UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto de Biologia

KARIN REGINA SEGER

HISTÓRIA DA DIVERSIFICAÇÃO NO GRUPO Proceratophrys bigibbosa (ANURA, ODONTOPHRYNIDAE)

DIVERSIFICATION HISTORY IN THE Proceratophrys bigibbosa GROUP (ANURA, ODONTOPHRYNIDAE)

CAMPINAS 2020 17

KARIN REGINA SEGER

“HISTÓRIA DA DIVERSIFICAÇÃO NO GRUPO Proceratophrys bigibbosa (ANURA, ODONTOPHRYNIDAE)”

“DIVERSIFICATION HISTORY IN THE Proceratophrys bigibbosa GROUP (ANURA, ODONTOPHRYNIDAE)”

Tese apresentada ao Institudo de Biologia da Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em BIOLOGIA ANIMAL, na Àrea de BIODIVERSIDADE ANIMAL.

Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of ANIMAL BIOLOGY, in the area of ANIMAL BIODIVERSITY.

Supervisor/Orientador: LUCIANA BOLSONI LOURENÇO MORANDINI

ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL TESE DEFENDIDA PELA ALUNA KARIN REGINA SEGER, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. LUCIANA BOLSONI LOURENÇO MORANDINI.

CAMPINAS 2020

Campinas, 17 de janeiro de 2020.

Banca examinadora:

Profa. Luciana Bolsoni Lourenço Morandini (Presidente da comissão examinadora)

Prof. Mirco Solé

Prof. Márcio Borges Martins

Prof. Daniel Pacheco Bruschi

Profa. Cinthia Aguirre Brasileiro

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Pós Graduação em Biologia animal do Instituto de Biologia.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, por fornecer as condições necessárias para essa etapa de minha formação.

Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal da Universidade Estadual de Campinas, pela oportunidade de realização do curso e em especial aos professores Silmara Allegretti e Danilo Ciccone Miguel pela disposição em auxiliar-nos sempre que possível.

À Professora Luciana Bolsoni Lourenço pela orientação, por me dar suporte e equilíbrio em todos os momentos; pelo exemplo de competência, seriedade e sensatez que será lembrado por mim ao longo de toda minha carreira e pela paciência em me orientar elucidando meus pensamentos mais complexos.

À Profa Dra. Ana Carolina Carnaval, por todo o apoio, ensinamentos além dos momentos descontraídos durante desenvolvimento do meu doutorado sanduíche em Nova York.

Às coleções de tecidos da UFRGS, PUC-RS, CFBH, SMRP aos pesquisadores que colaboraram com amostras de espécimes que auxiliaram a enriquecer este trabalho, em especial: Dr. Diego Baldo, Dr. Paulo Garcia e Dra. Carmen Busin.

A todos os colegas de laboratório pelo convívio e aprendizado em especial Stenio Vittorazzi, Kaleb Pretto Gatto, William Pinheiro Costa, Ariane Campos, Renata Oliveira Tenório, Marcos Manfrin, Ricardo Pedroso, Micheli Sielsky e todos que tive o prazer do convívio e momentos de aprendizado, em especial minha amiga Denise Pedrosa e meu amigo Kaleb Pretto Gatto por dividirem comigo nossos momentos de ansiedade e diversão que tornaram nossos dias um pouco mais leves no decorrer das nossas teses.

To my friends and colleagues that I have met in my Sandwich Ph.D. for the support and the happy and funny moments that made my days better during the six months I have been in New York, in special Kathryn Mecier, Mariana Vasconcelos, Laura Bertola, Andrea Paz, Marcus Thadeu Santos, Connor French, Gonzalo Enrique Pinilla Buitrago, Jeimy Kass, Patrick Shea and all of you guys that I will remember forever. Thank you very much.

À grande amiga Denise Pedrosa que tive o prazer de conhecer durante meu Mestrado, mas que parecia que nos conhecíamos há muitos anos, mesmo de longe me apoiou e dividiu comigo momentos de alegria e também os não tão alegres que afinal de contas é para isso que servem os amigos de verdade.

À amiga Valéria Martins, que além de amiga se tornou conselheira de tantos momentos durante essa vida acadêmica e um exemplo de mulher determinada que trata os problemas como pequenos obstáculos da vida e não como obstáculos impossíveis de serem contornados. Obrigada pelas cervejas e churrascos que levaram às nossas longas conversas sobre tudo.

À minha mãe Zeli Maria Machado de Oliveira que mesmo longe sempre me apoiou em todos os meus objetivos mesmo os que ela desconhecia. Agradeço a ela por minha vida, e exemplo de paciência em resolver os percalços da vida e levantar quando caímos, por mais brusca que seja a queda. Seu apoio sempre me deu força para continuar todo e qualquer caminho.

Ao meu irmão Daniel Fabiano Seger pelos ensinamentos de uma vida inteira que me permitem hoje tomar decisões importantes também em minha carreira. Obrigada por estar junto comigo em coletas e mesmo de longe sempre me dar o apoio que sei que terei para o resto da minha vida. Obrigada sempre.

À minha prima Heidi Daiana Machado de Oliveira por seu apoio e palavras amigas de conforto em todos os momentos, pela sua disposição em me dar o suporte necessário quando parecia que não havia ninguém.

Aos meus amigos que mesmo distantes me apoiam com o carinho a mim dedicado em especial Cristiane Trein da Silva, Michele Scur Dalatéia, Rafaela Fetzner Drey.

À minha avó Orlandina Machado de Oliveira, que mesmo sem conhecer meu trabalho sempre me apoiou e incentivou.

Ao meu marido Américo José Carvalho Viana, que em todos os momentos me apoiou desde o vestibular, pela sua paciência e companheirismo e principalmente por seu amor e dedicação incondicional. Por ser o melhor marido que eu poderia ter, por aceitar, suportar e me incentivar durante os seis meses que estivemos longe, obrigada sempre.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.

This study was financed in part by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001.

RESUMO

A Floresta de Araucária, subregião localizada no platô Sul da Mata Atlântica, sofreu ciclos de expansão e retração no passado. As expansões ocorreram nos períodos do último máximo glacial (LMG ~21.000 kya) e durante o holoceno (~6.000 kya) e as retrações ocorreram nos períodos mais quentes (interglaciais ~4.000 kya ou atualmente). Os anuros do grupo Proceratophrys bigibbosa possuem distribuição ao longo desse platô Sul, exceto uma das espécies, que ocorre em área de floresta semidecídua submontana da Mata Atlântica, adjacente à região Oeste da Floresta de Araucária. A coincidência da área de distribuição dessas espécies com a Floresta de Araucária (AFO) levanta a hipótese de que a diversificação das espécies do grupo P. bigibbosa possa ter sido influenciada pelos ciclos de expansão e retração da floresta. As datas já estimadas para a divergência dentro do gênero, no entanto, remetem a períodos anteriores à expansão e retração da AFO. Dessa forma, surge uma hipótese alternativa, baseada em uma divergência mais antiga, que considera uma possível influencia da formação do mar do Paraná na história evolutiva do grupo P. bigibbosa. Para avaliar essas hipóteses de diversificação do grupo, obtivemos tecidos de 82 indivíduos de 42 localidades que cobrem a área de distribuição conhecida para o grupo P. bigibbosa. Testamos o monofiletismo desse grupo realizando análises de Máxima Parcimônia e Inferência Bayesiana, usando sequências de DNA de fragmentos de três genes mitocondriais e três nucleares. Através do pacote *BEAST2 implementado no BEAST2, geramos uma árvore de espécies por coalescência, calibrada com um fóssil descrito para a família Odontophrynidae. Usando environmental principal component analysis (PCAs ambientais), exploramos o grau de similaridade ou divergência entre os nichos climáticos realizados pelas espécies atuais. Em todas as análises, P. palustris foi inferida como espécie irmã de P. brauni, compondo um clado irmão daquele composto por P. bigibbosa e uma espécie ainda não descrita (Proceratophrys sp.), que apresenta grandes distâncias genéticas em relação às outras espécies do grupo (entre 3,3% a 4,4% em relação ao gene ribossomal mitocondrial 16S). A espécie P. avelinoi na árvore de espécies inferida pelo StarBeast foi recuperada como irmã do clado formado por todas as demais espécies do grupo, arranjo que diferiu daquele encontrado nas outras análises, em que P. avelinoi foi inferida como espécie irmã de P. brauni + P. palustris. Segundo as estimativas de datação, os eventos de especiação no grupo P. bigibbosa foram mais antigos (11,71 a 2,4 Mya HPD = 95%) do que os ciclos de expansão e retração da Floresta de Araucária ocorridos no Quaternário. Entretanto, um evento possivelmente envolvido na diversificação das espécies desse grupo é a transgressão marítima ocorrida em torno de 15 a 8 Mya, que resultou na elevação dos rios da bacia do Uruguai. Esse aumento do rio teria separado três linhagens ancestrais do grupo: Linhagem Norte, acima do rio Uruguai (N); Linhagem Sul, abaixo do rio (S) e Linhagem Oeste, acima do Uruguai em uma área coberta por uma Floresta submontana (W). Já a origem de cada uma das espécies viventes pode ter sido influenciada por outras flutuações climáticas mais recentes anteriores ao Último Máximo Glacial (LMG), uma vez que seus nichos climáticos atuais parecem ser diferenciados entre as espécies irmãs como observamos em nossa análise de ePCA.

ABSTRACT

The Araucaria Forest, a subregion of Southern Atlantic Forest plateau, experienced cycles of expansion and retraction in the past. The expansions occurred during the last glacial maximum (LMG ~ 21,000 kya) and during the Holocene (~ 6,000 kya) periods and the retractions occurred in the warmer periods (interglacial ~ 4,000 kya or currently). The anurans of the Proceratophrys bigibbosa group are distributed along this southern plateau, except for one species, which occurs in an area of submontane semideciduous forest of the Atlantic Forest, adjacent to the western region of the Araucaria Forest. The coincidence of the distribution area of these species with the Araucaria Forest (AFO) raises the hypothesis that the species diversification of the P. bigibbosa group was influenced by the forest expansion and retraction cycles. The divergence time estimates available for the genus, however, refer to earlier period. Therefore, an alternative hypothesis arises, which also considers a possibible influence of the Paranean sea in the evolutionary divergence of the P. bigibbosa group. To assess these hypotheses, we obtained tissues of 82 individuals from 42 locations that cover the known distribution area for the P. bigibbosa group. We have tested the monophyly of this species group by performing Maximum Parsimony and Bayesian Inference analyses using DNA sequences from three mitochondrial and three nuclear gene fragments. In BEAST2 (with *BEAST2 package), we used a fossil described for the Odontophrynidae family to calibrate a dated species tree. Using envinronmental principal component analysis (environmental PCAs), we explored the degree of similarity or divergence between climate niches realized by current species. In all analyses, P. palustris was inferred as sister species of P. brauni, composing a sister clade of that composed of P. bigibbosa and an undescribed species (Proceratophrys sp.), which presents large genetic distances from other species (between 3.3% and 4.4% relative to the 16S mitochondrial ribosomal gene). The P. avelinoi species in the species tree inferred by StarBeast was recovered as sister of the clade formed by all the other species of the group, an arrangement that differed from that found in the other analyses, in which P. avelinoi was inferred as sister species of P. brauni + P. palustris. According to dating estimates, the speciation events in the P. bigibbosa group were older (11.71 to 2.4Mya HPD = 95%) than the Quaternary Araucaria Forest expansion and retraction cycles. However, an event possibly involved in the diversification of species in this group is the sea transgression that occurred around 15 to 8 Mya, which resulted in the uplift of the rivers of the Uruguay basin. This increase in the river would have separated three ancestral lineages in the group: North lineage, above the Uruguay River (N); South lineage, below the river (S) and West lineage, above Uruguay in an area covered by a submontane forest (W). Moreover, the origin of each living species may have been influenced by recent climate fluctuations before the Last Glagial Maximun (LGM), as their current climate niches could be differentiated in our ePCA analysis.

SUMÁRIO

I. INTRODUÇÃO ...... 11 1. Filogeografia – uma visão geral ...... 13 2. A Mata Atlântica ...... 15 3. A Floresta de Araucária ...... 16 4. O grupo Proceratophrys bigibbosa ...... 18 5. Distribuição geográfica e questões taxonômicas do grupo P. bigibbosa ...... 21 6. Justificativa do estudo ...... 23 II. OBJETIVOS ...... 25 III. CAPÍTULO 1 Uma nova espécie no grupo Proceratophrys biggibosa? ...... 26 1. Material e Métodos ...... 27 2. Resultados e Discussão ...... 32 3. Conclusão ...... 36 IV. CAPÍTULO 2 Southern South America marine transgression as a vicariant process influencing Proceratophrys biggibosa group speciation ...... 37 Abstract ...... 37 1. Introduction ...... 39 2. Methods ...... 42 3. Results ...... 54 4. Discussion ...... 64 5. Conclusion ...... 68 Supplementary material ...... 69 V. CONCLUSÕES GERAIS ...... 75 VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 76 VII. ANEXO...... 86

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1 I. INTRODUÇÃO

2 O Brasil é formado por seis biomas de acordo com o ministério do meio ambiente 3 brasileiro (MMA), com vegetação e fauna específicos. São eles: Amazônia, Caatinga, 4 Cerrado, Mata Atlântica, Pampa e Pantanal. No entanto, o conceito de bioma vem sendo 5 bastante discutido pelos pesquisadores pois muitas características de cada um desses biomas 6 são também observadas em diferentes partes do globo.

7 A palavra “bioma” remete a uma extensa área geográfica do planeta que abrange 8 uma comunidade de espécies peculiares associados, com plantas de características específicas 9 influenciadas por um macroclima (climas de uma área global que abrange grande parte de 10 uma região do planeta). Essas áreas possuem específicas condições ambientais que incluem 11 tipo de solo, altitudes, alagamentos, fogo, salinidade, entre outros (Coutinho, 2006). O 12 conceito de bioma vem sendo adaptado desde Clements (1949), que caracterizava bioma 13 como “uma comunidade de plantas e animais, geralmente ao nível de determinada formação: 14 uma comunidade biótica”. Nesse mesmo trabalho, o autor diferencia bioma de formação 15 fitofisionômica, definindo essa última como "comunidade clímax de uma área natural na qual 16 as relações climáticas essenciais são semelhantes ou idênticas” e destacando que “essa 17 unidade de vegetação está sob o controle de, é o produto delimitado pelo clima”, 18 referenciando cada vegetação a uma unidade climática, ou monoclima. Posteriormente, Dajoz 19 (1973) caracteriza bioma como áreas dependentes das fisionomias homogêneas do ambiente 20 independente da composição florística, sendo que diferentes floras podem compor um bioma 21 e floras semelhantes podem compor biomas distintos, determinados, por sua vez, pelos 22 macroclimas. A influência dos macroclimas nas características dos biomas foi reforçada por 23 Whittaker (1978) e reformulado por Walter (1986), destacando que podem ocorrer em 24 extensas áreas do planeta, mas eram definidos por continentais e subcontinentais. Walter 25 inclui que características de solo e altitude também poderiam influenciar a determinação de 26 um bioma. Muito ainda se discute sobre o conceito de bioma, mas parece haver um consenso 27 atual de que bioma representa um grupo extenso de ecossistemas em diferentes regiões 28 biogeográficas do mundo, com fauna e flora peculiares influenciados por condições climáticas 29 homogêneas dominantes (distribuição das chuvas e temperatura média anual) (Osborne, 30 2000).

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31 O conceito incial de biomas identificado unicamente a partir de fitofisionomias 32 até hoje causa alguns equívocos quando se fala de grandes florestas brasileiras como a 33 Amazônia (AM) e a Mata atlântica (MA), que, embora sejam chamadas de “biomas”, 34 representam na verdade dois domínios morfoclimáticos definidos por Ab’saber (1977) a partir 35 de províncias biogeográficas determinadas por suas comunidades florais e faunais além de 36 microclimas. No entanto, esses dois domínios estão incluídos em um grande bioma 37 correspondente às florestas úmidas ou florestas tropicais da América do Sul, sendo um bioma 38 correspondente ao das florestas tropicais úmidas da África por exemplo. Desta forma, as 39 florestas da Mata atlântica e Amazônia são de fato domínios morfoclimáticos que compõem o 40 grande bioma de florestas tropicais úmidas.

41 A costa brasileira é ocupada em sua maior parte pela MA, considerado um dos 42 domínios mais biodiversos, ficando atrás apenas da Amazônia (da Silva & Casteleti, 2003). É 43 isolada da AM por uma grande diagonal seca composta pela Caatinga, Cerrado e Chaco, de 44 clima mais seco e quente, vegetação rasteira e relevos em depressões bem como planícies de 45 baixada. As florestas da MA abrangem diferentes microclimas e ecossistemas que 46 caracterizam algumas subdivisões biogeográficas com flora e fauna endêmicas de suas regiões 47 e vão desde mangues costeiros com clima úmido e quente até florestas de altitude de clima 48 frio e temperado. Essas características diversas permitem as mais variadas formas de vida, 49 tornando a MA extremamente biodiversa e com grande endemismo de espécies bastante 50 diferentes das distribuídas nas matas dos outros domínios climáticos brasileiros (Rizzini, 51 1997; Myers et al., 2000).

52 Infelizmente, a MA vem sofrendo com o desmatamento, pela grande ocupação do 53 homem por conta do seu rico território que chama a atenção dos exploradores desde a 54 colonização dos europeus, restando hoje apenas 12% de conformação original dessa mata 55 (Ribeiro et al. 2009). Além do desmatamento, outro grande problema que interfere na 56 fragmentação da paisagem e perda de habitat são as mudanças climáticas que vêm alterando 57 as temperaturas globais e, consequentemente, modificando características do ambiente. Essas 58 alterações podem tornar o clima do ambiente diferente do nicho climático de cada espécie, 59 muitas vezes impedindo sua sobrevivência. Os problemas citados tornam a MA vulnerável, 60 dependente da conservação e manejo de suas espécies, e consequentemente alvo de interesse 61 dos pesquisadores do mundo todo. Acredita-se que muitas espécies ainda estão por serem

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62 descobertas e, com a aceleração de perda de habitat, muitas nem serão conhecidas. No 63 presente estudo, analisamos algumas espécies de anuros endêmicas da MA, utilizando uma 64 abordagem filogeográfica.

65 1. Filogeografia – uma visão geral

66 Estudos biogeográficos auxiliam no esclarecimento da distribuição de espécies 67 atuais e podem fornecer subsídios para identificação de novos grupos taxonômicos (exemplos 68 em Thomé et al., 2012; Gehara et al., 2014). A filogeografia é, dentro da biogeografia, “o 69 campo de estudo que se preocupa com os princípios e os processos que governam a 70 distribuição geográfica de linhagens genealógicas, especialmente aquelas dentro e entre 71 espécies proximamente relacionadas” (Avise, 2000). Com o advento de técnicas de estudos 72 com DNA, houve um aprofundamento desse ramo da biogeografia. O termo filogeografia foi 73 proposto por Avise et al., em 1987, que salientaram a importância dos marcadores 74 mitocondriais em estudos populacionais ou de espécies intimamente relacionadas. Assim, tem 75 sido amplamente difundida a utilização de marcadores moleculares para análises das relações 76 filogenéticas, associadas à história da distribuição do grupo a ser estudado para explicar a 77 respectiva história evolutiva (Thomé et al., 2012; Bruschi et al., 2014; Werneck et al., 2015; 78 Guarnizo et al., 2015; Duryea et al., 2015; Prates et al., 2017; Sabbag et al., 2018; Brusquetti 79 et al., 2018; Bruschi et al., 2019; etc.). O DNA mitocondrial (DNAmt), por apresentar uma 80 baixa frequência de recombinações e alta taxa evolutiva, representa um marcador filogenético 81 de grande eficiência. Ao longo dos genes ribossomais são observadas diferentes taxas 82 evolutivas, sendo os sítios mais conservados aqueles correspondentes a regiões dos RNAr que 83 se associam com proteínas, RNAm e RNAt (Hills & Dixon, 1991).

84 As sequências nucleotídicas mitocondriais frequentemente utilizadas para estudos 85 filogeográficos são as dos genes ribossomais 12S e 16S, do gene citocromo oxidase (COI) e 86 do gene NADH deshidrogenase subunidade 2 (ND2) (exemplos em: Guarnizo et al., 2009; 87 Guarnizo et al., 2012; Guarnizo et al., 2015; Thomé et al., 2014, Werneck et al., 2015, 88 Bruschi et al., 2019). O gene 16S apresenta cerca de 1500 pares de nucleotídeos, já o COI 89 cerca de 500 pb. Esses fragmentos revelam grande quantidade de informações importantes 90 para estudos filogenéticos de diferentes grupos taxonômicos, auxiliando tanto no estudo de 91 níveis hierárquicos mais abrangentes quanto de espécies (exemplos em Black IV & Piesman,

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92 1994; Kuo et al., 2003; Spicer & Dunipace, 2004; Vences et al., 2005; Fouquet et al., 2007; 93 Lyra et al., 2017).

94 Além do DNAmt, alelos nucleares têm sido frequentemente incluídos nas análises 95 filogenéticas e filogeográficas (Guarnizo et al., 2009; Guarnizo et al., 2012; Thomé et al., 96 2014, dentre outros). Os genes nucleares frequentemente utilizados em análises filogenéticas 97 (rodopsina, Beta fibrinogênio, POMC, RAG-1, entre outros) possuem taxas evolutivas 98 menores que os mitocondriais em regiões de alta pressão seletiva (éxons) e a quantidade de 99 homoplasia observada na análise de táxons de níveis taxonômicos mais abrangentes é 100 reduzida (Clabaut et al., 2005; Toews & Brelsford, 2012). Além disso, a combinação dos dois 101 tipos de marcadores, nucleares e mitocondriais, é de extrema importância por auxiliar na 102 identificação de possíveis introgressões (exemplos em Funk et al., 2011; Pereyra et al., 2015). 103 Dessa maneira, a utilização de diferentes marcadores, com diferentes taxas evolutivas, 104 permite inferências filogenéticas mais acuradas. Estudos com esse enfoque vêm 105 demonstrando a importância de análises multilocos, em que uma maior quantidade de genes 106 atrelada às respectivas e peculiares características pode revelar com maior acurácia a história 107 do grupo a ser estudado.

108 Árvores filogenéticas podem ser usadas para datação de eventos de cladogênese. 109 Para a calibração dos nós, dois tipos de calibração são comumente utilizados. Em um deles, 110 calibrações efetuadas com datas de fósseis descritos de espécies mais intimamente 111 relacionadas filogeneticamente à espécie em estudo que podem fornecer maior segurança 112 quanto às datas de divergência das linhagens, mas nem sempre estão disponíveis. 113 Alternativamente, a taxa evolutiva estimada para os genes por sítio por milhão de anos 114 (Crawford, 2003) tem sido bastante utilizada para estimativas dos períodos de divergência das 115 espécies com análises de relógio molecular (exemplos em Thomé et al., 2012 e Thomé et al., 116 2014, Dias et al., 2014 e Prates et al., 2017). Este tipo de calibração com taxas estimadas pode 117 ser feito por calibração direta, com taxas já descritas para um nível taxonômico mais 118 abrangente do grupo em estudo, ou por calibração secundária, quando uma data de 119 divergência para o grupo taxonômico alvo já foi registrado e a calibração do nó é realizada 120 com esta data (Prates et al., 2017). Histórias biogeográficas são sempre embasadas pelo 121 histórico geológico já registrado para a área de atual distribuição. Para estudos a respeito da

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122 história evolutiva das espécies e dos fenômenos que possam ter influenciado tal 123 diversificação, é de suma importância a inferência da data de divergência das linhagens.

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125 2. A Mata Atlântica

126 Com aproximadamente 1080 espécies de anfíbios já registradas, o Brasil 127 representa o país de maior diversidade, tendo sido descritas mais de 200 espécies somente nos 128 últimos dez anos (Segalla et al., 2016). A Amazônia representa a primeira maior área de 129 biodiversidade no Brasil, seguida da Mata Atlântica.

130 A Mata Atlântica passou por diversos períodos históricos de diferenciação, 131 expansão e conexão com a Amazônia (Batalha-Filho et al., 2013; Sobral-Souza et al., 2015; 132 Prates et al., 2017). A conexão mais antiga dos dois domínios teria ocorrido durante o 133 mioceno tardio, em torno de 23 milhões de anos atrás (mya), em decorrência do soerguimento 134 da cordilheira dos Andes, que teria formado um corredor de umidade na direção de onde hoje 135 ocorrem os domínios de clima mais seco e quente (Chaco, Cerrado e Caatinga). Esse corredor, 136 que apresentava chuvas orográficas e novos canais, referentes a grandes rios e bacias, 137 permitiu o fluxo de espécies que ocorriam onde hoje reconhecemos a Mata Atlântica e a 138 Amazônia. Tal conexão é corroborada por estudos que revelam grande proximidade 139 filogenética entre espécies de aves (Batalha et al., 2013), de lagartos (Prates et al., 2017) e 140 também de anfíbios (Castroviejo-Fisher et al., 2014, 2015; Fouquet et al., 2012a b; Padial et 141 al., 2014), que hoje habitam os distintos domínios morfoclimáticos da Mata Atlântica e da 142 Amazônia.

143 Durante os períodos glaciais, algumas áreas dessas florestas se mantiveram 144 estáveis, servindo de refúgios para vários organismos e, durante o plio/pleistoceno, a Mata 145 Atlântica e a Amazônia vieram novamente a se conectar, através da região Nordeste, onde 146 hoje está localizado o domínio da caatinga. Essa conexão mais recente foi identificada por 147 Batalha et al. (2013) a partir do estudo de uma espécie com linhagens de distribuição disjunta 148 nos domínios AM e MA. Posteriormente, outros autores reconheceram as mesmas conexões 149 destes domínios na região Nordeste e entre o Leste da AM e Sudoeste da MA realizando uma 150 modelagem de nicho climático. Os pesquisadores observaram uma área de sobreposição do 151 nicho para as duas florestas úmidas neotropicais (Sobral-Souza et al., 2015).

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152 Nos últimos anos, muitos estudos têm sido feitos a respeito da dinâmica 153 populacional de anuros da Mata Atlântica (Carnaval et al., 2009; Carnaval et al., 2014; Thomé 154 et al., 2014; Bruschi et al., 2014; Duryea et al., 2015; Nascimento et al., 2018; Bruschi et al., 155 2019; Paz et al., 2019; etc.) e várias novas espécies têm sido descritas (Kwet & Faivovich, 156 2001; Verdade 2003; Alves et al., 2006; Rivera-Correa & Orrico, 2013; Bruschi et al., 2014b).

157 No entanto, estudos que envolvam as sub-regiões biogeográficas específicas que 158 compõem a Mata Atlântica (a saber: Floresta de Araucária, Bahia, Brejos Nordestinos, 159 Diamantina Interior, Pernambuco Serra do mar, e região do São Francisco, conforme 160 classificação de Silva and Casteleti, 2003) e que revelem a dinâmica populacional de suas 161 espécies endêmicas ainda são escassos (e.g., Carnaval et al., 2009; Thomé et al., 2012; 162 Carnaval et al., 2014; Bruschi et al., 2014; Duryea et al., 2015; Nascimento et al., 2018; entre 163 outros). Estudar espécies que ocorrem em diferentes sub-regiões da MA pode fornecer 164 informações importantes sobre a biogeografia das espécies endêmicas e ainda auxiliar em 165 estudos de diferentes grupos taxonômicos.

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167 3. A Floresta de Araucária

168 Na Floresta de Araucária (FA) a fitofisionomia predominante é a Floresta 169 Ombrófila Mista (FOM) e cerca de apenas 12.6% da formação original permanece preservada 170 (Ribeiro et al., 2009). A FOM é uma das sub-regiões biogeográficas mais ameaçadas do 171 domínio morfoclimático Mata Atlântica (Hirota 2003, Ribeiro et al., 2009). A árvore que dá 172 nome a essa sub-região, a Araucaria angustifolia, também chamada de “pinheiro brasileiro”, 173 possui sua madeira nobre com troncos de 2 m de diâmetro e mais de 50 m de altura, e podem 174 viver até 700 anos (Andersson & Goodall, 2005). Essas características atraem os madeireiros, 175 tendo ocorrido intensa exploração dessa madeira entre 1930 e 1990. Uma variedade de 176 espécies de plantas vive nos sub-bosques dessas florestas usufruindo dos recursos 177 disponibilizados por ela. Com o desmatamento das araucárias, essa comunidade deixa de ter 178 as condições ambientais necessárias para o equilíbrio do respectivo ecossistema, e essas áreas 179 acabam se tornando grandes campos. A FA abrange regiões com baixas temperaturas, em que 180 a ocorrência de geadas é frequente, e representa as poucas ilhas de floresta intacta que 181 restaram de áreas desmatadas da Mata Atlântica. Além das várias populações de vegetação

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182 abrigadas pela FA (Higuchi et al., 2014), uma fauna peculiar também depende dos recursos 183 dessa mata. Muitas espécies são endêmicas da FA, incluindo as espécies de anuros do grupo 184 Proceratophrys bigibbosa, a ser investigado neste trabalho. Grande parte desta sub-região foi 185 degradada e merece maiores estudos com o intuito de auxiliar em projetos de manejo e 186 conservação.

187 A Floresta de Araucária sofreu eventos de expansão durante períodos geológicos 188 glaciais como o último máximo glacial (LGM=21.000 anos atrás) e o do Holoceno Médio 189 (6.000 anos atrás) e retração durante períodos mais quentes e úmidos como os interglaciais e 190 atualmente (Behling & Pillar, 2007; Jeske-Pieruschka & Behling, 2011; Luteryoung, 2018; 191 Bergamim et al., 2019). Algumas áreas após a retração mantiveram as características 192 ambientais dos períodos de expansão com estabilidade climática isoladas por outras 193 vegetações adaptadas a clima tropical e se tornaram possíveis refúgios para espécies mais 194 adaptadas a climas temperados (Barros 2015; Luteryoung, 2018; Bergamin et al., 2019). A 195 região do sul de Minas Gerais é uma dessas áreas de características das FOM, e 196 consequentemente é possível que as espécies que lá existiam e que possuíam características 197 específicas para a sobrevivência em ambientes como esse podem ter sofrido um isolamento 198 reprodutivo. Acredita-se que a espécie de anuro Proceratophrys palustris seja uma espécie 199 relictual que exemplifica o fenômeno acima descrito (Giaretta & Sazima, 1993 e Martins & 200 Giaretta, 2012). Essa espécie tem sua distribuição restrita a Poços de Caldas, uma região do 201 estado de Minas Gerias que apresenta as características muito similares às das localidades 202 onde ocorrem as outras espécies do grupo de P. bigibbosa (Giaretta & Sazima, 1993 e Martins 203 & Giaretta, 2012).

204 A Floresta de Araucária está localizada ao sul da América do Sul e, apesar de haver muitos 205 estudos sobre história natural de espécies dessa floresta (Solé et al., 2002; Solé et al., 2005; 206 Dietl et al., 2009; Solé et al.2010; Kwet et al., 2010; Solé et al., 2017, dentre outros), estudos 207 que descrevam relações filogenéticas e a história filogeográfica de espécies endêmicas dessa 208 região ainda são escassos e no geral envolvem a flora. Um desses poucos estudos sobre 209 espécies das famílias Fabaceae e Solenaceae destaca quatro principais áreas de alta 210 estabilidade climática de alta diversidade genética e revela a possível divergência de duas 211 espécies em áreas distintas de estabilidade que podem ter sido isoladas como refúgio 212 climático durante os períodos glaciais (Barros et al., 2015). Amaioria dos estudos para a

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213 região Sul da América do Sul envolve o domínio Pampa, Chaco ou Patagônia, poucos 214 exclusivamente a FA ou destacam processos evolutivos exclusivos daespécie que não se 215 estenderiam a outros grupos taxonômicos. Trabalhos de genética de populações que 216 envolveram a própria Araucaria angustifolia não destacam o envolvimento de diferentes 217 processos naturais ou geológicos como agentes causadores da diversidade genética observada 218 atualmente nessa espécie na região sul, mas sim a influência humana na dispersão que teria 219 auxiliado na diversificação genética da espécie (Lauterjung et al., 2018).

220 Três das quatro espécies de anuros que compõem atualmente o grupo 221 Proceratophrys bigibbosa (Figura 1) estão distribuídas ao longo da área remanescente de 222 distribuição da FA (ver item 4 para distribuição geográfica de cada espécie), e sua história 223 filogeográfica ainda não foi explorada. O estudo desse grupo pode, portanto, auxiliar também 224 na compreensão da diversidade contida na FA. Além disso, a distribuição geográfica 225 apresentando áreas de simpatria e a grande similaridade morfológica observada entre algumas 226 espécies desse grupo também motivam o estudo desse grupo, como destacado no próximo 227 item.

228 4. O grupo Proceratophrys bigibbosa

229 A família Odontophrynidae é composta por três gêneros: Macrogenioglottus, um 230 gênero monotípico; Odontophrynus, composto por 11 espécies; e Proceratophrys com 41 231 espécies descritas (Frost, 2019). Dois complexos de espécies e dois grupos fenéticos são 232 reconhecidos atualmente em Proceratophrys. Os complexos de P. boiei e P. appendiculata 233 compreendem espécies que possuem apêndices palpebrais, enquanto os grupos P. cristiceps e 234 P. bigibbosa reúnem espécies que não possuem tais apêndices (Izecksohn et al., 235 1998, Prado & Pombal, 2008, Cruz & Napoli, 2010, Teixeira et al., 2012 e Dias et al., 2013). 236 Também compõem o gênero três espécies não alocadas em qualquer dos grupos citados: P. 237 schirchi, P. rondonae e P. minuta. É importante salientar que apesar de o monofiletismo dos 238 diferentes grupos ainda não ter sido testado por conta de apenas algumas das 41 espécies do 239 gênero terem sido incluídas em análises filogenéticas até o momento, o grupo P. bigibbosa 240 não foi refutado nas análises de Amaro et al. (2009), Pyron & Wiens (2011), Teixeira et al. 241 (2012), Frasão et al. (2015) e Feng et al. (2017).

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242 Ao grupo Proceratophrys bigibbosa, objeto do presente estudo, pertencem as 243 espécies P. bigibbosa, P. avelinoi, P. brauni e P. palustris (Kwet & Faivovich, 2001) (Figura 244 1). Esse grupo é caracterizado pelo focinho abrupto e curto (Lynch, 1971), presença de 245 inchaços pós-oculares e ausência de apêndices palpebrais parecidos com chifres (Giaretta & 246 Sazima, 1993; Eterovick & Sazima, 1998).

247 A espécie Proceratophrys palustris é a de menor tamanho do grupo P. bigibbosa 248 e a única que não apresenta vistosa coloração no ventre. Todas as outras possuem manchas 249 abdominais com pontos de cor laranja avermelhada ou alva. Essa coloração vermelha parece 250 estar relacionada a um comportamento defensivo de contração, peculiar a alguns anfíbios, em 251 que o indivíduo permanece imóvel e com o ventre voltado para cima. Na contração, no 252 entanto, diferentemente da tanatose, os membros anteriores e posteriores permanecem 253 próximos ao corpo (Toledo et al., 2010, Lourenço-de-Moraes, 2012). A atividade reprodutiva 254 para as espécies deste grupo se estende de setembro a fevereiro, sendo mais intensa durante os 255 períodos chuvosos (Kwet & Faivovich, 2001 e Santos et al.., 2009). Algumas espécies do 256 grupo vocalizam durante o dia e início da noite, como é o caso de P. brauni, enquanto outras, 257 exclusivamente durante a noite, período no qual os machos de P. bigibbosa parecem estar em 258 maior atividade (Kwet & Faivovich, 2001).

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259 Figura 1. Imagens do dorso e ventre de exemplares de (a, b) Proceratophrys palustris, (c, d) 260 P. brauni, (e, f) P. bigibbosa e (g, h) P. avelinoi.

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261 5. Distribuição geográfica e questões taxonômicas do grupo Proceratophrys 262 bigibbosa

263 A maior parte das espécies do grupo Proceratophrys bigibbosa ocorre em áreas de 264 altitude ao longo da FA nas regiões sul e sudeste do Brasil e leste da Argentina caracterizadas 265 por floresta ombrófila mista (FOM). Proceratophrys avelinoi é a única que ocorre em áreas 266 caracterizadas por florestas estacionais semideciduais (FES) (Caldart et al., 2010) e que assim 267 como a FA é também uma sub-região da Mata atlântica, mas com características de plantas 268 cadulciformes. Essas florestas estão localizadas em uma sub-região submontana da Mata 269 Atlântica, ou seja, região de baixas altitudes (Caldart et al., 2010), localizadas adjacentes às 270 florestas de araucária. Já a FA se localiza em áreas de altitude e/ou altas latitudes e por causa 271 dessas características também é chamada de Floresta subtropical montana. Das quatro 272 espécies desse grupo, P. palustris é a única que possui distribuição restrita à sua localidade- 273 tipo, uma área remanescente de FA localizada em Poços de Caldas – MG (Giaretta & 274 Sazima,1993; Martins & Giaretta, 2012). Apesar de estar localizada em uma área de floresta, 275 o entorno da poça é bastante degradado e apresenta uma grande área de plantação de 276 eucalipto, o que colocou a espécie no livro vermelho de espécies brasileiras ameaçadas 277 (ICMBio, 2018).

278 A espécie Proceratophrys bigibbosa (Peters, 1872) ocorre na região central e 279 norte do Rio Grande do Sul adjacente a Santa Catarina, em duas localidades de Misiones, a 280 nordeste da Argentina, em elevações de 300 a 1200 m de altitude (Kwet & Faivovich, 2001; 281 Zanella & Busin, 2007), e provavelmente ocorra também no Paraguai (Brusquetti & Lavilla, 282 2006). A distribuição geográfica conhecida de P. avelinoi (Mercadal De Barrio & Barrio, 283 1993) tem registros em algumas localidades da província de Misiones, na Argentina, no 284 município de Derrubadas, no extremo norte do Rio Grande do Sul, Brasil, no extremo sul e 285 leste do Paraguai (Brusquetti & Lavilla 2006; Carosini et al., 2010) e em duas localidades do 286 estado do Paraná (Machado et al.,1999; De Sá & Langone 2001). Para P. brauni, há registros 287 de ocorrência em uma região central do Paraná (Guarapuava) (Kwet & Faivovich, 2001) e ao 288 longo da FA do Rio Grande do Sul e Santa Catarina (Frost, 2019), localidades de altitudes em 289 torno de 300 a 1100 m (Kwet & Faivovich, 2001) (Figura 2).

290 Ao comparar a distribuição das espécies do grupo Proceratophrys bigibbosa é 291 possível observar simpatria de algumas delas em certas localidades. Proceratophrys

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292 bigibbosa e P. avelinoi ocorrem em simpatria em Misiones, mas P. avelinoi ocupa poças de 293 água rasa enquanto P. bigibbosa ocupa pequenos fluxos de água. Proceratophrys bigibbosa e 294 P. brauni ocorrem simpatricamente em Anita Garibaldi, Campo Belo do Sul, em Bom Jesus e 295 São Francisco de Paula – RS, embora não ocupem o mesmo córrego (Kwet & Faivovich, 296 2001; Santos et al., 2009). Por fim, P. brauni e P. avelinoi são encontrados em simpatria em 297 Guarapuava – PR (Cruz et al., 2005; Santos et al., 2009); no entanto, erros de identificação 298 taxonômica não podem ser descartados uma vez que as espécies são bastante similares 299 morfologicamente (Figura 2).

300 Figura 2. Áreas de distribuição das espécies estimadas com base nos registros na literatura até 301 o momento do grupo P. bigibbosa. Vermelho: P. bigibbosa (Kwet & Faivovich, 2001); verde: 302 P. palustris (Giaretta & Sazima,1993; Martins & Giaretta, 2012); cinza claro: P. avelinoi 303 (Caldart et al., 2010); marrom: P. brauni (Kwet & Faivovich, 2001). Mapa base da área de 304 ocorrênca da Araucaria angustifolia estimada por Species Distribution Model (SDM) com 305 base no modelo de variáveis bioclimáticas realizadas por Wrege et al. (2016).

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306 Há grande similaridade morfológica entre as espécies do grupo Proceratophrys 307 bigibbosa (com exceção de P. palustris, a qual é a única que não apresenta coloração 308 aposemática no ventre) e essa similaridade tem provocado algumas confusões taxonômicas ao 309 longo do tempo. Em 1973, a espécie P. cristinae foi descrita por Braun (1973), com base em 310 indivíduos de “Nova Petrópolis - RS”, e sua comparação com P. bigibbosa parece ter sido 311 feita com base no trabalho de descrição e não no holótipo dessa espécie. Posteriormente, 312 Braun & Braun (1980) identificaram alguns espécimes encontrados em Cambará do Sul – RS 313 (Campos de Cima da Serra) como P. bigibbosa e espécimes de Arroio do Tigre, Canela e 314 Nova Petrópolis – RS como P. cristinae. No entanto, Kwet & Faivovich (2001) compararam 315 os holótipos de P. cristinae e de P. bigibbosa e consideraram P. cristinae sinônimo júnior de 316 P. bigibbosa. Os autores concluem que os espécimes considerados por Braun como P. 317 bigibbosa na verdade correspondiam a P. brauni, espécie descrita pelos autores no mesmo 318 trabalho para a localidade de Cambará do Sul, estado do Rio Grande do Sul, a qual apresenta 319 canto distinto de P. bigibbosa. É importante mencionar que a localidade-tipo apontada para P. 320 bigibbosa é “Rio Grande do Sul” (Peters, 1872), não tendo sido mencionado o nome da 321 cidade ou localidade em que foi obtido o holótipo.

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323 6. Justificativa do estudo

324 Considerando a carência de informação na descrição original de algumas espécies 325 do grupo Proceratophrys bigibbosa, e ainda a simpatria e a grande similaridade morfológica 326 apresentada por algumas delas, equívocos na identificação de espécimes desse grupo são 327 comuns (como discutido no item anterior) e a existência de espécies ainda não descritas deve 328 ser considerada como uma hipótese a ser avaliada. No presente estudo, com o intuito de 329 auxiliar na delimitação das espécies presentes nesse grupo, incluímos exemplares amostrados 330 ao longo de toda sua área de distribuição em uma análise filogenética baseada em sequências 331 de DNA mitocondrial e nuclear.

332 Ainda utilizando as sequências de DNA, também testamos a hipótese de que a 333 expansão e retração da FA tenha interferido na especiação dentro do grupo Proceratophrys 334 bigibbosa, uma vez que podemos observar a coincidência da distribuição da maioria das 335 espécies dentro desta floresta e ainda uma distribuição disjuta de uma das espécies (P.

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336 palustris) mais ao Norte de toda a área de distribuição do grupo. No entanto, um trabalho 337 recente que aborda a data de divergência estimada entre duas espécies desse grupo (P. 338 bigibbosa e P. avelinoi) não corrobora esta hipótese, uma vez que a estimativa é de que tenha 339 ocorrido em torno de 0,96 milhões de anos atrás (Mângia et al., 2018), o que é muito mais 340 antigo do que os registros de expansão e retração da Floresta de Araucária.

341 Uma hipótese alternativa pode também ter influenciado na divergência dos clados 342 dentro do grupo no perído do Mioceno Tardio. Um evento geológico importante desse 343 período que mudou a paisagem na América do Sul foi a transgressão marinha que 344 supostamente ocorreu entre 15 e 8 Mya, e cobriu grande parte do território da América do Sul 345 (Lundberg et al., 1998; Lovejoy et al., 2006; Costa et al. al., 2010; Cooke et al., 2012). Duas 346 grandes ilhas foram separadas em Escudo das Guianas e Escudo Brasileiro pela entrada do 347 mar a partira da foz do rio Amazonas (Hoorn, 1993; Räsänen et al., 1995) e na foz do rio 348 Paraná (Webb, 1995; Ludenberg et al., 1998; Lovejoy et al., 2006). As duas entradas 349 marítimas se encontraram cobrindo uma grande área na América do Sul e separando os dois 350 escudos. Apenas alguns estudos descreveram o mar do Paraná (formado por essa entrada do 351 mar) como uma barreira à especiação ou divisão de linhagens (García et al., 2012; Brusquetti 352 et al., 2018; Girini et al., 2017).

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363 II. OBJETIVOS

364 O presente trabalho teve como objetivo investigar as relações filogenéticas no 365 grupo Proceratophrys bigibbosa e os processos evolutivos que influenciaram a atual 366 distribuição das espécies nele alocadas, auxiliando, assim, na taxonomia do grupo e gerando 367 novos dados relativos a espécies endêmicas da Floresta de Araucária.

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369 Objetivos específicos

370 1. Analizar a relação filogenética das espécies do grupo Proceratophrys bigibbosa 371 e analizar a respectiva distribuição geográfica atual. (Os resultados referentes a esse objetivo 372 estão apresentados no Capítulo 1 desta tese.)

373 2. Testar dois possíveis cenários que possam ter influenciado na divergência das 374 espécies do grupo Proceratophrys bigibbosa com o auxílio de ferramentas da biogeografia 375 histórica e filogeografia: i) a expansão e retração da FA e ii) a incursão marítima do Mioceno 376 tardio pela entrada ao Sul da América do Sul. (Os resultados referentes a esse objetivo estão 377 apresentados no Capítulo 2 desta tese.)

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389 III. CAPÍTULO 1 - Uma nova espécie no grupo Proceratophrys biggibosa?

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391 1. Material e Métodos

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393 1.1 Amostra de espécimes

394 Foram analisados 48 espécimes do grupo Proceratophrys bigibbosa, provenientes 395 de 27 diferentes localidades que cobrem a área de distribuição de todas as espécies 396 atualmente incluídas nesse grupo fenético (Tabela 1). Incluímos também todas as 397 espécies do gênero Proceratophrys disponíveis no GenBank além de sequências dos 398 outros dois gêneros da família Odontophrynidae (Macrogenioglotus e Odontophrynus). 399 Utilizamos como raiz nas análises filogenéticas uma espécie próxima filogeneticamente 400 de Odontophrynidae (Cycloramphus acangatan, Cycloramphidae) (Tabela 1).

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402 1.2 Extração do DNA genômico

403 Para a obtenção de DNA genômico, fragmentos de fígado, de músculo ou amostras de 404 suspensão de células do intestino foram imersos em solução de lise (TNES: 50 mM de Tris 405 pH 7,5, 400 mM de NaCl, 20 mM de EDTA, 0,5% de SDS) contendo proteinase K (100 406 g/mL) e incubados por 3 a 5 horas a 55º C. As amostras foram centrifugadas depois do 407 acréscimo de NaCl 5 M (1/3 do volume de amostra). O sobrenadante foi recolhido e o DNA 408 precipitado com álcool isopropílico, lavado com etanol (70%), ressuspenso em TE (10 mM 409 Tris-HCl, 1 mM de EDTA pH 8,0) e armazenado a -20 ° C.

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411 Tabela 1. Relação dos táxons amostrados no presente estudo, incluindo identificação taxonômica, procedência e número de registro em 412 coleção zoológica de todos es espécimes analisados, bem como número de acesso das sequências nucleotídicas no GenBank. Em negrito, as 413 sequências obtidas neste trabalho. Asteriscos correspondem a sequências que possuem apenas a porção 12S (800pb) e porção final do fragmento 414 16S (500 pb). PUCRS: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul; UFRGS: Universidade Federal do Rio Grande do Sul; UPF: 415 Universidade de Passo Fundo; DB: collection from Professor Dr. Diego Baldo, Argentina and SMRP: Shirlei Maria Recco Pimentel; CFBHT: 416 Célio Fernando Baptista Haddad Tissue collection; LGE: Laboratorio de Genética Evolutiva.

Número de voucher em coleção de Espécie Localidade Número de acesso no GenBank museu 12S/tRNA-Val/16S fragment COI Grupo P. bigibbosa Proceratophrys bigibbosa Gramado - RS – Brazil ZUEC 23998 # X Gramado - RS – Brazil ZUEC 23999 # X Nova Petrópolis - RS – Brazil ZUEC 23400 # X São Francisco de Paula - RS – Brazil MCP 9718 # X Bom Jesus - RS – Brazil MCP 9717 # X Grupo P. bigibbosa Proceratophrys sp. Ipuaçu - SC – Brazil CFBHT 1297 # X Ipuaçu - SC – Brazil CFBHT 2100 # X

Xanxerê - SC – Brazil CFBHT 10333 # X

Fagundes Varela - RS – Brazil UFRGS 3246 # X

Mato Castelhano - RS – Brazil CFBHT 9664 # X

Cotiporã - RS – Brazil UFRGS 3234 # X Cotiporã - RS – Brazil UFRGS 3258 # X Sertão - RS – Brazil UPF 30.12 # X Sertão - RS – Brazil UPF 30.13 # X Sertão - RS – Brazil UPF 30.14 # X Sertão - RS – Brazil UPF 30.15 # X Chapecó - SC – Brazil UPF 13.05 # X Erechim - RS – Brazil – Brazil UFRGS 3248 # X Proximidades Arroyo Coral - Misiones – Argentina LGE 02952 # X Forestal Montreal - Misiones – Argentina DB 2313 # X Parque Provincial Moconá - Misiones – Argentina LGE 00550 # X

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Parque Provincial Moconá - Misiones – Argentina LGE 00554 # X Grupo P. bigibbosa P. brauni Vargem - SC – Brazil CFBHT 22670 # - Vargem - SC – Brazil CFBHT 22671 # - Vargem - SC – Brazil CFBHT 22672 # - Bom Jesus - RS – Brazil UFRGS 0204 # X

Bom Jesus - RS – Brazil UFRGS 0337 # X

Barracão - RS – Brazil UFRGS 2696 # X

Barracão - RS – Brazil UFRGS 2697 # X Barracão - RS – Brazil UFRGS 2699 # X

Campo Belo do Sul - SC – Brazil UFRGS 0688 # X

Campos Novos - SC – Brazil CFBHT 11463 # X

Campos Novos - SC – Brazil CFBHT 11464 # X

Grupo P. bigibbosa P. paulstris Poços de Caldas - RS – Brazil ZUEC 24002 # X Poços de Caldas - RS – Brazil ZUEC 24297 # X

Poços de Caldas - RS – Brazil ZUEC 24298 # X

Poços de Caldas - RS – Brazil ZUEC 24299 # X

Jaguariaíva - PR – Brazil UFMG 2624 # - Jaguariaíva - PR – Brazil UFMG 2626 # - Grupo P. bigibbosa P. avelinoi Palma Sola - SC – Brazil UPF 14.01 # X Ortigueira - PR – Brazil CFBHT 11250 # X Ruta Provincial Nº 6 - Misiones – Argentina LGE 08517 # X Garuapemí - Misiones – Argentina LGE 10927 # X San Vicente - Misiones – Argentina JF 1948 *DQ283039 - Misiones – Argentina DB 1246 *KF214102/FJ685691 - San Vicente - Misiones – Argentina MACN 47401 KP295643 - Complexo de espécies P. appendiculata **P.itamari Campos do Jordao - SP – Brazil MZUSP 135186 *KF214125/KF214147 - P. melanopogon Resende - RJ – Brazil UNIRIO 4603 *KF214128/KF214150 - **P.mantiqueira Araponga - MG – Brazil MZUFV 10139 *KF214121/KF214143 - P. melanopogon Serra da Bocaina, Sao Jos do Barreiro - SP – Brazil TG 3295 *KF214127KF214149 - **P.pombali Bertioga - SP – Brazil AF 1988 *CY034614/KF214144 - P. belzebul Barra do Una, Sao Sebastiao - SP – Brazil RCA2013aMTR9456 *KF214132/KF214154 - P. belzebul Picinguaba, Ubatuba - SP – Brazil RCA2013a28 *KF214134/KF214156 - P. appendiculata Sao Luis do Paraitinga - SP – Brazil CFBHT 01466 *- / KU495463 KU494670 P. appendiculata Sao Luis do Paraitinga - SP – Brazil CFBHT 00329 *- / KU495461 KU494668 P. appendiculata Teresopolis - RJ – Brazil CFBHT 16302 */- / KU495462 KU494669 P. appendiculata Teresopolis - RJ – Brazil MNRJ 53936 *KF214130/KF214151 -

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P. tupinamba Ilha Grande - RJ – Brazil MNRJ 54541 *KF214136/KF214158 - P. izeksoni Paraty - RJ – Brazil MNRJ 64584 *KF214135/KF214157 - P. cururu Serra do Cipo, Cardeal Mota - MG – Brazil MTR ALCX125P23 *- / KU495478 KU494685 P. cururu Serra do Cipo, Cardeal Mota - MG – Brazil MTR ALCX175P74 *- / KU495477 KU494684 P. cururu Cardeal Mota - MG – Brazil FSFL580 *KF214107/FJ685696 - P. goyanus Parana - TO – Brazil MTRLCX14P65 *- / KU495479 KU494686 P. goyanus Alto Paraíso de Goiás - GO – Brazil ZUEC 21200 # X P. goyanus Petrolina de Goias - GO – Brazil AF 1188 *KF214108/FJ685697 - Complexo de espécies P. boiei P. boiei Serra da Cantareira, Sao Paulo - SP – Brazil AF 1587 *KF214104/FJ685693 KC603982 P. laticeps - AF 1900 *- / FJ685698 - P. renalis Brejo Madre de Deus - PE – Brazil ZUFRJ 8682 *KF214111/FJ685700 - Grupo P. cristiceps P. cristiceps PARNA Serra das Confusões - PI – Brazil AF887 *KF214106/FJ685695 - P. cristiceps - GRC22955 *MF769774 - P. cristiceps - CFBHT 11332 *- / KU495475 KU494682 Sem grupo P. minuta Miguel Calmon - BA – Brazil AF 2308 *- / JX982965 - P. redacta Morro do Chapeu - BA – Brazil MTR 22579 *- / JX982967 - P. schirchi Santa Teresa - ES – Brazil 371* *KF214112/FJ685701 - P. concavitympanum Xambioá - TO – Brazil ZUEC 24525 # - P. concavitympanum - SM2016AAGARDA2736 *- / KX855986 - P. concavitympanum - ARI1193 *- / KX858855 - P. concavitympanum Vale de Sao Domingos - MT – Brazil MTRALCX101P3 *- / KU495473 KU494680 P. concavitympanum Palmas - TO – Brazil AF 1094 *KF214105/FJ685694 - P. huntingtoni Cuiabá - MT – Brazil ZUEC 24075 # X P. moratoi Bauru - SP (469.43) – Brazil CJJ 7931 # X P. moratoi Itirapina - SP – Brazil CFBH 6515 *KF214110/FJ685689 - Macrogenioglottus alipioi Uruçuca - BA – Brazil CFBHT 04337 *- / KU495385 KU494592 Macrogenioglottus alipioi - AF 919 *KF214097/FJ685684 - Macrogenioglottus alipioi Ribeirao Branco - SP – Brazil CFBHT 01032b *- / KU495384 KU494591 Macrogenioglottus alipioi Uruçuca - BA – Brazil CFBH 12929 KC593360 - O. salvatori Alto Paraíso de Goiás - GO – Brazil AAG-UFU 1548 # - O. americanus Buenos Aires – Argentina JF 1891 AY843704 - O. americanus Pocos de caldas - MG – Brazil AF 665 *KF214099/FJ685686 JX298366 Odontophrynus cultripes Varginha - MG – Brazil FSFL 875 *KF214101/FJ685688 - Cycloramphus acangatan1 Caucaia do Alto, Cotia - SP – Brazil AF 1605 *KF214096/FJ685683 - 417 1: utilizado como raís por ser grupo externo à família Odontophrynidae; #: Sequências que ainda não foram depositadas no banco de dados GenBank, portanto ainda não possuem numero de acesso

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418 1.3 Obtenção das sequências nucleotídicas

419 Foram realizadas reações de PCR para amplificação de um fragmento do gene 420 mitocondrial COI e do fragmento mitocondrial H1 que inclui aos genes ribossomais 12S e 421 16S e o gene para RNAt-Val. Para cada amostra, foi utilizado um volume de solução de 25 422 μL, contendo tampão de reação (10 mM de Tris-HCl pH 9, 50 mM de KCl, Invitrogen), 1,5

423 mM MgCl2 (Invitrogen), 200 μM de cada dNTP, 0,4 μM de cada um dos primers, 1 unidade 424 de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e cerca de 400 a 1000 ng de DNA. Para a amplificação 425 do fragmento 12S/RNAT-Val/16S, foram utilizados os pares de primers MVZ59 (Graybeal, 426 1997) e Titus I (Titus, 1992), e 12SL13 e 16Sbr (Palumbi et al., 1991). Para fragmento do 427 gene mitocondrial COI os primers utilizados foram ANF1 e ANR1 (Lyra et al. 2016).

428 Foram purificados os produtos resultantes das amplificações por PCR com o sistema 429 DNA Purification kit (Promega) ou com a Enzima ExoSap-IT (Affymetrix). Para as reações 430 de sequenciamento foi utilizado o kit BigDye Terminator (Applied Biosystems), seguindo os 431 protocolos recomendados pelo fabricante. As sequências nucleotídicas foram geradas pelo 432 Serviço de Sequenciamento de DNA - SSDNA IQUSP e editadas no programa Bioedit v.7.0.1 433 (http://www.mbio.ncsu.edu/ BioEdit/bioedit.html) e Geneious v7. Os fragmentos foram 434 sequenciados nos dois sentidos, usando os primers citados no parágrafo anterior e também os 435 primers MVZ50 (Graybeal, 1997) e H1KR (presente estudo), para o sequenciamento da 436 porção inicial do fragmento H1, e para o sequenciamento do gene 16S, os primers Titus I 437 (Goebel, 1999), 16L2a e16SH10 (Hedges, 1994) e 16Sar (Palumbi et al., 1991).

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439 1.4 Análises filogenéticas

440 Foram alinhadas todas as sequências obtidas para os diferentes táxons em estudo com 441 auxílio do algoritmo MAFFT (Katoh et al. 2019). Uma matriz concatenada (Matriz A) foi 442 montada com as sequências de DNA obtidas de todos os fragmentos mitocondriais 443 (12S/RNAt-Val/16S – 2362 pb e COI – 506 pb) composta por 90 sequências e 2868 444 caracteres incluindo o outgroup.

445 A partir desta matriz foram inferidas as relações filogenéticas pelo critério de Máxima 446 Parcimônia, com o auxílio do programa TNT v.1.1 (Goloboff et al., 2003), e por análise

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447 Bayesiana, utilizando o programa Mr. Bayes (Huelsenbeck e Ronquist, 2002). Os gaps foram 448 considerados como quinto estado de caráter nas análises de Máxima Parcimônia e as árvores 449 mais parcimoniosas (MPT) foram obtidas pelo método de busca heurística, com o comando 450 xmult, que combina buscas setoriais, ratchet, tree drifting e tree fusing, retendo 100 árvores 451 por réplica, e realiza permuta dos ramos por bissecção e reconexão de árvore (tree bisection 452 and reconnection-TBR). O menor número de passos foi atingido por 50 vezes nas buscas 453 realizadas. Os nódulos presentes nos cladogramas gerados foram avaliados pelo teste de 454 reamostragem Bootstrap (Felsenstein, 1985), baseado em 1000 pseudorréplicas, utilizando 455 traditional search.

456 Para a análise Bayesiana, o modelo evolutivo que melhor se ajustou aos dados foi 457 estimado com o auxílio do programa MR. MODELTEST v.2.3 (Nylander, 2004). Duas 458 análises simultâneas foram executadas, com quatro cadeias em cada uma delas (três aquecidas 459 e uma fria). O número de gerações a serem executadas foi aumentado até que o valor de 460 ASDSF (Desvio Padrão Média de Frequências de Divisão) fosse inferior a 0,01. O programa 461 Tracer v1.6 também foi utilizado para verificar a convergência dos parâmetros e valores de 462 ESS (Efetive sample size). Em cada uma das corridas, uma árvore foi amostrada a cada 100 463 gerações. Foram descartadas 25% das primeiras árvores geradas e uma topologia de consenso 464 com a probabilidade posterior para cada nó foi produzida.

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466 1.5 Delimitação de espécies baseada em sequências de DNA

467 Para esta etapa identificamos primeiramente os clados que possuíam indivíduos 468 referentes à localidade tipo das espécies. Posteriormente calculamos por p-distance a 469 diversidade genética entre e dentro de cada um dos clados designados com o auxílio do 470 programa Mega X (Kumar et al., 2018). Os gaps de alinhamento foram tratados com 471 pairwise deletion.

472 Além utilizar a mesma matriz de dados utilizada nas análises filogenéticas, outras 473 duas matrizes a parte foram construídas para calcular as distâncias genéticas: uma com 46 474 sequências de 550 pares de bases do fragmento 16Sar-16Sbr do gene mitocondrial ribossomal 475 16S (Matriz B); e outra com 34 sequências de 506 pb do fragmento COI. Tanto o fragmento 476 16Sar-16Sbr quanto o fragmento de COI têm sido amplamente utilizado para comparações

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477 interespecíficas em anuros (Fouquet et al., 2007; Lyra et al. (2017). Utilizando apenas a 478 porção final do gene 16S, foi possível incluir em nossa comparação várias sequências já 479 disponíveis na literatura para espécies do gênero Proceratophrys (Amaro et al., 2009; Amaro 480 et al., 2012; Teixeira et al., 2013; Dias et al. 2013; Dias et al., 2018; Mangia et al., 2018; 481 Mangia et al., 2020).

482 Utilizamos também o método de delimitação de espécie baseado em árvore 483 filogenética conhecido por PTP (Poisson Tree Processes), que infere possíveis limites entre 484 espécies considerando a premissa de que o número de substituições nucleotídicas entre 485 espécies é significativamente maior do que o número de substituições dentro das espécies 486 (Zhang et al., 2013). Essa análise foi conduzida utilizando uma implementação Bayesiana 487 do método PTP (bPTP), no servidor bPTP (http://species.h-its.org/ptp accessed in March, 488 2020). Nessa análise foi utilizada a árvore newick gerada a partir da inferência Bayesiana 489 descrita no item anterior. Foram utilizadas 100.000 gerações de Monte Carlo Marcov Chain 490 (MCMC), thinning de 100 e burnin de 0.25 (25% das primeiras árvores descartadas).

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492 2. Resultados e Discussão

493 Em todas as análises, identificamos os clados de duas espécies que apresentaram 494 indivíduos das respectivas localidades tipo: Proceratophrys avelinoi (localidade tipo: 495 Misiones – Argentina) e P. palustris (localidade tipo: Poços de Caldas – MG). Um 496 terceiro clado foi identificado como P. brauni por apresentar espécimes de Bom Jesus – 497 RS, uma localidade próxima à localidade tipo (Cambará do Sul – RS) dessa espécie 498 (Kwet e Faivovich 2001). A espécie P. bigibbosa foi descrita com localidade tipo “Rio 499 Grande do Sul”, sem uma localidade específica (Peters, 1872). Uma vez que a localidade 500 Linha Imperial, Nova Petrópolis – RS foi designada por Braun (1973) como a localidade 501 tipo da espécie P. cristinae e esta foi sinonimizada a P. bigibbosa por Kwet e Faivovich 502 (2001), o clado que apresentou indivíduos dessa localidade foi considerado como de P. 503 bigibbosa (Figura 1).

504 Tanto nas análises de Máxima Parcimônia quanto na análise Bayesiana, cinco 505 principais clados foram inferidos e com as mesmas relações filogenéticas. 506 Proceratophrys avelinoi foi recuperado como irmão de um clado que inclui as espécies P.

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507 brauni e P. palustris (Figura 1). O clado composto por P. avelinoi, P. brauni e P. 508 palustris, por sua vez, foi inferido como irmão de um grande clado, que incluiu a espécie 509 Proceratophrys bigibbosa e um clado que provavelmente represente uma espécie ainda 510 não descrita (clado Proceratophrys sp. na Figura 1).

511 Figura 1. Relações filogenéticas inferidas com base na matriz concatenada dos genes 512 mitocondriais (12S, tRNA-Val, 16S e COI) por (a) Análise Bayesiana e (b) Máxima 513 Parcimônia. Em b, é mostrada a árvore de consenso estrito, com 2543 passos. Acima dos nós 514 em a e b estão apresentados os valores de probabilidade a posteriori e de bootstrap, 515 respectivamente. Triângulos: sequências obtidas de topótipos.

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517 O clado de Proceratophrys sp., inferido como irmão de P. bigibbosa, agrupou 518 espécimes de Ipuaçú, Xanxerê e Chapecó, do estado de Santa Catarina; Fagundes Varela, 519 Mato Castelhano, Cotiporã, Sertão e Erechim, do estado do Rio Grande do Sul; além de 520 indivíduos da região de Misiones na Argentina, como proximidades do Arroyo Coral, 521 Parque Provincial Moconá e Florestal Montreal. Entre os clados irmãos Proceratophrys 522 sp. e P. bigibbosa foi estimada uma distância genética de 3,3 % em relação ao fragmento 523 16S e de 12,3% para o fragmento COI. Essas diferenças entre os dois clados é 524 consideravelmente alta quando comparadas às distâncias genéticas já registradas para 525 outras espécies do gênero Proceratophrys (Amaro et al., 2009; Amaro et al., 2012; Teixeira

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526 et al., 2013; Dias et al. 2013; Dias et al., 2018; Mangia et al., 2018 e Mangia et al., 2020). 527 Ambos os valores aqui estimados são também maiores do que aqueles sugeridos por Fouquet 528 et al. (2007) e Lyra et al. (2017) como limítrofes entre distâncias genéticas intra e 529 interespecíficas e, portanto, indicativos da presença de espécies distintas (i.e., em torno de 3% 530 para o fragmento 16S e em torno de 6% para o fragmento COI). Baixa distância genética foi 531 estimada dentro do clado de Proceratophrys sp. (0,5% e 2,5%, para os fragmentos 16S e 532 COI, respectivamente; Tabela 2). As distâncias intraespecíficas em P. palustris, P. 533 brauni, P. avelinoi e P. bigibbosa também foram baixas, tendo sido a maior delas 534 encontrada em P. biggibosa (1,7% no fragmento do 16S e 3,5% no fragmento do COI; 535 Tabela 2).

536 Tabela 2. Distâncias genéticas patrísticas (p-distance), em porcentagem, entre as espécies do 537 grupo Proceratophrys bigibbosa estimadas com base no fragmento 16Sar-16Sbr (triângulo 538 inferior) e no fragmento do gene COI (triângulo superior). Em destaque na linha diagonal, as 539 distâncias genéticas intraespecíficas, inferidas com base no fragmento 16Sar-16Sbr (esquerda) 540 e no COI (direita).

Espécies 1 2 3 4 5 1 P. bigibbosa 1,7/ 3,5 12,3 11,5 11,6 13,3 2 Proceratophrys sp. 3,3 0,5 / 2,5 12,9 12,8 13,5 3 P. palustris 4,1 4,6 0,2 / 1,1 5,4 9,8 4 P. brauni 4,3 4,4 1,6 0,1 / 0,6 9,2 5 P. avelinoi 4,2 4,0 3,9 3,3 0,3 / 2,5 541

542 Os resultados obtidos na análise de bPTP recuperaram os principais clados 543 também obtidos nas análises filogenéticas e sugerem que os clados identificados como 544 Proceratophrys sp. e P. bigibbosa não correspondam à mesma espécie (Figura 2). É 545 importante destacar que P. bigibbosa foi recuperado separado de Proceratophrys sp. e a 546 probabilidade destes clados fazerem parte de uma mesma espécie foi estimada como 547 sendo zero (Figura 2). Ainda nessa análise, foi estimada a presença de mais de uma 548 espécie tanto clado de Proceratophrys sp. quanto no clado de P. bigibbosa. Contudo, 549 sabe-se que tais análises de delimitação podem superestimar o número de espécies no 550 grupo em questão (Zhang et al., 2013 e Luo et al., 2018), recuperando como possíveis 551 espécies linhagens que apresentam evidente estruturação genética. Por essa razão, a 552 inclusão de outras análises, que integrem diferentes conjuntos de dados, como

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553 morfológicos e acústicos, e utilizem maior número de espécimes de diferentes 554 localidades, é de grande importância para uma melhor interpretação dos resultados 555 indicados pela análise bPTP. No caso em questão, análises morfológicas e acústicas 556 conduzidas pelo Dr. Diego Baldo até o momento dão suporte à descrição de uma nova 557 espécie de Proceratophrys, correspondente ao clado aqui denominado de 558 Proceratophrys.

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560 Figura 2. Estimativa de delimitação de espécies obtida na Maximum Likelihood solution 561 inferida na análise bPTP. Os valores acima dos nós correspondem às probabilidades 562 relativas de cada clado a ser considerado espécie plena. Note que há a probabilidade de 563 que Proceratophrys sp. e P. bigibbosa pertençam a uma única espécie é zero (seta azul).

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567 3. Conclusão

568 O presente estudo mostrou que um clado inferido como irmão de P. biggibosa 569 apresentou alta distância genética em relação a todas as espécies do grupo P. biggibosa (3,3% 570 de distância genétia estimada com base no fragmento 16S e 12,3% para o fragmento COI) e 571 alto suporte na análise bPTP para ser considerado uma espécie plena. Esses resultados irão 572 contribuir para a descrição de uma nova espécie de Proceratophrys, a qual está sendo 573 organizada pelo Prof. Dr. Diego Baldo. 574

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592 IV. CAPÍTULO 2 - Southern South America Miocene marine transgression as a

593 possible process influencing speciation in the Proceratophrys biggibosa group *

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595 *Este trabalho foi realizado em colaboração com Célio Fernando Baptista Haddad, Carmen 596 Silva Busin, Diego Baldo, Mariana Vasconcelos e Ana Carolina Carnaval.

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598 ABSTRACT

599 Aim: We investigate the phylogenetic relationships in the species group Proceratophrys 600 bigibbosa and some aspects of its biogeographical history

601 Location: Araucaria Forest, a subdivision of the morphoclimatic domain Atlantic Forest, 602 Southern South America and an adjascent area.

603 Methods: We performed Maximum Parsimony, Bayesian Inference and Maximum 604 Likelihood analyses using DNA sequences from three mitochondrial and three nuclear genes 605 of 92 individuals. Using a fossil described for the Odontophrynidae family, we generated a 606 calibrated coalescent species tree with *BEAST package implemented in BEAST2. We 607 constructed haplotype networks to better evaluate the genetic divergence between haplotypes 608 and alleles using the Network v.5 software. Exploring environmental Principal Component 609 Analysis (ePCA), we inferred the degree of similarity or divergence between climate niches 610 of each species.

611 Results: In all analyses, P. palustris was inferred as sister species of P. brauni, composing 612 the sister clade of that composed of P. bigibbosa and an undescribed species (Proceratophrys 613 sp.). This species here analyzed presented 16S genetic distances of 3.8%. 4.4% compared to 614 the other species in the group. In the *Beast species tree, P. avelinoi was recovered as sister of 615 a clade composed of the four remaining species of the P. bigibbosa group, but in the non- 616 coalescent species tree, P. avelinoi was sister of P. brauni + P. palustris. The time divergence 617 of the most recent common ancestor (MRCA) revealed that the first two lineages split around 618 11.71 to 6.24 Mya and after that the two main clades diverged around 6.3 to 3.4 Mya. Using a

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619 ePCA analysis it was possible to identify that the environmental variables differ between 620 sister species and are similar between species less phylogenetic related. This result is related 621 to the niche theory which such theory states that more phylogenetically related species tend to 622 present more similar niche than species less related.

623 Main conclusions: Despite the coincident distribution of the P. bigibbosa species group with 624 the Araucaria angustifolia range, the species did not split during the same period of 625 expansion and retraction of the Araucaria Forest during the Quaternary (4,000 ya). However, 626 a marine transgression that had occurred between 15 and 8 Mya may have influenced the P. 627 bigibbosa group diversification. Evaluation of the current climate variables revealed that the 628 sister species have different climate niches and some climatic events in the past could have 629 reinforced the genetic divergence between closely related species already separated.

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631 Keywords: Anura, biogeography, time divergence, Araucaria Forest, molecular 632 phylogenetics, speciation.

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644 1. INTRODUCTION

645 The Araucaria Forest (AFO) is located in the southern portion of South America 646 and is one of the subdivisions of the Atlantic Forest (AF) with particular characteristics. AFO 647 presents a striking gymnosperm that is endemic from high altitude regions in South America 648 called Araucaria angustifolia. This pine species is found within the Ombrophyllous Forest, 649 characterizing the peculiar phytophysionomy of the region as "Mixed Ombrophyllous Forest” 650 (MOF) (Ellenberg and Mueller-Dombois, 1967). Only 12% of the original shape of AFO is 651 preserved and little is known about its biodiversity (Ribeiro et al., 2009). This cold and humid 652 subtropical forest hosts the anuran species of the Proceratophrys bigibbosa species group, 653 with exception of P. avelinoi, which is distributed around the Mesophytic Semideciduous 654 Forest Southern Brazil, a sub montane vegetation (Caldart et al., 2010).

655 The genus Proceratophrys is composed of 41 species and belongs to the 656 Odontophrynidae family, which also comprises Macrogenioglottus, a monotypic genus and 657 Odontophrynus, composed of 11 species (FROST, 2019). Two species complexes and two 658 phenetic groups are recognizend in Proceratophrys. The P. boiei and P. appendiculata 659 complexes present palpebral appendage, while P. cristiceps and P. bigibbosa are the species 660 groups without that appendages (Izecksohn et al., 1998, Prado & Pombal 2008, Cruz & 661 Napoli 2010, Teixeira et al 2012 e Dias et al., 2013). Three other species not alocated in any 662 of these species complexes or groups are also comprised in the Proceratophrys genus: P. 663 schirchi, P. rondonae and P. minuta.

664 The P. bigibbosa species group currently consists of P. bigibbosa (Peters, 1872), 665 P. avelinoi Mercadal de Barrio & Barrio, 1993, P. brauni Kwet and Faivovich, 2001 and P. 666 palustris Giaretta and Sazima, 1993 (see review in Kwet and Faivovich, 2001) and one 667 unnamed species (hereafter referred to as Proceratophrys sp. - see Chapter 1 of this thesis). 668 This species group is characterized by the presence of blunt and short snout, postocular 669 swellings and large marginal tubercles on eyelids and the absence of hornlike palpebral 670 appendages (Lynch, 1971; Giaretta and Sazima, 1993; Eterovick and Sazima, 1998; Kwet and 671 Faivovich, 2001). Although all phylogenetic analyses available in the literature were not 672 designed to test specifically the monophyly of the P. bigibbosa group, P. avelinoi and P. 673 bigibbosa, the only species of this group included in such analyses, were always recovered as 674 sister species (Amaro et al., 2009; Pyron and Wiens, 2011; Teixeira Jr. et al., 2012; Dias et

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675 al., 2013). Furthermore, Dias et al. (2018) suggested four putative synapomorphies 676 concerning larval morphology (conical vent tube, dorsal fin at the body tail junction, large A2 677 gap and trapezoidal median ridge) for the P. bigibbosa group. In Chapter 1 of this thesis, we 678 present a phylogenetic analysis that included all the species currently allocated in the P. 679 bigibbosa group and all of them were recovered within a highly supported clade, which 680 suggests the monophyly of this species group.

681 Of the five species recognized in the P. bigibbosa group (see Chapter 1 of this 682 thesis), P. palustris is the only one whose distribution is currently restricted to its type- 683 locality, which is in a high altitude (1400 m) area in Poços de Caldas municipality, in the 684 Brazilian state of Minas Gerais. This site is the northern limit of distribution of this group and 685 is inserted in a fragment of AFO. The remaining species of the P. bigibbosa group occurs in 686 AFO or adjacent areas in south Brazil and/or eastern Argentina and Paraguay (for species 687 distribution, see Frost, 2019).

688 The Araucaria Forest has experienced expansion events during glacial geological 689 periods such as the Last Glacial Maximum (LGM = 21,000 ya) and the Middle Holocene 690 (6,000 ya) and retraction during warmer and wetter interglacial geological periods 691 (Luteryoung, 2018; Bergamim et al., 2019). Some palynological records supports the 692 hypothesis of expansions of AFO from south to north toward southwestern Brazil and 693 posterior retraction from north back to the south around 4,000 ya (Behling & Pillar, 2007; 694 Jeske-Pieruschka & Behling, 2011), which corroborates the inferences by Luteryoung et al. 695 (2018) and Bergamim et al. (2019). After the forest retraction, some areas probably 696 maintained the environmental characteristics of the forest and became isolated from each 697 other by areas with a tropical climate phytophysionomy. Such forest fragments may have 698 acted as refuges for species more adapted to temperate climates (Barros, 2015; Luteryoung et 699 al., 2018; Bergamin et al., 2019). According to the inferences based on ecological niche 700 models provided by Barros et al. (2015), Lauteryoung et al. (2018) and Bergamim et al. 701 (2019), during the expansion period of the AFO, the southern region of Minas Gerais state, in 702 Brazil, was also covered by this forest and, after the Araucaria population retraction, this area 703 maintained the climatic characteristics of the MOF, with some Araucaria spots. As a result, it 704 is possible to suppose that the extant species adapted to such environment may have suffered 705 reproductive isolation, which may have led to speciation events. Since Proceratophrys

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706 palustris occurs precisely in a forest fragment in southern Minas Gerais, one may suppose 707 that the Araucaria retraction could had been involved in the evolutionary origin of this 708 species. Such hypothesis was previously considered by some authors (Giaretta and Sazima, 709 1993; Martins and Giaretta, 2012), who referred to P. palustris as a relict of an ancestor of the 710 Proceratophrys bigibbosa group, widely distributed throughout the AFO.

711 Therefore, the coincidence between the geographical distribution of most species 712 of the Proceratophrys bigibbosa group with the current AFO range, the occurrence of P. 713 avelinoi in an adjacent area of AFO and the disjointed known distribution of P. palustris 714 would raise the hypothesis that the expansion and retraction cycles of AFO during the 715 Pleistocene in fact may have influenced the diversification in the P. bigibbosa group. 716 Nonetheless, a recent divergence-time estimate of split between two species of this group 717 weakens this hypothesis, since the split between P. avelinoi and P. bigibbosa was estimated to 718 have occurred 0.96 million years ago (Mângia et al., 2018), that is much more recent than the 719 expansion and retraction cycles of AFO.

720 In addition to the AFO cycles, the presence of large rivers of the La Plata drainage 721 basin should also be considered when assessing the evolutionary history of the P. bigibbosa 722 group. The Uruguay river is one of the main rivers of this draineage basin, together with 723 Parana and Paraguay rivers and it is possible that the paleocourse of the Uruguay river was 724 influenced by a big inundation of the La Plata basin during the miocene. During the late 725 Miocene, the basin was inundated by a marine transgrasion (Räsänen et al., 1996), 726 evidenciated by costal foraminiferes fossils finded sediments (Boltovskoy, 1991 and Marshall 727 et al., 1993). That South America Miocene marine transgration was niciated by two different 728 entrances: the Amazonian mouth sea entrance (Northern South America) and Paraná mouth 729 sea entrance (Southern South América), both water antrances from the Atlantic Ocean over 730 the continent (Marshall et al., 1993 and Lundberg et al., 1998). The Paraná mouth was the 731 entrance transgression where nowadays is located the foz of La Plata river estuary, and is the 732 river wich the Uruguay river debouches. A big scenario transformation as that marine 733 transgression surely influenced the course and volume of Uruguay and Parana rivers as 734 happened with the Amazon rivers on the Amazon entrance (Lovejoy et al., 2006).

735 Both hipothesys of AFO cycles or the vicariance/dispersion by influence of the 736 marine transgression are possible. But as these events have ocoured in different geological

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737 periods, it is important to know when the species diverged and where the species common 738 ancestral were distribuded in that time. In the present study, we provide a time-calibrated 739 multigene phylogeny and evaluated two possible scenarios: i) the expansion and retraction of 740 AFO influencing the dispersion of the P. bigibbosa group species and consequently speciation 741 by isolation; or ii) the Paranean sea inundation influencing the main river inundations as 742 Uruguay river sliting the populations in tree areas (upper and lower Uruguay, and an 743 additional area on the highlands eastern upper the Uruguay river).We assessed these questions 744 using a phylogeographic and historic biogeography approach.

745

746 2. METHODS

747 Initially, we tested the monophyly and the phylogenetic relationships in the 748 Proceratophrys bigibbosa group using mitochondrial and nuclear DNA sequences of 749 specimens collected from type-locality or vicinity of each species and from localities that 750 cover all the P. bigibbosa species group distribution. Each species was referenced to the 751 topotypical sample and interspecific genetic distances were estimated. We then inferred clade 752 divergence times using a species tree generated by a coalescent approach. With this dated 753 species tree, we could infer the possible distribution of putative ancestors and evaluate 754 whether the Paranean sea could have played a role in the diversification of the P. bigibbosa 755 species group. Finally, we conducted a Principal Component Analysis of the environmental 756 local variables to identify if they are differently used by the distinct species.

757

758 2.1 Taxon sampling

759 We analyzed 82 specimens of the Proceratophrys bigibbosa group, collected from 760 42 sites, which cover the known area of distribution of this group (Figure 1; Table 1). The 761 type-localities of P. avelinoi (Moncholito, Misiones, Argentina) and P. palustris (Morro do 762 Ferro, Poços de Caldas – MG, Brazil) were sampled as well as a site near the type-locality of 763 P. brauni (Bom Jesus – RS, Brazil). For the outgroup, at least one nucleotide sequence of 764 each Proceratophrys species for which data are available in GenBank was sampled (Table 1). 765 We also included representatives of Macrogenioglotus (M. alipioi) and Odontophrynus (O.

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766 americanus and O. cultripes), genera which were previously inferred as phylogenetically 767 closely related to Proceratophrys (Amaro et al., 2009; Amaro et al., 2012; Teixeira et al., 768 2012; Dias et al., 2013; Mângia et al., 2018). Most outgroup sequences were obtained from 769 GenBank. The sequences we generated here were obtained from tissue samples gently 770 provided by museums (Table 1) or from specimens collected under a permit issued by the 771 Brazilian Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio/SISBIO - 772 permit number 50672-1).

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773 Table 1. Taxon samples used in our analysis, their locality, voucher number and identification and accession number of nucleotide sequences in 774 GenBank. In bold, the sequences obtained in the present study. PUCRS: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul; UFRGS: 775 Universidade Federal do Rio Grande do Sul; UPF: Universidade de Passo Fundo; DB: collection from Professor Dr. Diego Baldo, Argentina and 776 SMRP: Shirlei Maria Recco Pimentel; CFBH-T: Célio Fernando Baptista Haddad Tissue collection; LGE: Laboratorio de Genetica Evolutiva.

Identification of tissue sample or Voucher number in Locality GenBank accession number Species museum collection 12S/tRNA-Val/ COI RAG POMC CXCR4 16S genes P. bigibbosa group Proceratophrys bigibbosa Gramado - RS – Brazil ZUEC 23998 # X X X X Gramado - RS – Brazil ZUEC 23999 # X X X X Nova Petrópolis - RS – Brazil ZUEC 23400 # X X X - São Francisco de Paula - RS – Brazil MCP 9718 # X X X X Bom Jesus - RS – Brazil MCP 9717 # X X X X Proceratophrys sp. Ipuaçu - SC – Brazil CFBH-T 1272 # - - X - Ipuaçu - SC – Brazil CFBH-T 1276 # - - X -

Ipuaçu - SC – Brazil CFBH-T 1296 # X X X X Ipuaçu - SC – Brazil CFBH-T 1297 # X X X X Ipuaçu - SC – Brazil CFBH-T 1298 # - - X X Trindade do Sul - RS – Brazil UFRGS 0670 # - X X X Ipuaçu - SC – Brazil CFBH-T 2100 # X X X X

Arvoredo - SC – Brazil CFBH-T 9192 # - X - X

Xanxerê - SC – Brazil CFBH-T 10333 # X X X X

Fagundes Varela - RS – Brazil UFRGS 3246 # X - X X

Mato Castelhano - RS – Brazil CFBH-T 9664 # X X X X

Mato Castelhano - RS – Brazil CFBH-T 9659 # - X X X Cotiporã - RS – Brazil UFRGS 3234 # X - X X

Cotiporã - RS – Brazil UFRGS 3258 # X - X X

Sertão - RS – Brazil UPF 30.12 # X - X X

Sertão - RS – Brazil UPF 30.13 # X X - X

Sertão - RS – Brazil UPF 30.14 # X X X X

Sertão - RS – Brazil UPF 30.15 # X - X X

Sertão - RS – Brazil UPF 30.17 # - X X X

Chapecó - SC – Brazil UPF 13.05 # X - X -

Erechim - RS – Brazil – Brazil UFRGS 3248 # X X X X

Proximidades Arroyo Coral - Missiones - Argentina LGE 02952 # X X X X Braga - RS – Brazil MCP 13064 # X - X - 45

Forestal Montreal - Missiones – Argentina DB 2313 # X - X X Parque Provincial Moconá - Missiones – Argentina LGE 00550 # X X X X Parque Provincial Moconá - Missiones – Argentina LGE 00551 # - X X X Parque Provincial Moconá - Missiones – Argentina LGE 00552 # - X X X Parque Provincial Moconá - Missiones – Argentina LGE 00553 # - X - X Parque Provincial Moconá - Missiones – Argentina LGE 00554 # X X X X Parque Provincial Moconá - Missiones – Argentina LGE 00569 # X X X X P. brauni Quiriri - SC – Brazil CFBH-T 22668 # - - - - Quiriri - SC – Brazil CFBH-T 22669 # - - - - Vargem - SC – Brazil CFBH-T 22670 # - - - - Vargem - SC – Brazil CFBH-T 22671 # - - - - Vargem - SC – Brazil CFBH-T 22672 # - - - - Rio Negro - PR – Brazil CFBH-T 11248 # - X X - Fazenda Rio Grande - PR – Brazil CFBH-T 5575 # X - X -

Fazenda Rio Grande - PR – Brazil CFBH-T 5576 # X X - - Bom Jesus - RS – Brazil UFRGS 0204 # X - X -

Bom Jesus - RS – Brazil UFRGS 0337 # X - X -

Barracão - RS – Brazil UFRGS 2696 # X - X X

Barracão - RS – Brazil UFRGS 2697 # X - X X Barracão - RS – Brazil UFRGS 2699 # X - X -

Campo Belo do Sul - SC – Brazil UFRGS 0688 # X - X -

Campos Novos - SC – Brazil CFBH-T 11463 # X X X -

Campos Novos - SC – Brazil CFBH-T 11464 # X X - -

P. paulstris Poços de Caldas - RS – Brazil SMRP 507.1 # X X X - Poços de Caldas - RS – Brazil SMRP 507.2 # X X X X

Poços de Caldas - RS – Brazil SMRP 507.3 # X X X X

Poços de Caldas - RS – Brazil SMRP 507.4 # X X X X

Jaguariaíva - PR – Brazil UFMG 2624 # - - - - Jaguariaíva - PR – Brazil UFMG 2626 # - - - - P. avelinoi Palma Sola - SC – Brazil UPF 14.01 # X X - - Palma Sola - SC – Brazil UPF 14.02 # X X X - Bom Progresso - RS – Brazil MCP 13066 # - X X X Ortigueira - PR – Brazil CFBH-T 11250 # X - X - Ortigueira - PR – Brazil CFBH-T 11182 # X X X - Ruta Provincial Nº 6 - Missiones – Argentina LGE 08516 # X X X X Ruta Provincial Nº 6 - Missiones – Argentina LGE 08517 # X X X X Ruta Provincial Nº 6 - Missiones – Argentina LGE 08519 # X X X X Ruta Provincial Nº 6 - Missiones – Argentina LGE 08743 # X X X X Ruta Provincial Nº 6 - Missiones – Argentina LGE 08744 # X X X X Reserva Privada Osununú - Missiones – Argentina LGE 11821 # X - X X

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Reserva Privada Osununú - Missiones – Argentina LGE 11822 # X - X X Puerto Iguazú - Missiones – Argentina LGE 10937 # X - X X Puerto Iguazú - Missiones – Argentina LGE 10938 # X - X X Puerto Esperanza - Missiones – Argentina LGE 01422 # X X X X Puerto Esperanza - Missiones – Argentina LGE 01423 # X X X X Garuapemí - Missiones – Argentina DB 6652 # X X X X Parque Provincial Caá Yarí – Argentina LGE 08926 # X - X X Andresito - Missiones – Argentina DB 1983 # X X X X Andresito - Missiones – Argentina LGE 10936 # X - X - Andresito - Missiones – Argentina LGE 10940 # X - X X Garuapemí - Missiones – Argentina LGE 10927 # X - - X San Vicente - Missiones – Argentina JF 1948 *DQ283039 - - - - Missiones – Argentina DB 1246 *KF214102/FJ685691 - FJ685711 - - San Vicente - Misiones – Argentina MACN 47401 KP295643 - - KP295583 - P. appendiculata species complex **P.itamari Campos do Jordao - SP – Brazil MZUSP 135186 *KF214125/KF214147 - - - - P. melanopogon Resende - RJ – Brazil UNIRIO 4603 *KF214128/KF214150 - KF214187 - - **P.mantiqueira Araponga - MG – Brazil MZUFV 10139 *KF214121/KF214143 - KF214182 - - P. melanopogon Serra da Bocaina, Sao Jos do Barreiro - SP – Brazil TG 3295 *KF214127KF214149 - KF214186 - - **P.pombali Bertioga - SP – Brazil AF 1988 *CY034614/KF214144 - KF214183 - - P. belzebul Barra do Una, Sao Sebastiao - SP – Brazil RCA2013aMTR9456 *KF214132/KF214154 - KF214191 - - P. belzebul Picinguaba, Ubatuba - SP – Brazil RCA2013a28 *KF214134/KF214156 - KF214193 - - P. appendiculata Sao Luis do Paraitinga - SP – Brazil CFBH-T 01466 *- / KU495463 KU494670 - - - P. appendiculata Sao Luis do Paraitinga - SP – Brazil CFBH-T 00329 *- / KU495461 KU494668 - - - P. appendiculata Teresopolis - RJ – Brazil CFBH-T 16302 *- / KU495462 KU494669 - - - P. appendiculata Teresopolis - RJ – Brazil MNRJ 53936 *KF214130/KF214151 - KF214189 - - P. tupinamba Ilha Grande - RJ – Brazil MNRJ 54541 *KF214136/KF214158 - KF214195 - - P. izeksoni Paraty - RJ – Brazil MNRJ 64584 *KF214135/KF214157 - KF214194 - - P. cururu Serra do Cipo, Cardeal Mota - MG – Brazil MTR ALCX125P23 *- / KU495478 KU494685 - - - P. cururu Serra do Cipo, Cardeal Mota - MG – Brazil MTR ALCX175P74 *- / KU495477 KU494684 - - - P. cururu Cardeal Mota - MG – Brazil FSFL580 *KF214107/FJ685696 - FJ685716 - - P. goyanus Parana - TO – Brazil MTRLCX14P65 *- / KU495479 KU494686 - - - P. goyanus Alto Paraíso de Goiás - GO – Brazil ZUEC 21200 # X X X X P. goyanus Petrolina de Goias - GO – Brazil AF 1188 *KF214108/FJ685697 - FJ685717 - - P. boiei species complex P. boiei Serra da Cantareira, Sao Paulo - SP – Brazil AF 1587 *KF214104/FJ685693 KC603982 KC604004 KC604071 - P. laticeps - AF 1900 *- / FJ685698 - FJ685718 - - P. renalis Brejo Madre de Deus - PE – Brazil ZUFRJ 8682 *KF214111/FJ685700 - FJ685720 - - P. cristiceps species group

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P. cristiceps PARNA Serra das Confusões - PI – Brazil AF887 *KF214106/FJ685695 - FJ685715 - - P. cristiceps - GRC22955 *MF769774 - - - - P. cristiceps - CFBH-T 11332 *- / KU495475 KU494682 - - - No group P. minuta Miguel Calmon - BA – Brazil AF 2308 *- / JX982965 - JX982969 - - P. redacta Morro do Chapeu - BA – Brazil MTR 22579 *- / JX982967 - JX982971 - - P. schirchi Santa Teresa - ES – Brazil 371* *KF214112/FJ685701 - FJ685721 - - P. concavitympanum Xambioá - TO – Brazil ZUEC 24525 # - X - X P. concavitympanum - SM2016AAGARDA2736 *- / KX855986 - - - - P. concavitympanum - ARI1193 *- / KX858855 - - - - P. concavitympanum Vale de Sao Domingos - MT – Brazil MTRALCX101P3 *- / KU495473 KU494680 - - - P. concavitympanum Palmas - TO – Brazil AF 1094 *KF214105/FJ685694 - FJ685714 - - P. huntingtoni Cuiabá - MT – Brazil ZUEC 24075 # X - X X P. moratoi Bauru - SP (469.43) – Brazil CJJ 7931 # X - X X P. moratoi Itirapina - SP – Brazil CFBH 6515 *KF214110/FJ685689 - FJ685709 - - Macrogenioglottus alipioi Uruçuca - BA – Brazil CFBH-T 04337 *- / KU495385 KU494592 - - - Macrogenioglottus alipioi - AF 919 *KF214097/FJ685684 - FJ685704 - - Macrogenioglottus alipioi Ribeirao Branco - SP – Brazil CFBH-T 01032b *- / KU495384 KU494591 - - - Macrogenioglottus alipioi Uruçuca - BA – Brazil CFBH 12929 KC593360 - KC593355 - - O. salvatori Alto Paraíso de Goiás - GO – Brazil AAG-UFU 1548 # - X X X O. americanus Buenos Aires – Argentina JF 1891 AY843704 - AY844480 - - O. americanus Pocos de caldas - MG – Brazil AF 665 *KF214099/FJ685686 JX298366 JX298191 JX298141 - Odontophrynus cultripes Varginha - MG – Brazil FSFL 875 *KF214101/FJ685688 - FJ685708 - - Cicloramphus acangatan Caucaia do Alto, Cotia - SP – Brazil AF 1605 *KF214096/FJ685683 - HQ634170 - -

*Partial sequences; **identification from Mângia et al. (2018) 777

48

778 Figure 1. Geographical distribution of the sites sampled for this study. Green: Proceratophrys 779 palustris. Brown: P. brauni. Red: P. bigibbosa. Blue: Proceratophrys sp.. Gray: P. avelinoi. 780 781 782 2.2 Genomic DNA extraction

783 Liver samples were obtained from animals anesthetized with 2% lidocaine 784 (protocol approved by CEUA/UNICAMP – permit number 3982-1). To obtain genomic DNA 785 samples, small fragments of liver tissue were immersed in lysis solution (TNES: 50 mM Tris 786 pH 7.5, 400 mM NaCl, 20 mM EDTA, 0.5% SDS) with proteinase K (final concentration of 787 100 g/mL) for 3 to 5 hours at 55º C. We added 1/3 volume of 5 M NaCl in each sample 788 (final concentration of NaCl: 1.25 M) and centrifuged the samples for 5 minutes in high 789 speed. We discarded the supernatant and genomic DNA was precipitated in isopropyl ethanol 790 and subsequently washed in 70% ethanol. The genomic DNA was resuspended in TE (10 mM 791 Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8) and stored at -20 ° C.

792 49

793 2.3 PCR amplification and DNA sequencing

794 We used PCR (Polymerase Chain Reaction) to amplify all the gene fragments. 795 The H1 mitochondrial fragment, which includes the 12S rRNA, tRNA-Val and 16S rRNA 796 genes, was amplified using the primer pairs MVZ59 (Graybeal, 1997) and Titus I (Titus, 797 1992) and 12SL13 and 16Sbr (PALUMBI et al., 1991). To amplify the COI mitochondrial 798 fragment (Cytochrome Oxidase I), we used the primers ANF1 and ANR1 (Lyra et al., 2017). 799 The nuclear gene fragments CXCR4 (C-X-C chemokine receptor type 4), POMC 800 (proopiomelanocortin) and RAG-1 (recombination-activating gene 1) were amplified using, 801 respectively, the primer pairs CXCR4R and CXCR4G (Biju and Bossuyt, 2003), POMC1 (F) 802 and POMC2(R) (Wiens et al., 2005) and RAG1 and RAG2. Each 25 μL of PCR mixture had

803 buffer reaction (10 mM de Tris-HCl pH 9, 50 mM KCl), 1.5 mM MgCl2, 200 μM of each 804 dNTP, 0.4 μM of each primer, 1 U Taq DNA polymerase (Invitrogen) and 400 to 1000 ng of 805 genomic DNA.

806 The PCR-amplified products were purified using the DNA Purification Kit 807 (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System, Promega) or ExoSap-IT Enzyme system 808 (Affymetrix). For sequencing reactions, we used the BigDye Terminator kit (Applied 809 Biosystems) following the protocols recommended by the manufacturer. Nucleotide 810 sequences were generated by DNA Sequencing Service - SSDNA IQUSP or Myleus Facility 811 and edited in the BIOEDIT v.7.0.1 program (Hall, 1999) or Geneious V. R7.0. The fragments 812 were sequenced in both directions using the primers cited in the previous paragraph and, in 813 the case of H1 fragment, also the primers MVZ50 (Graybeal, 1997), H1KR (present study), 814 Titus I (Goebel, 1999), 16L2a and 16SH10 (Hedges, 1994) and 16Sar (Palumbi et al., 1991).

815

816 2.4 Phylogenetic relationships

817 The nucleotide sequences were aligned with the algorithm MUSCLE (Edgar et al., 818 2004). We assembled all the mitochondrial (2365 bp of H1 fragment and 506 bp of COI) and 819 nuclear fragments (344 bp of RAG-1, 636 bp of CXCR4 and 609 bp of POMC) in a 820 concatenated matrix composed of 96 sequences and 4460 characters (Matrix A).

50

821 Phylogenetic relationships were inferred by Maximum Parsimony criterion using 822 the TNT v.1.1 program (Goloboff et al., 2003), Bayesian analysis using Mr. BAYES v. 3.2 823 software (Huelsenbeck et al., 2002). The gaps were considered as the fifth state of character in 824 the analyses. The most parsimonious trees (MPT) were obtained using the new technology 825 option, including sectorial searches, ratchet, tree drifting and tree fusing. The smallest number 826 of steps was reached 100 times. The support of the nodes was evaluated by the Bootstrap 827 resampling test (Felsenstein, 1985), based on 1000 pseudoreplicates, using traditional search.

828 For the Bayesian Markov Chain Monte Carlo (MCMC) analysis, the evolutionary 829 model GTR was used to the mitochondrial COI and H1 (12S and 16S) partitions and SKY+G 830 to the three nuclear partitions, which were estimated as the best-fit models to our data by the 831 software Mr. MODELTEST v.2.3 (Nylander, 2004). Two simultaneous analyses were 832 performed, with four chains in each of them (three heated and one cold). In each analysis, 30 833 million generations were run and one tree was sampled every 100 generations. The first 834 generated trees (25% initial as a burnin) were discarded and a consensus topology with the 835 posterior probability for each node was produced. The ASDSF (Average Standard Deviation 836 of Split Frequencies) value was below 0.01 and the PSRF (Potential Scale Reduction Factor) 837 values were approximately 1.000. The stabilization of posterior probabilities was checked 838 using Tracer v. 1.6 (Rambaut et al., 2014).

839

840 2.5 Coalescent-based species tree and diversification time estimation

841 In this analysis, we used a concatenated matrix with all mitochondrial and nuclear 842 gene sequences, generated on Sequence Matrix. A nexus file with each gene was created as a 843 partition, delimited and recognized by the BEAUTY v 2.5.1 software (Bouckaert et al., 2014). 844 For each partition we set the type of segregation with a value of 0.5 for the mitochondrial 845 partitions (N) and 2.0 for the nuclear partitions (4N). To infer the divergence time of the 846 clades, we used STARBEAST2 (*BEAST2) package implemented on the software BEAST2, 847 v 2.5.1 (Bouckaert et al., 2014) using the calibrated Yule coalescent model with auxiliary 848 tutorials from the website “Taming the BEAST” (2018) developed by Barido-Sottani et al. 849 (2017). We used an Odontophrynidae fossil assigned by Nicoli et al. (2017), aged from 27 a

51

850 28 million years ago (Mya), to calibrate the tree. We used the substitution rate previously 851 described for 12S and 16S rRNA (Gvozˇdík et al., 2010) and COI (Brusquetti et al., 2018) 852 gene fragments (0.0028 and 0.007 substitution/sites/million years, respectively). For nuclear 853 genes, substitution rate we used was estimated from the program. The Bayesian Markov 854 Chain Monte Carlo (MCMC) analysis was performed with 300 million generations and the 855 trees were sampled every 5000 generations. One maximum credibility tree was summarized in 856 the software TreeAnnotator v. 2.5.1 (Bouckaert et al., 2014). The verification of the 857 convergence and the parameters and ESS values (Efetive Sample Size) was made on the 858 program Tracer v1.6. The resulting tree was visualized and edited in FigTree 1.4.3 (available 859 on http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree).

860

861 2.6 Genetic divergence

862 Since most sequences of Proceratophrys available in the GenBank corresponds to 863 the final portion of the 16S rRNA gene, we constructed a matrix with the segments (with 864 approximately 500 bp) flanked by the primers 16Sar and 16Sbr (Matrix B). We also 865 constructed a matrix with only the COI fragment with 564 bp (Matrix C). The sequences with 866 missing data were not included. All the sequences were grouped according to the major clades 867 recovered in the phylogenetic analyses (i.e., P. bigibbosa, Proceratophrys sp., P. brauni A, P. 868 brauni B, P. palustris and P. avelinoi) and p-distances were estimated using the software 869 MEGA X (Kumar et al., 2018).

870 The haplotypes and alleles were detected and separated in phases using DnaSP 871 software v. 6. by default parameters (100 iterations with 100 burn-in and thinning interval of 872 10) and we defined 0.9 as minimum posterior probability to infer the haplotypes. Haplotype 873 networks were generated using the software Network v. 5 (Bandelt et al., 1999). One network 874 was generated with concatenated matrix with all the mitochondrialfragments as one molecule 875 (12S rRNA, tRNA-Val, 16S rRNA and COI genes) and three networks for the nuclear genes, 876 one for each fragment (CXCR4, POMC and RAG-1). All matrices were used without the 877 outgroup and alignment gaps were considered as fifth character state. The nucleotide diversity 878 (π), haplotype diversity (Hd), number of haplotypes (H) and the numbers of Fu’s Fs and

52

879 Tajima’s D for the neutrality test were calculated for the mithochondrial molecular markers 880 concatenated matrix with the DnaSP v 6.0 (Rozas et al. 2017) (Table S3 and S4).

881

882 2.7 Ancestral area

883 To infer the P. bigibbosa group ancestral distribution area, we used the package 884 BioGeoBEARS (Matzke, 2013) (http://www.R-project.org; detailed analysis in Appendix S3) 885 implemented in Rstudio (v. R 3.5.1). We reconstructed the ancestral area through the 886 Bayesian and maximum likelihood approaches and considering tree geographical areas 887 (N=North highland, S=South highland and W=West lowland). These areas were recognized 888 based on the geomorphology of the region where the species currently occur, taking into 889 account its topography (highland or lowland) once P. avelinoi is distributed on the lowland 890 and the Upper and lower Uruguay river (which may have influenced the diversification in the 891 P. bigibbosa group - see Discussion).

892 We used the dated species tree estimated on *BEAST and tested six distinct 893 models on BioGeoBEARS (Matzke, 2013): DIVALIKE (the likelihood version of the 894 dispersal–vicariance analysis) in which vicariance is favoured and dispersal and extinction 895 processes are minimized; DEC (the dispersal–extinction–cladogenesis model ), which allows 896 vicariance but estimates the dispersal and extinction parameters with discrete time intervals 897 and incorporated area connectivity); and the BAYAREALIKE model (Bayesian inference of 898 historical biogeography for discrete areas), which uses statistical implementation for testing 899 all possible ancestral ranges). The other three models were tested incorporatting the founder- 900 event speciation (+J) into each one of these previous models (DEC+J, DIVALIKE+J and 901 BAYAREALIKE+J). All the models were tested according to the software tutorial.

902

903 2.8 Demographic history

904 To infer the demographic history of the sympatric lineages of Proceratophrys sp. 905 and P. brauni, we used a concatenated matrix of all mitochondrial (COI and H1) and nuclear

53

906 (POMC, RAG 1 and CXCR4) genes to generate Extended Bayesian Skyline Plots (EBSP) in 907 BEAST2 program. We separated the lineages by the deeper branch and more supported nodes 908 of the species. The analyses used the evolutionary models GTR and SKY for the 909 mitochondrial and nuclear genes, respectively and the Yule process for the speciation model. 910 The substitution rates previously described for 12S and 16S rRNA (Lemmon et al., 2007) and 911 COI (Brusquetti et al., 2018) gene fragments (0.0028 and 0.007 substitution/sites/million 912 years, respectively) were considered and the nuclear gene rates were estimated by the 913 software. Each run was performed with 50 milion generations and one tree was sampled every 914 100 generations. We discarded 25% of the first trees as burnin and tested the “Effective 915 Sample Size” (ESS) values and the stability of probability values in the Tracer v. 1.6 program. 916 (Rambaut et al., 2014). The graphics were generated through R studio.

917

918 2.9 Environmental PCA

919 Environmental variables were obtained for the geographical area of occurrence of 920 each sampled species/clade of the P. bigibbosa group (for details on the analyzed sites, see 921 Table S1). Because the species of this group are not easily distinguished morphologically, to 922 avoid misinterpretations, we did not include the geographical data available in museum 923 collections as it is not possible to check to which clade or species they really belong to. For 924 each site, we downloaded environmental variables (19 bioclimatic variables) measured by 925 Remote sensing from https://vdeblauwe.wordpress.com/download/ (Deblauwe et al., 2016). 926 Dataset used derived from MOD11C3 v. 6.0 sensor & CHIRPS v. 2.0 precipitation dataset in 927 the resolution of 3 arc-minutes measured to the current time. With these data we estimated the 928 similarity or divergence between the realized climatic niches of the Proceratophrys species 929 using Environmental Principal Component Analysis (ePCA). We investigated if the current 930 variables differ between the species niches. We expected no divergence if the species occupy 931 the same niche and some differences between related species if they occupy different niches. 932 We used this approach because our sample is composed of few sites and the distribution area 933 of each species is very narrow to investigate by Species Distribution Model (SDM).

934

54

935 3. RESULTS

936 937 2.1 Phylogenetic hypothesis and divergence time

938 All phylogenetic analyses presented five main clades in the Proceratophrys 939 bigibbosa group with low support for the clade that include all species. The P. palustris and 940 P. avelinoi clades include representatives from their type-localities and the P. brauni clade 941 presents specimens from sites located near the type-locality of this species. In the case of P. 942 bigibbosa, the clade includes samples collected at the type-locality of P. cristinae (Braun, 943 1973) (Imperial Line, Nova Petrópolis - RS), a junior synonym of P. bigibbosa according to 944 Kwet and Faivovich (2001). In the clade identified as Proceratophrys sp. (a species to be 945 described by Diego Baldo and colleagues), no topotype of any known species of the P. 946 bigibbosa group was included (Figure 2). The individuals collected at Bom Jesus - RS were 947 allocated into two distinct clades, P. brauni and P. biggibosa, revealing the sympatry of the 948 two species in this area (Figure 1).

55

949 Figure 2. Phylogenetic relationships inferred from a concatenated matrix (with 4500 bp) of 950 mitochondrial (12S, tRNA-Val, 16S and COI) and nuclear genes (POMC, RAG and CXCR4) 951 by (a) Maximum Parsimony and (b) Bayesian analysis. Triangles indicate the branches of 952 topotypical specimens. Circles highlight P. bigibbosa and P. brauni individuals found in 953 sympatry. The cladogram shown in a is the strict consensus of 3 MPT with 2561 steps. The 954 numbers on nodes refer to Bootstrap values (a) or posterior probabilities (b). 955 956 It is worth noting that the specimens from Jaguariaíva, state of Paraná (Brazil) 957 clustered together with Proceratophrys palustris topotypes. All analyses recovered P. 958 palustris as sister of P. brauni and P. bigibbosa as sister of Proceratophrys sp. (Figure 2). In 959 contrast, the P. avelinoi relationships remain uncertain, since the analyses were not congruent. 960 In both non-coalescent analyses, P. avelinoi was recovered as sister of the clade that

56

961 comprises P. brauni and P. palustris (Figure 2), whereas the coalescent analysis inferred P. 962 avelinoi as sister of all other species of the P. bigibbosa group (Figure 4).

963 Proceratophrys bigibbosa, P. avelinoi, Proceratophrys sp., P. palustris and P. 964 brauni did not share any mitochondrial haplotypes and the sequences from each of the three 965 former species were clustered together in a single haplogroup (Figure 3a). In contrast, two 966 haplogroups were recovered for P. brauni, which we named P. brauni A and P. brauni B 967 (Figure 3a). In the nuclear alleles network, only P. avelinoi did not share alleles with other 968 species (Figure 3b-d). The mitochondrial haplotype diversity (Hd) was high in each species 969 (from 95,6 to 100% of variability). On the other hand, even with small number of analyzed 970 specimens, the nucleotide diversity (π) in P. bigibbosa (2.4%) was higher than all the other 971 species, whose π ranged from 0.4 to 0.9%. When we compare the genetic diversity between 972 all the species, the π was high and ranged from 1,6% to 3,4% and the Hd was 99% (Tables S3 973 and S4).

57

974 Figure 3. Mitochondrial haplotype network with each haplogroup identified (a) and nuclear 975 alleles network (b: RAG-1, c: POMC and d: CXCR4) generated by median-joining on 976 Network. The circle sizes are proportional to the haplotype/allele frequency. The nucleotide 977 substitutions are shown by dashes and gaps was not considerate.

978

979 The divergence of the P. avelinoi lineage and split between the sister clades (P. 980 bigibbosa + Proceratophrys sp.) and (P. palustris + P. brauni) were inferred to have occurred 981 in a short period of time. In the time-calibrated tree, P. avelinoi had diverged before the other 982 species of the P. bigibbosa group, approximately 7.67 million years ago (Mya) (11.71 – 6.24 983 Mya), while the ancestor of P. bigibbosa and Proceratophrys sp. diverged from the ancestor 984 of P. palustris and P. brauni around 6.12 Mya (8.5 – 4.6 Mya) (Figure 4). Proceratophrys 985 bigibbosa and Proceratophrys sp. diverged around 3.80 Mya (6.3 - 3.0 Mya), similarly to P. 986 palustris and P. brauni, which supposedly diverged around 3.51 Mya (4.7 - 2.4 Mya).

58

Cycloramphus acangatan

Odontophrynus Macrogenioglottus Proceratophrys

Oligocene Miocene Plio Quat 30 20 10 0 mya 987 Figure 4. Time-calibrated species tree generated on *BEAST2. The red circle corresponds to 988 the fossil calibration on the node represented by Odontophrynidae Most Recent Common 989 Ancestral (MRCA) (Nicoli et al., 2017). Divergence dates in million years (Mya) and 95% 990 High Posterior Probabilities average intervals are indicated. Numbers on the nodes correspond 991 to Bayesian posterior probabilities.

992

993 3.2 Genetic diversity

994 The genetic distance estimated between the five main clades inferred in our 995 phylogenetic analyses, which correspond to the five recognized species of the Proceratophrys 996 bigibbosa group, ranged from 1.6 to 4.4 % for the 16S gene fragment and from 3.7 to 13,9 % 997 for the COI gene fragment (Table 2). The smallest genetic distance was observed between 998 Proceratophrys palustris and P. brauni (from 1.6 to 1.7% for the 16S gene fragment and from

59

999 3.7 to 5.5% for the COI gene fragment). Proceratophrys sp. showed high genetic distances in 1000 relation to all the described species of the P. bigibbosa group, with the lowest values being 1001 found with respect to its sister species, P. bigibbosa (3.8% and 13% for the 16S and COI gene 1002 fragments, respectively) (Table 2).

1003 Table 2. Uncorrected p-distances (%) between and within species of the Proceratophrys 1004 bigibbosa group. Lower triangle: values estimated from the 550 bp-fragment of the 16S rRNA 1005 gene. Upper triangle values estimated from the 564 bp-fragment of COI. In the diagonal, the 1006 distances estimated within each group from 16S rRNA (left) and COI (right) gene fragments.

Species/Clades 1 2 3 4 5 6 1. P. bigibbosa 1.3 / 3.5 11.5 13.4 11.6 12.3 13.3 2. P. palustris 3.3 0.3 / 1.1 5.5 5.4 13.0 9.9 3. P. brauni A 3.5 1.7 0.0 / 0.2 3.7 13.9 9.1 4. P. brauni B 3.5 1.6 1.7 0.0 / 0.5 13.0 9.0 5. Proceratophrys sp. 3.3 4.4 4.1 4.1 0.5 / 2.7 13.6 6. P. avelinoi 3.5 3.9 3.3 3.2 3.6 0.2 / 1.5 1007

1008 3.3 Most recent common ancestor (MRCA) area and demographic history

1009 The DIVALIKE model was the most probable biogeographic model recognized 1010 by BioGeoBEARS from the six possible models we have tested (Table S2). The 1011 BioGeoBEARS analysis inferred that the MRCA of the P. bigibbosa group was distributed 1012 over the whole area currently occupied by the species of this group (Figure 5a). In addition, 1013 the inferred ancestors of P. avelinoi, (Proceratophrys sp. + P. bigibbosa) and (P. palustris + 1014 P. brauni) were supposed to occur in the northern upper Uruguay river (N), southern lower 1015 Uruguay river (S) and Western upper Uruguay river (W) zones, respectively (Figure 5b). 1016 According to the BioGeoBEARS analysis, we could infer that the MRCA area of P. bigibbosa 1017 group suffered a vicariant process where the first lineages were separated by some barrier as 1018 the Uruguay river and the altitude area of the South highlands, separating the three first 1019 lineages W, S and N.

1020

1021

60

a b c W N S

Before 13 – 8 Mya ~ 13 - 8 Mya Current

d N P. palustris

D N S P. brauni B V P. brauni N P. brauni A

D W S V Proceratophrys sp. W N S S P. bigibbosa

W P. avelinoi

1022 Figure 5. Ancestral (a-b) and current distribution area (c) of the P. bigibbosa species group. 1023 In b, the distribution range of the ancient lineages of the P. bigibbosa species group: Western 1024 upper Uruguay river (W), Northern upper Uruguay river (N) and Southern lower Uruguay 1025 river (S) lineages, inferred by BioGeoBEARS with the best fitting model DIVALIKE, using 1026 the species tree generated on *BEAST2. In d, the BioGeoBEARS analysis, presenting the 1027 probabilities for vicariance (V) and dispersion (D) events. Pie charts are the correspondent 1028 probability of MRCA distribution on the current distribution of each species. Colors 1029 correspond to each current species distribution.

1030

1031 The BioGeoBEARS analysis also inferred a dispersion event from N toward S 1032 area (of Proceratophrys brauni lineages) and another from S to W area (of Proceratophrys sp. 1033 lineages) (Figures 5d, arrows in Figure 8b). According to the demograph EBSP, P. brauni and 1034 Proceratohrys sp. lineages presented population size expansions in the past (Figures 6 and 7), 1035 which is in accordance to the abovementioned hypotheses of dispersion. The P. brauni A and 1036 P. brauni B lineages presented evidence of gradual recent population expansion around the

61

1037 last 100 kya. The small number of specimens of P. brauni included in this analysis prevents 1038 the inference of a more precise date for the expansion event, but it is clear that a recent 1039 population expansion in P. brauni B has happened (Figure 6). The negative but non- 1040 significative Fs and Tajima’s D values on the neutrality test for the Lineage B (-2.146 and - 1041 0.504, respectivelly) is in accordance with this hypothesis of expansion.

1042 Figure 6. Demographic history of each lineages (haplogroups) within P. brauni species 1043 analyzed by multilocus Extended Bayesian skyline plots (EBSP). The haplotype 1044 mitochondrial concatenated network and geographic distribution of these lineages are also 1045 shown. In the graphs, the efective population sizes are presented in logarithmic scale (Y axis) 1046 and the time, in milion years (X axis). CPD: central posterior density. Larger circles represent 1047 two individuals and smaller circles refers to one individual.

1048

1049 As the number of specimens of Proceratophrys sp. analyzed was high, the 1050 demographic analysis related to this species presented a low percentage of CPD and the dates 1051 of divergence were more similar between its lineages (Figure 7). The lineages 1 and 3 of 1052 Proceratophrys sp. showed gradual expansion, but an abrupt expansion was inferred to have

62

1053 happened around 4000 ya in lineage 2, after a retraction event (Figure 7). In the neutrality test, 1054 the lineages 2 and 3 presented negative Fs and Tajima’s D value and is in accordance to the 1055 hypothesis of expansion although the nonsignificative p value. The Lineage 1 neutrality 1056 values were not possible to infer because of the low number of samples.

1057

1058 Figure 7. Demographic history of each lineages (haplogroups) within the Proceratophrys sp. 1059 species analyzed by Extended Bayesian skyline plots (EBSP). The haplotype mitochondrial 1060 network and the geographic distribution of these lineages are also shown. In the graphs, the 1061 efective population size are presented in logarithmic scale (Y axis) and the time, in milion 1062 years (X axis). CPD: central posterior density.

63

1063 3.4. Environmental Principal Component Analysis (ePCA) 1064 1065 The ePCA pointed differences between the realized climate niches of each pair of 1066 phylogenetically related species, namely P. palustris/P. brauni and P. 1067 bigibbosa/Proceratophrys sp. There are more similarities between the distantly related species 1068 as the non-sister species P. bigibbosa and P. brauni, or P. avelinoi and Proceratophrys sp., 1069 for example, which occurs in sympatry (Figure 8).

1070 Figure 8. (a) Environmental Principal Component Analysis showing the environmental 1071 variables representing possible realized climate niches occupied by each species and (b) the 1072 current geographic distribution and phylogenetic relationships of the species of the P. 1073 bigibbosa group. The arrows in b indicates possible migration events from putative ancestral 1074 areas toward the regions of simpatry currently observed. 1075 1076 1077 1078 1079 1080

64

1081 4. DISCUSSION 1082

1083 4.1 Phylogenetic relationships and taxonomic comments

1084 The monophyly of each species included in the P. bigibbosa group was confirmed 1085 in our analyses, which included topotypes of P. palustris and P. avelinoi and specimens 1086 collected near the type-locality of P. brauni. In addition to the four named species currently 1087 assigned to the P. bigibbosa group, one clade did not include any topotypical sample and 1088 corresponds to a new species, which is being described by Baldo et al. (in prep.; see Capítulo 1089 1) and was inferred as the sister species of P. bigibbosa. In addition, the genetic distances 1090 between the species of the group observed here are in accordance to the divergences observed 1091 between the Proceratophrys species described up to now. The genetic distance estimated 1092 between all the species of Proceratophrys available up to date varied from 1% to 14.2% for 1093 the 16S gene fragment and 3.7 to 19.4% for the COI gene fragment (Amaro et al., 2009; 1094 Teixeira Jr. et al., 2012; Dias et al., 2013; Dias et al. 2017; Mangia et al. 2018; Mangia et al. 1095 2020).

1096 With our specimen sampling, we expanded the known geographic distribution of 1097 Proceratophrys palustris in around 550 km, once the specimens from Jaguariaíva – PR, 1098 Brazil were nested together with specimens from Poços de Caldas – MG, Brazil, which is the 1099 type-locality and the only site of occurrence registered to this species until now. It is possible 1100 that the species also occurs in other localities in the northern Paraná state, in Brazil.

1101 The close phylogenetic relationships between P. bigibbosa and Proceratophrys 1102 sp. and between P. brauni and P. palustris were inferred in all our analyses, with high 1103 statistical supports. In contrast, the relationship between P. avelinoi and the remaining species 1104 of the P. bigibbosa group remains uncertain because it was incongruent between the 1105 coalescent and non-coalescent analyses. In Maximum Parsimony and Bayesian analyses, P. 1106 avelinoi was inferred as sister of the clade that includes P. brauni and P. palustris, whereas in 1107 the *BEAST coalescent analysis, P. avelinoi was inferred as sister of the clade that includes 1108 all other species of P. bigibbosa group. A rapid evolution during the period in which P. 1109 avelinoi and the common ancestor of P. bigibbosa and Proceratophrys sp. and the common

65

1110 ancestor of. P. brauni and P. palustris diverged can explain such incongruence. The very high 1111 nucleotide diversity between all species observed in the mitochondrial genes is and in 1112 accordance with a hypothesis of a deep and very old split and. We present below a 1113 biogeographic hypothesis that takes this possibility into account.

1114

1115 4.2 Divergence time and biogeographic hypothesis

1116 The Odontophrynidae MRCA divergence was inferred here to have occurred 1117 around 28 Mya, which coincides to that estimated in previous studies (Feng et al., 2017, 1118 Frasão et al., 2015 and Pyron et al., 2014). All the time divergence analyses that have 1119 included Odontophrynidae up to date used nucleotide substitution rates to node calibration 1120 and did not include any fossil information. Here we used the Chachayphrynus linchey fossil 1121 (Nicoli at al., 2017) in addition to the substitution rates previously estimated for the 12S, 16S 1122 and COI genes to calibrate the ancestral nodes, which should provide a more precise dated 1123 tree.

1124 Our divergence time analysis reveals that the split of the species currently 1125 allocated in the P. bigibbosa group did not occur during the same period when AFO 1126 underwent expansion and retraction cycles, once the speciation in the P. bigibbosa group was 1127 earlier than AF expansion and retraction registers. These AFO processes dated from the 1128 quaternary period (~ 4,000 ya) (Behling & Pillar, 2007; Jeske-Pieruschka & Behling, 2011; 1129 Luteryoung et al.; 2018) and Bergamim et al.; 2019) and the last speciation event in the P. 1130 bigibbosa group was estimated to have occurred around 4.7 and 2.4 Mya. Therefore, we 1131 conclude that the first split within the P. bigibbosa group, which were estimated to have 1132 occurred from 7.67 and 3.51 Mya, may not be explained by the quaternary AF 1133 expansion/retraction cycles. The high support of the clade that includes all species of the P. 1134 bigibbosa group, the high genetic divergence between the species, the high nucleotide and 1135 haplotype diversity between the diferent haplogroups and group of alleles that represent each 1136 species reinforce the hypothesis of an old split of these species inferred on the calibrated 1137 three.

66

1138 An important geologic event that changed the landscape in South America was the 1139 marine transgression that supposedly occurred between 15 and 8 Mya, which covered a great 1140 part of South America territory (Lundberg et al., 1998; Lovejoy et al., 2006; Costa et al., 1141 2010; Cooke et al., 2012). Two big islands were separated in Guiana Shield and Brazilian 1142 Shield by the sea transgression in the mouth of Amazon river (Hoorn, 1993; Räsänen et al., 1143 1995) and in the mouth of Paraná river (Webb, 1995; Ludenberg et al., 1998; Lovejoy et al., 1144 2006). The two seaway entrances met each other covering a large area in South America and 1145 separating both shields. Although the Amazonian mouth is widely discussed as a sea entrance 1146 during the marine transgression on the literature, the south sea entrance (through the mouth of 1147 Paraná river) is not very commonly considered in biogeographic inferences. Only few studies 1148 have described the Paranean sea (formed by this marine entrance) as a vicariant barrier to 1149 speciation or lineages split (García et al., 2012; Brusquetti et al., 2018; Girini et al., 2017).

1150 Our results suggest that the MRCA of the P. bigibbosa group was distributed over 1151 the whole area where we currently find all the species of this group. The split of the three 1152 earliest lineages of the P. bigibbosa species group (W, N and S in Figure 5b) supposedly 1153 occurred between 11,71 and 6,24 Mya., which coincides with the time of the marine 1154 transgression that generated the Paranean sea, in the west Uruguay river basin. The Uruguai 1155 River flows through the area of distribution of the past three lineages (S, W and N). 1156 Therefore, it is possible that the Paranean sea formation may have increased the water level of 1157 Uruguay river causing a vicariant event that led to the split of the three past lineages of the P. 1158 bigibbosa group. As the species of this group reproduce in stream rivers (P. bigibbosa, 1159 Proceratophrys sp. and P. brauni) (Kwet and Faivovich, 2001) or swamps (P. palustris and 1160 P. avelinoi) (Giareta and Sazima, 1993; Caldart et al., 2010), it is possible that Uruguay river 1161 is large enough to have played a role as a reprecductive barrier in the past.

1162 In addition to the possibility of a river barrier, the altitude divergence of the areas 1163 where the species occur may have also influenced and reinforced the speciation of the P. 1164 bigibbosa group during the late Miocene. The current distribution of these species and the 1165 inferred ancestral area of their ancestors gave us some clues about this hypothesis. On the 1166 lowland, the W ancestral area is currently covered by the Mesophytic Semideciduous Forest 1167 and is the area where the species P. avelinoi. In contrast, the remaining species are distributed

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1168 over the highland, in the N and S area that are covered by Araucaria forest, with some areas 1169 of sympatry. Our results about current niche suggest that the realized climate niche of all 1170 highland species differs from that of the species on the lowland (P. avelinoi). However, the 1171 realized niche of P. avelinoi does not differentiate from that of Proceratophrys sp. This 1172 evidence and the occurrence of both species in the westernlowlands are in accordance with 1173 the hypothesis that Proceratophrys sp. had expanded through the west, where coincides with 1174 a set of the current distribution area of P. avelinoi recently as we can see on the demographic 1175 history results.

1176 The climate changes may have also played an important role in the most recent 1177 speciation events in the P. bigibbosa group. The ePCA suggests that the current realized 1178 climate niches differ between the sister species P. brauni and P. palustris and also between 1179 the sister species P. bigibbosa and Proceratophrys sp.. This finding supports the hypothesis 1180 that these species had adapted to specific microclimate conditions during their diversification.

1181 At last, it is worth noting that the dispersal events suggested by the best model 1182 inferred by BioGeoBEARS may represent recent expansions of the P. brauni and 1183 Proceratophrys sp. lineages toward the areas where these species occur in sympatry with P. 1184 bigibbosa and P. avelinoi respectively As the sympatric species are not sister species, the 1185 sympatry observed nowadays can be explained by a recent colonization of P. brauni 1186 populations toward the P. bigibbosa range (N through S) and Proceratophrys sp. toward the 1187 P. avelinoi range (S through W). The recent population expansions inferred for the lineages of 1188 P. brauni and Proceratophrys sp. may support this hypothesis.

1189 The data presented in the present study represents a little piece of the puzzle about 1190 the Araucaria Forest biodiversity history. This Southern Atlantic Forest sub region is poorly 1191 studied and reveals many endemic and highly threatened species, which deserve more studies 1192 and future actions for conservation. The data reported here for the Proceratophrys bigibbosa 1193 group may help in such studies.

1194 1195 1196

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1197 5. CONCLUSION 1198 1199 Despite the coincident distribution of most species of the P. bigibbosa group with 1200 the Araucaria angustifolia range, the past species diversification in this group did not occur 1201 during the same period of expansion and retraction of the Araucaria Forest. However, a 1202 marine transgression that had occurred between 15 to 8 Mya could have influenced the 1203 allopatric divergence in the P. bigibbosa group by vicariance. 1204

69

1205 Supplementary material 1206

1207 Table S1. Samples used in the ePCA analysis. The species/clade of each sample, its color in figures 2a and 2b, voucher identification in 1208 museum collection and geographical location are shown. The geographical coordinates were obtained from a GPS receiver or estimated for 1209 the city centroid (*). BR: Brazil. ARG: Argentine.

Species/Clade Color Reference Voucher Locality State/Country Longitude Latitude P. avelinoi gray UPF - Present study UPF14 1 Palma Sola SC/BR -53,27760 -26,34755 P. avelinoi gray UPF - Present study UPF14 2 Palma Sola SC/BR -53,27760 -26,34755 P. avelinoi gray PUC - Present study MCP 13062 Bom Progresso RS/BR -53,84545 -27,55879 P. avelinoi gray PUC - Present study MCP13066 Bom Progresso RS/BR -53,84545 -27,55879 P. avelinoi gray CFBH - Present study CFBH-T11182 Ortigueira PR/BR -50,92892 -24,20091 P. avelinoi gray CFBH - Present study CFBH-T11250 Ortigueira PR/BR -50,92892 -24,20091 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 01422 Puerto Esperanza ARG -54,33168 -26,00595 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 01423 Puerto Esperanza ARG -54,33168 -26,00595 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 08516 Ruta Provincial N 6 ARG -55,12463 -27,31388 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 08517 Ruta Provincial N 6 ARG -55,12463 -27,31388 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 08519 Ruta Provincial N 6 ARG -55,12463 -27,31388 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 08743 Ruta Provincial N 6 ARG -55,12463 -27,31388 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 08744 Ruta Provincial N 6 ARG -55,12463 -27,31388 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 10936 Andresito Peninsula Andresito ARG -54,12277 -25,53376 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 10938 Puerto Iguazú 600 hectareas ARG -54,54999 -25,60000 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 10940 Andresito Peninsula Andresito ARG -54,12277 -25,53376 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 11821 Reserva Privada Osununu ARG -55,58138 -27,28055 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 11822 Reserva Privada Osununu ARG -55,58138 -27,28055 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 10927 Garuapemi ARG -54,80000 -26,80000 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study DB 1983 Andresito Peninsula Andresito ARG -54,12277 -25,53376 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study DB 1984 Andresito Peninsula Andresito ARG -54,12277 -25,53376 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 10941 Puerto Iguazú 600 hectareas ARG -54,54999 -25,60000 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 10929 Puerto Iguazú 600 hectareas ARG -54,54999 -25,60000 70

P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study LGE 10937 Puerto Iguazú 600 hectareas ARG -54,54999 -25,60000 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study DB 4164 Puerto Iguazú 600 hectareas ARG -54,54999 -25,60000 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study DB 6652 Garuapemi ARG -54,80000 -26,80000 P. avelinoi gray Diego Baldo - Present study DB 8926 Reserva de Biosfera de Yaboti ARG -53,96440 -26,99300 P. avelinoi gray Faivovich et al., 2014 MACN47401 San Vicente Missiones ARG -54,52640 -26,99015 P. bigibbosa red SMRP - Present study SMRP 525.1 Gramado RS/BR -50,87643 -29,37456 P. bigibbosa red SMRP - Present study SMRP 525.2 Gramado RS/BR -50,87643 -29,37456 P. bigibbosa red SMRP - Present study SMRP 525.3 Nova Petrópolis RS/BR -51,11150 -29,37823 P. bigibbosa red PUC - Present study MCP 9717 Bom Jesus RS/BR -50,43511 -28,67228 P. bigibbosa red PUC - Present study MCP 9718 Sao Francisco de Paula RS/BR -50,57976 -29,44227 P. brauni brown UFRGST - Present study UFRGST0204 Bom Jesus RS/BR -50,43511 -28,67228 P. brauni brown UFRGST - Present study UFRGST0337 Bom Jesus RS/BR -50,43511 -28,67228 P. brauni brown UFRGST - Present study UFRGST0688 Campo Belo do Sul SC/BR -50,75733 -27,89854 P. brauni brown UFRGST - Present study UFRGST2696 Barracão RS/BR -51,45905 -27,67435 P. brauni brown UFRGST - Present study UFRGST2697 Barracão RS/BR -51,45905 -27,67435 P. brauni brown UFRGST - Present study UFRGST2699 Barracão RS/BR -51,45905 -27,67435 P. brauni brown CFBH - Present study CFBH-T5575 Fazenda Rio Grande PR/BR -49,30778 -25,66284 P. brauni brown CFBH - Present study CFBH-T5576 Fazenda Rio Grande PR/BR -49,30778 -25,66284 P. brauni brown CFBH - Present study CFBH-T11248 Rio Negro PR/BR -49,67072 -26,11305 P. brauni brown CFBH - Present study CFBH-T11463 Campos Novos SC/BR -51,22585 -27,40098 P. brauni brown CFBH - Present study CFBH-T11464 Campos Novos SC/BR -51,22585 -27,40098 P. palustris green UFMGt - Present study UFMGt2624 Jaguaríaiva PR/BR -49,72260 -24,23790 P. palustris green UFMGt - Present study UFMGt2625 Jaguaríaiva PR/BR -49,72260 -24,23790 P. palustris green UFMGt - Present study UFMGt2626 Jaguaríaiva PR/BR -49,72260 -24,23790 P. palustris green UFMGt - Present study UFMGt2627 Jaguaríaiva PR/BR -49,72260 -24,23790 P. palustris green SMRP - Present study SMRP 507.1 Poços de Caldas MG/BR -46,56193 -21,78537 P. palustris green SMRP - Present study SMRP 507.2 Poços de Caldas - MG MG/BR -46,56193 -21,78537 P. palustris green SMRP - Present study SMRP 507.3 Poços de Caldas - MG MG/BR -46,56193 -21,78537 P. palustris green SMRP - Present study SMRP 507.4 Poços de Caldas - MG MG/BR -46,56193 -21,78537 Proceratophrysm sp. blue UPF - Present study UPF 2298 (30.12) Sertão – RS RS/BR -52,25748 -27,98590 Proceratophrysm sp. blue UPF - Present study UPF 2295 (30.13) Sertão – RS RS/BR -52,25748 -27,98590

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Proceratophrysm sp. blue UPF - Present study UPF 2296 (30.14) Sertão – RS RS/BR -52,25748 -27,98590 Proceratophrysm sp. blue UPF - Present study UPF 2326 (30.15) Sertão – RS RS/BR -52,25748 -27,98590 Proceratophrysm sp. blue UPF - Present study UPF 2328 (30.17) Sertão – RS RS/BR -52,25748 -27,98590 Proceratophrysm sp. blue UPF - Present study UPF13.5 Chapecó – SC SC/BR -52,61569 -27,10093 Proceratophrysm sp. blue UFRGST - Present study UFRGST0670 Trindade do Sul – RS RS/BR -52,88333 -27,52028 Proceratophrysm sp. blue UFRGST - Present study UFRGST3234 Cotiporã – RS RS/BR -51,70451 -29,00350 Proceratophrysm sp. blue UFRGST - Present study UFRGST3246 Fagundes Varela – RS RS/BR -51,70193 -28,87988 Proceratophrysm sp. blue UFRGST - Present study UFRGST3248 Erechim – RS RS/BR -52,27373 -27,63490 Proceratophrysm sp. blue UFRGST - Present study UFRGST3258 Cotiporã – RS RS/BR -51,70451 -29,00350 Proceratophrysm sp. blue PUC - Present study MCP 13064 Braga – RS RS/BR -53,74103 -27,61783 Proceratophrysm sp. blue CFBH - Present study CFBH-T1272 Ipuaçu – SC SC/BR -52,45713 -26,63251 Proceratophrysm sp. blue CFBH - Present study CFBH-T1276 Ipuaçu – SC SC/BR -52,45713 -26,63251 Proceratophrysm sp. blue CFBH - Present study CFBH-T1296 Ipuaçu – SC SC/BR -52,45713 -26,63251 Proceratophrysm sp. blue CFBH - Present study CFBH-T1297 Ipuaçu– SC SC/BR -52,45713 -26,63251 Proceratophrysm sp. blue CFBH - Present study CFBH-T1298 Ipuaçu – SC SC/BR -52,45713 -26,63251 Proceratophrysm sp. blue CFBH - Present study CFBH-T1300 Ipuaçu – SC SC/BR -52,45713 -26,63251 Proceratophrysm sp. blue CFBH - Present study CFBH-T2100 Ipuaçu - SC SC/BR -52,45713 -26,63251 Proceratophrysm sp. blue CFBH - Present study CFBH-T9192 Arvoredo – SC SC/BR -52,45476 -27,07530 Proceratophrysm sp. blue CFBH - Present study CFBH-T9659 Mato Castelhano – Rs RS/BR -52,19370 -28,28051 Proceratophrysm sp. blue CFBH - Present study CFBH-T9664 Mato Castelhano – RS RS/BR -52,19370 -28,28051 Proceratophrysm sp. blue CFBH - Present study CFBH-T10333 Xanxerê – SC SC/BR -52,40408 -26,87518 Proceratophrysm sp. blue Diego Baldo - Present study LGE 00550 Parque Provincial Moconá ARG -53,92609 -27,14116 Proceratophrysm sp. blue Diego Baldo - Present study LGE 00551 Parque Provincial Moconá ARG -53,92609 -27,14116 Proceratophrysm sp. blue Diego Baldo - Present study LGE 00552 Parque Provincial Moconá ARG -53,92609 -27,14116 Proceratophrysm sp. blue Diego Baldo - Present study LGE 00553 Parque Provincial Moconá ARG -53,92609 -27,14116 Proceratophrysm sp. blue Diego Baldo - Present study LGE 00554 Parque Provincial Moconá ARG -53,92609 -27,14116 Proceratophrysm sp. blue Diego Baldo - Present study LGE 00569 Parque Provincial Moconá ARG -53,92609 -27,14116 Proceratophrysm sp. blue Diego Baldo - Present study LGE 02952 Proximidades Arroyo Coral ARG -54,06480 -26,19225 Proceratophrysm sp. blue Diego Baldo - Present study DB 2313 Forestal Montreal ARG -54,03333 -26,86666

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1210 Table S2. Statistics and comparison between the models of the ancestral range 1211 estimation by BioGeoBEARS. The dispersal (d), extinction (e) and founder event/jump 1212 dispersion (j) probabilities and log-likelihood (LnL) and Akaike’s information criteria values 1213 (AIC) for each model are presented. Models: BAYAREALIKE, Bayesian inference of 1214 historical biogeography; DEC, Dispersal–extinction–cladogenesis; DIVALIKE, Dispersal– 1215 vicariance analysis. The best fit model selected by BioGeoBEARS is higligthed in bold.

Model LnL d e j AIC DEC -9.54 0.024 0.000 0.000 23.08 DEC+J -9.16 0.026 0.000 0.140 24.31 DIVALIKE -9.02 0.032 0.000 0.043 22.04 DIVALIKE+J -9.02 0.032 0.000 0.044 24.04 BAYAREALIKE -11.08 0.044 1.033 0.000 26.16 BAYAREALIKE+J -11.08 0.044 1.033 0.000 28.16 1216

1217 Table S3. Genetic diversity and neutrality test for the species of the Proceratophrys 1218 bigibbosa group. N= number of sequences; H= number of haplotypes; Hd = Haplotype 1219 diversity and Pi= nucleotide diversity. In bold are the non-significant negative values of Fs = 1220 Fu’s Fs statistic and D = Tajima’s D neutrality (P < 0.05).

Species N H Hd Pi Fs D P. avelinoi 19 17 0.988 0.004 -7.294 -0.672 P. bigibbosa 4 4 1.000 0.021 2.179 0.270 Proceratophrys sp. 19 17 0.988 0.009 -2.718 0.807 P. palustris 5 5 1.000 0.005 -0.167 -0.372 P. brauni 15 11 0.962 0.008 0.665 0.589 1221

1222 Table S4. Genetic diversity and neutrality test for lineages of Proceratophrys sp. and P. 1223 brauni. N= number of sequences; H= number of haplotypes; Hd = Haplotype diversity and 1224 Pi= nucleotide diversity. In bold are the non-significant negative values of Fs = Fu’s Fs 1225 statistic and D = Tajima’s D neutrality (P < 0.05). X= less than four sequences analized and.

Lineages N H Hd Pi Fs D Proceratophrys sp. - 1 3 2 0.667 0.000 X X Proceratophrys sp. - 2 6 5 0.933 0.001 -2.711 -0.676 Proceratophrys sp. - 3 10 10 1.000 0.002 -6.698 -1.603 P. brauni A 4 2 0.833 0.003 1.919 1.918 P. brauni B 11 8 0.945 0.002 -2.146 -0.504

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1226 Table S5. Mitochondrial haplotype identification list. N= number of specimens with the 1227 haplotype.

Species Haplotyepe ID N specimens P. brauni Hap_1: 2 [Pbrauni_2696, Pbrauni_2699] Hap_2: 1 [Pbrauni_2697] Hap_3: 1 [Pbrauni_0688] Hap_4: 1 [Pbrauni_11464] Hap_5: 1 [Pbrauni_11463] Hap_6: 1 [Pbrauni_5575] Hap_7: 2 [Pbrauni_0337, Pbrauni_0204] Hap_8: 1 [Pbrauni_11248] Hap_9: 2 [Pbrauni_22668, Pbrauni_22669] Hap_10: 2 [Pbrauni_22670, Pbrauni_22672] Hap_11: 1 [Pbrauni_22671] Proceratophrys sp. Hap_1: 2 [Psp_550, Psp_551] Hap_2: 1 [Psp_553] Hap_3: 1 [Psp_554] Hap_4: 1 [Psp_30_12] Hap_5: 1 [Psp_30_13] Hap_6: 1 [Psp_30_14] Hap_7: 1 [Psp_30_15] Hap_8: 1 [Psp_30_17] Hap_9: 1 [Psp_13_5] Hap_10: 1 [Psp_10333] Hap_11: 2 [Psp_2100, Psp_1272] Hap_12: 1 [Psp_1297] Hap_13: 1 [Psp_9192] Hap_14: 1 [Psp_DB2313] Hap_15: 1 [Psp_3258] Hap_16: 1 [Psp_2952] Hap_17: 1 [Psp_0670] All species Hap_1: 1 [Pbigi_525_2] Hap_2: 1 [Pbigi_525_3] Hap_3: 1 [Pbigi_9718] Hap_4: 1 [Pbigi_9717] Hap_5: 3 [Ppal_507_1,Ppal_507_4, Ppal_507_2] Hap_6: 1 [Ppal_507_3] Hap_7: 1 [Ppal_2624] Hap_8: 1 [Ppal_2626] Hap_9: 2 [Pbrauni_2696, Pbrauni_2699] Hap_10: 1 [Pbrauni_2697] Hap_11: 1 [Pbrauni_0688] Hap_12: 1 [Pbrauni_11464] Hap_13: 1 [Pbrauni_11463] Hap_14: 1 [Pbrauni_5575] Hap_15: 2 [Pbrauni_0337, Pbrauni_0204] Hap_16: 1 [Pbrauni_11248] Hap_17: 2 [Pbrauni_22668, Pbrauni_22669] Hap_18: 2 [Pbrauni_22670, Pbrauni_22672] Hap_19: 1 [Pbrauni_22671] Hap_20: 2 [Psp_550, Psp_551] Hap_21: 1 [Psp_553] Hap_22: 1 [Psp_554] Hap_23: 1 [Psp_30_12] Hap_24: 3 [Psp_30_13, Psp_30_17, Psp_13_5] Hap_25: 1 [Psp_30_14] Hap_26: 1 [Psp_30_15] Hap_27: 1 [Psp_10333] Hap_28: 2 [Psp_2100, Psp_1272] Hap_29: 1 [Psp_1297] Hap_30: 1 [Psp_9192] Hap_31: 1 [Psp_DB2313] Hap_32: 1 [Psp_3258] Hap_33: 1 [Psp_2952]

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Hap_34: 1 [Psp_0670] Hap_35: 1 [Pave_11250] Hap_36: 3 [Pave_11821, Pave_11822, Pave_14_02] Hap_37: 1 [Pave_11182] Hap_38: 1 [Pave_10927] Hap_39: 2 [Pave_10936, Pave_10940] Hap_40: 1 [Pave_10937] Hap_41: 1 [Pave_10938] Hap_42: 1 [Pave_13066] Hap_43: 2 [Pave_8516, Pave_8743] Hap_44: 1 [Pave_8519] Hap_45: 1 [Pave_8926] Hap_46: 1 [Pave_1422] Hap_47: 1 [Pave_14_01] Hap_48: 1 [Pave_6652] Hap_49: 1 [Pave_MACN47401] 1228

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1245 CONCLUSÕES GERAIS 1246 1247 1248 1. Não há evidência de que os eventos de expansão e retração registrados para a 1249 Floresta de Araucária tenham sido responsáveis pela especiação do grupo Proceratophrys 1250 bigibbosa. No entanto, o evento da transgressão marítima do Mioceno tardio parece ter 1251 influenciado na separação das linhagens nesse período. 1252 1253 2. A dispersão recente de algumas linhagens foi inferida a partir dos resultados de 1254 demografia histórica e inferência da área de distribuição ancestral. As áreas de simpatria das 1255 espécies não relacionadas P. bigibbosa e P. brauni, e de Proceratophrys sp. e P. avelinoi, 1256 reforçam a existência de uma expansão populacional mediante a dispersão de P. brauni e 1257 Proceratophrys sp. em direção a essas áreas de simpatria. Estes resultados coincidem com os 1258 períodos de expansão e retração da Floresta de Araucárias durante as ocilações climáticas do 1259 Quaternário. 1260 1261 3. Este trabalho revelou um clado irmão de Proceratophrys bigibbosa, referido 1262 como Proceratophrys sp., que mostrou alta distância genética em relação a P. bigibbosa (4% 1263 de distância genétia estimada com base no fragmento H1). A diversificação desse clado 1264 ocorreu durante o Mioceno tardio, tal qual a das outras espécies do grupo. Esses resultados 1265 irão contribuir para a descrição de uma nova espécie de Proceratophrys, a qual está sendo 1266 realizada pelo Prof. Dr. Diego Baldo. 1267 1268 4. Foi registrada nesse trabalho uma nova localidade (Jaguariaíva - PR) para P. 1269 palustris, espécie cuja distribuição geográfica estava até então limitada à sua localidade tipo 1270 (Poços de Caldas – MG). Esta observação tem implicação para a conservação da espécie uma 1271 vez que ela foi incluída na lista vermelha de espécies ameaçadas. 1272 1273 1274 1275 1276 1277 1278 1279 1280

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1678 I. ANEXOS

1679 CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA

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1680 DECLARAÇÃO DE DIREITOS AUTORAIS

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1683 PRODUÇÃO CIENTÍFICA DESDE O INGRESSO

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