Dissertação-Mestrado YURI-PPG

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA COORDENAÇÃO DE TECNOLOGIA E INOVAÇÃO LABORATÓRIO DE BIOPROSPECÇÃO E BIOTECNOLOGIA

ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOATIVIDADE DE Eleutherine bulbosa (MILLER) URB.

Yuri de Souza Andrade Pastor Almeida

Manaus – AM

Julho, 2016

Yuri de Souza Andrade Pastor Almeida

ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOATIVIDADE DE Eleutherine bulbosa (MILLER) URB.

Orientador(a): Dra. Cecilia Veronica Nunez

Dissertação apresentada à Coordenação do Programa Integrado de Pós-Graduação em Botânica do INPA, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Botânica.

Manaus - AM

Julho, 2016

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À minha amada família, meus pais Eneida e Lauro, e meu irmão Igor, por serem os eternos pilares da minha vida, e aos verdadeiros e preciosos amigos que fiz nesta longa caminhada chamada vida, dedico esta dissertação.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente à DEUS, pelas inúmeras coisas boas que possuo em minha vida e por sempre contar com sua força na hora dos mais diversos desafios.

Agradeço à minha família, em especial aos meus pais e meu irmão. À minha mãe Eneida, eterna companheira e apoiadora, por nunca me deixar faltar nada e sempre me incentivar a crescer na vida, a ela devo uma gratidão eterna. Ao meu pai Lauro, que mesmo longe atualmente, me apoiou e me deu amor, e me ensinou que, na vida, pensamento positivo é tudo, e que no fim tudo dá certo. Ao meu irmão Igor, que sempre me estendeu a mão sem questionar, que sempre esteve lá quando eu mais precisei, um segundo pai, uma pessoa que sei que posso contar pelo resto de minha vida.

Aos meus amigos, pelos momentos felizes, aventuras e companheirismo, que me ajudavam a desligar dos problemas, nas horas boas e ruins, em especial à Alan Soares, Alan Almeida, Bruno da Mata Tio, Daniel Martini, Dennis Rafael, Maximiliano Moraes, Marcos Deilson, Rafael Ribeiro e Thales Filizola.

Aos meus amigos da faculdade e da Botânica, pela amizade, pelos inúmeros momentos hilários e aventuras que passamos, e pelo grande conhecimento científico que adquiri com os mesmos ao longo deste mestrado, em especial à Alysson, Diana, Gabriel, Jhenny, Lincoln, Marcos Melo, Rodrigo e Wellison.

Aos eternos companheiros e amigos de Laboratório, obrigado pela imensa e indispensável ajuda que me deram, tudo foi possível graças a vocês, nos momentos felizes e difíceis dessa jornada, vocês estavam lá. Agradeço à minha querida e amada Fabiele Cruz, sempre prestativa e pronta a ajudar, companheira de fracionamentos nas madrugadas de finais de semana, pelo amor, amizade, conhecimento e pela ajuda nos ensaios biológicos e diversos experimentos. Aos valiosíssimos amigos, pelos inúmeros momentos descontraídos no Laboratório, pelos vários momentos felizes fora do ambiente de trabalho, por serem incrivelmente prestativos e sempre terem tempo para me ajudar, pelas dicas, pelo imenso conhecimento que adquiri com eles e pelo apoio emocional e profissional: Alan, David, Fabiana, Jaci, Juliana, Kissinara (ensaio antioxidante cheio de emoções), Leomara, Luana, Sabrina e Vanessa.

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À Dra. Marne Carvalho de Vasconcellos, da UFAM, pela colaboração e realização do ensaio antitumoral.

À minha orientadora Dra. Cecilia Veronica Nunez, por me receber em seu laboratório e me conceder a oportunidade de realizar este trabalho, pelos ensinamentos e confiança.

Aos professores do PPG de Botânica do INPA, pelos ricos ensinamentos e incentivos à continuar sempre pesquisando as maravilhas da natureza.

Ao grupo CALTQPN, pelas análises de Ressonância Magnética Nuclear e Espectrometria de massas.

Ao CNPq pela concessão da bolsa e apoio financeiro para o projeto. Ao INPA pela infraestrutura e amparo, e por possibilitar a realização deste sonho.

À todos os colegas de Laboratório que contribuíram direta e indiretamente para este trabalho, meu imenso obrigado!

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“A sorte favorece os audazes”

VIRGÍLIO – A Eneida (10, 284)

RESUMO

A espécie Eleutherine bulbosa Miller (Urb.) apresenta uma vasta riqueza de substâncias isoladas, contudo, existem poucos trabalhos de indivíduos do bioma amazônico, podendo apresentar substâncias novas ou potenciais biológicos diferenciados. Portanto, o objetivo do presente estudo foi realizar a análise fitoquímica de E. bulbosa coletada na região de Altamira-PA, no bioma amazônico, e avaliar o potencial biológico de seus extratos. As folhas, flores e bulbos foram secos e posteriormente moídos. O material vegetal foi então submetido a extração com hexano ou diclorometano (DCM), metanol (MeOH) e H 2O, e seus extratos analisados por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC). O extrato hexânico apresentou precipitação de cristais após a concentração, sendo estes separados por lavagem com solvente e analisado por CCDC. O extrato selecionado para ser fracionado foi o metanólico do bulbo, revelando indícios da presença de classes de substâncias fenólicas, diferentes classes de terpenos, além de derivados antraquinônicos, sendo o mesmo posteriormente submetido à partição líquido-líquido e sua fase DCM fracionada. Foi possível isolar oito substâncias: sete do fracionamento da fase DCM, e uma do extrato hexânico. Por meio da análise de RMN, ao todo foi possível caracterizar 5 substâncias, eleuterina, eleuterol, eleuterinol-8-O-β-glicosídeo, isoeleuterina e eleuterinol. Os extratos e eleuterina apresentaram uma alta toxidade no teste com Artemia salina , onde o metanólico do bulbo e eleuterina apresentaram a maior toxidade, nas concentrações de 1000 µg/mL e 500 µg/mL. Para o ensaio antitumoral, nenhum dos extratos e nem eleuterina apresentaram uma citotoxidade significativa frente às linhagens tumorais MCF-7, MRC-5, HCT116 e Sk-Mel-28, com exceção do extrato hexânico do bulbo que causou morte celular de 50-60% contra as linhagens MCF-7, MRC-5 e Sk-Mel-28. No ensaio antimicrobiano, o extrato metanólico e a fase DCM apresentaram uma concentração inibitória mínima (CIM) de 1000 µg/mL e 500 µg/mL, respectivamente, e as substâncias Fr 61+62 (FD), eleuterol e isoeleuterina apresentaram CIM de 500 µg/mL frente à Staphylococcus aureus e Pseudomonas fluorescens. No geral, todos os extratos analisados não apresentaram atividade antioxidante significativa frente ao radical DPPH, nem ao Fe 3+ /fenantrolina. Eleuterina, eleuterinol e isoeleuterina se mostraram importantes marcadores químicos desta espécie, por sua predominância na planta, e esta é a segunda vez que é relatado a presença do eleuterinol glicosilado nesta espécie. Estudos mais profundos com as substâncias isoladas, bem como a caracterização das principais responsáveis pelo potencial antimicrobiano, são necessários. Ainda, os resultados obtidos podem ser utilizados em futuros estudos comparativos da espécie e gêneros da tribo, aliados à dados morfológicos e filogenia, para a solução de problemas taxonômicos.

Palavras – chave: Eleutherine bulbosa , ensaio antimicrobiano, ensaio antitumoral, Artemia salina , quinonas.

ABSTRACT

Eleutherine bulbosa Miller (Urb.) species presents a vast wealth of isolated substances, however, there are few studies of individuals from the Amazon biome, that may present new substances or different biological potentials. Therefore, the aim of this study was to perform the phytochemical analysis of E. bulbosa collected in Altamira- PA, region from the Amazon biome, and evaluation of the biological potential of its extracts. The leaves, flowers and bulbs were dried and then grounded. Subsequently, the plant material was subjected to extraction with hexane or dichloromethane (DCM), methanol (MeOH) and H 2O, and their extracts analyzed by thin layer chromatography (TLC). The hexane extract showed precipitation of crystals after concentration, which were separated by washing with solvent and analyzed by TLC. The extract selected for fractionation was the bulb's methanolic extract, which revealed evidence of the presence of phenolic substance classes, different classes of terpenes, and anthraquinone derivatives, the same being further subjected to liquid-liquid partition and it's DCM phase fractionated. It was possible to isolate eight substances: seven from the DCM phase fractionation, and one from the hexane extract. By NMR analysis, it was possible to characterize 5 substances: eleutherin, eleutherol, eleutherinol-8-O-β-glucoside, isoeleutherin and eleutherinol. The extracts and eleutherin showed high toxicity in Artemia salina assay, where the bulb's methanolic extract and eleutherin showed the highest toxicity at 1000 µg/mL and 500 µg/mL concentrations. For antitumor assay, none of the extracts or eleuterine showed significant cytotoxicity against MCF-7, MRC- 5, HCT116 and Sk-Mel-28 tumor cell lines, except the bulb’s hexanic extract, which caused 50-60% cell death against MCF-7, MRC-5 and Sk-Mel-28 cell lines. In the antimicrobial assay, the methanolic extract and the DCM phase showed a minimum inhibitory concentration (MIC) of 1000 µg/mL and 500 µg/mL, respectively, and also the substances Fr 61+62 (FD), eleutherol and isoeleutherin showed a MIC of 500 µg/mL against Staphylococcus aureus and Pseudomonas fluorescens. Overall, all extracts analyzed showed no significant antioxidant activity against the DPPH radical, or the Fe 3+ /phenanthroline. Eleutherin, eleutherol and isoeleutherin showed to be very important chemical markers of this species since its predominance in the plant, and this is the second time it is reported the presence of glycosylated eleutherinol in this species. Further studies with the isolated substances, as well the characterization of the main ones responsible for the antimicrobial potential, are necessary. Thus, the results obtained can be used in future comparative studies of the species and genera of the tribe, combined with morphological and phylogeny data, to solve taxonomical problems.

Key-word: Eleutherine bulbosa, antimicrobial essay, antitumor essay, Artemia salina, quinones.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ...... xiv LISTA DE TABELAS E QUADROS ...... xviii LISTA DE ABREVIATURAS ...... xx 1. INTRODUÇÃO ...... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ...... 3 2.1 METABOLISMO SECUNDÁRIO E PRODUTOS NATURAIS ...... 3 2.2 ENSAIOS BIOLÓGICOS ...... 11 2.2.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ...... 11 2.2.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA...... 12 2.2.3 ATIVIDADE TÓXICA E CITOTÓXICA ...... 13 2.2.3.1 Artemia salina ...... 13 2.2.3.2 CULTIVO CELULAR E ATIVIDADE ANTITUMORAL ...... 14 2.3 FAMÍLIA IRIDACEAE JUSSEU ...... 15 2.4 Eleutherine Herbert ...... 18 2.5 Eleutherine bulbosa (Miller) Urb...... 19 3. OBJETIVOS ...... 25 3.1. OBJETIVO GERAL ...... 25 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 25 4. MATERIAIS E MÉTODOS ...... 26 4.1 PREPARO E SELEÇÃO DOS EXTRATOS ...... 26 4.2 ANÁLISES, FRACIONAMENTOS CROMATOGRÁFICOS E ISOLAMENTO ...... 27 4.2.1 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DOS EXTRATOS ...... 27 4.2.2 PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO ...... 29 4.2.3 FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS E ISOLAMENTO ...... 30 4.3 ENSAIOS BIOLÓGICOS ...... 34 4.3.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ...... 34 4.3.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA...... 35 4.3.3 TESTE DE TOXIDADE UTILIZANDO Artemia salina ...... 36 4.3.4 ENSAIO ANTITUMORAL ...... 36 4.3.4.1 Linhagens Celulares ...... 36 4.3.4.2 Teste do Alamar blue ...... 37 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 38 5.1 Coleta e obtenção dos extratos ...... 38 5.2 Análises Cromatográficas, Isolamento e Elucidação Estrutural ...... 38

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5.2.1 Análise por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa e RMN ...... 38 5.2.1.1 Cristais do extrato bruto hexânico ...... 38 5.2.1.2 Análise em CCDC e elucidação estrutural do CR-Bulbo ...... 390 5.2.1.3 Fracionamento do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa ...... 49 5.2.1.4 Análise e Fracionamento das Fases da partição líquido-líquido ...... 51 5.2.1.5 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 51-53 (FD) ...... 54 5.2.1.6 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 01+02 (06-12) ...... 63 5.2.1.7 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 29+30 (06-12)...... 72 5.2.1.8 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 34+35 (14-20)...... 81 5.3 ENSAIOS BIOLÓGICOS ...... 90 5.3.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ...... 90 5.3.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA...... 93 5.3.3 TESTE DE TOXIDADE FRENTE À Artemia salina ...... 99 5.3.4 ENSAIO ANTITUMORAL ...... 100 6. CONCLUSÃO ...... 103 7. REFERÊNCIAS ...... 104

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Fatores que influenciam no teor e na produção de metabólitos secundários. Fonte: SANTOS (2007)...... p.3

Figura 2: Ciclo biossintético dos metabólitos secundários. Fonte: Adaptado de Santos (2007) e Dewick (2002)...... p.4

Figura 3 – Estrutura química de cumarina. Fonte: Adaptado de Soares (2002)...... p.6 Figura 4 - Estrutura química da flavona Fonte: Adaptado de Campos (2005)...... p.7

Figura 5 - Estrutura básica dos principais substâncias quinônicas. A – Benzoquinona; B – Naftoquinona; C - Antraquinona Fonte: Adaptado de Silva, Ferreira & Souza (2003)...... p.8

Figura 6 – Estrutura química do lapachol e das naftoquinonas derivadas: α-Lapachona e β-Lapachona. Fonte: Adaptado de Ferreira e colaboradores (2013)...... p.9

Figura 7 – Estrutura química dos tetraterpenos β-caroteno e licopeno. Fonte: Adaptado de Saxena et al. (2013)...... p.10

Figura 8: Mapa de distribuição global de Iridaceae Fonte: STEVENS (2008)...... p.15

Figura 9: Morfologia de Eleutherine bulbosa Fonte: GOLDBLATT & SNOW (1991)...... p.20

Figura 10: Flores, bulbo e espécie cultivada numa horta doméstica no interior de São Paulo Fonte: LORENZI & MATOS (2008)...... p.20

Figura 11: Eleuterina Fonte: Adaptado de Shibuya et al. (1997)...... p.22

Figura 12: Isoeleuterina Fonte: Adaptado de Shibuya et al. (1997)...... p.22

Figura 13: Isoeleuterol Fonte: Adaptado de Insanu et al. (2014)...... p.22

Figura 14: Eleuterinona Fonte: Adaptado de Alves, Kloos & Zani (2003)...... p.22

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Figura 15: Hongconin Fonte: Adaptado de Zhengxiong et al. (1986)…..……………………………...... p.22

Figura 16: Fluxograma da preparação dos extratos de Eleutherine bulbosa ...... p.26

Figura 17: Fluxograma da partição do extrato metanólico de Eleutherine bulbosa ...... p.29

Figura 18 : Fluxograma geral de fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa ...... p.33

Figura 19 – (a) Eleutherine bulbosa coletada no município de Altamira, PA. (b) Exsicata fértil depositada no herbário do INPA, Manaus, AM...... p.38

Figura 20 – Estruturas cristalinas originárias do extrato hexânico do bulbo de Eleutherine bulbosa ...... p.39

Figura 21 - Análise em CCDC do cristal originário do extrato hexânico do bulbo. Eluição em Hex/Acetona (7:3). Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – cloreto férrico; 5 – DPPH; 6 – Dragendorff; 7 – KOH 10 %; 8 – vapor de iodo...... p.40

Figura 22 – Estrutura da eleuterina e suas correlações no COSY e HMBC...... p.43

1 Figura 23 – Espectro de RMN de H da eleuterina em CDCl3 (300 MHz)...... p.44

13 Figura 24 – Espectro de RMN de C da eleuterina em CDCl3 (300 MHz)...... p.45

Figura 25 – Mapa de contorno HSQC da eleuterina em CDCl3 (300 MHz)...... p.46

Figura 26 – Mapa de contorno COSY da eleuterina em CDCl3 (300 MHz)...... p.47

Figura 27 – Mapa de contorno HMBC da eleuterina em CDCl3 (300 MHz)...... p.48

Figura 28 - Análise em CCDC do extrato metanólico do bulbo. Eluição em DCM/MeOH (9:1). Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – vapor de iodo; 4 – cloreto férrico; 5 – sulfato cérico; 6 – anisaldeído sulfúrico...... p.49

Figura 29 – Fluxograma parcial do fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa . Fases da partição líquido-líquido...... p.50

Figura 30 – Fluxograma do fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa . Fracionamento da FDE, da FD e o posterior fracionamento das frações da FD...... p.53

Figura 31 - Análise em CCDC das Frações Fr 51-53 da Fase DCM do extrato metanólico do bulbo. Eluição em DCM/MeOH 8:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV- 365; 3 – vapor de iodo; 4 – KOH 10 %; 5 – sulfato cérico; 6 – anisaldeído sulfúrico; 7 – cloreto férrico...... p.54

Figura 32 – Estrutura do eleutherinol-8-O-β-glicosídeo e suas correlações no COSY e HMBC...... p.56

1 Figura 33 – Espectro de RMN de H do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz)...... p.57

13 Figura 34 – Espectro de RMN de C do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz)...... p.58

o Figura 35 – Espectro de DEPT 135 do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz)...... p.59

Figura 36 – Mapa de contorno COSY do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz)...... p.60

Figura 37 – Mapa de contorno HMBC do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz)...... p.61

Figura 38 – Mapa de contorno HSQC do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz)...... p.62

Figura 39 - Análise em CCDC da Fração Fr 01+02 do fracionamento da fração Fr 06- 12 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo. Eluição em DCM/AcOEt 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – KOH 10 %; 6 – cloreto férrico...... p.63

Figura 40 – Estrutura do eleuterol e suas correlações no COSY e HMBC...... p.65

1 Figura 41 – Espectro de RMN de H do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)...... p.66

13 Figura 42 – Espectro de RMN de C do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)...... p.67

Figura 43 – Espectro de DEPT 135 do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)...... p.68

Figura 44 – Mapa de contorno HSQC do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)...... p.69

Figura 45 – Mapa de contorno COSY do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)...... p.70

Figura 46 – Mapa de contorno HMBC do eleuterol em CDCl3 (300 MHz)...... p.71

Figura 47 - Análise em CCDC da Fração Fr 29+30 do fracionamento da fração Fr 06- 12 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo. Eluição em DCM/MeOH 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – KOH 10 %; 6 – cloreto férrico...... p.72

Figura 48 - Estrutura da isoeleuterina e suas correlações no COSY e HMBC...... p.74

1 Figura 49 – Espectro de RMN de H da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)...... p.75

13 Figura 50 – Espectro de RMN de C da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)...... p.76

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o Figura 51 – Espectro de RMN de DEPT 135 da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)...... p.77

Figura 52 – Mapa de contorno COSY da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)...... p.78

Figura 53 – Mapa de contorno HSQC da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)...... p.79

Figura 54 – Mapa de contorno HSQC da isoeleuterina em CDCl3 (300 MHz)...... p.80

Figura 55 - Análise em CCDC da Fração Fr 34+35 do fracionamento da fração Fr 14- 20 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa . Eluição em DCM/MeOH 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – cloreto férrico; 6 – KOH 10 %; 7 – KOH 10% (UV – 365) ...... p.82

Figura 56 - Estrutura do eleuterinol e suas correlações no COSY e HMBC...... p.83

1 Figura 57 - Espectro de H do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz)...... p.84

13 Figura 58 - Espectro de C do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz)...... p.85

o Figura 59 - Espectro de RMN de DEPT 135 do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz)...... p.86

Figura 60 - Mapa de contorno COSY do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz)...... p.87

Figura 61 - Mapa de contorno HSQC do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz)...... p.88

Figura 62 – Mapa de contorno HMBC do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz)...... p.89

Figura 63 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para o extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa frente a S. aureus...... p.90

Figura 64 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a fase DCM obtida do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa frente a S. aureus...... p.94

Figura 65 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância 61 + 62 (FD) obtida a partir de Eleutherine bulbosa frente a P. fluorescens...... p.96

Figura 66 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância eleuterol obtida a partir de Eleutherine bulbosa frente a S. aureus ...... p.96

Figura 67 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância eleuterol obtida a partir de Eleutherine bulbosa frente a P. fluorescens...... p.97

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Figura 68 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância isoeleuterina obtida a partir de Eleutherine bulbosa frente a S. aureus ...... p.97

Figura 69 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância isoeleuterina obtida a partir de Eleutherine bulbosa frente a P. fluorescens...... p.98

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Tabela 1 – Reveladores químicos e físicos aplicados nas cromatoplacas de sílica como método colorimétrico para revelar as diversas classes químicas presentes no extrato, de acordo com Wagner, Bladt & Zgainski, 1984...... p.28

Tabela 2 – Massa dos extratos de Eleutherine bulbosa e seus respectivos rendimentos , produzidos e armazenados no Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia/ COTI- INPA...... p.38

1 13 Tabela 3 – Dados de RMN de H, C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) do CR-Bulbo...... p.42

Tabela 4 – Visão geral das massas obtidas pela partição do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa , mostrando a massa inicial obtida de cada fase, o rendimento em relação à massa do extrato bruto, a massa armazenada para eventuais análises e testes, as fases unidas por semelhança na CCDC, e a massa final utilizada no fracionamento...... p.51

Tabela 5 – Dados de RMN de 1H, 13 C e correlações heteronucleares (300 MHz,

DMSO-d6) da Fr 51-53 (FD), eleuterinol-8-O-β-glicosídeo...... p.55

1 13 Tabela 6 – Dados de RMN de H, C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) da Fr 01+02 (06-12), eleuterol...... p.65

1 13 Tabela 7 – Dados de RMN de H, C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) da Fr 29+30 (06-12), isoeleuterina...... p.74

Tabela 8 – Dados de RMN de 1H, 13 C e correlações heteronucleares (300 MHz,

DMSO-d6) da Fr 34+35 (14-20), eleuterinol...... p.83

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Tabela 9 – Resultados do teste de atividade antioxidante dos extratos brutos e da naftoquinona Eleuterine, isolada do extrato hexânico do bulbo, de Eleutherine bulbosa utilizando o método com DPPH, mostrando valores de absorbância, equivalência do ácido ascórbico (AA), equivalência das amostras e seus respectivos desvios padrão...... p.90

Tabela 10 - Resultados do teste de atividade antioxidante dos extratos brutos e da naftoquinona Eleuterine, isolada do extrato hexânico do bulbo, de Eleutherine bulbosa utilizando o método com Fe 3+ + Fenantrolina, mostrando valores de absorbância, equivalência do ácido ascórbico (AA), equivalência das amostras e seus respectivos desvios padrão...... p.91

Tabela 11 – Concentração inibitória mínima (MIC) para os extratos e fases de Eleutherine bulbosa ...... p.93

Tabela 12 – Resultado do teste de toxidade apresentando os valores médios expressos em porcentagem e desvio padrão dos extratos e da naftoquinona eleuterine frente à Artemia salina , valores finais em porcentagem...... p.99

Tabela 13 – Determinação da morte celular de linhagens de células tumorais frente à extratos de Eleutherine bulbosa e à naftoquinona eleuterina...... p.102

Quadro 01 : Substâncias químicas e atividades biológicas de constituintes químicos isolados de Eleutherine e sinonímias...... p.22

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LISTA DE ABREVIATURAS

AcOEt – Acetato de Etila CCDC – Cromatografia em Camada Delgada Comparativa

CDCl3 – Clorofórmio deuterado CIM – Concentração Mínima Inibitória CL – Concentração Letal CLSI – Clinical Laboratory and Standards Institute COTI – Coordenação de Tecnologia e Inovação DCM – Diclorometano DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO – Dimetilssulfóxido

DMSO – d6 – Dimetilssulfóxido deuterado DPPH – 1,1-difenil-2-picril-hidrazila FD – Fase DCM FA – Fase AcOEt HEX – Hexano Hz – Hertz INPA – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia KOH – Hidróxido de Potássio J – Constante de acoplamento MeOH – Metanol RMN de 1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN de 13 C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono Treze UV – Ultravioleta d – Dubleto t – Tripleto ddd – Duplo Duplo Dupleto dt – Duplo Tripleto m – Multipleto s – Singleto ppm – Partes por milhão

1. INTRODUÇÃO

A Floresta Amazônica é conhecida pela sua vasta biodiversidade, abrigando cerca de 20% da biodiversidade mundial (SUFFREDINI et al., 2002). A utilização das plantas, no tratamento e cura de diversas doenças, é uma prática milenar e, até hoje, se mostra como principal recurso terapêutico de muitos grupos e comunidades tradicionais. As informações populares sobre o uso dessas plantas conduziram ao longo dos anos a uma gama de informações de grande validade com relação à eficiência e aos efeitos medicinais das plantas (OTTOBELLI et al., 2011). Segundo Cunha & Roque (2005a), uma planta medicinal pode ser definida como aquela que possui atividade farmacológica, usada com fins terapêuticos, e ainda, cujos metabólitos posteriormente passam a ser incluídos em medicamentos.

As plantas são um dos principais organismos estudados produtores dos diversos tipos de estruturas moleculares na natureza, através de seu metabolismo primário, envolvido na manutenção da própria planta, e principalmente através do seu metabolismo secundário, onde tais substâncias não são essenciais à manutenção da planta, mas são essenciais para a sobrevivência da mesma no ecossistema, podendo ter inúmeras funções diferentes. Ciente do papel dos metabólitos secundários, estes estão especialmente relacionados com as propriedades terapêuticas das plantas (NEVES & CUNHA, 2012).

Os estudos dos metabólitos foram iniciados pelos químicos orgânicos, do século XIX e início do século XX, interessados nessas substâncias pela sua importância como drogas medicinais, venenos, aromatizantes e materiais industriais. Os medicamentos de origem natural possuem vantagem por serem de fácil disponibilidade, econômicos, e apresentarem pouco ou nenhum efeito colateral. Hoje em dia, há um interesse renovado em medicamentos de origem natural, por serem considerados mais seguros para a saúde humana e com produção menos prejudicial ao meio ambiente, ao contrário das drogas sintéticas (CHANDA, 2014).

Ainda, nos últimos anos, com o aumento da resistência de micro-organismos patogênicos a múltiplos fármacos, verificou-se um esforço maior na investigação de produtos naturais de forma a identificar novas substâncias ativas que pudessem ser

utilizadas como protótipos para o desenvolvimento de novos fármacos (NEWMAN et al., 2003; SHU, 1998).

No campo da fitoquímica se encontra um grande número de trabalhos experimentais publicados. A importância científica das pesquisas desenvolvidas nesta área é demonstrada pelos resultados obtidos em diversos trabalhos, que contribuíram para a elucidação e o conhecimento de milhares de substâncias naturais aplicados para a criação de novos medicamentos de origem vegetal (MATOS, 2009).

Brito e Brito (1993) apontam diversos estudos químicos e/ou farmacológicos realizados com espécies da flora brasileira, desde a Floresta Amazônica até o Pantanal, ressaltando as potencialidades de utilização de várias delas, bem como a necessidade de maiores estudos dessa riquíssima flora. A região Amazônica, com sua imensa biodiversidade, desponta como um celeiro a contribuir para o surgimento de novos medicamentos fitoterápicos (MALHEIROS, 2008).

Dentre as famílias vegetais encontradas na região Amazônica, com reconhecido potencial terapêutico, destaca-se Iridaceae, considerada por Reeves e colaboradores (2001) como uma das maiores famílias das Lilianae e provavelmente uma das mais estudadas entre as monocotiledôneas. Das diversas espécies estudadas da família Iridaceae, encontra-se a espécie Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb., planta inclusa na Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS), reconhecida por diversos potenciais terapêuticos e vasta riqueza de substâncias isoladas até hoje em diversos estudos e revisões recentes sobre a espécie e sinonímias (COUTO et al., 2016; INSANU, KUSMARDIYANI & HARTATI, 2014; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009).

Ainda, apesar de diversos estudos existirem sobre a espécie Eleutherine bulbosa , os variados potenciais de suas substâncias não foram inteiramente explorados, principalmente de indivíduos do bioma amazônico, do qual existem poucos trabalhos realizados. Assim, este trabalho teve como finalidade avaliar mais profundamente os potenciais dos extratos e das substâncias isoladas de um indivíduo de Eleutherine bulbosa do bioma amazônico, e verificar as substâncias produzidas pelo mesmo a fim de contribuir mais com o estudo da espécie.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 METABOLISMO SECUNDÁRIO E PRODUTOS NATURAIS

A floresta amazônica é conhecida por deter a maior diversidade vegetal do mundo com pelo menos 16 mil espécies de árvores. Apesar de existirem muitos estudos de plantas amazônicas em busca de metabólitos secundários de interesse, o conhecimento atual das plantas do bioma Amazônico representa apenas uma pequena parte dessa enorme diversidade (SKIRYCZ et al., 2016; TER STEEGE et al., 2013).

O aparecimento de metabólitos biologicamente ativos na natureza é determinado por necessidades ecológicas e possibilidades biossintéticas, tendo como fatores estimulantes à produção desses metabólitos secundários a co-evolução de plantas, insetos, micro-organismos e mamíferos (RHODES, 1994), além de vários outros fatores como temperatura, sazonalidade, disponibilidade de água, radiação Ultra Violeta (UV), disponibilidade de nutrientes e altitude, como observado na Figura 1 (GOBBO-NETO & LOPES, 2007). Atualmente, sabe-se que muitos metabólitos secundários têm funções ecológicas importantes, como proteção contra herbivoria e infecção por micro- organismos, ação atrativa para polinizadores e agentes de competição planta-planta (GERSHENZON & ENGELBERTH, 2013).

Figura 1: Fatores que influenciam no teor e na produção de metabólitos secundários. Fonte: GOBBO-NETO & LOPES (2007)

A origem de todos os metabólitos secundários pode ser resumida a partir do metabolismo da glicose através da via do ácido chiquímico e do acetato, onde o primeiro origina aminoácidos aromáticos, precursores da maioria dos metabólitos secundários aromáticos (alcaloides indólicos, quinolínicos, isoquinolínicos, benzilisoquinolínicos, protoalcaloides, taninos hidrolisáveis, lignanas e cumarinas), e o segundo origina derivados do acetato via ácido cítrico, mevalonato e através da condensação do acetato (terpenoides, esteróis, alcaloides pirrolidinicos, tropânicos, pirrolizidínicos, piperidínicos e quinolizidínicos), e ainda, a formação de isoprenoides conta com uma via alternativa da 5-desoxixilulose para sua formação. Metabólitos como antraquinonas, flavonoides e taninos condensados são produzidos a partir de reações de ambas as vias, como pode ser observado na figura 2 (DEWICK, 2002; SANTOS, 2007).

GLICOSE polissacarídeos heterosídeos 5-desoxixilulose

ácido chiquímico acetil - CoA

fenilalanina/ triptofano ácido gálico via condensação tirosina Ciclo mevalonato do Alcaloides taninos ácido indólicos e hidrolisáveis ácidos graxos quinolínicos acetogeninas

antraquinonas isoprenoides flavonoides taninos condensados

protoalcaloides ácido terpenoides e alcaloides cinâmico esterois isoquinolínicos e ornitina benzilisoquinolínicos lisina

fenilpropanoides alcaloides pirrolidínicos, tropânicos, pirrolizidínicos, lignanas e ligninas piperidínicos e cumarinas quinolizidínicos

Figura 2: Ciclo biossintético dos metabólitos secundários. Fonte: Adaptado de Santos (2007) e Dewick (2002).

Depois de séculos de uso empírico das ervas, o início do século XIX marcou a nova era da pesquisa moderna de plantas medicinais, através dos primeiros isolamentos de princípios ativos tais como a morfina, quinina e etc. A investigação dos metabólitos vegetais neste período era feita principalmente sob o ponto de vista fitoquímico e quimiotaxonômico, e posteriormente, com o desenvolvimento da ciência química e da farmacognosia, os médicos da época começaram a extrair substâncias químicas de plantas medicinais (SAXENA et al., 2013; HAMBURGER & HOSTETTMANN, 1991).

Com o passar dos anos, diversos estudos relataram o isolamento e a identificação de milhares de metabólitos secundários de diversas plantas com uma extensa gama de potenciais medicinais, entre eles potenciais antibacterianos, antitumorais, antioxidantes, inseticidas, fungicidas, diuréticos, antivirais, anti-inflamatórios, antiespasmódicos, anti- helmínticos, anti-alergênicos, etc. (CUNHA, CAVALEIRO & SALGUEIRO, 2005; FISCHER et al., 1998; LACAILLE-DUBOIS & WAGNER, 1996; SCHENKEL, GOSMANN & ATHAYDE, 2007; PESSOA et al., 2002; MIRANDA, 2001; CAMPOS, 2005).

Muitos metabólitos são de importância comercial, tanto na área farmacêutica quanto nas áreas alimentares, agronômica, da perfumaria, e entre outras. Entre estas áreas, há um maior interesse do ponto de vista farmacêutico por conta do grande número de substâncias farmacologicamente importantes já encontradas, tais como o taxol (diterpeno com potencial anticancerígeno, isolado de plantas do gênero Taxus ), a artemisinina (presente em Artemisia annua , que exerce potente atividade antimalárica) e a forscolina (oriundo de Coleus barbatus , possui promissor potencial contra hipertensão, asma, glaucoma e certos tumores) (KAMCHONWONGPAISAN & MESHNICK, 1996; DE SOUZA, 1993; CORRÊA, 1995; GERSHENZON & ENGELBERTH, 2013).

Entre os muitos metabólitos secundários com importantes potenciais medicinais, destacam-se as substâncias fenólicas, as quinonas e os terpenos.

As substâncias fenólicas possuem um grupo fenol em sua estrutura química e apresentam diversas funções, dentre elas: defesa contra herbivoria, atrativo para polinizadores e proteção contra radiação ultravioleta. Estes se enquadram em diversas categorias como fenóis simples, ácidos fenólicos, cumarinas, flavonoides, estilbenos,

taninos condensados e hidrolisáveis e lignanas, e são uma boa fonte de antioxidantes (NACZK & SHAHIDI, 2004; CHUN et al., 2005).

As principais substâncias fenólicas, flavonoides e cumarinas, podem ser encontrados em várias partes das plantas como flores, frutos, raízes, sementes, caule e cascas (CUNHA & BATISTA, 2005; CAMPOS, 2005; CUNHA & CAMPOS, 2005).

As cumarinas são oriundas da oxidação do ácido trans -cinâmico tornando-se ácido o-cumárico seguindo-se glicosilação, sendo posteriormente isomerizado para forma –cis dando origem à cumarina (CUNHA & CAMPOS, 2005), como demonstrado na figura 3. Elas possuem uma grande variedade de atividades biológicas, como ação antimicrobiana, antiviral, anti-inflamatória, antiespasmódica, antitumoral e antioxidante (MIRANDA, 2001), além de poderem estar relacionadas com a inibição de enzimas e com a sua capacidade de suprimir espécies ativas de oxigênio (EAO) (HOULT & PAYÁ, 1996).

Podem ser encontradas sozinhas ou combinadas com açúcares ou ácidos. Possuem características odoríferas que permitem o uso na fabricação de perfumes e agentes flavorizantes, como por exemplo, em repelente de insetos (MIRANDA, 2001).

Figura 3 – Estrutura química de cumarina. Fonte: Adaptado de Soares (2002).

Já os flavonoides são moléculas que tem por base a estrutura da flavona (figura 4), e as estruturas predominantes são de flavonóis e flavonas quase sempre na forma heterosídica. Os flavonoides sintetizam-se nas plantas e participam na fase luminosa da fotossíntese, a fenilalanina e a tirosina dão lugar ao ácido cinâmico e ao ácido p- hidroxicinâmico que originam a estrutura cinamoil dos flavonoides após condensar-se com unidades de acetato. O ácido cinâmico forma-se da fenilalanina, e é o precursor de outro fenilpropanoides como a lignina, flavonoides e cumarinas (CAMPOS, 2005).

Neste grupo encontram-se as antocianidinas, flavonas, flavonóis e, com menor freqüência, as auronas, calconas e isoflavonas (SOARES, 2002).

O Figura 4 - Estrutura química da flavona. Fonte: Adaptado de Campos (2005).

De acordo com Campos (2005), os flavonoides têm atraído a atenção da ciência médica devido às suas propriedades anti-carcinogênica, anti-alergênica, anti- inflamatória, antioxidante, antibacteriana, antidiarreica e antiviral, além de serem pouco tóxicos para o homem, sendo então, considerado por Fracaro (2004), como um dos grupos fenólicos mais importantes, estando amplamente distribuídos no reino vegetal e sendo altamente diversificados entre os produtos de origem natural.

Outro grupo que se destaca por sua importância medicinal são as quinonas. As quinonas são substâncias orgânicas originários da oxidação de fenóis, onde da mesma forma, a redução de quinonas dá origem aos fenóis. Esta classe tem como principal característica a presença de dois grupos carbonílicos formando um sistema conjugado (FALKENBERG, 2007).

As quinonas podem ser classificadas de acordo com a sua estrutura, onde leva-se em consideração o tipo de sistema aromático que sustenta o anel quinonoídico: as benzoquinonas, que possuem apenas um anel de 6 carbonos com duas carbonilas ligadas na sua estrutura; as naftoquinonas, que possuem um anel naftalênico; e as antraquinonas, que possuem um anel antracênico, podendo este ser linear ou angular, como demonstrado na figura 5. As quinonas naturais são consideradas de vital importância para diversos seres vivos como vegetais superiores, artrópodes, fungos, liquens e diversos micro-organismos, e sua distribuição nestes organismos se dá, possivelmente, de acordo com as suas funções biológicas (SILVA, FERREIRA & SOUZA, 2003).

O O O

A B C

Figura 5 - Estrutura básica dos principais substâncias quinônicas. A – Benzoquinona; B – Naftoquinona; C - Antraquinona

Fonte: Adaptado de Silva, Ferreira & Souza (2003 )

As quinonas são encontradas em abundância na flora brasileira, sendo altamente estudadas e seus potenciais biológicos comprovados, demonstrando potenciais antimicrobiano, antimalárico, antitumoral e até mesmo tripanossomicida quando associada a outras substâncias. Elas são encontradas em diversas famílias de plantas superiores, sobretudo nas famílias Rubiaceae, Fabaceae (Caesalpinioideae), Verbenaceae, Bignoniaceae, Myrsinaceae, Iridaceae, e entre outras (DE MOURA et al., 2001; MORELLO et al., 1995; VERMA, 2006; DE ANDRADE-NETO et al., 2004; FALKENBERG, 2007).

Um exemplo de substância conhecida é o lapachol, uma naftoquinona natural encontrada principalmente na família Bignoniaceae, especificamente no gênero Tabebuia (ARAÚJO, ALENCAR & ROLIM NETO, 2002). Descrito pela primeira vez por Paternò em 1882, e estrutura química estabelecida por Hooker em 1896, o lapachol possui a capacidade de induzir estresse oxidativo através da formação intracelular de espécies reativas do oxigênio, como o radical hidroxila (OH), sendo portanto capaz de danificar significativamente células normais e malignas, pela indução da apoptose em células tumorais e impedir seu crescimento desordenado. Contudo, por conta da mesma poder prejudicar células sadias, muitos estudos foram realizados para criar substâncias derivadas do lapachol, tornando esta a matéria prima para síntese e semi-síntese de muitas outras substâncias de distintas bioatividades. Exemplos disso seriam a α- lapachona e a β-lapachona (Figura 6), que possuem reconhecidas atividades biológicas

já descritas na literatura, tais como atividade antitumoral, leishmanicida, anti- inflamatória, anti-fúngica, tripanomicida, antiprotozoária e antimicrobiana (ASCHE, 2005; LIU, LI & SAKYA, 2004; SILVA, FERREIRA & SOUZA, 2003; ALMEIDA et al., 1990; DE MOURA et al., 2001; GAFNER et al., 1996; TEIXEIRA et al., 2001; ZANI et al., 1997; MACHADO et al., 2003).

O O O O CH OH O 3

CH CH3 3

O O CH3 O

H3C CH3

lapachol α-lapachona β-lapachona

Figura 6 – Estrutura química do lapachol e das naftoquinonas derivadas: α-lapachona e β-lapachona. Fonte: Adaptado de Ferreira e colaboradores (2013)

Outra classe de metabólitos com grande potencial medicinal são os terpenos. Os terpenoides são uma classe derivada de unidades de isopreno de 5 carbonos (C5), que possuem estruturas multi-cíclicas variadas que se diferenciam nos grupos funcionais e nos esqueletos básicos de carbono, e podem ser encontrados em praticamente todas as classes de seres vivos, por isso sendo considerado o maior grupo de produtos naturais. Estes são encontrados principalmente em óleos essenciais de plantas, e por conta disso, muitos dos terpenoides possuem alto interesse comercial por possuírem fragrâncias distintas, sendo usados no campo de alimentação e cosmética.

Os terpenos podem ser classificados em hemiterpenoides (C5), possuindo apenas uma unidade isoprênica em sua estrutura; monoterpenoides (C10), com duas unidades isoprênicas estruturadas de forma linear ou contendo dois anéis, como no caso do eucaliptol e do limoneno; sesquiterpenos (C15), que possuem três unidades isoprênicas, como no caso do eudesmol, encontrado no óleo de Eucalipto; diterpenos (C20), compostos por quatro unidades isoprênicas; triterpenos (C30), que consistem em seis unidades isoprênicas, encontrados, por exemplo, em óleos de oliva; e tetraterpenos (C40), que contém oito unidades isoprênicas em sua estrutura, exemplos de

tetraterpenos seriam o licopeno e o betacaroteno (figura 7) (SAXENA et al., 2013; LANGENHEIM, 1994).

Os terpenoides são conhecidos por serem o grupo com maior diversidade estrutural entre os metabólitos secundários, conferindo a eles uma ampla gama de funções, como defesas contra herbivoria, produção de óleos voláteis para atração de polinizadores, e funções de compostos sinalizadores e reguladores de crescimento na planta (fitohormônios). Ainda, eles apresentam diversas propriedades medicinais comprovadas, como propriedades anti-malárica, anti-tumoral, hepaticida e antimicrobiana (DEGENHARDT et al., 2003; DUDAREVA, PICHERSKY & GERSHENZON, 2004; LANGENHEIM, 1994; MCCASKILL; CROTEAU, 1998).

H3C CH3 H3C CH3

CH3 H3C H3C CH3 CH3 β-caroteno

CH CH H C 3 3 H3C 3 CH3

H3C CH3 CH3 H3C CH3

licopeno

Figura 7 – Estrutura química dos tetraterpenos β-caroteno e licopeno. Fonte: Adaptado de Saxena et al. (2013)

2.2 ENSAIOS BIOLÓGICOS

2.2.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Um antioxidante pode ser definido como qualquer substância que, em baixas concentrações, retarda ou previne significativamente a oxidação de um substrato. Eles podem ser sintéticos ou naturais e, entre os naturais destacam-se ácido ascórbico, vitamina E e β-caroteno. Além dessas vitaminas antioxidantes, outras substâncias de origem vegetal atuam como antioxidantes, como por exemplo, os polifenois das plantas que são uma importante classe de antioxidantes. Estes compostos estão distribuídos em grande quantidade em plantas alimentícias, e incluem fenóis, ácidos fenólicos, flavonoides, taninos e lignanas (HALLIWELL et al., 1995; PIETTA, 2000). A oxidação representa um processo essencial da vida aeróbica e do nosso metabolismo no processo de produção de energia. Durante este processo, elétrons singulares ou não acoplados podem surgir no fluxo de elétrons, gerando radicais livres ou espécies reativas de oxigênio (EROs). As EROs estão relacionados com o envelhecimento humano, além de diversas doenças degenerativas como doenças do coração, cataratas, disfunção cognitiva e câncer (PIETTA, 2000). Os produtos antioxidantes eficazes são os que impedem o excesso de EROs, através da estimulação do mecanismo de reparo antioxidante ou da doação ou captura de elétrons para a estabilização do radical livre (NÚÑEZ-SELLÉS, 2005). O ácido ascórbico (vitamina C) é considerado um dos mais potentes e o menos tóxicos dos antioxidantes naturais, atuando como sequestrador eficaz de radicais livres, além de combater eficientemente espécies reativas de nitrogênio em soluções aquosas, impedindo a nitrosação de moléculas. Entre as principais fontes de vitamina C, estão os frutos cítricos, acerola, goiaba e kiwi, além de algumas hortaliças (SUCUPIRA et al., 2014; WEBER, BENDICH & SCHALCH, 1996). Os antioxidantes naturais atuam nas plantas protegendo-as contra injúrias nos tecidos e ação danosa de subprodutos provenientes da fotossíntese. Muitas dessas substâncias são similares em sua estrutura molecular básica, onde todos possuem pelo menos um anel aromático com uma hidroxila ligada a ele (SHAHIDI, 1996).

2.2.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

O corpo humano é um conhecido habitat de uma microflora muito diversificada, composta de populações benéficas, populações prejudiciais à saúde e populações que exercem pouca influência sobre seu hospedeiro em condições normais. Desde tempos remotos as bactérias provocam doenças nos seres humanos, comprometendo a saúde dos seres vivos em geral com constantes ameaças ocasionadas por infecções de micro- organismos, onde a maior preocupação é o surgimento de cepas resistentes aos antimicrobianos disponíveis. Neste sentido, torna-se importante a pesquisa e o desenvolvimento de drogas mais eficazes, o que constitui uma estratégia promissora no campo da biotecnologia, através da prospecção de novas classes de moléculas naturais ou sintéticas (SILVA & FERREIRA, 2003; SOUZA et al., 2003; WANNMACHER, 2004). A pesquisa de atividade antimicrobiana refere-se a diferentes técnicas ou métodos laboratoriais in vitro , os quais são utilizados para determinar o potencial antimicrobiano de um determinado agente. Para isso existem três métodos que podem ser utilizados para esta avaliação: método de difusão, método de diluição e bioautográfico. O método de difusão consiste em utilizar um reservatório (disco de papel, cavidade no meio de cultura ou cilindro sobre a superfície) onde é colocada a substância a ser testada, ficando em contato direto com o meio de cultura sólido inoculado com um determinado micro-organismo, onde, após o tempo adequado de incubação, mede-se o diâmetro ou o halo de inibição. O método de diluição utiliza uma quantidade fixa de amostra que é dissolvida homogeneamente num meio sólido ou líquido, onde se encontra inoculado o micro-organismo de interesse em interação com a amostra. Após o período de incubação, é avaliado a inibição do crescimento bacteriano pela amostra. O potencial inibitório da amostra é definido pela concentração inibitória mínima (CIM), que é a menor concentração capaz de inibir o crescimento do micro-organismo. Já a bioautografia é um método que visa detectar substâncias com ação antimicrobiana nas bandas individuais numa placa cromatográfica onde está impregnado um extrato ou fração, permitindo assim guiar o isolamento da substância ativa (SOUZA et al., 2003).

2.2.3 ATIVIDADE TÓXICA E CITOTÓXICA

2.2.3.1 Artemia salina

Artemia salina é um microcrustáceo conhecido desde 1755, onde a partir da metade do século XIX, foram realizados vários estudos em relação à sua morfologia e taxonomia. O bioensaio utilizando este organismo foi inicialmente proposto por Michael e colaboradores (1956), onde se avaliou a toxidade de inseticidas . Posteriormente, este crustáceo seria usado em diversos experimentos científicos. O microcrustáceo Artemia salina tem sido introduzido em laboratórios de Produtos Naturais no intuito de selecionar e monitorar o estudo fitoquímico de extratos de plantas na procura de substâncias bioativas. Podem ser observadas a validade e confiabilidade deste bioensaio, onde a toxicidade para Artemia salina convergiu para frações que continham uma substância reconhecidamente ativa, o que demonstra a sensibilidade da metodologia (VINATEA, 1982; SIQUEIRA, BOMM & PEREIRA, 1998).

Substâncias bioativas são quase sempre tóxicas em altas doses, com isso, letalidade in vivo em um organismo zoológico simples pode ser usado como um conveniente monitor para varredura e fracionamento no descobrimento e monitoramento de compostos naturais bioativos. Os ovos de Artemia salina (Leach), estão prontamente disponíveis em pet shops a baixo custo e se mantem viáveis por anos quando mantidos em estado seco. Quando colocados em água salgada, os ovos eclodem dentro de 48h, fornecendo um grande número de larvas (nauplii) para uso experimental, permitindo a avaliação de metabólitos e extratos tóxicos e a determinação de sua concentração em que a porcentagem de mortalidade seja de 50% dos indivíduos (CL 50 ), conferindo assim, confiabilidade estatística. Além disso, as larvas possuem ciclo de vida relativamente curto, o que favorece seu uso em testes de toxidade. (MCLAUGHLIN, ROGERS & ANDERSON, 1998; GONZÁLEZ et al., 2007).

Alguns trabalhos tentam correlacionar a toxicidade sobre Artemia salina com atividades como antifúngica, viruscida, antimicrobiana, e ainda, como indicador prévio de possível atividade antitumoral (MACRAE, HUDSON & TOWERS, 1988; (MCLAUGHLIN, ROGERS & ANDERSON, 1998).

2.2.3.2 CULTIVO CELULAR E ATIVIDADE ANTITUMORAL

O cultivo de células animais tem sido utilizado pela indústria biotecnológica para sintetizar produtos, destinados em grande parte à área de saúde humana e animal. Diversos fatores como a composição do meio de cultivo, a densidade do inóculo celular e o tipo de suporte para adesão celular, quando combinados se tornam para o sucesso do cultivo in vitro das células animais (MITSUHASHI, 1989).

Muitas células animais, com os devidos cuidados específicos, podem ser induzidas a crescer fora de seus órgãos ou tecidos de origem. Células isoladas, tecidos e órgãos podem crescer quando mantidos a temperaturas definidas usando incubadora, meio suplementado com nutrientes para célula e fatores de crescimento. A cultura in vitro de órgãos, tecidos e células é conhecida como cultura de tecidos, e é usada em muitas áreas da ciência. Diversos tipos de células podem crescer em cultura, exemplos disso incluem elementos conectores de tecidos como os fibroblastos, tecido ósseo (osso e cartilagem), músculos cardíaco e liso, tecido epitelial (fígado, rim, pele, bexiga), células neuronais (células da glia e neurônios, contudo, estes não podem se proliferar in vitro ), células endócrinas (adrenal, pituitária, células pancreáticas), melanócitos e vários tipos diferentes de células tumorais. O desenvolvimento dessas técnicas de cultura de tecidos tem muito a contribuir com as duas principais linhas de pesquisa na área médica: pesquisas sobre câncer e virologia, e no desenvolvimento da biotecnologia (UNCHERN, 1999).

A história da medicina é repleta de relatos marcantes em como a descoberta de produtos naturais causou um grande impacto no avanço da pesquisa de drogas para terapia, permitindo a descoberta de substâncias com atividade antitumoral, por exemplo, que nunca poderiam ter sido previstas sem estes estudos direcionados (SHEN, 2015).

Os produtos naturais têm sido o pilar da quimioterapia para o tratamento do câncer nos últimos 30 anos, onde 70% das drogas anticâncer aprovadas pelo Food and Drug Administration (agência de vigilância de drogas e alimentos nos EUA) podem ser rastreadas de volta à sua origem até as plantas, tradicionalmente usadas como remédios antigos para várias doenças. A identificação de substâncias bioativas de plantas medicinais se tornou uma área de pesquisa altamente ativa. Este entusiasmo surgiu devido aos tratamentos atuais para doenças malignas e inflamatórias estarem longe de serem satisfatórias. A quimioterapia permanece como a principal estratégia como

tratamento ao câncer, mas os tratamentos são, em geral, cheios de diversas complicações à saúde do paciente (BARBERENA et al., 2004; WONG, YUAN & LUK, 2012).

2.3 FAMÍLIA IRIDACEAE JUSSEU

Dentre as famílias de monocotiledôneas de grande relevância medicinal encontradas na floresta amazônica, destaca-se Iridaceae. A família Iridaceae é pertencente à ordem Asparagales, monocotiledôneas petaloides, onde possui 2035 espécies distribuídas em 66 gêneros e 7 subfamílias (Isophysidoideae, Iridoideae, Patersonioideae, Geosiridoideae, Aristeoideae, Nivenioideae e Crocoideae), sendo destas subfamílias, Iridoideae a mais abundante na América do Sul e a única representada nos Neotrópicos, como visto na figura 8 (GOLDBLATT & MANNING, 2008; STEVENS, 2008). O nome da família deriva do gênero Iris L., descrito pelo botânico sueco Carolus Linnaeus em 1753, quando este fez referência à deusa grega Íris, responsável por levar as mensagens do Olimpo à Terra através do arco íris cujas cores estão presentes nas flores de muitas espécies deste gênero (MANNING, 2004).

Distribuída pelo mundo inteiro, esta família tem marcada concentração no sul da África, além de ser amplamente distribuída nos Neotrópicos, desde o México, América Central até a América do Sul, principalmente no Brasil. Iridaceae pode ser reconhecida por suas folhas bifoliadas e isobifaciais, e suas grandes flores com tépalas vistosas, três anteras, um estigma visível e complexo, e um ovário inferior (STEVENS, 2008).

Figura 8: Mapa de distribuição global de Iridaceae. Fonte: STEVENS, 2008 . 15

No Brasil ocorrem 170 espécies (dentre as quais 80 são endêmicas), 18 subespécies e 1 variedade, pertencentes a 22 gêneros . Na Amazônia, ocorrem cerca de 4 gêneros, 4 espécies e 1 subespécie: Cipura paludosa Aubl., Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb., Ennealophus foliosus (Kunth) Ravenna, Ennealophus foliosus subsp. amazonicus (N.E.Br.) Ravenna e Trimezia martinicencis (Jacq.) Herb. (EGGERS et al., 2013). Muitas destas espécies ainda estão escassamente estudadas devido ao curto período de floração, à fragilidade das flores e à dificuldade de preservação das características morfológicas importantes para definição das espécies (EGGERS, 2008).

As espécies ocorrem em uma variedade de habitats, desde savanas, florestas com secas sazonais, florestas tropicais, florestas secundárias e campos rupestres. Muitas Iridáceas neotropicais são adaptadas para habitats com seca sazonal e algumas até preferem ambientes secos nos quais seus sistemas subterrâneos possam permanecer dormentes por um longo período (AVILA, 2012).

A família Iridaceae é constituída de plantas perenifólias ou ervas decíduas, ocasionalmente arbustos com crescimento secundário anômalo ( Klattia Baker, Nivenia Vent., Witsenia Thunb.), raramente anuais ( Sisyrinchium L.). São plantas que podem possuir rizoma, cormo, bulbo ou quando arbustivas, um caule lenhoso. Apresentam folhas basais ou caulinares, às vezes duas ou três inferiores sem lâmina, embainhando a base do caule e sobressaindo-se um pouco do nível do solo, tal como catafilos. As bainhas das folhas podem ser abertas ou fechadas. As folhas caulinares possuem lâminas unifaciais, nervação paralela, com ou sem nervação central distinta (GOLDBLATT, MANNING & RUDALL, 1998).

As flores são dispostas em inflorescências determinadas, monocásios do tipo ripídio, frequentemente muito modificadas e, às vezes, reduzidas a uma flor solitária terminal. São protegidas por brácteas (espatas), sendo geralmente pediceladas. As flores são perfeitas e possuem simetria radial ou bilateral. Apresentam seis tépalas, as externas às vezes diferenciadas das internas, livres ou conatas, imbricadas, petaloides, podendo portar manchas. Os estames são tipicamente em número de três, opostos às tépalas externas, com filetes livres ou conatos, às vezes adnatos ao perianto; anteras livres ou às vezes adnatas aos ramos do estilete. Os grãos de pólen são geralmente monossulcados. O gineceu apresenta três carpelos conatos e o ovário é geralmente ínfero com placentação axial. Os ramos do estilete podem ser expandidos e petaloides, com dois ou

três estigmas terminais, ou também, presentes na superfície abaxial dos ramos do estilete. Os óvulos podem ser poucos a numerosos, anátropos ou campilótropos. As flores podem apresentar nectários nos septos do ovário ou nas tépalas. O fruto é uma cápsula loculicida, podendo apresentar sementes ariladas ou com uma testa carnosa. As principais sinapomorfias em Iridaceae são: i) folhas isobilaterais e unifaciais com lâminas orientadas no mesmo plano, dispostas em leque; ii) presença de cristais prismáticos de oxalato de cálcio, denominados estiloides, nas bainhas dos feixes vasculares (ocasionalmente ausentes); iii) inflorescências determinadas tipo ripídio e iv) três estames (GOLDBLATT et al., 2008 ; JUDD et al., 2009 ).

A família Iridaceae apresenta uma ampla gama de flavonoides quando comparados a outras famílias de monocotiledôneas petaloides, além de apresentar também aminoácidos livres e peptídeos. Como constituintes químicos comuns, são encontrados flavonóis O-glicosilados e flavonas C-glicosiladas, sendo que algumas espécies do gênero Pillansia apresentam um flavonol sulfatado, o qual é único nas Iridaceas (GOLDBLATT, 1990). Além disso, em monocotiledôneas, poucas famílias (apenas 6 têm sido registradas) parecem ser capazes de produzir isoflavonoides. Esta família é a maior fonte de isoflavonoides nesse grupo, com mais de 50 compostos diferentes, principalmente no gênero Iris onde eles estão presentes no rizoma de aproximadamente 20 espécies (HANAWA, TAHARA & MIZUTANI, 1991).

Certas espécies da sub-família Nivenioideae apresentam uma predominância de flavonóis O-glicosilados, incluindo derivados de myricertina e alguns traços de flavonas C-glicosiladas. As espécies das tribos Sisyrinchieae, Mariacea e Tigridieae não apresentam estes flavonóis. As sub-famílias Iridoideae e Ixioideae apresentam com freqüência, mas não de modo universal, o acúmulo da xantona mangiferina C- glicosilada (GOLDBLATT, 1990).

Outros grupos de metabólitos secundários encontrados na família são saponinas, frutanos, amino ácidos não-proteicos, esteroides e bufadienolideos. Dentro desta riqueza de metabólitos, alguns se destacam por suas importâncias econômicas, como por exemplo, os isolados de Iris florentina L., α-irona e iridina, ambos usados na perfumaria, sendo o primeiro um sesquiterpeno visado por sua fragrância similar de flores de violetas, e o segundo uma isoflavona que constitui a maior parte da composição química do rizoma desta espécie. Outro exemplo seria o pigmento croceína

oriundo da espécie Crocus sativus L., popularmente conhecido como açafrão verdadeiro, usado como corante alimentar (HARBORNE & WILLIAMS, 2000).

Dentro de Iridaceae, destaca-se o gênero Eleutherine , nativo da região amazônica, e hoje cultivado e naturalizado através do mundo, e que contém uma espécie considerada um elemento importante da farmacopeia indígena americana e um das poucas iridáceas neotropicais com conhecidos usos medicinais (GOLDBLATT & SNOW, 1991).

2.4 Eleutherine Herbert

Pertencente à família Iridaceae, subfamília Iridoideae e tribo Tigridieae, Eleutherine é um gênero de plantas bulbosas e nativas da América. O gênero é composto por quatro espécies caracterizadas por terem uma grande folha caulinar subapical e flores brancas, estreladas, pequenas, com abertura ao anoitecer. As espécies pertencentes a este gênero são: Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb. , distribuída pela América do Sul e amplamente cultivada por suas propriedades medicinais, Eleutherine latifolia (Standl. & L.O. Williams) Ravenna, distribuída em regiões tropicais da América do Sul e Central, Eleutherine citriodora (Ravenna) Ravenna, do norte da Argentina, e por último Eleutherine angusta Ravenna, distribuída pelo Paraguai e no Brasil, na região do Mato Grosso do Sul (RAVENNA, 1984; RAVENNA, 2003; GOLDBLATT & SNOW, 1991).

O gênero possui uma distribuição que abrange desde a América do Sul Tropical, através da América Central até o México e nas Índias Ocidentais (AVILA, 2012). Ainda, de acordo com Goldblatt & Snow (1991), são cultivadas, e agora naturalizadas, na África e Ásia, especialmente nas Filipinas e Indochina.

No Brasil, de acordo com Chukr (2010), ocorre apenas a espécie Eleutherine bulbosa , distribuída na Amazônia, Cerrado e Mata Atlântica, e conhecida também por doze sinônimos botânicos: basiônimo Sisyrinchium bulbosum Mill., heterotípicos Cipura plicata (Sw.) Griseb., Eleutherine americana (Aubl.) Merr. Ex K. Heyne, Eleutherine angusta Ravenna, Eleutherine anomala Herb., Eleutherine longifolia Gagnep., Eleutherine plicata (Sw.) Herb., Eleutherine subaphylla Gagnep., Galatea

Americana (Aubl.) Kuntze, Galatea plicata (Sw.) Baker, Galatea vespertina Salisb. e homotípico Galatea bulbosa (Mill.) Britton.

Munõz e colaboradores (2000), em seu estudo com plantas medicinais da amazônia boliviana, revelou potencial antimalárico dos extratos de Eleutherine citriodora de todas as partes da planta, utilizada pela tribo de índios Mosetene para tratamento de anemia, disenteria, feridas e corrimento vaginal.

Não foram encontrados estudos fitoquímicos ou usos medicinais pelo homem de Eleutherine latifolia , corroborando com a afirmação de Goldblatt & Snow (1991) sobre não haver registros de usos pelo homem desta espécie, e o mesmo vale para a espécie Eleutherine angusta .

2.5 Eleutherine bulbosa (Miller) Urb.

Conhecida como coquinho, marupari, marupazinho, palmeirinha, marupá- piranga, lírio-folha-de-palmeira e wá-ro, Eleutherine bulbosa é uma planta herbácea, bulbosa e rizomatosa, acaule, entourecida, de 20-30 cm de altura, nativa da América tropical, incluindo os campos secos da Amazônia brasileira. Os bulbos apresentam escamas semelhantes à cebola, de coloração vinho e exsudando látex branco quando cortados. Caracterizam-se por folhas simples, inteiras, plissadas longitudinalmente, de cerca de 25 cm de comprimento. Flores brancas ou rosadas, dispostas numa panícula ampla no ápice de um longo escapo rígido acima da folhagem, que se abrem apenas ao pôr do sol (figura 9). Multiplica-se facilmente por bulbos, tornando-se persistente em muitas áreas a ponto de ser considerada “planta daninha”. É amplamente utilizada na medicina caseira na Amazônia, usada para o tratamento de diarreia e amebíase, tomando chá preparado a partir do bulbo (ALBUQUERQUE, 1989; VIEIRA, 1992). Nas regiões Sul e Sudeste a parte aérea se perde durante o inverno e no Nordeste forma touceiras decumbentes (figura 10) (LORENZI & MATOS, 2008).

Figura 10 : Flores, bulbo e espécie cultivada numa Figura 9: Morfologia de Eleutherine bulbosa horta doméstica no interior de São Paulo Fonte: GOLDBLATT & SNOW, 1991 Fonte: LORENZI & MATOS, 2008

Diversos estudos revelaram o uso medicinal popular e os constituintes químicos desta espécie e de suas sinonímias:

 Brasileiro e colaboradores (2006) realizaram triagem de atividade microbiológica e citotóxica sobre plantas utilizadas na medicina tradicional da cidade de Governador Valadares-MG, e mostraram que o extrato etanólico de Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb. (espécie utilizada como purgante e anti-cancerígeno por seus habitantes), preparado a partir das folhas e bulbo desta planta, inibiu o crescimento de cepas de Staphylococcus aureus e apresentou toxidade sobre larvas de Artemia salina .

 Vásquez, Mendonça & Noda (2014) registraram o uso de Eleutherine bulbosa para o tratamento de diarreia e dor de estômago em comunidades ribeirinhas de Manacapuru no Estado do Amazonas.

 Martins e colaboradores (2005) registraram usos de Eleutherine plicata pela medicina tradicional para o tratamento de dor de estômago, cólicas, diarreia e amebíase.

 Shibuya e colaboradores (1997) isolaram três glicosídeos aromáticos dos bulbos de Eleutherine palmifolia , parte da planta usada na medicina tradicional da Indonésia para o tratamento de câncer.

 Ribeiro (2008) avaliou o potencial antimicrobiano do extrato etanólico seco das folhas frescas e bulbo de Eleutherine plicata , revelando potencial de inibição do crescimento de Staphyloccoccus aureus .

 Alves, Kloos & Zani (2003) isolaram a eleuterinona, uma naftoquinona isolada do extrato diclorometânico de Eleutherine bulbosa , que apresentou atividade antifúngica.

 Nascimento e colaboradores (2012) revelaram atividade da isoeleuterina contra Entamoeba histolytica e Entamoeba díspar isolada do extrato aquoso dos bulbos de Eleutherine plicata .

Compostos principais da espécie e sinonímias (Figuras 11-15) como eleuterol, isoeleuterol, eleuterina, isoeleuterina (HARA et al., 1997) e hongconin (ZHENGXIONG et al., 1986), além de seus derivados como a eleuterinona (KOMURA et al., 1983; ALVES, KLOOS & ZANI, 2003) e seus glicosídeos (SHIBUYA et al., 1997), já foram isolados e identificados dos bulbos de plantas pertencentes a esse gênero e muitos destes compostos apresentam importante atividade biológica, observando-se ao mesmo tempo, uma predominância de quinonas (quadro 01).

Quadro 01 : Compostos químicos e atividades biológicas de alguns constituintes químicos isolados de Eleutherine e sinonímias .

SUBSTÂNCIA ISOLADA E ESPÉCIE ATIVIDADE BIOLÓGICA VEGETAL Eleuterina (Figura 11): Inibição de TOPO II (HARA et al., 1997), atividade Eleutherine bulbosa , (BIANCHI & CERIOTTI, 1975) contra C. sphaerospermum , (ALVES, KLOOS & ZANI, Eleutherine americana , (KOMURA et al., 1983) 2003). Isoeleuterina (Figura 12): Inibição da atividade de replicação do HIV em linfócitos Eleutherine americana , (KOMURA et al., 1983) (HARA et al., 1997). Isoeleuterol (Figura 13): Inibição da atividade de replicação do Eleutherine americana , (HARA et al., 1997) HIV em linfócitos (HARA et al., 1997) Eleuterinona (Figura 14): Atividade contra C. sphaerospermum , (ALVES, KLOOS & Eleutherine bulbosa, (ALVES, KLOOS & ZANI, 2003) ZANI, 2003). Hongconin (Figura 15): Inibição da atividade da NOs, (HAN et al., 2008) Eleutherine americana , (ZHENGXIONG et al., 1986)

H C O O H C O O 3 H C 3 CH3 3 H H O O

CH3 H

H CH3 O O Figura 11: Eleuterina Figura 12: Isoeleuterina Fonte: Adaptado de Shibuya et al. (1997). Fonte: Adaptado de Shibuya et al. (1997).

H C O OH H C O O 3 H 3 CH3 CH3

O O

O O Figura 13: Isoeleuterol Figura 14: Eleuterinona Fonte: Adaptado de Insanu et al. ( 2014 ). Fonte: Adaptado de Alves, Kloos & Zani (2003).

H C O 3 OH CH3 O

CH3 OH OH Figura 15: Hongconin Fonte: Adaptado de Zhengxiong et al. (1986) 22

Foram também realizados ensaios microbianos em alguns estudos com Eleutherine bulbosa e espécies do gênero, onde foram observados resultados positivos contra diversos tipos de microrganismos de importância médica (ALVES, KLOOS & ZANI, 2003; BRASILEIRO et al., 2006; RIBEIRO, 2008; IFESAN et al., 2009a; IFESAN et al., 2009b).

A espécie Eleutherine bulbosa se mostrou muito promissora para estudos farmacológicos e fitoquímicos, pelo seu vasto potencial terapêutico já comprovado em pesquisas mencionadas neste estudo. Porém, apesar de já existirem diversos estudos realizados com a espécie e suas sinonímias, poucos são os estudos realizados com espécies da Amazônia brasileira (MALHEIROS, MELLO & BARBOSA, 2015); RIBEIRO, 2008; NASCIMENTO et al., 2012).

A pesquisa fitoquímica continua a contribuir significativamente para a geração de conhecimento referente à diversidade de compostos naturais de plantas, bem como a crescente descoberta de possíveis fármacos naturais. Além disso, essa linha de pesquisa enriquece o conhecimento do perfil metabólico de plantas e contribui para programas com foco em conservação da biodiversidade, através do reconhecimento do potencial e diversidade química de espécies de plantas endêmicas raras ou ameaçadas de extinção. Ainda, existem estudos fitoquímicos que oferecem dados importantes para estudos quimiotaxonômicos objetivando a classificação de plantas baseado na sua composição química, sendo de grande ajuda para taxonomistas, fitoquímicos e farmacologistas na solução de problemas taxonômicos. Bancos de dados contendo dados de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), Espectrometria de massas e de cromatografia, são normalmente a principal fonte de informação para referenciar as substâncias, bem como as técnicas mais eficientes na descoberta dos mesmos (COLEY et al., 2003; SINGH, 2016; SKIRYCZ et al., 2016).

Registros de estudos etnobotânicos revelam o amplo uso de Eleutherine bulbosa na medicina popular no combate à doenças do trato digestivo, como diarreia, dor de estômago, entre outros (VÁSQUEZ, MENDONÇA & NODA, 2014; OLIVEIRA NETO et al., 2007; MARTINS et al., 2005). Ainda, não há relatos de estudos com esta espécie que tenham realizado testes antimicrobianos contra Salmonella enteritidis ,

bactéria responsável por causar problemas graves de diarreia no mundo inteiro (O’RYAN, PRADO & PICKERING, 2005; OYOFO et al., 2002).

Recentemente, Insanu, Kusmardiyani & Hartati (2014) realizaram uma revisão de literatura sobre todas as substâncias isoladas, os respectivos usos e potenciais farmacológicos de Eleutherine americana , sinonímia de Eleutherine bulbosa originária da Ásia. Neste estudo, eles relataram que até hoje foram isoladas cerca de 34 substâncias, onde a maior parte delas apresentaram variados potenciais farmacológicos como antimicrobiano, anti-inflamatório, antiviral, antidiabético, anti-hipertensivo, anti- dermatófito, antimelanogênese e citotóxico.

A composição química das plantas pode variar de acordo com diversos fatores ambientais (GOBBO-NETO & LOPES, 2007). Sabendo disso, existe a possibilidade de o indivíduo da espécie do estudo em questão, coletado na Amazônia Brasileira, apresentar novos compostos químicos além dos já isolados em diversos trabalhos realizados até hoje com espécies nativas e cultivadas/naturalizadas em outros continentes, e, ainda, podendo apresentar diferentes potenciais biológicos. Com isso, faz-se necessário um estudo mais profundo para elucidar as estruturas químicas responsáveis por esse potencial medicinal.

O estudo fitoquímico de Eleutherine bulbosa pode fornecer informações que possam contribuir com trabalhos de quimiotaxonomia dentro do gênero Eleutherine , visto o grande número de estudos realizados na área de fitoquímica e sistemática sobre família e gênero (GOLDBLATT, 1990; GOLDBLATT & SNOW, 1991; WILLIAMS, HARBORNE & GOLDBLATT, 1986; WILLIAMS & HARBORNE, 1985; NØRBAEK & KONDO, 1998; NØRBAEK, NIELSEN & KONDO, 1999).

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Realizar a análise fitoquímica e avaliar os extratos de Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb. quanto ao potencial antioxidante, antibacteriano e tóxico.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Caracterizar classes de substâncias químicas presentes nos extratos de Eleutherine bulbosa através de técnicas cromatográficas; - Avaliar o potencial tóxico e citotóxico de extratos, frações e substâncias isoladas através de ensaios com Artemia salina e atividade antitumoral; - Avaliar o potencial antioxidante dos extratos, frações e substâncias isoladas; - Avaliar os extratos quanto ao potencial antibacteriano contra Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus , Salmonella enteritidis , Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae , Enterobacter clocae , Morganella morganii , Propionibacterium acnes , Yersinia enterocolitica, Enterococcus faecalis e Acinetobacter baumanii ; - Fracionar, isolar e identificar as substâncias majoritárias presentes nos extratos que tenham atividade biológica.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 COLETA DO MATERIAL, PREPARO E SELEÇÃO DOS EXTRATOS

A coleta do material vegetal foi realizada na Volta Grande do Xingu (Jurucuá), no município de Altamira, PA em 11/11/2008 (Figura 16a). A exsicata depositada no herbário do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA sob o nº 259.172 (Figura 16b).

a b

Figura 16 – (a) Eleutherine bulbosa coletada no município de Altamira, PA. (b) Exsicata fértil depositada no herbário do INPA, Manaus, AM.

As folhas, flores e bulbo de indivíduos da espécie Eleutherine bulbosa foram secos em temperatura ambiente e posteriormente moídas em moinho de facas Tecnal, modelo Willye TE-650. Cerca de 156,21 g de bulbos secos, 20,46 g de folhas secas e 2,15 g de flores secas foram submetidos à extração com hexano ou diclorometano

(DCM), metanol (MeOH) e H2O. Foram realizadas três extrações com cada solvente, utilizando um banho de ultrassom por 20 minutos em cada extração. Após o banho de ultrassom, o material foi filtrado. Os extratos hexânicos, diclorometânicos e metanólicos

foram concentrados em rotaevaporador, e os aquosos em liofilizador. Para a evaporação dos solventes, foi utilizado evaporador rotativo a vácuo (FISATOM) (figura 17).

Material vegetal coletado de Eleutherine bulbosa

secagem, trituração e moagem

1) Extração com DCM ou Hex usando ultrassom por 3x DCM ou HEX 20 minutos 2) Filtração Torta 3) Concentração 1) Extração com MeOH usando ultrassom por 20 3x MeOH minutos 2) Filtração Torta 3) Concentração

1) Extração com H O usando 2 ultrassom por 3x H O 20 minutos X 2 2) Filtração resíduo 3) Concentração

Figura 17 : Fluxograma da preparação dos extratos de Eleutherine bulbosa

A seleção do extrato fracionado neste estudo foi realizada levando em consideração ensaios de toxidade previamente realizados, análises de cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) e literatura.

4.2 ANÁLISES, FRACIONAMENTOS CROMATOGRÁFICOS E ISOLAMENTO

4.2.1 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DOS EXTRATOS

Os solventes utilizados para partições, cromatografias em coluna aberta e cromatografias em camada delgada possuem grau comercial de pureza, sendo previamente destilados no Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia, Coordenação de Tecnologia e Inovação, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia.

Para a Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC), foram utilizadas cromatofolhas de sílica gel 60, com indicador de fluorescência UV 254 nm, com 0,20 mm de espessura (MACHEREY – NAGEL - MN). Para as revelações das cromatofolhas foram utilizados: solução de sulfato de cério IV (VETEC), solução de cloreto férrico (VETEC), solução de anisaldeído sulfúrico, vapores de Iodo, solução metanólica de KOH a 10% e reagente de Dragendorff para a revelação de alcaloides, com o intuito de realizar uma investigação fitoquímica completa (tabela 1). Também foi utilizado irradiação no UV (254 e 365 nm). Esse procedimento visou escolher o melhor sistema de eluição, para a realização dos fracionamentos cromatográficos, e a obtenção do perfil químico preliminar da espécie. A aplicação das amostras nas cromatoplacas foi realizada com o uso de tubos capilares de vidro de 75 mm de comprimento e diâmetro interno e externo de 1,0 mm e 1,5 mm, respectivamente.

Reveladores Classes Químicas

Solução de Sulfato de Cério IV Terpenoides

Solução de Anisaldeído Sulfúrico Diversas classes químicas (açúcares, esteroides, terpenos)

Solução de Cloreto de Ferro III Substâncias fenólicas

Solução de Cloreto de Alumínio Alcaloides

Solução de DPPH Substâncias antioxidantes

Solução de Hidróxido de Potássio Quinonas e Antraquinonas 10% em MeOH

Solução de Dragendorff Alcaloides e outras substâncias nitrogenadas

UV 254 nm Derivados antraquinônicos, cumarinas, alcaloides

UV 365 nm Substâncias fenólicas, cumarinas, antraquinonas

4.2.2 PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO

Após a análise em CCDC, o extrato metanólico do bulbo foi submetido à partição. Para tal procedimento, 10 g de extrato bruto metanólico foram solubilizados em 500 mL de solução de MeOH e água destilada (7:3), transferidos para um funil de separação de 2 L e extraídos pelo menos três vezes com 500 mL de cada um dos solventes utilizados na partição, totalizando 1,5 L de cada solvente utilizado no processo. A partição foi realizada com diclorometano (DCM) e acetato de etila (AcOEt). Esse procedimento visou uma separação preliminar dos constituintes químicos para facilitar o fracionamento cromatográfico do mesmo (Figura 18).

Extrato metanólico de Eleutherine bulbosa (10 g)

Solução de MeOH e H 2O destilada 7:3 (500 mL)

Extrato solubilizado

DCM (3X)

Fase DCM Fase DCM (Emulsão) (3,139 g) (0,547 g) Fase Hidroalcoólica

AcOEt (3X)

Fase AcOEt Fase Hidroalcoólica (1,504 g) (4 g)

Figura 18 : Fluxograma da partição do extrato metanólico de Eleutherine bulbosa

4.2.3 FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS E ISOLAMENTO

Para o fracionamento dos extratos, foram realizadas cromatografia em coluna aberta, utilizando como fases estacionárias Sílica Gel e Florisil.

Após a partição do extrato metanólico do bulbo, ambas as fases DCM e AcOEt foram analisadas por CCDC e posteriormente fracionadas, e suas frações também foram submetidas a CCDC para o posterior refracionamento. As frações foram reveladas com Vapores de Iodo, Anisaldeído Sulfúrico, Cloreto Férrico, Sulfato de Cério IV, Reagente de Dragendorff e KOH 10%.

Fracionamento da fase DCM do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa :

Utilizou-se para este fracionamento coluna cromatográfica aberta com altura da fase estacionária x diâmetro interno de 47 cm x 2 cm, Florisil como fase estacionária e eluição com gradiente de sistemas DCM 100%, DCM/MeOH (95:5), DCM/MeOH (9:1), DCM/MeOH (8:2), DCM/MeOH (7:3), DCM/MeOH (1:1) e MeOH 100%, fase normal. A massa de amostra utilizada foi de 2 g para 100 g de Florisil, numa proporção de 1g de amostra para 100g de Florisil (1:50), cada sistema de eluição consistiu em uma quantidade de 400 mL. Foi preparada pastilha com Florisil para a inserção do material na coluna. Foram recolhidas 70 frações com aproximadamente 27 mL cada, que foram analisadas posteriormente por CCDC, reunidas, e analisadas novamente.

Fracionamento da fase AcOEt + fase DCM (emulsão) do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa :

Utilizou-se para este fracionamento coluna cromatográfica aberta de vidro e sem torneira, com altura da fase estacionária x diâmetro interno de 32 cm x 2,5 cm, Florisil como fase estacionária e eluição com gradiente de sistemas DCM/MeOH (95:5), DCM/MeOH (9:1), DCM/MeOH (8:2), DCM/MeOH (7:3), DCM/MeOH (1:1), MeOH

100%, MeOH/Acetona 1:1, Acetona/H 2O 1:1 e H 2O 100%, fase normal. A massa de amostra utilizada foi de 1,35g para 68g de Florisil, numa proporção de 1 g de amostra para 50 g de Florisil (1:50), cada sistema de eluição consistiu em uma quantidade de 120 mL. Foi preparada pastilha com Florisil para a inserção do material na coluna. Foram recolhidas 86 frações com aproximadamento 27 mL cada, que foram analisadas

posteriormente por CCDC, reunidas, e analisadas novamente para posterior refracionamento.

Fracionamento da fração 06 – 12 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa :

Utilizou-se para este fracionamento coluna cromatográfica aberta de vidro com torneira, possuindo altura da fase estacionária x diâmetro interno de 34 cm x 1,5 cm, Sílica Gel como fase estacionária, e eluição com gradiente de sistemas Hex/DCM 6:4, Hex/DCM 1:1, Hex/DCM 4:6, Hex/DCM 3:7, DCM 100 %, DCM/MeOH 99:1, DCM/MeOH 98:2, DCM/MeOH 97:3, DCM/MeOH 95:5 e DCM/MeOH 9:1, DCM/MeOH 7:3 e MeOH 100%, fase normal. A massa utilizada de amostra foi de 345,9 mg para 28 g de sílica, numa proporção de 1 g de amostra para 80 g de sílica (1:80), e cada sistema de eluição consistiu em uma quantidade de 150 mL. Foi preparada pastilha com Sílica e amostra para a inserção da mesma na coluna. Foram recolhidas 59 frações em frascos de aproximadamente 10 mL cada, que foram analisadas posteriormente por CCDC.

Fracionamento da fração 14 – 20 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa :

Utilizou-se para este fracionamento coluna cromatográfica aberta de vidro com torneira, possuindo altura da fase estacionária x diâmetro interno de 28 cm x 1 cm, Síliga Gel como fase estacionária, e eluição com gradiente de sistemas DCM 100%, DCM/MeOH 99:1, DCM/MeOH 98:2, DCM/MeOH 97:3, DCM/MeOH 95:5, DCM/MeOH 9:1, DCM/MeOH 8:2, DCM/MeOH 7:3, DCM/MeOH 1:1 e MeOH 100%, fase normal. A massa utilizada de amostra foi de 150 mg para 12 g de Sílica, numa proporção de 1g de amostra para 80g de sílica (1:80), e cada sistema de eluição consistiu em uma quantidade de 48 mL. Foi preparada pastilha com Sílica e amostra para a inserção da mesma na coluna. Foram recolhidas 47 frações em frascos de aproximadamente 10 mL cada, que foram analisadas por CCDC.

Fracionamento da fração 21 – 38 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa :

Utilizou-se para este fracionamento coluna cromatográfica aberta de vidro com torneira, possuindo altura da fase estacionária x diâmetro interno de 24,5 cm x 0,8 cm,

Sílica Gel como fase estacionária, e eluição com gradiente de sistemas DCM 100 %, DCM/MeOH 99:1, DCM/MeOH 98:2, DCM/MeOH 97:3, DCM/MeOH 95:5, DCM/MeOH 9:1, DCM/MeOH 8:2, DCM/MeOH 7:3, DCM/MeOH 1:1 e MeOH 100%, fase normal. A massa utilizada de amostra foi de 90,4 mg para 8 g de Sílica, numa proporção de 1 g de amostra para 80 g de sílica (1:80), e cada sistema de eluição consistiu em uma quantidade de 62 mL. Foi preparada pastilha com sílica e amostra para inserção da mesma na coluna. Foram recolhidas 14 frações em frascos de aproximadamente 27 mL cada, que foram analisados por CCDC.

As substâncias isoladas foram identificadas/elucidadas por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e de 13 C (mono e bidimensionais), e análise em Espectrometria de Massas. As análises dos espectros de Ressonância Magnética Nuclear foram realizadas em equipamento de 300 MHz (BRUKER) e as de Massas por Ionização por Eletrospray (ESI) em instrumento micrOTOF-Q (BRUKER).

O fluxograma geral de fracionamento e refracionamento dos extratos analisados neste estudo, podem ser visualizados a seguir (Figura 19).

Bulbo

Precipitação de cristais e lavagem com hexano Cr-Bulbo Hexano MeOH CCDC

Partição

Fase Fase DCM Fase Fase DCM (emulsão) AcOEt Hidroalcoólica Fr 06 - 12 Fr 14 - 20 Fr 21 - 38 CC de Sílica CC de Sílica CC de Sílica CC de Florisil 59 frações 47 frações 14 frações CC de Florisil 70 frações 86 frações CCDC CCDC CCDC CCDC Frações reunidas Frações reunidas Frações reunidas Frações reunidas CCDC Frações reunidas 22 frações 10 frações 28 frações 24 frações 18 frações

Fr 01+02 Fr 29+30 Fr 34+35 Fr 07+08

Fr 51-53 Fr 55-60 Fr 61+62

Figura 1 9: Fluxograma geral de fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa .

4.3 ENSAIOS BIOLÓGICOS

4.3.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

A avaliação da atividade antioxidante dos extratos (0,5 mg/mL) foi realizada utilizando os ensaios quantitativos com o 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH) e com o complexo Fe 3+ /1,10-Fenantrolina 0,25%, e os resultados obtidos foram comparados em termo de equivalência com os obtidos do padrão ácido ascórbico. A concentração equivalente do ácido ascórbico foi obtida pela interpolação dos dados entre a variação da absorbância e a concentração do ácido ascórbico representados em uma curva analítica. Para a construção desta curva analítica foram preparadas em seis microtubos, alíquotas diluídas do padrão ácido ascórbico. A quantificação foi realizada através da leitura da absorbância em espectrofotômetro. Foram usados para a curva do DPPH 10 µL dessas alíquotas diluídas em seis novos microtubos, adicionando em seguida 990 µL de DPPH para posteriormente serem submetidas à leitura em espectrofotômetro em um comprimento de onda de 517 nm, por 30 minutos. Para a curva do Fe 3+ foram utilizados 10 µL dessas alíquotas diluídas em seis novos microtubos também e então adicionado a eles 10 µL de Fe 3+ e 980 µL de 1,10-fenantrolina, 1 hora depois essas alíquotas foram submetidas também a leitura em espectrofotômetro em um comprimento de onda de 508 nm.

A solução do DPPH foi preparada no dia do experimento dissolvendo aproximadamente 3 mg do reagente em 100 mL de metanol (30 µg/mL). O ácido ascórbico foi preparado dissolvendo 44 mg do reagente em 50 mL de água deionizada (44 µg/mL). Para o procedimento utilizando DPPH como agente oxidante, foram adicionados 10 µL da solução do extrato e 990 µL da solução de DPPH, após 30 minutos foram realizadas a leitura em espectrofotômetro em um comprimento de onda de 517 nm. O preparo do branco consistiu em adicionar 10 µL de água deionizada com 990 µL de DPPH. Para o procedimento usando Fe 3+ como agente oxidante, foram utilizados 10 µL de extrato acrescidos de 10 µL de uma solução padrão de Fe 3+ e 980 µL de 1,10-fenantrolina. A leitura foi realizada após 1 hora em espectrofotômetro em um comprimento de onda de 508 nm. O preparo do branco consistiu em adicionar 10 µL de água deionizada, 10 µL da solução padrão de Fe 3+ e 980 µL de 1,10-fenantrolina. Os ensaios foram realizados em triplicata.

4.3.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

Neste estudo foram realizados ensaios microbianos para as seguintes bactérias: Aeromonas hydrophila (ATCC 7966) Edwardsiella tarda (ATCC 15947), Escherichia coli (ATCC 11775), Pseudomonas fluorescens (ATCC 13525), Serratia marcescens (ATCC 13880), Staphylococcus aureus (ATCC 12600), Salmonella enteritidis (ATCC 13076), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) , Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Enterobacter clocae (ATCC 13047) , Morganella morganii (ATCC 8019), Propionibacterium acnes (ATCC 6919), Yersinia enterocolitica (ATCC 9610) , Enterococcus faecalis (ATCC 29212) e Acinetobacter baumanii (ATCC 19606), cedidas pela Coleção de Microrganismos de Referência em Vigilância Sanitária – CRMVS, FIOCRUZ-INCQS, Rio de Janeiro, RJ. Estas bactérias foram selecionadas por serem considerados microrganismos patógenos humanos de alta significância médica (CLARRIDGE et al., 1980; TURNBULL et al., 1979; TILDEN et al., 1996; GERSHMAN et al., 2008; O’RYAN, PRADO & PICKERING, 2005; OYOFO et al., 2002; TELZAK et al., 1990; MARAGAKIS et al., 2008).

A atividade antibacteriana foi avaliada pelo método de microdilui ção em caldo segundo orientações propostas por CLSI (2002). Os extratos, fases e frações foram primeiramente solubilizados em DMSO a 5%, em seguida, foram realizadas diluições sucessivas dos extratos e fases a partir da concentração de 1000 μg/mL a 7,8 μg/mL, e das substâncias a partir da concentração de 500 a 3,9 μg/mL. Para a realização do ensaio, o inóculo foi previamente ajustado em espectrofotômetro, obtendo-se uma absorbância de 0,08 em 625 nm (o que equivale à escala 0,5 de Mc Farland), este então foi diluído 20 vezes. Assim, o volume final de bactéria aplicado em cada poço foi de aproximadamente 5 x 10 4 UFC. Em seguida foram adicionados em cada um dos poços (microplaca de 96 poços) 8 μL desta solução de inóculo e 100 μL de cada concentração do extrato.

Para o controle negativo foram utilizados 100 μL de caldo Müeller Hinton contendo 5% de DMSO e 8 μL de inóculo. Para o controle positivo foram utilizados 100 μL do antibiótico oxitetraciclina na concentração de 125 μg/mL e 8 μL de inóculo. Todos os testes foram realizados em triplicata. Em seguida a placa foi incubada à temperatura e tempo adequados para cada micro-organismo (30 ou 37 oC). Cada

microplaca foi avaliada através da leitura espectrofotométrica em 625 nm. Os dados obtidos foram processados utilizando-se o programa estatístico Origin 8.

4.3.3 ENSAIO DE TOXICIDADE UTILIZANDO Artemia salina

O ensaio de atividade tóxica foi realizado de acordo com o desenvolvido por Meyer e colaboradores (1982) com adaptações. Para uma triagem inicial, os extratos foram testados, em triplicata, na concentração de 1000 µg/mL. Após esses resultados, prosseguiu-se com o teste apenas com os extratos que foram ativos, ou seja, apresentaram toxidade para mais de 50% dos indivíduos. Neste teste os ovos de Artemia salina Leach foram eclodidos (náuplios) durante 48h em água do mar sintética (38 g/L de sal marinho) sob aeração e iluminação artificial. Os extratos ativos foram testados nas concentrações de 1000, 500, 250 e 125 µg/mL e solubilizados em DMSO 25%. Em uma placa de 24 poços transferiu-se dez larvas para cada poço contendo os extratos. Como controle negativo do teste utilizou-se DMSO 25% e solução salina. Após 24h sob iluminação artificial mortos e realizou-se a contagem dos indivíduos mortos em cada poço, o cálculo da média e desvio padrão da quantidade de indivíduos mortos, e as médias apresentadas em porcentagem.

4.3.4 ENSAIO ANTITUMORAL

4.3.4.1 Linhagens Celulares

Foram utilizadas linhagens de células neoplásicas: HCT116 (carninoma colorretal humano), MCF-7 (carcinoma de mama), SK-Mel-28 (melanoma humano) e uma linhagem não neoplásica: MRC-5 (fibroblasto de pulmão humano). Estas foram cultivadas em meio DMEM, suplementadas com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos, mantidas em estufa a 37ºC e atmosfera contendo 5% de CO 2. As amostras foram dissolvidas em DMSO na concentração estoque de 5 mg/mL paras as substâncias isoladas e de 20 mg/mL para os extratos brutos, e posteriormente separadas para teste nas concentrações de 50 µg/mL para extratos brutos e 20 µM para substâncias isoladas.

4.3.4.2 Teste do Alamar blue

O Alamar Blue é um indicador fluorescente/colorimétrico com propriedades redox, e em células em proliferação o Alamar Blue é reduzido. A forma oxidada é azul e não fluorescente (indicando célula não viável) e a forma reduzida é rósea e fluorescente (indicando célula viável).

O teste do Alamar Blue foi realizado conforme metodologia descrita por Ahmed e colaboradores (1994) com o intuito de se analisar a viabilidade celular das células testadas na presença de diferentes concentrações das substâncias e dos extratos testados. Células cultivadas em garrafa de cultura com meio DMEM foram contadas em câmara de Neubauer e plaqueadas em placas de 96 poços. A cada poço foram adicionadas 1 x

10 4 células em 200 µL de meio de cultura. A placa foi incubada por 24h em estufa a 37 o C com atmosfera de 5% de CO 2. Após este tempo, as células foram tratadas por 72 h. Como controle positivo, foi utilizada a Doxorrubicina a 5 μg/mL. O grupo controle recebeu no poço a mesma quantidade de DMSO da maior concentração das substâncias e extratos. Após 24 h de tratamento, 10 mL da solução de uso de Alamar Blue (solução estoque a 0,4% 1:5 em meio de cultura sem soro fetal bovino) foi adicionada em cada poço da placa. Após 3 h de exposição ao Alamar Blue, a placa foi retirada da estufa meia hora antes do término e a fluorescência foi medida usando-se um leitor de placas de Elisa (Beckman e Coulter®).

Os resultados foram analisados segundo suas médias e respectivos erros-padrão. Seus respectivos desvios foram realizados a partir da regressão não-linear no programa Graph Prism (versão 5).

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Obtenção dos extratos

Os extratos foram produzidos e armazenados no Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (LABB – INPA) e posteriormente submetidos a testes e análises. As massas obtidas da extração podem ser visualizadas na tabela 2. As maiores massas de extrato obtido foram oriundas da extração hexânica e metanólica do bulbo.

Tabela 2 – Massa dos extratos de Eleutherine bulbosa e seus respectivos rendimentos ,

produzidos e armazenados no Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia/ COTI-INPA

Solvente utilizado e Rendimento (R) Material Massa Hex (g) R (%) DCM (g) R (%) MeOH (g) R (%) H2O (g) R (%) Vegetal inicial (g)

Folhas 20,46 - - 0,499 2,43 1,841 8,99 0,212 1,03

Flores 2,15 - - 0,072 3,34 0,245 11,39 0,295 13,72

Bulbos 156,21 1,954 1,25 - - 12,089 7,73 - -

5.2 Análises Cromatográficas, Isolamento e Elucidação Estrutural

5.2.1 Análise por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa e RMN

Todos os extratos brutos foram submetidos à análise de CCDC, a fim de obter-se um perfil químico. Abaixo é descrita a análise de CCDC dos extratos selecionados para fracionamento e de substâncias. As interpretações das revelações com CCDC foram feitas de acordo com Wagner, Bladt & Zgainski, 1984.

5.2.1.1 Cristais do extrato bruto hexânico

Em análise visual do extrato, observou-se a presença de estruturas cristalinas à parte do extrato bruto. Foi realizada uma lavagem com hexano para precipitação dos cristais, onde estes foram separados e postos para secar em temperatura ambiente

(figura 20) obtendo-se uma amostra 50 mg de massa, posteriormente submetida à análise de CCDC para verificar o grau de pureza da substância.

Figura 20 – Estruturas cristalinas originárias do extrato hexânico do bulbo de Eleutherine bulbosa.

5.2.1.2 Análise em CCDC e elucidação estrutural do CR-Bulbo

A substância em questão foi denominada CR-Bulbo até a sua identificação. A análise de CCDC dos cristais revelou que a amostra encontrava-se em mistura (figura 21). Puderam-se observar fluorescências persistentes em ambos os comprimentos de onda do UV (254 nm e 365 nm, respectivamente), indicando a possível presença de derivados antraquinônicos e substâncias fenólicas. A revelação com anisaldeído indicou a possível presença de classes de terpenos, além de uma

complexidade de substâncias que torna difícil inferir as possíveis classes de metabólitos presentes na amostra. Na revelação com cloreto férrico, observou-se a presença de substâncias aromáticas na amostra. O DPPH revelou a presença de substância com potencial antioxidante. Já a revelação com Dragendorff não se mostrou positiva para a presença de alcaloides, contudo, houve a aparição de uma mancha de cor preta na placa, incomum para este revelador, e por isso não se pôde inferir a classe de metabólito que causou essa reação. A revelação com KOH 10% revelou a forte presença de classes de quinonas, representadas pelas manchas de cor vermelha e violeta. Na revelação com vapores de iodo, foi revelada a presença de substâncias com duplas ligações em sua estrutura. Por fim, na revelação com sulfato cérico, revelou manchas de cores avermelhadas que são indicativas da presença de terpenos (mas não houve a revelação de manchas roxas que são mais comuns para a presença de terpenos). E foram reveladas manchas de cor verde, que não são características de nenhuma classe química específica. A fluorescência de cor amarela na placa 2 é típica de classes como chalconas e flavonoides, e quando revelada com DPPH, revela uma substância com potencial antioxidante, característica comumente encontrada em substâncias fenólicas, o que reforça a possibilidade de esta mancha ser uma substância fenólica. É interessante ressaltar ainda que os cristais, quando testados no ensaio antioxidante, apresentaram baixo potencial. Essa observação sugere que as substâncias fluorescentes apresentem potencial antioxidante quando não estão em mistura, provavelmente por serem compostos minoritários da amostra.

A análise em CCDC indica a presença de um constituinte majoritário, o qual apresenta uma intensa absorção no comprimento de onda 254 nm, revelou com KOH e com o vapor de iodo, sendo que tudo isso indica se tratar de uma substância aromática, possivelmente da classe das antraquinonas.

A análise por espectrometria de massas por ESI/MS [M] + revelou íon pico molecular majoritário de 273.11 m/z , correspondendo à fórmula molecular de C 16 H16 O4. No espectro de RMN de 1H (300 MHz) do CR-Bulbo (Figura 23), foram observados sinais típicos de hidrogênios de metilas nos sinais em δ 1,33 (3H, d, J = 6,05, 3H) e δ 1,51 (3H, d, J = 6,6, 3H), sinais de hidrogênios de metilenos em δ 2,17 (ddd, J = 18,25; 10,24; 3,8, 1H) e 2,72 (dt, J = 18,25; 2,5, 1H). O sinal de singleto em δ 3,97 (3H) representa um sinal bem característico de metoxila, radical comumente presente nas substâncias isoladas desta espécie. Os sinais em δ 7,24 (d, J = 7,54), δ 7,61 (t, J = 8,0) e

δ 7,68 (d, J = 7,54) são sinais típicos de hidrogênios ligados a anel aromático. Por meio das análises dos espectros de 13 C (Figura 24) e HSQC (Figura 25), pôde-se definir que a substância em questão possui três carbonos metílicos (CH 3), sendo um ligado à oxigênio

(metoxila), um carbono metilênico (CH 2), cinco carbonos metínicos e sete carbonos quaternários (C), totalizando 16 carbonos na estrutura.

No mapa de contorno COSY (Figura 26) e no mapa de contorno HMBC (Figura 27), pôde-se observar as correlações de carbono e hidrogênio típicas de anéis ou ciclos, em específico as correlações entre os sinais δ 7,24 (d, J = 7,54), δ 7,61 (t, J = 8,0) e δ 7,68 (d, J = 7,54). Por estes dados (Tabela 3), e em comparação com dados da literatura (HARA et al., 1997; KUSUMA et al., 2010; SHIBUYA et al., 1997), a substância CR- Bulbo foi identificada como sendo a naftoquinona eleuterina em mistura (Figura 22).

A naftoquinona eleuterina já foi isolada de E. bulbosa e sinonímias em diversos trabalhos, tornando ela um potencial marcador quimiotaxonômico da espécie. Ainda, ela apresentou comprovados potenciais biológicos como antimicrobiano, antifúngico, ação vaso dilatadora (útil para tratamento de doenças do coração) e inibição da topoisomerase II humana (útil para inibição da replicação de células cancerígenas) (HARA et al., 1997; KOMURA et al., 1983; PHOEM & VORAVUTHIKUNCHAI, 2012; PARAMAPOJN et al., 2008; ZHENGXIONG et al., 1986; XU et al., 2006).

1 2 3 4

5 6 7 8 9

Figura 21 - Análise em CCDC do cristal originário do extrato hexânico do bulbo de E. bulbosa . Eluição em Hex/Acetona (7:3). Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – cloreto férrico; 5 – DPPH; 6 – Dragendorff; 7 – KOH 10 %; 8 – vapor de iodo; 9 – sulfato cérico.

1 13 Tabela 3 - Dados de RMN de H, C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl3) do CR-Bulbo.

DEPT δ H Posição δ C COSY HMBC 135 o (mult., J (Hz) 1 70,19 CH 4,82 (m) H-Me-1 - 3 68,65 CH 3,55 (m) H-Me-3, H-4 - 2,72 (dt, J = 18,25; 2,5), 4 29,82 CH H-3, H-4 C-11, C-12 2 2,17 (ddd, J = 18,25, 10.4; 3,8) 5 183,68 C - - C-8, C-14, 6 118,91 CH 7,68 (d, J = 7,54) H-7 C-5, C-10 C-8, C-7, C- 7 134,50 CH 7,61 (t, J = 8,0) H-6, H-8 13, C-9 8 117,69 CH 7,24 (d, J = 7,54) H-7 C-6, C-14 9 159,30 C - - - 10 183,95 C - - - 11 139,85 C - - - 12 148,60 C - - -

Continuação da Tabela 3 13 134,66 C - - - 14 120,15 C - - -

Me-1 21,17 CH 3 1,33 (d, J = 6,05) H-1 C-1

Me-3 20,70 CH 3 1,51 (d, J = 6,6) H-3 C-3, C-12 Me-O 56,37 OCH 3 3,97 (s) - C-9

Me-O H3C O Me-1 O H CH3

9 10 H COSY 8 11 1 HMBC 14 O 7 13 3 H 5 12 4 6 H CH H 3 O HH Me-3

Figura 22 – Estrutura da eleuterina e suas correlações no COSY e HMBC.

1 Figura 23 – Espectro de RMN de H da eleuterina em CDCl3 (300 MHz).

13 Figura 24 – Espectro de RMN de C da eleuterina em CDCl 3 (300 MHz).

Figura 25 – Mapa de contorno HSQC da eleuterina em CDCl 3 (300 MHz).

Figura 26 – Mapa de contorno COSY da eleuterina em CDCl 3 (300 MHz).

Figura 27 – Mapa de contorno HMBC da eleuterina em CDCl 3 (300 MHz).

5.2.1.3 Fracionamento do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa

A análise por CCDC do extrato metanólico do bulbo mostrou, a princípio, conter substâncias fenólicas e diferentes classes de terpenos (Figura 28). Na placa 1 e placa 2, pode-se visualizar fluorescências persistentes de cor azulada em ambos os comprimentos de onda, típico da presença de cumarinas. Na placa 3, os vapores de iodo revelaram a presença de substâncias com ligações duplas conjugadas em suas estruturas, típicos de substâncias fenólicas e seus derivados. Na placa 4, a revelação com cloreto férrico mostrou no centro da placa uma coloração azulada, e no topo da placa uma coloração vermelha-marrom, característicos de taninos, além de forte coloração negra na origem, típica de substâncias aromáticas. Na placa 5, no topo da placa pode-se visualizar na revelação com sulfato cérico, manchas roxas características de terpenos. Na placa 6, a revelação com anisaldeído sulfúrico revelou manchas de cor roxa e avermelhada, indicando a presença de diferentes classes de terpenos.

A análise por CCDC do extrato metanólico do bulbo revelou a presença de classes de substâncias aromáticas, diferentes classes de terpenos, além de derivados antraquinônicos. Posteriormente, esse extrato foi submetido à partição líquido-líquido, para a melhor análise de seus componentes, e as fases analisadas por CCDC, como indicado no fluxograma a seguir (Figura 29). As massas utilizadas posteriormente para realizar o fracionamento são diferentes das obtidas, pois uma parte da massa de cada fase obtida na partição foi separada e armazenada para eventuais testes e análises. A fase AcOEt e a fase DCM (emulsão) foram unidas por apresentarem uma grande similaridade na análise de CCDC, com isso, uma parte da amostra dessas fases unidas também foi separada para eventuais análises. A fase hidroalcoólica foi analisada por CCDC, porém, não foi fracionada, e com isso sua massa inicial se manteve. No final, foi selecionada para fracionamento foram fase DCM (emulsão) + fase AcOEt (1,351 g) e a fase DCM (2 g) (tabela 4).

1 2 3 4 5 6

Bulbo

Extrato MeOH

Partição

Fase Fase DCM Fase Fase DCM (emulsão) AcOEt Hidroalcoólica (3,139 g) (0,547 g) (1,504 g) (4 g)

CCDC

Figura 29 – Fluxograma parcial do fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa . Fases da partição líquido -líquido.

Rendimento em Massa Massa relação à massa reserva para Massa final para Fase inicial do extrato bruto eventuais fracionamento (g) (g) (10 g) (%) análises (g)

Fase DCM (emulsão) 0,547 5,47% 0,200 0,347*

Fase DCM 3,139 31,39% 1,139 2 Fase AcOEt 1,504 15,04% 0,300 1,204*

Fase Hidroalcoólica** 4 40% 4 4

Fase DCM (emulsão) + 1,551 - 0,200 1,351 Fase AcOEt

*Massas de Fases posteriormente unidas ** Fase não fracionada

5.2.1.4 Análise e Fracionamento das Fases da partição líquido-líquido

Todas as fases foram submetidas à análise por CCDC. A fase hidroalcoólica foi analisada separadamente por apresentar um grau de polaridade mais alto em relação às outras fases. A fase DCM (Emulsão) e a fase AcOEt apresentaram alta similaridade na análise por CCDC, por isso, estas fases foram unidas e posteriormente fracionadas. A análise por CCDC da fase DCM foi refeita com um sistema mais adequado e com mais reveladores, para melhor visualizar as classes químicas presentes. A fase hidroalcoólica não apresentou uma grande diversidade de classes químicas quando revelada com os diversos reveladores, portanto, esta não foi fracionada.

A análise por CCDC das fases, no geral, indicou a presença de classes de terpenos, flavonoides (na revelação com cloreto de alumínio) e antraquinonas. A fase DCM (FD) e a fase DCM (emulsão) (FDE) + fase Acetato (FA) se mostraram as fases mais interessantes, portanto, estas foram selecionadas para fracionamento.

O fracionamento gerou 70 frações para a fase DCM (FD) e 86 frações para a fase DCM (emulsão) (FDE) + fase Acetato (FA). As frações foram analisadas por CCDC, e constatou-se que ainda se encontravam em considerável mistura. As frações de ambas as colunas, que se mostraram semelhantes entre si na CCDC, foram reunidas, reduzindo o número total de frações das duas fases para 28 frações e 18 frações, respectivamente. Na análise por CCDC, a FD se mostrou mais interessante do que a FDE + FA, por se mostrar mais diversa em relação às classes de metabólitos presentes, por isso, o foco no fracionamento foi para a fase DCM. Das frações da fase DCM, 7 frações se destacaram na análise por CCDC por se mostrarem bem interessantes, e destas, 3 foram mandadas para análise de RMN e 4 foram refracionadas por se mostrarem ainda em grande mistura. As frações refracionadas foram analisadas por CCDC, reunidas de acordo com a semelhança entre si, e as que se mostraram interessantes foram mandadas para análise em RMN (figura 30).

No final, foram caracterizadas, em mistura, sete substâncias da fase DCM e frações, denominadas: Fr 51-53 (FD) (42, 8 mg); Fr 55-60 (FD) (91,4 mg); Fr 61+62 (FD) (6,3 mg); Fr 01+02 (06-12) (19,5 mg); Fr 29+30 (06-12) (30 mg); Fr 34+35 (14- 20) (22,4 mg) e Fr 07+08 (21-38) (12 mg). No total, contando com a primeira substância isolada do extrato hexânico, foram caracterizadas oito substâncias, contudo, no tempo hábil do trabalho, apenas 5 foram elucidadas neste trabalho.

CCDC

Fase Fase DCM (emulsão) + Fase DCM AcOEt

CC de Florisil CC de Florisil

70 frações 86 frações

CCDC Frações reunidas

18 frações CCDC

Frações reunidas CCDC 28 frações

CCDC

Fr 06 - 12 Fr 14 – 20 Fr 21 – 38 Fr 51-53 Fr 55-60 Fr 61+62 (346 mg) (150 mg) (90,4 mg) (42,8 mg) (91,4 mg) (6,3 mg) CC de Sílica CC de Sílica CC de Sílica 59 frações 47 frações 14 frações

CCDC CCDC CCDC Frações reunidas Frações reunidas Frações reunidas

24 frações 22 frações 10 frações

Fr 01+02 Fr 29+30 Fr 34+35 Fr 07+08 (19,5 mg) (30 mg) (22,4 mg) (12 mg)

Figura 30 – Fluxograma do fracionamento do extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa . Fracionamento da FDE, da FD e o posterior fracionamento das frações da FD.

5.1.2.4 Análise das Frações da Fase DCM (FD)

5.2.1.5 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 51-53 (FD)

A análise por CCDC da fração Fr 51-53 (FD) apresentou fluorescências persistentes em ambos os comprimentos de onda de UV-254 nm e UV-365 nm, além de forte revelação no iodo indicando substâncias com duplas ligações, corroborando com a revelação com cloreto férrico, que indicou a presença de substâncias aromáticas. A coloração roxa visualizada no anisaldeído indicaria a presença de terpenos, porém, a revelação com sulfato cérico não apresentou indícios desta classe, não corroborando então para o indício de terpenos nas frações. Por fim, a revelação com KOH 10% demonstrou a presença de derivados de quinonas na amostra (Figura 31).

A análise por espectrometria de massas por ESI/MS [M+H] + revelou íon pico molecular majoritário de 419.1337 m/z , com fórmula molecular de C 21 H23 O9. No espectro de RMN de 1H (300 MHz) da fração Fr 51-53 (Figura 33), foram observados sinais típicos de hidrogênios de metilas na região entre δ 0,81 e δ 2,73, sinais de hidrogênios de metilenos em δ 3,50 e 3,70 e sinais de metinos na região entre δ 3,24 e 3,38. O dupleto em δ 4,99 (1H, J = 7,26 Hz) demonstra a presença de hidrogênio próximos à oxigênio. Na região entre δ 6,21 e 7,31, há sinais típicos de hidrogênios ligados a anéis aromáticos. Os demais hidrogênios não foram considerados como sendo da substância, tal como o sinal em δ 1,20, típico de metilas de graxas ou lipídios, comumente isoladas de materiais extraídos com solventes mais apolares como hexano e diclorometano.

Através das análises dos espectros de 13 C (Figura 34) e DEPT 135 o (Figura 35), pôde-se definir que a substância em questão possui sinais de dois carbonos metílicos

(CH 3), um sinal de carbono metilênico (CH 2), dez sinais carbonos metínicos e oito sinais de carbonos quaternários (C), totalizando 21 carbonos na estrutura.

A análise das correlações observadas nos mapas de contorno COSY (Figura 36), HSQC (Figura 37) e HMBC (Figura 38), permitiu correlacionar os deslocamentos químicos que confirmaram a presença de anéis aromáticos na estrutura, além de correlações que demonstraram a presença de hidrogênios típicos de açúcares, mais especificamente da região entre δ 3,24 e 3,38 do espectro de 1H. Por estes dados (Tabela

6), e em comparação com dados da literatura (GALLO et al., 2010), a substância Fr 51- 53 (FD) foi identificada como sendo o policetídeo eleuterinol-8-O-β-glicosídeo (Figura 32).

Esta substância foi previamente isolada por Gallo e colaboradores (2010), tornando este o segundo relato de isolamento deste policetídeo na literatura. Ainda, não há também relatos de ensaios biológicos com esta substância.

1 2 3 4

51-53 51-53 51-53 51-53

5 6 7

51-53 51-53 51-53

Figura 31 - Análise em CCDC das Frações Fr 51-53 da Fase DCM do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa . Eluição em DCM/MeOH 8:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – vapor de iodo; 4 – KOH 10 %; 5 – sulfato cérico; 6 – anisaldeído sulfúrico; 7 – cloreto férrico

1 13 Tabela 5 – Dados de RMN de H, C e correlações heteronucleares (300 MHz, DMSO-d6) da Fr 51-53 (FD), eleuterinol-8-O-β-glicosídeo. δ H Posição δ C DEPT 135 o COSY HMBC (mult., J (Hz) 2 163,86 C - - - 3 112,19 CH 6,21 (s) - C-2, C-4a 4 178,70 C - - -

Continuação da Tabela 5 4a 117,10 CH - - - 5 134,64 C - - - C-10b, C-6a, C-4a, 6 125,61 CH 7,31 (s) - C-10a, C-9 6a 138,22 C - - - C-8, C-10, C-10a, 7 103,31 CH 6,80 (d, J = 2,05) - C-9 8 158,59 C - - - C-8, C-6, C-10a, 9 101,48 CH 6,90 (d, J = 2,05) - C-7 10 156,82 C - - - 10a 108,78 C - - - 10b 156,47 C - - -

Me-2 19,58 CH 3 2,38 (s) - -

Me-5 23,07 CH 3 2,73 (s) - C-5, C-6, C-4a 1’ 100,01 CH 4,99 (d, J = 7,26) H-2’ C-8 2’ 73,29 CH 3,29 (m) H-1’ - 3’ 77,13 CH 3,38 (m) - - 4’ 69,66 CH 3,24 (m) - - 5’ 76,73 CH 3,31 (m) - - 6’ 60,64 CH 3,5-3,70 (m) H-6’ - 2

COSY

HMBC O CH3

H 5 H 6 4 4a 3

6a 10b H 7 10a O 2 H OH CH3 H 10 8 6’ O 9 OH HO 4’ H O 5’ H 2’ 1’ HO 3’ OH H

Figura 32 – Estrutura do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo e suas correlações no COSY e HMBC.

1 Figura 33 – Espectro de RMN de H do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).

13 Figura 34 – Espectro de RMN de C do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).

o Figura 35 – Espectro de DEPT 135 do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).

Figura 36 – Mapa de contorno COSY do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).

Figura 37 – Mapa de contorno HSQC do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).

Figura 38 – Mapa de contorno HMBC do eleuterinol-8-O-β-glicosídeo em DMSO-d6 (300 MHz).

5.2.1.6 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 01+02 (06-12)

A fração Fr 01+02, originária do refracionamento da fração 06-12 da fase DCM, apresentou cromóforos intensos em ambos os comprimentos de onda de UV-254 nm e UV-365 nm, sugerindo a presença de derivados antraquinônicos e substâncias aromáticas. Na revelação com anisaldeído sulfúrico, manchas de coloração esverdeada e roxa sugerem a presença de classes de terpenos, incluindo os presentes em óleos essenciais devido a coloração esverdeada. Na revelação com sulfato cérico, formas circulares de coloração marrom revelaram-se ao redor das amostras, não podendo então inferir o tipo de classe revelada através deste revelador. Na revelação com KOH 10%, não houve revelação de quinonas para a fração 01+02, somente para as frações posteriores, sendo representadas pelas colorações em vermelho e roxo. Na revelação com o cloreto férrico não houve revelação de substâncias aromáticas para a fração 01+02, somente para as frações posteriores (Figura 39).

A análise por espectrometria de massas por ESI/MS [M+H] + revelou íon pico 01+02 molecular majoritário de 245.0813 m/z , com fórmula molecular de C 14 H11 O4. No espectro de RMN de 1H (300 MHz) da fração Fr 01+02 (06-12) (Figura 41), pôde-se observar um dupleto em δ 1,74 (3H, J = 6,5) típico de hidrogênio de metila, além de um forte sinal de singleto em δ 4,12, característico de metilas ligadas à oxigênio. Na região entre δ 5,70 e 7,88, verificou-se a presença de sinais típicos de hidrogênios ligados a carbonos de anéis aromáticos.

Através das análises dos espectros de 13 C (Figura 42), DEPT 135 o (Figura 43) e HSQC (Figura 44), pôde-se definir que a substância em questão possui sinais de dois carbonos metílicos (CH 3), cinco sinais carbonos metínicos (CH 2) e 7 sinais de carbonos quaternários (C), totalizando 14 carbonos na estrutura. A ausência de carbonos metilênicos sugere uma estrutura química composta de anéis aromáticos onde predomina-se a presença de metinos na estrutura.

No mapa de contorno do COSY (Figura 45) e no mapa de contorno do HMBC (Figura 46), pôde-se correlacionar os deslocamentos químicos que confirmaram a presença de anéis aromáticos na estrutura, além de correlações que demonstraram carbonos quaternários ligados a oxigênio, como o carbono 1 no sinal em δ 170,60, o que justifica seu deslocamento elevado. Por estes dados (Tabela 7), e em comparação com dados da literatura (IEYAMA, GUNAWAN-PUTERI & KAWABATA, 2011;

SHIBUYA et al., 1997), a substância Fr 01+02 (06-12) foi identificada como sendo o naftaleno eleuterol (Figura 40).

Esta substância é comumente isolada nesta espécie e suas sinonímias ao redor do mundo, tendo sido isolada em diversos outros trabalhos já publicados, com comprovadas atividades biológicas como antifúngico e estimulante da circulação sanguínea (BIANCHI & CERIOTTI, 1975; HARA et al., 1997; KOMURA et al., 1983; ZHENGXIONG et al., 1986).

1 2 3

4 5 6

Figura 39 - Análise em CCDC da Fração Fr 01+02 do fracionamento da fração Fr 06-12 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa . Eluição em DCM/AcOEt 98:2. Reveladores: 1

– UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – KOH 10 %; 6 – cloreto férrico

1 13 Tabela 6 – Dados de RMN de H, C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl 3) da Fr 01+02 (06-12), eleuterol.

δ H Posição δ C DEPT 135 COSY HMBC (mult., J (Hz) 1 170,60 C - H - Me-3 - 3 77,41 CH 5,73 (q, J = 6,5) - Me-3, C-11, C-4, C-1 4 149,16 C - - - 5 156,56 C - - - 6 106,25 CH 6,93 (d, J = 7,6) H-7 C-12, C-8, C-5 7 126,60 CH 7,41 (t, J = 8,1) H-8, H-6 C-6, C-13, C-5 C-6, C-9, C-12, C-13, 8 123,64 CH 7,57 (d, J = 8,2) H-7 C-5 C-13, C-8, C-4, C-12, 9 116,51 CH 7,88 (s) - C-11 10 125,88 C - - 11 127,90 C - - 12 117,49 C - - 13 137,19 C - - Me-3 19,16 CH 3 1,74 (d, J = 6,5) H-1 C-3, C-11 Me-O 56,39 CH 3 4,12 (s) - C-6, C-5 OH 149,16 C 9,65 (s) - C-12, C-11, C-4

Me-O H3C O OH COSY CH3 Me-3 HMBC 4 H H 5 1 6 12 11 O 13 10 3 7 H 8 9 H H O

Figura 40 – Estrutura do eleuterol e suas correlações no COSY e HMBC.

1 Figura 41 – Espectro de RMN de H do eleuterol em CDCl 3 (300 MHz).

13 Figura 42 – Espectro de RMN de C do eleuterol em CDCl 3 (300 MHz).

o Figura 43 – Espectro de DEPT 135 do eleuterol em CDCl 3 (300 MHz).

Figura 44 – Mapa de contorno HSQC do eleuterol em CDCl 3 (300 MHz).

Figura 45 – Mapa de contorno COSY do eleuterol em CDCl 3 (300 MHz).

Figura 46 – Mapa de contorno HMBC do eleuterol em CDCl 3 (300 MHz). 71

5.2.1.7 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 29+30 (06-12)

A fração Fr 29+30, originária do refracionamento da fração 06-12 da fase DCM, também apresentou cromóforos intensos em ambos os comprimentos de onda de UV- 254 e UV-365 nm, típicos de substâncias aromáticas, e cromóforos de coloração amarela típicos de derivados antraquinônicos. No geral, esta fração apresentou classes de substâncias como quinonas, representadas por manchas azuladas na revelação com KOH 10%, classes de terpenos visto na revelação com anisaldeído sulfúrico representados por manchas roxas e esverdeadas, porém não houve indícios de terpenos na revelação com sulfato cérico. A revelação com cloreto férrico não apresentou manchas típicas de substâncias aromáticas (escuras e marrons), apenas as manchas amarelas persistentes da amostra.

A análise por espectrometria de massas por ESI/MS [M] + revelou íon pico molecular majoritário de 273.11 m/z , com fórmula molecular de C 16 H16 O4. Os dados espectrais desta substância possuem grande semelhança com a substância eleuterina, por esta ser sua forma “iso”. No espectro de RMN de 1H (300 MHz) da Fr 29+30 (06-12) (Figura 49), foram observados sinais típicos de hidrogênios de metilas nos sinais em δ 1,34 (3H, d, J = 6,05) e δ 1,54 (3H, d, J = 6,71), onde comprova-se a diferença na estrutura da eleuterina pela constante de acoplamento da metila em δ 1,54. Foi possível visualizar também sinais de hidrogênios de metilenos em δ 2,23 (ddd, J = 19,0; 10,2; 1,8) e 2,69 (dd, J = 19,0; 3,3). O sinal de singleto em δ 4,01 (3H) representa um sinal bem característico de metoxila. Os sinais em δ 7,28 (d, J = 8,0), δ 7,64 (t, J = 8,0) e δ 7,73 (dd, J = 8,0; 1,0) são sinais típicos de hidrogênios ligados a anel aromático. Através das análises dos espectros de 13 C (Figura 50) e DEPT 135 o (Figura 51) pôde-se definir que a substância em questão possui três carbonos metílicos (CH 3), sendo um ligado à oxigênio (metoxila), um carbono metilênico (CH 2), cinco carbonos metínicos e sete carbonos quaternários (C), totalizando 16 carbonos na estrutura.

Através das análises dos mapas de contorno COSY (Figura 52), HSQC (Figura 53) e no mapa de contorno HMBC (Figura 54), pôde-se observar as correlações de carbono e hidrogênio típicas de anéis ou ciclos, em específico as correlações entre os sinais δ 7,28 (d, J = 8,0), δ 7,64 (t, J = 8,0) e δ 7,73 (dd, J = 8,0; 1,0). Por estes dados (Tabela 8), e em comparação com dados da literatura (GALLO et al., 2010; HARA et al., 1997; MALHEIROS, 2008; SHIBUYA et al., 1997), a substância Fr 29+30 (06-12)

foi identificada como sendo a naftoquinona (Figura 48), justificando o fato de sua fórmula molecular e massa serem idênticas a da eleuterina.

A naftoquinona isoeleuterina, já foi isolada de E. bulbosa e sinonímias em diversos trabalhos, sendo considerada como um dos importantes isoeleuterina constituintes químicos do gênero. Ainda, ela apresentou comprovados potenciais biológicos como antimicrobiano, antifúngico, antiamebiana, moduladora de respostas imunes em células de camundongos, ação vaso dilatadora (útil para tratamento de doenças do coração) e atividade inibitória da replicação do vírus HIV (HARA et al., 1997; PHOEM & VORAVUTHIKUNCHAI, 2012; PARAMAPOJN et al., 2008; ZHENGXIONG et al., 1986; XU et al., 2006; NASCIMENTO et al., 2012; HONG et al., 2008).

1 29+30 2 29+30 3 29+30

4 29+30 5 29+30 6 29+30

Figura 47 - Análise em CCDC da Fração Fr 29+30 do fracionamento da fração Fr 06-12 da fase

DCM do extrato metanólico do bulbo E. bulbosa . Eluição em DCM/MeOH 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – KOH 10 %; 6 – cloreto férrico

Tabela 7 – Dados de RMN de 1H, 13 C e correlações heteronucleares (300 MHz, CDCl ) da Fr 29+30 (06-12), 3 isoeleuterina. DEPT δ H Posição δ C COSY HMBC 135 (mult., J (Hz) Me-3, C-3, C-12, 1 62,43 CH 3,98 (m) H-Me-1 C-11 H-4, H- 3 67,39 CH 5,01 (q, J = 6,5) Me-3, C-1 Me-3 2,23 (ddd, J = 19,0; 10,2; 1,8) C-11, C-12, C-3, 4 29,48 CH H-4, H-3 2 2,69 (dd, J = 19,0; 3,3) Me-3, C-5, Me-1 5 184,21 C - - - 6 119,06 CH 7,73 (dd, J = 8,0; 1,0) H-8, H-7 C-5, C-8, C-14 7 134,73 CH 7,64 (t, J = 8,0) H-8, H-6 C-13, C-9 C-6, C-14, C-9, 8 117,77 CH 7,28 (d, J = 8,0) H-7, H-6 C-10 9 159,68 C - - - 10 182,73 C - - - 11 147,97 C - - - 12 139,35 C - - - 13 134,00 C - - - 14 119,64 C - - - Me-1 19,75 CH 3 1,54 (d, J = 6,71) H-1 C-11, C-1 Me-3 21,52 CH 3 1,34 (d, J = 6,05) H-3 C-3, C-4 Me-O 56,44 CH 3 4,01 (s) C-9

Me-O Me-1 H3C O O CH3 COSY H H 9 10 HMBC 8 14 1 11 O 7 13 12 3 H 5 4 H 6 CH3 H HH Me-3 O

Figura 48 – Estrutura da isoeleuterina e suas correlações no COSY e HMBC.

1 Figura 49 – Espectro de RMN de H da isoeleuterina em CDCl 3 (300 MHz).

13 Figura 50 – Espectro de RMN de C da isoeleuterina em CDCl 3 (300 MHz).

o Figura 51 – Espectro de RMN de DEPT 135 da isoeleuterina em CDCl 3 (300 MHz).

Figura 52 – Mapa de contorno COSY da isoeleuterina em CDCl 3 (300 MHz).

Figura 53 – Mapa de contorno HSQC da isoeleuterina em CDCl 3 (300 MHz).

Figura 54 – Mapa de contorno HMBC da isoeleuterina em CDCl 3 (300 MHz).

5.2.1.8 Análise em CCDC e elucidação estrutural da Fr 34+35 (14-20)

A fração Fr 34+35, originária do refracionamento da fração 14-20 da fase DCM, também apresentou cromóforos intensos em ambos os comprimentos de onda de UV- 254 e UV-365 nm, típicos de substâncias aromáticas. No geral, esta fração apresentou antronas e antranois no KOH 10% quando visualizada no UV-365, representadas pela fluorescência amarela. Pode-se visualizar também classes de terpenos vistos na revelação com anisaldeído sulfúrico representados por manchas roxas, porém não houve indícios de terpenos na revelação com sulfato cérico. Por fim, a revelação com cloreto férrico apresentou fraca revelação de substâncias aromáticas (Figura 55).

A análise por espectrometria de massas por ESI/MS [M]+ revelou íon pico molecular majoritário de 257.0806 m/z, com fórmula molecular de C 15 H12 O4. No espectro de RMN de 1H (300 MHz) da Fr 34+35 (14-20) (Figura 57), foram observados sinais típicos de hidrogênios de metilas nos sinais em δ 2,37 (3H, s) e δ 2,70 (3H, s), bem como sinais característicos de hidrogênios ligados a anéis aromáticos em δ 6,18 (s), 6,55 (d, J = 2,2), 6,58 (d, J = 2,2) e 7,19 (s). Foi possível visualizar também sinais de hidrogênios bem desprotegidos em δ 10,11 (s) e 10,21 (s), característicos de hidroxilas ligadas à anéis aromáticos. Através das análises dos espectros de 13 C (Figura 58) e DEPT 135 o (Figura 59) pôde-se definir que a substância em questão possui dois carbonos metílicos (CH 3), quatro carbonos metínicos (CH) e nove carbonos quaternários (C), totalizando 15 carbonos na estrutura.

Através das análises dos mapas de contorno COSY (Figura 60), HSQC (Figura 61) e no mapa de contorno HMBC (Figura 62), pôde-se observar as correlações de carbono e hidrogênio que possibilitaram a interpretação da estrutura, como por exemplo, as correlações dos hidrogênios em δ 10,11 (s) e 10,21 (s) com os carbonos ligados aos hidrogênios em δ 6,18 (s), 6,55 (d, J = 2,2), 6,58 (d, J = 2,2) e 7,19 (s), comprovando a proximidade entre eles e a formação de um padrão de interação cíclico. Por estes dados (Tabela 8), e em comparação com dados da literatura (GALLO et al., 2010; HAN et al., 2008), a substância Fr 34+35 (14-20) foi identificada como sendo a naftopirona eleuterinol (Figura 56).

Eleuterinol já foi isolada em pesquisas anteriores (GALLO et al., 2008; HAN et al., 2008) dos bulbos de E. bulbosa e sua sinonímia E. americana, e poucos estudos averiguando os diversos potenciais desta substância foram realizados até hoje, onde, um dos poucos, realizado por Hong e colaboradores (2008), revelaram o potencial inibitório do eleuterinol frente à células Th do sistema imune através da inibição da transcrição genética das mesmas, e tal potencial pode ser de grande relevância na aplicação em ensaios anti-tumorais e anti-microbianos.

1 2 3

34+35 34+35

4 5 6 7

34+35

Figura 55 - Análise em CCDC da Fração Fr 34+35 do fracionamento da fração Fr 14-20 da fase DCM do extrato metanólico do bulbo de E. bulbosa . Eluição em DCM/MeOH 98:2. Reveladores: 1 – UV-254; 2 – UV-365; 3 – anisaldeído sulfúrico; 4 – sulfato cérico; 5 – cloreto férrico; 6 – KOH 10 %; 7 – KOH 10% (UV – 365)

1 13 Tabela 8 – Dados de RMN de H, C e correlações heteronucleares (300 MHz, DMSO-d6) da Fr 34+35 (14-20), eleuterinol.

DEPT δ H Posição δ C COSY HMBC 135 (mult., J (Hz) 2 163,61 C - - C-4, C-2, C-4a, 3 112,10 CH 6,18 (s) H-Me-2 Me-2 4 178,69 C - - - 4a 116,28 C - - - 5 134,44 C - - - C-7, C10a, C-4a, 6 124,88 CH 7,19 (s) H-Me-5 C-6a, C-10b, Me- 5 6a 138,73 C - - - C-9, C-10a, C-6, 7 101,26 CH 6,58 (d, J = 2,2) - C-6a, C-8 8 159,30 C - - - C-7, C-10b, C-10, 9 102,98 CH 6,55 (d, J = 2,2) - C-8, C-10a 10 156,91 C - - - 10a 107,19 C - - - 10b 156,81 C - - - Me-2 19,56 CH 3 2,37 (s) H-3 C-2, C-10b, C-3 C-4, C-10b, C-5, Me-5 23,11 CH 2,70 (s) H-6 3 C-6, C-4a

H H Me-5 HO 7 6 CH 8 3 6a 5

10a O 9 4a H 10 10b 4

OH O 3 2 H CH COSY Me-2 3 HMBC

Figura 56 – Estrutura do eleuterinol e suas correlações no COSY e HMBC.

1 Figura 57 – Espectro de RMN de H do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).

13 Figura 58 – Espectro de RMN de C do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).

o Figura 59 – Espectro de RMN de DEPT 135 do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).

Figura 60 – Mapa de contorno COSY do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).

Figura 61 – Mapa de contorno HSQC do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).

Figura 62 – Mapa de contorno HMBC do eleuterinol em DMSO-d6 (300 MHz).

5.3 ENSAIOS BIOLÓGICOS

5.3.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Os resultados da atividade antioxidante de todos os extratos estão presentes nas tabelas a seguir. A equivalência de cada resultado é comparada com os valores de equivalência do Ácido Ascórbico (AA). Os extratos foram testados utilizando duas metodologias, DPPH e Fe 3+/Fenantrolina, para que se tenha uma confiabilidade maior dos dados.

Tabela 9 – Resultados do teste de atividade antioxidante dos extratos brutos e da naftoquinona eleuterina, isolada do extrato hexânico do bulbo, de Eleutherine bulbosa utilizando o método com DPPH, mostrando valores de absorbância, equivalência do ácido ascórbico (AA), equivalência das amostras e seus respectivos desvios padrão.

Extrato ou substância |ABS | [AA] eq Equivalência testada 517 Eleuterina -0,005±0,009 0,034±0,069 12,543±118,837

Bulbo_Hexano 0,031±0,015 0,323±0,117 17,159±7,027 Bulbo_MeOH 0,033±0,007 0,344±0,056 14,762±2,183

Flor_DCM -0,014±0,006 0,033±0,050 125,827±531,410 Folha_DCM -0,002±0,011 0,063±0,085 1414,472±2617,595

Flor_MeOH 0,059±0,006 0,550±0,047 9,132±0,817

Folha_MeOH 0,089±0,017 0,791±0,138 6,441±1,052 Folha_H O 2 0,039±0,001 0,392±0,008 12,746±0,261

Flor_H 2O 0,057±0,002 0,532±0,017 9,412±0,300

Tabela 10 - Resultados do teste de atividade antioxidante dos extratos brutos e da naftoquinona eleuterina, isolada do extrato hexânico do bulbo, de Eleutherine bulbosa utilizando o método com Fe 3+/Fenantrolina. mostrando valores de absorbância, equivalência do ácido ascórbico (AA), equivalência das amostras e seus respectivos desvios padrão.

Extrato ou substância [Fe 2+ ] [AA] eq Equivalência testada Eleuterina 0,040±0,017 -0,040±0,029 -164,602±83,380 Bulbo_Hexano 0,097±0,038 0,186±0,063 29,449±11,626 Bulbo_MeOH 0,213±0,028 0,377±0,046 13,414±1,742 Flor_DCM 0,086±0,027 -0,115±0,044 -47,610±15,747 Folha_DCM 0,015±0,018 0,001±0,030 -262,581±434,764 Flor_MeOH 0,370±0,003 0,636±0,005 7,861±0,059 Folha_MeOH 0,548±0,092 0,929±0,151 5,490±0,982 Folha_H O 2 0,199±0,068 0,355±0,111 14,948±4,073 Flor_H O 2 0,290±0,018 0,504±0,029 9,950±0,580

No geral, todos os extratos analisados apresentaram valores de equivalência distantes dos do ácido ascórbico, tanto no teste com DPPH (Tabela 8) quanto no com Fe 3+ /Fenantrolina (Tabela 9), portanto, não apresentaram atividade antioxidante significativa. Na análise de CCDC dos extratos brutos do bulbo, a revelação com cloreto férrico indicou a presença de substâncias aromáticas, porém, a falta de atividade antioxidante indica que as substâncias aromáticas não são fenólicas.

Contudo, ao mesmo tempo a análise de CCDC revelou a forte presença de quinonas através da revelação com KOH 10%, tal como a naftoquinona eleuterina oriunda do extrato hexânico do bulbo, que são classes de metabólitos secundários

conhecidos por induzir o estresse oxidativo. Malheiros (2008) obteve resultados semelhantes no teste antioxidante do extrato etanólico do bulbo de Eleutherine plicata (coletada em Belém-PA), das naftoquinonas isoeleuterina e isoeleuterol, e sugere que a presença de quinonas no extrato possa inibir a capacidade antioxidante das substâncias fenólicas presentes, caso existam, o que justificaria o fraco potencial antioxidante destes extratos e, claro, da naftoquinona eleuterina. Estudos feitos com Eleutherine bulbosa e Eleutherine americana da Indonésia (KARMINI, YULIET & KHUMAIDI, 2014; KUNTORINI & ASTUTI, 2010; KUNTORINI, 2013; SULASTRI & OKTAVIANI, 2015) mostraram resultados positivos quanto ao potencial antioxidante do extrato etanólico do bulbo e das naftoquinonas isoladas, presentes no mesmo (elecanacina, eleuterina, eleuterol, eleuterinona). Essa diferenciação no potencial antioxidante pode ser devido a uma produção diferenciada dos metabólitos secundários em resposta a estímulos ambientais dos diferentes biomas, podendo até mesmo aumentar ou diminuir a concentração das substâncias antioxidantes.

O extrato metanólico das folhas foi o que apresentou, de todos os extratos, o menor valor de equivalência, ainda sim, não foi considerada uma atividade antioxidante relevante. O mesmo padrão de resultado se repetiu no teste com Fe 3+/Fenantrolina, corroborando com os dados obtidos no teste com o DPPH. Com isso, os extratos e a naftoquinona eleuterina não apresentaram atividade antioxidante significativa.

5.3.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extrato metanólico do bulbo e fase DCM

O extrato metanólico do bulbo e a fase DCM, foram submetidos ao ensaio de microdiluição em caldo, sendo testados para 14 bactérias. O extrato metanólico do bulbo apresentou resultado positivo contra sete bactérias na concentração de 1000 µg/mL. Já a fase DCM apresentou atividade positiva contra onze bactérias na concentração de 1000 µg/mL, e atividade contra S. aureus na concentração de 500 µg/mL.

Tabela 1 1. Concentração inibitória mínima (MIC) para o extrato metanólico e a fase DCM oriundos do bulbo de Eleutherine bulbosa

Concentração mínima inibitória (MIC) em μg/mL Bactérias Extrato Bruto Fase

Aeromonas hydrophila 1000 1000 Edwardsella tarda - - Pseudomonas aeruginosa - 1000 Pseudomonas fluorescens 1000 1000 Salmonella enteritidis - 1000 Staphylococcus aureus 1000 500 Klebsiella pneumoniae 1000 1000 Enterobacter clocae - 1000 Serratia marcescens - - Morganella morganii 1000 1000 Propionibacterium acnes 1000 1000 Yersinia enterocolitica 1000 1000 Enterococcus faecalis - - Acinetobacter baumanii - 1000 *O controle positivo utilizado foi oxitetraciclina a uma concentração de 125 μg/mL. Concentração dos extratos e das fases de 1000 µg/mL até 7,8 µg/mL O extrato metanólico apresentou uma inibição significativa na concentração de 1000 µg/mL quando comparado com o controle positivo, e uma inibição de mais de 50% na concentração de 500 µg/mL frente à S. aureus , quando comparado com o controle negativo (figura 63). Já a fase DCM apresentou uma atividade inibitória significativa em ambas as concentrações de 1000 e 500 µg/mL (figura 64).

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3 Densidadeoptica 0,2

0,1

0,0 7,8 500 250 125 62,5 15,6 1000 31,25 Branco µ

Controle - Controle g/mL Controle + Controle

Figura 63 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para o extrato metanólico do bulbo de Eleutherine bulbosa frente a S. aureus.

1,0

0,8

0,6

0,4 Densidade optica 0,2

0,0 7,8 500 250 125 62,5 15,6 1000 31,25 Branco µ

Controle - Controle g/mL Controle + Controle

Com este resultado ficou clara a presença de substâncias com potenciais antimicrobianos, e com isso, foi realizado o teste de CIM para as substâncias isoladas.

Concentração Inibitória Mínima (CIM) das substâncias isoladas

As sete substâncias isoladas da fase DCM do extrato metanólico do bulbo, bem como a substância isolada do extrato hexânico do bulbo, foram submetidas ao teste de CIM frente à todas as bactérias mencionadas. Para as substâncias, a concentração inicial foi de 500 µg/mL sendo diluídas até 3,9 µg/mL.

No geral, de todas as substâncias testadas, apenas três delas apresentaram CIM de pelo menos 50% de inibição, contra somente S. aureus e P. fluorescens , sendo estas as frações 61+62 (FD), eleuterol e isoeleuterina. Na fração 61+62 (FD) observou-se que houve uma inibição de 49,68% na concentração de 500 µg/mL, contra P. fluorescens , quando comparado com o crescimento do controle negativo (figura 65). Para o eleuterol, observou-se que houve uma inibição de 51,59% na concentração de 500 µg/mL contra S. aureus (figura 66), e de 65,43% na concentração de 500 µg/mL, contra P. fluorescens (figura 67). Já para a isoeleuterina, observou-se que houve uma inibição de 49,13% na concentração de 500 µg/mL contra S. aureus (figura 68), quando comparado com o crescimento do controle negativo, e de 81,23% na concentração de 500 µg/mL contra P. fluorescens (figura 69). Eleuterinol e isoeleuterina apresentaram atividades semelhantes, com exceção do fato da isoeleuterina apresentar uma inibição maior contra P. fluorescens .

Observou-se que eleuterina não demonstrou potencial antimicrobiano significativo, ao contrário de isoeleuterina. Isto pode ser justificado pelo fato que as atividades biológicas das naftoquinonas estão diretamente relacionadas com os seus aspectos estruturais, sendo ativas ou inativas, por exemplo, pela simples retirada de um metileno (ARAÚJO, ALENCAR & ROLIM NETO, 2002). Com isso, é provável que a mudança na posição do hidrogênio e da metila do C-3 da estrutura de ambos influencie no potencial antimicrobiano.

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4 Densidadeoptica 0,2

0,0 7,8 3,9 500 250 125

62,5 15,6 31,25 Branco µg/mL Controle - Controle Controle + Controle Figura 65 - Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a substância 61 + 62 (FD) obtida a partir de Eleutherine bulbosa frente a P. fluorescens.

1,0

0,8

0,6

0,4

Densidadeoptica 0,2

0,0

7,8 3,9 500 250 125 62,5 15,6 31,25 Branco µg/mL Controle - Controle Controle + Controle

1,2

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0,6

0,4 Densidadeoptica 0,2

0,0 7,8 3,9 500 250 125 62,5 15,6 31,25

Branco µg/mL Controle - Controle Controle + Controle

1,0

0,8

0,6

0,4

Densidadeoptica 0,2

0,0 7,8 3,9 500 250 125 62,5 15,6 31,25

Branco µg/mL Controle - Controle Controle + Controle

1,0

0,8

0,6

0,4 Densidade optica Densidade 0,2

0,0 7,8 3,9 500 250 125 62,5 15,6 31,25 Branco µg/mL Controle - Controle Controle + Controle

Malheiros (2008) também realizou testes antimicrobianos com o extrato etanólico do bulbo de Eleutherine plicata coletada em Belém-PA contra S. aureus e E. coli , onde obteve resultados positivos para atividade antimicrobiana, enquanto que a do presente estudo, não apresentou atividade frente a essas cepas.

Padhi & Panda (2015) realizaram testes antimicrobianos com extratos de Eleutherine bulbosa , coletada na Índia, contra S. aureus, E. coli e P. fluorescens , encontrando resultados positivos para o extrato etanólico da espécie, testado através da metodologia de difusão em ágar, em uma concentração de 30 mg/mL de amostras.

Ifesan e colaboradores (2009) também realizaram testes antimicrobianos com extratos de Eleutherine americana , coletada na Tailândia, onde os extratos da mesma apresentaram atividade inibitória frente a várias cepas de S. aureus presentes em alimentos. Ainda, Ifesan, Ibrahim & Voravuthikunchai (2010) testaram os extratos contra diversos outros micro-organismos, e nesse trabalho constataram atividade contra S. aureus e nenhuma atividade contra E. coli.

Panda e colaboradores (2016), realizaram teste antimicrobiano com os extratos aquoso e metanólico de Eleutherine bulbosa frente a diversas bactérias, encontrando resultados positivos, onde uma porcentagem bem maior de inibição bacteriana foi

demonstrada pelo extrato metanólico, apresentando uma concentração inibitória mínima ainda maior do que a deste estudo, onde a menor foi de 22 µg/mL. Os autores justificam esse potencial maior do extrato metanólico por conta dele possuir substâncias de baixa e média polaridade, além de substâncias polares primárias. Além disso, extratos metanólicos que são parcialmente diluídos em água, tem maior chance de quebrar a membrana celular de bactérias, especialmente as Gram-Negativas, por estas possuírem uma camada parcialmente hidrofílica que permite a passagem de pequenas moléculas hidrofílicas do extrato na membrana, perturbando o equilíbrio celular e levando a morte celular da bactéria.

5.3.3 TESTE DE TOXIDADE FRENTE À Artemia salina

O teste com Artemia salina foi realizado em triplicata de cada uma das amostras testadas, nas concentrações de 1000, 500, 250, 125 µg/mL. Na tabela abaixo, são mostrados os valores da taxa de mortalidade dos indivíduos e os controles do solvente e solução salina, para uma maior confiabilidade nos resultados. As médias e o desvio padrão das amostras foram calculados baseados na mortalidade dos indivíduos de Artemia salina nos três poços, os resultados são demonstrados na tabela 12.

Tabela 12 – Resultado do teste de toxidade apresentando os valores médios expressos em porcentagem e desvio padrão dos extratos e da naftoquinona eleuterina frente à Artemia salina .

Concentrações das amostras (µg/mL) 1000 500 250 125 Amostras Valores médios (%) e Desvio Padrão Eleuterina 100±0 100±0 0±0 0±0 Bulbo Hexano 86,66±0,57 100±0 96,66±0,57 80±1 Bulbo MeOH 93,33±1,15 100±0 100±0 100±0 Folhas DCM 90±0 86,66±1,54 83,33±0,57 76,66±1,52 Folhas MeOH 93,33±0,57 63,33±4,72 83,33±1,54 73,33±3,78 Flor DCM 73,33±2,51 93,33±1,15 83,33±0,57 0±0 Flor MeOH 83,33±2,08 100±0 80±2,64 96,66±0,57 Controle DMSO 25% 0±0 0±0 0±0 0±0 Controle solução salina 0±0 0±0 0±0 0±0

De modo geral, as amostras apresentaram uma alta toxidade frente ao micro- crustáceo, nas menores e maiores concentrações. Eleuterina apresentou uma alta toxidade frente ao micro crustáceo nas concentrações de 1000 e 500 µg/mL, não apresentando toxidade nas menores concentrações. Os extratos do bulbo, tanto hexânico quanto metanólico, apresentaram alta toxidade, sendo o metanólico do bulbo o que apresentou, de todas as amostras, a maior toxidade. Os extratos de folhas e flores também apresentaram de média a alta toxidade, demonstrando que os extratos de diversas partes de Eleutherine bulbosa , possuem no geral, de média a alta toxidade frente à Artemia salina . De acordo com Harada (2009), os resultados de ensaio com Artemia salina mostram uma correlação positiva com ensaios antitumorais quando analisados de uma maneira qualitativa e não quantitativa, portanto, funcionando como uma pré-avaliação eficiente de substâncias com potenciais farmacológicos a serem avaliados por um bioensaio específico, como o antitumoral. Ainda, os produtos naturais que apresentarem baixa toxidade, podem subsidiar estudos de modificação estrutural, para explorar ainda mais o potencial das substâncias em diferentes circunstâncias, além de serem ideais para testes em organismos, pois a ausência de toxidade oferece uma tolerância do organismo teste ao princípio ativo encontrado na planta.

Com isso, os resultados mostrados tornaram as amostras interessantes para a realização de um ensaio antitumoral, para ver se tal toxidade tem potencial para inibir ou até mesmo eliminar células cancerígenas.

5.3.4 ENSAIO ANTITUMORAL

Na avaliação dos extratos e da naftoquinona eleuterina quanto ao seu potencial antitumoral, nenhuma das amostras mostrou uma citotoxidade significativa frente às linhagens tumorais, com exceção do extrato hexânico do bulbo, como demonstrado na Tabela 13. Todas as linhagens apresentaram entre 10-30% de morte celular após 24 h de reação com os extratos e a substância, contudo, o extrato hexânico do bulbo apresentou uma porcentagem de letalidade de 50-60% contra as linhagens MCF-7, MRC-5 e SK- Mel-28, valores que se aproximam dos apresentados pela Doxorrubicina, o que torna este extrato um extrato interessante para um futuro fracionamento, análise das substâncias presentes e estudos de sinergia com substâncias para explorar seu potencial

100

de uma maneira mais profunda. Ainda, é interessante ressaltar que a naftoquinona eleuterine apresentou uma porcentagem de letalidade de aproximadamente 10-30 % contra todas as linhagens, sendo ela originária do extrato hexânico do bulbo que apresentou uma letalidade de 50-60%, demonstrando que a eleuterina não é a principal responsável pela atividade antitumoral, podendo ser que ela contribua para este potencial quando em sinergia com outras substâncias. Com isso, torna-se importante fracionar o extrato hexânico para isolar as substâncias responsáveis por esta atividade.

As quinonas são conhecidas por apresentarem alta citotoxidade, e com isso serem responsáveis por intensa atividade antitumoral, devido a suas estruturas químicas apresentarem unidade quinonoídica capaz de gerar intermediários alquilantes, conhecidos por serem agentes antineoplásicos biorredutores, através da ativação por redução de suas carbonilas quinonoídicas (BRAND & FISHER, 1990; GAUDIANO & KOCH, 1991; SALMON-CHEMIN et al., 2001; SILVA, FERREIRA & SOUZA, 2003; LIN et al., 1984).

Kusuma e colaboradores (2010) realizaram teste antitumoral com a naftoquinona eleuterina isolada de E. americana cultivada na Indonésia, contra células de melanoma B16, obtendo resultados positivos com inibição de 87% das células tumorais nas concentrações de 50 e 25 µg/mL. Krishnan & Bastow (2000) descreveram atividade antitumoral de eleuterine, isolada também de E. americana , ao relatar a capacidade da substância de inibir a ação da topoisomerase II, uma importante enzima na replicação do DNA que ao ser inibida em células tumorais, impede que as mesmas continuem a se replicar, impedindo então a proliferação e crescimento do tumor.

Estes resultados quando relacionados com os do bioensaio com Artemia salina , mostraram algumas diferenças na correlação de toxidade, como por exemplo, do extrato metanólico do Bulbo, que apresentou baixa toxidade no ensaio antitumoral, e alta toxidade frente à Artemia salina . Harada (2009) afirmou que a correlação entre o teste de Artemia salina e o teste antitumoral é qualitativa, mas não quantitativa, o que poderia explicar a correlação vista neste trabalho, justificando que provavelmente a quantidade de extrato ou substância necessária para apresentar toxidade às linhagens tumorais, seja maior que a necessária para apresentar toxidade às larvas de Artemia .

101

Tabela 13 – Determinação da morte celular de linhagens de células tumorais frente à extratos de Eleutherine bulbosa e à naftoquinona eleuterina.

MORTE CELULAR (%) EXTRATOS/SUBSTÂNCIAS LINHAGENS DE CÉLULAS MCF-7 MRC-5 HCT116 SK-MEL-28 Eleuterina 30,10 33,81 11,47 15,29 Bulbo – Hexano 50,23 59,61 42,63 53,58 Bulbo - MeOH 27,15 34,25 10,93 22,74 Folha – DCM 18,83 12,72 14,39 23,29 Folha – MeOH 19,53 25,01 21,22 22,60

Folha – H2O 23,63 26,38 25,23 13,65 Flor – MeOH 23,27 30 18,04 9,73

Flor – H2O 17,68 17,93 20,81 13,68 Doxorrubicina (controle positivo) 62,76 67,11 62,56 66,08 DMSO (controle negativo) 0 0 0 0

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6. CONCLUSÃO

A análise fitoquímica de Eleutherine bulbosa coletada no bioma amazônico, revelou a presença quinonas e derivados de quinonas. Foi possível o isolamento de sete substâncias, contudo só foi possível a caracterização de cinco delas: eleuterina, eleuterol, eleuterinol-8-O-β-glicosídeo, isoeleuterina e eleuterinol.

O ensaio biológico de toxidade frente ao microcrustáceo Artemia salina , revelou que os extratos de folhas, flores e bulbo possuem substâncias com alta toxidade, sendo interessantes para a realização de ensaios antitumorais.

O ensaio antitumoral com revelou que o extrato hexânico do bulbo conseguiu matar 50-60% da células tumorais de MCF-7, MRC-5 e SK-Mel-28, sendo promissor para posteriores ensaios a fim de explorar esse potencial. Os extratos de folhas, flores e bulbo, juntamente com a naftoquinona eleuterina, não apresentaram potencial antitumoral frente às linhagens tumorais testadas, apesar da sua toxidade no ensaio contra Artemia salina .

O ensaio antimicrobiano revelou que o extrato metanólico do bulbo e a fase DCM, originária do mesmo, possuem substâncias com potencial antimicrobiano presente nas amostras para 11 das bactérias testadas, e em menor concentração para a fase DCM frente à S. aureus . Das substâncias isoladas, apenas a fração 61+62 (FD), eleuterol e isoeleuterina, apresentaram CIM de 500 µg/mL contra S. aureus e P. fluorescens.

Os extratos de folhas, flores e bulbo, juntamente com naftoquinona eleuterina, não apresentaram atividade antioxidante significativa.

Os resultados deste estudo contribuíram para o conhecimento químico e potencial biológico de Eleutherine bulbosa do bioma amazônico, contudo, em estudos posteriores faz-se necessário o teste das substâncias isoladas e em sinergia com outras substâncias, contra diferentes linhagens tumorais e cepas bacterianas para explorar ainda mais o potencial desta espécie. Os dados aqui podem ser usados em futuros trabalhos comparativos da química da espécie e gêneros inclusos em sua tribo, para estudos quimiotaxonômicos, aliados com dados de morfologia e genética para a solução de problemas taxonômicos.

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7. REFERÊNCIAS

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