CONTROL BIOLÓGICO EXTRACTOS ENZIMÁTICOS DE Beauveria bassiana, UNA ALTERNATIVA PARA EL CONTROL DE Metamasius spinolae (GYLLENHAL BUSK), BAJO CONDICIONES DE LABORATORIO Lluvia de Carolina Sánchez-Pérez1; Silvia Rodríguez-Navarro1; Juan Esteban Barranco-Florido2; Erika Chávez- Ibañez1; Miguel Ángel Ramos-López2. 1Departamento de Producción Agrícola y Animal. 2Departamento de Sistemas Biológicos. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco. Calzada del Hueso #1100, Colonia Villa Quietud, Delegación Coyoacán. México 04960. [email protected]; [email protected]; [email protected]. mx. RESUMEN. Se evaluó la acción de conidios y extractos enzimáticos de Beauveria bassiana individualmente y en conjunto con el fin de acelerar el proceso infectivo del B. bassiana sobre Metamasius spinolae obtenidos de Milpa Alta, D. F., bajo condiciones de laboratorio, planteándose como alternativa para el control de esta plaga en el cultivo del nopal. Se montó un bioensayo con 6 tratamientos obteniendo un 100% de mortalidad en todos los tratamientos sin existir diferencia significativa; pero al evaluar el tiempo de muerte existió diferencia significativa que muestra una aceleración de mortalidad. La propuesta de utilizar simultáneamente conidios + extractos enzimáticos se propuso debido a que probablemente acelera y facilita la degradación y penetración del tegumento del insecto. Palabras clave: extractos enzimáticos, Beauveria bassiana, Metamasius spinolae, degradación, fermentación sólida. Enzymatic extracts of Beauveria bassiana, an alternative to control Metamasius spinolae (Gyllenhal Busk) under laboratory conditions ABSTRACT. We evaluated the action of enzymatic extracts of conidia and Beauveria bassiana individually and together in order to accelerate the infective process of B. bassiana on Metamasius spinolae from Milpa Alta, D. F., under laboratory conditions, as v f h f h p ¨ p ”. A b w w h 6 m 100% m in all treatments without significant differences. However to assess the time of death, there were significant differences showing significant difference in mortality acceleration. The proposal to use simultaneously conidia + enzyme extracts was proposed because it probably accelerates and facilitates the degradation and penetration of the insect integument. Key words: enzymatic extracts, Beauveria bassiana, Metamasius spinolae, degradation, solid fermentation Introducción E “p ” (Metamasius spinolae Gyllenhal Busk) (Coleoptera: Curculionidae) se distribuye por todo el país (Mann, 1969). El daño lo causan las larvas que se alimentan del tejido interno del nopal; viven dentro de las pencas favoreciendo la entrada de patógenos a la planta y al alimentarse forman galerías en el interior de las pencas restándole estructura de soporte ocasionando su acame; adultos se alimentan de pencas tiernas (Orduño, 2009); la presencia de esta plaga disminuye la producción y reduce la calidad del cultivo (Mann, 1969; Muñiz, 1998; Mena-Covarrubias, 2004). El control biológico es una alternativa para el manejo de plagas, ya que no deja residuos en el medio ni en los cultivos (Sánchez et al., 2012); los hongos entomopatógenos (HE) son utilizados por su capacidad insecticida, pues producen la muerte en insectos por contacto (Assaf, 2007). Como es el caso de Beauveria bassiana, patógeno de distribución cosmopolita y de amplio espectro, capaz de causar epizootias (Alves et al., 2002). El proceso bajo el cual los HE infectan a su hospedero es mediante dos mecanismos uno físico, presión que ejerce el tubo germinativo hacia el interior del insecto y uno bioquímico donde segrega enzimas hidrolíticas como subtilisina Pr1 y Tripsina Pr2, quitinasas y un complejo enzimático del citocromo P450s, 273 que degradan la cutícula y proporcionar a su vez nutrientes al hongo (Monzón, 2001; Huang et al., 2004; Yang et al., 2007). Una de las ventajas de los extractos enzimáticos es la reducción del tiempo en el proceso infeccioso del hongo sobre el insecto y además de alterar la capacidad de alimentación de M. spinolae y por lo tanto la disminución de daños en el nopal (Sánchez et al., 2012). Los síntomas de los insectos infectados por HE son la pérdida de coordinación en sus movimientos, falta de movimiento y dejar de alimentarse para posteriormente ocasionar la muerte. La fermentación sólida es útil para producir enzimas con gran estabilidad; tiene como ventajas: uso de sustratos insolubles como fuentes de carbono y nitrógeno (Goettel et al., 1997); es un sistema simple; similar al ambiente natural de los hongos entomopatógenos; facilita la recuperación del extracto enzimático y la viabilidad de los conidios se incrementa al ser resistentes a los rayos UV (Rangel et al., 2008). El objetivo de presente trabajo fue evaluar la aplicación de conidios junto con extractos enzimáticos del cultivo sólido para acelerar el proceso infectivo de B. bassiana b “p ” (Metamasius spinolae) en el nopal verdura (Opuntia ficus indica Mill) provenientes de Milpa Alta, D.F. en condiciones de laboratorio. Materiales y Método Hongos entomopatógenos. Se utilizó la cepa de Beauveria bassiana donada por la Dra. Raquel Alatorre Rosas; se creció en agar dextrosa sabouraud a 25° C durante 7 días. Se colectaron las esporas con una solución de Tween 80 al 0.05 % y se conservaron a 4 ºC. La fermentación sólida se realizó en matraces Erlenmeyer de 250 ml usando como soporte bagazo de caña, un medio mineral de acuerdo con Barranco y cols. (2009) y como fuente de carbono cutícula de camarón (60 g l -1); los matraces contenían 35 g de materia húmeda, con una humedad inicial 75 %, pH 5.4 y temperatura de 25°C. Se inocularon con 1 x 107 esporas (g Peso húmedo)-1. Los extractos enzimáticos se obtuvieron después de 5 días de fermentación, pesando el contenido de cada matraz y se adicionó agua destilada en una proporción (1:1) se homogeneizó y se comprimió, se centrifugó a 10, 000 rpm durante 10 minutos, se almacenaron a 4ºC (Polanczyk et al, 2000). La obtención de conidios fue de una fermentación de 12 días con una solución de Tween 80 % ajustando a una cantidad de 1x108 conidios por mL (Barranco et al, 2009). Insectos. S “p ” b p q m b p parcelas de San Juan Tepenahuac, Milpa alta, D.F., posteriormente se llevaron al Insectario de la UAM-X, donde se pesaron, midieron y sexaron; se colocaron individualmente en vasos de plástico transparente de 265 ml de capacidad, se les alimentó con 20 g de nopal tierno, el cual se cambió cada dos días. Se aclimataron a 25°C y 65% HR durante 30 días. Bioensayo. Los insectos fueron inoculados mediante el método de inmersión durante 10 seg, para eliminar el exceso de humedad se dejaron sobre papel absorbente, cuando se secaron se metieron en vaso estéril y rotulado, con el nombre del tratamiento, repetición y fecha de inoculación (Fig. 2). Se usó un diseño completamente al azar, de 6 tratamientos con 5 repeticiones, los cuales fueron: Control negativo, extractos enzimáticos, conidios + extracto enzimático, conidios 1x108, control positivo (Bea Tron ®) y control positivo + extractos enzimático. Cada tratamiento se suspendió en una solución acuosa de 100 mL de Tween 80 al 0.05%. Manteniéndose en condiciones controladas de 25 ± 2° C, 65% ± 5% HR y fotoperiodo de 16 h luz. Análisis estadístico: Los datos obtenidos fueron analizados con un análisis de varianza de una vía y una prueba de ajuste de medias de Tukey, con el paquete estadístico SYSTAT9. 274 Resultados En el bioensayo realizado para evaluar la acción de conidios y extractos enzimáticos de B. bassiana producidos por fermentación sólida sobre M. spinolae, se tuvieron los siguientes resultados: en todos los tratamientos se obtuvo el 100% de mortalidad, excepto en el control negativo donde solo se produjo la muerte de uno de los individuos por causas no determinadas, no existiendo diferencia significativa en la mortalidad (Cuadro 1). Sin embargo al evaluar el tiempo que corresponde a la CL50 existen diferencias significativas que evidencian una aceleración de mortalidad 6.89 ± 1.69 con el tratamiento de extractos enzimáticos + conidios obtenidos de fermentación sólida, seguido por el control positivo + extractos de acuerdo con la prueba de Tukey. Los insectos muertos mostraron crecimiento del micelio posterior a ser inoculados vistos a través de un microscopio estereoscópico, en donde se observó el crecimiento del micelio en los espacios inter segmentales del insecto que facilitan la emergencia del hongo del interior del insecto muerto (Fig. 3). Cuadro 1. Porcentaje de mortalidad de insectos y valores de mortalidad evaluados en días. A y B Grupos de acuerdo a Tukey Tratamiento Mortalidad (Prom) Mortalidad (días) (A) Control negativo (Tween 80 al .05%) 20 (ND) (B) Extracto enzimático 80±20 10±1.35B (C) Extracto enzimático + Conidios 1x108 100±0 6.8±1.69A (D) Conidios 1x108 100±0 12.8±4.44B (E) Control positivo ( Bea Tron ® 100±0 13±0.41B A (F) Control positivo + Extracto enzimático 100±0 8.5±0.5 120 1a 20 1b 100 15 80 60 10 40 5 20 0 0 A B C D E F B C D E F Figura 1a y 1b. Graficas de las desviaciones estándar de mortalidad (Prom) y mortalidad en días del efecto de B. bassiana sobre M. spinolae en el cultivo del nopal Discusión Existe escasa literatura sobre la utilización de extractos enzimáticos que se obtienen en el cultivo sólido junto cuando se producen conidios a través de este sistema. La propuesta en que se utilizan simultáneamente conidios (cultivo sólido y producto comercial) + extractos enzimáticos acelera el proceso infectivo debido probablemente a que facilita la penetración de la superficie de la cutícula porque sufre un proceso de degradación que permite al conidio, el apresorio y el tubo germinativo del hongo encuentren sitios receptores específicos y la penetración mecánica y 275 enzimática. Recientemente se ha buscado estrategias que conjunten el uso de hongos entomopatógenos junto con extractos vegetales, feromonas y atrayentes (Nana et al, 2012), sin embargo cuando se utilizan extractos de Neem se ha demostrado que reducen el crecimiento de B.