UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Anja PALANDAČIĆ MOLEKULARNA EKOLOGIJA IMOTSKE GAOVICE (DELMINICHTHYS ADSPERSUS (HECKEL, 1843)) DOKTORSKA DISERTACIJA MOLECULAR ECOLOGY OF IMOTSKA GAOVICA (DELMINICHTHYS ADSPERSUS (HECKEL, 1843)) DOCTORAL DISSERTATION Ljubljana, 2012 II Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 Na podlagi Statuta Univerze v Ljubljani ter po sklepu Senata Biotehniške fakultete in sklepa seje Komisije za doktorski študij z dne 9.9. 2010 (po pooblastilu Senata UL z dne 20.1.2009) je bilo potrjeno, da kandidatka izpolnjuje pogoje za neposreden prehod na doktorski študij bioloških in biotehniških znanosti ter opravljanje doktorata znanosti s področja genetike. Za mentorja je bil imenovan višji znanstveni sodelavec dr. Aleš Snoj. Poleg Oddelka za zootehniko Biotehniške fakultete je bil del razsikave izveden na inštitutu Zoologische Institut, Universität Basel (Basel, Schweiz) s pomočjo štipendije Ad Future in Javnega sklada za kadre in štipendije. Komisija za oceno in zagovor: Predsednik: Dr. Peter Trontelj Član: Dr. Elena Varljen Bužan Član: Dr. Aleš Snoj Datum zagovora: 6.4.2012 Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Anja Palandačić KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dd DK UDK 575:597.2/.5(043.3)=163.3 KG molekularna ekologija/molekularna evolucija/filogenetika/populacijska genetika/mikromreže/ribe/gaovice(Cyprinidae)/imotska gaovica(Delminichthys adspersus) KK AGRIS L20/8100 AV PALANDAČIĆ, Anja, univ. dipl. biol. SA SNOJ, Aleš KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Podiplomski študij bioloških in biotehniških znanosti, področje genetike LI 2012 IN MOLEKULARNA EKOLOGIJA IMOTSKE GAOVICE (DELMINICHTHYS ADSPERSUS (HECKEL, 1843)) TD Doktorska disertacija OP XIII, 74 str., 5 pregl., 12 sl., 146 vir. IJ sl JI sl/en AI Namen raziskave je bil razširiti znanje o slabo raziskani skupini rib z imenom »gaovice« (Leuscisinae, Cyprinidae), ki naseljujejo centralni del južnega Dinarskega krasa in periodično kolonizirajo jame. Raziskava je potekala v treh sklopih, v okviru katerih smo postavili hipoteze: (1) Z dodatnimi jedrnimi geni (rodopsin, ERGF2B in ITS1) potrditi hipotezo, postavljeno na osnovi mitohondrijskega citokroma b in nedoločene jedrne regije Cyp_unFLP, ki predvideva uvrstitvev vrst imotska, popvska in jadovska gaovica ter krbavski pijor (D. adspersus, D.gethaldi, D. jadovensis, D. krbavensis) v svoj rod (Delminichthys). (2) Vrsta imotska gaovica (Delminichthys adspersus) predstavlja eno samo nediferencirano populacijo, kar je posledica podzemne migracije in (3) Pri vrsti imotska gaovica se v času podzemnega življenja izražanje genov spremeni. V prvem sklopu smo določili nukleotidno zaporedje trem delnim zapisom za rodopsin, ERGF2B in ITS1 pri vseh bivših predstavnikih rodu Phoxinellus (med katerimi so tudi štiri zgoraj omenjene vrste), jim določili evolucijski model ter z različnimi metodami (največje verjetje, NJ) izračunali filogenetska drevesa. V drugem sklopu smo na 8 mikrosatelitnih lokusih genotipizirali 544 osebkov vrste imotska gaovica iz 18 vzorčnih mest, ki nimajo nadzemnih vodnih povezav, so povezana preko občasnih potokov, ali pa so del istega vodnega telesa. Nato smo z metodami, ki temeljijo na F-statistiki, Bayesovem principu oziroma koalescenci določili populacijsko strukturo in jo primerjali z znanimi hidrološkimi podatki. V tretjem sklopu smo z mikromrežami analizirali razliko v izražanju genov v jetrih skupine rib vrste imotska gaovica, ki so preživele ene mesec v popolni temi, s skupino rib z normalno 12 urno foto-periodo. Potrdili smo prvo hipotezo, da je rod Delminichthys monofiletski in sestavljen iz štirih vrst. Populacijska struktura imotske gaovice je razkrila vsaj tri podskupine, ki pa so med sabo povezane po podzemnih vodnih poteh. V tretjem sklopu smo odkrili 28 diferencialno izraženih genov. IV Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 KEY WORDS DOCUMENTATION DN Dd DC UDK 575:597.2/.5(043.3)=163.3 CX molecular ecology/molecular evolution/phylogenetics/population genetics/microarrays/fish/gaovice (Cyprinidae)/imotska gaovica (Delminichthys adspersus) CC AGRIS L20/8100 AU PALANDAČIĆ, Anja AA SNOJ, Aleš PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Postgraduate Study of Biological and Biotechnical Sciences, Field: Genetics PY 2012 TI MOLECULAR ECOLOGY OF IMOTSKA GAOVICA (DELMINICHTHYS ADSPERSUS (HECKEL, 1843)) DT Doctoral Dissertation NO XIII, 74 p., 5 tab., 12 fig., 146 ref. LA sl AL sl/en AB The object of the research was a group of poorly studied fish with vernacular name »gaovice« (Leuscisinae, Cyprinidae), which inhabit central Dinaric karst and periodically colonize caves. The research was divided in three parts and for each a hypothesis was constructed: (1) Delminichthys adspersus, D.gethaldi, D. jadovensis and D. krbavensis form one, monophyletic genus also on the basisi of three nuclear DNA regions, (2) The species D. adspersus forms one panmictic population, sustained with subterranean gene flow, and (3) During the underground phase, gene expression in the species D. adspersus changes. In the first part, phylogenetic position and taxonomic status of former Phoxinellus taxa (including four previously mentioned species) was investigated on the basis of partial sequences of rhodopsin, EGRF2B and ITS1 and phylogenetic methods such as neighbor-joining and maximum likelihood. In the second part, 544 specimen of D: adspersus from 18 locations were genotyped for 8 microsatellite loci. The locations were either completely isolated, linked via temporal streams or a part of same water body. We determined population structure with methods based on F-statistic, Bayesian and coalescence and compared it with known hydrological data. In the third part we used microarrays to determine differentially express genes in liver of fish (D. adspersus), which spend one month in complete darkness, in comparison to the group with normal 12 hour photo-period. We confirmed that four species Delminichthys adspersus, D.gethaldi, D. jadovensis and D. krbavensis form monophyletic genus Delminichthys. The population structure of D: adspersus revealed at least three groups with gene flow occurring between them. Finally, we found 28 differentially expressed genes with the microarray analysis. KAZALO VSEBINE str. Ključna dokumentacijska informacija (KDI) ...................................................... III Key Words Documentation (KWD) ................................................................... IV Kazalo vsebine ..................................................................................................... V Kazalo preglednic .............................................................................................. VII Kazalo slik........................................................................................................ VIII Kazalo prilog ....................................................................................................... IX Okrajšave in simboli ............................................................................................ X Slovarček ............................................................................................................ XII 1 UVOD .................................................................................................................... 1 1.1 NAMEN DELA 2 1.2 RAZISKOVALNE HIPOTEZE 3 2 PREGLED OBJAV ............................................................................................... 5 2.1 KRAS 5 2.1.1 Sledenje vodnih povezav v krasu 5 2.1.2 Ekološke razmere v tokovih ponikalnic 6 2.1.3 Prilagoditev organizmov na podzemlje 7 2.1.4 Podzemeljska vodna favna Dinarskega krasa 8 2.2 GAOVICE (LEUSCISINAE, CYPRINIDAE) 9 2.2.1 Imotska gaovica (Delminichthys adspersus) 10 2.3 FILOGENETIKA IN POPULACIJSKA GENETIKA 11 2.3.1 Mitohondrijska DNA (mtDNA) 14 2.3.2 Jedrna DNA 15 2.3.3 Mikrosateliti 16 2.4 MIKROMREŽE 18 3 MATERIAL IN METODE .................................................................................. 20 3.1 OPIS VZORČNIH MEST 20 3.2 VZORČENJE IN IZOLACIJA DNA 24 3.3 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO (PCR), DOLOČANJE NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA IN GENOTIPIZACIJA 24 3.4 FILOGENETSKA ANALIZA VRST RODU PHOXINELLUS 26 VI Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 3.4.1 Jedrni geni 26 3.5 ANALIZA POPULACIJSKE STRUKTURE IMOTSKE GAOVICE 27 3.5.1 Mitohondrijska DNA 27 3.5.2 Mikrosateliti 28 3.6 ANALIZA DIFERENCIALNEGA IZRAŽANJA GENOV Z MIKROMREŽAMI 31 3.6.1 Postavitev poskusa 31 3.6.2 Analiza mikromrež 32 4 REZULTATI ........................................................................................................ 33 4.1 RAZREŠEVANJE TAKSONOMSKIH NEJASNOSTI V SKUPINI GAOVICE 33 4.2 POPULACIJSKA STRUkTURA IMOTSKE GAOVICE 35 4.2.1 Mitohondrijska DNA 35 4.2.2 Mikrosateliti 38 4.3 RAZLIKA V IZRAŽANJU GENOV (POSKUS Z MIKROMREŽAMI) 48 5 RAZPRAVA ........................................................................................................ 50 5.1 RAZREŠEVANJE TAKSONOMSKIH NEJASNOSTI V SKUPINI GAOVICE 50 5.2 POPULACIJSKO GENETSKA STRUKTURA IMOTSKE GAOVICE IN PRETOK GENOV MED GEOGRAFSKO LOČENIMI POPULACIJAMI 52 5.3 SPECIFIČEN