Uticaj Biljke Domaćina Na Kriptičnu Diferencijaciju Populacija Vektora

UNIVERZITET U BEOGRADU

BIOLOŠKI FAKULTET

Andrea M. Kosovac

Uticaj biljke domaćina na kriptičnu diferencijaciju populacija vektora Hyalesthes obsoletus Signoret, 1865 (Hemiptera: Cixiidae) i epidemiološke puteve prenošenja ‘Candidatus Phytoplasma solani’

doktorska disertacija

Beograd, 2018 UNIVERSITY OF BELGRADE

FACULTY OF BIOLOGY

Andrea M. Kosovac

The influence of host-plant use on cryptic differentiation of vector Hyalesthes obsoletus Signoret, 1865 (Hemiptera: Cixiidae) and on epidemiological transmission routes of ‘Candidatus Phytoplasma solani’

Doctoral Dissertation

Belgrade, 2018 Mentori:

______prof. dr Željko Tomanović, redovni profesor Biološki fakultet Univerzitet u Beogradu

______dr Jelena Jović sredinu , viša naučna saradnicaBeograd Institut za zaštitu bilja i životnu

Članovi komisije:

______dr Ivo Toševski

, naučni savetnikBeograd Institut za zaštitu bilja i životnu sredinu

Datum odbrane: ______

Doktorska disertacija urađena je u Institutu za zaštitu bilja i životnu sredinu, Odseku za štetočine bilja u Zemunu, u okviru projekta Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja br. III43001 - „Agrobiodiverzitet i korišćenje zemljišta u Srbiji: integrisana procena biodiverziteta ključnih grupa artropoda i biljnih patogena“ (rukovodilac prof. dr Željko Tomanović).

Deo populaciono-genetičkih istraživanja je urađen na Katedri za Zoologiju, Odseka za Ekologiju, Johan Gutenberg Univerziteta u Majncu u saradnji sa profesorom dr Jesom Johannesenom.

Morfološka identifikacija H. obsoletus primeraka asociranih sa V. agnus- castus i C. foetida je urađena u saradnji sa profesorkom dr Hannelore Hoch iz Prirodnjačkog muzeja u Berlinu.

***

Zahvaljujem mentorki dr Jeleni Jović na prenetom znanju i mentoru profesoru dr Željku Tomanoviću na savetima i podršci. Hvala kolegama Odseka za štetočine bilja, Instituta za zaštitu bilja i životnu sredinu u Beogradu: dr Ivu Toševskom, dr Milani Mitrović, dr Tatjani Cvrković, dr Oliveru Krstiću i Miljani Jakovljević na pomoći u istraživanjima, prijateljskim razgovorima i savetima. Hvala dr Sanji Radonjić i dr Snježani Hrnčić sa Biotehničkog fakulteta, Univerziteta u Podgorici, na pomoći pri sakupljanju materijala.

Zahvaljujem profesorki dr Hannelore Hoch na muzejskom paratipskom primerku vrste Hyalesthes thracicus ustupljenom iz lične entomološke kolekcije.

Zahvalnost dugujem profesoru dr Jesu Johannesenu za preneto znanje i prijateljsku podršku čime ga smatram neformalnim mentorom.

Posebno se zahvaljujem mojim roditeljima na nesebičnoj podršci i razmevanju.

UticajHyalesthes biljke domaćina obsoletus na kriptičnuSignoret, 1865diferencijaciju populacija vektora prenošenja ‘Candidatus(Hemiptera: Cixiidae) i

epidemiološke puteve Phytoplasma solani’

SAŽETAK

Hyalesthes: obsoletus, vektor biljnog patogena 'Candidatus (Ca solani', polifagn .) Phytoplasma Evropi ismatra Mediteranu se om štetočin sprovedenom od ekonomskog značaja u centralnoj . Istraživanjima im u jugoistočnoj 'Ca Evropi,. P. solani' koja- uslovljenihgravitira centru biljnih arela bolesti, vrste i gde je zabeležen značajan broj utvrđenoConvolvulus je postojanje arvensis (četiriCa , Urtica asocijacije dioica vektora(Ud , Vitex sa biljkamaagnus-castus dualnim (Vac domaćinima: i Crepis foetida (Cf . ) - ) ) ) Populaciono genetičkim analizamana mitohondrijskih i nuklearnih markera (mikrosatelita)sintopsk i geografski utvrđena udaljenihje kriptič H. obsoletudiferencijacijas simpatričkih (uključujući e) Ca-Ud populacija Vac i naCf .tri Pored filogenetičke jasne linije uslovljene na biljkom domaćinom: gen (1) (1.1%, - (2) (3) diferencijacijeizdvajanje mitohondrijskim ima klastera 1.5%) i mikrosatelita koji(pripadnost potvrđuju >90% populacija u jedan od tri premaH. obsoletusbiljci domaćinu sensu lato ), podršku za izdizanjeregistrovana genetičke divergencijeu odnosu na najsrodnijuna nivo kriptične vrstu - specijacijeHyalesthes dajethracicus (2.1% - distanca3.3% . morfološki H. obsoletus sensu lato ) Posledice specijalizacije i diferencijacije'Ca. prema biljkama domaćinima na epidemiologijudetektovanih P. solani' procenjenein situ su multigenskom karakterizacijom izolata fitoplazme vinograda(1) i (2 u prirodnim epidemiološkimunakrsne in sistemima biljaka mediteranskih h ) eksperimentima. okulacije putem prirodno ' inficiraniCa. P. solani'populacija na tuf-a/- ab vektora i tuf-b Potvrđena je osnovnaUd i Caepidemiološka uz ukrštanje divergencijasa Vac- tuf- cikluse vezane za tuf- uzrokovanom b epidemiologijom i utvrđenalinija vektora, kompleksnost H. obsoletus ex bCf , epidemiologije kao u kojoj učestvuje - i C. treća foetida genetička. i sama biljka dualni domaćin KLJUČNE REČI Hyalesthes obsoletus, ,

: , e biljka domaćin populaciona genetika,

NAUČNAkriptična evolucija,OBLAST: Biologijastolbur fitoplazma pidemiologija, multigenska karakterizacija UŽA NAUČNA OBLAST:

UDK: [[577.832+595.753]Entomologija] 579.887 :576.89 : (043.3)

-plant use of

TheHyalesthes influence obsoletus of host Signoret, 1865on cryptic differentiation andvector on (Hemiptera: of ‘Candidatus Cixiidae) epidemiological transmission routes Phytoplasma solani’ ABSTRACT:

Hyalesthes obsoletus

The cixiid planthopperCandidatus (Ca. is generally considered as a polyphagous vector of ' ) P. solani' associated with numerous wild and cultivated plants in central Europe and Mediterranean.H. obsoletu sResearch conducted in southeastern'Ca. P. solani' Europe,- the distribution centre of and the area of- plantmost inflictedConvolvulus crop diseases,arvensis ( Ca points, Urtica toward dioica specific (Ud , Vitex dual agnus host-castus associations(Vac and Crepis with: foetida (Cf -) ) ) ). Population genetic analysis of mitochondrial and nuclear genetic markers (microsatellites) have revealed cryptic differentiationH. obsoletus between sympatric (including syntopic) anddelineated geographically by host distant- populationsCa-Ud Vacinto threeCf phylogenetic lineages H. obsoletusplant preference: sensu lato 1) , 2) i 3) . Cryptic species diversification within - is supported by the genetic divergence of mitochondrial genes (1.1% 1.5%), microsatellites that confirm population- clustering into three genetic groups associated with specific- host plantH. obsoletus (average assignment >90%) and genetic distances among host associated metapopulations- Hyalesthes comparable thra tocicus the most(2.1% closely - related, morphologically H.distinguishable obsoletus sensu species lato differentiation on the 3.3%). Consequences'Ca. of the epidemiology of P. solani' arein situ assessed by multilocus genotyping of the phytoplasmaMediter isolates detected (1) in natural epidemiological systems of the ranean vineyards and (2) plantCa. inoculation experiments using naturally infectedtuf-a/-ab vectorand tuf populations.- Basic ' P. solani' epidemiologicalUd and Ca divergence into b cycles, each associatedVac - with tuf- , respectively, is confirmed with evidencestuf- of intermixingo induced br epidemiology, while complexity of the ofb epidemiol H.gy obsoletus is further ex evidenced C. foetida andth ough its dual influence host-plant of the . third genetic lineage the vector

KEY WORDS Hyalesthes obsoletus, host-

: plant, population genetics, cryptic

SCIENTIFICevolution, stolbur FIELD phytoplasma,: Biology epidemiology, multilocus genotypisation SPECIFIC SCIENTIFIC FIELD: y

UDC: [[577.832+595.753] Entomolog] :576.89 :579.887(043.3)

Sadržaj

1. Uvod ...... 1 1.1 Hyalesthes obsoletus Signoret, 1865 ...... 3 1.2 Candidatus ...... 7 Taksonomija, biologija i vektorska uloga 1.3 'Candidatus Biologija i epidemiologija fitoplazmi (' Phytoplasma') ...... 11 Phytoplasma solani' − stolbur fitoplazma: epidemiologija uslovljena 1.4 H. obsoletus vektorom, putevi prenošenja i molekularna identifikacija Ca. P. solani' ...... 14 Specijalizacija vektora prema biljkama domaćinima i uticaj na 2. epidemiologiju Ciljevi ...... ' ...... 17 3. Materijal i metode ...... 18 3.1 - H. obsoletus...... 19 3.1.1 ...... 19 Populaciono genetičke analize diverziteta 3.1.2 ...... 19 Sakupljanje populacija specijalizovanih prema biljci domaćinu 3.1.3 ...... 20 Ekstrakcija DNK 3.1.3.1 ...... 20 Genotipizacija mitohondrijskih markera 3.1.3.2 Amplifikacija ...... mitohondrijskih...... markera...... 23 3.1.3.3 FilogenetskeGenealogija analize mitohondrijskih ...... gena,...... analize diverziteta...... i populaciona...... 27 diferencijacija 3.1.4 ...... 28 3.1.4.1 ...... 28 Genotipizacija mikrosatelitskih nuklearnih markera 3.1.4.2 ...... 30 3.1.4.3 Amplifikacija mikrosatelitskih nuklearnih ...... markera ...... 30 Diverzitet i varijabilnost mikrosatelita 3.2 Ca H. obsoletus 32 Populaciona struktura i diferencijacija 3.2.1 Ca. P. solani' ...... 32 Molekularna detekcija i karakterizacija ' . P. solani' u populacijama 3.2.2 Ca. P. solani' ...... 33 Detekcija ' 3.2.2.1 Analiza tuf gena ...... 34 Multigenska karakterizacija izolata ' 3.2.2.2 Analiza stamp gena ...... 36 3.2.2.3 Analiza vmp1 gena ...... 37 3.3 Molekularno- Ca. P. solani' u ...... 39 epidemiološke analize praćenja puteva diseminacije ' 3.3.1 ...... 40 prirodnim sistemima mediteranskih vinograda 3.3.1.1 Sakupljanje H. obsoletus ...... 40 Sakupljanje materijala 3.3.1.2 H. obsoletus ...... 41 3.3.2 ...... 42 Sakupljanje biljaka domaćina 3.3.2.1 Ek H. obsoletus ...... 42 Ekstrakcija DNK 3.3.2.2 ...... 42 strakcija DNK iz 3.3.3 Ca. P. solani' ...... 43 Ekstrakcija DNK iz biljaka Molekularna detekcija i karakterizacija '

3.3.4 Vektorska uloga H. obsoletus ex V. agnus-castus Ca. P. solani' u ...... 43 u epidemiologiji ' 3.4 Ca H. mediteranskim vinogradima obsoletus...... 44 Eksperimenti prenošenja ' . P. solani' prirodno inficiranim populacijama 3.4.1 H. oboletus ...... 45 3.4.2 Ca Sakupljanje materijala ...... 46 Eksperimentalne procedure ukrštenog prenošenja ' . P. solani' između 4. Rezultatirazličitih prirodnih ...... asocijacija vektora...... 48 4.1 Lokaliteti uzorkovanja H. obsoletus ...... 48 populacija u asocijacijama sa različitim 4.2 - itet i varijabilnost H. obsoletus ...... 55 biljkama domaćinima 4.2.1 ...... 55 Populaciono genetički diverz 4.2.2 ...... 62 Diverzitet i varijabilnost mitohondrijskih markera 4.3 H. obsoletus Diverzitet i varijabilnost mikrosatelitskih nuklearnih markera ...... 64 Genetička diferencijacija populacija specijalizovanih prema biljkama 4.3.1 ...... 64 domaćinima 4.3.2 H. obsoletus ...... 68 Filogenetske analize mitohondrijskih i mikrosatelitskih markera 4.3.3 ...... 70 Struktura populacija bazirana na mikrosatelitima 4.4 'Ca H. obsoletus Segregacija sintopskih populacija ...... 71 . P. solani' inficiranost populacija specijalizovanih prema biljkama 4.4.1 Genotipski diverzitet 'Ca H. obsoletus ex U. dioica ...... 71 dualnim domaćinima 4.4.2 Genotipski diverzitet 'Ca H. obsoletus ex C. arvensis .. 77 . P. solani' u populacijama 4.4.3 Genotipski diverzitet 'Ca H. obsoletus ex V. agnus- . P. solani' u populacijama castus ...... 80 . P. solani' u populacijama 4.4.4 Genotipski diverzitet 'Ca H. obsoletus ex C. foetida i C. foetida ...... 82 . P. solani' u populacijama 4.5 potvrda statusa dualnog domaćinaCa ...... 85 Molekularna epidemiologija ' . P. solani': uticaj specijalizacije vektora prema 4.5.1 . P. biljkama dualnim domaćinima na puteve diseminacije patogena Ca ...... 85 Pokazatelji prirodnih ukrštanja epidemioloških puteva diseminacije ' 4.5.1.1 Ca H. obsoletus ex U. dioica, C. solani': slučaj mediteranskih vinograda arvensis i V. agnus-castus ...... 87 Genotipizacija ' . P. solani' u populacijama 4.5.1.2 Ca. P. solani' od biljaka le vinove loze ...... 89 Ukrštanje puteva infekcije: praćenje genotipova ' 4.5.2 rezervoara, kroz populacije vektora, do obole Ca. P. solani' ...... 91 Eksperimentalni pokazatelji ukrštanja epidemioloških ciklusa i puteva 4.5.2.1 Vektorska sposobnost i genotipovi 'Ca. P. solani' koje prenosi H. obsoletus diseminacije ' ex C. arvensis ...... 95 4.5.2.2 Vektorska sposobnost i genotipovi 'Ca. P. solani' koje prenosi H. obsoletus ex V. agnus-castus ...... 97

4.5.2.3 Vektorska sposobnost i genotipovi 'Ca. P. solani' koje prenosi H. obsoletus ex C. foetida ...... 100 4.5.3 Ca ...... 102 Genotipski i epidemiološki diverzitet ' . P. solani' uslovljen biljkama dualnim 5. Diskusijadomaćinima ...... patogena i vektora...... 106 5.1. H. obsoletus ...... 108 Genetička divergencija populacija kao posledica specijalizacije prema 5.1.1 H. obsoletus C. arvensis i U. dioica u biljci domaćinu ...... 109 Genetička homogenost u asocijacija sa 5.1.2 H. obsoletus sa V. agnus-castus ...... 111 jugoistočnoj Evropi 5.1.3 H. obsoletus sa Crepis foetida ...... 112 Asocijacija 5.2. H. obsoletus ...... 114 Asocijacija 5.3. Biogeografska istorija H. obsoletus ...... 116 Taksonomski status : potreba za integrativnim pristupom 5.4. Ca ...... 118 Razvoj epidemioloških puteva širenja ' . Phytoplasma solani' pod uticajem 5.4.1 Uloga H. obsoletus ex Urtica dioica u tuf- Ca. P. solani' ...... 120 specijalizacije vektora 5.4.2 Vektorska uloga H. obsoletus ex V. agnus-castus i ukrštanje tuf- b epidemiologiji ' 'Ca. P. solani' ex V. agnus-castus i C. arvensis ...... 123 b epidemiologije 5.4.3 Ukrštanje tuf- Ca. P. solani' i vektorska uloga tri Bois noir bolesti vinove loze ...... 128 b puteva diseminacije ' 6. Zaključciasocijacije ...... u epidemiologiji ...... 132 7. Literatura ...... 135

8. Prilozi ...... 157

1. Uvod

Hyalesthes obsoletus

Signoret, 1865 (Hemiptera: Auchenorrhyncha: Cixiidae) je polifagna cikada kserotermnih staništa, primarno mediteranskog rasprostranjenja čiji areal na severu doseže do jugozapadne Nemačke i severne Francuske, dok Hyalesthes se ka jugoistoku obsoletus pruža je ujedno do Male i tipska Azije vrsta i Bliskog roda istokaHyalesthes (Hoch koji & Remane še 1985). od sadrži vi trideset poznatih vrsta koje su podeljene u pet specijskih grupa sa dva pretpostavljena centra diverziteta, jedan u istočnom Mediteranu i drugi na Kanarskim ostrvima (Hoch 1986a).re U svega proteklih u petkontekstu decenija, vektorske ova cikada uloge je bila i predmet brojnih obligatnog istraživanja, biljnog p patogena 'Candidatus epidemiologije Phytoplasma solani', trivijalnog naziva stolbur fitoplazma, koja inficiraet al. više 196 desetina biljnih vrsta Sforza i etdirektno al. 1998; ugrožava Sharon mnoge et al. 2005; gajene Bressan kulture et (Aleksić al. 2007; Johannesen7; Maixner et al. 1994;2008; 2012; et al. et al. 2013; Maniyar et al. et al.

Kessleret al. 2011; Imo 2013; Đurić 2017; Chuche 2018). Do razvoja molekularnih metoda dijagnostike ovi patogeniet al. su najčešće navođeni kao virusi ili mikoplazmama slični organzmi (Doi 1967), dok sredinom devedesetih godina prošlog veka, bakterije koje izazivaju simptome et filodija,al. 1994; virescence Toth et i al. nekroze kod biljaka nisu nazvanein fitoplazmama vitro (Seemüller 1994). Zbog nemogućnosti gajenja i morfološke karakterizacije,'Candidatus (Ca. njihov taksonomski status je definisan statusom kandidata ) Phytoplasma' u okvitu klase Mollicutes (IRPCM 2004). - Primena molekularnih metoda u proučavanju populaciono genetičke strukture ekonomski korisnih ili štetnih insekata, omogućila je sagledavanje do tadaintra -nepoznatih genetičkih karakteristika pojedinih insekatskih vrstaBrunner na njihovom et al. 2004; Tsagkarakoui interpopulacionom et al. 2007; nivou (McPheron 2000; Hunter 2002;et al. 2013; Toševski et al. De Barro & Ahmed4 2011; Imo 2011; 2015; Horowitz & Ishaaya 201 ). Trenutni pristup u molekularnoj filogenijiotk podstiče testiranje i primenu različitih genetičkih markera koji mogu riti kriptični potencijal vrstade factokroz rasvetljavanje palete divergentnihet al. odnosa, od ekološke specijalizacije do specijacije (Caterino 2000; Scheffer &

et al. 2007; Toševski et al. 2011;

Lewis 2001;et al. Hebert 2013 & Gregory 2005; Bickford Peccoud ). Kada se poređenje morfološki istih organizama svede na genetiku, otkriva se unutrašnja diferencijacija koju fenotip ne oslikava i koja se kroz ingerativnu taksnomiju može kasnije dopuniti drugim karakterima kao što su akustični signali, interakcije sa drugim vrstama, pa čak i morfološkeet mikrostruktureal. (Schefferet al & Wiegmann 2000; Berlocher & Feder 2002; Toševski 2011; Wilkins . 2013). Identifikacija kriptične specijacije i diferencijacije srodnih vrsta je posebno značajna kod štetnih insekata zbog regulativa kojeet al. zemlje 2012; sprovodeet u al. cilju razvoja strategije kontrole (Brown 2004; Johannesen Peccoud 2013; Horowitz & Ishaaya 2014). Direktna agroekonomska šteta koju cikade nanose biljkama svojom ishranom je neznatna, ali ukoliko vrste uz ekspanziju unutar ekosistema i prodor na nova staništa, uđu u epidemiloški lanac raznošenja fitoplazmi, može doći do značajnih ekonomskih posledica (Weintraub & Beanlandbiljnih bolesti2006; Weintraub koje su etiološki & Jones 2010). Poslednjih nekoliko decenija incidenca vezane za fitoplazme je u značajnomet al porastu i kod ekonomski najznačajnijih poljoprivrednihet al. 2011; kultura (Jović . 2007; 2009;et al. Weintraub 2014; Jeger & et Jones al. 2016; 2010; Ember et al. Chuche & Thiéry 2014; CvrkovićH. obsoletus Mitrović Bois noir2016). Savremena istraživanja se u najvećoj meri fokusiraju na (BN) bolest vinove loze koja u nekim regionima eskalira et i do al. organičavajućeg2008; faktora u proizvodnjiet al. 2013; Aryan sa gubicima et al i do 80% (Johannesen Maixner 2011; Zahavi . 2014). Cikade predstavljaju najznačajniju kariku za širenje fitoplazmatičnihet al. bolesti čiji uspeh prenošenja zavisi od interakcijeiva patogenai produkata i insekta vektora (Suzuki (Hogenhout 2006), et al. odnosno2008 od stepena kompatibilnosti tk ). Cikade koje prenose fitoplazme na poljoprivredne kulture su uglavnom iz familijaH. obsoletus Cicadellidae i Cixiidae (Weintraub & Beanland 2006) među kojima je vrsta najpoznatijia, najšire rasrostranjena i sa učešćemet al. u najvećem1967; broju epidemioloških ciklusa u agroekosistemimaAryan Evrope et al. 2014;(Aleksić Atanasova et al.Langer & Maixner 2004; Weintraub & Jones 2010; 2015).

1.1 Taksonomija, biologija i vektorska uloga Hyalesthes obsoletus Signoret, 1865

H. obsoletus

Kao i sve cikade familije Cixiidae, najveći deo životnog ciklusa provodi u stadijumu endogejskeet al. larve hranećiet al. se floemskim sokovima korena biljaka domaćina (Sforza 1999; Cargnus 2012). Usled specifičnog načina života, ostvaruje blisku vezu sa biljkama koje koristi za razvoj, ishranu, parenje i kao supstrat za ovipoziciju. Brojne biljne vrste su ih do jedinki sada H. zabeležene obsoletus , dok kao povremeni ili stalni domaćini, ili biljke hraniteljke odrasl je za svega nekoliko njih utvrđenoazkina da 1955; pružaju Sforza pogodnu et al. 1999; nišu Sharon za kompletiranje et al. 2005; životnoget ciklusa al. (Suhov & Razvyet al. et al. Kessler 2011;H. Cargnus obsoletus 2012; Chuche 2018). Tokom protekle dve decenije biologija i asocijacije sa biljkama domaćinima su intenzivno proučavane'Candidatus zbog značaja ove cikadeCa kao glavnog vektora biljnog patogena Phytoplasma solani' (' . P. solani', CPs) poznatog podet trivija al. 2012;lnim nazivomQuaglino et stolbur al. fitoplazma (Langer & Maixner 2004; Johannesen 2013). Hyalesthes Palearktički- rod Signoret, 1865 čine 33 vrste od kojih je njih 28 prema morfo filogenetskim analizama genitalija mužjaka svrstano u jednu od 5 monofiletičkih grupa (Slika 1a) H. (Hoch obsoletus & Remane predstavlja 1985; jednu Remane od 6 & bliskih Hoch 1986;vrsta, Emelyanov 1995). Činjenica da koje pripadaju istoimenoj grupi vrsta (Slika 1b), doprinosi nedovoljno jasnoj slici o interakcijama koje ova cikada ostvarujebiljka u domaćin prirodi koju dodatno komplikuje česta i neadekvatna upotrebe termina . Identična spoljna morfologija, sličnost genitalnih struktura mužjaka - i simpatričko prisustvoH. obsoletus vrsta ove grupeH. flavovariuspraćeno je preklapanjem areala cirkum mediteranskogH. lacotei sa vrstama Kusnezov,H. thracicus 1935 (Uzbekistan), (Dlabola, 1970)H. yozgaticus (južna Francuska), Hoch, 1985H. hani (jugoistočna Grčka i Turska), Prepoznatljiva bela Hoch, 1985 (Turska, Anatolia) i Hoch, 1985 (Liban). kragna je kao zajednička karakteristika vrsta ove grupe korišćena H. u obsoletus mnogim studijama kao već na prvi pogled jasna sugestija da se radi o vrsti

(Slikaka 1c). Međutim, poređenjem muških genitalija može se jasno videti da rakteri spoljašnje morfologije nisu pouzdani prilikom determinacije vrste.

Slika 1 Hyalesthes H. obsoletus; -filogenetske grupe vrsta u okviru roda Hyalesthes H. obsoletus grupe . Diverzitet roda i fenotipske sličnosti između vrsta grupe a) morfo ; b) vrste vrsta; c) preparovani primerci iz lične kolekcije prof dr Hanelor Hoh. Areal H. obsoletus

koji pokriva široko područje od Portugala na zapadu do Iraka na istoku, od južne Nemačke na severu do Maroka na jugu, poklapa se sa podacima o agroekonomskoj šteti koju na brojnim poljoprivrednimEFSA 2014 kulturama uzrokuje stolbur fitoplazma (Hoch & Remane 1985; ). Staništa koja naseljava ova cikada su raznovrsna: u severnoj Africisti sukopna, to suva u Italiji rečna priobalna korita, u Španiji livadska vegetacija u priobalju i unutrašnjo područja, livade i žbunasta vegetacija na osunčanim padinama, u Grčkoj obala i suva rečna korita itd. (Hoch & RemaneH. obsoletus 1985). Međutim, odlučujući faktor kojisu obezbeđuje ili limitira opstanak u određenom ekosistemu specifične biljne vrste koje koristi kroz sve faze životnog ciklusa. Na ovom geografski i klimatski raznovrsnom području brojne biljke se često neprecizno dovode u vezu sa ovom cikadom (Prilog 1) uz opisne navode lokaliteta i biljnih

4 zajednica pogodnih za sakupljanje adulata kao što su: kserotermne trave, tople i osunčane padine, nasipi, H. stare obsoletus i napuštene bašte kao i degradirani ekosistemi. Veoma guste populacije može razviti na ivicama zasada, međamasa i brazdama gde uspešno kompletira ceo životni ciklus u associjaciji odgovarajućom biljkom domaćinom u biocenozi koju čine i mnogi drugi insekti štetočine (Hoch & Remane 1985; NickelH. 2003; obsoletus Alford 2011). - Prvi podaci o životnom ciklusu potiču sa teritorije bivšeg SSSR a gde se, osim opisaConvolvulus razvojnih arvensis stadijuma, i Cardaria prvi put draba pominju konkretne asocijacije sa biljkama, i to sa stolburom (Suhov & Razvyazkina 1955). Prateći pojavu i razvoj simptoma zaraze paradajiza H.i krompira obsoletus u kojejužnim su regionima zemlje, otkrivene su pojedinosti životnog ciklusa posebno značajne u kontekstu interakcija sa biljkama. Utvrđeno je da seC. endogejskearvensis i C. larve draba hrane na korenovima višegodišnjih stolburu korova, i neretko uglavnom pokazuju na , koje se navode kao prijemčive simptome zaraze. Krajem maja i početkom juna se završava larvalno razviće i adulti sredinom juna izleću na površinu nakon čega se jedno vreme biljkezadržavaju i upravo na biljci na čijem korenu su se i ispilili. Ubrzo zatim migrirajuje nauseva druge i korova. Suhov i u tom periodu se odvija masovno neselektivno inficiran Razvyazkina (1955) prvi put ukazuju na primarnu infekciju vektora tokom stadijuma larve kada se akvizicija patogena odvija preko korenovog sistema inficiranih korova. Već tokom jula ženke počinju da polažu jaja u pukotine zemlje, uz biljku domaćina. U avgustu se u južnoj Rusiji adulti više ne mogu naći, dok se prve L1 larve ispiljuju iz jaja već tokom jula kada se pozicioniraju uz korenoveazkina sisteme preferentnih biljaka gde im se nalaze i gnezda (Suhov & Razvy 1955). H. obsoletus se u Opšteprihvaćeno stanovište polifagnosti mnoštvu podataka može svestiC. arvensis na dve biljne vrsteUrtica preferentne dioica u ishrani (Slika adultima 2; Prilog u gotovo 1 celom arealu: (poponac) i (kopriva) ). Pored toga,podno za njih obe i da biljke se ispiljene je utvrđeno larve da hrane ženke na formiraju gnezda u pukotinama zemljeih (Sforzanjihovim et al. 199 korenovim9; et al.sistemima 2009; što činiet al. legitimnim biljkama domaćinimaH. obsoletus ostvaruje sa C. arvensisKaul je poznataKessler još od 2011). Tesna veza koji 5 polovine prethodnog veka (Suhov & Vovk 1949), kasnije je registrovana širom Evrope iet dopunjena al. CPs epidemiološkim studijamaet al. vezanim za ovog domaćinaet (Aleksićal. 1967;et Hochal. 2012; & Remane Atanasova 1985; et Fosal. 1992; Maixner 1994; Sforza U. dioica1998; Cargnus 2015), dok su prvi podaci vezani za 2004; Bressankao domaćina et al. 2007; vektoru Lessio novijeg et al. datuma (Almaet 2002; al. Langer & Maixneret al. -Bauer et al. 2013; Aryan2007; et al. Cargnus 2012; Šafářovaet al. 2011; Riedle H. obsoletus 2014: Atanasova 2015). Značajnim delom areala pokriva mediteranski basen (Hoch & Remane 1985;Vitex agnus Hoch- castus1986a, b) i među brojnim biljkama se ističu česti nalaziet al. agregacije na (konopljika) (Hoch & Remane 1985; Sharon et al. 2005). Status domaćinaAso ove biljke je potvrđen na teritoriji Izraela (Sharon 2005; 2015). dostupnogcijacija sapodatka konopljikom o preferentnosti na Balkanskom H. obsoletus poluostrvu je poznata još od najstarijeg premaV. agnus nekoj-castus biljnoj vrsti koji govori kako adulti često mogu biti pronađeni na u hrvatskom primorju (Horvath 1891). Prvi sledeći i jedini ovakav nalaz u Evropi je zabeležen gotovo ceo jedan vek kasnije na obali Grčke i grčkih ostrva Krit, Lezbos, Ikarija i Rodos (Hoch & Remane 1985).

Slika 2. Hyalesthes obsoletus Convolvulus arvensis; b) Urtica dioica

na biljci domaćinu: a)

LavandulaJedina angustifolia gajena kultura koju vektor eksploatiše' Ca. kroz P. ceosolani' životni ciklus engl. lavandin decline(lavanda) (Fos koja et al. biva 1992 pogođena indukovanom bolešću ). Njena pogodnost je zabeleženaet al. u Francuskoj i eksperimentalno potvrđena u laboratorijskim ogledima (Sforza 1999). Kao rezultat ovog istraživanja dat je opis pet larvenih stupnjeva po principu ključa, kao i razvojne razlike u laboratorijskom gajenju i prirodnim uslovima.H. Poponac,obsoletus, kopriva i lavanda, osim što pružaju nišu svim razvojnim stadijumima istovremeno su i rezervoaridualni domaćini stolbur fitoplazme čime se u epidemiološkim istraživanjimavektora i patogena. tretiraju kao kroz koje se ukrštaju životni ciklusi H. obsoletus su fokusirana

Gotovo sva istraživanja koja se bave biologijom'Candidatus na njegovu vektorsku ulogu u epidemiologiji Phytoplasma solani' i imaju za cilj utvrđivanje biljaka koje su izvor hrane adultima i/ili larvama kako bi se uključile, odnosno isključileSagledavanje iz epidemiološkog ciklusa kao rezervoari inokuluma u agroekosistemima. H. obsoletusbiljnih vrsta kao domaćina na osnovu povremenihkularno nalazaokarakterisanih ishrane adulata 'Ca. P. solani' na njima ili na osnovu poklapanja mole izolata u oba domaćina, daje zbunjujuće informacijevektora i njegove o preferentnosti vektorske uloge. vektora i onemogućava rasvetljavanja biologije ovog

1.2 Biologija i epidemiologija fitoplazmi ('Candidatus Phytoplasma')

Candidatus

Fitoplazme (' Phytoplasma', Mollicutes) su obligatni, intracelularni patogeni biljaka i insekata koji naseljavaju floemske sudove biljaka domaćinakoji se hr izazivajući sistemsku infekciju, a prenose se insektimaet al. 2000; iz reda Hogenhout Hemiptera et al. ane floemskim sadržajem biljaka domaćina (Lee 2008). Mehanizam prenošenja fitoplazmi putem vektora je (1) horizontalan, sa jedneposle biljkeperioda na in drugu, iste vrste ili različite, i (2) perzistentan, jer insekt vektor kubacije patogena ostaje infektivan tokom čitavog životnog ciklusa. Epidemiologija fitoplazmatičnih biljnih bolesti uključuje tri osnovne komponente: 1) biljku rezervoar infekcije i izvor inokuluma za inficiranje vektora (često asimptomatska), 2) insekta vektora i 3) obolelu biljku koja u većini slučajeva 7

gajenih kultura ispoljava karakteristične simptome infekcije fitoplazmama. Preferentnost vektora prema biljkama domaćinima je od ljati centralnog izvore epidemiološkog značaja, obzirom da različite biljke mogu predstav različite infekcije patogenom i polazišne tačke za razvijanje različitih puteva prenošenja, tj. epidemioloških ciklusa (Langer & Maixner, 2004).

Fitoplazme su prethodnomycoplasma poznate-like u organisms literaturi uglavnom kao organizmi slični mikoplazmama (engl. , MLO), prečnika su oko 500 nm, nestalnog oblika usled nedostatka ćelijskoget al. zida i redukovanog genoma veličine od 530 do 1350 kilobaza (Hogenhout 2008). Glavnain metodološkavitro gajenja prepreka(Lee et al. u identifikaciji i karakterizaciji fitoplazmi je nemogućnost 2000). Održavanje u laboratorijskim uslovima postiže se kalemljenjem eksperimentalnih biljaka koje su inicijalno inokulisane od nka strane (Cataranthus prirodno inficiranihroseus insekata vektora i u te svrhe se uglavnom koristi perivi ). Ova biljka pogoduje umnožavanju fitoplazmi u visokom titru i eksprimira različite(Aryan etsimptome al. u zavisnosti od vrste i genotipa fitoplazme kojom je inficirana 2016). Na osnovu jedinstvenih karakteristika fitoplazmi, na Internacionalnoj konferenciji sistematike bakterija održanoj 1996. godine na Floridi (SAD) predložena je i prihvaćena opšta klasifikacijaCandidatus fitoplazmi(Ca. u okviru novog rodaet podal. 1998; statusom kandidata, odnosnoet al. ' ) Phytoplasma' (Seemüller IRPCM 2004; Firrao 2005). Osnove detekcije i filogenije fitoplazmi su postavljene Polimerase primenom molekularnihChain Reaction metoda i to primarno lančane reakcije polimeraze (engl. koji eno poseduje, PCR) nakonzervativne genskom regionu i dovoljno prokariota varijabilne 16S rRNKgenske gena regione istovrem et al. (Murray & Schleifer 1994; Lee 2000). Klasifikacija bazirana na nukletodnim sekvencamapostojanje 33 16Sglavnih rRNK grupa gena fitopl fitoplazmi iz - različitih delova sveta, ukazuje na et al. azmiF (16SrI XXXIII) i preko 100 podgrupa (Zhao 2010; Zhao & Davis 2016). ilogenetski udaljene grupe fitoplazmi mogu dovesti do pojave istih simptoma kod inficirane biljke, ali i jedna fitoplazma može izazvati različite simptome na različitim biljnim vrstama. Radi jasnijeg tumačenja etiologije fitoplazmatičnih bolesti, pored razvoja metoda neposredne molekularne

8 dijagnostike, neophodno je i razumevanje biologije insekata vektora kroz multidisciplinarnaBeanland 2006; Hogenhout epidemiološka et al. istraživanja i eksperimente (Weintraub & 2008). Cuscuta Vaskularno povezivanje biljaka parazitskim cvetnicama ( sp.) gotovo zanemarljivo doprinosi širenju fitoplazmiet u al. prirodi u odnosuone na et prenošenje al. tokom ishrane inficiranog vektora (Marcone 1997; Marc 1999). Disperzija(Boudon-Padieu i fitofagne 2003; osobenostiHogenhout insekataet al. vektora diktiraju ritam infekcije 2008). Vektorska kompetentnost se određenoj vrsti insekta pripisuje ukoliko su zadovoljena tri kriterijuma: (1) akvizicija fitoplazmi ishranom floemskim sokovima zaraženih biljaka, (2) održavanje i umnožavanje patogena u pljuvačnim žlezdama vektora i (3) unošenje fitoplazmi putem ishrane i salivacije u floem nezaražene biljke (Weintraub & Jones 2010). Od inicijalne akvizicije fitoplazmi sa inficirane biljke (izvor inokuluma),latentni do trenutkaperiod mogućnosti inokulacije nezaražene biljke, potrebno je da prođe što je preduslovtokom kojeg z se fitoplazma umnožava do odgovarajućeg titra u telu vektora, a njen prelazak u drugog domaćina u ekosistemu. Dužina etovog al. perioda1996; Moya je najčešće- tri sedmice, ali može varirati od 7 do 80 dana (Murral Raygoza & Nault 1998). Fitoplazme mogu biti patogene po insekte, ali generalno ne utiču negativno na fitnes vektora (Bertaccini 2007). Neka istraživanja ukazuju da njihovo prisustvo u insektu može uvećati fekunditet ženki i produžiti životni vek zaraženih jedinki, ali i da mogu uticati(Hogenhout na preferentnosti et al. vektora prema inficiranim biljkama kao izvorima hrane 2008). Najuspešnije i nekoliko vektore fitoplazmi predstavljaju cikade iz familija Cixiidae i Cicadellidae vrsta familije Psyllidae jer se adulti uglavnom hrane floemskim sokovima biljnih vrsta na kojima se odvijalo i larvalno razviće, dok je sam način ishrane po biljku nedestruktivan (Weintraub & Beanland 2006). - Epidemiologija fitoplazmatičnih bolesti zasnovana je na tri trofičkim interakcijama koje se multilateralno Firrao ostvarujuet al. između biljaka, vektora i patogena (Weintraub & Beanland 2006; 2007). Preduslov raznošenja fitoplazmi u ekosistemima je disperzija vektora, dok odabir biljaka koje koristi(Lee u ishrani et al. rezultuje2000; Hogenhout u novom et potencijalnomal. 2003 inokulumu ili krajnjem domaćinu ). Raznovrsnost vektora i biljaka rezervoara uvećava 9

šansu za genetičkim promenama i adaptacijamaet al. fitoplazme što dovodi do razuđivanja epidemioloških puteva (Christensen 2005). Kada vektor promeni preferentnuvrste koje nisu biljku njeni za ishranu,prirodni ili rezervoari. biljku domaćina, fitoplazme se unose u biljne Evolutivna nekompatibilnost kao i dovoljno česti susreti fitoplazmi i nezaraženih biljaka u životnoj sredini. Ovakvi mogu dovesti do eskalacije infekcije do nivoa epidemije (Weiver & Reisen 2010) incidentni događaji dovode do neusklađenih interakcija patogena sa domaćinima u vidu nesinhronizovanih puteva prenošenja, nanošenja štete biljakama koje inficiraju ili uvećaneet virulentnosti al. 2003; kao etposledice al. kompeticije sa drugim izolatimaMannelli ili simbet al.iontima 2012 (Elliot Chen 2005; Weiver & Reisen 2010; ). Učestalost ovakvih dešavanja direktno zavisi od relativneet al. gustine 2006; populacija domaćinaet al. 2010; i geografskogAplin et al. rasprostranjenja vektora (Tatem Fabiszewski 2011). Interakcije fitoplazmi i biljaka koje koriste kao nišut al. je u kontekstu ekoloških interspecijskihbiljka odnosa domaćin teško definisati (Hogenhout e 2008). Iako se najčešće koristi termin , kao i u odnosu cikada i biljaka, u najširem smislu u slučaju fitoplazmi se radi se o obligatnom parazitizmu čime biljka biva neophodnost za preživljavanje ovog biljnog patogena. Fragmentacije staništa i narušavanje prirodne ravnoteže nutrijenata navode insekte na ishranu na gajenim kulturama što ima za posledicu unošenje patogena u biljne vrste koje nisu koevoluirale sa njim. Kao posledica povremene ishrane vektora na biljkama koje- nisuinsekt domaćini vektor iinsekta, vice versa fitoplazma može napustiti zatvoreni ciklus (biljka domaćin ) čime se epidemiološki ciklus otvara, a put prenošenja patogena usložnjava. Biljke prirodni izvori zaraze uglavnom nemaju simptome ili su takvi da ne ugrožavaju opstanak jedinke, za razliku od useva koji razvojem simptoma mogu potpuno stradati (COST action FA 0807 2014). Za mnoge gajene biljke koje trpe agroekonomskudead-end hosts štetu još uvek nije poznato da li predstavljaju krajnje domaćine (engl. etentnosti i brojnosti) ili izvore vektora, patogena, kao ali i jeod sigurno biljaka da dualnih stepen zarazedomaćina zavisi od komp Boudon-Padieu 2003; Johannesengde se et životni al. ciklusi insekta i fitoplazme ukrštaju ( 2012).

1.3 'Candidatus Phytoplasma solani' − stolbur fitoplazma: epidemiologija uslovljena vektorom, putevi prenošenja i molekularna identifikacija -

‘CandidatusStolbur fitoplazma (16S rRNKCa. XII A podgrupa), predložena i opisana kao Phytoplasma solani’ (' P. solani',et CPs) al. 1994; na osnovu Quaglino STOL et al. izolata 2 iz zaražene paprike sa teritorije Srbije (Seemüller 013), endemičnanekoliko oligo je za- ili Evropu polifagnih i Mediteran vektora i (Leeostvaruje et al. složene epidemiološkeet al. 1998; cikluse Firrao kroz et al. 1998; Seemüller Solanaceae i 2005). Iako se primarno dovodi u vezu sa usevima iz familije vinovom lozom u čijoj proizvodnji dovodi do značajnih gubitaka, u literaturi je do sadaprisustvo poznato (Quagli prekono 70 et biljnih al. vrsta2013; iz 14 familija u kojima je detektovanoŠiroko njeno COST-indukovanih action FAbolesti 0807 gajenih 2014 biljaka). su rasprostranjenje H. i visokaobsoletus incidenca kao efikasnog CPs vektora i povoljnih sredinskih uslova, posledica areala ali i raznovrsnih epidemioloških puteva diseminacije patogena u zavisnosti od prisustva biljaka koje su istovremenoet al. rezervoari infekcije i domaćini vektora (Langer & Maixner 2004; Johannesen 2008; 2012). Zbog togaefinisanje su istraživanja biljaka biologije i ekologije ove cikade primarno fokusirana na jasno d ꞌCa. P. solaniꞌ domaćina u cilju utvrđivanja njihovoget al. značaja u epidemiologiji et al. 2011; Aryan et al. 2014; (Langer &et Maixner al. 2004; Sharon 2005; Kessler H. obsoletus polifagna vrsta i Maixner 2014). Iako postoji konsenzus da je brojne publikacije navode da je ova vrsta prisutna na raznim zeljastim i drvenastim biljnim vrstama (pregled dat u Maixner 2010; Prilog 1), pojedini autori navodebiljaka (Suho takođe i striktne asocijacijacije larvi na korenovom sistemu određenih Sforza et al. v & Razvyazkina 1955; Güclü & Ozbeket al.1988; Hoch & Remane 1985; 1999; Langer & Maixner 2004; Sharon 2005). bolest kojuEkonomski uzrokuje najznačajnija, 'Ca. P. solani' najširejeste Bois rasprostranjena noir i najviše proučavana (BN) bolestH. obsoletus vinove loze (Maixner 2010). Većina dosadašnjih istraživanja asocijacija sa biljkama domaćinima i puteva CPs prenošenja su fokusirana na vinogradeSforza centralne et al. Evrope, 1998; područje koje gravitira severnoj granici areala ove cikade (

et al. 2007; Johannesen et al. etLanger al. & Maixneret al.2004; 2013; Bressan Maniyar et al. 2013; Aryan et al. 2008;. Biljke 2012; koje Kessler se na 2011; Imo H. obsoletus 2014) C. ovomarvensis području i U. dioica dovode u vezu sa su tradicionalni evropski domaćini kao korovske vrste direktno prisutne u vinogradima ili njihovoj okoliniJohannesen i na kojima et al. se odvija primarna akvizicija patogena (Langer & Maixner 2004;C. arvensis i U. dioica2012). Na osnovu razlika među CPs genotipovima vezanim za utvrđeno je postojanje dva nezavisna epidemiološka ciklusa uslovljena prisustvom dva izvora infekcije (Langer & Maixner, 2004;H. obsoletus Maixner, 2010). Skorašnja istraživanja invazivnosti, puteva širenja populacija specifičnosti prema biljkama domaćinama i uticaja na epidemijsku pojavu BN u južnoj Nemačkoj, iduC. arvensisu prilog genetičkoji U. dioica (Johannesensegregaciji populacija et al. na nivou inicijalnihet al. rasa asociranih sa H. obsoletus2018; 2012; Imo C. arvensis2013). Na i U. osnovu dioica analize mikrosatelita populacija asociranih sa , uočena je ekspanzija i porast brojnosti populacija na granici severnogporast areala vrste. Istraživanja u južnoj Nemačkoj su ukazala da je ekspanzija i brojnosti populacija pre svega posledica lokalnih adaptacijahost populacija shift ove cikade prelaskom na koprivu kaoet al. pogodnijeg domaćina (engl. ), a ne prodora iz južnih područja (Imo 2013). ni kao korisni u Različiti genski markeri'Ca. P. su solani' do sada testirani i predlože epidemiološkim studijama tuf među kojima se kao najinformativniji najčešće koriste konzervativnistamp i vmpgen koji kodira Tu faktor elongacije (Langer & Maixner 2004) i geni 1 koji kodiraju membranskeet al. 2009; proteine Fabre koji et al.učestv uju u interakciji fitoplazme sa domaćinom (Cimerman Multilocus Sequence2011a; Typing 2011b). Multilokusni pristup karakterizaciji izolata (engl. 'Ca. P. solani' jer se na, MLST) je postao standard u epidemiološkim istraživanjima ovaj način mogu prevazići geografske i biološke barijere, kao i otkriti(Johannesen preferentnost et al. 2012; patogena Aryan et al. prema specifičnomet al. domaćinu ili domaćinima 2014; Cvrković 2014).tuf gena pokazalo da on Iako se testiranjem filogenetske informativnosti nije adekvatan marker za'Ca nivo. P. diferencijacijesolani' kandidata vrsta fitoplazmi, njegov značaj u istraživanjima postaje nezamenljiv od trenutkaet al. otkrića 1997; stabilne divergencije uslovljene biljkom izvorom infekcije (Schneider 12

Langer et al. 2003; 'Ca. P. solani' Langer & Maixner 2004). H. obsoletus Pitanje dualnog domaćina u epidemiologiji vođenoj od strane kao vektora je krucijalno jerna se primarna akvizicija fitoplazme odvija od straneazkina larvi koje1955; se hrane eti razvijaju al. korenu odgovarajućihtuf biljaka (Suhov & Razvy Kaul 2009). Genotipizacijom gena kroz PCR i RFLP metode utvrđena jetuf bazična- - genetička divergencija u vidu epidemioloških U. dioica putevatuf- koje- realizuje (1) a (VK I) CPs tipC. izvirućiarvensis iz( inokuluma i (2) b (VK II) CPs tip čija je biljka domaćin Langer & Maixner 2004). Oba tipa stolbur fitoplazme kroz asocirane populacije vektora dospevaju do vinove loze tufi drugih-a ili tuf kultura- koje u zavisnosti od biljkeširenja dualnog dva tipa domaćina 'Ca. P. mogusolani' biti u inficiranekontekstu Bois noir bbolesti tipom. vinove Obrazac loze pojave je u i narednim godinama potvrđen širom areala vektora ističući postojanje dva epidemiološka sistema koji prožimaju prirodne i agroekosistemeJohannesen et i al.nedvosmisleno 2008; 2012; Aryanukazuju et naal. 2014; biljku Atanasova koja predstavlja et al. izvor infekcije ( 2015). Zaet razliku al. od simptoma koje mogu ispoljavatiet al. CPs zaražene biljke poponca (Aleksić 1967; Maixner 1994; Sforza 1998), nedostatak istih na koprivi ukazujeUpravo zbog na dugoročni toga je dokaz komensalni o koprivi odnos kao sarezervoaru ovim domaći 'Ca.nom P. solani' (Constable 2010). nakon ustanovljene preferentnosti H. obsoletus utvrđen tek populacija ka ovoj biljci kada se pojavilo interesovanje za njenu ulogu kao potencijalnog izvora infekcije (Langer & Maixner 2004). Zahvaljujući molekularnim metodama koje ' suCa . omogućileP. solani', utvrđivanjepokazalo se da izvora je kopriva zaraze karakterizacijom samo jednog Bois gena noir Austriji usled vrlo br odgovorna za uvećanu incidencu (Bressanu Nemačkoj et al. i 2007; Lessio et al. ojnih i visokoet al. inficiranih 2007; Aryanpopulacija et al. 2014 vektora Skorašnji nalaz2007; novog Maixner tuf tipa 'Ca. P. solani' detektovan). na teritoriji Austrije (Aryan et al.je prividno destabilizovao dotadašnju jasnu epidemiološku divergenciju 2014). Iako ovaj epidemiološki tip potiče isključivo iz koprive tufkao- dualne biljke domaćina i samo jednom mutacijom je udaljen od tradicionalnog a tipa, pozicija izmenjHpa enog nukleotida uslovljava nedostataktuf-b tipa restrikcionog odakle je i usledio mesta njegov prepoznavanja naziv tuf- II enzima i lažno prikazivanje kao 13 b2. Prilikom prvog nalaza prisustva ovog tufgenotipa-ab, odnosno na teritoriji tretiranje jugoistočne ovog genotipa Evrope predloženo je njegovo preimenovanje u tufkao prelaznog tipa koji se u RFLP analizi prikrivenotuf pokazujegenotip kaokoji pripadab i može tuf se-a precizno odrediti samo sekvenciranjemtanasova kao et al. epidemiologiji vezanoj za koprivu (A 2015).

1.4 Specijalizacija vektora H. obsoletus prema biljkama domaćinima i uticaj na epidemiologiju 'Ca. P. solani'

biološkihDosadašnjim i ekoloških istraživanjima razlika vezanih je otkriveno za H. obsoletus nekoliko manje ili više stabilnih C. arvensis, U. dioica i V. agnus-castus. asocijacije sa biljkama domaćinima, Toet al.su manje razlike u larvalnom razvićuperiodu zabeležene na teritorijiex C. arvensis Italije i(Cargnus ex U. dioica , uz2012) ozbiljnije i manje odstupanje razlike u odnosu letana ex populacija V. agnus -castus asocijaciju koje pored toga karakteriše i dvogeneracijsko2006; Sharon et al. razviće u Izraelu (Langer & Maixner 2004; Maixner & Langer 2005). Najupečatljivija razlikaCa. između P. solani' populacija asociranih sa poponcem i koprivom je stabilna divergencija ' izolata koje asocirane populacije vektora prenose kroz dva zasebnaH. obsoletus epidemiološka puta (Langer & Maixner 2004). Uprkos tome, simpatrija populacija asociranih sa ova dvaet al. domaćina 2013; Atanasova nije redak et al. slučaj 2015; i može Landi se et čakal. zabeležiti i u striktnoj sintopiji (Imo H. 2015). obsoletus Istraživanja genetičke struktureBois noir asocijacija su inicirana epidemijskim izbijanjem bolesti u vinogradima Nemačke, Austrije'Ca. P. i Švajcarske koja su pokazala da je potpuno sagledavanje (Johannesen epidemiologije et al. 2008; solani'2012; mogućeet al. samo 2013; poznavanjem Manyar et al. biologije 2013; Aryan vektora et al. 2014; Imo - Johannesen H. & Riedle‐Bauerobsoletus 2014). Analize populaciono genetičke strukture evropskih asocijacija sa poponcem i koprivom, Olea uz poređenjeeuropaea sa izraelskom na populacijom sakupljenom na konopljici i maslini ( ), ukazale su genetički(Johannesen diverzitet et al. uslovljen biljkomet al. domaćinom A kao i potencijal ekspanzije 2008; 2012; Imo 2013). nalizama mitohondrijskih gena 14

H. obsoletus utvrđena je ekspanzija - asocijacije sa koprivom u severne regione centralnediverziteta Evrope (Johanneseniz cirkum et al.alpijskog 2008; Aryan područja et al. 2014; uz detekciju niskog haplotipskog 2014 Johannesen & Riedle‐Bauer ). Sa druge strane, najviši genetički diverzitet zabeležen izraelske populacije sugeriše na bliskoistočno poreklo vrsteH. obsoletus i kolonizaciju novih staništa preko jugoistočne Evrope. Unutar evropskih populacijadve host su detektovanerase vezane dveza geografskiC. uslovljenearvensis i U. genetičke dioica koje linije, su in situ i postojanje ev domaćine oluirale na severozapadnojJohannesen granici et al.areala 2008; čime seet pokazalo al. genetičko raslojavanje vrste na više nivoa ( Imo 2013). nedostupnostiMonofagne preferentne vrste insekata biljke i/ili u slučajevimausled promene geografskog areala, promena u sopstvenom ponašanju moguet al. uvesti novu biljku domaćina u životni ciklus (Diehl & Bush 1984; Wingfield 2011). Međutim, sam prelazak na novog domaćina nije jedino mogućetaknuta objašnjenje za simpatričku diferencijaciju insekata koja može biti pods prestankom korišćenja dotadašnje biljke domaćina usled ekološkog pritiska, kojoj seet al.može vratiti nakon ponovnoghost rasa je uspostavljanja optimalnih uslova sredine (Singer bi 1992). Fenomen karakterističan i za insekte koji koriste spektar ljaka širom areala ali su usled klimatskih i geografskih ograničenja i specifičnosti staništa orjentisani na svega nekoliko domaćina. Specijalizacija i diferencijacija populacijagenet vezanih životnim ciklusom za različite biljke posledično može voditi ka ičkom udaljavanju ovih „linija“,host o čemu rasa svedoče mnogi slučajevi u prirodi koji zadovoljavaju kriterijume evolucije i potencijalne simpatričke specijacije (Drès & Mallet 2002; Berlocher & Feder 2002). Ovo je posebno značajno kada seH. obsoletusuzme u obzir činjenica da je na teritoriji Balkana utvrđena asocijacijaCrepis populacija foetida sa koprivom, poponcem i sa novom biljkom domaćinom et al. (Slika 3) kod kojih je registrovana genetska divergentnost (Kosovac 2013). Preliminarni rezultati genetičkih analiza pokazali su da se populacije asociraneC. foetida sa poponcem et i koprivom al. znatno razlikuju od populacija sakupljenih na (Kosovac 2013). Genetički parametriH. obsoletus su ukazali koja naje vezana mogu ćeza C. postojanje foetida u specifične filogenetičke linije unutar vrste jugoistočnoj Evropi čiji stepen diferencijacije u odnosu na populacije asocirane sa 15

C. arvensis i U. dioica prevazilazi host ranijerasa sa severa detektovan areala. fenomen

Odabir različitih biljaka domaćinavrste fitofagnog od strane populacijainsekta, kaoiste pogodne niše za kompletan životni ciklus ili samo deo razvića, nosi sa sobom čitav niz posledica, kao što su prostorne i vremenske promene ur populacionoj dinamici, eproduktivnom ponašanju i koevoluciji sa različitim endosimbiontima (Bernays & Slika 3. Hyalesthes obsoletus Chapman 2007). H. Istraživanja obsoletus Crepis foetida; ženka populacione genetike neposredno ispod cvasti sprovedena u poslednjoj deceniji lokalitet Niš, jul 2014. rezultiralasagledavanje ove su vrste promenomkao polifaga i ukazala da je prefer entnost ka određenoj biljci zapravo bihevioralno eksprimiranje divergencije genetičkih linija koje- podležu složenim evolutivnim promenama na području kompletnoget al. 2008; cirkum 2012; mediteranskoget al areala u odnosuet al. na biljku domaćina (Johanessen Imo . 2013; Kosovac 2013).

2. Ciljevi

H. obsoletusNaučni cilj doktorske disertacije je testiranje potencijala kriptične specijacije kao posledice ekološke specijalizacije premaCa. biljci domaćinu i uticaja ove diferencijacije na epidemiološke H.puteve obsoletus prenošenja ' Phytoplasma solani'. U cilju sagledavanja preferentnosti prema različitim domaćinima ispitivane su genetičke karakteristike populacija u sintopiji i široj simpatriji, prateći varijabilnost mikrosatelita kao markera informativnih za utvrđivanje skorašnje diferencijacije i razmene genetičkog materijalaki H. obsoletus među bliskim populacijama. Analizom mitohondrijskih markera jedin iz populacija sa šireg geografskog područja jugoistočne Evrope, ciljano sakupljenih sa različitih domaćina, testirana je njihova evolutivna istorija, filogenetskiCa. odnosi i status kriptičnih vrsta/podvrsta. Putevi diseminacije genotipova ' Phytoplasma solani' prisutni u biljkama dualni domaćinima vektora analizirani su molekularno epidemiološkim pristupom u cilju utvrđivanja njihovog ukrštanja i povezanosti. EksperimentalnimH. obsoletus sensu lato testiranjima ispitivano vektorskog potencijala specijalizovanih populacija 'Ca. je preklapanje epidemioloških ciklusa genotipova Phytoplasma solani' koji potiču od različitih biljaka rezervoara bolesti i koji preko asociranih populacija vektora uslovljavaju različite epidemiološke cikluse.

Specif• ični ciljevi ove disertacije su: H. obsoletus Ispitivanje genetičke diferencijacije populacija u asocijaciji sa • različitim biljkama domaćinima na području jugoistične Evrope; AnalizeH. obsolet nivoaus protoka gena među simpatričkim i sintopskim populacijama • u asocijaciji sa različitim biljkama domaćinima;H. obsoletus sa 'Ca. Utvrđivanje inficiranosti različitih populacija vektora Phytoplasma solani' i uloge biljaka domaćina vektora kao rezervoara • fitoplazme i izvora infekcije; H. obsoletus Analize uticaja preferentnosti i specifičnostiCa. prema biljkama • domaćinima na epidemiološke cikluse ' Phytoplasma solani'; Ca. Utvrđivanje molekularnih specifičnosti različitih genotipova ' Phytoplasmapreko insekta solani'vektora i do praćenje obolele putevabiljke. diseminacije od biljke rezervoara

3. Materijal i metode

Istraživanja populacionogHyalesthes diverziteta, obsoletus vektorske uloge i epidemiološkog značaja asocijacija vektora sa različitim biljkama domaćinima– u jugoistočnoj Evropi sprovedena su tokom perioda odH. šest obsoletus godina (2011 2016). Istraživanja su bazirana Convolvulus na sakupljenim arvensis populacijama, Urtica dioica , Vitex agnusasociranim-castus sa i Crepisčetiri biljkefoetida domaćina: na teritoriji 6 država jugoistočne Evrope i Turskoj: Srbije, Bugarske, Rumunije, Crne Gore, Makedonije, i Grčke. Analizama su priključene informacijeja H. obsoletus ili DNKex V. izolati agnus preuzeti-castus iz prethodno publikovanih istraživanja populaci iz Izraela, populacije iz Rumunijeet i al. Rusije i svi et prethodno al. 2013; okarakterisaniet al. mitohondrijski haplotipovi (Johannesen 2008; Imo Chuche 2018).

HyalesthesU filogenetske thracicus analize je uključen -filogenetski paratipski primeraknajsrodnije mužjaka vrste iz vrste H. obsoletus (Slika 4) kao morfo sakupljen grupe1979. vrstagodine (Hoch u okolini & Remane j 1985; Hoch 1986b). Preparovani insekt ezera Volvi(Museum (Grčka) für je Naturkunde, bio deponovan Leibniz u- Institutentomološkoj für Evolutions zbirci - prof. und Biodiversitätsforschung, dr Hannelore Hoch Berlin ).

Slika 4. Muzejski paratip Hyalesthes thracicus en od strane . Hoch, 1986. Primerak je ustuplj prof. dr Hannelore Hoch iz lične entomološke zbirke

3.1 Populaciono-genetičke analize diverziteta H. obsoletus

3.1.1 Sakupljanje populacija specijalizovanih prema biljci domaćinu Uzorkovanje H. obsoletus do populacija u asocijaciji sa ciljnim u skladu biljkama sa maćinima, sprovedeno je od kraja juna et do al. početka oktobra dostupnimSharon et al. podacima o perioduet al. leta (Aleksić et al.1967; Hoch & Remane 1985; 2005; Cargnus 2012; Kosovac 2013). Prilikom sakupljanja insekata metodom košenja entomološkom mrežom birane su individualne biljke ili manji monodominantni vegetacijski sklopovi. Ciljna staništa su bile nenarušene kserotermne livade, zaparložene površine, ruderalna staništa i kamenite podloge u mediteranskom litoralu čimeH. je obsoletus fokus bio usmeren ka prirodnim staništima ciljnih biljaka domaćina populacija , u odnosu na sva dosadašnja istraživanja koja su usmerena na agroekosisteme i korovsku vegetaciju. Na ovaj način je procenjena prirodna biološka dinamika vektora nezavisna od kultura koje mogu uticati na preživljavanje i populacionu brojnost cikada. Pojedinačni primerci su sakupljeni usnim aspiratorom, prebačeni u tubice zapremine 2ml (Sarstedt) ispunjene 96% etanolom i zatim transportovani do laboratorije u prenosnom frižideru na temperaturi od 10°C. Sakupljeni insekti su u laboratorijskim uslovima skladišteni u frižideruH. obsoletus na temperaturi od 4°C, do kasnijih analiza. Sve jedinke su determinisane kao pod Hyalesthes stereomikroskopom (Leica MZ7.5) prateći ključ za determinaciju vrsta roda (Hoch & Remane 1985) baziran na morfologiji genitalnog aparata mužjaka. Na lokalitetima u istočnoj Srbiji,H. obsoletusgde je sprovedenim istraživanjimaC. foetida, utvrđenoizvr prisustvo populacija adulata u asocijacijiC. foetida sa koje su šeno je ciljano sakupljanje larvi familije Cixiidae na korenu kasnije molekularno determinisane kako bi se proverio status ove biljke kao domaćina. 3.1.2 Ekstrakcija DNK

Nedestruktivna i delimičnoet modifikovana al. natrijum dodecil sulfat (SDS) metoda ekstrakcije DNK (Rees 2001; MahukuH. obsoletus 2004) korišćena je za izolovanje genomskog sadržaja iz pojedinačnih jedinki . Svi primerci su punktirani sterilnom iglom u predelu toraksa između drugog i trećeg tergita. 19

Punktiranje je vršeno pod binokularnom lupom (Leica MS5). Punktirani insekti su zatim prebačeni u tubice zapremine 2ml (Sarstedt), ispunjene sa 400 μl ekstrakcionog pufera (20 mM TRIS, 10 mM EDTA, 0.5% SDS) i 4 μl enzima proteinaze K (Fermentas) koncentracije 187.5 µg/mL. Inkubacijom tubica 12 sati u vodenom kupatilu na 56°C degradiraju se meka tkiva i nukleinski sadržaj se rastvara u puferu. Nakon inkubacije, insekti su uklonjeni iz rastvora i prebačeni u nove tubice zapremine 1.5 ml ispunjene 96% etanolom u kojima su čuvane na temperaturi od 4°C za dalje morfološke analize. U pufer sa organskim sadržajem uzorka dodata je jednaka zapremina hloroforma (400 μl) i DNK je izdvojenad centrifugiranjem sadržaja na 11000 obrt/min na temperaturi od 4°C u trajanju o 10 minuta. Korak sa hloroformom je ponovljen, a zatim je u dobijeni supernatant dodata jednaka zapremina ledeno hladnog izopropanola (400 μl). Centrifugiranjem brzinom 12000 obrt/min u trajanju od 15 minuta istaložena je DNK u vidu plake na dnu tubice, koja je zatim isprana 96% etanolom, osušena pod stujom steilnog vazduha i rastvorenaH. u thracicus50 μl TE pufera (10 mM TRIS, 1 mM EDTA, pH 7.6). Paratipski primerak (Slika 4) je pažljivo odvojen od entomološke pločice i zatim pripremljen za ekstrakciju na prethodno opisan način. Genomska DNK ovog primerka je izolovana koristeći komercijalni komplet za izolovanje DNK DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Nemačka) prateći uputstvasvih proizvođača. Obe metode izolacije DNK su omogućile morfološko očuvanje individua za potencijalne- dalje analize. Ekstrahovana DNK pojedinačnih insekata je čuvana u zamrzivaču na 20°C do daljih analiza. 3.1.3 Genotipizacija mitohondrijskih markera 3.1.3.1

Amplifikacija- mitohondrijskih markera

Populaciono genetičke analize mitohondrijske DNK (mtDNK) su sprovedene na dva genska regiona, od kojih jeH. svaki obsoletus sastavljen od po tri gena čija je informativnost u kontekstuet al. 2008; divergencije COI-tRNK(Leu)asocijacija-COII genski prethodno region sastavljenpotvrđena on (Johannesen citohrom oksidaze subjedinice2012): (1)I ( COI tRNK Leu citohrom oksidaza subjedinica II (COII), transportne16S - RNKtRNK(Leu) ( -ND1) za leucin ( ), 16S) i rRNK (2) region koji čine 16S subjedinica ribozomalne RNK ( ), transportna RNK

(tRNK Leu nikotinamid adenin dinukleotid dehidrogenaza subjedinica 1

(ND1 ) za leucin ( ), ). Umnožavanje mtDNK regiona je urađenoCOI lančanom-tRNK(Leu) reakcijom-COII genski polimeraze region ((PCR) koristećiet al. prajmere - S2792- i A3661-J - za12261 za 16S-tRNK(Leu)-ND1 region Brown 1996) i LR N 12945 i N1 (Hedinu 20 1997) (Tabela 1). Reakcije umnožavanja su za oba genska regiona urađene μl PCR2 smeše koju2 čine: Kapa BiosystemsCOI-tRNK(Leu) High-COII Yield Reaction Buffer A (1 x16S 1.5- mMtRNK(Leu) MgCl-),ND1 MgCl (3.5 mM za region, 1.5 mM za Taq region), dNTPs (0.5 mM), odgovarajući prajmeri (0.4 µM), KAPA polimeraza (Kapa Biosystems, Inc., Woburn, MA, USA) (0.0375 U/μl) i 1 μl ekstrahovane DNK. a u Temperaturni protokol umnožavanj Mastercycler ep gradient S

(Eppendorf, Hamburg, Germany) je bio sledeći:

95°C 2 min inicijalna denaturacija

95°C 30 sec denaturacija 48°C 1 min hibridizacija prajmera 35 ciklusa

72°C 90 sec elongacija

72°C 10 min finalna elongacija

Radi provere uspešnosti amplifikacije, 5μl PCR produkta svakog- uzorka je elektroforetski razdvojeno u 1% agaroznom gelu u TBE puferu (Tris Borat 90 mM, EDTA 1 mM), obojeno etidium bromidom i vizualizirano pod UV transiluminatorom. Nakon vizuelne procene koncentracije i dužine umnoženih fragmenata mtDNK regiona u odnosu na DNK marker 100 bp DNA Ladder Extended (SERVA), PCR produkti su sekvencirani na ABI Prism 3700 automatskom kapilarnomsekve sekvenatoru (Macrogen Inc., Seoul, South Korea). Provera kvaliteta nci i njihovo prevođenje u FASTA format je urađeno u programu FinchTV v.1.4.0 (www.geospiza.com). Poređenje, utvrđivanje nukleotidnih razlika i poravnanje sekvenci je izvršeno pomoću CLUSTALson et al. W programa integrisanoget al. unutar MEGA 5.2 programskog paketa (Thomp 1994; Tamura 2011).COI- tRNK(Leu)Dužine-COII sekvenci i 400 bp mtDNK (16S- tRNK(Leu) regiona korišćenih-ND1 kako u analizamabi rezultati su bili 780 poredivi bp ( sa ) ) 21

tretirana kao publikovanim podacima. Dva genska regiona su u analizama spojena i jedan jedinstven genski segment (jedna particija) koja u(Johannesen imenovanju ethaplotipova al. 2008; prati prethodno postavljenu alfabetsku nomenklaturu Prilog 2). Sekvence svih podataka novodetektovanih (engl. National haplotipova Center su pohranjene for Biotechnology u online NCBIInformation genetičku bazu (engl. accession, NCBI; number https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)- pod pristupnimCOI-tRNK(Leu) brojevima-COII i - , 16SrRNK acc. no.)- tRNK(Leu) KY368699-ND1KY368724 genski region. za KY368692 KY368698 za Tabela 1. H. thracicus Prajmeri korišćeni za amplifikaciju dva genska regiona paratipskog primerka . Nazivi novodizajniranih prajmera i degenerisana mesta prajmerskih sekvenci su označeni podebljanim slovima. Prikazane dužine mtDNK genskih segmenata ne obuhvataju prajmerske pozicije.

Naziv prajmera i sekvenca Region S2792 Dužina obuhvaćenog regiona u 5' → 3' smeru

et al S2792 / Hy-TL-R1 ATACCTCGACGTTATTCAGA 245 bp

(BrownHy- TL-R1. 1996) GRTTTW MTAGAYGAATTTTAAG COII - CTTTHy-TL-F1 RTGAA Hy-TL-F1 / Hy-COII-R TGGCAGAAAAGTGCTHy-COII-R1 340 bp R tRNK(Leu) - TCATATCTTCAHy-COIITATCATTGATG-F1 COI DATY HATAGG Hy-COII-F1 / A3661 CCATCAATTTCA3661AAAAC 270 bp

et al. CCACAAATTTCTGAACATTGACCA - -12945 (Brown 1996)

ND1 LR N - -12945 / Hy-ND1-R1 - CGACCTCGATGTTGAATTAA 307 bp (HedinHy-ND1 1997)-R1 LR N TTW YTGAATATAW

CGAAAHy-ND1-F1 CC tRNK(Leu) - Y Hy-ND1-F1 -J-12261 -J-12261 GTTGCTTA TTTATTCTTCTTGA 337 bp / N1 N1

16SrRNK TCGTAAGAAATTATTTGAGC (Hedin 1997)

Imajući u vidu da je DNK muzejskih primeraka insekata usled starosti i načina čuvanja često degradirana i fragmentisana,H. thracicus osmišljena je posebna metodologija njene analize kod paratipskog primerka , umnožavanjem kratkih fragmenata ciljanih genskih regiona. Dizajnirani su degenerisani prajmeri koji će omogućiti umnožavanje kraćih fragmenata genskih regiona i obuhvatiti kompletnu željenu sekvencu. Dizajn prajmera za umnožavanjeznata, kratkih bio je fragmenata,baziran na obzirom da je sekvenca za koju treba da se vežuH. nepoobsoletus poravnanju sekvenci svihHyalesthes poznatih philesakis haplotipova, H. luteipes, H. ponticorum,i sekvenci H. sledećihaylanus, cikadaReptalus familije panzeri, Cixiidae: R. melanochaetus, R. cuspidatus i Setapius apiculatus. Šest ( et al. 1996; novodizajniranih prajmera su u kombinaciji sa standardnim Brown Hedin 1997), pokrili kompletan željeni genski region naknadno sastavljen od 5 kratkih genskih fragmenata (Tabela 1). Korišćena PCR smeša za umnožavanjeH. obsoletuskratkih fra gmenata je bila ista kao za umnožavanje fragmenata pune dužine uzoraka, dok je termalni protokol izmenjen samo u koraku elongacijeH. thracicus koja, COI je- tRNK(Leu) skraćena - naCOII 45 i 16SrRNK sekundi.- NukleotidnetRNK(Leu)-ND1 sekvence genskihdeponovane regiona u , takođe su NCBI genetičku bazu pod pristupnim brojevima KY368725 i KY368726. 3.1.3.2

Genealogija mitohondrijskih gena, analize diverziteta i populaciona diferencijacija - - i inter-

Analize populaciono genetičkih specifičnosti, intra specijske varijabilnostiH. obsoletusi utvrđivanje ancestralnih (predačkih) haplotipova između i unutar populacija u asocijaciji sa različitim biljkama domaćina sprovedena je konstruisanjem genealoške haplotipske mreže zasnovane na mtDNK genskim regionima. Geneaološka analiza je urađena primenom dva programa sa različitim algoritamskim metodom formiranja haplotipske mreže:et al. 1) metod statističkeet parsimonijeal. primenjen u programu TCS v.1.21median (Clement-joining 2000; Templeton 1992) uz limit poverenja4.612 od 95% - i 2) metod primenjen u programu Network v. (www.fluxus engineering.com) uz vrednost parametraH. epsilon: Ɛ=0. Genealoške analize konstruisanja haplotipske mreže obuhvatale su

23 obsoletus

haplotipove detektovane u 55 populacija jugoistočne Evrope i Turske sakupljene u ovoj studiji kojima su pridruženi(Johannesen svi prethodnoet al. 2008; opisani 2012; haplotipovi iz zapadne-Baue i centralne Evropeet i Izraelaal. . Johannesen & Riedle r 2014; Chuche 2018) (Tabela 2, Prilog 2) Tabela 2. Uzorkovane H. obsoletus

GPS, dok je broj jedinki populacije asocirane sa četiri biljke domaćina na teritoriji jugoistočne Evrope i Turske. Geografska koordinata je označena skraćenicom sakupljenih po populaciji prikazan u koloni N. Lokalitet GPS H. obsoletus Biljka domaćin Država N Convolvulus Srbija Topola 20

arvensis N44 13.532 E20 40.224 6

PredejaneAleksinac N43 36.010 E21 40.592 9

Petrevo selo N42 49.992 E22 07.912 9

Rumunija N45 49.528 E21 31.548 17 N42 32.245 E19 10.763 20 Crna Gora Martinići Makedonija Podgorica N42 26.919 E19 12.509 12 Hamzali N41 29.860 E22 44.996 11 Strumica N41 26.505 E22 39.922 6

TurskaGrčka Kilkis N40 57.25354.984 E22E38 49.10138.063 3 Urtica dioica Srbija ErzindžanGakovo N39 22

N45 57.88 E19 3.28 20

Bačka Topola N45 47.518 E19 35.604 20 Bačko Petrovo selo N45 43.693 E20 06.114 12 SrednjevoVršac N45 03.874 E21 11.208 15

Boljetin N44 39.685 E22E21 30.36202.090 12

N44 31.740 6

Negotin N44 16.604 E22 30.484 20 Zaječar N43 54.492 E22 17.728 15 Knjaževac N43 30.610 E22 18.833 17 GrnčarVranje N43 01.270 E22 21.825 12

Vranjska banja N42 31.725 E21 54.319 11

Godinje N42 35.417 E21 59.839 6

Crna Gora N42 13.421 E19 06.800

Martinići N42 32.245 E19 10.763 20

Makedonija Podgorica N42 26.919 E19 12.509 17

Hamzali N41 29.860 E22 44.996 19 StrumicaAretusa N41 26.505 E22 39.922 12 N40 45.767 E23 33.096 Grčka Filadelfion 27.846 20 Profitis N40 45.246 E23 6

Vitex Bar N40 39.930 E23 17.331 18 agnus-castus Godinje N42 07.031 E19 04.581 19 Crna Gora N42 13.421 E19 06.800 20

Kamenari N42 28.591 E18 41.028 19 N41 56.515 E19 16.052 ApolonijaUlcinj 10 Asprovalta N40 38.380 E23 29.960 19 Grčka Aretusa N40 45.124 E23 44.024 20

Larisa N40 41.616 E23 40.397 7

Lezbos N39 38.544 E22 16.981 5

Tasos N39 18.565 E26 8.379 3

Crepis foetida Srbija N 40 35.177 E 24 37.525 10

Aleksinac N43 38.54636.010 E21 40.59233.444 20 Deligrad N43 12 Požarevac N44 39.310 E21 11.983 4 Porečka reka N 44 24.267 E22 10.350 21 Negotin N44 16.604 E22 30.484 7 Tamnič N44 04.973 E22 32.048 6 Zaječar N43 50.016 E22 17.334 12 TemskaPirot N43 12.88016.537 E22 31.84031.585 19

Jasenovik N43 20

Vranjska banja N43 22.365 E22 02.441 7

Bugarska N42 34.139 E21 58.367 Vidin 6

N43 57.711 E22 51.258 10

N43 59.926 E22 58.119 RumunijaTurska Kalafat 8

Erzindžan N39 57.253 E38 07.79538.063 1 Kıršehir N39 26.021 E34

Stepen divergencije unutar i između haplogrupa (metapopulacija)pairwise F- sugerisanihstatistike mtDNK genealoškom mrežom određen je primenom (Weir & Cockerhamtandardni 1984) koristeći program Arlequin v.3.5.1.2FST i (Excoffiertheta ( & Lischer 2010). S parametri molekularnog diverziteta θ) izračunati su uzimajući u obzir broj i frekvenciju haplotipovaC. arvensis prisutnih + U. dioica unutar, 177 tri metapopulacijeV. agnus formirane-castus , haplotipskom56 jedinki i mrežom:C. foetida (1) Stepen jedinki; (2) (3) , 83 jedinke (Tabela 2). genetičkog diverziteta unutar metapopulacijak je utvrđen koristeći parametar thetaH (θ) procenjen na osnovuS broja alela (θ ), očekivane Theta homozigotnosti (θ ), π segregacionih mesta (θ ) i nukleotidnih razlika (θ ). (θ) parametar pokazuje distribuciju varijacija unutar i između populacija kada se analizirani uzorak smatra elementom višeg novoa grupisanja iz koga potiče, što je u ovom slučaju metapopulacijaIndeks uslovljenaFST biljkom domaćinom (Tajimapairwise 1983; 1989). fiksacije ( ) i Neiov prosečan broj razlika (Nei & Li 1979) izračunatiH. obsoletus su u programu Arlequin kako bi se utvrdio stepen diferencijacije između ukupno 51 populpopulacija asociranih sa različitim biljkama. Kalkulacije su urađeneF zaST aciju koje su imale najmanje 5 individua (Tabela 2). Vrednost se kreće u intervalu od 0 (podrazumevajući negativne vrednosti) do 1, gde 0 ukazujerazdvajanje na (Hudson odsustvo et divergencije al. između populacija, a 1 ukazujepairwise na potpuno razlike 1992; Weir & Cockerham 1984). Neiove proističu iz mutacija i promena u frekvenciji haplotipova u populacijama usled slučajnog uzorkovanja. -

U cilju utvrđivanjaH. obsoletus delovanja selekcije ili populaciono demografskih procesa na populacije u asocijaciji sa navednim biljkama domaćinima, odnosno odstupanja od pretpostavki D testa neutralne evolucije,i izvršeneFuove FS sustatistike kalkulacije neutralnosti testova neutralnosti: Tadžiminog (Tajimangl. infinite 1989) sites model čije su simulacije bazirane na ISM (e Fs ) matematičkom modelu mutacija (Fu 1997). Negativne vrednosti Fuovog parametra ukazuju na prekobrojnost alela koja se očekuje kod populacija u ekspanziji, dok pozitivne vrednostidrift (Holsinger ukazuju na manjak alela D kod populacija koje su prošle kroz genetički 2012). Tadžimin test je zasnovan na frekvenciji segregacionih varijabilnih mesta i bazira se na odbacivanju nulte hipoteze neutralnog modela 26 nukleotidnenu varijabilnosti koji predviđa jednakost između prosečnog broja vrednostikleotidnih razlika izmeđuD haplotipova i broja varijabilnih mesta. Negativne Tadžiminog parametra ukazuju na pojavu mutacija usled evolutivnih pritisaka i populacione ekspanzije, dok pozitivne vrednosti ukazuju na balansnu selekciju ili skorašnje mešanje različitih populacija. 3.1.3.3 Filogenetske analize

Rekonstrukcija filogenetskih odnosa,H. obsoletus kao i haplotipova u slučaju detektovanih konstruisanja u genealoške mreže, izvršena je na osnovu thodno opisani haplotipovi iz 55Evrope populacija i Izraela iz ove(Johannesen studije kojima et al. su pridruženi i pre -Bauer 2014; et al. 2008; 2012; Johannesen & Riedle poravnateChuche za 2018).sve H. Spojeneobsoletus sekvence dva mtDNK regiona u dužini od 1180 bp su haplotipove i u analizama tretirane kao jedinstvene particije dvoslovne oznake. Najpogodnijiingroup model nukleotidne supstitucije za utvrđivanje filogenetskih odnosaet al. unutar sekvenci je izračunat u programu jModelTest(engl. Bayesian v.2.1.7 Information (Darriba Criterion2012) prateći Bajesov informacioni kriterijum ; BIC). Sugerisani model nukleotidne supstitucije jeneigbour u programu-joining PAUP* v.4.0b10 (Swofford 2002) predefinisan u okviru kalkulacija (NJ) filogenetske analize i korišćen prilikom izračunavanja evolutivnih distanci između haplotipova i sugerisanihCOI filogenetskih-COII gena klastera. Genetičke distance su procenjene i na osnovu izdvojenih kao(Hebert filogenetski et al. 2003; najinformativnijih Bertin et al. markera za diferencijacijuet al. i identifikaciju vrsta r 2010; Wangmaximum 2017). parsimony U istom programu je urađena i ekonstrukcija bootstrapfilogenetskih odnosa (MP) ACCTRANmetodom uz 500 replikacija (engl. ), kao i u slucaju NJ analize, odabiromTree- Bisection– optimizacijeReconnection karakbranchtera swapping i TBR mode topološke transformacije (engl. ). Filogenetske analize bazirane na Bajesovoj statistici urađene su u programu MrBayes v.3.1.2 (Huelsenbeck & Ronquist 2001; Ronquist & Huelsenbeck 2003) korišćenjemjModelTestmodela-u nukleotidne supstitucije sugerisanog BIC kriterijumom u . Parametri analize su podrazumevali: dva simultana ponavljanja od po 1,000,000 generacija,burn-in uzorkovanje na svakih 100 generacija i odbacivanje 25% rezultata (engl.

25%)odnosno radi eliminisanja greške. Za procenu verodostojnostiMarkov rezultata Chain analize, Monte Carlo dostizanje stacionarne faze Markovljevih lanca (engl. Bajesove analize u MrBayes, MCMC)- prilikom uzorkovanja i proveru stabilnosti u, korišćen je program Tracer v.1.5.0outgrup (Rambaut- & Drummond 2009). vrste H.Za thracicus sve tri filogenetske analize kao a je korišćena mtDNK sekvenca . Za vizualizaciju stabala i posteriornih verovatnoća korišćen je program FigTree v.1.4 (Rambaut 2012). 3.1.4 Genotipizacija mikrosatelitskih nuklearnih markera 3.1.4.1

Amplifikacija- mikrosatelitskih nuklearnihH. obsoletus markera

Populaciono genetička struktura asocijacija bazirana na- nuklearnoj DNK (nDNK), tačnije kratkim ponavljajućim varijabilnim sekvencama mikrosatelitima, procenjena je kombinacijom statističkihet al. i filogenetskh analiza sedam lokusa: B82, F56, F84, H120, E96, G85 i C147 (Imo 2011) (Tabela 3). Tabela 3. et al. Nazivi nuklearnih mikrosatelitskih markera, prikaz ponavljajućeg motiva mikrosatelita i nukleotidnih sekvenci odgovarajućih prajmera (Imo 2011).

Naziv lokusa Sekvenca prajmera Ponavljajući motiv (mikrosatelita)B82 10 u 5' → 3' smeru Frw: TGTAAGCACAAGAGACCTATCG (CA) Rev: CTCTTCCCTTCGTCAACG F56 12 Frw: AAGGCGCACGTTTCTACTGT (CCA) Rev: TCGAAAATCGCGTTATCAGTC F84 13 Frw:CCACCTTTTCCCCTTATGAA (CA) Rev: GAGACTCCAGTTGCCACACA H120 3 7 Frw: AACTCTCATGCGGACCAGAC (CA) TA(CA) Rev: AAGGGGATGGGTAGAACGAC E96 15 Frw: CGGCGTAAATTTGGAGAGAA (GA) (prekinuto sa 4 T) Rev: ATCCCTCTTCCCCTTCTTCA G85 10 Frw: AGCAAACACCTGCCTCTGAA (CA) Rev: CCAAAATTAGCGAACCGAAC 21 Frw: GGTGTTTTTCCTCTACTGTCTGAG C147 (CA) Rev: GGACATGGCTACGTTCAACA

Proceduri umnožavanja mikrosatelita je prethodilo utvđivanje- koncentracije ekstrahovane DNK koristeći mikrozapreminski nano spektrofotometar NanoDrop (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany) radi pripreme radnih rastvora DNK koncentracije 30 ng/μLet al. koji omogućavajuet al. poredive rezultate i optimalan kvalitet amplifikacije (Manyar 2013; Imo 2013). Mikrosateliti ukupno 702 H. obsoletus jedinke grupisane u 50 populacija (Tabela 2), amplifikovani su u dve nezavisne PCR procedure koristeći 4, odnosno 3 para fluorescentnihQIAGEN Multipleks prajmera. Umnožavanje PCR Kit (Qiagen, je urađeno koristeći komercijalni u ukupnoj PCR komplet Hilden, Nemačka) zapremini od 10 μl, odnosno 8.5 μl PCR smešeQIAGEN i 1.5Multiplex μl genomske PCR Master DNK Mix optimalne koncentracije.2 PCR smeša je sadržala 1x . (3 mM MgCl ) i 0.2 μM koncentracije svakog od prajmera et al.

Termalni uslovi reakcije su bili sledeći (Imo 2011; 2013):

95°C 30 sec inicijalna denaturacija

94°C 30 sec denaturacija ( 60°C B82, F56, F84 i H120) 30 90 sec 62.5°C hibridizacija pajmera ciklusa (E96, G85, i C147)

72°C 90 sec elongacija

72°C 10 min finalna elongacija

Amplikoni su sekvencirani na- GA3130XL kapilarnom sekvenatoru (Applied Biosystems) koristeći 11.7 μl HiDi formamida, 0.3 μl boje ROX 500 standard (Applied Biosystems, Carlsbad, USA) i 1 μl PCR produkta. Dužina umnoženih alela je utvrđena u programu GeneMapper v.4.0 (Applied Biosystems) kroz iščitavanje vrednosti pikova elektroferograma. U slučaju uzoraka čiji se mikrosateliti u jednom ili oba PCR miksa nisu umnožili, kompletnata. procedura amplifikacije i sekvenciranja je ponovljena u cilju verifikacije rezulta

3.1.4.2

Diverzitet i varijabilnost mikrosatelita

Prisustvo nultih alela je procenjeno koristeći EM algoritam inkorporiran u programet al. FreeNa (www1.montpellier.inra.fr/CBGP/software/FreeNA) (Dempester 1977; Chapuis & Estoup 2007). Pored određivanja frekvencija nultih alela na nivou lokusa i populacija, izračunata je i prosečna učestalost-Vajnbergove nultih alela na nivou asocijacija(engl. Hardy sa-Weinberg biljkom Equilibriumdomaćinom. Devijacije od Hardi ravnoteže- et al , HWE) procenjene su u programu MICRO CHECKERLinkage Disequilibrium (Van Oosterhout . 2004). Genotipskaon-line povezanost lokusa (engl. , LD) proverena je u verziji programa GENEPOP (Raymond & Rousset 1995) nakon čega je primenjena Bonferroni korekcijaAllelic (Rice 1989).number Iz obe analize je isključen polnoAllelic vezani richness lokus, A C147. Broj alela (engl. R , A) i bogatstvo alela (engl. ) su procenjeni na osnovu svih 7 mikrosatelita u programu FSTAT v.2.9.3 (Goudet 1995),FIS dok je lokus C147 isključenheterozigotnost pri izračunavanju (HE koeficijenta inbridinga ( ). Prosečna očekivana ) je izračunata u programu ARLEQUIN v.3.5.1.2 (Excoffier & Lischer 2010). Zavisnost ovog parametra od veličine uzorka proverenaE i A je R linearnom regresijom,- dok je statistička značajnost razlika između H-testa u vrednosti na među asocijacijskom nivou utvrđena primenom studentovog t programu STATISTICA v.5.1 (StatSoft, Inc. 1997). 3.1.4.3

Populaciona struktura i diferencijacija

Uticaj biljke domaćina i geografije na genetičku strukturu na individualnomH. iobsoletus populacionom jedinki nivouanaliziranih procenjen je na osnovu multilokusnih genotipova v.2.3.3 (Falush et al. Bajesovom statistikom u programu STRUCTURE 2003). Inicijalno je testiran optimalan broj klastera (ΔK) u okviruprethodno kojih genotipiziranih se grupišu 702 individua jedinke izH. 50 obsoletus populacija ex V. (Tabela agnus- castus2) uz priključenih 20 et al. la provera poklapanja sugerisanogiz Izraela broja(Imo 2013). Cilj polaznog testa je bi genetičkih klastera sa centralnom hipotezom o diferencijacijiBajesove populacija statistike u asocijaciji sa različitim biljkama domaćinima. Znajući da analize do prikrivanja signala mogu biti pod uticajem frekvencije genotipova i dovesti - nižeg nivoa klastriranja, procena broja genetičkih grupa je urađena i na unutar 30 asocijacijskomgeografije. U svakoj nivou od kako analiza bi je se zadato bolje po sagledao 20 nezavisnih uticaj biljkeponavljanja domaćina za sv i/iliaki n (broj a priori definisanih pojedinačni broj klastera (K) koji se kretao od 1 do burn-in populacija), uz definisane vrednost od 50,000 za period testiranja (engl. ) i 200,000admixture iteracija model Markovljevih lanaca. Za analizu je odabran mešoviti model (engl. ) koji pretpostavlja da individue pojedinačno vuku segmente svog genotipa u određenom procentu iz svakog od pretpostavljenih klastera, što znači dajedinke preci tretiraju mogu biti pripadnici različitih genetičkih grupa jer se sve analizirane kao pripadajućecorrelated istoj vrsti. allele Definisani frequencies model model frekvencije alela je model vezane frekvencije (engl. ) koji sugeriše da su frekvencije alela kodet al. različitih populacija slične usled migracija ili zajedničkog porekla (Falush 2003). Internet verzija programa STRUCTURE HARVESTER likelihood (Earl & vonHoldt plateau 2012) korišćena je za vizualizaciju platoa verovatnoće (engl. ) koji ukazuje na trenutak dostizanjaet al. stabilnosti logaritamske distribucije LnP(D) za različite vrednosti K (Evanno 2005). Sintopski lokaliteti gde se geografija isključuje kao destabilizirajući faktor su nezavisno analizirani. Stepen genetičke diferencijacije između genetičkih grupa identifikovanih u svakoj od postavljenih varijanseanaliza klastriranja (engl. Analysis u programu of MOlecular STRUCTURE VAriance su testirane analizom molekularne ; AMOVA) u programu ARLEQUIN v.3.5.1.2 (Excoffier & Lischer 2010). H. obsoletus Procenamaximum filogenetskih likelihood odnosa asocijacija urađena je i na osnovu mikrosatelita metodom u programu Contml Hyalesthes u okviru softverskogluteipes paketa Phylip v.3.69 (FelsensteinUlmus minor 2010). Jedinke vrste su kao outgrup, sakupljene- na poljskom brestu ( ) u istočnoj( Srbiji, korišćene a. Ova analiza je bazirana na 4 mikrosatelitaH. luteipes. Stablo F56, jeF84, vizualizirano H120 i G85) u koji su se uspešno amplifikovali kod primeraka outgrup- programu FigTree v.1.4 (Rambaut 2012). Odabir e se razlikuje u slučajurijskih filogenetskih analiza zasnovanih na mtDNK i nDNK. U slučaju mitohond markera dovoljanH. thracicus je bio samo jedan uzorak (sekvenca) filogenetski najsrodnijeg primerka , dok je u slučaju mikrosatelita neophodan minimum od 6

31 analiziranihrezultata. individua kako bi se održala verodostojnost i konzistentnost dobijenih

3.2 Molekularna detekcija i karakterizacija 'Ca. P. solani' u populacijama H. obsoletus

Sve jedinke H. obsoletus

- iz četiri asocijacije, sakupljene za istraživanje populacioneje 'Ca genetike vektora (poglavlja 3.1.1 i 3.1.2) analizirane su i na prisustvo infekci . P. solani' čiji su izolati dalje multigenski okarakterisani. 3.2.1 Detekcija 'Ca. P. solani' H. obsoletus adulata

Inicijalna provera prirodne inficiranosti sakupljenih et al. urađena je umnožavanjem STOL11 ' genskogCa. P. solani' regiona i obuhvata dužine 720deo gena bp (Daire za sintezu 1997).dihidrofolat Ovaj reduktaze region je specifičan(folA za - -sn- -3-fosfat plsC gen) i deo gena koji kodira 1 acil glicerol aciltransferazudirek ( gen). Amplifikacija je urađena u dve uzastopne PCR analize, tnoj i nested. PCR procedura je bilaTaq ista za obe analize, u zapremini2 od 220 (1.5 μl PCR smeše sledećeg sadržaja: KAPA A pufer (1 x 1.5mMTaq MgCl ), MgCl mM), dNTPs (0.3 mM), prajmeri (0.75 μM), KAPA polimeraza (KAPA Biosystems)STOL11f2 0,0375(5'- U/μl. U direktnoj PCR analizi- korišćen je prajmerski par- TATTTTCCTAAAATTGATTGGC- et al. 3') i STOL11r1 (5' TGTTTTTGCACCGTTAAAGC- 3') (Daire 1997), dok- su u nested reakciji- korišćeni STOL11f3 (5' ACGAGTTTTGATTATGTTCAC- et al. 3') i STOL11r2 (5' GATGAATGATAACTTCAACTGu 3') prajmeri (Clair 2003). Amplifikacija je urađena Mastercycler ep gradient S (Eppendorf, Hamburg,et al. Germany) po istom temperaturnom protokolu za obe PCR analize (Radonjić 2009):

92°C 90 sec inicijalna denaturacija 92°C 40 sec denaturacija 30

55°C 40 sec hibridizacija prajmera ciklusa 72°C 70 sec elongacija

72°C 5 min finalna elongacija

Ca. P. solani'

Kao pozitivna kontrola reakcije korišćena jeH. referentna obsoletus izDNK Mozel ' regiona u izolata izolovanih iz prirodno inficiranih adulata - NemačkojU (obezbeđeno- od strane dr Michael Maixner, Bernkastel Kues, Nemačka). direktnom PCR u korišćen je 1 μl ekstrahovane- DNK, dok je u nested reakciji korišćen 1 μl produkta direktnog PCR a razređenja 1:50. Radi kontrole unakrsne kontaminacije, na svakih 10 uzoraka stavljena je negativna kontrola u vidu 1 μl molekularne vode. Nakon umnožavanja gena, finalni produkti su posle elektroforetskog razdvajanja na 1% agaroznom gelu vizualizirani podCa . UVP. solani'transiluminatorom- radi provere uspešnosti reakcije i utvrđivanja broja ' inficiranih jedinki. 3.2.2 Multigenska karakterizacija izolata 'Ca. P. solani'

Među nekolicinom'Ca. P. solani'genetičkih markera koji su do sada testirani i korišćeni za karakterizaciju izolata u epidemiološkim studijama, sledeća tri gena sukonzervativni izabrana kao tufnajinformativnija: gen koji kodira fa EF-Tu (1) ktor elongacije Tu ( ) i funkcionalno učestvuje u procesu translacije; primarnoet al. testiran u svrhu filogenetske klasifikacijeosnovne fitoplazmi (Schneider 'Ca1997,). P. solani' a kasnije (Langer pokazan et al. kao 2003; gen epidemiološke divergencije Langervarijabilni & Maixner stamp 2004); 'Ca. P. (2) solani'; gen koji kodira antigenski membranski protein podleže pozitivnom pritisku selekcije i ima evolutivnu ulogu u interakcijidigestivnog sa trakta insektom (Fabre vektorom, et al. odnosno i vezivanju sa mikrofilamentima vmp1 2011a) 'Ca. P. solani' (3) gen koji kodira varijabilni membranski protein čije varijacije u dužini i sekvencama mogu uticati na ekološke osobenosti izolataet al. kao što prvobitno je preferentnost je nazvan prema stol-1H10 specifičnom domaćinu (Cimerman 2009); 'Ca. P. solani' gen i korišćenet al. ciljano za utvrđivanje genetičkog diverziteta (Pacifico 2007; 2009).

3.2.2.1 Analiza tuf gena tuf

Tuf1f/Tuf1rUmnožavanje gena je urađeno koristeći standardne prajmere, i to ( etu al. direktnoj 1997 reakciji amplifikacije i TufAYf/TufAYr ili TufUf/TufUr Schneider ) u nested- reakciji. Termalni uslovi reakcije su seet razlikovali al. 1997; u direktnom i nested PCR u i bili su delimično prilagođeni (Schneider

Langer & Maixner 2004).

U direktnoj reakciji temperaturni uslovi su bili sledeći:

95°C 2 min inicijalna denaturacija 95°C 30 sec denaturacija

45°C 30 sec hibridizacija prajmera 35 ciklusa 72°C 60 sec elongacija

66°C 5 min finalna elongacija

U nested reakciji temperaturni uslovi su bili sledeći:

95°C 2 min inicijalna denaturacija 95°C 30 sec denaturacija

53°C 30 sec hibridizacija prajmera 35 ciklusa 72°C 60 sec elongacija

72°C 5 min finalna elongacija Taq A

Amplifikacija gena2 se odvijala2 u 20 μl PCR smeše sadržaja: KAPA pufer Taq(1x) (1.5 mM MgCl ), MgCl (0.5 mM), dNTPs (0.2l mM), prajmeri (0.4 μM), KAPA polimerazatuf (KAPA Biosystems) 0.0375U/μ . Ponavljanje procedure umnožavanja gena je urađeno upotrebom novodizajniranih prajmera za sve uzorke koji se nisu umnožili primenom standardnih prajmera (Slika 5). Pozicije sedam novih prajmera odgovaraju mestima vezivanja standardnih, dokotpuno je nukleotidna sekvenca na određenimtuf pozicijama-a i tuf- izmenjena kako bi'Ca bila. P. p solani' komplementarna sa referentnimet al. b genotipovima (FJ441241 i FJ441242, Radonjić 2009). Temperaturni uslovi amplifikacije su

- bili isti u obe PCR reakcije i odgovarali su protokolu direktnog PCR a uz izmenu temperature elongacije sa 72°C na 66°C.

Slika 5. tuf

Šematski prikaz prajmera korišćenih za umnožavanje gena uz odgovarajuće nukleotidne sekvence. Zelena polja i linije ukazuju na pozicije prajmera preuzetih iz literature i dužine odgovarajućih regiona koje obuhvataju ne uključujući prajmere. Crvena polja predstavljaju novodizajnirane prajmere koji imaju preklapajuće pozicije sa već poznatima. HpaII

Svi dobijeni nested amplikoni su podvrgnuti restrikcionoj analiziRestriction endonukleazomFragment Length (Fermentas)Polymorphism prateći uputstva proizvođača (engl. , RFLP). Digestija je trajala 16 sati na temperaturi od 37°C i- urađena je u 15 μl RFLP smeše sadržaja: 1 x pufer za digestiju, 1-12 U enzima,Molecular 1 5 μl Biology PCR produkta Grade u zavisnosti od količine sintetisanih amplikona i 8 μlauto vode (Eppendorf). Restrikcioni produktiQiagen, su razdvojeni Hilden, matskom kapilarnomScreenin elektroforezom Gel Cartridge QIAxcel advanced ( Nemačka) koristeći uz sledeće parametre: voltaža injektiranja uzorka 5 kV, vreme injektiranjaQX uzorka alignment 30 sec, marker voltaža (15 separacije bp - 6 kV i vreme separacije 320 sec. DNK marker QX 5 kb) je korišćenFX174/Hae zaIII poravnanje (Qiagen, fragmenata analiziranih uzoraka, dok je DNK marker tufHilden,-a i tuf Nemačka)- korišćen za procenu dužine fragmenata.Ca. Kao pozitivne kontrole b restrikcionihH. profi obsoletusla korišćeni sakupljenih su referentni na koprivi, ' P. solani' izolati iz prirodno inficiranih jedinki

35 odnosno poponcu, u- Mozel regionu u Nemačkoj (obezbeđeno od strane dr Michael Maixner, Bernkastel Kues, Nemačka). tuf tuf-tipa u Nested produkti koji su bili nejasnog profila, neočekivanog odnosu na okarakterisana druga dva gena, kao i svi izolati koji su umnoženi primenom novodizajniranih prajmera, prečišćeni su, kvantifikovani i sekvencirani (Macrogen Inc., Seul, Južna Koreja).et al. 2009; Dobijene Aryan sekvenceet al. 2014; su Atanasova poravnate et al. sa referentnim izolatima (Radonjić 2015) koristećiet al. programski paket CLUSTAL W integrisanike. Ovo u softverje bilo posebno MEGA5 (Tamura 2011) kako bi se uporedile nukleotidnetuf- razl značajno radi nedvosmislene detekcije prisustva ab genotipa u analiziranim uzorcima. 3.2.2.2 Analiza stamp gena stamp

Prilikom umnožavanja gena korišćeni(5'-GTAGGTTTTGGATGTTTTAAG su samo standardni prajmeri- i za direktnu5' - i nested reakciju, i to StampF - 3') (5'StampR0- ( AAATAAAAGAACAAGTATAGACGA- 3')(5', -praćeni nested parom StampF1- (FabreTTCTTTAAACACACCAAGAC et al. 3') i StampR1 AAGCCAGAATTTAATCTAGC 3') Taq 2011a). Amplifikacija gena2 se odvijala2 u 20 μl PCR smeše sadržaja: (0.75KAPA A pufer Taq(1x) (1.5 mM MgCl ), MgCl (0.5 mM), dNTPs (0.3 mM),l prajmeri μM), KAPA polimeraza (KAPA Biosystems) 0.0375U/μ . (Fabre Primenjeni et al. temperaturni protokoli amplifikacije su opisani od -strane istih autora 2011a) i razlikuju se u 52 direktnom i nested PCR u u temperaturi hibridizacije prajmera (56°C, odnosno °C) i u dužini elongacije (90sec, odnosno 30 sec).

Temperaturni uslovi su bili sledeći:

94°C 4 min inicijalna denaturacija

94°C 30 sec denaturacija 35 56°C/52°C 30 sec hibridizacija prajmera ciklusa 72°C 90 sec/30 sec elongacija

72°C 7 min finalna elongacija

Dobijenistamp nested produkti su et sekvencirani al. 2011b; Johannesen(Macrogen et Inc.) al. 2012; i upoređeni Aryan saet referentnimal. etizolatima al. 2014; (Fabre Atanasova et al. Quaglino2014; Cvrkovićet al. et al. 2016 2015; Murolo & Romanazzi 2015; 2016;Genealogija Chuche stamp ) koristeći prethodno navedene programskegenotipova i novodetektovanh pakete. gena koja prikazuje relacije referentnih izolata urađenaet al. je metodom statističke parsimonije u okviru programa TCS v.1.21 (Clement 2000). 3.2.2.3 Analiza vmp1 gena vmp

Primarna amplifikacija 1 gena urađena je takođe kroz dvostruki PCR kombinacijom standardnih prajmerskih parova StolH10F1/StolH10R1et al. u direktnoj i TYPH10F/TYPH10R u nested reakciji (Fialová Taq2009). A pufer Umno žavanje je urađeno2 u 202 μl PCR smeše sledećeg sadržaja: KAPA (1x) (1.5 mMTaq MgCl ), MgCl (0.5 mM), dNTPs (0.3 mM), prajmeri (0.75 μM), KAPA polimeraza (KAPA Biosystems) 0.0375U/μl. Temperaturni uslovi amplifikacije su preuzeti od strane istih autora i bili sledeći u direktnoj reakciji:

94°C 4 min inicijalna denat uracija 94°C 30 sec denaturacija

52°C 30 sec hibridizacija prajmera 35 ciklusa 72°C 2 min elongacija

72°C 10 min finalna elongacija

U nested reakciji je termalni protokol bio sledeći:

94°C 4 min inicijalna denaturacija 94°C 30 sec denaturacija

55°C 30 sec hibridizacija prajmera 35 ciklusa 72°C 2 min elongacija

72°C 10 min finalna elongacija

Jedina izmena u odnosu na referentni temperaturni protokol je bilo zadržavanje istog vremena trajanja elongacijeCa. P. od solani' 2 minuta u obe reakcije. Kod uzoraka koji STOL11 se nisu umnožili, a prisustvo ' je prethodno potvrđeno detekcijom genskog regiona, amplifikacija je ponovljena u više kombinacija standardnih i novodizajniranih prajmera (Slika 6). Pozicije i sekvence novih(Johannesen prajmera et al. su 2012; odabrane Aryan na et osnovu al. poravnanja iet poređenja al. referentnih izolata vmp 2014; Cvrković 2014). Odabrane stabilne pozicije unutar 1 gena, iako obuhvataju kraći region u odnosu na standardne prajmere, pokrivaju informativni segmentet al. gena na osnovu kojeg se utvrđuju razlike restrikcionih profila (Cimerman 2009).

Slika 6. vmp1 g

Šematski prikaz prajmera korišćenih za umnožavanje ena uz odgovarajuće nukleotidne sekvence. Plava polja i linije ukazuju na pozicije prajmera preuzetih iz literature i odgovarajuće dužine regiona koje obuhvataju ne uključujući prajmere. Crvena polja ukazuju na položaj novodizajniranih prajmera u odnosu na već postojeće, dok se linije odgovarajuće boje odnose na dužine regiona koje obuhvataju. su podvrgnutiSvi nested digestiji produkti sa dobijeni Rsa korišćenjem standardnih prajmerskih parova I restrikcionim enzimom (Fermentas)Ca. P. pratećisolani' uputstva proizvođača. Kao referentni profili korišćeni su sledeći ' izolati iz kolekcije Laboratorije za molekularnu dijagnostiku, Instituta za zaštitu bilja i životnu sredinu i kolekcijetrane d Biologie du Fruit et Pathologie, INRA, (Bordeaux, France, obezbeđeno od s r Xavier Foissac): CH1 (inficirana loza R.iz panzeriItalije, V1 iz Srbije,profil); V2 GGY- (inficirana -loza iz Nemačke, V2 profil); Rpg39 (inficiran TA profil); Hr Br (inficirana loza iz Hrvatske, V3 profil); Rqg50 (inficiran

R. quinquecostatus iz -

Srbije, V4 profil); 19 25 (inficirana loza iz Nemačke, V5H. profil);obsoletus Vv5 (inficirana loza iz Srbije, V14 profil); Chrt2U. dioica(Charentes2) iz Makedonije, (inficiran V18 iz Francuske, V15 profil); U79 (inficirana TaqI i profil).Alu Izolati V2 profila su dodatno okarakterisani- sečenjem sa dva enzima, I (Fermentas),Alu radi razlikovanja V2 i V2 TA profila, dok su uzorci V7 -profilaA tipu dodatno sečeniet al. I enzimom kako bi seprodukti utvrdilo su da razdvojenili pripadaju i V7analizirani ili V7 na (Cvrković 2014). Restrikcioni kapilarnoj elektroforezi prema parametrima navedenim u poglavlju 3.2.2.1. Svi uzorci amplifikovani primenom novodizjaniranih prajmera nost nisu podvrgnuti RFLPvmp analizi, već su nested amplikoni sekvencirani. Njihova pripad određenom 1 profilu utvrđena je primarno virtuelnom digestijom u programu pDRAW32 (www.acaclone.com), a zatim i poređenjem sa publikovanim izolatima putem BLAST online servisa (blast.ncbi.nlm.nih.gov).

3.3 Molekularno-epidemiološke analize praćenja puteva diseminacije 'Ca. P. solani' u prirodnim sistemima mediteranskih vinograda

'Ca. P. solani' kroz koje se in situ Istraživanja prirodnih epidemioloških puteva kreće fitoplazma do momenta inokulacije vinove loze sprovedena su u Podgoričkom i Primorskom vinogorju Crne GoreH. obsoletus (Slika 7) u kojima su prethodnoet al. detektovani CPset al.infekcija zasada i prisustvo populacija (Radonjić 2009; Krstić 2012). U pet oglednihljeni vinograda 5- koji se nalaze na području mediteranske klime i međusobnoC. arvensis su, U.uda dioica i V.35 agnus km, -očekivanocastus je prisustvo tri biljke domaćina vektora: (Slika 7). U 3 od 4 vinograda koji se nalaze u Podgoričkom 19.324 vinogorju,0, E19 13 .3u22 Zetskoj ravnici severno od Skadarskog jezera: Šušunja (N42 C. arvensis i U. dioica0), Martinići i Podgorica( 42 (Tabela26.0510 , 2), E19 sintopski 10.439 su detektovaniuz C. arvensis prisutan i V. agnus, dok - jecastus. u Berima N 0) Južno od Skadarskogvinograd u jezera,Godinju u Primorskom vinogorju u litoralu Crne Gore, obrađen je gde su H. bile obsoletus prisutne i 'Ca sve. P. tri solani' prethodno pomenute Lokaliteti biljke na potencijalni o dualni pisutan domaćini V. agnus -castus (Slika 7). kojima je bi su bili posebno značajni jer je na njima 39 istovremeno proveren status ove biljke'Ca. P. kaosolani' domaćina izolata detektovaih vektoru i fitoplazmi.u vinovoj lozi, Na osnovu multigenske karakterizacije H. obsoletus biljkama domaćinima vektoru i sa njima asociranim populacijama u okviru odabranih mediteranskih vinograda, pokazani su prirodni putevi disperzije fitoplazme kroz odgovarajuće domaćine.

Slika 7 V. agnus- castus H. obsoletus . Mapa mediteranskih lokaliteta 5 oglednih vinograda i prirodnog staništa je na gde su uzorkovane biljke domaćini i asocirane populacije. Krugovi tri V. agnus-castus boje odgovaraju specifičnoj biljci domaćinu kao u legendi. Simbol vinove loze ukazu H. obsoletus ogledne vinograde, simbol na prirodno stanište ovog domaćina i asociranih populacija vektora u Baru, dok su strelicama označene populacije u Godinju i Baru odakle su prirodno inficirane jedinke korišćene u testovima inokulacije vinove loze.

3.3.1 Sakupljanje materijala 3.3.1.1 Sakupljanje H. obsoletus

Adulti H. obsoletus

su sakupljani prethodno opisanom metodologijom (poglavlje 3.1.1) u periodu od polovine juna do kraja jula. Svi lokaliteti su obrađeni tri puta u navedenom periodu kako bi se izbegla odstupanja uC. uzorkovanju arvensis i U. dioicauslovljena manjimet alrazlikama u periodu leta populacijaV. asociranih agnus-castus sa prethodno je (Cargnus . 2012). Za populacije vezane za

40 utvrđeno na jadranskim i egejskim obalama da se period letautno poklapa više od sa preostalim asocijacijama. U oglednim vinogradima gde je bilo pris jedne biljke domaćina, insekti su ciljano selektivno sakupljani kako ne bi došlo'Ca. doP. mešanjasolani' uvršten uzorkovanih je reprezentativan asocijacija. Zabroj potrebe jedinki detekcijeH. obsoletus i karakterizacije po lokalitetu (više ili i dve prethodno navede manjeH. obsoletus individua u odnosu na TabeluV. 2), agnus dok -sucastus uključene populacije asocirane sa na lokalitetima: Šušunja i Beri (Slika 7). 3.3.1.2 H. obsoletus

Sakupljanje biljaka domaćina 'Ca

Praćenje prirodnih puteva širenja . P. solani' u mediteranskim vinogradima zasnivalo se na prethodnoet al. detektovanim CPs izolatima koji inficiraju ogledne vinograde (Radonjić 2009). Ovi izolati su dopunjeni ciljanim uzorkovanjem simptomatskih biljaka vinove loze sakupljenim u avgustu i septembru kako bi se dostigao minimalni broj od šest CPs izolata po eksperimentalnom vinogradu. Uzorkovani su listovi i petiole čokota sa simptomima karakterističnimH. obsoletus za prisustvo fitoplazmi. vinograda, Za razliku nisu od vinove ispoljavale loze, biljke domaćini , prisutne. Po nalokalitetu lokalitetima je simptome infekcije fitoplazmama u istom periodu nasumično sakupljenokoje su bile 12prisutne asimptomatskih uzoraka biljaka potencijalnihC. dualniharvensis domaćinai U. dioica unutar ili na oboduH. obsoletus vinograda. U slučaju uzorkovana je biomasa korena jer možed prisutnih usvojiti biljaka fitoplazmu V. agnus hraneći-castus se nasakupljeni korenu inficiranesu i analizir biljke u stadijumu larve. O ani listovi jer ova žbunasta vrsta ima izuzetno razvijen korenov sistem koji prodire duboko u kamenitu podlogu čime podzemno uzorkovanje nije bilo moguće- realizovati. Svaki uzorak je pojedinačno spakovan u sterilnu plastičnu zip kesu i obeležen odgovarajućom šifrom. U prenosnom frižideru na temperaturi od oko 15°C su doneti u laboratoriju gde je po 1 gram biljnog tkiva - svakog uzorka pripremljen u aluminijumskoj foliji i čuvan u zamrzivaču na 20°C do DNK ekstrakcije.

3.3.2 Ekstrakcija DNK 3.3.2.1 H. obsoletus

UkupneEkstrakcija nukleinske DNK iz kiseline svih H. obsoletus adulata sakupljenih u oglednim vinogradima ekstrahovana je iz pojedinačnih insekata prethodno opisanom SDS metodom izolacije DNK (poglavlje 3.1.2). Alternativna metodaH. obsoletus ekstrakcije, primenjenaex V. agnus samo-castus prilikom analiza učestalosti CPs infekcije u jedinkama korišćenim u eksperimentalnim inokulacijama, odnosno vinove pulova loze od (poglavlje po tri adulta. 3.3.3) bilaUkupne je izolacija nukleinske DNK iz većeg broja primeraka - kiseline izolovane su primenomet al. CTAB (cetiltrimetilamonijum bromid) protokola ekstrakcije (Gatineau 2001). Insekti su homogenizovani u tubicama zapremine(engl. micropestle, 2 ml koristeći tečni azot za naglo zamrzavanje i plastične mikro tučkove 2%- Eppendorf) za fino usitnjavanje.- U tubice je dodato po 0.4 ml 0,2%tnog ß- CTAB pufera (2% CTAB, 100 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA, 1.4 M NaCl, merkaptoetanol) nakon čega su inkubirane u vodenom kupatilu 30 minuta na 65°C. U narednom koraku je u tubice dodata jednaka zapremina hloroforma (0.4 ml). Postupci koji su usledili posle 10 minuta centrifugiranja na 11000 obrt/min na 4°C su isti kao i u slučaju SDS ekstracije iz pojedinačnih primeraka. Izolovana- DNK daljihje finalno analiza. rastvorena u 80 μl TE pufera i takođe čuvana u zamrzivaču na 20°C do

3.3.2.2

Ekstrakcija DNK iz biljaka

Nukleinski sadržaj iz biljaka vinove loze i potencijalnih dualnih domaćina izolovan je primenom CTAB protokola izolacije koji je prilagođen biljnom materijalu, opisan od strane Angelini i saradnika (2001). Uzorci biljnog tkiva mase 1 g (koren ili lisni nervi i peteljke), svakog uzorka zasebno, usitnjeni su u avanu sa tučkom uz zamrzavanje tečnim- azotom i homogenizovani u 7ml 3% -CTAB pufera (3% CTAB, 100 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 0.2% ß mercaptoethanol). Jedan mililitar smeše izdvojen je u novu plastičnu tubicu zapremine 2 ml (Sarstedt) i inkubiran u vodenom kupatilu 20 minuta na 65°C. U narednom koraku je dodata jednaka zapremina hloroforma (1 ml) i nakon centrifugiranja 10 minuta na 11000 obrt/min na ambijentalnoj 42 temperaturi DNK je izdvojena u supernatantu. Ova suspenzija je prebačena-hladnog u tubicu zapremine 1.5 ml uz dodavanje jednake zapremine ledeno izopropanola (750 μl). Narednim centrifugiranjem od 15 minuta na 11000 obrt/min DNK je istaložena na dnu rastvora, zatim isprana 96% etanolom, osušenaana u pod digestorom- i rastvorena u 100 μl TE pufera. Ekstrahovana DNK je čuv zamrzivaču na 20°C. 3.3.3 Molekularna detekcija i karakterizacija 'Ca. P. solani'

Za sve uzorke insekata'Ca čija je DNK ekstrahovana iz pojedinačnih jedinki, detekcija i karakterizacija . P. solani' je urađena na prethodno opisan način (poglavlje 3.2). U slučaju uzoraka sačinjenih od DNK ekstrahovane iz pulova tri jedinke, izvršena je samo ciljana identifikacija CPs prisustva (poglavlje 3.2.1) bez dalje karakterizacije usled mogućnosti prisustva višestrukih genotipova fitoplazme. 'Ca. Inicijalna detekcija P. solani' na osnovu amplifikacije STOL11 genskog regiona je ponovljena kod uzoraka biljaka koji su se pokazali neinficiranim u inicijalnom DNK razređenju od 1:10. Detekcija bez razređenja i u razređenju od 1:100negativnih je urađena rezultata. kako bi se proverila inhibicija i eliminisala mogućnost lažno

3.3.4 Vektorska uloga H. obsoletus ex V. agnus-castus u epidemiologiji 'Ca. P. solani' u mediteranskim vinogradima 'Ca. P. solani' na vinovu lozu od strane prirodno

EksperimentiH. obsoletus prenošenja jedinki ex V. agnus-castus zaraženih postavljeni su nakon provere CPs inficiranosti populacija vektora i biljkeV. domaćina. agnus-castus U skladu sa tim odabrane su: populacija vektora iz Godinja gde raste uz sam vinograd i populacija iz Bara (N42 07.0310, E19 04.5810) gde je ova asocijacija detektovana na prirodnom ruderalnom staništu bez vinogradaPlovdina u blizini (Slika 7). Ogledne biljke vinovefilter- loze su odgajene iz semena sorte . Nakon isklijavanja na vlažnom papiru u petri šolji, pojedinačni klijanci su zasađeni u sterilnu zemlju (Klasmann TS 1, Klassman Dielmann) u saksije dimenzija: 10 cm prečnika i 15 cm

- visine u kojima su nastavili razvoj. Biljke su održavane u klima komori na temperaturi od 24 ± 1°C pod svetlosnim režimom od 16 sati svetla i 8 sati mraka tokomdostigle 2 habitus meseca. od Do 4- trenutka izlaganja insektima, sve mladice vinove loze su 6 listova i stabljike visine dvadesetak centimetara. Biljke suu neposredno pred postavljanje eksperimenata presađene u plastične cilindre koji s se sastojali od saksije i plastičnog poklopca visine 35 cm sa ventilacionim otvorom na vrhu za provetravanje i bočnim otvorom za manipulaciju insektima. Testovi inokulacije su sukcesivno postavljani u julu tokom više sezona i broj replikacija je zavisio od trenutne brojnosti odabranih populacija vektora. Po 30 insekata je sakupljeno prethodno opisanom metodologijom košenja entomološkom mrežom i pažljivo prebačeno usnim aspiratorom u zglobne flakone iz kojih su dalje direktno pušteni na eksperimentalnetransportovani vinove loze do pripremljene laboratorije na u prethodno opisan način. Postavljeni cilindri i su t prenosnom frižideru na temperaturi od 15°C okom narednih 48 sati su držani u klimaPre komori na temperaturi 24 ± 1°C (16/8 časova dan/noć period). življavanje insekata i ishrana na biljkama je praćena na svakih 8h. Posle 48h, sve jedinke izložene eksperimentalnim biljkama su -sakupljene usnim aspiratorom i prebačenebiljaka iz testo u 96% etanol nakon čega su čuvane na 4°C u frižideru. Pored oglednih va, pod istim uslovima je gajeno i 6 kontrolnih biljaka vinove loze. Tokom naredna tri meseca (do kraja novembra) biljke su održavane u klima komori prema ustaljenom režimu i praćene radi detektovanja simptoma CPs infekcije nakon čega su uzorkovane. Iz uzoraka 1 g lisne mase svake od replikacija (eksperimentalnih biljaka), kao i kontrolnih biljaka, ekstrahovana je genomska DNK (poglavlje 3.3.2.2) nakon čega su uzorci analizirani i okarakterisani prema prethodno opisanoj proceduri (poglavlje 3.3.3). 3.4 Eksperimenti prenošenja 'Ca. P. solani' prirodno inficiranim populacijama H. obsoletus

Ca. P. solani' od strane tri H. obsoletus

Eskeprimentalne transmisije ' tuf- ex C. asocijacijearvensis, ex sa V. teritorije agnus-castus jugoistočne i ex C. Evrope foetida uključene u b epidemiologiju: , imale su primarno za cilj proveru i

ex situ testiranje njihovog vektorskog potencijala. Kroz oglede inficiranja sopstevene(Catharantus i preostale roseus dve biljke domaćina,lture eksperimentalnevinove loze, rasvetljavava biljke perivinke se ) i ugrožene ku epidemiologija putem praćenja kretanja, ukrštanja i preklapanja CPs genotipova koje populacije ovog vektora raznose pod uticajem preferentnost prema bljkama. 3.4.1 Sakupljanje materijala H. oboletus

biljaka Svisu postavljeni eksperimenti nakon inokulacije provere prirodne inficiranosti odabranih oglednih populacija vektora. Testovi inficiranja biljaka su sprovedeni- tokom pet uzastopnih godina (2012 2016)postavlj u julu. Početkom meseca je H. obsoletusena većinaex C. arvensis, ogleda vezana za polovinom julasakupljanje su na jedinke teritoriji ex Crne V. agnus Gore- castus, dok je u drugoj polovini ex C. foetidauzorkovana. populacija vektora Slika 8. Mapa lokaliteta tri H. obsoletus ogleda biloKako jebi nese ophodnoodržala stabilnostodabrati 'Ca. P.asocijacije solani' čije su populacije korišćene u kako bi se postavio jednak broj populacije koje su dovoljno brojne lokaliteteeksperimentima unakrsnog prenošenja vektora . o Krugovi tri boje koji pokazuju uzorkovanjau legendi . oglednih populacija replikacijaoglednih H. obsoletus svih biljaka. U slučajuex C. dgovaraju specifičnoj biljci domaćinu kao arvensis i ex V. agnus-populacijacastus korišćene su jedinke sakupljene na svojim biljkamaC. domaćinimaarvensis unutar i u blizini vinograda (Slika 8). Populacija vektora vezana za je uzorkovanaV. agnus u-castus Topoli na unutar lokalitetu vinograda (Tabela 2), dok je populacija asocirana sa Beri sakupljenaex na C. foetida biljkama u neposrednoj blizini zasada. Eksperimentalnu populaciju vektora činile

45 su jedinke ove asocijacije sakupljene u Jasenoviku (okolina Niša) i nekoliko bliskih lokaliteteta međusobno udaljenihH. obsoletus desetak kilometara C. (Sli foetidaka 8). U sklopu sakupljanjauzorkovanje oglednekorena populacije asocirane sa urađeno'Ca. je P. i solani' ove biljke radi provere njene prirodne inficiranosti sa jaka i uloge kao izvora inokuluma. Uzorkovano je po 12 asimptomatskih bil na tri bliska lokalitetaH. obsoletus u okolini Jasenovika na kojima su prethodno detektovane CPs inficirane populacije. 3.4.2 Eksperimentalne procedure ukrštenog prenošenja 'Ca. P. solani' između različitih prirodnih asocijacija vektora ih H. obsoletus

Za svaku od oglednC. arvensis, V. agnus-castuspopulacija i C. foetida asociranih sa određenom biljkom domaćinom: , primarno je testirana sposobnost inokulacije sopstvenog domaćinaervoar na 'Ca. kojem P. solani' vektor kompletira razviće i koji mu u prirodi predstavlja izvor i rez infekcije. Postavljanje unakrsnih testova inokulacije druge dve biljke „neodgovarajućih“ domaćina H. obsoletus imalo je za ciljtuf testiranje- mogućnosti inficiranja drugih biljaka domaćina članova b ciklusa i posledičnog ukrštanja epidemiološkihH. obsoletus puteva ex prenošenja.C. arvensis u Iako je Bois vektorski noir značaj populacija epidemiologiji bolesti vinove loze prethodno eksperimentalno dokazan (Maixnerepid 1994), ponovljena su prenošenja na lozu radi boljeg razumevanja emioloških puteva kojima se CPs izolati kreću do momenta inokulacije i sagledavanja njihovog diverzitetaVektorska i potencijalne uloga H. genotipske obsoletus specifičnosti ex V. agnus -vezanecastus zau biljku izvor inokuluma.Bois noir in situ studije o 'Ca. epidemiologiji je eksperimentalno testirana u okviru P. solani' epidemiologiji H. u obsoletus mediteranskim ex C. foetidavinogradima (poglavlje 3.3.4). Prirodno inficirana populacija je takođe izložena ishrani na širenjuoglednim Bois vinovim noir lozama kako bi se proverio vektorski potencijal u iniciranju i na perivinke (Catharanthusu jugoistočnoj roseus Evropi. Svaka od populacija je takođe postavljana i ) kao biljke prijemčive fitoplazmama kako bi se sagledao puni diverzitet CPs izolata koje nose prirodno inficirane populacije vektora svake od tri testirane asocijacije.

Slika 9 'Ca. P. solani' H. obsoletus C. foetida . Dinamika postavljanja testova prenošenja na eksperimentalnu biljku C. foetida od strane prirodno inficirane populacije; a) u saksiji cilindra; b) kompletno pripremljena eksperimentalna biljka poklopljena cilindrom sa H. obsoletus adulti. ventilacionom gazom i otvorom za ubacivanje insekata (zatvorenim sunđerom); c) eksperimentalna vinka na koju su postavljeni

Broj replikacija je bio stabilan na nivou jedne testirane biljne vrste i zavisio je od brojnosti populacija vektora. Seme biljaka domaćina je- sakupljeno u prirodi, perivinkezaštitu b su uzgojene iz semena biljaka koje se gaje u klima komorama InstitutaPlovdina za ilja i životnu sredinu u Zemunu, dok je seme vinove loze sorte sakupljeno iz vinograda. Svake sezone su praćene i po tri kontrolne biljke od svake vrste koje nisu izlaganeologije insektima i dobijenih i gajene rezultata. su pod istim uslovima radi provere konzistentnosti metod Primenjena je prethodno opisana metodologija gajenja biljaka i pripremanja za eksperimente (poglavlje 3.3.4) uz manje specifičnosti (Slika 9).st Biljkeabljike su C. gajenearvensis u proseku dva meseca-8 tokomlistova kojihu rozeti su C.dostigle foetida sledeću veličinu: -10 listova V. agnus- odcastus 30 ,cm 10 dužine, listova 6perivinke i 4-6 listova vinove, 20 loze. cm visinePostupak i 8 koji je usledio do ije tretiranje i trenutka zatvaranja eksperimenata se nije razlikovao, kao ni kasn gajenjeuzoraka biljaka.od korena Uzorkovanje oglednih biljaka biljaka C. arvensis u novembru i C. foetida je podrazumevalo formiranjeV. agnus- castus , dok je u slučaju , perivinki i vinovih loza uzorkovan lisni materijal.

4. Rezultati

4.1 Lokaliteti uzorkovanja H. obsoletus populacija u asocijacijama sa različitim biljkama domaćinima

Sakupljanja H. obsoletus

populacija u asocijaciji sa različitim biljkama domaćinimaod a na teritoriji jugoistočne Evrope pružila su informacije o arealu svake socijacija, preklapanju njihove distribucije, populacionoj strukturiH. iobsoletus sintopskoj u diferencijaciji. Terenska istraživanja su pokazalaU. da dioica su populacije ovomu delu areala: 1) brojne i česteC. u arvensis asocijaciji sa , 2) retkog pojavljivanja i samerene V. agnus brojnosti-castus u asocijaciji sa , 3) relativno česteC. ifoetida brojne, uali asocijaciji prisutne i 4) izuzetno brojne i česte u asocijaciji sa e, kao samo u istočnim delovima istražene C. teritorije arvensis (Slika 10). Na teritoriji Srbij najpodrobnije istraženog područja, je kao korov prisutan u većini zasada (vinova loza, krompir, paprika i kukuruz). Asocijacija vektora sa poponcem je detektovana na brojnim staništima van obradivih površina: na vlažnom ili suvom zemljišu nenarušenih biljnih zajednica, degradiranim površinama ili poredU. dioicaputeva. kao Usled korova slabo unutar razvijene zasada mreže je retko akvadukta za navodnjavanje, pojavljivanje retkih lokalitetai kao korov vezanih se može za useve, naći samo uzorkovanje sporadično H. naobsoletus obodima i međama.U. Osim dioica populacija ex domaćinom uglavom je sprovedeno na prirodnim mezofilnim staništima koprive blizu potokaH. obsoletus i kanala sa iliV. naagnus degradiranom-castus su intenzivno zemljištu. Istraživanja mediteranske asocijacije sprovedena na teritoriji Crne Gore (poglavlje 3.3) i pokrajine Egejske Makedonije u severoistočnojbila su suva i polusuva Grčkoj. Preferentnakorita potoka staništa i reka, konopljikekao gde su sakupljani insekti i litoralna i kamenita područja u obalskoj zoni Jadranskog i Egejskog mora. H. obsoletus C. foetidaPosebna pažnja je uložena u pronalaženje populacija vezanih za Lokaliteti i uzorkovanutvrđivanje rasprostranjenja oveopla asocijacije i suva nastaništa Balkanskom kao što poluostrvu. su šindra, suve livade i ruderalneja populacijapovršine pored su bila puteva t i useva. Crepis foetida je pionirska vrstaprepoznatljiva kserotermnih po pokrivenosti staništa ili stablji prisutna u livadskim zajednicama i lako ke dlačicama, oborenim pupoljcima i 48 karakterističnim mirisom badema. Nakon prvog nalaza u istočnoj Srbiji, usledila su uzorkovanja dodatnih lokaliteta u istočnoj i jugoistočnoj H. obsoletus Srbiji, a zatim 2011.C. foetidagodine i dva nalaza ove asocijacije u Turskoj. Prisustvo populacija asocijacije je ciljano traženo na obalama obe strane Dunava, što je rezultiralo potvrdom prisustva asocijacije na tromeđi sa Rumunijom i Bugarskom. NasuprotBalkana, odnosno tome, utvrđeno teritoriji je G da ova asocijacija nije prisutna na području južnog C. foetida rčke, Crne Gore i Makedonije. Kako bi se proverio-L5 status domaćina C. foetida, sakupljeno je po 12 larvi familije Cixiidae L4 stadijuma sa korena na tri lokaliteta: Jasenovik, Negotin i Temska koje su kasnije molekularno determinisane.

Slika 10. Mapa lokaliteta uzorkovanja H. obsoletus

populacija na teritoriji jugoistočneje Evrope i Turske. Krugovi četiri boje koji pokazuju lokalitete odgovaraju specifičnoj biljci et al. domaćinu kao u legendi. Neobojeni krugovi označavaju prethodno publikovane populaci sakupljene na lokalitetima Radovanu (Rumunija) i Majak (Rusija) na krompiru (Imo 2013).

Ukoliko se uzme u obzir da je svaka od asocijacija uzorkovana u vreme maksimumagustine brojnosti populacije, broj sakupljenih jedinki je zavisio od prirodne populacije i agregacije insekata uslovljene sredinskim faktorima kao što su klima, specifičnostiSakupljanje podlogeH. obsoletus i opšta podobnost staništa. populacija realizovano na teritoriji 7 državaC. rezultovaloarvensis, U. jedioica uzorkovanjem i C. foetida najmanje jedneC. od arvensis četiri ciljanei C. foetida asocijacije: Srbija (C. arvensis, U. dioica i V. agnus-castus), Rumunija ( C. arvensis i U. dioica), Crna Gora (C. arvensis, U. dioica i V. agnus-castus), MakedonijaC. arvensis ( i C. foetida ), Grčka (C. foetida ), Turska ( ) i Bugarska (C. foetida). Na području Bugarske i Rumunije je uzorkovan po jedan lokalitet sa li su H. asocijacijomobsoletus i to uz obalu Dunava kako bi se proverila ruta kolonizacije i da populacije vezane za ovu biljku prevazišle Dunav kao barijeru prema centralnoj Evropi. Sakupljanja sprovedena u Turskoj su urađena samo na dva navedena lokaliteta bez; Tabel istraživanja njihovog okruženja i drugih potencijalnih biljaka domaćina (Slika 10 a 4). Tabela 4. H. obsoletus

Podaci o lokalitetima i genetičkom diverzitetu populacija organizovanim prema biljci domaćinu i geografiji. Convolvulus arvensis

- lokalitet GPS haplotipmtDNK AnDNK mikrosatelitiHE Fis N R 13.532 20 frekvencija6 4.774 0.791 0.054 E20 40.224 Topola (SRB) N44 EC* 6 6 4.626 0.771 -0.015 E21 40.592 Aleksinac (SRB) N43 36.010 EC* 9 6 4.956 0.837 0.164 E22 07.912 Predejane (SRB) N42 49.992 EC* 9 6 4.763 0.816 0.151 E21 31.548 Petrevo selo (RO) N45 49.528 EC* 17 6 4.412 0.777 0.264 E19 10.763 Martinići (CG) N42 32.245 AB* 20 6 4.192 0.748 0.143 E19 12.509 Podgorica (CG) N42 26.919 AB* 12 6 4.549 0.787 0.169 E22 44.996 Hamzali (MK) N41 29.860 EC*

11 4 4.282 0.744 0.146 E22 39.922 1 Strumica (MK) N41 26.505 EC* 1 πC 6 1 4.550 0.721 0.216 ψC E22 49.101 XB 1 Kilkis (GR) N40 54.984 AB* 2 2 WL 3 3 - - - WB E38 38.063 Erzindžan (TR) N39 57.253 SK Urtica dioica

- lokalitet GPS haplotipmtDNK AnDNK mikrosatelitiHE Fis N R 22 frekvencija4 4.937 0.820 0.141 N45E19 3.2857.88 1 Gakovo (SRB) EC* 1 FC* 20 4.934 0.826 0.157 RC 4 N45E19 35.60447.518 2 Bačka Topola EC* (SRB) 20 ωC 6 5.100 0.844 0.155 E20 06.114 Bačko Petrovo selo N45 43.693 EC* (SRB) 12 6 4.590 0.804 0.148 E21 11.208 Vršac (SRB) N45 03.874 EC* 15 6 4.705 0.787 0.087 E21 30.362 Srednjevo (SRB) N44 39.685 EC* 12 6 4.714 0.815 0.212 E22 02.090 Boljetin (SRB) N44 31.740 EC* 6 6 4.644 0.803 -0.003 E22 30.484 Negotin (SRB) N44 16.604 EC* 20 4 4.807 0.816 0.072

N43E22 17.72854.492 2 Zaječar (SRB) EC* 15 ξQ 6 4.923 0.836 0.226 E22 18.833 Knjaževac (SRB) N43 30.610 EC* 17 6 4.492 0.777 0.130 E22 21.825 Grnčar (SRB) N43 01.270 EC* 12 6 4.380 0.760 0.120 E21 54.319 Vranje (SRB) N42 31.725 EC* Vranjska banja 11 6 4.425 0.753 0.060 E21 59.839 N42 35.417 EC* (SRB) 6 6 4.395 0.758 0.166 E19 06.800 Godinje (CG) N42 13.421 EC*

20 6 4.306 0.746 0.122 E19 10.763 Martinići (CG) N42 32.245 EC* 20 2 4.362 0.760 0.113

N42E19 12.50926.919 2 Podgorica (CG) EC* 2 αC 17 6 4.091 0.714 0.024 βC E22 44.996 Hamzali (MK) N41 29.860 EC* 19 6 4.194 0.735 0.104 E22 39.922 Strumica (MK) N41 26.505 EC* 12 6 4.007 0.685 -0.060 N40E23 33.09645.767 Aretusa (GR) 20 EC* 6 3.500 0.622 -0.009 E23 27.846 Filadelfion (GR) N40 45.246 EC* 6 3 3.602 0.643 0.193

N40E23 17.33139.930 2 Profitis (GR) EC* 1 WB Vitex agnusρC -castus

- lokalitet GPS haplotipmtDNK AnDNK mikrosatelitiHE Fis N R 18 frekvencija5 4.198 0.747 0.038 N42E19 04.58107.031 1 Bar (CG) ZN 19 γN 6 4.590 0.803 0.101 E19 06.800 Godinje (CG) N42 13.421 ηN 20 5 3.667 0.670 0.059

N42E18 41.02828.591 1 Kamenari (CG) ZN 19 ZO 2 4.753 0.817 0.163

N41E19 16.05256.515 2 Ulcinj (CG) ZN 2 ηN 10 θN 6 4.732 0.819 0.168 N40E23 29.96038.380 Apolonija (GR) YM 19 6 4.771 0.795 0.176 E23 44.024 Asprovalta (GR) N40 45.124 YM 20 4 5.154 0.855 0.204

N40E23 40.39741.616 2 Aretusa (GR) YM 7 ηM 6 4.320 0.775 0.065 E22 16.981 Larisa (GR) N39 38.544 YM 5 3 - - -

N39E26 8.37918.565 2 Lezbos (GR) YM σM

3 3 - - - E 24 37.525 Tasos (GR) N 40 35.177 YM Crepis foetida

- lokalitet GPS haplotipmtDNK AnDNK mikrosatelitiHE Fis N R 10 JH frekvencija4 3.430 0.689 0.388 E21 40.592 Aleksinac (SRB) N43 36.010 MH 2 20 JH 2 3.552 0.688 0.193 E21 33.444 Deligrad (SRB) N43 38.546 MH 2 2

12 μHJH 4 3.334 0.638 0.181 E21 11.983 Požarevac (SRB) N44 39.310 MH 2 4 JH 1 - - - E22 10.350 Porečka reka N 44 24.267 MH 1 (SRB) UH 1 VH 1 21 JH 3 3.323 0.619 0.282 E22 30.484 Negotin (SRB) N44 16.604 MH 3 7 JH 4 3.365 0.613 0.165 E22 32.048 Tamnič (SRB) N44 04.973 MH 2 6 JH 4 3.329 0.602 0.363 E22 17.334 Zaječar (SRB) N43 50.016 MH 2 12 JH 6 3.370 0.656 0.200 E22 31.840 Temska (SRB) N43 16.537 19 JH 6 3.689 0.687 0.257 E22 31.585 Pirot (SRB) N43 12.880 20 JH 6 3.743 0.715 0.147 E22 02.441 Jasenovik (SRB) N43 22.365 Vranjska banja 7 JH 2 3.067 0.598 0.370

N42E21 58.36734.139 MH 2

(SRB) 2

6 λHJH 4 2.800 0.563 0.198 N43E22 51.25857.711 Vidin (BG) MH 2 10 JH 4 3.452 0.631 0.305 E22 58.119 Kalafat (RO) N43 59.926 MH 2

8 JH 6 4.379 0.768 0.175 E38 38.063 Erzindžan (TR) N39 57.253 1 JH 1 - - - E34 07.795 Kıršehir (TR) N39 26.021

Za svaku populaciju su predstavljeni sledeći podaci: lokalitet uzorkovanja uz skraćenice SRB (Srbija), RO (Rumunija), CG (Crna Gora), MK (Makedonija), GR (Grčka), TR (Turska) i BG (Bugarska); geografska koordinata (GPS); broj jedinki po populaciji (N). Za populacije- koje broje 6 ili više jedinki, pored prikazanog mitohondrijskog haplotipskog diverziteta E (mtDNK), predstavljeni su i parametri nuklearnog genetičkog diverziteta (nDNK (Fis - R mikrosateliti): bogatstvo alela (A ); očekivana heterozigotnost (H ) i koeficijent inbridinga COI-tRNK(Leu)- ). Simbol „ “ odnosi se na genetičke parametre koji nisu nisu izračunati usled niske COII genski region, a drugo na 16S-tRNA(Leu)-ND1 brojnosti populacije. Prvo slovo u oznaci mtDNK haplotipa se odnosi na et al. genski region. Haplotipovi obeleženi - et al. simbolom „*“ su prethodno publikovani (Johannesen 2008; 2012; Johannesen & Riedle Bauer 2014; Chuche 2018). Ukupno 718 H. obsoletus

adulata poreklom iz 55 populacija u asocijaciji; sa različitim biljkama domaćinima je uzorkovano na 44 lokaliteta (Slika 10 Tabela 4). Iako je uložen trud da broj sakupljenih jedinki po populaciji bude od minimalnih šest do poželjnih 20 adulata, na određenim lokalitetima to nije bilo moguće postići usled niske brojnosti populacije ili kraja perioda leta ciljane asocijacije. Na 11/44 lokalitetaC. arvensis je/U. detektovano dioica sintopska sintopsko lokalit prisustvo populacija dve asocijacije i to: po dvaU. dioica/V. agnus-castus eta u MakedonijiC. arvensis i Crnoj/ C. Gori, foetida po jedanu Srbiji i U. dioicau Grčkoj/C. foetida i Crnoj u Srbiji Gori, (Slika po jedan 10; Turskoj i čak tri H. obsoletus ex C. arvensisTabela je uzorko 4). vano na teritoriji Devet populacija ex U. dioica su sakupljene jugoistočne Evrope i jedna na istoku Turske. PopulacijeH. obsoletus sa V. agnus-castus je na ukupno 20 lokaliteta. Mediteranska asocijacija u Grčkoj uzorkovana na šest lokaliteta, od kojih su dva na egejskim ostrvima (Tasos i Lezbos) udaljenim 10 km od najbližeg kopna,H. dok obsoletus su u primorju ex C. foetidaCrne Gore su detektovanesakupljeni uzorci ugla četiri populacije. Populacije vnom na teritoriji istočne i jugoistočne Srbije do Morave kao zapadne granice rasprostranjenja, uz po jedan lokalitet u Bugarskoj i Rumuniji. Iako je sama biljka prisutnadevet na preostaloj H. obsoletus istraživanoj teritoriji, asocijacija vektora nije zabeležena. Dodatnih adulata je sakupljeno na ovoj biljci na

C. arvensis dva lokaliteta u Turskoj,(Slika od koji 10; je Erzindžan sintopski lokalitet sa asociranom populacijom Tabela 4). 4.2 Populaciono-genetički diverzitet i varijabilnost H. obsoletus

4.2.1 Diverzitet i varijabilnost mitohondrijskih markera

H. obsoletus

Poređenjem mtDNK regiona 316 analiziranih jedinkiC. arvensis poreklom - 57 jedinki,iz 55 populacija U. dioica - asociranih 120, V. agnus sa jednom-castus - od56 četirii C. foetid biljkea - domaćina ( 83), utvrđeno je prisustvo ukupno 29 haplotipova (Tabela 4).ex C. Tri arvensis haplotipa i ex (AB, U. dioica EC i FC)(Johannesen prethodno et al.su poznata iz centralne Evrope kao i 2008),haplotipovi dok ex je V. 26agnus haplotipova-castus iz Izraela, novoopisano GE i HE (Prilog (Johannesen 3). Prethodno et al. poznat 2008), nisu utvrđeninijedan od u haplotipova populacijama ex oveC. foetida asocijacije u Crnoj Gori i Grčkoj. Nasuprot tome, C. arvensis i U. dioica nije bio ranije poznat. Populacije asocirane sa ex V. agnus-castusdele pet i ex haplotipova, C. foetida za razliku od genetički zatvorenih asocijacija ; u kojima je opisano 8, odnosno šestH. obsoletusspecifičnih haplotipova (Slika 11 Prilog 3). Tri nova haplotipa su detektovana u populacijama Radovanu u Rumuniji (PC i φC) i Majak u Rusiji (QB) čija biljka domaćin nije poznata. 29 H. obsoletusU geneaološkim analizama rekonstrukcije mtDNK haplotipske mreže, pored (Tabela haplotipova iz jugoistočne Evrope, Turske i jugozapadne RusijeC. arvensis,4; U. Prilogdioica 3),i V. priključena agnus-castus su i 22 ranije opisana haplotipa asocirana sa (Prilog 2). U haplotipskoj mreži sačinjenoj od ukupno 51 haplotipa, pokazalo se istovremeno postojanje jasnih i dvosmislenih asocijacija- sa biljkama domaćinima (Slika 11).H. obsoletus Geneaološka otkrila analiza je postojanje filogenetskih tri među asocijacijskih odnosa unutar vrste haplogrupe koje poseduju dodatnu unutrašnjutipova ne divergenciju prati u potpunosti pod prikrivenim a priori geografskim uticajem. Klastriranje haplo ex C. obrazacarvensis i biljke ex U. dioica domaćina, već ukazuje na genetičku homogenost populacija V. agnus-castus, i nezavisno i C. foetida odvajanje genetičkih grupa vezanih za druga dva domaćina, . Dve alternativne haplotipske mreže koje su

55 dala oba korišćena programa razlikuju se samo u mestu račvanja tri osnovne genetičke grane (isprekidane linije na Slici 14).

Slika 11 COI-tRNA(Leu)-COII i 16S-tRNA(Leu)-ND1 genskih regiona 51 H. obsoletus haplotipa rekonstruisana median-joining . Haplotipska mreža statističkom parsimonijom i (Johannesen et al. metodom. Boja krugova odgovara biljci domaćinu ili nepoznatom domaćinu kao u legendi. -Bauer 20 et al. Haplotipovi opisani u prethodnim studijma 2008; 2012; Johannesen & Riedle 14; Chuche 2018) su označeni zvezdicom „*“. Najčešći haplotipovi su prikazani većim krugovima. Isprekidana linija predstavlja alternativnu varijantu haplotipske mreže koja se može dobiti u oba korišćena programa. Uz svaku haplogrupu su date mape distribucije na nivou država čime je pokriven gotovo ceo areal vrste, od Izraela i istočne Turske do Španije. C. arvensis i U. dioica dele pet haplotipova (BB, AB, AA,

Asocijacije vektora sa Jedinke iz WB i EC), ali poseduju i privatne i to 10, odnosno 17 haplotipova. Rumunije i jugozapadne Rusije (PC, φC i QB) klastrirale su se u ovuUkupno genetičku 32 grupuhaplotipa sugerišući ove stabilne da je njihov dvo- domaćin upravo jedna od ove dve biljke. asocijacijske haplotipske grupe razbijeno je u dve

56 filogeografske podgrupe prethodno sugerisane od strane Johannesen i saradnika

(2008, 2012): „zapadnu“ koju čine haplotipovi koji divergiraju od BB i AB haplotipovaIzuzetak ovog i „istočnu“geogr koju čini klaster koji proističe iz centralnog EC haplotipa. afskog klastriranja je QB haplotip poreklom iz H. Rusije obsoletus koji sei pridružio „zapadnoj“ liniji i koji ukazuje da je specijalizacija asocijacija sa biljkom domaćinom starija od geografske segregacije populacija (Slika 11).Haplotipovi ex V. agnus-castus su parafiletički podeljeni u tri geografske podrgupe koje čine monofiletičke crnogorska i grčka linija (pet, odnosno tri haplotipa) i parafiletička izraelska grupa (dva haplotipa). Haplotip ηM predstavlja vezu između crnogorske i grčke podgrupe (linije), i iako je sakupljen u Grčkoj on se postavlja u mreži na dva načina: (1) kao jasni član pripadajuće grčke haplogrupe ili (2) kao haplotip koji vodi ka crnogorskom klasteru.ani IzraelskiC. foetida haplotipovi GE i HE su nasuprot tome, filogenetski blisko pozicionir genetičkoj grupi i udaljeni 10ex (ili C. foetida 12) mutacija od genetičkog klastera svog domaćina (Slika 11). Populacije se u vidu 6 haplotipova monofiletički izdvajaju u stabilnu grupu koja divergira od centralnog i najčešćeg JH haplotipa detektovanog u svim analiziranimL4-L5 stupnja populacijama sakupljene na od korenu istočne C. Turskefoetida do istočne Srbije (Tabela 4). Larve na tri lokalitetaCixiidae u istočnoj (Sforza Srbiji, et sual. morfološkom analizom identifikovane kao pripadnici familije H. obsoletus jedinke 1999), a zatim su i molekularnim analizamaC. foetida identifikovne kao e C. foetidaJH haplotipa, odnosno pripadnici genetičke grupe. Ovim nalazomH. obsoletus s ka može smatrati legitimnom i potvrđenom biljkom domaćinom ko će se nadalje i tretirati. Haplotipovi detektovani u okviru jednog od tri genetička klastera nisu prisutni u druge dve genetičke grupe, odnosno svi haplotipovi su specifični i uslovljeni biljkom domaćinom na svim lokalitetima. Važno je napomenuti da je u populaciji iz Rumunije pored haplotipova PC i φC, detektovan i centralni haplotip „istočne“ linije grupe poponca i koprive, EC, kaoC. i haplotipovifoetida JH i MH čije je poreklo kroz genealošku mrežu vezano isključivo za Ukao dal domaćina (Slika 11). je procene mtDNK diverziteta i varijabilnosti uključeni suAnalize samo haplotipovi (diverzitet i frekvencije) populacija sakupljenih u ovoj studiji. 57 mtDNK diverziteta i varijabilnosti, koje su obuhvatile 316 jedinki iz 55 populacija (Tabela 4), pokazale su statistički značajnu divergenciju između tri genetičkeex grupeC. arvensis na koje i ex jeU. ukazaladioica haplotipska mreža:ex (1) V. metapopulacijaagnus-castus dva domaćina: ex C. foetida , (2) metapopulacija i (3) metapopulacija . Čak 88%F genetičkeST varijabilnostip < 0.001 između ove tri grupe je uslovljeno biljkom domaćinom ( = 0.88, ), dok svega 12% genetičkih razlika potiče od unutargrupnih diferencijacija.

Slika 12. H. obsoletus jedinki ex C. Grafički prikaz parametra theta (θ), izračunatog za 316 arvensis + ex U. dioica ex V. agnus-castus grupisanih u tri metapopulacije sugerisane genealoškom mrežom. Metapopulaciju ex C. foetida znake čini 177 jedinki, metapopulaciju čini 56 jedinki, - k metapopulaciju čine 83 jedinke. O θ parametra se odnose na sledeće H S genetičke osnove procene populaciono genetičkog diverziteta: broj alela (θ ), očekivana π homozigotnost (θ ), segregaciona mesta (θ ), nukleotidne razlike (θ ). Isprekidane linije na grafikonu označavaju standardnu devijaciju odgovarajućeg parametra.

Poređenjem θ vrednosti molekularnog diverziteta unutar svake od tri metapopulacije očekivano se pokazalo da je najveći genetički diverzitet,ex C. procenjen arvensis i exna osnovuU. dioica broja k alela i segregacionih mesta, prisutan unutar grupe (θ = 3.73 i θs= 3.13; Slika 12) koja je sakupljena na najširemk geografskom području i sačinjena od najvećeg broja populacija. Visoka vrednost θ koja ukazuje vrednost na bogatstvo genetičkih varijanti prisutnih unutar ove grupe, oponira π se niskoj θ i koja ukazuje na genetičku bliskostV. detektovanih agnus-castus haplotipovai C. foetida vezanih za dva domaćina.k, U slučaju asocijacija sa vrednosti parametra θ zasnovanom na broju alela, bile su 2.32, odnosno 1.31, a vrednosti parametra θs, procenjenom na osnovu segregacionih mesta, 2.39, odnosno 1.00 (Slikaex C. arvensis 12). Više i ex vrednostiU. dioica parametara genetičkog diverziteta metapopulacije su u saglasnosti sa odstupanjema skorašnju od populacionog ekvilibrijuma (neutralne evolucije) koje ukazuje n ekspanzijuFuovog Fs i populacija, oD čemu svedoče statistički značajneFs negativne-9.59, p<0.001; vrednosti D - Tadžiminog parametra testova neutralnosti ( = H = 1.87, p<0.01; Prilog 4). Niži nivo očekivaneH homozigotnostiex V. agnus-castus (θ =H 0.42) u poređenjex C. foetidau sa preostale dve asocijacije (θ = 1.71 za i θ = 0.67 za ) moguća je posledica dominantog napredovanja alela niske učestalosti tokom geografske ekspanzije ovih populacija (Excoffier & Ray 2008). Međutim, na osnovu analize molekularneex varijanse C. arvensis utvrđeno i ex U. je dioica da je stepen divergencijenizak (FST unutar združenih metapopulacija veoma = 0.25, p<0.001) i pokazuje da čak 75% prisutnih razlika potiče od unutargupne varijanse. Imajući to u vidu, razdvajanje ovog genetičkog klastera u dve asocijacije i ponavljanje kalkulacija testova neutralnostiH. obsoletus pokazalo je da prethodnosa U. dioica otkrivena naznaka ekspanzije zapravo potiče od asocijacijeFS - 8.59, p<0.001;čiji jeD signal- izraženiji u odnosu na prethodnu združenu procenu ( = = 2.18, p<0.001; Prilog 4). Testovi neutralnosti urađeni i za preostalesa V. agnus dve-castus asocijacije nisu pokazali statističku značajnost (Prilog 4). Asocijacija π je pokazala najviši stepen unutrašnje divergencije (θ ) što je u skladu sa analizama molekularne varijanse kojima je utvrđeno da 90.5% (p<0.001) genetičke diferencijacije potiče od divergencijeex C. foetida crnogorske i grčke haplogrupe (Slika 12). U slučaju metapopulacije , kroz sva četiri θ parametra je 59 utvrđen nizak nivo diferencijacije u vidu genetičke stabilnosti utemeljene na JH haplotipu koji nosi 90% analiziranih jedinki asociranih sa ovim domaćinom i malom broju haplotipova koji divergiraju od njega svega jednom nukleotidnom promenom (Slike 11 i 12).FST Indeks fiksacije (pairwise), kao mera populacione diferencijacije, i Neiove distance koje ukazuju na razlike izmeđugrupe i unutar unutar populacija, vrste H. obsoletus potvrdile koje su prethodne rezultate o postojanju tri genetičke uslovljava biljka domaćin (Slika 13). Analize unutargrupne genetičke struktureex C. otkrilearvensis su i ex diferencijaciju U. dioica u vidu na odstupanja populacionom FST vrednosti nivou unutar kod metapopulacijenek V. agnus-castus olicine populacija poponca, kao i unutar H. obsoletusgenetičke linije (Slika 13). Vrednosti genetičkih distanci izmeđuFST 51 populacije asocirane sa četiri biljke domaćina, prikazane kroz vrednosti, bile su visoke (od 0.81 do 1.00) i statistički značajne (p<0.01) (Slikaex C. 13; arvensis tamno i ex plavi U. dioica i zeleni elementi na grafikonima).FST Poređenjem populacija većinom su dobijene niske vrednostiije u ex intervalu C. arvensis, od 0 do 0.20, nezavisno od geografskog porekla. Međutim, tri populac iz Crne Gore (lokaliteti Martinići i Podgorica) i Grčke (lokalitet Kilkis), pokazale su visoku i statističkiFST značajnu– diferencijaciju u odnosu na preostale populacije iste genetičke grupe ( = 0.70 1.00; p<0.01)- (Slika 13a). Dati nalaz je posledica prisustva haplotipova vezanih za AB grupu na ovim lokalitetima (Tabela 4),- dok su u svim drugim populacijama ovih domaćina prisutni haplotipovi EC haplogrupe. Njihova genetička divergencijaex U. dioica je bila manje izraženavrednost samoFST u odnosu– na jednu grčku populaciju (Profitis) uz = 0.40 0.50 (p<0.05) zbog prisustva haplotipova obeex prethodno V. agnus- pomenutecastus haplogrupe na ovom lokalitetu. Unutar grupe populacija , pokazalaFST se – divergencija između populacija sakupljenih u Crnoj Gori i Grčkoj ( = 0.73 1.00;ex V. p<0.01). agnus-castus Nasuprot geografskom signalu genetičkogex C. razdvajanjafoetida populacija FST -0.20–, diferencijacija između populacija bila je veoma niska ( = 0.20), iako je u ovu analizu uvrštena i veoma udaljena populacija iz Erzindžanapairwise u istočnoj Turskoj (Slika 13a). Prosečan broj Neiovih razlika između populacija potvrdio je genetičku diferencijaciju prema biljci domaćinu (Slika 13b). Veoma visoke Neiove 60

ex C. arvensisdistance i su ex detektovane U. dioica između populacija koje pripadaju genetičkoj grupiV. agnus - castus (9- C. foetidai (12 populacija- asociranih sapairwise druga dva domaćina, -4.0 za 12) i ex C. arvensis15). i exUnutargrupne U. dioica, 0.0 - distance su bile 0.0 ex V. metapopulacijuagnus-castus – 1.2 u slučaju– crnogorskih populacija i 0.0 2.1 u slučajuex C. grčkih foetida (4 8 je između ove dve geografske0.0- celine), dok je između populacija zabeležena vrednost bila 1.0. Najviša vrednost C.unutarpopulacione foetida diferencijacije je zabeležena u slučaju populacija asociranih sa što je posledica broja i frekvencije haplotipova (Slika 13b; narandžasti elementi).

Slika 13. H. obsoletus

FST vrednosti Grafički prikaz parametara mtDNK genetičke diferencijacije između pairwise populacija asociranih sa specifičnom biljkom domaćinom u vidu: a) pairwise Ca (C. arvensis Ud (U. dioica Vac (V. agnus-castus i Cf (C. foetida i b) Neiovog prosečnog broja razlika. Biljke domaćini su označene sledećim ex C. skraćenicama: ), ), ) ). arvensis Raspored populacija je kao u Tabeli 4. Strelice na grafiku a) ukazuju na populacije Ca-Ud spod FST dijagonale su vrednostiiz odMartinića, - Podgorice i Kilisa koje iskazuju značajne genetičke razlike u odnosu na ostale populacije iste genetičke grupe ( ). Plavi elementi i 0.2 do 1, gde 0 i negativne vrednosti ukazuju na izostanak divergencije pairwise razlika između populacija, dok vrednost 1 označava da su populacije potpuno razdvojene. Na grafiku b) zeleni elementi iznad dijagonale pokazuju Neiov prosečan broj pairwise između populacija, narandžasti elementi duž dijagonale pokazuju Neiov prosečan broj razlika unutar populacija i plavi elementi ispod dijagonale pokazuju apsolutni broj nukleotidnih razlika između populacija (Neiova distanca, d).

4.2.2 Diverzitet i varijabilnost mikrosatelitskih nuklearnih markera

H. obsoletus

Nuklearni diverzitet i varijabilnost 50 populacija u okviru koji je uzorkovan dovoljan broj individua (≥6, ukupno 702 jedinke) procenjen je na osnovu analiza 7 mikrosatelitskih lokusa (Tabela 4). Od ukupno 162 detektovanaet al. alela, 15 je novih u odnosu na prethodno publikovane podatke (Imo 2013). Svi lokusi kroz sve populacije su se pokazali polimorfnim uz prosečnu vrednost od 23 alela po lokusu, u opsegu od 16 (F84) do 30 (C147). U analiziranom uzorku je detektovano 28 (17%) privatnih alela koji se pojavljuju samo u okviruex V. agnus jedne- populacije.castus Najviši broj privatnih alela je bio 7 i to u populacijamaex C. foetida je bilo (lokaliteti Asprovalta i Aretusa, GR). ex U C. metapopulaciji arvensis ex V. agnus-castus prisutnoi ex U. dioi najmanjeca privatnih alela (2), zatim (6), (9) (11). Prosečna frekvencija nultih alela kroz sve mikrosatelite i populacije je bila 0.06, uz najvišu vrednost detektovanu na lokusu B82 (0.11), a odmah zatim i naC. E96arve nsisi G85 i U.(0.10) dioica što ne bi trebalo da ima uticaja na analize. Združena asocijacijaex V. agnus - castus ima frekvenciju nultih alela 0.05, metapopulacijaex C. foetida i iznosi 0.09. gotovo istu (0.06), dok je znatno viša u slučaju Utvrđena disproporcija na nivou asocijacija ukazuje na nepotpunu kompatibilnost mikrosatelitskih prajmera sa uzorcima što je verovatno posledica činjenice da je razvijanje protokolaH. obsoletus za umnožavanja mikrosatelitaex C. arvensis i bilo ex U. dioica bazirano naet al.centralnoevropskim populacijama (Imo 2011). Registrovane- više vrednosti nultih alela su u skladu sa detektovanim populaciono genetičkim promenama jer se ovakav fenomen može očekivati kod populacija koje se udaljavaju od izvorneet al. vrste ili podležuethodno diverzifikaciji navedena nalokusa obodu sa areala (Chapius & Estoup 2007; Li 2003). Tri pr - najvišim vrednostima nultih alela (B82, E96 i G85) odstupaju od Hardi Vajnbergove ravnoteže što može biti posledica lažnog uvećanja homozigotnosti vezane za ove markere, dok opšta devijacija na nivou populacija nije detektovana. nije Statistički značajan poremećaj ravnoteže genotipske povezanosti (LD) detektovanBogatstvo alela ni za(A jedanH. obsoletus par lokusa nakon Bonferroniex C. foetida korekcije iznosi 3.449 (Rice i znatno 1989). R ) metapopulacije

R je niže u odnosu naA prosečne vrednosti preostale tri asocijacije ( = 4.498). R Značajna razlika u vrednostima je zabeležena i unutar same asocijacije u vidu uvećaneex C. foetida vrednosti kod turske populacije (lokalitet Erzincan) u odnosu na evropsku metapopulaciju (4.379, odnosno 3.371). Tabela 5. - - H. obsoletus Poređenje parametara genetičkog diverziteta baziranih na mikrosatelitima: He R očekivana heterozigotnost i A bogatstvo alela, između četiri metapopulacije uslovljene biljkom domaćinom.C. arvensis U. dioica C. foetida V. agnus-castus

E 0.777 0.765 0.785 prosečna H 4.567 4.455 0.651* 4.523

R prosečno A 9 20 133.449* 8 br. populacija H *C. p foetida < 0.05 vs C. arvensis E H R C. foetida vs U. dioica, E : t = 5.885, df = 20, p < 0.05; A : t = 7.910, df = 20, p < 0.05 H - R - C. foetida vs V. agnus-castus,: t =5.355,E df = 31, p < 0.05; A : t = 6.945, df = 31, p < 0.05 R : t = 5.291, df = 19, p < 0.05; A : t = 5.935, df = 19, p < 0.05 nezavisnostAnalizom linearne regresije na nivou asocijacija i populacija potvrđena je očekivane heterozigotnosti- (He) od veličine uzorka (0.00050.05). Studentovim t testom je pokazano da razlike u vrednostima genetičkihC. R arvensisparametara (HE He i A nisu statistički, U. značajnedioica (H E (p>0.05) između asocijacijaV. agnus sa - R R castus (HE = 0.777 i A = 4.567) = 0.765 i A = 4.455) i R = 0.785 i A = 4.523) (TabelaC. foetida 5). Nasuprot tome, oba genetička parametra su u slučaju asocijacije sa bila niža u odnosu na preostale tri uz statističku značajnost od p<0.05 (Tabela 5). Zabeleženi signal se može pripisati populacijama iz Srbije, Rumunije i Bugarske, dok je populacija E iz Turske imala R znatno više vrednosti oba parametra u odnosu na evropske (H = 0.768 i A = 4.379; Tabela 4).

4.3 Genetička diferencijacija populacija H. obsoletus specijalizovanih prema biljkama domaćinima

4.3.1 Filogenetske analize mitohondrijskih i mikrosatelitskih markera

51 H. obsoletusU filogenetskim analizama mtDNK utvrđene su evolutivne relacije između haplotipa koji su korišćeni i prilikom izrade genealoške mreže (poglavlje 4.2.1). Pre samih analiza urađena je procena najpogodnijeg modela nukleotidneHasegawa supstitucije-Kishino i - pratećiYano Bajesov kriterijum (BIC) utvrđeno je da model HKY+I ( et al. model sa invarijabilnim mestima, pinvar = 0.881) (Hasegawa 1985) najverodostojnije prikazuje odnose unutar analiziranog seta haplotipova asociranih sa različitim biljkama domaćinima. U skladuneighbour sa tim,- joiningovaj model je korišćen prilikom rekonstrukcije filogenetskih pairwise stabala metodom, u Bajesovoj analizi, kao i prilikom procene genetičkih distanci (Slika 14; Tabela 6). Topologija filograma dobijenog preklapanjem stabala triklastriranju filogenetske haplogr analize (Slika 14) u potpunosti odgovara prethodno prikazanom upa (poglavlje 4.2.1, Slika 11) i podrazumevaex C. arvensis jasno i razdvajanjeex U. dioica, tri exfilogenetske V. agnus-castus grupe uslovljeneex C. foetida biljkom domaćinom: 1) 2) , i 3) (mesto razdvajanja označeno zelenim, plavim i crvenim krugovima na Slici 17). Filogenetske analize bazirane na tri različita metoda izračunavanja filogenetskih odnosa su rezultirale u C. rekonstrukciji arvensis-U. dioica stabala i C. iste foetida opšte topologije. visMonofilija dve mitohondrijske linije, bootstrap , izražena87– je dokokim su iste podrškama podrške za Bajesove izdvajanje analize V. agnus (1.00)-castus i vrednostima ( 98%),(0.86, genetičke grane bile niže 53%ove grane. and 56%) Haplotipo kao posledicavi koji pripadaju uticaja geografijeex V. agnus na-castus genetičku i ex C. varijabilnost foetida unutar genetičkim linijama formiraju zajedničku polazišnu granu sa nižim podrškama (0.52, 53% i 58%) što je posledica visokog diverzitetalo. P unutar asocijacijskih klastera, ali može unutarukazivati C. i arvensis na zajedničko-U. dioica porek otvrđena su i razdvajanja geografskih linija grane na „istočnu“ bazalnu grupu haplotipova grupu i „zapadnu“unutar V. agnus haplogrupu-castus koja izvire iz nje, kao i naelskih „crnogorsku“ haplotipova i „grčku“ ex V. agnus- asocijacije. Grupisanje izra 64 castus u filogenetsku granu ex C. foetida

je očekivano u skladu sa geneaološkim analizama (Slike 11H. thracicus i 14) i ukazuje na kompleksneoutgrupa je stabilizoval procese simpatričkea stablo, ali diferencijacije. Vrsta korišćena kao nije omogućila izdvajanje bazalne grane ishodne asocijacije.

Slika 14. Bajesovo filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu 1180 bp COI-tRNK(Leu)-COII i 16S-tRNK(Leu)-ND1 H. obsoletus haplotipova detektovanih u okviru ove studije kao i svih ranije publikovanih haplotipova.mtDNK sekvenci Bajesove prikazane iznad grana, dok su ispod grana date bootstrap Relevantne verovatnoće (>0.50) dobijene u programu MrBayes su neighbor-joining –vrednosti parsimone i analize (>50%) dobijene u programu PAUP*. Čvorišta koja nisu rekonstruisana u nekoj od analiza su označena simbolom „ ”. Osnovna čvorišta su 65

ex C. arvensis i ex U. dioica, plava ex V. agnus-castus ex C. foetida označena krugovima čija boja odgovara asocijaciji: zelena i crvena . Evolutivne distance izračunate C. foetida klastera, dok su QB, po HKY+I modelu obuhvataju sve prikazane haplotipove; izraelski GE i HE u grupu C. arvensis-U. dioica. haplotipovi tretirani su kao članovi φC i PC uključeni Prosečne unutargrupne distance za svaku od tri genetičke grupe su prikazane levo od kruga odgovarajuće boje, dok su H. obsoletus međugrupne distance prikazane sa desne strane. Opseg vrednosti unutargrupnih i haplogrupa i outgrupe H. thracicus međugrupnih varijacija je prikazan u zagradama. Distance između Prethodno publikovani haplotipovi (Johannesen et al. prikazane su u donjem desnom uglu figure. - et al. 2008; 2012; Johannesen & Riedle Bauer 2014; Chuche 2018) su označeni zvezdicom pairwise„*“.

Genetička diferencijacija bazirana na nukleotidnim ( ) razlikama (x100) izračunata je između tri filogenetska klastera koji se izdvajaju na - stablu0.4%, (Slika 14). Genetička diferencijacija unutar asocijacija koja varira odC. arvensis 0.3 -U. dioicazanemarljivaV. agnus je u- castus odnosu i naV. međuasocija agnus-castuscijskeC. foetida vrednosti od 1.1% (C. arvensis-U. dioica↔C. foetida ↔ ) do 1.5% ( ↔ ). Tabela 6 COI-COII genski region za 37 H. obsoletus haplotipova, . Evolutivne distance (x100) izračunate za izdvojeni korigovane HKY+I modelom nukleotidne supstitucije srednja vrednost; d1- d2- (pinvar=0.813). Opseg vrednosti distanci je prikazan u zagradama ispod kojih je data D- prosečna divergencija između svih sekvenci, prosečna divergencija između parova sekvenci unutar asocijacije, prosečna divergencija između grupaH. obsoletus (asocijacija). D d1 d2 1 2 3 4 1 [0.001 - 0.009] asocijacija - C. arvensis 0.004

2 [0.001 - 0.007] [0 - 0.009] - U. dioica [0-0.027] 0.004 0.004 0.010 3 [0.001 - 0.011] [0.01 - 0.025] [0.009 - 0.021] V. agnus- - 0.005 0.018 0.016 castus 4 [0.001 - 0.004] [0.014 - 0.027] [0.012 - 0.025] [0.002 - 0.017] - C. foetida 0.003 0.020 0.018 0.012 Hyalesthes [0.033 - 0.043] [0.031 - 0.043] [0.025 - 0.032] [0.025 - 0.032] - - thracicus 0.038 0.037 0.029 0.029

66 su P, Pored toga, genetičke distance su procenjene i zaregiona 37 haplotipova COI-COII (isključeni gena (bez tRNK-φLeu, Q, G i H) izdvojenog filogenetski informativnog ) od 711bp dužine (Tabela 6). Vrednosti divergencije u ovom slučajuH. dostižuobsoletus čak 2.5% između haplotipovaH. thracicus različitih asocijacija.-filogenetski Genetičke n distanceajsrodniju asocijacija u odnosu na kao morfo vrstu, varirajuCOI između-COII 2.1% i 3.3% na nivou kompletnog mtDNK regiona, dok su na izdvojenom(Slika 14; genskom regionu vrednosti znatno više i to od 2.9%H. obsoletusdo 3.8% Tabela 6). Poređenjem genetičkih distanci između tri genetička klastera uslovljena biljkomH. thracicus domaćinom, i divergencije u odnosu na morfološki jasno različitu vrstu , uočavaju se evolutivni odnosi koji podsećaju na postojanje tri bliskonu. srodne kriptične vrste koje razdvaja specijalizacija prema biljci domaći

Slika 15. Maximum likelihood filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu 4 H. obsoletus jedinke. Svaka od grana na mikrosatelitska lokusa za ukupno 722 gene C. arvensis-U. dioica V. agnus-castus C. foetida. koncentričnom stablu predstavlja jednu od 51 populacije. Zelene grane predstavljaju ex C. foetida - tiču grupu asocijacije, plave i crvene ex V. agnus-castus - et al. outgrupa Populacija iz Erzindžana (Turska) je označena na stablu kao „Cf TR“, dok je Hyalesthes luteipes. izraelska populacija označena kao „V IL“ (Imo 2013). Kao analize korišćena je populacija vrste

maximum likelihood

Fenogram dobijen algoritmom, baziran je naH. luteipes na 4/7 mikrosatelitskih lokusa koji su se umnožili (Slikaoutgrupa 15) u slučaju vrste čijih je 6 jedinki korišćeno kao populaciona . Manji broj mikrosatelita uključenih u analizu nije ugrozio rezultat. Dobijeno filogenetsko stablo u strukturi odstupagrupisanju od izraelske mtDNK ex filogenetskog V. agnus-castus stabla popul (Slika 14) samo u odgovarajućem acije koja se postavlja kao bazalna grana preostalim populacijama odgovarajuće asocijacije. 4.3.2 Struktura populacija H. obsoletus bazirana na mikrosatelitima - H. obsoletus

U analizama procene populaciono genetičke strukture vrste zadržan je osnovni set uzoraka od 702 jedinkeuvrštena poreklom i prethodno iz 50 populacija publikovana (≥6 jedinki), dok je u određene testove klastriranjaV. agnus-castus et al. izraelska populacija koju čini 20 jedinki ex (Imo 2013). Analizom opšteg klastriranja celokupnog uzorka pokazano je grupisanje populacija upodrške tri prethodno utvrđene mtDNK genetičke grupe uz izuzetno visoku vrednost (Evanno ΔK(3) = 803.72) (Slika 16). >Prosečna genetička pripadnosta prioripopulacija klasterima bila je u visokom procentu ( 90%) i u potpunosti je pratila C. arvensisinformaciju-U. dioica o biljkama domaćinima sa kojih expotiču: V. agnus jedinke-castus asocirane su grupisane sa su grupisane u Klaster 1, jedinkeC. foetida u Klaster 2, dok su sve individue sakupljene na grupisane u Klaster 3 (Slika 16a). Populacija iz Izraela se nedvosmisleno grupisala u genetički klaster odgovarajućeg domaćina C. što foetida nije bio (poglavlje slučaj na4.2.1, nivou Slika mtDNK 11 i pogl u okviruavlje 4.3.1, kojih Slika ona gravitira ka asocijaciji ex ex V. agnus-castus 14). Za razliku od balkanskih populacija Klastera 2, izraelska populacija poseduje manji procenat genetičke pripadnosti (75%) što može biti posledicage geografske izolacije (Slika 16a). Odstupanjeex C. foetida u visokoj iz Turske pripadnost koja se, netičkoj grupi je zabeleženo i u slučaju populacije za3 sa razliku 60% pripadnosti od evropskih populacija iste asocijacije, grupisala u odgovarajući Klaster (Slika 16a). a 77% ukupne Analiza molekularne varijanse (AMOVA) je pokazala d genetičke varijabilnosti detektovane u uzorku potiče od asocijacije prema biljci domaćinu (Prilog 5). Kako bi se utvrdila podstruktura tri sugerisana klastera, svaki 68

ex C. arvensis i ex U. oddioica njih, je pojedinačno– – 11.14 analiziran. Klaster 1 (29 populacija ex C. foetida, – ΔK(2–5.3228)=0.06 ) i Klaster 3 (13 populacija ΔK(2 12)=0.18 ) nisu pokazali unutrašnju diferencijaciju uslovljenu geografijom, dok kod Klastera 1 nije prisutan ni signal divergencijeex V. prema agnus -domaćinu.castus Nasuprot tome, 60% genetičke varijanse unutar Klastera 2 ( ), pripisuje se genetičkoj divergenciji između crnogorskih i grčkih metapopulacija međusobnoV. agnus- castusudaljenih 400 km (Prilog 5). 45; U STRUCTURE Slika 16b analizi klastriranja unutar asocijacije (ΔK(2) = 80. ), genetičkoj grupi grčkih populacija se pridružuje istočnomediteranska od 81– populacija iz Izraela uz populacionu pripadnost ovom klasteru 97%. AMOVA analiza raspodele genetičke varijanse unutar asocijacije sa konopljikom pokazala je da 42% genetičke diveregencije vodi poreklo od geografskog grupisanja populacija u vidu dve genetičke grupe: (1) crnogorske i (2) združenih grčkih i izraelskih populacija (Prilog 5). Klaster 1 Klaster 2 Klaster 3 90-98% pripadnost 93-98% pripadnost 93-98% pripadnost

C. arvensis U. dioica V. agnus-castus C. foetida IL TR 75% 60%

Klaster 1 Klaster 2 84-96% pripadnost 81-97% pripadnost

Crna Gora Grčka IL 95%

Slika 16. H. obsoletus Bajesova analiza grupisanja jedinki i populacija u genetičke klastere dobijena u et al. programu STRUCTURE. (a) klastriranje 702 jedinke grupisane u 50 populacija H. obsoletus uz pridruženu izraelsku populaciju od 20 individua (Imo 2013); (b) klastriranje 132 jedinke iz 8 populacija asociranih sa konopljikom u Crnoj Gori i Grčkoj uz pridruženu prethodno pomenutu izraelsku populaciju. Svaka kolona predstavlja jednu individuu, dok crne uspravne linije predstavljaju granice između populacija. Boje na C. arvensis-U. dioica V. agnus-castus C. foetida grafikonima odgovaraju proporcionalnoj pripadnosti individua svakom od genetičkih klastera: zelena ( ), plava ( ), crvena ( ).

4.3.3 Segregacija sintopskih populacija

Od ukupno 11 sintopskih lokaliteta, njih deset je podvrgnuto analizama genetičkog klastriranja na osnovuH. mikrosatelita obsoletus čime je dobijen uvid u protok genetičkog materijalaC. arvensis u između ist asocijacija (Slika 17). Populacija asociranaex C. foetida sa očnoj Turskoj (Erzindžan) koja je sintopski prisutna sa populacijom, nije uvrštena u analize jer je broj uzorkovnih jedinkiex nedovoljanC. arvensis i (triex U.individue, dioica Tabela 4). Na 3/4 sintopska lokaliteta sa populacijama nije detektovana genetička divergencija uslovljena biljkom domaćinom štoHamzali je u skladu sa odsustvomStrumica iste u svim prethodnimMartinići analizama.

C. arvensis U. dioica C. arvensis U. dioica C. arvensis U. dioica

Podgorica Aleksinac Negotin

C. arvensis U. dioica C. arvensis C. foetida U. dioica C. foetida

Vranjska banja Zaječar

U. dioica C. foetida U. dioica C. foetida

Godinje Aretusa

U. dioica V. agnus-castus U. dioica V. agnus-castus

Slika 17 H. obsoletus

. Klastriranje jedinki na sintopskim lokalitetima. Svaka kolona predstavlja jednu individuu, dok su crne uspravne linije granice između populacija. Iznad grafikona je naznačen lokalitet, a ispod asocijacija kojoj data sintopska populacija pripada. -va

Međutim, na jednom sintopskom lokalitetu (Podgorica, CG) Evanno vrednost ΔK(2) = 76.94 ukazala je na postojanje dva klastera što podseća na

genetičkeet al. relacije ovih asocijacija u slučaju host rasa na jugozapadu Nemačke (Imo- 2013). Ovakav odnos je posledica prisustvaC. arvensis haplotipova iz „zapadne“ex AB U. haplogrupedioica u ovoj populaciji asociranoj sa- , dok su u populaciji prisutniC. arvensis/C. haplotipovi foetida „istočne“, U. dioica EC haplogrupe./C. foetida, U. Na dioica ostalim/V. agnus sintopskim-castus lokalitetima ( ) bili su očigledni genetička divergencija i manjak protoka gena između asocijacija uz populacionu pripadnost odgovarajućem klasteru od 68% do 99% (Slika 17). VećinskaGen pripadnost klasteru od >50% nije bila karakteristična za sve individue. otipizacija mtDNKa priori ovih „pogrešno klastriranih“ jedinki potvrdila je njihov identitet kao članova određene asocijacije čime je ispoljeno odstupanje u

podacima koje pružaju mitohondrjalni i nuklearni markeri. 4.4 'Ca. P. solani' inficiranost populacija H. obsoletus specijalizovanih prema biljkama dualnim domaćinima

Molekularno- Ca. P. solani' izolata

detektovanih u H. epidemiološkom obsoletus karakterizacijom ' jedinkama asociranim sa četiri tuf biljke-tipa ( domaćina,tuf-a, tuf- utvrđenoab i tuf- je prisustvo multilokusnih (MLST) genotipova sva tri b) čiji epidemiološki putevi otpočinjuCa. od P. specifičnihsolani' izolate dualnih tuf-a i domaćina tuf-ab tipa i šire se asociranim populacijamaU. dioica vektora. Za ' H. obsoletus potvrđena je korelacija sa tufkao rezervoarom i asociranim populacijama, dok je u slučaju b tipa izolata utvrđenoC. arvensis da se, epidemiologijaV. agnus-castus razvijai C. foetida u vidu mreže koja povezuje H.tri obsoletus dualna doma ćina: , kroz sa njima asocirane populacije. 4.4.1 Genotipski diverzitet 'Ca. P. solani' u populacijama H. obsoletus ex U. dioica H. obsoletus

EpidemiološkiU. dioica značaj i prirodna inficiranost populacija'Ca. P. solani' je asociranih sa kao biljkom domaćinom i rezervoarom istraživana na ukupno 21 lokalitetu na teritoriji Balkana (12 u Srbiji, četiri u Crnoj Gori,karakteri dva u Makedoniji'Ca. P. isolani' tri u Grčkoj;u 332 H. Tabela obsoletus 7). Molekularnom adulta sakupljena identifikacijom sa U. dioica i zacijom

tuf- potvrđeno je dominantno prisustvo a epidemiološkog genotipa specifičnogtuf- abza ovu asocijaciju (Tabela 7). Pored toga, detektovana je i infekcija vektora tipom koji je u jugoistočnoj Evropi prethodnoet al. zabeležen samotuf u- Makedoniji takođe u asocijaciji sa koprivom (Atanasova 2015).U. Obadioica štotipa je suu skladu specifična sa isključivo za epidemiološki ciklus koji izvire iz 'Ca. P. solani' u odnosu na dosadašnjim podacima o epidemiološkoj specijalizaciji H. obsoletus ex U. dioica biljku dualnog domaćina.tuf -Međutim, za značajan broj jedinki utvrđena je infekcija b CPs genotipom za kojigena se po(npr. literaturnim C. arvensis podacima smatra da potiče iz drugih biljaka rezervoara pato ; Langer & Maixner 2004) (Tabela 7). Tabela 7 Ca. P. solani' H. obsoletus ex U. dioica koje su prethodno . Učestalost infekcije- i prikaz MLST okarakterisanih izolata ' detektovanih u jedinkama populacija podvrgnute populaciono genetičkim analizama (Tabela 4). Uz lokalitet je u zagradi prikazana i država sledećim skraćenicama: SRB (Srbija), CG (Crna Gora), MK (Makedonija) i GR (Grčka). jedinki/ Broj Lokalitet GPS tuf stamp vmp1 ukupanbroj CPs+ broj izolata jedinki - 19-25 -

57.88 - HoU354 - (1) E19 3.28 4/22 N45 - HoU355 - (1) Gakovo (SRB) - - HoU362 (1) -ab 19-25 V18 tuf (1) E19 35.604 3/20 N45 47.518 - HoU346 - Bačka Topola (2) (SRB) tuf-ab 19-25 V18 (1) E20 06.114 2/20 N45 43.693 - 19-25 - Bačko Petrovo (1) 0/12 / / / selo (SRB) E21 11.208 (1) N45 03.874 Vršac (SRB) tuf-ab 19-25 V18 (0)

E21 30.362 3/15 - 19-25 - N44 39.685 (1) - HoU448 V23 Srednjevo (SRB) (1) tuf-a SB5 V3 (1) E22 02.090 7/12 N44 31.740 - STOL - (1) Boljetin (SRB) (5) 72

- HoU302 -

/ / / E22 30.484 0/6 (1) N44 16.604 Negotin (SRB) - STOL - (0)

E22 17.728 5/20 - HoU296 - N43 54.492 (3) Zaječar (SRB) - HoU294 - (1) 1/15 E22 18.833 - STOL - (1) N43 30.610 Knjaževac (SRB) 1 2 E22 21.825 1/17 tuf-a SB5 V3 (1) N43 01.270 Grnčar (SRB) tuf-a M2 V3 (1)

1 3 tuf-a SB5 V3 (3) E21 54.319 9/12 N42 31.725 tuf-b STOL - (1) Vranje (SRB) - STOL - (2) Vranjska banja tuf-a SB5 V3 (3) E21 59.839 4/11 - 19-25 N42 35.417 - (2) (SRB) tuf-a SB5 V3 E19 06.800 1/6 (2) N42 13.421 Godinje (CG) / / / (1) E19 10.763 0/20 N42 32.245 Martinići (CG) / / / (0) E19 12.509 0/20 N42 26.919 Podgorica (CG) tuf-a SB5 V3 (0) E19 13.3220 3/30 N42 19.3240 tuf-ab 19-25 V3 (2) Šušunja (CG) tuf-a1 M3 V3 (1) E22 44.996 2/17 N41 29.860 - SB5 - (1) Hamzali (MK) tuf-a SB5 V3 (1)

1 tuf-ab 19-25 V18 (1) E22 39.922 6/19 Strumica (MK) N41 26.505 - - (1) - STOL - Rpm35 (1)

E23 33.096 1/12 - HoU437 - (3) N40 45.767 Aretusa (GR) tuf-a M3 V3 (1) E23 27.846 2/20 N40 45.246 - BG4560 - (1) Filadelfio (GR) tuf-a M3 V3 (1) E23 17.331 3/6 N40 39.930 tuf-b V2-TA (2) Profitis (GR) Rqg31 (1)

„-“ tuf -f1/Tuf1-r1 i TufUf/TufU- 1 vmp1 gen Simbol označava odsustvo amplifikacije određenog gena; uzorci čiji je gen umnožen 2”, a sa prajmerima Tuf1 r1 obeleženi su sa „ ”; uzorci čiji je 3 „/“ umnožen prajmerima TypH10F/TypH10R i TypH10F1/TypH10R1 obeleženi su sa „ prajmerima TypH10F1/TypH10R1 i TypH10F2/ TypH10R2 obeleženi su sa „ ”. Simbol se odnosi na populacije u okiviru kojih nisu detektovane CPs inficirane jedinke. Populacija 'Ca. odi u Tabeli 11 u poglavlju u Šušunji (CG) je naknadno sakupljena za potrebe praćenja prirodnih puteva diseminacije P. solani' u mediteranskim vinogradima i kao takva se nav

4.5.1, ali je radi opšteg pregleda CPs izolata prikazana i u ovom poglavlju.

'Ca. genskogMolekularnom regiona, identifikacijomH. obsoletusP. solani' jedinki putem ex specifičnogU. dioica STOL11 utvr u približno 20% (57/332) đeno je CPs prisustvo. Izuzimajući četiri neinficirane populacije, procenat infekcije po lokalitetu je varirao od 6% do 75% (Tabela 7). Multilokusna genotipizacijaregiona (tuf, stamp izolata i vmp sprovedena za je kompletnom karakterizacijom tri genska okarakterisani tuf i/ili vmp1) 40% izolata, dok u slučaju 34/57 uzoraka nisu okarakterisana su na tuf1 gen usled neuspešne amplifikacije. Četiri CPs izolata genu sekvenciranjem nested oj produkata studiji i standardnih dobijenih kombinovanom- f1/Tuf1primenom-r1 unovih direktnoj prajmera i TufUf/TufU dizajniranih- u ov prajmera:Unutar Tuf1 H. obsoletus ex U. dioica na r1teritoriji prajmera Balkana u nested detektovana reakciji. su oba tuf-tipapopulacija (tuf-a i tuf- tuf- ab) karakterističnatuf- za ovu asocijacijutuf- u vidu pet MLSTtuf- genotipova:ab/19- a/SB5/V3tuf-ab/19 (9 uzoraka),- a/M2/V3 (3), a/M3/V3 (4), stamp/25/V3vmp1 okarakterisani (1) i kao25/V18 genotip (5). 19 - Nedoslednost uzoraka koji su na- 25/V3 (Crna Gora), ex odnosno U. dioica 19, a 25/V18 (Srbija), što je ukazivalotuf -na pripadnost epidemiološkoj liniji tuf gena. zatim u RFLP analizi pripisani b profilu, razjašnjena je sekvenciranjem Analizom nukleotidneHpa sekvence utvrđena je mutacijatuf koja- je rezultirala nedostatkom II restrikcione pozicije karakteristične za atuf RFLP- profil (Slika 18). Ova nukleotidna tuf promena-b tipu, jeali specifična je f za intermedijernituf- ab tip koji ima RFLP profil identičan ilogenetski bliži a grupi sekvenci (Slika 18).

Slika 18. tuf gena 'Ca. P. solani' pripadnost tuf-a, tuf-b ili tuf-ab tipu i Hpa tuf gena 'Ca. P. solani' Nukleotidne razlike u sekvencama koje određuju II restrikcioni profili razdvojeni1 na automatskoj kapilarnoj elektroforezi QIAxcel advanced (QIAGEN). 2 Hpa tuf-a ili tuf- Dužina sekvence od početka mesta vezivanja forward prajmera TufAYf (TufUf) Mesto sečenja II enzima koje definiše b tip prema Langer & Maixner (2004). anije opisanih, stamp genotipova koji pripadajuPored tuf -a/ identifikacijetuf- poznatih, r - sada nepoznatih izolataab epidemiologiji koji se od referentnog (19 25, SB5, genotipa M2 i M3),19- detektovano je 5 do et al. 25 (FN813267; Fabre 2011) razlikuju u jednoj ili dve nukleotidne promenstampe: HoU354, genotipova HoU355, nije HoU362, HoU448 i HoU437tuf (Tabela 7). Nijedan od novih uspešno amplifikovan na genu ni sa jednom vmp od1 različitih gena gde kombinacija je jedino uzorakprajmera. iz SličnaSrednjeva situacija (sa stamp je registrovana i u slučaju genotipom HoU448) na osnovu RFLP profila okarakterisan kao V23, a zatim je analizom nukleotidne sekvence pokazano da se u jednojet al. nukleotidnoj2014; Quaglino supstituciji et al. 2016 razlikuje od referentne. sekvencevmp Vm_At2 (Aryan ) (Slika 19) Kod dva uzorka 1 profil je određen primenom jedne od sledeće dve prajmerske kombinacije: standardni prajmeri TypH10F/TypH10R u direktnoj i novodizajnirani TypH10F1/TypH10R1 u nested reakciji, ili novi prajmeri u obe reakcije, TypH10F1/TypH10R1 i TypH10F2/TypH10R2 (Tabela 7). Zatuf sve-a iliizolate tuf-ab okarakterisane tipu, odnosno primenomV3 vmp1 profilu novih prajmera utvrđeno je da pripadaju

U. dioica koji su specifično vezani za CPs MLST genotipove čiji je izvor infekcije (Tabela 7, Slike 18 i 19).

Slika 19. Rsa vmp1 gena 'Ca. -TA, V2-TA-L, I restrikcioni (V) profili P. solani' razdvojeni na automatskoj H. obsoletus ex U. kapilarnoj elektroforezi QIAxcel advanced (QIAGEN). Prikazani profili (V2 dioica, C. arvensis, V. agnus-castus i C. foetida V3, V4, V14, V15, V17, V18, V23, und2) su detektovani u jedinkama - - . Pripadnost određenom profilu je utvrđena et al et al. (2 poređenjem sa referentnim izolatima poznatog V tipa (CH1, GGY, Rpg39, Hr Br, Rqg50, 19 25, Vv5, Chrt2, U79) preuzetim iz Cvrković . (2014), Atanasova 015)Gruzije ili obezbeđenim od strane X. Foissac (Bordo, Francuska). U slučaju und2 profila su nested (Quaglino et al. Hae amplikoni sekvencirani i putem nukleotidne sekvence pripisani ovom profilu iz 72 bp. 2016). Marker korišćen u analizi je FX174/ III: QX DNA size marker (QIAGEN) sa dužinama fragmenata: 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118 i

Posebno značajan nalaz u okviruH. obsoletus epidemiološkog ciklusa koprivetuf-b tip jea relativno česta inficiranost asociranih tuf- jedinki- CPs izolatima (42%)su dva tuf(Tabela-b/STOL 7). Poredizolata MLST genotipa b/Rqg31/V2stampTA (1genu uzorak), okarakterisani prisutna i 17 uzoraka koji su samo na stamp kao:genotipa STOL (HoU3 (15 izolata), Rpm35 (1) i BG4560 (1). Uz to, zabeležena su 4 nova 46, HoU302, HoU296 i HoU294) koji se razlikuju u jednojet al. ili dve nukleotidne promene od referentnog STOL izolata (FN813261; Fabre 2011) (Tabela 7).

4.4.2 Genotipski diverzitet 'Ca. P. solani' u populacijama H. obsoletus ex C. arvensis H. obsoletus ex C. arvensis bio je

Utvrđeni procenat CPs infekcije populacija od 20% do 66% (Tabela 8). Od ukupno 144 analizirana adulta sa 12 lokaliteta na teritorijituf-b tipa Balkana (Ta i Turske, 61 je bio CPs inficiran (42%) i to isključivo izolatima bela 8). Primenomtuf kombinacije standardnih i novodizajniranih prajmera uspešno je umnožen gen kod 3/12 prethodno neamplifikovanihtuf-b profilu, a da izolata.se 2/3 uzorkaNakon (MLSTsekvenciranja genotipovi utvrđeno iz Pred je da ovituf uzorci-b/BG4560/ pripadaju- i tuf-b/ /- ejana: tuf- HoCa632 ) jednim nukleotidom razlikuju od referentnog Hpa izolata b tipa (FJ441242). Ova razlika ne narušava karakteristično sečenje vmpII enzimom1 genu što je provereno virtuelnom digestijom. Karakterizacija izolata na je upotrebom novih prajmera uspešno urađena u slučaju 4/12 uzoraka (Tabela 8) . Tabela 8 Ca. P. solani' H. obsoletus ex C. arvensis koje su prethodno podvrgnut. Učestalost infekcije- i prikaz MLST okarakterisanih izolata ' detektovanih u jedinkama populacija e populaciono genetičkim analizama (Tabela 4). Uz lokalitet je prikazana i država u zagradi sledećim skraćenicama: SRB (Srbija), Rumunija (RO), CG (Crna Gora), MK (Makedonija), GR (Grčka) i Turska (TR). jedinki/ Broj Lokalitet GPS tuf stamp vmp1 ukupanbroj CPs+ broj izolata jedinki tuf-b V4 -b V14 tuf Rqg50 (2) tuf-b Rqg50 V14 (1) 12/20 E20 40.224 tuf-b Rpm35 V4 (2) N44 13.532 Topola (SRB) tuf-b Rqg31 V14 (3) tuf-b Rqg31 V2-TA (2) -b M5 V4 tuf Rqg31 (1) tuf-b V14 36.010 2/6 (1) E21 40.592 N43 tuf-b Rqg50 V14 (1) Aleksinac (SRB) und13 Predejane tuf-b Rqg31 (1) 6/9 E22 07.912 N42 49.992 - GGY - (1) (VmGe2) (SRB) GGY (1)

- -

tuf-b1 BG4560Rqg31 - (1)

und13 (1) -

Rqg31 (1) tuf-b1 HoCa632 (VmGe2)- Petrevo selo tuf-b V4 (1) 5/9 E21 31.548 N45 49.528 - BG4560Rqg50 - (1)

(RO) tuf-b V14 (4)

tuf-b Rqg31 V4 (1)

7/17 tuf-b Rqg50 V17 (2) E19 10.763 N42 32.245 -b V14 Martinići (CG) tuf Rqg50 (1) tuf-b1 HoCa242Rpm35 V4 (2)

tuf-b V4 (1)

tuf-b Rqg50 V17 (2) 11/20 3 E19 12.509 - Rqg50 V17 (5) N42 26.919 Podgorica (CG) tuf-b Rqg50 V2-TA (1) - HoCa341Rpm35 V2-TA2 (2)

tuf-b V14 (1) 26.0510, E19 2/10 N42 10.4390 tuf-b Rpm35 V14 (1) Beri (CG) 19.3240 6/20 E19 13.3220 tuf-b Rqg31 V14 (1) N42 Šušunja (CG) tuf-b Rpm35 V2-TA (6) 3/12 E22 44.996 tuf-b Rqg50 V14 (1) N41 29.860 Hamzali (MK) tuf-b Rqg50 V4 (1) tuf-b GGY V4 (1) 3/11 E22 39.922 N41 26.505 tuf-b GGY V14 (1) Strumica (MK) tuf-b Rqg50Vv24 V4 (2) 54.984 3/6 2 E22 49.101 tuf-b Vv24 V4 (1) N40 Kilkis (GR) tuf-b HoCa278 V14 (1) 1/3 E38 38.063 tuf-b STOL V15 (1) N39 57.253 Erzincan (TR) (1)

„-“ tuf gen -f1/Tuf1-r1 i TufUf/TufU- 1 Simbol označava neuspešnu amlifikaciju određenog gena; uzorci čijij je vmp umnožen prajmerima Tuf1 r1 obeleženi su sa „ ”; uzorci čiji je 2 3”. 1 gen umnožen prajmerima TypH10F/TypH10R i TypH10F1/TypH10R1 obeleženi su bol „/“ sa „ ”, a sa prajmerima TypH10F1/TypH10R1 i TypH10F2/ TypH10R2 obeleženi su sa „ Sim se odnosi na populacije u okiviru kojih nisu detektovane CPs inficirane jedinke. 'Ca. Tabeli 11 Populacija u Šušunji (CG) je naknadno sakupljena za potrebe praćenja prirodnih puteva diseminacije P. solani' u mediteranskim vinogradima i kao takva se navodi u u poglavlju 4.5.1, ali je radi opšteg pregleda CPs izolata prikazana i u ovom poglavlju.

16 MLSTTrogenska genotipova karakterizacija tuf- je urađena za 50 izolata koji pripadaju jednom od poznatih stamp b epidemiologije. Potvrđeno je prisustvo 8 prethodno genotipova (Rqg50, Vv24, Rqg31, BG4560, GGY, STOL, Rpm35 i M5), kao i četiri nova: HoCa632 (Predejane, Srbija) i HoCa242 (Martinići, Crna Gora) kojiet seal. jednim nukleotidom razlikuju od referentnog Rqg50 (KC703019; Cvrković 2014) i HoCa341 (Podgorica, Crna Gora) sa jednom promenom i HoCa278 (Kilkis, Grčka) sa tri nukleotidneet al. promene u odnosu na referentnistamp genotipRpm35 genotip (KC703015; Cvrković 2014) (Tabela 8). Najčešći -TA, V4,detektovan V14 i V17 u većinivmp populacija (20/50 uzoraka) je Rqg50 u kombinaciji sa V2 1 profilima. Trinaest jedinki-TA je (Slika bilo inficirano19; Rpm35 genotipom uparenim najčešće sa profilom V14, ređe V2 Tabela 8). Pored do sada neopisanog genotipastamp (izolat HoCa278), u populacijivmp vektora iz Kilkisa (Grčka) prisutan je bio Vv24 genotip praćen V4 1 profilom (TabelaMLST genotipa 8). Za Srbiju tuf- i Crnu Goru karakteristično vmp je prisustvo dve varijante izolata ovaj stamp genotip b/Rqg31vezan i to uz V4 i V14 1 profile, dokvmp je u Predajanima za nedavno opisani VmGe2 genotip et al.1 gena poreklom iz GruzijeMLST genotip čiji je restrikcionituf- profil nazvan und1 (Quagliano 2016)stamp (Tabela genotip 8). b/GGY/V4 detektovan je u Makedoniji, doktuf- je GGY prisutan i u dva izolata iz Predejana (Srbija) i to kao b/GGY/und2 i u još jednomPrethodni uzorku nalaz čija prisustva preostala tuf dva-b/M5/V4 gena nisu genotipa uspešno pore okarakterisanaC. (Tabela arvensis 8).u Makedoniji (Atanasova et al. klom sa H. obsoletus 2015) H. obsoletussada je potvrđen i u jednom adultu u Topoli (Srbija). U primerku tuf-b/STOL/V15sa severoistoka MLST Turske genotipa, utvrđeno dok je jeu prisustvo samo za njega karakterističnog stamp četiri uzorka iz Rumunije utvrđeno prisustvo BG4560 genotipa (Tabela 8).

4.4.3 Genotipski diverzitet 'Ca. P. solani' u populacijama H. obsoletus ex V. agnus-castus Prisustvo 'Ca. H. obsoletus V. agnus-

castus u P. solani' u jedinkama u asocijaciji sa tvrđenoH. jeobsoletus jedino jedinke u populacijama ex V. agnus poreklom-castus iz Crne Gore (Tabela 9). Nijedna od 64 sa 6 lokaliteta u Grčkoj nijeiz bila CPs inficirana (Tabela 9). Nasuprot tome, u svih 5 analiziranih populacija Crne Gore detektovana je CPs infekcija čija se stopa kretala od izuzetno niskih 4.5% u Berima, do 25% u Kamenarima.ex V. agnus Iako - jecastus srednji bio procenat 13%, ova zaraženosti H. obsoletus na nivou crnogorske metapopulacije asocijacija se pokazala kao vektorski vrlo sposobna'Ca. jer je uspešno inficirala eksperimentalne biljke u ogledima prenošenja P. solani' (poglavlje 4.5.2). Tabela 9 Ca. P. solani' H. obsoletus ex V. agnus-castus koje su prethodno . Učestalost infekcije- i prikaz MLST okarakterisanih izolata ' detektovanih u jedinkama populacija podvrgnute populaciono genetičkim analizama (Tabela 4). Uz lokalitet je prikazana i država u zagradi sledećim skraćenicama: CG (Crna Gora) i GR (Grčka). jedinki/ Broj lokalitet GPS tuf stamp vmp1 ukupanbroj CPs+ broj izolata jedinki - STOL - E19 04.581 3/18 N42 07.031 -b STOL - tuf (2) Bar (CG) -b V17 tuf (1) E19 06.800 3/30 N42 13.421 tuf-b Rqg50STOL V2-TA (1) Godinje (CG) tuf-b STOL - (2)

5/20 - STOL - (1) N42E18 41.02828.591 Kamenari (CG) - - (3)

- Rqg50STOL - (1) E19 16.052 2/19 N41 56.515 tuf-b STOL - (1) Ulcinj (CG) 1/22 tuf-b Ho- V17 (1) N42E19 26.0510,10.4390 Beri (CG) Vac1 (1) 0/10 / / / N40E23 29.96038.380 Apolonija (GR) (0)

0/19 / / / N40E23 44.02445.124 Asprovalta (GR) 0/20 / / / (0) N40E23 40.39741.616 Aretusa (GR) 0/7 / / / (0) N39E22 16.98138.544 Larisa (GR) 0/5 / / / (0) N39E26 18.5658.379 Lezbos (GR) (0) 0/3 / / / NE 2440 37.52535.177 Tasos„-“ (GR) „/“ se odnosi(0) na

Simbol označava neuspešnu amlifikaciju određenog gena. Simbol 'Ca. P. solani' u populacije u okiviru kojih nisu detektovane CPs inficirane jedinke. Populacija iz Beri (CG) je naknadno sakupljena za potrebe praćenja prirodnih puteva diseminacije mediteranskim vinogradima i kao takva se navodi u Tabeli 11 naknadnou poglavlju uzorkovana 4.5.1, ali je radi opštegdopune pregleda CPs izolata prikazana i u ovom poglavlju. U okviru populacije iz Godinja je prikazan veći broj jedinki odnosu na Tabelu 4 jer je takođe

epidemiološke studije u mediteranskim vinogradima. tuf i vmp

Neuspešnost umnožavanja 1 gena je prisutna i u slučaju ove asocijacije vektora u procentu od 30% detektovanih izolata. Primena novodizajniranihneokarakterisano prajmerana tuf, a 10 nije na vmp dala rezultate usled čega je 7 uzorakaH. obsoletus ostalo ex V. agnus-castus 1 genu. Centralni nalaz vezan za et al. populacije , tufkoji-b se'Ca. poklapa P. solani' sa izolatapodacima. iz Izraela (Sharon tuf 2015), je prisustvo isključivo Svi uzorcituf- umnoženi na genu suPored i sekvencirani dva prethodno i potvrđeni opisana kao stampidentični sa referentnim b izolatom. genotipa, stamp Rqg50 genotip i STOL o na lokalitetu- Beri (Crna Gora) detektovan je do sada nepoznat značen kao Ho Vac1 koji seet za al. dva2014 nukleotida razlikuje vmp od referentnog izolata Rqg50 (KC703019; Cvrković ). Analiza-TA uz tuf-b/STOL1 gena genotip četiri umnožena u dva uzorka izolata u Godinju pokazala i V17 je profprisustvoila vezanog dva profila: za tuf V2- tuf-b/Ho- Slika 19; b/Rqg50 u Godinju i Vac1 u Berima ( Tabela 9).

4.4.4 Genotipski diverzitet 'Ca. P. solani' u populacijama H. obsoletus ex C. foetida i potvrda statusa dualnog domaćina C. foetida Prvobitni nalaz prisustva tuf-b tipa 'Ca. P. solani' u H. obsoletus ex C. foetida et al

populacijama (Kosovac . 2013) potvrđen H. je obsoletuskroz znatno jedinke veći uzorak od 52 CPs izolata molekularno detektovana u 163 sakupljene uglavnom na području istočne i jugoistočne Srbije (Tabela80%, do10). sada Veoma kao visokatakva stopa infekcije, koja kod nekih populacija iznosi i preko preos nije poznata u literaturi, niti detektovana u ovom istraživanju u slučaju talih asocijacija. Kroz analizirane uzorke stamp ističe se homogenost infekcije STOL izolatom, kao jednim od 5 detektovanih genotipova, kojem pripada više od 80% genotipiziranih izolata. Trogenska karakterizacija je uspešno urađena u slučajutuf-b/STOL/V2 37/52 uzorka- i pokazala je da većina njih (83%) pripada MLST genotipu TA (Tabela 10). Tabela 10 Ca. P. solani' H. obsoletus ex C. foetida koje su prethodno po . Učestalost infekcije- i prikaz MLST okarakterisanih izolata ' detektovanih u jedinkama populacija dvrgnute populaciono genetičkim analizama (Tabela 4). Uz lokalitet je prikazana i država u zagradi sledećim skraćenicama: SRB (Srbija), BG (Bugarska), RO (Rumunija) i TR (Turska). jedinki/ Broj lokalitet GPS tuf stamp vmp1 ukupanbroj CPs+ broj izolata jedinki

0/10 / / / N43E21 40.59236.010 Aleksinac (SRB) V2-TA- tuf-b STOL (0) L 4/20 N43E21 33.44438.546 tuf-b STOL - (1) Deligrad (SRB) - STOL - (2) -b STOL V2-TA tuf (1) 6/12 -b STOL V2-TA1 N44E21 11.98339.310 tuf (2) Požarevac (SRB) tuf-b STOL - (2)

0/4 / / / (2) NE22 44 10.35024.267 Porečka reka 6/21 (SRB) E22 30.484 tuf-b STOL V2-TA (0) N44 16.604 Negotin (SRB) (4)

- STOL V2-TA

tuf-b STOL - (1) (1) 1/7 tuf-b STOL und2 N44E22 32.04804.973 Tamnič (SRB) tuf-b STOL V2-TA (1) 2/6 N43E22 17.33450.016 tuf-b STOL und2 (1) Zaječar (SRB) 1/12 tuf-b STOL V2-TA (1) N43E22 31.84016.537 Temska (SRB) 16/19 tuf-b STOL V2-TA (1) N43E22 31.58512.880 Pirot (SRB) tuf-b STOL V2-TA (16)

tuf-b STOL - 5/20 (2) N43E22 02.44122.365 - STOL - (1) Jasenovik (SRB) - - (1) Vranjska banja 0/7 / HoCf23/ / (1) N42E21 58.36734.139

(SRB) tuf-b V14 (0) 5/6 tuf-b BG4560Rpm35 V4 (1) N43E22 51.25857.711 Vidin (BG) - BG4560 - (1)

tuf-b V4 (3)

- Rqg31 - (1) 5/10 E22 58.119 N43 59.926 tuf-b Rqg31STOL V2-TA (1) Kalafat (RO) - BG4560 - (1)

0/8 / / / (2) N39E38 38.06357.253 Erzindžan (TR) 1/1 tuf-b STOL V2-TA (0) N39E34 07.79526.021 Kıršehir„-“ (TR) vmp1(1) gen 1”. Simbol označava neuspešnu amlifikaciju određenog gena; uzorci čiji je „/“ umnožen prajmerima TypH10F1/TypH10R1 i TypH10F2/TypH10R2 obeleženi su sa „

Simbol se odnosi na populacije u okiviru kojih nisu detektovane CPs inficirane jedinke. stamp

Dominanti STOL genotipvmp1 jetip udetektovan po jednom do uzorku sada u naGruziji lokalitetima i opisan kaoTamnič und2 i Zaječar(Quagliano (Srbija) et al. vezan za 2016), dok je u Deligradu (Srbija) uz njega detektovan 83 do sada nepoznat vmp -TA-L (engl. long ;

1 profil koji je obeležen kao V2 vmp1 )genotip (Slika 19 iz Tabela 10). Restrikcionom- analizom se pokazalo da je ovaj Deligrada srodan V2 TA profilu, ali da su produktintni digestije V2-TA duži.vmp1 Nakonprofil sekvenciranja utvrđenoet al. je 2014 da u odnosu na refere (KC703023, Cvrković ) poseduje inserciju u dužini od 243 bp (81 amino kiselinu).Prethodno opisani stamp genotipovi: Rpm35, BG4560 i Rqg31, detektovaniniji (Tabela su u svega 9 uzoraka i to isključivo u populacijama u Bugarskoj i Rumu tuf- 10). Na lokalitetu tuf Vidin- (BG) su prisutni u po jednom uzorku MLST genotipovi b/Rpm35/V14genotip tuf- i b/BG4560/V4, dok je na lokalitetu Kalafat (RO) identifikovanstamp genoti b/Rqg31/V4. U još 5 uzoraka u kojima je detektovan BG4560 p (BG i RO) izolatistamp nisu okarakterisani na drugastamp dva gena kao i u slučaju jednog uzorka Rqg31 tipa (RO). Jedan novi genotip, izolat HoCf23 udaljen jednom promenom od referentnog STOL izolata, detektovan je samo u Srbijina tuf (lokalitet Jasenovik). Po jedan uzorak svakog MLSTtuf- genotipa je sekvenciran genu i utvrđeno je da svi pripadaju referentnom b izolatu (TabelaCa. P. solani' 10). u Značajan nalaz vezan za ovuC. foetidaasocijaciju je potvrda prisustva ' prirodno inficiranim biljkama uzorkovanim na lokalitetima gde je zabeleženo i prisustvo inficiranih vektora: Negotin, Pirot i Jasenovik (Tabela 10). Stepen prirodne infekcije biljaka je bio 70%, 50% tufi 30%,-b/STOL/V2 i rezultovao- je u ukupno 14 CPs izolata koji su svi pripadaliH. obsoletus MLST genotipu TA, dominantno prisutnom u asociranim populacijama. Uspešna CPs detekcija C. foetida je, urađena u lisnom materijalu i podjednako uspešno u uzorcima korena ve.

što ukazuje na potencijal ove biljke kao endogejskog izvora inokuluma za lar

4.5 Molekularna epidemiologija 'Ca. P. solani': uticaj specijalizacije vektora prema biljkama dualnim domaćinima na puteve diseminacije patogena

4.5.1 Pokazatelji prirodnih ukrštanja epidemioloških puteva diseminacije 'Ca. P. solani': slučaj mediteranskih vinograda in situ 'Ca. P. solani' genotipova kroz prirodno

Rezultati praćenjaH. kretanja obsoletus inficirane biljke i asocirane populacije, pokazali su kompleksnuIn situ epidemiološku'Ca. P. mrežu solani' preplitanja CPs izolata na putu doH. obsoletus vinove loze.ex V. agnus- praćenjemcastus epidemiologije utvrđenBois noir je značaj asocijacije u iniciranju i širenju (BN) bolesti vinove loze kroz potvrdu inficiranosti populacija vektora asociranih sa ovim domaćinomV. agnus na 5- castuslokaliteta u Crnoj Gori (Tabela 11). Utvrđena je i prirodna inficiranostva u blizini stopom infekcije od 33 do 55% na tri lokaliteta, od kojih su d vinograda,je da V. agnus a jedan-castus predstavlja prirodno stanište ove biljke (Tabela 11). Pokazano H.predstavlja obsoletus šire potencijalni 'Ca. prirodni izvor infekcije od kojeg asocirane populacije P. solani' u mediteranskim vinogradiV. agnusma.- castusOvaj nalaz je od značaja za sve vinogradarske regione Sredozemlja gde raste u svom prirodnom okruženju i pruža nišu asociranom vektoru.C. arvensis kao Unutar svih ispitivanih vinograda bile su prisutne populacije potencijalnog H. obsoletus prirodno g CPs rezervoaraC. arvensisi izvora BN infekcije (Tabela 11). Prisustvo populacija u asocijaciji sa nije zabeleženo samo nalokalitetu u Godinju, dok su na preostala četiri lokaliteta detektovane CPs inficirane populacije vektora u asocijaciji sa ovim dualnim domaćinom.C. arvensis Na lokalitetu u Berima, uprkos tome što CPs infekcija nije detektovana u kao biljci domaćinu i potencijalnom rezervoaru patogena, utvrđeno je prisustvo inficiranih'Ca. P. solani'jedinki u vektora. C. arvensis Zabeleženi nalaz je posledica asimptomatskog prisustva i jednake verovatnoće uzorkovanja inficiranihH. obsoletus i neinficiranih biljaka za analizeC. arvensis prisustva patogena. Procenat zaraženostitetu. populacija asociranih sa je bio između 20 i 33% po lokali

U. dioica i

U četiriH. obsoletusvinograda su na obodu zasada bili prisutni asimptomatska asocirane populacije (Tabela- 11). Uzorkovane biljke su bile CPs inficirane- u Šušunji i Martinićima (8 25%), dok su insekti u Šušunji i Godinju bili CPs pozitivni. Registrovani disbalans inficiranosti biljke domaćina i odsustva infekcije u asociranoj populaciji vektora (Martinići) se može objasniti niskom brojnošću populacijaH. obsoletus vektora, ali i niskom stopom infekcije -vektoranegativnoj na lokalitetu.koprivi u Nasuprot tome, primerci sakupljeni na CPs Godinju, bili su zaraženi fitoplazmom, slično situaciji registrovanoj u populaciji sa poponca u Berimaal. (Tabela 11). Podaci o CPs infekciji mediteranskih vinograda (Radonjić et 2009) dopunjeni su dodatnim uzorkovanjima simptomatskih loza- na oglednim lokalitetima čime je dostignut broj od 48 izolata poreklom iz BN simptomatske vinove loze kao krajnjeg domaćina patogena (Tabela 11). Tabela 11 Ca H. obsoletus - - odstus . Incidenca ' . P. solani' u vinovoj lozi, biljkama rezervoarima i asociranim populacijama u 5 BN inficiranih vinograda Crne Gore. Simbol „ “ ukazuje na tvo biljke rezervoara ili asocirane populacije vektora na određenom lokalitetu. et al. C. arvensis – Brojevi u zagradama u koloni „vinova loza“ predstavljaju CPs izolate preuzete iz ranijih Ca, U. dioica – Ud i V. agnus-castus – Vac. istraživanja (Radonjić 2009); skraćenice dualnih domaćina su sledeće:

lokalitet broj CPs+/ukupan broj analiziranih uzoraka Hyalesthes biljaka obsoletusi insekata

biljke dualni domaćini vinova loza Ca Ud Vac Ca Ud Vac Šušunja 6/12 3/12 - 6/20 3/30 -

13/13 (5) 5/12 0/12 - 4/12 0/20 -

Podgorica 10/10 (4) 4/12 1/12 - 6/30 0/20 -

BeriMartinići 10/10 (6) 0/12 - 2/12 2/10 - 1/22

Godinje 9/9 (5) 0/12 0/12 3/12 - 1/6 3/30

6/6 (2)

4.5.1.1 Ca H. obsoletus ex U. dioica, C.

Genotipizacijaarvensis i V. agnus ' -.castus P. solani' u populacijama

U ukupno 98 uzoraka 'Ca. poreklom iz oglednih mediteranskih vinograda rezervoarautvrđena je i prirodna26 jedinki infekcija H. obsoletus P. solani': 48 biljaka vinove loze, 24 biljke CPs . Svi izolati su podvrgnuti MLST genotipizaciji u cidetektovanolju epidemiološkog 12 MLST praćenja genotipova kretanja i to sva patogena tri 3 tuf kroz- domaćine., Ukupno stamp je genotipova i 5 vmp tipa (a, b i ab), 8 tuf- 1 profila.e biljke Većina C. izolata arvensis (91/98) i V. agnus su RFLP-castus analizom, dok je određeni u ostalih kao 7 uzorakab tip detektovan čije su izvorišn tuf-a profil vezan za U. dioica H. obsoletus . Osam uzorakastamp vinove i vmp loze,1 koprive i sa njom asociranih individua koji su prema tuf- genima odgovarali genotipu asociranom sa koprivom, atuf pokazali-ab tip. seUsled kao nedovoljneb RFLP profil, sekvencirani su i potvrđeni kao intermedijernituf epidemiološkesve uzorke tuf- informativnosti RFLP analize 10gena, uzoraka sekvenciranje tuf-b profila je vezanihurađeno za i zaC. arvensis i V. agnusa profila-castus (7 izolata), kao i za po . Za ovih 17 sekvenci je potvrđeno da odgovaraju prethodno okarakterisanimet al izolatima iz crnogorskih vinograda (FJ441241 i FJ441242;tuf-a i tuf- Radonjić . 2009). Kopriva H.se obsoletuskao biljka domaćin pokazala izvorom- ab CPs tipa koji kroz asocirane populacijetuf -dospevajub tipa izvirala do BN iz simptomatske vinove loze, dok je preostalaC. arvensis većina i V. agnus izolata-castus , i druge dve biljke izvora inokuluma, populacijama vektora vezanim za ove domaćinevmp se širila kroz vinograde. V2-TA, Karakterizacija izolata na 1 genu je pokazala prisutvo 5 profila: V3,(Murolo V4, V14et al. i 2010; V17 (Slika 2013 20).- Četiri restrikcona V profilaet al. su od ranije poznata corrigendum; Cvrković 2014) dok je“ (Aryan sekvenca et al.koja odgovara V17 profilu publikovana pod nazivom „genotip Vm_At7 2014). Poređenjem virtuelnom digestijom ovog referentnog izolata (KJ469731) i sekvence profila detektovanog u 13 uzoraka u mediteranskim- vinogradima, utvrđeno je da se radi o V profilu imenovanom- prema SEE ERANET nomenklaturi zakao U. V17 dioica (X. -Foissac, INRA, Bordeaux France,tuf- alična i tuf komunikacija).- Svi izolatia, nosili vezani su ciklus, odnosno pripadajući ab epidemiologijam

tuf- isključivo V3 profil, dok je u okviru b ciklusa detektovan znatno veći diverzitet (Slika 20).

Slika 20. Rsa vmp1 gena 'Ca.

I restrikcioni (V) profili P. solani' razdvojeni na automatskoj , C. arvensis, U. dioica, V. agnus-castus, H. obsoletus kapilarnoj elektroforezi QIAxcel advanced (QIAGEN). Detektovani- profili u različitim-25, Vv5, domaćinima (vinova loza ) su prikazani et al uz referentne izolate poznatog V profila (CH1, Hae GGY, Rpg39, Hr Br, Rqg50, 19 Chrt2) preuzete iz Cvrković . (2014) ili obezbeđene od strane X. Foissac (INRA, Bordo, Francuska). Marker korišćen u analizi je FX174/ III: QX DNA size marker (QIAGEN) sa dužinama fragmenata: 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118 i 72 bp. 'Ca. P. solani

Kompleksnost i diverzitet ' u prirodnostamp gena inficiranim u vidu ekosistemima najbolje se oslikava kroz genotipizaciju- identifikacijeSTOL, i prisustvo 7 poznatih do sada nepoznatog genotipova: genotipa SB5, 19 Ho25,- Rqg50, u H. Rqg31, obsoletus Vv24, Rpm35e x i V. agnus-castus u Vac1 populaciji detektovana sva tri tufBerima-tipa i (Tabela5 stamp 9; Slika 21). U uzorcima vinove loze su genotipova u direktnoj korelaciji Genotipovi sa izolatimaSB5 i 19- detektovanim u biljkama domaćinima i vektorimaH. (Slikaobsoletus 21). 25 su vezani isključivo za koprivu i asocirane populacije.C. arvensis Nasuprot i V. tome,agnus -Rqg50,castus Vv24 i Rpm35 detektovani su u dva dualna domaćina: , kao i sa njima asociranimtuf- populacijama vektora, čime su ove četiri karike umrežene kao članovi b epidemiologije koji imaju velikog uticaja u

Ca. P. solani' i razvoju Bois noir bolesti vinove loze na Mediteranu diseminaciji ' (Slika 21).

4.5.1.2 Ca. P. solani' od biljaka

Ukrštanje puteva infekcije: praćenje genotipova ' rezervoara, kroz populacije vektora, do obolele vinove loze Složena epidemiološka mreža rekonstruisana u vinogradimaCa. P. Mediterana solani' što ukazujese ogleda na kroz preklapanje detektovanih i ukrštanje 12 MLST prirodnih genotip putevaova od diseminacijekojih je 8 prethodno ' poznato (Johannesen et al. 2012; Aryan et al. et al.

(Slika 21) 2014; Cvrković 2014).

Slika 21 'Ca. P. solani' MLST ogledu in situ . Grafički prikaz distribucije 12 genotipova kroz domaćine u prethodno poznate u literaturi dati su njihovi publikovani nazivi (Johannesen et al. 2012; praćenja epidemiologije u mediteranskim vinogradima. Uz MLST genotipove Aryan et al. et al. vino 2014; Cvrković 2014). Pet prikazanih- grafika predstavlja 5 oglednih grada, dok stubovi prikazuju procentualnu prisutnost svakog od detektovanih MLST genotipova u odgovarajućem domaćinu. Simbol „CPs “ ukazuje da određeni domaćin na datom lokalitetu nije inficiran fitoplazmom.

MLST genotipovaU vinovoj loziod kojihkao ishodištu su dva (tuf CPs-a/SB5/V3 epidemioloških i tuf-ab/19puteva- pronađeno je šestU. dioica H. obsoletus 25/V3) vezana za tufkao rezervoar i asocirane populacije koje ih prenose. Genotip b/Rpm35/V14 (Rpm35g)C. arvensis je takođe prisutan u zatvorenom epidemiološkom ciklusudetektovani vezanom genotipovi za u vinovoji asocirane lozi, populacije tuf- vektora (Slika 21). Najčešćetuf- b/Rqg50/V4vmp1 profilu, (Rqg50g) pokazali i su b/Rqg50/V17 (CPsM4_At10), koji se razlikuju samotuf- u složene puteve kretanja kroz H. domaćine. obsoletus Izolatiex C. arvensis b/Rqg50 vezani za V4 tip su identifikovani u populacijama , ali ne i u samom poponcu, dokex C. je arvensis kombinacija i ex V.sa agnusV17 tipom-castus prisutna u populacijama vektora dve asocijacije, detektovan i genotip tuf- , kao i u obe biljke. U vinovoj lozi je takođe b/Vv24/V14 (Vv24g) čiji izvor infekcije i vektor nisu utvrđeni u analiziranim uzorcima (Slika 21). H. obsoletus Nasuprot tome, u biljkama rezervoarimaCa. P. solani' i asociranim koji nisu detektovani populacijama je pronađeno 6 MLST genotipova ' uV. vinovoj agnus- castuslozi. Po ( tufdva-b/STOL/V2 genotipa su-TA karakteristična i tuf-b/Ho- samo za populacije asociraneex saC. arvensis (tuf- -TA i tuf- Vac1/V17) i za populacije b/Rqg31/V2 b/Rqg31/V14). Isti fenomen specifične asocijacijegenotipa tuf CPs- genotipa - sa pojedinačnim domaćinom je zabeležen u slučajutuf- b/Rqg50/V2- TA nađenog samo u poponcu,H. obsoletus dok MLST genotip b/Rpm35/V2 TA ovaj domaćinV. agnus deli- castussa asociranim populacijama kao i sa još jednim rezervoarom, (Slika 21). H. obsoletusDirektna i nedvosmislena korelacija između biljke izvora infekcije, tuf-a/SB5/V3,populacija tuf- i BN obolele vinovetuf- loze, utvrđena je kroz tri MLST genotipa: b/Rpm35/V14 i U.b/Rqg50/V17. dioica- Prvi genotip je detektovan samo u Šušunji i to isključivovezan vezan i genotip za tuf- ciklus. Takođe samo za jednu biljkuC. arvensisdualnog- domaćina je b/Rpm35/V14 čiji je kompletan epidemiološki ciklus detektovan u tuf istom- vinogradu, a sporadično se pojavljuje i na drugim lokalitetima. Genotip b/Rqg50/V17 je prisutan u svim vinogradimaiz C. arvensis i jasno se kreće kroz dva epidemiološka puta: (1) u Martinićima izvire i raznosi se asociranim populacijama vektora i (2) u Godinju otpočinje

V. agnus-castus H. obsoletus od inficiranih biljaka i asociranih populacija koje ga unose u vinograd (Slika 21).

4.5.2 Eksperimentalni pokazatelji ukrštanja epidemioloških ciklusa i puteva diseminacije 'Ca. P. solani' Ca. P. solani' Brojna sprovedenih testiranja (replikacija) unakrsnog prenošenja ' svaku od testiranih biljnih vrsta je tokom petogodišnjeg periodaH. istraživanjaobsoletus zavisio od međusezonskih promena brojnosti populacija testiranih biljaka je biloasocijacija zadovoljavaj i agregacije insekata. Preživljavanje inficiranih oglednih uće i posebno uspešno u slučaju perivinki koje dobro podnose gajenje u kontrolisanim uslovima klima komora, dostižu visok titar patogena i jasno ispoljivaju simptome CPs infekcije. Nakonija svake primarnih vrste, ogledi postavki su eksperimenata koje su podrazumevale po 12 replikac H. obsoletus C. zatvoreniarvensis, V. manjim, agnus-castus ali poredivim i C. foetida brojem replikacija po asocijaciji: vinovih loza za H. obsoletus ex C. arvensissa po i8 ex replikacija, C. foetida 12 replikacija perivinki i in6 situ i ex situ , dokH. jeobsoletus u kombinovanim ex V. agnus - castus eksperimentima vektorske uloge populacija u mediteranskim vinogradima postavljeno 19 oglednih loza (Slikasti u broju 22). Uspeh sprovedenih eksperimenata inokulacije, osim postignute stabilno replikacija i značajnom broju'Ca. P. CPssolani' inficiranih biljaka (skoro 80%), ogleda se i H. u zabeleženomobsoletus diverzitetu izolata koje su prenele prirodno zaraženestavlja populacije tri asocijacije. Centralni nalaz postavljenih ogleda pred eksperimentalnogenotipova, vezanih rekonstruisana za tuf- epidemiološkatuf- mreža koju-TA, gradituf- 12 MLST tuf- tuf- b epidemiologiju:tuf- b/Rqg31/V2tuf-b/BG4560/V2b/Rqg31/V4,-TA, tuf- b/Vv24/V14,b/Rqg31/V14, tuf-b/STOL/V b/Rqg50/V4,2-TA, tuf -b/M5/V4,b/Rqg50/V14, tuf-b/M5/V14, tuf- stamp tuf i vmp b/Rpm35/V14 i genotip Rqg50 koji nije okarakterisan na 1 genima usled izostanka amplifikacije (Slika 22).

Slika 22 Ca. P. solani' genotipova

. Kvalitativni i kvantitativni grafički prikaz diverziteta ' H. obsoletus eksperimentalno prenetih na ogledne biljke korišćenjem prirodno CPs inficiranih C. arvensis, V. agnus-castus, C. foetida, perivinka i populacija tri asocijacije. Svaki od grafika predstavlja jednu biljnu vrstu korišćenu u eksperimentima inokulacije: vinova loza. Veličina kruga odgovara ukupnom broju izolata detektovanih u replikcijama

92 odgovara jednoj od tri H. obsoletus ene u tuf- ex C. odgovarajuće ogledne biljne vrste (kvantitativni prikaz). Boja polja u okviru kruga arvensis ex V. agnus-castus ex C. foetida asocijacije uključ b epidemiologiju: Ca. P. solani' detektovanih u (zelena), (plava) i (crvena). Površina obojenih polja u okviru krugova odgovara broju različitih MLST genotipova ' replikacijama date eksperimentalne biljne vrste (kvalitativni prikaz). U okviru njih prikazani su MLST genotipovi detektovanih CPs izolata i broj inficiranih replikacija u zagradi. Pored svakog obojenog polja je prikazan broj inficiranih biljaka/ukupan broj replikacija. C. arvensis, V. agnus-castusDetektovani i C. foetida CPs izolati umrežavaju H. tri obsoletus dualna domaćina: preko asociranih populacija koje izuzetno uspešno inokulišu perivinke i ugroženu kulturu, vinovu lozu (Slika 22). Uopšteno'Ca. gledanoP. solani 'na nivou svih eksperimenata inokulacije biljaka, uspešnost prenošenja je bila veoma visoka i to od 66% u slučaju oglednih vinovih loza, do 100% inficiranih mladica konopljike i perivinki (Slika 22).

Ispoljavanje simptoma na oglednim biljkama je bilo moguće pratitiH. obsoletus jedino u slučaju perivinki koje su u eksperimentima inficirane od strane tri asocijacije sa čak 11 od 12 detektovanih MLST genotipova u okviru celog epidemiološkog ogleda (Slike 22 i 23).

Slika 23. tuf- H. obsoletus C. Simptomi eksperimentalno CPs zaraženih perivinki. a) ogledna perivinka arvensis inficirana genotipom b/Rqg31/V14 od strane populacije asocirane sa tuf- H. obsoletus koja ispoljava simptome žutila listova i početak razvoja nekroze listova; b) C. arvensis ogledna perivinka inficirana genotipom b/Rqg31/V14 od strane populacije tuf-b/STOL/V2-TA od strane H. obsoletus p asocirane sa koja ispoljava simptome formiranja virescenci; c) ogledna perivinka inficirana genotipom opulacije

C. foetida asocirane sa koja ispoljava simptome formiranja filodija i nekompletno razviće cvetova koji se suše i odumiru u fazi pupoljka.

Ogledne perivinke su pokazivale u različitom stepenu(zelena simptome obojenost žutila ne i nekroze listova, odumiranje i filodija izdanaka ( , formiranje virescenci zelenih delova cveta) retrogradna metamorfoza cvetnih organa u listove)'Ca. P. solani'(Slika 23). Posebno brzo ispoljavanje simptomaH. obsoletus je zabeleženo ex C. arvensis u slučaju kada je kod prenošenja od strane asocijacije inficiranih biljaka već nakon tri nedelje počelotuf-b/STOL/V2 pojavljivanje- virescenci cvetova (Slika 23b), dok suex perivinke V. agnus -castus inficirane i ex C. foetida najkraTA izolatom od strane populacija vektora će opstajale u životu i prosečnotkiva. nakon 6 meseci većinski odumirale usled progresivnog sušenja biljnih C. arvensis

U slučaju oglednih biljaka je došlo do promene habitusa, ali samo u dva izolovana slučaja (Slika 24), dok su sve ostale eksperimentalno inficirane biljke bile asimptomatske što odgovara opservacijama iz prirode.H. obsoletus U eksperimentima CPs inokulacije poponca od strane sa njim asocirane populacije kojituf- su postavljeni tokom 2012. godine, kod 1/2 tada inficirane biljke genotipom b/Rqg31/V14, došlo je do pojave crvenila i nekroza na rubu listova (Slika 24a) što se više nije ponovilo kroz ostale replikacije. tuf-b/STOL/V2- Tokom 2016. godineH. obsoletussu inficirana ex C. dva foetida poponca. Jedna genotipom od biljaka je ispoljila od TA od strane populacije ranije poznat simptom sitnih listova Ova i skraćenih individualna internodija biljka kojije bila podseća vijabilna na pojavu svega tzv. veštičije metle (Slika 24b, c). V. agnus-castus su mesec dana nakon pojave simptoma. Sve eksperimentalne biljke C. foetida nakon inokulacije nastavile normalan razvoj bez pojave simptoma. Biljke su primarno analizirane iz listova, a zatim i iz korena čime su sve replikacije iskorišćene za analize. Pojava simptoma je na ovim biljkama praćena tokom tri meseca od inokulacije, i u tom periodu pojava simptoma'Ca. P. nijesolani' zabeležena. od strane Ukupno sve tri testirane24 biljke tufvinove-b H. lozeobsoletus koje su uspešno inficirane sa asocijacije, ispoljile su u manjoj ili većoj meri uobičajene simptome zaraze kao što su crvenilo i klobučasto savijanje listova.

Slika 24 H. obsoletus C. . Simptomi koje su eksprimirale eksperimentalno CPs zaražene biljke poponca: a) arvensis tuf- ogledna biljka poponca inficirana od strane strane populacije asocirane sa H. obsoletus genotipom b/Rqg31/V14 koja ispoljava crvenilo i nekroze na rubu listova; b) i C. foetida tuf-b/STOL/V2- c) ogledna biljka poponca inficirana od strane strane populacije asocirane sa genotipom TA koja ispoljava formiranje sitnih listova i skraćivanje internodija.

4.5.2.1 Vektorska sposobnost i genotipovi 'Ca. P. solani' koje prenosi H. obsoletus ex C. arvensis

H. obsoletus C. arvensis

Prirodno inficirane jedinke populacija u asocijaciji sa 'Ca. P. eksperimentalnosolani' su prenele na ogledne biljke čak 11/12 detektovanih MLSTdiverziteta patogenagenotipova čime se ova asocijacija istakla kao nosilac najvećeg H. obsoletus. Izuzetan kapacitet prenošenja različitih CPs izolata od strane samo jedne populacije ogleda se u rezultatima inficiranja eksperimentalnih 95 perivinki u kojima je detektovano 7 MLST'Ca genotipova uz 100% infekciju oglednih biljaka (Slika 22). Nešto manji broj . P. solani' genotipova (5) ova asocijacija vektora je prenela na svoju originalnu biljku domaćina,H. obsoletus uz uspešnost ex C. arvensis inficiranja izvršena od 75%. Podjednako uspešno je pomoću jedinki inokulacija i druge dve biljkeV. agnus koje-castus su dualni biljaka domaćini i 75% drugihoglednih populacija biljaka vektora,C. foetida u. vidu 100% inficiranih tuf- e u Jedan CPs izolat je prenet na sva tri domaćinatuf i perivinku,- b/Rqg31/V4, dok j eksperimentalno inficiranoj vinovoj lozi uz b/Rqg31 genotip bio prisutan V14 profil. Procenat infekcijetuf eksperimentalnih- vinovih loza bio je 66% i dominirao je prethodno pomenutituf-b/BG4560/V2 b/Rqg31/V14- MLST genotip uz samo jednu biljku inficiranustamp sa TA genotipom. Generalno se može reći da je Rqg31 genotip najčešće prenet od strane ove populacijeH. obsoletus što je u skladu sa prethodno utvrđenom dominantnošću ovog genotipa u populaciji iz Topole (poglavlje 4.4.2, Tabela 8). Ovo može biti posledica korišćenja samo jedne populacije većinski inficirane ovim izolatom koji dominira u poponcu kao izvoru infekcije na ovom lokalitetu. H. obsoletus ex C. arvensis i ex V. agnus-castus prethodnoVeza je između posrednoasocijacija pokazana u studiji in situ Ca. P. solani' praćenja ' epidemiologije u Mediteranu preko genotipova koji istovremeno inficiraju dualne domaćine i asocirane populacije vektora (poglavlje 4.5.1.2). U postavljenim ogledima rezultati su dopunjeniH. obsoletus eksperimentalnom ex C. arvensis potvrdom inokulacije ove dve biljke od strane populacije u vidu ukupnotuf-b/M5/V4 7 CPs izolata i tuf- od kojih su dva MLST genotipa preneta naC .oba a domaćina: b/Rqg31/V4. Na stampsvog originalnog domaćina, rvensis,vmp ova populacija vektora V.je prenelaagnus-castus i Rqg31 on prenešengenotip uz V2 -u kombinaciji sa V14 1 profilom, dok je na tuf- C. foetida TA tip. Sličan odnos jetuf zabeležen- 50 i premagenotipa drugom sa V4 ili V14b domaćinu, vmp , uz dominantno'Ca. P. solani' prenošenje b/Rqg 1 profilom. Istim H. obsoletusgenotipom ex C. arvensis je inficirana i jedna od dvanaest perivinki izložena ishrani (Slika 22).

4.5.2.2 Vektorska sposobnost i genotipovi 'Ca. P. solani' koje prenosi H. obsoletus ex V. agnus-castus H. obsoletus ex V. agnus-castus

Asocijacija'Ca. P. solani' je primarno testirana u svetlu učešća u epidemiologiji u mediteranskimU skladu vinogradima sa preth kroz proveru vektorskog potencijala u inficiranju vinove loze. odno utvrđenom stopom infekcijeH. obsoletus oglednih populacija vektora, 10V. agnus replikacija-castus je postavljeno koristeći populaciju iz Godinja gde rasteH. obsoletus uz sam vinograd,jedinki dok je 9 eksperimentalnih vinovih loza izloženo ishrani bez vinogradasa lokalitetau okolini. Bar Adulti na kojempušteni konopljika na ogledne raste biljke na prirodnom su nakon staništu zatvaranja eksperimenataprisustvo 'Ca. P. (posle solani'. 48h) Popu sakupljeni i u pulovima od po 3 jedinke analizirani na lacija iz Godinja je uspešno inficirala 9/10 oglednih biljaka što je u skladu sa inficiranošću insekata, tačnije na jedinoj oglednoj vinovoj lozi koja nije inficirana nije bilo ni CPs pozitivinih jedinki (Tabela 12). Ista situacija je zabeležena i u slučaju eksperimentalne populacije vektora iz Bara koja je inficiralaV. agnus- castus7/9 vinovih loza. Na oba lokaliteta je procenat prirodne infekcije biljakatuf- u Godinjubio isti i ituf iznosio-b/STOL/V2 25%, - uz prisustvo dva MLST genotipa: b/Rqg50/V17 TA uC. Baru, arvensis, što ovu U. dioica biljku i nedvosmislenoC. foetida. svrstava u grupu dualnih domaćina zajedno sa

Tri meseca nakon zatvaranja eksperimenata, sadnice vinove loze su pokazale prve simptome u vidu crvenila i diskoloracije između lisnih nerava. Molekularnim analizama uzorkovanih listova oglednih biljaka utvrđeno je da su sve simptomatske loze uspešno CPs inokulisane (9 biljaka inficiranih vektorima ihiz Godinja i 7 iz Bara) (Tabela 12). Tri biljke bez simptoma,Svih kao 16 i 12'Ca. kontroln P. solani' biljaka koje nisu bile izložene insektima, bile su negativne. izolata su podvrgnuti genotipizaciji kako bi H.se odredili obsoletus MLST ex profiliV. agnus CPs genotipova-castus. U koje su na loze prenele populacije tuf- eksperimentalnim biljkama je ukupnotuf-b/STOL/V2 detektovano- 6 MLSTtuf- genotipova i to: tuf- b/Rpm35/V14 (6tuf replikacija),- i tuf- TA (5), b/Vv24/V14 (2), b/Rqg50/V4 (1), b/Rqg50/V17 (1) b/Rqg31/V14 (1) (Tabela 12).

Tabela 12. Ca. P. solani' na vinovu lozu od strane H. obsoletus ex V. agnus-castus Eksperimentalno prenošenje- ' prirodno inficiranih populacija . Simbol „+” označava H. obsoletus uzoraka se odnosi na broj uspešnu inokulaciju, dok se „ “ odnosi na neuspešnu CPs transmisiju na eksprimentalne biljke. Broj pozitivnih pozitivnih pulova od po 3 individue/broj insekataH. obsoletus korišćen u replikaciji. Lokalite ogledn Vitex agnus-castus broj analiziranih ex MLST genotip t uzorakabroj CPs+/ukupan konopljike a biljka pozitivni prenošenj e 3/12 1 2/30 + tuf- tuf- (tuf- 2 3/30 + b/Rpm35/V14 3 0/30 - - b/Rqg50/V17) b/Rqg50/V4

4 2/30 + tuf- tuf-b/STOL/V2-TA 5 3/30 + b/Rpm35/V14 6 4/30 + tuf-

Godinje tuf- 7 2/30 + b/Rpm35/V14 tuf- 8 2/30 + b/Rqg50/V17 tuf- 9 2/30 + b/Rpm35/V14 tuf- 10 3/30 + b/Rpm35/V14 3/12 11 3/30 + tuf-b/Vv24/V14b/Rpm35/V14

(tuf-b/STOL/V2- 12 4/30 + tuf-b/Vv24/V14 13 2/30 + tuf-b/STOL/V2-TA TA) -b/STOL/V2-TA 14 3/30 + tuf 15 0/30 - - Bar 16 2/30 + tuf- tuf-b/STOL/V2-TA 17 3/30 + b/Rqg31/V14 18 3/30 + tuf-b/STOL/V2-TA 19 0/30 - -

H. obsoletus ex V. agnus-castus prenelaOgledna MLST genotippopulacija tuf- iz Godinja je dominantno tufb/Rpm35/V14-b/STOL/V2-TA(6/9), dok su jedinke iz Bara većinski inficirale loze genotipom (4/6). Insekti iz Godinja su preneli još tri genotipa što ukazuje na prisutan znatnotuf- veći CPs diverzitet u odnosu prirodno na inicijalnu detekciju (TabelaV. agnus 12).-castus Genotip pored b/Rqg50/V17izolata tuf-b/STOL/V2 detektovan- u inficiranim biljkama TA, takođe je

98 prenet na ogledne vinove loze. Većina genotipova (4/6) prenetih u eksperimentima inokulacije na eksperimentalne vinove loze detektovani su i u prirodno4.5.1.2, S zaraženim čokotima u mediteranskim vinogradimaH. obsoletus (Tabela 12; poglavljeV. agnus-castulika 21,) što jasno potvrđujeBois vektorsku noir ulogu asocijacije sa u epidemiologiji bolesti vinove loze čime se ova zapostavljena'Ca. P. solani' asocijacija vektora vraća u fokus istraživanja bolesti indukovanih na području Sredozemlja. H. obsoletus ex V. agnus-castus su

Uspešne infekcije pomoću populacija zabeleženepostavljenih iC. kod arvensis ostalih eksperimentalnih biljaka u vidu inficiranja polovine V. agnus-castus replikacija, 5/8 oglednih bljaka svogCa. originalnog domaćina i očekivano najuspešnije prenošenje ' P. solani' u ogledimaCa. P. inokulacije perivinki (9/12 biljaka) (Slika 22). Jedino neuspešno prenošenje ' solani' na nivou celogC. foet epidemiološkogida od strane H. ogleda, obsoletus odnosi se naex inficiranjeV. agnus- castuseksperimentalne biljke asocijacije . Ova biljka se pokazala kao vrlo osetljiva biljka na variranja temperature i vlažnosti koja se nisu mogla uvekex V. dovoljno agnus-castus kontrolisati jer su kompletni testovi inficiranja biljaka od strane ove asocijacije vektora postavljeni sa populacijama iz Crne Gore što je zahtevalo boravak eksperimentalnih biljaka sa insektima u poljskim friziderima i na prirodnom dnevno/noćnom režimu tokom dela eksperimenta. Iako se ponavljanjem postavki ovog eksperimenta tokom tri godine istraživanja pokušao nadoknaditi broj izgubljenih biljaka i negativnihC. foetida rezultata, i nakon većeg broja ponavljanja, ni jedna experimentalnaV. agnus -biljkacastus . nije bila inficirana posle inokulacije insektimaC. arvensis poreklom, V. sa agnus -castus PrethodnoH. obsoletus pokazana interakcija i sa njima asociranih populacija (poglavlje 4.5.2.1) potvrđena je i u suprotnomH. smeru.obsoletus Isti ex potencijal V. agnus uspešnog-castus CPs inficiranja obe biljke domaćina je pokazala i tuf- populacjastamp u vidu 50% zaraženih poponaca MLST genotipovima: b/Rqg31/V14tuf-b/STOL/V2 i -TAgenotipom i tuf-b/Vv24/V14. Rqg50, i 60%Iako je inficiranih ogledna konopljika H. CPs obsoletus izolatima ex V. agnus-castus populacija iz Beri imala nisku stopu infekcije (5%), inokulacije 4/5 eksperimentalnih biljnih vrsta su bile veoma uspešne (Slika 22).

4.5.2.3 Vektorska sposobnost i genotipovi 'Ca. P. solani' koje prenosi H. obsoletus ex C. foetida C. foetida, i H. obsoletus

Novoutvrđeni dualni domaćin, sa njom asocirane Ca. P. populacije, značajno su proširili i usložnili epidemiološku slikuC. foetida kretanja ' solani'. Uključivanjem u testove unakrsnog prenošenja i asocijacijuuga dva vektora primarnoC. arvensis je i V. pokazano agnus-castus podjednako uspešno inficiranje dr domaćina, tuf-b/STOL/V2- i to očekivano u većini replikacija MLST genotipom stamp TA. PoredStamp toga, po jedna replikacija oba domaćina je inokulisanato Rqg50 uz V14 vmpgenotipom.1 profil na C. arvensisgenotip i uz V2Rqg31-TA na je takođeV. agnus prenet-castus na (Slika oba domaćina i tuf- C. 22).arvensis Imajući, pored u ex vidu C. arvensis da su MLST genotip b/Rqg31/V14 na ogledneV. agnus biljke-castus i C. foetida jedinki, prenele i populacijeCa. vezane za , može se zaključiti da prisustvo ovog ' P. solani' izolata u poponcu u prirodnim uslovima može voditituf- poreklo i od populacija vektora asociranih sa druga dva dualna domaćina b epidemiologije koji se povremeno neselektivno hraneV. agnus na- castusovoj „neodgovarajućoj“ i C. foetida biljci. Sa druge strane, ovaj genotip nije prenet naC. arvensis usled čega se može posumnjati da on opstaje samo u kao izvoru inokuluma nezavisnoH. obsoletus od vektora ex C. koji foetida ga prenosi. u potpunosti Inficiranje je u svog domaćina od strane asocijacije tuf-b/STOL/V2- skladu sa pojavom MLST genotipa C. foetida TA kao jedinog CPs izolata prisutnog u prirodno inficiranim biljkamaCa. (poglavlje 4.4.4; Slika 22). Iako je najniži diverzitet ' P. solani' izolata H. obsoletus zabeležen ex u C. oglednim foetida biljkama kroz koje je utvrđen vektorski potencijal asocijacije, detektovanih 5 MLST genotipova su donekle neočekivani imajući u vidu stabilnudualnog genotipsku homogenost infekcije populacija vektora vezanih za ovog domaćina na teritoriji Srbijetuf (Slika-b/STOL/V2 22; poglavlje- 4.4.4, Tabela 10). Iako je poredvećinski njega inokulisan su uspešno MLST preneti genotip i tuf- TA-TA, (60% tuf - inficiranih biljaka),tuf- okarakterisanab/Rqg31/V2 izolata stamp b/Rqg31/V14, b/Rqg50/V4 i dva nepotpuno genotipa Rqg50.tuf-b 'Ca. P. Nalaz koji se istakao u složenoj mreži rezultata epidemiologije solani' izolata, nedvojbenoH. obsoletus je višestruko eksperimentalno dokazanaC. foetida vektorska (Slika uloga populacija asociranih sa dualnim domaćinom 100

22). Osim što je prethodno utvrđena visoka stopa infekcije svih analiziranih populacija vektora (Tabela 10), kroz transinfekcijske oglede se pokazalo da pored inokulacije domaćina i širenja infekcije kroz svoju asocijaciju, raznošenje CPs izolata može realizovatituf i -u okviru epidemiološkihC. arvensis puteva i V. koji agnus otpočinju-castus. odPosebno druga dva dualna domaćina b epidemiologije, značajanizolato rezultattuf-b/STOL/V2 predstavlja- uspešna inokulacija sadnica vinove loze i to CPs konopljike.m Pored njega, prenetTA, koji je i jeMLST na lozegenotip uspešno tuf- prenela i asocijacija sa e C. arvensis b/Rqg31/V14 kojim je loze inficiralaIzolat takođe tuf- ib/STOL/V2 populacija - x (Slika 22). H. obsoletus ex C. foetida TA, osim za epidemiologiju asocijacije (20/32 CPsex inokulisane V. agnus-castus ogledne biljke), može se smatrati dominantnim i za epidemiologiju asocijacije znajući da je više od trećine eksperimentalnihH. obsoletus biljaka ex inficiranoC. arvensis upravo ovim genotipom (13/34) (Slika 22). Populacijaoglednu biljku V. agnus-castus je ovajex C. CPs foetida genotip na dve, prenela a insekti jedino ex naV. agnus jednu- castus , populacija Ca. iologije na Mediteranu,na tri eksperimentalne gde V. agnus konopljike. castus U kontekstu ' P.H. solani' obsoletus epidem i sa njim asocirane populacije pokreću i raznose CPstuf- b/STOL/V2 izolate, može- se zaključiti da eksperimentalna i prirodna infekcija V. izolatom agnus-castus na lokalitetuTA, Bar već (poglavlje detektovana 4.5.1, u Tabela prirodno 11, inficiranim biljkama H. obsoletus Slika 21), mogudruge bitistrane, posledica ogledne ishrane biljke C. bilo foetida koje od tri testirane asocijacije. Sa ana H. obsoletus je ovim MLST genotipom inficirala samo sa ovom biljkom asocir populacija (Slika 22) što uz prethodne- nalaze implicira da u okviru ove asocijacije. postoji izuzetnoH. obsoletus stabilna tri trofičkuex C. interakcijafoetida patogena, vektora i biljkea svakuOsim štood 5 je vrsta oglednihpopulacija biljaka u vidu prenela pomenuti genotip n minimum 2 replikacije, on je inficirao gotovo sve analizirane populacije vektora vezane za ovog dualnog domaćina, od istočne Turske do Srbije (Slika 22; Tabela 10).

101

4.5.3 Genotipski i epidemiološki diverzitet 'Ca. P. solani' uslovljen biljkama dualnim domaćinima patogena i vektora

Hyalesthes obsoletus jedinstvenUkoliko vektor bi u se 'Ca četiri asocijacije posmatrale kao . P. solani' epidemiologiji, na osnovu prikazanih nalaza (poglavlje 4.5) ova vrsta bi se mogla smatrati najzaslužnijom za disperziju vrlo diverzitetnihraznovrsnosti 'Ca CPs izolata u prirodi (Prilogizolate 6). Zbirni rezultati genetičke . P. solani' kojiH. objedinjuju:obsoletus prirodno inficiranih biljaka dualnih domaćina, asociranih populacija C. i arvensis eksperimentalnih, V. agnus- castus biljaka i inficiranihC. foetida od strane populacija vektora asociranih sa , u svojojtuf- a/ osnovituf-ab i sutuf - u skladu sa centralnom epidemiološkom divergencijom na b puteve CPs prenošenja.stamp Opšta genotipova organizacija nije klastera u okviru TCS mreže koja prikazuje srodnost narušena uključivanjem novoopisanih izolata (Slika 25). Od 57 izolata uključenih u konstrukcijuist genealoške/epidemiološke mreže, njih 27 je detektovano u okviru raživanja sprovedenih u ovoj studiji, u insektima i biljkamastamp domaćinimagenotipova, 12 na detektovanihteritoriji jugoistočne izolata Evrope je iprethodno Turske. Pored opisano 15 novihi zajedno sa preostalih 30 CPs referentnih sekvenci preuzeti su iz NCBI banke gena kao već opisani izolati koji potiču iz insekata vektora ili inficiranih biljaka.-I, b-II Očekivanoi b- izdvajanje 4 haplogrupe:stamp klaster a (subklasteri a1 i a2), klasteri b III, nisu poremetile nove sekvence koje su se nedvosmisleno priključiletuf- jednoj od navedenihstamp genetičkih genotip grupa diretkno uslovljenih odgovarajućim tuftipom-a/tuf koji-ab pratii tuf dati- (Slika 25). Duž linije povezivanja izolata b epidemiologije ugrađuje se 7 uzoraka detektovanihR. quinquecostatus u vinovoj lozi poreklom iz Gruzije i jedan okarakterisanigenotip (ST58) na iztuf vektoragenu (Quaglino et al. (Bordo,et al. Francuska) koji nisu genotipa koji pripadaju klasteru b- 2016; Chuche 2016). Nijedan, što je od bilo 4 I nije nađen u analiziranim uzorcima očekivanoIako tuf gen jer nije su uspešno ovi genotipovi okarakterisan geografski kod 22/55 specifični detektovanih za region MLST zapadne genotipova, Evrope. stamp gena jasno svrstavaju u jedan od 3 klastera onihaploti se prema genealogiji tuf- pske mreže koji sugerišu pripadnost odgovarajućem tipu (Slika 25).

102

Slika 25. stamp gena 'Ca

Genealoška mreža . P. solani' urađena u programu TCS primenom 42 genotipa prethodno opisana (Fabre et al. 2011b; Johannesen et al. 2012; Aryan et al. metode statističke parsimonije. U analizu je uključeno ukupno 57 genotipova od kojih su

103

et al. 2014; Atanasova et al. et al. et al. 2016 stamp genotipova po prvi put detektovano t 2014; Cvrković 2015; Murolo & Romanazzikoji nisu 2015; detektovani Quaglino u 2016; Chuche ), dok je 15 okom istraživanja u ovoj studiji. Trideset poznatih haplotipova analiziranom uzorku su prikazani u sivim krugovima. Dvadeset sedam haplotipova za koje je utvrđeno prisustvo na teritoriji jugoistočne Evrope i Turske su prikazani: u crnim novodetektovanih stamp genotipova krugovima u slučaju prethodno opisanih haplotipova ili u obojenim krugovima kod U. dioica C. arvensis čija boja odgovara epidemiologiji vezanoj za (V. agnus-castus C. foetida specifičnognesakupljene dualnog haplotipove, domaćina: dok tamnolinije koje zelena ih (poveziju ),ukazuju svetlo zelenana po jednu( nukleotidnu), plava ) i crvena ( ). Crne tačke predstavljaju nepostojeće ili pregle promenu između detektovanih haplotipova u krajnjem nizu povezivanja. U cilju bolje dnosti grafika, na određenim mestima je umesto prikaza tačaka nepostojećih ili nepoznatih haplotipova naveden tačan broj promena do sledećeg genotipa.

predstavljajuEpidemiološki izolati MLST posebno geno značajnetipova koji nalaze nose u okvirunovoopisane analiziranog stamp setahaplotipove, uzoraka od kojih su dva izolata uspešno okarakterisano na sva tri gena (tuf- i tuf- H. obsletus b/HoCa242/V4 b/HoCa278/V14, oba iz asocijacije sa tuf poponcem)-a/tuf-ab ili (Prilog tuf- 6). Za ostale genotipove se njihova pripadnost epidemiologijistamp ( Pored 19-b)25, može SB5, naslutiti isključivo kroz genealošku mrežu gena (Slika 25). U. M2dioica i M3, u genotipovasubklaster kojia1 kojiučestvuju divergira u zatvorenoj od genotipaepidemiološkoj 19- mreži vezanoj za stamp H. obsoletus25, priključuje ex U. dioica se 5 novih genotipova detektovanih u populacijamatuf-ab tipu izolata , čime se sugeriše mogućnost njihovetuf - pripadnosti (Slika 25; Prilog 6). Iznenađujući nalaz izolata b tipa u okviru epidemiologije-II i b- vezane za koprivustamp je razbijen kroz dva kastera u haplotipskojH. obsoletus mreži: b ex U. dioicaIII. Četiri su se nova ukl klastergenotipa b - detektovana u populacijama jučili u III ukazujući na do sada nepoznatu intenzivnu divergenciju STOL genotipa (Slika 25). stamp genotipova tuf-a/tuf-ab tipa uUpliv tuf - izolata u suprotnom smeru, odnosno novodetektovbanih epidemiološke stamp puteve, nije zabeležen (Prilog 6). Svih 6 od C. arvensis, V. agnus-castusgenotipova i C. foetida u okviru epidemioloških puteva koji otpočinju- II i b- kao dualnih domaćina, uključili su setuf u -bb III klastere unutar haplotipske mreže što ukazuje na njihovu pripadnost epidemiologiji (Slika 25). Novoopisani genotipovi HoCa632 i HoCa242 detektovani

104

H. obsoletus ex C. arvensis -II nadogradivši se u asocijaciji su se uključili u klaster b - direktno na H.genotip obsoletu Rqg50.s ex V. Ovoj agnus haplogrupi-castus se priključio i novi genotip Ho Vac1 genotipporeklom u okviruiz klastera b-III, pored 4 novoopisanapopulacije stamp (Slika genotipa 25; Prilog iz 6).H. obsoletusNa STOL H. asocijacijeobsoletus ex sa C. koprivom,foetida priključio se i genotipstamp HoCf23 pronađen u asocijaciji . U isti klaster, samo na genotip Rpm35 nadograđuju( se iSvaki genotipovi: od novoopisanihHoCa341 direktno, stamp genotipova i HoCa278 prekodetektovanih stamp genotipau okviru M5 H. Slika obsoletus 25). prisutan je bio u populacija asociranih sa specifičnim dualnim domaćinom, analiziranom uzorku u vidu samo jednog izolata čime se može zaključiti da su ovi genotipovi retki i specifični za asocijacije u kojima su i detektovani.

105

5. Diskusija

PoslednjihHyalesthes godina, nekoliko obsoletus studija je ukazalo na specijalizaciju životnog ciklusa cikade prema biljkama domaćinimaCa. P. solani' ( i L moguće posledice po epidemiološkeet al. 2005; cikluse Johannesen i puteve prenošenja et al. 2008; ' 2012; I et al.anger 2013; & Maixner 2004;et al Sharon et al. 2014 . Ove studije su ukazalemo na ekološku Kosovac . 2013; Maixnerhost rasa ) H. obsoletus (I etspecijalizaciju al. 2013 formiranja na severnim granicama areala mo ), moguću kriptičnu divergenciju populacija u asocijaciji sa različitim biljkama domaćinima, kao i da ovaj taksonet može al. predstavljati2016b kompleks sastavljen od morfološki sličnih vrsta (Kosovac ). ina, Kompleksna bazirana na genetička analizi proučavanja populacija u asocijaciji sa četiri biljke domać mitohondrijskih i nuklearnih markera, potvdila su jasnu genetičku separaciju populacijaM prema biljkama domaćinima na području jugoistočne Evrope i editerana. Dobijeni rezultati su nedvosmisleno ukazali na postojanje tri genetička entiteta sa specifičnim bioekH. ološkimobsoletus osobenostima, čime se dovodi u pitanje taksonomski integritet cikade kao jedinstvene vrste. GenetičkaC. diferencijacijaarvensis i U. dio jeica jasno ustanovljenaV. agnus-castus za populacijeC. foetida ove cikade u asocijaciji sa (1) , (2) i (3) . Diferencijacija zabeležena među ovim asocijacijama jeC. znatno arvensis izraženija-U. dioica od ranije registrovane segregacije populacija uJohannesen associjaciji e t sa al. 2008; et al. na granici areala u jugozapadnoj NemačkojSalvia sclarea ( i Lavandula angustifoliaImo 2013) ili populacija u asocijacijiet al.sa u zapadnom Mediteranu (Chuche H. 2018)obsoletus koje obe predstavljaju skorašnji evolutivni događaj. Specijalizacija M populacija prema biljkama domaćinima na Balkanu i u istočnom editeranu ukazuje na nivo diferencijacije koji odgovara kriptičnim vrstama,Ca. saP. solani'.dalekosežnim posledicima na širenje i epidemiologiju bolesti uzrokovanih ' - ebno dobijaju na

Promene u populaciono genetičkoj strukturi insekata pos značaju kada se detektuju unutar populacija ekonomski značajnih vrsta. oU što ovom je slučaju,H. otkriće obsoletus kriptične, otvara diferencijacijebrojna pitanja populacija poznate poljoprivrednu štetočine, proizvodnju, ka cikada posledica po

106

fitosanitarnu regulativu i strategije primene mera kontrole ovog organizmaet al. (Kabis2006; &Tsagkarakou Khush 1988; et al. Via 1990; McPheron 2000; Hunter 2002; Endersby regulisanih fitokarantinskih patogena,2007). Uzimajući u obzir biljaka da su fitoplazme na listama istraživanja domaćina koje cikada koristi uti u svom na životnom ciklusu je veoma značajno jer njihove interakcije direktno ču disperziju i epidemiologiju patogena (Nickel 2003; ostvaruju Weintraub ove & Jones 2010). Kada se govori o složenim odnosima koje sa biljkama geografske pretežno monofagije. stenofagne vrste, treba uzeti u obzir i prisustvo fenomena ali se njihovaU ovomuska slučaju, neke cikade su usko vezane za jednu biljnu vrstu, asocijacija sa domaćinom menja u različitim geografskim područjima njihovog rasprostranjenja (Drosopoulos 1999; Nickel 2003). Imajući u vidu složenost interakcija između cikada i biljaka domaćina,ekvatnog nepreciznost povezivanja prilikom insekata sakupljanja i biljaka materijala za studije je glavni uzrok nead što može usmeriti istraživanja u pogrešnom pravcu. Pažljivo uzorkovanje jedinki sa pojedinačnih biljaka ili manjih monodominantnih vegetacijskih sklopova je preduslov je za sagledavanje interakcija između cikada i biljaka određenog ekosistema (Nickel 2003). Kada se u ove dvosmerne relacije uključi fitoplazma, odnosi se izdižu na nivo tritrofičkih relacijabiljaka kojedualn seih mogu sagledati samo detaljnim istraživanjima vektora, patogena i domaćina. Ekološke relacije različitog nivoa koje cikade ostvaruju patogena,kroz asocijacije sa biljkama domaćinima, od suštinskog su značaja za distribuciju potencijal širenja i stepen uticaja bolesti koje fitoplazme izazivaju. Najadekvatniji pristup u istraživanju areala vektora i predviđanju uticaja fitoplazmatičnih bolesti koje vektor prenosi u agroekosistemu, predstavljaju temeljna istraživanja biljaka koje u okviru svojih prirodnih staništa okružuju obradive površine. Upravo suCa. one centralna tačka u epidemiologiji bolesti izazvanih stolbur fitoplazmom (' predstavljajuP. solani'), jer izvor kao širenja domaćini ili preprekuvektoru, fitoplazmi u širenju ilibiljnih oboma bolesti (dualni. domaćini) one p popu U tom kontekstu, romene u preferentnosti-, oligo-lacija ili polifagiju vektora insektaprema biljkama domaćinima narušavaju dotadašnju mono . Ovo može pokrenuti proces segregacije populacija- prema novom domaćinu, koje u kasnijoj fazi, posle akumulacije bio ekoloških i specifičnih 107

genetičnih promena ulaze u proces simpatričke specijacije kao klimaksa genotipske i bihevioralne diferencijacije (Berlocher & Feder 2002; Drès & Mallet 2002; Mullen & Shaw 2014). Na tom evolutivnomekološkim putu populacije rasama iliprolaze biotipovima kroz niz u taksonomski nejasnih stanja koja se nazivaju okviru kojih ekološki adaptirane populacije opstaju prilagođene novonastalim promenama biotičkih faktora. 5.1. Genetička divergencija populacija H. obsoletus kao posledica specijalizacije prema biljci domaćinu I a sprovedena u okviru ove a su

straživanj doktorskeH. obsoletus disertacije započet preliminarnim nalazima populacioneet al. strukture asocijacija na području jugoistočne Evrope (Kosovac 2013; 2014)C. arvensis,u cilju U. dioica testiranja i definisanju poznatih asocijacija sa biljakama dualnim domaćinimaV. agnus ( -castus, C. foetida) . Literaturni statusa zapostavljenih biologiji i ili novih domaćina ovog ( vektora ) podaciekološk oe epopulacionoj zapadnoevropskih genetici H. bili obsoletus su uglavnom vezani zaC. arvensis iinterakcij U. dioica populacijaCa. asociranih sa (Johannesen et al. uz karakterizacijuet al. 2013; ' P.Joh solani' u biljkama i vektoru 2008; 2012; Imo anessen & Riedle‐Bauer 2014). Dosadašnje publikacije daju donekle uvidznake u specifičneekspanzije životne vektora cikluse u populacijai sa asociranih, sa različitimhost domaćinima, rasa na severu areala i nagoveštaje eneasocijacij strukturekoprivom formiranja u Izraelu (Johannesen et al. prom genetičke kod populacija 2008).et al Ovaj nalaz uz skromne istočnomediteranskeda CPs epidemiološke studijeH. obsoletus (Sharon ju znatno. 2005; širi2015) kontekst ukazuje u tritrofički odnosi u kojima učestvuje a ima kome je centralni događaj genetička divergencij populacija ove cikade asociranih sa različitim biljkama domaćinima. H. obsoletus pitanje Genetičkada li se u divergencija okviru ovog registrovana taksona radi kod o populacijau vrsta nameće ke e et al. 2016b kompleks sa elementima kriptičukazala naspecijacij postojanje(Kosovac ). Realizovana istraživanjajedninstveni su jasno okvir tri genetičkaet al. entiteta koji narušavaju i taksonomskiH. obsoletus ove vrste (Kosovac 2018).C. arvensis Tri makromorfološk i U. dioica identičneV. agnus- metapopulacije asocirane sa (1) , (2) 108 castus C. foetida -

i (3) , pokazuju host znatno rase viši stepenet al. evolutivne populacionoet al. genetičke segregacije u odnosu na (Imo 2013; Chuche 2018) i neophodnoH. obsoletus je njihove relacije izdignuti iznad ekoloških okvira. Između navedenih metapopulacija postoje (1) stabilna mitohondrijska genetička divergencija populacija na gotovo celom području rasprostranjenja vrste, od istočnestruktnoj Turske sintopiji do Francuske, i bilo da su u pitanju populacije u široj simpatriji ili u (2) nuklearni (mikrosatelitski) genetički diverzitet koji podržava mitohondrijsku genealogiju sugerisanjem tri genetička klastera (Evanno ΔK(3) = 803.72) u koje se svaka od analiziranih populacija klastrira uz podršku odH. obsoletus>90%. Prosečne sensu lato genetičke distance od 1.1% do 1.5% između tri detektovane metapopulacijeHyalesthes poredive thracicus su(2.1 sa -stepenom razlika sa morfološki najsrodnijom vrstom 3.3%) približavaju kriptičkojH. specijacijiobsoletus detektovane procese genetičke diferencijacije između analiziranih a asocijacija. a Sprovedena unutar vrste istraživanja H. obsoletus su nedvosmisleno pokazala da je genetičk divergencij u korelaciji sa specifičnom biljkom domaćinom, što je u suprotnosti sa opšte prihvaćenim stanovištem da se radi o polifagnojse objašnjavala vrsti. sposobnostU literaturi H.je obsoletuspolifagnost bila jedna od glavnih osobenosti kojom da vrši akviziciju i prenošenje- fitoplazme na različite biljne vrste širom areala. Detektovane populaciono genetičke linije suC. međarvensisutim,, U .jasno dioica asocirane i V. agnus -castus sa specifičnim, bile poznate biljkama u literaturi, domaćinima dok je preferentnost od kojih su H. obsoletus C. foetida i Maloj Aziji kao novi

populacija prema u jugoistočnojsagledavanju Evropi biologije, ekologije i nalaz, doveo do značajnog pomaka u . epidemiologije bolesti izazvanih stolbur fitoplazmom 5.1.1 Genetička homogenost H. obsoletus u asocijacija sa C. arvensis i U. dioica u jugoistočnoj Evropi

H. obsoletus sa

Genetički odnosi izmeđuC. arvensis i U. dioica, supopulacija asociranih na teritoriji tradicionalnim domaćinima,zbog bliskih geografskih kompleksni kao jugoistočnepretpostavljen Evropei diverziteta roda Hyalesthesveza sa malom Azijom m centrom vezanih za(Hoch C. arvensis & Remane i U. 1985). dioica Nedostatak divergencije između populacija 109 sugeriše da H. obsoletus tnog

populacije mogu biti prisutne na obe biljke tokom živo ciklusa. Genetičkadiverziteta, homogenost filogenetske ovih analize asocijacija je potvrđena kroz sve dobijene parametre(haplotipski diverzitet i genealogija itheta testiranja ( diferencijacije populacija mtDNK, θ) parametar, indeks fiksacije, Neiove distance, populaciona struktura i klastriranje zasnovano na mikrosatelitima, bogatstvo alela, H. očekivana obsoletus heterozigotnost i koeficijent inbridinga).detektovana Uu kontekstua ekspanzije asocijacije sa koprivom, koja je nalizaranom setu uzoraka, pored nedvosmislenih parametara Fuovoginbridinga i Tadžiminog(Fis testa, važnona prekobrojnost je istaći i negativne alela, vrednosti koeficijenta ). One ukazuju što je očekivano kod populacija koje su prošle kroz skorašnju ekspC. arvensisanziju (Holsingerkao 2012), i prisutne su U.u jednoj dioica populaciji(Tabela 4 vektoraŠirenje asociranoj H. obsoletus sa i u 4 populacije vezane za ). populacija asociranih sa koprivom je prethodno dokazano'Ca. P. na solani' teritoriji Nemačke i Austrije, što je za Bois posledicu noir bolesti imalo vinovepovećanu loze stopu u poslednjih dvadesetakinfekcije godina i epidemijsko širenje (Johannesen et al. 2008; 2014;na navedenomAryan et al. području . - Johanessen & Riedle‐Bauer a 'Ca. P. solani' 2014) Populaciono genetički parametri vektora i karakterizacij u insektima vektorima i biljkama, ukazala je na korelaciju između prodora populacija'Ca. sa P.koprive solani' na infe sever i njihovu(Johannesen ekspanziju et al. 20 u12 vinogradima; et al. 2013; uz povećanu incidencu 2014 kcije Imo Johanessen ex C. arvensis & Riedle‐Bauer i ex U. dioica u ).zapadnoj Kada su pitanju populacije vektora Evropi, mitohondrijski haplotip AB zauzima centralnoJohannesen mesto od et koga al. 2008; divergiraju 2012; evropske „zapadna” BB i „istočna”2014 EC haplogrupa ( Johanessenu jugo & Riedle‐Bauer host) što rasa je potvrđeno i u istraživanjimazapadnoevropske sprovedenim istočnoj Evropi. Razvoj zabeleženu je u okviru skorašnje g širenja mtDNK haplotipskeoj grupe AB,oj i( prisutanet al. 2013; je područjManiyarima et al. vektora u teritorijNemački i Francusk Imo 2013). Nasuprot tome, na” jugoistočne Evrope na kojoj su prisutni mtDNK haplotipoviH. „obsoletusistočne genetičke linije (EC grupa) host može rase se zaključiti da u ovom delu areala populacije ne formiraju nana nivouhost rase asocijacija sa poponcem i koprivom. Signal diferencijacije koji podseća je detektovan samo na 110

rna Gora poglavlje 4.3.3, Slika 17 jednom sintopskom lokalitetu-geneti (Podgorica, C ) ( ). Ovakav vid populaciono čke divergencije je karakterističan za rubove areala gde sredinski biotički i abiotički, faktori utiču na proces selekcijeova. i podstiču kod populacija dalja razdavajanja primarno na nivou genotip Imajući u vidu da individue ovih dveju sintopskih populacija pripadaju geografski razdvojenim genetičkim grupama, AB u slučaju poponca i EC u slučaju koprive, zabeleženo stanje(Johan n može biti i posledica filogeografskog2014 uticaja, kao u vinogorjima Austrije esen & Riedle‐Bauer ), a ne toliko specijalizacije prema biljci domaćinu. 5.1.2 Asocijacija H. obsoletus sa V. agnus-castus

a H. obsoletus ih sa V. agnus- castus, Za komparativnu analizu populacij asociran korišćeni su primerci sakupljeni na teritoriji Crne Gore i Grčke. Značaj ovih populacijagde j vektora potrebno je dodatno istražiti duž obaleupne mediteranskogliterature poznato basena kao e njeno prisustvo očekivano, ali i na osnovu dost et al. prethodno potvrđeno za Dalmaciju (Horvath 1891), Izrael (Sharonet al. 2005), Tursku (Hoch & Remane, 1985) i Bosnu i Hercegovinu (Đurić 2017). Jedini podaci koji prethode rezultatima istraživanja disertacije po pitanju oveH. asocijacije obsoletus potiču(Sharon iz et Izraela al. i svrstali su konopljiku u grupu domaćina vektora 2005; 2015). - iza H. obsoletus sa V. Na agnus osnovu-castus rezultata populaciono genetičkih anal asocijacije na Balkanskom poluostrvu, ističu se dve geografski diferencirane haplogrupe genealoški povezane haplotipom ηM: grčka haplogrupa kojakla divergira od YM i crnogorska sa centralnim haplotipom ZN. Nedvosmisleno striranje svih balkanskih haplotipova asociranih sa konopljikom u jedinstvenua genetičkugenealošk a grupui filogenetsk sa a geografskom bliskost izraelske podstrukturom, H. narušava obsoletus neočekivanex V. agnus- castus koja se klastrira sa po vezanipopulacije za C. foetida . pulacijama m Međutim, Bajesova analiza individualnog i populacionog klastriranja procenjenog na osnovu mikrosatelita, identifikujea priori primerke iz Izraela kao pripadnike odgovarajuće asocijacije svog domaćina,poglavlje a zatim4.3.2, na dubljem nivou kao srodne sa grčkim jedinkama iste asocijacije ( Slika 16). Dobijeni rezultati ukazuju na 111 proces prelaska na novog su se domaćina,najverovatni ije daljeodigrali diverzifikacije na teritoriji Bliskog među istoka ovim i populacijama. Ovi procesi pretpostaviti da se bazirano na dostupnim i obrađenim podacima moglo bi se e sa fenomenC. foetida promene ka domaćinai sa V. odigrao agnus- ucastus pravcu. prelaska trepopulacijaba uzeti iz u asocijacij obzir da je asocijacij Međutim, prelazak na novu biljku veoma zahtevan proces za svakog fitofagnog insekta jer su fitohemijske barijere često neosvojiva prepreka za stabilizaciju populacija host i dostizanjeshift ravnoteže (Bernays & Chapman, 2007). Populacije koje su prošle nastavljaju evoluciju na dva načina koji teku putem istog procesa populacionog udaljavanja koji u krajnjoj instanci vodi ka statusu vrste. Ukoliko su ancestralna i nova biljka domaćin prisutne na datom staništu (geografskom prostoru) populacije insekta ih mogu simultano koristiti i trenutno usvojiti obrazac ponašanja polifaga koji će se razvijati ka divergenciji i udaljavanju dveju asocijacija ili potpunom napuštanju polazišnoga takva da domaćina. Ukoliko je promena koja je dovela do odabira novog domaćin onemogućava populacije da simultano detektovati koriste kroz i izvornog domaćina, makard i povremeno, to se može veoma rano H. obsoletuspromene hostadaptivne rasa vre nosti vezaneC. arvensis za biljku i U. domaćina dioica ( Via što 1990 je slučaj kod asociranihet al. sa et al. et al. ; Bernays & Chapman 2007; Imo 2013; Maixner 2014;H. obsoletusChuche individua2018). kojeImajući na ovo u vidu postoji mogućnost da sakupljanjem osnovu preferentnosti prema biljci, bihevioralno pripadaju jednom domaćinu, ali premareliktna genetičkim evolutivna karakteristikamaosobina. pripadaju drugim asocijacijama što je njihova

5.1.3 Asocijacija H. obsoletus sa Crepis foetida H. obsoletus sa C. foetida izuzetno brojne

Asocijaciju - karakterišu na (1) prostranstvu od populacije, (2) populacionoi Savegenetička stabilnost širokom istočnehaplotipsk Turskeog diverzitet do Dunavaa na Balkanskom poluostrvu sa niskom stopom stopa 'Ca. koncentrisanog oko JH haplotipa, (3) izuzetno visokaCa. P. solani' MLSTP. solani'genotip infekcijetuf- b/STOL/V2 jedinki i do- TA 80%, u 83% (4) inficiranost okarakterisanih specifičnim izolata ' om Ca. P. solani' u C. foetida. i (5) asimptomatsko prisustvo ' 112

Iako iz Anatolije (

Turska je analiziran mali broj primeraka ErzindžanH. obsoletus i Kiršehir, sa C. foetida ),na dobijeni istoku areala. rezultati su ukazali na prisustvoH. obs asocijacijeoletus u Turskoj navode Vitex sp. kao biljku d Prvi podaci o prisustvu omaćinaH. (Prilog obsoletus 1; Hochsa C. & arvensisRemane 1985). Güclü i Ozbek (1988) su saopštili asocijaciju iz okoline Erzuruma, (istočna Anatolija) koji je udaljen oko 150 km istočno od Erzindžana odakle su analiziraniH. primerciobsoletus u ovoj studiji. Na lokalitetuC. foetida Erzindžan i sa C. arvensis. sintopski Prisustvo su registrovane H. obsoletus u populacijeC. foetida asocirane sa associjaciji sa je potvrđeno i na lokalitetu Kiršehir (centralna Anatolija) što ukazuje na široko rasprostranjenje ovih populacijaH. obsoletus na teritoriji ex C. foetida Turske. aso e sugerišuMnoge na genetičke osobenosti populacija cijacij broj privatnihizražen alela kojistepen genetičke udaljenosti od ostalih asocijacija: (1) nizak ukazuje na zatvorenost ove metapopulacije i nizak broj migranata (Szpiech & Rosenberg 2011), (2) pad u štobogatstvu alela u evropskim populacijama u odnosu na populaciju iz Turske implicira na napuštanje ancestralnogporekla vrste područja H. obsoletus na bliskom (Johannesen istoku etukazujući al. na Malu Aziju kaovrednosti centar H. obsoletus2008) i (3) niske se pripisaheterozigotnostiti u poređenju inbriding saa druge dve og drifta genetičkekao linije, što može procesima i genetičk posledice ekspanzije populacija ka zapadu. Ca. P. solani Rezultati koji se C. tiču foetida ' ' detekcijeH. i obsoletus karakteriza cije u prirodno inficiranim biljkama , asociranim populacijama i eksperimentalno zaraženim biljkama, jasno ukazujustolbur da se radi fitoplazme o veoma potentnom vektoruEvrope, koji verovatno prednjači u epidemiologijikoju izaziva u ovom delu ne samo u kontekstu bolesti na vinovoj lozi, već i u prenošenju na druge kulture podložne infekciji i razvoju simptoma. Visoka brojnost populacija nazapadne poponcu Evrope, ili koprivi, koje su kao korovske biljke često prisutne u vinogradima ne predstavlja iznenađenje.C. foetida Međutim, izuzetno visoka brojnostkoja su populacija ove cikade asocirasnih sa na prirodnim staništima najčešćeinsekta i ruderalne biljke, koja ili degradiraneprevaz površine u sukcesiji, govore o uskoj povezanosti ilazi prepostavku oportunističkog ponašanja cikada prema biljkama domaćinima koje su bogate azotom jer rastu na obradivom 113

( et al. . C. foetida H. obsoletuszemljištu Olmstead 1997) Homogenosttuf-b/STOL/V2 u infekciji-TA i asociranih populacija sa CPs genotipom , takođe se može tumačiti kao stabilna interakcija na drugom trofičkom nivou, jer je jedini inficirani primerak iz istočne Turske (Kiršehir) takođe nosio upravo ovaj genotip.

5.2. Taksonomski status H. obsoletus: potreba za integrativnim pristupom

Hyalesthes, bazirana na

Detaljna revizija, južnopalearktičkog roda unutar kojihkladističkim vrste pokazuju analizama visokukazala stepen je na postojanje 5 monofiletičkih grupa morfološkeprkos sličnosti (Hoch & RemaneHyalesthes 1985; se Hoch 1986b; Remane & Hoch 1986). U tome, sve 33 vrste roda . Jasna mogu nedvosmisleno identifikovati na osnovu strukture igenitalija srodnih vrsta mužjaka kao što su razlikaH. obsoletus u strukturi i H. thracicus se vidi čak( i u slučaju izuzetno sličnih Hoch & Remane 1985). U ovom slučaju jasnu razliku u genitalnojregionu COI morfologiji-COII što ukazuje prati genetička na divergencija od 2.6% (3.6% na genskom njihovo skorašnje) razdvajanje. izuzetno bliske ancestralne odnose ovih taksona i Nešto niže vrednosti genetičke diferencijacije zabeležene su između analiziranih primerakaH. obsoletuspopulacija uz detektovanuu associjaciji sahaplotipsku različitim biljkama domaćinima unutar vrste divergenciju od preko 2.4% što svedoči o intenzivnim procesim diverzifikacije koji su1996; se 1 verovatno odigrali tokom serije Kvaternernih glacijalnih ciklusa (Hewitt 999). tri H. obsoletus Relacije detektovane između metapopulacije ukazuju na odvijanje procesa simpatričke specijacije uo dsustv kojojo geografske se evolucija odvija. Jasna na populacionom nivou- unutar postojeće vrste uz - izolacije genetička i bio ekološka segregacija populaciono genetičkih grupa uslovljenih odabirombliskost biljke domaćina, između kojih odsustvuje protok gena, ukazujubioloških, na konceptu „ihoperativne” razlika vrste koji podrazumevadva postojanje ekoloških i genetičk populacijaH. obsoletus na minimum simpatrička sintopskih lokaliteta (Berlocherlokaliteta & Feder 2002). Analizom populacija pokazanasa sedam je stabilna , u asocijaciji sa različitim biljkama domaćinima 114

ke razlike fenotipa postaju poslednji korak predgenetička status divergencija čime morfološ om različitih vrsta. Zabeleženi stepen segregacije između tri opisane metapopulacije sugeriše da jeH. dosadašnji obsoletus taksonomski koncept ove vrste neodrživ. Promena u percepciji vrste kao kompleksa vrsta podržavamorphologically uveliko zapostavljenstatic cladogenesis mehanizam morfološke statičke kladogeneze (engl. ), odnosno diverzifikacije vrsta bez fizičkihet al. promena jer morfologija ne ide nužno u korak sa specijacijom (Bickford 2007). Većina vrsta koje su u kriptičkom statusu su proizašle iz simpatričke specijacije koja je toliko skorašnja da morfološkiet al. karakteri ili druge fenotipske osobine još uvek nisu evoluirale (Bickford 2007; Saezniji &vektor Lozano 'Ca. 2005). P. solani', H. obsoletus Kao najpoznatiji i najuspeš dominira u epidemiološkim studijama ovog biljnog patogena, dok su ekologija i taksonomija same vrste, slabo istražene. Jedina studija koja se bavila pitanjem sistematike je doktorska teza prof. dr Hannelore Hoch koja kroz svoj istraživački rad nije uspela da dođe do tipskog primerka ove vrste uprkos višestrukim pregledima evropskih entomoloških zbirki i prateći literaturne tragove deponovanog materijala čime je s pravom donešen na zaključak osnovu da je tip najverovatnije izgubljen (Hoch & Remane 1985). Međutim, je H. informacija obsoletus opisan koje prate iz dostupne jedinkeFrance tipske mérid.serije, može(Grenier), se zaključitiChambéry da(Cartereau) enja podatakajužne Francuske sa koje biljke ( ) bez navođH. obsoletus Liorhinusprimerci potiču.albolimbatusPored toga, tipski primerak jedinog opisanesinonima, iz vrsteije Kirchbaum, 1868 (Fieber 1872), Dalmac je takođe H. najverovatnijeobsoletus izgubljen (Hoch & Remane 1985). Pripisivanje tipskog primerka nekoj od asocijacija bi bilo veoma špekulativno, ali znajući da su na području( tipskog lokaliteta prisutne sve četiri biljke domaćina http://ww2.bgbm.org/EuroPlusMed/) genetičke analize arhiviranog suvog materijala koji potiče sa juga Francuske bi bileH. veoma obsoletus značajn e jer taksonomska i nomenklaturna pitanja vezana za status vrste se ne mogu stabilizovati bez analize tipskog materijala. U slučaju kada je tipski materijal izgubljen, a stabilizacija taksonomskog statusa neke vrste neophodna, naročito kada seoološke radi o kriptičkim vrstama . odInternational ekonomskog Code značaja, of Zoological Međunarodn Nomenclaturei Kodeks Z daje Nomenklature (engl , ICZN) 115

a (neotypus jasne smernice o uspostavljenju novog tip ), prema uslovima članka broj 75 Kodeksa.

5.3. Biogeografska istorija H. obsoletus

Narušavanja genetičke struktureH. obsoletus vrsta,, nisu slična retkost međupopulacionoj u fauni insekata divergenciji koja se razvija unutar vrste - umereno kontinentalne Evrope. Promene u populaciono genetičkoj strukturiposlednjih vrsta 2.6 su najčešće posledica sredinskih promena koje su se odigralerezultat tokom naiz miliona godina. Genetičke, promenenjihovog kretanja unutar vrsta su meničnihi razdvajanjaprostornog sabijanjpopulacijaa natokom jugu perioda premaa, glacijalnimi refugijumima severnih staništa tokom periodaglacijacij rekolonizacija dostupnih u tokom interglacijalnih (Hewitt 1996). Periodi glacijacija poslednjih 2.6 miliona su dovoljno dugo trajali daInsekti bi došlo su poznati do akum po ulacijesvojoj genetskih promena između razdvojenih populacija. podlegnu pritisku izraženoj sposobnosti visoke disperzije i kada njihove populacije promene staništa dva scenarija se mogu odigrati: (1) nestanak vrste (ekstinkcija) ilikasnije (2) specijacija u izolovanim refugijumima prema ostrvskom modelu evolucije i (Moritz asortativnoet al. 2000; parenjes u 2001 novokoloniziranim; staništima nakon povlačenja leda - Knowle Coope 2004). , Centralno atlantska ostrva (Kanarska ostrvaHyalesthes i Madeira) i istočni Mediteran, koji se navode kao dva centra diverziteta roda (Hoch 1986a;- 1986b) bilaperioda su južni( refugijumi gdeFernández su se mnoge- vrste povlačile tokom post glacijalnih pretpostavitiHewitt da je 1999; Palacios & Whittaker 2008). Može se H. obsoletusuticaj ekoloških faktora na specijalizaciju i reproduktivnu izolacijudoveo do populacijaih adaptivni na h teritoriji Balkanskog poluostrvatnosti i Male Azije, kompleksn promena u preferen premaH. obsoletus biljci domaćinu u novim ili izmenjenim biotopima. Putevi diverzifikacije populacija su verovatno posledica višestrukih simultanih događaja koji su otpočinjali u refugijumima i dalje diverzifikovali širenjem arela prateći poboljšavanje sredinskih faktora, a ne jednosmeran trend koji istorijski vuče ovu vrstu iz njenog centra areala na istoku prema granici rasprostranjenja na zapadu. 116

Kao posledica širenja staništa i višestrukeH. re obsoletuskolonizacije ruta koje su korišćene tokom interglacijalnih perioda, populacije su ili ulazile u kompleksne procese genetičke razmene ili su, tako bile da već s dovoljno genetički udaljene usled, prostornenastavljale i vremenske izolacije g udaljavanju kaoa. nezavisne genetičke linije svoju evoluciju međusobno C. arvensis i U. dioica , koji geneaološkiPridruživanje pripada haplotipa zapadnoevropskoj QB genetičkoj AB grupi haplotipsk oj grupi, a za mtDNKkoga je ra , utvrđeno da potiče sa teritorije severoistočno od Azovskog mo (južna Rusija) sugeriše da je ova metaasocijacija mogla iz centra diverziteta na jugu da prodre u Rusiju na dva načina: (1) zaobilazeći Crno more duž obala ili (2) šireći svoj areal krozTrakije. Istočnoevropsku niziju nakon penetracije na evropski kontinentH. obsoletus preko ukazuje istočne da Takođe, prisustvo ovog haplotipa na istoku areala je genetička karakteristika populacija specifične asocijacije sa biljkom domaćinom starija od biogeografskih kretanja i promena populacija. H. obsoletus Uska linijaV. obale agnus Sredozemnog-castus koristila mora za bi širenje mogla bitika pojass koji je asocijacija sa evernom i zapadnom Mediteranu i vrlo verovatno i u pravcu juga prema Izraelu i južnim obalama Male Azije. Geografska distancastavlja Crne Gore i Grčke na Balkanskom poluostrvu je krucijalnilinije u ko nelementtekst koji zabeleženu genetičku divergenciju između ove dve potencijalnih podvrsta. Međutim, fizičku razdvojenost analiziranih, gde V. populacijaagnus-castus crnogorske i grčke haplogurpe, čini skoro 250 km albanske obale H.raste obsoletus na svom prirodnom staništu i vrlo verovatno pruža nišu asociranim populacijama koje mogu predstavljati genetičku sponu ovih regiona. Ukoliko bi se pokazalo da nijeV. agnus tako, -castus to bi značilozapravo da podvrste su dve razdvojenedetektovane genetičkePind linijea asocirane sa masivom i okolnim planinama kao nepremostivom barijerom koja sprečava protokasprostranjenja gena između H. ovihobsoletus populacija. i sa C. foetida su trenutnoGranice nepoznat r e populacija u asocijacij , ove prisutne, ali doprema Erzin analiziranim podacima i dobijenim rezultatima populacije su njihovogdžana areala u istočnoj. Turskoj, dok su Dunav i Velika H. Moravaobsoletus zapadna ex C. foetida granica Međutim,( registrovana, kao populacija i prisustvo na levoj obali Dunava Calafat, Rumunija) 117 najčešćeg haplotipagovori u JHprilog u populacšire rasprostranjenostiiji agroekosistema ove na lokalitetu Radovanu (Bugarska),teritoriji . Prodor asocijacije vektora na Rumunije na evropski kontinent je bio moguće prekokoje dele Bosfora ovaj i DardanelaBalkansko -Anatolski ili prateći i Ponto dolinu-Panonijski Dunava kaohorotip mnoge (Taglianti druge et vrst al. sa C. foetida 1999). Prisustvo asocijacijekorist ovog na obe obale Dunava, u Bugarskoj i Rumuniji, svedoče u ekspanzionog pravca.

5.4. Razvoj epidemioloških puteva širenja 'Ca. Phytoplasma solani' pod uticajem specijalizacije vektora

rezultateEpidemiološki koji su u osnovi segment potvrdili sprovedenih status H. istraživanja obsoletus kaoje izuzetno dao kompleksne efikasnog vektora 'Ca. P. solani' neposredno

kroz eksperimentalntufe- dokaze inokulacije laboratorijskh biljaka od strane tri asocijacije upletene u b epidemiologiju. Na ovaj način je dobijen uvid u složene'Ca. puteveP. solani kojima'. a prisustvose kroz vektore H. obs io letusbiljke udualne fauni domaćineSrbije kreću različiti sojevi Z znalo sei njegov vektorski potencijal u širenju bolesti izazvanihet al. stolburali fitoplazmom, do podataka još od šezdesetih godina prošlog veka (Aleksić 1967), datihnije bila prikazanim poznata istraživanjem, složenost epidemiologije vođena ovim vektorom . Istraživanja su jasno ukazala da na teritoriji'Ca. P. solani jugoistočne Evrope postoje vrlo složene i do sada nepoznate preferentnosti ' izolata prema vektoru i testiranim biljkama.ekoloških i evolutivnih odnosa unutar Razumevanjevrste H. obsoletus između tri genetičke linije od koje- su asocirane sa različitim biljkama domaćinima posebnog je značaja u tri trofičkim sistemima kakve su biljne bolestinu koje se raznose vektorima. Biljke dualni domaćini predstavljaju polaz tačku epidemiološkihpreferentnosti ciklusa koji mogu da se dodirnu, ukrste ili preklope u zavisnosti larvi od. Analiza uzorakavektora prema biljci na kojojodstupa se odvijanja endogejsko razviće je ukazala na vektora određena i disperzije 'Ca. P.od solani očekivanog' obrasca. korelacije genetičkog diverziteta u ekosistemimatuf-a/tuf-ab i Rezultati jasno ukazuju na (1) razvoj dva CPs epidemiološka puta, 118 tuf-

b, koji otpočinju od specifičnog domaćina koprive, odnosno poponca, uprkos genetičkojuz nejasno homogenostiprisustvo 'Ca. populacija P. solani vektora' izolata ovetuf - dvoasocijacijske metapopulacije,H. obsoletus sa koprivi i b epidemiologijetuf- u adultima sakupljenim (2) umrežavanje b ciklusa uz zajedničke izolate kao međuasocijacijskuC. arvensis sponu, V. populacija agnus-castus tri genetičkei C. foetida linije vezaneet al. za različite2016a; 2016 dualne domaćine: (Kosovac Metodologijac). odabran i a zakretanja karakterizaciju MLST CPs izolata se pokazala efikasnom informativnome vektorau i bilj praćenjuke. Iako se u literaturi testirajugenotipova i koriste kroz i drugi oba domaćina,geni kroz populacij 'Ca. P. solani' (Martini et al. 2007; Fialová et al. koje se utvrđuje genetički diverzitettuf, stamp i vmp1 su bili adekvatno i za 2009), tri odabrana gena: informativn sagledavanjekoji preferentnosti izolata ka domaćinima kojikolnosti, grade epidemiološkikoja je put m se fitoplazma kreće. Jedna od otežavajućih o delimičnotuf i/ili prevaziđenavmp dizajniranjem novih prajmera, je neuspešna amplifikacija 1 gena. U literaturi koja se tiče epidemiologije fitoplazmin ne postoji trend publikovanja negativnih rezultata koji bi bio značaja za molekularnu karakterizaciju ovih biljnih patogena.prikazuju Iako seneuspešn istraživačie selektivno e odlučuju za analize određenih gena, retko se karakterizacij obrađenih CPsse ne uzoraka. isti Čak i kada se takve situacije jasno vide kroz prikazane rezultate, one ču i kao takve ostaju bez objašnjenja jer, kojisu uglavnom je teško u vezi sa izolatima čiji su MLST genotipovi u unutrašnjem neskladu stampobjasniti genu je (Murolo potvrdila & Romanzzi 2015). Stabilna karakterizacija CPs izolata nae pripadnosti genotipova značajkroz njihovu ovog markeragenalogiju za ( karakterizacijupoglavlje 4.5.3,epidemiološk novoopisane stamp Slika 25). Na ovaj način je za tuf sve- a/tuf-ab ili tuf- genotipove bilo putev moguće utvrditi poreklo i asocijaciju sa b epidemiološki m ima u prirodi, nezavisno od domaćinatuf u kojimai vmp1 genisu detektovani. nisu pouzdaniNa osnovudijagno rezultata genotipizacije može se zaključiti da varijabilnosti vezana za geografskostički poreklo markeri jerkoja je među CPs izolatima prisutna zapadno evropskihonem genotipova.ogućava Ov amplifikacijuo prajmerima dizajniranim na osnovu može biti

119

V. agnus-castus u Izraelu gde su geni 16S

(Lorenzrazlog nedostatka et al. dokazai tuf o infekciji et al. 1995) , stampkorišćeni za detekciju i karakterizaciju (Sharon 2015). Nasuprot tome gen se u metodološkom smislu pokazao uspešnim markeromSTOL koji11 segena. u umnožio a osnovu u 100% analiziranog uzoraka setaprethodno određenih sekao inficiranih putemstamp biti N CPs izolata možeuzoraka zaključiti da može zamenski gen za inicijalnu detekciju infekcije čime se smanjuje utrošak vremena i resursa.'Ca. P. solani' stamp genotipova detektovanihIznenađujući uz 12 prethodno diverzitet poznatih, novi odgenotip čak 15tuf - novihb tipa i jedan novi vmp1 profil (V2-TA- obligatnog biljnogL), svedoče patogena o izuzetnom i do sada nepoznatom. Analiza diverzitetu dobijenih ovog u jugoistočnoj Evropi vektora, epidemioloških rezultata je izuzetno kompleksna jer svaka od asocijacija nastalavrste, raščlanjivanjem polifagne vrste na monofagne genetičke linije ili kriptične ispoljava složeno ponašanje prema biljci domaćinu i svomni kvalitativno patogenu kojeg ni kvantitativnoprenosi, usled doneti čega na se nivo jedinstveniu H. obsoletus zaključak sensu lneato može , već samo svake zasebne asocijacije. 5.4.1 Uloga H. obsoletus ex Urtica dioica u tuf-b epidemiologiji 'Ca. P. solani' Sa novoopisana

aepidemiološk H. obsoletusog sa stanovišta C. foetida može, i detaljno se reći da je najznačajnijaa a vektora i asocijacijpatogena sa V. agnus-castus istražen asocijacij H. obsoletus ex U. dioica . Međutim, dobijeni rezultati kada je u pitanjuored , takođ, eregistrovano od izuzetnog je značaja devet zado epidemiologiju, sada nepozna jertih je stampp genotipovabogatog CPs diverzitetaprvi put je ustanovljeno . Takođe 'Ca. P. solani' da populacijatuf-a i tuf vektora-b tipa može. biti istovremeno inficirana izolatimatuf tuf-Bazičnaab tipa epidemiološka(Atanasova et al.CPs 2015; divergencija tuf-b2, baziranaAryan et na al. genu je do otkrića g pokazatelja2014) porekl dominiralaa u centralnojtuf- U. i zapadnojdioica i tuf Evropi-b C. u arvensis vidu nedvosmisleno infekcije prelaznog: tufa - −tipa −tuf -a (Langer , & Maixner 2004). je Otkriće uključenog u širenjaepidemiologiju 'Ca. P. solanisamo' jer prividno je nakon njegoveunelo destabilizaciju u dvociklusni sistem prve detekcije u

120

Austriji

Makedonije, isti (Atanasova nalaz vezan et za al. epidemiologiju s koprive, potvrđen i za teritoriju vezan uz stamp genotip2015), 19-25 a subklasteraada i za područjea1 (poglavlje Crne 4.5.3,, Gore Slika i Srbije 25; isključivopoglavlje 4.4.1, tuf-b izolata u H.Tabela obsoletus 7). Naexlazom U. dioica relativno narušava česte prisutnostise dosadašnja stabilna populacijama epidemiologijatuf-a/ stolburtuf- fitoplazmeizolata, dokuslovljena su tuf-b izolati koprivom do sada kao bili biljkom izvorom inokoluma ab CPs vezani samotuf za- poponac (Langer & Maixnerstamp 2004). genotipa Detekcija grupisana izolata koji u suklaster već poznati b-III, ukazujučlanovi da b ciklusa,H. kao obsoletus i 4 nova kopriv primerci u asocijaciji sa om poseduju potencijal ishrane na biljkama domaćinima drugih asocijacija ovog vektora, ili nasumične tuf povremene- ishrane na drugim biljnim vrstama koje mogu biti prirodno inficiranetuf -ab i tipom.tuf-ab U analiziranim uzorcima koprive iz Crne Gore prisutni su isključivo CPs izolati. Ovaj nalaz se mora tretirati sa zadrškom jer može biti lažno negativan rezultattuf- koji zahteva podrobnije uzorkovanje koprive, posebno na lokalitetima gde b izolati inficiraju tuf asocirane-b populacije vektora. Nedoumice po pitanju prisustva CPs izolata tipa - niske koncentracije(engl. u prirodnoreal time inficiranim koja koprivama mogla bi otklonitii vrlo RTniskePCR metodologija genskog regionaPCR) u omogućava detekciju et al. 2017učestalosti ciljanog ošenje tuf-b izolata u analiziranombiljke koprive uzorku u prirodi (Chabirand ). Potencijalno un se mogloH. obsoletus realizovati na dva načina: (1) nespecifičnom ishranomtuf- na koprivi od strane adulata iz asocijacija koje učestvujutora koji u nosib tuf epidemiologiji- ili slučajnom ishranom nekog drugog polifagnog vek b izolate ili H.(2) obsoletus endogejskom inokulacijomtuf koprive-b izolate preko preuzeti korena iz korenskih od strane sa njom asociranih larvi koje, mogu ugih žilica drugih biljaka i uneti ih u koprivu ili pak slučajnom ishranomtuf-b izolati larvi dospeli dr u asocijacija ili drugih vektora. Ukoliko se pretpostavi da su koprivu slučajnim događajem i ostali vijabilni H. u obsoletus floemu u veoma niskoj desitikoncentraciji, da nakon akvizicije od strane asociranih populacija može se fitoplazma ove jedinke prepozna kao evolutivno podjednakoije sa odgovarajućeg domaćina u kojem dostiže visok titar kao i slučaju asocijac poponcem, što bi se moglo očekivati imajući u vidu njihovu genetičku bliskost. U 121 skladu sa ipoteza da su H. obsoletus adulti vezani za koprivu preuzeliovim, možetuf- se postaviti i h b izolate već kao larve sa korena neke druge biljke i daa priorisu se prelaskomrealizuje širenje u naredni tuf-a/ tuf stadijum- od njih razvili adulti, asocijacije koja ab epidemiologije, koji nespecifično nose izolate drugog epidemiološkog ciklusa kao trag endogejske ishrane. SvakakoC. arvensisse ne sme zanemariti i potencijal povremene ishrane adulata-g ove asocijacije na kao drugom domaćinu ove nedeljive populaciono enetičke linije u jugoistočnojvice versa Evropi., odnosno U skladu sa tim je zanimljivo da ovaj fenomenH. obso letus nije detektovan kod populacija sa poponca, ali i ostalih asocijacija i njihovih domaćina, koji su u ovom istraživanjutuf- kao i u literaturnim podacima inficirani isključivo jasno okarakterisanim b izolatima. tuf- Kada se situacija prisustvastamp genotipa CPs izolata se u H. obsoletusb epidemiolgije spusti na nivo detektovanih nalaza, četiri tufjedinkama- asociranim sau t ufkoprivom-a/tuf- pojavljuju kao spona sa drugim asocijacijama b ciklusa čiji se upliv MLSTab ciklusgenotip desio tuf prema- jednom- od pretpostavljenih scenarija: H.

(1) obsoletus b/Rqg31/V2 TA (Profitis, Grčka);poglavlje detektovan 4.5.1.2, uSlika populaciji sa poponca na lokalitetu Beri ( 21);et al. prethodno je opisano njegovo prisustvo u vinovoj lozi u Austriji (Aryan BG45602014); stamp genotip (Filadelfio, G ; Tabela 7 ; detektovan u H. (2) obsoletus C. arvensis (Predejanerčka , Srbija) i Petrevo selo ; asocijacijiTabela 8 sa ex C. foetida (Vidin, Bugarska , Rumunija ); prethodno i u asocijaciji je opisano njegovo prisustvo u vinovoji Calafat lozi Rumunijau Bugarskoj; Tabela (Fabre 9) et al. STOL stamp 2011a); (3) genotip (Boljetin,tuf Zaječar,- Knjaževac, Vranje u Srbiji i Strumica, Makedonija); inficira sve tri C. foetidab asocijacije, vrl kao apsolutno dominantanV. agnus u- populacijamacastus i detektovan asociranim i sa a C. o arvensis čest u populacijamau vidu jednog sa izolata iz Turske vezanog za V15u vmp asocijaciji1 s tuf-b/STOL/- i - /STOL/- ; čak su oba zabeležena izolata, , kao isti takviex nekompletno V. agnus-castus okarakterisani genotipovi i prisutni u i u Goraipopulacijama; Tabela 9 vektoraC. foetida (Bar, Kamenarii Jasenovik uUlcinj Srbiji; TabelaCrnoj ) i (Deligrad, Požarevac 122

) usled čega je moguće da; prisustvose radi o specifičnomMLST genotipa genotipu tuf koji-b/STOL/V2 neposredno-TA prethodnodele ove je tri detektovano asocijacije u vektoru Reptalus panzeri u Srbiji i vinovoj lozi u et al. 2014; Atanasova et al.

Srbiji i Makedonijistamp (Cvrković , Makedonija 2015); e uz (4) Rpm35 genotip (Strumica ) takođe dele sve asocijacija dva napomenu da je izolat ovog genotipa ostao neokarakterisan na drug genajavlja uu slučaju vidu jasnog asocijacije MLST sa genotipa koprivom, tuf dok- se kod preostale koji trije prethodnoasocijacije detektovan u vektoru R. panzeri b/Rpm35/V14et al. u Srbiji (Cvrković 2014).

Pitanje koje u skladu sa primenljivim H. značajem obsoletus istraživanja proizilaziU. dioica iz. dobijenih rezultata jeste vektorski potencijal asocijacije sa Sam nalaz prisustvatet biljnog prenošenja patogena 'Ca. uP. insektusolani' izolata nije dokaz tuf-b njegovetipa je neophodno vektorske sposobnosti i kapaci et al. 1994; Gatineau eksperimentalnoet al. 2001; etpotvrditi al. 2007 laboratorijskim; -Bauer et ogledima al. 2008;(Maixner et al. et al. 2016Jovića; et al.Riedle 2016 U Cvrković 2014; Kosovac Mitrović ). ovim istraživanjima prikazan je samo pregledni diverzitet CPsv rope. izolata Uz koji rezultat inficiranju prisustva ovu sva metapopulaciju tri tuf- vektora na području jugoistočne E u okviru vrste H. obsoletustipa u adultimanalaze u vezanim za koprivu, koji se kao asocijacija ekspanziji u centralnoj i jugoistočnoj Evropi, neophodnost testiranja vektorsketuf-b tipa, uloge ove asocijacije i provera sposobnosti inokulacije biljaka izolatima ističe se kao jedan od najvažnijih koraka u daljim istraživanjima. 5.4.2 Vektorska uloga H. obsoletus ex V. agnus-castus i ukrštanje tuf-b epidemiologije 'Ca. P. solani' ex V. agnus-castus i C. arvensis

Ciklusi biljnih bolesti koje prenose vektori su uslovljeni sa tri promenljive: (1) preferentnošću vektora prema biljkama, (2) biljkama dualnim domaćinima i (3)inokuliše sposobnošću zdravu biljku vektora da ishranom preuzme patogena iz biljke rezervoara i . U složenim sistemima gde je više od jednog vektora Boisi/ili noirjedne bolesti biljke vinovizvorae infekcijeloze, putevi uključeno prenošenja u epidem 'Ca. iologiju,P. solani' kao što je to u slučaju isprepletaniu prirodnim. staništima je i agroekosistemima mogu biti vrlo kompleksni i U tim slučajevima 123

e patogena eksperimentalna potvrda porekla i puteva diseminacij veoma zahtevna što se prevazilazi metodama molekularne epidemiologije koje kretanja na nivou i laboratorijske detekcije i karakterizacije patogena otkrivaju pravce širenja infekcije. Kombinacija eksperimentalnog i ' molekularnogCa. P. solani' ipristupa kao takva ima je zau ciprikazanlj otkrivanje svih uticaja naizuzetno puteve uspešno prenošenja razjasnila ulogu V. agnus-castus i imH.istraživanj obsoletusima Bois noir Gore.asociranih populacija u epidemiologiji u vinogradima Crne

Prateći put kretanja kroz domaćine trogenskiC. arvensis okarakterisanih i U. dioica CPs izolata detektovanihvektoru H. obsoletus u vinovoj lozi, potvrđeno je daM editerana su kao i u domaćini i patogenu na područjuV. agnus -castus je uz potvrducentralnoj prisutnosti Evropi. Pored tradicionalnihH. obsoletusdualnih domaćina, asociranih populacija, prvi put istaknut kao rezervoar CPs infekcije što je pokazano detekcijom fitoplazme u listovima asimptomatskih biljaka sakupljenih na terenu. Upoređujući CPs genotipove identifikovane u insektima određene asocijacije, biljkama dualnim domaćinima i vinovoj lozi, na svakom od 5 oglednih lokaliteta (vinograda), utvrđeni su prisutnivinovoj epidemiološki loz putevi. Međutim, neki genotipovia su identifikovani samo u i i/ili biljkama rezervoarima ili asocir nim populacijama vektora, ali ne istovremeno u sva tri domaćina što je verovatno posledica uzorkovanja, a ne realnog odsustva fitoplazmenego u što nekom bi se odto domaćina. Detektovani diverzitet CPsbiljk genotipovaa je bio znatno viši očekivalo u direknom prenošenju: rezervoar → vektor → zasad.U. dioica Ovakav, dok tipsu direktnogMLST genotipovi puta je vezani zabeležen za C. arvensis samo kod i V. genotipova agnus-castus vezanih za 'Ca. P. solani' u Mediteranu koja isprepletani. Kompleksnost epidemiologije potiče iz tri izvora infekcije se ogledaMLST genotip. u diverzitetu detektovanih izolata kao i u broju domaćina koje deli jedan tuf- nedavno okarakterisanNajčešće u detektovaniBois noir genotip u vinovoj lozi b/Rqg50/V17,et al. inficiranimaka vinogradimaC. arvensis i AustrijeV. agnus (Aryan-castus , kao 2014),i obe predstavlja zajednički izolat bilj'Ca. P. solani' i H. obsoletus asocijacije vektora. Ukoliko se V.smatraju agnus-castus organizmima zapravo mediteranskog porekla, moglo bi se pretpostaviti da je 124 originalni domaćin ovog CPs genotipa. U ovom slučaju ograničeno područje distribucije konopljikei put bi onemogućilo patogenu da se širi, pa se premapredstavljati tome epidemiološkekspanziju iz M vezan za poponac može smatrati alternativnim i et al. 2016a editerana u Panonsku ravnicu i donju Austriju (Kosovac tuf- b/STOL/V2). Sličan-TA obrazac detektovan zajedničkog u V. agnus MLST-castus genotipa je karakterističan, zaa prethodno izolat i asociranim insektima R. panzeri u poznat kao član drugog epidemiološkoget al. ciklusavog kojigenotipa razvija u vektor južnom Banatuokolini (Cvrković Bar a 2014). Nalaz o V. agnusprirodno-castus inficiranimkao izvora konopljikama ukazujeM na primarnu ulogu da R. panzeri do sada nije inokuluma ovog izolata u editeranu. S obzirom da su drugi vektori detektovan u Crnoj Gori, može se pretpostaviti i biljke domaćini uključeniPanonske unizije razmenu na severu, izolata izmeđunezavisno dva koja regiona, od ove sredozemlja dve oblasti na je jugu poreklo i Banata tuf - i b/STOL/V2-TA genotipa et al. 2016a je H. obsoletus C. arvensis(Kosovac ). Iako bi se moglo pretpostaviti da prisutan u C. arvensisex upravo taj intermedijerni vektor, ovaj genotip nije asocijaciji u Crnoj Gori, niti na širem područjuR. quinquecostatus Balkanskog, poluostrva. Prema tome, drugiet potencijalni al. vektori kao što je koji nose ovaj izolat (Cvrković 2014), mogu biti veza izmeđuC. foetida ova kao dva dualnogregiona. Takođe, ovaj izolatane jeH. dominantanobsoletus za ciklus vezan za domaćina i asocir populacije koje su njime uspešnopoglavl inficiraleje 4.5.2, Slikasvih pet oglednih biljaka u eksperimentima unakrsnog prenošenja ( 22) čime je pokazano da iako nije detektovan utuf crnogorskim- vinogradima, predstavlja možda i glavni genotipet koji al. 2014;se kreće Atanasova kroz etb epidemiološkial. ciklus na Balkanskom poluostrvu (Cvrković tuf- 2015). tri od petDrugi značajan CPs genotip u Mediteranu je b/Rpm35/V14 detektovan u C. arvensisinficiranih, dok je ovaj vinograda. izolat u Godinju U Šušunji registrovan i Berima jeu utvrđeno da je izvor infekcije V. agnus-castus prirodno inficiranim biljkama . Ovaj nalaz se bazira na kombinaciji rezultata molekularnog praćenja epidemioloških puteva prenošenja i eksperimentalne inokulacije vinove loze. U vinogradu u Godinju analiziranisu registrovane uzorci poponca nisu bili CPs inficirani, dok asocirane populacije vektora ni . Nasuprot tome, prisutne prirodno inficirane biljke konopljike su nosile ovaj genotip iako on nije detektovan u 125 asociranim vektorima, dok je u ogledima CPs transmisijeji su na prenešeni. vinove loze Iako upravo tuf- ovaj MLST genotip bio najčešći u okviru izolataH. obsoletus ko b/Rpm35/V14 nije pronađen u uzorkovanim populacijama asociranim sa konopljikom, možeet se al. smatrati 2016a da ovaj genotip podjednako dele dve pomenuteC. foetida asocijacije (Kosovac ). I u ovom slučaju se asocijacija sa pojavljuje kao nosilac ovog genotipa znatno severnije u Bugarskoj,, ali i još jedna populacija vektora asociranogH. obsoletus sa poponcem sa C. foetida u Topoli. Međutim u Crnoj Gori nije detektovanave asocijacija , iako sama biljka jeste, što ovog ktora isključuje kaoR. panzeri intermedijernog u slučaju ovog CPscrvenila izolata. kukuruza Kao i u prethodnomBanatu je slučaju, koji učestvuje u epidemiologijipretpostavlja da prelazni put širenja inficiran ovim genotipom, pa se takođe ide preko alternativnih vektora.ovog izolata između južnih u severnih regiona

Rezultati laboratorijski kontrolisanih ogleda inokulacije H. obsoletus vinovih ex loza V. povezujuagnus-castus eksperimentalne prenose 'Ca. i P. molekularne solani' dokaze da populacije na lozu, dok CPs detekcija u prirodno inficiranim asimptomatskim biljkama konopljike u okolini vinograda i uH. prirodnim obsoletus eksosistemima potvrđuje značaj ove biljke kao izvora zaraze. InficiraniV. agnus -castus u adulti sakupljeni na konopljici i CPs inficirane biljke ukazuju da je mediteranskoj zoni Crne Gore mesto primarne akvizicije patogena za asocirane populacijepripisuje vektora čime se ostvaruje jednosmerni epidemiološkiet al. 2016ciklusa i konopljiciPrikazani nalazi su primarni značaj kao izvoru infekcije (Kosovac odsustvo 'Ca. ).P. solani' u u suprotnosti sa prethodno registrovanim m V. konopljiciagnus-castus u Izraelu gde je patogen detektovan u vektoru i vinovoj lozi, ali ne i u et al. za koju je na ovoj teritoriji dokazanonalaza da je postoji domaćin nekoliko vektora (Sharon 2005; 2015). Za ovu- nekonzistentnost modućihex V. objašenjenja.agnus-castus Populacionona teritoriji genetički parametri jasno ukazuju da se asocijacija et al. Grčke i Izraela razlikuje od crnogorskih populacijaoli (Kosovac 2018) što se može ogledatiet al. u fenotipskim i metab čkim karakteristikama insekta (Kurbalija Novičić 'Ca. P. solani'2015). U skladu sa timH. je obsoletus posebno zanimljivo da u Grčkoj nije V.detektovana agnus-castus infekcija niti u - adultima, niti u biljkama što može ukazivati da ova unutar 126

asocijacijska genetička inokul linija kojukonopljik čine e metapopulacije, dok je u Izraeluvektora i iz Grčke i Izraela nemasa konopljike sposobnost neka drugaacije biljka kao što je to i sugerisano zvor(Sharon infekcije et al. adultima Izraelu H. obsoletus ostvaruje dve e godišnje, dok se na jadranskoj2015). Ui egejskoj obali pokazalo da H. obsoletusgeneracij ex V. agnus-castus ima jedan produženi period letnje generacije koja počinje krajem juna, sa pikom aktivnosti sredinom jula i opadajućim trendom ka početkuH. obsoletus oktobra. Genotipovi CPs izolatabi karakteristični za konopljikuod izolata prisutnih i asocirane u Izraelu. populacije u Crnoj'Ca. P. Gorisolani' izolatimogli bitisu različiti tuf Međutim, izraelskituf-b tipa što je okarakterisani samo na genu kao pripadnici nedovoljnoivanje za o sagledavanjerela njihovog epidemiološkog identitetaMediterana. i onemogućava Svakako zaključsu neophodna dodatnacijama istra izolata jadranske obale i istočnog živanja za otkrivanje potencijalnih uzrokaH. obsoletus koji dovode ex V. doagnus nekonzistentnosti-castus u ponašanju, infekciji i epidemiološkoj ulozi Eksp kao i njegove biljke domaćina u ova dva regionaH. obsoletusSredozemlja. erimentalnaV. agnus-castus potvrda u Bois vektorskenoir uloge populacija asociranih sa epidemiologiji u vinogradima Crne Gore ukazujeMediterana. na potencijalno veću ulogu ove asocijacje na mnogo širem području pojavljivanja Ovo'Ca. P. nameće solani' potrebu za rastevljavanjem incidence infekcije, u prirodno inficiranim biljkama i zasadimainove loz kaoe u i epidemiološkogvinogradarsk značaja jedne od najznačajnijih bolesti v im regionima mediteranskih država: Španije, Francuske,ula Italije i Hrvatske. Praćenje puteva kretanja CPs izolata kroz molek rnu detekciju i karakterizaciju je pokazalo da začetak bolesti leži u konopljiciH. obsoletus kao izvoru infekcije čije širenje kroz ekosisteme realizuju sa njom asocirane populacije. Ovadefinisanje epidemiološka strategija studijaupravljanja je dala i kontrole primer vektorautvrđivanja i patogenapolazišne bolesti tačke kroz za kontrolu biljaka rezervoara

fitoplazme, koje su najčešće i dualni domaćini, čime se istovremeno reguliše i populacija vektora.

127

5.4.3 Ukrštanje tuf-b puteva diseminacije 'Ca. P. solani' i vektorska uloga tri asocijacije u epidemiologiji Bois noir bolesti vinove loze

kretanjaKroz 'Ca. transinfek P. solani'cijske genotipova eksperimente, koji su verodostojno preslikali putevetuf-b u prirodi, otkrivenaH. je obsoletus kompleksnost epidemiološkog ciklusa kroz infekcijski umrežene tri asocijacije i njihove dualne domaćine. Iako elementC. arvensisi iste, V. epidemiologije, agnus-castus i genetičkiC. foetida različite, grade populacije vektora asocirane sa puteve prenošenja fitoplazme koji se selektivno ukrštaju u tačkama koje čine biljke dualni domaćini,Multigenska odakle se dalje širenje razuđuje 'Ca. P. u solani'više pravaca izolata vođenih dala je svakomuvid u prod asocijacija. karakterizacija i avac prenošenja određenog CPs genotipa, koj se činijegovog jasno usmerenizviranja samoiz biljke na začetku epidemiološkog puta, odnosno u momentu n dualnogulazi u tokove domaćina. ukrštanja Već prilikomi p prve nespecifične ishrane vektora, fitoplazma patogena (Bai et al. reklapanja epidemiološkog puta što utiče na samog 2006) i može biti uzrok parcijalneH. karakterizacijeobsoletus određenihU. izolatadioica. i epidemiološke neselektivnosti prisutne kod asocijacije sa pokazali da su sve tri testirane H. obsoletus

Postavljeni efikasni eksperimenti su a asocijacije izuzetakvektori i da svaka od njih uspešno inficira preostala dvC. foetidadomaćina. Jedini u unakrsnimV. agnus infekcijama-castus. Us je nedostatak inokulacije od strane asocijacije sa pešnost inficiranja „tuđeg“ domaćina implicira na sposobnost preuzimanja fitoplazme sa istog u momentima slučajne neselektivne ishrane na sintopskim lokalitetima. Da bi se ovo moglo empirijski potvrditi, neophodna je dopuna eksperimenata koja bi vodila u drugom pravcu,jedinki H. odnosno obsoletus podrazumevala ishranu laboratorijski odgajenih neinficiranih svake od asocijacija i njihovu kontrolisanu ishranu na inficiranim biljkama dualnim domaćinima. Molekularnim analizama insekata bi se moglo utvrditi da li su populacije vektora ove tri asocijacije sposobne da preuzmu fitoplazmu sa „neodgovarajućeg“ domaćina, u kolikom procentu i kojeg genotipa, a zatim i da li preuzetim CPs izolatimajer je laboratorijsko mogu inficirati gajenje druge H. biljke. obsoletus Ovakav tip eksperimenata nije jednostavan veoma

128 zahtevno (Sforza et al. et al.

1999; Cargnus 2012). Dok se ono metodološki u prirodi ne i pojednostavi, rezultati praćenja MLST genotipova stolbur fitoplazme transinfekcijskim eksperimentima mogu se uzeti kao dokaz umreženosti koja nastajeH. obsoletus kao posledica sposobnostituf- i preuzimanja i prenošenja fitoplazme od strane asocijacija b epidemiolgije. nadovezali na rezultate Utvrđenie Boisputevi noir transinfekcijau vin su editeran se a H. obsoletusmolekularne saepidemiologij V. agnus-castus. Genotipoviogradima 'Ca. P. solani' M i učešće asocijacije koji su detektovani u populacijama vektora,verovatno ali ne i u odgovarajućoj biljci dualnom domaćinu, poponcu i konopljici, su u prirodi ipak prisutni u biljkama, ali nisu detektovani usled nasumičnogšpekulativno uzorkovanjase asimptomatskih biljaka rezervoara patogena. Samo može govoriti o njihovom potencijanomovani. Ova hipoteza poreklu je rasv iz drugog,etljena „neodgovarajućeg“ domaćina u kojembiljaka su detekt vektora suprotne ogledima unakrsnog se inficiranja domaćina populacijoma asocijacije. Čak i ako uzme sa zadrškom nedoumic da li su populacije sposobne da unakrsno preuzmu fitoplazmu hraneći se na „neodgovarajućem“ domaćinu, možemo zaključiti da one imaju kapacitet'Ca. daP. nespecifičnomsolani' genotip ishranom unesu u domaćina druge asocijacije određeni prijemčiv svom „originalnom“ domaćinu. Na taj način biljka može postati rezervoar ovom genotipu koji asocirane populacijeC. foetida vektora mogu preuzeti i širiti u ekosistemu. koje jeAsocijacija ostvarilo sasuštinski zaslužuje da se istakne kao najznačajnije otkriće uzrokuje 'Ca. pomak u istraživanjukana epidemiologije bolesti koje P. solani' na širem području Bal . U nizu izuzetno značajnih i pionirskih nalaza koje su pružili sviH. epidemiološkiobsoletus eksperimenti, u prviC. planfoetida se, mogu istaći dokazi vektorske uloge populacija asociranihstatusa ove sa biljke kao izuzetno visoke CPs inficiranosti populacija i dokazanog dualnog domaćina. Ravnopravna uloga u disperziji CPs izolata u prirodnim ekosistemima je neupitna i to se jasno pokazalo H. obsoletus kroz najmanjetuf- podjednako uspešnesv inokulacije oglednih biljaka druge dve b asocijacije kao i og domaćina. Među genotipovima koji su preneti na ogledne biljke bilo je i izolata koji nisu prethodno detektovani ni u jednojC. foetida od prirodno inficiranih populacija, kao ni u prirodno inficiranim biljkama čime se takođe može 129 pretpostaviti da su ih

jedinke mogle preuzeti nespecifičnom ishranom iz druge dve biljke domaćina, ili iz drugih prirodno inficiranihH. obsoletus biljaka. gajenih biljaka Navode o L. bliskim angustifolia interakcijama populacija i (osim u slučaju ; Prilog. 1) trebalo bi Bois potpuno noir bolesti odbaciti vinove jer jedina loze, spona između njihje je CPs infekcija Kao na primeru H. obsoletus eksperimentalno(Sharon et al. pokazano da vinova loza ne podržava razviće 2015), usled čega tempo i pravac širenja infekcije diktirajuzasada, biljke ili dualni domaćini koje mogu biti korovske vrste unutar ili na obodu članovi okolnih nenarušenih biljnih zajednica. Sama vinova loza je povremeni i slučajni izvor hrane vektoru i ne predstavlja značajnu kariku u epidemiologiji bolesti jer na njoj insekt ne može izvršiti akviziciju fitoplazme već- samo može inokulacijom naneti štetu ovom krajnjem domaćinu (Boudon PadieuH. obsoletus 2000). Posebno značajni rezultati testovatuf- prenošenja koji pokazuju da sve tri asocijacije koje učestvuju u b epidemiologijiod 66% mogu do izuzetno uspešno inficirati vinovu lozu kao (procenat najuspešnijeg inficiranih vektora biljaka Bois noir 84%), potvrdili suprenetih reputaciju ove cikade bolesti. Poređenjem CPs genotipovajasnih MLST se izolata može kojezaključiti dele H. da obsoletus iako na nivou svih analiziranihC. arvensis uzoraka, V. agnus postoji-castus 5 i C. foetida (Prilog 6 asocijacijebiljaka sa vinove loze nije prenet ni ), u slučaju inficiranja oglednih jedan genotip od strane sve triC. arvensis asocijacije. i C. Epidemiološkafoetida (tuf- veza u CPs izolatima postoji izmeđuV. populacijaagnus-castus sa i C. foetida (tuf-b/STOL/V2-b/Rqg31/V14)C. arvensis i između i V. agnuspopulacija-castus sa TA), dok nisu preneli ni jedan zajednički genotip. NajvećaV. agnus pažnja-castus prilikom kako bi testova inficiranja vinovih loza je svakakoM bila usmerena na sekroz razumela k epidemiologija bolesti u editeranu. Osim složenih puteva prenošenjaH. obsoletusoje prolaze CPs izolati, pokazalo se da ova u Evropiputeve zapostavljena koji C. arvensisasocijacija, ne samo što ima upliv u epidemiološke počinju od vinograde inezavis šire se vezanim populacijama vektora, već i direktno unosi infekciju u no od ostalih biljaka dualnihV. agnus domaćina-castus i vektora. Praćenjem MLST izolata napravljena je veza između i sa njom asociranih populacija vektora kroz istovremenu detekciju CPs genotipova u prirodno inficiranim biljkama i adultima vezanim za nju. Ovaj nalaz je nadograđen 130 eksperimentalnom potvrdompoglavlje uspešnih 4.5.2, inokulacija mladica vektora konopljike sa C. od foetida strane je adulata ove asocijacije ( Slika 22). Asocijacija tuf- inficiralab/STOL/V2 66%- oglednih vinovih loza uz očekivanu dominaciju MLST genotipa za širenje 'Ca.TA P. čime solani' je ova biljka dualni domaćin utvrđena kao izuzetno značajna E infekcije u jugoistočnoj Evropi. je pidemiološki segmenta doktorske disertacijen obuhvatio vrlo opsežna terenska sakupljanja m terijala izuzetno kaog i kompleksg bogatsve eksperimentea 'Ca. P. solaniinokulacije' na teritoriji koji su rezultirali identifikacijom. stampgenetičko jugoistočne Evrope Među genotipovima detektovanim na ovom geografskomMediteran području veći je broj novih genotipova specifičnih za Balkan i istočni ili specifične biljne asocijacije, (uPrilog odnosu 6 .na Ukoliko ranije poznatese pretpostavi genotipove da i prisutne u centralnoj i zapadnoj Evropi ) et al. 2013 vektor i patogen imaju istočnomediteransko poreklo (Foissac ) može se pretpostaviti da određeni CPs genotipovi uspešno prodiru zajedno sesa navektorom tranzitnoj na prostorteritoriji zapadne Evrope i na tom putu se genetički menjaju, dok jugoistočne Evrope i dalje mogu detektovati, genotipovi koji su evolutivnoda bi stariji i vode poreklo iz centra diverziteta. Međutim može se pretpostaviti i diverzitetodnosu na CPstrenutn izolata u centralnoj i zapadnoj Evropi mogao biti znatno veći u o poznati ukoliko bi se istraživanja epidemiologije premestila kao iz strogih ciklusa koji se ostvaruju unutar. agroekosistema, u prirodne ekosisteme što je sprovedeno u ovom istraživanju

131

6. Zaključci

a -

Proučavanj populaciono genetičkih odnosa izmeđuHyalesthes asocijacija obsoletus koje na sa različitim biljkama domaćinima ostvaruje cikada vektor teritorijiputeve prenošenja jugoistočne biljnog Evrope patogena i posledice 'Candidatus specijalizacije populacija na epidemiološke doveli su do Phytoplasma solani' sledećih zaključaka: • H. obsoletus

Populacije na teritoriji Convolvulus jugoistočne arvensis Evrope, Urticasu u asocijacijidioica, Vitex sa jednomagnus-castus od četiri i Crepis biljke foetida domaćina:. • -

Populaciono genetičkim analizama mitohondrijskih H.i nuklearnihobsoletus markera (mikrosatelita)na utvrđena je kriptična diferencijacija C. arvensispopulacija i U. dioicatri , genetičke V. agnuslinije-castus uslovljene i (3 C. foetida biljkom. domaćinom: (1) • Analize (2)diverziteta, varijabilnosti,) genealogije i filogenije

, sprovedene na dva genska region mitohondrijske DNK 1.1%a, do pokazale 1.5%. su divergenciju između • tri detektovane genetičke grupe od H. obsoletus i

Genetičkenajsrodnije distancevrste Hyalesthesna niovu thracicus mtDNK ,između asocijacija . variraju između 2.1% i 3.3% ZabeleženaH. divergencija obsoletus sensu uz lato, detektovani stepen diferencijacije između asocijacijaove vrste. ide u prilog kriptične specijacije unutar • - H. obsoletus bazirane na

Analize populaciono genetičke strukture u jedan od mikrosatelitimatri klastera (7 lokusa), potvrdile su razdvajanje populacija genetička uslovljena i biljkom domaćinompripadnost uz ivisoku podršku klasteru(Evanno ΔK(3)=od > 803.72) populacioni procenat H. obsoletusodgovarajućem 90%. Isti obrazac klastriranja populacija je • pokazalo i filogenetsko stabloH. obsoletus bazirano na četiri mikrosatelitska lokusa.

Razdvajanje populacija uslovljeno specijalizacijom prema biljci domaćinu zabeleženo je i na nezavisno analiziranim sintopskim lokalitetima 132

C. arvensis/C. foetida, U. dioica/C. foetida i U. dioica/V. agnus-

castusasocijacija, 8% do 99%. • uz populacionuH. obsoletus pripadnost odgovarajućemV. agnus klasteru-castus od 6pokazale su

Populacije asocirane sa nedoslednost- grupisanja prilikom mitohondrijskih i mikrosatelitskih populaciono genetičkih analiza u zavisnosti analize od geografskogsu ukazale na porekla geneaološku (Crna Gora,s Grčka, Izrael). Mitohondrijske DNK C. foetidarodnost populacija izukazuje istočnog Mediterana sa haplotipovima populacija najverovatnijeasocijacije dogodio što na na proces Bliskog prelaska istoka na. novog domaćina koji se • Vrednosti Fuovog Fs i području D

Tadžiminog parametra testova neutralnostiH. obsoletus pokazali su statističkiU. dioica značajan signal ekspanzije populacija • asocijacije sa na širema H. području obsoletus jugoistočne Evrope. (C. arvensis,

ZaU. sve dioica četiri, V. biljke agnus domaćin-castus i C. foetida u jugoistočnoj Evropi prirodna ost sa 'Ca) . i asocirane populacije i insekta,njihova utvrđena je . inficiran Phytoplasma solani' • epidemiološka H.uloga obsoletus U jedinkama i biljkama dualnim domaćinima8 'Ca. P. solani' na teritoriji MLST jugoistočne Evrope detektovano je ukupnotuf, stamp 2 i vmp1. • genotipovaU okviru izolata okarakterisanih 'Ca. na tri gena: jedinki H. obsoletus Phytoplasma solani' koji potiču iz prirodno inficiranih , biljaka dualnihtuf tipa domaćina (tuf-a, i tuf eksperimentalnih-ab i tuf- biljaka,stamp utvrđenogenotipova je (15 prisustvo prvi put registrovanih sva tri vmp1 profila. b), 27 • ) i 11 'Ca. P. solani' detektovaNekompatibilnost standardnih prajmera sa izolatima nim u jugoistočnoj Evropi i delimično uspešna primena novodizajniranih prajmera i metoda analiza ukazuju na genetički diverzitet • ovogTuf-a/ biljnogtuf- patogena čije proučavanje'Ca. P. solani' zahteva nova metodološka rešenja.U. dioica ab epidemiološki tip vezan je isključivo za asocijaciju vektora.

133

• Tuf-ab tip U. dioica

19-25 stampporeklom genotip sa i V3 ili V18je u vmpjugoistočnoj1 profile Evropi što ukazuje vezan isključivona njegovu za

• Tufgenetičku- homogenost. 'Ca. P. solani' vezan je za C. arvensis, V. agnus-castus i C. foetidab epidemiološki tip • asocijacije 'Ca. P. solani' vektora MLST čije segenotip epidemiologije tuf-b/STOL/V2 preklapaju-TA identifikovan i ukrštaju. u H.Dominantni obsoletus sa C. foetida, ukazuje na izuzetno stabilnu tri asocijaciji biljke dualnog . trofičku • Preplitanjeinterakciju izmeđutuf-b puteva vektora, prenošenja patogena i 'Ca. domaćina H. obsoletus ex C. arvensis i ex V. agnusPhytoplasma-castus detek solani'tovano od stranein situ populacija u mediteranskimH. vinogradimaobsoletus ex C., foetida dodatno. je umreženo transinfekcijskim • eksperimentima 'Ca. na ogledne biljke pokazanaEksperimentima je vektorska transmisije uloga H. obsoletusPhytoplasma solani'a sa C. arvensis, V. agnus- castus i C. foetida -indukovaneasocijacij Bois noir bolesti vinove loze u u epidemiologiji CPs jugoistočnoj Evropi.

134

7. Literatura

Aleksić Ž, ŠutićHyalesthes D, Aleksić obsoletus D (1967) Transmission intensity ofZaštita stolbur bilja virus, 93– 95, by means67–73. of Sign. on some host plants. Plant pests

Alford DV (2011) (Vol. 116). HarperCollins UK.Denisia, 176, 531 – 538.

Alma A (2002) Auchenorryncha as pests on grapevine.-Pad Flavescence

Angelinidorée E, Clair D, Borgo M, Bertaccini- A, Boudon ieu E (2001) in France and Italy Occurence of closely related phytoplasma isolates and their near relationshipsVitis, 40 , to 79 Palatinate - 86. grapevine yellows and an alder yellows phytoplasma.

Aplin KP, Suzuki H, Chinen AA, Chesser RT, Have J, Donnellan SC, Austin J, Frost A,- Gonzalez JP, Herbreteau V, Catzeflis F, Soubrier J, Fang YP, Robins J, Matisoo Smith E, Bastos ADS, Maryanto I, Sinaga MH, Denys C, Van Den Busscheins RA,of Conroy C, Rowe K, Cooper A (2011) Multiple geographicPloS one orig, 6 commensalisme26357. and complex dispersal history of black rats. (11), -

Aryan' Candidatus A, Brader G, Mörtel J, Pastar M, Riedle Bauer M (2014) An abundant Phytoplasma, stinging solani' nettle Stolbur and tuf Hyalesthes b phytoplasma obsoletus . European strain is Journalassociated of Plant with Pathologygrapevine, 140, 213-227.

Aryan A, Musetti R, Riedle‐Bauer M, Brader G (2016) Phytoplasma Transmission by Heterologous Grafting Influences Viability of theJournal Scion and of PhytopathologyResults in Early, 16,Symp 631tom-640. Development in Periwinkle Rootstock.

Atanasova B, Jakovljević M, Spasov D, Jović bois J, Mitrović noir M, Toševski I, Cvrković T (2015)‘Candidatus The molecularPhytop epidemiology of grapevine yellows causedEuropean by Journal of Plant Pathologylasma , 142, solani’ 759 in-770. the Republic of Macedonia.

135

Bai X, Zhang J, Ewing A, Miller SA, Radek AJ, Shevchenko DV, Tsukerman K, Walunas T, Lapidus A, Campbell JW, Hogenhout SA (2006) Living with genome instability: the adaptation Journal of phytoplasmasof Bacteriology to, diverse environments-3696. of their insect and plant hosts. 188(10), 3682

Berlocher HS, Feder JL (2002) SympatricAnnual Review speciation of Ent omology in phytophagous, 47, 773–815. insects: moving beyond controversy? Host-

Bernays EA, Chapman RF (2007) plant selection by phytophagous insects (Vol. 2). Springer Science & Business Media.

BertacciniFrontiers A in (2007) Bioscience Phytoplasmas:, 12, 673-689. diversity, taxonomy, and epidemiology. Ber

tinHyalesthes S, Picciau L, Ács Z, Alma A, Bosco D (2010) Molecular identification of the speciesAnnals (Hemiptera:of Applied Biology Cixiidae), 157, 435 occurring–445. in vineyard agroecosystems.

Bickford D, Lohman DJ, Sodhi NS, Ng PK, Meier R, Winker K, IngramTrends K, Das in I Ecology(2007) Cryptic& Evolution species, as a window-155. on diversity and conservation. Boudon- 22(3), 148

Padieu E (2000) Recent advances on grapevine yellows: detection, etiology, epidemiology-88. and control strategies. In: Proceedings 13th ICVG BoudonConference,- pp. 87

Padieu E (2003) The situation of grapevine yellows and current research directions: distribution, diversity, vectors, diffusion and for control.the Study In:of ProceedingsVirus and Virus of the- 14th Meeting of the International Council Italy, pp. 47-53. like Diseases of the Grapevine (ICVG), Locorotondo (Bari), ‐

Bressan A, Turata R, MaixnerHyalesthes M, Spiazzi obsoletus S, Boudonliving onPadieu nettles E, and Girolami trans V (2007) Vector activity of Annals of Appliedmitting Biology a, 150stolbur phytoplasma-339. to grapevines: a case study. (3), 331

136

Brownhost JM,- Abrahamson JG, Way PA (1996) MitochondrialEurosta DNA solidaginis phylogeography of Tephraces ofEvolution the goldenrod, 50, 777 ball–786. gallmaker, (Diptera: ritidae).

Brown JK (2004) TracingGenetics, the origin evolution, of cryptic and biological insect pests control, and 113 vectors,-132. and their natural enemies. - Brunnerdifferentiation PC, Chatzivassiliou in Thrips EK, tabaci Katis NI, Frey JE (2004) Host associated genetic Heredity(Insecta; Thysanoptera),-370. as determined from mtDNA sequence data. , 93 (4), 364 CargnusHyalesthes E, Pavan obsoletus F, Mori N, Martini M (2012) Identification and phenology of instars. Bulletin of entomological(Hemiptera: research Auchenorrhyncha:, - 514. Cixiidae) nymphal 102(05), 504

Caterino MS, Cho S, Sperling FAH (2000) TheAnnual curr reviewent state of entomology of insect molecular, - 54.systematics: a thriving Tower of Babel. 45(1), 1

Chabirand A, Loiseau M, Renaudin I, Poliakoff F (2017) Data processingon of qualitativeFlavescence results dorée from an interlaboratory comparison for the detecti “ ” phytoplasma: How the use of statistics can improve PloS the reliabilityone, of the method validation process in plant pathology. 12(4), p.e0175247.

Chapuispopulation MP, Estoup differentiation. A (2007) Molecular Microsatellite Biology nulland Evolution alleles and, 24, estimation621–631. of

Chen H, White DJ, Caraco TB, Strattonate, HH 1990 (2005)–2000. Epidemic Journal and of medical spatial dynamicsentomology of, 42,Lyme 899 disease–908. in New York St

Christensen NM, Axelsen KB, Nicolaisen Trends in M, plant Schulz science A (2005), 10, 526 Phytoplasmas-535. and their interactions with hosts. Flavescence dorée

ChucheScaphoideus J, Thiéry Dtitanus (2014) Biology Agronomyand ecology for ofsustainable the development vector 381-403. : a review. , 34(2),

137

Candidatus

Chuche J, Danet JL, Salar P, FoissacReptalus X, Thiéry quinquecostatus D (2016) Transmission of ‘ PhytoplasmaAnnals of Applied solani’ Biology by, 169 -223. (Hemiptera: Cixiidae). (2),- 214

Chuche J, Danet JL, Rivoal JB, Arricau Bouvery N, Thiéry D (2018)Salvia Minor sclarea cultures as hosts for vectors of extensive crop diseases: Does Journal of Pestact Science as a, pathogen and–155. vector reservoir for lavender decline? 91(1), 145

Cimermanvmp A, Pacifico D, Salar P, Marzachì C, Foissac X (2009) Striking diversity of 1, a variableApplied gene and encoding environmental a putative microbiol membraneogy, 75protein of the-2957. stolbur phytoplasma. - (9), 2951

Clair D,sensitive Larrue diagnosisJ, Aubert G,of GilletFlavescence J, Cloquemin dorée G,and Boudon Bois noirPadieu E (2003) Direct nested- Extendedusing abstracts a multiplex 14th MeetingPCR ICVG, assay Locorotondo, and its Italy use, 13 in -17. field surveys.

Clementgenealogies. M, Posada Molecular D, Crandall Ecology K (2000), 9, 1657 TCS:– a1660. computer program to estimate gene

Constable F (2010) Phytoplasmaseds. epidemiology: grapevines as a model. In: Weintraub GP, Jones P, Phytoplasmas:– 212. Genomes, Plant Hosts, and Vectors. Wallingford, UK: CABI Publishing, 188

Coope GR (2004) Several million years of stability Philosophicalamong insect Transactionsspecies because of the of, Royalor in Society spite of, B: IceBiological Age climatic Sciences instability?, -214. 359(1442), 209

COST andsurroundings. action FA 0807 2014 Phytoplasma diseases and vectors in Europe

http://www.costphytoplasma.ipwgnet.org/InsectVectors.htmT, , Mitrovi M, O, Toševski I (2014

Cvrković Jović J Reptalusć Krsti panzerić ) Experimentalbois noir. Plant and Pathologymolecular, evidence63, 42-53. of as a natural vector of

138

Daire X, Clair D, Reinert W, Boudon Padieu E (1997) Detection and differentiation of grapevine yellows phytoplasmas belonging to the elm yellows- group and Europeanto the stolbur Journal subgroupof Plant Pathology by PCR, 103 amplification-514. of non ribosomal DNA. (6), 507

Darriba D, Taboada GL, Doallo R, PosadaNature D (2012) Methods jModelTest2:, 9, 772. more models, new heuristics and parallel computing. Bemisia tabaci

De Barro P, Ahmed MZ (2011) Genetic networking of the PLoScryptic One, species complex reveals pattern of biological invasions. 6(10):e25579.21998669 https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0025579 PMID:

Diehl biotypes. SR, Bush Annual GL (1984) review Anof entomology evolutionary, 29 and applied-504. perspective of insect (1), 471 -like

Doi Y, Teranaka M, Yor K, Asuyama H (1967) Mycoplasma or PLT group microorganisms found in the phloem elements of plants infected with mulberryAnnals dwarf, of potatothe Phytopathological witches' broom, Society aster yellows,of Japan , or33, paulownia 259 – 266. witches' broom. –

Drès M, Mallet J (2002) Host racesPhilosophical in plant feeding Transactions insects of and the their Royal importance Society in of sympatricLondon B: Biological speciation. Sciences , 357 -492. (1420),Eurhadi 471na

Drosopoulos S (1999)E. remanei On the genus HAUPT from Greece, with description of sp.n.Reichenbachia (Hemiptera:, 33,Auchenorrhyncha: 131-135. Cicadomorpha: Cicadellidae: Typlocibinae).

Đurić Hyalesthes Z, Hrnčić S, obsole Delićtus D (2017) Morphological and molecular identification of vineyards. MitteilungenSignoret Klosterneuburg (Auchenorrhyncha:, 67, 177–181. Cixiidae) in Herzegovina

Earl DA, vonHoldt BM (2012) STRUCTURE HARVESTER: a website and program forConservation visualizing Genetics STRUCTURE Resources output, 4, 359 and-361. implementing the Evanno method.

139

EFSA CandidatusPanel on Plant Health (2014) ScientificEFSA Journal Opinion on the pest categorisation of Phytoplasma solani. , 12(12), 3924. be to its

Elliot SL, AdlerEcology, FR, Sabelis 84, 2568 MW–2574. (2003) How virulent should a parasite vector?

Ember I, Acs Z, Munyaneza JE, Crosslin JM, Kölber M (2011) Survey and molecular detectionEuropean of phytoplasmas Journal of associatedPlant Pathology with, potato130, 367 in- 377.Romania and southern E Russia.

melyanov AF (1995) TheZoologicheskii new taxa of Zhurnal the tribe Pentastirini (Homoptera, Cixiidae) from Palaearctic. , 74(9), 73−89.

Endersby NM, McKechnie SW, Ridland PM, Weeks AR (2006) Microsatellites reveal a lack of structure inMolecular Australian Ecology populati. 15,ons 107 – of118. the diamondback moth, Plutella xylostella (L.).

Evanno G, Regnaut S, Goudet J (2005) Detecting the number of clustersMolecular of individualsEcology, 14, using2611- 2620. the software STRUCTURE: a simulation study.

Excoffier L, Lischer HEL (2010) Arlequin suite ver 3.5: a new series of programsMolecular to Ecologyperform Resources, population 10, genetics 564–567. analyses under Linux and Windows. -

Fabiszewski AM, Umbanhowar J, Mitchell CE (2010) Modelling landscape scale pathogenand kudzu. spillover Ecological between Applications, domesticated 20, 582 and–592. wild hosts: Asian soybean rust

Fabreprotein A, Danet gene JL, Foissac stamp X (2011a) The stolbur phytoplasma antigenic membraneGene, -41. is submitted to diversifying positive selection. 472(1), 37

Fabre A, Balakishiyeva G, Ember I, Omar A, Acs Z, Kölber M, Kauzner L, Della Bartola M, Danet JL, Foissac X (2011b) StAMP encoding the antigenic membraneepi proteinBulletin ofof Insectology stolbur phytoplasma, 64, 21-22. is useful for molecular demiology.

140

Falush D, Stephens M, Pritchard JK (2003) Inference of population structure using multilocusGenetics, 164, genotype 1567-1587. data: linked loci and correlated allele frequencies.

Felsenstein J (2010) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.69. Distributed by the author. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle

Fernández‐Palacios JM, Whittaker Journal RJ (2008) of Biogeogr The aphy Canaries:, an - important387. biogeographical meeting place. 35(3), 379

Fialová R, Válová P, Balakishiyeva G, Danet JL, Šafárová D, Foissac X, Navrátil M (2009) Genetic variability of stolburJournal phytoplasmaof Plant Pathology in annual crop and-416. wild plant species in south Moravia. , 91(2), 411 'Candidatus

Firrao G, Gibb K, StretenJournal C (2005) of Plant Short Pathology taxonomic, 87, 249 guide-263. to the genus Phytoplasma'.-

Firrao G, Garcia Chapa M, Marzachi C (2007) Phytoplasmas:Frontiers genetics, in Bioscience diagnosis: a journaland relationships and virtual withlibrary the, 12, plant 1353 and–1375. inse ct host. -

Foissac X, CarleCandidatus P, Fabre A, Salar P, Danet JL, STOLBUR EUROMED consortium (2013)in the ‘Euro- Phytoplasma solani’ genome project and genetic diversity Mediterranean basin. In: Abstracts, 3rd–13 European Bois Noir Workshop, March 22‒23, 2013, Barcelona, Spain, 11 tibody

Fos A, Danet JL, Zreik L, Garnier M, Bové JM (1992) Use of a monoclonal an to detect the stolbur mycoplasmalikePlant disease organism, 76 in plants-1096. and insects and to identify a vector in France. (11), 1092

Fu YX (1997) Statistical tests of neutrality ofGenetics mutations, 147 against population-925. growth, hitchhiking and background selection. -Molard M,(2), Boudon 915 -

Gatineau F, Larrue J, Clair D, Lorton F, Richard Padieu E (2001) APentastiridius new natural planthopper vector ofEuropean stolbur Journalphytoplasma of Plant in thePathology genus, 107, 263–271. (Hemiptera: Cixiidae).

141

GoudetJournal J (1995) of heredity FSTAT ,(Version 86, 485– 1.2):486. a computer program to calculate F statistics. Hyalesthes obsoletus Signoret

Güclü S, Ozbek H (1988) Erzurum kosullarrinda Turkiye (Homoptera;Entomoioji Dergisi Cixiidae), 12, 103 un–111 biyolojisi. hzerinde bazi calismalar.

Hebert PD, CywinskaProceedings A, Ball of SL the (2003) Royal Biological Society of identificationsLondon. Series through B, Biological DNA barcodes.sciences –321. , 270(1512), 313

Hebert PD, Penton EH, Burns JM, Janzen DH, Hallwachs W (2004) Ten species in one:butterfly DNA Astraptes barcoding fulgerator reveals. Proceedings cryptic species of the National in the neotropical Academy of Sciences skipper of the United States of America, 101, 14812–14817.

HebertSystematic PD, Gregory biology TR, 54 (2005) The-859. promise of DNA barcoding for taxonomy. (5), 852

Hedin MC (1997) Molecular phylogenetics at the population/speciesNesticidae interfaceNesticus in. Molecularcave spiders Biology of the and southern Evolution Appalachians, 14, 309–324. (Araneae: : )

Hewitt GM (1996) Some geneticBiological consequences journal of the ice Linnean ages and Society their, 58, role 247 in- 276.divergence and speciation. - - Biological journal

Hewittof GM the (1999)Linnean Post Societyglacial, 68, re 87colonization-112. of European biota.

Hoch Hyalesthes H (1986a) Patterns of geographic distribution in the planthopper genus Sign. (Homoptera: Fulgoroidea Cixiidae): A phylogenetic approach. In: Drosopoulos, pp. 31 S.– 32, (ed), Proceedings of the1986. 2nd International Congress of Rhynchota Mikrolimni, Greece,

Hoch H (1986b) Acht neue Arten derMarburger Gattung Entomologische Hyalesthes Signoret, Publicationen 1865, 2(Homoptera-122. Fulgoroidea Cixiidae). (3), 87

142

-Gattung

Hoch H, Remane R (1985) Evolution und Speziation der Zikaden HyalesthesMarburger SIGNORET, Entomologische 1865 (Homoptera Publikationen Auchenorrhyncha, 2, 1-427. Fulgoroidea Cixiidae).

Hogenhout SA, Redinbaugh MG,Trends Ammar in Microbiology E (2003) Plant, 11, 264 and– 271. animal rhabdovirus host range: a bug’s view.

Hogenhout SA, Oshima K, Ammar ED, Kakizawa S, Kingdom HN, NambaMolecular S (2008) Plant Phytoplasmas:Pathology, 9, 403 bacteria-423. that manipulate plants and insects. Lecture

Holsingernotes K in (2012) population Tajima’s genetics D, Fu’s, 239 Fs,–244. Fay and Wu’s H, and Zeng E et al.’s.

HorowitzBemisi AR,a tabaci Ishaaya I (2014) Dynamics of biotypes B and QPest of Management the whitefly Science and its impact-1572. on insecticide resistance. 24488629, 70(10), 1568 https://doi.org/10.1002/ps.3752 PMID: Glasnik

HorvathHrvatskoga G (1891) Naravoslovnoga Hemipterološki Drustva, izlet 4, u 29 Primorje-49. i Plitvička jezera.

Hudson RR, Slatkin M, MaddisonGenetics WP, 132, (1992) 583– Estimation589. of levels of gene flow from DNA sequence data.

Huelsenbecktrees. BioinformaticsJP, Ronquist , F17, (2001) 754– 755.MRBAYES: bayesian inference of phylogenetic

Hunter MD (2002)Agricultural Landscape and Forest structure, Entomology habitat .fragmentation, 4, 159–166. and the ecology of insects. -

Imo M, Lüneburg J, Hankeln T, Seitz A, Johannesen J (2011) Highly polymorphic di and trinucleotideHyalesthes obsoletus microsatellite markers for the grapevineEuropean yellows Journal disease of vectorEntomology , 108 . (Auchenorrhyncha: Cixiidae). (1), 161

Imo M, Maixner M, Johannesen‐ J (2013) Sympatric diversification vs. immigration: deciphering host plant specialization in a polyphagous insect, the stolbur

143

Hyalesthes obsoletus Molecular ecology, 22

phytoplasma2188-2203. vector (Cixiidae). (8), Candidatus -less, non-

IRPCM (2004) ' Phytoplasma', a taxon for theInternational wall Journalhelical of prokaryotesSystematic and that Evolutionary colonize plant Microbiology phloem ,and 54, 1243insects. – 1255. -

Jeger M, Bragard C, Caffier D, Candresse T, Chatzivassiliou E, Dehnen Schmutz K, Gilioli G, JaquesMiret JA, MacLeod A, Navajas Navarro M, Niere B, Parnell S, Potting R, Rafoss T, Urek G, Rossi V, Van Bruggen A, Van Der- Werf W, West J, Winter S, Bosco D, Foissac X, Strauss G, Hollo G, Mosbach SchulzFlavescence O, Grégoire dorée JCfor (2016) the ScientificEU territory.opinion on theEFSA risk to Journal plant health of , 14(12), 4603, 83. doi:10.2903/j.efsa.2016.4603.

Johannesen J, Lux B, Michel K, Seitz A, Maixner M (2008) Invasion Hyalesthes biology obsoletus and host in specificityEurope. Entomologia of the grapevine Experimentalis yellows et diseaseApplicata vector, 126, 217–227.

Johannesenhost- J, Foissac X, Kehrli P, Maixner M (2012) Impact of vector dispersalPLoS and ONE, plant7, e51809. fidelity on the dissemination of an emerging plant pathogen.

Johannesenst J, Riedle‐Bauer M (2014)Hyalesthes Origin obsoletus of a sudden mass occurrence Annals of the ofolbur Applied phytoplasma Biology, vector -495. (Cixiidae) in Austria. 165(3), 488

Jović J, Cvrković T, Mitrović M, Krnjajić S, Redinbaugh MG, Pratt RC, GingeryReptalus RE, Hogenhoutpanzeri SA, Toševski I (2007) Roles of stolbur phytoplasma and Serbia. European(Cixiinae, Journal Auchenorrhyncha) of Plant Pathology in the, epidemiology118 -89. of Maize redness in (1), 85

Jović, J, Cvrković T, Mitrović M, Krnjajić S, Petrović A, Redinbaugh MG, Pratt RC, Hogenhoutby Reptalus SA, panzeri Toševski I (2009) Stolbur phytoplasma transmission to maizeerbia. Phytopathology and the-1061. disease cycle of maize redness in S , 99(9), 1053

144

Kabis MA, KhushOryza sativaGS (1988) Plant Genetic Breeding analysis, 100, of resistance54–58. to brown planthopper in rice ( L.). ‐ ‐type‐I

Kaul C, Seitz A, Maixner M, JohannesenHyalesthes obsoletusJ (2009) Infection of Bois Noir tuf stolbur phytoplasma in Journal of Applied Entomology(Hemiptera:, Cixiidae) -larvae601. and influence on larval size. 133(8), 596

Kessler S, Schaerer S, Delabays Hyalesthes N, Turlings obsoletus TC, Trivellone V, Kehrli P (2011) Host plant preferences of Entomologia, the vector Experimentalis of the grapevine et Applicata yellows, 139,disease 60 -67. ‘bois noir’, in Switzerland.

Knowles LL (2001) Did the Pleistocene glaciations promote Molecular divergence? Ecology Tests, of explicit691-701. refugial models in montane grasshopprers. 10(3),

Kosovac A, JJohannesen J, Krstić O, Mitrović M, Cvrković T, Maixner M, Toševski I, Jovićof Hyalesthes(2013) obsoletusMicrosatellite populations and mtDNA evidence for genetic differentiation -beard (Crepis foetidaassociated with a new. Proceedings major host, of stinkingthe 3rd European hawk’s Bois Noir Workshop, 18), - in19. Southeast Europe

KosovacCrepis A, Jakovljević foetida L. – M, Krstić O, Cvrković T, MitrovićHyalesthes M, Toševski obsoletus I, Jović J (2014) nova biljka domaćin cikade Zaštita biljaSIGNORET- 186514. (Hemiptera: Cixiidae), vektora stolbur fitoplazme. , 65(1), 7

Kosovac A, Radonjić S, Hrnčić S, Krstić O, Toševski I, Jović J (2016a) Molecular tracing of the transmission routes of bois noir in Mediterranean vineyardsVitex of Montenegroagnus-castus and experimental evidence for theHyalesthes epidemiological obsoletus role of Plant Pathology(Lamiaceae), 65, 285-298. and associated (Cixiidae).

Kosovac(2016 A, b JohannesenHyalesthes J, Krstić obsoletus O, Mitrović M, Cvrković T, Toševski I, Jović J ) Is a - species complex undergoing cryptic speciation?Southeast Europe. More Mitteil evidenceungen of Klosterneuburg host associated, 66, genetic 24-25. differentiation in

145

Kosovac(2016 A, Krstić O, JakovljevićCandidatus M, Cvrković T, Mitrović M, Toševski I, Jović J c) Elucidation of ' phytoplasma solani' epidemiology through trac(k)ingMitteilungen transmission Klosterneuburg pathways, 66, using 9-11. field, experimental and molecular data.

Kosovac A, Johannesen J, Krstić O, Mitrović M, Cvrković T, Toševski I, JovićHyalesthes J (2018) Widespreadobsoletus plant specialization in the polyphagous planthopper (Cixiidae), a major vector of stolbur phytoplasma: Evidence of cryptic speciation. PLOS ONE, 13(5), p.e0196969.

Krstić O, Radonjić S, Hrnčić S, Cvrković T, Mitrović M, Kosovac A, Toševski I,Zaštita Jović J (2012)bilja, 63 Diverzitet, 107–112. faune Auchenorrhyncha u vinogradima Crne Gore. -

Kurbalija Novičić Z, Immonen - E, Jelić M, Anđelković M, Stamenković Radak M, Arnqvistrate in Drosophila G (2015). subobscura Within population. Journal ofgenetic Evolutionary effects Biologyof mtDNA, 28, on 338 metabolic–346.

Landi L, Riolo P, Murolo S, Romanazzi G, NardiHyalesthes S, Isidoro obsoletus N (2015) Genetic variability of stolbur phytoplasma in (Hemiptera:Journal of Cixiidae)economic entomology and its main, 108, host 1506 plants–1515. in vineyard agroecosystems.

Langer M, Darimont H, IOBC Maixner wprs MBulletin (2003), 26 Control - of202. phytoplasma vectors in organic viticulture. (8), 197

Langer M, Maixner M (2004) Molecular characterisation of grapevine yellows- associated phytoplasmasVitis, 43, 191of the–199. stolbur group based on RFLP analysis of non Lee IM,ribosomal Gundersen DNA.-

Rindal DE, Davis RE, Bartoszyk IM (1998) Revised classification scheme of phytoplasmas basedInternational on RFLP Journ analysesal of Systematic of 16S rRNA and and Evolutionary ribosomal Microbiologyprotein gene, sequences.48, 1153-1169. -

Lee IM, Davis RE,. Annual Gundersen Review Rindalof Microbiology DE (2000), 54, Phytoplasma:221-55. phytopathogenic mollicutes

146

Lee IM, Martini M, Bottner KD, Dane RA, Black MC, Troxclair N (2003) Ecological implications from a molecular analysis of phytoplasmasPhytopathology involved, 93 in an aster- yellows1377. epidemic in various crops in Texas. (11), 1368 , Boudon-

Lefol C, Lherminier J Padieu E, Larrue J, Louis - C, Caudwell A (1994) Propagation of flavescenceEuscelidius doree variegatus MLO (Mycoplasma. Journal of InvertebrateLike Organism) Pathology in the, leafhopper63, 285-293. vector

Lessio F, Tedeschi R, Alma A (2007) PopulationHyalesthes dynamics, obsoletus host plantsSignoret and in infection north- rate with StolburJournal phytoplasma of Plant Pathology of -102. western Italy. , 89(1), 97

Lorenz KH, Schneider B, Ahrens U, Seemüller E (1995) Detection of the apple proliferation and pear decline Phytopathology phytoplasmas , by 85, PCR771– 776. amplification of ribosomal and nonribosomal DNA. -based analysis of

Mahukuplant, GS fung(2004) A simple extractionPlant method Molecular suitable Biology for PCR Reporter, 22, 71-81. al, and bacterial DNA.

Maixner M (1994) Transmission of German Hyalesthes grapevine obsoletus yellows (Vergilbungskrankheit) by Vitis the, 33, 103 planthopper–104. (Auchenorrhyncha: Cixiidae).

Maixner M, Ahrens U, Seemüller E (1994) Detection of mycoplasmalike organismsJournal of associatedPhytopathology with, 142 a yellows-10. disease of grapevine in Germany. , Langer M (2006(1), 1 Hyalesthes obsoletus,

Maixner M ) Prediction of the flight of . IOBC wprs Bulletinvector, 29, of161 stolbur–166. phytoplasma, using temperature sums

MaixnerHyalesthes M, Johannesen obsoletus J, Michel K, Lux B, Seitz A (2007) Host plant specificity Bulletin of of Insectology, 60, 399and–400. consequences for ‘‘bois noir’’ epidemiology.

147

Maixner M (2010) Phytoplasmas epidemiological systems with multiple plant hosts. In: Phytoplasmas: Genomes, Plant Hosts and Vectors (ed. Weintraub &, Jones), CABI Publishing, Wallingford,Bois UK,noir 213‒232. Petria, 21, 17–32.

Maixner M (2011) Recent advances in research.

Maixner M, Albert A, Johannesen J. (2014) Survival relative to new and ancestral host plants, phytoplasma infection,Ecology and genetic and evolutionconstitution, 4 in host races-3092. of a Mannellipolyphagous A, Bertolotti insect L disease vector. Borrelia(15), burgdorferi 3082 sensu

lato , Gern L, Gray J (2012) Ecology of- in Europe: transmission dynamics in multi host systems,FEMS microbiology influence of molecularreviews, 36, processes837–861. and effects of climate change.

Maniyar B, Kehrli P, Johannesen J (2013)Hyalesthes Population obsoletusstructure and incidence of the stolbur phytoplasma vector Journal of Applied En(Cixiidae)tomology among geographic589–600. regions in Switzerland. , 137(8),

Marcone C, Ragozzino A, Seemuller E (1997) Dodder transmissionCatharanthus of alder yellows roseus phytoplasma European to the Journal experimental of Forest Pathology host, 27, 347-350. (periwinkle).

Marcone C, Hergenhahn F, Ragozzino A, Seemüller E (1999) Dodder transmission of pear decline, European stone fruit yellows, rubus stunt, picris Journal echioides of yellowsPhytopathology and cotton, 147, 187 phyllody-192. phytoplasmas to periwinkle.

Martini M, Lee IM, Bottner KD, Zhao Z, Botti S, Bertaccini A, Harrison-based NA, phylogenyCarraro L, Marcone C, Khan AJ, Osler R (2007) Ribosomal protein gene International forJournal finer of Systematic differentiation and Evolutionary and classification Microbiolog of phytoplasmas.y,

57, 2037‒2051. -

McPheron BA (2000) Population genetics and cryptic species. In Tan, K. H., (Ed). Areasains wideMalaysia, control Peneng. of fruit 483 flies–490. and other insect pests. Pernerbit Universiti

148

Mitrović M, Jakovljević M, Jović J, KrstićCandidatus O, Kosovac A, Trivellone V, Jermini M, Toševski I, Cvrković T (2016) ‘ phytoplasmaHyalesthes solani’ genotypes obsoletus associatedand Reptalus with panzeri potato stolbur in Serbia and the role of European Journal of Plant Pathology(hemiptera,, 144 cixiidae)-630. as natural vectors. (3), 619

Moritz C, Patton JL, Schneider CJ, Smith TB (2000) Annual Diversification Review of of Ecology rainforest and Systematicsfaunas: an , integrated -563. molecular approach. Moya- 31(1), 533

Raygoza G, Nault LR (1998) Transmission biology of maize Annals bushy of stunt the phytoplasmaEntomological by Society the corn of America leafhopper, 91, 668(Homoptera:-676. Cicadellidae).

Mullen SP, Shaw KL (2014) Annual Insect review Speciationof entomology Rules:, 59, 339 Unifying-361. Concepts in Speciation Research.

Murolo S, Marcone C, Prota V, Garau R, Foissac X, Romanazzi G (2010) Genetic variabilityand vegetables. of the Journal stolbur of phytoplasmaApplied Microbiology vmp1 gene in grapevines,2049-2059. bindweeds , 109(6), (2013

Murolo S, Marcone C, Prota V, Garau R, Foissacvmp1 X,gene Romanazzi in G ) Genetic variability of the stolbur phytoplasma grapevines,Journal bindweeds of Applied andMicrobiology vegetables, 115, (corrigendum 631–633. to vol 109, pg 2049, 2010). Murolo S, - Candidatus

Romanazzi G (2015) In vineyard population structure of ' Infection, PhytoplasmaGenetics and Evolution solani', 31, 221 using-230. multilocus sequence.

Murral DJ, Nault LR, Hoy CW, Madden LV, Miller SA (1996) Effects of temperature and vector age on transmission of two Ohio strains of asterJournal yellows of phytoplasmaEconomic Entomology by the aster, 89, 1223 leafhopper-1232. (Homoptera: Cicadellidae).

149

ording the

Murray RGE, Schleifer KH (1994) Taxonomic notes: International a proposal Journal for rec of Systematic propertiesand Evolutionary of putative Microbiology taxa of ,procaryotes. 44, 174-176.

Nei M, Li WH (1979) MathematicalProceedings model for ofstudying the National genetic Academy variation of inSciences terms of therestriction United Statesendonucleases. of America , 76, 5269–5273.

Nickel H (2003) The Leafhoppers and Planthoppers of Germany (Hemiptera, Auchenorrhyncha): Patterns andPublishers, strategies Bulgaria. in a highly diverse group of phytophagous insects. Pensoft , (1997

Olmstead KL, Denno RF, Morton TC Romeo JT ) InfluenceSpartina of alterniflora Prokelisia. Journalplanthoppers of Chemical on amino Ecology acid, 23, composition 303-321. and growth of

Pacifico D, Foissac X, Veratti F, Marzachi C (2007)Bulletin Genetic of Insectology diversity of Italian and French ''bois noir'' phytoplasma isolates. , 60(2), 345.

Pacifico D, Almaterization A, Bagnoli of B,Bois Foissac noir X, Pasquini G, Tessitori M, Marzachì C (2009) Charac - isolates by restriction fragment length Phytopathologypolymorphism , 99 of a Stolbur-715.specific putative membrane protein gene. (6), 711

Peccoud J, Labonne Cacops G,ylla Sauvion pruni N (2013)PLoS Molecular ONE, Test to Assign Individuals within the Complex. 8(8): e72454.

Quaglino‘Candidatus F, Zhao Y, Casati P, Bulgari D, Bianco PA, Wei W, Davis RE (2013)-and bois noir-relatedPhytoplasma diseases solani’, of plants. a novel International taxon associated journal of with systematic stolbur and evolutionary microbiology, -2894.

63(8), 2879

Quaglino F, Maghradze D, Casati P, Chkhaidze N, Lobjanidze M, Ravasio A, Passera A, VenturiniCandidatus G, Failla O, Bianco PA (2016) Identification and characterization ofdisease new in ‘ Vitis viniferaPhytoplasma solani’ strains associated with bois noir L. cultivarsPlant Diseaseshowing, a range of- 915.symptom severity in Georgia, the Caucasus region. 100(5), 904

150

Radonjić S, Hrnčić S, Jović J, Cvrković T, Krstić O, Krnjajić S, Toševski I (2009) Occurrence and distributionJournal of grapevine of Phytopathology yellows, 157 caused(11‐ by stolbur-685. phytoplasma in Montenegro. 12), 682

Rambaut A (2012) FigTree version 1.4.0. http://tree. bio. ed. ac. uk/software/figtree

Rambaut A, Drummond AJ (2009) Tracer 1.5.0. MCMC Trace Analysis Tool. http://beast.bio.ed.ac.uk/Tracer

Raymond M, Rousset F (1995) GENEPOP (versionJournal of 1.2): heredity population, 86, 248 - genetics249. software for exact tests and ecumenicism.

Remane R, Hoch H (1986) Sechs neue Arten der Gattung Hyalesthes Signoret, 1865 (HomopteraMarburger Fulgoroidea Entomologische Cixiidae) von Publicationen den Mittelatlantischen, 2, 123–154. Inseln urid aus dem Irak.

Rees DJ, Emerson BC, Oromi P, Hewitt GM (2001) Mitochondrial DNA, ecology and morphology: interpreting the phylogeography ofMolecular the Nesotes Ecology (Coleoptera:, 10, 427– 434.Tenebrionidae) of Gran Canaria (Canary Islands). Evolution, 43, 223–225.

Rice WR- (1989) Analyzing tables of statistical tests.

RiedletheBauer Agalliinae M, Sára A, Regnerleafhopper F (2008) TransmissionAnaceratagallia of a stolbur ribauti phytoplasma by Journal of Phytopathology, 156, 687(Hemiptera,–690. Auchenorrhyncha,- Cicadellidae).

RiedleHyalesthesBauer M, obsoletusMörtel J, onPastar Urtica M, dioica Aryan A, Bader G (2013) Mass occurrence-type of- in Austria and sole presence of tuf b stolbur phytoplasma on stinging nettles grapevine and in transmitting insects. In: Proceedings– 27. of the 3rd European Bois Noir Workshop 2013, Barcelona, Spain, pp. 26

Ronquist F, Huelsenbeck JPBioinformatics (2003) MrBayes, 19, 1572 3: bayesian–1574. phylogenetic inference Saez underAG, mixedLozano models. E Nature, 433, 111.

(2005) Body doubles. https://doi.org/10.1038/433111a PMID: 15650721 151

Scheffer SJ, Wiegmann BM (2000) Molecular phylogenetics of the holly leafminers (Diptera: Agromyzidae:. Molecular Phytomyza):phylogenetics speciesand evolution limits,, 17 speciation,-255. and dietary specialization (2), 244

Scheffer SJ, Lewis ML (2001)Liriomyza Two nuclear huidobrensis genes confirm mitochondrial evidenceAnnals of crypticof the Entomological species within Society of America, 94 (Diptera:-653. Agromyzidae). (5), 648

Schneider B, Gibb KS, Seemüller E (1997) Sequence and RFLP analysis of the elongation factorMicrobiology Tu gene, 143 used in differentiation-3389. and classification of phytoplasmas. (10), 3381

Seemüller E, Schneider B, Mäurer R, Ahrens U, Daire X, Kison H, Lorenz KH, Firrao G, Avinent L, Sears B, Stackebrandt E (1994) Phylogenetic classification of phytopathogenicInternational Journal mollicutes of Systemat by ic sequence Bacteriology analysis, 44, 440 of – 16S446. ribosomal DNA.

Seemüller E, Marcone C, Lauer U, Ragozzino A, Göschl Journal M (1998) of Current Plant Pathology status of, molecular-26. classification of the phytoplasmas. 80(1), Bourgoin 3 T (1998

SforzaHyalesthes R, obsoletus ) Female genitalia and copulation of the planthopper. Annales de la Société EntomologiqueSignoret de (Hemiptera, France (N.S.) Fulgoromorpha,, 34, 63–70. Cixiidae) - Hyalesthes

Sforzaobsoletus R, Clair D, Daire X, Larrue J, Boudon Padieu E (1998) The role of (Hemiptera:Journal of Phytopathology Cixiidae) in the, 146, occurrence 549–556. of bois noir of grapevines in France. -Pad

Sforza R, Bourgoin T, Wilson SW, Boudon ieu E (1999) Field observations, laboratoryHyalesthes obsoletus rearing and descriptions of European immatures Journal of the of planthopperEntomology, 96, 409–418. (Hemiptera: Cixiidae). Vitex

Sharonagnus R, Soroker-castus is V, a Wesley preferred SD, Zahavihost plant T, Harari for Hyalesthes A, Weintraub obsoletus PG (2005). Journal of Chemical Ecology, 31, 1051-1063.

152

‐ -

Sharon R, Harari AR, Zahavi T, Raz R, Dafny Yelin M, Tomer M, Sofer Arad C, Weintraub PG, Naor V (2015) A yellows disease system with differingPlant principalPathology , host64 plants-791. for the obligatory pathogen and its vector. (4), 785

Singer MC, Ng D, Vasco D, Thomas C (1992) Rapidly evolving associationsAmerican among ovipostionNaturalist, 139 preferences, 9–20. fail to constrain evolution of insect diet.

Suhov KS, Vovk AM (1949) 7-11. Stolbur of solanaceous plants. USSR Academy of Sciences Publishers, Biology of viruses and virus diseases of plants.

Suhov KS, Razvyazkina MG (1955)-153. Moscow: Soviet Science, 143

Suzuki S, Oshima K, Kakizawa S, Arashida R, Jung HY, Yamaji Y, Nishigawa H, Ugaki M, Namba S (2006) Interaction between the membrane protein- of a pathogen andProceedings insect microfilof the Nationalament complex Academy determines of Sciences insect of thevector United specificity. States of America -4257.

, 103(11), 4252

Swofford D (2002) PAUP* Phylogenetic Sunderland, Analysis MA, UsingUSA. Parsimony (*and other methods). Sinauer Associates:

Szpiechalleles." ZA, Rosenberg Theoretical NA population (2011) On biology the size, distribution-113. of private microsatellite 80(2), 100

ŠafářovaHyalesthes D, Lauterer obsoletu P,s Korbasova S, Starý M, Válová P, Navrátil M (2011) a vector ofBulletin stolbur of Insectology phytoplasma:, 64, current127–128. situation in South Moravia, Czech republic.

Taglianti AV, Audisio PA, Biondi M, Bologna MA, Carpaneto GM, De Biase A, Fattorini S, Piattella E, Sindaco R, Venchi A, Zapparoli M (1999) A proposal for a chorotype classification Biogeographia of the Near ,East 20, 31 fauna,-59. in the framework of the Western Palearctic region.

TajimaGenetics F (1983), 105, Evolutionary 437–460. relationship of DNA sequences in finite populations.

153

Tajima F (1989) StatisticalGenetics method, 123,for testing 585–595. the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism.

Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S (2011) MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximumMolecular likelihood, Biology evolutionaryand Evolution distance,, 28, 2731 and-2739. maximum parsimony methods.

TatemPNAS AJ, , Ha 103,y SI, 6242 Rogers–6247. DJ (2006) Global traffic and disease vector dispersal.

Templeton AR, Crandall KA, Sing CF (1992) A cladistic analysis of phenotypic associations with haplotypes inferred from restriction Genetics endonuclease, 132 , 619mapping–633. and DNA sequence data. III. Cladogram estimation.

Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity ofposition progressive- multiple sequence alignment through sequenceNucleic weighting, Acids Researchspecific gap – penalties4680. and weight matrix choice. , 22(22), 4673

Toth KF, Harrison N, Sears BB (1994) Phylogenetic relationships among. International members ofJournal the classof Systematic Mollicutes Bacteriology, deduced 44, from 119 rps3–124. gene sequences -

Toševski I, Caldara, R, Jović J, Hernández Vera G, Baviera C, Gassmann A, Emerson BC (2011) Morphological,Mecinus janthinus molecular and biological evidence reveal two cryptic species in Germar (Coleoptera, Linaria Curculionidae), dalmatica a successful biological controlSystematic agent of Entomology Dalmatian toadflax, -753. (Lamiales, Plantaginaceae). - , 36(4), 741

Toševski I, Caldara R,- Jović J, Hernández Vera G, Baviera C, Gassmann A, Emerson BC (2015) Host associated genetic divergence and taxonomy in theSystematic Rhinusa pilosaEntomology Gyllenhal, 40, 268 species-287. complex: an integrative approach.

154

Tsagkarakou A, Tsigenopoulos CS, Gorman K, Lagnel J, BemisiaBedford tabaciID (2007) Biotype status and genetic polymorphism of the whitefly (Hemiptera:Bulletin of Aleyrodidae)Entomological inResearch Greece:. 97, mitochondrial 29–40. DNA and microsatellites. -

Van Oosterhout C, Hutchinson WF, Wills DP, Shipley P (2004) MICRO CHECKER: softwaredata. Molecular for identifying Ecology Notes and , correcting4, 535-538. genotyping errors in microsatellite

Via S (1990) Ecological genetics and host adaptation in herbivorous insects:Annual the experimentalReview of Entomology study of. 35,evolution 421–446. in natural and agricultural systems.

Wang G, Li C, Zheng W, Song F, Guo X, Wu Z, Luo P, Yang Y, He L, Zhao T (2017) An evaluation of the suitability of COI and COII gene variation for reconstructing the phylogeny of, andMitochondrial identifying cDNAryptic Part species A in, anopheline–777. mosquitoes (Diptera, Culicidae). , 28(5), 769 Annual Review

Weintraubof Entomology, PG & Beanland 51, 91 –L111. (2006) Insect vectors of phytoplasmas.

Weintraub PG & Jones P (Eds.) (2010) Phytoplasmas: genomes, plant hosts and vectors, . Cabi. (1984 F-

Weir BS Cockerham CC. Evolution) ,Estimating 38, 1358–1370 statistics. for the analysis of population structure Antiviral

Weiverresea SC,rch Reisen, 85, 328 WK–345. (2010) Present and future arboviral threats.

Wilkins MR, Seddon N, Safran RJ (2013)Trends Evolutionary in Ecology divergenceand Evolution in, 28, acoustic 156- signals:166. causes and consequences.

Wingfield M, Roux J, Wingfield-natives B (2011) – Insect pests and pathogens of Australian- acacias grown as non Diversity andan Distributions experiment , in 17 biogeography, 968–977. with far reaching consequences.

155

‐

Zahavilong T, ‐ Sharon R, Sapir G, Mawassi M, Dafny Yelin M, Naor V (2013) The Australianterm effectJournal of of Stolbur Grape andphytoplasma Wine Research on grapevines, 19 in-284. the Golan Heights. (2), 277

Zhao Y, Davis RE (2016) Criteria for phytoplasma 16Sr group/subgroup delineationand subgroups. and the International need of a platform Journal for proper of Systematic registration and of Evolutionarynew groups Microbiology –2123.

, 66(5), 2121 -based

Zhao Y, Wei W, Davis RE, Lee IM (2010) Recent advances in 16S rRNA gene phytoplasmaJones P, eds. differentiation,Phytoplasmas: Genomes,classification Plant and Hosts, taxonomy. and Vectors In: Weintraub GP, –92. . Wallingford, UK: CABI Publishing, 64

156

8. Prilozi

Prilog 1

H. obsoletus kao

Pregled literaturnih podataka o biljkama koje se dovode ua vezu sa pogodne za razvoj larvi, ishranu ili agregaciju adulat čime se implicira na polifagnost ove cikade. U koloni „napomena” su prikazani detalji vezani za detektovanisl. koj razvojnii ukazuju stadijum na insekta, tipove staništa, metodologiju sakupljanja'Ca i. P. solaniPodaci' status biljaka H.domaćina obsoletus na nisu osnovu uzeti poklapanja izolata prisutnih u biljci i jedinkama u obzir. Podebljanim slovima su prikazaneH. obsoletus biljke koje se ističu kao najčešći nalazi širom areala vrste i čije su asocirane populacije ujedno i predmet istraživanja doktorske disertacije. Biljka

Država Convolvulus arvensis Nlarveapomena i adulti Referenca Lepidium draba Rusija 1955Sukhov & Razvyazkina adulti et al. 2013 (Solanum tuberosum krompir Imo adulti Turska Vitex sp. ) Crataegus sp. 1985 Hoch & Remane Myrtus sp. Paliurus sp. Quercus coccifera Quercus ilex Rubus sp. Sesamum indicum Cistus sp. paprika (Capsicum anuum

Convolvulus arvensis) Ozbek 1988 prezimljujući domaćini za Güclü & Crambe orientalis Medicago sativa nimfe; adulti imaju agregaciju Falcaria vulgaris uglavnom na Geranium tuberosum ali se mogu naći i na Isatis glauca različitim usevima kao što su Lepidium draba krompir, šećerna repa, crvena detelina, pasulj i ređe

157

Melilotus officinalis Onosuma armeneum suncokret i tikvica Rumex crispus Taraxacum sp.

lucerka (Medicago sativa

esparzeta ) (Onobrichis sativa adulti Izrael Tamarix sp. ) 1985 Gossypium Hoch & Remane

sp. (pamuk) (Solanum tuberosum krompir kukuruz ) (Zea mays adulti sakupljeni Sharon et al. Convolvulus) arvensis 2005 Vitex agnus-castus entomološkom mrežom i Amaranthus retroflexus klopkama izletanja; Myrtus communis V. agnus-castus Olea europaea larve su pronađene na korenu vinova loza (Vitis vinifera adulti; Convolvulus )sp. Vitex sp. 1985 Grčka Vitex Hoch & Remane Acer campestre Arbutus sp. najčešće su sakupljani na Arundo sp. sp. u obalskim staništima Artemisia sp. Carpinus betulus Cistus sp. Crataegus sp. Cynodon sp. Erica arborea Euphorbia dendroides Galium sp. Hipparhenia hirta Imperata cylindrica Juncus sp. Ligustrum vulgare Myrtus sp. Oreganum sp. Quercus coccifera Quercus cerris

158

Quercus ilex Quercus pubescens Paliurus sp. Phragmites sp. Platanus sp. Populus sp. Prunus spinosa Pteridium sp. Rubus sp. Salix sp. Tamarix sp. Ulmus sp. paprika (Capsicum anuum

) (Gossypium sp. pamuk

) (Sesamum indicum susam

) (Solanum tuberosum krompir kukuruz ) (Zea mays

Vitex sp. ) Arbutus sp. 1985 Vitexadulti; najčešće sakupljani na Hoch & Remane Kipar i Arundo sp. sp. u obalskim staništima grčka ostrva: Erica arborea Euphorbia dendroides Krit, Lezbos, Imperata cylindrica Ikarija, Rodos Juncus sp. Phragmites sp. Platanus sp. Pteridium sp. Tamarix sp Quercus pubescens adulti et al. 2013 (Solanum tuberosum Rumunija krompir Imo Makedonija Convolvulus arvensis) adulti su sakupljeni sa Atanasova et al. 2015 Urtica dioica ekshaustorima i entomološkim mrežama Srbija Convolvulus arvensis et al. 1967 Aleksić

159

prvi podatak o Crepis foetida vinogradu Cvrković 2010 različiti korovi u sa koje su adulti neselektivno sakupljenikao članu korovske zajednice

Convolvulus arvensis adulti su sakupljeni et al.

Urtica dioica 2013Kosovac

entomološkom mrežom i Crepis foetida ekshaustorom ; izuzetno detektovane na C. foetida brojne populacije su Bosna i Convolvulus arvensis adulti sakupljeni et al. 2017

Herzegovina Vitex agnus-castus Đurić entomološkom mrežom i Hrvatska Vitex agnus-castus ekshaustorom Horvath 1891 V. agnus-castus vrlo često mogu biti Slovenija Convolvulus arvensis pronađeni na Mehle et al. 2011 adulti sakupljeni žutim Urtica dioica trakama ili entomološkom mrežom Convolvulus arvensis adulti su sakupljeni na et al. 2013

Urtica dioica Imo pojedinačnim biljkama ekshaustorom ili na monodominantnim vegetacijskim sklopovima Urtica dioica entomološkom mrežom et al. 2004 Mađarska adulti sakupljeni vakuum Palermo Austrija Convolvulus arvensis ekshaustoromU. dioica je Aryan et al. 2014 Urtica dioica asocijacija sa dominantna Convolvulus arvensis adulti su sakupljeni et al. 2011 Švajcarska Urtica dioica Kessler larveekshaustorom su prisutne na nakoprivi; korenu koprive u prirodi i u

laboratorijskim eksperimentima su završile Calystegia sepium razviće na korenu iste biljke Cardaria draba adulti su sakupljeni na žutim Clematis vitalba trakama postavljenim iznad Lepidium draba specifične biljke

160

Calystegia sepium Plantago lanceolata direktnoadulti su iznadsakupljeni biljaka uz pomoć Polygonum aviculare žutih traka pozicioniranih Taraxacum officinale Convolvulus arvensis Allium sp. 1985 Nemačka krečnjak Hoch & Remane Festuca sp. Convolvulus arvensis Solanum nigrum Maixner 1994 vinova loza (Vitis vinifera

) Ranunculus bulbosus

Weber & Convolvulus arvensis Maixner 1998

Urtica dioica Langer & Maixner 2004 Calystegia sepium

Convolvulus arvensis Sforza et al. Cardaria draba 1999 Francuska adulti sakupljeni košenjem Calystegia sepium enotmološkom mrežom Galium verum Lavandula angustifolia Linaria striata Plantago cynops Satureia montana Convolvulus arvensis Bressan et al. 2008 Urtica dioica adulti sakupljeni vakuum eksthaustorom Lavandula angustifolia et al. 2017

Yvin Lavandula x intermedia sortiadulti lavande sakupljeni žutim trakama na poljima različitih Salvia sclarea larve sakupljene na korenu Hossard et al. biljaka; adulti sakupljeni u 2018

Convolvulus arvensis klopkama izletanja izletanja Lavandula hybrida adulti sakupljeni u klopkama

161

Salvia sclarea et al. 2018 adulti sakupljeni vakuum Chuche korenuekshaustorom biljaka i žutim trakama; larve sakupljene na Convolvulus arvensis

Urtica dioica adulti sakupljeni vakuum ekshaustorom I žutim trakama

Španija Trifolium pratense 1985 Hoch & Remane Convolvulus arvensis Sabate et al. 2014

Italija Convolvulus arvensis Lessio et al. U. dioica 2007 larve su pronađene na korenu Urtica dioica

Convolvulus arvensis adulti su sakupljeni et al. 2012 Urtica dioica sve tri biljke; Cargnus enotomološkom mrežom na Artemisia verlotorum korenu U. dioica i C. arvensis larve su ručno sakupljene na Dactylis sp. 1985 Hoch & Remane Sicilija Juncus sp.

Lamiaceae

Ulmusfam. sp.

Urtica sp.

Maroko Clematis sp. 1985 Pistacia sp. Hoch & Remane

Tamarix sp

Quercus coccifera

Literaturni izvori:

Atanasova B, Jakovljević M, Spasov D, Jović J, Mitrović M, Toševski I, Cvrković T (2015)Candidatus The molecular epidemiology of bois noir grapevine yellows caused by ‘

162

European Journal of Plant

PathologyPhytoplasma, 142, solani’ 759-770. in the Republic of Macedonia.

AleksićHyalesthes Ž, Šutić D, obsoletus Aleksić D (1967) Transmission intensityPlant Protection of stolbur, 93 virus–95, 67by– 73.means of

Sign. on some host plants.- Candidatus

Aryan A, Brader G, Mörtel J, Pastar M, Riedle Bauer M (2014) An abundant ' Phytoplasmastinging nettle solani' and Hyalesthes Stolbur tuf obsoletus b phytoplasma. European strain Journal is associated of Plant withPathology grapevine,, 140, 213-227.

Bressan A, Sémétey O, Nusillard B, Clair D, Boudon Padieu E (2008) Insect vectors (Hemiptera: Cixiidae) and pathogensPlant associated Disease, 92with the disease-119. syndrome “basses

richesses” of sugar beet in France.- (1), 113

Chuche J, Danet JL, Rivoal JB, Arricau Bouvery N, ThiérySalvia D (2018)sclarea Minor cultures as hosts for vectors of extensive crop diseases:Journal Does of Pest Science act as a pathogen-155. and vector reservoir for lavender decline? , 91(1), 145

Cvrkovićprenošenju T (2010) Bois Diverzitet Noir faune cikada u vinogradima Srbije i njihova uloga u Belgrade, 1-101. fitoplazme. PhD thesis, Faculty of Agriculture, University of

ation of Hyalesthes

Đurić obsoletusZ, Hrnčić S, Delić D (2017) Morphological and molecular identific MitteilungenSignoret Klosterneuburg (Auchenorrhyncha:, 67, 177-181. Cixiidae) in Herzegovina vineyard.

Hyalestes obsoletus Signoret

Güclü S, Ozbek H (1988) Some studies on the biology ofTurkiye -Entomoloji-Dergisi, 12, (Homoptera:103-111. Cixidae) in the conditions of Erzurum.

-Gattung Hyalesthes

Hoch H, Remane R (1985) Evolution und Speziation der Zikaden Marburger Signoret,Entomologische 1865 Publikationen (Homoptera , Auchenorrhyncha2, 1-427. Fulgoroidea Cixiidae).

Horváth Glasnik Hrvatskoga

NaravoslovnogaG (1891) Hemipterološki Drustva (Societas izlet historico u Primorje-naturalis i Plitvička Croatica) jezera., VI (1- -49.

5), 29 8

Hossard L, Guimier of Hyalesthes S, Vinatier obsoletus F, Barbier JM, Delmotte S, Fontaine M, Rivoal JB (201 ) Source Signoret planthopper (Hemiptera: Cixiidae) in 163

Bulletin of Entomological

Researchsouthern, 108, France 213 - and222 . potential effects of landscape.

Imo M, Maixner M, Johannesen- J (2013) Sympatric diversification vs. immigration: deciphering host plantHyalesthes specialization obsoletus in a polyphagousMolecular insect, Ecology the, 22 ,stolbur 2188- 2203.phytoplasma vector (Cixiidae).

Kessler S, Schaerer S,Hyalesthes Delabays obsoletus N, Turlings TC, Trivellone V, Kehrli P (2011) Host plant preferences of Entomologia Experimentalis, the vector of etthe Applicata grapevine, 139 yellows, 60-67. disease ‘bois noir’, in Switzerland.

Kosovac A, Johannesen J, Krstić O, Mitrović M, Cvrković T, Maixner M, ToševskiHyalesthes I, Jović J (2013)obsoletus Microsatellite and mtDNA evidence of genetic differentiation in -beard (Crepis foetidapopulations utheast associated Europe. with Proceedings a new major of host, the 3rd stinking European hawk’s Bois Noir Workshop ), in so -19. , Barcelona, 18

Kosovac A, Radonjić S, Hrnčić S, Krstić O, Toševski I, Jović J (2016) Molecular tracing of thend transmission routes of bois noir in Mediterranean vineyards ofVitex Montenegro agnus-castus a experimental evidence forHyalesthes the epidemiological obsoletus role Plant of Pathology, 65, 285- (Lamiaceae)298. and associated (Cixiidae).

Langerphyt M, Maixner M (2004) Molecular characterisation of grapevine yellows- associated Vitis,oplasmas 43, 191–199. of the stolbur group based on RFLP analysis of non ribosomal DNA.

Lessio F, Tedeschi R, Alma A (2007)Hyalesthes Population obsoletus dynamics, Signoret host plants in north and- infectionn Italy. rate withJournal Stolbur of Plant phytoplasma Pathology, 89 of, 97-102. wester

Maixner M (1994) Research note: TransmissionHyalesthes of Germanobsoletus grapevine yellows (Vergilbungskrankheit)Vitis, 33, 103-104. by the planthopper (Auchenorrhyncha: Cixiidae).

164

Palermo S, Elekes M, Botti S, Ember I, Alma A, Orosz A, Bertaccini A, KölberVitis M (2004). Presence201-203. of stolbur phytoplasma in Cixiidae in Hungarian vineyards. , 43(4),

erent

Sabaté J, Laviña A, Batlle A (2014) Incidence of Bois Noir phytoplasma in diff viticultureEuropean Journal regions of of Plant Spain Pathology and Stolbur, 139 , isolates185-193. distribution in plants and vectors.

Sforza R, Bourgoin T, Wilson SW, Boudon Padieu E (1999) Field observations,Hyalesthes laboratory obsoletus rearing and descriptionsEuropean of immatures Journal of ofEntomology the planthopper, 96, 409 –418.

(Hemiptera: Cixiidae). Vitex agnus-

Sharoncastus R, Soroker is a preferred V, Wesley host SD, plant Zahavi for Hyalesthes T, Harari A,obsoletus Weintraub. Journal PG (2005)of Chemical Ecology, 31, 1051-1063.

SuhovPublishers. KS, Vovk AM7-11. (1949) Stolbur of solanaceous plants. USSR Academy of Sciences

Hyalesthes obsoletus

Weber A, Maixner M (1998) Survey of populations of the planthopper Sign. (Auchenorrhyncha, Cixiidae)Journal for of Applied infection Entomology with the, 122 phytoplasma, 375-381. causing grapevine yellows in Germany.

Yvin C, Chaisse E, Fontaine M, Rivoal JB, Verdin E, Nicolè F, Jourdan P, Savarit P, Gallois P (2017) Dépérissement de la lavande et du lavandin : mise en oeuvre d’un programme deInnovations recherches Agronomiques appliquées , afin55, 107 d’apporter-120. des solutions de lutte aux

producteurs.

165

Prilog 2

Lista prethodno publikovanih H. obsoletus detektovanih u

mtDNK haplotipova se Evropiodnose ina Izraelu. COI-tRNK Oznake(Leu) haplotipova-COII i 16S-tRN se Ksastoje(Leu)- ND1od dva genske alfabetska regione. simbola Ispod oznakekoji haplotipa naveden je pristupni broj porekla. u NCBI genetičkoj bazi, biljka domaćin i država Oznake država su: Austrija (AT), Francuska (FR), Nemačka (DE), Slovenija Haplotipovi(SI), Italija rednih (IT), Španijabrojeva 1 (ES),–12 su Mađarska opisani od (HU), strane Izrael Johannesen (IL), Švajcarskaet al. (2008 (CH)., 13– 19 su opisani od strane Johannesen et al. (2012 20–22 su opisani od strane) et al. ), Chuche (2018). . Haplotip Biljka

R.br COI-tRNK(Leu)-COII 16S-tRNK(Leu)-ND1 Država domaćin 1. A A U. dioica EU155640 EU155649 C. arvensis AT, FR, DE, SI 2. A B U. dioica EU155650 C. arvensis SI AT, FR, IT, ES, 3. A F U. dioica IT EU155654 4. B B U. dioica EU155641 FR, DE, IT,ES 5. C D U. dioica EU155642 EU155652 FR, IT 6. D B U. dioica EU155643 FR 7. E C U. dioica HU, SI EU155644 EU155651 C. arvensis 8. F C U. dioica HU EU155645 9. I B U. dioica IT EU155648 10. I G U. dioica IT EU155655 11. G E V. agnus- IL EU155646 EU155653 castus

166

12. H E V. agnus- IL EU155647 castus 13. A J U. dioica IT JQ977743 14. A D U. dioica IT

15. T B U. dioica SI JX025163 16. N B U. dioica JX025161 CH 17. O B C. arvensis IT JX025162 18. K B C. arvensis IT JX025159 19. L B U. dioica JX025160 CH 20. ε B C. arvensis LT841310 FR 21. ζ B C. arvensis LT841311 FR 22. δ B C. arvensis LT841309 FR

167

Prilog 3

Lista novoopisanih H. obsoletus haplotipova COI-tRNK(Leu)-COII i 16S-tRNK(Leu)- ND1 genskih regiona

sa navedenim odgovarajućim pristupnim brojevima u NCBI genetičkoj bazi. Genski region Haplotip

S NCBI pristupni broj BiljkaC. arvensis domaćin X KY368699 C. arvensis

KY368700 C. arvensis

π (pi) KY368701 C. arvensis

ψ (psi) KY368702 U. dioica

α (alfa) KY368703 U. dioica

β (beta) KY368704 U. dioica

ξ (ksi) KY368705 U. dioica

R KY368706 U. dioica COII - ρ (ro) KY368707 U. dioica

ω (omega) KY368708 U. dioica, C. arvensis

JW KY368709 C. foetida tRNK(Leu) - M KY368710 C. foetida COI U KY368711 C. foetida

V KY368712 C. foetida

KY368713 C. foetida

λ (lambda) KY368714 C. foetida

μ (mikro) KY368715 V. agnus-castus

Y KY368716 V. agnus-castus

Z KY368717 V. agnus-castus

γ (gama) KY368718 V. agnus-castus

η (eta) KY368719

168

V. agnus-castus

σ (sigma) KY368720 V. agnus-castus

Pθ (teta) KY368721 nepoznata

KY368722 nepoznata

φQ (fi) KY368723 nepoznata

KY368724 C. arvensis

KL KY368692 C. arvensis ND1 - Q KY368693 U. dioica

H KY368694 C. foetida

M KY368695 V. agnus-castus tRNA(Leu) - KY368696 V. agnus-castus 16S ON KY368697 V. agnus-castus

KY368698

169

Prilog 4

H. obsoletus

Testovi neutralnosti izračunati na nivou svake , odkao četiri i na nivou vrste asocijacije,. združenih asocijacija sa poponcem i koprivom (Ukupno) KalkulacijeCOI-tRNK(Leu) su - urađeneCOII i 16S na-tRN osnovuK(Leu) seta-ND1 mtDNK. haplotipova dva genska regiona:

n Test neutralnosti

D test Fuova FS statistika Asocijacija Convolvulus arvensis 8 - - (br. jedinki) Tadžimin

0.43667 (p = 0.39500) 0.54393 (p = 0.44400) (57)Urtica dioica 9 - -

2.18859 (p = 0.00100)*** 8.59152 (p = 0.00000)*** (120)C. arvensis-U. dioica 15 - -

1.87421 (p = 0.00500)** 9.59790 (p = 0.00100)*** (177)Vitex agnus-castus 8

1.95886 (p = 0.97300) 2.65819 (p = 0.84600) (56)Crepis foetida 6 - -

1.04433 (p = 0.16800) 2.56721 (p = 0.07400) (83)Ukupno 29 - -

0.31990 (p = 0.38200) 3.16897 (p = 0.30700) n,(316) broj haplotipova

*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.

170

Prilog 5

AMOVA i F

Poređenje genetičkeH. obsoletusdivergencije statistikom na osnovu mikrosatelita unutar i između populacija grupisanih prema asocijaciji sa biljkom- domaćinom ili geografiji. Rezultati predstavljaju procenatFCT ukupne- grupnoj među populacionevarijansi (FSC divergencije koja se može pripisati grupi ( ) ili unutar ).

Analiza Ukupna Unutar- % Ukupne

grupna Varijansagrupa (biljka između genetičkavarijansa varijansa varijanse poreklom domaćin ili odili geografije biljke domaćina

FST FSC geografija)FCT FCT/FST

50 H. obsoletus 77% x 100% sakupljenih populacija 0.180*** 0.047*** 0.139*** u sprovedenimex istraživanjaV. agnus-castus i populacija iz Izraela , grupisane na osnovu biljke

domaćina H. obsoletus ex 60% V. agnus-castus Populacije 0.097*** 0.041*** 0.059* grupisaniz Crnee Gore i Grčke premaP geografijie H. obsoletus (državi) ex 42% V. agnus-castus opulacij 0.108*** 0.064*** 0.046** iz Crne ex GoreV. agnus i Grčke-castus i populacija iz Izraela grupisane u klastere sugerisane prema STRUCTURE analizi (poglavlje 4.3.2)

*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.

171

Prilog 6

Uporedni prikaz diverziteta 'Ca. P. solani' MLST genotipova detektovanih u okviru

četirikoji se epidemiološka odnose na U. ciklusadioica koji otpočinju od specifične biljke domaćina. Podaci H. obsoletus pop obuhvataju CPs isolate detektovane u asociranim C. arvensis, V. agnusulacijama-castus i prirodno i C. foetida inficiranim biljkama. Podaci koji se odnose na H. obsoletus obuhvataju CPs isolate detektovane u asociranimkoje je ex situ populacijama, prirodno inficiranim biljkama i genotipove na eksperimentalne biljke prenela ogledna populacija vektoratuf svaketip i klastriranjeod tri asocijacije. stamp Grupisanje izolata je urađeno prateći odgovarajući okviru MLST genotipagenotipova je tuf/stamp u genealoškoj/vmp1. S mreži (Slika- 25). Redosled gena u imbolom „ “ su ui okvirunisu okarakterisani.MLST genotipa označeni odgovarajući geni koji se nisu amplifikovali, Simbolom „#“ je označeno odsustvo određenog MLST genotipa u okviru odgovarajućeg epidemiološkog ciklusa. Urtica dioica Convolvulus arvensis Vitex agnus-castus Crepis foetida

epidemiološki epidemiološki epidemiološki epidemiološki tuf-ab/19ciklus-25/V3 ciklus ciklus ciklus

tuf-ab/19-25/V18 # # #

-/19-25/- # # #

-/HoU354/- # # #

-/HoU355/- # # #

# # # Subklaster a1 Subklaster -/HoU362/-

-/HoU448/V23 # # #

-/HoU437/- # # #

tuf-a/SB5/V3 # # #

# # # -/SB5/-

# # # tuf-a/M2/V3 Subklaster a2 Subklaster # # #

172

tuf-a/M3/V3

# # #

I -

# # # # Klaster b Klaster

tuf- -TA

# tufb/Rqg50/V2- tuf- # tuf- #

# tuf- b/Rqg50/V4 b/Rqg50/V4 b/Rqg50/V4

# tuf-b/Rqg50/V14 tuf- # #

# - b/Rqg50/V17 b/Rqg50/V17 #

# /Rqg50/V17 - # - - # -

# tuf-b/Vv24/V4# /Rqg50/ /Rqg50/

# tuf-b/Vv24/V14 tuf-b/Vv24/V14# #

# tuf- #

# tufb/HoCa242/V4- - # #

# b/HoCa632/ tuf-b/Ho-# # II - tuf- # -TA tuf- # -TA tuf- Vac1/V17-TA tuf- # -TA

b/Rqg31/V2 tufb/Rqg31/V2- b/Rqg31/V2 tufb/Rqg31/V2- Klaster b Klaster # tuf- b/Rqg31/V4 tuf- # tuf- b/Rqg31/V4

# - b/Rqg31/V14 b/Rqg31/V14 b/Rqg31/V14

# /Rqg31/und1- - # - # -

# tuf-b/BG4560/V2/Rqg31/ -TA # /Rqg31/

# # tuf-b/BG4560/V4#

# tuf-b/BG4560/# - #

-/BG4560/# - -/BG4560/- # -/BG4560/# -

tuf- #

# tuf- b/GGY/V4 # #

# b/GGY/und1- - # #

# /GGY/ # #

173

tuf-b/STOL/V2-TA tuf-b/STOL/V2-TA tuf-b/STOL/V2-TA

# tuf-b/STOL/V15

# # tuf-b/STOL/und2#

# # # tuf-b/STOL/V2-TA-L

tuf-b/STOL/# - # tuf-b/STOL/# - tuf-b/STOL/-

# -/STOL/V2-TA

-/STOL/# - # -/STOL/# - -/STOL/-

-/HoU346/- #

-/HoU302/- # # # III - -/HoU296/- # # #

-/HoU294/- # # # Klaster b Klaster # # - # -

# tuf- # -TA tuf- # -TA /HoCf23/

# tufb/Rpm35/V2- tufb/Rpm35/V2- tuf- #

- # - b/Rpm35/V14 b/Rpm35/V14 b/Rpm35/V14

/Rpm35/ tuf-b/M5/V4# # #

# tuf-b/M5/V14 # #

# tuf- # #

# - b/HoCa278/V14-TA # #

# /HoCa341/V2 # #

174

BIOGRAFIJA AUTORA

završeneAndrea osnovne Kosovac je rođena 26. juna 1986. godine u Beogradu. Nakon Biološki fakultet škole i gimnazije u Beogradu, Ekologija školske i zaštita 2005/2006 sredine. upisuje Univerziteta godine u Beogradu, smer životne Diplomirala je 2010. sa prosečnom ocenom vrsta 9.11 roda i odbranj Althaeaenim diplomskim radom pod fakultetunazivom „DistribucijaUniverziteta iu ugroženostBeogradu je 2010. godine upisalaL. u Srbiji”.doktorske Na Biološkomstudije, prvobitno smera Ekologija, a zatim od 2011. smera Biologija, modula

Morfologija,Od 201sistematika2. godine i filogenija je stipendistaživotinja, podmodulMinistarstvaEntomologija. nauke, prosvete i tehnohološkog razvoja, a od 2013. je zaposlena u Institutu za zaštitu sredinu, Odseku za bilja u , kao -saradnikbilja ui životnuokviru projektaštetočine finansiranog odZemunu strane Ministarstvaistraživač prosvete, nauke i nacionalnogtehnološkog razvoja Srbije br. III43001 - Republike biodiverziteta„Agrobiodiverzitet grupa artropodai korišćenje i zemljištabiljnih u Srbiji: integrisana procena ključnihbiljnih patogena i njihovih insekatskihpatogena“, podprojekat „Diverzitet i dinamika

U perioduvektora u agroekosistemima Srbije“. rea od 2013. projek do 2018. godine, Andrea Kosovac je učestvovala u lizaciji tri međunarodna finansiranogta bilateralne od strane saradnje, a zatim i SCOPES Joint researchFoundation projects, (Epidemiology projekta and management strategy ofSwiss stolbur National phytoplasma Science in agroecosystems

). interesovanja Andree su genetika insekataOblast naučnog Kosovac populaciona bolesti.

Publikov, interakcijeala je insekata 21 rad, i biljakaod i epidemiologija 7 fitoplazmatičnih

čega u naučnim časopisima međunarodnog

značaja.