

- -

Nośnik IMAB027 4 mg/kg IMAB027 8 mg/kg IMAB027 18 mg/kg IMAB027

Nośnik IMAB027 1,33 IMAB027mg/kg 2,67 IMAB027mg/kg 5,33 IMAB027mg/kg

Dni [d]

Dni [d]

dożylnnie

dożylnnie

Objętość nowotworu [mm3] Objętość nowotworu [mm3]

(A)

Figura 19 Figura

116

vcMMAE

-

vcMMAE vcMMAE

- -

Nośnik utrzymanie IMAB027 4 mg/kg IMAB027 8 mg/kg IMAB027 16 mg/kg IMAB027

Dni

(B)

Przeżywalność [%]

Figura 19 Figura

117

MAE 4 mg/kg MAE

vcMMAE 4 mg/kg vcMMAE 16 mg/kg vcMMAE

VCMMAE 8 mg/kg VCMMAE

- - -

vcM 8 mg/kg vcMMAE 16 mg/kg vcMMAE

- - -

Dzień 56Dzień

Nośnik IMAB027 IMAB027 IMAB027 IMAB027

Nośnik 35 mg/kg IMAB027 utrzymanie IMAB027 IMAB027 IMAB027

Dzień 14Dzień

Dni

Dzień

Dzień 7 Dzień

dożylnnie

Objętość nowotworu [mm3] Przeżywalność [%]

(B)

(A) (C)

Figura 20 Figura

118

vcMMAE

-

vcMMAE

-

Po Po przeszczepie 31)(dzień

Nośnik IMAB027

Nośnik IMAB027

APC

IMAB027

SSC-A

Dni

Dzień

Przed Przed przeszczepem

APC

dożylnnie

Izotyp

SSC-A

Przeżywalność [%] Objętość nowotworu [mm3]

(B)

(A) (C)

Figura 21 Figura

119

DM1 vcMMAE

- -

Nośnik IMAB027 IMAB027

d28

d21

d14

DM1 vcMMAE

- -

9 9 9 9 9 9 9 9

0

4,0×10 3,5×10 3,0×10 2,5×10 2,0×10 1,5×10 1,0×10 0,5×10

Całkowity strumień Nośnik IMAB027 IMAB027

[p/s]

(B)

(A)

Figura 22 Figura

120

OV90

Stężenie Stężenie [ng/ml]

IMAB027 + IMAB027 FabZap chimAB5F2D2 + FabZap

ZAP

-

Zmniejszenie żywotności [%] = 100 -

Stężenie Stężenie [ng/ml]

NEC14

ZAP

-

ZAP

-

IMAB027+ Fab IMAB027+ chimAB5F2D2 + Fab Izotyp + Fab

Zmniejszenie żywotności [%]

1

-

ZAP

-

PA

Stężenie Stężenie [ng/ml]

ZAP

-

ZAP

-

IMAB027+ Fab IMAB027+ chimAB5F2D2 +Fab Izotyp + Fab

Zmniejszenie żywotności [%]

(A)

Figura 23 Figura

121

względne

maksimum

NEC14

EC50

względna

względne

maksimum

OV90

EC50

względna

względne

maksimum

1

-

PA

EC50

względna

wiązanie IMAB027 endocytoza IMAB027 wiązanie chimAB5F2D2 endocytoza chimAB5F2D2

Nazwa

(B)

Figura 23 Figura