RZECZPOSPOLITA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 3105317 POLSKA

(13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (51) Int.Cl. 13.02.2015 15706399.1 A61K 35/17 (2015.01) C12N 5/0783 (2010.01)

(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 19.09.2018 Europejski Biuletyn Patentowy 2018/38 Urząd Patentowy EP 3105317 B1 Rzeczypospolitej Polskiej

(54) Tytuł wynalazku: KOMÓRKI DO IMMUNOTERAPII ZAPROJEKTOWANE DO CELOWANIA ANTYGENU OBECNEGO ZARÓWNO NA KOMÓRKACH ODPORNOŚCIOWYCH, JAK I KOMÓRKACH PATOLOGICZNYCH

(30) Pierwszeństwo: 14.02.2014 DK 201470076

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

21.12.2016 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2016/51

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

28.02.2019 Wiadomości Urzędu Patentowego 2019/02

(73) Uprawniony z patentu:

Cellectis, Paris, FR

(72) Twórca(y) wynalazku:

PHILIPPE DUCHATEAU, Draveil, FR

T3 LAURENT POIROT, Paris, FR

(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PATPOL 3105317 KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J 02-776 Warszawa

PL/EP

Uwaga:

W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

EP 3 105 317 B1

Opis

Dziedzina wynalazku

[0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobów opracowywania genetycznie skonstruowanych, korzystnie niealloreaktywnych, komórek T do immunoterapii, które są obdarzone chimerycznymi receptorami 5 antygenowymi ukierunkowanymi na marker antygenowy, który jest wspólny zarówno dla komórek patologicznych, jak i komórek odpornościowych (np. CD38). [0002] Sposób obejmuje ekspresję CAR skierowanego przeciwko temu markerowi antygenowemu i inaktywację genów w komórkach T przyczyniających się do obecności wspomnianego markera antygenowego na powierzchni wspomnianych komórek T. Tę inaktywację zazwyczaj prowadzi się stosując 10 transgen kodujący endonukleazy prowadzone przez RNA (ang. RNA-guided endonucleases) (np: Cas9/CRISPR), meganukleazy, nukleazy z motywem palca cynkowego lub nukleazy TAL. Skonstruowane komórki T kierują swoją aktywność odpornościową w kierunku złośliwych, zainfekowanych komórek lub uszkodzonych komórek odpornościowych, jednocześnie unikając ich wzajemnego zniszczenia, autostymulacji lub agregacji. Wynalazek otwiera drogę do standardowych i niedrogich strategii immunoterapii 15 adoptywnej wykorzystujących komórki odpornościowe do leczenia raka, zakażeń i chorób autoimmunologicznych.

Tło wynalazku

[0003] Immunoterapia adoptywna, polegająca na przeniesieniu autologicznych specyficznych wobec antygenu komórek odpornościowych wytworzonych ex vivo, jest obiecującą strategią leczenia zakażeń 20 wirusowych i raka. Na przykład, komórki T stosowane w immunoterapii adoptywnej można wytworzyć przez ekspansję komórek T specyficznych wobec antygenu lub przekierowanie komórek T przez inżynierię genetyczną (Park, Rosenberg i wsp. 2011). [0004] Nowe specyficzności w komórkach T zostały pomyślnie wytworzone poprzez genetyczny transfer receptorów transgenicznych komórek T lub chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) (Jena, Dotti i 25 wsp. 2010). CAR są syntetycznymi receptorami składającymi się z ugrupowania ukierunkowującego, które jest związane z jedną lub większą liczbą domen sygnałowych w pojedynczej cząsteczce fuzyjnej. Ogólnie, ugrupowanie wiążące CAR składa się z domeny wiążącej antygen przeciwciała jednołańcuchowego (scFv), zawierającego lekkie i zmienne fragmenty przeciwciała monoklonalnego połączone elastycznym łącznikiem. Z powodzeniem stosowane są również ugrupowania wiążące na bazie domen receptorowych lub 30 ligandowych. Domeny sygnałowe dla CAR pierwszej generacji pochodzą z regionu cytoplazmatycznego łańcucha CD3zeta lub Fc receptora gamma. Wykazano, że CAR pierwszej generacji skutecznie przekierowują cytotoksyczność komórek T, jednak nie zapewniają wydłużonej ekspansji i aktywności przeciwnowotworowej in vivo. Domeny sygnałowe z cząsteczek kostymulujących, w tym CD28, OX-40 (CD134) i 4-1BB (CD137) zostały dodane samodzielnie (druga generacja) lub w kombinacji (trzecia 35 generacja) w celu zwiększenia przeżywalności i zwiększenia proliferacji komórek T zmodyfikowanych pod kątem CAR. CAR z powodzeniem umożliwiły przekierowanie komórek T przeciwko antygenom wyrażanym na powierzchni komórek nowotworowych z różnych nowotworów złośliwych, w tym chłoniaków i guzów litych (Jena, Dotti i wsp. 2010). [0005] Obecny protokół leczenia pacjentów z zastosowaniem immunoterapii adoptywnej opiera się na 40 autologicznym transferze komórek. W tym podejściu limfocyty T są odzyskiwane od pacjentów,

1 EP 3 105 317 B1

modyfikowane genetycznie lub selekcjonowane ex vivo, hodowane in vitro w celu amplifikacji liczby komórek, jeśli to konieczne i ostatecznie podawane pacjentowi we wlewie. Oprócz wlewu limfocytów, gospodarza można manipulować innymi sposobami, które wspierają przeszczepienie komórek T lub ich udział w odpowiedzi immunologicznej, na przykład wstępne kondycjonowanie (za pomocą promieniowania 5 lub chemioterapii) i podawanie czynników wzrostu limfocytów (takich jak IL-2). Każdy pacjent otrzymuje indywidualnie wykonane leczenie, z wykorzystaniem własnych limfocytów pacjenta (tj. terapia autologiczna). Terapie autologiczne napotykają poważne przeszkody techniczne i logistyczne w praktycznym zastosowaniu, ich wytwarzanie wymaga drogich wyspecjalizowanych urządzeń i specjalistycznego personelu, muszą one zostać wytworzone w krótkim czasie po diagnozie pacjenta, a w wielu przypadkach 10 wstępne leczenie pacjenta doprowadziło do obniżenia odporności, tak że limfocyty pacjenta mogą być mało funkcjonalne i obecne w bardzo małych ilościach. Ze względu na te przeszkody, autologiczny preparat komórek pacjenta jest faktycznie nowym produktem, powodującym znaczne różnice w skuteczności i bezpieczeństwie. [0006] Idealnym rozwiązaniem byłoby zastosowanie standardowej terapii, w której allogeniczne komórki 15 terapeutyczne mogłyby być wstępnie wytwarzane, szczegółowo charakteryzowane i dostępne do natychmiastowego podania pacjentom. Przez allogeniczne rozumie się, że komórki są uzyskiwane od osobników należących do tego samego gatunku, ale są genetycznie odmienne. Jednakże, zastosowanie komórek allogenicznych ma obecnie wiele wad. U immuno-kompetentnych gospodarzy komórki allogeniczne są szybko odrzucane, procesem określanym gospodarz przeciwko przeszczepowi (HvG), a to zasadniczo 20 ogranicza skuteczność przenoszonych komórek. U immuno-kompetentnych gospodarzy komórki allogeniczne są zdolne do wszczepienia, ale specyficzności ich endogennych receptorów komórek T (TCR) mogą rozpoznawać tkankę gospodarza jako obcą, powodując chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD), co może prowadzić do poważnego uszkodzenia tkanki i śmierć. [0007] W celu dostarczenia allogenicznych komórek T, twórcy ujawnili uprzednio sposób genetycznego 25 konstruowania komórek T, w którym różne geny efektorowe, w szczególności te kodujące receptory komórek T, były inaktywowane przez zastosowanie specyficznych nukleaz TAL, lepiej znanych pod znakiem towarowym TALEN ™ (Cellectis, 8, rue de la Croix Jarry, 75013 PARIS). Okazało się, że ten sposób jest wysoce wydajny w komórkach pierwotnych z zastosowaniem transfekcji RNA jako części platformy umożliwiającej masową produkcję allogenicznych komórek T (WO 2013/176915; Torikai i wsp., Blood, 2012, 30 119 (24): 5697- 705). [0008] CD38 (klaster różnicowania 38), znana również jako hydrolaza cyklicznej ADP-rybozy, to glikoproteina znajdująca się na powierzchni wielu komórek odpornościowych (białych krwinek), w szczególności komórek T, w tym CD4+, CD8+, limfocytów B i komórek NK. CD38 pełni również funkcję adhezji komórkowej, transdukcji sygnału i sygnalizacji wapniowej. Informacje strukturalne o tym białku 35 można znaleźć w bazie danych UniProtKB/Swiss-Prot pod numerem referencyjnym P28907. U ludzi, białko CD38 jest kodowane przez gen CD38, który znajduje się na chromosomie 4. CD38 jest wielofunkcyjnym ektoenzymem, który katalizuje syntezę i hydrolizę cyklicznej ADP-rybozy (cADPR) z NAD+ do ADP-rybozy. Te produkty reakcji są niezbędne do regulacji wewnątrzkomórkowego Ca2+. Również utrata funkcji CD38 była związana z zaburzonymi odpowiedziami odpornościowymi i zaburzeniami metabolicznymi (Malavasi F., i 40 wsp. (2008). "Evolution and function of the ADP ribosyl cyclase/CD38 gene family in physiology and pathology" Physiol. Rev. 88 (3): 841-86).

2 EP 3 105 317 B1

[0009] Mihara i wsp. (J Immunother, 2009, 32 (7): 737-743) ujawniają immunoterapię, w której pośredniczą aktywowane limfocyty T z receptorem chimerycznym przeciwko CD38 w chłoniaku nieziarniczym z komórek B. [0010] Mihara i wsp. (Leukemia, 2012, 26 (2): 365-7) ujawniają immunoterapię komórkami T z 5 chimerycznym receptorem przeciwko CD38, który jest skuteczny w eliminacji komórek szpiczaka. [0011] Z drugiej strony, białko CD38 jest markerem zakażenia HIV, białaczek, szpiczaków, guzów litych, cukrzycy typu II i metabolizmu kości, a także niektórych innych uwarunkowań genetycznych. W szczególności, był on stosowany jako marker prognostyczny w białaczce (Ibrahim, S. i wsp. (2001) CD38 expression as an important prognostic factor in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 98: 181-186). 10 [0012] Chociaż komórki wyrażające CD38, jak również wiele innych markerów antygenów nowotworowych, o których mowa w Tabeli 4, takich jak CD70 i CS1, mogłyby być uważane za atrakcyjne cele dla CAR, fakt, że takie markery antygenowe są również wyrażane na powierzchni większości komórek T, znacząco utrudnia wybór tych markerów do prowadzenia immunoterapii. [0013] Twórcy dostarczają tutaj strategii dla immunoterapii obejmującej komórki patologiczne wyrażające 15 specyficzne markery antygenowe również obecne na powierzchni komórek T, jak na przykład wywołujące białaczkę, złośliwe komórki B CD38-dodatnie, CD70 i CS1.

Streszczenie wynalazku

[0014] W niniejszym wynalazku ujawniono sposoby konstruowania komórek T przeznaczonych do celowania w komórki patologiczne, podczas gdy wspomniane komórki patologiczne wyrażają jeden lub kilka markerów 20 antygenowych, które są również obecne na powierzchni komórek T. Przykłady takich markerów antygenowych znajdują się w Tabeli 4. Przykładem takiego markera antygenowego jest CD38. Inne przykłady to CD70 i CS1. Przez marker antygenowy rozumie się całe białko lub jego fragment reaktywny immunologicznie. [0015] Zgodnie z wynalazkiem, komórki T konstruuje się w celu inaktywacji ekspresji genów kodujących 25 takie markery antygenowe lub uczestniczących w prezentacji takiego markera antygenowego na powierzchni komórki. [0016] Ta inaktywacja jest korzystnie przeprowadzana przez modyfikację genomu, bardziej szczegółowo poprzez ekspresję w komórce T specyficznej, rzadko tnącej endonukleazy (ang. rare-cutting endonuclease) zdolnej do celowania w locus genetyczny bezpośrednio lub pośrednio zaangażowany w wytwarzanie lub 30 prezentację wspomnianego markera antygenowego na powierzchni komórki T. Można stosować różne typy rzadko tnących endonukleaz, takie jak meganukleazy, nukleazy TAL, nukleazy z motywem palca cynkowgo (ZFN) lub endonukleazy prowadzone przez RNA/DNA, takie jak Cas9/CRISPR lub Argonaute. [0017] Komórki T są wyposażone w co najmniej jeden chimeryczny receptor antygenowy (CAR) umożliwiający specyficzne wiązanie tych komórek niosących wspomniany celowany marker antygenowy. 35 [0018] Zgodnie z jednym przykładem wykonania komórki T można dalej konstruować, aby uczynić je allogenicznymi, szczególnie przez usunięcie genów biorących udział w samorozpoznawaniu, takich jak te, na przykład, kodujące składniki receptorów komórek T (TCR) lub kompleksu HLA. [0019] Niniejszy wynalazek obejmuje wyizolowane komórki lub linie komórkowe zawierające modyfikacje genetyczne przedstawione w szczegółowym opisie, przykładach i na figurach, a także dowolne białka, 40 polipeptydy lub wektory użyteczne do konstruowania wspomnianych komórek T.

3 EP 3 105 317 B1

[0020] W wyniku wynalazku skonstruowane komórki T można stosować jako produkty terapeutyczne, najlepiej jako produkt dostępny na półce, w sposobach leczenia lub profilaktyki raka, infekcji lub choroby autoimmunologicznej. [0021] Korzystnymi komórkami T według niniejszego wynalazku są te dające fenotypy:

5 • [CAR ukierunkowany na marker antygenowy z Tabeli 4]+[marker antygenowy z Tabeli 4]-takie jak następujące: • [CAR CD38]+[CD38]-, korzystnie także [TCR] ujemny;

• [CAR CD70]+[CD70]-, korzystnie także [TCR] ujemny; • [CAR CS1]+[CS1]-, korzystnie także [TCR] ujemny;

10 do ich stosowania jako produktów terapeutycznych, korzystnie allogenicznych.

Krótki opis figur i tabel

[0022]

Figura 1: Schematyczne przedstawienie skonstruowanych komórek T według niniejszego wynalazku z dysrupcją CD38 i wyposażonych w chimeryczny receptor antygenowy (reprezentowany 15 jako jednołańcuchowy CAR) skierowany przeciwko złośliwej komórce niosącej marker antygenowy CD38.

Figura 2: Schematyczne przedstawienie wielopodjednostkowego chimerycznego receptora antygenowego.

Figura 3: Schematyczne przedstawienie strategii terapeutycznej według wynalazku, łączącej 20 komórki T obdarzone wielopodjednostkowym CAR i krążące bispecyficzne przeciwciało. W tym szczególnym aspekcie, receptor obecny w łańcuchu zewnątrzkomórkowym wielopodjednostkowego CAR składa się z epitopu rozpoznawanego przez przeciwciało bispecyficzne. Przeciwciało bispecyficzne ma za zadanie wiązać wspomniany epitop z jednej strony i marker antygenowy z drugiej strony, aby ułatwić wiązanie się komórki T z komórką patologiczną.

25 Figura 4: Schematyczne przedstawienie strategii terapeutycznej według wynalazku, łączącej komórki T obdarzone wielopodjednostkowym CAR i krążące przeciwciało monoklonalne. W tym szczególnym aspekcie, receptor obecny w łańcuchu zewnątrzkomórkowym wielopodjednostkowego CAR składa się, na przykład, z receptora Fc przeznaczonego do wiązania przeciwciała monoklonalnego, które jest ukierunkowane przeciwko markerowi antygenowemu. Przeciwciało 30 monoklonalne zwiększa szansę na wiązanie komórek T z komórkami patologicznymi.

Figura 5: Schematyczne przedstawienie strategii terapeutycznej według wynalazku, łączącej komórki T obdarzone wielopodjednostkowym CAR, który zawiera dwie zewnątrzkomórkowe domeny komórkowe i jedno krążące przeciwciało bispecyficzne. W tym konkretnym aspekcie, zwnątrzkomórkowe domeny komórkowe są zlokalizowane na odrębnych podjednostkach. Domeny 35 te są odpowiednio złożone z epitopu, który jest rozpoznawany przez przeciwciało bispecyficzne i receptor skierowany przeciwko antygenowi. Receptor jest skierowany przeciwko pierwszemu markerowi antygenowemu, podczas gdy przeciwciało bispecyficzne ma wiązać epitop i drugi marker

4 EP 3 105 317 B1 antygenowy. Ta prezentacja ma na celu selektywne celowanie komórek patologicznych niosących na swojej powierzchni zarówno pierwszy, jak i drugi marker antygenowy.

Figura 6: Prezentacja jest podobna do przedstawionej na Figurze 5, ale wymieniono domeny stymulacji i kostymulacji (odpowiednio domeny białkowe 4-1BB i CD3zeta) w celu modulowania 5 intensywności aktywacji komórki T wynikającej z wiązania chimerycznego receptora antygenu z komórką patologiczną.

Figura 7: Prezentacja jest podobna do przedstawionej na Figurze 5, ale wymieniono domeny stymulacji i kostymulacji (odpowiednio domeny białkowe 4-1BB i CD3zeta) i dodano jedną domenę CD3zeta w celu zwiększenia intensywności aktywacji komórki T wynikającej z wiązania 10 chimerycznego receptora antygenowego z komórką patologiczną.

Figura 8: Schematyczne przedstawienie strategii terapeutycznej według wynalazku, łączącej komórki T obdarzone wielopodjednostkowym CAR, który zawiera dwie zewnątrzkomórkowe domeny komórkowe i jedno krążące przeciwciało monoklonalne. W tym konkretnym aspekcie, zewnątrzkomórkowe domeny komórkowe są zlokalizowane na odrębnych podjednostkach. Domeny 15 te są odpowiednio złożone z domeny wiążącej antygen, ukierunkowanej na marker antygenowy i receptora Fc, który ma wiązać przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko drugiemu markerowi antygenowemu. Ta prezentacja ma na celu selektywne celowanie komórek patologicznych niosących na swojej powierzchni zarówno pierwszy, jak i drugi marker antygenowy.

Figura 9: Ekspresja CD38 przez aktywowane komórki T. A. Ekspresja CD38 przez komórki T w dniu 20 6 po aktywacji za pomocą perełek powleczonych CD3/CD28 + IL2. B. Długotrwała analiza ekspresji CD38 przez komórki T podczas 17 dni po aktywacji.

Figura 10 Knock-out (KO) na genie CD38: A. Pozycja na sekwencji egzonu 1 CD3 z 3 różnych TALEN (T2, T4 i T5) zaprojektowanych do knock-outu Cd38 w komórce T. B. Ekspresja CD38 w komórkach T po transfekcji TALEN CD38ex1_T2. C. Barwienie CD38 w celu kontroli oczyszczania 25 komórek T CD38 KO.

Figura 11: CD38 CAR : A. Przedstawienie 3 wersji zaprojektowanych CAR. B. Poziom wyrażania CD38 przez docelowe linie komórkowe.

Figura 12: Eksperyment czasowy dla konstruowania komórek T CAR CS1+ i KO CS1 oraz ich późniejsze badanie;

30 Figura 13: Konstrukty T01, T02 i T03 z powtórzeniami TAL stosowanymi do KO genu CS1;

Figura 14: Lokalizacja docelowa dla TAL - T01, T02 i T03 w obrębie genu CS1 (SLAMF7). T01 i T02 są ukierunkowane na egzon 1 (Figura 14A), podczas gdy T03 jest ukierunkowany na egzon 2 (Figura 14B).

Figura 15A : Pomiar procentowej żywotności komórek docelowych w przypadku transfekowanych 35 TALEn lub nie TALEn w kombinacji z CAR+ lub nietransdukowanych komórek: zmniejszona żywotność komórek CS1(+) przedstawiona, gdy były hodowane wspólnie z komórkami T CAR+, natomiast nie zaobserwowano żadnego wpływu na żywotność komórek CS1(-).

5 EP 3 105 317 B1

Figura 15B: Pomiar procentowej specyficznej lizy komórek (CS1+) obliczonej z zastosowaniem danych z cytometrii przepływowej. Wykazano, że specyficzna liza komórek jest 2-krotnie wyższa, gdy komórki T transfekowano za pomocą TALEn ukierunkowanego na gen CS1 przed transdukcją CAR.

5 Figura 16: Wyniki analizy FACS z eksperymentu na aktywność cytotoksyczną, które wykazują, że wydajność transdukcji jest wyższa w pozorowanie transfekowanych komórkach niż w komórkach, które transfekowano TALEn ukierunkowanym na gen CS1 (NTD: nietransdukowane).

Figura 17: Wyniki analizy FACS, gdy różne próbki są ponownie aktywowane za pomocą perełek CD3/CD28 w D11 po transdukcji, przedstawiając wydajność transdukcji i poziomy ekspresji 10 CD8/CS1 w każdej próbce. Wzrost poziomów CS1 po ponownej aktywacji obserwuje się w pozorowanie transfekowanych komórkach, podczas gdy mała ilość komórek jest zdolna do ekspresji CS1 w populacjach transfekowanych TALEn.

Tabela 1: Różne programy cytopulse stosowane do elektroporacji komórek T.

Tabela 2: odpowiednie sekwencje docelowe dla prowadzącego RNA z zastosowaniem Cas9 w 15 komórkach T.

Tabela 3: Lista genów kodujących białka immunologicznych punktów kontrolnych (ang. immune checkpoint proteins)

Tabela 4: Markery antygenowe klastrów różnicowania (CD), które ulegają ekspresji na powierzchni komórek T, przy czym są charakterystyczne dla różnych rodzajów nowotworów.

20 Tabele 5 do 13: Główne powierzchniowe markery antygenowe wyrażane w komórkach T, podczas gdy ulegają nadekspresji w komórkach guza litego z różnych rodzajów raka. Wymienione markery antygenowe zidentyfikowano tak, jak wyjaśniono w Przykładzie 1.

Tabela 5: komórki nowotworu okrężnicy;

Tabela 6: komórki nowotworu sutka;

25 Tabela 7: komórki nowotworu przewodu pokarmowego;

Tabela 8: komórki nowotworu nerki;

Tabela 9: komórki nowotworu wątroby;

Tabela 10: komórki nowotworu płuc;

Tabela 11: komórki nowotworu jajnika;

30 Tabela 12: komórki nowotworu trzustki;

Tabela 13: komórki nowotworu prostaty;

Tabela 14: Główne powierzchniowe markery antygenowe wyrażane w komórkach T, podczas gdy ulegają nadekspresji w komórkach płynnych guzów z różnych rodzajów raka (ALL, AML, CML, MDS, CLL, CTRL). Wymienione markery antygenowe zidentyfikowano tak, jak wyjaśniono w Przykładzie 1.

35 Tabela 15: Sekwencje badanego celu CD38 i TALEN dla inaktywacji antygenu CD38;

6 EP 3 105 317 B1

Tabela 16: Sekwencje dwóch innych celów CD38 i odpowiednich TALEN dla ich inaktywacji;

Tabela 17: Sekwencje łańcuchów VH i VL przeciwciał scFv anty-CD38 - daratumumabu i MOR202 oraz specyficznych CDR dla łańcuchów VH i VL

Tabela 18: Sekwencja polipeptydowa 3 różnych struktur scFv na bazie daratumumabu CAR anty- 5 CD38 i poszczególnych zastosowanych składników;

Tabela 19: Sekwencje łańcuchów VH i VL przeciwciał scFv anty-CS1;

Tabela 20: Sekwencja polipeptydowa CAR anty-CS1 w oparciu o wersje V1, V2 i V3 na Figurze 11A;

Tabela 21: Sekwencje celu CS1 i TALEN dla jego inaktywacji;

Tabela 22: Sekwencje celu CD70 i TALEN dla jego inaktywacji;

10 Tabela 23: Sekwencje polinukleotydowe i kwasów nukleinowych łańcuchów VH i VL przeciwciał scFv anty-CD70 - Ab4, Ab8 i 1F6;

Tabela 24: Sekwencja polipeptydowa CAR anty-CD70 oparta na wersjach V1, V2 i V3 na Figurze 11A

Szczegółowy opis wynalazku

15 [0023] O ile wyraźnie tu nie zdefiniowano, wszystkie stosowane terminy techniczne i naukowe mają takie samo znaczenie jak powszechnie rozumiane przez specjalistę w dziedzinie terapii genowej, biochemii, genetyki i biologii molekularnej. [0024] Wszystkie metody i materiały podobne lub równoważne do opisanych tutaj mogą być stosowane w praktyce lub badaniu niniejszego wynalazku, z odpowiednimi metodami i materiałami tu opisanymi. 20 Wszystkie publikacje, zgłoszenia patentowe, patenty i inne odnośniki tu wspomniane są włączone w całości przez odniesienie. W przypadku konfliktu, pierwszeństwo ma niniejsza specyfikacja, w tym definicje. Ponadto, materiały, metody i przykłady są jedynie ilustracyjne i nie mają na celu ograniczania, o ile nie podano inaczej. [0025] W praktyce niniejszego wynalazku będą wykorzystywane, o ile nie wskazano inaczej, 25 konwencjonalne techniki biologii komórki, hodowli komórkowej, biologii molekularnej, biologii transgenicznej, mikrobiologii, rekombinowanego DNA i immunologii, które są w zakresie umiejętności w tej dziedzinie. Takie techniki są w pełni wyjaśnione w literaturze. Patrz, na przykład, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie trzecie, (Sambrook i wsp, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring 30 Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait red., 1984); Mullis i wsp. patent USA nr 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins red. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins red. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); seria, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson i M. Simon, red. naczelni, Academic Press, Inc., Nowy 35 Jork), szczególnie, tomy 154 i 155 (Wu i wsp. red.) i tom 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, red.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller i M. P. Calos red., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer i Walker, red., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, tomy I-IV (D. M. Weir i C. C. Blackwell, red., 1986); i Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). 7 EP 3 105 317 B1

[0026] W ogólnym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy sposobów nowych strategii adoptywnej immunoterapii w leczeniu chorób związanych z rozwojem patologicznych komórek, takich jak rak, infekcje i choroby autoimmunologiczne. [0027] Głównym celem wynalazku jest możliwość celowania komórek patologicznych, które niosą 5 specyficzne markery antygenowe wspólne z komórkami T. Przez komórkę patologiczną rozumie się wszelkie typy komórek obecnych u pacjenta, które uważa się za powodujące pogorszenie stanu zdrowia. [0028] Ogólnie, komórki patologiczne są złośliwymi lub zainfekowanymi komórkami, których ilość musi zostać zmniejszona lub wyeliminowana, aby uzyskać remisję pacjenta. [0029] W pierwszym przykładzie wykonania sposób według wynalazku dotyczy sposobu ex-vivo 10 przygotowania odpowiednich komórek T do immunoterapii obejmującego etap:

(a) Genetycznego inaktywowania genu w komórce T, która bierze udział w ekspresji lub prezentacji markera antygenowego, przy czym ten marker antygenowy jest znany jako obecny zarówno na powierzchni wspomnianej komórki T, jak i komórki patologicznej; (b) Wyrażania we wspomnianej komórce T transgenu kodującego chimeryczny receptor antygenowy 15 skierowanego przeciwko temu markerowi antygenowemu obecnemu na powierzchni wspomnianej komórki patologicznej.

[0030] Komórki T według wynalazku są obdarzone chimerycznym receptorem antygenowym skierowanym na marker antygenowy, który jest powszechnie wyrażany przez komórki patologiczne i komórki odpornościowe lub wiadomo, że jest obecny na powierzchni wspomnianych komórek T. Wyrażenie 20 "wiadomo, że jest obecny" oznacza, że marker antygenowy odnotowano na powierzchni komórek T hodowanych w warunkach naturalnych in vivo, zwłaszcza we krwi, ale niekoniecznie, gdy są hodowane in vitro. W każdym przypadku, sposób według wynalazku prowadzi do braku markera antygenowego na powierzchni komórki T, tym samym zapobiegając reakcji chimerycznego receptora antygenowego z powierzchnią skonstruowanych komórek T. Pod tym względem, sposób może obejmować dalszy etap 25 oczyszczania uzyskanych komórek T przez wykluczenie komórek prezentujących wspomniany marker antygenowy na ich powierzchni. [0031] Jak przedstawiono w Tabeli 4, niniejszy wynalazek dotyczy znacznej liczby kandydatów na markery antygenowe, o których donosi się, że są wyrażane przez komórki nowotworowe, ale także przez komórki T. Niektóre z nich, podobnie jak CD38, przez pewien czas były stosowane jako specyficzne markery w 30 metodach diagnostycznych, zwłaszcza w odniesieniu do komórek patologicznych białaczki, ale nie w terapii. Rzeczywiście, chociaż te markery zostały zidentyfikowane w tej dziedzinie jako dość specyficzne markery, nie mogły być stosowane jako cele do immunoterapii, ponieważ przeciwciała skierowane przeciwko tym markerom zniszczyłyby lub zakłócały komórki T pacjentów. Twórcy niniejszego wynalazku ustalili, że CS1 i CD70 są również obecne na powierzchni komórek T i że ekspresja CAR ukierunkowanych na CS1 i CD70 w 35 takich komórkach T prowadzi do ich wyczerpania (patrz przykład 2). [0032] Zgodnie z korzystnym przykładem wykonania wynalazku inaktywację genu z etapu a) powyższego sposobu prowadzi się z zastosowaniem rzadko tnącej endonukleazy. [0033] Przez inaktywację genu ma się na myśli, że gen będący przedmiotem zainteresowania nie ulega ekspresji w postaci funkcjonalnego białka. W szczególnych przykładach wykonania modyfikacja genetyczna 40 według sposobu polega na ekspresji, w dostarczonych komórkach do konstruowania, rzadko tnącej endonukleazy tak, że sama katalizuje cięcie w jednym genie docelowym, tym samym inaktywując

8 EP 3 105 317 B1

wspomniany gen docelowy. Pęknięcia nici kwasu nukleinowego spowodowane przez endonukleazę są często naprawiane przez odrębne mechanizmy rekombinacji homologicznej lub niehomologicznego łączenia końców (NHEJ). Jednak NHEJ jest niedoskonałym procesem naprawy, który często powoduje zmiany w sekwencji DNA w miejscu cięcia. Mechanizmy obejmują ponowne łączenie tego, co pozostało z dwóch 5 końców DNA, poprzez bezpośrednią ponowną ligację (Critchlow i Jackson 1998) lub poprzez tak zwane łączenie końców za pośrednictwem mikrohomologii (Betts, Brenchley i wsp. 2003, Ma, Kim i wsp. 2003). Naprawa przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) często powoduje małe insercje lub delecje i może być stosowana do tworzenia specyficznych knock-out genów. Wspomniana modyfikacja może być podstawieniem, delecją lub addycją co najmniej jednego nukleotydu. Komórki, w których zaszło zdarzenie 10 mutagenezy indukowanej przez rozszczepienie, tj. zdarzenie mutagenezy następujące po zdarzeniu NHEJ, można zidentyfikować i/lub wybrać dobrze znanym w tej dziedzinie sposobem. [0034] Określenie "rzadko tnąca endonukleaza" odnosi się do enzymu typu dzikiego lub wariantu zdolnego do katalizowania hydrolizy (rozszczepiania) wiązań pomiędzy kwasami nukleinowymi w cząsteczce DNA lub RNA, korzystnie cząsteczce DNA. W szczególności, wspomniana nukleaza może być endonukleazą, 15 bardziej korzystnie rzadko tnącą endonukleazą, która jest wysoce specyficzna, rozpoznając miejsca docelowe kwasu nukleinowego w zakresie od 10 do 45 par zasad (bp), zwykle w zakresie od 10 do 35 par zasad, częściej od 12 do 20 par zasad. Endonukleaza według niniejszego wynalazku rozpoznaje przy specyficznych sekwencjach polinukleotydowych, dalej nazywanych "sekwencją docelową" i rozszczepia kwas nukleinowy wewnątrz tych sekwencji docelowych lub w sekwencjach z nimi sąsiadujących, w 20 zależności od struktury cząsteczkowej wspomnianej endonukleazy. Rzadko tnąca endonukleaza może rozpoznawać i generować pęknięcie pojedynczej lub podwójnej nici w określonych sekwencjach polinukleotydów. [0035] W konkretnym przykładzie wykonania wspomniana rzadko tnąca endonukleaza według niniejszego wynalazku jest endonukleazą prowadzoną przez RNA, taką jak kompleks Cas9/CRISPR. Endonukleazy 25 prowadzone przez RNA stanowią nową generację narzędzi inżynierii genetycznej, w których endonukleaza wiąże się z cząsteczką RNA. W tym układzie, sekwencja nukleotydowa cząsteczki RNA określa specyficzność celu i aktywuje endonukleazę (Gasiunas, Barrangou i wsp. 2012, Jinek, Chylinski i wsp. 2012, Cong, Ran i wsp. 2013, Mali, Yang i wsp. 2013) .

Cas 9

30 [0036] Cas9, zwane także Csn1 (COG3513) jest dużym białkiem, które bierze udział zarówno w biogenezie crRNA, jak i w niszczeniu inwazyjnego DNA. Cas9 opisano u różnych gatunków bakterii, takich jak S. thermophiles, Listeria innocua (Gasiunas, Barrangou i wsp. 2012, Jinek, Chylinski i wsp. 2012) i S. pyogenes (Deltcheva, Chylinski i wsp. 2011). Duże białko Cas9 (> 1200 aminokwasów) zawiera dwie przewidywane domeny nukleazy, mianowicie domenę nukleazy HNH (podobną do McrA), która znajduje się w środku białka 35 i rozszczepioną domenę nukleazy podobną do RuvC (RNase H fold) (Makarova, Grishin i wsp. (2006)). [0037] Przez "Cas9" rozumie się skonstruowaną endonukleazę lub homolog Cas9, który jest zdolny do przetwarzania docelowej sekwencji kwasu nukleinowego. W szczególnym przykładzie wykonania Cas9 może indukować cięcie w docelowej sekwencji kwasu nukleinowego, które może odpowiadać zarówno dwuniciowemu pęknięciu, jak i jednoniciowemu pęknięciu. Wariant Cas9 może być endonukleazą Cas9, 40 która naturalnie nie występuje w przyrodzie i jest uzyskiwana za pomocą inżynierii białek lub za pomocą losowej mutagenezy. Warianty Cas9 według wynalazku można, na przykład, uzyskać przez mutacje, tj.

9 EP 3 105 317 B1

delecje z lub insercje lub podstawienia co najmniej jednej reszty w sekwencji aminokwasowej endonukleazy Cas9 S. pyogenes (COG3513). W aspektach niniejszego wynalazku takie warianty Cas9 pozostają funkcjonalne, tj. zachowują zdolność do przetwarzania docelowej sekwencji kwasu nukleinowego. Wariant Cas9 może być również homologiem Cas9 S. pyogenes, który może zawierać delecje z lub insercje lub 5 podstawienia co najmniej jednej reszty w obrębie sekwencji aminokwasowej Cas9 S. pyogenes. Dowolną kombinację delecji, insercji i podstawień można również dokonać w celu uzyskania końcowego konstruktu, pod warunkiem, że końcowy konstrukt posiada pożądaną aktywność, w szczególności zdolność do wiązania prowadzącej sekwencji docelowej RNA lub kwasu nukleinowego. [0038] Motyw RuvC/RNazaH obejmuje białka, które wykazują szerokie spektrum funkcji nukleolitycznych, 10 działając zarówno na RNA i DNA (RNazaH, RuvC, transpozazy DNA i integrazy retrowirusowe i domena PIWI białek Argonaut). W niniejszym wynalazku domena katalityczna RuvC białka Cas9 może być scharakteryzowana przez motyw sekwencji: D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A, gdzie X oznacza dowolny z naturalnych 20 aminokwasów, a [I/L] oznacza izoleucynę lub leucynę. Innymi słowy niniejszy wynalazek dotyczy wariantu Cas9, który zawiera co najmniej sekwencję D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A, gdzie X oznacza 15 dowolny z naturalnych 20 aminokwasów, a [I/L] oznacza izoleucynę lub leucynę. [0039] Motyw HNH jest charakterystyczny dla wielu nukleaz, które działają na dwuniciowym DNA, w tym kolicyn, enzymów restrykcyjnych i endonukleaz naprowadzających (ang. homing endonucleases). Domena HNH (SMART ID: SM00507, nomenklatura SCOP: rodzina HNH) jest związana z szeregiem białek wiążących DNA, pełniących różne funkcje wiązania i cięcia. Te o znanej funkcji biorą udział w szeregu 20 procesów komórkowych, w tym toksyczności bakteryjnej, funkcji naprowadzania w grupach I i II intronów i intein, rekombinacji, kontrolowanym rozwojowo przegrupowaniu DNA, pakowaniu fagów i aktywności endonukleazy restrykcyjnej (Dalgaard, Klar i wsp. 1997). Białka te znajdują się w wirusach, archeobakteriach, eubakteriach i eukariotach. Co ciekawe, podobnie jak w przypadku motywów LAGLI- DADG i GIY-YIG, motyw HNH jest często związany z domenami endonukleaz elementów 25 samonamnażających, takich jak inteiny, introny z Grupy I i Grupy II (Dalgaard, Klar i wsp. 1997). Domena HNH może być scharakteryzowana przez obecność konserwatywnej reszty Asp/His flankowanej konserwowanymi resztami His (koniec aminowy) i His/Asp/Glu (koniec karboksylowy) w pewnej odległości. Znaczna liczba tych białek może również mieć motyw CX2C po każdej stronie centralnej reszty Asp/His. Strukturalnie motyw HNH pojawia się jako centralna spinka do włosów skręconych pasm β, które są z każdej 30 strony flankowane helisą α (Kleanthous, Kuhlmann i wsp. 1999). Duża domena HNH Cas9 jest reprezentowana przez SEK NR ID 5. W niniejszym wynalazku motyw HNH można scharakteryzować motywem sekwencji: Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S, gdzie X oznacza dowolny z naturalnych 20 aminokwasów. Niniejszy wynalazek dotyczy wariantu Cas9, który zawiera co najmniej sekwencję Y-X-X-D-H- X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S, gdzie X oznacza dowolny z naturalnych 20 aminokwasów. 35 [0040] Wynalazek może być szczególnie interesujący dla łatwego dokonywania ukierunkowanych multipleksowych modyfikacji genów i tworzenia indukowalnego układu nukleazy przez wprowadzenie prowadzącego RNA do komórek Cas9. Dla celów niniejszego wynalazku twórcy ustalili, że białko Cas9 można podzielić na dwie odrębne rozszczepione domeny Cas9 RuvC i HNH, które mogą przetwarzać docelową sekwencję kwasu nukleinowego razem lub oddzielnie z prowadzącym RNA. 40 [0041] Również domeny RuvC i HNH z różnych endonukleaz prowadzonych przez RNA lub homologów Cas można zmontować w celu zwiększenia wydajności lub specyficzności nukleazy. Domeny różnych gatunków można albo rozszczepić na dwa białka lub sfuzować ze sobą tworząc wariant białka Cas. Układ

10 EP 3 105 317 B1 rozszczepionego białka Cas9 jest szczególnie odpowiedni do indukowalnego sposobu celowania genomu i do uniknięcia potencjalnego toksycznego efektu nadekspresji Cas9 w komórce. Rzeczywiście, pierwsza rozszczepiona domena Cas9 może być wprowadzona do komórki, korzystnie przez stabilną transformację wspomnianej komórki transgenem kodującym wspomnianą rozszczepioną domenę. Następnie 5 komplementarną rozszczepioną część Cas9 można wprowadzić do komórki tak, że dwie rozszczepione części ponownie łączą się z komórką w celu odtworzenia funkcjonalnego białka Cas9 w pożądanym czasie. [0042] Zmniejszenie wielkości rozszczepionego Cas9 w porównaniu z Cas9 typu dzikiego ułatwia wektoryzację i dostarczanie do komórki, na przykład, przez zastosowanie peptydów penetrujących komórki. Przeorganizowanie domen z różnych białek Cas, umożliwia modulowanie specyficzności i aktywności 10 nukleazy, na przykład, poprzez celowanie motywów PAM, które różnią się nieco od Cas9 S. pyogenes.

Układ rozszczepionego białka Cas9

[0043] Poprzednia charakterystyka domen RuvC i HNH skłoniła twórców do skonstruowania białka Cas9 w celu wytworzenia rozszczepionego białka Cas9. Niespodziewanie twórcy wykazali, że te dwa rozszczepione Cas9 mogą przetwarzać razem lub oddzielnie cel kwasu nukleinowego. Obserwacja ta umożliwia 15 opracowanie nowego układu Cas9 z zastosowaniem rozszczepionego białka Cas9. Każda rozszczepiona domena Cas9 może być wytwarzana i stosowana osobno. Zatem, ten rozszczepiony układ wykazuje kilka zalet w przypadku wektoryzacji i dostarczania endonukleazy prowadzonej przez RNA w komórkach T, umożliwiając dostarczanie krótszego i/lub nieaktywnego białka, i jest szczególnie odpowiedni do indukowania inżynierii genomu w komórkach T w pożądanym czasie, a zatem ograniczając potencjalną 20 toksyczność zintegrowanej nukleazy Cas9. [0044] Przez "rozszczepione Cas9" rozumie się tu zmniejszoną lub skróconą postać białka Cas9 lub wariantu Cas9, który zawiera albo domenę RuvC albo HNH, ale nie obie te domeny. Takie "rozszczepione Cas9" może być stosowane niezależnie z prowadzącym RNA lub w sposób komplementarny, jak na przykład jedno rozszczepione Cas9 dostarczające domeny RuvC i drugie dostarczające domeny HNH. Można razem 25 stosować różne rozszczepione endonukleazy prowadzone przez RNA, mające albo domenę RuvC i/albo NHN. [0045] Każda rozszczepiona domena Cas9 może pochodzić z tego samego lub od różnych homologów Cas9. W bazach danych genomu zidentyfikowano wiele homologów Cas9. [0046] Wspomniane rozszczepione domeny Cas9 (domeny RuvC i HNH) mogą być jednocześnie lub kolejno 30 wprowadzane do komórki tak, że wspomniana(-e) rozszczepiona(-e) domena(-y) Cas9 przetwarza(ją) docelową sekwencję kwasu nukleinowego w komórce. Wspomniane rozszczepione domeny Cas9 i prowadzący RNA można wprowadzić do komórki z zastosowaniem peptydów penetrujących komórki lub innych sposobów transfekcji, jak opisano w innym miejscu. [0047] W innym aspekcie wynalazku do wspomnianej komórki wprowadzana jest tylko jedna rozszczepiona 35 domena Cas9, określana jako kompaktowe Cas9. Rzeczywiście, nieoczekiwanie twórcy wykazali, że rozszczepiona domena Cas9 zawierająca motyw RuvC, jak opisano powyżej, jest zdolna do rozszczepiania docelowej sekwencji kwasu nukleinowego niezależnie od domeny rozszczepionej zawierającej motyw HNH. W ten sposób mogli ustalić, że prowadzący RNA nie potrzebuje obecności domeny HNH do wiązania się z docelową sekwencją kwasu nukleinowego i jest wystarczająco stabilny, aby wiązać się z rozszczepioną 40 domeną RuvC. W korzystnym przykładzie wykonania wspomniana rozszczepiona domena Cas9 jest w stanie sama naciąć wspomnianą docelową sekwencję kwasu nukleinowego.

11 EP 3 105 317 B1

[0048] Każda rozszczepiona domena może być sfuzowana z co najmniej jedną domeną aktywną na N- końcu i/lub C-końcu, wspomniana domena aktywna może być wybrana z grupy składającej się z: nukleazy (np. endonukleazy lub egzonukleazy), polimerazy, kinazy, fosfatazy, metylazy, demetylazy, acetylazy, deacetylazy, topoizomerazy, integrazy, transpozazy, ligazy, helikazy, rekombinazy, aktywatora transkrypcji 5 (np. VP64, VP16), inhibitora transkrypcji (np. KRAB), enzymu przetwarzającego końce DNA (np. Trex2, Tdt), cząsteczki reporterowej (np. białka fluorescencyjne, lacZ, lucyferaza). [0049] Domena HNH odpowiada za nacinanie jednej nici docelowego dwuniciowego DNA, a domena RNaseH fold podobna do RuvC jest zaangażowana w nacinanie drugiej nici (zawierającej motyw PAM) docelowego, dwuniciowego kwasu nukleinowego (Jinek, Chylinski i wsp. 2012). Jednakże, w Cas9 typu 10 dzikiego, te dwie domeny powodują tępe cięcie inwazyjnego DNA w obrębie tej samej sekwencji docelowej (proto-spacer) w bezpośrednim sąsiedztwie PAM (Jinek, Chylinski i wsp. 2012). Cas 9 może być nikazą i wywołuje zdarzenie nacięcia w obrębie różnych sekwencji docelowych. [0050] Jako nieograniczający przykład Cas9 lub rozszczepione Cas9 może zawierać mutację(-e) w katalitycznych resztach albo domeny HNH albo podobnej do RuvC, w celu zaindukowania zdarzenia 15 nacięcia w obrębie różnych sekwencji docelowych. Jako nieograniczający przykład, reszty katalityczne białka Cas9 odpowiadają resztom aminokwasowym D10, D31, H840, H868, N882 i N891 lub dopasowanym pozycjom z zastosowaniem metody CLUSTALW na homologach członków rodziny Cas. Dowolną z tych reszt można zastąpić dowolnymi innymi aminokwasami, korzystnie resztą alaniny. Mutacja w resztach katalitycznych oznacza albo podstawienie przez inne aminokwasy, albo delecję lub addycję aminokwasów, 20 które indukują inaktywację co najmniej jednej z domen katalitycznych cas9. (cf .. W szczególnym przykładzie wykonania Cas9 lub rozszczepione Cas9 może zawierać jedną lub kilka z powyższych mutacji. W innym szczególnym przykładzie wykonania rozszczepione Cas9 zawiera tylko jedną z dwóch domen katalitycznych RuvC i HNH. W niniejszym wynalazku można zastosować Cas9 z różnych gatunków, homologi Cas9, skonstruowane Cas9 i ich warianty funkcjonalne. Wynalazek przewiduje zastosowanie dowolnej 25 endonukleazy prowadzonej przez RNA lub wariantów rozszczepiających endonukleaz prowadzonych przez RNA w celu przeprowadzenia cięcia kwasu nukleinowego w sekwencji genetycznej będącej przedmiotem zainteresowania. [0051] Korzystnie, warianty Cas9 według wynalazku mają sekwencję aminokwasową dzielącą co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 80%, bardziej korzystnie co najmniej 90%, a jeszcze bardziej korzystnie 95% 30 identyczności z Cas9 S. pyogenes (COG3513).

Meganukleazy

[0052] Rzadko tnącą endonukleazą może być również endonukleaza naprowadzająca, znana również pod nazwą meganukleazy. Takie endonukleazy naprowadzające są dobrze znane w tej dziedzinie (Stoddard 2005). Endonukleazy naprowadzające są wysoce specyficzne, rozpoznając miejsca docelowe DNA o 35 długości od 12 do 45 par zasad, zwykle o długości od 14 do 40 pz. Endonukleaza naprowadzająca według wynalazku może, na przykład, odpowiadać endonukleazie LAGLIDADG, endonukleazie HNH lub endonukleazie GIY-YIG. Korzystną endonukleazą naprowadzającą według niniejszego wynalazku może być wariant I-Crel. “Wariant” endonukleazy, tj. endonukleaza, która naturalnie nie występuje w przyrodzie i która jest uzyskiwana przez inżynierię genetyczną lub mutagenezę losową, może wiązać sekwencje DNA różniące 40 się od sekwencji rozpoznawanych przez endonukleazy typu dzikiego (patrz międzynarodowe zgłoszenie WO2006/097854).

12 EP 3 105 317 B1

[0053] Wspomniana rzadko tnąca endonukleaza może być modularną nukleazą wiążącą DNA. Przez modularną nukleazę wiążącą DNA rozumie się dowolne białka fuzyjne zawierające co najmniej jedną domenę katalityczną endonukleazy i co najmniej jedną domenę lub białko wiążące DNA, określającą docelową sekwencję kwasu nukleinowego. Domena wiążąca DNA jest ogólnie domeną wiążącą RNA lub 5 DNA utworzoną przez niezależnie sfałdowaną domenę polipeptydową lub białkową, która zawiera co najmniej jeden motyw, który rozpoznaje polinukleotydy o podwójnej lub pojedynczej nici. Wiele takich polipeptydów zostało opisanych w dziedzinie, które mają zdolność wiązania określonych sekwencji kwasu nukleinowego. Takie domeny wiążące często obejmują, jako nieograniczające przykłady, domeny helisa- zwrot-helisa, domeny suwaka leucynowego, domeny uskrzydlonej helisy, domeny helisa-pętla-helisa, 10 domeny HMG-box, domeny immunoglobiny, domenę B3 lub skonstruowane domeny palca cynkowego.

Nukleazy z motywem palca cynkowego

[0054] Początkowo opracowane do cięcia DNA in vitro, "nukleazy z motywem palca cynkowego" (ZFN) są fuzją pomiędzy domeną cięcia enzymu restrykcyjnego typu IIS, Fokl i domeną rozpoznawania DNA zawierającą 3 lub więcej motywów palca cynkowego C2H2. Heterodimeryzacja w konkretnej pozycji w DNA 15 dwóch pojedynczych ZFN w precyzyjnej orientacji i odstępie prowadzi do dwuniciowego pęknięcia (DSB) w DNA. Zastosowanie takich chimerycznych endonukleaz zostało szeroko opisane w dziedzinie, jak zrecenzował Urnov i wsp. (Genome editing with engineered zinc finger nucleases (2010) Nature reviews Genetics 11: 636-646). [0055] Standardowe ZFN łączą domenę cięcia z C-końcem każdej domeny palca cynkowego. Aby umożliwić 20 dwóm domenom cięcia dimeryzację i cięcie DNA, dwie indywidualne ZFN wiążą przeciwne nici DNA z ich końcem C w pewnej odległości od siebie. Najczęściej stosowane sekwencje łącznikowe pomiędzy domeną palca cynkowego a domeną cięcia wymagają oddzielenia krawędzi 5' każdego miejsca wiązania od 5 do 7 pz. [0056] Najprostszym sposobem wytwarzania nowych macierzy palca cynkowego jest połączenie mniejszych 25 "modułów" palca cynkowego o znanej specyficzności. Najbardziej powszechny sposób montażu modułowego obejmuje łączenie trzech oddzielnych palców cynkowych, z których każdy rozpoznaje sekwencję DNA o długości 3 par zasad, w celu wytworzenia macierzy z trzema palcami, która może rozpoznać miejsce docelowe o długości 9 par zasad. Do wytworzenia macierzy palca cynkowego zdolnych do celowania pożądanych sekwencji stosowano liczne metody selekcji. Początkowe próby związane z 30 selekcją wykorzystywały prezentację fagową do selekcji białek, które wiążą dany cel DNA z dużej puli częściowo randomizowanych macierzy palca cynkowego. W nowszych próbach wykorzystano drożdżowe układy jednohybrydowe, bakteryjne układy jednohybrydowe i dwuhybrydowe oraz komórki ssacze.

Nukleazy TAL

[0057] "Nukleaza TALE" lub "nukleaza MBBBD" odnosi się do skonstruowanych białek powstałych w wyniku 35 fuzji domeny wiążącej DNA, typowo pochodzącej z białek TALE (ang. Transcription Activator Like Effector) lub domeny MBBBD (ang. Modular Base-per-Base Binding domain), z domeną katalityczną o aktywności endonukleazy. Taka domena katalityczna zwykle pochodzi z enzymów, takich jak, na przykład, I-Tevl, ColE7, NucA i Fok-I. Nukleazę TALE można wytwarzać w postaci monomerycznej lub dimerycznej w zależności od wybranej domeny katalitycznej (WO2012138927). Takie skonstruowane nukleazy TALE są dostępne w 40 handlu pod nazwą handlową TALEN™ (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paryż, Francja).

13 EP 3 105 317 B1

[0058] Zgodnie z korzystnym przykładem wykonania wynalazku domena wiążąca DNA pochodzi z TALE, przy czym specyficzność sekwencji jest kierowana serią 33-35 aminokwasowych powtórzeń pochodzących z białek bakteryjnych AvrBs3, PthXo1, AvrHah1, PthA, Tallc Xanthomonas lub Ralstonia, jako nieograniczających przykładów. 5 [0059] Te powtórzenia różnią się zasadniczo dwoma pozycjami aminokwasów, które określają interakcję z parą zasad (Boch, Scholze i wsp. 2009, Moscou i Bogdanove 2009). Każda para zasad w docelowym DNA jest kontaktowana przez pojedyncze powtórzenie, ze specyficznością wynikającą z dwóch wariantów aminokwasów powtórzenia (tak zwanego zmiennego dipeptydu powtórzenia, RVD (ang. Repeat Variable Dipeptide)). Domeny wiążące TALE mogą ponadto zawierać N-końcową domenę translokacji 10 odpowiedzialną za zapotrzebowanie na pierwszą zasadę tyminy (T0) docelowej sekwencji i domenę C- końcową, która zawiera sygnały lokalizacji jądrowej (NLS). Domena wiążąca kwasy nukleinowe TALE zasadniczo odpowiada skonstruowanemu rdzeniowi szkieletu TALE zawierającemu wiele sekwencji powtórzenia TALE, przy czym każde powtórzenie obejmuje RVD specyficzny dla każdej zasady nukleotydowej miejsca rozpoznawania TALE. W niniejszym wynalazku, każda sekwencja powtórzenia TALE 15 wspomnianego rdzenia szkieletu składa się z od 30 do 42 aminokwasów, bardziej korzystnie 33 lub 34, przy czym dwa krytyczne aminokwasy (tak zwany zmienny dipeptyd powtórzenia, RVD) umieszczone w pozycjach 12 i 13 pośredniczą w rozpoznawaniu jednego nukleotydu wspomnianej sekwencji miejsca wiążącego TALE; odpowiednie dwa krytyczne aminokwasy mogą znajdować się w pozycjach innych niż 12 i 13, szczególnie w sekwencji powtórzenia TALE o długości większej niż 33 lub 34 aminokwasy. Korzystnie, 20 RVD związane z rozpoznawaniem różnych nukleotydów są HD dla rozpoznawania C, NG dla rozpoznawania T, NI dla rozpoznawania A, NN dla rozpoznawania G lub A. W innym przykładzie wykonania krytyczne aminokwasy 12 i 13 mogą być zmutowane w kierunku innych reszt aminokwasowych w celu modulowania ich specyficzności względem nukleotydów A, T, C i G, a w szczególności w celu wzmocnienia tej specyficzności. Domena wiążąca kwasy nukleinowe TALE zawiera zwykle pomiędzy 8 i 30 sekwencji 25 powtórzenia TALE. Bardziej korzystnie, wspomniany rdzeń szkieletu według niniejszego wynalazku zawiera pomiędzy 8 i 20 sekwencji powtórzenia TALE; ponownie bardziej korzystnie 15 sekwencji powtórzenia TALE. Może również zawierać dodatkową pojedynczą skróconą sekwencję powtórzenia TALE złożoną z 20 aminokwasów umiejscowionych na C-końcu wspomnianego zestawu sekwencji powtórzenia TALE, tj. dodatkowej C-końcowej sekwencji powtórzenia pół-TALE. 30 [0060] Inne skonstruowane domeny wiążące DNA można stosować jako alternatywne sekwencje do tworzenia tak zwanych domen MBBBD (ang. modular base-per-base specific nucleic acid binding domains), jak opisano w WO 2014/018601. Wspomniane MBBBD można skonstruować na przykład z nowo zidentyfikowanych białek, a mianowicie białek EAV36_BURRH, E5AW43_BURRH, E5AW45_BURRH i E5AW46_BURRH z niedawno zsekwencjonowanego genomu endosymbiotycznych grzybów Burkholderia 35 rhizoxinica (Lackner, Moebius i wsp. 2011). Te polipeptydy wiążące kwas nukleinowy zawierają moduły o około 31 do 33 aminokwasów, które są specyficzne względem zasady. Moduły te wykazują mniej niż 40% identyczności sekwencji z powszechnymi powtórzeniami TALE Xanthomonas i wykazują większą zmienność sekwencji polipeptydów. Różne domeny z powyższych białek (moduły, końce N i C) z Burkholderia i Xanthomonas są przydatne do konstruowania nowych białek lub rusztowań o właściwościach wiążących do 40 określonych sekwencji kwasów nukleinowych i mogą być łączone w celu utworzenia chimerycznych białek TBA-MBBBD.

14 EP 3 105 317 B1

[0061] Jako przykłady, niniejszy wynalazek obejmuje sposób do konstruowania komórek T, w celu inaktywacji ekspresji genów kodujących markery antygenowe, takie jak CD38, CS1 i CD70 z zastosowaniem specyficznych nukleaz TALE. [0062] Szczególnie odpowiednie do realizacji wynalazku, nukleazy TALE, takie jak te w SEK NR ID: 2-3, 5-6, 5 8-9, SEK NR ID: 64-65, 67-68, 70-71 i SEK NR ID: 73-74; 76-77; 79-80 odpowiednio dla genów CD38, CS1 i CD70. Te specyficzne nukleazy TALE, ich cel sekwencji i zastosowany protokół zostały dokładniej przedstawione w poniższych Przykładach 1-3.

Metody dostarczania

[0063] Twórcy rozważali wszelkie metody znane w tej dziedzinie, aby umożliwić dostarczanie do komórek 10 lub przedziałów subkomórkowych tych komórek polinukleotydów wyrażających endonukleazy, ich możliwych koefektorów (np. prowadzącego RNA lub DNA związanego z nukleazami Cas9 lub Argonaute) jak również chimerycznych receptorów antygenowych. Środki te obejmują transdukcję wirusową, elektroporację, a także liposomalne środki do dostarczania, nośniki polimerowe, nośniki chemiczne, lipopleksy, polipleksy, dendrymery, nanocząstki, emulsję, szlaki naturalnej endocytozy lub fagocytozy jako nieograniczające 15 przykłady. [0064] W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku polinukleotydy kodujące endonukleazy według niniejszego wynalazku transfekuje się w postaci mRNA w celu uzyskania przejściowej ekspresji i uniknięcia integracji chromosomów obcego DNA, na przykład przez elektroporację. Twórcy określili różne optymalne warunki dla elektroporacji mRNA w komórkach T przedstawione w Tabeli 1. Twórca zastosował technologię 20 cytoPulse, która umożliwia, poprzez zastosowanie impulsowych pól elektrycznych, przejściową permeabilizację żywych komórek do dostarczania do komórek materiału (patent USA 6,010,613 i WO 2004/083379). Czas trwania impulsu, natężenie oraz odstęp pomiędzy impulsami można modyfikować w celu osiągnięcia najlepszych warunków dla wysokiej wydajności transfekcji przy minimalnej śmiertelności. Zasadniczo pierwsze wysokie impulsy pola elektrycznego umożliwiają tworzenie porów, podczas gdy kolejne 25 niższe impulsy pola elektrycznego umożliwiają przeniesienie polinukleotydu do komórki. W jednym aspekcie niniejszego wynalazku, twórca opisuje etapy, które doprowadziły do osiągnięcia > 95% wydajności transfekcji mRNA w limfocytach T, oraz zastosowanie protokołu elektroporacji do przejściowej ekspresji różnego rodzaju białek w komórkach T. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu transformacji komórki T obejmującego kontaktowanie wspomnianej komórki T z RNA i zastosowanie do komórki T sprawnej sekwencji impulsów 30 składającej się z:

(a) jednego impulsu elektrycznego o zakresie napięcia od 2250 do 3000 V na centymetr, szerokości impulsu 0,1 ms i odstępie impulsów od 0,2 do 10 ms pomiędzy impulsami elektrycznymi z etapu (a) i (b); (b) jednego impulsu elektrycznego o zakresie napięcia od 2250 do 3000 V z szerokością impulsu 35 100 ms i odstępem impulsów wynoszącym 100 ms pomiędzy impulsem elektrycznym z etapu (b) i pierwszym impulsem elektrycznym z etapu (c); i (c) 4 impulsów elektrycznych o napięciu 325 V z szerokością impulsu 0,2 ms i odstępem impulsów wynoszącym 2 ms pomiędzy każdym z 4 impulsów elektrycznych.

W szczególnym przykładzie wykonania sposób transformacji komórki T obejmujący kontaktowanie 40 wspomnianej komórki T z RNA i zastosowanie do komórki T sprawnej sekwencji impulsów składającej się z:

15 EP 3 105 317 B1

(a) jednego impulsu elektrycznego o napięciu 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 lub 3000 V na centymetr, o szerokości impulsu 0,1 ms i odstępie impulsów 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10 ms pomiędzy impulsami elektrycznymi z etapu (a) i (b); 5 (b) jednego impulsu elektrycznego o zakresie napięcia od 2250, wynoszącego 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 lub 3000 V o szerokości impulsu 100 ms oraz odstępie impulsów wynoszącym 100 ms pomiędzy impulsem elektrycznym z etapu (b) i pierwszym impulsem elektrycznym z etapu (c); i (c) 4 impulsów elektrycznych o napięciu 325 V z szerokością impulsu 0,2 ms i odstępem impulsów 10 wynoszącym 2 ms pomiędzy każdym z 4 impulsów elektrycznych.

Wszelkie wartości zawarte w opisanym powyżej zakresie wartości są ujawnione w niniejszym zgłoszeniu. Ośrodkiem do elektroporacji może być dowolny odpowiedni ośrodek znaną w dziedzinie. Korzystnie ośrodek elektroporacji ma przewodność w zakresie od 0,01 do 1,0 miliSiemensa.

16 EP 3 105 317 B1

Tabela 1 : Różne programy cytopulse stosowane do określania minimalnego napięcia wymaganego do elektroporacji w komórkach T pochodzących z komórek PBMC.

Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3

Program Cyto-pulse Pulsy V Czas trwania Odstęp (ms) Pulsy V Czas trwania Odstęp (ms) Pulsy V Czas trwania Odstęp (ms) (ms) (ms) (ms)

1 1 600 0,1 0,2 1 600 0,1 100 4 130 0,2 2

2 1 900 0,1 0,2 1 900 0,1 100 4 130 0,2 2

3 1 1200 0,1 0,2 1 1200 0,1 100 4 130 0,2 2

4 1 1200 0,1 10 1 900 0,1 100 4 130 0,2 2

5 1 900 0,1 20 1 600 0,1 100 4 130 0,2 2

17 EP 3 105 317 B1

Transdukcja wirusowa

[0065] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem zastosowanie wektorów retrowirusowych, a bardziej korzystnie wektorów lentiwirusowych jest szczególnie odpowiednie do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych do komórek T. Metody transdukcji wirusowej są dobrze znane w dziedzinie (Walther i wsp. 5 (2000) Viral Vectors for Gene Transfer, Drugs., 60 (2): 249-271). Integracyjne wektory wirusowe umożliwiają stabilną integrację polinukleotydów w genomie komórek T i ekspresję chimerycznych receptorów antygenowych przez dłuższy czas.

Niealloreaktywne komórki T

[0066] Chociaż sposób opisany w niniejszym dokumencie można przeprowadzić in vivo jako część terapii 10 genowej, na przykład, z zastosowaniem wektorów wirusowych ukierunkowanych na komórki T w krwioobiegu, które obejmowałyby sekwencje genetyczne wyrażające specyficzną rzadko tnącą endonukleazę wraz z innymi sekwencjami genetycznymi wyrażającymi CAR, przy czym sposób według wynalazku jest przeznaczony do praktykowania ex-vivo na hodowanych komórkach T otrzymywanych od pacjentów lub dawców. Skonstruowane komórki T skonstruowane ex-vivo można albo ponownie wszczepić 15 pacjentowi, skąd pochodzą, w ramach leczenia autologicznego albo zastosować w ramach leczenia allogenicznego. W tym ostatnim przypadku lepiej jest dalej konstruować komórki tak, aby nie były alloreaktywne, aby zapewnić ich odpowiednie wszczepienie. Odpowiednio, sposób według wynalazku może obejmować dodatkowe etapy pozyskiwania komórek T od dawcy i inaktywacji genów związanych z rozpoznawaniem MHC i/lub będących celami leków immunosupresyjnych, takich jak opisane, na przykład, w 20 WO 2013/176915. [0067] Receptory komórek T (TCR) to receptory na powierzchni komórki, które uczestniczą w aktywacji komórek T w odpowiedzi na prezentację antygenu. TCR jest ogólnie wytworzony z dwóch łańcuchów, alfa i beta, które tworzą heterodimer i łączą się z podjednostkami transdukcyjnymi CD3, tworząc kompleks receptora komórek T obecny na powierzchni komórki. Każdy łańcuch alfa i beta TCR składa się z N- 25 końcowego immunoglobulino-podobnego regionu zmiennego (V) i stałego (C), hydrofobowej domeny transbłonowej i krótkiego regionu cytoplazmatycznego. Jeśli chodzi o cząsteczki immunoglobulin, region zmienny łańcuchów alfa i beta jest wytwarzany przez rekombinację V(D)J, tworząc dużą różnorodność specyficzności antygenów w populacji komórek T. Jednakże, w przeciwieństwie do immunoglobulin, które rozpoznają nienaruszony antygen, komórki T są aktywowane przez przetworzone fragmenty peptydowe w 30 połączeniu z cząsteczką MHC, wprowadzając dodatkowy wymiar do rozpoznawania antygenu przez komórki T, znane jako ograniczenie MHC. Rozpoznawanie różnic między MHC pomiędzy dawcą a biorcą za pośrednictwem receptora komórek T prowadzi do proliferacji komórek T i potencjalnego rozwoju GVHD. Wykazano, że normalna ekspresja powierzchniowa TCR zależy od skoordynowanej syntezy i złożenia wszystkich siedmiu składników kompleksu (Ashwell i Klusner 1990). Inaktywacja TCRalfa lub TCRbeta może 35 prowadzić do eliminacji TCR z powierzchni komórek T, uniemożliwiając rozpoznanie alloantygenu, a zatem GVHD. [0068] Zatem, nadal zgodnie z wynalazkiem, wszczepianie komórek T można poprawić przez inaktywację co najmniej jednego genu kodującego składnik TCR. TCR staje się niefunkcjonalny w komórkach przez inaktywację genu TCR alfa i/lub genu(-ów) TCR beta. 40 [0069] W odniesieniu do stosowania układu Cas9/CRISPR, twórcy określili odpowiednie sekwencje docelowe w obrębie 3 egzonów kodujących TCR, umożliwiając znaczne zmniejszenie toksyczności w 18 EP 3 105 317 B1

żywych komórkach, przy zachowaniu skuteczności cięcia. Korzystne sekwencje docelowe są odnotowane w Tabeli 2 (+ dla niższego stosunku komórek TCR ujemnych, ++ dla pośredniego stosunku, +++ dla wyższego stosunku).

Tabela 2: odpowiednie sekwencje docelowe dla prowadzącego RNA z zastosowaniem Cas9 w komórkach T

Egzon TCR Pozycja Nić Docelowa sekwencja genomowa ID SEK wydajność

Ex1 78 -1 GAGAATCAAAATCGGTGAATAGG 102 +++

Ex3 26 1 TTCAAAACCTGTCAGTGATTGGG 103 +++

Ex1 153 1 TGTGCTAGACATGAGGTCTATGG 104 +++

Ex3 74 -1 CGTCATGAGCAGATTAAACCCGG 105 +++

Ex1 4 -1 TCAGGGTTCTGGATATCTGTGGG 106 +++

Ex1 5 -1 GTCAGGGTTCTGGATATCTGTGG 107 +++

Ex3 33 -1 TTCGGAACCCAATCACTGACAGG 108 +++

Ex3 60 -1 TAAACCCGGCCACTTTCAGGAGG 109 +++

Ex1 200 -1 AAAGTCAGATTTGTTGCTCCAGG 110 ++

Ex1 102 1 AACAAATGTGTCACAAAGTAAGG 111 ++

Ex1 39 -1 TGGATTTAGAGTCTCTCAGCTGG 112 ++

Ex1 59 -1 TAGGCAGACAGACTTGTCACTGG 113 ++

Ex1 22 -1 AGCTGGTACACGGCAGGGTCAGG 114 ++

Ex1 21 -1 GCTGGTACACGGCAGGGTCAGGG 115 ++

Ex1 28 -1 TCTCTCAGCTGGTACACGGCAGG 116 ++

Ex3 25 1 TTTCAAAACCTGTCAGTGATTGG 117 ++

Ex3 63 -1 GATTAAACCCGGCCACTTTCAGG 118 ++

Ex2 17 -1 CTCGACCAGCTTGACATCACAGG 119 ++

Ex1 32 -1 AGAGTCTCTCAGCTGGTACACGG 120 ++

Ex1 27 -1 CTCTCAGCTGGTACACGGCAGGG 121 ++

Ex2 12 1 AAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGG 122 ++

Ex3 55 1 ATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGG 123 ++

Ex3 86 1 TGCTCATGACGCTGCGGCTGTGG 124 ++

Ex1 146 1 ACAAAACTGTGCTAGACATGAGG 125 +

Ex1 86 -1 ATTTGTTTGAGAATCAAAATCGG 126 +

Ex2 3 -1 CATCACAGGAACTTTCTAAAAGG 127 +

Ex2 34 1 GTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGG 128 +

Ex3 51 -1 CCACTTTCAGGAGGAGGATTCGG 129 +

19 EP 3 105 317 B1

Egzon TCR Pozycja Nić Docelowa sekwencja genomowa ID SEK wydajność

Ex3 18 -1 CTGACAGGTTTTGAAAGTTTAGG 130 +

Ex2 43 1 AGCTTTGAAACAGGTAAGACAGG 131 +

Ex1 236 -1 TGGAATAATGCTGTTGTTGAAGG 132 +

Ex1 182 1 AGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGG 133 +

Ex3 103 1 CTGTGGTCCAGCTGAGGTGAGGG 134 +

Ex3 97 1 CTGCGGCTGTGGTCCAGCTGAGG 135 +

Ex3 104 1 TGTGGTCCAGCTGAGGTGAGGGG 136 +

Ex1 267 1 CTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGG 137 +

Ex1 15 -1 ACACGGCAGGGTCAGGGTTCTGG 138 +

Ex1 177 1 CTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGG 139 +

Ex1 256 -1 CTGGGGAAGAAGGTGTCTTCTGG 140 +

Ex3 56 1 TCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGG 141 +

Ex3 80 1 TTAATCTGCTCATGACGCTGCGG 142 +

Ex3 57 -1 ACCCGGCCACTTTCAGGAGGAGG 143 +

Ex1 268 1 TTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGG 144 +

Ex1 266 -1 CTTACCTGGGCTGGGGAAGAAGG 145 +

Ex1 262 1 GACACCTTCTTCCCCAGCCCAGG 146 +

Ex3 102 1 GCTGTGGTCCAGCTGAGGTGAGG 147 +

Ex3 51 1 CCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGG 148 +

[0070] Antygeny MHC są również białkami, które odgrywają główną rolę w reakcjach transplantacji. W odrzuceniu pośredniczą komórki T reagujące na antygeny zgodności tkankowej na powierzchni wszczepionych tkanek, a największa grupa tych antygenów stanowi główne antygeny zgodności tkankowej (MHC). Białka te ulegają ekspresji na powierzchni komórek wszystkich wyższych kręgowców i są nazywane 5 antygenami HLA (dla antygenów ludzkich leukocytów) w komórkach ludzkich. Podobnie jak TCR, białka MHC odgrywają istotną rolę w stymulacji komórek T. Komórki prezentujące antygen (często komórki dendrytyczne) prezentują peptydy, które są produktami degradacji obcych białek na powierzchni komórki MHC. W obecności sygnału kostymulującego komórka T staje się aktywowana i będzie oddziaływać na komórkę docelową, która również prezentuje ten sam kompleks peptyd/MHC. Na przykład, stymulowana 10 komórka T pomocnicza będzie ukierunkowana na makrofaga prezentującego antygen w połączeniu z jego MHC, lub cytotoksyczna komórka T (CTL) będzie działała na komórce zainfekowanej wirusem, prezentującej obce peptydy wirusowe. [0071] Zatem, w celu dostarczenia mniej alloreaktywnych komórek T, sposób według wynalazku może ponadto obejmować etap inaktywowania lub mutowania jednego genu HLA. 15 [0072] Klaster genów HLA klasy I u ludzi obejmuje trzy główne loci, B, C i A, jak również kilka mniejszych loci. Klaster HLA klasy II obejmuje również trzy główne loci, DP, DQ i DR, a zarówno klaster genów klasy I,

20 EP 3 105 317 B1

jak i klasy II jest polimorficzny, ponieważ w populacji występuje kilka różnych alleli obu genów klasy I i II. Występuje również kilka białek pomocniczych, które odgrywają również rolę w funkcjonowaniu HLA. Podjednostki TapI i Tap2 są częściami kompleksu transportera TAP, który jest niezbędny w obciążaniu antygenów peptydowych na kompleksach HLA klasy I, a podjednostki proteosomu LMP2 i LMP7 odgrywają 5 rolę w proteolitycznej degradacji antygenów do peptydów do prezentacji na HLA. Wykazano, że zmniejszenie ilości LMP7 zmniejsza ilość MHC klasy I na powierzchni komórki, prawdopodobnie przez brak stabilizacji (Fehling i wsp. (1999) Science 265: 1234-1237). Oprócz TAP i LMP występuje gen tapasyny, którego produkt tworzy mostek pomiędzy kompleksem TAP i łańcuchami HLA klasy I i zwiększa obciążenie peptydem. Zmniejszenie ilości tapasyny daje komórki z upośledzonym zestawem MHC klasy I, zmniejszoną 10 ekspresję na powierzchni komórkowej MHC klasy I i zaburzone odpowiedzi odpornościowe (Grandea i wsp. (2000) Immunity 13: 213-222 oraz Garbi i wsp. (2000) Nat. Immunol. 1: 234-238). Dowolny z powyższych genów można inaktywować jako część niniejszego wynalazku, jak ujawniono, na przykład w WO 2012/012667.

Sposób konstruowania lekoopornych komórek T:

15 [0073] Aby ulepszyć terapię przeciwnowotworową i selektywne wszczepianie allogenicznych komórek T, oporność na leki można nadawać skonstruowanym komórkom T, aby chronić je przed toksycznymi efektami ubocznymi chemoterapii lub środków immunosupresyjnych. Rzeczywiście, twórcy zaobserwowali, że jako standard opieki większość pacjentów leczono chemioterapią i lekami obniżającymi odporność, przed otrzymaniem immunoterapii komórkami T. Stwierdzili również, że mogą skorzystać z tych sposobów 20 leczenia, aby pomóc w selekcji skonstruowanych komórek T, albo przez dodanie leków do chemioterapii do pożywek hodowlanych w celu ekspansji komórek ex-vivo przed leczeniem, albo przez uzyskanie selektywnej ekspansji skonstruowanych komórek T in vivo u pacjentów poddawanych chemioterapii lub leczeniu immunosupresyjnemu. [0074] Także lekooporność komórek T umożliwia również ich wzbogacenie in lub ex vivo, ponieważ komórki 25 T, które wyrażają gen oporności na lek, będą przeżywały i mnożyły się w stosunku do komórek wrażliwych na lek. W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu konstruowania allogenicznych i opornych na lek komórek T opornych na immunoterapię obejmującego:

(a) dostarczenie komórki T; (b) wybór co najmniej jednego leku; 30 (c) modyfikowanie komórki T w celu nadania wspomnianej komórce T oporności na lek; (d) ekspansję wspomnianej skonstruowanej komórki T w obecności tego leku i ewentualnie

powyższe etapy można łączyć z etapami sposobów, jak opisano poprzednio. [0075] Oporność lekową można nadawać komórce T przez inaktywację jednego lub większej liczby genów odpowiedzialnych za wrażliwość komórki na lek (gen uwrażliwiający na lek), taki jak gen 35 fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej (HPRT) (Genbank: M26434.1). W szczególności HPRT można inaktywować w skonstruowanych komórkach T, aby nadać oporność na cytostatyczny metabolit, 6-tioguaninę (6TG), która jest przekształcana przez HPRT w cytotoksyczny nukleotyd tioguaniny i która jest obecnie stosowana w leczeniu pacjentów z rakiem, w szczególności z białaczkami (Hacke, Treger i wsp. 2013). Innym przykładem jest jeśli inaktywacja CD3 normalnie wyrażanej na powierzchni komórki T 40 może nadawać oporność na przeciwciała anty-CD3, takie jak teplizumab.

21 EP 3 105 317 B1

[0076] Lekooporność można również nadawać komórce T przez ekspresję genu oporności na leki. Wspomniany gen oporności na lek dotyczy sekwencji kwasu nukleinowego, która koduje "oporność" na środek, taki jak środek chemoterapeutyczny (na przykład, metotreksat). Innymi słowy, ekspresja genu oporności na leki w komórce umożliwia proliferację komórek w obecności środka w większym stopniu niż 5 proliferacja odpowiadającej komórki bez genu oporności na lek. Gen oporności na lek według wynalazku może kodować oporność na anty-metabolit, metotreksat, winblastynę, cisplatynę, środki alkilujące, antracykliny, antybiotyki cytotoksyczne, anty-immunofiliny, ich analogi lub pochodne i tym podobne. [0077] Określono warianty alleli kilku genów, takich jak reduktaza dihydrofolianowa (DHFR), dehydrogenaza inozynomonofosforanowa 2 (IMPDH2), kalcyneuryna lub transferaza metyloguaninowa (MGMT), aby 10 nadawać komórkom lekooporność. Wspomniany gen oporności na lek można wyrazić w komórce albo przez wprowadzenie transgenu kodującego ten gen do komórki albo przez integrację tego genu oporności na lek do genomu komórki przez rekombinację homologiczną. Zidentyfikowano kilka innych genów oporności na leki, które można potencjalnie zastosować do nadawania oporności na leki komórkom docelowym (Takebe, Zhao i wsp. 2001, Sugimoto, Tsukahara i wsp. 2003, Zielske, Reese i wsp. 2003, Nivens, Felder i wsp. 2004, 15 Bardenheuer, Lehmberg i wsp. 2005, Kushman, Kabler i wsp. 2007). [0078] DHFR jest enzymem zaangażowanym w regulowanie ilości tetrahydrofolianu w komórce i jest niezbędny do syntezy DNA. Analogi kwasu foliowego, takie jak metotreksat (MTX), hamują DHFR i dlatego są stosowane w klinice jako środki przeciwneoplastyczne. Opisano różne zmutowane postacie DHFR, które mają zwiększoną oporność na hamowanie przez środki będące antagonistami kwasu foliowego stosowane w 20 terapii. W szczególnym przykładzie wykonania gen oporności na lek według niniejszego wynalazku może być sekwencją kwasu nukleinowego kodującą zmutowaną postać ludzkiego DHFR typu dzikiego (GenBank: AAH71996.1), która zawiera co najmniej jedną mutację nadającą oporność na leczenie antagonistą kwasu foliowego takim jak metotreksat. W szczególnym przykładzie wykonania zmutowana postać DHFR zawiera co najmniej jeden zmutowany aminokwas w pozycji G15, L22, F31 lub F34, korzystnie w pozycjach L22 lub 25 F31 ((Schweitzer, Dicker i wsp. 1990), międzynarodowe zgłoszenie WO 94/24277; patent USA 6,642,043). [0079] Jak stosuje się w niniejszym dokumencie "środek będący antagonistą kwasu foliowego" lub "analogi kwasu foliowego" odnosi się do cząsteczki skierowanej do zakłócania na pewnym poziomie metabolicznego szlaku kwasu foliowego. Przykłady środków będących antagonistami kwasu foliowego obejmują np. Metotreksat (MTX); aminopterynę; trimetreksat (Neutrexin™); edatreksat; kwas N10-propargilo-5,8- 30 dideazafoliowy (CB3717); ZD1694 (Tumodex), kwas 5,8-dideazaizofoliowy (IAHQ); kwas 5,10- dideazapetrahydrofoliowy (DDATHF); kwas 5-deazafoliowy; PT523 (N alfa-(4-amino-4-deoksypteroilo)-N- delta-hemiftaloilo-L-ornityna); 10-etylo-10-deazaaminopterynę (DDATHF, lomatreksol); pirytreksym; 10- EDAM; ZD1694; GW1843; Pemetreksat i PDX (10-propargilo-10-deazaaminopteryna). [0080] Innym przykładem genu oporności na lek może być także zmutowana lub zmodyfikowana postać 35 dehydrogenazy inozyno-5'-monofosforanowej II (IMPDH2), enzymu ograniczającego szybkość w syntezie de novo nukleotydów guanozyny. Zmutowaną lub zmodyfikowaną postacią IMPDH2 jest gen oporności na inhibitor IMPDH. Inhibitorami IMPDH może być kwas mykofenolowy (MPA) lub jego prolek mykofenolan mofetylu (MMF). Mutant IMPDH2 może zawierać co najmniej jedną, korzystnie dwie mutacje w miejscu wiązania MAP ludzkiego IMPDH2 typu dzikiego (NP_000875.2), które prowadzą do znacznie zwiększonej 40 oporności na inhibitor IMPDH. Mutacje są korzystnie w pozycjach T333 i/lub S351 (Yam, Jensen i wsp. 2006, Sangiolo, Lesnikova i wsp. 2007, Jonnalagadda, Brown i wsp. 2013). W szczególnym przykładzie

22 EP 3 105 317 B1

wykonania, reszta treoniny w pozycji 333 jest zastąpiona resztą izoleucyny, a reszta seryny w pozycji 351 jest zastąpiona resztą tyrozyny. [0081] Innym genem oporności na leki jest zmutowana postać kalcyneuryny. Kalcyneuryna (PP2B) jest powszechnie wyrażaną serynowo-treoninową fosfatazą białkową, która bierze udział w wielu procesach 5 biologicznych i która jest kluczowa dla aktywacji komórek T. Kalcyneuryna jest heterodimerem złożonym z podjednostki katalitycznej (CnA, trzy izoformy) i podjednostki regulacyjnej (CnB, dwie izoformy). Po zaangażowaniu receptora komórki T, kalcyneuryna defosforyluje czynnik transkrypcyjny NFAT, umożliwiając jej translokację do jądra komórkowego i aktywnego kluczowego genu docelowego, takiego jak IL2. FK506 w kompleksie z FKBP12 lub cyklosporyna A (CsA) w kompleksie z CyPA blokuje NFAT dostęp do miejsca 10 aktywnego kalcyneuryny, zapobiegając jej defosforylacji i tym samym hamując aktywację komórek T (Brewin, Mancao i wsp. 2009). Gen oporności na lek według niniejszego wynalazku może być sekwencją kwasu nukleinowego kodującą zmutowaną postać kalcyneuryny opornej na inhibitor kalcyneuryny, taki jak FK506 i/lub CsA. W szczególnym przykładzie wykonania wspomniana zmutowana postać może zawierać co najmniej jeden zmutowany aminokwas heterodimeru a kalcyneuryny typu dzikiego w pozycjach: V314, Y341, 15 M347, T351, W352, L354, K360, korzystnie podwójne mutacje w pozycjach T351 i L354 lub V314 i Y341. Zgodność opisanych tu pozycji aminokwasowych jest często wyrażana w kategoriach pozycji aminokwasów postaci heterodimeru ludzkiej kalcyneuryny typu dzikiego (GenBank: ACX34092.1). [0082] W innym szczególnym przykładzie wykonania wspomniana zmutowana postać może zawierać co najmniej jeden zmutowany aminokwas heterodimeru b kalcyneuryny typu dzikiego w pozycjach: V120, N123, 20 L124 lub K125, korzystnie podwójne mutacje w pozycjach L124 i K125. Zgodność opisanych tu pozycji aminokwasowych jest często wyrażana w kategoriach pozycji aminokwasów w postaci polipeptydu heterodimeru b ludzkiej kalcyneuryny typu dzikiego (GenBank: ACX34095.1). [0083] Innym genem oporności na lek jest metylotransferaza 0(6)-metyloguaninowa (MGMT) kodująca ludzkiej alkiloguaninotransferazy (hAGT). AGT jest białkiem naprawczym DNA, które nadaje oporność na 25 działanie cytotoksyczne środków alkilujących, takich jak nitrozomoczniki i temozolomid (TMZ). 6- benzyloguanina (6-BG) jest inhibitorem AGT, który nasila toksyczność nitrozomocznika i jest podawany razem z TMZ w celu nasilenia cytotoksycznego działania tego środka. Kilka zmutowanych postaci MGMT kodujących warianty AGT jest wysoce opornych na inaktywację przez 6-BG, ale zachowuje zdolność do naprawy uszkodzeń DNA (Maze, Kurpad i wsp. 1999). W szczególnym przykładzie wykonania zmutowana 30 postać AGT może zawierać zmutowany aminokwas AGT typu dzikiego pozycji P140 (UniProtKB: P16455). [0084] Innym genem oporności na lek może być gen białka oporności wielolekowej 1 (MDR1). Ten gen koduje glikoproteinę błonową, znaną jako glikoproteina P (P-GP) zaangażowana w transport metabolicznych produktów ubocznych przez błonę komórkową. Białko P-Gp wykazuje szeroką specyficzność wobec kilku strukturalnie niespokrewnionych środków chemioterapeutycznych. Zatem, oporność na leki można nadawać 35 komórkom przez ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego, która koduje MDR-1 (NP_000918). [0085] Gen oporności na lek może również być genem oporności na antybiotyk cytotoksyczny, takim jak gen ble lub mcrA. Ektopowa ekspresja genu ble lub mcrA w komórce odpornościowej daje selektywną przewagę po ekspozycji na środek chemioterapeutyczny, odpowiednio bleomycynę lub mitomycynę C. [0086] Komórki T można również uczynić opornymi na środki immunosupresyjne. Środkiem 40 immunosupresyjnym jest środek, który hamuje funkcje odpornościowe za pomocą jednego z kilku mechanizmów działania. Innymi słowy, środek immunosupresyjny jest rolą odgrywaną przez związek, który wykazuje zdolność do zmniejszania zakresu i/lub zachłanności odpowiedzi odpornościowej. Jako

23 EP 3 105 317 B1

nieograniczający przykład, środkiem immunosupresyjnym może być inhibitor kalcyneuryny, cel rapamycyny, bloker łańcucha α interleukiny-2, inhibitor dehydrogenazy inozynomonofosforanowej, inhibitor reduktazy kwasu dihydrofoliowego, kortykosteroid lub antymetabolit immunosupresyjny. Klasyczne cytotoksyczne środki immunosupresyjne działają poprzez hamowanie syntezy DNA. Inne mogą działać poprzez aktywację 5 komórek T lub poprzez hamowanie aktywacji komórek pomocniczych. Sposób według wynalazku umożliwia immunosupresyjną oporność na komórki T w celu immunoterapii poprzez inaktywację celu środka immunosupresyjnego w komórkach T. Jako nieograniczające przykłady, celem dla środka immunosupresyjnego może być receptor dla środka immunosupresyjnego, takiego jak: CD52, receptor glukokortykoidowy (GR), gen będący członkiem rodziny FKBP i gen będący członkiem rodziny cyklofilin. 10 [0087] U immunokompetentnych gospodarzy komórki allogeniczne są zwykle szybko odrzucane przez układ odpornościowy gospodarza. Wykazano, że allogeniczne leukocyty obecne w nienapromienionych produktach krwi będą utrzymywać się przez nie więcej niż 5 do 6 dni. Zatem, aby zapobiec odrzuceniu komórek allogenicznych, układ odpornościowy gospodarza musi być skutecznie tłumiony. Glukokortykoidosteroidy są szeroko stosowane terapeutycznie do immunosupresji. Ta klasa hormonów 15 steroidowych wiąże się z receptorem glukokortykoidowym (GR) obecnym w cytozolu komórek T, co powoduje translokację do jądra i wiązanie specyficznych motywów DNA, które regulują ekspresję wielu genów zaangażowanych w proces immunologiczny. Traktowanie komórek T sterydami glukokortykoidowymi prowadzi do obniżenia poziomu produkcji cytokin, prowadząc do anergii komórek T i zakłócając aktywację komórek T. Alemtuzumab, znany również jako CAMPATH1-H, jest humanizowanym przeciwciałem 20 monoklonalnym ukierunkowanym na CD52, 12-aminokwasową glikoproteinę połączoną z glikozylofosfatydyloinozytolem (Waldmann i Hale, 2005). CD52 ulega ekspresji na wysokich poziomach na limfocytach T i B, i na niższych poziomach na monocytach, podczas gdy jest nieobecny na granulocytach i prekursorach szpiku kostnego. Wykazano, że leczenie alemtuzumabem, humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko CD52 indukuje szybkie wyczerpywanie krążących limfocytów i 25 monocytów. Jest często stosowany w leczeniu chłoniaków z komórek T, a w niektórych przypadkach jako część schematu kondycjonowania do przeszczepu. Jednakże w przypadku immunoterapii adoptywnej stosowanie leków immunosupresyjnych będzie miało również szkodliwy wpływ na wprowadzone terapeutyczne komórki T. Zatem, aby skutecznie stosować podejścia immunoterapii adoptywnej w tych stanach, wprowadzone komórki musiałyby być oporne na leczenie immunosupresyjne. 30 [0088] Jako korzystny przykład wykonania powyższych etapów, wspomnianym genem z etapu (b), specyficznym dla leczenia immunosupresyjnego, jest CD52, a leczenie immunosupresyjne z etapu (d) obejmuje humanizowane przeciwciało ukierunkowane na antygen CD52. W innym przykładzie wykonania wspomniany gen z etapu (b), specyficzny dla leczenia immunosupresyjnego, jest receptorem glukokortykoidowym (GR), a leczenie immunosupresyjne z etapu d) obejmuje kortykosteroid, taki jak 35 deksametazon. W innym przykładzie wykonania, wspomniany gen docelowy z etapu (b), specyficzny dla leczenia immunosupresyjnego, jest genem będącym członkiem rodziny FKBP lub jego wariantem, a leczenie immunosupresyjne z etapu (d) obejmuje FK506, znany również jako takrolimus lub fujimycyna. W innym przykładzie wykonania wspomnianym członkiem genu rodziny FKBP jest FKBP12 lub jego wariant. W innym przykładzie wykonania wspomniany gen z etapu (b), specyficzny dla leczenia immunosupresyjnego, jest 40 genem będącym członkiem rodziny cyklofilin lub jego wariantem, a leczenie immunosupresyjne z etapu (d) obejmuje cyklosporynę.

24 EP 3 105 317 B1

[0089] W szczególnym przykładzie wykonania wynalazku etap modyfikacji genetycznej sposobu polega na inaktywacji dwóch genów wybranych z grupy składającej się z CD52 i GR, CD52 i TCR alfa, CDR52 i TCR beta, GR i TCR alfa, GR i TCR beta, TCR alfa i TCR beta. W innym przykładzie wykonania etap modyfikacji genetycznej sposobu, opiera się na inaktywacji więcej niż dwóch genów. Modyfikację genetyczną korzystnie 5 prowadzi się ex-vivo, stosując co najmniej dwa prowadzący RNA ukierunkowany na różne geny. [0090] Przez inaktywację genu ma się na myśli, że gen będący przedmiotem zainteresowania nie ulega ekspresji w postaci funkcjonalnego białka.

Konstruowanie wysoce aktywnych komórek T do immunoterapii

[0091] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem komórki T mogą być wybrane z grupy składającej się z limfocytów 10 T zapalnych, limfocytów T cytotoksycznych, limfocytów T regulatorowych lub limfocytów T pomocniczych. W innym przykładzie wykonania, wspomniana komórka może pochodzić z grupy składającej się z limfocytów T CD4+ i limfocytów T CD8+. Mogą być ekstrahowane z krwi lub pochodzić z komórek macierzystych. Komórki macierzyste mogą być komórkami macierzystymi dorosłych, embrionalnymi komórkami macierzystymi, w szczególności komórkami macierzystymi niepochodzącymi od człowieka, komórkami macierzystymi krwi 15 pępowinowej, komórkami progenitorowymi, komórkami macierzystymi szpiku kostnego, indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi, totipotencjalnymi komórkami macierzystymi lub hematopoetycznymi komórkami macierzystymi. Reprezentatywne komórki ludzkie to komórki CD34+. Przed ekspansją i modyfikacją genetyczną komórek według wynalazku, źródło komórek można uzyskać od osobnika za pomocą szeregu nieograniczających metod. Komórki T można uzyskać z szeregu 20 nieograniczających źródeł, w tym z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, szpiku kostnego, tkanki węzłów chłonnych, krwi pępowinowej, tkanki grasicy, tkanki z miejsca zakażenia, wodobrzusza, wysięku opłucnowego, tkanki śledziony i guzów. W pewnych przykładach wykonania niniejszego wynalazku można zastosować dowolną liczbę linii komórek T dostępnych i znanych specjalistom w tej dziedzinie. W innym przykładzie wykonania wspomniana komórka może pochodzić od zdrowego dawcy, od pacjenta, u którego 25 zdiagnozowano raka lub od pacjenta, u którego zdiagnozowano zakażenie. W innym przykładzie wykonania wspomniana komórka jest częścią mieszanej populacji komórek, które wykazują różne charakterystyki fenotypowe. Zakres niniejszego wynalazku obejmuje również linię komórkową otrzymaną z transformowanej komórki T zgodnie z wcześniej opisanym sposobem. [0092] Jako dalszy aspekt wynalazku komórki T według wynalazku mogą być dalej konstruowane, korzystnie 30 metodami inżynierii genetycznej, w celu zwiększenia ich aktywności i/lub aktywacji, zwłaszcza przez modulowanie ekspresji białek zaangażowanych w ogólną regulację komórek T, określanych jako "punkty kontrolne układu odpornościowego ".

Punkty kontrolne układu odpornościowego

[0093] Specjaliści w tej dziedzinie zrozumieją, że określenie "punkty kontrolne układu odpornościowego" 35 oznacza grupę cząsteczek wyrażanych przez komórki T. Te cząsteczki skutecznie służą jako "hamulce" do modulowania w dół lub hamowania odpowiedzi odpornościowej. Cząsteczki punktów kontrolnych układu odpornościowego obejmują, ale nie wyłącznie, receptor programowanej śmierci 1 (PD-1, znany również jako PDCD1 lub CD279, numer dostępu: NM_005018), antygen 4 limfocytów T cytotoksycznych (CTLA-4, znany również jako CD152, numer dostępu GenBank AF414120.1), LAG3 (znany również jako CD223, numer 40 dostępu: NM_002286.5), Tim3 (znany również jako HAVCR2, numer dostępu GenBank: JX049979.1), BTLA (znany również jako CD272, numer dostępu: NM_181780.3) BY55 (znany również jako CD160, numer 25 EP 3 105 317 B1

dostępu GenBank: CR541888.1), TIGIT (znany również jako IVSTM3, numer dostępu: NM_173799), LAIR1 (znany również jako CD305, numer dostępu GenBank: CR542051.1, {Meyaard, 1997 nr 122}), SIGLEC10 (numer dostępu GeneBank: AY358337.1), 2B4 (znany również jako CD244, numer dostępu: NM_001166664.1), PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, CD96, CRTAM, SIGLEC7 {Nicoll, 1999 nr 123} 5 SIGLEC9 {Zhang, 2000 nr 124; lkehara, 2004 nr 125}, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF {Quigley, 2010 nr 121}, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, które bezpośrednio hamują komórki odpornościowe. Na przykład, CTLA-4 jest białkiem powierzchni komórkowej ulegającym ekspresji na 10 niektórych komórkach T CD4 i CD8; gdy są zaangażowane przez jego ligandy (B7-1 i B7-2) na komórkach prezentujących antygen, hamowana jest aktywacja komórek T i funkcja efektorowa. Zatem niniejszy wynalazek dotyczy sposobu konstruowania komórek T, zwłaszcza do immunoterapii, obejmującego genetyczne modyfikowanie komórek T przez inzaktywację co najmniej jednego białka zaangażowanego w punkt kontrolny układu odpornościowego, w szczególności PD1 i/lub CTLA-4 lub dowolnych białek punktów 15 kontrolnych układu odpornościowego, o których mowa w Tabeli 3.

Tabela 3: Lista genów kodujących białka punktów kontrolnych układu odpornościowego

Szlak Geny, które mogą zostać inaktywowane w szlaku

CTLA4 (CD152) CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22

PDCD1 (PD-1, CD279) PDCD1

CD223 (lag3) LAG3

HAVCR2 (tim3) HAVCR2

BTLA(cd272) BTLA

CD160(by55) CD160

Receptory koinhibitorowe TIGIT

Rodzina IgSF CD96

CRTAM

LAIR1(cd305) LAIR1

SIGLEC7 SIGLEC SIGLEC9

CD244(2b4) CD244

TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, TRAIL Receptory śmierci CASP3, CASP6, CASP7 FAS FADD, FAS

TGFBRII, TGFBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, Sygnalizacja TGF-beta Sygnalizacja cytokin SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1 Sygnalizacja IL10 IL10RA, IL10RB, HMOX2

26 EP 3 105 317 B1

Szlak Geny, które mogą zostać inaktywowane w szlaku

SygnalizacjaIL6 IL6R, IL6ST

Głodzenie pod kątem EIF2AK4 argininy/tryptofanu

Zapobieganie sygnalizacji CSK, PAG1 TCR SIT1

Indukowany Treg indukowany Treg FOXP3

PRDM1 (=blimp1, heterozygotyczne myszy kontrolują przewlekłą infekcję wirusową lepiej niż Czynniki transkrypcyjne Czynniki transkrypcyjne wt lub warunkowe KO) kontrolujące wyczerpanie kontrolujące wyczerpanie

BATF

Tolerancja, w której cyklaza guanylanowa GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3 pośredniczy hipoksja indukowana iNOS

Skonstruowane komórki T wyrażające chimeryczne receptory antygenowe przeciwko komórkom patologicznym

[0094] Chimeryczne receptory antygenowe wprowadzone do komórek T według wynalazku mogą przyjmować różne wzory, takie jak CAR o pojedynczym łańcuchu lub wielu łańcuchach. Te różne wzory 5 umożliwiają różne strategie poprawy specyficzności i skuteczności wiązania wobec celowanych komórkach patologicznych. Niektóre z tych strategii są zilustrowane na figurach niniejszego zgłoszenia. Jednołańcuchowe CAR są najbardziej klasyczną wersją w tej dziedzinie. Wielołańcuchowe architektury CAR zostały opracowane przez zgłaszającego jako umożliwiające modulację aktywności komórek T pod względem specyficzności i intensywności. Wielokrotne podjednostki mogą chronić dodatkowe domeny ko- 10 stymulacji lub utrzymywać takie domeny na odległość, a także inne rodzaje receptorów, podczas gdy klasyczna architektura jednołańcuchowa może być czasami uważana za zbyt wrażliwą i mniej tolerancyjną dla interakcji wielospecyficznych.

Jednołańcuchowy CAR

[0095] Immunoterapia adoptywna, polegająca na transferze autologicznych, antygenowo specyficznych 15 komórek T wytworzonych ex vivo, jest obiecującą strategią leczenia zakażeń wirusowych i raka. Komórki T stosowane w immunoterapii adoptywnej można wytworzyć albo przez ekspansję komórek T antygenowo specyficznych, albo przez przekierowanie komórek T przez inżynierię genetyczną (Park, Rosenberg i wsp. 2011). Transfer wirusowych swoistych antygenowo komórek T jest dobrze ugruntowaną procedurą stosowaną w leczeniu infekcji wirusowych związanych z przeszczepami i rzadkich nowotworów złośliwych 20 związanych z wirusem. Podobnie, wykazano, że izolacja i transfer komórek T specyficznych względem nowotworu jest skuteczna w leczeniu czerniaka. [0096] Nowe specyficzności w komórkach T zostały pomyślnie wytworzone poprzez genetyczny transfer transgenicznych receptorów komórek T lub chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) (Jena, Dotti i wsp. 2010). CAR są syntetycznymi receptorami składającymi się z ugrupowania ukierunkowującego, które

27 EP 3 105 317 B1 jest związane z jedną lub większą liczbą domen sygnałowych w pojedynczej cząsteczce fuzyjnej. Ogólnie, ugrupowanie wiążące CAR składa się z domeny wiążącej antygen przeciwciała jednołańcuchowego (scFv), zawierającego lekkie i zmienne fragmenty przeciwciała monoklonalnego połączone elastycznym łącznikiem. Z powodzeniem zastosowano również ugrupowania wiążące oparte na domenach receptorowych lub 5 ligandowych. Domeny sygnałowe dla CAR pierwszej generacji pochodzą z regionu cytoplazmatycznego łańcucha CD3zeta lub Fc receptora gamma. Wykazano, że CAR pierwszej generacji skutecznie przekierowują cytotoksyczność komórek T. Jednakże, nie udało im się zapewnić długotrwałej ekspansji i aktywności przeciwnowotworowej in vivo. Domeny sygnałowe z cząsteczek kostymulujących, w tym CD28, OX-40 (CD134) i 4-1BB (CD137) zostały dodane samodzielnie (druga generacja) lub w kombinacji (trzecia 10 generacja) w celu zwiększenia przeżywalności i zwiększenia proliferacji komórek T ze zmodyfikowanymi CAR. CAR z powodzeniem umożliwiły przekierowanie komórek T przeciwko antygenom wyrażanym na powierzchni komórek nowotworowych z różnych nowotworów złośliwych, w tym chłoniaków i guzów litych (Jena, Dotti i wsp. 2010). [0097] Oprócz CAR ukierunkowanego na marker antygenowy, który jest wspólny dla komórek 15 patologicznych i komórek T, takich jak CD38, przewiduje się ekspresję dalszych CAR skierowanych w kierunku innych markerów antygenowych niekoniecznie wyrażanych przez komórki T, tak jak w celu zwiększenia specyficzności komórek T. [0098] Przykładami chimerycznego receptora antygenowego, który może być dalej wyrażany przez komórki T w celu wytworzenia komórek wielospecyficznych, są receptory antygenowe skierowane przeciwko 20 markerom antygenowym szpiczaka mnogiego lub białaczki limfoblastycznej, takim jak TNFRSF17 (UNIPROT Q02223), SLAMF7 (UNIPROT Q9NQ25), GPRC5D (UNIPROT Q9NZD1), FKBP11 (UNIPROT Q9NYL4), KAMP3, ITGA8 (UNIPROT P53708), i FCRL5 (UNIPROT Q68SN8). [0099] Jako dalsze przykłady, antygen docelowy może pochodzić z dowolnej z cząsteczek klastra różnicowania (np. CD16, CD64, CD78, CD96, CLL1, CD116, CD117, CD71, CD45, CD71, CD123 i CD138), 25 antygenu powierzchniowego związanego z nowotworem takiego jak ErbB2 (HER2/neu), antygenu rakowo- płodowego (CEA), cząsteczki adhezyjnej komórki nabłonkowej (EpCAM), receptora czynnika wzrostu naskórka (EGFR), EGFR wariant III (EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, disialogangliozydu GD2, mucyny nabłonka przewodowego, gp36, TAG-72, glikosfingolipidów, antygenu związanego z glejakiem, podjednostki β ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej, alfafetoproteiny (AFP), reaktywnej względem lektyny 30 AFP, tyreoglobuliny, RAGE-1, MN-CA IX, ludzkiej odwrotnej transkryptazy telomerazy, RU1, RU2 (AS), jelitowej esterazy karboksylowej, mut hsp70-2, M-CSF, prostazy, antygenu specyficznego dla prostazy (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-1a, p53, prosteiny, PSMA, przeżycia i telomerazy, antygenu 1 raka gruczołu krokowego (PCTA-1), MAGE, ELF2M, elastazy neutrofilowej, efryny B2, CD22, insulinowego czynnika wzrostu (IGF1)-I, IGF-II, receptora IGFI, mezoteliny, cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej 35 (MHC) prezentującej specyficzny względem nowotworu epitop peptydowy, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, antygenów guza stromalnego, dodatkowej domeny A (ang. Extra Domain A - EDA) i dodatkowej domeny B (ang. Extra Domain B - EDB) fibronektyny i domeny A1 tenascyny-C (TnC A1) i białka związanego z fibroblastami (fap); antygenu specyficznego względem linii zarodkowej lub specyficznego względem tkanki, takiego jak CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD133, CD138, CTLA-4, B7-1 (CD80), B7-2 40 (CD86), GM-CSF, receptorów cytokin, endoglin, cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC), BCMA (CD269, TNFRSF17) lub antygenu powierzchniowego specyficznego wobec wirusa, takiego jak antygen specyficzny wobec HIV (taki jak HIV gp120); antygen specyficzny wobec EBV, antygen

28 EP 3 105 317 B1

specyficzny wobec CMV, antygen specyficzny wobec HPV, antygen specyficzny wobec wirusa Lasse, antygen specyficzny wobec wirusa grypy, jak również dowolnej pochodnej lub wariantu tych markerów powierzchniowych. Antygeny niekoniecznie są powierzchniowymi markerami antygenowymi, ale mogą być również endogennymi małymi antygenami prezentowanymi przez HLA klasy I na powierzchni komórek. 5 [0100] Jako przykłady, niniejszy wynalazek obejmuje jednołańcuchowe CAR, które są ukierunkowane konkretnie na marker na powierzchni komórki, taki jak CD38, CS1 i/lub CD70, jak opisano w przykładach, wraz z inaktywacją genów kodujących odpowiednio CD38, CS1 i/lub CD70 w komórkach wyrażających wspomniane CAR. [0101] Jako konkretny przykład, łańcuchy VH i VL scFv anty-CD38 mają co najmniej 80%, korzystnie 90%, a 10 bardziej korzystnie 95% identyczności z odpowiednio SEK NR ID: 10 i 12 oraz SEK NR ID: 11 i 13. [0102] Jako konkretny przykład, przeciwciało lub jego fragment wiążący epitop na antygenie CD38, charakteryzujące się tym, że wspomniane przeciwciało lub jego fragment wiążący epitop zawiera co najmniej jeden łańcuch ciężki i co najmniej jeden łańcuch lekki, przy czym wspomniany łańcuch ciężki zawiera trzy kolejne regiony determinujące komplementarność mające sekwencje aminokwasowe reprezentowane przez 15 SEK NR ID: 14-17, i w którym wspomniany łańcuch lekki zawiera trzy kolejne regiony determinujące komplementarność, mające sekwencje aminokwasowe reprezentowane przez SEK NR ID: 21-23. [0103] Jako inny konkretny przykład, przeciwciało lub jego fragment wiążący epitop na antygenie CD38, charakteryzuje się tym, że wspomniane przeciwciało lub jego fragment wiążący epitop zawiera co najmniej jeden łańcuch ciężki i co najmniej jeden łańcuch lekki, przy czym wspomniany łańcuch ciężki zawiera trzy 20 kolejne regiony determinujące komplementarność mające sekwencje aminokwasowe reprezentowane przez SEK NR ID: 18-20 i w którym wspomniany łańcuch lekki zawiera trzy kolejne regiony determinujące komplementarność, mające sekwencje aminokwasowe reprezentowane przez SEK NR ID: 24-26. [0104] Jako inny konkretny przykład, łańcuchy VH i VL scFv anty-CS1 dzielą co najmniej 80%, korzystnie 90%, a bardziej korzystnie 95% identyczności z odpowiednio SEK NR ID: 38-40-42-44-46 i SEK NR ID: 39- 25 41-42-45-46. [0105] Jako jeszcze inny konkretny przykład, łańcuchy VH i VL scFv anty-CD70 dzielą co najmniej 80%, korzystnie 90%, a bardziej korzystnie 95% identyczności na poziomie polinukleotydowym lub kwasu nukleinowego z odpowiednio SEK NR ID: 81-82; 85-86; 89-91 i SEK NR ID: 83-84; 87-88; 91-92. [0106] W przykładzie wykonania wynalazek obejmuje polinukleotyd kodujący pojedynczy CAR anty-CD38, 30 który dzieli co najmniej 80%, korzystnie 90%, a bardziej korzystnie 95% identyczności z SEK NR ID: 35-37. W innym przykładzie wykonania wynalazek obejmuje polinukleotyd kodujący pojedynczy CAR anty-CS1, który dzieli co najmniej 80%, korzystnie 90%, a bardziej korzystnie 95% identyczności z SEK NR ID: 48-62. [0107] W jeszcze innym przykładzie wykonania wynalazek obejmuje polinukleotyd kodujący pojedynczy CAR anty-CD70, który dzieli co najmniej 80%, korzystnie 90%, a bardziej korzystnie 95% identyczności z 35 SEK NR ID: 93-101. [0108] Niniejszy wynalazek w szczególności dotyczy komórek T, które są obdarzone CAR prezentującym pewną identyczność z tymi komórkami opisanymi w niniejszym zgłoszeniu i które niosłyby mutacje indukowane rzadko tnącą endonukleazą w genie kodującym marker komórkowy celowany przez wspomniany CAR (tj. CAR wykazuje powinowactwo z produktem wspomnianego inaktywowanego genu). 40 Przez identyczność rozumie się co najmniej 70%, korzystnie 80%, bardziej korzystnie 90%, a jeszcze bardziej korzystnie 95% identyczności polinukleotydowej lub polipeptydowej określonej przez oprogramowanie takie jak FASTA lub BLAST, które są dostępne jako część pakietu analizy sekwencji GCG.

29 EP 3 105 317 B1 (University of Wisconsin, Madison, Wis.). "Identyczności" BLASTP przedstawiają liczbę i frakcję całkowitych reszt w parach sekwencji o wysokim wyniku, które są identyczne. Sekwencje aminokwasowe mające takie stopnie identyczności lub podobieństwa lub dowolny pośredni stopień identyczności lub podobieństwa z sekwencjami aminokwasowymi tu ujawnionymi są rozważane i objęte niniejszym ujawnieniem. To samo 5 dotyczy sekwencji polinukleotydowych z zastosowaniem BLASTN.

Wielopodjednostkowy CAR

[0109] Chimeryczne receptory antygenowe z dziedziny wprowadzone do komórek T zostały utworzone z jednołańcuchowych polipeptydów, które wymagają szeregowego dołączania domen sygnałowych. Jednak przez przemieszczanie domen sygnałowych z ich naturalnej pozycji okołobłonowej może zakłócać ich 10 funkcję. W celu przezwyciężenia tej wady, zgłaszający niedawno zaprojektował wielołańcuchowy CAR dostarczony z FcεRI, aby umożliwić normalną pozycję okołobłonową wszystkich istotnych domen sygnałowych. W tej nowej architekturze, domena wiążąca IgE z wysokim powinowactwem łańcucha alfa FcεRI jest zastąpiona zewnątrzkomórkową domeną wiążącą ligand, taką jak scFv, w celu przekierowania specyficzności komórek T przeciwko celom komórkowym i stosowane są ogony końca N i/lub C łańcucha 15 beta FcεRI do umieszczania sygnałów kostymulatorowych w normalnych pozycjach okołobłonowych. [0110] Stosownie do tego, CAR wyrażany przez skonstruowane komórki T według wynalazku może być wielołańcuchowym, chimerycznym receptorem antygenowym (CAR), szczególnie przystosowanym do wytwarzania i ekspansji skonstruowanych komórek T według niniejszego wynalazku. Takie wielołańcuchowe CAR zawierają co najmniej dwa z następujących składników:

20 a) jeden polipeptyd zawierający domenę transbłonową łańcucha alfa FcεRI i zewnątrzkomórkową domenę wiążącą ligand, b) jeden polipeptyd zawierający część ogona cytoplazmatycznego końca N i C oraz domenę transbłonową łańcucha beta FcεRI i/lub c) co najmniej dwa polipeptydy zawierające każdą część ogona wewnątrzcytoplazmatycznego i 25 domenę transbłonową łańcucha gamma FcεRI, w wyniku czego różne polipeptydy multimeryzują razem spontanicznie tworząc dimeryczny, trimeryczny lub tetrameryczny CAR.

[0111] Zgodnie z takimi architekturami, domeny wiążące ligandy i domeny sygnałowe powstają na oddzielnych polipeptydach. Różne polipeptydy są zakotwiczone w błonie blisko siebie, umożliwiając wzajemne interakcje. W takich architekturach, domeny sygnałowe i kostymulatorowe mogą znajdować się w 30 pozycjach okołobłonowych (tj. w sąsiedztwie błony komórkowej po wewnętrznej stronie), co jest uważane za umożliwiające lepsze funkcjonowanie domen kostymulatorowych. Architektura wielopodjednostkowa oferuje także większą elastyczność i możliwości projektowania CAR z większą kontrolą nad aktywacją komórek T. Na przykład, możliwe jest włączenie kilku zewnątrzkomórkowych domen rozpoznających antygen o różnej specyficzności w celu uzyskania wielospecyficznej architektury CAR. Możliwe jest również kontrolowanie 35 względnego stosunku pomiędzy różnymi podjednostkami w wielołańcuchowym CAR. Ten rodzaj architektury został ostatnio opisany przez zgłaszającego w PCT/US2013/058005 (WO2014/039523). [0112] Złożenie różnych łańcuchów jako część pojedynczego wielołańcuchowego CAR jest możliwe, na przykład, z zastosowaniem różnych łańcuchów alfa, beta i gamma receptora o wysokim powinowactwie do IgE (FcεRI) (Metzger, Alcaraz i wsp. 1986), do których są sfuzowane domeny sygnałowe i kostymulatorowe. 40 Łańcuch gamma zawiera region transbłonowy i ogon cytoplazmatyczny zawierający jeden aktywujący motyw immunoreceptorowy oparty o resztę tyrozyny (ITAM) (Cambier 1995). 30 EP 3 105 317 B1

[0113] Wielołańcuchowy CAR może zawierać kilka zewnątrzkomórkowych domen wiążących ligand, aby jednocześnie wiązać różne elementy docelowe, zwiększając w ten sposób aktywację i funkcję komórek T. W jednym przykładzie wykonania zewnątrzkomórkowe domeny wiążące ligand można umieścić w tandemie na tym samym polipeptydzie transbłonowym i ewentualnie można je rozdzielić łącznikiem. W innym przykładzie 5 wykonania wspomniane różne zewnątrzkomórkowe domeny wiążące ligand można umieścić na różnych polipeptydach transbłonowych tworzących wielołańcuchowy CAR. W innym przykładzie wykonania niniejszy wynalazek dotyczy populacji wielołańcuchowych CAR zawierających każdy inne zewnątrzkomórkowe domeny wiążące ligand. W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu konstruowania komórek T obejmującego dostarczenie komórki T i ekspresję na powierzchni wspomnianej komórki populacji 10 wielołańcuchowego CAR, z których każdy zawiera inne zewnątrzkomórkowe domeny wiążące ligand. W innym szczególnym przykładzie wykonania niniejszy wynalazek dotyczy sposobu konstruowania komórek T obejmującego dostarczanie komórki T i wprowadzanie do wspomnianej komórki polinukleotydów kodujących polipeptydy tworzące populację wielołańcuchowych CAR, z których każdy zawiera różne zewnątrzkomórkowe domeny wiążące ligand. W szczególnym przykładzie wykonania sposób konstruowania 15 komórki T obejmuje ekspresję na powierzchni komórki co najmniej części łańcucha beta i/lub gamma FcεRI sfuzowanych z domeną transdukującą sygnał i kilka części łańcuchów alfa FcεRI sfuzowanych z różnymi zewnątrzkomórkowymi domenami wiążącymi ligand. W bardziej szczególnym przykładzie wykonania wspomniany sposób obejmuje wprowadzenie do komórki co najmniej jednego polinukleotydu, który koduje część łańcucha beta i/lub gamma FcεRI sfuzowanego z domeną transdukującą sygnał i kilkoma łańcuchami 20 alfa FcεRI sfuzowanymi z różnymi zewnątrzkomórkowymi domenami wiążącymi ligand. Przez populację wielołańcuchowych CAR rozumie się co najmniej dwa, trzy, cztery, pięć, sześć lub więcej wielołańcuchowych CAR, z których każdy zawiera różne zewnątrzkomórkowe domeny wiążące ligand. Różne zewnątrzkomórkowe domeny wiążące ligand według niniejszego wynalazku mogą korzystnie jednocześnie wiązać różne elementy docelowe, tym samym zwiększając aktywację i funkcję komórek T. 25 [0114] Niniejszy wynalazek dotyczy także wyizolowanej komórki T, która zawiera populację wielołańcuchowych CAR, z których każdy zawiera różne zewnątrzkomórkowe domeny wiążące ligand. [0115] Domena tramsdukująca sygnał lub wewnątrzkomórkowa domena sygnałowa wielołańcuchowego CAR według wynalazku jest odpowiedzialna za wewnątrzkomórkową sygnalizację po związaniu zewnątrzkomórkowej domeny wiążącej ligand z celem, co powoduje aktywację komórki T i odpowiedź 30 odpornościową. Innymi słowy, domena transdukująca sygnał jest odpowiedzialna za aktywację co najmniej jednej z normalnych funkcji efektorowych komórki T, w której wielołańcuchowy CAR ulega ekspresji. Na przykład, funkcją efektorową komórki T może być aktywność cytolityczna lub aktywność pomocnicza obejmująca wydzielanie cytokin. [0116] W niniejszym zgłoszeniu określenie "domena transdukująca sygnał" odnosi się do części białka, która 35 transdukuje sygnał funkcji sygnału efektorowego i kieruje komórkę do wykonywania wyspecjalizowanej funkcji. [0117] Korzystnymi przykładami domeny transdukującej sygnał do stosowania w jedno- lub wielołańcuchowych CAR mogą być cytoplazmatyczne sekwencje receptora Fc lub receptora komórek T i ko- receptorów, które działają wspólnie w celu zainicjowania transdukcji sygnału po zaangażowaniu receptora 40 antygenu, jak również dowolne pochodne lub warianty tych sekwencji i dowolna sekwencja syntetyczna, która ma taką samą zdolność funkcjonalną. Domena transdukująca sygnał zawiera dwie odrębne klasy cytoplazmatycznej sekwencji sygnałowej, te, które inicjują pierwotną aktywację zależną od antygenu, i te,

31 EP 3 105 317 B1

które działają w sposób niezależny od antygenu, aby dostarczyć sygnał drugorzędowy lub kostymulatorowy. Pierwotna cytoplazmatyczna sekwencja sygnałowa może zawierać motywy sygnałowe, które są znane jako immunoreceptorowe motywy aktywacji oparte na tyrozynie ITAM. ITAM są dobrze zdefiniowanymi motywami sygnałowymi znajdującymi się w ogonie śródplazmatycznym różnych receptorów, które służą jako miejsca 5 wiązania dla kinaz tyrozynowych klasy syk/zap70. Przykłady ITAM stosowanych w wynalazku mogą obejmować, jako nieograniczające przykłady, te pochodzące z TCRzeta, FcRgamma, FcRbeta, FcRepsilon, CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b i CD66d. W korzystnym przykładzie wykonania domena transdukcji sygnału wielołańcuchowego CAR może zawierać domenę sygnałową CD3zeta lub domenę śródcytoplazmatyczną łańcuchów beta lub gamma FcεRI. 10 [0118] W szczególnym przykładzie wykonania domena transdukcji sygnału wielołańcuchowego CAR według niniejszego wynalazku zawiera kostymulującą cząsteczkę sygnałową. Cząsteczką kostymulującą jest cząsteczka powierzchni komórki inna niż receptor antygenowy lub ich ligandy, które są wymagane do wydajnej odpowiedzi odpornościowej. [0119] Domeny wiążące ligand mogą być dowolnym receptorem antygenowym uprzednio stosowanym, i do 15 którego się odnoszono, w odniesieniu do jednołańcuchowego CAR, o którym mowa w literaturze, w szczególności scFv z przeciwciał monoklonalnych. Bispecyficzne lub wielospecyficzne CAR, jak opisano w WO 2014/4011988, są włączone przez odniesienie. [0120] Podobnie jak opisano wcześniej w odniesieniu do jednołańcuchowych CAR, niniejszy wynalazek obejmuje komórki T obdarzone wielołańcuchowymi CAR, które celują specyficznie marker powierzchni 20 komórki, taki jak CD38, CS1 lub CD70. Zgodnie z korzystnym przykładem wykonania wynalazku opisane powyżej CAR są wyrażane w komórkach T, podczas gdy inaktywacja endogennych genów kodujących wspomniany(-e) marker(y) powierzchniowy(-e) jest indukowana przez ekspresję rzadko tnącej endonukleazy.

Aktywacja i ekspansja komórek T

[0121] Sposób według wynalazku ogólnie obejmuje kolejny etap aktywacji i/lub ekspansji komórek T. Można 25 tego dokonać przed lub po modyfikacji genetycznej komórek T, stosując sposoby opisane, na przykład, w patentach USA 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; i publikacji zgłoszenia patentowego USA nr 20060121005. Zgodnie z tymi sposobami komórki T według wynalazku można poddać ekspansji przez kontakt z powierzchnią, do której przyłączony jest środek, który stymuluje 30 sygnał związany z kompleksem CD3 TCR i ligand, który stymuluje cząsteczkę kostymulatorową na powierzchni komórek T. [0122] W szczególności, populacje komórek T można stymulować in vitro, tak jak przez kontakt z przeciwciałem anty-CD3, lub jego fragmentem wiążącym antygen, lub przeciwciałem anty-CD2 unieruchomionym na powierzchni, lub przez kontakt z aktywatorem kinazy białkowej C (np. briostatyną) w 35 połączeniu z jonoforem wapnia. Do kostymulacji cząsteczki pomocniczej na powierzchni komórek T stosuje się ligand, który wiąże cząsteczkę pomocniczą. Na przykład, populację komórek T można kontaktować z przeciwciałem anty-CD3 i przeciwciałem anty-CD28, w warunkach odpowiednich do stymulowania proliferacji komórek T. Do stymulowania proliferacji albo komórek T CD4+ albo komórek T CD8+, stosuje się przeciwciało anty-CD3 i przeciwciało anty-CD28. Na przykład, środki dostarczające każdy sygnał mogą 40 znajdować się w roztworze lub być połączone z powierzchnią. Specjaliści mogą łatwo zauważyć, że stosunek cząstek do komórek może zależeć od wielkości cząstek w stosunku do komórki docelowej. W

32 EP 3 105 317 B1

dalszych przykładach wykonania niniejszego wynalazku, komórki, takie jak komórki T, łączy się z perełkami powleczonymi środkiem, perełki i komórki są następnie rozdzielane, a następnie komórki są hodowane. W alternatywnym przykładzie wykonania przed hodowlą perełki powleczone środkiem i komórki nie są rozdzielane, ale są hodowane razem. Białka powierzchni komórki można poddawać ligacji przez 5 uwzględnienie paramagnetycznych perełek, do których przyłączone są anty-CD3 i anty-CD28 (3 x 28 perełek), aby wejść w kontakt z komórkami T. W jednym przykładzie wykonania komórki (na przykład, 4 do 10 komórek T) i perełki (na przykład, perełki paramagnetyczne DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T w stosunku 1: 1) łączy się w buforze, korzystnie PBS (bez dwuwartościowych kationów, takich jak wapń i magnez). Specjaliści w tej dziedzinie łatwo zauważą, że można zastosować dowolne stężenie komórek. 10 Mieszaninę można hodować przez kilka godzin (około 3 godzin) do około 14 dni lub dowolną godzinową wartość całkowitą pomiędzy. W innym przykładzie wykonania mieszaninę można hodować przez 21 dni. Warunki odpowiednie dla hodowli komórek T obejmują odpowiednie pożywki (np. minimalna pożywka podstawowa lub pożywka RPMI 1640 lub X-vivo 5, (Lonza)), które mogą zawierać czynniki niezbędne do proliferacji i żywotności, w tym surowicę (np. płodową surowicę bydlęcą lub ludzką), interleukinę-2 (IL-2), 15 insulinę, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L-15, TGFp i TNF- lub dowolne inne dodatki do wzrostu komórek znane specjaliście w dziedzinie. Inne dodatki do wzrostu komórek obejmują, ale nie wyłącznie, środek powierzchniowo czynny, plazaminian i środki redukujące, takie jak N-acetylocysteina i 2- merkaptoetanol. Pożywki mogą obejmować RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 i X- Vivo 20, Optimizer, z dodanymi aminokwasami, pirogronianem sodu i witaminami, albo wolne od surowicy 20 albo uzupełnione odpowiednią ilością surowicy (lub osocza) lub określonym zestawem hormonów i/lub ilością cytokiny(cytokin) wystarczającą do wzrostu i ekspansji komórek T. Antybiotyki, np. penicylina i streptomycyna, są zawarte tylko w hodowlach eksperymentalnych, a nie w hodowlach komórek, które mają być podane osobnikowi przez wlew. Komórki docelowe są utrzymywane w warunkach niezbędnych do wspomagania wzrostu, na przykład odpowiedniej temperaturze (np. 37°C) i atmosferze (np. powietrza plus 25 5% CO2). Komórki T, które zostały wystawione na różne czasy stymulacji, mogą wykazywać różne cechy. [0123] W innym szczególnym przykładzie wykonania wspomniane komórki można ekspandować przez wspólną hodowlę z tkanką lub komórkami. Takie komórki można również ekspandować in vivo, na przykład we krwi osobnika po podaniu tej komórki osobnikowi.

Zastosowania terapeutyczne

30 [0124] Komórki T otrzymywane różnymi sposobami opisanymi powyżej są przeznaczone do stosowania jako lek do leczenia, między innymi, raka, zakażeń lub chorób immunologicznych u pacjenta, który tego potrzebuje. [0125] Wspomniane leczenie może być łagodzące, lecznicze lub profilaktyczne. Może to być część immunoterapii autologicznej lub część immunoterapii allogenicznej. Przez autologiczne rozumie się, że 35 komórki, linia komórkowa lub populacja komórek stosowanych do leczenia pacjentów pochodzą od wspomnianego pacjenta lub od dawcy zgodnego pod kątem ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA). Przez allogeniczny rozumie się, że komórki lub populacja komórek stosowanych do leczenia pacjentów nie pochodzą od tego pacjenta, ale od dawcy. [0126] Komórki T skonstruowane zgodnie z jednym z poprzednich sposobów można spulować, zamrozić i 40 podawać jednemu lub kilku pacjentom. Gdy są one niealloreaktywne, są dostępne jako produkt leczniczy "z półki", co oznacza, że mogą być powszechnie podawane we wlewie potrzebującym tego pacjentom.

33 EP 3 105 317 B1

[0127] Wymienione terapie są przede wszystkim przeznaczone dla pacjentów z rozpoznaniem raka, zakażenia wirusowego, zaburzeń autoimmunologicznych lub choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD). Rakami są korzystnie białaczki i chłoniaki, które mają guzy płynne, ale mogą również dotyczyć guzów litych. Rodzaje raków, które mają być leczone za pomocą CAR według wynalazku obejmują, ale nie 5 wyłącznie, carcinoma, blastoma i mięsaka, pewne białaczkowe lub limfoidalne nowotwory złośliwe, łagodne i złośliwe guzy i nowotwory złośliwe, np. mięsaki, carcinoma i czerniaki. Uwzględniono także nowotwory/raki dorosłych i nowotwory/raki dzieci. [0128] Niniejszy wynalazek dostarcza w tabelach od 4 do 14 przykłady markerów antygenowych, które mogą być celowane za pomocą skonstruowanych komórek według wynalazku do leczenia różnych rodzajów raka. 10 [0129] Korzystnymi markerami antygenowymi stosowanymi do immunoterapii według niniejszego wynalazku są w szczególności CD38, CD319 (CS1) i CD70. [0130] Niniejsze komórki T, gdy są uzbrojone w specyficzne CAR skierowane przeciwko własnym komórkom odpornościowym pacjenta, zwłaszcza komórkom T, umożliwiają hamowanie lub regulację tych komórek, co jest kluczowym etapem w leczeniu choroby autoimmunologicznej, takiej jak reumatoidalne zapalenie 15 wielostawowe, układowy toczeń rumieniowaty, zespół Sjogrena, twardzina skóry, fibromialgia, zapalenie mięśni, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, cukrzyca insulinozależna typu I, zapalenie tarczycy Hashimoto, choroba Addisona, choroba Crohna, celiakia, stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i stwardnienie rozsiane (MS). Odpowiednio, niniejszy wynalazek obejmuje komórki T według wynalazku do zastosowania w sposobie leczenia choroby immunologicznej przez kierowanie wspomnianych 20 skonstruowanych komórek T przeciwko własnym komórkom T pacjenta. [0131] Powyższe leczenie może mieć miejsce w kombinacji z jedną lub więcej terapiami wybranymi z grupy terapii przeciwciałami, chemioterapii, terapii cytokinami, terapii komórkami dendrytycznymi, terapii genowej, terapii hormonalnej, terapii światłem laserowym i radioterapii. [0132] Skonstruowane komórki T, jak opisano wcześniej, gdy są czynione odpornymi na leki 25 chemioterapeutyczne i leki immunosupresyjne, które są stosowane jako standardy opieki, zwłaszcza metotreksat i kombinacja fludarabiny i cyklofosfamidu, są szczególnie odpowiednie do leczenia różnych postaci raka. Rzeczywiście, niniejszy wynalazek korzystnie polega na komórkach lub populacji komórek. W tym aspekcie oczekuje się, że chemioterapia i/lub leczenie immunosupresyjne powinno pomóc w selekcji i ekspansji skonstruowanych komórek T in vivo. 30 [0133] W niektórych przykładach wykonania niniejszego wynalazku komórki są przeznaczone do podawania pacjentowi w połączeniu z (np. przed, równocześnie lub po) dowolną liczbą odpowiednich sposobów leczenia, w tym, ale nie wyłącznie, ze środkami takimi jak terapia antywirusowa, leczenie cydofowirem i interleukiną-2, cytarabiną (znaną również jako ARA-C) lub natalizumabem dla pacjentów ze stwardnieniem rozsianym lub leczenie efaliztymabem dla pacjentów z łuszczycą lub inne sposoby leczenia pacjentów z 35 PML. W dalszych przykładach wykonania komórki T według wynalazku mogą być stosowane w kombinacji z chemioterapią, napromienianiem, środkami immunosupresyjnymi, takimi jak cyklosporyna, azatiopryna, metotreksat, mykofenolan i FK506, przeciwciałami lub innymi czynnikami immunoablacyjnymi, takimi jak CAMPATH, przeciwciałami anty-CD3 lub innymi terapiami przeciwciałem, cytoksyną, fludarybiną, cyklosporyną, FK506, rapamycyną, kwasem mykofenolowym, steroidami, FR901228, cytokinami i 40 napromienianiem. Te leki hamują albo zależną od wapnia fosfatazę kalcyneuryny (cyklosporyna i FK506) albo hamują kinazę p70S6, która jest ważna dla sygnalizacji indukowanej czynnikiem wzrostu (rapamycyna) (Liu i wsp., Cell 66: 807-815, 11, Henderson i wsp. Immun 73: 316-321, 1991; Bierer i wsp., Citrr. Opin. mm,

34 EP 3 105 317 B1

n. 5: 763-773, 93). W kolejnym przykładzie wykonania kompozycje komórkowe według niniejszego wynalazku są przeznaczone do podawania pacjentowi w połączeniu z (np. przed, równocześnie lub po) przeszczepieniem szpiku kostnego, terapią ablacyjną komórkami T z zastosowaniem albo środków chemioterapeutycznych, takich jak fludarabina, radioterapię wiązką zewnętrzną (XRT), cyklofosfamid lub 5 przeciwciała, takie jak OKT3 lub CAMPATH. W innym przykładzie wykonania kompozycje komórkowe według niniejszego wynalazku są przeznaczone do podawania po terapii ablacyjnej komórkami B, takiej jak środki, które reagują z CD20, np. Rituxan. Na przykład, pacjenci mogą być poddani standardowemu leczeniu za pomocą chemioterapii o wysokiej dawce, po której następuje przeszczep komórek macierzystych krwi obwodowej. W niektórych przykładach wykonania po przeszczepie, pacjenci mogą otrzymać wlew 10 ekspandowanych komórek T według niniejszego wynalazku. W dodatkowym przykładzie ekspandowane komórki są podawane przed lub po operacji. Wspomniane zmodyfikowane komórki uzyskane za pomocą dowolnych z opisanych tu sposobów mogą być przeznaczone do leczenia pacjentów, którzy tego potrzebują, przeciwko odrzuceniu gospodarz przeciwko przeszczepowi (HvG) i chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD); w związku z tym w zakresie niniejszego wynalazku znajdują się zmodyfikowane 15 komórki możliwe do otrzymania sposobem według wynalazku do zastosowania w sposobie leczenia pacjentów, którzy tego potrzebują, przeciwko odrzuceniu gospodarz przeciwko przeszczepowi (HvG) i choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) obejmującego leczenie wspomnianego pacjenta przez podawanie temu pacjentowi skutecznej ilości zmodyfikowanych komórek zawierających inaktywowane geny TCR alfa i/lub TCR beta. 20 [0134] Wspomniane komórki T według wynalazku mogą ulegać silnej ekspansji komórek T in vivo po podaniu pacjentowi i mogą utrzymywać się w płynach ustrojowych przez dłuższy czas, korzystnie przez tydzień, bardziej korzystnie przez 2 tygodnie, jeszcze bardziej korzystnie przez co najmniej jeden miesiąc. Chociaż oczekuje się, że komórki T według wynalazku utrzymają się podczas tych okresów, ich żywotność w ciele pacjenta nie powinna przekraczać roku, korzystnie 6 miesięcy, bardziej korzystnie 2 miesięcy, a jeszcze 25 bardziej korzystnie 1 miesiąca. [0135] Podawanie komórek lub populacji komórek zgodnie z niniejszym wynalazkiem można prowadzić w dowolny dogodny sposób, w tym przez inhalację aerozolu, wstrzyknięcie, spożycie, transfuzję, implantację lub przeszczepienie. Opisane tu kompozycje można podawać pacjentowi podskórnie, śródskórnie, do wnętrza guza, do węzłów chłonnych, śródszpikowo, domięśniowo, dożylnie lub dolimfatycznie, lub 30 dootrzewnowo. W jednym przykładzie wykonania kompozycje komórkowe według niniejszego wynalazku korzystnie podaje się przez iniekcję dożylną. [0136] Podawanie komórek lub populacji komórek może polegać na podaniu 104-109 komórek na kg masy ciała, korzystnie od 105 do 106 komórek/kg masy ciała, w tym wszystkie całkowite wartości komórek w tych zakresach. Komórki lub populację komórek można podawać w jednej lub większej liczbie dawek. W innym 35 przykładzie wykonania wspomniana skuteczna ilość komórek jest podawana jako pojedyncza dawka. W innym przykładzie wykonania, wspomniana skuteczna ilość komórek jest podawana jako więcej niż jedna dawka w czasie. Czas podawania jest zgodny z oceną lekarza prowadzącego i zależy od stanu klinicznego pacjenta. Komórki lub populację komórek można uzyskać z dowolnego źródła, takiego jak bank krwi lub dawca. Podczas gdy indywidualne potrzeby są różne, określenie optymalnych zakresów skutecznych ilości 40 danego rodzaju komórek dla konkretnej choroby lub warunków jest w zakresie umiejętności w tej dziedzinie. Skuteczna ilość oznacza ilość, która zapewnia korzyść terapeutyczną lub profilaktyczną. Podawana dawka

35 EP 3 105 317 B1 będzie zależeć od wieku, stanu zdrowia i masy ciała biorcy, rodzaju równoczesnego leczenia, jeśli takie będzie, częstotliwości leczenia i natury pożądanego efektu. [0137] Wspomnianą skuteczną ilość komórek lub kompozycji zawierającej te komórki można podawać pozajelitowo. Wspomniane podawanie może być podawaniem dożylnym. Wymienione podawanie można 5 wykonać bezpośrednio przez wstrzyknięcie w guzie.

Identyfikacja markera antygenowego powierzchniowego ulegającego ekspresji na powierzchni komórek T, przy nadmiernej ekspresji w guzach litych dotyczących różnych rodzajów raka (Tabele 5 do 13)

[0138] Zastosowaliśmy dane z mikromacierzy BioGPS z panelu mikromacierzy nowotworowych 10 prawidłowych tkanek (Human U133A/GNF1H Gene Atlas), które można również pobrać z danych uniprot BioGPS (Human Primary Tumors, U95), który zawiera lokalizację subkomórkową. [0139] Nakreśliliśmy rozkład wartości pochodzących z prawidłowych tkanek i wyznaczyliśmy wartość progową 5 dla względnej ekspresji. [0140] Przebadaliśmy wszystkie geny testowane za pomocą mikromacierzy (44000 sond reprezentujących 15 około 13000 genów) i sprawdziliśmy ich lokalizację w błonie (odrzucono białko nieokreślone jako będące białkiem błonowym). Ekspresję w komórkach T CD8+ sprawdzono z bazy danych BioGPS. Geny zostały wymienione zgodnie z rodzajem raka, gdzie odpowiadająca mu ekspresja była najwyższa (Tabele 5 do 13).

Identyfikacja markera antygenowego powierzchniowego ulegającego ekspresji na powierzchni komórek T, przy nadmiernej ekspresji w różnych płynnych guzach krwi (Tabela 14)

20 [0141] W przypadku tego badania nie było dostępnych danych dotyczących RNA-sek i dlatego wykorzystaliśmy dane z mikromacierzy, które uzyskano z dużego badania z konsorcjum MILE (Microarray Innovations in Leukemia), w którym wzięło udział 11 laboratoriów (http://www.ngrl.org.uk /wessex/downloads/tm08/TM08-S4-1_KenMills.pdf - Haferlach i wsp. 2010, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20406941). Te surowe dane obejmują wyniki dla ALL (ostra białaczka 25 limfoblastyczna), AML (ostra białaczka szpikowa), CLL (przewlekła białaczka limfoblastyczna) i CML (przewlekła białaczka szpikowa) i MDS (zespół mielodysplastyczny). Jak zwykle stosowaliśmy również dane uniprot do lokalizacji subkomórkowej. [0142] Najpierw nakreśliliśmy ogólny rozkład wartości ze wszystkich genów na wszystkich badanych tkankach. Następnie, aby poznać poziom niezbędny do ekspresji, wybraliśmy listę genów, które ulegają 30 ekspresji w niektórych płynnych guzach i dla których dostępne są przeciwciała terapeutyczne (CD52, CD20, CD33, CD19, CD25, CD44, CD47, CD96, CD116, CD117, CD135, TIM-3). Dla każdego genu sprawdziliśmy wartość uzyskaną w guzie, w którym jest wyrażana. Następnie obliczyliśmy średnią dla każdego guza i pary genów, dla których wydaje się, że gen daje białko błony komórkowej (lokalizacja błony komórkowej + opis co najmniej jednej domeny transmembranowej w białku). Odrzuciliśmy geny, dla których ekspresja we 35 wszystkich tkankach była poniżej tego progu 0,15. Wymieniliśmy i uszeregowaliśmy w Tabeli 14 te geny, których względna ekspresja w komórkach T była powyżej 0,2. Zatem, w Tabeli 4 dostarczono przypuszczalnych kandydatów na marker antygenowy do celowania komórek płynnego guza według wynalazku, w szczególności do leczenia ALL, AML, CLL, CML i MDS.

Przykład etapów konstruowania komórek T według wynalazku do immunoterapii

36 EP 3 105 317 B1

[0143] Dla lepszego zrozumienia wynalazku, poniżej przedstawiono przykład etapów do wykonania w celu wytworzenia komórek T skierowanych przeciwko CD38-dodatnim komórkom białaczki:

1. Dostarczenie komórek T z hodowli komórkowej lub z próbki krwi od jednego indywidualnego pacjenta lub z banku krwi i aktywowanie wspomnianych komórek T z zastosowaniem perełek 5 aktywujących anty-CD3/C28 (Dynabeads®). Perełki dostarczają zarówno sygnałów pierwszorzędowych, jak i kostymulujących, które są wymagane do aktywacji i ekspansji komórek T.

2. Transdukowanie wspomnianych komórek za pomocą wektora retrowirusowego zawierającego transgen kodujący chimeryczny receptor antygenowy składający się z fuzji domeny aktywacyjnej CD3eta, domeny kostymulatorowej 4-1BB, domeny transbłonowej i regionu zawiasowego z CD28 10 sfuzowanego z sekwencją kodującą łańcuch zmienny przeciwciała anty-CD38. W celu poprawy bezpieczeństwa transformowanej komórki T, do wektora lentiwirusowego można ponadto wprowadzić gen samobójczy wrażliwy na rytuksymab, jak opisano w WO 2013/153391, oddzielony sekwencjami rozszczepiającymi T2A.

3. (Ewentualne) konstruowanie niealloreaktywnych i/lub opornych komórek T:

15 a) Możliwe jest zinaktywowanie TCR alfa we wspomnianych komórkach w celu wyeliminowania TCR z powierzchni komórki i zapobiegania rozpoznawaniu tkanki gospodarza jako obcej przez allogeniczny TCR, a tym samym w celu uniknięcia GvHD zgodnie z protokołami przedstawionymi w WO 2013/176915.

b) Możliwe jest również zinaktywowanie jednego genu kodującego cel dla środka 20 immunosupresyjnego lub leku do chemioterapii, aby uczynić wspomniane komórki opornymi na leczenie immunosupresyjne lub chemioterapeutyczne, aby zapobiec odrzuceniu przeszczepu bez wpływu na przeszczepione komórki T. W tym przykładzie, celem środków immunosupresyjnych jest CD52, a środkiem immunosupresyjnym jest humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-CD52 (np. Alemtuzumab), jak opisano w WO 2013/176915.

25 4. Inaktywację genów przeprowadza się przez elektroporację komórek T za pomocą mRNA kodującego specyficzną endonukleazę TAL (TALEN™ - Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, Francja). Inaktywowane komórki T są sortowane z zastosowaniem perełek magnetycznych. Na przykład, komórki T wciąż wyrażające docelowy gen (na przykład, CD38, CD70 i CD70) można usunąć przez utrwalenie na stałej powierzchni, a inaktywowane komórki nie są narażone na stres związany z 30 przechodzeniem przez kolumnę. Ten delikatny sposób zwiększa stężenie odpowiednio skonstruowanych komórek T.

5. Ekspansja in vitro skonstruowanych komórek T przed podaniem pacjentowi lub in vivo po podaniu pacjentowi poprzez stymulację kompleksu CD3. Przed etapem podawania pacjenci mogą być poddani leczeniu immunosupresyjnemu, takiemu jak CAMPATH1-H, humanizowane przeciwciało 35 monoklonalne anty-CD52.

6. Ewentualnie eksponowanie wspomnianych komórek za pomocą przeciwciał bispecyficznych ex vivo przed podaniem pacjentowi lub in vivo po podaniu pacjentowi w celu doprowadzenia skonstruowanych komórek do bliskości docelowego antygenu.

37 EP 3 105 317 B1 Analiza funkcjonalna skonstruowanych komórek T poddanych elektroporacji za pomocą monocistronowego mRNA kodującego jednołańcuchowy chimeryczny receptor antygenowy anty- CD38 (CAR CD38)

[0144] Aby zweryfikować, że konstruowanie genomu nie wpłynęło na zdolność skonstruowanych komórek T 5 do wykazywania aktywności przeciwnowotworowej, zwłaszcza gdy jest ona dostarczona z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR CD38). Skonstruowane komórki T inkubowano przez 4 godziny z komórkami Daudi wyrażającymi CD38 na ich powierzchni. Regulacja w górę na powierzchni komórek CD107a, markera cytotoksycznego uwalniania granulek przez limfocyty T (zwanego degranulacją), zmierzono za pomocą analizy cytometrii przepływowej (Betts, Brenchley i wsp. 2003). 10 [0145] 24 godziny po elektroporacji, komórki barwiono utrwalanym barwnikiem eFluor-780 i skoniugowanym z PE kozim anty-mysim specyficznym fragmentem F(ab')2 IgG dla oceny ekspresji CAR na powierzchni komórki na żywych komórkach. Ogromna większość żywych komórek T poddanych genetycznej dysrupji pod kątem CD38, wyraża CAR na swojej powierzchni. Komórki T hodowano razem z komórkami Daudi (CD38+) przez 6 godzin i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej w celu wykrycia ekspresji markera 15 degranulacji CD107a na ich powierzchni (Betts, Brenchley i wsp. 2003). [0146] Wyniki pokazują, że komórki T z dysrupcją CD38 utrzymują taką samą zdolność do degranulacji w odpowiedzi na komórki PMA/jonomycynę (kontrola dodatnia) lub komórki Daudi CD38+. Regulacja w górę CD107 zależy od obecności CD38 +. Dane te sugerują, że inżynieria genomu obecnych komórek T nie miała negatywnego wpływu na zdolność komórek T do wzmożenia kontrolowanej odpowiedzi 20 przeciwnowotworowej.

Tabela 4: Klaster różnicowania (CD) markerów antygenowych różnych raków, które ulegają ekspresji na powierzchni komórek T.

Antygen Inne nazwy Struktura Główny rozkład Funkcja

CD1a T6 IgSF, MHC- kortykalne tymocyty, prezentacja antygenu, z beta2m podobna komórki Langerhansa, DC

CD1b T6 IgSF, MHC- kortykalne tymocyty, prezentacja antygenu, z beta2m podobna komórki Langerhansa, DC

CD1c T6 IgSF, MHC- kortykalne tymocyty, prezentacja antygenu, z beta2m podobna komórki Langerhansa, DC, podzbiór B

CD1d IgSF, MHC- Nabłonek jelitowy, prezentacja antygenu, z beta2m podobna podzbiór B, niski poziom na monocytach, DC

CD3 T3 IgSF T, podzbiór tymocytów z TCR, powierzchniowa ekspresja gamma, TCR/transdukcja sygnału CD3

38 EP 3 105 317 B1

Antygen Inne nazwy Struktura Główny rozkład Funkcja delta

CD3 T3 IgSF T, podzbiór tymocytów z TCR, powierzchniowa ekspresja epsilon TCR/transdukcja sygnału

CD4 T4 IgSF podzbiór tymocytów, Koreceptor MHC klasy II, receptor podzbiór T, monocyty, HIV, różnicowanie/aktywacja makrofagi komórek T

CD5 T1, Tp67 Scavenger R SF tymocyty, T, podzbiór Recptor CD72, sygnalizacja TCR B , B-CLL lub BCR, interakcja T-B

CD7 IgSF hematopoetyczne Kostymulacja T progenitory, tymocyty, T, NK

CD8a T8, Leu-2 IgSF Podzbiór tymocytów, Koreceptor MHC klasy I, receptor podzbiór T, NK dla niektórych zmutowanych HIV-1, różnicowanie/aktywacja komórek T

CD8b IgSF Podzbiór tymocytów, podzbiór T

CD9 p24, MRP-1 TM4SF pre-B, eozynofile, adhezja i migracja komórkowa bazofile, płytki krwi, Tact

CD10 CALLA, NEP, typ II TM Prekursory B, metaloproteinaza wiążąca cynk, gp100 prekursory T, neutrofile rozwój komórek B

CD11a LFA-1, integryna Rodzina Integryn limfocyty, granulocyty, Receptor CD11a/CD18 dla ICAM-1, alfaL monocyty, makrofagi -2, -3, adhezja międzykomórkowa, kostymulacja T

CD11b Mac-1, integryna Rodzina Integryn komórki szpikowe, NK Wiąże CD54, ECM, iC3b alfaM

CD11c p150, 95, CR4, Rodzina Integryn DC, komórki szpikowe, wiąże CD54, fibrynogen i iC3b integryna alfaX NK, B, podzbiór T

CD13 Aminopeptydaza TM typu II komórki szpikowe metaloproteinaza wiążąca cynk, N, APN przetwarzanie antygenu, receptor dla szczepów koronawirusowych

CD14 LPS-R połączona z GPI monocyty, makrofagi, receptor do LPS/LBP, komórki Langerhansa, rozpoznawanie LPS niski poziom na granulocytach

39 EP 3 105 317 B1

Antygen Inne nazwy Struktura Główny rozkład Funkcja

CD15 Lewis-x, Lex CHO neutrofile, eozynofile, adhezja monocyty

CD16a FcgammaRIIIA IgSF neutrofile, makrofagi, składnik receptora Fc o niskim NK powinowactwie, fagocytoza i ADCC

CD16b FcgammaRIIIB IgSF neutrofile składnik receptora Fc o niskim powinowactwie, fagocytoza i ADCC

CD20 B1, Bp35 TM4SF B, podzbiór T Aktywacja komórek B

CD21 C3DR, CR2, CCRSF B, FDC, podzbiór T dopełniacz C3d i receptor EBV, EBV-R kompleks z CD19 i CD81, koreceptor BCR

CD22 BL-CAM, Siglec- IgSF, B adhezja, B-mono, interakcje B-T 2 sialoadhezyny

CD23 FcepsilonRII Lektyna typu C B, aktywowane Receptor CD19-CD21-CD81, makrofagi, eozynofile, receptor IgE o niskim FDC, płytki krwi powinowactwie, transdukcja sygnału

CD24 BA-1 Połączona z GPI tymocyty, erytrocyty, wiąże selektynę P obwodowe limfocyty, szpikowe

CD25 Tac, p55 TM typu I Tact, Bact, progenitory IL-2Ralfa, z IL-2Rbeta i gamma limfocytów tworzy kompleks o wysokim powinowactwie

CD31 PECAM-1 IgSF monocyty, płytki krwi, receptor CD38, adhezja granulocyty, śródbłonek, podzbiór limfocytów

CD33 p67, Siglec-3 IgSF, Progenitory szpikowe, adhezja sialoadhezyny monocyty, granulocyty, DC, komórki tuczne, Tact

CD37 TM4SF B, Tlow, niski poziom Transdukcja sygnału na granulocytach

CD38 T10 zmienne poziomy na cyklaza ekto-ADP-rybozylowa, większości komórek aktywacja komórek krwiotwórczych, wysoka ekspresja na komórkach

40 EP 3 105 317 B1

Antygen Inne nazwy Struktura Główny rozkład Funkcja

plazmatycznych, B i Tact

CD40 TNFRSF B, monocyty, Receptor CD154, makrofagi, FDC, różnicowanie/kostymulacja B, śródbłonek, podzbiór T przełączanie izotypów, ratowanie komórki B przed apoptozą

CD43 Leukosialina, Sialomucyna, TM leukocyty, z wyjątkiem hamowanie interakcji komórek T, sialoforyna typ I spoczynkowych B, CD54R, adhezja niski poziom na płytkach krwi

CD44 H-CAM, Pgp-1 rodzina komórki wiąże kwas hialuronowy, adhezja hialadheryny hematopoetyczne i niehematopoetyczne, z wyjątkiem płytek krwi, hepatocyty, jądra

CD45 LCA, T200, B220 komórki fosfataza tyrozynowa, wzmocnione hematopoetyczne, sygnały TCR i BCR wiele izoform z alternatywnego splicingu

CD45RA B, podzbiór T egzon A izoforma CD45 (naiwnych), monocyty

CD45RB Podzbiór T, B, egzon B izoforma CD45 monocyty, makrofagi, granulocyty

CD45RO Tact, T pamięci, izoforma CD45 bez egzonów A, B, podzbiór B, monocyty, C makrofagi, granulocyty

CD46 MCP CCRSF Komórki jądrzaste Błonowe białko kofaktorowe, wiąże C3b i C4b, umożliwiając degradację przez czynnik I, receptor wirusa odry

CD47 IAP IgSF komórki Adhezja leukocytów, migracja, hematopoetyczne, aktywacja nabłonek, śródbłonek, fibroblasty, inne tkanki

CD48 Blast-1 IgSF szeroki, wszystkie Adhezja komórkowa

41 EP 3 105 317 B1

Antygen Inne nazwy Struktura Główny rozkład Funkcja

leukocyty

CD52 CAMPATH-1 tymocyty, T, B (nie komórki plazmatyczne), monocyty, makrofagi

CD53 TM4SF leukocyty, DC, transdukcja sygnału osteoblasty, osteoklasty

CD55 DAF Połączona z GPI hematopoetyczne, wiąże C3b, regulacja dopełniacza śródbłonek

CD56 NCAM IgSF NK, podzbiór T, adhezja neurony, niektóre duże ziarniste białaczki limfocytowe, białaczki szpikowe

CD57 HNK-1, Leu-7 Podzbiór NK, podzbiór T

CD58 LFA-3 IgSF komórki receptor CD2, adhezja hematopoetyczne, niehematopoetyczne

CD59 Protektyna, GPI- komórki wiąże dopełniacz C8 i C9, blokuje inhibitor MAC hematopoetyczne, montaż kompleksu atakującego niehematopoetyczne błonę

CD60a GD3 CHO Podzbiór T, płytki kwi, kostymulacja nabłonek grasicy, astrocyty

CD63 LIMP, LAMP-3 TM4SF aktywowane płytki lizosomalne białko błonowe, po krwi, monocyty, aktywacji przesuwa się na makrofagi powierzchnię komórki

CD68 Makrosialina, Sialomucyna wewnątrzkomórkowo w monocytach, makrofagach, gp110 neutrofilach, bazofilach, dużych limfocytach, komórkach tucznych, DC, progenitorach szpikowych, wątrobie

CD69 AIM Lektyna typu C Tact, B, NK i transdukcja sygnału granulocyty, tymocyty, płytki krwi, komórki Langerhansa

CD70 Ki-24 TNFSF Bact i Tact ligand CD27, kostymulacja

42 EP 3 105 317 B1

Antygen Inne nazwy Struktura Główny rozkład Funkcja

komórek T i B

CD74 Li, łańcuch B, makrofagi, monocyty, komórki Wędrowanie i funkcja MHC klasy II niezmienny Langerhansa, DC, Tact

CD79a Iga IgSF B składnik BCR, powierzchniowa ekspresja BCR i transdukcja sygnału

CD79b Igb IgSF B składnik BCR, powierzchniowa ekspresja BCR i transdukcja sygnału

CD81 TAPA-1 TM4SF T, B, NK, tymocyty, kompleks z CD19 i CD21, DC, śródbłonek, sygnalizacja, kostymulacja T fibroblasty, neuroblastomy, czerniaki

CD82 R2 TM4SF leukocyty Transdukcja sygnału

CD83 HB15 IgSF Bact i Tact, DC, komórki Langerhansa

CDw84 monocyty, płytki krwi, B, podzbiór T, podzbiór makrofagów

CD86 B70, B7-2 IgSF monocyty, DC, Bact i wiąże CD28, CD152, kostymulacja Tact T

CD87 UPA-R Połączona z GPI granulocyty, monocyty, receptor aktywatora plazminogenu NK, Tact, śródbłonek, typu urokinazy, inwazja komórek fibroblasty zapalnych, przerzuty

CD90 Thy-1 IgSF, połączona z Podzbiór hematopoetyczne komórki GPI hematopoetycznych macierzyste i różnicowanie CD34 +, neurony neuronów

CD94 KP43 Lektyna typu C NK, podzbiór T kompleks z NKG2, hamuje funkcję NK

CD95 Apo-1, Fas TNFRSF limfocyty (wysoki receptor FasL (CD178), apoptoza poziom po aktywacji), monocyty, neutrofile

CD96 TACTILE IgSF NK, Tact adhezja aktywowanych T i NK

CD97 TM7SF Bact i Tact, monocyty, granulocyty

43 EP 3 105 317 B1

Antygen Inne nazwy Struktura Główny rozkład Funkcja

CD98 4F2 T, B, NK, granulocyty, Aktywacja komórkowa wszystkie ludzkie linie komórkowe

CD99 MIC2, E2 leukocyty Aktywacja komórek T, adhezja

CD100 komórki Adhezja komórki, aktywacja hematopoetyczne, z komórkowa wyjątkiem niedojrzałych komórek szpiku kostnego, RBC i płytek krwi

CD103 HML-1, alfa6, Rodzina Integryn Limfocyty z integryną beta7, wiąże E- integryna alfaE śródnabłonkowe, kadherynę, podzbiór limfocytów, naprowadzanie/zatrzymanie aktywowane limfocyty limfocytów

CD107a LAMP-1 aktywowane płytki lizosomalne białko błonowe krwi, T, śródbłonek, guzy przerzutowe

CD107b LAMP-2 aktywowane płytki lizosomalne białko błonowe krwi, T, śródbłonek, guzy przerzutowe

CD109 Tact i płytki krwi, podzbiór CD34+, śródbłonek

CD123 IL-3R CRSF podzbiór limfocytów, IL-3Ralfa, z CDw131 bazofile, progenitory hematopoetyczne, makrofagi, DC, megakariocyty

CD146 MUC18, S-endo IgSF śródbłonek, czerniaki, adhezja FDC, Tact

CD154 CD40L, gp39, TNFSF Tact ligand CD40, kostymulacja B i DC TRAP

CD158a p58.1 IgSF, rodzina KIR Podzbiór NK, podzbiór hamowanie aktywności T cytolitycznej komórek NK, receptor NK specyficzny wobec MHC klasy I

CD158b p58.2 IgSF, rodzina KIR Podzbiór NK, podzbiór hamowanie aktywności T cytolitycznej komórek NK, receptor

44 EP 3 105 317 B1

Antygen Inne nazwy Struktura Główny rozkład Funkcja

NK specyficzny wobec MHC klasy I

CD163 130kD receptor zmiatacz monocyty, makrofagi SF

CD164 MGC-24 nabłonek, interakcja hematopoetyczna komórka progenitorowa- monocyty, niski komórka zrębu poziom na limfocytach, komórki zrębowe szpiku kostnego, progenitory erytroidalne CD34+

CD168 RHAMM monocyty, podzbiór T, adhezja, migracja nowotworu, podzbiór tymocytów, przerzuty wewnątrzkomórkowo w komórkach raka sutka

CD171 L1 IgSF CNS, PNS, komórki morfogeneza nerek, architektura glejowe, monocyty, węzłów chłonnych, kostymulacja T, podzbiór T, B, DC, neurohistogeneza, interakcje kilka ludzkich komórek homotypowe, wiąże CD9, CD24, nowotworowych CD56, CD142, CD166, integryny

CD177 NB1 Podzbiór neutrofilów

CD178 FasL, CD95L TNFSF Tact, jądra Ligand CD95, apoptoza, przywilej immunologiczny, postać rozpuszczalna w surowicy

CD180 RP-105 LRRF, rodzina Podzbiór B, monocyty, Aktywacja komórek B, sygnalizacja TLR DC LPS, z MD-1

CD182 CXCR2, IL-8RB Rodzina GPCR1 neutrofile, bazofile, wiązanie IL-8 indukuje chemotaksję NK, podzbiór T, neutrofili monocyty

CD185 CXCR5, BLR1 Rodzina GPCR1 dojrzałe B i komórki z chemokiną BLC, możliwa funkcja chłoniaka Burkitta regulacyjna w genezie chłoniaka Burkitta i/lub różnicowaniu B, aktywacji dojrzałych B

CD191 CCR1, MIP- Rodzina GPCR1 T, monocyty, podzbiór wiąże chemokiny typu C-C i 1alfaR, komórek transdukuje sygnał, zwiększając

45 EP 3 105 317 B1

Antygen Inne nazwy Struktura Główny rozkład Funkcja

RANTES-R macierzystych wewnątrzkomórkowe poziomy jonów wapnia

CD193 CCR3, CKR3 Rodzina GPCR1 eozynofile, niższa wiąże eotaksynę, eotaksynę-3, ekspresja w MCP-3, MCP-4, RANTES i MIP- neutrofilach i 1delta, alternatywny koreceptor z monocytach, podzbiór CD4 w zakażeniu HIV-1 T

CD196 CCR6, receptor Rodzina GPCR1 Podzbiór T, B, wiąże MIP-3alfa/LARC LARC, DRY6 podzbiór DC

CD197 CCR7 Podzbiór T, podzbiór 6Ckina i receptor MIP-2beta DC

CD200 OX-2 tymocyty, śródbłonek, hamowanie odpowiedzi B, Tact odpornościowej

CD209 DC-SIGN Podzbiór DC Receptor ICAM-3, białko wiążące HIV-1

CD227 MUC1, EMA Rodzina mucyn, nabłonek, podzbiór adhezja, sygnalizacja, wiąże TM typu I komórek CD169, CD54 i selektyny macierzystych, FDC, monocyty, podzbiór B, niektóre szpiczaki

CD231 TALLA-1, A15 TM4SF białaczki z T, marker ostrej białaczki neuroblastoma, limfoblastycznej z komórek T neurony mózgu

CD246 ALK, Ki-1 anaplastyczne rozwój mózgu, związany z białaczki z komórek T, chłoniakami ALK jelito cienkie, jądra, mózg, nie na prawidłowych limfocytach

CD254 TRANCE, TNFSF węzeł chłonny i BM wiąże OPG i RANK, różnicowanie RANKL, OPGL Tact zrębu osteoklastów, wzmacnia DC w celu stymulowania proliferacji naiwnych komórek T

CD263 TRAIL-R3, limfocyty krwi receptor dla TRAIL, ale bez DcR1, LIT obwodowej domeny śmierci

CD272 BTLA IgSF Tact, B, pozostaje na Receptor HVEM, odpowiedź Th1 hamująca

46 EP 3 105 317 B1

Antygen Inne nazwy Struktura Główny rozkład Funkcja

CD273 B7DC, PD-L2, IgSF Podzbiór DC, Receptor PD-1, kostymulacja lub PDCD1 L2 monocyty, makrofagi supresja proliferacji T

CD276 B7-H3 Rodzina B7, ASV Hodowane in vitro DC kostymulacja, aktywacja T i monocyty, Tact, tkanka sutka

CD277 BT3.1, Rodzina B7/BT, T, B, NK, monocyty, Aktywacja T butyrofilina SF3 ASV DC, śródbłonek, A1, BTF5 komóreki CD34+, linie komórek nowotworowych

CD279 PD1, SLEB2 Tact i Bact Receptor B7-H1 i B7-DC, choroba autoimmunologiczna i tolerancja obwodowa

CD298 Podjednostka szeroki transport jonów sodu i potasu przez beta3 Na+/K+- błonę ATPazy

CD300a CMRF35H, IgSF, ASV NK, monocyty, nieznana IRC1, IRp60 neutrofile, podzbiór T i B oraz limfocytowe linie komórkowe, AML

CD300c CMRF35A, LIR IgSF monocyty, neutrofile, nieznana monocytowe linie komórkowe, podzbiory B i T

CD304 BDCA4, Rodzina neurony, CD4 +/CD25 oddziałuje z VEGF165 i neuropilina 1 semaforyn + Treg, DC, komórki semaforynami, koreceptor z śródbłonkowe i pleksyną, naprowadzanie nowotworowe aksonalne, angiogeneza, przeżycie komórek, migracja

CD305 LAIR1 IgSF, ASV NK, B, T, monocyty receptor hamujący na komórkach NK i T

CD314 NKG2D, KLR Receptor NK, aktywowane wiąże MHC klasy I, MICA, MICB, lektynopodobny CD8+, NK1.1 + T, Rae1 i ULBP4, aktywuje cytolizę i typu II niektóre komórki wytwarzanie cytokin, kostymulacja szpikowe

CD317 BST2, HM1.24 Typu II B, T, NK, monocyty, wzrost komórek pre-B, DC, linia komórkowa nadekspresja w szpiczaku mnogim

47 EP 3 105 317 B1

Antygen Inne nazwy Struktura Główny rozkład Funkcja

fibroblastów, szpiczak

CD319 CS1, CRACC, Rodzina Komórki B , komórki Szpiczak mnogi SLAMF7 receptorów SLAM dendrytyczne, NK, NKT

Tabela 5: Markery antygenowe ulegające ekspresji na powierzchni zarówno komórek nowotworu okrężnicy jak i komórek T

Względna ekspresja Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka w komórkach T komórkach raka okrężnicy

Cząsteczka adhezyjna komórek EPCAM 2,97 13,99 nabłonkowych

Indukowane interferonem białko IFITM1 10,55 13,06 transbłonowe 1

CLDN4 Klaudyna-4 2,87 11,62

CDH17 Kadheryna-17 1,85 11,52

Cząsteczka adhezji komórkowej CEACAM1 związana z antygenem rakowo- 3,33 10,84 płodowym 1

SLC26A3 Wymieniacz anionu chlorkowego 2,57 10,59

Podjednostka alfa-1 ATPazy ATP1A1 9,28 10,51 transportującej sód/potas

SI Izomaltaza 2,86 10,46

ABCB1 Białko oporności wielolekowej 1 6,09 10,24

Kanał potasowy bramkowany napięciem KCNQ1 3,36 9,99 podrodzina KQT członek 1

Duża podjednostka p51 receptora FcRn FCGRT 4,8 9,98 IgG

EPHB3 Receptor efryny 3 typu B 5,23 9,74

DSG2 Desmogleina-2 3,04 8,5

EPHB4 Receptor efryny 4 typu B 6,5 8,44

GUCY2C Receptor enteroksyny ciepło-stałej 2,23 8,05

EPHA2 Receptor efryny 2 typu A 2,8 7,95

Lymphocyte antigen 6 complex locus LY6G6D 2,02 7,91 protein G6f

CD97 Podjednostka beta antygenu CD97 7,7 7,87

48 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka w komórkach T komórkach raka okrężnicy

Nieopioidowy wewnatrzkomórkowy SIGMAR1 4,58 7,85 receptor sigma 1

EREG Epiregulina 2,93 6,9

FAIM2 Protein lifeguard 2 2,94 6,82

PIGR Składnik wydzielniczy 4,2 6,8

SLC7A6 Transporter 2 aminokwasów Y+L 8,06 6,55

Podjednostka delta kanału sodowego SCNN1D 1,77 5,74 wrażliwego na amiloryd

GPR35 Receptor 35 sprzężony z białkiem G 1,98 5,5

Członek 2 podrodziny G kasety wiążącej ABCG2 1,79 5,35 ATP

LPAR4 Receptor 4 kwasu lizofosfatydowego 2,93 5,05

GPR161 Receptor 161 sprzężony z białkiem G 2,71 4,96

Glikoproteina powierzchniowa CD1c CD1C 2,73 4,89 komórek T

SGCA Alfa-sarkoglikan 2,32 4,84

CD22 receptor CD22 komórek B 4,12 4,75

CD22 receptor CD22 komórek B 3,58 4,75

CD22 receptor CD22 komórek B 2,73 4,75

CD22 receptor CD22 komórek B 2,14 4,75

Członek 18 rodziny nośników 22 SLC22A18 2,32 4,62 substancji rozpuszczalnych

HTR7 Receptor 7 5-hydroksytryptaminy 3,02 4,46

LCT Hydrolaza florydzynowa 2,32 4,24

Antygen powierzchniowy CD33 komórek CD33 3,42 4,14 szpikowych

PVR Receptor wirusa Polio 5,07 4,07

PLXDC1 Białko zawierające domenę pleksyny 1 5,85 3,99

P2RY2 P2Y purynoceptor 2 2,15 3,97

Podjednostka beta-2 neuronalnego CHRNB2 6,31 3,88 receptora acetylocholiny

PTGDR receptor D2 prostaglandyny 4,08 3,65

49 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka w komórkach T komórkach raka okrężnicy

receptor 1 wyzwalający naturalną NCR1 2,63 3,33 cytotoksyczność

GYPA Glikoforyna A 3,18 3,31

Członek 8 nadrodziny receptora czynnika TNFRSF8 2 2,75 martwicy nowotworu

KEL Glikoproteina grupy krwi Kell 1,93 2,48

EDA Ektodysplazyna A, postać wydzielana 2,7 2,42

Enzym konwertujący angiotensynę, ACE 2,39 2,19 postać rozpuszczalna

DRD2 Receptor dopaminy D(2) 2,49 1,97

CXCR3 receptor typu 3 chemokiny C-X-C 4,19 1,66

receptor hormonu MC2R 1,94 1,43 adrenokortykotropowego

Tabela 6: Markery antygenowe ulegające ekspresji na powierzchni zarówno komórek nowotworu sutka, jak i komórek T

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

ABCA8 Członek 8 podrodziny A kasety wiążącej ATP 3,15 7,73

ABCC10 Białko 7 związane z opornością wielolekową 6,48 5,29

ABCC6 Białko 6 związane z opornością wielolekową 2,67 2,17

ACCN2 Kanał jonowy wyczuwający kwas 1 3,62 2,49

Białko 12 zawierające domeny dysintegryny i ADAM12 metaloproteinazy 4,96 7,72

receptor typu I polipeptydu aktywującego ADCYAP1R1 przysadkową cyklazę adenylanową 2,17 2,88

ADRA1A receptor adrenergiczny Alfa-1A 3,31 4,85

ADRA1B receptor adrenergiczny Alfa-1B 1,49 1,6

ADRA1D receptor adrenergiczny Alfa-1D 2,39 3,38

ADRA2A receptor adrenergiczny Alfa-2A 2,64 1,79

ADRB3 receptor adrenergiczny Beta-3 2,36 2,16

Receptor końcowych produktów AGER zaawansowanej glikozylacji 2,85 2,38

50 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

AGTR2 Receptor angiotensyny II typu 2 3,08 3,7

ALK Receptor kinazy tyrozynowej ALK 4,97 4,27

ANO3 Anoktamina-3 2,39 3,69

ANPEP Aminopeptidaza N 3,26 10,78

APLNR Receptor Apeliny 2,47 2,06

AQP2 Akwaporyna 2 2,12 1,43

Prawdopodobna ATPaza transportująca ATP10A fosfolipid VA 3,96 6,02

ATPaza 4 transportująca wapń błony ATP2B2 komórkowej 2,75 4,81

ATPaza 3 transportująca wapń błony ATP2B3 komórkowej 3,7 4,14

ATP4A Łańcuch alfa 1 ATPazy transportującej potas 1,56 11,49

Podjednostka beta ATPazy transportującej ATP4B potas 2,49 13,56

izoforma 2 podjednostki a ATPazy protonowej ATP6V0A2 typu V o wielkości 116 kDa 2,51 2,57

ATRN Atraktyna 4,09 9,44

AVPR1A Receptor V1a wazopresyny 2,52 4,03

AVPR1B Receptor V1b wazopresyny 2,97 3,32

AVPR2 Receptor V2 wazopresyny 2,68 2,93

BAI1 Inhibitor 1 angiogenezy specyficzny dla mózgu 2,73 0,33

BAI2 Inhibitor 2 angiogenezy specyficzny dla mózgu 2,34 4,14

BAI3 Inhibitor 3 angiogenezy specyficzny dla mózgu 2,73 4,76

BDKRB1 Receptor bradykininy B1 2,07 3,28

BRS3 podtyp 3 receptora bombezyny 2,74 4,12

BTF3 Członek A2 podrodziny 3 butyrofiliny 11,29 13,02

receptor klasy A białka 4 zawierającego C18orf1 domenę lipoproteiny o małej gęstości 3,18 8,45

C3AR1 Receptor chemotaktyczny anafilatoksyny C3a 3,04 5,15

C6orf105 Białko regulujące TFPI zależne od androgenu 2,34 3,84

51 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

Receptor wyczuwający wapń CASR zewnątrzkomórkowy 2,52 5

CCBP2 Atypowy receptor chemokin 2 1,72 3,29

CCKAR receptor Cholecystokininy typu A 2,46 3

CCKBR receptor Gastryny/cholecystokininy typu B 2,25 5,66

CCR2 receptor chemokiny C-C typu 2 5,94 3,56

CCR3 receptor chemokiny C-C typu 3 1,89 4,17

CCR6 receptor chemokine-podobny 2 C-C 3,33 5,23

CCR8 receptor chemokiny C-C typu 8 2,28 3,93

CCR9 receptor chemokiny C-C typu 9 1,68 1,98

glikoproteina powierzchniowa CD1 a komórek CD1A T 1,98 4,88

glikoproteina powierzchniowa CD1b komórek CD1B T 2,35 4,94

CD1D glikoproteina CD1d prezentująca antygen 2,82 4,96

CD300C Cząsteczka CMRF35-podobna 6 2,04 5,04

CD4 glikoproteina powierzchniowa CD4 komórek T 2,84 6,17

CD40LG ligand CD40, postać rozpuszczalna 2,1 3,49

CD5 glikoproteina powierzchniowa CD5 komórek T 3,14 1,01

CD63 Antygen CD63 8,6 13,18

CD84 Członek 5 rodziny SLAM 4,7 3,17

CDH15 Kadheryna-15 2,07 3,55

CDH19 protokadheryna-16 2,82 8,4

CDH22 kadheryna-22 3 4,9

CDH8 Kadheryna-8 3,63 5,87

związana z cząsteczką adhezji komórkowej CDON /regulowana w dół przez onkogeny 2,35 3,61

Podjednostka alfa 4 neuronalnego receptora CHRNA4 acetylocholiny 2,14 3,33

Podjednostka alfa 5 neuronalnego receptora CHRNA5 acetylocholiny 2,2 4,88

52 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

Podjednostka alfa 6 neuronalnego receptora CHRNA6 acetylocholiny 2,26 4,93

Podjednostka beta 3 neuronalnego receptora CHRNB3 acetylocholiny 1,85 3,91

CHRNE Podjednostka epsilon receptora acetylocholiny 2,56 2,83

CLDN3 klaudyna-3 2,91 13,56

CLDN7 klaudyna-7 1,89 12,87

CLDN8 klaudyna-8 2,46 10,67

CLDN9 klaudyna-9 1,74 1,69

Członek M rodziny 4 domeny lektynowej typu CLEC4M C 2,7 3,32

CMKLR1 Receptor chemokino-podobny 1 2,62 5

CNNM2 Transporter metali CNNM2 2,47 5,32

CNR2 Receptor kanabinoidowy 2 2,38 3,66

Receptor czynnika uwalniającego CRHR1 kortykotropinę 1 2,15 10,71

Receptor czynnika uwalniającego CRHR2 kortykotropinę 2 2,32 6,44

Przetworzony czynnik stymulujący wzrost CSF1 kolonii makrofagów 1 5,63 7,61

Receptor czynnika stymulującego wzrost CSF1R kolonii makrofagów 1 2,2 4,02

Receptor czynnika stymulującego wzrost CSF3R kolonii granulocytów 1,85 2,8

CX3CL1 Przetworzona fraktalkina 2,35 9,31

CXCR5 receptor chemokinowy C-X-C typu 5 2,07 6,06

DAGLA Sn1-specyficzna lipaza diacyloglicerolowa alfa 2,6 2,11

DRD1 Receptor dopaminowy D(1A) 2,67 5,71

DRD3 Receptor dopaminowy D(3) 2,72 4,99

DRD4 Receptor dopaminowy D(4) 1,49 0,89

DRD5 Receptor dopaminowy D(1B) 2,26 4,91

DSC2 Desmocollin-2 2,26 11,12

53 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

DSCAM Cząsteczka adhezyjna zespołu Downa 2,54 3,76

DSG1 Desmogleina-1 2,62 7,71

Mucynopodobny receptor hormonalny 2 EMR2 zawierający moduł EGF-podobny 2,25 3,38

EPHA5 Receptor efryny 5 typu A 2,42 7,48

EPHA7 Receptor efryny 7 typu A 2,61 4,87

ERBB3 Receptor kinazy tyrozynowo-białkowej erbB-3 2,39 12,76

F2RL2 Receptor 3 aktywowany proteinazą 3,2 5,16

Związany z mieliną inhibitor przerostu FAM168B neurytów 8,34 11,16

FAP Sepraza 1,87 10,15

Członek 6 nadrodziny receptorów czynników FAS martwicy nowotworu 5,68 7,24

FASLG Wewnątrzkomórkowa domena FasL 2,23 2,66

FCAR Receptor Fc immunoglobuliny alfa 2,8 3,85

Podjednostka alfa receptora epsilon FCER1A immunoglobuliny o wysokim powinowactwie 2,54 4,59

receptor II-a regionu Fc gamma FCGR2A immunoglobuliny o niskim powinowactwie 2,77 8,81

receptor II-b regionu Fc gamma FCGR2B immunoglobuliny o niskim powinowactwie 2,46 5,35

FGFR2 Receptor czynnika wzrostu fibroblastów 2 4,01 9,83

FGFR4 Receptor czynnika wzrostu fibroblastów 4 2,56 7,42

FLT3LG Ligand kinazy tyrozynowej związanej z Fms 3 7,86 4,37

FPR1 Receptor fMet-Leu-Phe 3,38 5,92

FPR3 Receptor N-formylowanych peptydów 3 1,91 2,61

FSHR Receptor hormonu folikulotropowego 1,89 3,78

FZD5 Frizzled-5 2,82 5,2

FZD5 Frizzled-5 1,81 5,2

FZD9 Frizzled-9 2,66 3,16

Podjednostka alfa-1 receptora kwasu gamma GABRA1 aminomasłowego 2,2 6,26

54 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

Podjednostka alfa-5 receptora kwasu gamma GABRA5 aminomasłowego 2,49 3,24

Podjednostka alfa-6 receptora kwasu gamma GABRA6 aminomasłowego 2,54 2,98

Podjednostka beta-1 receptora kwasu gamma GABRB1 aminomasłowego 1,89 2,37

Podjednostka beta-2 receptora kwasu gamma GABRB2 aminomasłowego 2,26 3,89

Podjednostka gamma-3 receptora kwasu GABRG3 gamma aminomasłowego 2,23 2,85

Podjednostka pi receptora kwasu gamma GABRP aminomasłowego 2,93 12,34

Podjednostka rho-1 receptora kwasu gamma GABRR1 aminomasłowego 2,35 3,47

Podjednostka rho-2 receptora kwasu gamma GABRR2 aminomasłowego 4,16 5,43

GALR2 Receptor galaniny typu 2 1,85 0,46

GALR3 Receptor galaniny typu 3 0,68 0,48

GCGR Receptor glukagonu 1,38 3,4

Receptor hormonalny uwalniający hormone GHRHR wzrostu 1,61 3,49

GJA5 Białko połączenia szczelinowego alfa-5 1,72 2,05

GJA8 Białko połączenia szczelinowego alfa-8 2,39 6,51

GJC1 Białko połączenia szczelinowego delta-3 1,94 3,89

GLP1R Receptor peptydu glukagonopodobnego 1 5,72 3,41

GLRA1 Podjednostka alfa-1 receptora glicyny 2,15 3,87

GLRA3 Podjednostka alfa-3 receptora glicyny 3,19 3,1

Receptor hormonalny uwalniający GNRHR gonadotropinę 2,72 4,1

GPNMB Glikoproteina transbłonowa NMB 2,14 13,94

GPR1 Receptor 1 sprzężony z białkiem G 3,83 4,1

GPR135 Prawdopodobny receptor 135 sprzężony z 4,15 1,91

55 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

białkiem G

GPR143 Receptor 143 sprzężony z białkiem G 1,93 3,65

GPR15 Receptor 15 sprzężony z białkiem G 1,81 4,41

Receptor nukleotydu GPR17 uracylowego/leukotrienow cysteinylowych 1,93 1,74

Prawdopodobny receptor 171 sprzężony z GPR171 białkiem G 7,73 6,32

GPR18 Receptor N-arachidonyloglicyny 7,05 3,52

GPR182 Receptor 182 sprzężony z białkiem G 1,66 1,29

Prawdopodobny receptor 19 sprzężony z GPR19 białkiem G 1,89 5,26

GPR20 Receptor 20 sprzężony z białkiem G 2,02 2,53

GPR3 Receptor 3 sprzężony z białkiem G 3,01 5,36

Receptor kwasu 12-(S)-hydroksy-5,8,10,14- GPR31 eikozatetraenowego 1,63 1,64

GPR37L1 receptor GPR37L1 prosapozyny 2,23 4

GPR39 Receptor 39 sprzężony z białkiem G 1,81 1,36

GPR44 Receptor 2 prostaglandyny D2 2 2,32

Prawdopodobny receptor 45 sprzężony z GPR45 białkiem G 2,78 5,31

GPR6 Receptor 6 sprzężony z białkiem G 2,56 3,38

GPR65 Receptor Psychozyny 6,59 4,5

GPR68 Receptor 1 raka jajnika sprzężony z białkiem G 2,12 1,09

GPR98 Receptor 98 sprzężony z białkiem G 1,89 4,7

GRIA1 receptor glutaminianu 1 4,17 4,77

GRIA3 receptor glutaminianu 3 2,51 6,83

GRIK2 jonotropowy receptor glutaminianu, kainowy 5 2,56 4,94

GRIK3 jonotropowy receptor glutaminianu, kainowy 3 2,05 3,58

GRIN1 jonotropowy receptor glutaminianu, NMDA 1 4,52 1,49

GRIN2B jonotropowy receptor glutaminianu, NMDA 2B 2,22 3,56

GRIN2C jonotropowy receptor glutaminianu NMDA 2C 2,56 3,37

56 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

GRM1 Metabotropowy receptor glutaminianu 1 3,21 3,69

GRM2 Metabotropowy receptor glutaminianu 2 2,04 0,44

GRM3 Metabotropowy receptor glutaminianu 3 2,39 3,41

GRM4 Metabotropowy receptor glutaminianu 4 5,2 3,78

GRM5 Metabotropowy receptor glutaminianu 5 2,26 5,28

GRM7 Metabotropowy receptor glutaminianu 7 2,86 3,07

GYPB Glikoforyna B 2,43 4,02

Białko wiążące glikoproteinę o wysokiej gęstości 1 z kotwicą HBP1 glikozylofosfatydyloinozytolową 7,32 9,27

HCRTR2 receptor oreksyny typu 2 2,32 2,42

HTR1B receptor 1B 5-hydroksytryptaminy 2,82 3,51

HTR1D receptor 1D 5-hydroksytryptaminy 2,29 2,33

HTR1E receptor 1E 5-hydroksytryptaminy 1,72 2,4

HTR2A receptor 2A 5-hydroksytryptaminy 2,1 3,67

HTR2C receptor 2C 5-hydroksytryptaminy 2,49 5,18

HTR4 receptor 4 5-hydroksytryptaminy 3,86 4,25

ICAM4 cząsteczka adhezji międzykomórkowej 4 2,51 2,16

ICOS Indukowalny kostymulator komórek T 3,91 3,86

IL6R Podjednostka alfa receptora Interleukiny-6 4,24 3,08

IL6R Podjednostka alfa receptora Interleukiny-6 2,64 3,08

IL6ST Podjednostka beta receptora Interleukiny-6 9,43 12,67

IL9R Receptor Interleukiny-9 2,71 2,86

ITGB3 Integryna beta-3 4,16 3,69

Członek 3 podrodziny A kanałów potasowych KCNA3 bramkowanych napięciem 2,09 4,9

Członek 2 podrodziny D kanałów potasowych KCND2 bramkowanych napięciem 2,67 4,25

Członek 1 podrodziny H kanałów potasowych KCNH1 bramkowanych napięciem 2,31 4,48

KCNJ4 wewnątrzprostowniczy kanał potasowy 4 2,43 3,49

57 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

Podjednostka alfa-1 kanału potasowego KCNMA1 aktywowanego wapniem 2,35 7,17

Członek 1 podrodziny S kanałów potasowych KCNS1 bramkowanych napięciem 5,66 6,49

Członek 2 podrodziny V kanałów potasowych KCNV2 bramkowanych napięciem 2,38 4,06

immunoglobulinopodobny receptor 2DL4 KIR2DL4 komórek cytotoksycznych 1,68 3,31

immunoglobulinopodobny receptor 3DL1 KIR3DL1 komórek cytotoksycznych 2,56 2,73

immunoglobulinopodobny receptor 3DL3 KIR3DL3 komórek cytotoksycznych 1,7 3,06

Członek 1 podrodziny G receptora KLRG1 lektynopodobnego komórek cytotoksycznych 8,3 5,76

Związana z lizosomem glikoproteina błonowa LAMP1 1 10,9 13,6

receptor dla hormonu lutropiny-gonadotropiny LHCGR kosmówkowej 2,23 4,92

Aminopeptydaza leucylo-cystynylowa, forma LNPEP surowicy ciążowej 2,68 5,05

LPAR2 Receptor 2 kwasu lizofosfatydowego 5,5 4,23

Białko 2 zawierające powtórzenia bogate w LRIG2 leucynę i domeny immunoglobulinopodobne 3,35 5,48

Transbłonowe, neuronalne białko 2 LRRTM2 zaiwerajace powtórzenie bogate w leucynę 2,42 4,24

LTB4R Receptor 1 Leukotrienu B4 4,96 2,26

MAS1 Proto-onkogen Mas 1,91 3,11

MC1R Receptor hormonu stymulującego melanocyty 2,94 0,96

MC5R Receptor melanokortynowy 5 2,28 1,63

MEP1B Podjednostka beta mepryny A 2,61 3,87

MFSD5 Transporter anionu molibdenianowego 1,98 4,72

MOG glikoproteina oligodendrocytów mieliny 3,08 4,74

MTNR1B receptor typu 1B melatoniny 1,61 1,67

58 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

MUC1 Podjednostka beta mucyny-1 2,73 13,68

MUSK Kinaza tyrozynowo-białkowa mięśni i szkieletu 2,39 4,75

NCAM2 Cząsteczka adhezji komórek nerwowych 2 2,12 4,49

Receptor 2 wywołujący naturalną NCR2 cytotoksyczność 4,79 7,09

Receptor 3 wywołujący naturalną NCR3 cytotoksyczność 4,55 2,74

NIPA2 transporter magnezu NIPA2 6,77 3,9

NLGN1 Neuroligina-1 2,62 7,71

NLGN4Y Neuroligina-4, Y-połączona 2,52 5,26

NMBR Receptor neuromedyny-B 1,68 2,47

NPHS1 Nefryna 2,74 4,33

NPY2R receptor typu 2 neuropeptydu Y 2,68 4,43

NPY5R receptor typu 5 neuropeptydu Y 2,38 5,05

NTSR2 receptor typu 2 Neurotensyny 1,72 3

OPRD1 Receptor opioidowy typu delta 2,26 2,14

OPRL1 Receptor nocyceptyny 2,31 1,51

OPRM1 Receptor opioidowy typu Mu 3,18 4,01

OR10H3 Receptor węchowy 10H3 1,63 4,02

OR1E1 Receptor węchowy 1E1 3,04 4,77

OR2F1 Receptor węchowy 2F1 2,64 5,73

OR2F2 Receptor węchowy 2F2 2,19 2,3

OR2H1 Receptor węchowy 2H1 3,39 3,82

OR2H2 Receptor węchowy 2H2 3,79 6,37

OR2J2 Receptor węchowy 2J2 2,41 2,16

OR2J2 Receptor węchowy 2J2 1,93 2,16

OR5I1 Receptor węchowy 5I1 1,85 2,8

OR7E24 Receptor węchowy 7E24 2,5 3,47

P2RX7 P2X purynoceptor 7 2,36 2,15

PANX1 Paneksyna-1 2,14 4,38

59 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

PCDHA9 Protokadheryna alfa-9 2,82 3,56

PCDHB11 Protokadheryna beta-11 1,91 5,23

PCDHGA8 Protokadheryna gamma-A8 3,13 4,48

Receptor rozpuszczlanej, wydzielniczej PLA2R1 fosfolipazy A2 2,91 5,16

PLXNA3 Pleksyna-A3 2,42 3,25

POP1 Substancja nasierdziowa naczyń krwionośnych 1,74 2,59

PPYR1 receptor typu 4 neuropeptydu Y 2,2 2,75

PTGER1 Podtyp EP1 receptora prostaglandyny E2 1,96 0,94

PTGFR Receptor prostaglandyny F2-alfa 2,75 4,89

PTGIR Receptor prostacykliny 2,78 2,12

Fosfataza tyrozynowo-białkowa eta typu PTPRJ receptorowego 2,63 4,6

Fosfataza tyrozynowo-białkowa R typu PTPRR receptorowego 2,47 9,99

PVRL1 Białko związane z receptorem wiusa Polio 1 2,52 4,51

PVRL2 Białko związane z receptorem wiusa Polio 2 3,84 10,05

Protoonkogen kinazy tyrozynowo-białkowej ROS1 ROS 2,93 3,38

S1PR2 Receptor 2 sfingozyno-1-fosforanu 1,74 1,17

S1PR4 Receptor 4 sfingozyno-1-fosforanu 4 0,21

Podjednostka beta kanału sodowego SCNN1B wrażliwego na amiloryd 1,89 3,16

Podjednostka gamma kanału sodowego SCNN1G wrażliwego na amiloryd 2,23 2,61

SEMA4D Semaforyna-4D 10,66 1,56

SEMA6A Semaforyna-6A 4,55 7,81

SEMA6C Semaforyna-6C 5,02 3,73

SGCB Beta-sarkoglikan 2,69 3,45

SGCB Beta-sarkoglikan 2,04 3,45

Członek 2 rodziny 12 nośników substancji SLC12A3 rozpuszczonych 2,26 3,36

60 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

SLC14A1 Transporter mocznika 1 2,97 6,21

SLC14A2 transporter mocznika 2 2,85 4,4

SLC16A1 transporter monokarboksylanu 1 3,46 8,84

SLC16A2 transporter monokarboksylanu 8 1,77 5,17

SLC16A6 transporter monokarboksylanu 7 2,41 11,66

Członek 1 rodziny 22 nośników substancji SLC22A1 rozpuszczonych 2,95 11,61

Członek 6 rodziny 22 nośników substancji SLC22A6 rozpuszczonych 2,26 2,53

Sprzężony z sodem transporter SLC5A12 monokarboksylanu 2 2,98 4,45

SLC6A1 Zależny od sodu i chlorku transporter GABA 1 2,45 4,3

SLC6A4 Transporter serotoniny zależny od sodu 2,17 2,66

SLC6A6 Transporter tauryny zależny od sodu i chlorku 2,54 4,13

SLC7A7 Transporter 1 aminokwasu Y+L 2,22 9,78

SLC8A1 Wymiennik sodowo-wapniowy 1 2,07 2,36

SLC9A1 Wymiennik sodowo-wodorowy 1 3,15 5,54

SLC9A3 Wymiennik sodowo-wodorowy 3 2,12 3,15

Członek 1A2 rodziny transporterów anionów SLCO1A2 organicznych substancji rozpuszczonych 3,87 4,98

Członek 2B1 rodziny transporterów anionów SLCO2B1 organicznych substancji rozpuszczonych 4,43 8,92

SORT1 Sortilina 2,93 4,6

SSTR2 receptor somatostatyny typu 2 3,08 4,47

SSTR3 receptor somatostatyny typu 3 2,23 1,5

SSTR4 receptor somatostatyny typu 4 1,83 1,53

SSTR5 receptor somatostatyny typu 5 2,57 1,47

TACR1 Receptor substancji-P 2,66 3,2

TACR3 Receptor neuromedyny-K 2,32 5,7

TLR6 Receptor Toll-podobny 6 2,2 4,58

TMPRSS6 Transbłonowa proteaza serynowa 6 4,02 3,69

61 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

Członek 11 nadrodziny ligandów czynnika TNFSF11 martwicy nowtworów 2,57 5,18

Członek 14 nadrodziny ligandów czynnika TNFSF14 martwicy nowtworów, postać rozpuszczalna 3,34 2,83

TPO Peroksydaza tarczycowa 1,96 1,89

Adapter transbłonowy 1 związany z TRAT1 receptorem komórek T 7,51 5,29

TRHR Receptor hormonu uwalniającego tyreotropinę 2 4,18

Członek 1 podrodziny M kanału kationowego związanego z receptorami przejściowego TRPM1 potencjału 2,43 5,22

TSHR Receptor tyreotropiny 2,9 4,87

TSHR Receptor tyreotropiny 2,12 4,87

UNC93A homolog A białka unc-93 2,64 4,94

Receptor 2 wazoaktywnego polipeptydu VIPR2 jelitowego 2,58 3,37

Przetworzone białko wiążące komórkę jajową- ZP2 plemnik 2 1,94 3,55

Tabela 7: Markery antygenowe ulegające ekspresji na powierzchni zarówno komórek nowotworu przewodu pokarmowego, jak i komórek T

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

ACVR1B Receptor aktywiny typu 1B 5,16 10,48

AMIGO2 Białko 2 indukowane amfoteryną 6,73 8,2

Podjednostka beta-1 ATPazy ATP1B1 transportującej sód/potas 2,64 12,31

Prawdopodobna ATPaza IC transportująca ATP8B1 fosfolipid 8,22 2,17

CCR7 Receptor chemokiny C-C typu 7 10,25 11,52

CD164 Białko rdzenia sialomucyny 24 10,27 12,12

CD180 Antygen CD180 2,5 6,47

62 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

Członek 5 nadrodziny receptora czynnika CD40 martwicy nowotworu 5,02 6

CD53 Antygen powierzchniowy leukocytu CD53 10,79 11,3

łańcuch alfa białka związany z kompleksem CD79A receptora antygenowego komórek B 3,74 9,17

łańcuch beta białka związany z kompleksem receptora antygenowego CD79B komórek B 3,6 6,66

Łańcuch beta glikoproteiny powierzchniowej CD8B CD8 komórki T 8,43 2,62

Cadherin EGF LAG seven-pass G-type CELSR1 receptor 1 2,72 8,68

CLCN5 transporter 5 wymiany H(+)/Cl(-) 2,71 4,97

CLDN18 Klaudyna-18 3,05 14,51

białko 1 wewnątrzkomórkowego kanału CLIC1 chlorkowego 9,94 13,83

COL13A1 Łańcuch alfa-1 kolagenu (XIII) 2,96 6,24

DIO3 dejodynaza jodotyroninowa typu III 2,04 2,9

EDNRA Receptor Endoteliny-1 2,9 8,96

Mucynopodobny receptor hormonalny 1 EMR1 zawierający moduł EGF-podobny 1,83 7,29

ENPP1 Pirofosfataza nukleotydów 2,57 9,66

EPHB1 Receptor efryn 1 typu-B 2,02 6,33

EPHB1 Receptor efryn 1 typu-B 1,81 6,33

F2R Receptor 1 aktywowany proteinazą 3,04 9,78

Receptor 2 aktywowany proteinazą, na F2RL1 przemian rozszczepiony 2 3,31 9,47

Receptor epsilon Fc immunoglobuliny o niskim powinowactwie postać FCER2 rozpuszczalna 2,49 8,77

Podjednostka 1 receptora kwasu gamma GABBR1 aminomasłowego typu B 5,1 8,52

GABRA3 Podjednostka alfa-3 receptora kwasu 2,12 3,84

63 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

gamma aminomasłowego typu B

GPR183 Receptor 183 sprzężony z białkiem G 4,79 10,22

GPR37 receptor GPR37 prosapozyny 3,1 8,23

GPRC5A Białko 3 indukowane kwasem retinowym 1,87 13,69

GRPR Receptor peptydu uwalniającego gastrynę 2,04 3,35

GYPC Glikoforyna-C 9,22 7,58

Receptor typu 2 dla interleukiny-1, postać IL1R2 rozpuszczalna 2,82 12,83

KIAA0319 białko KIAA0319 związane z dysleksją 2,43 5,61

Związana z lizosomem glikoproteina LAMP2 błonowa 2 4,05 11,29

Białko 8 związane z receptorem LRP8 lipoproteinowym o niskiej gęstości 4,24 8,84

Receptor lipoproteinowy stymulowany LSR lipolizą 4,99 11,48

Sekwencja B związana z polipeptydem MICB MHC klasy I 5,27 9,89

MMP16 metaloproteinaza-16 macierzy 3,19 6,18

MS4A1 antygen CD20 limfocytu B 2,15 8,02

MYOF Mioferlina 2,41 11,56

Transporter obojętnych aminokwasów 3 NAT1 sprzężony z sodem 3,49 12,09

NFASC Neurofascyna 3,78 8,28

NPY1R receptor typu 1 neuropeptydu Y 2,32 6,93

OR2B6 receptor węchowy 2B6 2,78 4,24

P2RY10 Przypuszczalny purynoceptor 10 P2Y 3,39 6,62

PCDH1 Protokadheryna-1 4,45 10,07

PROM1 Prominina-1 2,52 11,77

PSEN1 Presenilina-1 CTF12 2,94 8,83

PTGER2 Podtyp EP2 receptora prostaglandyny E2 6,33 6,74

PTGER4 Podtyp EP4 receptora prostaglandyny E2 8,62 5,12

64 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

Fosfataza tyrozynowo-białkowa kappa typu PTPRK receptorowego 2,14 10,9

Fragment 120kDa kadheryny RET RET zakotwiczony w błonie zewnątrzkomórkowej 2,38 12,3

SERINC3 Inkorporator seryny 3 7,93 12,01

transporter XTRP3 zależny od sodu i SIT1 chlorku 5,92 4,82

Cząsteczka sygnalizująca aktywację SLAMF1 limfocytów 4,4 9,03

SLC29A1 Równoważny transporter nukleozydu 1 2,07 6,12

SLC39A6 transporter ZIP6 cynku 6,69 15,23

Mała podjednostka 1 transportera dużych, SLC7A5 obojętnych aminokwasów 3,79 10,98

STX4 Syntaksyna-4 5,68 7,67

Receptor typu 3 transformującego czynnika TGFBR3 wzrostu beta 7,55 7,29

Integralne białko błonowe sieci Trans-Golgi TGOLN2 2 9,59 11,3

TLR1 Receptor 1 Toll-podobny 2,34 4,57

Białko 10 zawierające domenę TMED10 transbłonową emp24 9,34 12,24

TMEM97 Białko transbłonowe 97 2,75 9,02

Czynnik martwicy nowotworu, postać TNF rozpuszczalna 1,63 3,18

Członek 17 nadrodziny receptorów czynnika TNFRSF17 martwicy nowotworu 1,89 10,47

Białko 2 wiążące czynnik martwicy TNFRSF1B nowotworu 5,51 9,4

Białko 1 kanału aniono-selektywnego VDAC1 zależnego od napięcia 6,52 11,5

Tabela 8: Markery antygenowe ulegające ekspresji na powierzchni zarówno komórek nowotworu nerki, jak i komórek T

65 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

ADORA3 receptor A3 adenozyny 1,89 4,56

Pradopodobna ATPaza IH transportująca ATP11A fosfolipid 3,62 8,8

BSG Basigina 4,77 11,34

BTN3A2 Członek A2 podrodizny 3 butyrofiliny 10,86 8,19

Białko 4 zawierające domenę V-set I C10orf72 transbłonową 2,04 6,85

CADM3 Cząsteczka adhezji komórkowej 3 3,57 6,39

Łańcuch alfa glikoproteiny powierzchniowej CD8A CD8 komórki T 10,35 6,6

CDH16 kadheryna-16 2,17 7,09

CDH4 kadheryna-4 2,15 3,6

CDH5 kadheryna-5 2,5 9,55

Przetworzone białko podobne do CHL1 cząsteczki adhezyjnej komórki nerwowej L1 2,69 10,43

Podjednostka beta receptora dla CHRNB1 acetylocholiny 2,12 3,6

Białko 4 wewntątrzkomórkowego kanału CLIC4 chlorkowego 3,34 13,12

CNR1 receptor kanabinoidowy 1 2,26 5,64

Przetworzone bogate w cysteinę białko CRIM1 neuronu ruchowego 1 3,57 12,39

CSPG4 Proteoglikan siarczanu chondroityny 4 3,33 6,59

CYBB Łańcuch ciężki cytochromu b-245 2,86 8,07

EDNRB Receptor endoteliny B 3,04 8,97

Receptor 1 czynnika wzrostu śródbłonka FLT1 naczyń 2,75 8,5

FZD1 Frizzled-1 2,72 7,59

GJC2 Białko połączenia szczelinowego gamma-2 2,09 2,94

GLRB Podjednostka beta receptora glicyny 2,51 7,15

Receptor 1 egostrogenu sprzężony z GPER białkiem G 2,34 8,64

66 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

GPM6A Nerwowa glikoproteina błonowa M6-a 2,95 6,88

Prawdopodobny receptor 162 sprzężony z GPR162 białkiem G 2,75 2,81

GPR4 Receptor 4 sprzężony z białkiem G 2,93 8,09

GRM8 Metabotropowy receptor glutaminianu 8 3,43 8,25

Antygen zgodności tkankowej HLA klasy II, HLA-DPB1 łańcuch beta 1 DP 9,93 13,99

HTR6 Receptor 6 5-hydroksytryptaminy 4,83 10,07

INSR Podjednostka beta receptora insulinowego 3,44 8,95

ITM2B Peptyd Bri23 11,16 12,19

Wrażliwy na ATP wewnątrzprostowniczy KCNJ1 kanał potasowy 1 2,5 4,17

Receptor 2 czynnika wzrostu śródbłonka KDR naczyń 2,99 9,95

KL Peptyd Klotho 2,83 7,59

Związany z leukocytami receptor LAIR1 immunoglobulinopodobny 1 5,64 4,25

MFAP3 Glikoproteina związana z mikrofibrylami 3 3,7 7,3

MFAP3L Microfibrillar-associated protein 3-like 3,44 8,7

Sekwencja A związana z polipeptydem MICA MHC klasy I 4,07 2,01

NCAM1 Cząsteczka adhezyjna komórki nerwowej 1 2,45 7,31

NOTCH3 Wewntąrzkomórkowa domena Notch 3 3,21 12,41

NOTCH4 Wewntąrzkomórkowa domena Notch 4 5,89 8,84

Receptor 1 utlenionych pochodnych lipoprotein o niskiej gęstości, postać OLR1 rozpuszczalna 2,84 8,41

P2RY14 purynoceptor 14 P2Y 2,63 4,63

PCDH17 Protokadheryna-17 1,7 7,36

PDGFRB receptor beta płytkowego czynnika wzrostu 2,68 10,48

cząsteczka adhezji płytek do komórek PECAM1 śródbłonka 7,7 10,85

67 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

PLXND1 Pleksyna-D1 5,02 11,68

PPAP2B Fosfohydrolaza fosforanu lipidów 3 4,17 12,46

PTAFR Receptor czynnika aktywującego płytki krwi 3,01 4,81

PTGER3 Podtyp EP3 receptora prostaglandyny E2 4,76 10,26

Receptor parathormonu/peptydu PTH1R podobnego do parathormonu 2,35 7,31

RAMP3 Białko 3 modyfikujące aktywność receptora 1,79 8,84

Transbłonowy receptor ROR2 kinazy ROR2 tyrozynowo-białkowej 3,2 5,98

S1PR1 Receptor 1 sfingozyno-1-fosforanu 5,17 6,51

SCARB1 Receptor zmiatacz klasy B członek 1 3,01 10,4

Członek 3 rodziny 13 nośników substancji SLC13A3 rozpuszczonych 3,32 7,89

SLC16A4 Transporter 5 monokarboksylanu 2,88 12,54

Zależne od sodu białko 4 transportujące SLC17A3 fosforan 1,58 11,55

SLC28A1 Kotransporter 1 sodu/nukleozydu 4,76 6,3

Rodzina 2 nośników substancji rozpuszczonych, członek 5 transporterów SLC2A5 ułatwionego transportu glukozy 2,74 8,5

SLC39A14 transporter cynku ZIP14 2,66 11,63

Zależny od sodu i chlorku transporter SLC6A13 GABA 2 2,75 7,44

Mała podjednostka 2 transportera dużych, SLC7A8 obojętnych aminokwasów 5,03 10,46

Członek 2A1 rodziny transporterów anionów organicznych substancji SLCO2A1 rozpuszczonych 3,46 8,06

TBXA2R Receptor tromboksanu A2 4,01 3,64

TGFBR2 receptor typu-2 dla TGF-beta 10,41 10,94

Białko 7A zawierające domenę THSD7A trombospondyny typu 1 3,05 8

68 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

TIE1 receptor Tie-1 kinazy tyrozynowo-białkowej 2,04 4,41

Białko 1 wiążące czynnik martwicy TNFRSF1A nowotworu 6,84 10,52

Członek 12 rodziny ligandów czynnika TNFSF12 martwicy nowotworu, postać wydzielana 4,35 4,1

VAMP5 Białko błonowe 5 związane z pęcherzykami 3,49 6,18

Tabela 9: markery antygenowe wyrażane na powierzchni zarówno komórek nowotworu wątroby, jak i komórek T

Względna ekspresja Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka w komórkach T komórkach raka okrężnicy

ABCB4 Białko oporności wielolekowej 3 2,02 3,7

Białko 10 zawierające domenę ADAM10 dysintegryny i metaloproteinazy 9,42 9,41

ATR Receptor 1 toksyny wąglika 6,98 9,9

Antygen 2 komórek zrębowych szpitu BST2 kostnego 7,38 12,45

BTN3A3 Członek A3 podrodziny 3 butyrofiliny 9,72 7,48

C9 Składnik dopełniacza C9b 2,41 10,52

Podjednostka delta receptora CHRND acetylocholiny 2,43 4,05

CLDN14 klaudyna-14 2,79 2,4

EPOR Receptor erytropoetyny 4,67 10,55

Receptor erbB-2 kinazy tyrozynowo- ERBB2 białkowej 2,36 14,12

F2RL3 Receptor 4 aktywowany proteinazą 2,17 2,61

GJB1 Białko połączenia szczelinowego beta-1 2,96 9,4

GPR126 Receptor 126 sprzężony z białkiem G 2,23 11,32

receptor typu 1 dla interleukiny 1, postać IL1R1 rozpuszczalna 2,88 12,57

ITGB1 Integryna beta-1 8,76 13,48

N-acetylowane alfa-połączone kwasowe NAALADL1 białko podobne do dipeptydazy 3,03 1,46

69 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka w komórkach T komórkach raka okrężnicy

OR7A5 Receptor węchowy 7A5 1,51 3,83

SGCD Sarkoglikan delta 3,99 7,21

Ig-podobna lektyna 6 wiążąca kwas SIGLEC6 sialowy 3,57 3,49

Sprzężony z sodem transporter SLC38A3 obojętnych aminokwasów 3 1,89 8,91

TFR2 białko 2 receptora transferyny 2,74 10,47

Tabela 10: Markery antygenowe wyrażane na powierzchni zarówno komórek nowotworu płuc, jak i komórek T Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

Członek 6 podrodziny B kaset wiążących ABCB6 ATP, mitochondrialna 2,88 9,82

Białko 1 związane z opornością ABCC1 wielolekową 7,05 8,16

ACCN1 Kanał jonowy wrażliwy na kwas 2 2,25 0,8

Białko 23 zawierające domenę ADAM23 dysintegryny i metaloproteinazy 2,51 4,73

ADORA1 receptor dla adenozyny A1 4,49 8,22

ADORA2B receptor dla adenozyny A2b 1,66 7,5

AJAP1 Adherens junction-associated protein 1 1,85 6,24

APLP1 C30 2,22 6,02

AQP3 Akwaporyna-3 8,38 13,88

Prawdopodobna ATPaza VD ATP10D transportująca fosfolipidy 2,43 7,4

Podjednostka alfa 3 ATPazy ATP1A3 przenoszącej sód/potas 3,01 3,13

Podjednostka beta 2 ATPazy ATP1B2 przenoszącej sód/potas 3,21 3,8

Podjednostka beta 3 ATPazy ATP1B3 przenoszącej sód/potas 8,6 14,26

Receptor UFO kinazy tyrozynowo- AXL białkowej 2,51 9,58

70 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

BEST1 Bestrofina-1 2,49 4,44

BTC Betacelulina 2,86 4,59

BTN3A1 Członek 1 podrodziny 3 butyrofiliny 10,66 11,63

CALCR Receptor dla kalcytoniny 2,95 8,62

Receptor typu 1 dla peptydu związanego CALCRL z genem kalcytoniny 2,12 7,67

CCR1 Receptor dla chemokiny C-C typu 1 2,63 9,77

CD163 rozpuszczalny CD163 2,66 8,76

CD300A Cząsteczka CMRF35-podobna 8 7,96 4,23

CD300A Cząsteczka CMRF35-podobna 8 2,29 4,23

CD68 makrosialina 4,02 8,92

Łańcuch gamma antygenu zgodności CD74 tkankowej HLA klasy II 9,1 13,44

CD86 antygen CD86 aktywacji limfocytów T 2,93 5,04

Podjednostka alfa 3 neuronalnego CHRNA3 receptora acetylocholiny 2,54 4,62

Podjednostka alfa 3 neuronalnego CHRNA3 receptora acetylocholiny 2 4,62

CKAP4 Białko 4 związane z cytoszkieletem 6,15 11,94

Regulator 2 kanału chlorkowego CLCA2 aktywowanego wapniem, postać 35 kDa 2,99 9,81

CLDN5 klaudyna-5 3,66 7,73

CLSTN1 CTF1-alfa 8,26 12,51

CNIH3 Protein cornichon homolog 3 2,7 6,09

COMT katecholo-O-metylotransferaza 7,78 12,13

CSPG5 Proteoglikan siarczanu chondroityny 5 2,84 5,69

CXCR6 Receptor chemokiny C-X-C typu 6 3,16 3,91

CXCR7 Atypowy receptor 3 chemokiny 2,5 8,95

DCHS1 Protokadheryna-16 4,29 2,28

DSC3 Desmokolina-2 2,82 8,95

DSG3 Desmogleina-3 2,23 10,73

71 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

Receptor naskórkowego czynnika EGFR wzrostu 3,8 10,92

FAT2 Protokadheryna Fat 2 2,25 9,29

Podjednostka gamma receptora epsilon immunoglobuliny o wysokim FCER1G powinowactwie 3,13 8,96

receptor I Fc immunoglobuliny gamma o FCGR1A wysokim powinowactwie 2,09 9,65

Receptor 3 czynnika wzrostu śródbłonka FLT4 naczyń 3,19 3,36

FPR2 Receptor 2 N-formylowanych peptydów 2,9 7,14

FURIN Furyna 6,42 7,5

FZD6 Frizzled-6 2,64 10,45

Podjednostka 2 receptora kwasu gamma GABBR2 aminomasłowego typu B 3,79 9,19

Podjednostka 3 receptora kwasu gamma GABRB3 aminomasłowego typu B 2,46 8,83

Podjednostka delta receptora kwasu GABRD gamma aminomasłowego typu B 1,72 1,67

Podjednostka epsilon receptora kwasu GABRE gamma aminomasłowego typu B 1,85 9,18

Receptor żołądkowego peptydu GIPR hamującego 3,43 5,37

GJA1 Białko połączenia szczelinowego alfa-1 2,84 12,65

GJB3 Białko połączenia szczelinowego beta-3 3,72 3,79

GJB5 Białko połączenia szczelinowego beta-5 1,77 6,69

GLRA2 Podjednostka alfa-2 receptora glicyny 2,26 6,15

Receptor 3 kwasu GPR109B hydroksykarboksylowego 1,77 2,91

GPR12 Receptor 12 sprzężony z białkiem G 2 1,76

Prawdopodobny receptor 176 sprzężony GPR176 z białkiem G 2,05 3,86

GPR50 Receptor związany z melatoniną 2,26 3,16

72 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

Jonotropowy receptor glutaminianu, GRIK1 kainowy 1 4,66 5,65

Jonotropowy receptor glutaminianu, GRIN2D NMDA 2D 2,17 2,32

HCRTR1 receptor oreksyny typu 1 2,34 3,56

antygen zgodności tkankowej HLA klasy HLA-DPA1 II, łańcuch DP alfa 1 8,31 12,86

antygen zgodności tkankowej HLA klasy HLA-DQA1 II, łańcuch DQ alfa 1 2,35 11,44

antygen zgodności tkankowej HLA klasy HLA-DQB1 II, łańcuch DQ beta 1 7,4 12,71

antygen zgodności tkankowej HLA klasy HLA-DRA II, łańcuch DR alfa 1 6,42 14,18

antygen zgodności tkankowej HLA klasy HLA-DRB4 II, łańcuch DR beta 1 2,72 11,24

IGSF9B Protein turtle homolog B 3,92 2,81

Białko pomocnicze receptora IL1RAP interleukiny-1 3,99 11,4

Białko 1 podobne do receptora IL1RL1 interleukiny-1 2,55 5,15

Podjednostka alfa rozpuszczalnego IL4R receptora interleukiny-4 4,15 9,56

Podjednostka alfa receptora interleukiny- IL7R 7 11,62 11,26

ITGA6 Łańcuch lekki alfa-6 integryny 7,99 12,76

JPH3 Junctophilin-3 2,34 2,5

Członek 3 podrodziny S kanału KCNS3 potasowego bramkowanego napięciem 2,45 8,91

receptor Kit czynnika wzrostu komórek KIT tucznych/macierzystych 2,85 8,67

KITLG Rozpuszczalny ligand KIT 2,58 7,27

Członek 3 podrodziny B LILRB3 immunoglobulinopodobnych receptorów 5,65 8,03

73 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

leukocytów

Członek 4 podrodziny B immunoglobulinopodobnych receptorów LILRB4 leukocytów 3,12 10,44

LPAR1 Receptor 1 kwasu lizofosfatydowego 4,12 5,47

LPHN3 Latrofilina-3 2,85 6,43

Przetworzona metaloproteinaza MMP24 macierzy -24 5,19 5,73

MPZ Białko mieliny P0 2,56 3,63

MUC4 Łańcuch beta mucyny-4 3,04 10,34

NCKAP1L Nck-associated protein 1-like 6,69 7,51

NKG7 Białko NKG7 10,92 3,66

NOTCH2 Wewnątrzkomórkowa domena Notch 2 6,62 6,22

NRCAM Cząstka adhezyjna komórki nerwowej 2,78 8,16

NRG2 Neuregulina-2 3,55 9,22

NRXN1 Neureksyna-1 2,56 5,33

NTRK2 Receptor czynników wzrostu BDNF/NT-3 2,56 10,7

NTSR1 receptor typu 1 neurotensyny 1,74 9,74

P2RY1 purynoceptor 1 P2Y 2,34 7,62

P2RY6 purynoceptor 6 P2Y 4,27 5,79

PCDH8 Protokadheryna-8 2,67 9,29

PCDHA3 Protokadheryna alfa-3 2,14 3,54

Białko 1 oddziałujące z kinazą 3 PIK3IP1 fosfatydyloinozytydu 8,68 3,47

PLXNA2 Pleksyna-A2 2,88 7,3

Przetworzone białko 4 związane z PRR4 receptorem wirusa Polio 3,24 8,02

Fosfataza tyrozynowo-białkowa epsilon PTPRE typu receptorowego 6,03 7,92

Fosfataza tyrozynowo-białkowa U typu PTPRO receptorowego 10,46 9,01

PTPRU Fosfataza tyrozynowo-białkowa U typu 3,72 6,18

74 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

receptorowego

RABAC1 Prenylowane białko akceptorowe Rab 1 7,54 8,82

SCTR Receptor dla sekretyny 2,2 2,48

SECTM1 Wydzielane i transbłonowe białko 1 2,42 6,9

SGCE Sarkoglikan Epsilon 2,15 9,65

SGCG Sarkoglikan Gamma 2,56 5,74

SLC16A3 Transporter 4 monokarboksylanu 5,89 12,72

SLC16A7 Transporter 2 monokarboksylanu 5,39 6,97

Zależny od sodu transporter fosforanowy SLC20A2 2 2,51 12,69

SLC26A4 Pendryna 3,57 9,39

Rodzina nośników substancji rozpuszczonych 2, członek 1 transporterów ułatwionego transportu SLC2A1 glukozy 5,1 5,83

SLC4A7 kotransporter 3 wodorowęglanu sodu 4,89 8,7

Członek rodizny 3A1 transporterów nośników anionów organicznych SLCO3A1 substancji rozpuszczonych 4,87 7,91

SYNE2 Nespryna-2 9,43 10,43

TACR2 Receptor substancji-K 2,23 6,68

Białko receptora transferryny 1, postać TFRC surowicza 7,32 14,31

TMEFF1 Tomoregulina-1 3,22 5,05

Łańcuch katalityczny transbłonowej proteazy serynowej 11D TMPRSS11D 2,35 8,32

Tabela 11: Markery antygenowe ulegające ekspresji na powierzchni zarówno komórek nowotworu jajnika, jak i komórek T

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

75 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

ACVR2B receptor aktywiny typu-2B 2,1 4,26

Białko 28 zawierające domenę ADAM28 dysintegryny i metaloproteinazy 2,83 9,22

ADRA2C Adrenergiczny receptor Alfa-2C 4,6 5,13

ATPaza 1 transportująca wapń błony ATP2B1 komórkowej 5,3 11,49

ATPaza 4 transportująca wapń błony ATP2B4 komórkowej 8,21 10,1

ATP7A ATPaza transportująca jony miedzi 1 3,91 7,31

CD200 Glikoproteina błonowa OX-2 2,83 10,51

CD47 antygen powierzchniowy leukocytów CD47 9,88 10,42

CDH12 kadheryna-12 2,31 5,91

CDH18 kadheryna-18 2,28 4,79

CDH2 kadheryna-2 3,72 11,97

CDH6 kadheryna-6 2,77 8,68

CDP diacyloglicerolo-3- CDIPT fosfatydylotransferaza 8,88 10,73

Cadherin EGF LAG seven-pass G-type CELSR2 receptor 2 2,66 8,38

CHRNA1 Podjednostka alfa receptora acetylocholiny 2,42 5,71

CLSTN3 kalsyntenina-3 3,87 4,54

CX3CR1 Receptor 1 chemokiny CX3C 9 11,42

Receptor 1 zawierający nabłonkową DDR1 domenę dyskoidynową 3,83 12,36

EPHA1 receptor efryny 1 typu A 2,02 5,96

EPHA4 receptor efryny 4 typu A 2,39 8,56

ERBB4 Domena wewnątrzkomórkowa ERBB4 2,29 9,76

FGFR1 Receptor 1 czynnika wzrostu fibroblastów 5,42 11,4

FGFR3 Receptor 3 czynnika wzrostu fibroblastów 2,95 11,35

FZD2 Frizzled-2 1,91 8,06

FZD7 Frizzled-7 2,55 10,24

76 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

Białko połączenia szczelinowego alfa-4 GJA4 protein 2,04 6,7

Prawdopodobny receptor 125 sprzężony z GPR125 białkiem G 2,35 7,88

GPR56 C-końcowy fragment GPR56 8,6 11,27

GPR64 receptor 64 sprzężony z białkiem G 2,04 8,57

GPRC5B receptor sprzężony z białkiem G C5B 1,96 10,29

GRIA2 Receptor 2 glutaminianu 1,96 11,78

Jonotropowy receptor glutaminianu, GRIK5 kainowy 5 5,79 3,36

Jonotropowy receptor dla glutaminianu, GRIN2A NMDA 2A 1,68 2,96

HEG1 Homolog 1 białka HEG 4,8 10,1

HRH1 Receptor dla histaminy H1 2,31 6,26

HTR3A receptor 3A 5-hydroksytryptaminy 2,1 9,35

Białko transbłonowe 2 indukowane IFITM2 interferonem 10,27 11,36

Białko transbłonowe 3 indukowane IFITM3 interferonem 8,55 13,48

Członek 2 podrodziny H kanału KCNH2 potasowego bramkowanego napięciem 2,09 5,36

Wrażliwy na ATP wewnątrzprostowniczy KCNJ12 kanał potasowy 12 2,29 2,21

Cząsteczka adhezji komórek nerwowych L1CAM L1 2,61 8,73

Receptor 5 sprzężony z białkiem G LGR5 zawierający powtórzenia bogate w leucynę 2,45 12,12

LPHN1 Latrofilina-1 4,5 5,56

LPHN1 Latrofilina-1 1,63 5,56

LPHN2 Latrofilina-2 1,93 7,14

MGA Glukoamylaza 5,15 5,65

NEO1 Neogenina 1,85 10,31

77 EP 3 105 317 B1

Względna Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka ekspresja w komórkach raka komórkach T okrężnicy

NPTN Neuroplastyna 8,46 13,14

NRG1 Neuregulina-1 2,61 6,53

Receptor czynnika wzrostu nerwów o NTRK1 wysokim powinowactwie 2,09 2,49

PCDH7 Protokadheryna-7 2,89 8,52

PCDH9 Protokadheryna-9 2,99 6,15

Receptor alfa płytkopochodnego czynnika PDGFRA wzrostu 3,69 8,44

Receptor alfa płytkopochodnego czynnika PDGFRA wzrostu 2,26 8,44

PLXNB1 Pleksyna-B1 2,26 6,71

PLXNB2 Pleksyna-B2 3,1 10,68

PODXL podokaliksyna 2,73 11,41

PRSS8 Łańcuch ciężki prostazyny 2,07 10,77

PTH2R Receptor 2 parathormonu 1,85 8,67

Białko 3 związane z receptorem wirusa PVRL3 polio 2,56 10,15

Podjednostka alfa kanału sodowego SCNN1A wrażliwego na amyloryd 5,97 10,63

SLC29A2 Równoważny transporter nukleozydów 2 2,93 1,89

SSPN Sarkospan 3,49 9,16

STAR Receptor enterotoksyny ciepłostałej 2,36 7,13

TGFA Transformujący czynnik wzrostu alfa 2,64 1,71

Białko 1 zawierające domenę transbłonową TMED1 emp24 4,79 9,3

TMEM59 Białko transbłonowe 59 8,83 12,74

Członek 25 nadrodziny receptorów TNFRSF25 czynnika martwicy nowotworu 7,53 4,27

Receptor TYRO3 kinazy tyrozynowo- TYRO3 białkowej 4,11 10,27

UPK2 Uroplakina-2 2,29 7,49

78 EP 3 105 317 B1

Tabela 12: Markery antygenowe ulegające ekspresji na powierzchni zarówno komórek nowotworu trzustki, jak i komórek T

Względna ekspresja Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka w komórkach T komórkach raka okrężnicy

Białko 9 zawierające domenę dysintegryny ADAM9 i metaloproteinazy 3,49 10,99

Przetworzona beta-1,4- B4GALT1 galaktozylotransferaza 1 7,44 8,99

BDKRB2 Receptor dla bradykininy B2 2,52 4,44

CA9 Anhydraza węglanowa 9 3,34 11,9

Podjednostka alfa 1C kanału wapniowego CACNA1C typu L zależnego od napięcia 2,36 4,54

CD58 Antygen 3 związany z funkcją limfocytów 6,51 8,16

CDH11 kadheryna-11 2,85 10,38

CDH3 kadheryna-3 1,96 10,91

Regulator przewodzenia CFTR transmembranowego mukowiscydozy 3,12 11,45

Podjednostka beta-4 receptora CHRNB4 neuronalnego acetylocholiny 2,38 0,66

CLDN10 klaudyna-10 2,36 11,5

CXCR4 receptor typu 4 chemokiny C-X-C 11,74 10,98

DAG1 Dystroglikan Beta 5,65 10,98

Receptor 2 zawierający domenę DDR2 dyskoidynową 2,34 8

DMPK Białkowa kinaza miotoninowa 3,7 4,21

FAT1 Protokadheryna Fat 1, postać jądrowa 3,3 12,45

HTR2B receptor 2B 5-hydroksytryptaminy 2,22 7,73

LDLR receptor lipoproteiny o niskiej gęstości 2,93 12,14

NCKAP1 Białko 1 związane z Nck 3,34 11,99

PMP22 białko 22 mieliny obwodowej 2,09 10,66

Białko 2 zawierające patatyno-podobną PNPLA2 domenę fosfolipazy 5,46 3,45

Białko 2 zawierające patatyno-podobną PNPLA2 domenę fosfolipazy 2,35 3,45

TEK Receptor angiopoetyny 1 3,87 8,52

79 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka w komórkach T komórkach raka okrężnicy

TGFBR1 receptor TGF-beta typu-1 2,17 4,3

Tabela 13: Markery antygenowe ulegające ekspresji na powierzchni zarówno komórek nowotworu prostaty, jak i komórek T

Względna ekspresja Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka w komórkach T komórkach raka okrężnicy

ACCN3 Kanał jonowy 3 wrażliwy na kwas 2,47 2,03

ADRB1 receptor adrenergiczny beta-1 2,85 5,09

ADRB2 receptor adrenergiczny beta-2 5,74 9,43

AGTR1 Receptor angiotensyny II typu-1 2,81 11,62

APLP2 Białko 2 podobne do amyloidu 7,06 13,06

Podjednostka alfa-2 ATPazy ATP1A2 transportującej sód/potas 3,07 7,55

Prawdopodobna ATPaza IA transportująca ATP8A1 fosfolipidy 7,23 9,16

CADM1 Cząsteczka adhezji komórkowej 1 4,42 12,28

receptor muskarynowy M3 dla CHRM3 acetylocholiny 1,85 9,23

Podjednostka alfa-2 neuronalnego CHRNA2 receptora dla acetylocholiny 2,83 5,34

CXADR Receptor Coxsackie i adenowirusowy 3,31 12,74

Dipeptydylopeptydaza 4 postać DPP4 rozpuszczalna 6,42 11,22

ECE1 enzym 1 konwertujący endotelinę 7,14 4,7

ENPP4 Bis(5'-adenozyl)o-trifosfataza ENPP4 6,57 7,49

EPHA3 receptor 3 efryny typu A 2,84 7,85

Członek 2 podrodziny H kanałów ERG potasowych bramkowanych napięciem 2,72 11,3

Piezo-type mechanosensitive ion channel FAM38A component 1 8,4 9,57

FOLH1 karboksypeptydaza glutaminianu 2 2,96 13,18

Podjednostka alfa-2 receptora kwasu GABRA2 gamma-aminomasłowego 3 6,42

GHR Białko wiążące hormon wzrostu 2,52 6,84

80 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka w komórkach T komórkach raka okrężnicy

Glikoproteina błonowa komórek nerwowych GPM6B M6-b 3,22 6,56

Prawdopodobny receptor 116 sprzężony z GPR116 białkiem G 3,69 10,09

EGF-podobny czynnik wzrostu wiążący HBEGF heparynę 2,87 8,12

JAM3 Junctional adhesion molecule C 4,29 7,26

Członek 3 podrodziny D kanałów KCND3 potasowych bramkowanych napięciem 3,09 9,77

LIFR Receptor czynnika hamującego białaczkę 2,71 6,8

Lipopolysaccharide-responsive and beige- LRBA like anchor protein 5,35 9,26

MME Neprylizyna 2,62 8,05

NOV Pleksyna-A1 2,43 10,41

NRP1 Neuropilina-1 3,17 7,85

OPRK1 Receptor opioidowy typu Kappa 2,07 4,92

PLXNB3 Pleksyna-B3 2,57 3,59

PPAP2A Fosfohydrolaza fosforanu lipidowego 1 3,6 11,55

Białko błonowe związane z nośnikiem SCAMP5 wydzielniczym 5 3,03 8,43

Członek 2 rodziny 23 nośników substancji SLC23A2 rozpuszczonych 3,55 7,04

Rodzina nośników substancji rozpuszczonych 2, członek transporterów SLC2A4 ułatwionego transportu glukozy 4 2,67 5,96

Sprzężony z protonem transporter SLC36A1 aminokwasów 1 3,38 9,28

Elektrogenny kotransporter wodorowęglanu SLC4A4 sodu 1 3,14 11,29

STIM1 Cząsteczka interakcji zrębowych 1 3,68 6,51

Łańcuch katalityczny transbłonowej TMPRSS2 proteazy serynowej 2 2,67 9,63

Członek 6 podrodziny V kanału TRPV6 kationowego związanego z receptorami 4,84 8,09

81 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja Względna ekspresja w Antygen Nazwa białka w komórkach T komórkach raka okrężnicy

przejściowego potencjału

Receptor 1 wazoaktywnego polipeptydu VIPR1 jelitowego 4,41 7,73

YIPF3 białko YIPF3, 36 kDa postać III 4 4,3

Tabela 14: Markery antygenowe wyrażane na powierzchni komórek T i ulegające nadekspresji w komórkach płynnych guzów (ALL, AML, CML, MDS, CLL, CTRL)

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

CD63 Antygen CD63 0,83

CXCR4 receptor chemokiny C-X-C typu 4 0,82

IFITM2 białko transbłonowe 2 indukowane interferonem 0,82

ITM2B Peptyd Bri23 0,81

BTF3 członek A2 nadrodziny 3 butyrofiliny 0,8

HLA-DRB1 Antygen zgodności tkankowej HLA klasy II, łancuch beta DRB1-12 0,79

HLA-DRA Antygen zgodności tkankowej HLA klasy II, łańcuch alfa DR 0,78

IFITM3 białko transbłonowe 3 indukowane interferonem 0,78

NKG7 białko NKG7 0,78

Podjednostka gamma receptora epsilon immunoglobuliny o FCER1G 0,78 wysokim powinowactwie

IFITM1 białko transbłonowe 1 indukowane interferonem 0,76

NPTN Neuroplastyna 0,76

GYPC Glikoforyna-C 0,76

GPR160 Prawdopodobny receptor 160 sprzężony z białkiem G 0,76

HLA-DPB1 Antygen zgodności tkankowej HLA klasy II, łancuch beta 1 DP 0,75

BRI3 CT-BRI3 0,75

SLC38A2 Sprzężony z sodem transporter obojętnych aminokwasów 2 0,74

C5AR1 receptor chemotaktyczny 1 anafilatoksyny C5a 0,74

CDIPT CDP diacyloglicerolo-3-fosfatydylotransferaza 0,73

Członek 13b nadrodziny ligandów czynnika martwicy nowotworu, TNFSF13B 0,73 postać rozpuszczalna

CSF3R Receptor czynnika stymulującego wzrost kolonii granulocytów 0,73

HLA-DPA1 Antygen zgodności tkankowej HLA klasy II, łańcuch DP alfa 1 0,71

82 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

CD164 Białko rdzenia sialomucyny 24 0,71

CD97 Podjednostka beta antygenu CD97 0,7

C3AR1 receptor chemotaktyczny anafilatoksyny C3a 0,69

P2RY8 purynoceptor 8 P2Y 0,68

BSG Basigina 0,68

APLP2 Białko 2 podobne do amyloidu 0,67

TFRC Białko 1 receptora transferyny, postać surowicza 0,67

MGAM Glukoamylaza 0,67

GYPA Glikoforyna-A 0,67

TMED10 Białko 10 zawierające transbłonową domenę emp24 0,66

FCGRT Duża podjednostka p51 receptora FcRn IgG 0,66

CKAP4 Białko 4 związane z cytoszkieletem 0,66

DYSF Dysferlina 0,66

SPPL2A Peptyd sygnałowy peptydazopodobny 2A 0,65

LAMP2 Glikoproteina błonowa 1 związana z lizosomem 0,65

Mała podjednostka 1 transportera dużych, obojętnych SLC7A5 0,65 aminokwasów

TNFRSF1B Białko 2 wiążące czynnik martwicy nowotworu 0,64

TREM1 Receptor wyzwalający ekspresję na komókach szpikowych 1 0,64

GPR183 Receptor 183 sprzężony z białkiem G 0,63

SERINC3 Inkorporator seryny 3 0,63

CD58 Antygen 3 związany z funkcją limfocytów 0,63

GYPB Glikoforyna-B 0,63

RABAC1 Prenylowane białko akceptorowe Rab 1 0,62

Członek 2 podrodziny H kanałów potasowych bramkowanych KCNH2 0,62 napięciem

FPR1 Receptor fMet-Leu-Phe 0,62

P2RY13 purynoceptor 13 P2Y 0,62

CLEC5A Domena lektyny typu C, rodzina 5 członek A 0,62

SLC7A7 Transporter 1 aminokwasów Y+L 0,61

MICB Sekwencja B związana z polipeptydem MHC klasy I 0,61

83 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

CD300LF Cząsteczka CMRF35-podobna 1 0,61

GJB6 Białko połączenia szczelinowego beta-6 0,61

ATP1A1 Podjednostka alfa 1 ATPazy transportującej sód/potas 0,6

PTGER4 Podtyp EP4 receptora prostaglandyny E2 0,6

CD8A Łańcych alfa glikoproteiny powierzchniowej CD8 komórek T 0,6

PTGER2 Podtyp EP2 receptora prostaglandyny E2 0,6

GPR97 Prawdopodobny receptor 97sprzężony z białkiem G 0,6

IMP3 Peptyd sygnałowy peptydazopodobny 2A 0,59

LAMP1 Glikoproteina błonowa związana z lizosomem 1 0,59

Członek 3 podrodziny B immunoglobulinopodobnych receptorów LILRB3 0,59 leukocytów

GPR109B receptor 3 kwasów hydrokarboksylowych 0,59

SAT2 Sprzężony z sodem transporter obojętnych aminokwasów 2 0,58

GPR65 Receptor psychozyny 0,58

AMICA1 Junctional adhesion molecule-like 0,58

Fosfoproteina związana z mikrodomenami wzbogaconymi w PAG1 0,58 glikosfingolipidy 1

ENPP4 Bis(5'-adenozylo)-trifosfataza ENPP4 0,57

SLC40A1 Członek 1 rodziny 40 nośników substancji rozpuszczonych 0,57

Receptor 1 utlenionych pochodnych OLR1 0,57 lipoprotein o niskiej gęstości, postać rozpuszczalna

LRRC33 Ujemny regulator reaktywnych form tlenu 0,56

IL7R Podjednostka alfa receptora dla Interleukiny-7 0,56

LAIR1 Związany z leukocytami receptor immunoglobulinopodobny 1 0,56

ITM2C CT-BRI3 0,56

GPR84 receptor 84 sprzężony z białkiem G 0,56

SLC12A7 Członek 7 rodziny 12 nośników substancji rozpuszczonych 0,55

PTAFR Receptor czynnika aktywującego płytki krwi 0,55

CD33 Antygen powierzchniowy CD33 komórek szpikowych 0,55

SLC22A16 Członek 16 rodziny 22 nośników substancji rozpuszczonych 0,55

CCR7 receptor chemokiny C-C typu 7 0,54

84 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

TLR1 receptor 1 Toll-podobny 0,54

TGOLN2 Integralne białko błonowe sieci Trans-Golgi 2 0,54

YIPF3 białko YIPF3, 36 kDa postać III 0,54

BST2 Antygen zrębowy szpiku kostnego 2 0,54

MAGT1 Białko 1 transportera magnezu 0,54

TMEM173 Białko stymulatora genów interferonu 0,54

ERMAP Białko związane z błoną erytrocytową 0,54

CEACAM1 cząsteczka adhezji komórkowej antygenu płodowo-rakowego 0,54

NIPA2 Transporter magnezu NIPA2 0,53

PECAM1 cząsteczka adhezyjna płytka krwi-komórka śródbłonka 0,53

CD1D Glikoproteina CD1d prezentująca antygen 0,53

TMEM59 Białko transbłonowe 59 0,53

NCKAP1L Białko 1 związane z Nck 0,53

FAS członek 6 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu 0,53

IL6R Podjednostka alfa receptora interleukiny-6 0,53

TNFRSF1A Białko wiążące czynnik martwicy nowotworu 1 0,53

KEL Glikoproteina grupy krwi Kell 0,53

TMEM149 receptor 1 rodziny IGF-podobnej 0,52

SLC3A2 łańcuch ciężki antygenu powierzchni komórki 4F2 0,52

ORAI1 Białko 1 kanału wapniowego aktywowanego uwalnianiem wapnia 0,52

XKR8 Białko 8 związane z XK, postać przetworzona 0,52

C9orf46 receptor plazminogenu (KT) 0,52

TMEM127 Białko transbłonowe 127 0,52

Rodzina 2 nośników substancji rozpuszczonych, członek 1 SLC2A1 0,52 transporterów ułatwionego transportu glukozy

receptor IB Fc immunoglobuliny gamma o wysokim FCGR1B 0,52 powinowactwie

CXCR2 receptor chemokiny C-X-C typu 2 0,52

IL4R Podjednostka alfa rozpuszczalnego receptora interleukiny 4 0,51

HSD17B7 Reduktaza 3-ketosteroidu 0,51

SEMA4D Semaforyna-4D 0,51

85 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

ZDHHC5 palmitoilotransferaza ZDHHC5 0,51

ADRB2 Receptor adrenergiczny beta-2 0,51

S1PR4 receptor 4 sfingozyno-1-fosforanu 0,51

PILRA Sparowany immunoglobulinopodobny receptor alfa typu 2 0,51

LTB4R Receptor 1 dla leukotrienów B4 0,51

SORT1 Sortilina 0,51

Członek 4C1 rodziny transporterów anionów organicznych SLCO4C1 0,51 substancji rozpuszczonych

ANO10 Anoktamina-10 0,51

CLSTN1 CTF1-alfa 0,5

RHBDF2 Nieaktywne białko romboidalne 2 0,5

CCR1 receptor chemokiny C-C typu 1 0,5

EPCAM Cząsteczka adhezyjna komórek nabłonkowych 0,5

PNPLA2 Białko 2 zawierające patatyno-podobną domenę fosfolipazy 0,49

SLC12A6 członek 6 rodziny 12 nośników substancji rozpuszczonych 0,49

SLC30A1 transporter 1 cynku 0,49

GPR27 Prawdopodobny receptor 27 sprzężony z białkiem G 0,49

EPOR receptor erytropoetyny 0,49

łańcuch alfa białka związany z kompleksem receptora CD79A 0,48 antygenowego komórek B

HLA-DQB1 Antygen zgodności tkankowej HLA klasy II, łańcuch DQ beta 1 0,48

Białko wiążące glikoproteinę o wysokiej gęstości 1 z kotwicą HBP1 0,48 glikozylofosfatydyloinozytolową

ABCA7 Kaseta wiążąca ATP podrodzina A członek 7 0,48

RAG1AP1 transporter cukru SWEET1 0,48

CD47 Antygen powierzchniowy leukocytów CD47 0,48

CXCL16 motyw C-X-C chemokiny 16 0,48

SLC14A1 transporter mocznika 1 0,48

TGFBR2 receptor typu-2 TGF-beta 0,47

LRBA Lipopolysaccharide-responsive and beige-like anchor protein 0,47

MFSD5 transporter anionów molibdenianowych 0,47

86 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

RELT członek 19L nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu 0,47

ATP2B4 ATPaza 4 transportująca wapń błony komórkowej 0,47

FURIN furyna 0,47

GAPT białko GAPT 0,47

NFAM1 Cząsteczka 1 aktywacji NFAT 0,47

ATP2B1 ATPaza 1 transportująca wapń błony komórkowej 0,46

SLC26A11 Niezależny od sodu transporter anionu siarczanowego 0,46

STX4 Syntaksyna-4 0,46

NAT1 Sprzężony z sodem transporter obojętnych aminokwasów 3 0,46

STIM1 Cząsteczka interakcji zrębowej 1 0,46

SLC39A4 transporter cynku ZIP4 0,46

ESYT2 Extended synaptotagmin-2 0,46

TM7SF3 Transmembrane 7 superfamily member 3 0,46

SEMA4A Semaforyna-4A 0,46

CYBB Łańcuch ciężki cytochromu b-245 0,46

FCAR receptor alfa Fc immunoglobuliny 0,46

GABBR1 Podjednostka 1 receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu B 0,45

CD53 Antygen powierzchnowy leukocytów CD53 0,45

SIGLEC10 Ig-podobna lektyna 10 wiążąca kwas sialowy 0,45

S1PR1 Receptor 1 sfingozyno-1-fosforanu 0,45

BTN3A2 członek A2 podrodziny 3 butyrofiliny 0,45

NOTCH2 Domena wewnątrzkomórkowa Notch 2 0,45

PIK3IP1 Białko 1 oddziałujące z kinazą 3 fosfatydyloinozytydu 0,45

FAM168B Związany z mieliną inhibitor przerostu neurytów 0,45

LPAR2 receptor 2 kwasu lizofosfatydowego 0,45

ATP1B3 Podjednostka beta-3 ATPazy transportującej sód/potas 0,45

FLVCR1 Białko 1 receptora podgrupy C wirusa kociej białaczki 0,45

SECTM1 Wydzielnicze i transbłonowe białko 1 0,45

SLC38A5 Sprzężony z sodem transporter obojętnych aminokwasów 5 0,45

GPR18 receptor N-arachidonyloglicyny 0,44

LMBR1L białko LMBR1L 0,44

87 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

ABCC1 Białko 1 związane z opornością wielolekową 0,44

SLC22A18 członek 18 rodziny 22 nośników substancji rozpuszczonych 0,44

CSF1R Receptor 1 czynnika stymulującego wzrost kolonii makrofagów 0,44

Mucynopodobny receptor hormonalny 1 zawierający moduł EGF- EMR1 0,44 podobny

FPR2 Receptor 2 N-formylowanych peptydów 0,44

KIT receptor Kit czynnika wzrostu komórek tucznych/macierzystych 0,44

MS4A1 Antygen limfocytów B CD20 0,43

MICA Sekwencja A związana z polipeptydem MHC klasy I 0,43

rodzina 52 nośników substancji rozpuszczonych, transporter GPR172A 0,43 ryboflawiny, członek 2

F11R Junctional adhesion molecule A 0,43

ADAM10 Białko 10 zawierające domenę dysintegryny i metaloproteinazy 0,43

FAM38A Piezo-type mechanosensitive ion channel component 1 0,43

CD68 Makrosialina 0,43

SLC26A6 członek 6 rodziny 26 nośników substancji rozpuszczonych 0,43

MCOLN1 Mukolipina-1 0,43

Członek 3A1 rodziny transporterów anionów organicznych SLCO3A1 0,43 substancji rozpuszczonych

PPAP2B Fosfohydrolaza fosforanu lipidów 3 0,43

ICAM4 Cząsteczka adhezji wewnątrzkomórkowej 4 0,43

CXCR1 receptor chemokiny C-X-C typu 1 0,43

CD300A Cząsteczka CMRF35-podobna 8 0,43

RELL1 RELT-podobne białko 1 0,43

TAPBPL Białko związane z tapasyną 0,42

receptor II-c regionu Fc immunoglobuliny gamma o niskim FCGR2C 0,42 powinowactwie

SLC16A6 transporter 7 monokarboksylanu 0,42

TMED1 Białko 1 zawierające domenę transbłonową emp24 0,42

CD86 antygen CD86 aktywacji limfocytów T 0,42

SLC16A3 transporter 4 monokarboksylanu 0,42

SLC2A5 rodzina 2 nośników substancji rozpuszczonych, członek 5 0,42

88 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

transporterów ułatwionego transportu glukozy

SLC29A1 Równoważny transporter nukleozydu 1 0,42

SLC16A14 transporter 14 kwasów monokarboksylowych 0,42

P2RY2 purynoceptor 2 P2Y 0,42

SUCNR1 receptor 1 dla bursztynianu 0,42

BTN3A1 członek A1 podrodziny 3 butyrofiliny 0,41

LAT2 Łącznik do aktywacji członka 2 rodziny komórek T 0,41

PLXND1 Pleksyna-D1 0,41

ECE1 enzym 1 konwertujący endotelinę 0,41

TGFBR1 receptor TGF-beta typu-1 0,41

CCRL2 C-C chemokine receptor-like 2 0,41

TFR2 Białko 2 receptora transferyny 0,41

SLC44A1 Białko 1 podobne do transportera choliny 0,41

ITGA6 Lekki łańcuch integryny alfa-6 0,41

PMP22 Białko 22 mieliny obwodowej 0,41

LAX1 Adapter transbłonowy limfocytów 1 0,4

AMIGO2 Białko 2 indukowane amfoteryną 0,4

SLC38A1 Sprzężony z sodem transporter obojętnych aminokwasów 1 0,4

SLC41A1 członek 1 rodziny 41 nośników substancji rozpuszczonych 0,4

C2orf89 Metalloproteaza TIKI1 0,4

ABCC10 Białko 7 oporności wielolekowej 0,4

CLDN15 klaudyna-15 0,4

SLC39A6 transporter cynku ZIP6 0,4

SLC16A5 transporter 6 monokarboksylanu 0,4

TTYH3 Protein tweety homolog 3 0,4

ATP7A ATPaza 1 transportująca jony miedzi 0,4

COMT O-metylotransferaza katecholowa 0,4

SLC17A5 Sialina 0,4

TMIGD2 Białko 2 zawierające domenę transbłonową i immunoglobulinową 0,4

CLEC7A Domena lektynowa typu C rodzina 7 członek A 0,4

SLC31A1 Białko wychwytu miedzi o wysokim powinowactwie 1 0,4

89 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

LRRC4 Białko 4 zawierające powtórzenia bogate w leucynę 0,4

P2RY10 Przypuszczalny purynoceptor 10 P2Y 0,39

ATP10D Prawdopodobna ATPaza VD transportująca fosfolipidy 0,39

BTN3A3 członek A3 podrodziny 3 butyrofiliny 0,39

LIME1 Adapter transbłonowy 1 oddziałujący z Lck 0,39

TNF Czynnik martwicy nowotworu, postać rozpuszczalna 0,39

PAQR8 receptor beta progestyny błonowej 0,39

OXER1 Oxoeicosanoid receptor 1 0,39

TRAT1 Transbłonowy adapter 1 związany z receporem komórek T 0,39

GPBAR1 Receptor 1 kwasów żółciowych sprzężony z białkiem G 0,39

SLC36A1 Sprzężony z protonem transporter aminokwasów 1 0,39

PTPRE Fosfataza tyrozynowo-białkowa epsilon typu receptorowego 0,39

PROM1 Prominina-1 0,39

CD74 Łańcuch gamma antygenu zgodności tkankowej HLA klasy II 0,38

CNST konsortyna 0,38

TMEM49 Białko błonowe wakuol 1 0,38

CLIC4 Białko 4 chlorkowego kanału wewnątrzkomórkowego 0,38

N-acetylowane alfa-połączone kwasowe białko podobne do NAALADL1 0,38 dipeptydazy

ANTXR2 Receptor 2 toksyny wąglika 0,38

FGFR1 receptor 1czynnika wzrostu fibroblastów 0,38

IL1RAP Białko pomocnicze receptora interleukiny-1 0,38

ATP1B2 Podjednostka beta-2 ATPazy transportującej sód/potas 0,38

ABCG2 Kaseta wiążąca ATP podrodzina G członek 2 0,38

CLEC12A Domena lektynowa typu C rodzina 12 członek A 0,38

HLA-DQA1 Antygen zgodności tkankowej HLA klasy II, łańcuch alfa 1 DQ 0,37

B4GALT1 Przetworzona beta-1,4-galaktozylotransferaza 1 0,37

CNNM3 transporter metali CNNM3 0,37

ATP1B1 Podjednostka beta-1 ATPazy transportującej sód/potas 0,37

SLC39A1 transporter cynku ZIP1 0,37

ATRN Atraktyna 0,37

90 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

CYSLTR1 receptor 1 leukotrienów cysteinylowych 0,37

Członek 2 podrodziny V kanału kationowego związanego z TRPV2 0,37 receptorami przejściowego potencjału

SLC27A1 Białko 1 transportu długołańcuchowych kwasów tłuszczowych 0,37

GPR171 Prawdopodobny receptor sprzężony z białkiem G 171 0,37

DAGLB Sn1-specyficzna lipaza diacyloglicerolowa beta 0,37

Członek 1 podrodizny KQT kanałów potasowych bramkowanych KCNQ1 0,37 napięciem

FZD6 Frizzled-6 0,37

Podjednostka alfa receptora czynnika stymulującego kolonie CSF2RA 0,37 granulocytów

PTH2R Receptor parathormonu 2 0,37

MARCH1 ligaza MARCH1 ubikwityny E3 0,36

BACE2 Beta-sekretaza 2 0,36

CD5 Glikoproteina powierzchniowa komórek T CD5 0,36

TMEM219 Receptor białka 3 wiążącego insulinopodobny czynnik wzrostu 0,36

XPR1 Ksenotropowy i politropowy receptor 1 retrowirusa 0,36

CD1C Glikoproteina powierzchniowa komórek T CD1c 0,36

CNNM2 transporter metali CNNM2 0,36

TMEM88 Białko transbłonowe 88 0,36

ICOS Indukowalny kostymulator komórek T 0,36

Lektynopodobny receptor komórek cytotoksycznych podrodzina G KLRG1 0,36 członek 1

LRP8 Białko 8 receptora lipoproteiny o niskiej gęstości 0,36

F2R receptor 1 aktywowany proteinazą 0,36

HM13 mniejszy antygen zgodności tkankowej H13 0,36

Mucynopodobny receptor hormonalny 2 zawierający moduł EGF- EMR2 0,36 podobny

TREML1 Trem-like transcript 1 protein 0,36

C17orf60 Allergina-1 0,36

GPR146 Prawdopodobny receptor 146 sprzężony z białkiem G 0,36

SLAMF6 członek 6 rodziny SLAM 0,35

91 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

SLC7A6 Transporter 2 aminokwasów Y+L 0,35

RELL2 RELT-podobne białko 2 0,35

Receptor 6 sprzężony z białkiem G zawierający powtórzenia LGR6 0,35 bogate w leucynę

PANX1 Paneksyna-1 0,35

Białko 4 zawierające domenę klasy A receptora lipoprotein o C18orf1 0,35 niskiej gęstości

SLMAP Białko związane z sarkolemą 0,35

CCR5 receptor typu 5 dla chemokiny C-C 0,35

MUC1 Podjednostka beta mucyny-1 0,35

Podjednostka beta mucynopodobnego receptora hormonalnego 3 EMR3 0,35 zawierającego moduł EGF-podobny

COL23A1 Łańcuch alfa-1 kolagenu (XXIII) 0,35

OR2W3 receptor węchowy 2W3 0,35

LNPEP Aminopeptydaza leucylo-cystynylowa, forma surowicy ciążowej 0,34

PRR7 Białko 7 bogate w prolinę 0,34

NOTCH1 Domena wewnątrzkomórkowa Notch 1 0,34

Nośnik substancji rozpuszczalnych rodzina 52, transporter RFT1 0,34 ryboflawiny, członek 1

TNFRSF25 Członek nadrodziny receptora czynnika martwicy nowotworu 0,34

ANO6 Anoktamina-6 0,34

AQP3 Akwoporyna-3 0,34

ADAM9 Białko 9 zawierające domenę dysintegryny I metaloproteinazy 0,34

INSR Podjednostka beta receptora insuliny 0,34

FZD5 Frizzled-5 0,34

Członek 2 podrodziny H kanałów potasowych bramkowanych ERG 0,34 napięciem

MME Neprylizyna 0,34

receptor II-b regionu Fc immunoglobuliny gamma o niskim FCGR2B 0,33 powinowactwie

LSR Receptor lipoproteinowy stymulowany lipolizą 0,33

DDR1 Epithelial discoidin domain-containing receptor 1 0,33

92 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

CNR2 receptor kanabinoidowy 2 0,33

ATR receptor 1 toksyny wąglika 0,33

P2RY14 purynoceptor 14 P2Y 0,33

VEZT Vezatin 0,33

Przypuszczalna Dol-P-Glc:Glc(2)Man(9)GlcNAc(2)-PP-Dol alfa- ALG10B 0,33 1,2-glukozylotransferaza

PAQR7 błonowy progestynowy receptor alfa 0,33

FLT3LG 3 ligand kinazy tyrozynowej związanej z Fms 0,33

CD40LG ligand CD40, postać rozpuszczalna 0,33

receptor II-a regionu Fc immunoglobuliny gamma o niskim FCGR2A 0,33 powinowactwie

CLDN12 klaudyna-12 0,33

GP6 glikoproteina płytkowa VI 0,33

EPHB4 receptor efryny 4 typu-B 0,33

SEMA4C Semaforyna-4C 0,33

CD300C CMRF35-podobna cząsteczka 6 0,33

PEAR1 receptor 1 agregacji płytek do śródbłonka 0,33

FFAR2 receptor 2 wolnych kwasów tłuszczowych 0,33

Nośnik substancji rozpuszczalnych rodzina 2, członek 6 SLC2A6 0,32 transporterów ułatwionego transportu glukozy

TMEM150A Białko przezbłonowe 150A 0,32

ANO8 Anoktamina-8 0,32

CD200R1 receptor 1 glikoproteiny powierzchniowej CD200 0,32

Podjednostka alfa receptora immunoglobuliny epsilon o wysokim FCER1A 0,32 powinowactwie

BEST1 Bestrofina-1 0,32

CLDN5 klaudyna-5 0,32

SLC47A1 Multidrug and toxin extrusion protein 1 0,32

SLC5A10 kotransporter 5 sodu/glukozy 0,32

CD40 członek nadrodziny 5 receptora czynnika martwicy nowotworu 0,31

ANO9 Anoktamina-9 0,31

CLEC2D członek D rodziny 2 domeny lektyny typu C 0,31

93 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

VIPR1 receptor 1 wazoaktywnego jelitowego polipeptydu 0,31

SLC16A7 transporter 2 kwasów monokarboksylowych 0,31

UTS2R receptor urotensyny 2 0,31

CLSTN3 Calsyntenin-3 0,31

GPR35 receptor 35 sprzężony z białkiem G 0,31

SYT15 Synaptotagmina-15 0,31

FAM57A białko FAM57A 0,31

CD8B Łańcuch beta glikoproteiny powierzchniowej komórek T CD8 0,31

IL17RC receptor C interleukiny 17 0,31

GLDN Gliomedyna 0,31

FZD2 Frizzled-2 0,31

Członek 3 podrodziny A kanałów potasowych bramkowanych KCNA3 0,3 napięciem

MGA Glukoamylaza 0,3

GPR1 receptor 1 sprzężony z białkiem G 0,3

IL6ST Podjednostka beta receptora interleukiny 6 0,3

PCDHGB5 Protokadheryna gamma-B5 0,3

OR1l1 receptor węchowy 1l1 0,3

PTH1R receptor parathormonu/peptydu związanego z parathormonem 0,3

NLGN2 Neuroligina-2 0,3

MMP24 Przetworzona metaloproteinaza macierzy-24 0,3

CDH22 kadheryna-22 0,3

TNFRSF8 Członek 8 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu 0,3

CHRNG Podjednostka gamma receptora acetylocholiny 0,3

PSEN1 Presenilina-1 CTF12 0,3

GPR114 Prawdopodobny receptor sprzężony z białkiem G 114 0,3

PLXNB2 Pleksyna-B2 0,3

CHRNA2 Podjednostka alfa-2 neuronalnego receptora acetylocholiny 0,3

GPR34 Prawdopodobny receptor sprzężony z białkiem G 34 0,3

LPAR6 receptor 6 kwasu lizofosfatydowego 0,3

ATP8A1 Prawdopodobna ATPaza IA transportujaca fosfolipidy 0,3

94 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

FZD1 Frizzled-1 0,3

CCR2 receptor chemokiny C-C typu 2 0,3

P2RY1 purynoceptor 1 P2Y 0,3

SLC16A9 transporter 9 kwasów monokarboksylowych 0,3

C20orf103 glikoproteina błonowa 5 związana z lizosomem 0,3

ADORA2B receptor A2b adenozyny 0,3

CLEC12B Członek B rodziny 12 domeny lektyny typu C 0,3

FCRL3 Białko 3 podobne do receptora Fc 0,29

CD180 Antygen CD180 0,29

TIGIT immunoreceptor komórek T z domenami Ig i ITIM 0,29

PPAP2A Fosfohydrolaza fosforanu lipidów 1 0,29

ATP11C Prawdopodobna ATPaza IG transportujaca fosfolipidy 0,29

TNFRSF17 Członek 17 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu 0,29

Członek 12 nadrodziny ligandow czynnika martwicy nowotworu, TNFSF12 0,29 postać wydzielana

TBXA2R receptor A2 tromboksanu 0,29

OR3A3 receptor węchowy 3A3 0,29

GPR153 Prawdopodobny receptor sprzężony z białkiem G 153 0,29

ATP11A Prawdopodobna ATPaza IH transportujaca fosfolipidy 0,29

Białko 1 zawierające domenę powtórzenia bogatego w leucynę I LRFN1 0,29 fibronektyny typu III

OR51B2 receptor węchowy 51B2 0,29

Członek 1 podrodziny S kanałów potasowych bramkowanych KCNS1 0,29 napięciem

OR12D2 receptor węchowy12D2 0,29

GRM4 metabotropowy receptor glutaminianu 4 0,29

NEO1 Neogenina 0,29

DRD5 D(1B) receptor dopaminy 0,29

PLXDC1 Białko 1 zawierające domenę pleksyny 0,29

GPR157 Prawdopodobny receptor sprzężony z białkiem G 157 0,29

CD300LB CMRF35-podobna cząsteczka 7 0,29

95 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

MARVELD1 Białko 1 zawierające domenę MARVEL 0,29

MFAP3 glikoproteina 3 związana z mikrofibrylami 0,29

CHRNB1 Podjednostka beta receptora acetylocholiny 0,29

PVRL2 Białko 2 związane z recetorem wirusa polio 0,29

F2RL1 Receptor 2 aktywowany proteinazą , na przemian rozszczepiony 2 0,29

GPR124 receptor 124 sprzężony z białkiem G 0,29

BACE1 Beta-sekretaza 1 0,29

C6orf105 Białko regulujące TFPI zależne od androgenu 0,28

CXCR3 receptor chemokiny C-X-C typu 3 0,28

IGSF8 Członek nadrodziny 8 Immunoglobulin 0,28

ATP8B1 Prawdopodobna ATPaza IC transportujaca fosfolipidy 0,28

TP53I13 Tumor protein p53-inducible protein 13 0,28

MC1R receptor hormonu stymulującego melanocyty 0,28

CD84 Członek 5 rodziny SLAM 0,28

CALHM1 Tumor protein p53-inducible protein 13 0,28

CHRNA6 Podjednostka alfa 6 neuronalnego receptora acetylocholiny 0,28

CDH10 kadheryna-10 0,28

SLC16A1 transporter 1 kwasów monokarboksylowych 0,28

GPRC5D Członek D grupy 5 rodziny C receptora sprzężonego z białkiem G 0,28

Specyficzny receptor produktu końcowego zaawansowanej AGER 0,28 glikozylacji

FASLG Domena wewnątrzkomórkowa FasL 0,28

GPR56 Fragment C-końca GPR56 0,28

SIGLEC1 Sialoadhezyna 0,28

Immunoglobulinopodobny receptor 2DL5A komórek KIR2DL5A 0,28 cytotoksycznych

PLB1 lizofosfolipaza 0,28

CD200 Glikoproteina błonowa OX-2 0,27

ADAM28 Białko 28 zawierające domenę dysintegryny i metaloproteinazy 0,27

SIT1 transporter XTRP3 zależny od sodu i chlorku 0,27

SLC23A2 Nośnik substancji rozpuszczalnych rodzina 23 członek 2 0,27

96 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

CCR10 receptor typu 10 chemokiny C-C 0,27

PRR4 Przetworzone białko 4 związane z receptorem wirusa Polio 0,27

GJD2 Białko połączenia szczelinowego delta-2 0,27

Nośnik substancji rozpuszczalnych rodzina 2, członek 8 SLC2A8 0,27 transporterów ułatwionego transportu glukozy

CD209 Antygen CD209 0,27

CD274 ligand 1 programowanej śmierci komórki 1 0,27

PROM2 Prominina-2 0,27

ATP6V0A2 Izoforma 2 116 kDa podjednostki a ATPazy protonowej typu V- 0,27

MPZ Białko mieliny P0 0,27

TNFRSF18 Członek 18 nadrodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu 0,27

MFSD2A Major facilitator superfamily domain-containing protein 2A 0,27

HEG1 homolog 1 białka HEG 1 0,27

OXTR receptor oksytocyny 0,27

CD99L2 Białko 2 podobne do antygenu CD99 0,27

Receptor immunoglobulinopodobny leukocytów, podrodzina B LILRB4 0,27 członek 4

SMAGP Mała glikoproteina adhezji komórkowej 0,27

OR51I2 receptor węchowy 5112 0,27

LY6G6D Lymphocyte antigen 6 complex locus protein G6f 0,27

Członek 4 podrodziny KQT kanałów potasowych bramkowanych KCNQ4 0,27 napięciem

HRH2 receptor histaminy H2 0,27

SLC39A2 transporter cynku ZIP2 0,27

CLDN10 klaudyna-10 0,27

GPM6B Neuronalna błonowa glikoproteina M6-b 0,27

STEAP4 Metaloreduktaza STEAP4 0,27

APOLD1 Apolipoproteina zawierająca domenę L 1 0,27

S1PR3 Receptor 3 sfingozyno-1-fosforanu 0,27

SGMS2 Cholinofosfotransferaza 2 fosfatydylocholina:ceramid 0,27

Immunoglobulinopodobny receptor 2DS5 komórek KIR2DS5 0,27 cytotoksycznych

97 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

STAR receptor ciepłostałej enterotoksyny 0,27

NIPA1 transporter magnezu NIPA1 0,26

CNNM4 transporter metali CNNM4 0,26

SLAMF1 Cząsteczka sygnalizująca aktywację limfocytów 0,26

KIAA1919 transporter 1 glukozy zależny od sodu 0,26

TLR6 receptor 6 Toll-podobny 0,26

CRB3 Protein crumbs homolog 3 0,26

SLC12A9 Nośnik substancji rozpuszczalnych rodzina 12 członek 9 0,26

GPR68 receptor 1 raka jajnika sprzężony z białkiem G 0,26

OR51J1 receptor węchowy 51J1 0,26

TREML2 Trem-like transcript 2 protein 0,26

GPR176 Prawdopodobny receptor sprzężony z białkiem G 176 0,26

Białko 2 związane z receptorem wirusa kociej białaczki podgrupy FLVCR2 0,26 C

LPAR1 receptor 1 kwasu lizofosfatydowego 0,26

PANX2 Paneksyna-2 0,26

SLC6A6 transporter tauryny zależny od sodu i chlorku 0,26

PROKR2 Prokineticin receptor 2 0,26

CLDN9 klaudyna-9 0,26

MYOF Mioferlina 0,26

LY6G6F Lymphocyte antigen 6 complex locus protein G6f 0,26

ESAM cząsteczka adhezyjna komórek śródbłonkowych 0,26

NCR3 receptor 3 wyzwalający naturalną cytotoksyczność 0,25

HLA-DQB2 Antygen zgodności tkankowej HLA klasy II , łańcuch DQ beta 2 0,25

SLC4A5 Elektrogenny kotransporter 4 wodorowęglanu sodu 0,25

P2RY4 purynoceptor 4 P2Y 0,25

ABCB1 białko 1 oporności wielolekowej 0,25

SLC9A1 wymiennik 1 sodu/wodoru 0,25

CELSR2 Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2 0,25

SYT8 Synaptotagmina-8 0,25

PCDHA9 Protokadheryna alfa-9 0,25

98 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

TMEM204 Białko transbłonowe 204 0,25

PTPRJ Fosfataza tyrozynowo-białkowa eta typu receptorowego 0,25

GRPR receptor peptydu uwalniającego gastrynę 0,25

SEMA6B Semaforyna-6B 0,25

CLCN5 transporter 5 wymiany H(+)/Cl(-) 0,25

GLRA2 Podjednostka alfa-2 receptora glicyny 0,25

PLVAP Białko związane z pęcherzykami błony komórkowej 0,25

ACVR1 B receptor typu-1B aktywiny 0,25

JAM3 Junctional adhesion molecule C 0,25

Białko zawierające domenę receptora klasy A lipoproteiny o niskiej LDLRAD3 0,25 gęstości

XG Glikoproteina Xg 0,25

Nośnik substancji rozpuszczalnych rodziny 2, członek 11 SLC2A11 0,24 transporterów ułatwionego transportu glukozy

PCDH9 Protokadheryna-9 0,24

VAMP5 5 białko błonowe związane z pęcherzykami 0,24

CDHR2 Członek 2 rodziny związanej z kadherynami 0,24

DRD2 receptor dopaminy D(2) 0,24

Białko 2 zawierające powtórzenia bogate w leucynę i domeny LRIG2 0,24 immunoglobulinopodobne

RAMP3 Białko 3 modyfikujące aktywność receptora 0,24

SLC39A14 transporter cynku ZIP14 0,24

STRA6 Stymulowany przez kwas retynowy homolog białkowy genu 6 0,24

ADRA2C receptor adrenergiczny alfa-2C 0,24

CLDN19 klaudyna-19 0,24

CX3CR1 receptor 1 chemokiny CX3C 0,24

łańcuch beta białka związany z kompleksem receptora CD79B 0,24 antygenowego komórek B

Immunoglobulinopodobny receptor 2DL2 komórek KIR2DL2 0,24 cytotoksycznych

CXCR7 Atypowy receptor 3 chemokiny 0,24

OR5L2 receptor węchowy 5L2 0,24

99 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

LRRC52 białko 52 zawierające powtórzenie bogate w leucynę 0,24

JPH1 Junctophilin-1 0,24

ADORA1 receptor A1 adenozyny 0,24

GPRC5C Receptor sprzężony z białkiem G rodzina C grupa 5 członek C 0,24

Fragment kadheryny RET 120 kDa zakotwiczonej w błonie RET 0,24 zewnątrzkomórkowej

PVR receptor wiusa polio 0,24

ITGB3 Integryna beta-3 0,24

PTGIR receptor prostacykliny 0,24

LPHN1 Latrofilina-1 0,24

OR10J1 receptor węchowy 10J1 0,24

MFAP3L Microfibrillar-associated protein 3-like 0,24

GPNMB glikoproteina przezbłonowa NMB 0,24

CELSR3 Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3 0,23

CCR6 C-C chemokine receptor-like 2 0,23

DMPK Białkowa kinaza miotoninowa 0,23

UPK3B Uroplakina-3b 0,23

OR1D2 receptor węchowy 1D2 0,23

OR7D2 receptor węchowy 7D2 0,23

ITGB1 Integryna beta-1 0,23

HRH3 receptor histaminy H3 0,23

GRIN2C Jonotropowy receptor glutaminianu, NMDA 2C 0,23

immunoglobulinopodobny receptor 3DL1 komórek KIR3DL1 0,23 cytotoksycznych

EPHB2 receptor efryny 2 typu B 0,23

OR2S2 receptor węchowy 2S2 0,23

immunoglobulinopodobny receptor 2DL4 komórek KIR2DL4 0,23 cytotoksycznych

CNNM1 transporter metali CNNM1 0,23

MARVELD2 białko 2 zawierające domenę MARVEL 0,23

CXCR6 receptor typu 6 chemokiny C-X-C 0,23

100 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

NOV Pleksyna-A1 0,23

ABCB6 Kaseta wiążąca ATP podrodzina B członek 6, mitochondrialna 0,23

PVRL1 Białko 1 związane z receptorem wirusa polio 0,23

SLC46A2 Thymic stromal cotransporter homolog 0,23

ADORA3 receptor adenozyny A3 0,23

GPR125 Prawdopodobny receptor sprzężony z białkiem G 125 0,23

CD22 receptor komórek B CD22 0,22

FZD3 Frizzled-3 0,22

LPAR5 receptor 5 kwasu lizofosfatydowego 0,22

TMEM8B Białko przezbłonowe 8B 0,22

PLXNA1 Pleksyna-A1 0,22

NPFFR1 receptor 1 neuropeptydu FF 0,22

SEZ6L2 Seizure 6-like protein 2 0,22

Transbłonowe, neuronalne białko 2 zaiwerajace powtórzenie LRRTM2 0,22 bogate w leucynę

SLC16A11 transporter kwasów monokarboksylowych 11 0,22

GRIK5 Jonotropowy receptor glutaminianu, kainowy 5 0,22

SYT6 Synaptotagmina-6 0,22

TMEM102 Białko transbłonowe 102 0,22

OR8B8 receptor węchowy 8B8 0,22

GJB1 Białko połączenia szczelinowego beta-1 0,22

GRM6 metabotropowy receptor 6 glutaminianu 0,22

Nośnik substancji rozpuszczalnych rodziny 52, transporter C20orf54 0,22 ryboflawiny, członek 3

OR52D1 receptor węchowy 52D1 0,22

SLC46A1 Sprzężony z protonem transporter folianowy 0,22

DSC2 Desmokolina-2 0,22

FAT1 Protokadheryna Fat 1, postać jądrowa 0,22

GCGR receptor glukagonu 0,22

POP1 Substancja nasierdziowa naczyń krwionośnych 0,22

CXADR receptor coxackie i adenowirusa 0,22

101 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

ABCC6 Białko 6 oporności wielolekowej 0,22

GJA1 Białko połączenia szczelinowego alpha-1 0,22

CXCR5 receptor typu 5 chemokiny C-X-C 0,21

ABCB4 Białko 3 oporności wielolekowej 0,21

CTLA4 Białko 4 cytotoksycznych limfocytów T 0,21

Członek 1 podrodziny V kanału kationowego związanego z TRPV1 0,21 receptorami przejściowego potencjału

MRGPRX4 Mas-related G-protein coupled receptor member X4 0,21

SIGLEC6 Ig-podobna lektyna 6 wiążąca kwas sialowy 0,21

IL9R receptor interleukiny-9 0,21

CHRNB2 Podjednostka beta-2 neuronalnego receptora acetylocholiny 0,21

PDGFRB Recetor beta płytkowego czynnika wzrostu 0,21

TMPRSS11D Łańcuch katalityczny przezbłonowej proteazy serynowej 11D 0,21

CDH24 kadheryna-24 0,21

PRRT2 Transbłonowe białko 2 bogate w prolinę 0,21

GALR3 receptor typu 3 galaniny 0,21

OR5111 receptor węchowy 5111 0,21

PTPRU Fosfataza tyrozynowo-białkowa U typu receptorowego 0,21

LPAR4 receptor 4 kwasu lizofosfatydowego 0,21

ZNRF3 E3 ubiquitin-protein ligase ZNRF3 0,21

P2RY6 purynoceptor 6 P2Y 0,21

AGTR1 receptor angiotensyny II typu-1 0,21

GPR182 receptor 182 sprzężony z białkiem G 0,21

PODXL podokaliksyna 0,21

BDKRB1 receptor bradykininy B1 0,21

DCHS1 Protokadheryna-16 0,21

GRIN3B Jonotropowy receptor glutaminianu, NMDA 3B 0,21

PTGDR receptor prostaglandyny D2 0,21

PVRL4 Przetworzone białko 4 związane z receptorem wirusa Polio 0,21

GPR77 2 receptor chemotaktyczny anafilatoksyny C5a 0,21

PARM1 Prostate androgen-regulated mucin-like protein 1 0,21

102 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

OR10H1 receptor węchowy 10H1 0,21

OR10D3 Przypuszczalny receptor węchowy 10D3 0,21

Ligand czynnika martwicy nowtworu członek nadrodziny 14, TNFSF14 0,21 postać rozpuszczalna

FCRL5 Białko 5 podobne do receptora Fc 0,2

RNF43 E3 ubiquitin-protein ligase RNF43 0,2

AMIGO1 białko 1 indukowane amfoteryną 0,2

OR1F1 receptor węchowy 1F1 0,2

Członek 4A1 rodziny transporterów anionów organicznych SLCO4A1 0,2 substancji rozpuszczonych

TTYH2 Protein tweety homolog 2 0,2

GABRR2 Podjednostka rho-2 receptora kwasu gamma aminomasłowego 0,2

GJD3 Białko połączenia szczelinowego delta-3 0,2

GRID1 Jonotropowy receptor glutaminianu, delta-1 0,2

CLDN1 klaudyna-1 0,2

SLC6A13 transporter 2 GABA zależny od sodu i chlorku 0,2

SLC30A8 transporter cynku 8 0,2

Immunoglobulinopodobny receptor 2DL3 komórek KIR2DL3 0,2 cytotoksycznych

GPR78 receptor 78 sprzężony z białkiem G 0,2

UPK2 Uroplakina-2 0,2

CLDN14 klaudyna-14 0,2

EDA Ektodysplazyna-A, postać wydzielana 0,2

PTGER1 Podtyp EP1 receptora prostaglandyny E2 0,2

Członek 5 podrodziny V kanału kationowego związanego z TRPV5 0,2 receptorami przejściowego potencjału

PRIMA1 Kotwica błonowa bogata z prolinę 1 0,2

GJA9 Białko połączenia szczelinowego alpha-9 0,2

SLC7A3 kationowy transporter aminokwasów 3 0,2

SSTR2 receptor typu 2 somatostatyny 0,2

CD1A glikoproteina powierzchniowa komórek T CD1 a 0,2

SLC7A8 Mała podjednostka 2 transportera dużych, obojętnych 0,2

103 EP 3 105 317 B1

Względna ekspresja na Antygen Nazwa białka komórkach T

aminokwasów

CLIC6 białko 6 chlorkowego kanału wenwątrzkomórkowego 0,2

EPHA8 receptor efryny 8 typu A 0,2

SLC20A2 Zależny od sodu transporter fosforanowy 2 0,2

SCNN1A Podjednostka alfa kanału sodowego wrażliwego na amyloryd 0,2

OR51 B6 receptor węchowy 51B6 0,2

OR14J1 receptor węchowy 14J1 0,2

OR10C1 receptor węchowy 10C1 0,2

OPRL1 receptor nocyceptyny 0,2

CCR9 receptor typu 9 chemokiny C-C 0,2

JPH4 Junctophilin-4 0,2

HTR1E receptor 1E 5-hydroksytryptaminy 0,2

MC3R receptor 3 melanokortyny 0,2

CD163L1 Scavenger receptor cysteine-rich type 1 protein M160 0,2

SEZ6 Seizure protein 6 homolog 0,2

PRSS8 Łańcuch ciężki protazyny 0,2

CDH26 białko podobne do kadheryny 26 0,2

ODZ1 Teneurin C-terminal-associated peptide 0,2

FGFR3 Receptor 3 czynnika wzorstu fibroblastów 0,2

PRZYKŁAD 1 - KNOCK OUT (KO) NA GENIE CD38 & EKSPRESJA CAR ANTY-CD38

Prezentacja celu CD38 - hydrolaza cyklicznej ADP-rybozy

[0147] CD38 jest glikoproteiną znajdującą się na powierzchni wielu komórek odpornościowych, w tym komórek szpiczaka mnogiego (MM), które wyrażają wysoki poziom CD38 u zdecydowanej większości 5 pacjentów. CD38 jest zatwierdzonym celem dla MM, ponieważ wiele badań wykazało skuteczne zabijanie komórek CD38+ MM od pacjentów i linii komórek CD38+ MM z zastosowaniem mAb anty-CD38 przez CDC i ADCC (Ellis, JHK i wsp., Journal of Immunology, 1995, 155 (2), 925-937). Daratumumab jest terapeutycznym ludzkim przeciwciałem monoklonalnym CD38, które indukuje zabijanie szpiczaka mnogiego i innych nowotworów hematologicznych (De Weers, M. i wsp., J Immunol 2011 186: 1840-1848). W 10 niektórych badaniach wykazano, że CD38 jest również wyrażany na wysokim poziomie przez aktywowane komórki T (Sandoval-Montes CJ i wsp., 2005, Leukoc Biol. 77 (4): 513-21).

Ekspresja CD38 przez komórki T

104 EP 3 105 317 B1

[0148] Ekspresję CD38 przez komórki T po perełkach CD3/CD28 i stymulacji IL-2 analizowano za pomocą FACS co 3-4 dni przez 17 dni. Zaobserwowano, że ponad 90% komórek T ulega ekspresji pomiędzy dniem 6 a dniem 17 po aktywacji (Figura 10B). [0149] Zatem, aby uniknąć zabijania aktywowanych komórek T przez komórki T CAR+ anty-CD38, należy 5 zapobiegać ekspresji powierzchniowej CD38 w komórkach T. Można to osiągnąć przez inaktywację genu CD38 z zastosowaniem nukleaz TALE. TALEN jest znakiem towarowym będącym własnością zgłaszającego (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 PARYŻ) określającym spersonalizowany format nukleaz TAL.

Strategia dla knock-outu (KO) CD38

[0150] Zaprojektowano i wytworzono heterodimeryczną nukleazę TALE ukierunkowaną na dwie sekwencje 10 długości 17 pz oddzielone odstępnikiem 13 pz w obrębie genu CD38. Każda połowa celu jest rozpoznawana przez powtórzenia nukleaz pół-TALE wymienionych w poniższej Tabeli 15 i na Figurze 10A. [0151] Sekwencja powtórzeń lewej TALEN dla celu CD38ex1_T2 była następująca NN-NI-NN-NN-NG-NN- NN-NN-NG-NG-NN-NN-HD-NN-NI-NG, a dla prawej TALEN była następująca NN-NG-HD-HD-HD-HD-NN- HD-NI-NN-NG-NN-HD-HD-HD-NG.

15 Tabela 15: Sekwencje badanego celu CD38 i TALEN dla inaktywacji antygenu CD38

Nazwa TALEN L/P SEK NR ID Sekwencja kwasu nukleinowego lub sekwencja polipeptydowa

Cel CD38 N/A 1 TGAGGTGGGTTGGCGAC taaggcgcaccgg TGGGCACTGCGGGGACA

CD38ex 1_T2- L 2 L1 TALEN

105 EP 3 105 317 B1

Nazwa TALEN L/P SEK NR ID Sekwencja kwasu nukleinowego lub sekwencja polipeptydowa

CD38ex 1_T2- P 3 R1 TALEN

[0152] Każdy konstrukt nukleazy TALE subklonowano z zastosowaniem trawienia enzymem restrykcyjnym w ssaczym wektorze ekspresyjnym pod kontrolą promotora T7. mRNA kodujący nukleazę TALE rozszczepiającą CD38 zsyntetyzowano z plazmidów niosących sekwencję kodującą poniżej promotora T7. [0153] Oczyszczone komórki T aktywowane podczas 72 godzin z perełkami powleczonymi anty-CD3/CD28 i 5 zrekombinowaną IL-2 transfekowano przez elektroporację (Cytopulse) z każdym z 2 mRNA (10 μg każdy) kodującym obie nukleazy pół-TALE CD38ex1_T2. Aby zbadać, CD38 KO, procent komórek T CD38 ujemnych oceniano za pomocą cytometrii przepływowej w dniu 3, 6, 10 i 13 po transfekcji mRNA TALEN. Zaobserwowano, że 15% transfekowanych komórek T miało niedobór CD38 (Figura 10C) i ten niedobór był stabilny podczas 13 dni po transfekcji. 10 [0154] Ponadto zaprojektowano dwie alternatywne nukleazy TALE ukierunkowane na gen CD38. Każdy pół- cel jest rozpoznawany przez powtórzenia nukleaz pół-TALE wymienionych w poniższej Tabeli 16 i na Figurze 10A. Sekwencja powtórzeń lewej TALEN dla celu CD38ex1_T4 była następująca NG-NN-HD-NN-NI-NN-NG- NG-HD-NI-NN-HD-HD-HD-NN-NN-NG, a dla prawej TALEN była następująca NG-NN-HD-NG-NN-HD-HD- NN-NN-HD-NG-HD-NG-HD-NG-NI. Sekwencja powtórzeń dla lewej TALEN dla celu CD38ex1_T5 była 15 następująca NG-NN-NI-NG-HD-HD-NG-HD-NN-NG-HD-NN-NG-NN-NN-NG, a dla prawej TALEN była następująca HD-NN-NI-NN-NN-NG-NN-NN-HD-NN-HD-HD-NI-NN-HD-NI.

Tabela 16: Sekwencje dwóch innych celów CD38 i odpowiednich TALEN dla ich inaktywacji

Nazwa TALEN L/P SEK NR ID Sekwencja kwasu nukleinowego lub sekwencja powtórzeń

Cel CD38ex 1_T4 N/A 4 TGCGAGTTCAGCCCGGtgtccggggacaaacccTGCTGCCG GCTCTCTA

106 EP 3 105 317 B1

Nazwa TALEN L/P SEK NR ID Sekwencja kwasu nukleinowego lub sekwencja powtórzeń

CD38ex 1_T4-L L 5 TALEN

CD38ex 1_T4-R P 6 TALEN

Cel CD38ex 1_T5 N/A 7 TGATCCTCGTCGTGGTgctcgcggtggtcgtccCGAGGTGGC GCCAGCA

107 EP 3 105 317 B1

Nazwa TALEN L/P SEK NR ID Sekwencja kwasu nukleinowego lub sekwencja powtórzeń

CD38ex 1_T5-L L 8 TALEN

CD38ex 1_T5-R P 9 TALEN

Strategia ekspresji CAR anty-CD38

Struktura i kompozycja CAR anty-CD38

[0155] W Tabeli 17 przedstawiono łańcuch VH i VL scFv anty-CD38. SEK NR ID: 10-11 odpowiada humanizowanemu przeciwciału anty-CD38 - daratumumabowi (Genmab), a SEK NR ID: 12-13 odpowiada 5 MOR202 (lub MOR03087), tak jak opisano w patencie USA nr 8,263,746B. [0156] SEK NR ID:14-20 i SEK NR ID:21-26 odpowiada sekwencji CDR odpowiednio dla łańcucha VH (HCDR) i łańcucha VL (LCDR), jak opisano w zgłoszeniu WO 2008/047242.

Tabela 17: Sekwencje łańcuchów VH i VL przeciwciał scFv anty-CD38 - daratumumabu, MOR202 i specyficznych CDR dla łańcuchów VH i VL

108 EP 3 105 317 B1

Nazwa Łańcuch VH lub VL SEK NR ID Sekwencja polipeptydu lub kwasu nukleinowego

Daratumumab VH 10

VL 11

MOR202 (lub VH 12 MOR03087)

VL 13

HCDR1-1 VH 14 GFTFSSYYMN

HCDR1-2 VH 15 SYYMN

HCDR2 VH 16 GISGDPSNTYYADSVKG

HCDR3 VH 17 DLPLVYTGFAY

HCDR4 VH 18 DYWMQ

HCDR5 VH 19 TIYPGDGDTGYAQKFK

HCDR6 VH 20 GDYYGSNSLDY

LCDR1 VL 21 SGDNLRHYYVY

LCDR2 VL 22 GDSKRPS

LCDR3 VL 23 QTYTGGASL

LCDR4 VL 24 KASQDVSTVVA

109 EP 3 105 317 B1

Nazwa Łańcuch VH lub VL SEK NR ID Sekwencja polipeptydu lub kwasu nukleinowego

LCDR5 VL 25 SASYRYI

LCDR6 VL 26 QQHSPPYT

[0157] Dla daratumumbabu scFv 3 różne konstrukty CAR (GMB005-V1 i V2 i V3) zaprojektowano tak, jak przedstawiono na Figurze 11A, a ich sekwencję przedstawiono w poniższej Tabeli 18. Wszystkie trzy konstrukty dzielą wspólne te same składniki, pod względem peptydu sygnałowego (CD8α), łącznika GS (pomiędzy łańcuchami VH i VL scFV), domeny transbłonową (TM), domeny kostymulatorowej 4-1BB i 5 domeny aktywującej CD3ζ (sekwencje przedstawione w poniższej Tabeli 18). Różnice te wynikają z wyboru regionu zawiasowego (Tabela 18):

V1 : region zawiasowy FcRlla

• V2 : region zawiasowy CD8a • V3 : region zawiasowy IgG1

10 Tabela 18: Sekwencja polipeptydowa 3 różnych struktur scFv CAR anty-CD38 na bazie daratumumabu i poszczególnych stosowanych składników

Nazwa CAR SEK NR ID

Peptyd sygnałowy (SP) 27 MALPVTALLLPLALLLHAARP CD8α

Łącznik GS 28 GGGGSGGGGSGGGGS

Region zawiasowy FCRIIα 29 GLAVSTISSFFPPGYQ

Region zawiasowy CD8α 30

Region zawiasowy IgG1 31

Domena TM 32 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

Domena kostymulatorowa 33 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE 4-1 BB L

Domena aktywująca CD3ζ 34

CAR GMB005-V1 35

110 EP 3 105 317 B1

Nazwa CAR SEK NR ID

CAR GMB005-V2 36

CAR GMB005-V3 37

Badania przesiewowe

[0158] TALEN CD38 będą transfekowane w dniu 4 po aktywacji. 3 dni po tym, jak komórki z niedoborem CD38 zostaną posortowane przez selekcję negatywną i transfekowane 3 dni później za pomocą mRNA CAR anty-CD38. Wytworzone cząsteczki CAR będą następnie przeszukiwane pod kątem ekspresji i aktywności 5 degranulacyjnej w kierunku docelowych linii komórkowych wyrażających CD38 po przejściowej transfekcji mRNA CAR. Do badania aktywności zostaną zastosowane docelowe linie komórkowe wyrażające różne poziomy ekspresji CD38 (Figura 11B):

- U266 CD38+ i U266 CD38- otrzymane przez rozdział magnetyczny z zastosowaniem mikroperełek anty- CD38 10 - L363, linia komórek szpiczaka mnogiego wyrażająca pośrednie poziomy CD38 - Daudi, linia komórkowa pochodząca od chłoniaka Burkitta wyrażająca wysokie poziomy CD38 - K562, CD38-ujemna linia komórkowa pochodząca z przewlekłej białaczki szpikowej.

[0159] Po tym pierwszym badaniu przesiewowym zostanie przeprowadzony drugi etap badań przesiewowych, w którym kilku wybranych kandydatów zostanie przebadanych pod względem ich zdolności 15 do indukowania degranulacji, uwalniania IFNγ i specyficznej aktywności cytotoksycznej w stosunku do wybranych docelowych linii komórkowych. Wybór kandydatów zostanie zawężony, a niektórzy kandydaci wybrani do produkcji wektorów lentiwirusowych, a aktywność CAR będzie oceniana w komórkach T CD38 KO stabilnie wyrażających CAR.

PRZYKŁAD 2 AKTYWNOŚĆ CAR ANTY-CS1 W KONTEKŚCIE CS1 KO

20 Prezentacja celu CS1

[0160] Szpiczak mnogi (MM) to to nowotwór złośliwy z komórek B, charakteryzujący się nieprawidłową klonalną ekspansją komórek plazmatycznych (PC) w szpiku kostnym, z szacunkowymi 21700 nowymi

111 EP 3 105 317 B1

przypadkami i 10710 zgonami z powodu MM zidentyfikowanych w Stanach Zjednoczonych w 2012 roku (Siegel R, i wsp. Cancer J Clin 2012 62: 10-29). Szacuje się, że w 2013 r. w Stanach Zjednoczonych nowo zdiagnozowanych z MM osób będzie 22350, z czego umrze 10710 osób, co stanowi 20% zgonów z powodu wszystkich hematologicznych nowotworów złośliwych. Pomimo zastosowania inhibitorów proteasomu i leków 5 modulujących układ odpornościowy, które poprawiły całkowity czas przeżycia (Palumbo A i wsp. Leukemia 2009 23: 449-456), MM pozostaje nieuleczalnym nowotworem złośliwym (Podar K i wsp. Leukemia 2009 23:10-24), dla którego pilnie potrzebne są nowe podejścia terapeutyczne. [0161] Glikoproteina CS1 powierzchni komórki (określana w literaturze również jako SLAMF7, CD319 lub CRACC - sekwencja referencyjna NCBI: NP_067004.3) jest wysoce i powszechnie wyrażana na powierzchni 10 komórek szpiczaka (Hsi ED, i wsp. Clin Cancer Res 2008 14: 2775-84). CS1 ulega ekspresji na bardzo niskich poziomach w większości immunologicznych komórek efektorowych, w tym w komórkach NK, niektórych podzbiorach komórek T i prawidłowych komórkach B, i jest prawie niewykrywalna na komórkach szpikowych (Hsi ED i wsp. Clin Cancer Res 2008 14: 2775-84). Warto zauważyć, że CS1 jest w sposób nieistotny wyrażana w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych (Hsi ED i wsp. Clin Cancer 15 Res 2008 14: 2775-84), które można stosować do przeszczepu komórek macierzystych w celu leczenia hematologicznych nowotworów złośliwych, w tym MM. Funkcje CS1 w MM pozostają nie w pełni zrozumiane i udokumentowano, że CS1 może odgrywać rolę w adhezji komórek szpiczaka, wzroście klonogennym i tworzeniu się nowotworów (Benson DM Jr, i wsp. J Clin Oncol 2012 30: 2013-5; YT i wsp. Blood 2009 113: 4309-18).

20 Struktura CAR anty-CS1

[0162] Te same struktury V1, V2 i V3 są zaprojektowane tak, jak w Przykładzie 1 dla docelowego jednołańcuchowego CAR antygenu anty-CD38, z tymi samymi składnikami pod względem regionu zawiasowego, domeny transbłonowej, domen koaktywacji i transdukcji (takich jak przedstawione na Figurze 11A i w sekwencjach przedstawionych w Tabeli 18). 25 [0163] W Tabeli 19 przedstawiono łańcuchy VH i VL scFv anty-CS1. SEK NR ID: 38-40-42-44-46 i SEK NR ID: 39-41-43-45-47 odpowiadają odpowiednio łańcuchowi VH i łańcuchowi VL mysiego scFv Luc63, Luc90, Luc34, LucX1 i LucX2 . [0164] W Tabeli 20 przedstawiono CAR anty-CS1 z powyższym scFv; te CAR są oparte na wersjach V1, V2 i V3 z Figury 11A, w których stosuje się odpowiednio krótki region zawiasowy FcERγ, średni region 30 zawiasowy CD8α i długi region zawiasowy IgG1. Podkreślone części odpowiadają łańcuchom VH i VL scFv związanym przez łącznik.

Tabela 19: Sekwencje łańcuchów VH i VL przeciwciał scFv anty-CS1

Nazwa Łańcuch VH lub VL SEK NR ID: Sekwencja polipeptydowa

Luc63 VH 38 VL 39

Luc90 VH 40

112 EP 3 105 317 B1

Nazwa Łańcuch VH lub VL SEK NR ID: Sekwencja polipeptydowa

VL 41 Luc34 VH

42 VL 43 LucX1 VH

44

VL 45 LucX2 VH 46 VL 47

Tabela 20: Sekwencja polipeptydowa CAR anty-CS1 oparta na wersjach V1, V2 i V3 z Figury 11A

Nazwa CAR SEK NR ID Sekwencja polipeptydowa

CAR Luc63-V1 48

CAR Luc63-V2 49

CAR Luc63-V3 50

113 EP 3 105 317 B1

Nazwa CAR SEK NR ID Sekwencja polipeptydowa

CAR Luc90-V1 51

CAR Luc90-V2 52

CAR Luc90-V3 53

CAR Luc34-V1 54

CAR Luc34-V2 55

CAR Luc34-V3 56

CAR LucX1-V1 57

114 EP 3 105 317 B1

Nazwa CAR SEK NR ID Sekwencja polipeptydowa

CAR LucX1-V2 58

CAR LucX1-V3 59

CAR LucX2-V1 60

CAR LucX2-V2 61

CAR LucX2-V3 62

Strategia konstruowania CAR CS1 + i KO CS1

[0165] CS1 ulega ekspresji na wysokim poziomie w komórkach plazmacytoidalnych od pacjentów ze szpiczakiem mnogim, co czyni go interesującym celem dla opracowywania CAR. Komórki T, zwłaszcza podzbiór CD8, wyrażają niskie poziomy CS1, co jest wadą dla opracowywania komórek T CAR, ponieważ 5 mogą one być zabite podczas ekspresji CAR anty-CS1. [0166] W tym przykładzie oceniliśmy aktywność Luc90-v2 CAR (sekwencja przedstawiona w Tabeli 20) w ludzkich komórkach T, które były albo pozornie transfekowane, albo transfekowane TALEN ukierunkowaną na gen CS1 (SLAMF7), aby zobaczyć czy aktywność CAR została wzmocniona, gdy gen CS1 poddano dysrupcji w komórkach T CAR +. Przebieg eksperymentu przedstawiono na Figurze 12.

115 EP 3 105 317 B1

[0167] Komórki T oczyszczono z próbek kożuszka leukocytarno-płytkowego i aktywowano stosując perełki powleczone CD3/CD28. Komórki były kotransfekowane 72 godziny po aktywacji za pomocą 10 μg mRNA kodującego T01_lewa TAL i 10 μg mRNA kodującego T01_prawa TAL. Sekwencje TAL przedstawiono w poniższej Tabeli 21 i konstruktach plazmidowych (T01, T02 i T03) z powtórzeniami TAL przedstawionymi na 5 Figurze 13. [0168] Na Figurze 14 przedstawiono docelową lokalizację dla TAL - T01, T02 i T03 w obrębie genu CS1 (SLAMF7): T01 i T02 są ukierunkowane na egzon 1 (Figura 14A), podczas gdy T03 jest ukierunkowana na egzon 2 (Figura 14B).

Tabela 21: Sekwencje celu CS1 i TALEN do jego inaktywacji

Nazwa TALEN L/P SEK NR ID Sekwencja kwasu nukleinowego

Cel T01 63

L 64 TGACTTCCAGAGAGCAA

P 65 AACATGCCTCACCCTCA

Cel T02 66

L 67 TTCCAGAGAGCAATATG

P 68 TGCCTCACCCTCATCTA

Cel T03 69

L 70 TTGACTCTATTGTCTGG

P 71 CCTCTTGTCACCATACA

10 [0169] 3 dni po transfekcji TALEn komórki transdukowano rekombinowanym wektorem lentiwirusowym kierującym ekspresją CAR L90-v2 z promotora EF1a. Wektor lentiwirusowy zbudowany jest w taki sposób, że ekspresja CAR jest sprzężona z ekspresją BFP (ang. Blue Fluorescent Protein – białko niebieskiej fluorescencji) poprzez rybosomalny peptyd skip. CAR L90-v2 składa się z zewnątrzkomórkowej domeny wiążącej rozpoznającej cel CS1 (scFv L90), a następnie regionów zawiasowych i transbłonowych 15 pochodzących z białka hCD8α. Wewnątrzkomórkowa część cząsteczki zawiera domenę kostymulatorową pochodzącą z 41BB, a następnie domenę sygnałową CD3γ (sekwencje przedstawione w poprzedniej Tabeli 18-19-20 dla poszczególnych składników, odpowiednio sekwencji scFv i CAR). [0170] Wydajność transdukcji oceniano 6 dni po transdukcji za pomocą cytometrii przepływowej, po czym następowała ekspresja BFP. Komórki barwiono również przeciwciałami anty-CD8 i anty-CS1.

116 EP 3 105 317 B1

Wyniki

Ekspresja CAR CS1+

[0171] Wyniki z Figury 16 pokazują, że wydajności transdukcji są wyższe w pozornie transfekowanych komórkach niż w komórkach, które transfekowano TALEn ukierunkowaną na gen CS1. Jest to 5 prawdopodobnie spowodowane specyficznym zabijaniem komórek niepoddanych transdukcji komórek T wyrażających CS1, podczas gdy ta populacja nie jest dotknięta, gdy komórki nie wyrażają już CS1 w wyniku dusrupcji genu kierowanej przez TALEN. [0172] Nie obserwuje się istotnych różnic w poziomach CS1 w tym punkcie czasowym pomiędzy komórkami transfekowanymi TALEN lub pozornie (kontrola ujemna - transfekcja bez plazmidu), ponieważ poziomy CS1 10 zmniejszają się z upływem czasu po początkowej aktywacji komórek T. Z drugiej strony, znaczące zmniejszenie w % komórek CD8+ obserwuje się w pozornie transfekowanych komórkach wyrażających CAR w porównaniu z komórkami CAR+ transfekowanymi TALEN, co wskazuje, że wysoki odsetek komórek CD8+ został wyeliminowany przez komórki T CAR+.

Ocena aktywności cytotoksycznej

15 [0173] Aktywność cytotoksyczną tych komórek oceniano 8 dni po transdukcji CAR przez wspólną hodowlę tej samej ilości komórek T, albo z linią komórkową wyrażającą CS1 (komórki L363) albo ujemną kontrolną linią komórkową bez ekspresji CS1 (MOLM13). Żywotność docelowych linii komórkowych mierzono za pomocą cytometrii przepływowej 4 godziny po rozpoczęciu wspólnej hodowli komórek. Wyniki przedstawione na Figurze 15A pokazują zmniejszoną żywotność komórek CS1(+), gdy były wspólnie hodowane z 20 komórkami T CAR+, podczas gdy nie zaobserwowano żadnego wpływu na żywotność komórek CS1(-). Specyficzna liza komórek została obliczona z zastosowaniem danych z cytometrii przepływowej i była 2- krotnie wyższa, gdy komórki T transfekowano za pomocą TALEn ukierunkowanej na gen CS1 przed transdukcją CAR (Figura 15B). Należy wziąć pod uwagę, że wpływ może być nawet większy, ponieważ ilość komórek T CAR+ obecnych we wspólnych hodowlach jest wyższa, gdy komórki pozornie transfekowano 25 (patrz dane cytometrii przepływowej z Figury 16). Wyniki eksperymentu są następujące:

- dla próbki pozornie/NTD, % komórek BFP+ wynosi 0,1%, a ilość komórek CD8+ wynosi 53,9%; - dla próbki TALEn/NTD, % komórek BFP+ wynosi 0,2%, a ilość komórek CD8+ wynosi 49,5%; - dla próbki pozornie/L90-2, % komórek BFP+ wynosi 94%, a ilość komórek CD8+ wynosi 1,8%; - dla próbki TALEn/L90-2, % komórek BFP+ wynosi 61%, a ilość komórek CD8+ wynosi 8,3%.

30 Wydajności transdukcji są wyższe w pozornie transfekowanych komórkach niż w komórkach, które transfekowano TALEnem ukierunkowaną na gen CS1 (NTD: nietransdukowane).

Ponowna aktywacja po transdukcji

[0174] W celu potwierdzenia, że gen CS1 uległ dysrupcji w komórkach T transfekowanych TALEn, różne próbki ponownie aktywowano za pomocą perełek CD3/CD28 w D11 po transdukcji. 72 godziny po ponownej 35 aktywacji komórki barwiono przeciwciałami anty-CD8 i anty-CS1, a ekspresję analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. [0175] Figura 17 przedstawia wydajności transdukcji i poziomy ekspresji CD8/CS1 w każdej próbce. Jak przedstawiono na dolnym panelu, obserwuje się wzrost poziomów CS1 po ponownej aktywacji w pozornie

117 EP 3 105 317 B1

transfekowanych komórkach, podczas gdy mała ilość komórek jest w stanie wyrażać CS1 w transfekowanych populacjach TALEn. [0176] Wyniki eksperymentu są następujące:

• dla próbki pozornie/NTD, % komórek BFP+ wynosi 0,01%, CS1 ulega ekspresji w 65,2% komórek, a 5 ilość komórek CD8+ wynosi 80,7%; • dla próbki TALEn/NTD, % komórek BFP+ wynosi 0,2%, CS1 ulega ekspresji w 9,7% komórek, a ilość komórek CD8+ wynosi 78,8%; • dla próbki pozornie/L90-2, % komórek BFP+ wynosi 94%, CS1 ulega ekspresji w 37,5% komórek, a ilość komórek CD8+ wynosi 16%. 10 • dla próbki TALEn/L90-2, intensywność BFP wynosi 61%, ekspresja CS1 wynosi 8,5%, a ekspresja CD8 wynosi 68,5%.

[0177] Wzrost poziomów CS1 po ponownej aktywacji obserwuje się w pozornie transfekowanych komórkach, podczas gdy mała ilość komórek jest zdolna do ekspresji CS1 w populacjach transfekowanych TALEn. 15 [0178] Łącznie, wyniki te wskazują, że gen CS1 ulega dysrupcji w komórkach T transfekowanych TALEn i że zwiększa to aktywność cytotoksyczną komórek CAR+ anty-CS1, głównie przez zachowanie cytotoksycznych komórek T CD8+.

Przykład 3: Cel CD70

Prezentacja celu CD70

20 [0179] CD70 jest cytokiną, która wiąże się z CD27 i jest częścią rodziny TNF (Goodwin R.G. i wsp., 1993, Cell 73: 447-456). Białko to odgrywa rolę w adoptywnych odpowiedziach komórek T, indukuje proliferację kostymulowanych komórek T i wzmacnia wytwarzanie komórek T cytolitycznych. Jej numer dostępu to P32970 (Uniprot). Niektóre badania, takie jak Schürch, C. i wsp., (J. Clin. Invest., 2012; doi: 10.1172/JCI45977) sugerują, że blokowanie interakcji CD27-CD70 może pomóc w leczeniu przewlekłej 25 białaczki szpikowej (CML).

Strategia dla CD70 KO

[0180] Ta sama strategia dla KO genu CD70 zostanie przeprowadzona tak, jak w Przykładzie 1 i Przykładzie 2. Heterodimeryczna nukleaza TALE ukierunkowana na dwie sekwencje o długości 49 pz oddzielone odstępnikiem o długości 15 pz w obrębie genu CD70 i jedna nukleaza TALE ukierunkowana na sekwencję o 30 długości 57 pz oddzieloną odstępnikiem o długości 23 pz. Każda połowa celu jest rozpoznawana przez powtórzenia nukleaz pół-TALE wymienionych w poniższej Tabeli 22.

Tabela 22: Sekwencje celu CD70 i TALEN dla jego inaktywacji

Nazwa TALEN L/P SEK NR ID Sekwencja kwasu nukleinowego

72 TGGTCTTTTCTTCCAGT gggacgtagctgagcTGCAGCTGAATCACACA

Cel 1 L 73 TGGTCTTTTCTTCCAGT

TALEN 1 P 74 TGCAGCTGAATCACACA

Cel 2 75 TGGTGATCTGCCTCGTGgtgtgcatccagcgcTTCGCACAGGCTCAGCA

118 EP 3 105 317 B1

Nazwa TALEN L/P SEK NR ID Sekwencja kwasu nukleinowego

TALEN 2 L 76 TGGTGATCTGCCTCGTG

P 77 TTCGCACAGGCTCAGCA

Cel 3 78 TALEN 3

L 79 TGCGGGCTGCTTTGGTC

P 80 CTGCCTCGTGGTGTGCA

Strategia ekspresji CAR anty-CD70

[0181] Ta sama strategia ekspresji CAR anty-CD70 zostanie przeprowadzona tak, jak w Przykładzie 1 i w Przykładzie 2. [0182] Te same struktury V1, V2 i V3 są zaprojektowane tak, jak w Przykładzie 1-2 z tymi samymi 5 składnikami pod względem peptydu sygnałowego, łącznika pomiędzy łańcuchami VH i VL, domeną transbłonową, domenami koaktywacji i transdukcji (ogólne architektury przedstawiono na Figurze 11A, a sekwencje dla poszczególnych składników przedstawiono w Tabeli 18). Tylko region zawiasowy różni się pomiędzy trzema wersjami V1, V2 i V3, przy czym stosuje się odpowiednio krótki region zawiasowy FcERγ, średni region zawiasowy CD8α i długi region zawiasowy IgG1. 10 [0183] W Tabeli 23 przedstawiono łańcuch VH i VL scFv anty-CD70. SEK NR ID: 81-82, 85-86, 89-90 i SEK NR ID: 83-84, 87-88, 91-92 odpowiadają odpowiednio łańcuchowi VH i łańcuchowi VL scFv Ab4, Ab8 z AMGEN i 1F6 z Seattle Genetics. [0184] W Tabeli 24 przedstawiono CAR anty-CD70 z powyższym scFv; te CAR są oparte na wersjach V1, V2 i V3 zgodnie z Figurą 11A, przy czym stosuje się odpowiednio krótki region zawiasowy FcEγ, średni 15 region zawiasowy CD18 i długi region zawiasowy IgG1.

Tabela 23: Sekwencje polinukleotydowe i kwasu nukleinowego łańcuchów VH i VL dla przeciwciał scFv anty- CD70 Ab4, Ab8 i 1F6

Nazwa Łańcuch VH lub VL SEK NR ID Sekwencja polinukleotydowa i kwasu nukleinowego

Ab4 VH 81

119 EP 3 105 317 B1

Nazwa Łańcuch VH lub VL SEK NR ID Sekwencja polinukleotydowa i kwasu nukleinowego

82

VL 83

84

Ab8 VH 85

86

120 EP 3 105 317 B1

Nazwa Łańcuch VH lub VL SEK NR ID Sekwencja polinukleotydowa i kwasu nukleinowego

VL 87

88

1F6 VH 89

90

VL 91

92

Tabela 24: Sekwencje polipeptydowe CAR anty-CD70 oparte na wersjach V1, V2 i V3 zgodnie z Figurą 11A

Nazwa CAR SEK NR ID: Sekwencja polinukleotydowa

CAR Ab4-V1 93

CAR Ab4-V2 94

121 EP 3 105 317 B1

Nazwa CAR SEK NR ID: Sekwencja polinukleotydowa

CAR Ab4-V3 95

CAR Ab8-V1 96

CAR Ab8-V2 97

CAR Ab8-V3 98

CAR 1F6 V1 99

CAR 1F6 V2 100

122 EP 3 105 317 B1

Nazwa CAR SEK NR ID: Sekwencja polinukleotydowa

CAR 1F6 V3 101

Odniesienia

[0185]

Bardenheuer, W., K. Lehmberg, i wsp., (2005). "Resistance to cytarabine and gemcitabine and in vitro selection of transduced cells after retroviral expression of cytidine deaminase in human 5 hematopoietic progenitor cells." Leukemia 19(12): 2281-8. Betts, M. R., J. M. Brenchley, i wsp., (2003). "Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation." J Immunol Methods 281(1-2): 65-78. Boch, J., H. Scholze, i wsp., (2009). "Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors." Science 326(5959): 1509-12. 10 Brewin, J., C. Mancao, i wsp., (2009). "Generation of EBV-specific cytotoxic T cells that are resistant to calcineurin inhibitors for the treatment of posttransplantation lymphoproliferative disease." Blood 114(23): 4792-803. Cambier, J.C. (1995) "Antigen and Fc Receptor Signaling:The Awesome Power of the Immunoreceptor Tyrosine- I Based Activation Motif (ITAM)" The Journal of Immunology 155 (7) 15 3281-3285. Cong, L., F. A. Ran, i wsp., (2013). "Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems." Science 339(6121): 819-23. Critchlow, S. E. i S. P. Jackson (1998). "DNA end-joining: from yeast to man." Trends Biochem Sci 23(10): 394-8. 20 Dalgaard, J. Z., A. J. Klar, i wsp., (1997). "Statistical modeling and analysis of the LAGLIDADG family of site-specific endonucleases and identification of an intein that encodes a site-specific endonuclease of the HNH family." Nucleic Acids Res 25(22): 4626-38. Deltcheva, E., K. Chylinski, i wsp., (2011). "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Nature 471(7340): 602-7. 25 Garneau, J. E., M. E. Dupuis, i wsp., (2010). "The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA." Nature 468(7320): 67-71. Gasiunas, G., R. Barrangou, i wsp., (2012). "Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria." Proc Natl Acad Sci U S A 109(39): E2579- 86. 30 Hacke, K., J. A. Treger, i wsp., (2013). "Genetic modification of mouse bone marrow by lentiviral vector-mediated delivery of hypoxanthine-Guanine phosphoribosyltransferase short hairpin RNA confers chemoprotection against 6-thioguanine cytotoxicity." Transplant Proc 45(5): 2040-4. 123 EP 3 105 317 B1

Jena, B., G. Dotti, i wsp., (2010). "Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor." Blood 116(7): 1035-44. Jinek, M., K. Chylinski, i wsp., (2012). "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Science 337(6096): 816-21. 5 Jonnalagadda, M., C. E. Brown, i wsp., (2013). "Engineering human T cells for resistance to methotrexate and mycophenolate mofetil as an in vivo cell selection strategy." PLoS One 8(6): e65519. Kushman, M. E., S. L. Kabler, i wsp., (2007). "Expression of human glutathione S-transferase P1 confers resistance to benzo[a]pyrene or benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol mutagenesis, 10 macromolecular alkylation and formation of stable N2-Gua-BPDE adducts in stably transfected V79MZ cells co-expressing hCYP1A1."Carcinogenesis 28(1): 207-14. Lackner, G., N. Moebius, i wsp., (2011). "Complete genome sequence of Burkholderia rhizoxinica, an Endosymbiont of Rhizopus microsporus." J Bacteriol 193(3): 783-4. Ma, J. L., E. M. Kim, i wsp., (2003). "Yeast Mrell and Rad1 proteins define a Ku-independent 15 mechanism to repair double-strand breaks lacking overlapping end sequences." Mol Cell Biol 23(23): 8820-8. Mak, A. N., P. Bradley, i wsp., (2012). "The crystal structure of TAL effector PthXo1 bound to its DNA target." Science 335(6069): 716-9. Mali, P., L. Yang, i wsp., (2013). "RNA-guided human genome engineering via Cas9." Science 20 339(6121): 823-6. Metzger, H. i wsp., (1986) "The Receptor with High Affinity for Immunoglobulin E" Annual Review of Immunology. 4: 419-470 Moscou, M. J. i A. J. Bogdanove (2009). "A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors." Science 326(5959): 1501. 25 Nivens, M. C., T. Felder, i wsp., (2004). "Engineered resistance to camptothecin and antifolates by retroviral coexpression of tyrosyl DNA phosphodiesterase-I and thymidylate synthase." Cancer Chemother Pharmacol 53(2): 107-15. Park, T. S., S. A. Rosenberg, i wsp., (2011). "Treating cancer with genetically engineered T cells." Trends Biotechnol 29(11): 550-7. 30 Sangiolo, D., M. Lesnikova, i wsp., (2007). "Lentiviral vector conferring resistance to mycophenolate mofetil and sensitivity to ganciclovir for in vivo T-cell selection." Gene Ther 14(21): 1549-54. Schweitzer, B. I., A. P. Dicker, i wsp., (1990). "Dihydrofolate reductase as a therapeutic target." Faseb J 4(8): 2441-52. Sugimoto, Y., S. Tsukahara, i wsp., (2003). "Drug-selected co-expression of P-glycoprotein and gp91 35 in vivo from an MDR1-bicistronic retrovirus vector Ha-MDR-IRES-gp91." J Gene Med 5(5): 366-76. Takebe, N., S. C. Zhao, i wsp., (2001). "Generation of dual resistance to 4- hydroperoxycyclophosphamide and methotrexate by retroviral transfer of the human aldehyde dehydrogenase class 1 gene and a mutated dihydrofolate reductase gene." Mol Ther 3(1): 88-96. Waldmann H. and Hale G. (2005) "CAMPATH: from concept to clinic". Phil. Trans. R. Soc. B 360: 40 1707-1711.

124 EP 3 105 317 B1

Yam, P., M. Jensen, i wsp., (2006). "Ex vivo selection and expansion of cells based on expression of a mutated inosine monophosphate dehydrogenase 2 after HIV vector transduction: effects on lymphocytes, monocytes, and CD34+ stem cells." Mol Ther 14(2): 236-44. Zielske, S. P., J. S. Reese, i wsp., (2003). "In vivo selection of MGMT(P140K) lentivirus-transduced 5 human NOD/SCID repopulating cells without pretransplant irradiation conditioning." J Clin Invest 112(10): 1561-70.

LISTA SEKWENCJI

<110> CELLECTIS <120> KOMÓRKI DO IMMUNOTERAPII ZAPROJEKTOWANE DO CELOWANIA ANTYGENU 10 OBECNEGO ZARÓWNO NA KOMÓRKACH ODPORNOŚCIOWYCH, JAK I KOMÓRKACH PATOLOGICZNYCH <130> P81400737PCT00 <150> PA201470076 <151> 2014-02-14 15 <160> 101 <170> PatentIn wersja 3.5 <210> 1 <211> 47 <212> DNA 20 <213> homo sapiens <220> <223> cel CD38 <400> 1 tgaggtgggt tggcgactaa ggcgcaccgg tgggcactgc ggggaca 47 25 <210> 2 <211> 936 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> 30 <223> CD38ex1_T2-L1 TALEN

125 EP 3 105 317 B1

<400> 2

126 EP 3 105 317 B1

127 EP 3 105 317 B1

128 EP 3 105 317 B1

129 EP 3 105 317 B1

<210> 3 <211> 942 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CD38ex1_T2-R1 TALEN <400> 3

10

130 EP 3 105 317 B1

131 EP 3 105 317 B1

132 EP 3 105 317 B1

133 EP 3 105 317 B1

<210> 4 <211> 49 <212> PRT <213> homo sapiens 5 <220> <223> cel CD38ex1_T4 <400> 4

<210> 5 10 <211> 970 <212> PRT <213>sztuczna sekwencja <220> <223> CD38ex1_T4-L TALEN 15 <400> 5

134 EP 3 105 317 B1

135 EP 3 105 317 B1

136 EP 3 105 317 B1

137 EP 3 105 317 B1

<210> 6 <211> 942 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CD38ex1_T4-R TALEN <400> 6

10

138 EP 3 105 317 B1

139 EP 3 105 317 B1

140 EP 3 105 317 B1

141 EP 3 105 317 B1

<210> 7 <211> 49 <212> PRT 5 <213> homo sapiens <220> <223> CD38ex1_T5 <400> 7

10 <210> 8 <211> 936 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> 15 <223> CD38ex1_T5-L TALEN

142 EP 3 105 317 B1

<400> 8

143 EP 3 105 317 B1

144 EP 3 105 317 B1

145 EP 3 105 317 B1

<210> 9 <211> 942 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CD38ex1_T5-R TALEN

146 EP 3 105 317 B1

<400> 9

147 EP 3 105 317 B1

148 EP 3 105 317 B1

149 EP 3 105 317 B1

<210> 10 <211> 451 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VH Daratumumabu

150 EP 3 105 317 B1

<400> 10

151 EP 3 105 317 B1

<210> 11 <211> 214 5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VL Daratumumabu

152 EP 3 105 317 B1

<400> 11

<210> 12 <211> 120 5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223>łańcuch VH MOR202

153 EP 3 105 317 B1

<400> 12

<210> 13 <211> 109 5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VL MOR202 <400> 13

10

154 EP 3 105 317 B1

<210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja 5 <220> <223> łańcuch VH HCDR1-1 <400> 14

<210> 15 10 <211> 5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VH HCDR1-2 15 <400> 15

<210> 16 <211> 17 <212> PRT 20 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VH HCDR2 <400> 16

25 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> 30 <223>łańcuch VH HCDR3 <400> 17

<210> 18 <211> 5 35 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VH HCDR4

155 EP 3 105 317 B1

<400> 18

<210> 19 <211> 16 5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VH HCDR5 <400> 19

10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja 15 <220> <223> łańcuch VH HCDR6 <400> 20

<210> 21 20 <211> 11 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VH LCDR1 25 <400> 21

<210> 22 <211> 7 <212> PRT 30 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VH LCDR2 <400> 22

35 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> 40 <223> łańcuch VH LCDR3 156 EP 3 105 317 B1

<400> 23

<210> 24 <211> 11 5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VH LCDR4 <400> 24

10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja 15 <220> <223> łańcuch VH LCDR5 <400> 25

<210> 26 20 <211> 8 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VH LCDR6 25 <400> 26

<210> 27 <211> 21 <212> PRT 30 <213> sztuczna sekwencja <220> <223>peptyd sygnałowy (SP) CD8α <400> 27

35 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213>sztuczna sekwencja 157 EP 3 105 317 B1

<220> <223> łącznik GS <400> 28

5 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <220> 10 <223> FCRIIα region zawiasowy <400> 29

<210> 30 <211> 69 15 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> CD8α region zawiasowy <400> 30

20 <210> 31 <211> 231 <212> PRT <213> homo sapiens 25 <220> <223> region zawiasowy IgG1

158 EP 3 105 317 B1

<400> 31

5 <210> 32 <211> 24 <212> PRT <213> homo sapiens <220> 10 <223> domena TM

159 EP 3 105 317 B1

<400> 32

<210> 33 <211> 42 5 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> domena kostymulująca 4-1 BB <400> 33

10

<210> 34 <211> 112 15 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> CD3ζ domena aktywująca <400> 34

20 <210> 35 <211> 442

160 EP 3 105 317 B1

<212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR GMB005-V1 5 <400> 35

161 EP 3 105 317 B1

<210> 36 <211> 471 5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR GMB005-V2 <400> 36

10

162 EP 3 105 317 B1

163 EP 3 105 317 B1

<210> 37 <211> 657 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR GMB005-V3 <400> 37

10

164 EP 3 105 317 B1

165 EP 3 105 317 B1

166 EP 3 105 317 B1

<210> 38 <211> 119 <212> PRT 5 <213> mus musculus <220> <223>łańcuch VH Luc63 <400> 38

167 EP 3 105 317 B1

<210> 39 <211> 107 5 <212> PRT <213> mus musculus <220> <223> łańcuch VL Luc63 <400> 39

10 <210> 40 <211> 120 <212> PRT <213> mus musculus 15 <220> <223> łańcuch VH Luc90

168 EP 3 105 317 B1

<400> 40

<210> 41 <211> 107 5 <212> PRT <213> mus musculus <220> <223>łańcuch VL Luc90 <400> 41

10

<210> 42 <211> 121

169 EP 3 105 317 B1

<212> PRT <213> mus musculus <220> <223>łańcuch VH Luc34 5 <400> 42

<210> 43 <211> 107 <212> PRT 10 <213> mus musculus <220> <223> łańcuch VL Luc34 <400> 43

170 EP 3 105 317 B1

<210> 44 <211> 120 5 <212> PRT <213> mus musculus <220> <223> łańcuch VH LucXl <400> 44

10

<210> 45 <211> 107

171 EP 3 105 317 B1

<212> PRT <213> mus musculus <220> <223>łańcuch VL LucX1 5 <400> 45

<210> 46 <211> 120 <212> PRT 10 <213> mus musculus <220> <223> lańcuch VH LucX2 <400> 46

172 EP 3 105 317 B1

<210> 47 <211> 108 5 <212> PRT <213> mus musculus <220> <223>łańcuch VL LucX2 <400> 47

10 <210> 48 <211> 432 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja 15 <220> <223> CAR Luc63-V1

173 EP 3 105 317 B1

<400> 48

174 EP 3 105 317 B1

<210> 49 <211> 485 5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR Luc63-V2

175 EP 3 105 317 B1

<400> 49

176 EP 3 105 317 B1

<210> 50 <211> 647 5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR Luc63-V3

177 EP 3 105 317 B1

<400> 50

178 EP 3 105 317 B1

179 EP 3 105 317 B1

<210> 51 <211> 433 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR Luc90-V1 <400> 51

10

180 EP 3 105 317 B1

181 EP 3 105 317 B1

<210> 52 <211> 486 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR Luc90-V2 <400> 52

10

182 EP 3 105 317 B1

183 EP 3 105 317 B1

<210> 53 <211> 648 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR Luc90-V3 <400> 53

10

184 EP 3 105 317 B1

185 EP 3 105 317 B1

186 EP 3 105 317 B1

<210> 54 <211> 434 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR Luc34-V1 <400> 54

10

187 EP 3 105 317 B1

188 EP 3 105 317 B1

<210> 55 <211> 487 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR Luc34-V2 <400> 55

10

189 EP 3 105 317 B1

190 EP 3 105 317 B1

<210> 56 <211> 649 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR Luc34-V3 <400> 56

10

191 EP 3 105 317 B1

192 EP 3 105 317 B1

193 EP 3 105 317 B1

<210> 57 <211> 433 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR LucX1-V1 <400> 57

10

194 EP 3 105 317 B1

195 EP 3 105 317 B1

<210> 58 <211> 487 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR LucX1-V2 <400> 58

10

196 EP 3 105 317 B1

197 EP 3 105 317 B1

<210> 59 <211> 648 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR LucX1-V3 <400> 59

10

198 EP 3 105 317 B1

199 EP 3 105 317 B1

<210> 60 5 <211> 434

200 EP 3 105 317 B1

<212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR LucX2-V1 5 <400> 60

201 EP 3 105 317 B1

<210> 61 5 <211> 487 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja

202 EP 3 105 317 B1

<220> <223> CAR LucX2-V2 <400> 61

5

203 EP 3 105 317 B1

204 EP 3 105 317 B1

<210> 62 <211> 649 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja 5 <220> <223> CAR LucX2-V3 <400> 62

205 EP 3 105 317 B1

206 EP 3 105 317 B1

<210> 64 5 <211> 17 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CS1 T01 lewy TALE

207 EP 3 105 317 B1

<400> 64 tgacttccag agagcaa 17 <210> 65 <211> 17 5 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CS1 T01 prawa TALE <400> 65 10 aacatgcctc accctca 17 <210> 66 <211> 49 <212> DNA <213> homosapiens 15 <220> <223> cel CS1 T02 <400> 66 ttccagagag caatatggct ggttccccaa catgcctcac cctcatcta 49 <210> 67 20 <211> 17 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CS1 T02 lewa TALE 25 <400> 67 ttccagagag caatatg 17 <210> 68 <211> 17 <212> DNA 30 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CS1 T02 prawa TALE <400> 68 tgcctcaccc tcatcta 17 35 <210> 69 <211> 49 <212> DNA <213> homo sapiens <220> 40 <223> cel CS1 T03 <400> 69 ttgactctat tgtctggacc ttcaacacaa cccctcttgt caccataca 49

208 EP 3 105 317 B1

<210> 70 <211> 17 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja 5 <220> <223> CS1 T03 lewa TALE <400> 70 ttgactctat tgtctgg 17 <210> 71 10 <211> 17 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CS1 T03 prawa TALE 15 <400> 71 cctcttgtca ccataca 17 <210> 72 <211> 49 <212> DNA 20 <213> homo sapiens <220> <223> cel 1 CD70 <400> 72 tggtcttttc ttccagtggg acgtagctga gctgcagctg aatcacaca 49 25 <210> 73 <211> 17 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> 30 <223> cel 1 CD70-lewa TALE <400> 73 tggtcttttc ttccagt 17 <210> 74 <211> 17 35 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> <223> cel 1 CD70-prawa TALE <400> 74 40 tgcagctgaa tcacaca 17 <210> 75 <211> 49

209 EP 3 105 317 B1

<212> DNA <213> homo sapiens <220> <223> cel 2 CD70 5 <400> 75 tggtgatctg cctcgtggtg tgcatccagc gcttcgcaca ggctcagca 49 <210> 76 <211> 17 <212> DNA 10 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> cel 2 CD70-lewa TALE <400> 76 tggtgatctg cctcgtg 17 15 <210> 77 <211> 17 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> 20 <223> cel 2 CD70-prawa TALE <400> 77 ttcgcacagg ctcagca 17 <210> 78 <211> 57 25 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <223> cel 3 CD70 <400> 78 30 tgcgggctgc tttggtccca ttggtcgcgg gcttggtgat ctgcctcgtg gtgtgca 57 <210> 79 <211> 17 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja 35 <220> <223> cel 3 CD70-lewa TALE <400> 79 tgcgggctgc tttggtc 17 <210> 80 40 <211> 17 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja

210 EP 3 105 317 B1

<220> <223> cel 3 CD70-prawa TALE <400> 80 ctgcctcgtg gtgtgca 17 5 <210> 81 <211> 122 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> 10 <223> łańcuch VH Ab4 anty-CD70 <400> 81

15 <210> 82 <211> 1358 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> 20 <223> łańcuch VH Ab4 anty-CD70

211 EP 3 105 317 B1

<400> 82

<210> 83 <211> 112 5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VL Ab4 anty-CD70 <400> 83

10

<210> 84 <211> 1476 15 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VL Ab4 anty-CD70

212 EP 3 105 317 B1

<400> 84

<210> 85 <211> 122 5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VH Ab8 anty-CD70 <400> 85

10 <210> 86 <211> 560

213 EP 3 105 317 B1

<212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VH Ab8 anty-CD70 5 <400> 86

<210> 87 <211> 107 <212> PRT 10 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VL Ab8 anty-CD70 <400> 87

15 <210> 88 <211> 645 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> 20 <223> łańcuch VL Ab8 anty-CD70

214 EP 3 105 317 B1

<400> 88

<210> 89 <211> 117 5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VH 1F6 anty-CD70 <400> 89

10 <210> 90 <211> 411 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja 15 <220> <223> łańcuch VH 1F6 anty-CD70 <400> 90

215 EP 3 105 317 B1

<210> 91 <211> 112 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja 5 <220> <223> łańcuch VL 1F6 anty-CD70 <400> 91

<210> 92 10 <211> 396 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> <223> łańcuch VL 1F6 anty-CD70 15 <400> 92

<210> 93 <211> 464 <212> PRT 20 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR Ab4-V1 anty-CD70

216 EP 3 105 317 B1

<400> 93

217 EP 3 105 317 B1

<210> 94 <211> 493 5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR Ab4-V2 anty-CD70

218 EP 3 105 317 B1

<400> 94

219 EP 3 105 317 B1

<210> 95 5 <211> 584 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja

220 EP 3 105 317 B1

<220> <223> CAR Ab4-V3 anty-CD70 <400> 95

5

221 EP 3 105 317 B1

222 EP 3 105 317 B1

<210> 96 <211> 459 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR Ab8-V1 anty-CD70 <400> 96

10

223 EP 3 105 317 B1

224 EP 3 105 317 B1

<210> 97 <211> 488 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR Ab8-V2 anty-CD70 <400> 97

10

225 EP 3 105 317 B1

226 EP 3 105 317 B1

<210> 98 <211> 674 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR Ab8-V3 anty-CD70 <400> 98

10

227 EP 3 105 317 B1

228 EP 3 105 317 B1

229 EP 3 105 317 B1

<210> 99 <211> 459 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR 1F6-V1 anty-CD70 <400> 99

10

230 EP 3 105 317 B1

231 EP 3 105 317 B1

<210> 100 <211> 488 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR 1F6-V2 anty-CD70 <400> 100

10

232 EP 3 105 317 B1

233 EP 3 105 317 B1

<210> 101 <211> 674 <212> PRT 5 <213> sztuczna sekwencja <220> <223> CAR 1F6-V3 anty-CD70 <400> 101

10

234 EP 3 105 317 B1

235 EP 3 105 317 B1

236 EP 3 105 317 B1

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania komórek T ex vivo do immunoterapii przeciwko komórkom patologicznym 5 obejmujący etap:

(a) genetycznego inaktywowania genu w komórce T, który bierze udział w ekspresji lub prezentacji markera antygenowego, który to marker antygenowy jest obecny zarówno na powierzchni komórki T, jak i komórki patologicznej; (b) wyrażania we wspomnianej komórce T transgenu kodującego chimeryczny receptor antygenowy 10 skierowany przeciwko markerowi antygenpwemu obecnemu na powierzchni komórki patologicznej.

2. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym etap a) przeprowadza się z zastosowaniem rzadko tnącej endonukleazy.

3. Sposób według zastrzeżenia 2, w którym endonukleaza ulega ekspresji z transfekowanego mRNA.

4. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, który to sposób obejmuje dalszy etap inaktywowania 15 genu kodującego składnik receptora komórki T (TCR).

5. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, który to sposób obejmuje dalszy etap inaktywowania genu kodującego składnik HLA.

6. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, który to sposób obejmuje dalszy etap inaktywowania genu kodującego β2m.

237 EP 3 105 317 B1

7. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, który to sposób obejmuje dalszy etap inaktywowania genu kodującego białko punktu kontrolnego układu odpornościowego wybranego spośród CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, 5 FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 i GUCY1B3.

8. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, który to sposób obejmuje dalszy etap inaktywowania genu nadającego wrażliwość komórkom odpornościowym na chemioterapię lub leki immunosupresyjne.

10 9. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 8, w którym komórka T w etapie a) pochodzi z limfocytu T zapalnego, limfocytu T cytotoksycznego, limfocytu T regulatorowego lub limfocytu T pomocniczego.

10. Skonstruowana komórka T możliwa do uzyskania zgodnie ze sposobem według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 9, znamienna tym, że gen zaangażowany w ekspresję lub prezentację markera antygenowego, który jest obecny zarówno na powierzchni komórki T, jak i komórki patologicznej jest 15 genetycznie inaktywowany, co skutkuje brakiem markera antygenowego na powierzchni komórki T; i ponadto znamienna tym, że komórka T wyraża chimeryczny receptor antygenowy skierowany przeciwko markerowi antygenowemu obecnemu na powierzchni komórki patologicznej.

11. Skonstruowana komórka T według zastrzeżenia 10 dająca fenotyp [CAR CD38]+[CD38]-.

12. Skonstruowana komórka T według zastrzeżenia 10 dająca fenotyp [CAR CD70]+[CD70]-.

20 13. Skonstruowana komórka T według zastrzeżenia 10 dająca fenotyp [CAR CS1]+[CS1]-.

14. Populacja skonstruowanych komórek T według któregokolwiek z zastrzeżeń 10 do 13 do zastosowania w leczeniu pacjenta zdiagnozowanego na obecność komórek patologicznych prezentujących specyficzne markery antygenowe wspólnie z komórkami T.

238 EP 3 105 317 B1

239 EP 3 105 317 B1

240 EP 3 105 317 B1

241 EP 3 105 317 B1

242 EP 3 105 317 B1

243 EP 3 105 317 B1

244 EP 3 105 317 B1

245 EP 3 105 317 B1

246 EP 3 105 317 B1

247 EP 3 105 317 B1

248 EP 3 105 317 B1

249 EP 3 105 317 B1

250 EP 3 105 317 B1

251 EP 3 105 317 B1

252 EP 3 105 317 B1

253 EP 3 105 317 B1

254 EP 3 105 317 B1

255 EP 3 105 317 B1

256 EP 3 105 317 B1

ODNOŚNIKI CYTOWANE W OPISIE

Lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma jedynie służyć wygodzie czytelnika. Nie stanowi ona części europejskiego dokumentu patentowego. Mimo że wyboru odnośników dokonano z wielką starannością, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń, a EUP nie bierze żadnej odpowiedzialności w tym względzie.

Dokumenty patentowe cytowane w opisie

Literatura niepatentowa cytowana w opisie

257 EP 3 105 317 B1

258 EP 3 105 317 B1

259