Inventarizace Molekulární Biodiverzity Vybraných Druhů Ryb Čeledi Cyprinidae a Umbridae
Total Page:16
File Type:pdf, Size:1020Kb
MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE Inventarizace molekulární biodiverzity vybraných druhů ryb čeledi Cyprinidae a Umbridae Disertační práce Soňa Stierandová Školitel: Mgr. Jan Mendel, Ph.D. Brno 2015 Bibliografický záznam Autor: Mgr. Soňa Stierandová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Inventarizace molekulární biodiverzity Název práce: vybraných druhů ryb čeledi Cyprinidae a Umbridae Studijní program: Biologie Studijní obor: Obecná a molekulární genetika Mgr. Jan Mendel, Ph.D. Vedoucí práce: Ústav biologie obratlovců AV ČR, v.v.i Akademický rok: 2015/2016 Počet stran: 97 Klíčová slova: barcoding, cytochrom b, čeleď Cyprinidae, čeleď Umbridae, fylogeografie, genetická diverzita, inventarizace, mikrosatelity, mtDNA, ochranářská genetika, rod Alburnoides, sekvenování Bibliographic Entry Author: Mgr. Soňa Stierandová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Molecular biodiversity inventory of selected Title of Thesis: fish species from families Cyprinidae and Umbridae Degree Biology Programme: Field of Study: General and Molecular Genetics Mgr. Jan Mendel, Ph.D. Supervisor: Institute of Vertebrate Biology, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i Academic Year: 2015/2016 Number of Pages: 97 Keywords: barcoding, consevation genetics, cytochrome b, family Cyprinidae, family Umbridae, phylogeography, genetic diversity, genus Alburnoides, inventory, microsatellites, mtDNA, sequencing Abstrakt Doktorská práce se zabývá inventarizací molekulární diverzity vybraných taxonů dvou čeledí Cyprinidae a Umbridae na národní i evropské úrovni. Spojovacími prvky jsou rozsáhlá molekulárně-genetická analýza zahrnující analýzy jaderných i mitochondriálních markerů a vývoj mikrosatelitových lokusů. Práce je tematicky složená ze čtyř volně navazujících částí. Inventarizace biodiverzity ichtyofauny ČR byla založena na sekvenační analýze mitochondriálního a jaderného markeru. Projekt byl zpracován pod záštitou iniciativy Barcode of Life metodou „DNA barcoding“ a významně rozšířil mezinárodní databázi BoLD. Poskytl důležité informace pro monitorovací systém NATURA 2000 i novou druhovou kolekci pro Národní muzeum ČR. Fylogeografická studie vybraných druhů rodu Alburnoides odhalila 17 evropsko-asijských linií. Byl nalezen vhodný linijně-identifikační klíč složený z analýzy mitochondriálního markeru a indelové diagnostiky dvou jaderných genů. Byla potvrzena druhová podhodnocenost tohoto rodu. Byla podpořena validita 11 morfologicky uznaných druhů a čtyři nové linie byly předloženy jako „species-in-waiting“. Pro nominotypický druh Alburnoides bipunctatus s. stricto byl vymezen nový distribuční areál. Pro populační studie rodu Alburnoides byla připravena nová knihovna polymorfních mikrosatelitových lokusů. Použitelnost těchto lokusů byla testována při cross-species amplifikacích zástupců rodu Alburnoides a dalších čtyř ohrožených cyprinidů. Při rozlišování vybraných druhů ouklejky se některé testované mikrosatelity projevily jako diagnostické. Konstrukcí knihovny nových STR lokusů pro blatňáka tmavého jsme se významně podíleli na doplnění malého již publikovaného mikrosatelitového setu. Tyto mikrosatelitové lokusy jsou použitelné pro budoucí repatriační a populační studie na českém a evropském území. Abstract The doctoral thesis is focused on molecular biodiversity inventory of selected fish species from two families, Cyprinidae and Umbridae. Linking elements are extensive molecular- genetic analysis concluding testing of nuclear and mitochondrial markers and testing of microsatellite loci. This thesis is thematically composed of four freely follow-up parts. The biodiversity inventory of ichthyofauna of the Czech Republic was based on analyses of the mitochondrial and nuclear markers. The project was processed under the auspices of the initiative Barcode of Life by method “DNA barcoding” and widened the database BoLD. This project also contributed to the monitoring system NATURA 2000 and for National Museum. Phylogeographical study of selected species of the genus Alburnoides revealed 17 Eurasian lineages. A good lineage-identification key composed of mitochondrial marker and indel diagnostics of nuclear genes was determined. Species underestimation within this genus was confirmed. The validity of 11 morphological valid species of genus Alburnoides was supported. Four lineages are considered as “species-in-waiting”. A new distribution area was determined for nominotypical species Alburnoides bipunctatus s. stricto. The new microsatellite library of polymorphic microsatellite loci for population studies was constructed. Usability of the loci was tested in the cross-species amplifications with individuals of genus Alburnoides and another four endangered cyprinids. Chosen species of spirlin are recognisable by using some microsatellites which were proved as diagnostic. We constructed the library of STR loci from the genome of European mudminnow and enriched the published small set of microsatellite loci. These microsatellites will be possible to use for repatriation and population studies in the Czech Republic and also widely in Europe. © Soňa Stierandová, Masarykova univerzita, 2015 Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli Mgr. Janu Mendelovi, Ph.D. za jeho ochotu a možnost získat rozsáhlé laboratorní dovednosti a životní zkušenosti. Nemalý dík patří Mgr. Blance Urbánkové za pomoc při formálním zpracování disertační práce. Manželovi a rodině za jejich morální podporu, cenné rady a optimismus. OBSAH 1 ÚVOD 10 2 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 11 2.1 Inventarizace ichtyofauny a DNA barcoding iniciativa 11 2.2 Taxonomický status vybraných druhů/poddruhů rodu Alburnoides v evropsko-asijském kontextu 12 2.3 Mikrosatelitové lokusy pro druhy rodu Alburnoides a Umbrides 14 3 CÍLE PRÁCE 15 4 MATERIÁL A METODIKA 16 4.1 Použitý materiál 16 4.1.1 Sběr vzorků vybraných druhů ichtyofauny ČR 16 4.1.2 Sběr vzorků rodu Alburnoides 17 4.1.3 Příprava a testování knihovny mikrosatelitů ouklejky pruhované a blatňáka tmavého 17 4.2 Analýza a hodnocení vnitrodruhové diverzity 17 4.2.1 Využití jaderného markeru 18 4.2.2 Využití mitochondriálního markeru 18 4.2.3 Využití mikrosatelitových lokusů 19 4.3 Použitá metodika 19 4.3.1 Metoda přímého sekvenování obecně 19 4.3.2 Metody použité při inventarizaci ichtyofauny ČR 20 4.3.3 Metody použité při inventarizaci evropských druhů rodu Alburnoides 20 4.3.4 Analýza mikrosatelitových lokusů obecně 21 4.3.5 Příprava knihovny mikrosatelitů 21 4.3.6 Zaklonování DNA řetězců heterozygotních jedinců u jaderných markerů 22 4.4 Použité statistické nástroje 23 4.4.1 Statistické nástroje použité při inventarizaci ichtyofauny ČR 23 8 4.4.2 Statistické nástroje pro vyhodnocení fylogeneze evropských ouklejek 23 4.4.3 Vyhodnocovací nástroje použité při přípravě mikrosatelitové knihovny 24 5 VÝSLEDKY 25 5.1 Inventarizace ichtyofauny České republiky 25 5.2 Fylogeneze a taxonomický status evropských ouklejek rodu Alburnoides 26 5.3 Mikrosatelitové lokusy využitelné pro studium ouklejky pruhované a dalších kriticky ohrožených cyprinidů 27 5.4 Mikrosatelitové lokusy pro populační studii rodu Umbra na území České republiky – nepublikovaný výsledek 27 6 DISKUZE 29 6.1 Inventarizace ichtyofauny České republiky 29 6.2 Taxonomický status evropských druhů rodu Alburnoides 30 6.3 Mikrosatelitové lokusy využitelné pro studium populací ouklejky pruhované a dalších cyprinidů 32 6.4 Mikrosatelitové lokusy využitelné pro repatriační program blatňáka tmavého 33 7 SHRNUTÍ 35 8 SEZNAM LITERATURY 37 9 SEZNAM ZKRATEK 42 10 PŘÍLOHY 44 Příloha I 44 Příloha II 73 Příloha III 86 9 1 ÚVOD Genetická diverzita je jedním ze znaků všech živých organismů. Tento proces je přirozenou protiváhou neustále se měnícímu životnímu prostředí. Genetická variabilita se tak stává zásadním faktorem pro adaptaci a přežití organismů. Zástupci ryb jsou vázáni k vodním zdrojům. Nemohou se volně pohybovat napříč územími, jsou tedy limitováni koryty řek, jezery, tůněmi. Během prehistorického vývoje docházelo k oddělování či spojování vodních ploch. Tyto procesy probíhají kontinuálně. Důsledkem lidské činnosti a s nástupem umělé regulace vodních toků vzniká nový činitel působící na obyvatele vodní říše. Tyto a další faktory jsou nedílnou součástí vývoje prostředí a působí jak pozitivně tak i negativně na genofond populací. Je proto snahou vědců a výzkumných týmů zjistit, jaké zákonitosti platí a pokusit se zachytit co největší množství této variability. Získané informace slouží při záchranných projektech a udržování populací. Při populačních výzkumech se využívají metodické přístupy jako sekvenace jaderných a mitochondriálních markerů nebo fragmentační analýza. Sekvenační analýza se uplatňuje při fylogenetických a fylogeografických studiích, při mapování aktuální diverzity na úrovni druhů, rodů, atd. Zatímco fragmentační analýza se používá při pozorování populací a příbuzenských vztahů uvnitř. Tato metoda vychází z vyšší mutační četnosti mikrosatelitů ve srovnání s bodovými mutacemi u jaderných či mitochondriálních markerů. Ochranářské aktivity se realizují jak na lokální tak i na celosvětové úrovni. Dobrými příklady mohou být iniciativy NATURA 2000, která se snaží o periodický monitoring a ochranu lokálních biotopů a populací nebo také iniciativa iBOL (International Barcode of Life project) sdružující největší databázi genetické diverzity na světě. Udržování a zachování biodiverzity je klíčovou spojnicí všech níže popsaných a vypracovaných studií. Navazuje