Nouvelles Sondes Électrochimiques Pour Le Marquage De Biocapteurs D’Aﬀinité Amani Ben Jrad

Nouvelles sondes électrochimiques pour le marquage de biocapteurs d’aﬀinité Amani Ben Jrad

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Amani Ben Jrad. Nouvelles sondes électrochimiques pour le marquage de biocapteurs d’aﬀinité. Autre. Université de Perpignan, 2019. Français. NNT : 2019PERP0038. tel-02612848

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Spécialité : Chimie

Présentée par Mme Amani BEN JRAD

NOUVELLES SONDES ELECTROCHIMIQUES POUR LE MARQUAGE DE BIOCAPTEURS D’AFFINITE

Soutenue le 13 décembre 2019 devant le jury composé de

M. Pierre GROS, Pr, LGC - Université Paul Sabatier Rapporteur M. François MORVAN, DR INSERM, IBMM - Université de Montpellier Rapporteur Mme. Monica CAMPAS, MCF, IRTA Sant Carles de Ràpita Examinateur M. Victor GONCALVES, MCF, ICMUB - Université de Bourgogne Examinateur M. Thierry NOGUER, Pr, LBBM-BAE - UPVD Examinateur Mme. Carole Calas Blanchard, Pr, LBBM-BAE - UPVD Directeur

M. Nicolas Inguimbert, Pr, CRIOBE - UPVD Co-Directeur

Remerciements

Je tiens tout d’abord à exprimer ma gratitude et mes sincères remerciements à Mme Carole Calas Blanchard, Professeur à l’Université de Perpignan, pour m’avoir confié ce travail, pour sa présence et son soutien tout au long de ces trois ans.

Je remercie vivement Mr Nicolas Inguimbert, Professeur à l’Université de Perpignan, d’avoir accepté de codiriger ce travail. Merci pour ta disponibilité, tes conseils avisés et ta patience.

Mes remerciements s’adressent aussi à Thierry Noguer, Professeur à l’Université de Perpignan, pour ses encouragements, sa bonne humeur et ses précieux conseils.

J’espère avoir été à la hauteur de vos attentes.

Je remercie également les membres du jury qui ont accepté d’évaluer ce travail. J’adresse mes remerciements particulièrement à M. Pierre Gros, Professeur à l’Université Paul Sabatier, et M. François Morvan, Directeur de recherche INSERM à l’université de Montpellier, pour m’avoir fait l’honneur d’examiner ce travail et d’en être les rapporteurs. J’adresse également un vif remerciement à Mme Monica Campas, chercheur à IRTA, Sant Carles de Ràpita et M. Victor Goncalves, Maître de conférences à l’Université de Bourgogne, qui ont accepté de faire partie du jury de ma thèse.

Je ne saurai oublier dans mes remerciements tous les membres du laboratoire BAE qui m’ont accompagnée dans la réalisation de ce travail. Merci pour les sourires, les discussions, les sorties, et la bonne humeur.

Je remercie également Dr Hussein Kanso, qui n'a épargné aucun effort pour m'aider et qui m’a suivie de près tout au long de mon travail.

Je tiens à remercier profondément toute l’équipe CRIOBE de m’avoir bien accueillie depuis mon stage de M2 et tout au long de ma thèse.

A toute personne qui m’a soutenue et qui a participé de près ou de loin à la réalisation de ce travail, je vous remercie du fond du cœur.

DEDICACE

A mon très cher Père, Taher BEN JRAD, Autant de phrases aussi expressives soient-elles ne sauraient montrer le degré d’amour que j’éprouve pour toi. Tu n’as cessé de me soutenir et de m’encourager durant toutes les années de mes études, tu as toujours été présent à mes côtés pour me consoler quand il fallait. Tu as su m’inculquer le sens de la responsabilité, de l’optimisme et de la confiance en soi face aux difficultés de la vie. Tes conseils ont toujours guidé mes pas vers la réussite. En ce jour mémorable, pour moi ainsi que pour toi, reçoit ce travail en signe de ma vive reconnaissance et ma profonde estime.

A ma très chère mère, Moufida BEN JRAD, Tu m’as comblé avec ta tendresse et ton affection tout au long de mon parcours. Ta patience sans fin, ta compréhension et ton encouragement sont pour moi le soutien indispensable que tu as toujours su m’apporter. Je te dois ce que je suis aujourd’hui et ce que je serai demain et je ferai toujours de mon mieux pour rester ta fierté et ne jamais te décevoir.

A ma petite sœur, Ghada BEN JRAD, Pour ta gentillesse et ta présence à tout instant, je t’exprime à travers ce travail mes sentiments d’amour et de reconnaissance. Je te souhaite un avenir plein de joie, de bonheur, de réussite et de sérénité.

A mon chéri Yassine Merci d’être là pour moi et d’avoir subir mes folies et mes caprices tout au long de ces trois ans. Je sais que je ne saurai exprimer ma gratitude en ces quelques mots mais je te dédie ce travail pour tous ce que tu fais pour moi pour que tu sois toujours fière de moi.

A toute ma famille, petits et grands, à mes amis Veuillez trouver dans ce travail l’expression de mon affection et de ma gratitude. Je vous remercie pour votre soutien et votre amour.

A toute personne qui m’a soutenu et qui a participé de près ou de loin à la réalisation de ce projet, je vous remercie du fond du cœur.

Liste des figures

Figure 1: Structures chimiques des composés estrogéniques : estrogène naturel : 17-β-estradiol (E2) (A) et estrogène synthétique : 17-α-éthinylestradiol (EE2) (B) ...... 22 Figure 2: Principe du test YES ...... 26 Figure 3: Schéma explicatif d’un immunoessai de type direct...... 27 Figure 4: Schéma explicatif d’un immunoessai de type sandwich ...... 28 Figure 5: Schéma explicatif d’un immunoessai par compétition ...... 28 Figure 6: Illustration schématique du principe du MPs-CLEIA 56 ...... 29 Figure 7: Représentation schématique du principe d’un biocapteur 62 ...... 30 Figure 8: Représentation des différents types de bio-récepteurs ...... 31 Figure 9: Schéma du processus SELEX105 ...... 34 Figure 10: Processus d’impression moléculaire lors de la synthèse de MIP113 36 Figure 11: Exemples de techniques d’immobilisation. 1) adsorption physique, 2) couplage covalent 3) inclusion ou piégeage...... 36 Figure 12: Schéma montrant un changement de conformation possible de l’aptamère après fixation de la cible ...... 43 Figure 13: Aptamère doublement marqué par un fluorophore et son « quencher » pour une détection par fluorescence ...... 44 Figure 14: Principe d’un aptacapteur électrochimique sans marquage.A) système ON / OFF B) système OFF / ON ...... 45 Figure 15: Différents principes d’aptacapteurs électrochimiques avec marquage redox, configuration de type signal OFF / ON (A) et signal ON / OFF (B)...... 46 Figure 16: Structure du bleu de méthylène sous sa forme oxydée et réduite. . 49 Figure 17:Représentation schématique du principe d’un biocapteur électrochimique marqué au MB pour la détection d’ADN187 ...... 50 Figure 18: Représentation schématique d’un biocapteur électrochimique marqué au MB de type compétitif 189 ...... 51 Figure 19: Exemple d’un système ON-OFF : représentation schématique d’un aptacapteur avec un marquage au MB pour la détection du TNF-α (facteur de nécrose tumorale) : une cytokine inflammatoire clé, dans le sang 186...... 51 Figure 20: Couple redox ferrocène / ferricénium ...... 52

Figure 21: Structure de l’anthraquinone et sa réaction d’oxydoréduction...... 53 Figure 22: Structure du ligand tetradentates (N2O2) basique de type salen, formé par un ethylenediamine et deux salicylaldehydes...... 54 Figure 23: Représentation schématique de l’immunocapteur électrochimique basé sur la compétition entre E2 libre et E2 lié au complexe oxovanadium-salen 146...... 55 Figure 24: Ligands salen 1a et salan 1b fonctionnalisés ...... 57 Figure 25: Etude rétrosynthétique pour l’obtention des composés 1a et 1b par une approche convergente ou une synthèse linéaire...... 58 Figure 26: Produits observés lors de la tentative de synthèse du composé 1b par la voie de synthèse convergente ...... 59 Figure 27: Stratégie de synthèse du ligand salen fonctionnalisé ...... 60 Figure 28: Stratégie de synthèse du ligand salan fonctionnalisé ...... 61 Figure 29: Synthèse des complexes métalliques (Composés 8, 9 et 10)...... 62 Figure 30: A) spectre UV-visible du salen 1a (noire), Cu-salen (rouge) et VO- salen (bleu). B) Voltamogrammes du salen 1a (noir), Cu-salen 8 (rouge) and VO-salen 9 (bleu)...... 64 Figure 31: A) spectre UV-visible du salan 1b (noir) et de son complexe d’oxovanaium (vert). B) Voltamogrammes du salan 1b (noir) et VO-salan 9 (Vert)...... 65 Figure 32: Spectre RMN du composé 4a ...... 67 : Figure 33: Chromatogramme LC/MS du composé 4a ...... 67 Figure 34: Chromatogramme LC/MS du composé 6a...... 69 Figure 35: Synthèse du Composé 7b ...... 70 Figure 36: Spectre RMN du composé 7a ...... 70 Figure 37: Spectre RMN du composé 7a ...... 71 Figure 38: Chromatogramme LC/MS du composé 1a...... 72 Figure 39: Chromatogramme LC/MS du composé 4c...... 73 Figure 40: Chromatogramme LC/MS du composé 6c...... 74 Figure 41: Chromatogramme LC/MS du composé 1b ...... 75 Figure 42: Spectre RMN du composé 1b ...... 76 Figure 43: Chromatogramme LC/MS du composé 1b ...... 77 Figure 44: Structure 2D de l’aptamère Alsager 35 anti-E2, modélisée par le logiciel m-fold ...... 81

Figure 45: Structures chimiques du 17-β-estradiol (E2) (A), 17-α-éthinylestradiol (EE2) (B), la testostérone (C) et la progestérone (D)...... 82 Figure 46: Composé 11 : Résultat du couplage aptamère/ ligand salen ...... 84 Figure 47: Composé 14 : Résultat du couplage aptamère/dérivé de dégradation du ligand salen 1a...... 85 Figure 48: Chromatogrammes LC/HRMS (A) et spectres de masse (B) de l’aptamère (A1, B1) ; du ligand salen 1a (A2, B2) et du composé 11 (A3, B3). .. 86 Figure 49: Spectres RMN du (A) salen 1a, salen 1a en présence de D2O2 B) t=1h ; C) t=24h ...... 87 Figure 50: Composé 12 : Résultat du couplage aptamère/salan 1b ...... 89 Figure 51: Composé 13 résultant du couplage aptamère/ VO-salan ...... 89 Figure 52: Chromatogrammes LC/HRMS (A) et spectres de masse (B) de l’aptamère (A1, B1) ; du salan 1b (A2, B2), du composé 12 (A3, B3), du composé 10 (A4, B4) et du composé 13 (A5, B5)...... 90 Figure 53: A) Machine à sérigraphier DEK 248 B) Etapes de fabrication des électrodes par sérigraphie ...... 95 Figure 54: Schéma des étapes d’immobilisation de l’aptamère sur une électrode de carbone sérigraphiée ...... 96 Figure 55: Voltammétrie à vague carrée (SWV) réalisée pour des aptacapteurs conçus à partir de différentes concentrations d’aptamères marqués par VO- salan ...... 97 Figure 56: (A) Diagrammes de Nyquist et (B) cyclovoltammogrammes obtenus en présence de 2 mM [Fe(CN)6]3-/4- ...... 98 Figure 57: (A) Voltammogrammes obtenus par SWV après incubation de l’aptacapteur avec des concentrations croissantes de E2. (B) courbe d’étalonnage représentant la variation d’intensité Δ I en fonction des concentrations d’E2...... 100 Figure 58: (A) Voltammogrammes obtenus par SWV après incubation de l’aptacapteur avec des concentrations croissantes de EE2 EE2. (B) courbe d’étalonnage représentant la variation d’intensité Δ I en fonction des concentrations d’EE2...... 100 Figure 59: Histogramme présentant la spécificité de l’aptacapteur contre un blanc et 0,1µM : E2, EE2 et Ts (testostérone)...... 101

Figure 60: (A) Voltammogrammes obtenus par SWV après incubation de l’aptacapteur avec des concentrations croissantes de E2. (B) courbe d’étalonnage de la variation de l’intensité de pic Δ I en fonction des concentrations de E2...... 102

Liste des tableaux

Tableau 1:Comparaison des caractéristiques des aptamères et des anticorps...... 35 Tableau 2: Caractéristiques des principales méthodes d’immobilisation ...... 38 Tableau 3: Exemples de différents marquages utilisés dans des immunocapteurs électrochimiques pour la détection d’E2...... 42 Tableau 4: Exemples d’aptacapteurs électrochimiques développés pour la 3-/4- détection d’E2 en présence de Fe(CN)6 comme espèce électroactive...... 48 Tableau 5: Tableau comparatif des constantes de dissociation (Kd (µM)) des complexes aptamères anti-E2/hormones (E2, testostérone et progestérone) ; N.B : No Binding et - : pas de mesure...... 83

Liste des abréviations

AlkP : Alkalyne Phosphatase

AQ : anthraquinone

AuNPs : Nanoparticules d’or

Boc : tert-Butoxycarbonyle

BSA : Albumine de sérum bovin

CLEIA : ChemiLuminescence Enzyme ImmunoAssay

CPRG: ChloroPhenol Red-β-D-Galactopyranoside

Cu: Cuivre

CV: Voltammétrie cyclique

DCM: Dichlorométhane

DCE : Directive Cadre sur l’Eau

DIPEA : N,N-Diisopropylethylamine

DMF : N,N-Dimethylformamide

DPV : Voltampérométrie différentielle

E1 : Estrone

E2 : 17-β-estradiol

EE2 : 17-α-éthinylestradiol

EI : Ionisation électronique

EIS : Spectroscopie d’impédance électrochimique

ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

ERE : Estradiol-Récepteur à Estradiol

ESI : Ionisation par électrospray

Fc : Ferrocéne

GC-MS : Chromatographie gazeuse couplée au spectromètre de masse hER: Récepteur humain d'estradiol

HRP: Peroxydase de raifort

ITC: Calorimétrie isotherme à titrage

IUPAC: Union internationale de chimie pure et appliquée

Kd: Constante de dissociation

LC-MS : Chromatographie liquide couplée au spectromètre de masse

LMCT : Ligand Metal Charge Transfer

LOD : Limite de détection

LSV : Voltamétrie à balayage linéaire

MB: Bleu de méthylène

MIP: Polymère à empreinte moléculaire

MP-11: Microperoxidase

MS : Spectromètrie de masse

OMS: Organisation mondiale de la santé

QCM : Microbalance en cristal de quartz

Rct : Résistance au transfert de charge

RMN : Résonance magnétique nucléaire

SAM : Monocouche auto-assemblée

SELEX: Evolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel

SPR: Résonance des plasmons de surface

STEP: Station d’épuration des eaux usées

SWV: Voltammétrie à vagues carées

Ts : Testostérone

TNF: Facteur de nécrose tumoral

VO: Oxovanadium

YES: Yeast Estrogen Screen

Sommaire

Introduction Générale ...... 14

Chapitre 1 : Etude bibliographique ...... 18

I. Contexte scientifique ...... 19

I.1. Pollution des eaux...... 19

I.2. Substances émergentes ...... 20

I.3. Hormones ostrogéniques ...... 21

II. Détection des substances cibles ...... 23

II.1. Méthodes de détection classiques ...... 23

II.1.1. Méthodes chromatographiques ...... 23

II.1.2. Méthodes biologiques globales ...... 25

II.1.3. Méthodes biologiques spécifiques ...... 26

II.2. Méthodes alternatives : Les biocapteurs ...... 30

II.2.1. Définition ...... 30

II.2.2. Eléments pour la conception de biocapteurs ...... 31

II.2.2.1. Récepteurs ...... 31

a. Récepteurs catalytiques ...... 32

b. Récepteurs d’affinité non catalytiques ...... 33

II.2.2.2. Principales méthodes d’immobilisation des bio-récepteurs ...... 36

a. Adsorption physique ...... 36

b. Inclusion ou piégeage ...... 37

c. Couplage covalent ...... 37

II.2.2.3. Transducteurs ...... 38

a. Transducteurs optiques ...... 38

b. Transducteurs massiques ...... 39

c. Transducteurs thermométriques ...... 39

d. Transducteurs électrochimiques ...... 39

II.2.3. Biocapteurs pour la détection des estrogènes ...... 40

II.2.3.1. Immunocapteurs ...... 40

II.2.3.2. Aptacapteurs ...... 42

a. Principe général d’un aptacapteur ...... 42

b. Aptacapteurs pour la détection des estrogènes ...... 46

III. Sondes redox pour le marquage des biocapteurs ...... 48

III.1. Marqueurs électro-actifs classiques ...... 49

III.1.1. Bleu de méthylène ...... 49

III.1.2. Ferrocène ...... 52

III.1.3. Anthraquinone ...... 53

III.2. Nouveaux marqueurs électro-actifs : Complexes métalliques de type salen/salan………………………………………………………………………………………..54

Chapitre 2 : Synthèse et caractérisation des complexes métalliques ...... 56

I. Introduction ...... 57

II. Résultats et discussion ...... 58

II.1. Synthèse des composés salen 1a et salan 1b ...... 58

II.2. Synthèse des complexes ...... 61

II.3. Caractérisation physicochimique des complexes ...... 63

II.3.1. Caractérisation des composés 10 et 11 ...... 63

II.3.2. Caractérisation du composé 12 ...... 64

III. Partie expérimentale ...... 65

III.1. Réactifs et appareillages ...... 65

III.2. Synthèse des complexes métalliques ...... 66

III.1.1. Synthèse du ligand salen ...... 66

III.1.2. Synthèse du ligand salan ...... 72

III.1.3. Complexation métallique ...... 77

III.2. Caractérisation des complexes métalliques ...... 78

III.2.1. Spectroscopie UV-Visible ...... 78

III.2.2. Voltammétrie cyclique (CV) ...... 78

IV. Conclusion ...... 79

Chapitre 3 : Couplage d’un aptamère anti-estradiol aux composés synthétisés .80

I. Introduction ...... 81

II. Résultats et discussion ...... 82

II.1. Choix de l’aptamère ...... 82

II.2. Résultats du marquage ...... 83

II.2.1. Linéarisation de l’aptamère ...... 83

II.2.2. Couplage aptamère-salen ...... 84

II.2.3. Couplage aptamère-salan ...... 88

III. Partie expérimentale ...... 91

III.1. Linéarisation de l’aptamère...... 91

III.2. Couplage Aptamère-marqueur ...... 91

IV. Conclusion ...... 92

Chapitre 4 : Conception de l’aptacapteur pour la détection de l’estradiol ...... 93

I. Introduction ...... 94

II. Résultats et discussion ...... 95

II.1. Conception de l’aptacapteur marqué au VO-salan ...... 95

II.2. Détection des hormones cibles par l’aptacapteur marqué au VO-salan99

II.3. Détection de l’estradiol par l’aptacapteur marqué au bleu de méthylène…………………………………………………………………………………………10 1

III. Partie expérimentale ...... 102

III.1. Conception de l’aptacapteur marqué au VO-salan ...... 102

III.1.1. Modification de la surface de l’électrode ...... 102

III.1.2. Activation de la surface modifiée ...... 103

III.1.3. Immobilisation de l’aptamère marqué ...... 103

III.1.4. Détection des cibles ...... 103

III.2. Détection d’E2 par l’aptacapteur marqué au bleu de méthylène ...... 104

IV. Conclusion ...... 104

Conclusion et Perspectives ...... 105

Références ...... 114

Introduction Générale

De nos jours, le problème de la pollution environnementale est devenu un sujet sociétal qui préoccupe autant la population que les gouvernements. Cette pollution qui concerne tous les compartiments de l’environnement, l’air, l’eau et le sol fait l’objet de différents accords internationaux depuis une quarantaine d’années. Le premier de ces accords est la convention de Genève de 1979 portant sur la pollution atmosphérique transfrontière à longue distance. Ce premier accord a été suivi de nombreux autres portant sur la protection de la couche d’ozone et la lutte contre le réchauffement climatique ; la protection des milieux marins et aquatiques ; la protection de la flore et la faune pour le maintien de la biodiversité1. Dans un contexte de changement climatique global, la réduction des pollutions affectant la santé des biosystèmes et leur biodiversité est devenue un objectif global comme l’atteste la signature de l’accord de Paris en 2016 par 195 pays sur les 197 pays reconnus par l’Organisation des Nations Unies. Bien que cet accord ne porte que sur la réduction des émissions de gaz à effet de serre, il atteste de par sa portée mondiale de cette prise de conscience collective. L’augmentation de la population, la généralisation d’un mode de vie basé en partie sur l’hyperconsommation se traduisent par une production massive de déchets, un épuisement des ressources naturelles concourant à une pollution généralisée.

Une des premières ressources qui est impactée et fragilisée est l’eau tant au niveau des rivières que des océans car elle constitue le réceptacle final de très nombreux polluants. Dans le but de remédier à cette pollution, les eaux usées sont collectées et traitées au niveau des stations d’épuration. Mais ces traitements restent insuffisants pour éliminer tous les polluants et préserver la ressource en eau. Ainsi, 35% de la population mondiale soit 3.5 milliards de personnes n’ont qu’un accès restreint à une eau de qualité sanitaire suffisante dont 800 millions ne disposent pas d’une source d’eau potable. Cette problématique est aujourd’hui au cœur des débats concernant l’environnement et l’accès à une ressource en eau en quantité et de qualité suffisantes. Pour traiter ce problème, plusieurs questions sont posées sur le devenir de ces substances dans le milieu aquatique, leurs effets sur les organismes vivants, le meilleur moyen de les éliminer et la possibilité de réduire leur déversement dans la nature.

Dans ce contexte, des directives européennes ont été mises en place. Parmi elles, la directive cadre sur l’eau ou DCE (2000/60/CE) vise à la protection et à l’amélioration

15 de la qualité des milieux aquatiques naturels. Pour atteindre ces objectifs, la DCE présente une méthode de travail qui repose sur l’identification du problème, l’établissement d’un plan de gestion, la définition des actions nécessaires et enfin le suivi des résultats. La DCE a aussi établi une liste qui regroupe les substances jugées dangereuses et qui doivent être surveillées et traitées en priorité vu les menaces identifiées. Parmi ces substances, on trouve essentiellement des métaux lourds et des pesticides. Cette liste est ensuite complétée par une liste de vigilance avec, pour la première fois, des produits pharmaceutiques.

Afin d’assurer la surveillance de ces polluants dans les milieux naturels ou leur suivi au cours des traitements des eaux, des outils analytiques sont indispensables. Il existe certes des techniques analytiques conventionnelles efficaces mais elles sont souvent limitées par la durée des analyses et l’utilisation d’un appareillage imposant comme dans le cas des techniques chromatographiques. En effet, pour répondre aux défis actuels, il est indispensable de s’affranchir de ces outils conventionnels et de chercher d’autres alternatives qui sont plus adaptées aux besoins de pays ayant des budgets limités et aux mesures sur site rapides et directes. Les biocapteurs électrochimiques semblent être les plus à même de répondre à un projet de miniaturisation pour faciliter la surveillance et le suivi des polluants dans l’eau au niveau mondial. Pour ce type de biocapteur, un marquage redox est souvent utilisé afin d’améliorer le signal. Ces marqueurs bien que disponibles et efficaces sont en nombre très limité et développer de nouvelles sondes est un prérequis à leur développement.

Ce travail de thèse a porté sur le développement et l’étude de nouveaux marqueurs électrochimiques de type complexes métalliques pour le marquage d’un biocapteur d’affinité. Afin de réaliser une preuve de concept, nous nous sommes intéressés à la détection de deux hormones estrogéniques : le 17-β-estradiol (E2) et son dérivé synthétique le 17-α-ethinylestradiol (EE2), citées dans la liste de vigilance européenne en tant que perturbateur endocrinien et considéré comme polluant émergent. L’élément de reconnaissance qui va être marqué par nos complexes métalliques est un aptamère spécifique aux molécules cibles.

Ce travail est présenté en quatre parties. Après une introduction générale permettant de replacer l’étude dans son contexte, la première partie décrit les étapes de synthèse des complexes métalliques de type salen et salan ainsi que leurs

16 caractérisations physico-chimiques. Ensuite, la deuxième partie porte sur la mise au point et le suivi du marquage de l’aptamère par les composés synthétisés. Enfin, dans la dernière partie la conception de l’aptacapteur et son utilisation pour la détection des cibles sont présentées.

Chapitre 1 : Etude bibliographique

I. Contexte scientifique I.1. Pollution des eaux

Plus des deux tiers de la surface de la Terre sont recouverts d'eau et malgré cette abondance, cette ressource essentielle est en danger. Alors que la population mondiale continue de croître et que l’activité humaine se développe, la pression exercée sur les ressources en eau ne cesse d’augmenter. En plus d’une surconsommation d’eau à l’échelle mondiale, la pollution aquatique a atteint un seuil alarmant. La présence de polluants dans l’eau conduit à un changement des caractéristiques physico-chimiques des milieux, à des contaminations microbiologiques importantes, à une accumulation des substances toxiques, à des perturbations endocriniennes et enfin à une mortalité massive des espèces marines. Aujourd’hui, la menace ne se manifeste plus comme une simple dégradation de la qualité des eaux, mais elle concerne aussi la santé et la sécurité des êtres vivants. Les organismes aquatiques sont généralement les plus exposés aux dangers de cette pollution. Cependant, la santé humaine est aussi menacée, notamment par la consommation de produits de la mer (poissons, mollusques ou crustacés), qui ont accumulé des éléments toxiques dans leurs tissus ou aussi l’eau potable contaminée.

Les principales sources de pollution des milieux aquatiques sont les activités urbaines, industrielles et agricoles. En effet, le rejet d’effluents provenant de différentes sources (stations d’épurations, industries ou autre) et le lessivage des sols contaminés (voies routières ou terres agricoles traitées) sont à l’origine de la présence de divers polluants dans l’eau. Ces polluants peuvent être classés selon différentes catégories. Ainsi, parmi les polluants chimiques, on distingue les polluants minéraux qui sont généralement représentés par les éléments traces métalliques (plomb, zinc, chrome…), les phosphates, les sulfates et les nitrates des polluants organiques de l’environnement tels que les hydrocarbures (aromatiques polycycliques ou aliphatiques), les solvants chlorés et non chlorés, les phénols, les pesticides organiques… Il existe également des polluants, qualifiés de contaminants biologiques, comme les microorganismes pathogènes regroupant des bactéries, parasites ou virus, essentiellement d’origine fécale, mais aussi les cyanobactéries toxiques. Enfin, les éléments radioactifs forment une catégorie distincte car leurs

19 sources sont bien définies et ils bénéficient d’un suivi et d’une surveillance spécifique.

Face aux menaces qui pèsent sur nos ressources en eau, le parlement Européen a établi une politique globale communautaire dans le domaine de l’eau en adoptant une directive cadre sur l’eau (DCE) (2000/60/CE). Cette directive a pour but de protéger l’environnement et d’améliorer la qualité des écosystèmes aquatiques en établissant des programmes de prévention et réduction de la pollution de l’eau et en promouvant son utilisation durable.

I.2. Substances émergentes

Le programme de surveillance et la protection des milieux aquatiques, établi par l’Union Européenne et réglementé par la DCE, se basait sur une liste regroupant des substances ou groupes de substances chimiques « prioritaires » dont certaines sont considérées comme « dangereuses prioritaires » (2455/2001). Cette liste est régulièrement mise à jour afin de faciliter le suivi et la surveillance de la qualité chimique des eaux, de limiter les dégâts de la pollution et d’améliorer l’environnement aquatique.

En plus des substances prioritaires, les polluants dits « émergents » sont au centre des préoccupations des législateurs. Ces contaminants sont définis comme des composés utilisés quotidiennement en large quantité sans que leurs effets sur l’environnement ne soient toujours avérés. Leur suivi dans l’eau n’est pas encore soumis à réglementation et les études qui traitent cette problématique sont rares2–7. Le manque des données concernant les risques liés à la présence de ces substances émergentes dans les milieux aquatiques rend la prise de décision difficile quant à leur intégration ou non, dans la liste des polluants prioritaires.

Pour remédier à ce problème, une liste de vigilance a été élaborée à partir des programmes de surveillance nationaux, en marge de la DCE. Cette liste regroupe les substances émergentes qui nécessitent une attention particulière en raison de leur quantité élevée, du potentiel danger pour la santé des organismes vivants et/ou du besoin de développer plus de techniques d’analyse pour leur détection. Cette liste de vigilance a été publiée en 2015 (2015/495) et mise à jour en 2018 (2018/840). Actuellement, elle inclut 8 substances ou groupes de substances : les dérivés estrogéniques : 17-β-estradiol (E2), estrone (E1) et 17-α-ethinylestradiol (EE2) ; les

20 antibiotiques de la classe des macrolides : érythromycine, clarithromycine, azithromycine ainsi que l’amoxicilline et le ciprofloxacine ; les pesticides, methiocarbe ; les insecticides de la famille des néonicotinoides : imidaclopride, thiaclopride, thiamethoxame, clothianidine, acétamipride mais également le métaflumizone. Cette liste mentionne les concentrations sans effet prévisible pour l’environnement (PNECs : Predicted No Effect Concentrations) et les méthodes d'analyse possibles.

I.3. Hormones ostrogéniques

Parmi les substances de la liste de vigilance, figurent trois hormones estrogéniques, deux hormones sexuelles naturelles, l’estrone (E1) et le 17-β- estradiol (E2) et une hormone synthétique, le 17-α-ethinylestradiol (EE2). Ces composés ainsi que leurs produits d’oxydation, sont considérés comme perturbateurs endocriniens8. En effet, l’OMS a défini en 2002 les perturbateurs endocriniens comme « des substances chimiques d’origine naturelle ou artificielle étrangères à l’organisme. Elles peuvent interférer avec le fonctionnement du système endocrinien et introduire des effets néfastes sur l’organisme d’un individu ou sur ses descendants ». Une fois dans l’organisme, les perturbateurs endocriniens peuvent interférer avec l’action des hormones naturelles en se fixant sur les récepteurs de ces dernières. Des modifications des concentrations hormonales peuvent également être observées suite à une perturbation ou à une inhibition du mécanisme de production2. Ces substances sont un danger potentiel pour l’environnement et la santé3. Plusieurs études ont été réalisées afin de comprendre les conséquences de la présence des perturbateurs endocriniens dans les eaux. Chez l’Homme, les résultats ont montré que l'exposition à des perturbateurs endocriniens de type estrogénique pourrait être impliquée dans le cancer du sein, des testicules et de la prostate ainsi que des problèmes de reproduction et d’infertilité. Chez les organismes marins, des problèmes liés à la croissance, la reproduction et la mortalité ont été constatés en plus de l'hermaphrodisme animal4–7,9.

Parmi les hormones estrogéniques, nous nous sommes intéressés dans ce travail au 17-β-estradiol (E2) et son dérivé synthétique le 17-α-ethinylestradiol (EE2). L'E2 est le principal estrogène chez les vertébrés. Il est associé au système de reproduction féminin et au maintien des caractères sexuels. Cette hormone est produite chez la femme par le follicule de De Graaf, le corps jaune, les glandes

21 surrénales ainsi que le placenta et chez l'homme par les testicules. L’EE2 est une hormone synthétique dérivée de l'estrogène naturel E2 (Fig.1). Elle est principalement utilisée en tant que composant de pilules contraceptives mais aussi en médecine humaine pour la thérapie hormonale de substitution et dans le cas de la suspension de l'allaitement.

Figure 1: Structures chimiques des composés estrogéniques : estrogène naturel : 17-β- estradiol (E2) (A) et estrogène synthétique : 17-α-éthinylestradiol (EE2) (B) Les estrogènes (E2 et EE2) sont en grande partie excrétés chez les humains comme chez les animaux dans les urines et les selles sous forme libre active ou sous forme conjuguée inactive10–12. L'excrétion d'estrogènes varie en fonction du sexe, de l’âge et de l'état physiologique de l’individu. Les principaux contributeurs sont les femmes enceintes et les femmes en période de menstruation, excrétant respectivement 308 et 4,66 µg d'E2 par jour dans les urines et 202 et 0,2 µg d'E2 par jour dans les selles. Généralement, la femme et l'homme présentent une excrétion similaire en E2, comprise entre 1,5 et 7 µg par jour13–15. En ce qui concerne l’EE2, selon les estimations dans les pays occidentaux, 17% de la population féminine totale est sous traitement contraceptif oral régulier et l’excrétion correspondante est de 4,5 et 6 µg d'EE2 par jour et par personne respectivement dans les urines et les selles. Ces données ont permis de prédire un rejet total d’œstrogènes de 4,4 kg par an et par million d’habitants10,14,15. Ces estrogènes se retrouvent dans l’environnement lors du rejet des effluents des eaux usées, car ils ne sont pas dégradés par les traitements mis en place dans les stations d’épuration (STEP)16. Par ailleurs, il convient de mentionner que les déjections animales sont souvent épandues dans les champs en tant que fertilisant. Ainsi, une partie des estrogènes qu’elles contiennent contaminent les cours d’eau et nappes phréatiques suite aux épisodes pluvieux et aux ruissellements. En fait, de nombreuses études ont confirmé

la présence d'E2 et d'EE2 dans les eaux de surface de divers pays, à des concentrations allant respectivement de 5 ng/L à 70 ng/L et de 0,2 ng/L à 11 ng/L14,17–21. Les deux œstrogènes ont également été détectés dans des échantillons de boues de stations d’épuration et de sédiments22–25 de cours d’eau, montrant leur persistance dans l'environnement26.

Etant donné les risques potentiels que représentent les estrogènes stéroïdiens pour l’environnement, il est indispensable de développer des méthodes analytiques robustes et fiables pour la surveillance de ces produits dans les eaux. Les STEP contribuant fortement aux rejets d’estrogènes dans l’environnement, il parait nécessaire d’assurer le suivi des concentrations d’estrogènes en entrée et sortie de STEP pour identifier l’utilité d’un traitement. Ainsi une action préventive pourrait être mise en place pour réduire la contamination des eaux de surface et du milieu marin pour limiter les conséquences constatées sur la faune.

II. Détection des substances cibles II.1. Méthodes de détection classiques

Plusieurs méthodes ont été développées et optimisées pour la détection et l’identification des estrogènes dans l’eau. Des techniques chromatographiques ainsi que des méthodes biologiques ont présenté une sensibilité différente selon la spécificité des tests et des outils de reconnaissance utilisés. Des problèmes de sélectivité et de durée d’analyse ont été aussi décelés.

II.1.1. Méthodes chromatographiques

Ces méthodes sont basées essentiellement sur la chromatographie en phase liquide ou gazeuse couplées à la spectrométrie de masse (MS ou le tandem MS/MS). La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC- MS ou GC-MS/MS) a été la première à être développée. Dans la plupart des cas, l’analyse GC-MS des échantillons gazeux est réalisée par ionisation par électron ionization (EI)) souvent en mode négatif. Cette technique nécessite généralement une dérivatisation des échantillons pour augmenter la volatilité des composés cibles ce qui contribue à améliorer la sensibilité et la sélectivité de la détection17,24,27. Différentes procédures ont été proposées pour la dérivatisation des estrogènes dans des extraits environnementaux. Différents réactifs ont été utilisés pour la dérivatisation tels que le N-méthyl-N-(triméthylsilyl) trifluoroacétamide

(MSTFA)19,28,29, le chlorure de pentafluorobenzoyle (PFBCl)17,24,27,28 et le chlorure de tert-butyldiméthylsilyle (TBDMSCl)30. La procédure utilisée dans la plupart des études est la dérivatisation avec addition de N,O-bis(triméthylsilyl)trifluoroacétamide (BSTFA) contenant 1% de triméthylchlorosilane (TMCS) et de la pyridine à une température de 60-80°C. Ces conditions de dérivatisation ont montré une sensibilité et une sélectivité plus satisfaisantes31,32. Comme les procédures de dérivatisation sont longues, une optimisation a été réalisée en utilisant des ultrasons permettant de réduire le temps de réaction de 30 à 60 minutes à des temps de 1 ou 10 minutes et d’abaisser les limites de détection (LOD) entre 0,35 et 6,1ng/L31. Cependant, malgré l’efficacité de cette technique et les différentes optimisations réalisées pour faciliter son application, il est important de signaler la possibilité d’une surestimation des concentrations dans certains cas pouvant être due, par exemple, à une co-élution de l’acide tétracosanique avec l’EE2. En effet, ce composé présente la même masse que le produit cible ainsi que le même temps de rétention33,34. La chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC- MS ou LC-MS/MS) est la deuxième méthode la plus utilisée pour la détection d’E2 et d’EE2 dans des échantillons d'eau. Les méthodes à base de LC ne nécessitent pas de dérivatisation préalable et présentent des LOD de 0,5 ng/L à 70 ng/L. Cependant, la dérivatisation peut être effectuée pour obtenir une sensibilité plus élevée en améliorant l’ionisation des composés avec des LODs allant jusqu’à 0,13 ng/L35. D’autres techniques ont été aussi utilisées pour améliorer le signal analytique, telles que les dérivatisations des estrogènes par un fluorophore pour une détection par fluorométrie36. Les LOD atteintes par cette méthode sont de 5 ng/L ce qui représente des valeurs comparables à celles obtenues par LC-MS/MS. Comparée aux autres techniques de chromatographie couplées à la détection MS, la méthode LC-MS/MS semble être la plus sensible aux interférences de la matrice, ce qui entraîne une réduction du signal par rapport au bruit de fond et par conséquent la diminution de la fiabilité et de la stabilité32,35,37. Afin de minimiser les effets de la matrice, plusieurs stratégies ont été adoptées telles que l’extraction sélective, la préconcentration ou la modification de la composition de la phase mobile35,38,39.

En conclusion, une comparaison des techniques GC-MS, GC-MS/MS et LC- MS/MS pour la mesure des estrogènes dans des échantillons environnementaux a révélé que des concentrations similaires pouvaient être détectées37. Les techniques en tandem MS/MS, en particulier GC-MS/MS, sont plus sélectives et permettent

24 d'atteindre des limites de détection plus basses37,40. Néanmoins, comparé à la LC- MS/MS, la GC-MS/MS nécessite une étape de dérivatisation en amont, ce qui augmente la durée globale de l’analyse.

II.1.2. Méthodes biologiques globales

Alors que l'analyse chromatographique d'échantillons environnementaux peut permettre l'identification de composés cibles et la détermination de leurs concentrations individuelles, les techniques biologiques sont généralement utilisées pour mesurer l'activité de la molécule ou d’un ensemble de molécules cibles. Dans le cas d’E2 et d’EE2, cette activité est généralement exprimée en estrogénicité totale. Les résultats de la détermination chimique ne tiennent pas compte des interactions potentielles entre les composés et/ou de la présence de composés qui, même s'ils sont inconnus, peuvent avoir un effet sur l'activité estrogénique globale41. Par conséquent, les méthodes biologiques sont complémentaires des méthodes d’analyses chimiques car elles permettent de déterminer l'estrogénicité totale d’échantillons d’eaux réels, sans connaître tous les composés présents qui contribuent à cette activité. L'estrogénicité totale évaluée par les essais biologiques est généralement estimée par rapport à E2 et exprimée en équivalents d'estradiol (EEQ). Les limites de détection (LOD) rapportées vont de 0,02 à 0,68 ng EEQ.L-1 pour les matrices liquides biologiques (plasma, urine…) et environnementales (eau de mer, eau de surface, eau usée…)10.

Ces méthodes biologiques permettent d’évaluer l’activité estrogénique en se basant sur l’interaction des composés cibles et des récepteurs estrogéniques. Les tests biologiques in vitro les plus utilisés sont le test YES (Yeast Estrogen Screen)42, le test E-Screen43 et le test ER-Calux®44. Le test YES a été développé à l'origine par Routledge et Sumpter42 en utilisant une souche de levure Saccharomyces cerevisiae dont le génome a été modifié par l’intégration de la séquence d'ADN codant pour le récepteur d'estrogène humain (hER). L'ADN intégré contenait également des plasmides d'expression portant des séquences sensibles au hER et un gène rapporteur approprié codant pour l'enzyme β-galactosidase (lacZ). Une fois exprimé, le hER se lie à E2 présent dans le milieu et le complexe composé (ERE) se fixe sur le plasmide au niveau de sa séquence spécifique. Cette étape d’activation engendre l’expression du gène Lac-Z produisant l'enzyme β-galactosidase. Cette dernière est libérée dans le milieu cellulaire où elle métabolise le substrat CPRG (chromogenic

25 substrate: ChloroPhenol Red-β-D-Galactopyranoside), entraînant un changement de couleur du jaune au rouge (Fig.2). Les tests à base de levure (test YES) sont moins sensibles aux conditions non stériles que ceux basés sur l'utilisation de lignées cellulaires de mammifères (test E-Screen43 et ER-Calux®)44, ce qui les rend plus appropriés pour les matrices environnementales complexes44. En effet, le test YES est l'analyse la plus fréquemment utilisée pour la mesure de l'activité estrogénique dans des échantillons environnementaux aqueux et solides25,34,45–48.

Figure 2: Principe du test YES : Principe du test YES : 1- expression du gène du récepteur des estrogènes humains préalablement intégré au génome principal. 2- liaison du récepteur aux éléments de réponse aux estrogènes (ERE) au sein d'un promoteur hybride sur le plasmide d'expression. 3- activation du récepteur en présence du ligand. 4- expression du gène rapporteur Lac-Z produisant l'enzyme β-galactosidase. 5- sécrétion de l’enzyme dans le milieu cellulaire. 6- métabolisation du substrat chromogène CPRG (jaune) en un produit rouge mesuré par absorbance.42 II.1.3. Méthodes biologiques spécifiques

Contrairement aux méthodes biologiques globales, des techniques immunologiques, appelés immunoessais, plus spécifiques ont été développées pour la détection des estrogènes dans les eaux.

L’immunoessai est une méthode bioanalytique hautement sélective qui mesure la présence ou la concentration d’analyte dans une solution grâce à l’utilisation d’un anticorps ou d’un antigène en tant qu’élément de bioreconnaissance. La grande

26 sélectivité de l’immunoessai est due à l’utilisation d’un anticorps spécifique et présentant une forte affinité pour l’antigène correspondant. Pour la transduction et l'amplification du signal, un système de marquage tel qu’un marqueur enzymatique pour le test ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) est généralement utilisé. Ce test est une technique immuno-enzymatique utilisée en laboratoire pour la détection et la quantification d’une molécule cible dans une matrice liquide ou l’extrait d’un matrice solide. La détection repose sur une réaction enzymatique colorée qui permet de révéler la reconnaissance antigène-anticorps. Cette réaction enzymatique consiste en la métabolisation d’un substrat par une enzyme préalablement fixée à l’anticorps dans le cas d’un dosage direct ou d’un dosage en sandwich (ELISA sandwich) ou bien fixé à l’antigène dans le cas d’un dosage par compétition.

 Dosage direct (sans compétition) : pour cette technique, l’échantillon testé est déposé sur un support permettant l’immobilisation de la totalité de l’antigène. L’ajout d’un anticorps spécifique marqué permet ensuite la détermination de la quantité le l’antigène dans la solution dosée. Pour ce type de test, il est indispensable que l’antigène étudié soit capable de s’adsorber sur le support (Fig.3).

Figure 3: Schéma explicatif d’un immunoessai de type direct.

 Dosage en sandwich : deux anticorps spécifiques à l’antigène dosé sont utilisés. L‘anticorps primaire est fixé sur le support permettant la capture de la cible. L‘anticorps secondaire est marqué par une enzyme ou une sonde fluorescente qui permet de révéler et quantifier l’association antigène- anticorps primaire. Pour cette technique, l’antigène doit présenter plus d’un épitope de reconnaissance, d’où son utilisation pour la détection des molécules de grandes tailles (Fig.4).

Figure 4: Schéma explicatif d’un immunoessai de type sandwich

 Dosage par compétition : pour ce type de dosage, il est question de compétition entre l’antigène libre à doser et son dérivé marqué pour la fixation à l’anticorps. Un signal faible se traduit donc par une concentration élevée de la cible libre dosée. Cette technique est la plus utilisée car elle s’applique à tous les antigènes quelle que soit leur taille (Fig.5).

Figure 5: Schéma explicatif d’un immunoessai par compétition Pour la détection des estrogènes, les tests ELISA développés dans différentes études sont basés sur un dosage compétitif en utilisant des anticorps monoclonaux pour garantir une plus grande affinité et éviter la réactivité croisée avec d’autres composés chimiques présentant des structures similaires à la cible. Le marquage enzymatique a été, dans la plupart des cas, réalisé par la peroxydase de raifort (HRP: HorseRadish Peroxidase) et la révélation est faite en présence du substrat TMB (3,3’,5,5’-Tetraméthylbenzidine). Les limites de détection enregistrées varient entre 30 et 0,05 ng/L pour l’E2 et 20 et 0,01 ng/L pour l’EE249–53.

Aujourd’hui, il existe quelques kits ELISA commercialisés pour le dosage des estrogènes dans les eaux. Les limites de détection proposées par ces outils sont intéressantes, pouvant aller jusqu’à 100 ng/L pour la détections d’un mélange d’estrogènes dont l’E2 (Ecologiena® Estrogen (E1/E2/E3) ELISA Kit), et jusqu’à 50 ng/L pour la détection d’E2 et EE2 (Ecologiena® EE2 ELISA Kit). Ce genre de kits est souvent utilisé pour l’étude des fluctuations spatio-temporelles des concentrations en E2 et EE2 dans des échantillons d’eaux usées. Comparés aux tests réalisés en laboratoire, ils présentent une sensibilité moins importante mais une bonne sélectivité pour E2 et EE2 permettant leur utilisation pour des échantillons environnementaux chargés en polluants54,55. D’autres immunoessais ont été développés et optimisés pour les analyses environnementales, tel que le test CLEIA (ChemiLuminescence Enzyme ImmunoAssay), en utilisant des particules magnétiques marquées avec un anticorps secondaire servant à la fois de matrice d’immobilisation et d’outils de séparation (Fig.6). C’est une méthode de détection compétitive associant une technologie de séparation magnétique, une réaction antigène-anticorps spécifique et une révélation par chimioluminescence56,57.

Figure 6: Illustration schématique du principe du MPs-CLEIA 56 Les immunoessais ont montré une fiabilité et une spécificité plus importantes que les méthodes biologiques globales. Cependant, ces techniques sont coûteuses et lentes avec plusieurs étapes d’incubation et de lavage.

II.2. Méthodes alternatives : Les biocapteurs

Dans un contexte d’optimisation des outils de contrôle et de surveillance de la qualité des ressources en eau et face aux limites des méthodes conventionnelles, des méthodes alternatives, appelées biocapteurs, ont été développées. Ils assurent une détection rapide, simple et efficace.

II.2.1. Définition

Un biocapteur est un outil analytique compact qui transforme une réponse biologique en un signal physique mesurable. Il est composé d’un élément biologique ou dérivé de biologie, capable de reconnaître spécifiquement un analyte, associé à un transducteur permettant de traduire cette bio-reconnaissance en un signal physique mesurable58 (Fig.7). Selon l’IUPAC, un biocapteur doit être spécifique et fiable, indépendant de paramètres physiques tels que le pH et la température, et assurer une connexion réelle entre l’élément biologique et le transducteur59–61.

Figure 7: Représentation schématique du principe d’un biocapteur 62 Un premier exemple de biocapteur a été introduit en 1962 pour déterminer la concentration du glucose dans le sang 63. Depuis, plusieurs études ont présenté des biocapteurs pour différentes applications telles que les diagnostics cliniques, l’industrie alimentaire, la surveillance de l’environnement et d’autres domaines dans lesquels des analyses précises et fiables sont nécessaires. Les biocapteurs les plus courants sur le marché aujourd'hui sont les détecteurs de glucose dans le sang. Toutefois, il existe une volonté de produire de nouveaux biocapteurs dans le but de les commercialiser pour une large gamme d'applications, notamment pour un suivi de la pollution environnementale64.

II.2.2. Eléments pour la conception de biocapteurs

Les biocapteurs peuvent être classés en fonction du mécanisme conférant la spécificité biologique, le bio-récepteur, ou du mode de transduction du signal58,65. Ceci donne donc deux classifications possibles :  par mode de reconnaissance : récepteurs catalytiques ou récepteurs d’affinité non catalytiques  par mode de transduction : optique, massique, électrochimique... La conception du biocapteur passe par le choix de ses principaux éléments : un récepteur, le mode de son immobilisation et un transducteur.

II.2.2.1. Récepteurs

Généralement, la reconnaissance de l'analyte cible par le biorécepteur (protéines, ADN, cellules, tissus) est basée sur des interactions biomoléculaires, ce qui constitue la différence entre le biocapteur et d'autres types de capteurs chimiques. L'élément de reconnaissance biologique est un élément essentiel dans la fabrication d'un biocapteur, capable de détecter les cibles biologiques et non biologiques dans un échantillon donné. Selon le principe d'interaction biomoléculaire, les biorécepteurs sont généralement divisés en deux catégories : les éléments de reconnaissance catalytiques et d’affinité non catalytiques66 (Fig.8). Même si les récepteurs d’affinité sont généralement biologiques, de nombreux éléments de reconnaissance synthétiques, appelés éléments biomimétiques, sont actuellement utilisés pour le développement des biocapteurs d’affinité58,67,68(Fig.8).

Figure 8: Représentation des différents types de bio-récepteurs

a. Récepteurs catalytiques

Les biocapteurs utilisant des éléments de reconnaissance biocatalytiques ou métaboliques sont les plus connus et les plus étudiés. Depuis les travaux pionniers de Clark63,69, ils ont été souvent appliqués à l’étude de matrices biologiques. Les éléments biocatalytiques, tels que les enzymes, reconnaissent de façon spécifique un substrat ou un inhibiteur. Les méthodes de mesure par biocapteurs enzymatiques sont classées en deux types en fonction de l’interaction entre l’enzyme et les analytes cibles : (1) si l’enzyme métabolise l’analyte qui est alors un substrat, la concentration en analyte diminue. On mesure alors soit la diminution de la concentration en analyte soit l’apparition du produit de la réaction enzymatique; la réponse est alors proportionnelle à la concentration initiale en analyte (2) si l’analyte agit comme un inhibiteur de l'activité enzymatique, le substrat est rajouté pour évaluer l’activité de l’enzyme avant et après inhibition. La transformation du substrat est alors quantifiée grâce au suivi du produit généré par la réaction enzymatique. Pour ce type de biocapteur, le signal sera inversement proportionnel à la concentration de la cible dans l’échantillon64,68. D'autres éléments biocatalytiques, tels que des organismes (bactéries, champignons, levures, cellules eucaryotes), les organites cellulaires (mitochondrie, peroxysomes…) et les tissus (animaux et végétaux) sont également utilisés. Cependant, l’enzyme reste le bioélément le plus largement exploité pour le développement des biocapteurs biocatalytiques69. Cet élément est très bien étudié présentant un fonctionnement assez simple et bien connu et des conditions de stockage et d’utilisation moins compliquées que les cellules par exemples. En effet, ces dernières sont très sensibles aux contaminations et nécessitent de grandes précautions lors leur manipulation. Les enzymes sont disponibles à des prix abordables et parmi les familles d’enzymes les plus exploitées dans la conception des biocapteurs, on trouve les oxydases, comme le glucose70–73 ou cholestérol74–76 oxydase et les déshydrogénases telles que l’alcool déshydrogénase77–80. Elles ont montré une sensibilité importante et des LOD satisfaisantes. Les biocapteurs enzymatiques ont été utilisés dans divers domaines, tels que les applications biomédicales81,82, la détection des polluants environnementaux83,84, la surveillance de la sécurité des aliments85,86 et la surveillance des bioprocédés industriels87,88.

b. Récepteurs d’affinité non catalytiques

Le fonctionnement du biocapteur d’affinité est basé sur l'interaction de l'analyte avec un récepteur représenté par des macromolécules d’origine biologique (anticorps) ou synthétique (aptamères ou polymères à empreinte moléculaire)59,89. Pour ce type de biocapteur, il n'y a pas de consommation de l'analyte par l’élément de reconnaissance immobilisé et l’interaction récepteur-analyte conduit généralement à un équilibre. Ce dernier peut être détecté directement grâce à un système intégré ou dans certains cas nécessite une réaction biocatalytique complémentaire60,69.

 Récepteurs d’affinité biologiques : les anticorps

Les anticorps sont les récepteurs d'affinité les plus utilisés dans les biocapteurs pour des domaines d’application diverses, tels que l'analyse clinique, le diagnostic médical, la sécurité des aliments, la surveillance de l'environnement90–92. Un anticorps est une protéine produite par les lymphocytes b en réponse à une stimulation par un antigène. Deux types d’anticorps sont utilisés, des polyclonaux, avec une spécificité faible car ils peuvent reconnaître plusieurs épitopes d’une seule cible ; et des monoclonaux, présentant une grande spécificité car ils reconnaissent un épitope unique de la cible. Le principe d’un immunocapteur est basé sur la conversion de l’interaction spécifique anticorps-antigène en un signal mesurable par le système de transduction (électrochimique, optique…). Tout comme les immunoessais, les immunocapteurs peuvent prendre différents formats : direct, compétitif ou de type sandwich93. Des techniques de marquage enzymatique ou redox sont appliquées pour détecter le signal et augmenter la sensibilité dans le cas des immunocapteurs colorimétriques ou ampérométriques 94–96. Sans marquage, la reconnaissance est généralement suivie par spectroscopie d’impédance électrochimique93,97–99, la résonance de plasmons de surface (SPR) et aussi la microbalance à quartz (QCM).

 Récepteurs d’affinité synthétiques

Depuis une dizaine d’années, plusieurs travaux se sont focalisés sur des biocapteurs utilisant des molécules synthétiques comme éléments de reconnaissance tels que les aptamères68, ou encore les polymères à empreintes moléculaires (MIP)67,100,101. Ces récepteurs dits biomimétiques présentent une reconnaissance basée sur le modèle d’interaction antigène-anticorps.

Les aptamères : ce sont des séquences d'ADN ou d’ARN simple brin récemment utilisées comme nouveaux récepteurs d’affinité dans les dispositifs de biodétection. Les aptamères sont sélectionnés in vitro contre une variété de cibles (petites molécules, ions métalliques, protéines et acides nucléiques) en utilisant le processus SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)66,114–116 (Fig.9).

Figure 9: Schéma du processus SELEX105 En raison de leur forte affinité pour leur cible, leur stabilité, leur faible coût et leur synthèse facile et reproductible, les aptamères sont utilisés comme alternatives aux anticorps dans le développement de biocapteurs d’affinité118–121. Les aptamères présentent de nombreux avantages, tels que leur stabilité thermique, la possibilité d’introduire des modifications pour leur immobilisation ou leur marquage en incorporant des sondes fluorescentes, enzymatiques ou redox 122,123. Outre leur polyvalence et le fait d'éviter une production par voie animale, les aptamères offrent des avantages majeurs par rapport aux anticorps122 qui sont référencés dans le tableau 1. Par conséquent, leur utilisation en tant qu'éléments de reconnaissance dans les biocapteurs a augmenté au fil des ans.

Tableau 1:Comparaison des caractéristiques des aptamères et des anticorps.

Aptamère Anticorps Stabilité  Résistance à des cycles répétés de  Facile dénaturation. dénaturation / renaturation.  Sensibilité à la  Résistance à la température: température température ambiante stable.  Basse température requise  Longue durée de vie (plusieurs pour éviter la dénaturation années). pendant le stockage et le  Possibilité de lyophilisation. transport.  Dégradation possible par les  Durée de conservation nucléases. limitée.  Résistance aux protéases.  Dégradation possible par des protéases.  Résistance aux nucléases. Synthèse  SELEX in vitro en 2 à 8 semaines.  Production in vivo durant  Grande reproductibilité. plus de 6 mois.  Faible coût.  Variabilité d’un lot à un autre.  Laborieuse et chère. Cible Des ions et des petites molécules aux Les cibles qui provoquent une potentielle cellules entières. forte réponse immunitaire pour la production d'anticorps. Affinité Élevée (de l’ordre du nM) Spécificité Mutations ponctuelles identifiables.

Les polymères à empreinte moléculaire (MIP : Molecularly Imprinted Polymers) les MIP sont synthétisés par polymérisation de monomères fonctionnels en présence d’agents de réticulation et de molécules « empreintes » qui sont les analytes cibles ou leurs analogues. La matrice polymère réticulée agit comme un moule qui prend l’empreinte des molécules. Après l'élimination de ces molécules du polymères qu’elles ont imprimé, des sites de reconnaissance chimiquement sélectifs ou des cavités sont créés et sont complémentaires en forme, taille et groupe fonctionnel, aux molécules modèles (Fig.10). Les MIP sont considérés comme des matériaux synthétiques réticulés avec des cavités à empreinte moléculaire comportant des sites de reconnaissance artificiels, imitant ainsi l'activité biologique des récepteurs naturels112,113,124. En raison de leur grande sélectivité, de leur stabilité, de leur rapide synthèse ainsi que leur thermo-stabilité élevée et leur rapport coût-efficacité, ils intéressent de plus en plus les chercheurs en tant qu’éléments de reconnaissance pour les biocapteurs d’affinité67,100,101.

Figure 10: Processus d’impression moléculaire lors de la synthèse de MIP113 II.2.2.2. Principales méthodes d’immobilisation des bio-récepteurs

Plusieurs techniques d’immobilisation sont appliquées pour la fixation des éléments de reconnaissance sur la surface du biocapteur. Le choix de la technique d’immobilisation dépend de l’application visée et aussi des contraintes pouvant être rencontrée quant à la nature du biorécepteur et celle de la surface utilisée114,115. Les méthodes d’immobilisation les plus utilisées sont la fixation par adsorption physique, l’inclusion ou le piégeage dans une matrice à la surface du transducteur et enfin le couplage covalent (Fig.11).

Figure 11: Exemples de techniques d’immobilisation. 1) adsorption physique, 2) couplage covalent 3) inclusion ou piégeage. a. Adsorption physique

L'adsorption physique est une méthode simple et rapide pour l’immobilisation des récepteurs tels que les enzymes. Trois phénomènes possibles sont à l’origine de cette fixation : des interactions de type ionique ou encore des liaisons hydrogène entre l’enzyme et la surface du transducteur116. C’est une technique simple et non

36 dénaturante pour l’enzyme mais peu utilisée pour la conception des biocapteurs compte tenu de la réversibilité de l’adsorption.

b. Inclusion ou piégeage

Cette méthode consiste à mélanger le récepteur et essentiellement les enzymes, avec un gel insoluble. Une fois déposé sur la surface du transducteur, l’enzyme se trouve piégée à l’intérieur de la matrice grâce à une rétention purement physique entre les mailles du gel. L’aspect poreux de la matrice permet au substrat de diffuser jusqu’au site actif de l’enzyme immobilisée. Cette technique, malgré sa simplicité, reste très limitée par le phénomène de relargage du récepteur. Par ailleurs, la sensibilité de l’enzyme aux conditions mises en œuvre pour le piégeage (pH, force ionique…) constitue également un facteur limitant de cette méthode117,118.

c. Couplage covalent

L’immobilisation par couplage covalent est assurée grâce à la présence de groupements fonctionnels sur la surface du transducteur capables de se lier à des groupements de réactivités chimiques complémentaires portés par le récepteur. Les fonctions les plus utilisées sont les fonctions carboxyle (–COOH), amine (-NH2), ou thiol (–SH). Selon la nature de la surface du transducteur, l’une ou l’autre de ces fonctions sera choisie et conditionnera la méthode de couplage entre le biorécepteur et le transducteur. Par exemple, la formation d’une monocouche dite auto assemblée (SAM) au niveau d’une électrode est réalisée grâce à un couplage de molécules thiolées à une surface d’or119,120. Pour les surfaces de carbone, undéricatisation électrochimiques par réduction de sations de diazonium est souvent générés in situ. Dans ce cas, la couche formée est chargée par un groupe fonctionnel (carboxyl, azide, amine…) qui sera activé pour fixer le biorécepteur.

Ces différentes méthodes d’immobilisation présentent des avantages et des inconvénients quant à la simplicité et l’efficacité de la technique. Ces caractéristiques sont répertoriées dans un tableau comparatif (Tab.2).

Tableau 2: Caractéristiques des principales méthodes d’immobilisation

Méthodes Avantages Inconvénients d’immobilisation Adsorption  Extrême simplicité  Système instable (phénomène de physique désorption)  Relargage biorécepteur  Domaine d’utilisation limité  Stabilité insuffisante  Sensible au pH, à la force ionique, et à la température Inclusion ou  Application à des cellules  Membrane épaisse : effet de la piégeage entières ou des organelles, diffusion des espèces.  l’environnement peut préserver une bonne activité enzymatique Couplage  Grande stabilité,  Nécessite une surface de transducteur covalent  Problème de diffusion atténué, ou de membrane fonctionnalisable,  Conservation de l’accessibilité  Perte d’activité due à la réaction des sites induisant des temps chimique de réponse très courts,  Peu de perte d’éléments de reconnaissance

II.2.2.3. Transducteurs

Le type de transducteur utilisé permet de définir, selon la nature de la détection mise en œuvre, quatre groupes de biocapteurs: les biocapteurs optiques, massiques, thermométriques ou électrochimiques.

a. Transducteurs optiques

Les transducteurs optiques utilisent des techniques spectroscopiques différentes pour suivre l’interaction entre l’analyte et le récepteur. Ces techniques sont basées sur des mesures d’absorption, de luminescence ou de fluorescence. La quantification est effectuée en fonction de l’intensité ou de l’amplitude du signal optique car il existe une corrélation directe entre ce signal et la concentration de l’analyte. Parmi les méthodes optiques les plus utilisées, la résonance de plasmons de surface (SPR) est la mieux adaptée à l’industrialisation des biocapteurs121. Le premier instrument utilisant un biocapteur basé sur la SPR est le BiacoreTM122. En effet, la technique optique SPR mesure les variations de l’indice de réfraction à la surface métallique sur laquelle le biorécepteur est fixé. Le suivi de ces variations sensible à l’interaction ligand/analyte à la surface, permet une détection en temps réel et sans avoir recours à un marquage121,123,124. Cependant, cette méthode est limitée par le choix de la surface qui ne peut être qu’en or, ce qui limite le choix des

38 techniques d’immobilisation122. Par ailleurs, les modes de transduction basés sur la détection de la fluorescence sont aussi souvent utilisés. Ils nécessitent aussi un appareillage assez lourd et contrairement au cas précédent, un système de marquage est indispensable122,125,126.

b. Transducteurs massiques

Les biocapteurs piézoélectriques comportant une plate-forme piézoélectrique ou un cristal piézoélectrique fonctionnent sur le principe de variation des oscillations consécutives à une variation de masse à la surface du cristal suite à sa liaison avec l’analyte. Diverses applications basées sur cette technique ont été établies. Par exemple, la plate-forme de microbalance à quartz (QCM) est très utilisée pour la conception des immunocapteurs127–130. Cette popularité est due au fait que les QCM sont largement utilisées dans les dispositifs électroniques et sont disponibles dans le commerce127.

c. Transducteurs thermométriques

Les biocapteurs thermométriques sont destinés à déterminer la concentration d’un substrat par la variation thermique associée à une réaction enzymatique. Lorsque l’analyte est exposé à l’enzyme, la chaleur de la réaction enzymatique est mesurée et calibrée par rapport à la concentration en analyte131,132. Cette méthode fait essentiellement appel aux réactions exo ou endothermiques. Le changement de température est déterminé par un microcalorimètre tel que le système de calorimétrie isotherme à titrage (ITC)133.

d. Transducteurs électrochimiques

Les capteurs électrochimiques convertissent les informations associées aux réactions électrochimiques au niveau des électrodes en un signal qualitatif ou quantitatif. Généralement, ces réactions électrochimiques génèrent soit un courant mesurable (ampérométrique), un potentiel mesurable ou une accumulation de charge (potentiométrique), soit altèrent de manière mesurable les propriétés conductrices d’un milieu (conductimétrique) entre électrodes. La spectroscopie d’impédance électrochimique (SIE) est une technique de plus en plus utilisée permettant la mesure de la résistance de transfert électronique. Ainsi, les biocapteurs

électrochimiques sont principalement divisés en quatre types : potentiométrique, conductimétrique, ampérométrique et impédimétrique134. Les électrodes jouent un rôle crucial dans la performance des biocapteurs électrochimiques car les réactions ont lieu sur la surface même de ces électrodes. Le choix de l’électrode, son matériau, sa modification de surface ou ses dimensions influencent grandement sa capacité de détection. La détection électrochimique nécessite généralement un système constitué de trois électrodes : une électrode de référence, une électrode auxiliaire et une électrode de travail, également appelée électrode de détection ou électrode redox135.

La transduction électrochimique présente plusieurs avantages par rapport aux autres modes de transduction précédemment décrits. Elle est plus simple, rapide, économique, très sensible et sélective. Cette technique est compatible avec les nouveaux objectifs d’un biocapteur jetable ou réutilisable selon l’application, facile à miniaturiser et robuste. Les réactions électrochimiques fournissent généralement directement un signal électronique, évitant ainsi le recours à un équipement coûteux et une étape supplémentaire pour le traitement de signal136.

II.2.3. Biocapteurs pour la détection des estrogènes II.2.3.1. Immunocapteurs

Comme les immunoessais, le fonctionnement des immunocapteurs se base sur la reconnaissance entre un anticorps spécifique et un antigène cible. Cependant, et contrairement aux immunoessais, la détection et la quantification sont plus rapides avec moins d’étapes d’incubation et surtout une possibilité de développer un outil miniaturisé et utilisable sur le terrain.

Pour la détection d’E2 et d’EE2, des immunocapteurs optiques et électrochimiques sont développés. La SPR est souvent utilisée pour le développement des immunocapteurs optiques. Par exemple, un système compétitif basé sur la SPR est présenté en mettant en jeu E2 et un anticorps anti-E2 en solution et E2-BSA immobilisé sur la surface du capteur. En effet, l’E2 en solution est incubé en présence d’un anticorps anti-E2 sur la surface du capteur modifiée. Une compétition pour une immuno-réaction avec l’anticorps anti-E2 est conduite entre la cible libre et celle immobilisée. L’interaction de l’anticorps anti-E2 sur la surface du capteur diminue avec la concentration croissante d’E2 en solution137.

En ce qui concerne les immunocapteurs électrochimiques, ils peuvent être classés en deux groupes, selon le marquage ou non du biorécepteur. Pour les immunocapteurs sans marquage, la détection est généralement réalisée par mesure d’impédance138. En effet, cette technique se base sur la variation de la résistance de l’électrode au transfert d’électrons avant et après reconnaissance de la cible. Par exemple, une étude a été réalisée en immobilisant une monocouche de 17β-estradiol sur des électrodes en or. Dans ce cas, la liaison E2-anticorps se traduit par une augmentation de la résistance au transfert d’électrons mesurée par spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS) en présence du couple redox 3− 4− Fe(CN)6 /Fe(CN)6 en solution. La diminution de la réponse électrochimique observée est attribuée à l’encombrement stérique formé par l’association antigène- anticorps et empêchant l’espèce redox en solution d’accéder à l’électrode. En présence d’E2 libre, une compétition est créée avec l’E2 immobilisée. Le signal augmente suite à la libération de la surface après la formation des complexes anticorps-E2 libre. En se basant sur cette stratégie, l’immunocapteur est développé en utilisant la compétition pour l’anticorps entre l’analyte à doser en solution et le 17β-estradiol immobilisé sur la surface de l’électrode. La limite de détection du E2 est estimé de 1 nM139.

Dans le but d’augmenter la sensibilité et amplifier le signal électrochimique, le marquage a été largement appliqué dans le développement des immunocapteurs pour la détection des estrogènes. Les marqueurs enzymatiques sont toujours les plus utilisés bien que d’autres marqueurs, notamment de type redox, soient aussi employés (Tab.3). Le marquage peut concerner l’anticorps comme la cible mais la détection repose systématiquement sur une compétition. En effet, quelques études décrivent une compétition entre une cible immobilisée et une en solution pour l’interaction avec un anticorps marqué par une enzyme telle que la microperoxidase ou l’alcaline phosphatase140–142.

Dans d’autres études, l’E2 a été modifié par marquage avec une enzyme comme la peroxydase de raifort ou une sonde redox. En présence d’E2 dans la solution testée, une compétition est observée pour la fixation à l’anticorps spécifique immobilisé143–146. Dans toutes ces configurations, plus il y a d’E2 à doser dans l’échantillon analysé et moins le signal mesuré est important puisque la quantité d’élément marqué (anticorps ou cible) est moindre.

Tableau 3: Exemples de différents marquages utilisés dans des immunocapteurs électrochimiques pour la détection d’E2.

Type du Marqueur Elément Transducteur Technique de LOD Echantillon marquage marqué mesure testé Microperoxidase Anticorps140 Surface en or Ampérométrie - - (MP-11)

143 Alcaline E2* Electrode *DPV 200 pM *Sérum phosphatase sérigraphiée en (AlkP) Anticorps**141 carbone (SPCE) **Ampérométrie **0,9 pM **Eaux Enzymatique ***142 (distillée, de rivière et de ***SWV ***3,6 pM robinet) ***Eaux usées Electrode Peroxydase de E2144 couverte de CV 20 pM Sérum raifort (HRP) nanoparticules d’or Nanostructures Cu2S-BSA- - CV-SWV 28 pM Eau 145 de Cu2S E2 Redox VO-Salen-E2* Complexes VO-Salan- SPCE EIS *160 pM Eau de oxovanadium- E2**146 **14 pM surface Salen/Salan

II.2.3.2. Aptacapteurs a. Principe général d’un aptacapteur

Les capteurs utilisant un aptamère comme récepteur sont appelés aptacapteurs. Ce type de biocapteur constitue une plate-forme simple, précise et peu coûteuse pour des applications telles que la sécurité alimentaire111,147,148 et le contrôle de la pollution de l'environnement108,136. Plusieurs aptacapteurs ont été mis au point pour la détection de résidus médicamenteux (antibiotiques, anti- inflammatoires, hormones)148–152, de toxines147,153–155, de pesticides156–159 et de métaux lourds160–165.

Le principe de fonctionnement d’un aptacapteur repose sur le changement de conformation de l’aptamère suite la reconnaissance de sa cible (Fig.13). Pour détecter ces modifications structurales liées à la formation du complexe cible- aptamère, divers transducteurs peuvent être utilisés tels qu’un transducteur massique, optique ou l'électrochimique148,166.

Figure 12: Schéma montrant un changement de conformation possible de l’aptamère après fixation de la cible L’avantage des aptacapteurs massiques est qu’ils n’ont pas besoin d’un marquage des récepteurs. Par exemple, en se basant sur la technique QCM, l’aptacapteur détecte la reconnaissance aptamère-cible avec augmentation de la masse sur la surface du cristal. Cette méthode a été souvent utilisée pour la détection des protéines comme la thrombine167 avec une LOD de 1nM ou la protéine spécifique au VIH-1168 avec une LOD de 0,25 ppm. Ce type d’aptacapteur reste très limité du fait de la sensibilité de la manipulation et la complexité du contrôle des conditions externes pouvant influencer les mesures. La technique optique la plus utilisée pour la conception des aptacapteurs est la fluorescence en raison de la facilité de marquage des aptamères par des sondes fluorescentes, de la disponibilité de nombreux fluorophores et répresseurs de fluorescence, et de la possibilité de détecter en temps réel166. Dans ce contexte, deux approches différentes sont souvent appliquées. La première consiste à marquer l’aptamère à la fluorescéine et l’immobiliser à la surface d’un support en verre. L’association de l’aptamère à la cible entraine un changement de la position du marqueur et donc la dépolarisation de la fluorescence c’est-à-dire le changement de la direction de l’émission. Le suivi de cette dépolarisation permet donc la quantification spécifique de la cible. Cette technique a été appliquée pour la détection dans des extraits cellulaires ou dans du sérum des protéines impliquées dans des cancers169. La deuxième approche repose sur la conception de balises moléculaires (molecular beacon). Dans ce cas, l’aptacapteur met en place un aptamère marqué au niveau de ses deux extrémités, une portant un fluorophore et l’autre un « quencher » de fluorescence qui a la propriété d’absorber le rayonnement émis par le fluorophore lorsque celui-ci est suffisamment proche. Ce principe peut fonctionner selon deux modes. L’analyte peut induire un rapprochement du « quencher » et du fluorophore ce qui se traduit par une extinction de fluorescence

(Fig.14A), ou l’association bimoléculaire entre le « quencher » et le fluorophore est rompue par addition de la cible et la fluorescence augmente (Fig.14B)166,169,170.

Figure 13: Aptamère doublement marqué par un fluorophore et son « quencher » pour une détection par fluorescence A) le signal s’éteint après reconnaissance de la cible suite au rapprochement du « quencher » et du fluorophore. B) le signal est activé après la reconnaissance suite à l’éloignement du « quencher » du fluorophore.

En ce qui concerne les aptacapteurs éléctrochimiques développés, ils peuvent être classés en deux groupes selon que l’aptamère utilisé soit marqué par une sonde redox ou non. Dans le cas d’un aptamère non marqué, la reconnaissance peut être suivie par spectroscopie d’impédance électrochimique (SIE) en présence d’une espèce électroactive en solution, le ferricyanure par exemple. Cette méthode permet d’évaluer la résistance au transfert d’électron (Ret) qui varie en fonction de la conformation adoptée par l’aptamère en présence de sa cible. Si la conformation obtenue lors de la formation du complexe aptamère-cible engendre un encombrement stérique de la surface de l’électrode, le transfert d’électrons est gêné

(Fig.15 A) et la résistance Ret augmente. Dans le cas contraire, la reconnaissance peut entrainer la libération de l’espace au niveau de l’électrode facilitant le passage 166,171 des électrons et la diminution de la Ret (Fig.15 B) .

Figure 14: Principe d’un aptacapteur électrochimique sans marquage.A) système ON / OFF B) système OFF / ON

Dans le cas d’un aptamère marqué par une sonde redox telle que le bleu de méthylène, le ferrocène ou autre, la détection repose sur l’oxydation ou la réduction de cette sonde au niveau de l’electrode. Selon l’éloignement du marqueur électro- actif à l’électrode, le transfert électronique est rendu possible ou non. Ainsi, après fixation de la cible, le signal électrochimique peut augmenter (configuration de type signal OFF/ON, Fig.16A) ou diminuer (configuration de type signal ON/OFF, Fig.16B)166,172. Les mesures sont effectuées par des techniques voltammétriques telles que la DPV et SWV.

Figure 15: Différents principes d’aptacapteurs électrochimiques avec marquage redox, configuration de type signal OFF / ON (A) et signal ON / OFF (B) Le système de détection électrochimique reste le plus simple à appliquer avec des équipements disponibles et peu couteux. Pour la conception d’outils portables et miniaturisés, cette technique de détection est donc la plus adaptées136. La technique de marquage des aptamères a déjà fait l’objet de plusieurs études pour le développement d’aptacapteurs dédiés à la détection de polluants émergents tels que des pesticides ou des antibiotiques136,173 mais rarement des estrogènes.

b. Aptacapteurs pour la détection des estrogènes

Depuis une dizaine d’année, des aptacapteurs optiques et souvent électrochimiques pour la détection des estogènes ont été développés.

Pour les techniques optiques, les nanoparticules d’or ont été les plus utilisées soit pour une détection colorimétrique ou par fluorescence. En effet, ces nanoparticules ont la capacité de changer de couleur lorsqu’elles passent d’un état dispersé à une agrégation. En présence de l’aptamère libre, ce dernier s’associe aux nanoparticules via l’interaction des bases d’ADN avec les ions d’or. Dans ce cas, les nanoparticules sont dispersées et présentent une coloration rouge. Après la formation des complexes aptamère-E2, les nanoparticules forment une agrégation en présence de NaCl donnant une coloration bleue à la solution. L’intensité de cette

46 coloration permettra donc de quantifier la cible. La LOD atteinte dans cette étude est de 0,1ng/mL174. Le même principe, c’est-à-dire la formation d’agrégats de nanoparticules d’or quand l’aptamère reconnait sa cible, est appliqué lors d’une détection par fluorescence. En effet, les nanoparticules dispersées jouent le rôle d’inhibiteur de fluorescence de la rhodamine B présente dans le milieu contrairement aux agrégats. Une importante fluorescence est donc indicatrice de présence de la cible dans l’échantillon testé. Cette méthode présente une LOD de 130 nM175.

En ce qui concerne les aptacapteurs électrochimiques, la SIE réalisée en 3−/4− présence de Fe(CN)6 en solution est dominante. Cependant, des mesures par des techniques voltammétriques sont aussi utilisées pour détecter la modification du coefficient de diffusion apparent lorsque la cible est liée à l’aptamère138,176. Des exemples d’aptacapteurs électrochimiques sont présentés dans le tableau 4. Ces capteurs sont fabriqués avec des séquences d’aptamères différentes sélectionnées pour la même cible E2. Dans la majorité des études, l’aptamère utilisé pour détecter E2 est également utilisé pour détecter EE2 vu que les deux hormones présentent des structures très similaires.

Tableau 4: Exemples d’aptacapteurs électrochimiques développés pour la détection d’E2 en 3-/4- présence de Fe(CN)6 comme espèce électroactive.

Aptamères Transducteurs Techniques LOD Références de mesures (pM) 5’-Biotin-GCT TCC AGC TTA TTG AAT TAC Plateforme ACG CAG AGG GTA GCG GCT CTG CGC ATT nanocomposites d’or + CV-SWV 100 177 CAA TTG CTG CGC GCT GAA GC GCG GAA GC-3’ Poly(3,4- ethylenedioxythiophene) 5’-SH-GCT TCC AGC TTA TTG AAT TAC ACG Electrode d’or EIS 2 178 CAG AGG GTA GCG GCT CTG CGC ATT CAA TTG CTG CGC GCT GAA GCG CGG AAG C-3’ 5′-SH-(CH2)6-TTT TTT TTT T GCT TCC AGC Electrode modifiée par DPV 1 176 TTA TTG AAT TAC ACG CAG AGG GTA GCG du disulfure de GCT CTG CGC ATT CAA TTG CTG CGC GCT GAA GCG CGG AAG C-3′ vanadium

Electrode de diamant EIS 5.10-3 180 Kim et al. 2007179 5′-SH-GCT TCC AGC TTA TTG AAT TAC ACG dopé au bore CAG AGG GTA GCG GCT CTG CGC ATT CAA Electrode d’or modifiée CV 1 181 TTG CTG CGC GCT GAA GCG CGG AAG C-3′ par hexacyanoferrate de nickel Alsager et al. 2014182 5’-NH2(CH2)6-ATA CGA GCT TGT TCA ATA Electrode de polymère EIS 1.10-3 183 CGA AGG GAT GCC GTT TGG GCC CAA GTT CGG CAT AGT GTG GTG ATA GTA AGA GCA nano-poreuse ATC-3’ 5’-GCA TCA CAC ACC GAT ACT CAC CCG CCT GAT TAA CAT TAG CCC ACC GCC CAC Electrode d’or EIS 3.103 184 CCC CGC TGC-3‘

III. Sondes redox pour le marquage des biocapteurs

Les marqueurs électro-actifs présentent une alternative intéressante aux techniques de détection sans marquage, aux marqueurs enzymatiques et optiques. Ils permettent une bonne amplification du signal électrochimique, sont compatibles avec la miniaturisation et la réutilisation des outils de détection et réduisent les étapes de détection. Le marquage redox assure une réponse directe contrairement au marquage enzymatique qui nécessite l’ajout d’un substrat. En ce qui concerne les marqueurs optiques, ils présentent des temps de réponse longs et la détection nécessite l'utilisation d'instruments coûteux et volumineux. Alors que la réponse d’une sonde redox est rapide et l’équipement utilisé est disponible et peu coûteux. Les sondes redox sont généralement liées de manière covalente au récepteur ou à la cible. Le marquage redox des récepteurs concerne surtout les séquences d’oligonucléotides telles que les aptamères185–187 ou l’ADN187–189 utilisées pour une reconnaissance par hybridation. En ce qui concerne les immunocapteurs, une étude décrit la modification de la cible, E2, par des complexes métalliques électroactifs146,190.

La majorité des capteurs électrochimiques à base d’oligonucléotides utilisent comme marqueur redox : le bleu de méthylène (MB)185,191–194, le ferrocène (Fc)188,191,195–199 ou l’anthraquinone198–202. La popularité de ces sondes provient de leurs potentiels redox ; de leur réversibilité électrochimique et de leur disponibilité commerciale sous des formes faciles à conjuguer à des oligonucléotides synthétiques203. Ces sondes sont aussi proposées par la plupart des sociétés qui commercialisent les oligonucléotides, comme modification possible à introduire au niveau des séquences demandées. Ce genre de prestation bien qu’elle facilite la conception du capteur en évitant une étape de couplage, reste assez coûteuse comparée au prix d’une séquence non modifiée. Ainsi, le choix de sondes redox reste très limité et les recherches sont fortement encouragées pour trouver des marqueurs alternatifs199. Récemment, des complexes métalliques électro-actifs ont été utilisés comme marqueurs redox dans un système d’immunocapteur de type compétitif. Dans ce cas, il s’agissait d’un marquage redox de la cible placée en compétition avec son homologue non marqué121,163.

III.1. Marqueurs électro-actifs classiques III.1.1. Bleu de méthylène

Le bleu de méthylène est un colorant organique photo-actif de la famille des phénothiazines, avec une structure aromatique hétérocyclique et des capacités d’oxydo-réduction (Fig.17).

Figure 16: Structure du bleu de méthylène sous sa forme oxydée et réduite. Il est utilisé depuis plus de 100 ans comme colorant en histologie, bactériologie et hématologie. Lorsqu’il est ingéré, il provoque une coloration bleu de la peau, des muqueuses et de l’urine204. Il a été également prescrit comme traitement de la malaria205–207, de troubles psychiques tels que le trouble bipolaire208, de la démence et de certaines maladies neuro-dégénératives209. Le MB a été aussi utilisé comme

49 colorant clinique à des fins de diagnostics tels que la localisation des tumeurs ou de thérapie comme le traitement photo-dynamique des tumeurs210,211. Il est actif comme agent antimicrobien contre le staphylocoque doré, résistant à la méthiciline, dans les plaies superficielles et profondes212.

Depuis les années 2000, plusieurs groupes tels que Chaix et son équipe et Plaxco et ses collaborateurs se sont intéressés au MB qui a été utilisé comme marqueur électroactif d’oligonucléotides et d’aptamères191,192,213,214. Ils se sont basés pour le développement d’aptacapteurs et de biocapteurs à ADN, sur son efficacité au transfert d’électron et sa bonne stabilité dans les conditions de détection. D’autres critères ont fait du MB un bon candidat pour le rôle de sonde redox dont son faible potentiel d’oxydation (de -0.5 V à - 0,2 V vs Ag/AgCl selon les études) et son faible coût 194,215,216. Ce système de détection intéressant a servi au développement de biocapteurs électrochimiques pour diverses applications dont l’identification de micro- organismes217,218, la détection d’ADN spécifique à des maladies193,219–221.

Plusieurs études ont mis en place des biocapteurs à ADN ou aptamères marqués au MB. Le signal de ce dernier, dû à son oxydation ou sa réduction, dépend de sa position par rapport à l’électrode sur laquelle le récepteur est immobilisé. Par exemple, dans cette étude, l’interaction entre l’ADN cible et l’ADN marqué engendre un changement de la conformation de ce dernier et donc l’éloignement du MB de la surface du transducteur (Fig.18). Le transfert électronique devient alors limité ce qui se traduit par la diminution du signal électrochimique et permet ainsi de détecter une hybridation187,214.

Figure 17:Représentation schématique du principe d’un biocapteur électrochimique marqué au MB pour la détection d’ADN187 Un autre type de système de détection d’hybridation d’ADN par compétition a été décrit. En absence de la séquence cible, l’ADN double brin forme une double

50 hélice et possède un brin marqué au MB à son extrémité. L’ajout de l’ADN cible induit une compétition avec une région de la séquence marquée qui se détache engendrant le rapprochement de la sonde de l’électrode et l’augmentation du signal189 (Fig.19).

Figure 18: Représentation schématique d’un biocapteur électrochimique marqué au MB de type compétitif 189 Un système comparable a été appliqué à la détection de toxines172, de drogues187, de composés pharmaceutiques et de marqueurs de maladies tels que les cytokines186. L’élément de reconnaissance utilisé dans ces différents cas est un aptamère qui change de conformation en se liant à sa cible. Pour la détection de la cytokine TNF- α, une étude décrivant un aptacapteur à marquage au MB est développée (Fig.20). Le suivi du signal de la sonde avant et après l’ajout de l’échantillon de sang contenant la cible est assuré par SWV et la LOD obtenue est de 58 pM. En plus de l’efficacité confirmée de l’aptamère, le MB montre une grande stabilité et une signal sélectif dans une matrice aussi complexe que le sang humain186.

Figure 19: Exemple d’un système ON-OFF : représentation schématique d’un aptacapteur avec un marquage au MB pour la détection du TNF-α (facteur de nécrose tumorale) : une cytokine inflammatoire clé, dans le sang 186.

III.1.2. Ferrocène

Le ferrocène (Fc) est un composé organométallique de la classe des métallocènes. Dans cette molécule, le fer est pris en sandwich entre deux cycles cyclopentadiényle en conformation décalée (Fig.21).

Figure 20: Couple redox ferrocène / ferricénium Le ferrocène permet la préparation de nombreux dérivés et offre une stabilité thermique élevée ainsi qu’une bonne solubilité dans l’eau et la plupart des solvants organiques. De plus, son caractère lipophile facilite la pénétration dans les membranes cellulaires ce qui a permis l’utilisation du Fc et ses dérivés dans le domaine médical. La conjugaison / incorporation du Fc dans des molécules bioactives telles que des produits naturels, des médicaments de synthèse ou des peptides est une stratégie appliquée pour l'amélioration de l'activité thérapeutique. Les dérivés du Fc ont été considérés comme agents anti-infectieux et classés en quatre groupes principaux : antiparasitaires, antibactériens, antifongiques et antiviraux. L’étude de ces nouvelles molécules thérapeutiques a été réalisée dans le but de contourner la résistance des agents infectieux aux médicaments actuels et d’éviter leurs effets indésirables222.

L’utilisation du Fc en tant que marqueur électro-chimiquement actif a été explorée dans différents travaux de recherche. Par exemple, les travaux d’Anne et son équipe ont porté sur la synthèse et l’utilisation des dérivés du Fc pour le marquage des oligonucléotides197,223,224. Le choix de cette sonde repose d’abord sur la facilité de synthétiser des dérivés pouvant simplifier le couplage au récepteur. Le Fc et de nombreux dérivés sont commercialisés à des prix acceptables. Le potentiel d’oxydation, bien que plus élevé que celui du MB, reste faible (de 0.1V à 0.4 V vs Ag/AgCl). Le Fc présente une instabilité aux balayages voltammétriques répétés comparé au MB assez stabe dans ce cas199.

Ce marqueur redox est appliqué essentiellement pour le développement des capteurs à marquage redox pour la détection d’’ADN197 par hybridation mais aussi pour la détection de petites molécules195,196,225 par reconnaissance spécifique aptamère-cible. Le principe de fonctionnement des biocapteurs marqué au Fc est le même que celui des biocapteurs marqués au MB décrits précédemment. La variation du signal induite par changement de la conformation du bio-récepteur (ADN ou aptamère) en présence de la cible permet la détection et la quantification de cette dernière. Différents types de système de reconnaissance ont été décrits : détection par hybridation, système compétitif ou système d’auto-assemblage aptamère-cible.

III.1.3. Anthraquinone

L’anthraquinone (AQ) est un composé de la famille des quinones. Sa structure est formée par trois cycles aromatiques dont un noyau central portant deux groupement cétone en position 9 et 10. Différents groupes fonctionnels tels que -OH,

-CH3, -OCH3, -CH2OH, -CHO, -COOH, etc. peuvent se substituer à diverses positions formant des dérivés de l’anthraquinone (Fig.22).

Figure 21: Structure de l’anthraquinone et sa réaction d’oxydoréduction.

Cette molécule se trouve naturellement dans certaines plantes telle que la rhubarbe, les champignons, les lichens et les insectes où elle joue le rôle de squelette de base pour leurs pigments. Elle est aussi synthétisée chimiquement par oxydation de l’anthracène par exemple.

L’AQ et ses dérivés sont utilisés dans plusieurs domaines226 tels que l’alimentaire comme colorant, dans l’agriculture227 en tant que biopesticide et aussi dans l’industrie pharmaceutique comme antimicrobien228, antiviral229–231 et antiparasite226. L’AQ est aussi largement utilisée comme marqueur électroactif des biomolécules telles que l’ADN198,202,232 et les aptamères200,233. Avec la possibilité d’introduire des modifications par l’ajout de groupes fonctionnels au niveau de sa

53 structure, cette sonde redox est facilement adaptée pour se lier au biorécepteur pour la conception des biocapteurs. Avec un pic d’oxydation à un potentiel différent de celui du MB, une étude a mis en place un aptacapteur basé sur deux aptamères marqués l’un au MB et l’autre à l’AQ pour la détection simultanée de deux cytokines différentes200.

Bien qu’elle présente un potentiel d’oxydation plus faible que le MB (-0,5 V à - 0,3V vs Ag/AgCl), l’AQ est beaucoup moins utilisée à cause de son instabilité aux balayages voltammétriques répétés199.

III.2. Nouveaux marqueurs électro-actifs : Complexes métalliques de type salen/salan

Un complexe métallique de type salen est un composé de coordination entre un cation métallique divalent et un ligand de bases de Schiff. Le ligand salen est formé par condensation d’une diamine avec deux salicylaldheydes formant une base particulière de type tetradentates de bases de Schiff (N2O2 ou [O, N, N, O])234,235. Ce composé avec deux N (imines) et deux O (phénolates) comme de potentiels donneurs aux ions métalliques, est considéré comme un très bon chélate (Fig.22).

Figure 22: Structure du ligand tetradentates (N2O2) basique de type salen, formé par un ethylenediamine et deux salicylaldehydes. Les complexes métalliques de type salen et ceux basés sur leur forme réduite plus stable, de type salan, sont des composés de coordination assez polyvalents. Ils ont été souvent préparés et étudiés quant à leur utilisation dans différentes d’applications telles que la catalyse, la chimie bio-inorganique236, la chimie médicinale minérale, le développement de médicaments237, la science des matériaux et les capteurs de fluorescence234,238.

Récemment, dans notre équipe, ces complexes ont été utilisés comme marqueurs redox pour un immunocapteur électrochimique. Cette étude présente la synthèse et la caractérisation de ces marqueurs détectables par DPV et SWV. En

54 effet, ils présentent des propriétés électrochimiques intéressantes, et étant de bons chélates, les ligands salen/salan, peuvent complexer différents métaux tels que le cuivre, l’oxovanadium, le nickel, ce qui offre la possibilité de créer de multiples marqueurs. De plus, l'introduction de différents substituants donneurs d’électrons comme un tert-butyl ou un méthoxyle sur la partie aromatique du ligand permet de jouer sur les caractéristiques électroniques du centre métallique. Ainsi, les groupements donneurs, favorisent l’oxydation du centre métallique du complexe et facilitent donc le transfert d’électrons lors de la détection.

L’immunocapteur développé repose sur une compétition entre une cible marquée, l’E2 lié au complexe oxo-vanadium salen et une cible libre à doser, E2, pour la fixation sur des anticorps spécifiques immobilisés au niveau d’une électrode(Fig.23)146. Le signal généré par le complexe est inversement proportionnel à la quantité d’E2 dans l’échantillon testé.

Figure 23: Représentation schématique de l’immunocapteur électrochimique basé sur la compétition entre E2 libre et E2 lié au complexe oxovanadium-salen146. Les résultats de cette étude ont montré que les complexes métalliques utilisés présentent une bonne alternative aux marqueurs classiques, notamment le MB et Fc. Ces nouveaux marqueurs présentent une électro-activité importante assurant une détection sensible et simple tout en gardant des performances comparables au marquage enzymatique dans le cas des immunocapteurs ainsi qu’un potentiel d’oxydation plus faible que le MB (-0.6V à -0.3V vs Ag/AgCl). Ces complexes permettent d’enrichir la liste des marqueurs redox en offrant des caractéristiques intéressantes et comparables avec une plus large gamme de potentiel de détection liée au choix du métal complexé.

Chapitre 2 : Synthèse et caractérisation des complexes métalliques

I. Introduction

Dans ce chapitre, nous présenterons la stratégie développée pour la synthèse des sondes redox destinées au marquage d’aptamères. Ces sondes sont constituées de complexes métalliques électroactifs de type salen et salan détectables par des techniques électrochimiques. Les complexes de type salen 1a et salan 1b sont des ligands tétradentates (Fig.25) connus pour être de bons chélateurs de métaux235,239,240.

Figure 24: Ligands salen 1a et salan 1b fonctionnalisés Ils sont constitués par l’association de deux unités salicylidènes liées entre elles par un acide 2,3-diaminopropionique et se caractérisent par une base de Schiff présente dans le composé 1a. La réduction de la fonction imine peut permettre d’accéder aux composés de type salan 1b dont les propriétés électrochimiques seront comparées à celles du composé 1a. Les salicylidènes comportent deux substituants : un groupement tertbutyle, et un groupement méthoxy qui favorisent la complexation au métal par une réduction de la liberté conformationnelle. Les ligands ont été fonctionnalisés par un espaceur portant un groupement malémide dans le but de conjuguer les complexes salen et salan à la séquence d’un aptamère porteur d’une fonction thiol via une réaction de chimie click241,242. La fonctionnalisation du complexe était indispensable pour développer un biocapteur associant un aptamère et un complexe métallique électroactif, l’espaceur permet d’assurer une distance

suffisante entre ces deux éléments du biocapteur et d’éviter d’éventuelles interférences.

Dans ce chapitre, la synthèse des composés 1a-b puis celle des complexes seront présentées, et leurs caractéristiques physico-chimiques seront discutées.

II. Résultats et discussion II.1. Synthèse des composés salen 1a et salan 1b

Pour la synthèse des composés 1a et 1b deux stratégies peuvent être adoptées, l’une reposant sur une synthèse convergente l’autre sur une synthèse linéaire (Fig.25).

Figure 25: Etude rétrosynthétique pour l’obtention des composés 1a et 1b par une approche convergente ou une synthèse linéaire.

La première synthèse que nous avions envisagée, repose sur une approche convergente présentant les avantages d’un nombre d’étape et de purification

58 restreint à même de contribuer à un rendement optimal. Cette synthèse est basée sur l’obtention de deux précurseurs l’un contenant le bras espaceur et le maléimide composé 4 et l’autre constitué du chélate 8a qui pouvait être utilisé soit sous sa forme salen soit après réduction des fonctions imines sous sa forme salan pour obtenir après couplage les composés 1a et 1b. Lors de cette synthèse les composés 4 et 8a ont été obtenus avec des rendements satisfaisants de 92% et 75% respectivement. Toutefois, le couplage des composés 4 et 8a sous forme salan en présence de EDC et d’oxyma s’est systématiquement accompagné d’un sous-produit dont la masse correspondait à une déshydratation du salan et seule une quantité faible du composé 1b était obtenue : 15mg soit 8% de la quantité attendue. L’examen des spectres de masse du sous-produit nous a laissé supposer qu’une cyclisation intramoléculaire du dérivé salan 8a était à l’origine des sous-produits 9 (Fig.26). Le dérivé de benzo 1,4-oxazépanone 9a est certainement celui qui est formé du fait de la stabilité plus importante des cycles à 7 chaînons par rapport aux cycles à 8 chaînons.

Figure 26: Produits observés lors de la tentative de synthèse du composé 1b par la voie de synthèse convergente

Afin de contourner cette difficulté une nouvelle tentative de synthèse a été entreprise en utilisant la voie de synthèse linéaire. La synthèse du ligand salen 1a a été réalisée en 3 étapes avec un rendement global de 62% (Fig. 27). Le couplage du chlorhydrate de N-Boc-1,6-hexadiamine au N-succinimidyl 4-maleimidobutyrate dans un mélange de DCM et DMF en présence

59 du DIPEA permet l’obtention du composé 4a comprenant l’espaceur et le maléimide qui sera utilisé lors de l’étape de conjugaison avec l’aptamère. Après purification, le produit 4a est obtenu avec un rendement de 92%. Après déprotection du Boc en présence de TFA, le composé 4b est obtenu avec un rendement quantitatif. Le composé 4b est ensuite couplé avec le BocDap(Boc) 5 en utilisant le cocktail de couplage constitué d’oxyma et d’EDC pour conduire au composé 6a. Le chromatogramme du composé 6a confirme sa pureté avec un pic unique correspondant à m/z : 567,94 [M+H]+ et m/z : 590,24 [M+Na]+. Enfin, la dernière étape consistait en la formation du ligand salen en associant le 3-(tert-butyl)-2- hydroxy-5-methoxybenzaldehyde5 (composé 7b) avec le composé 6b. Les résultats de la RMN et de la LC/MS ont permis de valider la structure du composé 1a et de vérifier sa pureté.

Figure 27: Stratégie de synthèse du ligand salen fonctionnalisé La synthèse des dérivés de type salan 1b a été souvent décrite dans la littérature par une réduction directe des imines du ligand salen 1a en présence d’un agent réducteur tel que borohydrure de sodium imines244,245. Cependant, dans notre cas, l’ajout de l’agent réducteur a causé la réduction du groupement maléimide, ce qui nous a conduit à proposer une autre stratégie de synthèse (Fig.28). En effet pour la

60 fixation du complexe sur l’aptamère, il était indispensable de disposer d’un maléimide pour réaliser l’étape de conjugaison, ainsi nous avons choisi de protéger ce dernier grâce à une réaction de Diels Alder246–248 entre le composé 4a et du 1,4- dimethylfurane. Le composé 4c est ensuite soumis aux mêmes étapes de synthèse que celles réalisées pour l’obtention du ligand salen. La réduction des fonctions imines du composé 6d permet l’obtention d’un intermédiaire qui est soumis lors de la dernière étape à une réaction de rétro Diels Alder permettant la déprotection du maléimide et conduisant au ligand salan fonctionnalisé par un groupement maléimide 1b. Toutefois le rendement de cette dernière étape est faible ce qui se traduit par un rendement global de 16%. Néanmoins, les quantités obtenues et la pureté du composé 1b confirmée par RMN et LC/MS ont été jugées suffisantes pour la poursuite de ce projet.

Figure 28: Stratégie de synthèse du ligand salan fonctionnalisé II.2. Synthèse des complexes

Une fois les ligands obtenus, nous avons entrepris la synthèse de complexes de cuivre et d’oxovanadium en appliquant le même protocole. La complexation a été conduite simplement par une réaction du ligand salen 1a ou salan 1b purs avec un sel de métal l’acétate de cuivre ou le vanadyl acetylacetonate dans un rapport molaire 1 :1 L : M (ligand : métal). Les complexes sont obtenus sous forme de solides avec des rendements allant de 87% à 94% (Fig.29). Le choix de ces deux

61 métaux se justifie par les résultats obtenus au sein de notre équipe lors de la conception d’immunocapteurs électrochimiques190. En effet, les complexes de cuivre et d’oxovanadium présentent des propriétés électrochimiques intéressantes en terme de potentiel tout en restant dans une gamme de potentiel comprise entre – 0,4 et 0,5 V compatible avec l’application visée. Pour vérifier que les résultats obtenus lors de l’étude précédente sont transposables aux complexes développés dans le cadre de cette étude, une caractérisation spectroscopique en UV-visible et électrochimique par voltammétrie cyclique a été réalisée.

Figure 29: Synthèse des complexes métalliques (Composés 8, 9 et 10)

II.3. Caractérisation physicochimique des complexes

La caractérisation physicochimique a été réalisée par spectroscopie UV-visible et voltammétrie cyclique. Le choix des méthodes a été basé d’abord sur les moyens matériels du laboratoire et ensuite sur la nécessité de définir le comportement physique et électrochimique des composées étudiés avant de les utiliser pour la conception de biocapteurs.

II.3.1. Caractérisation des composés 10 et 11

Les complexes obtenus, ainsi que les ligands ont été solubilisés dans du MeOH à une concentration de 0,125 µM. Les spectres ont été enregistrés à des longueurs d’ondes allant de 200 à 900 nm. Pour le ligand salen 1a (Fig.30 A, courbe noire), le spectre a montré des bandes maximum d’absorption à 223, 261 et 354 nm. La première bande est attribuée au groupe azomethine alors que la deuxième et la troisième sont dues aux transitions de type ππ* des chromophores phénoliques9,10. Après complexation (Fig.30), un décalage bathochromique des bandes a été observé les plaçant à 233, 284 et 403 nm pour le complexe de cuivre et à 248, 291 et 407 nm pour le complexe d’oxovanadium. L’apparition d’une nouvelle bande de faible intensité a été aussi notée à 580 et 600 nm respectivement pour les complexes de cuivre et d’oxovanadium. Cette bande, absente sur le spectre des ligands, correspond au transfert de charge du ligand au métal (LMCT).

La caractérisation électrochimique a été réalisée par voltammétrie cyclique avec des composés solubilisés dans du MeOH et adsorbés au niveau de l’électrode de travail de la SPCE. Le voltamogramme obtenu pour le complexe de cuivre (composé 8) a montré un comportement quasi-reversible du cuivre avec un potentiel de demi-vague de 0,04 V (vs Ag/AgCl) (Fig.30 B, courbe rouge). En ce qui concerne l’oxovanadium (composé 9), le voltamogramme a aussi montré une quasi-réversibilité de l’oxydoreduction du métal à un E1/2 = 0,14V (vs Ag/AgCl) (Fig.30 B, courbe Bleue). En revanche, aucun pic n’a été observé pour le ligand salen (Fig.30 B, courbe noire). Les voltamogrammes enregistrés présentent une forme bien définie du pic de réduction du complexe VO-salen en comparaison avec le complexe Cu-salen. Cette observation nous a conduit à privilégier le complexe d’’oxovanadium pour le complexe salan.

A) B)

2 0

Abs -2 1

Current (µA) -4

0 -6

300 400 500 600 700 800 900 1000 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 Wavelength (nm) Potential (V vs Ag/AgCl)

Figure 30: A) spectre UV-visible du salen 1a (noire), Cu-salen (rouge) et VO-salen (bleu). B) Voltamogrammes du salen 1a (noir), Cu-salen 8 (rouge) and VO-salen 9 (bleu). 6 nmol de chaque composé, préparé dans le MeOH, ont été adsorbés sur la surface de la SPCE. Vitesse de balayage : 0,1 V / s

II.3.2. Caractérisation du composé 12

Pour le spectre d’absorption du ligand salan 1b (Fig.31 A courbe noire), deux premières bandes ont été observées à 225 et 292 nm. Ces bandes, aussi observées sur le spectre du complexe VO-salan (composé 12) avec un décalage bathochromique (Fig.31 A courbe verte), ont été attribués aux transitions de type ππ* des liaisons aromatiques. L’apparition d’une nouvelle bande a été observée à 450 nm sur le spectre du complexe correspondant au transfert de charge du ligand au métal (LMCT). Les résultats de la caractérisation électrochimique, réalisée par voltammétrie cyclique, ont montré un comportement quasi réversible du complexe

VO-salan à un E1/2 = 0,16 V (Fig.31 B courbe verte) comparé au ligand salan (Fig.

31 B courbe noire). Cette faible valeur d’E1/2 devrait conférer une meilleure sélectivité à l’aptacapteur résultant, évitant les signaux non spécifiques dus aux substances potentiellement interférentes.

A) B)

8 4 6 4 3 2 0

Abs 2

-2 Current (µA) Current 1 -4 -6

0 -8 -10 300 400 500 600 700 800 900 1000 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 Wavelenght (nm) Potential (V vs Ag/AgCl)

Figure 31: A) spectre UV-visible du salan 1b (noir) et de son complexe d’oxovanaium (vert). B) Voltamogrammes du salan 1b (noir) et VO-salan 9 (Vert). 6 nmol de chaque composé, préparé dans le MeOH, ont été adsorbées sur la surface de la SPCE. Vitesse de balayage : 0,1 V / s III. Partie expérimentale III.1. Réactifs et appareillages

L’hydrochlorure de N-Boc 1,6-hexandiamine, N, N-Diisopropyléthylamine (DIPEA), 3-(tert-Butyl)-2-hydroxy-5-methoxybenzaldehyde, le chlorure d'étain (IV) (SnCl4), Paraformaldéhyde, le 2,5-Diméthylfurane, l'acétate de Cuivre (II), le vanadyl acétylacétonate ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (France). Le N-succinimidyl 4-maleimidobutyrate a été acquis auprès de Bachem (Suisse). Le Boc-D-Dap(Boc)- OH*DCHA, le chlorhydrate de N-éthyl-N '- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC * HCl) et l’Oxyma Pure ont été achetés auprès de Iris (Allemagne). Les solvants organiques utilisés pour la synthèse ont été achetés auprès de VWR (France) à l'exception du DMF acquis chez Carlo Erba (France). La séquence d'aptamères a été synthétisée par Microsynth, entreprise suisse spécialisé dans la synthèse de l’ADN. Tous les spectres RMN 1H ont été enregistrés en utilisant un spectromètre JEOL 400 MHz et les solvants RMN ont été achetés auprès d'Eurisotop (France). Les analyses de chromatographie liquide ont été réalisées à l'aide d'un appareil Thermo Fisher Scientific LC / MS, Accela HPLC couplé à une LCQ Fleet équipée d'une source d'ionisation par électrospray et d'un analyseur 3D ion-trap. L'analyse spectrale de masse a été réalisée en utilisant la spectrométrie de masse à ionisation Electrospray (ESI-MS) (Thermo Scientific, France). Les résultats du couplage Aptamer - Markers ont été vérifiés par uHPLC Vanquish Thermo couplé au détecteur de masse Orbitrap, QExactive Plus Thermo équipée d'une source chauffée par ionisation électrospray ESI.

III.2. Synthèse des complexes métalliques III.1.1. Synthèse du ligand salen

Composé 4a

Le N-succinimidyl 4-maleimidobutyrate (756 mg ; 2,7 mmol) et l’hydrochlorure de N- Boc 1,6-hexandiamine (455 mg ; 1,8 mmol) ont été suspendus dans un mélange DCM/DMF (3 mL / 3 mL), avec DIPEA (5,4 mmol). Après 1h sous agitation à température ambiante, 40 mL d’acétate d’éthyle ont été ajoutés. La solution résultante est lavée deux fois avec du HCl (1N, 15 mL), deux fois avec du Na2CO3 saturé (15 mL) et deux fois avec une solution saturée de NaCl (10 mL). La phase organique a été séchée avec du MgSO4, filtrée puis évaporée sous pression réduite. Le brut réactionnel a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice avec un mélange dichlorométhane/méthanol (9,8/0,2) comme éluant. 650mg du composé 4a (92%) sont obtenus sous forme de poudre blanche.

1H RMN 400 MHz (DMSO-d6) δ/ppm : 7,72 (t, 1H, NH), 7,00 (d, 2H, H-maleimide group), 6,75 (t, 1H, NH), 3,36 (m, 2H, CH2-CH2-N), 2,98 (q, 2H, NH-CH2-CH2), 2,86

(q, 2H, NH-CH2-CH2), 2,01 (t, 2H,CO-CH2-CH2-), 1,69 (m, 2H,-CH2-CH2-CH2), 1,40 -

1,32 (13H, 1,38 (s, 9H, CH3 butyl group) 1,36 (m, 4H, CH2-CH2-CH2), 1,20 (m, 4H, + + CH2-CH2-CH2), (Fig.32). Ms C27H45N5O8 [M+H] m/z : 382,23 ; [M+Na] m/z : 404,21 ; obtenu m/z : [M+H]+ m/z : 381,87 ; [M+Na] + m/z : 404,11 (Fig.33).

Figure 32: Spectre RMN du composé 4a

: Figure 33: Chromatogramme LC/MS du composé 4a

Composé 4b

Le composé 4a a été suspendu dans un mélange de 3 mL DCM et 3 mL acide trifluoroacetique (TFA) puis agité pendant 1h. Après élimination des solvants sous pression réduite, le produit obtenu (composé 3b) a été co-évaporé 3 fois avec du cyclohexane pour éliminer le TFA.

Composé 6a

130 mg (0,38 mmol) de Boc-L-Dap(Boc)-OH*DCHA (5) sont ajoutés à un mélange du composé 4b (85 mg ; 0,25 mmol), d’EDC (118 mg, 0,62 mmol), d’Oxyma (88 mg ; 0,62 mmol) et de DIPEA (175 µl ; 1 mmol) dans 3 mL de DMF à température ambiante. Après une nuit sous agitation, le mélange a été dilué avec de l’acetate d’éthyle (20 mL) et lavé successivement avec du HCl (0,5 M, 5 mL), H2O (5 mL),

NaHCO3 (10% ; 5 mL), H2O (2 x 5 mL) et enfin une solution saturée de sel (1 x 5ml).

La phase organique a été séchée par du MgSO4, filtrée et évaporée sous pression réduite. 125 mg de composé 6a (89%) ont été obtenus sous forme de solide blanc.

+ + + Ms C27H45N5O8 [M+H] m/z : 568,33 ; [M+Na] m/z :590,31 ; [M+K] m/z : 606,42 ; obtenu m/z : [M+H] + m/z : 567,71 ; [M+Na] + m/z : 590,04 (Fig.34)

Figure 34: Chromatogramme LC/MS du composé 6a Composé 6b

Pour la déprotection du groupement Boc, le composé 6a a été suspendu dans 5 mL DCM et 5 mL TFA et agité pendant 3h. Le produit obtenu (composé 6b) a été lavé 3 fois avec du cyclohexane.

Composé 7b

Le 2-(tert-butyl)-4-methoxyphenol (7a) (13,7 mmol ; 2,5 mg) a été dissous dans une solution de toluéne avec du tributylamine (11 mmol ; 2,5 mL) et SnCl4 (1,38 mmol ; 0,16 mL). Après 20 min d’agitation, le paraformaldehyde (1 g ; 33,3 mmol) a été ajouté et la solution a été agitée pendant une nuit à 100°C. Le mélange réactionnel a été complété avec 140 mL de HCl (1 M) et agité pendant 45 min à température ambiante (Fig.35). La solution obtenue a été lavée avec du diéthyl éther (4 x 100mL) et une solution saturée de NaCl (1 x 20 ml). La phase organique a été séchée avec du MgSO4, filtrée et évaporée sous basse pression. Le composé brut a été purifié par

69 chromatographie sur colonne avec cyclohexane/acétate d’éthyle (4/6) comme éluant. Le rendement de la réaction était de 67% et 1,9 g du composé 7b pur ont été obtenus sous forme de cristaux jaunes.

Figure 35: Synthèse du Composé 7b 1H RMN 400 MHz (Chloroform-D) δ/ppm: 11,49 (s, 1H, -OH); 9,83 (s, 1H, C-CHO),

7,16 – 7,80 (s, 1H, ArH); 3,78 (s, 3H, O-CH3), 1,39 -1,35 (m, 9H, CH3-butyl group) (Fig.36)

Figure 36: Spectre RMN du composé 7a Composé 1a

Le 3-(tert-Butyl)-2-hydroxy-5-methoxybenzaldehyde (7b) (125 mg ; 0,6 mmol), dissous dans 3ml méthanol, a été ajouté goutte à goutte au mélange du composé 6b (150 mg ; 0,264 mmol) et de la DIPEA (0,56 mL ; 0,6 mmol) dans 2 mL méthanol. Après une nuit d’agitation à température ambiante, le mélange réactionnel a été dilué avec 10 mL d’eau, acidifié avec de l’acide acétique (0,8 mmol). La solution obtenue a été complétée avec 20 mL d’acétate d’éthyl, lavée avec de l’eau (2 x 5ml) et

70 finalement la phase organique a été séchée avec du MgSO4, filtrée et le solvant a été éliminé sous basse pression. Le composé brut a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice avec du DCM/MeOH (9,5/0,5) comme éluant, donnant 150 mg (76%) du composé 1a sous forme de solide jaune.

1H RMN 400 MHz (MeOH-D3) δ/ppm : 8.48 (s, 1H, Ar-CH=N), 8.40 (s, 1H, Ar- CH=N), 6.94 – 6.93 (d, 1H, ArH), 6.902 (d, 1H, ArH), 6.76 (d, 2H, H-maleimide group), 6.74 – 6.74 (d, 1H, ArH), 6.704 – 6.769 (d,1H, ArH), 4.291 – 4.260 (t, 1H,

CH2-CH-N), 4.13 – 4.08 (m, 1H, -CH-CH2-N),4.038 – 3.99 ( m, 1H, CH-CH2-N), 3.71

– 3.70 (6H, 3.718 (s, 3H, O-CH3), 3.710 (s, 3H, O-CH3)) , 3.49 (t, 2H, CH2-CH2-N),

3.25 – 3.04 (4H, 3.23 (m, 2H, CH2-CH2-NH), 3.06 (q,2H, CH2-CH2-NH), 2.12 – 2.10

(t, 2H, CH2-CH2-CO), 2.02 – 1.97 (m, 2H, CH2-CH2-CH2), 1.87 (m, 4H, CH2-CH2-

CH2), 1.39-1.31 (22H, 1.38 (s, CH3 butyl group), 1.37 (s, CH3 butyl group), 1.31 (q,

4H, CH2-CH2-CH2)) (Fig.37).

+ + Ms C41H58N5O8 [M+H] m/z : 748.42, obtenu [M+H] m/z : 748.32 (Fig.38).

Figure 37: Spectre RMN du composé 7a

Figure 38: Chromatogramme LC/MS du composé 1a III.1.2. Synthèse du ligand salan

Composé 4c

Le composé 4a (100 mg ; 0,25 mmol) a été dissous dans 3 mL 2,5-dimethylfurane. Le mélange réactionnel a été agité pendant 3h à 60°C. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice avec du DCM/MeOH (9,5/0,5) comme éluant, donnant 112 mg (95%) du composé 4c sous forme de solide blanc.

+ + + Ms C25H39N3O6 [M+H] m/z : 478.29, [M+Na] m/z : 500.27 ; obtenu m/z : [M+H] m/z : 477.88, [M+Na]+ m/z :499.94 (Fig.39).

Figure 39: Chromatogramme LC/MS du composé 4c Composé 4d

Le composé 4c a été suspendu dans 2 mL DCM et 2 mL TFA et mis sous agitation pendant 1h. Le produit obtenu (composé 4d) a été co-évaporé 3 fois avec du cyclohexane.

Composé 6c

Boc-D-Dap(Boc)-OH*DCHA (5) (110 mg ; 0,36 mmol) a été ajouté au mélange du composé 4d (70 mg ; 0,18 mmol) avec d’EDC (83 mg ; 0,54 mmol), d’Oxyma (51 mg ; 0,36 mmol) et de DIPEA (125 µl ; 0,72 mmol) dans 3 mL de DMF à température ambiante. Après une nuit sous agitation, le mélange a été complété avec de l’acétate d’éthyle (20 mL) et lavé successivement avec du HCl (0,5M ; 5 mL), H2O (5 mL),

NaHCO3 (10% ; 5 mL), H2O (2 x 5 mL) une solution de NaCl saturée (5ml). La phase organique a été séchée avec du MgSO4, filtrée et évaporée sous pression réduite. Le composé brut 6c a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice avec du DCM/MeOH (9,75/0,25) comme éluant, donnant 80mg de composé 6c (68%).

+ + + Ms C33H53N5O9 [M+H] m/z : 664.39 ; [M+Na] m/z : 686.37 obtenu m/z : [M+H] m/z : 663.86 ; [M+Na]+ m/z 685.87 (Fig.40).

Figure 40: Chromatogramme LC/MS du composé 6c

Composé 6d

Le composé 6c a été suspendu dans 2 mL DCM et 2 mL TFA et mis sous agitation pendant 1h pour assurer la déprotection du groupement Boc, le produit obtenu (composé 6d) a été lavé 3 fois avec du cyclohexane.

Composé 1c

3-(tert-Butyl)-2-hydroxy-5-methoxybenzaldehyde (7b) (50 mg ; 0,25 mmol), dissous dans 2 mL MeOH, a été ajouté goutte à goutte au mélange du composé 6d (80mg ; 0,12 mmol) et de la DIPEA (0,83 mL ; 0,48 mmol) dans 2 mL MeOH . Après une nuit sous agitation à température ambiante, le mélange réactionnel a été refroidi et du borohydrure de sodium (18,2 mg ; 0,422 mmol) a été ajouté. Après 1h d’agitation, le solvant a été évaporé ; le produit obtenu a été mis en suspension dans 10 mL d’eau acidifiée par ajout d’acide acétique (0,48 mmol). Le mélange a été ensuite complété avec 20 mL d’acétate d’éthyle, lavé avec de l’eau (2 x 5 mL) et finalement la phase

74 organique a été séchée en présence de MgSO4, filtrée et le solvant a été éliminé sous basse pression. Le produit brut obtenu a été purifié par chromatographie sur colonne avec du DCM/MeOH (9,8/0,2) comme éluant, donnant 70mg (69%) du composé 1c.

+ + + Ms C47H69N5O9 [M+H] m/z : 848,51, [M+Na] m/z : 870,49 ; obtenu m/z : [M+H] m/z : 848,01, [M+Na]+ m/z : 869,77 (Fig.41).

Figure 41: Chromatogramme LC/MS du composé 1c

Composé 1b

Le composé 1c (50 mg, 0,05 mmol) a été mis en suspension dans 3 mL de toluène anhydre à 90 ° C et agité pendant une nuit. Le solvant a été ensuite évaporé et la

75 purification par chromatographie sur colonne a été effectuée avec du DCM / MeOH (9,5 / 0,5) comme éluant, donnant à 15 mg (40%) du composé 1b.

1H RMN 400 MHz (Chloroform-D) δ/ppm : 6,86 (d,1H, ArH), 6,78 (d,1H,ArH), 6.69 (d, 1H, ArH), 6,63 (d, 2H, H-maleimide group), 6,46 (d, 1H, ArH), 6,088 ( t, 1H, NH –

CH2), 4,23 (t, 1H, CH2-CH2-N), 3,86 (t,1H, , CH2-CH2-N), 3,75 – 3,66 (6H, 3.71 (s,

3H, O-CH3), 3,69 (s, 3H, O-CH3)), 3,46 (t, 1H, CH2-CH-NH), 3,25 – 3,12 (4H, 3,23 (t,

2H, CH2-CH2-NH), 3,14 (t, 2H, CH2-CH2-NH)), 2,11 (t, 2H, CH2-CH2-CO), 1,80 (m,

2H, CH2-CH2-CH2), 1,47 (m, 4H, CH2-CH2-CH2), 1,39 – 1,21 (22H, 1,37 (m, 4H, CH2-

CH2-CH2), 1,36 (s, 9H, CH3 butyl group), 1,34 (s, 9H, CH3 butyl group), 1,27 (q, 4H,

CH2-CH2-CH2)) (Fig.42).

- - Ms C41H61N5O8 [M-H] m/z : 750,45 obtenu m/z : [M-H] m/z : 750,44 (Fig.43).

Figure 42: Spectre RMN du composé 1b

Figure 43: Chromatogramme LC/MS du composé 1b III.1.3. Complexation métallique

Composé 10 : Complexe de cuivre de type salen

L’acétate de cuivre (II) (5,19 mg, 0,026 mmol) dissous dans 2 mL de MeOH a été ajouté à une solution du composé 1a (20 mg, 0,026 mmol) dans 1mL de MeOH. Le mélange réactionnel a été porté à reflux pendant 1h puis évaporé sous basse pression. 19 mg (90%) du complexe de cuivre salen sont obtenus sous forme d’un solide bleu foncé.

Composé 11 : Complexe d’Oxo-vanadium de type salen

L’acétylacétonate de vanadyle (6,9 mg : 0,026 mmol), dissous dans 2 mL MeOH est ajouté à une solution du ligand salen (1a) (20 mg ; 0,026 mmol) dissous dans 1 mL MeOH. Le mélange réactionnel a été chauffé sous reflux pendant 1h puis évaporé sous basse pression. 20 mg (95%) du complexe d’oxo-vanadium salen sont obtenus sous forme d’un solide vert foncé.

Composé 12 : Complexe d’Oxo-vanadium de type salan

L’acétylacétonate de vanadyle (0,69 mg ; 0,0026 mmol), dissous dans 1 mL MeOH est ajouté à une solution du ligand salan (1b) (2 mg ; 0,0026 mmol) dissous dans 1 mL MeOH. Le mélange réactionnel a été chauffé sous reflux pendant 1h puis évaporé sous basse pression. 20 mg (94.3%) du complexe d’oxo-vanadium salan sont obtenus sous forme d’un solide vert foncé.

III.2. Caractérisation des complexes métalliques III.2.1. Spectroscopie UV-Visible

Les composés étudiés (1a, 1b, 10, 11 et 12) ont été solubilisés dans du MeOH à une concentration de 0,125 mM. Les spectres d’absorption ont été enregistrés à des longueurs d’onde allant de 200 à 900 nm.

III.2.2. Voltammétrie cyclique (CV)

Les composés ont été dissous dans du MeOH à une concentration de 2 mM. Ensuite, une goutte de 3 µL (6 nmol) a été déposée à la surface de l’électrode de travail de la SPCE, en la laissant sécher à l’air libre pendant 2h afin d’avoir les composés adsorbés à la surface. Les mesures de CV ont été effectuées avec du tampon PBS (0,1 M) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 et 2 mM KH2PO4 à pH 7,4). Les valeurs du potentiel ont été enregistrées par rapport à une électrode de référence de type Ag / AgCl avec une vitesse de balayage égale à 0,1 V / s.

IV. Conclusion

Dans ce chapitre, nous avons présenté deux stratégies de synthèse des dérivés salen et salan fonctionnalisés par un maléimide pour un couplage ultérieur à un aptamère. Les stratégies de synthèse mises en place font appel à des réactifs simples ne nécessitant pas de recourir à des réactifs sophistiqués ce qui est un avantage dans la perspective de généralisation de cette approche à d’autres aptamères ou biomolécules. D’une façon générale de bons rendements de synthèse ont été obtenus pour l’ensemble des étapes à l’exception de la dernière étape de synthèse du salan où le rendement était faible. Pour une utilisation future de la méthode que nous avons développée, il serait souhaitable d’optimiser les conditions de la réaction de déprotection du maléimide lors de la réaction rétro-Diels-Alder. A cette fin, les paramètres réactionnels de température et de durée de la réaction devront être pris en considération ainsi que les conditions de purification sur colonne. Toutefois, dans l’optique d’une première application, les quantités obtenues étaient suffisantes pour entreprendre la suite du travail, la caractérisation des composés synthétisés et la conception de biocapteurs électrochimiques. La simplicité et la fluidité de ces stratégies de synthèse ouvrent les possibilités pour un éventuel développement commercial de ce genre de marqueurs redox.

La caractérisation électrochimique des complexes de cuivre et d’oxovanadium a montré des propriétés intéressantes pour une éventuelle utilisation comme marqueurs redox dans des biocapteurs. Dans l’objectif d’améliorer le signal et d’explorer d’autres gammes de potentiel, différents métaux tels que le fer ou le nickel pourraient être testés.

Chapitre 3 : Couplage d’un aptamère anti-estradiol aux composés synthétisés

I. Introduction

Dans ce chapitre, nous décrirons l’étape de marquage par les complexes métalliques synthétisés de l’aptamère Alsager 35 reconnaissant spécifiquement et sélectivement E2250 (Fig.44) et jamais utilisé pour la conception d’aptacapteur. En effet, les résultats prometteurs de la caractérisation de ces composés confirment leur aptitude à être de nouvelles sondes redox dans la conception de capteurs d'affinité.

Figure 44: Structure 2D de l’aptamère Alsager 35 anti-E2, modélisée par le logiciel m-fold

Pour les besoins de cette étude, l’aptamère Alsager 35 est synthétisé par la société Microsynth avec l’introduction de deux modifications :  un groupement amine terminal du côté 5’ pour son immobilisation sur la surface de l’électrode fonctionnalisée par un groupement carboxyle, lors de la conception du biocapteur  un groupement thiol, du côté 3’, indispensable pour fixer la sonde redox par une réaction avec un maléimide. Cette étape de conjugaison, basée sur la réaction entre le groupe maléimide des chélates fonctionnalisés et le groupe terminal thiol de la séquence de l’Alsager 35 modifié, présente l’avantage de pouvoir être facilement mise en œuvre sans avoir recours à des agents activateurs ni à des conditions extrêmes. Dans cette partie, nous décrivons le marquage de l’aptamère par les chélates ainsi qu’un suivi des résultats par HPLC couplée à un système HRMS à ionisation par électrospray.

II. Résultats et discussion II.1. Choix de l’aptamère

Plusieurs séquences d’aptamères anti-E2 sont décrites dans la littérature, présentant une spécificité et une sélectivité différentes d’une étude à une autre. En 2016, M. Sovobodova et ses collaborateurs ont publié une revue rassemblant les aptamères anti-E2 les plus connus250. A partir de ce travail, nous avons classé ces aptamères selon leurs constantes de dissociation (Kd) (Tab.5) définies pour trois hormones différentes : le 17-β-estradiol (E2), la testostérone et la progestérone (Fig.45). Le choix de ces deux hormones est basé sur la ressemblance de leur structure avec celle des hormones cibles.

A B

Figure 45: Structures chimiques du 17-β-estradiol (E2) (A), 17-α-éthinylestradiol (EE2) (B), la testostérone (C) et la progestérone (D). Selon ces résultats, l’aptamère Alsager 75mer, avec la valeur de constante de dissociation Kd la plus faible, présentait une meilleure affinité pour le 17-β- estradiol (E2) que les autres aptamères182. Toutefois, l’Alsager 75mer présente également une forte affinité pour les deux autres hormones ce qui se traduit par une sélectivité faible. En revanche, les versions tronquées de cet aptamère (Alsager 35mer et Alsager 22mer) ont montré une grande sélectivité car ils ne se sont pas liés à la testostérone ni à la progestérone tout en conservant une forte affinité pour l’E2251. Parmi les deux aptamères tronqués, une affinité plus importante a été notée pour l’Alsager 35mer avec un Kd plus faible que celui d’Alsager 22mer.

En se basant donc sur cette étude bibliographique, nous avons choisi pour le reste de notre étude l’aptamère Alsager 35mer ayant la séquence suivante 5’- AAG GGA TGC CGT TTG GGC CCA AGT TCG GCA TAG TG-3’ et nommé pour la suite de l’étude Alsager 35.

Tableau 5: Tableau comparatif des constantes de dissociation (Kd (µM)) des complexes aptamères anti-E2/hormones (E2, testostérone et progestérone) ; N.B : No Binding et - : pas de mesure Kd(µM) E2 Testostérone Progestérone Alsager 75mer182 0,018 20,7 2,7 Alsager 35mer251 0,023 N.B N.B Alsager 22mer251 0,07 N.B N.B Akki252 0,23 1,8 0,11 Kim179 0,098 7,3 10,4 Apt6A253 5,14 1,4 0,113 Apt1B253 33,4 - -

II.2. Résultats du marquage II.2.1. Linéarisation de l’aptamère

L’aptamère est reçu sous forme lyophylisée et est stocké à -25°C. La solubilisation est ensuite réalisée dans de l’eau stérile afin d’éviter toute contamination pouvant dégrader l’ADN. Avant son marquage, l’aptamère subit un traitement thermique afin de linéariser sa séquence. La première étape consiste à chauffer jusqu’à 90°C pendant 8 min afin de rompre les liaisons hydrogènes formées entre les bases de l’aptamère. Un refroidissement rapide est ensuite appliqué à la fin du chauffage, en plaçant la solution d’aptamère à 0°C pendant 4min. Cette étape est nécessaire pour stabiliser l’aptamère et maintenir la structure linéaire. Avant utilisation, la solution est placée à température ambiante pendant 15min.

II.2.2. Couplage aptamère-salen

Un premier couplage est réalisé entre l’aptamère thiolé linéarisé et le ligand salen 1a pour conduire au composé de conjugaison 13 (Fig.46). Cette manipulation est effectuée pour suivre la cinétique de la réaction entre le maléimide et le thiol. Un autre but de ce suivi était d’étudier la stabilité des ligands dans les conditions du couplage, mais également celle du produit de conjugaison 13.

Figure 46: Composé 13 : Résultat du couplage aptamère/ ligand salen

La réaction est effectuée dans un mélange MeOH / eau (1/9 v/v) en utilisant 11 nmol d'aptamère linéarisé avec 22 nmol (2 éq) de ligand salen. La réaction est conduite à deux températures 45°C et à température ambiante. Des prélèvements du milieu réactionnel sont réalisés après une durée de 6 h et de 24 h. Ce suivi est évalué par HPLC couplée à un système HRMS à ionisation par électrospray en mode négatif. L’aptamère et le ligand salen 1a sont aussi analysés par LC/HRMS. L’aptamère présente un temps de rétention de 4,76 min et des ions moléculaires à 1865,8052 et 2239,1635 uma correspondant respectivement aux espèces chargées six et cinq fois (Fig.48 A1-B1). Le dérivé salen 1a se caractérise par un pic présentant un temps de rétention de 14,52 min et un ion moléculaire à 746,4141 uma compatible avec

- la masse isotopique calculée pour C41H56N5O8 [M-H] de 746,4129 (Fig.48 A2- B2). Les spectres LC/MS correspondant au couplage de l’aptamère Algaser35 et du salen 1a après 6h et 24h ne permettent pas de détecter le composé 13. En effet, un mélange complexe est produit lors de la réaction. Parmi les

84 produits détectés, différents ions moléculaires ont pu être identifiés dans la zone du chromatogramme correspondant au temps de rétention de l’aptamère dont :  Les ions moléculaires m/z : 2239,16 et 1865,80 correspondant à l’aptamère anti-E2 libre non couplé (Fig.48 A3 et B3/2).  Les ions moléculaires m/z : 2312,60 et 1926,84 (Fig.48 A3, B3-1) correspondant respectivement à un état de charge de cinq et six unités d’un composé de masse compatible avec un aptamère. Ce composé 14 (Fig.47) a été identifié comme étant le résultat du couplage de l'aptamère avec un dérivé de dégradation du ligand salen 1a suite à la perte des deux entités salicylidènes consécutives à l’hydrolyse des imines.

Figure 47: Composé 14 : Résultat du couplage aptamère/dérivé de dégradation du ligand salen 1a

Figure 48: Chromatogrammes LC/HRMS (A) et spectres de masse (B) de l’aptamère (A1, B1) ; du ligand salen 1a (A2, B2) et du composé 13 (A3, B3).

Suite à ces résultats, la stabilité du salen 1a en présence d’eau a été testée. Le ligand a été préparé dans du tetradeuteromethanol (MeOH-D3) et analysé par RMN. Dans le même tube, une goutte d’oxyde deutérium est ajoutée et l’échantillon est analysé à des temps d’incubation allant de 10 min à 24 h. Les résultats de ce test ont confirmé l’instabilité du salen 1a. En effet, au cours du temps, le profil du spectre RMN (Fig.49) change avec l’apparition de signaux correspondant aux salicylidènes.

Figure 49: Spectres RMN du (A) salen 1a, salen 1a en présence de D2O2 B) t=1h ; C) t=24h

Cette expérience permet de mettre en évidence la possibilité de suivre le couplage de l’aptamère thiolé sur le maléimide. Toutefois, la cinétique de cette réaction est relativement lente et pour les expériences suivantes un temps de couplage de 24h semble préférable. En effet, la proportion relative d’aptamère non couplé a diminué de façon sensible après 24h de réaction à température ambiante et après une nuit à 45°C. Par ailleurs, comme le ligand salen 1a s’est montré instable dans les conditions de couplage en milieu aqueux, nous en avons déduit qu’il ne pourrait pas être utilisé comme sonde redox dans les capteurs que nous souhaitons développer.

II.2.3. Couplage aptamère-salan

La sensibilité des composés salen à l'hydrolyse nous a amenés à examiner le ligand salan 1b en tant qu'alternative. Le couplage a été réalisé dans les conditions expérimentales optimales à savoir une durée de réaction d’une nuit à 45°C dans un mélange de méthanol aqueux (1/9 v/v). La réaction a été suivie par LC/HRMS dans les mêmes conditions que le couplage aptamère-salen 1a (Fig.50). Une solution de l’aptamère et du salan 1b a aussi été analysée. Le pic correspondant à l’aptamère a été détecté à un temps de rétention de 4,76 min et des ions moléculaires à 1865,8067 et 2239,1659 uma correspondant respectivement aux espèces chargées six et cinq fois (Fig.52 A1-B1). Le ligand salan 1b présente un temps de rétention de 13,71 min et un ion moléculaire à 750,4445 uma compatible avec la masse - isotopique calculée pour C41H61N5O8 [M-H] de 750,4441 (Fig.52 A2-B2). Le spectre LC/MS, réalisé après couplage de l’aptamère et du salan 1b, montre un pic à 6,43 min dont les ions moléculaires m/z : 2389,4520 et 1991,0488 correspondent à la masse isotopique calculée pour le composé 12 :

- - C393H508N143O223P36S [M-5H] m/z: 2389,44 ; [M-6H]- m/z: 1991,03. Ce résultat confirme la stabilité supérieure du ligand salan par rapport au salen en présence d’eau d’où un couplage réussi au bout de 24h.

Figure 50: Composé 15 : Résultat du couplage aptamère/salan 1b

En se basant sur ces résultats, nous avons appliqué les mêmes conditions de réaction en engageant l'aptamère E2 et le complexe VO-salan (composé 10). Le produit de la réaction ainsi qu’une solution de complexe VO-salan ont été analysés par LC/HRMS. Le spectre correspondant au complexe présente un pic à un temps de rétention de 13,23 min et un ion moléculaire à 814,3607

- uma compatible avec la masse isotopique calculée pour C41H61N5O8 [M-H] de 814,3674 (Fig.52 A3-B3). Le résultat de l’analyse de la solution du couplage permet de détecter le composé 13 (Fig.51). Ce dernier se caractérise par un pic à un temps de rétention de 9,00 min et des ions moléculaires m/z = 2402,2490 et 2001,8773 (Fig.52 A4-B4) correspondant respectivement à un état de charge de cinq et six unités.

Figure 51: Composé 16 résultant du couplage aptamère/ VO-salan

Figure 52: Chromatogrammes LC/HRMS (A) et spectres de masse (B) de l’aptamère (A1, B1) ; du salan 1b (A2, B2), du composé 12 (A3, B3), du composé 10 (A4, B4) et du composé 13 (A5, B5).

III. Partie expérimentale III.1. Linéarisation de l’aptamère

L’aptamère Alsager35 est commandé chez Microsynth avec un groupement amine à l’extrémité 5’ et un groupement thiol à l’extrémité 3’. Le produit reçu sous forme lyophilisée a été solubilisé jusqu’à une concentration de 1,1 mM (M=11201,0 g/mol et m=1282,7 µg). La linéarisation de la séquence a été conduite en chauffant la solution à 90°C pendant 8 min, ensuite un refroidissement à 0°C pendant 4 min. La solution a été ensuite placée à température ambiante au moins 15 min avant utilisation.

III.2. Couplage Aptamère-marqueur

L’aptamère linéarisé (10 µL, 11 nmol) dans de l’eau stérile est ajouté à la solution du composé souhaité (1a, 1b, 10) (90 µL, 22 nmol) préparé dans le MeOH. Le mélange réactionnel est ensuite mis sous agitation. La réaction de couplage du salen 1a est réalisée à deux différentes températures : température ambiante et 45°C. Des analyses en LC/HRMS sont effectuées entre 6 h et 24 h. Pour le salan 1a et le composé 17, le couplage est conduit à 45°C pendant une nuit.

Composé 13:

- - - C393H506N143O223P36S [M-5H] m/z: 2388,634 ; [M-6H] m/z: 1990,362 obtenu - - - m/z: C369H478N143O219P36S (composé 14) [M-5H] m/z: 2312,60962 ; [M-6H] m/z: - - 1926,84460 ; C352H449N138O215P36S (Aptamère libre) [M-5H] m/z: 2239,15771 ; [M- 6H]- m/z: 1865,63354.

Composé 15:

- - C393H508N143O223P36S [M-5H] m/z: 2389,44 ; [M-6H]- m/z: 1991,03 obtenu m/z: [M-5H]- m/z: 2389,45207, [M-6H]- m/z: 1991,04880.

Composé 16:

- - - C393H506N143O224P36SV [M-5H] m/z: 2402,022, [M-6H] m/z: 2001,5183 obtenu m/z: [M-5H]- m/z: 2402,24902, [M-6H]- m/z: 2001,87732.

IV. Conclusion

A cette étape de notre travail, nous avons testé le marquage de l’aptamère par nos produits de synthèse dans des conditions réactionnelles simples.

D’abord, grâce une étude bibliographique, l’aptamère a été choisi en raison de sa spécificité et de sa sélectivité vis-à-vis du 17-β-estradiol, E2. Au cours de la réaction de couplage, nous avons pu constater un problème de dégradation du ligand salen en présence d’eau. En effet, une hydrolyse des imines du salen a été notée conduisant à la destruction de la structure du ligand. En revanche, le couplage aptamère-salan a été réussi permettant ainsi de confirmer la stabilité de ce ligand dans les conditions de la réaction ainsi que la faisabilité de ce couplage. Le marquage de l’aptamère avec le complexe VO-salan a été réalisé dans les mêmes conditions et validé par LC/HRMS.

Cette technique de marquage présente des résultats promoteurs pour une éventuelle application avec d’autres séquences d’aptamère thiolé.

Chapitre 4 : Conception de l’aptacapteur pour la détection de l’estradiol

…

I. Introduction

Depuis que des études ont mis en exergue les risques liés à la présence des hormones estrogéniques dans l’environnement, des équipes de recherche se sont intéressées au développement de méthodes pour la détection de ces composés. Classiquement, la LC-MS/MS et la GC-MS/MS sont mises en œuvre et présentent des limites de détection de l’ordre du micromolaire soit 0,3 µg/mL254,255. Cependant, ces méthodes nécessitent souvent des instruments coûteux, un prétraitement complexe de l’échantillon, de grands volumes de solvants et l’intervention d’un manipulateur qualifié. D’autres techniques comme les immunoessais et les immunocapteurs, dites techniques alternatives, sont aussi utilisées. Certes, elles présentent des avantages remarquables mais le recours aux anticorps produits par voie animale reste leur point faible. Dans ce contexte, les aptamères se positionnent comme de nouveaux éléments pour la conception de biocapteurs pour la détection des estrogènes. Ils combinent plusieurs avantages dont une affinité pour leur cible analogue à celle des anticorps, tout en étant des composés produits par voie synthétique256. Depuis le premier aptamère à ADN sélectionné par Kim et son équipe en 2007257 contre le 17-estradiol (E2) présentant un Kd de 130 nM, de nombreux autres ont été décrits comme ayant une sélectivité et une sensibilité importantes vis- à-vis de la cible182,250–252. Ces aptamères sont souvent utilisés pour la reconnaissance à la fois d’E2 et d’EE2 car ces composés ont des structures chimiques très similaires. Ainsi, des aptacapteurs basés sur des détections électrochimiques et optiques ont été développés pour la détection de ces cibles dans différentes matrices, essentiellement environnementales. Pour les aptacapteurs électrochimiques, les systèmes à marquage redox sont rarement cités, la détection est souvent basée sur le suivi du transfert d’électrons en présence d’une espèce 3-/4- électroactive en solution, [Fe(CN)6] , suite au changement de conformation du récepteur.

Dans ce travail, nous présentons le développement d’un aptacapteur pour la détection d’E2 et d’EE2. Ce capteur est basé sur un aptamère marqué par une sonde redox, le complexe salan d’oxovanadium précédemment synthétisé (chapitre II). Dans cette partie, nous allons détailler les étapes de la conception de l’aptacapteur depuis la modification des électrodes SPCE et l’immobilisation de

l’aptamère jusqu’à la détection de la cible. Les résultats de l’utilisation de l’outil développé pour la détection de différentes concentrations sont aussi décrits.

II. Résultats et discussion II.1. Conception de l’aptacapteur marqué au VO-salan

Les électrodes de travail utilisées sont des électrodes sérigraphiées en carbone SPCE (Screen-Printed Carbon Electrodes) fabriquées dans notre laboratoire. Une pâte de carbone est utilisée pour imprimer l’électrode de travail circulaire qui est située au centre ainsi que la contre-électrode. Une pâte Ag/AgCl sert à imprimer l’électrode de référence (Fig.53).

Figure 53: A) Machine à sérigraphier DEK 248 B) Etapes de fabrication des électrodes par sérigraphie

Avant toute utilisation, une étape de prétraitement en présence de H2SO4 est indispensable pour nettoyer la surface et pour assurer la reproductibilité des capteurs développés. Pour ce travail, nous avons choisi d’immobiliser de façon covalente l’aptamère sur l’électrode de travail par l’intermédiaire de 4-carboxyphenyl diazonium. Ce dernier est réduit sur la surface de l’électrode par voltammétrie à balayage linéaire LSV (Linear Sweep Voltammetry). Cette électrodéposition est irréversible, stable dans le temps et conduit à la formation d’un film à la surface de l’électrode. Contrairement à d’autres types de modification comme avec de la biotine, cette méthode est simple et rapide258,259. Suite à cette modification, les groupements carboxyles à la surface de l’électrode sont activés en présence de carbodiimide/N- hydroxysuccinimide (EDC/NHS) pour permettre le couplage peptidique avec l’aptamère aminé (Fig.54).

Figure 54: Schéma des étapes d’immobilisation de l’aptamère sur une électrode de carbone sérigraphiée L’immobilisation de l’aptamère est une étape très importante pour la conception de l’aptacapteur, il faut déposer une quantité suffisante pour assurer une bonne réponse et un signal détectable. L’optimisation de cette étape est réalisée en déposant 20µL de solution à différentes concentrations en aptamère marqué (5 µM ; 10 µM ; 20 µM et 30 µM dans le PBS à pH 7,4). Les électrodes sont préparées en triplicat et incubées pendant 4h à température ambiante dans une atmosphère humide. Les résultats des mesures effectuées par voltammétrie à vague carrée SWV sont rassemblés dans la figure 55. Cette expérience montre une augmentation de l’intensité du courant mesuré avec la concentration d’aptamère déposé. Au- dessus d’une concentration de 20 µM, la réponse semble atteindre un plateau et la comparaison des intensités nous a conduit à choisir un dépôt de 20 µM car il parait plus reproductible. Les deux autres concentrations présentent aussi une bonne reproductibilité mais le signal est faible voire comparable à celui du blanc pour 5 µM. Pour la suite du travail, la concentration de l’aptamère est fixée à 20 µM.

Figure 55: Voltammétrie à vague carrée (SWV) réalisée pour des aptacapteurs conçus à partir de différentes concentrations d’aptamères marqués par VO-salan (-- : 30 µM, -- : 20µM, -- : 10µM, -- : 5µM et -- : Blanc PBS). Potentiel entre -0,4 V à 0,1 V vs Ag/AgCl, fréquence : 25 Hz et vitesse de balayage : 0,05 V/s.

Pour vérifier la reproductibilité des différentes étapes réalisées jusqu’à la fixation de l’aptamère, un suivi par spectroscopie d’impédance électrochimique EIS est assuré. Cette technique permet la caractérisation de la surface de l’électrode après chaque modification via l’étude de l’évolution du transfert d’électrons d’une espèce 3-/4- électroactive en solution, le couple ferricyanure/ferrocyanure [Fe(CN)6] à 2 mM dans notre cas. Les diagrammes de Nyquist (fig.56 A) sont réalisés après chaque étape de modification de la surface d’électrode en partant d’une électrode nue jusqu’à l’immobilisation de l’aptamère. La résistance au transfert de charges (Rct) est représentée par le demi-cercle sur les courbes d’impédance. Une importante augmentation du Rct est notée suite à l’électro-réduction du sel de diazonium passant de 2 kΩ à 108 kΩ155,260. En effet, à pH neutre, le film organique est chargé négativement (groupes carboxylates) tout comme le complexe ferri/ferrocyanure. Ainsi, cette couche constitue une barrière électrostatique entravant la diffusion de l’espèce redox vers la surface de l’électrode. Après activation des groupements carboxyles, la Rct diminue jusqu’à 21 kΩ mais sans revenir pour autant à la valeur initiale lorsque l’électrode était nue. Ceci est expliqué par la formation des esters succinimides non chargés, diminuant ainsi la répulsion électrostatique, auparavant exercée par les groupes carboxylates la couche de diazonium. Enfin, l’étape d’immobilisation de l’aptamère conduit à un blocage des sites activés et par suite à 3-/4- l’inhibition à la fois stérique et électrostatique de la diffusion du [Fe(CN)6] , d’où la 261,262 ré-augmentation de la Rct à 50 kΩ .

3-/4- Le comportement du [Fe(CN)6] étudié par voltammétrie cyclique (CV) permet également d’avoir une information sur la cinétique du transfert électronique après chaque étape de modification. L’oxydoréduction de cette espèce au fil des étapes est donc également étudiée sur une gamme de potentiel optimisée allant de -0,6 V à 1,2 V avec une vitesse de balayage égale à 0,1 V/s (fig.56 B). Avant toute modification, nous pouvons constater une bonne conductivité de l’électrode nue en se référant au système quasi-réversible observé. Ce système montre deux pics, d’oxydation et de réduction, placés à 0,45 V et 0,2 V vs Ag/AgCl respectivement. Ces pics initialement intenses (≈50µA), diminuent drastiquement après formation de la couche de carboxyphenyl, vu l’obstruction du transfert d’électrons. L’activation des groupes COOH engendre comme observé précédemment une amélioration de la diffusion électronique. Néanmoins, le voltamogramme enregistré à ce stade présente un système électrochimique lent, schématisé par une augmentation de l’écart entre les potentiels des deux pics ( E) ainsi qu’une faible intensité de courant par rapport à l’électrode nue (≈28µA). Après immobilisation de l’aptamère, le processus est à nouveau retardé. Ces deux techniques de caractérisation électrochimique, l’EIS et la CV, montrent des résultats cohérents et complémentaires. Les observations tirées nous ont permis de vérifier le bon déroulement et la reproductibilité de chaque étape de modification de nos électrodes.

Figure 56: (A) Diagrammes de Nyquist et (B) cyclovoltammogrammes obtenus en présence de 2 mM [Fe(CN)6]3-/4- pour une électrode : nue ( ) , fonctionnalisée avec le 4- carboxyphényl après électroréduction du sel de diazonium (----), après activation des groupes carboxyles (…..), et après immobilisation de l’aptamère (.-.-.-). Potentiel appliqué : 0,15 V vs Ag/AgCl, gamme de fréquences : 10 kHz - 1 Hz.

II.2. Détection des hormones cibles par l’aptacapteur marqué au VO-salan

La détection des cibles utilisant l’aptacapteur à marquage au VO-Salan est réalisée en laissant incuber la solution testée sur l’électrode fonctionnalisée pendant une heure le temps que l’aptamère reconnaisse sa cible. Des solutions de E2 et EE2 à différentes concentrations sont préparées dans du tampon Tris. Ce dernier est le tampon utilisé lors du procédé SELEX pour la sélection de l’aptamère ayant le plus d’affinité avec la cible182,251. En effet, il est nécessaire de respecter ces conditions afin d’assurer un milieu favorable pour la reconnaissance de la cible. Les résultats montrent que notre système est de type ON / OFF (fig.58 A et fig.58 A) puisque le signal électrochimique diminue en présence de la cible. Ces résultats sont en accord avec la simulation de dynamique moléculaire réalisée dans un milieu aqueux, confirmant que les extrémités 5 ’et 3’ n’interagissent pas avec E2 et peuvent être utilisées pour l’immobilisation ou la fixation de la sonde263.

Des courbes d’étalonnage sont établies pour les deux cibles E2 et EE2. La similarité des résultats de détection d’E2 (fig.57 B) et EE2 (fig.58 B) confirme le fait que cet aptamère reconnaît aussi bien les deux composés et qu’il n’est pas sélectif. Malgré la corrélation observée entre la concentration de la cible et le signal obtenu, les valeurs de LOD obtenues sont de l’ordre de 36 nM (9 µg/L) pour l’E2 et 17 nM (5 µg/L) pour l’EE2 calculées selon la formule suivante : (3 * déviation standard du Blanc / la sensibilité). Ces valeurs restent donc élevées comparées aux aptacapteurs développées pour la détection des mêmes cibles et qui présentent généralement des LOD de l’ordre des pM (Tab.4 chapitre 1). Ce résultat peut être expliqué par le choix du métal. L’oxovanadium n’est peut-être pas le meilleur candidat pour cette application bien qu’il ait fait ses preuves avec l’immunocapteur compétitif développé dans notre laboratoire présentant des LOD de 4 à 45 ng/L.

Figure 57: (A) Voltammogrammes obtenus par SWV après incubation de l’aptacapteur avec des concentrations croissantes de E2 : réponse de l’aptacapteur en absence de cible (---); 0,05 µM de E2 ( ); 0,1 µM de E2 ( ); 0,5 µM de E2 ( ); 2 µM de E2 ( ); 4 µM de E2 ( ); 8 µM de E2 ( ). (B) courbe d’étalonnage représentant la variation d’intensité Δ I en fonction de la concentration d’E2.

Figure 58: (A) Voltammogrammes obtenus par SWV après incubation de l’aptacapteur avec des concentrations croissantes de EE2 : réponse de l’aptacapteur en absence de cible (---); 0,05 µM de E2 ( ); 0,1 µM de E2 ( ); 0,5 µM de E2 ( ); 2 µM de E2 ( ); 4 µM de E2 ( ); 8 µM de E2 ( ). (B) courbe d’étalonnage représentant la variation d’intensité Δ I en fonction de la concentration d’EE2.

L’aptacapteur a été aussi testé avec une autre hormone, la testostérone, qui présente une structure chimique proche des cibles E2 et EE2. La testostérone est testée à une unique concentration de 0,1 µM. La réponse obtenue est comparable à celle obtenue suite à un essai à blanc. En effet, le signal initial observé ne subit qu’une légère diminution après 1 h d’incubation avec la testostérone. Pour la même concentration en E2 et EE2, la diminution du pic est bien plus significative que dans

100 le cas de la testostérone (Fig.59). Ces résultats confirment la spécificité de l’aptamère Alsager 35 pour l’E2 et l’EE2 et sont en accord avec les travaux d’Alsager250,251. Par conséquent, il est très probable que l’aptamère reconnait la partie phénolique commune à E2 et EE2 et différente sur la structure de la testotérone.

Figure 59: Histogramme présentant la spécificité de l’aptacapteur contre un blanc et 0,1µM : E2, EE2 et Ts (testostérone). II.3. Détection de l’estradiol par l’aptacapteur marqué au bleu de méthylène

Le développement d’un aptacapteur basé sur le même aptamère mais étant marqué au bleu de méthylène (MB) a été réalisé dans les mêmes conditions que précédemment. L’aptamère modifié a été synthétisé par la société Microsynth avec une modification au MB à l’extrémité 3’ et une amine au 5’. Il faut signaler que le coût du marquage au MB est assez important comparé à un aptamère avec de simples groupes fonctionnels tel que -SH et -NH2

Les résultats de la détection d’E2 en utilisant cet aptacapteur confirment qu’il s’agit bien d’un système de type ON / OFF (Fig.60). Le signal électrochimique observé avec cet outil est deux fois plus important que celui obtenu avec notre aptacapteur marqué au VO-salan. L’intensité du signal obtenu avec le MB peut être expliquée par le nombre d’électron mis en jeu lors de cette oxydation. En effet, le MB permet de libérer deux électrons alors que l’oxovanadium n’en perd qu’un seul : (+IV)  (+V). La LOD atteinte pour cet aptacapteur marqué au MB est de l’ordre de 17 nM soit 4.6 µg/L E2. Elle est environ 2 fois plus faible que celle de l’aptacapteur marqué

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au VO-salan (36 nM, 9 µg/L) vu que ce dernier présente une sensibilité moins importante.

Une bonne corrélation est aussi notée entre le signal et la concentration d’E2. Ceci confirme donc l’efficacité de notre outil. La moindre sensibilité est probablement due au choix du métal présent dans la sonde redox synthétisée.

Figure 60: (A) Voltammogrammes obtenus par SWV après incubation de l’aptacapteur MB avec des concentrations croissantes de E2 : réponse de l’aptacapteur en absence de cible (---); 0,025 µM ( ); 0,05 µM ( ); 0.1 µM ( ); 0,5 µM ( ); 2 µM ( ); 4 µM ( ); 8 µM ( ). (B) courbe d’étalonnage de la variation de l’intensité de pic Δ I en fonction de la concentration de E2.

III. Partie expérimentale III.1. Conception de l’aptacapteur marqué au VO-salan III.1.1. Modification de la surface de l’électrode

Les SPCE ont été prétraitées avec du H2SO4 en appliquant plusieurs scans successifs en voltammétrie cyclique entre -1,5 V et 1 V. La modification de la surface de l’électrode est réalisée par électrodéposition d’un sel de 4-carboxyphenyl diazonium. Ce dernier a été formé en mélangeant pendant 5 min de l’acide 4- aminobenzoïque à 2 mM préparé dans HCl à 0,5M avec une solution aqueuse de nitrite de sodium à 0,1 M. La solution a été ensuite déposée sur l’électrode et une LSV est appliquée à un potentiel de -0,8 V à 0,6 V avec une vitesse de balayage de 0,05 V/s.

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III.1.2. Activation de la surface modifiée

Une première étape d’activation à l’EDC/NHS des groupements carboxyles à la surface des électrodes modifiées a été réalisée comme suit. Vingt µl de la solution d’EDC/NHS à 100 mM / 20 mM, préparée dans du tampon MES à 100 mM, ont été déposés sur l’électrode de travail. Après 1h d’incubation sous atmosphère humide et à température ambiante, les électrodes sont lavées avec du tampon PBS à 0,1 M

(137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 et 2 mM KH2PO4 à pH 7,4).

III.1.3. Immobilisation de l’aptamère marqué

L’immobilisation de l’aptamère marqué a été réalisée par couplage peptidique entre la fonction amine terminale et le groupement carboxyle activé au niveau de la surface de l’électrode. Pour ce faire, un traitement thermique (Chapitre III) a été d’abord réalisé pour assurer la linéarisation de l’aptamère. Ensuite, 20 µL de la solution de l’aptamère marqué, dilué dans du PBS jusqu’à 20 µM, ont été déposés sur l’électrode de travail. Une incubation de 4h a été assurée dans une atmosphère humide et à température ambiante. Finalement, les électrodes sont lavées plusieurs fois avec du tampon PBS.

Une optimisation de la concentration en aptamère marqué est réalisée. La solution est diluée dans le tampon PBS jusqu’aux concentrations voulues (5 µM, 10 µM, 20 µM et 30 µM). Après l’incubation, des mesures par SWV sont effectuées dans une gamme de potentiel allant de -0,4 V à 0,1 v avec une fréquence de 25 Hz et une vitesse de balayage de 0,05 V/s. Pour chaque concentration, trois électrodes sont préparées.

Les étapes de modification, activation et immobilisation de l’aptamère ont été suivies par EIS en appliquant un potentiel de 0,15 V vs Ag/AgCl et une gamme de fréquences 10 kHz - 1 Hz.

III.1.4. Détection des cibles

L’étape de détection consiste à déposer 20 µL de la solution de la cible préparée dans du tampon Tris à des concentrations de 0,05 ; 0,1 ; 0,5 ; 2 ; 4 ou 8 µM. Après 1h d’incubation dans une atmosphère humide et à température ambiante, l’électrode a été lavée avec du tampon Tris. Des mesures par SWV ont été réalisées à un

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potentiel de -0,4 V à 0,1 v avec une fréquence de 25 Hz et une vitesse de balayage de 0,05 V/s. Pour chaque concentration, trois électrodes ont été préparées.

III.2. Détection d’E2 par l’aptacapteur marqué au bleu de méthylène

Afin d’avoir un élément de comparaison, un autre aptacapteur a été conçu. Ce capteur repose toujours sur le même aptamère, Alsager35, celui-ci étant marqué par une sonde redox classique, le bleu de méthylène. Cet aptamère modifié a été synthétisé par la société Microsynth. Le même protocole de conception de l’apatacapteur a été appliqué en respectant strictement les mêmes conditions. Des mesures de SWV ont été également effectuées.

IV. Conclusion

Ce chapitre décrit la conception de l’aptacapteur à base d’aptamères marqués au VO-salan pour la détection d’E2 et EE2. Les résultats des analyses effectuées en utilisant cet outil montrent bien l’efficacité du système à détecter sa cible. Bien que la sensibilité reste faible comparée à d’autres biocapteurs, une corrélation entre les réponses et les quantités dosées est observée.

Le complexes VO-salan a permis une détection électrochimique simple, rapide et directe même si le signal est limité. L’avantage de ce types de complexes est la possibilité de tester d’autres métaux afin d’améliorer la sensibilité.

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Conclusion et Perspectives

Dans ce travail, nous proposons des nouvelles sondes redox comme alternatives aux marqueurs classiques souvent utilisés pour les biocapteurs d’affinité. Ces nouveaux marqueurs sont appliqués dans le développement d’un aptacapteur électrochimique pour la détection des hormones estrogéniques : le 17-β-estradiol (E2) et son dérivé synthétique le 17-α-ethinylestradiol (EE2).

Nous nous sommes intéressés en premier lieu à la synthèse de ces sondes électrochimiques de type complexes métalliques salen et salan. Plusieurs stratégies de synthèse sont présentées dont deux ayant permis d’obtenir les composés d’intérêt avec des rendements satisfaisants. Les complexes de cuivre et d’oxovanadium formés ont présenté des propriétés électrochimiques intéressantes suite à leur caractérisation. Par conséquent, et avec des stratégies de synthèse simples et fluides mettant en jeu des réactifs disponibles, une éventuelle utilisation de ces complexes comme marqueurs redox des biomolécules est possible ainsi qu’un éventuel développement commercial.

Nous avons ensuite utilisé les produits synthétisés pour marquer une séquence d’aptamère spécifique aux molécules cibles. Cet aptamère est décrit dans la littérature comme étant très spécifique et présentant une grande sélectivité comparé à d’autres aptamères décrits pour les mêmes cibles.

Le marquage de l’aptamère est basé sur une réaction de type chimie click entre le groupement maléimide au niveau du complexe métallique et le groupement thiol terminal de la séquence d’aptamère. Ce couplage est réalisé dans des conditions réactionnelles simples qui ont été sélectionnées après optimisation. Au cours de cette réaction, le ligand salen, contrairement à son dérivé salan, s’est montré instable en présence d’eau dans le milieu réactionnel. Une hydrolyse des imines a conduit à la dégradation de la structure du ligand. En contrepartie, le couplage de l’aptamère avec le ligand salan ainsi que le couplage avec son complexe d’oxovanadium ont été réalisés avec succès. Cette étape de couplage a été suivie et optimisée au travers d’une étude par LC/HRMS. La confirmation de la faisabilité de cette réaction a ainsi pu être établie.

En dernière étape de ce travail, nous avons utilisé l’aptamère marqué pour la conception d’un aptacapteur électrochimique dédié à la détection d’E2 et d’EE2. Pour ce faire, une électrode de carbone sérigraphiée est fonctionnalisée par des

106 groupes carboxyles pour la fixation de l’aptamère aminé via une liaison amide. Ces étapes de modification sont suivies par impédimétrie et par voltammétrie cyclique en présence du couple ferricyanure/ferrocyanure.

L’efficacité de l’aptacapteur développé pour la détection des cibles est confirmée avec une corrélation acceptable entre la réponse et les quantités dosées. Cependant, la sensibilité reste faible comparée aux biocapteurs conçus pour la détection des mêmes cibles. Malgré un signal limité et par conséquent une LOD élevées, le complexe VO-salan a permis une détection électrochimique simple, rapide et directe des estrogènes ciblés. Le développement d’un tel biocapteur, même s’il nécessite encore des améliorations, est un grand pas dans ce domaine.

Les perspectives immédiates de ce travail au niveau de la synthèse chimique concernent l’amélioration du rendement de la dernière étape de synthèse du ligand salan. En effet, il faut optimiser les conditions de pH et de température de la réaction de déprotection du maléimide lors de la réaction rétro-Diels-Alder ainsi que celles de la purification sur colonne.

La complexation d’autres métaux tels que le nickel, est aussi envisageable pour améliorer la réponse de l’aptacapteur et essayer d’abaisser les LOD. Les sondes redox développées pourront être utilisées par la suite pour le marquage d’autres aptamères thiolés spécifiques aux cibles étudiées ou à d’autres polluants. Sur le long terme, ce type de marquage pourra servir pour des aptacapteurs détectant simultanément plusieurs cibles avec des aptamères marqués avec des complexes de différents métaux donnant des signaux à des potentiels bien distincts.

La faisabilité du marquage des aptamères par les complexes métalliques étant validée, l’équipe envisage de transposer ce concept vers un système de marquage universel impliquant des sondes oligonucléotidiques marquées. Pour cela, il sera nécessaire de fixer le complexe métallique sur un aptamère de séquence courte et non spécifique. Ainsi, cette nouvelle sonde pourra s’hybrider à tout aptamère prolongé par une séquence d’oligonucléotides complémentaire. Ces nouvelles sondes seront donc utilisables comme traceurs universels au sein de différents types d’aptacapteurs. Par ailleurs, comme un des points faibles des aptacapteurs électrochimiques à sonde redox réside dans leurs performances en termes de sensibilité, une des perspectives consiste en la synthèse de sondes redox plurielles

107 pouvant être assimilées à des dendrimères de première génération. Il faut cependant noter que, dans cette nouvelle configuration, l’encombrement stérique de la sonde risque d’entraver la reconnaissance aptamère/cible. Enfin, pour valoriser le travail de synthèse chimique initié, une dernière perspective consisterait en la mise au point de complexes métalliques de zinc qui ont la particularité d’être à la fois électroactifs et fluorescents264. Ainsi, les mêmes molécules pourraient être utilisées comme marqueurs redox pour développer des capteurs électrochimiques et/ou comme marqueurs de fluorescence pour des capteurs optiques. L’utilisation d’autres complexes métalliques de type DOTA ou NOTA est aussi envisagée. Généralement utilisés dans l’imagerie médicale, ces composés sont intéressants du fait de leurs structures : ils forment une cage d’amines propice à la formation de complexes métalliques stables in vivo265,266. Cette extension fait l’objet d’une thèse en cours de réalisation au sein de notre équipe.

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Communications

Type de Congrès communication Titre de la présentation Date Lieu

Nouveaux capteurs pour la Congrès des doctorants Orale détection de polluants Novembre 2017 Perpignan émergents dans les eaux

Salen / salan metal complexes Société chimique de France (SCF) Orale as new markers for affinity Juillet 2018 Montpellier biosensors

Transfrontier meeting on sensors and biosensors Orale New metal complexes for the Septembre 2018 Barcelone (TMSB) labeling of affinity biosensors

Journées d’électrochimie Orale New electrochemical probes Juillet 2019 Toulouse for labeling affinity sensors

ChemComm

COMMUNICATION

Salen/salan metallic complexes as redox labels for electrochemical aptasensors† Cite this: Chem. Commun., 2019, 55, 12821 Amani Ben Jrad, abc Hussein Kanso, abd Delphine Raviglione, c Received 26th September 2019, Thierry Noguer, ab Nicolas Inguimbert *c and Carole Calas-Blanchard *ab Accepted 2nd October 2019

DOI: 10.1039/c9cc07575e

rsc.li/chemcomm

This work presents the synthesis and characterization of salen/salan In this context and to extend the scope of electroactive salen/ metal complexes for their future application as electrochemical salan complexes, this study proposes to use them for the labels in aﬃnity sensors. Due to its stability and electrochemical labeling of DNA oligonucleotides, aptamers, which are used as properties, an oxovanadium salan complex was selected and biomimetic recognition elements in biosensors. Aptamers have coupled to an estradiol-specific aptamer. The response of the numerous advantages compared to other recognition elements resulting aptasensor was shown to decrease with increasing estradiol such as antibodies or enzymes as they are specifically synthe- concentration. sized in large quantities at moderate cost. The intrinsic stability of DNA aptamers allows their modification on both sides, one Salen ligands and their more stable reduced form, salan, are being used for attachment on the electrode surface, while the popular chelates in chemistry.1,2 Over the last decade, salen other supports the marker.7,8 Traditionally, optical markers, based metal complexes have been adopted for many applications in especially fluorescent ones such as fluorophores,9,10 are used catalysis,3 cancer diagnosis,4 and magnetism and for their biological for labeling aptamers.11 Despite their high selectivity, optical activities.5 The present work proposes to use such complexes as aptasensors have long response times and the detection requires redox labels for electrochemical aﬃnity biosensing. The tetradentate the use of expensive and bulky instruments.12 Electrochemical

(N2O2) system offers the possibility of chelating a variety of metal detection offers faster response and requires inexpensive and ions, leading to several combinations for a better sensitivity and compact equipment. Electrochemical aptasensors based on redox selectivity of electrochemical response. Additionally, the intro- labeling have high selectivity and low detection limits.12,13 Electro- duction of different substituents on the salicylaldehyde moiety chemical labeling generally involves a redox probe molecule, such as allows optimizing the electronic characteristics of the metallic methylene blue14–16 or ferrocene,17–19 usually detectable by active center.1 Such complexes have been already used by our voltammetric techniques.20 The sensing strategy of the resulting group as electrochemical labels with the aim of developing an electrochemical aptasensors depends on the efficiency of electron electrochemical immunosensor for estradiol (E2) detection in transfer between the redox marker and the electrode surface. In fact, water.6 Indeed, E2 has been placed on the European watch list the binding of the target molecule on the aptamer induces a (EU 2015/495) to prevent its potential hazard. This hormone is conformational change that results in moving the marker closer considered as an endocrine disruptor requiring monitoring in (Fig. 1A) or farther away from the electrode surface (Fig. 1B). Such the environment, mainly in water. Therefore, it is essential displacement results in a variation of the measured signal which to have effective tools for the rapid detection of this molecule. can be correlated with the target concentration.21 For applications such as environmental pollution monitoring, this type of device that combines a stable, specific aptamer and compact electrochemical a Universite´ Perpignan Via Domitia, Biocapteurs-Analyses-Environnement, F-66860, transducers to generate an electrical signal offers a simple, accurate Perpignan, France. E-mail: [email protected] b Laboratoire de Biodiversite´ et Biotechnologies Microbiennes, USR 3579 Sorbonne and inexpensive platform. It is the ideal tool for analysis in fields 13,22 Universite´s (UPMC) Paris 6 et CNRS Observatoire Oceánologique, F-66650, with miniaturized equipment. In this work, we report the Banyuls-sur-Mer, France synthesis of salen/salan metal complexes and their conjugation to c USR 3278 CRIOBE, PSL Research University, EPHE-UPVD-CNRS, Universite´ de aptamers for their future application in affinity sensors. As a proof Perpignan Via Domitia, Laboratoire d’Excellence ‘‘CORAIL’’, Baˆtiment T, 58 avenue of concept and for comparison purposes with our previous work, we P. Alduy, 66860 Perpignan, France. E-mail: [email protected] 23,24 d Faculte´ de Me´decine Dentaire, Univ. Libanaise, Campus Rafic Hariri, Hadath, Liban chose an E2-specific aptamer to test the effectiveness of the † Electronic supplementary information (ESI) available: Synthesis and character- labeling of such a molecule with these metallic complexes. In order ization of compounds 1–13. See DOI: 10.1039/c9cc07575e to fulfill the above-mentioned aims, we developed a suitable strategy

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the spectrum shows three absorption bands at 223, 261 and 354 nm. The first band is assigned to the azomethine group. The second and third bands are due to the p - p* transitions of the phenolic chromophores. In the presence of metals, bathochromic shifts of these bands to 233, 284 and 403 nm and to 248, 291 and 407 nm were observed for copper and oxovanadium complexes, respectively, thus confirming proper metal complex formation (ESI,† S17, Fig. 1A). Lower intensity absorption bands were observed at 580 and 600 nm for the copper and oxovanadium complexes, respectively. These bands were not observed in the salen ligand spectra and were thus assigned to ligand-to-metal charge-transfer (LMCT) transitions.31,32 The electrochemical behavior of the different products was studied by cyclic voltammetry (CV). The cyclic voltammogram of the copper Fig. 1 Principle of electrochemical aptasensors based on the recognition complex 8 showed a quasi-reversible oxidoreduction behavior of of the target by an aptamer. The increase (A) or decrease (B) of the electrochemical signal after the detection depends on the aptamer copper, with a half-wave potential (E1/2)of0.04Vvs. Ag/AgCl. For the configuration and the probe position relative to the electrode (screen oxovanadium (VO) complex 9, the voltammogram also showed a printed carbon electrode). quasi-reversible oxidoreduction behavior of oxovanadium at E1/2 = 0.14 V vs. Ag/AgCl (Fig. 2A). The voltammogram presented a well- defined shape of the VO-salen reduction peak when compared with allowing the synthesis of salen 1a or salan 1b ligand functionalized the Cu-salen one. Based on the characterization results of the salen with a maleimide coupling group for further conjugation to the complexes 8 and 9, oxovanadium was preferred for the salan aptamer (ESI†). Therefore, the designed compounds 1a and 1b complex. An absorption spectrum of the free salan ligand 1b (ESI,† S3, Scheme S1) are composed of two parts, a tetradentate exhibited two bands at 225 and 292 nm. These bands were ligand prepared by condensation of 3-(tert-butyl)-2-hydroxy-5- also observed in the spectrum of the VO-salan complex 10 after methoxybenzaldehyde and 2,3-diaminopropionic acid, with bathochromic shifts at 282 and 345 nm, and were assigned to a spacer supporting a maleimide end-group. The spacer is a the p - p* transitions of the aromatic rings. The spectrum of 1,6-hexamethylenediamine moiety that allows segregating the VO-salan complex 10 showed an additional band at 450 nm electroactive ligands from the aptamer in order to avoid unfavor- able interactions between these two elements. The synthesis of compound 1a containing the salen chelate was achieved in 3 steps with an overall yield of 62% (ESI,† S3,SchemeS2).Spacer4a was prepared by adding Boc-hexanediamine 2 with the NHS ester of the N-succinimidyl 3-maleimidopropionate 3. After Boc deprotection compound 4b was engaged in a coupling reaction with Boc-Dap-Boc 5 mediated by oxyma/EDC coupling reagents.25 Boc deprotection of compound 6a and subsequent reaction with 3-(tert-butyl)-2-hydroxy-5-methoxybenzaldehyde 7b at neutral pH allowed the formation of the Schiff base ligand 1a. Generally, salan can be obtained by reduction of salen imines.2,26 However, the reduction of compound 1a with sodium borohydride led to the reduction of the maleimide group rather than the imine one.27 Therefore, the maleimide group of 4a was protected through a Diels Alder reaction with dimethylfuran leading to compound 4c (ESI,† S9, Scheme S3). The next steps of the synthesis were identical to the salen one with an additional deprotection of the maleimide through a reverse Diels–Alder reaction.28–30 It is noteworthy that the final step leading to compound 1c was unsatisfactory and thus impacted the global yield, which was 16% (ESI†). Metal complexes (compounds 8–10, ESI,† S14 and S15) were prepared in MeOH with pure functionalized ligands 1a and b Fig. 2 Cyclic voltammograms measured in 0.1 M KCl for (A) salen 1a and two different metal salts, copper(II) acetate or vanadyl (black), Cu-salen 8 (red) and VO-salen 9 (blue); and (B) salan 1b (black) and acetylacetonate. Characterization of complexes 8–10 was carried VO-salan 10 (green). Before the experiment, 6 nmol of each compound, out by UV-Vis spectroscopy. The absorption spectra were recorded prepared in MeOH, were adsorbed on the surface of a screen-printed over the wavelength range 200–900 nm. For the salen ligand, carbon electrode. Scan rate: 0.1 V s1.

12822 | Chem. Commun., 2019, 55, 12821--12824 This journal is © The Royal Society of Chemistry 2019 ChemComm Communication corresponding to the LMCT transitions (ESI,† S17, Fig. 1B).26,31 CV experiments showed that VO-salan complex 10 displays a quasi-reversible oxidoreduction wave at E1/2 = 0.16 V (Fig. 2B).

This low value of E1/2 is expected to impart a better selectivity to the resulting aptasensor, avoiding non-specific signals due to potential interfering substances. The promising characterization results of the salen and salan complexes confirm the potential of these redox systems for the development of affinity sensors. Next the labeling strategy based on the reaction between the maleimide group of the functionalized ligands 1 and the thiol terminal group of the E2 aptamer sequence was explored. This type of bioconjugation for labile biomolecules like proteins and antibodies presents the advantage of being easily performed without the need for activating agents or harsh conditions.33 Therefore, the estradiol specific aptamer having the following sequence 50-AAG GGA TGC CGT TTG GGC CCA AGT TCG GCA TAG TG-30 and modified by an amine group at the 50 end and a thiol group at the 30 end was subjected to reaction with compounds 1. An aptamer in its lyophilized form was solubilized in sterile water to the desired concentration. In order to facilitate the coupling step, a heat treatment was performed to linearize the aptamer sequence (8 min at 90 1C, 4 min at 0 1C and 15 min at room temperature). The coupling reaction was then carried out using 11 nmol of aptamer prepared in sterile water and 22 nmol (2 eq.)34,35 of ligands in MeOH so that the reaction medium will be finally constituted by 10% water and 90% MeOH. This reaction was carried out to test the maleimide–thiol coupling and to observe the behavior of the ligands under the reaction conditions. Proper coupling of the two parts was assessed by monitoring the reaction using HPLC coupled to electrospray ionization HRMS operating in negative mode. Fig. 3 LC/HRMS of the E2 aptamer (A1 and B1), salan 1b (A2 and B2), Besides the remaining E2 aptamer characterized by peaks at compound 12 (A3 and B3), compound 10 (A4 and B4) and compound 13 (A5 and B5). m/z 2239.16 and 1865.80 (ESI,† S16, A1, B1 and A3, B3-2) corresponding to the five and six charged states, respectively, a small amount of compound 14 (ESI,† S15) resulting from the coupling of the aptamer with a degradation derivative of 1a for expected compound 13 with m/z at 2081.87 and 2402.24 which the two benzaldehyde derived groups are lacking due to (Fig. 3A5 and B5). the imine hydrolysis was characterized by a mass at m/z = In order to verify the effectiveness of our redox-labeled 2312.60 and 1926.84 (ESI,† S15, A3, B3-1). The susceptibility of detection system, the aptasensor was set up and tested in the the salen compounds to hydrolysis drove us to examine the presence of E2. The VO-salan-labeled aptamer was immobilized salan ligand (1b) as an alternative. The coupling was performed through a peptide bond after EDC/NHS activation of the under the same conditions and the MS spectra showed peaks at carboxyl groups on the electrode surface.36 Salan-labeled and m/z = 2389.4520 and 1991.0488 corresponding to the five and label-free aptamers were immobilized by the same method and six charged states of compound 12 respectively (Fig. 3A3 and used as controls. As shown by Square Wave Voltammetry B3). The peak corresponding to the starting aptamer m/z = (SWV), in the absence of E2, a significant peak was observed 2239.1659 (Fig. 3A1 and B1) entirely disappeared, showing that only for the VO-salan labeled aptamer, which was attributed to the totality of the aptamer was labeled by the salan ligand. oxovanadium electroactivity (Fig. 4A). After incubation of the A peak at m/z = 750.44 was assigned to the ligand added in aptasensor with 8 mM of E2, this peak was almost switched off excess for the reaction (Fig. 3A2 and B2). This result confirms and our aptasensor was considered as an on/off system (Fig. 4A). the superior stability of the salan ligand compared to the salen. This observation can be attributed to the spatial rearrangement Indeed, the structure of compound 12 is not affected by the of the E2/aptamer assembly compared to the aptamer alone. presence of 10% water during the coupling reaction. Based on Thus, before the association with E2 the VO-salan complex is theseresults,weappliedthesamereactionconditionsbyengaging nearby the electrode surface, and a peak with an intensity of the E2 aptamer and the VO-salan complex 10 (Fig. 3A4 and B4). about 0.1 mA was measured (Fig. 4A).37 After E2 binding to the LC/MS monitoring allowed identifying the formation of the aptamer, the VO-salan complex moved away from the electrode

This journal is © The Royal Society of Chemistry 2019 Chem. Commun., 2019, 55, 12821--12824 | 12823 Communication ChemComm Notes and references

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Ozsoz, Electroanalysis, 2001, (B) the immobilized VO-salan-labeled aptamer (red solid line) and the 13, 219–223. results of the biorecognition of 8, 4 and 0.05 mM E2 (dashed, dashed 17 A.-E. Radi, Int. J. Electrochem., 2011, 1–17. ´ dotted and dotted lines). 18 S. Amaya-Gonza´lez, N. de-los-Santos-Alvarez, A. Miranda-Ordieres and M. Lobo-Castanõń, Sensors, 2013, 13, 16292–16311. 19 A. Anne, A. Bouchardon and J. Moiroux, J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 1112–1113. surface and the signal decreased to 0.025 mA. These results are 20 H. Abu-Ali, A. Nabok and T. J. Smith, Chemosensors, 2019, 7, 27. sustained by a molecular dynamics study of the E2 aptamer in 21 Y. Xiao, T. Uzawa, R. J. White, D. DeMartini and K. W. Plaxco, 0 0 Electroanalysis, 2009, 21, 1267–1271. water, concluding that its 5 and 3 ends are not in contact with E2 22 M. Moorcroft, Talanta, 2001, 54, 785–803. and can serve for immobilization on a surface or for conjugation 23 O. A. Alsager, S. Kumar, B. Zhu, J. Travas-Sejdic, K. P. McNatty and with a suitable probe.24 Furthermore, target recognition induced a J. M. Hodgkiss, Anal. Chem., 2015, 87, 4201–4209. 0 24 A. Eisold and D. Labudde, Molecules, 2018, 23, 1690. conformational change of the aptamer 3 end that folds in the 25 R. Subiros-Funosas, R. Prohens, R. Barbas, A. El-Faham and direction of the hairpin core, thus precluding interaction with the F. Albericio, Chem. – Eur. J., 2009, 15, 9394–9403. electrode surface. 26 R. M. Clarke, K. Herasymchuk and T. Storr, Coord. Chem. Rev., 2017, 352, 67–82. Complementary experiments were carried out in the presence of 27 A. Chihab-Eddine, A. Daı¨ch, A. Jilale and B. Decroix, Tetrahedron the decreasing concentration of E2 (8, 4 and 0.05 mM), showing Lett., 2001, 42, 573–576. that the decrease in peak intensity is correlated with the E2 28 C. Garcıá-Astrain, A. Gandini, D. Coelho, I. Mondragon, A. Retegi, A. Eceiza, M.A.CorcueraandN.Gabilondo,Eur. Polym. J., 2013, 49, 3998–4007. concentration (Fig. 4B). These results confirm that the VO-salan 29 X. Elduque, A. Sańchez, K. Sharma, E. Pedroso and A. Grandas, complex can serve as an alternative electrochemical label for Bioconjugate Chem., 2013, 24, 832–839. future aptasensors. 30 C. Vilela, A. J. D. Silvestre and A. Gandini, J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem., 2013, 51, 2260–2270. The work was carried out in the framework of Capt’Avenir 31 M. Cozzolino, V. Leo, C. Tedesco, M. Mazzeo and M. Lamberti, project No. 2015006021. This project received funding from the Dalton Trans., 2018, 47, 13229–13238. Languedoc-Roussillon region through the European Regional 32 S. Gopal Rao, M. B. Ismail, E. Deivanayagam, K. R. Srinivasalu, S. K. Belliraj and C. Manohar, J. Braz. Chem. Soc., 2016, 28, 756–767. Development Fund (ERDF). 33 H. Y. Song, M. H. Ngai, Z. Y. Song, P. A. MacAry, J. Hobley and M. J. Lear, Org. Biomol. Chem., 2009, 7, 3400. 34 I. Flamme, US Pat., 9315543B2, 2013. 35 M. Smith, US Pat., 9295729B2, 2010. Conflicts of interest 36S.BarantonandD.Be´langer, J. Phys. Chem. B, 2005, 109, 24401–24410. 37 S. Song, L. Wang, J. Li, C. Fan and J. Zhao, TrAC, Trends Anal. Chem., There are no conflicts to declare. 2008, 27, 108–117.

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