RZECZPOSPOLITA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 3199643 POLSKA
(13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (51) Int.Cl. 29.12.2016 16207282.1 C12Q 1/6888 (2018.01)
(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 08.05.2019 Europejski Biuletyn Patentowy 2019/19 Urząd Patentowy EP 3199643 B1 Rzeczypospolitej Polskiej
(54) Tytuł wynalazku: SPOSÓB IDENTYFIKACJI EUROPEJSKICH RYB SŁODKOWODNYCH I ICH MIESZAŃCÓW W MATERIAŁACH BIOLOGICZNYCH METODĄ S7ICAPS
(30) Pierwszeństwo: 31.12.2015 CZ 20150957
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
02.08.2017 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2017/31
(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
31.03.2020 Wiadomości Urzędu Patentowego 2020/03
(73) Uprawniony z patentu:
Ústav biologie obratlovců AV ČR, v.v.i., Brno, CZ
(72) Twórca(y) wynalazku:
JAN MENDEL, Brno, CZ
T3 KAREL HALACKA, Brno, CZ LUKAS VETESNIK, Brno, CZ
(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Cybulka 3199643 PORAJ KANCELARIA PRAWNO-PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Słowackiego 31/33/1 60-824 Poznań
PL/EP
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
1
Tłumaczenie opisu wynalazku EP 3 199 643 B1
SPOSÓB IDENTYFIKACJI EUROPEJSKICH RYB SŁODKOWODNYCH I ICH MIESZAŃCÓW W MATERIAŁACH BIOLOGICZNYCH METODĄ S7ICAPS
Opis Dziedzina techniki
[0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu identyfikacji europejskich ryb słodkowodnych i ich mieszańców w materiałach biologicznych i produktach rybnych przy użyciu metody S7iCAPS, a ponadto dotyczy nowatorskiego projektu startera, diagnostycznych regionów JGM i ich unikalnych długości, specyficznych wzorów restrykcyjnych i zestawów do identyfikacji.
Stan techniki
[0002] Ze względu na rosnące globalne wysiłki na rzecz mapowania i ochrony rzeczywistej różnorodności ryb słodkowodnych, w tym określania ich rodzimych obszarów, istnieje potrzeba ulepszenia obecnych metod identyfikacji lub opracowania całkowicie nowych. Znajomość i zrozumienie prawdziwej różnorodności biologicznej i jej ochrony jest ważnym tematem w polityce międzynarodowej i krajowej dla większości państw. Ostateczna identyfikacja ryb jest ważna dla ochrony oryginalnej puli genów ryb w każdym kraju oraz dla ustalenia właściwego zarządzania. Ważną grupą gatunków ryb są gatunki chronione, które na podstawie rozporządzeń Unii Europejskiej (Dyrektywa Rady 92/43 / EWG) wymagają różnych reżimów ochrony i dla których wyznaczono chronione obszary Unii Europejskiej - Natura 2000 i sieć EMERALD w ramach konwencji berneńskiej, ze stałym okresowym monitorowaniem. W przypadku zagrożenia zaniku populacji jednego z „krytycznie zagrożonych” gatunków zainicjowany został program ratunkowy, w którym kluczową kwestią jest identyfikacja genetyczna. Ministerstwo Rolnictwa Republiki Czeskiej wdrożyło program wsparcia dla „Wprowadzania szczególnie zagrożonych gatunków na wolność”, ale w większości przypadków nadal nie respektuje ochrony różnorodności genetycznej.
[0003] Ostateczna identyfikacja ryb jest ważna również pod względem stosunkowo częstej hybrydyzacji. W literaturze opisano zdarzenia hybrydyzacji w > 95 rodzinach ryb (Schwartz, F. J. 1981. World literature to fish hybrids with an analysis by family, species, and hybrid: Supplement 1. NOAA Technical Report NMFS SSRF-750, 507 p.; Schwartz, F. J. 2001. Freshwater and marine fish family hybrids: A worldwide changing scene revealed by the scientific literature. Journal of the Elisha Mitchell Scientific Society, 117 (1), 62-65; Scribner, K. T., Page, K. D., Bartron, M. L. 2001. Hybridization in freshwater fishes: a review of case studies and cytonuclear methods of biological inference. Reviews in Fish Biology and Fisheries 10, 293-323; Bartley D. M., Rana K., Immink A. J. 2001. The use of inter-specific hybrids in aquaculture and fisheries. Reviews in Fish Biology and Fisheries 10, 325-337). W przypadku niektórych ryb produkcyjnych hybrydyzacja jest bezpośrednio wymagana (sieje, pstrągi itp.). W przypadku innych, hybrydyzacja jest niepożądana, co dotyczy również importu i wprowadzenia nierodzimych linii i gatunków dla określonego obszaru geograficznego. Bez terminowej identyfikacji genetycznej, hybrydyzacje genetyczne mogą być jedną z przyczyn zniszczenia pierwotnej różnorodności wewnątrzgatunkowej i międzygatunkowej. 2
[0004] Wiarygodne określenie genetyczne poszczególnych linii i ras jest również konieczne w intensywnej hodowli w celu zachowania czystości rasy, zwiększenia i poprawy wydajności produkcji, zachowania odporności na choroby i różne czynniki stresowe oraz ustalenia właściwego zarządzania hodowlą ogólnie. Od 1996 r. Ministerstwo Rolnictwa Republiki Czeskiej prowadzi „Krajowy program ochrony i wykorzystania zasobów genetycznych zwierząt” i wspiera finansowo zarejestrowanych hodowców w zakresie ochrony zasobów genetycznych zwierząt gospodarskich, w tym ryb.
[0005] Również zapobieganie fałszowaniu produktów rybnych, jaj, narybku i młodych ryb jest znaczne, przy czym takie fałszowanie prowadzi do specyficznych pomyłek, jeśli chodzi o jakość i cenę. Rozporządzenie Rady Unii Europejskiej 104/2000 przewiduje obowiązek wskazania również konkretnej nazwy, pochodzenia geograficznego itp. na etykiecie produktów rybnych.
[0006] Na świecie znanych jest kilka sposobów i procedur określania gatunków / linii ryb. Metody oparte na identyfikacji morfologicznej są stosowane do oznaczania gatunków całkowicie lub umiarkowanie zmodyfikowanych ryb (Kottelat, M., Freyhof, J. 2007. Handbook of European freshwater fishes. Kottelat, Cornol, Switzerland and Freyhof, Berlin, Niemcy). Jednak w przypadku utraty lub braku zewnętrznych cech identyfikacyjnych, metoda ta jest trudna do zastosowania. Ponadto metoda ta należy do wysoce inwazyjnych. Metody oparte na analizie białek ekstrahowanych z mięśni, wątroby itp. są również stosowane do identyfikacji ryb, takie jak analiza allozymów (Lusková, V., Šlechtová, V., Povž, M., Šlechta, V., Lusk, S. 1997. Genetic variability of Chondrostoma nasus population in rivers of the Black Sea and the Baltic Sea drainage systems. Folia Zoologica 46 (Suppl. 1), 27-36), ogniskowanie izoelektryczne (Ataman, C., Celik, U., Rehbein, H., 2006. Identification of some Aegean Fish by native isoelectric focusing. European Research Research and Technology, 222, 99-104) lub techniki immunologiczne (Dominquez, E., Perez, M. D., Puyol, P., Calvo, M. 1997. Use of imunological techniques for detecting species substitution in raw and smoked fish. Zeitschrift für Lebensmittelunter-suchung und - Forschung A, 204/4, 279-281). Ich głównym ograniczeniem jest szybka degradacja białka w wyższych temperaturach, wysokie ryzyko wzajemnej reaktywności lub problemy związane ze specyficznością tkankową, bardzo ograniczony poziom polimorfizmu, wyższy wskaźnik subiektywnej oceny i wysoce inwazyjny charakter.
[0007] Obecnie, w celu określenia szerokiej gamy ryb, częściej stosuje się molekularne metody genetyczne oparte na analizie DNA. Te metody mają wiele zalet w porównaniu do metod wykorzystujących analizę białek. DNA jest obecne we wszystkich tkankach zwierzęcych, w większości przypadków nie zależy od źródła próbki i może być izolowane ze wszystkich etapów życia organizmu. DNA degraduje się wolniej i nawet niewielka ilość jest wystarczająca dzięki metodzie PCR. W większości przypadków decydująca jest nieinwazyjna metodologia, duża informatywność i możliwość wyboru markera współdominującego.
[0008] Ze względu na swoją dokładność, klasyczne sekwencjonowanie metodą Sanger stanowi znaczący wkład w badania identyfikacyjne europejskich ryb. Ta metoda jest często stosowana do sprawdzania poprawności wyników uzyskanych innymi metodami. Do identyfikacji gatunków ryb stosuje się różne markery jądrowe o różnym stopniu zmienności. Do sekwencjonowania eksonów, na przykład RAG1 (gen 1 aktywujący rekombinację), stosuje się dużą podjednostkę rybosomalną 28S i rodopsynę (Choleva, M., Musilova, Z., Kohoutova-Sediva, A., Paces, J., Rab, P., Janko, K., 2014. Distinguishing between Incomplete Lineage Sorting and Genomic Introgressions: Complete Fixation of Allospecific Mitochondrial DNA in a Sexually Reproducing Fish (Cobitis; Teleostei), despite Clonal Reproduction of Hybrids. PLoS ONE 9(6): e80641). Automatyczne sekwencjonowanie regionów kodowania jądrowego często wykazuje 3 zmniejszoną zmienność, a zatem niską zdolność do identyfikacji (Li Ch., Ortí G., Zhang G., Lu G. 2007. A practical approach to phylogenomics: the phylogeny of ray-finned fish (Actinopterygii) as a case study. BMC Evolutionary Biology 7, 44). Do sekwencjonowania intronów stosuje się na przykład intron podjednostki beta genu syntazy adenozynotrifosforanowej (Atp-β) i drugi intron genu aktyny (Act-2) (Touriya A, M. Rami, G. Cattaneo- Berrebi, C. Ibanez, S. Augros, E. Boissin, A. Dakkak i P. Berrebi. 2003. Primers for EPIC amplification of intron sequences for fish and other vertebrate population genetic studies. BioTechniques 35: 676-682). Można również zastosować pierwszy lub drugi intron rybosomalnego r-białka S7 (RPS7) (Perea, S., Böhme, M., Zupančič, P., Freyhof, J., Šanda, R., Özulug, M., Abdoli, A., Doadrio, I. 2010. Phylogenetic relationships and biogeographical patterns in Circum-Mediterranean subfamily Leuciscinae (Teleostei, Cyprinidae) inferred from both mitochondrial and nuclear data. BMC Evolutionary Biology, 10, 265). Białko R S7 jest jednym z białek odgrywających ważną rolę w matrycy i interakcji podjednostek 40S (Mundus, DA, Bulygin, KN, Ven'yaminova, AG, Vladimirov, SN, Vratskikh, LV, Repkova, MN, Yamkovoi, VS , Karpova, GG 1993. Human placenta 40S ribosomal subunit affinity modification by oligoribo-nucleotide derivatives containing the AUG codon. Ribosomal proteins composing the codon-anticodon interaction site. Molecular Biology, 27, 91-95). Marker jądrowy RPS7 składa się z 7 eksonów i 6 intronów i stwierdzono, że dla niektórych gatunków ryb słodkowodnych pierwsza architektura intronów ma znaczenie diagnostyczne (Annilo, T., Laan, M., Stahl, J., Metspalu, A. 1995. The human ribosomal protein S7-encoding gene: Isolation, structure and localization in 2p25. Gene, 165, 297-302; Mendel, J., Lusk, S., Vasileva, E. D. et al. 2008. Molecular phylogeny of the genus Gobio Cuvier, 1816 (Teleostei: Cyprinidae) and its contribution to taxonomy. Mol. Phylogenet. Evol., 47, 1061-1075). Pary starterów PCR do amplifikacji tego markera opisano w publikacji Chow, S., Hazama, K. 1998. Universal PCR primers for S7 ribosomal protein gene introns in fish. Ekologia molekularna, 7, 1255- 1256. Ale te zestawy starterów bardzo często dawały niezadowalające wyniki, co było zrozumiałe, ponieważ autorzy zaproponowali projekt startera tylko na trzech taksonach ryb (Oncorhynchus keta, Thunnus spp., Fugu rubripes), genetycznie i geograficznie bardzo różniących się od gatunków ichtiofauny słodkowodnej w Europie. Ponadto częsta obecność indeli powodujących mutację przesuwającą ramkę odczytu, brakująca platforma referencyjnych sekwencji homozygotycznych i ogólnie fragmentacja markerów w genetycznych bazach danych powoduje znaczne trudności w stosowaniu markerów intronowych.
[0009] Technika sekwencjonowania - kod kreskowy DNA, wykorzystujący mitochondrialny marker COI (oksydaza cytochromu c) jako wspólny kod kreskowy identyfikacji, stworzyła już informacyjną platformę bazy danych (BoLD) i znormalizowaną metodologię. Ponadto w sposób satysfakcjonujący rozwiązuje także problem fragmentacji markera i skomplikowanych porównań. Ma jednak swoje główne ograniczenia - nie potrafi poprawnie zidentyfikować hybryd i oferuje niewystarczający obraz jednego genomu (żeńskiego) na badany obiekt, ponieważ to geny jądrowe są przede wszystkim odpowiedzialne za fenotyp.
[0010] Techniki fingerprint , takie jak PCR-RFLP (polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych) i AFLP (polimorfizm długości fragmentów amplifikowanych), są również przydatne w badaniach oznaczania niektórych gatunków ryb słodkowodnych i ich mieszańców (Campbell, D., Bernatchez, L. 2004. Generic scan using AFLP markers as a means to assess the role of directional selection in the divergence of sympatric whitefish ecotypes. Mol. Biol. Evol 21 (5), 945-956). Analiza STR jest stosowana szczególnie w biologii populacyjnej, przy szacowaniu parametrów populacji, badaniach nad ojcostwem itp. (Baker, A. J. 2000. Molecular methods in ecology. Blackwell science Ltd., Oxford), ale ze względu na 4 wysoką czułość stosuje się go w badaniach identyfikacyjnych jako technikę drugiego kroku, zwykle po sekwencjonowaniu DNA. Ponadto wysoka specyficzność starterów uniemożliwia łatwe zastosowanie w badaniach identyfikacyjnych dużych grup o różnych poziomach taksonomicznych.
[0011] Koncepcja SPInDel wykorzystuje insercje i delecje do identyfikacji gatunków różnych grup eukariotów, w tym niektórych gatunków ryb. Jednak to podejście jest ograniczone w swej konstrukcji, która opiera się wyłącznie na zmienności sekwencji mitochondrialnych genów rRNA (Carneiro J., Pereira F., Amorium A. 2012. SPInDel: a multifunctional workbench for species identification using insertion/deletion variants. Molecular Ecology Resources 12, 1190-1195; Pereira F., Carneiro J., Matthiesen R., Van Asch B., Pinto N., Gusmao L., Amorim A. 2010. Identification of species by multiplex analysis of variable-length sequences. Nucleic Acids Research 38, e203).
[0012] Obecnie pojawiają się techniki sekwencjonowania drugiej generacji („sekwencjonowanie nowej generacji”, NGS) na różnych platformach (pirosekwencjonowanie, technologie sekwencjonowania Illumina, SOLID, Ion Torrent itp.). Te podejścia wymagają jednak specjalneo sprzętu i oprogramowania do przetwarzania ogromnych ilości danych. Koncentrują się przede wszystkim na skompletowaniu całych genomów. Wiążą się z dużymi inwestycjami, kosztowną operacją i drogimi odczynnikami.
[0013] Inne podejścia molekularne do identyfikacji gatunków zwierząt wykorzystują techniki biochipów (Cheng J., Sheldon EL, Wu, L., Uribe, A., Gerrue, LO, Heller, MJ i O'Connell, JP 1998, Preparation and hybridization analysis of DNA/RNA from E. coli on microfabricated bioelectronic chips. Nature Biotechnology 16: 541-546). Jednak ta technika jest przede wszystkim związana z komercyjną produkcją i dystrybucją produktów kosmetycznych, żywności i pasz przeznaczonych do spożycia przez ludzi i zwierzęta. Służy do weryfikacji obecności / braku obecności składników zwierzęcych w mieszance bez specyfikacji gatunków. Podobny charakter ma metoda PCR w czasie rzeczywistym do wykrywania i oceny ilościowej niektórych gatunków ryb.
Streszczenie wynalazku
[0014] Wady oznaczania europejskich ryb słodkowodnych na podstawie materiałów biologicznych i produktów rybnych metodami opartymi na identyfikacji białek, bezpośrednim sekwencjonowaniu i genotypizacji genów mitochondrialnych oraz najnowszymi technikami jakościowymi i ilościowymi eliminuje się dzięki metodzie identyfikacji ryb słodkowodnych w materiałach biologicznych i produktach rybnych metodą S7iCAPS (trawiona powielona sekwencja polimorficzna z intronem S7), zgodnie z niniejszym wynalazkiem, który charakteryzuje się tym, że identyfikacja taksonów ichtiofauny europejskiej i ich mieszańców odbywa się za pomocą konwencjonalnego PCR ze specyficznymi dla gatunku lub specyficznymi dla grupy parami starterów, które definiują cząstkową unikalną sekwencję gatunkową / liniową pierwszego intronu genu S7, zwaną regionem identyfikacyjnym Johanna Gregora Mendla (region JGM). Sekwencje poszczególnych starterów pokazano w Tabeli 1, gdzie otrzymane amplikony, w przypadku rodzajów o większej liczbie gatunków / linii, są polimorficzne o wystarczającej długości (z powodu obecności indeli; Tabela 2) i / lub są dalej trawione przez specyficzne endonukleazy restrykcyjne (Tabela 3), gdzie zastosowano projekt CAPS, gdzie miejsca restrykcyjne znajdują się w pozycjach indelowych unikalnych dla gatunku / linii (marker InDel-CAPS) i / lub w określonych mutacjach punktowych - SNP (polimorfizm pojedynczego nukleotydu, SNP - marker CAPS), jak pokazano w Tabeli 2. 5
Tabela 1. Projekt startera i konkretna temperatura Ta w zidentyfikowanych rodzajach i gatunkach
Rodzina Rodzaj Gatunek i linia Skrót nazwy Sekwencja 5 ' 3' Temperatura Przybliżona startera wyżarzania długośća regionu JGM (pz) (°C) Acipenseridae Acipenser, Huso A. baeri, A. ruthenus, A. stellatus, A. AcS7F TGGYDTTTCCCGTACTGTR 60 440 gueldenstaedtii, A. sturio, H. huso AcS7R CTGGTRCTGAACATGGCCTAT Nemacheilidae Barbatula B. barbatula - 3 linie BaS7F TGCCCAGCTATAAGGA 60 435 BaS7R TTTATCTTAATMGTCGATGAG Centrarchidae L. gibbosus, M. salmoides, M. CeS7F GTTGTTTAATRTTTGCGTTTG 60 660 Lepomis, Micropterus dolomieu CeS7R GGTACTGAACATGGCCTRTG Cobitidae Cobitis CoS7F TKGTTKTCCTCATGTAYTGGR 60 515 C. elongatoides, C. tanaitica, C. taenia, CoS7R GWATCACAACAGAAACCACG C. taurica, C. strumicae, C. fahirae, C. melanoleuca, C. choii, C. vardarensis, C. lutheri, C. paludica Sabanejewia S. balcanica SabS7F TGAATGTGCCCAGCTAGAGG 60 550 SabS7R ACTGAAATAATATGCCGTTTG Misgurnus M. fossilis, M. nikolskyi MiS7F TGTGAGTATRTTTGRCRATG 60 475 MiS7R AGAGTTTAAMGCTCGYACCTT Cottidae Cottus C. gobio, C. poecilopus - 2 linie*, CoS7F GTTTAATCTTYGCGTGGACCC 60* a 64 420 C. microstomus CoS7R TGAACATGGCCGTTGTGTC Rodzina Rodzaj Gatunek i linia Skrót nazwy Sekwencja 5 ' 3' Temperatura Przybliżona startera wyżarzania długośća regionu (°C) JGM (pz) Cyprinidae CyS7F TTCACTGAGATGCGTTAGATG 60 470 6
(ciąg dalszy)
Rodzina Rodzaj Gatunek i linia Skrót nazwy Sekwencja 5 ' 3' Temperatura Przybliżona startera wyżarzania długośća regionu (°C) JGM (pz) Abramis, Rutilus, CyS7R GACAYACAAWCTGATKYGTCT Scardinius, Blicca, A. brama, B. bjoerkna, S. erythrophthalmus, S. Ballerus, Leuciscus, plotizza, S. acarnanicus, S. hesperidicus, L aspius, B. ballerus, B. sapa, L leuciscus, L idus, Leuciscus, Squalius, genus Rutilus - R. ohridanus, R. prespensis, R. Chondrostoma, aula, R. basak, R. pigus, R. virgo, R. ylikiensis, Alburnus, Vimba R. panosi, R. frisii, R. caspicus, R. rubilio, R. rutilus, R. heckelii R. meidingeri, R. karamani, R. sp. Sperchios, genus Squalius - S. cephalus- 2 linie, S. sp. SP-2010a, S. pyrenaicus, S. keadicus, S. castellanus, S. prespensis, S. valentinus, S. torgalensis, S. squalius, S. orientalis, S. malacitanus, S. illyricus, S. carolitertii, genus Chondrostoma - Ch. nasus, Ch. oxyrhynchum, Ch. miegii, Ch. turiense, Ch. angorense, Ch. lemmingii, Ch. oretanum, Ch. arcasii, Ch. knerii, Ch. willkommii, Ch. occidentale, Ch. phoxinus, Ch. polylepis, Ch. duriense, genus Alburnus - A. alburnus - 3 linie, A. filippii, A. belvica, A. arborella, A. sp. SP-2010, A. kotschyi, A. escherichii, V. vimba, V. melanops Alburnoides AIS7F TTCRCTGAGATGSGTTAGATG 60 455 7
(ciąg dalszy)
Rodzina Rodzaj Gatunek i linia Skrót nazwy Sekwencja 5 ' 3' Temperatura Przybliżona startera wyżarzania długośća regionu (°C) JGM (pz) A. bipunctatus, A. tzanevi, A. rossicus, AIS7R GACATAMAATYTGWTGCGTCT A. sp. 1 (Danube 1), A. sp. 2 (Danube 2), A. sp. 3 (Greece, A. thessalicus), A. economoui (Greece, Sperchios), A. sp. 5 (Azerbaijan, Tugcay), A. maculatus, A.ohridanus, A. prespensis complex (A. devolli, A. fangfangae, A. prespensis), A. strymonicus, A. fasciatus, A.kubanicus, A. eichwaldii Cyprinus, Carassius C. carpio, C. carassius, C. gibelio, C. langsdorfii CaS7F ATTYAGACAGGGATGCGTTAG 60 590 CaS7R AAGCGTCAGCASTAACATCST Leucaspius L delineatus - 2 linie LeuS7F TACCTCCATGCATGAGCTTTA 60 850 LeuS7R TTCGCACTGGTACTGAACAT Leuciscus, Leuciscus, LeS7F TTCACTGAGATGCGTTAGATG 60 835 Alburnus, Squalius, L leuciscus, L idus, L cf. latus SP- LeS7R TATTTTCGCACTGGTACTGAAC Vimba 2010, L aspius, genus Alburnus - A. alburnus - 3 linie, A. filippii, A. belvica, A. arborella, A. sp. SP-2010, A. kotschyi, A. escherichii, V. vimba, V. melanops Hypophthalmichthys, C. idella, H. molitrix, H. nobilis HyS7F GCCCATGTGCTGTTCTAAGA 60 480 Ctenopharyngodon HyS7R AAAMTGAYAGCCTCAATCTCC Pelecus P. cultratus PeS7F CCGAAAATGCCTCTATT 60 670 PeS7R CTATTTTCGCACTGGTACTGA Pseudorasbora P. parva - 2 linie PsS7F GCTAACSGCATGCTAAGA 60 590 PsS7R CGCGCTGGTACTGAAC Phoxinus P. phoxinus - 2 linie, P. lumaireul PhS7F GAGATRCVTTAGATGCGARTA 60 465 PhS7R ACATACAATCTGATG CGTCT Romanogobio RoS7F AAAATCMCTWCACAGYAAGGC 60 810 8
(ciąg dalszy)
Rodzina Rodzaj Gatunek i linia Skrót nazwy Sekwencja 5 ' 3' Temperatura Przybliżona startera wyżarzania długośća regionu (°C) JGM (pz) R. albipinnatus, R. vladykovi, R. RoS7R TTGACCTCCACGCATGAG belingi, R. uranoscopus, R. kesslerii, R. banaticus, R. parvus, R. pentatrichus, R. sp. - Albanie, R. elimeius Tinca T. tinca - 2 linie, carp x tench TiS7F GGCCCATGTGCTGTTCTAAGA 64 660 TiS7R TTTCGCGCTGGTACTGA Vimba V. vimba - 2 linie, V. melanops ViS7F CGAAAATGCCTCTATTAAGT 60 595 ViS7R GATTGTCTCATTTACTAACCC Esocidae Esox E. lucius EsS7F GCTCTCACTGATCGGAATATG 60 420 EsS7R CAACTACTGTAGCAGCGTTAG Gasterosteidae Gasterosteus G. aculeatus GaS7F TAAACCCTTCGTAACGCTTCT 60 500 GaS7R GCATGTACTGTGGGCTAAGAG Gobiidae GobidS7F GCTATTTCTGCATCGGAACCC 57 475 N. melanostomus, B. gymnotrachelus, GobidS7R CCTAGTTATGCMBSTCT Babka, Neogobius, N. eurycephalus, N. fluviatilis, N. Ponticola, caspius, N. cephalargoides, N. gorlap, Proterorhinus N. platyrostris, N. syrman, N. rhodioni, N. cyrius, N. constructor, N. ratan, P. kessleri, P. semilunaris - haploskupina Serbia, haploskupina Ukraine - Dniester, haploskupina Ukrajina- Krym, haploskupina Ukraine - Odessa, P. cf. semipellucidus, P. sp. CAS-2008, P. marmoratus Lotidae Lota L. lota LoS7F AACAAACATTTAATCGCCATA 65 475 LoS7R CGACAGAAAGCCGACCAC 9
(ciąg dalszy)
Rodzina Rodzaj Gatunek i linia Skrót nazwy Sekwencja 5 ' 3' Temperatura Przybliżona startera wyżarzania długośća regionu (°C) JGM (pz) Percidae Gymnocephalus G. cernua - 3 linie, G. schraetser*, G. baloni- 2 GyS7F GTCGTWTGTGTAGCGTGGATG 58* a 60 605 linie GyS7R AAAAGACATGTGGGGTTAC Sander, Perca S. lucioperca, S. volgensis, S. marinus, S. PeS7F CTACCGTATACATYGTAAGGC 60 480 vitreus, P. fluviatilis, P. flavescens PeS7R GGCGCTGGTACTGAAC Zingel Z. zingel, Z. streber ZiS7F CCGTCGTTGACAGAGGTTMG 60 440 ZiS7R GCATGTACATTGGCTAGGCTA Salmonidae Salvelinus, Salmo, S. alpinus, S. fontinalis, S. salar, S. SaS7F TGGATGRMCRTTGTGTAATKA 60 560 Oncorhynchus trutta, O. mykiss SaS7R YCGAGTGGTCCATGCCGACT Salvelinus, Hucho S. alpinus, S. fontinalis, H. hucho HuS7F TGGATGGSCGTTGTGTAATGA 60 560 HuS7R CMRAGTGGTCCATGCCGACT Salvelinus S.alpinus, S. fontinalis, S. fontinalis x S. alpinus SalS7F TGGATGGCCGTTGTGTAATGA 60 560 SalS7R CCGAGTGGTCCATGCCGACT Siluridae Silurus S. glanis SiS7F CCTCGAGCCGAAAGCGTC 60 445 SiS7R TTGTGCACTACAGCGGTATGG Umbridae Umbra U. krameri UmS7F CATGCGTTCCTGTGCCTATCC 60 490 UmS7R CTGAACATGGCCAACGTCTCT a Przybliżona długość = wartość zaokrąglona i uśredniona 10
Tabela 2. Klucz identyfikacyjny S7iCAPS - dokładna długość regionu JGM, specyficzne markery Indel-CAPS i SNP-CAPS dla wybranych gatunków / linii oraz heterozygot i ich hybryd
Gatunek / linia / heterozygota / Unikalny region Marker CAPS Długość fragmentu Marker CAPS Długość fragmentu Marker CAPS Długość fragmentu Marker CAPS Długość hybryda JGM 1 2 3 4 fragmentu (pz) Salvelinus alpinus 524 Tasl 243, 175,86,20 X X X X X X Salvelinusfontinalis_ linia A 583 Tasl 305, 172,86,20 X X X X X X Salvelinus fontinalis_ linia B 589 Tasl 394, 175,20 X X X X X X S. fontinalis_A/S. fontinalis_B 583/589 Tasl 305/394 X X X X X X S. fontinalis_A/S. alpinus 583/524 Tasl 243/305 X X X X X X S. fontinalis_B/S. alpinus 589/524 Tasl 243/394 X X X X X X Leucaspius delineatus_ linia A 816 Dral 378, 341, 97 X X X X X X Leucaspius delineatus_ linia B 850 Dral 468, 382 X X X X X X Vimba vimba 593 Vspl 593 Blpl 497, 96 X X X X Vimba melanops 594 Vspl 494, 100 Blpl 594 X X X X V. vimba 835 Vspl 835 Aflll 835 X X X X V. melanops 836 Vspl 597, 239 Aflll 836 X X X X Squalius cephalus 813 Vspl 460, 353 Aflll 432, 381 X X X X genus Vimba/Squalius 835, 597, 460, 835-836, 432, cephalus 835/813 Vspl 353, 239 Aflll 381 X X X X Zingel zingel 441 MluCI 363, 78 Mwol 239, 202 X X X X Zingel streber 441 MluCI 214, 149, 78 Mwol 239, 140, 62 X X X X Cottus gobio 423 Bsll 212, 125, 86 Pstl 423 X X X X 125, 108, 100, Cottus poecilopus 421 Bsll 88 Pstl 354, 67 X X X X Pseudorasbora parva_ linia A 591 Hindll 266, 175,75,75 Aflll 478, 89, 24 X X X X 11
(ciąg dalszy)
Gatunek / linia / Unikalny region Marker Długość fragmentu Marker Długość fragmentu Marker CAPS Długość fragmentu Marker CAPS Długość heterozygota / hybryda JGM CAPS 1 CAPS 2 3 4 fragmentu (pz) Pseudorasbora parva_ linia B 583 Hincll 264, 243, 76 Aflll 529, 24 X X X X Neogobius melanostomus 481 Alul 333, 148 Kpn2l 481 Ddel 481 X X Ponticola kessleri 484 Alul 484 Kpn2l 484 Ddel 484 X X Babka gymnotrachelus 485 Alul 485 Kpn2l 422, 63 Ddel 485 X X Neogobius fluviatilis 482 Alul 334, 148 Kpn2l 482 Ddel 277, 205 X X 165-154, 143, Proterorhinus semilunaris 465-485 Csel 465-485 Dral 92,76 X X X X Proterorhinus semipellucidus 483 Csel 416, 67 Dral 315, 92,76 X X X X Proterorhinus marmoratus 484 Csel 484 Dral 392, 92 X X X X Gymnocephalus cernua 602 EcoT22l 525,77 Psil 602 Msll 405, 197 X X Gymnocephalus schraetser 603 EcoT22l 603 Psil 448, 155 Msll 400, 203 X X Gymnocephalus baloni 606 EcoT22l 606 Psil 606 Msll 240,201,165 X X 194, 171, 129, Lepomis gibbosus 661 BseMII 423, 238 Taal 474, 187 Ddel 100, 53, 14 X X Micropterus salmoides 641 BseMII 439, 202 Taal 310, 188, 143 312, Ddel 332, 160, 96, 53 X X 145, 135, Micropterus dolomieu 638 BseMII 638 Taal 46 Ddel 334, 251, 53 X X Barbatula barbatula_ linia A 436 Sspl 436 NhaXI 390, 46 X X X X Barbatula barbatula_ linia B 436 Sspl 230, 206 NhaXI 390, 46 X X X X Barbatula barbatula_ linia C 433 Sspl 230, 203 NhaXI 433 X X X X Sander volgensis 482 Ball 482 BsuRI 318, 144,20 184, X X X X 144, 134, Sander lucioperca 482 Ball 278, 204 BsuRI 20 X X X X 12
(ciąg dalszy)
Gatunek / linia / Unikalny region Marker Długość fragmentu Marker Długość fragmentu Marker CAPS Długość fragmentu Marker CAPS Długość heterozygota / hybryda JGM CAPS 1 CAPS 2 3 4 fragmentu (pz) Perca fluviatilis 498 Tasl 443, 55 Mph1103l 498 X X X X Perca flavescens 483 Tasl 483 Mph1103l 252, 231 X X X X Cobitis elongatoides 507 Mph1103l 507 Aflll 359, 148 X X X X Cobitis strumicae 517 Mph1103l 429, 88 Aflll 517 X X X X Cobitis taenia 516 Mph1103l 273, 243 Aflll 516 X X X X Cobitis tanaitica 516 Mph1103l 516 Aflll 516 X X X X Tinea tinca_linia wschodnia 656-660 Mboll 656-660 Taql 656-660 X X X X Tinea tinca_linia zachodnia (CZ, 3, 4) 659 Mboll 433, 226 Taql 432, 212, 15 X X X X Tinea tinca_linia zachodnia (1,2, 5) 657-659 Mboll 341, 226, 90 Taql 432, 212, 16 X X X X Hypophthalmichthys molitrix 487 Rsal 337,150 Pfel 250, 192, 45 X X X X Hypophthalmichthys nobilis 484 Rsal 484 Pfel 295, 189 X X X X Ctenopharyngodon idella 481 Rsal 322, 159 Pfel 425, 56 X X X X Phoxinus lumaireul 467 Xmnl 278, 85, 63, 41 Dral 267, 200 Pacl 315, 152 X X Phoxinus phoxinus_ linia A 462 Xmnl 277, 144, 41 Dral 462 Pacl 462 X X Phoxinus phoxinus_ linia B 467 Xmnl 319, 144 Dral 267, 200 Pacl 467 X X Phoxinus phoxinus_ linia C 463 Xmnl 319, 144 Dral 463 Pacl 463 X X Romanogobio - grupa z białymi 604-610, płetwami 806-817 Bsll 202-207 Avall 806-817 Xap+I 710-721, 96 X X Romanogobio - grupa kesslerii 593-600, 802-806 Bsll 802-806 Avall 206-209 Xapl 706-710, 96 X X 13
(ciąg dalszy)
Gatunek / linia / Unikalny region Marker Długość fragmentu Marker Długość fragmentu Marker CAPS Długość fragmentu Marker CAPS Długość heterozygota / hybryda JGM CAPS 1 CAPS 2 3 4 fragmentu (pz) Romanogobio- grupa longbarbel 811 Bsll 811 Avall 602, 209 Xapl 436, 279, 96 X X Romanogobio belingi 806 Vspl 417, 389 Dral 806 X X X X Romanogobio vladykovi 808 Vspl 808 Dral 808 X X X X Romanogobio 817 Vspl 817 Dral 469, 348 X X X X albipinnatus Romanogobio kesslerii 802 Scal 672, 130 X X X X X X Romanogobio banaticus 806 Scal 806 X X X X X X Cyprinus carpio 596 Dral 596 Acll 596 X X X X Carassius carassius 588 Dral 444, 144 Acll 588 X X X X Carassius gibelio 568 Dral 568 Acll 425, 143 X X X X Carassius auratus 579 Dral 579 Acll 378, 139, 62 X X X X Carassius carassius_ 588 BsuRI 397, 118, 73 BstNl 523, 65 X X X X linia A Carassius carassius_ 588 BsuRI 459, 118 BstNl 588 X X X X linia B Misgurnus fossilis 474 Pstl 398, 76 BstZ17l 474 X X X X Misgurnus nikolskyi 485 Pstl 245, 240 BstZ17l 434, 51 X X X X Alburnoides rossicus 461 Aflll 461 Scal 297, 164 X X X X Alburnoides maculatus 460 Aflll 309, 151 Scal 460 X X X X Alburnoides strymonicus 459 Pvull 323, 136 Alw26l 194, 175, 90 BseDI 459 X X Alburnoides economoui 463 Pvull 463 Alw26l 373, 90 BseDI 463 X X Alburnoides thessalicus 459 Pvull 459 Alw26l 194, 175, 90 BseDI 324, 135 X X Alburnoides fasciatus 463 Aflll 463 Alw26l 198, 175, 90 X X X X Alburnoides kubanicus 461 Aflll 310, 151 Alw26l 371, 90 X X X X Alburnoides eichwaldii 466 Aflll 466 Alw26l 196, 175, 95 X X X X Alburnoides sp. 5 462 Aflll 462 Alw26l 367, 95 X X X X Acipenser sturio 439 Pscl 439 Ddel 203, 136, 77, 23 Bfal 284, 155 X X 14
(ciąg dalszy)
Gatunek / linia / Unikalny region Marker Długość fragmentu Marker Długość fragmentu Marker CAPS Długość fragmentu Marker CAPS Długość heterozygota / hybryda JGM CAPS 1 CAPS 2 3 4 fragmentu (pz) Acipenser ruthenus 427 Pscl 247, 180 Ddel 187, 164, 76 Bfal 282, 145 X X Acipenser stellatus 449 Pscl 449 Ddel 246, 203 Bfal 294, 155 X X Acipenser baeri 427 Pscl 247, 180 Ddel 187, 164, 76 Bfal 282, 145 X X Acipenser gueldenstaedtii 443 Pscl 443 Ddel 187, 164, 76 Bfal 288,155 X X Huso huso 443 Pscl 443 Ddel 187, 164, 76 Bfal 443 X X Bester (H. huso/A. ruthenus) 443/427 Pscl 443/247/180 X X Bfal 443/282/145 X X Leuciscus leuciscus 833 Alul 599, 234 Hindlll 833 Bsp143l 833 X X Leuciscus idus 837 Alul 517, 234, 86 Hindlll 749, 88 Bsp143l 837 X X Leuciscus aspius 835 Alul 835 Hindlll 835 Bsp143l 704, 131 X X Squalius cephalus 813 Alul 507, 234, 72 Hindlll 813 Bsp143l 813 X X Leuciscus leuciscus_ linia A 832 Hincll 399, 348, 92 BspTI 832 X X X X Leuciscus leuciscus_ linia B 833 Hincll 833 BspTI 682, 151 X X X X Squalius cephalus_ 251, 150,49, linia A 466 Hincll 386, 80 Ddel 11, 5 X X X X Squalius cephalus_ linia B 468 Hincll 468 Ddel 251, 212, 5 X X X X Alburnus alburnus_ linia A 837 Csel 837 Sspl 837 Taql 466, 198, 173 X X Alburnus alburnus_ linia B 822 Csel 461,361 Sspl 638, 184 Taql 452, 197, 173 X X Alburnus alburnus_ linia C 836 Csel 836 Sspl 652, 184 Taql 466, 177, 173,20 X X 356, 115/184, A. alburnus/S. cephalus 471/467 Ssil 168, 115 Bsll 316, 155/466 Hhal 309, 162/467 X X Cyprinidae_hybrids_l Abramis brama 472 Aanl 406, 66 Alul 238, 234 Hincll 472 Bsu15l 472 15
(ciąg dalszy) Gatunek / linia / Unikalny region Marker Długość fragmentu Marker Długość fragmentu Marker CAPS Długość fragmentu Marker CAPS Długość heterozygota / hybryda JGM CAPS 1 CAPS 2 3 4 fragmentu (pz) (Scardinius erythrophthalmus 472 Aanl 406, 66 Alul 238, 234 Hincll 472 Bsu15l 371, 101 Ballerus ballerus 460 Aanl 262, 68, 66, 64 Alul 234,156, 70 Hincll 460 Bsu15l 460 Ballerus sapa 466 Aanl 333, 66, 64 Alul 234, 155, 75 Hincll 466 Bsu15l 466 Rutilus rutilus 464 Aanl 333, 66, 64 Alul 234, 155, 75 Hincll 389, 75 Bsu15l 464 Blicca bjoerkna 463 Aanl 333, 66, 64 Alul 202, 185, 44, 32 Hincll 463 Bsu15l 463 Cyprinidae_hybrids_ll Chondrostoma nasus 470 Vspl 358, 112 Taql 366, 104 X X X X Rutilus rutilus 464 Vspl 355, 109 Taql 190, 173, 101 X X X X Blicca bjoerkna 463 Vspl 463 Taql 189, 173, 101 X X X X Squalius cephalus 466 Vspl 352,114 Taql 293, 173 X X X X Cyprinidae_hybrids_lll Vimba vimba 835 Bsll 553, 282 BspTI 835 X X X X Scardinius 733, 98 522, erythrophthalmus 831 Bsll 707, 124 BspTI 302 a 518, X X X X Leucaspius delineatus - 2 linie 824, 790 Bsll 824, 790 BspTI 272 X X X X Squalius cephalus 813 Bsll 600,213 BspTI 430, 383 X X X X Cyprinidae_hybrids _IV Alburnus alburnus - 3 397, 347/333, 486, 350/336, linie 836 Tail 92, 15 Acll 15 Alul 522, 234, 80 X X Blicca bjoerkna 833 Tail 741, 92 Acll 833 Alul 414, 202, 185, 32 X X Vimba vimba 835 Tail 743, 77, 15 Acll 835 Alul 416, 234, 185 X X Abramis brama 830 Tail 518, 220, 9 Acll 521,309 Alul 596, 234 X X Leuciscus idus 837 Tail 513, 232, 92 Acll 837 Alul 517, 234, 86 X X Leuciscus leuciscus 833 Tail 511, 230, 92 Acll 833 Alul 601, 232 X X Scardinius erythrophthalmus 472 Afllll 444, 28 Bsp143l 472 Rsal 285, 98, 66, 23 X X Scardinius hesperidicus 472 Afllll 472 Bsp143l 397, 75 Rsal 285, 98, 66, 23 X X Scardinius acarnanicus 472 Afllll 472 Bsp143l 472 Rsal 351, 98, 23 X X 16
Tabela 3. Testy RE specyficzne dla poszczególnych rodzajów i motywów restrykcyjnych
Rodzaj Test RE 1 Motyw restrykcyjny Test RE 2 Motyw restrykcyjny Test RE 3 Motyw restrykcyjny Test RE 4 Motyw restrykcyjny Salvelinus Tasl AATT Leucaspius Dral TTTAAA Vimba Asel ATTAAT Blpl GCTNAGC Squalius Asel ATTAAT Aflll CTTAAG Zingel Tasl AATT Mwol GCNNNNNNNGC Cottus Bsll CCNNNNNNNGG Pstl CTGCAG Pseudorasbora Hincll GTYRAC Aflll CTTAAG Neogobius and Babka Alul AGCT Kpn2l TCCGGA Ddel CTNAG Ponticola Alul AGCT Kpn2l TCCGGA Ddel CTNAG Proterorhinus Csel GACGCNNNNN Dral TTTAAA Gymnocephalus EcoT22l ATGCAT Psil TTATAA Msll CAYNNNNRTG Lepomis BseMII CTCAG(N)10 Taal ACNGT Ddel CTNAG Micropterus BseMII CTCAG(N)10 Taal ACNGT Ddel CTNAG Barbatula Sspl AATATT NhaXI CAAGRAG Sander Ball TGGCCA BsuRI GGCC Perca Tasl AATT EcoT22l ATGCAT Cobitis EcoT22l ATGCAT Aflll CTTAAG Tinea tinea Mboll GAAGA(N)8 Taql TCGA Hypophthalmichthys Rsal GTAC Pfel GAWTC Ctenopharyngodon Rsal GTAC Pfel GAWTC Phoxinus Xmnl GAANNNNTTC Dral TTTAAA Pacl TTAATTAA Romanogobio - zróżnicowanie na 3 grupy Bsll CCNNNNNNNGG Avall GGWCC Xapl RAATTY Romanogobio (bel-vla-alb) Asel ATTAAT Dral TTTAAA Romanogobio (kess-ban) Scal AGTACT Cyprinus Dral TTTAAA Acll AACGTT Carassius (car-gib-aur) Dral TTTAAA Acll AACGTT Carassius carassius_2 linie BsuRI GGCC BstNl CCWGG Misgurnus Pstl CTGCAG BstZ17l GTATAC Alburnoides (linie rosyjsko- ukraińskie) Aflll CTTAAG Scal AGTACT 17
(ciąg dalszy) Rodzaj Test RE 1 Motyw restrykcyjny Test RE 2 Motyw restrykcyjny Test RE 3 Motyw restrykcyjny Test RE 4 Motyw restrykcyjny Alburnoides (linie egejskie) Pvull CAGCTG Alw26l GTCTCN BseDI CCNNGG Alburnoides (linie ponto- kaspijskie Aflll CTTAAG Alw26l GTCTCN Acipenser Pscl ACATGT Ddel CTNAG Bfal CTAG Huso Pscl ACATGT Ddel CTNAG Bfal CTAG Leuciscus Alul AGCT Hindlll AAGCTT Bsp143l GATC Leuciscus (Aspius) Alul AGCT Hindlll AAGCTT Bsp143l GATC Squalius Alul AGCT Hindlll AAGCTT Bsp143l GATC Leuciscus leuciscus - 2 linie Hincll GTYRAC Aflll CTTAAG Squalius cephalus - 2 linie Hincll GTYRAC Ddel CTNAG Alburnus alburnus - 3 linie Csel GACGCNNNNN Sspl AATATT Taql TCGA A. alburnus/S. cephalus hybrid Ssil CCGC Bsll CCNNNNNNNGG Hhal GCGC Cyprinidae_hybrids_l Abramis Aanl TTATAA Alul AGCT Hincll GTYRAC Bsu15l ATCGAT Scardinius Aanl TTATAA Alul AGCT Hincll GTYRAC Bsu15l ATCGAT Ballerus Aanl TTATAA Alul AGCT Hincll GTYRAC Bsu15l ATCGAT Rutilus Aanl TTATAA Alul AGCT Hincll GTYRAC Bsu15l ATCGAT Blicca Aanl TTATAA Alul AGCT Hincll GTYRAC Bsu15l ATCGAT Cyprinidae_hybrids_ll Chondrostoma Vspl ATTAAT Taql TCGA Rutilus Vspl ATTAAT Taql TCGA Blicca Vspl ATTAAT Taql TCGA Squalius Vspl ATTAAT Taql TCGA Cyprinidae_hybrids _lll Vimba Bsll CCNNNNNNNGG Aflll CTTAAG Scardinius Bsll CCNNNNNNNGG Aflll CTTAAG Leucaspius Bsll CCNNNNNNNGG Aflll CTTAAG 18
(ciąg dalszy) Cyprinidae_.hybrids _III Squalius Bsll CCNNNNNNNGG Aflll CTTAAG Cyprinidae_.hybrids _IV Alburnus Tail ACGT Acll AACGTT Alul AGCT Blicca Tail ACGT Acll AACGTT Alul AGCT Vimba Tail ACGT Acll AACGTT Alul AGCT Abramis Tail ACGT Acll AACGTT Alul AGCT Leuciscus Tail ACGT Acll AACGTT Alul AGCT Leuciscus Tail ACGT Acll AACGTT Alul AGCT Scardinius Afllll ACRYGT Bsp143l GATC Rsal GTAC 19
Tabela 4. Gatunki pstrągów wykrywalne metodą S7iCAPS
Nazwa polska Nazwa łacińska Pochodzenie Golec zwyczajny Salvelinus alpinus Dania, Niemcy Pstrąg źródlany Salvelinus fontinalis Republika Czeska, Słowacja Palia alzacka Salvelinus alpinus x Salvelinus fontinalis Republika Czeska
Tabela 5. Identyfikacja gatunków i linii pstrągów z materiału biologicznego z intensywnej hodowli
Wyniki
Sa SfA SfB SfA/SfB SalsH2A SalsH2B Deklarowane Nr Sa 20 20 Sf 42 21 4 10 6 1 Sals 34 1 1 22 10
[0015] Sposób według wynalazku pozwala na wykrycie odpowiednich gatunków / linii w próbkach świeżej, zamrożonej, utrwalonej żywności i we wszystkich próbkach żywności, paszy i ogólnie produktów zawierających mięso rybne.
[0016] Kolejnym przedmiotem wynalazku są zestawy do identyfikacji gatunków / linii europejskich ryb słodkowodnych przy użyciu sposobu według wynalazku. Zestawy identyfikacyjne zawierają specyficzne dla gatunku pary starterów i specyficzne endonukleazy restrykcyjne dające specyficzne wzory gatunków / linii, za pomocą których oznaczanie osobników homozygotycznych („czystych”), heterozygotycznych i hybrydowych przeprowadza się w materiałach biologicznych i produktach rybnych. Nawet proste wzory elektroforetyczne (bez trawienia enzymów restrykcyjnych) obrazujące polimorfizm długości uzyskanych amplikonów - regionów JGM, które są również stosowane w wynalazku, są w niektórych przypadkach wystarczające do identyfikacji.
[0017] Sposób według wynalazku dotyczy konwencjonalnej techniki PCR przy użyciu specyficznych starterów, które definiują unikalne dla gatunku regiony intronowe JGM i generują albo polimorficzne amplikony długości i / lub specyficzne wzory restrykcyjne w połączeniu z trawieniem przez specyficzne endonukleazy restrykcyjne w pozycjach indelowych i / lub pozycjach SNP. Metoda, zwana S7iCAPS (trawiona powielona sekwencja polimorficzna z intronem S7), która jest również przedmiotem wynalazku, została wyprowadzona z późniejszej konwersji unikalnych indeli i SNP na specyficzne dla gatunku / linii markery CAPS (trawiona powielona sekwencja polimorficzna). Metoda S7iCAPS została stworzona do rutynowego stosowania w laboratorium do identyfikacji wyżej wymienionych taksonów ichtiofauny europejskiej. Opiera się na amplifikacji częściowych sekwencji pierwszego intronu r-białka S7 (S7).
[0018] Metoda identyfikacji S7iCAPS wykorzystuje kombinację: 1) długości diagnostycznej produktów PCR (ze względu na obecność wystarczająco długich indeli) i specyficznego markera SNP-CAPS lub indel CAPS, lub 2) dwóch markerów InDel-CAPS lub SNP-CAPS lub ich kombinacje.
[0019] Stworzono nowy projekt startera dla gatunków europejskich lub grup gatunków ukierunkowany na regiony konserwatywne i ograniczający hiperzmienne gatunki / linie specyficzne części sekwencji intronowej S7, tak zwane regiony JGM. Dokonano również optymalizacji wszystkich komponentów, kroków i profili temperaturowych.
[0020] Unikalną zaletą sposobu według wynalazku jest to, że opracowany układ na dwubiegunowym trybie dziedziczenia 20 alleli S7 i ich możliwej rekombinacji allelicznej pozwala wykryć historyczne zdarzenia hybrydyzacji zachodzące zarówno przez rozmnażanie płciowe, jak i bezpłciowe ryb.
[0021] Kolejną zaletą jest to, że profil temperaturowy dla wszystkich monopleksowych reakcji PCR jest uniwersalny i różni się tylko w kilku przypadkach temperaturą wyżarzania. Odczynniki chemiczne zostały również dostosowane do koncepcji pojedynczego mastermiksu. Jest to korzystne w przypadku przetwarzania dużej liczby próbek, w których gatunki / linie różnych próbek mogą być analizowane jednocześnie w jednym eksperymencie, co prowadzi do znacznych oszczędności kosztów i czasu.
[0022] Kolejną zaletą jest to, że koszty testów CAPS są ogólnie niskie, ponieważ stosuje się tanie i powszechnie dostępne enzymy restrykcyjne.
[0023] Powstałe produkty PCR są specyficzne i nie jest konieczne weryfikowanie ich specyficzności innymi metodami. Niemniej jednak, jeśli to konieczne, wyżej wspomniane startery można również stosować jako startery do sekwencjonowania w celu szybkiego i łatwego potwierdzenia, co jest tanie ze względu na zastosowanie tylko jednej pary starterów, tj. dwóch serii na konwencjonalnym analizatorze genetycznym.
[0024] Kolejną zaletą jest to, że długość regionu diagnostycznego J. G. Mendela jest zaprojektowana w zakresie od około 450 do 850 pz, co jest wystarczające do wytworzenia łatwo rozpoznawalnego wzoru restrykcyjnego na żelu agarozowym.
[0025] Niezawodność i solidność proponowanego układu przetestowano na próbkach z różnych obszarów geograficznych (różnych obszarów odwadniania i basenów morskich), a także na różnych cyklerach i mastermiksach różnych firm.
[0026] Klucz identyfikacyjny S7iCAPS jest przeznaczony dla dwóch etapów, a w niektórych przypadkach nawet dla trzech etapów. Wszystkie próbki można analizować przy użyciu co najmniej dwóch różnych enzymów restrykcyjnych w pozycjach indelowych i / lub pozycjach SNP. W niektórych przypadkach jeden z nich można zastąpić diagnostycznym polimorfizmem długości amplikonów, co zapewnia wystarczającą wiarygodność oznaczania.
[0027] Główną zaletą metody S7iCAPS jest łatwa powtarzalność i możliwość zastosowania (możliwość wykonywania w różnych laboratoriach z konwencjonalnym oprzyrządowaniem bez dalszej optymalizacji), oszczędność czasu i niskie koszty finansowe w porównaniu z technologiami sekwencjonowania nowej generacji. Niniejszy proces nie wymaga zastosowania komercyjnych wzorców odniesienia, które są niezbędne w przypadku metod opartych na analizie białka.
[0028] Sposób według niniejszego wynalazku ma szczególne znaczenie w mapowaniu bogactwa gatunków i rzeczywistej wewnątrzgatunkowej (genetycznej) różnorodności ichtiofauny, pod względem ochrony oryginalnej puli genowej ryb w różnych krajach, oceny wysiłków związanych z wprowadzeniem i ponownym wprowadzeniem oraz jako narzędzie zapobiegania zagrożeniom związanych z importem obcych gatunków / linii ryb. Ponadto metoda jest ważna w dziedzinie genetycznego określania poszczególnych linii i ras w intensywnej hodowli pod względem zarządzania hodowlanego, w celu zachowania czystości rasy, zwiększenia i poprawy wydajności produkcji, w celu zachowania odporności na choroby i różne czynniki stresowe. Znaczny jest również obszar zapobiegania fałszowaniu jaj rybnych, paluszków, materiału do smażenia i produktów zawierających ryby, w których występują specyficzne pomyłki jeśli chodzi o jakość i cenę.
[0029] Poniższy przykład wykonania ilustruje sposób według wynalazku, bez ograniczania go w jakikolwiek sposób.
Krótki opis rysunków 21
[0030] Figura 1 - Określone regiony JGM i oznaczanie TasI z wzorami restrykcyjnymi czystych gatunków pstrągów, ich wewnątrzgatunkowych heterozygot i mieszańców międzygatunkowych.
1. Unikalny region JGM
[0031] M = Marker (155-970 pz)
1 = S. alpinus (524 pz) 2 = S. fontinalis wariant A (583 pz) 3 = S. fontinalis wariant B (589 pz) 4 = heterozygotyczny S. Fontinalis A / B (583/589 pz) 5 = hybrydowy S. alpinus / S. fontinalis wariant A (524/583 pz) 6 = hybrydowy S. alpinus/S. fontinalis wariant B (524/589 pz) 7 = kontrola negatywna
M = Marker (155-970 pz)
2. Oznaczanie TASL (test TASL)
[0032] M = Marker (155-970 pz)
8 = S. alpinus (fragment diagnostyczny 243 pz) 9 = S. fontinalis wariant A (fragment diagnostyczny 305 pz) 10 = S. fontinalis wariant B (fragment diagnostyczny 394 pz) 11 = heterozygotyczny S. Fontinalis A / B (305/394 pz) 12 = hybrydowy S. alpinus / S. fontinalis wariant A (243/305 pz) 13 = hybrydowy S. alpinus/S. fontinalis wariant B (243/394 pz) M = Marker (155-970 pz)
Przykłady
Przykład 1
Przygotowanie materiału i odczynników oraz konwencjonalna metodologia
[0033] Materiał DNA. Do weryfikacji nowej metody identyfikacji S7iCAPS w rutynowej analizie zastosowano szablony DNA uzyskane z 96 próbek pstrągów z dwóch czeskich zakładów hodowlanych pochodzących od sześciu czeskich i zagranicznych dostawców (Tabela 4). W szczególności próbki były częściami płetw trzymanych w etanolu. Jako kontrolę pozytywną zastosowano próbki pstrągów z certyfikatem od dostawcy, które zostały dodatkowo przebadane morfologicznie i genetycznie.
[0034] Pobieranie próbek. Z każdego źródła pobierano 10–55 próbek tkanek płetw do analizy PCR.
[0035] Izolacja DNA. Izolację wykonano przy użyciu zestawu ZR Genomic DNA-Tissue MiniPrep (Zymo Research, USA) 22 zgodnie z instrukcjami producenta. DNA wyizolowano z 25 mg tkanki. Stężenie i czystość matrycy DNA zmierzono za pomocą urządzenia Helios γ (Thermo Spectronic, GB).
[0036] Projektowanie starterów. Zestaw starterów dla regionu hiperzmiennego sekwencji jądrowej pierwszego intronu genu S7 (region JGM) został zaprojektowany przez program Oligo (Molecular Biology Insights, USA), Tabela 1.
[0037] System Monoplex PCR. Odczynniki do monopleksowej techniki PCR zostały zoptymalizowane, w tym warunki temperaturowe protokołu PCR. Zoptymalizowana mieszanina reakcyjna zawierała 12,5 µl PPP Master Mix (Top-Bio,
Republika Czeska; skład: Tris-HCl, (NH4)2SO4, Tween 20, MgCl2, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, polimeraza DNA Taq-Purple, stabilizatory i dodatki), 20 pmoli każdego startera SalS7F i SalS7R oraz 3 µl izolowanego DNA ogółem objętość 25 µl. Amplifikacja PCR przebiegała w termocyklerze Mastercycler pro (Eppendorf, Niemcy) w następujących warunkach: wstępna denaturacja przez 2 min w 95 ° C, następnie 30 cykli przez 30 s w 95 ° C, 45 s w 60 ° C, 1 min w 72 ° C, a na koniec końcowe wydłużenie przez 10 min w 72 ° C .
[0038] Separacja i wizualizacja fragmentów. Produkty amplifikacji PCR i produkty trawienia restrykcyjnego rozdzielono na 1,7% żelach agarozowych metodą elektroforezy poziomej, stosując bufor SB i barwienie Midori Green Advance przy 10 V / cm przez 45-50 minut. Jako standard wielkości zastosowano marker DNA 155-970 (Top-Bio, Republika Czeska). Poszczególne fragmenty wizualizowano za pomocą dokumentacji żelu i systemu analitycznego GeneGenius Match (Trigon-plus, Republika Czeska).
Przykład 2 Metoda identyfikacji
[0039] Metoda S7iCAPS. Metoda identyfikacji pstrągów S7iCAPS wykorzystuje połączony projekt „amplikon-SNP-CAPS”, tj. obecność dwóch indeli zapewniających różne długości produktów PCR regionu zmiennego pierwszego intronu, a także ukierunkowane trawienie do SNP specyficznych dla gatunku / linii. Dwa programy, CAPS Designer (http://solgenom- ics.net/tools/caps_designer/caps_input.pl) i SNP2CAPS (Thiel, T., Kota, R., Grosse, I., Stein, N., Graner, A 2004. SNP2CAPS: narzędzie analizy SNP i INDEL do opracowywania markerów CAPS. Badania kwasów nukleinowych 32 (1), e5) wykorzystano jako narzędzia do projektowania CAPS do komputerowej konwersji SNP na markery CAPS. Znaleziono 64 kandydatów CAPS, z których TasI wybrano jako najbardziej odpowiedni (Tabela 3).
[0040] Długość regionów JGM. Długości amplifikowanych produktów PCR są specyficzne dla gatunku / linii, a dla Salvelinus alpinus (Sa) wynosi 524 pz, dla linii Salvelinus fontinalis „A” (SfA) 583 pz, a dla linii Salvelinus fontinalis „B” (SfB) 589 pz . W przypadku wykrywania palii alzackiej (hybryda międzygatunkowa - Salvelinus fontinalis x Salvelinus alpinus), długości właściwe dla hybrydy typu SalsH2A i SalsH2B wynoszą odpowiednio 524/583 i 524/589 (Tabela 2).
[0041] Potwierdzający marker SNP-CAPS TasI. Produkt amplifikacji PCR jest następnie trawiony (zgodnie z instrukcjami producenta) enzymem restrykcyjnym TasI specyficznym dla gatunku / linii z miejscem restrykcyjnym „/ AATT” w regionie określonym przez parę starterów. Ten marker SNP-CAPS (test TasI) potwierdza prawidłowe określenie gatunku, a także bardziej niezawodnie rozróżnia obie linie Salvelinus fontinalis od siebie. Długość fragmentu restrykcyjnego diagnostyki Salvelinus alpinus wynosi 243 pz, linia Salvelinus fontinalis „A” 305 pz i linia „B” 394 pz (Tabela 2, Figura 1).
[0042] Bardziej czuła rozdzielczość heterozygot i mieszańców międzygatunkowych. Moc rozdzielczą testu TasI stosuje się 23 również do jednoznacznego rozdzielania wewnątrzgatunkowych heterozygot pstrąga potokowego, a także międzygatunkowych hybryd palii alzackiej. Specyficzny wzorzec restrykcyjny TasI do rozróżnienia wewnątrzgatunkowej heterozygoty A / B pstrąga potokowego wynosi 305/394, a dla międzygatunkowej hybrydy palii alzackiej typu „A” i „B”, odpowiednio 243/305 i 243/394.
[0043] Weryfikacja heterozygotycznych haplotypów jądrowych. W celu niezawodnej identyfikacji poszczególnych haplotypów S7 powstałe produkty PCR sklonowano i zsekwencjonowano. Ponadto, wszystkie heterozygotyczne genotypy zostały porównane do haplotypów homozygotycznych i potwierdzone metodą Phase wdrożoną w programie DnaSP (Librado, P., Rozas, J. 2009. DNASP v5: Oprogramowanie do kompleksowej analizy danych dotyczących polimorfizmu DNA. Bioinformatics, 25, 1451-1452).
[0044] Test międzylaboratoryjny. Wiarygodność metody S7iCAPS została przetestowana w oparciu o testy międzylaboratoryjne nieokreślonych próbek. Próbki przesłano do analizy przez klonowanie, a następnie sekwencjonowanie w laboratorium uniwersyteckim. Te same ślepe próbki analizowano przez sekwencjonowanie w komercyjnym laboratorium.
[0045] Zapobieganie zanieczyszczeniu. Metoda PCR charakteryzuje się wysoką czułością, dlatego konieczne jest przestrzeganie ścisłych zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Ekstrakcję DNA i przygotowanie mastermixu z dodatkiem matrycy rozdzielono przestrzennie. Wszystkie narzędzia i pipety zostały wysterylizowane przed użyciem w czynniku sieciującym UV BLX-254 (Vilber Lourmat, Francja), a cały materiał z tworzywa sztucznego wysterylizowano w sterylizatorze parowym Vaposteri / P (BMT, Republika Czeska). Do obsługi użyto końcówek z filtrami. Przy każdej amplifikacji zastosowano próbkę kontroli negatywnej (PCR H2O), aby wykluczyć zanieczyszczenie odczynników i tworzyw sztucznych.
Przykład 3 Weryfikacja wiarygodności metody S7iCAPS na próbkach komercyjnych
[0046] Niezawodność projektu startera. Zaprojektowane startery przetestowano pod kątem niezawodnej amplifikacji PCR poszczególnych taksonów, a także ich przydatności do analizy sekwencji. Sprawdzono laboratoryjnie, czy para starterów amplifikowała i sekwencjonowała analizowane gatunki, w tym hybrydy, prawidłowo.
[0047] Specyficzność długości regionów JGM. Przeanalizowano konkretne długości unikalnych regionów JGM badanych taksonów i wyraźnie wykazano ich charakter diagnostyczny (Rysunek 1).
[0048] Specyficzność testu TasI. Zbadano specyficzność testu TasI i warunki wykonalności zaproponowane przez producenta. Wykazano charakter diagnostyczny wzorów ograniczeń i funkcjonalność proponowanych warunków (Rysunek 1).
[0049] Wyniki badania. Metodę S7iCAPS przetestowano dla dwóch komercyjnych gospodarstw z analizą 96 próbek od różnych dostawców krajowych i zagranicznych.
[0050] Spośród 96 testowanych próbek, 42 próbki zadeklarowano jako czysty pstrąg potokowy bez dalszego podziału linii i w 35 próbkach (83%) zostało to potwierdzone. Ponadto, dokonano również szczegółowej klasyfikacji na dwie różne linie „A” i „B”. Wyróżniono linię A w 21 próbkach, linię B w 4 próbkach, a heterozygotę międzyliniową (A / B) wykryto w 10 24 próbkach. W 7 próbkach (17%) wykryto zupełnie inny gatunek pstrąga, palię alzacką, który powstaje w wyniku ukierunkowanej hybrydyzacji golca zwyczajnego z pstrągiem potokowym. Dwadzieścia próbek zgłoszono jako golca zwyczajnego z dwóch różnych źródeł, a wszystkie dwadzieścia (100%) potwierdzono jako gatunki należące do golca zwyczajnego, ale tylko z jednego źródła. Trzydzieści cztery próbki zidentyfikowano jako palię alzacką, przy czym potwierdzono 32 próbki (94%). Dodatkowo, szczegółowa klasyfikacja palii alzackiej ujawniła 22 hybrydy z udziałem pstrąga potokowego linii „A” (H2A) i 10 hybryd z udziałem pstrąga potokowego linii „B” (H2B). W dwóch próbkach (6%) wykryto zupełnie inny gatunek pstrąga, w jednym przypadku czysty golec zwyczajny a w drugim przypadku wewnątrzgatunkową heterozygotę A / B pstrąga potokowego (Tabela 5).
[0051] Wiarygodność opracowanej metody identyfikacji według wynalazku została przetestowana poprzez analizę pustych próbek przygotowanych przez autorów. Próbki referencyjne analizowano metodami klonowania i sekwencjonowania w laboratorium uniwersyteckim. Te same ślepe próbki analizowano w zagranicznym komercyjnym laboratorium metodą bezpośredniego sekwencjonowania. Uzyskane wyniki porównano z wynikami uzyskanymi przez wynalazców i nie znaleziono żadnej różnicy.
Zastosowanie przemysłowe
[0052] Metoda identyfikacji europejskich taksonów ichtiofauny jest przeznaczona do rutynowej identyfikacji genetycznej ryb słodkowodnych i ich mieszańców w materiałach biologicznych i produktach rybnych. Ważnym warunkiem udanego zastosowania jest izolacja wysokiej jakości DNA i odpowiednie leczenie wybranymi endonukleazami restrykcyjnymi zgodnie z instrukcjami producenta. Opracowana metoda S7iCAPS została przetestowana w praktyce dla próbek wymienionych rodzajów i gatunków z różnych obszarów geograficznych. Metoda obejmuje konwencjonalną metodologię PCR, która obejmuje kompozycję mastermiksu PCR z proporcją poszczególnych składników, protokołem temperatury PCR i analizą indywidualnych wzorów restrykcyjnych lub polimorfizmu długości diagnostycznych regionów JGM. Proponowana konfiguracja jest przydatna zarówno dla publicznych, jak i prywatnych laboratoriów genetycznych, instytutów badawczych, obiektów hodowli ryb (hodowla ryb, rybołówstwo itp.), władz basenów, stowarzyszeń rybackich i lokalnych organizacji, agencji ochrony przyrody i poszczególnych administracji PLA, uniwersytetów rolniczych i przyrodniczych, urzędów kontroli żywności i ceł, ministerstw zajmujące się rolnictwem i środowiskiem, muzeów narodowych itp. zarówno w Republice Czeskiej, jak i w innych krajach.
[0053] Ta metoda obejmuje metodologię S7iCAPS, która zawiera kompozycję mastermiksu PCR ze specyficznymi parami starterów i proporcją innych składników, protokołem temperatury PCR i analizą wyników gatunków / linii według określonych markerów CAPS lub unikalnych długości amplikonu, jeśli są określone. 25
Zastrzeżenia patentowe 1. Metoda identyfikacji ryb słodkowodnych w Europie w materiałach biologicznych i produktach rybnych metodą S7iCAPS, znamienna tym, że próbkę DNA z materiału biologicznego lub produktu rybnego poddaje się analizie PCR przy użyciu par starterów specyficznych dla gatunku lub grupy przedstawionych w Tabeli 1, które definiują sekwencję specyficzną dla gatunku / linii pierwszego intronu genu S7, tak zwany region diagnostyczny J. G. Mendla (JGM), przy czym regiony diagnostyczne JGM są specyficznie zdefiniowane dla każdego gatunku i mają swoją własną specyficzną długość przedstawioną w Tabeli 2, po czym na podstawie długości produktów PCR przeprowadzana jest identyfikacja gatunku lub hybrydy.
2. Sposób identyfikacji według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że próbkę DNA wprowadza się do mieszaniny PPP
Master Mix składającej się z Tris-HCl, (NH4)2SO4, Tween 20, MgCl2, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, polimerazy DNA Taq- Purple, stabilizatorów i dodatków oraz co najmniej jednej specyficznej pary starterów, gdzie wstępna denaturacja jest przeprowadzana przez 2 minuty w temperaturze 95 ° C, a następnie przez 30 cykli przez 30 s w 95 ° C, 45 s w temperaturze 60 ° C lub w temperaturze wyżarzania przedstawionej w Tabeli 1, 1 minutę w temperaturze 72 ° C, i na koniec, końcowe wydłużanie prowadzi się przez 10 minut w temperaturze 72 ° C.
3. Sposób według zastrzeżenia 1 albo 2, znamienny tym, że po analizie PCR produkty PCR są trawione endonukleazami restrykcyjnymi specyficznymi dla gatunku / linii w określonym miejscu restrykcyjnym, które znajduje się w diagnostycznym regionie JGM, w celu potwierdzenia specyficznej długości niestrawionego regionu JGM lub w celu rozróżnienia gatunków mających podobną długość regionu JGM lub różnych linii gatunków i hybryd międzygatunkowych, przy czym specyficzne endonukleazy restrykcyjne oraz miejsca restrykcyjne lub motywy dla poszczególnych gatunków są przedstawione w Tabelach 2 i 3, po czym przeprowadza się identyfikację gatunku, wewnątrzgatunkoweją heterozygoty lub międzygatunkowej bądź międzypokoleniowej hybrydy w oparciu o kombinację długości specjalnie strawionych fragmentów.
4. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, znamienny tym, że próbkę DNA otrzymuje się z próbek ze świeżych, mrożonych, utrwalonych materiałów biologicznych lub z próbek żywności, pasz i ogólnie produktów zawierających mięso rybne.
5. Zestaw identyfikacyjny do identyfikacji gatunków / linii ryb słodkowodnych w Europie sposobem określonym w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 4, znamienny tym, że zawiera on specyficzne dla gatunku pary starterów przedstawione w Tabeli 1, protokół warunków reakcji PCR obejmujący określone temperatury i czasy cyklu, opis sposobu identyfikacji i interpretacji, w tym wykaz długości JGM, wykaz specyficznych endonukleaz restrykcyjnych z listą przypisanych motywów restrykcyjnych i określonych długości strawionych fragmentów.
6. Zestaw identyfikacyjny według zastrzeżenia 5, znamienny tym, że zawiera ponadto Master Mix PPP składający się z Tris-HCl, (NH4)2SO4, Tween 20, MgCl2, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, polimerazy DNA Taq-Purple, stabilizatorów i dodatków.
7. Zestaw identyfikacyjny według zastrzeżenia 5 lub 6, znamienny tym, że zawiera ponadto endonukleazy restrykcyjne przedstawione w Tabeli 3. 26