Racionalno Načrtovanje Potencialnih Antidepresivov Iz Skupine Reverzibilnih Inhibitorjev Monoamin-Oksidaze A

Diplomsko delo

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine reverzibilnih inhibitorjev monoamin-oksidaze A

Junij, 2017 Marko Breznik

Marko Breznik

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine reverzibilnih inhibitorjev monoamin-oksidaze A

Diplomsko delo

Maribor, 2017

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine reverzibilnih inhibitorjev monoamin-oksidaze A Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnje

Študent: Marko Breznik

Študijski program: univerzitetni študijski program I. stopnje Kemija

Predvideni strokovni naslov: diplomirani kemik (UN)

Mentor: izr. prof. dr. Urban Bren

Komentor: dr. Janez Konc

Maribor, 2017

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Kazalo

...... IV Kazalo...... I Izjava ...... II Zahvala ...... III Povzetek ...... IV Abstract ...... V Seznam tabel ...... VI Seznam slik ...... VII Uporabljeni simboli in kratice ...... VIII 1 Uvod in opredelitev problema ...... 1 2 Teoretični del ...... 3 2.1 Mehanizem delovanja antidepresivov ...... 3 2.2 Biokemija monoaminov ...... 6 2.2.1 Zaviralci monoamin-oksidaze ...... 8 2.3 Harmala alkaloidi ...... 9 2.3.1 Derivati harmina kot RIMA ...... 10 2.4 Racionalno načrtovanje učinkovin ...... 13 2.4.1 Smernice - farmakodinamika ...... 13 2.4.2 Smernice - farmakokinetika ...... 14 3 Eksperimentalni del...... 15 3.1 Načrtovanje na osnovi znanega liganda ...... 15 3.1.1 Postopek (program LiSiCA) ...... 16 3.2 Načrtovanje na osnovi strukture tarčnega proteina ...... 17 3.2.1 Ovrednotenje rezultatov programa LiSiCA (program ProBiSdock) ...... 19 3.2.2 Iskanje ligandov na osnovi podobnosti vezavnih mest (program ProBiS) ...... 20 4 Rezultati in diskusija ...... 21 4.1 Spojine pridobljene s programoma LiSiCA in ProBiSdock ...... 21 4.1.1 Ocena farmakokinetičnih lastnosti...... 22 4.1.2 Ocena farmakodinamičnih lastnosti ...... 22 4.2 Derivati harmina ...... 23 4.2.1 Lipofilni žepek (R7 derivati) ...... 23 4.2.2 Heteroatomi fragmentov v lipofilnem žepku ...... 25 4.2.3 Primerjava z znanimi RIMA ...... 26 4.2.4 R6 derivati β-karbolina ...... 27 4.3 Spojine pridobljene s programom ProBiS ...... 28 4.4 Ocena zanesljivosti sidranja ...... 28 5 Zaključek ...... 29 6 Literatura ...... 31 7 Priloge ...... 35 7.1 Tabela najboljših 100 ujemanj glede na oceno vezavne energije ...... 35 8 Življenjepis ...... 41 Izjava o istovetnosti tiskane in elektronske verzije...... 43

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Izjava

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal sam, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledal sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih:

Vir: Google Scholar (http://scholar.google.si/) Gesla: Število referenc Harmine 9 230 Harmala IN MAO 4 570 Carboline IN MAO 10 100 MAOI 22 400 Moclobemide IN harmine 508 Peganum harmala 9 840

Vir: UM:NIK univerzitetni iskalnik (http://www.ukm.um.si/) Gesla: Število referenc Monoamine oxidase IN reversible 20 553 Harmine IN RIMA 41 Moclobemide 9 771

Vir: COBISS+ (https://plus.si.cobiss.net/opac7/bib/search) Gesla: Število referenc Antidepressants (le knjige) 46 Pharmacology (le knjige) 6 123 Drug design (le knjige) 2 215 Medicinal chemistry (le knjige) 376

Skupno število pregledanih člankov: 84 Skupno število pregledanih knjig: 15

Maribor, junij 2017 Marko Breznik

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Zahvala

Iskreno se zahvaljujem mentorju, izr. prof. dr. Urbanu Brenu, za strokovno usmerjanje, dosegljivost in zaupanje v moje sposobnosti ter Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo za vzpodbujanje samostojnosti pri pripravi teme diplomske naloge. Zahvala Kemijskem inštitutu, v sklopu katerega so bili ustvarjeni računalniški programi in ki mi je omogočil opravljanje diplomske naloge v svojih prostorih. Še posebej se zahvaljujem somentorju, dr. Janezu Koncu, za vodstvo, zaupanje v diplomsko temo ter sprotno podporo ter dr. Samu Lešniku in Blažu Škrlju za vse koristne informacije in pomoč pri programiranju. Rad bi se zahvalil še staršema za finančno in moralno podporo ter vsem prijateljem, dodatno Luciji Fleisinger in Vesni Gorenjak za nasvete ter Alini Holntaner in Maši Šraml, ki sta mi med opravljanjem diplomske naloge omogočili bivanje v Ljubljani.

III

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine reverzibilnih inhibitorjev monoamin-oksidaze A

Povzetek

Klinična depresija je poglaviten vzrok invalidnosti in pomemben dejavnik tveganja za samomor, ki je nadpovprečno pogost vzrok smrti v Sloveniji. Kljub zahtevnosti se motnja lahko zdravi uspešno in ima dobro prognozo. Antidepresivi se za zdravljenje depresije in drugih motenj uporabljajo vse pogosteje; navkljub obsežnim raziskavam pa za ta zdravila še vedno obstajajo številne možnosti izboljšav. Antidepresivi iz skupine reverzibilnih inhibitorjev monoamin-oksidaze A (RIMA) so bili doslej zapostavljeni zaradi pogostega enačenja s skupino antidepresivnih zdravil, ki so se na encim monoamin-oksidazo (MAO) vezali ireverzibilno in s tem povzročali smrtno nevarne interakcije s hrano. RIMA predstavljajo drugo generacijo antidepresivov z encimskim delovanjem in teh interakcij ne povzročajo, prav tako imajo bistveno zmanjšano tveganje interakcij z drugimi zdravili. Na osnovi dobre učinkovitosti, varnosti, ugodnega profila stranskih učinkov ter pomanjkanja predstavnikov te skupine na trgu, smo se v diplomskem delu osredotočili na racionalno načrtovanje antidepresivov tipa RIMA. Harmin je naravna spojina s tradicionalno rabo kot RIMA. Po strukturi predstavlja majhno, rigidno molekulo z dobro absorpcijo, penetracijo krvno-možganske pregrade in nanomolarno inhibitorno koncentracijo MAOA, vendar zaradi pomanjkanja selektivnosti delovanja povzroča številne stranske učinke. Reševanja problematike smo se lotili po treh pristopih. Zdravilom-podobne substance smo razvrstili po strukturni podobnosti derivatu harmina, ki tvori dodatne interakcije v lipofilnem žepku aktivnega mesta in ima in vitro izboljšano afiniteto za MAOA. Najbolj podobne molekule smo sidrali v tarčo in jih razvrstili po oceni vezavne energije. Kot rezultat prvega pristopa navajamo 100 tarči najbolje prilegajočih se molekul, za katere lahko pričakujemo spremembe v delovanju na sekundarnih mestih; vezava na MAOA pa je (vsaj in sillico) ohranjena. Struktura 15 najboljših ujemanj prvega pristopa nakazuje dobre farmakokinetične lastnosti. Iz njih smo vzeli fragmente, ki segajo v lipofilni žepek, ter jih inkorporirali na ogrodje harmina. S tem smo pridobili nabor strukturnih derivatov harmina za bodoče in vitro študije in obogatili znanje o povezavi struktura-aktivnost za RIMA. Za derivate harmina, ki so rezultati drugega pristopa, predvidevamo izboljšano vezavo in s tem povezano višjo selektivnost delovanja. Zadnji pristop pa je temeljil na iskanju ligandov iz drugih podobnih kristalnih struktur na redefiniranem vezavnem mestu. Priporočene so variante uporabe in usmerjenega razvoja harmala alkaloidov v druge zdravstvene namene. Zlasti inovativno je zdravljenje Downovega sindroma in Alzheimerjeve bolezni z inhibicijo DYRK1A-kinaze.

Ključne besede: harmin, zaviralci, antidepresivi, racionalno načrtovanje, in silico, monoamin-oksidaza, MAO, RIMA

UDK: 544.475:547.944.8(043.2)

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Rational design of reversible monoamine oxidase A inhibitors

Abstract

Depression is the single leading cause of disability worldwide. It represents a significant risk factor for suicide - a remarkably common preventable cause of death in Slovenia. Despite its complexity, the disorder can be treated successfully with the use of antidepressants. Although antidepressants have been studied extensively; possibilities for improvement remain. Reversible inhibitors of monoamine oxidase A (RIMA) represent a hardly-ever used class of antidepressants, since they are often equated to one of the first generations of antidepressants – the “classical” irreversible monoamine oxidase inhibitors (MAOI). The classical MAOI covalently bind to the enzyme, causing life-threatening drug-food interactions. RIMA represent the second generation of MAO-acting antidepressants that pose a significantly lower drug interaction threat. Due to their robust efficacy, safety, and favorable side effect profile, as well as the lack of representatives on the market, we focused on the rational drug design of RIMA-type antidepressants. Harmine is a natural compound traditionally considered a RIMA. It is a small, rigid compound that exhibits good gastrointestinal absorption, good penetration of the blood-brain barrier, and a nanomolar MAOA inhibitory concentration. However, it causes various side effects due to low target selectivity. This problem was tackled by several approaches. A collection of drug-like substances was rated by structural resemblance to a harmine derivative that forms additional interactions with the harmine-unoccupied lipophilic pocket in the MAOA binding site and exhibits an improved affinity towards MAOA in vitro. Structurally similar compounds were docked in the target protein and rated by binding energy estimates. The resulting 100 top-rated molecules show a vast structural diversity. Their activity at secondary physiological sites is expected to be altered, while MAOA-affinity remains preserved in silico. Structural indicators of pharmacological properties were examined for the 15 top-fitting molecules of the first approach. The fragments reaching into the lipophilic pocket were collected and incorporated onto the harmine scaffold. A collection of harmine derivatives was proposed for the in vitro evaluation and further studies of the structure-activity relationship. Additionally, the possibility of using the targeted development of harmala alkaloids for other medical purposes was highlighted. Particularly innovative is the option of treating Down's syndrome or Alzheimer's disease using harmine-based DYRK1A-kinase inhibitors. Key words: harmine, inhibitor, antidepressant, rational design, in silico, monoamine oxidase, MAO, RIMA

UDK: 544.475:547.944.8(043.2)

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Seznam tabel

Tabela 2-1 Razvrstitev antidepresivov po mehanizmu delovanja. Prirejeno po [19], dopolnjeno po podatkih iz CBZ[6] ...... 5 [9],[15],[27],[28] Tabela 2-2 Primerjava MAOA in MAOB...... 7 Tabela 2-3 Derivati harmina in inhibicija MAO. Prirejeno po [45] ...... 11 Tabela 4-1 Najbolje ocenjenih 15 spojin...... 21 Tabela 4-2 Pokazatelji farmakokinetičnih lastnosti ...... 22 Tabela 4-3 Predlagani derivati harmina ...... 24 Tabela 4-4 Primerjava pozicije harmina v kristalni strukturi (svetlomodro) s sidrano konformacijo ...... 28

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Seznam slik

Slika 1-1 Poraba antidepresivov v Sloveniji za obdobje 2002-2015 ...... 1 Slika 1-2 Iproniazid ...... 2 Slika 1-3 Moklobemid ...... 2 Slika 2-1 Sinapsa. Prirejeno po [16]...... 3 Slika 2-2 Razgradnja kateholaminov in serotonina ...... 6 Slika 2-3 Primeri harmala alkaloidov ...... 9

Slika 2-4 Harmin s površino vhoda v aktivno mesto MAOA in stranske verige aminokislin, ki ga tvorijo...... 10 Slika 2-5 Spojina vodnica 3e »7-(4,4,4-trifluorobutoksi)-1-metil-β-karbolin« ...... 12

Slika 2-6 Harminu podobni inhibitorji MAOA ...... 12 Slika 2-7 Struktura a) CX157 in b) befloksatona ...... 12 Slika 3-1 Izbor spojin na spletni strani ZINC15 ...... 16 Slika 3-2 PyMOL in programski vmesnik LiSiCA...... 17 Slika 3-3 ProBiSdock – potek in podatki ...... 18 Slika 3-4 Molekula ZINC1652347 ...... 18 Slika 3-5 Zapis za molekulo ZINC1652347 ...... 18

Slika 3-6 PLIP: predviden vodni mostiček harmin-H2O (746)-GLN215 ...... 19 Slika 3-7 Aktivno mesto: a) vhod v aktivno votlino; b) & c) pogled s strani iz notranjosti encima ...... 20 Slika 4-1 β-karbolinsko ogrodje derivatov ...... 23 Slika 4-2 Gruča predvidenih aktivnih konformacij molekul a) – o) iz tabele 4-1 in harmol s površino (modro) ...... 23 Slika 4-3 Harmol s fragmenti rezultatov, ki segajo izven njegove površine ...... 23 Slika 4-4 Polarni »sendvič« med karbonilnima skupinama PHE208 in ALA111 (zgoraj) ter tiolno skupino CYS323 na drugi strani aktivnega mesta (spodaj)...... 25 Slika 4-5 Vodikova vez med amidno skupino in molekulo e) ali m) iz tabele 4-1 ...... 25 Slika 4-6 Primerjava harmina z zasidrano konformacijo: a) befloksatona in b) CX157 ...... 26 Slika 4-7 Polarni del encima ob metilni skupini ...... 27 Slika 4-8 Karbonilni del spojine b) iz tabele 4-1, ki s cisteinom tvori vodikovo vez, se v zasidrani konformaciji ujema z območjem R6 β-karbolinskega obroča...... 27 Slika 4-9 a) MDMA in b) 6,7-metilendioksi derivati β-karbolina ...... 28

VII

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Uporabljeni simboli in kratice

Simboli ΔG sprememba Gibbsove proste energije ΔH sprememba entalpije ΔS sprememba entropije

EC50 srednja efektivna koncentracija

Ki konstanta inhibicije T temperatura

Kratice 5-HIAA 5-hidroksiindolocetna kislina (5-hydroxyindoleacetic acid)

5HT[XY] 5-hidroksitriptamin oz. serotonin [okrajšava za receptorje; podtip XY] ATC anatomsko-terapevtsko-kemični (anatomical therapeutic chemical) CBZ centralna baza zdravil COMT katehol O-metiltransferaza (catechol-O-methyltransferase) DHMA 3,4-dihidroksimandelična kislina (3,4-dihydroxymandelic acid) DID definiran dnevni odmerek na 1 000 prebivalcev na dan DMT N,N-dimetiltriptamin DOPAC 2,3-dihidroksifenilocetna kislina (3,4-dihydroxyphenylacetic acid) FAD flavinadenindinukleotid GABA γ-aminobutanojska kislina (gamma-aminobutyric acid) HVA homovanilična kislina (homovanillic acid)

MAO[X] monoamin-oksidaza [izooblika x] MAOI zaviralci monoamin-oksidaze (monoamine oxidase inhibitor) MDMA 3,4-metilendioksimetamfetamin PDB podatkovna baza proteinskih struktur (protein data bank) RIMA reverzibilni inhibitorji monoamin-oksidaze A (reversible inhibitor of monoamine oxidase A) RMSD koren povprečja kvadratov deviacije v atomski legi (root-mean-square deviation) SSRI selektivni zaviralci ponovnega privzema serotonina (selective serotonin reuptake inhibitors) TCA triciklični antidepresiv (tricyclic antidepressants) VMA vanililmandelična kislina (vanillylmandelic acid) ZINC ID identifikacijska številka spojine v ZINC

VIII

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

1 Uvod in opredelitev problema

Klinična depresija je karakterizirana z žalostjo, izgubo volje in užitka, utrujenostjo, slabo koncentracijo, občutki krivde ter težavami s spancem in prehranjevanjem. Je pogosta motnja, ki z okvirno 350 milijonov obolelih na svetu predstavlja poglavitni vzrok invalidnosti na svetu.[1] V določenem obdobju življenja zanjo zboli kar šestina populacije. Vpliva na čustvovanje, mišljenje, vedenje, telesno zdravje, medosebne odnose bolnika in predstavlja veliko finančno breme zaradi manjše zmogljivosti na delovnem mestu in stroškov zdravljenja.[2],[3] Depresivne bolezni so vzrok približno 70 %[4] vseh samomorov. V Sloveniji je standardizirana stopnja umrljivosti zaradi samomora dvakrat višja od povprečja EU.[5] Nezdravljena ali neuspešno zdravljena depresivna motnja lahko vodi do kar 20 let krajše življenjske dobe.[4] Kljub težavnostim, se ta bolezen zdravi uspešno in ima dobro prognozo.[4] V zadnjem času je glavni pristop zdravljenje z antidepresivi. Poleg indikacije, ki skupini daje ime in jo definira, te substance učinkovito zdravijo še številna druga bolezenska stanja. V Centralni bazi zdravil (CBZ)[6] so za zdravila, ki po anatomsko-terapevtsko-kemičnem (ATC) klasifikacijskem sistemu spadajo med antidepresive, navedene še naslednje terapevtske indikacije: panična, obsesivna-kompulzivna, posttravmatska stresna in generalizirana stresna motnja ter bulimija, socialna fobija, nočno mokrenje postelje in boleča diabetična periferna nevropatija. Po podatkih Porabe zdravil v Sloveniji v letu 2015[7] se je v letih 2002-2015 za 60 antidepresive število definiranih dnevnih 50 odmerkov na 1 000 prebivalcev na dan 40 (DID) povečalo za 2-krat (slika 1-1). 30 Razvoj antidepresivov je torej pomemben Število DID Število 20 že zaradi visoke porabe in lastnosti motenj za katere so indicirani: pogostost, 10 dolgotrajnost in izrazit vpliv na bolnika.[4] 0 Dodaten razlog dajejo omejena učinkovitost, stranski učinki in zakasnel začetek delovanja antidepresivov, ki so Slika 1-1 Poraba antidepresivov v Sloveniji za trenutno v rabi. obdobje 2002-2015 Odkritje prve skupine zdravil z relativno specifičnim antidepresivnim delovanjem je bilo naključno. Zdravljenje tuberkuloze z iproniazidom je povzročilo izboljšanje počutja, spanca, družabnosti in vitalnosti.[8] Intenziteto vpliva poudarja objava Associatted press leta 1953, kjer so pod sliko plešočih pacientov omenili, da je bilo še pred par meseci v bolnici slišati le žrtve tuberkuloze izkašljevati življenje. Govorilo se je o bolnikih, ki »plešejo po hodnikih kljub luknjam v pljučih«. Zdravilo je postalo senzacija, saj so dotlej depresijo zdravili s substancami katerih delovanje ni primarno antidepresivno in je povzročalo odvisnost (poživila, pomirjevala in opioidi). Še bolj kočljiva je bila raba postopkov kot so: inzulinsko-komatozna, spalna in farmakokonvulzivna ali elektrokonvulzivna terapija.[9]-[11]

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Iproniazid (slika 1-2) sodi med »klasične« neselektivne in ireverzibilne zaviralce monoamin- oksidaze (MAOI), ki še zdaj veljajo za ene učinkovitejših antidepresivov in lahko zdravijo tudi najzahtevnejše primere motenj čustvovanja.[8] V Sloveniji jih ne uporabljamo, v nekaterih državah (npr. ZDA) pa le po neuspešnem zdravljenju z novejšimi antidepresivi. Klasični MAOI s kovalentno vezavo dokončno preprečijo delovanje obeh izooblik encima monoamin- oksidaze (MAO). Ta narava inhibicije otežuje menjavo antidepresiva ob slabem odzivu in je razlog potencialno smrtonosnih interakcij z drugimi zdravili in celo s hrano.[9],[10]

Slika 1-2 Iproniazid

Interakcije so povzročile preusmeritev rabe in razvoja antidepresivov predvsem na spekter zaviralcev privzema monoaminov. Zdravila z delovanjem na MAO so ostala zapostavljena kljub razvoju selektivnih in reverzibilnih zaviralcev izooblike MAOA (RIMA), ki omogočajo hitro menjavo antidepresiva ter ne povzročajo škodljivega nakopičenja substratov.[8],[9] Trenutno je v Sloveniji edini dosegljiv RIMA moklobemid (slika 1-3), ki se pri zdravljenju uporablja redko in je pri nas indiciran za zdravljenje depresivne motnje in socialne fobije.[7],[12] Meta-analize in primerjalne študije za zdravljenje depresije in panične motnje zanj kažejo učinkovitost podobno tricikličnim antidepresivom (TCA) in selektivnim zaviralcem ponovnega privzema serotonina (SSRI). Ker nima antiholinergičnega in antihistaminičnega delovanja, je profil stranskih učinkov veliko ugodnejši od TCA, v primerjavi s SSRI pa ima manj stranskih učinkov na prebavila in spolnost ter ne povzroča povišanja telesne teže. Nima bistvenega vpliva na psihomotoriko, kognitivne sposobnosti ali kardiovaskularno zdravje, zato je še zlasti primeren za zdravljenje pri starejših bolnikih. Simptomatika predoziranja je relativno blaga, kar je ključnega pomena pri indikacijah, kjer obstaja višja verjetnost za poskus samomora.[13]

Slika 1-3 Moklobemid

Moklobemid potrebuje najmanj 2-kratno dnevno odmerjanje. Takšen način odmerjanja je nevšečen in najverjetneje povezan s pogostim stranskim učinkom - nespečnostjo.[12] Da bi zmanjšali tveganje nespečnosti, se običajno jemlje zjutraj in popoldan.[14] Dodatno težavo predstavlja nekoliko nižja učinkovitost[8] v primerjavi s klasičnimi MAOI. Način odmerjanja bi lahko vplival na učinkovitost zdravila, saj sedanji antidepresivi ne delujejo akutno (po potrebi), temveč je za učinek nujno neprekinjeno večtedensko delovanje. Z diplomsko nalogo želimo prispevati k odgovoru na vprašanje, kako ohraniti učinkovitost klasičnih MAOI in obenem zmanjšati tveganje interakcij. Namen je zasnovati potencialna antidepresivna zdravila tipa RIMA z izboljšanim kliničnim profilom v primerjavi z moklobemidom, ki se je izkazal kot delujoč in relativno dobro toleriran. Razvoj odpira možnosti zdravljenja za paciente, ki to zdravilo slabo prenašajo ali so nanj alergični ter za razvoj učinkovin z daljšim razpolovnim časom, ugodnejšim profilom stranskih učinkov ali višjo učinkovitostjo.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

2 Teoretični del

2.1 Mehanizem delovanja antidepresivov Najstarejša hipoteza o etiologiji depresije je monoaminska hipoteza, ki bolezen pripisuje pomanjkanju ali neravnovesju monoaminov (serotonina, noradrenalina in dopamina) v centralnem živčnem sistemu. V poenostavljenem pogledu je serotonin povezan s spanjem, gibanjem, obsesijami in kompulzijami, tesnobo, paniko, agresijo, apetitom, mišljenjem, učenjem, razpoloženjem in spolnostjo. Noradrenalin z budnostjo, pozornostjo, uravnavanjem krvnega tlaka, razpoloženjem, gibanjem, motivacijo in mišljenjem. V zdravljenju depresivne motnje je v manjši meri vključen tudi dopamin, vendar je njegova vloga pomembnejša pri zdravljenju psihoz ter Parkinsonove bolezni.[10] Zdravljenje z antidepresivi pogosto vodi do zmanjšanja simptomov klinične depresije. Če raven zmanjšanja simptomatike znaša najmanj 50 %, lahko govorimo o odzivu na zdravljenje. Zdravljenje s sedanjimi antidepresivi po osmih tednih povzroči odziv pri približno dveh tretjinah bolnikov, placebo pa pri eni tretjini. Cilj zdravljenja ni le zmanjšati, temveč odpraviti znake bolezni – tj. doseči remisijo.[15] Da se izognemo relapsu, moramo remisijo vzdrževati z nespremenjenimi odmerki antidepresiva najmanj štiri mesece.[10] Možgane sestavlja desetine bilijonov živčnih celic (nevronov), katerih zgradba je zasnovana tako, da čim učinkoviteje prejemajo in posredujejo informacije iz različnih virov: drugih nevronov, okolja, svetlobe, substanc itd. Osnova nevrona je njegovo telo (soma), ki vsebuje celične organele in deluje kot veznik med prejetimi informacijami, informacijami dednega materiala ter nadaljnjim posredovanjem signala. Medcelična komunikacija poteka po posebnih »izrastkih« - nevroni informacije običajno prejemajo z dendriti, ki so pogosto razvejani, naprej jih posredujejo z aksonom.[15] Po aksonu se do živčnega končiča informacije prenašajo kot električni impulz, med celicami pa kot substance, ki jih imenujemo živčni prenašalci ali nevrotransmiterji. Vsak nevron ima povezavo s tisočimi drugimi nevroni, tako da je v možganih po trilijone stičnih mest med nevroni z imenom sinapsa, ki je shematsko prikazana na sliki 2-1. Najbolj značilne so sinapse med aksoni in dendriti (aksodendritske-), razvijejo se pa lahko tudi na somi (aksosomatske-) ali med aksoni (aksoaksonske sinapse).[15]

Slika 2-1 Sinapsa. Prirejeno po [16].

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Ko električni signal doseže živčni končič, se na njegovi membrani odprejo kalcijevi kanalčki. Vtok kalcijevih ionov v presinaptični nevron povzroči zlitje sinaptičnih mehurčkov s celično membrano in s tem sprostitev nevrotransmiterjev iz mehurčkov v sinaptično špranjo. Nevron, ki s takšnim načinom informacijo »sporoča«, je presinaptični nevron. Na drugi strani sinaptične špranje se informacije z vezavo nevrotransmiterja na ustrezen receptor postsinaptičnega nevrona pretvorijo v drugo obliko ali substanco (sekundarne obveščevalce).[15] Sproščanje je regulirano z negativno povratno zanko. Ob povišani koncentraciji prenašalca pride do aktivacije avtoreceptorjev in zmanjšanja njegove sinteze ter nadaljnjega sproščanja. Aktivacija presinaptičnih adrenergičnih α2 receptorjev omejuje sproščanje noradrenalina in serotonina; aktivacija serotoninskih 5HT1B in 5HT1D receptorjev pa le serotonina. Somatodendritski 5HT1A receptorji ob aktivaciji pospešujejo gensko ekspresijo, zmanjšujejo sproščanje glutamata ter znižajo raven serotonina z upočasnitvijo živčnega impulza. 5HT2A in 5HT2C v možganskem deblu negativno regulirata sproščanje dopamina in noradrenalina v prefrontalnem korteksu.[15],[17] Ob povečani aktivaciji receptorja lahko sčasoma pride do zmanjšane občutljivosti receptorjev oz. navzdol-regulacije (ang. downregulation) – zmanjšanja transkripcije genov receptorjev in s tem njihovega števila. Ker antidepresivi zvišujejo raven monoaminov, ali posnemajo njihovo delovanje, praviloma s časom pride do navzdol-regulacije monoaminskih receptorjev.[15] Časovno se ta odziv ujema z začetkom okrevanja, ki praviloma nastopi šele nekaj tednov po začetku zdravljenja. Ker se raven monoaminov vseeno zviša že ob prvem vnosu zdravila, obstaja hipoteza genske ekspresije, ki bolezen pripisuje nezadostnemu prenosu signala do postsinaptičnih nevronov kljub normalni koncentraciji monoaminov in receptorjev. V normalnem stanju do navzdol-regulacije ne pride, ker se ravnovesna koncentracija monoaminov po sprostitvi v sinaptično špranjo ohranja z monoaminskimi črpalkami, s katerimi so monoamini privzeti nazaj v presinaptični nevron za ponovno rabo, ali pa jih razgradijo encimi.[10],[15],[17] Monoaminska hipoteza je posledica pojasnjevanja antidepresivnih »stranskih« učinkov zdravljenja tuberkuloze z iproniazidom in ne izvira iz preučevanja patofiziologije depresije.[10] Kljub temu, je po desetletjih od njenega nastanka še vedno stičišče farmakodinamike skoraj vseh antidepresivov v rabi. Antidepresivi učinke nevrotransmiterjev iz skupine monoaminov povečujejo na tri različne načine: 1. Blokada črpalk. Tako se prepreči privzem nevrotransmiterja nazaj v presinaptični nevron in zviša njegova koncentracija v sinaptični špranji. 2. Neposredni učinek na receptorje. Bistveni receptorji so našteti v odstavku, ki pojasnjuje regulacijo sproščanja – značilna je blokada avtoreceptorjev z antagonisti in s tem pospešitev sproščanja v špranjo. Izjema je 5HT1A receptor, za katerega je značilna delna aktivacija s parcialnimi agonisti. 3. Prekinitev ali oviranje razgradnje monoaminov z inhibicijo encimov.[10],[17]-[19] Nekateri stranski učinki niso povezani z mehanizmom antidepresivnega delovanja, temveč so posledica neselektivnosti. Blokada α1 receptorjev (npr. pri trazodonu) povzroča hipotenzijo (posledično omotico in slabost) in najverjetneje prispeva k sedaciji. Blokada histaminskega H1 receptorja (npr. pri maprotilinu in mirtazapinu) sicer lahko omili tesnobo in izboljša spanec, vendar povzroča sedacijo, zaspanost in povišanje telesne teže. Blokada acetilholinskih M1 receptorjev, značilna za triciklične antidepresive, povzroča motnje spomina, suha usta, zamegljen vid in zaprtje.[15]

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Tabela 2-1. Antidepresivi po ATC klasifikacijskem sistemu in podskupinah. Za podskupino so navedeni: številka, mehanizma delovanja s prejšnje strani, značilni stranski učinki in primer zdravila z dovoljenjem za uporabo v Sloveniji.

Tabela 2-1 Razvrstitev antidepresivov po mehanizmu delovanja. Prirejeno po [19], dopolnjeno po podatkih iz CBZ[6] ATC sistem # Stranski učinki Primer Glavobol, vrtoglavica, povečanje Triciklični antidepresivi telesne mase, sedacija, suha usta, Amitriptilin 1&2 Neselektivni (TCA) zamegljen vid, zaprtje, tahikardija, (Amyzol®) zaviralci privzema palpitacije, znojenje monoaminov Tetraciklični Sedacija, glavobol, tremor, suha Maprotilin antidepresivi 1&2 usta, nemir, zamegljen vid, slabost, (Ladiomil®) (TeCA) povečanje telesne mase

Prebavne težave, nespečnost, Selektivni zaviralci privzema serotonina Fluoksetin 1 utrujenost, tesnoba, težave v (SSRI) (Prozac®) spolnosti, glavobol, omotica, slabost

Neselektivni zaviralci monoamin-oksidaze Povečanje telesne mase, utrujenost, (MAOI) 3 težave v spolnosti, hipotenzija / Zaviralci monoamin-oksidaze A Motnje spanja, omotica, glavobol, Moklobemid 3 (RIMA) suha usta, slabost (Aurorix®) Zaviralci privzema serotonina in Podobni SSRI, vendar pogostejši Venlafaksin 1 noradrenalina (kombinacija SSRI in NRI) (Efectin®) (SNRI) Zaviralci privzema Nespečnost, omotica, suha usta, Reboksetin noradrenalina 1 zaprtje, slabost, potenje (Edronax®) (NRI) Zaviralci privzema noradrenalina in Glavobol, nemir, nespečnost, izguba Bupropion 1 dopamina apetita, izguba telesne mase, potenje (Wellbutrin®) (NDRI) Drugi antidepresivi Noradrenergični in Povečanje telesne mase, specifični serotoninski Mirtazapin 2 somnolenca, glavobol, suha usta, antidepresivi (Mirzaten®) omotica, tremor, slabost (NaSSA) Serotoninski modulatorji in Slabost, diareja, vrtoglavica, Vortioksetin 1&2 stimulatorji nenormalne sanje, srbenje (Brintellix®) (SMS) Serotoninski antagonisti Sedacija, vrtoglavica, zmedenost, Trazodon in zaviralci privzema 1&2 (SARI) zaspanost, zamegljen vid, slabost (Trittico®)

V tabelo 2-1 ni možno uvrstiti naslednjih antidepresivov z dovoljenjem za promet v Sloveniji: ekstrakt šentjanževke, agomelatin, oksitriptan in tianeptin. Ekstrakt šentjanževke s povečanjem znotrajcelične koncentracije natrija (nestandarden način) zavira privzem monoaminov, glicina in γ-aminobutanojske kisline (GABA)[20]; agomelatin je agonist [21] melatoninskih receptorjev in antagonist 5HT2C receptorja ; oksitriptan pa prekurzor serotonina in melatonina. Podatki o mehanizmu delovanja tianeptina niso skladni – povišanje privzema serotonina[22], aktivacija µ-opioidnih receptorjev[23] ali vpliv na glutaminski sistem[24], najverjetneje pa gre za sinergistično delovanje.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

2.2 Biokemija monoaminov Monoamini oz. biogeni amini so bili prvi identificirani nevrotransmiterji. Adrenalin, noradrenalin in dopamin so derivati aminokisline tirozin. Zanje je značilna komponenta 1,2- dihidroksibenzena oz. katehola, zato jih uvrščamo med kateholamine. Serotonin je sintetiziran iz aminokisline triptofan. Prvi korak sinteze monoaminov je hidroksilacija aminokisline, nato odstranitev kislinskega dela z L-aromatično-aminokislinsko-dekarboksilazo.[11],[17] Razgrajeni so z dvema encimoma: Monoamin-oksidazo (MAO) in Katehol O-metiltransferazo (COMT). Monoamin-oksidaza je encim, ki vsebuje flavinadenindinukleotid (FAD) in katalizira oksidacijo monoaminov do ustreznih iminov; oksidirani produkti nato spontano hidrolizirajo na ustrezne ketone ali aldehide. Aldehidi, ki nastanejo z MAO so z dehidrogenazo pretvorjeni v karboksilne kisline ali z reduktazo v alkohole in v takšni obliki izločeni iz telesa.[25] Končni produkti v primeru dehidrogenacije so: homovanilična kislina (HVA); 2,3- dihidroksifenilocetna kislina (DOPAC); vanililmandelična kislina (VMA); 3,4- dihidroksimandelična kislina (DHMA) in 5-hidroksiindolocetna kislina (5-HIAA).[17] Substrati, derivati in spremembe ob MAO-odvisni razgradnji monoaminov so prikazani na sliki 2-1.

MAO COMT MAO

← ← →

HVA 3-Metoksitiramin Dopamin DOPAC

Dopamin ↓ β-hidroksilaza

← ← →

VMA Normetanefrin Noradrenalin DHMA

Feniletanolamin ↓ N-metiltransferaza

← ← →

VMA Metanefrin Adrenalin DHMA

→

Serotonin 5-HIAA Slika 2-2 Razgradnja kateholaminov in serotonina

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Obstajata dve izoobliki encima: MAOA in MAOB, ki se razlikujeta po telesni in celični razporeditvi ter selektivnosti do substratov.[26] Glavne značilnosti posamezne izooblike so prikazane v tabeli 2-2.

[9],[15],[27],[28] Tabela 2-2 Primerjava MAOA in MAOB.

MAOA MAOB Substrati Tiramin Tiramin Dopamin Dopamin Triptamin Triptamin Serotonin Benzilamin Adrenalin β-feniletilamin Noradrenalin Porazdelitev po tkivu Kateholergični nevroni Serotonergični nevroni Črevesje Astrociti Jetra Trombociti Placenta Limfociti Koža

Vsaka izooblika je kodirana s svojim genom na X-kromosomu, njuni aminokislinski zaporedji se ujemata v približno 70 %.[26] Meyer, Ginovart, Boovariwala idr. so v raziskavi[29] z radioaktivno-označenim harminom in pozitronsko emisijsko tomografijo odkrili signifikantno povišane vrednosti MAOA pri 17 bolnikih v depresivni epizodi v primerjavi s kontrolo 17 zdravih ljudi. V povprečju za celotne možgane bi naj bila gostota MAOA kar 34 % višja pri bolnikih. Na podlagi rezultatov raziskave in ob pomanjkanju drugih pojasnitev zmanjšanih vrednosti monoaminov med depresivnimi epizodami, so ta učinek pripisali povišanim vrednostim MAOA.

Aktivno mesto MAOA je večinoma hidrofobno, z izjemo lizina (LYS305), ki sodeluje pri vezavi koencima. Dva tirozina (TYR407 in TYR444) ob vezavi tvorita aromatski sendvič na vsaki strani substrata in sta nujna za delovanje encima – bodisi zaradi njune vloge pri lociranju substrata ali višanju njegove nukleofilnosti. Aktivno mesto se sestoji iz votline velikosti cca. 400 Å3. Pomembno razliko med izooblikama, ki določa selektivnost za substrate in zaviralce [25] predstavlja izolevcin (ILE335) v MAOA proti tirozinu (TYR326) v MAOB.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

2.2.1 Zaviralci monoamin-oksidaze Encimski inhibitorji oz. zaviralci so substance, ki omejujejo, uničijo ali deaktivirajo delovanje encima. Vodikov peroksid, amonijak in aldehidi, ki nastajajo ob razgradnji monoaminov lahko poškodujejo celično strukturo, zato obstaja teoretična podlaga za nevroprotektivno delovanje zaviralcev monoamin-oksidaze.[30] Prvi zaviralci monoamin-oksidaze so delovali ireverzibilno - z močno vezavo so dokončno uničili delovanje encima. Te zaviralce uvrščamo tudi med »samomorilske zaviralce«, ker se po vezavi na aktivno mesto tvori reaktivna zvrst, ki z vezavo uniči nadaljnje delovanje encima. Ireverzibilna vezava, ki ni selektivna do ene izmed izooblik MAO je problematična, ker povzroča nevarno nakopičenje določenih substratov.[15] Če se bolnik na zdravilo slabo odziva, je po ukinitvi klasičnega MAOI z uvajanjem novega antidepresiva z delovanjem na serotonin (recimo SSRI) nujno počakati najmanj 2 tedna, da se z de novo biosintezo obnovijo encimi MAO. Če tega ne storimo, tvegamo pojav nevarnega povišanja koncentracije ali učinkov serotonina – serotoninski sindrom. Možni znaki in posledice tega stanja so: vročina, migrena, diareja, vznemirjenost, koma, krči, možganske poškodbe, srčni zastoj in celo smrt. Menjave antidepresivov ne predstavljajo največjega tveganja za serotoninski sindrom, ker so praviloma kontrolirane. Sindrom se lahko pojavi tudi, če z MAOI zaužijemo nekatere zaviralce apetita (sibutramin), opioide za zdravljenje odvisnosti (metadon), protibolečinska zdravila (meperidon, dekstropropoksifen, tramadol) ali zdravila za blaženje kašlja (dekstrometorfan).[15]

Razgradnja tiramina v črevesju poteka z MAOA-odvisno reakcijo. V normalnem stanju se raven tiramina zviša šele po zaužitju 400 mg in več - za primerjavo vsebuje obrok z visoko količino tiramina v povprečju 40 mg. Če je delovanje MAO izničeno z ireverzibilnimi zaviralci pa je lahko škodljivih že samo 10 mg te substance. Tiramin povzroči sproščanje noradrenalina iz nevronov in posledično poviša krvni tlak in povzroči hipertenzivno krizo, v nekaterih primerih zato pride do možganskih krvavitev in smrti. Bolniki, ki uporabljajo ta zdravila morajo zato upoštevati posebno dieto.[15] Pojav je prvič opisal britanski farmacevt, katerega žena je jemala zdravila iz skupine klasičnih MAOI. Opazil je, da je vedno po zaužitju sira dobila močne glavobole, zato je pojav poimenovan »sirna reakcija«.[31] Rešitev nevarnih interakcij so zdravila RIMA – reverzibilni zaviralci monoamin-oksidaze A. Reverzibilnost pomeni, da je raven inhibicije neposredno povezana s koncentracijo in le začasna, po odcepitvi je delovanje encima povrnjeno. Zaviralci takšnega tipa z encimom tvorijo nekovalentne vezi, nevezana substanca pa je v dinamičnem ravnovesju s kompleksom, ki ga tvori z encimom. S tem lažje menjamo antidepresiv - z izločitvijo zdravila iz sistema se prekine njegovo delovanje. Možnost »sirne reakcije« je izredno zmanjšana, ker tiramin z molekulo zdravila (z reverzibilnim zaviralcem) tekmuje za vezavo. Če se koncentracija tiramina bistveno poviša, bo ta enostavno izpodrinil zdravilo iz kompleksa z encimom.[15]

Inhibicija MAOB se uporablja za zdravljenje Parkinsonove bolezni in nima antidepresivnega učinka. Zdravila RIMA po definiciji selektivno delujejo le na MAOA, zato ne pride do znatnega povišanja koncentracije substratov izooblike B – med katere spada tudi tiramin. RIMA imajo s tega vidika potencialno enako učinkovitost kot drugi MAOI, le da ne pride do nevarnih interakcij.[15]

V vlogi potentne reverzibilne inhibicije MAOA so se za obetavne izkazale naravne substance s tradicionalno rabo, ki za stoletja presega čas odkritja prvih antidepresivnih zdravil. Te substance predstavljajo osnovo načrtovanja učinkovin v tem diplomskem delu in so podrobneje opisane v naslednjem poglavju.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

2.3 Harmala alkaloidi Čajna mešanica ayahuasca predstavlja ključen del življenjskega nazora avtohtonih ljudstev Amazonskega pragozda, kjer jo uporabljajo v zdravstvu, religiji ter obredih prehoda. Najpogostejša različica ayahuasce se sestoji iz rastlin Banisteriopsis caapi in Psychotria viridis. Slednja je pri samostojnem zaužitju povsem neaktivna, v kombinaciji z B. caapi pa deluje kot psihadelik in povzroči močno spremembo zavesti z izboljšanjem počutja, spiritualnimi doživetji, prividi, okrepitvijo čustev ter olajšano zaznavo osebnih spominov.[32] Psihadelik N,N-dimetiltriptamin (DMT) je naravno prisoten v listih P. viridis. Ob zaužitju se ta substanca v črevesju hitro razgradi z MAOA-katalizirano reakcijo, kar prepreči psihoaktivno delovanje rastline. Sestavine B. caapi delujejo kot RIMA in s tem zavirajo razgradnjo DMT. Gre za spojine, ki jih uvrščamo v skupino harmala alkaloidov (harmin, harmalin, harmalol itd.).[32] Harmala alkaloidi po strukturi spadajo med β-karboline - dušikove heterociklike indola, spojenega z različno saturiranim piridinskim obročem. Struktura nekaterih harmala alkaloidov je prikazana na sliki 2-3.[27]

Harmalin Norharman Harman

Tetrahidroharmin Harmin Harmol

Slika 2-3 Primeri harmala alkaloidov

Kettler, Da Prada in Burkard so v in vitro raziskavi[33] za harmalin napram moklobemidu dokazali več kot 100-krat močnejšo inhibicijo MAOA, ex vivo na možganih podgan pa 2 do 4- krat šibkeje delovanje. Kontradiktorno je Gerardy[34] spoznal, da je harmalin tudi ex vivo močnejši zaviralec MAOA od moklobemida. Izmed preverjenih harmala alkaloidov [35] (norharman, harman, harmin, harmalin), pa harmin najmočneje zavira MAOA. Z administracijo 10 mg/kg harmina v trebušno votlino podgan se efluks dopamina poviša na 243 % začetne vrednosti, koncentracije njegovih metabolitov pa se zmanjšajo (DOPAC na 10 % ter HVA na 20 %). Koncentracija razgradnega produkta serotonina (5-HIAA) se zmanjša na 72 %. V primerjavi 20 mg/kg moklobemida raven dopamina poviša na 256 % in zmanjša vrednosti DOPAC na 30 %, HVA na 24 %, in 5-HIAA na 62 %.[36] Glavni vir vnosa β-karbolinov pri splošni populaciji sta kava in tobak (pri kadilcih inhibirajo [27],[37] MAOA za cca. 28 % in MAOB za cca. 40 %). Ker kava in tobak vsebujeta tudi druge psihoaktivne substance, nista primerna osnova za sklepanje o učinkih harmala alkaloidov. Te lahko najbolj zanesljivo opazujemo pri tradicionalni ter rekreativni rabi semen Peganum harmala. Znano je, da ekstrakt te rastline selektivno in močno zavira MAOA in da lahko ta učinek neposredno pripišemo harmala alkaloidom, ki so po njej tudi poimenovani. Suha semena rastline vsebujejo še višje ravni bioaktivnih β-karbolinov od B. caapi: 4,3 %-5,6 % harmina in harmalina skupaj, 0,6 % harmalola in 0,1 % tetrahidroharmina. Zastrupitev s semeni lahko povzroči hipotermijo, paralizo, evforijo, konvulzije, slabost, bruhanje, bradikardijo in halucinacije. Primeri zastrupitve izzvenijo v nekaj urah, pacienti praviloma bolnico zapustijo v dobrem zdravju.[30]

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Nekateri učinki P. harmala so morda posledica drugih sestavin, recimo derivatov kinazolina, kot je peganin.[26] Ti učinki bi bili z izolacijo harmina izločeni. Največjo oviro pri prenosu harmina v medicinsko rabo je njegova slaba selektivnost delovanja. Njegova podobnost endogenim signalnim molekulam pa mu poleg delovanja kot RIMA omogoča še vezavo na [38] [39] [39] [40] acetilholinesterazo , dopaminske (D1 in D2) , muskarinske , serotoninske (5-HT1A , 5- [41],[42] [41] [27] [27] HT2A …), imidazolinske (I1 in I2) , opioidne in benzodiazepinske receptorje. Harmala alkaloidi so tudi potencialni kandidati za preprečevanje nastanka in poslabšanja Alzheimerjeve bolezni - zavirajo delovanje DYRK1A-kinaze ter s tem zmanjšajo koncentracijo fosforiliranih oblik tau proteina.[41],[43] Gen DYRK1A se nahaja v območju kromosoma 21, ki je bistven za pojav Downovega sindromoma. Območje je potrebno za razvoj in vzdrževanje funkcije možganov; študije na miših s čezmernim izražanjem DYRK1A nakazujejo povezavo z deficiti v učenju in mišljenju ter s pojavom omenjenih bolezni.[44]

2.3.1 Derivati harmina kot RIMA Z modifikacijo harmina lahko pridobimo strukture z izboljšanimi lastnostmi. Načrtovani strukturni analogi se bodisi sami izkažejo kot uporabna zdravila, dajo informacije o razmerju struktura-delovanje ali služijo kot nove spojine vodnice. S tem želimo odkriti substance z višjo selektivnostjo delovanja, s čimer bi se potencialno izognili stranskim učinkom, kot so [42] halucinacije, ki so najverjetneje posledica vezave harmina na 5HT2A in 5HT2C receptorje.

Kristalna struktura kompleksa harmin-MAOA je bila že preučena; v podatkovni bazi proteinskih struktur PDB (ang. Protein Data Bank) sta objavljeni dve PDB datoteki pod identifikacijskima kodama 2Z5X in 2Z5Y. Harmin se nahaja v aktivnem mestu MAOA in je obdan s sedmimi molekulami vode ter aminokislinskimi preostanki TYR69, ASN181, PHE208, VAL210, GLN215, CYS323, ILE325, ILE335, LEU337, PHE352, TYR407, TYR444 in kofaktorjem FAD10. V piridinskem delu je stabiliziran s π-π interakcijo s TYR407, TYR444 in FAD10 ter s π-π interakcijo z amidno skupino GLN215. Harmin v MAOB ni možno prenesti zaradi prekrivanja metoksi dela z aminokislino TYR326 (pri MAOA je na tej poziciji ILE335).[45] Reniers idr. [45] so opazili, da v kristalni strukturi kompleksa 2Z5X na encimu ostane nezaseden hidrofobni žepek v bližini metoksi skupine harmina. Razvili so 15 derivatov, pri katerih so to funkcionalno skupino zamenjali z večjimi lipofilnimi skupinami ter in vitro preverili spremembe v afiniteti vezave na MAOA ter MAOB. Lipofilni žepek tvorijo aminokisline VAL93, LEU97, PHE108, ALA111, PHE208, CYS323 in ILE325.

Slika 2-4 Harmin s površino vhoda v aktivno mesto MAOA in stranske verige aminokislin, ki ga tvorijo.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Sinteza derivatov, ki jo predlagajo avtorji, je relativno enostavna. Harminu so dodali bromovodikovo in ocetno kislino ter zmes čez noč pustili pod refluksom. Dobili so 100 % izkoristek harmola in ga zaetrili z dodatkom alkil halida v prisotnosti Cs2CO3 ter dimetilformaldehida. Na človeški MAOA in MAOB so preverili vezavo sintetiziranih spojin in predvideli njihovo konstanto inhibicije Ki. Rezultati raziskave so prikazani v tabeli 2-3.[45]

Manjša konstanta inhibicije pomeni boljšo vezavo. Za primerjavo Ki moklobemida za MAOA v homogeniziranih mišjih možganih znaša 0,4 mM.[46]

Tabela 2-3 Derivati harmina in inhibicija MAO. Prirejeno po [45] Ki [nM] Oznaka Struktura MAOA MAOB

Harmin 16,9 (13,7-21,0) 120 800 (49 900-153 900)

3a 5,0 (4,5-5,6) NI

3b 3,9 (2,0-7,7) 14 % (± 6 %) pri 1 µM

3c 29,5 (24,0-36,3) NI

3d 28,4 (20,0-40,3) NI

3e 3,6 (2,6-5,0) 24 % (± 4 %) pri 1 µM

3f 4,3 (3,2-5,6) 221,6 (145,1-338,3)

3g 12,6 (11,6-13,7) 42 % (± 2 %) pri 1 µM

3h 5,0 (4,0-6,2) 39 % (± 2 %) pri 1 µM

3i cca. 500 NI

3j 24,9 (20,1-30,7) NI

3k 35,4 (18,9-66,5) NI

3l 100

3m 1 023,8 (920,0-1 139,4)) NI

3n 684,0 (558,6-836,9) NI

3o 255,7 (196,7-324,5) NI

NI = Ni inhibicije pri 1 µM

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Izmed navedenih derivatov 3e (slika 2-5) kaže najmočnejšo inhibicijo MAOA in dobro raven selektivnosti. Kot nadgradnjo harmina jo bomo uporabili za spojino vodnico (referenčna spojina programa LiSiCA – poglavje 3.1).

Slika 2-5 Spojina vodnica 3e »7-(4,4,4-trifluorobutoksi)-1-metil-β-karbolin« Dodatna oporna točka za povezavo med strukturo in delovanjem ter za predvidevanje fiziološkega učinka so naslednji sintetični harminu-podobni RIMA: metralindol, pirlindol, tetrindol.

metralindol pirlindol tetrindol

Slika 2-6 Harminu podobni inhibitorji MAOA Pirlindol ima dovoljenje na Portugalskem za zdravljenje depresivne motnje. Se hitro absorbira in porazdeli po telesu.[47] Naključne, dvojno-slepe študije kažejo signifikantno višjo učinkovitost napram placebu za zdravljenje depresije.[48] Poleg RIMA delovanja, ima tudi sekundarne antidepresivne učinke kot zaviralec ponovnega privzema serotonina in noradrenalina ter izkazuje nizke možnosti povzročitve »sirne reakcije«. Toksikološke študije za to spojino pri običajnih odmerkih ne kažejo nevarnih učinkov.[48] Po senzorično-motoričnih sposobnostih se v študijah ne razlikuje od placeba in ne stopnjuje učinkov alkohola. Dolgotrajna izpostavljenost terapevtskim odmerkom ne povzroči sprememb v sproščanju hormonov hipotalamusa in hipofize.[47] Pri derivatu 3e iz tabele 2-3 je metoksi skupina harmina zamenjana s trifluorirano alkilno verigo. Po pregledu literature smo naleteli še na dva RIMA s podobnim fragmentom. Befloksaton se v fragmentu razlikuje le za dodatek hidroksilne skupine, CX157 pa ima v tem delu za dva ogljika krajšo verigo - trifluoroetoksi napram trifluorobutoksi. Pri ljudeh za befloksaton polovica maksimalne efektivne koncentracije (EC50) v plazmi za inhibicijo [49] [50] možganske MAOA znaša 4,75 ng/ml ; za CX157 pa 19,3 ng/ml.

a) b)

Slika 2-7 Struktura a) CX157 in b) befloksatona

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

2.4 Racionalno načrtovanje učinkovin Razvoj računalniške tehnologije in algoritmov za izračun molekularnih lastnosti omogoča racionalno načrtovanje farmacevtskih učinkovin. Če je iz rentgenske kristalografije znana struktura tarče (npr. receptorja ali encima), lahko na osnovi izračunov in prikaza strukture predvidimo molekule, za katere lahko pričakujemo izboljšano eksperimentalno vezavo. Novi kandidati so lahko zasidrani v vezavno mesto za preučitev kemijskih interakcij. Tak način odkrivanja potencialnih učinkovin se imenuje načrtovanje na osnovi strukture tarče (ang. Structure-based drug design).[51] Če struktura tarčnega proteina ni znana, lahko načrtovanje postavimo na osnovi farmakofora, ki temelji na primerjavi molekularnih značilnosti substanc in vezave že znanih ligandov. Gre za predstavitev prostorskega razmerja med funkcionalnimi skupinami ligandov, ki so ključni za vezavo na receptor. Tak pristop se imenuje načrtovanje na osnovi ligandov (ang. Ligand- based drug design).[51] Načrtovanje lahko temelji tudi na združevanju več manjših delov (fragmentov), ki kažejo dobro ujemanje z določenim območjem tarče, vendar so zaradi svoje majhnosti neaktivni. Fragmente lahko združimo v večjo spojino, katere vsak posamezni fragment se prilega lastnemu delu tarče in aditivno prispeva k vezavni afiniteti celotne molekule.[52]

2.4.1 Smernice - farmakodinamika Neželene učinke harmina lahko odstranimo z izboljšanjem ujemanja z vezavnim mestom in s tem tudi selektivnostjo delovanja na MAOA. Pri zaviralcih reverzibilnega tipa sta encim in zaviralec v dinamičnem ravnovesju s kompleksom, ki ga tvorita: Encim + Zaviralec ↔ Kompleks Ravnovesje se vzpostavi in poteče v smer zmanjšanja proste energije (ΔG), ki je izračunana po enačbi 2.1.[51]

훥퐺 = 훥퐻 − 푇훥푆 (2.1)

Kjer je: ΔH sprememba entalpije; T temperatura; ΔS sprememba entropije. Na proces lahko gledamo kot na ravnotežno kemijsko reakcijo, le da ne gre za dejansko snovno spremembo, temveč dinamično tvorbo nekovalentnih medmolekulskih interakcij (ionske, vodikove, π-π, van der Waalsove, dipol/dipol ali ion/dipol interakcije). Spremembe zaradi tvorbe (ne)ugodnih interakcij liganda z encimom napram interakcijami s topilom so izražene v entalpijskem delu spremembe proste energije.[51] Entropijski delež predstavlja izgube zaradi reorganizacije topila ter zmanjšanja rotacijskega in translacijskega gibanja liganda. Z uvedbo nenasičenih vezi, cikličnih delov in velikih skupin lahko omejimo gibljivost liganda v nevezanem stanju. Rigidna struktura ima dve prednosti s stališča farmakodinamike: • Če se na vezavno mesto veže rigidna molekula, je entropijska izguba vezave manjša, kar pozitivno vpliva na ugodnost tvorbe kompleksa. • Na drugih mestih preprečimo vezavo konformacij molekule, ki za ujemanje z encimom niso ključne, kar pozitivno vpliva na selektivnost delovanja.[51]

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

2.4.2 Smernice - farmakokinetika Selektivnost delovanja in ujemanje pa še ne zagotavljata dobrega zdravila. Spremembe v strukturi se ne kažejo le v spremembi delovanja na telo, temveč tudi v delovanju telesa na spojino - na absorpciji, distribuciji, metabolizmu in eliminaciji (farmakokinetiki). Da bi prišlo do učinka, moramo doseči zadostne koncentracije učinkovine v ciljnem tkivu. Kot merilo absorpcije uporabljamo biološko uporabnost - delež učinkovine v glavnem krvnem obtoku glede na celoten odmerek.[51] Za boljšo biološko uporabnost pri načrtovanju substanc se je izkazalo koristno pravilo Lipinskega. Gre za karakteristike oralno aktivnih učinkovin, ki so bile izpeljane na podlagi pregleda 2 500 registriranih zdravil. Pravilo predstavlja priročno smernico, vendar ni univerzalno – sporoča, da izven kriterijev obstaja le majhna verjetnost za aktivnost ob oralni administraciji. Kriteriji dobre biološke uporabnosti po Lipinskem so: • molska masa naj bo manjša od 500 g/mol; • manj kot 5 donorskih skupin vodikove vezi (npr. hidroksilna skupina); • manj kot 10 akceptorskih skupin vodikove vezi (npr. karbonilna skupina); • izračunana lipofilnost (logP) naj bo med -1 in 5.[51] Manjša molska masa je povezana z boljšo zmožnostjo difuzije in s tem dosego učinkovite koncentracije v smiselnem časovnem obdobju. Zmožnost tvorbe vodikovih vezi je povezana s polarnostjo – molekula mora biti dovolj vodotopna, da se raztopi v črevesju in kasneje absorbira, hkrati previsoka vodotopnost pomeni slab prehod skozi lipidne membrane, kar se lahko kaže v zakasnelem delovanju ali slabši učinkovitosti. Optimalna lipofilnost (logP) za prehod krvno-možganske pregrade znaša 1,5-2,7 s povprečno vrednostjo 2,1.[51] Dobra penetracija pregrade je pomembna, saj je MAOA prisotna tudi v črevesju in jetrih, ciljna inhibicija pa je v možganih. Z zvišanjem porazdelitve med možgani in črevesjem/jetri lahko pričakujemo manjšo intenziteto stranskih učinkov in vpliv na metabolizem tiramina. Kasneje je prišlo do nadgradnje teh pravil. Molekulska masa naj ne bi imela ključne vloge pri biološki uporabnosti, temveč je le posledica dobre korelacije s številom funkcionalnih skupin za tvorbo vodikovih vezi in z gibljivostjo molekule. Rigidne strukture imajo torej prednost tudi po farmakokinetiki. Po trenutnih smernicah naj molekula vsebuje največ 10 vrtljivih vezi in eno izmed naslednjih lastnosti: • polarna površina naj bo manjša od 140 Å2 ali • število donorskih in akceptorskih mest vodikove vezi naj bo manjše ali enako 12.[52] Nekatere analize priporočajo celo 7 ali manj gibljivih vezi, s tem bi naj bila biološka uporabnost še višja. Priporočena pKa vrednost je med 6 in 9, izven tega območja so spojine običajno pretirano ionizirane in slabo prehajajo skozi membrane.[52]

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

3 Eksperimentalni del

In silico načrtovanje potencialnih antidepresivov smo opravili s programi, ki so bili razviti na Kemijskem inštitutu v Ljubljani. Lotili smo se ga po treh pristopih 1. V prvem smo na osnovi liganda (3e iz tabele 2-3) s programskim vmesnikom LiSiCA izvedli virtualno rešetanje, s čimer smo pridobili prvi nabor 3e-podobnih substanc in ga ovrednotili s sidranjem na MAOA s programom ProBiSdock. S tem smo dobili substance, ki se kot 3e ujemajo z molekulo encima. 2. Najboljših 15 ujemanj smo v sidrani konformaciji primerjali s harminom in predlagali nov nabor lipofilnih fragmentov, ki bi zapolnili žepek in s tem izboljšali vezavo harmina. Prednosti za sintezo derivatov so lastnosti harmina: o naravno dostopna molekula brez kiralnih centrov; o majhna, rigidna in fragmentom-podobna molekula;

o nanomolarna inhibicija MAOA; o enostavna in hitra sinteza derivatov. 3. V tretjem pristopu smo s spletno aplikacijo ProBiS poiskali ligande na osnovi znanih podobnih proteinskih struktur in njihovih ligandov.

3.1 Načrtovanje na osnovi znanega liganda Rešetanje na osnovi liganda temelji na predpostavki, da imajo podobne molekule podobno farmakološko delovanje. Za rešetanje smo uporabili vmesnik LiSiCA (ang. Ligand Similarity using Clique Algorithm), ki je razširitev programa za vizualizacijo struktur Pymol. Program na podlagi primerjave topologije (2D) ali konformacije (3D) molekul v zbirki tarčnih spojin poišče tiste, ki so najbolj podobne referenčni spojini - znanemu ligandu. Za delovanje potrebuje podatke o strukturi referenčne spojine in o strukturi tarčnih spojin v Tripos mol2 formatu. Pri 3D rešetanju mora biti struktura referenčne molekule podana v aktivni konformaciji, prav tako potrebujemo nabor konformacij za vsako izmed tarčnih molekul.[53] LiSiCA molekule pretvori v grafe – množico vozlišč in povezav med njimi. Vozlišča predstavljajo atome. LiSiCA se s tem razlikuje od drugih programov tega tipa, ki uporabljajo poenostavljene grafe, kjer vozlišča predstavljajo funkcionalno skupino. Pri 2D rešetanju povezave predstavljajo kovalentno vez, pri 3D pa so tvorjene med vsakim parom vozlišč in nimajo kemijskega pomena. Algoritem pred primerjavo dveh molekul tvori pripadajoča grafa in poišče njuno skupno največjo podstrukturo. Kot rezultat dobimo poljubno dolg seznam molekul razvrščenih glede na njihov Tanimoto koeficient T, ki služi kot merilo podobnosti molekul. Koeficient je izračunan po enačbi 3.1.[53]

푇(푆, 푅) = 푁푠 (3.1) 푁푡+푁푟−푁푠 Kjer je: Ns število atomov v skupnem delu strukture; Nr število atomov referenčne molekule; Nt število atomov tarčne molekule.

Želeno delovanje načrtovanja na osnovi ligandov je preskok na novo ogrodje molekule. S tem bi se morebitno izognili delovanju na druga vezavna mesta, ki povzroča stranske učinke.[53]

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

3.1.1 Postopek (program LiSiCA) Iz priloge k članku[45] smo pridobili datoteko Cpd-3e.mol, ki vsebuje podatke o strukturi spojine vodnice (3e iz tabele 2-3) in jo s programom OpenBabel pretvorili v obliko mol2 za uporabo v programu LiSiCA, kjer je služila kot referenčna spojina. Ker nismo imeli podatka o tem, ali je molekula podana v aktivni konformaciji, smo izvedli le 2D rešetanje. Nabor tarčnih molekul smo pridobili iz ZINC15 podatkovne baze komercialno dostopnih spojin za virtualno rešetanje. Na spletni strani http://zinc15.docking.org/tranches/home/ smo izbrali 3D podatkovno zbirko spojin in filtrirali molekule z molsko maso med 250 in 500 Da. Zgornja meja je bila določena na podlagi pravil Lipinskega, spodnja na podlagi molske mase referenčne spojine (308,30 Da). Za boljši prehod krvno-možganske bariere smo izbor dodatno omejili le na spojine z lipofilnostjo (LogP) med 1 in 3. Uporabili smo »clean« nastavitev za reaktivnost, ki odstrani reaktivne zvrsti kot so aldehidi, tioli in reaktanti michaelove adicije – njihova odsotnost je pomembna, ker želimo zaviralce reverzibilnega tipa. Za spojine načrtujemo eksperimentalno ovrednotenje vezave, zato smo za komercialno dostopnost izbrali nivo »agent«, ki zajema spojine na zalogi in tiste, ki so dosegljive s pomočjo sredstev javnega naročanja (recimo Molport ali eMolecules).[54]

Slika 3-1 Izbor spojin na spletni strani ZINC15

Spojine smo naložili v 1 719 delih, jih ekstrahirali in združili v datoteko zbirka.mol2, ki je zajemala 4 014 896 spojin. S programom LiSiCA smo spojine primerjali z referenčno spojino v 2D načinu in shranili 10 000 spojin z najvišjo vrednostjo Tanimoto koeficienta.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Slika 3-2 PyMOL in programski vmesnik LiSiCA

3.2 Načrtovanje na osnovi strukture tarčnega proteina

Za načrtovanje na osnovi aktivnega mesta MAOA, smo uporabili programa ProBiS in ProBiSdock. Program ProBiS (ang. Protein Binding Site) primerja fizikalno-kemijske lastnosti površine tarčnega proteina s kristalnimi strukturami vezavnih mest v PDB bazi proteinskih struktur. Na tarčni protein iz baze prenese ligande, ki so aktivni na drugih, podobnih vezavnih mestih. Za te substance lahko pričakujemo višjo verjetnost vezave in jih kasneje priredimo za uporabo na želenem mestu. Tako lahko obstoječa zdravila preusmerimo v uporabo za druge indikacije ali pa prepoznamo podobne strukturne elemente ligandov. Omogoča prostorski prikaz predvidenih vezavnih mest in za vsako mesto tudi seznam ligandov ter minimizacijo energije. Prav tako prikaže in preračuna jakost interakcij med proteinom in ligandom (npr. vodikove vezi).[55] ProBiS programski vmesnik za PyMOL je za akademsko rabo dosegljiv brezplačno na spletni strani http://insilab.org/probis-plugin. Program je dostopen tudi preko strežnika na spletnih straneh http://probis.cmm.ki.si/ in https://probis.nih.gov/ .[55] Program ProBiSdock spojine zasidra v protein in oceni predvideno konformacijo in vezavno energijo. Enako kot ProBiS na začetku iz kristalnih struktur v PDB bazi poiskana poišče vezavna mesta, nato pa v tarčni protein premesti še ligande teh podobnih mest.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Slika 3-3 ProBiSdock – potek in podatki Atomi ligandov so pretvorjeni v točke v vezavnem mestu s 3D koordinatami in pripisanim tipom atoma. Sliki 3-4 in 3-5 prikazujeta primer strukture liganda in njegovo pretvorbo. Za sidranje ni pomembno, s katere molekule ti atomi izvirajo, na podlagi njih je le določena dimenzija prostora zasedenega z ligandi.

Slika 3-4 Molekula ZINC1652347

Slika 3-5 Zapis za molekulo ZINC1652347 V tak zapis je pretvorjena tudi sleherna molekula, ki jo sidramo. Spojina je nato na vrtljivih vezeh razdeljena na posamezne fragmente. Fragmenti so najprej rigidno umeščeni v vezavno mesto, za vsako pozicijo je ocenjena vezavna energija. Če je razdalja med fragmenti primerna, je delež najugodnejših konformacij fragmentov združen v izvorno spojino. Spojina in vezavno mesto sta energijsko minimizirana, nato je vezavna energija ocenjena ponovno in izpisana v rezultatih.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

3.2.1 Ovrednotenje rezultatov programa LiSiCA (program ProBiSdock)

Iz PDB baze smo pridobili 2z5x.pdb datoteko strukture MAOA z vezanim harminom. Preverili smo strukturno ohranjenost molekul vode s pregledom gruče 45 struktur s 70 % identičnostjo aminokislinskega zaporedja (PDB ID: '2XCG', '3PO7', '1S3E', '1OJD', '2C73', '1GOS', '1OJC', '1S3B', '2C75', '2C76', '2C70', '2C72', '4A79', '1O5W', '2BK4', '2BXR', '1OJA', '4CRT', '2V5Z', '1S2Q', '1S2Y', '2XFN', '2XFO', '2XFP', '2XFQ', '2BK3', '2BK5', '2XFU', '2V60', '2V61', '2BXS', '5MRL', '4A7A', '1OJ9', '2C67', '2BYB', '2C65', '2C64', '3ZYX', '2Z5Y', '2Z5X', '2C66', '2VZ2', '2VRL' in '2VRM'). Za okolico FAD smo identificirali 4 gruče s 46 molekulami vode in ohranjenostjo 1,00 (na 2z5x.pdb so to molekule 761, 706, 759 in 715). Za okolico harmina smo identificirali 3 gruče s 46 molekulami vode in ohranjenostjo 0,92 (na 2z5x.pdb molekule 717, 738 in 724). Ohranjena molekula vode št. 706 je bila izmed naštetih edina v aktivnem mestu. S spletno aplikacijo za analizo interakcij proteinov in ligandov PLIP (ang. Protein-Ligand Interaction Profiler) smo ugotovili, da molekula vode 746 predstavlja veznik edine polarne interakcije harmina z MAOA. Slika 3-6 prikazuje predlagano interakcijo. Aplikacijo ponuja Biotehnološki Center TU Dresden (BIOTEC) in je dosegljiva na spletni strani https://projects.biotec.tu- dresden.de/plip-web/plip/index.

Slika 3-6 PLIP: predviden vodni mostiček harmin-H2O (746)-GLN215

Iz 2z5x.pdb smo s programom Chimera izbrisali molekulo harmina in molekule vode razen 706 in 746 ter spremembe shranili kot MAOa.pdb. 10 000 spojin, ki smo jih pridobili s programom LiSiCA smo s programom ProBiSdock zasidrali v aktivno mesto encima iz datoteke MAOa.pdb. Najboljših 100 rezultatov smo podali glede na vrednosti energije vezave.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

3.2.2 Iskanje ligandov na osnovi podobnosti vezavnih mest (program ProBiS) V programu Chimera smo poiskali aminokisline, ki so sledeč članku[45] bodisi v stiku s harminom ali pa tvorijo lipofilni žepek (poglavje 2.3.1). Vključili smo prikaz encimske površine in izbor dopolnili do celotnega vhoda v votlino aktivnega mesta. Izbor je zajemal aminokislinske preostanke: 69, 93, 95, 97, 108, 109, 110, 111, 180, 181, 207, 208, 209, 210, 211, 215, 323, 325, 335, 337, 350, 352, 407 in 444. Slika 3-7 prikazuje površino žepka in aktivnega mesta (s harminom) ter koencim FAD.

a) b)

c) Slika 3-7 Aktivno mesto: a) vhod v aktivno votlino; b) & c) pogled s strani iz notranjosti encima Podatke o PDB datoteki (PDB ID: 2Z5X; CHAIN ID(s): A) smo vnesli na stran http://probis.cmm.ki.si/ in poiskali ligande z novo definiranim mestom, ki vključuje žepek.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

4 Rezultati in diskusija

4.1 Spojine pridobljene s programoma LiSiCA in ProBiSdock Tabela najboljših 100 substanc po oceni vezavne energije se nahaja v prilogi 7.1. Za najboljših 15 pa smo ocenili še farmakološke lastnosti.

Tabela 4-1 Najbolje ocenjenih 15 spojin

a) ZINC ID: 00257216859 b) ZINC ID: 000257216858 c) ZINC ID: 000065458858

d) ZINC ID: 000215987948 e) ZINC ID: 000225804366 f) ZINC ID: 000065458853

g) ZINC ID: 000096155892 h) ZINC ID: 000065434706 i) ZINC ID: 000226021340

j) ZINC ID: 000048313173 k) ZINC ID: 000040553415 l) ZINC ID: 000065434708

m) ZINC ID: 000225804383 n) ZINC ID: 000226021125 o) ZINC ID: 000096260721

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

4.1.1 Ocena farmakokinetičnih lastnosti Pokazatelji farmakokinetike najboljših 15 rezultatov so prikazani v tabeli 4-2. Kjer je bilo možno, so za spojine značilnosti navedene pri fiziološkem pH (7,4). Za a), b), e), i), j), k), m), n), o) so podatki navedeni pri »referenčnem pH«. Lipofilnost in molska masa nista obravnavani, ker so bile za te lastnosti spojine že filtrirane v postopku prenosa iz baze. Za nabor molekul velja: LogP ∈ (1, 3] in M ∈ (300, 500]. Tabela 4-2 Pokazatelji farmakokinetičnih lastnosti

Vodikova vez – število Spojina iz Ocena vezavne skupin Polarna Število tabele 4-1 energije [/] površina [Å2] vrtljivih vezi Donorske Akceptorske a) -59,63 3 2 58 4 b) - 58,55 3 2 58 4 c) -56,82 3 2 49 3 d) -56,77 2 2 47 7 e) -56,32 2 3 47 4 f) -55,71 3 2 49 3 g) -54,69 1 5 49 6 h) -54,29 3 2 49 3 i) -53,87 1 3 43 8 j) -53,83 1 5 58 4 k) -53.73 2 5 64 5 l) -53.66 3 2 49 3 m) -53.59 2 3 47 4 n) -53.31 2 2 54 6 o) -53.22 2 5 54 4

Vse spojine imajo manj od 5 donorskih in manj od 10 akceptorskih skupin vodikove vezi. Vsebujejo 10 ali manj vrtljivih vezi, strožjega kriterija (7 ali manj) ne dosega le molekula i), ki ima 8 vrtljivih vezi. Njihova polarna površina je manjša od 140 Å2. Tudi seštevek donorskih in akceptorskih mest vodikove vezi za vsako molekulo je manjši od 12. Za vse spojine posledično predvidevamo dobro farmakokinetiko in penetracijo krvno-možganske pregrade.

4.1.2 Ocena farmakodinamičnih lastnosti Para c)&f) ter e)&m) iz tabele 4-1 sta enantiomera, zato (vsaj s stališča ujemanja s tarčo) purifikacija oz. stereoselektivna sinteza ni potrebna, kar zmanjša stroške sinteze. Para a)&b) ter h)&l) sta skoraj enantiomera, z manjšo razliko v lokaciji dvojne vezi. Spojine ne vsebujejo fragmentov, ki so značilni za ireverzibilne MAOI: trojna vez (selegilin, klorgilin), hidrazin (iproniazid, fenelzin) ali ciklopropanilamin (tranilcipromin). Iz knjižnice zdravilom podobnih substanc so spojine filtrirane najprej po podobnosti derivatu harmina 3e iz tabele 2-3, nato še glede na ujemanje z aktivnim mestom encima. Konformacija aktivnega mesta je prirejena vezavi harmina, zato predvidevamo, da se struktura mesta ob interakciji s temi spojinami bistveno ne razlikuje. V sledečem poglavju so natančneje komentirani deli pridobljenih spojin, ki segajo v lipofilni žepek.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

4.2 Derivati harmina

Harmin ima dobro afiniteto za MAOA– prav tako kaže ugodne lastnosti, kot so rigidnost, lipofilnost in nizka molska masa. Če ga dopolnimo s fragmenti, ki izboljšajo vezavo, se lahko izognemo stranskim učinkom z znižanjem terapevtske koncentracije ali z izločitvijo ujemanja z drugimi vezavnimi mesti. Simulacije sidranja so v izhodni študiji[45] pokazale, da se konformacija aktivnega mesta z dodatkom trifluorobutoksi fragmenta, prisotnega v referenčni spojini 3e iz tabele 2-3, ne spremeni bistveno. Ker je struktura harmina že v osnovi rigidna, se načrtovanje fragmentov, ki bi zapolnili žepek na osnovi harminu-prilagojene strukture MAOA zdi še posebej obetavno. Za lažjo obravnavo predlaganih za strukturnih analogov harmina, je na sliki 4-1 prikazano β-karbolinsko ogrodje s ključnimi pozicijami za razvoj derivatov.

Slika 4-1 β-karbolinsko ogrodje derivatov

4.2.1 Lipofilni žepek (R7 derivati) Na sliki 4-2 lahko opazimo, da se izven površine harmola nahaja le majhen delež najboljših 15 molekul. V zgornjem desnem kotu se nahajajo fragmenti, ki zapolnjujejo lipofilni žepek.

Slika 4-2 Gruča predvidenih aktivnih konformacij molekul a) – o) iz tabele 4-1 in harmol s površino (modro) Če elemente, ki zajemajo površino harmola odstranimo, lahko dobimo nov nabor fragmentov, ki bi jih lahko analogno izhodni študiji[45] zaetrili s harmolom in preverili vezavo (slika 4-3).

Slika 4-3 Harmol s fragmenti rezultatov, ki segajo izven njegove površine

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Poleg nepolarnih π-π interakcij, ki so omenjene v članku[45], in vodnega mostička, ki ga predlaga PLIP, je program Chimera predlagal še vodikovo vez med kisikom metoksi skupine harmina (iz kristalne strukture) in cisteinom 323. Komentarji interakcij predlaganih fragmentov so prikazani v tabeli 4-3.

Tabela 4-3 Predlagani derivati harmina Predlagan fragment + Vir iz Oznaka Komentar harmol tabele 4-1 Spojina je že bila testirana 3m a), b) [Ki = 1 023,8 nM] Terciarni amin

1a) c), f), j) Terciarni amin

Izboljšanje afinitete ob dodatku nepolarnih 1b) d) verig podobne velikosti, predvidevamo dobro ujemanje Odboj 1c) g) karbonilna – karbonilna skupina glavne verige (PHE208)

Spojina podobna 3f iz tabele 2-3 1d) h), l) [Ki = 3,4 nM]

Spojina podobna 3c iz tabele 2-3 1e) i) [K = 29,5 nM] i

1f) k) Terciarni amin

Vodikova vez kisik (tetrahidrofuran) – amid 1g) e), m) glavne verige (VAL210)

Terciarni amin Prisotnost aromatskega obroča lahko 1h) n) zmanjša selektivnost s povišanjem afinitete na MAOB (interakcija s TYR326) Vodikova vez: 1i) o) Hidroksilna– karbonilna skupina glavne verige (ALA11)

Za spojino 1c) predlagamo redukcijo karbonilne skupine na hidroksilno, kar bi namesto odboja med elektronegativnima karbonilnima skupinama omogočilo vodikovo vez.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

4.2.2 Heteroatomi fragmentov v lipofilnem žepku Fragmenti so v povprečju nekoliko bolj hidrofilni od tistih z najboljšimi rezultati v članku[45]. To je najverjetneje posledica izbranega razpona lipofilnosti v naboru molekul iz ZINC15. Harmin je relativno lipofilen (logP = 3,6) sam po sebi, uvedba dodatnih lipofilnih fragmentov bi lahko povzročila nižjo biološko uporabnost. Pri ligandih se elektronegativna elementa dušik in kisik nahajata v območju drugega ali tretjega mesta alkilne verige ligandov. To območje se v aktivnem mestu encima nahaja med tremi polarnimi skupinami – karbonilnima skupinama PHE208 in ALA111 v glavni verigi in na drugi strani tiolno skupino stranske verige CYS323 (slika 4-3).

Slika 4-4 Polarni »sendvič« med karbonilnima skupinama PHE208 in ALA111 (zgoraj) ter tiolno skupino CYS323 na drugi strani aktivnega mesta (spodaj) Za spojine 3m, 1c), 1d), 1f), 1g) in 1i) predlagamo primerjavo vezave sekundarni/terciarni amin v lipofilnem žepku. V pretekli študiji[45] so bili vsi testirani amini terciarni. Vodikovo vez lahko terciarni amini tvorijo le s tiolno skupino omenjenega polarnega dela ter in vitro kažejo slabšo afiniteto v primerjavi s harminom. V sidranih konformacijah se spojine nahajajo pretežno bližje karbonilni strani, ki lahko vodikovo vez tvori s primarno ali sekundarno aminsko skupino liganda. Primarnim aminom se izogibamo zaradi ioniziranosti in s tem slabše absorpcije. Terciarni amini bi lahko bili primernejši pri R6 derivatih (poglavje 4.2.3). Visoko afiniteto predvidevamo za spojino 1g). Fragment smo pridobili iz molekul e) in m) iz tabele 4-1, ki tvorita vodikovo vez z amidno skupino glavne verige (VAL210).

Slika 4-5 Vodikova vez med amidno skupino in molekulo e) ali m) iz tabele 4-1

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

4.2.3 Primerjava z znanimi RIMA V aktivno mesto smo sidrali tudi v poglavju 2.3.1 omenjena sintetična RIMA s trifluoriranim alkilnim fragmentom. β-karbolinom podobnih sintetičnih RIMA (pirlindol, metralindol, tetrindol) v aktivno mesto s ProBiSdock nismo mogli zasidrati zaradi velike, rigidne strukture z dodatnim (četrtim) obročem. Prekrivanje harmina iz kristalne strukture s predvideno aktivno konformacijo befloksatona (levo) in CX157 (desno) je prikazana na sliki 4-6. Harmin je prikazan v svetlomodri barvi.

a) b)

Slika 4-6 Primerjava harmina z zasidrano konformacijo: a) befloksatona in b) CX157

• Lipofilni žepek (R7) Iz primerjave strukture lahko opazimo, da predvidena aktivna konformacija befloksatona v trifluorobutoksi delu skoraj popolnoma dopolnjuje molekulo harmina v derivat 3e (Slika 4-6, a)), le da dodatno vsebuje še hidroksilno skupino. Hidroksilna skupina befloksatona v polarnem žepku predvideno tvori vodikovo vez s karbonilno skupino ALA111 v glavni verigi. Ta skupina je v območju encima ena izmed polarnih skupin, ki se nahajajo v bližini drugega/tretjega člena fragmentov lipofilnega žepka. • β-karbolinsko ogrodje Glede na literaturo[45] v tem delu prevladujejo π-π interakcije. Za območje je značilna delokalizacija elektronskih parov in planarnost aktivnih konformacij. Odsotnost aromatskega obroča v piridinskem delu pirlindola, metralindola in tetalindola najverjetneje nekoliko zniža afiniteto za MAOA zaradi odsotnosti tovrstnih interakcij s tirozinoma. Enako lahko opazimo tudi pri primerjavi in vitro vezave nasičenih in nenasičenih harmala alkaloidov. Za omenjene spojine predvidevamo interakcijo s TYR407, TYR444 in FAD10: • karbaminski del befloksatona; • piridinski del harmina; • aromatski del CX157. Karbonilna skupina befloksatona in sulfonilna skupina CX157 najverjetneje tvorita vodikovo vez s TYR69. Harmin v tem območju nima heteroatomov - v konformaciji encima, ki je prilagojena vezavi harmina, hidroksilna skupina tirozina tvori vodikovo vez z vodo 729 in je odmaknjena, aktivno mesto v tem primeru tirozin pokriva z nepolarnim delom. Etrski del med benzenskima obročema spojine CX157, tako kot amidna skupina aromatskih obročev harmina, v sidrani konformaciji tvori vodikov mostiček z vodo 746 (slika 3-6).

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

• Metilni del harmina (R1)

Na sliki 4-6 opazimo heteroatome na delu befloksatona in CX157, ki se prilega R1-metilnemu delu harmina. V sidranih konformacijah se ti nahajajo ob polarnih karbonilnih skupin glavne verige: ASN181, ILE180, ILE207, karbonilni skupini stranske verige ASN181 ter hidroksilnima skupinama TYR444 in TYR407. Polarno območje aktivnega mesta je prikazano na sliki 4-7.

Slika 4-7 Polarni del encima ob metilni skupini

S sekundarno aminsko skupino kot donorjem vodikove vezi to lastnost na R1 metilnem delu najverjetneje izkoriščata tudi spojini metralindol in tetrindol, ki sta omenjeni v poglavju 2.3.1.

4.2.4 R6 derivati β-karbolina Spojini a) in b) iz tabele 4-1 glede na rezultate programa Chimera s cisteinom 323 tvorita vodikovo vez. Pri pridobljenih spojinah je kisik etrov na mestu R7 od cisteina dlje od mesta R6. Zaradi interakcij aminskih skupin v fragmentih lipofilnega žepka pa je še dodatno nekoliko premaknjen proti karbonilnem delu polarnega sendviča. S tem lahko cistein v aktivnem mestu ostane nezaseden. Možna rešitev je sinteza R6 derivatov, ki so tudi razumen izid primerjave strukture s substrati – noradrenalin ima na benzenskem obroču s hidroksi skupino substituirani obe mesti; če prekrijemo indolni del molekul, je pri serotoninu zasedeno le mesto, skladno z R6 β-karbolina.

Slika 4-8 Karbonilni del spojine b) iz tabele 4-1, ki s cisteinom tvori vodikovo vez, se v zasidrani konformaciji ujema z območjem R6 β-karbolinskega obroča Vsi izmed naštetih harminu podobnih sintetičnih RIMA (metralindol, pirlindol, tetrindol) imajo substituente na R6, vendar ne na R7 mestu β-karbolinskega ogrodja. Mesto R7 je kljub temu ugodno pustiti substituirano, ker prispeva k selektivnosti delovanja MAOA/MAOB (poglavje 2.3.1). Glede na farmakološke prednosti rigidnih struktur, predlagamo sintezo in ovrednotenje omenjenih fragmentov na 6,7-metilendioksi derivatih β-karbolina. Takšna struktura je prisotna pri rekreativni drogi 3,4-metilendioksimetamfetamin (MDMA), ki med drugim deluje tudi kot kompetitivni zaviralec MAOA ter na to izoobliko deluje relativno [56] selektivno (IC50[MAOA]= 44µM; IC50[MAOB]= 370µM).

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

a) b)

Slika 4-9 a) MDMA in b) 6,7-metilendioksi derivati β-karbolina Iz lastnosti MDMA lahko sklepamo, da uvedba 6,7-metilendioksi skupine: • ne bo imela bistvenega učinka na zmanjšanje penetracije krvno-možganske bariere;

• ne bo odpravila ujemanja ali neselektivnosti na izoobliko MAOA; • ne bo povzročila večjih toksičnih učinkov.

4.3 Spojine pridobljene s programom ProBiS

Pri vnosu aktivnega mesta MAOA skupaj z nezasedenim lipofilnim delom ob vhodu v votlino aktivnega mesta je program zaznal 3 podobne proteinske strukture s standardnim odklonom (z) višjim od 1:

• podganja MAOA (PDB ID: 1O5W; z = 3,35),

• človeška MAOB (PDB ID: 2XFN; z = 2,09), • cikloheksilamin-oksidaza iz Brevibacterium oxydans (PDB ID: 4I59; z = 1,25).

Iz 1O5W smo pridobili klorgilin, ki je ireverzibilni selektivni zaviralec MAOA, in iz 2XFN smo dobili 2-(2-benzofuranil)-2-imidazolin.

4.4 Ocena zanesljivosti sidranja

Ob sidranju harmina nazaj v harminu prilagojeno aktivno mesto MAOA ProBiSdock predlaga dve konformaciji. V tabeli 4-4 je prikazana oznaka konformacije, primerjava s pozicijo harmina v kristalni strukturi, koren povprečja kvadratov deviacije v atomski legi (RMSD) in ocena vezavne energije s ProBiSdock.

Tabela 4-4 Primerjava pozicije harmina v kristalni strukturi (svetlomodro) s sidrano konformacijo Konformacija Primerjava RMSD Ocena vezavne energije

#0 0,823 Å -20,2747

#1 2,086 Å -21,4237

Obe konformaciji se s strukturo relativno dobro ujemata. Ocena vezavne energije je v prid konformaciji #1, ki se sicer bistveno slabše ujema s kristalno pozicijo harmina. Kristalna struktura nakazuje na tvorbo vodikove vezi med metoksi skupino harmina in CYS323 – v sidranih konformacijah je ta vez odsotna.

Vsekakor gre za dinamične sisteme in se pozicija harmina v aktivnem mestu s časom spreminja.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

5 Zaključek

Z diplomskim delom želimo vzpodbuditi povratek raziskav in rabe antidepresivov z delovanjem na MAO. Njihovi uporabi se zdravniki trenutno na veliko izogibajo - pretežno zaradi stigme iz preteklosti pa tudi zaradi pomanjkanja tako novejših zdravil tipa RIMA, kot tudi promocije s strani farmacevtskih družb. Osredotočili smo se na delovanje β-karbolinov kot antidepresivov in izpostavili njihovo inhibicijo MAOA. Omenjena skupina substanc izkazuje veliko podobnost endogenim molekulam in odpira številne možnosti raziskav v razvoju zdravil. Nekatera področja možne rabe: anksiolitiki (GABAA pozitivni alosterični agonisti), protistrupi (GABAA antagonisti), zdravila za lajšanje simptomov Alzheimerjeve bolezni (inhibitorji acetilholinesteraze) ali Downovega sindroma (zaviralci DYRK1A-kinaze) itd. Na podlagi primerjave vezavnih mest ali ligandov je možno celo usmerjanje k dualnem delovanju.

Namesto inhibicije GABAA receptorja pri harmala alkaloidih bi njegova aktivacija blagodejno vplivala na agitirane vrste depresivne motnje. Ta podatek je še zlasti pomemben zaradi kontraindikacije moklobemida za zdravljenje tega spektra motenj - v Povzetku temeljnih značilnosti zdravila za moklobemid (Aurorix) je navedeno[11]: »Depresivnih bolnikov s klinično sliko ekscitacije ali agitacije z Aurorixom ne zdravimo ali pa jih zdravimo le v kombinaciji Aurorixa s sedativom (npr. benzodiazepinom)«. Benzodiazepini so pozitivni alosterični modulatorji GABA receptorja. Znani so tudi β- karbolini s takšnim delovanjem - primer je gedokarnil, ki je v ATC klasifikaciji zdravil registriran kot anksiolitik pod kodo N05BX02, vendar se na trgu še ni pojavil. S tem bi bilo koristno preveriti možnosti združitve inhibicije monoamin-oksidaze z delovanjem na GABA- ergični sistem. Ti lastnosti sta po nekoliko drugačnem mehanizmu, že združeni v delovanju fenelzina, ki deluje kot klasični MAOI, metaboliti fenelzina pa zavirajo razgradnjo nevrotransmiterja GABA. Tak mehanizem delovanja je sicer lahko problematičen zaradi pojava odvisnosti – čeprav je za β-karbolinske anksiolitike v literaturi[57] (specifično za abekarnil) naveden manjši pojav tolerance in odtegnitvenih simptomov zaradi razlike v vezavi na podenote receptorja. Iz nabora 4 milijonov zdravilom podobnih substanc smo pridobili 10 000 najbolj podobnih derivatu harmina 3e iz tabele 2-3. Substance so referenčni spojini podobne po položaju funkcionalnih skupin v aktivni konformaciji, nimajo pa nujno tudi iste farmakodinamike. Ker je bil cilj antidepresivno delovanje, smo spojine sidrali v aktivno mesto MAOA, ki je bilo konformacijsko prilagojeno vezavi harmina. Vezavno energijo smo numerično ovrednotili in navedli 100 substanc s predvidenim najboljšim ujemanjem. Tako smo ohranili ključne dele molekule 3e za vezavo na encim, strukture pa so kljub temu dokaj drugačne in praviloma sploh ne zajemajo β-karbolinskega ogrodja. S tem smo morda odpravili topološko ujemanje z receptorji, ki so povezani s stranskimi učinki harmina. Ocena molekulskih lastnosti 15 najboljših rezultatov nakazuje dobro farmakokinetiko pridobljenih substanc. V nalogi smo predlagali nabor fragmentov za vezavo na harmol, ki se prilegajo lipofilnem žepku in utemeljili uvedbo donorske spojine vodikove vezi (sekundarni amin) v bližini drugega oz. tretjega mesta alkilne verige. Predvideli smo tudi možnost tvorbe vodikove vezi med amidno skupino glavne verige VAL210 in akceptorsko skupino na koncu predlaganih fragmentov, ki segajo v nepolarni žepek. Strukturo inhibitorjev smo razdeli na tri dele. Interakcije v vsakem področju smo ločeno obravnavali z ozirom na gručo sidranih konformacij rezultatov, na podobnost s sintetičnimi RIMA in na strukturo aktivnega mesta ter s tem obogatili znanje o povezavi struktura- aktivnost za RIMA. Z molekularnim sidranjem že testiranega sintetičnega RIMA smo uspeli

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

harmin s skoraj popolnim prileganjem dopolniti do spojine 3e. Predlagani fragmenti torej niso koristni le za sintezo derivatov harmina, možno jih je uporabiti tudi na drugih ogrodjih, v primeru, da derivati harmina pokažejo znake toksičnosti (npr. zaradi policiklične planarne strukture obstaja tveganje interkelacije med bazne pare DNA in s tem mutagenosti). Omenili smo možnosti uvedbe polarne skupine na metilnem mestu harmina ter komentirali prednosti v vezavni afiniteti in selektivnosti R6 ali 6,7-metilendioksi derivatov. Molekulo harmina smo sidrali v aktivno mesto harminu prilagojene MAOA (2z5x.pdb); primerjali predlagano pozicijo s tisto v kristalni strukturi PDB in s tem ovrednotili zanesljivost rezultatov diplomske naloge. Za substance, ki jih prilagamo nalogi, ne moremo zagotoviti odlične eksperimentalne inhibicije, vendar na osnovi strukture tarče in preteklih raziskav, zanjo kažejo dober potencial. Za nadaljevanje študije predlagamo in silico toksikološko rešetanje in oceno vezave na MAOB, acetilholinesterazo, muskarinske receptorje in benzodiazepinsko vezavno mesto ter in vitro ovrednotenje vezave na MAOA. Izmed receptorjev za katere literatura navaja vezavo harmala alkaloidov, harmin na opioidne receptorje ne deluje, PDB struktura dopaminskih, serotoninskih in imidazolinskih receptorjev pa še ni objavljena. Če iz nabora substanc izberemo tiste, ki so obstojne, se dajo pridobiti z enostavno in ugodno sintezo ter nakazujejo odsotnost teratogenih in mutagenih učinkov, dobimo spojine z dobrim potencialom za rabo v zdravstvu, s čimer lahko pripomorejo k zdravljenju težavnih in vse pogostejših duševnih motenj.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

6 Literatura

[1] Svetovna zdravstvena organizacija. Depression fact sheet. 2016. Pridobljeno 22.07.2016 iz http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs369/en/ [2] KONEC Juričič, N. Depresija. 2014. Pridobljeno 28.07.2016 iz http://www.nijz.si/sl/depresija [3] McTERNAN, W.; DOLLARD, M; in LaMONTAGNE, A. Depression in the workplace: An economic cost analysis of depression-related productivity loss attributable to job strain and bullying. Work & Stress. 2013, 27(4), str. 321-338. [4] TERŽIČ, D. Medikamentozno zdravljenje rezistentnih depresij. V ROMIH J.; ŽMITEK A. (Ur.). Zdravljenje z antidepresivi. Begunje: Psihiatrična bolnišnica, 1997, str. 167- 197. [5] Eurostat. Causes of death statistics. 2016. Pridobljeno 02.06.2016 iz http://ec.europa.eu/eurostat/statistics-explained/index.php/Causes_of_death_statistics [6] Ministrstvo za zdravje, Javna agencija Republike Slovenije za zdravila in medicinske pripomočke, Zavod za zdravstveno zavarovanje Slovenije, Inštitut za varovanje zdravja RS. Centralna baza zdravil. 2014. Pridobljeno 01.06.2016 iz http://www.cbz.si/ [7] ERŽEN, I. Poraba zdravil v Sloveniji v letu 2015. Nacionalni inštitut za javno zdravje: Ljubljana, 2016. [8] SHULMAN, K.; HERRMANN, N. in WALKER, S. Current Place of Monoamine Oxidase Inhibitors in the Treatment of Depression. CNS Drugs. 2013, 27(10), str. 789- 797. [9] LÓPEZ-MUÑOZ, F. in ALAMO, C. Monoaminergic neurotransmission: the history of the discovery of antidepressants from 1950s until today. Current Pharmaceutical Design, 2009, 15(14), str. 1563-1586. [10] KORES-PLESNIČAR, B. Osnove psihofarmakoterapije. Maribor: Medicinska fakulteta, 2007. [11] RANG, H.P.; DALE, M.M.; RITTER, J.M. in MOORE, P.K. Pharmacology. Edinburgh: Churchill Livingstone, 2003. [12] Povzetek glavnih značilnosti zdravila [Aurorix]. Pridobljeno 30.07.2016 iz http://www.cbz.si/ZZZS/pao/bazazdr2.nsf/o/EB37D3FFC37EBD19C12579C2003F5B 8A/$File/s-009019.pdf [13] BONNET, U. Moclobemide: Therapeutic Use and Clinical Studies. CNS Drug Reviews. 2003, 9, str. 97–140. [14] The National Institute for Mental Health Research; The Australian National University. Reversible Monoamine Oxidase Inhibitor (RIMA) Antidepressants. 2006. Pridobljeno 13.12.2016 iz http://bluepages.anu.edu.au/index.php?id=reversible-monoamine- oxidase-inhibitor-rima-antidepressants [15] STAHL, M.S. Stahl's essential psychopharmacology: neuroscientific basis and practical applications, (3). New York: Cambridge University Press, 2008. [16] SPLETTSTOESSER, T. Synapse schematic (unlabeled). 2015. Pridobljeno 29.05.2017 iz: https://en.wikipedia.org/wiki/Synapse#/media/File:SynapseSchematic_lines.svg [17] WAYMIRE, C.J., Department of Neurobiology and Anatomy, The UT Medical School at Houston. 2017: Chapter 12: Biogenic Amine Neurotransmitters. Pridobljeno 13.03.2017 iz http://neuroscience.uth.tmc.edu/s1/chapter12.html

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

[18] GOODMAN, L.S. in GILMAN A. Goodman and Gilman's the pharmacological basis of therapeutics (12). New York [idr.]: Pergamon Press, 2012. [19] SANTARSIERI, D. in SCHWARTZ, L.T. Antidepressant Efficacy and Side-Effect Burden: A Quick Guide for Clinicians. Drugs in Context, 2015, 4, str. 212-290. [20] NATHAN, P.J. Hypericum perforatum (St John's Wort): a non-selective reuptake inhibitor? A review of the recent advances in its pharmacology. Journal of Psychopharmacology, 2001, 15(1), str. 47. [21] GUARDIOLA-LEMAITRE, B.; DE BODINAT, C.; DELAGRANGE, P.; MILLAN, M. J.; MUNOZ, C. in MOCAËR, E. Agomelatine: mechanism of action and pharmacological profile in relation to antidepressant properties. British Journal of Pharmacology. 2014, 171(15), str. 3604-3619. [22] Javna agencija Republike Slovenije za zdravila in medicinske pripomočke. Povzetek glavnih značilnosti zdravila [Tianeptin], 2015. [23] GASSAWAY, M.M.; RIVES, M.; KRUEGEL, A.C.; JAVITCH, J.A. in SAMES, D. The atypical antidepressant and neurorestorative agent tianeptine is a μ-opioid receptor agonist, Translational Psychiatry. 2014, 4, str. 411. [24] McEWEN, B. S.; CHATTARJI, S.; DIAMOND, D. M.; JAY, T. M., REAGAN, L. P., SVENNINGSSON, P. in FUCHS, E. The neurobiological properties of Tianeptine (Stablon): from monoamine hypothesis to glutamatergic modulation. Molecular Psychiatry, 2010, 15(3), str. 237-249. [25] GAWESKA, H. in FITZPATRICK, P. F. Structures and Mechanism of the Monoamine Oxidase Family. Biomolecular Concepts, 2011, 2(5), str. 365–377. [26] BLAKELY, M.; CANNER, D. in HAREL, M. Monoamine oxidase b. 2011. Pridobljeno 10.01.2017 iz http://proteopedia.org/wiki/index.php/Monoamine_oxidase_b [27] HERRAIZ, T. in CHAPARRO, C. Analysis of monoamine oxidase enzymatic activity by reversed-phase high performance liquid chromatography and inhibition by β- carboline alkaloids occurring in foods and plants. Journal of Chromatography A, 2006, str. 237-243. [28] CHOI, J.; JANG, B.; CHO, N.; PARK, J.; YEON, S.; PARK, K. idr. Synthesis of a series of unsaturated ketone derivatives as selective and reversible monoamine oxidase inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2015, 23, 6486-6496. [29] MEYER, J.H.; GINOVART, N.; BOOVARIWALA, A. idr.: Elevated Monoamine Oxidase A Levels in the Brain An Explanation for the Monoamine Imbalance of Major Depression. Arch Gen Psychiatry. 2006, 63(11), str. 1209-1216. [30] HERRAIZ, T.; GONZÁLEZ, D.; ANCÍN-AZPILICUETA, C. in GUILLÉN, H. β- Carboline alkaloids in Peganum harmala and inhibition of human monoamine oxidase (MAO). Food and Chemical Toxicology, 2010, 48, str. 839-845. [31] SATHYANARAYANA RAO, T.S. in YERAGANI, V.K. Hypertensive crisis and cheese. Indian Journal of Psychiatry, 2009, 51(1), str. 65–66. [32] DOMÍNGUEZ-CLAVÉ, E.; SOLER, J.; ELICES, M.; PASCUAL, J.; ÁLVAREZ, E.; RIBA, J., idr. Ayahuasca: Pharmacology, neuroscience and therapeutic potential. Brain Research Bulletin, 2016, 126(1), str. 89-101. [33] KETTLER, R.; DA PRADA, M. in BURKARD, W. Comparison of monoamine oxidase-A inhibition by moclobemide in vitro and ex vivo in rats. Acta Psychiatrica Scandinavica. Supplementum, 1990, 360, str.101-102.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

[34] GERARDY, J. Effect of moclobemide on rat brain monoamine oxidase A and B: comparison with harmaline and clorgyline. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry, 1994, 18(4), str. 793-802. [35] KIM, H.; SABLIN, S. in RAMSAY, R. Inhibition of monoamine oxidase A by beta- carboline derivatives. Arch Biochem Biophys, 1997, 337(1), str. 137-42. [36] IURLO, M.; LEONE, G.; SCHILSTRÖM, B.; LINNÉR, L.; NOMIKOS, G.; SVENSSON, H. idr. Effects of harmine on dopamine output and metabolism in rat striatum: role of monoamine oxidase-A inhibition. Psychopharmacology, 2001, 159(1), str. 98. [37] FOWLER, J. S., VOLKOW, N. D., WANG, G.-J. idr. Brain monoamine oxidase A inhibition in cigarette smokers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, 93(24), str. 14065–14069. [38] HE, D.; WU H.; WEI Y. idr. Effects of harmine, an acetylcholinesterase inhibitor, on spatial learning and memory of APP/PS1 transgenic mice and scopolamine-induced memory impairment mice. Eur J Pharmacol. 2015, 768, str. 96-107. [39] FARZIN, D.; NASEHI, M.; NOURI, M.; NAYER-NOURI, T.; PIRI, M. in ZARRINDAST, M.R. Involvement of dopamine D1/D2 receptors on harmane-induced amnesia in the step-down passive avoidance test. European Journal of Pharmacology, 2010, 634 1-3, str. 77-83. [40] ABDEL-FATTAH, A.F.; MATSUMOTO, K.; GAMMAZ, H.A.; WATANABE H. Hypothermic effect of harmala alkaloid in rats: involvement of serotonergic mechanism. Pharmacol Biochem Behav, 1995, 52(2), str. 421-6. [41] PATEL, K.; GADEWAR, M.; TRIPATHI, R.; PRASAD, S. in PATEL, D. K. A review on medicinal importance, pharmacological activity and bioanalytical aspects of beta- carboline alkaloid “‘Harmine.’” Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2012, 2(8), str. 660–664. [42] MOSHIRI, M., ETEMAD, L., JAVIDI, S., in ALIZADEH, A. Peganum harmala intoxication, a case report. Avicenna Journal of Phytomedicine, 2013, 3(3), str. 288-292. [43] FROST, D., MEECHOOVET, B., TONG, W., GATELY, S., GIORGETTI, M., SHCHERBAKOVA, I., in DUNCKLEY, T. β-Carboline Compounds, Including Harmine, Inhibit DYRK1A and Tau Phosphorylation at Multiple Alzheimer's Disease- Related Sites. Plos ONE, 2011, 6(5), str. 1-9. [44] ADAYEV, T.; WEGIEL, J. in HWANG, Y.W. Harmine is an ATP-competitive Inhibitor for Dual-Specificity Tyrosine Phosphorylation-Regulated Kinase 1A (Dyrk1A). Arch Biochem Biophys. 2011, 507(2), str. 212–218. [45] RENIERS, J.; ROBERT, S. in FREDERICK, R. Synthesis and evaluation of β-carboline derivatives as potential monoamine oxidase inhibitors. Bioorg Med Chem. 2011, 19(1), str. 134-44. [46] BONNET, U. Moclobemide: Evolution, Pharmacodynamic, and Pharmacokinetic Properties, CNS Drug Reviews, 2002, 8(3), str. 283–308. [47] BRANCO, J.C.; TOMÉ, A.M.; CRUZ, M.R. in FILIPE, A. Pirlindole in the Treatment of Depression and Fibromyalgia Syndrome. Drug Investig 2011, 30(10), str. 675-689. [48] BRUHWYLER, J.; LIÉGEOIS, J.F.; GÉCZY J. Pirlindole: a selective reversible inhibitor of monoamine oxidase A. A review of its preclinical properties. Pharmacological Research, 1997, 36(1), str. 23-33.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

[49] PATAT, A.; LE COZ, F.; DUBRUC, C.; GANDON, J.M.; DURRIEU, G.; CIMAROSTI, I. idr. Pharmacodynamics and pharmacokinetics of two dose regimens of befloxatone, a new reversible and selective monoamine oxidase inhibitor, at steady state in healthy volunteers. J Clin Pharmacol. 1996, 36(3), str. 216-29. [50] FOWLER, J.; LOGAN, J.; AZZARO, A.; FIELDING, R.; ZHU, W.; APELSKOG- TORRES K idr. Reversible Inhibitors of Monoamine Oxidase-A (RIMAs): Robust, Reversible Inhibition of Human Brain MAO-A by CX157. Neuropsychopharmacology. 2010, 35, str. 623–631. [51] KROGSGAARD-LARSEN, P.; LILJEFORS, T. in MADSEN, U. Textbook of drug design and discovery (3). London in New York: Taylor & Francis, 2002. [52] GRAHAM, L.P. in SPENCER, J. An Introduction to Medicinal Chemistry (4). Oxford[idr.]: Oxford University Press, 2009. [53] LEŠNIK, S.; Š TULAR T.; BRUS, B.; KNEZ, D.; GOBEC, S.; JANEŽIČ, D. in KONC, J. LiSiCA: A Software for Ligand-Based Virtual Screening and Its Application for the Discovery of Butyrylcholinesterase Inhibitors. J. Chem. Inf. Model. 2015, 55, str. 1521−1528. [54] IRWIN, J.. Tranche Browser. 2015. Pridobljeno 19.05.2017 iz http://wiki.docking.org/index.php/Tranche_Browser [55] ŠTULAR, T.; LEŠNIK, S.; ROŽMAN, K.; SCHINK, J.; ZDOUC, M.; GHYSELS, A. idr. Discovery of Mycobacterium tuberculosis InhA Inhibitors by Binding Sites Comparison and Ligands Prediction. J. Med. Chem., 2016, 59 (24), str. 11069–11078. [56] EFTHIMIA, T.; KOKOTOS LEONARDI, M.S.; in EFRAIN C.A. MDMA (Ecstasy) Inhibition of MAO Type A and Type B: Comparisons with Fenfluramine and Fluoxetine (Prozac). Neuropsychopharmacology, 1994, 10, str. 231–238. [57] HEBERLEIN, A. in HILLEMACHER T. Chapter 49 Medications for Sedative Dependence. V MILLER M.P. Interventions For Addiction: Comprehensive Addictive Behaviours and Disorders 1(3), San Diego [idr.]: Academic Press, 2013.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

7 Priloge

7.1 Tabela najboljših 100 ujemanj glede na oceno vezavne energije

Ocena # ZINC ID vezavne Struktura energije 8 000065434706 -54,29

1 000257216859 -59,63

9 000226021340 -53,87

2 000257216858 -58,55

10 000048313173 -53,83

3 000065458858 -56,82

11 000040553415 -53,73

4 000215987948 -56,77

12 000065434708 -53,66

5 000225804366 -56,32

13 000225804383 -53,59

6 000065458853 -55,71

14 000226021125 -53,31

7 000096155892 -54,69

15 000096260721 -53,22

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

16 000225805968 -53,13 25 000096038362 -51,48

17 000046953308 -53,09 26 000046953306 -51,12

18 000225805989 -52,66 27 000215987894 -50,98

19 000048345054 -52,64 28 000071871492 -50,87

20 000226021139 -52,62 29 000067692866 -50,66

21 000072290132 -52,55 30 000024865563 -50,51

22 000044970721 -52,00 31 000036007382 -50,47

23 000064552379 -51,82 32 000095960483 -50,34

24 000048341014 -51,66 33 000058393282 -50,16

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

34 000244764151 -50,03 43 000089700896 -49,35

35 000409122649 -49,98 44 000033673100 -49,28

36 000065112343 -49,93 45 000084338884 -49,25

37 000067852376 -49,72 46 000095986107 -49,21

38 000076017887 -49,61 47 000029403461 -49,12

39 000078959713 -49,60 48 000037201918 -49,10

40 000084425287 -49,58 49 000206790038 -49,10

41 000048251205 -49,57 50 000005572743 -49,02

42 000020035614 -49,48 51 000082115173 -49,01

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

52 000001868639 -49,00 61 000070451589 -48,21

53 000041944622 -48,77 62 000096155914 -48,19

54 000072402219 -48,67 63 000095527604 -48,16

55 000029696718 -48,50 64 000020268181 -48,13

56 000073858835 -48,40 65 000048341011 -48,08

57 000097572168 -48,40 66 000097756512 -48,06

58 000040285873 -48,38 67 000029403458 -48,04

59 000061583034 -48,38 68 000216011650 -47,96

60 000299791750 -48,32 69 000033138746 -47,94

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

70 000036007383 -47,88 79 000044966983 -47,52

71 000065129110 -47,81 80 000170677212 -47,47

72 000020356075 -47,80 81 000299765210 -47,44

73 000096400802 -47,72 82 000257192784 -47,37

74 000009752197 -47,71 83 000069771808 -47,36

75 000089689071 -47,65 84 000257224592 -47,35

76 000038021402 -47,64 85 000299764015 -47,33

77 000046833744 -47,58 86 000075125178 -47,32

78 000226021374 -47,52 87 000033448931 -47,32

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

88 000014162238 -47,31 95 000226021581 -47,15

89 000095497656 -47,26 96 000020905636 -47,14

90 000244882482 -47,24 97 000073620002 -47,14

91 000071855425 -47,23 98 000089598445 -47,04

92 000189985018 -47,21 99 000096138378 -47,03

93 000067650226 -47,18 100 000067773734 -47,01

94 000504750898 -47,17

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

8 Življenjepis

OSEBNI PODATKI Breznik Marko

Ob kostanjih 8, 2000 Maribor (Slovenija) +38670924724 [email protected]

Spol Moški | Datum rojstva 10. junij 1994 | Državljanstvo slovensko

IZOBRAŽEVANJE IN

USPOSABLJANJE

2009–2013 Gimnazijski maturant Raven 4 EOK II. gimnazija Maribor, Maribor (Slovenija)

2013–2017 Diplomirani kemik (UN) Raven 7 EOK Fakulteta za Kemijo in Kemijsko Tehnologijo, Maribor (Slovenija)

3. februar 2016–28. februar Erasmus študijska izmenjava Raven 7 EOK 2017 Graz University of Technology, Gradec (Avstrija) ▪ Poleg ekvivalentov obveznih vsebin matične fakultete sem opravil še tečaj nemščine (B2) ter izbirne predmete: Toksikologija, Strukturna biologija, Molekularna in celična biologija, Celična komunikacija in Biokemija II. ▪ Pridobil sem znanje s področja molekularnega modeliranja, molekularne fiziologije in zdravil naravnega izvora.

KOMPETENCE

Materni jezik Slovenščina

PISNO Tuji jeziki RAZUMEVANJE GOVORJENJE SPOROČANJE Slušno Bralno Govorno Govorno razumevanje razumevanje sporazumevanje sporočanje angleščina C2 C2 C1 C1 C1 nemščina C2 B2 B1 B1 B1 francoščina A2 A2 A1 A1 A1 Stopnja: A1 in A2: Osnovni uporabnik - B1 in B2: Samostojni uporabnik - C1 in C2: Usposobljeni uporabnik Skupni evropski jezikovni okvir

Komunikacijske kompetence ▪ Diplomatski, zanesljiv, obziren, odprt ter pozoren v medosebnih odnosih. ▪ Z lahkoto zbiram informacije, jih integriram v celoto in razumljivo predstavim drugim. ▪ Izkušen s pisanjem poročil in nastopanjem v javnosti. ▪ Akademske in neformalne izkušnje v mednarodnem okolju.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Strokovne kompetence ▪ Znanje s področja kemije in naravoslovja ter sposobnosti dela v laboratoriju sem pridobil s študijem kemije na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Mariboru. ▪ Dodatno znanje s področja medicinske kemije (farmakologija, farmakognozija, toksikologija, načrtovanje in razvoj zdravil ter molekularna in strukturna biologija) sem pridobil samostojno in ga nadgradil z opravljanjem tematsko povezanih predmetov med izmenjavo ter praktično z izvedbo diplomskega dela.

Digitalna pismenost ▪ Med študijem sem pridobil izkušnje v uporabi: ▫ programov zbirke Microsoft Office (Word, Excel, PowerPoint), ▫ programov Chimera, LiSiCA, ProBiS in ProBiSdock, ▫ brskalnika Wolfram Alpha, ▫ programskega jezika Fortran, ▫ operacijskih sistemov Ubuntu in Windows.

Druge kompetence ▪ Introspekcija, vztrajnost, marljivost in kritično mišljenje. ▪ Dobra intuicija, abstraktnost v mišljenju in idealizem - osredotočenost v prihodnost, možnosti napredka ter inovativno reševanje problemov. ▪ Delovne izkušnje sem pridobil s študentskimi deli, ki so zajemala naslednja področja in obveznosti: ▫ proizvodnja in pakiranje (BikeCityGuide Apps GmbH), ▫ skladiščenje in vzdrževanje opreme (Keor, d.o.o.), ▫ selitve in avtoprevozništvo (Skokec, s.p.), ▫ števnica kovancev (Nova KBM, d.d.).

DODATNI PODATKI

Projekti ▪ Projekt Breaking the silence (3.8.2013-12.8.2013) ▫ delo z gluhimi in naglušnimi, njihove pravice in osnove komunikacije znakovnega jezika.

Priznanja in nagrade ▪ V 1. in 2. letniku študijskega programa Kemija sem se po študijskem uspehu uvrstil med najboljših 5% generacije.

Racionalno načrtovanje potencialnih antidepresivov iz skupine RIMA

Izjava o istovetnosti tiskane in elektronske verzije