Isolamento, Caracterização E Transferência De Marcadores Microssatélites Para Vriesea Carinata Wawra (Bromeliaceae)
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Isolamento, caracterização e transferência de marcadores microssatélites para Vriesea carinata Wawra (Bromeliaceae) desenvolvidos in silico. Cristina Corrêa Todeschini Porto Alegre, dezembro de 2016. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL – UFRGS INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO Isolamento, caracterização e transferência de marcadores microssatélites para Vriesea carinata Wawra. (Bromeliaceae) desenvolvidos in silico. Aluno: Cristina Corrêa Todeschini Orientadora: Fernanda Bered Relatório apresentado à Comissão de Bacharelado do Departamento de Genética para a obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas, ênfase em Biologia Molecular, Celular e Funcional - UFRGS 2016/2 2 "Você não está aqui somente para ganhar a vida. Está aqui para fazer com que a vida seja mais ampla, com uma visão maior, com um espírito grande de esperança e conquista, você está aqui para enriquecer o mundo, e se empobrece quando esquece disso" - Woodrow Wilson 3 Agradecimentos Agradecer não é o suficiente, mas é a forma como tenho para expressar sua importância na minha vida, mesmo que seja durante anos ou minutos, cada instante foi essencial para que no decorrer da minha caminhada eu me encontrasse agora onde estou. Agradeço a vocês meus amados, pai Fernando, mãe Maria Idelma e irmãos Fernando, Victor e Débora que durante toda minha existência sempre me apoiaram, me deram força quando eu achava obstáculos difíceis demais e sempre foram exemplos para mim. A toda minha família obrigada pelo amor incondicional. Agradeço a ti, minha querida orientadora, professora Fernanda Bered, por toda sua dedicação, paciência, empenho e esforço para que eu me tornasse melhor como pessoa e como profissional. Muito obrigada por todas as oportunidades e por sua confiança em mim. Serei eternamente grata. Agradeço a vocês professores, colegas e amigos do Núcleo de Genética e Conservação de Plantas da UFGRS sem os quais esse trabalho não existiria, obrigada pela ajuda, pela disposição, responsabilidade e trabalho em conjunto. Foi um prazer conviver com vocês, dividindo as angústias de quando os experimentos davam errados e as alegrias de quando tudo dava certo. Em especial agradeço a Camila Zanella, Camila Aguiar, Laís Mara, Márcia Goetze e Luíza Hirsch pela amizade e por dias de trabalho mais sorridentes e divertidos. Agradeço a Frank Guzman, que ajudou com a construção da biblioteca de RNA de V.carinata através de NGS e ao José Luiz Parizotto, que ajudou na análise preliminar e desenho dos primers. A vocês meus queridos amigos o meu muito obrigada por me darem força, me incentivar e acreditar em mim. Por nas horas tristes e felizes estarem ao meu lado, por compreenderem minha ausência e estarem sempre de braços abertos para me receber. Por todas as conversas e espairecimento nos finais de semana. 4 Agradeço a Capes, Fapeg e CNPq pelo suporte financeiro fundamental na execução deste trabalho. Muito obrigada a todos por mais uma etapa da minha vida ser concluída, cada um teve sua participação no meu crescimento. “A felicidade só é real quando compartilhada. ” - H. David Thoreau 5 “A mutação é parte intrínseca da vida. Sem mutação, não pode haver variabilidade genética, pois a mutação é a origem de toda variabilidade. Sem variabilidade não poderia haver seleção. Sem seleção não há evolução. Sem evolução não há adaptação.” - Bernardo Erdtmann 6 SUMÁRIO ABSTRACT ......................................................................................................................... 8 Capítulo 1 .......................................................................................................................... 9 1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 10 1.1. Família Bromeliaceae ................................................................................... 10 1.2. O Gênero Vriesea e a espécie Vriesea carinata (Wawra) ............................ 12 1.3. Marcadores moleculares do tipo microssatélites ........................................ 13 1.4. Genética da Conservação ............................................................................. 19 1.5. Objetivos ...................................................................................................... 21 Capítulo 2 ........................................................................................................................ 22 ARTIGO ........................................................................................................................ 23 RESUMO .................................................................................................................. 24 1. Introdução ........................................................................................................... 26 2. Materiais e Métodos ........................................................................................... 28 2.1. Coleta das amostras e extração de DNA ...................................................... 28 2.2. Construção da biblioteca enriquecida de microssatélite e desenho de primers .................................................................................................................... 28 2.3. Condições de amplificação e genotipagem ................................................. 29 2.4. Análises dos dados ....................................................................................... 29 2.5. Amplificação heteróloga .............................................................................. 30 3. Resultados ........................................................................................................... 31 3.1. Identificação dos microssatélites e desenho de primers ............................. 31 3.2. Polimorfismo dos microssatélites em V. carinata ....................................... 38 3.3. Análise de diversidade genética ................................................................... 41 3.4. Amplificação heteróloga .............................................................................. 42 4. Discussão ............................................................................................................. 44 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................ 48 Capítulo 3 ........................................................................................................................ 54 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 55 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS .......................................................................... 58 7 ABSTRACT Bromeliads are typical plants of the New World and have been widely used for various purposes such as ornamentation, fibers, fodder, food, medicinal, among others. Vriesea is the second largest genus of the subfamily Tillandsioideae, being composed of native species from South America, mainly from Brazil, covering the South and Southeast regions of the country. They are mainly epiphytic plants, and have aerial roots exposed to the humid atmosphere. Vriesea carinata is a small species, has a red inflorescence with yellow border of bracts and also yellow flowers, being quite attractive for hummingbirds and much sought after for ornamentation of baskets and floral arrangements. In the present study, thirty microsatellite markers were developed and characterized from an RNA enriched library of V. carinata. Of these, seventeen microsatellite loci had satisfactory amplification, of which thirteen were polymorphic and tested in three natural populations of V. carinata. The results indicated a relatively high expected heterozygosity (HE = 0.682), but there is a heterozygote deficit compared to the heterozygosity values obtained (HO = 0.456). The allelic richness ranged from 2,395 to 2,722 and the number of alleles ranged from four to 15 with an average of 7.23 alleles per locus. Heterologous amplification was performed in 15 species of three subfamilies of Bromeliaceae. Of the 13 developed loci, four amplified in more than 50% of the species, suggesting its potential usefulness in studies on population genetics involving other bromeliad’s species. All microsatellite markers developed here may be used in future studies to evaluate genetic diversity and may propose effective conservation strategies based on the results obtained. 8 Capítulo 1 9 1. INTRODUÇÃO 1.1. Família Bromeliaceae A família Bromeliaceae compreende aproximadamente 3.510 espécies distribuídas em 59 gêneros (Gouda, 2016), e está entre as famílias de maior riqueza e diversidade da Mata Atlântica (Martinelli et al., 2008). Podem ser encontradas em praticamente todos os ecossistemas neotropicais, desde o nível do mar, em praias, mangues e restingas, até altitudes de 5.000m, nos Andes, com distribuição geográfica restrita basicamente às Américas (exceção feita somente à uma espécie do gênero Pitcairnia, originária da África) (Smith & Downs, 1974). A família se caracteriza por apresentar uma alta radiação adaptativa, devido aos diversos processos de especiação que ocorreram em curto período de tempo, a partir de uma mesma espécie ancestral, ocupando, essas novas espécies, simultaneamente, vários nichos ecológicos livres (Benzing, 2000; Aoki-Gonçalves et al., 2014). Sendo assim, as bromélias podem ser terrestres, epifíticas ou rupícolas (Benzing, 2000), geralmente herbáceas, variando de plantas delicadas e de pequeno porte, como Tillandsia recurvata (L.)