UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

Anja PALANDAČIĆ

MOLEKULARNA EKOLOGIJA IMOTSKE GAOVICE (DELMINICHTHYS ADSPERSUS (HECKEL, 1843))

DOKTORSKA DISERTACIJA

MOLECULAR ECOLOGY OF IMOTSKA GAOVICA (DELMINICHTHYS ADSPERSUS (HECKEL, 1843))

DOCTORAL DISSERTATION

Ljubljana, 2012

II Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Na podlagi Statuta Univerze v Ljubljani ter po sklepu Senata Biotehniške fakultete in sklepa seje Komisije za doktorski študij z dne 9.9. 2010 (po pooblastilu Senata UL z dne 20.1.2009) je bilo potrjeno, da kandidatka izpolnjuje pogoje za neposreden prehod na doktorski študij bioloških in biotehniških znanosti ter opravljanje doktorata znanosti s področja genetike. Za mentorja je bil imenovan višji znanstveni sodelavec dr. Aleš Snoj. Poleg Oddelka za zootehniko Biotehniške fakultete je bil del razsikave izveden na inštitutu Zoologische Institut, Universität Basel (Basel, Schweiz) s pomočjo štipendije Ad Future in Javnega sklada za kadre in štipendije.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: Dr. Peter Trontelj

Član: Dr. Elena Varljen Bužan

Član: Dr. Aleš Snoj

Datum zagovora: 6.4.2012

Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Anja Palandačić

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dd DK UDK 575:597.2/.5(043.3)=163.3 KG molekularna ekologija/molekularna evolucija/filogenetika/populacijska genetika/mikromreže/ribe/gaovice(Cyprinidae)/imotska gaovica(Delminichthys adspersus) KK AGRIS L20/8100 AV PALANDAČIĆ, Anja, univ. dipl. biol. SA SNOJ, Aleš KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Podiplomski študij bioloških in biotehniških znanosti, področje genetike LI 2012 IN MOLEKULARNA EKOLOGIJA IMOTSKE GAOVICE (DELMINICHTHYS ADSPERSUS (HECKEL, 1843)) TD Doktorska disertacija OP XIII, 74 str., 5 pregl., 12 sl., 146 vir. IJ sl JI sl/en AI Namen raziskave je bil razširiti znanje o slabo raziskani skupini rib z imenom »gaovice« (Leuscisinae, Cyprinidae), ki naseljujejo centralni del južnega Dinarskega krasa in periodično kolonizirajo jame. Raziskava je potekala v treh sklopih, v okviru katerih smo postavili hipoteze: (1) Z dodatnimi jedrnimi geni (rodopsin, ERGF2B in ITS1) potrditi hipotezo, postavljeno na osnovi mitohondrijskega citokroma b in nedoločene jedrne regije Cyp_unFLP, ki predvideva uvrstitvev vrst imotska, popvska in jadovska gaovica ter krbavski pijor (D. adspersus, D.gethaldi, D. jadovensis, D. krbavensis) v svoj rod (Delminichthys). (2) Vrsta imotska gaovica (Delminichthys adspersus) predstavlja eno samo nediferencirano populacijo, kar je posledica podzemne migracije in (3) Pri vrsti imotska gaovica se v času podzemnega življenja izražanje genov spremeni. V prvem sklopu smo določili nukleotidno zaporedje trem delnim zapisom za rodopsin, ERGF2B in ITS1 pri vseh bivših predstavnikih rodu Phoxinellus (med katerimi so tudi štiri zgoraj omenjene vrste), jim določili evolucijski model ter z različnimi metodami (največje verjetje, NJ) izračunali filogenetska drevesa. V drugem sklopu smo na 8 mikrosatelitnih lokusih genotipizirali 544 osebkov vrste imotska gaovica iz 18 vzorčnih mest, ki nimajo nadzemnih vodnih povezav, so povezana preko občasnih potokov, ali pa so del istega vodnega telesa. Nato smo z metodami, ki temeljijo na F-statistiki, Bayesovem principu oziroma koalescenci določili populacijsko strukturo in jo primerjali z znanimi hidrološkimi podatki. V tretjem sklopu smo z mikromrežami analizirali razliko v izražanju genov v jetrih skupine rib vrste imotska gaovica, ki so preživele ene mesec v popolni temi, s skupino rib z normalno 12 urno foto-periodo. Potrdili smo prvo hipotezo, da je rod Delminichthys monofiletski in sestavljen iz štirih vrst. Populacijska struktura imotske gaovice je razkrila vsaj tri podskupine, ki pa so med sabo povezane po podzemnih vodnih poteh. V tretjem sklopu smo odkrili 28 diferencialno izraženih genov.

IV Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

KEY WORDS DOCUMENTATION

DN Dd DC UDK 575:597.2/.5(043.3)=163.3 CX molecular ecology/molecular evolution/phylogenetics/population genetics/microarrays/fish/gaovice (Cyprinidae)/imotska gaovica (Delminichthys adspersus) CC AGRIS L20/8100 AU PALANDAČIĆ, Anja AA SNOJ, Aleš PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Postgraduate Study of Biological and Biotechnical Sciences, Field: Genetics PY 2012 TI MOLECULAR ECOLOGY OF IMOTSKA GAOVICA (DELMINICHTHYS ADSPERSUS (HECKEL, 1843)) DT Doctoral Dissertation NO XIII, 74 p., 5 tab., 12 fig., 146 ref. LA sl AL sl/en AB The object of the research was a group of poorly studied fish with vernacular name »gaovice« (Leuscisinae, Cyprinidae), which inhabit central Dinaric karst and periodically colonize caves. The research was divided in three parts and for each a hypothesis was constructed: (1) Delminichthys adspersus, D.gethaldi, D. jadovensis and D. krbavensis form one, monophyletic genus also on the basisi of three nuclear DNA regions, (2) The species D. adspersus forms one panmictic population, sustained with subterranean gene flow, and (3) During the underground phase, gene expression in the species D. adspersus changes. In the first part, phylogenetic position and taxonomic status of former Phoxinellus taxa (including four previously mentioned species) was investigated on the basis of partial sequences of rhodopsin, EGRF2B and ITS1 and phylogenetic methods such as neighbor-joining and maximum likelihood. In the second part, 544 specimen of D: adspersus from 18 locations were genotyped for 8 microsatellite loci. The locations were either completely isolated, linked via temporal streams or a part of same water body. We determined population structure with methods based on F-statistic, Bayesian and coalescence and compared it with known hydrological data. In the third part we used microarrays to determine differentially express genes in liver of fish (D. adspersus), which spend one month in complete darkness, in comparison to the group with normal 12 hour photo-period. We confirmed that four species Delminichthys adspersus, D.gethaldi, D. jadovensis and D. krbavensis form monophyletic genus Delminichthys. The population structure of D: adspersus revealed at least three groups with gene flow occurring between them. Finally, we found 28 differentially expressed genes with the microarray analysis.

KAZALO VSEBINE str. Ključna dokumentacijska informacija (KDI) ...... III Key Words Documentation (KWD) ...... IV Kazalo vsebine ...... V Kazalo preglednic ...... VII Kazalo slik...... VIII Kazalo prilog ...... IX Okrajšave in simboli ...... X Slovarček ...... XII

1 UVOD ...... 1 1.1 NAMEN DELA 2 1.2 RAZISKOVALNE HIPOTEZE 3 2 PREGLED OBJAV ...... 5 2.1 KRAS 5 2.1.1 Sledenje vodnih povezav v krasu 5 2.1.2 Ekološke razmere v tokovih ponikalnic 6 2.1.3 Prilagoditev organizmov na podzemlje 7 2.1.4 Podzemeljska vodna favna Dinarskega krasa 8 2.2 GAOVICE (LEUSCISINAE, CYPRINIDAE) 9 2.2.1 Imotska gaovica (Delminichthys adspersus) 10 2.3 FILOGENETIKA IN POPULACIJSKA GENETIKA 11 2.3.1 Mitohondrijska DNA (mtDNA) 14 2.3.2 Jedrna DNA 15 2.3.3 Mikrosateliti 16 2.4 MIKROMREŽE 18 3 MATERIAL IN METODE ...... 20 3.1 OPIS VZORČNIH MEST 20 3.2 VZORČENJE IN IZOLACIJA DNA 24 3.3 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO (PCR), DOLOČANJE NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA IN GENOTIPIZACIJA 24 3.4 FILOGENETSKA ANALIZA VRST RODU PHOXINELLUS 26

VI Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

3.4.1 Jedrni geni 26 3.5 ANALIZA POPULACIJSKE STRUKTURE IMOTSKE GAOVICE 27 3.5.1 Mitohondrijska DNA 27 3.5.2 Mikrosateliti 28 3.6 ANALIZA DIFERENCIALNEGA IZRAŽANJA GENOV Z MIKROMREŽAMI 31 3.6.1 Postavitev poskusa 31 3.6.2 Analiza mikromrež 32 4 REZULTATI ...... 33 4.1 RAZREŠEVANJE TAKSONOMSKIH NEJASNOSTI V SKUPINI GAOVICE 33 4.2 POPULACIJSKA STRUkTURA IMOTSKE GAOVICE 35 4.2.1 Mitohondrijska DNA 35 4.2.2 Mikrosateliti 38 4.3 RAZLIKA V IZRAŽANJU GENOV (POSKUS Z MIKROMREŽAMI) 48 5 RAZPRAVA ...... 50 5.1 RAZREŠEVANJE TAKSONOMSKIH NEJASNOSTI V SKUPINI GAOVICE 50 5.2 POPULACIJSKO GENETSKA STRUKTURA IMOTSKE GAOVICE IN PRETOK GENOV MED GEOGRAFSKO LOČENIMI POPULACIJAMI 52 5.3 SPECIFIČEN METABOLIZEM VEZAN NA DOLGOTRAJNO ŽIVLJENJE V PODZEMLJU 58 6 SKLEPI ...... 60 7 POVZETEK (SUMMARY) ...... 61 7.1 POVZETEK 61 7.2 SUMMARY 62 8 VIRI ...... 63 ZAHVALA PRILOGE

KAZALO PREGLEDNIC

str. Preglednica 1: Preučevane vrste iz bivšega rodu Phoxinellus in referenčni predstavniki 20 Preglednica 2: Vzorčna mesta imotske gaovice (Delminichthys adspersus) 21 Preglednica 3: Začetni oligonukleotidi uporabljeni v analizi populacijske strukture imotske gaovice z mikrosateliti 26 Preglednica 4: Populacijski parametri imotske gaovice 39 Preglednica 5: Seznam vseh zaporedji na mikromreži s spremenjenim izražanjem pri primerjavi rib, ki so bile en mesec v temi, in rib z normalno 12 urno foto periodo 49

VII Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) I Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

KAZALO SLIK

str.

Slika 1: Imotska gaovica (Delminichthys adspersus) 10

Slika 2: Preučevani areal imotske gaovice 22

Slika 3: Rdeče jezero (Crveno jezero) 23

Slika 4: Filogenetsko drevo bivšega rodu Phoxinellus ter referenčnih vrst Telestes souffia in Squalius cephalus 35

Slika 5: Nekoreninjena genealogija haplotipov izrisana na podlagi citokroma b 36

Slika 6: Analiza demografske ekspanzije 38

Slika 7: Populacijsko drevo (Populations) 41

Slika 8: Graf FCA (Genetix) 42

Slika 9: Grafi posterirne verjetnosti (LnP (D); STRUCTURE) 43

Slika 10: Populacijska struktura (STRUCTURE, BAPS) 44

Slika 11: Hierarhična analiza populacijske (STRUCTURE) 45

Slika 12: Vzorec migracij ocenjen (IMa2, Geneclass2) 47

KAZALO PRILOG

Priloga A: Seznam haplotipov citokroma b (mtDNA) po vzorčnih mestih Priloga B: Paroma primerjane genetske razdalje med vzorčnimi mesti na osnovi mitohondrijske DNA Priloga C: Paroma primerjane genetske razdalje med vzorčnimi mesti na osnovi

osmih mikrosatelitnih lokusov (paroma primerjani FST) Priloga D: Paroma primerjane genetske razdalje med vzorčnimi mesti na osnovi

osmih mikrosatelitnih lokusov (paroma primerjani RST) Priloga E: Rezultati anlize z modelom izolacija-z-migracijo, izračunani s programom IMa2

X Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

AIC angl. Akaike information criterion (slo. Akaiketov informacijski kriterij) AMOVA angl. Analysis of molecular variance (slo. Anliza molekularne variance) ATP adenozin trifosfat AWTY angl. Are We There Yet (slo. ali smo že tam) BIC angl. Bayes information criterion (slo. Bayesov informacijski kriterij) bp bazni par cDNA komplementarna DNA Cyp_unFLP nedoločena jedrna sekvenca DNA deoksiribonukleinska kislina EGR2B angl. Early Growth Response Factor 2b (slo. faktor odziva v zgodnji fazi rasti) ETS angl. External Transcribed Spacers (slo. zunanji prepisujoči se distančnik) F81 Felsensteinov (1981) model nukleotidne substitucije FCA angl. factorial correspondence analysis (slo. faktorska korespondenčna analiza)

FIS koeficient parjenja v sorodstvu

FST fiksacijski indeks, temelji na identiteti alelov G stopnje variacije med nukleotidnimi mesti (angl. rate variation among site) GTR splošni časovno reverzibilni model nukleotidne substitucije

HEXP angl. expected heterozygosity (slo. pričakovana heterozigotnost) HKY Hasegawa Kishino Yano model nukleotidne substitucije

HOBS angl. observed heterozygosity (slo. opažena heterozigotnost) HW Hardy in Weinberg IAM angl. Infinite Alleles Model (slo. model neskončno alelov) IGS angl. Internal Genetic Spacer (slo. notranji genetski distančnik) ITS angl. Internal Transcribed Spacer (slo. notranji prepisujoči se distančnik) IUCN angl. International Union for Conservation of Nature (slo. Svetovna zveza za varstvo narave)

LSU angl. nuclear Large Subunit (slo. jedrna velika podenota ribosoma) MCMC angl. Markov Chain Monte Carlo (slo. Markova veriga Monte Carlo) ML angl. Maximum Likelihood (slo. največje verjetje) MP angl. Maximum Parsimony (slo. metoda varčnosti) mtDNA mitohondrijska DNA

NA povprečno število alelov na lokus NADH angl. nicotinamide adenine dinucleotide (slo. nikotinamid adenin dinukleotid ) NJ angl. Neighbour-Joining (slo. sosedsko združevanje) NTS angl. Non-Transcribed Spacer (slo. ne-prepisujoči se distančnik) PCR angl. Polymerase Chain Reaction (slo. verižna reakcija s polimerazo ) RAG1 angl. Recombination Activating Gene (slo. gen, ki aktivira rekombinacijo) RNA ribonukleinska kislina rRNA ribosomska RNA

RST fiksacijski indeks, temelji na številu ponovitev osnovnega motiva na posameznem alelu SMM angl. Stepwise Mutational Model (slo. model postopnega mutiranja) SNP angl. Single Nucleotid Polymorphism (slo. točkovni polimorfizem) SSU angl. nuclear Small Subunit (slo. jedrna mala podenota ribosoma) Taq Termophilus aquaticus (bakterijska vrsta) TPM triparametrični model nukleotidne substitucije TrN Tamurin in Neiev model nukleotidne substitucije tRNA prenašalna RNA TVM transverzijski model nukleotidne substitucije uf angl. unequal frequencies (slo. neenake frekvence) UPGMA angl. Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (slo. metoda neponderirane aritmetične sredine) VNTR angl. variable number tandem repeats (slo. tandemske ponovitve osnovnega motiva dolgega različno število baznih parov)

XII Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

SLOVARČEK

Bayesov princip/metoda metoda/princip v statistiki in verjetnosti, ki vrednoti hipoteze na podlagi posteriorne verjetnosti centromera regija DNA, kjer sta kromatidi kromosoma v najbližjem kontaktu efektivna velikost populacije dejansko število posameznikov, ki se razmnožujejo; pomembno za naključni genski drs ekson kodirajoči del gena evkromatin razvit kromatin fluorokrom fluorescentna molekula heterokromatin nerazvit, skondenziran kromatin intron nekodirajoči del gena metoda varčnosti metoda, ki na podlagi vzorcev stanj znakov izbere tisto hipotezo sorodstvenih odnosov, ki zahteva najmanj sprememb stanj znakov metoda največjega verjetja metoda, ki izbere hipotezo sorodstvenih odnosov, ki ima največje verjetje v okviru izbranega evolucijskega modela monofiletsi tisti, ki ima(jo) skupnega prednika naključni genski drs spremembe v frekvenci alelov iz generacije v generacijo, ki so posledica naključnih dogodkov, kot je naključen izbor gamet za zigoto Predkambrij najstarejše in najdaljše geološko obdobje, začelo se je pred 4,5 milijarde leti polifiletski tisti, ki nima(jo) skupnega prednika troglobiont vrste ali populacije, ki so normalno vezane na podzemni habitat evtroglofil v osnovi površinska vrsta, ki pa lahko oblikuje trajno podzemno populacijo subtroglofil vrsta, ki trajno ali začasno poseljuje podzemni habitat, ampak je vezana na površe z vsaj eno življenjsko

aktivnostjo (dnevno, sezonsko, med življenjsko zgodovino) trogloksen vrsta, ki se v podzemlju pojavlja le sporadično telomera ponovitve nizov nukleotidov na koncih kromosomov troglomorfoza spremembe in prilagoditve povezane z življenjem v podzemlju zunanja skupina najbližji sorodnik skupini vrst, ki jo preučujemo (angl. outgroup)

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 1 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

1 UVOD

Kras je izraz za vrsto pokrajine, kjer so se zaradi raztapljanja kamnin razvile posebne površinske in podzemeljske kraške oblike. Za običajno apnenčasto ali dolomitno pokrajino je značilna močna povezanost med površinsko in talno vodo (Gams, 2003). Eno izmed najbolj preučevanih ter preučenih kraških območji na svetu je Dinarski kras, ki sega od Italije do Albanije in je poznan po visoki stopnji biodiverzitete in endemizma (Sket in sod., 2004). Najbolj znani endemit tega področja je edina evropska podzemna dvoživka močeril (Proteus anguinus), poleg njega pa tu najdemo še številne druge endemite, kot so ceponožni rak Bryocamptus zschokkei, jamski trdoživ Velkovrhia enigmatica, dinarska voluharica Dinaromys bogdanovi ter druge podzemne in nadzemne vrste, med katerimi je tudi slabo raziskana skupina rib iz družine krapovcev (Cyprinidae) s poljudnim imenom »gaovice« (Sket, 2004a).

Gaovice naseljujejo izvirna območja vodotokov kraških polj v centralnem in južnem delu Dinarskega krasa (Mrakovčić in sod., 2006). Na območju Hrvaške in Bosne in Hercegovine živi predvidoma deset endemičnih vrst prvotno uvrščenih v rod Phoxinellus, ki pa se je kasneje izkazal za polifiletskega. Tako so bile vrste Phoxinellus ghetaldii, Ph. adspersus, Ph. jadovensis in Ph. krbavensis na osnovi dela mitohondrijske in jedrne DNA uvrščene v nov rod Delminichthys, medtem ko so bile Ph. metohiensis, Ph. croaticus, Ph. fontinalis premeščene v že obstoječi rod Telestes. Tri vrste, Ph. alepidotus, Ph. pseudalepidotus in Ph. dalmaticus, pa so ostale v rodu Phoxinellus (Freyhof in sod., 2006). Ne glede na taksonomsko uvrstitev pa je vsem trem vrstam skupna prilagoditev na življenje v ponikalniškem habitatu. Skupaj s presihajočo vodo se v sušnih mesecih umaknejo v podzemlje, kjer lahko preživijo tudi več mesecev, nato pa ob ponovnem porastu kraških voda izplavajo iz izvirov in požiralnikov. Pri tem se ribe v obe smeri selijo aktivno, ne le pasivno z vodnim tokom (Mrakovčić in sod., 2006). Ena od posledic življenja v začasnih kraških izvirih, ki so raztreseni ob robovih kraških polj, pa je razdrobljen areal, ki je še posebno izrazit pri vrsti imotska gaovica Delminichthys adspersus (Zupančič, 2008).

2 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Areal imotske gaovice je majhen (r = 30 km) in se razteza od mesta Imotski (Hrvaška) na severzahodu do Grud (BiH) na severovzhodu in Ploč (Hrvaška) na jugu, ter obsega izvire rek Vrljika (Hrvaška), Tihaljina (BiH) in Matica (Hrvaška), ki so pogosto medsebojno površinsko izolirani (Zupančič, 2008). Najbolj očiten primer izolacije je tipska lokacija D. adspersus (Heckel 1843) Rdeče jezero (Crveno jezero), ki je kraško brezno s permanentnim jezerom, katerega vodni nivo je od 250 do 300 metrov pod robom (Bonacci, 2006). Poleg informacij o razširjenosti imotske gaovice (Zupančič, 2008), njenega filogenetskega položaja (Freyhof in sod., 2006) in morfološke opredelitve (Franičević in Tičina, 2003) je o biologiji in ekologiji imotske gaovice malo znanega in večina geografsko ločenih populacij še ni bila raziskana ne z morfološkega ne z molekularnega vidika. Vrsta je na seznam IUCN (angl. International Union for Conservation of Nature) uvrščena kot ranljiva, ogrožena pa je predvsem zaradi omejene razširjenosti, uničevanja kraških območji ter občasnega prekomernega izlova.

1.1 NAMEN DELA

Namen doktorske disertacije je razširiti znanje o slabo raziskani skupini rib z imenom »gaovice«, ki naseljujejo centralni del južnega Dinarskega krasa in periodično kolonizirajo jame. Raziskovalno delo smo v ta namen razdelili v tri sklope: (1) razreševanje taksonomskih nejasnosti v skupini gaovice, (2) populacijsko genetska struktura imotske gaovice in pretok genov med določenimi populacijami ter (3) specifičen metabolizem vezan na dolgotrajno življenje v podzemlju.

V prvem sklopu raziskovalnega dela (Razreševanje taksonomskih nejasnosti v skupini gaovice) je bil naš namen ovrednotili dosedanje študije, ki so že poskušale razrešiti taksonomijo skupine gaovice. Freyhof in sodelavci (2006) so postavili hipotezo o sorodstvenih odnosih med desetimi vrstami gaovic na osnovi mitohondrijske DNA ter na osnovi nepoznane jedrne sekvence, za katero ni znano, ali je pod vplivom selekcijskega pritiska, zato smo to hipotezo preverili še na osnovi novih odsekov jedrne DNA (deli genov za rodopsin, EGR2B (angl. Early Growth Response Factor 2B) in ITS1 (angl. Internal Transcribed Region)). Naš glavni namen je bil predvsem ugotoviti, ali je bila ustanovitev novega rod Delminichthys smiselna, če je le-ta monofiletski ter ali ga sestavljajo štiri predlagane vrste. Poleg tega nas je zanimal tudi položaj ostalih šestih vrst

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 3 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 gaovic in kolikšna je podpora za njihovo razdelitev med dva rodova, Phoxinellus in Telestes.

Ker je kraški sistem poznan po nepredvidljivih podzemnih in nadzemnih vodnih povezavah, je bil naš namen v drugem sklopu raziskovalnega dela (Populacijsko genetska struktura imotske gaovice in pretok genov med določenimi populacijami) ugotoviti, ali med populacijami iste vrste, med katerimi ni površinskih vodnih povezav, prihaja do genetskega pretoka oziroma migracij rib. V ta namen smo izbrali vrsto imotska gaovica (D. adspersus), ki ima največji in hkrati najbolj razdrobljen areal. Z vzorčenjem in molekularno analizo izoliranih populacij smo želeli ugotoviti populacijsko strukturo vrste ter morebitno prisotnost genetsko izoliranih populacij, ki bi lahko predstavljale potencialen vir evolucijsko pomembnih enot ali celo kandidatov za nove vrste.

V tretjem sklopu (Specifičen metabolizem vezan na dolgotrajno življenje v podzemlju) je bil naš namen razširiti znanje o biologiji imotske gaovice, predvsem pa ugotoviti, kaj se dogaja z metabolizmom ribe v času bivanja pod zemljo. Ker nobena izmed vrst v katerikoli fazi ne kaže vidnih prilagoditev na podzemlje, smo poskušali s pomočjo tehnologije mikromrež ugotoviti, ali v podzemni fazi pride do sprememb metabolizma ribe ter kakšne so te spremembe.

1.2 RAZISKOVALNE HIPOTEZE

V okviru raziskave bomo potrdili ali ovrgli naslednje hipoteze:

1. Z dodatnimi jedrnimi geni (rodopsin, ERGF2B in ITS1) bomo potrdili hipotezo, postavljeno na osnovi mitohondrijskega citokroma b in nedoločene jedrne regije Cyp_unFLP, ki predvideva uvrstitvev vrst imotska, popvska in jadovska gaovica ter krbavski pijor (D. adspersus, D.gethaldi, D. jadovensis, D. krbavensis) v svoj rod (Delminichthys). 2. Vrsta imotska gaovica (Delminichthys adspersus) predstavlja eno panmiktično populacijo. Osebki med različnimi lokacijami migrirajo tako po nadzemnih kot tudi podzemnih vodnih povezavah.

4 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

3. Pri vrsti imotska gaovica se v času življenja pod zemljo izražanje genov spremeni.

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 5 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

2 PREGLED OBJAV

2.1 KRAS

Kras je izraz za vrsto pokrajine, kjer so se zaradi raztapljanja kamnin razvile posebne površinske in podzemeljske kraške oblike. Površinske so žlebiči oz. škrape, vrtače, vdornice, polja ter občasna in stalna jezera, podzemeljske pa jame in brezna. Značilen je kompleksen nadzemni in podzemni vodni sistem in močna povezanost med površinsko in talno vodo. Kras se najpogosteje razvije v sedimentnih kameninah (apnencih, dolomitih, sulfatih, haloidih, kremenovih peščenjakih), lahko pa tudi v metamorfnih (marmorjih, kvarcitih) ali magmatskih (karbonatnih) kameninah ali s taljenjem v ledu. Postopek, pri katerem se v apnencu topita CaCO3 ali MgCO3, netopni silikati in oksidi pa ostajajo kot zemlja (jerovica oz. terra rossa), se imenuje zakraševanje ali karstifikacija. Zakraševanje poteka v več fazah (predkraška, zgodnje kraška, zrela kraška, smrt krasa) in traja dokler se ne raztopijo vse topne snovi in ostane le netopna podlaga. Samo ime »kras« prihaja iz lastnega imena za pokrajino, ki se razteza med Tržaškim zalivom in Vipavsko dolino ter Soško dolino in Brkini, in se je razširilo na stvarno ime za to posebno vrsto pokrajine. Kraška ozemlja se nahajajo povsod po svetu, največja so na Kitajskem in v Avstraliji. V Evropi je kras zelo raznolik in ne zajema samo apnenčastih tvorb, popolnoma brez kraškega ozemlja pa so le Finska, Danska in Nizozemska (Gams, 2003). Dinarski kras zavzema del Italije, južni polovici Slovenije in Hrvaške, celo Črno Goro, zahodno Srbijo ter Albanijo do Helenidov in vključuje tudi večino jadranskih otokov, potopljene jame pod morjem ter visoke gorske grebene, ki tečejo paralelno z obalo v smeri severozahod- jugovzhod. Posebna značilnost Dinarskega krasa so kraška polja: velike, zaprte depresije brez površinskega pritoka ali odtoka, ki periodično poplavljajo. Na začetku polja voda privre iz podzemlja, teče po površju ter na drugem koncu zopet ponikne. Ponikalnice so tako tudi ene od pomembnih ekoloških niš na Dinarskem krasu (Gams, 2003; Kranjc, 2004; Sket, 2004b).

2.1.1 Sledenje vodnih povezav v krasu

Zaradi zapletenega vodnega sistema krasa je za ugotavljanje podzemnih povezav najbolj uveljavljena tehnika sledenje s pomočjo soli, barve ali sprememb v temperaturi in količini

6 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

vode. Sledilni testi veljajo za najbolj zanesljiv in učinkovit način zbiranja informacij o nedostopnih in neraziskanih podzemnih delih kraškega sistema (Field, 1999; Goldscheider in sod., 2008). V kombinaciji z drugimi geološkimi in hidrološkimi tehnikami pa predstavljajo tudi najmočnejšo metodo za določevanje skrajnih mej razvodji v krasu (Goldscheider, 2005), kar je izjemnega pomena za vse vede, ki se ukvarjajo s preučevanje kraških področji (geologija, hidrologija, kemija, fizika, vodno upravljanje, biologija in limnologija; Käs, 1998). Obstaja več vrst kriterijev, po katerih se sledilni testi delijo. Ford in Williams (2007) jih delita na kvantitativne in kvalitativne ali glede na učinkovino, ki se uporablja, na delce, impulze umetne označevalce in naravne označevalce, ki jih naprej delita na mikroorganizme, ione in raztopine ter okoljske izotope. Smart in Worthington (2004) razvrščata sledilce kot fizikalne, kemične, izotopične in biološke, pri čemer biološke definirata kot organizme, ki so v vodi prisotni po naključju (npr. koliformne bakterije). Pipan in Culver (2007) sta predstavila idejo o sistematični uporabi bioloških sledilcev kot dopolnilo dosedanjim hidrološkim metodam. Biološki sledilci so naravno prisotni v vodi, zato ni potrebe po uporabi za okolje potencialno škodljive barve ali soli, poleg kvantitativnih meritev pa dajejo tudi kvalitativne informacije o tipu vodne povezave in njeni primernosti za disperzijo organizmov.

2.1.2 Ekološke razmere v tokovih ponikalnic

Ponikalnice so stalni ali občasni vodotoki, ki se formirajo na površju in tečejo v podzemlje. Obstajata dve vrsti ponikalnic, perienalne in intermitentme. Perenialne ponikalnice imajo na površini popolnoma osnovano floro in favno, zato je tudi njihov podzemni del razmeroma bogat s hranili. Podzemne življenjske združbe so poleg obligatnih podzemnih organizmov (troglobiontov) sestavljene še iz površinskih organizmov, ki jih v podzemlje naključno odnese tok (troglokseni), organizmov, katerih del življenjskega cikla je vezan na podzemlje (subtroglofili) in organizmov, ki lahko tvorijo popolnoma troglomorfne populacije (evtroglofili). Klimatski parametri v perenialnih ponikalnicah vsaj delno dnevno in letno nihajo, kar pa je odvisno od oddaljenosti od ponora, vodne mase in toka. Z oddaljenostjo od ponora se spreminjajo tudi količina in kvaliteta hrane, prodiranje svetlobe in količina nitratov, ki se zaradi odsotnosti zelenih rastlin ne absorbirajo in se kopičijo po toku navzdol. Zaradi spreminjanja vseh parametrov v odvisnosti od oddaljenosti od ponora lahko podzemeljski del toka razdelimo v več »podhabitatov«, ki se odražajo tudi v razlikah

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 7 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 lokalne favne. Intermitentne ponikalnice nimajo osnovane flore in favne, vendar podzemeljske vire hrane občasno obogatijo kopenski organizmi, ki jih tok odnese v podzemlje. Združbe so sestavljen predvsem iz vodnih troglobiontov, klimatski parametri pa so praktično identični kot pri perenialnih ponikalnicah. Delno se ohranijo dnevno/nočni in sezonski ritmi, ki pa se z določeno oddaljenostjo od ponora porušijo. Poleg oddaljenosti je glavni parameter, ki narekuje temperaturo, vsebnost hranil, kisika in nitratov, količina vode oziroma njen pretok (Sket, 2004b).

Na ekološke razmere v ponikalnicah vplivajo tudi antropogeni dejavniki oziroma onesnaževanje. Kraška pokrajina je navadno revna z uporabno vodo, saj v sušnih obdobjih površinski deli tokov presahnejo, podzemeljske zaloge pa so omejene in težje dostopne. Če v tem času pride do izliva odpadne vode ali drugega vira onesnaževanja, se v obstoječih razdrobljenih in omejenih vodnih telesih strupene snovi pojavijo v izjemno visokih koncentracijah ter povzročijo uničenje flore in favne, ki se zaradi izoliranosti ponovno razvijeta mnogo kasneje. V kolikor do onesnaženja pride v času visokega vodostaja, se zaradi prepletenosti vodnega sistema onesnažila sicer razredčijo, hkrati pa se tudi razširijo na obsežno področje. Zaradi številnih povezav, ki jih ne poznamo v celoti, je tudi nemogoče oceniti, do kam vse je kontaminirana voda segla. Drugačni abiotski in biotski dejavniki (morfologija struge, odsotnost zelenih rastlin...) podzemeljskih tokov zmanjšajo njihove samoočiščevalne sposobnosti in otežijo predvidevanja, koliko onesnaževanja bodo prenesli brez nepovratnih negativnih posledic. Oceno vpliva onesnaževanja ovira tudi slabo poznavanje fizioloških značilnosti ter življa in združb v ponikalnicah (Sket in Velkovrh, 1980).

2.1.3 Prilagoditev organizmov na podzemlje

Podzemni organizmi izkazujejo različne znake (troglomorfoze), ki so posledica življenja v podzemlju. Najpogostejši troglomorfozi sta pomanjkanje pigmenta in redukcija očesnega aparata, poleg teh pa obstajajo še številne druge morfološke (podaljševanje izrastkov), fiziološke (upočasnitev metabolizma), vedenjske (fotofobija) in ekološke (zgodnji razvoj oziroma neotenija) prilagoditve na razmere v podzemlju. Okoljske razmere v podzemlju so relativno konstante, zato so podzemni organizmi neodporni na hitre spremembe okoljskih dejavnikov. Poleg tega so populacije običajno majhne in geografsko izolirane, zato so še

8 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

toliko bolj dovzetne za lokalna ali splošna izumrtja (Culver, 1982; Culver in sod., 1995; Romero in Pulson, 2001; Trajano, 2001).

Leta 2001 sta Romero in Pulson zbrala seznam več kot 86 vrst jamskih rib iz 18 družin, med tem ko je bilo leta 2003 opisanih že več kot 125 vrst (Proudlove, 2006). Glede na visoko stopnjo odkrivanja novih vrst pa se predvideva, da bo številka do leta 2050 narasla na 250 jamskih ribjih vrst (Proudlove, 2006). Redke od družin so sestavljene iz izključno jamskih vrst in tudi znotraj posameznih vrst pogosto najdemo popolnoma troglobiontske populacije, nadzemne populacije ter vse vmesne stopnje, ki se medsebojno lahko parijo (Romero in Pulson, 2001). Najbolj raziskane jamske ribe so iz mehiškega rodu Astyanax in amblyopsidi iz Severne Amerike (Trajano, 2001). Prav tako kot pri drugih organizmih so podzemne ribe najpogosteje brez pigmenta, medtem ko je njihov očesni aparat in z njim povezano živčevje na različnih stopnjah redukcije. Poleg tega so fotofobične, imele pa naj bi tudi spremenjeno obliko in strukturo ribjega mehurja ter zreducirano število oziroma kompleksnost lusk. Avtorji omenjajo še upočasnjeno metabolno stopnjo in odsotnost formiranja jat (Romero in Pulson, 2001).

Pri gaovicah ni opaziti morfoloških sprememb, ki bi kazale na posledice njihovega bivanja v podzemlju, razen zmanjšanega števila lusk, ki ga Freyhof in sodelavci (2006) navajajo kot možno prvo stopnjo prilagoditve na podzemne razmere. Ob padcu vodostaja se aktivno začnejo premikati v podzemne dele tokov, kar bi lahko šteli kot vedenjsko prilagoditev na specifične razmere v občasnih kraških izvirih (Mrakovčić in sod., 2006; osebna opažanja). Druge morfološke, ekološke, fiziološke ali vedenjske prilagoditve niso opisane.

2.1.4 Podzemeljska vodna favna Dinarskega krasa

Podzemeljska vodna favna Dinarskega krasa je najbolj bogato zastopana z raki, od katerih je največ ceponožcev in postranic. Zelo veliko pa je tudi polžev, kar je glede na druga kraška območja precej nenavadno. Vredna omembe sta zagotovo tudi edina vodna troglobiontska školjka (Congeria kusceri) in ožigalkar (Velkovrhia enigmatica) ter seveda močeril (Proteus anguinus), ki je edini vodni troglobiontski vretenčar. V centralnem delu južnega dela Dinarskega krasa so prisotne številne endemične ribe iz družine krapovcev, ki periodično kolonizirajo jame (Sket in sod., 2004; Sket, 2004a).

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 9 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

2.2 GAOVICE (LEUSCISINAE, CYPRINIDAE)

Gaovice so majhni, do 12 cm veliki endemiti iz družine krapovcev (Cyprinidae) in poddružine Leuciscinae, ki živijo v kraških vodah jugozahodnega Balkana (Mrakovčić in sod., 2006). Do leta 2006 so bile vse vrste uvrščene v rod Phoxinellus, ki pa se je izkazal za polifiletskega. Freyhof in sodelavci (2006) so vrste Phoxinellus ghetaldii, Ph. adspersus, Ph. jadovensis in Ph. krbavensis na osnovi mitohondrijskga citokroma b in dela nedoločene jedrne DNA, ki so ga poimenovali Cyp_unFLP, uvrstili v nov rod Delminichthys, medtem ko so Ph. metohiensis, Ph. croaticus, Ph. fontinalis premestili v že obstoječi rod Telestes, tri vrste, Ph. alepidotus, Ph. pseudalepidotus in Ph. dalmaticus, pa so ostale v rodu Phoxinellus. Vseh deset opisanih vrst se nahaja na Rdečem seznamu ogroženih vrst IUCN. Medtem ko imajo Delminichthys adsperus, D. ghetaldii, Phoxinellus dalmaticus in Telestes metohiensis status ranljive vrste, sta Ph. alepidotus in T. croaticus ogroženi, D. jadovensis, D. krbavensis, Ph. dalmaticus in T. fontinalis pa kritično ogrožene (Mrakovčić in sod., 2006).

Morfološko je desetim vrstam skupno vretenasto in bočno sploščeno telo pokrito z majhnimi luskami, ki ponekod manjkajo, in žrelni zobje, ki so v eni vrsti. Vse so bentopelagične in litofilne, saj ikre odlagajo na trdi substrat oziroma kamnito podlago. Drstijo se spomladi ozirom zgodaj poleti. Prehrana ni podrobno raziskana, zato se predvideva, da se prehranjujejo z nevretenčarji. Gaovice so prilagojene na življenje v ponikalniškem habitatu in se v času nizkega vodostaja skupaj s presihajočo vodo umikajo v podzemlje, kjer preživijo tudi več mesecev (Mrakovčić in sod., 2006).

Vrste D. krbavensis in Ph. fontinalis ter D. jadovensis in Ph. dalmaticus živijo paroma v simpatriji, druge pa so medsebojno alopatrične (Mrakovčić in sod., 2006). Predvideva se, da so vse vrste evolucijsko zelo stare in da izhajajo iz obdobja srednjega miocena (13 milijonov let). So ene izmed geografsko najbolj izoliranih vrst ciprinidov v Evropi in zahodni Aziji (Freyhof in sod., 2006). Za vse je značilen fragmentiran habitat, ki je še posebej očiten pri imotski gaovici (Delminichthys adspersus) (Zupančič, 2008).

10 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

2.2.1 Imotska gaovica (Delminichthys adspersus)

Imotska gaovica (Slika 1) ima vretenasto in bočno sploščeno telo ter podaljšano glavo s terminalnimi usti. Bočna proga je prekinjena in se najpogosteje zaključi na repnem nastavku. Hrbet in boki so pokriti s številnimi temnimi pikami nepravilne oblike, ki se lahko zlijejo v večje packe. D. adspersus je litofilna vrsta, ki se drsti v juniju in juliju. Samcem v času drsti po glavi in prsnih plavutih zrastejo bradavice. Hrani se z vodnimi nevretenčarji, predvsem z rakci in ličinkami vodnih žuželk. Naseljuje kraške reke, jezera, izvire, pa tudi zamočvirjene predele, pri temperaturi vode med 5 in 20 stopinj. Ob neugodnih razmerah, ko vode presušijo, se umakne v podzemlje (Mrakovčić in sod., 2006). Poleg osnovnih informacij (zgoraj navedeno), filogenetskega položaja (Freyhof in sod., 2006, Franičević in Tičina, 2003) in morfološke opredelitve vrste (Bogutskaya in Zupančič, 2003) je o biologiji in ekologiji imotske gaovice malo znanega in večina geografsko ločenih populacij še ni bila raziskana niti z morfološkega niti z molekularnega vidika.

Slika 1: Imotska gaovica (Delminichthys adspersus; fotografija: Arne Hodalič, Palandačić in sod., 2012b) Figure 1: Imotska gaovica (Delminichthys adspersus, photography by Arne Hodalič, Palandačić et al., 2012b)

Na Rdečem seznamu ogroženih vrst IUCN-a (1996) je uvrščena med občutljive vrste. Mednarodno je zaščitena z Bernsko konvencijo in z Evropsko direktivo o zaščiti habitatov.

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 11 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Glavni vzroki za ogroženost so zmanjševanje in uničevanje kraških območji zaradi agrikulturnega onesnaževanja in regulacije vodotokov ter občasen prekomeren izlov za potrebe lokalnega prebivalstva, ki ribe uporablja v prehrani (Mrakovčić in sod., 2006).

2.3 FILOGENETIKA IN POPULACIJSKA GENETIKA

Filogenija je zgodovina razvoja določene skupine organizmov oziroma genov in njihovih prednikov, s filogenetiko pa razvoj določene skupine rekonstruiramo. Cilja filogenetskih študij sta dva: rekonstrukcija pravilnih sorodstvenih odnosov med organizmi in ocena časa od cepitve med skupinami (divergenca). Organizmi so v skupine razvrščeni glede na stopnjo sorodnosti (npr., kraljestva, redovi, družine, rodovi, vrste, populacije). Za ponazoritev sorodnosti se uporabljajo filogenetska drevesa, ki so včasih temeljila na morfoloških lastnostih, danes pa so vse bolj v uporabi molekularne metode, ki podobnost med skupinami določijo na osnovi nukleotidnih zaporedji DNA. Filogenetsko drevo je sestavljeno iz vej in vozlišč. Notranja vozlišča pomenijo prednika oziroma predniško stanje, zunanja vozlišča pa preučevane skupine. Veje povezujejo vozlišča in običajno predstavljajo oddaljenost med skupinami (količino sprememb). Koreninjeno drevo poleg odnosov med skupinami prikazuje tudi zaporedje odcepljanja skupin (evolucijsko pot), korenina pa predstavlja skupnega prednika vseh vključenih skupin, medtem ko nekoreninjeno drevo predstavlja samo odnose med skupinami. Drevo se ukorenini s pomočjo zunanje skupine (angl. outgroup), za katero obstajajo zunanje informacije (npr. paleontološki podatki), da se je odcepila prej kot katera od preučevanih skupin in se ne bo uvrstila med preučevane skupine (Li in Graur, 1991).

Metode za izris filogenetskih dreves se delijo na distančne metode in metode na osnovi znakov. Distančne metode nukleotidna zaporedja (ali morfološke znake) pretvorijo v distančno matriko, v kateri razdalje predstavljajo število razlik med preučevanimi skupinami. V primeru nukleotidnih zaporedji določijo število različnih nukleotidov, ki jih preračunajo v distanco med skupinama (Li in Graur, 1991). Med najpogosteje uporabljenimi metodami za rekonstrukcijo filogenetskih dreves iz podatkov o razdaljah je metoda NJ (sosedsko združevanje oz. angl. Neighbour Joining), ki temelji na principu združevanja parov v operacijske taksonomske enote tako, da je celotna dolžina vej na koncu združevanja enot minimalna. Začne z zvezdastim drevesom in ko najde prvi

12 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

(najbližji) par, ga združi v operacijsko enoto ter nadaljuje iskanje dokler ne razreši vseh medsebojnih odnosov na drevesu (Saitou in Nei, 1987). NJ dopušča različne stopnje sprememb na posameznih vejah. Metode na osnovi znakov v nukleotidnem zaporedju primerjajo stanje znakov na določeni poziciji, v primeru nukleotidnih zaporedji je to primerjava med zaporedji v vertikalnem stolpcu poravnave. Metode na osnovi znakov, ki se največ uporabljajo, so metoda varčnosti (Parsimony), največjega verjetja (ML, angl. Maximum Likelihood) in varianta ML, podprta z Bayesovo statistiko (angl. Bayesian). Metoda varčnosti (Fitch, 1971) najprej v poravnavi najde informativna mesta, ki dajejo prednost določenemu drevesu pred drugimi, kot najbolj verjetno drevo pa določi tisto, do katerega pride z najmanjšim številom sprememb med temi mesti (najbolj varčno drevo). Z metodo največjega verjetja (Felsenstein, 1981) ocenimo verjetnost hipoteze o evolucijski zgodovini, ki jo v našem primeru predstavlja filogenetsko drevo. Izračunamo kolikšna je verjetnost, da bi ob danem drevesu in izbranem modelu dobili obstoječi rezultat oziroma, pri določenem modelu in obstoječih podatkih, med vsemi možnimi drevesi izračuna tisto z največjim verjetjem. Podporo drevesu zagotovi s samovzorčenjem, tako da ovrednoti število ponovitev, pri katerem je bila ponujena določena rešitev filogenetskega odnosa. ML, ki temelji na Bayesovi statistiki (Yang in Rannala, 1997), najboljše drevo izriše z algoritmom MCMC (angl. Markov Chain Monte Carlo), tako da algoritem v vsakem koraku predlaga novo drevo, ki ga izbere z naključno premestitvijo vej na trenutnem drevesu. Primerja ga s prejšnjo rešitvijo in v primeru, da bolj ustreza vhodnim podatkom, rešitev sprejme. Iskanje traja, dokler se stanje spreminja na boljše oziroma dokler se ne ustali - konvergira. Kolikokrat je bilo določeno drevo »obiskano«, pa je dober približek njegove posteriorne verjetnosti.

Za izris filogenetskih dreves, ki temeljijo na nukleotidnih zaporedjih, je ključen izbor primernega evolucijskega modela, ki najbolje opiše, kako hitro in na kakšen način se v določenem zaporedju kopičijo substitucije. Kateri model je najprimernejši, se oceni iz analiziranih nukleotidnih sekvenc. Eno-parametrični model (Jukes – Cantorjev model) predvideva, da so vse spremembe (substitucije) enako verjetne, medtem ko dvo- parametrični model (Kimura) predpostavlja razliko med tranzicijami in transverzijami. Najkompleksnejši je generaliziran časovno reverzibilni model (GTR, angl. General Time Reversible), ki predvideva šest različnih stopenj za kodonska mesta, razlikuje med

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 13 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 tranzicijam in transverzijami ter upošteva še številne druge spremenljivke (Li in Graur, 1991).

Populacijska genetika preučuje genetsko sestavo in procese v bioloških populacijah, na katere vplivajo štiri evolucijske sile: selekcija, naključni genski drs, mutacije in migracije. Ukvarja se s populacijsko strukturo v času in poskuša razložiti pojave kot so adaptacija in speciacija. Temelj populacijske genetike so abstraktni matematični modeli, ki opisujejo dinamiko frekvenc genov in alelov. Teoretični modeli poskušajo posneti vzorce genetske variacije, ki se jih nato primerja z realnimi podatki, zbranimi na vzorčnem številu organizmov. Bazo populacijske genetike in sorodne kvantitativne genetike so postavili S. Wright, J.B.S. Haldane in R.A. Fisher, ki so integrirali principe Mendelske genetike z Darwinovo naravno selekcijo in s tem postavili temelje za neo-darwinizem ter ključno vlogo populacijske genetike v moderni evolucijski sintezi. Medtem ko sta bila Fisher in Haldane prepričana, da je naravna selekcija tista, ki ima najpomembnejši vpliv na genetsko kompozicijo populacije, je Wright kot enko pomembna štel tudi vpliv naključja (naključni genski drs) in migracije (Fisher, 1918 cit. po Okasha, 2008; Haldane cit. po Okasha, 2008; 1932, Wright cit. po Okasha, 2008; 1931; Kimura in Ohta, 1971 cit. po Okasha, 2008; Hartl, 1980 cit. po Okasha, 2008; Allendorf in sod., 1987).

Najenosnovnejši teorem populacijske genetike je Hardy-Weinbergov teorem, ki sta ga ločeno odkrila G.H. Hardy in W. Weinberg leta 1908, in predvideva, da so v idealizirani populaciji frekvence alelov in genotipov v ravnotežju, kar pomeni, da se ohranjajo iz generacije v generacijo. Odnos med frekvenco alelov in genotipov opisujeta enačbi p2 + 2pq + q2= 1 in p + q = 1, pri čemer sta p in q frekvenci alelov. V kolikor je prisotnih več alelov, se enačba razširi. Hardy-Weinbergov zakon omogoča modeliranje evolucijskih sprememb, saj lahko iz relativnih frekvenc alelov ob predpostavki, da je populacija v HW ravnotežju, izračunamo distribucijo celotne frekvence genotipov. Kljub temu da je v realnih populacijah le redko zadoščeno zgoraj navedenim pogojem, je opisan princip (v približku) osnovno orodje populacijske genetike. Preko odstopanja od HW ravnotežja je možno prepoznati številne procese, kot so izolacija med populacijami, parjenje v sorodstvu, ozka grla in selekcija (Weinberg, 1908 cit. po Okasha, 2008; Crow, 1999 cit. po Okasha, 2008).

14 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

V populacijski genetiki se uporabljajo deterministične in stohastične metode. Deterministične predpostavljajo neskončno velikost populacije ter zanemarjajo spreminjanje genskih frekvenc, zato populacijsko dinamiko opisujejo s srednjimi genskimi frekvencami. Sem spadajo metode osnovane na F-statistiki (Wright, 1978; Slatkin, 1994), s katerimi računamo fiksacijske koeficiente ter koeficiente parjenja v sorodstvu. Stohastične metode opisujejo verjetnostni proces v populacijah končne velikosti in, za razliko od metod F-statistike, ki računajo povprečje lokusov, podatke iz vseh lokusov vključijo v en verjetnostni model ter jih analizirajo z MCMC analizo (Pritchard, 2000; Corander, 2003). Leta 1982 je Kingman v populacijsko genetiko vpeljal koalescentno teorijo, ki sledi prednikom vzorca, ne modelira pa spremembe v frekvenci alelov v populaciji kot celoti. Gre za obraten pristop, ki poteka od sedanjosti k preteklost in omogoča uporabo manjšega števila vzorcev, določanje časa od ločitve dveh populacij, oceno velikosti populacij ter migracije med njimi (Beerli in Felsenstein, 1999; Beaumont, 1999; Kuhner in sod., 2000; Hey in Nielsen, 2004; Beerli, 2006).

Za razreševanje nekega vprašanja iz področja filogenetike ali populacijske genetike je ključen izbor primernega odseka DNA, ki mora biti v skladu s kategorično ravnjo, na kateri so preučevani taksoni. Za primerjavo bližnje sorodnih skupin (sorodne vrste, populacije iste vrste) so primerni odseki DNA, v katerih se spremembe kopičijo hitreje, medtem ko se za razreševanje globokih filogenij uporabljajo bolj ohranjeni odseki, v katerih se spremembe kopičijo počasneje. V splošnem se najpogosteje uporabljajo odseki mitohondrijske DNA, od jedrnih zaporedji pa odseki ribosomske DNA, točkovni polimorfizmi in mikrosateliti (Hwang in Kim, 1999).

2.3.1 Mitohondrijska DNA (mtDNA)

Mitohondrijska DNA se za ugotavljanje strukture populacij in odnosov med bližnje sorodnimi vrstami uporablja zaradi visoke stopnje mutacij, enostavne organizacije, dedovanja po materini strani in odsotnosti rekombinacije (Avise, 2000). V celici je prisotna v več kopijah, kar olajša njeno izolacijo (Hwang in Kim, 1999). Zaradi haploidnosti in dedovanja po materini strani, se nove variante v primerjavi z jederno DNA hitreje fiksirajo. Tudi hitrost substitucij v mtDNA je višja kot pri jedrnih genih, kar je posledica višje metabolne stopnje in večjega števila prostih radikalov v mitohondriju, pogostejše delitve

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 15 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 mtDNA in slabših popravljalnih mehanizmov ter manjšega selekcijskega pritiska nekaterih regij (npr. kontrolne regije). Zaradi pojavljanja in fiksacije novih variant se mtDNA uporablja za sledenje novejše evolucijske zgodovine: genskega pretoka med populacijami, kolonizacije ter efekta ozkega grla. Od konkretnih odsekov se za populacijske študije najpogosteje uporablja hipervariabilna kontrolna regija. Deli mtDNA pa so uporabni tudi za študije oddaljenih taksonomskih linij, npr. ohranjeno zaporedje genov, ki nakazuje starodavni vzorec evolucije živali. Za ugotavljanje sorodnosti med družinami ali redkimi rodovi se uporablja 16S rDNA (Hwang in Kim, 1999).

Velika variabilnost mtDNA včasih otežuje konstrukcijo univerzalnih začetnih oligonukleotidov za pomnoževanje specifičnih regij pri širokem krogu organizmov. Zato so v filogenetske študije vključeni večinoma samo geni za 12S in 16S rDNA, citokrom b, NADH dehidrogenazo in citokrom oksidazo, ki so med najbolj ohranjenimi in je modeliranje začetnih oligonukleotidov za njihovo pomnoževanje lažje. Mitohondrijski geni (citokrom oksidaza) se uporabljajo tudi v t.i. DNA barcoding-u, ki je uporaba kratkih odsekov DNA za namen identifikacije organizmov (Kress in sod., 2005). Tudi v filogenetskih in populacijskih študijah rib se najpogosteje uporabljajo odseki ali deli odsekov za citokrom b, citokrom oksidaza, NADH dehidrogenaza in kontrolne regije (Nesbo in sod., 1999; Robalo in sod., 2007; Perdices in sod., 2008).

2.3.2 Jedrna DNA

Jedrna DNA se uporablja za širok spekter filogenetskih in populacijskih analiz. Kodirajoče regije, ki so bolj ohranjene, se uporabljajo za študijo sorodnosti med osnovnimi skupinami organizmov, kot so redovi in družine, nekodirajoče pa za razreševanje sorodnosti med rodovi, vrstami in populacijami. Najpogosteje uporabljana jedrna DNA je ribosomska DNA, ki kodira rRNA in je pri evkariontih v jedru prisotna v več kopijah. Sestavljena je iz zapisov za tri gene: za jedrno malo podenoto (SSU-18S), jedrno veliko podenoto (LSU- 28S) in za 5,8S ribosomsko DNA. Kodirajoča zaporedja so med seboj ločena z ne- kodirajočimi regijami (angl. spacers). SSU in LSU sta ločena z medgensko ne-kodirajočo regijo (angl. Internal Genetic Spacer; IGS). IGS sestavljata dve zunanji prepisujoči nekodirajoči regiji (ETS) in ne-prepisujoča nekodirajoča regija (NTS). 5,8S rDNA leži med dvema notranjima prepisujočima nekodirajočima regijama (angl. Internal Transcribed

16 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Spacer, ITS1 in ITS2). SSU rDNA je ena najbolj ohranjenih regij v DNA. Uporabili so jo za rekonstrukcijo globokih filogenetskih razvejitev, ki vključujejo kraljestva, debla, razrede in redove ter za rekonstrukcijo filogenetskih dogodkov iz predkambrija. Tudi 5,8S rDNA je zelo ohranjena, vendar je premajhna (okoli 150bp) in ne vsebuje dovolj filogenetske informacije, zato se večinoma ne uporablja. LSU rDNA je velika in precej bolj variabilna kot SSU rDNA. Uporablja se za določanje odnosov med bolj sorodnimi skupinami, kot so redovi in družine. Regij IGS in ITS sta močno variabilni in se uporabljata za razreševanje nejasnosti med nižjimi kategoričnimi stopnjami: rodovi, vrstami in populacijami. Ker so daljše, so IGS regije bolj uporabne od ITS regij (Hwang in Kim, 1999).

Za filogenetske in populacijske analize se pogosto uporabljajo točkovni polimorfizmi (angl. single nucleotid polymorphisms; SNP), ki predstavljajo večino razlik v DNA med dvema posameznikoma iste vrste (približno 0, 1%). Ljudje naj bi imeli okoli 3 milijone točkovnih polimorfizmov, ki so razporejeni bolj ali manj naključno po genomu na vsakih 300 do 1000 baznih parov in se nahajajo v kodirajočih, nekodirajočih ali medgenskih odsekih DNA (Vignal in sod., 2002). Za populacijsko genetske študije se pogosto uporabljajo tandemske ponovitve (angl. variable number tandem repeats, VNTR-ji), ki jo sestavlja različno število ponovitev osnovnega motiva, katerega dolžina je od dva do nekaj tisoč baznih parov. Osnovni motiv minisatelitov je dolg med 9 in 100 baznih parov, najpogostejša dolžina pa je okoli 30 baznih parov. Minisateliti so po genomu razporejeni precej enakomerno, najdemo jih tako v ev- kot tudi v heterokromatinu, največ pa jih je v bližini telomernih regij (Goldstein in Schlötterer, 1999). Osnovni motiv mikrosatelitov je dolg med ena in šest baznimi pari, ki se od petkrat do stokrat ponovi. Enakomerno so razporejeni po celem genomu, vendar so manj pogosti v centromerni in telomerni regiji (Goldstein in Schlötterer, 1999).

2.3.3 Mikrosateliti

Najpogostejši osnovni motiv mikrosatelitov je dolg dva, tri oziroma štiri bazne pare. Za mikrosatelite je značilna visoka variabilnost v številu ponovitev osnovnega motiva oziroma velik dolžinski polimorfizem, ki je posledica pogostih mutacij (10-3 do 10-5 mutacij na lokus na generacijo) značilnih za mikrosatelitno DNA. Najvišjo stopnjo mutacij imajo

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 17 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 dinukleotidni mikrosateliti, sledijo tri- in tetranukleotidi. Pogoste mutacije so posledica večjega števila napak pri podvojevanju, saj polimerazni kompleks zaradi velikega števila ponovitev lahko zdrsne (angl. DNA slippage), pri čemer nastane zanka, ki običajno povzroči podaljšanje dolžine mikrosatelita. Stopnja zdrsa je odvisna od narave ponavljajočega motiva ter od njegove dolžine. S citozinom in gvaninom bogati in krajši mikrosateliti imajo nižjo stopnjo zdrsov. Mutacije so večinoma v prid podaljševanja mikrosatelitov, rast pa je počasnejša pri mikrosatelitih z daljšim osnovnim motivom. Stopnja mutacij je alelno specifična, zato nastajajo na različnih lokusih različni aleli (Goldstein in Schlötterer, 1999).

Osnovna mutacijska modela, ki opisujeta evolucijo mikrosatelitov sta IAM (model neskončno alelov) in SMM (model postopnega mutiranja). Model IAM predvideva, da vsaka mutacija povzroči nastanek novega alela v populaciji. Model ne upošteva povratnih mutacij ter homoplazije. Nasprotno drugi model za enako verjetno šteje povečevanje ali pomanjševanje mikrosatelita. Razširjen SMM model dopušča spremembo za več osnovnih enot. Vendar so mutacije mikrosatelitov preveč kompleksen proces, da bi jih razložili s katerim od teh dveh modelov. Nobeden namreč ne upošteva lokusno specifičnih mutacijskih procesov. Novejši mutacijski modeli upoštevajo tudi robna zaporedja, ki so veliko bolj variabilna med vrstami kot znotraj vrst (Goldstein in Schlötterer, 1999).

Negativna lastnost mikrosatelitov v populacijskih študijah je možnost njihove konvergentne evolucije oz. pojava homoplazij. Če predpostavimo, da mutacije z enako verjetnostjo povzročijo tako zmanjšanje kot povečanje števila osnovnega motiva, je velika verjetnost povratnih mutacij. To je ena od možnosti, ki pogojuje, da imajo določeni mikrosateliti enako število istih osnovnih enot, vendar niso istega porekla. Če ne upoštevamo možnosti homoplazij, potem lahko podcenimo pravo divergenco med preučevanima populacijama. Druga negativna lastnost uporabe mikrosatelitov je nastanek amplifikacijskih repov (angl. stutter bands), ki so posledica napak pri prepisovanju v verižni reakciji s polimerazo (PCR). Ker in vitro ni popravljalnih mehanizmov, med podvojevanjm nastanejo številni krajši produkti, ki se razlikujejo za dolžino osnovnega motiva. Problem predstavljajo tudi mutacije v robnem zaporedju, ki predstavljajo vezna mesta za začetne oligonukleotide, kamor se le-ti zato v verižni reakciji s polimerazo (PCR)

18 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

ne morejo vezati, posledica pa je odsotnost produkta. Dobimo t.i. ničelni alel, vidimo le drug homologni produkt in preučevani osebek nepravilno prepoznamo kot homozigota, ocena heterozigotnosti pa je glede na Hardy-Weinbergovo ravnotežje prenizka. Ničelni aleli so pogosti, zato je potrebno upoštevati njihov vpliv v populacijski študiji (Goldstein in Schlötterer, 1999).

Pozitivne lastnosti uporabe mikrosatelitov v populacijskih raziskavah so visoka stopnja genetske variabilnosti in heterozigotnosti, nevtralna evolucija, kodominantnost in enostavno mendelsko dedovanje. Ker so mikrosateliti visoko polimorfni, lahko med sabo ločujemo zelo sorodne populacije na ozkem geografskem območju (Goldstein in Schlötterer, 1999).

2.4 MIKROMREŽE

Tehnologija DNA mikromrež omogoča sočasno preučevanje več tisoč genskih prepisov. DNA mikromreže so na podlago (npr. kemično obdelano steklo) pritrjene skupine tisočih cDNA ali DNA molekul z znanimi nukleotidnimi zaporedji, ki predstavljajo matrico za hibridizacijo s fluorescentno označenima poskusnim in kontrolnim vzorcem. Hibridizacijski signal na določenem mestu matrice izraža identiteto nukleotidnega zaporedja, velikost signala pa je merilo za količino izraženega genskega produkta. Pripravljena mikromreža se hibridizira s preiskovanim vzorcem in/ali kontrolnim vzorcem, ki je lahko iz celic izolirana in v cDNA prepisana RNA ali celična DNA, označena s fluorokromom. Rezultat je računalniška slika, kjer je jakost hibridizacijskega signala ponazorjena z intenziteto slikovnih pik. Sledi obdelava rezultatov s statističnimi in korelacijskimi programi, ki izluščijo seznam statistično signifikantno različno izraženih genov (Juvan in Rozman, 2006).

Mikromreže se razlikujejo po izdelavi. Obstajajo mikromreže s krajšimi oligonukleotidi (20 do 50 nt), ki so sintetizirani na matrici in situ. To metodo je razvilo in patentiralo podjetje Affymetrix. Posamezne sonde so med sabo oddaljene nekaj nanometrov, vsak gen pa je zastopan s preko 10 kratkimi oligonukleotidi. To so t.i. mikromreže visoke gostote, ki so bolj specifične, vendar tudi dražje od druge možnosti, mikromrež nizke gostote, na katere se nanese že prej sintetizirane oligonukleotide ali produkte verižne reakcije. Ti so

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 19 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 lahko daljši (do 500 baznih parov), sonde pa so oddaljene nekaj mikrometrov (Juvan in Rozman, 2006).

Do pred kratkim so se mikromreže uporabljale za nekaj modelnih organizmov, za katere so bila dostopna zaporedja celega genoma. Z napredkom tehnologije pa so sedaj omogočene tudi raziskave drugih, ne-modelnih organizmov, ki so zaradi svoje posebne fiziologije ali življenjskega prostora pomemben vir novih podatkov v znanosti (Juvan in Rozman, 2006). Problem, ki se pojavlja pri uporabi mikromrež na ribjih vrstah, je pomanjkanje poznavanja genoma in majhno število genov s poznanim nukleotidnim zaporedjem. Zato se najpogostejše raziskave s pomočjo mikromrež izvajajo na modelnih organizmih zebrici (Danio rerio) in napihovalki (Fugu rubripes) ter pri komercialno pomembnih ribah iz družin salmonidov in ciprinidov. Za preučevanje nepoznanih organizmov je možna uporaba mikromrež sorodnih organizmov, le hibridizacijski signal je na splošno manjši (Reynders in sod., 2006).

20 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

3 MATERIAL IN METODE

3.1 OPIS VZORČNIH MEST

Kratki opisi vzorčnih mest trinajstih vrst uporabljenih v prvem sklopu raziskav (Razreševanje taksonomskih nejasnosti rodu Phoxinellus) so navedeni v Preglednici 1.

Preglednica 1: Preučevane vrste iz bivšega rodu Phoxinellus in referenčni predstavniki, njihova prejšnja in sedanja klasifikacija ter opis vzorčnih mest (Palandačić in sod., 2010) Table 1: The studied taxa (previously belonging to Phoxinellus), their former and new classification and the list of sampling locations (Palandačić et al., 2010) Vrsta Rod Vzorčna mesta Prejšnje Novo poimenovanje poimenovanje Delminichthys Phoxinellus Delminichthys Reka Vrljika, Imotsko polje, Hrvaška adspersus (CRO) Delminichthys Phoxinellus Delminichthys Ljubomirski potok, Popovo polje, Bosna ghetaldii in Hercegovina (BiH) Delminichthys Phoxinellus Delminichthys Reka Jadova, Ličko polje, Hrvaška jadovensis (CRO) Delminichthys Phoxinellus Delminichthys Izvir Vukova pećina, Krbavsko polje, krbavensis Hrvaška (CRO) Phoxinellus Phoxinellus Phoxinellus Mostarsko blato, Bosna in Hercegovina pseudalepidotus (BiH) Phoxinellus alepidotus Phoxinellus Phoxinellus Reka Korana, Bosna in Hercegovina (BiH) Phoxinellus Phoxinellus Phoxinellus Reka Čikola, Povodje reke Krke, dalmaticus Hrvaška (CRO) Telestes metohiensis Phoxinellus Telestes Reka Mušnica, Gatačko polje, Bosna in Hercegovina (BiH) Telestes croaticus Phoxinellus Telestes Reka Jadova, Ličko polje, Hrvaška (CRO) Telestes fontinalis Phoxinellus Telestes Izvir Vukova pećina, Krbavsko polje, Hrvaška (CRO) Pelasgus prespensis Pseudophoxinus Pelasgus Prespansko jezero, Albanija Telestes souffia Telestes Telestes Reka Kamnica, Slovenija (SLO) Squalius cephalus Leuciscus Squalius Reka Cerkniščica, Slovenija (SLO) Chondrostoma nasus Chondrostoma Chondrostoma Reka Vipava (prinesena), Slovenija (SLO)

Osemnajst vzročnih mest imotske gaovice smo izbrali tako, da smo pokrili večji del njenega areala (Slika 2, Preglednica 2).

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 21 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Preglednica 2: Vzorčna mesta imotske gaovice (Delminichthys adspersus) s pripadajočimi zemljepisnimi širinami (E) in dolžinami (N), nadmorsko višino (A) in okrajšavami. Navedeno je število vzorcev iz posameznega vzorčnega mesta (No.) ter število vzorcev (NoC), pri katerih je bilo določeno nukleotidno zaporedje citokroma b (mtDNA). V zadnjem stolpcu je navedena razdelitev v skupine glede na površinsko izoliranost in genetsko strukturo (GDS; Palandačić in sod., 2012a). Table 2: Summary of sampling locations for Delminichthys adspersus with respective latitude (E), longitude (N), elevation (A) and abbreviations, with number of specimens per sampling location (No), number analyzed for mtDNA analysis (NoC) and group assignment based on genetic structure and geographic proximity reported (Palandačić et al., 2012a). Vzorčno mesto Okrajšava No NoC E in N A (m) “GDS” Reka Rastočka Matica, izvir MAT 10 0 / prbl. 30 Studena Reka Vrgoračka N 43 13 07.03 južni izvir Matica, izvir BVRG 27 20 65 porečje E 017 23 14.29 Banja, Vrgorac Tihaljine Potok Draga, vas N 43 13 15.7 DRA 16 15 76 Radušići E 017 30 41.5 Potok Nezdravica, N 43 18 58.45 NEZ 46 21 161 Nezdravica vas Tihaljina E 017 23 20.29 N 43 27 25.77 Jezerine pJEZ 53 19 269 E 017 10 20.93 N 43 27 06.22 izviri Grbavac GRB 34 18 275 E 017 10 36.67 Vrljike N 43 26 52.41 Stari vodovod STR 19 16 274 E 017 10 34.1 Vrata, Prološko N 43 27 30.59 Prološko PRBL 29 23 281 Blato E 017 06 44.01 Blato Grančice, Glavina N 43 26 15.48 GRAN 24 21 268 Donja E 017 13 3.82 Medvidovića N 43 26 18.41 MED 17 17 268 Draga E 017 13 41.64 N 43 26 05.2 porečje Rebić REB 23 21 258 E 017 14 26.4 Vrljike Izvir Jažva, N 43 26 36.76 izviri v GLD 37 20 274 Glavina Donja E 017 11 42.93 Imotskem Udovice, Vinjanji N 43 25 39.2 UDV 28 21 261 Donji E 017 15 15.36 Vinajnji Donji, N 43 26 05.32 BVID 25 19 264 vodnjak E 017 14 26.4 N 43 26 11.35 Vinjani Donji VID 40 19 264 E 017 14 20.33 N 43 23 22.45 Grudsko Vrijelo GRV 24 15 263 E 017 22 04.78 izviri v N 43 22 29.35 Grudah Jamine, Grude JAM 40 15 273 E 017 23 23.77 Rdeče jezero N 43 27 14.84 CRV 33 37 452 Rdeče jezero (Crveno jezero) E 017 11 54.93

Med nakaterimi vzorčnimi mesti ni površinskih vodnih povezav, medtem ko so druga povezana preko občasnih potokov in umetnih kanalov, ali pa so v času poplav celo del istega vodnega telesa.

22 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Slika 2: Preučevani areal imotske gaovice je del Dinarskega krasa, ki se nahaja na Balkanskem polotoku, in sega od jugovzhodne Hrvaške do južne Bosne in Hercegovine. Osemnajst vzorčnih mest obsega tipsko lokacijo Rdeče jezero ter reke Vrljike, Tihaljine, Rastočke in Vrgoračke Matice in njihove pritoke. Podrobnejši opis je v Materialih in metodah (Opis vzorčnih mest), okrajšave so v Preglednici 1 (Palandačić in sod., 2012a). Figure 2: The study area is part of the Dinaric karst of the Balkan Peninsula, ranging from the southeastern Croatia to southern Bosnia-Herzegovina. Eighteen sampling locations include type locality Rdeče jezero, and direct and indirect springs of the Vrljika, Tihaljina and Matica river systems, which cover most of the distribution area of D. adspersus. See text for a detailed description, and Table 1 for abbreviations of sampling locations (Palandačić et al., 2012a).

Rdeče jezero (Slika 3), ki je 500 metrov globoko brezno z vodno gladino 250 do 300 metrov pod robom, nima nobene površinske povezave s katerim koli vzorčnim mestom ali drugim nadzemnim vodnim virom (Garašić 2001, Bonacci 2006). Medsebojno površinsko izolirani sta tudi porečji Vrljike in Tihaljine, ki ju spaja umeten podzemni kanal, ki ob ca. 100-metrskem višinskem padcu usmerja vodo iz ponornega dela Vrljike v HE centralo Peć Mlini na izviru Tihaljine, ter ponikalnica Vrgoračka Matica, ki izvira in ponikne na Vrgoračkem polju (Kanaet 1959, Džeba 2010). V študijo smo vključili tudi mesta, ki so povezana preko presihajočih potokov in umetnih kanalov, vendar je migracija rib po teh

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 23 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 poteh zaradi pogoste presušitve malo verjetna. Migracijo poleg tega ovirajo tudi velika razdalja, previsoka temperatura vode v poletnih mesecih, razlike v elevaciji ter izpostavljenost plenilcem. Ta vzorčna mesta so Prološko Blato, izviri Vrljike in izviri Grude v porečju Vrljike (Džeba 2010), ter reke Nezdravica, Draga in Rastočka Matica v porečju Tihaljine (Kanaet 1959). Vzorčili smo tudi izvire v mestu Imotski z okolico, ki jih z izjemo Glavine Donje in Udovic povezujejo potoki, zaradi bližine pa se voda iz izvirov premeša tudi v času poplav.

Slika 3: Rdeče jezero (Crveno jezero; fotografija: Arne Hodalič, Palandačić in sod., 2012) Figure 3: Red lake (photography by: Arne Hodalič, Paladnačić et al., 2012)

Glede na medsebojno izolacijo in geografijo smo vzorčna mesta razdelili v naslednje geografsko določene skupine (GDS): Prološko Blato, izviri Vrljike, izviri v mestu Imotski in okolici, izviri v Grudah, Rdeče jezero, Nezdravica in južni izviri (Draga in obe Matici) (Preglednica 1).

24 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

3.2 VZORČENJE IN IZOLACIJA DNA

Za prvi sklop raziskav razreševanja taksonomskih nejasnosti smo vzorčili 13 vrst (Preglednica 1), vključno z vsemi bivšimi vrstami iz rodu Phoxinellus ter s predstavniki rodu Telestes, Pelasgus (staro ime Pseudophoxinus), Chodrostoma in Squalius.

V študijo populacijske strukture imotske gaovice smo vključili 544 osebkov, ki so bili večinoma vzorčeni med letoma 2007 in 2010, z izjemo vzorcev iz Vrgoračke Matice, ki so bili nabrani leta 1999 (osebna zbirka P. Zupančič). Zaradi starosti in morda tudi neprimernega shranjevanja (nezadostna količina alkohola), nam mitohondrijske DNA iz te skupine vzorcev ni uspelo pomnožiti. Uspelo pa je pomnoževanje sedmih mikrosatelitnih lokusov, ki smo jih zaradi pomembnosti lokacije vključili v analizo. Vzorčni set iz Rdečega jezera je bil sestavljen iz petih vzorcev ujetih leta 2007 in 32 iz leta 2010.

Ribe so bile ujete z električnim agregatom, mrežami ali vršami. Odvzet jim je bil približno 25 mm2 velik delček plavuti, po vzorčenju so bile ribe vrnjene na mesto ulova.

Celokupno DNA smo izolirali z izsoljevanjem (Miller in sod., 1988).

Za analizo diferencialnega izražanja genov z mikromrežami smo uporabili osem primerkov imotske gaovice iz vzorčnega mesta Jezerine (pJEZ, Slika 2).

3.3 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO (PCR), DOLOČANJE NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA IN GENOTIPIZACIJA

Odsek gena za rodopsin in EGR2B (angl. Early Growth Response 2B) smo pomnožili v verižni reakciji s polimerazo z začetnimi oligonukleotidi RH_28F, RH_233F in RH_1039R za rodopsin ter E2B_278F, E2B_287F, E2B_1108R in E2B_1117R za EGR2B (Chen in sod., 2008). Regijo ITS1 smo pomnožili z začetnimi oligonukleotidi ITS1F (Wyatt in sod., 2006), ITS2R (Hamilton in Tyler, 2007) ali z ITS3R (AGTGTCGATGATCAATGTGT), ki smo ga oblikovali na osnovi rDNA nukleotidnih zaporedji vrst Scardinius erythrophthalmus, Rutilus rutilus in Abramis brama iz Genske banke z zaporednimi številkami AM183338, AM183339 ter AM183341.

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 25 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Dvajset mikrolitrska mešanica za reakcijo je vsebovala 50 ng vzorčne DNA, 0.5 μM vsakega začetnega oligonukleotida, 0.2 mM vsakega nukleotida (dNTP), 1.5 mM MgCl2, 1mM pufra za reakcijo ter 1 U Taq polimeraze (Fermentas). Pogoji reakcije so bili: 4 minute začetne denaturacije pri 95 °C, ki ji je sledilo 35 ciklov 40 sekundne denaturacije pri 95 °C, 40 sekundnega naleganja začetnih nukleotidov pri 55 °C ter 90 sekund podaljševanja pri 72 °C (za ITS1 45 s). Na koncu je sledilo še sedemminutno končno podaljševanje pri 72 °C. Vse reakcije so bile izvedene v namiznem mikroprocesorsko vodenem termostatu GeneAmp®PCRSystem2720 (AB Applied Biosystems).

Delni zapis gena za citokrom b je bil pomnožen iz približno dvajsetih naključno izbranih primerkov imotske gaovice (n = 15–37; Preglednica 2) iz vsakega vzorčnega mesta, razen Vrgoračke Matice, z začetnimi oligonukleotidi Glu-F in Thr-R (Zardoya in Doadrio, 1998) in enako 20-mikrolitrsko reakcijsko mešanico kot je opisana za EGR2B in ITS1. Pogoji reakcije so bili: 1 minuta začetne denaturacije pri 94 °C, ki ji je sledilo 35 ciklov 30 sekundne denaturacije pri 94 °C, 30 sekundnega naleganja začetnih nukleotidov pri 55 °C ter 60 sekund podaljševanja pri 72 °C. Na koncu je sledilo še triminutno končno podaljševanje pri 72 °C. Vse reakcije so bile izvedene v namiznem cikličnem pomnoževalniku GeneAmp®PCRSystem2720 (AB Applied Biosystems).

Čiščenje in določitev nukleotidnega zaporedja pomnoženih DNA fragmentov je bilo opravljeno v Macrogen Inc (Koreja).

Pomnoževanje izbranih mikrosatelitnih lokusov (Preglednica 3) smo izvedli s fluorescentno označenimi začetnimi oligunukleotidi v 10 μl reakcijskih mešanicah s 50 ng vzorčne DNA, 0.5 μM vsakega začetnega oligonukleotida, 0.2 mM vsakega nukleotida

(dNTP), 1.0 mM MgCl2, 1mM pufra za reakcijo ter 1 U Taq polimeraze (Fermentas) po t.i. »touchdown« protokolu (Hamilton in Taylor, 2007). »Touchdown« protokol pomeni postopno zniževanje temperature naleganja začetnih oligonukleotidov vsakih nekaj ciklov pomnoževanja, s čimer se izogibamo pomnoževanju nespecifičnih nukleotidnih zaporedji. Del fluorescentno označene pomnožene DNA (1.5 μl) smo zmešali s formamidom in dolžinskim standardom GENESCAN-LIZ 500 (Applied Biosystems) in genotipizirali na avtomatskem kapilarnem določevalniku nukleotidnih zaporedji (sekvenatorju) ABI-3130 s

26 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

programom GeneScan Analysis Software 3.7. Podatke smo obdelali s programom GeneMapper 4.0 (ABI), v katerem označimo razpon velikosti za določen alel mikrosatelita (npr. od 177 do 178 bp), saj je dolžina istega alela mikrosatelita pogosto različna za nekaj desetink (npr. 171.6, 171.8, 172.0). Ker pa je pri avtomatskem odčitavanju mikrosatelitov lahko dolžina napačno poenostavljena (npr. 171 in 172, čeprav je osnovni motiv dolg 2 bp), smo podatke še ročno pregledali, nato pa izvozili dejanske, decimalne vrednosti dolžin mikrosatelitov ter jih poenotili s programom TANDEM 1.07 (Matschiner in Salzburger, 2009). Program določi dolžino osnovnega motiva ter decimalne vrednosti pravilno poenoti tako, da je vsaka naslednja dolžina večja za dolžino osnovnega motiva. Preglednica 3: Začetni oligonukleotidi uporabljeni v analizi populacijske strukture imotske gaovice z mikrosateliti (ime, razpon velikosti, osnovni motiv, nukleotidno zaporedje, barvna značka, referenca). Tabel 3: Primers used for microsatellite analysis (name, size range, core motif, primer sequence, fluorescent dye, reference). IME Razpon Osnovni Nukleotidno zaporedje začetnega Barvna Reference velikosti (bp) motiv oligonukleotida značka

Ca1 110–230 (CA)24 F: AAGACGATGCTGGATGTTTAC FAM Dimsoski et (150–180) R: CTATAGCTTATCCCGGCAGTA al. (2000) Ca3 190–350 (TAGA)14 F: GGACAGTGAGGGACGCAGAC VIC - | | - (200–300) R: TCTAGCCCCCAAATTTTACGG CypG3 200–380 (CAGA)2 F: AGTAGGTTTCCCAGCATCATTGT NED Baerwald & (200–300) (TAGA)11 R: GACTGGACGCCTCTACTTTCATA May (2004) CypG5 160–300 (TAGA)12 F: AGTTGATGCCTGTTTTGTTTGTAT PET - | | - (150–300) R: AGTTGTGTCAGGGTCTGTAGAA CypG27 210–310 (TAGA)8 F: AAG GTA TTC TCC AGC ATT TAT FAM - | | - (250–300) R: GAG CCA CCT GGA GAC ATT ACT

CypG24 150–160 (CAGA)19 F:CTGCCGCATCAGAGATAAACACTT FAM - | | - (150–200) R: TGGCGGTAAGGGTAGACCAC Rru4 160–200 (CA)15 F: TAAGCAGTGACCAGAATCCA PET - | | - (200) R: CAAAGCCTCAAAAGCACAA Lsou34 230–280 (GT)15 F: CCAGACAGGGTGATGATTCC NED Muenzel et (280–290) R: GTAGCGACGTTCAGGTCTCG al. (2007)

3.4 FILOGENETSKA ANALIZA VRST RODU PHOXINELLUS

3.4.1 Jedrni geni

Pridobljena delna nukleotidna zaporedja rodopsina, EGR2B in ITS1 smo poravnali s programom Muscle (Edgar, 2004), ki je vključen v program Seaview 4.2.3. Nato smo odrezali slabo določene konce zaporedji in določili evolucijski model, ki najbolje opiše potek substitucij v izbranih zaporedjih (test modela DNA substitucij) s programom jModelTest 0.1 (Guindon in Gascuel, 2003; Posada, 2008). Testirali smo vsako regijo ločeno kot tudi vse tri regije skupaj. Za izbiro modela smo uporabili dva kriterija: Bayesov

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 27 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 informacijski kriterij (BIC; Schwarz, 1978) in Akaiketov informacijski kriterij (AIC; Akaike, 1974). Sledil je izris filogenetskih dreves na podlagi različnih kombinacij zaporedji (npr. samo ITS1, vse tri regije skupaj…) z metodami: (i) največjega verjetja (ML) vključeno v program GARLI 1.0 (Zwickl, 2006), (ii) Bayesova metoda vključena v program MrBayes 3.1.2 (Ronquist in Huelsenbeck, 2003) in (iii) NJ vključeno v program Seaview. V programu GARLI smo podporo filogenetskemu drevesu zagotovili s samovzorčenjem z 2000 ponovitvami. Da smo lahko vsaki od združenih regij določili svoj model evolucije, smo uporabili program GARLI-PART 0.97 (500 ponovitev za podporo s samovzorčenjem). Program MrBayes je tekel 500,000 generacij, dokler številka za standardno deviacijo ločenih frekvenc ni padla pod 0.01, kot svetuje priročnik programa. Ali se je analiza ustalila (konvergirala), smo grafično preverili tudi s programom AWTY (angl. Are We There Yet, Wilgenbusch in sod., 2004). Drevo z metodo sosedskega združevanja je bilo izračunano z 10,000 ponovitvami.

3.5 ANALIZA POPULACIJSKE STRUKTURE IMOTSKE GAOVICE

3.5.1 Mitohondrijska DNA

Pridobljena (delna) nukleotidna zaporedja za citokrom b smo pregledali in poravnali v programu MEGA 5.0 (Tamura in sod., 2011). Nato smo v programu jModeltest z BIC kriterijem določili model, ki najbolje opiše potek substitucij v zbranih zaporedjih (TrN; Tamura in Nei, 1993) ter poravnavo »zrušili« (angl. collapse), kar pomeni, da smo ohranili le po en unikaten haplotip in informacijo, pri katerih vzorci ga najdemo. Sledil je izris filogenetskega drevesa s programom PAUP (Swofford, 2003), na podlagi katerega smo naredili genealogijo haplotipov. S pomočjo programa Arlequin 3.11 (Excoffier, 2007) smo izračunali nukleotidno diverziteto (Nei, 1987) zaporedji.

Stopnjo raznolikost med vzorčnimi mesti smo določili s paroma primerjanimi genetskimi razdaljami na podlagi Φ-statistike (paroma primerjani ΦST-ji; Wright, 1978) ter z analizo molekularne variance (angl. analysis of molecular variance, AMOVA), ki smo jih izračunali v programu Arlequin. Signifikantnost analiz je bila testirana s 16,000 permutacijami originalnega seta podatkov. P-vrednosti smo modificirali z Bonferronijevo korekcijo (Rice, 1989; Cabin in Mitchell, 2000).

28 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Demografska zgodovina populacije (ekspanzije ali ozka grla) je bila testirana na nivoju vrste s ti. »mismatch« analizo (Li, 1977), za katero smo uporabili vsa določena zaporedja citokroma b. Dobljeno distribucijo paroma primerjanih distanc smo primerjali z modelom hitre populacijske ekspanzije s pomočjo generaliziranega nelinearnega postopka najmanjšega kvadrata (Schneider in Excoffier, 1999), ki je vključen v program Arlequin. Statistična signifikantnost ustreznosti modela je bila ocenjena z vsoto kvadriranih deviacij in Harpendingovim indeksom (angl. raggedness index; 10,000 ponovitev).

3.5.2 Mikrosateliti

Rezultate dobljene z genotipizacijo smo testirali s programom Micro-Checker (Van Oosterhout in sod., 2004), da bi odkrili ničelne alele, zdrse polimeraze (angl. stuttering) in izpad alelov. Ker program deluje na osnovi Hardy-Weinbergovega ravnotežja in bi lahko podstrukture napačno interpretiral kot enega od zgoraj naštetih pojavov, smo testirali vsako od geografsko določenih skupin posebej.

Genetsko raznolikost vrste, povprečno število alelov ter pričakovano in opaženo heterozigotnost smo ocenili s programom Arlequin (100,000 MCMC generacij in 10,000 dememorizacijskih korakov (Nei, 1987)). Informacijo o populacijski strukturi in parjenju v

sorodstvu smo pridobili s pomočjo izračuna Wrightovega koeficienta FIS (Wright, 1978) po metodi Weira in Cockerhama (1984) v programu Fstat 2.9.3.2 (Goudet, 2001), ki ima že vključeno Bonferronijevo korekcijo.

S primerjavo koeficientov RST (temelji na številu ponovitev mikrosatelitnega motiva) in

FST (temelji na identiteti alelov) smo ugotavljali, ali so mutacije bistveno doprinesle k genetski diferenciaciji med skupinami. Iz tega lahko tudi sklepamo, da večji kot je razpon števila ponovitev, več časa je minilo, od kar so se populacije medsebojno ločile (Hardy in

sod., 2003). RST in FST smo primerjali s programom SPAGEDI 1.3 (Hardy in Vekemans,

2002; 20,000 permutacij), ki izračuna, ali je vrednost opaženega RST signifikantno različna

od vrednosti RST izračunane po permutacijah alelnih velikosti znotraj populacij.

Stopnjo genetske raznolikosti med pari vzorčnih mest (paroma primerjani FST-ji) smo izračunali v programu Arlequin (1000 permutacij, 5 % manjkajočih podatkov) in programu

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 29 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

RST-CALC (paroma primerjani RST-ji; 1000 ponovitev; Goodman, 1997). Na osnovi opaženih razlik smo izvedli tudi analizo molekularne variance s programom Arlequin, s katero smo ugotovili, kako je varianca razporejena med skupinami, med populacijami znotraj skupin ter znotraj populacij.

Z metodo skupnih alelnih razdalj (angl. shared allele distances; Chakraborty in Jin, 1993) smo v programu Populations 1.2.30 (Langella, 1999) izračunali populacijsko drevo. Podporo drevesu smo zagotovili s samovzorčnejem s 100 ponovitvami.

Genetsko podobnost oziroma variabilnost med vzorci smo grafično predstavili v tridimenzionalnem prostoru s faktorielno korespondenčno analizo (FCA; angl. Factorial Correspondence Analysis) s programom Genetix 4.05.2 (Belkhir in sod., 2004).

Od metod za določanje podskupin, ki temeljijo na Bayesovem principu, smo uporabili STRUCTURE 2.3.1 (Pritchard in sod., 2000; Falush in sod., 2003; Falush in sod., 2007; Hubisz in sod., 2009) in BAPS 5.3 (Corander in sod., 2003; Corander in Marttinen, 2006; Corander in sod., 2006; Corander in sod., 2008). V STRUCTURE smo za analizo uporabili model mešanja (angl. admixture model) in korelirane alelne frekvence med populacijami (angl. correlated allele frequencies). MCMC veriga je tekla 1500,000 generacij, po tem ko smo začetnih 100,000 generacij zavrgli. Število klastrov (K) je bilo določeno med ena in sedem. Za vsako vrednost K smo naredili 20 ponovitev. Da smo zagotovili konvergenco MCMC verige, smo celotno analizo trikrat ponovili. Rezultate smo nato analizirali še z metodo po Evannu (Evanno in sod., 2005), ki določa najverjetnejšo vrednost K. S programom STRUCTURE smo izvedli tudi hierarhično analizo (Vähä in sod., 2007), v kateri postopno izločamo iz analize najbolj diferencirano skupino. Poleg tega vsako izločeno skupino analiziramo, da bi odkrili morebitno skrito pod-strukturiranost. Pri tem pristopu smo po 50,000 zavrženih generacijah MCMC verigo pustili teči še dodatnih 150,000 generacij, testirane K vrednosti pa smo izbrali glede na posamezen primer. V programu BAPS smo minimalno velikost populacije nastavili na 10 osebkov. Za oceno koeficienta mešanja (angl. admixture coeficient) smo uporabili 100,000 ponovitev ter za število referenčnih osebkov iz vsake populacije določili 200, za število ponovitev za oceno koeficienta mešanja za referenčne osebke pa smo določili 10.

30 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Ker metode vključene v STRUCTURE in BAPS delujejo na osnovi več-lokusnih genotipov, katerih lokusi so med seboj neodvisni, je bilo potrebno neodvisnost izbranih mikrosatelitnih lokusov preveriti z uporabo vezavnega neravnovesja (angl. linkage disequlibrium; Slatkin, 1994; Slatkin in Excoffier, 1996). Test smo opravili v programu Arlequin s 16,000 permutacijami in štirimi začetnimi pogoji ter p-vrednosti prilagodili z Bonferronijevo korekcijo.

Ali je v posameznih geografsko določenih skupinah oziroma v podatkovnem setu kot celoti prišlo do ozkih grl, smo testirali s programom Bottleneck 1.2.02 (Piry in sod., 1999), ki primerja opaženo heterozigotnost in heterozigotnost izračunano glede na število alelov (Cornuet in Luikart, 1996). Ker mikrosateliti redko mutirajo strogo po SMM modelu (angl. Stepwise Mutation Model; Ellegren, 2004), smo analizo izvedli z dvostopenjskim mutacijskim modelom, pri katerem smo določili, da se v desetih odstotkih mutacij dolžina mikrosatelita spremeni za več kot eno ponovitev osnovnega motiva in z desetodstotno varianco. Po navodilih avtorjev smo uporabili Wilcoxonov test, ki je najprimernejši, kadar imamo manj kot 20 lokusov.

Da bi določili količino in smer genskega toka med skupinami, smo uporabili model izolacije-z-migracijo (angl. isolation-with-migration model; IM), kot je vključen v program IMa2 (Hey in Nielsen, 2007). Vzorčna mesta so bila v skupine združena glede na

geografske lastnosti ter paroma primerjane FST-je. Iz vsake skupine smo v analizo vključili set naključno izbranih 36 osebkov in kjer je bilo možno (dovolj veliko število osebkov), analizo vzporedno izvedli še z dodatnim neodvisnim setom iz iste skupine. S tem smo želeli testirati, ali z različnimi seti vzorcev iz istih vzorčnih mest dobimo enake rezultate, torej ali je prišlo do ustalitve MCMC verige (konvergence). Analiza je bila izvedena na kombiniranem setu podatkov, sestavljenem iz mikrosatelitne in mitohondrijske DNA. Za mikrosatelitne lokuse smo uporabili model SMM, za del zapisa za citokrom b pa model HKY. Za prilagoditev pričakovane efektivne velikosti populacije smo uporabili skale dedovanja (angl. inheritance scalars): 0.25 za mtDNA ter 1 za mikrosatelite. Razponi parametrov za nespremenljive vhodne podatke (angl. uniform priors) so bili določeni s poskusnimi testi ter nato določeni na t ϵ (0, 2] in Θ1, Θ2, ΘA ϵ (0, 500]. Kot vhoden podatek za izračun migracijskih stopenj smo uporabili eksponentne distribucije s srednjo

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 31 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 vrednostjo 2. Geometrična shema segrevanja (angl. heating scheme) parametrov in njihov efekt na stopnje zamenjav sta bila preučena v preliminarnih testih in nato določena na ha = 0.97 in hb = 0.80. Za vsako par primerjanih skupin smo izvedli pet neodvisnih ponovitev in pustili teči MCMC verigo v M-načinu po prvotno zavrženih 500,000 generacijah še 3,5 milijonov generacij. Pet neodvisnih ponovitev je bilo nato združenih v L-načinu in testiranih z enakimi parametri.

Ker program IMa2 oceni celokupno migracijo od časa ločitve populacij do sedanjosti, iz rezultatov pa ni razvidno, kdaj je do migracije prišlo, smo s programom Geneclass2 (Piry in sod., 2004) ocenili, koliko osebkov se je domnevno preselilo v zadnji generacij. V ta namen smo uporabili metodo, ki jo je razvil Paetkau in sod. (2004) in omogoča oceno migrantov v zadnji generaciji (angl. genetic assignment method for direct real-time estimation of first generation migrants). Za izračun števila domnevnih migrantov smo uporabili metodo na osnovi frekvenc (Paetkau in sod., 1995). Za število manjkajočih alelov smo uporabili frekvenco 0.01 ter možnost Lhome (verjetnost, da izberemo genotip osebka iz populacije, v kateri je bil tudi vzorčen), ker je možno, da nismo vzorčili vseh populacij, ki so prispevale migrante v podatkovni set. Verjetnostni izračun je bil izveden z MCMC algoritmom ponovnega vzorčenja in 10,000 simuliranimi osebki ter napako prve vrste (α)

0.05 kot predlaga avtor, kadar uporabljamo Lhome.

3.6 ANALIZA DIFERENCIALNEGA IZRAŽANJA GENOV Z MIKROMREŽAMI

3.6.1 Postavitev poskusa

V tretjem sklopu raziskav smo izbrali 8 rib enake velikosti in teže. Ribe so tri mesece preživele v skupnem akvariju. Nato smo jih razdelil v dve skupini ter jih dali v ločena enako velika akvarija s temperaturo vode 15 °C. Obe skupini rib smo hranili z enako količino akvarijske ribje hrane v lističih. V prvem akvariju smo z avtomatsko lučjo vzdrževali normalno, 12 urno foto-periodo. Druga skupina je živela v neprestani temi, ki smo jo zagotovili z večkratnim ovitjem akvarija z aluminijasto folijo. Po enem mesecu smo ribe ob enih ponoči evtanazirali, jim odvzeli jetra in jih shranili v tekočino, ki blokira delovanje encimov za razgradnjo RNA (RNAlaterTM, Ambion). Odvzem jeter smo opravili ponoči, da bi se izognili razliki v izraženosti genov zaradi dnevno-nočnega ritma rib z 12

32 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

urno foto-periodo. Jetra smo nato na ledu poslali v analizo z mikromrežami v podjetje EcoArray, Inc. (Gainesville, Florida).

3.6.2 Analiza mikromrež

Izolacijo RNA ter razliko v ekspresiji genov na mikromreži so opravili v podjetju EcoArray Florida. Uporabljeni čipi so bili razviti v podjetju EcoArray in proizvedeni v podjetju Agilent Technologies, Inc. Vsebujejo več kot 26,000 kratkih zaporedji (sond), ki so bila pripravljena s pomočjo DNA knjižnic iz različnih organov (jeter, možganov, ledvic) vrste črnoglavi pisanec (Pimepales promelas), ki pripada isti poddružini (Leuscisinae) kot imotska gaovica.

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 33 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

4 REZULTATI

4.1 RAZREŠEVANJE TAKSONOMSKIH NEJASNOSTI V SKUPINI GAOVICE

Z določanjem nukleotidnega zaporedja smo pri trinajstih vrstah naštetih v Preglednici 1 dobili 700 baznih parov dolg fragment gena EGR2B, 687 baznih parov dolg fragment gena za rodopsin in med 350 (Squalius cephalus) in 175 (Delminichthys krbavensis) baznih parov dolge fragmente ITS1. Dolžine so se razlikovale predvsem zaradi številnih delecij in insercij, zaradi katerih so bili deli ITS1 pri nekaterih vrstah neberljivi. Zato smo na koncu uporabili 262 baznih parov dolgo poravnano zaporedje, pri čemer je bilo zaporedje vrste D. krbavensis krajše. Pri podusti (Chondrostoma nasus) je bilo določanje nukleotidnega zaporedja vseh treh izbranih regij neuspešno, zato smo jo izpustili iz nadaljnje analize. Nukleotidna zaporedja so dostopna v Genski banki pod zaporednimi številkami HQ232304 do HQ232342.

Evolucijski modeli, ki glede na kriterij BIC najbolje opišejo razvoj izbranih fragmentov, so F81 za EGR2B, HKY + G za rodopsin in TPM2uf + G za ITS1, medtem ko so bili glede na AIC kriterij najustreznejši modeli TPM1uf za EGR2B, HKY za rodopsin in TVM + G za ITS1. Kombinacijo vseh treh delnih zaporedji (EGR2B, rodopsin in ITS1; 1657 bp) najbolje opišeta modela TPM2uf + G (BIC) in GTR + G (AIC).

Ne glede na uporabljeno metodo ali evolucijski model so na vseh filogenetskih drevesih štirje predstavniki novo predlaganega rodu Delminichthys vedno tvorili eno, dobro podprto skupino, kateri je sestrsko skupino predstavljala vrsta Pelasgus prespensis. Ostali topološki odnosi so se spreminjali glede na to, katero kombinacijo regij in kateri program za izačun drevesa smo uporabili. Največje razlike so bile med drevesom, ki je temeljil le na regiji ITS1, in drevesom osnovanim na treh združenih zaporedjih. Na ITS1 drevesu vrste Ph. dalmaticus, Ph. pseudalepidotus in Ph. alepidotus tvorijo eno dobro podprto skupino z vrednostmi podpore s samovzorčenjem 75 (ML), 86 (NJ) in posteriorno verjetnostjo ena. Na drevesu združenih zaporedji se vrste odcepljajo v padajočem zaporedju (Slika 4), vendar je ta vzorec slabo podprt. Prav tako je razlika pri vrstah Telestes croaticus in T. fontinalis, ki na ITS1 drevesu tvorita dobro podprto skupino, medtem ko je ista skupina na

34 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

drevesu iz združenih zaporedji zelo slabo podprta (28, -,46). Na drevesu iz združenih zaporedji je bil dobro podprt sestrski odnos med združenima rodovoma Pelasgus - Delminichthys in vrsto Ph. pseudalepidotus (Slika 4), medtem ko je bil položaj T. metohiensis nejasen in slabo podprt. V Bayesovi metodi in odvisno od evolucijskega modela je vrsta večinoma tvorila politomijo s T. croaticus and T. fontinalis, medtem ko je pri metodi največjegaega verjetja predstavljala sestrsko skupino T. croaticus – T. fontinalis. Z metodo sosedskega združevanja položaja T. metohiensis sploh ni bil mogoče razrešiti. Tudi položaj T. souffia je bil nekonsistenten, a je bil pogosteje določen kot bližnji sorodnik vrst rodu Phoxinellus, kot sorodnik vrst T. croaticus, T. fontinalis in T. metohiensis, ki naj bi sodile v rod Telestes. Najbolj je bila sorodnost med vrstami Phoxinellus in T. souffia očitna pri analizi z Bayesovo metodo, ki je bila podprta s posteriorno verjetnostjo 0.97 (Slika 4). Razporeditev vrst znotraj rodu Delminichthys je ostala nerazrešena, vzorec sorodnosti je bil odvisen od uporabljene metode in zaporedja.

Med odkritimi delecijami in insercijami v nukleotidnem zaporedju regije ITS1 je bila ena od njih razločevalna. Opažena je bila le v zaporedjih vseh vrst iz rodu Delminichthys in vrste Pelasgus prespensis. Deset baznih parov dolgo insercijo smo zato uporabili kot ločen filogenetski znak, saj programi za izračun dreves insercij običajno ne upoštevajo.

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 35 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Slika 4: Filogenetsko drevo bivšega rodu Phoxinellus ter referenčnih vrst Telestes souffia in Squalius cephalus izračunano z metodo največjega verjetja v programu GARLI, kjer je bil omogočen lasten evolucijski model za vsakega od združenih zaporedji (delno zaporedje rodopsina – HKY+G, EGR2B – F81, ITS1 - TPM2uf+G). Na vejah so napisane tudi vrednosti podpore (ML/PP/NJ). Poleg podpore izračunane z metodo ML, še pri izračunu z Bayesovo metodo (posteriorne verjetnosti, PP) in metodo NJ (podpora s samovzorčenjem; Palandačić in sod., 2010). Figure 4: Maximum likelihood (ML) tree of former Phoxinellus genus along with Telestes souffia and Squalius cephalus as reference taxa, performed in GARLI partitioned version and based on three nuclear DNA regions (partial gene sequences for Rhodopsin - HKY+G, Early Growth Response 2B - F81,and Internal Transcribed Region 1 - TPM2uf+G). ML bootstrap values, values for posterior probabilities in Bayesian analysis (PP) and Neighbour-Joining (NJ) bootstrap values are indicated on branches (ML/PP/NJ; Palandačić et al., 2010).

4.2 POPULACIJSKA STRUKTURA IMOTSKE GAOVICE

4.2.1 Mitohondrijska DNA Z določanjem nukleotidnega zaporedja citokroma b pri 337 osebkih iz sedemnajstih vzorčnih mest smo dobili 999 baznih parov dolgo poravnavo brez vrzeli. Zaporedja so

36 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

dostopna v Genski banki pod zaporednimi številkami JN101952-JN102110 in JQ315936- JQ316113. Po »zrušenju« poravnave (»collapsing«) smo dobili 74 unikatnih haplotipov.

Izrisana genealogija haplotipov je imela zvezdasto obliko (Slika 5). Nobeno od vzorčnih mest in nobena od geografsko določenih skupin ni tvorila ločene populacije. Haplotipi 1 (H1; 46% vseh vzorcev), 2 (H2; 19%) in 3 (H3; 7%) so bili najpogostejši in tudi geografsko najbolj razširjeni, pri čemer se H2 in H3 od H1 razlikujeta v eni substituciji. Tudi večina prostalih haplotipov se je od treh najpogostejših razlikovala le za eno substitucijo. Večinoma so bili ti haplotipi prisotni le pri enem vzorcu oziroma pri vzorcih iz enega vzorčnega mesta.

Slika 5: Nekoreninjena genealogija haplotipov izrisana na podlagi 337 delnih nukleotidnih zaporedji citokroma b (999 bp). Oznake se nanašajo na opažene haplotipe, ki jih tudi v tekstu imenujemo H1, H2, H3… Barve predstavljajo vzorčna mesta, velikost premera krogov pa število vzorcev, ki nosijo določen haplotip (Palandačić in sod., 2012a). Figure 5: Unrooted haplotype genealogy based on 337 cytochrome b gene sequences (999bp). Labels refer to observed haplotypes (in the text referred to as H1, H2, H3, etc.); colors denote sampling sites, and radii reflect the number of individuals per haplotype (Palandačić et al. 2012a).

Najbolj opazna lastnost genealogije je skoraj popolna odsotnost vzorcev s haplotipom H1 v reki Vrljiki (en vzorec iz pJEZ), medtem ko pri vzorcih v Nezdravici nismo odkrili nobenega vzorca s haplotipom H2. Tudi v južnih izvirih je prisoten le en vzorec s

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 37 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 haplotipom H2. Haplotip H3 je najpogostejši pri vzorcih iz izvirov Vrljike, imajo pa ga še trije vzorci iz izvirov Imotskega, eden vzorec iz Grud in eden iz Prološkega Blata. Vzorci iz Nezdravice so večinoma nosilci haplotipa H1 (81%) in H49 (14%). Podobno tudi v Rdečemu jezeru najdemo največ vzorcev s haplotipom H1 (68%), čeprav jih je nekaj imelo tudi H2 (8%), 24% osebkov pa je imelo unikatne haplotipe. Natančen seznam haplotipov po vzorčnih mestih je v Prilogi A.

Povprečna nukleotidna raznolikost vseh lokusov je bila 0.001243 (+/- 0.000873).

Rezultati paroma primerjanih genetskih razdalj med vzorčnimi mesti so potrdili opažanja na osnovi genealogije, saj so se najbolj razlikovali vzorci iz Nezdravice in vsa tri vzorčna mesta izvirov Vrljike (p ≤ 0.001). Signifikantne razlike so bile še med vzorčnimi mesti Nezdravica in Prološko Blato, Rdeče jezero ter Medvidovičeva Draga, medtem ko so bila tri vzorčna mesta izvirov Vrljike poleg Nezdravice še signifikantno različna od Rdečega jezera in Banje v Vrgorcu. Podrobni rezultati so predstavljeni v Prilogi B.

Za analizo molekularne variance (AMOVA) smo vzorčna mesta razdelili glede na paroma primerjane genetske razdalje v tri skupine: (i) Nezdravica, (ii) izviri Vrljike, (iii) vsa ostala vzorčna mesta. Varianca je bila največja znotraj populacij (89%; p ≤ 0.00069), medtem ko je bila med skupinami 9% (p ≤ 0.00001). Razlika med populacijami znotraj skupin ni bila signifikantna (2%; p ≤ 0.11436).

Pri analizi nenadne demografske ekspanzije (Slika 6; angl. mismatch analysis) smo pri primerjavi porazdelitve paroma primerjanih razlik med haplotipi naših vzorcev odkrili ujemnje z modelno, eno-modalno porazdelitvijo, vendar je bila hipoteza demografske ekspanzije zavrnjena tako s testom vsote paroma primerjanih deviacij (p = 0.041), kot tudi s signifikantnim Harpendingovim indeksom (p = 0.002), ki je nakazal na razpršenost okoli hipotetične krivulje.

38 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Slika 6: Analiza demografske ekspanzije (angl. mismatch analysis). Porazdelitev se je ujemala s hipotetično krivuljo, a je bila s statističnimi testi zavrnjena. Figure 6: Mismatch analysis. The hypothesis of sudden demographic exansion was rejected.

4.2.2 Mikrosateliti

Petsto štiriinštirideset osebkov D. adspersus iz 18 različni lokacij je bilo genotipizirano z osmimi mikrosatelitnimi lokusi. Tisti vzorci, pri katerih je bilo določanje števila ponovitev neuspešno pri treh ali več lokusih, so bili izključeni iz nadaljnje analize. Vse nadaljnje postopke smo izvedli s podatkovnim setom, ki je vključeval 522 genotipiziranih osebkov.

Analiza s programom Micro-Checker ni razkrila ničelnih alelov pri nobeni izmed geografsko določenih skupin, z izjemo skupine iz Rdečega jezera. Pri samostojni analizi vzorcev iz leta 2007 in 2010, ničelni aleli niso bili več prisotni. Izpadov alelov ali zdrsov polimeraze ni bilo pri nobeni skupini.

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 39 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Povprečno število alelov na vseh lokusih je bilo 11.4 (sd = ±2.4), pričakovana heterozigotnost pa 0.761 (sd = ± 0.053). FIS indeks za celokupen set podatkov je bil 0.055

(p = 0.0001), kar lahko pomeni parjenje v sorodstvu oziroma podstrukture. Vrednosti FIS indeksov izračunanih na posameznih vzorčnih mestih, kot tudi na geografsko določenih skupinah, niso nakazovale na podstrukture (Preglednica 4). Primerjava opažene vrednost

RST (0.087) z vrednostjo RST po permutacijah alelnih velikosti med aleli znotraj populacij (0.037; p = 0.0018) je pokazala, da so enostopenjske mutacije doprinesle h genetski različnosti populacij. Signifikantno večji RST v primerjavi z FST (0.051) je pokazal tudi relativno pomembnost mutacijske stopnje v primerjavi z naključnim genskim drsom.

Preglednica 4: Populacijski parametri imotske gaovice: število osebkov (N); indeksi parjenja v sorodstvu, izračunani s programom FSTAT (FIS), za vsakega od vzorčnih mest in za geografsko določene skupine; povprečno število alelov na lokus, pričakovana in opažena heterozigotnost (Arlequin; Palandačić in sod., 2012a). Table 4: Population parameters; N, number of individuals; FIS (FSTAT) for each population and for pooled groups; NA, average number of alleles per locus; HEXP, expected average heterozygosity; HO, observed heterozygosity (Arlequin; Palandačić et al., 2012a). GDS Okrajšava N FIS Pooled FIS NA HEXP HO južni izviri DRA 16 0.111 0.012 9.750 0.710 0.796 BVRG 27 -0.031 11.000 0.822 0.798 MAT 10 -0.003 7.250 0.779 0.772 Rdeče jezero CRV 33 0.082 0.073 10.750 0.676 0.728 izviri v Imotskem GLD 37 0.026 0.016 13.500 0.785 0.806 BVID 25 0.010 13.000 0.773 0.780 REB 23 0.020 13.000 0.785 0.800 GRAN 24 0.030 12.375 0.776 0.795 MED 17 0.060 11.625 0.760 0.807 UDV 28 0.029 12.875 0.770 0.792 VID 40 -0.041 15.625 0.832 0.800 izviri v Grudah GRV 24 0.007 0.016 11.500 0.787 0.792 JAM 40 0.021 14.125 0.784 0.801 Nezdravica NEZ 46 0.012 0.012 5.500 0.615 0.622 izviri Vrljike PJEZ 53 0.004 -0.024 11.250 0.719 0.721 GRB 34 -0.086 10.375 0.817 0.754 STR 19 0.001 9.250 0.748 0.749 Prološko Blato PRBL 29 -0.013 -0.013 12.625 0.779 0.769

40 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Paroma primerjane genetske razdalje med vzorčnimi mesti na osnovi F in R statistike so

podane v Prilogi C (FST) in D (RST). Glede na paroma primerjane FST-je je v podatkovnem setu prisotnih šest skupin, ki so v skladu z razdelitvijo na geografske skupine. Teh šest skupin je: Nezdravica, Rdeče jezero, izviri Vrljike, Prološko Blato, južni izviri in »centralna« skupina, ki združuje izvire v Imotskem in okolici (BVID, GLD, GRAN, MED, REB, UDV in VID) ter oba izvira v Grudah (GRV in JAM). Za analizo molekularne variance (AMOVA) smo vzorčna mesta razdelili glede na paroma primerjane genetske razdalje v šest skupin: (i) Nezdravica, (ii) izviri Vrljike, (iii) Rdeče jezero, (iv) Prološko Blato, (v) »centralna« skupina in (vi) južni izviri. Varianca je bila največja znotraj populacij (93.3%, p ≤ 0.00001), medtem ko je bila med skupinami 6% (p ≤ 0.00001). Razlika med populacijami znotraj skupin ni bila statistično signifikantna (0.2%; p ≤ 0.20554).

Populacijsko drevo je pokazalo zelo podobne rezultate kot FST analiza (Slika 7). Med šestimi skupinami sta najbolj oddaljeni Nezdravica in izviri Vrljike. Med izvir v Grudah in izviri v Imotskem ni razlik.

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 41 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Slika 7: Populacijsko drevo narisano z metodo skupnih alelnih razlik v programu Populations. Figure 7: Population tree based on shared allelic distances (Populations).

Na grafu FCA (Slika 8) prve tri osi razložijo 5.11% celotne genetske variance. Šest skupin določenih s paroma primerjanimi FST-ji in populacijskim drevesom ni očitnih, čeprav so vzorci iz Nezdravice in južnih izvirov skoncentrirani na enem koncu ter vzorci iz Vrljike na drugem koncu grafa. Vzorci iz Rdečega jezera in Prološkega Blata so pomešani med vzorce iz »centralne« skupine.

42 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Slika 8: Graf FCA narejen v programu Genetix. Prve tri osi razložijo 5.11% celotne genetske variance. Pomen barvnih oznak je enak kot na sliki 7. Figure 8: FCA plot, produced with the software Genetix. The first three axes explain 5.11 % of total genetic variance; color coding as in Figure 7.

Test vezavnega neravnovesja je potrdil neodvisnost izbranih mikrosatelitnih lokusov in s tem omogočil njihovo uporabo za analizo z Bayesovimi metodami.

Analiza podatkovnega seta z z Bayesovimi metodami je razdelila vzorce v tri oziroma štiri skupine. Program STRUCTURE je kot najverjetnejše število skupin tako za vrednost K=3 kot tudi za K=4 izračunal skoraj enake vrednosti posteriorne verjetnosti (Slika 9).

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 43 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Slika 9: Grafi posterirne verjetnosti (LnP (D)) izračunane pri številu skupin K = 1 – 7 s programom STRUCTURE. Analiza je bila ponovljena dvajsetkrat za vsako K vrednost (prva vrstica). Vrednosti K = 3 in K = 4 imata enako posteriorno verjetnost (druga vrstica), le da je pri vrednosti K = 3 manj odstopanj od srednje vrednosti (tretja vrstica). Figure 9: Plots of posterior probability (LnP (D)) calculated for clusters from K = 1 to K = 7 conducted with software STRUCTURE. Analysis was repeated 20 times for each K value (1st row), values of LnP (D) for K = 3 and K = 4 were the same (2nd row), however K = 4 has more variance around the mean value.

Ko smo rezultate iz analize s programom STRUCTURE modificirali, kot predlaga Evanno in sodelavci (2004), je bilo najverjetnejše število skupin dve. Program BAPS je podatkovni set razdelil v štiri skupine (Slika 10).

44 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Slika 10: Populacijska struktura določena z metodami na osnovi Bayesovega principa s programi STRUCTURE (K=2 do K=4, prve tri vrstice) in BAPS. Oznaki * in ** sta za MED in MAT. (Palandačić in sod., 2012a) Figure 10: Bayesian clustering analyses: STRUCTURE (K=2 to K=4) and BAPS (bottom row); *, MED; **, MAT (Palandačić et al., 2012a).

Če glede na Evannovo metodo privzamemo, da je število skupin dve, je iz grafa razvidno, da sta ti dve skupini izviri Vrljike s Prološkim Blatom in Nezdravica z južnimi izviri. »centralna« skupina in Rdeče jezero sta med njima kot hibridizacijska cona (Slika 10, prva vrsta). V primeru, da je število skupin tri, je prva skupina Nezdravica, druga izviri Vrljike, tretja pa Rdeče jezero (Slika 9, druga vrsta). Osebki iz južnih izvirov delno pripadajo Nezdravici, delno pa ostalima dvema skupinama. Prav tako mešanico genotipov (iz izvirov Vrljike in Rdečega jezera) predstavljata Prološko Blato in »centralna« skupina (iz Nezdravice, izvirov Vrljike in Rdečega jezera; Slika 10, druga vrsta). V kolikor privzamemo, da je število skupin 4, je četrta skupina težko prepoznavna, saj je raztresena med skupinami prepoznanimi s K=3 (Slika 10, tretja vrsta). Analiza s programom BAPS kot četrto skupino izpostavi južne izvire (Slika 10, četrta vrsta), Prološko Blato in

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 45 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

»centralno« skupino pa določi kot genetsko mešani skupini. Tako STRUCTURE kot BAPS sta potrdila, da predstavljajo gaovice iz izvirov v Imotskem in v Grudah genetsko enotno populacijo.

Hierarhična analiza s programom STRUCTURE (Slika 11) ni razrešila vprašanja, ali je bolj verjetno število skupin v podatkovnem setu tri ali štiri. Prav tako znotraj opaženih treh oziroma štirih skupin ni bilo podstruktur. Potrdila je, da Prološko Blato, »centralna« in južni izviri predstavljajo genetsko mešane skupine z genotipi iz izvirov Vrljike, Nezdravice in Rdečega jezera.

Slika 11: Hierarhična analiza populacijske strukture s programom STRUCTURE (Palandačić in sod., 2012a). Figure 11: Hierarchical structure analysis (Palandačić et al., 2012a)

46 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Analiza s programom Bottleneck, s katero smo analizirali podatkovni set kot celoto ter vsako geografsko določeno skupino ločeno, ni razkrila nobenega ozkega grla v bližnji preteklosti vrste.

Čeprav uporabljene Bayesove metode nakazujejo, da je v podatkovnem setu manj kot šest skupin, smo zaradi mešane identitete treh od njih za nadaljnjo analizo s programom IMa2

uporabili šest skupin, ki smo jih osnovali na podlagi paroma primerjanih FST-jev: (i) Prološko Blato, (ii) izviri Vrljike, (iii) »centralna«, (iv) Rdeče jezero, (v) južni izviri in (vi) Nezdravica. Da bi potrdili upravičenost združevanja izvirov v Imotskem in izvirov v Grudah v »centralno« skupino, smo tudi med njima izvedli analizo s programom IMa2. Analiza je čas od ločitve skupin ocenila kot nič in potrdila, da predstavljata eno panmiktično populacijo. Rezultati analize s podatki o ocenah parametrov z modelom IM (čas od ločitve populacij, efektivne velikosti predniške populacije in obeh populacij, ki so njene potomke, migracijske stopnje in populacijske migracijske stopnje) in njihovi konvergenci so podani v Prilogi E. Rezultati paralelnih analiz, za katere smo uporabili različne vzorce iz istih skupin, so bili zelo podobni, v tabeli pa je prikazana tista paralelka, ki je bolje konvergirala.

Analiza z IMa2 je razkrila kompleksen vzorec s številnimi enosmernimi migracijskimi potmi (Slika 11). Migracijska stopnja iz Rdečega jezera v »centralno« skupino je bila sedemkrat višja kot v obratno smer, višja pa je bila tudi migracija iz Nezdravice v južne izvire. Enosmerne migracije so bile določene iz izvirov Vrljike v Prološko Blato, iz Prološkega Blata v »centralno« skupino ter iz Nezdravice v »centralno« skupino. Edini par skupin, med katerima je bila migracijska stopnja ocenjena z nič, sta bili Rdeče jezero in izviri Vrljike. Najvišja stopnja migracije je bila ocenjena iz izvirov Vrljike v Prološko Blato.

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 47 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Slika 12: Vzorec migracij ocenjen z modelom IM v programu IMa2. Širine puščic predstavljajo ocene migracijske stopnje (HiPt) in segajo od nič med Rdečim jezerom in izviri Vrljike do štiri med izviri Vrljike in Prološkim Blatom. Točne številke HiPt vrednosti s pripadajočimi intervali zaupanja so podane v Prilogi E. Rdeče številke na sliki predstavljajo število migrantov v zadnji generaciji, ki jih je med skupinami izračunal program Geneclass2 (Palandačić in sod., 2012a). Figure 12: Migration patterns according to IM model estimates. Arrow width directly corresponds to IMa2’s HiPt estimate of migration rate (ranging from 0 between CRV and Vrljika springs to 4 between Vrljika springs and PRBL); see Table E in supplementary for details; red numbers correspond to first-generation migrants (Geneclass2; Palandačić et al., 2012a).

S programom Geneclass2 smo skupno odkrili 84 rib, ki naj bi se preselile v zadnji generaciji (α=0.05). Čeprav se je večina domnevnih migracij zgodila znotraj šestih geografsko določenih skupin, se je 32 % migracij zgodilo med skupinami (Slika 11).

V izvirih Vrljike je bilo identificiranih dvanajst priseljenih rib, od katerih naj bi se ena riba priselila iz »centralne« skupine in ena iz južnih izvirov. Preostalih deset domnevnih migrantov se je preselilo znotraj skupine, med tremi vzorčnimi mesti.

48 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Znotraj »centralne« skupine je program ocenil skupno 34 preseljenih rib, devet naj bi se jih preselilo med izviri v Imotskem in izviri v Grudah, pet rib prišlo iz izvirov Vrljike, pet iz Prološkega Blata, ena iz južnih izvirov ter ena iz Rdečega jezera.

V Rdeče jezero sta se v zadnji generaciji domnevno priselili dve ribi in sicer iz »centralne« skupine.

V južnih izvirih naj bi se osem rib preselilo med tremi vzorčnimi mesti, medtem ko naj bi jih šest prišlo iz »centralne« skupine in ena iz izvirov Vrljike.

Nezdravica je glede na rezultate programa Geneclass2 popolnoma izolirana, oziroma v zadnji generaciji naj ne bi izmenjala rib z nobeno od petih skupin. Možno pa je, da izmenjava rib poteka s kakšno populacijo, ki je nismo vzorčili, saj so bili štirje osebki označeni kot »home-assigned«. To pomeni, da jim je bližja populacija, v katero so se priselili (v našem primeru Nezdravica) kot katerakoli druga populacija vključena v analizo.

En osebek, ki je bil določen kot »home-assigned«, je bil opažen tudi v skupini Prološko Blato. Poleg njega sta se še dve ribi priselili iz izvirov Vrljike in dve iz »centralne« skupine.

4.3 RAZLIKA V IZRAŽANJU GENOV (POSKUS Z MIKROMREŽAMI)

V poskusu z mikromrežami je bilo identificiranih 107 diferencialno izraženih zapisov, ki so ob primerjavi dveh poskusnih skupin imeli za več kot enkrat višjo oziroma enkrat nižjo stopnjo izražanja. Od teh je imelo 28 zapisov stopnjo izražanja povečano oziroma pomanjšano za več kot dvakrat. Sedem zapisov ima popolnoma neznano funkcijo, devet pa jih je zelo slabo poznanih in ni točno jasno, kaj kodirajo. Od zapisov, ki imajo poznano funkcijo, so imeli v temi povečano izražanje zapisi za fibrilin in plazminogen ter za s HLA-B kompleksom povezan prepis 3 (angl. »HLA-B-associated Transcript 3«) in protein GASP6 (angl. Growth Arrest Specific Protein 6). Zmanjšano izražanje pa so imeli zapisi za specialen z AT-bogat protein (angl. Special AT-rich Sequence Binding Protein), CCR4- NOT prepisovalni kompleks (angl. CCR4-NOT Transcription Complex), s presenilinom

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 49 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 povezan romboidni protein (PARL, angl. Presenilin-Associated Rhomboid-like Protein), komponenta komplementa C3a, mio-inozitol oksidaza, kolagen tipa VI in ureidopropionaza ß. Rezultati so podani v Preglednici 5.

Preglednica 5: Seznam vseh zaporedji na mikromreži s spremenjenim izražanjem pri primerjavi rib, ki so bile en mesec v temi, in rib z normalno 12 urno foto-periodo (tema vs. normalna). Navedeno je ime zaporedja na mikromreži (sonda), rang spremembe, regulacija in ime gena, kjer je poznano. Table 5: The list of differentially expressed microarray probes, which are the result of comparison of fish kept in the dark for one month and fish with normal 12 hour photoperiod. The name of the probe, fold change, regulation (Dark vs. Normal), and the gene title, where it is known.

Sonda Rang Regulacija Ime gena spremembe (tema vs. normalna) EA_Pp_52731 4.463 znižana EA_Pp_70486 4.100 znižana EA_Pp_60167 3.551 znižana Gen za protein, ki se veže na z AT bogate sekvence (angl. Special AT-rich Sequence Binding Protein 1) EA_Pp_56373 3.246 znižana EA_Pp_62128 3.026 znižana Tretja podenota transkripcijskega kompleksa CCR4-NOT (angl. CCR4-NOT Transcription Complex, Subunit 3) EA_Pp_67034 2.943 znižana EA_Pp_70902 2.861 znižana Gen za s presenilinom povezan romboidni protein (angl. Presenilin Associated, Rhomboid-like Protein) EA_Pp_64321 2.613 znižana Odprti bralni okvir 1 na kromososmu 18 (angl. Chromosome 18 Open Reading Frame 1) EA_Pp_64381 2.499 znižana Gen za protein podoben DNA- vezavnemu proteinu (angl. Similar To DNA-binding Protein) EA_Pp_62596 2.416 znižana EA_Pp_69763 2.361 znižana Gen za komponento komplomenta C3a (angl. Complement Component C3a) EA_Pp_71093 2.335 znižana Odprti bralni okvir 29 na kromososmu 2 (angl. Chromosome 2 Open Reading Frame 29) EA_Pp_50582 2.284 znižana Homolog Unc-13 (angl. Unc-13 Homolog B) EA_Pp_53579 2.262 znižana Odprti bralni okvir 34 na kromososmu X (angl. Chromosome X Open Reading Frame 34) (se nadaljuje)

50 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Sonda Rang Regulacija Ime gena spremembe (tema vs. normalna) EA_Pp_50674 2.239 znižana Mio-inozitol oksigenaza (angl. Myo-inositol Oxygenase) EA_Pp_52026 2.102 znižana Kolagen tipa VII (angl. Collagen, Type VII, Alpha 1) EA_Pp_55711 2.098 znižana EA_Pp_55406 2.068 znižana EA_Pp_69533 2.055 znižana Ureidopropionaza (angl. Ureidopropionase, Beta) EA_Pp_56238 5.168 povišana S HLA-B povezan transkript 3 (angl. HLA-B-associated Transcript 3) EA_Pp_59444 3.839 povišana RIKEN CDNA E430025E21 EA_Pp_52442 3.202 povišana Homolog cinkovega proteina 64 (angl. Zinc Finger Protein 64 Homolog) EA_Pp_67561 2.665 povišana Domena podobna CUB in zoni pellucidi (angl. Similar To CUB And Zona Pellucida-like Domains 1) EA_Pp_67426 2.599 povišana Fibrilin 2 EA_Pp_68222 2.503 povišana Gena za protein podoben treoninski sintazi (angl. Threonine Synthase-like Protein) EA_Pp_67937 2.433 povišana Palzminogen EA_Pp_51237 2.298 povišana Gen za faktor, ki zaustavlja rast (angl. Growth Arrest Specific Faktor 6) EA_Pp_68176 2.259 povišana Segment DNA na kromosomu 6 (angl. DNA Segment, Chr 6, Wayne State University 163)

5 RAZPRAVA

5.1 RAZREŠEVANJE TAKSONOMSKIH NEJASNOSTI V SKUPINI GAOVICE

Rezultati raziskav v okviru prvega sklopa Razreševanje taksonomskih nejasnosti v skupini gaovice so bili predstavljeni v članku »Revised classification of former genus Phoxinellus using nuclear DNA sequences« (Palandačić in sod., 2010). V njem smo z deli jedrnih zapisov za rodopsin, EGRF2 in ITS1 potrdili hipotezo, ki jo je na osnovi sekvenčne analize mitohondrijskega gena za citokrom b in neanotirane jedrne sekvence Cyp_unFLP postavil Freyhof s sodelavci (2006), da vrste D. adspersus, D. gethaldi, D. jadovensis in D. krbavensis predstavljajo svoj rod Delminichthys. S tem smo tudi potrdili predpostavko, da je rod Phoxinellus polifiletski. V skladu z raziskavo Freyhofa in sod. (2006) je bil tudi

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 51 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 položaj rodu Pelasgus kot sestrske skupine rodu Delminichthys, kar je poleg filogenetske analize pokazala tudi opažena sinapomorfija v obliki deset baznih parov dolge insercije v zapisu za ITS1, ki si jo rodova delita, medtem ko je pri drugih rodovih ni.

V opravljeni filogenetski analizi pa nismo podprli vključitve vrst T. croaticus, T. fontinalis in T. metohiensis v rod Telestes, kot so predlagali Ketmaier in sod. (2004) ter Freyhof in sod. (2006). T. fontinalis in T. croaticus sta bili sicer z nizko podporo (28/-/46) prepoznani kot sestrski skupini in pri T. metohiensis je bilo opaziti tendenco do uvrščanja skupaj z njima. Vendar je zaradi slabe ločljivosti, ki je verjetno posledica uporabe le enega potrjenega predstavnika rodu Telestes (T. souffia) kot referenčnega vzorca, nemogoče potrditi uvrstitev teh treh vrst v predlagan rod. Prav tako naši rezultati niso v skladu z ugotovitvijo Freyhofa in sodelavcev (2006), da Ph. pseudalepidotus skupaj s Ph. dalmaticus in Ph. alepidotus tvori enotno skupino, kar so ugotovili na osnovi mitohondrijske ne pa tudi jedrne DNA. Na našem filogenetskem drevesu se je vrsta Ph. pseudalepidotus z visoko podporo (91/0.97/90) uvrstila kot sestrska skupina skupine Delminichthys–Pelasgus (Slika 4). Perea in sodelavci (2010) so sočasno z našo raziskavo opravili obsežno študijo predstavnikov poddružine Lauscisinae, ki naseljujejo Mediteran. Izvedli so jo na mitohondrijskih zapisih za citokromu b in citokrom oksidazo 1 ter na jedrnih zapisih za RAG1 (angl. Recombination Activating Gene) in prvem intronu ribosomalnega proteina S7, vendar se rezultati mitohondrijske in jedrne DNA niso ujemali. Na osnovi kombiniranega seta jedrne in mtDNA kot tudi samo na osnovi jedrnih odsekov so sicer potrdili, da rod Phoxinellus sestavljajo Ph. pseudalepidotus, Ph. dalmaticus in Ph. alepidotus. Vendar pa so uvrstitev vrsts T. metoiensis, T. croaticus in T. fontinalis v rod Telestes, potrdili le na kombiniranem setu, saj so se na filogenetskem drevesu izračunanem le na osnovi jedrne DNA uvrstile med predstavnike rodu Chondrostoma. Na istem filogenetskem drevesu se je rod Delminichthys uvrstil kot sestrska skupina vrste Pseudophoxinus egridiri, ne rodu Pelasgus.

Kljub trem izvedenim študijam na predstavnikih bivšega rodu Phoxinellus, odnosi znotraj rodu Delminichthys, položaj vrst T. metoiensis, T. croaticus in T. fontinalis ter treh vrst, ki naj bi ostale v rodu Phoxinellus, še vedno niso pojasnjeni, zato so potrebne dodatne raziskave.

52 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

5.2 POPULACIJSKO GENETSKA STRUKTURA IMOTSKE GAOVICE IN PRETOK GENOV MED GEOGRAFSKO LOČENIMI POPULACIJAMI

Rezultati raziskav v drugem sklopu Populacijsko genetska struktura imotske gaovice in pretok genov med geografsko ločenimi populacijami so predstavljeni v članku »Fish migrate underground: the example of Delminichthys adspersus (Cyprinidae)« (Palandačić in sod., 2012a). V okviru teh raziskav smo določili populacijsko strukturo D. adspersus, ki nakazuje na genski pretok med populacijami brez površinskih vodnih povezav, in v kombinaciji z znanimi hidrološkimi podatki podpira hipotezo o podzemni migraciji rib. Ob enem smo poglobili znanje o tem slabo raziskanem endemitu, kar je možno aplicirati na gaovici sorodne vrste oziroma druge kraške organizme.

Populacijska struktura določena na osnovi mitohondrijske DNA je pokazala nerazčlenjeno populacijo, brez očitnih izoliranih skupin. Vendar pa se najpogosteje zastopan haplotip (H1) pri vzorcih iz izvirov Vrljike pojavi le enkrat, medtem ko pri vzorcih iz Nezdravice ne najdemo haplotipov, ki so značilni za izvire Vrljike. Medsebojno izoliranost teh dveh skupin je potrdila tudi primerjava genetskih razdalj med vzorčnimi mesti, ki je identificirala Nezdravico in izvire Vrljike kot najbolj oddaljeni skupini. Zvezdasto obliko genealogije z majhnim številom najpogostejših haplotipov, ki se razlikujejo za samo eno substitucijo, nekateri avtorji opisujejo kot posledico nedavne kolonizacije na novo ozemlje, čemur sledi širjenje vrste (Kvist, 2000; Norgat in sod., 2009; Polihronakis in Caterino, 2010). Vendar pa je analiza, ki testira možnost nenadne demografske ekspanzije (angl. mismatch analysis), to hipotezo zavrnila, kar pomeni, da vzrok za majhno raznolikost haplotipov ni nedavna ločitev med skupinami (populacijami). Oblika genealogije razvidne iz drevesa je lahko posledica nizke stopnje mutacij, ki jo za rod Delminichthys predpostavljajo Freyhof in sod. (2006), ali pa ponavljajoči genski pretok, ki lahko popolno izolacijo populacij prepreči že z migracijo nekaj osebkov na generacijo (Hartl in Clark, 1989). Tudi nukleotidna diverziteta imotske gaovice je nizka (1.2 × 10-3) in v primerjavi z nukleotidno raznolikostjo tajske jamske ribe Schistura oedipus bolj podobna nukleotidni raznolikosti S. oedipus znotraj populacij (1 × 10-3) kot med populacijami (5 × 10-3; Borowsky in Mertz, 2001). Vendar je tudi nizka nukleotidna raznolikost pri imotski

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 53 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 gaovici lahko posledica nizke mutacijske stopnje, genskega toka ali majhne efektivne velikostji populacije.

Osnovne mere populacijske raznolikosti določene na podlagi analize mikrosatelitov so pokazale, da je večina molekularne variance razporejena znotraj vzorčnih mest. Vendar je koeficient parjenja v sorodstvu (FIS) izračunan na celotnemu setu podatkov nakazal na obstoj podstruktur in paroma primerjani fiksacijski indeksi so razkrili 6 skupin, ki so bile skoraj popolnoma v skladu z geološko in hidrološko določenimi skupinami. Izjema so bile ribe iz izvirov v Imotskem in njegovi okolici, ki se genetsko niso razlikovale od vzorcev iz dveh izvirov iz vasi Grude (skupina imenovana »centralne«). Bayesove metode določanja podstruktur v podatkovnem setu so potrdile genetsko homogenost skupine »centralna«, hkrati pa so število podstruktur v setu zmanjšale iz šest na tri oziroma štiri (Slika 10). Vendar te predlagane podstrukture niso bile popolnoma geografsko izolirane in v vsaki skupini so bili prisotni genotipi iz drugih skupin, kar je bilo še posebno očitno v skupinah »centralna« in Prološko Blato, ki sta bili mešanica genotipov iz Rdečega jezera, izvirov Vrljike ter južnih izvirov (obe Matici in Draga). Vendar je podobnost med skupinami lahko poleg genskega toka tudi posledica nedavne ločitve med skupinami. Primerjava metod, ki so osnovane na dolžini alelov (RST) z metodami osnovanimi na njihovi identiteti (FST) je pokazala, da so mutacije bistveno doprinesle k raznolikosti v preučevanem podatkovnem setu. Ker je število mutacij odraz starosti sistema (Hardy in sod., 2003), lahko sklepamo, da do ločitve skupin ni prišlo pred kratkim. V skladu s to ugotovitvijo je tudi odsotnost ozkih grl, ki jih nismo zaznali ne v celotnem podatkovnem setu ne v posameznih geografsko določenih skupinah. Dodatno je možno o starosti sistema sklepati na podlagi geološke zgodovine območja, na katerem ni bilo poledenitev (Taberlet in sod., 1998).

Program IMa2, ki deluje na osnovi modela migracija-z-izolacijo (»migration with isolation«; Hey, 2004), je pokazal genski pretok med šestimi skupinami, določenimi s paroma primerjanimi FST-ji. Vendar ta model predvideva stalno stopnjo migracije od časa ločitve populacij do sedanjosti, zato nihanja v migracijski stopnji lahko pomenijo odstopanje od modela in privedejo do nepravilnih rezultatov. Program ne loči med stalnim genskim pretokom, migracijo, ki se je zgodila v omejenem časovnem obdobju, ali sekundarnim stikom med preučevanimi skupinami. Da v našem primeru migracija rib ni

54 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

bila časovno omejen pretekli dogodek, nakazujejo rezultati programa Geneclass2, glede na katere naj bi se šestnajst procentov vseh vzorčenih osebkov preselilo v zadnji generaciji. Sekundarnega stika sicer to ne izključuje, vendar ni verjetno, da bi komercialno nepomembne ribe, kot so gaovice (Mrakovčić in sod., 2006), vlagali ali prenašali ljudje. Poleg tega poznamo vsaj eno lokacijo (i.e. Rdeče jezero /tipska lokacija/), katere nedostopnost zagotavlja naravno prisotnost rib. Hipoteza o ponavljajočem se genskem pretoku med geografsko izoliranimi ribjimi populacijami je torej podprta z opisano populacijsko strukturo imotske gaovice, hidrološki podatki in sledenje vode v krasu (Kanaet 1959, Bonacci 2006, Džeba 2010) pa podpirajo del teze, da vsaj nekaj genskega pretoka poteka pod zemljo, kar najbolje prikazujejo trije spodaj opisani primeri.

Prvi primer sta »centralna« skupina in skupina rib iz brezna Rdeče jezero z vodno gladino 250 metrov pod robom (Slika 3), od koder je površinska disperzija rib v okoliške vodne vire v času poplav nemogoča. Številni avtorji opisujejo obstoj vsaj dveh podzemnih kanalov (za pregled glej Bonacci, 2006), ki jezero povezujeta z nižje ležečimi izviri v okolici Imotskega, kar je v skladu tudi z našimi rezultati. Rdeče jezero in »centralna« imata skupne najpogostejše haplotipe gena za citokrom b. Paroma primerjana vzorčna mesta na

osnovi dolžin alelov (RST) niso pokazale signifikantne različnosti med Rdečim jezerom in vzorčnimi mesti (BVID, GRAN and REB) iz »centralne« skupine. Program BAPS med skupinama ne razločuje, s programom Geneclass2 pa smo odkrili tri domnevno preseljene ribe med skupinama v zadnji generacij. Številke so majhne, vendar metoda upošteva samo zadnjo generacijo migrantov, medtem ko je kanal med Rdečim jezerom in izviri aktiven le v letih, ko je veliko padavin (Bonacci, 2006). Do selitve rib verjetno ne prihaja v vsaki generaciji, kar nakazuje tudi nehomogenost med vzorci nabranimi v različnih letih (2007 in 2010), ki je opazna v neravnotežju lokusa Ca3. IM program, ki pokaže tudi pretekli genski tok, je razkril visoke stopnje migracij, še posebno iz smeri Rdečega jezera v »centralno« skupino.

Drug primer, ki podpira hipotezo podzemne migracije, je genetska homogenost med vzorci iz površinsko nepovezanih rek Rastočke in Vrgoračke Matice, ki so bili določeni kot ena panmiktična populacija z vsemi izvedenimi analizami. Vrgoračka Matica je popolnoma izolirana in brez nadzemnih vodnih povezav, pa vendar smo s programom Geneclass2

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 55 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 identificirali dva osebka v Rastočki Matici, ki naj bi se v zadnji generaciji priselila iz Vrgoračke Matice, medtem ko naj bi se trije osebki preselili v obratni smeri. Poleg genetskih dokazov je sledenje z barvo leta 1954 zasledilo podzemne vodne povezave med obema Maticama (Kanaet, 1959), kar potrjuje našo hipotezo o podzemni migraciji imotslih gaovic.

Tretji primer, ki podpira hipotezo o podzemni migraciji, so genotipi značilni za »centralno« skupino, ki so prisotni tudi v južnih izvirih (obe Matici in Draga), in obratno, kar jasno ilustrirajo programi STRUCTURE in BAPS (Slika 10) ter Geneclass2 in IMa2 (Slika 12). Če obravnavamo le površinske vodotoke, izviri »centralne« skupine formalno pripadajo rečnemu sistemu Vrljike, ki se konča v požiralniku Sajnoviči (Slika 2). Voda nato teče skozi umetni podzemni kanal pod hribovjem Drinovci in vsaj delno izvira na drugi strani kot reka Tihaljina, s katero pa so indirektno povezani južni izviri. Čeprav bi lahko predpostavljali, da precejšnja razlika v višini med ponorom Vrljike in izvirom Tihaljine (90 m) predstavlja neprehodno oviro za selitev rib, naši rezultati nakazujejo drugače. Poleg tega so hidrologi z barvanjem odkrili vodno povezavo med izviri v Grudah (»centralna«) in rečnim sistemom Tihaljine (glej »Opis vzročnih mest«). Izviri so medsebojno povezani z estavelami, v katerih ob naraslih vodah v porečju Tihaljine zaradi pritiska voda lahko začasno teče navzgor v porečje Vrljike (Jović 2003). Čeprav ta pojav v kraškem svetu ni redek in bi lahko razložil migracijo imotske gaovice, je verjetnejša razlaga selitev rib po kakšnih še ne odkritih, a bolj dostopnih vodnih poteh. Kanaet (1959) je s pomočjo hidroloških meritev, pri katerih je meril količino vode, ki izgine v požiralniku Vrljike, in količino vode na izviru Tihaljine, ugotovil, da Tihaljino z vodo poleg Vrljike oskrbujejo še drugi vodni viri, ki mogoče predstavljajo tudi poti selitve rib.

Od več kot 125 zabeleženih troglomorfnih vrst rib jih večina naseljuje kraška območja Avstralije, Kitajske, ZDA, Mehike, Tajske in Srednjega Vzhoda (Proudlove, 2006; Romero in Paulson, 2001). Za mnoge vrste je značilno, da jih sestavljajo tako troglobiontske kot tudi površinske populacije ter »vmesne« populacije na različni stopnji razvoja troglomorfoz, ki pa se v primeru stika med seboj lahko parijo. Pri mehiških ribah Astyanax mexicanus in A. fasciatus so Strecker in sod. (2004) obstoječi poselitveni vzorec razložili s ponavljajočo kolonizacijo jam s površja. Površinske populacije, ki so bile vir rib

56 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

za razvoj podzemnih populacij, so večkrat izumrle, nato pa so populacije iz drugih območji najprej poselile nadzemne vodotoke, od tam pa podzemne vode. Zato so jamske populacije iz sosednjih jam pogosto nesorodne, saj nimajo skupnih prednikov. Kompleksna populacijska struktura rodu Astyanax torej ni posledica podzemnih povezave temveč ponavljajočega poseljevanja iz površja. Nasprotno pa so Dilman in sod. (2010) populacijsko strukturo ameriških troglomorfnih perkopsiformov razložili s pomočjo podzemnih povezav. Sedanjo populacijsko strukturo vidijo kot odraz nekdanjih povezav v krasu, ki so se kasneje spremenile oziroma prekinile. Tudi Borowsky in Mertz (2001) menita, da je tajska vrsta S. oedipus podzemlje naselila v enkratni invaziji ter se nato razširila po podzemnih vodnih poteh, ki so se nato prekinile. Posledica pa je bila izolacija in diferenciacija populacij. Pri nadzemnih ribah je primer domnevne podzemne disperzije mehkoustna postrv (Salmo obtusirostris), ki naj bi naselila reko Vrljiko iz reke Trebižat (pritok Neretve), čeprav reki nista površinsko povezani (Snoj in sod., 2008). V treh opisanih primerih naj bi šlo za kratkotrajno oziroma enkratno podzemno selitev, ne za ponavljajočo podzemno migracijo kot jo predlagamo za vrsto D. adspersus. Vendar pa trije opisani primeri dokazujejo, da je podzemna migracija verjeten način disperzije organizmov. Z morfološkega vidika vrsta nima vidnih prilagoditev na podzemno življenje, razen zmanjšanega števila in kompleksnosti lusk, ki ga Mrakovčić in sod. (2006) opisujejo kot začetni znak prilagoditve na podzemlje. Ker naj bi bil rod Delminchthys na tem kraškem območju ujet že od dviga Dinaridov pred deset do osem milijonov let nazaj, pa menimo, da pomanjkanje troglomorfnih znakov ni posledica upočasnjene prilagoditve na podzemlje, temveč dejstva, da gaovice periodično kolonizirajo podzemlje.

V zadnjem času se je med raziskovalci, ki se ukvarjajo z različnimi vidiki raziskovanja krasa, pojavila ideja o združitvi različnih ved z namenom oblikovanja celostnega pristopa raziskovanja tega kompleksnega območja ter predvsem njegove zaščite. Čeprav je pomen medsebojnega vpliva hidroloških pojavov na floro in favno v krasu že leta 1939 opisal Hawes, so se šele pred kratkim pojavile ideje o kombiniranih raziskavah, z njimi pa podlaga za novo vedo, ekohidrologijo krasa (Bonacci in sod., 2009). Pronk in sod. (2009) so predlagali uporabo mikrobioloških združb za sledenje vode, Pipan in Culver (2007) pa sta predstavila idejo o uporabi dognanj s področja biologije za določanje vodnih povezav v krasu kot dodatek k sedanjim tehnikam sledenja z barvo, temperaturo oziroma soljo. Ker

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 57 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 konkretnih študij, ki bi primerjale hidrološke povezave z disperzijo organizmov po našem vedenju ni, smo hidrološke podatke, ki so na voljo za areal vrste imotske gaovice, primerjali z njeno populacijsko strukturo oziroma predvidenimi migracijskimi potmi. Študija je bila objavljena v obliki članka z naslovom »Molecular data as a possible tool for tracing groundwater flow in karst environment: example of Delminichthys adspersus in Dinaric karst system« (Palandačić in sod,. 2012b) in je poleg primerjave poskušala oceniti potencial bioloških sledilcev ter podati primer interdisciplinarnega sodelovanja za boljšo zaščito kraških območji. Dostopni hidrološki podatki (Kanaet, 1959; Bonacci; 2006, Džeba, 2010) se ujemajo s populacijsko strukturo in hkrati predstavljajo okvir za njeno razumevanje. Tako smo z genetskim ujemanjem med skupinami rib podprli povezavo Rdečega jezera z izvir v okolici Imotskega (kanal iz Rdečega jezera je direktno povezan z izvirom Jažva, ki je v naši raziskavi poimenovan kot vzorčno mesto Glavina Donja), rek Vrgoračke in Rastočke Matice ter rečnih sistemov Vrljika in Tihaljina. Poleg teh smo predlagali tudi možne nove podzemne povezave med Grudami in Imotskim izviri, Prološkim Blatom in izviri Vrljike ter med Drago in obema Maticama. Vsi ti izviri so sicer posredno povezani tudi preko površinske mreže potokov in umetnih kanalov, ki pa pogosto presušijo. Poleg tega je opaženo vedenje rib (redko jih je opaziti daleč od izvirov, osebna opažanja) neskladno z njihovo več kilometrsko migracijo po toku navzgor, kjer bi bile izpostavljene plenilcem in neprimernim življenskim pogojem ob pogostih presušitvah. Zato predvidevamo, da tudi med naštetimi lokacijami obstajajo podzemne povezave, ki pa s tradiconalnimi tehnikami sledenja podzemnih vodnih poti še niso bile odkrite. Drugi cilj raziskave je bil oceniti uporabnost bioloških sledilcev v primerjavi s kemičnimi in fizikalnimi. Ker so ribe živi organizmi, se ne gibajo le pasivno z vodnim tokom, temveč imajo svojo lastno energijo in nagone, zato do neke mere lahko kljubujejo silam gravitacije. V krasu večino časa prevladuje nizek nivo talne vode (80%), in glede na genetsko homogenost populacij lahko sklepamo, katere izmed njih so v tem času povezane, s čimer lahko ugotavljamo tudi kvalitativno oceno podzemnih vodnih povezav. Tak primer so izviri v Imotskem in Grudah, kjer so ribe popolnoma premešane, česar z občasni mešanjem v času poplav (malo število rib, ne vsako generacijo) ne moremo razložiti. Dodatna prednost bioloških sledilcev je tudi ta, da so v vodotokih že naravno prisotni, zato ni potrebe po vnašanju umetnih snovi kot je barva. Nove kombinirane metode bi lahko

58 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

omogočile izris posebnih zemljevidov občutljivosti za posamezna področja (Goldscheider, 2010), kar bi pomagalo pri zaščiti ogrožene kraške favne (Culver, 2001).

5.3 SPECIFIČEN METABOLIZEM VEZAN NA DOLGOTRAJNO ŽIVLJENJE V PODZEMLJU

V tretjem sklopu Specifičen metabolizem vezan na dolgotrajno življenje v podzemlju smo s pomočjo mikromrež primerjali izražanje genov v jetrih skupine imotskih gaovic, ki je en mesec preživela v pogojih normalne foto-periode, s skupino, ki je bila ta čas v popolni temi. V nasprotju s pričakovanji, rezultati niso pokazali znižane stopnje metabolizma pri skupini, ki je živela v temi. Od zapisov za gene, katerih funkcija je poznana, sta imela SAT-B1 (angl. Special AT-rich Sequence Binding Protein 1) in CCR4-NOT kompleks, ki sta vključena v zaviranje transkripcije, nižjo stopnjo izražanja v primerjavi s skupino z normalno foto-periodo. SAT-B1 je protein, ki se veže na določene z A in T bogate sekvence v zankah kromatina in prepreči njihovo razvijanje. Primarno je izražen v timocitih in verjetno z vezavo vpliva na regulacijo genov specifičnih za T-celice (de Belle in sod., 1998). CCR4-NOT je vključen v številne funkcije mRNA metabolizma. Najprej je bil odkrit kot zaviralec RNA polimeraze II, vključen pa je tudi v razgradnjo mRNA preko razgradnje poli-A repa (Tucker in sod., 2001; Yamashita in sod., 2005). Mio-inozitol je sekundarni sporočevalec, ki je vključen v številne procese, kot so signalna transdukcija in ozmoregulacija, njegovi derivati pa so vključeni tudi v organizacijo signaliziranja, preurejanje aktinskega citoskeleta in znotrajcelični transport veziklov (Arner in sod., 2001). Mio-inozitol v celicah razgrajuje mio-inozitol oksigenaza, katere izražanje je v skupini z neprestano temo zmanjšano. To bi lahko pomenilo večjo aktivnost procesov, v katerih kot sekundarni sporočevalec nastopa mio-inozitol. Prav tako je v skupini z neprestano temo zmanjšano izražanje encima ureidopropionaza ß, ki je vključen v razgradnjo pirimidinov uracila in timina. Primidina sta vključena v številne biološke procese, kot je sinteza DNA, RNA, fosfolipidov in glikogena (van Kullenburg in sod., 2004), torej je znižana stopnja njune razgradnje kvečjemu pokazatelj zvišanega metabolizma kot obratno. Prav tako na zvišan metabolizem nakazuje povišano izražanje plazminogena, katerega glavna produkcija poteka v jetrih, vključen pa je v raztapljanje krvnih strdkov, aktivacijo komplementnega sistema, ovulacijo in obnavljanju jetrnih celic po poškodbi (Bezerra in sod., 1999). Edini odkriti gen, ki bi lahko pomenil zmanjšano

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 59 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012 stopnjo metabolizma, je zapis za komponento komplementnega sistema C3a, katere glavna produkcija poteka v jetrih, njena stopnja izražanja pa je v skupini z neprestano temo nižja.

Zanimivo je, da je med diferencialno izraženimi geni veliko takih, ki so povezani s kontrolirano celično smrtjo ali apoptozo. Vendar so si rezultati nasprotujoči. Medtem ko GASP6 (angl. Growth Arrest Specific Protein 6), HLA-B in PARL (angl. Presenilin- Associated Rhomboid-like Protein) s svojim izražanjem nakazujejo, da je stopnja apoptoze v temi povečana, zmanjšano izražanje Unc13 homologa B, ki je induktor apoptoze (Song, 1999), kaže ravno obratno. HLA-B preko acetilacije aktivira apoptotski faktor p53 in s tem vzpodbuja apoptozo (Sasaki in sod., 2007) in GASP6, ki v zadnjih stopnjah apoptoze deluje kot most med apoptotičnimi celicami in fagociti (Wu in sod., 2005), imata povišano stopnjo izražanja. V skladu s tem je tudi nižje izražanje gena za PARL, ki ščiti celice pred apoptozo, tako da preprečuje izpust citokroma c iz membrane mitohondrija v citoplazmo (Jeyaraju in sod., 2006). Pri vrsti vrabca (Zonotrichia leucophrys gambelii) so povečano izražanje PARL odkrili med selitvijo, ko ptice veliko manj spijo.

Možna razlaga za višjo stopnjo apoptoze ter večje izražanje plazminogena in fibrilina 2 pa je tudi poškodba jeter pri skupini v neprestani temi. Medtem ko je v zdravih jetrih izvenceličnega matriksa malo, se ob poškodbi jeter zmanjša število celic, poveča pa se količina izvenceličnih tvorb, katerih glavni gradnik je kolagen tipa I. Pojavi se fibroza jeter. Fibrilini 1 je bil odkrit pri fibrozi podganjih jeter (Lorena in sod., 2004), zato je možno, da ima fibrilin 2 podobno vlogo. Plazminogen sodeluje v obnavljanju jeter po poškodbah (Bezerra in sod., 2011), enako vlogo pa naj bi imela tudi komponenta C3a, ki pa ima nasprotno od plazminogena zmanjšano izražanje. Zmanjšano izražanje pa ima tudi kolagen tipa VII, ki v jetrih še ni bil opisan, oziroma naj ga v epitelnem tkivu jeter sploh ne bi bilo (Wetzels in sod., 1991).

Glede na nasprotujoče si rezultate je težko določiti, kateri procesi se med bivanjem v temi pri imotski gaovici spremenijo in zakaj. Za večjo zanesljivost bi bilo dobljene diferencialno izražene gene potrebno dodatno ovrednotiti z verižno reakcijo s polimerazo v realnem času. Zaradi finančnih omejitev je bila študija izvedena na majhnem številu vzorcev in bi jo bilo za večjo zanesljivost ugotovitev potrebno ponoviti na večjem številu

60 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

rib. Od vseh metodoloških omejitev pa je največji izziv vsaj približno posneti pogoje, katerim so gaovice izpostavljene v naravi, saj o njihovem podzemnem življenju nimamo nobenih podatkov.

6 SKLEPI

Rezultati prvega sklopa raziskave Razreševanje taksonomskih nejasnosti v skupini gaovice so potrdili hipotezo Freyhofa in sod. (2006), da je rod Phoxinellus polifiletski ter uvrstitev štirih vrst D. adspersus, D.gethaldi, D. jadovensis in D. krbavensis v nov rod Delminichthys, katerega sestrska skupina je rod Pelasgus. Niso pa potrdili premestitve vrst T. croaticus, T. metohiensis in T: fontinalis v rod Telestes in sorodstvenih odnosov med preostalimi tremi predstavniki rodu Phoxinellus, Ph. alepidotus, Ph. pseudoalepidotus in Ph. dalmaticus.

Rezultati drugega sklopa raziskave Populacijsko genetska struktura imotske gaovice in pretok genov med geografsko ločenimi populacijami so pokazali, da je populacijsko strukturo imotske gaovice (D. adspersus) sestavljajo vsaj tri skupine, ki pa med seboj niso popolnoma izolirane. Primerjava določene populacijske strukture z znanimi hidrološkimi podatki je doprinesla k hipotezi o delnem genskem toku po podzemnih vodnih poteh.

V tretjem sklopu Specifičen metabolizem vezan na dolgotrajno življenje v podzemlju je bilo s pomočjo mikromrež določenih 28 diferencialno izraženih genov, ki so imeli za več kot dvakrat spremenjeno izražanje. Rezultati so nakazali, da se pri skupini, ki je preživela en mesec v popolni temi, spremeni izražanje genov povezanih s transkripcijo, apoptozo, izvenceličnim matriksom in strjevanjem krvi.

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 61 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

7 POVZETEK (SUMMARY)

7.1 POVZETEK

V centralnem Dinarskem krasu živi deset endemnih vrst rib s poljudnim imenom »gaovice«. Taksonomsko jih uvrščamo v družino Cyprinidea in poddružino Leuscisinae ter do pred kratkim v rod Phoxinellus, ki pa se je izkazal za polifiletskega. S filogenetsko raziskavo bivših predstavnikov rodu Phoxinellus in referenčnih vrst smo potrdili hipotezo Freyhofa in sodelavcev (2006), da gre pri gaovicah vsaj za tri različne rodove, od katerih so štiri vrste uvrščene v rod Delminichthys. Nismo pa uspeli razrešiti položaja treh vrst, ki naj bi ostale v rodu Phoxinellus, in treh vrst, ki so bile premeščene v rod Telestes. Poleg naše sta se vsaj še dve študiji ukvarjali z razreševanjem taksonomske pozicije desetih vrst, vendar so določene nejasnosti ostale. Tako bo za razreševanje odnosov znotraj skupine gaovice potrebno izvesti še dodatne raziskave.

Ker je znano, da so vodne povezave v krasu zelo raznolike in nepredvidljive ter pogosto potekajo pod zemljo, je razdrobljeni areal imotske gaovice (D. adspersus), ki naseljuje izvire v okolici Imotskega, Grud in Vrgorca, idealen za študijo populacijske strukture kraških organizmov. Čeprav je že več avtorjev predvidevalo disperzijo organizmov po podzemnih poteh, po našem vedenju ni študije, ki bi odkrila ponavljajoč genski pretok med površinsko izoliranimi populacijami. Določena populacijska struktura imotske gaovice je v povezavi z znanimi hidrološkimi podatki podprla hipotezo o podzemni migraciji, ki preprečuje popolno izolacijo rib iz površinsko nepovezanih izvirov. Nakazala pa je tudi na možnost uporabe kraških organizmov oziroma njihove populacijske strukture za sledenje vodnih povezav v krasu.

Ker gaovice na prvi pogled nimajo prilagoditev na podzemno življenje in bi jih glede na to, da se drstijo v površinskih vodotokih označili kvečjemu za subtroglofile ne za prave vodne troglobionte, nas je zanimalo, ali pride do spremembe metabolizma v času bivanja pod zemljo. V ta namen smo izvedli poskus z mikromrežami, v katerem smo primerjali izražanje genov v jetrih rib, ki so preživele cel mesec v temi, z ribami z normalno 12 urno

62 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

foto-periodo. Ugotovili smo, da se diferencialno izražajo geni povezani z apoptozo, transkripcijo, komplementnim sistemom, strjevanjem krvi in izvenceličnim matriksom.

7.2 SUMMARY

The central part of Dinaric karst is inhabited by ten endemic fish species with vernacular name »gaovice«. They were classified into family Cyprinidae and subfamily Leuscisinae, and until recently into genus Phoxinellus, which turned out to be polyphyletic. With phylogenetic study of former Phoxinellus taxa and reference species, we determined that the group »gaovice« is composed of at least three genuses, of which four species form genus Delminichthys. However; we could not corroborate the placement of three species in the genus Telestes and also the position of remaining three Phoxinellus species. Besides the present research, two more studies were performed on former Phoxinellus taxa, nevertheless; the results remain unclear and require additional studies.

Since karst has complex aquifer with many underground water connections, the fragmented distribution range of imotska gaovica (D. adspersus), inhabiting springs around Imotski, Grude and Vrgorac, offers ideal background for population study of karst organisms. Even though many researches suggested underground dispersion through underground karst water connections, we found none that would explicitly detect recurrent genetic flow between surface-isolated populations. Determined population structure of D: adspersus in combination with known hydrological data supports the hypothesis of underground migration, which prevents complete isolation of fish from surface-isolated springs. Further, the research implies the use of organisms and their population structure for water tracing in karst areas.

Because there are no obvious adaptations of »gaovice« to the subterranean environment, and they are better described as subtroglophils rather than water troglobionts, we performed a microarray experiment to find possible changes in the methabolism of fish in the underground stage of life. We compared the gene expression in liver of fish, which spend one month in complete darkness, with fish, which had normal 12 hour photoperiod. We found that genes with altered expression are related to apoptosis, transcription, complement system, blood clotting and extracellular matrix.

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 63 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

8 VIRI

Akaike H. 1974. A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on Automatic Control, 19, 6: 716–723

Allendorf F., Ryman N., Utter F. 1987 Genetic and Fishery Management: Past, Present, and Future. V Population Genetics and Fishery Management. Seattle, University of Washington Press: 420 str.

Arner R.J., Prabhu S., Thompson J.T., Hildenbrandt G.R., Liken A.D., Reddy C.C. 2001. Myo-Inositol oxigenase: molecular cloning and expression of a unique enzyme that oxidizes myo-inositol and D-chiro-inositol. Biochemical Journal, 360: 313-320

Avise J.C.2000. Phylogeography, the history and formation of species. Harvard university press, London, 447 pp.

Baerwald M.R., May B. 2004. Characterization of microsatellite loci for five members of the minnow family Cyprinidae found in the Sacramento–San Joaquin Delta and its tributaries. Molecular Ecology Notes, 4, 3: 385–390

Beaumont M.A. 1999. Detecting population expansion and decline using microsatellites. Genetics, 153: 2013–2029

Beerli P. 2006. Comparison of Bayesian and maximum-likelihood inference of population genetic parameters. Bioinformatics, 22, 3: 341-345

Beerli P., Felsenstein J. 1999. Maximum-likelihood estimation of migration rates and effective population numbers in two populations using a coalescent approach. Genetics, 152: 763–773

Belkhir K., Borsa P., Chikki L., Raufaste N., Bonhomme F. Genetix Version 4.05.2, Logiciel sous Windows pour la Génétique des Populations, 1996 -2004. Page Web de Genetix. http://www.genetix.univ–montp2.fr/genetix/constr (10.sep. 2009)

Bezerra J.A., Bugge T.H., Melin-Aldana H., Sabla G., Kombrinck K.W., Witte D.P., Degen J.L.1999. Plasminogen deficiency leads to impaired remodeling after a toxic injury to the liver. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96, 26: 15143-15148

64 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Bogutskaya N.G., Zupančič P. 2003. Phoxinellus pseudalepidotus (Telostei: Cyprinidae), a new species from the Neretva basin with an overview of the morphology of Phoxinellus species of Croatia and Bosnia-Herzegovina. Ichthyological Exploration of Freshwaters, 14: 359–383

Bonacci O., Pipan T., Culver D. 2009. A framework for karst ecohydrology. Environmental Geology, 56: 891-900

Bonacci O. 2006. Crveno i Modro jezero kod Imotskog [Red and Blue Lakes near Imotski]. Hrvatske Vode, 14: 45-54

Borowsky R.B., Mertz L. 2001. Genetic differentiation among populations of the cave fish Schistura oedipus (Cypriniformes: Balitoridae). Environmental Biology of Fishes, 62, 1-3: 225–231

Cabin R.J., Mitchell R.J. 2000. To Bonferroni or Not to Bonferroni: When and How Are the Questions. Ecological Society of America, 81, 3: 246–248

Chakraborty R., Jin L. 2004. A unified approach to study hypervariable polymorphicism: statistical considerations of determining relatedness and population distances. V DNA Fingerprinting: State of the Science. Pena, S.D.J., Chakraborty, R., Epplen, J.T., Jeffreys, A.J. (eds.) Basel, Switzerland, Berkhauser Verlag: 153-175

Chen W.J., Miya M., Saitoh K., Mayden R.L. 2008. Phylogenetic utility of two existing and four novel nuclear gene loci in reconstructing tree of life of rayfinned fishes: the order Cypriniformes (Ostariophysi) as a case study. Gene 423, 2: 125–134

Corander J., Marttinen P., Mäntyniemi S. 2006. Bayesian identification of stock mixtures from molecular marker data. Fishery Bulletin, 104, 4: 550–558

Corander J., Marttinen P., Sirén J., Tang J. 2008. Enhanced Bayesian modelling in BAPS software for learning genetic structures of populations. BMC Bioinformatics, 9: 539

Corander J., Marttinen P. 2006. Bayesian identification of admixture events using multi- locus molecular markers. Molecular Ecology, 15, 10: 2833–2843

Corander J., Waldmann P., Sillanpää M.J. 2003. Bayesian analysis of genetic differentiation between populations. Genetics, 163, 367–374

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 65 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Cornuet J.M., Luikart G. 1996. Description and power analysis of two tests for detecting recent population bottlenecks from allele frequency data. Genetics, 144, 4: 2001– 2014

Culver D.C. 2001. The dark zone. The Science 41, 2: 30-35

Culver, D.C. 1982. Cave life: evolution and ecology. Harvard University Press, Cambridge: 189 str.

Culver D.C., Kane T.C., Fong D.W. 1995. Adaptation and natural selection in caves. Cambridge, Harvard University Press: 223 str. de Belle I., Cai S., Kohwi-Shigematsu T. 1998. The Genomic Sequences Bound to Special AT-rich Sequence-binding Protein 1 (SATB1) In Vivo in Jurkat T Cells Are Tightly Associated with the Nuclear Matrix at the Bases of the Chromatin Loops. The Journal of Cell Biology, 141, 2: 335–348

Deharveng L., Stoch F., Gibert J., Bedos A., Galassi D., Zagmajster M., Brancelj A., Camacho A., Fiers F., Martin P., Giani N., Magniez G., Marmonier P. 2009. Groundwater biodiversity in Europe. Freshwater Biology, 54, 4: 709-726

Dillman C.B., Bergstrom D.E., Noltie D.B., Holtsford T.P., Mayden R.L. 2010. Regressive progression, progressive regression or neither? Phylogeny and evolution of the Percopsiformes (Teleostei, Paracanthopterygii). Zoologica Scripta, 40, 1: 45-60

Dimsoski P., Toth G.P., Bagley M.J. 2000. Microsatellite characterization in central stoneroller Campostoma anomalum (Pisces: Cyprinidae). Molecular Ecology, 9, 12: 2187–2189

Džeba T. 2010. Određivanje otjecanja u slivu rijeke Ričine, Suvaje i Matice (Determination of runoff in the Ričina, Suvaja and Matica river basins). Master’s thesis, University of Split, Faculty of Civil Engineering and Architecture: 237 str.

Edgar R.C., 2004. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research, 32, 5: 1792–1797

Ellegren H. 2004. Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nature Reviews Genetics, 5: 435-445

66 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Evanno G., Regnaut S., Goudet J. 2005. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology, 14, 8: 2611–2620

Excoffier L. 2007. Arlequin ver. 3.11 An integrated software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online, 1: 47–50

Falush D., Stephens M., Pritchard J.K. 2003. Inference of population structure using multilocus genotype data: linked loci and correlated allele frequencies. Genetics, 164, 4: 1567–1587

Falush D., Stephens M., Pritchard J.K. 2007. Inference of population structure using multilocus genotype data: dominant markers and null alleles. Molecular Ecology Notes 7, 4: 574–578

Felsenstein J. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach. Journal of Molecular Evolution, 17: 368-376

Field M.S. 1999. The QTRACER Programm for Tracer-Breakthrough Curve Analysis for Karst and Fractured Aquifers. Washington DC, USEPA: 137 str.

Fitch W.M. 1971. Toward defining the course of evolution: minimum change for a specific tree topology. Sytematic Zoology, 20: 406-416.

Ford D, Williams P. 2007. Karst Hydrogeology and Geomorphology. Chichester, Wiley: 576 str.

Franičević M., Tičina V. 2003. Biometric characteristics of rare endemic fish, Phoxinellus adspersu (Heckel 1843), from Red Lake (Imotski, Croatia). Periodicum Biologorum, 4: 453-460

Frankham R., Ballou J.D., Briscoe D.A. 2004. Conservation Genetics. Cambridge, Cambridge University Press: 220 str.

Freyhof J., Lieckfeldt D., Bogutskaya N.G., Pitra C., Ludwig A. 2006. Phylogenetic position of the Dalmatian genus Phoxinellus and description of the newly proposed genus Delminichthys (Teleostei: Cyprinidae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 38, 2: 416-425

Gams I. 2003. Kras v Sloveniji v prostoru in času, Ljubljana, ZRC SAZU: 293 str.

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 67 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Garašić M. 2001. New speleohydrogeological research of Crveno jezero (Red Lake) near Imotski in Dinaric karst area (Croatia, Europe). Proceedings 13th International Congress of speleology. Brasilia; Brasilia DF (15.7. – 22.7.): 168-171

Goldscheider N., Meiman J., Pronk M., Smart C. 2008. Tracer test in karst hydrogeology and speleology. International Journal of Speleology, 37, 1: 27-40

Goldscheider N. 2005. Fold structure and underground drainage pattern in the alpine karst system Hochifen-Gottesacker. Ecologae Geologicae Helvetiae, 98, 1: 1-17

Goldscheider N. 2010. Delineation of spring protection zones.V Groundwater Hydrology of Springs. Kresic N, Stevanovic Z (eds). Amsterdam, Elsevier: 305-338

Goldstein D., Schlötterer C. 1999. Microsatellites: Evolution and applications. Oxford, UK, Oxford University Press: 368 str.

Goodman S.J. 1997. RST-CALC: a collection of computer programs for calculating estimates of genetic differentiation from microsatellite data and a determining their significance. Molecular Ecology, 6, 9: 881–885.

Goudet J. 2001. FSTAT, a program to estimate and test gene diversities and fixation indices (version 2.9.3). Lausanne, Switzerland, University of Lausanne http://www.unil.ch/izea/softwares/fstat.html (9. jul. 2009)

Guindon S., Gascuel O. 2003. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Systematic Biology, 52, 5: 696–704.

Hall B.G. 2004. Phylogenetic trees made easy. A how-to manual. Second edition. Sunderland, Sinauer Associates, Inc: 221 str.

Hamilton P.B., Tyler C.R. 2007. Identification of microsatellite loci for parentage analysis in roach Rutilus rutilus and eight other cyprinid fish by crossspecies amplification, and a novel test for detecting hybrids between roach and other cyprinids. Molecular Ecology Notes, 8, 2: 462–465

Hardy O.J., Charbonnel N., Freville H., Heuertz M. 2003. Microsatellite allele sizes: a simple test to assess their significance on genetic differentiation. Genetics, 163, 4: 1467–1482

68 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Hardy O.J., Vekemans X. 2002. SPAGeDi: a versatile compute program to analyse spatial genetic structure at the individual or population levels. Molecular Ecology Notes, 2, 4: 618 - 620

Harpending H.C. 1994. Signature of ancient population growth in a low-resolution mitochondrial DNA mismatch distribution. Human Biology, 66, 4: 591–600

Hawes R.S. 1939. The flood factor in the ecology of caves. Journal of Animal Ecology, 1: 1-5

Hey J., Nielsen R. 2004. Multilocus methods for estimating population sizes, migration rates and divergence time, with applications to the divergence of Drosophila pseudoobscura and D. persimilis. Genetics, 167, 2: 747–760

Hey J., Nielsen R. 2007. Integration within the Felsenstein equation for improved Markov chain Monte Carlo methods in population genetics. Proceedings of the National Academy of Sciences, 104, 8: 2785 - 2790

Hubisz M.J., Falush D., Stephens M., Pritchard J.K. 2009. Inferring weak population structure with the assistance of sample group information. Molecular Ecology Resources, 9, 5: 1322 - 1332

Hwang U.W., Kim W. 1999. General properties and phylogenetic utilities of nuclear ribosomal DNA and mitochondrial DNA commonly used in molecular systematics. The Korean Journal of Parasitology, 37, 4: 215–228

Jeyaraju D.V., Xu L., Letellier M.C., Bandaru S., Zunino R, Berg E.A., McBride H.M., Pellegrini L. 2006. Phosphorylation and cleavage of presenilin-associated rhomboid- like protein (PARL) promotes changes in mitochondrial morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, 103, 49: 18562- 18567

Jović V. 2003. Vode zabiokovskog dijela neretvanskog sliva: istraženost i prijedlog daljnjih aktivnosti (Waters of Biokovo hinterland in Neretva watershead: research and future activity). Symposium Voda u kršu Cetine, Neretve i Trebišnice, Neum, Zbornik radova, 25–27, 18–30

Juvan P. Rozman D. 2006. Tehnologija mikromrež in njena uporaba v medicini. Informatica Medica Slovenica, 11, 1: 2-15

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 69 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Kanaet T. 1959. Hidrografske prilike u slivu Tihaljina-Malde-Trebižat (Hydrographic characteristics in watershed of Tihaljina-Malde-Trebižat), Zbornik radova: 5. Kongres geografa FNR Jugoslavije u NR Crnoj Gori (Abstract book of geographic symposium in Yugoslavija, Montenegro), Cetinje, 531

Käs W. 1998. Tracing Techniques in Geohydrology. Rotterdam, Balkema, 526 str.

Ketmaier V., Bianco P.G., Cobolli M., Krivokapic M., Caniglia R., De Matthaeis E. 2004. Molecular phylogeny of two lineages of Leuciscinae cyprinids (Telestes and Scardinius) from the peri-Mediterranean area based on cytochrome b data. Molecular Phylogenetics and Evolution, 32, 3: 1061–1071

Kingman J.F.C. 1982. The coalescent. Stochastic Processes and their Applications, 13, 3: 235–248

Kranjc O. 2004. Dinaric karst. V Encyclopedia of caves and karst science. Gunn J. (ed) New York : Fitzroy Dearborn: 287–289

Kress W.J., Wurdack K.J., Zimmer E.A., Weigt L.A., Janzen D.H. 2005. Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A, 102, 23: 8369–74

Kuhner M.K., Yamato J., Felsenstein J. 2000. Maximum likelihood estimation of recombination rates from population data. Genetics, 156, 3: 1393–1401

Kvist L. 2000. Phylogeny and phylogeography of European pardis. Academic Dissertation Acta Universitatis Ouluensis, Academic Dissertation, Finland, University of Oulu: 341 str.

Langella O. 1999. Populations, 1.2.30, http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/ (23. nov.2009)

Li W.H. 1977. Distribution of nucleotide differences between two randomly chosen cistrons in a finite population. Genetics, 85, 2: 331–337

Lorena D., Darby I.A., Reinhardt D.P., Sapin V., Rosenbaum J., Desmoulie A. 2004. Fibrillin-1 expression in normal and fibrotic rat liver and in cultured hepatic fibroblastic cells: modulation by mechanical stress and role in cell adhesion. Laboratory Investigation, 84: 203–212

70 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Matschiner M., Salzburger W. 2009. Tandem: integrating automated allele binning into genetics and genomics workflows. Bioinformatics, 25: 1982–1983

Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. 1988. A simple salting out procedure from human nucleated cells. Nucleic Acids Research, 16: 3: 1215

Mrakovčić M., Brigić A., Buj I., Ćaleta M., Mustafić P., Zanella D. 2006. Crvena knjiga sladkovodnih riba hrvatske. Republika Hrvatska, Ministrstvo kulture, Državni zavod za zaštitu prirode: 253 str.

Muenzel F.M., Sanetra M., Salzburger W., Meyer A. 2007. Microsatellites from the vairone Leuciscus souffia (Pisces: Cyprinidae) and their application to closely related species. Molecular Ecology Notes, 7, 6: 1048–1050

Nei M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics. New York, Columbia University Press: 302 str.

Nesbo C.L., Fossheim T., Vollestad L.A., Jakobson K.S. 1999. Genetic divergence and phylogeographic relationships among European perch (Perca fluviatis) populations reflect glacial refugia and postglacial colonization. Molecular Ecology, 8, 9: 1387- 1404

Norgat M., Chamings J., Pavlova A., Bull J.K., Murray N.D., Sunnuck P. 2009. Mitochondrial DNA indicates late Pleistocene divergence of populations of Heteronympha merope, an Emerging Model in Environmental Change Biology. PLoS ONE, 4, 11: e7950

Okasha S. 2008 Population Genetics. V The Stanford Encyclopedia of Philosophy, Edward N. Zalta (ed.) http://plato.stanford.edu/archives/fall2008/entries/population-genetics (15. nov. 2011)

Paetkau D., Calvert W., Stirling I. Strobeck C. 1995. Microsatellite analysis of population structure in Canadian polar bears. Molecular Ecology, 4, 3: 347-354

Paetkau D., Slade R., Burdens M., Estoup A. 2004. Genetic assignment methods for the direct, real-time estimation of migration rate; a simulation-based exploration of accuracy and power. Molecular Ecology, 13, 1: 55–65

Palandačić A., Zupančič P., Snoj A. 2010. Revised classification of former genus Phoxinellus using nuclear DNA sequences. Biochemical Systematics and Ecology, 38, 5: 1069–1073

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 71 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Palandačić A., Matschiner M., Zupančič P., Snoj A. 2012a. Fish migrate underground: the example of Delminichthtys adspersus (Cyprinidae). Molecular Ecology,

Palandačić A., Bonacci O., Snoj A. 2012b. Molecular data as a possible tool for tracing groundwater flow in karst environment: example of Delminichthys adspersus in Dinaric karst system. Ecohydrology,

Perdices A., Bohlen J., Doadrio I. 2008. The molecular diversity of adriatic spined loaches (Teleostei, Cobitidae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 46, 1: 382-390

Perea S., Bohme M., Zupančič P., Freyhof J., Šanda R., Ozulug M., Abdoli A., Doadrio I. 2010. Phylogenetic relationships and biogeographical patterns in Circum- Mediterranean subfamily Leuciscinae (Teleostei, Cyprinidae) inferred from both mitochondrial and nuclear data. BMC Evolutionary Biology, 10: 265

Pipan R., Culver D.C. 2007. Epikarst communities: biodiversity hotspots and potential water tracers. Environmental Geology, 53, 2: 265-269

Piry S., Alapetite A., Cornuet J.M., 2004. GENECLASS2: A software for genetic assignment and first-generation migrant detection. Journal of Heredity, 95, 6: 536- 539

Piry S., Luikart G., Cornuet J.M. 1999. BOTTLENECK: a computer program for detecting recent reductions in the effective population size using allele frequency data. Journal of Heredity, 86: 502–503

Polihronakis M., Caterino M.S. 2010. Contrasting patterns of phylogeographic relationships in sympatric sister species of ironclad beetles (Zopheridae: Phloeodes spp.) in California's Transverse Ranges. BMC Evolutionary Biology, 10, 195-206

Posada D. 2008. jModelTest 0.1 Package. Spain, Department of Biochemistry, Genetics and Immunology, University of Vigo

Pritchard J.K., Stephens M., Donnelly P. 2000. Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics, 155, 4: 945–959

Pronk M., Goldscheider N., Zopfi J. 2009. Microbial communities in karst groundwater and their potential use for biomonitoring. Hydrogeology Journal, 17, 1: 37-48

72 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Proudlove G.S. 2006. Subterranean fishes of the world: An account of the subterranean (hypogean) fishes described up to 2003 with a bibliography 1541-2004. Kalifornija, ZDA, International Society for Subterranean Biology, 300 str.

Reynders H., van der Ven K., Moens L.N., van Remortel P., De Coen W.M., Blust R. 2006 Patterns of gene expression in carp liver after exposure to a mixture of waterborne and dietary cadmium using a custom-made micriarray. Aquatic Toxicology, 80, 2: 180-193

Rice W.R. 1989. Analyzing tables of statistical tests. Evolution, 43, 1: 223–225

Robalo J.I., Almada V.C., Levy A., Doadrio I. 2007. Re-examination and phylogeny of the genus Chondrostoma based on mitochondrial and nuclear data and the definition of 5 new genera. Molecular Phylogenetics and Evolution, 42, 2: 362-372

Romero A., Paulson K.M. 2001. It’s a wonderful hypogean life: a guide to the troglomorphic fishes of the world. Environmental Biology of Fishes, 62, 1 - 3: 13–41

Ronquist, F., Huelsenbeck, J.P. 2003. MRBAYES 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics 19, 12: 1572–1574

Saitou N., Nei M. 1987. Thee Neighbour-joining Method: A New Method for Reconstructing Phylogenetic Trees. Molecular Biology and Evolution 4, 4: 406-425

Sasaki T., Gan E.C., Wakeham A., Kornbluth S., Mak T.W., Okada H. 2007. HLA-B- associated transcript 3 (Bat3)/Scythe is essential for p300-mediated acetylation of p53. Genes and Developement, 21, 7: 848-861

Schwarz G. 1978. Estimating the dimension of a model. The Annals of Statistics, 6, 2: 461–464

Seaview, Version 4.2.3 Manolo Gouy Laboratoire de Biometrie et Biologie Evolutive CNRS/Universite Lyon 1996–2009 http://pbil.univ-lyon1.fr/software/seaview.html, (3. mar. 2010)

Sket B., Paragamian K., Trontelj P. 2004. A census of the obligate subterranean fauna of the Balkan Peninsula. V Balkan Biodiversity, Pattern and Process in the European Hotspot. Griffiths H.I., Kryštufek B., Reed J.M. (eds.). Dordrecht, Kluwer: 309–322

Sket B. 2004a. Dinaric Karst, Diversity in, V Encyclopedia of Caves. Culver D.C., White W.B. (eds.). Elsevier Science and Technology: 680 str.

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 73 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Sket B. 2004b. Subterranean habitats. V Encyclopedia of Caves and Karst Science. Gunn J. (ed.). New York. Fitzroy Dearborn: 902 str.

Sket B.; Velkovrh F. 1980. Postojnsko-Planinski jamski sistem kot model za preučevanje onesnaženja podzemeljskih voda, Naše jame, 22: 27-44

Slatkin M. 1994. Linkage disequilibrium in growing and stable populations. Genetics, 137, 1: 331–336

Slatkin M., Excoffier L. 1996. Testing for linkage disequilibrium in genotypic data using the Expectation-Maximization algorithm. Heredity, 76, 4: 377–383

Smart C., Worthington S.R.H. 2004. Water tracing. V Encyclopedia of Caves and Karst Science. Gunn J (ed.). New York. Fitzroy Dearborn: 777-779

Snoj A., Bogut I., Sušnik S. 2008. Evidence of a genetically distinct population of Vrljika softmouth trout Salmo obtusirostris (Heckel) evolved by vicariance. Journal of Fish Biology, 72: 1945–1959

Song Y., Ailenberg M., Silverman M. 1999. Human MunC13 is a diacylglycerol receptor that induces apoptosis and may contribute to renal cell injury in hyperglycemia. Molecular Biology of the Cell, 10, 5: 1609-1619

Strecker U., Faúndez V.H., Wilkens H. 2004. Phylogeography of surface and cave Astyanax (Teleostei) from Central and North America based on cytochrome b sequence data. Molecular Phylogenetics and Evolution 33, 2 :469-8

Swofford D.L. 2003. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods), ed. 4.04a. Sunderland, Massachusetts, Sinauer Associates (software)

Taberlet P., Fumagalli L., Wust-Saucy A.G., Cosson J.F. 1998. Comparative phylogeography and postglacial colonization routs in Europe. Molecular Ecology, 7, 4: 453-464

Tamura K., Nei M. 1993. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution, 10, 3: 512–526

Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. 2011. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood,

74 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731-2739

Trajano E. 2001. Ecology of subterranean fishes: an overview. Environmental Biology of Fishes 62, 1 - 3: 133–160

Tucker M., Valencia-Sanchez M.A., Staples R.R., Chen J., Denis C.L., Parker R. 2001. The transcription factor associated Ccr4 and Caf1 proteins are components of the major cytoplasmic mRNA deadenylase in Saccharomyces cerevisiae. Cell 104, 3: 377–386

Vähä J.P., Erkinaro J., Niemelä E., Primmer C.R. 2007. Life-history and habitat features influence the within-river genetic structure of Atlantic salmon. Molecular Ecology, 16, 13: 2638–2654

van Kuilenburg A.B.P, Meinsma R., Beke E., Assmann B., Ribes A., Lorente I., Busch R., Mayatepek E., Abeling N.G.G.M., van Cruchten A., Stroomer A.E.M., van Lenthe H., Zoetekouw L., Kulik W., Hoffmann G.F., Voit T., Wevers R.A., Rutsch F., van Gennip A.H. 2004 ß-Ureidopropionase deficiency: an inborn error of pyrimidine degradation associated with neurological abnormalities. Human Molecular Genetics, 13, 22: 2793-2801

Van Oosterhout C., Hutchinson W.F., Wills D.P.M., Shipley P. 2004. Micro-checker: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology Notes, 4, 3: 535-538

Vignal A., Milan D., SanCristobal M., Eggen A. 2002. A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics. Genetics, Selection, Evolution, 34, 3: 275–305

Weir B.S., Cockerheim C.C. 1984. Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evololution, 38, 6: 1358-1370

Wetzels R.H.W., Robben H.C.M., Leigh I.M., Schaafsma H.E., Vooijs G.P., Ramaekerst FCS. 1991. Distribution Patterns of Type VII Collagen in Normal and Malignant Human Tissues. American Journal of Pathology, 139, 2: 451-459

Wilgenbusch J.C., Warren D.L., Swofford D.L. 2004. AWTY: a system for graphical exploration of MCMC convergence in Bayesian phylogenetic inference. http://ceb.csit.fsu.edu/awty (se uporablja na internetu)

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 75 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Wright S. 1978. Evolution and the Genetics of Populations, 4. Chicago, Illinois. University of Chicago Press: 590 str.

Wu Y., Singh S., Georgescu M.M., Birge R.B. 2005. A role for Mer tyrosine kinase in alphavbeta5 integrin-mediated phagocytosis of apoptotic cells. Journal of Cell Science, 118, 3: 539-553

Wyatt P.M.W., Pitts C.S., Butlin R.K. 2006. A molecular approach to detect hybridization between bream Abramis brama, roach Rutilus rutilus and rudd Scardinius erythrophthalmus. Journal of Fish Biology, 69, Supplement sa: 52–71

Yamashita A., Chang T.C., Yamashita Y., Zhu W., Zhong Z., Chen C.Y., Shyu A.B. 2005. Concerted action of poly(A) nucleases and decapping enzyme in mammalian mRNA turnover. Natural Structure and Molecular Biology 12, 12: 1054–1063

Yang Z. Rannala B. 1997. Bayesian phylogenetic inference using DNA sequences: a Markov Chain Monte Carlo Method. Molecular Biology and Evolution, 14, 17: 717- 724.

Zardoya R., Doadrio I. 1998. Phylogenetic relationships of Iberian cyprinids: Systematic and biogeographical implications. Proceedings of the Royal Society of London, 265, 1403: 1365–1372

Zupančič P. 2008. Rijetke i ugrožene slatkovodne ribe jadranskog slijeva Hrvatske, Slovenije i Bosne i Hercegovine (Rare and endangered freshwater fishes of Croatia, Slovenia and Bosnia and Hercegovina) Atlas u boji, Dolsko.

Zwickl D.J., 2006. GARLI: Genetic algorithm approaches for the phylogenetic analysis of large biological sequence datasets under the maximum likelihood criterion. PhD dissertation, The University of Texas at Austin. www.bio.utexas.edu/faculty/antisense/garli/Garli.html, version 1.0 and GARLI- PART Version 0.97. (https://www.nescent.org/wg_garli/Partition_testing_version) (10. jul. 2010)

76 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 77 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

ZAHVALA

Mentorju dr. Alešu Snoju se zahvaljujem za strokovno vodstvo in podporo.

Zahvaljujem se dr. Simoni Sušnik, ki me je uvedla v laboratorijsko delo in me naučila osnov računalniških analiz.

Prof. Petru Trontlju se zahvaljujem za pomoč v prvem letu doktorskega študija in koristnih nasvetov pri pisanju doktorata. Tudi dr. Eleni Varljen Bužan se zahvaljujem za tehtne pripombe.

Zahvaljujem se Dušanu Jesenšku, Ante Mikuliću, prof. Ivanu Bogutu, prof. Ognjenu Bonaciju, Arnetu Hodaliču in še posebno Gašperju Pustovrhu za pomoč na terenu.

Prof. Walterju Salzburgerju in dr. Michaelu Matschinerju se zahvaljujem za pomoč in svetovanje pri uporabi računalniških programov.

Za pomoč v laboratoriju in pri pisanju gradiva se zahvaljujem dr. Ireni Oven, Daliborki Dušanić ter dr. Ivanki Cizelj.

Zahvaljujem se tudi vsem ostalim sodelavcem, ki so bistveno pripomogli k mojemu delu.

Staršem in prijateljem se zahvaljujem za podporo in potrpežljivst.

78 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

PRILOGE

Priloga A: Seznam haplotipov citokroma b (mtDNA) po vzorčnih mestih Appendix A: Haplotype distribution per sampling site (cytochrome b, mtDNA) VZORČNA MESTA HAPLOTIPI PROLOŠKO BLATO H1 – 13 % H2 – 35 % H6; H50; H59 – 9 % H3; H10; H14; H45; H71 – 4% NEZDRAVICA H1 – 81 % H49 – 14 % H19 – 5 % DRAGA H1 – 73 % H41 – 13 % H43; H72 – 6 % BANJA VRGORAC H1 – 60 % H2; H20; H24; H40; H42; H48; H64; H74 – 5 % PROLOŽAC JEZERINE H2; H3 – 37 % H1; H7; H9; H61; H62 – 5 % STARI VODOVOD H2; H3 – 31 % H62 – 14 % H16; H23; H31; H70 – 6 % GRBAVAC H2 – 45 % H3 – 34 % H62 – 11 % H8; H35 – 5 % RDEČE JEZERO H1 – 68 % H2 – 7 % H53 – 4 % H12; H21; H22; H25; H26; H29; H32 – 3 % GRUDSKO VRIJELO H1 – 60 % H2 – 12 % H3; H34; H46; H66 – 7 % JAMINE H1 – 30 % H2; H4; H5; H11; H33; H50; H27; H28; H36; H37 – 7 % VINJANI DONJI – BUNAR H1 – 58 % H2 – 20 % H54; H58 – 11 % VINJANI DONJI H1 – 48 % H2 – 22 % H13; H15; H55; H63; H69; H67 – 5 % UDOVICE H1 – 62 % H2 – 18 % H12; H56; H57; H65 – 5 % GLAVINA DONJA H1 – 45 % H2; H3 – 10 % H39, H47 – 10 % H33; H44; H51 – 5 % MEDVIDOVIČEVA H1 – 35 % DRAGA H2 – 29 %

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 79 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

H3; H33; H52; H55; H60; H65 – 6 % GRANČICE H1 – 52 % H2 – 24 % H30 – 9 % H17; H45; H73 – 5 % REBIĆ H1 – 67 % H2 – 24 % H18; H38 – 5 %

80 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Priloga B: Parne genetske primerjave med vzorčnimi mesti na osnovi mitohondrijske DNA. Φ-statistika je bila izračunana s programom Arlequin 3.11 s 16, 000 permutacijami originalnega seta podatkov. P-vrednosti so bile modificirane z Bonferroni korekcijo. Pod diagonalo so parne vrednosti ΦST indeksov, nad diagonalo pa statistična signifikantnost za p = 0.001. Appendix B: Pairwise genetic distances between sampling sites on the basis of mitochondrial DNA. Φ-statistics, performed with Arlequin 3.11, was tested by 16,000 permutations of the original data set and with p-values adjusted by Bonferroni correction. Below the diagonal: ΦST-values, above the diagonal: significance for p = 0.001. GRV BVID GLD REB VID MED JAM GRAN UDV PJEZ STR GRB CRV PRBL NEZ BVRG DRA GRV 0.000 ------BVID 0.005 0.000 ------GLD 0.005 0.018 0.000 ------REB -0.021 0.015 0.039 0.000 ------VID -0.021 -0.001 0.018 -0.021 0.000 ------MED -0.023 0.028 0.039 -0.018 -0.023 0.000 ------+ - - JAM -0.003 0.011 0.009 0.023 0.008 0.019 0.000 ------GRAN -0.016 0.006 0.038 -0.021 -0.024 -0.012 0.022 0.000 ------UDV -0.019 0.002 0.021 -0.024 -0.018 -0.013 0.010 -0.014 0.000 ------PJEZ 0.087 0.172 0.133 0.155 0.120 0.081 0.138 0.131 0.148 0.000 - - + - + + - STR 0.047 0.142 0.117 0.098 0.077 0.030 0.106 0.085 0.095 -0.015 0.000 - + - + + - GRB 0.079 0.184 0.146 0.143 0.114 0.061 0.141 0.129 0.137 -0.027 -0.043 0.000 + - + + + CRV 0.020 0.003 0.015 0.025 0.013 0.053 0.020 0.025 0.006 0.216 0.187 0.225 0.000 + - - - PRBL 0.029 0.090 0.097 0.046 0.033 0.015 0.072 0.037 0.058 0.087 0.034 0.060 0.136 0.000 + - - NEZ 0.101 0.074 0.047 0.150 0.088 0.143 0.047 0.127 0.093 0.280 0.271 0.316 0.031 0.195 0.000 - - BVRG 0.027 0.007 0.013 0.049 0.029 0.058 0.010 0.047 0.027 0.184 0.160 0.196 0.011 0.125 0.025 0.000 - DRA 0.071 0.059 0.036 0.119 0.067 0.108 0.029 0.101 0.074 0.228 0.213 0.256 0.036 0.159 0.067 -0.007 0.000

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) 81 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Priloga C: Parne genetske primerjave med vzorčnimi mesti na osnovi osmih mikrosatelitnih lokusov. F-statistika je bila izračunana s programom Arlequin 3.11 s 1000 permutacijami originalnega seta podatkov in 5% manjkajočih podatkov. P-vrednosti so bile modificirane z Bonferroni korekcijo. Pod diagonalo so parne vrednosti FST indeksov, nad diagonalo pa statistična signifikantnost (NS, ne signifikantno; *, signifikantno za p-vrednost 0.05; **, signifikantno za p-vrednost 0.01; ***, signifikantno za p-vrednost 0.001). Appendix C: Pairwise genetic distances between sampling sites on the basis of eight microsatellite loci. F-statistics, performed with Arlequin 3.11, was tested by 16,000 permutations of the original data set and with p-values adjusted by Bonferroni correction. Below the diagonal: FST- values, above the diagonal: significance (NS, not significant; *, significant with p-value 0.05; **, significant with p-value 0.01; ***, significant with p-value 0.001). BVID BVRG CRV DRA GLD GRAN GRB GRV JAM MAT MED NEZ PJEZ PRBL REB STR UDV VID BVID 0.000 *** *** *** NS NS *** NS NS NS NS *** *** *** NS *** NS NS BVRG 0.043 0.000 *** NS *** *** *** ** *** NS ** *** *** *** *** *** *** *** CRV 0.041 0.081 0.000 *** *** *** *** ** *** * *** *** *** *** *** *** *** *** DRA 0.037 -0.005 0.070 0.000 *** NS *** NS NS NS NS *** *** *** NS *** NS * GLD 0.009 0.028 0.045 0.029 0.000 NS ** NS NS NS NS *** *** *** NS * NS NS GRAN 0.002 0.031 0.040 0.022 0.006 0.000 *** NS NS NS NS *** *** *** NS *** NS NS GRB 0.049 0.057 0.085 0.063 0.024 0.049 0.000 *** *** *** *** *** NS *** *** NS *** *** GRV -0.009 0.027 0.025 0.022 -0.002 -0.007 0.051 0.000 NS NS NS *** *** *** NS *** NS NS JAM 0.002 0.033 0.039 0.021 0.001 -0.005 0.043 -0.005 0.000 NS NS *** *** *** NS *** NS NS MAT -0.009 -0.058 0.048 -0.047 -0.007 -0.012 0.054 0.007 -0.010 0.000 NS NS *** * NS *** NS NS MED 0.003 0.026 0.045 0.021 -0.002 -0.006 0.038 -0.004 -0.003 -0.006 0.000 *** *** * NS * NS NS NEZ 0.109 0.072 0.148 0.071 0.116 0.115 0.165 0.106 0.114 0.026 0.119 0.000 *** *** *** *** *** *** PJEZ 0.063 0.082 0.111 0.088 0.040 0.062 0.002 0.060 0.052 0.066 0.049 0.183 0.000 *** *** NS *** *** PRBL 0.038 0.068 0.074 0.062 0.028 0.035 0.024 0.037 0.027 0.040 0.028 0.176 0.029 0.000 ** NS ** *** REB 0.002 0.031 0.038 0.020 -0.001 0.003 0.033 -0.004 -0.004 -0.017 -0.009 0.112 0.047 0.026 0.000 ** NS NS STR 0.056 0.074 0.091 0.072 0.031 0.051 -0.002 0.055 0.043 0.067 0.037 0.184 -0.006 0.019 0.035 0.000 *** *** UDV -0.002 0.030 0.042 0.022 0.010 0.003 0.048 -0.006 -0.004 -0.008 -0.002 0.100 0.060 0.032 -0.001 0.049 0.000 NS VID -0.005 0.029 0.033 0.023 0.004 -0.001 0.045 -0.005 -0.005 -0.001 -0.003 0.102 0.055 0.035 -0.004 0.044 -0.005 0.000

82 Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

Priloga D: Parne genetske primerjave med vzorčnimi mesti na osnovi osmih mikrosatelitnih lokusov. R-statistika je bila izračunana s programom RST-CALC s 1000 ponovitvami. P-vrednosti so bile modificirane z Bonferroni korekcijo. Pod diagonalo pa statistična signifikantnost (NS, ne signifikantno; *, signifikantno za p-vrednost 0.05; **, signifikantno za p-vrednost 0.01; ***, signifikantno za p-vrednost 0.001). Appendix D: Pairwise genetic distances between sampling sites on the basis of eight microsatellite loci. R-statistics, performed with RST-CALC, was tested by 1000 iterations and with p-values adjusted by Bonferroni correction. Below the diagonal: RST-values, above the diagonal: significance (NS, not significant; *, significant with p-value 0.05; **, significant with p-value 0.01; ***, significant with p-value 0.001). BVID BVRG CRV DRA GLD GRAN GRB GRV JAM MAT MED NEZ PJEZ PRBL REB STR UDV VID BVID *** ** *** NS NS ** NS ** *** NS *** ** ** NS ** NS NS BVRG 0.236 *** NS *** *** *** *** *** NS *** *** *** *** *** *** *** *** CRV 0.054 0.402 *** *** ** *** *** *** *** *** *** *** *** ** *** *** *** DRA 0.167 0.018 0.321 *** *** *** *** *** NS *** *** *** *** *** *** *** *** GLD -0.001 0.179 0.069 0.108 NS ** NS * *** NS *** ** ** NS ** NS NS GRAN -0.018 0.237 0.051 0.164 -0.005 *** NS * *** NS *** *** * NS ** NS NS GRB 0.055 0.239 0.112 0.151 0.029 0.047 ** *** *** * *** NS *** * NS ** *** GRV -0.001 0.233 0.082 0.166 0.002 -0.008 0.040 NS *** NS *** ** ** NS * NS NS JAM 0.040 0.215 0.104 0.162 0.018 0.032 0.087 0.020 *** NS *** *** *** NS *** * ** MAT 0.177 -0.011 0.358 0.052 0.142 0.188 0.226 0.189 0.172 ** NS *** *** *** *** *** *** MED -0.012 0.210 0.071 0.130 -0.013 -0.018 0.023 -0.021 0.017 0.173 *** NS * NS NS NS NS NEZ 0.277 0.129 0.474 0.213 0.249 0.288 0.352 0.282 0.254 0.024 0.279 *** *** *** *** *** *** PJEZ 0.047 0.247 0.107 0.162 0.028 0.043 -0.008 0.033 0.074 0.226 0.019 0.343 *** * NS *** *** PRBL 0.055 0.328 0.054 0.249 0.058 0.036 0.050 0.048 0.098 0.307 0.040 0.401 0.061 NS NS * ** REB 0.002 0.228 0.041 0.152 -0.006 -0.010 0.036 -0.007 0.011 0.200 -0.016 0.290 0.034 0.023 NS NS NS STR 0.054 0.300 0.087 0.222 0.041 0.044 -0.007 0.032 0.085 0.274 0.027 0.392 -0.003 0.026 0.033 * ** UDV -0.008 0.216 0.053 0.154 -0.002 -0.014 0.046 -0.003 0.036 0.170 -0.009 0.271 0.049 0.033 -0.006 0.042 NS VID -0.005 0.255 0.045 0.197 0.011 -0.009 0.064 -0.001 0.032 0.199 0.001 0.275 0.058 0.041 0.000 0.049 -0.005

Priloga E: Rezultati anlize z modelom izolacija-z-migracijo, izračunani s programom IMa2. Čas od ločitve populacij (t0), efektivne velikosti predniške in obeh populacij, ki so iz nje nastale (qA, q1, q2), migracijske stopnje (m0>1 and m1>0) in populacijske migracijske stopnje (2N0m0>1 and 2N1m1>0) in s 95 % intervali posteriorne gostote. Okrajšave: RCENT = izviri v Imotskem (7 vzorčnih mest); JAGR = izviri v Grudah (2vzorčni mesti); CENT, izviri v Imotskem + izviri v Grudah; NEZ = Nezdravica; BVDR = Banja Vrgorac + Draga; GPJS = Grbavac + Proložac Jezerine + Stari vodovod; CRV= Crveno jezero; PRBL = Prološko Blato; GLD = Glavina Donja. Appendix E: IM model estimates: time since divergence (t0), effective population sizes of ancestral and descendent populations (qA, q1, q2), migration rates (m0>1 and m1>0) and population migration rates (2N0m0>1 and 2N1m1>0) with the lower and upper boundaries of the 95 % Highest Posterior Density (HPD) interval. Abbreviations: RCENT = Imotski springs (7 locations); JAGR = Grude (2 locations); CENT = Imotski springs + Grude; NEZ = Nezdravica; BVDR = Banja Vrgorac + Draga; GPJS = Grbavac + Proložac Jezerine + Stari vodovod; CRV = Crveno jezero; PRBL = Prološko Blato; GLD = Glavina Donja. Group t0 qA q1 q2 m0>1 m1>0 2N0m0>1 2N1m1>0 pair HiSmth HiPt HiPt HiPt HiPt HiPt HiPt HiPt (95%Lo– (95%Lo– (95%Lo– (95%Lo– (95%Lo– (95%Lo– (95%Lo– (95%Lo– 95%Hi) 95%Hi) 95%Hi) 95%Hi) 95%Hi) 95%Hi) 95%Hi) 95%Hi) CENT– 0.223 73.75 0.75 20.25 0.62 (0.1– 0.02 18.81 0.007 NEZ (0.105– (39.75– (0.25– (12.75– 1.74) (0.02–3.9) (2.179– (0.0111– 1.751) 485.8) 1.25) 34.75) 38.96) 0.8393) CENT– 1.599 16.75 10.25 36.25 0.18 0.1 (0.02– 3.098 0.7556 BVDR (0.625– (10.75– (6.25– (21.25– (0.02– 0.82) (0.2599– (0.06985– 1.967) 36.25) 18.75) 83.75) 1.22) 9.975) 3.651) CENT– 0.285 27.75 2.75 19.75 1.06 0.14 15.39 0.6138 CRV (0.149– (16.75– (1.75– (12.25– (0.14– (0.02–3.5) (3.178– (0.07485– 1.891) 458.2) 5.75) 50.75) 3.06) 38.24) 3.678) CENT– 0.175 30.75 4.75 21.25 2.3 (0.18– 0.02 20.97 0.01999 PRBL (0.069– (19.25– (2.75– (12.75– 5.98) (0.02– (2.139– (0.09995– 1.905) 480.2) 10.75) 53.75) 4.38) 38.96) 8.376) CENT– 0.239 97.75 2.75 21.75 2.34 1.22 39.96 1.934 GPJS (0.149– (40.25– (1.75– (13.25– (0.82– (0.14– (7.536– (0.269– 1.911) 487.2) 4.75) 55.75) 4.62) 3.98) 39.52) 4.035) CRV– 0.315 3.25 3.75 27.25 0.02 0.02 0.00397 0.00407 GPJS (0.173– (1.75– (2.25– (15.75– (0.02–1.7) (0.02– (0.02779– (0.03663– 1.515) 6.25) 6.75) 66.25) 1.58) 2.322) 2.56) PRBL– 0.123 5.75 3.25 20.75 4.06 0.3 (0.1– 12.01 2.099 GPJS (0.027– (3.25– (1.25– (12.25– (0.38– 6.54) (1.779– (0.1399– 1.483) 419.2) 6.25) 60.25) 11.46) 36.56) 7.816) BVDR– 0.689 236.2 0.75 30.25 1.98 1.62 39.96 0.6746 NEZ (0.259– (54.75– (0.75– (18.75– (1.34– (0.46–4.7) (11.09– (0.245– 1.899) 488.8) 1.25) 76.75) 3.86) 39.64) 1.267) GLD– 0.345 11.75 4.25 30.25 0.82 0.02 5.657 0.09671 CRV (0.155– (6.75– (2.25– (19.25– (0.06– (0.02– (0.4997– (0.03563– 1.823) 32.25) 7.25) 67.25) 2.38) 1.94) 16.89) 2.733) RCENT– 0.001 499.8 7.75 26.75 0.02 (0.1– 0.3 (0.06– 0.01999 1.299 JAGR (0.001– (36.25– (3.25– (18.25– 13.14) 6.54) (0.6597– (0.3398– 1.565) 488.2) 454.2) 56.25) 38.6) 30.88)