UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ANÁLISE CITOGENÉTICA COMPARATIVA EM GAFANHOTOS DAS FAMÍLIAS ACRIDIDAE E ROMALEIDAE ATRAVÉS DE TÉCNICAS CONVENCIONAIS E MOLECULARES

VILMA LORETO DA SILVA

Recife, fevereiro 2005 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ANÁLISE CITOGENÉTICA COMPARATIVA EM GAFANHOTOS DAS FAMÍLIAS ACRIDIDAE E ROMALEIDAE ATRAVÉS DE TÉCNICAS CONVENCIONAIS E MOLECULARES

Doutoranda: Vilma Loreto da Silva

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração em Genética.

Orientadora: Profa. Dra. Maria José de Souza Lopes Depto. Genética, CCB/UFPE

Recife, fevereiro de 2005

AOS MEUS PAIS MARIA DO CARMO (in memorian) E BERIVALDO

E AOS MEUS IRMÃOS SÍLVIA, HUGO E HENRIQUE AGRADECIMENTOS

Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, em especial à Profa. Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho e corpo docente, pela oportunidade de realização e conclusão do curso; À PROPLAN e PROPESQ pela viabilização de transporte para a realização de coletas das espécies de gafanhotos estudadas; À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro e pela concessão de bolsa de estudo para realização do Doutorado Sandwich; À Professora Maria José de Souza Lopes, pela orientação, oportunidade de desenvolver este projeto, apoio constante, empenho, dedicação e paciência para conclusão deste trabalho; Aos Professores Juan Pedro M. Camacho, Josefa Cabrero (Pepi) e Maria Dolores López-León (Lola) da Universidade de Granada, Espanha pela orientação, excelente convívio e empenho durante todo o período do Doutorado Sandwich; Ao Prof. Carlos S. Carbonell da Universidade de Montevideo, Uruguai pela identificação taxonômica das espécies, especialmente pelos esclarecimentos sobre o gênero Rhammatocerus; Ao Prof. Marcelo Guerra, aos colegas e ex-colegas citogeneticistas do Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Botânica, em especial a Andrea Pedrosa, Ana Christina Brasileiro, Natoniel Melo e Reginaldo Carvalho pelas discussões e inúmeras contribuições a esse trabalho; À Profa. Neide Santos pela orientação no estágio à docência e arte final das ilustrações; À Profa. Aline Chaves pela valiosa ajuda na revisão do Abstract À Dra. Constância Flávia J. Ayres do Departamento de Entomologia (CpqAM-FIOCRUZ) pela disponibilização da infra-estrutura e orientação na extração de DNA; Aos Profs. José Ferreira e Tania Rieger pelo auxílio e disponibilidade para coletas; Às amigas Cirlene Maria da Silva e Francisca Tavares, técnicas do Laboratório de Citogenética Animal por todo o apoio, suporte e convivência; Às funcionárias do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, Adenilda, Jaci e Liane pelo grande apoio prestado; Aos colegas do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, em especial aos da turma 2001, por todo o empenho e companheirismo ao longo dessa jornada; Aos amigos Maria, Eli, Inma e Jesús do Grupo de Evolução em Insetos da Universidade de Granada pelo excelente convívio e apoio durante o estágio; Aos amigos, colegas e ex-colegas do Laboratório de Citoanimal da UFPE, Amaro Castro, Cecilia Lanzone, Cibele Caio, Danielle Carvalho, Ebenézer Bernardes, Eva Stadtler, Guilherme Messias, Helen Barros, Luís Henrique Silva, Marcela Maria, Mércia Maria, Merilane Calixto, Pollyanna Burégio, Rannyellen Costa e Sandra Silva por todo apoio, convívio, auxílio nas coletas e sobretudo a amizade; Às amigas de hoje e de sempre Marília, Marise, Neide e Rita por todo o estímulo, suporte e apoio profissional e pessoal fundamentais para a conclusão desta etapa; A todos que direta ou indiretamente ajudaram na realização desse trabalho. SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS RESUMO ABSTRACT I. INTRODUÇÃO 14 II. REVISÃO DA LITERATURA 17 II.1 CITOGENÉTICA DE GOMPHOCERINAE 18 II.2 CITOGENÉTICA DE ROMALEIDAE 25 II.3 CROMOSSOMOS B EM GAFANHOTOS 29 II.4 HIBRIDIZAÇÃO in situ FLUORESCENTE (FISH) EM INSETOS 36 III. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 41 IV. CAPÍTULO 1: Chromosome differences between the grasshopper species 50 Chromacris nuptialis and C. speciosa (Romaleidae): constitutive heterochromatin variability and rDNA sites Abstract 51 Introduction 52 Material and methods 53

C-banding and CMA3/DA/DAPI staining 54

Silver nitrate staining (AgNO3) and fluorescence in situ hybridization (FISH) 54 Results 55 Discussion 56 Acknowledgements 59 References 60 V. CAPÍTULO 2: Cariótipos e análise comparativa de sítios de DNAr em cinco 67 espécies de gafanhotos gonfoceríneos neotropicais Resumo 68 Introdução 68 Material e Métodos 70 Resultados 72 Discussão 73 Agradecimentos 75 Referências 76 VI. CAPÍTULO 3: Provável origem autossômica para macro - cromossomos B em 81 duas espécies de gafanhotos Resumo 82 Introdução 82 Material e Métodos 84 Hibridização in situ fluorescente (FISH) para DNAr 45S e 5S 85 Resultados 86 O cromossomo B de Rhammatocerus brasiliensis 86 O cromossomo B de Xyleus angulatus 87 Discussão 88 O cromossomo B de Rhammatocerus brasiliensis e a sua provável origem 88 O cromossomo B de Xyleus angulatus e a sua provável origem 91 Agradecimentos 92 Referências 93 VII. CONCLUSÕES GERAIS 100 VIII. ANEXOS 103 LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1 Pág. Figure 1 Meiotic cells of Chromacris nuptialis (a, b, d, f) and C. speciosa (c, 63 e). (a) Pachytene, (b) Diplotene, (c) Metaphase I, (d) Anaphase I, (e) Metaphase II with 11 chromosomes, and (f) Anaphase II with 12 chromosomes. Note the X chromosome heteropycnotic positive (a, b) and negative (c). Bar = 10 μm.

Figure 2 Irregularities in the meiosis I of C. nuptialis. (a, b) Anaphase 64 showing the bridge formation among homologous chromatids of

bivalent L2. Note in (b) the terminal block of CH in L2 (arrow). (c) and (d) Telophase showing the delayed pair and the union among chromatids resulting in fragments. Bar = 10 μm. Figure 3 C-banding pattern in C. nuptialis (a) and C. speciosa (b, c). Note the 65

CH blocks on the small pairs and in L23 . CMA /DA/DAPI staining of diplotene cells from C. nuptialis (d, e) and C. speciosa (f, g). The + arrows indicate the CMA3 blocks. Bar = 10 μm.

Figure 4 Identification of nucleolar organizer regions (NORs) and rDNA sites 66 in C. nuptialis and C. speciosa by silver nitrate staining (a, c) and

FISH (b, d) respectively. The arrows indicate the M6 pair with NORs in the pericentromeric region of C. nuptialis (a, b) and in the proximal region of C. speciosa (c, d). Bar = 10 μm.

CAPÍTULO 2 Figura 1 Coloração convencional em células meióticas de Rhammatocerus 79 brasiliensis (a-b) e Amblytropidia sp. (c-d). (a) diplóteno, (b) metáfase II com 11 cromossomos, (c) diplóteno, o M representa o cromossomo megamérico e (d) metáfase I. Barra = 10Pm.

Figura 2 Coloração com nitrato de prata (a,c,e) e FISH com sonda de DNAr 45S 80 (b,d,f-h). (a-b) Paquíteno e diplóteno de R. brasiliensis, (c-d) Paquíteno e diplóteno em R. palustris, (e-f) Paquíteno e metáfase I de Amblytropidia sp., o M representa o megamérico, (g-h) Diplóteno e Diacinese de R. brunneri e R. pictus. As setas indicam as RONs e os sítios de DNAr. Barra = 10 Pm.

CAPÍTULO 3 Fig.1 96 Comportamento meiótico do cromossomo B de Rhammatocerus brasiliensis (a-d) e Xyleus angulatus (e-f). Note em (b) o gap no cromossomo B (seta) em (c) a associação ponta-a-ponta e em (e) lado-a-lado entre o B e o X. Diplótenos (a, b, e), diacinese em c e metáfase I (d, f). Barra = 10Pm.

Fig.2 97 Fig.2 Padrão de bandeamento C (a, c-e) e CMA3 (b, f) no cariótipo de indivíduos 1B de R. brasiliensis (a-b) e de X. angulatus (c, d, f). Em (e) metáfase mitótica de uma fêmea 2B de X. angulatus. Note em (d) os três pares com segmentos extras hetrocromáticos (setas). Paquíteno em (f), diplótenos (a, d), metáfase II com 13 cromossomos em (b) e metáfase espermatogonial em (c). Barra = 10 Pm.

Fig.3 98 Hibridização in situ fluorescente com sondas de DNAr 45S (a) e (d) e 5S (b-c) de indivíduos 1B de R. brasiliensis (a-c) e X. angulatus (d). Note em (a) e (d) ausência de sinais no B e em (b-c) os pequenos sinais 5S no B de R. brasiliensis. Barra = 10 Pm. LISTA DE TABELAS

II. Revisão da Literatura Pág. Tabela 1 Número cromossômico, mecanismo de determinação do 19 sexo e morfologia cromossômica em gafanhotos representantes de Gomphocerinae da Região Neotropical.

Tabela 2 20 Número cromossômico, mecanismo de determinação do sexo e morfologia cromossômica em gafanhotos representantes da subfamília Gomphocerinae das Regiões Paleártica e Neártica.

Tabela 3 28 Número cromossômico, mecanismo de determinação do sexo e morfologia cromossômica em gafanhotos representantes da família Romaleidae.

Tabela 4 29 Padrão de bandeamento C descrito em oito espécies de gafanhotos representantes da família Romaleidae.

CAPÍTULO 2 Tabela 1 Localidades e número de indivíduos de Rhammatocerus 71 brasiliensis coletados no Estado de Pernambuco, Brasil.

CAPÍTULO 3 Tabela 1 Amplitude da distribuição e freqüência de cromossomo B 99 em Rhammatocerus brasiliensis

Tabela 2 99 Localização das seqüências de DNAr 45S e 5S no cariótipo de Rhammatocerus brasiliensis. RESUMO

Uma análise citogenética comparativa foi realizada entre as espécies de romaleídeos Chromacris nuptialis e C. speciosa buscando detectar possíveis marcadores cromossômicos através de bandeamento C, coloração com nitrato de prata, fluorocromos base-específicos

(CMA3 e DAPI) e FISH com sonda de DNAr 45S. Ambas as espécies têm o mesmo cariótipo 2n=23,X0 e cromossomos acrocêntricos. Diferenças foram observadas com relação à localização e quantidade de heterocromatina constitutiva (HC) e na localização das regiões organizadoras de nucléolos (RONs). Chromacris speciosa tem maior quantidade de HC estando os blocos situados nas regiões pericentroméricas, teloméricas e intersticiais. O único par de RONs nessa espécie está na região proximal do M6. Por sua vez, C. nuptialis tem pouca HC com pequenos blocos praticamente restritos as regiões pericentroméricas e a RON está situada na região pericentromérica do M6. Alguns indivíduos desta última espécie mostraram irregularidades meióticas (retardo anafásico e formação de pontes) envolvendo o bivalente G2 . O uso dos fluorocromos base-específicos

CMA3 e DAPI revelou padrões diferenciais com relação à composição de bases da HC nas espécies. Análise comparativa também foi realizada nas cinco espécies de gonfoceríneos (Rhammatocerus brasiliensis, R. brunneri, R. palustris, R. pictus e Amblytropidia sp.). Estas espécies apresentaram cariótipo do tipo 2n=23,X0 e cromossomos acro-telocêntricos. Adicionalmente, a análise das RONs através da coloração com nitrato de prata e FISH com sonda de DNAr 45S revelou o mesmo par (P9 ) como portador de RONs. Entretanto, R. brasiliensis apresentou múltiplas seqüências de DNAr 45S localizadas na região pericentromérica do M46 , M e P 9 . A análise do cromossomo B em R. brasiliensis e no romaleídeo Xyleus angulatus permitiu identificar vários aspectos com relação ao tamanho, picnose e comportamento meiótico desses elementos extras, assim como sugerir uma provável origem autossômica para o surgimento desses cromossomos no cariótipo das espécies com base no padrão de HC e localização de genes de DNAr 45S e 5S. Palavras-chave: cariótipo, FISH, gafanhotos, heterocromatina e-mail: [email protected] ABSTRACT

A comparative cytogenetic analysis was performed between the romaleid species Chromacris nuptialis and C. speciosa in order to detect possible chromosomic markers through C banding, silver nitrate staining, base-especific fluorochromes (CMA3 and DAPI) and FISH using a 45S rDNA probe. Both species have the same karyotype number, 2n=23,X0 and acrocentric chromosomes. Differences were observed in location and amount of constitutive heterochromatin (CH) and nucleolar organizer regions (NORs) location. Chromacris speciosa presents a high CH amount with the blocks located in pericentromeric, telomeric and intersticial regions. The single NORs pair in this species was in the proximal region of M6 . On the order hand, C. nuptialis has few CH, with small blocks, almost restricted to the pericentromeric regions and the NORs were observed in the pericentromeric region of M6 . Some individuals from that species showed meiotic irregularities (anaphasic delay and bridges) involving the L2 bivalent. The use of base- especific fluorochromes CMA3 and DAPI revealed diferencial patterns in terms of CH base composition within the species. Comparative analysis was also performed in five gonphocerine species (Rhammatocerus brasiliensis, R. brunneri, R. palustris, R. pictus e Amblytropidia sp.). These species showed a karyotype 2n=23,X0 and acro-telocentric chromosomes. Adicionally, the analysis of NORs by silver nitrate staining and FISH with a

45S rDNA probe revealed the same pair (S9 ) as a carrier. However, R. brasiliensis showed

45S rDNA multiple sequences located in the pericentromeric regions of M46 , M and S 9 . The analysis of B chromosome polimorfism in R. brasiliensis and in the romaleid Xyleus angulatus allowed us to identify some aspects about size, picnosis and meiotic behavior in these extra elements, as well as to suggest a probable autosomic origin for these chromosomes in the karyotype of the species based in CH pattern and 45S and 5S rDNA genes location.

Key words: karyotype, FISH, grasshoppers, heterochromatin e-mail: [email protected] Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

I. INTRODUÇÃO

14 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

I. INTRODUÇÃO

A fauna de gafanhotos está organizada taxonomicamente em oito famílias: Eumastacidae, Pyrgomorphidae, Acrididiae, Romaleidae, Proscopiidae, Tristiridae, Ommexechidae e Paulinidae, sendo as quatro últimas exclusivamente neotropicais. Romaleidae, entretanto, apesar de ser predominantemente neotropical possui alguns gêneros (Brachystola, Dracotettix, Litoscircus, Phrynotettix, Romalea, Taeniopoda e Tytthotyle) de ocorrência na Região Neártica. Por outro lado, Acrididae também está representada por grande número de gêneros, compreendendo 10 subfamílias, entre estas Gomphocerinae que tem distribuição mundial (Amedegnato, 1974; Carbonell, 1977). Os romaleídeos representam um grupo particular com relação aos aspectos morfológicos (coloração do corpo, patas e formato do pronoto) e pela ocorrência em distintos habitats (matas, campos e caatinga) (Kevan, 1982). Por sua vez, os gonfoceríneos são muito comuns em certas regiões da América Tropical e Subtropical ocorrendo em vegetações abertas como campos e pradarias. Poucas espécies, como as do gênero Amblytropidia, ocorrem em ambientes de mata. Para a região neotropical destacam-se os gêneros Amblytropidia e Rhammatocerus como os mais representativos (Carbonell, 1995). Estudos citogenéticos em Romaleidae estão amplamente concentrados em descrições cariotípicas. As espécies desse grupo caracterizam-se por apresentarem cariótipos conservados do tipo 2n=23,X0, 2n=24,XX e morfologia cromossômica acro- telocêntrica. Os poucos casos de rearranjos cromossômicos descritos envolvem fusão autossomo-autossomo (Diponthus dispar, D. electus e D. maculiferus) com redução do número diplóide para 2n=21,X0, fusão X-autossomo (Diponthus communis, Xyleus laevipes e Zoniopoda iheringi) resultando em cariótipos 2n=22,XY e inversão pericêntrica no par M8 de Xestotrachelus robustus (Mesa et al., 1982; Souza et al., 2003). Nas poucas espécies em que técnicas de coloração diferencial foram utilizadas a análise das regiões heterocromáticas e de RONs mostraram-se úteis para comparações interespecíficas. Os romaleídeos são altamente variáveis quanto à localização e

15 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... quantidade de blocos de heterocromatina constitutiva (HC) sendo estes blocos + predominantemente ricos em GC (CMA3 ) (Rocha et al. 1997; Pereira e Souza, 2000; Souza et al., 1998; 2003). A localização de RONs é variável, sendo um par de sítios pericentroméricos por genoma a condição mais freqüente (Bione 1996; Rocha et al., 1997; Pereira e Souza, 2000; Souza et al., 2003). Gonfoceríneos neotropicais compreendem um grupo pouco estudado do ponto de vista citogenético. As únicas análises realizadas também descrevem o número cromossômico e a ocorrência de polimorfismos para cromossomos B em vários representantes. O número básico para o grupo é 2n=23,X0, 2n=24,XX com cromossomos acro-telocêntricos. Apenas Scyllina signatipennis apresentou rearranjos do tipo fusão X-autossomo resultando em cariótipo 2n=22,XY (Mesa et al., 1982). Polimorfismos para cromossomos B parecem representar o principal aspecto de variabilidade em algumas espécies. Esses elementos extras foram descritos em Euplectrotettix shultzi e E. conspersus (Vilardi, 1986a), Amblytropidia australis (Remis, 1989), Scyllina signatipennis (Bidau, 1984) e Sinipta dalmani (Colombo e Remis, 1997). O objetivo deste trabalho foi realizar uma análise citogenética comparativa entre os gafanhotos Chromacris nuptialis e C. speciosa (Romaleidae- Romaleinae) através de diferentes técnicas de bandeamento procurando identificar possíveis marcadores cromossômicos. Adicionalmente, cinco espécies de gomphocerinae neotropicais (Rhammatocerus brasiliensis, R. brunneri, R. palustris, R. pictus e Amblytropidia sp.) foram comparadas a partir da caracterização cromossômica visando iniciar uma discussão evolutiva no grupo à luz de estudos citogenéticos realizados em gonfoceríneos paleárticos. Além disso, cromossomos B detectados em Rhammatocerus brasiliensis e Xyleus angulatus (Romaleidae- Romaleinae) foram caracterizados e a origem desses cromossomos extras foi proposta a partir de análise convencional, bandeamento C e FISH com sonda de DNAr.

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II. REVISÃO DA LITERATURA

17 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

II. REVISÃO DA LITERATURA

II.1 CITOGENÉTICA DE GOMPHOCERINAE

A subfamília Gomphocerinae (Acrididae) apresenta distribuição mundial, contudo este grupo ainda permanece pouco estudado do ponto de vista citogenético, especialmente as espécies que ocorrem na Região Neotropical. Nesse último caso, dentre as espécies estudadas destaca-se a descrição cariotípica e a análise de alguns rearranjos cromossômicos pela coloração convencional. Para a Região Neotropical apenas os trabalhos de Mesa et al. (1982), Vilardi (1986a) e Remis (1993) descrevem cariótipos de gonfoceríneos. No total trinta e seis espécies foram descritas e uma grande uniformidade cariotípica (2n=23,24, mecanismo sexual XO:XX, cromossomos acro- telocêntricos) foi observada (Tabela 1). Apenas Scyllina signatipennis mostrou polimorfismo para uma fusão X-autossomo, que resultou em cariótipo 2n=22 e mecanismo sexual XY:XX. Uma situação particular ocorreu em Sinipta dalmani. Esta espécie foi descrita inicialmente com 2n=23,24 X0:XX (Mesa et al., 1982). Contudo, Remis (1993) ao analisar populações naturais desse gafanhoto do Parque El Palmar (Argentina) observou fusão cêntrica entre um cromossomo do quinto par e o X determinando a formação de mecanismo neo XY nesta espécie. De acordo com alguns autores, como Santos et al. (1983), Cabrero e Camacho (1986a, b) e Bugrov (1996), foram analisadas até o momento noventa espécies e duas subespécies de gonfoceríneos da Região Paleártica com seus respectivos números diplóides e mecanismos sexuais (Tabela 2). Desse total, trinta e uma espécies (34,44%) apresentaram cariótipo com 2n=23,24 X0:XX, considerado a condição básica para Acridoidea. Contudo, cinqüenta e quatro espécies e duas subespécies (60%) apresentaram cariótipos derivados do tipo 2n=17,18 X0:XX, sendo três pares

(principalmente G1-G3 ) com dois braços cromossômicos originados a partir de rearranjos do tipo fusões cêntricas e translocações Robertsonianas. No gênero Chorthippus, por exemplo, das vinte e quatro espécies estudadas, vinte e duas

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apresentaram número diplóide de 2n=17,X0, enquanto, Ch. Schimidti apresentou

cariótipo 2n=23,X0 e Ch. hammarstraemi tem 2n=21,X0 com o par G1 mostrando morfologia metacêntrica. As espécies Eremippus mistshenkoi e E. sobolevi também apresentaram outros rearranjos cromossômicos resultando em cariótipos com 2n=19,20

X0:XX com os pares G12 e G submetacêntricos na primeira espécie e G 128 , G e P submetacêntricos na segunda. No que se refere ao mecanismo de determinação sexual, oitenta e oito espécies mostraram o tipo X0:XX. Apenas Mizonocara uravovi e Stenobothrus eurasius apresentaram o mecanismo neo-XY, sendo que na primeira espécie ocorreu redução do número cromossômico para 2n=22 e na segunda para 2n=16, com o cromossomo neo X mostrando dois braços.

Tabela 1. Número cromossômico, mecanismo de determinação do sexo e morfologia cromossômica em gafanhotos representantes de Gomphocerinae da Região Neotropical

Espécie N0 diplóide Mecanismo Sexual Morfologia Cromossômica Referência(s)

Amblytropidia australis 23,24 X0:XX Acro-telocêntricos 1 Apolobamba n.sp. pulchra 23,24 X0:XX “ 1 Dichromorpha australis 23,24 X0:XX “ 1 D. australis 23,24 X0:XX “ 1 Euplectrotettix conspersus 23,24 X0:XX “ 3 E. shultzi 23,24 X0:XX Acrocêntricos 3 Fenestra bohlsii 23,24 X0:XX “ 1 Isonyx paraguayensis 23,24 X0:XX Acro-telocêntricos 1 Isonyx n.sp. N01 23,24 X0:XX “ 1 Laplatacris dispar 23,24 X0:XX “ 1 Laplatacris n.sp. N01 23,24 X0:XX “ 1 Meloscirtus montanus 23,24 X0:XX “ 1 Meloscirtus n.sp. N01 23,24 X0:XX “ 1 Notopomala glaucipes 23,24 X0:XX “ 1 Orphulella concinnula 23,24 X0:XX “ 1 O. punctata 23,24 X0:XX “ 1 Orphulella sp. 23,24 X0:XX “ 1 Orphulina pulchella 23,24 X0:XX “ 1 Parapellopedon instabilis 23,24 X0:XX “ 1 Parapellopedon sp.(obscurum) 23,24 X0:XX “ 1 Peruvia nigromarginata 23,24 X0:XX “ 1 Scyllina humilis 23,24 X0:XX “ 1 S. signatipennis 22 XY:XX “ 1

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Continuação da Tabela 1... S. sp. 23,24 X0:XX “ 1 Scyllinops brunneri 23,24 X0:XX “ 1 S. pallida 23,24 X0:XX “ 1 Scyllinops n.sp. N01 23,24 X0:XX “ 1 Scyllinops n.sp. N02 23,24 X0:XX “ 1 Silvitettix concolor 23,24 X0:XX “ 1 Sinipta acuta 23,24 X0:XX “ 1 S. dalmani 23,24 X0:XX “ 1e 2 22 neoXY:XX acro, X meta S. maldonadoi 23,24 X0:XX Acro-telocêntricos 1 Staurorhectus longicornis 23,24 X0:XX “ 1 Stereotettix n.sp. N01 23,24 X0:XX “ 1 Gen. Nov. Staurorhectus n.sp. N01 23,24 X0:XX “ 1 Gen Nov. Orphulella n.sp. N01 23,24 X0:XX “ 1

Referências: 1-Mesa et al. (1982); 2-Remis (1993) e 3-Vilardi (1986a)

Tabela 2. Número cromossômico, mecanismo de determinação do sexo e morfologia cromossômica em gafanhotos representantes da subfamília Gomphocerinae das Regiões Paleártica e Neártica

Espécie N0 diplóide Mecanismo sexual Morfologia cromossômica. Referência(s) Aeropedellus variegatus 23,24 X0:XX Acrocêntricos 5 A. baliolus 23,24 X0:XX acro 5 Aeropus sibiricus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 Arcyptera fusca 23,24 X0:XX acro 2 e 5 A.microptera 23,24 X0:XX acro 1 A. tornosi 23,24 X0:XX acro 2 e 12 Brachycrotaphus tryxalicerus 23,24 X0:XX acro 12 Chorthippus albomarginatus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 Ch. angulatus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 Ch. apicalis 17,18 X0:XX acro, G13 -G meta 6, 7 e 12 Ch. biguttulus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 e 12 Ch. binotatus 17,18 X0:XX acro, G-G13 meta 6, 7 e 12 Ch. brunneus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 6 e 7 Ch. dichrous 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 Ch. dorsatus 17,18 X0:XX acro, G-G13 meta 6 e 7 Ch. falllax 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 Ch. ferganensis 17,18 X0:XX acro, G-G13 meta 5 Ch. hammarstroemi 21,22 X0:XX acro, G1 meta 5 Ch. intermedius 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 Ch. jacobsi 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 Ch. jucundus 17,18 X0:XX - 5, 6, 7 e 12 Ch. longicornis 17,18 X0:XX acro, 3 pares submeta 10 Ch. loratus 17,18 X0:XX acro, G13 -G meta 5 Ch. macrocerus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 Ch. montanus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5

20 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

Continuação da Tabela 2... Ch. nevadensis 17,18 X0:XX acro, G-G13 meta 6 e 7 Ch. parallelus erythropus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 submeta 3 e 9 Ch. parallelus parallelus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 submeta 3 e 9 Ch. saxatilis 17,18 X0:XX acro,G13 -G meta 5 Ch. schmidti 23,24 X0:XX acro 5 Ch. vagans 17,18 X0:XX acro,G1-G3 meta 6, 7 e 12 Ch. vicinus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 Dashyppus barbipes 23,24 X0:XX acro 5 Dociostaurus brevicollis 23,24 X0:XX acro 5 D. crassiusculus 23,24 X0:XX acro 12 D. genei 23,24 X0:XX - 5, 6, 7, 11 e 12 D. hispanicus 23,24 X0:XX acro 12 D. jagoi 23,24 X0:XX acro 11 D. kraussi 23,24 X0:XX acro 5 D. maroccanus 23,24 X0:XX acro 5 e 12 D. plotnicovi 23,24 X0:XX acro 5 D. tartarus 23,24 X0:XX acro 5 Eclipophleps glacialis 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta e M46 , M e X 4 submeta Eremippus comatus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 submeta 5 E. foveolatus 17,18 X0:XX acro, G1-G37 submeta e P meta 5 E. miramae 17,18 X0:XX acro, G1-G3 submeta e 5 P7 meta E. mistshenkoi 19,20 X0:XX acro, G-G12 submeta 5 E. onerosus 17,18 X0:XX acro, G1 -G3 submeta 5 E. simplex 17,18 X0:XX acro, G1-G3 submeta 5 E. sobolevi 19,20 X0:XX acro, G1-G2 submeta e P8 meta 5 Euchorthippus albolineatus 17,18 X0:XX acro, 3 pares submeta 12 E. chopardi 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 6 e 7 E. pulvinatus 17,18 X0:XX acro, G13 -G meta 5, 6, 7 e 12 E. unicolor 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 Gomphocerus rufus 17,18 X0:XX G13 -G meta 5 G. sibiricus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 submeta 8 Mesasippus kozhevnikovi 23,24 X0:XX acro 5 M. tarbagataicus 23,24 X0:XX acro 5 Mizonocara kusnezovae 23,24 X0:XX acro 5 M. saxinae 23,24 X0:XX acro 5 M. uvarovi 22 neo XY:XX acro, neo-X meta 5 Myrmeleotettix maculatus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 e 12 M. pallidus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 M. palpalis 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 Notostaurus albicornis 23,24 X0:XX acro 5 N. popovi 23,24 X0:XX acro 5 Omocestus bolivari 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 6, 7 e 12 O. haemorrhoidalis 17,18 X0:XX acro, G-G13 meta 5 O. llorenteae 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 6 e 7 O. minutissimus 17,18 X0:XX acro, 3 pares submeta 12 O. panteli 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 e 12 O. petraus 17,18 X0:XX acro,G13 -G meta 6 e 7 O. raymondi 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 O. viridulus 17,18 X0:XX acro, G13 -G meta 5 Pararcyptera microptera 23,24 X0:XX acro 5 Pezohippus callosus 23,24 X0:XX acro 5 Ramburiella bolivari 23,24 X0:XX acro 5 R. foveolata 23,24 X0:XX acro 5

21 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

Continuação da Tabela 2... R. hispanica 23,24 X0:XX acro 6, 7 e 12 R. turcomana 23,24 X0:XX acro 5 Stauroderus scalaris 17,18 X0:XX acro, G-G13 meta 5 , 6 e 7 Stenobothrus carbonarius 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 S. eurasius 16 neoXY:XX acro, G1-G3 e neo-X submeta 5 S. festivus 17,18 X0:XX acro,G1-G3 meta 6, 7 e 12 S. fisheri 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 S. grammicus 17,18 X0:XX acro, G-G13 meta 6 e 7 S. lineatus 17,18 X0:XX acro, G1-G3 meta 5 S. nevskii 17,18 X0:XX acro, G-G13 meta 5 S. stigmaticus 17,18 X0:XX acro, 3 pares submeta 12 Truxalis eximia 23,24 X0:XX acro 5 T. nasuta 23,24 X0:XX acro 6 e 7 Referências: 1-Bella et al. (1990); 2-Bella e Gosálvez (1991); 3- Bella et al. (1993); 4-Bugrov (1994); 5- Bugrov (1996); 6-Cabrero e Camacho (1986a); 7-Cabrero e Camacho (1986b); 8- Gosálvez et al. (1982); 9- Gosálvez et al. (1988); 10-Moens (1978); 11-Rodríguez-Iñigo et al. (1993) e 12-Santos et al. (1983). acro= acrocêntrico; submeta= submetacêntrico; meta= metacêntrico.

Informações citogenéticas obtidas com o uso de técnicas de coloração diferencial (coloração com nitrato de prata, bandeamento C e uso de fluorocromos base- específicos) em gonfoceríneos estão restritas aos estudos de espécies provenientes da Região Paleártica, não sendo conhecidos relatos para a Região Neotropical. Pela coloração com AgNO3, Cabrero e Camacho (1986b) localizaram as regiões organizadoras de nucléolos (RONs) em vinte representantes deste grupo. As RONs foram preferencialmente encontradas nos pares G23 , G e no X (17 espécies), nos bivalentes médios M46 -M e no P 8 em algumas espécies. A localização cromossômica ocorreu principalmente em sítios intersticiais, no caso de RONs com atividade primária, e em sítios paracentroméricos nas RONs secundárias. Por esse estudo, também foi possível constatar que dez espécies tinham as RONs restritas a autossomos, como por exemplo Chorthippus binotatus e Ch. vagans, quatro apresentaram RONs restritas ao cromossomo X como Omocestus raymondi e as outras seis em autossomos e no X.

Outra espécie estudada utilizando a coloração com AgNO3 foi Gomphocerus sibiricus, que mostrou RONs nos bivalentes M45 , M e no X (Gosálvez et al., 1982). Padrões de distribuição de heterocromatina constitutiva (HC) analisados por bandeamento C foram descritos por Cabrero e Camacho (1986a) em vinte espécies de gonfoceríneos coletados em populações naturais da Espanha. Nesse estudo, as bandas C paracentroméricas estavam presentes em todos os cromossomos de todas as espécies.

22 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

Além disso, bandas C intersticiais e distais (menos freqüentes) ocorreram em dois pares cromossômicos diferentes dentro do mesmo complemento. Comparações dos padrões de bandas C revelaram diferenças entre algumas espécies, inclusive entre aquelas taxonomicamente relacionadas. Polimorfismos para quantidade e distribuição de HC foram observados em diferentes populações do gafanhoto Chorthippus albomarginatus. Exemplares dessa espécie coletados na Polônia foram caracterizados por apresentar grandes blocos de HC na região paracentromérica e uma freqüência maior de blocos distais quando comparado com populações Asiáticas (Gusachenko et al., 1992). Grande variabilidade da HC também foi observada quando oito diferentes populações de Euchorthippus pulvinatus gallicus (Santos e Giráldez, 1982) foram analisadas. O bandeamento C revelou quatro tipos de padrões diferentes do par M67, três do M e dois do M 8 levando-se em conta o tamanho de blocos e a localização da HC. Tem sido constatado que algumas vezes polimorfismos para bandas C podem estar associados a algum tipo de rearranjo cromossômico. Em Eclipophleps glacialis, o par M4 e o X apresentaram, além da banda C paracentromérica, todo o braço curto heterocromático. Foi sugerido que essa condição em E. glacialis teria surgido pela combinação de inversões pericêntricas e heterocromatinização das regiões teloméricas do par M4 e do X (Bugrov, 1994). Por outro lado, em Gomphocerus sibiricus uma translocação heterozigota envolvendo as regiões centroméricas dos pares G23 e G não alterou o padrão de distribuição de HC, restrito à região centromérica, nessa espécie (Gosálvez et al., 1982). Em Gomphocerinae a ocorrência de polimorfismos da HC na forma de segmentos extras é bastante freqüente. Esses segmentos têm sido observados nas espécies Chorthippus binotatus (Navas-Castillo et al., 1987), Truxalis nasuta (Navas- Castillo et al., 1986), Stenobothrus festivus (Del Cerro e Santos, 1997), Euchorthippus pulvinatus, Omocestus raymondi, Chorthippus apicalis, Ch. vagans e Ch. brunneus (Camacho e Cabrero, 1987). Em Dociostaurus genei segmentos extras heterocromáticos distais foram descritos para sete dos onze pares cromossômicos do complemento (Rodríguez-Iñigo et al., 1993). Um caso particular de segmento extra ocorre em

23 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

Omocestus bolivari e Chorthippus binotatus. Nessas espécies, o segmento está localizado distalmente no par M6, sendo de natureza eucromática (Camacho et al., 1984; Camacho e Cabrero, 1987). De forma geral, os segmentos extras podem influenciar a alteração da freqüência média e redistribuição de quiasmas por célula (Navas-Castillo et al., 1987), mas em Chothippus binotatus sua ocorrência também tem efeito sobre a atividade das regiões organizadoras de nucléolos (Cabrero et al., 1986). Dociostaurus jagoi e D. genei são duas espécies de gonfoceríneos paleárticos que mostram grandes diferenças quanto ao conteúdo de heterocromatina e localização de RONs. Em D. jagoi os remanescentes nucleolares, visualizados com AgNO3 , estão associados à região intersticial do cromossomo G1 e centromérica de um par pequeno, enquanto em D. genei os sítios de RONs estão na região centromérica de dois bivalentes pequenos. As regiões de heterocromatina constitutiva centromérica, de ambas as espécies, foram diferenciadas quanto ao conteúdo de pares de base AT ou GC quando submetidas à tríplice coloração CMA33 /DA/DAPI. Nenhuma banda brilhante CMA ou DAPI foi vista nos sítios de HC em D. jagoi, contudo a HC centromérica em D. genei ++ mostrou composição complexa com blocos DAPI justapostos a bandas CMA3 (Rodríguez-Iñigo et al., 1993). Por outro lado, grandes semelhanças cariotípicas foram observadas por Gosálvez et al. (1988) e Bella et al. (1993) em uma zona híbrida entre Chorthippus parallelus parallelus e C. p. erythropus. Padrões de bandas C nessas subespécies foram evidenciados na região pericentromérica de todos os cromossomos, além de sítios terminais (G2, G347 , M -M , P834 e X) e intersticiais nos bivalentes G , M e no X. Toda a heterocromatina constitutiva do genoma de ambas as subespécies foi corada pelo CMA3 sendo, portanto, rica em pares de bases GC. A principal diferença entre as subespécies foi a presença de uma RON ativa na posição distal do cromossomo X de C. p. parallelus, enquanto em C. p. erythropus a RON está localizada na região intersticial do + X. Para ambas subespécies as RONs se mostraram CMA3 . Diferentemente do que ocorre para outras espécies do gênero Chorthippus, C. brunneus e C. jacobsi não são distinguidas com base nas características cariotípicas

24 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... como padrões de bandeamento C, localização de RONs ativas e composição da heterocromatina, obtidos pelo bandeamento C, coloração com nitrato de prata e flurocromos base-específicos. Contudo, alguma diferenciação entre as espécies foi obtida usando hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNAr. Indivíduos de C. brunneus mostraram seqüências de DNAr adicional no cromossomo X que não foram observadas em nenhum indivíduo de C. jacobsi (Bridle et al., 2002). Mudanças na estrutura da cromatina, produzidas pelo bandeamento C, levaram a modificações na capacidade de ligação dos fluorocromos CMA3 , Hoescht 33258 e DAPI nos cromossomos de Arcyptera fusca e A. tornosi. Essas alterações permitiram discriminar regiões aparentemente homogêneas para o bandeamento C. A resposta positiva para o CMA3 após o pré-tratamento para o bandeamento C, em regiões que não respondiam positivamente ao corante seria produzida pela retirada de proteínas e exposição dos pares de base GC, presentes no segmento, ao CMA3 (Bella e Gosálvez, 1991). Acridina Orange (AO) é um corante fluorescente que tem sido usado para diferenciar regiões heterocromáticas. Em Arcyptera fusca o bandeamento C não discriminou entre regiões centroméricas e teloméricas, todavia depois de pré-tratamento para banda C e coloração com AO foi possível observar uma clara diferenciação entre as mesmas (Bella et al., 1986). Material de Chorthippus parallelus parallelus e Ch. p. erythropus tratado para o bandeamento C e corado com AO mostrou diferenciação nas bandas C positivas que possuíam sítios de DNAr com uma coloração verde bem mais brilhante em contraste com a fluorescência verde homogênea visualizada nas demais regiões (Gosálvez et al., 1988).

II.2 CITOGENÉTICA DE ROMALEIDAE

Romaleídeos são gafanhotos predominantemente neotropicais e assim como os acridídeos se caracterizam pela conservação cariotípica. A grande maioria dos estudos citogenéticos nessa família referem-se à descrições dos cariótipos (Mesa et al., 1982).

25 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

Nesse trabalho, os autores descreveram o número cromossômico e o mecanismo de determinação do sexo em 45 espécies (Tabela 3). Destas, 39 apresentaram o cariótipo básico (2n=23,24 X0:XX com cromossomos acro-telocêntricos), três (Diponthus dispar, D. electus e D. maculiferus) tiveram redução do número diplóide para 21,22 X0:XX, através de fusão autossomo-autossomo, originando um par de metacêntricos e em outras três (Diponthus communis, Xyleus laevipes e Zoniopoda iheringi) também ocorreu redução para 2n=22, contudo, a fusão foi do tipo X-autossomo resultando em mecanismo sexual XY:XX. Nos últimos anos, cariótipos de mais cinco espécies foram descritos (Tabela 3), todas 2n=23,24 X0:XX (Souza e Silva-Filha, 1993; Souza e Kido, 1995; Rocha et al., 1997; Pereira e Souza, 2000). Um interessante caso de polimorfismo foi descrito para Xestotrachelus robustus. Nesta espécie, populações provenientes da Bahia (Chapada Diamantina) e de

Pernambuco (Buíque), mostraram alteração da morfologia cromossômica no par M8 por inversão pericêntrica, modificando a condição acrocêntrica original para submetacêntrica. Cinco exemplares da Bahia foram heterozigotos para a inversão e três indivíduos de Pernambuco foram homozigotos (Souza et al., 2003). No que se refere à análise de marcadores cromossômicos como RONs e regiões heterocromáticas através de técnicas de bandeamento, apenas oito espécies de romaleídeos foram analisadas. A heterocromatina constitutiva (HC) detectada pelo bandeamento C apresentou intensa variabilidade de tamanho e localização de blocos quando as espécies foram comparadas (Tabela 4). De forma geral, existe uma predominância de HC na região pericentromérica. Contudo, blocos intersticiais e distais são muito freqüentes. Uma exceção foi Radacridium mariajoseae que apresentou poucos blocos de HC (Rocha et al., 1997). HC na condição extra também foi relatada em algumas espécies. Em Zoniopoda tarsata foi visto um segmento extra heterocromático no par 11 em condição polimórfica. Este segmento teve efeito intra- e intercromossômico alterando a freqüência de quiasmas (Vilardi, 1986b). Segmentos heterocromáticos também estavam presentes em Xyleus angulatus e foram detectados nos pares médios (M5, M67 e M ) e no

26 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

P11 na população de Caruaru (PE). Em outra população (Recife-PE), segmento extra heterocromático estava associado a segmento eucromático no P10 . Esses polimorfismos resultaram em diminuição na freqüência média de quiasmas (Souza e Silva-Filha, 1993). A análise comparativa do gênero Radacridium (Rocha et al., 1997) mostrou a ocorrência de segmento extra heterocromático em quatro pares (G346 , M , M e M 7 ) no cariótipo de R. nordestinum. A análise da HC extra no par 4 evidenciou redistribuição de quiasmas sem alterar a freqüência média por célula.

A análise da HC com fluorocromos base-específicos (CMA3 e DAPI) foi empregada até o momento em três espécies de romaleídeos. Essa análise revelou que + essas regiões são predominantemente ricas em GC (CMA3 ). Em Xyleus angulatus e + Xestotrachelus robustus toda a HC foi CMA3 ocorrendo correspondência entre o tamanho do bloco de HC com o de CMA3 (Souza et al., 1998; Souza et al., 2003). + Adicionalmente, Phaeoparia megacephala também apresentou toda a HC CMA3 .

Contudo, os blocos de CMA313 dos pares G -G e do X foram menores que os vistos pelo bandeamento C (Pereira e Souza, 2000). A localização das RONs nessa família pode ser agrupada em três categorias: aquelas restritas a autossomos, como ocorre em Brasilacris gigas (região telomérica de

M9) (Bione, 1996), Radacridum nordestinum (região intersticial de G2) (Rocha et al.,

1997) e Phaeoparia megacephala (região proximal de M6 ) (Pereira e Souza, 2000); aquelas localizadas em cromossomo sexual, como em Radacridium mariajoseae (sítio proximal do X) (Rocha et al., 1997); e aquelas que ocorrem tanto em autossomos como em alossomos como no caso de Xyleus angulatus com RONs em sítios proximais dos bivalentes G34 , M e do cromossomo X (Souza et al., 1998).

27 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

Tabela 3: Número cromossômico, mecanismo de determinação do sexo e morfologia cromossômica em gafanhotos representantes da família Romaleidae Espécie N0 diplóide Mecanismo sexual Morfologia cromossômica Referência Abila bolivari 23,24 X0:XX Acro-telocêntrica 1 Alcamenes clarazianus “ “ “ “ Antandrus viridis “ “ “ “ Brasilacris gigas “ “ “ 3 Chariacris miniacea “ “ “ 1 Chromacris miles “ “ “ “ C. speciosa “ “ “ “ C. peruviana “ “ “ “ Coryacris angustipennis “ “ “ “ Diponthus prope communis “ “ “ “ D. clarazianus “ “ “ “ D. communis 22,22 XY:XX “ “ D. dispar 21,22 X0:XX Acrocêntrica + par “ metacêntrico D. electus 21,22 X0:XX “ “ D. maculiferus 21,22 X0:XX “ “ Diponthus sp. 23,24 X0:XX Acro-telocêntrica “ Elaeochlora basalis “ “ “ “ E. brachyptera “ “ “ “ E. trilineata “ “ “ “ E. viridicata “ “ “ “ E. (viridicata?) “ “ “ “ Elaeochlora sp. “ “ “ “ Eutropidacris collaris 23,24 X0:XX “ 1 Phaeoparia megacephala “ “ “ 5 Phaeoparia n.sp.prope curtipennis “ “ “ 1 Phaeoparia linealba “ “ “ “ Prionolopha serrata “ “ “ “ Procolpia minor “ “ “ “ Radacridium nordestinum “ “ “ 4 R. mariajoseae “ “ “ 4 Securigera acutangula “ “ “ 1 Xestotrachelus robustus “ “ “ “ Xyleus angulatus “ “ “ 2 X. attenuatus “ “ “ 1 X. discoideus “ “ “ “ X. fuscipennis “ “ “ “ X. gracilis “ “ “ “ X. insignis “ “ “ “ X. laevipes 22,22 XY:XX “ “ X. modestus 23,24 X0:XX “ “ Xyleus sp. N01 “ “ “ “ Xyleus sp. N02 “ “ “ “ Xyleus sp. N03 “ “ “ “ Zoniopoda hempeli “ “ “ “ Z. iheringi 22,22 XY:XX “ “ Z. juncorum 23,24 X0:XX “ “ Z. onnicolor “ “ “ “ Z. tarsata “ “ “ “ Zoniopoda nsp. N01 “ “ “ “ Zoniopoda nsp. N02 “ “ “ “ Referências: 1-Mesa et al.(1982), 2- Souza e Silva-Filha (1993), 3- Souza e Kido (1995), 4- Rocha et al. (1997) e 5- Pereira e Souza (2000).

28 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

Tabela 4: Padrão de bandeamento C descrito em oito espécies de gafanhotos representantes da família Romaleidae

Espécie Padrão de bandeamento C Referência

Zoniopoda tarsata HC intersticial em G12 , G e G 3 1

HC pericentromérica em todos os cromossomos / blocos Xyleus angulatus grandes 2 HC distal nos pares médios e pequenos (5,7,9 e 11) HC distal e intersticial pares 4,6 e 8 No X bloco pericentromérico e proximal

HC pericentromérica em todos os cromossomos / blocos Brasilacris gigas pequenos 3 M5 pequeno bloco telomérico

HC pericentromérica em todos os cromossomos Chromacris speciosa HC proximal em M3, M46 , M e M 7 3 HC telomérica em G1 e G2 HC intersticial em M9

HC pericentromérica G1 / pequeno bloco R. mariajoseae HC pericentromérica P10 e P11 / blocos diminutos 4 No X bloco pericentromérico, intersticvial e um distal fino M9 tem proximal, distal e intersticial fino

HC pericentromérica em todos os cromossomos / blocos R. nordestinum pequenos 4 Intersticial em G2 e M5

HC pericentromérica em todos os cromossomos destacando- 5 Phaeoparia megacephala se blocos grandes em G12 , G e G 3

HC pericentromérica em todos os cromossomos 6 Xestotrachelus robustus P9 e P10 inteiramente heterocromáticos Referências: 1-Vilardi (1986b), 2- Souza e Silva-Filha (1993), 3- Souza e Kido (1995), 4- Rocha et al. (1997), 5- Pereira e Souza (2000) e 6- Souza et al. (2003).

II.3 CROMOSSOMOS B EM GAFANHOTOS

Os cromossomos B, também chamados de supernumerários ou acessórios, têm sido caracterizados como elementos extras encontrados no cariótipo de diferentes

29 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... organismos eucariotas. Cerca de 80% dos casos de polimorfismos para cromossomos B no reino animal ocorrem em insetos, principalmente dípteros, coleópteros e ortópteros. Nestes últimos, cromossomos B têm sido descritos em mais de 100 espécies, sendo a maioria pertencente a gafanhotos da família Acrididae (Hewitt, 1979; Jones e Rees, 1982). Cromossomos B podem ser mitótica ou meioticamente estáveis se todas as células dos indivíduos que os possuem apresentarem o mesmo número, ou instáveis quando seu número varia em diferentes células. Além disso, os cromossomos B apresentam um padrão de herança não-mendeliano e geralmente não pareiam com nenhum membro do complemento A. Quanto ao tamanho podem ser divididos em quatro categorias: 1- cromossomos B médios, com tamanho semelhante ao X e geralmente estáveis na mitose ou meiose; 2- cromossomos B com tamanho semelhante ao menor par do complemento e geralmente instáveis; 3- cromossomos minúsculos (minicromossomos), menor do que qualquer elemento do cariótipo normal, instável podendo ser encontrado em grande quantidade e 4- os B isocromossomos de morfologia meta ou submetacêntrica que podem parear formando um anel na meiose (Jones e Rees, 1982). Na grande maioria das espécies, a transmissão e distribuição de cromossomos B para as células filhas ocorre de maneira semelhante aos outros cromossomos do complemento. Contudo, a não-disjunção de cromossomos B pode causar variação no número desses elementos entre as células de um mesmo indivíduo, resultando no direcionamento mitótico e meiótico e acumulação. Quando mecanismos de acumulação ocorrem na meiose de fêmeas, os cromossomos B tendem a migrar preferencialmente para o pólo que formará a célula ovo (Olmo, 1987). A partir da instabilidade meiótica as taxas de acumulação de cromossomos B na linhagem germinativa podem ultrapassar a razão de 0,5 (limite para os padrões mendelianos) e essa acumulação é refletida no número total de cromossomos B observados na descendência (Camacho et al., 2000). Souza e Kido (1995) observaram a acumulação do cromossomo B de Xyleus angulatus

30 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... analisando metáfases de fêmeas. Em 5 dos 18 indivíduos analisados o número de cromossomos B variou entre 1 e 2. A manutenção de polimorfismo para cromossomo B através de mecanismo de acumulação está relacionada aos diferentes estágios de interação entre B e cromossomos A. Um B recém-surgido no genoma de uma dada espécie estabelece a condição parasítica, transmitindo-se por direcionamento meiótico às custas do genoma hospedeiro (Camacho et al., 2000). Este genoma freqüentemente evolui resistindo ao direcionamento do B. Como resultado deste conflito pode ser obtido um equilíbrio (modelo parasítico) ou um não-equilíbrio onde o cromossomo B muda da forma parasítica à neutralizada. Relato deste modelo foi descrito para o cromossomo B2 de Eyprepocnemis plorans (Camacho et al., 1997). Após a neutralização o B tende a ser extinto ou substituído por uma forma mutante, recuperando a condição parasítica e prolongando seu ciclo de vida (B24 substitui o B 2 de E. plorans) (Camacho et al., 2003). Cromossomos B são muito comuns em gafanhotos e constituem uma grande parcela dos principais polimorfismos encontrados. Eyprepocnemis plorans tem sido considerado como um modelo para estudo de cromossomos B. Nessa espécie, mais de quarenta tipos distintos de B foram descritos, em populações naturais da Espanha, levando-se em consideração o tamanho, comportamento, morfologia e o padrão de bandeamento C (Bakkali et al., 1999). Nos primeiros estudos em E. plorans (Henriques-Gil et al., 1982) foram descritos quatro tipos distintos de B com relação à ocorrência e possível origem desses cromossomos. Nesse estudo, foi constatado que o tipo B1 era o mais freqüente e o B3 o mais raro, encontrado apenas em um indivíduo.

Quanto à origem foi sugerido que o B21 surgiu a partir do B e ambos podem ter originado o B34 , enquanto B teria origem independente. Posteriormente, Henriques-Gil et al. (1984a) observaram 14 tipos distintos de cromossomos B em E. plorans. Levando em consideração a morfologia e o pareamento meiótico os autores sugeriram uma origem monofilética para os principais tipos de B (B124812 , B , B -B , B -B14 ). Quanto à sua natureza, os cromossomos B podem apresentar conteúdos de heterocromatina variáveis. Henriques-Gil et al. (1984a) analisaram 14 tipos de B, em E.

31 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... plorans, quanto ao padrão de bandas C e observaram que o conteúdo de HC variou entre os Bs. Alguns tipos como o B5, B813 e B de E. plorans apresentavam-se quase inteiramente heterocromáticos. Por sua vez, os isocromossomos B10 e B 11 tinham pouca HC. Pesquisas realizadas a partir dos anos 90, envolvendo isolamento, clonagem e sequenciamento de DNA repetitivo localizado em cromossomos B, têm demonstrado que esses cromossomos são constituídos de seqüências similares às encontradas em cromossomos A, bem como de seqüências específicas (Camacho et al., 2000). López- León et al. (1994) observaram que a principal localização no genoma de E. plorans de uma seqüência de 180pb de DNA repetitivo foi no cromossomo B. No que se refere à origem e evolução dos cromossomos B, alguns autores admitem que eles surgiram a partir de cromossomos do complemento básico, principalmente daqueles elementos que podem ser mais facilmente tolerados em condições polissômicas, como os cromossomos sexuais e alguns fragmentos cêntricos resultantes de fusões ou amplificações de regiões de cromossomos A (Jones e Rees, 1982). Recentes estudos citológicos e moleculares têm dado suporte à origem de cromossomos B a partir de elementos do complemento básico. Além disso, outros possíveis mecanismos têm sido propostos para a origem dos B, entre eles, cruzamentos interespecíficos (quando um B de uma nova espécie surgiu do complemento A de uma das espécies progenitoras) ou por mecanismos de eliminação cromossômica em espécies partenogenéticas (Camacho et al., 2000). A provável origem de cromossomos B a partir do X, tem sido sugerida com base nas semelhanças quanto ao comportamento picnótico ao longo da meiose e a heterocromatinização desses cromossomos. Em E. plorans, os 14 tipos distintos de B apresentam heteropicnose positiva durante a prófase meiótica. Ausência de quiasmas e associações pelas regiões heterocromáticas entre o X e o B também foram observadas dando suporte à possível origem do B a partir do X (Henriques-Gil et al., 1984b). López-León et al. (1996), ao analisarem a ocorrência de cromossomos B em duas populações espanholas (Jete e Solobreña) de E. plorans, constataram que cromossomos B eram mais freqüentes nos machos do que nas fêmeas.

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Considerando também o comportamento de migração do X e do B na anáfase I, os autores observaram que na primeira população esses cromossomos migravam para pólos opostos e na segunda de forma aleatória indicando não haver associações quiasmáticas e sim afinidade heterocromática entre eles. A relação de proximidade entre o B e o X e outros elementos do complemento básico também pode ser demonstrada por rearranjos cromossômicos envolvendo estes elementos. Henriques-Gil et al. (1983) descrevem translocações entre um B e um autossomo de tamanho médio e entre o B e o X em E. plorans. Esses rearranjos poderiam indicar também uma possível integração do B ao complemento normal em populações naturais deste gafanhoto. Translocação recíproca entre cromossomo B (B8) e o par 4 foi observada em um indivíduo macho de E. plorans (Bakkali et al., 2003). Esse polimorfismo resultou em uma inviabilidade gamética (50%), aumentando a taxa de mortalidade de embriões e reduzindo a freqüência do polimorfismo na geração seguinte. Técnicas citogenéticas moleculares empregadas nos últimos anos têm permitido caracterizar distintas regiões do cromossomo B e analisar o papel de possíveis seqüências gênicas ativas nesses cromossomos. Uma das seqüências que tem merecido grande atenção é a de DNAr, uma vez que em algumas espécies foram detectadas RONs em cromossomos supernumerários (Bidau, 1986; Cabrero et al., 1987). López-León et al. (1995) localizaram através da hibridização in situ uma RON distal no cromossomo B de E. plorans. Essa seqüência de DNAr nunca aparecia ativa pois apresentava-se metilada nos indivíduos adultos e embora estivesse desmetilada em células de embrião, outros possíveis fatores como estrutura da cromatina ou repressão por genes do complemento A estariam provocando a inativação dessa região. López-Fernández et al. (1992) compararam as semelhanças e diferenças das distintas classes de heterocromatina localizada nos autossomos, cromossomo X e B de E. plorans através da digestão do DNA por endonucleases de restrição, sugerindo que a possível origem do B pode estar relacionada com processos evolutivos envolvendo amplificação e reorganização de material autossômico.

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Como os segmentos supernumerários, a incidência de cromossomos B no cariótipo de certos indivíduos pode trazer efeitos como alteração na freqüência de quiasmas, aparecimento de espermátides anormais (macro e microespermátides) e infertilidade. Efeitos exofenotípicos, contudo, têm sido verificado em poucos casos

(Hewitt, 1979; Colombo, 1989a). A ocorrência do cromossomo B1 em algumas populações de E. plorans levou ao aparecimento de espermátides anormais (micro e macro), sendo admitido que as microespermátides seriam resultantes de falhas na divisão meiótica do cromossomo B (divisão reducional na anáfase I) e os micronúcleos formados são geralmente eliminados. Por sua vez, macroespermátides teriam origem de fusão nuclear (Suja et al., 1989). Efeitos de cromossomos B na atividade de regiões organizadoras de nucléolos foi observada por Cabrero et al. (1987) em E. plorans. Nessa espécie, machos com 1B mostraram um aumento da atividade das RONs no par P11 e no X. Além disso, a fusão do cromossomo B com o G1 ativou uma RON latente localizada na porção telomérica do braço longo do B. A atividade dessa RON resultou na redução da atividade das

RONs nos pares P910 e P possivelmente por um efeito de competição entre elas. Salcedo et al. (1988) observaram que o B de Locusta migratoria influenciou de forma positiva a atividade das RONs localizadas em todos os cromossomos do complemento (G135 , M -M intersticial, G2 intersticial e distal, M 6 e M 7 distal, M 8 , P 10 , P 11 e no X em sítios proximais e P9 intersticial) em diferentes populações dessa espécie. Em Locusta migratoria o cromossomo B é geralmente telocêntrico e de tamanho um pouco maior que os menores pares autossômicos. Apesar de sua instabilidade mitótica e altas taxas de acumulação na linhagem germinativa, nenhum efeito na freqüência de quiasmas foi observado por Cabrero et al. (1984) nas quatro populações de L. migratoria cuja ocorrência de B foi detectada. Ausência de efeitos significativos quanto a aspectos morfológicos e fisiológicos nessa espécie, sugeriram que o B nesses indivíduos estão inócuos e dessa forma eles raramente produzem efeitos fenotípicos visíveis (Castro et al., 1998).

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Em algumas situações, uma única espécie pode apresentar dois tipos distintos de cromossomos Bs. Em uma amostra de 83 machos de 5 populações de Psophus stridulus dois B diferentes foram descritos: o B metacêntrico semelhante ao X e mitoticamente estável (isocromossomo) e um pequeno B. Em ambos os casos um aumento na produção de espermátides anormais (microespermátides) foi detectado (Suja et al., 1986). Estudos de ocorrência e distribuição de cromossomos B também têm sido realizados em acridoideos da Região Neotropical. Pastori e Bidau (1994) descreveram um isocromossomo B em Metaleptea brevicornis adspersa (coletada da província de Corrientes, Argentina) que influenciou o aumento de espermátides anormais. Confalonieri e Bidau (1986) observaram a presença de cromossomos B distintos em duas espécies de Cylindrotettix. Em C. obscurus dois B foram identificados: um telocêntrico instável mitoticamente (BT) e um B submetacêntrico de tamanho médio e estável (BI ), sendo este último um isocromossomo que forma um anel na prófase I. Posteriormente, Colombo (1989b) estudando os possíveis efeitos de cromossomo B na recombinação também mostrou a influência que esses tipos de B exerciam sobre a freqüência de quiasmas de C. obscurus. Nesse trabalho foi constatado que o BI exercia influência maior que o BT . Foi sugerido que este cromossomo era mais facilmente mantido no cariótipo da espécie devido ao importante papel que ele apresentava para a recombinação. Por sua vez, C. santaroseae mostrou um único B telocêntrico pequeno que não apresentou efeito sobre a freqüência de quiasmas (Confalonieri e Bidau, 1986). Em duas populações naturais de Leptysma argentina, um polimorfismo para cromossomo B estava associado a outros polimorfismos como fusões cêntricas e translocações entre os autossomos. O B nessa espécie foi telocêntrico de tamanho médio com características picnóticas semelhantes ao X. A ocorrência de B e demais polimorfismos em L. argentina está associada com um período de intensa reestruturação cromossômica e evolução que essa espécie está passando (Bidau e Hasson, 1984). Um papel evolutivo também foi atribuído ao cromossomo B de Trimerotropis pallidipennis, uma vez que o B poderia interferir no controle genético da

35 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... formação de quiasmas (Confalonieri, 1992). No gênero Dichroplus, os cromossomos B descritos para D. elongatus e D. pratensis mostraram efeito sobre a freqüência de quiasmas e produção de espermátides anormais. Além disso, uma interação entre o cromossomo B e um polimorfismo para fusão cêntrica em D. pratensis deve estar relacionada com a determinação da freqüência de quiasmas (Bidau, 1987; Clemente et al., 1994).

II.4 HIBRIDIZAÇÃO in situ FLUORESCENTE (FISH) EM INSETOS

A hibridização in situ é um método que permite localizar seqüências de ácidos nucléicos (DNA ou RNA) no citoplasma, organelas, cromossomos ou núcleo em organismos eucariotas. Essa técnica foi introduzida por Gall e Pardue em 1969 usando sondas de RNA marcadas radioativamente para localizar seqüências específicas do DNA dentro do nucléolo de Xenopus laevis. Posteriomente, a técnica passou por refinamentos e as seqüências de DNA satélite e genes de cópia única puderam ser mapeados. Durante a década de 80, métodos não isotópicos foram desenvolvidos buscando um aprimoramento da técnica de hibridização, visando principalmente eliminar o background causado pelas reações das sondas isotópicas nas emulsões fotográficas. Desse aprimoramento, destaca-se o uso de sondas marcadas com biotina e detectadas nas preparações citológicas por avidina fluorescente (Langer et al., 1981). A partir daí, a FISH (hibridização in situ fluorescente) tem apresentado inúmeras aplicações, entre elas: a) construção de mapas físicos de cromossomos; b) análise de estruturas e rearranjos cromossômicos e c) estudo de estrutura, função e evolução de cromossomos e genomas. Desta forma FISH, tem sido amplamente utilizada para a localização cromossômica de seqüências de DNA em uma grande variedade de espécies. Em gafanhotos, essa técnica tem sido principalmente usada para a localização de diferentes tipos de seqüências de DNA repetitivo, incluindo DNA ribossomal e DNA satélite (López-León et al., 1994). Devido a sua alta resolução, o uso de FISH com sonda de

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DNA ribossomal tem sido útil para uma detecção precisa de todos os sítios de DNAr (ativos ou inativos), incluindo aqueles que tem uma quantidade diminuta de genes ribossomais. Genes que codificam RNA ribossômico 18S, 5.8S e 26S estão presentes em numerosas cópias no genoma eucariota, sendo agrupados em sítios cromossômicos que correspondem as regiões organizadoras de nucléolos (RONs). Variações na distribuição desses sítios podem ser usadas como caracteres taxonômicos e cromossômicos evolutivos (Ameniya e Gold, 1990). Genes de DNAr 5S, por sua vez, podem ser agrupados em simples ou múltiplos sítios dentro do genoma. Em eucariotas inferiores genes ribossomais 5S podem ser encontrados interespaçados com outros genes multicópias, incluindo DNAr 45S. Nos eucariotas superiores genes 5S e 45S frequentemente estão em diferentes áreas dentro do genoma (Drouim e Moniz de Sá, 1995; Danna et al., 1996) ou podem co-localizar no mesmo cromossomo (Almeida- Toledo et al., 2002). Em certas situações tem sido observado que sítios de DNAr não detectados pela coloração com nitrato de prata são facilmente visualizados por FISH mesmo estando inativos (Suja et al., 1993; López-León et al., 1994). Uma grande quantidade de DNAr inativo foi observado em duas populações do gafanhoto Stauroderus scalaris. Quando utilizada a sonda pTa71 (que contêm os genes 5,8S, 18S e 28S interespaçados), sítios de DNAr foram visualizados nas regiões paracêntricas de todos os cromossomos. Contudo, apenas uma única RON ativa foi observada quando os cromossomos foram corados com nitrato de prata (região paracentromérica no par G3), indicando que os demais sítios de DNAr estão silenciados (Lópes-León et al., 1999). A sonda pTa71 também foi usada para detecção dos sítios de DNAr (localizados na região pericentromérica de G3 ,

M4 e X) no romaleídeo Xyleus angulatus (Souza et al., 1998). Baixos níveis de diferenciação cromossômica foram reveladas pelo uso de FISH com sonda de DNAr entre as espécies Chorthippus brunneus e C. jacobsi. Ambas as espécies tem quatro sítios de DNAr localizados nos braços curtos dos pares G23 e G próximo ao centrômero. Adicionalmente, em C. brunneus foi observado um pequeno sítio na extremidade distal

37 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... do cromossomo X. Essa seqüência não é transcrita e parece indicar um sítio ancestral de RON para espécies de Chorthippus (Bridle et al., 2002). A variabilidade no número e localização de seqüências ribossomais vistas entre espécies do mesmo gênero também pode ser evidenciada para gêneros de uma mesma subfamília. Cabrero et al. (2003a) compararam a localização das seqüências de DNAr entre cinco representantes de gafanhotos Eyprepocnemidinae. O número de bivalentes portando a seqüência foi variável. Os sítios foram vistos no par P9 em Thisoicetrinus pterostichus, P9 e P10 em Eyprepocnemis unicolor, M 8 e P 11 em Heteracris adspersa, P 9 ,

P10 e P 11 em Shirakiacris shirakii e P 9 e P 11 para E. plorans da região dos Caúcasos. Esses resultados sugeriram que o número ancestral de sítios de DNAr em Eyprepocnemidinae é restrito a um ou até três pares autossômicos envolvendo os menores membros do cariótipo (M811 -P ). Diferenças no número e na localização de sequências de DNAr foram descritas quando distintas populações de E. plorans foram analisadas. Exemplares dessa espécie coletados na Espanha e Marrocos mostraram vários cromossomos incluindo o X contendo os sítios ribossômicos (Lopéz-León et al., 1994; Bakkali et al., 2001), enquanto representantes dos Caúcasos tinham somente DNAr nos pares P9 e P11 (Cabrero et al., 2003a). A análise por FISH de segmentos supernumerários, que contêm RONs, tem mostrado importantes resultados sobre a provável origem dessa HC extra. Em

Pyrgomorpha conica, segmentos supernumerários presentes nos pares M5 e M6 mostraram um sinal brilhante quando utilizada a sonda pAlr8 (constituída de uma unidade de DNAr de Ascaris lumbricoides) (Suja et al., 1993). Por estes resultados os autores propõem que as RONs dos segmentos extra poderiam ter surgido por amplificação das regiões organizadoras originais (região pericentromérica do M5 e do

M6 ) e estariam silenciadas por metilação do DNA, pois as mesmas não são coradas pelo nitrato de prata. A localização de um sítio de DNAr no segmento supernumerário localizado distalmente no bivalente P10 de Oedipoda fuscocincta deu suporte a hipótese de que este segmento poderia ter surgido a partir de uma translocação da região

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proximal do bivalente M9 , pois é nesta última que está localizado o único sítio ativo de RON (Cabrero et al., 1998). A provável origem do cromossomo B de E. plorans foi sugerida a partir da análise de FISH usando sondas ribossômicas (DNAr 45S e 5S) e de DNAsat para exemplares das populações da Espanha e de Marrocos. Pela localização e a ordem em que as seqüências estavam dispostas nos cromossomos, a origem do B foi associada ao cromossomo X (Lopéz-León et al., 1994; Cabrero et al., 2003b). Em Coleoptera, o uso da FISH como forma de identificar a correta localização de genes DNAr tem sido muito útil, uma vez que a coloração com nitrato de prata geralmente marca todo o material heterocromático dos cromossomos, inclusive as RONs associadas a HC (Vitturi et al., 1999; Colomba et al., 2000). Variabilidade quanto ao número e localização dos sítios ribossomais tem sido vista em alguns representantes desse grupo. Em Thorectes intermedius a FISH evidenciou sítios de DNAr em quatro cromossomos (pares 1 e 3). Um dos espécimens analisado foi polimórfico apresentando células com um sítio e outras com quatro (Vitturi et al., 1999). Moura et al. (2003) analizando três representantes de Melolontinae observaram diferenças na localização dos sítios de DNAr. P.(Phytatus) vestita e Lyogenis fuscus tinham a seqüência no X e P.(Phyllophaga) aff. capillata em um autossomo pequeno. Em 16 espécies de formigas australianas do gênero Myrmecia, cujo número cromossômico variou de 2n= 4 a 76, o emprego da FISH para seqüências ribossômicas evidenciou um caso único de dispersão de sítios de DNAr. O número de cromossomos contendo as seqüências aumentou de dois (nas espécies com baixo número cromossômico) para 19 em espécies com maior número, indicando que fissão cêntrica e translocação recíproca são os principais mecanismos envolvidos na dispersão (Hirai et al., 1996). Além do DNAr, a técnica de FISH também tem possibilitado analisar seqüências de DNA satélite, permitindo caracterizar a organização molecular das regiões heterocromáticas. Duas famílias de DNA altamente repetitivo foram caracterizadas e clonadas a partir da clivagem do DNA de Dociostaurus genei por endonucleases de

39 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... restrição. Dos clones obtidos foi direcionada a construção de duas sondas, a DgT2 que hibridizou nas regiões de banda C centromérica de todos os cromossomos e a DgA3 que marcou toda a heterocromatina extra (segmentos extras distais na maioria dos autossomos), caracterizando duas famílias de DNA repetitivo distintas que ocupam diferentes domínios cromossômicos (Rodríguez-Iñigo et al., 1996). Uma sequência satélite de 180 pares de bases obtida pela digestão com enzimas de restrição do DNA genômico de Eyprepocnemis plorans, foi hibridizada nos cromossomos dessa espécie. Essa sonda produziu sinais de hibridização nas regiões paracentroméricas da maioria dos cromossomos e um sinal maior no cromossomo B (López-León et al., 1994; 1995). Em Coleóptera, grupo onde alguns representantes são caracterizados por apresentar grande quantidade de HC no genoma, a FISH com sonda de DNAsat tem fornecido importantes conclusões a cerca da natureza da HC nesses insetos. Essas seqüências têm se mostrado espécie-específica (Lorite et al., 2001), podem revelar novos modelos para a organização da heterocromatina, como ocorreu para a combinação das seqüências satélite tipo I e II em Tribolium madens (Zinic et al., 2000) e ainda servir como base para estudos de filogenia (Mestrovic et al., 2000). Localização de seqüências mitocondriais no DNA cromossômico de alguns gafanhotos foi descrita por Vaughan et al. (1999). A sequência de DNA mitocondrial COI (citocromo oxidase I) hibridizou nas regiões centroméricas e teloméricas de oito bivalentes de Chorthippus parallelus, região centromérica em Schistocerca gregaria e no genoma de Italopodisma sp. Como essa seqüência foi observada em diferentes gêneros e em distintas posições cromossômicas deve ter surgido a partir do DNA cromossômico no início da história evolutiva dos acridídeos.

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III. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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III. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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IV. CAPÍTULO 1: Chromosome differences between the grasshopper species Chromacris nuptialis and C. speciosa (Romaleidae): constitutive heterochromatin variability and rDNA sites.

Artigo submetido para publicação à revista Genética publicada na Holanda

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Chromosome differences between the grasshopper species Chromacris nuptialis and C. speciosa (Romaleidae): constitutive heterochromatin variability and rDNA sites

Vilma Loreto1*, Eva Stadtler1, Natoniel F. de Melo2 & Maria José de Souza1 1Departamento de Genética, CCB, Universidade Federal de Pernambuco. *Author for correspondence: Av. Prof. Moraes Rego s/n, Cidade Universitária, Recife, PE, 50732-970, Brasil (Tel. 558121268520) E-mail: [email protected] 2Embrapa Semi-árido, Petrolina, Brasil.

Key words: FISH, grasshopper, heterochromatin, karyotype, NORs

Abstract

The chromosomes of the romaleids Chromacris nuptialis and C. speciosa were analyzed comparatively using different cytogenetic techniques. The results show similarities among these species in terms of chromosome number (2n=23,X0) and acrocentric morphology. In some individuals of C. nuptialis meiotic irregularities were detected involving the bivalent

L2. This bivalent was delayed and present anaphasic bridges and other aberrations. Differences in the patterns and composition of constitutive heterochromatin (CH) were observed by C-banding and fluorochromes staining. Silver nitrate staining revealed a single medium nucleolar organizer regions (NORs) pair per species. Differences were also observed in the NORs location, which was pericentromeric in C. nuptialis and proximal in C. speciosa. FISH using an rDNA probe confirmed the existence of ribosomal sites coinciding with active regions visualized by silver nitrate. The possible implications of the karyotype differences observed between both species are discussed.

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Introduction

Grasshoppers of the genus Chromacris are restricted to the Neotropical region and are found from Mexico to Argentina. These insects are generally characterized by strong colors with yellow or red stains on the wings. On the basis of these characteristics, Roberts and Carbonell (1982) divided the genus Chromacris into two groups. The first called trogon includes C. trogon, C. psittacus, C. icterus and C. peruviana species, and the second called colorata consists of C. colorata, C. minuta, C. miles, C. speciosa and C. nuptialis species. The latter taxon is related to C. speciosa, which was initially considered to be a variant form, but the study of some morphological traits has indicated that it is a distinct species (Roberts & Carbonell, 1982). The family Romaleidae has shown a marked predominance of conserved karyotypes (2n= 23,24 XO:XX) (Mesa, Ferreira & Carbonell, 1982). However, analysis of constitutive heterochromatin (CH) by C-banding has revealed variations in terms of the quantity and location of CH blocks among different species. In this respect, the pericentromeric location has been the most frequent being observed in seven out of eight species studied so far (Vilardi, 1986; Souza & Kido, 1995; Pereira & Souza, 2000; Souza, Haver & Melo, 2003). Additionaly, ocurrence of interstitial and distal blocks has been reported for Xyleus angulatus (Souza & Kido, 1995; Souza, Rufas & Orellana, 1998), Radacridium mariajoseae and R. nordestinum (Rocha, Souza & Tashiro, 1997), and Chromacris speciosa (Souza & Kido, 1995). Polymorphisms for supernumerary heterochromatic segments have been described for X. angulatus (Souza & Silva-Filha, 1993) and R. nordestinum (Rocha, Souza & Tashiro, 1997) and B chromosomes have been observed in X. angulatus (Souza & Kido, 1995) and Zoniopoda tarsata (Vilardi, 1986), demonstrating the intensive variability in CH between representatives of this family. With respect to cytogenetic characteristics, knowledge about the genus Chromacris is limited to the studies of Mesa, Ferreira and Carbonell (1982) and Souza and Kido (1995) who described the karyotype of three species (C. speciosa, C. peruviana and C. miles) as 2n=23,XO and 2n=24,XX and analyzed the variability in CH distribution in C. speciosa by C-banding, respectively.

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Some studies have shown that comparative cytogenetic analysis of grasshoppers can contribute to the understanding of the process of speciation (Bella et al., 1990). Bridle et al. (2002) emphasized the close karyotype similarity between Chorthippus brunneus and C. jacobsi when analyzing C-banding patterns and CH composition by fluorochrome labeling. However, Rodríguez-Iñigo, Bella and García de la Vega (1993) analyzing two species of the genus Dociostaurus, and Camacho and Cabrero (1983) analyzing the species Acrotylus insubricus and A. patruelis showed differences in the patterns and composition of CH between related species, indicating that loss or acquisition in the heterochromatin might be involved in the karyotype evolution. In the present study, we performed a comparative cytogenetic analysis between C. nuptialis and C. speciosa by conventional analysis, C-banding, fluorochrome and silver nitrate staining, and fluorescence in situ hybridization (FISH) using a 45S rDNA probe in order to determine the level of similarities and differences between these species.

Material and methods

A total of 16 adult male specimens of C. nuptialis collected in the locality of Exu (7026’0’’S 390 50’36’’W) and 25 specimens of C. speciosa collected in Moreno (800 7’7’’S 35 5’32’’W) (15 males and 3 females) and Igarassú (700 50’3’’S 34 54’23’’W) (5 males and 2 females), state of Pernambuco, Brazil, were studied. The grasshoppers were brought to the laboratory, dissected and the testes and ovaries were fixed in ethanol:acetic acid (3:1). Females were injected with 0,1% colchicine for six hours. The slides were prepared using the classical testicular and ovarian follicles squashing technique, followed by staining with 2% lactoacetic orcein for conventional chromosome analysis. For the different banding techniques, the slides were prepared by the addition of one drop of 45% acetic acid and covered with coverslips that were removed after freezing in liquid nitrogen.

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C-banding and CMA3/DA/DAPI staining

C-banding was performed by the method of Sumner (1972). Slides aged for 2 days were treated with 0.2 N HCl for 30 min, 5% barium hydroxide (60oC) for 45 s, and 2 x SSC (60oC) for 45 min. After drying, the preparations were stained with Giemsa 5% diluted in phosphate buffer, pH 7.0, for 3 min. For CMA3/DA/DAPI staining (Schweizer et al., 1983), the slides were aged for 3 days, stained with CMA3 (0.5 mg/ml in McIlvaine buffer, pH 7.0) for 1 hour, washed in distilled water, stained with Distamycin A (DA) (0.1 mg/ml) for 45 min, washed again, and stained with DAPI (0.5 Pg/ml) for 20 min.

Silver nitrate staining (AgNO3 ) and fluorescence in situ hybridization (FISH)

For silver nitrate staining, the cytological preparations were pretreated with 2 x SSC at o 60 C for 10 min, washed, dried, stained with one drop of AgNO3 solution (1:1) in distilled water (with the pH adjusted with formic acid), and then incubated in a humid chamber at 70o C for 3 min (Rufas, Esponda & Gosálvez, 1985). Some preparations were counterstained with Giemsa before mounting. For FISH, a probe containing fragments of the 45S ribosomal genes (18S-5.8S-25S) of Arabidopsis thaliana (Unfried, Stocker & Gruendler, 1989; Unfried & Gruendler, 1990) was used to localize rDNA sequences. The probe was labeled with biotin-11-dUTP by nick translation, and the preparations were incubated with RNAse, proteinase K, MgCl2 /PBS and paraformaldehyde/PBS solutions, and finally dehydrated in an increasing alcohol series (70%-90%-100%, 5 min each) according to Moscone, Matzke & Matzke (1996). Hybridization was performed at 80o C using 5 μl of the mixture. The slides were kept at 37o C overnight for renaturation. The probe was detected with an anti-biotin-rhodamine antibody. The chromosomes were counterstained with DAPI and the slides were mounted in Antifade Vectashield (Vector) medium. Photographs were taken under a Leica microscope using Kodak ISO 25 films, TMAX-400 and Fuji Film ISO-400 for FISH and printed on Kodak Kodabrome Print F3 paper.

54 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

Results

The diploid number of Chromacris speciosa and C. nuptialis corresponds to 2n=23,X0 in males and 2n=24,XX in females. Both species present acrocentric chromosomes which were grouped in two large (L1-L2), six medium (M3-M8911 ) and three small pairs (S -S ), in addition the X was of medium size (Figure 1a-f). In both species, the X presented a variable heteropycnotic behavior, positive from leptotene to diplotene and negative during diakinesis and metaphase I (Figure 1a-c). Our cytogenetics studies in the 16 individuals of C. nuptialis confirmed that six of them have meiotic irregularities likely the stickiness. The pair L2 presented anaphasic delay and formation of bridges by union of the homologous chromatids in the terminal position (Figure 2a,b). In this region a block of constitutive heterochromatin (CH) was observed close to the sticky point (Figure 2b). In some cells the behavior of the laggard pair, may indicated that it has been not incorporated to the new nucleus formed (Figure 2c). The presence of chromosomal fragments (Figure 2d) might have appeared by the separation of telophasic cells and breaking of bridges. Out of the 647 cells in anaphase and telophase I from three individuals analyzed, 15 (2.3%) presented bridge formation and 632 (97.7%) were normal. Application of C-banding permitted the visualization of distinct CH distribution patterns in the two species. C. nuptialis exhibited CH blocks in the pericentromeric region of most chromosomes, while the small pairs presented variable CH blocks in terms of location and size. It was visualized an interstitial, a telomeric and a small block and apparently pericentromeric in the S9, S10 and S 11 bivalentes, respectively. Additionally, a block was observed in the telomeric region of the L2 pair (Figure 3a). C. speciosa, on the other hand, presented highly variable CH in terms of size and block position. C-banding of mitotic metaphases revealed pericentromeric CH in all chromosomes, however, on the M3, M4, M56 and M pairs CH blocks covered a marked portion of the proximal part of the long arm. A telomeric C-band was observed on the L1 and L2 pairs, and a large interstitial block was seen in the M8 pair. A small intersticial block was also noted on the M57 and M pairs and in the X chromosome (Figure 3c). This pattern was detected in meiotic cells (Figure 3b).

55 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

The CMA3 /DA/DAPI staining revealed different patterns in the two species. Whereas + C. nuptialis presented only one bivalent (M63 ) with a CMA block in the pericentromeric + region (Figure 3d), C. speciosa had two CMA36 blocks, one in the proximal portion of M and the other in the telomeric region of L2 (Figure 3f). DAPI staining was homogenous in the two species (Figure 3e,g).

Silver nitrate staining identified only one NOR in the medium pair (M6 ) of both species (Figure 4a,c). In situ hybridization with the rDNA probe confirmed the existence of only one pair of ribosomal sites per species (M6 ) and these sites were located in different regions of the chromosomes, with a pericentromeric location being observed for C. nuptialis (Figure 4b) and a proximal location for C. speciosa (Figure 4d). In both cases, the + nucleolar organizer regions (NORs) coincided with the CMA3 heterochromatin regions.

Discussion

The karyotypes of C. nuptialis and C. speciosa resemble those reported for other Chromacris species and for most romaleid species in terms of chromosome number (2n=23,X0 and 2n=24,XX) and morphology (acrocentric) (Mesa, Ferreira & Carbonell, 1982; Souza & Kido, 1995; Rocha, Souza & Tashiro, 1997). One exception to this uniformity has been described for Xestotrachelus robustus (2n=23,X0 and 2n=24,XX), a species taxonomically related to Chromacris. In this species, the S9 and S10 pairs are meta- submetacentric and probably originated from pericentric inversion since the rearrangement did not change the chromosome number of the species (Souza, Haver & Melo, 2003). Indeed, romaleid species have shown a highly conserved karyotype, with only few cases of rearrangements (X-autosome and autosome-autosome fusion) being known, that lead to a reduction in chromosome number (Mesa, Ferreira & Carbonell, 1982). Cellular events as paracentric inversion (Koehler et al., 2002), cohesion loss among chromatid-sisters (Cimini et al., 2003) and failure in the control of the checkpoint metaphase/anaphase (LeMaire-Adkins, Radke & Hunt, 1997) it has been described in some organisms. However, the detailed analysis of the meiotic aberrations in C. nuptialis seems not to indicate none of those events. A possibility to explain the observed abnormalities would be that the sticky among homologous chromatids to the block of CH of L2 is

56 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... maintained by proteins connection of the heterochromatin. Stickness have been described in polytene chromosomes of Drosophila and Chironomus, in mitotic chromosomes of maize callus culture (Fluminhan Jr., Aguiar-Perecin & Dos Santos, 1996) and in Ornithogalum longibracteatum (Pedrosa et al., 2001). In this last species the existence of proteic factors associated with CH was admitted. The karyotype similarity detected by conventional analysis between romaleid species was not observed when comparing CH patterns. No similar pattern has been identified between the few species studied thus far. Despite of a predominance of pericentromeric CH, a wide variability in size, block location (telomeric, interstitial and proximal) and the presence of extra CH in the form of supernumerary segments and B chromosomes have been reported (Vilardi, 1986; Souza & Kido, 1995; Rocha, Souza & Tashiro, 1997; Pereira & Souza, 2000; Souza, Haver & Melo, 2003). When CH patterns of C. nuptialis and C. speciosa were compared with those of Xestotrachelus robustus, a closer similarity was observed between C. nuptialis and X. robustus due to the predominance of pericentromeric CH. However, differences were detected in the small pairs. Whereas C. nuptialis possesses an interstitial block in S91011 , a telomeric in S and a pericentromeric one in S , in X. robustus the S910 and S chromosomes are entirely heterochromatic (Souza, Haver & Melo, 2003). Chromacris speciosa showed a pattern even more particular consisting of large pericentromeric CH blocks on the large and medium bivalents and a diversity of proximal, telomeric and interstitial blocks.

Comparison of the results obtained by CMA3 /DA/DAPI staining for C. nuptialis and + C. speciosa also revealed differences. C. nuptialis had only one CMA3 pericentromeric block, while two blocks, a proximal and a telomeric one, were observed in C. speciosa. This scarcity of GC base pairs in CH contrasts with data reported for other romaleid species + in which CMA3 blocks predominate (Souza, Rufas & Orellana, 1998; Pereira & Souza, 2000; Souza, Haver & Melo, 2003). John et al. (1985) analyzing ten Australian acridid grasshoppers, identified distinct classes of CH when cytological preparations of these species were stained with CMA3 and DAPI fluorochromes. In Recitropis sp.1 a part of CH + was CMA3 , while the other was homogenous for this fluorochromes. On the other hand, ++ Ursina sp. showed three classes, being CMA3 , DAPI and a third one without specificity.

57 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

Two categories of CH could be distinguished in the species analyzed here, one GC-rich and the other one, more frequent, without any specific richness. The location of the NORs in representatives of the family Romaleidae can be divided into three categories: those restricted to autosomes, as observed in Xestotrachelus robustus

(pericentromeric region of M5) (Souza, Haver & Melo, 2003), Radacridium nordestinum

(interstitial region of the L2 bivalent) (Rocha, Souza & Tashiro, 1997) and Phaeoparia megacephala (proximal region of M6 ) (Pereira & Souza, 2000); those located on the sex chromosome, as in Radacridium mariajoseae (proximal site of the X) (Rocha, Souza & Tashiro, 1997); and those with NORs on both autosomes and allosomes, as in Xyleus angulatus, with proximal sites on the L3 and M4 bivalents and the X chromosome (Souza, Rufas & Orellana, 1998). C. nuptialis and C. speciosa had only one nucleolar organizer pair as observed for most romaleid species analyzed, but they differed in terms of the position of the NOR, which was pericentric in C. nuptialis and proximal in C. speciosa. Since the NOR is located on the same pair (M6) in the two species, we may suppose that some event (paracentric inversion, heterochromatin amplification or unequal crossing-over) might have led to the modification of the original pericentric position to the proximal one, observed in C. speciosa during the course of its evolution. In Oedipoda charpentieri, a paracentric inversion in M6 pair has been shown to have altered the paracentromeric position of CH, although it did not modify the position of the two NORs (paracentromeric and interstitial) on this chromosome (Navas-Castillo, Cabrero & Camacho, 1987). FISH using an 45S rDNA probe confirmed the existence of only one nucleolar organizer pair in the two species and helped clarify the position of the rDNA sites, which is sometimes hidden by nucleolar remnants when visualized by silver nitrate. This result is similar to that reported by Souza, Haver and Melo (2003) for X. robustus showing only one sign on M5 pair. Since FISH coincided with the proximal region of the M6 bivalent + + (CMA3 ) of C. speciosa and no sign was observed in the also CMA3 telomeric region of

L2 , the CH in this region, although GC-rich, is likely to show no functional relationship with rDNA sites and might be organized differentially from the other CH regions. Our results indicated a significant degree of chromosome differentiation between C. nuptialis and C. speciosa when comparing the distribution pattern and composition of CH,

58 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... as well as the position of the rDNA sites. The karyotype differences observed indicate a distinction in taxonomic status between species, confirming the analysis of some morphological traits performed by Roberts and Carbonell (1982), who demonstrated that C. nuptialis is not a variant form of C. speciosa. However, only cytogenetic and molecular analysis of other members of the colorata and trogon groups will determine whether the differences observed are frequent among these representatives or whether C. speciosa and C. nuptialis can be included in distinct groups.

Acknowledgements

We are very grateful to Dr. Carlos S. Carbonell, Montevideo University, for the taxonomic identification of the species and Prof. Dr. Marcelo Guerra for laboratory facilities for FISH experiment and for his opinion and valuable comments on the manuscript. The authors also grateful to Dr. Rita de Cássia de Moura and Dr. Neide Santos for helpful suggestions and the revision of the manuscript. To Francisca Tavares for technical support. This research was supported by CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) and FACEPE (Fundação de Amparo à Ciência do Estado de Pernambuco). Eva Stadtler was student of scientific initiation (PIBIC/CNPq).

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References

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Figure 1. Meiotic cells of Chromacris nuptialis (a, b, d, f) and C. speciosa (c, e). (a) Pachytene, (b) Diplotene, (c) Metaphase I, (d) Anaphase I, (e) Metaphase II with 11 chromosomes, and (f) Anaphase II with 12 chromosomes. Note the X chromosome heteropycnotic positive (a, b) and negative (c). Bar = 10 μm.

63 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

Figure 2. Irregularities in the meiosis I of C. nuptialis. (a, b) Anaphase showing the bridge formation among homologous chromatids of bivalent L2. Note in (b) the terminal block of

CH in L2 (arrow). (c) and (d) Telophase showing the delayed pair and the union among chromatids resulting in fragments. Bar = 10 μm.

64 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

Figure 3. C-banding pattern in C. nuptialis (a) and C. speciosa (b, c). Note the CH blocks on

the small pairs and in L2. CMA3/DA/DAPI staining of diplotene cells from C. nuptialis (d, e) + and C. speciosa (f, g). The arrows indicate the CMA3 blocks. Bar = 10 μm. 65 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

Figure 4. Identification of nucleolar organizer regions (NORs) and rDNA sites in C. nuptialis and C. speciosa by silver nitrate staining (a, c) and FISH (b, d) respectively. The arrows indicate the M6 pair with NORs in the pericentromeric region of C. nuptialis (a, b) and in the proximal region of C. speciosa (c, d). Bar = 10 μm.

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V. CAPÍTULO 2: Cariótipos e análise comparativa de sítios de DNAr em cinco espécies de gafanhotos gonfoceríneos neotropicais.

Artigo a ser submetido à revista Genetic and Molecular Biology, publicada no Brasil

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Cariótipos e análise comparativa de sítios de DNAr em cinco espécies de gafanhotos gonfoceríneos neotropicais.

Vilma Loreto1, Josefa Cabrero22 , Maria Dolores López-León , Juan Pedro Martínez Camacho21 e Maria José de Souza

1Departamento de Genética, CCB, Universidade Federal de Pernambuco. Recife, Brasil 2Departamento de Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada, Spain

Resumo

Descrição do número cromossômico, localização e análise de RONs por coloração com nitrato de prata e hibridização in situ fluorescente (FISH) foram realizadas nos gonfoceríneos neotropicais: Rhammatocerus brasiliensis, R. brunneri, R. palustris, R. pictus e Amblytropidia sp. Todas as espécies apresentaram 2n=23,24 cromossomos e mecanismo sexual X0:XX Amblytropidia sp. foi a única espécie que apresentou um par cromossômico marcador típico, o megamérico M8 . Os sítios de DNAr foram restritos a pares autossômicos, sendo o P9 organizador nucleolar em todas as espécies. Adicionalmente, R. brasiliensis tem RONs nos pares M46 e M que juntamente com as do P 9 são sempre expressas. Esses resultados indicam P9 como um novo reservatório de genes DNAr em gonfoceríneos neotropicais contrastando com a localização preferencial no X ou em pares autossômicos grandes em representantes paleárticos do grupo.

Palavras-chave: Cromossomo, DNAr, Rhammatocerus, RONs.

Introdução

Gafanhotos da subfamília Gomphocerinae constituem um grupo bastante representativo da fauna de ortópteros na região Neotropical. Embora ocorram em várias áreas geográficas e algumas espécies apresentem grande densidade populacional (Rhammatocerus brasiliensis, R. schistocercoides e Orphulella punctata), as poucas descrições e revisões taxonômicas realizadas nesse grupo (Otte 1979; Otte e Jago, 1979) ainda não são suficientes para estimar o número de gêneros e espécies ou estabelecer relações evolutivas no grupo. De acordo com as análises de Carbonell (1995), gonfoceríneos neotropicais poderiam ser agrupados em quatro tribos: Orphulellini (4 gêneros), Amblytropidini (7 gêneros), Compsacrini (5 gêneros) e Scyllinini (12 gêneros). Nesta última, destaca-se o gênero Rhammatocerus constituído de 13 espécies sendo que nove destas (R. brasiliensis, R. brunneri, R. guerrai, R. palustris, R. pictus, R. pratensis, R.

68 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... pseudocyanipes, R. schistocercoides e R. suffusus) ocorrem no Brasil (Assis-Pujol 1997a, b, 1998). R. brasiliensis, particulamente, apresenta-se em populações naturais sob duas formas morfológicas. A forma típica é a mais abundante, enquanto a forma atípica, com diferenças na estrutura do pronoto e coloração mais clara, é menos abundante (Carbonell, comunicação pessoal). Apesar de uma ampla diversidade e distribuição, estudos citogenéticos em gonfoceríneos neotropicais estão restritos a poucos trabalhos que enfatizam a descrição cariotípica pela análise convencional (Mesa et al., 1982; Vilardi, 1986; Remis, 1989; 1993). Dentre as espécies analisadas, a maioria apresenta cariótipos do tipo 2n=23,24 cromossomos, mecanismo sexual XO:XX e morfologia acro-telocêntrica. Apenas Scyllina signatipennis mostrou polimorfismo para uma translocação X-autossomo resultando em cariótipos 2n=22 e mecanismo sexual XY:XX. Em Sinipta dalmani ocorreu uma situação particular. Essa espécie foi descrita com 2n=23,24 XO:XX (Mesa et al., 1982). Contudo, Remis (1993) ao analisar populações naturais desse gafanhoto do Parque El Palmar (Argentina), observou uma fusão cêntrica entre um dos cromossomos do quinto par e o X, determinando a formação de mecanismo neo-XY nesta espécie. Por outro lado, apesar da grande conservação cariotípica em gonfoceríneos neotropicais, polimorfismos para cromossomos B são freqüentes (Bidau, 1984; Vilardi, 1986; Colombo e Remis, 1997). A análise de genes de DNAr tem sido muito útil em insetos como marcadores cromossômicos usados para comparações interespecíficas (Bridle et al., 2002; Moura et al., 2003) e posteriores estudos filogenéticos (Cabrero et al., 2003). Nos genomas de eucariotas, os genes ribossomais 45S estão geralmente localizados em sítios cromossômicos conhecidos como regiões organizadoras de nucléolos (RONs), os quais consistem de conjuntos de subunidades de DNAr (18S + 28S + 5,8S) repetidas em tandem. Em 1975, Goodpasture e Bloom introduziram um método de coloração com nitrato de prata (AgNO3) permitindo a localização de RONs. Marcações com AgNO3 são facilmente visualizadas em cromossomos mitóticos e meióticos desde que tenha ocorrido atividade transcricional dessas regiões na intérfase anterior (Miller et al., 1976). Nos últimos anos, a técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH) tem sido usada para mapear diretamente nos cromossomos seqüências de DNAr em vários organismos, inclusive em insetos (Hirai et al., 1996; Bridle et al., 2002; Moura et al., 2003). Além

69 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... disso, FISH com sonda de DNAr permite identificar o número total desses sítios no cariótipo de uma espécie independente da atividade ou inatividade transcricional das RONs.

Em alguns casos essa técnica tem revelado sítios de DNAr não evidenciados com AgNO3 (López-León et al., 1994; López-León et al., 1999). A análise de padrões de expressão de RONs tem sido útil na compreensão dos mecanismos que podem exercer controle sobre essas regiões. Inicialmente as RONs foram classificadas em primárias e secundárias de acordo com sua capacidade de expressão (Fernández-Piqueras et al., 1983). Contudo, posteriormente fatores como a presença de heterocromatina extra na forma de segmentos supernumerários ou cromossomos B podem influenciar a atividade das RONs aumentando a expressão de algumas regiões e diminuindo ou inativando outras (Cabrero et al., 1998). A metilação do DNA também tem sido associada como elemento regulador de RONs. Em Eyprepocnemis plorans seqüências de DNAr presentes no cromossomo B não são expressas por estarem metiladas (López-León et al., 1995). Outras hipóteses sobre regulação da expressão de RONs admitem que a atividade de diferentes sítios de DNAr em espécies com múltiplas seqüências dependem do sucesso dessas regiões na competição por fatores de transcrição. Isto resulta em uma hierarquia de ativação (Zurita et al., 1998). Neste trabalho são descritos os cariótipos de cinco espécies de gonfoceríneos neotropicais (Rhammatocerus brasiliensis, R. brunneri, R. palustris, R. pictus e Amblytropidia sp.) e analisados o número e localização das RONs. De acordo com os padrões obtidos foi possível iniciar uma discussão sobre aspectos de evolução cromossômica em gonfoceríneos neotropicais à luz de conhecimentos descritos para representantes desta subfamília na região Paleártica.

Material e métodos

Foram coletados e analisados 52 exemplares de R. brasiliensis de diferentes localidades do estado de Pernambuco (áreas mata-litoral, agreste e sertão), Brasil (Tabela 1). Exemplares de R. palustris e R. brunneri foram obtidos em Rio de Contas, Bahia, Brasil (1300 34’44’’S 41 48’41’’W) sendo analisados três machos e duas fêmeas da primeira espécie e cinco machos e duas fêmeas da segunda. Cinco exemplares machos de R. pictus foram

70 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... coletados em Cerro Chato Dorado (3100 03’S 55 30’W), Uruguai. Para Amblytropidia sp. foram analisados 20 exemplares provenientes do Cabo (800 17’12’’S 35 2’6’’W) (10 machos e duas fêmeas) e de São Lourenço da Mata (800 0’8’’S 35 1’6’’W) (cinco machos e três fêmeas), Brasil. Testículos e ovários foram fixados em etanol:ácido acético (3:1). As fêmeas foram injetadas com solução de colchicina 0,1% por seis horas. Para a análise cromossômica convencional, as lâminas foram preparadas usando a técnica clássica de esmagamento de folículos testiculares e ovarianos seguida pela coloração com orceína lacto-acética a 2%. Para a coloração com nitrato de prata e FISH, as lâminas foram preparadas com a adição de uma gota de ácido acético a 45% e as lamínulas retiradas em nitrogênio líquido.

Tabela 1. Localidades e número de indivíduos de Rhammatocerus brasiliensis coletados no Estado de Pernambuco, Brasil.

Micro-região Localidade Coordenadas Sexo Machos Fêmeas Mata-Litoral Recife 803’14’’S 34052’52’’W 03 01 Jaboatão 86’46’’S00 350’53’’W 04 02 Cabo 8017’12’’S 3502’6’’W 08 - Surubim 7049’59’’S 350 45’17’’W 04 - Agreste Gravatá 800 12’4’’S 35 33’53’’W 10 05 Bonito 8028’13’’S 350 43’43’’W 05 - Toritama 800 0’24’’S 36 3’24’’W 05 - Sertão Serra Talhada 7059’31’’S 38017’54’’W 05 -

A coloração com nitrato de prata seguiu a metodologia de Rufas et al. (1985). As preparações citológicas foram pré-tratadas com 2xSSC a 600C por 10 minutos e coradas com uma solução de AgNO3 em água destilada (pH ajustado com ácido fórmico) (1:1) e incubadas em câmara úmida a 700C por 3 minutos. Para a retirada de excesso de citoplasma, lâminas foram incubadas em 150Pl de pepsina (50Pg/ml em HCl a 0,1%) a 370C em câmara úmida por cerca de 10 minutos. Em seguida as lâminas foram lavadas três vezes em água destilada, desidratas em uma série de etanol (70, 90 e 100%) por 3, 3 e 5 minutos respectivamente e estocadas a 600 C overnight antes da hibridização in situ. A FISH foi realizada com a sonda pTa71 que contêm uma repetição de 9kb isolado de Triticum aestivum. A sonda foi marcada por nick translation com Fluored-11-dUTP. A hibridização seguiu a metodologia descrita em López-León et al. (1994). A sonda foi

71 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... misturada a uma concentração final de 5ng/Pl em uma solução contendo formamida a 40%, sulfato de dextran a 10%, SDS (sulfato dodecil de sódio) a 0,1% e 70ng/Pl de DNA de esperma de salmão. O DNA cromossômico foi desnaturado pela incubação com a mistura de hibridização em uma placa aquecedora a 800C por 8 minutos. A renaturação ocorreu a 370 C overnight. Posteriormente, as lâminas foram submetidas a uma série de lavagens (2xSSC a 370 C, 2xSSC e 4xSSC/Tween20 a temperatura ambiente). As lâminas foram contracoradas com DAPI e montadas em solução antifade. Fotografias foram feitas usando filme Kodak ISO 25 e para FISH imagens foram digitalizadas e montadas em Adobe Photoshop.

Resultados

As espécies Rhammatocerus brasiliensis, R. brunneri, R. palustris, R. pictus e Amblytropidia sp. apresentaram cariótipos similares, todas com 2n=23, X0 e 24,XX (Figura 1 e 2) com cromossomos acrotelocêntricos (Figura 1b). Os bivalentes foram organizados de acordo com o tamanho em 3 pares grandes (G13 -G ), 5 médios (M 4 -M 8 ) e 3 pequenos (P 9 -

P11 ) sendo o X de tamanho médio. O comportamento heteropicnótico variável do cromossomo X também foi observado e mostrou-se similar nas cinco espécies (Figura 1a, c-d). Adicionalmente, Amblytropidia sp. apresentou um par autossômico (M8 ) megamérico (Figura 1c-d). O par megamérico foi heteropicnótico positivo no início da prófase I e a partir de diacinese retornou à condição isopicnótica. A coloração com nitrato de prata permitiu visualizar RONs ativas apenas na região pericentromérica do bivalente P9 em R. brunneri, R. palustris (Figura 2c), R. pictus e Amblytropidia sp. (Figura 2e). R. brasiliensis, por sua vez, mostrou três pares autossômicos

(M4, M69 e P ) como organizadores nucleolares com as RONs localizadas pericentromericamente (Figura 2a). Analisando exemplares dessa espécie de diferentes populações foi possível observar que o comportamento de atividade das RONs foi similar. Aproximadamente 85% das 100 células em leptóteno e zigóteno observadas, mostraram três massas nucleolares individualizadas e de tamanho similar, enquanto cerca de 15% mostraram uma ou duas massas de tamanho distinto indicando o resultado da fusão entre alguns nucléolos. Levando em consideração um valor médio de 50 células em paquíteno ou

72 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... início de diplóteno, nas quais os bivalentes podem ser individualizados, 100% das células analisadas mostraram atividade transcricional nos três pares portadores de RONs. A hibridização in situ com sonda de DNAr (18S + 28S e 5.8S) foi utilizada em células meióticas de R. brasiliensis, R. brunneri, R. palustris, R. pictus e Amblytropidia sp. permitindo mapear todos os sítios de DNAr. Em todas as espécies a FISH confirmou as RONs ativas visualizadas com nitrato de prata e nenhum sítio adicional foi identificado (Figura 2b, d, f-h).

Discussão

De acordo com a análise convencional, as espécies descritas nesse trabalho apresentaram número diplóide de 2n=23,X0 e 24,XX concordando com os estudos cariotípicos descritos em gonfoceríneos neotropicais (Mesa et al., 1982; Vilardi, 1986; Remis 1993). Este número também representa a condição cariotípica básica para Acrididae. Quando comparados os cariótipos de gonfoceríneos neotropicais com aqueles da Região Paleártica (mais amplamente estudados), esses últimos se destacam pela variabilidade cariotípica apresentada. Espécies com 2n=23,X0 cromossomos acro-telocêntricos constituem uma menor parcela diante da grande maioria de espécies que possuem complemento cariotípico de 2n=17,X0 e 18,XX e apresentam 3 pares de autossomos com dois braços (geralmente os pares G13 -G metacêntricos). Entre essas espécies destacam-se aquelas dos gêneros Chorthippus (22), Euchorthippus (4), Omocestus (8) e Stenobothrus (7) todas com 2n=17,X0. Por outro lado, embora a constituição cariotípica de 2n=17,X0 seja a mais freqüente, parece ter sido derivada a partir de fusões cêntricas de cariótipos com 2n=23,X0 (para revisão ver Cabrero e Camacho, 1986; Bugrov, 1996). Cromossomos megaméricos apresentam alta compactação e heteropicnose positiva no início da prófase I correspondendo a importantes marcadores cariotípicos. Esses cromossomos têm sido descritos em vários representantes de Gomphocerinae (Chorthippus binotatus, C. brunneus, C. jucundus, C. vagans, Euchorthippus pulvinatus, Omocestus bolivari e O. llorenteae) (Cabrero e Camacho, 1986). Para o gênero Amblytropidia, megaméricos podem ser freqüentes pois foram descritos em A. australis (M89 ou M )

(Remis, 1989) e em Amblytropidia sp. (M8 ) (aqui analisada).

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Considerando a possível origem e dispersão de gafanhotos neotropicais, Carbonell (1977) admitiu que grupos de distribuição mundial teriam, primeiramente, surgido no Velho Mundo e depois alcançado as Américas. Particulamente para gonfoceríneos, Jago (1971) propôs que a dispersão desse grupo teria iniciado no Período Cenozóico pelo Leste da Ásia, atingido a América do Norte pelo estreito de Bering e por fim irradiaram-se pela América Central e América do Sul. Com base nessas teorias a análise citogenética comparativa usando marcadores cromossômicos pode ser útil para traçar um possível caminho evolutivo dentro da subfamília Gomphocerinae. O resultado da análise de RONs tem se mostrado útil para esse propósito. Em alguns organismos a localização mais freqüente de genes de DNAr em cromossomos específicos são apontadas como a condição ancestral. Cabrero e Camacho

(1986) analisaram 20 espécies de gonfoceríneos com AgNO3, e nesses representantes paleárticos a localização mais freqüente das RONs foi nos pares G23 , G e no X. Para representantes da região Neotropical a única descrição cromossômica de RONs em gonfoceríneos foi em Scyllina signatipennis com localização desses sítios na região proximal do X e terminal de G3 através do uso da coloração com hematoxilina (Bidau, 1984). Nossos resultados indicam um novo sítio de localização e expressão de genes de

DNAr em gonfoceríneos neotropicais: a posição pericentromérica do P9 . Essa região foi o reservatório de genes ribossomais em todas as espécies analisadas e em Rhammatocerus brunneri, R. palustris, R. pictus e Amblytropidia sp. representa o único sítio de DNAr destas espécies. Embora Amblytropidia sp. tenha sido a única a apresentar cromossomo megamérico, nenhum sítio ribossomal foi visto neste cromossomo. Uma possível explicação para as diferenças no número de sítios de DNAr entre Rhammatocerus brasiliensis (três pares portadores de RONs) e as demais espécies poderia estar relacionada com a amplificação de genes DNAr (18S + 28S e 5.8S). Supõe-se que essa seqüência, inicialmente presente na região pericentromérica do P9, teria sido amplificada e dispersa para outras regiões cromossômicas em R. brasiliensis (região pericentromérica de M4 e M6 ). Em alguns casos a multiplicação de genes ribossômicos no cariótipo é seguida de metilação de algumas seqüências resultando na inativação de genes (Suja et al., 1993; López-León et al., 1995). Um caso particular ocorreu no gonfoceríneo Staurodeurus scalaris em que todos os cromossomos apresentaram sítios de DNAr.

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Entretanto, apenas no bivalente G3 o sítio foi expresso (López-León et al., 1999), sugerindo que o pequeno tamanho de alguns sítios e a competição por fatores de transcrição pode ter impedido a expressão de múltiplas seqüências. Em R. brasiliensis, os três sítios de DNAr 45S observados são de tamanhos similares e todas as seqüências são sempre expressas. Diferenças populacionais de expressão de RONs foram relatadas em Eyprepocnemis plorans. Enquanto nos espécimens provenientes da Espanha, RONs são vistas em grande atividade nos pares P911 -P e no X, nos exemplares provenientes de Marrocos todos os cromossomos mostram RONs ativas. Contudo o P910 e o P são menos ativos nesses exemplares do que nos provenientes da Espanha (Bakkali et al., 2001). Em R. brasiliensis não foi observada nenhuma diferença na atividade de RONs entre as populações analisadas mesmo considerando as variações ambientais tais como temperatura e índice pluviométrico nas micro regiões do Estado de Pernambuco (mata, agreste e sertão). Considerando que o centro de surgimento e dispersão de gonfoceríneos foi o Velho Mundo e que as espécies da Região Neotropical são derivadas do grupo Paleártico, nossos resultados indicam uma diferenciação cromossômica quanto ao número e à localização de RONs nos representantes neotropicais. Por outro lado, algumas dessas espécies têm apenas um par cromossômico portador de RONs (P9). Esse padrão pode representar uma condição evolutiva derivada, considerando que esse marcador cariotípico apresentava localização preferencial em autossomos de tamanho grande, megaméricos e no cromossomo X nos grupos ancestrais.

Agradecimentos

Somos gratos ao Prof. Carlos S. Carbonell da Universidade de Montevideo, Uruguai pela identificação taxonômica das espécies e pelo envio dos exemplares de Rhammatocerus pictus. Contamos com o apoio financeiro da CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) – Programa Doutorado Sandwich, e da FACEPE (Fundação de Amparo à Ciênica do Estado de Pernambuco) para a realização deste trabalho. J Cabrero, MD López-León and JPM Camacho são gratos ao Ministerio de Ciencia y Tecnologia (BOS2000-1521) e Plan Andaluz de Investigación, Grupo no. CVI-165, Espanha.

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Figura 1 Coloração convencional em células meióticas de Rhammatocerus brasiliensis (a- b) e Amblytropidia sp. (c-d). (a) diplóteno, (b) metáfase II com 11 cromossomos, (c) diplóteno, o M representa o cromossomo megamérico e (d) metáfase I. Barra = 10 Pm.

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Figura 2 Coloração com nitrato de prata (a,c,e) e FISH com sonda de DNAr 45S (b,d,f-h). (a-b) Paquíteno e diplóteno de R. brasiliensis, (c-d) Paquíteno e diplóteno em R. palustris, (e-f) Paquíteno e metáfase I de Amblytropidia sp., o M representa o megamérico, (g-h) Diplóteno e Diacinese de R. brunneri e R. pictus. As setas indicam as RONs e os sítios de DNAr. Barra = 10 Pm.

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VI. CAPÍTULO 3: Provável origem autossômica para macro - cromossomos B em duas espécies de gafanhotos

Artigo a ser submetido à revista Heredity publicada na Inglaterra

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Provável origem autossômica para macro - cromossomos B em duas espécies de gafanhotos

V Loreto1, MJ Souza12 , J Cabrero , MD López-León 2 and JPM Camacho 2 1Departamento de Genética, CCB, Universidade Federal de Pernambuco. Av. Prof. Moraes Rego s/n, Cidade Universitária, Recife, PE, 50732-970, Brasil 2Departamento de Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, 18071, Granada, Spain

Análise convencional dos macro-cromossomos B acrocêntricos de Rhammatocerus brasiliensis (Acrididae-Gomphocerinae) e Xyleus angulatus (Romaleidae) indicou extensa similaridade com o cromossomo X de cada espécie com relação à morfologia, tamanho, picnose e à ocorrência de associações. Contudo, a utilização de bandeamento C, fluorocromos base-específicos e FISH com sonda de DNAr 45S e 5S possibilitaram sugerir que o cromossomo B de R. brasiliensis tenha se originado a partir de um cromossomo médio, portador de sítio DNAr 5S, enquanto o B de X. angulatus provavelmente não tem como precursor o X pela ausência de genes de DNAr 45S no B e sua presença no X. A ocorrência do cromossomo B em todas as nove populações de R. brasiliensis analisadas permitiu determinar que o polimorfismo para esse cromossomo é amplamente distribuído, sugerindo uma origem anterior à dispersão da espécie pelo Nordeste do Brasil.

Palavras-chave: cromossomo B; FISH; polimorfismo; Rhammatocerus; Xyleus

Introdução

Cromossomos B, também chamados de supernumerários ou acessórios, têm sido caracterizados como elementos extras encontrados no cariótipo de diferentes organismos eucariotas. Esses cromossomos têm sido descritos em mais de 1300 espécies de plantas e 500 de animais (Jones e Rees, 1982; Jones e Puertas, 1993). Cerca de 80% dos casos de cromossomos B no reino animal ocorrem em insetos, principalmente dípteros, coleópteros e ortópteros. Nesses últimos, foram descritos em mais de 100 espécies, sendo a maioria pertencente a gafanhotos da família Acrididae (Hewitt, 1979). Esses cromossomos apresentam características particulares como modo de transmissão não-mendeliano, baixa frequência de genes funcionais e comportamento variável nas divisões meióticas e mitóticas, podendo levar ao surgimento de mecanismo de acumulação. Adicionalmente, são considerados parasitas genômicos dos indivíduos portadores (Jones e Rees, 1982; Camacho et al., 2000).

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De acordo com a sua natureza heterocromática, os cromossomos B passaram a ser estudados através de técnicas que permitem identificar aspectos da composição e organização da heterocromatina constitutiva (HC). Henriques-Gil et al. (1984) analisaram o padrão de bandas C em 14 tipos de B em Eyprepocnemis plorans, e observando que o conteúdo de HC variou entre os Bs. Alguns tipos como o B5, B8 e B13 apresentaram-se quase inteiramente heterocromáticos. Por sua vez, os isocromossomos B10 e B 11 mostraram pouca HC. No tetigonídeo Pycnogaster cucullata, o padrão de bandeamento C permitiu distinguir o cromossomo B dos demais cromossomos do complemento pela presença de dois blocos intercalares de HC neste cromossomo (Sentis e Fernandez-Piqueras, 1985). Pesquisas realizadas a partir dos anos 90 envolvendo isolamento, clonagem e sequenciamento de DNA repetitivo localizado em cromossomos B têm demonstrado que esses cromossomos são constituídos de seqüências similares às encontradas em cromossomos A, além de seqüências específicas. Em E. plorans, por exemplo, a principal localização de uma seqüência de DNA repetitivo (180pb) foi no cromossomo B (López- León et al., 1994; Camacho et al., 2000). Além disso, cromossomos B também podem conter genes estruturais, particularmente genes ribossomais. Essas seqüências foram detectadas por hibridização in situ fluorescente (FISH) em algumas espécies de plantas e animais, como no caso dos gafanhotos Dichroplus pratensis e E. plorans (Bidau, 1986; López-León et al., 1994). Considerando a origem e evolução de cromossomos B, algumas teorias clássicas (Jones e Rees, 1982) e outras mais recentes (Camacho et al., 2000) têm sido propostas para explicar sua manutenção em populações naturais. Entre essas teorias, a mais amplamente aceita é a origem a partir de cromossomos A do cariótipo das espécies hospedeiras, principalmente de elementos que podem ser mais facilmente tolerados em condições polissômicas, como os cromossomos sexuais e alguns fragmentos cêntricos resultantes de fusões ou amplificações. Novas abordagens sobre origem de cromossomos B indicam outros mecanismos envolvidos na ocorrência desse polimorfismo. A origem interespecífica (cromossomos B surgem de cromossomos A de espécies relacionadas) foi demonstrada no peixe Poecilia formosa assim como a origem por mecanismos de eliminação cromossômica em espécies partenogenéticas como no caso do cromossomo B PSR do hinenóptero Nasonia vitripennis (Werren, 1991). Para explicar a manutenção de cromossomos B em

83 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... populações naturais duas hipóteses foram propostas. O modelo parasita ou egoísta propõe que esses cromossomos são mantidos pela ação de mecanismos de acumulação apesar de seus efeitos deletérios para o equilíbrio do hospedeiro. Por sua vez, o modelo heterótico admite que cromossomos B sem mecanismo de acumulação devem ser mantidos devido a efeitos benéficos que eles proporcionam aos seus hospedeiros quando ocorrem em pequeno número (Shaw e Hewitt, 1990; Camacho et al, 2000). Neste trabalho analisamos alguns aspectos do comportamento meiótico dos cromossomos B de Rhammatocerus brasiliensis (Acrididae, Gomphocerinae) e de Xyleus angulatus (Romaleidae, Romaleinae). Além disso, características da HC detectadas pelo bandeamento C, coloração com fluorocromos base-específicos e FISH com sondas de DNAr 45S e 5S possibilitaram propor evidências sobre a origem e manutenção desses polimorfismos nas populações analisadas destas espécies.

Material e Métodos

Uma amostra de 400 indivíduos (378 machos e 22 fêmeas) de Rhammatocerus brasiliensis foi coletada em diferentes localidades dos estados de Pernambuco (PE) e Bahia (BA) no Nordeste do Brasil (Tabela 1). Trinta e oito indivíduos de Xyleus angulatus foram coletados em duas populações naturais, sendo uma no estado de Pernambuco (700 50’3’’S 34 54’23’’W) (Igarassú -18 fêmeas e 10 machos) e outra no Piauí, Brasil (70 26’33’’S 400 39’40’’W) (Marcolândia- 10 machos). Os gafanhotos foram trazidos ao laboratório, dissecados e os testículos e ovários fixados em etanol:ácido acético (3:1). As fêmeas foram tratadas com colchicina por um período de 6 horas. As lâminas foram preparadas a partir da técnica clássica de esmagamento de folículos testiculares e ovarianos, seguida pela coloração com orceína lacto-acética a 2% para a análise cromossômica convencional e detecção dos indivíduos com e sem cromossomo B. Para as diferentes técnicas de bandeamento e FISH, as lâminas foram preparadas com a adição de uma gota de ácido acético 45% e cobertas com lamínulas que foram retiradas após o congelamento em nitrogênio líquido. O bandeamento C foi realizado segundo a metodologia de Sumner (1972). As lâminas envelhecidas por dois dias foram tratadas com HCl 0,2N por 30 minutos, hidróxido de bário

84 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... a 5% (6000 C) 45 segundos e em 2xSSC (60 C) 45 minutos. Depois de secas as preparações foram coradas com Giemsa a 5% diluído em tampão fosfato (pH 7.0) por 3 minutos. Para a tríplice coloração CMA3 /DA/DAPI (Schweizer et al., 1983) as lâminas foram envelhecidas por 3 dias e coradas com CMA3 (0,5 mg/ml em tampão McIlvaine, pH 7.0) por uma hora, lavadas em água destilada, coradas com Distamicina A (DA) (0,1 mg/ml) por 40 minutos, lavadas novamente e coradas com DAPI (0,5 Pg/ml) por 15 minutos. As fotografias foram obtidas em microscópio Leica usando filmes KODAK asa 25 e TMAX-400. Cópias fotográficas foram feitas em papel Kodak Kodabrome Print F3.

Hibridização in situ fluorescente (FISH) para DNAr 45S e 5S

A sonda pTa71 contendo fragmentos de genes de DNAr 45S (5,8S, 18S e 28S) de Triticum aestivum foi usada para localizar seqüências de DNAr de acordo com López-León et al (1994). A sonda foi marcada com Fluored (rodamina-11-dUTP) e as preparações citológicas foram submetidas a um pré-tratamento com RNase, lavagens em solução salina (2xSSC), fixação com paraformaldeído e desidratação. A hibridização ocorreu a 700C por 10 minutos. As lâminas foram deixadas overnight para renaturação, depois sofreram processos de novas lavagens em 2xSSC, coradas com DAPI e montadas em solução de antifade. As lâminas foram analisadas e aquelas células de interesse digitalizadas a partir da captura de imagens (Zeiss com câmera Olimpus DP50) e as figuras compostas usando o Adobe Photoshop. A sonda de DNAr 5S foi obtida por PCR a partir do DNA genômico de Rhammatocerus brasiliensis usando os primers universais 5S-nRNA.F-1 (5’-AACGACCATACC ACGCTGAA-3’) e 5S-nRNA.R-1 (5’-AAGCGGTCCCCCATCTAAGT-3’). Os produtos da PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose para verificar a amplificação da seqüência e avaliar o tamanho do fragmento (<100pb). A sonda DNAr 5S foi marcada diretamente com Fluored (rodamina-11-dUTP) e a FISH seguiu a técnica de López-León et al (1994).

85 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

Resultados

O cromossomo B de Rhammatocerus brasiliensis

O cariótipo normal de R. brasiliensis consiste de 2n=23,XO/2n=24,XX. Adicionalmente, um cromossomo B acrocêntrico foi identificado em 50 machos dos 400 indivíduos analisados (Tabela 1, Fig.1a). Apenas um indivíduo da população de Bezerros foi 2B (Fig. 1d). Em algumas células o cromossomo B aparentou tamanho similar ao X (Fig.1a), contudo, em diacinese e metáfase I foi possível notar que esse elemento extra é um pouco menor que o X (Fig. 1c-d). O cromossomo B, assim como o X, apresentou comportamento heteropicnótico variável ao longo da meiose I, sendo heteropicnótico positivo do leptóteno ao diplóteno (Fig. 1a-b) e negativo em diacinese e metáfase I (Fig. 1c-d). Em paquíteno e diplóteno de alguns indivíduos portadores do cromossomo B, foi possível observar no terço distal do braço longo do B uma região descondensada caracterizada como um gap (Fig. 1b). Associações entre o B e o X foram vistas freqüentemente (Fig. 1c). Esse tipo de associação entre os elementos foi ponta-a-ponta e em apenas um indivíduo ela persistiu até a telófase I. O padrão de bandeamento C do cromossomo B de R. brasiliensis revelou um pequeno bloco heterocromático na região pericentromérica. Adicionalmente, a eucromatina desse cromossomo apresentou-se mais condensada (corada mais fortemente) do que a dos demais cromossomos do complemento (Fig. 2a). Quando analisada a riqueza deste bloco, quanto ao conteúdo de pares de base GC/AT pela tríplice coloração CMA3/DA/DAPI, foi vista uma fluorescência brilhante pelo CMA3 correspondente a toda a banda C pericentromérica (Fig. 2b). A utilização da FISH com sondas ribossomais (DNAr 45S e 5S) mostrou diferentes respostas no cariótipo de indivíduos 1B de R. brasiliensis. A sonda de DNAr 45S evidenciou sinais pericentroméricos apenas nos autossomos M4, M6 e P9 (Fig. 3a) sem que o X e o B apresentassem seqüências adicionais. Por outro lado, a sonda 5S mostrou pequenos sinais brilhantes na região pericentromérica de alguns pares médios (M56 e M ) e no P11 , intersticial no M 4 e pericentromérica no B (Fig. 3b-c). Uma vez que o B e o X podem ser confundidos pelo tamanho e picnose similar, realizamos a FISH para DNAr 5S em indivíduos (0B) e os sinais foram apenas visualizados nos autossomos.

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O cromossomo B de Xyleus angulatus

Xyleus angulatus apresenta número diplóide de 2n=23,X0/2n=24,XX. O cromossomo B desta espécie é acrocêntrico e seu tamanho um pouco menor que o X. Comportamento heteropicnótico variável também foi visto. Sendo o B, assim como o X, heteropicnótico positivo do leptóteno ao diplóteno e negativo em diacinese e metáfase I (Fig. 1e-f). Associação entre o B e o X foram vistas com freqüência. Em diplóteno, na grande maioria das células, estão dispostos em uma organização do tipo lado-a-lado geralmente na periferia da célula (Fig. 1e), em diacinese essa associação é desfeita e em metáfase I dispõem-se separadamente em direção aos pólos (Fig. 1f). O bandeamento C quando empregado em metáfase espermatogonial revelou que o cromossomo B apresenta uma típica banda pericentromérica e regiões heterocromáticas alternadas com eucromáticas em todo o comprimento do braço longo. Nas porções heterocromáticas destacam-se dois blocos, um proximal e outro subdistal (Fig. 2c). Em diplóteno a análise do padrão de bandeamento C foi dificultada devido à maior condensação desse cromossomo. Por outro lado, em alguns indivíduos com cromossomo B foi possível verificar a ocorrência de segmentos extras heterocromáticos em dois bivalentes médios e um pequeno (Fig. 2d). Os indivíduos 1B mostraram constância no número de cromossomo adicional em todas as células. Em metáfases mitóticas de células de parede de ovaríolo de fêmea foi observado 2B, com padrão de bandas C idêntico (Fig. 2e). Tanto em mitose como em meiose a eucromatina do B sempre mostrou-se mais fortemente corada pelo Giemsa o que permitiu a rápida identificação desse cromossomo entre os membros normais do cariótipo (Fig. 2c-e). A análise da HC do B com fluorocromos base-específicos + evidenciou uma uniformidade na coloração com o DAPI e um diminuto bloco CMA3 localizado na região pericentromérica desse cromossomo (Fig. 2f). Quando usada a FISH com sonda de DNAr 45S em indivíduos 1B foram visualizados sinais apenas no par autossômico G3 e no X (Fig. 3d).

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Discussão

Considerando as teorias de origem de cromossomo B a partir de elementos A (origem intraespecífica) uma das questões que tem intrigado os pesquisadores é saber qual elemento exato do cariótipo deu origem ao B. De acordo com a classificação de Hewitt (1973) para esses cromossomos em gafanhotos, cromossomos B que são de tamanho médio (macro- cromossomos) e que apresentam similaridades com o X, possivelmente foram derivados do cromossomo X. Outros aspectos que contribuem para consolidar essa hipótese são o comportamento meiótico similar (morfologia, picnose e associações) e organização da heterocromatina constitutiva. De fato, considerando esses aspectos, nossos resultados indicariam inicialmente uma provável origem do B a partir do X. Contudo, quando utilizados a análise diferencial por bandeamentos e o uso de marcadores moleculares (DNAr 45S e 5S), autossomos médios parecem mais aceitáveis como precursores dos cromossomos B, para as duas espécies estudadas.

O cromossomo B de Rhammatocerus brasiliensis e a sua provável origem

A ocorrência e a possível origem de cromossomos B em representantes de Gomphocerinae têm sido freqüentemente descritas, com ênfase na análise convencional. Myrmeleotettix maculatus foi uma das primeiras espécies desse grupo para a qual cromossomo B foi descrito. Nesse gonfoceríneo, uma grande semelhança entre o isocromossomo B (iso-B) e o X foi observada, o que levou os autores a sugerirem uma possível origem do B a partir da deleção da metade distal do X (Gallagher et al., 1973). Por sua vez, o B submetacêntrico de Chorthippus vagans mostrou blocos heterocromáticos no braço longo e nos telômeros, sugerindo uma condição derivada de um iso-B metacêntrico por inversão pericêntrica (Cabrero e Camacho, 1987). Em outros representantes deste grupo (Gomphocerus sibiricus e Omocestus bolivari) também foi observado polimorfismo para cromossomo B, contudo, nenhuma hipótese foi proposta para a sua origem (Gosálvez e López-Fernandez, 1981; Viseras e Camacho, 1985). Nos gonfoceríneos neotropicais cromossomos B foram descritos em Euplectrotettix shultzi e E. conspersus (Vilardi, 1986a), Amblytropidia australis (Remis, 1989), Scyllina

88 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... signatipennis (Bidau, 1984) e Sinipta dalmani (Colombo e Remis, 1997). Nessa última, dois tipos de B foram identificados: um B telocêntrico (BT) médio semelhante ao X e um B diminuto menor que os pequenos pares autossômicos. O cromossomo B de R. brasiliensis tem características mais similares com o B de alguns representantes neotropicais, como A. australis e o BT de Sinipta dalmani, o que poderia constituir os primeiros indícios de similaridade entre esses gêneros ou uma origem intraespecífica comum entre cromossomos B. Origem comum de cromossomos B foi proposta para explicar a similaridade dos iso-Bs de E. shultzi e E. conspersus por Vilardi (1986a). Foi sugerido que um iso-B estava presente no ancestral comum às espécies antes da divergência entre as mesmas.

Em R. brasiliensis o bandeamento C e a coloração CMA3/DA/DAPI permitiram sugerir + que o tipo e a organização da HC do B (pequeno bloco pericentromérico, CMA3 ) é similar aos demais cromossomos do complemento. Nos estudos cromossômicos de gafanhotos portadores de cromossomos B, fluorocromos base-específicos têm sido pouco usados na análise da HC extra. Em E. plorans, a utilização de CMA3 e DAPI mostrou que o B foi homogeneamente corado (López-Fernández et al. 1992). Como em R. brasiliensis foi detectado um único tipo de HC mostrando conservação cariotípica, as técnicas de bandeamento não foram suficientes para propor algum indício sobre a origem do B desta espécie.

A provável origem do B2 de E. plorans a partir do X foi proposta através da utilização de duplo FISH (DNAr e DNAsat) mostrando que a ordem da localização de ambas as seqüências no centrômero do cromossomo B coincidia somente com a do X (López-León et al., 1994). Embora no presente trabalho não tenha sido usado duplo FISH para as seqüências ribossômicas em R. brasiliensis, os resultados mostraram que as seqüências múltiplas 45S e 5S co-localizam em alguns pares cromossômicos (M46 e M ) e no M 6 parecem estar justapostas. Co-localização de seqüências ribossômicas são pouco conhecidas, contudo, alguns exemplos têm sido destacados em peixes (Almeida-Toledo et al., 2002). De fato, o uso de marcadores moleculares permitiu sugerir as primeiras evidências da origem do B de R. brasiliensis. Como não houve correlação entre as seqüências DNAr 45S dos três pares autossômicos com o X ou o B e as seqüências DNAr 5S foram vistas em vários autossomos (M4, M5, M611 e P ) e também no B, a hipótese mais provável para a

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origem do B seria a partir de um cromossomo médio (provavelmente o M5 ) que também possui sítios de DNAr 5S (Tabela 2). Cabrero et al. (2003) aplicaram como marcadores moleculares genes de DNAr 5S para confirmar a origem do B1 a partir do X em distintas populações de E. plorans. Em populações da Espanha e de Marrocos a ausência desses genes no B e no X (os sinais foram vistos em vários pares autossômicos) confirmaram a hipótese prévia, mas em populações dos Cáucasos sinais 5S foram vistas no B e em autossomos indicando origem autossômica. A ocorrência de gap no braço longo do B de R. brasiliensis permitem duas explicações. A primeira seria a possível localização de uma RON naquela posição, contudo, dados de FISH mostraram a inexistência de seqüências DNAr 45S no B. Outra possibilidade estaria relacionada a uma descondensação da cromatina ou mudança na sua organização sugerindo um processo inicial de evolução do B. Gaps que não apresentam relação com regiões de banda C ou RONs são pouco freqüentes em gafanhotos. Um caso conhecido ocorreu no cromossomo X de Psophrus stridulus (Suja et al., 1986), contudo, não foi descartada a possibilidade de ser uma RON latente. Com relação a visualização de gap em cromossomo B de gafanhoto nenhum relato até então é conhecido. O cromossomo B de R. brasiliensis apresentou freqüência média geral de 12,5%. Com relação a sua distribuição dois aspectos significantes merecem destaque a amplitude e a similaridade de freqüências médias nas populações de maior amostragem. Uma vez que em todas as populações analisadas ocorreram indivíduos portadores do B podemos determinar que se trata de um polimorfismo amplamente distribuído, sugerindo uma origem anterior à sua dispersão pelo Nordeste do Brasil. Em E. plorans as barreiras geográficas e fatores históricos (o local do qual o B foi originado) foram apontados por Cabrero et al. (1997) como aspectos que poderiam constituir variação na capacidade invasora de indivíduos portadores de B nesta espécie. Por outro lado, o sucesso da ampla distribuição do B de Locusta migratoria parece estar relacionada com o sucesso reprodutivo e a ampla capacidade de vôo dessa espécie justamente com a inexistência de efeitos danosos ao hospedeiro (Castro et al., 1998). Nas populações de R. brasiliensis aqui analisadas, se considerarmos, por exemplo, as duas mais extremas Itamaracá-PE e Rio de Contas-BA, a altitude e as distâncias entre elas são suficientes para constituir isolamento reprodutivo o que consolida a condição de surgimento do B prévio à irradiação. A descoberta do mesmo

90 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... cromossomo B de Metaleptea brevicornis adspersa a uma distância de cerca de 1000km do local de sua identificação original, sugere antiguidade do polimorfismo e/ou existência de interação reprodutiva e fluxo genético entre populações com uma vasta separação geográfica (Pastori e Bidau, 1994).

O cromossomo B de Xyleus angulatus e sua provável origem

Os romaleídeos, gafanhotos predominantemente neotropicais, apresentam poucas espécies descritas cariotipicamente. Desta forma, polimorfismos para cromossomos B são pouco conhecidos nesse grupo. Zoniopoda tarsata, representa uma espécie com esse polimorfismo (Vilardi, 1986b). Nessa espécie dois tipos de cromossomo B foram descritos, um BT cujo comprimento representa 1/3 do X com banda C proximal e um B diminuto com banda C procêntrica. Em X. angulatus a ocorrência de B foi primeiro descrita por Souza e Kido (1995). Assim como ocorreu para R. brasiliensis, o B de X. angulatus mostrou extrema similaridade com o X quanto à morfologia, tamanho (embora o X seja pouco maior), picnose e à ocorrência de associações ao longo da meiose I. Entretanto, diferenças foram observadas quando técnicas de bandeamento foram empregadas. O padrão de bandas C do B é diferente dos outros membros do cariótipo de acordo com a descrição de Souza e Kido (1995). Este padrão permite sugerir ocorrência de amplificação de HC para formar as regiões heterocromáticas alternadas com as eucromáticas nesse cromossomo. Além disso, quando utilizada a coloração com CMA3 /DA/DAPI no B de X. angulatus apenas o bloco + pericentromérico foi CMA3 , indicando que as demais regiões heterocromáticas no B têm composição distinta da pericentromérica. Heterocromatina extra na forma de segmentos supernumerários foi encontrada em indivíduos portadores de cromossomo B em X. angulatus. Em Gomphocerus sibiricus e Zoniopoda tarsata, cromossomos B e segmentos supernumerários também foram descritos, contudo ocorreram independentemente em diferentes indivíduos (Gosálvez e López- Fernandez, 1981; Vilardi, 1986b). Por sua vez, fêmeas de E. plorans apresentaram segmentos extras em conjunto com cromossomo B. A associação desses dois elementos levou a uma redução da transmissão de segmentos extras para a prole de fêmeas 1B e 2B

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(Perfectti et al., 2000). A grande quantidade de heterocromatina extra no cariótipo de X. angulatus (representada por indivíduos portadores de B e segmentos heterocromáticos) sugere novos questionamentos, tais como, se a origem dos segmentos extra é similar a do B e que tipos de benefícios ou estratégias de manutenção esses elementos apresentam para serem mantidos em conjunto no genoma. O principal indício que permite sugerir origem autossômica para o B de X. angulatus foi a localização das seqüências ribossomais 45S no cariótipo dessa espécie. Como um dos sítios está localizado na região pericentromérica do X e nenhum sinal de hibridização foi visto no B é mais correto admitir que o X não é precursor do B. Contudo, não descartamos a possibilidade de que ao longo da sua evolução o B possa ter perdido a seqüência, mas como visto em E. plorans, cuja origem do B2 está associada ao X pelo fato que ambos os cromossomos apresentaram um grande sítio ribossomal (López-León et al.,1994) que estava metilado no B (López-León et al.,1995), parece mais fácil a manutenção e aquisição de seqüências repetitivas do que a sua eliminação em cromossomos extras. Em conclusão, além dos conhecidos mecanismos de acumulação (vistos nas espécies aqui estudadas, porém em baixa freqüência) que garantem a manutenção de cromossomos B nas populações, nesse trabalho constatamos que o comportamento meiótico dos cromossomos B (“imitando” cromossomos X) pode também ser considerado uma estratégia evolutiva para sua integração ao cariótipo. Desta forma, a análise com marcadores moleculares começa a demonstrar que nem todos os casos de similaridade entre o B e o X indicam o seu modo de origem, mas como proposto por Camacho et al. (2000) pode ser um reflexo de processos que atuam sobre cromossomos extras.

Agradecimentos

Somos gratos ao Prof. Carlos S. Carbonell da Universidade de Montevideo, Uruguai pela identificação taxonômica das espécies. À Dra. Constância Ayres por disponibilizar a estrutura para a extração de DNA e à Cirlene Maria Silva pelo auxílio técnico. Contamos com o apoio financeiro da CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) – Programa Doutorado Sandwich, e da FACEPE (Fundação de Amparo à Ciênica do Estado de Pernambuco) para a realização deste trabalho. J Cabrero, MD López-León

92 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... and JPM Camacho são gratos ao Ministerio de Ciencia y Tecnologia (BOS2000-1521) e Plan Andaluz de Investigación, Grupo no. CVI-165, Spain.

Referências

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Fig.1 Comportamento meiótico do cromossomo B de Rhammatocerus brasiliensis (a-d) e Xyleus angulatus (e-f). Note em (b) o gap no cromossomo B (seta) em (c) a associação ponta-a-ponta e em (e) lado-a-lado entre o B e o X. Diplótenos (a, b, e), diacinese em (c) e metáfase I (d, f). Barra = 10 Pm.

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Fig.2 Padrão de bandeamento C (a, c-e) e CMA3 (b, f) no cariótipo de indivíduos 1B de R. brasiliensis (a-b) e de X. angulatus (c, d, f). Em (e) metáfase mitótica de uma fêmea 2B de X. angulatus. Note em (d) os três pares com segmentos extras hetrocromáticos (setas). Paquíteno em (f), diplótenos (a, d), metáfase II com 13 cromossomos em (b) e metáfase espermatogonial em (c). Barra = 10 Pm.

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Fig.3 Hibridização in situ fluorescente com sondas de DNAr 45S (a) e (d) e 5S (b-c) de indivíduos 1B de R. brasiliensis (a-c) e X. angulatus (d). Note em (a) e (d) ausência de sinais no B e em (b-c) os pequenos sinais 5S no B de R. brasiliensis. Barra = 10 Pm.

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Tabela 1 Amplitude da distribuição e freqüência de cromossomo B em Rhammatocerus brasiliensis

Localidade Coordenada Altitude 0B 1B Total Freqüência Itamaracá-PE 70 44’52’’S 3m 23 4 27 14,81% 340 49’32’’W Gravatá-PE 80 12’4’’S 447m 69 15 84 17,86% 350 33’53’’W Bezerros-PE 80 14’0’’S 470m 79 9* 88 10,23% 350 47’49’’W Bonito-PE 8028’13’’S 443m 56 8 64 12,50% 35043’43’’W Toritama-PE 800’24’’S 349m 60 6 66 9,09% 3603’24’’W Serra Talhada-PE 7059’31’’S 429m 11 1 12 8,33% 38017’54’’W Sobradinho-BA 9027’19’’S 28 2 30 6,67% 40049’24’’W Rio de Contas-BA 13034’44’’S 999m 11 2 13 15,39% 410 48’41’’W Itaberaba-BA 12031’39’’S 265m 13 3 16 18,75% 40018’25’’W *Um dos indivíduos foi 2B

Tabela 2 Localização das seqüências de DNAr 45S e 5S no cariótipo de Rhammatocerus brasiliensis.

G1 G2 G3 M4 M5 M6 M7 M8 P9 P10 P11 XB DNAr 45S - - - + - + - - + - - - - DNAr 5S - - - + + + - - - - + - +

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VII. CONCLUSÕES GERAIS

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VII. CONCLUSÕES GERAIS

A análise citogenética de três espécies de gafanhotos da subfamília Romaleinae (Romaleidae) e cinco representantes de Gomphocerinae (Acrididae), envolvendo técnicas de análise convencional, bandeamento C, coloração com nitrato de prata, fluorocromos CMA3 e DAPI e hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNAr, permitiu as seguintes conclusões:

1) Embora Chromacris nuptialis e C. speciosa tenham apresentado similaridades com relação ao número cromossômico, sistema sexual e morfologia cromossômica (2n=23,X0), as diferenças encontradas com relação ao padrão de bandas C, composição de bases da HC detectada pelo uso dos fluorocromos e posição de RONs indicaram um grau significativo de divergência entre essas espécies. Isto reforça, a distinção de status taxonômico proposto pela análise morfológica; 2) As irregularidades meióticas vistas em alguns indivíduos de C. nuptialis foram caracterizadas como eventos de adesão cromossômica que poderão resultar em rearranjos cromossômicos futuros nas regiões afetadas; 3) A análise comparativa da descrição cariotípica em Rhammatocerus brasiliensis, R. brunneri, R. palustris, R. pictus e Amblytropidia sp. indica similaridade quanto ao número diplóide (2n=23,X0) e morfologia acro-telocêntrica. Esses resultados confirmam a tendência de gonfoceríneos neotropicais em apresentar apenas esta constituição cariotípica em contraposição com representantes paleárticos que em sua maioria mostram complemento cariotípico do tipo 2n=17,X0;

4) A localização dos sítios de DNAr 45S na região pericentromérica do P9 em R. brunneri, R. palustris, R. pictus e Amblytropidia sp. constitui uma nova região para localização desses genes em gonfoceríneos e se contrapõem à localização cariotípica múltipla ou simples, envolvendo pares grandes, cromossomos megaméricos e o X predominantes em representantes da Região Paleártica. Por

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sua vez, as seqüências múltiplas de DNAr observadas no cariótipo de R. brasiliensis podem ser o produto da amplificação e dispersão de um par de

seqüências originais presentes no P9; 5) A provável origem do cromossomo B de R. brasiliensis foi atribuída a um par autossômico médio de acordo com os dados obtidos pela análise por FISH com sonda de DNAr 45S e 5S. Origem autossômica também é a explicação mais provável para o surgimento do cromossomo B em Xyleus angulatus com base nos padrões de banda C e FISH com DNAr 45S; 6) A ocorrência do cromossomo B em todas as nove populações de R. brasiliensis analisadas permitiu determinar que esse polimorfismo é amplamente distribuído, sugerindo uma origem anterior à dispersão da espécie pelo Nordeste do Brasil.

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VIII. ANEXOS

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Normas para a Genetica

Kluwer Academic Publishers request the submission of manuscripts and figures in electronic form in addition to a hard-copy printout. The preferred storage medium for your electronic manuscript is a 3 1/2 inch diskette. Please label your diskette properly, giving the manuscript number, exact details on the name(s) of the file(s), the operating system and software used. Always save your electronic manuscript in the word processor format that you use; conversions to other formats and versions tend to be imperfect. In general, use as few formatting codes as possible. For safety‘s sake, you should always retain a backup copy of your file(s). After acceptance, please make absolutely sure that you send the latest (i.e., revised) version of your manuscript, both as hard-copy printout and on diskette (submission in electronic form of the final version of your article is compulsory).

Kluwer Academic Publishers prefer articles submitted in word processing packages such as MS Word, WordPerfect, etc. running under operating systems MS DOS, Windows and Apple Macintosh, or in the file format LaTeX. Articles submitted in other software programs can also be accepted.

For submission in LaTeX, Kluwer Academic Publishers have developed a Kluwer LaTeX class file, which can be downloaded from: http://www.wkap.nl/authors/jrnlstylefiles/ use of this class file is highly recommended. Do not use versions downloaded from other sites. Technical support is available at: [email protected]. If you are not familiar with TeX/LaTeX, the class file will be of little use to you. In that case, submit your article in a common word processor format.

For the purpose of reviewing, articles for publication should be submitted as hard-copy printout (3-fold) and on diskette to:

Genetica Editorial Office P.O. Box 990 3300 AZ Dordrecht The Netherlands

Authors in North and South America should submit manuscripts to:

Editor-in-Chief, R.C. Woodruff Departments of Biological Sciences Life Science Building Bowling Green State University Bowling Green, OH 43403 U.S.A.

Manuscript Presentation

The journal‘s language is English. British English or American English spelling and terminology may be used, but either one should be followed consistently throughout the article British English (American English) spelling and terminology should be used consistently throughout the article. Manuscripts should be printed or typewritten on A4 or

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US Letter bond paper, one side only, leaving adequate margins on all sides to allow reviewers‘ remarks. Please double-space all material, including notes and references. Quotations of more than 40 words should be set off clearly, either by indenting the left- hand margin or by using a smaller typeface. Use double quotation marks for direct quotations and single quotation marks for quotations within quotations and for words or phrases used in a special sense.

Number the pages consecutively with the first page containing:

Title page

The title page should list in order: the title of the manuscript; the authors names and their institutional affiliations with concise addresses; the name, address, telephone and fax numbers, and E-mail address.

Abstract

The abstract should consist of a single paragraph of approximately 200 words which summarizes the subject. References should not be cited in the abstract.

Key words

Please provide 5 to 10 key words or short phrases in alphabetical order.

Abbreviations

Abbreviations and their explanations should be collected in a list.

Text

Four levels of headings should be used in the text. The first level should be bold-faced, freestanding and positioned flush to the left margin. This heading level should be reserved for blocks or text that constitute a major fraction of the article (e.g. Materials and methods). The second level of headings should be italics, freestanding, flush left. This heading level is used to group two or more closely related third-level heads in long-papers. The third level headings is the most frequently used subhead. It is italics, flush left with no white line underneath and is used to initiate the first paragraph of a sub-topic. The fourth level heading is paragraph-initiating italic followed by a colon. Desired location of tables and figures should be indicated in the margins.

Text citations with three or fewer authors should include all names while those with four or more authors should cite the first author and et al. Only articles that are published or in press should be cited. Citations of personal communications or unpublished results should list all names and initials. Numbers of ten or less should be written in full unless part of a date, a fraction or decimal, a percent or a unit of measurement.

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Taxonomic names

Taxonomic names of genera and lower taxa should be italicized. Authors are requested to mention the authorities of any taxa named in the articles.

Figures and Tables

Submission of electronic figures

In addition to hard-copy printouts of figures, authors are requested to supply the electronic versions of figures in either Encapsulated PostScript (EPS) or TIFF format. Many other formats, e.g., Microsoft Postscript, PiCT (Macintosh) and WMF (Windows), cannot be used and the hard copy will be scanned instead.

Figures should be saved in separate files without their captions, which should be included with the text of the article. Files should be named according to DOS conventions, e.g., ‘figure1.eps‘. For vector graphics, EPS is the preferred format. Lines should not be thinner than 0.25pts and in-fill patterns and screens should have a density of at least 10%. Font- related problems can be avoided by using standard fonts such as Times Roman and Helvetica. For bitmapped graphics, TIFF is the preferred format but EPS is also acceptable. The following resolutions are optimal: black-and-white line figures - 600 - 1200 dpi; line figures with some grey or coloured lines - 600 dpi; photographs - 300 dpi; screen dumps - leave as is. Higher resolutions will not improve output quality but will only increase file size, which may cause problems with printing; lower resolutions may compromise output quality. Please try to provide artwork that approximately fits within the typeset area of the journal. Especially screened originals, i.e., originals with grey areas, may suffer badly from reduction by more than 10-15%.

Avoiding problems with EPS graphics

Please always check whether the figures print correctly to a PostScript printer. If they do not, simplify your figures or use a different graphics program.

If EPS export does not produce acceptable output, try to create an EPS file with the printer driver (see below). This option is unavailable with the Microsoft driver for Windows NT, so if you run Windows NT, get the Adobe driver from the Adobe site (www.adobe.com).

If EPS export is not an option, e.g., because you rely on OLE and cannot create separate files for your graphics, it may help us if you simply provide a PostScript dump of the entire document.

How to set up for EPS and PostScript dumps under Windows

Create a printer entry specifically for this purpose: install the printer ‘Apple Laserwriter Plus‘ and specify ‘FILE‘: as printer port. Each time you send something to the ‘printer‘ you will be asked for a filename. This file will be the EPS file or PostScript dump that we can use.

The EPS export option can be found under the PostScript tab. EPS export should be used only for single-page documents. For printing a document of several pages, select

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‘Optimise for portability‘ instead. The option ‘Download header with each job‘ should be checked.

Submission of hard-copy figures

If no electronic versions of figures are available, submit only high-quality artwork that can be reproduced as is, i.e., without any part having to be redrawn or re-typeset. The letter size of any text in the figures must be large enough to allow for reduction. Photographs should be in black-and-white on glossy paper. If a figure contains colour, make absolutely clear whether it should be printed in black-and-white or in colour. Figures that are to be printed in black-and-white should not be submitted in colour. Authors will be charged for reproducing figures in colour.

Each figure and table should be numbered and mentioned in the text. The approximate position of figures and tables should be indicated in the margin of the manuscript. On the reverse side of each figure, the name of the (first) author and the figure number should be written in pencil; the top of the figure should be clearly indicated. Figures and tables should be placed at the end of the manuscript following the Reference section. Each figure and table should be accompanied by an explanatory legend. The figure legends should be grouped and placed on a separate page. Figures are not returned to the author unless specifically requested.

In tables, footnotes are preferable to long explanatory material in either the heading or body of the table. Such explanatory footnotes, identified by superscript letters, should be placed immediately below the table.

Appendices

This section should be reserved for large bodies of data of mathematical derivations that would disrupt the main text.

Cross-Referencing

In the text, a reference identified by means of an author‘s name should be followed by the date of the reference in parentheses and page number(s) where appropriate. When there are more than two authors, only the first author‘s name should be mentioned, followed by ‘et al.‘. In the event that an author cited has had two or more works published during the same year, the reference, both in the text and in the reference list, should be identified by a lower case letter like ‘a‘ and ‘b‘ after the date to distinguish the works.

Examples: Winograd (1986, p. 204) (Winograd , 1986a, b) (Winograd, 1986; Flores et al., 1988) (Bullen, Beauchamp & Bennett, 1990)

Acknowledgements

Acknowledgements of people, grants, funds, etc. should be placed in a separate section before the References.

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References

References to books, journal articles, articles in collections and conference or workshop proceedings, and technical reports should be listed at the end of the article in alphabetical order (see examples below). Articles in preparation or articles submitted for publication, unpublished observations, personal communications, etc. should not be included in the reference list but should only be mentioned in the article text (e.g., T. Moore, personal communication).

References to books should include the author‘s name; year of publication; title; page numbers where appropriate; publisher; place of publication, in the order given in the example below.

Green, M.M., 1988. Mobile DNA elements and spontaneous gene mutation, pp. 41-50 in Eukaryotic Transposable Elements as Mutagenic Agents, edited by M.E. Lambert, J.F. McDonald and I.B. Weinstein. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

References to articles in periodicals should include the author‘s name; year of publication; abbreviated title of periodical; volume number (issue number where appropriate); first and last page numbers, in the order given in the example below. All abbreviations of titles of journals should be in accordance with the World List of Scientific Periodicals.

Zhou, J.H., A. Myers & A. Atherly, 1991. Functional analysis of terminal sequences of the maize controlling element (Ac) by internal replacement and deletion mutagenesis. Genetica 80: 1-17.

Proofs

Proofs will be sent to the corresponding author by e-mail (if no e-mail address is available or appears to be out of order, proofs will be sent by regular mail).

Your response, with or without corrections, should be sent within 72 hours. Please do not make any changes to the PDF file. Minor corrections (+/- 10) should be sent as an e-mail attachment to: [email protected]. Always quote the four-letter journal code and article number and the PIPS No. from your proof in the subject field of your e-mail. Extensive corrections must be clearly marked on a printout of the PDF file and should be sent by first-class mail (airmail overseas).

Offprints

50 offprints of each article will be provided free of charge. Additional offprints (both hard copies and PDF files) can be ordered by means of an offprint order form supplied with the proofs.

Page Charges and Colour Figures

No page charges are levied on authors or their institutions. Colour plates will be inserted only at the author‘s expense.

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Copyright

Authors will be asked, upon acceptance of an article, to transfer copyright of the article to the Publisher. This will ensure the widest possible dissemination of information under copyright laws.

Permissions

It is the responsibility of the author to obtain written permission for a quotation from unpublished material, or for all quotations in excess of 250 words in one extract or 500 words in total from any work still in copyright, and for the reprinting of figures, tables or poems from unpublished or copyrighted material.

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Normas para a Genetic and Molecular Biology

Genetics and Molecular Biology (formerly named Revista Brasileira de Genética/Brazilian Journal of Genetics - ISSN 0100-8455) is published quarterly by the Sociedade Brasileira de Genética (Brazilian Society of Genetics).

The Journal considers contributions that present the results of original research in genetics, evolution and related scientific disciplines.

Although Genetics and Molecular Biology is an official publication of the Brazilian Society of Genetics, contributors are not required to be members of the Society.

It is a fundamental condition that submitted manuscripts have not been and will not be published elsewhere. With the acceptance of a manuscript for publication, the publishers acquire full and exclusive copyright for all languages and countries.

Manuscripts considered in conformity with the scope of the journal as judged by the Editor in conjunction with the Editorial Board are reviewed by the Associate Editors and two or more external reviewers. Acceptance by the Editor is based on the quality of the work as substantial contribution to the field and on the overall presentation of the manuscript .

SUBMISSION OF PAPERS

1. Manuscripts should be submitted to:

Fábio de Melo Sene, Editor-in-Chief Genetics and Molecular Biology Rua Capitão Adelmio Norberto da Silva, 736 14025-670 Ribeirão Preto, SP - Brasil

2. A submission package sent to the Editorial Office must contain:

a) A cover letter signed by all authors stating that they have approved the submission of the manuscript and that the findings have not been published or are not under consideration for publication elsewhere;

b) A copy of the manuscript, including original figures.

c) A cop of any unpublished or in-press companion articles referred to in the submission.

d) A copy of the text, tables and figures on a disk. Be sure that the disk is adequately protected. Formats for text are Word or RTF, in Windows platform. Images in TIFF or JPEG formats should be sent in separate files (For Figures, see detailed instructions in 3.1.g). Disk must be labeled

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with the first author's last name, platform and software. (See detailed instructions below). Failure to adhere to these guidelines can delay the handling of your contribution, and manuscripts may be returned before being reviewed.

3. Categories of Contribution:

3.1. Research Articles

Manuscripts must be written in English in double-spaced, 12-point type throughout, including the References Cited section, appendices, tables and legends; printed on one side only of A4 paper with 2.5 cm margins; marked with consecutive page numbers, beginning with the cover page.

The following elements must start on a new page and be ordered as they are listed below:

a) The title page must contain: a concise and informative title; the authors' names (first name at full length); the authors' institutional affiliation, including department, institution, city, state or province and country; different affiliations indicated with superscript numbers; a short running title of about 35 characters, including spaces; up to five key words; the corresponding author's name, postal address, phone and fax numbers and email address. The corresponding author is the person responsible for checking the page proofs, arranging for the payment of color illustrations and author's alteration charges.

b) The Abstract must be a single paragraph that does not exceed 200 words and summarizes the main results and conclusions of the study. It should not contain references.

c) The text must be as succinct as possible. Text citation s: articles should be referred to by authors' surnames and date of publication; citations with two authors must include both names; in citations with three or more authors, name the first author and use “et al”. Only articles that are published or in press should be cited. In the case of personal communications or unpublished results, all contributors must be listed by initials and last name (“et al” should not be used). Number s: In the text, numbers nine or less must be written out except as part of a date, a fraction or decimal, a percentage, or a unit of measurement. Use Arabic numerals for numbers larger than nine. Avoid starting a sentence with a number. Binomial Name s: Latin names of genera, species and intraspecific taxa in the text must be printed in italics; names of orders and families should be in the Title.

The text includes the following elements:

Introduction – Description of the background that led to the study.

Material (or Subjects) and Methods – Details relevant to the conduct of the study. Statistical methods should be explained at the end of this section.

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Results – Undue repetition in text and tables should be avoided. Comment on significance of results is appropriate but broader discussion should be part of the Discussion section.

Discussion – The findings of the study should be placed in context of relevant published data. Ideas presented in other publications should not be discussed solely to make an exhaustive presentation.

Some manuscripts may require different formats appropriate to their content.

d) The Acknowledgments must be a single paragraph that immediately follows the discussion and includes references to grant support.

e) The References Section: citations must be ordered alphabetically by the first author; only articles that are published or in press should be included; personal communications must be cited within the text; journal titles must be abbreviated according to Medline (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/jrbrowser.cgi).

Sample journal article citatio n:

Breuer ME and Pavan C (1955) Behaviour of polytene chromosomes of Rhynchosciara angelae at different stages of larval development. Chromosoma 7:371-386.

Bertollo LAC, Takahashi CS and Moreira-Filho O (1978) Cytotaxonomic consideration on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Rev Bras Genet 1:103- 120.

Sample book citation:

Salzano FM and Freire-Maia N (1967) Populações Brasileiras. Companhia Editora Nacional and EDUSP, São Paulo, 178 pp.

Dobzhansky T (1951) Genetics and Origin of Species. 3rd edition. Columbia University Press, New York , 364 pp.

Sample chapter-in-book citation:

Carvalho A, Monaco LC and Krug CA (1966) Melhoramento genético das plantas e sua repercussão econômica. In: Pavan C and da Cunha AB (eds) Elementos de Genética. 2nd ed. EDUSP and Companhia Editora Nacional, São Paulo, pp 587-653.

Sample abstracts in meeting citation

Basile R (1973) Cromossomos Politênicos em células nutritivas de ovócitos de ovário atrofiado de Rhyncosciar a. Ciênc e Cult 25 (suppl): 248. XXV Reunião Anual da SBPC, Rio de Janeiro, Brazil.

Sample Thesis/Dissertation citation

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Frota-Pessoa O (1953) Revision of the Tripunctata group of Drosophila with description of fifteen new species. PhD Thesis, Universidade do Brasil, Rio de Janeiro .

Sample Electronic Article citation:

Simin K, Wu H, Lu L, Pinkel D, Albertson D, Cardiff RD, Van Dyke T (2004) pRb Inactivation in Mammary Cells Reveals Common Mechanisms for Tumor Initiation and Progression in Divergent Epithelia. Plos Biol 2: 194-205. http://www.plosbiology.org .

Sample Electronic Database citation:

Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/OMIM

f) Tables each table must start on a new page. A concise title should be provided above the table. Tables must be numbered consecutively in Arabic numerals. Each column must have a title in the box head. Footnotes typed directly below the table should be indicated in lowercase superscript numbers.

g) Figures must be numbered consecutively in Arabic numerals. Legends should be typed on a separate sheet. A set of original illustrations of the highest quality must be provided in glossy paper. If you have created figures electronically submit them also as hard copies. Scanned figures should not be submitted. Images should be in TIFF or JPEG format and provided in separate files. Figures in Word format cannot be published. Journal quality reproduction will require grayscale and color at resolution yielding 300 dpi. Authors should submit bitmapped line art at resolution yielding 600–1200 dpi. These resolutions refer to the output size of the file; if it is anticipated that images will be enlarged or reduced, the resolutions should be adjusted accordingly. Identify each illustration by affixing on the back a label containing: the number of the figure, the name of the first author and an arrow indicating top of illustration. Illustrations supplied on disks must follow instructions in item 2 (Submission package). Color illustration can be accepted, but authors are asked to defray the cost. For costs of color figures, check with the Editorial Office.

h) Nomenclature: current standard international nomenclature should be adhered to.

i) Sequences may appear in text or in figure. DNA, RNA and protein sequences equal to or greater than 50 units must be entered into public databases. The accession number must be provided and released to the general public together with publication of the article. Long sequences requiring more than two pages to reproduce will not be published unless the Editorial decision is that the publication is necessary. Complete mtDNA sequence will not be published.

j) Data acces s: reference should be made to availability of detailed data and materials used for reported studies.

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k) Ethical issues: Reports of experiments on live vertebrates must include a brief statement that the work was approved by the institutional review board. For experiments involving human subjects, authors must also include a statement that informed consent was obtained from all subjects. If photos or any other identifiable data are included, a copy of the signed consent must accompany the manuscript.

3.2 Short Communications present brief observations that do not warrant full-length articles. They should not be considered preliminary communications. They should be 15 or fewer typed pages in double spaced 12-point type, including literature cited. They should include an Abstract no longer than five percent of the paper's length and no further subdivision with introduction, material and methods, results and discussion in a single section. Up to two tables and two figures may be submitted. The title page and reference section format is that of full-length article.

3.3 Letters to the Editor relate or respond to recent published items in the journal. Discussions of political, social and ethical issues of interest to geneticists are also welcome in this form.

3.4 Review Articles are welcome.

3.5 Book Review s: publishers are invited to submit books on Genetics, Evolution and related disciplines, for review in the journal. Aspiring reviewers may propose writing a review.

3.6 History, Story and Memories: accounts on historical aspects of Genetics relating to Brazil .

4. Proofs: Page proofs will be sent to the corresponding author. Changes made to page proofs, apart from printer's errors, will be charged to the authors. Notes added in proof require Editorial approval.

5. Reprints are free of charge and provided as a pdf-file.

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Normas para a Heredity

1. Heredity - An International Journal of Genetics founded by CD Darlington and RA Fisher and published on behalf of The Genetics Society.

Editors:

Managing Editor Dr R A Nichols, SBS, Queen Mary, University of London, E1 4NS, UK Book Review Editor Professor David Skibinski, Department of Biological Sciences, University of Wales, UK Reviews Editor Dr Christian Biémont, Université Claude Bernard, Lyon

EDITORS: Dr SA Harris, University of Oxford, UK, Professor K Holsinger, University of Connecticutt, USA, Dr JD Thompson, Centre d'Ecologie Fonctionelle et Evolutive, Montpellier, France, Dr J Hughes, Griffith University, Australia Dr J Goudet, Université de Lausanne, Switzerland

Heredity is the official journal of the Genetics Society, publishing articles in all aspects of genetics. The journal particularly encourages submissions in ecological, population and evolutionary genetics, including: • Human population genetics • Genomics, functional genomics and proteomics • Biometrical and statistical genetics • Animal and plant breeding • Cytogenetics

With its move to Nature Publishing Group Heredity has augmented its coverage to reflect the development of genetics in the post-genomic era. Papers report new theories and the results of important research. In addition, Heredity publishes regular short reviews and book reviews. Heredity is essential reading for research workers, teachers and students in genetics.

Preparation of Manuscripts: Authors are urged to write as concisely as possible. Full-length manuscripts should not exceed eight pages, including references, figures and any appendices. One full page of text is approximately 1150 words. Manuscripts should be double-spaced on one side only of A4 paper, with all margins at least 4 cm in width. Pages and lines should be numbered to aid cross-referencing. One copy of any manuscript cited as ‘in press’ should be enclosed if possible. Papers based on thesis chapters normally require rewriting and drastic abbreviation before submission.

All manuscripts are subject to editorial review. Papers must be submitted exclusively to Heredity and are accepted on the understanding that they have not been, and will not be, published elsewhere. If accepted, papers become the property of The Genetics Society. Submitted manuscripts that are not subsequently accepted will not be

115 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos... returned to the authors; authors should therefore ensure that a full copy of all submitted material, including illustrations, is retained. It is the author’s responsibility to obtain permission to reproduce illustrations, tables, etc from other publications.

Arrangement of Full Length Manuscripts: All manuscripts should be in English. Please ensure that the manuscripts are well presented and that grammar, spelling and punctuation are checked. The manuscript should be legibly typed in A4 or American quarto format. All sections of the manuscript must be double-spaced with generous margins. Number each page, including the title page. Underline only words or letters to appear in italics. Please indicate the position of each figure and table in the margin.

This journal is abstracted/indexed in Medline/Index Medicus, Biological Abstracts, Chemical Abstracts, Current Awareness in Biological Sciences, Current Contents Agriculture, Biology & Environmental Sciences, Current Contents Life Sciences, Genetics Abstracts, Research Alert, Science Citation Index, Sci/Search and Social Sciences Citation. Index

Format of Papers

Title page: This should include the following, in sequence:

1. A succinct title. 2. Full names and addresses of all authors. 3. Name of corresponding author (to whom proofs and all correspondence will be sent) together with their full address, telephone and fax numbers, and e-mail address. 4. Up to six keywords, which should be relevant for literature searching and each normally comprising not more than two words. 5. A running title of no more than 50 characters. 6. Word count for main text (excluding references, tables and figures).

Abstract : This should not exceed 250 words and should be provided on a separate page in the file, as well as on the online submission form.

References: There should normally be no more than 40 references. These should be indicated in the text by the surnames of the authors with the year of publication, as shown in the examples below. References to more than one publication by an author in the same year should be distinguished alphabetically with small letters, eg (Watson, 1991a,b). The abbreviated author and date reference should be placed in parentheses unless the name forms part of the text, eg Willmer (1982) has demonstrated that… If no person is named as author, the name of the appropriate body should be used, eg (The Genetics Society, 2000).

The full list of references should be given in alphabetical order at the end of the article, double-spaced, in the form of the examples below. Journal titles should be abbreviated according to Medline. All authors up to the first six should be listed, followed by et al for seven or more authors.

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Dickinson, WJ (1991). The evolution of regulatory genes and patterns in Drosophila. In: Hecht MK, Wallace B, Maclntyre RJ (eds) Evolutionary Biology, Plenum Press: New York. Vol 25, pp 127–173.

Falconer DS (1989). Introduction to Quantitative Genetics, 3rd edn. John Wiley and Sons: New York.

Latta RG (1992). Inbreeding Depression and Mixed Mating Systems in Mimulus. MSc Thesis, University of Toronto.

Sano Y, Sano R (1990). Variation of the intergenic spacer region of ribosomal DNA in cultivated and wild rice species. Genome 3: 209–218.

Swofford DL, Selander RB (1989). BIOSYS-1. A computer program for the analysis of allelic variation in population genetics and biochemical systematics. Release 1.7. University of Illinois, Urbana, Illinois.

Wilde J, Waugh R, Powell W (1992). Genetic fingerprinting of Theobroma clones using randomly amplified polymorphic DNA markers. Theor Appl Genet 83: 871–877.

Short reviews: Short Review articles should not normally exceed five printed pages, including main text, summary, references, tables, and figures. One full page of text is approximately 1150 words (equivalent to 40 references). Short Reviews are normally less than 4000 words long and have fewer than 30 references. Longer review articles should be submitted to Heredity as normal review articles.

Style: As the electronic submission will provide the basic material for typesetting, it is important that papers are prepared in the editorial style of the journal.

Tables: Tables should be presented at the end of the manuscript, headed as briefly as possible and numbered consecutively throughout the article. A guide to the appropriate position of each table should be indicated in the text margin. Only horizontal lines should be used, one above and one below the column headings and one at the table foot. Unlike figures or images, tables may be included in the electronic word processed manuscript file, or supplied as separate electronic files. If, however, the tables are supplied in Excel, each table must be on a separate Excel file.

Figures: Magnification should be given in the caption or shown by a scale or bar. Colour photographs are welcome, but authors are expected to contribute towards the cost of colour reproduction. These should be referred to as ‘Figure…’ and numbered consecutively in the order in which they are referred to in the text. Legends to figures, giving the appropriate figure number, should be presented on a separate page at the end of the article file. All figures should be named with author’s surname, figure number and an arrow indicating orientation. Keys should be included within the figure, not as part of the legend. While figures should be referred to specifically in the body of the manuscript text file they must not included as part of that file.

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Figure files: Supply the actual figures as separate electronic files. Symbols, lettering, and numbering should be clear and large enough to be legible after the figure has been reduced. The use of ‘three-dimensional’ histograms is strongly discouraged when the addition of the third dimension gives no extra information.

Please do not prepare figures using Powerpoint software, as that is unsuitable for production.

Using the guidelines, please submit production quality artwork with your initial online submission.

Guidelines in Short: A JPEG prepared using Adobe Photoshop, Illustrator, Freehand, CorelDraw (or similar industry software) is preferable. Many applications have options to save files as JPEGs or TIFFs, but it is worth noting that sometimes they are only saved at 72dpi, whereas we require 300-600dpi. Following the peer review process, if your paper is accepted for publication, we will not require the artwork to be resubmitted if you have followed the guidelines. File formats for manuscript files, figures and tables that are acceptable for our electronic manuscript submission process are given on the online forms. Further advice on filetypes is also available from the 'Tips' webpage. As a rule of thumb, you should stick to high quality JPEG or TIFF files for figures/images, a common word processing package (like Microsoft Word) for the text, and either embed tables converted into images at the end of your Word document, or as separate files in which ever program you used to generate them. If you submit raw data, this can be done in Excel, or tab/comma delimited format.

If your files are large...... or your Internet connection is slow (28kbps or below) you may wish to submit low quality artwork for peer review purposes. High quality artwork will then be requested if your paper is accepted. This may be sent as an email attachment or by post on CD- ROM (600MB), ZIP (100-200MB), 3.5” floppy (1.44MB), or 5.25” floppy (1.2MB). At that stage, you should email the journal office at: the journal office (UK) for the correct address.

On acceptance: To expedite publication accuracy, authors are requested to submit production quality figures with their initial submission. Then, even if final versions of text need to be supplied, the remainder of the files can be sent into production.

Colour on the Web Authors who wish their articles to have FREE colour figures on the web (only available in the HTML full text version of manuscripts and NOT on the online PDF) must supply separate files in the following format. These files should be submitted as supplementary information and authors are asked to mention they would like colour figures on the web in their submission letter.

Authors may be asked to pay the full colour fee for figures that are not submitted in the format described above.

Proofs: A copy of the proof is sent electronically as PDF to the corresponding author by email attachment. This should be printed off, read carefully for errors and corrected as necessary. The corrected copy must be returned to the Publisher within 48 hours. Major alterations to the text cannot be accepted at this stage.

118 Loreto, V. Análise Citogenética comparativa em gafanhotos...

Offprints: 50 offprints are supplied free of charge to the corresponding author. Additional offprints may be ordered on the form accompanying the proofs. The charges are necessarily higher if orders for reprints are received after the issue has gone to press.

Business Matters

Nick Campbell Heredity, Nature Publishing Group The Macmillan Building, 4 Crinan Street, London N1 9XW, UNITED KINGDOM

Tel: + 44 (0)207 833 4000 Fax: + 44 (0)207 843 4839 Email: [email protected]

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