Massenspektrometrische Identifizierung Von Membranproteinen Aus Humanen Spermatozoen

Dissertation

Zur Erlangung des Grades des Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Chemie und Biochemie an der Ruhr-Universität Bochum

Massenspektrometrische Identifizierung von Membranproteinen aus humanen Spermatozoen

Vorgelegt von

Biochemikerin (MSc.)

Kathrin Bartho

Bochum 2010 Erklärung

Die vorliegende Dissertation wurde an der Fakultät für Chemie und Biochemie am Lehrstuhl für Analytische Chemie in der Arbeitsgruppe Biomolekulare Massenspektrometrie der Ruhr-Universität Bochum in der Zeit vom 01. Dezember 2006 bis 31. Dezember 2009 unter Anleitung von Herrn Dr. Dirk Wolters ausgeführt.

Ehrenwörtliche Versicherung

Ich erkläre an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe verfasst, andere als die angegebenen Quellen nicht verwendet und die den benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe.

Bochum, den 15.06.2010

Kathrin Bartho

Dissertation eingereicht am 15.06.2010

1. Gutachter: Herr Dr. Dirk Wolters 2. Gutachter: Frau Prof. Dr. Katrin Marcus

...geboren um zu leben, für den einen Augenblick, bei dem jeder von uns spürte, wie wertvoll Leben ist...

(Unheilig – Geboren um zu Leben)

Für meine Eltern

Inhaltsverzeichnis

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ...... 8

TABELLENVERZEICHNIS ...... 9

1. EINLEITUNG ...... 10

1.1 HUMANE OLFAKTORISCHE REZEPTOREN ...... 10

1.2 MORPHOLOGIE UND FUNKTION HUMANER SPERMATOZOEN ...... 11

1.3 CHARAKTERISIERUNG BIOLOGISCHER MEMBRANEN ...... 13 1.3.1 Morphologie und Funktion biologischer Membranen ...... 13 1.3.2 Klassifizierung von Membranproteinen ...... 13 1.3.2.1 Integrale Membranproteine ...... 13 1.3.2.2 Membran-assoziierende und periphere Proteine ...... 14

1.4 STRATEGIEN ZUR ANREICHERUNG VON MEMBRANPROTEINEN ...... 15 1.4.1 Affinitätchromatographie ...... 15 1.4.1.1 Lektinaffinität ...... 15 1.4.1.2 PBA-vermittelte Affinität ...... 17 1.4.2 Affinitätsverteilung im wässerigen System ...... 17

1.5 MULTIDIMENSIONALE PROTEINIDENTIFIKATIONSTECHNOLOGIE (MUDPIT) ...... 19

1.6 MASSENSPEKTROMETRISCHE ANALYSE ...... 20 1.6.1 Fragmentionen-Analyse mit linearen Ionenfallen ...... 20 1.6.2 Selected Reaction Monitoring (SRM) ...... 21

2. ZIELSTELLUNG ...... 22

3. MATERIAL UND METHODEN ...... 23

3.1 MATERIAL ...... 23 3.1.1 Chemikalien ...... 23 3.1.2 Biologisches Material, Enzyme, Kit-Systeme, Gebrauchsmaterial ...... 24 3.1.3 Chromatographie Material ...... 25 3.1.4 Geräte ...... 25

3.2 METHODEN ...... 26 3.2.1 Aufarbeitung und Separation humaner Spermatozoen ...... 27 3.2.1.1 Spermatozoenseparation von seminalem Plasma ...... 27 3.2.1.2 Lipoproteinlipase-/Phospholipase C-Verdau ...... 27 3.2.1.3 Aufbrechen der Plasmamembran ...... 28 3.2.2 BCA-Assay zur Bestimmung der Proteinkonzentration ...... 29 3.2.3 Anreicherung von Plasmamembranproteinen aus humanen Spermien ...... 29 3.2.3.1 Affinitätsverteilung im wässerigen System ohne Lektinaffinität ...... 30 3.2.3.2 Affinitätsverteilung im wässerigen System mit Lektinaffinität ...... 31 3.2.3.3 Multilektin-Affinitätschromatographie (MLAC) ...... 33 3.2.3.4 PBA-vermittelte Affinitätschromatographie ...... 35 3.2.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ...... 37 3.2.5 Visualisierung der Proteine im SDS-Gel mit Silberionen ...... 38 3.2.6 Protein-Präzipitation nach der Affinitätschromatographie ...... 39 3.2.6.1 Ethanol -Präzipitation ...... 39 3.2.6.2 TCA-Präzipitation ...... 39 3.2.7 Abreicherung von löslichen und Membran-assoziierenden Proteinen ...... 40 3.2.8 Proteolytischer Flüssigverdau und Peptidextraktion...... 40 3.2.9 Flüssigchromatographie ...... 42 3.2.9.1 Herstellung von HPLC-Säulen ...... 42 3.2.9.2 HPLC-Gradienten ...... 43 3.2.10 Massenspektrometrische Analyse ...... 48 3.2.10.1 CID-Experimente ...... 48 3.2.10.2 SRM-Experimente ...... 48 3.2.11 Datenauswertung ...... 49

4. ERGEBNISSE ...... 51

4.1 ANREICHERUNG INTEGRALER PLASMAMEMBRANPROTEINE AUS HUMANEN SPERMATOZOEN ...... 51 4.1.1 Anreicherung integraler Plasmamembranproteine im wässerigen biphasischen System ...... 54 4.1.2 Anreicherung von integralen Plasmamembranproteinen mittels Affinitätschromatographie . 56 4.1.2.1 Kontrolle von Bindekapazität und Elutionsbedingungen mit SDS-PAGE ...... 56 4.1.2.2 Anreicherung von integralen Plasmamembranproteinen mit Lektinen und m-Amino- Phenylboronsäure ...... 59

4.2 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG ANGEREICHERTER PLASMAMEMBRANPROTEINE...... 62

4.3 MASSENSPEKTROMETRISCHE IDENTIFIZIERUNG OLFAKTORISCHER REZEPTOREN IN DER PLASMAMEMBRAN

HUMANER SPERMATOZOEN ...... 64 4.3.1 Analyse niedrig abundanter Membranproteine mit linearen Ionenfallen ...... 64 4.3.2 Semi-quantitative Analyse von Membranproteinen mit Triple-Quadrupolen...... 65 4.3.3 Identifizierung intra- und inter-individueller Unterschiede im Expressionsmuster olfaktorischer Rezeptoren ...... 68

5. DISKUSSION ...... 71

5.1 EINFLUSS UND BEDEUTUNG VON HYDROPHOBIZITÄT UND PTMN INTEGRALER PLASMAMEMBRANPROTEINE AUF

DIE ANREICHERUNGSEFFIZIENZ ...... 71 5.1.1 Einfluss der Hydrophobizität von Membranproteinen auf die Anreicherungseffizienz ...... 71 5.1.2 Bedeutung von Glykosylierungen auf die Anreicherungseffizienz ...... 73 5.2 Kriterien für eine erfolgreiche massenspektrometrische Identifizierung niedrig abundanter Plasmamembranproteine humaner Spermatozoen ...... 77 5.2.1 Methodische Optimierungen für die massenspektrometrische Analyse ...... 77 5.2.2 Detektion von inter-individuellen Unterschieden bezüglich der Expression von olfaktorischen Rezeptoren ...... 80

5.3 BESTEHT EINE KORRELATION ZWISCHEN OR-EXPRESSIONSMUSTERN, CHEMO-SENSORISCHER WAHRNEHMUNG

UND SPERMIENMOTILITÄT?...... 82 5.3.1 Biologische Bedeutung integraler Plasmamembranproteinen für die Fertilisation ...... 82 5.3.2 Beeinflusst ein natürlicher Selektionsdruck durch Manipulation chemo-sensorischer Wahrnehmung und Spermienmotilität die Reproduktionsmaschinerie? ...... 85

6. ZUSAMMENFASSUNG ...... 88

LITERATUR ...... 89

DANKSAGUNG ...... 96

CURRICULUM VITAE ...... 97

ANHANG ...... 98

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

ABBILDUNG 1: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER BIOCHEMISCHEN PROZESSE IM OLFAKTORISCHEN EPITHEL ...... 11

ABBILDUNG 2: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG EINES HUMANEN SPERMATOZOON...... 12

ABBILDUNG 3: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG VON MEMBRANPROTEINEN ...... 14

ABBILDUNG 4: BETA-FALTBLATTSTRUKTUREN VON CONCANAVALIN A UND DEM ERDNUSSAGGLUTININ ...... 16

ABBILDUNG 5: BILDUNG EINES PHENYLBORONSÄURE-DIOL-KOMPLEXES ...... 17

ABBILDUNG 6: AFFINITÄTSVERTEILUNG IM WÄSSERIGEN BIPHASISCHEN PEG/DX-SYSTEM ...... 18

ABBILDUNG 7: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG EINER MUDPIT-ANALYSE ...... 19

ABBILDUNG 8: ZWEIDIMENSIONALE SCHEMATISCHE DARSTELLUNG EINER LINEAREN IONENFALLE ...... 20

ABBILDUNG 9: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DES SRM FUNKTIONSPRINZIPES EINES TRIPLE-QUADRUPOL GERÄTES ...... 21

ABBILDUNG 10: SCHEMATISCHER METHODENÜBERBLICK...... 26

ABBILDUNG 11: ANREICHERUNG VON MEMBRANPROTEINEN AUS HUMANEN SPERMATOZOEN MITTELS AFFINITÄTSVERTEILUNG IM

WÄSSERIGEN SYSTEM UND AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE ...... 52

ABBILDUNG 12: ANREICHERUNG INTEGRALER PLASMAMEMBRANPROTEINE DURCH AFFINITÄTSVERTEILUNG IM WÄSSERIGEN SYSTEM

MIT UND OHNE LEKTINAFFINITÄT ...... 55

ABBILDUNG 13: KONTROLLE VON BINDEKAPAZITÄT UND ELUTIONSEFFIZIENZ VON ANGEREICHERTEN PROTEINEN MIT MULTILEKTIN-

AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE ...... 57

ABBILDUNG 14: KONTROLLE VON BINDEKAPAZITÄT UND ELUTIONSEFFIZIENZ VON ANGEREICHERTEN PROTEINEN MIT PBA-

VERMITTELTER AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE ...... 58

ABBILDUNG 15: VERGLEICH DER ANREICHERUNGSEFFIZIENZ VON INTEGRALEN PLASMAMEMBRANPROTEINEN ZWISCHEN MULTILEKTIN-

UND PBA-VERMITTELTER AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE ...... 61

ABBILDUNG 16: FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON INTEGRALEN PLASMAMEMBRANPROTEINEN ...... 63

ABBILDUNG 17: MASSENSPEKTROMETRISCHE IDENTIFIZIERUNG VON OLFAKTORISCHEN REZEPTOREN MIT LINEAREN IONENFALLEN. . 65

ABBILDUNG 18: ELUTIONSPROFIL DER INDIVIDUELLEN ÜBERGÄNGE DES DOPPELT-GELADENEN ALPHA-CASEIN-PEPTIDES YLGYLEQLLR

IN ABHÄNGIGKEIT VON DER RELATIVEN INTENSITÄT ...... 67

ABBILDUNG 19: VERGLEICH MS/MS-SPEKTRUM UND SRM-CHROMATOGRAMM DES DOPPELT GELADENEN PEPTIDES

EVDNHTVTTR DES OLFAKTORISCHEN REZEPTORS OR6Y1 ISOLIERT AUS HUMANEN SPERMATOZOEN ...... 68

Tabellenverzeichnis

TABELLE 1: ELUTIONS- UND REGENERATIONSSCHEMA FÜR DIE PBA-VERMITTELTE AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE...... 36

TABELLE 2: VERTEILUNG DER IDENTIFIZIERTEN INTEGRALEN PLASMAMEMBRANPROTEINE AUF DIE VERWENDETEN

ANREICHERUNGSSTRATEGIEN IN ABHÄNGIGKEIT VON DER ANZAHL AN TRANSMEMBRANDOMÄNEN ...... 53

TABELLE 3: IDENTIFIZIERUNG DER DOPPELT-GELADENEN ALPHA-CASEINPEPTIDE YLGYLEQLLR (M/Z = 634), FFVAPFPEVFGK

(M/Z = 692) UND HQGLPQEVLNENLLR (M/Z = 880) MIT SRM UND SRM-AUSGELÖSTEN MS/MS EXPERIMENTEN ..... 66

TABELLE 4: UNTERSUCHUNG INTER-INDIVIDUELLER UNTERSCHIEDE IM EXPRESSIONSMUSTER OLFAKTORISCHER REZEPTOREN

MITTELS LC-SRM-MS ...... 69

TABELLE 5: ANREICHERUNG UND MASSENSPEKTROMETRISCHE IDENTIFIZIERUNG INTEGRALER PLASMAMEMBRANPROTEINE AUS

HUMANEN SPERMATOZOEN...... 98

TABELLE 6: GESAMTLISTE DER SRM-ÜBERGÄNGE FÜR DIE VERWENDETEN REZEPTORPEPTIDE...... 102

E i n l e i t u n g S e i t e | 10

1. Einleitung

Das Fertilisationspotenzial humaner Spermatozoen ist sehr stark von ihrer Motilität während der sexuellen Fortpflanzung abhängig. Die Motilität ist von enormer Bedeutung, damit das Spermatozoon nach der Insemination im weiblichen Genitaltrakt zum Ort der Fertilisation gelangen kann, um dort den Akt der Fertilisation zu vollziehen1. Auf dem Weg zur Oozyte werden Spermatozoen durch chemotaktische Reize, pH-Wert- und Temperaturveränderungen geleitet2. Die Wahrnehmung von chemischen Signalen erfolgt unter anderem über olfaktorische Rezeptoren, die in der Plasmamembran von humanen Spermatozoen lokalisiert sind3.

1.1 Humane olfaktorische Rezeptoren

Die Wahrnehmung und Verarbeitung von chemischen und sensorischen Reizen ist essentiell für Überleben, Fitness und Reproduktion von Organismen. Das olfaktorische System von Vertebraten und Säugetieren ist in der Lage eine Vielzahl verschiedener Duftstoffe zu erkennen und zu verarbeiten. Das Verständnis dieses komplexen Prozesses wurde erst mit der Entdeckung der multiplen olfaktorischen Rezeptor Genfamilie im Jahre 1991 möglich4. Olfaktorische Rezeptoren bestehen aus sieben Transmembrandomänen und gehören zur Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRn). Die Geruchsverarbeitung erfolgt über kleine G-Proteine, die einen zweiten Botenstoff aktivieren (siehe Abbildung 1). Mit der extrazellulären Bindung eines Odors an einen aktiven olfaktorischen Rezeptor wird eine Konformationsänderung des ORs ausgelöst, die mit einer hohen Affinität zum nachgeschalteten Golf.-Protein einher geht. Dadurch wird das trimere G-Protein aktiviert und dissoziiert in seine Untereinheiten. Die alpha-Untereinheit bindet an eine membranständige Adenylatzyklase des Types III (AC III). Die stimulierte AC III katalysiert anschließend die Bildung von cAMP aus ATP. Zyklisches AMP als sekundärer Botenstoff bindet intrazellulär an einen Liganden-gesteuerten Ionenkanal. Diese Induktion bedingt eine Kanalöffnung, die mit einem intrazellulären Kalziumanstieg einhergeht5. Die geschätzten 350 funktionellen ORn von Säugetieren werden nicht nur im olfaktorischen sensorischen Neuron exprimiert6, sondern sind auch außerhalb des

E i n l e i t u n g S e i t e | 11 olfaktorischen Epithels lokalisiert. Dies konnte mit der Expression verschiedener olfaktorischer Rezeptoren in spermatogenetischen Zellen des Menschen bewiesen werden7. Beispielsweise erfolgt die Expression der humanen olfaktorischen Rezeptoren hOR17-2 und hOR17-4 ausschließlich in den Hoden3, 7. Für den hOR17- 4 konnte zusätzlich gezeigt werden, dass er in der Plasmamembran humaner Spermatozoen lokalisiert ist und in vitro die Bindung von Bourgeonal an diesen Rezeptor einen intrazellulären Kalziumanstieg, chemotaktische Motilität und eine Geschwindigkeitszunahme in Abhängigkeit von der Odorkonzentration bewirkt3.

Ca2+ Na+ O

R AC α γ γ β P P β α Cl- RGS2 ORK GTP GDP CaBP ATP PKA cAMP

PDE AMP

Abbildung 1: Schematische Darstellung der biochemischen Prozesse im olfaktorischen Epithel. Die Bindung eines Odormoleküles (O) an einen olfaktorischen Rezeptor (R) führt zur Dissoziation des trimeren G-Proteins (αβγ). Anschließend bindet die alpha-Untereinheit (α) an die membranständige Adenylatzyklase 3 (AC), was mit einem Anstieg an zyklischem AMP (cAMP) einhergeht. Zyklisches AMP interagiert mit einem Liganden-gesteuerten Kationenkanal (blau). Der Kanal öffnet sich und es kommt zum Einstrom von Kalziumionen.

1.2 Morphologie und Funktion humaner Spermatozoen

Humane Spermatozoen sind stark glykosylierte, differenzierte und haploide Zellen8, 9 mit einer durchschnittlichen Länge von 50-60 µm10. Sie bestehen aus Kopf, Mittelstück mit Hals und Flagellum (siehe Abbildung 2). Die äußere Abgrenzung bildet eine Plasmamembran, die im Wesentlichen aus Glykoproteinen, Proteoglykanen, Cholesterin und Phospholipiden besteht11. Der Kopf weißt eine ovale Form auf und enthält das Erbgut in Form eines haploiden Zellkernes. Im vorderen Teil des Kopfes befindet sich das Akrosom. Es ist E i n l e i t u n g S e i t e | 12 kappenformig und enthält hydrolysierende Enzyme. Kommt es zur Spermatozoon- Oozyten-Erkennung, wird die sogenannte Akrosomenreaktion ausgelöst. Dabei verschmelzen die Plasmamembran des Kopfes mit der äußeren Akrosomenmembran. Die dabei freigesetzten Enzyme spielen eine entscheidende Rolle bei der Penetration der Oozyte durch das Spermatozoon während des Fertilisationsprozesses. Das Mittelstück verbindet den Kopf mit dem Flagellum. Im Halsbereich sind die Mitochondrien lokalisiert. Diese Organellen liefern Energie in Form von ATP, was für die Motilität von enormer Bedeutung ist.

Das Flagellum bildet den längsten Teil des Spermatozoon und bewirkt durch peitschenartige Bewegungen die Motilität der Zelle. Erst die Oozytenerkennung löst eine Änderung der Amplitudenbewegung und die Erhöhung der Schlagzahl aus, so dass eine Geschwindigkeit von mindestens 25 µm/s die Penetration der Oozyte ermöglicht3, 8.

Kopf Mittelstück mit Hals und Flagellum

haploider Zellkern haploider

Mitochondrien

Akrosom

Abbildung 2: Schematische Darstellung eines humanen Spermatozoon.

Humane Spermatozoen dienen der Fertilisation der Oozyte und werden nach der Spermatogenese in den Nebenhoden gelagert. Während der Ejakulation gelangen 4-40x107 Spermatozoen10 über den Samenleiter und die Harnröhre in den weiblichen Genitaltrakt, wo sie bis kurz vor der Ovulation aufbewahrt werden2. Während dieser Zeit durchlaufen Spermatozoen einen kapazitiven Prozess, der durch den Zervixschleim positiv beeinflusst wird und zu biochemischen Veränderungen im Spermatozoon führt. Dadurch wird die Auslösung der akrosomalen Reaktion erleichtert und die Fertilisation ermöglicht8. Auf dem Weg zur Oozyte werden die E i n l e i t u n g S e i t e | 13

Spermatozoen über chemotaktische Signale, pH- und Temperaturänderungen geleitet2. Über Rezeptoren, die in der Plasmamembran des Spermatozoonkopfes lokalisiert sind, interagiert das Spermatozoon mit dem glykosylierten Zona Pellucida Protein 3 (ZP3) der Oozyte9. Diese Interaktion löst die Akrosomenreaktion im Spermatozoon aus, die mit der Verschmelzung der Plasmamembran der Kopfregion und der äußeren Akrosomenmembran sowie einem intrazellulären Anstieg der Kalziumkonzentration einhergeht. Dadurch werden hydrolysierende Enzyme, wie Akrosin, freigesetzt11, die zur punktuellen Lysierung der Zona Pellucida beitragen. Somit kann das Spermatozoon an das Zona Pellucida Protein 2 (ZP2) binden und die Oozyte penetrieren9.

1.3 Charakterisierung biologischer Membranen 1.3.1 Morphologie und Funktion biologischer Membranen

Biologische Membranen bilden eine natürliche Barriere zwischen dem extrazellulären Milieu und dem Zellinnenraum. Sie werden als dynamisches Flüssigmosaikmodell12 beschrieben und bestehen aus einer Lipiddoppelschicht, die von Strukturproteinen vollständig oder nur teilweise durchzogen wird13. Über diese Proteine kommunizieren Zellen untereinander oder mit ihrer Umwelt. Außerdem werden Ionen, Wasser und andere kleine Moleküle transportiert, die für einen ausgeglichenen pH-Wert, eine stabile Ionenzusammensetzung und den osmotischen Druck unabdingbar sind.

1.3.2 Klassifizierung von Membranproteinen

Membranproteine werden nach ihrer Lokalisation in integrale, periphere und membranassoziierende Proteine unterteilt (siehe Abbildung 3). Circa 20-30 % aller Gene in einem Organismus kodieren für integrale Membranproteine14, welche mit mehr als 70 % die Hauptklasse für drug targets bilden.

1.3.2.1 Integrale Membranproteine

Integrale Membranproteine durchziehen als alpha-helikale Strukturen (1 + 2) oder beta-Faltblätter (3) mit ihren Transmembranbereichen vollständig die Lipiddoppelschicht und stehen in intensiver Wechselwirkung mit den hydrophoben E i n l e i t u n g S e i t e | 14

Kohlenwasserstoffketten der Phospholipide, die wesentlicher Bestandteil von

Plasmamembranen sind. Alpha-helikale Strukturen werden aus 15 bis 25 hydrophoben Aminosäuren gebildet15 und durchspannen die Lipiddoppelschicht bitopisch (1) oder polytopisch (2)16. Bitopische integrale Membranproteine verfügen nur über eine Transmembrandomäne und haben ausgestellte globuläre Domäne an jeder Seite der Membran. Zu dieser Klasse von integralen Membranproteinen gehören hauptsächlich Zelloberflächenstrukturen, Adhäsionsproteine und Rezeptoren, die den Kontakt zum Zytoskelett herstellen und bei der Vermittlung zellulärer Signale von Bedeutung sind. Im Vergleich dazu bestehen polytopische integrale Membranproteine aus 6 bis 12 Transmembrandomänen, die über extrazelluläre und intrazelluläre loop-Bereiche miteinander verbunden sind. Zu dieser Klasse gehören viele Transportproteine sowie die G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRn) mit ihren 7 TMDn.

1 2 3 4 5

Abbildung 3: Schematische Darstellung von Membranproteinen. Membranproteine werden nach ihrer Lokalisation in der Lipiddoppelschicht in integrale (1-3), membranassoziierende und periphere Proteine (4-5) unterteilt. Integrale Membranproteine durchziehen als alpha-helikale Strukturen bitopisch (1) und polytopisch (2) oder als beta-Faltblätter (3) die Membran. Periphere und Membran- assoziierende Proteine besitzen keine Transmembrandomäne, aber sind können über einen Anker (4) mit der Membran verbunden sein oder stehen über nicht-kovalente Wechselwirkungen (5) mit der Membranoberfläche in Verbindung.

1.3.2.2 Membran-assoziierende und periphere Proteine

Membranassoziierende Proteine besitzen keinen transmembranen Bereich, sondern sie sind über einen Glykolipid-Rest oder Polyisoprenylierungen in der Membran verankert (4), während periphere Proteine über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit der Membranoberfläche (5) in Verbindung stehen.

E i n l e i t u n g S e i t e | 15

1.4 Strategien zur Anreicherung von Membranproteinen

Plasmamembranen sind dynamische Strukturen mit einer ständig wechselnden Lipid- und Proteinzusammensetzung. Im Fokus von Proteomstudien stehen sehr oft integrale Membranproteine aufgrund ihrer Funktionalität in zellulären Prozessen. Da die meisten integralen Membranproteine niedrig abundant sind, ist eine selektive Anreicherung durch die Affinitätschromatographie oder eine Affinitätsverteilung im wässerigen System möglich.

1.4.1 Affinitätchromatographie

Die Affinitätschromatographie basiert auf äußerst spezifischen Interaktionen von Proteinen oder Proteingruppen mit einem entsprechenden Liganden, der an eine chromatographische Matrix gekoppelt ist.

1.4.1.1 Lektinaffinität

Lektine sind Proteine pflanzlichen, tierischen, bakteriellen, pilzlichen oder viralen Ursprungs17-22, die keine eigene Enzymaktivität aufweisen, aber reversibel und spezifisch Monosaccharide, Polysaccharide oder die Zuckerreste von glykosylierten Proteinen binden. Die biologische Interaktion zwischen Zuckerrest und Matrix- gekoppelten Lektin basiert auf elektrostatischen oder hydrophoben Wechselwirkungen, van der Waals-Kräften und/oder Wasserstoffbrückenbindungen. Über Lektine angereicherte Glykoproteine werden reversibel durch konkurrierende Liganden, Änderung des pH-Wertes, Ionenstärke oder Polarität eluiert. Für die Anreicherung von Glykoproteinen aus der Plasmamembran humaner Spermien eignen sich besonders die pflanzlichen Agglutinine aus Weizenkeimen (WGA), Erdnüssen (PNA) sowie das Metalloprotein Concanavalin A (ConA). Untersuchungen von Spermatozoen mit fluoreszenzmarkierten Lektinen zeigten, dass WGA bevorzugt mit glykosylierten Proteinen der Plasmamembran des Kopfes und des Flagellums interagiert. Während Glykoproteine des akrosomalen Bereiches mit PNA angereichert werden können. Proteine, die in der akrosomalen Kappe oder der post-akrosomalen Region lokalisiert sind, weisen eine Con A-Spezifität auf23. E i n l e i t u n g S e i t e | 16

Das Weizenkeimagglutinin wird aus der Weizenspezies Triticum vulgare gewonnen und besitzt eine hohe Affinität für N-Acetyl-D-Glukosamin, N-Acetyl-Galaktosamin und Monosaccharidderivaten von Glukose und Galaktose24. Dieses Lektin ermöglicht die Anreicherung von N- und O-glykosylierten Proteinen, das unter sauren Bedingungen (pH 3) als Monomer (17 kDa) und bei neutralem bis leicht saurem pH- Wert als Dimer (35 kDa) vorliegt. Das Erdnussagglutinin ist Bestandteil von Arachis hypogaea und besteht aus vier identischen 27 kDa großen Untereinheiten25 (vgl. Abbildung 4). Es bindet spezifisch O-Glykane mit der Disacchariduntereinheit Galaktosyl (β-1,3) N-acetylgalaktosamin. Das Metalloprotein Concanavalin A wird aus Canvalia ensiformis isoliert und bildet ein 102 kDa großes Tetramer aus identischen Untereinheiten bei pH-Werten 7 (siehe Abbildung 4). Für die Bindung von Oligomannosylsacchariden von N- Glykanen25 ist das Vorhandensein von Magnesium- oder Kalziumionen unabdingbar24, da sonst bei sauren Bedingungen die Kohlenhydratbindeaktivität aufgehoben wird.

Abbildung 4: Beta-Faltblattstrukturen von Concanavalin A und dem Erdnussagglutinin. Für Concanavalin A ist nur ein Einzelmonomer des multimeren Proteins dargestellt, während vom Erdnussagglutinin die komplette quaternäre Struktur zu sehen ist. Die grauen Kugeln repräsentieren Metallionen, die für die Lektinaktivierung essentiell sind. Gebundene Saccharide sind als grünes Kugel-Stab-Modell eingezeichnet26.

E i n l e i t u n g S e i t e | 17

1.4.1.2 PBA-vermittelte Affinität

Im Vergleich zur Lektinaffinität wird bei der PBA-vermittelten Affinität ein Boronsäurederivat als Ligand zur Anreicherung von Glykoproteinen verwendet. Boronsäuren und ihre Derivate können nicht direkt an eine chromatographische Matrix gekoppelt werden, so dass bei der PBA-vermittelten Affinität amino- Phenylboronsäure als Matrixligand verwendet wird27. Das Boratanion der 3-amino- Phenylboronsäure bildet mit Molekülen, die cis-1,2-diol-Gruppen bei hohen pH- Werten aufzeigen, einen reversiblen fünfringförmigen Boronatester (vgl. Abbildung 5) zur Erkennung von Glykoproteinen aus28.

Abbildung 5: Bildung eines Phenylboronsäure-Diol-Komplexes. Phenylboronsäure (1) bzw. das Phenylboronsäureanion (2) bilden mit den Diol-Motiven von Sacchariden hoch affine, aber reversible Boronatester (3,4) aus. Abkürzung: Keq = Gleichgewichtskonstante

1.4.2 Affinitätsverteilung im wässerigen System

Eine weitere effektive Möglichkeit zur schonenden Extraktion von Proteinen bilden wässerige Systeme, die aus zwei wasserlöslichen, nicht mischbaren Polymeren bestehen29. Da zwischen den Polymerphasen nur eine geringe Grenzflächenspannung auftritt, es aufgrund des hohen Wassergehaltes kaum zu Denaturierungen kommt, bleibt bei diesen milden Bedingungen die Proteinstruktur und biologische Aktivität erhalten. Das am häufigsten verwendete System besteht aus Polyethylenglykol (PEG) und Dextran (Dx) und wurde bereits Mitte der 1950er Jahre zur Trennung und Aufreinigung biologischen Materials verwendet30, 31. PEG ist E i n l e i t u n g S e i t e | 18 aus Ethylenoxid-Monomeren unterschiedlicher Kettenlänge aufgebaut. Im Vergleich dazu sind Dextrane hochmolekulare, neutrale Polysaccharide aus Glukosemonomeren. Die Verteilung von Membranen und den darin enthaltenen Proteinen im System basiert auf ihren unterschiedlichen Affinitäten für eine der beiden Phasen sowie ihrer Oberflächeneigenschaften, der Größe und Dichte29. Dabei werden Plasmamembranen bevorzugt in der oberen PEG-Phase angereichert, während Membranen der restlichen subzellulären Komponenten eher in der unteren Dx-Phase akkumulieren. Die Affinitätsverteilung wird nicht nur durch die Zusammensetzung und Konzentration der verwendeten Polymere beeinflusst, sondern ist auch Salz-, Temperatur- und Liganden-abhängig29, 32. Für eine besonders effiziente Trennung diverser subzellulärer Komponenten ist die Koppelung spezifischer Liganden an eine der Polymerphasen (z.B. ConA an Dx) möglich33 (siehe Abbildung 6). Dabei wird das Zielmolekül selektiv in der Ligand-Polymer- Phase angereichert. Für die Anreicherung von Plasmamembranen aus Leber, Gehirn oder Blutblättchen wird bevorzugt WGA als Dx-Ligand im biphasischen System verwendet34-38. Auch bakterielle subzelluläre Kompartimente lassen sich mit diesem Polymersystem extrahieren, trennen und anreichern39, 40.

Abbildung 6: Affinitätsverteilung im wässerigen biphasischen PEG/Dx-System. Das dargestellte Polymersystem setzt sich aus einer oberen PEG-Phase und einer unteren Dx-Phase mit gekoppelten Lektin zusammen (links). Nach Zugabe des Lysates werden beide Phasen miteinander vermischt (mitte) und nach einem Zentrifugationsschritt erfolgt eine Phasentrennung, wobei sich Lektin- spezifische glykosylierte Membranproteine in der unteren Phase anreichern, während unspezifische und nicht glykosylierte Membranproteine in der oberen Phase verteilt sind.

E i n l e i t u n g S e i t e | 19

1.5 Multidimensionale Proteinidentifikationstechnologie (MudPIT)

Die Separation komplexer Peptidgemische wird häufig mit der Gel-freien Hochdurchsatz-multidimensionalen Proteinidentifikationstechnologie (MudPIT) durchgeführt. Diese Methode ist erstmals für die Trennung komplexer Zelllysate aus Saccharomyces cerevisae beschrieben worden41. Hierbei handelt es sich um die Weiterentwicklung der Umkehrphasen-Flüssigchromatographie-Tandemmassen- spektrometrie (RP-LC-MS2). Die verwendeten Mikrokapillaren bestehen aus drei Phasen, wobei ein starker Kationenaustauscher von zwei Umkehrphasen flankiert wird42. Die erste kurze RP-Phase entspricht einer klassischen Vorsäule und dient der Aufkonzentrierung von Peptiden und der Entfernung unerwünschter Kontaminationen. In einem linear ansteigenden Acetonitrilgradienten werden die Peptide von der ersten PR-Phase auf den starken Kationenaustauscher eluiert. Aufgrund ionischer Wechselwirkungen zwischen den positiv geladenen Peptidionen und der negativ geladenen stationären Phase kommt es zur Retention der Peptide. Die an den Kationenaustauscher immobilisierten Peptide werden durch Erhöhung der Salzkonzentration in mehreren Stufen schrittweise von der SCX-Phase auf die zweite RP-Phase eluiert. Diese dritte Phase dient der hochauflösenden Separation der Peptide und diese können direkt in ein Massenspektrometer zur Analyse eluiert werden.

1 MS

PB[%] 2 MS

PC[%] PB[%] 3 4 MS PC[%] PB[%] 5 6 MS

Abbildung 7: Schematische Darstellung einer MudPIT-Analyse. Die mehrdimensionale Säule besteht aus einer kleinen RP-Vorsäule, einem starken Kationenaustauscher und einer längeren RP- Trennsäule. Die komplexe Peptidmischung wird offline auf die RP-Vorsäule geladen (1). Mit einem linear ansteigenden Acetonitrilgradienten werden die Peptide von der Vorsäule auf den starken Kationenaustauscher eluiert (2). Durch ansteigende Salzgradienten erfolgt eine schrittweise Elution der Peptide vom Kationenaustauscher auf die RP-Trennsäule (3, 5). Mit einem linear ansteigenden Acetonitrilgradienten werden abschließend die Peptide nach chromatographischer Trennung direkt ins Massenspektrometer (MS) eluiert(4, 6).

E i n l e i t u n g S e i t e | 20

1.6 Massenspektrometrische Analyse

Für die massenspektrometrische Trennung von ionischen Analyten in der Bioanalytik stehen beispielsweise Ionenfallen und Quadrupole als Analysatoren zur Verfügung. Mit diesen Massenanalysatoren werden die physikalischen Eigenschaften der Analytionen anhand ihres Verhältnisses von Masse zu Ladung bestimmt.

1.6.1 Fragmentionen-Analyse mit linearen Ionenfallen

Lineare Ionenfallen bestehen aus vier parallel angeordneten stabförmigen Metallelektroden, an denen zur Fragmentionen-Analyse ein kombiniertes Wechsel- und Gleichspannungsfeld angelegt wird, so dass ein quadrupolares Feld entsteht. Dadurch können Ionen mit einem definierten m/z-Wert die Ionenfalle auf stabilen oszilierenden Bahnen durchlaufen. Ionen, die ein abweichendes m/z-Verhältnis aufzeigen, bewegen sich auf instabilen Bahnen innerhalb des quadrupolaren Feldes. Folglich kollidieren diese Ionen mit den Metallelektroden und werden dadurch abgestoppt. Im Vergleich zu herkömmlichen dreidimensionalen Ionenfallen besitzen die zweidimensionalen Analysatoren ein erheblich größeres Volumen43 um Ionen in der Falle zu akkumulieren. Dadurch wird die Sensitivität, die Auflösung und die Massengenauigkeit deutlich erhöht. Während der Analyse wird zunächst ein Übersichtsspektrum von ionisierten Peptiden generiert. Dabei verbleiben die Ionen über verschiedene Zeitintervalle in der Falle, bevor die drei intensivsten Ionen einer Spezies durch Kollision mit Inertgas in amino- oder carboxyterminale Fragmente dissoziieren44. Anschließend erfolgt die Generierung eines MS/MS-Spektrums von den erhaltenen Fragmentionen.

Abbildung 8: Zweidimensionale schematische Darstellung einer linearen Ionenfalle. Eine lineare Ionenfalle besteht aus 4 parallel angeordneten stabförmigen Metallelektroden (grau dargestellt). Durch das Anlegen eines kombinierten Wechsel- und Gleichspannungsfeldes können Ionen mit definierten m/z-Werten das quadrupolare Feld auf stabilen oszillierenden Bahnen durchlaufen.

E i n l e i t u n g S e i t e | 21

1.6.2 Selected Reaction Monitoring (SRM)

Selected-Reaction-Monitoring (SRM) ist eine effektive und sehr sensitive Methode zur Quantifizierung von niedrig abundanten Analyten aus komplexen Proben mit einem Triple-Quadrupol-Gerät45. Dabei wird das m/z-Verhältnis eines vordefinierten Vorläuferiones und eines seiner Fragmentionen für den ersten und dritten Quadrupol ausgewählt, die als Massenfilter fungieren. Für ein SRM-Experiment wird eine Serie von Übergängen, bestehend aus Vorläufer- und Fragmentionenpaar, in Kombination mit der Retentionszeit des Zielpeptides verwendet46. Alle Vorläuferionen, die den vordefinierten m/z-Wert besitzen, bewegen sich auf stabilen oszillierenden Bahnen von dem ersten in den zweiten Quadrupol. Dieser zweite Quadrupol dient als Kollisionszelle. Hier erfolgt die Fragmentierung der Vorläuferionen durch die Kollision mit einem Inertgas. Nach der Fragmentierung gelangen die Fragmentionen in den dritten Quadrupol. Von Q3 gelangen nur die Fragmentionen auf stabilen Bahnen zum Detektor, die ebenfalls einem definierten m/z-Verhältnis entsprechen. Bedingt durch die Massenfilter wird sowohl die Sensitivität als auch die Selektivität gesteigert. Zum Einen wird der nicht erwünschte Hintergrund der komplexen Probe ausgeblendet und zum Anderen entfällt bei dieser Methode der Übersichtsscan im Vergleich zu herkömmlichen Ionenfallengeräten46. Dadurch kann schneller gescannt werden und die Massenanalyse konzentriert sich nur auf die vordefinierten m/z-Werte.

ESI Q1 Q2 Q3 D

Abbildung 9: Schematische Darstellung des SRM Funktionsprinzipes eines Triple-Quadrupol Gerätes. Q1 und Q3 dienen als Massenanalysatoren und Q2 fungiert als Kollisionszelle. Die Ionisierung der Probenmoleküle erfolgt mit Elektrospray (ESI) und die Fragmentionen treffen auf einen Detektor (D). Zielstellung S e i t e | 22

2. Zielstellung

Im Fokus dieser Arbeit steht die massenspektrometrische Identifizierung von Membranproteinen aus humanen Spermatozoen. Plasmamembranen bilden eine natürliche Barriere zwischen Zellinnenraum und extrazellulärem Milieu. Ihre Lipiddoppelschicht wird häufig von integralen Proteinen durchzogen, die für essentielle Funktionen, wie Überleben, Kommunikation oder Reproduktion von enormer Bedeutung für den Organismus sind.

Aufgrund der Tatsache, dass Membranproteine niedrig abundant sind, soll die Anreicherung von integralen Plasmamembranproteinen mit dem Ziel erfolgen, olfaktorische Rezeptoren nachzuweisen. Da bislang noch nicht vollständig geklärt ist, welche aus dem Riechepithel bekannten olfaktorischen Rezeptoren in Spermatozoen exprimiert werden und welche biologische Funktionalität sie aufzeigen.

Zusätzlich ist die Untersuchung von inter-individuellen Unterschieden im Expressionsmuster olfaktorischer Rezeptoren in der Plasmamembran humaner Spermatozoen durchzuführen. Dafür sollen Methoden für selected reaction monitoring-Experimente von ausgewählten Rezeptorkandidaten entwickelt werden, damit selektive target-Listen erstellt werden können.

Material und Methoden S e i t e | 23

3. Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Chemikalien

Für alle Arbeiten wird 18 MΩ Wasser aus einer Arium 611 Wasseranlage der Firma Satorius verwendet.

Chemikalien Hersteller β-Mercaptoehtanol Sigma-Aldrich, München, Deutschland 2,2,2 Trifluorethansulfonylchlorid Fluka, Steinheim, Deutschland Acetonitril J.T.Baker, Deventer, Niederlande Acrylamidlösung (Rotiphorese® Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, NF-Acrylamid/Bis-Lösung 30% Deutschland (29:1) Ameisensäure Merck, Darmstadt, Deutschland Ammoniumacetat Merck, Darmstadt, Deutschland Ammoniumhydrogencarbonat Fluka, Steinheim, Deutschland Ammoniumhydroxid J.T.Baker, Deventer, Niederlande Ammoniumperoxodissulfat Merck, Darmstadt, Deutschland Borsäure Merck, Darmstadt, Deutschland Calciumchlorid J.T.Baker, Deventer, Niederlande Coomassie Brilliant Blue G250 AppliChem, Darmstadt, Deutschland Dextran T500 Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland Dichlormethan J.T.Baker, Deventer, Niederlande Dimethylsulfoxid J.T.Baker, Deventer, Niederlande Essigsäure J.T.Baker, Deventer, Niederlande Ethanol Riedel-de Haën, Seelze, Deutschland Formaldehyd (37 %) VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland Formamidlösung J.T.Baker, Deventer, Niederlande Galaktose AppliChem, Darmstadt, Deutschland Glycin AppliChem, Darmstadt, Deutschland Kasil, Kaliwasserglas PQ Austria GmbH, Wien, Österreich Lithiumsulfat Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Magnesiumchlorid J.T.Baker, Deventer, Niederlande Manganchlorid J.T.Baker, Deventer, Niederlande Methanol J.T.Baker, Deventer, Niederlande Methyl-α-D-Mannopyranosid Fluka, Steinheim, Deutschland N,N,N‘,N‘- Merck, Darmstadt, Deutschland Tetramethylethylendiamin N-acetyl-D-Glycosamin Fluka, Steinheim, Deutschland

Material und Methoden S e i t e | 24

Natriumcarbonat J.T.Baker, Deventer, Niederlande Natriumchlorid J.T.Baker, Deventer, Niederlande Natriumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt, Deutschland Natriumdodecylsulfat AppliChem, Darmstadt, Deutschland Natriumthiosulfat J.T.Baker, Deventer, Niederlande Percoll Plus GeHealthcare,Uppsala, Schweden Phosphataseinhibitor 1 und 2 Sigma-Aldrich, Steimheim, Deutschland Polyethylenglykol 6000 Merck, Darmstadt, Deutschland Proteaseinhibitorcocktail, Roche Diagnostrics Corporation, complete, EDTA-frei Indianapolis, USA ProteasMax™, Surfactant Promega, Madison, USA Saccharose AppliChem, Darmstadt, Deutschland Salzsäure J.T.Baker, Deventer, Niederlande Schwefelsäure J.T.Baker, Deventer, Niederlande Silbernitrat J.T.Baker, Deventer, Niederlande Sorbitol CAL BIOCHEM®, Darmstadt, Deutschland Taurin Acros Organics, New Jersey, USA Trichloressigsäure Merck, Darmstadt, Deutschland Triethylamin Fluka, Steimheim, Deutschland Trifluoressigsäure Merck, Darmstadt, Deutschland Tris (hydroxymethyl) Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland aminomethanhydrochlorid

3.1.2 Biologisches Material, Enzyme, Kit-Systeme, Gebrauchsmaterial

Material Hersteller α-, β-, γ-Casein (bos taurus) Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Angiotensin I und II Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland BCA-Assay Pierce, Rockford, USA Bradford-Assay Pierce, Rockford, USA Chymotrypsin, modified Princeton Separations, Adelphia, NJ, USA Dialyseschlauch, 12 kDa MWCO Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Ejakulat Jumbosep™ Zentrifugalbecher, PALL Filtersystems GmbH, Crailsheim, 100 K Deutschland Konzentratoren, Biomax® UF- Millipore GmbH, Schwalbach, Deutschland Membran, 5 kDa MWCO Lipoproteinlipase Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Phospholipase C Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Trypsin, sequencing grade Promega, Madison, USA Ultrazentrifugen Becher, AH650 SCI, Weinheim, Deutschland Ultrazentrifugen Becher, SW41+ Herolab Centrifuge Labware, Weinheim, Deutschland

Material und Methoden S e i t e | 25

3.1.3 Chromatographie Material

Material Hersteller Lektin-beads (WGA, PNA, ConA) Vector Laboratories, USA WGA Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland PBA-beads Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland UltraLink® Biosupport Pierce, Rockford, USA Kapillaren, 100-440 µm ID, nicht Optronics GmbH, Kehl, Deutschland deaktiviert (Polymicro) Luna C18 (2), 3 µm, 100 Å Phenomenex, Aschaffenburg, Deutschland PolySULFOETHYL™, 5 µm, Chromatographic Technologies, Basel, 200 Å Schweiz

3.1.4 Geräte

Gerät Hersteller Elektrophorese-Equipment Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland Horizontalschüttler GFL, Burgwedel, Deutschland HPLC-Pumpe G1311A Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland HPLC-Pumpe, Switchos™ Dionex, Idstein, Deutschland HPLC-Pumpe, Ultimate™ Dionex, Idstein, Deutschland Laserpuller P-2000 Sutter Instruments, Novato, USA LCQ™ ThermoFisher Scientific, Dreieich, Deutschland LTQ™ XL ThermoFisher Scientific, Dreieich, Deutschland Photometer Anthos, Krefeld, Deutschland Reinstwasseranlage Arium® 611 Satorius AG, Göttingen, Deutschland Rotationsschüttler, Intelli-Mixer ELMI Ltd. Laboratory Equipment, Riga, RM-2 Litauen Sonifier Sonoplus Bandelin, Berlin, Deutschland TSQ™ Vantage ThermoFisher Scientific, Dreieich, Deutschland Ultrazentrifuge Sorvall Discovery DuPont, Bad Homburg, Deutschland 90 Ultrazentrifuge Sorvall OTD DuPont, Bad Homburg, Deutschland Combi Vakuum Konzentrator 5301 Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH, Wesseling-Berzdorf, Deutschland Zentrifuge 5415 R / 5810 R Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH, Wesseling-Berzdorf, Deutschland

Material und Methoden S e i t e | 26

3.2 Methoden

Aufarbeitung + Separation humaner Spermatozoen (3.2.1)

Bestimmung der Proteinkonzentration (3.2.2)

Anreicherung von Plasmamembranproteinen (3.3.3)

Affinitätsverteilung im Affinitätschromatographie wässerigen System

- Lektin + Lektin MLAC PBA-vermittelt (3.3.3.1) (3.3.3.2) (3.3.3.3) (3.3.3.4)

Proteinabreicherung SDS-Page Präzipitation (3.2.7) (3.2.4/3.2.5) (3.2.6)

Proteolytischer Verdau + Peptidextraktion (3.2.8)

Flüssigchromatographie (3.2.9)

Massenspektrometrische Analyse (3.2.10)

CID-Experimente SRM-Experimente (3.2.10.1) (3.2.10.2)

Datenauswertung (3.2.11)

Abbildung 10: Schematischer Methodenüberblick.

Material und Methoden S e i t e | 27

3.2.1 Aufarbeitung und Separation humaner Spermatozoen

Humanes Ejakulat wird von fertilen und infertilen (ICSI)-Spendern (25-45 Jahre) gesammelt, vereinigt und bei -80°C gelagert, wenn die Aufarbeitung nicht sofort erfolgt.

3.2.1.1 Spermatozoenseparation von seminalem Plasma

Für die Analyse humaner Spermatozoen müssen zunächst die Spermatozoen von dem seminalen Plasma separiert werden. Dazu werden gefrorene Proben zunächst bei 37°C und 500 rpm vorsichtig aufgetaut. Anschließend wird das liquifizierte Ejakulat (15 min, RT) vorsichtig auf einen zweistufigen Percollgradienten (45 % und 90 %) appliziert und zur Separation der Spermatozoen 15 min bei 4°C mit 1500x g zentrifugiert, da intakte Spermien an der Phasengrenze zwischen den beiden Percollstufen akkumulieren. Zur Entfernung von Percollresten werden die separierten Spermatozoen mit deionisiertem Wasser versetzt, in ein 2 mL Reaktionsgefäß überführt und für 5 min bei 4°C und 1500x g pelletiert. Dieser Waschschritt wird zweimal wiederholt.

Lösungen:

Percoll-Lösung 90 % 90 % Percoll 2,25 mM NaCl

Percoll-Lösung 45 % 90 %-ige Lösung mit aquadest. entsprechend versetzt

3.2.1.2 Lipoproteinlipase-/Phospholipase C-Verdau

Die Plasmamembran humaner Spermatozoen wird von Glykoproteinen, Proteoglykanen, Cholesterin und Phospholipiden dominiert11. Damit die Anreicherungseffizienz von Plasmamembranproteinen (PMPn) gesteigert werden kann, wird zu Beginn der Aufarbeitung eine enzymatische Hydrolyse der Lipide

Material und Methoden S e i t e | 28 zu freien Fettsäuren durchgeführt. Dabei hydrolysiert die Lipoproteinlipase Triacylglycerine in drei Fettsäuren und ein Glycerinmolekül. Während die Phospholipase C Phospholipide zwischen dem Glycerin und der Phosphatgruppe spaltet, so dass Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerin (DAG) entstehen. Isolierte und pelletierte Spermatozoen werden für die Lipidhydrolyse in 300 µL 50 mM Ammoniumbicarbonatpuffer resuspendiert und mit 10 000 U/g Lipoproteinlipase und 0,25 U/µL Phospholipase C versetzt. Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 37°C.

3.2.1.3 Aufbrechen der Plasmamembran

Zum Aufbrechen der Plasmamembran wird die Inkubationslösung des Lipaseverdaues mit 200 µL Lysepuffer versetzt und sechsmal für 15 s bei 30 % Leistung auf Eis mit einem Sonifier beschallt. Resultierende Membranfragmente werden durch einen anschließenden Zentrifugationsschritt (5 min, 4°C, 10 000x g) pelletiert. Das erhaltene Rohlysat wird abgenommen und in einem 2 mL Reaktionsgefäß auf Eis gelagert. Anschließend wird die Aufschlußprozedur zweimal wiederholt, wobei die pelletierten Membranfragmente in 500 µL Lysepuffer resuspendiert werden. Das vereinigte Rohlysat wird abschließend 10 min bei 4°C mit 16 000x g zentrifugiert, um unerwünschte Zellbestandteile, Plasmamembranfragmente von Organellen und Zelldebris endgültig zu entfernen.

Lösungen:

Lysepuffer 250 mM Saccharose 15 mM Tris 1 % (v/v) Proteaseinhibitormix 1 % (v/v) Phosphataseinhibitor 1+2

Material und Methoden S e i t e | 29

3.2.2 BCA-Assay zur Bestimmung der Proteinkonzentration

Um die Aufschlusseffizienz zu überprüfen und vergleichbare Proteinmengen für die anschließende Anreicherung von PMPn einsetzen zu können, wird die Konzentration der Gesamtproteinmenge des Rohlysates mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay bestimmt. Durch die Reduktion von Kupferionen kann die Proteinkonzentration über einen temperaturabhängigen Farbkomplex bei einer Wellenlänge von λ=562 nm photometrisch bestimmt werden.

Zur Konzentrationsbestimmung werden jeweils 25 µL von jedem Standard (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 und 2000 µg/mL) und dem Rohlysat in einer 96- Lochplatte vorgelegt. Hierzu werden 200 µL Reaktionslösung pipettiert. Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei 37°C im Dunkeln wird die Extinktion bei einer Wellenlänge von λ=562 nm durch einen Mikroplatten-Reader ausgelesen. Anschließend wird die Proteinkonzentration der Probe rechnerisch anhand des BSA-Standards bestimmt.

Lösungen:

BSA-Stocklösung 2 mg/mL

Reaktionslösung 50:1, Lösung 1 und Lösung 2

3.2.3 Anreicherung von Plasmamembranproteinen aus humanen Spermien

Die Anreicherung von Plasmamembranproteinen erfolgt über eine Affinitätsverteilung im wässerigen System oder eine Affinitätschromatographie. Für die Anreicherung von glykosylierten PMPn mittels Affinitätschromatographie muss die im Lysepuffer enthaltene Saccharose zunächst wieder aus dem Lysat entfernt werden. Dieses Disaccharid würde sonst als potentieller Ligand mit den glykosylierten PMPn um die Lektin- oder PBA-Bindestelle konkurrieren. Zur

Material und Methoden S e i t e | 30

Entfernung der Saccharose wird das Lysat 1:10 mit deionisierten Wasser verdünnt und die enthaltenen Proteinfragmente bei 100 000x g in einem AH650- oder SW41+-Rotor für 60 min bei 4°C pelletiert. Nach diesem Ultrazentrifugationsschritt wird der Saccharose-haltige Überstand abgenommen und verworfen. Mit dem Proteinpellet wird wie unter 3.2.3.3 bzw. 3.2.3.4 beschrieben weiter gearbeitet.

3.2.3.1 Affinitätsverteilung im wässerigen System ohne Lektinaffinität

Eine effektive Methode zur Anreicherung von Plasmamembranproteinen ist die Verwendung eines wässerigen biphasischen Systemes, das aus Polyethylenglykol (PEG) und Dextran (Dx) besteht. Die kettenartigen Molekülstrukturen des PEGs imitieren die Lipiddoppelschicht, so dass PMPn bevorzugt in der oberen Phase des Systemes akkumulieren. Nach dem Membranaufschluß wird das Rohlysat mit dem frisch angesetzten biphasischen System auf 5 mL aufgefüllt, vermischt und zur Phasentrennung 15 min bei 4°C mit 1500x g zentrifugiert. Die obere PEG-Phase mit den akkumulierten PMPn wird einschließlich der Interphase abgenommen und aufbewahrt. Die verbliebene Dx-Phase wird mit frischem biphasischem System erneut auf 5 mL aufgefüllt und nachextrahiert. Anschließend werden die abgenommenen PEG-Phasen vereinigt und mit deionisiertem Wasser 1:10 versetzt. Mit einem abschließenden Ultrazentrifugationsschritt (60 min, 4°C, 150 000x g) werden die angereicherten PMPn pelletiert und der resultierende Überstand verworfen.

Lösungen:

Biphasisches System 6,5 % PEG 3350 6,5 % Dx T500 200 mM Tris Lagerung über Nacht bei 4°C 200 mM LiSO4 1 % (v/v) Proteaseinhibitormix 1 % (v/v) Phosphataseinhibitor 1+2 pH 7,5 mit H2SO4 eingestellt

Material und Methoden S e i t e | 31

3.2.3.2 Affinitätsverteilung im wässerigen System mit Lektinaffinität

Viele Plasmamembranproteine weisen extrazelluläre Glykosylierungen auf. Zur spezifischen und effizienteren Anreicherung dieser glykosylierten PMPn wird das pflanzliche Weizenkeimagglutinin (WGA) an Dextran gekoppelt.

Kopplung des Weizenkeimagglutinins (WGA) an Dextran

Vor der eigentlichen Kopplung muss das Dextran aktiviert werden. Dafür werden 5 g lyophilisiertes Dx in 25 mL wasserfreiem DMSO gelöst. Unter Rühren werden langsam und nacheinander 1 mL Triethylamin (wasserfrei) und 5 mL Dichlormethan (wasserfrei) hinzu gegeben. Bis zur vollständigen Vermischung wird die Lösung, im Eisbad stehend, weiter gerührt. Zur Tresylierung des Dextranes werden sehr langsam 220 µL Tresylchlorid hinzu pipettiert und die Lösung eine Stunde auf Eis weiter gerührt. Damit das Einbringen der Tresylgruppen vollständig verläuft, wird die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur permanent weiter vermischt. Am nächsten Tag wird das tresylierte Dx präzipitiert. Die Dx-Lösung wird zunächst mit 50 mL und anschließend viermal mit 25 mL wasserfreiem Dichlormethan versetzt und mit einem Trigalsky-Spatel bis zur vollständigen Präzipitation bearbeitet. Zur Entfernung des Dichlormethans wird das Präzipitat in deionisiertem Wasser resuspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur gegen deionisertes Wasser dialysiert, bis eine klare Lösung vorliegt. Abschließend wird das tresylierte Dx über Nacht lyophilisiert. Für die Kopplung von 10 mg WGA werden 2 g lyophilisiertes Tresyl-Dx in 9 mL Kopplungspuffer resuspendiert und anschließend mit dem WGA (in 1 mL Kopplungspuffer resuspendiert) versetzt. Die Kopplung erfolgt über Nacht bei 4°C mit 75 rpm in einem Rotationsschüttler. Zum Abstoppen der Kopplungsreaktion wird die Lösung mit 10 mL Quenchingpuffer für 120 min bei 4°C mit 75 rpm inkubiert. Anschließend wird die WGA-Dx-Lösung mit Wasser versetzt und aufkonzentriert, um ungebundenes WGA zu entfernen. Der resultierende Durchlauf wurde zur Bestimmung der Kopplungsrate für einen anschließenden Bradford-Assay aufbewahrt. Das Kopplungsprodukt wird abschließend für eine Langzeitlagerung lyophilisiert.

Material und Methoden S e i t e | 32

Der Bradford-Assay wird nach Herstellerangaben mit WGA als Standard in einer 96-Lochplatte durchgeführt. Die resultierende Extinktion ist photometrisch mit einem Mikroplatten-Reader bei einer Wellenlänge von λ=562 nm ausgelesen und die Kopplungsrate (~80 %) rechnerisch anhand des WGA-Standards bestimmt worden.

Lösungen:

Kopplungspuffer 500 mM NaCl 100 mM NaH2PO4 pH 7,5

Quenchingpuffer 400 mM Tris-HCl pH 7,5

Anreicherung glykosylierter Plasmamembranproteine

Zunächst werden die Plasmamembranproteine des Rohlysates in der PEG- Phase des biphasischen Systemes ohne Lektinaffinität angereichert (vgl. 3.2.3.1). In einem zweiten Schritt wird die PEG-Phase mit den PMPn zu einer WGA-Dx-Lösung hinzu gegeben. Der anschließende Zentrifugationsschritt bewirkt die Trennung der Phasen. Dabei werden alle extrazellulär glykosylierten PMPn, die eine starke Affinität zum WGA aufweisen, in der unteren WGA-Dx- Phase angereichert. In der oberen PEG-Phase befinden sich alle nicht glykosylierten und für WGA nicht affinen PMPn. Zur Isolation der angereicherten PMPn wird die WGA-Dx-Phase 1:10 mit N-Acetyl-D-Glucosamin und die PEG- Phase 1:10 mit deionisiertem Wasser versetzt. Das N-Acetyl-D-Glucosamin interagiert mit dem WGA und verdrängt somit die glykosylierten PMPn. Alle angereicherten PMPn werden in einem finalen Ultrazentrifugationsschritt (60 min, 4°C, 150 000x g) pelletiert und die Überstände verworfen.

Material und Methoden S e i t e | 33

Lösungen:

Biphasisches System 6,5 % PEG 3350 6,5 % Dx T500 200 mM Tris Lagerung über Nacht bei 4°C 1 % (v/v) Proteaseinhibitormix 1 % (v/v) Phosphataseinhibitor 1+2 pH 7,5 mit H2SO4 eingestellt

Biphasisches System mit Affinität 6,5 % PEG 3350 6,5 % Dx T500 200 mM LiSO4 Lagerung über Nacht bei 4°C 200 mM H3BO3 2 g WGA/Dx 1 % (v/v) Proteaseinhibitormix 1 % (v/v) Phosphataseinhibitor 1+2 pH 7,8 mit Tris eingestellt

N-Acetyl-D-Glucosamin-Lösung 100 mM N-Acetyl-D-Glucosamin 250 mM Saccharose 5 mM Tris pH 7,8

3.2.3.3 Multilektin-Affinitätschromatographie (MLAC)

Die Anreicherung von glykosylierten PMPn wird im batch-Verfahren mit den an Agarose-beads immobilisierten Lektinen WGA, PNA und ConA durchgeführt. Dafür werden vergleichbare Mengen der jeweiligen beads bis zu einem Gesamtbettvolumen von 1 mL in ein 2 mL Reaktionsgefäß pipettiert. Zur Entfernung des Lagerungspuffers werden die beads mit 30 Säulenvolumen (SV) Inkubationspuffer equilibriert. Nach dem vorausgegangenen Ultrazentrifugationsschritt (vgl. 3.2.3) wird das Membranpellet zweimal mit Inkubationspuffer gewaschen, damit alle Saccharosereste entfernt sind. Anschließend wird 1 mg Protein in Inkubationspuffer resuspendiert und für 60 min bei Raumtemperatur (RT) in einem Rotationsschüttler mit 50 rpm inkubiert. Nach der Inkubation sedimentieren die beads und die ungebundene Proteinfraktion wird abgenommen und aufbewahrt. Zur Entfernung aller unspezifisch gebundener Proteine werden die

Material und Methoden S e i t e | 34 beads mit 2 SV Inkubationspuffer gewaschen. Die anschließende Elution der gebundenen Proteine erfolgt abwechselnd mit jeweils 3 SV Elutionspuffer 1 und 2 bis ein Gesamtvolumen von 12 SV pro Puffer erreicht ist. Zwischen den einzelnen Elutionsschritten werden die beads für jeweils 5 min bei RT mit 50 rpm im Rotationsschüttler inkubiert. Alle abgenommenen Überstände sind nach der Vereinigung für 2 min mit 1000-1300x g zentrifugiert worden, um versehentlich überführte beads zu sedimentieren. Der Überstand wird bis zur anschließende Präzipitation (siehe 3.2.6) bei 4°C gelagert. Zum Schluß werden die beads mit 1 SV Regenerationspuffer über Nacht bei 4°C im Rotationsschüttler (50 rpm) behandelt.

Lösungen:

Inkubationspuffer 20 mM Tris-HCl; pH 7,4

1 mM MnCl2

1 mM CaCl2 0,15 M NaCl

Elutionspuffer 1 0,17 M Methyl-α-D-Mannopyranosid 0,17 M N-Acetyl-D-Glucosamin 0,27 M Galaktose 20 mM Tris-HCl; pH 7,4 0,5 M NaCl

pH 3,0 mit CH3COOH eingestellt

Elutionspuffer 2 0,17 M Methyl-α-D-Mannopyranosid 0,17 M N-Acetyl-D-Glucosamin 0,27 M Galaktose 20 mM Tris-HCl; pH 7,4 0,5 M NaCl pH 7,6

Material und Methoden S e i t e | 35

Regenerationspuffer 1 M NaCl

pH 3,0 mit CH3COOH eingestellt

3.2.3.4 PBA-vermittelte Affinitätschromatographie

Alternativ zum MLAC-Verfahren können glykosylierte Plasmamembranproteine auch mittels PBA-vermittelter Affinitätschromatographie im batch-Verfahren angereichert werden. Für die Affinitätschromatographie wird das Chromatographiematerial zur verwendeten Proteinmenge im Verhältnis 1:1 eingesetzt. Die entsprechende Menge an Agarose-beads mit immobilisierten PBA wird in ein 2 mL Reaktionsgefäß pipettiert und zur Entfernung des Lagerungspuffers werden die beads mit 40 SV Inkubationspuffers T equilibriert. Nach dem vorausgegangenen Ultrazentrifugationsschritt (vgl. 3.2.3) wird das Membranpellet zweimal mit dem Inkubationspuffer T gewaschen, damit alle Saccharosereste entfernt sind. Nach der Probenzugabe folgt eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur im Rotationsschüttler bei 50 rpm. Zur Entfernung ungebundener Proteine sedimentieren zunächst die beads, um anschließend den Überstand abnehmen zu können. Zur Abreicherung unspezifisch gebundener Proteine werden die beads mit 2 SV des zuvor verwendeten Inkubationspuffer T gewaschen. Abschließend werden alle gebundenen Proteine schrittweise mit 10 SV des passenden Elutionspuffers (siehe Tabelle 1) eluiert. Zwischen den einzelnen Elutionsschritten werden die beads für jeweils 5 min bei RT mit 50 rpm im Rotationsschüttler inkubiert. Alle abgenommenen Überstände sind nach der Vereinigung für 2 min mit 1300x g zentrifugiert worden, um versehentlich überführte beads zu sedimentieren. Zum Schluss werden die beads mit jeweils 5 SV Regenerationspuffer (siehe Tabelle 1) versetzt, inkubiert und abzentrifugiert. Alle Überstände aus den Elutionen und Regenerationen werden gesammelt, vereinigt und für die anschließende Präzipitation (siehe 3.2.6) bei 4°C gelagert.

Material und Methoden S e i t e | 36

Tabelle 1: Elutions- und Regenerationsschema für die PBA-vermittelte Affinitätschromatographie. Die Zusammensetzung der einzelnen Puffer ist der Auflistung am Ende des Kapitels zu entnehmen. Abkürzungen: T = Taurin, A bzw. B = jeweiliger Ansatz.

T_ A T_B Elution 1 X X Elution 2 X Regeneration 1 X X Regeneration 2 X X Regeneration 3 X X Regeneration 4 X X

Zusätzlich zu den Agarose- beads wird auch UltraLink® Biosupport als Matrix zur Immobilisierung von PBA verwendet. Die Kopplung von PBA an dieses poröse Harz erfolgt nach Herstellerangaben. Die anschließende Affinität wird wie oben beschrieben durchgeführt.

Lösungen:

Inkubationspuffer T 50 mM Taurin

20 mM MgCl2 pH 8,7

Elutionspuffer T1 50 mM Taurin

20 mM MgCl2 0,1 M Sorbitol pH 8,7

Elutionspuffer T2 Elutionspuffer T1

20 % CH3CN

Regenerationspuffer T1 0,1 M H3BO3 1 M NaCl pH 9,8

Material und Methoden S e i t e | 37

Regenerationspuffer T2 0,1 M H3BO3 pH 9,8

Regenerationspuffer T3 H2O

Regenerationspuffer T4 2 M NaCl

3.2.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Um die Bindekapazität der beads und die Effizienz der Elutions- und Regenerationsschritte zu kontrollieren, sind Aliquots der einzelnen Proteinfraktionen sowie des Lysates aufbewahrt und nach ihrem Molekulargewicht mittels denaturierender Bedingungen diskontinuierlich gelelektrophoretisch aufgetrennt worden. Jeweils 16 µL der aufbewahrten Aliquots werden mit 1x (v/v) Laemmli-Puffer versetzt. Falls der pH-Wert einer Lösung zu sauer ist, wird er vor der Denaturierung mit 25 % (w/v) Ammoniumhydroxid eingestellt. Die Denaturierung erfolgt für 30 min bei 60°C und 800 rpm. Neben den Proben wird zur Unterscheidung der einzelnen Proteinbanden ein vorgefärbter Proteinmarker (PageRuler; Fermentas) auf das Gel (6 cm x 9 cm x 1 mm) aufgetragen. Die Trennung der Proben erfolgt in zwei Schritten: 10 min bei 75 V, danach 30 min bis 40 min bei 170 V bis die Farbbande den unteren Gelrand erreicht. Zur Visualisierung der Proteine werden die Gele anschließend mit Silbernitrat (siehe 3.2.5) behandelt.

Lösungen:

SDS-Trenngel (12 %/15 %) 1,8 mL/1,3 mL H2O 1,5 mL Lower-Tris; pH 8,8 2,3 mL/2,85 mL Acrylamidlösung

Material und Methoden S e i t e | 38

75 µL 10 % (w/v) APS 5 µL TEMED

SDS-Sammelgel (4 %) 1,35 mL H2O 250 µL Upper-Tris; pH 6,8 340 µL Acrylamidlösung 40 µL 10 % (w/v) APS 5 µL TEMED

Elektrophoresepuffer (1x) 100 mL 10x Tris Glycin 10 mL 10 % (w/v) SDS

Ad 1L H2O

Laemmli-Puffer (5x) 0,25 M Tris-HCl; pH 7,6 (reduzierend) 8 % (w/v) SDS 40 % (w/v) Glycerin 0,04 % (w/v) Coomassie BB G250

(70 µM β-Mercaptoethanol)

Acrylamid-Lösung 30 % (w/v) Acrylamid 0,8 % (w/v) Bis-Acrylamid

Tris Glycin-Lösung (10x) 0,25 M Tris 1,92 M Glycin

3.2.5 Visualisierung der Proteine im SDS-Gel mit Silberionen

Die Silberfärbung beruht auf der Reduktion von Silberionen zu Silber. Nach der elektrophoretischen Trennung wird das Gel 5 min in deionisiertem Wasser gewaschen um den Elektrophoresepuffer zu entfernen. Die Fixierung der Proteine erfolgt für 30 min in 50 %Ethanol/10 % Eisessig. Anschließend wird das

Material und Methoden S e i t e | 39

Gel dreimal für 10 min mit deionisiertem Wasser gewaschen und zur

Verbesserung der Sensitivität kurz mit 0,02 % Na2O3S2-Lösung behandelt. Nach zweimaligem Waschen mit deionisiertem Wasser werden die Proteine für 30 min mit 0,1 % AgNO3-Lösung im Dunkeln inkubiert. Die Farbentwicklung

(2 % Na2CO3 mit 30 µL 37 % Formaldehyd je 100 mL) wird abschließend mit 1 % Essigsäure gestoppt.

3.2.6 Protein-Präzipitation nach der Affinitätschromatographie

Nach der Affinitätschromatographie sind die gebundenen und ungebundenen/unspezifisch gebundenen Proteine der einzelnen Fraktionen durch einen Präzipitationsschritt aufkonzentriert worden.

3.2.6.1 Ethanol -Präzipitation

Jede erhaltene Elutions- und Regnerationsfraktion wird mit 9 Anteilen eiskaltem Ethanol (100 %) versetzt und vermischt. Die Präzipitation erfolgt bei -30°C für 48 h. Zur Entfernung des Überstandes wird das Präzipitat 1 h bei 4°C mit 16 000x g pelletiert. Für den anschließenden proteolytischen Verdau wird das Pellet in 100 mM Ammoniumhydrogencarbonat resuspendiert.

3.2.6.2 TCA-Präzipitation

Nach der Affinitätschromatographie sind alle Fraktionen mit den ungebundenen und unspezifisch gebundenen Proteinen vereinigt worden. Zur Aufkonzentrierung dieser Proteine wird die Gesamtfraktion mit TCA (100 %) bis zu einer Endkonzentration von 13 % (v/v) TCA versetzt. Anschließend wird die Probe ausreichend vermischt und die Präzipitation erfolgt in zwei Schritten. Nach einer Inkubationszeit von 5 min bei -20°C präzipitierten die Proteine anschließend bei 4°C für 60 min. Zur Isolation des Präzipitates wird die Lösung für 30 min bei 4°C mit 4000x g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das resultierende Pellet wird nach Einstellung des pH-Wertes anschließend proteolytisch verdaut.

Material und Methoden S e i t e | 40

3.2.7 Abreicherung von löslichen und Membran-assoziierenden Proteinen

Die meisten Plasmamembranproteine sind wesentlicher Bestandteil von unzähligen Signaltransduktionswegen und interagieren mit einer Vielzahl von Molekülen, die mit der Membran assoziieren oder aus dem Plasma zur Membran rekrutiert werden um extrazelluläre Signale intrazellulär weiterzuleiten. Im Fokus der Untersuchungen standen keine Interaktionsstudien von Signalmolekülen, sondern die Identifikation von niedrig abundanten Plasmamembranproteinen. Demzufolge wurden die pelletierten und angereicherten Membranproteine (siehe

3.2.3.1 und 3.2.3.2) in eiskaltem Na2CO3 resuspendiert, kurz mit Ultraschall behandelt und erneut ultrazentrifugiert (60 min, 4°C, 150 000x g). Das Salz bewirkt einerseits das Öffnen der Membranvesikel und führt andererseits zur Depolymerisation von Aktinbündeln, so dass im Überstand lösliche und membran-assoziierende Proteine enthalten sind. Dieser Abreicherungsschritt wurde noch einmal wiederholt und alle resultierenden Überstände verworfen. Die resultierenden Pellets sind anschließend proteolytisch verdaut worden.

Lösungen:

Natriumcarbonat-Puffer 100 mM Na2CO3 pH 11,5

3.2.8 Proteolytischer Flüssigverdau und Peptidextraktion

Mit den bisher durchgeführten Methoden konnten die niedrig abundanten, aber hydrophoben PMPn ohne Detergenzien effizient angereichert werden. Da Detergenzien vielfach die anschließende Massenspektrometrie negativ beeinflussen, müssen sie meist aufwendig entfernt werden. Bedingt durch die niedrige Abundanz der PMPn sollten sich die Aufarbeitungsschritte auf ein Minimum beschränken. Damit die Transmembrandomänen dennoch für Proteasen zugänglich sind, werden die pelletierten (Membran)-Proteinfraktionen mit einem Surfactant nach Herstellerangaben solubilisiert. Dieses Surfactant fungiert wie ein Detergenz, muss aber nicht entfernt werden, da es die

Material und Methoden S e i t e | 41 anschließende massenspektrometrische Analyse nicht stört. Desweiteren wird ein Kombinationsverdau mit den Proteasen Trypsin und Chymotrypsin durchgeführt. Die Transmembranbereiche bestehen zwischen 20 und 25 hydrophoben Aminosäuren und weisen keine tryptischen Schnittstellen auf, so dass zu lange tryptische Fragmente entstehen, die sich massenspektrometrisch äußerst schlecht fragmentieren lassen. Um zusätzlich Fragmente aus dem Transmembranbereich massenspektrometrisch identifizieren zu können, wird Chymotrypsin als weitere Protease verwendet.

Proteolytischer Verdau von Membranproteinpellets

Membranpellets werden in 300 µL Verdaupuffer resuspendiert, 5 min mit Ultraschall behandelt und zur vollständigen Solubilisierung mit Surfactant (Endkonzentration 0,005 %) inkubiert. Für den anschließenden

Kombinationsverdau werden 15 mM CaCl2, 40 µg Trypsin und 25 µg Chymotrypsin hinzu pipettiert. Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 37°C mit 1000 rpm.

Proteolytischer Verdau präzipitierter Proteinpellets

Präzipitierte Proteinpellets werden in 50-100 µL Verdaupuffer resuspendiert und der pH-Wert gegebenenfalls mit NaOH eingestellt. Nach kurzer Ultraschallbehandlung werden die Proteine zur vollständigen Solubilisierung mit Surfactant (Endkonzentration 0,005 %) inkubiert. Für den anschließenden

Kombinationsverdau werden 15 mM CaCl2, 4 µg Trypsin und 4 µg Chymotrypsin hinzu pipettiert. Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 37°C mit 1000 rpm.

Peptidextraktion

Am nächsten Tag wird zum Abstoppen der Reaktion und zum Ansäuern der Probe 2-5 µL 100 % TFA hinzu gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei 37°C und 1000 rpm wird die Verdaulösung der Membranpellets für 10 min bei 16 000x g und die Verdaulösung der Proteinpellets für 5 min bei 10 000x g

Material und Methoden S e i t e | 42 zentrifugiert. Die klare Peptidlösung wird abgenommen, in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bei -30°C bis zur Analyse gelagert.

Lösungen:

Verdaupuffer 100 mM Ammoniumbicarbonat

Surfactant 1% ProteasMax™ trypsin enhancer

3.2.9 Flüssigchromatographie 3.2.9.1 Herstellung von HPLC-Säulen

Herstellung von Vorsäulen

Zur Herstellung von Vorsäulen werden nicht-deaktivierte fused-silica-Kapillaren mit einem Innendurchmesser von 440 µm verwendet. Dazu wird das eine Ende mit einer Fritte versehen. Hierzu werden 50 µL einer 25 % (v/v) Formamid- Lösung mit 100 µL Kaliwasserglas gemischt. 5µL dieser Lösung werden auf einen Fiberglasfilter gegeben. Mit dem Kapillarende werden aus dem benetzten Filter Stücke ausgestochen bis eine Fritte mit gewünschter Länge entsteht. Zum Auspolymerisieren der Fritte wird die Kapillare über Nacht bei 85°C gelagert. Nach der Fertigstellung wird die Kapillare mit 5-7 cm C18-Material gepackt (vgl. Herstellung von Trennsäulen).

Vorbereitung der Kapillaren

Für die chromatographische Trennung werden nicht-deaktivierte fused-silica- Kapillaren mit einem Innendurchmesser von 100 µM verwendet, die an einem Ende spitz zulaufend sind. Zunächst wird die Polyimidummantelung der Kapillare im Bereich der zukünftigen Spitze abgeflämmt. Zum Ausziehen der Spitze wird die Kapillare in einen Laserpuller eingespannt, der Polyimid-freie Bereich kurz mit einem Laserstrahl beschossen und die feine Spitze durch kurze Zugkraft ausgezogen.

Material und Methoden S e i t e | 43

Herstellung von Trennsäulen

Für die Trennung komplexer Peptidgemische werden multidimensionale Kapillaren mit verschiedenen Chromatographiematerialien gepackt. Dazu wird das entsprechende RP- bzw. SCX-Material in Methanol aufgeschlämmt und in eine Druckkammer gestellt. Anschließend wird die Kapillare mit der Spitze nach oben in die Suspension geschoben. Mit einem Druck von maximal 100 bar und durch Einleiten von Argon wird das Chromatographiematerial in die Kapillare gepresst. Die sogenannten MudPIT-Säulen werden zunächst mit 11 cm C18- Material gefüllt, was der eigentlichen Trennsäule entspricht. Anschließend wird auf diese Phase 5-8 cm SCX-Material gepackt. Den Abschluss bildet eine 5 cm lange C18-Phase, die einer klassischen Vorsäule entspricht. Wird die Trennsäule mit einer Vorsäule (5-7 cm RP) kombiniert, dann besteht die verkürzte MudPIT- Säule nur aus 11 cm C18-Material und 8 cm SCX-Material. Zur Etablierung von SRM-Experimenten werden eindimensionale Trennsäulen mit einer 15 cm langen C18-Phase hergestellt.

RP SCX RP

3.2.9.2 HPLC-Gradienten

Im Vorfeld der massenspektrometrischen Analyse werden komplexe Peptidmischungen über tridimensionale Trennsäulen (MudPIT) schrittweise chromatographisch aufgetrennt und die Peptide direkt in das Massenspektrometer eluiert. Um unspezifische und irreversible Peptidbindungen an das Chromatographiematerial zu verhindern und die Trennschärfe der Säule zu prüfen, sind zunächst alle Vor- und Trennsäulen mit Angiotensin oder Casein abgesättigt und getestet worden. Die Flussrate wird für jede verwendete Säule auf 300 nL/min eingestellt.

Material und Methoden S e i t e | 44

Testgradient - Vorsäule 100

40 Puffer B Anteil Puffer Anteil [%] B 20

0 0 10 20 30 40 50 Zeit [Minuten]

Die Vorsäule wird zunächst 5 min mit Puffer A gespült, um Salze und andere Verunreinigungen zu entfernen. Über einen 30 minütigen linear ansteigenden Gradienten von 7 % auf 100 % Acetonitril, der für weitere 10 min bei 100 % Acetonitril verbleibt, werden die Testpeptide von der Vorsäule eluiert. Eindimensionale Trennsäulen sind mit Angiotensin abgesättigt und ebenfalls mit dem Testgradienten für Vorsäulen getestet worden. Zum Absättigen der MudPIT-Säulen werden die Peptide zunächst über Stufengradienten von den ersten beiden Phasen eluiert, um über einen abschließenden schnell ansteigenden Acetonitrilgradienten vollständig von der Trennsäule zu eluieren. Nach einer Spülphase von 10 min, die der Entfernung unspezifisch gebundener Peptide und zur Aufkonzentrierung dient, werden die gebundenen Peptide von der RP1-Phase auf den Kationenaustauscher mit 100 % Acetonitril für 5 min eluiert. Nach einer Spülphase von 10 min mit Puffer A werden die Peptide mit 1,5 M Ammoniumacetat innerhalb von 5 min von der SCX-Phase auf die Trennphase eluiert. Zur Entfernung störender Salze wird vor der eigentlichen chromatographischen Trennung die Säule mit Puffer A für 10 min equilibriert. Der abschließende Elutionsgradient steigt von 2 % auf 100 % Acetonitril innerhalb von 5 min an und verbleibt 10 min bei 100 % Puffer B, damit die Peptide vollständig eluiert werden können.

Material und Methoden S e i t e | 45

Testgradient - Trennsäule 100

40 Puffer B Puffer D

20 Anteil Puffer Anteil B/Puffer [%] D

0 0 10 20 30 40 50 60 Zeit [Minuten]

Jede abgesättigte Säule, die eine Trennschärfe zwischen 10 s und 12 s für das entsprechende Testpeptid bei halber peak-Höhe und einer Intensität zwischen 106-108 (gerätespezifisch) aufzeigt, wird für die anschließenden MudPIT- Analysen verwendet.

MudPIT-Analyse

Für die MudPIT-Analyse wird das komplexe Peptidgemisch offline mit einem maximalen Druck von 100bar und unter Einleitung von Argon in einer Druckkammer vollständig auf die Säule (ID = 100 µm) geladen. Dabei binden die Peptide zunächst auf der ersten RP-Phase, die im klassischen Sinne als Vorsäule zur Peptidkonzentrierung und Aufreinigung dient. Nach dem Ladevorgang wird die Kapillare mit einer HPLC-Anlage verbunden und 30 min mit Puffer A gespült, um Salze und unerwünschte Kontaminationen zu entfernen. In einem ersten linear ansteigenden Acetonitrilgradienten werden die Peptide von der ersten RP-Phase auf den starken Kationenaustauscher eluiert.

Material und Methoden S e i t e | 46

Erster MudPIT-Gradient 100

40 Puffer B Anteil Puffer Anteil [%] B 20

0 0 30 60 90 120 150 180 Zeit [Minuten]

Von dem Kationenaustauscher werden die Peptide schrittweise durch Erhöhung der Salzkonzentration (12,5; 25; 50; 75; 100; 125 und 187,5 mM) auf die zweite RP-Phase eluiert, um nach der chromatographischen Trennung anschließend massenspektrometrisch analysiert werden zu können. Die Anzahl und Höhe der Salzstufen richtet sich nach dem jeweiligen Trennproblem und wird manuell angepasst. Ein abschließender Salzgradient mit 1,5 M Ammoniumacetat dient der Regeneration der SCX-Phase.

Salzstufengradienten 100

40 Puffer B Puffer C

20 Anteil Puffer Anteil B/Puffer [%] C

0 0 30 60 90 120 150 180 Zeit [Minuten]

Material und Methoden S e i t e | 47

Wenn eine Vorsäulen-Konstruktion verwendet wird, ist das komplexe Peptidgemisch vollständig auf die Vorsäule (ID = 440 µm; 5-7 cm C-18) geladen worden. Nach dem Ladevorgang wird die Vorsäule über einen Konnektor mit der Trennsäule (ID = 100 µm; bestehend aus SCX und RP) verbunden und an die HPLC-Anlage angeschlossen. Die chromatographische Trennung erfolgt, wie zuvor beschrieben, über einen ersten Acetonitrilgradienten, dem nach kurzer Equilibrierung mit Puffer A sieben Salzstufengradienten (12,5; 25; 37,5; 50; 162,5; 250 mM und 1,5 M Ammoniumacetat) folgen.

Eindimensionale RP-Analyse

Zur Etablierung der SRM-Experimente werden eindimensionale Trennsäulen verwendet. Dazu wird 1 pmol einer Caseinpeptidmischung, wie zuvor beschrieben, auf die Trennsäule geladen. Nach einer Spülphase von 5 min mit Puffer A werden die Peptide über einen 55 min Gradienten eluiert. Der Gradient steigt innerhalb von 45 min linear von 7 % auf 100 % Acetonitril an. Nachdem 10 min mit 100 % Puffer B gespült wird, endet der Gradient mit einem Spüllauf von 10 min bei 100 % Puffer A.

RP-Gradient 100

40 Puffer B Anteil Puffer Anteil [%] B 20

0 0 15 30 45 60 75 Zeit [Minuten]

Material und Methoden S e i t e | 48

Lösungen:

Puffer A 0,1 % HCOOH

2 % CH3CN

Puffer B 0,1 % HCOOH

80 % CH3CN

Puffer C 0,1 % HCOOH

250 mM CH3COONH4

Puffer D 0,1 % HCOOH

1,5 M CH3COONH4

3.2.10 Massenspektrometrische Analyse 3.2.10.1 CID-Experimente

Für alle durchgeführten CID-Experimente wird eine Spray-Spannung von 2 kV angelegt und die Temperatur der Transferkapillaren beträgt 200°C. Zur Identifizierung von Peptiden werden 12 scan events pro scan-Zyklus programmiert. In den scans 1, 5 und 9 wird jeweils ein Übersichtsspektrum im Bereich von 400-2000 m/z generiert, wobei der komplette Massenbereich gedrittelt wird. Die drei intensivsten Ionen aus jedem der drei scan-Bereiche werden ausgewählt, um diese mit einer Kollisionsenergie von 35 % zu fragmentieren. Das Massenfenster für zu fragmentierende Ionen liegt bei 3 Da, während fragmentierte Ionen für 30 s auf eine Ausschlussliste gesetzt werden.

3.2.10.2 SRM-Experimente

Für alle SRM-Experimente wird eine spray-Spannung von 2 kV angelegt und die Temperatur der Transferkapillare beträgt 270°C. Zur Methodenetablierung wird alpha-Casein in die Pinpoint-Software (Thermo Fisher Scientific) geladen. Nach einem tryptischen in-silico-Verdau sind 19

Material und Methoden S e i t e | 49

Peptide mit 79 Übergängen und ihren theoretisch bestimmten Kollisionsenergien für die SRM-Experimente ausgewählt worden. Die Auflösung von Quadrupol 1 und 3 beträgt 0,7 (FWHM) bei einem Kollisionsgasdruck von 1,5 mTorr in Quadrupol 2. Für die Generierung von MS/MS-Spektren wird ein scan-Zyklus bestehend aus 2 scans programmiert. Im ersten scan wird anhand der programmierten Übergänge ein SRM-Spektrum im Bereich von 100-1500 m/z generiert. Übersteigt das intensivste Ion einen Schwellwert von mindestens 5000 counts, wird dieses ausgewählt, um im zweiten Scan im CID-Modus mit einer ansteigenden Kollisionsenergie von 10 % auf 40 % fragmentiert zu werden. Die Wiederholungsdauer beträgt dabei 0,3 min. Anschließend wird das ausgewählte Ion für 1 min auf eine Ausschlussliste gesetzt. Zur eindeutigeren Identifizierung von Peptiden olfaktorischer Rezeptoren sind 38 Peptide, die 33 Rezeptoren zugeordnet werden konnten, in die Pinpoint-Software (Thermo Fisher Scientific) geladen worden. Für jedes Peptid werden entsprechend der Fragmentlänge 4-6 Übergänge gewählt. Insgesamt sind für die SRM-Analysen 214 unique Übergänge einschließlich der theoretisch berechneten Kollisionsenergie verwendet worden. Dabei beträgt die Auflösung (FWHM) 0,2 für Quadrupol 1 und 0,7 für Quadrupol 3 bei einem Stoßgasdruck von 1,5 mTorr in Quadrupol 2. Die scan-Zeit wird auf 0,1 s bei einer scan-Weite von 0,01 m/z gesetzt.

3.2.11 Datenauswertung

Die massenspektrometrisch erhaltenen LTQ-Daten werden mit der Bioworks Software SP1 3.3.2 analysiert. Die Suchen werden mit dem SEQUEST- Algorithmus gegen die humane Datenbank (www.uniprot.org; release date 20/03/2009) mit folgenden Parametern durchgeführt: tryptische und chymotryptische Peptide, Peptidtoleranz von 1,5 Da und einer Fragmentionentoleranz von 1,0 Da. Außerdem werden 5 proteolytische Fehlschnitte sowie die Oxidation von Methionin (+16 Da) als variable Modifikation zugelassen. Anschließend werden alle erhaltenen Peptide nach folgenden Kriterien gefiltert: Xcorr mit 1,8/2,5/3,5 für 1/2/3-fach geladene Peptide, RSp ≥ 5, ΔCN > 0.085 und eindeutige Peptide. Zusätzlich sind die Sprektren aller identifizierter olfaktorischer Rezeptoren manuell validiert worden.

Material und Methoden S e i t e | 50

Die Rohdaten aller SRM-Experimente sind ebenfalls manuell validiert worden. Damit ein Peptid als eindeutig identifiziert bewertet werden konnte, müssen mindestens drei Übergänge mit einer relativen Abundanz von mindestens 102 innerhalb einer Salzstufe bei vergleichbarer Retentionszeit detektiert werden. Die SRM ausgelösten MS/MS-Spektren werden mit Mascot gegen die SwissProt- Datenbank mit tryptischen Peptiden, einer Peptid-/Fragmenttoleranz von 1,5/1,0 Da und Methionin als variable Modifikation gesucht.

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4. Ergebnisse

Integrale Plasmamembranproteine (IPMPn) humaner Spermatozoen sind essentiell für das Überleben der Spermienzelle, für die Wahrnehmung von extrinsischen Reizen und die Kommunikation mit ihrer Umwelt sowie für die Fertilisation. Aufgrund der sehr geringen Abundanz, des hydrophoben Charakters und der extrazellulären Glykosylierung von IPMPn sind zur Charakterisierung des Spermatozoenproteomes diverse Anreicherungsstrategien in Kombination mit äußerst sensitiven massenspektrometrischen Methoden notwendig, bei gleichzeitiger Abreicherung stark abundanter zytosolischer und mit der Membran assoziierende Proteine.

4.1 Anreicherung integraler Plasmamembranproteine aus humanen Spermatozoen

Für die effiziente Anreicherung integraler Plasmamembranproteine (PMPn) sind vergleichend die Affinitätsverteilung im wässerigen biphasischen System mit und ohne Lektinaffinität (2PS mit/ohne WGA und die Affinitätschromatographie mit diversen Lektinen (MLAC) und m-Amino-Phenylboronsäure (PBA) als Matrixligand durchgeführt worden. Die nachfolgend dargestellten Ergebnisse beruhen auf insgesamt 24 MudPIT-Analysen. Zur Anreicherung wird der hydrophobe Charakter sowie die extrazelluläre Glykosylierung der integralen PMPn ausgenutzt. Mit den verwendeten Anreicherungsstrategien konnten insgesamt 2045 eindeutige Proteine angereichert werden (siehe Abbildung 11A). 1409 (69 %) dieser Proteine sind nach der Affinitätsverteilung im wässerigen biphasischen System mit und ohne Lektinaffinität (2PS mit/ohne WGA) identifiziert worden. Mittels Affinitätschromatographie (MLAC und PBA) ließen sich über 11 % aller identifizierter Proteine anreichern. Erstaunlicherweise können nur 400 Proteine mit allen verwendeten Strategien angereichert werden. 23 % von den 2045 identifizierten Proteinen sind Plasmamembranproteine (siehe Abbildung 11B). Davon sind 280 Proteine mit mindestens einer Transmembrandomäne in der Plasmamembran lokalisiert. Mit 77 % (1573) bilden alle anderen Membranproteine, lösliche und Membran-assoziierende Proteine den Hauptteil der angereicherten Gesamtproteinmenge.

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A Affinitäts- Affinitäts- verteilung chromatographie 1409 400 236

B 1573

192 280

Proteine PMP IPMP

13% 9% 10% 13%

74% 81%

Proteine PMP IPMP Proteine PMP IPMP

Abbildung 11: Anreicherung von Membranproteinen aus humanen Spermatozoen mittels Affinitätsverteilung im wässerigen System und Affinitätschromatographie. Mit den verwendeten Strategien konnten insgesamt 2045 Proteine angereichert werden (A). Davon sind 280 Proteine mit mindestens einer Transmembrandomäne in der Plasmamembran lokalisiert (B). Werden beide Anreicherungsstrategien vergleichend betrachtet (C), können mittels Affinitätsverteilung im wässerigen System 13 % (1809) integrale Plasmamembranproteine identifiziert werden (links). Durch eine Affinitätschromatographie sind 9 % (636) angereicherte integrale Plasmamembranproteine (rechts). Abkürzungen: PMP = Plasmamembranproteine, IPMP = integrale Plasmamembranproteine, Proteine = Membranproteine, lösliche und membranassoziierende Proteine.

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In Abbildung 11C ist die Verteilung der angereicherten integralen PMPn auf die verwendeten Anreicherungsstrategien dargestellt. Mit der Affinitätsverteilung im wässerigen biphasischen System lassen sich 13 % (232 von 1809) der identifizierten integralen PMPn anreichern. Während 9 % (70 von 636) der integralen PMPn mit dem Matrix-gekoppelten Liganden eine reversible Interaktion eingehen. Darüber hinaus können mit den verwendeten Strategien integrale Plasmamembranproteine mit bis zu 24 Transmembrandomänen (TMDn) angereichert werden (siehe Tabelle 2). Die Anreicherung an integralen PMPn wird durchschnittlich um das 3,5-fache bei Verwendung der Affinitätsverteilung im Vergleich zur Affinitätschromatographie gesteigert. Besonders effizient können mit allen Strategien integrale Proteine angereichert werden, die ein und sieben Transmembrandomänen besitzen. Mit dem klassischen wässerigen Affinitätsverteilungssystem (2PS ohne WGA) können im Vergleich zu den anderen 3 Strategien zusätzlich Proteine mit zwei, vier, zehn und 12 Transmembrandomänen angereichert werden. Dagegen bewirkt eine Kombination aus klassischer Affinitätsverteilung und Lektinaffinität (2PS mit WGA) eine erhöhte Anreicherung von Proteinen (6), die mit 13 bis 24 Domänen die Membran durchspannen.

Tabelle 2: Verteilung der identifizierten integralen Plasmamembranproteine auf die verwendeten Anreicherungsstrategien in Abhängigkeit von der Anzahl an Transmembrandomänen. Mit den verwendeten Strategien können integrale Plasmamembranproteine mit bis zu 24 Transmembrandomänen angereichert werden. Am effizientesten ist die Anreicherung für Proteine, die mit ein und sieben TMDn in der Plasmamebran lokalisiert sind. Abkürzungen: TMD = Transmembrandomäne, 2PS mit/ohne WGA = biphasiches Affinitätsverteilungssystem mit und ohne Weizenkeimagglutinin, MLAC = Multilektin- Affinitätschromatographie, PBA = m-Amino-Phenylboronsäure vermittelte Affinitätschromatographie.

2PS 2PS # TMD MLAC PBA ohne WGA mit WGA 1 61 29 10 17 2 14 2 1 - 3 2 3 - - 4 8 3 2 2 5 1 1 - 1 6 5 1 - 2 7 46 46 13 11 8 1 1 - - 9 1 - - - 10 8 5 1 2 11 1 - - - 12 8 7 3 2 13-24 2 2 2 2 Σ 158 100 32 39

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4.1.1 Anreicherung integraler Plasmamembranproteine im wässerigen biphasischen System

Für die Anreicherung von integralen Plasmamembranproteinen aus humanen Spermatozoen im wässerigen Milieu durch eine Affinitätsverteilung wurde ein biphasisches System bestehend aus PEG und Dx mit und ohne WGA-gekoppeltes Dx verwendet. Bei Verwendung des klassischen biphasischen Systemes (2PS ohne WGA) akkumulieren nach einer Phasentrennung Plasmamembranproteine bevorzugt in der oberen PEG-Phase. Zur weiteren Anreicherung glykosylierter integraler Plasmamembranproteine ist die PEG-Phase des klassischen Systemes mit einer WGA-gekoppelten Dx-Phase vermischt worden (2PS mit WGA). Die anschließende Phasentrennung bewirkt eine Umverteilung der glykosylierten PMPn aus der oberen PEG-Phase in die untere Dx-Phase. In dieser Phase werden aber nur Glykoproteine angereichert, die eine Affinität für das WGA aufzeigen, alle anderen Glykoproteine sowie nicht glykosylierte Plasmamembranproteine verbleiben in der oberen PEG- Phase. Mit der Affinitätsverteilung im wässerigen biphasischen System konnten insgesamt 1809 unterschiedliche Proteine in der PEG-Phase mit 12 MudPIT-Analysen identifiziert werden (vgl. Abbildung 11A). Davon entfallen 1020 Proteine auf das klassische biphasische System und 308 Proteine konnten durch die Kombination aus klassischem und dem WGA-gekoppelten biphasischen System angereichert werden. 481 Proteine lassen sich sowohl mit als auch ohne zusätzlichen Affinitätsschritt anreichern (siehe Abbildung 12A). Wird das klassische System als eigenständiger Anreicherungspool betrachtet, konnten insgesamt 1501 eindeutige Proteine identifiziert werden (siehe Abbildung 12A, links). Davon sind 11 % (158) als integrale Membranproteine mit mindestens einer Transmembrandomäne in der Plasmamembran lokalisert. Weitere 10 % (157) lassen sich als PMPn klassifizieren, zeigen aber keinen hydrophoben Membranbereich auf. Den Hauptanteil bilden mit 79 % alle anderen Membranproteine, lösliche und membranassoziierende Proteine (siehe Abbildung 12B, links). Im Vergleich zum klassischen System lassen sich durch einen zusätzlichen Lektinaffinitätsschritt insgesamt 789 Proteine identifizieren (siehe Abbildung 12A, rechts). Der Anteil an Plasmamembranproteinen beträgt hier 23 % (vgl. Abbildung 12B, rechts). Davon sind über 56 % (100) mit mindestens einer Transmembrandomäne in der Plasmamembran lokalisiert. Alle anderen

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Membranproteine, lösliche und Membran-assoziierende Proteine werden zusammengefasst und bilden mit 604 (77 %) Proteinen den Hauptanteil.

A -WGA +WGA

1020 481 308

11% 13%

10% 10%

79% 77%

Proteine PMP IPMP Proteine PMP IPMP

Abbildung 12: Anreicherung integraler Plasmamembranproteine durch Affinitätsverteilung im wässerigen System mit und ohne Lektinaffinität. Mit dem Affinitätsverteilungssystem können insgesamt 1809 Proteine identifiziert werden. Davon lassen sich 481 sowohl mit als auch ohne WGA- Affinität anreichern (A). Das klassische Affinitätsverteilungssystem (-WGA) ermöglicht die Anreicherung von 1501 Proteinen, von denen 11 % mit mindestens einer Transmembrandomäne in der Plasmamembran humaner Spermatozoen lokalisiert sind (B, links). Im Vergleich zum klassischen System bewirkt ein zusätzlicher Affinitätsschritt mit Weizenkeimagglutinin (+WGA), dass 13 % von 789 Proteinen integrale Plasmamembranproteine sind (B, rechts). Abkürzungen: WGA = Weizenkeimagglutinin, PMP = Plasmamembranproteine, IPMP = integrale Plasmamembranproteine, Proteine = Membranproteine, lösliche und membranassoziierende Proteine.

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4.1.2 Anreicherung von integralen Plasmamembranproteinen mittels Affinitätschromatographie

Für die Anreicherung integraler Plasmamembranproteine aus humanen Spermien mittels Affinitätschromatographie sind zwei verschiedene Matrixliganden, Lektine (MLAC) und m-Amino-Phenylboronsäure (PBA), verwendet worden. Die dargestellten Ergebnisse beruhen auf jeweils 6 MudPIT-Analysen. Dafür wurden die an eine Matrix-immobilisierten Liganden im batch-Verfahren verwendet und mit der entsprechenden Menge Protein inkubiert. Nach der durchgeführten Elution (3.2.3.3, 3.2.3.4) sind die jeweiligen Präzipitate (3.2.6) über eine MudPIT-Säule (3.2.9.2) im CID-Modus (3.2.10.1) massenspektrometrisch analysiert worden. Bei dieser Strategie werden aus dem eingesetzten Rohlysat alle glykosylierten Proteine angereichert, die eine spezifische Affinität zum verwendeten Matrixliganden aufzeigen.

4.1.2.1 Kontrolle von Bindekapazität und Elutionsbedingungen mit SDS- PAGE

Zur Kontrolle der Bindekapazität sowie der Effizienz der Elutionsschritte sind im Vorfeld Aliquots der einzelnen Schritte auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel (SDS-PA-Gel) aufgetragen und nach elektrophoretischer Trennung mit Silber visualisiert worden. In Abbildung 13 ist beispielhaft ein mit Silber angefärbtes SDS-PA-Gel eines MLAC- Versuches mit aufgetragenem Rohlysat (L), Durchläufen (A,B) und Elutionsschritten (1-9) dargestellt. Im diesem Silbergel ist deutlich erkennbar, dass ein großer Teil der im Rohlysat (L) befindlichen Proteine mit den Lektinen eine Interaktion eingegangen und der durchgeführte Zellaufschluss effizient gewesen ist. Nur sehr wenige Proteine haben gar nicht (A) oder nur unspezifisch (B) an die Lektine binden können und sind damit im Durchlauf enthalten. Dies wird durch die Detektion sehr geringer Proteinbanden oberhalb der 70 kDa Bande und im Bereich zwischen 15 kDa-70 kDa in den Spuren A und B deutlich. Desweiteren ist knapp unterhalb von 15 kDa eine deutliche Proteinbande visualisierbar, die nur im Rohlysat und den beiden Durchläufen enthalten ist. Die Spuren 1-9 enthalten die nach der Lektinbindung eluierten Proteine. Die Proteine sind abwechselnd unter stark azidischen und leicht alkalischen Pufferbedingungen von den beads eluiert worden. Mit zunehmendem

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Elutionsvolumen ist eine deutlich erkennbare Elution von Proteinen zwischen 25 kDa und 70 kDa in den Spuren 1-5 beobachtbar. Während die visualiserten Proteine in den Elutionsschritten 6-9 erkennbar über den gesamten Massenbereich abnehmen. Die erste saure Elution enthält nur sehr wenige Proteine (1) im Vergleich zu den nachfolgenden Elutionsschritten (2-5), aber die Anzahl der Proteine gegenüber den beiden Durchläufen (A, B) hat zugenommen. Elutionschritt 5 fand unter leicht alkalischen Bedingungen über Nacht statt. Zum einen soll damit eine nahezu vollständige Elution der Proteine erreicht werden und zum anderen soll verhindert werden, dass sich über einen längeren Zeitraum unter den stark azidischen Bedingungen die beads auflösen beziehungsweise die verwendeten Lektine in ihrer Funktionalität zerstört werden. Die sich anschließenden Elutionsschritte 6-9 sind erneut abwechselnd unter stark azidischen und leicht alkalischen Bedingungen mit einem Zusatz von 50 % Acetonitril im Elutionspuffer durchgeführt worden. Die Zugabe von Acetonitril soll die Elutionskraft des verwendeten Puffers zusätzlich verstärken. Das die Elution unter den durchgeführten Bedingungen effizient genug gewesen ist, wird durch die letzten drei Elutionsschritte (7-9) verdeutlich. In diesen Spuren sind fast keine Proteine mehr visualisierbar.

kDa M L A B 1 1 2 2 3 4 5 6 7 7 8 9

70 55 45 35 25

Abbildung 13: Kontrolle von Bindekapazität und Elutionseffizienz von angereicherten Proteinen mit Multilektin-Affinitätschromatographie. Die Anreicherung der Proteine erfolgte im batch-Verfahren mit gleichen Anteilen an WGA, ConA und PNA. Jeweils ein Aliquot von 16 µL sind von der gebundenen (1-9) und ungebundenen (A, B) Proteinfraktion aufgetragen worden. Nach der elektrophoretischen Trennung sind die Proteinbanden mit Silber visualisiert worden. Zur Kontrolle der Bindekapazität ist zusätzlich das Rohlysat (L) nach dem Zellaufschluss aufgetragen worden. Das verwendete Verhältnis von immobilisierten Lektinen zu eingesetzter Proteinmenge sowie die verwendeten Elutionsbedingungen sind in der Art optimiert worden, um Glykoproteine anzureichern und effizient von den Lektinen zu eluieren. Abkürzungen: M = Marker, L = Rohlysat, A = ungebundene Proteine, B = unspezifisch gebundene Proteine, 1-9 = Elutionsschritte.

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Im Vergleich zur Multilektinaffinität (MLAC) ist in Abbildung 14 das Elutionsprofil einer PBA-vermittelten affinitätschromatographischen Anreicherung dargestellt. Auf das SDS-PA-Gel sind nur die Elutionsschritte (1-8) und die beiden Durchläufe der ungebundenen (A) und der unspezifisch (B) gebundenen Fraktion aufgetragen. In diesem Gel ist deutlich erkennbar, dass in allen Spuren, mit Ausnahme der Spuren 3 und 8, sehr viele Proteinbanden zwischen 25 kDa und >70 kDa visualisierbar sind. Desweiteren können einige wenige Proteinbanden in den zuvor erwähnten Spuren im Bereich zwischen 10 kDa bis 15 kDa detektiert werden. Besonders auffallend im Vergleich zum MLAC-Versuch ist, dass ein bedeutend großer Teil der im Rohlysat enthaltenen Proteine nach der Inkubationszeit nicht mit m-Aminophenylboronsäure eine reversible Interaktion eingegangen ist. Dies betrifft hauptsächlich den Bereich der nicht gebundenen und unspezifisch gebundenen Proteine ab einem Molekulargewicht von 45 kDa aufwärts in den Spuren A und B.

kDa A B M 2 3 4 1 5 6 7 8

70 55 45 35 25

Abbildung 14: Kontrolle von Bindekapazität und Elutionseffizienz von angereicherten Proteinen mit PBA-vermittelter Affinitätschromatographie. Die Anreicherung der Proteine erfolgte im batch-Verfahren. Das verwendete Verhältnis von PBA zu Proteinmenge betrug 1:1. Jeweils ein Aliquot von 16 µL sind von der gebundenen (1-8) und ungebundenen (A, B) Proteinfraktion aufgetragen worden. Nach der elektrophoretischen Trennung sind die Proteinbanden mit Silber visualisiert worden. Abkürzungen: M = Marker, A = ungebundene Proteine, B = unspezifisch gebundene Proteine, 1-8 = Elutionsschritte, PBA = m-Amino-Phenylboronsäure.

Die ersten vier Elutionsschritte sind mit einem Taurin-haltigen Sorbitol-Puffer unter alkalischen Bedingungen durchgeführt worden (Spur 1-4). Anschließend erfolgte die Proteinelution mit Borat und NaCl in Kombination oder nacheinander (Spur 5-6,8). In Spur 7 ist die Elution mit Wasser aufgetragen. Allgemein ist erkennbar, dass die

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Elution der Proteine von Spur 1 zu Spur 4 abnimmt, aber anschließend wieder deutlich in den Spuren 5-7 zunimmt und ihr Bandenmuster sowie die Intensität vergleichbar mit der Proteinelution von Spur 1 ist. Im letzten Elutionsschritt sind kaum noch Proteine detektierbar, so dass die Elution effizient genug gewesen ist. Die Spuren 2 und 3 zeigen ein vergleichbares Elutionsprofil wie die Durchläufe in den Spuren A und B. Dennoch zeigen sie ein leicht verändertes Bandenmuster zwischen 25 kDa und 35 kDa auf. Gleichzeitig ist in Spur 3 keine Doppelbande bei 15 kDa eindeutig visualisierbar. Nach der vierten Elution (4) werden nur noch Proteine oberhalb von 45kDA detektiert. Interessanterweise führt der Austausch von Taurin/Sorbitol gegen Borat/NaCl und die Erhöhung des pH-Wertes von 8,7 auf 9,8 im Elutionspuffer zu einem deutlichen Anstieg der Elutionskraft des Puffers, was mit einer Zunahme an visualisierbaren Proteinen in den Spuren 5 und 6 einhergeht. Das Elutionsprofil dieser beiden Spuren ist vom Bandenmuster und der Proteinintensität mit dem ersten Elutionsschritt (1) vergleichbar. Desweiteren weist diese Elution Ähnlichkeiten mit den Spuren A und B auf, aber mit einer deutlichen Zunahme an Proteinbanden und Intensität im Bereich zwischen 25 kDA und 35 kDa. Ein nochmaliger Wechsel des Elutionspuffers führt zu einem vergleichbaren Elutionsprofil wie in den vorangegangenen Spuren 1, 5 und 6.

4.1.2.2 Anreicherung von integralen Plasmamembranproteinen mit Lektinen und m-Amino-Phenylboronsäure

Die Anreicherung von glykosylierten Plasmamembranproteinen ist vergleichend mit Lektinen und m-Amino-Phenylboronsäure im batch-Verfahren durchgeführt worden. Mit beiden Matrixliganden konnten aus 12 MudPIT-Analysen insgesamt 636 unterschiedliche Proteine massenspektrometrisch identifiziert werden, die sich auf beide Strategien nahezu gleichmäßig verteilen (vgl. Abb 15A). 248 Proteine konnten durch Verwendung der Lektine WGA, PNA und ConA nach der Anreicherung (MLAC) identifiziert werden. Im Vergleich dazu ergab die PBA-vermittelte Affinitätschromatographie 223 Proteine. Erstaunlicherweise können nur 26 % (165) aller identifizierten Proteine mit beiden Methoden angereichert werden. Von diesen 636 angereicherten Glykoproteinen sind über 23 % (148) Plasmamembranproteine. 70 von 148 Proteinen sind mit mindestens einer Transmembrandomäne in der Plasmamembran humaner Spermatozoen lokalisiert.

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Multilektinaffinitätschromatographie

Nach der Inkubation des Rohlysates mit 3 spezifischen Lektinen konnten insgesamt 483 Proteine identifiziert werden. Davon befinden sich 413 Proteine entweder in der gebundenen oder in der ungebundenen Fraktion, während 70 zusätzliche Proteine in beiden Fraktionen vorhanden sind (siehe Abbildung 15A). Fast 80 % (279 von 349) aller identifizierter Proteine (483) befinden sich nur in der gebundenen Fraktion, während weitere 18,3 % (64 von 134) nur in der ungebundenen Fraktion nachgewiesen werden konnten (siehe Abbildung 15B, links). Die verbleibenden Proteine befinden sich in beiden Fraktionen. Nach Entfernung aller Duplikate der gebundenen und ungebundenen Fraktion verbleiben 413 Proteine (vgl. Abbildung 15C, links). Davon sind 8 % (32) als integrale Membranproteine mit mindestens einer Transmembrandomäne in der Plasmamembran lokalisiert. Weitere 5 % (22) können als Plasmamembranproteine klassifiziert werden, die aber nicht über Transmembrandomänen in der Membran verankert sind. Den Hauptanteil bilden mit 87 % alle anderen Membranproteine sowie lösliche und Membran-assoziierende Proteine.

PBA-vermittelte Affinitätschromatographie

Nach Durchführung der PBA-vermittelten Affinitätschromatographie konnten insgesamt 476 Proteine massenspektrometrisch nachgewiesen werden (siehe Abbildung 15A). Davon sind 388 Proteine entweder in der gebundenen oder in der ungebundenen Fraktion detektiert worden, während 88 Proteine in beiden Fraktionen vorkommen. Wie die rechte Seite der Abbildung 15B verdeutlicht, sind ungefähr 49 % (232 von 320) aller mit dieser Methode identifizierten Proteine (476) eine Interaktion mit PBA eingegangen, während knapp 14 % (68 von 156) keine Affinität zu PBA aufzeigen. Die verbleibenden 37 % aller angereicherten Proteine konnten sowohl in der gebundenen als auch in der ungebundenen Fraktion nachgewiesen werden. Nach Entfernung aller Duplikate aus der gebundenen und ungebundenen Fraktion verbleiben 388 Proteine (vgl. Abbildung 15C, rechts). Davon sind 11 % (39) als integrale Membranproteine mit mindestens einer Transmembrandomäne in der Plasmamembran lokalisiert. Weitere 13 % (52) können als Plasmamembranproteine klassifiziert werden, die aber nicht über Transmembrandomänen in der Membran verankert sind. Den Hauptanteil bilden mit 76 % alle anderen Membranproteine sowie lösliche und Membran-assoziierende Proteine.

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A MLAC PBA

248 165 223

279 70 64 68 88 232

Ungebundene Gebundene Fraktion Gebundene Fraktion Fraktion

8% 11% 5% 13%

76% 87%

Proteine PMP IPMP Proteine PMP IPMP

Abbildung 15: Vergleich der Anreicherungseffizienz von integralen Plasmamembranproteinen zwischen Multilektin- und PBA-vermittelter Affinitätschromatographie. Mit der Affinitätschromatographie können insgesamt 636 Proteine identifiziert werden. Davon lassen sich 165 Proteine sowohl mit MLAC als auch PBA anreichern (A). Mit MLAC können 413 Proteine angereichert werden, von denen 279 Proteine nur in der gebundenen und 64 Proteine nur in der ungebundenen Fraktion nachweisbar sind. 70 Proteine verteilen sich auf beide Fraktionen (B, links). Insgesamt lassen sich mit dieser Methode 32 (8 %) integrale Plasmamembranproteine identifizieren (C, links). Die Verwendung von PBA als Matrixliganden ermöglicht die Anreicherung von 388 Proteinen. Davon sind 88 Proteine sowohl in der gebundenen als auch in der ungebundenen Fraktion enthalten. Mindestens 36 % der identifizierten Proteine gehen eine Interaktion mit PBA ein, während 68 Proteine in der ungebundenen Fraktion nachweisbar sind. Dennoch ist eine Steigerung an integralen Plasmamembranproteinen um 3 % im Vergleich zu MLAC möglich. Abkürzungen: MLAC = Multilektin- Affinitätschromatographie, PBA = m-Amino-Phenyl-vermittelte Affinitätschromatographie, PMP = Plasmamembranproteine, IPMP = integrale Plasmamembranproteine, Proteine = Membranproteine, lösliche und membranassoziierende Proteine.

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4.2 Funktionelle Charakterisierung angereicherter Plasmamembranproteine

Im Anschluss an die Anreicherung, flüssigchromatographische Trennung und massenspektrometrische Analyse sind die resultierenden Peptidfragmentionen mit Hilfe des SEQUEST-Algorithmus gegen die humane Datenbank in SwissProt gesucht worden. Nach erfolgter Zuordnung der Peptide zum entsprechenden Protein sind die integralen Plasmamembranproteine manuell nach ihrer molekularen Funktion in Anlehnung an die GO-Annotierung charakterisiert worden. In Abbildung 16 sind für die verwendeten und jede einzelne Anreicherungsstrategie die identifizierten Plasmamembranproteine eingeteilt nach ihrer molekularen Funktion bezüglich der Signaltransduktionsprozesse zusammenfassend dargestellt. Besonders effizient konnten mit den vier verwendeten Strategien Rezeptoren, einschließlich der G- Protein gekoppelten Rezeptoren, und Enzyme angereichert werden. Aber auch Proteine, die als Kanäle fungieren sowie an der Zelladhäsion und dem Transport beteiligt sind, lassen sich verstärkt identifizieren. Mit dem Begriff „sonstige“ sind Proteine zusammengefasst, die bezüglich ihrer Funktion nicht direkt mit Signaltransduktionsprozessen in Spermatozoen in Verbindung stehen oder deren molekulare Funktion noch nicht aufgeklärt ist. Die insgesamt 280 identifizierten integralen Plasmamembranproteine verteilen sich wie folgt auf die einzelnen Kategorien: 124 Rezeptoren, 46 Enzyme, 24 Zelladhäsions-, 16 Transport- und 11 Kanalproteine sowie 9 Proteine, die am Vesikeltransport beteiligt sind. Den verbleibenden 18 % (50; sonstige) kann keine eindeutige Funktion zugeordnet werden. Ein allgemeiner Vergleich der Strategien untereinander spiegelt wieder, dass ein affinitätschromatographischer Anreicherungsschritt Proteine, denen keine spezielle Funktion zugeordnet wird, um bis zu 30 % reduzieren kann. Dabei nimmt die Anzahl von 39 Proteinen bei der klassischen Affinitätsverteilung (2PS ohne WGA) auf 9 Proteine bei der Affinitätsverteilung mit WGA ab und bezogen auf die Affinitätschromatographie sogar auf 6 Proteine (MLAC) bzw. 3 Proteine (PBA). Interessanterweise ist eine 3,5-fache Identifizierungszunahme für Rezeptoren bei Verwendung der Affinitätsverteilung im Vergleich zur Affinitätschromatographie beobachtbar. Wird aber die Anzahl der identifizierten Rezeptoren auf die angereicherte Menge an integralen PMPn pro Anreicherungsstrategie bezogen, sind ungefähr 50% dieser Proteine bei MLAC (32) und 2PS mit WGA (100) Rezeptoren. Vergleichsweise nur 35 % (von 158) bzw. 33 % (von 39) lassen sich nach der

E r g e b n i s s e S e i t e | 63 klassischen Affinitätsverteilung bzw. PBA-vermittelter Affinitätschromatographie als Rezeptoren klassifizieren. Bei der klassischen Affinitätsverteilung kann die Anzahl an integralen Plasmamembranproteinen mit Transport- und Zelladhäsionsfunktion im Vergleich zur Affinitätsverteilung mit WGA um 50 % und bezüglich der Kanalproteine um das 3-fache verbessert werden. Rezeptoren und Enzyme weisen dagegen vergleichbare Werte für beide Verteilungsstrategien im wässerigen System auf. Besonders effizient lassen sich mittels Affinitätschromatographie Matrixliganden- unabhängig Rezeptoren anreichern. Bemerkenswert ist auch die Tatsache, dass Zelladhäsionsproteine eine starke Affinität zu m-Amino-Phenylboronsäure aufzeigen (siehe Abbildung 16, PBA).

Gesamt

2PS ohne WGA

2PS mit WGA

MLAC

PBA

2PS ohne PBA MLAC 2PS mit WGA Gesamt WGA Rezeptoren 13 15 53 55 124 Enzyme 8 5 21 31 46 Transporter 2 1 6 11 16 Kanalproteine 2 1 2 6 11 Zelladhäsion 9 2 6 11 24 Vesikeltransport 2 2 3 5 9 Sonstige 3 6 9 39 50

Abbildung 16: Funktionelle Charakterisierung von integralen Plasmamembranproteinen. Angereicherte integralen Plasmamembranproteine sind in 7 Kategorien zusammengefasst und für jede Anreicherungsstrategie graphisch dargestellt. Mit den verwendeten Strategien lassen sich besonders effizient Rezeptoren und Enzyme anreichern. Die Verwendung eines Affinitätsschrittes führt zur Reduzierung von Proteinen, denen keine Funktion innerhalb der 6 Kategorien zugeordnet werden kann oder deren Funktion unbekannt ist (Sonstige). Abkürzungen: PBA = m-Amino- Phenylboronsäure, MLAC = Multilektinaffinitätschromatographie, 2PS mit/ohne WGA = Affinitätsverteilung im wässerigen biphasischen System mit/ohne Weizenkeimagglutinin-Affinität.

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4.3 Massenspektrometrische Identifizierung olfaktorischer Rezeptoren in der Plasmamembran humaner Spermatozoen

Im ersten Teil konnte mit der Affinitätsverteilung im wässerigen biphasischen System mit und ohne Lektinaffinität und der Multilektin- bzw. PBA-vermittelten Affinitätschromatographie gezeigt werden, dass integrale Plasmamembranproteine effizient und Detergenzien-frei aus humanen Spermatozoen angereichert werden können. Für die Identifizierung dieser niedrig abundanten integralen Membranproteine ist eine Kombination aus optimaler Anreicherungsstrategie und äußerst sensitiven massenspektrometrischen Methoden unabdingbar.

4.3.1 Analyse niedrig abundanter Membranproteine mit linearen Ionenfallen

Integrale Plasmamembranproteine mit einer Rezeptoraktivität konnten besonders effizient angereichert und massenspektrometrisch identifiziert werden. Zwischen 80 % und 87 % der identifizierten Rezeptoren pro Anreicherungsstrategie vermitteln Signale im Bereich der Plasmamembran über kleine membranständige G-Proteine. Abbildung 17A verdeutlicht, dass je nach Anreicherungsstrategie 52 %-92 % aller G- Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRn) der Familie der olfaktorischen Rezeptoren (ORn) zugeordnet werden können. Diese hohen prozentualen Werte spiegeln eine starke Verzerrung wider, da generell nur eine geringe Anzahl an GPCRn detektierbar ist. Dabei werden doppelt bis viermal so viele olfaktorische Rezeptoren durch die Affinitätsverteilung im wässerigen System (24/26) mit anschließender massenspektrometrischer Analyse identifiziert im Vergleich zur durchgeführten Anreicherung mittels Affinitätschromatographie (6/12). Insgesamt konnten 59 olfaktorische Rezeptoren außerhalb des Riechepithels in der Plasmamembran humaner Spermatozoen mit den verwendeten Anreicherungsstrategien in Kombination mit der Massenspektrometrie identifiziert werden. Diese Rezeptoren verteilen sich auf 14 Familien (siehe Abbildung 17B). Besonders dominant sind die Familien 2 und 5, die mit 12 bzw. 13 Rezeptoren in der Plasmamembran lokalisiert sind und die mit 42 % die größte Gruppe bilden. Über 18 % (11) der olfaktorischen Rezeptoren sind Vertreter der Familien 10 und 52. Die dritte Gruppe (15) umfasst die Familien 1, 4, 8 und 9. Ihr können 3 bis 4 Rezeptoren pro Familie zugeordnet

E r g e b n i s s e S e i t e | 65 werden. Die verbleibenden 6 Familien haben ein bis zwei Rezeptoren, die in der Plasmamembran lokalisiert sind.

A 2PS 2PS MLAC PBA ohne WGA mit WGA Rezeptoren 54 53 16 13

davon GPCR 43 46 13 11

davon OR 26 24 12 6

B 13 OR-Familien 12

6 5 4 4 4 3 2 2 1 1 1 1

1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 13 51 52 56

Abbildung 17: Massenspektrometrische Identifizierung von olfaktorischen Rezeptoren mit linearen Ionenfallen. Dargestellt ist die Verteilung identifizierter olfaktorischer Rezeptoren auf die einzelnen Anreicherungsstrategien (A) und ihre Verteilung auf die einzelnen Familien (B). Das wässerige biphasische Affinitätsverteilungssystem reichert doppelt bis dreifach so viele olfaktorische Rezeptoren im Vergleich zur Affinitätschromatographie an (A). Insgesamt können 59 olfaktorische Rezeptoren verteilt auf 14 Familien massenspektrometrisch identifiziert werden (B). Besonders dominant sind olfaktorische Rezeptoren der Familien 2 und 5 in der Plasmamembran humaner Spermatozoen lokalisiert. Sechs weiteren Familien können 3-6 Rezeptoren pro Familie zugeordnet werden. Die restlichen Familien sind mit 1-2 Rezeptoren in der Plasmamembran vorhanden. Abkürzungen: GPCR = G Protein-gekoppelter Rezeptor, OR = olfaktorischer Rezeptor, 2PS mit/ohne WGA = Affinitätsverteilung im wässerigen biphasischen System mit und ohne Weizenkeimagglutinin- Affinität, MLAC = Multilektinaffinität, PBA = m-Amino-Phenylboronsäure-vermittelte Affinitätschromatographie.

4.3.2 Semi-quantitative Analyse von Membranproteinen mit Triple- Quadrupolen

Obwohl die olfaktorischen Rezeptoren effizient angereichert und stark abundante membranassoziierende und lösliche Proteine vor der massenspektrometrischen

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Analyse entfernt worden sind, konnte aufgrund der Probenkomplexität und der erreichten Detektionsgrenze des verwendeten Massenspektrometers häufig nur ein Peptid pro olfaktorischem Rezeptor identifiziert werden, wobei das MS/MS-Spektrum manuell überprüft wurde. Damit die Identifizierung eindeutig ist, wurden nach Anreicherung der Plasmamembranproteine im klassischen biphasichen System (2PS ohne WGA) eine semi-quantitative Analyse der bislang identifizierten olfaktorischen Rezeptorpeptide mittels selected reaction monitoring an einem Quadrupolgerät durchgeführt. Zur Methodenoptimierung ist im Vorfeld das alpha-Caseinprotein in die Pinpoint- software geladen, in-silico mit Trypsin verdaut und bevorzugte Übergängen resultierender Peptide ausgewählt worden. Schließlich wurde ein SRM auslösendes MS/MS-Experiment mit 79 eindeutigen Übergängen, die 19 Peptiden zugeordnet werden und den entsprechend vorgeschlagenen Kollisionsenergien durchgeführt. Nach erfolgter Datenbanksuche konnten 3 Peptide anhand der ausgewählten Übergänge mittels ausgelöster MS/MS-Spektren identifiziert werden (siehe Tabelle 3).

Tabelle 3: Identifizierung der doppelt-geladenen alpha-Caseinpeptide YLGYLEQLLR (m/z = 634), FFVAPFPEVFGK (m/z = 692) und HQGLPQEVLNENLLR (m/z = 880) mit SRM und SRM-ausgelösten MS/MS Experimenten. Dargestellt sind für die einzelnen Peptide jeweils 4 Übergänge (m/z) sowie die Intensitäten bei entsprechender Retentionszeit. Abkürzungen: RT = Retentionszeit, SRM = selected reaction monitoring, MS2 = Tandemmassenspektrometrie.

Übergänge SRM/MS2 SRM Peptid Fragment RT [min] Intensität RT [min] Intensität Ion Ion 401 6,41*104 2,67*104 529 2,21*105 8,33*104 634 25,18 25.84 658 3,90*105 1,38*105 771 4,84*105 1,78*105 450 2,06*104 1,53*105 579 3,64*103 2,63*104 692 26,05 26.45 676 1,22*105 9,67*105 823 1,80*104 1,35*105 401 2,59*103 2,04*104 515 7,22*103 4,50*104 880 19,92 20.21 644 2,46*103 1,62*104 758 7,19*103 3,29*104

In Abbildung 18 ist die relative Intensität gegen die Retentionszeit für die vier ausgewählten Übergänge des doppelt geladenen alpha-Caseinpeptides

E r g e b n i s s e S e i t e | 67

YLGYLEQLLR dargestellt. Alle vier Übergänge werden nach 25,18 Minuten von der RP-Phase mit einer relativen Intensität von 6,41*104 bis 4,48*105 eluiert (siehe Tabelle 3). Basierend auf den Ergebnissen der SRM ausgelösten MS/MS- Experimente sind zur Implementierung von Reproduzierbarkeit und Intensität weiter SRM-Experimente ohne auslösende MS/MS vergleichend durchgeführt worden. Peptide, die in Tabelle 3 dargestellt sind, eluieren 0,3 min bis 0,5 min später von der RP-Phase, wenn klassische SRM-Experimente im Vergleich zu SRM ausgelösten MS/MS-Versuchen verwendet werden. Dennoch liegt das Elutionsprofil innerhalb eines kleinen Zeitfensters und die Intensitäten für die einzelnen Übergänge weisen vergleichbare Werte auf, so dass falsch positive Ergebnisse ausgeschlossen werden können.

Abbildung 18: Elutionsprofil der individuellen Übergänge des doppelt-geladenen alpha-Casein- Peptides YLGYLEQLLR in Abhängigkeit von der relativen Intensität. Die vier Übergänge des YLGYLEQLLR-Peptides eluieren nacheinander bei 25.18 Minuten mit einer relativen Intensität von 6,413*104 bis 4,837*105 von der RP-Phase.

Typischerweise werden triple-Quadrupolgeräte für die quantitative Analyse eingesetzt. Für die Identifizierung von niedrig abundanten olfaktorischen Rezeptoren aus einer komplexen Peptidmischung wurde die SRM-Option des triple- Quadrupolgerätes nur semi-quantitative benutzt. Die Identifizierung der ORn mittels SRM basiert auf 4-8 Übergängen pro Rezeptorpeptid aus den Ionenfallenexperimenten (vgl. 4.3.1). Insgesamt ist eine Liste mit 214 Übergängen

E r g e b n i s s e S e i t e | 68 verwendet worden, die von 38 Peptiden stammen, die wiederum 33 ORn zugeordnet werden können (siehe Anhang; Tabelle 6). Für die erhaltenen Ergebnisse ist beispielhaft in Abbildung 19 das doppelt geladene Peptid EVDNHTVTTR des olfaktorischen Rezeptors OR6Y1 mit den entsprechenden Übergängen und den dazugehörigen Intensitäten bei einer Elutionszeit von 36,96 Minuten dargestellt. Dabei entsprechen die y-Ionen 5, 6 und 8 des MS/MS-Spektrums den Übergängen 586 > 577, 586 > 714 und 586 > 943 aus dem SRM-Profil.

Abbildung 19: Vergleich MS/MS-Spektrum und SRM-Chromatogramm des doppelt geladenen Peptides EVDNHTVTTR des olfaktorischen Rezeptors OR6Y1 isoliert aus humanen Spermatozoen. Die individuellen Übergänge 586 > 577, 714 und 943 der SRM-Messung entsprechen den y-Ionen 5, 6 und 8.

4.3.3 Identifizierung intra- und inter-individueller Unterschiede im Expressionsmuster olfaktorischer Rezeptoren

Nachdem die Identifizierung einzelner olfaktorischer Rezeptoren aus einer komplexen Peptidmischung erfolgreich gewesen ist, wurden mit weiteren SRM- Experimenten individuelle Unterschiede im Expressionsmuster von olfaktorischen Rezeptoren zwischen fertilen und infertilen Männern untersucht. Basierend auf den Erkenntnissen von Spehr und Kollegen, dass olfaktorische Rezeptoren nach der Erkennung ihres spezifischen Agonisten sich chemotaktisch zum Odormolekül bei

E r g e b n i s s e S e i t e | 69 gleichzeitiger Zunahme der Motilität bewegen3, sind für die durchgeführte Studie nur infertile Männer berücksichtigt worden, deren Spermatozoen eine eingeschränkte bis gar keine Motilität aufzeigen und eine in vitro Fertilisation nur durch intracytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) möglich ist. Zur Kontrolle sind zwei Kandidaten ausgewählt worden, die bereits eigene Kinder haben und sich über einen längeren Zeitraum für diese Studie zur Verfügung stellen konnten.

Tabelle 4: Untersuchung inter-individueller Unterschiede im Expressionsmuster olfaktorischer Rezeptoren mittels LC-SRM-MS. Insgesamt konnten 14 olfaktorische Rezeptoren mit SRM identifiziert werden. Dabei lassen sich intra- und inter-individuelle Unterschiede bei fertile und infertile Patienten feststellen. 8 von 14 Rezeptoren werden nur in den Kontrollpatienten exprimiert, während 3 Rezeptoren ausschließlich in der Plasmamembran humaner Spermien von infertilen (ICSI) Patienten lokalisiert sind. Abkürzungen: OR = olfaktorischer Rezeptor, K = Kontrollpatient (fertil), ICSI = Patient für intrazytoplasmatische Spermieninjektion (infertil).

OR Peptidsequenz K K ICSI ICSI ICSI ICSI ICSI 1 2 1 2 3 4 5 2A14 FFLSHLAIVDISY X 2C3 YGSIIFMYL X X X X 2S2 LVILLGNGVLIL X X 2Z1 RGEGATSYGGGAAQIFF X X X X 4C15 IVVTILSSPALLVSPMY X X 6Y1 EVDNHTVTTR X X 7D2 LIGVMTSLLHISLMMHL X X X X 8K1 MFILVAILRMNSR X 10A4 MGNVLIILVTIADSAL X X X X 10J1 PVMKLSCIDTTVNEILTL X X X 11H6 CYPVPIVL X X X X X 13C9 ACADISGNEFLMLVATILF X 52A5 QMWLIHSFQAIESGILL X 52W1 ALALKAVAIVVPFPL X X

In Tabelle 4 sind die Ergebnisse der zuvor beschriebenen Studie zusammenfassend dargestellt. Insgesamt konnten 14 von 33 ausgewählten olfaktorische Rezeptoren mittels SRM-Experimenten identifiziert werden. Es lassen sich sowohl inter- als auch intra-individuelle Unterschiede im Expressionsprofil von olfaktorischen Rezeptoren ausserhalb des Riechepithels nachweisen. Ungefähr 79 % der 14 identifizierten Rezeptoren sind in der Plasmamembran humaner Spermatozoen von fertilen Männern lokalisiert. Dafür sind jeweils 2 mg Lysat von 3-4 Replikaten im klassischen biphasischen System (2PS ohne WGA) angereichert worden. Die vier Rezeptoren OR2S2, OR4C15, OR6Y1 und OR52W1 lassen sich in beiden Kontrollpatienten (K1 und K2) identifizieren. In der Plasmamembran von Kontrollpatient K1 befinden sich zwei weitere Rezeptoren (OR2A14 und OR13C9), die weder bei Kontrollpatient K2 noch bei den ICSI-Patienten nachweisbar sind. Im Vergleich zu K1 enthält K2

E r g e b n i s s e S e i t e | 70 ebenfalls zwei Rezeptoren, die nur in seiner Plasmamembran identifizierbar sind. Es handelt sich dabei um die Rezeptoren OR8K1 und OR52A5. Zusätzlich sind drei Rezeptoren nur bei K2 und 3 von 5 ICSI-Patienten vorhanden, die bei K1 nicht detektierbar sind. K1 besitzt vergleichsweise nur Rezeptoren, die entweder bei ihm oder K2, aber bei keinem der ICSI-Patienten identifiziert werden konnten. Für die Untersuchung von inter-individuellen Unterschieden sind 60-200 µg Lysat von 5 ICSI- Patienten verwendet worden. Ein Vergleich der ausgewählten Rezeptoren in Tabelle 4 zeigt, dass 8 Rezeptoren nur bei Kontrollpatienten (K1 und K2) detektierbar sind. Erstaunlicherweise lassen sich nur die olfaktorischen Rezeptoren OR10A4, OR10J1 und OR11H6 bei den ICSI-Patienten identifizieren, während 21 % der identifizierten Rezeptoren in allen Patientenproben nachweisbar sind.

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5. Diskussion

5.1 Einfluss und Bedeutung von Hydrophobizität und PTMn integraler Plasmamembranproteine auf die Anreicherungseffizienz

5.1.1 Einfluss der Hydrophobizität von Membranproteinen auf die Anreicherungseffizienz

Die Plasmamembran eukaryotischer Organismen bildet die Schnittstelle zwischen dem Innenraum biologischer Zellen und ihrer extrazellulären Umgebung. Sie übernimmt essentielle Funktionen, die für Überleben, Transportprozesse, Kommunikation und Fortpflanzung für die Zelle selbst und den kompletten Organismus von enormer Bedeutung sind. Daran sind äußerst hydrophobe Proteine mit extrem niedriger Abundanz beteiligt299, die die Plasmamembran mit mindestens einer Transmembrandomäne durchspannen. Diesbezüglich ist die Entwicklung und Optimierung von äußerst selektiven Anreicherungsstrategien notwendig um effizient integrale Plasmamembranproteine anzureichern bei gleichzeitiger Abreicherung hoch abundanter Proteine40 und um den Verlust von Plasmamembranproteinen während der Fraktionierung zu reduzieren47. Eine besonders selektive und sensitive Methode zur Isolation von Plasmamembranen ist die Verteilung der Membranen in einem wässerigen biphasischen System, das aus einem hydrophoben (PEG) und einem hydrophilen (Dx) Polymer besteht. Dieses System nutzt zur Anreicherung die hydrophoben und hydrophilen Oberflächeneigenschaften sowie die Nettoladung der Proteine vor Partikelgrösse und Dichte aus29, 48. Dabei tendieren Plasmamembranen aufgrund ihrer Phasenaffinität zur oberen PEG-Phase, gefolgt von Membranen des Golgiapparates, Lysosoms, Endoplasmatischen Retikulums und Mitochondriums48, wobei diese Verteilung speziesunabhängig32 ist und vermutlich auf die hydrophoben/hydrophilen Eigenschaften der einzelnen Membranen zurückzuführen ist30, 31, 48. Die Effizienz des angewandten Systemes ist ausserdem vom Verteilungskoeffizienten abhängig. Dieser kann durch Ionenzugabe, Änderungen von pH-Wert, Konzentration oder Molekulargewicht des verwendeten PEGs zusätzlich beeinflusst werden29, 39, 48. So führt die Optimierung des Verteilungskoeffizienten zur Steigerung an integralen Bakterienmembranproteinen um das Fünffache bei gleichzeitiger Reduzierung von zytosolischen Proteinen (88 % auf 55 %)39. Für die

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Anreicherung integraler Plasmamembranproteine aus humanen Spermatozoen ist ein optimiertes klassisches biphasisches System bestehend aus 6,5 % PEG 6000, 6,5 % Dx T500, 200 mM Tris/H2SO4 pH 7,5 verwendet worden. Damit konnten 1501 eindeutige Proteine identifiziert werden. Davon sind 159 Proteine (11 %) mit mindestens einer Transmembrandomäne in der Plasmamembran humaner Spermatozoen lokalisiert. Diese identifizierten integralen Plasmamembranproteine umfassen hauptsächlich Rezeptoren, Enzyme, Transportproteine sowie Proteine, die Kanäle formen, an der Zelladhäsion oder dem Vesikeltransport beteiligt sind. Vergleichbare biphasische Systemzusammensetzungen werden für die Anreicherung von Membranproteinen aus Leber49, Blutplättchen34, 50 oder Gehirngewebe38, 47 in der Literatur beschrieben. Im Vergleich zu diesen Systemen ist für die Isolation von Plasmamembranproteinen aus humanen Spermatozoen die Konzentration an Tris von 15 mM auf 200 mM erhöht und ein PEG mit größerem Molekulargewicht verwendet worden. Mit dem beschriebenen optimierten klassischen biphasischen System konnten 21 % PMP aus humanen Spermatozoen angereichert werden im Vergleich zu 29 % in Blutplättchen und 39 % in Hirngewebe. Zur weiteren Steigerung der Selektivität dieses Systemes können diverse Liganden an einen der beiden Polymere gekoppelt werden48. Als besonders effizient stellt sich für Plasmamembranproteine die Kopplung des Weizenkeimagglutinins an Dextran heraus38, 47, da sich Dextran nur in sehr geringer Konzentration in der PEG-Phase ansammelt als umgekehrt PEG in der Dx-Phase, das größere Molekulargewicht von Dextran weniger die Phasentrennung beeinflusst, wenn ein Ligand gekoppelt ist oder eine limitierende Anzahl an Bindestellen für das Zielmolekül am Liganden vorliegt48. Mit diesem zusätzlichen Affinitätsschritt konnten 789 Proteine in humanen Spermatozoen identifiziert werden, von denen 56 % (102) mit mindestens einer Transmembrandomäne in der Plasmamembran lokalisiert sind. Bedingt durch diese Selektivität reduzierte sich die Anzahl eindeutig identifizierter Proteine im Vergleich zum klassischen System um das 3,3-fache von 1020 auf 308 bei gleichzeitig erwünschter Abreicherung von Proteinen, denen keine eindeutige Funktion zugeordnet werden kann. Für die Verwendung des wässerigen biphasischen Systemes spricht I) die Membranselektivität mit und ohne zusätzlichen Affinitätsschritt, II) niedrig abundante Membranproteine können trotz geringer Ausgangsmengen effizient angereichert werden und III) die milden Bedingungen bei einem sehr hohen Wasseranteil ermöglichen den Erhalt der biologischen

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Funktionalität der Proteine29. Darüber hinaus verdeutlichen die Ergebnisse, dass sich mit dem Verteilungssystem bevorzugt Plasmamembranproteine mit einer und sieben Transmembrandomänen anreichern lassen. Erstaunlicherweise ist auch die Identifizierung von Proteinen mit bis zu 24 Transmembrandomänen möglich. Interessanterweise bewirkt die Verwendung von WGA als Ligand an Dextran, dass integrale Plasmamembranproteine ohne zugehörige molekulare Funktion hinsichtlich des Fertilisationsprozesses um 30 % minimiert werden können. Gleichzeitig ist kein signifikanter Unterschied bezüglich der Anreicherung von Rezeptoren erkennbar, so dass zur vollständigen Identifizierung von Rezeptoren auf den zusätzlichen Affinitätsschritt nicht verzichtet werden kann, da die Überlappung nur auf eine geringe Anzahl von Rezeptoren zutrifft.

5.1.2 Bedeutung von Glykosylierungen auf die Anreicherungseffizienz

Glykosylierungen sind spezies-, gewebs-, zelltyp- und proteinspezifische posttranslationale Modifikationen. Diese können die Proteinstabilität erhöhen, Proteine vor unerwünschter Proteolyse schützen, sind essentiell für die Konformation und sind imstande die Bindeaffinität zu verändern. Außerdem sind sie ein wichtiger Strukturbestandteil und essentiell für Zellinteraktionen51. Die Glykosylierung selbst findet im endoplasmatischen Retikulum statt und die glykosidische Verknüpfung der Kohlenhydratseitenketten der N-Glykane mit Asparagin und der O-Glykane mit Serin- bzw. Threonin erfolgt innerhalb des Peptidrückgrates52. Dabei weisen Plasmamembranproteine verstärkt N-Glykosylierungsmuster auf, während die Zuckerreste von Kernproteinen und zytoplasmatischen Proteinen O-glykosidisch verknüpft sind. Die Isolierung und Separation von glykosylierten Proteinen der Plasmamembran humaner Spermatozoen ist mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung verschiedener Liganden erfolgt. Lektine binden dabei ein oder mehrere spezifische Zuckerreste, während Boronsäurederivate zyklische Ester über die diol- Gruppen von Sacchariden, Nukleotiden oder Nukleosiden formen28, 53, 54. Diesbezüglich muss vor der Anreicherung von glykosylierten Proteinen die im Lysat enthaltene Saccharose des Lysepuffers entfernt werden. Da dieses Disaccharid ansonsten als potentieller Ligand mit den Glykoproteinen um die Lektin- oder PBA- Bindestelle konkurrieren würde. Einerseits wird Saccharose-haltiger Puffer zur Lyse von Zellen als Standardpuffer in der Literatur beschrieben11, andererseits kann auf

D i s k u s s i o n S e i t e | 74 dieses Disaccharid schwer verzichtet werden, da isotonische Bedingungen für den Aufschluss benötigt werden und alternativ beschriebene Zusätze wie Natriumchlorid vergleichbare Probleme hervor rufen55. Techniken wie eine Detergenzienextraktion56, Homogenisierung57 oder ein hypertonischer Schock58 benötigen viel Ausgangsmaterial, können die Enzymaktivität inhibieren, zur Denaturierung von Proteinen führen oder das Lysat ist mit anderen nicht für die gewünschte Fragestellung in Frage kommenden zellulären Bestandteilen kontaminiert11. Folglich sind die beschriebenen Techniken nicht anwendbar, da die erhältliche Proteinkonzentration und die einzusetzende Menge an Spermatozoen der limitierende Faktor ist. Trotzallem konnten insgesamt 636 Proteine mittels Affinitätschromatographie im batch-Verfahren angereichert und identifiziert werden. Davon sind 248 Proteine mit diversen Lektinen und 223 Proteine mit PBA eine reversible Interaktion eingegangen. Zur Kontrolle von Bindekapazität und Elutionseffizienz sind die eluierten Proteinfraktionen elektrophoretisch getrennt und mit Silberionen visualisiert worden. Dabei ist eine vergleichbare Anreicherungseffizienz von glykosylierten Proteinen der Plasmamembran humaner Spermatozoen für die verwendeten Liganden (Lektine und PBA) für die Affinitätschromatographie erkennbar und die Überlappung identifizierter Proteine für beide Liganden beträgt nur 26 % (165). Das die Saccharose mittels Ultrazentrifugation vor der Anreicherung effizient aus dem Rohlysat entfernt werden konnte, verdeutlicht ein Vergleich der Bindekapazitäten in den Abbildungen 13 und 14, wobei die verwendeten Lektine Glykoproteine spezifischer anreichern als PBA. Dies ist einerseits auf den Liganden selbst zurückzuführen und zum anderen auf das eingesetzte Verhältnis von immobilisierten Liganden zur Proteinmenge. Dabei ist das gewählte Verhältnis von immobilisierten Lektinen im Vergleich zur PBA-vermittelten Affinitätschromatographie optimal gewählt worden, da sehr dominante Lysatbanden kaum noch in der ungebundenen bzw. unspezifisch gebundenen Proteinfraktion der MLAC-Versuche visualisierbar sind. Ein weiterer Grund für die große Anzahl an gebundenen Proteinen scheint die Verlängerung der Inkubationszeit von 15 min59, 60 auf 60 min zu sein. Inwiefern eine Übernacht-Inkubation die Bindeeffizienz zusätzlich steigern kann, muss in zukünftigen Experimenten ausgetestet werden. Im Rahmen dieser Arbeit ist dies nicht durchgeführt worden, um irreversible Interaktionen zwischen Protein und Matrix zu vermeiden. Im Vergleich zur Lektinaffinität sind sehr viele Proteine nach der Anreicherung mit PBA in der ungebundenen bzw.

D i s k u s s i o n S e i t e | 75 unspezifisch gebundenen Fraktion detektierbar, obwohl Salze zur Stabilisierung dem Puffersystem zugesetzt waren. Dennoch ist ein großer Teil der Glykoproteine eine Interaktion mit PBA eingegangen, was die Visualisierung von deutlichen Proteinbanden in den Eluaten bestätigt. Diese Interaktion zwischen PBA und Glykoproteinen wird durch den Zusatz von Natrium- und Magnesiumchlorid stabilisiert54. Aufgrund der Unspezifität von PBA sollte das Verhältnis von Beads zu Proteinmenge nicht wie bei den MLAC-Versuchen 1:1 betragen, sondern mindestens 2:1 bis 5:1, da PBA mit jedem Glykorest eine Interaktion über die diol-Gruppe eingehen kann, während die verwendeten Lektine nur spezifische N- bzw. O-Glykane binden können. Nicht nur die Bindekapazität ist entscheiden für die effiziente Anreicherung glykosylierter Proteine, sondern auch die Elutionskraft des verwendeten Puffersystems, damit reversibel gebundene Proteine nahezu vollständig zurückgewonnen werden können. Glykoproteine, die mit Lektinen eine reversible Interaktion eingegangen sind, können mit dem entsprechenden Zucker von den Lektinen eluiert werden. Wie Abbildung 12 verdeutlicht, sind die gebundenen Proteine mit zunehmenden Elutionsvolumen vollständig eluiert werden. Zur Verstärkung der Elutionskraft des Puffers ist die Zugabe von Acetonitril nicht essentiell, aber der Wechsel des pH-Wertes unabdingbar. Desweiteren bietet eine Inkubation der Probe mit einem alkalischen Elutionspuffer den Vorteil, dass eine nahezu vollständige Rückgewinnung der reversibel gebundenen Proteine ermöglicht wird und es besteht nicht die Gefahr, dass ein stark azider Puffer über einen längeren Zeitraum die Funktionalität der Lektine negativ beeinflußt. Im Vergleich dazu sind dennoch sehr viele Glykoproteine eine Interaktion mit PBA eingegangen, obwohl die Bindekapazität nicht optimal gewählt war, wie Abbildung 14 verdeutlicht. Trotzdem sind an PBA gebundene Glykoproteine durch ausreichende Elutionsvolumina und Elutionsschritte effizient von PBA eluiert worden. In der Literatur wird sowohl die Elution mit 0,1 M Sorbitol28 für Membranproteine als auch 0,3 M Fruktose53 für die Isolation von Glykoproteinen, Nukleotiden und Nukleosiden beschrieben, wobei die Elutionskraft der Fruktose durch pH-Änderungen verstärkt werden kann. Wie aus Abbildung 14 mit einer Zunahme an visualisierbaren Proteinbanden hervorgeht, zeigen Borat- und Natriumchlorid-haltige Puffer eine stärkere Elutionskraft im Vergleich zum Taurin-haltigen Sorbitolpuffer. Auf starke pH-Wert-Veränderungen im Puffersystem ist bei PBA verzichtet worden, da eine nahezu vollständige Rückgewinnung der reversibel gebundenen Proteine durch Borat und NaCl bei

D i s k u s s i o n S e i t e | 76 leichter Erhöhung des pH-Wertes von 8,7 auf 9,8 erreicht wurde. Ferner ist für die Inkubation der vom Hersteller vorgeschlagene Taurinpuffer verwendet worden, da der beschriebene Morpholinpuffer28 scheinbar nicht kompatibel mit der anschließenden massenspektrometrischen Analyse ist (Daten nicht gezeigt). Eine Elution durch tryptische Proteolyse ist für PBA für den direkten Nachweis mit MALDI publiziert52. Aufgrund des batch-Verfahrens, der verwendeten Proteinmenge und der daraus resultierenden Probenkomplexität ist ein direkter proteolytischer Elutionsschritt für die eigene Arbeit nicht realisierbar gewesen. Von besonderem Interesse war die Anreicherung von integralen Plasmamembranproteinen (IPMP). Dabei zeigt keiner der beiden affinitätschromatographisch verwendeten Liganden eine besondere Signifikanz für IPMP auf. Mit Lektinen konnten 33 (8 %) und mit PBA 41 (11 %) aller identifizierter Proteine mit einer Plasmamembranlokalisation identifiziert werden. Besonders interessant ist im Vergleich dazu die Verteilung der IPMP auf einzelne Proteinklassen. Besonders affin sind beide Liganden für Membranrezeptoren (MLAC: 16; PBA: 13), während mit PBA zusätzlich Enzyme (9:5) und Zelladhäsionsproteine (9:2) angereichert werden können. Tendenziell ist die Multilektin- Affinitätschromatographie besser für Plasmamembranproteine geeignet, während Kernproteine, zytoplasmatische Proteine und andere lösliche Proteine bevorzugt mit PBA interagieren. Die Vermutung kann durch folgende Ergebnisse untermauert werden: mit den Lektinen WGA, ConA und PNA konnten doppelt so viele olfaktorische Rezeptoren (12:6) nach der Anreicherung identifiziert werden im Vergleich zu PBA als Ligand. Olfaktorische Rezeptoren sind in der Plasmamembran humaner Spermatozoen lokalisiert, gehören zu den G-Protein gekoppelten Rezeptoren und weisen eine extrazelluläre N-glykosydische Verknüpfung der Seitenkette mit dem Peptidrückgrat auf. Die verwendeten Lektine reichern bevorzugt N- und O-Glykane an, wobei der Anteil an N-Glykan-spezifischen Lektinen überwiegt. Desweiteren lassen die eigenen Ergebnisse vermuten, dass ORn sehr niedrig abundant in der Plasmamembran humaner Spermatozoen exprimiert werden, so dass diese mit einer größeren Wahrscheinlichkeit mit dem entsprechenden Lektin- Liganden interagieren können als mit PBA, da PBA aufgrund der Unspezifität über diol-Gruppen möglicherweise verstärkt abundante, aber lösliche O-Glykane anreichert.

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5.2 Kriterien für eine erfolgreiche massenspektrometrische Identifizierung niedrig abundanter Plasmamembranproteine humaner Spermatozoen

5.2.1 Methodische Optimierungen für die massenspektrometrische Analyse

Für die Identifizierung niedrig abundanter Plasmamembranproteine ist eine Kombination von selektiven Anreicherungsstrategien und äußerst sensitiven massenspektrometrischen Analysemethoden unverzichtbar. Diesbezüglich ist die Probenvorbereitung durch den Verzicht von Detergenzien durch Reduzierung der Aufarbeitungsschritte optimiert worden. Detergenzien werden häufig für die Solubilisierung von Membranproteinen eingesetzt, unterdrücken aber häufig Ionen, die für die anschließende Massenspektrometrie unabdingbar sind. Durch die Zugabe von Detergenzien wird die Lipiddoppelschicht der Membran gelöst, ein in Wasser löslicher Lipidkomplex setzt integrale Membranproteine frei, die sich mit den Detergenzien zu sogenannten Micellen vereinigen61. Die entstehenden Micellen variieren in Größe und Form bezüglich molekularer Topologie und physikochemischen Eigenschaften des Detergenz sowie dem Verhältnis von Lipid und Detergenz62. Der Solubilisierungsgrad wird durch die Ladung des verwendeten Detergenz beeinflusst, so dass zwischen anionischen (SDS), kationischen, nicht- ionischen (Triton X-100/114) und zwitterionischen (CHAPS, CHAPSO) Detergenzien unterschieden wird63. Mit der Verwendung von SDS und CHAPS können erfolgreich und sehr selektiv Serotonin-Rezeptoren (5HT-1A-Rezeptoren) solubilisiert und identifiziert werden. SDS besteht aus einer polaren, anionischen Sulphatgruppe und einem langen unpolaren Rest, so dass dieses Detergenz stark denaturierend wirkt. CHAPSO wird häufig als Co-Detergenz verwendet und ist strukturell mit CHAPS vergleichbar. Dieses Zwittergent wurde zur Solubilisierung von CSF-, Opiat-, Neurotensin-, Somatostatin und dem humanen Prostata-Sexhormon-bindenden Globulin-Rezeptor eingesetzt64. In Spermien konnte bislang der humane olfaktorische Rezeptor 17-4 bei der Verwendung von L-α-Lysophosphatidylcholin und SDS unter reduzierenden Bedingungen massenspektrometrisch identifiziert werden65. Auch die effiziente und nicht-denaturierende Solubilisation von Membranproteinen bei gleichzeitiger Anreicherung im wässerigen biphasichen System wurde untersucht66. Membranproteine aus Hefe isolierter Mitochondrien konnten vollständig solubilisiert werden, wenn das Zwittergent 3-10 und das nicht-

D i s k u s s i o n S e i t e | 78 ionische Detergenz Triton X-114 in Kombination verwendet werden. Die Anreicherung der Membranproteine erfolgte in einem wässerigen biphasischen System, bestehend aus Triton X-114 und PEG, in der Detergenzien-haltigen Phase, die für die anschließende massenspektrometrische Analyse zur Detergenzienentfernung elektrophoretisch getrennt wurde. Die vollständige Solubilisierung von niedrig abundanten Membranproteinen ist entscheidend für die massenspektrometrische Identifizierung. Die Verwendung von Detergenzien unterstützt einerseits die Solubilisierung, erfordert aber zusätzliche Aufreinigungsschritte zur Entfernung der störenden Detergenzien für die Massenspektrometrie, was mit einem potentiellen Verlust an Proteinen, vor allem niedrig abundanten Kandidaten einher geht. Folglich haben wir Anreicherungsstrategien optimiert, bei denen auf die Verwendung von Detergenzien verzichtet werden kann, aber gleichzeitig die Solubilisierung der Membranfraktion gewährleistet ist, eine ausreichende Proteolyse der Proteine erfolgen kann und eine Gel-freie chromatographische Trennung der Peptide mit anschließender massenspektrometrischer Analyse möglich ist. Das verwendete klassische biphasische System reichert effizient integrale Plasmamembranproteine an, ist kompatibel für den verwendeten Flüssigverdau und ermöglicht auch den Proteasen den Zugang zur Membranregion39. Diese Bedingungen sind notwendig bezüglich des hydrophoben Charakters der Membranproteine und der geringen Anzahl an tryptischen Schnittstellen innerhalb der Transmembrandomäne16, 67. Die anschließende Kombination aus Trypsin, Chymotrypsin und Surfactant ermöglicht eine direkte massenspektrometrische Analyse nach dem Flüssigverdau, da das verwendete Surfactant leicht gespalten und durch das direkte off-line Laden auf MudPIT-Säulen entfernt wird. Im Vergleich zu Detergenzien solubilisiert es Membranpellets genauso effektiv, ermöglicht den Proteasen den Zugang zu den Transmembrandomänen ohne diese zu inhibieren und es präzipitiert nicht auf dem Chromatographiematerial der Kapillarsäulen. Ein weiterer Vorteil des biphasischen Systems ist die Kombinierbarkeit mit sehr sensitiven und selektiven SRM-Methoden. Durch das Ausblenden des Hintergrundes bei gleichzeitiger Fokussierung auf vordefinierte Übergänge, kann auch die Aufarbeitung der Proben auf ein Minimum reduziert werden, was zusätzlich die Identifizierung niedrig abundanter Membranproteine erhöht bei gleichzeitiger Minimierung des Proteinverlustes. In einem zweiten Optimierungsschritt lag der Fokus auf der Entwicklung von selektiven

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Targetlisten für einzigartige Peptide für die Verwendung von SRM-Versuchen. Bislang sind zahlreiche SRM/MRM-Methoden45, 46, 68-70 für die Untersuchung von Biomarkern aus Plasma71, 72 oder die Identifizierung von posttranslationalen Modifikationen bekannt73-76. Basierend auf diesen Informationen erfolgte die Entwicklung von SRM-Methoden für die Analyse von Peptiden des transmembranen Bereiches niedrig abundanter olfaktorischer Rezeptoren humaner Spermatozoen. Für diese Experimente sollten ideale Kandidatenpeptide einzigartig sein, eine Länge zwischen 7 und 30 Aminosäuren aufweisen, keine Modifikationen oder proteolytisch überlesene Schnittstellen haben68. Für die Peptidselektion sind die Ionenfallen- Ergebnisse vorausgegangener LC-MS/MS-Messungen verwendet worden, wobei die Auswahl von Peptiden mit Methionin, Tryptophan, Asparagin oder Glutamat als potenzielle Modifikation nicht immer vermieden werden konnte. Für jedes einzigartige Peptid sind mit Hilfe der Pinpoint-Software bevorzugte Übergänge und die entsprechenden Kollisionsenergien ermittelt worden. Diese Vorgehensweise hat den Vorteil, dass die Zuordnung falsch positiver Ergebnisse minimiert wird, da das ausgewählte Peptid anhand der Ionenfällen-Experimente eindeutig einem Protein zugeordnet und damit identifiziert worden ist. Außerdem können Fehlschnitte, Modifikationen, Addukte oder die Auflösung des verwendeten Massenspektrometers die Redundanz des SRM/MRM-Ansatzes erhöhen68, 70. Wenn Ionenfallen-Ergebnisse nicht für die Methodenetablierung genutzt werden können, dann ist die Validierung der SRM/MRM-Ergebnisse hinsichtlich Retentionszeit, Fragmente und einzigartiger Peptide unabdingbar46. Dabei ist zu beachten, dass die Ergebnisvalidierung allein über die Retentionszeit nur bei gleichzeitiger Verwendung von synthetischen Standards sinnvoll ist, um falsch positive Daten zu vermeiden70. Für die Etablierung eigener SRM- Methoden ist zur Optimierung alpha-Casein in die Pinpoint-Software geladen, in-silico tryptisch verdaut und bevorzugte Übergänge resultierender Peptide ausgewählt worden. Darauf basierend ist eine Methodenetablierung einer SRM ausgelösten MS/MS-Methode mit 79 Übergängen von 19 Peptiden erfolgt. Die anschließende Datenbanksuche ermöglichte die Identifizierung von 4 Peptiden anhand der MS/MS-Spektren. Normalerweise sind MS/MS-Spektren bei dem verwendeten Triple-Quadrupol-Massenspektrometer nicht vergleichbar mit den Ergebnissen von Geräten, die als Massenanalysator eine lineare Ionenfalle besitzen. Lineare Ionenfallen akkumulieren Ionen um Sensitivität, Auflösung und Massengenauigkeit deutlich zu erhöhen. Dieser akkumulierende Effekt ist bei

D i s k u s s i o n S e i t e | 80 hintereinander geschalteten Quadrupolen nicht gegeben, so dass alle auf stabilen Bahnen befindliche Ionen die Quadrupole passieren und direkt detektierbar sind. Folglich ist das Zeitfenster für eine zusätzliche Fragmentierung äußerst klein und die Fragmentierung der Ionen erfolgt während des Passierens des Quadrupoles. Basierend auf diesen Ergebnissen sind weitere SRM-Experimente ohne ausgelöste MS/MS-Fragmentierung bezüglich Reproduzierbarkeit von Retentionszeit und Intensität implementiert worden. Die erhaltenen Peptide zeigten eine Verzögerung in der Retentionszeit von 0,3 bis 0,5 Minuten im Vergleich zu den Peptiden aus den SRM ausgelösten MS/MS-Versuchen auf. Trotzallem können hier falsch positive Werte ausgeschlossen werden, da das Elutionsprofil für diese Peptide innerhalb eines sehr schmalen Zeitfensters liegt und die Intensitäten der einzigartigen Übergänge vergleichbare Werte aufzeigen.

5.2.2 Detektion von inter-individuellen Unterschieden bezüglich der Expression von olfaktorischen Rezeptoren

SRM/MRM-Experimente werden üblicherweise mit Triple-Quadrupol-Geräten zur Quantifizierung45, 46, 68, 71-73, 76 durchgeführt. Für die Entwicklung selektiver target- Listen wurde diese Option nur semi-quantitativ angewendet, um die Identifizierung niedrig abundanter olfaktorischer Rezeptorpeptide aus vorangegangenen MS/MS- Experimenten erneut zu bestätigen, wenn die etablierte SRM-Methode für komplexe Peptidmischungen angewendet wird. Die bereits erhaltenen MS/MS-Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass olfaktorische Rezeptoren und andere G-Protein gekoppelte Rezeptoren äußerst niedrig abundant in der Plasmamembran humaner Spermatozoen exprimiert werden, was einen reproduzierbaren und damit zuverlässigen Vergleich inter-individueller Unterschiede im Expressionsmuster olfaktorischer Rezeptoren äußerst schwierig macht. Dies gilt besonders, wenn dafür nur Einzelspender im Vergleich zu vereinigten Ejakulaten untersucht werden können. Deshalb lag der Fokus im Vorfeld auch auf der Optimierung und Reduzierung von Aufarbeitungsschritten um den Verlust an Proteinmenge, besonders bei geringen Ausgangsvolumina und niedriger Abundanz, so gering wie möglich zu halten. Erstaunlicherweise belegen unsere Ergebnisse, dass prinzipiell eine Durchführung unseres Konzeptes validierbar ist. Die Identifizierung olfaktorischer Rezeptoren mit Hilfe der etablierten SRM-Methode basiert auf 4 bis 8 Übergängen pro einzigartigem

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Rezeptorpeptid. Insgesamt umfasste unsere Methodenliste 214 Übergänge von 38 Peptiden, die 33 Rezeptoren zugeordnet werden können. Zunächst ist die Validierung der Methode für komplexe Peptidmischungen für beide Kontrollpatienten aus der beschriebenen Studie erfolgt. Einerseits konnte das Material mehrerer Einzelspenden vereinigt werden um bei erfolgreichem Nachweis andererseits schrittweise reduziert zu werden, damit inter-individuelle Unterschiede zwischen Einzelspendern verlässlich detektierbar sind. Anhand eines Beispieles konnte gezeigt werden, dass die bevorzugten Übergänge mit den entsprechenden Intensitäten innerhalb eines Zeitfensters von der MudPIT-Säule eluieren, massenspektrometrisch erfasst und als Peak im Chromatogramm dargestellt werden können. Demzufolge ist unsere Methode für die Identifizierung von einzigartigen Peptiden niedrig abundanter Proteine aus komplexen Peptidmischungen anwendbar. Nachdem gezeigt werden konnte, dass auch intra-individuelle Unterschiede bei den verwendeten Kontrollpatienten nachweisbar sind, ist für die Untersuchung inter- individueller Unterschiede im Expressionsmuster olfaktorischer Rezeptoren zwischen Kontrollpatienten und ICSI-Kandidaten die eingesetzte Proteinmenge von 2 mg auf 60 µg bis 200 µg reduziert worden. Diese Reduzierung und Varianz der Proteinmenge ist auf die Einzelspende des jeweiligen ICSI-Kandidaten zurückzuführen. Die Vereinigung mehrerer Proben bzw. die Wiederholung der Reproduzierbarkeit pro ICSI-Kandidat war im Vergleich zu den Kontrollpatienten zwecks Anonymität und zusätzlicher medizinischer Relevanz nicht möglich. Deshalb sind die Einzelergebnisse der ICSI-Kandidaten als Replikate betrachtet worden. Erstaunlicherweise konnte gezeigt werden, dass trotz limitierender Proteinmenge inter-individuelle Unterschiede im Expressionsmuster olfaktorischer Rezeptoren nachweisbar sind. Nur die olfaktorischen Rezeptoren OR10A4, OR10J1 und OR11H6 werden in der Plasmamembran humaner Spermatozoen von ICSI- Kandidaten exprimiert. Folglich gibt dieses Ergebnis Anlass zur Annahme, dass diese Rezeptoren die Spermienmotilität zu beeinflussen können, da im Vorfeld für diese Studie nur Patienten ausgewählt worden sind, deren Spermatozoen eine stark eingeschränkte oder gar keine Motilität aufzeigen. Das olfaktorische Rezeptoren sowohl Einfluss auf die Motilität als auch die Chemotaxis von Spermatozoen nach der Odorwahrnehmung haben, ist seit den publizierten Experimenten für den humanen olfaktorischen Rezeptor 17-4 bekannt3. So bewirkt die konzentrationsabhängige Wahrnehmung von Bourgeonal eine starke Zunahme der

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Spermatozoenmotilität bei gleichzeitiger Chemotaxis zum Duftstoff, während Undecanal inhibierend auf Motilität und Chemotaxis wirkt. Basierend auf diesen Erkenntnissen sollte die etablierte SRM-Methode für zukünftige large-scale Rezeptorprofilstudien verwendet werden, um target-Listen für ein robustes und äußerst sensitives Schnellerkennungsverfahren entwickeln zu können. Beispielsweise könnten Intensitätsverluste sowie Probleme bei der Detektion oder Quantifizierung durch die Verwendung von intelligenten SRM-Ansätzen (iSRM) vermieden werden. Bislang war der limitierende Faktor der Methode die Anzahl der Übergänge pro Scanzyklus und LC-Lauf, wenn eine sehr große Anzahl von einzigartigen Peptiden mehrerer Proteine untersucht wurde. Dies konnte bislang durch die Verwendung von 50-100 Übergängen pro Zyklus bei einer Zykluszeit von maximal 5 Sekunden oder einem sehr kleinen Zeitfenster umgangen werden73. ISRM kombiniert mit der Pinpoint-Software ermöglicht dahingehend die Mehrfachausnutzung gezielter Protein/Peptid-Quantifizierungen. Basierend auf heuristischen Datensätzen, können bis zu 8 Übergänge pro olfaktorischem Rezeptorpeptid ausgewählt werden. Für die Quantifizierung werden die beiden Übergänge mit der höchsten Intensität als primäre Übergänge ausgewählt. Wenn im Verlauf der Messung diese beiden primären Übergänge nach Überschreitung eines festgelegten Grenzwertes detektiert werden, wird zur Verifizierung die Quantifizierung der restlichen 6 sekundären Übergänge ausgelöst77. Damit ist eine Hochdurchsatzanalyse hunderter Proteine mit bis zu 10 000 Übergängen möglich und die gleichzeitige Reduzierung einer langen Rezeptorpeptidliste innerhalb eines schmalen Zeitfensters stellt weitere Vorteile für diesen Ansatz dar.

5.3 Besteht eine Korrelation zwischen OR-Expressionsmustern, chemo- sensorischer Wahrnehmung und Spermienmotilität?

5.3.1 Biologische Bedeutung integraler Plasmamembranproteinen für die Fertilisation

Diverse Rezeptoren, die in der Plasmamembran lokalisiert sind, wurden zuerst in Neuronen identifiziert78. Interessanterweise sind die meisten von ihnen auch in Spermien lokalisiert, wo sie für die Motilitätskontrolle der Samenzelle verantwortlich

D i s k u s s i o n S e i t e | 83 sind. Es ist bekannt, dass Glutamatrezeptoren und Glutamattransporter in den Hoden exprimiert werden und im Kopfbereich, dem Mittelstück und im Flagellum reifer Spermatozoen von Säugetieren lokalisiert sind.79, 80 Im Vergleich dazu werden OR- Gene im Verlauf der letzten Phase der Spermatogenese und während der Maturation im Nebenhoden exprimiert81, 82. Aber einige wenige Gene olfaktorischer Rezeptoren weisen keine oder nur eine geringe Expression in der Riechschleimhaut auf.81 Da viele Geruchsrezeptoren im Mittelstück des Flagellum lokalisiert sind, scheinen sie eine entscheidende Rolle bezüglich der Spermatozoenmotilität zu spielen.65, 81, 83 Die Plasmamembran humaner Spermatozoen ist reich an Glykoproteinen, Proteoglykanen, Cholesterin und Phospholipiden.11 Während der Kapazitation kommt es zu einer Umorganisation der Plasmamembran. Dabei kann eine Entfernung von Cholesterin beobachtet werden.84 Dieser Prozess lässt vermuten, dass lipid raft- assoziierende Proteine eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion in Spermatozoen zu spielen scheinen. Verschiedene Signaltransduktionswege innerhalb des olfaktorischen Epithels sind in der Literatur beschrieben.85-90 Die Signaltransduktion über olfaktorische Rezeptoren in humanen Spermatozoen ist noch nicht vollständig geklärt, aber sie scheint ähnlich abzulaufen wie für ORn, die im Riechepithel exprimiert werden98. Deshalb haben wir die identifizierten integralen Plasmamembranproteine bezüglich ihrer Funktionalität innerhalb von Signal- übertragenden Prozessen klassifiziert. Mit den verwendeten Anreicherungsstrategien konnten effektiv Transmembranrezeptoren (124), Enzyme (47), Transporter (16) und Kanalproteine (11) sowie Proteine, die am Vesikeltransport (8) und der Zelladhäsion (24) beteiligt sind, angereichert und massenspektrometrisch identifiziert werden (vgl. Abbildung 15, Gesamt). 104 von 124 identifizierten Rezeptoren sind GPCRn. Interessant ist vor allem, dass 57 % aller identifizierter GPCRn (104) olfaktorische Rezeptoren (59) sind, die sich auf 14 Familien verteilen (vgl. Abb. 17 B). Besonders die Mitglieder der Familien 2 und 5 sind dominierend in der Plasmamembran humaner Spermatozoen lokalisiert. Nach der Ejakulation wird der Samen im weiblichen Genitaltrakt bis kurz vor der Ovulation aufbewahrt. Deshalb scheint es eine Korrelation zwischen den olfaktorischen Rezeptoren und der Spermatozoenmotilität zu geben, da davon ausgegangen wird, das die Oozyte selbst oder der Follikel die Motilität der Spermatozoen auslöst.2 Ergebnisse von in vitro- Experimenten zeigen, dass die Follikelflüssigkeit eine chemo-attraktantive Wirkung auf die Spermatozoenmotilität hat.91 Nach der Odorbindung dissoziieren kleine

D i s k u s s i o n S e i t e | 84 trimere G-Proteine von dem aktivierten olfaktorischen Rezeptor und die α- Untereinheit stimuliert eine membranständige Adenylatzyklase des Types III (O60266),92-94 der neben AC4-7 (Q8NFM4, O95622, O43306, P51828) mit unseren Methoden nachweisbar war. Dieser Aktivierungsschritt initiiert die Umwandlung von ATP in zyklisches AMP, was wiederum die Öffnung eines Ionenkanals bewirkt. Die Kanalöffnung führt durch den Einstrom von Natrium- und Kalzium-Ionen zur Depolarisation der Plasmamembran und geht mit einer Hyperaktivierung des Flagellums einher.3 Von den 11 identifizierten Kanalproteinen sind 10 permeabel für Kationen und einer formt einen Wasserkanal (P55064). Die Identifizierung von zwei Spannungs-abhängigen Natriumkanälen (Q07699, P35498) und 3 Spannungs- abhängigen Kalziumkanälen (Q8NHX9, Q13936, O95180) bestätigt die zuvor beschriebene Theorie. Zusätzlich scheinen die Kanäle Q13936 und O95180 an der Zellmotilität beteiligt zu sein, was die Beobachtung von in vitro-Ergebnissen bestätigt, dass nach Odorbindung eine Hyperaktivierung des Flagellums beobachtbar ist.3 Mit dem Einstrom von Kationen werden auch intrazelluläre Kalziumdepots zur Ausschüttung von Kalzium-Ionen geöffnet. Intrazellulär freigesetztes Kalzium bewirkt die Öffnung von Kaliumkanälen (Q9NPA1, O15554). Zusätzlich sind 2 transient receptor potential channel proteins (Q8NET8, Q9UL62) in der Plasmamembran humaner Spermatozoen lokalisiert, die durch Zell-Zell-Kontakt nach der Spermatozoon-Oozyten-Erkennung aktiviert werden. Das Spermatozoenproteom unterliegt ständigen Veränderungen. Sowohl eine hohe Konzentration an Progesteron als auch Rab3A, SNARE-Komplex-Proteinen, Synaptogamin IV und VII haben Einfluss auf die Akrosomenreaktion.95 Die kleinste Gruppe an identifizierten Proteinen ist am Vesikeltransport (Q9P0L0, O95473, P49755, P23763, O43760, Q9BV40, P63027, Q15836) beteiligt. Diese Proteine scheinen eine Rolle beim Recycling im Endosomen zu spielen. Neben kleinen G-Proteinen kann auch β- Arrestin an intrazelluläre Phosphorylierungsstellen des aktivierten olfaktorischen Rezeptors binden und bewirkt dadurch, dass Clathrin, Adapterprotein 2 (AP2) und Dynamin zur Plasmamembran rekrutiert werden.96, 97 Diese zytosolischen Proteine wirken als Effektoren für die Endozytose von Vesikeln, die in ihrem Inneren GPCRn eingeschlossen haben, zur Wiederverwertung im Endosomen. Nach diesem Schritt werden erneuerte Rezeptoren wieder der Plasmamembran zugeführt. Außerdem konnte die Translokalisation von β-Arrestin vom Zytoplasma in den Zellkern nach der Stimulation des humanen olfaktorischen Rezeptors 17-4 in Spermatozoen

D i s k u s s i o n S e i t e | 85 nachgewiesen werden.98 An der Zelladhäsion sind über 8,5 % (24) aller identifizierter Plasmamembranproteine beteiligt. Die Oberfläche humaner Spermien ist stark glykosyliert und enthält eine Vielzahl von Membranproteinen, die wichtig für die Spermatozoon-Oozyten-Erkennung sind.9, 99 Am interessantesten ist die Identifizierung des N-glykosylierten Zelladhäsionsproteins IZUMO 1 (Q8IYV9), das höchst wahrscheinlich bei der Fusion von Spermatozoon und Oozyte beteiligt ist. Desweiteren schützen diese glykosylierten Membranproteine die Oberfläche der Spermatozoen und verhindern, dass das Spermatozoon auf dem Weg zur Oozyte unspezifische Interaktionen im weiblichen Genitaltrakt eingeht und somit eine Fertilisation nicht möglich wird. Die identifizierten membranständigen Enzyme (47) bilden die zweit größte Gruppe. Für die Penetration der Oozyte durch das Spermatozoon sind Enzyme essentiell. Die Oozyte ist von der Zona Pellucida (ZP), einer glykosylierten Membranhülle, umgeben. Die ZP spielt eine entscheidende Rolle während der Fertilisation.9 Das Zona Pellucida Protein 3 (ZP 3) fungiert als Rezeptor für Spermatozoon und eine Interaktion zwischen Spermatozoon und den ZP 3 löst die Akrosomenreaktion aus. Eine Vielzahl von hydrolysierenden Enzymen sind im Akrosom humaner Spermatozoen lokalisiert.11 Die Freisetzung von Akrosin, einer Trypsin-ähnlichen Protease, führt zur Auflösung der ZP und das Spermatozoon kann nun an ZP 2 binden um die Oozyte zu penetrieren.9 Interessanterweise wird das Zona Pellucida bindende Protein 2 (ZPBP 2) nur in den Hoden exprimiert100, während mit unseren verwendeten Anreicherungsstrategien auch das extrazellulär vorhandene ZPBP 1 (Q9BS86) identifiziert werden konnte. Mittels in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass der Fertilisationsprozess durch Proteasominhibitoren (MG-132 oder Lactacystein) verhindert werden kann, da Spermatozoen nicht mehr in der Lage sind die ZP zu penetrieren.95

5.3.2 Beeinflusst ein natürlicher Selektionsdruck durch Manipulation chemo-sensorischer Wahrnehmung und Spermienmotilität die Reproduktionsmaschinerie?

Posttranslationale Modifikationen haben einen signifikanten Einfluss auf die Übertragung von Signalen für die Kapazitation, Akrosomenreaktion und Chemotaxis91, 101 in humanen Spermatozoen und können während der Maturation beobachtet werden102. Diverse Aktivatoren und Inhibitoren sind für die Auslösung

D i s k u s s i o n S e i t e | 86 kapazitativer Prozesse innerhalb humaner Spermatozoen bekannt103. Vor der Kapazitation zeigen ungefähr 18% aller Spermatozoen eine niedrige Phosphorylierung im Bereich des Flagellum auf, während nach der Kapazitation eine deutliche Erhöhung des Phosphorylierungspotentials im Kopf der Spermatozoen detektierbar ist104. Auch eine Serinphosphorylierung in der beta-Untereinheit der F1- ATPase kann die Spermatozoenmotilität beeinflussen102. Interessanterweise ist das Arginin-X-X-Serin/Threonin-Motiv während der Kapazitation phosphoryliert. Dieses Motiv ist charakteristisch für Substrate der Proteinkinase A (PKA), die im Flagellum lokalisiert sind und durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Nicht-Rezeptortyp Proteintyrosinkinasen reguliert werden103. Im Vergleich dazu konnte die PKA sowohl im Flagellum als auch in der Akrosomenkappe detektiert werden105. Der humane olfaktorische Rezeptor 17-4 ist beispielsweise im Mittelstück humaner Spermatozoen lokalisiert65 und migriert nach Aktivierung in den Kopfbereich98. Eine Beteiligung dieses Rezeptors an der Chemotaxis und dem Fertilisationsprozesses ist bereits bestätigt worden, da dieser Rezeptor Signale nach der Phosphorylierung durch G- Proteine über Membran-ständige Adenylatcyclasen des Types III oder den MAP- Signalweg3, 98, der durch die PKA aktiviert wird, auslöst. Erstmalig konnte mit unseren Ergebnissen gezeigt werden, dass inter- und intra-individuelle Unterschiede im Expressionsmuster olfaktorischer Rezeptoren innerhalb der Plasmamembran humaner Spermatozoen vorhanden sind. Die Analyse von Spermatozoen, die eine natürlich eingeschränkte Motilität nach der Ejakulation aufzeigen und damit in vivo nicht in der Lage sind eine Oozyte zu befruchten, zeigt, dass das Repertoir olfaktorischer Rezeptoren sich von vollständig funktionalen Spermatozoen unterscheidet. Ausschließlich drei ORs konnten in ICSI-Kandidaten, aber nicht in Kontrollpatienten nachgewiesen werden. Obwohl in vitro Fertilisationen beweisen, dass mit diesen Spermatozoen gesunde Nachkommen gezeugt werden können, stellt sich die Frage, ob die Immobilität der Spermatozoen nicht einen natürlichen Schutzmechanismus darstellt um die Weitergabe defekter Gene zu unterbinden. Genetische Veränderungen, eine unvollständig abgelaufene Replikation oder fehlende posttranslationale Modifikationen innerhalb solcher Spermatozoen könnten essentiell für die vollständige Funktionalität sein. Vermutlich ist die Signaltransduktion in diesen Spermatozoen eingeschränkt, so dass möglicherweise der Maturationsprozess der Spermatozoen bereits unterbunden wird. Denn diese Maturation ist essentiell für die Fertilisation, da sonst weder die Kapazitation noch die

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Akrosomenreaktion ausgelöst werden können. In zukünftigen Experimenten sollten die drei olfaktorischen Rezeptoren der ICSI-Kandidaten näher bezüglich Struktur, Lokalisation und Funktion innerhalb des Fertilisationsprozesses untersucht werden. Wenn nämlich bestätigt werden kann, dass die Expression dieser Rezeptoren eine natürliche Fertilisation unterbindet, könnte der komplexe Signaltransduktionsprozess diesbezüglich gezielt manipuliert werden. Dafür könnte die Spermatozoon-Oozyten- Erkennung durch Blockierung der Ligandenbindestelle oder potentiellen intrazellulären Phosphorylierungsstellen für Adaptormoleküle am Rezeptor unterdrückt werden. Was eine Weiterentwicklung von Kontrazeptive für den Mann ermöglicht. Bisherige Kontrazeptiva bewirken, dass sich der pH-Wert des Vaginalsekretes verändert, so dass die Überlebenswahrscheinlichkeit von Spermatozoen auf ein Minimum reduziert wird bzw. zum sofortigen Abtöten der Spermatozoen führt.

Zusammenfassung S e i t e | 88

6. Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Plasmamembranproteom humaner Spermatozoen massenspektrometrisch untersucht. Dabei lag der Schwerpunkt zum einen auf der Anreicherung niedrig abundanter Plasmamembranproteine mit dem Ziel olfaktorische Rezeptoren nachzuweisen, die bislang im Riechepithel exprimiert werden und Rückschlüsse auf die biologische Funktionalität innerhalb des Spermatozoon zu ziehen. Für eine effiziente Anreicherung integraler Plasmamembranproteine sind vergleichend affinitätschromatographische Methoden sowie die Affinitätsverteilung im wässerigen biphasischen System optimiert worden.

Insgesamt konnten 2045 Proteine massenspektrometrisch mit beiden Anreicherungsstrategien (1409 mit 2PS WGA; 236 mit MLAC und PBA) identifiziert werden. 23 % von 2045 Proteinen sind Plasmamembranproteine. Davon sind 280 Proteine mit mindestens einer Transmembrandomäne in der Plasmamembran lokalisiert. Mit beiden Strategien konnten Membranproteine mit bis zu 24 Transmembrandomänen Detergenzien-frei angereichert werden. Hinsichtlich ihrer biologischen Funktionalität konnten besonders effizient Rezeptoren, Enzyme, Kanal- und Transportproteine sowie Proteine, die an der Zelladhäsion und dem Vesikeltransport beteiligt sind, angereichert werden. Insgesamt ist es mit beiden Strategien gelungen 59 olfaktorische Rezeptoren zu identifizieren, die sowohl im Riechepithel als auch in der Plasmamembran humaner Spermatozoen lokalisiert sind. Diese olfaktorischen Rezeptoren verteilen sich auf 14 Familien, wobei die Familien 2 und 5 besonders dominant auftreten.

Anhand dieser Ergebnisse konnten intra- und inter-individuelle Unterschiede im Expressionsmuster olfaktorischer Rezeptoren detektiert werden. Dazu sind SRM- Methoden von 32 ausgewählten Kandidaten entwickelt worden. Mit 14 von 32 Rezeptoren konnte eine selektive Targetliste erstellt werden. Drei von 14 Rezeptoren konnten nur in der Plasmamembran humaner Spermatozoen massenspektrometrisch nachgewiesen werden, die eine eingeschränkte oder gar keine Motilität aufzeigen. Diese Ergebnisse sind für die Funktionalität von olfaktorischen Rezeptoren in humanen Spermatozoen hinsichtlich des Fertilisationsprozesses von besonderem Interesse und liefern zahlreiche Ansatzpunkte für die weitere molekularbiologische und physiologische Charakterisierung.

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Literatur

1. Aitken, R., Development of in vitro tests of human sperm function: A diagnostic tool and model system for toxicologial analyses. Toxic. in Vitro 1990, 4, (4/5), 560-569. 2. Ward, C. R.; Kopf, G. S., Molecular events mediating sperm activation. Dev Biol 1993, 158, (1), 9-34. 3. Spehr, M.; Gisselmann, G.; Poplawski, A.; Riffell, J. A.; Wetzel, C. H.; Zimmer, R. K.; Hatt, H., Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science 2003, 299, (5615), 2054-8. 4. Buck, L.; Axel, R., A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell 1991, 65, (1), 175-87. 5. Fleischer, J.; Breer, H.; Strotmann, J., Mammalian olfactory receptors. Front Cell Neurosci 2009, 3, 9. 6. Zozulya, S.; Echeverri, F.; Nguyen, T., The human olfactory receptor repertoire. Genome Biol 2001, 2, (6), RESEARCH0018. 7. Parmentier, M.; Libert, F.; Schurmans, S.; Schiffmann, S.; Lefort, A.; Eggerickx, D.; Ledent, C.; Mollereau, C.; Gerard, C.; Perret, J.; et al., Expression of members of the putative olfactory receptor gene family in mammalian germ cells. Nature 1992, 355, (6359), 453-5. 8. Aitken, R. J., Evaluation of human sperm function. Br Med Bull 1990, 46, (3), 654-74. 9. Schroter, S.; Osterhoff, C.; McArdle, W.; Ivell, R., The glycocalyx of the sperm surface. Hum Reprod Update 1999, 5, (4), 302-13. 10. Eisenbach, M.; Tur-Kaspa, I., Do human eggs attract spermatozoa? Bioessays 1999, 21, (3), 203-10. 11. Mack, S. R.; Everingham, J.; Zaneveld, L. J., Isolation and partial characterization of the plasma membrane from human spermatozoa. J Exp Zool 1986, 240, (1), 127-36. 12. Singer, S. J.; Nicolson, G. L., The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science 1972, 175, (23), 720-31. 13. Singer, S. J.; Nicolson, G. L., The structure and chemistry of mammalian cell membranes. Am J Pathol 1971, 65, (2), 427-37. 14. Fischer, F.; Wolters, D.; Rogner, M.; Poetsch, A., Toward the complete membrane proteome: high coverage of integral membrane proteins through transmembrane peptide detection. Mol Cell Proteomics 2006, 5, (3), 444-53. 15. Santoni, V.; Molloy, M.; Rabilloud, T., Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis 2000, 21, (6), 1054-70. 16. Speers, A. E.; Wu, C. C., Proteomics of integral membrane proteins-theory and application. Chem Rev 2007, 107, (8), 3687-714. 17. Wright, C. S., New folds of plant lectins. Curr Opin Struct Biol 1997, 7, (5), 631-6. 18. Weis, W. I., Cell-surface carbohydrate recognition by animal and viral lectins. Curr Opin Struct Biol 1997, 7, (5), 624-30. 19. Van Damme, E. J.; Barre, A.; Rouge, P.; Peumans, W. J., Cytoplasmic/nuclear plant lectins: a new story. Trends Plant Sci 2004, 9, (10), 484-9. 20. Rudiger, H.; Gabius, H. J., Plant lectins: occurrence, biochemistry, functions and applications. Glycoconj J 2001, 18, (8), 589-613.

L i t e r a t u r Sei t e | 90

21. Kilpatrick, D. C., Animal lectins: a historical introduction and overview. Biochim Biophys Acta 2002, 1572, (2-3), 187-97. 22. Imberty, A.; Mitchell, E. P.; Wimmerova, M., Structural basis of high-affinity glycan recognition by bacterial and fungal lectins. Curr Opin Struct Biol 2005, 15, (5), 525-34. 23. Lee, M. C.; Damjanov, I., Lectin binding sites on human sperm and spermatogenic cells. Anat Rec 1985, 212, (3), 282-7. 24. Lis, H.; Sharon, N., The biochemistry of plant lectins (phytohemagglutinins). Annu Rev Biochem 1973, 42, (0), 541-74. 25. Hirabayashi, J.; Kasai, K., Separation technologies for glycomics. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2002, 771, (1-2), 67-87. 26. Loris, R., Principles of structures of animal and plant lectins. Biochim Biophys Acta 2002, 1572, (2-3), 198-208. 27. Bouriotis, V.; Galpin, I. J.; Dean, P. D. G., Application of immobilized phenylboronic acids as supports for group-specific ligands in the affinity chromatography of enzymes. Chrom 1981, 13, (677), 267-278. 28. Williams, G. T.; Johnstone, A. P.; Dean, P. D., Fractionation of membrane proteins on phenylboronic acid-agarose. Biochem J 1982, 205, (1), 167-71. 29. Schindler, J.; Nothwang, H. G., Aqueous polymer two-phase systems: effective tools for plasma membrane proteomics. Proteomics 2006, 6, (20), 5409-17. 30. Albertsson, P. A., Chromatography and partition of cells and cell fragments. Nature 1956, 177, (4513), 771-4. 31. Albertsson, P. A., Partition of proteins in liquid polymer-polymer two-phase systems. Nature 1958, 182, (4637), 709-11. 32. Gierow, P.; Sommarin, M.; Larsson, C.; Jergil, B., Fractionation of rat liver plasma-membrane regions by two-phase partitioning. Biochem J 1986, 235, (3), 685-91. 33. Flanagan, S. D.; Barondes, S. H., Affinity partitioning. A method for purification of proteins using specific polymer-ligands in aqueous polymer two- phase systems. J Biol Chem 1975, 250, (4), 1484-9. 34. Lewandrowski, U.; Wortelkamp, S.; Lohrig, K.; Zahedi, R. P.; Wolters, D. A.; Walter, U.; Sickmann, A., Platelet membrane proteomics: a novel repository for functional research. Blood 2009, 114, (1), e10-9. 35. PERSSON, A.; JOHANSSON, B.; OLSSON, H.; JERGIL, B., Purification of rat liver plasma membranes by wheat-germ-agglutinin affinity partitioning. Biochem. J. 1991, 273, 173-177. 36. Schindler, J.; Jung, S.; Niedner-Schatteburg, G.; Friauf, E.; Nothwang, H. G., Enrichment of integral membrane proteins from small amounts of brain tissue. J Neural Transm 2006, 113, (8), 995-1013. 37. Schindler, J.; Lewandrowski, U.; Sickmann, A.; Friauf, E.; Nothwang, H. G., Proteomic Analysis of Brain Plasma Membranes Isolated by Affinity Two- phase Partitioning. Molecular & Cellular Proteomics 2006, 5, 390-400. 38. Wang, Q.; Wu, Y.; Aerts, T.; Slegers, H.; Clauwaert, J., Purification of rat C6 glioma plasma membranes by affinity partitioning. Biol Signals Recept 2000, 9, (1), 45-52. 39. Franzel, B.; Fischer, F.; Trotschel, C.; Poetsch, A.; Wolters, D., The two- phase partitioning system--a powerful technique to purify integral membrane proteins of Corynebacterium glutamicum for quantitative shotgun analysis. Proteomics 2009, 9, (8), 2263-72.

L i t e r a t u r Sei t e | 91

40. Poetsch, A.; Wolters, D., Bacterial membrane proteomics. Proteomics 2008, 8, (19), 4100-22. 41. Washburn, M. P.; Wolters, D.; Yates, J. R., 3rd, Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol 2001, 19, (3), 242-7. 42. Wolters, D. A.; Washburn, M. P.; Yates, J. R., 3rd, An automated multidimensional protein identification technology for shotgun proteomics. Anal Chem 2001, 73, (23), 5683-90. 43. Aebersold, R.; Mann, M., Mass spectrometry-based proteomics. Nature 2003, 422, (6928), 198-207. 44. Pandey, A.; Mann, M., Proteomics to study genes and genomes. Nature 2000, 405, (6788), 837-46. 45. Duncan, M. W.; Yergey, A. L.; Patterson, S. D., Quantifying proteins by mass spectrometry: the selectivity of SRM is only part of the problem. Proteomics 2009, 9, (5), 1124-7. 46. Lange, V.; Picotti, P.; Domon, B.; Aebersold, R., Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Mol Syst Biol 2008, 4, 222. 47. Schindler, J.; Lewandrowski, U.; Sickmann, A.; Friauf, E.; Nothwang, H. G., Proteomic analysis of brain plasma membranes isolated by affinity two- phase partitioning. Mol Cell Proteomics 2006, 5, (2), 390-400. 48. Persson, A.; Jergil, B., The purification of membranes by affinity partitioning. Faseb J 1995, 9, (13), 1304-10. 49. Cao, R.; Li, X.; Liu, Z.; Peng, X.; Hu, W.; Wang, X.; Chen, P.; Xie, J.; Liang, S., Integration of a two-phase partition method into proteomics research on rat liver plasma membrane proteins. J Proteome Res 2006, 5, (3), 634-42. 50. Everberg, H.; Peterson, R.; Rak, S.; Tjerneld, F.; Emanuelsson, C., Aqueous two-phase partitioning for proteomic monitoring of cell surface biomarkers in human peripheral blood mononuclear cells. J Proteome Res 2006, 5, (5), 1168-75. 51. Jensen, O. N., Interpreting the protein language using proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol 2006, 7, (6), 391-403. 52. Kim, J. H. L. a. Y.; Lee, M. Y. H. a. E. K.; Choo, J., Immobilization of Aminophenylboronic Acid on Magnetic Beads for the Direct Determination of Glycoproteins by Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. American Society for Mass Spectrometry 2005, 16, 1456–1460. 53. Anspach, F. B.; Wirth, H.-J.; Klaus K. Unger; Peter Stanton; Davies, J. R.; Hearn, M. T. W., High-Performance Liquid Affinity Chromatography with Phenylboronic Acid, Benzamidine, Tri-L-alanine, and Concanavalin A Immobilized on 3-lsothiocyanatopropyltriethoxysilane-Activated Nonporous Monodisperse Silicas. ANALYTICALBIOCHEMISTRY 1989, 179, 171-181. 54. Bouriotis, V.; Galpin, I. J.; Dean, P. D. G., Applications of immobilised phenylboronic acids as supports for group-specific ligands in the affinity chromatography of enzymes. Journal of Chromatography A 1981, 210, (2), 267-278. 55. Shetty, J.; Diekman, A. B.; Jayes, F. C.; Sherman, N. E.; Naaby-Hansen, S.; Flickinger, C. J.; Herr, J. C., Differential extraction and enrichment of human sperm surface proteins in a proteome: identification of immunocontraceptive candidates. Electrophoresis 2001, 22, (14), 3053-66. 56. Multamaki, S.; Pelliniemi, L. J.; Suominen, J., Ultrastructural study of separated cell and acrosomal membranes from bull spermatozoa. Fertil Steril 1975, 26, (9), 932-8.

L i t e r a t u r Sei t e | 92

57. Zahler, W. L.; Doak, G. A., Isolation of the outer acrosomal membrane from bull sperm. Biochim Biophys Acta 1975, 406, (4), 479-88. 58. Ivanov, N.; Profirov, Y., Isolation of plasma membranes from ram spermatozoa by a two-phase polymer system. J Reprod Fertil 1981, 63, (1), 25-9. 59. Yang, Z.; Harris, L. E.; Palmer-Toy, D. E.; Hancock, W. S., Multilectin affinity chromatography for characterization of multiple glycoprotein biomarker candidates in serum from breast cancer patients. Clin Chem 2006, 52, (10), 1897-905. 60. Yang, Z.; Hancock, W. S.; Chew, T. R.; Bonilla, L., A study of glycoproteins in human serum and plasma reference standards (HUPO) using multilectin affinity chromatography coupled with RPLC-MS/MS. Proteomics 2005, 5, (13), 3353-66. 61. Jackson, M. L.; Schmidt, C. F.; Lichtenberg, D.; Litman, B. J.; Albert, A. D., Solubilization of phosphatidylcholine bilayers by octyl glucoside. Biochemistry 1982, 21, (19), 4576-82. 62. Garavito, R. M.; Ferguson-Miller, S., Detergents as Tools in Membrane Biochemistry. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 2001, 276, 32403-32406. 63. Kragh-Hansen, U.; le Maire, M.; Moller, J. V., The mechanism of detergent solubilization of liposomes and protein-containing membranes. Biophys J 1998, 75, (6), 2932-46. 64. Banerjee, P.; Joo, J. B.; Buse, J. T.; Dawson, G., Differential solubilization of lipids along with membrane proteins by different classes of detergents. Chem Phys Lipids 1995, 77, (1), 65-78. 65. Spehr, M.; Schwane, K.; Riffell, J. A.; Barbour, J.; Zimmer, R. K.; Neuhaus, E. M.; Hatt, H., Particulate adenylate cyclase plays a key role in human sperm olfactory receptor-mediated chemotaxis. J Biol Chem 2004, 279, (38), 40194-203. 66. Everberg, H.; Leiding, T.; Schioth, A.; Tjerneld, F.; Gustavsson, N., Efficient and non-denaturing membrane solubilization combined with enrichment of membrane protein complexes by detergent/polymer aqueous two-phase partitioning for proteome analysis. Journal of Chromatography A 2006, 1122, 35–46. 67. Wu, C. C.; MacCoss, M. J.; Howell, K. E.; Yates, J. R., 3rd, A method for the comprehensive proteomic analysis of membrane proteins. Nat Biotechnol 2003, 21, (5), 532-8. 68. Han, B.; Higgs, R. E., Proteomics: from hypothesis to quantitative assay on a single platform. Guidelines for developing MRM assays using ion trap mass spectrometers. Brief Funct Genomic Proteomic 2008, 7, (5), 340-54. 69. Picotti, P.; Rinner, O.; Stallmach, R.; Dautel, F.; Farrah, T.; Domon, B.; Wenschuh, H.; Aebersold, R., High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes. Nat Methods 2010, 7, (1), 43-6. 70. Sherman, J.; McKay, M. J.; Ashman, K.; Molloy, M. P., How specific is my SRM?: The issue of precursor and product ion redundancy. Proteomics 2009, 9, (5), 1120-3. 71. Anderson, L.; Hunter, C. L., Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics 2006, 5, (4), 573-88.

L i t e r a t u r Sei t e | 93

72. Lange, V.; Malmstrom, J. A.; Didion, J.; King, N. L.; Johansson, B. P.; Schafer, J.; Rameseder, J.; Wong, C. H.; Deutsch, E. W.; Brusniak, M. Y.; Buhlmann, P.; Bjorck, L.; Domon, B.; Aebersold, R., Targeted quantitative analysis of Streptococcus pyogenes virulence factors by multiple reaction monitoring. Mol Cell Proteomics 2008, 7, (8), 1489-500. 73. Stahl-Zeng, J.; Lange, V.; Ossola, R.; Eckhardt, K.; Krek, W.; Aebersold, R.; Domon, B., High sensitivity detection of plasma proteins by multiple reaction monitoring of N-glycosites. Mol Cell Proteomics 2007, 6, (10), 1809- 17. 74. Unwin, R. D.; Griffiths, J. R.; Leverentz, M. K.; Grallert, A.; Hagan, I. M.; Whetton, A. D., Multiple reaction monitoring to identify sites of protein phosphorylation with high sensitivity. Mol Cell Proteomics 2005, 4, (8), 1134- 44. 75. Williamson, B. L.; Marchese, J.; Morrice, N. A., Automated identification and quantification of protein phosphorylation sites by LC/MS on a hybrid triple quadrupole linear ion trap mass spectrometer. Mol Cell Proteomics 2006, 5, (2), 337-46. 76. Wolf-Yadlin, A.; Hautaniemi, S.; Lauffenburger, D. A.; White, F. M., Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proc Natl Acad Sci U S A 2007, 104, (14), 5860-5. 77. Picotti, P.; Bodenmiller, B.; Mueller, L. N.; Domon, B.; Aebersold, R., Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targeted proteomics. Cell 2009, 138, (4), 795-806. 78. Meizel, S., The sperm, a neuron with a tail: 'neuronal' receptors in mammalian sperm. Biol Rev Camb Philos Soc 2004, 79, (4), 713-32. 79. Hu, J. H.; Yang, N.; Ma, Y. H.; Jiang, J.; Zhang, J. F.; Fei, J.; Guo, L. H., Identification of glutamate receptors and transporters in mouse and human sperm. J Androl 2004, 25, (1), 140-6. 80. Storto, M.; Sallese, M.; Salvatore, L.; Poulet, R.; Condorelli, D. F.; Dell'Albani, P.; Marcello, M. F.; Romeo, R.; Piomboni, P.; Barone, N.; Nicoletti, F.; Nicoletti, F.; De Blasi, A., Expression of metabotropic glutamate receptors in the rat and human testis. J Endocrinol 2001, 170, (1), 71-8. 81. Vanderhaeghen, P.; Schurmans, S.; Vassart, G.; Parmentier, M., Olfactory Receptors Are Displayed on Dog Mature Sperm Cells. The Journal of Cell Biology 1993, 123, 1441-1452. 82. Vanderhaeghen, P.; Schurmans, S.; Vassart, G.; Parmentier, M., Specific repertoire of olfactory receptor genes in the male germ cells of several mammalian species. Genomics 1997, 39, (3), 239-46. 83. Walensky, L. D.; Roskams, A. J.; Lefkowitz, R. J.; Snyder, S. H.; Ronnett, G. V., Odorant receptors and desensitization proteins colocalize in mammalian sperm. Mol Med 1995, 1, (2), 130-41. 84. Sleight, S. B.; Miranda, P. V.; Plaskett, N. W.; Maier, B.; Lysiak, J.; Scrable, H.; Herr, J. C.; Visconti, P. E., Isolation and Proteomic Analysis of Mouse Sperm Detergent-Resistant Membrane Fractions: Evidence for Dissociation of Lipid Rafts During Capacitation. BIOLOGY OF REPRODUCTION 2005, 73, 721-729. 85. Cockerham, R. E.; Leinders-Zufall, T.; Munger, S. D.; Zufall, F., Functional analysis of the guanylyl cyclase type D signaling system in the olfactory epithelium. Ann N Y Acad Sci 2009, 1170, 173-6.

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86. Hassenklover, T.; Kurtanska, S.; Bartoszek, I.; Junek, S.; Schild, D.; Manzini, I., Nucleotide-induced Ca2+ signaling in sustentacular supporting cells of the olfactory epithelium. Glia 2008, 56, (15), 1614-24. 87. Mammen, A.; Simpson, P. J.; Nighorn, A.; Imanishi, Y.; Palczewski, K.; Ronnett, G. V.; Moon, C., Hippocalcin in the olfactory epithelium: a mediator of second messenger signaling. Biochem Biophys Res Commun 2004, 322, (4), 1131-9. 88. Simpson, P. J.; Wang, E.; Moon, C.; Matarazzo, V.; Cohen, D. R.; Liebl, D. J.; Ronnett, G. V., Neurotrophin-3 signaling maintains maturational homeostasis between neuronal populations in the olfactory epithelium. Mol Cell Neurosci 2003, 24, (4), 858-74. 89. Trinh, K.; Storm, D. R., Vomeronasal organ detects odorants in absence of signaling through main olfactory epithelium. Nat Neurosci 2003, 6, (5), 519-25. 90. Wang, Z.; Balet Sindreu, C.; Li, V.; Nudelman, A.; Chan, G. C.; Storm, D. R., Pheromone detection in male mice depends on signaling through the type 3 adenylyl cyclase in the main olfactory epithelium. J Neurosci 2006, 26, (28), 7375-9. 91. Eisenbach, M., Sperm chemotaxis. Rev Reprod 1999, 4, (1), 56-66. 92. Defer, N.; Marinx, O.; Poyard, M.; Lienard, M. O.; Jegou, B.; Hanoune, J., The olfactory adenylyl cyclase type 3 is expressed in male germ cells. FEBS Lett 1998, 424, (3), 216-20. 93. Peterson, R. N.; Russell, L.; Hook, L.; Bundman, D.; Freund, M., Characterization and localization of adenylyl cyclase in membrane vesicles and intact boar and human spermatozoa. J Cell Sci 1980, 43, 93-102. 94. Zigman, J. M.; Westermark, G. T.; LaMendola, J.; Boel, E.; Steiner, D. F., Human G(olf) alpha: complementary deoxyribonucleic acid structure and expression in pancreatic islets and other tissues outside the olfactory neuroepithelium and central nervous system. Endocrinology 1993, 133, (6), 2508-14. 95. Sutovsky, P.; Manandhar, G.; McCauley, T. C.; Caamano, J. N.; Sutovsky, M.; Thompson, W. E.; Day, B. N., Proteasomal interference prevents zona pellucida penetration and fertilization in mammals. Biol Reprod 2004, 71, (5), 1625-37. 96. Luttrell, L. M.; Lefkowitz, R. J., The role of beta-arrestins in the termination and transduction of G-protein-coupled receptor signals. J Cell Sci 2002, 115, (Pt 3), 455-65. 97. Mashukova, A.; Spehr, M.; Hatt, H.; Neuhaus, E. M., Beta-arrestin2- mediated internalization of mammalian odorant receptors. J Neurosci 2006, 26, (39), 9902-12. 98. Neuhaus, E. M.; Mashukova, A.; Barbour, J.; Wolters, D.; Hatt, H., Novel function of beta-arrestin2 in the nucleus of mature spermatozoa. J Cell Sci 2006, 119, (Pt 15), 3047-56. 99. Stein, K. K.; Go, J. C.; Lane, W. S.; Primakoff, P.; Myles, D. G., Proteomic analysis of sperm regions that mediate sperm-egg interactions. Proteomics 2006, 6, (12), 3533-43. 100. Johnston, D. S.; Wooters, J.; Kopf, G. S.; Qiu, Y.; Roberts, K. P., Analysis of the human sperm proteome. Ann N Y Acad Sci 2005, 1061, 190-202. 101. Breitbart, H.; Naor, Z., Protein kinases in mammalian sperm capacitation and the acrosome reaction. Rev Reprod 1999, 4, (3), 151-9. 102. Baker, M. A.; Witherdin, R.; Hetherington, L.; Cunningham-Smith, K.; Aitken, R. J., Identification of post-translational modifications that occur during

L i t e r a t u r Sei t e | 95

sperm maturation using difference in two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics 2005, 5, (4), 1003-12. 103. O'Flaherty, C.; de Lamirande, E.; Gagnon, C., Phosphorylation of the Arginine-X-X-(Serine/Threonine) motif in human sperm proteins during capacitation: modulation and protein kinase A dependency. Mol Hum Reprod 2004, 10, (5), 355-63. 104. Ficarro, S.; Chertihin, O.; Westbrook, V. A.; White, F.; Jayes, F.; Kalab, P.; Marto, J. A.; Shabanowitz, J.; Herr, J. C.; Hunt, D. F.; Visconti, P. E., Phosphoproteome analysis of capacitated human sperm. Evidence of tyrosine phosphorylation of a kinase-anchoring protein 3 and valosin-containing protein/p97 during capacitation. J Biol Chem 2003, 278, (13), 11579-89. 105. Visconti, P. E.; Johnson, L. R.; Oyaski, M.; Fornes, M.; Moss, S. B.; Gerton, G. L.; Kopf, G. S., Regulation, localization, and anchoring of protein kinase A subunits during mouse sperm capacitation. Dev Biol 1997, 192, (2), 51-63.

D a n k s a g u n g S e i t e | 96

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich all jenen meinen persönlichen Dank aussprechen, die mich sowohl wissenschaftlich als auch privat tatkräftig unterstützt und zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben!

Herrn Dr. Dirk Wolters danke ich für die Bereitstellung und Bearbeitung des interessanten Forschungsthemas, die ständige Diskussionsbereitschaft und, das er mir die Freiheit der eigenverantwortlichen und selbstständigen Durchführung der Arbeit sowie die Umsetzung meiner eigenen Ideen ermöglichte.

Frau Prof. Dr. Katrin Marcus möchte ich für die Übernahme der Prüfungsverpflichtung und Begutachtung meiner Dissertation danken.

Allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe, besonders Sabine und Marilena gebührt mein Dank für das tolle Arbeitsklima und die steten Diskussionen zur Umsetzung innovativer Ideen.

Kathrin und Urs möchte ich vor allem für die vielen Tipps und Tricks in der Anfangsphase, die ständige Diskussionsbereitschaft und die gemeinsamen Aktivitäten außerhalb des Laboralltages danken.

Björn gilt mein Dank für die wunderbare Freundschaft, seine unendliche Geduld und die gemeinsamen Entdeckungstouren durch das wunderschöne Ruhrgebiet, Europa und Kanada – unvergessliche Zeiten!!!

Für die herzliche Aufnahme und die vielen gemeinsamen Dienste danke ich allen Rotkreuzlern des Kreisverbandes Bochum, ganz besonders der Gemeinschaft Mitte. Ihr habt mir das Gefühl gegeben, in Bochum zu Hause zu sein!

Von Herzen möchte ich meinem ganz privaten Engel danken – einfach fürs Zuhören, mit Rat und Tat zur Seite zu stehen, für die ehrlichen und sehr kritischen Worte sowie fürs Kraftgeben zum Kämpfen in den ausweglosen Situationen.

Meinen Eltern danke ich von Herzen für die nie endende Unterstützung in allen Lebenslagen. Ohne euch wäre ich nie soweit gekommen. Danke fürs immer Dasein und die offenen Ohren, wenn der Schuh drückte!!!

Curriculum Vitae S e i t e | 97

Curriculum Vitae

Name: Kathrin Bartho

Geburtstag 08. Juli 1981

Geburtsort: Bautzen

Familienstand: ledig

Akademischer 2006 – 2010 Werdegang: wissenschaftliche Mitarbeiterin am Lehrstuhl für Analytische Chemie; Ruhr-Universität Bochum

seit 2006 Promotionsstudium am Lehrstuhl für Analytische Chemie in der AG Biomolekulare MS; Ruhr-Universität Bochum

2004 – 2006 Masterstudium der Biochemie; Ruhr-Universität Bochum; Abschluss: M.Sc. Biochemie

2001 – 2004 Bachelorstudium der Biotechnologie; HS Zittau/Görlitz; Abschluss: B.Sc. Biotechnologie

Freiwilliges 2000 – 2001 ökologisches Jahr: Ökologische Station Neunzehnhain; Erzgebirge

Schulbildung: 1992 – 2000 Abitur am Friedrich-Schiller-Gymnasium; Bautzen

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Anhang Tabelle 5: Anreicherung und massenspektrometrische Identifizierung integraler Plasmamembranproteine aus humanen Spermatozoen.

# 2PS AC Proteinname 2PS MLAC PBA TM +WGA Rezeptoren O00264 Membrane-associated progesterone receptor component 1 1 X O15173 Membrane-associated progesterone receptor component 2 1 X X X O75581 Low-density lipoprotein receptor-related protein 6 1 X O75787 Renin receptor 1 X P11215 Integrin alpha-M 1 X P11717 Cation-independent mannose-6-phosphate receptor 1 X P17181 Interferon alpha/beta receptor 1 1 X P20701 Integrin alpha-L 1 X P22607 Fibroblast growth factor receptor 3 1 X P35613 Basigin 1 X P48058 Glutamate receptor 4 3 X P98164 Low-density lipoprotein receptor-related protein 2 1 X Q13003 Glutamate receptor, ionotropic kainate 3 3 X Q13873 Bone morphogenetic protein receptor type-2 1 X Q8TD46 Cell surface glycoprotein CD200 receptor 1 1 X Q96DU3 SLAM family member 6 1 X Q9HCM2 Plexin-A4 1 X Q9UBG0 C-type mannose receptor 2 1 X Q9UKR8 Tetraspanin-16 4 X Q9ULK0 Glutamate receptor delta-1 subunit 3 X G-Protein gekoppelte Rezeptoren O43603 Galanin receptor type 2 7 X O60412 Olfactory receptor 7C2 7 X O95221 Olfactory receptor 5F1 7 X P20309 Muscarinic acetylcholine receptor M3 7 X P21462 fMet-Leu-Phe receptor 7 X P25101 Endothelin-1 receptor 7 X P29274 Adenosine receptor A2a 7 X P30954 Olfactory receptor 10J1 7 X P35367 Histamine H1 receptor 7 X P41143 Delta-type opioid receptor 7 X P41597 C-C chemokine receptor type 2 7 X P49238 CX3C chemokine receptor 1 7 X P50391 Neuropeptide Y receptor type 4 7 X P59535 Taste receptor type 2 member 40 7 X P59537 Taste receptor type 2 member 43 7 X P59922 Putative olfactory receptor 2B8 7 X Q13585 Melatonin-related receptor 7 X Q15761 Neuropeptide Y receptor type 5 7 X Q5T6X5 G-protein coupled receptor family C group 6 member A 7 X Q5T848 Probable G-protein coupled receptor 158 7 X Q6IF63 Olfactory receptor 52W1 7 X Q6NV75 Probable G-protein coupled receptor 153 7 X Q86SP6 Probable G-protein coupled receptor 149 7 X Q86VZ1 P2Y purinoceptor 8 7 X Q8IZF3 Probable G-protein coupled receptor 115 7 X Q8IZF6 Probable G-protein coupled receptor 112 7 X Q8IZP9 G-protein coupled receptor 64 7 X Q8N162 Olfactory receptor 8H2 7 X Q8N349 Olfactory receptor 2L13 7 X Q8N628 Olfactory receptor 2C3 7 X Q8NFJ6 Prokineticin receptor 2 7 X Q8NG76 Olfactory receptor 2T33 7 X Q8NG81 Olfactory receptor 2M7 7 X Q8NG97 Olfactory receptor 2Z1 7 X Q8NGB6 Olfactory receptor 4M2 7 X Q8NGC9 Olfactory receptor 11H4 7 X Q8NGE0 Olfactory receptor 10AD1 7 X Q8NGE9 Olfactory receptor 9Q2 7 X Q8NGI9 Olfactory receptor 5A2 7 X Q8NGJ4 Olfactory receptor 52E2 7 X Q8NGK4 Olfactory receptor 52K1 7 X Q8NGL1 Olfactory receptor 5D18 7 X

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# 2PS AC Proteinname 2PS MLAC PBA TM +WGA Q8NGL2 Olfactory receptor 5L1 7 X Q8NGL4 Olfactory receptor 5D13 7 X X Q8NGL9 Olfactory receptor 4C16 7 X Q8NGM1 Olfactory receptor 4C15 7 X X Q8NGN3 Olfactory receptor 10G4 7 X Q8NGP3 Olfactory receptor 5M9 7 X Q8NGQ6 Olfactory receptor 9I1 7 X Q8NGR2 Olfactory receptor 1L6 7 X Q8NGR9 Olfactory receptor 1N2 7 X Q8NGS0 Olfactory receptor 1N1 7 X X Q8NGS3 Olfactory receptor 1J1 7 X Q8NGS9 Olfactory receptor 13C2 7 X Q8NGT0 Olfactory receptor 13C9 7 X Q8NGT5 Olfactory receptor 9A2 7 X Q8NGU2 Olfactory receptor 9A4 7 X Q8NGV6 Olfactory receptor 5H6 7 X Q8NGV7 Olfactory receptor 5H2 7 X Q8NGX2 Olfactory receptor 2T35 7 X Q8NGX8 Olfactory receptor 6Y1 7 X X Q8NGZ0 Olfactory receptor 2AJ1 7 X Q8NGZ4 Olfactory receptor 2G3 7 X Q8NH00 Olfactory receptor 2T4 7 X Q8NH74 Olfactory receptor 10A6 7 X Q8NH76 Olfactory receptor 56B4 7 X Q8NH83 Olfactory receptor 4A5 7 X Q8NH90 Olfactory receptor 5AK2 7 X Q8NHC4 Olfactory receptor 10J5 7 X Q8NHC7 Olfactory receptor 14C36 7 X X Q8TDS5 Oxoeicosanoid receptor 1 7 X Q8TDV2 Probable G-protein coupled receptor 148 7 X Q8TE23 Taste receptor type 1 member 2 7 X Q8WXG9 G-protein coupled receptor 98 7 X X Q96G91 P2Y purinoceptor 11 7 X Q96R08 Olfactory receptor 5B12 7 X Q96R47 Olfactory receptor 2A14 7 X Q96R84 Putative olfactory receptor 1F2 7 X Q96RA2 Olfactory receptor 7D2 7 X Q96RB7 Olfactory receptor 5M11 7 X Q96RC9 Olfactory receptor 8B4 7 X Q96RI0 Proteinase-activated receptor 4 7 X Q99680 Probable G-protein coupled receptor 22 7 X Q9GZK3 Olfactory receptor 2B2 7 X X X Q9GZM6 Olfactory receptor 8D2 7 X X Q9H208 Olfactory receptor 10A2 7 X Q9H244 P2Y purinoceptor 12 7 X Q9H2C5 Olfactory receptor 52A5 7 X Q9H343 Olfactory receptor 51I1 7 X Q9H346 Olfactory receptor 52D1 7 X Q9H3N8 Histamine H4 receptor 7 X Q9HCU4 Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2 7 X Q9NYQ6 Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 1 7 X Q9NYW0 Taste receptor type 2 member 10 7 X Q9NYW5 Taste receptor type 2 member 4 7 X Q9NYW6 Taste receptor type 2 member 3 7 X Q9NZD1 G-protein coupled receptor family C group 5 member D 7 X Q9UGF5 Olfactory receptor 14J1 7 X Q9UHX3 EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 2 7 X Q9ULW2 Frizzled-10 7 X Q9UPC5 Probable G-protein coupled receptor 34 7 X Q9Y271 Cysteinyl leukotriene receptor 1 7 X Q9Y2T6 G-protein coupled receptor 55 7 X Q9Y302 Protein GPR89 7 X Q9Y653 G-protein coupled receptor 56 7 X Enzyme O00519 Fatty-acid amide hydrolase 1 1 X O14494 Lipid phosphate phosphohydrolase 1 6 X X X Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family O14638 1 X member 3 O15393 Transmembrane protease serine 2 1 X O43306 Adenylate cyclase type 6 12 X O60266 Adenylate cyclase type 3 12 X

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# 2PS AC Proteinname 2PS MLAC PBA TM +WGA O60906 Sphingomyelin phosphodiesterase 2 2 X O75976 Carboxypeptidase D 1 X O95168 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 4 1 X O95622 Adenylate cyclase type 5 13 X P04839 Cytochrome b-245 heavy chain 6 X P05023 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1 10 X X X P08473 Neprilysin 1 X X P08575 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C 1 X P12821 Angiotensin-converting enzyme 1 X P15144 Aminopeptidase N 1 X X P19440 Gamma-glutamyltranspeptidase 1 1 X P20020 Plasma membrane calcium-transporting ATPase 1 10 X P20648 Potassium-transporting ATPase alpha chain 1 10 X P22966 Angiotensin-converting enzyme 1 X X X X P23634 Plasma membrane calcium-transporting ATPase 4 10 X X P28907 ADP-ribosyl cyclase 1 1 X P49641 Alpha-mannosidase 2x 1 X P50993 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-2 10 X X P51828 Adenylate cyclase type 7 12 X P51841 Retinal guanylyl cyclase 2 1 X X P54707 Potassium-transporting ATPase alpha chain 2 10 X P54709 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-3 1 X X X Q04609 Glutamate carboxypeptidase 2 1 X X X Q13733 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-4 10 X X X Q495T6 Membrane metallo-endopeptidase-like 1 1 X Q6UX98 Probable palmitoyltransferase ZDHHC24 5 X Q8IUS5 Epoxide hydrolase 4 1 X Q8N5Y8 Poly [ADP-ribose] polymerase 16 1 X Glycerophosphodiester phosphodiesterase domain-containing Q8N9F7 2 X protein 1 Q8NFM4 Adenylate cyclase type 4 12 X X Q8TC27 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 32 1 X Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase Q8TCJ2 13 X subunit STT3B Q99965 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 2 1 X Q9H2U9 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 7 1 X Q9H6R6 Probable palmitoyltransferase ZDHHC6 4 X X Q9HBG4 V-type proton ATPase 116 kDa subunit a isoform 4 8 X Q9NZC3 Glycerophosphodiester phosphodiesterase 1 2 X Q9UKF5 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 29 1 X Q9Y487 V-type proton ATPase 116 kDa subunit a isoform 2 8 X Transportproteine O00341 Excitatory amino acid transporter 5 10 X P08183 Multidrug resistance protein 1 12 X P08195 4F2 cell-surface antigen heavy chain 1 X P11169 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3 11 X P13569 Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator 12 X P22732 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 5 12 X X P36021 Monocarboxylate transporter 8 12 X P53794 Sodium/myo-inositol cotransporter 12 X P53985 Monocarboxylate transporter 1 12 X X Q02094 Ammonium transporter Rh type A 12 X Q13183 Solute carrier family 13 member 2 12 X Q14802 FXYD domain-containing ion transport regulator 3 1 X Q53GD3 Choline transporter-like protein 4 10 X Q8TDB8 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 14 12 X X X Q99758 ATP-binding cassette sub-family A member 3 14 X Q9Y666 Solute carrier family 12 member 7 12 X Kanalproteine Intermediate conductance calcium-activated potassium channel O15554 7 X protein 4 O60706 ATP-binding cassette sub-family C member 9 15 X O95180 Voltage-dependent T-type calcium channel subunit alpha-1H 24 X P35498 Sodium channel protein type 1 subunit alpha 24 X P55064 Aquaporin-5 6 X Q07699 Sodium channel subunit beta-1 1 X Q13936 Voltage-dependent L-type calcium channel subunit alpha-1C 24 X Q8NET8 Transient receptor potential cation channel subfamily V member 3 6 X Q8NHX9 Two pore calcium channel protein 2 12 X Q9NPA1 Calcium-activated potassium channel subunit beta-3 2 X Q9UL62 Short transient receptor potential channel 5 6 X

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# 2PS AC Proteinname 2PS MLAC PBA TM +WGA Zelladhäsionsproteine O15394 Neural cell adhesion molecule 2 1 X O94856 Neurofascin 1 X O95471 Claudin-7 4 X P05107 Integrin beta-2 1 X X P12830 Cadherin-1 1 X P21926 CD9 antigen 4 X P32004 Neural cell adhesion molecule L1 1 X P55283 Cadherin-4 1 X X X P82279 Crumbs homolog 1 1 X Q02413 Desmoglein-1 1 X X Q12864 Cadherin-17 1 X Q14714 Sarcospan 4 X Q8IYV9 Izumo sperm-egg fusion protein 1 1 X Q92982 Ninjurin-1 2 X Q96QU1 Protocadherin-15 1 X Q9H0X4 Protein ITFG3 1 X Q9H195 Mucin-3B 1 X Q9P2S2 Neurexin-2-alpha 1 X Q9UN74 Protocadherin alpha-4 1 X Q9Y5F3 Protocadherin beta-1 1 X Q9Y5G3 Protocadherin gamma-B1 1 X Q9Y5I3 Protocadherin alpha-1 1 X Q9Y5I4 Protocadherin alpha-C2 1 X Q9Y639 Neuroplastin 1 X Vesikeltransportproteine O43760 Synaptogyrin-2 4 X O95473 Synaptogyrin-4 4 X X X P23763 Vesicle-associated membrane protein 1 1 X P49755 Transmembrane emp24 domain-containing protein 10 1 X P63027 Vesicle-associated membrane protein 2 1 X Q15836 Vesicle-associated membrane protein 3 1 X Q16563 Synaptophysin-like protein 1 4 X Q9BV40 Vesicle-associated membrane protein 8 1 X Q9P0L0 Vesicle-associated membrane protein-associated protein A 1 X X Sonstige Proteine O60309 Sperm acrosome membrane-associated protein 1 1 X X X O75121 Microfibrillar-associated protein 3-like 1 X O75352 Mannose-P-dolichol utilization defect 1 protein 5 X O96005 Cleft lip and palate transmembrane protein 1 5 X P01889 HLA class I histocompatibility antigen, B-7 alpha chain 1 X P01903 HLA class II histocompatibility antigen, DR alpha chain 1 X P04440 HLA class II histocompatibility antigen, DP beta 1 chain 1 X P08962 CD63 antigen 4 X P09564 T-cell antigen CD7 1 X P11279 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 1 X P13164 Interferon-induced transmembrane protein 1 2 X P13688 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 1 X P27105 Erythrocyte band 7 integral membrane protein 1 X P27824 Calnexin 1 X P30443 HLA class I histocompatibility antigen, A-1 alpha chain 1 X P49447 Cytochrome b561 6 X P60033 CD81 antigen 4 X P60852 Zona pellucida sperm-binding protein 1 1 X Q00765 Receptor expression-enhancing protein 5 2 X Q01628 Interferon-induced transmembrane protein 3 2 X Q13445 Transmembrane emp24 domain-containing protein 1 1 X Q5JX69 Uncharacterized protein C20orf107 1 X Q5TBA9 Protein furry homolog 2 X Q5VU65 Nuclear pore membrane glycoprotein 210-like 1 X Q6UWU4 Uncharacterized protein C6orf89 1 X Q6UX71 Plexin domain-containing protein 2 1 X Q7Z5M5 Transmembrane channel-like protein 3 10 X Q7Z6W1 Transmembrane and coiled-coil domain-containing protein 2 1 X Q86WI0 Lipoma HMGIC fusion partner-like 1 protein 3 X Q86XL3 Ankyrin repeat and LEM domain-containing protein 2 1 X Q8IUK5 Plexin domain-containing protein 1 1 X Q8IWB9 Testis-expressed sequence 2 protein 2 X Q8IZ96 CKLF-like MARVEL transmembrane domain-containing protein 1 4 X X Q8NC44 Protein FAM134A 3 X Q92542 Nicastrin 1 X

A n h a n g S e i t e | 102

# 2PS AC Proteinname 2PS MLAC PBA TM +WGA Q96A26 Protein FAM162A 1 X Q96HR9 Receptor expression-enhancing protein 6 2 X X X Q96JQ2 Calmin 1 X Q9C0E8 Protein lunapark 2 X Q9H330 Transmembrane protein C9orf5 14 X Q9H1E5 Thioredoxin-related transmembrane protein 4 1 X Q9H3K2 Growth hormone-inducible transmembrane protein 7 X Q9H6D5 Williams-Beuren syndrome chromosomal region 23 protein 1 X Q9HBL7 Transmembrane protein C9orf46 2 X Q9HD45 Transmembrane 9 superfamily member 3 9 X Q9HDC9 Adipocyte plasma membrane-associated protein 1 X X Q9NPR2 Semaphorin-4B 1 X Q9NT68 Teneurin-2 1 X Q9NV96 Cell cycle control protein 50A 2 X X Q9Y3A6 Transmembrane emp24 domain-containing protein 5 1 X

Tabelle 6: Gesamtliste der SRM-Übergänge für die verwendeten Rezeptorpeptide.

Rezeptor- Peptid- Vorläufer- Fragment- Kollisions- name fragment Ion Ionen energie 352.186 423.223 OR5D13 IVTVASVF 418.250 17.53 522.292 623.339 344.254 441.307 OR11H6 CYPVPIVL 452.254 18.69 540.375 637.428 457.208 556.276 OR5K1 YECAVQFY 511.718 20.71 627.313 730.322 426.205

573.274 OR2C3 YGSIIFMYL 553.783 686.358 22.14 799.442 886.474 395.192

510.219 OR52E2 MFLPNDTQF 556.758 624.262 22.24 721.315 834.399 343.197 456.281 569.365 OR4C15 IILNPLLNPL 560.360 22.37 666.418 780.461 893.545 377.214 476.282 577.330 OR6Y1 EVDNHTVTTR 586.289 23.25 714.389 828.432 943.459 358.269 457.338 514.359 OR2S2 LVILLGNGVLIL 618.918 628.402 24.36 685.424 798.508 911.592 1024.676 361.244 432.281 OR5M9 DVKEAVNKAITK 658.383 25.70 560.376 674.419

A n h a n g S e i t e | 103

773.487 844.525 973.567 1101.662 380.217 477.270 591.313 704.397 OR10G4 TVLTPLLNPVVY 664.895 25.92 817.481 914.534 1015.582 1128.666 380.181 493.265 624.306 752.401 OR6Y1 VTVISPKMLVDF 674.881 26.26 849.453 936.485 1049.569 1148.638 392.254 539.322 636.375 723.407 OR52D1 RSVAIVSPFIFL 674.903 26.26 822.475 935.560 1006.597 1105.665 345.213 473.308 586.392 657.429 OR5M11 NKDVKQALKNVL 685.412 26.62 785.487 913.582 1012.651 1127.678 442.233 539.286 653.329 766.413 OR1N2 MVIIPTLNPFIY 710.899 27.48 867.461 964.513 1077.597 1190.681 361.182 432.220 519.252 590.289 703.373 OR10J5 VISSILQIASAEGR 722.412 27.88 831.431 944.515 1057.599 1144.632 1231.664 397.255 525.314 582.335

697.362 OR6Y1 IILAIHSDGQLHK 722.917 784.394 27.89 921.453 1034.537 1105.574 1218.658 330.238 443.322 542.391 629.423

728.491 OR5A2 IVSVVVGIVSVLVVL 747.997 841.575 28.75 898.597

997.665 1096.733 1195.802 1282.834

A n h a n g S e i t e | 104

382.197 479.249 593.292

706.376 OR8B4 YTNVVPMLNPSIY 755.884 837.417 29.01 934.470

1033.538 1132.607 1246.649 394.233 481.265 595.308

708.392 OR5L1 YTVVIPMLNSVIY 756.413 839.433 29.03 936.485 1049.569 1148.638 1247.706 376.223 473.275 572.344 671.412

784.496 OR52W1 ALALKAVAIVVPFPL 761.492 855.533 29.20 954.602 1025.639 1153.734 1266.818 1337.855 382.197 497.224 596.292

709.376 OR2A14 FFLSHLAIVDISY 762.908 780.413 29.25 893.497

1030.556 1117.588 1230.672 330.202 443.286

556.370 657.418

820.481

921.529 DLVLSVTYTIITPL 774.450 29.65 OR10J5 1020.597 1107.629 1220.713 1319.782 376.193 507.234 663.335

776.419 OR8K1 MFILVAILRMNSR 782.447 889.503 29.92 960.540 1059.609 1172.693 1285.777 290.170 405.197 476.235 589.319 690.366 789.435 OR10A4 MGNVLIILVTIADSAL 821.976 31.26 902.519 1015.603 1128.687 1241.771 1340.839 1454.882 426.238

554.297 OR2Z1 RGEGATSYGGGAAQIFF 844.905 625.334 32.04 696.371 753.392

A n h a n g S e i t e | 105

810.414 867.435 1030.499 1117.531 1218.578 1289.616 1346.637 1475.680 366.202 465.270 564.339 621.360 734.444 871.503 OR13D1 KTFSTCASHLGVVSLF 848.940 32.18 958.535 1029.572 1132.581 1233.629 1320.661 1467.730 396.212 509.296 622.380 719.433

833.476 946.560 1077.601 OR2B2 FCGIIAPMLNPLIYTL 889.983 33.57 1174.653 1245.691 1358.775 1471.859 410.174 497.206 596.274 709.358 822.442 893.480 OR4C15 IVVTILSSPALLVSPMY 902.020 33.98 990.532 1077.564 1164.596 1277.680 1390.765 1491.812 361.182 432.220 519.252 616.304

729.388 OR5U1 IRIFSTVLRIPSAEGR 908.034 885.490 34.19 998.574 1097.642 1198.690 1285.722 1432.790 363.166 500.225 571.262 642.299

757.326 OR1N2 TGNVEAHRAKDAAHSAW 910.943 885.421 34.29 956.458 1112.559 1249.618 1320.655 1449.698 382.197 495.281 608.365

707.433 OR9I1 FGNFVILANASVILISY 921.014 794.465 34.63 865.502 979.545 1050.582 1163.667

A n h a n g S e i t e | 106

1276.751 1375.819 400.201 531.241 644.325 731.357 844.441 OR7D2 LIGVMTSLLHISLMMHL 955.027 35.78 981.500 1094.584 1207.668 1294.700 1395.748 358.269 415.291 502.323 631.366

744.450 OR52A5 QMWLIHSFQAIESGILL 993.530 815.487 37.09 943.545 1090.614 1177.646 1314.705 1427.789 346.233 459.317 588.360 702.403

801.471 OR10J1 PVMKLSCIDTTVNEILTL 995.534 902.519 37.16 1003.566 1118.593 1231.677 1334.687 1421.719 392.254 493.302 564.339 663.407

776.491 OR13C9 ACADISGNEFLMLVATILF 1014.513 907.532 37.81 1020.616

1167.684 1296.727 1410.770 1467.791 457.244 571.287 670.355 771.403

884.487 OR56B4 CSNLGVISLACDDITVNKFY 1088.027 999.514 40.31 1114.541

1217.550 1288.587 1401.671 1488.703 382.179 453.216 552.284 655.294 OR52N1 TGMESGVLMLMALDHCVAICF 1121.016 792.353 41.43 907.380 1020.464 1091.501 1222.541 1335.625 1466.666