UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOMAS DE ZAMORA MAESTRIA EN FLORICULTURA

"Bases para un programa de mejoramiento genético en Alstroemeria"

Tesis presentada por el Ing. Agr. Conrado A. Pakoca para optar por el título de Magister en Floricultura

2014

AGRADECIMIENTOS

Al Instituto de Floricultura CIRN INTA A la Cooperativa Argentina de Floricultores Ltda

ÍNDICE GENERAL

Resumen 1

Abstract 3

1 Introducción 5 1.1 Floricultura en Argentina ...... 5 1.2 Historia del cultivo de Alstroemeria en Argentina ...... 6 1.3 Sistemática y distribución geográfica del género Alstroemeria . . . 11 1.4 Morfología y biología floral ...... 13 1.5 Cariotipo ...... 16 1.6 La hibridación interespecífica y el rescate de embriones como es- trategia del mejoramiento de Alstroemeria ...... 19

2 Objetivos 25 2.1 Objetivo general ...... 25 2.2 Hipótesis ...... 25 2.3 Objetivos específicos ...... 25

3 Materiales y Métodos 27 3.1 Material vegetal ...... 27 3.2 Evaluaciones preliminares ...... 29 3.2.1 Estimación de la viabilidad del polen ...... 29 3.2.2 Evaluación del crecimiento del tubo polínico ...... 30 3.3 Cruzamientos dirigidos ...... 32 3.3.1 Crecimiento del ovario post polinización ...... 32 3.4 Rescate de óvulos in vitro ...... 33 3.4.1 Caracterización del crecimiento de los óvulos in vitro . . . . 34 3.4.2 Desarrollo de brotes, raíces y aclimatación ...... 35 3.4.3 Coeficiente de eficiencia reproductiva ...... 35 3.5 Estimación del contenido relativo de ADN por citometría de flujo . . 36 3.6 Registro ...... 37

4 Resultados y Discusión 39 4.1 Evaluaciones Preliminares ...... 39 4.1.1 Estimación de la viabilidad del polen ...... 39 4.1.2 Evaluación del crecimiento del tubo polínico ...... 40

i 4.2 Cruzamientos dirigidos ...... 44 4.2.1 Crecimiento del ovario post polinización ...... 44 4.3 Rescate de óvulos in vitro ...... 45 4.3.1 Caracterización del crecimiento de los óvulos in vitro . . . . 45 4.3.2 Germinación in vitro ...... 49 4.3.3 Análisis conjunto del crecimiento de los ovarios post polini- zación, caracterización de los óvulos, germinación in vitro y producción de plántulas ...... 52 4.3.4 Coeficiente de eficiencia reproductiva (CER) ...... 56 4.3.5 Desarrollo brotes, raíces y aclimatación ...... 59 4.4 Caracterización del contenido relativo de ADN mediante citometría de flujo ...... 63

5 Conclusiones Generales 69

Bibliografía Consultada 71

ii INDICE DE TABLAS

Tabla 1 Variedades y número de plantas introducidas en la primera importación de Alstroemeria para producción de flor de corte en la Argentina (1996) ...... 7 Tabla 2 Variedades de Alstroemeria clasificadas por su porcentaje de participación y empresas fitomejoradoras presentes en el mer- cado a finales del año 2008...... 10 Tabla 3 Especies de Alstroemeria nativas de Argentina y su distribu- ción geográfica ...... 13 Tabla 4 Especies, variedades y lugar de recolección de la colección de Alstroemeria del Instituto de Floricultura ...... 28 Tabla 5 Porcentaje de viabilidad del polen de las entradas de Alstroe- meria psittacina y las variedades comerciales (%) por el mé- todo de Greissl (1989) ...... 40 Tabla 6 Germinación del polen y crecimiento del tubo polínico en cru- zamientos entre Alstroemeria psittacina, A. aurea y variedades comerciales...... 42 Tabla 7 Volumen del ovario a 5 y 14 DPP (mm3) en cruzamientos en- tre especies y variedades de Alstroemeria: valores mínimos y máximos en cada grupo de cruzamientos ...... 47 Tabla 8 Crecimiento de los óvulos (ECO) a diferentes edades al res- cate (DPP) en diferentes combinaciones (%) ...... 48 Tabla 9 Germinación de óvulos (%) respecto al total de óvulos involu- crados en la polinización de todos los cruzamientos por com- binación...... 51 Tabla 10 Combinaciones en las que se obtuvo germinación de embrio- nes en rescates realizados a diferentes tiempos post polinización 53 Tabla 11 Volumen teórico del ovario al rescate (VTOR) en mm3 a 14 DPP en ‘Belvedere’ × 20090602A4 y 'Belvedere' × 20091009B1 y sus recíprocos...... 54 Tabla 12 Volumen teórico del ovario al rescate (VTOR) en mm3 de ‘Vir- ginia’ × 20091009B1 y ‘Virginia’ × 20100729C1 en rescates a 5 y 14 DPP en cruzamientos cuyos óvulos rescatados no germinaron ...... 56

iii Tabla 13 Cruzamientos totales (Nº), cruzamientos que produjeron óvu- los que germinaron (Nº) y cruzamientos de los cuales se ob- tuvo plantas (Nº) para cada el estado de crecimiento del óvulo (ECO) observado a los 30 días de cultivo in vitro ...... 56 Tabla 14 Coeficiente de eficiencia reproductiva (CER) para ’Belvedere’, ‘Virginia’, 10#233 (A. aurea) y 10#263 (A. psittacina) en dife- rentes combinaciones...... 58 Tabla 15 Número de cruzamientos, número de óvulos rescatados, nú- mero de embriones germinados, número de plantas obtenidas y porcentaje de plantas obtenidas respecto al número de óvu- los rescatados y al de óvulos germinados en rescates a 5 y 14 DPP ...... 61 Tabla 17 Diferencia entre especies, variedades e híbridos respecto al trigo ‘Chinese Spring’ en el contenido relativo de ADN evalua- do por DAPI...... 64

iv ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Entrada 20081107I1, A. psittacina en el sitio de recolección Entrada a Santa Ana, Pcia. Corrientes, 27°27′40.6′′ 58°41′18′′ 72 msnm...... 27 Figura 2 Parcela de cultivo de variedades de Alstroemeria en el IF . . 29 Figura 3 Cruzamientos identificados sobre Alstroemeria psittacina . . . 33 Figura 4 Medición de largo y ancho en ovarios de ‘Diamond’ en cruza- mientos con 20081107I1 (A. psittacina) rescatados a 5 DPP (168,169) y 20090602A4 (A. psittacina) en cruzamientos con ‘Belvedere’ rescatados a 14 DPP (149, 160) ...... 34 Figura 5 A Granos de polen viables (Vi) y no viables (NoVi) por el méto- do de Greissl correspondientes a 20090611Z1 (A. psittacina) B Granos de polen no viables de ‘Sacha’ ...... 41 Figura 6 Crecimiento de tubos polínicos A serpenteante y B errático del tubo polínico a 2 DPP en ‘Diamond’ × 20081107I1. C Tubos polínicos en la línea de abscisión del estilo, separado del ova- rio en ‘Sacha’ × 20081107I1. Barra=50 µm...... 43 Figura 7 Crecimiento del tubo polínico a 2DPP, A terminaciones globo- sas anormales en la mitad del estilo, en ‘Sacha’ × 20081107I1 y B en ‘Fuego’ × 20090611Z1, C Crecimiento serpenteante del tubo polínico en el ovario con variación del diámetro en 20081107I1 × ‘Jive’ Barra=50 µm...... 44 Figura 8 A Crecimiento serpenteante del tubo polínico en la zona mi- cropilar a 2 DPP en ‘Diamond’ × 20090602Z2. Barra=40 µm B Deposición de calosa en la región de la chalaza y funículo en ‘Fuego’ × ‘Belvedere’ Barra=200 µm...... 45 Figura 9 Estado de crecimiento de los óvulos. (a) ECO 1, 2 y 3 (b) ECO 4 48 Figura 10 A Embrión germinado, 20091009B1(*) × ‘Belvedere’, resca- te a 14 DPP y 103 días de cultivo in vitro. (*) A. psittacina.B Embrión germinado, 20091009B1(*) × ‘Belvedere’, rescate a 19 DPP y 82 días de cultivo in vitro. (*) A. psittacina. C Em- brión germinado, 20090602A4(*) × 20081107I1(*), rescate a 25 DPP y 70 días de cultivo in vitro. (*) A. psittacina . . . . . 52 Figura 11 A Plántula, ‘Belvedere’×10#263(*), rescate a 8 DPP y 112 días de cultivo in vitro. (*) A. psittacina B Plántula, ‘Virginia’ × 20091009B1(*), rescate a 14 DPP y 105 días de cultivo in vitro. (*) A. psittacina...... 60

v Figura 12 A Planta en aclimatación, ‘Virginia’ × 20091009B1(*), resca- te a 14 DPP 200 días de cultivo in vitro y 14 días en ma- ceta. (*) A. psittacina B Planta en aclimatación, ‘Virginia’ × 20091009B1(*), rescate a 14 DPP 227 días de cultivo in vitro y 137 días en maceta. (*) A. psittacina ...... 61 Figura 13 Flores de 20091009B1 (A. psittacina) (izquierda), 'Virginia' × 20091009B1 -cruzamiento 11-1052-(centro) y 'Virginia' (dere- cha) ...... 65 Figura 14 Inflorescencias de 20091009B1 (A. psittacina) (izquierda), 'Vir- ginia' × 20091009B1 -cruzamiento 11-1052-(centro) y 'Virgi- nia' (derecha) ...... 65 Figura 15 Contenido relativo de ADN obtenido por citometría de flujo de A 20091009B1 (A. psittacina) (1), ‘Virginia’×20091009B1- cru- zamiento 11-1051 (2) y ‘Virginia’ (3) ...... 66 Figura 16 Contenido relativo de ADN obtenido por citometría de flujo de 20091009B1 (A. psittacina) (1), ‘Virginia’ × 20091009B1, cru- zamiento 11-1052 (2), y ‘Virginia’ (3) ...... 67 Figura 17 Contenido relativo de ADN obtenido por citometría de flujo de 20091009B1 (A. psittacina) (1), ‘Belvedere’×20091009B1 cru- zamiento 11-1058 (2) y ‘Belvedere’ (3) ...... 68

vi LISTA DE ABREVIATURAS

1-NAA 2-(1-Naphthyl)acetic acid ó Acido 1-Naftalen Acetico ó Acido alfa naftalen acético 2-4D Acido 2,4-diclorofenoxiacético 6-BA N-benciladenina ó N-bencil-7H-purin-6-amina. Sin= BA, BAP ADN Acido desoxiribonucleico CAF Cooperativa Argentina de Floricultores Ltda. CER Coeficiente de Eficiencia Reproductiva CETEFFHO Centro Tecnológico en Floricultura Fruticultura y Hor- ticultura DAPI 2-(4-amidinofenil)-1H -indol-6-carboxamidina DPP Días Post Polinización ECO Estado de crecimiento del óvulo FAA Formol-Acido Acético-Alcohol FDA Diacetato de fluoresceina

GA3 Acido Giberelico GISH Genomic In Situ Hybridization IBA Acido Indol 3-butírico INTA Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria MS Murashigue-Skoog PI Ioduro de Propidio RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RVZ Royal van Zanten TCP-IP Transmission Control Protocol-Internet Protocol VTOR Volumen Teorico del Ovario al Rescate

RESUMEN

La importancia de Alstroemeria como cultivo para flor de corte en Argentina y la distribución geográfica del género, sustentan su inclusión en un programa de mejoramiento tendiente a obtener variedades nacionales. Como base del mis- mo, se realizaron cruzamientos interespecíficos a fin de conocer la cruzabilidad y hacer luego selección en aquellos cruzamientos exitosos. Se condujeron cru- zamientos dirigidos entre 25 genotipos, que incluyeron entradas de A. psittaci- na, A. aurea y variedades comerciales. En todos los cruzamientos se rescataron los óvulos a diferentes tiempos transcurridos desde la polinización para efec- tuar su cultivo in vitro. En todas las combinaciones estudiadas, se obtuvieron diferentes patrones en el crecimiento de los óvulos rescatados y en algunas de ellas, distintos porcentajes de germinación, obtención de plántulas y de plan- tas, cuya floración resultó de interés ornamental en el caso de dos híbridos de ‘Virginia’ × A. psittacina. En algunas combinaciones fueron observadas anoma- lías de diferente naturaleza e intensidad en el patrón de deposición de calosa durante el crecimiento del tubo polínico, no obstante la presencia de tales ano- malías, se obtuvo como respuesta pospolinización el crecimiento de los ovarios en todas las combinaciones estudiadas. Se identificaron los genotipos, las com- binaciones y el tiempo transcurrido desde la polinización al rescate mediante un coeficiente de eficiencia reproductiva, cuyo valor varió entre 0 y 41,6%. En to- dos los casos se comprobó con antelación la viabilidad del polen que registró valores de entre 0 y 35% para las variedades y de más del 35% para las es- pecies. Mediante la citometría de flujo con DAPI se encontraron diferencias en la cantidad de ADN con uniones AT entre las especies y las variedades, en- tre las variedades y entre ambos progenitores y los híbridos putativos producto de cruzamientos entre especies y variedades, lo cual confirmó su naturaleza híbrida.

Palabras clave

Alstroemeria, híbridos interespecíficos, rescate de óvulos in vitro, mejoramiento.

1

ABSTRACT

The importance of Alstroemeria as a cut flower crop in Argentina and the geographical distribution of the genus, supports its inclusion in a breeding program aimed at obtaining domestic varieties. As a basis, in order to know interspecific crossability and make the selection of successful crosses, directed crosses were performed between 25 genotypes which included entries of A. psittacina, A. aurea, and commercial varieties. In all crosses, ovules were rescued at different elapsed times counted from pollination and were cultivated in vitro. In all tested combinations, different growing patterns of rescued ovules were found. In some of them, different germination and produced plants percentages was achieved. Two flowering hybrid plants that shows ornamental interest were obtained from ‘Virginia’ × A. psittacina. In some combinations, different type and intensity abnormalities were observed in the pattern of callose deposition during pollen tube growth, despite the presence of such abnormalities, growth of ovaries as postpollination response was obtained in all studied combinations. Genotypes, combinations and elapsed time from pollination to the rescue were identified by a reproductive efficiency coefficient whose value varied between 0 and 41.6%. In all cases pollen viability was found ahead, which recorded values between 0 and 35% for the varieties and over 35% for species. By flow cytometry with DAPI, differences were found in the amount of DNA with AT unions among species and varieties, and among parents and putative hybrids in crosses involving species and varieties, confirming its hybrid nature.

Keywords

Alstroemeria, interespecific hybrids, in vitro rescue ovules culture, breeding.

3

1 Introducción

1 Introducción

1.1 Floricultura en Argentina

La floricultura Argentina se inicia a principios del siglo XX, impulsada por inmi- grantes japoneses y alemanes, a los cuales más tarde se les sumaron portu- gueses e italianos.

A mediados del mencionado siglo, el grado de desarrollo que tuvo la actividad fue mayor, comparado al que tenía en otros países latinoamericanos, estatus que no reviste en la actualidad debido a que, entre otros factores determinan- tes, y a diferencia de lo que ocurrió en aquellos, no se desarrollaron políticas oficiales con el objetivo de mejorar la gestión, la inserción socio-económica de la actividad, y la adecuación de su producto a las tendencias globales en cuanto a especies, variedades y calidad.

Las asociaciones de productores y empresas del sector privado promovieron la actualización de variedades en cultivos como clavel, crisantemo, gerbera, lilium, lisianthus, freesia o alstroemeria. La disponibilidad de material de propagación de estas especies, con un nivel de calidad acorde a estándares internaciona- les y en el marco legal vigente, no siempre ha resultado accesible a todos los productores de acuerdo a su escala.

La dificultad en el acceso a material de propagación con alta calidad y de nue- vas variedades contribuyó a acentuar las diferencias entre pequeños y grandes productores y a colocar en el mercado un producto de calidad inferior, con una gran heterogeneidad.

Las nuevas variedades, exitosas por la aceptación del consumidor y por su aptitud para el cultivo, mejoran la rentabilidad de la producción, e impulsan la expansión de la demanda, mejorando el valor del producto en el mercado in- terno.

La producción con variedades exitosas, con la calidad que puede obtenerse con determinadas especies en las condiciones agroecológicas locales, even- tualmente podría exportarse.

Acceder a nuevas variedades, es condición sine qua non para desarrollar una floricultura competitiva, con continuidad, sustentabilidad y proyección a futuro. Tales características le otorgan a la actividad inserción, tanto en el mercado in-

5 terno por su competitividad frente a las importaciones, como en el internacional, en el cual, la presencia es imposible con variedades antiguas, o con aquellas cuyo origen no este documentado.

Esta situación aplica particularmente a Alstroemeria, por su productividad y por la calidad que puede obtenerse en condiciones agro climáticas locales.

Es de destacar que la Argentina no dispone de variedades nacionales de este género a pesar de que es un recurso genético disponible.

1.2 Historia del cultivo de Alstroemeria en Argentina

A principios de la década del ’90, las empresas argentinas dedicadas a la im- portación de flores de corte comenzaron a operar en forma regular con Alstroe- meria de origen chileno. El tipo de cambio, el precio del producto y su demanda sostenida en el mercado interno impulsaron tales operaciones.

A mediados de la mencionada década, el comercio internacional y la produc- ción de Alstroemeria se encontraban en plena expansión. Tal situación motivó a algunos socios de la CAF (Cooperativa Argentina de Floricultores Ltda.) a iniciar la producción con este cultivo en el área de La Plata. En el año 1995 el Departamento Técnico de la CAF inició contactos con las empresas holandesas a fin de obtener el material de propagación.

La primera introducción de 3100 plantas de la empresa van Staaveren Aals- meer (más tarde adquirida por Royal van Zanten) fue realizada en el año 1996, destinada a dos productores de la zona de El Peligro, en el partido de La Plata, quienes llevaron a cabo la primera experiencia comercial con el cultivo (Tabla 1).

En el año 1997, diez variedades de la empresa Könst Alstroemeria B.V. fueron introducidas y evaluadas durante tres años en el ámbito del CETEFFHO (Cen- tro Tecnológico en Floricultura Fruticultura y Horticultura) (Morisigue, Inaba y Yasui, 2003)

Dada la aceptación y demanda en el mercado local de las flores de Alstroeme- ria, la CAF importó en el año 1997 un total de 20720 plantas. En 1999 la cantidad importada ascendió a 28606, incrementándose también la cantidad de cultiva- dores. Como consecuencia del contexto macro económico de Argentina a partir de 2001, las importaciones se redujeron a 422 plantas.

6 1 Introducción

Tabla 1: Variedades y número de plantas introducidas en la primera importa- ción de Alstroemeria para producción de flor de corte en la Argentina (1996)

Variedades N° de plantas 'Astra' 300 'Diamond' 500 'Pink Triumph' 200 'Rebecca' 200 'Sacha' 200 'Amanda' 300 'Tiara' 500 'Samora' 200 'Amor' 500 'Cinderella' 200 Total 3100 Fuente: Cooperativa Argentina de Floricultores Ltda. (CAF)

Tal reducción tuvo como causa el alto costo relativo del material de propagación debido a la variación en tipo de cambio vigente.

En 2004, 2005 y 2006 las importaciones fueron 4350, 4592 y 4340 respectiva- mente. Con posterioridad a 2006 las cantidades importadas fueron en aumento (Fuente: CAF). Otro origen del material de propagación utilizado en los cultivos ha sido el producido por Könst Alstroemeria B.V. e ingresado al país a través de su representante local.

Hacia 2008 existían aproximadamente 85000 plantas y 52 productores vincu- lados a las empresas fitomejoradoras mediante contratos de cultivo y pago de regalías (Fuente: Registros personales). Un 84% de las mismas eran varieda- des de RVZ (Royal van Zanten) el resto de Könst Alstroemeria B.V. mientras que un 40% de los productores utilizaba exclusivamente variedades RVZ, un 32% se encontraba vinculado a las dos empresas y un 28% únicamente a Könst Alstroemeria B.V.

Las variedades de cada empresa no han tenido la misma demanda, debido a límites agronómicos o comerciales, solo algunas de ellas adquirieron importan- cia comercial luego del transcurso de al menos un año de cultivo en prueba. A tal efecto, es usual la importación de cantidades reducidas de material para evaluación.

La introducción de cada variedad resultó de un proceso dinámico, las nuevas variedades fueron reemplazando a las antiguas debido a las preferencias del

7 consumidor, mientras que otras, por sus características, se tornaron en clási- cas, permaneciendo vigentes en el mercado durante varios años.

La distribución porcentual del total de las importaciones de material de propa- gación de cada empresa fitomejoradora a principios de 2008, puede observarse en la Tabla 2.

La modalidad bajo la cual las empresas holandesas transferían el material de propagación era el leasing de la planta, con un pago por adelantado de regalías durante el tiempo que ésta se encontrara en producción, estimando un período productivo de 5 años.

En el año 2005, se hizo evidente que las empresas no podían asegurar el buen desempeño agronómico de las nuevas variedades en las condiciones locales y su aceptación por el mercado. Desde la CAF fue negociado cambiar el pago único por adelantado por un pago anual por las plantas que se encontraban en producción, debido a que los productores no estaban dispuestos a asumir la totalidad del riesgo.

Hasta el año 2001 el costo del leasing de la planta era de entre 12 y 16 tallos a valores del precio medio de venta del productor en el mercado local, mientras que la regalía era de 1 a 3 tallos, valores similares a los que tenían en Holanda.

La productividad media en condiciones locales varía según las diferentes varie- dades y de acuerdo al manejo que se haga del cultivo oscilando entre 60 y 80 tallos por planta y por año, existiendo algunas combinaciones de ciertas varie- dades y manejo que pueden producir más de 100 tallos por planta y por año. A fines de 2002, el costo de importación sumado al del leasing de la planta au- mentó hasta alcanzar el equivalente a 100 tallos vendidos en el mercado local, mientras que el monto de la regalía anual ascendió al equivalente del valor de entre 6 y 9 tallos por planta por año.

Tal situación determinó la reducción en las importaciones y la proliferación de cultivos desvinculados de las empresas fitomejoradoras, obtenidos de forma irregular partiendo de material de propagación multiplicado sin la autorización de las empresas. Estos cultivos, mantenían en parte su rentabilidad mediante la reducción en los costos directos que tal situación originó.

Los productores con mejor gestión técnico comercial, conservaron la rentabi- lidad mediante la optimización del manejo, logrando rendimientos superiores a los 110 tallos por planta y por año. De esta manera se obtuvieron mejores

8 1 Introducción

precios de venta en el mercado, asimismo continuaron con la importación de nuevas variedades.

Como consecuencia del mal desempeño de algunas variedades y a efectos de mantener el número de plantas en producción, para no modificar el total de los contratos, los agentes de las empresas obtentoras, aceptaron realizar la remoción de las plantas en los invernaderos, su relocalización en los mismos y el reemplazo de las plantas de variedades que fracasaron.

Para ello se incrementó el número de plantas de las variedades exitosas, algo que los contratos originales no preveían. A tal fin se realizó la multiplicación de las plantas mediante la división de matas en los cultivos.

Si bien el objetivo de tal práctica fue el de mantener la rentabilidad del cultivo, la falta de control sobre tal procedimiento facilitó, en algunos casos, la salida irregular de algunas variedades desde los cultivos vinculados a las empresas fitomejoradoras, hacia a un mercado creciente de plantas no registradas.

Tal situación condujo a un incremento en la superficie del cultivo, que al au- mentar la oferta, causó la depresión de los precios debido a una demanda poco elástica.

Es importante destacar que inicialmente las empresas fitomejoradoras no re- gistraron en el organismo correspondiente todas las variedades ingresadas al país, lo que condujo a la proliferación de cultivos que se obtuvieron partiendo de plantas multiplicadas. Tales cultivos, redujeron el precio de venta de la flor cortada en el mercado, al reducir el costo de producción.

La relación entre el costo de las regalías y la producción individual de las plantas de Alstroemeria no condiciona la rentabilidad del cultivo, por tal razón no limita el acceso a un nivel de producción integrado a la tecnología de variedades más avanzada y rentable.

El costo de implantación con las variedades más actuales, requiere un nivel de inversión muy superior al de los cultivos tradicionales, lo cual excluye a los pequeños productores. Los productores de Alstroemeria vinculados a las em- presas fitomejoradoras acceden a las nuevas variedades y pagan las regalías. Los productores grandes tienen más de 5000 plantas en producción, acceden a nuevas variedades a escala comercial y prueban variedades nuevas en sus cultivos.

Otro grupo de productores acceden a escala comercial únicamente a varieda-

9 des que ya fueron probados en el país. Un tercer grupo de productores man- tiene en producción variedades exitosas, pero sólo ocasionalmente incorporan nuevas variedades, limitados por el costo de implantación.

Es importante mencionar también que todavía existen productores no vincu- lados a empresas fitomejoradoras que utilizan variedades antiguas, con baja calidad y productividad.

Tabla 2: Variedades de Alstroemeria clasificadas por su porcentaje de partici- pación y empresas fitomejoradoras presentes en el mercado a finales del año 2008.

% Compras Könst Royal van Zanten >10 'Firenze' 'Rebecca' 'Fuego' 'Diamond' entre 5 y 10 'Napoli' 'Sacha' 'Audrey' 'Amor' 'Balance' 'Belinda' 'Fuji' 'Tiara' entre 2 y 5 'Bordeaux' 'Pink Diamond' 'Calgary' 'Cinderella' 'Modena' 'Natasja' 'Chanel' 'Dalilah' 'Albatros' 'Amanda' 'Estrada' 'Irena' 'Odessa' 'Sunny Rebecca' 'Impacto' 'Ovation' entre 1 y 2 'Cuba' 'Virginia' 'Elegance' 'Petra' 'Pistache' 'MyFair' 'Isola' 'Laura' 'Aspen' 'Fiona' 'Nairobi' 'Everest' 'Prada' 'Kristina' < 1 'Tampa' 'Soleada' 'Topaz' 'Mango' 'Wilhelmina' 'O. Queen' 'Astra' 'Pink Triumph' 'Tropicana' 'Red Velvet' 'Larissa' 'Rosita' 'Goa' 'Helios' 'Senna' 'Samora' 'Amulet' 'Maya' 'Tamara' 'Swet Finesse' 'Stratus' 'Xandra' 'Belvedere' 'Beatrice' 'Sacramento' 'Jive' 'Finesse' 'Destiny' 'Olga' 'Libelle' 'Jazmina' Fuente: V. Drewes A. Manager Royal van Zanten. Comunicación personal, 2008

Las empresas holandesas no abandonaron el mercado argentino entre el 2001

10 1 Introducción

y 2004 debido a que el 80% de los productores cumplió en tiempo y forma con los contratos y el 20% negoció su deuda. En los años posteriores, varios productores que se iniciaron irregularmente, regularizaron su situación firmando contratos con las empresas fitomejoradoras.

Esta realidad productiva de la Argentina dependiente de empresas extranje- ras amerita el desarrollo de variedades locales que posibilitarían una mayor competitividad del sector florícola. Asimismo las variedades que actualmente son utilizadas por los productores fueron desarrolladas para otras condiciones agroecológicas, razón del fracaso de muchas de las variedades introducidas.

1.3 Sistemática y distribución geográfica del género Alstroe- meria

En 1714, Louis Feuillée miembro de la orden religiosa Cristiana de los “Míni- mos”, explorador, geógrafo y botánico, en su viaje de exploración por Sudamé- rica, describió tres especies que crecían en la proximidad de un arroyo cerca de la ciudad de Concepción, Chile. Probablemente debido a que éstas presen- taban raíces carnosas, con substancias de reserva, las clasificó en el género Hemerocallis, denominándolas H. ligtu, H. pelegrina y H. salcilla. Posteriormen- te, Linneo, en la segunda edición de Species Plantarum, describió las mismas, pero considerando que existían diferencias en la morfología floral respecto al género Hemerocallis que lo ameritaban, establece en 1762 el género Alstroe- meria, en reconocimiento a Clas Alströmer, quien le enviara semillas de esta misma especie recolectadas en Perú.

Linneo incluyó en el nuevo género a A. pelegrina, la cual fue considerada la es- pecie tipo. También propuso incluir a las otras dos, aunque al no haber obser- vado por sí mismo a H. ligtu, no especuló sobre su clasificación. Hemerocallis salcilla más tarde fue incluida en el género Bomarea. Alstroemeria fue suce- sivamente clasificado en las Amarillidaceae, las Liliaceae y finalmente en las Alstroemeriaceae (Aker y Healy, 1990).

Utilizando la morfología de los rizomas de A. aurea (sin=A. aurantiaca)(Bux- baum, 1954) ubicó el género en Liliaceae, pero en una nueva subfamilia: Als- troemerioideae. Hutchinson (1959) adhirió a la existencia de relación de Alstroe- meria con Amarillidaceae planteada por Baker (1888) pero propuso Alstroeme- riaceae sobre la base de diferencias en la morfología floral. Dahlgren y Clifford

11 (1982) ubicaron el taxón a nivel de familia.

La sistemática del género Alstroemeria continuó cambiando como resultado de la aplicación de nuevas técnicas que permiten establecer características dife- renciales, como por ejemplo, las presentadas en los trabajos de Baeza et al. (2007a, 2006, 2007b, 2008, 2011); Cajas et al. (2009); Muñoz Schick (2003); Ruiz et al. (2010); Sanso y Xifreda (2001) y la descripción de nuevas especies Assis (2003, 2002); Baeza y Ruiz (2011); Meerow et al. (1999); Muñoz Schick (2000).

A la fecha, el WCSP (2012) incluye en el género Alstroemeria, 150 nombres aceptados a nivel especie y 26 nombres aceptados como subespecie. Los gé- neros Alstroemeria, Bomarea, Schickendantziella, Drymophila y Luzuriaga in- tegran la familia Alstroemeriaceae, luego de la unificación de Alstroemeriaceae y Luzuriagaceae propuesta por el APG III THE ANGIOSPERM PHYLOGENY GROUP (2009).

La familia Alstroemeriaceae se ubica en el sitio n° 55 de acuerdo al LAPG III (Haston et al. 2009), e integra el orden Liliales, el superorden Lilianae y los clados Monocotiledóneas y Angiospermas (Chase y Reveal, 2009).

Es importante mencionar que identificar individuos a nivel de especie no es un procedimiento sencillo debido a que las poblaciones varían ampliamente en sus características morfológicas bajo diferentes condiciones ambientales (Bayer, 1987). Las diferencias en la anatomía y morfología foliar tienen valor taxonó- mico e implicancias en la delimitación subgenérica (Sanso, Aagesen y Xifreda, 2014). De igual forma ocurre con la morfología de los granos de polen (Sarwar et al., 2010).

El género se distribuye en una amplia variedad de hábitats, desde localidades pantanosas, hasta áreas desérticas y desde los estratos inferiores de bosques tropicales de tierras bajas, hasta áreas alpinas en los Andes (Aker y Healy, 1990). Las especies de Alstroemeria se encuentran en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Perú y Venezuela, determinado dos áreas mayores de distribución: el área brasilera que comprende el este del Amazonas y las tierras altas (Estados de Goias, Minas Gerais, Piaui, Para, Sau Paulo y Rio Grande do Sul) y el área chilena que comprende centro y norte de Chile, las costas del Perú y al este de la cordillera de los Andes en áreas de Bolivia y sur de Argentina.

De acuerdo a Meerow, Tombolato y Meyer (1999) el centro brasilero se extien- de a áreas contiguas en Argentina y Paraguay. De acuerdo a Assis (2003) el

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género Alstroemeria comprende cerca de 90 especies restrictas a América del Sur, 38 con distribución peri amazónica al este en Brasil.

En la Argentina se distribuyen 10 especies, una de las cuales, A. bakeri, es en- démica en la provincia de Catamarca (Sanso, 1996). En la Tabla 3 se presentan las especies argentinas y su distribución geográfica, de lo cual infiere que en el país se encuentran poblaciones naturales de especies pertenecientes a ambos centros de origen y dispersión (Sanso, Camargo de Assis y Xifreda, 2005)

Tabla 3: Especies de Alstroemeria nativas de Argentina y su distribución geo- gráfica

Especies Provincias andina subsp. venustula San Juan apertiflora Misiones aurea Chubut, Neuquén, Río Negro bakeri Catamarca isabellana Corrientes, Misiones patagonica Chubut, Neuquén, Santa Cruz, Tierra del Fuego presliana Chaco pseudospathulata Mendoza, Neuquén psittacina Buenos Aires, Corrientes, Entre Ríos, Misiones, Tucumán pygmaea Jujuy, Salta, Tucumán

1.4 Morfología y biología floral

El género Alstroemeria incluye especies perennes, erectas o trepadoras, de reproducción sexual y asexual mediante rizomas. Las raíces de los rizomas va- rían de gruesas y tuberosas a delgadas y fibrosas y presentan engrosamientos cilíndricos de almacenamiento que principalmente contienen almidón y son co- mestibles, lo cual había determinado su importancia económica en el imperio Inca (Aker y Healy, 1990).

Alstroemeria aurea produce brotes vegetativos y brotes generativos, los cuales se inician en rizomas subterráneos que ramifican simpodialmente. El ápice del rizoma es la yema axilar de primer grado de un brote previo, por lo tanto, cada brote aéreo sucesivo que crece desde el rizoma, es un brote que se originó en una yema axilar del brote aéreo precedente. La yema axilar, que también tiene ubicación subterránea, es la hoja de segundo grado del brote aéreo y tie- ne el potencial de producir otro rizoma. Las otras hojas no tienen el meristema

13 especial para producir rizomas (Aker y Healy, 1990). Buitendijk (1998) descri- bió tal crecimiento simpodial trabajando con A. aurea, A. hookeri ssp. hookeri, A. ligtussp. simsii, A. magnifica ssp. magnifica, A. pellegrina, A. philipi, A we- dermannii, A. inodora y A. psittacina, la variedad diploide ‘Orchid’, la variedad triploide ‘Eleanor’ y un híbrido tetraploide resultado del cruzamiento A. pelegrina × A. psittacina.

De acuerdo a Sanso et al. (2005); Sanso (1996) la mayoría de las especies presentan hojas resupinadas entre ellas A. psittacina y A. aurea, en las cuales la cara morfológica abaxial, es funcionalmente la cara adaxial y viceversa, debido al giro de 180 grados de su parte basal. Tal carácter no es encontrado en A. isabellana, A. apertiflora, A. bakeri y A. andina ssp. venustula, mientras que A. presliana, A. pseudoespatulata, A. pigmaea y A. patagonica no presentan en forma definida la resupinación de las hojas.

Las flores zigomorfas, multicolores y manchadas integran inflorescencias um- beliformes de dos a doce radios, que a su vez están formadas por monocasios helicoidales de una a cinco flores aunque existen excepciones tales como A. pygmaea y A. patagonica que presentan una única flor que no es definidamen- te zigomorfa (Sanso, 1996).

El perigonio está formado por seis tépalos libres en la base, ubicados en dos verticilos, el androceo está conformado por seis estambres insertos en dos ver- ticilos, las anteras son basifijas, de dehiscencia es introrsa y longitudinal. La microsporogénesis es sucesiva y el tapete es de tipo glandular. Los granos de polen son surcados, generalmente plano convexos, formados por dos células y presenta diferencias morfológicas con valor taxonómico a nivel infragenérico (Sarwar et al., 2010).

El estigma es trífido. El ovario tricarpelar es ínfero, trilocular, con numerosos óvulos anátropos de placentación axilar ubicados en dos hileras por lóculo, a lo largo de la placenta central, el número total de óvulos varía entre 24 y 36 dependiendo del genotipo (De Jeu et al., 1992).

El fruto es una cápsula loculicida, umbonada hacia el ápice, con seis costillas longitudinales, tricarpelar. La semilla es esferoidal, con un embrión pequeño en relación al tamaño del endosperma, cuya dispersión es balística (Sanso, 1996). De acuerdo a De Jeu et al. (1992), A. aurea y la variedad ‘Jubilee’ presentan dicogamia protándrica. Dos días después de la antesis, la primera antera inicia la dehiscencia, en ese momento, el estilo no ha desarrollado aún, encontrándo-

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se muy corto. Las seis anteras producen la dehiscencia en un orden definido, durante cuatro días, al cabo de los cuales se comienzan a secar y se curvan hacia abajo; el estilo aún se encuentra en desarrollo. Hunziker (1991) también observó dicogamia protándrica en A. psittacina.

Dos días después de deshidratarse la última antera, el estilo adquiere el estado receptivo lo cual se manifiesta con la presentación de gotas de exudado sobre el estigma tripartito, completamente curvado (De Jeu et al., 1992). En tal momento el estigma se clasifica como tipo III (Heslop-Harrison y Shivanna, 1977).

La protandria es completa y la duración de la fase masculina es mayor que la femenina, en A. aurea la duración de la fase masculina es de cuatro días y la de la femenina de tres, estando separadas por una etapa neutra de un día (Aizen y Basilio, 1995). Pueden transcurrir hasta tres días entre la senescencia de la última antera y el inicio de la receptividad del estigma, tal lo que ocurre en A. pulchra, A. ligtu, A. ligtu ssp. simsii (sin = A. haemantha) y A. pulchella (sin = A. psittacina), Esta situación promueve la fecundación cruzada con otros individuos de la población, e incluso con otras especies simpátricas (Aker y Healy, 1990).

La polinización, dependiendo de las especies, es entomófila u ornitófila, las flo- res se presentan vistosas, exhiben manchas y líneas en los tépalos y tienen nectarios. De acuerdo a Tombolato y Matthes (1998) A. psittacina, especie típi- ca del subcentro brasilero, es principalmente polinizada por los colibríes (espe- cies de la subfamilia Trochilinae). Alstroemeria aurea es autocompatible, pero presenta una gran depresión con la endocría y es totalmente dependiente de agentes bióticos para producir la polinización (Aizen y Basilio, 1995). La poli- nización ocurre mediante la intervención de especies que pertenecen al orden Himenóptera e integran el género Bombus.

Alstroemeria aurea posee mecanismos de adaptación que actúan con el fin de aumentar la eficiencia de la polinización en condiciones adversas. Ante un fracaso en la polinización temprana, incrementa la secreción de néctar como atractivo para el polinizador y la receptividad en la floración tardía, que actúa como reserva de ovarios (Ladio y Aizen, 1999). La secreción de néctar es mayor durante el día y en la fase masculina, no solo por su mayor duración sino por una mayor tasa de secreción (Aizen y Basilio, 1998) (Aizen y Basilio 1998). De acuerdo a Botto-Mahan y Ojeda-Camacho (2000), A. ligtu no es visitada por cuatro diferentes polinizadores potenciales al remover los tépalos amarillos con las manchas que actúan como guía hacia los nectarios, mientras que la

15 visita de polinizadores no es afectada de la misma forma cuando es alterada la simetría mediante la remoción parcial o total de los tépalos rojos, resultados que coinciden con los encontrados por Varela (2009) en A. aurea.

En Alstroemeria, la dicogamia determinada por la protandria, en un gran número de especies conduce a la fecundación cruzada. No obstante tal adaptación, las especies que normalmente producen sus semillas por la fecundación cruzada, también lo hacen si son autopolinizadas (De Jeu et al., 1996). En otro conjunto de especies existen barreras citológicas que impiden la fecundación interes- pecífica (De Jeu y Jacobsen, 1995; De Jeu y Garriga Calderé, 1997; De Jeu et al., 1992). Asimismo la ocurrencia de la hibridación interespecífica espontá- nea también se verifica frecuentemente (Aker y Healy, 1990; Tsuchiya y Hang, 1987; Tsuchiya et al., 1987)

En A. aurea han sido encontradas barreras precigóticas intraespecíficas asocia- das a promover el cruzamiento entre individuos que se encuentran localizados a mayor distancia respecto a los que se encuentran próximos. En esta especie, no es afectado el número de granos de polen que germinan en el estigma, pero resulta significativamente menor el número de tubos polínicos que alcanzan el ovario considerando cruzamientos entre individuos separados 1m respecto a individuos separados 100m (Souto et al., 2002).

Según Harder y Aizen (2004) la dicogamia sincrónica en A. aurea ha evolucio- nado como un mecanismo para evitar la autopolinización.

1.5 Cariotipo

Existe una gran variabilidad en el cariotipo de Alstroemeria tanto inter como in- traespecífica y entre las variedades como resultado del mejoramiento genético.

En estudios sobre A. aurea, A. psittacina, A. pelegrina, A. versicolor, A. hae- mantha, A. chilensis, A. caryopyllae y A. hookeri, Tsuchiya et al. (1987), encon- traron a todas con un número cromosómico de 2n=2x=16 con diferentes cario- tipos, incluso algunas exhibieron heterocigosis estructural, presentando uno o más pares de homólogos heteromorfos en sus células somáticas.

En un grupo de 25 variedades, los mismos autores encontraron cuatro varieda- des diploides (2n=2x=16), 12 variedades triploides (2n=3x=24), una variedad triploide con aneuploidía (2n=3x+1=25) y 8 variedades tetraploides; 6 con jue- gos completos (2n=4x=32) y 2 con aneuploidías: 1 con 2n=4x-1=31 y 1 con

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2n=4x+1=33. La meiosis fue normal en algunas de estas especies, pero anor- mal en todas las variedades incluidas las diploides. En la variedad ‘Canaria’, el apareamiento meiotico varió de célula en célula en el número de bivalentes y univalentes. La meiosis en los triploides fue observada anormal en grado extre- mo, mientras que en los tetraploides resultó bastante normal con buen número de bivalentes y algunos univalentes.

La viabilidad del polen fue alta en las especies, aunque A. chilensis presentó polen no viable. En las variedades resultó muy baja excepto ‘Orange Beauty’ 2n=25 y la mayoría de los tetraploides.

La baja viabilidad del polen está asociada a una meiosis anormal y podía ser un indicador del grado de fertilidad femenina de las variedades, para evaluar su posible inclusión en planes de mejoramiento (Tsuchiya et al., 1987).

La comparación de los cariotipos de A. angustifolia ssp. angustifolia, A. aurea, A. inodora, A. ligtu, A. magnifica, A. pelegrina, A. philippii y A. psittacina que realizaron Buitendijk y Ramanna (1996) mediante bandeo C Giemsa y tinción de Feulgen, reveló que los cariotipos eran asimétricos y existen diferencias en la longitud relativa de los cromosomas y en la relación del largo de los brazos en todas las especies comparadas.

Las longitudes de los cromosomas variaron aproximadamente entre 4 y 20 µm. El patrón de bandeo C resultó prominente en las especies del grupo chileno, e inconspicuo en las del grupo brasilero, presentando variación intraespecífica en diferentes entradas de A. angustifolia ssp. angustifolia, A. aurea, A. ligtu y A. magnifica ssp. magnifica. Algunas especies como A. aurea, A. angustifolia ssp. angustifolia, incluso A. inodora y A. psittacina presentan cariotipos similares.

De acuerdo a Kuipers et al. (1997) en las especies con pronunciadas bandas C se encontró gran cantidad de DNA repetitivo, específico para cada especie. Una gran variabilidad en el cariotipo de dos de las subespecies de A. ligtu (A. ligtu ssp. ligtu y ssp. simsii) indican que es probable que cambios a nivel cro- mosómico, hayan contribuido a la diversificación de la especie (Baeza et al., 2007a). Una situación similar fue estudiada en A. hookeri (Cajas et al., 2009; Ruiz et al., 2010).

En poblaciones naturales de A. aurea del parque Nahuel Huapi, Souto y Premo- li (2003) encontraron diferencias genéticas mediante electroforesis de aloenzi- mas. En poblaciones de la VIII y IX región de Chile, Baeza, Schrader, Ruiz y Negritto (2007b) encontraron que el cariotipo es muy constante e independiente

17 de las poblaciones analizadas, a pesar de ello el perigonio varía ampliamente en la coloración de los tépalos y en su tamaño.

El contenido de ADN nuclear (valor 2C) varía entre las especies. Buitendijk, Boon y Rammana (1997) trabajaron sobre 29 entradas de 12 especies de Als- troemeria con un número cromosómico 2n=2x=16 utilizando la citometría de flujo y encontraron valores desde 36,5 pg a 78,9 pg en las pertenecientes al grupo chileno y valores de 49,8 pg a 56,4 pg en el grupo brasilero. Buitendijk et al. (1998) también encontraron variaciones intraespecíficas significativas en 43 entradas de A. ligtu y A. magnifica mediante el mismo método.

De tal forma, puede concluirse que la longitud de los cromosomas, la exten- sión relativa de las regiones de ADN repetitivo y el contenido de ADN nuclear aparecen asociados a la distribución geográfica de la especie y el clima, obser- vándose importantes diferencias interespecíficas especialmente entre las per- tenecientes a los distintos subcentros, o con diferente extensión y grado de confinamiento en sus áreas de distribución.

También existen diferencias intraespecíficas en especies cuya evolución es di- vergente debido a la extensión de su área de distribución, o a barreras geográ- ficas que separaron las poblaciones. Tales situaciones son consistentes con la ocurrencia de cruzamientos interespecíficos espontáneos entre algunas espe- cies del mismo grupo y la dificultad en la ocurrencia de tales cruzamientos entre especies que pertenecen a grupos diferentes.

De acuerdo a Kamstra et al. (1999) la diferenciación en los genomas, espe- cialmente entre las especies brasileras y las chilenas, es evidente en los tres niveles citados previamente; la hibridación sexual no es posible salvo median- te el rescate de embriones (Buitendijk et al., 1992, 1995; De Jeu y Jacobsen, 1995; De Jeu et al., 1992) el apareamiento de cromosomas homólogos en el hibrido es mucho menor que en las especies parentales (Lu y Bridgen, 1997) y los genomas difieren claramente en cuanto a la organización molecular de las secuencias repetitivas de ADN (Kuipers et al., 2002, 1997).

El bandeo C y la tinción de Feulgen en metafase podría usarse para analizar y confirmar la naturaleza híbrida de algunos híbridos interespecíficos. De acuerdo a Kuipers et al. (1997), mediante GISH puede diferenciarse claramente los cro- mosomas parentales en híbridos entre especies chilenas y brasileras, incluso entre chilenas si al menos una de las especies presentan bandas C prominen- tes.

18 1 Introducción

1.6 La hibridación interespecífica y el rescate de embriones como estrategia del mejoramiento de Alstroemeria

En la gran mayoría de las angiospermas, cuando suceden cruzamientos intra- específicos compatibles, una vez depositado el polen en el estigma receptivo, éste se adhiere, hidrata y germina. El tubo polínico crece a través del estilo hacia los óvulos ubicados en el interior del ovario, para alcanzar y penetrar la micró- pila, produciendo la doble fecundación y la triple fusión, originando la cigota y el endosperma respectivamente.

El proceso puede durar meses u horas dependiendo de las especies. Durante el desarrollo del tubo polínico, se encuentran en contacto directo células intactas de tejido esporofítico (el estilo) y de tejido gamentofítico (el tubo polínico). Este mecanismo, denominado sifonogamia, es propio de las angiospermas y no es de naturaleza haustorial como en Cycadidae y otras coníferas.

De acuerdo a Shivanna, Cresti y Ciampolini (1997) el primer evento pospolini- zación que debe producirse exitosamente es la adhesión del grano de polen al estigma. En el caso de Alstroemeria, es de esperar que la adhesión no sería crítica debido al hecho de que este género presenta estigmas húmedos y papi- losos (tipo III) de acuerdo a Heslop-Harrison y Shivanna (1977). Por la misma razón, el proceso de hidratación que se produce por la diferencia de presión osmótica entre el grano de polen y el estigma, la cual es requerida para la ocu- rrencia de la germinación tampoco resultaría crítico. La penetración del tubo polínico en el tejido estigmático no debería revestir dificultad, debido a que no existe la barrera que presenta la cutícula en los estigmas secos (tipos I y II), en los cuales, además, el régimen de hidratación es crítico pues debe ocurrir gradualmente. El crecimiento del tubo polínico, al tratarse de polen binucleado, presenta una primera etapa lenta, a expensas de las reservas propias del grano de polen y una segunda etapa rápida en la que son utilizados los nutrientes que aporta el estilo (Heslop-Harrison y Shivanna, 1977).

En la señalización y modulación del crecimiento del tubo polínico de acuer- do a estudios realizados en otras especies juegan un rol trascendente la con- centración en el citoplasma de Ca+2, las variaciones en la concentración de la fosfoinositido-kinasa y las rho-GTP-asas (Franklin-Tong 1999), de igual forma ocurre con el gradiente de iones y flujos (Holdaway-Clarke y Hepler, 2003).

El crecimiento del tubo polínico es oscilatorio y según el modelo mecánico pro-

19 puesto por Chebli y Geitmann (2007), depende de la presión de turgencia, la deformabilidad de la pared celular y el aporte contínuo de energía. Trabajos re- cientes identifican aquaporinas y genes específicos cuya activación ocurre en el grano de polen y en el tubo polínico (Qin et al., 2009; Salem et al., 2011, 2012; Soto et al., 2010).

En cruzamientos compatibles de Alstroemeria, De Jeu et al. (1996) encontraron que una hora después de la polinización se produjo la germinación del primer grano de polen, a las tres horas el tubo polínico se encontraba penetrando el canal estigmático y a las cinco horas fue posible encontrar un manojo de tubos polínicos en el estigma. Transcurridas siete horas, algunos tubos polínicos in- gresaron al estilo, alcanzando el ovario y las micrópilas 12 horas después de la polinización.

De acuerdo a De Jeu et al. (1992) en algunos cruzamientos interespecíficos realizados en Alstroemeria, el tubo polínico detiene su crecimiento produciendo engrosamientos terminales, o produciendo giros en su trayectoria.

En cruzamientos dialélicos entre siete especies, cinco de origen chileno: A. au- rea, A. hookeri, A. pulchra, A. ligtu y A. pelegrina y dos de origen brasilero: A. inodora, A. brasiliensis De Jeu y Jacobsen (1995) obtuvieron semillas en las autopolinizaciones y en los cruzamientos recíprocos en A. inodora × A. brasi- liensis y en A. inodora × A. pelegrina. En las otras 39 combinaciones estudiadas encontraron barreras precigóticas de incompatibilidad de dos tipos diferentes, una a nivel del estigma, en el cual no ocurre el reconocimiento del polen cuando A. pulchra es utilizada como madre y otra en el estilo, en el cual ocurren reaccio- nes de inhibición del crecimiento del tubo polínico. Estas barreras son débiles y pueden ser superadas en condiciones de estrés. También encontraron barre- ras poscigóticas fuertes, que fueron superadas mediante el rescate de óvulos a 2 DPP y su cultivo en un medio con 9% de sacarosa, al obtener plantas de 27 de estas combinaciones. En todas ellas observaron anomalías de diferente intensidad en el desarrollo del tubo polínico.

También pueden ocurrir anomalías en la segunda fecundación y triple fusión, lo cual determina defectos en el desarrollo del endosperma, que no alcanza un estado celular, permaneciendo cenocítico y desorganizándose posteriormente. Esta situación determina la muerte del embrión, tal como describen Busmann- Loock, Dambroth y Menge-Hartmann (1992) en el género Lupinus entre los 9 y 12 DPP.

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En Alstroemeria, como resultado de estudios histológicos realizados en autofer- tilizaciones exitosas y cruzamientos de especies distantes cuyo desarrollo de la semilla aborta, De Jeu y Garriga Calderé (1997) encontraron que, el aborto del embrión estuvo asociado a un retardo en su crecimiento y una degeneración temprana del tejido esporofítico.

Al resultar de gran interés combinar en un híbrido, características propias de especies distantes, superar la barrera poscigótica mediante el procedimiento de rescate de embriones y su posterior cultivo in vitro ha sido utilizado en nu- merosas ocasiones, con diferentes métodos y modificaciones en el medio de cultivo.

De acuerdo a Buitendijk et al. (1992) el éxito en el rescate de embriones de- pendería de la edad del óvulo al rescate, la concentración de sacarosa en el medio y del tiempo en que aborta el ovulo en el cruzamiento interespecífico. Este evento tendría lugar entre los 10 y 20 DPP. En cruzamientos dialélicos entre algunos híbridos del tipo ‘Butterfly’, A. aurea, A. pelegrina y A. magenta, sin utilizar a esta última como madre efectuaron el rescate de los óvulos que aparecieron hinchados a los 14 DPP y los cultivaron en un medio con 6% de sacarosa. De tal procedimiento obtuvieron plantas en todas las combinaciones.

En rescates de cruzamientos realizados entre especies brasileras, chilenas y variedades, Tombolato et al. (1993) utilizaron diferentes medios de cultivo con el agregado de diferentes concentraciones de GA3, 6-BA (Ver Teixeira da Silva (2012)) y 1-NAA, como resultados, señalaron degeneración de los óvulos entre los 10 y 14 DPP, un mayor porcentaje de embriones germinados con MS, el efecto negativo de hormonas en el medio de cultivo.

Buitendijk et al. (1995) trabajaron con A. aurea, A. pelegrina, A. magnifica, A. inodora y A. psittacina en combinación dialélica y encontraron que en mitades de los óvulos rescatados a 7 DPP y 14 DPP la germinación fue máxima a una concentración de sacarosa entre 6 y 12%, mientras que los rescatados a 21 DPP el mejor resultado fue obtenido con una concentración de sacarosa de entre 4 y 8%. La temperatura para el cultivo de óvulos resultó óptima entre 21 y 24◦C

Alstroemeria inodora × A. psittacina, su recíproco y A. inodora × A. pelegrina produjeron semillas naturalmente.

Lu y Bridgen (1996) reportaron diferencias significativas entre 10 cruzamientos interespecíficos respecto al porcentaje de germinación, producción de callo y

21 producción de brotes a partir de los embriones germinados. También encontra- ron que el porcentaje de germinación resultó dependiente de la edad del óvulo al momento del rescate, registrando diferencias significativas en el porcentaje de germinación del rescate a 7 DPP respecto a los rescates a 5 y 10 DPP. El efecto negativo de la adición al medio de cultivo (MS) de 2-4D y benciladenina sobre la germinación y producción de brotes fué otro resultado de ese trabajo. Los híbridos que obtuvieron resultaron estériles.

Ishikawa et al. (1997) obtuvieron híbridos del cruzamiento ‘Harushigasa’ × A. pelegrina var. rosea y su recíproco. Encontraron diferencias entre los mismos respecto al porcentaje de germinación, el porcentaje de germinación en rela- ción a la edad del óvulo al rescate y a la obtención de plantas. Estos autores reportaron los mayores porcentajes de germinación a los 14 DPP en el mencio- nado cruzamiento y 21 DPP en su recíproco. Los híbridos producidos tuvieron muy baja fertilidad del polen y no produjeron semillas por autofertilización o re- trocruza con ambos parentales. La eficiencia fue baja, la mayoría de los óvulos germinados no produjeron brotes.

Pulido, Rodríguez y Mosquera (1999) realizaron cruzamientos entre ‘Saxony’ y ‘Azula’, dos variedades del tipo ‘Butterfly’ que naturalmente producen semilla y ‘Tiara’, del tipo ‘Orchid’, que no lo hace. Este grupo determinó, en base a observaciones realizadas, que la edad óptima para el rescate fue de 7 DPP.

Ishikawa et al. (2001) obtuvieron híbridos mediante el rescate y cultivo de óvulos incluyendo la placenta, producto del cruzamiento entre A. pelegrina var. rosea y A. magenta, dicho cruzamiento y su recíproco in vivo no producen semillas. Estos autores reportaron el mayor número de plantas con rescates a los 7 y 14 DPP. La estimación de la viabilidad del polen resultó superior al 96% en las especies y del 20,8% en los híbridos.

Pérez-Cotapos et al. (2007); Perez-Cotapos Dunker (2007) realizó autopolini- zaciones y combinaciones interespecíficas entre A. magnifica ssp. magnifica, A. pelegrina y A. pulchra rescató a 7, 14 y 21 DPP obtuvo plantas únicamente de la combinación A. pelegrina × A. magnifica y la autopolinización de A. pulchra (0,29% sobre el total de óvulos rescatados).

Burchi et al. (2000) utilizaron las especies chilenas y brasileras A. aurea, A. diluta ssp. incarnata, A. diluta ssp. diluta, A. ligtu ssp. ligtu, A. ligtu ssp. sim- sii, A. ligtu ssp. incarnata, A. pallida, A. pelegrina, A. psittacina, A revoluta y A. versicolor ssp. tigrina y las variedades comerciales ‘Rosita’, ‘Cardinal King’,

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‘Ganna’, ‘Harmony’, ‘Yellow King’, ‘Marina’, ‘Orange King’, ‘Regina’, ‘Rosario’ y ‘Pink Triumph’. Con ellas iniciaron en el año 1991 una serie de cruzamientos en diferentes combinaciones y en varias estaciones sucesivas, autopolinizacio- nes, retrocruzamientos y cruzamientos entre las F1. Mediante rescate de em- briones, en 1995 y 1996 obtuvieron 154 plantas correspondientes a 25 nuevas combinaciones interespecíficas. Una selección de plantas y flores, evaluada por obtentores y cultivadores fue patentada. En 1997 incluyeron en el plan de cruzamientos a las mejores combinaciones interespecíficos como progenitores y mediante rescate in vitro obtuvieron 778 plantas de 59 nuevas combinacio- nes interespecíficas, partiendo de 2900 cruzamientos correspondientes a 281 combinaciones. De los mismos cruzamientos obtienen solo 77 semillas in vi- vo. Con un análisis del cariotipo y RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) confirmaron la condición de híbridos. Los híbridos cuyos parentales incluyeron especies brasileras florecieron de siete a 20 días antes que las especies chile- nas o las variedades comerciales.

Bridgen et al. (2009) utilizaron varias especies chilenas tales como A. aurea, A. pelegrina, A. pelegrina ssp. alba, A. werdemanii, A. ligtu, A. pulchra, A. mag- nifica, A. magnifica ssp. magenta, A. diluta, A. pseudospathulata y A. hookeri. También utilizaron especies brasileras: A. caryophillacea, A. brasiliensis y A. psittacina. El plan de hibridación de la Universidad de Cornell tuvo su inicio en 1987 con la recolección de las especies en su hábitat natural y fue desarrolla- do para incluir cada una de las especies a medida que florecían, efectuándose la selección sobre la base de las características morfológicas de interés y la disponibilidad de las plantas florecidas. Se puso énfasis en A. aurea por su resistencia a las bajas temperaturas y largo de tallos florales y A. caryophylla- cea por su fragancia. Como resultado del programa fueron obtenidas varieda- des con las características de poseer fragancia como por ejemplo la variedad ‘Sweet Laura’, resistencia invernal y nuevas formas y colores. De acuerdo a estos autores, los genes que controlan la fragancia serían nucleares y pueden ser transmitidos mediante el polen, siendo además tal carácter dominante, ya que se expresó en la F1 en todos los casos cuando se utilizó A. caryophylla- cea como polinizador. De acuerdo a Aros et al. (2012) en la fragancia de ‘Sweet Laura’ aparecen involucrados terpenos; (E)-cariofileno, α-cariofileno, compues- tos similares al ocimeno y en menor grado mirceno. La emisión volátil tiene su máxima expresión durante la antesis y coincide con la máxima expresión del un gen putativo terpeno sintetasa, el AlstroTPS.

23 En Holanda se crearon las primeras variedades que adquirieron difusión mun- dial como productoras de flor de corte y se establecieron áreas importantes del cultivo. Muy pocas especies, en Holanda, se han cultivado comercialmente co- mo tales, algunas selecciones de A. aurantiaca (A. aurea) como flor de corte y para uso en jardín, presumiblemente algunos híbridos de A. ligtu (A. ligtu × A. haemanta) y A. pelegrina f. alba en pequeña escala, también como flores de corte. A. violacea y A. psittacina existían en colecciones, pero no cultivadas como flor de corte. La mejora y obtención de variedades en Holanda comenzó con la introducción de ‘Walter Fleming’, un híbrido interespecífico entre A. au- rea y A. violacea obtenido en Inglaterra, que al ser expuesto por el Coronel S. R. Clarke de Sussex, el 22 de Junio de 1948 recibe un premio al mérito de la Real Sociedad de Horticultura. Este híbrido se comercializó en Holanda con la característica de ‘Orchid Flowering’ popularizándose como ‘Orchid’ (Vonk Noor- degraaf, 1981).

La variedad ‘Walter Fleming’ es completamente estéril y fue multiplicada por rizomas, de acuerdo al mismo autor su origen es incierto, dado que los intentos de volver a cruzar sus parentales fracasaron, los estudios citológicos parecen no avalar tal cruzamiento y la tradición oral habla de que en realidad no fue el resultado de un cruzamiento dirigido, o de que A. violacea por problemas en su determinación taxonómica, en realidad no era tal. A la fecha del trabajo de Noordegraaf era la variedad más importante y de la misma, por irradiación se obtuvieron mutantes. Según De Jeu et al. (1992) durante la propagación vege- tativa de ‘Walter Fleming’ (2n=2x), se encontró una planta tetraploide (2n=4x), la cual producía gametas viables 2x. Esa planta fue cruzada con especies diploi- des, obteniéndose descendencia triploide (2n=3x) la cual constituye el grupo de los denominados ‘Orchid-hybrids’, estos son casi estériles y constituyen uno de los grupos iniciales de variedades comerciales. Otro grupo de variedades co- merciales, las ‘Butterfly’, están constituidos por híbridos interespecíficos entre las especies A. pelegrina o A. violacea del centro Andino, con las A. psittacina o A. inodora, del centro Brasilero. Duplicando los genomas de estos híbridos, re- sultan luego alotetraploides (2n=4x) y producen gametas 2x viables. Un tercer grupo, los ‘Hybrids’, se obtuvieron por cruzamiento entre especies de Chile, Bra- sil y Perú, combinando características interesantes para el cultivo tales como floración durante todo el año sin necesidad de bajar la temperatura del suelo, aptitud para la propagación in vitro, larga duración de la flor cortada, además de colores variados y formas especiales en las flores.

24 2 Objetivos

2 Objetivos

2.1 Objetivo general

Establecer las bases necesarias para llevar a cabo un programa de mejora- miento genético en Alstroemeria

2.2 Hipótesis

La eficiencia en la obtención de híbridos interespecíficos en Alstroemeria de- pende en gran parte de la elección de genotipos parentales adecuados y de técnicas que asistan al cruzamiento sexual. Estudios previos acerca del: con- tenido de ADN genómico, la deposición de calosa en los tubos polínicos, el crecimiento de los ovarios, óvulos y la germinación de estos últimos brindan valiosa información que colabora en ese objetivo.

2.3 Objetivos específicos

Definir técnicas para la realización de cruzamientos controlados entre especies nativas de Alstroemeria y variedades comerciales.

Establecer la existencia de barreras a la hibridación interespecífica mediante el estudio del crecimiento de los tubos polínicos.

Evaluar el crecimiento de los ovarios como resultado de la polinización.

Evaluar la técnica de cultivo de óvulos in vitro para el rescate de los híbridos putativos.

Determinar los contenidos relativos de ADN de las variedades y especies nati- vas por citometría de flujo a los fines de seleccionar parentales.

Evaluar la citometría de flujo como técnica para confirmar la naturaleza híbrida de los genomas obtenidos en cruzamientos dirigidos.

25 26 3 Materiales y Métodos

3 Materiales y Métodos

3.1 Material vegetal

Se utilizaron 25 genotipos de Alstroemeria de acuerdo al siguiente detalle; ocho entradas de A. psittacina, cuatro de A. aurea, 10 variedades comerciales, dos plantas obtenidas a partir de semillas F1 en polinización libre sobre dos de las entradas de A. psittacina y una planta obtenida de la semilla F1 producida por una de las variedades en polinización libre (Tabla 4).

El cultivo (Fig. 2) fue establecido en el invernadero No10 del Instituto de Flori- cultura INTA Castelar. El mismo cuenta con estructura metálica, cobertura de polietileno, pantalla térmica móvil y calefactor para control de temperatura mí- nima, además de sistema de riego y fertilización

Figura 1: Entrada 20081107I1, A. psittacina en el sitio de recolección Entrada a Santa Ana, Pcia. Corrientes, 27°27′40.6′′ 58°41′18′′ 72 msnm.

27 Tabla 4: Especies, variedades y lugar de recolección de la colección de Alstroemeria del Instituto de Floricultura

Código Especie/Variedad Lugar de recolección/Donación 09A538#1 Belvedere x ? Siembra IF, semillas polinización libre 09#582 200811077I1 x ? Siembre IF, semillas polinización libre 09#583 20090602A4 x ? Siembra IF, semillas polinización libre 10#233 A. aurea Lago Lacar 20090602A5 A. aurea Colectó A. Mazzoni 20101215A1 A. aurea Polen recolectado por A. Mazzoni 20110303A1 A. aurea Colectó A. Mazzoni, Bariloche c. chico 10#263 A, psittacina Recolección Dr. Arizumi 19971101-1 (CETEFFHO - JICA) 20081107I1 A. psittacina Entrada a Santa Ana, Pcia. Corrientes, 27°27'40.6" 58°41'18" 72 msnm (Fig. 1)

28 20090602A4 A. psittacina Donación M. Pappone, Jardin Particular, Castelar. 20090611Z1 A. psittacina Donación Doris Bischoff, Jardín Particular, Misiones 20090611Z2 A. psittacina Donación M. Matsura, Pcia. Entre Ríos 20091009B1 A. psittacina Montecarlo, Av. del Libertador, sotobosque suelo arcilloso-pedregoso rojo, 26°33.8' 54°46.4' 20100729C1 A. psittacina Iguazú, Arroyo Falso Uruguaí, RP 212, a 1 km SE Pje El Susto. Barranca 25°59' 17.39' 20111114A1 A. psittacina 'Belvedere' variedad Donación cultivo José, La Plata 'Diamond' variedad Donación cultivo Raúl, La Plata 'Fuego' variedad Donación cultivo Raúl, La Plata 'Irena' variedad Donación cultivo Raúl, La Plata 'Jive' variedad Donación cultivo José, La Plata 'Orange Queen' variedad Donación cultivo Raúl, La Plata 'Rebecca' variedad Donación cultivo José, La Plata 'Sacha' variedad Donación cultivo José, La Plata 'Virginia' variedad Donación cultivo José, La Plata 'Lorena' variedad Donación cultivo Raúl, La Plata 3 Materiales y Métodos

3.2 Evaluaciones preliminares

Previo a la realización de los cruzamientos entre las especies y variedades de Alstroemeria mencionadas se realizaron estimaciones tanto de la viabilidad del polen como del crecimiento del tubo polínico a los efectos de asegurar el posible éxito de los mismos.

Figura 2: Parcela de cultivo de variedades de Alstroemeria en el IF

3.2.1 Estimación de la viabilidad del polen

Para obtener una caracterización preliminar de la viabilidad del polen produci- do por las especies y variedades involucradas, se utilizó el procedimiento de Greissl (1989).

Para ello se colocó el polen sobre un portaobjeto con dos gotas de la solución de sacarosa 0.4 M durante 15 minutos, luego se agregaron dos gotas de la solución de diacetato de fluoresceína (FDA) y 1 gota de solución de ioduro de propidio (PI) y se dejó actuar durante 10 minutos.

Finalmente se colocó el cubreobjetos eliminando el excedente mediante el la- vado con una gota de la solución de sacarosa en el borde del cubreobjetos y su posterior succión con papel de filtro a efectos de evitar la fluorescencia de fondo.

Se efectuó la observación con un microscopio de epifluorescencia OLYMPUS

29 BX 50 (Japón) con filtros de excitación y emisión de 330-385 y 420 nm, respec- tivamente.

Cabe mencionar que la solución de tinción de FDA fue preparada según el pro- tocolo descripto por Greissl. La solución madre se preparó con 5 mg de FDA en 1 ml de acetona y se utilizaron 0.2 ml de la misma en 10 ml de agua bidesti- lada. La solución de tinción de PI se preparó con 1 mg de PI en 50 ml de agua bidestilada.

Con este procedimiento los granos viables aparecen verde fluorescente en di- ferentes grados de intensidad, mientras que los inviables se ven rojos. En esta tesis se consideraron como viables los granos que presentaron una fluorescen- cia intensa y como subviables los que presentaron una fluorescencia de menor intensidad.

Las muestras de polen fueron tomadas en la semana 4 de 2010 de flores cuya segunda o tercer antera se encontraba dehiscente.

A efectos de establecer el porcentaje de viabilidad se contaron los granos de polen viables, subviables, e inviables que aparecían en campos del microsco- pio, hasta totalizar un mínimo de 300 granos categorizados por individuo.

Para el análisis estadístico se condujo repetidamente en todos los pares de proporciones el test exacto de Fisher con el ajuste de error tipo I de Benjamini Hochberg (Narum, 2006), utilizando el paquete fmsb (Nakazawa, 2012) en el software estadístico R (R core Team, 2012).

En los casos en que la conservación del polen fue requerida debido a la ausen- cia de solapamiento en el régimen de floración de las especies, variedades, e híbridos involucrados, se procedió a la extracción de las anteras dehiscentes con pinza desinfectada en alcohol al 96 % y se introdujeron inmediatamente en cápsulas de hydroxipropilmetilcelulosa, que se colocaron en recipientes con silicagel a una temperatura de 8°C durante un tiempo de hasta tres semanas.

3.2.2 Evaluación del crecimiento del tubo polínico

Se efectuaron 164 cruzamientos entre mayo de 2009 y mayo de 2010 de acuer- do a la floración de las especies y variedades que se disponían, de los cuales fueron evaluados 150 y 14 fueron descartados al presentar la pérdida del estilo y no observarse la presencia de tubos polínicos en el ovario.

30 3 Materiales y Métodos

La preparación y observación de los pistilos se realizó de acuerdo a la técnica propuesta por Martin (1959) modificada por Gibbs y Bianchi (1999). La técnica fue adaptada nuevamente para esta tesis teniendo en cuenta las características de los tejidos de Alstroemeria.

A los 2 DPP, los pistilos fueron recolectados y se colocaron en FAA (formol, ácido acético y etanol en proporción 1:0.5:8) al menos durante 24 horas, para producir el fijado de los tejidos y posibilitar su conservación hasta el momento de la observación.

Se lavaron los pistilos con agua corriente y luego de enjuagarlos con agua des- tilada fueron sumergidos en OHNa 0.8 N y colocados en estufa a 60°C durante 20 minutos para producir el ablandamiento y facilitar la penetración de la anilina.

Posteriormente fueron lavados y enjuagados con agua corriente y agua des- tilada nuevamente, luego de lo cual fueron teñidos con azul de anilina al 1 % durante 30 minutos y montados sobre un portaobjetos con una gota de la solu- ción y se presionó levemente con el cubreobjetos.

Mediante la utilización de un microscopio de epifluorescencia, bajo iluminación directa con luz ultravioleta con una longitud de onda (λ) de 356 nm fue observa- do el crecimiento del tubo polínico y las deposiciones de calosa, evidentes por la emisión verde fluorescente de la misma, en contraste con la emisión azul- grisácea del tejido estilar.

Para evaluar los eventos pospolinización a efectos de detectar indicadores de incompatibilidad, se observó la presencia de polen sin germinar adherido al estigma, germinado y con crecimiento de tubos polínicos. Se consideró la pe- netración de los mismos en las papilas estigmáticas, el crecimiento hasta la primera y segunda mitad del estilo y la llegada al ovario.

Se describió la trayectoria crecimiento del tubo polínico, y la presencia de depo- siciones de calosa, normales y anormales. El crecimiento normal de los tubos polínicos se identificó por la característica deposición regular de calosa, con diámetro regular y trayectoria recta. Los tubos polínicos anormales se identifi- caron por patrones aberrantes en la deposición de calosa, diámetros variables, trayectoria errática y/o serpenteante, deposición de calosa de tamaño y fre- cuencia irregulares y en algunos casos detención del crecimiento y terminación globosa (Bell, 1995; Fernando y Cass, 1997).

Para comparar la germinación del polen de las especies y variedades y el desa-

31 rrollo del tubo polínico, se estableció una escala de 0 a 4, donde 0 indicó que no se observaron granos de polen germinados en el estigma, 1 cuando fue posible observar granos de polen adheridos al estigma y tubos polínicos creciendo en el mismo, 2 cuando éstos se observaron en la primera mitad del estilo, 3 cuando alcanzaron la segunda mitad del mismo y 4 cuando se los observó en el interior del ovario.

3.3 Cruzamientos dirigidos

Se realizaron 4549 cruzamientos, en 3952 fué evaluado el porcentaje de ger- minación de los óvulos (Tabla 9) y el crecimiento de los mismos (Tabla 13). En 2227 cruzamientos correspondientes a combinaciones de las cuales se obtuvie- ron plantas, se indicó el número de cruzamientos de los cuales fueron obtenidas y número de las mismas (tabla 16).

Se consideró como control, al único fin de corroborar la existencia de creci- miento, germinación de óvulos y desarrollo de plántulas en los medios de culti- vo utilizados, una combinación intraespecífica: 20090602A4 × 20081107I1 (A. psittacina × A. psittacina).

Los cruzamientos involucraron distintas combinaciones entre las especies y las variedades antes mencionadas (Tabla 4). Se utilizaron como polinizadoras a las especies y a tres variedades cuyo polen resultó viable de acuerdo a los test efectuados (Tabla 5). No se evaluaron 597 cruzamientos debido a la pérdida de la identificación del material o por resultar contaminados durante el cultivo in vitro.

A efecto de dirigir la polinización, se emascularon las flores antes de que ocu- rra la antesis, simultáneamente se eliminó la corola para evitar la atracción de polinizadores. Cuando el estigma se encontró receptivo, hecho indicado al pre- sentarse tripartito y con gotas de exudado, se procedió a la polinización. Cada cruzamiento se identificó con un número, se registraron ambos progenitores y la fecha del cruzamiento (Fig. 3).

3.3.1 Crecimiento del ovario post polinización

Los ovarios se cosecharon a intervalos de 5, 8, 14, 19, 24 y 30 DPP a las 08.00 am. Inmediatamente después de la cosecha se midió el largo y el ancho de los

32 3 Materiales y Métodos

Figura 3: Cruzamientos identificados sobre Alstroemeria psittacina mismos empleando un calibre digital Mitutoyo (Fig. 4) A efectos de comparar el crecimiento de los ovarios luego de la polinización, se estableció un índice que resultó de calcular un volumen teórico asociado a su largo y ancho medidos (VTOR). Dicho cálculo se basó en el volumen de una esfera cuyo radio es la mitad del valor promedio entre el largo (diámetro mayor) y ancho (diámetro menor) medidos, de acuerdo a: ( ) 4 largo + ancho 3 VTOR = × π × 3 4

Con los datos calculados se realizó un análisis de la varianza y se establecie- ron diferencias entre las medias mediante el test de Tukey Se utilizó el software estadístico infostat (Di Rienzo et al., 2011). Los cruzamientos cuyos óvulos res- catados resultaron contaminados durante su cultivo in vitro fueron excluidos en la base de datos.

3.4 Rescate de óvulos in vitro

En las condiciones de asepsia proporcionadas por un flujo laminar vertical (Dal- ton, USA), se desinfectaron los ovarios por inmersión durante 2 minutos en al- cohol etílico al 70% y un posterior flameado, seguidos de una re inmersión y un nuevo flameado.

Se seccionó el ovario mediante tres cortes sagitales simétricos, se extrajeron

33 Figura 4: Medición de largo y ancho en ovarios de ‘Diamond’ en cruzamientos con 20081107I1 (A. psittacina) rescatados a 5 DPP (168,169) y 20090602A4 (A. psittacina) en cruzamientos con ‘Belvedere’ rescatados a 14 DPP (149, 160) las placentas con los óvulos y se sembraron en número de seis cruzamientos por caja de Petri de nueve cm con 25 ml de medio de cultivo esterilizado en autoclave en condiciones estándar.

Se utilizó el medio propuesto por Murashige y Skoog (1962) modificado; macro elementos al 50%, sacarosa 40 g/l y la adición de glutamina a razón de 146 mg/l (Lu y Bridgen, 1996).

La glutamina debido a su naturaleza termolábil se esterilizó por filtrado y se incorporó al medio licuado, inmediatamente antes de su distribución. Las cajas se colocaron en cámara de cultivo a 25°C ± 2 con nictoperíodo de 24 h.

3.4.1 Caracterización del crecimiento de los óvulos in vitro

A los 30 días de cultivo se caracterizó el crecimiento y desarrollo para lo cual se estableció una escala visual de cuatro estados de crecimiento del óvulo (ECO): 1. indicó ausencia de crecimiento y desarrollo, en este estado se incluyó a los óvulos que a la fecha programada de rescate no fueron rescatados debido a que se encontraron colapsados y a los que transcurridos 30 días de cultivo in vitro se encontraron de la misma forma y tamaño que al momento del rescate.

Los estados 2, 3 y 4 implicaron incrementos de al menos el 50% en el volumen respecto al estado inmediato anterior. Asimismo se detectaron cambios en la forma que pasó progresivamente de cilíndrica a esférica, característica de la

34 3 Materiales y Métodos

semilla de Alstroemeria.

Se relevó la germinación de los óvulos hasta al menos 12 meses de cultivo in vitro. Se consideró germinación a la emisión de la radícula. En distintas com- binaciones, se comparó la proporción de cada estado de crecimiento del óvulo (ECO) alcanzado, respecto al total de cruzamientos a diferentes tiempos al res- cate (5, 14, y 24 DPP)

3.4.2 Desarrollo de brotes, raíces y aclimatación

Los óvulos cuyos embriones iniciaron su desarrollo emitiendo la radícula, se repicaron a tubos de ensayo con medio de cultivo MS modificado de la siguiente forma: macro-elementos al 50% con 0.5 mg/l de 6-BA (Ver Teixeira da Silva (2012)), los tubos se colocaron en cámara de cultivo a 25°C en las siguientes condiciones de iluminación: fotoperiodo de 12 horas con una intensidad de 4000 lx.

Cuando las plántulas obtenidas desarrollaron brotes de aproximadamente 1.5 cm se repicó a frascos de 125 cm3 con medio de cultivo MS modificado de la siguiente forma: macro-elementos al 50% con 0.2 mg/l de IBA. Los mismos fueron colocados bajo un régimen de iluminación y temperatura similar al de la etapa anterior.

Las plantas fueron trasplantadas a macetas de 9 cm, las cuales se colocaron en cámara de cultivo a 25°C y atmósfera controlada mediante un saco de po- lietileno cerrado durante 15 días, condición seguida por una apertura gradual del mismo durante los siguientes 15 días.

Transcurridos 20 días, se fertilizaron con 250 mg/l de Hakaphos verde, com- puesto comercial que proporcionó una relación N:P:K de 15:10:15 con adición de micro elementos (0.01% B y 0.02% Cu)

3.4.3 Coeficiente de eficiencia reproductiva

Se calculó la eficiencia reproductiva mediante la relación entre el número de óvulos cuyo embrión germinó, respecto del total de óvulos involucrados en la polinización, considerando todos los cruzamientos de la combinación evalua- da y utilizando el número medio de óvulos por ovario del progenitor femenino, expresado en porcentaje:

35 N◦embrionesgerminados CER = × 100 N◦polinizaciones × mediaovulosporovario

Con este índice se comparó el resultado obtenido en los distintos grupos de rescate. Tanto el análisis de la proporción de óvulos germinados como el de la eficiencia reproductiva se aplicó la implementación del Test Exacto de Fisher en una comparación múltiple de proporciones con ajuste de Benjamini Hochberg, tal ajuste se prefirió al de Bonferroni de acuerdo a (Narum, 2006).

Los cálculos se efectuaron con el software estadístico R (R core Team, 2012) y el paquete fmsb (Nakazawa, 2012).

3.5 Estimación del contenido relativo de ADN por citometría de flujo

Se caracterizaron los contenidos relativos de ADN de las especies, variedades, e híbridos en función de la estimación de la cantidad de uniones AT presentes mediante su comparación con un testigo. A tal fin se utilizó Triticum aestivum L. cv. ’Chinese Spring’ (Bennett y Leitch, 1995; Buitendijk, 1998; Buitendijk et al., 1997).

Los núcleos fueron liberados mediante el “chopeado” de muestras de 1 cm2 extraídas del limbo de hojas tomadas de la base del tercio superior de los tallos, utilizando para ello una hoja de afeitar como elemento de corte.

La operación se realizó en una caja de Petri de vidrio con la adición de 0:5 ml de buffer hipotónico de extracción Otto I a efectos de producir el lisado de los protoplastos. Posteriormente la suspensión se pasó por un filtro de nylon de 30 μm y se vertió sobre el tubo contenedor de plástico adicionándole 2 ml del buffer de tinción Otto II (Otto 1990).

Para las mediciones se utilizó un citómetro de flujo PARTEC PA (software Par- tec Gmbh Alemania). La cantidad relativa de ADN se estimó a partir de los picos obtenidos en el histograma donde se indica el número de núcleos evaluados y la intensidad de radiación reflejada en escala lineal. Se hicieron al menos tres repeticiones de cada determinación utilizando hojas diferentes.

Las variedades y especies se analizaron en test sucesivos de mezclas del ma- terial correspondiente al individuo a investigar y el trigo como referencia, com-

36 3 Materiales y Métodos

parándose la serie de datos tomados el mismo día.

En el caso de los híbridos putativos se efectuó el análisis de la mezcla del ma- terial correspondiente al padre, la madre y el híbrido.

Se establecieron diferencias significativas entre los valores medios obtenidos mediante el análisis de la varianza y test de Tukey utilizando el software esta- dístico InfoStat (Di Rienzo et al., 2011).

3.6 Registro

Se creó una base de datos multiplataforma con estructura cliente-servidor vin- culados vía TCP-IP utilizando mysql, apache y los lenguajes de programación php, html y python. El sistema informático creado (Anahit 1.0) permitió definir y registrar variables y sus valores en forma ilimitada.

37 38 4 Resultados y Discusión

4 Resultados y Discusión

4.1 Evaluaciones Preliminares

4.1.1 Estimación de la viabilidad del polen

El porcentaje de viabilidad del polen presentó diferencias entre las entradas de A. psittacina, entre éstas y las variedades y entre las variedades (Tabla 5).

En ‘Belvedere’ y en cuatro entradas de A. psittacina (20090611Z2, 20081107I1, 20090602A4 y 20090611Z1) se observó que el porcentaje de granos de polen viables registró valores iguales o mayores al 35%.

Estas especies y variedades se utilizaron como dadoras de polen y como ma- dres.

Las variedades en las cuales el porcentaje de granos de polen viables no superó el 35% se utilizaron solamente como madres.

Es de destacar que las variedades ‘Belvedere’ e ‘Irena’ registraron valores de viabilidad del polen de 35 y 27%, respectivamente.

Es importante mencionar que las variedades comerciales de Alstroemeria son generalmente estériles.

Esto es debido a que es un carácter buscado en el mejoramiento genético ya que las variedades estériles presentan potencialmente mayor longevidad flo- ral debido a que al no haber posibilidad de fecundación se desencadena más tardíamente la senescencia (Castro, Silveira y Navarro, 2008).

Además esta característica es deseada por los fitomejoradores como una forma indirecta de protección varietal.

El método de Greissl (1989) para determinar la viabilidad del polen permitió claramente discriminar dos tipos de granos de polen.

En la Fig. 5 A pueden observarse granos de polen viables y no viables corres- pondientes a la entrada 20090611Z1 (A. psittacina) y en la Fig. 5 B granos de polen no viables de la variedad ‘Sacha’.

39 Tabla 5: Porcentaje de viabilidad del polen de las entradas de Alstroemeria psittacina y las variedades comerciales (%) por el método de Greissl (1989)

Especie/ Variedades Polen Polen Inviable (%) Viable+Subviable (%) 20090611Z2 (A. psittacina) 63 37 a 20081107I1 (A. psittacina) 60 40 a 20090602A4 (A. psittacina) 48 52 b 20090611Z1 (A. psittacina) 35 65 c 'Belvedere' 35 65 c 'Irena' 27 73 d 'Sacha' 13 87 e 'Orange Queen' 12 88 e 'Virginia' 11 89 e 'Rebecca' 10 90 e 'Fuego' 5 95 f 'Diamond' 2 98 g 'Lorena' 0 100 - Letras iguales indican diferencias no significativas a p=0.05

4.1.2 Evaluación del crecimiento del tubo polínico

Se observó el crecimiento del tubo polínico en el estigma y el estilo en 150 cruzamientos correspondientes a 43 combinaciones.

Se registró la presencia de polen sin germinar adherido al estigma en 13 com- binaciones. En 5 combinaciones se observaron granos de polen germinados en el estigma. En un caso en la primera mitad del estilo. En cuatro combinaciones de observó el desarrollo del tubo polínico hasta la segunda mitad del estilo. En 19 combinaciones se observaron tubos polínicos en el interior del ovario (Tabla 6).

El hecho de haber encontrado tubos polínicos en el ovario amerita el planteo del rescate de óvulos como técnica a aplicar en esta tesis.

En algunas combinaciones se observó irregularidad del crecimiento en el diá- metro del tubo polínico y en la frecuencia de las deposiciones de calosa, con algunas terminaciones globosas, trayectorias erráticas y/o serpenteantes como por ejemplo en ‘Diamond’ × 20080711I1, ‘Diamond’ × 20090602Z2, 20080711I1 × ‘Jive’, ‘Sacha’ × 20080711I1 y ‘Fuego’ × 20090611Z1.

40 4 Resultados y Discusión

Figura 5: A Granos de polen viables (Vi) y no viables (NoVi) por el método de Greissl correspondientes a 20090611Z1 (A. psittacina) B Granos de polen no viables de ‘Sacha’

Tubos polínicos delgados y con trayectoria errática fueron observados en pisti- los de ‘Irena’ cuando fue polinizada con 20090602A4.

Se detectó alta densidad y trayectoria recta con algunas acumulaciones glo- bosas de calosa en los extremos de los tubos polínicos en ‘Belvedere’ × 20090602A4.

En la Fig. 6 A y B se puede observar crecimiento errático y serpenteante en la combinación ‘Diamond’ × 20080711I1.

En la Fig. 6 C se observan tubos polínicos en la base del estilo, superando la línea de abscisión, en la combinación ‘Sacha’ × 20080711I1.

En la Fig. 7 A y B se observan terminaciones globosas anormales en la combi-

41 nación ‘Sacha’ × 20080711I1 y ‘Fuego’ × 20090611Z1, respectivamente.

En la Fig. 7 C se observan tubos polínicos con crecimiento serpenteante y va- riaciones en el diámetro correspondiente a la combinación 20080711I1 × ‘Jive’.

En la Fig. 8 A se pueden observar tubos polínicos en la proximidad de la micró- pila de ‘Diamond’ cuando fue polinizada por 20090611Z2.

Tabla 6: Germinación del polen y crecimiento del tubo polínico en cruzamientos entre Alstroemeria psittacina, A. aurea y variedades comerciales. 20090602A4 (ap) 20090602A5 (aa) 20090602Z2 (ap) 20090611Z1 (ap) 'Jive' madres padres 20081107I1 (ap) 'Belvedere' 20080711I1 (ap) - - 0 - - - 4 20090602A4 (ap) - - 4 - - - - 20090611Z1 (ap) - 4 - 3 - - - 20090602Z2 (ap) - - - - 1 - - 'Belvedere' 2 4 0 4 - - 4 'Diamond' 4 4 1 4 - - 4 'Fuego' 4 4 0 - 1 4 - 'Irena' 4 3 1 0 - 0 - 'Jive' - 0 1 - - - - 'Lorena' 0 4 - - - - - 'Orange Queen' - 4 0 0 3 - - 'Rebeca' 4 4 - - - - - 'Sacha' 4 3 0 - - - -

(ap) A. psittacina, (aa) A. aurea, 0 polen sin germinar en el estigma, 1 polen germinado en el estigma, 2 tubos polínicos en la primera mitad del estilo, 3 tubos polínicos en la segunda mitad del estilo, 4 tubos polínicos en el ovario, '-' sin datos.

En los cruzamientos en que intervinieron ‘Fuego’ y ‘Sacha’ como madres, se observó un patrón de fluorescencia caracterizado por la deposición de calosa en el sistema vascular de los óvulos, en el funículo y la región de la chalaza (Fig. 8 B).

Determinados patrones de deposición de calosa en los óvulos, observada en distintas especies, han sido asociados a óvulos que abortan debido a la inte- rrupción de su nutrición.

A los 2 DPP, Pimenta y Polito (1982) también encontraron deposición de calosa en la región de la chalaza en Prunus dulcis.

42 4 Resultados y Discusión

Rodrigo y Herrero (1998) describieron un comportamiento similar en P. arme- niaca y Teng et al. (2006) en Leymus chinensis. En Caesalpinia gilliesii Calvi y Carrizo Garcia (2009) describieron diferentes patrones de deposición de calosa en óvulos viables y los que abortan.

Figura 6: Crecimiento de tubos polínicos A serpenteante y B errático del tubo polínico a 2 DPP en ‘Diamond’ × 20081107I1. C Tubos polínicos en la línea de abscisión del estilo, separado del ovario en ‘Sacha’ × 20081107I1. Barra=50 µm.

La deposición de calosa observada en cruzamientos de las variedades ‘Fuego’ y ‘Sacha’ como madres podría estar relacionada a los óvulos que abortan.

El estudio del crecimiento del tubo polínico ha resultado efectivo para el análisis preliminar de los eventos pospolinización en los cruzamientos entre A. psittaci- na y las variedades comerciales consideradas en este estudio.

Se lograron identificar 19 combinaciones en donde el tubo polínico se observó

43 en el ovario, situación que permitió seleccionar parentales a ser utilizados en un plan de mejora genética de Alstroemeria.

Figura 7: Crecimiento del tubo polínico a 2DPP, A terminaciones globosas anormales en la mitad del estilo, en ‘Sacha’ × 20081107I1 y B en ‘Fuego’ × 20090611Z1, C Crecimiento serpenteante del tubo polínico en el ovario con variación del diámetro en 20081107I1 × ‘Jive’ Barra=50 µm.

4.2 Cruzamientos dirigidos

4.2.1 Crecimiento del ovario post polinización

El crecimiento del ovario es una variable que permite estimar los eventos post- polinización. En la tabla 7 se presentan los valores mínimos y máximos del volumen de los ovarios a los 5 y 14 DPP en distintas combinaciones.

44 4 Resultados y Discusión

Figura 8: A Crecimiento serpenteante del tubo polínico en la zona micropilar a 2 DPP en ‘Diamond’ × 20090602Z2. Barra=40 µm B Deposición de calosa en la región de la chalaza y funículo en ‘Fuego’ × ‘Belvedere’ Barra=200 µm.

En todos los casos se observó crecimiento ya que los valores máximos a los 14 DPP siempre fueron mayores que los registrados a 5 DPP. Los volúmenes calculados menores a 150 mm3 correspondieron a ovarios colapsados.

4.3 Rescate de óvulos in vitro

4.3.1 Caracterización del crecimiento de los óvulos in vitro

Los óvulos rescatados tuvieron los siguientes comportamientos en su cultivo in vitro:

1. No modificaron su forma y tamaño, independientemente del tiempo de cul- tivo in vitro. Tal comportamiento fue el esperado en óvulos que no fueron fertilizados (Fig. 9, estado 1).

2. Produjeron modificaciones en su forma y tamaño, observables a los 30 días de cultivo in vitro.

(a) No germinaron. Se asumió que hubo fertilización y posterior activa- ción de barreras pos cigóticas.

45 (b) Germinaron entre los 30 días y 12 meses luego de modificar su forma y tamaño en los primeros 30 días de cultivo.

i. Detuvieron su desarrollo luego de la germinación. ii. Continuaron el desarrollo para luego detenerlo en un estado de plántula cuya organogénesis fue aberrante o incompleta. iii. Continuaron el desarrollo formando plántulas pero éstas no cre- cieron ni desarrollaron. iv. Continuaron el desarrollo formando plántulas de cuya organogé- nesis resultaron tallos, hojas y raíces no típicos de los progeni- tores y éstas no continuaron evolucionando. v. Formaron plántulas que desarrollaron a plantas cuyas caracte- rísticas resultaron similares a los progenitores.

3. Un porcentaje menor a 0.075% de los óvulos rescatados formaron callos friables, los cuales podrían generar plántulas.

La caracterización del crecimiento de los óvulos a los 30 días de cultivo in vitro permitió observar distinto grado, logrando en algunos casos detectar estructu- ras análogas a una semilla. Nótese el estado más avanzado en la Fig. 9 carac- terizado como ECO: 4. El estado 1 de no crecimiento permite suponer que no se produjo la fecundación.

46 4 Resultados y Discusión - - - - 14 871-1931 225-1259 806-2758 1407-1987 'Belvedere' - - - - 5 362-555 150-927 500-1110 164-1802 : valores mínimos - - - - 14 26-2687 515-2572 597-1579 580-1912 10#233 (a) - - - - 5 Alstroemeria 374-539 294-523 563-696 696-1579 ------14 115-1259 508-1875 ------5 20100729C1 (p) 207-327 321-1047 ------14 315-2026 515-2460 ------5 20091009B1 (p) 94-1059 350-2006 - - - 14 ) en cruzamientos entre especies y variedades de 33-2482 57-1838 775-2026 588-1177 3 1563-1697 - - - 5 20081107I1 (p) 44-950 187-547 229-500 143-1124 927-1085 - - - - 14 91-1547 225-2482 477-1483 1629-2045 - - - - - 5 20090602A4 (p) 212-508 882-927 216-1436 DPP Padres Volumen del ovario a 5 y 14 DPP (mm y máximos en cada grupo de cruzamientos Tabla 7: Madres 'Diamond' 'Belvedere' 'Virginia' 'Sacha' 'Lorena' 20091009B1 (p) 10-263 (p) 20081107I1 (p)

47 (a) (b)

Figura 9: Estado de crecimiento de los óvulos. (a) ECO 1, 2 y 3 (b) ECO 4

La distribución porcentual de los valores de ECO en cada grupo de edad al res- cate resultó diferente entre distintas madres y en las diferentes combinaciones (Tabla 8).

Tabla 8: Crecimiento de los óvulos (ECO) a diferentes edades al rescate (DPP) en diferentes combinaciones (%)

ECO Combinaciones 1 2 3 4 5DPP n n % n % n % n % 'Diamond' × 20081107I1 17 1 5.88 a 4 23.5 a 10 58.8 a 2 11.8 a 'Sacha' × 20081107I1 11 7 63.6 b 3 27.3 a 1 9.09 a 0 0 - 'Irena' × 20090611Z2 12 1 8.33 a 7 58.3 a 3 25 a 1 8.33 a 'Virginia' × 20091009B1 18 0 0 - 0 0 - 9 50 a 9 50 a 'Belvedere' × 20091009B1 15 6 40 ab 5 33.3 a 4 26.7 a 0 0 - 20081107I1 × 'Belvedere' 17 0 0 - 4 23.5 a 10 58.8 a 3 17.6 a 'Virginia' × 20100729C1 10 0 0 - 5 50 a 5 50 a 0 0 - 14DPP 'Diamond' × 20081107I1 14 13 92.9 ab 0 0 - 1 7.14 a 0 0 - 'Sacha' × 20081107I1 13 9 69.2 abd 3 23.1 a 1 7.69 a 0 0 - 'Irena' × 20090611Z2 11 11 100 a 0 0 - 0 0 - 0 0 - 'Virginia' × 20091009B1 10 5 50 bd 0 0 - 4 40 a 1 10 a 'Belvedere' × 20091009B1 16 1 6.25 cd 5 31.3 a 7 43.8 a 3 18.8 a 20081107I1 × 'Belvedere' 53 7 13.2 cd 5 9.43 a 8 15.1 a 33 62.3 b 'Virginia' × 20100729C1 15 5 33.3 d 6 40 a 2 13.3 a 2 13.3 a 24DPP 'Diamond' × 20081107I1 6 6 100 a 0 0 - 0 0 - 0 0 - 'Sacha' × 20081107I1 5 5 100 a 0 0 - 0 0 - 0 0 - 20081107I1 × 'Belvedere' 13 6 46.2 a 0 0 - 2 15.4 a 5 38.5 a Letras iguales para cada ECO y grupo de rescate indica diferencias no significativas a p=0.05 resaltado indica grupos en los que se registró germinación de óvulos

48 4 Resultados y Discusión

Los ECO=2 y ECO=3 cuando se presentaron no registraron diferencias signi- ficativas entre distintas combinaciones en rescates a 5, 14 y 24 DPP mientras que el ECO=1 y ECO=4 si lo hicieron.

4.3.2 Germinación in vitro

La proporción de óvulos germinados respecto al número de óvulos totales a todos los DPP para todos los cruzamientos evaluados varió de 0 a 20.8% (Tabla 9). Este valor más alto se dio en la combinación ‘Belvedere’ × 20090611Z2.

Es de destacar que este valor supera a los más altos hallados por Ishikawa et al. (2001) en rescates a 7 y 14 DPP de la combinación A. pelegrina × A. Magenta (19.8%).

Con valores cercanos o superiores al 10% se registraron las combinaciones ‘Belvedere’ × 20090602A4 (12%), ‘Belvedere’ × 20081107I1 (11.8%) y ‘Belve- dere’ × 20091009B1 (9.2%) mientras sus recíprocos produjeron valores meno- res: 0.9% 1% y 0.9%, respectivamente.

Es de destacar que ‘Belvedere’ utilizada como madre produjo óvulos que germi- naron cuando fue polinizada con todas las entradas de A. aurea y A. psittacina evaluadas. En las combinaciones ‘Belvedere’ × 10#263 (2.5%) y ‘Belvedere’ × 20100729C1 (3.1%) se dio la situación inversa, sus recíprocos produjeron valores mayores, 6.7% y 9.7%, respectivamente.

Las combinaciones 10#263 × 10#233 (8.9%) y 20081107I1 × 10#233 (9.4%) obtuvieron altos coeficientes en un reducido número de cruzamientos (n=25 en la primera y n=12 en la segunda). 20090602A4 × 20081107I1 y su re- cíproco dieron valores similares (3.7% y 4.2%, respectivamente). ‘Virginia’ × 20090602A4, ‘Virginia’ × 20091009B1 y ‘Virginia’ × 20100729C1 obtuvieron 0.4% 0.8% y 0.8% respectivamente, valores superiores a los que se obtuvie- ron con ‘Diamond’ × 20090602A4 (0.03%), ‘Diamond’ × 20091009B1 (0.5%) y ‘Diamond’ × 20100729C1 (sin óvulos germinados).

Con ‘Rebecca’ y ‘Sacha’ como progenitores femeninos no se obtuvo descen- dencia capaz de germinar, lo mismo ocurrió con ‘Fuego’ y ‘Jive’ como poliniza- dores (Tabla 9).

Con un tiempo al rescate mayor a 14 DPP, (rescates efectuados a 19, 24 y 30 DPP) se obtuvo germinación de embriones solamente en algunas combinacio-

49 nes que involucraron a A. psittacina, A. aurea, ‘Belvedere’ y la F1 de ‘Belvedere’ en polinización libre. En estas combinaciones también se obtuvieron embriones germinados en rescates efectuados a cinco y ocho DPP.

En las combinaciones que involucraron a las variedades ‘Lorena’, ‘Diamond’, ‘Virginia’, las entradas de A. psittacina 20090602A4, 20081107I1 en combina- ción con A. aurea (10#233) y la F1 de ‘Belvedere’ en polinización libre como madres, solamente se obtuvo germinación de embriones en rescates efectua- dos hasta 14 DPP.

Las variedades ‘Fuego’, e ‘Irena’ se obtuvieron embriones germinados única- mente en rescates hasta 8 DPP (Tabla 10).

Los resultados obtenidos con los cruzamientos de las variedades ‘Lorena’, ‘Dia- mond’, ‘Virginia’ en combinaciones con A. psittacina, A. aurea y la variedad ‘Bel- vedere’ (Tabla 10) rescatados a 14 DPP, resultaron similares a los obtenidos con A. aurea, A. pelegrina, A. magenta y un híbrido tetraploide comercial tipo ‘Butterfly’ en cruzamiento dialélico realizado por Buitendijk et al. (1992).

Tal tiempo al rescate también fue señalado como el que produjo mejores re- sultados por Ishikawa et al. (2001) trabajando con A. pelegrina var. rosea y A. magenta.

Los cruzamientos de las variedades ‘Fuego’ e ‘Irena’ en combinación con di- ferentes entradas de A. psittacina y con la variedad ‘Belvedere’, produjeron embriones que germinaron en rescates efectuados hasta 8 DPP únicamente (Tabla 10). Tal resultado es consistente con la observación de Tombolato et al. (1993) acerca de la degeneración de los óvulos entre los 10 y 14 DPP en cru- zamientos entre especies chilenas y brasileras. También resultan coincidentes con lo señalado por Pulido et al. (1999) acerca de que la edad óptima al rescate fue de 7DPP trabajando con variedades tipo ‘Butterfly’.

Los cruzamientos entre A. psittacina (5 entradas) y ‘Belvedere’ produjeron em- briones que germinaron en rescates efectuados a más de 14 DPP. De igual forma ocurrió con los recíprocos en tres de las entradas. Tal resultado indica que se trata de una combinación compatible en ambas direcciones.

50

4 Resultados y Discusión Jv'(Vc) 'Jive'

------0 0 0 0 Feo (Vc) 'Fuego'

------0 0 Bleee (Vc) 'Belvedere'

1 0 0 0

6.7 0.9 0.9 9.7 0.1 0.6 0.1 01141(Ap) 20111114A1

------0 0

4.2 01331(Aa) 20110303A1

------0 0 0

0.1 00251(Aa) 20101215A1

- - - - - 0 0 0 0 0 0 0 00791(Ap) 20100729C1

------0 0 0 0 09091(Ap) 20091009B1

------0 0

1.9 0.8 0.8 09612(Ap) 20090611Z2

------0 0 0 0

0.3 0.5 09611(Ap) 20090611Z1

- - - - - 0 0 0 0 0 0

3.3 20.8 9.2 3.1 09624(Ap) 20090602A4 - - - - - 0 0 0 4.2 0.4 0.03

, Vc Variedad comercial. 08171(Ap) 20081107I1 - - - - - 0 0 0 0 0 3.7

A. Psittacina 023(Ap) 10#263 ------0 0 0

, Ap 2.5 11.8 12 023(Aa) 10#233 A. aurea

- 0 0 1 0 0 0 0

8.9 9.4 1.3 0.1 padres - ' sin datos, Aa Germinación de óvulos (%) respecto al total de óvulos involucrados en la polinización de todos los cruzamientos por Tabla 9: combinación. madres 10#263 (Ap) 'Diamond' (Vc) 20081107I1 (Ap) 20090602A4 (Ap) 20090611Z1 (Ap) 20091009B1 (Ap) 20100729C1 (Ap) 'Belvedere' (Vc) 'Rebecca' (V) 'Lorena' (Vc) 'Sacha' (Vc) 'Virginia' (Vc)

51 Figura 10: A Embrión germinado, 20091009B1(*) × ‘Belvedere’, rescate a 14 DPP y 103 días de cultivo in vitro. (*) A. psittacina. B Embrión germinado, 20091009B1(*) × ‘Belvedere’, rescate a 19 DPP y 82 días de cultivo in vitro. (*) A. psittacina. C Embrión germinado, 20090602A4(*) × 20081107I1(*), rescate a 25 DPP y 70 días de cultivo in vitro. (*) A. psittacina

4.3.3 Análisis conjunto del crecimiento de los ovarios post polinización, caracterización de los óvulos, germinación in vitro y producción de plántulas

El incremento en el volumen del ovario y el crecimiento con cambios en la for- ma de un número variable de óvulos correspondientes al mismo ovario durante su cultivo in vitro se obtuvieron como respuesta pospolinización. Tal comporta- miento se observó en todos los genotipos estudiados. Ambos procesos tuvieron diferentes intensidades, no siempre ocurrieron en la totalidad de los cruzamien- tos efectuados en cada combinación y tales cambios no necesariamente condu- jeron a la germinación de los embriones durante el cultivo in vitro de los óvulos rescatados.

Tal hecho coincidió con la observación realizada por De Jeu et al. (1992) y Lu y Bridgen (1996) donde los ovarios polinizados en cruzamientos incompatibles formaron frutos sin semillas, o que éstas abortaban.

Este resultado también es consistente con la observación de De Jeu y Jacob- sen (1995), estos autores afirmaron que las barreras precigóticas en Alstroe- meria pueden ser débiles y son factibles de ser superadas bajo determinadas condiciones ambientales tales como el estrés y las temperaturas elevadas. Tal

52 4 Resultados y Discusión

observación podría ser extendida a las variedades y entradas de las especies estudiadas, asumiendo que tales respuestas no ocurren en virtud de un estí- mulo previo a la llegada del tubo polínico al ovario.

Como resultado de las polinizaciones, en los cruzamientos dirigidos se obtuvie- ron ovarios que colapsaron y se deshidrataron y ovarios que iniciaron y conti- nuaron el crecimiento en largo y ancho. El primer caso, sin crecimiento, coinci- dió con el de ovarios que fueron separados del estilo antes de éste alcanzara el estado receptivo.

Tabla 10: Combinaciones en las que se obtuvo germinación de embriones en rescates realizados a diferentes tiempos post polinización

Tiempos post polinización Madres Padres 'Fuego' (Vc) 20090611Z1 (Ap), 20111114A1 (Ap) 20100729C1 (Ap), 20081107I1 (Ap), 'Belvedere' ⩽ 'Irena' (Vc) 8 DPP (Vc) Belvedere' (Vc) 10#263 (Ap) 'Lorena' (Vc) 'Belvedere' (Vc), 20091009B1 (Ap) 10#233 (Aa), 'Belvedere' (Vc), 20090602A4 (Ap), 'Diamond' (Vc) 20091009B1 (Ap), 20110303A1 (Aa), 20090611Z2 (Ap) 20090602A4 (Ap), 20090611Z2 (Ap), 'Belvedere' (Vc) 20111114A1 (Ap), 10#233 (Aa) ⩽ 14 DPP 20090602A4 (Ap), 20091009B1 (Ap), 'Virginia' (Vc) 20100729C1 (Ap) 09-538#1 (Vc × ?) 20090602A4 (Ap), 10#233 (Aa) 20090602A4 (Ap) 10#233 (Aa) 20081107I1 (Ap) 10#233 (Aa) 10#263 (Vc) 10#233 (Aa) 20081107I1 (Ap) 'Belvedere' (Vc), 20090602A4 (Ap) 20090602A4 (Ap) 20081107I1 (Ap), 'Belvedere' (Vc) 20090611Z2 (Ap) 'Belvedere' (Vc) ⩽ 14 y ⩾ 14 DPP 20091009B1 (Ap) 'Belvedere' (Vc) 20111114A1 (Ap) 10#233 (Aa), 'Belvedere' (Vc) 20081107I1 (Ap), 20091009B1 (Ap), 20100729C1 'Belvedere' (Vc) (Ap) 09-538#1 (Vc × ?) 20091009B1 (Ap) (Ap) A. psittacina, (Aa) A. aurea (Vc) variedad comercial (Vc × ?) Vc en polinización libre.

Los óvulos presentaron un crecimiento y desarrollo observable in vivo hasta los 5, 8 o 14 DPP y a una mayor edad pospolinización colapsaron y se resumieron entre los 24 y 30 DPP. Tal comportamiento fue el esperado como resultado de la presencia de barreras poscigóticas. Muchos de estos ovarios que permane- cieron en la planta sin haber producido semillas, manifestaron el mecanismo

53 propio de la dehiscencia balística característica del género. Por otro lado se detectaron óvulos que desarrollaron y se obtuvieron frutos con un número va- riable de semillas inmaduras cuando el rescate se produjo a los 30 DPP. Tal comportamiento fue el esperado en cruzamientos compatibles.

La evolución del crecimiento en volumen del ovario pospolinización fue dife- rente entre las distintas madres y combinaciones. A 14 DPP el volumen del ovario de ‘Belvedere’ registró diferencias significativas en los cruzamientos con 20090602A4 que no produjeron óvulos que germinaron, respecto al alcanza- do en los cruzamientos que germinaron y al que registró en cruzamientos con 20091009B1 indistintamente de que produjeran o no óvulos que germinaban (Tabla 11). ‘Belvedere’ × 20091009B1 registró un incremento en el volumen del ovario, incluso cuando no se produjeron embriones que germinaron. En los cruzamientos recíprocos, 20091009B1 y 20090602A4 como madres no regis- traron diferencias significativas en el VTOR cuando ‘Belvedere’ actuó como po- linizador, independientemente de que los óvulos rescatados germinaron o no. (Tabla 11).

Tabla 11: Volumen teórico del ovario al rescate (VTOR) en mm3 a 14 DPP en ‘Belvedere’ × 20090602A4 y 'Belvedere' × 20091009B1 y sus recíprocos.

Combinaciones germinación VTOR medio n 'Belvedere' × 20090602A4 no 221.06 10 a 'Belvedere' × 20090602A4 si 1031 7 b 'Belvedere' × 20091009B1 no 1098.42 6 b 'Belvedere' × 20091009B1 si 1177.11 10 b

20091009B1 × 'Belvedere' no 878.68 66 a 20090602A4 × 'Belvedere' si 1023.35 14 a 20090602A4 × 'Belvedere' no 932.35 52 a 20091009B1 × 'Belvedere' si 1077.66 8 a Medias con una letra igual no son significativamente diferentes (p<= 0,05)

En los cruzamientos ‘Virginia’ × 20091009B1 y ‘Virginia’ × 20100729C1 cuyos óvulos rescatados no germinaron, el VTOR registró diferencias significativas en rescates a 5 y 14 DPP (Tabla 12).

Los datos relevados, no permitieron establecer un patrón común a todas las es- pecies y variedades involucradas respecto al régimen de crecimiento del ovario a 5 y 14 DPP y relacionarlo con la germinación de los óvulos rescatados. De acuerdo a los resultados obtenidos tal característica aparece como genotipo-

54 4 Resultados y Discusión

dependiente. Para las combinaciones evaluadas, el incremento en el volumen del ovario fue un indicador de la actividad pospolinización.

Considerando todos los cruzamientos efectuados en todas las combinaciones y tiempos al rescate, se encontraron diferencias significativas en la proporción de cruzamientos que produjeron al menos un embrión germinado respecto al total obtenido en cada estado del crecimiento in vitro del óvulo. En la Tabla 13 se presentan los resultados correspondientes a todos los cruzamientos de todas las combinaciones evaluadas respecto a esta característica (ECO), germina- ción del embrión y producción de plantas.

Los cruzamientos que alcanzaron ECO=4 en los primeros 30 días de cultivo in vitro fueron los que germinaron en mayor proporción, mientras los que per- manecieron en ECO=1 germinaron en una proporción de cuatro en 1731 y de ellos no se obtuvieron plantas. Con ECO= 2,3 y 4 se registraron porcentajes de germinación crecientes significativamente diferentes.

Los cruzamientos que alcanzaron ECO=3 y ECO=4 no presentaron diferencias significativas en el porcentaje de plantas obtenidas y tal porcentaje resultó ma- yor respecto al que se obtuvo de óvulos que alcanzaron ECO=2.

Algunas combinaciones alcanzaron ECO = 3 y 4 pero no produjeron la germi- nación de embriones en diferentes edades al rescate.

En rescates a 5 DPP no se observó germinación de óvulos que alcanzaron ECO = 3 y 4 en 'Diamond' × 20081107I1, 'Sacha' × 20081107I1, 'Irena' × 20090611Z2, 'Virginia' × 20091009B1 y ‘Virginia’ × 20100729C1.

Tampoco se registraron germinaciones en rescates a 14 DPP con ECO=3 en 'Diamond' × 20081107I1 y 'Sacha' × 20081107I1. En estas combinaciones no se observó ECO=4.

No obstante, en rescates a 14 DPP se observó germinación con ECO=3 y 4 en 'Virginia' × 20091009B1, 'Belvedere' × 20091009B1, 20081107I1 × 'Belvede- re', y ‘Virginia’ × 20100729C1.

55 Tabla 12: Volumen teórico del ovario al rescate (VTOR) en mm3 de ‘Virginia’ × 20091009B1 y ‘Virginia’ × 20100729C1 en rescates a 5 y 14 DPP en cruza- mientos cuyos óvulos rescatados no germinaron

'Virginia' × 20091009B1 'Virginia' × 20100729C1 DPP VTOR medio n VTOR medio n 5 687.19 22 a 991.04 17 a 14 1434.08 11 b 1451.67 14 b Medias con una letra igual no son significativamente diferentes (p<= 0,05)

Tabla 13: Cruzamientos totales (Nº), cruzamientos que produjeron óvulos que germinaron (Nº) y cruzamientos de los cuales se obtuvo plantas (Nº) para cada el estado de crecimiento del óvulo (ECO) observado a los 30 días de cultivo in vitro

Cruzamientos Cruzamientos con Cruzamientos que ECO óvulos que produjeron plantas germinaron Nº Nº Nº 1 1731 4 a 0 - 2 765 34 b 4 a 3 875 99 c 22 b 4 581 123 d 18 b Totales 3952 260 44 Letras iguales indican diferencias no significativas a p=0,05

De acuerdo a estos resultados la relación entre ECO y germinación sería ge- notipo dependiente y también dependería de la edad al rescate (Tabla 8).

Se observó una mayor proporción de ECO=3 y ECO=4 cuando la polinización se efectuó saturando con polen el estigma (datos no presentados) lo cual po- dría relacionarse al efecto poblacional observado en varias especies, según el cual, la performance de la germinación del polen se relaciona con la densi- dad alcanzada por el mismo en el estigma durante la polinización, tal el caso de Passiflora, Nicotiana, Pyrus, Malus, Rosa y Leucaena (Sari-Gorla y Frova, 1997).

4.3.4 Coeficiente de eficiencia reproductiva (CER)

El coeficiente de eficiencia reproductiva (CER) resultó diferente en las distin- tas tiempos al rescate para ‘Belvedere’, ‘Virginia’ y 10#263 como madres en

56 4 Resultados y Discusión

combinación con diferentes padres.

En la combinación ‘Belvedere’ × 20091009B1 el mayor CER se obtuvo en res- cates a 8 y 14 DPP (13.5 a 14.3%), mientras que en su recíproco con un valor mucho menor, (1.86%) ocurrió en rescates a 19 DPP.

Las combinaciones ‘Belvedere’ × 20090611Z2 y ‘Virginia’ × 20091009B1 coin- cidieron con el mayor CER a 14 DPP (41.6 y 2 % respectivamente), mientras que ‘Virginia’ × 20100729C1 presentó su mayor CER a 19 DPP.

En ‘Belvedere’ × 20090602A4 no fue posible diferenciar el CER en rescates a 5 y 14 DPP. ‘Belvedere’ × 20081107I1 registró el mayor CER (20.3 a 29.2%) en rescates de 14 y 19 DPP y en su recíproco no se registraron diferencias significativas a ninguna edad al rescate, el cual registró un valor muy bajo.

La combinación 10#263 × 10#233 (A. psittacina × A. aurea) presentó el mayor CER (16.15%) en rescates a 8 DPP disminuyendo éste significativamente al aumentar la edad al rescate. Este resultado resultó consistente con el hallado por Buitendijk et al. (1995) para el mismo cruzamiento.

De acuerdo a estos resultados, el CER obtenido en rescates a diferentes tiempos desde la polinización para diferentes combinaciones aparece como genotipo-dependiente.

Los porcentajes de germinación de los óvulos según sus edades al rescate po- dría haber sido influida también por la concentración de sacarosa del medio, debido a que ésta, de acuerdo a la observación de Buitendijk et al. (1995) pro- dujo diferentes resultados en el cultivo de los óvulos rescatados a diferentes edades.

57 Tabla 14: Coeficiente de eficiencia reproductiva (CER) para ’Belvedere’, ‘Virgi- nia’, 10#233 (A. aurea) y 10#263 (A. psittacina) en diferentes combinaciones.

'Belvedere' × 20091009B1 20091009B1 × 'Belvedere' DPP N° Óvulos CER N° Óvulos CER Total Germinados Total Germinados 5 223 12 5.38 a 768 0 0 - 8 119 17 14.3 b 1382 3 0.22 a 14 238 32 13.5 b 1894 12 0.63 a 19 119 6 5.04 a 1562 29 1.86 b 24 - - - - 1434 12 0.84 a

'Belvedere' × 20081107I1 20081107I1 × 'Belvedere' DPP N° Óvulos CER N° Óvulos CER Total Germinados Total Germinados 5 179 8 4.47 a 405 8 1.98 a 8 104 8 7.69 a 928 6 0.65 a 14 74 15 20.3 b 1261 10 0.79 a 19 89 26 29.2 b 523 7 1.34 a 24 89 6 6.74 a 309 4 1.29 a

'Belvedere' × 20090611Z2 'Belvedere' × 20090602A4 DPP N° Óvulos CER N° Óvulos CER Total Germinados Total Germinados 5 - - - - 45 11 24.4 a 8 75 0 0 - - - - - 14 89 37 41.6 a 253 32 12.7 a 19 ------24 - - - - 119 0 0 -

'Virginia' × 20091009B1 'Virginia' × 20100729C1 DPP N° Óvulos CER N° Óvulos CER Total Germinados Total Germinados 5 371 0 0 - 453 0 0 - 8 371 0 0 - 412 0 0 - 14 350 7 3 a 288 2 0.69 a 19 41 0 0 - 103 4 3.88 b 24 ------

10#263 × 10#233 DPP N° Óvulos CER Total Germinados 8 192 31 16.15 a 14 275 27 9.82 b 24 220 3 1.36 c

- sin datos. Letras distintas en filas para cada cruzamiento indican diferencias significativas a p=0.05

58 4 Resultados y Discusión

El CER reflejó la eficiencia de la polinización y el resultado de los procesos fi- siológicos precigóticos, dado que consideró a todos los óvulos factibles de ser fecundados y la eficiencia de los procesos poscigóticos, al haber considera- do los embriones que lograron capacidad de desarrollar. Por tal razón resultó análogo al coeficiente de eficiencia reproductiva establecido por Dafni (1992) por lo cual podría ser considerado una adaptación del mismo y podría ser utili- zado para seleccionar progenitores y tiempos desde la polinización al rescate.

4.3.5 Desarrollo brotes, raíces y aclimatación

En la Tabla 16 se listan las combinaciones en las cuales se obtuvieron plantas, consignando el número total de cruzamientos efectuados. Se destacan algunos cruzamientos de ‘Belvedere’× A. psittacina, ‘Belvedere’ × A.aurea, y ‘Virginia’ × A. psittacina.

Cabe mencionar que de 09-538#1 × 10#233 (Un híbrido de ‘Belvedere’ en poli- nización libre × A.aurea) se obtuvieron 2 plantas originadas en 2 cruzamientos distintos de un total de 4 realizados.

En la Tabla 15 se indica, para los cruzamientos que se destacaron, el porcentaje de plantas obtenidas respecto al total de óvulos rescatados y al total de óvulos germinados, en rescates a 5 y 14 DPP. Un 10.53% de los óvulos germinados en 10#263 × 10#233 (A. psittacina × A.aurea ) desarrollaron a plantas, tal valor sería inferior al obtenido por Buitendijk et al. (1995) reportan 4 híbridos a partir de un único cruzamiento y posterior cultivo de la mitad micropilar de los óvulos en medio líquido. No obstante, el valor es superior al reportado para A. pelegrina × A. magnifica por Pérez-Cotapos et al. (2007) que alcanzó a 0.29%.

Este parámetro registró valores muy superiores en cruzamientos entre las Va- riedades comerciales y A. psittacina, alcanzando un 42.86% en para ‘Virginia’ × 20091009B1 (Fig. 8A, 10A y B) en rescates a 14 DPP resultando también mayor al obtenido por Ishikawa et al. (1997) en A. ligtu hybrid × A. pelegrina var rosaea en rescates a 14 DPP (8.7%). Un valor similar al obtenido por estos autores en el mencionado cruzamiento, se obtuvo en 20081107I1 × 10#233, otro cruza- miento de la combinación A. psittacina × A. aurea. Las entradas 20081107I1 y 20091009B1 de A. psittacina se destacaron como polinizadoras y las varieda- des ‘Belvedere’ y ‘Virginia’ como madres.

En la combinación de control A. psittacina × A. psittacina (20090602A4 ×

59 20081107I1) fueron realizados 55 cruzamientos que se rescataron a los 5, 8, 14, 19, 24 y 30 DPP. De los mismos, se obtuvo la germinación de 46 embriones y éstas ocurrieron en todas las edades al rescate. El mayor valor de CER (8.3) se encontró a los 24 DPP. En rescates a 24 y 30 DPP se logró desarrollo de plántulas. Tales resultados son consistentes con la adecuación de los medios de cultivo utilizados y la compatibilidad de la combinación.

Figura 11: A Plántula, ‘Belvedere’×10#263(*), rescate a 8 DPP y 112 días de cultivo in vitro. (*) A. psittacina B Plántula, ‘Virginia’ × 20091009B1(*), rescate a 14 DPP y 105 días de cultivo in vitro. (*) A. psittacina.

60 4 Resultados y Discusión

Figura 12: A Planta en aclimatación, ‘Virginia’ × 20091009B1(*), rescate a 14 DPP 200 días de cultivo in vitro y 14 días en maceta. (*) A. psittacina B Planta en aclimatación, ‘Virginia’ × 20091009B1(*), rescate a 14 DPP 227 días de cultivo in vitro y 137 días en maceta. (*) A. psittacina

Tabla 15: Número de cruzamientos, número de óvulos rescatados, número de embriones germinados, número de plantas obtenidas y porcentaje de plantas obtenidas respecto al número de óvulos rescatados y al de óvulos germinados en rescates a 5 y 14 DPP

N° N° óv. N° emb. N° plant. % pl. emb. % pl. emb. combinación cruz. res. germ. obt. res. ger. 'Belvedere' × 20090611Z2 6 90 37 7 7.78 18.92 'Belvedere' × 20081107I1 5 75 15 2 2.67 13.33 'Belvedere' × 20090602A4 17 254 32 6 2.36 18.75

14 DPP 20081107I1 × 10#233 5 119 23 2 1.68 8.7 'Virginia' × 20091009B1 17 350 7 3 0.86 42.86

'Belvedere' × 20081107I1 12 179 8 1 0.56 12.5 'Belvedere' × 20090602A4 3 45 11 1 2.22 9.09 5 DPP 10#263 × 10#233 3 83 19 2 2.41 10.53

61 Madres Padres 62 20081107I1 (Ap) 'Belvedere' (Vc) 20090611Z2 (Ap) 20090611Z1 (Ap) 20091009B1 (Ap) 10#233 (Aa) 10#263 (Ap) 20090602A4 (Ap) 20100729C1 (Ap) totales

09-538#1 (Vc x?) [4] (2) 2 - - [6] (0) 0 - - [18] (1) 1 [5] (0) 0 - [33] (3) 3 10#263 (Ap) [25] (2) 2 ------[35] (1) 1 [60] (3) 3 20081107I1 (Ap) [12] (1) 2 - - [14] (0) 0 - - - - [148] (1) 1 [174] (2) 3 20090602A4 (Ap) [14] (0) 0 [3] (0) 0 [55] (2) 2 - [6] (0) 0 [8] (0) 0 - - [243] (0) 0 [329] (2) 2 20091009B1 (Ap) [4] (0) 0 ------[14] (0) 0 [289] (2) 2 [307] (2) 2 'Belvedere' (Vc) [20] (1) 1 [8] (1) 1 [36] (8) 13 [28] (5) 7 [10] (1) 1 [12] (4) 7 [48] (7) 7 [34] (1) 1 - [196] (28)38 'Lorena' (Vc) [3] (0) 0 - [18] (0) 0 [26] (0) 0 [10] (0) 0 - [8] (1) 1 [3] (0) 0 [43] (0) 0 [111] (1) 1 'Diamond' (Vc) [44] (0) 0 [7] (0) 0 [72] (0) 0 [138] (0) 0 [116] (0) 0 [79] (0) 0 [36] (1) 1 [55] (0) 0 [188] (0) 0 [735] (1) 1 'Virginia' (Vc) [26] (0) 0 [9] (0) 0 [20] (0) 0 [27] (0) 0 [9] (0) 0 [17] (0) 0 [55] (2) 3 [61] (0) 0 [58] (0) 0 [282] (2) 3 Totales [152] (6) 7 [27] (1)1 [201] (10) 13 [239] (5) 7 [151] (1) 1 [116] (4) 7 [165] (12) 13 [172] (1) 1 [1004] (4) 4 [ ] Número de cruzamientos, ( ) número de cruzamientos de los cuales se obtuvo plantas. (Aa) Alstroemeria aurea, (Ap) A. psittacina, (Vc) variedad comercial, (Vc x?) variedad comercial en polinización libre. 4 Resultados y Discusión

4.4 Caracterización del contenido relativo de ADN mediante citometría de flujo

Al comparar las distintas entradas de A. psittacina con las variedades, se esta- blecieron diferencias en el contenido relativo de ADN con uniones AT entre las variedades y entre las variedades y las entradas.

No fue posible establecer diferencias entre las entradas de A. psittacina (Tabla 17).

La magnitud de la diferencia, expresada en unidades de intensidad en la escala lineal entre ‘Sacha’, ‘Irena’ y ‘Diamond’ no resultó significativa.

La diferencia entre éstas respecto al trigo resultó significativa y duplicó aproxi- madamente la que se estableció entre las entradas de A. psittacina y el trigo (Tabla 17 a).

‘Belvedere’ y ‘Virginia’ triplican la mencionada diferencia, lo cual implica que éstas difieran respecto a ‘Sacha’, ‘Irena’ y ‘Diamond’ (Tabla 17 b).

La variedad ‘Jive’ se diferencia significativamente con un valor mayor de ‘Lo- rena’, ‘Orange Queen’ y ‘Rebecca’. (Tabla 17 c) pero se ubicó por debajo de ‘Virginia’ y ‘Belvedere’.

Como se estableció una diferencia significativa con un valor menor de ‘Irena’ respecto a ‘Rebecca’ (Tabla 17 d), puede concluirse que tal diferencia puede ser extendida a ‘Sacha’ y ‘Diamond’, pues éstas no se diferenciaron significati- vamente de ‘Irena’.

Como ‘Lorena’ y ‘Orange Queen’ no establecieron diferencia significativa con ‘Rebecca’, puede inferirse la diferencia de ‘Jive’ con un valor mayor, respecto a las entradas de A. psittacina, ‘Sacha’, ‘Irena’, Diamond’, ‘Lorena’, ‘Orange Queen’ y ‘Rebeca’.

En los casos en los que se investigó la presunta naturaleza híbrida del producto de los cruzamientos ‘Variedad’ × A. psittacina mediante la citometría de flujo con DAPI, se determinó una diferencia significativa entre los valores obtenidos de la madre, el padre y el hibrido putativo en conteo simultáneo (Tabla 17 f, g).

63 Tabla 17: Diferencia entre especies, variedades e híbridos respecto al trigo ‘Chinese Spring’ en el contenido relativo de ADN evaluado por DAPI.

Entradas Diferencia media a 20090602A4 (Ap) 53.65 a 20081107I1 (Ap) 55.22 a 'Sacha' (Vc) 104.81 b 'Irena' (Vc) 105.7 b 'Diamond' (Vc) 110.05 b b 20090611Z1 (Ap) 58.32 a 20090602A4 (Ap) 58.62 a 20090611Z2 (Ap) 58.72 a 20081107I1 (Ap) 58.73 a 'Belvedere' (Vc) 166.98 b 'Virginia' (Vc) 167.73 b c 'Lorena' (Vc) 111.18 a 'Orange Queen' (Vc) 112.69 a 'Rebecca' (Vc) 115.38 a 'Jive' (Vc) 123.96 b d 'Irena' (Vc) 105.7 a 'Rebecca' (Vc) 115.38 b e 20090611Z2 (Ap) 56.27 a 'Belvedere' (Vc) 148.51 b 09-538/#1 (Hn) 152.15 b f 20101009B1 (Ap) 70.12 a 111158 (Ho) 96.89 b 'Belvedere' (Vc) 130.1 c g 20101009B1 (Ap) 56.45 a 111051 (Ho) 82.19 b 'Virginia' (Vc) 101.57 c Letras iguales indican diferencias no significativas a p=0.05 (Ap) Alstroemeria psittacina, (Vc) Variedad comercial. (Hn) híbrido natural. (Ho) híbrido obtenido.

La ubicación del pico correspondiente al híbrido entre los que originaron los parentales, confirmó la naturaleza híbrida del mismo (Fig. 15, 16, 17)

La comparación entre 20090611Z2 y ‘Belvedere’ produce diferencias significa- tivas, al igual que entre 20090611Z2 y 09-538#1.

Entre ‘Belvedere’ y 09-538#1 no fue posible establecer diferencias (Tabla 17 e), lo cual resultó consistente con el hecho de que 09-538#1 tenga su origen en una autopolinización de ‘Belvedere’.

Las características de las flores de los híbridos obtenidos resultaron diferentes

64 4 Resultados y Discusión

a las de ambos progenitores (Fig. 13) y de interés ornamental.

Figura 13: Flores de 20091009B1 (A. psittacina) (izquierda), 'Virginia' × 20091009B1 -cruzamiento 11-1052-(centro) y 'Virginia' (derecha)

Figura 14: Inflorescencias de 20091009B1 (A. psittacina) (izquierda), 'Virginia' × 20091009B1 -cruzamiento 11-1052-(centro) y 'Virginia' (derecha)

65 Figura 15: Contenido relativo de ADN obtenido por citometría de flujo de A 20091009B1 (A. psittacina) (1), ‘Virginia’×20091009B1- cruzamiento 11-1051 (2) y ‘Virginia’ (3). En la abscisa está representada la fluorescencia relativa (escala lineal) y en la ordenada la cantidad de células analizadas.

66 4 Resultados y Discusión

Figura 16: Contenido relativo de ADN obtenido por citometría de flujo de 20091009B1 (A. psittacina) (1), ‘Virginia’ × 20091009B1, cruzamiento 11-1052 (2), y ‘Virginia’ (3). En la abscisa está representada la fluorescencia relativa (escala lineal) y en la ordenada la cantidad de células analizadas.

67 Figura 17: Contenido relativo de ADN obtenido por citometría de flujo de 20091009B1 (A. psittacina) (1), ‘Belvedere’×20091009B1 cruzamiento 11- 1058 (2) y ‘Belvedere’ (3). En la abscisa está representada la fluorescencia relativa (escala lineal) y en la ordenada la cantidad de células analizadas.

68 5 Conclusiones Generales

5 Conclusiones Generales

En la presente tesis se obtuvo información significativa que sustenta el inicio de un plan de mejoramiento genético en Alstroemeria.

Las barreras poscigóticas pudieron ser superadas mediante el rescate de óvu- los y su cultivo in vitro en algunas combinaciones entre las entradas de A. psit- tacina, A. aurea y las variedades comerciales.

Se logró la germinación de embriones y la obtención de plantas. Dos híbridos de ‘Virginia’ × A. psittacina presentaron floración de interés ornamental.

Mediante la citometría de flujo con DAPI se establecieron diferencias en la can- tidad de ADN con uniones AT entre las especies y variedades y entre las varie- dades.

Se validó la citometría de flujo con DAPI como técnica rápida para confirmar la naturaleza híbrida de la descendencia obtenida en las combinaciones entre las especies y algunas de las variedades.

Mediante un Coeficiente de Eficiencia Reproductiva se establecieron diferen- cias en las distintas combinaciones entre las entradas de A. psittacina, A. aurea y las variedades en rescates a distintos DPP, permitiendo identificar los genoti- pos, combinaciones y tiempos al rescate que produjeron los mejores resultados, destacándose ‘Belvedere’ × 20091009B1, ‘Virginia’ × 20091009B1, 10#263 × 10#233, y ‘Belvedere’ × 20090611Z2.

Se identificaron como tiempos al rescate óptimos 5, 8 y 14 DPP para diferentes grupos de combinaciones y se observó la probable auto compatibilidad en la variedad ‘Belvedere’.

El crecimiento del ovario en rescates a distintos DPP presentó diferencias que no fue posible generalizar a todas las especies y variedades.

Los óvulos que alcanzaron estado tres o cuatro en los primeros 30 días de cultivo in vitro tuvieron mayor porcentaje de germinación y de plantas obtenidas.

Se observaron anomalías en el crecimiento del tubo polínico en algunas combi- naciones y en todas se obtuvo como respuesta pospolinización el crecimiento

69 del ovario en diferente grado.

Se establecieron diferencias en la viabilidad del polen en las entradas de A. psittacina y en las variedades comerciales.

Una variedad comercial presentó polen viable, lo cual permitió su inclusión en los cruzamientos.

Estos resultados representan un avance a los fines de obtener variedades co- merciales nacionales.

70 Bibliografía Consultada

Bibliografía Consultada

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